(57)【要約】    【課題】  ホルモンなどの有用タンパク質の新規な探索法を提供する。    【解決手段】セクレトグラニンIIIをリポゾームにアンカリングさせてなる組成物に生体抽出物を接触させて、該生体抽出物中に含まれるセクレトグラニンIII結合因子と前記組成物との複合体を形成させ、次いで、セクレトグラニンIII結合因子を同定する。    【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セクレトグラニンIIIをリポゾームに結合させてなる組成物に生体抽出物を接触させて、該生体抽出物中に含まれるセクレトグラニンIII結合因子と前記組成物との複合体を形成させる工程、及びセクレトグラニンIII結合因子を同定する工程を含む、セクレトグラニンIII結合因子の探索方法。
【請求項２】
前記複合体を膜にブロットした後に、セクレトグラニンIII結合因子を同定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
膜がＰＶＤＦ膜である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
セクレトグラニンIII結合因子がホルモンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
セクレトグラニンIII及びリポゾームを含む、セクレトグラニンIII結合因子を探索するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホルモンなどの、セクレトグラニンIII結合因子を探索するための方法に関する。本発明はまた、前記結合因子を探索するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体膜コレステロールを核にして種々のタンパク質が集積して機能複合体を形成することが知られている。例えば、ホルモンなどの分泌性タンパク質は、内分泌顆粒においては他のタンパク質と複合体を形成して内分泌顆粒の高コレステロール膜にアンカリングされているという説が提唱されていた。しかしながら、これをもとにホルモンなどの分泌性タンパク質を同定することは容易ではなかった。すなわち、通常のタンパク質−タンパク質相互作用を利用した方法では、高コレステロール膜上で複雑な３次元構造をとるタンパク質同士の相互作用を再現することが困難であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、ホルモンなどの有用タンパク質を効率よく同定できる方法を提供することを課題とする。本発明はまた、ホルモンなどの有用タンパク質を効率よく同定するためのキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、POMC（proopiomelanocortin）などのホルモンがセクレトグラニンIIIを介して分泌顆粒の高コレステロール膜に結合していることを見出した。さらに、セクレトグラニンIIIを高コレステロール含有リポゾームに結合させた組成物を用いることで、ホルモンなどの有用タンパク質を効率よく同定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）セクレトグラニンIIIをリポゾームに結合させてなる組成物に生体抽出物を接触させて、該生体抽出物中に含まれるセクレトグラニンIII結合因子と前記組成物との複合体を形成させる工程、及びセクレトグラニンIII結合因子を同定する工程を含む、セクレトグラニンIII結合因子の探索方法。
（２）前記複合体を膜にブロットした後に、セクレトグラニンIII結合因子を同定する、（１）の方法。
（３）膜がＰＶＤＦ膜である、（２）の方法。
（４）セクレトグラニンIII結合因子がホルモンである、（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）セクレトグラニンIII及びリポゾームを含む、セクレトグラニンIII結合因子を探索するためのキット。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ホルモンなどの有用タンパク質を効率よく同定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明を詳しく説明する。
本発明の方法ではセクレトグラニンIIIをリポゾームに結合させてなる組成物を用いる
。ここで、セクレトグラニンIIIとは、例えば、Ottiger, H.P., Battenberg, E.F., Tsou, A.P., Bloom, F.E. & Sutcliffe, J.G. J. Neurosci. 10, 3135-3147 (1990)に記載されたタンパク質又はそのホモログタンパク質などが挙げられる。セクレトグラニンIIIとしては、ヒトセクレトグラニンIIIやマウスセクレトグラニンIIIなどを用いることができ、例えば、ヒトセクレトグラニンIIIとしては配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、マウスセクレトグラニンIIIとしては配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を用いることができる。また、これらのホモログ、例えば、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、セクレトグラニンIIIの生理活性を有するタンパク質を用いてもよい。こで、数個とは、例えば、２〜５０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。
また、セクレトグラニンIIIは、必ずしも全長タンパク質を用いる必要はなく、部分タンパク質を用いてもよい。部分タンパク質としては、例えば、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸番号２０〜４６８の部分タンパク質や、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸番号２３〜４７１の部分タンパク質などが挙げられる。
【０００８】
セクレトグラニンIIIは、細胞や組織から精製したものや化学合成したものを用いてもよいが、遺伝子組換えによって製造したものを用いることもできる。例えば、配列番号１や３の塩基配列又はその部分配列を有するＤＮＡを適当な発現ベクターに組込み、それを大腸菌や哺乳動物細胞などに導入してセクレトグラニンIIIを発現させ、精製したものを用いてもよい。発現ベクターの種類は特に制限されないが、例えば、大腸菌での発現ベクターとして、pGEX 2T（アマシャムバイオサイエンス社）などが挙げられる。このベクターは、タンパク質をＧＳＴ（グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ）との融合タンパク質として発現し、グルタチオン親和性を利用して融合タンパク質を精製するためのベクターであるが、このように、セクレトグラニンIIIは融合タンパク質として発現させ、そのまま、セクレトグラニンIII結合因子の探索に用いてもよい。
【０００９】
リポゾームは、分泌顆粒の生体膜を再現できるようなコレステロール含量の高いものを用いる。例えば、コレステロール含量が４０〜９０mol％、好ましくは５０〜８０mol％のものを用いることができる。このコレステロールに、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンなどの脂質の１又は２種以上を混合することによってリポゾームを得ることができる。リポゾームは、公知の方法に従って調製することができる。例えば、Liposome Technology, vol. 1, 2nd edition (by Gregory Gregoriadis (CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo), Chapter 4, pp67-80, Chapter 10, pp167-184 and Chapter 17, pp261-276 (1993))に記載された方法を用いることができる。より具体的には、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エーテル注入法、コール酸法、カルシウム融合法、凍結融解法、逆相蒸発法等が挙げられる。リポゾームのサイズは、特に制限されないが、通常は平均１００〜２００ｎｍが好ましく、１００〜１５０ｎｍがより好ましい。リポゾームの内部に内包される溶液としては、水、緩衝液、生理食塩水などを用いることができる。
【００１０】
上記のようなリポゾームを、好ましくは有機溶媒に溶解し、セクレトグラニンIIIの溶液に添加することで、セクレトグラニンIIIがその疎水性ドメインを介してリポゾームにアンカリングされる。
本発明の方法では、このようなセクレトグラニンIIIがリポゾームにアンカリングされた組成物を含む溶液に、生体抽出物を添加することによって、該生体抽出物中に含まれるセクレトグラニンIII結合因子と該組成物との複合体を形成させる。ただし、本発明の方法では、必ずしも最初にセクレトグラニンIIIとリポゾームの組成物を作製し、そこに抽出物を添加する必要はなく、セクレトグラニンIII、リポゾーム、生体抽出物を同時に混
合し、セクレトグラニンIIIをリポゾームにアンカリングさせるとともに、前記複合体形成反応を行ってもよい。
生体抽出物としては、組織や細胞の抽出物などが挙げられ、好ましくは、内分泌組織や内分泌細胞の抽出物が挙げられる。具体的には、細胞の破砕物、細胞内小器官分画の破砕物などが挙げられるが、これらには限定されない。
複合体形成反応は、セクレトグラニンIII結合因子とセクレトグラニンIIIの結合反応が起こりうる温度、例えば、４〜４０℃で、結合反応に十分な時間、例えば、３０分〜２４時間行う。セクレトグラニンIII結合因子は、セクレトグラニンIIIに特異的に結合しうる生体内因子であれば特に制限されないが、例えば、ホルモンなどの分泌性タンパク質が挙げられる。
【００１１】
複合体形成反応後、好ましくは生理緩衝液などで前記複合体を洗浄し、セクレトグラニンIII結合因子の同定を行う。
セクレトグラニンIII結合因子の同定は、例えば、前記複合体をリポゾームを含んだまま膜に固定し、次いで、膜上のリポゾームからセクレトグラニンIII結合因子を解離させた後に、行うことができる。ここで、用いる膜としては、ニトロセルロース膜やPVDF(polyvinylidene fluoride)膜などがあげられるが、PVDF膜がより好ましく用いられる。
また、GST-セクレトグラニンIII融合タンパク質を用いた場合、グルタチオンビーズに、複合体を結合させ、セクレトグラニンIII結合因子をグルタチオンビーズから解離させた後に、セクレトグラニンIII結合因子の同定を行ってもよい。
同定は、例えば、電気泳動、アミノ酸配列分析、質量分析、抗体を用いた検出法、又はこれらの組み合わせによって行うことができる。
【００１２】
本発明は、また、セクレトグラニンIII及びリポゾームを含む、セクレトグラニンIII結合因子を探索するためのキットを提供する。セクレトグラニンIII及びリポゾームについては、上述したとおりである。本発明のキットは、その他の構成物としてバッファーなどを含んでもよい。
【実施例】
【００１３】
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１４】
１．分泌顆粒膜の脂質組成をもつリポゾームの作製
クロロホルムに溶解した各種リン脂質とコレステロールを、モル比でホスファチジルコリン：ホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルセリン：ホスファチジルイノシトール：スフィンゴミエリン：コレステロール＝6.2：17.7：3.6：1.0：7.5：64になるように混和し、窒素ガスで乾燥後、緩衝液 50 mM HEPES (pH 7.4), 0.1 M NaCl, もしくは 50 mM MES (pH5.5), 0.1 M NaClを加えた（コレステロールを473 μg加えた時トータル2 mlの上記緩衝液で混和する）。これを超音波処理した後、１００００ x gで遠心し、上清を分泌顆粒膜組成をもつリポゾームとして用いた。なお、コレステロール組成の異なるリポゾームを作製する場合、コレステロール量を変え、そのモル比に応じて他の脂質のモル比を増減させて、作製した。
【００１５】
２．GST融合セクレトグラニンIIIの発現及び精製
GST発現用ベクター(pGEX 2T; アマシャムバイオサイエンス社)にセクレトグラニンIIIの23-471番目のタンパク質をコードするcDNAを挿入した。この発現用ベクターを大腸菌BL21(DE3)で発現し、グルタチオンビーズ（Glutathione Sepharose 4 Fast Flow; アマシャムバイオサイエンス社）を用い精製した。
【００１６】
３．放射標識リポゾームの作製とセクレトグラニンIIIのアンカリングの確認
クロロホルムに溶解させた各種リン脂質とコレステロールを、モル比でホスファチジルコリン：ホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルセリン：ホスファチジルイノシトール：スフィンゴミエリン：コレステロール＝6.2：17.7：3.6：1.0：7.5：64になるように混和し、そこに3H-ホスファチジルコリン（L-3-Phophatidyl[N-methyl-3H] choline, 1,2-dipalmitoyl、アマシャムバイオサイエンス社；トータルボリュームが2 mlの場合、3H-ホスファチジルコリンは8 μl）を加え、窒素ガスで乾燥後、緩衝液 50 mM MES (pH5.5), 0.1 M NaClを加えた（コレステロールを473 μg加えた時トータル2 mlの上記緩衝液で混和する）。これを超音波処理した後、１００００ x gで遠心し、上清を分泌顆粒膜組成をもつリポゾームとして用いた。同様にして、コレステロール含量がそれぞれ、０、２０、４０、６０、８０mol％の放射標識リポゾームも作製した。
【００１７】
上記のようにして大腸菌で発現させたグルタチオンビーズに結合しているGST-セクレトグラニンIII 25 μgと、上記それぞれの放射標識リポゾーム50 μlに、最終濃度10 mMになるようにCaCl2と1mMのEGTAを加え、トータルボリュームを100 μlにした。これを室温で激しく混和し、10分間反応させた。その後反応チューブを1000 x gで遠心し、上清を捨てた。その後ビーズに50 mM MES (pH5.5), 0.1 M NaCl, 10 mM CaCl2, 1mM EGTAを加え洗浄した。この洗浄を合計三回繰り返した。最後にビーズを10 mMのEDTA溶液に懸濁し、ビーズに残った放射活性を計測した。結果を図１に示した。
これにより、セクレトグラニンIIIとリポゾームの結合が確認できた。
【００１８】
４．セクレトグラニンIIIをアンカリングさせたリポゾームを用いたプロオピオメラノコルチン(POMC)沈降実験
大腸菌で発現させ、グルタチオンビーズに結合させたGST-セクレトグラニンIII 20 μgとAtT-20（マウス脳下垂体由来細胞株）の細胞抽出液 5 mgとリポゾーム（コレステロール64 mol %） 25 μl を4°Cで12時間混和後、50 mM HEPES (pH 7.4), 0.1 M NaCl, 1 % TritonX-100, 10 mM CaCl2, 1mM EGTAで3回洗った。これに1xSDS-loading bufferを混ぜ、ビーズ結合物をSDS-ポリアクリルアミドを支持体とした電気泳動で分離し、抗POMC抗体を用いたウエスタンブロットにより解析した（図２のレーン１）。GST-CPE（レーン２）はPOMCと結合することが知られているカルボキシペプチダーゼEとGSTの融合タンパク質を用いた場合の結果を示している。また、GST（レーン３）はGSTのみを用いた場合、Cell Extract（レーン４）は、細胞抽出物そのもののウエスタンブロットである。
この結果より、リポゾームにアンカリングさせたセクレトグラニンIIIを用いることにより、セクレトグラニンIII結合因子としてPOMCを同定することに成功した。
【００１９】
５．セクレトグラニンIIIによる新規生体調節因子探索実験
新規なセクレトグラニンIII結合因子は以下のようにして探索することができる。
大腸菌で発現させたGST-セクレトグラニンIII 20 μgと脳下垂体などの内分泌組織抽出液 5 mgとリポゾーム（64 mol %） 25 μl を4°Cで12時間混和後、PVDF (polyvinylidene difluoride) 膜にリポゾームを含む複合体を固定する。リポゾームにはセクレトグラニンIIIを介して新規生体調節因子が結合していることが期待される。結合している新規生体調節因子を少量の50 mM HEPES (pH 7.4),  0.1 M NaCl, 1 % TritonX-100, 1mM EGTAで遊離させ、これを前述のようにSDS-ポリアクリルアミドを支持体とした電気泳動で分離し、シルバー染色を行い、染色バンドのアミノ酸配列を決定して、新規生体調節因子の探索を行う。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】各コレステロール含量のリポゾームとセクレトグラニンIIIの結合を示す図。
【図２】リポゾームにアンカリングさせたセクレトグラニンIIIとPOMCの結合を示す図。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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