(57)【要約】【課題】  造影能に優れ、安全性の高いＸ線造影剤を提供すること。【解決手段】  本発明のＸ線造影剤は、エタノールを含む有機溶媒を一切使用しない超臨界二酸化炭素法により作製され、脂質膜内外の水相に、造影物質として水溶性の非イオン型ヨウド系化合物、および生理的に許容される製剤助剤を含有するリポソームを含む造影剤である。そのリポソームの脂質膜は、構成成分として少なくともリン脂質、ポリエチレングリコール基を有する脂質およびステロール類を含み、平均粒径が0.05〜0.8μｍのリポソームであり、かつ、該脂質膜が２〜10枚膜で構成されるリポソームが少なくとも80％を占めており、該ヨウド系化合物をヨウド原子として100〜250mgＩ/mL造影剤、全脂質を60〜150mg/mL造影剤の濃度で含むことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質膜内外の水相に、造影物質として水溶性の非イオン型ヨウド系化合物および１種類以上の生理的に許容される製剤助剤を含有するリポソームを含む造影剤であり、
そのリポソームの脂質膜は、構成成分として少なくともリン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を有する脂質およびステロール類を含み、リン脂質（ＰＥＧ基を有する脂質を含まず）/ステロール類のモル比が100/60〜100/90、リン脂質（ＰＥＧ基を有する
脂質を含まず）/ＰＥＧ基を有する脂質のモル比が100/5〜100/25であり、平均粒径が0.05〜0.8μｍのリポソームであり、かつ、該脂質膜が２〜10枚膜で構成されるリポソームが
少なくとも70％を占めており、
該ヨウド系化合物をヨウド原子として100〜250mgＩ/mL造影剤、全脂質を60〜150mg/mL
造影剤の濃度で含むことを特徴とするＸ線造影剤。
【請求項２】
前記リン脂質には、22〜60℃の範囲にある転移温度を有するリン脂質が含まれることを特徴とする請求項１に記載のＸ線造影剤。
【請求項３】
前記リポソームが、超臨界もしくは亜臨界状態の二酸化炭素、１重量部に対して、脂質膜成分として少なくともリン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を有する脂質およびステロール類を含む脂質、0.075〜0.125重量部を加えて、強撹拌下で混合することにより作製された実質的に有機溶媒を含まないリポソームであり、
その強撹拌における撹拌条件として、撹拌機が以下の式
Ｃ ＝ Ｎ × Ｖ -0.15
Ｃ：撹拌子または撹拌羽根の回転数（ｒｐｍ）
Ｖ：混合溶液の容量（Ｌ）
Ｎ：３００〜３０００
を満たすことを特徴とする請求項1に記載のＸ線造影剤。
【請求項４】
前記ヨウド系化合物のうち、リポソームに内包された部分の前記脂質の量に対する重量比が、1〜7（g/g）であることを特徴とする請求項1に記載のＸ線造影剤。
【請求項５】
前記ヨウド系化合物の65〜85質量％が、リポソームに内包されていない形態にあり、リポソームを分散させている水性媒体中に存在することを特徴とする請求項１または４に記載のＸ線造影剤。
【請求項６】
前記脂質膜内外の水相に、カチオンが塩化物、リン酸塩または炭酸水素塩として含有され、このうちナトリウムイオン、カルシウムイオンおよびカリウムイオンの量が下記式：
[Ｎａ+]＋120・[Ｃａ2+]＋50・ [Ｋ+]≦130
（ただし、ナトリウムイオン量が20〜70mM、カルシウムイオン量が0.1〜0.6 mMおよびカ
リウムイオン量が0.4〜0.9 mMである。）
を満たし、マグネシウムイオンの量が、0.05〜0.8mMであることを特徴とする請求項１〜
５のいずれかに記載のＸ線造影剤。
【請求項７】
前記リポソームの平均粒径が、0.2〜0.8μｍであり、肝臓撮像に使用されることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のＸ線造影剤。
【請求項８】
（i）圧力容器内のリポソーム膜構成成分に液化二酸化炭素を供給して混合し、加温加圧
して液化二酸化炭素を超臨界状態とし、強撹拌下で、最終的に超臨界もしくは亜臨界状態の二酸化炭素、１重量部に対して、リポソーム膜構成成分として少なくともリン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を有する脂質およびステロール類を含む脂質、0.075
〜0.125重量部の割合で混合し分散させる工程と、
（ii）次いで、ヨウド系化合物および製剤助剤を含む溶液もしくは懸濁液を導入し、強撹拌下で混合することによりミセルを形成させる工程と、
（iii）その後圧力容器内を減圧して二酸化炭素を排出して、それらのヨウド系化合物お
よび製剤助剤を内部に含有するリポソームの水性分散液を作製する工程と、
（iv）前記リポソームの水性分散液を、0.1〜1μｍの孔径を有する濾過膜を装着した静圧式押出し装置に通して、平均粒径が0.05〜0.8μｍのリポソームに整粒する工程と、およ
び
（v）得られた濾液をさらに限外濾過により濃縮する工程と、
を少なくとも含み、
これらの工程によりリン脂質（ＰＥＧ基を有する脂質を含まず）/ステロール類のモル
比が100/60〜100/90、リン脂質（ＰＥＧ基を有する脂質を含まず）/ポリエチレングリコ
ール基を有する脂質のモル比が100/5〜100/25であり、
脂質膜が２〜10枚膜で構成されるリポソームが少なくとも70％を占めており、かつ、該ヨウド系化合物をヨウド原子として100〜250mgＩ/mL造影剤、全脂質を60〜150mg/mL造影
剤の濃度で含むことを特徴とするＸ線造影剤の製造方法。
【請求項９】
（i）リポソーム膜構成成分として少なくともリン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）基を有する脂質およびステロール類を含む脂質と、ヨウド系化合物および製剤助剤を含む水溶液とを混合した懸濁液を収容している圧力容器内に、液化二酸化炭素を供給し、強撹拌下で、最終的に二酸化炭素、１重量部に対して、脂質、0.075〜0.125重量部の割合で混合し分散させる工程と、
（ii）次いで、加温加圧して液化二酸化炭素を超臨界状態とし、強撹拌下で混合することによりミセルを形成させる工程と、
（iii）その後圧力容器内を減圧して二酸化炭素を排出して、それらのヨウド系化合物お
よび製剤助剤を内部に含有するリポソームの水性分散液を作製する工程と、
（iv）前記リポソームの水性分散液を、0.1〜1μｍの孔径を有する濾過膜を装着した静圧式押出し装置に通して、平均粒径が0.05〜0.8μｍのリポソームに整粒する工程と、およ
び
（v）得られた濾液をさらに限外濾過により濃縮する工程と、
を少なくとも含み、
これらの工程によりリン脂質（ＰＥＧ基を有する脂質を含まず）/ステロール類のモル
比が100/60〜100/90、リン脂質（ＰＥＧ基を有する脂質を含まず）/ポリエチレングリコ
ール基を有する脂質のモル比が100/5〜100/25であり、
脂質膜が２〜10枚膜で構成されるリポソームが少なくとも70％を占めており、かつ、該ヨウド系化合物をヨウド原子として100〜250mgＩ/mL造影剤、全脂質を60〜150mg/mL造影
剤の濃度で含むことを特徴とするＸ線造影剤の製造方法。
【請求項１０】
前記強撹拌における撹拌条件として、撹拌機が以下の式
Ｃ ＝ Ｎ × Ｖ -0.15
Ｃ：撹拌子または撹拌羽根の回転数（ｒｐｍ）
Ｖ：混合溶液の容量（Ｌ）
Ｎ：３００〜３０００
を満たすことを特徴とする請求項８または９に記載のＸ線造影剤の製造方法。
【請求項１１】
前記リン脂質には、２２〜６０℃の範囲にある転移温度を有するリン脂質が含まれ、３２〜５５℃の温度条件下で超臨界二酸化炭素と混合することを特徴とする請求項８または９に記載のＸ線造影剤の製造方法。
【請求項１２】
前記ヨウド系化合物が、イオヘキソール、イオパミドール、イオメプロール、イオプロミド、イオキシラン、イオタスル、イオトロランまたはイオジキサノールであることを特
徴とする請求項8〜11のいずれかに記載のＸ線造影剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内での安定性に優れ、かつ造影物質の内包率が高いリポソームを含んでなるリポソーム含有造影剤の製造方法、および該方法により得られたリポソーム含有造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在実用化されているＸ線造影剤の大部分は、トリヨウドフェニル基を含み水溶性化された化合物を造影物質とするものである。このような造影剤が投与された場合、ヨウド系化合物の多くは、組織や疾患部位と相互作用をすることなく管腔部位から速やかに排出されてしまう。組織や疾患部位、特に癌病巣をより詳細に観察する目的には明らかに役立たない。このため目標とする組織もしくは疾患部位、特に癌組織に選択的に集積し、病変箇所の周囲またはその他の部位と明瞭なコントラストで区別できる画像を提供するＸ線造影剤が望まれている。
【０００３】
その問題の解決には、造影剤を微粒子状にするとともにその血中半減期を改善することにより標的組織へ選択的に送達する方法が有効である。生体膜類似の脂質から構成され、低い抗原性であるリポソームに造影物質を内包させる手法が従来から検討されている。例えば国際公開ＷＯ88/09165、同ＷＯ89/00988、同ＷＯ90/07491、特開平07-316079、特開2003-5596では、非イオン性の造影物質を含有するリポソームが提案されている。これらの造影剤では、安全性が高い素材の脂質で構成され、生体内で適度な分解性を有するリポソームを用いるにもかかわらず、依然として多くの課題を残している。Bangham法や逆相蒸
発法（REV法）などによる製造過程においては、リポソーム膜を構成するリン脂質の溶剤
として、有機溶媒、特にクロロホルム、ジクロロメタンといったクロル系溶剤を使用される（例えば、特許文献１参照）。したがって、どうしても残存する溶媒の毒性があるという理由で、いずれのリポソーム含有造影剤も実用化に至っていないのが現状である（特許文献２）。
【０００４】
さらに従来の方法では、リポソーム内に薬物を充分に内包させることができず、リポソーム含有製剤を大量に投与する必要があるため患者に過度の負担となる問題があった。このように、治療用薬剤に比べて投与量が多くなる診断用造影剤への応用を考えた場合、造影物質の保持効率（内包率）が高いリポソーム含有製剤が求められていた。
【０００５】
特許文献３に記載の超臨界二酸化炭素を用いた方法は、そうした有害な有機溶媒を使用しないが、その内包率に改良の余地があった。造影性能の理由から造影物質の内包率を上げるためにはエタノール等の助溶剤の使用が望まれており、有機溶媒を使用せずに内包率の高いリポソームは作製できないとされていた（非特許文献１）。
【０００６】
首尾良く造影物質をリポソーム内部に内包させても、時間経過とともに外部へ漏出する問題、あるいはリポソームそのものが不安定となる事態も考慮されねばならない。したがって、造影能に優れた非イオン型ヨウド系化合物を効率よくリポソームに内包させる方法とともに、経時安定的にそれを保持し、血中滞留性を改善することができる剤形、製剤組成の改良ならびに造影剤の安全性の向上など、引き続き様々な要請が存在する。
【特許文献１】特許2619037号公報
【特許文献２】特開平7-316079号公報
【特許文献３】特開2003-119120号公報
【非特許文献１】Pharm Tech Japan 19巻、 5号、 91〜100（2003）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
リポソームと言ってもそれには多種多様な形態があることから、本発明者らはＸ線造影剤に最適なリポソームの構造および形態を確立し、しかも安定で安全なリポソームを作製することが課題解決には重要であるとの認識のもとに、鋭意研究を続けて本発明を完成した。本発明は、上記の要請に取り組むものであり、有機溶媒を使用せずに作製されるリポソーム内に水溶性非電解質である非イオン型ヨウド系化合物を効率よく内包させてなるＸ線造影剤を提案する。本製剤は、がん組織の良好な描出性、容易な排泄性、低副作用性を有する安全性の高いＸ線造影剤であり、全身投与および局所投与のいずれにも使用できる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のＸ線造影剤は、
脂質膜内外の水相に、造影物質として水溶性の非イオン型ヨウド系化合物および１種類以上の生理的に許容される製剤助剤を含有するリポソームを含む造影剤であり、
そのリポソームの脂質膜は、構成成分として少なくともリン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を有する脂質およびステロール類を含み、リン脂質（ＰＥＧ基を有する脂質を含まず）/ステロール類のモル比が100/60〜100/90、リン脂質（ＰＥＧ基を有する
脂質を含まず）/ＰＥＧ基を有する脂質のモル比が100/5〜100/25であり、平均粒径が0.05〜0.8μｍのリポソームであり、かつ、該脂質膜が２〜10枚膜で構成されるリポソームが
少なくとも70％を占めており、
該ヨウド系化合物をヨウド原子として100〜250mgＩ/mL造影剤、全脂質を60〜150mg/mL
造影剤の濃度で含むことを特徴としている。
【０００９】
前記リン脂質には、22〜60℃の範囲にある転移温度を有するリン脂質が含まれることが望ましい。
また前記リポソームは、超臨界もしくは亜臨界状態の二酸化炭素、１重量部に対して、脂質膜成分として少なくともリン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を有する脂質およびステロール類を含む脂質、0.075〜0.125重量部を加えて、強撹拌下で混合することにより作製された実質的に有機溶媒を含まないリポソームであり、
その強撹拌における撹拌条件として、撹拌機が以下の式
Ｃ ＝ Ｎ × Ｖ -0.15
Ｃ：撹拌子または撹拌羽根の回転数（ｒｐｍ）
Ｖ：混合溶液の容量（Ｌ）
Ｎ：３００〜３０００
を満たすことを特徴としている。
【００１０】
前記ヨウド系化合物のうち、リポソームに内包された部分の前記脂質の量に対する重量比が、1〜7（g/g）であることが好ましい。また前記ヨウド系化合物の65〜85質量％が、
リポソームに内包されていない形態にあり、リポソームを分散させている水性媒体中に存在してもよい。
【００１１】
前記脂質膜内外の水相に、カチオンが塩化物、リン酸塩または炭酸水素塩として含有され、このうちナトリウムイオン、カルシウムイオンおよびカリウムイオンの量が下記式：
[Ｎａ+]＋120・[Ｃａ2+]＋50・ [Ｋ+]≦130
（ただし、ナトリウムイオン量が20〜70mM、カルシウムイオン量が0.1〜0.6 mMおよびカ
リウムイオン量が0.4〜0.9 mMである。）
を満たし、マグネシウムイオンの量が、0.05〜0.8mMである。
【００１２】
前記リポソームの平均粒径が0.2μｍ〜0.8μｍである造影剤は、肝臓撮像に好ましく使
用される。
本発明によるＸ線造影剤の製造方法は、
（i）圧力容器内のリポソーム膜構成成分に液化二酸化炭素を供給して混合し、加温加圧
して液化二酸化炭素を超臨界状態とし、強撹拌下で、最終的に超臨界もしくは亜臨界状態の二酸化炭素、１重量部に対して、リポソーム膜構成成分として少なくともリン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を有する脂質およびステロール類を含む脂質、0.075
〜0.125重量部の割合で混合し分散させる工程と、
（ii）次いで、ヨウド系化合物および製剤助剤を含む溶液もしくは懸濁液を導入し、強撹拌下で混合することによりミセルを形成させる工程と、
（iii）その後圧力容器内を減圧して二酸化炭素を排出して、それらのヨウド系化合物お
よび製剤助剤を内部に含有するリポソームの水性分散液を作製する工程と、
（iv）前記リポソームの水性分散液を、0.1〜1μｍの孔径を有する濾過膜を装着した静圧式押出し装置に通して、平均粒径が0.05〜0.8μｍのリポソームに整粒する工程と、およ
び
（v）得られた濾液をさらに限外濾過により濃縮する工程と、
を少なくとも含み、
これらの工程によりリン脂質（ＰＥＧ基を有する脂質を含まず）/ステロール類のモル
比が100/60〜100/90、リン脂質（ＰＥＧ基を有する脂質を含まず）/ポリエチレングリコ
ール基を有する脂質のモル比が100/5〜100/25であり、
脂質膜が２〜10枚膜で構成されるリポソームが少なくとも70％を占めており、かつ、該ヨウド系化合物をヨウド原子として100〜250mgＩ/mL造影剤、全脂質を60〜150mg/mL造影
剤の濃度で含むことを特徴としている。
【００１３】
また、別のＸ線造影剤の製造方法として、
（i）リポソーム膜構成成分として少なくともリン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）基を有する脂質およびステロール類を含む脂質と、ヨウド系化合物および製剤助剤を含む水溶液とを混合した懸濁液を収容している圧力容器内に、液化二酸化炭素を供給し、強撹拌下で、最終的に二酸化炭素、１重量部に対して、脂質、0.075〜0.125重量部の割合で混合し分散させる工程と、
（ii）次いで、加温加圧して液化二酸化炭素を超臨界状態とし、強撹拌下で混合することによりミセルを形成させる工程と、
（iii）その後圧力容器内を減圧して二酸化炭素を排出して、それらのヨウド系化合物お
よび製剤助剤を内部に含有するリポソームの水性分散液を作製する工程と、
（iv）前記リポソームの水性分散液を、0.1〜1μｍの孔径を有する濾過膜を装着した静圧式押出し装置に通して、平均粒径が0.05〜0.8μｍのリポソームに整粒する工程と、およ
び
（v）得られた濾液をさらに限外濾過により濃縮する工程と、
を少なくとも含み、
これらの工程によりリン脂質（ＰＥＧ基を有する脂質を含まず）/ステロール類のモル
比が100/60〜100/90、リン脂質（ＰＥＧ基を有する脂質を含まず）/ポリエチレングリコ
ール基を有する脂質のモル比が100/5〜100/25であり、
脂質膜が２〜10枚膜で構成されるリポソームが少なくとも70％を占めており、かつ、該ヨウド系化合物をヨウド原子として100〜250mgＩ/mL造影剤、全脂質を60〜150mg/mL造影
剤の濃度で含む方法であってもよい。
【００１４】
前記強撹拌における撹拌条件として、撹拌機が以下の式
Ｃ ＝ Ｎ × Ｖ -0.15
Ｃ：撹拌子または撹拌羽根の回転数（ｒｐｍ）
Ｖ：混合溶液の容量（Ｌ）
Ｎ：３００〜３０００
を満たすことである。
【００１５】
前記リン脂質には、22〜60℃の範囲にある転移温度を有するリン脂質が含まれ、32〜55℃の温度条件下で超臨界二酸化炭素と混合することが望ましい。
また前記ヨウド系化合物として、イオヘキソール、イオパミドール、イオメプロール、イオプロミド、イオキシラン、イオタスル、イオトロランまたはイオジキサノールが好ましい。
[発明の詳細な説明]
本明細書において、「リポソーム」は、通常、脂質膜、すなわち脂質二重膜から形成されている構造物である。また本明細書では、リポソーム膜を「脂質膜」と言及することもある。リポソーム内に「内包」されるとは、リポソーム内に封入されてそのリン脂質膜と会合しているか、またはリン脂質膜内部に閉じ込められている水相（内部水相）中に存在している状態の両方を含むものとする。また、「がん」は、悪性腫瘍を指し、単に「腫瘍」ということもある。
造影物質
本発明のＸ線造影剤に使用される造影物質は、水溶性の非イオン型ヨウド系化合物である。これをイオン型ヨウド系化合物よりも望ましい造影物質としている理由は、イオン性官能基が溶液中でイオンに解離して高い浸透圧を示し、これがイオン型ヨウド系化合物を含む造影剤の副作用の主因となっていることを重視することによる。
【００１６】
水溶性の非イオン型ヨウド系化合物として、特にヨウ化フェニルを含み、例えば2,4,6
−トリヨウドフェニル基を少なくとも1個有する非イオン型ヨウド系化合物が好適である
。
【００１７】
上記の基準、製造コストおよび生理的、使用上の制約から本発明のＸ線造影剤の造影物質として、特に好ましいヨウド系化合物は、イオメプロール、イオパミドール、イオヘキソール、イオペントール、イオプロミド、イオキシラン、イオシミド、イオベンゾール、イオトロラン、イオジキサノール、イオデシモル、イオタスル、メトリザミド、1，3−ビス−（Ｎ−3，5−ビス−（2，3−ジヒドロキシプロピルアミノカルボニル）−2，4，6−
トリヨードフェニル）−Ｎ−ヒドロキシアセチル−アミノ）−プロパンなどが挙げられる。
これらの化合物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。またその例示に限定されるものではない。前記ヨウド系化合物のうち、特にイオメプロール、イオパミドール、イオヘキソール、イオプロミド、イオキシラン、イオタスル、イオトロランまたはイオジキサノールが好ましい。
【００１８】
上記の造影物質は、血漿タンパク質との結合が僅かであるか、ほとんど認められない。しかし非イオン型ヨウド系化合物でも副作用のおそれが全くなくなったわけではない。イオン型造影剤に比べると確かに僅かであるが、それでも造影剤に起因した免疫的刺激に誘発されてアナフィラキシー様全身反応の発生が懸念される（特開平5-208921号公報）。そこで非イオン型ヨウド系化合物をリポソームに内包させれば、免疫系を刺激する可能性も僅少となり、ヨウド過敏症のリスクは軽減される。特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化により外表面をステルス化されたリポソーム（後記する）に上記の非イオン型ヨウド系化合物を内包することは、この面からも造影剤の安全性が高まるため望ましい。
【００１９】
本発明のＸ線造影剤は、通常、リポソームに内包されていないヨウド系化合物もまた含む。このような造影剤にあっては、リポソーム内に内包されている造影物質の割合（内包率）も考慮されねばならない。リポソーム内外におけるヨウド系化合物の濃度は、その造影物質の性質、意図する製剤の投与経路および臨床上の指標といった諸要因に基づき任意に設定することができる。
【００２０】
本発明のＸ線造影剤は、前記水溶性ヨウド系化合物の65〜85質量％が、リポソームに内包されていない形態にあり、リポソームを分散させる水性媒体中に存在することを特徴としている。実質的にほとんど、または大半のヨウド系化合物がリポソーム内に内包されている製剤も可能であるが、そうした製剤は、浸透圧差、リポソームの形態と安定性、内包化させる効率、製剤の造影能なども考えると現実の製剤として実用上、特に優れるわけではない。医薬物質の薬物送達システム（ＤＤＳ）においてはリポソーム内に封入することにより副作用が軽減され、内包化により得る利益を一層増すために、内包されていない医薬物質を分離除去して製剤を調製する場合もある。実際には、リポソーム懸濁薬剤が製造され、分離された直後は、ほぼ100％の封入が達成されても、短時間経過後には封入成分
が時間とともに漏失する例が報告されている（Betageri, G. V.  Drug  Devel. Ind. Pharm. 19, 531-539(1993)）。この現象は、浸透圧効果によるリポソーム構造の不安定化に
基づくものである。またＷＯ88/09165のリポソーム調製物のように、リポソーム内部のみにＸ線造影物質を有する造影剤をオートクレーブ滅菌すると、造影物質がリポソーム外に漏れ出てしまうことが報告されている（特許文献２）。逆に内包化されていない遊離の造影物質を含む製剤の診断的意義が論じられた（特表平9-505821号公報）。これは造影剤固有の使用態様に根ざすものであり、リポソームに内包されなかった医薬化合物を所期の目的からは無用のものとする立場とは一線を画すべき事情については既に上記した。
【００２１】
特にリポソームにヨウド系化合物を効率的に内包化し、ヨウド系化合物を担持するリポソームの経時的不安定化を充分に防止するためには、リポソーム内に封入されたヨウド系化合物の量は、Ｘ線造影剤における全ヨウド系化合物の10〜40質量％、好ましくは15〜35質量％、より好ましくは15〜30質量％であることが望ましい。Ｘ線造影剤において、リポソーム内に封入されたヨウド系化合物の割合が、全体の10〜40質量％（好ましくは15〜35質量％）であれば、残り60〜90質量％（好ましくは65〜85質量％）が存在するリポソーム外の水性分散液へ流出する量については実質的に無視できる。したがって、ヨウド系化合物をカプセル化したリポソームの浸透圧効果による不安定化を防止でき、リポソームにおける造影物質の経時的な保持安定性は向上する。このことは、本発明のリポソーム含有Ｘ線造影剤においては、製剤調製時におけるヨウド系化合物の内包率と使用時における内包率が実質的に同一に保たれることを意味し、造影剤の品質管理の観点からも好ましい。リポソームへの内包率が貯蔵・保管の間に低下する結果、製剤ごとに、または保管期間ごとに異なっては、その造影性能にも影響する。
【００２２】
以上より本発明のＸ線造影剤におけるリポソーム膜内部の水相（脂質膜により封入された水溶液）に内包されているヨウド原子の重量は、10〜200 mg／mL、好ましくは20〜180mgI／mL、より好ましくは70〜110 mg／mLである。これは上記内包率と全ヨウド含有量によって規定されるパラメータである。
リポソーム
本発明のＸ線造影剤は、脂質膜内外の水相に、造影物質として水溶性非電解質である非イオン型ヨウド系化合物などを内包し、実質的に有機溶媒を含まないリポソームを含有することを特徴としている。すなわち、水溶性ヨウド系化合物などをマイクロキャリヤーとしてのリポソーム内に封入した形態で使用することにより、標的の臓器、組織の病巣へ効率よく送達させることを図っている。本発明に用いられるリポソームは、Ｘ線造影剤用に最適なリポソームとして設計された形態、構造を有する。すなわち本発明において使用するリポソームは、その脂質膜が実質的に数枚膜で構成されるために経時的な安定性および血中での安定性が改善されており、しかも造影物質の内包率を高めて造影剤の造影能を向上させている。
【００２３】
本発明のＸ線造影剤において、水溶性ヨウド系化合物を内包するリポソームの粒径およびその脂質膜を適切に設計することによりターゲティング機能を付与することができる。
特に全身投与の場合には、受動的ターゲティングおよび能動的ターゲティングいずれも考慮することが望ましい。前者は、リポソームの粒径、脂質組成、荷電などの調整を通じてその生体内挙動を制御することができる。リポソーム粒径を狭い範囲に揃える調整もまた容易に行うことができる。リポソーム膜表面の設計では、リン脂質の種類と組成、共存物質を変えることにより所望の特性を付与することができる。さらに投与されたリポソームの体内移動と分布に関して、より高度な送達選択性と集積性を可能とする能動的ターゲティングの採用もまた検討されるべきである。一例として、リポソーム膜表面にポリアルキレンオキシド高分子鎖またはポリエチレングリコール基を導入することは、標的部位への誘導を制御し得るために有益である。
【００２４】
他方、がん組織などに到達しなかったリポソームは、正常な組織には集積することなく、比較的速やかに分解されて体外に排泄される。これはリポソームを設計する際にその安定性を体外排出時間との関係で適切にコントロールすることにより可能である。そうしたクリアランスの制御により、遊離形態では副作用が皆無ではない非イオン型ヨウド系化合物をリポソームに内包させるＤＤＳ剤形のもう一つの効果が期待できる。すなわち水溶性の非イオン型ヨウド系化合物をリポソームに内包させると、ヨウド系化合物が肝臓、脾臓、腎臓などに非特異的に沈着して、分解・排泄に時間がかかる事態に陥りにくくなる。このため徒に体内に留まることによる弊害、遅発性の副作用などを防止できる。
【００２５】
リポソームの脂質膜を構成する脂質膜成分には、少なくともリン脂質、糖脂質、ステロール類、グリコール類、カチオン性脂質、ポリエチレングリコール基を有する脂質（例えばＰＥＧ基を有する脂質）などが含まれる。本発明のＸ線造影剤に含まれるリポソームの脂質膜成分として、一般にリン脂質および／または糖脂質が好ましく使用される。好ましい中性リン脂質として、大豆、卵黄などから得られるレシチン、リゾレシチンおよび／またはこれらの水素添加物、水酸化物の誘導体を挙げることができる。
【００２６】
その他のリン脂質として、卵黄、大豆またはその他の動植物に由来するか、または半合成のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、合成により得られるホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジミリストリルホスファチジルコリン（DMPC）、ジオレイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジステアロイルホスファチジルセリン（DSPS）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPＧ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（DPPI）、
ジステアロイルホスファチジルイノシトール（DSPI）、ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）などを挙げることができる。
【００２７】
本発明のリポソームを構成する脂質膜のリン脂質類には、転移温度を有するリン脂質が少なくとも含まれていることが望ましい。リン脂質の「（相）転移温度」とは、リン脂質がとり得るゲルと液晶との両状態間の相転移を生じる温度である。その測定は、示差走査熱量計（ＤＳＣ）を使用する示差熱分析による。２２〜６０℃の範囲にある相転移点を有するリン脂質として、ジミリストイルホスファチジルコリン（転移温度、以下同じ、23〜24℃）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（41.0〜41.5℃）、水素添加大豆レシチン（53℃）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（54℃）、ジステアロイルホスファチジルコリン（54.1〜58.0℃）などが例示される。
【００２８】
これらのリン脂質は通常、単独で使用されるが、２種以上併用してもよい。ただし２種以上の荷電リン脂質を使用する場合には、負電荷のリン脂質同士または正電荷のリン脂質同士で使用することが、リポソームの凝集防止の観点から望ましい。中性リン脂質と荷電リン脂質を併用する場合、重量比として通常、200：1〜3：1、好ましくは100：1〜4：1、
より好ましくは40：1〜5：1である。
【００２９】
糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステルなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4などのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。
【００３０】
リポソーム膜の構成成分として、上記脂質の他に必要に応じて他の物質を加えることもできる。例えば、脂質膜安定化剤として作用するステロール類、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロール、コレステロールエステル、フィトステロール、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、コレスタノール、またはラノステロールなどが挙げられる。また１−Ｏ−ステロールグルコシド，１−Ｏ−ステロールマルトシドまたは１−Ｏ−ステロールガラクトシドといったステロール誘導体もリポソームの安定化に効果があることが示されている（特開平5-245357号公報）。これらの中で、特にコレステロールが好ましい。
【００３１】
リポソーム膜中のコレステロールは、ポリアルキレンオキシド導入用のアンカーにもなり得る。特開平09−3093号公報には、ポリオキシアルキレン鎖の先端に、種々の機能性物質を共有結合により固定化することができ、リポソーム形成用の成分として利用することができる新規なコレステロール誘導体が開示されている。
【００３２】
ステロール類の使用量として、リン脂質（ＰＥＧ基を有する脂質を含まず）/ステロー
ル類のモル比が100/60〜100/90、好ましくは100/70〜100/85である。このモル比は、ＰＥＧ基を有する脂質を除くリン脂質量を基準としている。モル比が100/60未満であると混合脂質の分散性を向上させるステロール類による安定化が充分に発揮されない。
【００３３】
上記ステロール類の他にリポソーム膜の構成成分として、グリコール類を加えてもよい。リポソームを作製する際に、リン脂質などともにグリコール類を添加すると、リポソーム内での水溶性ヨウド系化合物の保持効率が上昇する。グリコール類として、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリメチレングリコール、1,4-ブタンジオールなどが挙げられる。グリコール類の使用量として、脂質全質量に対して0.01〜20質量％、好ましくは0.5〜10質量％の割合が望ましい。
【００３４】
リポソーム製剤である本発明のＸ線造影剤の意図する目的に応じて、高分子鎖であるポリアルキレンオキシド（ポリオキシアルキレン鎖）（ＰＡＯ）基または類似の基を有するリン脂質または化合物を、リポソーム膜の一成分として使用してもよい。ポリアルキレンオキシド基またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基をリポソーム膜表面に付けることにより、崩壊、凝集といったリポソーム自体の不安定性が解決され、経時安定性も改善される。さらに新たな機能をリポソームに付与することができる。例えば、ＰＥＧ化リポソームには免疫系から認識されにくくなる効果が期待できる。さらにリポソームは、ＰＥＧ基の導入により水和層が形成されて親水的傾向を示すことにより、血中安定性を増して長時間にわたり血液中の濃度を維持できることが明らかになっている（Biochim. Biophys. Acta., 1066, 29-36(1991)）。よって−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＨであらわされるＰＥＧ基
のオキシエチレン単位の長さと導入する割合を適宜変えることにより、その機能を調節することができる。ＰＥＧ基として、オキシエチレン単位が10〜3500、好ましくは100〜2000のポリエチレングリコールが好適である。ポリエチレングリコールを使用する場合の使
用量は、該リポソームを構成する脂質に対して1〜40質量％、好ましくは5〜25質量％含むのがよい。リポソームのＰＥＧ化には、公知の技術を利用することができる。好ましくはＰＥＧ基を有する脂質を、ポリエチレングリコール基を有する脂質として用いてもよい。
これは、後述するように、リン脂質などを超臨界二酸化炭素に混合する際に、溶解助剤的な作用も示すからである。
【００３５】
上記ポリエチレングリコールに代わり、公知の各種ポリアルキレンオキシド基、−（ＡＯ）n−Ｙをリポソーム膜表面に導入してもよい。ここでＡＯは炭素数２〜４のオキシア
ルキレン基を表し、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数であり、1〜2000、好まし
くは10〜500、さらに好ましくは20〜200の正の整数である。また、Ｙは、水素原子、アルキル基（例えば炭素数１〜５の、分岐していてもよい脂肪族炭化水素基）または機能性官能基を表す。
【００３６】
炭素数２〜４のオキシアルキレン基（ＡＯで表される）として、例えばオキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシテトラメチレン基、オキシ−１−エチルエチレン基、オキシ−１，２−ジメチルエチレン基などが挙げられる。
【００３７】
ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基の種類は、同一のものでも異なるものでもよい。後者の場合、ランダム状に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。ポリアルキレンオキシド鎖に親水性を付与する場合、オキシアルキレン基としてはエチレンオキシドが単独で付加したものが好ましく、この場合、ｎが１０以上のものが好ましい。また種類の異なるアルキレンオキシドを付加する場合、エチレンオキシドが２０モル％以上、好ましくは５０モル％以上付加しているのが望ましい。ポリアルキレンオキシド鎖に親油性を付与する場合には、エチレンオキシド以外のオキシアルキレン基の付加モル数を多くする。例えばポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドとのブロック共重合物を含有するリポソームは、本発明の好ましい態様である。
【００３８】
上記のＹで表される機能性官能基は、ポリアルキレンオキシド鎖の先端に糖、糖タンパク質、抗体、レクチン、細胞接着因子といった「機能性物質」を付するためのもので、例えばアミノ基、オキシカルボニルイミダゾール基、Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミド基とい
った反応性に富む官能基が挙げられる。
【００３９】
先端に「機能性物質」を結合しているポリアルキレンオキシド鎖が固定化されたリポソームは、ポリアルキレンオキシド鎖導入の効果に加えて、「機能性物質」の機能、例えば「認識素子」として特定臓器指向性、腫瘍組織指向性などの作用が充分に発揮される。腫瘍組織指向性を付与するには、腫瘍細胞のみに存在する腫瘍特異抗原に対応する抗腫瘍モノクローナル抗体を、機能性物質としてリポソーム膜に結合させると、よりターゲット選択性の高いリポソームとなる（例えば、特開平11-28087号公報）。
【００４０】
リポソーム膜へのポリアルキレンオキシド鎖の導入は、公知の技術を利用することができる。ポリアルキレンオキシド基を有するリン脂質または化合物は、一種類を単独で使用することができ、あるいは二種以上のものを組み合わせて使用することもできる。その含有量は、リポソーム膜構成成分の合計量に対し、0.001〜50モル％、好ましくは0.01〜25
モル％、より好ましくは0.1〜10モル％である。
【００４１】
他に添加できる化合物として、負荷電物質であるジセチルホスフェートといったリン酸ジアルキルエステルなど、正電荷を与える化合物としてステアリルアミンなどの脂肪族アミンが例示される。
【００４２】
本発明のＸ線造影剤において、微細粒子としてのリポソームのサイズとその分布の調整は、高いヨウド系化合物の内包率、ターゲティング性、送達効率と密接に関わっている。粒径（粒子径）は水溶性ヨウド系化合物を内包するリポソームを含む分散液を凍結し、その後破砕した界面をカーボン蒸着し、このカーボンを電子顕微鏡で観察すること（凍結破
砕ＴＥＭ法）により測定することができる。ここで「平均粒径」とは、観察された造影剤粒子の一定の個数、例えば20個の径の単純平均を指している。これは粒径分布で最も出現頻度の高い粒径を言う「中心粒径」と、通常一致するか、または概ね近似している。
【００４３】
受動的ターゲティング能力をリポソームに持たせるには、リポソームを作製する際に、その粒径のサイズを適切に揃えて調製することが必要になる。特許2619037号公報には、
粒径3μm以上のリポソームを排除することにより、肺の毛細血管におけるリポソームの不都合な滞留が回避されると記載されている。しかし、0.5〜3μmの粒径範囲のリポソーム
は、必ずしも自然に向腫瘍性とはならない。本発明のＸ線造影剤においては、その用途に応じて平均粒径を、好ましくは0.05〜0.8μmの範囲内で適宜調整してリポソームを作製する。例えば、肝臓の撮像を目的とするＸ線造影剤の場合、リポソームの好ましい平均粒径は、0.2μｍ〜0.8μｍである。水溶性ヨウド系化合物を内包するリポソームがこの範囲のサイズであれば、非腫瘍組織に多い細網系内皮細胞による捕獲貪食の対象になり、腫瘍組織とのコントラストが明瞭となるためである。なお肝臓用の造影剤に使用するリポソームは、その表面にあるＰＥＧは、なるべく少ない方が望ましい。
【００４４】
血流を利用する「ＥＰＲ効果（Enhanced permeability and retention、透過性の亢進
および滞留）」に基づいてリポソームを向腫瘍性とするためには、その平均粒径を0.1〜0.2μm 、より好ましくは0.11〜0.13μmとすることが望ましい。リポソームの平均粒径を0.11〜0.13μm の範囲に揃えることにより、リポソーム含有造影剤をがん組織へ選択的に
集中させることが可能となる。固形がん組織にある新生血管壁の孔は、正常組織の毛細血管壁窓（fenestra）の孔サイズ、0.03〜0.08μm に比べて異常に大きく、概ね0.1μm 〜0.2μm の大きさの分子でも血管壁から漏れ出る。このようにＥＰＲ効果は、がん組織にある新生血管壁では、正常組織の微小血管壁より透過性が高いことによるものである。
リポソームの製造方法
リポソームを作製する方法として、これまで種々の方法が提案されている。作製方法が異なると、最終的にでき上がったリポソームの形態および特性も著しく異なることが多い（特開平6-80560号公報）。そのため所望するリポソームの形態、特性に応じて製造方法
が選択される。一般にリポソームの調製は、まずリン脂質、カチオン性脂質、ステロールといった脂質膜成分を、ほとんど例外なく有機溶媒（例えばクロロホルム、ジクロロメタン、エチルエーテル、四塩化炭素、酢酸エチル、ジオキサン、THFなど）とともに容器中
で混合、溶解することから始まる。特にクロル系溶媒がよく用いられている。このようなリポソームの調製品は、必ず有機溶媒を含んでいる。
【００４５】
他方、超臨界二酸化炭素を利用してリポソームを調製する方法は、二酸化炭素の臨界温度が31.1℃、臨界圧力が7.38 MPaと比較的扱いやすく、不活性なガスゆえ残存しても人体に無害であり、高純度流体が安価で容易に入手できるなどの理由により魅力ある製造方法であると言える。しかしながら、例え有機溶媒を使用しないとする従来の超臨界二酸化炭素法でも、脂質類を超臨界二酸化炭素に効率よく分散させるためにエタノールなどの使用が推奨されていた（非特許文献１参照）。残存するこれらの有機溶媒を除去するために、複数の工程および長時間の処理を要しているのが現状である。そうした残留する有機溶媒、特にクロル系有機溶媒については、生体に及ぼす悪影響、例えば副作用が懸念される。
【００４６】
本発明の造影剤に使用するリポソームは、Ｘ線造影剤用に最適な形態、構造を有するリポソームを製造できるように開発された方法である。すなわち、超臨界二酸化炭素を用いる方法により作製されたリポソームは、実質的にクロル系溶剤、エタノールおよびその他の有機溶媒を含有せず、水溶性ヨウド系化合物を内包するのに種々の好ましい特性、すなわち、従来法に比べてリポソームの生成率、封入する薬物の内包率、内包されている薬物のリポソーム内の保持率が高いことが示されている（上記特許文献３参照）。さらに工業的スケールでの応用も可能である。なお「実質的に」とは、造影剤における残存有機溶媒
の濃度の上限値が10μg/Ｌであることを意味する。
【００４７】
最初の第１および第２工程は、物質の添加順序が異なる次の２つのうちいずれでもよい。
（i）圧力容器内のリポソーム膜構成成分に液化二酸化炭素を供給して混合し、加温加圧
して液化二酸化炭素を超臨界状態とし、強撹拌下で、最終的に超臨界もしくは亜臨界状態の二酸化炭素、１重量部に対して、リポソーム膜構成成分として少なくともリン脂質、ポリエチレングリコール基を有する脂質およびステロール類を含む脂質、0.075〜0.125重量部の割合で混合し分散させる工程、
（ii）次いで、ヨウド系化合物および製剤助剤を含む溶液もしくは懸濁液を導入し、強撹拌下で混合することによりミセルを形成させる工程、
の順で行なう。あるいは、別の順序として
（i）リポソーム膜構成成分として少なくともリン脂質、ポリエチレングリコール基を有
する脂質およびステロール類を含む脂質と、ヨウド系化合物および製剤助剤を含む水溶液とを混合した懸濁液を収容している圧力容器内に、液化二酸化炭素を供給し、強撹拌下で、最終的に二酸化炭素、１重量部に対して、上記脂質、0.075〜0.125重量部の割合で混合し分散させる工程、
（ii）次いで、加温加圧して液化二酸化炭素を超臨界状態とし、強撹拌下で混合することによりミセルを形成させる工程、
の順序で行なう方法であってもよい。
【００４８】
さらに以下の第３〜第５工程が続く。
（iii）その後圧力容器内を減圧して二酸化炭素を排出して、それらのヨウド系化合物お
よび製剤助剤を内部に含有するリポソームの水性分散液を作製する工程、
（iv）前記リポソームの水性分散液を、0.1〜1μｍの孔径を有する濾過膜を装着した静圧式押出し装置に通して、平均粒径が0.05〜0.8μｍのリポソームに整粒する工程、および
（v）得られた濾液をさらに限外濾過により濃縮する工程。
【００４９】
これらの工程によりリン脂質（ＰＥＧ基を有する脂質を含まず）/ステロール類のモル
比が100/60〜100/90、リン脂質（ＰＥＧ基を有する脂質を含まず）/ポリエチレングリコ
ール基を有する脂質のモル比が100/5〜100/25であり、ヨウド系化合物および製剤助剤を
内包し、２〜10枚膜で構成されるリポソームが少なくとも70％を占めるリポソームが得られる。
【００５０】
以下、各工程に沿って説明する。
・第１工程（i）および第２工程（ii）
第１および第２工程では、圧力容器内で、リポソーム膜構成成分と、液化二酸化炭素と、非イオン性ヨウド化合物および製剤助剤を含有する薬物水溶液との添加順序に基づいて２方法に別れる。
【００５１】
圧力容器に液化二酸化炭素を加え、後記範囲の圧力および温度のもとに液化二酸化炭素を超臨界状態もしくは亜臨界状態にする。超臨界（もしくは亜臨界）状態の二酸化炭素に、リポソーム膜を構成する脂質成分としてリン脂質類および脂質膜の安定化作用を有する物質を溶解または分散させる。リン脂質として、22〜60℃の範囲にある転移温度を有する少なくとも1種以上のリン脂質を含む各種のリン脂質が好ましい。リン脂質以外の膜脂質
成分として、脂質膜の安定化作用を有する物質であるステロール類およびポリエチレングリコール基を有する脂質を上記リン脂質類とともに混合して溶解、分散させる。または予めこれらの化合物を加えた圧力容器に液化二酸化炭素を加え、次いで温度、圧力を調整して超臨界状態にして混合してもよい。引き続き生成したリン脂質および脂質膜安定化物質などを含有する超臨界二酸化炭素中に、内包させる水溶性薬物の非イオン型ヨウド系化合
物および製剤助剤を含む薬物水溶液を導入することによりミセルを形成させる。
【００５２】
あるいは、リポソーム膜構成成分として少なくともリン脂質、ポリエチレングリコール基を有する脂質およびステロール類と、ヨウド系化合物および製剤助剤を含む薬物水溶液とを混合した懸濁液を収容している圧力容器内に、液化二酸化炭素を供給し、強撹拌下で、混合し分散させ、次いで加温加圧して液化二酸化炭素を超臨界状態とし、さらに強撹拌下で混合することによりミセルを形成させてもよい。
【００５３】
これらは、ポリエチレングリコール基を有する少なくとも１種以上の脂質が存在する条件下で、行なうことが望ましい。強撹拌下で、最終的に二酸化炭素、１重量部に対して、脂質、0.075〜0.125重量部、好ましくは0.08〜0.1重量部の割合で混合し分散させる。こ
の脂質量は、従来使用されている脂質量よりも1.5〜2.5倍多くしている。後述するように１枚膜よりはむしろ数枚膜のリポソームを形成させるためである。脂質量が多すぎると、リポソーム作成時には脂質の溶け残りが生じるおそれがある。しかしながら撹拌当初は脂質相が存在してもよく、次のような強撹拌により、脂質が配列する、ＣＯ2／水界面を多
数生じさせて、これにより内包率も上昇させることができる。脂質と超臨界二酸化炭素との乳化は、下記のようにＰＥＧ基を有する脂質の存在で促進される。
【００５４】
「強撹拌」とは、混合溶液の容量や撹拌手段によって好ましい範囲が異なるが、例えば、混合溶液の容量が10〜100mL程度の場合において、長さ15mm、直径5mmの略円柱状の撹拌子を用い、マグネチックスターラーで回転数400〜4000ｒｐｍ、好ましくは1000〜1500ｒ
ｐｍ、特に好ましくは1200〜1400ｒｐｍで撹拌することを意味する。なお、混合溶液の容量や撹拌手段が上記とは異なる場合であっても、前記撹拌条件で混合溶液に与えられるせん断力等を考慮して、適宜撹拌条件を定めることが好ましい。具体的には、撹拌条件が以下の式を満たすことが特に好ましい。
【００５５】
式：Ｃ ＝ Ｎ × Ｖ -0.15
Ｃ：撹拌子または撹拌羽根の回転数（ｒｐｍ）
Ｖ：混合溶液の容量（Ｌ）
Ｎ：３００〜３０００
また、強撹拌の時間は、1〜120分間、好ましくは5〜60分間であることが望ましく、混
合液量、脂質量に応じて適宜設定する。なお、上記強撹拌の時間には、薬物水溶液を供給する時間も含む。
【００５６】
このような条件を満たす強撹拌下で、リポソーム膜構成成分と、超臨界二酸化炭素とを所定の時間混合することにより、リポソームの生成率がより高く、水溶性薬物の内包率がより高いリポソームを含有する製剤を得ることができる。撹拌手段として、特に限定されないが、マグネチックスターラー、ホモジナイザー、ホモミキサー、ウルトラミキサーなど、通常の撹拌機を使用してもよい。
【００５７】
リン脂質、コレステロールを含む脂質類は、そもそも超臨界二酸化炭素、水のいずれにも溶けにくいし、分散もしにくい。所望する形態のリポソームが効率的に形成されるためには、脂質類が超臨界二酸化炭素中に良好に分散し、両者間の乳化が進んで均質な状態を形成することが重要な鍵である。そのための溶解助剤（または助溶剤、分散促進剤）として、ヒドロキシル基を有する少なくとも1種の化合物を利用して溶解、分散または混合を
することが好ましい。
【００５８】
ヒドロキシル基を有する化合物（すなわちヒドロキシル基含有化合物）には、例えば、ヒドロキシル基、ポリオール基、ポリアルキレングリコールエーテル基、またはポリオール／ポリグリコールエーテル基などの組み合わせを、親水性基として有する化合物が含ま
れる。実際に溶解助剤として使用できるヒドロキシル基含有化合物としては、リン脂質、コレステロールなどの脂質膜成分と親和性を示し、これらと充分混合するものが望ましい。さらに、脂質膜成分を極性の液化二酸化炭素中に良好に分散させ、溶解させるためには、適度の親水性と疎水性を兼ね備えた両親媒性のものが好適である。
【００５９】
上記のヒドロキシル基を有する化合物において、さらに残存する溶解助剤の毒性をも懸念する場合には、安全性の観点から、低級アルコールなどを用いないことが望ましい。したがって、効力および安全性を考慮してより好ましい溶解助剤は、ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール基を有する化合物である。ポリエチレングリコール基を有する化合物として、具体的にはポリエチレングリコール基を有する脂質、例えばＰＥＧ基を有する脂質が好ましい。そのオキシエチレン単位が10〜3500、好ましくは100〜2000
のポリエチレングリコールが適する。
【００６０】
このようなヒドロキシル基を有する化合物を1種または2種以上併用することは、内包率を向上させるために望ましい。ヒドロキシル基を有する化合物を、超臨界状態もしくは亜臨界状態にする二酸化炭素の0.01〜1質量％、好ましくは、0.1〜0.8質量％の割合で溶解
助剤として使用するのがよい。ヒドロキシル基を有する化合物が、ポリエチレングリコール基を有する脂質である場合、リン脂質（ＰＥＧ基を有する脂質を含まず）/ポリエチレ
ングリコール基を有する脂質のモル比が100/5〜100/25、好ましくは100/5〜100/10である。
【００６１】
溶解助剤としてエタノールなどを用いる従来の超臨界二酸化炭素法では、エタノールが、超臨界二酸化炭素中へ脂質類が溶解もしくは分散することを促進する。その結果、コレステロールとリン脂質などを含有する二酸化炭素領域と、主にＰＥＧ化リン脂質および水溶性薬物を含有する水の領域からなる２相系を形成し、これが撹拌されると超臨界二酸化炭素の乳化が進行し、脂質のミセルが形成される。最終的には、１枚膜の脂質膜を有するリポソームが主として調製されていた。
【００６２】
これに対し本発明の方法では、リポソーム膜構成成分としてのポリエチレングリコール基を有する脂質（例えばＰＥＧ基を有する脂質）が、エタノールなどの溶解助剤に代わって乳化促進作用をする。水溶性薬物およびＰＥＧ化リン脂質が水相に溶解もしくは分散して水の表面張力を下げるとともに、リン脂質およびコレステロールなどが集まった脂質相もまた形成され、脂質類をほとんど含まない超臨界二酸化炭素の相との３相系の状態となる。撹拌により超臨界二酸化炭素の乳化が進行するが、界面を従来法よりも多く形成することとなり、そうした界面に脂質が配列して脂質単膜を形成する。特に上記の強撹拌条件下では、ミセルが均一で小さいものが多数生成する。
【００６３】
結局、エタノールなどが存在してもしなくとも、超臨界二酸化炭素の乳化が起きて脂質ミセルが形成される点では同じであるが、強撹拌を行なう本発明の方法では、均一な微小ミセルが効率的に形成されるため、その後の二酸化炭素の排出によって誘発される、脂質単膜から脂質二分子膜の形成の過程において、水溶性薬物の内包率は、例えば17％から21％へと高くなる。エタノールなどを用いる従来の超臨界二酸化炭素法では、主に１枚膜リポソームが形成されるのに対し、本発明の方法では、脂質量を増やしたので２枚膜から10枚膜までの多重膜リポソームを主体に形成される。このように、脂質量、撹拌条件および溶解助剤を変更することにより、内包率の向上と、生成したリポソームの形態が異なることが注目される。さらに驚くべきことにこのような多重膜リポソームにおいては、整粒工程で再び内包率の上昇が観察され、膜の再配列が起きていることが示唆される。
【００６４】
本発明の製造方法で使用する超臨界状態（亜臨界状態を含む）の二酸化炭素の温度は、一般には32〜70℃に設定されるが、好ましくは40〜65℃、より好ましくは45〜60℃である
。また、超臨界状態の二酸化炭素の好適な圧力は、上記温度範囲から適宜選択されるが、5〜50 MPa、好ましくは10〜30 MPaである。本発明においては、亜臨界状態を含めて超臨
界状態とする。
【００６５】
本発明では、このように体温に近い温度で二酸化炭素を超臨界状態として、転移温度を有するリン脂質を含むリン脂質類からリポソームを形成しているため、リポソームの形成温度と、製剤として投与された後にリポソームが生体内で受ける温度（体温）とが略等しい。したがって、本発明のリポソーム製剤が生体内に投与された後に、生体内においてリポソームが体温で加温されても、かかる温度はリポソームが形成した際の温度と略等しいことから、リン脂質の配列が温度による影響をほとんど受けることがなく、リポソームの生体内での安定性が向上すると考えられる。
【００６６】
このような効果は、超臨界状態の二酸化炭素の温度を、転移温度を有するリン脂質に対し、転移温度〜「該転移温度＋10℃」、好ましくは転移温度〜「該転移温度＋5℃」とな
るように設定することにより、さらに顕著となる。従来は、リン脂質の転移温度よりも高い温度に加温すると、転移温度を有するリン脂質は液晶状態となって流動性が高まり、リン脂質が超臨界二酸化炭素と効率良く混合されるとして、リポソームの調製が50〜80℃で行われていた。しかし本発明者らは、超臨界状態の二酸化炭素の温度を、上記のようにリン脂質の転移温度付近であっても、リン脂質に過度の熱がかからないため変性することがなく、さらにリン脂質が規則的に配列してリポソーム膜が生成されることを見出した。乳化促進のために強撹拌の操作を行なう状況下では、局所的過熱を軽減する意味からも上記の温度範囲を採用することが望ましい。
・第３工程（iii）
第３工程では、リポソーム膜構成成分と、超臨界二酸化炭素と、薬物水溶液とを充分に混合した後に、系内に必要であれば水を加えて、圧力容器内を減圧する。この混合溶液から二酸化炭素を排出することにより、ヨウド系化合物などが内包されたリポソームの水性分散液を調製する。この過程でリポソームは水相に転相していると推定されるため、二酸化炭素を排出するだけで、ヨウド系化合物などを内包するリポソームが分散している水性分散液が生成する。リポソーム内部にも上記水溶液が封入されているため、造影物質はリポソームの外部水相のほか、リポソーム内部の水相に存在し、いわゆる「内包」の状態にある。造影剤を製造する場合、該リポソームの内部以外の水相に水溶性薬物が含まれていてもよい。
・第４工程（iv）
リポソームの粒径の調整は、処方またはプロセス条件を変更することにより行なうことができる。例えば、上記の超臨界状態の圧力を大きくすると形成されるリポソームの粒径は小さくなる。作製するリポソームの粒径分布をより狭い範囲に揃えるには、ポリカーボネート膜、セルロース系の膜などで濾過してもよい。したがって第４工程では、圧力容器内を空気などの導入により大気圧に調整し、第３工程により得られたリポソームの水性分散液を、0.1〜1.0μm、最終的には0.1〜0.45μmの孔径を有する濾過膜を通す。例えば濾
過膜として0.6〜1μmの孔径のフィルターを装着した静圧式押出し装置に通すことにより
行われる。具体的には、各種の静圧式押出し装置、例えば「エクストルーダ」（商品名、日油リポソーム製）、「リポナイザー」（商品名、野村マイクロサイエンス製）などを使用して、フィルターを強制的に通過させる。エクストルーダに通すことにより、平均粒径として0.8μmのリポソームを効率よく調製することができる。さらに小さい平均粒径に揃えるには、0.45μmなどのフィルターでろ過する。このような操作は、必要であれば繰り
返し実施される。この押出し濾過法については、例えばBiochim. Biophys.Acta 557巻,9
ページ(1979)に記載されている。このような「押出し」操作を取り入れることにより、上記サイジングに加えて、リポソーム外に存在する水溶性ヨウド系化合物の濃度の調整、リポソーム分散液の交換、望ましくない物質の除去も併せて可能になるという利点もある。なお、上記孔径の濾過膜で濾過する前に、1.0〜2.0μｍ程度の濾過膜で濾過し、サイジン
グや、望ましくない物質の除去を予備的に行ってもよい。
・第５工程（v）
本工程は、得られたリポソーム含有濾液をさらに限外濾過により濃縮する工程である。リポソームの水性分散液を上記のように濾過膜で濾過し、必要に応じて限外濾過、遠心分離、ゲル濾過などの方法により、リポソーム内に未保持の薬物を除去して精製してもよい。また所定の濃度となるように限外濾過法により濃縮し、さらに通常使用される希釈剤等の製剤補助剤を適宜混合してもよい。また、本発明のリポソーム含有Ｘ線造影剤は、常法にしたがって、リポソームの水性分散液から、リポソームを凍結乾燥させて得ることもできる。リポソームを凍結乾燥した場合には、使用直前に水性媒体などで再懸濁させて用いる。
【００６７】
本発明のＸ線造影剤に含有されるリポソームは、実質的に２枚膜〜10枚膜、好ましくは２枚膜〜数枚膜（例えば３枚、４枚、５枚または６枚の膜）からなるリポソームである。このようなリポソームは、上記工程（i）〜（v）による製造方法において主成分として生成する。「実質的に」とは、本発明のＸ線造影剤において、２枚から１０枚の膜で構成されるリポソームを、造影剤中に含まれる全リポソームのうち、少なくとも70％、好ましくは80％を占めることを意味し、80〜98％含むことがより好ましい。
【００６８】
これに対して１枚膜のリポソームは、リン脂質二重層が一層としてなる膜（unilamellar vesicle）で構成されるリポソームである。これは凍結かつ断（Freeze fracture ）レ
プリカ法による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による観察において、レプリカが概ね1つの
層として認められるリン脂質二重層により構成されているものである。すなわち、観察したカーボン膜に残された粒子の跡について段差がないものが１枚膜と判定され、２つ以上の段差が認められるものは「多重層膜」と判定される。２枚もしくは３枚の膜で構成されるリポソームは、１枚膜リポソームより強度が増しており、整粒工程でも壊れない。
【００６９】
１枚膜リポソームは、脂質膜成分の溶媒として超臨界二酸化炭素を使用し、水による相分離方式により生成することが知られ、特にエタノールを溶解助剤として用いると、効率よく作製できる。これに対して従来のBangham法や逆相蒸発法（REV法）などによるリポソーム作製方法によると、様々なサイズ、形態の多重層膜（multilamellar vesicles; ＭＬＶ）からなるリポソームがかなりの割合で存在することが多い。１枚膜または数枚膜のリポソームは、ＭＬＶと比較して、リポソームの投与量、換言すると投与脂質量が大きくならないという利点もある。
【００７０】
リポソーム膜の脂質膜枚数が少ない数枚膜のリポソーム、特に粒径の大きい１枚膜リポソームであるＬＵＶ（Large unilamellar veislcles）は、多重層膜リポソームに比べて
、大きい封入容量を提供するという利点がある。反面、水溶性ヨウド系化合物の内包率が良好な１枚膜または数枚膜のリポソームでも、内包する化合物の重量が相対的に多過ぎるとリポソームの安定性は低下する。特にイオン強度の急激な変化には脆弱である傾向が観察されていた。本発明の造影剤に使用するリポソームの作製では、２枚膜〜10枚膜構造のリポソーム、好ましくは２枚膜〜数枚膜（例えば３枚、４枚、５枚または６枚の膜）のリポソームが効率よく形成されるように超臨界二酸化炭素法およびその後の整粒工程を改良している。さらにリポソーム膜にポリアルキレンオキシド基を有する化合物（例えばリン脂質）、ステロール類、グリコールなどを含有させて、脂質膜の安定化を図っている。その結果、作製されたリポソームは、塩ショックに対しても安定的であることが判明した。Ｘ線造影剤の製造
本発明のＸ線造影剤は、上記リポソームおよび１種類以上の生理的に許容され得る製剤助剤を使用して、当業界において公知の技術により製造することができる。本発明の製剤は、リポソームの脂質膜内部の水相およびリポソームを分散させる水性媒体中に製剤助剤を含有している。この製剤助剤は、リポソームの製剤化に際し、水溶性ヨウド系化合物な
どとともに添加される物質であり、これまでの造影剤製造技術に基づいて各種の物質が必要に応じて使用される。具体的には生理的に許容される各種の緩衝剤、ＥＤＴＡNa2−Ca
、ＥＤＴＡNa2などのエデト酸系のキレート化剤、無機塩類、薬理的活性物質（例えば血
管拡張剤、凝固抑制剤など）、さらには浸透圧調節剤、安定化剤、抗酸化剤（例えばα‐トコフェロール、アスコルビン酸）、粘度調節剤、保存剤なども挙げられる。ｐＨ緩衝剤として、水溶性アミン系緩衝剤および炭酸塩系緩衝剤が好ましく用いられる。特に好ましくはアミン系緩衝剤であり、中でもトロメタモールが望ましい。キレート化剤は好ましくは、ＥＤＴＡNa2−Ca（エデト酸カルシウム２ナトリウム）である。好ましくは、アミン
系緩衝剤およびキレート化剤をともに含めるのがよい。
【００７１】
上記の「水性媒体」とは、水溶性非イオン型ヨウド系化合物、製剤助剤などを溶解もしくは懸濁する水をベースとする溶媒である。その水は、滅菌した発熱物質を含まない水を使用する。リポソーム脂質膜内部の水相以外の水溶液（すなわち該リポソームを分散させる水性媒体）にも上記の製剤助剤が含まれている場合の好ましい態様として、脂質膜内外の水相に製剤助剤がそれぞれ実質的に同一の濃度で含有されている。そうした場合には、該膜内外で著しい浸透圧差が生じることはなく、リポソームの構造安定性が保たれる。貯蔵期間中でもなどを内包したリポソームの浸透圧効果による不安定化を防止でき、リポソーム内における水溶性ヨウド系化合物の保持安定性は向上する。
【００７２】
非イオン型ヨウド系化合物を造影物質とする造影剤のカチオン（すなわちナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウム）濃度が正常血漿イオン濃度の範囲内にないか、またはかけ離れていることが、好ましくない副作用、例えば筋肉の収縮性に対する影響、赤血球の凝集または心収縮力の低下などをもたらすことが示された。さらにリポソーム化造影剤の場合には、イオン、特にカチオンの種類と組成が、リポソームの内包率およびリポソームの安定性、凝集性にも影響を及ぼすことが本発明者らの研究により明らかとなった。
【００７３】
本発明のＸ線造影剤は、カチオン、好ましくは４種の血漿カチオン、ナトリウム、カルシウム、カリウムおよびマグネシウムを、安全性の点から問題のないイオン濃度とするとともに、リポソームの内包率および安定性が向上する組成で含有している。
【００７４】
通常、ナトリウム対カルシウムの比は、血漿中のその比より上でなければならない。またカルシウムの添加は、心収縮力の望ましくない増大を避け、また不整脈の起こる可能性を回避するためにも、比較的少量でなければならない。このためナトリウムイオン濃度とカルシウムイオン濃度との比（[Ｎａ+]／[Ｃａ2+]）は、55より大きく、好ましくは60よ
り大きく、より好ましくは８０以上、特に100〜250である。
【００７５】
本発明のＸ線造影剤は、さらにカリウムイオンおよびマグネシウムイオンも含んでもよい。比較的少量のカリウムおよび／またはマグネシウムの包含によって、不整脈（心房細動）の発生を一層低下させることができるためである。ナトリウムイオン対カリウムイオンの濃度比（[Ｎａ+]／[K+]）は、好ましくは15より大きく、さらに好ましくは20より大
きく、とりわけ30より大きく、例えば25〜80である。カルシウムおよびマグネシウム塩を含有する場合には、カルシウムイオン対マグネシウムイオンの濃度比（ [Ｃａ2+]／[Mg2+]）は、少なくとも約1.4、好ましくは少なくとも約1.5、より好ましくは少なくとも正常
血漿の比（約2.9）であるか、またはいくらか高く、例えば３〜８である。
【００７６】
本発明のＸ線造影剤では、ナトリウムイオン、カルシウムイオンおよびカリウムイオンの量の間に成立する関係として、好ましくは下記の条件に設定される。
ナトリウムイオン、カルシウムイオンおよびカリウムイオンの量が、下記式：
[Ｎａ+]＋120・[Ｃａ2+]＋50・ [Ｋ+]≦130
（ただし、ナトリウムイオン量が20〜70mM、カルシウムイオン量が0.1〜0.6 mMおよびカ
リウムイオン量が0.4〜0.9 mMである。）を満たすことが望ましい。ナトリウムイオン、
カルシウムイオンおよびカリウムイオンの量が上式を満たす造影剤では、リポソームの内包率が高くなり、しかも凝集性が小さく凝集物の発生は見られない傾向にある。
【００７７】
ナトリウム、カルシウム、カリウムおよびマグネシウムイオンは、生理的に許容される対イオンとの塩の形態で本発明の造影剤中に組み入れることができる。特に適している対イオンは、血漿アニオン、例えば塩化物、リン酸塩および炭酸水素イオンを包含する。
【００７８】
本発明のＸ線造影剤のように水溶性ヨウド系化合物などの薬物をリポソームというマイクロキャリヤーに封入する場合、水溶性ヨウド系化合物の封入効率および内包安定性に加えてリポソームの膜脂質の重量も考慮されねばならない。リポソームの膜脂質の重量が多くなると製剤の粘度が大きくなる。リポソーム内への薬物の封入量として、リポソーム内に封入された水溶液中に、全薬物（非イオン型ヨウド系化合物および製剤助剤を含む）がリポソーム膜脂質に対して、1〜7、好ましくは3〜7、より好ましくは5〜7の重量比（g/g
）で含有されていることが望ましい。
【００７９】
リポソーム内に内包された全薬物の重量比が１未満であると、造影物質の送達効率が悪くなり、造影能の低下も避けられない。造影物質を数枚膜のリポソームに高い内包率で封入した本発明の造影剤は、リポソームの安定性を確保するとともに、内包容積および送達効率にも優れるため、造影能の向上には有利である。反対に、リポソーム膜脂質に対する全薬物の封入重量比が７を超えると、リポソームは構造的にも不安定となり、リポソーム膜外への薬物の拡散、漏出は、貯蔵中または生体内に注入された後でも避けられない。またリポソーム懸濁薬剤が製造され、分離した直後は100％の封入が達成されても、浸透圧
効果による不安定化に基づき、早くも短時間に封入成分が減少していくことが記載されている（特表平9−505821号公報）。
【００８０】
Ｘ線造影剤
本発明のＸ線造影剤の濃度は、撮像の目的、部位、造影剤中の化合物の性質、および患者の状態に依存し、必要に応じて調節することができる。またＸ線造影剤の至適投与量は上記条件を勘案して個々に設定するのが通例である。このためリポソーム内外のヨウド系化合物の総量が、従来の投与量と同程度になるようにしてもよい。余りに高濃度の溶液とすると、リポソーム同士の凝集、粘度の増大という不都合な事態も起こり得る。本発明のＸ線造影剤は、ヨウド含有量として、通常、想定される10〜300mLの製剤溶液の投与量で
は、40〜450mgI／mLであり、好ましくは70〜400mgI／mL、リポソーム内への造影物質を内包する効率の観点からは 100〜350mgI／mL、特に好ましくは、150〜300mgI／mLの範囲で
ある。また、前記脂質膜内外の水相に、ヨウド系化合物および製剤助剤がそれぞれ実質的に同一の濃度で含有されることが好ましい。
【００８１】
本発明のＸ線造影剤における全脂質濃度は、20〜200 mg／mL造影剤、好ましくは60〜150 mg／mL造影剤、より好ましくは60〜100mg／mL造影剤の濃度で含むことを特徴としてい
る。この場合の「全脂質」とは、リポソームを構成するリン脂質、ステロール、グリコールといったすべての種類の脂質類を含める意味である。そうした全脂質は、造影剤に含まれるリポソームの量と概ね見なしてもよい。リポソームの形態には種々あるために、全脂質量は単純にリポソームの数には対応しない。
【００８２】
本発明のＸ線造影剤は、全身投与または局所投与いずれにも使用される。好ましくは注射剤または点滴注入剤として全身的に静注投与される。直接投与ができない部位へ局所的に投与する場合は、例えばカテーテルまたは他の適当な薬物送達システムなどを用いて、当業界で公知の技術により投与を行うことができる。
【００８３】
比較的高濃度のＸ線造影剤を大量に短時間で投与する必要がある場合に、このようなボーラス注入を可能とする要件は、Ｘ線造影剤の流動性と低い粘度である。注入抵抗を少なくして患者の苦痛を軽減し、血管外漏出の危険を回避するため、本発明のリポソーム分散液の粘度（オストワルド法で測定した場合）は、37℃で、30 mPa・ｓ以下、好ましくは25
ｍＰa・ｓ以下、より好ましくは20ｍＰa・ｓ以下である。このような範囲内では実用上
、特に問題ないとされる（特許文献１）が、必要に応じて投与時に注射用水などを使用し、所定の粘度になるよう希釈して用いることができる。
またＸ線造影剤の浸透圧モル濃度は、典型的には250〜500 mosmol/L、好ましくは290〜350 mosmol/Lである。投与する造影剤のオスモル濃度が高いと、心臓・循環系の負担が大きい。血液と等張の溶液または懸濁液を得るには、等張液を提供する濃度で、造影剤を媒質中に溶解もしくは懸濁させる。例えば造影物質の溶解性が低いために造影物質だけでは等張液を提供できない場合、等張の溶液もしくは懸濁液が形成されるように他の非毒性の水溶性物質、例えば塩化ナトリウムのごとき塩類、マンニトール、グルコース、ショ糖、ソルビトールなどの糖類を媒質中に添加してもよい。
【００８４】
上記溶液もしくは懸濁液の好ましいｐＨ範囲は、室温で6.5〜8.5、さらに好ましくは6.8〜7.8である。造影物質が多ヒドロキシル基を有する水溶性ヨウド系化合物である場合、好ましい緩衝液は、米国特許第4278654号に記載されているような負の温度係数を有する
緩衝液である。アミン系緩衝液はこのような要求を満たす性質を有しており、特に好ましくはトリス（TRIS）である。このタイプの緩衝液は、オートクレーブ温度で低いｐＨを有し、このことがオートクレーブ中のＸ線造影剤の安定性を増し、他方、室温では生理的に許容されるｐＨに戻る。本発明の製剤は、好ましくは滅菌した状態にて上市されるが、その滅菌は、滅菌ろ過、オートクレーブ滅菌、または加熱滅菌などにより行なわれる。例えば注射用無菌造影剤を製造するために、リポソーム調製物をオートクレーブ滅菌できることは極めて便利であり、貯蔵安定性なども確保できる。しかしオートクレーブ滅菌を適用できないリポソームには、濾過滅菌を行なうのがよい。
［発明の効果］
本発明のＸ線造影剤は、造影物質として水溶性非電解質である非イオン型ヨウド系化合物をマイクロキャリヤーであるリポソームに効率よく、かつ安定的に担持させることによってターゲティング性を付与し、さらに造影性能を高めている。
【００８５】
ポリエチレングリコール基を有する脂質、転移温度を有するリン脂質を含む脂質を用いるとともに、用量を多くした脂質を強撹拌下で超臨界二酸化炭素と混合することにより、数枚膜リポソームが多く形成される。これに封入されるヨウド系化合物の内包率は高く、しかも安定的に内包される。
【００８６】
本発明のＸ線造影剤は、有機溶媒を全く使用せずに製造されるため、従来のＸ線造影剤に比べて毒性、副作用がはるかに軽減されており、その投与を受ける患者の負担は少ない。
【実施例】
【００８７】
本発明を以下の実施例によって、より具体的に説明する。しかし、実施例は、実例を挙げて説明しようとするものであり、本発明の範囲を何ら限定しようとする意図のものではない。
[実施例１] 
造影剤の作成
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）552.6mgと、コレステロール221.1mg、ＰＥＧ基を有するリン脂質（日本油脂株式会社製、SUNBRIGHT DSPE-020CN）167.3mgの混合
物をステンレス製の特製オートクレーブに仕込み、オートクレーブ内を50℃に加熱し、次
いで液体二酸化炭素13gを加えた。撹拌を行いながら、5.0 MPaであったオートクレーブ内の圧力を、オートクレーブ内の体積を減ずることにより、12 MPaにまで上げて、二酸化炭素を超臨界状態にした。1400rpmで強撹拌しながら、さらに造影剤溶液（イオヘキソール
溶液517.7mg/mL（ヨウド含有量240mg/mL）、トロメタモールを1mg/mL、エデト酸カルシウム２ナトリウム（ＥＤＴＡNa2−Ca）0.1mg/mLを含有し、適量の塩酸および水酸化ナトリ
ウムでｐＨを７前後に調整）13mLを定量ポンプで連続的に注入した。注入終了後、系内を減圧して二酸化炭素を排出し、造影剤溶液を含有するリポソームの分散液を得た。この試料を80℃まで加熱し、アドバンテック社製のポリカーボネート・フィルター、0.80μmで
加圧濾過した。続いて、同様に80℃まで加熱し、アドバンテック社製のポリカーボネート・フィルター、0.40μmで加圧濾過し、オートクレーブで121℃、圧力0.21 MPaで15分間処理して、リポソーム含有造影剤を得た。
[比較例１]
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）552.6mgと、コレステロール221.1mg、ＰＥＧ基を有する脂質（日本油脂株式会社製、SUNBRIGHT DSPE-020CN）167.3mgの混合物を
クロロホルムとエタノールと水との混合物（重量比 100：20：0.1）13mLをメスフラスコ
中で混合した。この混合物を湯浴（50℃）上で加熱し、溶液をロータリーエバポレータで溶媒を蒸発させた。残渣をさらに２時間、真空乾燥して、脂質フィルムを形成させた。ここに、さらに上記造影剤溶液13mLを混合し、この混合物を50℃に加熱しながらミキサーで約10分間撹拌した。さらに撹拌することにより造影剤溶液を含有するリポソームの分散液を得た。この混合物を60℃まで加熱し、アドバンテック社製のポリカーボネート・フィルター、0.80μmおよび0.40μmで加圧濾過してリポソーム含有造影剤を得た。
【００８８】
[実施例２〜６、比較例２〜４]
リポソームに内包させる造影剤種および濃度、造影剤中の脂質含有量を表1に記載のよ
うに変更すること以外は、実施例1と同様にして、実施例２〜６、比較例３および４のリ
ポソーム含有造影剤を得た。比較例１と同様にして比較例２の造影剤を得た。
[評価]
＜ヨウド系化合物の内包化率＞
試料（リポソーム分散液）を等張の食塩水で透析し、透析終了後にエタノールを添加してリポソームを破壊して、吸光度の測定によりリポソーム内のヨウド化合物量を求めた。
【００８９】
【表１】
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【００９０】
表１からも分かるように、本発明により、高い内包化率であり、かつ実用上問題のない粘度のリポソーム含有造影剤を作成することができた。