(57)【要約】【課題】  被検物質の高感度検出を可能とする。【解決手段】  被検物質として抗原又は抗体のうち一方を含む試料溶液と被検物質に特異的に結合する結合物質として抗原又は抗体のうち他方とを接触させた後、電極電位を変化させながら被検物質と結合物質との特異的結合により生じる電流変化を測定する。試料溶液に、固定化タンパク質を介して結合物質を担体表面に固定してなる結合物質固定化担体を添加し、被検物質と結合物質とを特異的に結合させた後、結合物質固定化担体を電極に接触させた状態で電流変化を測定する。結合物質を電極表面に固定してなる結合物質固定化電極と試料溶液とを接触させて被検物質と結合物質とを特異的に結合させた後、電流変化を測定する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質として抗原又は抗体のうち一方を含む試料溶液と前記被検物質に特異的に結合する結合物質として抗原又は抗体のうち他方とを接触させた後、電極電位を変化させながら前記被検物質と前記結合物質との特異的結合により生じる電流変化を測定することを特徴とする被検物質の検出方法。
【請求項２】
被検物質として核酸又は核酸結合タンパク質のうち一方を含む試料溶液と前記被検物質に特異的に結合する結合物質として核酸又は核酸結合タンパク質のうち他方とを接触させた後、電極電位を変化させながら前記被検物質と前記結合物質との特異的結合により生じる電流変化を測定することを特徴とする被検物質の検出方法。
【請求項３】
被検物質としてレクチン又は糖鎖のうち一方を含む試料溶液と前記被検物質に特異的に結合する結合物質としてレクチン又は糖鎖のうち他方とを接触させた後、電極電位を変化させながら前記被検物質と前記結合物質との特異的結合により生じる電流変化を測定することを特徴とする被検物質の検出方法。
【請求項４】
被検物質としてレセプター又はリガンドのうち一方を含む試料溶液と前記被検物質に特異的に結合する結合物質としてレセプター又はリガンドのうち他方とを接触させた後、電極電位を変化させながら前記被検物質と前記結合物質との特異的結合により生じる電流変化を測定することを特徴とする被検物質の検出方法。
【請求項５】
前記試料溶液に、固定化タンパク質を介して前記結合物質を担体表面に固定してなる結合物質固定化担体を添加し、前記被検物質と前記結合物質とを特異的に結合させた後、前記結合物質固定化担体を電極に接触させた状態で前記電流変化を測定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の被検物質の検出方法。
【請求項６】
前記固定化タンパク質がトリプトファン及び／又はチロシンを含むことを特徴とする請求項５記載の被検物質の検出方法。
【請求項７】
前記担体が磁性微粒子であることを特徴とする請求項５記載の被検物質の検出方法。
【請求項８】
前記結合物質を電極表面に固定してなる結合物質固定化電極と前記試料溶液とを接触させて前記被検物質と前記結合物質とを特異的に結合させた後、前記電流変化を測定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の被検物質の検出方法。
【請求項９】
前記被検物質がトリプトファン及び／又はチロシンを含むことを特徴とする請求項８記載の被検物質の検出方法。
【請求項１０】
前記被検物質がトリプトファン及びチロシンのいずれも含まない場合、前記結合物質固定化電極と前記試料溶液とを接触させる際にトリプトファン及び／又はチロシンを含むタンパク質で被検物質を修飾した競合物質を添加し、前記結合物質に前記競合物質と前記被検物質とを競合的に反応させることを特徴とする請求項８記載の被検物質の検出方法。
【請求項１１】
前記結合物質固定化電極は、前記結合物質が固定化タンパク質を介して前記電極表面に固定されたものであることを特徴とする請求項８記載の被検物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料溶液中の被検物質を検出する検出方法に関し、特に高感度検出が可能な検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
溶液中に含まれる微量のタンパク質やペプチド等を定量する方法としては、抗原と抗体との特異的な結合を利用するとともに、標識酵素による発光・発色の程度により抗原（被検物質）を定量する酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immunosorbent assay）法が知られている。ＥＬＩＳＡ法は、競合法と非競合法とに分けられ、例えば競合ＥＬＩＳＡ法は、測定対象抗原に特異的な抗体を担体表面に固定し、酵素で標識した測定対象抗原と同一の抗原及び測定対象抗原を抗体と反応させ、洗浄後、標識酵素の反応による発光の程度から測定対象抗原の濃度を測定する。非競合ＥＬＩＳＡ法では、先ず、測定対象抗原とこれに特異的な一次抗体とを反応させた後、酵素標識された二次抗体を反応させて、洗浄後、標識酵素の反応による発光の程度から測定対象抗原の濃度を測定する。ＥＬＩＳＡ法は例えばガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）や高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）等の分析法に比べ大規模な装置が不要で操作が簡便であり、しかも高感度である等の利点を持つことから、現在広く普及している。
【０００３】
これまでに様々なＥＬＩＳＡ法の改良法が開発されており、例えば電気化学的測定を利用したＥＬＩＳＡ法が提案されている。特許文献１においては、コリンエステラーゼを結合させた標識抗体を使用し、標識酵素反応生成物のチオコリンを貴金属電極表面に吸着、濃縮させ、吸着チオコリンの還元脱離に基づく電流値あるいはその積分値を測定することにより、反応したあるいは未反応の酵素標識抗体のコリンエステラーゼ活性を測定し、被験物質の量又は濃度を求める方法が開示されている。特許文献１によれば、コリンエステラーゼ酵素分解物であるチオコリンを貴金属電極に吸着、濃縮し、このチオコリンの電極における還元脱離により発生する電流信号を増幅して検出することにより、高感度な測定が可能とされる。
【特許文献１】特開２００４−２５７９９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ヒトゲノムの解析終了に伴い、細胞内で発現したタンパク質を網羅的に解析する、いわゆるプロテオーム解析に注目が集まり、世界中で活発な研究が行われている。プロテオーム解析においては、サンプル中の極微量のタンパク質を迅速かつ高感度に検出する技術が不可欠であり、従来のＥＬＩＳＡ法を超える高感度検出方法の開発が強く望まれている。また、臨床検査を実施するような医療分野、残留農薬や内分泌攪乱物質等の検出を行う環境分析分野等においても、さらなる検出感度の向上が望まれている。このような高感度が求められる状況にあっては、通常のＥＬＩＳＡ法はもちろん、例えば特許文献１等のＥＬＩＳＡ法での感度は不十分であり、さらなる改善が必要である。また、従来のＥＬＩＳＡ法では、特許文献１に示すように、被検物質（抗原）又は抗体をあらかじめ酵素標識しておく必要があり、実験作業が繁雑になるという問題もある。
【０００５】
そこで本発明はこのような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、被検物質を高感度に検出することが可能な被検物質の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らが長期にわたり検討を重ねた結果、例えば抗原抗体反応のような特異的結合を利用し、この結合の程度を電気化学的方法により測定することが、抗体の標識を必要とせず被検物質を高感度で検出するのに極めて有効であるとの結論を得るに至った。
【０００７】
本発明に係る被検物質の検出方法はこのような知見に基づいて完成されたものであり、被検物質として抗原又は抗体のうち一方を含む試料溶液と前記被検物質に特異的に結合する結合物質として抗原又は抗体のうち他方とを接触させた後、電極電位を変化させながら前記被検物質と前記結合物質との特異的結合により生じる電流変化を測定することを特徴とする。
【０００８】
また、本発明に係る被検物質の検出方法は、被検物質として核酸又は核酸結合タンパク質のうち一方を含む試料溶液と前記被検物質に特異的に結合する結合物質として核酸又は核酸結合タンパク質のうち他方とを接触させた後、電極電位を変化させながら前記被検物質と前記結合物質との特異的結合により生じる電流変化を測定することを特徴とする。
【０００９】
また、本発明に係る被検物質の検出方法は、被検物質としてレクチン又は糖鎖のうち一方を含む試料溶液と前記被検物質に特異的に結合する結合物質としてレクチン又は糖鎖のうち他方とを接触させた後、電極電位を変化させながら前記被検物質と前記結合物質との特異的結合により生じる電流変化を測定することを特徴とする。
【００１０】
また、本発明に係る被検物質の検出方法は、被検物質としてレセプター又はリガンドのうち一方を含む試料溶液と前記被検物質に特異的に結合する結合物質としてレセプター又はリガンドのうち他方とを接触させた後、電極電位を変化させながら前記被検物質と前記結合物質との特異的結合により生じる電流変化を測定することを特徴とする。
【００１１】
本発明の被検物質の検出方法は、先ず、被検物質に対する結合物質を試料溶液に添加し、これらを反応させて被検物質と結合物質との複合体を形成させる。被検物質と結合物質との組み合わせは、被検物質に応じて抗原−抗体、核酸−核酸結合タンパク質、レクチン−糖鎖、又はレセプター−リガンドから選択される。次に、電極電位を変化させながら電流変化を測定することによって、被検物質と結合物質との複合体の存在、すなわち被検物質の存在が電流値に反映されるため、試料溶液中の被検物質の高感度検出が実現される。
【００１２】
また、通常のＥＬＩＳＡ法では、検出用に被検物質（抗原）又は抗体の酵素標識が必要であり、実験操作が煩雑であるという問題がある。また、簡便な分析方法として知られている免疫クロマトグラフィー法においても、やはり検出用に金コロイドやポリスチレン粒子等による抗体の修飾が必要となる。これに対し本発明では、抗体等の結合物質を酵素標識したり金コロイドで修飾したりする必要がなく、ラベルフリーで高感度な測定が実現される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の被検物質の検出方法によれば、抗原−抗体間、核酸−核酸結合タンパク質間、レクチン−糖鎖間、又はレセプター−リガンド間の特異的な結合を利用するとともに、電極電位を変化させながら電流変化を測定することによって、結合物質の酵素標識や金コロイド修飾を利用することなく検出限界を大幅に低下させ、試料溶液中の極微量の被検物質を高感度に検出することができる。また、本発明の検出方法によれば、標識が不要で被検物質を迅速に検出可能である。さらに、本発明によれば、材料費が安価で、またサンプル量も少なくて済み、低コストな検出を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を適用した被検物質の検出方法について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１５】
本発明の被検物質の検出方法では、生体物質、合成物質等あらゆる物質を被検物質とすることができる。また、被検物質を含む試料溶液としては、例えば血液、血清、尿等の生体由来の試料溶液、自然環境から採取した水や土壌等を含む試料溶液、これらを調製して得た試料溶液等、任意のものを用いることができる。
【００１６】
結合物質は、被検物質を特異的に認識し、結合して複合体を形成可能な物質のことを指し、具体的には、被検物質−結合物質の関係が、抗原−抗体、核酸−核酸結合タンパク質、レクチン−糖鎖、又はレセプター−リガンドの組み合わせとなるように、被検物質に応じて適宜選択する。被検物質−結合物質の関係の順序は、前記と逆でもよい。例えば被検物質が抗原として機能する場合、結合物質として前記抗原に特異的に結合する抗体を選択する。被検物質が抗体である場合、被検物質として前記抗体と特異的に結合する抗原を選択する。
【００１７】
被検物質と結合物質との関係が抗原−抗体である場合、抗原としては、抗原として機能するものであれば特に問わないが、例えばタンパク質、糖タンパク質、アミノ酸、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質等の核酸結合タンパク質、レクチン、糖、糖鎖、レセプター、リガンドの生体物質等が挙げられる。また、抗体と抗原との特異的な結合を利用する場合、単独では免疫原性を持たない薬剤、農薬、内分泌攪乱物質等の低分子化合物等も抗原とすることができる。なお、核酸結合タンパク質とは、ＤＮＡ又はＲＮＡを特異的に認識して結合するタンパク質のことである。レクチンとは、糖鎖を特異的に認識して結合するタンパク質のことである。タンパク質とは、少数のアミノ酸が結合したペプチドも含む意味として用いる。
【００１８】
本発明の検出方法では、被検物質と結合物質とを特異的に結合させるとともに、電極電位を変化させながら特異的な結合により生じる電流変化を測定し、試料溶液中の被検物質を検出する。先ず、試料溶液に結合物質を添加することにより、被検物質と結合物質との複合体を形成させる。形成された複合体の量に応じて電極電位を変化させたときに測定される酸化電流が変わるため、この電流変化を指標として被検物質を検出する。電極電位を変化させながら電流変化を測定する方法としては、具体的には、矩形波ボルタンメトリー等のボルタンメトリーが挙げられる。
【００１９】
具体的な検出方法は、以下に説明するように２つの方法がある。第１の方法は、試料溶液に固定化タンパク質を介して結合物質を固定してなる結合物質固定化担体を添加し、被検物質と結合物質とを特異的に結合させ、その後結合物質固定化担体を電極に接触させた状態で電極電位を変化させながら電流を測定し、固定化タンパク質の電気化学的酸化による電流変化を検出するものである。第２の方法は、結合物質を固定した結合物質固定化電極と試料溶液とを接触させ、結合物質と被検物質とを特異的に結合させた後、被検物質の電気化学的酸化による電流変化を測定するものである。いずれの方法も、抗原−抗体間、核酸−核酸結合タンパク質間、レクチン−糖鎖間、又はレセプター−リガンド間の特異的結合により生じる電流変化を電極電位を変化させながら測定するものである。
【００２０】
最初に第１の方法について説明する。第１の方法では、先ず、測定物質に特異的に結合する結合物質を固定化タンパク質を介して担体表面に固定し、結合物質固定化担体を用意しておく。固定化タンパク質は、結合物質を担体表面へ固定化するためのタンパク質である。結合物質固定化担体を試料溶液に添加すること等により、結合物質に対し被検物質を結合させる。未反応の被検物質及び非特異的に吸着又は結合した被検物質等は、結合物質固定化担体から除去する。次に、結合物質固定化担体を含む溶液を電極表面に供給する等により結合物質固定化担体を電極表面に接触させ、この状態で電極電位を変化させながら電流変化を測定する。
【００２１】
固定化タンパク質としては、結合物質を担体表面に固定可能であるとともに、電気化学的に活性なアミノ酸であるトリプトファン及び／又はチロシンを含むタンパク質を用いることが好ましい。より具体的には、菌体より単離される１５９アミノ酸残基からなるストレプトアビジン等のアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ等が挙げられる。固定化タンパク質がアビジンの場合、ビオチン化した結合物質をアビジン固定化担体と接触させることにより、結合物質固定化担体を調製する。固定化タンパク質がプロテインＡ、プロテインＧの場合、プロテインＡ又はプロテインＧと抗体との特異的結合を利用して結合物質固定化担体を調製する。
【００２２】
担体としては、固定化タンパク質を表面に固定可能であれば特に限定されるものではなく、公知の担体を使用可能である。例えば担体としては、反応チューブに収容可能な略球状の微粒子担体、より具体的には磁性を持つ磁性微粒子を使用可能である。試料溶液を収容するチューブ等の容器の外側に磁石を配置し、磁力によって磁性微粒子を容器内壁面や底面等に吸着させることにより、未反応の被検物質及び結合物質に非特異的に吸着又は結合した被検物質の洗浄・除去を容易かつ確実に行うことができ、検出感度をさらに向上させることができる。また、例えば電極の裏面等に磁石を配置し、磁力によって磁性微粒子を確実且つ容易に電極表面に吸着・接触させることができる。
【００２３】
第１の方法では、試料溶液と結合物質との反応後の結合物質固定化担体を電極表面に接触させたとき、結合物質と被検物質の特異的結合、すなわち結合物質−被検物質複合体の存在によって固定化タンパク質と電極表面との接触が阻害される。この接触阻害により固定化タンパク質、特には固定化タンパク質中のトリプトファン及び／又はチロシンの電気化学的酸化が妨げられ、被検物質が結合していない場合に比べて電流値が低下するので、これを指標として試料溶液中の被検物質を検出できる。ピーク電流値及びピーク電流の現れる電極電位は、電極と固定化タンパク質との接触、タンパク質中のトリプトファン及び／又はチロシンの量（分子数）、タンパク質の構造、タンパク質の分子量等の影響を受けると考えられる。第１の方法では、試料溶液中の被検物質濃度が高くなるほど複合体形成量が増加し、ピーク電流値が低下するので、例えば既知濃度の被検物質を含むサンプルを用いて前記測定を行い、電流値との相関を求めて検量線を作成し、この検量線から換算することにより試料溶液中の被検物質の定量分析が可能となる。
【００２４】
なお、第１の方法では、固定化タンパク質が電気化学的に活性なトリプトファン及び／又はチロシンを含んでいればよく、被検物質としてはトリプトファン及び／又はチロシンの有無に関わらず、あらゆる物質を選択できる。
【００２５】
次に、第２の方法について説明する。第２の方法では、先ず、結合物質を電極表面に固定してなる結合物質固定化電極を用意しておく。次に、試料溶液に結合物質固定化電極を浸漬する等により結合物質固定化電極と試料溶液とを接触させ、結合物質と被検物質とを結合させて複合体を形成させる。次に、未反応の被検物質及び非特異的に吸着又は結合した被検物質等を洗浄・除去した後、電極電位を変化させながら電流変化を測定する。
【００２６】
第２の方法では、被検物質−結合物質複合体に含まれるトリプトファン及び／又はチロシンを電気化学的に酸化し、これにより生じる電流変化を測定する。被検物質の結合量、すなわちトリプトファン及び／又はチロシンの増加量（分子数）に応じて電極電位を変化させたときの電流値が上昇するので、これを指標として試料溶液中の被検物質を検出できる。つまり、第２の方法では、試料溶液中の被検物質濃度が高くなるほど、複合体に含まれるトリプトファン及び／又はチロシンの量（数）が増加し、ピーク電流値が上昇するので、例えば既知濃度の被検物質を含むサンプルを用いて前記測定を行い、電流値との相関を求めて検量線を作成しておき、この検量線から換算することにより試料溶液中の被検物質の定量分析が可能となる。
【００２７】
なお、第２の方法では、被検物質がトリプトファン及び／又はチロシンを含むことが好ましいが、被検物質がトリプトファン及び／又はチロシンを含まない場合であっても、トリプトファン及び／又はチロシンを含むタンパク質等を修飾した被検物質を用意し、いわゆる競合法を適用して測定することにより、被検物質の検出が可能となる。競合法で測定する場合には、添加したトリプトファン及び／又はチロシンを含むタンパク質で修飾した被検物質と、試料溶液中の被検物質とを結合物質に競合的に結合させ、その後、電極電位を変化させながら電流変化を測定することにより、被検物質を検出することができる。
【００２８】
また、第２の方法では、電極表面に結合物質を直接固定化するだけでなく、電極表面に固定した固定化タンパク質を介して、結合物質を電極に固定してもよい。ここで用いる固定化タンパク質としては、第１の例の説明で列挙した固定化タンパク質を使用可能である。ただし、第２の方法で用いる固定化タンパク質は、電気化学的に活性なトリプトファン及び／又はチロシンは必須ではなく、公知の固定化タンパク質をいずれも使用可能である。
【００２９】
以上のように、本発明の検出方法では、被検物質と結合物質とを特異的に結合させた後結合物質を担体に固定するために用いる固定化タンパク質を電気化学的に酸化するか、または、結合物質を介して電極に結合した被検物質を電気化学的に酸化し、その電流信号を電極電位を変化させながら測定することにより、被検物質の高感度検出が可能となる。さらに、本発明の検出方法では、結合物質に酵素や金コロイド等の検出用の標識を結合させる必要はなく、非常に簡便な方法で迅速な検出が可能である。また、材料費が安価で、またサンプル量も少なくて済むことから、プロテオーム解析や、患者の傍で行う臨床検査（いわゆるポイントオブケア検査）。環境分析等に非常に有用である。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を適用した具体的な実施例について、実験結果に基づいて説明する。なお、本発明は以下の実施例の記載に限定されるものではない。
〔実施例１〕
実施例１では、測定対象となる被検物質をヒト絨毛性ゴナドトロピン（human chorionic gonadotropin：ｈＣＧ）とした。ｈＣＧは、妊娠後に胎盤より分泌される２量体の糖タンパク質ホルモンであり、非共有結合したα−サブユニットとβ−サブユニットとからなる。α−サブユニットは１１６個のアミノ酸からなり、α−鎖ファミリーに属する糖タンパクホルモンである黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、及び甲状腺刺激ホルモンのα−サブユニットと同じであると知られている。β−サブユニットは、１３２個のアミノ酸からなり、ｈＣＧに固有である。実施例１では、抗原としてのｈＣＧをストレプトアビジンを介して磁性微粒子に固定した抗ｈＣＧ抗体と、カーボン印刷電極とを用いて検出した。なお、以下で用いる抗ｈＣＧ抗体とは、ｈＣＧのβ−サブユニットを認識し結合する抗体のことである。
【００３１】
本実施例の概念図を、図１に示す。先ず、図１（ａ）に示すように、ストレプトアビジン１が表面に結合した磁性微粒子２を含む溶液を用意する。次に、図１（ｂ）に示すように、ビオチン３で標識した被検物質に対する抗体４を溶液に添加し、抗体４を磁性微粒子２に結合させ、これを抗体固定化磁性微粒子とする。次に、図１（ｃ）に示すように、被検物質５を添加して抗体固定化磁性微粒子の抗体４と結合させる。その後、被検物質５が結合した抗体固定化磁性微粒子を電極表面に供給し、ストレプトアビジンを電気化学的に酸化する。被検物質５が結合することにより電極で測定される電流が減少するので、本実施例では、この電流の減少をカーボン印刷電極を用いて測定した。
【００３２】
本実施例の測定は、具体的には以下のように行った。本実施例では、ストレプトアビジンで被覆されている磁性微粒子（径１μｍ以下）（シグマ社製）を用いた。先ず、ポリスチレン製の培養チューブ中で、６．７×１０８個／ｍｌの磁性微粒子を含む溶液２μｌと、５０μｇ／ｍｌのビオチン化抗ｈＣＧ抗体を含む溶液４８μｌとを混合し、ビオチン化抗ｈＣＧ抗体を磁性微粒子表面に固定し、抗体固定化磁性微粒子を調製した。抗ｈＣＧ抗体は、Ｍｅｄｅｘ社より購入し、Ｐｉｅｒｃｅ社のビオチン化キット（ＥＺ−Ｌｉｎｋ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ）を用いてビオチン化した。ビオチン化抗ｈＣＧ抗体を含む溶液は、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、０．０１％（ｖ／ｖ）のｔｗｅｅｎ−２０、及び０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈され、ｐＨ７．４０に調整されている。ＢＳＡ及びｔｗｅｅｎ−２０は、非特異的な吸着を防ぐ目的で添加した。磁性微粒子に結合していない過剰量の抗体はＰＢＳを用いて除去した。その際、チューブの外側に磁石を付けて磁性微粒子を固定しておき、ＰＢＳを除去した。なお、抗体の濃度は、必要とされる量より高くしてあり、磁性微粒子上の全ての結合サイトは埋まっていると考えられる。
【００３３】
電気化学的測定は、図２に示すような、電気化学分析用のポテンシオスタット１１に接続したカーボンプリント電極１２を用いた矩形波ボルタンメトリーにより行った。カーボンプリント電極１２は、平らな３電極ストリップより構成され、カーボン作用電極（表面積２ｍｍ２）、カーボン対極、及び銀参照電極（デュポン社製）が形成されている。先ず、カーボンプリント電極１２の下部に磁石１３を配置し、２０μｌのＰＢＳに抗体固定化磁性微粒子１５を再懸濁した溶液１４をカーボンプリント電極１２のカーボン印刷電極上に滴下し、抗体固定化磁性微粒子１５をカーボンプリント電極１２上に吸着し、接触させた。抗体固定化磁性微粒子は、図２に示す状態で３０秒間置いた。次に、ポテンシオスタット１１としてＡｕｔｏｌａｂ  ＰＧＳＴＡＴ１２、及び電気化学分析用のソフトウェア（Ｅｃｏ  Ｃｈｅｍｉｅ社製）を用いて矩形波ボルタンメトリーにより電気化学測定を行った。ストレプトアビジンの酸化電流は、４０ｍＶの振幅及び２００Ｈｚでの１５ｍＶのステップポテンシャルで＋０．１０Ｖから＋１．２０Ｖまで走査することによる矩形波ボルタンメトリーによって測定した。ボルタモグラムは、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ（ｌｅｖｅｌ  ４）を用いてスムージングを行い、ＧＰＥＳでベースラインを校正した。再現性の測定（ｎ＝３）は、表面を新しくして同様の方法で行った。
【００３４】
先ず、抗体固定化前のストレプトアビジンが被覆された磁性微粒子を濃度４×１０７個／ｍｌに調製した溶液を用意し、この溶液２０μｌを用いて前述の電気化学的測定を行った。結果を図３中、ａに示す。図３ａに示すように、ＰＢＳ中でのストレプトアビジンの酸化電位は約＋０．９０Ｖであった。また、ビオチン化抗ｈＣＧ抗体を固定した抗体固定化磁性微粒子のボルタモグラムをｂで表す。図３のａとｂとの比較から、抗ｈＣＧ抗体を結合させることによって、結合前に比べ電流値が低下することがわかる。
【００３５】
次に、抗体固定化磁性微粒子に抗原を接触、結合させた後、電気化学的測定を行った。具体的には、抗体固定化磁性微粒子と濃度５０ｆｇ／ｍｌの抗原（ｈＣＧ）とを５分間震盪して反応させた後、ＰＢＳを用いて磁性微粒子を洗浄し、２０μｌのＰＢＳに再懸濁し、測定を行った。測定時の磁性微粒子の濃度は、前述と同様に４×１０７個／ｍｌとした。測定結果を、図３中ｄに示す。
【００３６】
また、前記抗ｈＣＧ抗体とは異なる部位で抗原（ｈＣＧ）に対し結合する抗ＨαＳ抗体を用い、前述と同様の方法でストレプトアビジンが被覆された磁性微粒子に抗ＨαＳ抗体を固定した。なお、抗ＨαＳ抗体とは、ｈＣＧのα−サブユニットを認識し結合する抗体のことである。この抗ＨαＳ抗体が固定された抗体固定化磁性微粒子と５０ｆｇ／ｍｌ抗原（ｈＣＧ）とを用い、前述と同様の方法により電気化学的測定を行った。結果を図３中ｃに示す。
【００３７】
抗原（ｈＣＧ）結合前（ｂ）と、抗原（ｈＣＧ）結合後（ｄ）との比較より、抗体固定化磁性微粒子に抗原が結合することにより、ストレプトアビジンの酸化電流が減少することが分かった。抗原と抗体との特異的な結合が立体障害となり、固定化タンパク質であるストレプトアビジンと電極表面との直接的な接触を阻害し、電気化学的応答を有意に減少させたと考えられる。また、抗体として抗ｈＣＧ抗体を用いた場合（ｄ）と抗ＨαＳ抗体を用いた場合（ｃ）とで電流値が異なる理由は、抗原（ｈＣＧ）に対する抗体の結合力の差によると考えられる。したがって、抗原（ｈＣＧ）に対する結合力の強い抗ｈＣＧ抗体を用いることによって、感度の高い結果が得られることがわかる。
【００３８】
次に、ｈＣＧ濃度を求めるための検量線について説明する。抗体として抗ｈＣＧ抗体を用いて抗体固定化磁性微粒子を調製し、０〜５００ｆｇ／ｍｌのｈＣＧ濃度範囲内の５点で測定した。測定回数は５回とした。結果を図４に示す。なお、図４においては、抗原（ｈＣＧ）濃度を横軸にとり、ピーク電流値の逆数を縦軸にとった。図４に示すように、４×１０７個／ｍｌの抗体固定化磁性微粒子上の抗体に５００ｆｇ／ｍｌの抗原を結合させたとき、ほぼ完全にストレプトアビジンの酸化電流が消失した。検量線は２０ｆｇ／ｍｌ〜５００ｆｇ／ｍｌのｈＣＧ濃度範囲内で直線性が得られた。その相関関数は０．９９９であった。本実験での検出限界は計算上１０ｆｇ／ｍｌであった。したがって、実施例２の検出方法によれば超高感度でｈＣＧの検出及び定量を実現できることが確認された。また、実施例１の方法では抗体の酵素標識は不要であり、約２０分で迅速にｈＣＧの検出を行うことができた。さらに、用いた炭素印刷電極は使い捨てで安価であり、低コストな検出が可能であった。
【００３９】
〔実施例２〕
実施例２では、ｈＣＧ固有の電気活性を抗ｈＣＧ抗体を結合した電極を用いて測定し、試料溶液中のｈＣＧを検出した。
【００４０】
本実施例の実験の概念図を、図５に示す。本実施例では、図５（ａ）に示すように、電極２１の表面に被検物質（抗原）２２に対する抗体２３を固定した抗体固定か電極を調製しておき、次に図５（ｂ）に示すように、被検物質２２を結合させて複合体とした後、電気化学的測定を行う。被検物質２２が結合することにより複合体中のチロシン及び／又はトリプトファンの総数が増加し、電流が上昇する。本実施例では、この電流変化をペンシル型電極を用いて測定した。
【００４１】
本発明で用いる３電極システムは、作用電極として針状のカーボン（グラファイト）電極、参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）、及び補助電極として白金線から構成される。針状カーボン電極（長さ６０ｍｍ、直径０．５ｍｍ）はトンボ株式会社より購入した。
【００４２】
抗体固定化電極の調製は、以下のように行った。すなわち、５０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に抗体（濃度７．５μｇ／ｍｌ）を溶解した溶液２０μｌに、それぞれの電極を１時間浸し、抗体を固定した。その後、未結合の抗体をＰＢＳで洗浄除去し、１％のポリビニルアルコールを含むＰＢＳ溶液１００μｌにより、室温で１時間、電極表面をブロッキングした。ブロッキング後、電極をＰＢＳで電極を洗浄し、これを抗体固定化電極として測定に用いた。
【００４３】
電気化学的測定は以下のように行った。すなわち、先ず、所定量の抗原（ｈＣＧ）を含む溶液１００μｌに抗体固定化電極を浸漬し、室温で１０分間維持して抗原と抗体とを結合させた。抗原−抗体複合体が形成された抗体固定化電極をＰＢＳですすいだ後、４０ｍＶの振幅、２０Ｈｚ、１５ｍＶのステップポテンシャルで＋０．１０Ｖから＋１．２０Ｖまで走査することによる矩形波ボルタンメトリーにより電気化学的測定を行った。ボルタモグラムは、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ（ｌｅｖｅｌ  ４）を用いてスムージングを行い、ＧＰＥＳでベースラインを校正した。
【００４４】
先ず、抗原（ｈＣＧ）に対する２種類の抗体（抗ｈＣＧ抗体又は抗ＨαＳ抗体）を電極表面に固定して抗体固定化電極を調製し、抗原を添加せず、抗体固定化電極のチロシン及びトリプトファンの酸化電流を測定した。結果を図６中、ｃに示す。抗体中に含まれるチロシン及びトリプトファンは、抗ｈＣＧ抗体と抗ＨαＳ抗体とで同数であるため、これら抗体の電流値は等しくなる。
【００４５】
次に、抗ｈＣＧ抗体を電極表面に固定して抗体固定化電極を調製し、１ｐｇ／ｍｌの抗原（ｈＣＧ）を結合させた後に電気化学的測定を行った。結果を図６中、ａに示す。また、抗ＨαＳ抗体を電極表面に固定して抗体固定化電極を調製し、１ｐｇ／ｍｌの抗原（ｈＣＧ）を結合させた後に電気化学的測定を行った。結果を図６中、ｂに示す。抗原（ｈＣＧ）濃度は同一であるにもかかわらずａとｂとで電流値が異なるのは、抗ｈＣＧ抗体と抗ＨαＳ抗体とで抗原（ｈＣＧ）に対する結合力が異なるためである。
【００４６】
また、測定終了後の抗体固定化電極を再度用いて同様の測定を行った結果を、図６中ｄに示す。ｄに示すように、２度目の測定では酸化電流が観察されないが、これは最初の測定によって全てのチロシン及びトリプトファンが酸化され、電極上に強固に吸着しているためである。
【００４７】
次に、ｈＣＧ濃度を求めるための検量線について説明する。抗ｈＣＧ抗体を用いて前述の方法で抗体固定化電極を調製し、０〜１２００ｆｇ／ｍｌの範囲内で測定した結果を図７に示す。図７に示すように、検量線は１ｆｇ／ｍｌ〜１２００ｆｇ／ｍｌのｈＣＧ濃度範囲内で直線性が得られた。相関関数は０．９９０８であった。本実験での検出限界は計算上１ｆｇ／ｍｌであった。したがって、実施例２の検出方法によれば超高感度でｈＣＧの検出及び定量を実現できることが確認された。また、実施例２の検出方法に要した時間は約１０分であり、迅速な検出が可能であった。さらに、針状電極は使い捨てで安価であり、必要なサンプル液量は２０μｌで済むので、低コストな検出が可能であった。
【００４８】
なお、商業的に入手可能な金コロイド微粒子を用いたｈＣＧストリップテストと比較すると、この金コロイド微粒子を用いた従来法の検出限界は４ｎｇ／ｍｌであり、本実験での検出限界はそれより４００、０００倍低い値を達成することができた。
【００４９】
〔実施例３〕
実施例３では、前立腺特異抗原（ＰＳＡ：prostate specific antigen）固有の電気活性を、抗ＰＳＡ抗体を固定した抗体固定化電極により電気化学的に測定し、試料溶液中のＰＳＡの検出を試みた。ＰＳＡは、９個のトリプトファン残基及び４個のチロシン残基を有するタンパク質である。血液中でのＰＳＡは、遊離型のフリーＰＳＡ（Ｆ−ＰＳＡ）、又はα−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）と結合した状態のＰＳＡ（ＰＳＡ／ＡＣＴ）として存在する。血清中におけるフリーＰＳＡとトータルＰＳＡとの比は、前立腺ガンのスクリーニングテストに利用されている。
【００５０】
先ず、実施例２と同様にして１２．５μｇ／ｍｌの抗トータルＰＳＡモノクローナル抗体（以下、抗Ｔ−ＰＳＡ抗体と称する。）、又は抗ＰＳＡ／α−１−アンチキモトリプシン複合体モノクローナル抗体（以下、抗ＰＳＡ／ＡＣＴ抗体と称する。）を固定した抗体固定化電極を調製し、これら抗体の内在性の電気化学的活性を、実施例２で用いた針状炭素電極を用いた矩形波ボルタンメトリーにより測定した。結果を図８中、ｃに示す。
【００５１】
また、抗ＰＳＡ／ＡＣＴ抗体を固定した抗体固定化電極を用い、１２５ｆｇ／ｍｌのトータルＰＳＡを反応させた後の測定結果を、図８中、ｂに示す。また、抗Ｔ−ＰＳＡ抗体を固定した抗体固定化電極を用い、１２５ｆｇ／ｍｌのトータルＰＳＡを反応させた後の測定結果を、図８中、ａに示す。トータルＰＳＡは、ＰＳＡ／ＡＣＴ複合体とフリーPSAを区別していない状態であり、抗Ｔ−ＰＳＡ抗体は、ＰＳＡ／ＡＣＴ複合体とフリーＰＳＡとの両方に等モルで結合する抗体である。そのため、抗ＰＳＡ／ＡＣＴ抗体を用いた場合（ｂ）では小さく、抗Ｔ−ＰＳＡ抗体（ａ）では相対的に大きな電流応答が得られた。なお、電極表面を変えずに同じ条件で矩形波ボルタンメトリーにより２度目の測定を行ったが、実施例２と同様に、電流応答は得られなかった（図８中、ｄ）。
【００５２】
次に、抗Ｔ−ＡＣＴ抗体を固定した抗体固定化電極を用いてトータルＰＳＡ濃度と電流値との関係を調べ検量線を作成した（図９）。検量線は、０．１ｆｇ／ｍｌから２００ｆｇ／ｍｌの濃度範囲で直線性を持ち、相関係数は０．９９９８で、ＣＶｓ＜６．２％であった。本実験でのＰＳＡの測定限界は計算上０．１ｆｇ／ｍｌであり、これは１５．７９yoctoモル（１５．７９×１０−２４モル）又は２．６３attoＭに相当する。以上のように、実施例３の方法によって、ＰＳＡの検出及び定量を実現できることが確認された。また、実施例３の検出方法に要した時間は約１０分であり、迅速な検出が可能であった。さらに、針状電極は使い捨てで安価であり、必要なサンプル液量は２０μｌで済むので、低コストな検出が可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】実施例１の検出方法を説明するための模式図であり、（ａ）はストレプトアビジンが表面に結合した担体を示す図、（ｂ）は抗体固定化磁性担体を示す図、（ｃ）は被検物質結合後の抗体固定化担体を示す図である。
【図２】実施例１で用いた電気化学測定システムを示す模式図である。
【図３】実施例１のボルタモグラムであり、ａはストレプトアビジン被覆磁性微粒子から得られた電流、ｂは抗体固定化磁性微粒子から得られた電流、ｃは抗ｈＣＧ抗体固定化磁性微粒子に抗原（ｈＣＧ）を結合させた後に得られた電流、ｄは抗ＨαＳ抗体固定化磁性微粒子に抗原（ｈＣＧ）を結合させた後に得られた電流である。
【図４】実施例１の方法により作成した検量線である。
【図５】実施例２の検出方法を説明するための模式図であり、（ａ）は抗体固定化電極を示す図、（ｂ）は被検物質結合後の抗体固定化電極を示す図である。
【図６】実施例２のボルタモグラムであり、ａは抗ｈＣＧ抗体固定化電極に抗原（ｈＣＧ）を結合させた後に得られた電流、ｂは抗ＨαＳ抗体固定化電極に抗原（ｈＣＧ）を結合させた後に得られた電流、ｃは抗体固定化電極の電流、ｄは２回目の測定で得られた電流である。
【図７】実施例２の方法により作成した検量線である。
【図８】実施例３のボルタモグラムであり、ａは抗Ｔ−ＰＳＡ抗体固定化電極に抗原（トータルＰＳＡ）を結合させた後に得られた電流、ｂは抗ＰＳＡ／ＡＣＴ抗体固定化電極に抗原（トータルＰＳＡ）を結合させた後に得られた電流、ｃは抗体固定化電極の電流、ｄは２回目の測定で得られた電流である。
【図９】実施例３の方法により作成した検量線である。
【符号の説明】
【００５４】
１  ストレプトアビジン、２  磁性微粒子、３  ビオチン、４  抗体、５  被検物質、１１  ポテンシオスタット、１２  カーボンプリント電極、１３  磁石、１５  抗体固定化磁性微粒子、２１  電極、２２  被検物質（抗原）、２３  抗体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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