(57)【要約】      （修正有）【課題】様々な酵素が布帛の限られた種類のしみの除去に洗濯洗剤として常用されてきたが、他のタイプの汚れやしみに対してはさほど有効でない。そこで、黒ずみ除去効果などが優れた漂白組成物を提供する。【解決手段】天然でみられないアミノ酸配列を有するカルボニルヒドロラーゼ変種であり、異なるアミノ酸による前駆カルボニルヒドロラーゼの複数アミノ酸残基の置換で誘導されたプロテアーゼ酵素（この前駆酵素において置換された上記複数のアミノ酸残基の番号位置はBacillus amyloliquefaciensの天然ズブチリシンあるいは他のカルボニルヒドロラーゼまたはズブチリシン（例えば、Bacillus lentusズブチリシン）の相当アミノ酸残基に対応する）と漂白剤を含んでなる漂白組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然でみられないアミノ酸配列を有するカルボニルヒドロラーゼ変種であって、ズブチリシン前駆カルボニルヒドロラーゼから誘導された、有効量のプロテアーゼ酵素（ここで、このプロテアーゼ酵素はN76D/S99D 、N76D/S101R、N76D/S103A、N76D/V104I、N76D/I107V、N76D/N123S、N76D/S99D/S101R 、N76D/S99D/S1O3A 、N76D/S99D/V1O4I 、N76D/S101R/S1O3A、N76D/S101R/V1O4I、N76D/S1O3A/V104I、N76D/V104I/I1O7V、N76D/V1O4Y/I1O7V、N76D/V1O4I/N123S、N76D/I1O7V/N123S、N76D/S99D/S101R/S1O3A 、N76D/S99D/S101R/V1O4I 、N76D/S99D/S1O3A/V104I 、N76D/S101R/S1O3A/V104I、N76D/S1O3A/V104I/N123S、N76D/V104I/I107V/N123S、N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 、N76D/S99D/S1O3A/V104I/N123S 、N76D/S99D/S101R/S1O3A/V1O4I/N123S 、N76D/S1O3A/V104I/S128G、N76D/S1O3A/V104I/T26OP、N76D/S1O3A/V1O4I/S265N、N76D/S1O3A/V104I/D197E、N76D/S1O3A/V104I/S105A、N76D/S1O3A/V104I/L135I、N76D/S1O3A/V104I/L126F、N76D/S1O3A/V1O4T/L1O7T、N76D/S1O3A/V104I/L126F/S265N、N76D/S1O3A/V1O4I/M222Aおよびそれらの混合物から選択されるズブチリシン変種である）と、
（ｂ）（ｉ）下記式の有機ペルオキシ酸：
【化１】
2006117937.tif 000039
（上記式中Ｒ１は約１〜約１４の炭素原子を有するアルキル、アリールまたはアルカリール基であり、Ｒ２は約１〜約１４の炭素原子を有するアルキレン、アリレンまたはアルカリレン基であり、Ｒ５はＨあるいは約１〜約１０の炭素原子を有するアルキル、アリールまたはアルカリール基である）および
（ii）組成物から形成される漂白溶液中その場で活性剤と反応して有機ペルオキシ酸を形成しうる過酸化水素を生じることができるペルオキシゲン化合物と漂白活性剤との組合せ（上記漂白活性剤は下記一般式を有する：
【化２】
2006117937.tif 000040
上記式中Ｒは約５〜約１８の炭素原子を有するアルキル基であって、カルボニル炭素を含めてそこから伸びる最長の直鎖アルキル鎖は約６〜約１０の炭素原子を有し、Ｌは脱離基であり、その共役酸は約４〜約１３の範囲内のｐＨを有する）からなる群より選択される漂白剤約０．５〜約２０％と
（ｃ）組成物の少くとも約５重量％の界面活性剤および少くとも約５％のビルダーを含んだ、プロテアーゼ酵素および漂白剤と適合する１種以上のクリーニング組成物物質とを含んでなることを特徴とする、布帛クリーニング組成物。
【請求項２】
クリーニング組成物物質が、界面活性剤、溶媒、緩衝剤、酵素、汚れ放出剤、土汚れ除去剤、分散剤、増白剤、起泡抑制剤、布帛柔軟剤、起泡増強剤、酵素安定剤、ビルダー、漂白剤、色素、香料およびそれらの混合物からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の布帛クリーニング組成物。
【請求項３】
セルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、他のプロテアーゼ、ペルオキシダーゼおよびそれらの混合物からなる群より選択される少くとも１種の酵素を更に含んでなる、請求項１に記載の布帛クリーニング組成物。
【請求項４】
液体、粒状もしくは固形の形態からなる、請求項１に記載の布帛クリーニング組成物。
【請求項５】
プロテアーゼ酵素がN76D/S99D、N76D/V104I、N76D/S99D/V104I、N76D/V104I/I1O7V、N76D/V1O4Y/I1O7V、N76D/S101R/S1O3A/V104I、N76D/S99D/S101R/S103A/V104I、N76D/S1O1R/V1O4Iおよびそれらの混合物から選択されるズブチリシン変種である、請求項１に記載の布帛クリーニング組成物。
【請求項６】
プロテアーゼ酵素が、N76D/V104I、N76D/S1O3A/V104Iおよびそれらの混合物から選択されるBacillusズブチリシン変種である、請求項１に記載の布帛クリーニング組成物。
【請求項７】
水性液中で過酸化水素を生じることができる少くとも約０．１重量％のペルオキシゲン漂白化合物と少くとも０．１重量％の１種以上の漂白活性剤を含んでなる請求項１に記載の組成物であって、
前記漂白活性剤が、
（ａ）下記一般式の漂白活性剤：
【化３】
2006117937.tif 000041
またはそれらの混合物（上記式中Ｒ１は約１〜約１４の炭素原子を有するアルキル、アリールまたはアルカリール基であり、Ｒ２は約１〜約１４の炭素原子を有するアルキレン、アリレンまたはアルカリレン基であり、Ｒ５はＨあるいは約１〜約１０の炭素原子を有するアルキル、アリールまたはアルカリール基であり、Ｌは脱離基である）
（ｂ）下記式のベンゾオキサジンタイプ漂白活性剤：
【化４】
2006117937.tif 000042
（上記式中Ｒ１はＨ、アルキル、アルカリール、アリール、アリールアルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はＨ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アリール、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、アルキルアミノ、‐ＣＯＯＲ６（Ｒ６はＨまたはアルキル基である）およびカルボニル官能基から選択される同一または異なる置換基である）
（ｃ）下記式のＮ‐アシルカプロラクタム漂白活性剤：
【化５】
2006117937.tif 000043
（Ｒ６はＨあるいは１〜１２の炭素を有するアルキル、アリール、アルコキシアリールまたはアルカリール基である）および、
（ｄ）  （ａ）、（ｂ）および（ｃ）の混合物、
からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の布帛クリーニング組成物。
【請求項８】
前記有機ペルオキシ酸漂白剤の対応カルボン酸の、Ｈ．Ｌ．Ｂ値（親水性−親油性バランス）が約３〜約６．５の範囲である、請求項１に記載の布帛クリーニング組成物。
【請求項９】
組成物１００ｇ当たりの活性プロテアーゼｍｇ対有機ペルオキシ酸の理論有効Ｏ２ｐｐｍが、約１：１〜約２０：１の範囲である、請求項８に記載の布帛クリーニング組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物を含む洗浄溶液を、洗浄の必要な布帛に接触させることを含む、布帛のクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は漂白組成物、特に洗濯洗剤と、カルボニルヒドロラーゼ変種である１種以上のプロテアーゼ酵素および１種以上の漂白剤、特にブリーチ活性剤含有の漂白系を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々なタイプの酵素が布帛からのある種のしみの除去に役立つ洗濯洗剤として常用されてきた。これらのしみは、典型的には脂質およびタンパク質汚れと関係がある。
【０００３】
しかしながら、酵素は他のタイプの汚れおよびしみに対してはさほど有効でないことが知られている。
【０００４】
ペルオキシゲンブリーチは布帛からのしみおよび／または汚れ除去に有効であるが、このようなブリーチは温度依存性であることも長く知られてきた。６０℃の洗濯液温度のとき、ペルオキシゲンブリーチは部分的に有効なだけである。洗濯液温度が６０℃より下がると、ペルオキシゲンブリーチは比較的無効になる。結果として、有効な漂白系を開発する工業的研究が続けられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明によると、カルボニルヒドロラーゼ変種である新規プロテアーゼ酵素と漂白剤、特にブリーチ活性剤との組合せは、有効なしみ除去および／または黒ずみ除去効果を示すことが見出された。したがって、改善されたしみ除去および／または黒ずみ除去効果および／または布帛クリーニング効果および／または漂白性質を有する漂白組成物、特に洗濯洗剤組成物を提供することが本発明の目的である。
【０００６】
本発明のこれらおよび他の目的は、以下の詳細な記載から明らかであろう。
【０００７】
１９８７年１月６日付で発行されたBurns ら米国特許第４，６３４，５５１号明細書では、本発明において用いられるアミドペルオキシ酸漂白化合物とそれらの前駆体について開示している。１９８９年８月１日付で発行されたBurns ら米国特許第４，８５２，９８９号明細書も参照できる。１９９１年１２月３日付で発行されたLagerwaardらの米国特許第５，０６９，８０９号明細書では、ＮＯＢＳブリーチ活性剤とリパーゼ酵素LIPOLASEとの組合せについて開示している。リパーゼ酵素とある種の漂白系との適合性問題の説明に関しては、１９８９年１１月１５日付で公開されたLagerwaardらの欧州特許第３４１，９４７号明細書参照。１９８５年１０月８日付で発行されたSanderson の米国特許第４，５４５，７８４号明細書では、過ホウ酸ナトリウム一水和物への活性剤の吸収について開示している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は
（ａ）天然でみられないアミノ酸配列を有するカルボニルヒドロラーゼ変種であり、異なるアミノ酸による前駆カルボニルヒドロラーゼの複数アミノ酸残基の置換により誘導された、有効量のプロテアーゼ酵素（ここで、この前駆酵素において置換された上記複数のアミノ酸残基は＋７６位と、下記残基：＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４のうち１以上とに相当し、その番号位置はBacillus amyloliquefaciensの天然ズブチリシンあるいは他のカルボニルヒドロラーゼまたはズブチリシン（例えば、Bacillus lentus ズブチリシン）の相当アミノ酸残基に対応する）、
（ｂ）有機ペルオキシ酸であるか、または組成物から形成される漂白溶液中その場で活性剤と反応して有機ペルオキシ酸を形成しうる過酸化水素を生じることができるペルオキシゲン化合物とブリーチ活性剤との組合せである漂白剤、
および
（ｃ）プロテアーゼ酵素および漂白剤と適合する１種以上のクリーニング組成物物質
を含んでなる漂白組成物を提供する。
【０００９】
本発明には、好ましくは撹拌しながら布帛を上記漂白組成物含有水性液と接触させることからなる、布帛のクリーニング方法も包含する。その方法は約６０℃以下の温度で行えるが、もちろん沸騰までの洗濯温度であるとかなり有効である。水性洗濯液は、好ましくは少くとも約３００ｐｐｍの慣用的洗剤成分と、少くとも約２５ｐｐｍのブリーチ活性剤および少くとも約２５ｐｐｍの漂白化合物を含む。好ましくは、上記水性液は約９００〜約２０，０００ｐｐｍの慣用的洗剤成分と、約１００〜約２５，０００ｐｐｍの漂白化合物および約１００〜約２５００ｐｐｍの上記ブリーチ活性剤を含む。
【００１０】
上記方法で用いられる慣用的洗剤成分には、約１〜約９９．８％、好ましくは約５〜約８０％の洗浄界面活性剤を含む。場合により、洗浄組成物は約５〜約８０％の洗剤ビルダーも含むことができる。他の任意洗浄成分も本発明により提供される完全処方洗剤／ブリーチ組成物に含有される。
【００１１】
すべてのパーセンテージ、比率および割合は、他で指摘されないかぎり重量による。引用されたすべての文献は本明細書の開示の一部とされる。
【００１２】
発明の具体的説明
本発明において用いられる漂白組成物は、布帛の有効で効率的なクリーニングを行い、それにより布帛からしみおよび／または汚れを除去する。プロテアーゼ酵素と組合せた漂白系は、タンパク質および脂質汚れ、黒ずんだ汚れとしつこい汚れ、特に求核性および身体の汚れを含めて、布帛から様々なタイプの汚れを除去する上で特に効率的である。
【００１３】
ここで有用なプロテアーゼ酵素、漂白剤（ペルオキシ酸および漂白系を含む）およびクリーニング組成物物質は、以下で詳細に記載されている。
【００１４】
（１）漂白剤
本漂白組成物は漂白剤を含有し、これは好ましくは組成物の約０．５〜約２０ｗｔ％である。漂白剤は実質上不溶性で好ましくは固体の有機ペルオキシ酸、または過酸化水素を生じることができるペルオキシゲン漂白化合物とブリーチ活性剤からなる漂白系、あるいは双方の組合せである。組成物中にあるか、または活性剤およびペルオキシゲン化合物の組合せにより形成される過酸は、約３〜約６．５の範囲内の親水性‐親油性バランス（“Ｈ．Ｌ．Ｂ．”）値を有する対応カルボン酸を有することが好ましい。したがって、本発明で有用な好ましいペルオキシ酸（活性剤からまたは前形成ペルオキシ酸として）を特徴付けるために使用できる方法は、引用することにより本明細書の開示の一部とされるDavies,J.T.,Proc.2nd Internat.Congr.Surface Activity,1,426,Butterworths,London(1957)に記載されたような“Ｈ．Ｌ．Ｂ．スケール”である。このようなＨ．Ｌ．Ｂ．スケール（親水性‐親油性バランス）は、親水（水様）と親油（油様）相への界面活性剤の分配を表す手段として界面活性剤の研究で用いられてきた。このやり方だと、Ｈ．Ｌ．Ｂ．値は洗液中における活性漂白種の親油（疎水）特性の指標（即ち、洗液から離れて汚れ／界面に集まるペルオキシ酸の能力）として用いることができる。
【００１５】
選択されたペルオキシ酸について（対応カルボン酸として）計算されたＨ．Ｌ．Ｂ．値は下記表Ａで示されている。Ｈ．Ｌ．Ｂ．値を計算するために用いられる式は
ＨＬＢ＝合計（親水基数）−合計（疎水基数）＋７
として示すことができる。
【００１６】
親水基数の値は〔‐Ｃ（Ｏ）ＯＨ  ＆  ‐Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）‐＝２．１〕であり、疎水基数の値は〔脂肪族／芳香族炭素＝０．４７５  ＆  極性基間の脂肪族炭素原子は炭化水素鎖中脂肪族炭素の値の１／２＝（０．４７５）／２〕である。参考のため、Ｈ．Ｌ．Ｂ．値＞７は物質が主に水溶性であることを示し、Ｈ．Ｌ．Ｂ．値＜７は界面活性および疎水性が増加していることを示す。
【００１７】
表Ａ
様々なペルオキシ酸で示されるＨ．Ｌ．Ｂ．値
活性剤／前形成 略記 ペルオキシ酸 Ｈ．Ｌ．Ｂ．
ペルオキシ酸 対応カルボン酸
テトラアセチル          ＴＡＥＤ          CH3 C(O)OOH                  ８．６
エチレンジアミン
ジペルオキシ            ＤＰＤＤＡ        HOO(O)C(CH2)10                ６．５
ドデカン二酸                              ‐C(O)OOH
ペルオキシコハク酸      ＮＡＰＳＡ        CH3(CH2)8N(H)‐              ６．４
のノニルアミド                            C(O)(CH2)2C(O)OOH 
ベンゾイルオキシ        ＢＯＢＳ          C6H5C(O)OOH                  ６．３
ベンゼンスルホネート
ペルオキシアジピン酸    ＮＡＰＡＡ        CH3(CH2)8N(H)‐              ６．０
のノニルアミド                            C(O)(CH2)4C(O)OOH
ノナノイルオキシ        ＮＯＢＳ          CH3(CH2)７C(O)OOH            ５．３
ベンゼンスルホネート
デカノイルオキシ        ＤＯＢＳ          CH3(CH2 ) 8 C(O)OOH          ４．８
ベンゼンスルホネート
ペルラウリン酸          ＰＬＡ            CH3(CH2)10C(O)OOH            ３．９
【００１８】
前記のように、（直接加えられるかまたはその場で生成される）本発明のペルオキシ酸に関する（対応カルボン酸の）Ｈ．Ｌ．Ｂ．値の好ましい範囲は約３．０〜約６．５の範囲内である。（直接加えられるかまたはその場で生成される）本発明で有用なペルオキシ酸に関する（カルボン酸としての）Ｈ．Ｌ．Ｂ．値の更に好ましい範囲は約４．０〜６．５の範囲内である。（直接加えられるかまたはその場で生成される）本発明のペルオキシ酸に関する（カルボン酸としての）Ｈ．Ｌ．Ｂ．値の最も好ましい範囲は約４．０〜約６．０の範囲内である。
【００１９】
（ａ）ペルオキシ酸
本発明は、有効量のプロテアーゼ酵素と、少くとも約０．１％、好ましくは約０．１〜約５０重量％の実質上不溶性の有機ペルオキシ酸を含む漂白系とを含んでなる洗剤組成物にも関する。ここで有用なペルオキシ酸は、好ましくは組成物の約０．５〜約２０、更に好ましくは約１〜約１０、最も好ましくは約２〜約７ｗｔ％である。
【００２０】
好ましい有機ペルオキシ酸は、４‐ノニルアミノ‐４‐オキソペルオキシ酪酸、６‐（ノニルアミノ）‐６‐オキソペルオキシカプロン酸、１，１２‐ジペルオキシドデカン二酸、ヘプチルスルホニルペルプロピオン酸、デシルスルホニルペルプロピオン酸、ヘプチル‐、オクチル‐、ノニル‐、デシル‐スルホニルペル酪酸およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００２１】
有機ペルオキシ酸の中では、アミドペルオキシ酸（アミド置換ペルオキシカルボン酸）が好ましい。ここで使用上適切なアミドペルオキシ酸は、双方とも引用することにより本明細書の開示の一部とされる、各々１９８７年１月６日付および１９８７年８月１１日付で発行された双方ともBurns らの米国特許第４，６３４，５５１号および第４，６８６，０６３号明細書で記載されている。適切なアミドペルオキシ酸は下記式である：
【化１】
2006117937.tif 000002
上記式中Ｒ１は約１〜約１４の炭素原子を有するアルキル、アリールまたはアルカリール基であり（好ましくは、Ｒ１は約６〜約１２の炭素原子を有するアルキル基である）、Ｒ２は約１〜約１４の炭素原子を有するアルキレン、アリレンまたはアルカリレン基であり（好ましくは、Ｒ２は約１〜約６の炭素原子を有するアルキレン基である）、Ｒ５はＨあるいは約１〜約１０の炭素原子を有するアルキル、アリールまたはアルカリール基である（好ましくは、Ｒ５はＨである）。更に好ましくは、Ｒ１は約８〜約１０の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ２は約２〜約４の炭素原子を有するアルキレン基である。
【００２２】
引用することにより本明細書の開示の一部とされる１９８９年８月１日付で発行されたBurns らの米国特許第４，８５２，９８９号明細書で記載されたペルオキシフマレートと、すべて引用することにより本明細書の開示の一部とされる、各々１９８８年７月１９日付、１９８９年４月２５日付および１９９１年４月２日付で発行されたすべてDryoffらの米国特許第４，７５８，３６９号、第４，８２４，５９１号および第５，００４，５５８号明細書で記載されたスルホンペルオキシ酸（スルホンペルオキシカルボン酸）も、好ましく使用できる。
【００２３】
米国特許第４，６８６，０６３号明細書の例Ｉは、第８欄４０行目〜第９欄５行目のＮＡＰＳＡと、第９欄１５行目〜第９欄６５行目のＮＡＰＡＡの合成の記載を含んでいる。アミドペルオキシ酸合成の最後に、反応は水で停止され、ロ過され、一部過剰の硫酸（またはペルオキシ酸が作られた他の強酸）を除去するために水で洗浄され、再びロ過される。
【００２４】
こうして得られたアミドペルオキシ酸湿潤ケークは、引用することにより本明細書の開示の一部とされる１９９０年３月２０日付で発行されたSadlowski らの米国特許第４，９０９，９５３号に従い、約３．５〜６、好ましくは約４〜５のｐＨでリン酸緩衝液と接触させることができる。
【００２５】
貯蔵安定性または発熱コントロール用の他剤も、最終製品中への配合前にアミドペルオキシ酸に添加できる。例えば、引用することにより本明細書の開示の一部とされる１９８７年８月１１日付で発行されたBurns の米国特許第４，６８６，０６３号明細書で開示された発熱コントロール剤、ホウ酸は、約２：１過酸：ホウ酸比で（リン酸緩衝液で洗浄された）アミドペルオキシ酸と混合できる。リン酸緩衝液洗浄アミドペルオキシ酸は、適量のジピコリン酸およびピロリン酸四ナトリウム、キレート化安定系と混合してもよい。キレート化剤は、湿潤ケークとの接触前に、場合によりリン酸緩衝液に含有させることができる。
【００２６】
湿潤ケークは約０．１〜約２６０ミクロン、好ましくは約１０〜約１００ミクロン、最も好ましくは約３０〜約６０ミクロンの平均粒径の粒子から構成されることが好ましい。小さな粒度のＮＡＰＡＡ結晶がここでは望ましい。引用することにより本明細書の開示の一部とされる、１９９１年１０月８日付で発行されたGetty らの米国特許第５，０５５，２１８号明細書参照。
【００２７】
このＮＡＰＡＡロ過ケークは、好ましくはリン酸緩衝液で２回洗浄される。２連続リン酸緩衝液洗浄でＮＡＰＡＡに最良の安定性を与えることがわかった。
【００２８】
約３〜約１２、最も好ましくは５〜７の理論ＡｖＯ（有効酸素）を有する粒状（固体）有機ペルオキシ酸が好ましい。
【００２９】
ＮＡＰＡＡがここでは使用上最も好ましい。ペルオキシアジピン酸のノニルアミド（“ＮＡＰＡＡ”）に関するもう１つの名称は、６‐（ノニルアミノ）‐６‐オキソペルオキシカプロン酸である。ＮＡＰＡＡの化学式は以下である：
【化２】
2006117937.tif 000003
ＮＡＰＡＡの分子量は２８７．４である。
【００３０】
ＮＡＰＡＡを含有した洗剤組成物および漂白組成物は、布帛の極めて有効で効率的な表面漂白を行う。しみおよび／または汚れは布帛から除去される。これらの組成物は布帛から黒ずんだ汚れを除去する上で特に有効である。
【００３１】
ＮＡＰＡＡの極性アミドまたは置換アミド部分は、非常に低い蒸気圧を有し、ひいては臭気の小さな、優れた漂白性能を有したペルオキシ酸を作る。アミド基の極性はペルオキシ酸の蒸気圧の減少と融点の増加を起こすと考えられる。
【００３２】
ＮＡＰＡＡは漂白剤として直接使用できる。それは洗濯適用上低い蒸気圧と良好な臭気特性を有する。
【００３３】
ＮＡＰＡＡは、例えば、初めにＮＡＡＡ（アジピン酸のモノノニルアミド）、硫酸および過酸化水素を反応させることにより製造できる。反応生成物は氷水の添加で冷却され、その後ロ過、蒸留水洗浄、最後に湿潤ケークを回収するために吸引ロ過される。洗浄はロ液のｐＨが中性になるまで続けることができる。
【００３４】
ＮＡＰＡＡ  ｐＨ（水中１０％固形分）は約４．２〜４．８であることも好ましい。意外にも、このｐＨはより熱的に安定な粒子を作る。
【００３５】
（ｂ）漂白系‐ブリーチ活性剤およびペルオキシゲン漂白化合物
（ｉ）ブリーチ活性剤
ここで有用な漂白系のブリーチ活性剤は、好ましくは下記構造を有する：
【化３】
2006117937.tif 000004
上記式中Ｒは約５〜約１８の炭素原子を有するアルキル基であって、カルボニル炭素を含めてそこから伸びる最長の直鎖アルキル鎖は約６〜約１０の炭素原子を有し、Ｌは脱離基であり、その共役酸は約４〜約１３、好ましくは約６〜約１１、最も好ましくは約８〜約１１の範囲内のｐＫａを有する。
【００３６】
Ｌは本質的にいかなる適切な脱離基であってもよい。脱離基とは、ブリーチ活性剤でペルヒドロキシドアニオンによる求核攻撃の結果としてブリーチ活性剤から離れる基である。このペルヒドロライシス(perhydrolysis) 反応では過カルボン酸を形成する。通常、その基が適切な脱離基であれば、それは電子吸引効果を発揮するにちがいない。これはペルヒドロキシドアニオンによる求核攻撃を容易にする。
【００３７】
Ｌ基は反応が最適の時間枠（例えば、洗浄サイクル）内で起きるほど十分に反応性でなければならない。しかしながら、Ｌが反応性すぎると、この活性剤は安定化させることが困難になる。これらの特徴は脱離基の共役酸のｐＫａと通常パラレルであるが、この慣例の例外が知られている。
【００３８】
好ましいブリーチ活性剤は下記一般式の場合である：
【化４】
2006117937.tif 000005
上記式中Ｒ１は約６〜約１２の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ２は１〜約６の炭素原子を有するアルキレンであり、Ｒ５はＨあるいは約１〜約１０の炭素原子を有するアルキル、アリールまたはアルカリールであり、Ｌは
【化５】
2006117937.tif 000006
からなる群より選択される。Ｒ６は約１〜約１４の炭素原子を有するアルキレンル、アリレンまたはアルカリレン基であり、Ｒ３は約１〜約８の炭素原子を有するアルキル鎖であり、Ｒ４はＨまたはＲ３であり、ＹはＨまたは安定基である。Ｙは好ましくは‐ＳＯ３−Ｍ＋、‐ＣＯＯ−Ｍ＋、‐ＳＯ４−Ｍ＋、（‐Ｎ＋Ｒ′３）Ｘ−およびＯ←Ｎ（Ｒ′３）からなる群より選択され、ここでＲ′は約１〜約４の炭素原子を有するアルキル鎖であり、Ｍはブリーチ活性剤に安定性を与えるカチオンであり、Ｘはブリーチ活性剤に溶解性を与えるアニオンである。好ましくは、Ｍはアルカリ金属、アンモニウムまたは置換アンモニウムカチオンであり、ナトリウムおよびカリウムが最も好ましく、Ｘはハライド、ヒドロキシド、メチル硫酸および酢酸アニオンからなる群より選択されるアニオンである。更に好ましくは、Ｙは‐ＳＯ３−Ｍ＋および‐ＣＯＯ−Ｍ＋である。溶解基を含まない脱離基のあるブリーチ活性剤は、それらの溶解を助けるためにブリーチ溶液によく分散させるべきであることに注意すべきである。好ましくは以下である：
【００３９】
【化６】
2006117937.tif 000007
上記式中Ｒ３は前記のとおりであり、Ｙは‐ＳＯ３−Ｍ＋または‐ＣＯＯ−Ｍ＋であり、Ｍは前記のとおりである。
【００４０】
特に好ましいブリーチ活性剤は、Ｒ１が約６〜約１２の炭素原子を有する直鎖アルキル鎖であり、Ｒ２が約２〜約６の炭素原子を有する直鎖アルキレン鎖であり、Ｒ５がＨであり、Ｌが
【化７】
2006117937.tif 000008
（上記式中Ｒ３は前記のとおりであり、Ｙは‐ＳＯ３−Ｍ＋または‐ＣＯＯ−Ｍ＋であり、Ｍは前記のとおりである）からなる群より選択される場合である。
【００４１】
好ましいブリーチ活性剤は：
【化８】
2006117937.tif 000009
であり、上記式中ＲはＨ、アルキル、アリールまたはアルカリールである。これは、引用することにより本明細書の開示の一部とされるHodge らの米国特許第４，９６６，７２３号明細書で記載されている。
【００４２】
好ましいブリーチ活性剤は：
【化９】
2006117937.tif 000010
または
であり、上記式中Ｒ１はＨまたは約１〜約６の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ２は約１〜約６の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｌは前記のとおりである。
【００４３】
更に、好ましいブリーチ活性剤は、Ｌが一般式で定義されたとおりであり、Ｒ１がＨまたは約１〜約４の炭素原子を有するアルキル基である、前記一般式の場合である。
【００４４】
Ｌが一般式で定義されたとおりであり、Ｒ１がＨである前記一般式のブリーチ活性剤が更に一層好ましい。
【００４５】
更に好ましいブリーチ活性剤は、Ｒが約５〜約９、好ましくは約６〜約８の炭素原子を有する直鎖アルキル鎖であり、Ｌが
【化１０】
2006117937.tif 000011
（上記式中Ｒ、Ｒ２、Ｒ３およびＹは前記のとおりである）からなる群より選択される、前記一般式の場合である。
【００４６】
特に好ましいブリーチ活性剤は、Ｒが約５〜約１２の炭素原子を有するアルキル基であって、カルボニル炭素を含めてそこから伸びるアルキル鎖の最長直鎖部分が約６〜約１０の炭素原子を有し、Ｌが
【化１１】
2006117937.tif 000012
（上記式中Ｒ２は約１〜約８の炭素原子を有するアルキル鎖であり、Ｙは‐ＳＯ３−Ｍ＋または‐ＣＯＯ−Ｍ＋であり、Ｍはアルカリ金属、アンモニウムまたは置換アンモニウムカチオンである）からなる群より選択される、前記一般式の場合である。
【００４７】
特に好ましいブリーチ活性剤は、Ｒが約５〜約９、好ましくは約６〜約８の炭素原子を有する直鎖アルキル鎖であり、Ｌが
【化１２】
2006117937.tif 000013
（上記式中Ｒ２は前記のとおりであり、Ｙは‐ＳＯ３−Ｍ＋または‐ＣＯＯ−Ｍ＋であり、Ｍは前記のとおりである）からなる群より選択される、前記一般式の場合である。
【００４８】
最も好ましいブリーチ活性剤は下記式を有する：
【化１３】
2006117937.tif 000014
上記式中Ｒは約５〜約９、好ましくは約６〜約８の炭素原子を有する直鎖アルキル鎖であり、Ｍはナトリウムまたはカリウムである。
【００４９】
好ましくは、本ブリーチ活性剤はナトリウムノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）またはナトリウムベンゾイルオキシベンゼンスルホネート（ＢＯＢＳ）である。
【００５０】
更に、本発明漂白組成物で使用上特に好ましいのは、天然ゴム部分を有する機械で使用上特に安全である下記ブリーチ活性剤である。これはこれらのアミド酸誘導ブリーチ活性剤のペルヒドロライシス反応により油状ジアシルペルオキシド（ＤＡＰ）種を生じず、むしろ不溶性結晶固体ＤＡＰを形成する結果であると考えられる。これらの固体物はコーティングフィルムを形成しないと考えられ、このため天然ゴム部分は長期間にわたりＤＡＰに暴露されない。これらの好ましいブリーチ活性剤は下記からなる群より選択されるメンバーである：
【００５１】
ａ）下記一般式のブリーチ活性剤：
【化１４】
2006117937.tif 000015
またはそれらの混合物。上記式中Ｒ１は約１〜約１４の炭素原子を有するアルキル、アリールまたはアルカリール基であり、Ｒ２は約１〜約１４の炭素原子を有するアルキレン、アリレンまたはアルカリレン基であり、Ｒ５はＨあるいは約１〜約１０の炭素原子を有するアルキル、アリールまたはアルカリール基であり、Ｌは脱離基である；
【００５２】
ｂ）下記一般式のベンゾオキサジンタイプブリーチ活性剤：
【化１５】
2006117937.tif 000016
上記式中Ｒ１はＨ、アルキル、アルカリール、アリール、アリールアルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はＨ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アリール、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、アルキルアミノ、ＣＯＯＲ６（Ｒ６はＨまたはアルキル基である）およびカルボニル官能基から選択される同一または異なる置換基である；
【００５３】
ｃ）下記式のＮ‐アシルカプロラクタムブリーチ活性剤：
【化１６】
2006117937.tif 000017
Ｒ６はＨあるいは１〜１２の炭素を有するアルキル、アリール、アルコキシアリールまたはアルカリール基である；
【００５４】
ｄ）ａ）、ｂ）およびｃ）の混合物
タイプａ）の好ましいブリーチ活性剤は、Ｒ１が約６〜約１２の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ２が約１〜約８の炭素原子を有し、Ｒ５がＨまたはメチルである場合である。特に好ましいブリーチ活性剤は、Ｒ１が約７〜約１０の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ２が約４〜約５の炭素原子を有する、前記一般式の場合である。
【００５５】
タイプｂ）の好ましいブリーチ活性剤は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５がＨであり、Ｒ１がフェニル基である場合である。
【００５６】
タイプｃ）の上記Ｎ‐アシルカプロラクタムブリーチ活性剤の好ましいアシル部分は式Ｒ６‐ＣＯ‐を有し、ここでＲ６はＨあるいは１〜１２、好ましくは６〜１２の炭素原子を有するアルキル、アリール、アルコキシアリールまたはアルカリール基である。高度に好ましい態様において、Ｒ６はフェニル、ヘプチル、オクチル、ノニル、２，４，４‐トリメチルペンチル、デセニルおよびそれらの混合からなる群より選択されるメンバーである。
【００５７】
‐アミド誘導ブリーチ活性剤‐本発明で用いられるタイプａ）のブリーチ活性剤は下記一般式のアミド置換化合物：
【化１７】
2006117937.tif 000018
【００５８】
またはそれらの混合物であり、上記式中Ｒ１、Ｒ２およびＲ５は前記のとおりであり、Ｌは本質的にいかなる適切な脱離基であってもよい。好ましいブリーチ活性剤は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５がペルオキシ酸に関して定義されたとおりであり、Ｌが
【化１８】
2006117937.tif 000019
およびそれらの混合からなる群より選択され、Ｒ１が約１〜約１４の炭素原子を有するアルキル、アリールまたはアルカリール基であり、Ｒ３が１〜約８の炭素原子を有するアルキル鎖であり、Ｒ４がＨまたはＲ３であり、ＹがＨまたは安定基である、前記一般式の場合である。
【００５９】
好ましい溶解基‐ＳＯ３−Ｍ＋、‐ＣＯ２−Ｍ＋、‐ＳＯ４−Ｍ＋、‐Ｎ＋（Ｒ３）４Ｘ−およびＯ←Ｎ（Ｒ３）３、最も好ましくは‐ＳＯ３−Ｍ＋および‐ＣＯ２−Ｍ＋であり、ここでＲ３は約１〜約４の炭素原子を有するアルキル鎖であり、Ｍはブリーチ活性剤に安定性を与えるカチオンであり、Ｘはブリーチ活性剤に溶解性を与えるアニオンである。好ましくは、Ｍはアルカリ金属、アンモニウムまたは置換アンモニウムカチオンであり、ナトリウムおよびカリウムが最も好ましく、Ｘはハライド、ヒドロキシド、メチル硫酸および酢酸アニオンである。溶解基を含まない脱離基のあるブリーチ活性剤は、それらの溶解を助けるためにブリーチ溶液によく分散させるべきであることに注意すべきである。
【００６０】
好ましいブリーチ活性剤は、Ｌが
【化１９】
2006117937.tif 000020
（上記式中Ｒ３は前記のとおりであり、Ｙは‐ＳＯ３−Ｍ＋または‐ＣＯＯ−Ｍ＋であり、Ｍは前記のとおりである）からなる群より選択される、前記一般式の場合である。
【００６１】
タイプｂ）およびタイプｃ）の場合を含めてブリーチ活性剤のもう１つの重要なクラスでは、環式環のカルボニル炭素でペルヒドロキシドアニオンによる求核攻撃の結果として、開環によりここで記載されたような有機ペルオキシ酸を生じる。例えば、タイプｃ）活性剤の開環反応では過酸化水素またはそのアニオンによりカプロラクタム環カルボニルで攻撃する。過酸化水素またはそのアニオンによるアシルカプロラクタムの攻撃が好ましくは環外カルボニルで起きるため、開環の重要なフラクションを得るには触媒を要するかもしれない。開環ブリーチ活性剤のもう１つの例は、１９９０年１０月３０日付で発行されたHodge らの米国特許第４，９６６，７２３号明細書で開示されたようなタイプｂ）活性剤でみられる。
【００６２】
‐ベンゾオキサジンタイプブリーチ活性剤‐Hodge により開示されたこのような活性剤化合物には、下記式を有するベンゾオキサジンタイプ：
【化２０】
2006117937.tif 000021
と、下記タイプの置換ベンゾオキサジン：
【００６３】
【化２１】
2006117937.tif 000022
（上記式中Ｒ１はＨ、アルキル、アルカリール、アリール、アリールアルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はＨ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アリール、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、アルキルアミノ、ＣＯＯＲ６（Ｒ６はＨまたはアルキル基である）およびカルボニル官能基から選択される同一または異なる置換基である）を含めた活性剤がある。
【００６４】
ベンゾオキサジンタイプの好ましい活性剤は以下である：
【化２２】
2006117937.tif 000023
活性剤が用いられるとき、最良の表面漂白性能は、溶液のｐＨがペルヒドロライシス反応を促進するために約８．５〜１０．５、好ましくは９．５〜１０．５である洗浄溶液で得られる。このようなｐＨは、本漂白系の任意成分である、緩衝剤として普通知られる物質で得られる。
【００６５】
‐Ｎ‐アシルカプロラクタムブリーチ活性剤‐本発明で用いられるタイプｃ）のＮ‐アシルカプロラクタムブリーチ活性剤は下記式を有する：
【化１９】
2006117937.tif 000024
Ｒ６はＨあるいは１〜１２の炭素を有するアルキル、アリール、アルコキシアリールまたはアルカリール基である。Ｒ６部分が少くとも約６、好ましくは６〜約１２の炭素原子を有するカプロラクタム活性剤は、前記のような求核およびボディ汚れクリーンアップを示す疎水性漂白を行う。Ｒ６が１〜約６の炭素原子を有するカプロラクタム活性剤は、飲料しみを漂白する上で特に効果的である親水性漂白種を供する。典型的には１：５〜５：１、好ましくは１：１の重量比にある疎水性および親水性カプロラクタムの混合物が、混合しみ除去効果のためにここで用いることができる。
【００６６】
高度に好ましいＮ‐アシルカプロラクタムはベンゾイルカプロラクタム、オクタノイルカプロラクタム、ノナノイルカプロラクタム、３，５，５‐トリメチルヘキサノイルカプロラクタム、デカノイルカプロラクタム、ウンデセノイルカプロラクタムおよびそれらの混合物からなる群より選択される。Ｎ‐アシルカプロラクタムの製造方法は当業界で周知である。
【００６７】
米国特許第４，５４５，７８４号明細書の開示とは逆に、ブリーチ活性剤はペルオキシゲン漂白化合物に吸収されないことが好ましい。他の有機洗浄成分の存在下でそうすることは、安全性問題を引き起こすことがある。
【００６８】
タイプａ）、ｂ）またはｃ）のブリーチ活性剤は、漂白系または洗剤組成物の少くとも０．１重量％、好ましくは約０．１〜約５０％、更に好ましくは約１〜約３０％、最も好ましくは約３〜約２５％である。
【００６９】
ここで好ましいアミド誘導およびカプロラクタムブリーチ活性剤は、典型的には１：５〜５：１、好ましくは約１：１の範囲内にあるアミド誘導またはカプロラクタム活性剤：ＴＡＥＤの重量比で、ＴＡＥＤのようなゴム安全性、酵素安全性、親水性活性剤と併用することもできる。
【００７０】
通常漂白メカニズム、特に表面漂白メカニズムは、完全には理解されていない。しかしながら、ブリーチ活性剤はペルオキシゲンブリーチにより放出される過酸化水素から生じるペルヒドロキシドアニオンによる求核攻撃をうけて、ペルオキシカルボン酸を形成すると通常考えられる。この反応はペルヒドロライシスと通常称される。
【００７１】
活性剤が用いられるとき、最良の表面漂白性能は、溶液のｐＨがペルヒドロライシス反応を促進するために約８．５〜１０．５、好ましくは９．５〜１０．５である洗浄溶液で得られる。このようなｐＨは、本漂白系の任意成分である、緩衝剤として普通知られる物質で得られる。
【００７２】
（ii）ペルオキシゲン漂白化合物
ここで有用なペルオキシゲン漂白系は、水性液中で過酸化水素を生成できるものである。これらの化合物は当業界で周知であり、それには過酸化水素と、アルカリ金属ペルオキシド、有機ペルオキシド漂白化合物、例えば過酸化尿素、および無機過酸塩漂白化合物、例えば過ホウ酸、過炭酸、過リン酸アルカリ金属などがある。２種以上のこのような漂白化合物の混合物も所望であれば使用できる。
【００７３】
好ましいペルオキシゲン漂白化合物には、一、三および四水和物の形で市販されている過ホウ酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウムペルオキシ水和物、尿素ペルオキシ水和物、過炭酸ナトリウムおよび過酸化ナトリウムがある。過ホウ酸ナトリウム四水和物、過ホウ酸ナトリウム一水和物および過炭酸ナトリウムが特に好ましい。貯蔵中非常に安定で、しかも漂白液に非常に速やかに溶解することから、過炭酸塩が特に好ましい。このように速やかな溶解はより高レベルの過カルボン酸を形成し、こうして表面漂白性能を高めると考えられる。
【００７４】
高度に好ましい過炭酸塩は非コート形でもまたはコートされた形でもよい。非コート過炭酸塩の平均粒度は約４００〜約１２００ミクロン、最も好ましくは約４００〜約６００ミクロンの範囲内である。コートされた過炭酸塩が用いられるとき、好ましいコーティング物質にはカーボネート、サルフェート、シリケート、ボロシリケートまたは脂肪カルボン酸の混合物がある。
【００７５】
ペルオキシゲン漂白化合物は、漂白系または洗剤組成物の少くとも０．１重量％、好ましくは約１〜約７５％、更に好ましくは約３〜約４０％、最も好ましくは約３〜約２５％である。
【００７６】
漂白系中におけるブリーチ活性剤対ペルオキシゲン漂白化合物の重量比は、典型的には約２：１〜１：５の範囲内である、好ましい比率は約１：１〜約１：３の範囲内である。
【００７７】
ペルオキシゲン漂白化合物により生成される過酸化水素対ブリーチ活性剤のモル比は約１．０以上、更に好ましくは約１．５以上、最も好ましくは約２．０〜約１０である。好ましくは、本漂白組成物は約０．５〜約２０、最も好ましくは約１〜約１０ｗｔ％のペルオキシゲン漂白化合物を含む。
【００７８】
本ブリーチ活性剤／漂白化合物系はそれ自体ブリーチとして有用である。しかしながら、このような漂白系は界面活性剤、ビルダーなどのような様々な洗浄助剤を含むことができる組成物で特に有用である。
【００７９】
（２）プロテアーゼ酵素：
本発明には、変種のアミノ酸配列が誘導されている前駆カルボニルヒドロラーゼと比較して、異なるタンパク質分解活性、安定性、基質特異性、ｐＨプロフィルおよび／または性能特徴を有した、非天然カルボニルヒドロラーゼ変種であるプロテアーゼ酵素を含む。前駆カルボニルヒドロラーゼは天然カルボニルヒドロラーゼでもまたは組換えヒドロラーゼであってもよい。特に、このようなカルボニルヒドロラーゼ変種は天然でみられないアミノ酸配列を有しており、異なるアミノ酸による前駆カルボニルヒドロラーゼの「複数アミノ酸残基」の置換により誘導されている。前駆酵素の「複数アミノ酸残基」は＋７６位と、下記残基：＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４のうち１以上とに相当し、その番号位置はBacillus amyloliquefaciensの天然ズブチリシンあるいは他のカルボニルヒドロラーゼまたはズブチリシン、例えばBacillus lentus ズブチリシンの相当アミノ酸残基に対応する。
【００８０】
本発明組成物において有用なプロテアーゼ酵素であるカルボニルヒドロラーゼ変種は、アミノ酸残基＋７６位の置換を１以上の追加の修飾と共に有する。好ましくは、本発明で有用な変種プロテアーゼ酵素は下記組合せ：76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265および／または 76/103/104/222 でアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有する。最も好ましくは、本発明で有用な変種酵素は残基の下記組合せ：Ｂ．amyloliquefaciens ズブチリシンの76/99; 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 および 76/101/104 でアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有する。
【００８１】
このようなカルボニルヒドロラーゼまたはズブチリシン変種をコードする変種ＤＮＡ配列は、天然または組換え前駆酵素をコードする前駆ＤＮＡ配列から誘導される。変種ＤＮＡ配列は、Bacillus amyloliquefaciensにおいて７６、９９、１０１、１０３、１０４、１０７、１２３、２７、１０５、１０９、１２６、１２８、１３５、１５６、１６６、１９５、１９７、２０４、２０６、２１０、２１６、２１７、２１８、２２２、２６０、２６５および／または２７４位あるいはそのいずれかの組合せに相当する前駆ＤＮＡ配列によりコードされる１以上の特定アミノ酸残基の置換についてコードするように前駆ＤＮＡ配列を修飾することにより誘導される。ここで修飾について特定されたアミノ酸残基は（すべてのズブチリシンで残基位置を特定する上で常法になった）Ｂ．amyloliquefaciens に適用しうる番号付けに従い特定されているが、本発明において有用な好ましい前駆ＤＮＡ配列は図９〜１１で示されたようなBacillus lentus のＤＮＡ配列である（Seq.ID No.11）。
【００８２】
これらの変種ＤＮＡ配列は、１以上の追加の修飾と共にアミノ酸残基７６の挿入または置換をコードしている。好ましくは、変種ＤＮＡ配列は下記組合せ：76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265および／または 76/103/104/222 でアミノ酸残基の置換または挿入についてコードしている。最も好ましくは、変種ＤＮＡ配列は残基の下記組合せ：76/99; 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 および 76/101/104 の修飾についてコードしている。これらの組換えＤＮＡ配列は、一般的に前駆カルボニルヒドロラーゼＤＮＡ配列によりコードされる酵素の同性質とは実質的に異なる少くとも１つの性質と、新規アミノ酸配列を有する、カルボニルヒドロラーゼ変種をコードしている。このような性質にはタンパク質分解活性、基質特異性、安定性、変化したｐＨプロフィルおよび／または向上した性能特徴が含まれる。
【００８３】
有用なプロテアーゼ酵素は、表示されたアミノ酸残基位置で１９種天然Ｌ‐アミノ酸のうちいずれかの置換を有している。このような置換はいかなる前駆ズブチリシン（原核、真核、哺乳動物など）でも行える。この出願全般にわたり、共通１および３文字コードで様々なアミノ酸について表している。このようなコードはDale,J.W.(1989),Molecular Genetics of Bacteria,John Wiley & Sons,Ltd.,Appendix Bと同じである。
【００８４】
好ましくは、特定アミノ酸残基位置の各々で行われる置換には、７６位におけるＤ、Ｈ、Ｅ、Ｇ、Ｆ、Ｋ、ＰおよびＮを含めた置換；９９位におけるＤ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＳを含めた置換；１０１位におけるＧ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ａ、Ｅ、ＳおよびＲを含めた置換；１０３位におけるＱ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｋ、Ｇ、Ｒ、ＳおよびＡを含めた置換；１０４位における全１９種天然アミノ酸を含めた置換；１０７位におけるＶ、Ｌ、Ｍ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｆ、Ｔ、Ｓ、Ａ、ＮおよびＩを含めた置換；１２３位におけるＮ、Ｔ、Ｉ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＳを含めた置換；２７位におけるＫ、Ｎ、Ｃ、ＶおよびＴを含めた置換；１０５位におけるＡ、Ｄ、Ｇ、ＲおよびＮを含めた置換；１０７位におけるＡ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｇ、Ｆ、Ｔ、ＳおよびＡを含めた置換；１０９位におけるＳ、Ｋ、Ｒ、Ａ、ＮおよびＤを含めた置換；１２６位におけるＡ、Ｆ、Ｉ、ＶおよびＧを含めた置換；１２８位におけるＧ、ＬおよびＡを含めた置換；１３５位におけるＡ、Ｆ、Ｉ、ＳおよびＶを含めた置換；１５６位におけるＤ、Ｅ、Ａ、Ｇ、ＱおよびＫを含めた置換；１６６位における全１９種天然アミノ酸を含めた置換；１９５位におけるＥを含めた置換；１９７位におけるＥを含めた置換；２０４位におけるＡ、Ｇ、Ｃ、ＳおよびＤを含めた置換；２０６位におけるＬ、Ｙ、Ｎ、ＤおよびＥを含めた置換；２１０位におけるＬ、Ｉ、Ｓ、ＣおよびＦを含めた置換；２１６位におけるＶ、Ｅ、ＴおよびＫを含めた置換；２１７位における全１９種天然アミノ酸を含めた置換；２１８位におけるＳ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＶを含めた置換；２２２位における全１９種天然アミノ酸を含めた置換；２６０位におけるＰ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｃ、ＫおよびＤを含めた置換；２６５位におけるＮ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｋ、ＹおよびＨを含めた置換；２７４位におけるＡおよびＳを含めた置換があるが、これらに制限されない。このような各位置で置換される特に好ましいアミノ酸は下記表Ｉで表示されている。特定のアミノ酸が表Ｉで示されているが、いかなるアミノ酸も特定残基で置き換わっていてよいことが理解されるべきである。
【００８５】
表Ｉ
アミノ酸残基 置換／挿入される好ましいアミノ酸
＋７６          Ｄ，Ｈ
＋９９          Ｄ，Ｔ，Ｎ，Ｇ
＋１０１        Ｒ，Ｇ，Ｄ，Ｋ，Ｌ，Ａ，Ｅ
＋１０３        Ａ，Ｑ，Ｔ，Ｄ，Ｅ，Ｙ，Ｋ，Ｇ，Ｒ
＋１０４        Ｉ，Ｙ，Ｓ，Ｌ，Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｆ，Ｍ，Ｗ，Ｄ，Ｖ，Ｎ
＋１０７        Ｖ，Ｌ，Ｙ，Ｇ，Ｆ，Ｔ，Ｓ，Ａ，Ｎ
＋１２３        Ｓ，Ｔ，Ｉ
＋２７          Ｋ
＋１０５        Ａ，Ｄ
＋１０９        Ｓ，Ｋ，Ｒ
＋１２６        Ａ，Ｉ，Ｖ，Ｆ
＋１２８        Ｇ，Ｌ
＋１３５        Ｉ，Ａ，Ｓ
＋１５６        Ｅ，Ｄ，Ｑ
＋１６６        Ｄ，Ｇ，Ｅ，Ｋ，Ｎ，Ａ，Ｆ，Ｉ，Ｖ，Ｌ
＋１９５        Ｅ
＋１９７        Ｅ
＋２０４        Ａ，Ｇ，Ｃ
＋２０６        Ｌ
＋２１０        Ｉ，Ｓ，Ｃ
＋２１６        Ｖ
＋２１７        Ｈ，Ｉ，Ｙ，Ｃ，Ａ，Ｇ，Ｆ，Ｓ，Ｎ，Ｅ，Ｋ
＋２１８        Ｓ
＋２２２        Ａ，Ｑ，Ｓ，Ｃ，Ｉ，Ｋ
＋２６０        Ｐ，Ａ，Ｓ，Ｎ，Ｇ，
＋２６５        Ｎ，Ａ，Ｇ，Ｓ
＋２７４        Ａ，Ｓ
【００８６】
Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの＋７６に相当するアミノ酸残基においてＢ．lentusズブチリシンにおいてインビトロ変異を有するこれらのプロテアーゼ酵素は、前駆ズブチリシンにはない変化した安定性（例えば、修正された自己タンパク質分解安定性）を示すズブチリシン変種を生じる（表IVおよびVI参照）。
【００８７】
しかも、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンにおいて＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４に相当する残基のインビトロ変異は、単独でまたは互いの組合せで、＋７６変異と一緒になって、変化したタンパク質分解活性、変化した熱安定性、変化したｐＨプロフィル、変化した基質特異性および／または変化した性能特徴を示すズブチリシン変種を生じる。
【００８８】
カルボニルヒドロラーゼはＣ（Ｏ）‐Ｘ結合（ここで、Ｘは酸素または窒素である）を有した化合物を加水分解するプロテアーゼ酵素である。それらには天然カルボニルヒドロラーゼおよび組換えカルボニルヒドロラーゼがある。天然カルボニルヒドロラーゼには主としてヒドロラーゼ、例えばズブチリシンまたはメタロプロテアーゼのようなペプチドヒドロラーゼがある。ペプチドヒドロラーゼとしてはα‐アミノアシルペプチドヒドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、チオールプロテイナーゼ、カルボキシルプロテイナーゼおよびメタロプロテイナーゼがある。セリン、メタロ、チオールおよび酸プロテアーゼと、エンドおよびエキソプロテアーゼが含まれる。
【００８９】
“組換えカルボニルヒドロラーゼ”とは、天然カルボニルヒドロラーゼをコードするＤＮＡ配列がカルボニルヒドロラーゼアミノ酸配列で１以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失についてコードする変異ＤＮＡ配列を生じるように修飾されてなる、カルボニルヒドロラーゼに関する。適切な修飾法は本明細書、ならびに米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ３４，６０６）、米国特許第５，２０４，０１５号および米国特許第５，１８５，２５８号明細書に開示されており、それらの開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００９０】
ズブチリシンは、タンパク質またはペプチドのペプチド結合を開裂するように通常作用する細菌または真菌カルボニルヒドロラーゼである。ここで用いられる“ズブチリシン”とは天然ズブチリシンまたは組換えズブチリシンを意味する。天然ズブチリシンのシリーズは様々な微生物種により産生されて、しばしば分泌されることが知られている。このシリーズのメンバーのアミノ酸配列は完全に相同的ではない。しかしながら、このシリーズのズブチリシンは同一または類似タイプのタンパク質分解活性を示す。このセリンプロテアーゼは、それらとキモトリプシン関連クラスのセリンプロテアーゼとを区別する触媒三残基(catalytic triad) を規定する共通アミノ酸配列を有している。ズブチリシンおよびキモトリプシン関連セリンプロテアーゼの双方はアスパラギン酸、ヒスチジンおよびセリンからなる触媒三残基を有している。ズブチリシン関連プロテアーゼにおいて、これらアミノ酸の相対順序は、アミノからカルボキシ末端にかけて読取ると、アスパラギン酸‐ヒスチジン‐セリンである。しかしながら、キモトリプシン関連プロテアーゼでは、相対順序がヒスチジン‐アスパラギン酸‐セリンである。このため、本ズブチリシンはズブチリシン関連プロテアーゼの触媒三残基を有するセリンプロテアーゼを意味する。実施例には図３において特定されたズブチリシンを示すが、本発明はそれに限定されない。
【００９１】
“組換えズブチリシン”とは、ズブチリシンをコードするＤＮＡ配列が天然ズブチリシンアミノ酸配列で１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入についてコードする変種（または変異）ＤＮＡ配列を生じるように修飾されたズブチリシンを意味する。このような修飾を生じて、本明細書に開示されたものと組み合わせてもよい適切な方法には、米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ３４，６０６）、米国特許第５，２０４，０１５号および米国特許第５，１８５，２５８号明細書に開示されものがある。
【００９２】
“非ヒトカルボニルヒドロラーゼ”およびそれらについてコードするＤＮＡは、多くの原核および真核生物から得られる。原核生物の適切な例には、E.coliまたはPseudomonas のようなグラム陰性生物と、Micrococcus またはBacillusのようなグラム陽性細菌がある。カルボニルヒドロラーゼおよびそれらの遺伝子が得られる真核生物の例には、Saccharomyces cerevisiaeのような酵母、Aspergillus sp. のような真菌と、非ヒト哺乳動物源、例えばカルボニルヒドロラーゼキモシンついてコードする遺伝子が得られるウシsp. がある。ズブチリシンの場合のように、カルボニルヒドロラーゼシリーズは、そのシリーズのメンバー間で完全に相同的ではないアミノ酸配列を有するが、それでもなお同一または類似タイプの生物活性を示す、様々な関連種から得られる。このため、ここで用いられるような非ヒトカルボニルヒドロラーゼは、原核および真核源と直接または間接的に関連したカルボニルヒドロラーゼに関する機能的規定を有する。
【００９３】
“カルボニルヒドロラーゼ変種”は、“前駆カルボニルヒドロラーゼ”のアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列を有する。前駆カルボニルヒドロラーゼ（例えばズブチリシン）には天然カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）および組換えカルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）がある。カルボニルヒドロラーゼ変種のアミノ酸配列は、前駆アミノ酸配列の１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入により、前駆ヒドロラーゼアミノ酸配列から“誘導”される。このような修飾は、前駆カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）酵素自体の操作よりもむしろ、前駆カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）のアミノ酸配列についてコードする“前駆ＤＮＡ配列”に関するものである。前駆ＤＮＡ配列のこのような操作に適した方法にはここで開示された方法と、当業者に公知の方法がある（例えば、ＥＰ  Ｏ  ３２８２９９、ＷＯ８９／０６２７９とそこで既に参照された米国特許および出願参照）。
【００９４】
Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの＋７６位と、下記位置：＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４のうち１以上とに相当する特定残基がここでは変異のために特定されている。好ましくは、修飾される残基は下記組合せ：76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265および／または 76/103/104/222 、最も好ましくは76/99; 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 および 76/101/104 から選択される。これらのアミノ酸位置番号は、図１〜３で表された成熟Bacillus amyloliquefaciensズブチリシン配列に当てはめられた場合に関する。しかしながら、本発明において有用なプロテアーゼ酵素はこの具体的ズブチリシンの変異に制限されず、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの具体的な特定残基に“相当”する位置でアミノ酸残基を有する前駆カルボニルヒドロラーゼにもおよぶ。好ましくは、前駆ズブチリシンはBacillus lentus ズブチリシンであり、置換、欠失または挿入は上記場合に対応するＢ．lentusの相当アミノ酸残基で行われる。
【００９５】
前駆カルボニルヒドロラーゼの残基（アミノ酸）は、それが相同的である（即ち、一次または三次構造の位置に対応する）ならばBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの残基に対応するか、あるいはBacillus amyloliquefaciensズブチリシンにおける特定残基またはその残基の一部と類似している（即ち、化学的に化合、反応または相互作用する上で同一または類似した機能的能力を有する）。
【００９６】
一次構造とのホモロジーを確立するために、前駆カルボニルヒドロラーゼのアミノ酸配列はBacillus amyloliquefaciensズブチリシン一次配列、特に配列が公知であるズブチリシンにおいて非変種であることが知られた一連の残基と直接比較される。図４は amyloliquefaciensズブチリシンとＢ．lentusズブチリシンとの間における保存残基について示している。保存残基を並べて、並びを維持する（即ち、予定にない欠失および挿入による保存残基の除去を避ける）ために必要な挿入および欠失を行った後、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの一次配列にある特定アミノ酸に相当する残基が明らかにされる。保存残基の並びは、好ましくはこのような残基の１００％を保存しているべきである。しかしながら、保存残基の７５％以上または５０％もの少ない並びでも、相当残基を明らかにする上で十分である。触媒三残基Ａｓｐ３２／Ｈｉｓ６４／Ｓｅｒ２２１の保存は維持されているべきである。
【００９７】
例えば、図５および図６において、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtillis、Bacillus licheniformis(carisbergensis)およびBacillus lentus のズブチリシンのアミノ酸配列はアミノ酸配列間で最大のホモロジー量を与えるように並べられている。これら配列の比較では、各配列に多くの保存残基が含まれていることを示している。これらの保存残基（ＢＰＮ′およびＢ．lentus間）は図４で特定されている。
【００９８】
このため、これらの保存残基は、Bacillus lentus のズブチリシン（１９８９年７月１３日付で公開されたＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８９／０６２７９）、ここで好ましいズブチリシン前駆酵素、または好ましいBacillus lentus ズブチリシンと高度に相同的であるＰＢ９２として称されるズブチリシン（ＥＰ  Ｏ  ３２８２９９）のような他のカルボニルヒドロラーゼで、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの対応する相当アミノ酸残基を明らかにするために用いられる。これらズブチリシンのうちあるもののアミノ酸配列が、保存残基の最大ホモロジーを生じるBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの配列と共に、図５および６で並べられている。みられるように、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンと比較してBacillus lentus の配列にいくつかの欠失がある。このため、例えば、他のズブチリシンにおいてBacillus amyloliquefaciensズブチリシンのＶａｌ１６５に相当するアミノ酸は、Ｂ．lentusおよびＢ．licheniformis の場合にイソロイシンである。
【００９９】
このため、例えば、＋７６位のアミノ酸はＢ．amyloliquefaciens およびＢ．lentusズブチリシン双方でアスパラギン（Ｎ）である。しかしながら、本発明で有用な好ましいズブチリシン変種において、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンで＋７６に相当するアミノ酸はアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている。ここで置換について特定されたすべてのアミノ酸残基 vs.このような各位置で好ましい置換の比較は、説明目的で表IIに示されている。
【０１００】
表II
+76   +99  +101  +103  +104  +107  +123
Ｂ．amyloliquefaciens           Ｎ    Ｄ    Ｓ    Ｑ    Ｙ    Ｉ    Ｎ
（野生型）
Ｂ．lentus（野生型）            Ｎ    Ｓ    Ｓ    Ｓ    Ｖ    Ｉ    Ｎ
最も好ましいズブチリシン        Ｄ    Ｄ    Ｒ    Ａ  Ｉ／Ｙ  Ｖ    Ｓ
【０１０１】
相当残基は、三次構造がＸ線結晶学で決定された前駆カルボニルヒドロラーゼの三次構造レベルでホモロジーを調べることにより明らかにしてもよい。相当残基は、前駆カルボニルヒドロラーゼおよびBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの特定アミノ酸残基の２以上の主鎖原子（ＮとＮ、ＣＡとＣＡ、ＣとＣ、およびＯとＯ）の原子座標が並べた後に０．１３ｎｍ、好ましくは０．１ｎｍ以内である場合として明らかにされる。ベストモデルがBacillus amyloliquefaciensズブチリシンに対して問題のカルボニルヒドロラーゼの非水素タンパク質原子の原子座標の最大オーバーラップを与えるように配向および配置された後で、並びが実現される。ベストモデルは利用できる最高解像能で実験回折データについて最低Ｒ因子を与える結晶学モデルである。
【数１】
2006117937.tif 000025
【０１０２】
Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの特定残基と機能的に類似した相当残基とは、それらがBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの特定残基に限られかつ属するやり方でタンパク質構造、基質結合性または触媒作用を変更、修飾またはそれに寄与するようなコンホメーションをとる前駆カルボニルヒドロラーゼのアミノ酸として規定される。更に、それらは、所定残基の主鎖原子が相同位置を占めることに基づく一致性の基準を満たさないが、残基の側鎖原子の少くとも２つの原子座標がBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの対応側鎖原子の０．１３ｎｍ内に存在する程度まで類似した位置を占める（三次構造がＸ線結晶学で得られた）前駆カルボニルヒドロラーゼの残基である。Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの三次元構造の座標はＥＰＯ公開Ｎｏ．０  ２５１  ４４６（米国特許出願第０８／２１２，２９１号に相当する、その開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる）に示され、三次構造のレベルで相当残基を決めるために上記のように使用できる。
【０１０３】
置換、挿入または欠失について特定された残基の一部は保存残基であるが、その他はそうでない。保存されていない残基の場合、１以上のアミノ酸の置換は天然でみられるものに相当しないアミノ酸配列を有する変種を生じる置換に限定される。保存残基の場合、このような置換は天然配列で起こらないはずである。本発明で有用なカルボニルヒドロラーゼ変種には、カルボニルヒドロラーゼ変種の成熟形とこのようなヒドロラーゼ変種のプロおよびプレプロ形がある。プレプロ形は、これがカルボニルヒドロラーゼ変種の発現、分泌および成熟を促進することから、好ましい構造である。
【０１０４】
“プロ配列”とは、除去されたときにカルボニルヒドロラーゼの“成熟”形を出現させる、カルボニルヒドロラーゼの成熟形のＮ末端部分に結合されたアミノ酸の配列に関する。多くのタンパク質分解酵素が翻訳プロ酵素産物として天然でみられ、翻訳後プロセッシングがないとこのまま発現される。カルボニルヒドロラーゼ変種、特にズブチリシン変種を生じる好ましいプロ配列はBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの推定プロ配列であるが、他のズブチリシンプロ配列も用いてよい。例では、Bacillus lentus （ＡＴＣＣ  ２１５３６）のズブチリシンの推定プロ配列が用いられる。
【０１０５】
“シグナル配列”または“プロ配列”とは、カルボニルヒドロラーゼのＮ末端部分、あるいはヒドロラーゼの成熟またはプロ形の分泌に関与するプロヒドロラーゼのＮ末端部分に結合されたアミノ酸の配列に関する。シグナル配列のこの定義は機能的なもので、天然条件下でズブチリシンまたは他のカルボニルヒドロラーゼの分泌の実施に関与するズブチリシン遺伝子または他の分泌性カルボニルヒドロラーゼのＮ末端部分によりコードされるすべてのアミノ酸配列を含めた意味である。本発明で有用なプロテアーゼ酵素は、ここで記載されたカルボニルヒドロラーゼ変種の分泌を行うためにこのような配列を利用する。例で用いられる好ましいシグナル配列は、Bacillus lentus （ＡＴＣＣ  ２１５３６）ズブチリシンのシグナル配列の残部に融合されたBacillus amyloliquefaciensズブチリシンからのシグナル配列の初めの７アミノ酸残基を含んでなる。
【０１０６】
カルボニルヒドロラーゼ変種の“プレプロ”形は、ヒドロラーゼのアミノ末端に作動的に結合されたプロ配列と、プロ配列のアミノ末端に作動的に結合された“プレ”または“シグナル”配列とを有する、ヒドロラーゼの成熟形からなる。
【０１０７】
“発現ベクター”とは、適切な宿主でＤＮＡの発現を行える適切な制御配列に作動的に結合されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ組立体に関する。このような制御配列には、転写を行うプロモーター、このような転写を制御する任意オペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位についてコードする配列と、転写および翻訳の終結を制御する配列を含んでいる。ベクターはプラスミド、ファージ粒子または単純な可能ゲノムインサートである。適切な宿主に形質転換されると、ベクターは宿主ゲノムから独立して複製および機能するか、あるいは一部の場合にはゲノム自体の中に組み込まれる。本明細書において、“プラスミド”および“ベクター”は時々互換的に用いられるが、プラスミドが現在最も常用される形のベクターである。しかしながら、相当する機能を発揮して、当業界で知られるかまたは知られるようになった、このような他の形の発現ベクターもここに含まれる。
【０１０８】
本発明で用いられる“宿主細胞”は、通常それらを酵素的に活性なエンドプロテアーゼを分泌できないようにするために、好ましくは米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ３４，６０６）で開示された方法により操作された原核または真核宿主である。ズブチリシンを発現させる上で好ましい宿主細胞は、酵素的に活性な天然プロテアーゼおよびアルカリプロテアーゼ（ズブチリシン）を欠くBacillus株ＢＧ２０３６である。株ＢＧ２０３６の作成は米国特許第５，２６４，３６６号明細書で詳細に記載されている。ズブチリシンを発現させる上で他の宿主細胞には、Bacillus subtilis １１６８（米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ３４，６０６）および米国特許第５，２６４，３６６号明細書でも記載されており、それらの開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる）とＢ．licheniformis 、Ｂ．lentusなどのようないずれか適切なBacillus株がある。
【０１０９】
宿主細胞は組換えＤＮＡ技術を用いて作成されたベクターで形質転換またはトランスフェクトされる。このような形質転換された宿主細胞は、カルボニルヒドロラーゼ変種をコードするかまたは望ましいカルボニルヒドロラーゼ変種を発現するベクターを複製することができる。カルボニルヒドロラーゼ変種のプレおよびプレプロ形をコードするベクターの場合、このような変種は発現されると、典型的には宿主細胞から宿主細胞媒体中に分泌される。
【０１１０】
“作動的に結合された”とは、２つのＤＮＡ領域間の関係について表すとき、それらが互いに機能的に関連していることを単純に意味する。例えば、プレ配列は、それがシグナル配列として機能して、タンパク質の成熟形の分泌に関与し、おそらくシグナル配列を開裂させるならば、ペプチドに作動的に結合されている。プロモーターはそれが配列の転写を制御するならばコード配列に作動的に結合されており、リボソーム結合部位はそれが翻訳を行えるように配置されているならばコード配列に作動的に結合されている。
【０１１１】
天然前駆カルボニルヒドロラーゼをコードする遺伝子は、当業者に知られる一般的方法に従い得られる。その方法では通常関心あるヒドロラーゼの領域をコードする推定配列を有した標識プローブを合成し、ヒドロラーゼを発現する生物からゲノムライブラリーを作り、プローブとのハイブリッド形成により目的の遺伝子についてライブラリーをスクリーニングする。次いで、陽性ハイブリッド形成クローンの酵素地図が作成され、配列決定される。例で用いられるＢ．lentus遺伝子は米国特許第５，１８５，２５８号明細書の例１で記載されたようにクローニングされ、その開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。例で用いられるＢＰＮ′遺伝子はＲＥ３４，６０６明細書の例１で記載されたようにクローニングされ、その開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０１１２】
次いで、クローン化カルボニルヒドロラーゼが宿主細胞を形質転換してヒドロラーゼを発現させるために用いられる。次いでヒドロラーゼ遺伝子は高コピー数プラスミドに結合される。このプラスミドは、それがプラスミド複製に必要な周知要素：即ち問題の遺伝子に作動的に結合されたプロモーター（それが宿主により認識、即ち転写されるならば、遺伝子自体の相同的プロモーターとして供給される）、外来性であるかまたはヒドロラーゼ遺伝子の内在ターミネーター領域により供給される（ある真核宿主細胞のヒドロラーゼ遺伝子から宿主で転写されたｍＲＮＡの安定性にとり必要な）転写終結およびポリアデニル化領域と、望ましくは抗生物質含有培地中の増殖でプラスミド感染宿主細胞の連続培養維持を行える抗生物質耐性遺伝子のような選択遺伝子を含んでいるという意味で、宿主で複製される。高コピー数プラスミドは宿主用の複製起点も含み、それにより染色体制限なしに細胞質で多数のプラスミドを生成させることができる。しかしながら、ヒドロラーゼ遺伝子の多数コピーを宿主ゲノム中に組込むことも範囲内とされる。これは、特に相同的組換えを受けやすい原核および真核生物で容易化される。
【０１１３】
本例で用いられる遺伝子は天然Ｂ．lentus遺伝子および天然Ｂ．amyloliquefaciens 遺伝子である。一方、天然または変異前駆カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）をコードする合成遺伝子も作成してよい。このようなアプローチで、前駆ヒドロラーゼ（ズブチリシン）のＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列が決定される。その後多数の重複合成一本鎖ＤＮＡ断片が合成され、ハイブリッド形成および結合により前駆ヒドロラーゼをコードする合成ＤＮＡを生じる。合成遺伝子作成例は米国特許第５，２０４，０１５号明細書の例３で示され、その開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０１１４】
天然または合成前駆カルボニルヒドロラーゼ遺伝子がクローニングされると、いくつかの修飾が天然前駆カルボニルヒドロラーゼの合成以外にも遺伝子の使用を高めるために行われる。このような修飾には、米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ３４，６０６）およびＥＰＯ公開第０  ２５１  ４４６号明細書で開示されたような組換えカルボニルヒドロラーゼの産生と、ここで記載されたカルボニルヒドロラーゼ変種の産生がある。
【０１１５】
下記カセット変異誘発法も本発明において有用なカルボニルヒドロラーゼ変種の作成および同定を容易にするために用いられるが、部位特異的変異誘発を含めた他の方法も用いてよい。最初に、ヒドロラーゼをコードする天然遺伝子が得られ、全部または一部が配列決定される。次いで配列がコードされた酵素で１以上のアミノ酸の変異（欠失、挿入または置換）を行うことが望まれる箇所について操作される。この箇所に隣接する配列は、発現されたときに様々な変異体をコードするオリゴヌクレオチドプールで遺伝子の短いセグメントを置換するための制限部位の存在について評価される。このような制限部位は、好ましくは遺伝子セグメントの置換を容易にするためにヒドロラーゼ遺伝子内で独特な部位である。しかしながら、ヒドロラーゼ遺伝子で過度に重複していない好都合な制限部位はいずれも用いうるが、但し制限切断で作られた遺伝子断片は適正な配列で再アセンブリーできねばならない。制限部位が選択された箇所から好都合な距離内の位置（１０〜１５ヌクレオチド）に存在しないならば、このような部位は読取枠だけでなくコードされたアミノ酸も最終作成で変わらないように遺伝子でヌクレオチドを置換させることにより作成される。その配列を変えて望ましい配列にするための遺伝子の変異は、通常知られる方法に従いＭ１３プライマー伸長により行われる。適切な隣接領域を配置して、２つの好都合な制限部位配列にするために必要な変化を評価する作業は、遺伝子コードの重複性、遺伝子の制限酵素地図および多数の異なる制限酵素によりルーチン化される。好都合な隣接制限部位が利用しうるならば、上記方法は部位を含まない隣接領域だけと併用される必要があることに注意せよ。
【０１１６】
天然ＤＮＡまたは合成ＤＮＡがクローニングされると、変異される位置に隣接した制限部位は同族制限酵素で切断され、複数の末端相補オリゴヌクレオチドカセットがその遺伝子に結合される。変異誘発は、すべてのオリゴヌクレオチドが同様の制限部位を有するように合成できて、合成リンカーが制限部位を作成する上で不要であるため、この方法により簡易化される。
【０１１７】
ここで用いられるタンパク質分解活性は、活性酵素ｍｇ当たりのペプチド結合の加水分解速度として規定される。多くの周知操作がタンパク質分解活性を測定するために存在する（K.M.Kalisz,"Microbial Proteinases",Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,A.Fiechter ed.,1988）。修正タンパク質分解活性に加えてまたは代えて、本発明の変種酵素はＫｍ、Ｋｃａｔ、Ｋｃａｔ／Ｋｍ比および／または修正基質特異性および／または修正ｐＨ活性プロフィルのような他の修正された性質を有していてもよい。これらの酵素は、例えば洗濯用途のような加水分解プロセスで存在することが予想される特定基質用に作ることができる。
【０１１８】
１つの目的は前駆カルボニルヒドロラーゼと比較して変化したタンパク質分解活性を有する変種カルボニルヒドロラーゼを得ることであり、そうすればこのような活性を（数値的に大きく）増加させて標的基質で更に効率的に作用するように酵素を使用できるようになるからである。前駆体と比較して変化した熱安定性および／または変化した基質特異性を有する変種酵素にも興味ある。好ましくは、変異されるカルボニルヒドロラーゼはズブチリシンである。Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの＋７６、＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４あるいはそれらいずれかの組合せに相当する残基においてズブチリシンタイプカルボニルヒドロラーゼでこのような結果を得るために有用な特定のアミノ酸が例で示されている。一部の場合には、低いタンパク質分解活性が望ましい。逆に、一部の場合には、前駆体よりも変種酵素のタンパク質分解活性を増加させることが望まれる。加えて、アルカリまたは熱安定性であろうと、変種の安定性の増加または減少（変更）が望まれる。Ｋｃａｔ、ＫｍまたはＫｃａｔ／Ｋｍの増加または減少は、これらの動力学的パラメーターを決定するために用いられる基質に特異的である。
【０１１９】
しかも、ズブチリシンでいくつか他の修飾と共に＋７６位に相当する残基は酵素の全体的安定性および／またはタンパク質分解活性を調節する上で重要なことがわかった。このため、例で示されたように、相当する＋７６位におけるBacillus lentus ズブチリシンのアスパラギン（Ｎ）は、得られる変異酵素で高い安定性および／または高い活性を生じるように、下記アミノ酸残基＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４のうち１以上の修飾と共に、好ましいプロテアーゼ酵素でアスパラギン酸（Ｄ）により置換することができる。
【０１２０】
本発明で有用な最も好ましいプロテアーゼ酵素は例で示されている。これらには置換残基の下記特定組合せ：N76D/S99D 、N76D/V104I、N76D/S99D/V104I 、N76D/S103A/V1041、N76D/V1041/I107V、N76D/V104Y/I107VおよびN76D/S101R/S103A/V104Iがある。これらの置換は好ましくはBacillus lentus （組換えまたは天然型）ズブチリシンで行われるが、置換はいかなるBacillusズブチリシンで行ってもよい。
【０１２１】
このおよび他の変種ズブチリシンで得られた結果に基づくと、Bacillus amyloliquefaciensの＋７６、＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４位に相当するカルボニルヒドロラーゼ（好ましくは、ズブチリシン）の残基が、これら酵素のタンパク質分解活性、性能および／または安定性と、このような変種酵素のクリーニングまたは洗浄性能にとり、重要であることは明らかである。
以下は本発明組成物で有用なプロテアーゼ酵素の製造例により示されている。
【０１２２】
プロテアーゼ製造例
Ｂ．subtilisでＧＧ３６遺伝子発現用の作成
Ｂ．lentusからのズブチリシン遺伝子の発現のためのクローニングおよび作成は、米国特許第５，１８５，２５８号明細書で記載された場合と本質的に同様に行う。プラスミドＧＧＡ２７４（図７に記載）が図８で示されたように下記の方法で更に修飾される。ＧＧＡ２７４プラスミドの作成時に導入されたＰｓｔＩ部位は、下記配列：５′ＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＴＴＡＡＡ３′（Seq.ID No.1 ）を有するオリゴヌクレオチドで、下記のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発により除去される。下線“Ａ”残基は制限酵素ＰｓｔＩの認識配列を除いて、２７４位でアラニンからトレオニンに対応アミノ酸残基を変える。２７４位のトレオニンはクローン化Ｂ．lentusズブチリシン遺伝子配列で本来みられる野生型残基である。ズブチリシンをコードするＤＮＡセグメントは、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩの切断でプラスミドＧＧＡ２７４またはその誘導体（図８で示されたＧＧＴ２７４）から切り出される。ＤＮＡ断片は、変異誘発のために、ＭＰ１９のようなバクテリオファージＭ１３ベースベクター中に逆サブクローニングされる。変異誘発後、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII 切断、その後クローニングが、変異ズブチリシンタンパク質の発現および回収のために、ＧＧＡ２７４のような発現プラスミド中に変異ズブチリシン遺伝子を逆移動させる上で行われる。
【０１２３】
オリゴヌクレオチド特異的変異誘発
オリゴヌクレオチド特異的変異誘発はZoller,M.et al.(1983),Methods Enzymol.,100:468-500で記載されたように行われる。例として、配列５′ＧＣＴＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＡＴＴＣＧ３′（Seq.ID No.2 ）の合成オリゴヌクレオチドが７６位のアミノ酸残基をアスパラギン（Ｎ）からアスパラギン酸（Ｄ）、即ちＮ７６Ｄに変えるために用いられる。下線“Ｇ”および“Ｃ”残基は野生型遺伝子配列からの変化を表す。ＣＡは＋７５位でロイシンを保ち、Ｘｂａｌ制限酵素のＸｂａｌ認識部位（ＴＣＴＡＧＡ）を導入するようにアミノ酸配列を変化させ、一方ＧＡＣの変化は＋７６のアスパラギンをアスパラギン酸に変化させる。
【０１２４】
９９、１０１、１０３および１０４位の変異誘発には、異なるオリゴヌクレオチドが望ましい変異の組合せに応じて使用できる。例えば、配列５′ＧＴＡＴＴＡＧＧＧＧＣＧＧＡＣＧＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＧＡＴＴ３′（Seq.ID No.3 ）のオリゴヌクレオチドが単一ズブチリシン分子で下記変化：Ｓ９９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０３ＡおよびＶ１０４Ｉを同時に行うために用いられる。同様に、配列５′ＴＣＡＧＧＴＴＣＧＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＴＴＧ３′（Seq.ID No.4 ）および５′ＣＡＣＧＴＴＧＣＴＡＧＣＴＴＧＡＧＴＴＴＡＧ３′（Seq.ID No.5 ）のオリゴヌクレオチドがＩ１０７ＶおよびＮ１２３Ｓを各々作るために利用される。同じく、下線残基はアミノ酸配列または制限酵素認識配列で望ましい変化を生じさせる野生型配列からの変化を表す。
【０１２５】
ズブチリシン変種のタンパク質分解活性
前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発の方法に従い、表III で掲載された変種が作られる。これらズブチリシン変種の各々のタンパク質分解活性は表III で示されている。動力学的パラメーターｋｃａｔ、Ｋｍおよびｋｃａｔ／Ｋｍは、P.Bonneau et al.(1991) J.Am.Chem.Soc.,Vol.113,No.3,p.1030 に記載された方法を用いて、合成ペプチド基質サクシニル‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ｐｒｏ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ｐ‐ニトロアニリドの加水分解に関して測定される。簡単にいえば、少量のズブチリシン変種ストック溶液がｐＨ８．６の０．１Ｍ Tris-ＨＣｌ緩衝液に溶解された基質を含む１ｃｍキュベットに加えられ、２５℃で恒温される。反応の進行は４１０ｎｍで反応生成物ｐ‐ニトロアニリンの吸光度をモニターすることにより分光測定で追跡される。動力学的パラメーターは、非直線回帰アルゴリズムを用いて各反応毎に反応速度および生成物濃度をMichaelis-Menten式に当てはめることにより得られる。
【０１２６】
表III 
動力学的パラメーターｋｃａｔ、ＫＭおよびｋｃａｔ／ＫＭ
Bacillus lentus ズブチリシンおよび変種の測定
プロテ        酵素                       kcat        KM(M)       kcat/KM
アーゼ＃      変種                       (ｓ-1)                (ｓ-1Ｍ-1）
‐    B.lentusズブチリシン                170      0.00078      2.18×105 
‐    N76D                                219      0.0008       2.74×105 
１    N76D/S99D                            88      0.00061      1.44×105 
２    N76D/S101R                          371      0.0013       2.85×105 
３    N76D/S103A                          400      0.0014       2.86×105 
４    N76D/V104I                          459      0.0011       4.17×105 
５    N76D/I107V                          219      0.0011       1.99×105 
６    N76D/N123S                          115      0.0018       6.40×104 
７    N76D/S99D/S101R                     146      0.00038      3.84×105 
８    N76D/S99D/S103A                     157      0.0012       1.31×105 
９    N76D/S99D/V104I                     247      0.00097      2.55×105 
10    N76D/S101R/S103A                    405      0.00069      5.90×105 
11    N76D/S101R/V104I                    540      0.00049      1.10×106 
12    N76D/S103A/V104I                    832      0.0016       5.20×105 
13    N76D/V104I/I107V                    497      0.00045      1.10×106 
14    N76D/V104Y/I107V                    330      0.00017      1.90×106 
15    N76D/V104I/N123S                    251      0.0026       9.65×104 
16    N76D/I107V/N123S                    147      0.0035       4.20×104 
17    N76D/S99D/S101R/S103A               242      0.00074      3.27×105 
18    N76D/S99D/S101R/V104I               403      0.00072      5.60×105 
19    N76D/S99D/S103A/V104I               420      0.0016       2.62×105 
20    N76D/S101R/S103A/V104I              731      0.00065      1.12×106 
21    N76D/S103A/V104I/N123S              321      0.0026       1.23×105 
22    N76D/V104I/I107V/N123S              231      0.003        7.70×104 
23    N76D/S99D/S101R/S103A/V104I         624      0.00098      6.37×105 
24    N76D/S99D/S103A/V104I/N123S         194      0.0043       4.51×104 
25    N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S   311      0.0023       1.35×105 
【０１２７】
表III に掲載された結果は、試験されたズブチリシン変種のすべてがタンパク質分解活性を留めていることを示している。更に、データの詳しい分析では、タンパク質分解活性がBacillus amyloliquefaciensで７６、９９、１０１、１０３、１０４、１０７および１２３位に相当するアミノ酸残基において置換の様々な組合せによりBacillus lentus ズブチリシンで有意に変わっていることを示している。
【０１２８】
ズブチリシン変種の熱安定性
前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発のプロセスにより作られた本発明のBacillus lentus ズブチリシンおよび変種で観察される熱安定性の比較は表IVで示されている。５０ｍＭ  ＣａＣｌ２含有または非含有０．１Ｍグリシン、０．０１％Tween-80ｐＨ１０．０中の精製酵素１５μg/mlを小さな管中に入れ、１０℃で５分間、１０〜６０℃で１分間および６０℃で２０分間インキュベートする。次いで管を氷上に１０分間おく。管からの一部は、２５℃に恒温された０．１Ｍ tris-ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．６に溶解された１．２ｍＭの合成ペプチド基質サクシニル‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ｐｒｏ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ｐ‐ニトロアニリドを含有する１ｃｍキュベットへの添加により、酵素活性について調べる。初期の直線的反応速度は、時間の関数として４１０ｎｍで反応生成物ｐ‐ニトロアニリンの吸光度をモニターすることにより分光測定で追跡する。データは加熱前に対する活性％として表示される。表IVに掲載された結果は、大多数の変種（２６例中２４）が５０ｍＭ  ＣａＣｌ２添加試験条件下でBacillus lentus ズブチリシンに匹敵する熱安定性を発揮することを示している。５０ｍＭ  ＣａＣｌ２非添加試験条件下でも、大多数の変種（２６例中１９）がBacillus lentus ズブチリシンよりも有意に安定である。更に、変種N76D/S99D 、N76D/V104I、N76D/S99D/V104I 、N76D/S103A/V1041、N76D/V1041/I107V、N76D/V104Y/I107VおよびN76D/S101R/S103A/V104Iは５０ｍＭ  ＣａＣｌ２非添加試験条件下で単一置換変種Ｎ７６Ｄよりも有意に安定である。
【０１２９】
表IV
ｐＨ１０、６０℃、＋／−５０ｍＭ  ＣａＣｌ２添加で
Bacillus lentus ズブチリシンおよび変種について測定された熱安定性
初期活性残留％
酵素 −ＣａＣｌ２ ＋ＣａＣｌ２
B.lentusズブチリシン                          ２              ９６
N76D                                      ３４              ９７
N76D/S99D                                 ４９              ９８
N76D/S101R                                  ０              ８２
N76D/S103A                                ２６              ９２
N76D/V104I                                ５８              ９８
N76D/I107V                                ３２              ９６
N76D/N123S                                  ０              ９７
N76D/S99D/S101R                           ３０            １００
N76D/S99D/S103A                           ３６            １００
N76D/S99D/V104I                           ４８              ９７
N76D/S101R/S103A                          ２６            １００
N76D/S101R/V104I                          ３８            １００
N76D/S103A/V104I                          ５８            １００
N76D/V104I/I107V                          ６０              ９７
N76D/V104Y/I107V                          ４８              ７４
N76D/V104I/N123S                            ０              ９８
N76D/I107V/N123S                          １６            １００
N76D/S99D/S101R/S103A                     ３８            １００
N76D/S99D/S101R/V104I                     ３３            １００
N76D/S99D/S103A/V104I                     ３８              ９８
N76D/S101R/S103A/V104I                    ４０              ９９
N76D/S103A/V104I/N123S                      １              ９８
N76D/V104I/I107V/N123S                      ３              ９９
N76D/S99D/S101R/S103A/V104I               ３６              ９９
N76D/S99D/S103A/V104I/N123S                 ２              ９５
N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S           ０            １００
【０１３０】
ファージミドから作られた一本鎖ＤＮＡ鋳型による
オリゴヌクレオチド特異的変異誘発
Ａ．Ｂ．lentus変種の作成
変異誘発プロトコールはオリゴヌクレオチド特異的変異誘発で前記された場合と本質的に同様である。一本鎖ＤＮＡ鋳型はファージミド法で作る。一本鎖ＤＮＡ鋳型作成用のファージミドベクターを作成するために、我々はベクターｐＢＣＤＡＩＣＡＴを最初に作成した。ベクター作成のフローチャートは図１５および図１６で示されている。初めに、ｐＣ１９４プラスミド（Horinouchi,S.and Weisblum,B.,J.Bacteriol.,150: 8-15,1982）のＣＡＴ遺伝子をコードするＣ１ａＩ‐Ｃ１ａＩ断片をｐＵＣ１９（New England BioLabs,Beverly,MA）のポリリンカー領域のＡｃｃＩ部位中にクローニングしてプラスミドｐＵＣＣＨＬを作り、ＧＧ３６ＤＡＩコードＤＮＡの５′末端からのＥｃｏＲＩ‐ＤｒａＩ  ０．６ＫＢ断片をｐＢＳＫＳプラスミド（Stratagene,Inc.,San Diego,CA）のＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ部位中にクローニングしてｐＢＣ２ＳＫ５を作る。プラスミドｐＢＣ２ＳＫ５の単一ＥｃｏＲＩ部位をＥｃｏＲＩ切断により除去し、その後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ触媒で補充し、再結合させて、ＥｃｏＲＩ部位を有しないプラスミドｐＢＣ２ＳＫ‐５Ｒを作る。ｐＢＣＳＫ‐５Ｒ中にクローニングされたＥｃｏＲＩ‐ＤｒａＩ断片をＰｓｔＩ‐ＨｉｎｄIII 断片として単離し、ｐＵＣＣＨＬのＰｓｔＩ‐ＨｉｎｄIII 部位（ｐＵＣ１９のポリリンカーの一部）中にクローニングしてプラスミドｐＵＣＣＨＬ５Ｒを作る。ＧＧ３６ＤＡＩ遺伝子のコード配列をＥｃｏＲＩ‐ＢａｍＨＩ断片として切出し、ｐＵＣＣＨＬ５ＲのＥｃｏＲＩ‐ＢａｍＨＩ部位中にクローニングしてｐＵＣＣＡＴを作る。次いでｐＵＣＣＡＴの大きなＥｃｏＲＩ‐ＨｉｎｄIII 断片をＢＳ２ＫＳ＋のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII 部位中にクローニングしてプラスミドｐＢＣＤＡＩＣＡＴを作る。
【０１３１】
一本鎖ＤＮＡを作るために、ｐＢＣＤＡＩＣＡＴを含むE.coliをRessel,M.,Kidd,S.and Kelley,M.R.,GENE,45: 333-338,1986に記載されたプロトコールに従いファージＲ４０８（Stratagene,Inc.,San Diego,CAから得た）で感染させる。一本鎖ＤＮＡ鋳型が入手できたら、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発で前記されたような標準変異誘発方法を実施する。ある変異体の作成は説明目的で以下に詳述されている。
【０１３２】
Ｂ．lentus（ＧＧ３６）N76D/S103A/V104I/L217Hの作成では、ＧＧ３６  N76D/S103A/V104IについてコードするＥｃｏＲＩ‐ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片をｐＵＣＣＡＴの作成（図１５、１６参照）に用いて、プラスミドｐＢＣＤＡＩＣＡＴを作る。一本鎖ＤＮＡ鋳型を前記プロトコールに従い作った後、下記配列の変異誘発プライマー
ｘＣ１ａｌ
5´ TAT GCC AGC   CAC AAC GGT ACT TCG ATG GCT 3´ (Seq.ID No.13)
を用いて、Ｌ２１７Ｈを作る。前記のように、下線残基は行われたヌクレオチド変化を表し、ｘＣ１ａＩは存在するＣ１ａＩ部位が変異誘発後に除去されたことを示す。変異誘発プロトコールは前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発で記載されたとおりである。変異誘発後、プラスミドＤＮＡを初めにＣ１ａＩ部位の除去についてスクリーニングし、Ｃ１ａＩ部位を欠いたクローンをＤＮＡ配列分析に付して、２１７位アミノ酸残基でＬからＨに変化したＤＮＡ配列について確認する。
【０１３３】
Ｂ．ＢＰＮ′変種の作成およびＢ．subtilisでのそれらの発現
Ｂ．amyloliquefaciens （ＢＰＮ′）N76D/Q103A/Y104I/Y217Lの作成を２つの連続工程のほかは同様の方式で行う。Ｎ７６Ｄを最初にＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌ中に導入してＢＰＮ′N76D/Y217Lを作り、第二の変異誘発を行ってＢＰＮ′N76D/Y217LをＢＰＮ′N76D/Q103A/Y104I/Y217Lに変換する。第一変異誘発用の一本鎖ＤＮＡ鋳型を作るために、ＢＰＮ′Ｙ２１７ＬズブチリシンについてコードするＥｃｏＲＩ‐ＢａｍＨＩ断片（Wells,J.,et al.,PNAS,84,5167,1087 で記載されたＹ２１７Ｌプラスミドから誘導される）を用いて、プラスミドｐＵＣＣＡＴＦＮＡを作る（図１７、１８参照）。ＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌを含むｐＵＣＣＡＴＦＮＡプラスミドを用いて、ｐＢＣＦＮＡＣＡＴプラスミドを作成する（図１７、１８）。一本鎖ＤＮＡを前記のように作る。ＢＰＮ′N76D/Y217Lを作るために、下記配列のオリゴヌクレオチドプライマー
Ｘbal 
5´ C ACA GTT GCG GCT CTA GAT AAC TCA ATC GGT G 3´   (Seq.ID No.15 ）
を用いて、変化Ｎ７６Ｄを作る。次いで一本鎖ＤＮＡをＢＰＮ′N76D/Y217L保有ｐＢＣＦＮＡＣＡＴプラスミド（Ｎ７６Ｄ変異誘発後のｐＢＣＦＮＡＣＡＴプラスミド）から作り、下記配列のもう１つのオリゴヌクレオチド
ｘＰvull
5´ GCT GAC GGT TCC GGC GCT ATT AGT TGG ATC ATT 3´   (Seq.ID No.15 ）
で変異誘発させて、ＢＰＮ′N76D/Q103A/Y104I/Y217Lを得る。クローニング、一本鎖ＤＮＡ作成、変異誘発および変異体のスクリーニングに関係するすべての工程は前記のように実施する。ＢＰＮ′遺伝子およびその変種の発現は、ＲＥ３４，６０６に記載されたようなBacillus subtilis のプロテアーゼ欠失株中に直接プラスミドＤＮＡ（異なる変種のＢＰＮ′遺伝子を含むｐＢＣＦＮＡＣＡＴ）を組込むことにより行う。
【０１３４】
多数の変種をこれらのプロテアーゼ製造例の開示どおりに作る。動力学的データおよび安定性データはこのような変種について作る。動力学的データは前記方法を用いて作り、表Ｖで示されている。安定性データはここで詳述されたように作成した。結果は表VIで示されている。
【０１３５】
熱安定性アッセイ操作
精製酵素は、緩衝液で平衡化されたSephadex G-25 からなるカラムに酵素を適用し、同緩衝液を用いてカラムから酵素を溶出させることにより、０．１ＭグリシンｐＨ１０．０、０．０１％Tween-80中に緩衝液交換する。
【０１３６】
６０℃に恒温された０．１Ｍグリシン、０．０１％Tween-80ｐＨ１０．０を含有する管に緩衝液交換された酵素を加えて、１５μg/mlの最終酵素濃度にする。
【０１３７】
一部を様々な時間に６０℃インキュベートから取出し、２５℃に恒温された０．１Ｍ tris-ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．６に溶解された１．２ｍＭの合成ペプチド基質サクシニル‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ｐｒｏ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ｐ‐ニトロアニリドを含有する１ｃｍキュベットへの添加により、酵素活性について直ちに調べる。初期の直線的反応速度は、時間の関数として４１０ｎｍで反応生成物ｐ‐ニトロアニリンの吸光度をモニターすることにより分光測定で追跡する。
【０１３８】
５０％酵素不活化に要する時間の長さである半減期は、６０℃でインキュベート時間の関数として反応速度の一次プロットから決める。
【０１３９】
データは同一条件下でBacillus lentus ズブチリシン（ＧＧ３６）について決められた半減期の％として表VIに掲載されている。
【０１４０】
表Ｖ
酵素                              ｋｃａｔ      ＫＭ      kcat／ＫＭ
（ｓ-1）     (ｍＭ)     （ｓ-1Ｍ-1）
B.lentusズブチリシン                170         0.78        2.20E+05
N76D/S103G/V104I★                  380         1.4         2.70E+05
N76D/S103A/V104F                    730         0.33        2.20E+06
N76D/S103A/V104N                    790         2.8         2.80E+05
N76D/S103A/V104S                    170         0.83        2.00E+05
N76D/S103A/V104T                    370         1.9         2.00E+05
N76D/S103A/V104W                    880         0.31        2.80E+06
N76D/S103A/V104Y                    690         0.5         1.40E+06
K27R/N76D/V104Y/N123S               500         1.2         4.20E+05
N76D/S101G/S103A/V104I★            620         1.3         4.80E+05
N76D/S103A/V104I/S105A★            550         1.3         4.20E+05
N76D/S103A/V104I/S105D★            440         1.7         2.60E+05
N76D/S103A/V104T/I107A★            120         5.7         2.10E+04
N76D/S103A/V104T/I107L★            310         3.2         9.70E+04
N76D/S103A/V104I/L126A               90         2.2         4.10E+04
N76D/S103A/V104I/L126F              180         1.9         9.50E+04
N76D/S103A/V104I/L126I              100         2.4         4.20E+04
N76D/S103A/V104I/L126V               64         3.2         2.00E+04
N76D/S103A/V104I/S128G★            560         1.7         3.30E+05
N76D/S103A/V104I/S128L★            430         3.8         1.10E+05
N76D/S103A/V104I/L135A              140         0.76        1.80E+05
N76D/S103A/V104I/L135F              390         0.69        5.70E+05
N76D/S103A/V104I/L135I              110         0.73        1.50E+05
N76D/S103A/V104I/L135V              140         0.86        1.60E+05
N76D/S103A/V104I/S156E★            170         2.6         6.50E+04
N76D/S103A/V104I/S166D★            160         3.5         4.60E+04
N76D/S103A/V104I/D197E              510         1.4         3.60E+05
N76D/S103A/V104I/N204A★            530         1.1         4.80E+05
N76D/S103A/V104I/N204G★            580         1.4         4.10E+05
N76D/S103A/V104I/N204C★            370         1.3         2.90E+05
N76D/S103A/V104I/P210I★            500         1.2         4.20E+05
N76D/S103A/V104I/L217H★             80         0.63        1.30E+05
N76D/S103A/V104I/M222A               70         3.1         2.30E+04
N76D/S103A/V104I/M222S               80         3.1         2.60E+04
N76D/S103A/V104I/T260P              660         1.5         4.40E+05
N76D/S103A/V104I/S265N              590         1.3         4.50E+05
K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S         220         1.4         1.60E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E         430         1.1         3.90E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C         400         1.1         3.60E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L         440         1.2         3.70E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V         440         1.2         3.70E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S         760         0.98        7.80E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/T206P         410         1.2         3.40E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A         390         1           3.90E+05
N76D/S103A/V104I/L126F/S265N        170         2.1         8.10E+04
N76D/S103A/V104I/L156E/S166D★       40         6.8         6.40E+03
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E   410         0.98        4.20E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S   540         0.66        8.20E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S   770         0.79        9.80E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S   610         0.99        6.20E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S   580         0.78        7.40E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P   660         1           6.60E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A   590         0.89        6.60E+05
K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/  520         1           5.20E+05
T274A 
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/  460         0.65        7.10E+05
N218S 
B.amyloliquefaciens                  50         0.14        3.60E+05
ズブチリシン（BPN´）
BPN´−N76D/Y217L*                   380         0.46        8.30E+05
＊これらの変異体はファージミドから作られた一本鎖ＤＮＡ鋳型でオリゴヌクレオチド特異的変異誘発により作られ、他のすべては前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発により作られた。
【０１４１】
表VI
酵素                                                熱安定性
（天然酵素の半減期％）
B.lentusズブチリシン                                  100 
N76D                                                  590 
N76D/S99D                                             840 
N76D/S103A                                            390 
N76D/V104I                                            660 
N76D/I107V                                            710 
N76D/N123S                                             70 
N76D/S99D/S101R                                       610 
N76D/S99D/S103A                                       590 
N76D/S99D/V104I                                       910 
N76D/S101R/S103A                                      930 
N76D/S101R/V104I                                      500 
N76D/S103A/V104I                                      460 
N76D/S103G/V104I★                                    370 
N76D/S103A/V104F                                      480 
N76D/S103A/V104N                                      230 
N76D/S103A/V104S                                      230 
N76D/S103A/V104T                                      370 
N76D/S103A/V104W                                      280 
N76D/S103A/V104Y                                      400 
N76D/V104I/I107V                                      940 
N76D/V104Y/I107V                                      820 
N76D/V104I/N123S                                       80 
N76D/I107V/N123S                                      150 
K27R/N76S/V104Y/N123S                                 100 
N76D/S99D/S101R/S103A                                 570 
N76D/S99D/S101R/V104I                                1000 
N76D/S99D/S103A/V104I                                 680 
N76D/S101G/S103A/V104I★                              390 
N76D/S101R/S103A/V104I                                470 
N76D/S103A/V104I/S105A★                              360 
N76D/S103A/V104I/S105D★                              370 
N76D/S103A/V104T/I107A★                              270 
N76D/S103A/V104T/I107L★                              230 
N76D/S103A/V104I/N123S                                110 
N76D/V104I/I107V/N123S                                220 
N76D/S103A/V104I/L126A                                270 
N76D/S103A/V104I/L126F                                950 
N76D/S103A/V104I/L126I                                410 
N76D/S103A/V104I/L126V                                320 
N76D/S103A/V104I/L128G★                              640 
N76D/S103A/V104I/L128L★                              760 
N76D/S103A/V104I/L135A                                230 
N76D/S103A/V104I/L135F                                200 
N76D/S103A/V104I/L135I                                510 
N76D/S103A/V104I/L135V                                500 
N76D/S103A/V104I/S156E★                              120 
N76D/S103A/V104I/D166D★                              590 
N76D/S103A/V104I/D197E                                460 
N76D/S103A/V104I/N204A★                              230 
N76D/S103A/V104I/N204G★                              240 
N76D/S103A/V104I/N204C★                              500 
N76D/S103A/V104I/P210I★                             1370 
N76D/S103A/V104I/L217H★                               60 
N76D/S103A/V104I/M222A                                520 
N76D/S103A/V104I/M222S                                490 
N76D/S103A/V104I/T260P                                490 
N76D/S103A/V104I/S265N                                360 
K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S                           210 
K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E                           120 
K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C                           110 
K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L                           380 
K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V                           140 
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S                           270 
K27R/N76D/V104Y/N123S/T260P                            40 
K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A                            60 
N76D/S99D/S101R/S103A/V104I                           590 
N76D/S99D/S103A/V104I/N123S                           110 
N76D/S103A/V104I/L126F/S265N                          810 
N76D/S103A/V104I/S156E/S166D★                        220 
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E                      90 
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S                     250 
K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S                     270 
K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S                     460 
K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S                    1400 
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P                     310 
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A                     180 
N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S                      90 
K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/T274                230 
K27R/N76D/V104Y/N123S/G198E/D197E/N21                 240 
B.amyloliquefaciens ズブチリシン（ＢＰＮ′）          100 
BPN´-N76D/Y217L *                                    420 
＊これらの変異体はファージミドから作られた一本鎖ＤＮＡ鋳型でオリゴヌクレオチド特異的変異誘発により作られ、他のすべては前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発により作られた。
【０１４２】
（３）クリーニング組成物物質：
本発明のクリーニング組成物は、前記漂白剤およびプロテアーゼ酵素に加えて、プロテアーゼ酵素と適合する１種以上のクリーニング組成物物質も含んでいる。ここで用いられる“クリーニング組成物物質”という用語は、望まれるクリーニング組成物の具体的タイプおよび製品の形（例えば、液体、顆粒、スプレー組成物）について選択されるあらゆる液体、固体または気体物質を意味し、しかもその物質は組成物で用いられるプロテアーゼ酵素と適合している。クリーニング組成物物質の具体的選択は、クリーニングされる表面、物品または布帛と使用中（例えば、洗浄洗剤使用中）のクリーニング条件にとり組成物の望ましい形について考慮することにより容易に行われる。ここで用いられる“適合する”という用語は、プロテアーゼが通常の使用状況中に望んでいるほど有効でなくなる程度までにはクリーニング組成物物質がプロテアーゼ酵素のタンパク質分解活性を減少させないことを意味する。具体的なクリーニング組成物物質は以下で詳細に例示されている。
【０１４３】
１種以上の前記プロテアーゼ酵素の有効量がタンパク質汚れ除去の必要な様々な表面をクリーニングする上で有用な組成物中に含有される。このようなクリーニング組成物には、形態上制限されない（例えば、液体及び顆粒）、硬質表面をクリーニングするための洗剤組成物；形態上制限されない（例えば、顆粒、液体及び固形処方）、布帛をクリーニングするための洗剤組成物；皿洗い組成物（形態上制限されない）；形態上制限されない（例えば、歯磨剤、練歯磨剤及び洗口液処方）口内洗浄組成物；形態上制限されない（例えば、液体、錠剤）義歯クリーニング組成物がある。ここで記載される“プロテアーゼ酵素の有効量”とは、特定のクリーニング組成物で必要な酵素活性を出すために必要な前記プロテアーゼ酵素の量に関する。このような有効量は当業者により容易に確認でき、用いられる具体的酵素変種、クリーニング適用例、クリーニング組成物の具体的組成と、液体または乾燥（例えば、顆粒、固形）組成物が必要かどうかなどのような多くのファクターに基づいている。
【０１４４】
好ましくは、本発明のクリーニング組成物は約０．０００１〜約１０％、更に好ましくは約０．００１〜約１％、更に一層好ましくは約０．００１〜約０．１％の１種以上のプロテアーゼ酵素を含んでいる。しかも好ましくは、プロテアーゼ酵素は、酵素対ブリーチ比（Ｅ／Ｂ比）としてここでは称される、約１：１〜約２０：１の範囲内で組成物１００ｇ当たりの活性プロテアーゼｍｇ対洗浄液中ペルオキシ酸からの理論有効Ｏ２（“ＡｖＯ２”）ｐｐｍの比率を示すために十分な量で組成物中に存在する。プロテアーゼ酵素が用いられた数例の様々なクリーニング組成物が以下で更に詳細に記載されている。ここで用いられたすべての部、パーセンテージおよび比率は、他で指摘されないかぎり重量による。
【０１４５】
（ｉ）任意の洗浄酵素
本組成物および方法は、特定のプロテアーゼ酵素に加えて、すべての種類の洗浄酵素と有効である。本発明で有用な任意の洗浄酵素も、例えばタンパク質ベース、炭水化物ベースまたはトリグリセリドベース汚れの除去を含めた様々な布帛洗濯目的と、遊離染料移動の防止のために含有させてよい。配合される酵素には他のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼおよびペルオキシダーゼとそれらの混合物がある。他のタイプの酵素も含んでよい。それらは植物、動物、細菌、真菌および酵母起源のようにいかなる適切な起源であってもよい。しかしながら、それらの選択はｐＨ活性および／または最良安定性、熱安定性、活性洗剤、ビルダーなどに対する安定性のようないくつかのファクターにより支配される。この点において、細菌アミラーゼおよびプロテアーゼと真菌セルラーゼのような細菌または真菌酵素が好ましい。
【０１４６】
酵素は、洗剤組成物１ｇ当たり重量で約５０ｍｇ以内、更に典型的には約０．０１〜約１０ｍｇの活性酵素を供給するために十分なレベルで通常配合される。換言すれば、本発明で用いられる任意酵素の有効量は、典型的には洗剤組成物の少くとも約０．００１重量％、好ましくは約０．００１〜約５％、更に好ましくは約０．００１〜約１％、最も好ましくは約０．０１〜約１％である。
【０１４７】
任意プロテアーゼの適切な例は、Ｂ．subtilisおよびＢ．licheniformsの特定株から得られるズブチリシンである。もう１つの適切なプロテアーゼは、８〜１２のｐＨ範囲で最大活性を有するBacillus subtilis またはBacillus licheniformisから得られ、Novo Industries A/S から登録商品名ESPERASEとして開発および販売されている、修正された細菌セリンプロテアーゼ酵素である。この酵素および類似酵素の製品はNovoの英国特許明細書第１，２４３，７８４号明細書で記載されている。市販されている他のタンパク質分解酵素には、Novo Industries A/S （デンマーク）から商品名ALCALASEおよびSAVINASEとして、International Bio-Synthetics,Inc.(オランダ）からMAXATASEとして販売されるものがある。更に他のプロテアーゼには、プロテアーゼＡ（１９８５年１月９日付で公開された欧州特許出願第１３０，７５６号明細書参照）およびプロテアーゼＢ（１９８７年４月２８日付で出願された欧州特許出願第８７３０３７６１．８号および１９８５年１月９日付で公開されたBottらの欧州特許出願第１３０，７５６号明細書参照）と、１２３位でチロシンがバリンに置き換わり、１２３位でセリンがアスパラギンに置き換わり、２７４位でアラニンがトレオニンに置き換わったBacillusからのアルカリセリンプロテアーゼのトリプル変種である、ここでは“プロテアーゼＣ”と称されるものがある。プロテアーゼＣは、引用することにより本明細書の開示の一部とされる、１９９１年５月１６日付で公開されたＷＯ９１／０６６３７に対応するＥＰ第９０９１５９５８．４号明細書で記載されている。特にプロテアーゼＣの遺伝子的に修正された変種もここに含まれる。
【０１４８】
アミラーゼには、例えば英国特許明細書第１，２９６，８３９号（Novo）明細書で記載されたα‐アミラーゼ、International Bio-Synthetics,Inc. のRAPIDASEおよびNovo Industries のTERMAMYLがある。
【０１４９】
本発明で使用しうるセルラーゼには細菌または真菌双方のセルラーゼを含む。好ましくは、それらは５〜９．５の至適ｐＨを有する。適切なセルラーゼは１９８４年３月６日付で発行されたBarbesgoard らの米国特許第４，４３５，３０７号明細書で開示されており、そこではHumicola insolens およびHumicola株ＤＳＭ１８００またはAeromonas 属に属するセルラーゼ２１２産生真菌から産生される真菌セルラーゼと、海洋軟体動物(Dolabella Auricula Solander) の肝膵から抽出されるセルラーゼについて開示している。適切なセルラーゼはＧＢ‐Ａ‐２，０７５，０２８、ＧＢ‐Ａ‐２，０９５，２７５およびＤＥ‐ＯＳ‐２，２４７，８３２でも開示されている。
【０１５０】
洗剤用に適したリパーゼ酵素には、英国特許第１，３７２，０３４号明細書で開示されたPseudomonas stutzeriＡＴＣＣ１９．１５４のようなPseudomonas 属の微生物により産生されるものがある。更に１９７８年２月２４日付で公開された日本特許出願第５３‐２０４８７号のリパーゼ参照。このリパーゼは商品名 Lipase Ｐ"Amano" として日本、名古屋のAmano Pharmaceutical Co.Ltd.から市販され、以下"Amano-P" と称される。他の市販リパーゼにはAmano-CES 、リパーゼ ex Chromobacter viscosum 、例えば日本、田方の東洋醸造社から市販されるChromobacter viscosum var.lipolyticum NRRLB 3673；ＵＳＡのU.S.Biochemical Corp. およびオランダのDisoynth Co.からのChromobacter viscosum リパーゼ；リパーゼ ex Pseudomonas gladioliがある。真菌Humicola lanuginosa に由来し、宿主としてAspergillus oryzaeで発現され、Novoから市販されるLIPOLASE酵素（更にＥ．Ｐ．特許第３４１，９４７号明細書参照）がここで使用上好ましいリパーゼである。
【０１５１】
ペルオキシダーゼ酵素は酸素源、例えばペルカーボネート、ペルボレート、ペルサルフェート、過酸化水素などと組合せて用いられる。それらは“溶液漂白”に、即ち洗浄操作中に物品から落ちた染料または顔料が洗浄溶液中で他の物品に移動することを防ぐために用いられる。ペルオキシダーゼ酵素は当業界で公知であり、それには例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、リグニナーゼとクロロおよびブロモペルオキシダーゼのようなハロペルオキシダーゼがある。ペルオキシダーゼ含有洗剤組成物は、例えばO.Kirkにより１９８９年１０月１９日付で公開されて、Novo Industries A/S に譲渡された、ＰＣＴ国際出願ＷＯ第８９／０９９８１３号明細書で開示されている。
【０１５２】
様々な酵素物質と顆粒合成洗剤中へのそれらの配合手段も１９７１年１月５日付で発行されたMcCarty らの米国特許第３，５５３，１３９号明細書で開示されている。酵素は１９７８年７月１８日付で発行されたPlace らの米国特許第４，１０１，４５７号および１９８５年３月２６日付で発行されたHughesの米国特許第４，５０７，２１９号双方の明細書でも更に開示されている。液体洗剤処方で有用な酵素物質とこのような処方中へのそれらの配合は、１９８１年４月１４日付で発行されたHoraらの米国特許第４，２６１，８６８号明細書で開示されている。洗剤で有用な酵素は様々な技術で安定化させることができる。酵素安定化技術は、１９８１年４月１４日付で発行されたHornらの米国特許第４，２６１，８６８号、１９７１年８月１７日付で発行されたGedge らの米国特許第３，６００，３１９号および１９８６年１０月２９日付で公開されたVenegas の欧州特許出願公開第０１９９４０５号、出願第８６２００５８６．５号明細書で開示および例示されている。酵素安定化系も、例えば米国特許第４，２６１，８６８号、第３，６００，３１９号および第３，５１９，５７０号明細書で記載されている。
【０１５３】
（ii）酵素安定剤
ここで用いられる酵素は、酵素にカルシウムイオンを供給する最終組成物中の水溶性カルシウムイオン源の存在により安定化させることができる。追加安定は様々な他の業界開示安定剤、特にボレート種の存在により得られる：前記Seversonの米国特許第４，５３７，７０６号明細書参照。典型的洗剤、特に液体は最終組成物１リットル当たり約１〜約３０、好ましくは約２〜約２０、更に好ましくは約５〜約１５、最も好ましくは約８〜約１２ミリモルのカルシウムイオンを含む。これは存在する酵素の量とカルシウムイオンに対するその応答に応じてやや変動しうる。カルシウムイオンのレベルは、組成物中でビルダー、脂肪酸などとの錯体形成後に酵素にとり有用な最少レベルで常に存在するように選択されるべきである。限定されないが、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、リンゴ酸カルシウム、水酸化カルシウム、ギ酸カルシウムおよび酢酸カルシウムを含めたあらゆる水溶性カルシウム塩がカルシウムイオン源として使用できる。通常約０．０５〜約０．４ミリモル／リットルの少量のカルシウムイオンも、酵素スラリーおよび処方水中のカルシウムのために組成物中にしばしば存在している。固形洗剤組成物でも、処方物は洗濯液中でこのような量を供給するために十分な量の水溶性カルシウムイオン源を含有していてよい。代わりに、天然水硬度でも十分である。
【０１５４】
本組成物は場合により、但し好ましくは、シリケートコーティングを含めた様々な追加安定剤、特にボレートタイプ安定剤を含有してもよい。典型的には、このような安定剤は（ホウ酸に基づき計算して）ホウ酸または組成物中でホウ酸を形成できる他のボレート化合物について組成物中約０．２５〜約１０重量％、好ましくは約０．５〜約５％、更に好ましくは約０．７５〜約３％のレベルで用いられる。ホウ酸が好ましいが、酸化ホウ素、ボラックスおよび他のアルカリ金属ボレート（例えば、オルト、メタおよびピロホウ酸ナトリウムと五ホウ酸ナトリウム）のような他の化合物も適切である。置換ホウ酸（例えば、フェニルボロニン酸、ブタンボロニン酸およびｐ‐ブロモフェニルボロニン酸）もホウ酸の代わりに使用できる。
【０１５５】
(iii) 洗浄界面活性剤
本発明で提供されるフル処方洗剤組成物中に含有される洗浄界面活性剤の量は、用いられる具体的界面活性剤と望まれる効果に応じて、約１〜約９９．８％である。好ましくは、洗浄界面活性剤は洗剤成分の約５〜約８０重量％である。
【０１５６】
洗浄界面活性剤にはノニオン系、アニオン系、両性、双極性、カチオン系がある。これら界面活性剤の混合物も使用できる。好ましい洗剤組成物は、アニオン系洗浄界面活性剤、またはアニオン系界面活性剤と他の界面活性剤、特にノニオン系界面活性剤との混合物を含む。
【０１５７】
ここで有用な界面活性剤の非制限例には慣用的なＣ11‐Ｃ18アルキルベンゼンスルホネート、一級、二級およびランダムアルキルサルフェート、Ｃ10‐Ｃ18アルキルアルコキシサルフェート、Ｃ10‐Ｃ18アルキルポリグリコシドおよびそれらの対応サルフェート化ポリグリコシド、Ｃ12‐Ｃ18α‐スルホン化脂肪酸エステル、Ｃ12‐Ｃ18アルキルおよびアルキルフェノールアルコキシレート（特に、エトキシレートおよび混合エトキシ／プロポキシ）、Ｃ12‐Ｃ18ベタインおよびスルホベタイン（“スルタイン”）、Ｃ10‐Ｃ18アミンオキシド、Ｃ８‐Ｃ24サルコシネート（特に、オレオイルサルコシネート）などがある。他の慣用的で有用な界面活性剤は標準テキストに掲載されている。
【０１５８】
ここで特に有用な補助ノニオン系界面活性剤の１つの具体的なクラスには下記式のポリヒドロキシ脂肪酸アミドがある：
【化２４】
2006117937.tif 000026
上記式中、Ｒ１はＨ、Ｃ１‐Ｃ８ヒドロカルビル、２‐ヒドロキシエチル、２‐ヒドロキシプロピルまたはそれらの混合物、好ましくはＣ１‐Ｃ４アルキル、更に好ましくはＣ１またはＣ２アルキル、最も好ましくはＣ１アルキル（即ちメチル）であり、Ｒ２はＣ５‐Ｃ32ヒドロカルビル部分、好ましくは直鎖Ｃ７‐Ｃ19アルキルまたはアルケニル、更に好ましくは直鎖Ｃ９‐Ｃ17アルキルまたはアルケニル、最も好ましくは直鎖Ｃ11‐Ｃ19アルキルまたはアルケニル、あるいはそれらの混合物であり、Ｚは直鎖ヒドロカルビル鎖とその鎖に直接結合された少くとも２つ（グリセルアルデヒドの場合）または少くとも３つ（他の還元糖の場合）のヒドロキシルあるいはそのアルコキシル化（好ましくはエトキシル化またはプロポキシル化）誘導体とを有するポリヒドロキシヒドロカルビル部分である。Ｚは好ましくは還元アミノ化反応で還元糖から誘導され、更に好ましくはＺはグリシチル部分である。適切な還元糖にはグルコース、フルクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、マンノースおよびキシロースとグリセルアルデヒドがある。原料として、高デキストロースコーンシロップ、高フルクトースコーンシロップおよび高マルトースコーンシロップと上記個別の糖が利用できる。これらのコーンシロップはＺについて糖成分の混合物を与えることがある。他の適切な原料を決して排除するつもりはないことが理解されるべきである。Ｚは好ましくは‐ＣＨ２‐（ＣＨＯＨ）ｎ‐ＣＨ２ＯＨ、‐ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）‐（ＣＨＯＨ）n-1 ‐ＣＨ２ＯＨ、‐ＣＨ２‐（ＣＨＯＨ）２（ＣＨＯＲ′）（ＣＨＯＨ）‐ＣＨ２ＯＨからなる群より選択され、ここでｎは１〜５の整数であり、Ｒ′はＨまたは環状単糖または多糖およびそのアルコキシル化誘導体である。ｎが４であるグリシチル、特に‐ＣＨ２‐（ＣＨＯＨ）４‐ＣＨ２ＯＨが最も好ましい。
【０１５９】
式（Ｉ）において、Ｒ１は例えばＮ‐メチル、Ｎ‐エチル、Ｎ‐プロピル、Ｎ‐イソプロピル、Ｎ‐ブチル、Ｎ‐イソブチル、Ｎ‐２‐ヒドロキシエチルまたはＮ‐２‐ヒドロキシプロピルである。最高起泡性のためには、Ｒ１は好ましくはメチルまたはヒドロキシアルキルである。低い起泡性が望まれるならば、Ｒ１は好ましくはＣ２‐Ｃ８アルキル、特にｎ‐プロピル、イソプロピル、ｎ‐ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシルおよび２‐エチルヘキシルである。
【０１６０】
Ｒ２‐ＣＯ‐Ｎ＜には、例えばコカミド、ステアラミド、オレアミド、ラウラミド、ミリストアミド、カプリカアミド、パルミトアミド、タロウアミドなどがある。
【０１６１】
本発明で特に有用なノニオン系界面活性剤のもう１つのクラスは、５〜１７、好ましくは６〜１４、更に好ましくは７〜１２の範囲内の平均親水性‐親油性バランス（ＨＬＢ）を有する界面活性剤を与えるような疎水性部分とのエチレンオキシドの縮合物である。疎水性（親油性）部分は性質上脂肪族でもまたは芳香族でもよく、いずれか特定の疎水基と縮合されるポリオキシエチレン基の長さは、親水性および疎水性要素間で望ましいバランス度を有する水溶性化合物を生じるように容易に調整することができる。
【０１６２】
このタイプの特に好ましいノニオン系界面活性剤は、アルコール１モル当たり３〜８モルのエチレンオキシドを含むＣ９‐Ｃ15一級アルコールエトキシレート、特にアルコール１モル当たり６〜８モルのエチレンオキシドを含むＣ14‐Ｃ15一級アルコール、アルコール１モル当たり３〜５モルのエチレンオキシドを含むＣ12‐Ｃ15一級アルコールとそれらの混合物である。
【０１６３】
（iv）洗浄ビルダー
本発明で用いられる任意洗剤成分には、ミネラル硬度のコントロールを助ける無機および／または有機洗浄ビルダーがある。用いられるならば、これらのビルダーは洗剤組成物の約５〜約８０重量％である。
【０１６４】
無機洗浄ビルダーにはポリホスフェート（トリポリホスフェート、ピロホスフェートおよびガラス質ポリマーメタホスフェートで例示される）、ホスホネート、フィチン酸、シリケート、カーボネート（ビカーボネートおよびセスキカーボネートを含む）、サルフェートおよびアルミノシリケートのアルカリ金属、アンモニウムおよびアルカノールアンモニウム塩があるが、それらに限定されない。しかしながら、非ホスフェートビルダーも一部の場所で要求される。
【０１６５】
シリケートビルダーの例はアルカリ金属シリケート、特に１．６：１〜３．２：１範囲のＳｉＯ２：Ｎａ２Ｏ比を有するものと、１９８７年５月１２日付でH.P.Rieck に発行された米国特許第４，６６４，８３９号明細書で記載された、商標名“ＳＫＳ”としてHoechst から市販される積層ナトリウムシリケートのような積層シリケートであり、“ＳＫＳ‐６”が特に好ましい積層シリケートビルダーである。
【０１６６】
カーボネートビルダー、特に１０ｍ2 /g以上の表面積を有する微細炭酸カルシウムが、顆粒組成物で使用できる好ましいビルダーである。このようなアルカリ金属カーボネートビルト洗剤の密度は、好ましくは４％以下の水分で４５０〜８５０g/ｌの範囲内である。
【０１６７】
カーボネートビルダーの例は、１９７３年１１月１５日付で公開されたドイツ特許出願第２，３２１，００１号明細書で開示されるようなアルカリ土類およびアルカリ金属カーボネートである。
【０１６８】
アルミノシリケートビルダーは本発明で特に有用である。好ましいアルミノシリケートは下記式を有するゼオライトビルダーである：
Ｎａｚ〔（ＡｌＯ２）ｚ（ＳｉＯ２）ｙ〕・ｘＨ２Ｏ
上記式中ｚおよびｙは少くとも６の整数であり、ｚ対ｙのモル比は１．０〜約０．５の範囲であり、ｘは約１５〜約２６４の整数である。
【０１６９】
有用なアルミノシリケートイオン交換物質は市販されている。これらのアルミノシリケートは構造上結晶でもまたは非晶質でもよく、天然アルミノシリケートでもまたは合成してもよい。アルミノシリケートイオン交換物質の製造方法は、１９７６年１０月１２日付で発行されたKrummel らの米国特許第３，９８５，６６９号および１９８６年８月１２日付で発行されたCorkill らの米国特許第４，６０５，５０９号明細書で開示されている。ここで有用な好ましい合成結晶アルミノシリケートイオン交換物質はゼオライトＡ、ゼオライトＰ（Ｂ）（ＥＰＯ３８４，０７０で開示されたものを含む）およびゼオライトＸという名称で市販されている。好ましくは、アルミノシリケートは直径約０．１〜１０ミクロンの粒度を有する。
【０１７０】
本発明の目的に適した有機洗浄ビルダーには様々なポリカルボキシレート化合物、例えば１９６４年４月７日付で発行されたBergの米国特許第３，１２８，２８７号および１９７２年１月１８日付で発行されたLambertiらの米国特許第３，６３５，８３０号明細書で開示されたようなオキシジサクシネートを含めたエーテルポリカルボキシレートがあるが、それらに限定されない。更に１９８７年５月５日付でBushらに発行された米国特許第４，６６３，０７１号の“ＴＭＳ／ＴＤＳ”ビルダー参照。適切なエーテルポリカルボキシレートには、米国特許第３，９２３，６７９号、第３，８３５，１６３号、第４，１５８，６３５号、第４，１２０，８７４号および第４，１０２，９０３号で記載されたもののような環式化合物、特に脂環式化合物も含む。
【０１７１】
他の有用な洗浄ビルダーにはエーテルヒドロキシポリカルボキシレート、無水マレイン酸とエチレンまたはビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５‐トリヒドロキシベンゼン‐２，４，６‐トリスルホン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸と、エチレンジアミン四酢酸およびニトリロ三酢酸のようなポリ酢酸の様々なアルカリ金属、アンモニウムおよび置換アンモニウム塩と、メリット酸、コハク酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン‐１，３，５‐トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸およびそれらの可溶性塩のようなポリカルボキシレートがある。
【０１７２】
シトレートビルダー、例えばクエン酸およびその可溶性塩（特にナトリウム塩）は、特にゼオライトおよび／または積層シリケートビルダーと組合せて、顆粒組成物でも使用できる、好ましいポリカルボキシレートである。
【０１７３】
本発明の洗剤組成物では、１９８６年１月２８日付で発行されたBushの米国特許第４，５６６，９８４号明細書で開示された３，３‐ジカルボキシ‐４‐オキサ‐１，６‐ヘキサンジオエート類と関連化合物も適している。
【０１７４】
リンベースビルダーが使用できる状況下、特に手洗い操作で用いられる固形物の処方において、周知トリポリリン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウムおよびオルトリン酸ナトリウムのような様々なアルカリ金属ホスフェートが使用できる。エタン‐１‐ヒドロキシ‐１，１‐ジホスホネートおよび他の公知ホスホネートのようなホスホネートビルダー（例えば、米国特許第３，１５９，５８１号、第３，２１３，０３０号、第３，４２２，０２１号、第３，４００，１４８号および第３，４２２，１３７号明細書参照）も使用できる。
【０１７５】
（ｖ）任意の洗浄助剤
好ましい態様として、ここで用いられる慣用的洗剤成分は洗浄界面活性剤および洗浄ビルダーのような典型的洗剤組成物成分から選択することができる。場合により、洗剤成分にはクリーニング性能、クリーニングされる物品の処理を助けるかまたは高めるために、あるいは洗剤組成物の美観を変えるために、１種以上の他の洗浄助剤または他の物質を含有することができる。洗剤組成物の通常の洗浄助剤には、引用することにより本明細書の開示の一部とされるBaskerville らの米国特許第３，９３６，５３７号明細書で示された成分がある。本発明で用いられる洗剤組成物に使用上慣例的な業界確立レベル（通常洗剤成分の０〜約２０％、好ましくは約０．５〜約１０％）で含有させることができるこのような助剤には、カラースペクル(color speckle) 、起泡増強剤、起泡抑制剤、曇り防止および／または腐食防止剤、汚れ懸濁剤、汚れ放出剤、色素、フィラー、光学増白剤、殺菌剤、アルカリ性源、ヒドロトロピー剤、酸化防止剤、香料、溶媒、溶解剤、土汚れ除去／再沈着防止剤、ポリマー分散剤、加工助剤、布帛柔軟化成分（例えば、スメクタイト土）、色素移動阻止剤（例えば、ポリビニルピロリドン）、静電気抑制剤などがある。
【０１７６】
ブリーチ系は場合により、但し好ましくはブリーチを分解する傾向がある重金属イオンを除去することでブリーチ安定性を高めるだけでなく、茶汚れなどのようなポリフェノール系汚れの除去にも役立つキレート化剤も含む。MonsantoからDEQUEST として市販されるアミノホスホネート、ニトリロトリアセテート、ヒドロキシエチルエチレンジアミントリアセテートなどを含めた様々なキレート化剤がこのような使用にとり知られている。好ましい生分解性無リンキレート化剤にはエチレンジアミンジサクシネート（“ＥＤＤＳ”、Hartman およびPerkins の米国特許第４，７０４，２３３号明細書参照）、エチレンジアミン‐Ｎ，Ｎ′‐ジグルタメート（ＥＤＤＧ）および２‐ヒドロキシプロピレンジアミン‐Ｎ，Ｎ′‐ジサクシネート（ＨＰＤＤＳ）化合物がある。このようなキレート化剤は、それらのアルカリまたはアルカリ土類金属塩として、典型的には本組成物の約０．１〜約１０％のレベルで使用できる。
【０１７７】
本発明組成物は、顆粒洗剤または洗濯固形物で典型的にみられるような慣用的洗濯洗剤組成物として特に有用である。１９６５年４月１３日付で発行されたOkenfussの米国特許第３，１７８，３７０号明細書は、固形洗濯洗剤とそれらの製造方法について記載している。１９８０年９月２３日付で発行されたAndersonのフィリピン特許第１３，７７８号明細書は、合成洗剤洗濯固形物について記載している。様々な押出し方法による固形洗濯洗剤の製造方法が当業界で周知である。
【実施例】
【０１７８】
下記例は本発明を更に説明するために示されており、それを制限すると解釈されるべきでない。
【０１７９】
例１
下記成分を含んだ顆粒洗剤組成物を製造する。
成分 重量％
Ｃ12直鎖アルキルベンゼンスルホネート                            22
ホスフェート（トリポリリン酸ナトリウムとして）                  30
炭酸ナトリウム                                                  14
ケイ酸ナトリウム                                                 3
プロテアーゼ１２                                                 0.3
過炭酸ナトリウム                                                 5
エチレンジアミンジサクシネートキレート化剤（ＥＤＤＳ）           0.4
硫酸ナトリウム                                                   5.5
ノナノイルカプロラクタム                                         5
フィラー＊および水                                      残部１００％まで
＊ＣａＣＯ３、タルク、土、シリケートなどのような好ましい物質から選択できる
【０１８０】
洗剤組成物の熱およびアルカリ安定性成分の水性クラッチャー(crutcher)混合物を調製し、スプレードライし、他の成分はそれらが表示された成分を示されたレベルで含有するように混合する。
【０１８１】
この例において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１８２】
例２
下記成分を含んだ顆粒洗剤組成物を製造する。
成分 重量％
アニオン系アルキルサルフェート                                   7
ノニオン系界面活性剤                                             5
ゼオライト（０．１〜１０ミクロン）                              10
クエン酸三ナトリウム                                             2
ＳＫＳ‐６シリケートビルダー                                    10
アクリレートマレエートポリマー                                   4
ノナノイルカプロラクタム                                         5
過炭酸ナトリウム*                                               15
炭酸ナトリウム                                                   5
エチレンジアミンジサクシネートキレート化剤（ＥＤＤＳ）           0.4
起泡抑制剤                                                       2
プロテアーゼ１２                                                 0.3
リパーゼ                                                         0.3
汚れ放出剤                                                       0.2
微量成分、フィラー**および水                            残部１００％まで
＊４００〜１２００ミクロンの平均粒度
**ＣａＣＯ３、タルク、土、シリケートなどのような好ましい物質から選択できる
【０１８３】
洗剤組成物の熱およびアルカリ安定性成分の水性クラッチャー混合物を調製し、スプレードライし、他の成分はそれらが表示された成分を示されたレベルで含有するように混合する。
【０１８４】
この例において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１８５】
例３
洗剤組成物を例２の場合と同一の操作で製造するが、但し１５％のベンゾイルカプロラクタム、ノナノイルカプロラクタムおよび（６‐ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネートの１：１：１混合物がノナノイルカプロラクタムに置き代わり、過炭酸ナトリウムの量は３０％である。
【０１８６】
この例において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１８７】
例４
洗剤組成物を例１の場合と同一の操作で製造するが、但し２０％のベンゾイルカプロラクタムおよび（６‐ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネートの１：１混合物がノナノイルカプロラクタムに置き代わり、過炭酸ナトリウムの量は２０％であり、ホスフェートの量は０％である。
【０１８８】
この例において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１８９】
例５
洗剤組成物を例２の場合と同一の操作で製造するが、但し相当量のベンゾオキサジンタイプ活性剤をノナノイルカプロラクタムの代わりに用いる。
【０１９０】
この例において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１９１】
例６
洗剤組成物を例２の場合と同一の操作で製造するが、但し１０％のベンゾオキサジンタイプ活性剤およびテトラアセチルエチレンジアミンの１：１混合物がノナノイルカプロラクタムに置き代わり、過炭酸ナトリウムの量は２５％である。
この例において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１９２】
例７
手洗い汚れ布帛用に適した洗濯固形物を標準押出しプロセスにより製造し、以下を含有させる。
成分 重量％
Ｃ12直鎖アルキルベンゼンスルホネート                            30
ホスフェート（トリポリリン酸ナトリウムとして）                   7
炭酸ナトリウム                                                  25
ピロリン酸ナトリウム                                             7
ココナツモノエタノールアミド                                     2
ゼオライト（０．１〜１０ミクロン）                               5
カルボキシメチルセルロース                                       0.2
ポリアクリレート（ｍ．ｗ．１４００）                             0.2
（６‐ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート         5
過炭酸ナトリウム                                                 5
増白剤、香料                                                     0.2
プロテアーゼ１２                                                 0.3**
リパーゼ                                                         0.3
ＣａＳＯ４                                                       1
ＭｇＳＯ４                                                       1
水                                                               4
フィラー＊                                              残部１００％まで
＊ＣａＣＯ３、タルク、土、シリケートなどのような好ましい物質から選択できる
**組成物ｇ当たりの活性酵素ｍｇを表示している
【０１９３】
洗剤洗濯固形物を当業界で常用される慣用的石鹸または固形洗剤製造装置で処理する。
【０１９４】
この例において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１９５】
例８
洗剤組成物を例７の場合と同一の操作で製造するが、但し相当量のベンゾイルカプロラクタムを（６‐ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネートの代わりに用いる。
【０１９６】
この例において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１９７】
例９
洗剤組成物を例７の場合と同一の操作で製造するが、但し相当量のノナノイルカプロラクタムを（６‐ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネートの代わりに用いる。
【０１９８】
この例において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０１９９】
例１０
下記成分を含んだ顆粒洗剤組成物を製造する。
成分 重量％
アニオン系アルキルサルフェート                                   7
ノニオン系界面活性剤                                             5
ゼオライト（０．１〜１０ミクロン）                              10
クエン酸三ナトリウム                                             2
ＳＫＳ‐６シリケートビルダー                                    10
アクリレートマレエートポリマー                                   4
ノナノイルカプロラクタム                                         5
過炭酸ナトリウム*                                               15
炭酸ナトリウム                                                   5
エチレンジアミンジサクシネートキレート化剤（ＥＤＤＳ）           0.4
起泡抑制剤                                                       2
プロテアーゼ１２                                                 0.5
汚れ放出剤                                                       0.2
微量成分、フィラー**および水                            残部１００％まで
＊４００〜１２００ミクロンの平均粒度
**ＣａＣＯ３、タルク、土、シリケートなどのような好ましい物質から選択できる
【０２００】
洗剤組成物の熱およびアルカリ安定性成分の水性クラッチャー混合物を調製し、スプレードライし、他の成分はそれらが表示された成分を示されたレベルで含有するように混合する。
【０２０１】
この例において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０２０２】
例１１
洗剤組成物を例１０の場合と同一の操作で製造するが、但し相当量のベンゾイルカプロラクタムをノナノイルカプロラクタムの代わりに用いる。
【０２０３】
この例において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０２０４】
例１２
洗剤組成物を例１０の場合と同一の操作で製造するが、但し１５重量％の（６‐ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネートがノナノイルカプロラクタムに置き代わり、過炭酸ナトリウムの量は３０％である。
【０２０５】
この例において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０２０６】
例１３
洗剤組成物を例１０の場合と同一の操作で製造するが、但し１５重量％のベンゾオキサジンタイプ活性剤がノナノイルカプロラクタムに置き代わり、過炭酸ナトリウムの量は３０％である。
【０２０７】
この例において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、この例において、特に表III 、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。
【０２０８】
例１４
洗浄性能試験
本発明組成物で有用な変種の洗浄性能は、ＥＭＰＡ１１６（コットン上に血液／ミルク／カーボンブラック）衣切れ（Testfabrics,Inc.,Middlesex,NJ 07030 ）から汚れの除去を調べることにより評価する。
【０２０９】
ギザギザ端のある３×４-1/2インチに切断された６枚のＥＭＰＡ１１６布切れを、水１０００ｍｌ、硬度１５ｇｐｇ（Ｃａ++：Ｍｇ++３：１ｗ：ｗ）、洗剤７ｇおよび適宜に酵素を含有したモデル７２４３Ｓ  Terg-O-Tometer（United States Testing Co.,Inc.,Hoboken,NJ ）の各ポットに入れる。洗剤ベースはwfk-Testgewebe GmbH,Adlerstrasse 42,Postfach 13 07 62,D-47759 Krefeld,Germany のＷＦＫ１洗剤である：
【０２１０】
成分                                                  最終処方の％
ゼオライトＡ                                            ２５％
硫酸ナトリウム                                          ２５％
ソーダ灰                                                １０％
直鎖アルキルベンゼンスルホネート                          ８．８％
アルコールエトキシレート（７‐８ＥＯ）                    ４．５％
ナトリウム石鹸                                            ３％
ケイ酸ナトリウム（ＳｉＯ２：Ｎａ２Ｏ  ３：３：１）        ３％
【０２１１】
このベース洗剤に下記添加を行う：
成分                                                  最終処方の％
過ホウ酸ナトリウム一水和物                              １３％
コポリマー（Sokalan CP5 ）                                ４％
ＴＡＥＤ（Mykon ATC Green ）                              ３％
酵素                                                      ０．５％
増白剤（Tinopal AMS-GX）                                  ０．２％
【０２１２】
過ホウ酸ナトリウム一水和物はDegussa Corporation,Ridgefield-Park,NJ 07660から得る。Sokalan CP5 はBASF Corporation,Parsippany,NJ 07054から得る。Mykon ATC Green （ＴＡＥＤ，テトラアセチルエチレンジアミン）はWarwick International,Limited,Mostyn,Holywell,Clwyd CH8 9HE,England から得る。Tinopal AMS GXはCiba-Geigy Corporation,Greensboro,NC 27419から得る。
【０２１３】
６枚のＥＭＰＡ１１６布切れを６０℃で３０分間酵素入り洗剤で洗浄し、その後各回毎に水１０００ｍｌで５分間にわたり２回すすぎ洗いする。酵素を標準曲線では０．０５〜１ｐｐｍ、ルーチン分析では０．２５ｐｐｍの最終濃度で加える。布切れを乾燥し、プレスし、布切れの反射率をMinolta Chroma Meter,Model CR-200(Minolta Corporation,Ramsey,NJ 07446)のＬ＊ａ＊ｂ＊スケールでＬ値を用いて測定する。性能はB.Lentus（ＧＧ３６）プロテアーゼの性能の％として報告し、同様の汚れ除去性能を示すために必要な変種プロテアーゼの量でB.Lentus（ＧＧ３６）プロテアーゼの量を割り１００を掛けることにより計算する。データは表VII で示されている。
【０２１４】
表VII 
酵素                                                洗浄性能
B.Lentusズブチリシン                                  100 
N76D                                                  310 
N76D/S103A                                            230 
N76D/V104I                                            130 
N76D/I107V                                            160 
N76D/S99D/S101R                                       370 
N76D/S99D/S103A                                       290 
N76D/S101R/S103A                                      130 
N76D/S101R/V104I                                      300 
N76D/S103A/V104I                                      320 
N76D/S103G/V104I                                      160 
N76D/S103A/V104F                                      210 
N76D/S103A/V104N                                      110 
N76D/S103A/V104T                                      170 
N76D/V104I/I107V                                      210 
N76D/S99D/S101R/S103A                                 220 
N76D/S99D/S101R/V104I                                 140 
N76D/S101G/S103A/V104I                                170 
N76D/S101R/S103A/V104I                                150 
N76D/S103A/V104I/S105A                                170 
N76D/S103A/V104T/I107A                                120 
N76D/S103A/V104T/I107L                                110 
N76D/S103A/V104I/L126F                                110 
N76D/S103A/V104I/L128G                                280 
N76D/S103A/V104I/L135V                                160 
N76D/S103A/V104I/D197E                                160 
N76D/S103A/V104I/N204A                                170 
N76D/S103A/V104I/N204G                                160 
N76D/S103A/V104I/N204C                                150 
N76D/S103A/V104I/P210I                                470 
N76D/S103A/V104I/M222A                                100 
N76D/S103A/V104I/T260P                                280 
N76D/S103A/V104I/S265N                                190 
【０２１５】
配列表
【表１】
2006117937.tif 000027
【０２１６】
【表２】
2006117937.tif 000028
【０２１７】
【表３】
2006117937.tif 000029
【０２１８】
【表４】
2006117937.tif 000030
【０２１９】
【表５】
2006117937.tif 000031
【０２２０】
【表６】
2006117937.tif 000032
【０２２１】
【表７】
2006117937.tif 000033
【０２２２】
【表８】
2006117937.tif 000034
【０２２３】
【表９】
2006117937.tif 000035
【０２２４】
【表１０】
2006117937.tif 000036
【０２２５】
【表１１】
2006117937.tif 000037
【０２２６】
【表１２】
2006117937.tif 000038
【図面の簡単な説明】
【０２２７】
【図１】Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ酸配列と、この遺伝子の部分制限地図について示す（Seq.ID No.6 ）。
【図２】Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ酸配列と、この遺伝子の部分制限地図について示す（Seq.ID No.6 ）。
【図３】Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ酸配列と、この遺伝子の部分制限地図について示す（Seq.ID No.6 ）。
【図４】Bacillus amyloliquefaciens（ＢＰＮ）′およびBacillus lentus （野生型）のズブチリシンの中に保存されたアミノ酸残基について示す。
【図５】４種ズブチリシンのアミノ酸配列について示す。最上列はBacillus amyloliquefaciensのズブチリシン（ズブチリシンＢＰＮ′とも時々称される）のアミノ酸配列について表す（Seq.ID No.7 ）。第二列はBacillus subtillisのズブチリシンのアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.8 ）。第三列はＢ．licheniformis のズブチリシンのアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.9 ）。第四列はBacillus lentus のズブチリシン（ＰＣＴ  ＷＯ８９／０６２７６ではズブチリシン３０９とも称されている）のアミノ酸配列について表す（Seq.ID No.10）。記号＊はズブチリシンＢＰＮ′と比較した特定アミノ酸残基の不在について示す。
【図６】４種ズブチリシンのアミノ酸配列について示す。最上列はBacillus amyloliquefaciensのズブチリシン（ズブチリシンＢＰＮ′とも時々称される）のアミノ酸配列について表す（Seq.ID No.7 ）。第二列はBacillus subtillisのズブチリシンのアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.8 ）。第三列はＢ．licheniformis のズブチリシンのアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.9 ）。第四列はBacillus lentus のズブチリシン（ＰＣＴ  ＷＯ８９／０６２７６ではズブチリシン３０９とも称されている）のアミノ酸配列について表す（Seq.ID No.10）。記号＊はズブチリシンＢＰＮ′と比較した特定アミノ酸残基の不在について示す。
【図７】プラスミドＧＧＡ２７４の作成について示す。
【図８】この出願で用いられるある発現プラスミドへの中間体であるＧＧＴ２７４の作成について示す。
【図９】Bacillus lentus のズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.11）。成熟ズブチリシンタンパク質はＡｌａに対応するコドンＧＣＧ（３３４‐３３６）で始まるコドンによりコードされている。
【図１０】Bacillus lentus のズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.11）。成熟ズブチリシンタンパク質はＡｌａに対応するコドンＧＣＧ（３３４‐３３６）で始まるコドンによりコードされている。
【図１１】Bacillus lentus のズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.11）。成熟ズブチリシンタンパク質はＡｌａに対応するコドンＧＣＧ（３３４‐３３６）で始まるコドンによりコードされている。
【図１２】本発明の好ましい態様のＤＮＡおよびアミノ酸配列について示す（N76D/S103A/V1041）（Seq.ID No.12）。この図面におけるＤＮＡは７６位でアスパラギン酸、１０３位でアラニンおよび１０４位でイソロイシンについてコードするように記載された方法で修飾されている。成熟ズブチリシン変種タンパク質はＡｌａに対応するコドンＧＣＧ（３３４‐３３６）で始まるコドンによりコードされている。
【図１３】本発明の好ましい態様のＤＮＡおよびアミノ酸配列について示す（N76D/S103A/V1041）（Seq.ID No.12）。この図面におけるＤＮＡは７６位でアスパラギン酸、１０３位でアラニンおよび１０４位でイソロイシンについてコードするように記載された方法で修飾されている。成熟ズブチリシン変種タンパク質はＡｌａに対応するコドンＧＣＧ（３３４‐３３６）で始まるコドンによりコードされている。
【図１４】本発明の好ましい態様のＤＮＡおよびアミノ酸配列について示す（N76D/S103A/V1041）（Seq.ID No.12）。この図面におけるＤＮＡは７６位でアスパラギン酸、１０３位でアラニンおよび１０４位でイソロイシンについてコードするように記載された方法で修飾されている。成熟ズブチリシン変種タンパク質はＡｌａに対応するコドンＧＣＧ（３３４‐３３６）で始まるコドンによりコードされている。
【図１５】ベクターｐＢＣＤＡＩＣＡＴの作成について示す。
【図１６】ベクターｐＢＣＤＡＩＣＡＴの作成について示す。
【図１７】ベクターｐＵＣＣＡＴＦＮＡの作成について示す。
【図１８】ベクターｐＵＣＣＡＴＦＮＡの作成について示す。
【図１】
2006117937.tif 000044
【図２】
2006117937.tif 000045
【図３】
2006117937.tif 000046
【図４】
2006117937.tif 000047
【図５】
2006117937.tif 000048
【図６】
2006117937.tif 000049
【図７】
2006117937.tif 000050
【図８】
2006117937.tif 000051
【図９】
2006117937.tif 000052
【図１０】
2006117937.tif 000053
【図１１】
2006117937.tif 000054
【図１２】
2006117937.tif 000055
【図１３】
2006117937.tif 000056
【図１４】
2006117937.tif 000057
【図１５】
2006117937.tif 000058
【図１６】
2006117937.tif 000059
【図１７】
2006117937.tif 000060
【図１８】
2006117937.tif 000061