(57)【要約】      （修正有）【課題】ＤＮＡ標的型の抗腫瘍剤を提供する。【解決手段】以下の一般式で表わされる抗腫瘍剤。2006321753.tif 000018（但し、式中、Ｒ１は、水素又はアルコキシカルボニルアルキル基、Ｒ２は水素、アルキル、アルコキシ、アルコキシカルボニル基を表わす。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（１）で表わされる化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【化１】
2006321753.tif 000016
（但し、式中、Ｒ１は、水素又はアルコキシカルボニルアルキル基、Ｒ２は水素、アルキル、アルコキシ、アルコキシカルボニル基を表わす。）
【請求項２】
以下の一般式（１）で表わされる化合物。
【化２】
2006321753.tif 000017
（但し、式中、Ｒ１は水素又はアルコキシカルボニルアルキル基、Ｒ２は水素、アルキル、アルコキシ、アルコキシカルボニル基を表わす。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−カルボリン誘導体を有効成分とする抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−カルボリン誘導体のあるものは、ＤＮＡ認識分子としてＤＮＡ分子の塩基対間に特異的に挿入するインターカレーターとして知られ、また、その医薬としての利用も研究されている。
例えば、その４−置換体は、Ｔ細胞の活性化及び増殖因子であるＩＬ−２の産生を抑制し、炎症性疾患、自己免疫疾患、臓器及び骨髄移植拒絶及びＩＬ−２媒介免疫応答と関連する種々免疫異常の予防、治療剤として使用でき、特に、慢性の炎症、アレルギー、接触性皮膚炎、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症等の予防、治療に使用される可能性があることが知られている（特許文献１参照）。また、大豆発酵産物中に存在する、１−メチル−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−β−カルボリン−３−カルボン酸が糖尿病性白内症予防作用を有するとの知見もある（特許文献２参照）。
しかし、極めて多数存在するβ−カルボリン誘導体の医薬効果、機能の解明は一部の誘導体に限られ、全て解明されたわけではなく、特に抗腫瘍剤としての機能についてはあまり報告されてはいない。
【０００３】
【特許文献１】特表２０００−５１６２３１号公報
【特許文献２】特開２００３−３００８９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、β−カルボリン誘導体の中から、有用な薬理作用、特に抗腫瘍作用を有する誘導体を探索し、該誘導体を有効成分として含有するＤＮＡ標的型の抗腫瘍剤を新たに提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、インターカレーターとしての機能を有するβ−カルボリン誘導体に着目し、これを用いてＤＮＡ塩基対周辺にアルキル化剤を運搬して、腫瘍細胞のＤＮＡの合成を阻害し、効率的にガン細胞の増殖を抑制する手段について研究してきた。このため、種々のβ−カルボリン誘導体を合成し、これらβ−カルボリン誘導体にメチルニトロソユリア等のアルキル化剤を結合せしめ、その腫瘍細胞に対する毒性を調べたが、その研究過程において、特定のβ−カルボリン誘導体が、特にアルキル化剤を結合させなくても、それのみで極めて顕著な抗腫瘍活性を有するという知見を得て、本発明を完成させた。
すなわち本発明は以下のとおりである。
１．以下の一般式（１）で表わされる化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【０００６】
【化１】
2006321753.tif 000002
（但し、式中、Ｒ１は、水素又はアルコキシカルボニルアルキル基、Ｒ２は水素、アルキル、アルコキシ、アルコキシカルボニル基を表わす。）
２．以下の一般式（１）で表わされる化合物。
【０００７】
【化２】
2006321753.tif 000003
（但し、式中、Ｒ１は水素又はアルコキシカルボニルアルキル基、Ｒ２は水素、アルキル、アルコキシ、アルコキシカルボニル基を表わす。）
【発明の効果】
【０００８】
本発明の一般式（１）で表わされるβ−カルボリン誘導体は、それ自体で、腫瘍細胞に対し極めて顕著な細胞毒性を有する。例えば、Sarcoma180に対して、抗ガン剤として知られているシスプラチンがＩＣ５０＝１．０μＭであるのに対して、本発明のβ−カルボリン誘導体はＩＣ５０がその１／２以下である。
また、本発明の化合物は、それ自体インターカレータであり、ＤＮＡ標的型の抗腫瘍剤として極めて有用なものである。また、ＤＮＡの複製、転写、翻訳等を阻害するメチル化剤等の種々のガン化学療法剤を結合せしめてＤＮＡ標的型の抗腫瘍剤に変換する上でも、それ自体がインターカレータ機能と高い抗腫瘍活性を有することは、極めて有効な抗腫瘍剤を提供できる可能性を有し、抗ガン剤の研究、開発における基礎化合物としても極めて重要なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の一般式（１）の化合物の化学構造上の最大の特徴は、β−カルボリンの３位のアミノ基窒素原子上に置換あるいは非置換のベンジル基が導入された点にある。本発明者らが合成し、腫瘍細胞に対する細胞毒性を調べた多数の化合物のうち、上記ベンジル基が導入された化合物のみが顕著な細胞毒性を示した。
この理由としては、ベンジル基導入により、疎水性の増加に伴う、β−カルボリン誘導体の細胞膜及び細胞核膜の透過性の向上がその一因として考えられる。
本発明の化合物を、具体的に示すと、例えば以下の化合物が挙げられる。
【００１０】
【化３】
2006321753.tif 000004
【００１１】
【化４】
2006321753.tif 000005
これら化合物は、いずれも、インターカレータの機能を有するとともに、Sarcoma-180（マウス肉腫細胞）、HelaＳ-3（ヒト子宮頸癌細胞）、L1210（マウス白血病細胞）等の各種腫瘍細胞に対し極めて顕著な毒性を有し、その増殖を抑制し、効果的な抗腫瘍剤である。
【００１２】
本発明において抗腫瘍剤として用いる化合物は、以下の（ａ）〜（ｈ）の各ステップを含む合成法により得られる（図１）。
(a)  L-トリプトファンとホルムアルデヒドによる環化反応を行いテトラヒドロ−β−カルボリン−３−カルボン酸を得るステップ。
(b)  テトラヒドロ−β−カルボリン−３−カルボン酸と塩化チオニルとメタノールによるエステル化を行い、テトラヒドロ−β−カルボリン−３−カルボン酸メチルエステルを得るステップ。
(c)  テトラヒドロ−β−カルボリン−３−カルボン酸メチルエステルをトリクロロイソシアヌル酸により脱水素化し、β−カルボリン−３−カルボン酸メチルエステルを得るステップ。
(d)  β−カルボリン−３−カルボン酸メチルエステルをヒドラジン一水和物で処理することでβ−カルボリン−３−カルボヒドラジドを得るステップ。
(e)  β−カルボリン−３−カルボヒドラジドを亜硝酸ナトリウムと塩酸で処理することでβ−カルボリン−３−カルボニルアジドを得るステップ。
(f)  β−カルボリン−３−カルボニルアジドを７０％酢酸水溶液で処理することで３−アミノ−β−カルボリンを得るステップ。
(g)  ３−アミノ−β−カルボリンを置換または非置換のベンズアルデヒドで還元的アミノ化することにより本発明の化合物１（３−ベンジルアミノ−β−カルボリン）を得て、単離、精製するステップ。
(h)  さらに、化合物１（３−ベンジルアミノ−β−カルボリン）を、例えばアクリル酸メチル等の不飽和脂肪酸アルキルエステルによるマイケル付加反応を行うことにより、化合物２を含む、本発明の９位がアルコキシカルボニルアルキル基で置換された３−ベンジルアミノ−β−カルボリンを得るステップ。
なお、上記ステップ（ｇ）において、アルキル基、アルコキシ基あるいはアルコキシカルボニル基で置換された３−ベンジルアミノ−β−カルボリンを使用する場合においては、一般式（１）中、Ｒ２がアルキル基、アルコキシ基あるいはアルコキシカルボニル基である化合物が得られる。
【実施例】
【００１３】
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００１４】
〔実施例１〕
１）テトラヒドロ−β−カルボリン−３−カルボン酸の合成
【００１５】
【化５】
2006321753.tif 000006
乾燥、アルゴン置換した１LフラスコにＬ−トリプトファン（1） (7.00g, 3.40×10-2mol)と2.5 M水酸化ナトリウム(13.6ml）を入れ、透明になるまで撹拌した。これに37 %ホルマリン(7.46g, 3.40×10-2 mol)をゆっくり加え、室温で2時間撹拌後、3時間還流した。室温まで冷却した後、6 N塩酸で中和し、0 ℃まで冷却した。析出した結晶をろ過し、水、MeOH、CH2Cl2の順で洗浄し、減圧乾燥を行い、mp 303.9-305.4 ℃の生成物を6.7g得た（収率91%）。これを単離精製することなく次のステップに使用した。
２）テトラヒドロ−β−カルボリン−３−カルボン酸メチルエステルの合成
【００１６】
【化６】
2006321753.tif 000007
乾燥、アルゴン置換した1 Lフラスコにテトラヒドロ−β−カルボリン−３−カルボン酸（2） (4.32 g, 2.00×10-2 mol)とMeOHを溶媒として60 ml加え0 ℃まで冷却した。これに塩化チオニル(3.57 g, 3.00×10-2 mol)をゆっくり滴下した。滴下終了後、30 ℃で4時間撹拌し，その後20時間還流した。この反応混合物を濃縮し、水を加えて溶解させ、炭酸ナトリウムで中和した。これをCHCl3で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤をろ別し、濃縮、減圧乾燥を行いmp 183.0-184.2 ℃の生成物を3.9g得た（収率91%）。これを単離精製することなく次のステップに使用した。
３）β−カルボリン−３−カルボン酸メチルエステルの合成
【００１７】
【化７】
2006321753.tif 000008
乾燥、アルゴン置換した200 mlフラスコにテトラヒドロ−β−カルボリン−３−カルボン酸メチルエステル（3 ）(7.32g, 3.18×10-2mol)、DMFを溶媒として50 ml加え、さらにトリエチルアミン(11.1 ml, 7.95×10-2 mol)を加え-20 ℃まで冷却した。これに触媒としてTCCA(7.30g, 3.18×10-2mol)をDMF(25 ml)に溶かしたものをゆっくり滴下した。滴下終了後、系内を0 ℃までゆっくりと上げ、その後2時間撹拌した。この反応混合物を冷水に加え、析出した結晶をろ過し、H2Oで洗浄し減圧乾燥した。その後MeOHで再結晶し、mp 242.3-243.9 ℃の生成物を6.5g得た（収率77%）。
４）β−カルボリン−３−カルボヒドラジドの合成
【００１８】
【化８】
2006321753.tif 000009
乾燥後、アルゴン置換した200 mlフラスコにβ−カルボリン−３−カルボン酸メチルエステル（4） (0.70g, 3.09×10-3mol)と溶媒として1-ペンタノールを47 ml入れた。これにヒドラジン一水和物(3.84g, 76.7×10-2mol)をゆっくりと滴下した。その後、7時間還流し、冷蔵庫で一晩冷却した。析出した結晶をろ過し、ヘキサンで洗浄し、減圧乾燥し分解点350 ℃の生成物を得た。
５）β−カルボリン−３−カルボニルアジドの合成
【００１９】
【化９】
2006321753.tif 000010
100mlフラスコにβ−カルボリン−３−カルボヒドラジド（5 ）(0.50g, 2.21×10-3mol)と0.2 N HClを37ml入れ、撹拌しながら氷浴で0℃まで冷却した。亜硝酸ナトリウム(0.34g, 5.04×10-3mol)水溶液をゆっくりと滴下した後、０℃で1時間撹拌した。炭酸ナトリウム水溶液で中和し、ろ過した。冷却した水で洗浄した後、減圧乾燥し、β−カルボリン−３−カルボニルアジド（6）を得た。不安定な化合物であるため直ちに次のステップに用いた。
６）３−アミノ−β−カルボリンの合成
【００２０】
【化１０】
2006321753.tif 000011
100 mlフラスコにβ−カルボリン−３−カルボニルアジド（6） (0.50g, 211mmol)と70 % 酢酸水溶液20mlを入れ、30分還流した。その後室温まで冷却し、炭酸水素ナトリウムで中和した。これを酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。そして乾燥剤をろ別し、濃縮、減圧乾燥を行い、エタノールで再結晶しmp 287-292 ℃の生成物を0.33g得た（収率85%）。
７）３−ベンジルアミノ−β−カルボリン（3-benzylamino-β-carboline）の合成
【００２１】
【化１１】
2006321753.tif 000012
60mlの精製MeOH中の100mg(0.55mmol)の３−アミノ−β−カルボリン溶液に0.51ml(8.88mmol)の氷酢酸を加えた。0.11ml(1.64mmol)のベンズアルデヒドを滴下後、室温で1.5時間攪拌した。反応混合物に350mg(0.55mmol)のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え室温でさらに6時間攪拌した。反応を6M-HClで停止させアンモニア水溶液でpH10にした後、CHCl3で数回抽出した。一緒にしたCHCl3抽出物を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させて濃縮した。溶離液として10%EtOAc/MeOHを用いたシリカゲルカラムで精製し、３−ベンジルアミノ−β−カルボリン141mg(0.52mmol))を得た（収率９４％）。
＜３−ベンジルアミノ−β−カルボリンの物性データ＞
mp 195.5-196.5 ℃;
1H-NMR(DMSO-d6, 300MHz) 
δ4.51 (2H, s), 6.43 (1H, s), 7.06-7.40 (9H, m), 8.00 (1H, d), 8.31 (1H, s), 10.84 (1H, s);
13C-NMR (CDCl3-d, 75 MHz) δ 31.3, 45.6, 79.4, 93.3, 109.1, 117.1, 119.7, 124.9, 125.2, 126.4, 126.5, 128.0, 128.5, 137.3, 137.5, 150.6; MS (FAB) m/z [M+H]+ 274.
８）３−ベンジルアミノ−９−メトキシカルボニルエチル−β−カルボリン（3-benzylamino-9-methoxycarbonylethyl-β-carboline）の合成
【００２２】
【化１２】
2006321753.tif 000013
窒素雰囲気下、ヘキサンで数回洗浄した4.4mg(0.18mmol)のNaHに-10℃を維持しながら4mlのTHFに溶解した50mg(0.37mmol)の３−ベンジルアミノ−β−カルボリンをゆっくり滴下した。-10℃を維持しながら0.05ml(0.55mmol)のアクリル酸メチルを加え、-10℃で１時間攪拌した。反応をH2Oで停止させCHCl3で数回抽出した。一緒にしたCHCl3抽出物を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して濃縮した。溶離液として10%MeOH/CHCl3を用いたシリカゲルカラムで精製し、３−ベンジルアミノ−９−メトキシカルボニルエチル−β−カルボリン121mg(0.34mmol)を得た（収率：91%）。
＜３−ベンジルアミノ−９−メトキシカルボニルエチル−β−カルボリンの物性データ＞
mp 142.3-142.6℃; 
1H-NMR (CDCl3-d, 500 MHz)
δ2.82 (2H, t), 3.61 (3H, s), 4.55-4.58 (4H, m), 6.99 (1H, s), 7.12-7.51 (9H, m), 7.95 (1H, d), 8.39 (1H, s);
13C-NMR (CDCl3, 75 MHz) δ31.2, 36.8, 45.6, 50.0, 93.3, 106.7, 116.7, 119.8, 124.9, 125.2, 126.3, 126.4, 126.8, 130.2, 137.5, 139.8, 150.8, 169.4; MS (FAB) m/z [M+H]+ 360.
【００２３】
〔実施例２〕
細胞毒性試験
Sarcoma-180（マウス肉腫細胞）、HelaＳ-3（ヒト子宮頸癌細胞）、L1210（マウス白血病細胞）がそれぞれ培養されている培養容器から、培地を除去後、PBS (-) で細胞を洗浄し、Trypsin-EDTAで細胞を剥離した。次いで、培地を加えてTrypsinの作用を止め、遠心分離した。上清を除去後、新しい培地を加えてから、色素排除法により細胞数をカウントした。細胞濃度を調製 ( sarcoma-180, HeLa S-3 : 2.0 x 104cells / ml, L1210 : 4.0 x 104cells / ml) し、37℃のCO2インキュベーター内で3時間インキュベートした。次いで、以下の表２に示す抗腫瘍剤（化合物）（処理濃度 : 12.5 - 100μg/ml）を各々添加し、37℃のCO2インキュベーター内で72時間インキュベートした。細胞死の定量にはMTT法を用いた。
この後、培養液中にMTT(0.2μg/μl)を加え、さらに、37℃のCO2インキュベーター内で4時間インキュベートした。反応を停止させる為にDMSOを培養液と等量加えた。マイクロプレートリーダー (580nmのfilter使用) でMTT formazanの生成量を測定することにより抗腫瘍剤毎に各細胞の生存率を求め、IC50を算出した。
本発明のβ−カルボリン誘導体（化合物Ｎｏ．１、２）、β−カルボリン、シスプラチン及び他のβ−カルボリンン誘導体の、Sarcoma-180（マウス肉腫細胞）、HelaＳ-3（ヒト子宮頸癌細胞）、L1210（マウス白血病細胞）に対するＩＣ５０を以下の表１に示す。
【００２４】
【表１−１】
2006321753.tif 000014
【００２５】
【表１−２】
2006321753.tif 000015
【００２６】
これによれば、本発明の化合物（１）及び（２）は、抗ガン剤として使用されているシスプラチンに比べても高い抗腫瘍活性を示し、これに対して、β−カルボリン及びその他の誘導体の活性は低い。本発明の化合物１及び２のみがβ−カルボリン誘導体として顕著な抗腫瘍活性を示す。
【００２７】
蛍光顕微鏡による観察
Sarcoma-180（マウス肉腫細胞）、HelaＳ-3（ヒト子宮頸癌細胞）、L1210（マウス白血病細胞）がそれぞれ培養されている培養容器から、培地を除去後、PBS (-) で細胞を洗浄し、Trypsin-EDTAで細胞を剥離した。培地を加えてTrypsinの作用を止め、遠心分離した。上清を除去後、新しい培地を加えてから、色素排除法により細胞数をカウントした。細胞濃度を調製 ( 1.5x 106cells / ml) 後、上記表中Ｎｏ．３の化合物及び同Ｎｏ．１の化合物及び比較として同Ｎｏ．４及び５の化合物をそれぞれ最終濃度150μMになるように添加し、37℃のCO2インキュベーター内で24時間インキュベートした。蛍光顕微鏡U領域で観察した。結果を図２−１〜図２−３に示す。なお、図中、各細胞についての写真は、上段が透過光を撮影したものであり、下段が蛍光を撮影したものである。これによれば、ＩＣ５０が小さい値を示すものほど、蛍光強度が強く、これは、使用化合物の膜透過性の違いが活性発現に大きく貢献していることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の一般式（１）の化合物の合成過程の概略を示す図である。
【図２−１】実施例３における化合物添加後のSarcoma-180（マウス肉腫細胞）、HelaＳ-3（ヒト子宮頸癌細胞）、L1210（マウス白血病細胞）を蛍光顕微鏡で撮影した写真である。
【図２−２】実施例３における化合物添加後のSarcoma-180（マウス肉腫細胞）、HelaＳ-3（ヒト子宮頸癌細胞）、L1210（マウス白血病細胞）を蛍光顕微鏡で撮影した写真である。
【図２−３】実施例３における化合物添加後のSarcoma-180（マウス肉腫細胞）、HelaＳ-3（ヒト子宮頸癌細胞）、L1210（マウス白血病細胞）を蛍光顕微鏡で撮影した写真である。
【図１】
2006321753.tif 000019
【図２−１】
2006321753.tif 000020
【図２−２】
2006321753.tif 000021
【図２−３】
2006321753.tif 000022