(57)【要約】【課題】本発明は、ゲノムＤＮＡの遺伝的組換え頻度を上昇させる方法およびゲノム再編成を誘発する方法に関する。【解決手段】ゲノム中の任意の部位において遺伝的組換えが起きている細胞の遺伝的組換え頻度を上昇させる方法であって、該細胞中で制限酵素を発現させ、該制限酵素の一過的活性化を誘導し、該細胞の任意のゲノムＤＮＡ中に２以上の二本鎖切断を導入することにより、遺伝的組換え頻度を上昇させる方法および前記方法を用いたゲノム再編成の誘発方法、並びに前記２つの方法を用いて各々作製される細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム中の任意の部位において遺伝的組換えが起きている細胞の遺伝的組換え頻度を上昇させる方法であって、該細胞中で制限酵素を発現させ、該制限酵素の一過的活性化を誘導し、該細胞のゲノムＤＮＡ中の任意の部位に２以上の二本鎖切断を導入することにより、遺伝的組換え頻度を上昇させる方法。
【請求項２】
前記遺伝的組換えが相同組換えである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝的組換えが非相同組換えである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、真菌細胞、出芽酵母細胞、分裂酵母細胞から成る群より選択されるものであることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記制限酵素を誘導的に発現させることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記制限酵素が認識する塩基数が４塩基であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記制限酵素が耐熱性細菌から単離したものであることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記細胞の温度を前記制限酵素が活性化される温度まで上昇させ、上昇させた温度で該細胞をインキュベートすることにより、前記制限酵素の一過的活性化を達成することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記制限酵素がＴａｑＩであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記制限酵素が活性化される温度が４０℃〜６０℃であることを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記インキュベートを３〜３０分間行うことを特徴とする請求項８ないし１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれかに記載の方法を用いて、前記細胞中のゲノム再編成を誘発する方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれかに記載された方法によって作製された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にゲノムＤＮＡの遺伝的組換え頻度を上昇させる技術に係り、より詳細には、ゲノムＤＮＡの遺伝的組換え頻度を上昇させることによりゲノム再編成を誘発する方法および係る方法によってゲノム再編成が行われた細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術として知られているものに、ＨＯエンドヌクレアーゼ（例えば、特許文献１を参照。）、Ｉ−ＳｃｅＩ（例えば、特許文献２、非特許文献１、非特許文献２を参照。）、Ｃｒｅ−ｌｏｘ（例えば、非特許文献３を参照。）などの部位特異的組換え酵素の細胞内導入型がある。これらの酵素はきわめて配列認識が厳密で、異種ゲノム中には全く切断部位を持たない。そのため予めゲノム中にこれらの切断配列を導入しておくことで、その周辺における相同組換えのみ活性化することが出来る。ただし、今回の発明のようにゲノム一般での組換え頻度向上に用いることは原理的に出来ない。一方、ＤＮＡ切断酵素を用いてゲノム一般箇所の組換えを上昇させる手法については、切断酵素の活性を厳密に制御することができないため、細胞に致死的な影響が生じやすく、これまで有用な系は実現されていない。ただ、類縁の従来手法であるＲＥＭＩ法  （Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）（例えば、特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）では、形質転換時に制限酵素とＤＮＡを混合して細胞内に導入し、導入ＤＮＡの染色体挿入頻度を上昇させることが可能になっている。しかし、この手法ではごく一部の細胞にしかＤＮＡと制限酵素が取り込めないので、あくまで外来ＤＮＡの染色体への挿入を促進する用途に限定され、ゲノムシャッフリングなど大規模なゲノム組成の改変には利用する事が出来ないという本質的な欠点がある。
【０００３】
【特許文献１】米国特許第６，０３７，１６２号明細書
【特許文献２】米国特許第６，６１０，５４５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，７９２，６３３号明細書
【非特許文献１】Ｊａｃｑｕｉｅｒ等，１９８５．Ｃｅｌｌ，４１：３８３−３９４
【非特許文献２】Ｒｏｕｅｔ等，１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：６０６４−６０６８
【非特許文献３】ＤｉＳａｎｔｏ等，１９９５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３７７−３８１
【非特許文献４】ＳｃｈｉｅｓｔｌおよびＰｅｔｅｓ，１９９１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７５８５−７５８９
【非特許文献５】Ｓｃｈｉｅｓｔｌ等，１９９４．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４４９３-４５００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、一般には、ゲノムＤＮＡの遺伝的組換え頻度を上昇させる方法を提供することを目的とする。
また、本発明はゲノム再編成の誘発方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、上記方法によってゲノムＤＮＡの遺伝的組換えが行われた細胞、またはゲノムＤＮＡ再編成が行われた細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記事情に鑑みて、ゲノムＤＮＡの遺伝的組換え頻度を効率よく上昇させる方法がないかについて鋭意研究した結果、意外にも、細胞内で制限酵素活性を一過的に上昇させ、該細胞中に存在するゲノムＤＮＡに二本鎖切断を導入することにより、該ゲノムＤＮＡの遺伝的組換え頻度が効率よく上昇することを見出した。
従来手法では、制限酵素活性を制御することが出来ないため、本手法のようにゲノム中に多数の切断部位を持つ制限酵素を予め組み込んだ細胞を作り出すことが出来ない。したがって、酵母など微生物のゲノムシャッフリングの促進に用いるにはきわめて効率が悪く、利用は現実的に不可能である。ところが、本発明で利用する好熱菌等の制限酵素ＴａｑＩ等は常温下ではほとんど活性を示さないので、該酵素を大量に発現した状態で細胞生存をある程度維持することができる。また、温度上昇の時間と温度を制御することで、組換え頻度の調節をすることが可能になる。さらにＴａｑＩは４塩基認識であるため、ゲノム中に多数の切断箇所を持ち、これらの任意の場所における組換え頻度の向上に利用することが可能である。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１３）に関する。
（１）本発明の第１の実施態様に係る発明は、「ゲノム中の任意の部位において遺伝的組換えが起きている細胞の遺伝的組換え頻度を上昇させる方法であって、該細胞中で制限酵素を発現させ、該制限酵素の一過的活性化を誘導し、該細胞のゲノムＤＮＡ中の任意の部位に２以上の二本鎖切断を導入することにより、遺伝的組換え頻度を上昇させる方法。」である。
（２）本発明の第２の実施態様に係る発明は、「前記遺伝的組換えが相同組換えである上記（１）に記載の方法。」である。
（３）本発明の第３の実施態様に係る発明は、「前記遺伝的組換えが非相同組換えである上記（１）に記載の方法。」である。
（４）本発明の第４の実施態様に係る発明は、「前記細胞が、真菌細胞、出芽酵母細胞、分裂酵母細胞から成る群より選択されるものであることを特徴とする上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の方法。」である。
（５）本発明の第５の実施態様に係る発明、「前記制限酵素を誘導的に発現させることを特徴とする上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の方法。」である。
（６）本発明の第６の実施態様に係る発明は、「前記制限酵素が認識する塩基数が４塩基であることを特徴とする上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の方法。」である。
（７）本発明の第７の実施態様に係る発明は、「前記制限酵素が耐熱性細菌から単離したものであることを特徴とする上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の方法。」である。
（８）本発明の第８の実施態様に係る発明は、「前記細胞の温度を前記制限酵素が活性化される温度まで上昇させ、上昇させた温度で該細胞をインキュベートすることにより、前記制限酵素の一過的活性化を達成することを特徴とする上記（７）に記載の方法。」である。
（９）本発明の第９の実施態様に係る発明は、「前記制限酵素がＴａｑＩであることを特徴とする上記（８）に記載の方法。」である。
（１０）本発明の第１０の実施態様に係る発明は、「前記制限酵素が活性化される温度が４０℃〜６０℃であることを特徴とする上記（８）または（９）に記載の方法。」である。
（１１）本発明の第１１の実施態様に係る発明は、「前記インキュベートを３〜３０分間行うことを特徴とする上記（８）ないし（１０）のいずれかに記載の方法。」である。
（１２）本発明の第１２の実施態様に係る発明は、「上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の方法を用いて、前記細胞中のゲノム再編成を誘発する方法。」である。
（１３）本発明の第１３の実施態様に係る発明は、「上記（１）ないし（１２）のいずれかに記載された方法によって作製された細胞。」である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明を用いることにより、本発明に係る方法を適用したほぼ全ての細胞集団において、ゲノムＤＮＡの遺伝的組換え頻度を効率的に向上させることが可能となる。
【０００７】
また、本発明に係る方法を細胞に適用することにより、該細胞内での遺伝的組換えの活性化を任意の時期に誘導することができ、該細胞のゲノム中におけるシャッフリングが可能となる。
【０００８】
さらに、本発明の方法を種々の細胞に適用することで相同染色体間の組換え促進によるゲノム再編成が可能となり、遺伝形質の改良を比較的容易に行なえるようになり得る。
【０００９】
さらにまた、本発明の方法を用いることで、異なる属性を持つ細胞間（例えば、タンパク質発現用酵母と凝集性の高い酵母間、醤油酵母と酒造酵母、低温耐性酵母とパン酵母、極限環境に存在する種々の微生物間）におけるゲノムシャッフリングを促進し、新たな特性を獲得した細胞の創出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明を実施するための最良の形態として、酵母細胞内にＴａｑＩ遺伝子を誘導的に発現させ、制限酵素ＴａｑＩを一過的に活性化さることにより、遺伝的組換え頻度を上昇させる方法を中心に以下に詳細に説明する。
【００１１】
１．細胞
本発明を適用することができる細胞は、低レベルであっても遺伝的組換えが生じている細胞であれば、原核細胞であっても真核細胞であっても適用可能であり、当業者であれば容易に選択することができる。そのような細胞としては、限定はしないが、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌類細胞、酵母細胞、好ましくは分裂酵母、出芽酵母などが選択可能である。
ここで「遺伝的組換え」とは、広い意味において、ＤＮＡ間で起きるＤＮＡ切断・再結合現象を意味する。本発明における「遺伝的組換え」には、相同組換えおよび非相同組換えの両方が含まれる。また、「ゲノム再編成」とは、「遺伝的組換え」頻度の上昇に伴い、既存のゲノム配列間において組換えが起こり、その結果、部分的もしくは全体的にゲノム配列に変化を生じることを意味する。
本発明で用いる細胞の培養条件は当該技術分野において周知の方法によって行われるが、選択される細胞に適した培地、培養条件（培養温度など）下で行われることは言うまでもない。培地としては、一般に使用されているＳＤ培地などがあり、又は選択マーカーによる形質転換体の選択を可能ならしめるための選択培地などが挙げられる。培養は、通常、用いる細胞にとっての適温（酵母細胞の場合には、例えば、３０℃）で数日間行う。培養中は必要に応じて抗生物質を培地に添加してもよい。また、細胞内に導入した制限酵素の発現を誘導的に行う場合には、該制限酵素の転写制御を誘導的に行うべく、誘導的転写プロモーターを用いてもよい。誘導的転写プロモーターを利用する場合には、転写を誘導するための薬剤（例えば、ガラクトースなど）を添加してもよい。
【００１２】
２．制限酵素
本発明に係る方法を実施するにあたり、遺伝的組換え頻度の上昇が望まれる細胞中において、制限酵素を一過的に活性化し、ゲノムＤＮＡ中の適当箇所に二本鎖切断を導入する必要がある。切断箇所の数に遺伝的組換え頻度の上昇効率が依存するため、切断箇所が多すぎる酵素または少なすぎる酵素は本方法における使用にはあまり適さない。限定はしないが、例えば、本発明に係る方法に用いる制限酵素としては、４塩基〜６塩基の認識部位を持つものが好ましく、さらに好ましくは、４塩基〜５塩基の認識部位を持つ酵素であり、最も好ましくは４塩基の認識部位を持つ酵素である。また、本発明に用いられる制限酵素は、「一過的に活性化させる」ことが可能である必要がある。ここで「一過的に活性化させる」とは、細胞を通常の培養条件とは異なる条件下で数分間培養することにより、該制限酵素を数分間活性化させることを意味する。また、「通常の培養条件とは異なる条件」とは、当業者において選択可能な条件であれば如何なる条件でもよいが、例えば、用いた制限酵素の活性化に必要とされる物質（例えば、金属イオンなど）を添加した条件、あるいは、用いた制限酵素の活性化に必要な温度条件などを使用することができる。
例えば、本発明を出芽酵母細胞に適用する場合においては、好ましい制限酵素としては、ＴａｑＩを挙げることができ、ＴａｑＩを一過的に活性化する方法としては、ＴａｑＩを発現可能に導入した酵母細胞を１分〜３０分間、４０〜６０℃にて、より好ましくは５０℃にてインキュベートすることできる。
また、本発明の方法を分裂酵母細胞に適用する場合においては、好ましい制限酵素としては、ＴａｑＩを挙げることができ、ＴａｑＩを一過的に活性化する方法としては、ＴａｑＩを発現可能に導入した酵母細胞を１分〜５分間、４０〜６０℃にて、より好ましくは５０℃にてインキュベートすることできる。
【００１３】
３．制限酵素の発現
本方法において用いる制限酵素は、目的の細胞内で発現させる必要があるが、好ましくは、該制限酵素の発現を誘導的に行うことにより発現調節が可能であることが望ましい。制限酵素の発現調節は、当業者にとって周知の技術であれば、如何なる方法を用いてもよいが、好ましくは、該制限酵素の転写制御を行う領域および該制限酵素遺伝子を適当なベクターに構築し、該ベクターを細胞内へ導入することで達成することができる。制限酵素の発現誘導は、プラスミドの状態で目的細胞内に保持することによっても行うことができるが、好ましくは、該制限酵素の転写制御を行なう領域および該制限酵素遺伝子を染色体上の任意の領域に組込ませ、該制限酵素を安定に発現させる方法、より好ましくは安定かつ誘導的に発現させる方法が用いられる。ここで、「制限酵素の転写制御を行なう領域」とは、特定の遺伝子の転写制御に必要なＤＮＡ配列であって、該遺伝子に隣接して存在し、転写プロモーター、エンハンサー、その他転写活性を制御するのに必要な任意の配列が含まれる。
転写プロモーターは、構成的プロモーター又は誘導的プロモーターのいずれも使用可能であるが、制限酵素の発現制御が可能であることから、誘導的プロモーターが好ましい。  誘導的プロモーターとしては、チアミン欠乏に応答するもの、及びガラクトースに応答するものなどが含まれ、特に、ガラクトースに応答するものが好ましい。
【実施例】
【００１４】
以下に、酵母細胞を用いた実施例を示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
本実施例は、１）耐熱性細菌のＴａｑＩ遺伝子クローニングと出芽酵母または分裂酵母細胞内での発現ベクター構築、２）ＴａｑＩ発現細胞の熱処理による組換え上昇の確認、からなる。これにより、酵母内での組換え活性化を任意の時期に誘導し、酵母ゲノム間でのシャフリングが可能となる。
まず、二倍体酵母細胞内でＴａｑ１を誘導的に発現する細胞株を樹立した。この細胞では組換えの活性化を計測するために２つの異なる点変異を持つ栄養マーカー遺伝子を持つ。点変異マーカー遺伝子間での組換えの結果、変異が除去されて非栄養要求性となる割合を測定することにより組み換えの活性化をモニターする。ＴａｑＩを細胞内で活性化することにより細胞内で組換えを誘導することが確認された。
【００１５】
実験例１：出芽酵母における組換え活性化
（１）ＴａｑＩ発現用プラスミド作製
ＴａｑＩエンドヌクレアーゼのクローニングは、以下のように行った。ＴａｑＩ−Ｎｔｅｒｍ２  （ＧＧＡＡＡＣＡＴＧＧＣＣＣＣＴＡＣＡＣＡＡＧＣＣＣ）（配列番号１）および−ＴａｑＩ−Ｃｔｅｒｍ  （ＣＧＧＧＣＣＧＧＴＧＡＧＧＧＣＴＴＣＣＣ）（配列番号２）をプライマー、またＴｈｅｒｍｕｓ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（宝酒造）を鋳型とし、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （宝酒造）により、５０μｌスケールで増幅を行った。９８℃２分加温した後９８℃２０秒、６３℃３０秒、７２℃１分を２３サイクル行い、最後に７２℃５分反応させた。その後ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社）０．５μｌを加えた後、７２℃で１０分間反応させた。ここで得られたサンプル１０μｌを１％アガロースゲル電気泳動により分離し、ＴａｑＩ遺伝子に相当するバンドを切り出し、Ｍｉｎｉ  Ｅｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Qiagen社）を用いて精製した。なお、カラムからの溶出は、１２μｌの溶出バッファー（キット添付）で行った。この溶出物４μｌをｐＹＥＳ２，１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター（Stratagene社）１μｌと、Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １μｌ存在下で反応させ、ＤＨ１０Ｂ株にトンラスフォーメーションした。得られたコロニーから培養を行い、プラスミドをアルカリ法により抽出した。プラスミドはＶ５  Ｃ−ｔｅｒｍ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  およびＧＡＬ１  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  （いずれもStratagene社）を用い、ＡＢＩ  ３１０シーケンサにより配列を確認し、ｐＨＳ１４１とした。このベクターを用いることでガラクトースによってＴａｑＩタンパク質の酵母内での発現を制御することが可能になる。
【００１６】
（２）形質転換
（１）で作製したプラスミドｐＨＳ１４１を実験室出芽酵母ＯＲＤ１４９に形質転換させる。ＯＲＤ１４９のコンピテントセルとプラスミドｐＨＳ１４１を試験管内で混合し、Ｆａｓｔ  Ｙｅａｓｔ−Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ (Geno Technology Inc.) を使用して形質転換させた。ｐＨＳ１４１はＵＲＡ３選択マーカーを持つため、形質転換した細胞の選択にはウラシルをドロップアウトした選択培地（ＳＤ−Ｕｒａ）を用い、ＳＤ−Ｕｒａ寒天培地上に出現したＵｒａ＋のコロニーを選択した。
【００１７】
（３）組換え頻度の測定
（２）で選択したプラスミドｐＨＳ１４１  を組み込んだＯＲＤ１４９株をＳＤ−Ｕｒａ選択液体培地に入れ、３０℃で一晩培養する。細胞数２−３×１０７／ｍＬ程度まで培養後、菌体を遠心分離し、菌体を滅菌水で洗浄した。菌体を、ウラシルをドロップアウトしたガラクトース選択液体培地（ＳＤ  Ｇａｌａｃｔｏｓｅ−Ｕｒａ）に移し、再び３０℃で培養を開始した。ガラクトース培地での培養開始前の培養液を１ｍＬ採取し、ガラクトース培養０時間のサンプルとした。
ガラクトース培地での培養開始から２時間経過後、培養を終了し、培養液を１ｍＬ採取した。これをガラクトース培養２時間のサンプルとした。
ガラクトース培地での培養２時間サンプルを試験管に分注し、５０℃でそれぞれ０分、５分、１０分、１５分間保温した。ガラクトース０時間培養液は組換え頻度の基準となるコントロール用サンプルとし、５０℃の保温は行わなかった。
保温処理した２時間培養のサンプルと０時間のサンプルを、ＹＰＤ寒天培地ならびにアルギニンをドロップアウトした選択寒天培地（ＳＤ−Ａｒｇ）に塗布し、２〜３日間３０℃で培養した。ＹＰＤ寒天培地には生存したすべての細胞がコロニー形成するのに対し、ＳＤ−Ａｒｇ寒天培地には発現したタンパク質で組換えを起こしてＡｒｇ＋になった細胞しかコロニー形成しないため、コロニーの発現数の割合から組換え頻度を測定することができる。ＳＤ−Ａｒｇ寒天培地には培養液１００μＬを塗布するが、ＹＰＤ寒天培地には培養液を１０４〜１０５倍に希釈して同量を塗布した。
この実験にはネガティブコントロールとして、形質転換で前述のＯＲＤ１４９にプラスミドｐＹＥＳｌａｃＺを組み込んだ酵母を使用した。この酵母でも同様の実験を行い、ｐＨＳ１４１との比較を行った。
プラスミドｐＨＳ１４１により酵母細胞内でＤＮＡ切断を起こすタンパク質ＴａｑＩが発現し、５０℃で保温により活性が顕在化し、ａｒｇ４ヘテロアリルでの染色体間相同組換え頻度が上昇した（図１）。
【００１８】
（４）温度別組換え頻度の測定
プラスミドｐＨＳ１４１を組み込んだＯＲＤ１４９株を使用して、（３）の組換え頻度測定と同じ方法で培養実験を２時間まで行い、０時間と２時間のサンプルを作製した。ガラクトース培養２時間のサンプルを３０℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃で２０分間保温し、ＳＤ−ＡｒｇおよびＹＰＤ寒天培地に培養液を塗布した。２日後、培養寒天培地上のコロニー数をカウントし、組換え頻度を算出した。
この実験にもネガティブコントロールとしてプラスミドｐＹＥＳｌａｃＺを組み込んだＯＲＤ１４９株を使用した同じ実験を行い、プラスミドｐＨＳ１４１を組み込んだ株と測定結果を比較した。
プラスミドｐＨＳ１４１を組み込んだ株においては、５０℃で保温した場合に、組換え頻度の上昇が最も高かったが、ネガティブコントロールの株では、組換え頻度の有意な上昇は認められなかった（図２）。
【００１９】
（５）アデニン要求性酵母の出現頻度測定
プラスミドｐＨＳ１４１を組み込んだＯＲＤ１４９株を使用して（３）の組換え頻度測定と同じ方法用い培養実験を２時間まで行い、０時間と２時間の培養液を採取した。ガラクトース培養２時間のサンプルを５０℃で２０分保温し、培養液をＹＰＤ寒天培地１枚当たり１０００〜２０００個になるように希釈調整し、５枚に分けて塗布した。同時にネガティブコントロール（プラスミドｐＹＥＳｌａｃＺを組み込んだＯＲＤ１４９株）についても実験を行った。ＹＰＤ寒天培地に出現したコロニーのうち、組換えが起こったＡｄｅ−を示す赤いコロニー（ＡＤＥ１遺伝子が破壊されたアデニン要求性酵母）の割合を測定した。
測定の結果、５０℃で保温することによってＡｄｅ−酵母の割合が増加し、組換えが誘発されていることが確認された（図３）。
【００２０】
（６）Ａｕｒｅｏｂａｃｉｄｉｎ耐性酵母の組換え頻度測定
プラスミドｐＨＳ１４１にＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ  Ａ耐性遺伝子（Ａｕｒ１）（宝酒造）を挿入し、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ  Ａ耐性を持たせた発現プラスミド（ｐＨＳ１４１  Ａｕｒ＋）を作成する。その遺伝子を形質転換でＯＲＤ１４９株に組み込んだ。ＳＤ−Ｕｒａ培地で培養し、形成されたコロニーを採取した。
（３）の組換え頻度測定と同じ実験方法で、組換え頻度を測定した。
測定の結果、組換え頻度の上昇を確認した（図４）。
【００２１】
（７）発現したタンパク質の検出
ガラクトースによるタンパク質の発現誘導の確認をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法とウェスタンブロッティング法で確認した。
本実験においてＴａｑＩはＶ５タグと融合した形態で発現されるため、Ｖ５タグに対する抗体により、ＴａｑＩの発現を確認した。
プラスミドｐＨＳ１４１を組み込んだＯＲＤ１４９株とプラスミドｐＨＳ１４１  Ａｕｒ＋を組み込んだＯＲＤ１４９株を使用して、（３）の組換え頻度の測定の場合と同じ条件でガラクトース液体培地での培養を行った。ただし、取得するサンプルはガラクトース培養開始から０、０．５、１、２時間（計４点）の培養液１ｍＬとし、５０℃での保温は行わなかった。サンプル採取後、遠心分離して上清を除去し、純水で洗浄後、遠心機分離した。沈殿した菌体にＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０），  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １ｍＭ  ＥＧＴＡ，  １ｍＭ  ＭｇＣｌ２）５００μｌを加えて懸濁した。遠心分離で上清を除去し、再びＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒと１／５０量のコンプリート（Ｒｏｃｈｅ社）を加え、懸濁した。
０．６ｇのグラスビーズが入ったマルチビーズショッカー専用チューブに懸濁液を移し、マルチビーズショッカー（安井機器）で細胞破壊を行った。
細胞破壊したチューブから低速の遠心分離で抽出液のみを回収した。溶液をさらに遠心分離し、沈殿と上清をそれぞれ回収した。
沈殿と上清それぞれに等量のＳＤＳプリアクリルアミドゲル電気泳動サンプルバッファ（１／１０量の２−メルカプトエタノールが含まれたもの）を加え、懸濁し、１００℃で５分間保温した。
ＶＸ  ＰＡＮＴＥＲＡ  Ｇｅｌ  ＳＹＳＴＥＭ（高速ＳＤＳプリアクリルアミドゲル電気泳動システム：  ＤＲＣ社）を使用し、ＶＸ  ＰＡＮＴＥＲＡ  Ｇｅｌ（DRC社）ゲル、付属の泳動バッファを用い電気泳動を行った。
次にウェスタンブロッティング法でタンパク質の検出を行った。サンプルを電気泳動したゲルにセミドライ方式で５０ｍＡ、５０Ｖの電流をかけ、ＰＶＤＦ膜 (Immobilon Transfer Memblanes : Millipore社)にタンパク質を転写させた。泳動バッファにはセミドライBuffer（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），  １９２ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ，  ２０％  エタノール）を使用した。
タンパク質を転写したＰＶＤＦ  膜のブロッキング処理をＴＢＳ−Ｔ  （ｐＨ７．４）（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  ５００ｍＭ  Ｎａｃｌ，  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）に溶解した５％  Ｓｋｉｍ  Ｍｉｌｋ溶液を用いて行った。次に一次抗体Ａｎｔｉ  Ｖ５−Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Invitrogen社）を用い抗体反応を行った後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、二次抗体ＡＰ  α−ｍｏｕｓｅ  Ｆ（ａｂ’）２（Amersham社）と抗体反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｃｔ(KPL社) を用い発現したタンパク質の検出を行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウェスタンブロッティング法によりｐＨＳ１４１がＴａｑＩ由来のタンパクを発現していることを確認した（図５）。
【００２２】
実験例２：分裂酵母内での組換え活性化
（１）Ｄ５０株作製
耐熱性細菌ゲノムを鋳型に用い下記のｏｌｉｇｏＤＮＡを用いてＰＣＲ反応をおこなうことでＴａｑＩ遺伝子断片を取得した。
ｃｃｃＣＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＴＡＣＡＣＡＡＧＣＣＣ（配列番号３）（下線部はＮｄｅＩ制限酵素認識部位）
ｃｃｃＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＧＧＧＣＣＧＧＴＧＡＧＧＧＣ（配列番号４）（下線部はＢａｍＨＩ制限酵素認識部位）
得られた断片の配列を確認し、ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩで切断した。この断片をＴａｑＩ−ＦＲとよぶ。分裂酵母転写プロモーターｎｍｔ１、ＴａｑＩＦＲ、転写ターミネーター、ＫａｎＲ（ジェネティシン耐性マーカー遺伝子）、分裂酵母ｌｅｕ１遺伝子３’断片、ｐＵＣ１１８の順で結合および環状化し、ｉｎｔＬ−ＴａｑＩプラスミドを得た。ｉｎｔＬ−ＴａｑＩのｌｅｕ１遺伝子内にあるＸｈｏＩ部位で切断し、分裂酵母株Ｄ２６株に形質転換する。形質転換法およびジェネティシン耐性形質転換体の取得方法は、Hirotaら, Genes to Cells, 6:201-214, 2001に記載された方法に従った。
この株は培地中チアミン除去によってＴａｑ１タンパクの発現を制御することが可能である。
【００２３】
（２）組換え頻度の測定
Ｄ５０株をＳＤ培地（チアミンを含む）にストリークし、シングルコロニーが出るまで培養をおこなった。シングルコロニーをＭＭ＋Ｎ液体培地（チアミンを含まない）に懸濁し３０℃で１６時間培養した。細胞数１×１０７／ｍｌ程度まで培養後、菌体を遠心分離し、菌体を滅菌水で洗浄した。菌体サンプルを試験管に分注し、５０℃でそれぞれ０分、１分、３分、５分間保温した。Ｔａｑ１を発現していないＤ２６株もコントロールとして同様の操作を行った。
保温処理したＤ５０サンプルとＤ２６サンプルを、ＹＥプレートならびにアデニンをドロップアウトした選択培地（ＳＤ−ａｄｅ）に塗布し、７−１０日間３０℃で培養した。
ＹＥプレートには生存したすべての細胞がコロニー形成するのに対し、ＳＤ−ａｄｅプレートには組換えを起こしてａｄｅ＋になった細胞しかコロニー形成しないため、コロニーの発現数の割合から組換え頻度を測定することができる。ＳＤ−ａｄｅには１００μｌを塗布するが、ＹＥには培養液を１０４〜１０５倍に希釈して同量を塗布した。
実験の結果、タンパク質の発現後に温度を上昇させると、出芽酵母に比べてかなりの細胞が死に至ったが、それでも多数の細胞が生存した（図６ＡおよびＢ）。
ＴａｑＩ発現細胞を一過的に（５分間）加温すると、著しい相同組換え頻度の上昇（１００倍）が認められた。なお、この頻度は最も相同組換え頻度の高い減数分裂期の頻度に匹敵する（図７）。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実験酵母をガラクトース培地で２時間培養した後、５０℃で加温したときの組換え頻度を示す。横軸は５０℃で保温してから経過した時間、縦軸は組換え頻度を表示する。また、実線はＰＨＳ１４１プラスミドを組み込んだ株についての、破線はｐＹＥＳｌａｃＺプラスミドを組み込んだ株についての結果をそれぞれ示す。
【図２】実験酵母をガラクトース培地で２時間培養した後、３０、４０、４５、５０、５５℃で加温した場合と保温しなかった場合の組換え頻度を示す。縦軸は保温温度、縦軸は組換え頻度を示す。また、黒棒はＰＨＳ１４１プラスミドを組み込んだ株についての、白棒はｐＹＥＳｌａｃＺプラスミドを組み込んだ株についての結果をそれぞれ示す。
【図３】実験酵母をガラクトース培地で２時間培養した後、５０℃で１５分加温した場合としなかった場合の組換え頻度を示す。横軸は加温時間、縦軸は組換え頻度を示す。また、黒棒はＰＨＳ１４１プラスミドを組み込んだ株についての、白棒はｐＹＥＳｌａｃＺプラスミドを組み込んだ株についての結果をそれぞれ示す。
【図４】Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ  Ａ耐性を持つＰＨＳ１４１プラスミドを組み込んだ酵母をガラクトース培地で２時間培養した後、５０℃で加温したときの組換え頻度を示す。横軸は５０℃で加温してから経過した時間、縦軸は組換え頻度を示す。
【図５】ＰＨＳ１４１プラスミドを組み込んだ酵母から発現したタンパクをウェスタンブロッティング法で検出した結果を示す。ＰＨＳ１４１プラスミドを組み込んだ酵母をガラクトース培地で培養し、０、０．５、１．０、２．０時間経過した菌体を破壊して抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ウェスタンブロッティング法で膜に転写してタンパクを染色した。ＰＨＳ１４１プラスミドを組み込んだ株と、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ  Ａ耐性を持つＰＨＳ１４１プラスミドを組み込んだ株についてのそれぞれの結果を示す。
【図６】Ｔａｑ１発現細胞Ｄ５０および非発現細胞Ｄ２６を５０℃加温後０，１，３，５分後での生細胞の存在率を示す。０分を１００％とする。
【図７】ＴａｑＩ発現細胞Ｄ５０および非発現細胞Ｄ２６を５０℃加温後０，５分後でＹＥおよびＳＤ−ａｄｅプレートに塗布し、生存細胞に占める組換え体の割合を調べた結果を示す。また、各グラフに示される１〜６は、実験に用いた６枚のプレートに便宜的に付けられた番号である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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