(57)【要約】【課題】            無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質の合成方法において、直鎖状ＤＮＡを鋳型として用い、長時間の連続合成反応により大量のタンパク質を合成するための簡便かつ効率的な方法を提供する。【解決手段】        １８℃乃至３６℃の何れかの温度で培養した大腸菌細胞の抽出液と、タンパク質をコードする直鎖状鋳型ＤＮＡとを含む無細胞タンパク質合成系を用いて、少なくとも１時間連続的な合成反応を行う。連続的なタンパク質合成系としては、透析系又は連続フロー系であることが好ましい。透析系による無細胞タンパク質合成系は、抽出液と直鎖状鋳型ＤＮＡとを含む透析内液と、タンパク質合成用低分子基質を含む透析外液と、前記基質がそれを介して移動可能な透析膜とを備える。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１８℃乃至３６℃の何れかの温度で培養した大腸菌細胞の抽出液と、タンパク質をコードする直鎖状鋳型ＤＮＡとを含む無細胞タンパク質合成系を用いて、少なくとも１時間連続的な合成反応を行うことを特徴とするタンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記大腸菌の培養温度が２０℃乃至３４℃である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記無細胞タンパク質合成系が透析系又は連続フロー系である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記透析系が、前記抽出液と前記直鎖状鋳型ＤＮＡとを含む透析内液と、タンパク質合成用低分子基質を含む透析外液と、前記基質がそれを介して移動可能な透析膜とを備えることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抽出液がＳ３０抽出液である請求項１〜４何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記直鎖状鋳型ＤＮＡがＰＣＲ増幅産物である請求項１〜５何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記大腸菌がＢＬ２１株、又はＢＬ２１コドンプラス株である請求項１〜６何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
１８℃乃至３６℃の何れかの温度で培養した大腸菌細胞の抽出液を含むことを特徴とする、直鎖状鋳型ＤＮＡ用の無細胞タンパク質合成キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質の合成方法、特に、直鎖状ＤＮＡを鋳型として無細胞系でタンパク質合成を行う方法、及びそのためのキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
無細胞タンパク質合成システムによるタンパク質の合成は、基礎的な研究だけでなく、分子診断やハイスループットな医薬品ターゲットの発見等の応用分野にまで急速に進展している。近年、タンパク質合成量を飛躍的に増大させる技術（例えば、特許文献１及び２参照。）が開発されたことから、該システムは、Ｘ線結晶解析やＮＭＲ等による立体構造解析用のタンパク質の大量合成にも利用されるようになってきた。
【０００３】
翻訳反応を行わせる抽出液は、大腸菌由来のもの、コムギ胚芽由来のもの、ウサギ網状赤血球由来のものが市販されている。大腸菌の抽出液では、転写、翻訳の共役反応によりＤＮＡからタンパク質を合成できることが知られ、例えば、ズベイらによって大腸菌のＳ３０抽出液を用いる方法が系統的に開発されている（例えば、非特許文献１参照）。Ｓ３０抽出液には、ｍＲＮＡの翻訳に必要なリボソーム、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、ポリペプチド鎖開始因子（ＩＦ）、同伸長因子（ＥＦ）及び同終結因子が含まれている。合成タンパク質の鋳型としてＤＮＡを用いる場合は、強力なプロモーター（一般的にはＴ７プロモーター）の下流に目的タンパク質遺伝子を配置したＤＮＡが用いられ、転写と翻訳の両反応を共役させるために、系内にＴ７ＲＮＡポリメラーゼと４種類のリボヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ）を添加する。アミノアシルｔＲＮＡの合成、及びｍＲＮＡの翻訳反応にはＡＴＰのエネルギーが必要であることから、クレアチンキナーゼ−クレアチンリン酸系等のエネルギー再生系を無細胞系に加える。このような構成成分により、細胞内で起こるタンパク質合成反応を試験管内で再構成している。
【０００４】
Ｓ３０抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系において、タンパク質の合成収率に影響を与える種々の因子が知られている。例えば、抽出液中に存在するプロテアーゼは合成されたタンパク質を分解する。プロテアーゼによる分解を最小限にするために、ｏｍｐＴやｌｏｎプロテアーゼを欠損させた種々の大腸菌株（例えば、大腸菌Ｂ株）が作製されている。
【０００５】
一方、抽出液中に存在する種々のヌクレアーゼは、鋳型ＤＮＡや転写産物のｍＲＮＡを分解する。無細胞タンパク質合成系の鋳型ＤＮＡとしては、プラスミドやラムダファージ等にクローン化された環状ＤＮＡを用いる方法と、ＰＣＲ産物等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法とに大別されるが、一般的に、環状ＤＮＡの方が上記ヌクレアーゼによる分解を受けにくく、タンパク質の合成収率が高い。しかしながら、近年のポストゲノム研究において多種類のタンパク質の構造と機能を網羅的に解析することが行われるようになり、タンパク質の生産性の向上や作業の効率化は必須の課題となっている。このため、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより多種類の直鎖状ＤＮＡを増幅合成し、これらを用いて無細胞タンパク質合成系で効率よくタンパク質を合成するシステムが強く望まれている。
【０００６】
この直鎖状鋳型ＤＮＡは、大腸菌抽出液中に存在する内在性のエキソヌクレアーゼによって分解されやすいことが報告されている(例えば、非特許文献２〜４参照。)。また、デグラドソームと呼ばれるタンパク質複合体は、ＲＮＡを認識して分解するため、発現効率が低下することも知られている。これらの問題を解決するために、Ｓ３０抽出液の調製工程において凍結融解操作を行い、デグラドソームを除いたり（例えば、特許文献３参照）、或いは、デグラドソームの重要成分であるエンドヌクレアーゼＲＮａｓｅＥをコードするｒｎｅ遺伝子に変異を導入した大腸菌株も作製されている（例えば、ＢＬ２１-Star株、Invitrogen社）。直鎖状ＤＮＡを分解する酵素としては、ＲｅｃＢＣＤのようなＤＮＡエキソヌクレアーゼが原因と考えられ、これらの分解酵素のいくつかを欠損した種々のＲｅｃＢＣＤ変異体大腸菌株が作製されている(例えば、非特許文献５参照)。しかしながら、ＲｅｃＢＣＤ変異体大腸菌株は、直鎖状ＤＮＡの分解活性は低下しているものの、同時に増殖能も低下している場合が多く、無細胞タンパク質合成用の抽出液の製造には必ずしも適していない(例えば、非特許文献６参照)。
【０００７】
【特許文献１】特公平７−１１０２３６号公報
【特許文献２】特開平４−２００３９０号公報
【特許文献３】国際公開第０１／８３８０５号パンフレット
【非特許文献１】ジェフリー・ズベイ(Geoffrey Zubay)、「アニュアル・レビュー・オブ・ジェネティクス（Annual Review of Genetics）」１９７３年、第７巻、ｐ．２６７−２８７
【非特許文献２】Pratt et al., Nucleic Acids Res., 9, 4459-4474, (1981)
【非特許文献３】Benzinger et al., J. Virol., 15, 861-871, (1975)
【非特許文献４】Lorenz and Wackernagel, Microbiol Rev., 58, 563-602, (1994)
【非特許文献５】Yang et al., PNAS 77, 7029-7033 (1980)
【非特許文献６】Yu et al., PNAS, 97, 5978-5983, (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質の合成方法において、直鎖状ＤＮＡを鋳型として用い、長時間の連続合成反応により大量のタンパク質を合成するための簡便かつ効率的な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明者らは大腸菌を用いた無細胞タンパク質合成系について種々の検討を行った結果、直鎖状ＤＮＡを鋳型として長時間の合成反応を行う場合に、低温で培養した大腸菌細胞より調製した抽出液を用いるとタンパク質合成収率が向上、安定し、特に、透析法や連続フロー法等の連続反応において高い合成収率が得られることを見出して本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明に係るタンパク質の製造方法は、１８℃乃至３６℃の何れかの温度で培養した大腸菌細胞の抽出液と、タンパク質をコードする直鎖状鋳型ＤＮＡとを含む無細胞タンパク質合成系を用いて、少なくとも１時間、好ましくは２〜８時間連続的な合成反応を行うことを特徴とする。前記大腸菌の培養温度は、２０℃乃至３４℃であることが好ましく、さらに好ましい条件としては２６℃乃至３２℃である。本発明のタンパク質合成方法は、長時間の連続反応に適していることを特徴とし、連続的なタンパク質合成系としては、特に、透析系又は連続フロー系であることが好ましい。透析系による無細胞タンパク質合成系は、抽出液と直鎖状鋳型ＤＮＡとを含む透析内液と、タンパク質合成用低分子基質を含む透析外液と、前記基質がそれを介して移動可能な透析膜とを備えることを特徴とする。
【００１１】
本発明の異なる視点において、１８℃乃至３６℃の何れかの温度で培養した大腸菌細胞の抽出液を含むことを特徴とする、直鎖状鋳型ＤＮＡ用の無細胞タンパク質合成キットが提供される。前記大腸菌の培養温度は、２０℃乃至３４℃であることが好ましく、さらに好ましい条件としては２６℃乃至３２℃である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、ＰＣＲ等の手段により調製された多種類の直鎖状の二本鎖ＤＮＡを鋳型として、透析法等の連続反応系において効率よく大量のタンパク質合成を行うことができる。タンパク質の合成量自体は、環状のプラスミドＤＮＡを用いた場合と比較すると若干低下するが、鋳型ＤＮＡのクローニング操作を行う必要なく、一度に多数のサンプルを処理することができるため、ハイスループットのスクリーニングやタンパク質の網羅的な解析を行うためのサンプル調製に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の方法において、無細胞タンパク質合成系とは、タンパク質の翻訳に必要なタンパク質因子を細胞抽出液として取り出し、試験管内でこの反応を再構成することで目的とするタンパク質を合成させる系である。さまざまな生物種に由来する抽出液を利用して無細胞系を構成することができ、例えば、大腸菌や好熱性細菌等の細菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞及び出芽酵母等の、高いタンパク質合成活性の状態の真核細胞、及び原核細胞の抽出液を用いることができる(Clemens, M.J., Transcription and Translation - A Practical Approach, (1984), pp. 231-270, Henes, B.D. et al. eds., IRL Press, Oxford)。
【００１４】
本発明の方法において、これら真核細胞、又は原核細胞を至適生育温度よりも低温で培養することにより直鎖状鋳型ＤＮＡに適した無細胞タンパク質合成用の抽出液を調製することができる。例えば、大腸菌の場合、最適生育温度は３７℃付近であるから、本発明の方法においては１８℃乃至３６℃の何れかの温度で培養する。１８℃より低すぎると生育が極端に遅くなったり、低温ストレスといった反応が起こるからである。さらの大腸菌を培養する場合、増殖速度は遅いものの２０℃程度まで温度を下げても大腸菌の増殖が見られることは当業者にとってよく知られていることから、好ましくは２０℃乃至３４℃、さらに好ましくは２６℃乃至３２℃で培養する。
【００１５】
大腸菌を低温で培養することにより、細胞内におけるプロテアーゼ、及び種々のヌクレアーゼの産生が抑制されると考えられるが、その機構については必ずしも明らかではない。細胞内では様々なタンパク質が相互作用をしながら細胞の増殖を制御していることから低温で培養することによって種々のプロテアーゼやヌクレアーゼタンパク質自体の発現が抑制されるだけでなく、他のタンパク質の発現抑制や増強を通じて間接的にこれらの活性や発現が制御されることも考えられる。ヌクレアーゼの作用に対する影響としては細胞内の直鎖状ＤＮＡを分解するエキソヌクレアーゼ活性と、翻訳産物であるｍＲＮＡの分解を促進するリボヌクレアーゼ活性の何れか又は両方が抑制されると考えられる。また、大腸菌は最も遺伝的解析の進んだ生物でありこれまで多くの変異株が作製されている。従って、抽出液の調製に用いる大腸菌株の遺伝的背景によって、本発明の方法の効果が異なることも考えられるが、少なくとも大腸菌Ｂ株、特に、ＢＬ２１株及びＢＬ２１コドンプラス株において特段の効果が認められる。本発明の方法は大腸菌の培養温度を下げるという比較的簡易な方法であるから、種々の遺伝的変異を持った大腸菌株と組み合わせて相乗的な効果を得ることも可能である。
【００１６】
大腸菌の抽出液としては、ズベイら(前掲)又はプラットら(Pratt, J.M. et al., Transcription and Translation - A Practical Approach, (1984), pp. 179-209, Henes, B.D. et al. eds., IRL Press, Oxford)に記載された方法により調製されたＳ３０抽出液を用いることができる。大腸菌Ｓ３０抽出液は、転写及び翻訳に必要な大腸菌の全ての酵素と因子を含んでいる。更に補充的な混合液を添加することができる。具体的な調製方法としては、まず最初に大腸菌を培養し、菌体を遠心分離等により回収する。回収された菌体は、洗浄後、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリングブレンダー等を用いて破砕する。破砕された大腸菌の不溶物質を遠心分離で除去し、プレインキュベーション混合液と混合してインキュベーションする。この操作によって内在性のＤＮＡ、ＲＮＡが分解されるが、更に、カルシウム塩やマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加して内在性の核酸を分解させてもよい。続いて、透析により内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシド等を除き、適量ずつ分注して液体窒素又は−８０℃にて保存する。
【００１７】
タンパク質合成反応を行う際には、上記細胞抽出液に転写／翻訳鋳型となるＤＮＡ又はＲＮＡ、基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、ｔＲＮＡ、還元剤、ポリエチレングリコール、ｃＡＭＰ、葉酸類、抗菌剤、また鋳型としてＤＮＡを用いる場合にはＲＮＡ合成の基質、及びＲＮＡポリメラーゼ等を含むことができる。これらは目的タンパク質や、用いるタンパク質合成系の種類によって適宜選択して調製される。例えば、大腸菌のＳ３０抽出液の場合は、Ｔｒｉｓ−酢酸、ＤＴＴ、ＮＴＰｓ（ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ，及びＵＴＰ）、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、少なくとも一種のアミノ酸（天然の２０種類のアミノ酸の外それらの誘導体を含む。放射性同位元素でタンパク質を標識する場合には標識アミノ酸を除いた残りを添加する。）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、葉酸、ｃＡＭＰ、ｔＲＮＡ、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、グルタミン酸カリウム、及び至適濃度の酢酸マグネシウム等の一部あるいは全部を添加する。これらの補充的な混合液は、通常Ｓ３０抽出液とは別に保存しておき、使用直前に混合するが、これらをＳ３０抽出液とあらかじめ混合して凍結融解を行い、ＲＮＡ分解酵素複合体を除去することもできる（国際公開ＷＯ０１８３８０５号パンフレット参照）。
【００１８】
本発明の方法に用いるために上記方法により調製された大腸菌の細胞抽出液は、使用しやすいように一定量ごと分注して、直鎖状鋳型ＤＮＡ用の無細胞タンパク質合成キットとして配送することができる。これらの製品は凍結又は乾燥状態で保存することができ、保存及び輸送に適した容器に収容してキットとして販売される。キットには取扱説明書や陽性コントロールＤＮＡ、ベクターＤＮＡ等を添付することができる。
【００１９】
本発明の方法に用いられる直鎖状鋳型ＤＮＡは、適当な発現制御領域と、発現させたい所望のタンパク質をコードする遺伝子配列とを含む二本鎖ＤＮＡである。当該タンパク質の発現効率を上げるためには強力なプロモーターやターミネーターを用いて転写を促進すると共に、ｍＲＮＡとリボソームとの親和性を上げて翻訳効率を高める必要がある。例えば、Ｔ７ファージに由来するＴ７ＲＮＡポリメラーゼは極めて強力な転写活性を有し、高いレベルで組換えタンパク質を生成することが知られている。さらにＳＤ配列とも呼ばれるリボソーム結合配列（ＲＢＳ）を導入することが翻訳効率を上げるために重要である。また、合成されたタンパク質を迅速に精製、若しくは検出するためにはアフィニティー標識（タグ）配列を組み込んだ融合タンパク質が合成できるように鋳型ＤＮＡを設計することもできる。このような直鎖状鋳型ＤＮＡを効率的に製造するための改善された方法は本出願人により国際公開第０３００４７０３号パンフレットに開示されており、その内容も参照により本出願に組み込まれる。
【００２０】
本発明の無細胞タンパク質合成系には、バッチ法、連続フロー法等、従来公知の技術が適用可能であるが、本発明の方法は、長時間の連続反応に適しており、少なくとも１時間、好ましくは２〜８時間の連続的なタンパク質合成反応に適している。合成反応の途中で透析外液を新鮮なものと交換する等、反応系を工夫することによって１８時間あるいはそれ以上の連続合成も可能である。
【００２１】
[透析装置]
透析膜を介して内液と外液とを隔離して含む振とうもしくは攪拌可能な透析装置を用いることができる。小スケール反応用装置としては、例えばDispo Dialyzer(登録商標)(Spectrum社製)やSlidealyzer(登録商標)(Pierce社製)が挙げられる。また、大スケール反応用装置としては、Spectra/Por(登録商標)透析用チューブ(Spectrum社製)を例示できる。
【００２２】
[透析内液]
無細胞タンパク質合成系における透析内液（すなわち、タンパク質合成反応液）には、大腸菌Ｓ３０等の濃縮細胞抽出液の他に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ、ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン５’−三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン５’−三リン酸）、ＵＴＰ（ウリジン５’−三リン酸）、緩衝液、塩類、アミノ酸、ＲＮアーゼ阻害剤、抗菌剤、ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ等）およびｔＲＮＡ、などを含んでもよい。その他、ＡＴＰ再生系としてホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組合わせまたはクレアチンホスフェートとクレアチンキナーゼの組合わせ、ポリエチレングリコール（例えば＃８０００）、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸類、ＲＮアーゼ阻害剤、還元剤（例えばジチオトレイトール）、などを含むことができる。
【００２３】
［透析外液］
一方、透析外液（すなわち、タンパク質合成基質溶液）は、透析内液組成から細胞抽出液、ＲＮアーゼ阻害剤、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼを除いたものが使用できる。例えば、緩衝液、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、塩類、アミノ酸、抗菌剤などを含むことができる。添加成分の濃度は任意に選択することができる。緩衝液としては、例えばＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＯＡｃのような緩衝剤を使用できる。塩類の例は、酢酸塩（例えばアンモニウム塩、マグネシウム塩など）、グルタミン酸塩などであり、抗菌剤の例はアジ化ナトリウム、アンピシリンなどである。アミノ酸はタンパク質を構成する２０種のアミノ酸である。
【００２４】
透析膜の内部に上記透析内液を、一方その外部に透析外液を入れた、膜の分子量限界に応じて物質が膜を介して移動可能とする閉鎖系を振とうまたは攪拌（回転攪拌など）し、生成した目的タンパク質を、透析内液または外液から回収することができる。
【００２５】
以下に本発明の実施例として、ＣＡＴタンパク質を用いて本発明の方法について詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
［種々の温度で培養した大腸菌のＳ３０抽出液を用いたＣＡＴタンパク質の合成］
大腸菌ＢＬ２１コドンプラス株を通常の液体培地を用いて一晩培養し、種培養を行った。この種培養液を７Ｌの２ｘＹＴ培地（１６ｇ／ｌのバクトトリプトン、１０ｇ／ｌの酵母エキス、及び５ｇ／ｌのＮａＣｌ）を含むファーメンターに接種し、十分な通気を行いながら４００ｒｐｍの攪拌速度にて３０℃、３２℃、３４℃及び３７℃のそれぞれの温度で培養を行った。培養液の濁度（６００ｎｍの吸光度）を指標として菌体数を推定し、対数増殖期後期（６００ｎｍの吸光度が約３、菌体数では約１０９個／ｍｌのとき）に細胞を回収してズベイら（前掲）の方法に従って大腸菌Ｓ３０抽出液を調製した。
【００２７】
タンパク質合成反応の鋳型ＤＮＡとして、ＣＡＴ発現用プラスミドベクターであるｐＫ７−ＣＡＴ（Kim et al., Eur. J. Biochem. 239, 881-886, 1996参照）、及びこれを鋳型としてＰＣＲで増幅した直鎖状二本鎖ＤＮＡの両方を用いた。この直鎖状二本鎖ＤＮＡの調製は、５’プライマーＭ１３−４５Ｆｗ：5'-CCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'（配列番号１）及び３’プライマーＭ１３Ｒｅｖ：5'-AATTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3'（配列番号２）を用いて下記の表１に示した組成の反応液中で通常のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。反応条件は、初期変性を９４℃で２分間行ったあと、９４℃で３０秒間、５３℃で３０秒間、７２℃で２分間のサイクルを１０回、続いて９４℃で３０秒間、５３℃で３０秒間、７２℃で（２分＋５秒／サイクル）間のサイクルを２０回繰り返し、最後に７２℃で５分間の伸長反応を１回行った。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
このようにして調製した直鎖状鋳型ＤＮＡ及び環状プラスミドｐＫ７−ＣＡＴを用い、下記の表２に示した組成の溶液を、表３に示した組成の透析外液に対して透析し、３０℃で途中サンプリングを行いながら１８時間までタンパク質合成反応を行った。反応スケールは反応液３０μｌ、透析外液３００μｌとした。合成されたＣＡＴタンパク質の定量はＳｈａｗらの方法(Methods Enzymol. 735-755, 1975参照)に従った。すなわち、アセチルコエンザイムＡとクロラムフェニコールを基質としてＣＡＴによるクロラムフェニコールのアセチル化反応を行い、その結果生じた還元型コエンザイムＡを５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＮＴＢ）を用いて発色定量した。３７℃、４１２ｎｍにおける吸光度の単位時間当たりの増加量よりＣＡＴの活性を定量し、これを指標としてＣＡＴタンパク質量を決定した。なお、対照実験として、表２に示した組成のうち、アミノ酸としてシステインのみ３ｍＭとし、アジ化ナトリウム無添加、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを１３３μｇ／ｍｌ、大腸菌Ｓ３０抽出液を反応液の２４容量％、及び鋳型ＤＮＡをそれぞれ４μｇ／ｍｌとなるように変更して３７℃、１時間バッチ法による合成反応を行った。
【００３０】
【表２】
2006141276.tif 000003
【００３１】
【表３】
2006141276.tif 000004
【００３２】
図１は、上記透析法による合成反応５時間後の反応溶液を用いてＣＡＴ活性を測定し、タンパク質量を定量した結果を示す。３０℃〜３７℃の何れの温度においてもプラスミドＤＮＡを鋳型とした場合の方がタンパク質合成量は多いが、直鎖状ＤＮＡを鋳型とした場合には、Ｓ３０抽出液を調製するための大腸菌の培養温度によって、タンパク質の合成量に大きな差が生じた。培養温度３７℃では、直鎖状ＤＮＡを鋳型とした場合のタンパク質の合成量は、プラスミドＤＮＡに比べて３分の１以下となったが、培養温度が低下するに従って徐々に増加し、培養温度３０℃ではプラスミドＤＮＡを用いた場合とほぼ同程度のタンパク質合成量が認められた。
【００３３】
一方、図２は対照実験として行ったバッチ法によるタンパク質合成の結果を示す。この合成条件においては３７℃、１時間でほぼ合成反応は終了するため、鋳型ＤＮＡの種類によって合成量に大きな差は生じないが、図２から明らかなようにＣＡＴタンパク質の合成量自体は、上記透析法による合成量よりもはるかに低いものである。
【００３４】
図３は、上記透析法により１８時間合成反応を行った反応液１μｌを試料としてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果である。図３の左半分はプラスミドＤＮＡを鋳型とした場合の、大腸菌の各培養温度について合成されたタンパク質を示し、右半分は直鎖状ＤＮＡを鋳型とした場合の同様の結果を示す。試料の両端には分子量マーカーを流した。図３から明らかなように、分子量２３ｋダルトン（Ｄａ）付近に検出されるＣＡＴタンパク質は、プラスミドＤＮＡを用いた場合は、大腸菌の培養温度に影響を受けないが、直鎖状ＤＮＡを用いた場合には大腸菌の培養温度の低下に伴ってタンパク質のバンドの濃さが増加していることが認められ、上記図１に示した結果と再現性よく一致した。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】大腸菌ＢＬ２１コドンプラス株を種々の温度で培養して調製したＳ３０抽出液を用いて、透析系により３０℃、５時間タンパク質合成反応を行った結果を示す。ＣＡＴタンパク質の合成量は、ＣＡＴ活性の測定値から計算した。
【図２】大腸菌ＢＬ２１コドンプラス株を種々の温度で培養して調製したＳ３０抽出液を用いて、バッチ法により３７℃、１時間タンパク質合成反応を行った結果を示す。ＣＡＴタンパク質の合成量は、ＣＡＴ活性の測定値から計算した。
【図３】大腸菌ＢＬ２１コドンプラス株を種々の温度で培養して調製したＳ３０抽出液を用いて、透析系により３０℃、１８時間タンパク質合成反応を行った反応液１μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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