(57)【要約】      （修正有）【課題】被子植物の四季咲き性に関与する遺伝子の提供。【解決手段】次の（ａ）または（ｂ）に示されるタンパク質をコードする遺伝子：（ａ）植物由来の特定なアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、（ｂ）植物由来の特定なアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたアミノ酸配列を含んでなり、被子植物の茎頂での花芽形成を抑制しうるタンパク質。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）に示されるタンパク質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたアミノ酸配列を含んでなり、被子植物の茎頂での花芽形成を抑制しうるタンパク質。
【請求項２】
前記被子植物がバラ科に属するものである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項３に記載の遺伝子。
【請求項５】
請求項３または４に記載の遺伝子のセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部または一部を含んでなる、一本鎖核酸分子。
【請求項６】
請求項３または４に記載の遺伝子のアンチセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部または一部を含んでなる、一本鎖核酸分子。
【請求項７】
請求項３または４に記載の遺伝子と同一のヌクレオチド配列の全部または一部を含んでなる、二本鎖核酸分子。
【請求項８】
請求項５もしくは６に記載の一本鎖核酸分子または請求項７に記載の二本鎖核酸分子を用いて、請求項３または４に記載の遺伝子の発現を抑制することを含んでなる、被子植物に四季咲き性を付与する方法。
【請求項９】
前記被子植物がバラ科に属するものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
以下の（ａ）または（ｂ）に示されるＤＮＡ：
（ａ）配列番号３で表されるヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３で表されるヌクレオチド配列において、１以上のヌクレオチドが欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列を含んでなり、被子植物におけるトランスポゾンとして機能しうるＤＮＡ。
【請求項１１】
前記被子植物がバラ科に属するものである、請求項１０に記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のＤＮＡを含んでなるトランスポゾン。
【請求項１３】
請求項１０もしくは１１に記載のＤＮＡまたは請求項１２に記載のトランスポゾンを用いて、請求項３または４に記載の遺伝子の発現を抑制することを含んでなる、被子植物に四季咲き性を付与する方法。
【請求項１４】
前記被子植物がバラ科に属するものである、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、被子植物の四季咲き性に関与する遺伝子およびＤＮＡ断片に関する。
【０００２】
背景技術
現代の花卉産業において、売上高の上位三種は、四季を通じて開花させることのできる品種である。すなわち、周年出荷できることが花卉生産にとって最も重要な因子の一つである。キクは、栽培法を工夫することによって周年生産されている。バラとカーネーションに関しては、遺伝的に四季を通じて開花する性質（四季咲き性）を有する品種が生産されている。家庭その他の庭園においても、一度植えれば四季を通じて花を楽しめることは重要な利点であるため、四季咲き性を有する品種は種苗産業においても有用である。
【０００３】
バラの栽培品種の多くは四季咲き性を有し、これらは全て交雑育種によって得られたものである。ハイブリッドティー（HT）やフロリバンダ（F）等の現代の四季咲き性バラは、18世紀に始まった、中国のいくつかの四季咲き性のバラとそれまであったヨーロッパのバラとの一連の交雑によって、１００年以上かけて完成したものである。
【０００４】
交雑育種により作出された四季咲き性品種は、偶然の産物である。特に、バラの栽培品種の多くは４倍体以上の高次倍数体であるため、交雑による遺伝形質の伝わり方は特に複雑である。従って、特定の品種を四季咲き化することも、また四季咲き性の品種に特定の形質を導入することも、確実に行なうことは困難である。そのため、鑑賞的に価値のある品種であっても、それが四季咲き性を有さないために、実際上商品化できないものがある。また、他の多くの花卉では、適当な育種素材が無いために、四季咲き性の品種はほとんど存在しない。
【０００５】
キンギョソウ（Antirrhinum）のｃｅｎ（centroradialis）遺伝子及びアラビドプシス（Arabidopsis）のｔｆｌ１（terminal flower 1）遺伝子と開花との関連性について検討がなされている（特許文献１：特表平１１−５１２２８９号公報）。例えば、アラビドプシスのｔｆｌ１遺伝子またはそのオルソログの作用は茎頂での花芽形成を抑制することであることが知られている。野生型の茎頂では、花芽形成が起こらず、温度、水、肥料などの栽培条件が整えば伸びつづける。一方で、人工的に誘導した、ｔｆｌ１遺伝子またはそのオルソログが発現しない突然変異型では、早期に花芽形成が起こり、茎の伸長が止まり、草丈は小さくなる。
【０００６】
しかし、被子植物、特にバラの四季咲き性に関しては検討されていない。
【０００７】
【特許文献１】
特表平１１−５１２２８９号公報
【０００８】
【発明の概要】
本発明者は、被子植物の四季咲き性に関与するタンパク質およびその遺伝子、ならびに該遺伝子の発現を抑制するＤＮＡを特定することに成功し、この遺伝子の発現が抑制されると、被子植物の茎頂での花芽形成が促進されて該植物が四季咲き性となるとの知見を得た。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００９】
従って、本発明は、四季咲き性に関与するタンパク質およびその遺伝子、ならびに該遺伝子の発現を抑制しうるＤＮＡを提供することを目的とする。
【００１０】
そして、本発明によるタンパク質は、以下の（ａ）または（ｂ）に示されるものである：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたアミノ酸配列を含んでなり、被子植物の茎頂での花芽形成を抑制しうるタンパク質。
【００１１】
さらに、本発明による遺伝子は、本発明によるタンパク質をコードするものである。
【００１２】
さらに、本発明によるＤＮＡは、以下の（ａ）または（ｂ）に示されるＤＮＡである：
（ａ）配列番号３で表されるヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３で表されるヌクレオチド配列において、１以上のヌクレオチドが欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列を含んでなり、被子植物におけるトランスポゾンとして機能しうるＤＮＡ。
【００１３】
本発明によれば、被子植物に四季咲き性を付与することが可能となり、さらには、四季咲き性の被子植物を開発する上で有用な標的タンパク質、標的遺伝子、核酸分子および前記遺伝子の発現を抑制するＤＮＡが提供される。
【００１４】
【発明の具体的説明】
本明細書において「四季咲き性」とは、全ての季節において継続的に花を咲かせる植物の性質をいう。
【００１５】
本明細書において「被子植物」とは、胚珠が子房の中に入っている植物をいい、花を観賞するための植物の殆どは、被子植物に含まれる。被子植物としては多種多様なものが挙げられ、本発明において特に限定されるものではないが、好ましくはバラ目（Rosales）に属する植物、より好ましくはバラ科（Rosaceae）に属する植物、さらに好ましくはバラ（Rosa）とされる。
【００１６】
本明細書において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。
【００１７】
本明細書において、核酸分子について用いられる「特異的」とは、その核酸分子のヌクレオチド配列が対象となる遺伝子中にのみ存在し、被子植物中の他の遺伝子中には存在しないことを意味する。
【００１８】
本明細書に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくはＢＬＡＳＴ〔J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)〕においてデフォルト（初期設定）のパラメータ（例えば、Protein-Based BLAST Search (FiHer:ON, Scoring Matrix:BLOSUM62, Word Size:3, E value:10, Gap costs:II, I, Aliguments:50)）を用いて算出される数値とされる。
【００１９】
本発明によるタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含んでなるものであり、該タンパク質は被子植物の茎頂での花芽の形成を抑制しうるものである。また、本発明によるタンパク質は上記のものに限定されるものではなく、被子植物の茎頂での花芽の形成を抑制しうる限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたアミノ酸配列を含んでなる変異体であってもよい。前記変異体において、置換、欠失、付加または挿入されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１〜９個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個とされる。また、上記変異体のアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するものとされる。
【００２０】
本発明による遺伝子は、本発明によるタンパク質をコードするものである。そのヌクレオチド配列は特に限定されないが、好ましくは配列番号１で表されるヌクレオチド配列とされる。配列番号１で表されるヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡにおける翻訳開始コドンから翻訳終止コドンまでの配列であり、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードしている。また、本発明による遺伝子は、ｃＤＮＡの配列を含んでなるものだけでなく、ゲノムＤＮＡの配列を含んでなるものであってもよい。このようなゲノムＤＮＡの配列を含んでなる遺伝子は、本発明のタンパク質をコードするエクソンの配列の他にイントロンの配列を含んでなるものであり、好ましくは配列番号１で表されるヌクレオチド配列中にイントロンに相当する配列が挿入されたもの、例えば、図４に示されるヌクレオチド配列（配列番号１９）を含んでなるものである。さらに、本発明による遺伝子は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、１以上のヌクレオチドが置換、欠失、付加または挿入されたヌクレオチド配列を含んでなるものとすることができる。ここで、置換、欠失、付加または挿入されるヌクレオチドの数は特に限定されないが、好ましくは１〜９個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個とされる。また、このようなヌクレオチド配列は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するものとされる。
【００２１】
本発明による遺伝子およびタンパク質は、当業者に公知の方法に従って得ることができる。本発明による遺伝子を得る方法としては、例えば、ホスホアミダイド法等により化学的に合成する方法、ロサ・キネンシス・スポンタネア（Rosa chinensis spontanea）等の被子植物からの核酸試料を鋳型とし、目的とする遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いる核酸増幅法などが挙げられる。本発明によるタンパク質を得る方法としては、例えば、被子植物の茎頂部から天然物として精製する方法、本発明による遺伝子を大腸菌や酵母などを宿主とした発現システムに組み込んでタンパク質を生産させる方法などが挙げられる。
【００２２】
本発明によるタンパク質は被子植物の茎頂での花芽の形成を抑制するものであり、本発明による遺伝子は該タンパク質をコードするものである。よって、被子植物において本発明によるタンパク質または遺伝子の機能が阻害されれば、茎頂での花芽の形成抑制が解除されるため、花芽の形成が促進され、その被子植物は四季咲き性となる。従って、本発明によれば、本発明によるタンパク質または遺伝子の機能を阻害することを含んでなる、被子植物に四季咲き性を付与する方法が提供される。該方法は、当業者に公知の方法に従って行なうことができるが、好ましくは本発明による遺伝子の発現を抑制することを含んでなる。このような方法としては、例えば、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術［バイオサイエンスとインダストリー, 50, 322 (1992)、化学, 46, 681 (1991)、Biotechnology,9, 358 (1992)、Trends in Biotechnology,10, 87 (1992) 、Trends in Biotechnology,10, 152 (1992)、細胞工学, 16, 1463 (1997)］、トリプル・ヘリックス技術［Trends in Biotechnology,10, 132 (1992)］等が挙げられる。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による遺伝子の発現の抑制は、本発明による遺伝子のアンチセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部または一部を含んでなる一本鎖核酸分子を用いて行なわれる。このような方法はアンチセンス法として知られている。アンチセンス法では、発現を抑制したい遺伝子に相補的な配列をもつＲＮＡを高レベルで発現させることにより、標的遺伝子の発現が抑制される。この方法では、本発明による遺伝子のアンチセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることができる。また、上記の方法では、本発明による遺伝子のアンチセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の一部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることもできる。このような部分的な一本鎖ＲＮＡは本発明による遺伝子の発現を抑制しうるものであればよく、当業者であれば適宜設計することができるが、好ましくは本発明による遺伝子に特異的なものとされ、その鎖長は、好ましくは５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１０〜２０ヌクレオチドとされる。
【００２４】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による遺伝子の発現の抑制は、本発明による遺伝子のセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部または一部を含んでなる一本鎖核酸分子を用いて行なわれる。すなわち、このセンス一本鎖核酸は、上記のアンチセンス一本鎖核酸と同様に、本発明による遺伝子の発現の抑制に用いることが可能である。この方法では、本発明による遺伝子のセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることができる。また、上記の方法では、本発明による遺伝子のセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の一部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることもできる。このような部分的な一本鎖ＲＮＡは本発明による遺伝子の発現を抑制しうるものであればよく、当業者であれば適宜設計することができるが、好ましくは本発明による遺伝子に特異的なものとされ、その鎖長は、好ましくは５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１０〜２０ヌクレオチドとされる。
【００２５】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による遺伝子の発現の抑制は、本発明による遺伝子と同一のヌクレオチド配列の全部または一部を含んでなる二本鎖核酸分子を用いて行なわれる。例えば、この二本鎖核酸分子を用いることにより、被子植物において本発明による遺伝子のアンチセンスまたはセンス一本鎖核酸を発現させることができる。本発明による二本鎖核酸分子は、好ましくはＤＮＡとされ、その鎖長および具体的なヌクレオチド配列は、目的とする一本鎖核酸分子の鎖長およびヌクレオチド配列に対応するものとされる。例えば、上記アンチセンス一本鎖核酸を発現させる場合には、本発明による二本鎖核酸分子は、本発明による遺伝子のアンチセンス鎖をコード鎖として含むものとされる。また、上記センス一本鎖核酸を発現させる場合には、本発明による二本鎖核酸分子は、本発明による遺伝子のセンス鎖をコード鎖として含むものとされる。
【００２６】
本発明による二本鎖核酸分子は、当業者に公知の方法を用いて被子植物中で発現させることができる。例えば、プロモーター、本発明による二本鎖核酸分子、および転写ターミネーター等を含む発現用構築物を、目的とする被子植物中に導入し、得られた植物体を栽培することにより、本発明による二本鎖核酸分子を発現させることができる。植物への発現用構築物の導入は、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。特に、遺伝子導入のためのバラの形質転換は、米国特許第５４８０７８９号明細書等に記載の方法によって行うことができる。
【００２７】
本発明による核酸分子を用いた遺伝子発現の抑制法としては、例えば、アンチセンス鎖による形質転換法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6160-6164, 1993）が挙げられる。この方法では、本発明による遺伝子の全ヌクレオチド配列を有するアンチセンス二本鎖ＤＮＡが目的の植物中に導入される。これにより、本発明による遺伝子のｍＲＮＡに相補的なＲＮＡとして、本発明によるアンチセンス一本鎖ＲＮＡが発現され、この相補的ＲＮＡにより該遺伝子の発現が極端に抑制される。
【００２８】
本発明による核酸分子を用いた遺伝子発現の抑制法の他の例としては、コサプレッション法が挙げられる。この方法では、本発明による遺伝子の全ヌクレオチド配列を有するセンス二本鎖ＤＮＡが目的の植物中に導入される。これにより、本発明によるセンス一本鎖ＲＮＡが発現され、このＲＮＡにより該遺伝子の発現が極端に抑制される（Plant Cell 9: 1357-1368, 1997）。
【００２９】
本発明によるＤＮＡは、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を含んでなるものであり、該ＤＮＡは被子植物におけるトランスポゾンとして機能しうるものである。なお、配列番号３で表されるヌクレオチド配列において、第１〜８５６残基はＬＴＲであり、第８５７〜６１０５残基はＯＲＦであり、第８０６９〜８９２５残基はＬＴＲである。また、本発明によるＤＮＡは上記のものに限定されるものではなく、被子植物におけるトランスポゾンとして機能しうる限り、配列番号３で表されるヌクレオチド配列において、１以上のヌクレオチドが欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列を含んでなるものであってもよい。ここで、置換、欠失、付加または挿入されるヌクレオチドの数は特に限定されないが、好ましくは１〜９個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個とされる。また、このようなヌクレオチド配列は、配列番号３で表されるヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するものとされる。
【００３０】
本発明によるＤＮＡは、当業者に公知の方法、例えば、ホスホアミダイド法等により化学的に合成する方法、オールド・ブラッシュ（Old blush）等の四季咲き性バラからの核酸試料を鋳型とし、目的とする遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いる核酸増幅法などによって得ることができる。
【００３１】
本発明によるＤＮＡは、被子植物においてトランスポゾンとして機能し、本発明による遺伝子中に挿入されることにより該遺伝子の発現を抑制するものである。これにより、茎頂での花芽の形成抑制が解除されるため、花芽の形成が促進され、その被子植物は四季咲き性となる。従って、本発明によれば、本発明によるＤＮＡを含んでなるトランスポゾンが提供され、さらには、本発明によるＤＮＡまたはこれを含んでなるトランスポゾンを用いて本発明による遺伝子の発現を抑制することを含んでなる、被子植物に四季咲き性を付与する方法が提供される。
【００３２】
この方法では、本発明によるＤＮＡまたはトランスポゾンが被子植物に導入される。これは、本発明による遺伝子の発現が抑制されるように、当業者によって適宜行なわれるが、本発明によるＤＮＡまたはトランスポゾンは、本発明による遺伝子中またはその近傍に導入されることが好ましく、より好ましくは本発明による遺伝子の第２イントロン中、さらに好ましくは四季咲き性バラと同じ場所に導入される。
【００３３】
植物へのＤＮＡの導入は、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。特に、遺伝子導入のためのバラの形質転換は、米国特許第５４８０７８９号明細書等に記載の方法によって行うことができる。
【００３４】
【実施例】
例１：四季咲き性に関与する因子の特定
現代の四季咲き性バラ品種では、シュートや腋芽は４〜７枚程度の葉を伸ばすと茎頂に花芽を形成する。花が咲き終わるとすぐに下の腋芽が伸び、同様にして花芽を形成する。こうして、温度、水、肥料などの栽培条件が整えば、次々にシュートを伸ばし、その先に花芽を形成し、四季を通じて開花する。これに対し、つる性のバラでは、シュートが３０枚または４０枚以上の葉を伸ばしても、茎頂に花芽を形成することなく伸びつづけ、一季咲きとなる。
【００３５】
本発明者は、アラビドプシス（Arabidopsis）の野生型（無限花序）と突然変異型（有限花序）に関する知見、ならびに現代四季咲き性バラにおいて一季咲き性バラへの突然変異が多く見られることに基づき、以下の仮説を立て、これを証明した。
【００３６】
（仮説１）一季咲き性のつる型バラではｔｆｌ１遺伝子のオルソロガス遺伝子が活性を持っているため、茎頂における花芽形成が抑制されるが、四季咲き型バラでは突然変異によって前記遺伝子の活性が低下しているため、茎頂における花芽形成が抑制されない。
【００３７】
（仮説２）四季咲き性バラは、ｔｆｌ１遺伝子のオルソロガス遺伝子へのトランスポゾンの挿入という突然変異によって生じ、一季咲き性のつる型バラは、該トランスポゾンの欠失という復帰突然変異によって生じる。
【００３８】
（１）ｔｆｌ１遺伝子のバラオルソロガス遺伝子の配列決定および該遺伝子中のトランスポゾンの存否
以下のようにして、ｔｆｌ１遺伝子のバラオルソログのヌクレオチド配列を明らかにし、四季咲き型ではその遺伝子全てにトランスポゾンが挿入されており、一季咲き型では、トランスポゾンが挿入されていない遺伝子が少なくとも一つ存在することを証明した。
【００３９】
ｔｆｌ１遺伝子は、ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質（ＰＥＢＰ）と称する遺伝子ファミリーに属する。アラビドプシスでは６種のＰＥＢＰ遺伝子が知られている。アラビドプシス、イネ、キンギョソウ、ペチュニア、トマトなどの公知のＰＥＢＰ遺伝子のヌクレオチド配列に基づき、特に保存性の高い部分を選んで以下のプライマーを設計した：
フォワードプライマー（UtflF1）：GATAGACCCAGATGTTCCAGGTCC（配列番号４）；
リバースプライマー（UtflR1）：CCTGGAATATCTGTCACCATCCT（配列番号５）。
【００４０】
これらのプライマーを用いて、ロサ・キネンシス・スポンタネア（Rosa chinensis spontanea）（Ｒｃｓ）のＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、複数の増幅産物を得た。これらの増幅産物のヌクレオチド配列を決定し、そのヌクレオチド配列からＰＥＢＰファミリー遺伝子と考えれるもの４種を選び、これらをＲＰＥＢＰ１、ＲＰＥＢＰ２、ＲＰＥＢＰ３、およびＫＳＮと名付けた。これらの増幅産物のうち、ＫＳＮの４００ｂｐ余りの産物のヌクレオチド配列は図１に示すとおりであった。このヌクレオチド配列は、アラビドプシスｔｆｌ１遺伝子のエクソン２から３にかけてのヌクレオチド配列と高い相同性を有していた。
【００４１】
上記のように決定されたＫＳＮの部分的なヌクレオチド配列に基づき、ＫＳＮ遺伝子全体のヌクレオチド配列決定を以下のようにして行なった。すなわち、ＲｃｓのＤＮＡを鋳型として、ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲ法により決定した。
【００４２】
まず、ＲｃｓのＤＮＡ数μgをNEB社の制限酵素Cac 8Iで消化し（ＤＮＡ１７μl、酵素１μl、１０倍バッファー２μlを３７℃で４時間反応）、加熱によって酵素を不活化してから（６５℃で２０分間）、NEB社のT4-DNA-Ligaseを用いて環状化した（酵素消化ＤＮＡ２０μl、リガーゼ１μl、１０倍バッファー１２．５μl、および精製水９１．５μlを８℃で一昼夜反応）。この環状ＤＮＡを鋳型とし、下記の二つのプライマーを用いるＰＣＲを行なった：
KSN-IR1：CTGTAAGTTATACCAGTGCAGGTGC（配列番号６）；
KSN-IF2：GGAAGTACATATTATGGCATAATC（配列番号７）。
得られた増幅産物のヌクレオチド配列を図２に示す。図２から明らかなように、Utfl-FIの上流４１６ｂｐのヌクレオチド配列が決定された。
【００４３】
さらに、ＲｃｓのＤＮＡ数μgをNEB社の制限酵素Sau96Iで消化し（ＤＮＡ１７μl、酵素１μl、１０倍バッファー２μlを３７℃で４時間反応）、加熱によって酵素を不活化してから（８０℃で２０分間）、NEB社のT4-DNA-Ligaseを用いて環状化した（酵素消化ＤＮＡ２０μl、リガーゼ１μl、１０倍バッファー１２．５μl、および精製水９１．５μlを８℃で一昼夜反応）。この環状ＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマーKSN-IR1および以下のプライマーKSN-IF1を用いるＰＣＲを行なった：
KSN-IF1：AGGAGCTAACATTTTTGCCTTG（配列番号８）。
得られた増幅産物のヌクレオチド配列を図３に示す。図３から明らかなように、UtflR1の下流４０１ｂｐのヌクレオチド配列が決定された。
【００４４】
以上のように決定された配列をまとめたＫＳＮのヌクレオチド配列を図４に示す。図４において、アラビドプシスｔｆｌ１遺伝子のヌクレオチド配列と比較してエクソンと思われる部分に囲み線を付した。さらに、ＫＳＮのコード領域のヌクレオチド配列を配列番号１に示し、これによりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示した。
【００４５】
同様にして、ＲＰＥＢＰ１、ＲＰＥＢＰ２、およびＲＰＥＢＰ３のヌクレオチド配列も明らかにした（配列は示さない）。
【００４６】
上述のように決定されたＲＰＥＢＰ１、ＲＰＥＢＰ２、ＲＰＥＢＰ３、およびＫＳＮのヌクレオチド配列に基づき、これらの遺伝子のコーディング領域のほぼ全域を特異的に増幅するプライマーを設計した。例えば、ＫＳＮ増幅用のプライマーは以下の配列とした：
KSNF1：ATTAGGAGTACAATCCTTCCTTCC（配列番号９）；
KSNR2：ACCTGCCTCCTGCTAGCTGC（配列番号１０）。
【００４７】
四季咲き性のオールド・ブラッシュ（ＯＢＢ）およびその突然変異体とされる一季咲き性のオールド・ブラッシュ・クライミング（ＯＢＣｌ）のＤＮＡを鋳型とし、上記のコーディング領域増幅用プライマーを用いて、１Ｋｂｐ程度の増幅物を得る条件（Promega社製のPCR Master Mixを添付プロトコルに従って使用）でのＰＣＲを行なった。その結果、ＲＰＥＢＰ１、ＲＰＥＢＰ２、およびＲＰＥＢＰ３の増幅産物は、ＯＢＢとＯＢＣｌとの間で違いが認められなかった。ＫＳＮでは予想された大きさの増幅産物が認められなかったため、ＰＣＲの条件を１０Ｋｂｐ程度の増幅産物が得られる条件（タカラ社製のOne Shot LAPCR Mixを添付プロトコルに従って使用）に変更して再度ＰＣＲを行った。その結果、ＯＢＢでは約１０Ｋｂｐの増幅産物が、ＯＢＣｌでは約２Ｋｂｐの増幅産物が得られた。
【００４８】
ＯＢＢおよびＯＢＣｌのＤＮＡを鋳型として得られた増幅産物は、ＫＳＮに何らかのＤＮＡが挿入されているものと推定された。そこで、以下のようにしてその挿入物のヌクレオチド配列を明らかにした。
【００４９】
まず、挿入地点と推定される前後にいくつかのプライマーを設計してＰＣＲを行ない、増幅産物を得た。その結果、下記のプライマーが最も挿入ＤＮＡに近接したプライマーであることが明らかとなった：
KSNIF3：CATATTATGGCATAGGGTGTGGC（配列番号１１）；
KSNR5：CAAATGTAACATCTGTGGTGCCTG（配列番号１２）。
【００５０】
９００ｂｐ前後と推定された短い挿入物（Ｓｉ）は、上記二つのプライマーを用いてヌクレオチド配列を明らかにした。
【００５１】
さらに、９Ｋｂｐ前後と推定された長い挿入物（Ｌｉ）のヌクレオチド配列は以下のようにして決定した。まず、ＰＣＲ増幅産物を、添付のプロトコールに従って、pT7BlueT-Vector（Novagen社製）にDNA Ligation Kit Ver.2（タカラ社製）を用いて連結し、環状化した。このプラスミドを用いて、コンピテント細胞ＪＭ１０９株（タカラ社製）を添付プロトコールに従って形質転換した。形質転換したこの大腸菌を、添付プロトコールに従って、あらかじめ２％５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘｇａｌ）５０μｌと０．１Ｍイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）１０μｌとを塗布しておいたＬ−ａｇａｒ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む）に塗布し、生じたコロニーの中から白色のコロニーを増殖させた。
【００５２】
生じたクローンのうち、クローン６が完全長のＰＣＲ増幅産物を含んでいると推定されたので、以下のようにしてそのヌクレオチド配列を明らかにした。まず、このベクターのクローニングサイトに断点を持つ制限酵素HindIIIまたはEcoRIで切断し、DNA Ligation Kit Ver.2（タカラ社製）を用いて再度連結し、環状化した。このプラスミドを用いて、コンピテント細胞ＪＭ１０９株（タカラ社製）を添付プロトコールに従って形質転換し、そのコロニーを得た（それぞれクローン６−１２およびクローン６−１６）。EcoRIを用いた大きなＤＮＡ断片を持つクローン６−１６は、さらに、SpeI、Nole1、Xba1、およびPstIを用いてそれぞれに対応する箇所を切断し、同様にしてクローンを得た。得られたクローンのうち、クローン６−１６−２７、クローン６−１６−３２、クローン６−１６−３４、クローン６−１６−４０、およびクローン６−１６−４３の５種は互いに異なるＤＮＡ断片を含んでいると推定された。
【００５３】
上記の８種のクローンのプラスミドに挿入されたＤＮＡのヌクレオチド配列を、以下のプライマーを用いて前後から決定し、つなぎ合わせた：
M13R18：CAGGAAACAGCTATGACC（配列番号１３）；
MR13F18：TGTAAAACGACGGCCAGT（配列番号１４）。
【００５４】
その結果、このＤＮＡ断片（Ｌｉ）は約９Ｋｂｐの大きさで、ｂｌａｓｔホモロジー検索の結果、コピアタイプのレトロトランスポゾンと相同性が高かった。このトランスポゾン（配列番号３）は、ＯＢＢのＫＳＮ遺伝子のイントロン２に挿入されていた。また、ＯＢＣｌの約９００ｂｐの挿入物は、このレトロトランスポゾンが消失する際にその場に残した約９００ｂｐのＬＴＲ（長い末端反復配列）であることが判明した。
【００５５】
以上のように、Ｒｃｓ、ＯＢＢ、およびＯＢＣｌのＫＳＮとしては、挿入のない野生型（ｗ型、約１Ｋｂｐ）、レトロトランスポゾンの入った型（Ｌｉ型、約１０Ｋｂｐ）、レトロトランスポゾンがＬＴＲを残して出ていった型（Ｓｉ型、約２Ｋｂｐ）の三種が認められた。
【００５６】
上記の結果から、Ｌｉ型では、約９０００ｂｐのＤＮＡの挿入によってｍＲＮＡの転写が大きく阻害されるためにＫＳＮの発現がほとんど阻害され、Ｓｉ型では、９００ｂｐという短いＤＮＡの挿入であるためＫＳＮ発現の阻害が軽微であると考えられる。これは、ＯＢＢが四季咲きとなり、他方でＯＢＣｌはつるバラのように良く伸びるが、夏から秋にかけてもぽつぽつと咲くことと一致する。
【００５７】
次いで、いくつかの園芸品種を、ＫＳＮ遺伝子の構造について調べた。先に設計したレトロトランスポゾンの挿入位置の前（KSNIF3）と後（KSNR5）のプライマーを用いると、ｗ型とＳｉ型はそれぞれ２５０ｂｐと１１５０ｂｐの異なる大きさの増幅産物を与える。また、KSNIF3と共に用いてレトロトランスポゾンの一部を増幅するようなプライマーKSNInsR3を、ＬＴＲよりも内側に設計した（KSNInsR3：TGTAATCTGTAGGAGATCCCATGC, 配列番号１５）。KSNIF3、KSNR5およびKSNInsR3を用いて、つる性の突然変異の園芸品種が作られている６園芸品種（「フレーミング・ピース」、「ピース」、「ウエンディ・クッソンズ」、「ゴールド・バニー」、「アイス・バーグ」、および「ピンク・シホン」）のＫＳＮを調べた。これら全ての品種において、四季咲き性の品種ではKSNIF3およびKSNR5のプライマーペアでは増幅産物がなく、KSNIF3およびKSNInsR3のプライマーペアで増幅産物が得られた。これは、四季咲き性品種ではすべてのＫＳＮにレトロトランスポゾンが挿入されていたことを示す。一方で、つる性の突然変異品種では、KSNIF3およびKSNInsR3のプライマーペアによる増幅産物以外にKSNIF3およびKSNR5のプライマーペアによる１１５０ｂｐのＳｉ型の増幅産物が見られ、レトロトランスポゾンを含んだＫＳＮ以外に、ＬＴＲのみが残ったＫＳＮが存在していることが明らかとなった。この様に、これら６種の園芸品種においても、四季咲き性品種ではトランスポゾンが挿入されており、つる性（一季咲き性）品種では少なくとも一つはＬＴＲを残してトランスポゾンが転移したと思われるＫＳＮが存在することが明らかとなった。
【００５８】
（２）四季咲き性バラと一季咲き性バラとの、ｔｆｌ１遺伝子バラオルソログｍＲＮＡ発現レベルの比較
上記（１）で明らかとなったトランスポゾンの挿入により、四季咲き型バラのＫＳＮのｍＲＮＡ発現レベルが、一季咲き型のそれよりも著しく低いことを、以下のようにして証明した。
【００５９】
まず、野生型ＫＳＮを有するＲｃｓの腋芽から、ＲＮＡを抽出した。Ｒｃｓの腋芽としては、１５ｃｍのもの、１０ｃｍのもの、および５ｃｍ以下のものの３種類を用い、それぞれ図５に示す位置からサンプルを採取した。同様に、ＯＢＢの腋芽の茎頂およびＯＢＣｌの蕾を含む腋芽からもＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出は、Rneasy Plant Mini Kit（Qiagen社製）を用いて行なった。
次いで、ＫＳＮのｍＲＮＡ量を、Quanti Tect SYBR Green RT-PCR Kit（Qiagen社製）およびLight Cycler System（Roche Molecular Biochemicals社製）を用いて比較した。また、本実験では、バラのアクチンのｍＲＮＡをコントロールとして用いた。ＫＳＮのｍＲＮＡは量が少なく、QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kitでは測定できないことがあったので、限界希釈法によってさらに測定した。限界希釈法とは、ＲＮＡ抽出液の３倍希釈系列を作り、OneStep RT-PCR Kit（Qiagen社製）を用いてＫＳＮのｍＲＮＡが検出できなくなる希釈倍率を求め、ｍＲＮＡ量を推定する方法である。Ｒｃｓについての結果を下記の表１に示す。表１において、各数値は、Rcs3pについての測定値を１とした場合の相対量で示した。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
表１から、茎頂でのＫＳＮのｍＲＮＡ発現量は、腋芽の成長に従って増加し、茎頂から離れるにしたがって減少することが明らかとなった。さらに、ＯＢＣｌ茎頂におけるＫＳＮのｍＲＮＡ発現量はRcs3pの１／１００００程度であり、ＯＢＢ茎頂においては検出できなかった。
【００６２】
（３）考察
以上の結果から、四季咲き性のバラでは、ＫＳＮ遺伝子中にトランスポゾンが挿入されており、これにより該遺伝子の発現が阻害され、茎頂における花芽の形成が促進されることが明らかとなった。従って、ＫＳＮ遺伝子を阻害することにより、バラに四季咲き性を付与することが可能となる。
【００６３】
アラビドプシスのＴＦＬ１およびＡＴＣ、キンギョソウのＣＥＮ、ならびにライ・グラス（単子葉類の牧草）のＬｐＴＦＬ１をアラビドプシスで発現させたときの表現形に差異は認められないため、これらの機能の違いは、タンパク質の構造の違いではなく、主に遺伝子発現の違いによると報告されている（Shepard,K.A.and Purugganon M.D., The genetics of plant morphological evolution., Current Opinion in Plant Biology 5:49-55, 2002）。さらに、ＫＳＮ遺伝子の構造が真核生物全体で良く保存されていること、および単子葉植物の遺伝子が双子葉植物においても本来の機能を発揮することをも考慮すると、バラ属で発見された四季咲きのメカニズムは他の被子植物でも働くものと考えられる。
【００６４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、部分的に決定されたＫＳＮ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す図である。
【図２】図２は、部分的に決定されたＫＳＮ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１７）を示す図である。
【図３】図３は、部分的に決定されたＫＳＮ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す図である。
【図４】図４は、ＫＳＮ遺伝子のコーディング領域のヌクレオチド配列（配列番号１９）を示す図である。
【図５】図５は、バラ（Ｒｃｓ）腋芽の様々な部位におけるＫＳＮのｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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