(57)【要約】【課題】植物の不定根形成促進剤を提供する。【解決手段】  大豆蛋白質原料にバチルス・サーキュランス(Bacillus circulans) HA12 (FERM P-13428)株または該株由来の蛋白質分解酵素を作用させて得られる植物の不定根形成促進作用を有する大豆蛋白質分解物を有効成分として含有することを特徴とする植物の不定根形成促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆蛋白質原料にバチルス・サーキュランス(Bacillus circulans) HA12 (FERM P-13428)株または該株由来の蛋白質分解酵素を作用させて得られる植物の不定根形成促進作用を有する大豆蛋白質分解物を有効成分として含有することを特徴とする植物の不定根形成促進剤。
【請求項２】
大豆蛋白質原料が、大豆粕である請求項1に記載の不定根形成促進剤。
【請求項３】
不定根形成促進作用を有する大豆蛋白質分解物が、分子量5000以下のペプチドである請求項1に記載の不定根形成促進剤。
【請求項４】
植物が、ナス科、マメ科、キク科およびナデシコ科から選択されるものである請求項1に記載の不定根形成促進剤。
【請求項５】
請求項1に記載の不定根形成促進剤を植物と接触させることを特徴とする植物の不定根形成促進方法。
【請求項６】
植物が、ナス科、マメ科、キク科およびナデシコ科から選択されるものである請求項5に記載の不定根形成促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の不定根形成促進剤、詳しくは大豆蛋白質に特定酵素を作用させて得られる大豆蛋白質分解物を有効成分とする植物の不定根形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆粕(大豆ミール)などの植物油搾り粕類は、有機質肥料として古くから利用されてきたが、これらは高分子蛋白質を主成分とするために植物への吸収性に乏しい欠点があり、また、安価でより効果の高い硫安や尿素などの化学肥料の開発によって、現在はほとんど利用されておらず、一部家畜の飼料として利用される以外は、埋め立てや海洋投棄されている現状にある。一方、化学肥料はその使用初期においては非常に優れた効果を奏するが、使用回数が重なるに伴ない土中への蓄積により土中微生物の存在種類および量を減少させ、植物成長効果を低下させる欠点がある。
【０００３】
本発明者らは、大豆粕の有効利用を図るべく鋭意研究を重ねた結果、先に、大豆粕の蛋白質を特異的に且つ速やかに低分子量化分解し得る酵素を産生するバチルス属に属する菌株および該菌株由来の蛋白質分解酵素を見出し、これらを利用して得られる大豆粕由来の植物成長肥料を開発するに成功し、これらに係る発明を完成した(特許文献1および2参照)。
【０００４】
本発明者らが先に開発した肥料は、上記菌株と共に大豆粕分解ペプチドを多量に含有することに基づいて、例えば小松菜およびカイワレ大根の収穫量(重量)を増大させる効果および栽培期間を短縮させる効果を奏し得、また植物の根毛を増殖させる効果を期待できるものであった。
【特許文献１】特開平6-237760号公報
【特許文献１】特開平14-362988号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、植物の不定根形成促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、先に開発した植物成長肥料、特にこれに含まれる各種の大豆蛋白分解ペプチドについて鋭意研究を重ねる過程において、該肥料中に含まれる大豆蛋白質分解物中に植物の不定根形成促進作用を有する物質が存在することを見出した。
【０００７】
本発明はこの新しい知見を基礎として、更に鋭意研究を重ねた結果完成されたものであり、下記項1-6に記載の植物の不定根形成促進剤および植物の不定根形成促進方法を提供する。
【０００８】
項1.  大豆蛋白質原料にバチルス・サーキュランス(Bacillus circulans) HA12 (FERM P-13428)株または該株由来の蛋白質分解酵素を作用させて得られる植物の不定根形成促進作用を有する大豆蛋白質分解物を有効成分として含有することを特徴とする植物の不定根形成促進剤。
【０００９】
項2.  大豆蛋白質原料が、大豆粕である項1に記載の不定根形成促進剤。
【００１０】
項3.  不定根形成促進作用を有する大豆蛋白質分解物が、分子量5000以下のペプチドである項1に記載の不定根形成促進剤。
【００１１】
項4.  植物が、ナス科、マメ科、キク科およびナデシコ科から選択されるものである項1に記載の不定根形成促進剤。
【００１２】
項5.  項1に記載の不定根形成促進剤を植物と接触させることを特徴とする植物の不定根形成促進方法。
【００１３】
項6.  植物が、ナス科、マメ科、キク科およびナデシコ科から選択されるものである項5に記載の不定根形成促進方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明不定根成長促進剤有効成分(大豆蛋白質分解物)は、植物の不定根の成長を促進させる作用を奏し得るものであって、植物に速やかに吸収されてその不定根を成長させ、これによって、植物体の生育・成長を旺盛にし、植物体が野菜・果実などの場合はその収穫量を増大させ、切り花などの場合は長期に亘る生育を可能とし、カルスなどの場合はその分化・生育を促進する。しかも、本発明促進剤有効成分は、安価に入手容易な大豆粕などを原料として得られるものであり、その有効利用を図り得ると共に、環境や人体に悪影響を及ぼす惧れはない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の植物の不定根形成促進剤につき詳述する。
【００１６】
本発明に係る植物の不定根成長促進剤は、大豆蛋白質原料にバチルス・サーキュランス(Bacillus circulans) HA12 (FERM P-13428)株自体を、或いは該株由来の蛋白質分解酵素を、作用させて得られる植物の不定根形成促進作用を有する大豆蛋白質分解物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１７】
ここで、酵素を作用させる大豆蛋白質原料は、大豆から精製して得られる蛋白質であってもよいが、その必要はなく、例えばこれを含む大豆自体、その粉砕物、該大豆から油脂分を抽出した残りの大豆油かすなどであってもよい。特に、本発明ではこの大豆蛋白質原料として、大豆油かす、その内でも大豆から油脂(食用油原料)を抽出した後、消化を良くするために加熱乾燥させ、粒状に粉砕した油かすである大豆ミール(以下、「大豆粕」という)を有効に利用することができる。該大豆粕の原料大豆に対する歩留まりは約80％とされており、その蛋白質含量は約45％にも及んでおり、この点でも大豆粕は本発明に好適に利用できる。大豆蛋白質原料に酵素を作用させるに当たり、該大豆蛋白質原料は通常水を加えた溶液形態に調製される。
【００１８】
大豆蛋白質原料に作用させるバチルス・サーキュランス(Bacillus circulans) HA12 (FERM P-13428)株または該株由来の蛋白質分解酵素は、本発明者らが先に開発したものである(特許文献1参照)。該蛋白質分解酵素は、これを微生物から単離、精製して利用することもできるが、特に単離、精製する必要はなく、これを含む状態で、例えば上記菌株自体としてまたは該菌体の培養液などとして利用することもできる。菌体自体を利用する場合、大豆蛋白質原料を含む適当な培地を用いて菌体を培養することによって、該菌体が大豆蛋白質原料を資化して、所望の大豆蛋白質分解物を得ることができる。
【００１９】
大豆粕などの原料大豆蛋白質に対する酵素もしくは菌株の使用量は、原料が分解され得ることを前提として適宜決定され特に限定されない。一般には、10w/v％大豆粕液体培地に対して1v/v%HA12株培養液を植菌する条件が採用される。大豆蛋白質原料の酵素による分解反応は、通常、該酵素の至適条件を考慮して適当な条件下に実施できる。温度条件としては、より具体的には、約50℃程度を挙げることができ、一般に振盪培養条件下に、約48時間前後で反応は完結する。反応系のpHは、特に調整する必要はない。
【００２０】
有効成分とする植物の不定根形成促進作用を有する大豆蛋白質分解物は、上記で得られる培養液から常法に従い取得することができ、必要に応じて精製することができる。より具体的には、大豆蛋白質原料にバチルス・サーキュランス(Bacillus circulans) HA12 (FERM P-13428)株由来の蛋白質分解酵素を上記の条件で作用させ、得られる大豆蛋白質分解物を遠心分離して、その上清として得ることができる。該上清を、活性炭処理して、活性炭吸着画分と活性炭非吸着画分とに分画し、活性炭吸着画分をゲルろ過クロマトグラフィーにより精製することによって、精製された大豆蛋白質分解物を得ることができる。この大豆蛋白質分解物精製物は、例えば後記実施例に示されるとおり、リテンションタイム8.5〜9.9分の分画(ペプチド)として得ることができ、その分子量は5000以下、通常約500〜2000である。
【００２１】
本発明の不定根成長促進剤は、上記大豆蛋白質分解物精製物を含有する限り特に限定されず、例えばこれを含むものであることができる。具体的には、上述したように、大豆蛋白質原料に特定酵素またはこれを産生する微生物を作用させて得られる水溶液または培養液が、そのまま本発明促進剤として利用できる。
【００２２】
本発明促進剤の植物に対する適用は、植物が該促進剤を吸収できるような適用形態である限り特に限定されない。例えば植物の茎が本発明促進剤を含む液と接触するような形態であればよい。
【００２３】
本発明促進剤の使用形態も特に限定されず、液剤形態および固剤形態(粉末形態)のいずれでもよい。液剤形態の本発明促進剤は、通常、液剤中に本発明有効成分が、ペプチド・アミノ酸濃度換算で、約1〜500μg/mL、好ましくは約30〜400μg/mL含まれるものとされる。なお、この濃度の測定については、後記実施例3において詳述する。
【００２４】
その植物への適用は、散布、噴霧などの一般的な方法によって行うことができる。また、植物が切り花、カルスなどの場合は、これらを本発明促進剤液中に浸漬する方法によることもできる。
【００２５】
本発明促進剤を適用される植物は、特に限定されるものではなく、栽培用、観賞用、収穫用などに適した各種の植物のいずれでもよい。具体的には、この適用可能な植物には、ナス科(トマト、ピーマンなど)、マメ科(ダイズ、インゲン、エンドウ、モヤシなど)、キク科(キク、レタスなど)、ナデシコ科(カーネーション、カスミ草など)が含まれる。
【００２６】
本発明不定根形成促進剤は、各種植物の不定根の形成を促進させる作用を奏し得るものであり、この作用を利用して例えば下記に示す各種の用途に有効に利用することができる。
(1) カルスの形成促進および成長促進によって植物を成長させる、
(2)  切り花を長期間保存する、
(3)  芝生を繁殖させる、
(4)  サツマイモの増収をはかる、
(5)  農薬量を低減させて低(減)農薬有機栽培を行う、
(6)  庭木などの移植時の保存性を向上させる、
(7)  植物の株分けを行う(同一品種を茎から大量に株分けできる)、
(8)  植物工場(水耕栽培)によって植物収穫量を増大させる(土壌を用いることなく、不定根の形成促進によって、栽培日数の短縮化と収穫量増大が期待できる)。
実施例
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。
【実施例１】
【００２７】
(1)大豆粕分解微生物のスクリーニング
(1-1)大豆粕液体培地の調整
大豆粕10gに蒸留水100mLを加え、500mL振盪培養フラスコ中でオートクレーブ処理(121℃／20分)を行い、大豆粕液体培地を調整した。
【００２８】
(1-2)スクリーニング用培地の調整
300mL三角フラスコに、ペプトン1g、酵母エキス0.5g、塩化ナトリウム0.5g、寒天0.5g、カゼイン2gおよび蒸留水100mLを加え、蓋をして高圧蒸気滅菌(121℃／20分)を行い、オートクレーブ終了後、培地が60〜70℃に冷えてから、三角フラスコの底部に濃く溶けた寒天をよく振り混ぜながら、乾熱滅菌したシャーレに分注して、LB＋寒天＋カゼインのプレート(培地)を作製した。
【００２９】
(1-3)前培養用LB液体培地の調整
ペプトン1g、酵母エキス0.5gおよび塩化ナトリウム0.5gを蒸留水100mL中に加えて前培養用LB液体培地を調整し、これをオートクレーブにて滅菌後、滅菌試験管10本に5mLずつ分注した。
【００３０】
自然界から採集した土壌サンプル1gを、前記大豆粕液体培地に加え、振盪培養した(150回転／分、50℃、24時間)。振盪培養終了後、得られた培養液100μLを、10mLの希釈用滅菌水を入れた試験管に分注して希釈し、さらにその希釈培養液100μLを、希釈用滅菌水10mLを入れた試験管に分注する操作を2回繰返して、培養液を106 倍に希釈した。
【００３１】
得られた希釈培養液100μLを、前記(2)で調製したスクリーニング用培地プレートに分注し、コンラジ棒にて広げ、50℃で12時間培養し、生育したコロニーの数，色，形態，ハローの様子などを観察した。
【００３２】
ハローが観察されたシングルコロニーを、滅菌した爪楊枝にて新たなスクリーニング用培地プレートに植菌し、50℃で12時間培養した。その後、生育した各シングルコロニーから1白金耳を採取し、前記(3)で調整した前培養用LB液体培地を入れた試験管内に加え、50℃で12時間培養した(前培養)。
【００３３】
次に、得られた前培養液を、前記(1)で調整した大豆粕液体培地100mLに1mLずつ加え、振盪培養器(150回転／分)内で、50℃下に24〜72時間振盪培養した。浸透培養器内の大豆粕がドロドロになっていた場合、その菌をプラス(＋)とし、それ以外をマイナス(-)と判定した。尚、表皮の堅い部分は除いて考えた。
【００３４】
(2)大豆粕資化の判定と各菌株の生育温度
300mL三角フラスコに、ペプトン1g、酵母エキス0.5g、塩化ナトリウム0.5gおよび寒天2gと共に蒸留水100mLを加え、オートクレーブで滅菌後、乾熱滅菌したシャーレに分注して、LB＋寒天のプレート(培地)を作製した。
【００３５】
大豆粕分解微生物のスクリーニングでプラス(＋)と判定された菌を滅菌した爪楊枝で採取し、上記LB＋寒天のプレート(培地)に植菌し、30℃以下、37.5℃、50℃、70℃および75℃に設定した恒温器でそれぞれ12時間培養した。
【００３６】
カゼインを分解して蛋白質分解酵素(プロテアーゼ)を産生しているハローが観察された菌をプラス(＋)とし、それ以外の菌をマイナス(−)と判定した。その結果、大豆粕培地で生育する菌株合計20株を取得し、それぞれHA1〜HA20と命名した。
【００３７】
取得した大豆粕分解菌5株とその培養条件(温度)を下記表1に示す。
【００３８】
【表１】
2006063023.tif 000002
【００３９】
(3)菌株の同定
分離選別した大豆粕分解菌の菌学的性質を調べるために、グラム染色を始めとした種々の確認試験をそれぞれ下記の手法により行った。
【００４０】
1.グラム染色
Huckerの変法に従って、スライドガラス上に塗抹し、乾燥後火炎固定した菌液について、Huckerの液(1.5％クリスタルバイオレット-エタノール溶液)で30秒間染色した。染色後直ちに水洗し、Lugol 液で1分間媒染した。媒染終了後水洗し、更にアルコールで30秒間脱色し直ちに水洗した。水をよく切った後、サフラニンで30秒間染色した。染色した標本を顕微鏡で観察し、紫色に染色された菌をグラム陽性とし、赤色に染色された菌をグラム陰性とした。また、顕微鏡により菌の形態を観察した。
【００４１】
2.生育温度
下記組成の液状チオグリコレート培地を121℃で15分間滅菌し、試験管に5mL分注した。この培地にコロニーから採取した菌を植え、それぞれの温度で静置培養して、12時間または24時間後に培地が混濁したものを生育したと判断した。
【００４２】
＜液状チオグリコレート培地の組成＞
L-シスチン                  0.75g
NaCl                        2.5g
ブドウ糖                    5.0g
酵母エキス                  5.0g
寒天                        0.75g
カゼイン消化物             15.0g
チオグリコール酸ナトリウム  0.5g
0.1%レザズリン              1.0mL
蒸留水                     1000mL
pH                          7.2
3.オキシダーゼ
テルモ(株)製バクトラボ オキシダーゼ・テストを用いて試験した。即ち、二塩化N,N,N',N'-テトラメチル-p-フェニレンジアミンを含んだ綿棒に菌体を付け、オキシダーゼ活性により生成する青紫色を生じた場合に、オキシダーゼ陽性と判断した。
【００４３】
4.カタラーゼ
毛細管の一端に菌を付けた後、毛細管の菌を付けた一端から3％過酸化水素水を吸い上げて菌体と過酸化水素水とを毛細管内で混合させた。毛細管内で過酸化水素分解にともない酸素の気泡が発生した場合をカタラーゼ陽性とした。
【００４４】
5.硝酸塩還元能
0.1％硝酸ナトリウム加ブイヨン培地に菌を接種し、最適生育温度で5日間培養した。得られた培養液に、α- ナフチルアミン液(α- ナフチルアミン0.1gを30％酢酸水溶液200mLに溶解したもの)1.0mLとスルファニル酸液(スルファニル酸0.5gを30％酢酸水溶液150mLに溶解したもの)1.0mLを加えてよく混和させた後、30分以内に硝酸還元により生成した亜硝酸による桃赤色を呈した場合を陽性とした。
【００４５】
6.クリグラー培地
下記組成のクリグラー培地を試験管に分注した後、121℃で15分間高圧蒸気滅菌して高層斜面に固めた。斜面部分および高層部分に被検菌を植え、各菌の生育温度で18〜24時間培養した。培養後、斜面部分が黄変色した場合を斜面部陽性(乳糖を分解し酸を生成)とし、高層部分で黄変色した場合を高層部陽性(ブドウ糖を分解し酸を生成)とした。
【００４６】
＜クリグラー培地の組成＞
肉エキス           4.0g
ペプトン          15.0g
乳糖              10.0g
ブドウ糖           1.0g
塩化ナトリウム     5.0g
チオ硫酸ナトリウム 0.08g
亜硫酸ナトリウム   0.4g
硫酸第一鉄         0.2g
フェノール赤       0.02g
寒天末            15.0g
精製水           1000mL
pH                 7.2
7.SC培地
下記組成の培地を蒸留水に溶し約2mLずつ試験管に分注し、121℃で15分間高圧蒸気滅菌し全斜面に固めた。斜面部分に被検菌を植え、各菌の生育温度で18〜24時間培養した。この培地に含まれる唯一の炭素源であるクエン酸を利用し生育した場合を陽性とした。陽性の場合に、培地に含まれるブロム・チモールが緑色から深青色に変色した。
【００４７】
＜SC培地の組成＞
塩化ナトリウム              5.0g
硫酸マグネシウム            0.2g
リン酸二水素アンモニウム    1.0g
リン酸二水素カリウム        1.0g
クエン酸ナトリウム          2.0g
ブロム・チモール青          0.08g
寒天末                     15.0g
精製水                   1000mL
pH                          6.8
8. SIM培地
下記組成の培地を1000mLの蒸留水に加温溶解して約3mLずつ試験管に分注し、121℃で15分間高圧蒸気滅菌した後高層に固めた。被検菌を高層部分に穿刺し、それぞれの菌の生育温度で18〜24時間培養した。培養後培地が黒変した場合を硫化水素発生(＋)とし、穿刺部分から広がって生育した場合を運動性(＋)とし、さらに培地上部にクロロホルム1mLを重層し、その上にコバック試薬1mLを重層してクロロホルム層が赤変した場合をインドール(＋)とした。
【００４８】
＜SIM培地の組成＞
エールリッヒ肉エキス      3.0g
プロテオーゼペプトン     10.0g
ポリペプトン             20.0g
チオ硫酸ナトリウム        0.2g
クエン酸鉄アンモニウム    0.2g
寒天末                    3.0g
精製水                 1000mL
pH                      7.3
9.メチルレッド
下記組成のグルコース-リン酸塩-ペプトン水を試験管に3mL分注し、100℃で30分間の滅菌操作を3回繰返した。この培地に被検菌を植え、各菌の生育温度で3日間培養した。得られた培養液1mLを別の試験管に移し、メチルレッドを滴下し、培地色調が赤変した場合を陽性とした。
【００４９】
＜グルコース-リン酸塩-ペプトン水の組成＞
ペプトン             7.0g
リン酸二水素カリウム 5.0g
ブドウ糖             5.0g
蒸留水             1000mL
10.フォゲスプロスカウエル(VP)
上記グルコース-リン酸塩-ペプトン水を試験管に3mL分注し、100℃で30分間の滅菌操作を3回繰返した。この培地に被検菌を植え、各菌の生育温度で3日間培養した。得られた培養液1mLを別の試験管に移し、これにα-ナフトール液(5％α-ナフトール-無水エタノール溶液)0.6mLと40％KOH水溶液0.2mLを加えてよく混和させた後、試験管を斜めに傾けて静置した。静置後15分後と1時間後にそれぞれ培地色調の変化を観察し、培地色調が濃赤色となったものを陽性とした。
【００５０】
11.OF(Oxidation or Fermentation )
Hugh-Leifsonの方法に従って、下記組成のOF培地を121℃で15分間高圧蒸気滅菌し、培地が60℃程度に冷めたところで終濃度1％となるように濾過滅菌したグルコースを加え、得られた培地を2本の試験管にそれぞれ3mL分注し、高層に固めた。この培地に被検菌を穿刺し、1本の試験管には流動パラフィンを1〜2cmの厚さに重層して嫌気的に培養し、他方の試験管はそのまま好気的に培養した。各菌体の生育温度で3〜4日間培養した後、酸化的糖分解を行なう菌で好気的条件で培養した培地色調が黄変したものを(O)と結果に表記し、発酵的糖分解を行なう菌で好気的および嫌気的両条件で培地色調が黄変したものを(F)と結果に表記し、また4日間の培養後さらに次の7日間に糖分解が観察されたものを(W)と結果に表記した。
【００５１】
＜OF培地の組成＞
トリプトン             2.0g
塩化ナトリウム         5.0g
寒天                   2.5g
リン酸二水素カリウム   0.3g
B.T.B.                  0.03g
蒸留水              1000mL
pH                     7.1
12.Urease
下記組成の栄研化学(株)製ウレアーゼ確認用尿素培地(滅菌済み)を用い、0.5〜1.0mLを滅菌済の試験管に分注し、被検菌を接種した。この培地を各被検菌の生育温度で6〜24時間培養し、アンモニアの生成にともなう培地の赤変を生じた場合を陽性とした。なお、赤変が弱い場合には「W」と表示する。
【００５２】
＜尿素培地の組成＞
ペプトン          2.0g
尿素             30.0g
塩化ナトリウム    5.0g
リン酸1カリウム   9.0g
リン酸2ナトリウム 3.0g
フェノールレッド  0.01g
pH                6.2
13.NaCl
1％ペプトン水に種々の濃度のNaClを加え、滅菌した培地(pH7.2)を約3mL試験管に加えて被検菌を植菌後、各菌体の生育温度で18〜24時間静置培養した。そして培養液が混濁したものを陽性とした。
【００５３】
14.マンニット
食塩(MS)培地下記組成の栄研化学(株)製マンニット食塩培地「栄研」を用い、この培地112gを蒸留水1000mLに溶解して、121℃で15分間高圧蒸気滅菌した。滅菌した培地を滅菌したシャーレに約20mLずつ分注し、平板に固めた。得られた平板培地に被検菌を植菌し、各菌体の生育温度で24〜48時間培養した。マンニットを分解しコロニーの周囲が黄変したものをMS陽性とし、黄変せず生育しコロニーを形成したものをNaCl陽性とした。
【００５４】
＜マンニット食塩培地「栄研」の組成＞
肉エキス「栄研」  2.5g
ペプトン「栄研」 10.0g
マンニット       10.0g
塩化ナトリウム   75.0g
フェノールレッド  0.025g
寒 天            15.0g
15.Hemolysis
普通寒天15mLを溶解し45℃に保ちながら、これに5％の割合で脱繊維素血液を加えた。この培地に微量の被検菌を植えてよく混和し、滅菌シャーレに注ぎ平板に固めた。各菌の生育温度で24時間培養し、溶血の有無により判定した。溶血を起しハローを生じたものを陽性とした。
【００５５】
16.エスクリン
121℃で15分間高圧蒸気滅菌した下記組成のBarsiekow 培地が80℃に冷えたところで濾過滅菌したエスクリン(配糖体)を0.5％の割合で加え、滅菌試験管に2mL分注した。この培地に被検菌を植菌し、各菌体の生育温度で18〜24時間培養し、エスクリン分解により培地色調が青色から黄変した場合を陽性とした。
【００５６】
＜Barsiekow培地の組成＞
ペプトン水       100mL
0.2％B.T.B溶液      1.2mL
17.ゼラチンの液化
普通ブイヨン1000mLに精製ゼラチン100gを加え、121℃で12分間高圧蒸気滅菌した培地を滅菌試験管に3mL分注し、高層に固めた。被検菌を高層部分に穿刺し、各菌体の生育温度で1週間培養した。穿刺線に沿ったゼラチン液化の有無を観察し、液化が観察されたものを陽性とした。
【００５７】
18.オルニチンからの脱炭酸試験
Difco 社製 Standard Dehydrated Culture Medium 10.5gおよびL-オルニチン10.0gを蒸留水1000mLに溶解させ、121℃で15分間高圧蒸気滅菌し、滅菌試験管に3mL分注した。この培地に被検菌を植菌し、各菌体の生育温度で18〜24時間培養し、培地色調が小豆色から黄変したものを陽性とした。
【００５８】
19.リジンからの脱炭酸試験
Difco 社製 Standard Dehydrated Culture Medium 10.5gおよびL-オルニチン10.0gを蒸留水1000mLに溶解させ、121℃で15分間高圧蒸気滅菌し、滅菌試験管に3mL分注した。この培地に被検菌を植菌し、各菌体の生育温度で18〜24時間培養し、培地色調が赤紫色から黄変したものを陽性とした。
【００５９】
20.アルギニンからの脱炭酸試験
Difco 社製 Standard Dehydrated Culture Medium 10.5gおよびL-オルニチン10.0gを蒸留水1000mLに溶解させ、121℃で15分間高圧蒸気滅菌し、滅菌試験管に3mL分注した。この培地に被検菌を植菌し、各菌体の生育温度で18〜24時間培養し、培地色調が茶褐色から黄変したものを陽性とした。
【００６０】
21.糖の資化能判定
前記OF培地を121℃で15分間高圧蒸気滅菌し、培地温度が60℃程度に冷めたところで濾過滅菌した糖を1％の割合で加え、よく混和した後、試験管に3mL分注し、高層に固めた。この培地に被検菌を穿刺し、各菌体の生育温度で24時間培養し、培地色調が黄変したものを陽性とした。
【００６１】
以上の試験の結果を表2に示す。
【００６２】
【表２】
2006063023.tif 000003
【００６３】
尚、NCは斜面部陰性を、Yは高層部陽性を、Rは高層部陰性を、それぞれ意味する。
【００６４】
上記表2に示した種々の同定確認試験の結果から、ここで分離選別した菌株はグラム陽性の中桿菌であり、内胞子を形成し、またオキシダーゼやカタラーゼを産生する、等の性質を有することが確認された。また、両菌株ともバチルス(Bacillus)属に属する菌株であることが判明し、種名はHA12がサーキュランス(circulans)、HA19がステアロサーモフィルス(stearothermophilus)であると同定され、それぞれバチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)HA12並びにバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)HA19と命名した。以後、これら菌株をそれぞれHA12，HA19と称する。本発明者らは、これらの新規菌株を、1993年2月12日に旧工業技術院微生物工業技術研究所(日本国茨城県つくば市東1-1-1  中央第6に住所を有する独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター)に寄託しており、その寄託番号はそれぞれFERM P-13428およびFERM P-13429である。
【実施例２】
【００６５】
新菌株HA12(FERM P-13428)を用いた大豆粕分解物の挙動について説明する。新菌株HA12(FERM P-13428)を用いた大豆粕分解過程における蛋白質濃度の経時変化を、BCA法を用いて以下の通り測定した。
大豆粕液体培地および試薬の調整
＜大豆粕液体培地の調整＞
大豆粕1.5gに蒸留水150mLを加えて、500mL振盪培養フラスコでオートクレーブ(121℃／20分 )を行い大豆粕液体培地とした。
＜BCA試薬の調整＞
試薬A：100溶＋試薬B：2溶
＜検量線用標準溶液(ウシアルブミン)の調整＞
下記の表3に従い、種々の蛋白質濃度の標準溶液を調整した。
【００６６】
【表３】
2006063023.tif 000004
【００６７】
調整した検量線用アルブミン標準溶液0.1mLとBCA試薬2.0mLとを試験管内で撹拌した後、37℃の恒温槽内に30分間放置することによりBCA反応を行なった。反応終了後、各試験管を室温まで放置し、同時に測定した水0.1mLとBCA試薬0.2mLの溶液をブランクとして562nmにおける吸光度を測定し、検量線を作成した。
【００６８】
次に、オートクレーブした1w/v％大豆粕液体培地(150mL)から1mLを無菌的に採取し、10000回転/15分遠心して得られた上清についてBCA法による蛋白質濃度測定を行い、この操作により得られた蛋白質濃度を培養時間0(ゼロ)における蛋白質濃度とした。同様にして、1w/v％大豆粕液体培地から1mLを無菌的に採取し、その培地に、予め大豆粕液体培地で前培養したHA12(FERM P-13428)の菌液1.5mLをそれぞれ植菌し、50℃，150回転/15分の条件で培養を行い、この培養液から経時的に培養液を無菌的に採取し、各培養時間における蛋白質濃度を測定した。新菌株HA12(FERM P-13428)を用いた大豆粕分解過程における蛋白質濃度の経時変化を図1(横軸：時間(hr)、縦軸：ペプチド(左側に表示)および蛋白質(右側に表示)の濃度(mg/mL))に示す。
【００６９】
図1から理解されるように、新菌株HA12(FERM P-13428)は大豆粕蛋白質を高速で効率良く低分子化分解している。尚、図1中の白丸は蛋白質の濃度(mg/mL)を示し、黒丸はペプチドの濃度(mg/mL)を示す。
【実施例３】
【００７０】
本発明の大豆蛋白質分解物を有効成分とする不定根形成促進剤の植物に対する効果について説明する。
【００７１】
(1)ミニトマト(ピコ)(タキイ種苗株式会社、京都)を用いた例
[供試植物]
3週間生育させたミニトマトの茎を切断したものをサンプルとして使用した。
［供試試薬の調整］
LB培地5mLに、実施例1で調製した菌株HA12(FERM P-13428)(1白金耳又は1×109個/mL〜5×109個/mL)を1%植菌し、一晩、37℃で振盪培養して前培養液を調製した。得られた前培養液1v/v%を10w/v%大豆粕培地に加えて、振盪培養(50℃、120回転／分、48時間)し、培養終了後、培養液のpHが9.0を越えたものを供試試薬(DSP, Degradation Soybean meal Products)とした。
【００７２】
次いで、活性炭(Darco G-60)10gにイオン交換水1Lを加えて、1時間攪拌して活性炭を洗浄した。攪拌終了後、活性炭が沈殿するまで静置した。静置後、イオン交換水を捨て、得られる残渣にイオン交換水およびDSPをそれぞれ100mL加えて1時間攪拌し、活性炭にDSPを吸着させた。攪拌後、遠心分離(10000回転／分、10分)し、上清と沈殿(活性炭)に分けた。上清は濾紙で濾過して、活性炭を除去した(活性炭非吸着画分)。沈殿はイオン交換水と100%アセトンとをそれぞれ100mL加え、1時間攪拌した。攪拌後、遠心分離(10000回転／分、10分)し、上清と沈殿(活性炭)に分け、更に得られた上清を減圧蒸留して、アセトンを除去した(活性炭吸着画分)。
【００７３】
DSP中のフェノール性物質としては、DSP(30mg/mL)20 mLにジエチルエーテルを100 mL加え、その上清からロータリーエバポレーター(Rotavapor R-114、柴田、東京)を用いてジエチルエーテルを除き抽出したものを利用した。
【００７４】
[試験方法]
植物サンプルの切断茎部分を下記に示す各供試試薬を入れた容器内に浸漬し、その状態で1週間生育させた後、不定根の形成される様子を肉眼観察した。
【００７５】
容器A: 蒸留水(H2O)のみ(コントロール)
容器B: DSP 30μg/mL
容器C: DSP 300μg/mL
容器D: DSP活性炭吸着画分30μg/mL
容器E: DSP活性炭吸着画分300μg/mL
容器F: DSP活性炭非吸着画分30μg/mL
容器G: DSP活性炭非吸着画分300μg/mL
容器H: DSP中のフェノール性物質
なお、各供試試薬の濃度は、ニンヒドリン反応(ヒドリンダンチン法、 Moore, S. and Stein, W. H., "Amodified ninhydrin regent for the photometric determination of amino acids and related compounds", Biol. Chem., 211, pp.907-913 (1954))により測定したペプチド・アミノ酸濃度(μg/mL)を示す。該濃度は、y=0.0176x(x:ペプチド・アミノ酸濃度、y:570nm吸光度)により算出される。
【００７６】
[結果]
得られた結果を、図2および図3に示す。
【００７７】
図2は、上記各容器A〜Hを用いて得られた結果(各容器に茎部を浸漬して生育させたミニトマト(3本)の写真；図中の各写真には、用いた容器と対応させてA〜Hと表示する)である。また、図3は、容器B-EおよびGを用いて得られた結果(各容器に茎部を浸漬して生育させたミニトマト(1本)の切断茎先端部の拡大写真；図中の各写真には、用いた容器と対応させてB-EおよびGと表示する)である。
【００７８】
上記各図から、容器B, C, D, EおよびGを用いた場合、不定根形成が認められ、その他の容器(AおよびF)の場合は不定根の形成は認められないことが明らかである。特に、形成された不定根の本数は、容器Cの場合が最も多く、次いでE, B, D, Gの順に少なくなっていくことが判った。
[考察]
上記結果から、本発明において有効成分として利用する大豆分解蛋白質(DSP)は、不定根形成促進効果を発揮し、不定根形成促進剤として有効であることが明らかである。また、不定根形成促進効果を発揮する主要な有効成分物質（ペプチド）は、D, Eとして示す活性炭吸着画分に存在することが明らかである。
【実施例４】
【００７９】
カルス培養
(1)  実験方法
カルス誘導用寒天培地(MS培地)を下記の組成で作製し、ニンジンを用いてカルス誘導を行った。
【００８０】
〈培地の作製〉
MS培地のストック溶液の調整
下記A〜Dの各成分からなるMS培地のストック溶液を調整した。
【００８１】
A.                                                                              主要無機栄養成分
【００８２】
【表４】
2006063023.tif 000005
【００８３】
調整後、4℃で保存。
【００８４】
B.                                                                              微量成分
【００８５】
【表５】
2006063023.tif 000006
【００８６】
調整後、4℃で保存。
【００８７】
C.                                                                              鉄成分
【００８８】
【表６】
2006063023.tif 000007
【００８９】
20分オートクレーブ後、メスアップして4℃で保存。
【００９０】
D.                                                                              有機栄養成分
【００９１】
【表７】
2006063023.tif 000008
【００９２】
調整後、小分けにして−20℃で保存。
【００９３】
MS培地の調整
下記表8に記載の各成分からなるMS培地を調整した。
【００９４】
【表８】
2006063023.tif 000009
【００９５】
調整されたMS培地は1N KOHでpH5.8に調整後、オートクレーブし、これに生長調節物質(2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、2,4-D)を加えて比較試料とし、また本発明不定根形成促進剤の有効成分であるDSPを100μg/mLまたは300μg/mLそれぞれ加えて本発明試料とした。何も加えなかったものをコントロール(対照試料)とした。
【００９６】
2,4-Dは、合成オーキシンであり、オーキシンはカルスを増殖させる作用を有するものとして知られている。
【００９７】
(2)  ニンジンの滅菌とカルス誘導
新鮮なニンジンをよく洗い、上部と下部を切り捨てた。残った部分を70%エタノールに10秒間浸した。次に、ニンジンをクリーンベンチ内で1%次亜塩素酸ナトリウム水溶液に15分間浸して滅菌し、その後、滅菌水で3回以上洗浄した。そして、滅菌したニンジンをコルクボーラーで打ち抜き、コンラージ棒で押し出した。その打ち抜いたニンジンの形成層の部分を約1mmの厚さに切り抜き、カルス誘導用寒天培地に植え、暗所、25℃で7日間培養した。
【００９８】
(3)  結果
対照試料、比較試料および本発明試料のそれぞれを用いて得られた結果(カルス誘導の培養0日目と7日目の結果)を、図4に示す。
【００９９】
図4中、左列は0日目の結果であり、右列は7日目の結果である。また、上段から順に、対照試料(コントロール)、比較試料(2,4-Dと表示)、本発明試料(DSP 100μg/mLおよびDSP300μg/mL使用)を示す。
【０１００】
図4に示される結果から、コントロールでは0日目と7日目を比較すると殆ど変化はないが、2,4-DとDSP 100μg/mLおよび300μg/mLでは、培養7日目において、いずれもコントロールの培養7日目に比して、カルスの肥大が観察された。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明は、植物の不定根の形成を促進する薬剤を提供するものであり、このものは植物の不定根形成促進効果に基づいて、植物の生育、成長、収穫を良好なものとし、植物が関与する分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】実施例2に従うHA12株による大豆粕分解過程におけるペプチド・蛋白質濃度の経時変化を示すグラフである。
【図２】実施例3に従う試験において、ミニトマトに不定根形成が認められることを明らかにする写真である。
【図３】実施例3に従う試験において、ミニトマトに不定根形成が認められることを明らかにする写真である。
【図４】実施例4に従う試験におけるニンジンのカルス培養の結果を示す写真である。
【図１】
2006063023.tif 000010
【図２】
2006063023.tif 000011
【図３】
2006063023.tif 000012
【図４】
2006063023.tif 000013