(57)【要約】【課題】本発明は新規抗腫瘍性アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。【解決手段】本発明はＳ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（SAMDC）をコードする遺伝子に由来するDNA 又はRNA に特異的にハイブリダイズでき、かかるハイブリダイゼーションを可能にするに足りる数及び種類のヌクレオチド単位類似体を含んで成るオリゴヌクレオチド誘導体、又は塩形成基があるならこのオリゴヌクレオチド誘導体の塩を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを除く動物についてＳ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（SAMDC）発現に関係する症状を診断する方法であって、SAMDC 発現に関係する症状を有すると推定された動物由来の細胞又は組織又は体液を、SAMDC 遺伝子に由来する選定のDNA 又はRNA に特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体もしくは塩形成基があるならその塩、又はその対立遺伝子と接触させ、そしてハイブリダイゼーションが起こるか否かを決定することを含んで成り、
ここで当該オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体もしくは塩形成基があるならその塩、又はその対立遺伝子はヒトSAMDC cDNAの塩基位置1065（５’）から1105（３’）に至る配列の一部に対応する又はヒトSAMDC cDNAの塩基位置−248(５’）から−20（３’）に至る配列の一部に対応する配列を有する、又は当該配列と３個までのヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体で相違する配列を有し、かつ15個以上のヌクレオチド単位に対応する長さを有する、方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体もしくは塩形成基があるならその塩、又はその対立遺伝子がSEQ ID NO : ２、９及び10から成る群から選択される配列を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヒトSAMDC をコードする遺伝子に由来するmRNAにハイブリダイズでき、ヒトSAMDC cDNAの塩基位置1065（５’）から1105（３’）に至る配列の一部に対応する配列を有する、又は当該配列と３個までのヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体で相違する配列を有し、かつ15個以上のヌクレオチド単位に対応する長さを有するオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体もしくは塩形成基があるならその塩、又はその対立遺伝子。
【請求項４】
SEQ ID NO : 10に示す配列の請求項３記載のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体もしくは塩形成基があるならその塩、又はその対立遺伝子。
【請求項５】
SEQ ID NO : ９に示す配列の請求項３記載のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体もしくは塩形成基があるならその塩、又はその対立遺伝子。
【請求項６】
ヒトSAMDC をコードする遺伝子に由来するmRNAにハイブリダイズでき、ヒトSAMDC cDNAの塩基位置−248(５’）から−20（３’）に至る配列の一部に対応する配列を有する、又は当該配列と３個までのヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体で相違する配列を有し、かつ15個以上のヌクレオチド単位に対応する長さを有するオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体もしくは塩形成基があるならその塩、又はその対立遺伝子。
【請求項７】
SEQ ID NO : ２に示す配列の請求項６記載のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体もしくは塩形成基があるならその塩、又はその対立遺伝子。
【請求項８】
少なくとも一種の次の式の構成単位：式Ｉ又はＩ* 
【化１】
2006109846.tif 000017
〔（式中、ＱはSH, SCH3, Ｆ，Ｎ3 ，CN，OCN ，Ｏ（CH2)z NH2 又はＯ（CH2)z CH3 〔ここでｚは１〜約10〕，Ｏ（CH2CH2O)v CH3 〔式中ｖは０〜12〕又はより広い意味において、類似の特性を有する別の置換基である）式IIａ〜IIｆ又はIIａ* 〜IIｆ* ，
【化２】
2006109846.tif 000018
式の基            タイプ
（IIａ），  ホスホロチオエート        Ｘ＝SH      Ｙ＝Ｏ
（IIａ* ）
（IIｂ），  ホスホロジチオエート      Ｘ＝SH      Ｙ＝Ｓ
（IIｂ* ）
（IIｃ），  メチルホスホネート        Ｘ＝CH3     Ｙ＝Ｏ
（IIｃ* ）
（IIｄ），  ホスホラミデート          Ｘ＝NH−Ｒ  Ｙ＝Ｏ
（IIｄ* ）
（IIｅ），  ボラノホスフェート        Ｘ＝BH3     Ｙ＝Ｏ
（IIｅ* ）
（IIｆ），  ホスホトリエステル        Ｘ＝Ｏ−Ｒ  Ｙ＝Ｏ；
（IIｆ* ）
（ここでＲは低級アルキルである）；
III ａ〜III ｈ又はIII ａ* 〜III ｈ* 
【化３】
2006109846.tif 000019
式の基              タイプ              ｎ      Ｘ’    Ｙ’
（III ａ），    スルフェート          ２      Ｏ      Ｓ
（III ａ* ）
（III ｂ），    スルホネート          ２      Ｏ      CH2 
（III ｂ* ）
（III ｃ），    スルファメート        ２      Ｏ      NH
（III ｃ* ）
（III ｄ），    スルホンアミド        ２      NH      CH2 
（III ｄ* ）
（III ｅ），    スルホン              ２      CH2     CH2 
（III ｅ* ）
（III ｆ），    スルフィット          １      Ｏ      Ｏ
（III ｆ* ）
（III ｇ），    スルホキシド          １      CH2     CH2 
（III ｇ* ）
（III ｈ），    スルフィド            ０      CH2     CH2 ;
（III ｈ* ）
式IVａ〜IVｄ又はIVａ* 〜IVｄ* 
【化４】
2006109846.tif 000020
式の基                    タイプ                  Ｘ''  Ｙ''
（IVａ), (IVａ* ）  ホルムアセタール            Ｏ    Ｏ
（IVｂ), (IVｂ* ）  3'−チオホルムアセタール    Ｓ    Ｏ
（IVｃ), (IVｃ* ）  5'−チオホルムアセタール    Ｏ    Ｓ
（IVｄ), (IVｄ* ）  チオエーテル                CH2   Ｓ；
式Ｖａ〜Ｖｃ又はＶａ* 〜Ｖｃ* 
【化５】
2006109846.tif 000021
式の基                    タイプ                      Ｘ*     Ｙ* 
（Ｖａ), (Ｖａ* ）  ヒドロキシルアミン              N-H     Ｏ
（Ｖｂ), (Ｖｂ* ）  メチレン（メチルイミノ)         N-CH3   Ｏ
（Ｖｃ), (Ｖｃ* ）  メチレンオキシ（メチルイミノ)   Ｏ    N-CH3;
式VIａ〜VIｂ又はVIａ* 〜VIｂ* 
【化６】
2006109846.tif 000022
式の基                    タイプ                Ｘ**    Ｙ**
（VIａ), (VIａ* ）  カルボネート              Ｏ      Ｏ
（VIｂ), (VIｂ* ）  5'−Ｎ−カルバメート      Ｏ      NH
（VIｃ), (VIｃ* ）  アミド                    CH2     NH
（VIｄ), (VIｄ* ）  アミドII                  NH      CH2 
【化７】
2006109846.tif 000023
式の基                      タイプ              Ｘ1     Ｙ1 
（VII ), (VII * ）        アミドIII           NH      CH2 
【化８】
2006109846.tif 000024
式の基                      タイプ              Ｘ2 
（VIII），                アミドIV            NH
（VIII* ）
【化９】
2006109846.tif 000025
式の基                    タイプ
IX，IX*       モルホリノ−カルバメート
【化１０】
2006109846.tif 000026
式の基                タイプ
Ｘ，Ｘ*         ペプチド核酸
（ここで、Ｂは下記に定義する塩基性基であり、ＱはＨ，OH, SH,SCH3，Ｆ，Ｎ3 ，CN，OCN ，Ｏ（CH2)z NH2 又はＯ（CH2)z CH3 〔ここでｚは１〜約10である〕、Ｏ（CH2CH2O)v CH3 〔ここでｖか０〜12である〕であるか、又は類似の特性を有する別の置換基でもあり；そしてその他の成分は関連の式の後に示している意味を有する）；
そしてここでその他の構成単位は、前述したものに加えて、更に式Ｉ又はＩ* の構成単位（式中、ＱはＨ又はOHであり、そしてＢはアデニン、グアニン、チミン、シトシン及び５−メチルシトシンより選ばれる塩基の基である）を含んで成ってよく；そして
Ｂは、特定していないとき、式ＸＩ，ＸＩａ，ＸＩｂ，ＸＩｃ，ＸＩｄ，ＸＩｅ又はＸＩｆのプリン基又はその類似体である。
【化１１】
2006109846.tif 000027
（ここで、
Ｒb1はＨ，Cl，Br，OH又は−Ｏ−Ｃ1 −Ｃ12アルキルであり、
Ｒb2，Ｒb3及びＲb5はそれぞれ互いと独立してＨ，OH, SH, NH2 ，NHNH2 ，NHOH， NHO−Ｃ1 −Ｃ12アルキル、−Ｎ＝CH−Ｎ（Ｃ1 −Ｃ12アルキル）2 ，Ｆ，Cl，Br，Ｃ1 −Ｃ12アルキル、ヒドロキシ−Ｃ1 −Ｃ12アルキル、アミノ−Ｃ1 −Ｃ12アルキル、Ｃ1 −Ｃ12アルコキシ、ベンジルオキシ又はＣ1 −Ｃ12アルキルチオ（そのヒドロキシ及びアミノ基はそのまま、又は保護基により置換されている）；又はフェニル、ベンジル、１〜20個の炭素原子を有する第一級アミノ基又は２〜30個の炭素原子を有する第二級アミノ基であり、
Ｒb4は水素、CN又は−Ｃ≡Ｃ−Ｒb7であり、そして
Ｒb6及びＲb7は水素又はＣ1 −Ｃ4 アルキルのそれぞれである）、
又は次式ＸII，ＸIIａ，ＸIIｂ，ＸIIｃに係るチミン又はシトシン基又はその類似体
【化１２】
2006109846.tif 000028
（式中、Ｒb6は水素又はＣ1 −Ｃ4 アルキルであり、そしてＲb8はＨ，OH, SH, NH2 ，NHNH2 ，NHOH， NHO−Ｃ1 −Ｃ12アルキル、−Ｎ＝CH−Ｎ（Ｃ1 −Ｃ12アルキル）2 ，Ｆ，Cl，Br，Ｃ1 −Ｃ12アルキル、ヒドロキシ−Ｃ1 −Ｃ12アルキル、アミノ−Ｃ1 −Ｃ12アルキル、Ｃ1 −Ｃ12アルコキシ、ベンジルオキシ又はＣ1 −Ｃ12アルキルチオ（そのヒドロキシ及びアミノ基は未置換であるか、又は保護基により置換されている）、又はフェニル、ベンジル、１〜20個の炭素原子を有する第一級アミノ、２〜30個の炭素原子を有する第二級アミノ、Ｃ1 −Ｃ12アルケニル又はＣ1 −Ｃ12アルキニルであり、そしてＸIIｂにおけるNH2 基は未置換であるか、又はＣ1 −Ｃ6 アルキル、ベンゾイルもしくは保護基により置換されており、そして式ＸII，ＸIIａ，ＸIIｂ及びＸIIｃの基のジヒドロ誘導体である）である〕；
を含んで成る、請求項３記載のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体もしくは塩形成基があるならその塩、又はその対立遺伝子。
【請求項９】
式IIａ及び／又はIIａ* のホスホロチオエート構成単位のみを含み、ここでＸがSHであり、そしてＹがＯであり、そしてＢがアデニン、グアニン、シトシン、５−メチルシトシン又はチミンの基であり、そしてＱがOH又はＨである、請求項８記載のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体もしくは塩形成基があるならその塩、又はその対立遺伝子。
【請求項１０】
SEQ ID NO : ９に示す配列のホスホロチオエート類似体である請求項５記載のヌクレオチド誘導体又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項１１】
請求項８に記載のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド誘導体の合成のための方法であって、
次式ＸＩの５’末端フラグメントを含む出発材料（又はその互変異性体）
【化１３】
2006109846.tif 000029
（式中、Ｄはヒドロキシ保護基である、又はＢ及びＢ’は独立して式Ｉ〜ＸのいずれかにおけるＢについて上記した塩基を表わし、Ｑ及びＱ’は独立してＨ，OH, SH, SCH3, Ｆ，Ｎ3 ，CN，OCN ，Ｏ（CH2)z NH2 又はＯ（CH2)z CH3 〔ここでｚは１〜約10である〕又はＯ（CH2CH2O)v CH3 〔ここでｖは０〜12である〕であるか、又は類似の特性を有する別の置換基であり；Ｇは水素、低級アルコキシ又は２−シアノエトキシであり、そしてＥはヒドロキシ保護基、担体、又は３’遊離又は担体結合型モノ−又はオリゴヌクレオチド類似体であり、ここで任意のホスホジエステル基｛Ｏ−〔Ｐ（＝Ｏ）（−OH）〕−Ｏ｝の代わりに、ホスホロチオエート類似体｛Ｏ−〔Ｐ（＝Ｓ）（−OH）〕−Ｏ｝／｛Ｏ−〔Ｐ（−SH）（＝Ｏ）〕｝又は式｛Ｏ−〔（Ｐ＝Ｏ）−Ｈ〕−Ｏ｝／｛Ｏ−（Ｐ−ＯＨ）−Ｏ｝の基、が存在している）を、スルフリル化剤と、任意の三価燐の同時酸化を伴いながら、適宜更なる官能基を保護形態にしておいて、且つ適宜任意の保護基及び／又は担体を除去しながら、そして所望により、
得られる任意の異性体混合物を個々の異性体に分離し、及び／又は得られる遊離のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを塩へと変換し、及び／又は得られる塩を遊離形態もしくは別の塩へと変換する、
ことを特徴とする方法。
【請求項１２】
SAMDC の調節に応答とする障害を処置する方法であって、かかる処置を必要とするヒトを除く動物に上記の障害に対して有効な量の請求項３記載のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体もしくは塩形成基があるならその薬理学的に許容される又はその対立遺伝子を投与することを含んで成る方法。
【請求項１３】
ヒトを除く動物においてSAMDC の発現を調節する方法であって、遺伝子含有組織又は細胞を、請求項３記載のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体もしくは塩形成基があるならその薬理学的に許容される又はその対立遺伝子と接触させることを含んで成る方法。
【請求項１４】
細胞又は組織中のSAMDC をコードするDNA 又はRNA の存在を検出する方法であって、この細胞又は組織を請求項３記載のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体もしくは塩形成基があるならその薬理学的に許容される又はその対立遺伝子と接触させ、次いでハイブリダイゼーションが起きたか否かを検出することを含んで成る方法。
【請求項１５】
温血動物の診断又は治療処置のための請求項３記載のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体もしくは塩形成基があるならその薬理学的に許容される又はその対立遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明はデオキシリボ−及びリボ−オリゴヌクレオチド並びに誘導体、並びにＳ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（SAMDC)酵素の合成の調節に応答する疾患状態に関係する薬理製剤、治療法、診断及び商業的研究用試薬に関する。特に、本発明は（好ましくはヒトの）SAMDC に関係する核酸に特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド誘導体に関する。これらのオリゴヌクレオチド及びその誘導体は細胞中でのSAMDC の合成を調節することが見い出された。
【０００２】
SAMDC はポリアミン生合成において重要な酵素である。この酵素の直接阻害を示す特異的なインヒビターは細胞性ポリアミンプールの枯渇が付随する細胞増殖の休止を引き起こし、そして動物において腫瘍形成休止を示す（Regenassら、Cancer Res. 54, 3210-7 (1994))。これらのインヒビターは従って細胞性ポリアミンプールの枯渇に応答する病気、例えば増殖性障害、例えば腫瘍の処置にとって適当である。しかしながら、酵素メカニズムの完璧な理解が特異的なインヒビターのデザインにとって必要とされる。
【０００３】
SAMDC は非常に速い代謝回転速度を有する酵素であり、それ故in vivo で非常に短い半減期を示す（約50分又はそれより短い：Pegg, J. Biol. Chem. 254, 3249-53 (1979)参照）。従ってこのタンパク質の生合成の低下は酵素活性の低下をもたらし、それ故細胞性スペルミジン及びスペルミンプールの枯渇をもたらし、究極的に細胞性塞栓及び潜在性のアポプトシス細胞死をもたらす。
【０００４】
驚くべきことに、以下に記載の化合物は細胞中でのSAMDC 合成を調節する能力を示すことが見い出された。従って、これらはSAMDC合成、それ故酵素活性のかかる調節、特に阻害に応答する病気の予防及び治療処置に適し、かかる阻害は一の効果として、ポリアミンの生合成の調節、例えば細胞中のスペルミン及びスペルミジンプールの減少を発揮する。特に、本発明の化合物は例えば温血動物における良好な抗増殖活性を有する。
【０００５】
本発明は、従来技術者が治療的効果を達成するのに遭遇する問題を、酵素を直接阻害するのではなく、SAMDC の生合成を調節することにより解決する。
【０００６】
本発明に従うと、機能性SAMDC 、好ましくはヒトSAMDC をコードする遺伝子に由来するDNA 又はRNA 、好ましくはmRNAに特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド及びその誘導体（並びに塩形成基が存在しているときはその塩）が提供される。かかるオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体化合物はかかるハイブリダイゼーションを可能とするに足りる数及び種類のヌクレオチド単位又はその類似体／誘導体を含んで成る。この関係は一般に「アンチセンス」と呼ばれ、それ故本発明の化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体である。
【０００７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド及びその誘導体はWatson−Crick 塩基対合により規定される通りにDNA 、プレmRNA又は成熟mRNAの相補性配列に特異的に結合（ハイブリダイズ）し、DNA からSAMDCタンパク質に至る遺伝情報の流れを妨げる。
【０００８】
本発明の一の好適な態様において、このオリゴヌクレオチド又はその誘導体はSAMDC(特にヒトSAMDC)をコードするmRNA、より好ましくは論文に記載されているが如きヒトSAMDC cDNAのそれに対応する配列(Pajunenら、J. Biol. Chem. 263 (32), 17040-9 (1988))及びその対立形態変異体を有するmRNAの３’非翻訳領域に特異的にハイブリダイズ可能である。このcDNAの配列はGenBank(商標）／EMBLデーターバンクにおいて受託番号J04048でアクセス可能である。より好ましいのは、以下に記載の試験系におけるその予測に反する高い効率性により、SAMDC についてのヒトcDNAの塩基位置1060（５’）から1557（３’）に至る配列（好ましくは、Pajunen らに記載の配列；上記参照）の一部に対応するオリゴヌクレオチド及びその誘導体であり、塩基位置1065から1105に至る配列の一部に対応するオリゴヌクレオチド誘導体が最も好ましい（塩基位置は、このcDNAに対応するmRNAの出発コドンの第１（５’）ヌクレオチドとの関連で示している）。これらの化合物のうち、（好ましくは）以下に記載のSEQ ID NO : 10、そして特にSEQ ID NO : ９の配列に対応するオリゴヌクレオチド誘導体が最も好ましい。
【０００９】
本発明の別の好適な態様において、このオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体はSAMDC mRNAの５’非コード領域に特異的にハイブリダイズ可能であり、そして好ましくはその配列はヒトSAMDC cDNAの塩基位置−248(５’）から−20（３’）に至る配列の一部、より好ましくは塩基位置−85から−55に至る配列の一部に対応する領域に対応する。これらの化合物のうち、SEQ ID NO : ２で下記に記述する配列のオリゴヌクレオチド誘導体が最も好ましい。
【００１０】
一般に、オリゴヌクレオチド誘導体はかかるオリゴヌクレオチドよりも好ましい。
【００１１】
本明細書において、その中で使用する一般用語及び定義は好ましくは以下の意味を有する：
本化合物は異性体的に純粋であるか、又は異性体混合物として存在していてよい。即ち、もし不斉リン原子があるなら、この化合物はジアステレオマー混合物又は純粋なジアステレオマーとして存在しうる。
【００１２】
オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体の一部は、とりわけ溶媒及び電離性基のイオン化状態に依存して、種々の互変異性体として存在しうる。即ち、例えばホスホロチオエート〔Ｏ−（Ｐ−SH）（＝Ｏ）−Ｏ〕の中の中心基は〔Ｏ−（Ｐ＝Ｓ）（−OH）−Ｏ〕へと互変性であり、より安定な形態はとりわけ溶媒及びイオン化状態に依存する。本明細書において、オリゴヌクレオチド誘導体なる語はこのような互変異性体を含むものとも解され、その存在は当業者にとって明らかである。
【００１３】
「低級」な接頭語は７個以下、好ましくは４個以下、そして最も好ましくは２個以下の炭素原子を有する基をいう。
【００１４】
「SAMDC 合成の調節」なる語は、細胞の中での活性酵素の濃度の低下をもたらしめるSAMDC の生合成の阻害を意味する。
【００１５】
「対応」なる語は、所定の化合物が、言及する核酸配列と同等の塩基対合特性、即ち同等のハイブリダイゼーション特性を有することを意味する。
【００１６】
ハイブリダイゼーション条件は当業界において公知であり、そしてとりわけノーザンブロッティングについて以下に挙げる文献、又はManiatisらの「Molecular Cloning − A Laboratory Manual」第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, vol. ２，9.47−9.58において見い出せうる。例えば、対応のSAMDC cDNAのニトロセルロースフィルター上に固定化できうる。
【００１７】
（非特異的なバックグランド結合を低下させるための）プレハイブリダイゼーションは第一工程として、例えば６×のSSC(20×のSSC-800ml のH2O 中の 175.3ｇのNaCl及び88.2ｇのクエン酸ナトリウム；数滴の10ＭのNaOHにより7.0 にpH調整；H2O で１ｌに容量を調整−の希釈により調製）／５×のデンハーツ試薬（６×のSSC の、５ｇのフィコル（タイプ400, Pharmacia, Sweden) 、５ｇのポリビニルピロリドン、５ｇの牛血清アルブミン（Pentex画分Ｖ）及び 500mlに至るH2O による10倍希釈により調製）／ 0.5％のドデシル硫酸ナトリウム（＝SDS)／10μｇの変性断片化サケ精子DNA (SigmaタイプIII ナトリウム塩（10mg／ml）を水に、必要ならば磁気スターラーで撹拌しながら室温で溶かす；その溶液を 0.1ＭのNaClに調整し、そしてフェノールで１回、次いでフェノール／クロロホルムで１回抽出する；その水性相を回収し、そしてDNA を17ゲージ皮下注射針に12回すばやく通すことにより剪断する；そのDNA を２容量の氷冷エタノールの添加により沈殿させる；次いでそれを遠心により回収し、そして水に10mg／mlの濃度において再溶解させる；OD260 を測定し、そしてDNA の抽出濃度を計算する；その溶液を10分煮沸し、次いで小分けして−20℃で保存する；使用直前、その溶液を沸騰湯浴の中で５分加熱し、次いで氷冷水の中で急冷する；変性断片化サケ精子DNA は好ましくは 100μｇ／mlのハイブリダイゼーション溶液の濃度で使用する）及び所望に応じて50％のホルムアミドを含んで成る混合物を利用して、可能である。このプレハイブリダイゼーション溶液は好ましくは0.45μｍのディスポーザブルセルロースアセテートフィルターで濾過する（例えば、Schleicher and Schuell Uniflowシリンジフィルター No.57240又は同等品）。
【００１８】
ニトロセルロースフィルターを６×のSSC のトレーの表面の上に、それが完全に湿るまで浮かし、次いで２分間浸漬する。このウェットフィルターをヒートシール性バッグ（例えばSears Seal−Ａ−Meal又は同等品）の中にすべり込ませる。２mlのプレハイブリダイゼーション溶液／cm2 を加える。空気をフィルターから追い出し、そしてバッグの開放端をヒートシールする。このバッグを68℃（水性溶媒用）又は42℃（50％のホルムアミドの存在下）で１〜２ｈインキュベートする。フィルターを含むバッグを湯浴から取り出し、そして角をハサミで切ることにより開く。ラベル化プローブ（例えば、32Ｐ−ラベルされたヌクレオチド又は好ましくは本発明に係るヌクレオチド誘導体）をプレハイブリダイゼーション溶液に加え、そして空気を追い出す。このバッグを再シールする（可能な限り少ない泡が捕捉されている状態で）。このバッグをハイブリダイゼーションに必要な温度及び必要な時間において湯浴の中に浸漬する。このバッグを角において開封する。ハイブリダイゼーション溶液を除去後、このフィルターを取り出し、そして数百mlの２×のSSC 及び 0.5％のSDS の中に室温においてフィルターが乾かないように数分浸漬する；この処理を新鮮な溶液で繰り返す。次いでフィルターを 0.1×のSSC/ 0.5％のSDS の中で30〜60min ，37℃にて、静かに撹拌しながらインキュベートする。この溶液を新鮮なアリコートと交換し、そして68℃で30〜60min インキュベートする。放射能の量はＸ線フィルム（例えば Kodak XAR−２又は同等品）上で測定でき、オートラジオグラフィー像が得られる。
【００１９】
ハイブリダイゼーションを可能とするに足りる数及び種類のヌクレオチド単位又は類似体／誘導体を含んで成る本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体は標的配列に特異的に結合することを可能にする長さ、特に５〜50ヌクレオチド単位、好ましくは10〜35ヌクレオチド単位、より好ましくは15〜22ヌクレオチド単位、そして最も好ましくは18〜20ヌクレオチド単位に相当する長さを有する。
【００２０】
ヒトSAMDC 遺伝子の対立形態変異体並びにハイブリダイゼーションが可能であり続けるほどごくわずかな数の誤対合を示すハイブリダイゼーション可能なオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体の包含も可能にするため、これらの配列はヒトcDNAに対応するそれ（好ましくはPajunen らに記載、前記参照）から数個のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体で異なっていてよい；好ましくは、対応のSAMDC cDNAに対し、所定のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体の配列において、より好ましくは保存性突然変異の意味において、３個までのヌクレオチド又はヌクレオチド類似体で相違してよい。
【００２１】
ヌクレオチド単位はホスホジエステル又はその他の結合を介して隣りのヌクレオチド単位に適切に結合した塩基糖又は塩基類似体の組合せである。
【００２２】
本発明に係るオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体はSAMDC の所定のアイソザイムもしくは特定のアイソザイムの組を特異的に阻害するように、又はSAMDC の所定のアイソザイム族の全ての構成員を阻害するようにデザインされうる。
【００２３】
本発明との関連において、「オリゴヌクレオチド」なる語は、天然ホスホジエステル結合により連結された天然の塩基性基とペントフラノシル（リボシル又は（好ましくは）２’−デオキシリボシル）基又はその修飾形態とから形成されたオリゴヌクレオチド、即ち、以下の式Ｉ及び／又はＩ* の構成単位を含んで成るものを意味する（ここで、ＱはＨ又はOHであり、ここでＢはアデニン、シトシン、５−メチルシトシン、チミン及びグアニンより選ばれる塩基性基である）：
【００２４】
【化１】
2006109846.tif 000002
【００２５】
「オリゴヌクレオチド誘導体」なる語は天然ヌクレオチドサブユニット又はそれに近い同族体に由来する合成物質も意味し、そして天然オリゴヌクレオチドと似たように機能するが、非天然部分、例えば天然オリゴヌクレオチドの構成単位とは異なる少なくとも一の構成単位を有する成分も意味しうる。即ち、骨格に関してオリゴヌクレオチドは改変糖成分及び／又は糖間連結を有し得、そして塩基に関して改変塩基が存在しうる。
【００２６】
かかるオリゴヌクレオチド誘導体は、天然オリゴヌクレオチド（又は天然系に即した合成オリゴヌクレオチド）との機能的な互換性を有するが、天然構造とは１又は複数の相違を有するものが最良である。かかるオリゴヌクレオチドは全て、SAMDC 遺伝子に由来するDNA 又はRNA 、好ましくはmRNAに対するハイブリダイゼーション特性を有効に示す限り、本発明に包括される。
【００２７】
骨格、即ち改変糖成分及び／又は糖間連結に関し、好ましいのは以下のタイプである：
−  式Ｉ又はＩ* の天然ヌクレオチドサブユニット又はそれに近い同族体（式中、Ｂは以下に定義する塩基性基であり、そしてＱはSH，SCH3，Ｆ，Ｎ3 ，CN，OCN ，Ｏ（CH2)z NH2 又はＯ（CH2)z CH3 〔ここでｚは１〜約10、又はＯ（CH2CH2O)v CH3 でありｖは０〜12、好ましくはｖは０又は１である〕であるか、又はＱはより広い意味において、類似の特性を有する別の置換基、例えばCl，Br，CF3 ，ONO2，NO2 ，NH2 及びＯ−，Ｓ−又はNH−低級アルキルから選ばれる置換基である）に由来する物質；
−  ホスホロチオエート、そしてより広い意味において、その他の物質、例えばホスホロジチオエート、スルフェート、スルホネート、スルホンアミド、スルホン、スルフィット、スルホキシド、スルフィド、ホルムアセタール、３’−チオホルムアセタール、５’−チオエステル、ヒドロキシルアミン（ホスホジエステル結合Ｏ−〔（HO−）Ｐ（＝Ｏ）〕−Ｏ−CH2 の代わりにCH2 −NH−Ｏ−CH2 を有する）、メチレン（メチルイミノ）（ホスホジエステル結合の代わりにCH2 −Ｎ（CH3)−Ｏ−CH3 を有する）；メチレンオキシ（メチルイミノ）（ホスホジエステル結合の代わりにCH2 −Ｏ−Ｎ（CH3)−CH2 を有する）、メチレン−（（メチルイミノ）−メチルイミノ）（ホスホジエステル結合の代わりにCH2 −Ｎ（CH3)−Ｎ（CH3)−CH2 を有する）、カルボネート、５’−Ｎ−カルバメート、アミド（ホスホジエステル結合の代わりにCH2 −（Ｃ＝Ｏ）−NH−CH2 を有する；国際出願WO92/20823を参照のこと）、モルホリノ−カルバメート（Summerton, J. E. and Weller, D. D.、米国特許第 5,034,506号参照のこと）、又はペプチド核酸（P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science 254, 1497 (1991))であって、当業界において利用が公知のもの（これらの修飾型ヌクレオチドに関する文献については、Milliganら、J. Med. Chem. 36 (14), 1923-37 (1993) 及びUhlmann ら、 Chemical Reviews 90 (4),543-84 (1990) を参照のこと）。いくつかの好適な態様に従うと、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合の少なくとも一本は、活性が調節されるべきRNA 又はDNA が存在する細胞の領域への当該組成物の浸透能を高めるように機能し、且つ無能な切断生成物をもたらすであろうヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチド誘導体の多大な分解を回避するために機能する構造に置き換えられている。かかる置き換えには、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホラミデート結合、ボラノホスフェート結合、ホスホトリエステル結合、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル構造、又はヘテロ原子置換化短鎖アルキル構造、そして特にホスホロチオエート結合が含まれる。
【００２８】
これらのうちで好ましいのは、以降に示す式の以下の単位（二価基）の少なくとも一つを（そのヌクレオチド／ヌクレオチド誘導体配列において）含んで成るオリゴヌクレオチド誘導体である（ここで、Ｂは以下に定義している塩基性基であり；ＱはSH，SCH3，Ｆ，Ｎ3 ，CN，OCN ，Ｏ（CH2)z NH2 又はＯ（CH2)z CH3 （ここでｚは１〜約10である）又はＯ（CH2CH2O)v CH3 （ここで、ｖは０〜12である）であるか、又はより広い意味において類似の特性を有する別の置換基、例えばCl，Br，CF3 ，ONO2，NO2 ，NH2 及びＯ−，Ｓ−又はNH−低級アルキルから選ばれる置換基であり、最も特別にはＱはヒドロキシ、又は好ましくは水素であり；そしてその他の成分は対応の式の後に示す意味をもつ）：
【００２９】
【化２】
2006109846.tif 000003
【００３０】
次式の基          タイプ
（IIａ），  ホスホロチオエート        Ｘ＝SH      Ｙ＝Ｏ
（IIａ* ）
（IIｂ），  ホスホロジチオエート      Ｘ＝SH      Ｙ＝Ｓ
（IIｂ* ）
（IIｃ），  メチルホスホネート        Ｘ＝CH3     Ｙ＝Ｏ
（IIｃ* ）
（IIｄ），  ホスホラミデート          Ｘ＝NH−Ｒ  Ｙ＝Ｏ
（IIｄ* ）
（IIｅ），  ボラノホスフェート        Ｘ＝BH3     Ｙ＝Ｏ
（IIｅ* ）
（IIｆ），  ホスホトリエステル        Ｘ＝Ｏ−Ｒ  Ｙ＝Ｏ
（IIｆ* ）
ここでＲは低級アルキルである；
【００３１】
【化３】
2006109846.tif 000004
【００３２】
次式の基            タイプ              ｎ      Ｘ’    Ｙ’
（III ａ），    スルフェート          ２      Ｏ      Ｓ
（III ａ* ）
（III ｂ），    スルホネート          ２      Ｏ      CH2 
（III ｂ* ）
（III ｃ），    スルファメート        ２      Ｏ      NH
（III ｃ* ）
（III ｄ），    スルホンアミド        ２      NH      CH2 
（III ｄ* ）
（III ｅ），    スルホン              ２      CH2     CH2 
（III ｅ* ）
（III ｆ），    スルフィット          １      Ｏ      Ｏ
（III ｆ* ）
（III ｇ），    スルホキシド          １      CH2     CH2 
（III ｇ* ）
（III ｈ），    スルフィド            ０      CH2     CH2 
（III ｈ* ）
【００３３】
【化４】
2006109846.tif 000005
【００３４】
次式の基                  タイプ                  Ｘ''  Ｙ''
（IVａ), (IVａ* ）  ホルムアセタール            Ｏ    Ｏ
（IVｂ), (IVｂ* ）  3'−チオホルムアセタール    Ｓ    Ｏ
（IVｃ), (IVｃ* ）  5'−チオホルムアセタール    Ｏ    Ｓ
（IVｄ), (IVｄ* ）  チオエーテル                CH2   Ｓ
【００３５】
【化５】
2006109846.tif 000006
【００３６】
次式の基                  タイプ                        Ｘ*         Ｙ* 
（Ｖａ), (Ｖａ* ）  ヒドロキシルアミン                N-H         Ｏ
（Ｖｂ), (Ｖｂ* ）  メチレン（メチルイミノ)           N-CH3       Ｏ
（Ｖｃ), (Ｖｃ* ）  メチレンオキシ（メチルイミノ)     Ｏ          N-CH3
【００３７】
【化６】
2006109846.tif 000007
【００３８】
次式の基                  タイプ                Ｘ**    Ｙ**
（VIａ), (VIａ* ）  カルボネート              Ｏ      Ｏ
（VIｂ), (VIｂ* ）  5'−Ｎ−カルバメート      Ｏ      NH
（VIｃ), (VIｃ* ）  アミド                    CH2     NH
（VIｄ), (VIｄ* ）  アミドII                  NH      CH2
【００３９】
【化７】
2006109846.tif 000008
【００４０】
次式の基                    タイプ              Ｘ1     Ｙ1 
（VII ), (VII * ）        アミドIII           NH      CH2
【００４１】
【化８】
2006109846.tif 000009
【００４２】
次式の基                  タイプ                  Ｘ2 
（VIII），              アミドIV                NH
（VIII* ）
【００４３】
【化９】
2006109846.tif 000010
【００４４】
次式の基                  タイプ
IX，IX*       モルホリノ−カルバメート
【００４５】
【化１０】
2006109846.tif 000011
【００４６】
次式の基              タイプ
Ｘ，Ｘ*         ペプチド核酸
オリゴヌクレオチド誘導体はその骨格（糖成分及び／又は糖間連結）に関し、これらの単位の組合せより成るか、又それらは好ましくはこれらの単位のうちの１のタイプのみを含んで成ってよく、それは関連のオリゴヌクレオチド誘導体鎖全体にわたって存在し、最も好ましくは２’−デオキシリボース−ホスホロチオエートタイプより成る。関連のオリゴヌクレオチド誘導体分子の５’及び３’末端において、上記の式Ｉ，Ｉ* ，II〜Ｘ及びII* 〜Ｘ* の任意の基の遊離結合手は、その末端原子がＮ，Ｏ及びＳから選ばれるとき、好ましくは水素に結合しており、そして末端原子がＣであるとき、ヒドロキシ又はその類似体、例えばCl，BrもしくはＩ、メルカプト（SH）又はアジド（Ｎ3 ）に結合しており、より好ましくは以下の基のいづれかに結合しており、しかしながらコンジュゲートを形成する以下のその他のコンジュゲート成分に結合していてもよい。
【００４７】
式Ｉ，IIａ〜IIｆ，III ａ，III ｃ，III ｆ，IVａ〜IVｄ，Ｖａ〜Ｖｃ，VIａ〜VIｃ，IX及びＸ* の任意のどれかの末端成分を有する化合物において、５’末端は好ましくは末端OH基に、そして３’末端は水素に結合している。
【００４８】
式Ｉ* ，IIａ* 〜IIｆ* ，III ａ* 〜III ｈ* ，IVａ* 〜IVｃ* ，Ｖａ* 〜Ｖｃ* ，VIａ* 〜VIｄ* ，VII * ，VIII* 及びＸの任意のどれかの末端成分を有する化合物において、５’末端は好ましくは末端水素に結合しており、そして３’末端はOH基に結合している。
【００４９】
式IX* の任意のどれかの末端成分を有する化合物において、５’末端は好ましくは末端−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏに置き代わって結合している末端OH基に結合しており、そして３’末端は水素原子に結合している。
【００５０】
式III ｂ，III ｄ，III ｅ，III ｅ* ，III ｇ，III ｇ* ，III ｈ，III ｈ* ，IVｄ* ，VIｄ* ，VII ，VIII及びVIII* の任意のどれかの末端成分を有する化合物において、５’末端は好ましくは末端OH基に結合しており、そして３’末端は好ましくはOH基に結合している。
【００５１】
改良及び改善された薬理動力特性、例えば細胞への高められた取り込みを可能にするため、本発明に係るオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体は１又は複数の（同一又は異なる）追加の成分にコンジュゲーションされていてもよい。その成分は以下より選ばれる：ミセル形成基、抗体、炭水化物、レセプター結合性基、ステロイド、例えばコレステロール、ポリペプチド、挿入剤、例えばアクリジン誘導体、長鎖アルコール、リン脂質及びその他の親油性基。
【００５２】
最も好ましいオリゴヌクレオチド誘導体はホスホロチオエートタイプのものである。
【００５３】
式（Ｉｉ）〜（Ｘｉ）及び（Ｉｉ* ）〜（Ｘｉ* ）のいづれかにおけるＢ（「ｉ」は上記の式における関連の記号、例えば「ａ」，「ｂ」を表わし、又は何も必要ないときは表示なしである）は塩基性基であり、そしてプリン基又はその類似体及びピリミジン基又はその類似体を含んで成る群から選ばれる。
【００５４】
もしＢがプリン基又はその類似体なら、それは式ＸＩ，ＸＩａ，ＸＩｂ，ＸＩｃ，ＸＩｄ，ＸＩｅ又はＸＩｆの基でありうる。
【００５５】
【化１１】
2006109846.tif 000012
【００５６】
ここで
Ｒb1はＨ，Cl，Br，OH又は−Ｏ−Ｃ1 −Ｃ12アルキルであり、そして
Ｒb2，Ｒb3及びＲb5はそれぞれ互いと独立してＨ，OH, SH, NH2 ，NHNH2 ，NHOH， NHO−Ｃ1 −Ｃ12アルキル、−Ｎ＝CH−Ｎ（Ｃ1 −Ｃ12アルキル）2 ，Ｆ，Cl，Br，Ｃ1 −Ｃ12アルキル、ヒドロキシ−Ｃ1 −Ｃ12アルキル、アミノ−Ｃ1 −Ｃ12アルキル、Ｃ1 −Ｃ12アルコキシ、ベンジルオキシ又はＣ1 −Ｃ12アルキルチオであり、ここでヒドロキシ及びアミノ基はそのまま又は保護基により置換され存在しており；又はフェニル、ベンジル、１〜20個の炭素原子を有する第一級アミノ又は２〜30個の炭素原子を有する第二級アミノであり、
Ｒb4は水素、CN又は−Ｃ≡Ｃ−Ｒb7であり、そして
Ｒb6及びＲb7は水素又はＣ1 −Ｃ4 アルキルである。
【００５７】
保護基を有するヒドロキシ基を誘導化するための保護基及び方法は一般に糖及びヌクレオチド化学において一般に公知であり、そして標準の参考書に記載されている（例えば、Greene, B. T., Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley Interscience, New York (1991), Sonveaux, E., Bioorganic Chemistry 14 : 274-325(1986)又はBeaucage, S. L., Iyer, R., Tetrahedron 48 : 2223-2311 (1992)を参照のこと）。
【００５８】
かかる保護基の例は：ベンジル、メチルベンジル、ジメチルベンジル、メトキシベンジル、ジメトキシベンジル、ブロモベンジル、２，４−ジクロロベンジル；ジフェニルメチル、ジ（メチルフェニル）メチル、ジ（ジメチルフェニル）メチル、ジ（メトキシフェニル）メチル、ジ（ジメトキシフェニル）メチル、トリフェニルメチル、トリス−４，４’，４’−tert−ブチルフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、トリ（メチルフェニル）メチル、トリ（ジメチルフェニル）メチル、メトキシフェニル（ジフェニル）メチル、ジ（メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（メトキシフェニル）メチル、トリ（ジメトキシフェニル）メチル；トリフェニルシリル、アルキルジフェニルシリル、ジアルキルフェニルシリル、及びトリアルキルシリルであって、１〜20、好ましくは１〜12、そして特に１〜８個の炭素原子をアルキル基の中において有する基、例えばトリメチルシリル、トリエチルシリル、トリ−ｎ−プロピルシリル、イソプロピル−ジメチルシリル、tert−ブチル−ジメチルシリル、tert−ブチル−ジフェニルシリル、ｎ−オクチル−ジメチルシリル、（１，１，２，２−テトラメチルエチル）−ジメチルシリル；−（Ｃ1 −Ｃ8 アルキル）2 Si−Ｏ−Si（Ｃ1 −Ｃ8 アルキル）2 −（ここで、アルキルは、例えばメチル、エチル、ｎ−及びイソ−プロピル、又はｎ−、イソ−又はtert−ブチルである）；Ｃ2 −Ｃ12アシル、特にＣ2 −Ｃ8 アシル、例えばアセチル、プロパノイル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイル、ベンゾイル、メチルベンゾイル、メトキシベンゾイル、クロロベンゾイル及びブロモベンゾイル；ＲS1−SO2 −（ここで、ＲS1はＣ1 −Ｃ12アルキル、特にＣ1 −Ｃ6 アルキル、Ｃ5 −又はＣ6 −シクロアルキル、フェニル、ベンジル、Ｃ1 −Ｃ12アルキルフェニル、特にＣ1 −Ｃ4 アルキルフェニル、又はＣ1 −Ｃ12アルキルベンジル、特にＣ1 −Ｃ4 アルキルベンジル、又はハロフェニル又はハロベンジル、例えばメチル−、エチル−、プロピル−、ブチル−、フェニル−、ベンジル−、ｐ−ブロモ−、ｐ−メトキシ−及びｐ−メトキシフェニル−スルホニルである；Ｃ1 −Ｃ12アルコキシカルボニル、好ましくはＣ1 −Ｃ8 アルコキシカルボニルであって、未置換であるか、又はアルコキシカルボニルの如き置換されている基、例えばメチル−又はメトキシ−又はクロロ−フェノキシカルボニル又はメチル−又はメトキシ−又はクロロ−ベンジルオキシカルボニル、及び９−フルオレニルメトキシカルボニルである。もしヒドロキシ保護基がアルキルなら、この成分はフッ素、塩素、臭素、Ｃ1 −Ｃ4 アルコキシ、フェノキシ、クロロフェノキシ、メトキシフェノキシ、ベンジルオキシ、メトキシベンジルオキシ又はクロロフェノキシにより置換されていてよい。もし複数のヒドロキシ基が関連のオリゴヌクレオチド又はその誘導体において保護されているとき、その保護基は同一でも異なるものであってもよい。
【００５９】
保護基を有するアミノ基（及びイミノ基；アミノ保護基について言及する以下の段落における「アミノ」基は、適宜、イミノも意味する）を誘導化するための保護基及び方法は糖、アミノ酸及びヌクレオチド化学において一般的に知られ、そして例えば標準の参考書に記載されている（J. F. W. McOmie 「Protective Groups in Organic Chemistry」Plenum Press, London and New York 1973 ; Th. W. Greene「Protective Groups in Organic Synthesis」Wiley, New York 1981, 「The Peptides」Volume 3 (E. Gross and J. Meienhofer、編）, Academic Press, London and New York 1981 ;「Methoden der organischen Chemie 」Houben-Weyl, 4th edition, Volume 15/I, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974；及びH.-D. Jakubke and H. Jescheit 「Aminosaeuren, Peptide, Proteine」（「Amino acids, peptides, proteins 」）Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach and Basle 1982 を参照のこと）。
【００６０】
保護されたアミノ基は、例えば、アシルアミノ、アリールメチルアミノ、エーテル化メルカプトアミノ、２−アシル−低級アルク−１−エニルアミノ、シリルアミノ又はＮ−低級アルキルピロリジニリデン基の形態で、あるいはアジド基の形態で、保護されることができる。
【００６１】
対応のアシルアミノ基においては、アシルは、例えば、18までの炭素原子をもつ有機カルボン酸、特に置換されていないか又は置換された、例えば、ハロ−もしくはアリール−置換された低級アルカンカルボン酸又は置換されていないか又は置換された、例えば、ハロ−、低級アルコキシ−もしくはニトロ−置換された安息香酸の、又は好ましくは炭酸のセミエステルの、アシル基である。このようなアシル基は、好ましくは、低級アルカノイル、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル又はピバロイル、ハロ−低級アルカノイル、例えば、２−ハロ−アセチル、例えば、２−クロロ−、２−ブロモ−、２−ヨード、２，２，２−トリフルオロ−もしくは２，２，２−トロクロロ−アセチル、フェニルオキシ−又は（低級アルコキシ）フェノキシ−低級アルキル、例えばフェノキシアセチル又は４−tert−ブチルフェノキシアセチル、置換されていないか又は置換された、例えば、ハロ−、低級アルコキシ−もしくはニトロ−置換されたベンゾイル、例えば、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−メトキシベンゾイル又は４−ニトロベンゾイル、低級アルコキシカルボニル、好ましくは、その低級アルキル基の１−位で枝分かれし、又は１−もしくは２−位で好適に置換されている低級アルコキシカルボニル、例えばtert−低級アルコキシカルボニル、例えば、tert−ブトキシカルボニル、１，２もしくは３つのアリール基をもつアリールメトキシカルボニルであって、フェニルが置換されていないか又は例えば、低級アルキル、特に、tert−低級アルキル、例えば、tert−ブチル、低級アルコキシ、例えば、メトキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、例えば、塩素、及び／又はニトロにより、モノ−もしくはポリ−置換されたフェニルであるもの、例えば、ベンジルオキシカルボニル、４−ニトロベンジルオキシカルボニル、ジフェニルメトキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシ−カルボニル又はジ（４−メトキシフェニル）メトキシカルボニル、アロイルメトキシカルボニルであって、アロイル基が好ましくは、置換されていないか又は例えば、ハロゲン、例えば、臭素により置換されているベンゾイルであるもの、例えば、フェナシルオキシカルボニル、２−ハロ−低級アルコキシカルボニル、例えば、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、２−ブロモエトキシカルボニル又は２−ヨードエトキシカルボニル、２−（トリ−置換シリル）−低級アルコキシカルボニル、例えば、２−トリ−低級アルキルシリル−低級アルコキシカルボニル、例えば、２−トリメチル−シリルエトキシカルボニル又は２−（ジ−ｎ−ブチル−メチル−シリル）−エトキシカルボニル、トリアリールシリル−低級アルコキシカルボニル、例えば、２−トリフェニルシリルエトキシカルボニル、又はＮ，Ｎ−ジ−低級アルキルホルムアミジニル、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニルである。
【００６２】
アリールメチルアミノ基、例えば、モノ−、ジ−もしくは特にトリ−アリールメチルアミノ基においては、このアリール基は、特に、置換されていないか又は置換されたフェニル基である。このような基は、例えば、ベンジル−ジフェニルメチル−もしくは特にトリチル−アミノである。
【００６３】
エーテル化されたメルカプトアミノ基においては、このメルカプト基は、特に、置換されたアリールチオ又はアリール−低級アルキルチオであって、アリールが置換されていないか又は例えば、低級アルキル、例えば、メチル又はtert−ブチル、低級アルコキシ、例えば、メトキシ、ハロゲン、例えば、塩素、及び／又はニトロにより、置換されたフェニルであるもの、例えば、４−ニトロフェニルチオの形態にある。
【００６４】
アミノ−保護基として使用されることができる２−アシル−低級アルク−１−エニル基においては、アシルは、例えば、低級アルカンカルボン酸の又は置換されていないか又は例えば、低級アルキル、例えば、メチル又はtert−ブチル、低級アルコキシ、例えば、メトキシ、ハロゲン、例えば、塩素、及び／又はニトロにより置換された安息香酸の、又は特に炭酸のセミエステル、例えば、炭酸の低級アルキルセミエステルの、それに対応する基である。対応する保護基は、特に、１−低級アルカノイル−低級アルク−１−エン−２−イル、例えば、１−低級アルカノイルプロプ−１−エン−２−イル、例えば、１−アセチルプロプ−１−エン−２−イル、又は低級アルコキシカルボニル−低級アルク−１−エン−２−イル、例えば、低級アルコキシカルボニルプロプ−１−エン−２−イル、例えば、１−エトキシカルボニルプロプ−１−エン−２−イルである。
【００６５】
シリルアミノ基は、例えば、トリ−低級アルキルシリルアミノ基、例えば、トリメチルシリルアミノ又はtert−ブチル−ジメチルシリルアミノである。このシリルアミノ基の珪素原子は、ただ２つの低級アルキル基、例えば、メチル基により、及び本発明に係る化合物の第二分子のアミノ基又はカルボキシル基により、置換されてもよい。このような保護基をもつ化合物は、例えば、シリル化剤として、その対応するクロロシラン、例えば、ジメチルクロロシランを使用して合成されることができる。
【００６６】
Ｎ−低級アルキルピロリジニリデン基は好ましくはＮ−メチルピロリジン−２−イリデンである。
【００６７】
好ましいアミノ−保護基は、低級アルコキシカルボニル、フェニル−低級アルコキシカルボニル、フルオレニル−低級アルコキシカルボニル、２−低級アルカノイル−低級アルク−１−エン−２−イル及び低級アルコキシカルボニル−低級アルク−１−エン−２−イルであり、イソブチリル、ベンゾイル、フェノキシアセチル、４−tert−ブチルフェノキシアセチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル及び／又はＮ−メチルピロリジン−２−イリデンである。
【００６８】
第一級アミノ（例えばＲb2，Ｒb3及びＲb5の定義における）は好ましくは１〜12、そして特に１〜６個の炭素原子を含み、そして第二級アミノ（例えばＲb2，Ｒb3及びＲb5の定義における）は好ましくは２〜12、そして特に２〜６個の炭素原子を含む。
【００６９】
１〜６個の炭素原子を好適には含むアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシアルキル及びアミノアルキルのいくつかの例はメチル、エチル、並びにプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル及びドデシルの異性体、並びに対応のアルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシアルキル及びアミノアルキル基である。アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシアルキル及びアミノアルキルは特に１〜４個の炭素原子を含む。好適なアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシアルキル及びアミノアルキル基はメチル、エチル、ｎ−及びイソ−プロピル、ｎ−、イソ−及びtert−ブチル、メトキシ、エトキシ、メチルチオ及びエチルチオ、アミノメチル、アミノエチル、ヒドロキシメチル及びヒドロキシエチルである。
【００７０】
第一級アミノ及び第二級アミノは、例えば式Ｒa1Ｒa2Ｎの基であってよく、ここで、Ｒa1は水素であるか、又は独立して、Ｒa2と定義され、そしてＲa2はＣ1 −Ｃ20−、好ましくはＣ1 −Ｃ12−、そして特にＣ1 −Ｃ6 アルキル、Ｃ1 −Ｃ20−、好ましくはＣ1 −Ｃ12−、そして特にＣ1 −Ｃ6 −アミノアルキル、Ｃ1 −Ｃ20−、好ましくはＣ1 −Ｃ12−、そして特にＣ1 −Ｃ6 −ヒドロキシアルキル；カルボキシアルキル又はカルバアルコキシアルキル（このカルバアルコキシ基は２〜８個の炭素原子を含み、そしてそのアルキル基は１〜６、好ましくは１〜４個の炭素原子を含む）；Ｃ2 −Ｃ20−、好ましくはＣ2 −Ｃ12−、そして特にＣ2 −Ｃ6 −アルケニル；フェニル、モノ−又はジ−（Ｃ1 −Ｃ4 −アルキル又はＣ1 −Ｃ4 アルコキシ）フェニル、ベンジル、モノ−又はジ−（Ｃ1 −Ｃ4 アルキル又はＣ1 −Ｃ4 アルコキシ）ベンジル；又は１，２−，１，３−又は１，４−イミダゾイル−Ｃ1 −Ｃ6 アルキルであるか；あるいはＲa1とＲa2とは一緒になってテトラ−又はペンタ−メチレン、３−オキサ−１，５−ペンチレン、−CH2 −NRa3−CH2 −CH2 −又はCH2CH2−NRa3−CH2CH2−（ここでＲa3は水素はＣ1 −Ｃ4 アルキルである）である。アミノアルキルにおけるアミノ基は１もしくは２個のＣ1 −Ｃ4 アルキル又はＣ1 −Ｃ4 ヒドロキシアルキル基により置換されていてよい。ヒドロキシアルキルにおけるヒドロキシ基はＣ1 −Ｃ4 アルキルによりエーテル化されていてよい。
【００７１】
アルキルの例は上記した。アミノアルキルの例はアミノメチル、アミノエチル、１−アミノプロプ−２−イルもしくは−３−イル、１−アミノ−ブト−２−イルもしくは−３−イルもしくは−４−イル、Ｎ−メチル−もしくはＮ，Ｎ−ジメチル−もしくはＮ−エチル−もしくはＮ，Ｎ−ジエチル−もしくはＮ−２−ヒドロキシエチルもしくはＮ，Ｎ−ジ−２−ヒドロキシエチル−アミノメチル又は−アミノエチルもしくは−アミノプロピルもしくは−アミノブチルである。ヒドロキシアルキルの例はヒドロキシメチル、１−ヒドロキシ−エト−２−イル、１−ヒドロキシ−プロプ−２−もしくは−３−イル、及び１−ヒドロキシブト−２−イル、−３−イルもしくは−４−イルである。カルボキシアルキルの例はカルボキシメチル、カルボキシエチル、カルボキシプロピル及びカルボキシブチルであり、そしてカルバアルコキシアルキルの例はメチルもしくはエチルによりエステル化されたカルボキシアルキル基である。アルケニルの例はアリル、ブト−１−エン−３−イル又は−４−イル、ペント−３−又は−４−エン−１−イル又は−２−イル、ヘキス−３−又は−４−又は−５−エン−１−イル又は−２−イルである。アルキル−及びアルコキシ−フェニル並びにアルキル−及びアルコキシ−ベンジルはメチルフェニル、ジメチルフェニル、エチルフェニル、ジエチルフェニル、メチルベンジル、ジメチルベンジル、エチルベンジル、ジエチルベンジル、メトキシフェニル、ジメトキシフェニル、エトキシフェニル、ジエトキシフェニル、メトキシベンジル、ジメトキシベンジル、エトキシベンジル及びジエトキシベンジルである。アルキル基が好適には２〜４個の炭素原子を含むイミダゾリルアルキルの例は１，２−，１，３−又は１，４−イミダゾリル−エチル又は−ｎ−プロピル又は−ｎ−ブチルである。Ｒa3は好ましくは水素、メチル又はエチルである。
【００７２】
第一級アミノ及び第二級アミノの好適な例はメチル−、エチル−、ジメチル−、ジエチル−、アリル−、モノ−又はジ−（１−ヒドロキシ−エト−２−イル）−、フェニル−及びベンジル−アミノ、アセチル−アミノ、イソブチリルアミノ及び／又はベンゾイルアミノである。
【００７３】
好適な形態において、Ｒb1は水素である。別の好適な形態において、Ｒb5は水素である。更なる好適な形態において、Ｒb2及びＲb3は互いと独立してＨ，Ｆ，Cl, Br, OH, SH, NH2 ，NHOH, NHNH2 ，メチルアミノ、ジメチルアミノ、ベンゾイルアミノ、イソブチリルアミノ、メトキシ、エトキシ及びメチルチオである。
【００７４】
プリン系の類似体のいくつかの例は、プリンの他に、キサンチン、ヒポキサンチン、アデニン、Ｎ−メチルアデニン、Ｎ−ベンゾイルアデニン、２−メチルチオアデニン、２−アミノアデニン、６−ヒドロキシプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２−アミノ−６−メチルチオプリン、グアニン、Ｎ−イソブチリルグアニンである。特に好ましいのはアデニン及びグアニンであり、そして本発明のより広い観点においては２−アミノアデニン又はその塩基保護誘導体である。
【００７５】
式（Ｉｉ）〜（Ｘｉ）及び（Ｉｉ* ）〜（Ｘｉ* ）の任意のどれかにおけるＢがピリミジン基又はその類似体であるなら、それは好ましくはウラシル、より好ましくはチミン又はシトシン基、又は式ＸII，ＸIIａ，ＸIIｂ又はＸIIｃのその類似体：
【００７６】
【化１２】
2006109846.tif 000013
【００７７】
（式中、Ｒb6は水素又はＣ1 −Ｃ4 アルキルであり、そしてＲb8はＨ，OH, SH, NH2 ，NHNH2 ，NHOH,  NHO−Ｃ1 −Ｃ12アルキル、−Ｎ＝CH−Ｎ（Ｃ1 −Ｃ12アルキル）2 ，Ｆ，Cl, Br, Ｃ1 −Ｃ12アルキル、ヒドロキシ−Ｃ1 −Ｃ12アルキル、アミノ−Ｃ1 −Ｃ12アルキル、Ｃ1 −Ｃ12アルコキシ、ベンジルオキシ又はＣ1 −Ｃ12アルキルチオ（そのヒドロキシ及びアミノ基は未置換であるか又は保護基により置換されている）、又はフェニル、ベンジル、１〜20個の炭素原子を有する第一級アミノ基、２〜30個の炭素原子を有する第二級アミノ基、Ｃ1 −Ｃ12アルケニル又はＣ1 −Ｃ12アルキルであり、そして式ＸIIｂにおけるNH2 基は未置換であるか又はＣ1 −Ｃ6 アルキル、ベンゾイル又は保護基により置換されている）並びに式ＸII，ＸIIａ，ＸIIｂ及びＸIIｃの基のジヒドロ誘導体である。式ＸIIにおけるＲb8は好ましくは水素、Ｃ1 −Ｃ6 水素又はＣ1 −Ｃ6 ヒドロキシアルキル、Ｃ2 −Ｃ6 アルケニル又はＣ2 −Ｃ6 アルキニル、Ｆ，Cl, Br, NH2 、ベンゾイルアミノ又はモノ−もしくはジ−Ｃ1 −Ｃ6 アルキルアミノである。式ＸIIｂ及びＸIIｃにおけるＲb8は好ましくは水素、Ｃ1 −Ｃ6 アルキル又はＣ1 −Ｃ6 アルコキシ又はＣ1 −Ｃ6 ヒドロキシアルキル、Ｃ2 −Ｃ6 アルケニル又はＣ2 −Ｃ6 アルキニル、Ｆ，Cl, Br, NH2 、ベンゾイルアミノ又はモノ−もしくはジ−Ｃ1 −Ｃ6 アルキルアミノである。
【００７８】
Ｒb6は好ましくは水素又はメチルである。式ＸIIにおけるＲb8は好ましくはＨ，Ｆ，Cl, Br, NH2 ，NHCH3 ，Ｎ（CH3)2 ，Ｃ1 −Ｃ4 アルキル、Ｃ2 −Ｃ4 アルケニル又はＣ2 −Ｃ4 アルキン−１−イルである。式ＸIIｂ及びＸIIｃにおけるＲb8は好ましくは水素、Ｃ1 −Ｃ4 アルキル、特にメチル、Ｃ2 −Ｃ4 アルケニル、特にビニル、又はＣ2 −Ｃ4 アルキン−１−イル、特に１−プロピン−１−イル、又はNH2 ，NHCH3 又は（CH3)2 Ｎである。
【００７９】
ピリミジン類似体のいくつかの例はウラシル、チミン、シトシン、５−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−ブロモウラシル、ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、５−プロピンチミン及び５−プロピンシトシンであり、チミン、シトシン及び５−メチルシトシンが最も好ましい。
【００８０】
本発明に係るオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体の塩は特に酸付加塩、塩基との塩、又は複数の塩形成基があるとき、任意的に複合塩又は内部塩である。
【００８１】
塩は特に薬理学的に許容される、上記及び下記に特定するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体の無毒の塩である（適切な用量で服用したときに無毒な塩）。
【００８２】
かかる塩は、例えば、酸性基、例えばカルボキシ、ホスホジエステル又はホスホロチオエート基を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体から形成され、そして例えば適当な塩基との塩、例えば元素周期表のＩａ，Ｉｂ，IIａ及びIIｂ族の金属に由来する無毒な金属塩、特に適当なアルカリ金属塩、例えばリチウム、ナトリウム又はカリウム塩、又はアルカリ土類金属塩、例えばマグネシウム又はカルシウム塩、更には亜鉛塩又はアンモニウム塩、また有機アミンにより形成される塩、例えば未置換又はヒドロキシ置換されたモノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミン、特にモノ−、ジ−又はトリ−低級アルキルアミンにより形成される塩、又は第四級アンモニウム化合物、例えばＮ−メチル−Ｎ−エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、モノ−、ビス−又はトリス−（２−ヒドロキシ−低級アルキル）アミン、例えばモノ−、ビス−又はトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、２−ヒドロキシ−tert−ブチルアミン又はトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−Ｎ−（ヒドロキシ−低級アルキル）−アミン、例えばＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−アミン又はトリ−（２−ヒドロキシエチル）−アミン、又はＮ−メチル−Ｄ−グルカミンにより形成される塩、又は第四級アンモニウム塩、例えばテトラブチルアンモニウム塩である。塩基性基、例えばアミノ又はイミノ基を有するオリゴヌクレオチド及びその誘導体は、例えば無機酸、例えばハロゲン化水素酸、例えば塩酸、硫酸又はリン酸と、又は有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ又はホスホ酸と、又はＮ−置換化スルファミド酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、グルカリン酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桔草酸、マンデリン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボニン酸、ニコチン酸又はイソニコチン酸と、更にはアミノ酸、例えば上記のα−アミノ酸、そして更にはメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、２−又は３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミド酸（シクラメートの形成が伴う）、又はその他の酸性有機化合物、例えばアスコルビン酸と酸付加塩を形成できる。酸性及び塩基性基を有する化合物は内部塩をも形成しうる。複数個の塩形成基が存在するなら、複合塩が存在することも可能である。
【００８３】
単離又は精製の目的のため、薬理学的に許容されない塩を利用することも可能である。
【００８４】
用語「オリゴヌクレオチド」「オリゴヌクレオチド誘導体」「化合物」及び「塩」は個々の化合物又は個々の塩を含む表現でもある。
【００８５】
本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体は価値ある薬理特性を有する。即ち、これらはSAMDC 酵素の合成を阻害することにより、それ故細胞中のポリアミンのレベル、特にスペルミン及びスペルミジンのレベルを下げることができることにより、細胞におけるSAMDC 活性を低下させ、例えば抗増殖活性を発揮することができる。
【００８６】
本発明に係るオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体の有利な薬理特性はとりわけ以下の実験により示されうる：
ラットの肝臓SAMDC を利用することにより、本発明の化合物は単離化SAMDC の直接阻害を発揮しないことが示されうる。これを実証するため、SAMDC をヒトSAMDC に関する遺伝子を担持する発現プラスミドでトランスフェクションしたSAMDC 欠損大腸菌（Escherichia coli) から調製し（Shantzら、 Biochemistry 31 (29), 6848-55 (1992))、そして本質的に公知の手順に従って検定する（Peggら（1983），Tabor ら（編） Methods Enzymol. 94 :「Polyamines」Academic Press, New York, p234) 。無細胞透析細菌抽出物のアリコートを−70℃で保存する。SAMDC 活性の決定のためのアッセイ混合物は 150μｌの全容量において、（最終濃度）100mM のトリス−HCl pH7.0, 0.7mMのEDTA，7.5mM のジチオスレイトール、3.3mM のプトレシン、0.21mMのＳ−アデノシルメチオニン（Amersham ; 0.1μCi／アッセイ）及び様々な量のSAMDC(比活性38±20 nmol.mg-1.min-1) より成る。37℃で15〜60min のインキュベーションの後、0.17mlの２ＭのHCl の添加により反応を停止させ、そして37℃で20minインキュベーションする。25μｌの Soluene−100 (Packard) により湿らしたWhatman ３MMフィルター上に捕促されたCO2 をトルエンベース液体シンチレーションカクテル（lrgaszint（登録商標）；Ciba−Geigy, Basle, Switzerland)の中で計測する。SAMDC 調製品を欠くコントロールアッセイは通常100cpmよりはるかに下まわる。単離化ラット肝臓SAMDC に加えたとき、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその誘導体は酵素活性を阻害しない。従って、細胞性SAMDC 活性に対するオリゴヌクレオチド／その誘導体の作用はこれらの分子の直接的SAMDC 阻害効果に寄与できない。
【００８７】
低張性バッファー中のＴ24ヒト膀胱癌細胞の凍結融解より得られる細胞抽出物のSAMDC 活性を当業界公知の手順に従って本発明のオリゴヌクレオチド又はその誘導体の有無で細胞とインキュベーションした後に決定する（Regenassら、Cancer Res. 52, 4712-8 (1992) 参照）。
【００８８】
簡単に述べると、下記の手順を利用する；低張性バッファー中の細胞の凍結融解により得られた細胞抽出物のSAMDC 活性を決定し、そして比SAMDC 活性を Bio−Rad タンパク質アッセイキット(Bio−Rad Laboratories, Richmond, USA − Bradford, Anal. Biochem.72, 248-54 (1976) 参照）によるタンパク質測定の後に算定する。ヒトＴ24膀胱癌細胞をEagle 最少必須培地（Gibco, Paisley, UK)中で培養する（Meyer ら、 Int. J. Cancer 43, 851-6 (1989)を参照）。半集密Ｔ24細胞を無血清培地の中で、取込増強剤、例えば５μｇ／mlのLipofectin（登録商標）（膜濾過水中のカチオン性脂質Ｎ−〔１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド及びジオレイルホスファチジルエタノールアミン（１mg／mlに至るまで添加）の１：１（ｗ／ｗ）のリポソーム製剤）の存在下で 0.5μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体に６ｈ曝露すると、SAMDC アンチセンスオリゴヌクレオチド／その誘導体は細胞性SAMDC 活性の有意な低下を引き起こし、好ましくは試験化合物抜きの比活性の20％以下、最も好ましくは10％以下の比SAMDC 活性となる。これに反し、単純ヘルペスウィルスのUL13オープンリーディングフレーム（参考例として以下のSEQ ID 16 に示す；Crookeら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy 36 (3), 527-32 (1992) 参照）内の翻訳開始コドン領域に相補性のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドインヒビターはSAMDC 活性の若干の低下のみを示す。この試験系において、本発明に係るオリゴヌクレオチド及びその誘導体はSAMDC 活性の調節に関して特異性を示す。
【００８９】
類似の試験系を利用し、本発明に係るオリゴヌクレオチド、そして特にその誘導体は、培養培地に取込増強剤、例えば５μｇ／mlのLipotectin（登録商標）の存在下で 0.5μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を加えたとき、組織培養においてヒトＴ24膀胱癌細胞の増殖を阻害することが示されうる。
【００９０】
本発明のオリゴヌクレオチドによるSAMDC 調節がＴ24細胞中のSAMDC mRNAの濃度の低下と相関しうるかを調べるため、SAMDC mRNAのノーザンブロット分析を利用する（このアッセイの原理については、Maniatisら「Molecular Cloning − A Laboratory Manual」Cold Spring Habor Laboratory, New York 1982, p.383及びアッセイ原理に関する下記を参照のこと）。ヒトSAMDC cDNAを含んで成るプラスミド pCM９(Pajunenら、J. Biol. Chem. 263 (32), 17040-9 (1989))を大腸菌HB101 の中で増幅させる。 XbaＩ／ SacＩ消化によりプラスミドから遊離するSAMDC cDNAをEcoRＩにより 600bpづつのサイズの２本のフラグメントに更に切断する。EcoRＩ／ XbaＩフラグメントをランダムプライミングを利用してα−〔32Ｐ〕−dCTPラベルし、そしてグリオキサル−アガロースゲルでの10μｇの細胞性RNA の電気泳動分離の後にSAMDC mRNAの検定のために用い、そしてニトロセルロース膜に転写する。ラベルした膜をPhosphor−Imagerスクリーン（Molecular Dynamics／Bucher, Basel, Switzerland) により分析し、そしてラベル強度をPhosphor−Imagerのレーザースキャナーで積分する。Ｔ24細胞において、主として 2.1kbのフラグメントが検出でき、一方 3.4kbの転写物が微量で存在する。半集密Ｔ24細胞を 0.5μＭの濃度の本発明に係るオリゴヌクレオチド又はその誘導体、又はSEQ ID 16 及び以下の実施例16（コントロール）に係る単純ヘルペスウィルス（HSV)ホスホロチオエートアンチセンスヌクレオチドを伴ってもしくは伴わないで、５μｇ／mlのLipofectin（登録商標）を含む無血清培地に曝露する。様々な時間を経て（例えば０ｈ，６ｈ及び24ｈ後）細胞を回収し、そして上記の通りにSAMDC 活性及びSAMDC mRNA含有量について分析する。等量のRNA の添加はゲル検定用rRNAのUV照光及びハウス・キーピング遺伝子用のプローブ（グルタルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ＝GAPDH)による膜のプロービングによりコントロールする。Lipofectin（登録商標）のみ又はSEQ ID 16 及び以下の実施例16に係る（HSV)ホスホロチオエートアンチセンスヌクレオチドの存在下でインキュベートした細胞に反して、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体の存在下でインキュベートした細胞はSAMDCmRNAの強い削減を示す。
【００９１】
酵素レベルでの直接阻害による細胞中のSAMDC 活性の枯渇は細胞増殖に基づく障害、好ましくは腫瘍性障害にとって特に期待されるアプローチであることが当業界において公知である（Regenassら、Cancer Res.,52, 4712-8 (1992) 参照）。
【００９２】
本発明の化合物は、SAMDC の合成の調節、特にその阻害に基づく細胞の中に存在するSAMDC の量の調節による細胞中のSAMDC を削減するその能力により、増殖性、そして特に過剰増殖性障害、好ましくは腫瘍障害、特に白血病；前立腺腫瘍、例えば前立腺癌腫；腸の腫瘍；脳腫瘍；過剰増殖性の皮膚及び上皮障害、例えば乾癬、上皮腫瘍、例えば黒色腫；（好ましくは）肺癌、例えば肺小細胞癌腫；及び／又は（最も好ましくは）尿管の腫瘍、特に膀胱癌；並びにそれらからの任意の転移の処置において驚くべきほどに有効である。アンチセンスオリゴヌクレオチド及びその誘導体は例えば腫瘍の退行を引き起こす、並びに転移の樹立を防ぐ及び微小転移の増大を防ぐことができる。
【００９３】
本発明の化合物のin vivo 抗腫瘍効能はとりわけ以下のタイプの実験により示されうる。Ｔ24ヒト膀胱癌細胞（Regenassら、Cancer Research 54, 3210-3217, (1994) 参照）を皮下移植した雌のBalb／ｃヌードマウス（Bomholtgaard, Copenhagen, Denmark)を１日１回 0.9％のNaCl水溶液に溶かした６，0.6 又は0.06mg／kgの本発明の化合物のｉ．ｖ．注射により処置する（５〜19日目）。全部で３回の投与で、腫瘍増殖の有意な抑制が見い出せうる。
【００９４】
例えば、実施例９の化合物（SEQ ID：９）は以下のＴ／Ｃ％の値（コントロールに対する処置されたパーセント腫瘍容積）を示した：
Ｔ／Ｃ（％）                  用量（mg／kg）
59％                            0.06
22％                            0.6
7％                            6
本発明のオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド誘導体は診断において、並びに研究試薬及びキットとしても使用できうる。本発明のオリゴヌクレオチド及びその誘導体はSAMDC 遺伝子及びそのmRNAにハイブリダイズするため、サンドイッチ及びその他のアッセイがこの事実を開拓するために容易に構築できる。更に、本発明のオリゴヌクレオチド及びその誘導体はSAMDC の特定のアイソザイムに関連するRNA 又はDNA 配列並びにSAMDC mRNAの対立形態変異体に対して特異的にハイブリダイズするため、かかるアッセイは別の動物種における特定のSAMDC アイソザイムについての細胞及び組織のスクリーニングのためにも設計されうる。かかるアッセイは様々なSAMDC 形態及び様々な種、好ましくはヒトに関連する病気の診断のために利用できうる。オリゴヌクレオチドとSAMDC 遺伝子とのハイブリダイゼーションを検定するための手段の提供は日常的に成し遂げられうる。かかる提供は酵素コンジュゲーション、放射性ラベリング又は任意のその他の適当な検出システムを含みうる。
【００９５】
以下の本発明のより好適な態様のうちで、より一般的な定義は上記した又は（特に薬理組成物及びその使用方法の定義に関する）下記に従ってより特異的な定義に置き換えられうる。
【００９６】
好ましいのは、SAMDC 、好適にはヒトSAMDC をコードする遺伝子に由来するDNA 又はRNA 、好ましくはmRNAに特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド誘導体であって、かかるハイブリダイゼーションを及ぼすのに足りる数及び種類のヌクレオチド単位の類似体を含んで成り、好ましくは５〜20ヌクレオチド単位、好ましくは10〜35ヌクレオチド単位、より好ましくは15〜22ヌクレオチド単位、そして最も好ましくは18〜20ヌクレオチド単位に対応する長さを有する誘導体、又は塩形成基が存在するそのオリゴヌクレオチド誘導体の塩である；
又は好ましくは、薬理組成物であって、増殖性、そして特に過剰増殖性障害、好ましくは腫瘍障害、特に白血病；前立腺の腫瘍、例えば前立腺癌；腸の腫瘍；脳腫瘍；増殖性皮膚又は上皮障害、例えば乾癬、上皮の腫瘍、例えば黒色腫；（好ましくは）肺癌、例えば肺小細胞癌腫；及び／又は（最も好ましくは）尿管の腫瘍；特に膀胱癌腫；並びにそれらに由来する任意の転移から選ばれるSAMDC 合成の調節に応答する病気に苦しむ温血動物、特にヒトへの投与に適し、SAMDC の合成の調節、好ましくは阻害、好ましくは上記の病気の処置又は予防に有効な量のオリゴマー誘導体又は塩形成基が存在するならその塩を、少なくとも一種の薬理学的に許容される担体と共に含んで成る薬理組成物；並びに／あるいは好ましくは薬理組成物の形態での上記のオリゴヌクレオチド誘導体の投与により上記の病理症状を処置する方法；並びに／あるいはin vivo でのSAMDC 合成の調節、好ましくは阻害のためのオリゴヌクレオチド誘導体の利用である。
【００９７】
より好ましいのは、前段落に規定するオリゴヌクレオチド誘導体、又はSAMDC(特にヒトSAMDC)をコードするmRNAの３’非翻訳領域に特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド、より好ましくはヒトSAMDC cDNA、好ましくは論文(Pajunenら、J. Biol. Chem. 263 (32), 17040-9 (1988))に記載のそれに対応する配列を有するオリゴヌクレオチド；並びに（より広い本発明の観点において）その対立形態変異体、好ましくは対応のSAMDC cDNAに対して所定のオリゴヌクレオチド誘導体又はオリゴヌクレオチドの配列において、より好ましくは保存突然変異の意味において３個までのヌクレオチド類似体で相違する対立形態変異体、又は塩形成基が存在するならその塩である。
【００９８】
上記の試験系におけるその驚くべきほどの高い効率性に基づきより好ましいのは、オリゴヌクレオチド誘導体又は（より広い本発明の観点において）その対立形態変異体であって、対応のSAMDC cDNAに対して所定のオリゴヌクレオチド誘導体の配列において３個までのヌクレオチド類似体で相違し、５〜50ヌクレオチド単位、好ましくは10〜35ヌクレオチド単位、より好ましくは15〜22ヌクレオチド単位、そして最も好ましくは18〜20ヌクレオチド単位の長さを有し、又は塩形成基があるならその塩であり、SAMDC cDNA（特にヒトSAMDC cDNA）の３’非翻訳領域、より好ましくはSAMDC についてのヒトcDNAの塩基位置1060（５’）から1557（３’）に至る配列の一部（好ましくは、Pajunen らに記載の配列；上記参照）にハイブリダイズできるものである。オリゴヌクレオチド誘導体又は（より広い意味において）その対立形態変異体であって対応のSAMDC cDNAに対して所定のオリゴヌクレオチド誘導体の配列において３個までヌクレオチド類似体で相違し、５〜50ヌクレオチド単位、好ましくは10〜35ヌクレオチド単位、より好ましくは15〜22ヌクレオチド単位、そして最も好ましくは18〜20ヌクレオチド単位の長さを有し、又は塩形成基があるならその塩であり、塩基位置1065から1105に至る配列の一部に対応するものが最も好適である。
【００９９】
これらの化合物のうち、SEQ ID NO : 10に示す、又は特にSEQ ID NO : ９に示す配列に対応するオリゴヌクレオチド誘導体が最も好ましい。
【０１００】
更に非常に好ましいのは、オリゴヌクレオチド誘導体であってSAMDC mRNAの５’非コード領域に特異的にハイブリダイズでき、５〜50ヌクレオチド単位、好ましくは10〜35ヌクレオチド単位、より好ましくは15〜22ヌクレオチド単位、そして最も好ましくは18〜20ヌクレオチド単位に対応する長さを有し、そして好ましくはヒトSAMDC cDNAの塩基位置−248(５’）から−20（３’）に至る配列の一部、より好ましくは塩基位置−85から−55に至る配列の一部に対応する配列を有するオリゴヌクレオチド誘導体、並びに（より広い本発明の観点において）その対立形態変異体であって、好ましくは対応のSAMDC cDNAに対して所定のオリゴヌクレオチド誘導体の配列において３個までヌクレオチド類似体で、より好ましくは（コード領域が保存される限り）保存性突然変異の意味において相違する変異体である。これらの化合物のうちで、SEQ ID NO : ２に示す配列のオリゴヌクレオチド誘導体又は塩形成基が存在するならその塩が最も好ましい。
【０１０１】
上記の好適なオリゴヌクレオチド誘導体又は塩形成基が存在するその塩の全てにおいて、少なくとも一の式Ｉ又はＩ* の構成単位（ここで、ＱはSH，SCH3，Ｆ，Ｎ3 ，CN，OCN ，Ｏ（CH2)z NH2 又はＯ（CH2)z CH3 〔ここでｚは１〜約10である〕又はＯ（CH2CH2O)v CH3 〔ここでｖは０〜12、好ましくはｖは０又は１である〕であるか、又はＱはより広い意味において類似の特性を有する別の置換基、例えばCl, Br, CF3, ONO2, NO2, NH2 及びＯ−，Ｓ−又はNH−低級アルキルより選ばれる置換基であり；そしてＢは以下に定義する塩基である）；式IIａ〜IIｆ，IIａ* 〜IIｆ* ，III ａ〜III ｈ，III ａ* 〜III ｈ* ，IVａ〜IVｄ，IVａ* 〜IVｄ* ，Ｖａ〜Ｖｃ，Ｖａ* 〜Ｖｃ* ，VIａ〜VIｂ，VIａ* 〜VIｂ* ，VII ，VII * ，VIII，VIII* ，IX，IX* ，Ｘの構成単位、又は上記の式Ｘ* の構成単位（ここでＢは以下に定義する塩基性基であり、ＱはＨ，OH, SH, SCH3, Ｆ，Ｎ3 ，CN，OCN ，Ｏ（CH2)z NH2 又はＯ（CH2)z CH3 〔ここでｚは１〜約10である〕、又はＯ（CH2CH2O)v CH3 〔ここでｖは０〜12であり、好ましくはｖは０又は１である〕であるか、又はＱは更にはより広い意味において類似の特性を有する別の置換基、例えばCl, Br, CF3, ONO2, NO2, NH2 及びＯ−，Ｓ−又はNH−低級アルキルから選ばれる置換基、最も特別にはヒドロキシ又は好ましくは水素であり、そしてその他の成分は関連の式の後に示す意味を有する）を含んで成る（好ましくは含む）ものが好ましい；そしてここでこのその他の構成単位は、上記したものに加え、式Ｉ又はＩ* の構成単位（ここでＱはＨ又はOHであり、そしてＢはアデニン、グアニン、チミン及びシトシンから選ばれる基である）；式Ｉ又はＩ* の構成単位（ここでＱはＨ又はOHであり、そしてＢはアデニン、グアニン、チミン及びシトシンから選ばれる基（又は塩形成基が存在するならその塩）である）のないヌクレオチド誘導体が非常に好ましい；そして改変糖成分及び／又は糖間連結との関係で全ての構成単位が同じタイプのヌクレオチド誘導体（又は塩形成基があるならその塩）が最も好ましい；塩基性の基Ｂは、上記で特定されていないなら、プリン基もしくはその類似体、又はピリミジン基もしくはその類似体、好ましくは式ＸＩ，ＸＩａ，ＸＩｂ，ＸＩｃ，ＸＩｄ，ＸＩｅもしくはＸＩｆのプリン基もしくはその類似体、又は式ＸII，ＸIIａ，ＸIIｂ，ＸIIｃに係るシトシン基もしくはその類似体であり、最も好ましいのはアデニン、グアニン、シトシン、５−メチルシトシン又はチミンの基である。
【０１０２】
上記の定義全てにおいて、式IIａ及び／又はIIａ* （式中、ＸはSHであり、そしてＹはＯである）（中心基〔Ｏ−（Ｐ−SH）（＝Ｏ）−Ｏ〕は、とりわけ溶媒及びイオン化状態に依存して、より安定な形態を有する〔Ｏ−（Ｐ＝Ｓ）（−OH）−Ｏ〕へと互変性である）であり、そしてＢ及びＱは所定の意味を有し、最も好ましくはＢはアデニン、グアニン、シトシン又はチミンであり、そしてＱはOHであるか、又は好ましくはＨである）のホスホロチオエート構成単位のみを含むヌクレオチド誘導体又はその塩が最も好ましい。
【０１０３】
最も好ましいのは、実施例において示すオリゴヌクレオチド誘導体、特にSEQ ID NO : 10、そしてより好ましくはSEQ ID NO : ９に対応するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド誘導体、又はその薬理学的に許容されるその塩、又はこれらの配列のいづれかの未修飾オリゴヌクレオチド、又はその塩である。
【０１０４】
上記の群のいづれかにおいて、このオリゴヌクレオチド誘導体は遊離であるか、又はミセル形成基、抗体、炭水化物、レセプター結合性基、ステロイド、例えばコレステロール、ポリペプチド、挿入剤、例えばアクリジン誘導体、長鎖アルコール、リン脂質及び／又はその他の親油性基、又は互いと独立して選択されうる複数のこれらの基にコンジュゲーションされていてよい。
【０１０５】
本発明に係るオリゴヌクレオチド及びその誘導体は当業界に公知の方法に類似して又は介して、公知の出発材料を利用して（とりわけ、Milliganら、J. Med. Chem. 36 (14), 1923-37 (1993) 及びUhlmann ら、Chemical Rev. 90 (4), 543-84 (1990) を参照のこと；更には1992年11月11日公開の国際出願WO92/20823も参照のこと）、例えば固相合成の公知の技術により簡便、且つ日常的に作られうる。かかる合成用の装置は複数の業者から市販されている（AppliedBiosystems Inc., Foster City, California, USA)。かかる合成のための任意のその他の手段も採用されうる。オリゴヌクレオチドの実際の合成法は当業者によく理解されている。その他のオリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエート及びヌクレオチド修飾誘導体を調製するために類似の技術もよく理解されている。
【０１０６】
最も好ましくは、本発明のホスホロチオエート類似体は当業界公知の方法により、好ましくは、
次式ＸIII の５’末端フラグメントを含む出発材料（又はその互変異性体）
【０１０７】
【化１３】
2006109846.tif 000014
【０１０８】
（式中、Ｄはヒドロキシ保護基である、又はＢ及びＢ’は独立して式Ｉ〜ＸのいづれかにおけるＢについて上記した塩基を表わし、Ｑ及びＱ’は独立してＨ，OH, SH, SCH3, Ｆ，Ｎ3 ，CN，OCN ，Ｏ（CH2)z NH2 又はＯ（CH2)z CH3 〔ここでｚは１〜約10である〕又はＯ（CH2CH2O)v CH3 〔ここでｖは０〜12であり、好ましくはｖは０又は１である〕であるか、又はＱはより広い意味において類似の特性を有する別の置換基、例えばCl, Br, CF3, ONO2, NO2, NH2 及びＯ−，Ｓ−又はNH−低級アルキルから選ばれる；Ｇは水素、低級アルコキシ又は２−シアノエトキシであり、そしてＥはヒドロキシ保護基、担体、又は３’遊離又は担体結合型モノ−又はオリゴヌクレオチド類似体であり、ここで任意のホスホジエステル基｛Ｏ−〔Ｐ（＝Ｏ）（−OH）〕−Ｏ｝の代わりに、ホスホロチオエート類似体｛Ｏ−〔Ｐ（＝Ｓ）（−OH）〕−Ｏ｝／｛Ｏ−〔Ｐ（−SH）（＝Ｏ）〕｝が存在している）を、スルフリル化剤と、任意の三価燐の同時酸化を伴いながら、適宜更なる官能基を保護形態にしておいて、且つ適宜任意の保護基及び／又は担体を除去しながら、そして所望により、
得られる任意の異性体混合物を個々の異性体に分離し、及び／又は得られる遊離のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを塩へと変換し、及び／又は得られる塩を遊離形態もしくは別の塩へと変換する、
ことにより作られうる。
【０１０９】
詳しくは、合成は好ましくは以下の通りに実施する：
存在している任意の官能基は未保護であるか又は保護形態であってよく、その保護基はOH又はアミノ／イミノ基について上記したものから選ばれる（SH保護基はヒドロキシ基について上記したものから選ばれうる）。これらの保護基の特徴は、それらが最終生成物の中に存在しないことにある。保護基は当業界公知の方法、例えば前述してある文献に記載の方法により除去できる。
【０１１０】
Ｄは好ましくはジメトキシトリチル基である。この基は好ましくは酸加水分解により、例えば温和な酸、例えばギ酸、酢酸、ジクロロ酢酸又は更にはトリフルオロ酢酸で、水又は有機溶媒、例えばハロゲン化溶媒、例えばジクロロメタン、環式エーテル、例えばテトラヒドロフラン、又は低級アルキルシアニド、例えばアセトニトリル、又はそれらの混合物の中で除去できる。
【０１１１】
得られるホスホロチオエートオリゴヌクレオチド中の末端ヒドロキシ保護基Ｄを、別の保護基、例えばアセチル、ベンゾイル、フェノキシアセチル、４−tert−ブチルフェノキシアセチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジニル、Ｎ−メチルピロリジン−２−イリデン、スクシニル、２−シアノエチル及び類似の保護基であって塩基性加水分解を介する、好ましくは窒素塩基、例えばエタノールアミンの存在下でのアルコール中での、例えばエタノール中での、又は好ましくは水酸化アンモニウムの存在下での水性溶媒、例えば水の中での、好ましくは約10〜約80℃に範囲する温度での第一脱保護工程において除去できる基の除去とは別の且つ後の工程において除去し、次いで得られるOH保護されたオリゴヌクレオチドを親油性吸着材、例えば逆相HPLC材料でのクロマトグラフィーにより精製し、そしてその精製オリゴヌクレオチド誘導体において、最後にOH保護基、好ましくはジメトキシトリチル基を、上記の酸加水分解により除去する。
【０１１２】
Ｂ及びＢ’は好ましくはそれぞれアデニン、グアニン、チミン、シトシン又は５−メチルシトシンの塩基のいづれかに由来する基を表わす。
【０１１３】
Ｇは好ましくは２−シアノエトキシであり、この場合その３’遊離又は担体結合型モノ−又はオリゴヌクレオチド類似体は、任意のホスホジエステル基｛Ｏ−〔Ｐ（＝Ｏ）（−OH）〕−Ｏ｝の代わりに、ホスホロチオエート類似体｛Ｏ−〔Ｐ（＝Ｓ）（−OH）〕−Ｏ｝／｛Ｏ−〔Ｐ（−SH）（＝Ｏ）〕｝が存在しているものである。
【０１１４】
もしＧがOHなら、３’遊離又は担体結合型モノ−又はオリゴヌクレオチド類似体は、任意のホスホジエステル基｛Ｏ−〔Ｐ（＝Ｏ）（−OH）〕−Ｏ｝の代わりに、ホスホロチオエート基｛Ｏ−〔Ｐ（＝Ｓ）（−OH）〕−Ｏ｝／｛Ｏ−〔Ｐ（−SH）（＝Ｏ）〕｝（２通りの互変異性体）が存在しているか、又は１もしくは複数の、最大全てのホスホロチオエート結合の代わりに１もしくは複数の｛Ｏ−〔（Ｐ＝Ｏ）−Ｈ〕−Ｏ｝／｛Ｏ−（Ｐ−OH）−Ｏ｝（２通りの互変異性体）が存在しているものでありうる。後者の場合、本発明に係る方法において、関連のオリゴヌクレオチド中の燐原子は全て同時にチオール化されうる。
【０１１５】
Ｅは好ましくは３’遊離又は担体結合型モノ−又はオリゴヌクレオチド類似体であり、それにおいて任意のホスホジエステル基｛Ｏ−〔Ｐ（＝Ｏ）（−OH）〕−Ｏ｝の代わりに、ホスホロチオエート類似体｛Ｏ−〔Ｐ（＝Ｓ）（−OH）〕−Ｏ｝／｛Ｏ−〔Ｐ（−SH）（＝Ｏ）〕｝又は式｛Ｏ−〔（Ｐ＝Ｏ）−Ｈ〕−Ｏ｝／｛Ｏ−（Ｐ−OH）−Ｏ｝（２通りの互変異性体）が存在する。
【０１１６】
可能なら、任意の出発材料が塩の形態で存在していることもある。
【０１１７】
存在している任意の三価燐の同時酸化を伴って反応できるスルフリル化剤は例えば窒素塩基の存在下での有機溶媒中のＳ8 を含んで成る群から選ばれ、例えばピリジン／トリエチルアミン中のＳ8 又は２，６−ルチジン中のＳ8 ；窒素塩基、例えばトリエチルアミン又はピリミジンの存在下でのCS2 中の硫黄；アセトニトリル中の3H−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド；そして最も好ましくは第三級窒素塩基、例えばピリジンの存在下での有機溶媒、例えばアセトニトリル中の式ＸIV
【０１１８】
【化１４】
2006109846.tif 000015
【０１１９】
のジイソプロポキシ−チオホスホリン酸ジスルフィドである。好適な温度は10〜80℃に範囲し、最も好ましくは室温前後である。
【０１２０】
式ＸIII に係るフラグメント（これは関連のオリゴヌクレオチドを、ヌクレオチド単位の数に関して完璧にする）は、当業界公知の方法に従って、好ましくは標準のシアノエチルホスホラミジット化学、同時スルフリル化、酸化、及び対応のトリエステル出発材料（式ＸIII におけるＧは低級アルキル又は２−シアノエチルとなっている）を作るための標準のシアノエチルアミジット化学に従う更なる工程、又は（特に、任意のホスホジエステル基の代わりに式｛Ｏ−〔（Ｐ＝Ｏ）−Ｈ〕−Ｏ｝／｛Ｏ−（Ｐ−OH）−Ｏ｝が存在しているオリゴヌクレオチド類似体に対応する適当なＥ基に基づき、複数のホスホジエステル基が式ＸIII の出発材料の中に存在しているときには）Ｈ−ホスホネート化学に従う更なる工程の組合せにより合成できる（参考及び更なる文献に関してはUhlmann ら、 Chemical Reviews 90 (4), 543-84 (1990) を参照のこと）。
【０１２１】
式Ｉ及びＩ* 〜Ｘ及びＸ* （式中、ＱはＯ（CH2CH2O)v CH3 であり、ここでｖは上記の意味を有し、そしてその他の成分は上記の通りである）の任意のいづれかの１又は複数の構成単位を有するオリゴヌクレオチド誘導体を合成するため、少なくとも１のＱがヒドロキシである関連の出発材料（構成単位、又は完全オリゴヌクレオチドもしくはその誘導体のいづれか）を例えば式ＸＶの化合物
Ｘ−（CH2 −CH2 −Ｏ）v −CH3           （ＸＶ）
（式中、Ｘは離核基であり、そしてｖは上記の通りである）と不活性溶媒の中で反応させてよく、ここで出発材料の中にある官能基は適当な段階において外すことのできる上記の保護基により保護されている。
【０１２２】
離核基Ｘは例えばハロゲン、例えばCl, Br又はＩ、アリールスルホニル、例えば４−トルオールスルホニル、又は低級アルカンスルホニル、例えばメシル−スルホニルであってよい。
【０１２３】
反応は強塩基、例えば水素化アルカリ金属、例えばNaH の存在下で、不活性溶媒、例えばエーテル、例えば環状エーテル、例えばテトラヒドロフランの中で、30℃から反応混合物の沸点に至る温度で、好ましくは還流条件下で実施するのが好ましい。
【０１２４】
個々の異性体への得られる異性体混合物の分離は当業界公知の方法、例えばジアステレオマーを分離するためのクロマトグラフィー手順の利用に行ってよい。出発材料又は小型の中間体の段階での分離が好ましく、その理由は大型オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオチド類似体の分離の可能性のある困難性にある。
【０１２５】
得られる遊離化合物のその塩への転換は標準の方法に従って成し遂げることができ、カチオン基の塩は例えば適当な酸又はアニオン交換体による処理によって得られ、そしてアニオン基の塩は適当な塩基もしくはカチオン交換体による処理により、又は好ましくは所望のカチオン溶液に対する関連化合物の透析により得られる。
【０１２６】
塩は標準の手順に従って遊離化合物へと転換でき、金属又はアンモニウム塩は例えば適当な酸又は酸性イオン交換体による処理により、そして酸付加塩は適当な塩基又は塩基性イオン交換体による処理により得られる。
【０１２７】
塩の別の塩に至る変換は上記の遊離化合物の塩に至る転換に類似して可能である。
【０１２８】
上記の反応は、それ自体既知の反応条件下で、溶媒又は希釈剤、好ましくは、使用された試薬に対して不活性でありそしてそれ故の溶媒である溶媒及び希釈剤の非存在中又は慣習的には存在中で、触媒、縮合剤又は中和剤の非存在又は存在中で、反応及び／又は反応基質の性質に依存して、減少された、正常の又は上昇された温度で、例えば、約−80℃から約 250℃までの、好ましくは約−20℃から約 150℃までの温度範囲内で、例えば、室温からその還流温度までで、融解する場合は、 220℃までで、大気圧下又は密閉容器内で、所望により圧力、例えば、密閉管内での反応条件下での反応混合物中で作られた圧力で、そして／又は、不活性雰囲気中で、例えば、アルゴン又は窒素雰囲気下で、行われることができる。それぞれの場合において特に記載された反応条件が、好ましい。
【０１２９】
溶媒及び希釈剤は、例えば、水、アルコール、例えば、低級アルキルヒドロキシド、例えば、メタノール、エタノール又はフェノール、ジオール、例えば、エチレングリコール、トリオール、例えば、グリセロール、又はアリールアルコール、例えば、フェノール、酸アミド、例えば、カルボン酸アミド、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド又は１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（1H）−ピリミジノン（DMPU）、又は無機酸のアミド、例えば、ヘキサメチルリン酸トリアミド、エーテル、例えば、環状エーテル、例えば、テトラヒドロフラン又はジオキサン、又は非環状エーテル、例えば、ジエチルエーテル又はエチレングリコールジメチルエーテル、ハロゲン化炭化水素、例えば、ハロ−低級アルカン、例えば、塩化メチレン又はクロロホルム、ケトン、例えば、アセトン、ニトリル、例えば、アセトニトリル、酸無水物、例えば、無水酢酸、エステル、例えば、酢酸エチル、ビスアルカンスルフィン、例えば、ジメチルスルホキシド、窒素の複素環、例えば、ピリジン、炭化水素、例えば、低級アルカン、例えば、ヘプタン、又は芳香族化合物、例えば、ベンゼン又はトルエン、又はこれらの混合溶媒であり、上記の反応のそれぞれに好適な特定の溶媒を選択できるようにしたものである。
【０１３０】
遊離形態と、塩及び／又は互変異性体の形態とにおける、本発明に係る特性を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体及びその前駆体の密接な関係の観点において、本明細書における遊離化合物及び出発材料又はそれらの塩及び／もしくは互変異性体についての言及は、適宜、且つ好適には、対応の塩又は遊離化合物及び／もしくは互変異性体のそれぞれを含むものと解すべきであり、ただしその化合物が１又は複数個の塩形成基、例えば塩基性基、例えばアミノ又はイミノ基、及び／又は酸性基、例えばカルボキシ、リン酸基又はスルホ（SO3H) 、及び／又は互変可能基を含むことを条件とする。出発材料、中間体又は最終生成物に関し、置換基、化合物、互変異性体もしくは塩、又は複数の置換基、化合物、互変異性体もしくは塩についての言及は、単数型又は複数型を使用していようとしていまいと関係なく、適宜且つ適切に、「１又は複数」をいうと解すべきである。出発材料は必要、適宜、及び好適なら保護形態で利用されることも可能であり、保護基は適時除去可能である。保護基、その導入及びその除去は特に上記に従う。
【０１３１】
その塩を含む当該化合物は水和物の形態で獲得し得、又はその結晶体は例えば結晶化に使用した溶媒を含みうる。
【０１３２】
本発明の方法において、使用する出発材料は好ましくは最初に好適と記述した化合物をもたらすものとする。
【０１３３】
本発明はまだ、本法の任意の段階において中間体として得られる化合物を出発材料として利用し、そして残りの段階を実施する工程の形態、又は出発材料を反応条件下で形成する、もしくは誘導体の形態、例えばその塩の形態で使用する工程の形態にも関連する。
【０１３４】
上記の反応の全ての順序及び反応条件は好ましくは当業者に適当且つ適切と考えられるものとして選ぶ。
薬理組成物及び方法：
本発明は活性成分として本発明に係る特性を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る薬理組成物にも関連する。特に好ましいのは結腸、特に経口又は非経口投与用組成物である。この組成物は活性成分を単独で、又は薬理学的に許容される担体と一緒に含んで成る。活性成分の用量は処置すべき障害、並びに種、年齢、体重及び個体の症状、更には投与方法に依存する。
【０１３５】
好適なのは、SAMDC 合成の調節に応答する障害、例えば増殖性、そして特に過剰増殖性障害、好ましくは腫瘍障害、特に白血病；前立腺の腫瘍、例えば前立腺癌腫；腸の腫瘍；脳腫瘍；過剰増殖性皮膚又は上皮病、例えば乾癬、上皮の腫瘍、例えば黒色腫；（好ましくは）肺癌、例えば肺小細胞癌腫；及び／又は（最も好ましくは）尿管の腫瘍、特に膀胱癌；並びにそれらに由来する任意の転移に苦しむ温血動物、特にヒトへの投与に適する、SAMDC の合成の調節において有効な量の、好ましくは上記の障害の処置又は予防において有効な量の活性成分、又は塩形成基が存在するならその塩を、少なくとも一種の薬理学的に許容される担体と一緒に含んで成る薬理組成物である。
【０１３６】
この薬理組成物は約0.0001％〜約95％の活性成分を含んで成り、一回投与形態は好ましくは約 0.001％〜約20％の活性成分を含んで成り、そして一回投与形態でない投与形態は好ましくは約 0.001％〜約10％の活性成分を含んで成る。単位投与形態、例えば糖依錠、錠剤、アンプル又はカプセルは約0.0005mg〜約 0.5ｇの活性成分、好ましくは 0.005mg〜約20mgの活性成分を含んで成る。
【０１３７】
本発明の薬理組成物は公知の態様で、例えば慣用の混合、顆粒化、糖依化、溶解又は凍結乾燥工程を介して調製される。例えば、経口投与用の薬理組成物は活性成分を１又は複数種の固形担体と混合し、必要なら得られる混合物を顆粒化し、そしてその混合物又は顆粒を所望するなら又は適当な更なる賦形剤の添加により加工し、錠剤又は糖依錠にすることにより得られうる。
【０１３８】
適当な担体は特に充填剤、例えば糖、例えばラクトース、サッカロース、マンニトール又はソルビトール、セルロース調製品及び／又はリン酸カルシウム、例えばリン酸三カルシウム又はリン酸水素カルシウム、及び結合剤、例えばデンプン、例えばコーン、コムギ、コメ又はポテトスターチ、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び／又はポリビニルピロリドン、及び／又は所望するならば崩壊剤、例えば上記のデンプン、更にはカルボキシメチルスターチ、架橋化ポリビニルピロリドン、又はアルギン酸又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウムである。追加の賦形剤は特に流動コンディショナー及び潤滑剤、例えば珪酸、タルク、ステアリン酸又はその塩、例えばステアリン酸マグネシウム又はカルシウム、及び／又はポリエチレングリコール、又はそれらの誘導体である。
【０１３９】
糖依錠のコアに適当な任意的な経腸用コーティングを施してよく、使用されるのはとりわけ、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタンを含んで成りうる濃縮糖溶液であり、又は適当な有機溶媒又は溶媒混合物中のコーティング溶液、又は経腸用コーティングの調製のためには、適当なセルロース調製品、例えばアセチルセルロースフタレート又はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートの溶液である。色素又は顔料を、例えば識別の目的のため、又は活性成分の種々の用量を表示するため、錠剤又は糖依錠コーティングに加えてよい。
【０１４０】
経口投与用薬理組成物は更にはゼラチンより成る乾燥充填カプセル、そして更にはゼラチン及び可塑剤、例えばグリセロール又はソルビトールより成る軟質封入カプセルでもある。乾燥充填カプセルは顆粒形態において活性成分を、例えば充填剤、例えばコーンスターチ、結合剤及び／又は潤滑剤、例えばタルカム又はステアリン酸マグネシウム、そして適宜安定剤と一緒に含みうる。軟質カプセルにおいては、活性成分は好ましくは適当な液状賦形剤、例えば脂肪油、Lauroglycol（登録商標）（Gattefosse' S. A., Saint Priest, France), Gelucire（登録商標）（Gattefosse' S. A., Saint Priest, France)又はセサミ油、パラフィン油又は液状ポリエチレングリコール、例えばPEG300又は400 (Fluka, Switzerland)、又はポリプロピレングリコールの中に溶解又は懸濁されており、それぞれには安定剤又は界面活性剤も添加されていてよい。
【０１４１】
その他の経口投与形態は、例えば慣用の方法で調製され、例えば懸濁形態で、約 0.001％〜20％、好ましくは約 0.001％〜約２％の濃度において、又は投与したとき例えば５又は10mlの量で適当には一回の用量を供する似たような濃度で活性成分を含んで成るシロップである。また、例えばミルク中のシェークを調製するために粉末又は液体濃縮物であることも適当である。かかる濃縮物は一回用量で包装されていてもよい。
【０１４２】
特に本発明に係る中性活性成分を有する経皮導入製剤が可能である。適当な製剤は、例えば約0.0001〜約２重量％の活性成分を含んで成る。好適な観点において、約２％〜99.9999 ％（又は全体を 100％にする量）の短鎖の脂肪アルコールを含んで成る製剤が供される。適当なアルコールにはエタノール、イソプロパノール、プロピレングリコール及びグリセロールが含まれる。より好適な観点において、これらの製剤は流動増強剤を更に含んで成りうる。適当な流動増強剤には、例えばデシルメチルスルホキシド、ジメチルスルホキシド及び環状ケトン、ラクトン、無水物及びエステルである。これらの流動増強剤の一部は活性成分の保持力をも高め、それ故皮膚自体におけるその濃度を高める。直接（局所）処置は、例えば皮膚への局所塗布用の製剤に関し、経皮流動を最大にするのみならず、皮膚中の活性成分の保持力をも高める流動増強剤の使用が好ましい。所定の環状ケトン及びラクトン増強剤は局所保持力を高めると報告され、それ故活性成分の局所投与のための好適な増強剤のクラスを含んで成る。全身処置のための製剤において、活性成分の最低限の局所保持力を有する流動性を最大にする流動増強剤を使用することが好ましい。
【０１４３】
適当な直腸投与用薬理組成物は例えば活性成分と座薬ベースとの組合せより成る座薬である。適当な座薬ベースは例えば天然又は合成トリグリセリド、パラフィン炭化水素、ポリエチレングリコール又は高級アルカノールである。
【０１４４】
非経口投与にとって（これが好適である）、粘度増強物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び／又はデキストランを含んで成り、そして適宜安定剤を含んで成る水溶性形態の、例えば水溶性塩形態の、活性成分の水性溶液又は水性注射懸濁液が特に好適である。この活性成分は、適宜賦形剤と共に凍結乾燥品の形態であってもよく、そして適当な溶媒の添加により非経口投与の前に溶液にすることができうる。
【０１４５】
例えば非経口投与のために使用する溶液は点滴溶液としても使用されうる。
【０１４６】
本発明は上記の病理症状を処置するための方法にも関する。この目的のため、本発明の活性成分又はその薬理学的に許容される塩は、予防用に、又は治療用に、好ましくは上記の障害に対して有効な量で、かかる処置を必要とする温血動物、例えばヒトに、好ましくは薬理組成物の形態で投与してよい。活性成分の用量は処置すべき温血動物の種、体重、年齢及び個々の状態、個体の薬動力学的状況、処置すべき障害及び適用ルートに依存する。好ましくは、約70kgの体重当り、 0.001mg〜1000mgの日常用量、例えば約0.01mg〜約 100mg、好ましくは約0.05mg〜約50mgの活性成分を投与する。
発明の更なる態様
本発明は更には、SAMDC の発現を調節するための方法にも関連し、この方法は遺伝子含有組織又は細胞を、SAMDC 遺伝子、最も好ましくは対応のDNA 又はmRNAに由来する選定のDNA 又はRNA に特異的にハイブリダイズ可能な５〜50ヌクレオチド単位、好ましくは10〜35、最も好ましくは18〜20ヌクレオチド単位を含んで成るオリゴヌクレオチド誘導体と接触させることを含んで成る。
【０１４７】
本発明は更に細胞中のSAMDC をコードするDNA 又はRNA の存在を検出する方法にも関連し、これは細胞又は組織を、前記DNA 又はRNA に特異的にハイブリダイズ可能な例えば５〜50ヌクレオチド単位を含んで成る上記のオリゴヌクレオチド誘導体と接触させ、次いでハイブリダイゼーションが起きたかを検出することを含んで成る。
【０１４８】
本発明は更にSAMDC(過剰）発現に関連する症状を診断する方法にも関連し、この方法はSAMDC(過剰）発現に関連する症状を有すると推定される動物に由来する細胞又は組織又は体液、あるいはかかるサンプルの抽出物を、SAMDC をコードする遺伝子、最も好ましくはそのDNA 又はmRNAに由来する選定のDNA 又はRNA に特異的にハイブリダイズ可能な（好ましくは）８〜50ヌクレオチド単位、より好ましくは10〜35、そして最も好ましくは18〜20ヌクレオチド単位を含んで成る上記のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体と接触させることを含んで成る。
【０１４９】
SAMDC(過剰）発現に関連する症状は、例えばSAMDC 発現の調節に応答する上記の障害の任意のいづれかである。
【０１５０】
本発明の更なる態様の全てにおいて、好適であるとして上記したオリゴヌクレオチド又はその誘導体がより好ましく、SEQ ID NO :10、そして特にSEQ ID NO : ９に従うオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体が最も好ましい。
【０１５１】
細胞又は組織を本発明に係るオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体とin vitroで接触させるとき、取込増強剤が存在している条件が好適、又は必須でさえもある。取込増強剤は例えばLipofectin（登録商標）（脱濾過水中の、カチオン性脂質Ｎ−〔１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドとジオレイルホスファチジルエタノールアミン（１mg／mlにまで添加）の１：１（ｗ／ｗ）のリポソーム製剤；GIBCO BRL Life Technology Inc., Gaithersburg, USA) ; Lipofectamine （登録商標）（脱濾過水中のポリカチオン性脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−〔２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル〕−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA)及び中性ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）の３：１（ｗ／ｗ）のリポソーム製剤；GIBCO BRL, USA) ; Ｎ−〔１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムスルフェート（Boehringer Mannheim GmbH, FRG)であり、
これは関連のin vitro実験において、約 0.2〜約20μｇ／ml、例えば約５μｇ／mlに範囲する濃度で好適に存在する。
実施例
以下の実施例は本発明の例示であり、限定を意図するものではない。
【０１５２】
略語 MALDI−TOF MSはマトリックス結合化レーザー脱着飛行時間質量スペクトル（Matrix Associated Laser Desorption Time-of-Flight Mass Spectrum)を意味する。
【０１５３】
下記のオリゴヌクレオチドは下記の手順に従って得られる：
実施例１〜15及び参照例16のオリゴヌクレオチド誘導はAppliedBiosystems 392 DNA−RNA シンセサイザー（Applied Biosystems Inc., Foster City, California, USA)で、標準のシアノエチルホスホラミジット化学を利用し、末端ジメトキシトリチル基を除去することなく合成する。コントロール孔質ガラスを担体材料として用いる（Applied Biosystems Inc., Foster City, USA)。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに関しては、ホスフィット結合の段階式チア化（thiation) のために、標準酸化ボトルを周囲温度の 0.1Ｍのジイソプロポキシ−チオリン酸ジスルフィドのピリジン／アセトニトリル（１：３；ｖ／ｖ）溶液に置き換える。チア化工程の後にキャッピング工程が続く（無水酢酸／２，６−ルチジン／Ｎ−メチルイミダゾール（12％／12％／14％（ｖ／ｖ／ｖ））のテトラヒドロフラン溶液）。得られる粗オリゴヌクレオチドを33％の水性水酸化アンモニウムを用い、55℃で一夜脱保護する。その後の精製はNucleosil（登録商標）Ｃ18カラム（10μｍの平均ビーズ直径のオクタデシルシラン誘導化シリカゲル；Macherey & Nagel, Duren, FRG由来）を利用するWaters HPLC システムでの逆相HPLCを含む（溶出剤：0.05Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート、pH7.0 ；10容量％のアセトニトリルを含み、50分以内で45容量％にまで高める；カラムの長さ： 250mm；直径20mm；流速15ml／min ；検出： 254nmでのUV吸収）。次いで５’末端ジメトキシトリチル基を80％の酢酸での処理により外し、次いでジエチルエーテルによる抽出にかける）。得られるオリゴヌクレオチドを分子量カットオフ値 1,000の再生セルロース透析膜（Spetra／Por Multiple Dialyzer（登録商標）；Spectrum Medical Industries, Inc., Los Angeles, USA)を用い、 100mMのNaCl（１回）及び水（２回）に対して透析する。正確な分子量を MALDI−TOF 質量スペクトルにより確認する。
【０１５４】
以下の実施例が得られる（配列の下の数字は開始コドンの第１ヌクレオチドに対するPajunen ら、J. Biol. Chem. 263 (32), 17040-9 (1988) に記載の対応のヒトSAMDC cDNA上の関連の末端ヌクレオチド類似体の位置を示す（そのcDNAは位置−248 から位置1557に至る全長を有し、SAMDC のコード領域の開始コドンの第１ヌクレオチドとして１位を、そして停止コドンの最後の位置として1005位を有する）：
【０１５５】
【表１】
2006109846.tif 000016
【０１５６】
実施例（１〜15及び参照例）は全て対応の天然オリゴ−２’−デオキシリボヌクレオチドのホスホロチオエート類似体である。
実施例17：ｉ．ｖ．投与用溶液
実施例９の活性成分を 0.9％の塩化ナトリウム水溶液と無菌条件で混合し、以下の濃度にする：
ａ）0.6mg／ml
ｂ）0.06mg／ml
ｃ）0.006mg／ml
【配列表フリーテキスト】
【０１５７】
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：CIBA−GEIGY AG
（Ｂ）通り：Klybeckstr. 141
（Ｃ）市：Basel
（Ｅ）国：Switzerland
（Ｆ）郵便番号：4002
（Ｇ）電話番号：＋41 61 69 11 11
（Ｈ）ファックス番号：＋41 61 696 79 76
（Ｉ）テレックス番号：962 991
（ii）発明の名称：抗腫瘍性アンチセンスオリゴヌクレオチド
（iii ）配列の数：16
（iv）コンピューター読取フォーム：
（Ａ）媒体タイプ：フロッピー（登録商標）ディスク
（Ｂ）コンピューター：IBM PC コンパチブル
（Ｃ）作動システム：PC−DOS／MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース #1.0 ，
バージョン #1.25（EPO)
（２）SEQ ID NO : １についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（iii ）アンチセンス：YES
（viii）ゲノムでの位置
（Ｂ）地図位置：−192
（Ｃ）単位：bp
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：misc 特徴
（Ｂ）位置：１..20
（Ｄ）その他の情報：／備考＝「ヌクレオチドは全てホスホロ
チオエート型である」
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO : １：
AATTTTCCCG GCTTTGTGTG                                   20
（２）SEQ ID NO : ２についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（iii ）アンチセンス：YES
（viii）ゲノムでの位置
（Ｂ）地図位置：−80
（Ｃ）単位：bp
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：misc 特徴
（Ｂ）位置：１..20
（Ｄ）その他の情報：／備考＝「ヌクレオチドは全てホスホロ
チオエート型である」
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO : ２：
CCCGCCGCTG CCGCCGCCGC                                   20
（２）SEQ ID NO : ３についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（iii ）アンチセンス：YES
（viii）ゲノムでの位置
（Ｂ）地図位置：−16
（Ｃ）単位：bp
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：misc 特徴
（Ｂ）位置：１..20
（Ｄ）その他の情報：／備考＝「ヌクレオチドは全てホスホロ
チオエート型である」
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO : ３：
CCATCACCGT GAGACTAGCG                                   20
（２）SEQ ID NO : ４についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（iii ）アンチセンス：YES
（viii）ゲノムでの位置
（Ｂ）地図位置：１
（Ｃ）単位：bp
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：misc 特徴
（Ｂ）位置：１..20
（Ｄ）その他の情報：／備考＝「ヌクレオチドは全てホスホロ
チオエート型である」
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO : ４：
AAAAAATGTG CAGCTTCCAT                                   20
（２）SEQ ID NO : ５についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（iii ）アンチセンス：YES
（viii）ゲノムでの位置
（Ｂ）地図位置：60
（Ｃ）単位：bp
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：misc 特徴
（Ｂ）位置：１..20
（Ｄ）その他の情報：／備考＝「ヌクレオチドは全てホスホロ
チオエート型である」
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO : ５：
GGTTTGCGTC GGGCTGCTGC                                   20
（２）SEQ ID NO : ６についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（iii ）アンチセンス：YES
（viii）ゲノムでの位置
（Ｂ）地図位置：979
（Ｃ）単位：bp
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：misc 特徴
（Ｂ）位置：１..20
（Ｄ）その他の情報：／備考＝「ヌクレオチドは全てホスホロ
チオエート型である」
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO : ６：
TGCTGTTGTT GCTGCTTCTT                                   20
（２）SEQ ID NO : ７についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（iii ）アンチセンス：YES
（viii）ゲノムでの位置
（Ｂ）地図位置：993
（Ｃ）単位：bp
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：misc 特徴
（Ｂ）位置：１..20
（Ｄ）その他の情報：／備考＝「ヌクレオチドは全てホスホロ
チオエート型である」
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO : ７：
TTCTTAATCA ACTCTGCTGT                                   20
（２）SEQ ID NO : ８についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（iii ）アンチセンス：YES
（viii）ゲノムでの位置
（Ｂ）地図位置：1046
（Ｃ）単位：bp
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：misc 特徴
（Ｂ）位置：１..20
（Ｄ）その他の情報：／備考＝「ヌクレオチドは全てホスホロ
チオエート型である」
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO : ８：
AAAGCATCCA CCACCTTCTA                                   20
（２）SEQ ID NO : ９についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（iii ）アンチセンス：YES
（viii）ゲノムでの位置
（Ｂ）地図位置：1067
（Ｃ）単位：bp
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：misc 特徴
（Ｂ）位置：１..20
（Ｄ）その他の情報：／備考＝「ヌクレオチドは全てホスホロ
チオエート型である」
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO : ９：
GCCCCCAGCA TCGACATCTA                                   20
（２）SEQ ID NO : 10についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（iii ）アンチセンス：YES
（viii）ゲノムでの位置
（Ｂ）地図位置：1081
（Ｃ）単位：bp
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：misc 特徴
（Ｂ）位置：１..20
（Ｄ）その他の情報：／備考＝「ヌクレオチドは全てホスホロ
チオエート型である」
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO : 10：
TTATGGAAAG CACTGCCCCC                                   20
（２）SEQ ID NO : 11についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（iii ）アンチセンス：YES
（viii）ゲノムでの位置
（Ｂ）地図位置：1108
（Ｃ）単位：bp
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：misc 特徴
（Ｂ）位置：１..20
（Ｄ）その他の情報：／備考＝「ヌクレオチドは全てホスホロ
チオエート型である」
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO : 11：
GGGCTTTCTG CAACTACACA                                   20
（２）SEQ ID NO : 12についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（iii ）アンチセンス：YES
（viii）ゲノムでの位置
（Ｂ）地図位置：1223
（Ｃ）単位：bp
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：misc 特徴
（Ｂ）位置：１..20
（Ｄ）その他の情報：／備考＝「ヌクレオチドは全てホスホロ
チオエート型である」
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO : 12：
ACAGCAAGAG TGGCAGAGAA                                   20
（２）SEQ ID NO : 13についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（iii ）アンチセンス：YES
（viii）ゲノムでの位置
（Ｂ）地図位置：1361
（Ｃ）単位：bp
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：misc 特徴
（Ｂ）位置：１..20
（Ｄ）その他の情報：／備考＝「ヌクレオチドは全てホスホロ
チオエート型である」
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO : 13：
AGAAAAGCCT TGTCTGTGGG                                   20
（２）SEQ ID NO : 14についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（iii ）アンチセンス：YES
（viii）ゲノムでの位置
（Ｂ）地図位置：1394
（Ｃ）単位：bp
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：misc 特徴
（Ｂ）位置：１..20
（Ｄ）その他の情報：／備考＝「ヌクレオチドは全てホスホロ
チオエート型である」
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO : 14：
AGAGGGTTAG GCTGAGGCCA                                   20
（２）SEQ ID NO : 15についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：20塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（iii ）アンチセンス：YES
（viii）ゲノムでの位置
（Ｂ）地図位置：1483
（Ｃ）単位：bp
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：misc 特徴
（Ｂ）位置：１..20
（Ｄ）その他の情報：／備考＝「ヌクレオチドは全てホスホロ
チオエート型である」
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO : 15：
GGATGTAAAA TTCTGGCAGC                                   20
（２）SEQ ID NO : 16についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：21塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）
（iii ）アンチセンス：YES
（vi）起源：
（Ａ）生物：単純ヘルペスウィルス
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：misc 特徴
（Ｂ）位置：１..21
（Ｄ）その他の情報：／備考＝「ヌクレオチドは全てホスホロ
チオエート型である」
（xi）配列の詳細：SEQ ID NO : 16：
GCCGAGGTCC ATGTCGTACG C                                 21