(57)【要約】【課題】  ヒト翻訳開始因子eIF4Gに関係して引き起こされる疾患の発症機構の解明、診断および治療に利用可能な物質、または翻訳などの細胞内プロセスの研究に利用可能な物質を提供する。【解決手段】  SELEX法によって得られ、ヒト翻訳開始因子eIF4Gと結合するRNA。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜９記載の塩基配列で表されるRNA。
【請求項２】
請求項１記載のRNAの塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失若しくは挿入された塩基配列で表されるRNAであって、eIF4G若しくはそのファミリー又はそれらのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【請求項３】
請求項１又は２記載のRNAに別のRNAを付加したRNAであって、eIF4G若しくはそのファミリー又はそれらのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【請求項４】
請求項１〜３記載のRNAの一部を切断して短くしたRNAであって、eIF4G若しくはそのファミリー又はそれらのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【請求項５】
請求項１〜４記載のRNAにおいて少なくとも1個の修飾ヌクレオチドが導入されているRNAであって、eIF4G若しくはそのファミリー又はそれらのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【請求項６】
標識化されている請求項１〜５記載のRNA。
【請求項７】
請求項１〜４に記載のRNAの塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNA。
【請求項８】
請求項７に記載のDNAが挿入されたベクター。
【請求項９】
請求項１〜５に記載のRNAを用いて、eIF4G若しくはそのファミリー又はそれらのフラグメントを検出または定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は翻訳開始因子eIF4Gに結合するリボ核酸に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の生合成は遺伝情報発現の最終段階であり、生命の維持に極めて重要な反応である。遺伝子からタンパク質への翻訳はmRNAの示す情報に基づいておこなわれるが、その開始過程はいくつかの段階から成り立っており、多くの翻訳開始因子が逐次関与する複雑な反応である。真核細胞の翻訳開始因子（eIF）はそれらを構成するサブユニットや関連因子を含めると30種類以上が知られている。eIF4Gはモジュレーター（足場）的役割を担っている翻訳開始因子で、mRNA５’端のキャップ構造に結合するeIF4EとRNAヘリカーゼであるeIF4Aと結合してeIF4Fと呼ばれる複合体を形成する。eIF4FはmRNAのキャップ構造に結合し、40SリボソームサブユニットやeIF3から成る43S複合体をキャップ構造に導く。その際、eIF4GとeIF3の結合が重要となる。キャップ構造に導かれたリボソーム複合体はmRNAの非翻訳領域を開始コドンの位置まで移動する。40Sリボソームサブユニットから翻訳開始因子が解離すると、60Sリボソームサブユニットが40Sリボソームサブユニットに結合して翻訳を開始する。eIF4Gは60Sリボソームサブユニットが40Sリボソームサブユニットに結合する以前に40Sリボソームサブユニットから解離する必要があるが、詳しいことはわかっていない。
【０００３】
eIF4GはN末端ドメイン、中央ドメイン、C末端ドメインの3つのドメインで構成されている。N末端ドメインはeIF4EとPABPの結合部位を含んでいる。中央ドメインはeIF4AとeIF3の結合部位を、またRNAの結合部位を含んでいる。C末端ドメインはeIF4AとMnk1の結合部位を含んでいる。
【０００４】
eIF4GにはeIF4GIとeIF4GIIの2種類のアイソフォームが知られている。これらはアミノ酸配列で46％の相同性を保持しており、生体内ではよく似た役割を担っている。また、eIF4Gと相同性の高いタンパク質としてPaip1とDAP5が知られている。Paip1はPABPと結合して翻訳を活性化する。DAP5は別名p97またはNAT1と呼ばれており、キャップ依存の翻訳を抑制する。これらの相同性の高いタンパク質はeIF4Gファミリーと呼ばれている。
【０００５】
ウイルスは感染細胞中で宿主のキャップ依存型翻訳を抑制し、ウイルス自身の翻訳を開始するが、その過程でeIF4Gは中心的役割を演じる。ロータウイルスはそのmRNAの5'末端にキャップ構造を3'末端にコンセンサス配列（UGACC）を持つ。NSP3というタンパク質はこの3'末端のコンセンサス配列とeIF4GIに結合し、mRNAのループ構造の形成に関与する。NSP3はPABPよりeIF4GIに対する親和性が高いので、eIF4GIはNSP3により多く結合するようになり、宿主の翻訳はウイルスの翻訳に移行していく。この他、口蹄疫ウイルスやHIVウイルスなどは、eIF4GのeIF4Eとの結合部位を含むN末端ドメインを自身のプロテアーゼで切断し、eIF4Gが宿主mRNAと相互作用できないようにする。そして、eIF4Gの残りの部分がウイルスmRNAのIRESに結合してウイルス翻訳が開始される。
【０００６】
eIF4Gは翻訳開始過程以外のプロセスにおいても重要な役割を果たしていると考えられている。eIF4GはmRNAの分解過程で重要なDcp1というタンパク質と結合することが知られている。これはeIF4GがmRNAの翻訳と分解の両方に関係していることを示唆している。またeIF4Gは翻訳終結因子であるeRF3とPABPを介して相互作用することも知られており、翻訳の開始と終結の両方に関係している可能性がある。更にeIF4Gはスプライシング直後のmRNAのキャップ構造に結合するCBC複合体と結合し、mRNAの品質管理に関与していることが示唆されている。
【０００７】
以上示したようにeIF4Gは細胞の維持に極めて重要な因子であるが、このタンパク質の発現異常が細胞の癌化と密接に関係していることが知られている。Brassらは肺癌の細胞中でeIF4G遺伝子の増幅が見られることを発見した。また、ShimogoriらはNIH3T3細胞中でeIF4Gを過剰発現させると細胞が癌化することを報告している。この他、eIF4G以外の翻訳開始因子で癌化と関係があると考えられているものとしてeIF4EやeIF4Aなどが知られている。
【０００８】
近年、RNAアプタマーの医薬品への応用が注目されており、いくつかのRNAアプタマーが臨床段階に入っている。RNAアプタマーとはタンパク質などの標的物質に特異的に結合するRNAのことで、SELEX法により取得することができる。SELEX法とは1014程度の異なる塩基配列を持つRNAを含んだRNAプールから標的物質に特異的に結合するRNAを選別してくる方法である。RNAは40残基程度のランダム配列をプライマー配列で挟み込んだ構造をしている。このRNAプールを標的物質と会合させて、フィルターなどを用いて標的物質に結合したRNAのみ回収する。回収したRNAはRT-PCRで増幅し、これを次のラウンドのテンプレートとして用いる。この作業を10回程度繰り返すことにより、標的物質と特異的に結合するRNAアプタマーを取得することができる。得られたRNAアプタマーが標的物質の機能を促進したり阻害したりするような生理活性を持っていた場合、このRNAアプタマーを医薬品などに応用することができる。
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−３００８８５号公報
【非特許文献１】Ellington, A.D. and Szostak, J.W. (1990) In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature, 346, 818-822.
【非特許文献２】Tuerk, C. and Gold, L. (1990) Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science, 249, 505-510.
【非特許文献３】Oguro, A., Ohtsu, T., Svikin, Y.V., Sonenberg, N. and Nakamura, Y. (2003) RNA aptamers to initiation factor 4A helicase hinder cap-dependent translation by blocking ATP hydrolysis. RNA, 9, 394-407.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ヒト翻訳開始因子eIF4G若しくはそのファミリー又はそれらのフラグメントに関係して引き起こされる疾患の発症機構の解明、診断および治療に利用可能な物質、または翻訳などの細胞内プロセスの研究に利用可能な物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、SELEX法を用いてeIF4Gに特異的に結合するRNAアプタマーを作製し、得られたRNAアプタマーの結合活性をニトロセルロースフィルターを用いたフィルターバインディング実験で確認し、更に得られたRNAアプタマーの翻訳阻害活性をウサギ網状赤血球抽出液を用いた実験により確認した。本発明は以上の知見に基づき完成されたものである。
【００１２】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（９）を提供する。
【００１３】
（１）配列番号１〜９記載の塩基配列で表されるRNA。
【００１４】
（２）（１）記載のRNAの塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失若しくは挿入された塩基配列で表されるRNAであって、eIF4G若しくはそのファミリー又はそれらのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【００１５】
（３）（１）又は（２）記載のRNAに別のRNAを付加したRNAであって、eIF4G若しくはそのファミリー又はそれらのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【００１６】
（４）（１）〜（３）記載のRNAの一部を切断して短くしたRNAであって、eIF4G若しくはそのファミリー又はそれらのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【００１７】
（５）（１）〜（４）記載のRNAにおいて少なくとも1個の修飾ヌクレオチドが導入されているRNAであって、eIF4G若しくはそのファミリー又はそれらのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【００１８】
（６）標識化されている（１）〜（５）記載のRNA。
【００１９】
（７）（１）〜（４）に記載のRNAの塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNA。
【００２０】
（８）（７）に記載のDNAが挿入されたベクター。
【００２１】
（９）（１）〜（５）に記載のRNAを用いて、eIF4G若しくはそのファミリー又はそれらのフラグメントを検出または定量する方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によりeIF4Gに対して結合能を有するRNAアプタマーが提供される。本発明のRNAアプタマーはeIF4Gの機能解析や癌などの疾患の診断および治療に利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明のRNAには、以下の(a)〜(e)のRNAが含まれる。
【００２５】
(a)配列番号１〜９記載の塩基配列で表されるRNA。
【００２６】
(b)(a)記載のRNAの塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失若しくは挿入された塩基配列で表されるRNAであって、eIF4G若しくはそのファミリー又はそれらのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【００２７】
(c)(a)又は(b)記載のRNAに別のRNAを付加したRNAであって、eIF4G若しくはそのファミリー又はそれらのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【００２８】
(d)(a)〜(c)記載のRNAの一部を切断して短くしたRNAであって、eIF4G若しくはそのファミリー又はそれらのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【００２９】
(e)(a)〜(d)記載のRNAにおいて少なくとも1個の修飾ヌクレオチドが導入されているRNAであって、eIF4G若しくはそのファミリー又はそれらのフラグメントに対して結合活性を有するRNA。
【００３０】
(a)のRNAは、本発明者によって実際にSELEX法で取得されたRNAである。(a)のRNAの二次構造は図３〜図１１に示すとおりである。(a)のRNAのうち、配列番号１〜３の塩基配列で表されるRNAはウサギ網状赤血球抽出液を用いた翻訳阻害実験でキャップ構造に依存する翻訳を阻害することが確認されている。eIF4Gの過剰発現と細胞の癌化には密接な関係があるので、eIF4Gの機能を阻害するこれらのアプタマーは癌に対する予防または治療剤の有力な候補となり得る。配列番号４の塩基配列で表されるRNAはウサギ網状赤血球抽出液を用いた翻訳阻害実験でキャップ構造に依存する翻訳を阻害するとともに、C型肝炎ウイルスのIRES（HCV IRES）に依存する翻訳を阻害することが確認されている。また、配列番号2で表されるRNAは主にeIF4Gの中央ドメインに結合してeIF4AやeIF3の結合と競合するが、配列番号1で表されるRNAは主にeIF4GのC末端ドメインに結合してeIF4Aの結合と競合しない。このように、（a）のRNAは、異なる二次構造をとり、また、異なる性質を保持しており、それぞれの特徴を生かすことによって、eIF4Gに関係して引き起こされる疾患の発症機構の解明や翻訳などの細胞内プロセスの研究に利用できる。
【００３１】
(b)のRNAは、(a)のRNAに変異が導入されたものであって、(a)のRNAと同様にeIF4G若しくはそのファミリー又はそれらのフラグメントに対して結合活性を有するRNAである。ここで「結合活性を有する」とは、ランダム配列のRNAプールより高い結合活性を有していることを意味する。「eIF4Gファミリー」とは、eIF4Gを構成するドメインと類似のドメインで構成されているタンパク質（非天然タンパク質も含む。）のことをいい、例えば、PAIP1やDAP5などがこれに含まれる。「フラグメント」とはeIF4G若しくはそのファミリーの一部で、そのアミノ酸配列からそれがeIF4G若しくはそのファミリーの一部であると認識できるものである。
【００３２】
(a)のRNAに変異を導入し再度SELEXをおこなうことにより、(a)のRNAのeIF4Gに対する親和性を変化させることができる。導入する変異量は、結合活性を失わない範囲内であれば特に限定されるものではないが、1〜20塩基程度が適当と考えられる。また、1〜20塩基程度を欠失若しくは挿入することでも (a)のRNAとeIF4Gの親和性を変化させることができる。
【００３３】
(c)のRNAは、(a)又は(b)のRNAに別のRNAを付加したRNAである。例えば、5'末端又は3'末端にアデニル酸を16ヌクレオチド程度付加することにより、オリゴ(dT)セルロース（アマシャム社製）のビーズに(a)又は(b)のRNAを固相化することができる。また、(a)又は(b)のRNAに別の標的分子に親和性のある30〜100残基程度の長さのRNAを付加することで、2分子以上の分子を特異的に認識するRNAを作製することができる。このように別のRNAを付加することにより、種々の目的に合ったRNAアプタマーを作製することができる。
【００３４】
(d)のRNAは、(a)〜(c)のRNAを目的に応じて短くしたものである。例えば、(a)〜(c)のRNAの5'末端と3'末端の塩基対を形成していない部分は、結合活性や生理活性を保持したまま、その一部又は全部を切断することができる。切り詰める塩基の個数は特に限定されないが、一般に結合活性が落ちない限り短くした方がよいと考えられる。例えば、RNAアプタマーを細胞に導入する場合、一般により短いRNAの方が細胞毒性が低くなる。また、50残基程度以下の長さまで短くすることができると、効率よくそのRNAを化学合成できるようになる。
【００３５】
(e)のRNAは、(a)〜(d)のRNAのリボースの部分または核酸塩基の部分または5'末端または3'末端を修飾したものである。このような修飾により、RNAの安定性、結合活性、生理活性を高めることができる。例えば、ピリミジンヌクレオチドのリボースの2'-OHをフルオロ化するとリボヌクレアーゼA耐性になり、安定性が飛躍的に向上する。
【００３６】
以上の(a)〜(e)のRNAは、蛍光物質、放射性同位体、ビオチン、ジゴキシゲニン等で標識化することができる。このように標識化されたRNAは、eIF4Gの検出と定量に用いることができる。例えば、蛍光物質で標識化した前記RNAを細胞内に導入することで、細胞内でのeIF4Gの挙動が観察できる。また、末端をビオチン化し固相化することで、RNAアプタマーを用いたeIF4G分離カラムを作製することができる。
【００３７】
本発明には、上述した本発明のRNAのほかに、本発明のRNAの塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAや、そのようなDNAが挿入されたベクターも含まれる。このようなDNAおよびベクターはeIF4Gの異常に関係して引き起こされる疾患の遺伝子治療に用いることができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００３９】
最初に本実施例中に記載した実験の概要について説明する。
【００４０】
eIF4Gに対するRNAアプタマーはSELEX法を用いて作製した。GSTタグの付いた中央ドメインとC末端ドメインから成るヒトeIF4GIをグルタチオンセファロースに固相化してセレクションをおこなった。最初のプールとして40残基のランダム配列をもつRNAを用いた。12ラウンドセレクションをおこなった後、48クローンの塩基配列を調べたところ、配列番号2の塩基配列で表されるRNAが18クローン、配列番号1で表されるRNAが3クローン、配列番号3で表されるRNAが3クローン存在し、他は全て異なる配列からなっていた。
【００４１】
次に、配列番号1〜9で表されるRNA のeIF4Gに対する結合活性をニトロセルロースフィルターを用いたフィルター結合実験によって調べた。eIF4GとしてGSTタグの付いていない中央ドメインとC末端ドメインから成るヒトeIF4GIを用いた。配列番号4〜9で表されるRNAは塩基配列分析の結果1クローンのみ存在していた24クローンのうちから無作為に選んだ。
【００４２】
実験の結果、9種類のRNA全てがランダム配列のRNAプールより優位にeIF4Gに結合することがわかった（図1）。これらのRNAアプタマーの解離定数は0.1〜4μMの範囲内にあった。
【００４３】
次にこれらのRNAアプタマーが翻訳に与える影響を見るためにウサギ網状赤血球抽出液を用いた翻訳阻害実験をおこなった。基質としてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）とルシフェラーゼ（LUC）の遺伝子を含むバイシストロニックなmRNAを用いた（図2A）。CATのmRNAの5'末端にキャップ構造を付加し、LUCのmRNAの上流にHCV IRESを付加した（cap-CAT/HCV/LUC）。実験の結果、配列番号１〜３の塩基配列で表されるRNAはキャップ構造に依存するCATの翻訳を阻害した（図2B）。一方、HCV IRESに依存するLUCの翻訳は阻害しなかった。また、配列番号4の塩基配列で表されるRNAはCATとLUCの両方の翻訳を阻害した。他のRNAは翻訳を阻害しなかった。
【００４４】
Cap構造に依存する翻訳はeIF4Gを必要とするが、HCV IRES依存の翻訳はeIF4Gを必要としない。従って、上記の翻訳阻害実験の結果は、配列番号１〜３の塩基配列で表されるRNAがeIF4Gに特異的に結合して翻訳を阻害していることを強く支持している。
【００４５】
次に配列番号1の塩基配列で表されるRNAの5'末端と3'末端を6塩基ずつ切り詰めたRNAの結合活性と翻訳阻害活性を調べた。フィルター結合実験の結果、切り詰めたRNAの結合活性は元のRNAの結合活性とほぼ同じであることがわかった。また、ウサギ網状赤血球抽出液を用いた翻訳阻害実験では、切り詰めたRNAは元のRNAと同程度にキャップ構造に依存するCATの翻訳を阻害した。
【００４６】
［実施例1］精製タンパク質
本発明で用いた中央ドメインとC末端ドメインから成るヒトeIF4GIはGSTタグのついた融合タンパク質として大腸菌内で過剰発現させ、Ni-NTAアガロース（キアゲン社製）を用いて粗精製し、さらに陰イオン交換カラムResource Q（アマシャムバイオサイエンス社製）により精製した。
【００４７】
［実施例2］RNAアプタマーの取得
SELEXはEllingtonらの方法（Ellington and Szostak, Nature 346, 818-822, 1990）及びTuerkらの方法（Tuerk and Gold, Science 249, 505-510, 1990）を改良しておこなった。最初のラウンドで用いたRNAは、化学合成によって得られたDNAをT7 RNAポリメラーゼによって転写して得られた。DNA鋳型として40残基のランダム配列の両側にプライマー配列を持った長さ90残基のものを用いた。DNA鋳型の配列とプライマー配列を以下に示す。
【００４８】
DNA鋳型: 5'-ctctcatgtcggccgtta-40N-cgtccattgtgtccctatagtgagtcgtatta-3'（配列番号１０）
プライマーA: 5'-taatacgactcactatagggacacaatggacg-3'（配列番号１１）
プライマーB: 5'-ctctcatgtcggccgtta-3'（配列番号１２）
プライマーAはT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。最初のラウンドで用いたRNAプールのバリエーションは理論上1014であった。
【００４９】
標的eIF4Gはグルタチオンセファロースビーズ（アマシャム社製）に吸着させて固相化した。これにRNAプールを加え30分間室温で保持した後、標的eIF4Gに結合しなかったRNAを溶液Aで洗い流した。ここで溶液Aは80mM酢酸カリウム（KOAc）、2.5mM酢酸マグネシウム（MgOAc）、20mM pH7.6トリスの混合溶液である。標的eIF4Gに結合したRNAは還元型グルタチオンを加えて回収し、RT-PCRで増幅後、T7 RNAポリメラーゼによって転写し、次のラウンドに用いた。12ラウンド終了後、PCR産物をpGEM-T Easyベクター（プロメガ社製）にサブクローニングし、大腸菌株NovaBlue（Novagen社製）にトランスフォーメーションした。単一コロニーからプラスミドを抽出後、DNAシーケンサー（ABI PRISM 3100、ABI社製）で塩基配列を決定した（配列番号１〜９を含む）。RNAの二次構造はMFOLDROOTプログラム（Zuker, Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415, 2003）を用いて予測した（図3〜11）。
【００５０】
［実施例3］結合活性の評価
12ラウンド後に得られたRNAのうち9種類のRNA（配列番号１〜９）のeIF4Gに対する結合活性を、ニトロセルロースフィルターを用いたフィルター結合実験によって評価した。eIF4Gとして、GSTタグの付いていない中央ドメインとC末端ドメインから成るeIF4GIを用いた。32Pで標識されたRNAとeIF4Gを混合し室温で30分保持した後、この混合液をニトロセルロースフィルターでろ過した。ニトロセルロースフィルターにタンパク質は吸着しやすいので、eIF4Gに結合したRNAはフィルター上に残る。フィルターを溶液Aで洗浄してeIF4Gに結合していないRNAを洗い流した後、フィルター上に残った32Pのカウントをシンチレーター（Beckman社製）で測定した。結合率は系に加えた全RNAの32Pのカウントに対するフィルターに吸着したRNAの32Pのカウントの相対量で表した。結合定数はeIF4Gの濃度を変えた実験をおこない、RNAinitial/RNAtrapped=Kd/[eIF4G]initialの関係から求めた。
【００５１】
以上の実験の結果を図１に示す。図に示すように、配列番号１〜９で表されるRNAのいずれもランダム配列のRNAプールよりも優位にeIF4Gに結合した。
【００５２】
［実施例4］翻訳阻害実験
翻訳阻害実験はウサギ網状赤血球抽出液（プロメガ社製）を用いておこなわれた。基質としてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）とルシフェラーゼ（LUC）の遺伝子を含むバイシストロニックなmRNAを用いた。CAT遺伝子の５‘末端はキャッピングされており、LUCはその上流にHCVのIRESが付加されていた（cap-CAT/HCV/LUC）。mRNAのキャッピングは、T7 RNAポリメラーゼによる転写の際にm7GpppGキャップアナログ（プロメガ社製）を加えることでおこなわれた。転写にはT7 Ribo MAX system（プロメガ社製）を用いた。
【００５３】
In vitro翻訳は以下のような組成の混合液を用いて行った。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
上記の混合溶液を30℃で30分保持した後、その一部をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルを乾燥させてイメージングプレートに約4時間感光させた後、BAS-2000（フジフィルム）で解析した。
【００５６】
配列番号１で表されるRNA（濃度0〜4μM）を用いた上記翻訳阻害実験の結果を図２Ｂに示す。図中のCAT%は、RNAアプタマー無添加時のCAT翻訳量に対するRNAアプタマー添加時のCAT翻訳量の比を示す（LUCの翻訳量では補正していない）。図に示すように、RNAを0.5 μM加えるとCATの翻訳量は30%まで低下したが、LUCの翻訳量は低下しなかった。
【００５７】
［実施例5］末端欠損RNAの作製
配列番号1で表されるRNAと化学合成した以下のプライマーを用いて、配列番号１で表されるRNAの5'末端と3'末端が6塩基ずつ欠損したRNAを作製した。T7 RNAポリメラーゼによる転写の関係で5'末端にグアノシンを1残基付加し、全長を65残基とした。
【００５８】
プライマーC: 5'-taatacgactcactatagacaatggacgcacctcc-3'（配列番号１３）
プライマーD: 5'-tgtcggccgttagcatttag-3'（配列番号１４）
この末端欠損RNAを用いて実施例３（結合活性の評価）及び実施例４（翻訳阻害実験）と同様の実験を行った。実験の結果、末端欠損RNAは元のRNAとほぼ同様の結合活性及び翻訳阻害活性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ニトロセルロースフィルターを用いたフィルター結合実験の結果を示す図。
【図２】実施例４で用いたmRNAの概略図（図２Ａ）、実施例４の翻訳阻害実験の結果を示す図（図２Ｂ）。
【図３】配列番号１で表されるRNAの二次構造予測図。
【図４】配列番号２で表されるRNAの二次構造予測図。
【図５】配列番号３で表されるRNAの二次構造予測図。
【図６】配列番号４で表されるRNAの二次構造予測図。
【図７】配列番号５で表されるRNAの二次構造予測図。
【図８】配列番号６で表されるRNAの二次構造予測図。
【図９】配列番号７で表されるRNAの二次構造予測図。
【図１０】配列番号８で表されるRNAの二次構造予測図。
【図１１】配列番号９で表されるRNAの二次構造予測図。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図２】
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【配列表】
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