(57)【要約】  【課題】  数日から数ヶ月間にも及ぶ培養時にコンタミネーションのリスクを極力排除してｐＨの測定を行うことができるようにする。  【解決手段】  保温箱手段に配置された培養器手段を保温箱から取り出すことなく、薬品供給手段を用いて新たな薬品を培養器手段に供給したり、廃液排出手段を用いて不要な廃液を培養器手段から排出しているので、廃液排出手段によって排出される廃液に基づいて培地成分（ｐＨ）を測定することによって、培養中に培養器手段内の培地成分を精度よく測定することができ、また、培養器手段に直接外気が混入することがなくなり、コンタミネーションのリスクは皆無となくなり、培養操作を長期間に渡って自動で行なうことが可能となる。【選択図】  図２１
2006141324.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部で培養を行う培養器手段と、
前記培養器手段に未使用の薬品を供給する薬品供給手段と、
前記培養器手段から不要な廃液などを前記保温箱手段の外側に排出する廃液排出手段と、
前記培養器手段から排出される前記不要な廃液に基づいて前記培養器手段内のｐＨを測定する培地成分測定手段と
を備えたことを特徴とする培養装置。
【請求項２】
上記培地成分測定手段は、上記培養器手段の排出口から廃液を貯留する廃液タンクまでの配管中に配置されることを特徴とする請求項１の培養装置。
【請求項３】
前記配管は光学的に透明であり、
前記配管内に挿入され、ｐＨの変化に応じて物理的変化を示すｐＨセンサーと、
前記配管の外部の前記ｐＨセンサー対応位置に配置され、
前記ｐＨセンサーの物理的変化を検知してｐＨの変化として認識する検知手段をさらに備えたことを特徴とする請求項２の培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養する培養装置に係り、特に、数日から数ヶ月間にも及ぶ培養に伴う操作を自動的に行うことのできる培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養は、培養器内の培地の交換や、細胞密度を適正にするための再播種などといった煩雑な継代プロセスが手作業により行われている。通常、これらの作業は、コンタミネーションなどの発生を回避するため、半導体製造分野で培われたクリーン環境生成技術により大気中の浮遊微粒子濃度を抑制した比較的清浄な雰囲気で注意深く行われる。しかし、この清浄な雰囲気でもコンタミネーションを回避するには十分ではなく、培養器として通常用いられる円形シャーレで細胞を培養する場合、培地交換の際にはシャーレの蓋を持ち上げるように上方にかざして菌が混入しないよう注意を払いながら、ピペッタをシャーレとその蓋のすきまに、かつピペッタがシャーレの縁など周囲のものに触れないようすばやく挿入するといったように煩雑で難しい作業を必要としていた。このような作業は、頻繁かつ日常的に行われ、通常非常に熟練した作業者が行う。
【特許文献１】ＵＳＰ５，９８５，６５３
【特許文献２】特開昭６２−１１５２９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
通常、ペーハー（ｐＨ）計測は、ｐＨ指示薬（フェノールレッド）を含む培養液の色の変化を目視にて判断したり、目視判断を自動で行なう裝置（特許文献２に記載されたもの）などが存在しているが、培養に関係の無いｐＨ指示薬を培養液中に入れることは、培養に影響を与えるため好ましくなく、また精度の点でも劣っていた。また、ｐＨ電極を培養液中に浸漬させてその電位差計測を行なう方法もあるが、ｐＨ電極が十分に滅菌されていないと、雑菌等のコンタミネーションを起こす可能性があり、好ましくなかった。また、培養液を培養皿から取り出すと、温度変化により細胞増殖に悪影響を与え、二酸化炭素濃度が変化するので精度が悪化するといいう問題があった。
【０００４】
この発明の目的は、数日から数ヶ月間にも及ぶ培養時にコンタミネーションのリスクを極力排除してｐＨの測定を行うことのできる培養装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の培養装置の第１の特徴は、内部で培養を行う培養器手段と、前記培養器手段に未使用の薬品を供給する薬品供給手段と、前記培養器手段から不要な廃液などを前記保温箱手段の外側に排出する廃液排出手段と、前記培養器手段から排出される前記不要な廃液に基づいて前記培養器手段内のｐＨを測定する培地成分測定手段とを備えたことにある。
本発明の培養装置の第２の特徴は、上記培地成分測定手段は、上記培養器手段の排出口から廃液を貯留する廃液タンクまでの配管中に配置されることにある。
本発明の培養装置の第３の特徴は、前記配管は光学的に透明であり、前記配管内に挿入され、ｐＨの変化に応じて物理的変化を示すｐＨセンサーと、前記配管の外部の前記ｐＨセンサー対応位置に配置され、前記ｐＨセンサーの物理的変化を検知してｐＨの変化として認識する検知手段をさらに備えたことにある。
この培養装置では、廃液排出手段を用いて不要な廃液を培養器手段から排出しているので、廃液排出手段によって排出される廃液に基づいてｐＨを測定することによって、培養中に培養器手段内のｐＨを精度よく測定することができ、また、培養器手段に直接外気が混入することがなくなり、コンタミネーションのリスクは皆無となくなり、培養操作を長期間に渡って自動で行なうことが可能となる。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、数日から数ヶ月間にも及ぶ培養時にコンタミネーションのリスクを極力排除してｐＨのの測定を行うことができるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を適用してなる培養装置の実施の形態について図面を参照して説明する。図１は、本発明を適用してなる培養装置の基本構成を示すブロック図である。
【０００８】
培養器１は、細胞を培養する容器であり、ポンプ３及び可撓性管部材２を介して未使用の薬品が注入されたリザーブタンク４に接続されている。廃液タンク７は、使用済みの薬品を貯めるものであり、ポンプ６及び可撓性管部材５を介して培養器１に接続されている。駆動手段８は、培養器１を回動させるものである。カメラ９は、培養器１を透過した光源１０から発した光により中の培養細胞を観察する。システムコントローラ１１は、ポンプ３、ポンプ６、駆動手段８、カメラ９、光源１０に接続され、これらポンプ３、ポンプ６、駆動手段８、カメラ９、光源１０を制御する。
【０００９】
図２は、本発明を適用してなる培養装置の機構部の詳細図であり、図１におけるシステムコントローラ１１を省いた実際の構成を示している。培養器３８は、透明な非毒性の材質、好ましくはポリスチレン、またはポリエチレンテレフタレートで形成されていることが望ましい。培養器３８の本体１５の表面にはガス透過膜１６が貼ってある。培養器３８の表面は、細胞が付着しやすいように親水性を持つように改質されていると良い。培養器３８の略中央には薬品注入のためのチューブ接続部材１９を設けられ、培地１７などの薬品を培養器３８内部に流し込む働きをする。この時、傾斜部３８１が各種液体の落下の衝撃を和らげて培養細胞へのダメージを防いでいる。
【００１０】
培養器３８の底面には細胞が接着してそこで培養が行なわれる。チューブ接続部材１８は細胞の老廃物が溶出し、培地中の栄養素が少なくなった古い培地を排出する排出口である。培養器３８は、ロータ２２上に固定され、このロータ２２は下方にてカムフォロア２７にて矢印Ｅ方向に回転できるよう、例えば、円周方向３箇所で自在に支持される。さらに、ロータ２２の下方にはインターナルギア（図示せず）を形成し、このギアは、保温箱（フレーム）３０に固定した培養器駆動モータ２９の出力軸に勘合したピニオン２８と噛みあう。ケーブルドラム２５は、ロータ２２に設けられたピンチ弁２４の配線を巻く。巻き取りドラム２６は、ロータ２２が回転してもピンチ弁２４の配線を巻き取り、配線が緩むことにより、他の突起物に絡まないように自動的に配線を巻き取るようになっている。例えば、ばねを利用し定常的にケーブルに張力を与えることで実現できる。
【００１１】
供給チューブ２１は、培養器３８の略中央に設けられたチューブ接続部材１９に接続されている。ガイド部材３５は、供給チューブ２１をガイドするものである。この供給チューブ２１は、ガイド部材３５の上方に設けられたチューブ固定部材３６にてフレーム３０に固定され、このチューブ固定部材３６からチューブ接続部材１９までの間のチューブは、ガイド部材３５の内部を自由に動くようになっている。
【００１２】
培地タンク６７は未使用の培地を貯留し、緩衝液タンク６８は緩衝液を貯留し、細胞剥離剤タンク６９，７０，７１は細胞剥離剤を貯留している。各タンク６７，６８，６９，７０，７１は、断熱箱８０内に設けられている。ピンチ弁７２，１０５，７３，７４，７５は、各タンク６７，６８，６９，７０，７１からの送液を制御するものである。また、ピンチ弁６６は、後述する培養前細胞の注入を制御するものである。空気流入口７８，７９は、チューブ内の液溜まりを防止するために大気中の空気を導入するものであり、大気中の不純物を取り除くためのフィルタ（目の大きさが０．２μｍ以下が望ましい）を備えている。各タンク６７，６８，６９，７０，７１から取り出されるチューブは、前述した供給チューブ２１に接続され、しごきポンプ３７で送液できるようになっている。しごきポンプ３７は、ローラでチューブを挟み込み、そのローラを回転することによりチューブ内の液を送り出すポンプである。
【００１３】
廃液チューブ２３は、培養器３８の底面に設けられたチューブ接続部材１８に接続され、ガイド部材９９によりフレーム３０外にガイドされる。このガイド部材９９の下部には、チューブ固定部材１００が設けれており、このチューブ固定部材１００によって廃液チューブ２３は固定され、かつこのチューブ固定部材１００とチューブ接続部材１８との間では廃液チューブ２３は、自由に動くようになっている。細胞の老廃物が溶出し、培地中の栄養素が少なくなることによって生成される古い培地は、しごきポンプ１０１により廃液チューブ２３を通って、廃液回収箱９８内の廃液タンク１０２に貯留される。ピンチ弁１０３は、廃液タンク１０２への送液を制御し、ピンチ弁１０４は、廃液をしごきポンプ１０１で廃液タンク１０２へ送液する際の送液状態を制御するものである。
【００１４】
シャッターモータ５０は、フレーム３０の右側面に設けられた開口部をシャッター５１で開閉するものであり、その回転軸にシャッター５１に接続されたワイヤが巻回されている。シャッターモータ５０の回転を制御することによりシャッター５１を矢印Ａ方向（図面上の上下方向）に移動できるようになっている。培養前細胞を貯留する容器５２は、ホルダー部６２に支持される。ホルダー６２は、送りねじを有したモータ６３によって矢印Ｂ方向（図面上の左右方向）に移動できるようになっている。容器５２の上面にはゴム材が設けられ、外気からカバーされている（図示略）。針５３は、細胞注入チューブ５６に接続され、ピペッターアーム５５に固定されている。ピペッタアーム５５は、軸５４に支持され、ピペッタ回転動モータ５７により矢印Ｄ１方向に回転できるようになっている。回転部材５８は、軸５４と共に回転する部材であり、ピペッタ上下動モータ５９とプーリ６０を備えている。ピペッタ上下動モータ５９の出力軸に固定されたプーリとプーリ６０はベルト６１により連結され、そのベルト６１の一部は軸５４と固定されている。
【００１５】
ピペッタ上下動モータ５９の駆動により、軸５４は上下動作するようになっている。ピンチ弁６６は、培養前細胞をしごきポンプ３７で送液する際、送液状態を制御するものである。なお、ピペッタアーム５５には針３９が固定されており、その一端にはエアーフィルター４０が設けられている。この針３９の機能は、容器５２が硬質のプラスチック材料で形成された場合において、内部が印圧になって細胞が吸引しにくくなるのを防止するものである。なお、培養前細胞は、しごきポンプ３７により吸引されると説明したが、針３９から容器５２に空気を圧送することによって送液するようにしてもよい。
【００１６】
シャッターモータ８１は、フレーム３０の左側面に設けられた開口部をシャッター８２で開閉するものであり、その回転軸にシャッター８２に接続されたワイヤが巻回されている。シャッターモータ８１の回転を制御することによりシャッター８２を矢印Ｆ方向（図面上の上下方向）に移動できるようになっている。培養後細胞を貯留する容器８４は、ホルダー部９３に支持される。ホルダー９３は、送りねじ９５を有したモータ９４によって矢印Ｇ方向（図面の左右方向）に移動できるようになっている。容器８４の上面にはゴム材が設けられ、外からカバーされている（図示略）。針８３は、細胞注入チューブ８４に接続され、ピペッタアーム８５に固定されている。ピペッタアーム８５は、軸８７に支持され、ピペッタ回転動モータ８８により矢印Ｄ２方向に回転できるようになっている。回転部材８９は、軸８７と共に回転する部材であり、ピペッタ上下動モータ９０とプーリ９１を備えている。ピペッタ上下動モータ９０の出力軸に固定されたプーリとプーリ９１はベルト９２により連結され、そのベルト９２の一部は軸８７と固定されている。
【００１７】
ピペッタ上下動モータ９０の駆動により、軸８７は上下動作するようになっている。ピンチ弁１０３は、培養後細胞をしごきポンプ１０１で送液する際、送液状態を制御するものである。なお、ピペッタアーム５５には針４１が固定されており、一端にはエアーフィルター４２が設けられている。この針４１の機能は、容器８４が硬質のプラスチック材料で形成された場合において、内部が陽圧になって細胞が吐出しにくくなるのを防止するものである。なお、培養後細胞は、しごきポンプ１０１により送液されると説明したが、培養器３８に空気を圧送することによって、送液するようにしてもよい。
【００１８】
光源３４は、フレーム３０の下側からフレーム３０内に光を供給するものであり、光の出射側にフィルター３３を備えている。ＣＣＤカメラ３１は、レンズを備えており、フレーム３０の上側に設けられた観察窓３２から培養器３８にて培養される細胞を観察したり、継代時のタイミングを判定したりするのに利用されるものである。光源３４は、画像の輝度ムラを防止するために複数のＬＥＤをフラットに配置したタイプのものが好ましいが、光量が十分であるならば１つのＬＥＤもしくはランプで構成してもよい。また、フィルター３３は、ＣＣＤカメラ３１に入射する光量を低減するためＮＤフィルター、及び細胞観察に適したコントラストを得るため適当なバンドパスフィルターから構成される。このフィルターは、ＣＣＤカメラ３１の前面に設けても良い。ＮＤフィルターは、ＣＣＤカメラ３１の前面に、またバンドパスフィルターは細胞に害を与える短波長光をカットするものの場合は光源３４の前面の方が好ましい。ヒータ１０８は、温度センサ１０６からの検知温度に基づいてフレーム３０の内部を一定の温度に保つものである。ファン６５は、フレーム３０内の空気を攪拌するものである。スタンド９６，９７は、この培養装置全体を床面に立設させるものである。継ぎ手１０７は、二酸化炭素と窒素と酸素の割合を制御した混合気体を供給する際の不純物を除くためのフィルターを備えている。
【００１９】
培養器３８の上面に貼ったガス透過膜１６は、全面を覆うように図示したが、部分的に設けてもよい。なお、培地の蒸発を防止するため、フレーム３０内部の湿度を上げた方が良いのは言うまでもない。この場合、水を入れたトレーを内部に配置するのが容易かつ効果的である。培養器３８の前面をガス透過膜１６で覆わない場合には、継ぎ手１０７から供給される混合気体を直接培養器３８の内部に供給するようにしてもよいし、また培地などに溶け込ませても良い。
【００２０】
また、フレーム３０は、概ね全体を覆う形体としたが、培養器３８の周辺部分のみ覆う構造としても良い。すなわち、２組のピペッタはフレーム３０の一部として左右に設けられる場合について説明したが、フレーム３０とは別個に構成して、フレーム３０の外部に２組のピペッタを配置するようにしても良い。
【００２１】
図３は、図２の培養器３８の詳細構成を示す図である。図３（ａ）は図２の培養器３８を上面から見た平面図であり、図３（ｂ）はその側断面図である。図３（ａ）において、チューブ接続部材１９は、培養器３８の円中心から距離Ｌ１だけ離れた位置に回転中心付近に設けられている。古い培地を排出するチューブ接続部材１８や堰２０の位置と形状は、変形例１１２，１１３，１１４のようにしても良い。変形例１１２は、堰２０を省略したものであり、変形例１１３は、チューブ接続部材１８が培養器３８の側面に設けられているものであり、変形例１１４は、チューブ接続部材１８の開口部が培養器３８の底面に接するように設けられているものである。
【００２２】
変形例１１２，１１４は、培養器３８の回転に伴う遠心力によって、細胞がチューブ接続部材１８の開口部以外のくぼみ部分に凝集することがあるので、この点では変形例１１３が遠心力によって、細胞を培養器３８外に排出することができるので、より好ましい。なお、このチューブ接続部材１８の位置は、培養器３８のどこに配置してもよく、特に限定はしない。また、距離Ｌ１も特に限定されるものではない。但し、培養器３８の円中心と回転中心は、ずらした方が細胞の均一播種の点で好ましい。チューブ接続部材１８の位置を、たとえば培養器３８の円中心付近に配置することによっても細胞の凝集を避けることができる。
【００２３】
ここで回動とは、回転、偏心回転、平行移動、往復平行移動のうち少なくとも一つとこれらの組み合わせを含むものであり、特に細胞や液の攪拌や均一化に有用な動作のことである。例えば、培地や中和済み細胞剥離剤の培養器からの排出は、培養器を傾斜動作させても良い。また、培養器内の細胞の均一播種は、培養器を振動させてもよい。手作業による培養では、培養器を８の字の軌跡を描かせるように動作させることで均一に播種することができる。このように回転動作が最もシンプルでかつ構成することも容易であるが、回転に限定する必要はなく、様々な並進動作、または回転と並進動作の組み合わせで対応してもよい。
【００２４】
図４は、図２の培養装置の制御ブロック図の詳細を示し、複数の培養装置を接続してそれをプラント化した場合を示すブロック図である。図２の培養装置は、図４では大きなブロック１２７で示される。各ピンチ弁２４，６６，７２，７３，７４，７５，７６，７７，１０３，１０４、温度センサ１０６、ヒータ１０８、ファン６５、しごきポンプ３７，１０１、容器移動モータ９４，６３、培養器駆動モータ２９、ピペッタ上下動モータ５９、ピペッタ回転動モータ５７、ピペッタ上下動モータ９０、ピペッタ回転動モータ８８、シャッターモータ５０、８１などは、それぞれＩ／Ｏ  １２０を介してバス１２１に接続される。また、ＣＣＤカメラ３１は、画像取り込みボード２５０とＩ／Ｏ  １２０を介してバス１２１に接続される。バス１２１には、ＣＰＵ１２２、操作卓１２３、操作器１２６、メモリ１２４、コンピュータネットワークドライバ１２５が接続されている。
【００２５】
図４においては、コンピュータネットワークが外部に配設されており、このコンピュータネットワークに培養装置１２７及びこれ以外の複数の培養装置１２８，１２９が接続され、さらに、このコンピュータネットワークに接続された制御監視装置１３０によって、これら複数の培養装置１２７，１２８、１２９がそれぞれの離れた所から監視され、制御されるようになっている。制御監視装置１３０は、汎用のパーソナルコンピュータで対応可能である。なお、コンピュータネットワークの場合は、双方向のデータ通信手段であれば特に限定しない。また、単に培養装置の状態を離れた所から認識する目的ならば、片方向のデータ通信手段で良い。このコンピュータネットワークに接続する培養装置の台数は特に限定しない。複数の培養装置を利用する場合、データ通信手段により接続することにより、通常数週間もの長い時間を要す培養期間中、各培養装置の状態を常に遠隔監視できるので、大規模な培養設備には好適である。
【００２６】
制御監視装置１３０の機能は、図５において説明する培養装置の動作を逐次監視し、異常時には外部に信号を発する機能を備えたものであり、現時点では公知の技術であるため、その詳細な説明は省略するが、監視機能は各培養装置が担ってもよいし、制御監視装置１３０が請負ってもよい。例えば制御監視装置１３０は、時分割で各培養装置の動作を確認し、細胞各培養装置が異常をおこした場合に、当該培養装置を外部に知らしめる方法がもっとも容易である。
【００２７】
図５は培養装置の動作を説明するためのフローチャートである。以下、図１〜図５を参照して、培養装置の動作を説明する。なお、図４に示すＣＰＵ１２２、メモリ１２４、バス１２１は汎用コンピュータで用いられている技術であるので、以下それらＣＰＵ１２２、メモリ１２４、バス１２１の詳細動作は省略し、各アクチュエータの動作のみ説明する。
【００２８】
ステップＳ５１：「スタート」
培養装置１２７の動作開始であり、操作者が操作卓１２３の操作器１２６のスタートスイッチを押すことによってスタートする処理である。また、前述した図４に示すように複数の培養装置と制御監視装置がコンピュータネットワークに接続されている場合は、制御監視装置側でスタートスイッチを押すように構成してもよい。なお、この時点では既に培養器３８や、各タンク６７，６８，６９，７０，７１には薬品が培養装置１２７にセットされている。
【００２９】
ステップＳ５２：「培地注入」
ピンチ弁７２が開放され、しごきポンプ３７が動作して、培地タンク６７内の培地がチューブ２１を通って送液される。送液される培地は、矢印Ｊ１、矢印Ｊの経路を通り培養器３８に流れ込み、培養器３８で培地１７となる。予め設定された量の培地が注入されたら、しごきポンプ３７の動作を停止し、ピンチ弁７２は閉じる。ここでの培地量の設定値は予めメモリ１２４に記憶されている。なお、この実施の形態では後述するポンプ１０１も同様であるが、液料を図る手段を設けずに、ポンプの動作時間において液料を決定している。
【００３０】
ステップＳ５３：「容器５２の投入」
操作者が操作器の該当するスイッチを操作すると、シャッターモータ５０が動作し、シャッター５１が矢印Ａ方向（上昇方向）にスライドする。シャッター５１が所定量上昇した後、容器移動モータ６３が動作し、ホルダーが矢印Ｂ方向（右方向）に移動する。この移動後、操作者は培養前細胞を入れた容器５２をホルダー６２に置く。その後、容器移動モータ６３は上記と逆方向に回転し、ホルダー６２は矢印Ｂ方向（左方向）に移動する。シャッターモータ５０が回転し、シャッター５１は矢印Ａ方向（下降方向）に移動して、閉じる。
【００３１】
ステップＳ５４：「ピペッタを駆動させ細胞を培養器３８に移送」
容器移動モータ６３が小刻みに正逆回転し、容器５２内の細胞を懸濁する。詳細は述べないが、ホルダー６２内部に容器５２を振動させるアクチュエータを備えても良い。この動作と前後して、ピペッタ回転動モータ５７が動作し、ピペッタアーム５５が回転する。次にピペッタ上下動モータ５９が動作し、ピペッタアーム５５が下降して、容器５２内に針５３が挿入する。ピンチ弁６６が開放し、しごきポンプ３７が動作する。これにより、容器５２内の培養前細胞は吸いだされ、細胞は矢印Ｊ２→Ｊ方向へチューブ５６を通って、送液され、チューブ２１を通り、培養器３８に注入される。この注入終了後、ピンチ弁６６は閉じ、またしごきポンプ３７は停止する。
【００３２】
ステップＳ５５：「培養器をシャッフリングし、均一化・播種」
モータ２８が回転し、培養器３８に注入した細胞を均一化・播種のため懸濁する。細胞の均一化・播種は、過度の細胞密度は細胞の変質を招く恐れがあるため、培養を効率高く行うために必要な処理である。なお、培養前細胞の注入が確認された後にモータ２８が回転を始めるのではなく、培養細胞が接着依存性細胞（固形物を認識してこの固形物に接着することにより培養する細胞）の場合、培養前細胞が培養器３８内部に注入されている最中に、モータ２８を回転させた方が良い。なお、ステップＳ５５の次にはステップＳ５６に進む場合とステップＳ５８にジャンプする場合がある。ここではステップＳ５８にジャンプする場合で説明する。
【００３３】
ステップＳ５８：「培養」
このステップでは、培養前細胞は培養に入ることになるが、培養中は、温度センサ１０６及びヒータ１０８によりフレーム３０内は培養に適した温度（３７℃前後）に制御されており、またファン６５によってフレーム３０内部の大気も攪拌されて、温度ムラがないようにしてある。
【００３４】
ステップＳ５６：「培地を排出」
このステップは、ステップＳ５８を実行する前に適宜に実行できるステップであり、ピンチ弁２４と、ピンチ弁１０４が開放され、しごきポンプ１０１が動作して、培養器３８内の培地１７がチューブ２３を通って、廃液タンク１０２に培地が送液（排出）される。送液（排出）完了後、しごきポンプ１０１が停止し、ピンチ弁２４と、ピンチ弁１０４は閉じる。
【００３５】
ステップＳ５７：「新しい培地を注入」
このステップも同様にステップ６を実行する前に適宜に実行できるステップであり、ピンチ弁７２が開放し、しごきポンプ３７を動作させ、培養器３８内に新しい培地が注入される。この培地の注入後、ピンチ弁７２は閉じ、しごきポンプ３７は停止する。
【００３６】
ステップＳ５９：「継代のタイミングか？」
上記培養中において、予め時間を決めておいてもよいし、操作卓にスイッチを設けて、術者が動作を指示するようにしてもよいが、次のように画像を利用すると細胞の品質安定化に寄与する。すなわち、適宜に光源３４が発光し、ＣＣＤカメラ３１が培養器３８内で培養されている細胞の画像を取得する。培養初期段階の細胞は多くの箇所で密度が非常に低く、部分的に密な状態（コロニー）を形成する場合が多い。そのコロニーを培養器駆動モータ２８の動作によりＣＣＤカメラ３１が捉え、計測する。このコロニー部分の細胞がコンフルエントに到達していなければ、引き続き培養される。コンフルエントか否かの判断は、後述するステップＳ６０の細胞数カウントと同じでよい。その時必要であれば、ステップＳ５６とす５７の処理を行なってからステップＳ５８に進む。また、コンフルエントに到達していれば、継代のタイミングということになり、次のステップＳ６０に進む。
【００３７】
ステップＳ６０：「目標の細胞数か？」
ＣＣＤカメラ３１からの情報を元に細胞数をカウント又は演算する。その結果として、細胞数が予め操作者が設定した値に達していれば、ステップＳ６８に進み、目標細胞数に達していなければ、ステップＳ６１に進む。
【００３８】
ステップＳ６１：「培地を排出」
ステップＳ６１〜ステップＳ６７の処理は、細胞数が予め操作者が設定した値に達していなかった場合に実行される処理である。まず、このステップでは、ピンチ弁２４とピンチ弁１０４が開放され、しごきポンプ１０１が動作して、培養器３８内の培地１７がチューブ２３を通って、廃液タンク１０２に培地が送液（排出）される。送液（排出）完了後に、しごきポンプ１０１が停止し、ピンチ弁２４と、ピンチ弁１０４は閉じる。
【００３９】
ステップＳ６２：「培養器を緩衝液で洗浄」
ピンチ弁１０５が開放し、しごきポンプ３７が動作して、緩衝液タンク６８から緩衝液が培養器３８に注入される。注入後、ピンチ弁１０５が閉じ、しごきポンプ３７が停止する。培養器駆動モータ２８が回転し、培養器３８を回動させ緩衝液を培養器底面に行き渡らせる。その後、ピンチ弁２４が開放し、しごきポンプ１０１が動作して、廃液タンク１０２に培養器３８内の緩衝液を送液する。
【００４０】
ステップＳ６３：「細胞剥離剤を注入」
ピンチ弁７３が開放され、しごきポンプ３７が動作し、細胞剥離剤タンク６９から細胞剥離剤が培養器３８に注入される。注入後、ピンチ弁７３が閉じ、しごきポンプ３７が停止する。培養器駆動モータ２８が回転し、細胞剥離剤を培養器底面に行き渡らせる。
【００４１】
ステップＳ６４：「中和剤を注入」
ここでは中和剤を培地としている。上述の細胞剥離剤としては様々なものが利用されているが、ここでは培地には血清が含まれるものとして、この血清により中和される細胞剥離剤を想定している。従って、動作としては、上述のステップＳ５２と同様で、ピンチ弁７４を開放してタンク７０から中和剤が注入される。  
【００４２】
ステップＳ６５：「培養器をシャッフリングし、均一化・播種」
ステップＳ５５と同一の処理が行なわれる。すなわち、モータ２８が回転し、培養器３８に注入した細胞を均一化・播種のため懸濁する。そして、所定時間経過後すなわち細胞が接着した後に、次のステップＳ６６に進む。
【００４３】
ステップＳ６６：「中和された細胞剥離剤を排出」
ピンチ弁２４とピンチ弁１０４が開放され、しごきポンプ１０１が動１０２に培地が送液（排出）される。送液（排出）完了後に、しごきポンプ１０１が停止し、ピンチ弁２４と、ピンチ弁１０４が閉じる。
【００４４】
ステップＳ６７：「新しい培地注入」
ステップＳ５２と同一の処理が行なわれる。すなわち、ピンチ弁７２が開放され、しごきポンプ３７が動作して、培地タンク６７内の培地がチューブ２１を通って送液される。送液される培地は、矢印Ｊ１、矢印Ｊの経路を通り培養器３８に流れ込み、培養器３８で培地１７となる。予め設定された量の培地が注入されたら、しごきポンプ３７の動作を停止し、ピンチ弁７２は閉じる。
【００４５】
ステップＳ６８〜ステップＳ７１の処理は、細胞数が予め操作者が設定した値に達していた場合に実行される処理であり、上述のステップＳ６１〜ステップＳ６４の処理と同じである。
【００４６】
ステップＳ６８：「培地を排出」
ステップＳ６１と同一の処理が行なわれる。すなわち、ピンチ弁２４とピンチ弁１０４が開放され、しごきポンプ１０１が動作して、培養器３８内の培地１７がチューブ２３を通って、廃液タンク１０２に培地が送液（排出）される。送液（排出）完了後に、しごきポンプ１０１が停止し、ピンチ弁２４と、ピンチ弁１０４は閉じる。
【００４７】
ステップＳ６９：「培養器を緩衝液で洗浄」
ステップＳ６２と同一の処理が行なわれる。すなわち、ピンチ弁１０５が開放し、しごきポンプ３７が動作して、緩衝液タンク６８から緩衝液が培養器３８に注入される。注入後、ピンチ弁１０５が閉じ、しごきポンプ３７が停止する。培養器駆動モータ２８が回転し、培養器３８を回動させ緩衝液を培養器底面に行き渡らせる。その後、ピンチ弁２４が開放し、しごきポンプ１０１が動作して、廃液タンク１０２に培養器３８内の緩衝液を送液する。
【００４８】
ステップＳ７０：「細胞剥離剤を注入」
ステップＳ６３と同一の処理が行なわれる。すなわち、ピンチ弁７３が開放され、しごきポンプ３７が動作し、細胞剥離剤タンク６９から細胞剥離剤が培養器３８に注入される。注入後、ピンチ弁７３が閉じ、しごきポンプ３７が停止する。培養器駆動モータ２８が回転し、細胞剥離剤を培養器底面に行き渡らせる。
【００４９】
ステップＳ７１：「中和剤を注入」
ステップＳ６４と同一の処理が行なわれる。すなわち、ピンチ弁７４を開放してタンク７０から中和剤が注入される。そして、所定時間経過後すなわち細胞が接着した後に、次のステップＳ７２に進む。
【００５０】
ステップＳ７２：「中和された細胞剥離剤を排出」
ステップ６６と同一の処理が行なわれる。すなわち、ピンチ弁２４とピンチ弁１０４が開放され、しごきポンプ１０１が動１０２に培地が送液（排出）される。送液（排出）完了後に、しごきポンプ１０１が停止し、ピンチ弁２４と、ピンチ弁１０４が閉じる。
【００５１】
ステップＳ７３：「ピペッタを駆動させ細胞を容器に移送」
ピペッタ回転動モータ８８が動作し、ピペッタアーム８５を回転させる。次にピペッタ上下動モータ９０が動作し、ピペターアーム８５が下降して、容器８４内に針８３が挿入される。ピンチ弁２４、１０３が開放し、しごきポンプ１０１が動作する。これにより、培養器３８内の培養後細胞は吸いだされ、細胞は矢印Ｐ１方向にチューブ２３を通って、送液（移送）される。そして、チューブ８６を通り、細胞保管容器８４に注入される。
【００５２】
ステップＳ７４：「細胞保管容器を装置外に搬出」
シャッターモータ８１が動作し、シャッター８２が上昇する。所定量上昇後、容器移動モータ９４が動作し、ホルダーが矢印Ｇ方向に移動する。これによって、操作者は培養された細胞が入った細胞保管容器８４を取得できる。
【００５３】
ステップＳ７５：「終了」
操作者は培養前と比較し、コンタミネーションのない純粋な培養細胞が入った容器８４を取得することができる。なお、上記ステップＳ５３にて、容器５２に入れた培養前細胞が骨髄液に含まれる細胞である場合、目的とする細胞以外の不要な細胞（血液関係の細胞）を取り除くために、ステップＳ６２，ステップＳ６３，ステップＳ６４，ステップＳ６６をステップＳ５６とステップＳ５７との間に入れるとよい。
【００５４】
図６は、図５のステップＳ５５の「培養器をシャッフリングし、均一化・播種」の動作の一例を示す図である。培養器３８は、この図６（ａ）に示すように正逆回転を繰り返す。例えば、正方向１回、逆方向１回、最後の正方向１回の停止時にはゆっくりと停止させるようにする。すなわち、最初の加速時間と減速時間（ｔ１，ｔ２，ｔ３，ｔ４，ｔ５）を短くすることにより、培養器３８の培地１７は激しく波打ち、懸濁状態になる。さらに、最後の動作の減速時間（ｔ６）を長く取ることにより、培地はその慣性により円周方向に流れを継続しながら、その速度を落とし、やがて停止する。これにより細胞は均等に播かれるようになる。なお、最後の減速時間（ｔ６）をＳ字曲線にしても良い。
【００５５】
図６（ｂ）は細胞の播種状態を示すシミュレーション結果の概略スケッチ図である。色の濃い中心付近の箇所（内周部Ｓ２）は、最後の動作（減速時間ｔ６）にて、流れの接線速度が低いので比較的細胞が凝集している様子が示され、外周部Ｓ１は、細胞が薄く播かれている様子が示されている。なお、正逆回転の繰り返し数、回転速度、角加速度（ｔ１，ｔ２，ｔ３，ｔ４，ｔ５，ｔ６）は、特に限定せず、条件によって培養器３８の前面にわたり、均等に細胞を播くこともできる。しかし、例えば、上述のように中心付近に細胞を凝集する動作を故意に実現することで、その部分のみ画像観察することによりコンフルエントのタイミング判定には都合がよくなることもある。すなわち、培養器３８の全面にわたり観察する必要がなくなり、また過度に培養することで細胞の品質を損なうことがなくなる。また、密度に応じて増殖しやすくなる細胞種を培養する場合において、このような密度制御は好適である。
【００５６】
図７は、上述の実施の形態に係る培養装置の培養器３８の第１の変形例を示す図であり、図７（Ａ）は、上面から見て図を、図７（Ｂ）はその側面図を示す。例えば、４つの培養器１７０ａ〜１７０ｄをロータ２２に回転中心が４つの培養器１７０ａ〜１７０ｄの中心となるように乗せる。この図の培養器１７０ａ〜１７０ｄは、概ね同一の円柱形状に形成されており、各培養器１７０ａ〜１７０ｄのチューブ接続部材１７４ａ〜１７４ｄはチューブ１７１によって接続されている。なお、図７（Ｂ）では、培養器１７０ａ，１７０ｃを省略してある。このチューブ１７１は、図２のチューブ２１と同一機能を果たすものである。チューブ接続部材１７５ａ〜１７５ｄは、古い培地を排出するものである。ここでは、培養器１７０ａ〜１７４ｄは４ヶとしたが、特に４ヶに限定せず、２ヶ，３ヶ，６ヶと自由に選択してもよい。また、培養器を重ねて配置しても良い。この図７のように培養器を複数に分けることにより、培養面積を自由に変更できる。これにより、細胞が接着系の細胞（例えば間葉系幹細胞）では、培養可能な細胞数は面積と比例関係にある場合が多く、培養における細胞数の調整が可能となる。なお、動作は図５の処理フローと同一であり、矢印Ｍの様にシャッフリングすることにより、培養器１７０ａ〜１７４ｄ内の培地は矢印Ｑの方向に最終的に流れることになって、培養器１７０ａ〜１７４ｄ内の細胞は均一に播かれることになる。
【００５７】
図８は、上述の実施の形態に係る培養装置の培養器３８の第２の変形例を示す図である。細胞は培養時、その細胞種によって異なるが、概ねコロニー状に増える。従って、コンフルエントになったら、より広い面積の、比較的清浄な面に播種、つまり継代することが必要である。図８（Ａ）に示す培養器１６７，１６８，１６９は、このような特性が顕著な場合の培養に適用して好適な培養器の一例である。培養器１６７は、概ね円形のシャーレ構造をしており、その上面には図２の供給チューブ２１と同じ機能の供給チューブ１８２が接続される。培養器１６８は、培養器１６７とほぼ同じ外囲器構造をしているが、内部に培養補助板１８９が１枚設けられている。培養器１６９は、培養器１６７とほぼ同じ外囲器構造をしているが、内部に培養補助板１９１，１９２が２枚設けられている。この培養器１６９の底面には廃液チューブ１８５が接続される。各々の培養器１６７，１６８，１６９は接続チューブ１８３，１８４でそれぞれ接続され、その途中に設けられたピンチ弁１８６，１８７，１８８によって送液が制御される。こられの培養器１６７，１６８，１６９とピンチ弁１８６，１８７，１８８とが、図２に示すロータ２２に固定される。図８（Ｂ）は、各培養器１６７，１６８，１６９の回転中心軸との位置関係を示す図であり、図に示すように回転中心軸Ｔより大幅にずらしてもよく、矢印Ｒにて示す方向にシャッフリングすることにより培養器１６７，１６８，１６９内の細胞は均一に播かれることになる。
【００５８】
図８の培養器１６７，１６８，１６９を用いた培養装置の動作は、前述までの培養器と大きな差異はないが、培養器が３ヶとなり、またピンチ弁が２ヶ増えている。
【００５９】
図９は、図８の培養器を用いた培養装置の動作を説明するためのフローチャートである。図８の培養器を用いた動作は、図５と動作が似ているので図５との相違点について説明する。図９において、図５と同じ構成のものには同一の符号が付してあるので、その説明は省略する。
【００６０】
図５にて説明した動作は、継代時に培地を排出（ステップＳ６１）、培養器を緩衝液で洗浄（ステップＳ６２）、細胞剥離剤を注入（ステップＳ６３）、中和剤を注入（ステップＳ６４）、培養器をシャッフリングし、均一化・播種（ステップＳ６５）、中和された細胞剥離剤を排出（ステップＳ６６）、新しい培地を注入（ステップＳ６７）であった。すなわち、継代時には新しい培養器に移し変えることなく、コロニー状に増えた細胞をその場所で培養器をシャッフリングすることにより均等に播種し、再度目標の細胞になるまで培養するというものであった。これに対して、図８の培養器ではステップＳ６４の後に、ステップＳ９０の「下段の培養器に播種」という処理を実行している。
【００６１】
すなわち、培養器１６７でコンフルエントになると、その下の培養器１６８に細胞を送液により移し変える。そして、この培養器１６８でコンフルエントになると、その下の培養器１６９に細胞を送液により移し変える。各々の培養器に注入する培地量は、継代毎に培地量を多くし、培養補助板での培養ができるようにする。すなわち、初回の培養において培地量は、培養器１６７において培養器本体１８０の底面のみ培養する量とする。１回の継代後の培養は、培養器１６８において培養補助板１８９が漬かる程度の培地量とする。これにより、細胞は培養器本体１８０と、培養補助板１８９の両方で培養できるようになる。２回の継代後の培養は、培養器１９７において培養補助板１９０と培養補助板１９１が漬かる程度の培地量とする。これにより、細胞は培養器本体１８０と、培養補助板１９０と、培養補助板１９１の３枚で培養できるようになる。培養補助板が漬かる量とすることで、培養器１６８は培養器１６７に対して約２倍、培養器１６９は培養器１６７に対して約３倍となる。
【００６２】
次に、ピンチ弁の動作を説明する。
（１）初回の培養：培地、緩衝液、細胞剥離剤、中和剤を排出する時にピンチ弁１８６，１８７，１８８を開放する。
（２）継代１回後の培養：培地、緩衝液、細胞剥離剤、中和剤を注入する時にピンチ弁１８６を開放する。また、培地、緩衝液、細胞剥離剤、中和剤を排出する時にはピンチ弁１８７，１８８を開閉する。
（３）継代２回後の培養：培地、緩衝液、細胞剥離剤、中和剤を注入する時にピンチ弁１８６，１８７を開放する。また、培地、緩衝液、細胞剥離剤、中和剤を排出する時にはピンチ弁１８８を開閉する。
【００６３】
上述の実施の形態においては、培養器の個数、各培養器の形や大きさなどは限定されるものでなくなく、楕円や矩形としてもよく、各々の大きさを変えてもよい。また、培養補助板の枚数も１枚や２枚に限定されるものではない。図８の実施の形態においては、培養器は全体的に小型化でき、しいては装置の小型化を実現することが可能である。なお、図８においては、複数の鏡２７８，２７９，２８２，２８３，２８４，２８５が各培養器１６７〜１６９間に配置されている。これらの鏡は光源２８１から出射した光をＣＣＤカメラ２８０で受けるためのものである。光源２８１の直前にはフィルター２８６が設けられている。ＣＣＤカメラ２８０、光源２８１、フィルター２８６は、ユニット２８８のように一体化されており、図示を省略してある駆動機構（例えば、モータと送りねじで構成）により矢印Ｖ方向に移動することができるようになっている。このユニット２８８を矢印Ｖ方向に移動することによって、培養器が多層構造となっていても、ＣＣＤカメラ２８０と鏡２７８，２７９，２８２，２８３，２８４，２８５を利用し、横から培養器１６７〜１６９の観察ができるようになっている。これらの鏡２７８，２７９，２８２，２８３，２８４，２８５は、図において横方向（Ｘ軸方向）に移動して、培養器内を走査可能としてもよい。
【００６４】
図１０は、上述の実施の形態に係る培養装置の培養器３８の第３の変形例を示す断面図である。図１０の培養器が図８の培養器と異なる点は、継代時に新しい培養器に移し変えることなく、図２に示す培養器３８と同様に扱えるようにした点である。構造的には、概ね円形のシャーレ構造をしており、上面には図２の供給チューブ２１と同じ機能の供給チューブ１９７が接続されている。培養器本体１９５には蓋１９９が被され、その内部には培養補助板２０１，２０２が２枚設けられている。動作の概要は、図８と同じであるが、継代毎に培地量を多くし、培養補助板での培養ができるようにしてある。すなわち、初回の培養において培地量は、培養器本体１９５の底面のみである。１回の継代後の培養は、培養補助板２０１が漬かる程度の培地量とする。これにより、細胞は培養器本体１９５と、培養補助板２０１の両方で培養できるようになる。２回の継代後の培養は、培養補助板２０２が漬かる程度の培地量とする。これにより、細胞は培養器本体１９５と、培養補助板２０１と、培養補助板２０２の３枚で培養できるようになる。これによって、図２の培養器３８と比べて、図８と同様に小型化を実現できる。以上の説明において、培養器の個数や各培養器の形や大きさなどは限定されるものではなく、楕円や矩形としてもよく、各々の大きさを種々変えてもよい。また、培養補助板の枚数も２枚に限定されるものではない。図１０に示す実施の形態によれば、培養器を全体的に一層小型化でき、しいては装置の小型化を実現することができる。
【００６５】
図１１は、細胞を均一に播種する手法の一例を示す図である。この手法は、上述の実施の形態の培養器に適用することによって好適な効果を生むものである。図１１（Ａ）において、培養器本体３００には、培養器本体の蓋３０１が設けられ、その上面側に供給用チューブ接続部材３０２が設けられ、下面側に磁石３０７，３０８，３０９，３１０が設けられている。傾斜部３８１は、供給用チューブ接続部材３０２から供給される液体の落下の衝撃を和らげて細胞へのダメージを防ぐものである。これら磁石３０７，３０８，３０９，３１０は、図２においてフレーム３０に固定される。球状部材３０３，３０４，３０５，３０６は、培養器本体３００（図２の培養器３８と同一）の中に入れられるものであり、球状磁性材の表面に細胞に対して無毒性の高分子プラスチック、セラミック、チタンなどがコーティングされたものである。培養器３００が回転するとそれに伴い球状部材３０３，３０４，３０５，３０６も培養器本体３００内を転がり、内部の培地を攪拌するようになり、細胞の均一播種が可能になる。図１１（Ｂ）は、培養器本体３１２に培養器本体の蓋３１３が設けられ、その上面側に供給用チューブ接続部材３１４が設けら、下面側に棒状部材３１５が設けられている。棒状部材３１５は、培養器本体３００（図２の培養器３８と同一）の中に入れられるものであり、棒状の磁性材の表面に細胞に対して無毒性の高分子プラスチック、セラミック、チタンなどがコーティングされたものである。図１１（Ｂ）の棒状部材３１５を用いた場合も、図１１（Ｂ）と同様の効果を奏する。
【００６６】
図１２は、上述の実施の形態における培養器とチューブの接続方法の一例を示す図である。図２では培養器、チューブ、リザーバタンクなどは予め接続されているものとして説明したが、ここでは途中で切断されたチューブを供給用チューブ接続部材に接続して培養している。培養器３２５（図２の培養器３８と同一）には供給チューブ３２０と廃液チューブ３２６が接続されている。それぞれのチューブ３２０，３２６の切断部には、例えばゴムのような柔軟材からなる栓３２１，３２７が挿入されている。実際に培養に入る前に、針３２２，３２８を有した供給チューブ３２３と廃液チューブ３２９を接続する。なお、針３２２，３２８を刺す前に栓３２１，３２７をアルコールなどで滅菌するとよい。このようにすることにより、長いチューブが接続された培養器を装置にセットする際にチューブの取り回しが楽になり、操作性が上がる。なお、培養前細胞を注入する際、シリンジ３２４を使えば、直接培養器３２５に細胞を入れることができる。また、途中で切断された供給チューブ３２３と廃液チューブ３２９を培養器３２５に予め接続せずに、直接ゴム栓３２１，３２７をチューブ接続部材に取り付けても良い。
【００６７】
図１３は、上述の実施の形態における培養装置の一部の滅菌法を示す図である。この滅菌法では、培養器３８と各タンク７１，７０，６９，６８，６７，１０２とがそれぞれチューブによって接続され、そのままの状態で滅菌バッグに矢印Ｓに示すように丸ごと封入され、ガンマ線などからの滅菌に供するようになっている。滅菌バッグ３４０は、外気との接触を防ぐ材質で作られたものであり、一般に利用されているもので良い。このように細胞に触れるものは全て滅菌することにより、培養中はチューブを外さなくてすむことから、コンタミネーションのリスクは皆無となる。なお、図２において、液面検出手段３３ｂは、光又は超音波を用いた培養器３８の液面高さを検出するものである。ポンプやピンチ弁が動作不良を起こした場合、液面高さが設定値から逸脱するがこのような場合、外部に警報を出すようになっている。
【００６８】
図１４は、本発明を適用してなる培養装置の別の実施の形態に係る機構部の詳細図を示す図である。この培養装置は、基本的には図２のものと同じ構成をしている。従って、図１４において、図２と同じ構成のものには同一の符号が付してあるので、その説明は簡略化する。
【００６９】
培養器１４０は、図２の培養器３８と同様に底面には細胞が接着してそこで培養が行なわれる。培養器１４０は、培養器本体と蓋部材とからなる。培養器１４０は、培養中の細胞について顕微鏡などで観察できることが必要であることから透明な材質が好ましく、また毒性のないものである必要がある。これらのことから材質としては、ポリスチレン（ＰＳ）やポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）材が好ましい。この蓋部材には、薬品注入及び排出のための３つの第１ポート１４１、第２ポート１４２、第３ポート１４３が設けられている。
【００７０】
第１ポート１４１は、培地などの薬品や培養後の細胞の排出用ポートである。第１ポート１４２には廃液チューブ１４１ｂが接続され、培地を排出するためのしごきポンプ１４４，１４５が配され、培地を排出できるように構成されている。第２ポート１４２は、培地などの薬品や培養前の細胞を供給するためのポートである。この第２ポート１４２には供給チューブ１４２ｂが接続され、第１ポート１４１と同様にしごきポンプ１４６，１４７が配されている。第３ポート１４３は、培養器１４０内部への大気吸入用ポートであり、その外側にはチューブ１４３ａを介してエアーフィルター１４３ｂが接続されている。この第３ポート１４３は、培養器１４０内部への空気吸入ポートであり、この目的を実現するものであれば、特にポートを備えなくてもよい。図１４の培養装置では、培養器１４０を保持する保持リング１４８の底面側にフック１４９を引っかけ、それをレバー１５０及びチルトモータ１５１で持ち上げることによって、培養器１４０全体を傾斜するようにしている。
【００７１】
培養器１４０は、保温箱（インキュベータ）１６０内のロータ１５３に固定された保持リング１４８に保持されており、このロータ１５３は、保温箱１６０の上部に設けられた培養器駆動モータ２９ａの出力軸に連結され、矢印Ｅ方向に回転駆動されるように構成されている。図１４は、ロータ１５３が時計回り（左方向）に旋回して保持リング１４８及び培養器１４０が保温箱１６０の左側に移動した状態を示す。従って、この状態からロータ１５３は半時計回り（右方向）に旋回することによって、保持リング１４８及び培養器１４０は図面上の手前を通過して保温箱１６０の右側に移動することになる。保温箱１６０は、従来のように２重箱構造をとらずに、また気密をほとんど考慮しなくて済む簡易な方法で構成されたものである。この保温箱１６０の詳細構成について後述する。
【００７２】
供給チューブ１４２ｂの一端は、培養器１４０の外周付近に設けられた第２ポート１４２に接続されている。この供給チューブ１４２ｂは、保温箱１６０内部のロータ１５３上方に設けられ、ロータ１５３の旋回に応じて内部を自由に動くようになっている。供給チューブ１４２ｂの他端は、加温バッグ１７０に接続されている。加温バッグ１７０は、供給チューブ１４２ｂを通過する媒体の温度を４度から約２０度に加温するものであり、背面に加温用ヒータ１７１を備えている。なお、加温バッグ１７０は、液体の温度を上げることができれば、その形状は限定されない。チューブをスパイラル状に巻いたものでもよい。この加温バッグ１７０を媒体が通過する時には、ポンプ１４６，１４７、ピンチ弁１４７ａを制御し、媒体を一時滞留させる。
【００７３】
培地タンク６７は、未使用の培地を貯留し、緩衝液タンク６８は緩衝液を貯留し、細胞剥離剤タンク６９，７０，７１は細胞剥離剤を貯留している。なお、図１４では細胞剥離剤タンク６９のみを示し、細胞剥離剤タンク７０，７１の図示を省略してある。各タンク６７，６８，６９，７０，７１は、断熱箱８０内に設けられている。断熱箱８０の側面には、ペルチェ素子１０９を介して外部に放熱ヒートシンク１１０が、内部に吸熱ヒートシンク１１１がそれぞれ設けられていて、熱交換が行なわれ、一定温度に保持されている。ピンチ弁７２，１０５，７３，７４，７５は、各タンク６７，６８，６９，７０，７１から供給チューブ１４２ｃへの送液を制御するものである。各タンク６７，６８，６９，７０，７１から取り出されるチューブは、供給チューブ１４２ｃに接続され、しごきポンプ１４６，１４７で送液できるようになっている。しごきポンプ１４６，１４７は、ローラでチューブを挟み込み、そのローラを回転することによりチューブ内の液を送り出すポンプである。しごきポンプ１４６，１４７のすぐ後には送液調整用のピンチ弁１４６ａ，１４７ａが設けられている。なお、前記しごきポンプ１４６，１４７、しごきポンプ１４４，１４５が送る液量を計る手段を設けず、これらポンプの動作時間によって液量を決定する。
【００７４】
ピンチ弁６６ａ，６６ｂは、供給チューブ１４２ｂへの培養前細胞の注入を制御するものであり、補助供給チューブ１４２ｄに２個設けられている。２個のピンチ弁６６ａ，６６ｂを並べて設けてあるのは、細胞注入後に補助供給チューブ１４２ｄを介して外気などが流入するのを防止するためである。
【００７５】
供給チューブ１４２ｃの一端は、加温バッグ１７０に接続され、他端はピンチ弁１７２を介して保温箱１６０内に挿入され、その端部にエアーフィルター１７３が設けられている。このエアーフィルター１７３、供給チューブ１４２ｃ、加温バッグ１７０、供給チューブ１４２ｂ、第３ポート１４３、チューブ１４３ａ、エアーフィルター１４３ｂによって空気循環経路が形成されている。すなわち、しごきポンプ１４６，１４７が回転して、供給チューブ１４２ｂ，１４２ｃ内のエアーを送出することによって、培養器１４０内のエアーを循環させるようになっている。
【００７６】
廃液チューブ１４１ｂの一端は、培養器１４０の外周付近に設けられた第１ポート１４１に接続されている。この廃液チューブ１４１ｂは、保温箱１６０内部のロータ１５３上方に設けられ、ロータ１５３の旋回に応じて内部を自由に動くようになっている。廃液チューブ１４１ｂは、途中で二股に分岐され、それぞれの経路を介して廃液タンク１０２又は培養後細胞を貯留する容器８４に送液されるようになっている。すなわち、廃液チューブ１４１ｂの分岐した一方は、ピンチ弁１７６、ペーハー測定部１７７、しごきポンプ１４５、ピンチ弁１７８を介して廃液タンク１０２に接続され、他方はピンチ弁１７４、しごきポンプ１４４を介して廃液タンク１０２又はピンチ弁１７４、しごきポンプ１４４、ピンチ弁１７５を介して容器８４に接続されている。
【００７７】
細胞の老廃物が溶出し、培地中の栄養素が少なくなることによって生成される古い培地は、しごきポンプ１４４により廃液チューブ１４１ｂを通って、廃液回収箱内の廃液タンク１０２に貯留される。一方、廃液のペーハーを測定するために、古い培地は、しごきポンプ１４５により廃液チューブ１４１ｂを通って、ペーハー測定部１７７を通過して、同じく廃液タンク１０２に送液される。
【００７８】
ペーハー測定部１７７は、廃液のペーハーを測定する前に、保温箱１６０内に設けられた校正液タンク１６１，１６２に貯留されている校正液をピンチ弁１６３，１６４を通過させることによってペーハーを基準値に校正し、その後に廃液を通過させてペーハー測定するものである。このペーハー測定部１７７の詳細については後述する。
【００７９】
培養前細胞を貯留する容器２３０は、モータ２３１の回転軸に対して偏心して設けられたホルダー２３２に支持されている。モータ２３１が回転することによって、容器２３０内の培養前細胞は十分に懸濁される。容器２３０の上面にはゴム材からなるキャップ２３３が設けられ、外気からカバーされている。キャップ２３３の内部にはアルコール消毒液が染み込んだ不織布２３４が設けられており、キャップ全体を覆うようにカバー２３５が設けられている。針２３６は、キャップ２３３及び不織布２３４を介して容器２３０内の管部材２３８に接続され、図示していないアームに固定されており、矢印Ｄ１方向に直線移動できるようになっている。針２３７は、容器２３０内に大気を供給するものであり、その端部にエアーフィルター２３９を備えている。この針２３７の機能は、容器２３０が硬質のプラスチック材料で形成された場合において、内部が陰圧になって細胞が吸引しにくくなるのを防止するものである。なお、培養前細胞は、しごきポンプ１４７により吸引されるが、この針２３７から容器２３０内に空気を圧送することによって送液するようにしてもよい。この培養前細胞を貯留する容器２３０及び針２３６，２３７の詳細構成については後述する。
【００８０】
培養後細胞を貯留する容器２４０は、図示していないホルダーに支持されている。容器２４０の上面にはゴム材からなるキャップ２４１が設けられ、外気からカバーされている。キャップ２４１の内部にはアルコール消毒液の染み込まれた不織布２４４が設けられており、キャップ全体を覆うようにカバー２４５が設けられている。針２４６は、キャップ２４１及び不織布２４４を介して容器２４０内の侵入し、培養後細胞を送液可能になっている。針２４６は、図示していないアームに固定されており、矢印Ｇ１方向に直線移動できるようになっている。針２４７は、容器２４０内の空気を排出するものであり、その端部にエアーフィルター２４９を備えている。この針２４７の機能は、容器２４０が硬質のプラスチック材料で形成された場合において、内部が陽圧になって細胞を吸引しにくくなるのを防止するものである。なお、培養後細胞は、しごきポンプ１４４により吸引されるが、この針２４７から容器２４０内の空気を排出することによって送液するようにしてもよいし、保温箱１６０内に空気を圧送することによって、送液するようにしてもよい。この培養後細胞を貯留する容器２４０及び針２４６，２４７の詳細構成については後述する。
【００８１】
光源３４ａは、保温箱１６０の上側から保温箱１６０内に光を照射するものであり、光の出射側にフィルターなどを備えている。ＣＣＤカメラ３１ａは、レンズを備えており、保温箱１６０の下側に設けられた観察窓３２ａから培養器１４０にて培養される細胞を観察したり、継代時のタイミングを判定したりするのに利用されるものである。光源３４ａは、画像の輝度ムラを防止するために複数のＬＥＤをフラットに配置したタイプのものが好ましいが、光量が十分であるならば１つのＬＥＤもしくはランプで構成してもよい。また、光源３４ａに配置されるフィルターとしては、ＣＣＤカメラ３１ａに入射する光量を低減するためＮＤフィルター、及び細胞観察に適したコントラストを得るため適当なバンドパスフィルターから構成される。このフィルターは、ＣＣＤカメラ３１ａの前面に設けても良い。ＮＤフィルターは、ＣＣＤカメラ３１ａの前面に、またバンドパスフィルターは細胞に害を与える短波長光をカットするものの場合は光源３４ａの前面の方が好ましい。光源３４ａ及びＣＣＤカメラ３１ａは、図１４の紙面に対して垂直な方向に移動可能に設けられている。すなわち、光源３４ａ及びＣＣＤカメラ３１ａは、図に対して垂直方向に延びたレール３４ｂ，３１ｂに対してローラ３４ｃ，３４ｄ，３１ｃ，３１ｄを介して移動可能に設けられている。これによって、旋回移動する培養器１４０と垂直方向に移動する光源３４ａ及びＣＣＤカメラ３１ａによって、培養器１４０の所望の場所を観察可能な構成となっている。
【００８２】
ヒータ２０１〜２０４は、保温箱１６０内に設けられた温度センサ１０６からの検知温度に基づいて保温箱１６０の内部を一定の温度に保つものである。なお、この実施の形態では、ヒータ２０１〜２０４には、熱拡散用の放熱板２０５，２０６が保温箱１６０の側面に沿って設けられている。ファン６５は、保温箱１６０内の空気を攪拌するものである。継ぎ手１０７は、二酸化炭素と窒素と酸素の割合を制御した混合気体を供給する際の不純物を除くためのフィルターを備えている。二酸化炭素センサ２０５は、保温箱１６０内の二酸化炭素を検出し、一定に保持するためのものであり、二酸化炭素ボンベ２１０からレギュレータ２１１及び電磁弁２１２を介して所定量の二酸化炭素を保温箱１６０内に供給できるようにしてある。なお、この実施の形態では、二酸化炭素ボンベ２１０からレギュレータを介して送出される二酸化炭素ガスを用いて多連型電磁弁２１３を制御して、チューブの各所に設けられたピンチ弁を制御するようにしている。
【００８３】
図１５は、図１４で使用される培養器の詳細を示す図である。培養器１４０は、培養器本体１４０ａと、蓋部材１４０ｂとからなる。この蓋部材１４０ｂには、薬品注入及び排出のための３つの第１ポート１４１、第２ポート１４２及び第３ポート１４３が設けられており、それぞれのポートに廃液チューブ１４１ｂ、供給チューブ１４２ｂ及びチューブ１４３ａが接続されている。
【００８４】
図１６は、培養器における第１ポート１４１、第２ポート１４２、第３ポート１４３の詳細を示す図である。なお、図示を明確にするため断面図のように明示しているが、正確な位置関係は後述する図１７に示すようになっている。第１ポート１４１は、培地などの薬品や培養後の細胞の排出用ポートである。この第１ポート１４１には、培養器１４０内部に突出するよう管部材１４１ａが設けられる。この管部材１４１ａは、その先端部が培養器本体１４０ａの底面に触れても培地１４０ｃを吸引できるよう斜めにカットしてある。
【００８５】
第１ポート１４２の外側には廃液チューブ１４１ｂが接続され、培地を排出するためのしごきポンプ１４４，１４５が配され、培地１４０ｃを排出できるように構成されている。第２ポート１４２は、培地１４０ｃなどの薬品や培養前の細胞を供給するためのポートである。この第２ポート１４２の外側には供給チューブ１４２ｂが接続され、第１ポート１４１と同様にしごきポンプ１４６，１４７が配されている。
【００８６】
第３ポート１４３は、培養器１４０内部への大気吸入用ポートであり、その外側にはチューブ１４３ａを介してエアーフィルター１４３ｂが接続されている。このエアーフィルター１４３ｂは、微粒子や菌などが培養器１４０内部へ侵入するのを防止する役目を負い、０．５μｍ程度の孔径を有したフィルターが内封されて構成されたものである。この孔径は、菌の侵入を完全にシャットアウトするならば０．２μｍが望ましい。なお、チューブ１４３ａの先端にエアーフィルター１４３ｂと同様のフィルターを接続し、しごきポンプにより空気を培養器１４０内部に送るようにしてもよい。この場合、培養器１４０内部に積極的に空気を送ることができる。
【００８７】
なお、この第３ポート１４３は、培養器１４０内部への空気吸入ポートであり、この目的を実現するものであれば、特にポートを備えなくてもよい。例えば蓋部材の一部を切り欠き、ガス透過膜を貼り付けてもよい。また、培養器１４０内部に板材を備え、底面積を増加させる構造を取ることもできる。このようにすることにより、底面に接着し単一層で増殖する接着（足場）依存性細胞の場合、増殖させる細胞数を増やすことが可能になる。
【００８８】
図１７は、図１５の一部断面を示す図であり、培養器内の培地を排出する場合を示す図である。培養器１４０内部に突出する管部材１４１ａがある方に対して、管部材１４１ａがない方を相対的に上昇させ、水平面に対して角度θ゜だけ傾斜させ、管部材１４１ａから培養器１４０内部の培地１４０ｃなどの液体を吸引することにより、培養器１４０の蓋部材１４０ｂを開けずに内部の培地１４０ｃや細胞１４０ｄを排出することが可能になる。管部材１４１ａがある方に対して、管部材２０がない方を相対的に上昇させる機構は特に限定しないが、図１４の培養装置では、培養器１４０を保持する保持リング１４８の底面側であって、管部材１４１ａが存在しない方の保持リング１４８にフック１４９を引っかけ、それをレバー１５０及びチルトモータ１５１で持ち上げることによって、培養器１４０全体を傾斜するようにしている。すなわち、管部材１４１ａがある方に支点軸を設け、管部材１４１ａがない方を引き上げるような傾動動作機構によって実現してもよいし、手作業で行なうようにしても良い。なお、図２にて説明したように、液面検出手段３３ｂは、光又は超音波を用いた培養器１４０の液面高さを検出するものである。ポンプやピンチ弁が動作不良を起こした場合、液面高さが設定値から逸脱するがこのような場合、外部に警報を出すようになっている。
【００８９】
図１８は、図１４の保温箱の詳細構成を示す図であり、図１８（Ａ）は、保温箱の内部構造を分かり易く示したものであり、図１８（Ｂ）は保温箱の外観斜視図である。図１９は、図１８（Ａ）の断熱構造の詳細を示すＳ−Ｓ面の断面を示す図である。この保温箱１６０は、培養用恒温槽であり、内部に培養器１４０を備える。培養器１４０は、培養器駆動モータ２９ａの出力軸に連結されたロータ１５３に取り付けられており、ロータ１５３の旋回動作に応じて保温箱１６０内を矢印Ａ１−Ａ２のように旋回する。保温箱１６０は、外箱となる筐体１６０ａと、その内側に所定の空間を持って配置された内箱１６０ｂとからなる。筐体１６０ａ及び内箱１６０ｂの材質は、ステンレスやＡＢＳなどのプラスチックが好ましい。
【００９０】
外箱１６０ａと内箱１６０ｂとの間には、第１の断熱材１６０ｃと第２の断熱材１６０ｄが設けられている。第１の断熱材１６０ｃとしては、発砲ウレタンなどの比較的断熱性能の優れたものが好ましい。ただ、後述するように第２の断熱材１６０ｄよる外側への伝熱量より、内側への伝熱量を大きくするために、発砲ウレタンであっても軟質系のものがより好ましく、かつ第２の断熱材１６０ｄよりも薄く形成するのが良い。熱拡散板１６０ｅ，１６０ｆは、内箱１６０ｂの左右側面部を覆うような概ねコの字形状をしている。すなわち、保温箱１６０の上下には光源３４ａやＣＣＤカメラ３１が設けられ、培養器１４０の観察を行なう必要があるので、観察に必要な部分については熱拡散板１６０ｅ，１６０ｆを設けないようにしてある。
【００９１】
熱拡散板１６０ｅ，１６０ｆの材質は、熱伝導率の高いアルミニウムや黄銅板などで構成される。この熱拡散板１６０ｅ，１６０ｆは、第１の断熱材１６０ｃの左右側面を覆うように両面テープなどで接着される。さらに、この熱拡散板１６０ｅ，１６０ｆの底面側及び側面側にはパネル型ヒータ１６０ｇ〜１６０ｊが同じく両面テープなどで接着されている。第２の断熱材１６０ｄを伝達して外部に漏れる熱量は、保温箱外部の漏れロスとなる。従って、第２の断熱材１６０ｄは、できるだけ断熱性能を高めることが肝要であり、具体的には硬質系の発砲ウレタンや真空断熱材、例えば発砲ウレタンなどをアルミニウムパックに入れ、このパック内部を真空にし、板状にしたものなどを用いることが好ましい。この保温箱１６０には、図１８（Ｂ）に示すように同様の断熱構造をした扉１６０ｋが蝶番１６０ｍによって矢印１６０ｎのように開閉自在に支持されている。
【００９２】
図２０は、図１４の培養装置の保温箱１６の制御ブロックを示す図であり、図４の中から説明に必要な部分を抜き出し、他は省略して示したものである。図２０において、図４と同じ構成のものには同一の符号が付してあるので、その説明は省略する。この制御ブロックにおいて、操作卓２２は、動作スイッチや温度設定スイッチなどを備えている。制御部１１には、ヒータ１６０ｇ〜１６０ｊと、培養器駆動モータ２９ａと、温度センサ１０６が接続されている。温度センサ１０６は、熱伝対などの公知技術を用いた温度センサでよい。
【００９３】
この制御ブロックの動作を説明する。操作者は操作卓２２の動作スイッチや温度設定スイッチを操作すると、制御部１１は温度センサ１０６の温度データを取り込み、設定温度と比較して、その差に応じた電力をヒータ１６０ｇ〜１６０ｊに与える。温度データの取り込みや設定温度との比較は適時行い、保温箱１６０内部の温度が設定温度と等しいか、もしくはそれより大きくなった場合、ヒータ１６０ｇ〜１６０ｊに与える電力を下げる。一方、温度が上昇したヒータ１６０ｇ〜１６０ｊの熱量は、熱拡散板１６０ｅ，１６０ｆを伝わり、保温箱１６０の内部を暖めるが、第１の断熱材１６０ｃよりも第２の断熱材１６０ｄの方が伝熱量が小さいので、ヒータ１６０ｇ〜１６０ｊの熱量の多くは保温箱１６０の内部を加温することに寄与する。なお、培養器駆動モータ２９ａは、培養器１４０内部の細胞を均等に播くために回転動作をするためのものである。
【００９４】
この実施の形態によれば、従来の２重箱構造をとらずに、また気密をほとんど考慮しなくて済む簡易な方法や構成で保温箱を構成できる。また、第１の断熱材１６０ｃを伝わる熱量は、第２の断熱材１６０ｄを伝わる熱量よりも小であるようにすることにより、加温のためのエネルギーを抑制できる。また、熱拡散板１６０ｅ，１６０ｆは、培養器１４０の培養面と垂直方向の重なる面には、切り欠きを形成することにより、培養器への直接的な輻射熱を抑えることができ、保温箱のみならず培養器内部の温度をより一定化することができる。
【００９５】
図２１及び図２２は、ペーハー測定部の詳細構成を示す図であり、図２１は、図１４の一部を拡大して示したものであり、図２２は、ペーハー測定部のセンサ部の詳細構成を示す図である。通常、ペーハー（ｐＨ）計測は、ｐＨ指示薬（フェノールレッド）を含む培養液の色の変化を目視にて判断したり、目視判断を自動で行なう裝置（特開昭６２−１１５２９７号公報に記載されたもの）などが存在しているが、培養に関係の無いｐＨ指示薬を培養液中に入れることは、培養に影響を与えるため好ましくなく、また精度の点でも劣っていた。また、ｐＨ電極を培養液中に浸漬させてその電位差計測を行なう方法もあるが、ｐＨ電極が十分に滅菌されていないと、雑菌等のコンタミネーションを起こす可能性があり、好ましくなかった。そこで、この実施の形態では、培養器から廃液タンクまでの流路の途中にフィルム状のｐＨセンサ膜を用いたｐＨ測定部１７７を設け、培養器１４０からの廃液を利用してｐＨ計測を行なうようにした。
【００９６】
図２２に示すように、ペーハー測定部１７７は、約５７０［ｎｍ］の波長の光を出射する発光素子（ＬＥＤ）１７７ａと、約７７０［ｎｍ］の波長の光を出射する発光素子１７７ｂと、これらの各発光素子１７７ａ，１７７ｂからの光であって、ｐＨセンサ膜１７７ｄを透過した光を受光する光検出器１７７ｃを備えている。
この実施の形態では、ｐＨセンサ膜１７７ｄとして透過式指示薬色素フィルムＦ−ＰＲ型（フェノールレッド）を使用する。このｐＨセンサ膜１７７ｄは、ｐＨに応じて変色するため、その透過光を分光計測することによりｐＨを求めることができる、いわゆるフィルム状の光学式化学センサである。この実施の形態では、透過式を用いているが、反射式指示薬色素フィルムＦＲ−ＰＲ型（フェノールレッド）を使用し、反射光を分光計測してもよい。
【００９７】
このｐＨセンサ膜１７７ｄは、廃液チューブ１４１ｂから分岐された廃液チューブ１４１ｃと、廃液タンク１０２に接続された廃液チューブ１４１ｄとの間の透過部材からなるセンサホルダ１７７ｅに設けられている。廃液チューブ１４１ｃからの廃液は、ｐＨセンサ膜１７７ｄの保持されたセンサホルダ１７７ｅ内を通過して廃液チューブ１４１ｄに送液される。このときにｐＨセンサ膜１７７ｄは、廃液に浸漬される。廃液に浸漬されたｐＨセンサ膜１７７ｄからの透過光及び反射光を光検出器１７７ｃで受光して、その吸光スペクトル変化を測定して、ｐＨを計測する。
【００９８】
ペーハー測定部１７７でｐＨを計測する前に、ｐＨセンサ膜１７７ｄの校正を行なう必要がある。保温箱１６０内に設けられた校正液タンク１６１，１６２には、校正液が貯留されているので、しごきポンプ１４５によって校正液タンク１６１，１６２内の校正液を廃液タンク１０２に送液する。これによって、校正液はピンチ弁１６３，１６４を通過し、ペーハー測定部１７７を通過するので、ｐＨセンサ膜１７７ｄは校正液によってペーハー基準値に校正される。校正後に廃液を通過させてペーハーを測定する。
【００９９】
ペーハーの算出は以下説明するｐＨ値算出アルゴリズムに従って行なわれる。
まず、最初のステップでは、以下の演算式（１）に基づいて、ＰＤ暗電流、アンプやＡＤＣのオフセット補正を行なう。
Ｉ＝Ｉｒａｗ−Ｉｄ・・・（１）
ここで、Ｉｄは光遮断時のベースライン信号、Ｉｒａｗは計測生データであり、Ｉ，Ｉｒａｗは共に波長λの関数である。ここでの波長は、λ１＝５７０ｎｍ，λ２＝７７０ｎｍとする。
【０１００】
次のステップでは、以下の演算式（２），（３）に基づいて、相対透過率Ｔ及び生の相対吸光度Ａｒａｗを算出する。
Ｔ＝Ｉ／Ｉ２・・・（２）
Ａｒａｗ＝−ｌｏｇＴ＝ｌｏｇ（Ｉ２／Ｉ）・・・（３）
ここで、Ｉ２は、ｐＨ校正液２（ｐＨ２）のＩ値である。従って、相対透過率Ｔ及び相対吸光度Ａｒａｗはλの関数となる。
【０１０１】
次のステップでは、ベースライン波長２における吸光補正を行なう。気泡混入などにより、相対吸光度Ａｒａｗが波長λに対して非依存的に変動するので、これを補正するために、演算式（４）に基づいて、オフピーク波長（λ２＝７７０ｎｍ）の値をピーク波長（λ１＝５７０ｎｍ）の値から減算して正味の吸光度Ａを算出する。
Ａ＝Ａｒａｗ（λ１）−Ａｒａｗ（λ２）・・・（４）
【０１０２】
次のステップでは、応答曲線の直線近似を行なう。ｐＨが測定範囲付近では、センサの相対吸光度Ａ（ベースライン補正）はｐＨにほぼ比例するので、直線近似することができる。そこで、演算式（５）〜（７）に基づいて直線近似を行なう。ｐＨは以下の演算式（５）のようになる。
ｐＨ＝Ｓ・Ａ＋ｂ・・・（５）
ここで、Ｓは感度を示す。
ここで、ｐＨ校正液２のｐＨ値はｐＨ２なので、以下の演算式（６）になる。
ｐＨ２＝ｂ・・・（６）
また、ｐＨ校正液２の時は、演算式（４）の結果は「０」となるので、
Ａ＝Ａｒａｗ（λ１）＝Ａｒａｗ（λ２）＝０
ｐＨ＝Ｓ・Ａ＋ｐＨ２・・・（７）
となる。
【０１０３】
次のステップでは、以下の演算式（８）に基づいて校正（感度Ｓの算出）を行なう。
ｐＨ１＝Ｓ・Ａ１＋ｐＨ２・・・（８）
Ａ１は、ｐＨ標準液１（ｐＨ１）のＡ値である。なお、ｐＨ１＜ｐＨ２ならＡ１は負値となる。従って、感度Ｓは、以下の演算式（９）のようになる。
Ｓ＝（ｐＨ１−ｐＨ２）／Ａ１・・・（９）
【０１０４】
次のステップで、未知試料のｐＨ計測は以下の演算式（１０）によって求めることができる。
ｐＨ＝Ａ・（ｐＨ１−ｐＨ２）／Ａ１＋ｐＨ２・・・（１０）
ここで、Ａは未知試料の相対吸光度である。なお、ｐＨ１＜ｐＨ２ならＡは負値となる。
【０１０５】
以下、実際の測定手順について説明する。
まず、標準液１，２のｐＨ値をｐＨ１，ｐＨ２とする。
このときの、ダークカレントＩｄを計測する。
ｐＨ校正液２の場合の計測電流値Ｉ２ｒａｗ（λ１）、Ｉ２ｒａｗ（λ２）を前記演算式（１）に代入すると、次のようになる。
Ｉ２（λ１）＝Ｉ２ｒａｗ（λ１）−Ｉｄ
Ｉ２（λ２）＝Ｉ２ｒａｗ（λ２）−Ｉｄ
【０１０６】
同じく、ｐＨ校正液１の場合のＩ１ｒａｗ（λ１）、Ｉ１ｒａｗ（λ２）を前記演算式（１）に代入すると、次のようになる。
Ｉ１（λ１）＝Ｉ１ｒａｗ（λ１）−Ｉｄ
Ｉ１（λ２）＝Ｉ１ｒａｗ（λ２）−Ｉｄ
【０１０７】
ｐＨ校正液１の場合の生の相対吸光度は、前記演算式（３）に従って次のようになる。
Ａ１ｒａｗ（λ１）＝ｌｏｇ（Ｉ２（λ１）／Ｉ１（λ１））
Ａ１ｒａｗ（λ２）＝ｌｏｇ（Ｉ２（λ２）／Ｉ１（λ２））
ｐＨ校正液１の場合の正味の吸光度Ａは前記演算式（４）に従って、次のようになる。
Ａ１＝Ａ１ｒａｗ（λ１）−Ａ１ｒａｗ（λ２）
【０１０８】
前記演算式（６），（９）に従って検量線導出を行なう。
ｂ＝ｐＨ２
Ｓ＝（ｐＨ１−ｐＨ２）／Ａ１
【０１０９】
未知試料について、Ｉｒａｗ（λ１）、Ｉｒａｗ（λ２）の計測を行い、前述と同様の手順により正味の吸光度Ａを求める
【０１１０】
前記演算式（７），（８），（９）に従ってｐＨを導出すると、次のようになる。
ｐＨ＝Ａ・Ｓ＋ｂ＝Ａ・（ｐＨ１−ｐＨ２）／Ａ１＋ｐＨ２
【０１１１】
このペーハー測定部は廃液を利用しているため、培養装置内の細胞とｐＨセンサが接触することもなく、また、校正液も廃液流路に流すため、培養器へ注入することも無い。従って、細胞とセンサ、校正液の直接接触を回避することができ、滅菌処理問題が起こることも無い。また、ｐＨ計測部を培養装置内に設けずに、廃液流路の途中に設けているので、装置の機構構造も小型簡略化することができる。上述の説明では図１４の培養装置に適用した場合について説明したが、図２の培養装置に適用してその廃液を利用してｐＨを計測するようにしてもよい。なお、図２１に示したペーハー測定部１７７を設けることには限定しない。すなわち、培養液の色の変化を見るようにしても、この場合、前述のＣＣＤカメラ３１をカラーカメラとし、演算によって求めてもよい。なお、チューブ１４１Ｃ、ピンチ弁１７６，１６３，１６４、ポンプ１４５、チューブ１４１ｄ、校正液タンク１６１，１６２は不要なのは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】本発明を適用してなる培養装置の基本構成を示すブロック図である。
【図２】本発明を適用してなる培養装置の機構部の詳細図であり、図１におけるシステムコントローラ１１を省いた実際の構成を示している。
【図３】図２の培養器３８の詳細構成を示す図である。
【図４】図２の培養装置の制御ブロック図の詳細を示し、複数の培養装置を接続してそれをプラント化した場合を示すブロック図である。
【図５】培養装置の動作を説明するためのフローチャートである。
【図６】図５のステップＳ５５の「培養器をシャッフリングし、均一化・播種」の動作の一例を示す図である。
【図７】上述の実施の形態に係る培養装置の培養器３８の第１の変形例を示す図であり、図７（Ａ）は、上面から見て図を、図７（Ｂ）はその側面図を示す。
【図８】上述の実施の形態に係る培養装置の培養器３８の第２の変形例を示す図である。
【図９】図８の培養器を用いた培養装置の動作を説明するためのフローチャートである。
【図１０】上述の実施の形態に係る培養装置の培養器３８の第３の変形例を示す断面図である。
【図１１】細胞を均一に播種する手法の一例を示す図である。
【図１２】上述の実施の形態における培養器とチューブの接続方法の一例を示す図である。
【図１３】上述の実施の形態における培養装置の一部の滅菌法を示す図である。
【図１４】本発明を適用してなる培養装置の別の実施の形態に係る機構部の詳細図を示す図である。
【図１５】図１４で使用される培養器の詳細を示す図である。
【図１６】培養器における第１ポート１４１、第２ポート１４２、第３ポート１４３の詳細を示す図である。
【図１７】図１５の一部断面を示す図であり、培養器内の培地を排出する場合を示す図である。
【図１８】図１４の保温箱の詳細構成を示す図であり、図１８（Ａ）は、保温箱の内部構造を分かり易く示したものであり、図１８（Ｂ）は保温箱の外観斜視図である。
【図１９】図１８（Ａ）の断熱構造の詳細を示すＳ−Ｓ面の断面を示す図である。
【図２０】図１４の培養装置の保温箱１６の制御ブロックを示す図であり、図４の中から説明に必要な部分を抜き出し、他は省略して示したものである。
【図２１】ペーハー測定部の詳細構成を示す図であり、図１４の一部を拡大して示したものである。
【図２２】ペーハー測定部の詳細構成を示す図であり、ペーハー測定部のセンサ部の詳細構成を示す図である。
【符号の説明】
【０１１３】
１…培養器
２…可撓性管部材
３…ポンプ
４…リザーブタンク
５…可撓性管部材
６…ポンプ
７…廃液タンク
８…駆動手段
９…カメラ
１０…光源
１１…システムコントローラ
１５…本体
１６…ガス透過膜
１７…培地
１８…チューブ接続部材
１９…チューブ接続部材
２０…堰
２１…供給チューブ
２２…ロータ
２３…廃液チューブ
２４…ピンチ弁
２５…ケーブルドラム
２６…巻き取りドラム
２７…カムフォロア
２８…ピニオン
２９…培養器駆動モータ
３０…保温箱（フレーム）
３１…ＣＣＤカメラ
３２…観察窓
３３…フィルター
３４…光源
３５…ガイド部材
３６…チューブ固定部材
３７…しごきポンプ
３８…培養器
３８１…傾斜部
３９…針
４０…エアーフィルター
４１…針
４２…エアーフィルター
５０…シャッターモータ
５１…シャッター
５２…培養前細胞を貯留する容器
５３…針
５６…細胞注入チューブ
５５…ピペッターアーム
５４…軸
５７…ピペッタ回転動モータ
５８…回転部材
５９…ピペッタ上下動モータ
６０…プーリ
６２…ホルダー部
６１…ベルト
６３…モータ
６５…ファン
６６ａ，６６ｂ…ピンチ弁
６７…培地タンク
６８…緩衝液タンク
６９，７０，７１…細胞剥離剤タンク
７２，１０５，７３，７４，７５…ピンチ弁
７８，７９…空気流入口
８０…断熱箱
８１…シャッターモータ
８２…シャッター
８３…針
８４…培養後細胞を貯留する容器
８５…ピペッタアーム
８７…軸
８８…ピペッタ回転動モータ
８９…回転部材
９０…ピペッタ上下動モータ
９１…プーリ
９２…ベルト
９３…ホルダー部
９４…モータ
９５…送りねじ
９６，９７…スタンド
９８…廃液回収箱
９９…ガイド部材
１００…チューブ固定部材
１０１…しごきポンプ
１０２…廃液タンク
１０３…ピンチ弁
１０４…ピンチ弁
１０６…温度センサ
１０７…継ぎ手
１０８…ヒータ
１２０…Ｉ／Ｏ
１２１…バス
１２２…ＣＰＵ
１２３…操作卓
１２４…メモリ
１２５…コンピュータネットワークドライバ
１２６…操作器
１２７，１２８，１２９…培養装置
１３０…制御監視装置
１６７，１６８，１６９…培養器
１７０ａ〜１７０ｄ…培養器
１７１…チューブ
１７４ａ〜１７４ｄ…チューブ接続部材
１７５ａ〜１７５ｄ…チューブ接続部材
１８２…供給チューブ
１８３，１８４…接続チューブ
１８５…廃液チューブ
１８６，１８７，１８８…ピンチ弁
１９１，１９２…培養補助板
１９５…培養器本体
１９７…供給チューブ
１９９…蓋
２０１，２０２…培養補助板
２５０…画像取り込みボード
２７８，２７９，２８２，２８３，２８４，２８５…鏡
２８０…ＣＣＤカメラ
２８１…光源
２８６…フィルター
２８８…ユニット
３００…培養器本体
３０１…蓋
３０２…供給用チューブ接続部材
３０７，３０８，３０９，３１０…磁石
３０３，３０４，３０５，３０６…球状部材
３１４…供給用チューブ接続部材
３１５…棒状部材
３２０…供給チューブ
３２１，３２７…栓
３２２，３２８…針
３２３…供給チューブ
３２４…シリンジ
３２５…培養器
３２６…廃液チューブ
３２９…廃液チューブ
３８１…傾斜部
１４０…培養器
１４１…第１ポート
１４２…第２ポート
１４３…第３ポート
１４１ｂ…廃液チューブ
１４４，１４５…しごきポンプ
１４２ｂ…供給チューブ
１４２ｃ…供給チューブ
１４２ｄ…補助供給チューブ
１４６，１４７…しごきポンプ
１４６ａ，１４７ａ…ピンチ弁
１４３ａ…チューブ
１４３ｂ…エアーフィルター
１４８…保持リング
１４９…フック
１５０…レバー
１５１…チルトモータ
１５３…ロータ
１６０…保温箱（インキュベータ）
１７０…加温バッグ
１７２…ピンチ弁
１７３…エアーフィルター
１７７…ペーハー測定部
２９ａ…培養器駆動モータ
１０９…ペルチェ素子
１１０…放熱ヒートシンク
１１１…吸熱ヒートシンク
２０１〜２０４…ヒータ
２０５，２０６…放熱板
２０５…二酸化炭素センサ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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