(57)【要約】【課題】  脳および網膜において血液脳関門及び血液網膜関門選択的な遺伝子および蛋白の発現をラットにおいて行う。このことで、血液網膜関門選択的な遺伝子・タンパク発現、およびラットにおいて血液脳関門及び血液網膜関門選択的な遺伝子・タンパクの発現を可能とする。【解決手段】  マウスTie2プロモーター/エンハンサーの内部に目的遺伝子を組み込んだ組み換え遺伝子ベクターを作成し、次いでバクテリア内で増幅した前記組み換え遺伝子ベクターから単離・精製したマウスTie2プロモーター/エンハンサー及びに目的遺伝子組み換え遺伝子をラット受精卵にマイクロインジェクションすることにより、ラット脳及び網膜における血液脳関門（脳毛細血管内皮細胞）および血液網膜関門（網膜毛細血管内皮細胞）に目的とする遺伝子及びタンパク質を特異的かつ限局的に発現させるトランスジェニックラットを作出する。【選択図】  図６
2006141228.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスTie2プロモーター/エンハンサーの内部に目的遺伝子を組み込んだ組み換え遺伝子ベクターを作成し、
次いでバクテリア内で増幅した前記組み換え遺伝子ベクターから単離・精製したマウスTie2プロモーター/エンハンサー及びに目的遺伝子組み換え遺伝子をラット受精卵にマイクロインジェクションすることにより、
ラット脳及び網膜における血液脳関門（脳毛細血管内皮細胞）および血液網膜関門（網膜毛細血管内皮細胞）に目的とする遺伝子及びタンパク質を特異的かつ限局的に発現させるトランスジェニックラットを作出することを特徴とするトランスジェニックラットの作出方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法により目的遺伝子とマーカータンパク質の遺伝子を導入したトランスジェニックラットを作出し、
次いで前記トランスジェニックラットの脳組織および網膜組織から血液脳関門及び血液網膜関門を構成する脳毛細血管内皮細胞及び網膜毛細血管内皮細胞を単離することを特徴とする脳毛細血管内皮細胞及び網膜毛細血管内皮細胞の単離方法。
【請求項３】
マウスTie2プロモーター/エンハンサーの内部に目的遺伝子機能を低下させる遺伝子を組み込んだ組み換え遺伝子ベクターを作成し、
次いでバクテリア内で増幅した前記組み換え遺伝子ベクターから単離・精製したマウスTie2プロモーター/エンハンサー及びに目的とする発現抑制遺伝子組み換え遺伝子をラット受精卵にマイクロインジェクションすることにより、
ラット脳及び網膜における血液脳関門（脳毛細血管内皮細胞）および血液網膜関門（網膜毛細血管内皮細胞）に目的遺伝子機能を特異的かつ限局的に低下させたトランスジェニックラットを作出することを特徴とするトランスジェニックラットの作出方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法により目的遺伝子機能を低下させた遺伝子とマーカータンパク質の遺伝子を導入したトランスジェニックラットを作出し、
次いで前記トランスジェニックラットの脳組織および網膜組織から血液脳関門及び血液網膜関門を構成する脳毛細血管内皮細胞及び網膜毛細血管内皮細胞を単離することを特徴とする脳毛細血管内皮細胞及び網膜毛細血管内皮細胞の単離方法。
【請求項５】
請求項３または請求項４の方法において用いられる目的遺伝子機能を低下させた遺伝子の遺伝子配列であって、機能を低下させたい遺伝子がABCG2遺伝子であり、該ABCG2遺伝子の発現、タンパク発現、機能発現を選択的に抑制するsiRNAが下記の配列番号１〜３のいずれかで表されることを特徴とするsiRNAの遺伝子配列。
配列番号１：5&#0;-CAGAGAAACAAGAACGGCCtt（upper, sense）
ttGUCUCUUUGUUCUUGCCGG-5&#0;（lower, antisense）
配列番号２：5&#0;-CCCUGACAGUGAGAGAAAAtt（upper, sense）
ttGGGACUGUCACUCUCUUUU-5&#0;（lower, antisense）
配列番号３：5&#0;-GCAAACAAGACAGAAGAGCtt（upper, sense）
ttCGUUUGUUCUGUCUUCUCG-5&#0;（lower, antisense）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニックラットの作出方法、および脳毛細血管内皮細胞及び網膜毛細血管内皮細胞の単離方法に関し、さらに詳しくは、Tie2プロモーターを用いたラット血液脳関門及び血液網膜関門に選択的な遺伝子・タンパク発現の技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脳と網膜の毛細血管はそれぞれ血液脳関門(ＢＢＢ)と内側血液網膜関門(ｉＢＲＢ)を形成している。現在まで、様々な輸送担体（トランスポーター）が脳と網膜の毛細管内皮細胞に発現していることが明らかにされている。輸送機能の更なる解析のためには、ラットでのＢＢＢとｉＢＲＢの機能の遺伝学的操作が重要な方法である。実際に、mdr1a/1bノックアウト・マウスを使用して、ＢＢＢでの脳から血液への薬物排出輸送におけるmdr1aの貢献に関して多くの研究が報告されている。ノックアウトマウスは、ＢＢＢとｉＢＲＢでの輸送システムにおけるトランスポーターの貢献を明らかにするために重要な手法である。しかし、ノックアウトの手法はマウスにのみ利用できる。そして、過去の多くのデータ蓄積とラットに限定される解析方法のため、ラットを使用した分析はトランスポーターの研究に必要である。
【０００３】
ＢＢＢとｉＢＲＢは、毛細血管の内皮細胞で形成されている。したがって、トランスジェニック技術によって毛細血管内皮細胞に選択的な遺伝子を誘導できれば、それによってラットの脳と網膜においてＢＢＢとｉＢＲＢに選択的に遺伝子発現を行うことが可能となる。輸送解析に加えて、ＢＢＢとｉＢＲＢでの遺伝子操作は、ＢＢＢやｉＢＲＢの分子機構(例えばCNSと関連する疾患でのＢＢＢ浸透性の変更や糖尿病性網膜症でのｉＢＲＢの破壊）を解析するために必要である。
【０００４】
モトイケらは、Tie2（血管内皮の選択的チロシンキナーゼ受容体）のプロモーター/エンハンサーに結合したＧＦＰを導入した遺伝子導入マウスでは、ＧＦＰが内皮細胞に選択的に発現することを報告している（非特許文献１参照）。
【０００５】
【非特許文献１】Motoike et al. Genesis 28:75-81 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、ラットでの情報や、網膜毛細管内皮細胞における遺伝子誘導に関する報告は今までにない。
本発明は、脳及び網膜への薬物の分布を制限している血液脳関門および血液網膜関門選択的な遺伝子操作をラットにおいて可能とするために、Tie2プロモーター下流に目的遺伝子を組み込み、遺伝子組み換えラットを作成することによって、脳、網膜において、血液脳関門およに血液網膜関門を構成する血管内皮細胞に選択的に遺伝子を発現する手法を確立すると共に、マーカータンパク質の遺伝子をTie2プロモーターの下流に組み込んだ遺伝子を導入することにより、例えば蛍光を発するマーカータンパク質の蛍光を指標に高純度に脳毛細血管内皮細胞を単離する手法を確立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち本発明は、マウスTie2プロモーター/エンハンサーの内部に目的遺伝子を組み込んだ組み換え遺伝子ベクターを作成し、次いでバクテリア内で増幅した前記組み換え遺伝子ベクターから単離・精製したマウスTie2プロモーター/エンハンサー及びに目的遺伝子組み換え遺伝子をラット受精卵にマイクロインジェクションすることにより、ラット脳及び網膜における血液脳関門（脳毛細血管内皮細胞）および血液網膜関門（網膜毛細血管内皮細胞）に目的とする遺伝子及びタンパク質を特異的かつ限局的に発現させるトランスジェニックラットを作出することを特徴とするトランスジェニックラットの作出方法、
および上記の方法により目的遺伝子とマーカータンパク質の遺伝子を導入したトランスジェニックラットを作出し、次いで前記トランスジェニックラットの脳組織および網膜組織から血液脳関門及び血液網膜関門を構成する脳毛細血管内皮細胞及び網膜毛細血管内皮細胞を単離することを特徴とする脳毛細血管内皮細胞及び網膜毛細血管内皮細胞の単離方法である（請求項１および請求項２）。
【０００８】
また本発明は、マウスTie2プロモーター/エンハンサーの内部に目的遺伝子機能を低下させた遺伝子を組み込んだ組み換え遺伝子ベクターを作成し、次いでバクテリア内で増幅した前記組み換え遺伝子ベクターから単離・精製したマウスTie2プロモーター/エンハンサー及びに目的とする発現抑制遺伝子組み換え遺伝子をラット受精卵にマイクロインジェクションすることにより、ラット脳及び網膜における血液脳関門（脳毛細血管内皮細胞）および血液網膜関門（網膜毛細血管内皮細胞）に目的遺伝子機能を特異的かつ限局的に低下させたトランスジェニックラットを作出することを特徴とするトランスジェニックラットの作出方法、
および上記の方法により目的遺伝子機能を低下させた遺伝子とマーカータンパク質の遺伝子を導入したトランスジェニックラットを作出し、次いで前記トランスジェニックラットの脳組織および網膜組織から血液脳関門及び血液網膜関門を構成する脳毛細血管内皮細胞及び網膜毛細血管内皮細胞を単離することを特徴とする脳毛細血管内皮細胞及び網膜毛細血管内皮細胞の単離方法である（請求項３および請求項４）。
【０００９】
さらに本発明によれば、上記請求項３または請求項４の方法において用いられる目的遺伝子機能を低下させた遺伝子の遺伝子配列であって、機能を低下させたい遺伝子がABCG2遺伝子であり、該ABCG2遺伝子の発現、タンパク発現、機能発現を選択的に抑制するsiRNAが下記の配列番号１〜３のいずれかで表されることを特徴とするsiRNAの遺伝子配列が提供される（請求項５）。
【００１０】
配列番号１：5&#0;-CAGAGAAACAAGAACGGCCtt（upper, sense）
ttGUCUCUUUGUUCUUGCCGG-5&#0;（lower, antisense）
配列番号２：5&#0;-CCCUGACAGUGAGAGAAAAtt（upper, sense）
ttGGGACUGUCACUCUCUUUU-5&#0;（lower, antisense）
配列番号３：5&#0;-GCAAACAAGACAGAAGAGCtt（upper, sense）
ttCGUUUGUUCUGUCUUCUCG-5&#0;（lower, antisense）
【００１１】
血液脳関門及び血液網膜関門に関連した遺伝子操作に関しては、従来、ノックアウトマウスが用いられている。しかし、ノックアウトマウスは、全身の遺伝子発現が低下もしくは無発現となっている。血液脳関門及び血液網膜関門選択的な遺伝子・タンパク発現を可能とする遺伝子操作によって、以下のような課題を解決できる。
すなわち、ラットで遺伝子操作が可能となることにより、マウスでは利用できない手法及びデータが利用できる。また材料としてマウスより豊富に確保できる。薬物研究はラットが主に用いられているため、データの蓄積が多い。さらに、ラットでのみ解析が可能な重要手法がある。従来の毛細血管単離法は、他の細胞の混入や、培養による遺伝子発現の変化が問題である。マーカータンパク発現により高純度脳及び網膜毛細血管内皮細胞の単離が可能となる。血液脳関門及び血液網膜関門選択的なsiRNA,アンチセンスによる遺伝子抑制によって薬物輸送に関わるタンパクの同定と関与の解明が可能になる。血液脳関門及び血液網膜関門を標的とした遺伝子治療血液脳関門及び血液網膜関門選択的な条件的遺伝子発現技術は、血液脳関門及び網膜関門に関わる病態ラットの開発、薬剤開発に重要なツールを提供することが可能である。
【００１２】
さらに本発明によれば、目的遺伝子とマーカータンパク質の遺伝子を導入したトランスジェニックラットを作出し、このトランスジェニックラットから単離した脳毛細血管内皮細胞及び網膜毛細血管内皮細胞を利用して関門透過性化合物のスクリーニングが可能となる。すなわち単離した脳もしくは網膜毛細血管内皮細胞を培養容器上で培養する。試験を行う化合物を培地中に添加し、一定時間後に細胞内に取り込まれた薬物の量を測定することで、内皮細胞に取り込まれる速度を測定する。また、特開２００１−２３８６８１の図１で示されているフィルターを用いたトランスウェル上に単離細胞を培養することで、血液から脳方向（フィルタ上部から下部）および脳から血液方向（フィルタ下部から上部）への薬物輸送速度をin vitroで計測することが可能である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、脳および網膜において血液脳関門及び血液網膜関門選択的な遺伝子および蛋白の発現がラットにおいて可能となる。
また、本発明の優位性は、以下の２点である。
1.血液網膜関門選択的な遺伝子・タンパク発現が可能である。
2.ラットにおいて血液脳関門及び血液網膜関門選択的な遺伝子・タンパクの発現が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の具体的な実施の形態について説明する。
血液脳関門及び血液網膜関門に存在する脳から血液及び網膜から血液方向の薬物排出輸送分子は、薬物の脳及び網膜への分布を妨げる大きな因子となっており、中枢作動薬や網膜作動薬の開発において大きな障壁となっている。このような輸送分子として、これまでABCB1(MDR1)、ABCC1(MRP1)、ABCC4(MRP4)、ABCG2(BCRP)、OAT3、oatp2等の分子が同定されている。薬物がこれら分子のそれぞれどのぐらい寄与の排出輸送によって脳辺分布が妨げられているかを解析することは、脳への分布改善を行う上で必須である。また、上記薬物輸送系以外にも排出輸送分子として、ATA2, ASCT2, TAUT, EAAT, SERT, NET, GAT2/BGT-1が同定されており、薬物の脳及び網膜への移行通路となる血液から脳方向の輸送系としても、GLUT1, LAT1, CRT, CAT1, CNT1, SERT, TAUT, insulin receptor, transferrin receptor等が同定されている。
【００１５】
このうち一部の分子(ABCB1, ABCC1, ABCG2, OAT3)に関しては、ノックアウトマウスが作出されているが、薬物の体内動態に関わる多くのデータはラットを用いた解析によって得られており、さらに、in vivoで脳から血液方向の薬物排出を直接測定するためにはラットでの解析が必須である。さらに、上記分子群は、血液脳関門及び血液網膜関門以外の肝臓、腎臓、小腸、胎盤等の上皮細胞で機能し、薬物の吸収、分布、排泄に関わっている。すなわち、ノックアウトマウスでは全身の分子機能が低下し、薬物の吸収、分布、排泄が変化した結果、血液脳関門及び血液網膜関門の機能のみを測定することが困難である。血液脳関門及び血液網膜関門を構成する、脳毛細血管及び網膜毛細血管内皮細胞でのみ目的遺伝子の機能を低下させた本発明方法によって作成したトランスジェニックラットによってのみ、本問題点を解決できる。
【００１６】
単離培養脳毛細血管内皮細胞及び網膜毛細血管内皮細胞は、血液脳関門及び血液網膜関門に発現する遺伝子及び蛋白、機能の同定に有用である。また、本単離培養細胞は脳関門及び網膜関門薬物透過性のin vitro測定システム及び薬物に対する血液脳関門及び血液網膜関門の機能の変化（薬効）を測定するシステムとして必須である。従来法である、単離脳毛細血管および内皮細胞は神経等の混入があり純度の問題点が存在する。また、不死化細胞株は細胞発現の変化を伴うために、in vivoの再現性に問題点が存在した。これら問題点は、脳及び網膜毛細血管内皮細胞マーカーを利用して短時間で高純度に単離することによってのみ解決できる。マーカーによる単離は、細胞表面抗原に対する抗体を用いて行うことが可能である。しかし、抗原抗体反応や洗浄の時間、および表面抗原の特異性、抗体接着による機能変化という問題点から本発明方法によって作成したトランスジェニックラットを用いた手法が優れている。
【００１７】
マウスTie2プロモーター/エンハンサーの内部に目的遺伝子を組み込んだ組み換え遺伝子を膜小胞やウィルスに組み込むことにより、血液脳関門及び血液網膜関門を標的として遺伝子治療薬に有用である。血液脳関門の機能低下は、中枢疾患と結びついている。また血液網膜関門の破綻は、糖尿病性網膜症の病因である。従って、低下した機能を補う遺伝子（例：トランスポーター遺伝子）や、血液脳関門の破綻を回復・予防する遺伝子（例、密着結合蛋白遺伝子）をマウスTie2プロモーター/エンハンサーの内部に組み込むことによって、これら遺伝子を血液脳関門及び血液網膜関門で発現することができる。このような血液脳関門及び血液網膜関門を標的した遺伝子治療には血液脳関門及び血液網膜関門選択的な遺伝子発現を誘導するプロモーター/エンハンサーが必須である。
【実施例】
【００１８】
実施例１
1.1トランスジェニック・ラットの作成
全ての動物実験は、東北大学大学院薬学研究科の動物管理委員会の承認を受けている。Tie2/GFP遺伝子（pSP14/15.t2hgfpPan5&#0;）を含んでいる遺伝子は、T. N.サトウ博士（ダラスのテキサスSouthwestern Medical Center大学）から供与された。Tie2/GFP導入遺伝子は供与された遺伝子をSal Iで消化することで単離した。ウィスターラットと他の外科的手技の受胎する受精卵細胞へのマイクロインジェクションは、YS研究所（栃木（日本））において行った。第1代目のスクリーニングとディプロイド・ゲノムあたり導入遺伝子コピーの数の見積りは、GFP遺伝子を含んでいるNot Iフラグメントをもちいゲノム・サザン法によって解析した。全ての子孫の導入遺伝子調査は、Extract-N Amp Tissue PCRキットを使用し、尾からゲノムDNAを抽出しPCRによって分析した（SIGMA;セントルイス、MO、米国）。プライマーは、5'-ATTCTCGTGGAACTGGATGG-3&#0;および5-GGACAGGTAATGGTTGTCTGG-3&#0;である。PCRは、以下のサイクル・プログラムで行われた：94度3分、40サイクルの94度30秒、55度1分、72度1分、そして最終的な延長の1サイクル72度2分。増幅されたバンドは、567bpで検出される。
【００１９】
1.2免疫組織学的解析
ラットは、ケタミンとキシラジンによる麻酔後、4%パラホルムアルデヒド（PFA）によって環りゅう固定を行い、摘出した組織は4%パラホルムアルデヒド、4度で保存した。その後、組織切片を作成した。免疫染色は、GLUT1抗体と組織切片を反応させ、TRITC標識2次抗体で可視化した。細胞核は、プロピヂウムアイオダイド(PI)によって染色した。切片は、共焦点レーザー顕微鏡（TCS SP（ライカ））によって観察した。
【００２０】
1.3結果
200個のマイクロインジェクトした受精卵から、2匹のトランスジェニックラット（それぞれ染色体当たり30個トランスジーン）がえられた。両トランスジェニックラットともに導入遺伝子はWistarラットとの交配によって子孫に受け継がれた。そして、明らかな異常は観察されなかった。トランスジェニックラットの表現型は、脳におけるGFP発現によって調べた。一つの系統では、脳全体で毛細血管様に強いGFP発現が認められた。対照的に、もう一つの系統では、脳の一部領域においてのみ、脳毛細血管の内皮細胞核周辺で弱いGFP表現が認められた。この系統では、GFP発現は、肝臓と腎臓において観察されなかった。したがって、今後の解析は、脳において強度のGFP発現を示したトランスジェニックラットの系統のヘミ接合体を用いて行った。
【００２１】
1.4トランスジェニックラットの脳におけるGFP発現
トランスジェニックラットの脳全体においてGFPの発現が認められた。脳のGFP発現はGLUT1の発現と重なった。拡大像においては、GLUT1は脳毛細血管の脳側および血液側の細胞膜に局在が認められた。同一の切片において、GFPの蛍光は、GLUT1のシグナルの間の細胞質に認められた。これらの結果は、GFPが脳毛細管内皮細胞に発現したことを示している。GFPの蛍光は、毛細血管内皮細胞に加え、より大きな血管の内皮細胞においても発現が検出された。PIによる二重染色法では、扁平な形の毛細血管内皮細胞の核は、GFPの蛍光と重なった。対照的に、神経系の細胞の核は、大脳皮質と海馬でGFPの蛍光と重ならなかった。したがって、Tie2プロモーター/エンハンサーは、脳において血管内皮細胞に選択的にGFP発現を誘導することが明らかとなった（図１参照）。
【００２２】
1.5トランスジェニックラットの網膜におけるGFP発現
トランスジェニック・ラットの網膜の全体を通じて、GFPの蛍光は分岐された毛細血管状として検出された。このGFPの蛍光は網膜毛細管内皮細胞の細胞膜に局在するGLUT1の発現と重なった。弱い蛍光は杆状細胞と錐体細胞層で観察された。この蛍光は、正常ラットでも検出されたことから、この蛍光はGFPによる蛍光ではないことを示唆している。PIによる二重染色法では、GFP蛍光は、網膜毛細血管内皮細胞の核以外の核とは重ならなかった。この結果は、GFPが網膜において毛細管内皮細胞に選択的に発現したことを示している。GFPの発現は、また、脈絡膜の毛細管内皮細胞においても検出された（図２参照）。
【００２３】
1.6トランスジェニックラットの腎臓と肝臓におけるGFP発現
トランスジェニック・ラットにおいてGFPの蛍光は肝臓と腎臓の限られた部位において検出された。腎臓では、GFPの蛍光は、腎糸球体内と腎細管周囲の毛細血管において検出された。腎臓と肝臓では、GFPの蛍光は、洞様毛細血管で検出された（図３参照）。
【００２４】
1.7考察と結論
本研究は、Tie2プロモーター/エンハンサーがトランスジェニックラットの脳と網膜において血管内皮細胞選択的に遺伝子発現を誘導することを明らかにした。モトイケらは、トランスジェニックマウスで脳血管内皮細胞選択的なGFPの発現を報告している。トランスジェニックラットにおいて、同様に脳血管内皮細胞選択的なGFPの発現が検出された。この結果は、脳に関しては、ラットではマウスと同様の転写調節によってTie2プロモーター/エンハンサーが脳血管内皮細胞選択的な遺伝子誘導を行っていることを示唆している。
【００２５】
Tie2プロモーター/エンハンサーによる網膜での遺伝子誘導の情報はない。本研究は、初めてTie2 promoter/enhanceが網膜においても毛細血管内皮細胞選択的に遺伝子を誘導する能力を持つということを明らかにした。網膜毛細管内皮細胞はiBRBを形成する、そして、色素性上皮細胞は外側血液網膜関門（oBRB）を形成する。網膜毛細管内皮細胞のGFP表現とは対照的に、色素性上皮細胞においてはGFPの発現は検出されたなかった。したがって、Tie2プロモーター/エンハンサーは、oBRBでは遺伝子を誘導せず、iBRBで選択的に遺伝子発現を誘発する。
【００２６】
肝臓と腎臓において、GFPは血管内皮細胞において選択的に発現を誘導した、しかし、その発現は限られた部位で検出された。薬物輸送が関する限り、腎細管と肝細胞の上皮細胞が大きな役割を果たしている。したがって、内皮細胞のトランスポーター発現がTie2プロモーター/エンハンサーによって誘導・抑制されたとき、腎臓と肝臓の中の薬物輸送機能をほとんど影響を受けない。
【００２７】
ラットでのBBBとiBRB選択的な遺伝子発現は、マウスと比較してトランスポーター解析において利点を持つ。1つの利点は、毛細血管内皮細胞を分離するための材料である。材料サイズの限定から、ほとんどの解析は、ラットまたはウシ脳から単離した脳毛細血管または初代培養脳毛細血管内皮細胞を用いて行われている。Tie2/GFPラットでのGFPは、脳毛細血管内皮細胞を識別するための良いマーカーである。したがって、細胞分離装置を用いて、GFPをマーカーとすることで毛細血管内皮細胞を高純度で分離することができる。これは、単離毛細血管画分での神経細胞の混入や培養による毛細血管内皮細胞での遺伝子発現変化の問題を解決することができる。
【００２８】
GFP遺伝子の代わりにアンチセンスＲＮＡまたはshRNAの発現カセットを挿入することで、トランスジェニックラットにおいて、脳および網膜でBBB及びiBRB選択的なトランスポーターの発現抑制が可能となる。このBBBとiBRB選択的な遺伝子抑制は、BBBとiBRBにおける薬物輸送に対する各トランスポーターの貢献度を解析するために重要な手法である。薬物の体内分布の解析は、マウスよりむしろラットを主に使用して行われている。さらに、brain-to-bloodとretina-to-blood方向の排出輸送は脳と網膜への薬物分布を制限することに重要な役割を果たす。排出輸送を解析する方法はラットでしか行えない手法がある（例えばBBB排出輸送を解析するBrain Efflux Index法やiBRB排出輸送を解析するための微小透析方法）。従って、BBBやiBRBにおける輸送システム（特に排出輸送）に対するトランスポーターの解析を可能にする点がもう一つの利点である。
【００２９】
遺伝子操作は、BBBとiBRBの輸送以外の機能を解析するためにも重要な技術である。疾患モデルラットから脳及び網膜毛細血管を高純度に単離することで、病態時におけるBBB及びiBRBの分子発現や機能変化を解析することができる。さらに、BBBとiBRBの機能調節の分子機構は、これまで培養細胞を用いて解析されてきた。今後、これらの分子機構を生体内(in vivo)において、BBBやiBRB選択的な遺伝子誘導とサイレンシングを用いて明らかにすることは、必須である。したがって、このBBBてiBRB選択的な遺伝子操作は、薬輸送の解析だけでなくBBBとiBRBの関門機能（密着結合やシグナル伝達を含む）を解析するためにも重要である。
【００３０】
結論として、マウスTie2プロモーター/エンハンサーは、トランスジェニックラットの脳と網膜において血管内皮細胞特異的な発現を誘導することを明らかにした。現在まで、ノックアウトマウスがBBBとiBRBにおけるトランスポーター機能を生体内で解析するために使用できる唯一の遺伝子改変動物であった。Tie2プロモーター/エンハンサーは、トランスジェニック・ラットの脳と網膜においてBBBとiBRBで選択的に遺伝子発現を操作することを可能にする手法である。
【００３１】
実施例２
単離した脳にリン酸緩衝液を加え、ホモジナイザーによって組織破砕溶液を作成する。組織破砕溶液に同量の32%デキストラン/リン酸緩衝液を加えたのち、4500xg、4℃、10分遠心分離を行い、上清を除く。沈殿物に16%デキストラン/リン酸緩衝液を加え、懸濁した後、4500xg、4℃、10分遠心分離を行い、上清を除く。沈殿物をliberase/リン酸緩衝液に懸濁し、37℃、1.5時間反応させる。０．４μmの小孔をもつフィルターでろ過した後、ろ液をセルソーターに添加する。GFPの蛍光(FL1)を測定し、高い蛍光をもつ細胞を分離する。分離した細胞は、1500xg、4℃、10分遠心分離によって回収し、培地（Dulbecco&#0;s modified Eagle&#0;s medium (DMEM)に 20mM sodium bicarbonate, 100U/ml benzylpenicillin potassium, 100μg/ml streptomycin sulfate and 10% fetal bovine serumを添加）に懸濁後、Type I コラーゲンでコートした培養皿上で37℃、5%CO2、湿度95%条件下で培養する。
【００３２】
図４は、Tie2/GFPトランスジェニックマウスから上記の方法でセルソーターに添加するサンプルを調製し、その細胞液を内皮細胞および血球細胞の表面抗原であるCD31に対する抗体と反応させ、抗体を指標に磁気ビーズ法によって細胞を単離後にFACSによってGFPの蛍光を測定したものである。R1の部分は、GFPの蛍光強度が強い細胞群を示す（＝脳毛細血管内皮細胞）。一方、R2は蛍光の弱い細胞群を示す（＝血球細胞）。この結果は、蛍光により細胞が分離可能であること、及び抗体による方法では、分離が不十分であることを示している。
【００３３】
図５は、野生型ラットから上記の方法でセルソーターに添加するサンプルを調製し、その細胞液を内皮細胞および血球細胞の表面抗原であるCD31に対する抗体と反応させる。抗体を指標に磁気ビーズ法によって細胞を単離後にFACSによって抗体由来の蛍光を測定する。この結果は、セルソーターに添加可能な細胞液が作成できたこと、及び抗体による方法では、分離が不十分である(R2の存在)ことを示している。
【００３４】
＜遺伝子発現抑制＞
HEK293細胞（ヒト胎児腎上皮細胞）にmycタグを付加したラットABCG2遺伝子(pCMV-Tag3A/rABCG2,1ug)と次の表１に示すsiRNA（各一種類, 3 ug）をLipofectamin 2000/OPTI-MEMを用いて遺伝子導入する。24,48,78時間培養後に遺伝子発現、タンパク発現、ABCG2機能を測定する。
【００３５】
【表１】
2006141228.tif 000003
【００３６】
導入ABCG2の遺伝子発現を定量的RT-PCRによって測定した結果、図６に示すようにsiRNA #01, #03, #04で60％-80％の発現抑制が検出された。siRNA #02では、siRNA無添加（siRNA: NC, cDNA +）と同等の遺伝子発現が検出され、本siRNAは阻害効果を発揮しないことが示された。また、ABCG2未導入(siRNA: NC, cDNA-)ではABCG2の発現は検出されなかった。
【００３７】
蛋白レベルでの発現抑制をWestern blotによって検討した（図７）。48時間処理（図７a）では、siRNA#03では、タンパク発現は検出されず、siRNA#01,#04では、発現の低下が認められた。一方、siRNA #02では、siRNA無添加（siRNA: NC, cDNA +）と同等の蛋白発現が検出された。すべてのサンプルでβアクチンの発現は差がないことから、サンプルのタンパク量には差がない。また、siRNA#03は、24時間及び72時間においてもタンパク発現を完全に抑制している（図７b,c）。
【００３８】
機能レベルでの抑制をABCG2基質の細胞内蓄積によって検討した（図８）。図８のsiRNA未添加(siRNA:NC)において、cDNA未導入と比較してcDNA導入では細胞内蓄積が低下している（棒グラフが短くなる）。これは、ABCG2によって細胞内の基質が細胞外に排出されたためである。siRNA#03導入によって、基質の細胞内蓄積がcDNA未導入（一番上）と同程度になった。siRNA#01,#04によって細胞内蓄積が増加した。一方、siRNA#02は、siRNA無添加（siRNA: NC, cDNA +）と優位な差がなかった。
【００３９】
以上の結果から、siRNA#03が遺伝子、蛋白、機能のすべてのレベルで最もよく抑制することが示された。
【００４０】
TR-BBB細胞（培養ラット脳毛細血管内皮細胞）にsiRNA（一種類, 4 ug）をLipofectamin2000/OPTI-MEMを用いて遺伝子導入する。24時間培養後に遺伝子発現を測定する。17beta-estradiolによる誘導は  100nM 17beta-estradiolによって24時間処理することで行った。図９aに示すように、siRNA#03によってABCG2遺伝子発現が抑制された（左側白い棒グラフ（siRNA-）と黒い棒グラフ(siRNA#03添加)の比較）。7beta-estradiol誘導条件下（右側のグラフ、遺伝子誘導は左右の白い棒グラフの比較）、siRNA#03はABCG2発現を非誘導条件下と同レベルまで抑制した。一方で、このようなsiRNA#03による遺伝子発現抑制は、同一細胞でのABCB1（図９ｂ）、ABCC1（図９ｃ）、ABCG1（図９ｄ）の遺伝子発現には認められなかった。
以上の結果は、siRNA#03はラット脳毛細血管内皮細胞においてABCG2の遺伝子発現を選択的に抑制することを示しており、本siRNAを発現するカセットをマウスTie2プロモーター/エンハンサーの内部に組み込んだ組み換え遺伝子を導入することでトランスジェニックラットにおいて血液脳関門におけるABCG2の発現を選択的に抑制することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】トランスジェニック・ラットの脳で検出されたGFPの蛍光を示す写真である。
【図２】トランスジェニック・ラットの網膜で検出されたGFPの蛍光を示す写真である。
【図３】トランスジェニック・ラットの腎臓と肝臓で検出されGFPの蛍光を示す写真である。
【図４】Tie2/GFPトランスジェニックマウスから抗CD31抗体を用いて細胞を単離後にFACSによってGFPの蛍光を測定した図である。
【図５】野生型ラットから抗CD31抗体を用いて細胞を単離後にFACSによって抗CD31抗体由来の蛍光を測定した図である。
【図６】導入ABCG2の遺伝子発現を定量的RT-PCRによって測定した結果を示す図である。
【図７】蛋白レベルでの発現抑制をWestern blotによって検討した図である。
【図８】siRNAの機能レベルでの抑制をABCG2基質の細胞内蓄積によって検討した結果を示す図である。
【図９】siRNA#03によってABCG2遺伝子発現が抑制されることを示す図である。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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