(57)【要約】      （修正有）【課題】繊毛上皮細胞を調製するための方法及びインビトロで未分化細胞から誘導された繊毛上皮細胞を提供する。【解決手段】胚様体（好ましくは構成する細胞がヒト由来）を無血清培地で培養することにより繊毛上皮細胞を調製する方法を見いだした。本方法によりインビトロで未分化細胞（好ましくはヒト由来の胚性幹細胞）から誘導された繊毛上皮細胞を得ることが初めて可能となった。【効果】得られる繊毛上皮細胞は、ヒトなどの疾病の診断や治療に有用な材料を提供する。また呼吸器系でのウイルスや細菌などによる異常や疾病を、研究あるいは治療するための薬剤開発において、モデルや評価系構築に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚様体を無血清培地で培養する工程を含む、繊毛上皮細胞を調製するための方法。
【請求項２】
無血清培地が、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔを含む培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
胚様体を構成する細胞が、ヒトに由来する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
胚様体が培養容器に付着している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
インビトロで未分化細胞から誘導された繊毛上皮細胞。
【請求項６】
未分化細胞が、ヒトに由来する、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
未分化細胞が、胚性幹細胞である、請求項６に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、繊毛上皮細胞を調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や組織性（体性）幹細胞などの哺乳類の未分化細胞から、腎臓や肝臓などの種々の器官や、脂肪などの種々の組織を作るための方法が開発されている。しかしながら、現在のところ、ＥＳ細胞を含むあらゆる哺乳類の幹細胞から繊毛上皮を誘導する技術は開発されていない。このような技術が存在しないことは、ヒトを含めた繊毛に関係する異常や疾病に関する研究、診断、および治療薬の開発などの過程における重大な障害となっており、繊毛上皮細胞の調製方法の開発が待たれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、繊毛上皮細胞を調製するための方法及びインビトロで未分化細胞から誘導された繊毛上皮細胞を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意努力した結果、胚様体（胚様体）を無血清培地で培養すると、繊毛上皮細胞が誘導されることを見出し、本発明を完成させた。
【０００５】
すなわち、本発明は、下記のとおりである。
１  胚様体を無血清培地で培養する工程を含む、繊毛上皮細胞を調製するための方法。
２  無血清培地が、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔを含む培地である、１に記載の方法。
３  胚様体を構成する細胞が、ヒトに由来する、１又は２に記載の方法。
４  胚様体が培養容器に付着している、１〜３のいずれか１に記載の方法。
５  インビトロで未分化細胞から誘導された繊毛上皮細胞。
６  未分化細胞が、ヒトに由来する、５に記載の細胞。
７  未分化細胞が、胚性幹細胞である、６に記載の細胞。
【発明の効果】
【０００６】
インビトロで未分化細胞から誘導された繊毛上皮細胞を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
受精卵の胎児へと成長していく過程の一つに胚盤胞と呼ばれる状態がある。胚盤胞は、球状の形をしており、外側の細胞層である栄養外胚葉と将来的に身体を形成する内部細胞塊を含む胞胚腔とから構成されている。ＥＳ細胞等の未分化細胞を浮遊状態で培養すると、周辺部が内皮様に分化した胞胚腔に類似する大きな細胞集塊を形成する。本発明では、この細胞集塊を胚様体（embryoid bodies）という。
【０００８】
胚様体は、従来公知の技術にしたがって調製することができる。胚様体を構成する細胞は、胚様体を形成することができる程度に未分化な細胞であれば特に制限されることはないが、好ましくは、ＥＳ細胞又は体性幹細胞であり、特に好ましくはＥＳ細胞である。例えば、ＥＳ細胞を出発材料として、ウシ胎仔血清等を含む血清培地又は無血清培地中で浮遊培養してＥＳ細胞の集合体である胚様体を調製することができる。
【０００９】
本発明に用いることができる未分化細胞は、哺乳類に由来する細胞であれば特に制限されることはないが、好ましくは、げっ歯類又は霊長類に由来する細胞であり、特に好ましくは、ヒトに由来する細胞である。
【００１０】
無血清培地とは、合成培地に血清代替物としてポリペプチドホルモン類、各種ステロイドホルモン、結合タンパク質、成長因子、細胞の基質付着因子等を添加して良好な細胞増殖や生存を可能にする培養液をいう。無血清培地は、未分化細胞の増殖に適しているものであれば特に制限されないが、好ましくは、血清代替物としてインビトロジェン社より市販されているKnockout（商標） Serum Replacement（ＫＳＲ培地）を含む培地である。合成培地は、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０等の市販の培地を用いることができる。
【００１１】
未分化細胞は、必要に応じ、フィーダー細胞上に播種することによって培養することができる。フィーダー細胞としては、Ｘ線、γ線、マイトマイシンＣ等で処理することによって生存はするが増殖しない状態にした細胞を用いることができる。例えば、マウス由来ＥＳ細胞のフィーダー細胞としては、マイトマイシンＣで処理したマウス胎児繊維芽細胞を用いることができる。なお、典型的には、培地は毎日交換し、かつ、継代培養を３日間おきに行う。
【００１２】
培養した未分化細胞を、トリプシン処理によって単一細胞懸濁液とし、得られた懸濁液を、培養用の容器に播種して、ＣＯ２インキュベーター内で培養する。この操作により、フィーダー細胞は培養面に付着するが、未分化細胞は培養面に付着せずに浮遊したままとなる。そこで培養上清を回収し、遠心分離することによって、未分化細胞をフィーダー細胞と分離することができる。
【００１３】
次に、得られた未分化細胞を、傾けた低付着性の培養用容器中で一晩浮遊培養し、次に容器を水平状態にして、さらに培養を２〜３日間継続して胚様体を調製する。また、ミネラルオイル上に形成させた液滴中に未分化細胞を懸垂状態とさせて、培養することによっても胚様体を調製することができる。この胚様体調製用培地としては、ウシ胎仔血清を含む培地又は無血清培地を用いることができる。
【００１４】
得られた胚様体は、付着性容器を用いて血清培地又は無血清培地の中で培養することによって、培養容器の底面に付着させることができる。
【００１５】
得られた胚様体を無血清培地の中で培養することによって、無数の繊毛様構造を有する細胞が誘導される。
【００１６】
この繊毛様構造は、ドーム様構造（管状構造）の内部に見出される。また、これらのドーム様構造の内部だけでなく、その他の領域にも見出される。繊毛様構造がドーム様構造の内部にある場合には、繊毛に特有な「あおり運動」に起因してドーム様構造の内部で液体が流動するので、容易に繊毛用構造を特定することができる。なお、この培養過程において血清培地を用いると、繊毛様構造は誘導されない。
【００１７】
繊毛上皮細胞とは、繊毛様構造を有する細胞であり、繊毛特有の「あおり運動」を行い、気管上皮や輸卵管などの繊毛に特有な軸糸の配列構造である９＋２構造を有し、さらに、軸糸を構成するタンパク質であるチューブリン（β−チューブリンＩＶ）や同じく繊毛に特有なタンパク質（マーカータンパク質）の遺伝子であるＦｏｘｊ１を発現する。
【００１８】
したがって、例えば、抗原染色法を用いて、軸糸の構成タンパク質であるβ−チューブリンＩＶを検出すること、また、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、Ｆｏｘｊ１の発現を同定することによって、繊毛上皮細胞の誘導を確認することができる。
【００１９】
繊毛上皮細胞は、生体内においては、気管上皮や輸卵管などに存在する。
【実施例１】
【００２０】
ＥＳ細胞の維持
マウスＥＳ細胞（例：Ｅ１４（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１８２１）、Ｄ３（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１１６３２））を、フィーダー細胞上で維持した。フィーダー細胞としては、あらかじめ１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣで１〜３時間処理して細胞分裂を止めたマウス胎児繊維芽細胞を、０．１％のゼラチンをコートした培養用の容器に播種したものを用いた。ＥＳ細胞のための維持培地として用いた血清培地は、１５％の牛胎児血清（ES qualified, Invitrogen社）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Invitrogen社）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Sigma社）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Sigma社）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び１，０００Ｕ／ｍＬの白血病抑制因子（Chemicon社）を含む高グルコースのＤＭＥＭ培地（Invitrogen社）であった。培養液は毎日交換し、３日に１回継代培養した。
【００２１】
胚様体の作成
ＥＳ細胞のコロニーを０．１％トリプシン及び０．５ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で処理し、単一細胞懸濁液を得た。得られたＥＳ細胞の懸濁液を、培養用の容器（例えば、１０ｃｍの培養用ディッシュ）に播種して、４０分間ＣＯ２インキュベーターで培養した。こうしてフィーダー細胞から分離したＥＳ細胞を、遠心分離して集めた。次に、これらのＥＳ細胞を、市販の低接着性培養用容器（ローセルバインディグディッシュ、Ｎｕｎｃ社）に移して、胚様体調製用培地中で、容器を傾けてＥＳ細胞を相互に隣接させながら１晩浮遊培養し、次に容器を水平状態にして、さらに培養を２〜３日間継続してＥＢを調製した。
【００２２】
このＥＢ作成用培地としては、ＦＢＳを含む血清培地を用いた。また、１０％のＫＳＲ（Invitrogen社）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含む低グルコースＤＭＥＭ培地（Invitrogen社）、すなわち、無血清培地を用いてもＥＢを調製することができた。
【００２３】
繊毛上皮の誘導
０．１％のゼラチンなどでコートした細胞接着性容器（例えば、２４穴のウェルプレート）に、上述のごとくして得たＥＢを播種し、上記の血清培地の中で、又は、無血清培地の中でＥＢを培養して、ＥＢを培養プレート上に接着させた。
【００２４】
次いで、無血清培地の中で、接着したＥＢの培養を継続すると、無数の繊毛様構造を有する細胞が誘導された。この繊毛様構造は、ドーム様構造（管状構造）の内部に見出された（図１）。また、これらのドーム様構造の内部だけでなく、その他の領域にも存在した。繊毛様構造がドーム様構造の内部にある場合には、繊毛に特有な「あおり運動」に起因してドーム様構造の内部で液体が流動するので、繊毛用構造を特定して観測することが容易であった。なお、この培養過程において血清培地を用いると、繊毛様構造は誘導されなかった。
【００２５】
繊毛上皮の同定
上述のごとく、誘導された繊毛様構造は、繊毛に特有な「あおり運動」を行う。その繊毛様構造を電子顕微鏡で観察すると、その内部に管状構造（軸糸）が認められ、その軸糸の配置は、気管上皮や輸卵管などの繊毛に特有な軸糸の配列構造である９＋２構造であることが確認された（図２：感覚器などの繊毛は９＋２構造でなく９＋０構造である）。
【００２６】
抗原染色法にて軸糸の構成タンパク質であるβ−チューブリンＩＶが検出され、また、ＲＴ−ＰＣＲ法にて繊毛に特有なタンパク質（マーカータンパク質）であるＦｏｘｊ１が確認された（図３）。
【００２７】
このように、本発明の方法によって誘導された細胞が、繊毛上皮細胞であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本手法により、これまで実現されていなかった哺乳類の幹細胞から気管上皮や輸卵管などを構成する繊毛上皮を誘導することがはじめて実現された。これらの繊毛上皮は、繊毛上皮性のタンパク質などが特異的に欠如、あるいは異常発現しているヒトなどの疾病の診断や、痰の排出障害や妊娠障害などの繊毛上皮の欠陥や欠損などに起因するヒトなどの異常や疾病を治療する目的などに有用な材料を提供する。また、肺の気道、気管、気管上皮などを経由するウイルス、細菌などによる異常や疾病、さらには、呼吸疾病などの異常や疾病に関する研究や治療のための薬剤の開発における有用なモデルや評価系（アッセイ系）を開発することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】左図は、胚葉体から誘導されたドーム様構造の光学顕微鏡写真である。右図は、１の破線で囲まれた範囲（２）を拡大して示した図である。ドーム様となった胚様体の内部に繊毛上皮様構造（３）が認められる。
【図２】１は、図２の一部の電子顕微鏡像である。繊毛上皮組織上に発達した繊毛が認められる（矢印２）。３は、繊毛部分の縦断面電子顕微鏡像である。繊毛の外部分と中心部分にある軸糸が認められる（矢印４）。５は、繊毛部分の横断面電子顕微鏡像である。繊毛の外部分に９対の軸糸と中心部分に１対の軸糸が認められる（矢印６）。
【図３】１は、図１のドーム状構造を抗β−チューブリンIV抗体で染色した光学顕微鏡像である。２は、抗β−チューブリンIV抗体による染色で緑色蛍光を発する組織である（２）。３は、ドーム状構造に含まれるｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法で増幅した試料の電気泳動像（Ｆｏｘｊ１に対する抗体で染色した）である。各レーンは、下記のとおりである。１：マーカー（標準試料）、２：培養期間（０日）、３：培養期間（５日）、４：培養期間（１０日）、５：培養期間（１５日）、６：培養期間（２０日）、７：培養期間（２５日）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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