(57)【要約】【課題】  破骨細胞分化抑制因子の産生を促進することができる成分であって、入手容易でかつ製剤の使用形態に制限を与えない成分を有効成分として含有する破骨細胞分化抑制因子の産生促進剤を提供する。【解決手段】  ケルセチンを有効成分として含有する破骨細胞分化抑制因子産生促進剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケルセチンを有効成分として含有する破骨細胞分化抑制因子産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケルセチンを有効成分として含有する破骨細胞分化抑制因子（Osteoclastogenesis inhibitory factor：ＯＣＩＦ。別名Osteoprotegrin: ＯＰＧともいう。）の産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は常に形成と吸収を繰り返している組織であり、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収との代謝バランスが保たれることにより良好な状態が維持される。しかしながら、代謝バランスが崩れ、破骨細胞が過剰に生成されると、骨粗鬆症、骨パジェット病、慢性関節リウマチなどの骨吸収性疾患の発症につながる。これらの疾病を治療又は予防するためには、破骨細胞の分化・活性化を抑制することが有効である。
【０００３】
破骨細胞の分化・活性化を抑制する方法としては、ビスフォスフォネートを使用し波状縁を消失あるいはアポトーシスを促進することにより抑制する方法や、カルシトニンを使用し受容体を介して抑制する方法などがよく知られているが、現在においても破骨細胞の分化・活性化を抑制することについて、様々な角度からさかんに研究が進められている。
【０００４】
そのような中、破骨細胞分化抑制因子の産生を促進することにより破骨細胞の分化を抑制するとの報告がなされた（例えば、特許文献１参照）。破骨細胞分化抑制因子の産生による破骨細胞の分化抑制は、広い活性スペクトルを持つことから、破骨細胞の分化・活性化を抑制する方法としては好ましいものと思われる。しかし、この文献に記載の破骨細胞分化抑制因子の産生促進剤は、乳由来塩基性タンパク質を有効成分として用いており、このタンパク質は熱や酸に弱いことから使用形態に制限がある。
【０００５】
一方、ケルセチンは、たまねぎ等が有する黄色い色素であり、フラボノイドの一種である。このケルセチンに、破骨細胞の分化を抑制する作用があることは知られている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、ここでは破骨細胞のマーカーであるＴＲＡＰ活性の破骨細胞分化因子（Osteoclast differentiation factor:ＯＤＦ。別名ＲＡＮＫＬともいう。）による上昇が阻害されることが示されているだけであり、破骨細胞分化抑制因子については何ら記載されていない。
【０００６】
また、ケルセチンに、多剤耐性抑制作用、アミラーゼ阻害作用、紫外線防護作用等があることは知られているが（例えば、特許文献２〜４参照）、破骨細胞分化抑制因子の産生促進活性があることは知られていなかった。
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−１１５５０９号公報
【特許文献２】特開平５−７０３４８号公報
【特許文献３】特開平５−２３６９１０号公報
【特許文献４】特開平６−８８０６３号公報
【非特許文献１】禹済泰、外２名、「ケルセチンによる破骨細胞の分化および機能抑制」、生物機能開発研究所紀要  第４号、中部大学生物機能開発研究所、２００４年３月３１日、ｐ．１１−１４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記観点からなされたものであり、破骨細胞の分化を抑制するため、破骨細胞分化抑制因子の産生を促進することができる破骨細胞分化抑制因子の産生促進剤を提供す
ることを課題とする。
【０００９】
より詳しくは、破骨細胞分化抑制因子の産生を促進することができる成分であって、入手容易でかつ製剤の使用形態に制限を与えない成分を有効成分として含有する破骨細胞分化抑制因子の産生促進剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために破骨細胞分化抑制因子の産生を促進させることができる成分を探索した結果、ケルセチンに破骨細胞分化抑制因子の産生促進活性があることを見出し、発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、ケルセチンを有効成分として含有する破骨細胞分化抑制因子産生促進剤を提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、破骨細胞分化抑制因子の産生を促進する活性を有するケルセチンの、破骨細胞分化抑制因子が産生されることにより治療可能な各種疾患に対する治療剤の製造における使用、及び、破骨細胞分化抑制因子の産生を促進する活性を有するケルセチンの治療的に有効な量を、破骨細胞分化抑制因子の産生が促進されることが必要な患者に投与することを含む、破骨細胞分化抑制因子が産生されることにより治療可能な各種疾患に対する治療方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の破骨細胞分化抑制因子産生促進剤を適用することにより、破骨細胞分化抑制因子の産生が促進され、破骨細胞の分化が抑制されるため、骨粗鬆症、骨パジェット病、慢性関節リウマチなどの骨吸収性疾患に対し、有効に治療及び予防をすることができる。
【００１４】
また、本発明の破骨細胞分化抑制因子産生促進剤は、上記のような一般の骨吸収性疾患に対してだけでなく、一般の骨吸収性疾患を除く、癌性高カルシウム血症、悪性腫瘍骨転移の抑制、癌に伴う骨痛などの癌に伴う骨病変に対しても有効な治療剤として使用することができる。
【００１５】
また、上記以外の疾患に対しても、破骨細胞分化抑制因子の産生を促進することにより治療可能な疾患に対し、本発明の破骨細胞分化抑制因子産生促進剤は効果的かつ患者に安心して適用できる治療剤として使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明の破骨細胞分化抑制因子産生促進剤は、ケルセチンを有効成分として含有する。
【００１８】
ケルセチンは、フラボノイドのうち、フラボノールに分類されるポリフェノール化合物で、タマネギ、ホウレン草、ケール、パセリなどに多く含まれている。
【００１９】
ケルセチンを得る技術は確立されているので、通常行われている方法をもとにケルセチンを得ることができる。また、市販のものを用いてもよい。
【００２０】
本発明の破骨細胞分化抑制因子産生促進剤においては、ケルセチンを単独で用いてもよいし、医薬用として通常用いられている他の任意成分を含有させてもよい。
【００２１】
本発明の破骨細胞分化抑制因子産生促進剤（破骨細胞分化抑制因子産生促進剤含有医薬
組成物の形態も含む）の剤型は、特に限定されないが、一般に製剤上許容される１または２種類以上の担体、賦形剤、統合剤、防腐剤、安定剤、香味剤等と共に混合して、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、水薬、ドリンク剤等の内服剤型とすることが好ましい。このような製剤化は、通常、医薬の製造に用いられる方法に従って製剤化することができる。
【００２２】
本発明の破骨細胞分化抑制因子産生促進剤（破骨細胞分化抑制因子産生促進剤含有医薬組成物の形態も含む）の投与量としては、疾患の種類、症状、患者の年齢、体重等により異なるが、成人１日当たり、ケルセチンが０．５〜５００ｍｇ摂取できるような量の破骨細胞分化抑制因子産生促進剤を投与するのが好ましい。
【００２３】
上記のようにして得られた本発明の破骨細胞分化抑制因子産生促進剤は、骨粗鬆症、骨パジェット病、慢性関節リウマチなどの骨吸収性疾患に対し、有効な治療剤及び予防剤となる。また、本発明の破骨細胞分化抑制因子産生促進剤は、一般の骨吸収性疾患を除く、癌性高カルシウム血症、悪性腫瘍骨転移の抑制、癌に伴う骨痛などの癌に伴う骨病変に対しても、有効な治療剤となる。さらにまた、上記以外の疾患に対しても、破骨細胞分化抑制因子の産生を促進することにより治療可能な疾患に対し、有効な治療剤となる。
【００２４】
また、本発明の破骨細胞分化抑制因子産生促進剤を飲食品用として通常用いられている他の任意成分に添加して破骨細胞分化抑制因子産生促進剤含有飲食品を得てもよい。
【００２５】
本発明の破骨細胞分化抑制因子産生促進剤含有飲食品の種類や形態としては、上記の破骨細胞分化抑制因子産生促進活性作用が期待できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、日本茶、ジュース、ゼリー、ビスケット、タブレットなどに適用することができる。種々の飲食品原料に、ケルセチンを所要量配合させることができる。また、ケルセチンをそのままカプセルに充填してサプリメント剤とすることもできる。ケルセチンを配合する際に特に留意することはなく、通常の製造方法により加工製造することができる。配合量は、飲食品の種類により異なるが、味を損なわず、且つ十分な破骨細胞分化抑制因子産生促進活性効果を得るためには、飲食品全量に対して、ケルセチンを０．５ｍｇ〜１００ｇ／１００ｇの割合で配合させるのが好ましい。
【００２６】
本発明の破骨細胞分化抑制因子産生促進剤を含有する飲食品は、健康食品等を含む各種機能性食品に適用されることができ、特に飲食品の最終商品形態に対し、破骨細胞分化抑制因子の産生を促進するために用いられる旨の表示を付してもよい。
【実施例１】
【００２７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
＜方法＞
【００２８】
マウス骨芽細胞様細胞株  ＳＴ−２細胞（理研細胞バンク）およびマウス頭蓋冠より抽出し培養した初代培養系骨芽細胞  Primary osteoblast 細胞（POB）を、破骨細胞分化促進ホルモンであるデキサメタゾン（Sigma）および活性型ビタミンＤ３（Sigma）をそれぞれ１０ｎＭ、ならびにケルセチン（Sigma）５μＭまたは１０μＭを含むα−ＭＥＭ 培地で（Sigma）培養した（３７℃）。培養２４時間後、細胞よりTRI-Reagent （Invitrogen）を用いて全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡ（２．５μｇ）は、DNase I（Invitrogen）処理後、oligo dT プライマー（Invitrogen）、1st Strand Buffer（Invitrogen）、2.5mM dNTP、（Invitrogen）0.1M DTT（Invitrogen）、逆転写酵素（M-MLV-RT）（Invitrogen）を含む反応溶液で４２℃１時間、さらに９５℃で２分間反応させてｃＤＮＡを合成した。
【００２９】
合成したｃＤＮＡを用いて破骨細胞分化抑制因子遺伝子の発現についてＰＣＲ法により検討を行った。コントロールとして、ほぼ全ての細胞中に存在し、発現量が一定であるβ
-アクチンを用いた。以下に、使用したプライマーの配列を示す。ＰＣＲは、ｉ）９５℃
１分、ｉｉ）９５℃  １分、５８℃  １分、７２℃  ２分、を３０サイクル、ｉｉｉ）７２℃  ５分で行った。
【００３０】
ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル（（株）ニッポンジーン）で電気泳動し、エチジウムブロマイド（片山化学工業（株））染色により検出した。
得られたバンドを画像解析ソフト（NIH image:米国National Institute of Health 製）を用いて解析し、色の濃度を定量化してβ−アクチンの測定値を基準に相対値化した。
【００３１】
１）ＯＣＩＦ：センスプライマー（配列番号１）
aggaccacaatgaacaagtggctg
２）ＯＣＩＦ：アンチセンスプライマー（配列番号２）
gtctcacctgagaagaacccatc
３）β-アクチン：センスプライマー（配列番号３）
catcgtgggccgctctaggcacca
４）β-アクチン：アンチセンスプライマー（配列番号４）
cggttggccttagggttcaggggg
【００３２】
尚、前記培養に用いた培地が、デキサメタゾンおよび活性型ビタミンＤ３を含まない場合、及びデキサメタゾンおよび活性型ビタミンＤ３を含みケルセチンを含まない場合についても、破骨細胞分化抑制因子遺伝子の発現について調べた。
【００３３】
各実施例、比較例、及び参考例の添加条件は、下記の表１に示すとおりである。
【００３４】
【表１】
2006117550.tif 000002
＜結果＞
【００３５】
破骨細胞分化抑制因子遺伝子の発現の結果を図１及び図２に示す
【００３６】
図１及び図２に示すように、用いたＳＴ−２及びＰＯＢの両細胞においてデキサメタゾンおよび活性型ビタミンＤ３添加により破骨細胞分化抑制因子ｍＲＮＡの発現量は著しく減少する（比較例１の結果参照）。しかし、デキサメタゾンおよび活性型ビタミンＤ３を添加した場合であっても、ケルセチン５μＭまたは１０μＭで処理すると、破骨細胞分化抑制因子ｍＲＮＡの発現量は参考例１のデキサメタゾンおよび活性型ビタミンＤ３非添加と同等のレベルを示す（実施例１及び２の結果参照）。
【００３７】
これにより、ケルセチンに破骨細胞分化抑制因子の産生促進作用があることが確認でき
た。よって、ケルセチンは破骨細胞分化抑制因子の産生促進剤の有効成分として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＳＴ−２細胞における破骨細胞分化抑制因子ｍＲＮＡの発現量の相対値を示すグラフである。
【図２】ＰＯＢ細胞における破骨細胞分化抑制因子ｍＲＮＡの発現量の相対値を示すグラフである。
【図１】
2006117550.tif 000003
【図２】
2006117550.tif 000004
【配列表】
2006117550000001.app