(57)【要約】【課題】従来の簡便性を維持した上で、動物の生物学的標本をストロー等の細管内で凍結保存し、この細管内において生物学的標本の融解、希釈を行い、生物学的標本の生存性を高く維持することができる、生物学的標本の凍結保存技術を確立する。【解決手段】動物の生物学的標本を含むガラス化保存液と希釈液とを凍結状態で保存し、その後融解して生物学的標本を動物へ移植するための凍結保存用細管であって、凍結状態において、希釈液５が細管本体２内の一端側から他端側に向けて充填され、生物学的標本を含むガラス化保存液４を先端部に付着させた線状支持具３が、同線状支持具３の先端側が希釈液５凍結層の終端面に隣接するように細管本体２内に配置されていることを特徴とする生物学的標本の凍結保存用細管。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の生物学的標本を含むガラス化保存液と希釈液とを凍結状態で保存し、その後融解して生物学的標本を動物へ移植するための凍結保存用細管であって、
凍結状態において、希釈液が細管本体内の一端側から他端側に向けて充填され、生物学的標本を含むガラス化保存液を先端部に付着させた線状支持具が、同線状支持具の先端側が希釈液凍結層の終端面に隣接するように細管本体内に配置されていることを特徴とする生物学的標本の凍結保存用細管。
【請求項２】
前記細管本体内には、前記希釈液を分断する空気層が設けられている請求項１記載の生物学的標本の凍結保存用細管。
【請求項３】
凍結状態のもとで細管に内蔵された動物の生物学的標本を含むガラス化保存液と希釈液とを凍結保存する方法であって、
細管本体内に希釈液を吸引し凍結する希釈液凍結工程と、生物学的標本を含むガラス化保存液を線状支持具の先端部に付着させて急速凍結するガラス化凍結工程と、ガラス化凍結工程後の線状支持具を同線状支持具の先端側が細管本体内にある希釈液凍結層の終端面に隣接するように細管本体内に配置する支持具配置工程と、凍結状態の生物学的標本を含むガラス化保存液と希釈液とを内蔵する細管を封閉する封閉工程と、封閉工程後の細管を冷却物質中に浸漬して低温保存する保存工程と、を含むことを特徴とする生物学的標本の凍結保存方法。
【請求項４】
支持具配置工程における線状支持具の細管本体内での移動を、一部または全部が強磁性体からなる線状支持具を磁石によって誘導することにより行う請求項３記載の生物学的標本の凍結保存方法。
【請求項５】
請求項１記載の凍結保存用細管を使用し、請求項３または４記載の凍結保存方法によって凍結保存した動物の生物学的標本を融解するにあたり、あらかじめ冷却物質中に浸漬した細管の封閉部を空気中に引き出した状態で直立させ、封閉部を加温して緩めることで融解時に発生するガスの封閉部からの排出を可能とし、その後細管を冷却物質中から取り出して加温して、凍結した生物学的標本を含むガラス化保存液と希釈液とを融解するとともに、ガラス化保存液を希釈液にて希釈することを特徴とする凍結保存後の生物学的標本の融解方法。
【請求項６】
細管を加温して、凍結した生物学的標本を含むガラス化保存液と希釈液とを融解しガラス化保存液を希釈液にて希釈する際に、融解した希釈液中に線状支持具を移動させる請求項５記載の凍結保存後の生物学的標本の融解方法。
【請求項７】
前記線状支持具の融解した希釈液中への移動を、一部または全部が強磁性体からなる線状支持具を磁石によって誘導することにより行う請求項６記載の凍結保存後の生物学的標本の融解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の人工授精技術に関し、詳しくは動物の卵子，胚，組織細胞等の生物学的標本を保存し移植するための凍結保存用細管と、これを使用した凍結保存方法、および凍結保存後の融解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、例えば牛の胚移植技術に用いられる胚は、受胚牛の発情周期に合わせて移植が行われている。この発情周期に胚の移植を合わせるために、生産した胚を液体窒素等の冷却物質の中で凍結した状態で保存し、その後に胚を融解して移植を行っている。胚を凍結した状態で保存するための凍結方法として、胚の保存液を概ね−３０℃まで緩慢に凍結させて胚の細胞内の自由水を脱水しながらゆっくりと冷却する緩慢冷却法が知られている。この方法により凍結した胚を保存する際には、プラスチック製ストロー等の細管内において保存し、この細管内で融解した胚が移植に利用されている。このように、胚を凍結保存した細管は、動物の雌子宮内へ注入して胚を移植できるため、産業として多くの場で利用されている。
【０００３】
しかし、牛胚、特に体外受精胚を緩慢冷却法で凍結して保存すると、融解後の胚の生存性が低下することが知られている。このため、凍結していない新鮮な胚と比較して、受胎率が低下するという問題がある。このような緩慢冷却法の問題を解消するための胚の凍結方法として、高濃度耐凍剤を含んだ胚の保存液を、胚とともに液体窒素等の冷却物質で急速に冷却して、ガラス状に固化するガラス化法が知られている。このガラス化法により凍結して保存した胚は、高い生存性を維持したまま長期間保存することが可能であり、ガラス化法により凍結した胚の保存方法や保存器具に関する発明が幾つかなされている（例えば、特許文献１〜３参照。）。
【０００４】
特許文献１には、胚移植用ストローに希釈液を入れて冷却凍結し、この上にガラス化低温保存液を直接接するように注入し、それと同時あるいはその前後に胚を注入し、これを液体窒素で冷却しガラス化した哺乳動物胚移植用ストロー及びこのストローの製造法が記載されている。
【０００５】
特許文献２には、ストロー内において、内部に哺乳動物胚を有するガラス化保存液層と希釈液層とを隣接して設けるとともに、その両端部に空気層を配したストロー内希釈型の哺乳動物胚ガラス化保存ストローが記載されている。
【０００６】
特許文献３には、哺乳動物胚または卵子を滅菌処理した凍結ストロー、凍結バイアルまたは凍結チューブ等の凍結保存用容器の内面に、これらの胚または卵子を包被するに充分な最少量のガラス化液で貼り付け、この凍結保存用容器を密封し、この容器を液体窒素に接触させて急速に冷却した哺乳動物胚または卵子の保存方法が記載されている。また、この容器を液体窒素から取出し、容器の一端部を開口し、この容器内に希釈液を注入して胚または卵子の凍結を溶解する融解方法が記載されている。
【０００７】
【特許文献１】特開平５−１７６９４６号公報
【特許文献２】特開平１０−２４８８６０号公報
【特許文献３】特開２０００−１８９１５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１に記載された哺乳動物胚移植用ストローを用いて凍結保存させた場合、胚にとって毒性の高いガラス化低温保存液の使用量が多く、この保存液に一旦浸漬してからガラス化するため、冷却に要する時間が長くなり、非ガラス化の状態で毒性の高いガラス化液に触れることになる。このため、胚の生存率が低下して不安定となる可能性がある。また、保存液が多いため、融解時においても希釈時間が長くなることにより、胚の生存率が低下して不安定となる可能性がある。
【０００９】
特許文献２に記載された哺乳動物胚ガラス化保存ストローは、マウス胚の生存率を高めることができるとしているが、ガラス化までに行う操作が煩雑である。また、ガラス化までに時間を要するため、特許文献１のストローと同様に、胚の生存率が安定せず、生存率が低くなる可能性がある。
【００１０】
特許文献３に記載された保存方法は、ストロー内にガラス化液と希釈液とを内蔵させた場合、ストローを液体窒素中に投入するため、ストロー内の希釈液は急速に冷却されて凍結することとなる。このとき、希釈液中に気泡を抱えて凍結する可能性があり、融解時にストロー内に多くの気泡が発生し、ガラス化液の希釈が不充分となって胚等の生存性が低下したり、融解時にストローが破損したりする危険性がある。また、ストローが細い場合、ガラス化液中の胚または卵子をストロー内面に貼り付けることは煩雑な作業のうえ、ガラス化液中の胚等が確実にストロー中に付着したかが不確実であり、付着を確かな物にするには多くのガラス化液を胚等とともに付着する必要がある。更に、液体窒素によるガラス化がストローを介して行われるため、冷却熱の伝達が鈍く生存性が落ちる可能性がある。
【００１１】
以上のように、従来の牛胚を凍結して保存するためのストロー等の器具や保存方法では、保存融解後の胚の生存性を維持できず、移植後の受胎率が低下する等の問題がある。このような問題は、牛胚のみならず哺乳動物胚等の生物学的標本においても同様に生じている問題である。
【００１２】
本発明が解決しようとする課題は、従来のストローを利用するという点での簡便性を維持した上で、動物の生物学的標本をストロー等の細管内で凍結保存し、この細管内において生物学的標本の融解、希釈を行い、生物学的標本の生存性を高く維持することができる、生物学的標本の凍結保存技術を確立することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の生物学的標本の凍結保存用細管は、動物の生物学的標本を含むガラス化保存液と希釈液とを凍結状態で保存し、その後融解して生物学的標本を動物へ移植するための凍結保存用細管であって、凍結状態において、希釈液が細管本体内の一端側から他端側に向けて充填され、生物学的標本を含むガラス化保存液を先端部に付着させた線状支持具が、同線状支持具の先端側が希釈液凍結層の終端面に隣接するように細管本体内に配置されていることを特徴とする。
【００１４】
動物の生物学的標本（以下、「標本」と称する。）を含むガラス化保存液を線状支持具の先端部に付着させることにより、使用するガラス化保存液量を標本の包被に必要な最小限の量とすることができるため、標本をガラス化保存液に含ませてからガラス化するまでの時間を短縮することができる。更に、凍結保存後の融解時には、ガラス化保存液を素早く融解して希釈液で確実に希釈することが可能となる。従って、凍結や融解に要する時間が短く、融解後の希釈も確実であることから、標本の生存性を高く維持することができる。
【００１５】
ここで、細管本体内に、希釈液を分断する空気層を設ければ、希釈後から移植までの間、標本を含んだ希釈液は確実に細管本体内で隔離された状態とすることができ、細管下部等からの不純物の混入を確実に防ぐことができる。
【００１６】
本発明の標本の凍結保存方法は、凍結状態のもとで細管に内蔵された動物の標本を含むガラス化保存液と希釈液とを凍結保存する方法であって、細管本体内に希釈液を吸引し凍結する希釈液凍結工程と、標本を含むガラス化保存液を線状支持具の先端部に付着させて急速凍結するガラス化凍結工程と、ガラス化凍結工程後の線状支持具を同線状支持具の先端側が細管本体内にある希釈液凍結層の終端面に隣接するように細管本体内に配置する支持具配置工程と、凍結状態の標本を含むガラス化保存液と希釈液とを内蔵する細管を封閉する封閉工程と、封閉工程後の細管を冷却物質中に浸漬して低温保存する保存工程と、を含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明に係る凍結保存方法は、前記の凍結保存用細管を使用して標本を凍結保存する方法である。凍結保存にあたっては、まず細管本体内に希釈液を吸引して凍結させる。その後に、ガラス化保存液を付着させ凍結させた線状支持具を細管本体内に配置する。これにより、標本を確実に細管本体内に導入することができるとともに、細管本体内で標本を含むガラス化保存液と希釈液とを凍結状態で確実に分離させて配置することができる。また、前記の凍結保存用細管を使用することによって得られる前述の作用効果があることはもちろんである。
【００１８】
ここで、前記の支持具配置工程における線状支持具の細管本体内での移動を、一部または全部が強磁性体からなる線状支持具を磁石によって誘導することにより行えば、細管本体内での線状支持具の移動を容易に且つ確実に行うことができる。
【００１９】
本発明の標本の融解方法は、前記凍結保存用細管を使用し、前記凍結保存方法によって凍結保存した動物の標本を融解するにあたり、あらかじめ冷却物質中に浸漬した細管の封閉部を空気中に引き出した状態で直立させ、封閉部を加温して緩めることで融解時に発生するガスの封閉部からの排出を可能とし、その後細管を冷却物質中から取り出して加温して、凍結した標本を含むガラス化保存液と希釈液とを融解するとともに、ガラス化保存液を希釈液にて希釈することを特徴とする。
【００２０】
本発明に係る融解方法には、前記の凍結保存用細管を使用して標本を凍結保存した後に融解する方法である。凍結保存後の細管を加温して融解する前に、細管の封閉部を緩めておくことで、融解時に発生するガスの排出が容易となり、融解時に細管内のガスが膨張することにより起こる封閉物の突出や細管の破損を防止することができる。また、前記の凍結保存用細管を使用することによって得られる前述の作用効果があることはもちろんである。
【００２１】
ここで、細管を加温して、凍結した生物学的標本を含むガラス化保存液と希釈液とを融解しガラス化保存液を希釈液にて希釈する際に、融解した希釈液中に線状支持具を移動することにより、線状支持具に付着しているガラス化保存液を確実に融解した希釈液にて希釈することができる。
【００２２】
また、線状支持具の融解した希釈液中への移動を、一部または全部が強磁性体からなる線状支持具を磁石によって誘導することにより行えば、線状支持具を確実に融解した希釈液中に移動させることができ、ガラス化保存液の融解と希釈をさらに確実にすることができる。また、ガラス化保存液が完全に除去された後の線状支持具を細管内から取り出す際にも、磁石により細管外へ誘導して取り出すことも可能である。
【発明の効果】
【００２３】
本発明における最大の特徴は、標本を含むガラス化保存液を線状支持具の先端部に付着させ、これを急速凍結してガラス化した状態で、希釈液を吸引して凍結させた細管内に線状支持具とともに導入することにある。このように、標本を含むガラス化保存液を線状支持具の先端部に付着させ、凍結させて、これを細管内に導入する方式とすることにより、使用するガラス化保存液量を必要最小限の量とすることができるため、凍結時には凍結所要時間を短縮することができ、融解時には融解所要時間を短縮することができ、更に、融解後の希釈液による希釈を短時間でかつ確実に達成することができる。凍結や融解に要する時間が短く、融解後の希釈も確実であることから、標本の生存性を高く維持することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
図１は、本発明の第１の実施形態である凍結保存用細管１を示す図である。図１に示すように、本実施形態における凍結保存用細管（以下、「細管」と称する。）１は、凍結状態において、希釈液５が細管本体２内の一端側から他端側に向けて充填され、標本を含むガラス化保存液４を先端部３ａに付着させた線状支持具３が、同線状支持具３の先端側が希釈液５の凍結層の終端面に隣接するように細管本体２内に配置されている。
【００２５】
細管１は、細管本体２の希釈液５が充填されている側の一端は綿栓８により塞がれており、線状支持具３が配置されている側の他端側は封閉部材７により塞がれて、細管本体２全体が封閉されて、凍結された状態にある。綿栓８付近の希釈液５の充填側には空気層６が２箇所設けられており、希釈液５は、この空気層６ａ，６ｂにより分断されて、少量の希釈液５ａ，５ｂとが設けられている。
【００２６】
ここで、線状支持具３について図２を用いて説明する。図２は線状支持具３を示す図であって、（ａ）は側面図、（ｂ）は平面図、（ｃ）はガラス化保存液４で包被した標本Ｅを保持した状態を示す側面図、（ｄ）はガラス化保存液４で包被した標本Ｅを保持した状態を示す平面図である。線状支持具３は、標本Ｅを含むガラス化保存液４を凍結したうえで細管本体２内に導入するための用具であって、図２に示すように、本体部３ｂ、先端部３ａおよび金属部３ｃにより構成されている。
【００２７】
本体部３ｂは、耐低温性、液体窒素耐性、耐伸縮性かつ耐変質性を有するポリアミド繊維（例えば、表面円滑ナイロン等）からなる直線糸状の繊維素材である。この本体部３ｂの全長は５〜４０ｍｍ、直径は０．２〜０．４ｍｍである。先端部３ａは、本体部３ｂの延長であり、本体部３ｂの一端に２０〜４０°の勾配を設けて平面状に形成されたものである。先端部３ａの幅は、０．３〜０．６ｍｍ、長さは０．５〜２．０ｍｍである。なお、先端部３ａの内側（本体部３ｂとのなす角が鈍角である面の側）は平面状とする。また、先端部３ａは、本体部３ｂと同じ材質であり、先端部３ａの厚さは約０．１ｍｍである。
【００２８】
本体部３ｂに対して先端部３ａの反対側の他端には、強磁性体製の金属部３ｃが設けられている。金属部３ｃは、外径０．５〜０．８ｍｍ、内径０．３〜０．５ｍｍの１〜２ｍｍ長の鋼製管を、本体部３ｂの末端部に包被装着したものである。なお、この金属部３ｃは磁石等に引き寄せられるため、磁石等を利用して線状支持具３を細管本体２内へ容易に誘導することができる。
【００２９】
従って、この線状支持具３では、本体部３ｂの一端に平面状の先端部３ａが勾配を設けて形成されているため、この平面状の先端部３ａの平面が略水平となるように本体部３ｂを斜め下向きに保持した状態を維持したまま、平面状の先端部３ａの上面にガラス化保存液４で包被した標本Ｅを滴下して保持し、冷却物質である液体窒素の中へ浸漬することにより、標本Ｅを含むガラス化保存液４のガラス化を行うことができる。
【００３０】
また、標本Ｅを含むガラス化保存液４を線状支持具３の先端部３ａに付着させることにより、使用するガラス化保存液量を標本Ｅの包被に必要な最小限の量とすることができるため、標本Ｅをガラス化保存液４に含ませてからガラス化するまでの時間を短縮することができる。更に、標本Ｅを含むガラス化保存液４と希釈液５とを凍結状態で保存した後、融解する際には、線状支持具３を希釈液５内に容易に誘導することができるため、ガラス化保存液４を素早く融解して希釈液５で確実に希釈することが可能となる。従って、凍結や融解に要する時間が短く、融解後の希釈も確実であることから、標本Ｅの生存性を高く維持することができ、簡便性を維持した上で受胎率を向上させることが可能となる。なお、本実施形態では図２に示した形状、材質の線状支持具３を用いているが、標本Ｅを含むガラス化保存液４を付着させて細管本体２内外に誘導できるものであれば、これに限定するものではない。また、冷却物質として液体窒素を利用しているが、その他の物質を利用できる可能性があるため、これに限定するものではない。
【００３１】
更に、空気層６ｂを設けることで、希釈後から移植までの間、標本Ｅを含んだ希釈液５は確実に細管本体２内で分断された状態とすることができ、また、綿栓８の綿繊維等の夾雑物を綿栓８に直近の希釈液５ｂが保持するため、希釈液５への夾雑物の混入を確実に防ぐことができ、移植時にこの希釈液５ｂの動物体内への流出を防止することが可能となる。また、標本Ｅは重力により沈降して希釈液５の下端付近に存在する場合、空気層６ａと希釈液５ａを設けることで、細管１内での極端な下降を防止することができ、標本Ｅを上方に位置させることができる。このため、移植時に希釈液５を押し出す時に、標本Ｅを細管１から押し出しやすくなり、受胎率の低下を抑制することができる。また、移植時に標本Ｅを含む希釈液５を押し出した後に、希釈液５ａを更に押し出せば、細管本体２の内壁に付着した希釈液５を確実に押し出すことが可能となる。ここで、希釈液５ａの量は、標本Ｅの細管１内での極端な下降を防止できれば良く、本実施形態では希釈液５の略２０％としている。
【００３２】
（標本の凍結保存方法）
標本の凍結保存方法について、図３を用いて説明する。図３は、標本Ｅを含むガラス化保存液４と希釈液５とを細管１に内蔵した状態で凍結保存する工程を示す図である。本凍結保存方法は、細管本体２内に希釈液５を吸引し凍結する希釈液凍結工程と、線状支持具３に付着させた標本Ｅを含むガラス化保存液４をガラス化するガラス化凍結工程と、線状支持具３を細管本体２内に導入配置する支持具配置工程と、細管本体２を封閉する封閉工程と、この細管１を低温保存する保存工程とを含む凍結保存方法である。以下、詳細について説明する。
【００３３】
１）希釈液凍結工程（希釈液の吸引と凍結）
まず、０．２５ｍｌ容の細管本体２の一端側の綿栓８に希釈液５を吸収させて、綿栓８の反体側に１５ｍｍ〜２０ｍｍ長の空気層６をとれるように希釈液５を吸引する。次に、図３（ａ）に示すように、容器１１内の液体窒素１２に浮かせた略１０ｍｍ厚発泡スチロール板１３上に、細管本体２を横にした状態で静置して、希釈液５を液体窒素ガス１２ａ内で緩慢に凍結した後、液体窒素１２中に浸漬する。希釈液５を緩慢に凍結することにより、希釈液５中に気泡を含むことなく凍結することができ、融解時の気泡の発生を抑制することができる。
ここで、希釈液５は、０．５Ｍシュクロースおよび２０％仔牛血清（以下、仔牛血清を「ＣＳ」と称する。）を添加したダルベッコリン酸緩衝液（以下、「Ｄ−ＰＢＳ」と称する。）である。また、希釈液５ａ，５ｂの濃度は、希釈液５の濃度と同一である。
【００３４】
２）ガラス化凍結工程（標本を含むガラス化保存液の線状支持具への付着とガラス化）
標本Ｅを、後述する前処理Ａ液と前処理Ｂ液に各５分間ずつ浸漬する。更に、標本Ｅをガラス化保存液４に浸漬してパスツールピペット９に吸引し、実体顕微鏡下で確認しながら、図３（ｂ）に示すように、ピンセット１４で把持しながら線状支持具３の先端部３ａに標本Ｅを含んだガラス化保存液４を滴下する。この後、図３（ｃ）に示すように、標本Ｅをガラス化保存液４へ浸漬してから３０秒後に、線状支持具３を、素早く液体窒素１２に投入しガラス化保存液４のガラス化を行う。ここで、各液の組成について以下に示す。
前処理Ａ液は、１０％グリセロール、０．１Ｍシュクロース、０．１Ｍキシロースおよび１％ポリエチレングリコールを添加したＤ−ＰＢＳであり、前処理Ｂ液は、１０％グリセロール、１０％エチレングリコール、０．２Ｍシュクロース、０．２Ｍキシロースおよび２％ポリエチレングリコールを添加したＤ−ＰＢＳである。ガラス化保存液４は、２０％グリセロール、２０％エチレングリコール、０．３Ｍシュクロース、０．３Ｍキシロースおよび３％ポリエチレングリコールを添加したＤ−ＰＢＳである。
【００３５】
３）支持具配置工程（細管本体内への導入）
液体窒素１２中で細管本体２を水平に静置した状態で保持し、標本Ｅを含むガラス化保存液４をガラス化した線状支持具３を先端部３ａ側から細管本体２の開口部へ挿入し、線状支持具３を細管本体２内の希釈液５の凍結層の終端面まで、磁石１５により外部から間接的に誘導する。磁石１５はピンセット１４を用いて操作することができる。
【００３６】
４）封閉工程
図３（ｄ）に示すように、予め別のデュワー瓶１６に、細管本体２長より１５ｍｍ程度短い長さに相当する深さとなるように液体窒素１２を満たしておく。このデュワー瓶１６に、線状支持具３を挿入した細管本体２の綿栓８側を下にして、ピンセット１４を用いて細管本体２を素早く移す。細管本体２内に存在する液体窒素を気化させて、パウダー糊と封閉部材７とで封閉し、凍結保存用細管１とする。ここで、封閉部材７は、耐凍性で０．２５ｍｌ容プラスチックストローに押し込み可能で、且つパウダー糊で固定可能な物であれば良く、ポリプロピレン等の耐低温性のものが好ましい。
【００３７】
５）保存工程
この細管１は綿栓８側を下にし、液体窒素ボンベ（図示せず）に移し変えて、この液体窒素ボンベ内で保存する。
【００３８】
以上のような方法により、標本Ｅを確実に細管本体２内に導入することができるとともに、細管本体２内で標本Ｅを含むガラス化保存液４と希釈液５とを凍結状態で確実に分離させて配置し、凍結保存することができる。なお、本実施形態で使用される希釈液５やガラス化保存液４等の成分組成については、一例を示したものであり、状況に応じて成分や濃度を調整することができる。
【００３９】
（標本の融解方法）
標本Ｅの融解方法について、図４を用いて説明する。図４は、標本Ｅを細管１内で融解する工程を示す図である。この融解方法は、細管１の封閉部を空気中に引き出した状態で直立させ、封閉部を加温して緩めることで融解時に発生するガスの封閉部からの排出を可能とし、その後細管１を加温して、ガラス化保存液４と希釈液５とを融解するとともに、ガラス化保存液４を希釈液５にて希釈する方法である。以下、詳細について説明する。
【００４０】
１）余剰ガスの排出工程
図４（ａ）に示すように、凍結保存したボンベ（図示せず）の液体窒素から細管１の封閉部のみをつまみ出し、空気中に引き出した状態で直立させ、指２１で封閉部を保持しながら封閉部材７の糊を暖めて緩め、融解時に発生するガスの封閉部からの排出を可能とする。
【００４１】
２）融解工程
図４（ｂ）に示すように、細管１を直立させたまま２０〜２５℃の微温湯２３に浸し、希釈液５を融解させる。このとき、ガラス化保存液４も融解する。
【００４２】
３）希釈工程
図４（ｃ）に示すように、線状支持具３を細管本体２の外側から磁石１５で誘導して、線状支持具３の先端部３ａを融解した希釈液５に浸漬させ、標本Ｅの融解およびガラス化保存液４の希釈を行う。このとき、標本Ｅを含むガラス化保存液４が融解直後に細管本体２の内壁面に付着して希釈されない場合が考慮されるので、図４（ｄ）に示すように、微温湯２３から細管１を取り出し、綿栓８を押し金具２４で５ｍｍ程度押し入れることで希釈液５を押し上げ、ガラス化保存液４を完全に希釈液５に浸すようにすると確実に希釈することができる。また、標本Ｅを含むガラス化保存液４が希釈液５よりも比重が高ければ、自ら下降し、希釈液５の中でガラス化保存液５が希釈される。
【００４３】
４）線状支持具の吊り出し工程
線状支持具３から標本Ｅを含むガラス化保存液４が完全に離脱して希釈液５内に移行したのを確認した後、図４（ｅ）に示すように、細管１の封閉部をカッターで切断し、磁石１５を使い線状支持具３を誘導して細管１外に取り出す。
【００４４】
以上のように、凍結保存後の細管１を加温する前に、細管１の封閉部を緩めておくことで、融解時に発生するガスの排出が容易となり、融解時に細管１内のガスが膨張することにより起こる細管１の破損を防止することができる。また、標本Ｅを含むガラス化保存液４を少量付着させて凍結させた線状支持具３を用いての融解、希釈により、ガラス化保存液４を素早く融解、希釈させることができる。これにより、標本Ｅの生存性を高く維持しながら、生産現場においても融解、希釈と移植作業を行うことが可能となる。
【００４５】
次に、図５を用いて本発明の第２の実施形態である細管３１について説明する。図５に示すように、細管３１は、凍結状態において、希釈液２５，２５ａ，２５ｂ以外は符号が同一であるため、説明を省略する。希釈液２５は希釈液５（第１の実施形態）と同一組成液であり、希釈液２５ａ，２５ｂは、０．５Ｍシュクロースを含有していない希釈液２５であり、濃度が低いものである。
【００４６】
本実施形態では、希釈液２５と希釈液２５ａとを略同容量（液長ア＝液長イ）に設定している。融解時に、第１段階としてガラス化保存液４の希釈が希釈液２５で行われ、移植まで標本Ｅは希釈液２５内に留まっている。次に第２段階として、動物体内に押し出された時点（子宮内）で希釈液２５と希釈液２５ａとが混合されることとなる。ここで、標本Ｅを含むガラス化保存液４の希釈は、濃い希釈液２５から、段階的に濃度の低い希釈液２５と希釈液２５ａとの混合液に移ることにより、標本Ｅの浸透圧ストレスを解消して、生存性を高めることができる。さらに、各希釈液量はこれに限定されるものではなく、各希釈液の組成および液量を変えることができ、各標本に相応しい希釈が可能となる。
【実施例】
【００４７】
本発明の第１実施形態における細管１を用い、ガラス化法により、標本である牛体外受精胚を含んだガラス化保存液のガラス化を行って凍結保存、融解し、牛体外受精胚の生存性を調査した。対照として、緩慢冷却法により、牛体外受精胚を含んだ緩慢冷却保存液を凍結させた後に凍結保存、融解した牛体外受精胚の生存性について調査した。
【００４８】
（１）体外受精胚生産
雌牛の卵巣からと畜６時間以内に、牛血清アルブミンを添加したＤ−ＰＢＳとともに、卵丘細胞卵子複合体を吸引した。形態的に良好な卵丘細胞卵子複合体を、ＣＳを添加した１９９培地（以下、「卵子成熟液」と称する。）で数回洗浄後、この卵子成熟液で２０時間から２２時間体外成熟した。
体外受精は、融解した凍結精液をテオフィリンおよびカフェインを添加したブラケット・オリファント液で希釈して遠心分離を２回施して洗浄濃縮し、牛血清アルブミンおよびヘパリンを添加したブラケット・オリファント液で精子濃度を調製して、成熟卵子を導入し４時間実施した。
体外受精した卵子は、受精８日まで発生培養した。胚生産に掛かる培養気相条件は５％ＣＯ2、９５％空気および３８．５℃で行った。
【００４９】
（２）供試胚
体外受精胚については、体外受精後７日または８日において、形態的に栄養膜細胞が単層で均一に発育した上、充実した内部細胞塊を有している拡張胚盤胞期胚を標本とし、２０％ＣＳ添加Ｄ−ＰＢＳ（以下、「保存液」と称する。）で洗浄後、緩慢冷却法およびガラス化法による凍結保存に供試した。
体内受精胚については、過排卵処理後人工授精して採取した良質な体内受精胚を保存液で洗浄後、緩慢冷却法およびガラス化法による凍結保存に供試した。
【００５０】
（３Ａ）緩慢冷却法による胚の凍結保存方法
前述により得られた各胚（体外受精胚，体内受精胚）を緩慢冷却保存液に導入し、１５分間平衡後、０．２５ｍｌ容細管本体（プラスチック製ストローであり、以下、「ストロー」と称する。）吸引封入した。プログラムフリーザを用い、−７℃の冷媒中にストローをセットし、２分経過後に液体窒素で冷却したピンセットを用い強制植氷した。強制植氷し１０分経過後、０．３℃／分で緩慢冷却して、−３０℃に到達した後、ストローを液体窒素へ導入し保存した。
ここで、緩慢冷却保存液は、１０％エチレングリコール、０．１Ｍシュクロースを添加した保存液（２０％ＣＳ添加Ｄ−ＰＢＳ）であるが、状況に応じて濃度等を変更することができる。
【００５１】
（３Ｂ）ガラス化法による胚の凍結保存方法
前述により得られた各胚（体外受精胚，体内受精胚）を、前述の標本の凍結保存方法で行った。
【００５２】
（４Ａ）緩慢冷却法により凍結保存した胚（緩慢冷却凍結胚）の融解方法
融解後の胚の生存性を調査するため、緩慢冷却法により凍結保存したストローを液体窒素から取り出し、室温で６秒間保持し、その後３０℃温湯中で２０秒間維持することで緩慢冷却保存液とともに胚を融解した。次に融解したストローを室温で５分間保持し、封閉側をストローカッターで切断後、ストローの綿栓側から圧力をかけ、シャーレに緩慢冷却保存液とともに胚を押し出し、胚を３７℃の保存液に導入して緩慢冷却保存液を希釈した。
【００５３】
（４Ｂ）ガラス化法により凍結保存した胚（ガラス化凍結胚）の融解方法
前述の標本の融解方法で行った。なお、生存性調査のために、融解開始（液体窒素ボンベからストローを取り出した時）から５分後に綿栓に圧力をかけ、シャーレに希釈液とともに胚を押し出して、胚を３７℃の保存液に導入し保存した。
【００５４】
（５）融解胚の培養
融解希釈した緩慢冷却凍結胚およびガラス化凍結胚は、培養液で洗浄後、１胚あたり２０μｌの培養液ドロップで７２時間培養した。培養の気相条件は５％ＣＯ2、９５％空気および３８．５℃で行った。
ここで、培養液は、１００μＭβメルカプトエタノールおよび２０％牛胎仔血清を添加した１９９培地である。
【００５５】
（６）融解胚の生存性
培養開始から２４時間後、４８時間後および７２時間後での融解した体外受精胚の生存、発育および状態を観察した。また、融解後７２時間後での透明帯脱出完了胚のうち、栄養膜細胞および内部細胞塊の発育が良好なものを良質透明帯脱出胚とした。
【００５６】
（７）胚の移植
緩慢冷却凍結胚（体外受精胚，体内受精胚）およびガラス化凍結胚（体外受精胚，体内受精胚）を前述のように融解後、移植器にストローを装着して融解開始後約５分前後に、発情７日後のホルスタイン種乳牛の排卵した黄体側子宮角内に移植した。なお、１本のストローに対して、体外受精胚の場合は２胚を、体内受精胚の場合は１胚を、凍結保存時にそれぞれ封入しており、これらを移植した。
【００５７】
（８）保存胚の融解後生存
表１に、保存胚の加温または融解後の胚生存率を示す。ガラス化法によるガラス化凍結した体外受精胚の経時的生存率は、緩慢冷却法による緩慢冷却凍結胚と比較して、培養２４時間で９６％（緩慢冷却：６９％）、４８時間で９６％（緩慢冷却：６９％）および７２時間で９４％（緩慢冷却：６６％）と有意に高く推移した。
【表１】
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【００５８】
（９）保存胚の融解後透明帯脱出
表２に、体外受精胚の融解後透明帯脱出率を示す。ストロー内で融解希釈したガラス化胚の透明帯脱出率は、緩慢冷却法と比較して、培養４８時間で６７％（緩慢冷却：２９％）、７２時間で８９％（緩慢冷却：５１％）と有意に高く、発育が良好であった。また、透明帯脱出胚の形態も有意に良質透明帯脱出率が高かった（良質透明帯脱出率；８４％：３２％）。
【表２】
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【００５９】
（１０）胚の移植による受胎成績
表３に、体外受精胚のストロー内融解移植による受胎成績を示す。緩慢冷却またはガラス化した２胚の牛体外受精胚をストローで保存後、移植現場で融解移植した受胎成績は、緩慢冷却で３５％（１５／４３）、ガラス化が６１％（１７／２８）とガラス化が有意に高い受胎率を得た。
また、表４に体内受精胚のストロー内融解移植による受胎成績を示す。緩慢冷却またはガラス化した１胚の牛体内受精胚を、体外受精胚と同様に、ストロー内で保存後、移植現場で融解移植した成績は、緩慢冷却で５４％（７／１３）、ガラス化が５０％（４／８）であり、有意な差は見られないものの、本手法により、ガラス化した牛胚をストロー内で融解希釈および移植することで高い受胎率を得た。
【表３】
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【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の凍結保存用細管は、生物学的標本の生存性を高く維持したまま、哺乳動物への移植に広く利用することができ、牛胚移植に利用する場合において特に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明の第１の実施形態である細管を示す図である。
【図２】線状支持具を示す図であって、（ａ）は側面図、（ｂ）は平面図、（ｃ）はガラス化保存液で包被した標本を保持した状態を示す側面図、（ｄ）はガラス化保存液で包被した標本を保持した状態を示す平面図である。
【図３】標本を含むガラス化保存液と希釈液とを細管に内蔵した状態で凍結保存する工程を示す図である。
【図４】標本を細管内で融解する工程を示す図である。
【図５】本発明の第２の実施形態である細管を示す図である。
【符号の説明】
【００６２】
１，３１  凍結保存用細管
２  細管本体
３  線状支持具
３ａ  先端部
３ｂ  本体部
３ｃ  金属部
４  ガラス化保存液
５，５ａ，５ｂ，２５，２５ａ，２５ｂ  希釈液
６ａ，６ｂ  空気層
７  封閉部材
８  綿栓
９  パスツールピペット
１１  容器
１２  液体窒素
１２ａ  液体窒素ガス
１３  発泡スチロール板
１４  ピンセット
１５  磁石
１６  デュワー瓶
２１  指
２２  ガス
２３  微温湯
２４  押し金具
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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