(57)【要約】【課題】  体液から、赤血球の混入が少ない高濃度の幹細胞液を、効率的に分離する方法、および短期間で効率よく体液由来幹細胞を培養・回収できる培養方法を提供する。【解決手段】  幹細胞を含んだ体液を上澄み２と沈殿３とに分画し、この上澄み２と沈殿３との界面４から下方に連続する前記沈殿の一部分であって、該沈殿の全体積の１／２以下の体積を有する部分を含む採取部分５を採取する。この採取部分の一部または前部から体液由来幹細胞を培養して増殖させる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を含んだ体液を上澄みと沈殿とに分画し、
前記上澄みと前記沈殿との界面から下方に連続する前記沈殿の一部分であって、該沈殿の全体積の１／２以下の体積を有する部分を含む採取部分を採取する体液由来幹細胞の分離方法。
【請求項２】
前記沈殿の一部分が、該沈殿の全体積の１／１０以上の体積を有する請求項１に記載の体液由来幹細胞の分離方法。
【請求項３】
前記採取部分が、前記上澄みと前記沈殿との界面から上方に連続する前記上澄みの一部分であって、該上澄みの全体積の１／２以下の体積を有する部分を含む請求項１又は２に記載の体液由来幹細胞の分離方法。
【請求項４】
前記分画が、１００Ｇ以上５００Ｇ以下の遠心加速度で、２分以上３０分以下の時間行う遠心を介して行われる、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の体液由来幹細胞の分離方法。
【請求項５】
前記分画が、前記幹細胞を含んだ体液を１時間以上静置することによって行われる、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の体液由来幹細胞の分離方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか一項に記載の体液由来幹細胞の分離方法により採取した前記採取部分の一部または全部から体液由来幹細胞を培養して増殖させる体液由来幹細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄液から間葉系幹細胞を分離する方法等、体液由来の幹細胞を分離する方法およびこれを利用した体液由来幹細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、ストローマ細胞、神経細胞、腱細胞等、様々な細胞への分化能を有しているため、これら細胞からなる組織を再生することができる細胞として知られている。このため、間葉系幹細胞を用いて組織再生や治療を行う試みが多くなされている。
【０００３】
間葉系幹細胞は骨髄液に多く含まれている。しかしながら、骨髄液から採取可能な間葉系幹細胞はごく微量であり、組織の再生に必要な量の間葉系幹細胞を得るためには、骨髄液中の間葉系幹細胞を濃縮してから分離する必要がある。あるいは更に、間葉系幹細胞を培養することにより増殖させる必要がある。
【０００４】
従来、骨髄液中の間葉系幹細胞を濃縮・分離してから培養する方法としては、採取した骨髄液を遠心した後に、その上澄み液を除去し、残った沈殿部分のみを播種する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。この方法においては、播種の際に間葉系幹細胞が均一になるように、前記沈殿部分が培養容器に播種される。こうして播種された間葉系幹細胞は、培養容器中で培養される。骨髄液中の間葉系幹細胞は、培養容器の底面に付着して増殖する性質を有している。
【特許文献１】特開２００４−４９１４２号公報（図１等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、上記の方法を採用した場合、前記沈殿部分には間葉系幹細胞が濃縮されるほかに、骨髄液中の赤血球も大量に集められる。このため、播種した際に培養容器中に赤血球が大量に散在することになる。赤血球は浮遊細胞であるが、静置された培養容器中で沈降し、培養容器の底一面を覆うため、間葉系幹細胞が培養容器の底に接着するのを阻害する。従って、骨髄播種後、間葉系幹細胞を回収できるまでの初代培養期間は早くても１０日、遅い場合は約２週間かかっていた。このため、より短期間で効率よく間葉系幹細胞を培養・回収できるようにするために、赤血球の混入が少なく、より高濃度の間葉系幹細胞液を骨髄液から分離する方法が望まれていた。
【０００６】
この発明は上述した事情に鑑みてなされてものであって、骨髄液、末梢血、臍帯血等の体液から、赤血球の混入が少ない高濃度の幹細胞液を、効率的に分離する方法を提供することを目的としている。さらにこの発明は、短期間で効率よく体液由来幹細胞を培養・回収できる培養方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従来の骨髄由来間葉系幹細胞の分離方法および培養方法における以上のような問題点を解決するために、本発明者は鋭意研究したところ、遠心または静置後の骨髄液の沈殿部分には、下部から上部にかけて間葉系幹細胞が濃くなっていく濃度分布があることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の体液由来幹細胞の分離方法は、以下の手段を提供する。
【０００８】
本発明は、幹細胞を含んだ体液を上澄みと沈殿とに分画し、前記上澄みと前記沈殿との界面から下方に連続する前記沈殿の一部分であって、該沈殿の全体積の１／２以下の体積を有する部分を含む採取部分を採取する体液由来幹細胞の分離方法を提供する。
この発明によれば、体液由来幹細胞の培養に好適に用いられる、赤血球の混入が少なく高濃度の幹細胞液を、体液から効率的に分離することができる。
【０００９】
本発明の体液由来幹細胞の分離方法において、前記沈殿の一部分が、該沈殿の全体積の１／１０以上の体積を有することが好ましい。
採取する沈殿の量の下限を上記のとおりとすることにより、培養するのに十分な量の間葉系幹細胞を採取することができる。
【００１０】
また、本発明の体液由来幹細胞の分離方法において、前記採取部分が、前記上澄みと前記沈殿との界面から上方に連続する前記上澄みの一部分であって、該上澄みの全体積の１／２以下の体積を有する部分を含むことが好ましい。
上澄みの下部にも幹細胞が含まれるため、上記の範囲の上澄みも採取することにより、より効率よく幹細胞を採取することができる。
【００１１】
また、本発明の体液由来幹細胞の分離方法において、前記分画が、１００Ｇ以上５００Ｇ以下の遠心加速度で、２分以上３０分以下の時間行う遠心を介して行われることが好ましい。
上記条件で遠心をおこなうことにより、幹細胞を損傷または破壊することなく、効率的かつ経済的に、体液を沈殿と上澄みとに十分に分画することができる。
【００１２】
また、上記遠心に代えて、前記幹細胞を含んだ体液を１時間以上静置することによって前記分画を行ってもよい。
この場合、簡便な方法で、効率的かつ経済的に、体液を沈殿と上澄みとに十分に分画することができる。
【００１３】
本発明の体液由来幹細胞の分離方法で得られた間葉系幹細胞等の体液由来幹細胞をそのまま生体内に移植することにより、組織の再生が促進される。また、必要に応じて体液由来幹細胞を、それぞれの組織に適用される生体材料や分化因子、増殖因子、栄養物質などと組み合わせた後に、リアルタイムで体内に移植することもできる。
【００１４】
さらに本発明は、前記体液由来幹細胞の分離方法により採取した前記採取部分の一部または全部から体液由来幹細胞を培養して増殖させる体液由来幹細胞の培養方法を提供する。
この発明によれば、赤血球の混入が少なく高濃度の幹細胞液から培養を行うので、短期間で効率よく幹細胞を培養・回収できる。
【００１５】
さらに、体液由来幹細胞を分離した後に、前記本発明の培養方法により体液由来幹細胞を培養することにより、より多くの体液由来幹細胞を得ることが可能となる。ここで得られた間葉系幹細胞等の体液由来幹細胞を組織再生に用いれば、再生能力はさらに向上する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、体液から赤血球の混入が少なく高濃度の幹細胞液を分離することでき、その幹細胞液を用いることにより、短期間で効率よく体液由来幹細胞を培養・回収することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に、本発明の体液由来幹細胞の分離方法および培養方法に係る実施形態について、図面を参照して以下に説明する。
【００１８】
本実施形態で分離・培養する体液由来幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞である。本実施形態に係る骨髄由来間葉系幹細胞の分離方法では、患者から採取した骨髄液はまず遠心分離容器１に収容される。遠心分離容器１は用いられる遠心分離装置に適用したものであればよく、例えば、容量１５ｍｌの遠沈管を用いることができる。収容される骨髄液の量は特に限定されず、遠心分離容器および遠心分離装置の使用において許容される範囲内であればよい。
【００１９】
次に、骨髄液を収容した遠心分離容器１は、閉栓後、遠心分離装置（図示略）の所定の位置に収容される。遠心分離装置としては、細胞分画に通常用いられる遠心分離機を用いることができる。遠心分離容器１を遠心分離装置に収容した後、遠心分離装置を操作して遠心分離容器１を旋回する。
【００２０】
遠心分離装置の回転速度は、骨髄液に作用する遠心加速度が１００Ｇ以上５００Ｇ以下となる範囲が好ましい。遠心加速度が１００Ｇ未満では、沈殿と上澄みとが十分に分画されず、好ましくない。また、遠心加速度が５００Ｇを超えると、細胞が損傷または破壊される場合があるので、好ましくない。
【００２１】
遠心時間は、２分以上３０分以下が好ましい。遠心時間が２分未満では、沈殿と上澄みとが十分に分画されず、好ましくない。また、遠心時間が３０分を超えても時間に見合った分離効果が得られないので、効率および経済性の点から好ましくない。
【００２２】
通常、遠心加速度が大きいほど、遠心時間は短くてよい。例えば、骨髄液に作用する遠心加速度が３００Ｇとなる回転速度で遠心を行う場合、遠心時間は５分間でよい。
【００２３】
上記のように骨髄液を遠心すると、図１に示すように、遠心分離容器１内の骨髄液は上澄み２と沈殿３とに分画される。
【００２４】
また、上記遠心に代えて、容器に収容した骨髄液を静置することによって上澄み２と沈殿３とを分画しても良い。
静置時間は、１時間以上が好ましい。静置時間が１時間未満では、沈殿と上澄みとが十分に分画されず、好ましくない。また、静置時間の上限は、細胞が生存できる範囲であれば特に限定されないが、通常は１週間以内である。
【００２５】
この沈殿３中において、間葉系幹細胞は下部から上部にかけて濃くなっていく濃度分布を有している。一方、赤血球は、沈殿３中の下部から上部にかけて薄くなっていく濃度分布を有している。なお、これら濃度分布における濃度勾配は、沈殿３底部から上澄み２との界面４にかけて直線的に変化するものではなく、ある一定の箇所で急激に増加又は減少しているものと考えられる。
【００２６】
次いで、沈殿３の上澄み２との界面４から下方の特定範囲を採取することにより、間葉系幹細胞が濃く、赤血球が少ない部分を得られることがわかった。本発明においては、採取部分５は上澄み２と沈殿３との界面４から下方に連続する、沈殿３の一部分を含むものとし、この沈殿３の一部分の体積は、沈殿３の全体積の１／２以下とした。この範囲を超えて沈殿３を採取すると、採取部分における赤血球の割合が多くなりすぎて、間葉系幹細胞を培養する際に増殖が阻害されてしまうからである。
【００２７】
また、採取部分５に含まれる沈殿３の一部分の体積は、沈殿３の全体積の１／１０以上であることが好ましい。この量より少ないと、培養するのに十分な間葉系幹細胞が得られないからである。
【００２８】
採取部分５に含まれる沈殿３の一部分の体積は、沈殿３の全体積の１／３が特に好ましい。この部分にほとんどの間葉系幹細胞が含まれていると考えられるためである。
【００２９】
また、上澄み２の下部にも間葉系幹細胞が含まれるため、効率よく間葉系幹細胞を採取するために採取部分５が上澄み２の下部の一部分を含んでいることが好ましい。この場合、採取部分５に含まれる上澄み２の部分は、上澄み２と沈殿３との界面４から上方に連続する上澄み２の一部分であって、上澄み２の全体積の１／２以下の体積を有する部分であることが好ましい。上澄み２のこの範囲より上の部分では間葉系幹細胞の濃度が低くなり、間葉系幹細胞を効率よく採取できるという効果が得られないので好ましくない。残りの上澄みは、間葉系幹細胞培養の増殖促進物として利用可能となる。
【００３０】
採取部分５を採取する方法は、上記範囲の採取部分５を採取できる方法であれば特に限定されないが、例えば、まず上澄み２上部の採取部分５に含まれない部分をピペットを用いて除去し、次に採取部分５をピペットを用いて採取する方法を採用することができる。採取はピペットを手で操作して行ってもよく、またロボット等の自動制御された装置を用いて行ってもよい。採取部分５の採取後、残った沈殿の部分は赤血球を多く含むため廃棄される。
【００３１】
上記の方法で分離・採取された採取部分５は、間葉系幹細胞の濃度が濃く、赤血球の濃度が薄いものとなる。
【００３２】
次に、上記の方法で分離・採取された採取部分５を播種して、骨髄由来間葉系幹細胞を培養する方法について説明する。
【００３３】
上記のとおり採取された採取部分５は、播種の際に間葉系幹細胞が均一になるように、いったん所定の容器内で培地と混合される。培地は、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）と、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）またはヒト血清と、抗生剤とを、例えば、８４：１５：１の配合割合で混合したものである。抗生剤は、例えば、ペニシリン系抗生物質である。
【００３４】
このようにして採取部分５と培地とを混合して得られた混合液は、通常は分割されて複数の培養容器に移される。本発明によれば、採取部分５に高濃度の間葉系幹細胞が含まれているので、培養容器の数は沈殿３のすべてを用いる場合の半数以下でよい。従って、培養の手間が減り、またコストも削減できる。
【００３５】
培養は、前記混合液を収容した培養容器をインキュベータ内に配置して、例えば、３７±０．５℃、５％ＣＯ２濃度に保持することにより行われる。培養容器内においては、間葉系幹細胞が培養容器の底面に付着しながら成長する。そして、培養期間の所定の時期、例えば、１日置きに定期的に培地を交換することにより、間葉系幹細胞の栄養分を補い、また老廃物等の不要分を除去する。
【００３６】
このようにして６〜８日で初代培養が終了する。これは、沈殿３のすべてを用いて培養を行った場合の初代培養期間（１０日〜約２週間）と比べて大幅に短縮されている。
【００３７】
培養が終了すると、増殖した間葉系幹細胞が培養容器の底面に付着した状態で得られる。その後、例えば、トリプシンのような蛋白質分解酵素を培養容器内に供給することにより、間葉系幹細胞を培養容器底面から引き剥がす。引き剥がされた間葉系幹細胞は、例えば、遠心分離機にかけることによりトリプシン等の他の成分から分離される。
【００３８】
あるいは、トリプシンのような蛋白質分解酵素を用いる代わりに、温度応答性培養容器を使用することにして培養容器の底面から間葉系幹細胞を引き剥がしてもよい。
温度応答性培養容器は、その底面に温度応答性高分子ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を共有結合で固定したものである。このような温度応答性培養容器は、その底面が、３２℃を境界温度として、それ以上では、市販の細胞用培養容器と同程度の弱い疎水性を呈するが、温度を境界温度以下に冷却することにより高い親水性を呈する。
【００３９】
したがって、培養温度の３７℃では、間葉系幹細胞は、疎水性を呈する培養容器の底面に付着して成長するが、培養終了後に、培養容器の温度を３２℃以下に冷却することにより、底面を親水性に切り替えて、細胞を容易に剥離させることができる。このようにすることで、蛋白質分解酵素を使用しなくて済むので、細胞を傷つけることなく非侵襲的に回収することができる。
【００４０】
なお、上記の例では、抗生剤として、ペニシリン系抗生物質を例に挙げて説明したが、これに限定されるものではなく、これに代えて、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
【００４１】
また、上記の例においては、培地と血清と抗生剤との配合割合が、例えば、８４：１５：１となることとしたが、これに代えて、ＭＥＭ：ＦＢＳ：抗生剤＝８０〜９０：５〜１０：０．１〜５となるようにしてもよい。
【００４２】
また、培地構成成分を、ＭＥＭとＦＢＳと抗生剤の３成分からなるものとして説明したが、これに代えて他の培地構成成分、血清あるいは、追加の培地構成成分を採用することにしてもよい。特に、成長因子、例えば、サイトカイン、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を培地構成成分として混合することにしてもよい。また、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤を混合することにしてもよい。
【００４３】
なお、上記の実施形態では、幹細胞（間葉系幹細胞）を含む体液（骨髄液）を上澄みと沈殿とに分画するために遠心分離を採用しているが、本発明における分画の方法は遠心分離に限定されず、例えば、体液を遠心せずに静置するだけで、自然沈降により上澄みと沈殿とに分画する方法であってもよい。この場合、１時間以上静置を行えば、十分に分画することが可能である。
【００４４】
また、上記の実施形態では、体液由来幹細胞として骨髄由来間葉系幹細胞を分離・培養する方法について述べたが、体液由来の幹細胞（間葉系幹細胞、造血幹細胞）は基本的には単核球に存在すると考えられており、本発明における幹細胞の分画では主に単核球が分画されると考えられるので、本発明の体液由来幹細胞の分離・培養方法は造血幹細胞等の間葉系幹細胞以外の幹細胞にも適用される。また、幹細胞は骨髄由来のものに限定されず、末梢血や臍帯血等の体液に由来するものであってもよい。骨髄由来間葉系幹細胞以外の体液由来幹細胞を分離・培養する際の分離や採取の条件は、上記実施形態において記載した条件と同じである。
以下、骨髄以外の体液（末梢血、臍帯血）由来の間葉系幹細胞の分離・培養方法および体液（骨髄、末梢血、臍帯血）由来の造血幹細胞の分離・培養方法について述べる
【００４５】
（１）骨髄以外の体液（末梢血、臍帯血）由来の間葉系幹細胞の分離・培養方法
骨髄と同じように、末梢血や臍帯血中にも大量な赤血球が存在し、間葉系幹細胞はわずかに存在する。従って、末梢血や臍帯血を用いる場合も、骨髄液を用いる場合と同様に、赤血球の除去および間葉系幹細胞の濃縮が必要となる。この場合も、骨髄液を用いる上記実施形態の分離・培養方法を採用することができる。
【００４６】
（２）体液（骨髄、末梢血、臍帯血）由来の造血幹細胞の分離・培養方法
造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＨＳＣ）は、自己再生能を有し、赤血球、白血球、血小板へと分化・成熟する、いわゆる分化成熟能を有する細胞である。
従来、造血幹細胞は細胞表面マーカーＣＤ３４を用いてＣＤ３４陽性細胞を分画し、造血幹細胞用培地および増殖因子を用いて体外増幅を行っていた。しかし、赤血球などが大量に存在するため、ＣＤ３４マーカーを用いた分画や解析は困難であった。
体液由来の造血幹細胞の分離方法に本発明の分離方法を適用した場合は、遠心等による分画後に上澄みと沈殿との界面付近に造血幹細胞の元になる単核球が多く含まれるため、図１の中央部に示した採取部分５を採取することにより、赤血球の除去および造血幹細胞の濃縮ができる。さらに、ＣＤ３４マーカーを組み合わせることにより、より効率的に造血幹細胞を分離することができる。
造血幹細胞を培養する際には、以下に示す培地および増殖因子のいずれかを組み合わせて用いることができる。
培地：
Stemline（商標） Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium
ステムプロ−３４（StemPro-34）  無血清培地
増殖因子：
SCF (stem cell factor)、FL (flk2/flt3 ligand)、IL (interleukin)-1、IL-3、IL-6、IL-11、G-CSF
(granulocyte colony-simulating factor)、M-CSF (macrophage colony-stimulating
factor)、GM-CSF、IL-3/GM-CSF、fusion protein (PIXY321)、Epo
(erythropoietin)、TPO (thrombopoietin)
【００４７】
以下、本発明の実施例、比較例および参考例によって本発明をさらに詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本願の各請求項の範囲において任意に変更可能である。
【００４８】
（実施例１）
患者から骨髄液を採取し、容量１５ｍｌの遠沈管に入れた。この遠沈管を遠心分離機に収容し、骨髄液に作用する遠心加速度が３００Ｇとなるような回転速度で、５分間遠心した。遠心後、骨髄液は上澄みと沈殿とに分画された。
【００４９】
続いて、上澄みと沈殿との界面から上方に連続する上澄みの一部分であって、上澄みの全体積の１／３の体積を有する部分と、前記界面から下方に連続する沈殿の一部分であって、沈殿の全体積の１／２の体積を有する部分とを採取した。
【００５０】
次に、採取した上澄みと沈殿との混合物を播種する試料として容器に取り、ＤＭＥＭ、ＦＢＳ、ペニシリン系抗生物質を８４：１５：１の配合割合で混合した培養培地と混合した。試料と培養培地との混合割合は１：１０とした。
【００５１】
こうして得られた試料と培養培地の混合物を、１０ｍｌ採取して培養皿に移し、３７±０．５℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータで１０日間培養した。図２は本実施例の培養後の状態を示す写真である。培養皿には３．２３×１０６個の間葉系幹細胞が得られた。
【００５２】
（比較例１）
前記実施例１で採取しなかった、沈殿の残りの１／２を試料として容器に取り、上記実施例１と同様の培養培地と混合した。試料と培養培地の混合割合は、上記実施例１と同様に、１：１０とした。
【００５３】
こうして得られた試料と培養培地の混合物を、１０ｍｌ採取して培養皿に移し、上記実施例１と同じ条件で１０日間培養した。図３は本比較例の培養後の状態を示す写真である。培養皿には２．８２×１０５個の間葉系幹細胞が得られた。
【００５４】
図２および図３から、骨髄液を遠心した後で得られる沈殿の上部を用いて培養を行った方が、沈殿の下部を用いて培養を行うより、より多くの間葉系幹細胞が得られることがわかる。これは、沈殿の上部においては、沈殿の下部に比較して、間葉系幹細胞の濃度がより高く、赤血球の濃度がより低いためと考えられる。
【００５５】
（参考例１）
本参考例ならびに下記参考例２〜参考例５および比較例２〜比較例３では、以下の試料、器具、機器、試薬を用いた。
［試料］
以下のドナー由来の骨髄液を用いた。
ロットＡ：２５歳女性、採取量１５ｍｌ、採取日２００４年９月３０日
ロットＢ：２３歳男性、採取量２５ｍｌ、採取日２００４年１０月２９日
ロットＣ：２０歳女性、採取量２５ｍｌ、採取日２００４年１２月２日
【００５６】
［器具］
１ｍｌピペット：  ＦＡＬＣＯＮ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）製、カタログ番号：３５６５２１
５ｍｌピペット：  ＦＡＬＣＯＮ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）製、カタログ番号：３５６５４３
１０ｍｌピペット：  ＦＡＬＣＯＮ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）製、カタログ番号：３５６５５１
２５ｍｌピペット：  ＦＡＬＣＯＮ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）製、カタログ番号：３５６５２５
５０ｍｌピベット：  ＦＡＬＣＯＮ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）製、カタログ番号：３５７５５０
１５ｍｌ遠心管：  ＦＡＬＣＯＮ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）製、カタログ番号：３５２０９６
５０ｍｌ遠心管：  住友ベークライト製、カタログ番号：ＭＳ−５６５００
細胞培養ディッシュ（９０ｍｍφ×２０ｍｍ）：  住友ベークライト製、カタログ番号：ＭＳ−１３９００
【００５７】
［機器］
ピペッター：  アズワン販売、型番：９９０８２００
血球計算盤：  アズワン販売（ＴＡＴＡＩ製）、型番：Ａ１５１
ＣＯ２インキュベータ：  タバイエスペック，  機種：Ｍｏｄｅｌ  ３１１０
遠心機：  クボタ商事，  機種：８４１０
顕微鏡：  オリンパス製、型番：ＣＫ−４０
安全キャビネット：  日立，機種：ＳＣＶ−１３０５ＥＣ
４℃ショーケース：  三洋製、型番：ＭＰＲ−３１１ＤＲ（Ｈ）
−３０℃フリーザ：  三洋製、型番：ＭＤＦ−Ｕ３３３
オートクレーブ：  三洋製、型番：ＭＬＳ−３０２０
超純水システム：  ＭｉｌｌｉＱ製、ＭＱ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ａ１０
乾熱滅菌機：  ヤマト製、型番：ＳＧ４００
天秤：  島津製、型番：ＡＷ  ３２０、ｄ＝０．１ｍｇ
恒温槽：  アズワン製、型番：ＴＲ−１Ａ
【００５８】
［試薬］
ＤＭＥＭ培地：  インビトロジェン製、カタログ番号：１１８８５−０８４、ロット番号：１２０６７９３
０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ＋０．５３ｍＭＥＤＴＡ−４Ｎａ：  インビトロジェン（株）、カタログ番号：２５３００−０５４、ロット番号：１２０５９２１
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）：  ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号：１２００３−５００Ｍ、ロット番号：２Ｈ０４９８ＲＩ
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（−）：  インビトロジェン、カタログ番号：２００１２−０２７、ロット番号：１２１３０６０
フィブラストスプレー：  科研製薬、ロット番号：１３１０７２
Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物：  和光純薬工業、カタログ番号：０１９−１２０６３、ロット番号：ＣＥＲ１９１３
【００５９】
β−ＧＰ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ２−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｉｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔ  ｎ−Ｈｙｄｒａｔｅ（グリセロール２−りん酸二ナトリウムｎ水和物））：  和光純薬工業、カタログ番号：１９１−０２０４２、ロット番号：ＡＳＫ１４４２
デカドロン注射溶液（ＤＥＸ）：  万有製薬、ロット番号：８ＥＤ１０Ｐ
ファンギゾン：  ブリストルマイヤーズ、ロット番号：Ｆ２Ｖ２２３２
ゲンタシン：  シェリングプラウ、ロット番号：Ｃ６０２Ｄ，Ｃ４０７Ｍ
ギムザ染色液：  メルク（株）、カタログ番号：１０９２０４
【００６０】
上記の試料、器具、機器、試薬を用いて、以下の実験を行った。
［実験］
使用培地および培養培地：
使用培地    ＯＢＧＭ：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ＯＢＡｎｔｉ
培養培地    ＯＢＧＭ  ＋  ＯＢｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）
＋  ＯＢＶＣ（５０μｇ／ｍｌ）
【００６１】
播種方法：
ロットＡの骨髄液の１４ｍｌを１日静置したところ、８ｍｌの上澄みと６ｍｌの沈殿とに分かれた。
上澄み１ｍｌを採取して細胞培養ディッシュに播種し、初代培養を開始した。このサンプルをサンプルＳ−１とした。
次に、上記採取・静置した骨髄液から余分の上澄みを除去後、沈殿部分を上から下まで０．５ｍｌずつ１２回採取し、計１２枚の細胞培養ディッシュにそれぞれ播種し、初代培養を開始した。沈殿部分の上から採取したサンプルから順に、サンプルＤ−１〜サンプルＤ−１２とした。
【００６２】
培養４日後に上澄みサンプルであるサンプルＳ−１および沈殿サンプルの１枚目であるサンプルＤ−１を培地交換したものを新しい細胞培養ディッシュに播種した。それぞれのサンプルをサンプルＭＳ−１およびサンプルＭＤ−１とした。
培養１０日後に、各サンプルについて５％ギムザ染色液によるコロニー染色を行った。
【００６３】
結果：
サンプルＳ−１、サンプルＤ−１〜サンプルＤ−１２、サンプルＭＳ−１およびサンプルＭＤ−１のコロニー染色写真を、それぞれ図４〜図１８に示す。
静置によって得られた上澄みおよび沈殿を用いてそれぞれに初代培養を行なった結果、沈殿部分の一番上から０．５ｍｌ分を採取したサンプル（サンプルＤ−１およびサンプルＭＤ−１）のみ間葉系幹細胞を大量に得ることができ、それより下の沈殿部分には殆ど間葉系幹細胞がいないことが分かった。また、上澄みの部分から採取したサンプル（サンプルＳ−１およびサンプルＭＳ−１）では少量の間葉系幹細胞が得られたことから、上澄みと沈殿の界面に近い部分に間葉系幹細胞が存在していると示唆された。よって、静置法で分画した骨髄液においても、遠心法で分画した骨髄液と同様に、骨髄液中の間葉系幹細胞の濃度分布がはっきりしていることが確認された。静置法により得られた沈殿部分の上の部分を播種し、培地交換液を播種しても（サンプルＭＤ−１）さらに細胞の増殖が見られたことから、沈殿上部に大量の間葉系幹細胞が濃縮されていることが確認された。
【００６４】
（比較例２、参考例２および参考例３）
参考例１に記載の試料、器具、機器、試薬を用いて、以下の実験を行った。
［実験］
使用培地および培養培地：
使用培地    ＯＢＧＭ：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ＯＢＡｎｔｉ
培養培地    ＯＢＧＭ  ＋  ＯＢｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）
＋  ＯＢＶＣ（５０μｇ／ｍｌ）
【００６５】
播種方法および培養結果：
ロットＢの骨髄液を１０ｍｌずつ採取した容器を２本と、５ｍｌ採取した容器を１本用意し、それぞれを４時間静置した。これら骨髄液について、以下の比較例２、参考例２および参考例３の播種を行い、培養した細胞を回収した。
【００６６】
比較例２（懸濁法：  懸濁した骨髄液を播種）：
５ｍｌの骨髄液を採取した容器中の骨髄液を懸濁し、内２ｍｌを取って、２０ｍｌの培地で希釈した。この希釈液の５ｍｌ、２．５ｍｌおよび１．０ｍｌをそれぞれ別々の２５ｃｍ２フラスコに採取した。従って、サンプルの播種密度は、それぞれ０．５ｍｌ／枚、０．２５ｍｌ／枚および０．１ｍｌ／枚であった。それぞれのサンプルを、サンプルＢ１−５．０−１、サンプルＢ１−２．５−１およびサンプルＢ１−１．０−１とした。なお、各サンプルは、それぞれ同じ播種密度のものを２つずつ調製した。
培養１０日後に、各サンプルについて５％ギムザ染色液によるコロニー染色を行い、細胞数を数えた。
【００６７】
各サンプルについて、播種密度ならびに培地１枚当たりおよび骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌあたりの回収細胞数を表１に示す
図１９は、比較例２の各サンプルの播種密度と培地１枚当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。図２０は、比較例２の各サンプルの播種密度と骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌ当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【００６８】
参考例２（静置法：  骨髄液を静置により分画後、沈殿部を播種）：
１０ｍｌの骨髄液を採取した容器のうちの１本には、前記４時間の静置の後、そのままの状態で２ｍｌの上澄みおよび８ｍｌの沈殿が得られた。この容器から、上澄みの上部１．２ｍｌを除去した。
この容器中の沈殿のうち、上から２ｍｌ（以下、「６ｍｌから８ｍｌまでの沈殿」ともいう）を採取し、２０ｍｌの培地で希釈した。この希釈液の５ｍｌ、２．５ｍｌおよび１．０ｍｌをそれぞれ別々の２５ｃｍ２フラスコに採取した。従って、サンプルの播種密度は、それぞれ０．５ｍｌ／枚、０．２５ｍｌ／枚および０．１ｍｌ／枚であった。それぞれサンプルＢ２．８−５．０−１、サンプルＢ２．８−２．５−１およびサンプルＢ２．８−１．０−１とした。
【００６９】
次に、残った沈殿のうち、上から２ｍｌ（以下、「４ｍｌから６ｍｌまでの沈殿」ともいう）を採取し、２０ｍｌの培地で希釈した。この希釈液の５ｍｌ、２．５ｍｌおよび１．０ｍｌをそれぞれ別々の２５ｃｍ２フラスコに採取した。従って、サンプルの播種密度は、それぞれ０．５ｍｌ／枚、０．２５ｍｌ／枚および０．１ｍｌ／枚であった。それぞれサンプルＢ２．６−５．０−１、サンプルＢ２．６−２．５−１およびサンプルＢ２．６−１．０−１とした。
次に、残りの４ｍｌの沈殿を上から１ｍｌずつ採取した（以下、上から順に「３ｍｌから４ｍｌまでの沈殿」、「２ｍｌから３ｍｌまでの沈殿」、「１ｍｌから２ｍｌまでの沈殿」および「下から１ｍｌまでの沈殿」ともいう）。採取した各沈殿は、それぞれ二分して、２つの２５ｃｍ２フラスコに取った。従って、各フラスコの播種密度は０．５ｍｌ／枚であった。３ｍｌから４ｍｌまでの沈殿、２ｍｌから３ｍｌまでの沈殿、１ｍｌから２ｍｌまでの沈殿および下から１ｍｌまでの沈殿より得られたサンプルを、それぞれサンプルＢ２．４−５．０−１、サンプルＢ２．３−５．０−１、サンプルＢ２．２−５．０−１およびサンプルＢ２．１−５．０−１とした。
培養１０日後に、各サンプルについて細胞解離剤トリプシンによって細胞を回収し、細胞数を数えた。
【００７０】
各サンプルについて、播種密度ならびに培地１枚当たりおよび骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌあたりの回収細胞数を表１に示す。
図２１は、参考例２の各サンプルの沈殿採取位置と培地１枚当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。図２２は、参考例２の各サンプルの沈殿採取位置と骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌ当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【００７１】
参考例３（遠心法：  骨髄液を遠心により分画後、沈殿部を播種）：
１０ｍｌの骨髄液を採取したもう一本の容器は、３００Ｇで５分間遠心処理した。その結果、４．５ｍｌの上澄みおよび５．５ｍｌの沈殿が得られた。上澄みのうち、上から４．０ｍｌを除去した。
沈殿のうち、上から２ｍｌ（以下、「３．５ｍｌから５．５ｍｌまでの沈殿」ともいう）を採取し、２０ｍｌの培地で希釈した。この希釈液の５ｍｌ、２．５ｍｌおよび１．０ｍｌをそれぞれ別々の２５ｃｍ２フラスコに採取した。従って、サンプルの播種密度は、それぞれ０．５ｍｌ／枚、０．２５ｍｌ／枚および０．１ｍｌ／枚であった。それぞれのサンプルを、サンプルＢ３．５−５．０−１、サンプルＢ３．５−２．５−１およびサンプルＢ３．５−１．０−１とした。なお、各サンプルは、それぞれ同じ播種密度のものを２つずつ調製した。
【００７２】
残りの３．５ｍｌの沈殿の上から、１ｍｌずつを３回採取した（以下、上から順に「２．５ｍｌから３．５ｍｌまでの沈殿」、「１．５ｍｌから２．５ｍｌまでの沈殿」および「０．５ｍｌから１．５ｍｌまでの沈殿」ともいう）。採取した各沈殿は、それぞれ二分して、２つの２５ｃｍ２フラスコに採取した。従って、各フラスコの播種密度は０．５ｍｌ／枚であった。２．５ｍｌから３．５ｍｌまでの沈殿、１．５ｍｌから２．５ｍｌまでの沈殿および０．５ｍｌから１．５ｍｌまでの沈殿より得られたサンプルを、それぞれサンプルＢ３．３−５．０−１、サンプルＢ３．２−５．０−１およびサンプルＢ３．１−５．０−１とした。
培養１０日後に、各サンプルについて細胞解離剤トリプシンによって細胞を回収し、細胞数を数えた。
【００７３】
各サンプルについて、播種密度ならびに培地１枚当たりおよび骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌあたりの回収細胞数を表１に示す
図２３は、参考例３の各サンプルの沈殿採取位置と培地１枚当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。図２４は、参考例３の各サンプルの沈殿採取位置と骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌ当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【００７４】
【表１】
2006149375.tif 000003
【００７５】
（比較例３、参考例４および５）
参考例１に記載の試料、器具、機器、試薬を用いて、以下の実験を行った。
［実験］
使用培地および培養培地
使用培地    ＯＢＧＭ：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ＯＢＡｎｔｉ
培養培地    ＯＢＧＭ  ＋  ＯＢｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）
＋  ＯＢＶＣ（５０μｇ／ｍｌ）  
【００７６】
播種方法および培養結果：
ロットＣの骨髄液を１０ｍｌずつ採取した容器を２本と、５ｍｌ採取した容器を１本用意し、それぞれを４時間静置した。これら骨髄液について、以下の比較例３、参考例４および参考例５の播種を行い、培養した細胞を回収した。
【００７７】
比較例３（懸濁法：  懸濁した骨髄液を播種）：
５ｍｌの骨髄液を採取した容器中の骨髄液を懸濁し、内２ｍｌを取って、２０ｍｌの培地で希釈した。この希釈液の５ｍｌ、２．５ｍｌおよび１．０ｍｌをそれぞれ別々の２５ｃｍ２フラスコに採取した。従って、サンプルの播種密度は、それぞれ０．５ｍｌ／枚、０．２５ｍｌ／枚および０．１ｍｌ／枚であった。それぞれのサンプルを、サンプルＣ１−５．０−１、サンプルＣ１−２．５−１およびサンプルＣ１−１．０−１とした。なお、各サンプルは、それぞれ同じ播種密度のものを２つずつ調製した。
培養１０日後に、各サンプルについて細胞解離剤トリプシンによって細胞を回収し、細胞数を数えた。
【００７８】
各サンプルについて、播種密度ならびに培地１枚当たりおよび骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌあたりの回収細胞数を表２に示す
図２５は、比較例３の各サンプルの播種密度と培地１枚当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。図２６は、比較例３の各サンプルの播種密度と骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌ当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【００７９】
参考例４（静置法：  骨髄液を静置により分画後、沈殿部を播種）：
１０ｍｌの骨髄液を採取した容器のうちの１本には、前記４時間の静置の後、そのままの状態で４ｍｌの上澄みおよび６ｍｌの沈殿が得られた。この容器から、上澄みの上部２．５ｍｌを採取して、播種した。このサンプルをサンプルＣＳ２−２．５−１とした。
続いて残りの上澄みの上部１．０ｍｌを採取して、播種した。このサンプルをサンプルＣＳ２−１．０−２とした。
【００８０】
次に、残りの上澄み０．５ｍｌおよび沈殿６ｍｌのうち、上から２ｍｌを採取した（以下、「４．５ｍｌから６．５ｍｌまでの沈殿と上澄み」ともいう）。採取した沈殿と上澄みの混合液を２０ｍｌの培地で希釈した。この希釈液の５ｍｌ、２．５ｍｌおよび１．０ｍｌをそれぞれ別々の２５ｃｍ２フラスコに採取した。従って、サンプルの播種密度は、それぞれ０．５ｍｌ／枚、０．２５ｍｌ／枚および０．１ｍｌ／枚であった。それぞれサンプルＣ２．６−５．０−１、サンプルＣ２．６−２．５−１およびサンプルＣ２．６−１．０−１とした。
次に、残りの４．５ｍｌの沈殿から２ｍｌを採取した（以下、「２．５ｍｌから４．５ｍｌまでの沈殿」ともいう）。採取した沈殿を２０ｍｌの培地で希釈した。この希釈液の５ｍｌ、２．５ｍｌおよび１．０ｍｌをそれぞれ別々の２５ｃｍ２フラスコに採取した。従って、サンプルの播種密度は、それぞれ０．５ｍｌ／枚、０．２５ｍｌ／枚および０．１ｍｌ／枚であった。それぞれサンプルＣ２．４−５．０−１、サンプルＣ２．４−２．５−１およびサンプルＣ２．４−１．０−１とした。
【００８１】
次に、残りの２．５ｍｌの沈殿を上から０．５ｍｌずつ採取した（以下、上から順に「２ｍｌから２．５ｍｌまでの沈殿」、「１．５ｍｌから２ｍｌまでの沈殿」、「１ｍｌから１．５ｍｌまでの沈殿」、「０．５ｍｌから１ｍｌまでの沈殿」および「下から０．５ｍｌまでの沈殿」ともいう）。採取した各沈殿を、５つの２５ｃｍ２フラスコに取った。従って、各フラスコの播種密度は０．５ｍｌ／枚であった。２ｍｌから２．５ｍｌまでの沈殿、１．５ｍｌから２ｍｌまでの沈殿、１ｍｌから１．５ｍｌまでの沈殿、０．５ｍｌから１ｍｌまでの沈殿および下から０．５ｍｌまでの沈殿より得られたサンプルを、それぞれサンプルＣ２−２．５−１、サンプルＣ２−２．０−１、サンプルＣ２−１．５−１、サンプルＣ２−１．０−１、およびサンプルＣ２−０．５−１とした。
培養１０日後に、各サンプルについて細胞解離剤トリプシンによって細胞を回収し、細胞数を数えた。
【００８２】
サンプルＣＳ２−２．５−１、サンプルＣＳ２−１．０−２、サンプルＣ２−１．０−１およびサンプルＣ２−０．５−１を除く各サンプルについて、播種密度ならびに培地１枚当たりおよび骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌあたりの回収細胞数を表２に示す
図２７は、表２に示した参考例４の各サンプルの播種密度と培地１枚当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。図２８は、表２に示した参考例４の各サンプルの播種密度と骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌ当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【００８３】
参考例５（遠心法：  骨髄液を遠心により分画後、沈殿部を播種）：
１０ｍｌの骨髄液を採取したもう一本の容器は、３００Ｇで５分間遠心処理した。その結果、６．５ｍｌの上澄みおよび３．５ｍｌの沈殿が得られた。この容器から、上澄みの上部２．５ｍｌを採取して、播種した。このサンプルをサンプルＣＳ３−２．５−１とした。
続いて残りの上澄みの上部２．５ｍｌを採取して、播種した。このサンプルをサンプルＣＳ３−２．５−２とした。
続いて残りの上澄みの上部１．０ｍｌを採取して、播種した。このサンプルをサンプルＣＳ３−１．０−３とした。
【００８４】
次に、残りの上澄み０．５ｍｌおよび沈殿３．５ｍｌのうち、上から２ｍｌを採取した（以下、「２ｍｌから４ｍｌまでの沈殿と上澄み」ともいう）。採取した沈殿と上澄みの混合液を２０ｍｌの培地で希釈した。この希釈液の５ｍｌ、２．５ｍｌおよび１．０ｍｌをそれぞれ別々の２５ｃｍ２フラスコに採取した。従って、サンプルの播種密度は、それぞれ０．５ｍｌ／枚、０．２５ｍｌ／枚および０．１ｍｌ／枚であった。それぞれサンプルＣ３．５−５．０−１、サンプルＣ３．５−２．５−１およびサンプルＣ３．５−１．０−１とした。なお、各サンプルは、それぞれ同じ播種密度のものを２つずつ調製した。
【００８５】
次に、残りの２ｍｌの沈殿を上から１ｍｌずつ採取した（以下、上から順に「１ｍｌから２ｍｌまでの沈殿」および「下から１ｍｌまでの沈殿」ともいう）。採取した各沈殿を、播種密度が０．５ｍｌ／枚になるように希釈して２つの２５ｃｍ２フラスコに取った。１ｍｌから２ｍｌまでの沈殿および下から１ｍｌまでの沈殿より得られたサンプルを、それぞれサンプルＣ３．２−１およびＣ３．２−２とした。
培養１０日後に、各サンプルについて細胞解離剤トリプシンによって細胞を回収し、細胞数を数えた。
【００８６】
ＣＳ３−２．５−１、サンプルＣＳ３−２．５−２およびサンプルＣＳ３−１．０−３を除く各サンプルについて、播種密度ならびに培地１枚当たりおよび骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌあたりの回収細胞数を表２に示す
図２９は、表２に示した参考例５の各サンプルの播種密度と培地１枚当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。図３０は、表２に示した参考例５の各サンプルの播種密度と骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌ当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【００８７】
【表２】
2006149375.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】遠心後の骨髄液を示す概略図である。
【図２】本発明の実施例１による培養後の細胞コロニーを染色した状態を示す写真である。
【図３】本発明の比較例１による培養後の細胞コロニーを染色した状態を示す写真である。
【図４】本発明の参考例１によるサンプルＳ−１の、培養後の細胞コロニーを染色した状態を示す写真である。
【図５】本発明の参考例１によるサンプルＤ−１の、培養後の細胞コロニーを染色した状態を示す写真である。
【図６】本発明の参考例１によるサンプルＤ−２の、培養後の細胞コロニーを染色した状態を示す写真である。
【図７】本発明の参考例１によるサンプルＤ−３の、培養後の細胞コロニーを染色した状態を示す写真である。
【図８】本発明の参考例１によるサンプルＤ−４の、培養後の細胞コロニーを染色した状態を示す写真である。
【図９】本発明の参考例１によるサンプルＤ−５の、培養後の細胞コロニーを染色した状態を示す写真である。
【図１０】本発明の参考例１によるサンプルＤ−６の、培養後の細胞コロニーを染色した状態を示す写真である。
【図１１】本発明の参考例１によるサンプルＤ−７の、培養後の細胞コロニーを染色した状態を示す写真である。
【図１２】本発明の参考例１によるサンプルＤ−８の、培養後の細胞コロニーを染色した状態を示す写真である。
【図１３】本発明の参考例１によるサンプルＤ−９の、培養後の細胞コロニーを染色した状態を示す写真である。
【図１４】本発明の参考例１によるサンプルＤ−１０の、培養後の細胞コロニーを染色した状態を示す写真である。
【図１５】本発明の参考例１によるサンプルＤ−１１の、培養後の細胞コロニーを染色した状態を示す写真である。
【図１６】本発明の参考例１によるサンプルＤ−１２の、培養後の細胞コロニーを染色した状態を示す写真である。
【図１７】本発明の参考例１によるサンプルＭＳ−１の、培養後の細胞コロニーを染色した状態を示す写真である。
【図１８】本発明の参考例１によるサンプルＭＤ−１の、培養後の細胞コロニーを染色した状態を示す写真である。
【図１９】比較例２の各サンプルの播種密度と培地１枚当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【図２０】比較例２の各サンプルの播種密度と骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌ当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【図２１】参考例２の各サンプルの沈殿採取位置と培地１枚当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【図２２】参考例２の各サンプルの沈殿採取位置と骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌ当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【図２３】参考例３の各サンプルの沈殿採取位置と培地１枚当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【図２４】参考例３の各サンプルの沈殿採取位置と骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌ当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【図２５】比較例３の各サンプルの播種密度と培地１枚当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【図２６】比較例３の各サンプルの播種密度と骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌ当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【図２７】表２に示した参考例４の各サンプルの播種密度と培地１枚当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【図２８】表２に示した参考例４の各サンプルの播種密度と骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌ当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【図２９】表２に示した参考例５の各サンプルの播種密度と培地１枚当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【図３０】表２に示した参考例５の各サンプルの播種密度と骨髄液（ＢＭ）１０ｍｌ当たりの回収細胞数の関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【００８９】
１    遠心分離容器
２    上澄み
３    沈殿
４    上澄みと沈殿との界面
５    採取部分
【図１】
2006149375.tif 000005
【図１９】
2006149375.tif 000006
【図２０】
2006149375.tif 000007
【図２１】
2006149375.tif 000008
【図２２】
2006149375.tif 000009
【図２３】
2006149375.tif 000010
【図２４】
2006149375.tif 000011
【図２５】
2006149375.tif 000012
【図２６】
2006149375.tif 000013
【図２７】
2006149375.tif 000014
【図２８】
2006149375.tif 000015
【図２９】
2006149375.tif 000016
【図３０】
2006149375.tif 000017
【図２】
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【図３】
2006149375.tif 000019
【図４】
2006149375.tif 000020
【図５】
2006149375.tif 000021
【図６】
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【図７】
2006149375.tif 000023
【図８】
2006149375.tif 000024
【図９】
2006149375.tif 000025
【図１０】
2006149375.tif 000026
【図１１】
2006149375.tif 000027
【図１２】
2006149375.tif 000028
【図１３】
2006149375.tif 000029
【図１４】
2006149375.tif 000030
【図１５】
2006149375.tif 000031
【図１６】
2006149375.tif 000032
【図１７】
2006149375.tif 000033
【図１８】
2006149375.tif 000034