(57)【要約】【課題】  ポリカチオンとそれを担持し得る水不溶性担体とを含む物質であって、菌体吸着能や核酸吸着能を有し、かつ容易に製造されることができる物質を提供する。また、該物質を含む菌体吸着除去剤、および核酸デリバリー材料を提供する。【解決手段】  ポリカチオン、水難溶性カルシウム塩、および溶媒を含む混合物から、溶媒を除去することにより得られる生成物が提供される。好ましくは、当該ポリカチオンはポリリジンである。また、当該生成物を含む組成物が提供される。【選択図】            なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリカチオン、水難溶性カルシウム塩および溶媒を含む混合物から、溶媒を除去することにより得られる生成物。
【請求項２】
混合物が、ポリカチオン、水溶性カルシウム塩、該水溶性カルシウム塩を水難溶性カルシウム塩とする化合物および溶媒を混合して得られることを特徴とする、請求項１に記載の生成物。
【請求項３】
ポリカチオンがフリーのポリカチオンであることを特徴とする、請求項１または２に記載の生成物。
【請求項４】
ポリカチオンがポリアミノ酸であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生成物。
【請求項５】
ポリカチオンがポリリジンであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の生成物。
【請求項６】
ポリカチオンがε−ポリリジンであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の生成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の生成物を含む、口腔内エンドトキシンを除去するための組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の生成物を含み、核酸を吸着して、吸着した核酸を細胞に導入するための組成物。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の組成物を製造する方法であって、
ポリカチオン、水難溶性カルシウム塩および溶媒を含む混合物から溶媒を除去することにより得られる生成物を配合するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリカチオンおよびカルシウム塩を含む物質、およびそれを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリカチオンを不溶性担体に結合させた物質は、１）口腔内から、歯周炎の原因となるエンドトキシンを除くため、２）核酸を吸着し、かつ吸着した核酸を細胞に導入するため（核酸のＤＤＳ）、または３）イオン交換体として用いられている。
【０００３】
歯周炎は、以下のメカニズムで発症する。歯の表面に付着した病原細菌が、エンドトキシンであるＬＰＳ（リポ多糖類）を放出する。次に、このＬＰＳが歯周組織を構成する特定のタンパク質と結合する。そして、その結合体が更に単球に結合して、この単球が活性化することから歯周炎は発症する。活性化した単球からは、IL-1（インターロイキン１）、TNF−α（腫瘍壊死因子）などのサイトカイン類やPGE2（プロスタグランジンE2）が過剰に生産され、これらのサイトカイン類やPGE2が歯周組織に炎症をもたらす。また、エンドトキシンの作用としては、歯と歯肉の接着を妨げることが知られている。サイトカイン類やPGE2が血流を通して全身へ伝播することにより、歯周のみならず全身性疾患へと炎症が侵攻する可能性があることは一般的に知られている。
このようにエンドトキシンは口腔内の疾患に深く関わっている毒素であり、このエンドトキシンを除去することは歯周炎の治療にとって重要なことである。
【０００４】
口腔内エンドトキシンを吸着除去するための技術がいくつか知られている。
ポリリジンなどのカチオン性ポリマーを口腔内エンドトキシンの吸着除去剤に用いる技術が知られている（特許文献１）。この技術では、水不溶性担体にカチオン性ポリマーを固定化した吸着除去剤が用いられる。この吸着除去剤は共有結合でカチオン性ポリマーを水不溶性担体に結合させている。
【０００５】
また、フゾバクテリウムなどの口腔内微生物を除去する技術も知られている。
例えば、カチオン性アミノ酸やそれを含むペプチドを水不溶性担体へ固定化した口腔用組成物を用いて、口腔内微生物を吸着除去する技術が例示される（特許文献２）。この口腔用組成物も、ペプチドなどが、共有結合によって多糖系水不溶担体に固定化されているため、製造方法が煩雑である。
【０００６】
ドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）は、薬効を持続させ、投与量を低減させ、かつ副作用などを減らすことが可能な投与法である。ホルモン治療薬のＤＤＳとして、生体内分解性高分子化合物である乳酸重合体を担体としたマイクロカプセルに酢酸リュープロレリンを含有させた、リュープリン（武田薬品工業株式会社製）が有名である。
【０００７】
核酸のＤＤＳとして、ウイルス系ベクターや非ウイルス系ベクターが知られている。非ウイルス系ベクターには、ポリカチオン（特にポリエチレンイミンやα−ポリリジン、リジンデンドリマー、キトサンなど）が応用されている。例えば、ポリカチオンとタンパク質との結合体を、ウイルスベクターとして応用することが知られている（特許文献３）。しかしながら、これらの非ウイルス系ベクターは、ウイルス特有の問題は無いものの、細胞毒性が強い点や遺伝子の導入効率、発現効率が低いという問題がある。
【０００８】
イオン交換法は、重金属化合物、アンモニア性窒素、リン酸化合物などの汚濁物質を除去したり、有価物として回収再利用したりすることに用いられる。イオン交換法は、排水
基準が今後強化されていくと考えられる状況から鑑みても、廃水処理などに今後とも採用されていくものと考えられている。
イオン交換法は、イオン交換反応を示す物質であるイオン交換体を用いて行われる。イオン交換体は、不溶性担体にイオン交換能を有する物質（例えばポリカチオン）を結合させて得られる。イオン交換体の担体の例には、セルロースイオン交換体に代表される多糖系担体、および合成樹脂系担体が含まれる。
【０００９】
イオン交換能を有する物質であるポリカチオンは、不溶性担体である多糖と、多糖に存在する水酸基と架橋基を解して結合される必要がある。ここで架橋は、エピクロルヒドリンなどを架橋剤として用いて行われる。
また、合成樹脂を不溶性担体とするイオン交換体は、カチオン性モノマー（ポリカチオンの構成モノマー）を含むモノマー組成物を重合させることで製造される。
【００１０】
前述のように、ポリカチオンを不溶性担体に結合させた物質は種々の用途を有する。
一般的に、これらの物質はいずれも、不溶性担体である微粒子に、吸着能またはイオン交換能を有するリガンド（すなわちポリカチオン）を固定化して製造されることが多い。
【００１１】
不溶性担体である微粒子は、シリカゲル、セルロースなどの多糖系ゲル、またはアクリル系、ビニル系、スチレン系、ナイロン、エポキシ系などの合成ポリマー系の物質から合成されることが多い。
吸着能またはイオン交換能を有するリガンドであるポリカチオンは、塩基性を示す水溶性の高分子である。通常、ポリカチオンを吸着剤またはイオン交換体として用いるためには、不溶性担体である微粒子に固定化する必要がある（例えば非特許文献１参照）。不溶性担体へのポリカチオンの固定化は、一般的に、アミノ基と反応性を有する活性基を導入された不溶性担体に、ポリカチオンを反応させて共有結合させて行われる。不溶性担体に導入される、アミノ基と反応させる活性基としては、エポキシ基、アルデヒド基、クロロメチル基、カルボキシル基、酸クロライド基などが知られている。
【００１２】
一方ポリカチオンは、植物抽出物と併用されることにより、植物抽出物が有するグルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）阻害活性を向上させて、歯垢形成抑制効果を改善させることが知られている（特許文献４）。
【特許文献１】特開２００４−２９２３５７号公報
【特許文献２】特開平６−２８７１２６号公報
【特許文献３】特表平６−５０５９８０号公報
【特許文献４】特開２００４−１９６７５６号公報
【非特許文献１】Liq.Chrom&Rel.Technol. , 25(4), 2002, 601-614
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、ポリカチオン、およびポリカチオンを担持することができる担体を含む新たな物質を提供することを課題とする。
特に、ポリカチオンを担持するために活性化される必要がなく、天然系物質を主成分とするので消費者に対するイメージがよく、かつポリカチオンと組み合わされることにより、菌体毒素の吸着力を発揮し、ＤＤＳの材料やイオン交換体として用いられ得る担体を提供することを課題とする。
さらに本発明はポリカチオンと担体を含む物質であって、従来以上に、その菌体毒素の吸着力、または核酸の吸着力が向上された物質を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者等は、新たなポリカチオンの担体を求めて鋭意研究を重ねた結果、ポリカチオ
ンとカルシウム塩類とを混合させることにより得られる生成物が、ポリカチオンを担持し、かつ低塩濃度の水溶液においても担持されたポリカチオンを分離させることなく結合していることを見出した。そこで、カルシウム塩をポリカチオンの担体として用いることを検討した。すなわち本発明は以下の通りである。
【００１５】
［１］  ポリカチオン、水難溶性カルシウム塩および溶媒を含む混合物から、溶媒を除去することにより得られる生成物。
［２］  混合物が、ポリカチオン、水溶性カルシウム塩、該水溶性カルシウム塩を水難溶性カルシウム塩とする化合物および溶媒を混合して得られることを特徴とする、［１］に記載の生成物。
［３］  ポリカチオンがフリーのポリカチオンであることを特徴とする、［１］または［２］に記載の生成物。
［４］  ポリカチオンがポリアミノ酸であることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれかに記載の生成物。
［５］  ポリカチオンがポリリジンであることを特徴とする、［１］〜［４］のいずれかに記載の生成物。
［６］  ポリカチオンがε-ポリリジンであることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載の生成物。
［７］  ［１］〜［６］のいずれかに記載の生成物を含む、口腔内エンドトキシンを除去するための組成物。
［８］  ［１］〜［６］のいずれかに記載の生成物を含み、核酸を吸着して、吸着した核酸を細胞に導入するための組成物。
［９］  ［７］又は［８］に記載の組成物を製造する方法であって、ポリカチオン、水難溶性カルシウム塩および溶媒を含む混合物から溶媒を除去することにより得られる生成物を配合するステップを含む方法。
［１０］  水難溶性カルシウム塩が、CaF2、CaSO4、および下記の組成式１または２で表される塩からなる群から選択される一種または二種以上の混合物であることを特徴とする、［１］に記載の生成物。
［組成式１］  ＨwＣａxＯyＰz・Ａb
組成式１において、Ｈは水素、Ｃａはカルシウム、Ｏは酸素、Ｐはリンを示す。
ｗは０以上、ｘ，ｙ，zは１以上の整数を示す。
またＡは水素、カルシウム、酸素、リン以外の元素または組成であり、カルシウムの難溶性を妨げないもの、例えばフッ素であり、ｂは０以上の整数を示す。
［組成式２］  ＨwＣａxＯyＣz・Ａb
Ｈは水素、Ｃａはカルシウム、Ｏは酸素、Ｃは炭素を示す。
ｗは０以上、ｘ，ｙ，zは１以上の整数を示す。
またＡは水素、カルシウム、酸素、炭素以外の元素または組成でありカルシウムの難溶性を妨げないもの、例えばマグネシウムであり、ｂは０以上の整数を示す。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の生成物は菌体毒素吸着力または核酸吸着力を有するので、本発明の生成物を含む組成物は、菌体毒素吸着除去剤や核酸デリバリー担体などとして用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
＜本発明の生成物＞
本発明の生成物は、ポリカチオン、水難溶性カルシウム塩および溶媒を含む混合物（以下、この混合物を「混合液」と称する）から溶媒を除去することにより得られる物質であり、例えば乾燥粉末などでありうる。
本発明の生成物は、ポリカチオンと水難溶性カルシウム塩との複合塩、またはポリカチオンと水難溶性カルシウム塩との混合物であってもよい。後述の通り本発明の生成物は、
低塩濃度の水溶液に懸濁されてもポリカチオンを溶離させない（または、させにくい）ので、ポリカチオンの少なくとも一部は水難溶性カルシウム塩との複合塩として存在していると考えられる。
また、後述の通り本発明の生成物は、ポリカチオンと水難溶性カルシウム塩混合物、およびポリカチオン塩酸塩と水難溶性カルシウム塩混合物とエンドトキシン吸着効率が異なるので、本発明の生成物は単なる混合物ではなく水難溶性カルシウム塩に担持されたポリリジンを含むものと考えられる。
【００１８】
混合液に含まれるポリカチオンとは、カチオン性基またはカチオン性基になり得る基を有する高分子化合物であって、フリーのポリカチオンの水溶液は塩基性を示す。カチオン性基になり得る基の例には、アミノ基、イミノ基などが含まれる。
【００１９】
ポリカチオンの例には、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリトリプトファン、ポリ−２，４−ジアミノブチリックアシッド、ポリ−２，３−ジアミノプロピオン酸、及びプロタミン、ならびにリジン、ヒスチジン、アルギニン、トリプトファン、オルニチン、２，４−ジアミノブチリックアシッド、及び、２，３−ジアミノプロピオン酸からなる群から選ばれる、少なくとも一種以上のアミノ酸の残基をポリペプチド鎖中に含むポリペプチドなどのポリアミノ酸；ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、アリルアミンとジアリルアミンとの共重合物、及びポリジアリルアミンなどのポリアミン；ポリエチレンイミンなどのポリイミンが含まれる。
【００２０】
ポリカチオンのより好ましい例にはポリアミノ酸が含まれ、さらに好ましい例にはポリリジンなどが含まれる。ポリリジンは、ε−ポリリジン、α−ポリリジン、またはαとεの混合されたポリリジンであってもよいが、好ましくはε−ポリリジンである。ε−ポリリジンの好ましい重合度は２５〜３５である。また、ε−ポリリジンの平均重合度は約３１であることが好ましい。ε−ポリリジンは、発酵生産により製造され化学合成品よりも安価である点、食品添加剤として長年使用されており安全性が高い点などから最も好ましく使用される。
また、ポリリジンはリジンのデンドリマーであってもよい。
【００２１】
混合液に含まれるポリカチオンはフリーのポリカチオンであることが好ましい。すなわち、ポリカチオンは酸性物質と作用することにより塩となりうるが、本発明で用いられるポリカチオンはそのような塩でないことが好ましい。その理由は以下の通りである。
１）フリーのポリカチオンを用いることにより、塩のポリカチオンを用いた場合と比べて、生成物におけるポリカチオンの含有量を高くすることができる。これは後述の実施例にも示されている。
２）フリーのポリカチオンを用いて得られた生成物は、塩酸塩のポリカチオンを用いて得られた生成物と比べて、ポリカチオンが分離（例えば溶離）しにくくなる。
３）フリーのポリカチオンを用いて得られた生成物は、塩酸塩のポリカチオンを用いて得られた生成物と比べて、ポリカチオン含有量が同じであっても、エンドトキシン吸着能が高いことがある。これは後述の実施例にも示されている。
これらの理由は定かではないが、フリーのポリカチオンは、カルシウム塩と複合塩を形成しやすいため、カルシウム塩がより多くのポリカチオンを担持し、かつ担持したポリカチオンを分離させず、結果として吸着能が向上するものと考えることができる。
【００２２】
混合液に含まれる水難溶性カルシウム塩とは、カルシウムイオンと、カルシウムイオンと結合して水難溶性塩を形成するイオンから構成される無機カルシウム塩である。混合液に含まれる水難溶性カルシウム塩は、一種単独でもよいが、二種以上の組み合わせでもよい。
水難溶性カルシウム塩の例としては、CaF2、CaSO4、および下記の組成式１または２で
表される塩からなる群から選択される一種または二種以上の混合物が含まれる。
【００２３】
［組成式１］  ＨwＣａxＯyＰz・Ａb
組成式１において、Ｈは水素、Ｃａはカルシウム、Ｏは酸素、Ｐはリンを示す。
ｗは０以上、ｘ，ｙ，zは１以上の整数を示す。
またＡは水素、カルシウム、酸素、リン以外の元素または組成であり、カルシウムの難溶性を妨げないもの、例えばフッ素であり、ｂは０以上の整数を示す。
【００２４】
組成式１で表される水難溶性カルシウム塩の例には、リン酸カルシウム類（ヒドロキシアパタイトを含む）が含まれ、具体的には、Ca3(PO4)2，CaHPO4，Ca10(PO4)6(OH)2，二リ酸カルシウム(ピロリン酸カルシウム) Ca2P2O7，二リン酸二水素カルシウム(ピロリン酸二水素カルシウム) CaH2P2O7，水酸化トリスリン酸５カルシウム（Ca5(OH)（PO4）3），フルオロアパタイトCa10(PO4)6F2、およびこれらの群から選択される一種または二種以上の混合物などが含まれる。さらに好ましい例には、Ca3(PO4)2，Ca10(PO4)6(OH)2，およびCa3(PO4)2とCa10(PO4)6(OH)2の混合物が含まれる。
【００２５】
［組成式２］  ＨwＣａxＯyＣz・Ａb
Ｈは水素、Ｃａはカルシウム、Ｏは酸素、Ｃは炭素を示す。
ｗは０以上、ｘ，ｙ，zは１以上の整数を示す。
またＡは水素、カルシウム、酸素、炭素以外の元素または組成でありカルシウムの難溶性を妨げないもの、例えばマグネシウムであり、ｂは０以上の整数を示す。
【００２６】
組成式２で表される水難溶性カルシウム塩の例には、炭酸カルシウム類が含まれ、具体的にはCaCO3，CaMg(CO3)2などが含まれる。さらに好ましい例には、CaCO3が含まれる。
【００２７】
ポリカチオン、水難溶性カルシウム塩および溶媒を含む混合液は、
Ａ）ポリカチオンと水難溶性カルシウム塩を溶媒中で混合させて調製される混合液（「混合液Ａ」と称する）であってもよく、
Ｂ）ポリカチオン、水溶性カルシウム塩、この水溶性カルシウム塩を水難溶性カルシウム塩とする化合物を、溶媒中で混合させて調製される混合液（「混合液Ｂ」と称する）であってもよい。
【００２８】
混合液Ａにおいて混合されるポリカチオン、および水難溶性カルシウム塩は、前述のポリカチオン、および水難溶性カルシウム塩と同様である。
【００２９】
混合液Ａにおける溶媒は、水難溶性カルシウム塩を溶解させにくく、かつポリカチオンを溶解させやすい水性溶媒が好ましい。
水性溶媒の例には、水、エタノール、イソプロピルアルコール、水・エタノールの混合液、メタノールなどが含まれる。好ましい水性溶媒は水、エタノール、イソプロピルアルコール、水・エタノールの混合液であり、さらに好ましい水性溶媒は水である。
【００３０】
混合液Ａの調製において、溶媒に含まれる水難溶性カルシウム塩類の含有量は、ポリカチオン溶液と水難溶性カルシウム塩類が均一に混合できる組成であればよく、好ましくは等量から３倍量である。具体的に好ましい含有量は０．１〜１ｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは０．２〜１ｇ／ｍｌである。一方、溶媒に含まれるポリカチオンの含有量は、好ましくは１〜３３０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは１〜５０ｍｇ／ｍｌである。
また、混合液Ａにて混合される水難溶性カルシウム塩類と、ポリカチオンの比率は、ポリカチオン量に特に制限はなく、多くても構わないが、過剰のポリカチオンを流す水洗浄を考慮すると、好ましくは質量比で０．３：１〜２００：１であり、さらに好ましい質量比は２０：１〜２００：１である。
【００３１】
また、混合液Ａにて混合される水難溶性カルシウム塩の粒径は、１〜１００μｍであることが好ましい。水難溶性カルシウム塩の粒径は、市販の食品添加物リン酸カルシウムの粉末程度でもよく、口腔内での使用限定の場合は、数十μｍ程度が好ましい。粒径を調整することにより、得られる生成物におけるポリカチオンの含有量を調整することができる。
【００３２】
混合液Ａの調製における混合は、水難溶性カルシウム塩または得られた生成物が均一に分散されるように行われることが好ましい。混合の手段は特に制限されないが、例えば、攪拌器、ホモミキサー、分散機などを用いて行うことができる。
【００３３】
混合液Ａの調製における混合は、ポリカチオンが分解しない温度で行われればよく、１０〜６０℃の温度で行うことが好ましい。また、混合する時間は特に制限はないが、１〜８時間であることが好ましい。
【００３４】
混合液Ｂにおいて混合されるポリカチオンは、前述のポリカチオンと同様である。
【００３５】
混合液Ｂにおいて混合される水溶性カルシウム塩は、溶媒に溶解されるものであれば特に制限されないが、無機カルシウム塩であることが好ましい。また水溶性カルシウム塩は、混合液Ｂにおいて水難溶性カルシウム塩を形成し、形成された水難溶性カルシウム塩類は溶媒中に析出される。
水溶性カルシウム塩の例には、塩化カルシウム、Ca(H2PO4)2、酢酸カルシウム、乳酸カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウムなどが含まれる。好ましくは、塩化カルシウム、Ca(H2PO4)2、酢酸カルシウム、乳酸カルシウムである。
【００３６】
混合液Ｂにおいて混合される「水溶性カルシウム塩を水難溶性カルシウム塩とする化合物」とは、カルシウムイオンと結合することにより水難溶性塩を形成するイオンを溶媒中で発生する化合物であれば特に制限はない。このイオンの例には、リン酸イオン、硫酸イオンなどが含まれる。リン酸イオンを発生する化合物の例には、リン酸ナトリウム、リン酸アンモニウム、リン酸、リン酸１水素ナトリウム、リン酸２水素ナトリウム、リン酸カリウムなどが含まれる。
【００３７】
混合液Ｂにおける溶媒は、水溶性カルシウム塩と、ポリカチオンとを溶解させる溶媒であることが好ましく、かつ混合により生成した物質を析出（沈殿）させることができる水性溶媒であることが好ましい。
水性溶媒の例には、水、エタノール、イソプロピルアルコール、水・エタノールの混合液、メタノールなどが含まれる。好ましい水性溶媒は水、エタノール、イソプロピルアルコール、水・エタノールの混合液であり、さらに好ましい水性溶媒は水である。
【００３８】
混合液Ｂの調製において、混合液における水溶性カルシウム塩の含有量は、０．０５〜０．５ｍｏｌ／ｌであることが好ましい。一方、水溶性カルシウム塩を水難溶性カルシウム塩とする化合物の含有量は、０．１〜１．０ｍｏｌ／ｌであることが好ましい。
混合液Ｂの調製において、混合される水溶性カルシウム塩と、水溶性カルシウム塩を水難溶性カルシウム塩とする化合物の比率は、（モル比で）２：１〜１：２であることが好ましい。
【００３９】
混合液Ｂに含まれるポリカチオンの含有量は０．０１〜０．１０ｇ／lであることが好ましい。また、混合液Ｂの調製において、混合されるポリカチオンは、カルシウム塩に対して、２０〜２０００ｇ／ｍｏｌであることが好ましい。
【００４０】
混合液Ｂは、前述の３種類の成分を溶媒中で混合させればよく、その手順（例えば、各成分の溶媒への添加順序など）は特に制限されない。
好ましい手順としては、
１）水溶性カルシウム塩と、水溶性カルシウム塩を水難溶性カルシウム塩とする化合物を含む溶液に、ポリカチオンを添加するか、
２）ポリカチオンを含む均一溶液に、水溶性カルシウム塩と、水溶性カルシウム塩を水難溶性カルシウム塩とする化合物とを添加するか、
３）ポリカチオンと水溶性カルシウム塩とを含む均一溶液であっても、固液混合体であってもよい溶液に、水溶性カルシウム塩を水難溶性カルシウム塩とする化合物を添加するか、または
４）ポリカチオンと水溶性カルシウム塩を水難溶性カルシウム塩とする化合物を含む溶液に、水溶性カルシウム塩を添加する手順が考えられる。
【００４１】
さらに、３種類の成分を混合させた系が酸性である場合は、必要に応じて中和して中性〜塩基性（ｐＨ７〜９）にすることが好ましい。中和剤としては水酸化カリウムなどを用いればよい。ただし、水酸化カリウムとポリリジンのみを混合加熱すると加水分解を起こすことがあるため、ポリカチオンのみの溶液には水酸化カリウムを添加しないことが好ましい。
【００４２】
混合液Ｂの調製における混合は、混合液Ａの調製における混合と同様に、水溶性カルシウム塩、および水溶性カルシウム塩を水難溶性カルシウム塩、ならびに析出した生成物が均一に分散されるように行われることが好ましい。混合の手段は特に制限されず、混合液Ａの調製における混合と同様である。
【００４３】
混合液Ｂの調製における混合は、２０〜９５℃の温度で行うことが好ましい。なお、ポリカチオンは６０℃以上の高温にすると分解する可能性があるため、ポリカチオンを混合する際は、１０〜６０℃の温度で行うことが好ましい。また、混合する時間は１〜１０時間であることが好ましい。
【００４４】
本発明の生成物は、前述の混合液に含まれる溶媒を除去することにより得られるが、ここで溶媒の除去は、ろ過及び／又は溶媒の留去などにより行われる。ここで、溶媒はその少なくとも一部が除去されればよいが、好ましくは実質的に全てが除去される。溶媒を除去することにより、ポリカチオンを水難溶性カルシウム塩に、より強固に担持することができると考えられる。
【００４５】
混合液から溶媒を除去して得られた生成物は、洗浄、乾燥などの処理をされることができる。例えば、水で洗浄することにより、不純物（例えば、水難溶性カルシウム塩に未結合のポリカチオン）を除去することができる。また、乾燥することにより、乾燥粉末とすることができる。乾燥はどのような手段で行われてもよく、例えば、加熱乾燥、減圧乾燥（真空乾燥を含む）、凍結乾燥、噴霧乾燥などで行われる。
【００４６】
本発明の生成物は水難溶性カルシウム塩とポリカチオンとを含むが、ポリカチオンの含有量は、生成物全体に対して０．０１質量％以上であることが好ましく、０．０５質量％以上であることがより好ましく、０．２質量％以上であることがさらに好ましい。
ポリカチオンの含有量は、生成物の製造において、ポリカチオンの種類や量、カルシウム塩の種類や粒径、および混合する条件などを適宜選択することにより調整されるが、例えば、フリーのポリカチオンを用いた場合は、ポリカチオンの塩（例えば塩酸塩）を用いた場合よりもその含有量が高くなる。
本発明の生成物におけるポリカチオンの含有量は、ケールダール法により測定された窒素含有量から算出される。
【００４７】
本発明の生成物は、水難溶性カルシウム塩とポリカチオンとを含むが、低塩濃度の水溶液（例えば、生体系の塩濃度域の水溶液、生理食塩水）（０．１５mol／ｌ程度）に懸濁されてもカルシウムを溶離させないか、させにくいことを特徴とする。特に、唾液の塩濃度に相当するバッファーに懸濁された本発明の生成物からは、ポリカチオンが溶離しにくい。
したがって、ポリカチオンの少なくとも一部は水溶性カルシウム塩と複合塩を形成していると考えられる。
【００４８】
本発明の生成物は菌体毒素を吸着する性質を有する。菌体毒素の好ましい例には、口腔内毒素であるエンドトキシンが含まれる。したがって、本発明の生成物は、菌体毒素を吸着除去するための組成物（吸着除去剤）に含有されることが好ましい。この組成物は、例えば口腔内洗浄剤、チューインガムなどに応用され得る。
【００４９】
本発明の生成物は核酸を吸着する性質を有する。核酸の例にはデオキシリボ核酸、リボ核酸が含まれる。したがって本発明の生成物は、核酸を吸着し、吸着した核酸を細胞内に送達する（核酸デリバリー）ための組成物の成分として含有されることが好ましい。この組成物は、例えば化粧品、ドラッグデリバリー担体、遺伝子導入用担体、診断薬用担体などに応用され得る。
【００５０】
＜本発明の組成物＞
本発明の組成物は、前述の本発明の生成物を含むことを特徴とするが、本発明の効果を著しく損なわない範囲で、さらに任意の成分を含む。任意の成分とは、組成物の用途や剤型に応じて適宜選択される。
本発明の生成物は菌体毒素（特に口腔内毒素）吸着能または核酸吸着能を有するので、本発明の組成物は菌体を吸着除去するため、または核酸を送達するために用いられる。本発明の組成物は、口腔内毒素を吸着除去するために用いられる場合は、口腔内洗浄剤（イリゲーター液、マウスウォッシュ、歯磨き剤など）、チューインガムとして用いられ、核酸を送達するために用いられる場合は化粧品、ドラッグデリバリー担体、遺伝子導入用担体、診断薬用担体などとして用いられる。
【００５１】
＜本発明の製造方法＞
本発明の製造方法は上記組成物を製造する方法であって、１）ポリカチオン、水難溶性カルシウム塩および溶媒を含む混合物から、溶媒を除去することにより得られる生成物を得るステップ、および２）得られ生成物を、任意の成分とともに配合するステップを含む。任意の成分は、上記の通り、組成物の用途に応じて適宜選択されることができる。
【実施例】
【００５２】
＜実施例１＞
［本発明の生成物の調製例１］
４０℃に加熱されたカルシウム塩類と溶剤の混合物に、ポリカチオンを加えて、マグネットスターラーで攪拌した（４０℃、１時間）。得られた反応液をエバポレーターにて溶剤を留去後、真空乾燥させて（４０℃、１８時間）、乾燥粉末を得た。乾燥粉末を乾燥粉末に対して５倍量の水で２回洗浄した後、再度真空乾燥させて（４０℃、１８時間）、乾燥粉末を得た。得られた粉末におけるポリカチオンの含有量を、ケールダール法により測定された全窒素含有量から求めた。
【００５３】
表１に、用いられた水難溶性カルシウム塩の種類および量、溶媒の種類および量、ならびにポリカチオンの種類および量を示した。
ポリカチオンの名称の欄における記載は、以下の化合物の略称である。
EPL：ε−ポリリジン（平均重合度：３１）（チッソ株式会社製品）
APL：α−ポリリジン（平均重合度：３７００）（東レ株式会社製品）
PAA：ポリアリルアミン（平均重合度：１８０）（日東紡績株式会社製品）
PEI：ポリエチレンイミン（平均重合度：９００）（和光純薬工業株式会社）
【００５４】
【表１】
2006298879.tif 000002
【００５５】
表１より、いずれの場合も乾燥粉末中にポリカチオンが含まれていることが分かる。さらに、フリーのポリカチオンを用いた場合（CP1）と塩のポリカチオンを用いた場合（CP6）を比較すると、難溶性カルシウム塩に対して、CP6はCP1の2倍モルポリカチオンを用いたにもかかわらず、乾燥粉末のポリカチオン含有率はCP1の方が高い。すなわち、塩のポリカチオンを用いた場合と比べて、フリーのポリカチオンを用いることにより、生成物におけるポリカチオンの含有量を高くすることができることが分かる。
【００５６】
＜実施例２＞
［本発明の生成物の調製例２］
１ｌの０．０１mol／ｌのリン酸一ナトリウム水溶液を９５℃に加熱した。０．５mol／ｌの塩化カルシウム水溶液（１ｌ）、および０．５mol／ｌのリン酸水素二ナトリウム水溶液（１．５ｌ）を、およそ２時間３０分かけて滴下した。
その後、１mol／ｌの水酸化カリウム水溶液（表２に記載の量）を、およそ４０分かけて滴下したのち３０分間さらに撹拌した。温度を４０℃にまで放冷し、２５質量％のε-ポリリジン（表２に記載の量）を加えて３時間撹拌した。得られた反応液をろ過して、ろ過液が中性になるまで水でろ過洗浄をした。濾取された物質を真空乾燥（６０℃、１８時間）させ、乾燥粉末とした。乾燥粉末中のポリカチオン含有量を、ケールダール法により測定した全窒素含有量から求めた。
【００５７】
【表２】
2006298879.tif 000003
【００５８】
＜実施例３＞
［エンドトキシンの吸着性］
以下に示す組成のバッファーＡに、380,000EU/ml 、 1,470,000EU/ml 、 1,530,000EU/mlまたは、1,260,000EU/mlのエンドトキシン（Lipopolysaccharide from Esherichia Coli 0111:B4,sigma社）を配合して、溶液１（380,000EU/ml）、溶液２（1,470,000EU/ml）、溶液３（1,530,000EU/ml）および溶液４（1,260,000EU/ml）を得た。
バッファーＡ：
NaCl,15mmol;KCl,20mmol;NaHCO3,15mmol;NaH2PO4,13.2mmol(pH6.7)
【００５９】
得られた溶液１，２，３および４（それぞれ１０ｍｌ）に、実施例１および２で得られた乾燥粉末（０．２ｇ）を添加して、３７℃で２時間振盪した。その後、孔径０．４５μｍのフィルターにてろ過し、ろ過液中のエンドトキシン濃度を測定した。
エンドトキシンの定量は、生化学工業株式会社製のエンドトキシン測定キット（エンドスペシー）によって測定した。結果を表３に示した。
【００６０】
＜比較例１＞
［エンドトキシンの吸着性］
実施例３において、実施例１および２で得られた乾燥粉末を、ポリカチオンを含まないカルシウム塩（Ca3(PO4)2、CaHPO4、またはヒドロキシアパタイト）、カルシウム塩とポリカチオンの単なる混合物（試料番号Ref1：Ca3(PO4)2(0.2g)＋EPL(0.001g)混合（ポリカチオン含有率0.5w/w%））、およびカルシウム塩とポリカチオン塩酸塩の単なる混合物（試料番号Ref2：Ca3(PO4)2(0.2g)＋EPL塩酸塩(0.001g)混合（ポリカチオン含有率0.5w/w%））に換えること以外は実施例３と同様に実験して、エンドキシン濃度を測定した。結果を表３に示した。
【００６１】
表３において、ＥＴとはエンドトキシンの略称である。
【００６２】
【表３】
2006298879.tif 000004
【００６３】
表３に示されたように、ポリカチオンを含まないカルシウム塩を用いた場合と比べて、実施例１および２で得られた乾燥粉末（CP1,2,6,7,HA2,3:ポリカチオンとカルシウム塩を含む粉末）を用いた場合は、エンドトキシン除去率が有意に高い。すなわち、実施例１および２で得られた乾燥粉末のエンドトキシン吸着能が高いことがわかる。
また、カルシウム塩とポリカチオンを添加した場合（Ref1）と比べて、本願発明の生成物を添加した場合（CP1）は、エンドトキシン除去率が高い。また、カルシウム塩と塩酸塩のポリカチオンを添加した場合（Ref2）と比べて、本願発明の生成物を添加した場合（CP6）は、エンドトキシン除去率が高い。すなわち、本願発明で得られた乾燥粉末は、単なる混合物ではないこと、および単なる混合物よりエンドトキシン吸着能が高いことが分かる。
カルシウム塩とポリカチオンの単なる混合物（Ref1）とカルシウム塩と塩酸塩のポリカチオンの単なる混合物（Ref2）はポリカチオン含有量が同じであるとエンドトキシン除去率がほぼ同じであるのに対し、本願発明のカルシウム塩とポリカチオン混合物（CP1）と本願発明のカルシウム塩と塩酸塩のポリカチオン混合物（CP6）はポリカチオン含有量がほぼ同じであってもエンドトキシン除去率が異なる。すなわち、フリーのポリカチオンを用いて得られた生成物は、塩酸塩のポリカチオンを用いて得られた生成物と比べてエンドトキシン吸着能が高いことが分かる。
【００６４】
＜実施例４＞
［核酸の吸着性］
核酸（デオキシリボ核酸  サケ精液由来  和光純薬工業）０．０４ｍｇ／ｍｌを含む、１０ｍｌの０．０２ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．７）に、実施例１で得られた粉末を添加して、２５℃で２時間振盪した。その後、孔径０．４５μｍのフィルターにてろ過し、ろ過液中の核酸濃度を求めた。
具体的には、波長２６０ｎｍの紫外線の吸収を測定し、測定結果と作成した検量線とから核酸濃度を求めた。結果を表４に示した。
【００６５】
＜比較例２＞
［核酸の吸着性］
実施例４において、実施例１および２で得られた粉末に換えて、ポリカチオンを含まないカルシウム塩（Ca3(PO4)2、ヒドロキシアパタイト）を用いたこと以外は、実施例４と同様に実験し、核酸濃度を測定した。結果を表４に示した。
【００６６】
【表４】
2006298879.tif 000005
【００６７】
表４に示されたように、ポリカチオンを含まないカルシウム塩を用いた場合と比較して、実施例１で得られた粉末（ポリカチオンとカルシウム塩を含む）を用いた場合は、優位に核酸除去率が高い。すなわち、実施例１および２で得られた乾燥粉末の核酸吸着能が高いことがわかる。
【００６８】
＜実施例５＞
［ポリカチオンの溶出性１］
実施例１および実施例２で得た乾燥粉末を、バッファーＡあるいはバッファーＢに懸濁させて３７℃で２時間振盪した。バッファーＡおよびＢは、以下の組成を有する。これらバッファーは唾液の塩濃度に相当する水溶液である。
バッファーＡ：
NaCl,15mmol;KCl,20mmol;NaHCO3,15mmol;NaH2PO4,13.2mmol(pH6.7)
バッファーＢ：NaCl,15mmol;KCl,20mmol;NaHCO3,15mmol(pH8.4)
【００６９】
その後、孔径０．４５μｍのフィルターにてろ過し、ろ過液中のポリカチオン濃度をニンヒドリン法によって定量した。溶出率は測定値および表１の乾燥粉体中のポリカチオン含有量（%）を用いて、下記の式１より算出した。その結果を表５に示した。
【００７０】
【数１】
2006298879.tif 000006
【００７１】
【表５】
2006298879.tif 000007
【００７２】
表５に示されたように、実施例１および２で調製された試料は、何れも溶出率が低い（0〜2.4％）ことがわかる。すなわち、唾液の塩濃度に相当する水溶液においてポリカチオンを溶出しにくく、ポリカチオンを保持することができる。
【００７３】
＜実施例６＞
［ポリカチオンの溶出性２］
実施例１および実施例２で得られた乾燥粉末（約２００mg）を、１mol／ｌのNaCl水溶液１０ｍｌに添加し、室温で２時間振盪した。その後、懸濁液の一部を孔径０．４５μｍのフィルターにてろ過し、ろ過液中のポリカチオン濃度をHPLCによって測定した。
【００７４】
測定されたろ過液中のポリカチオン濃度（実測値）と、試料（乾燥粉末）に含まれるポリカチオンが全て溶出した場合の濃度（理論値）とを、以下の式２にあてはめて溶出率を求めた。
【００７５】
（式２）・・・
溶出率（％）＝｛溶出濃度（実測値）／溶出濃度（理論値）｝×１００
【００７６】
HPLCによるポリカチオン濃度の測定は、カラムをＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１２０Ｔとして、溶離液を９．２mmol／ｌリン酸水素二カリウム、９．２mmol／ｌ硫酸ナトリウム、アセトニトリル８．０v/v％（ｐＨ３．４）の水溶液として、温度４０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎの条件下で行った。紫外部の２１５ｎｍにおける吸収ピークをモニターした方法
を採用した。
標準物質としてε−ポリリジンを用いて検量線を作成し、溶出液のε−ポリリジン濃度を定量した。表６に実験結果をまとめて示した。
【００７７】
【表６】
2006298879.tif 000008
【００７８】
表６に示された通り、実施例５で用いたバッファー（唾液の塩濃度域）よりはるかに高濃度域の１mol／ｌのNaCl水溶液では、ポリカチオンとNaイオンの交換が生じポリカチオンがほぼ１００％溶出されている。すなわち、本発明の生成物において、ポリカチオンは、共有結合により固定化されているのではないことがわかる。