(57)【要約】  【課題】  潰瘍性大腸炎の緩解期導入または緩解期維持に有効なＴＬＲ４転写因子を抑制するＴＬＲ４転写因子活性抑制剤を提供する。  【解決手段】  酪酸菌、酪酸産生菌の代謝物、酪酸菌の代謝物または酪酸を含むことを特徴とするＴＬＲ４転写因子活性抑制剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酪酸菌、酪酸菌の代謝物、酪酸菌製剤または酪酸を含むことを特徴とするＴＬＲ４転写因子活性抑制剤。
【請求項２】
前記酪酸菌の代謝物が、酪酸菌の培養上清または酪酸菌、乳酸菌および糖化菌の混合培養上清であることを特徴とする請求項１に記載のＴＬＲ４転写因子活性抑制剤。
【請求項３】
前記酪酸菌製剤が、酪酸菌、乳酸菌および糖化菌配合製剤であることを特徴とする請求項１に記載のＴＬＲ４転写因子活性抑制剤。
【請求項４】
酪酸菌、酪酸菌の代謝物、酪酸菌製剤または酪酸を含むことを特徴とする潰瘍性大腸炎の緩解期導入剤または緩解期維持剤。
【請求項５】
前記酪酸菌製剤が、酪酸菌、乳酸菌および糖化菌配合製剤であることを特徴とする請求項４に記載の潰瘍性大腸炎の緩解期導入剤または緩解期維持剤。
【請求項６】
前記酪酸菌の代謝物が、酪酸菌の培養上清または酪酸菌、乳酸菌および糖化菌の混合培養上清であることを特徴とする請求項４に記載の潰瘍性大腸炎の緩解期導入剤または緩解期維持剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、潰瘍性大腸炎の緩解期導入または緩解期維持に有効なＴＬＲ４転写因子活性抑制剤および潰瘍性大腸炎の緩解期導入剤若しくは緩解期維持剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
トールライクレセプター（以下、「ＴＬＲ」と略称する）とは自然免疫において最初に働く受容体であり、病原体に共通する様々な分子構造のＰＡＭＰを認識する分子として現在までに１０種発見されている。ここでＰＡＭＰとは、Pathogen-associated molecular patternsの略称であり, 病原体関連分子パターンのことであり、自然免疫細胞が認識しうる病原体分子構造を意味する。
【０００３】
ＴＬＲのＰＡＭＰ認識をきっかけに貪食細胞やリンパ球による免疫反応が誘導されるため、ＴＬＲの制御が免疫反応全体の制御につながると考えられている。
【０００４】
ＴＬＲの一つＴＬＲ４は、グラム陰性細菌由来細胞壁（リポポリサッカライド, LPS）  を認識することが知られており、特に潰瘍性大腸炎患者の腸管内において健常人よりも発現量が高いことが報告されている。
【０００５】
潰瘍性大腸炎（以下、「ＵＣ」と略称することがある）は特定難治性疾患に指定されている疾患であり、根本的な治療法は未だ確立されていない。現在、メサラジン、サラゾスルファピリジンなどの５−ＡＳＡ系薬剤による緩解期維持、もしくはステロイド剤による炎症軽減などが行われているが、ＵＣ患者に対する作用機序は不明である。また、ＴＬＲの発現量に与える影響についても報告はない。
【０００６】
従って、ＵＣ患者において過剰発現中のＴＬＲ４を減少させることができれば、それに伴い炎症反応も軽減されると考えられるが、現在、ＴＬＲ４の転写制御については不明な状態である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、潰瘍性大腸炎の緩解期導入または緩解期維持に有効なＴＬＲ４転写因子を抑制するＴＬＲ４転写因子活性抑制剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、酪酸菌培養上清がTLR4 mRNA発現量を減少させるとの知見を得た。また、酪酸菌培養上清中に含まれる代謝産物の一つである酪酸を用いても同様にTLR4 mRNA発現量を減少させる知見を得た。係る知見に基づき、本発明を完成するに至った。さらに、酪酸菌培養上清および酪酸は、TLR4 mRNA発現量のみならず、TLR4タンパク発現量も減少させることを知見した。
【０００９】
すなわち本発明は、
（１）  酪酸菌、酪酸菌の代謝物、酪酸菌製剤または酪酸を含むことを特徴とするＴＬＲ４転写因子活性抑制剤、
（２）  前記酪酸菌の代謝物が、酪酸菌の培養上清または酪酸菌、乳酸菌および糖化菌混合培養上清であることを特徴とする（１）に記載のＴＬＲ４転写因子活性抑制剤、
（３）  前記酪酸菌製剤が、酪酸菌、乳酸菌および糖化菌配合製剤であることを特徴とする（１）に記載のＴＬＲ４転写因子活性抑制剤、
（４）  酪酸菌、酪酸菌の代謝物、酪酸菌製剤または酪酸を含むことを特徴とする潰瘍性大腸炎の緩解期導入剤または緩解期維持剤、
（５）  前記酪酸菌が、酪酸菌、乳酸菌および糖化菌配合製剤に含まれる酪酸菌であることを特徴とする（４）に記載の潰瘍性大腸炎の緩解期導入剤または緩解期維持剤、
（６）  前記酪酸菌の代謝物が、酪酸菌の培養上清または酪酸菌、乳酸菌および糖化菌の混合培養上清であることを特徴とする（４）に記載の潰瘍性大腸炎の緩解期導入剤または緩解期維持剤、
に関するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＴＬＲ４転写因子活性抑制剤を経口的に服用することにより、ＴＬＲ４発現を抑制し、それに伴い潰瘍性大腸炎の緩解期導入、または緩解期維持が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明のＴＬＲ４転写因子活性抑制剤は、酪酸菌、酪酸菌の代謝物、酪酸菌製剤または酪酸を含むことを特徴とするものである。
【００１３】
本発明における酪酸菌とは、ｎ−酪酸を産生するクロストリジウム  ブチリカムである。
【００１４】
本発明における酪酸菌製剤は、酪酸菌、乳酸菌および糖化菌の配合製剤であってもよい。酪酸菌、乳酸菌および糖化菌の配合製剤は、酪酸菌，乳酸菌，糖化菌を培養し，培養終了後，遠心分離機により集菌，安定化剤を混合し凍結乾燥する。乾燥後，粉砕しコーンスターチ，バレイショデンプン，デキストリンなど好ましい基剤と混合し，酪酸菌単独あるいは酪酸菌，乳酸菌および糖化菌により構成されたものである。
【００１５】
本発明における酪酸菌の代謝産物とは、酪酸産生菌または酪酸菌を培養して得られる代謝物である。本発明における代謝物は酪酸菌を培養した後に得られる培養上清であってもよい。さらに培養上清を乾燥後，コーンスターチ，バレイショデンプン，デキストリンなど好ましい基剤に混合したものであってもよい。酪酸菌の代謝産物として、酪酸菌、乳酸菌および糖化菌の混合培養上清を用いてもよい。
【００１６】
また本発明におけるＴＬＲ４転写因子活性抑制剤としては、酪酸そのものであってもよい。
【００１７】
本発明者らは、ＴＬＲ４  ｍＲＮＡの転写量制御に直接関わる転写因子ＰＵ．１に対して酪酸が作用し、ＰＵ．１とその結合領域との結合親和性を抑制することを見出した。
【００１８】
したがって、酪酸がＴＬＲ４転写因子の活性を抑制することでＴＬＲ４ ｍＲＮＡ転写量を減少させ、その結果ＴＬＲ４タンパク（＝受容体）発現量が減少する。
【００１９】
以上より、酪酸菌、これらの代謝産物、酪酸菌，乳酸菌および糖化菌配合製剤または酪酸が、ＴＬＲ４転写因子ＰＵ．１とその結合領域への結合親和性を抑制し、その結果ＴＬＲ４受容体量を減少させ、これらの作用が、潰瘍性大腸炎患者のＴＬＲ４過剰発現の抑制と、ＴＬＲ４過剰発現に伴う炎症反応の抑制が期待される。
【００２０】
本発明のＴＬＲ４転写因子活性抑制剤は、たとえば酪酸菌生菌菌体単独で，あるいは酪酸菌，乳酸菌および糖化菌を混合し，粉末，細粒，顆粒，錠剤などの剤型で投与することが好ましい。酪酸菌培養上清粉末単独で，あるいは酪酸菌，乳酸菌および糖化菌の培養上清粉末を混合し，粉末，細粒，顆粒，錠剤などの剤型で投与することが好ましい。
【００２１】
本発明のＴＬＲ４転写因子活性抑制剤は、酪酸菌あるいは酪酸菌，乳酸菌および糖化菌乾燥菌体を粉末，細粒，顆粒，錠剤にした場合は，１００ｍｇから１０ｇの濃度範囲で用いればよい。酪酸菌，酪酸菌，乳酸菌および糖化菌を培養した後に得られる培養上清粉末の場合は，０．１ｍｇから１０００ｍｇの濃度範囲で用いればよい。
【００２２】
本発明のＴＬＲ４転写因子活性抑制剤は、ＴＬＲ４発現を抑制し、それに伴い潰瘍性大腸炎の緩解期導入、または緩解期維持が期待される。
【実施例１】
【００２３】
クロストリジウム  ブチリカムTO-A株(以下、「CB」と略称する)，ストレプトコッカス  フェカーリス（以下，「SF」と略称する），バチルス  メセンテリカス(以下、「BM」と略称する)各々を下記のPYG (変法)培地に接種し、37℃24時間培養した。培養後、遠心分離 (5000G 10min)にかけ、上清を採取。上清をメンブランフィルター(0.45μm)にて濾過滅菌して使用した。
【００２４】
PYG（変法）培地
ペプトン (Difco製) 0.5%
トリプチカーゼ (BBL製) 0.5%
酵母抽出物. (BBL製) 1.0%
グルコース (国産化学製) 1.0%
pH 7.0
【００２５】
＜試験例１＞
ヒト腸管粘膜上皮細胞株HT-29に実施例１で調製したCB培養上清あるいはCB，SF，BMの３種菌混合上清を添加後、HT-29よりtotal RNAを抽出しreal time RT-PCRにてTLR4 mRNA発現量を測定した。非刺激時のTLR4 mRNA/GAPDH mRNAを100%として図１に結果を示す。
【００２６】
図１に示すように、CB培養上清および３種菌混合上清添加により、TLR4mRNA発現量が16±8%，と著明に低下した。
【００２７】
＜試験例２＞
本試験では炎症時を想定した状況として、実施例１で調製したCB培養上清あるいは３種菌混合上清の他にTh1サイトカインIFNγ(100μg/ml)を同時にヒト腸管粘膜上皮細胞株HT-29に添加した後、HT-29よりtotal RNAを抽出しreal time RT-PCRにてTLR4 mRNA発現量を測定した。非刺激時のTLR4 mRNA/GAPDH mRNAを100%として図２に結果を示す。
【００２８】
図２に示したように、IFNγ(100μg/ml)添加により191±18%に増加したTLR4 mRNA発現量は、CB培養上清あるいは３種菌混合上清添加により21±6%と著明に抑制された。
【００２９】
＜試験例３＞
CB培養上清中のTLR4 mRNA発現量抑制因子を探索するため、クロストリジウム  ブチリカムの代表的な代謝産物である短鎖脂肪酸に着目し、CB培養上清(−20℃にて冷凍保存)を日本食品分析センターへ送付、５成分（コハク酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸）の分析を依頼した。
【００３０】
［HPLC分析試料調製］
CB培養上清5gに5%過塩素酸5ml添加し、50mlに定容後、フィルターろ過し、HPLC分析で分析した。
【００３１】
［HPLC分析条件(ポストカラムpH緩衝電気伝導度検出法)］
機種        LC-10AD (株式会社島津製作所)
検出器      紫外可視分光光度計 SPD-10AVP (株式会社島津製作所)
カラム      Shodex RSpak C-811, φ8 mm ×500 mm (昭和電工株式会社)
カラム温度  60℃
移動相      3 mM 過塩素酸
反応液      15 mM リン酸水素二ナトリウム溶液
(0.2 mM ブロモチモールブルー含有)
測定波長    445nm
流量        移動相 1.0 ml/min, 反応液 1.4 ml/min
【００３２】
［結果］
ギ酸      4.34 mM
酢酸      8.33 mM
酪酸      13.62 mM
コハク酸      検出限界(0.01%)以下
プロピオン酸  検出限界(0.01%)以下
【００３３】
CB培養上清のHPLC分析結果に基づき、各有機酸を単独あるいは組み合わせた下記7種のサンプルを作成した。
【００３４】
［有機酸サンプル作成］
FAB :    ギ酸+酢酸+酪酸
AB :     酢酸+酪酸
FB :     ギ酸+酪酸
FA :     ギ酸+酢酸
F :      ギ酸のみ
A :      酢酸のみ
B :      酪酸のみ
サンプル中の各種有機酸濃度がCB培養濾液中の各有機酸濃度(ギ酸4.34mM、酢酸8.33mM、酪酸13.62mM)に等しくなるように各有機酸を蒸留水で希釈し、各サンプルのpHがCB培養濾液上清と同じpH4.50(22℃における測定値。各サンプルは誤差範囲±0.05以内に調製)になるように水酸化ナトリウムにより調整した。
【００３５】
pH調整後、各サンプル液をメンブランフィルター(0.45μm)にて濾過滅菌して使用した。
【００３６】
各有機酸サンプルをヒト腸管粘膜上皮細胞株HT-29に添加した後、HT-29よりtotal RNAを抽出しreal time RT-PCRにてTLR4 mRNA発現量を測定した。
【００３７】
［結果］
非刺激時のTLR4 mRNA/GAPDH mRNAを100%として図３に結果を示す。
【００３８】
図３に示すように、酪酸含有時にのみCBの培養上清添加とほぼ同等のTLR4 mRNAレベル抑制活性を示したことから、酪酸がTLR4 mRNA抑制因子と考えられた。
【００３９】
＜試験例４＞
各濃度別酪酸溶液をヒト腸管粘膜上皮細胞株HT-29に添加した後、HT-29よりtotal RNAを抽出しreal time RT-PCRにてTLR4 mRNA発現量を測定した。
【００４０】
非刺激時のTLR4 mRNA/GAPDH mRNAを100%として図４に結果を示す。
【００４１】
図４に示すように、約1mM以上の酪酸濃度においてTLR4 mRNA抑制が観察された。
【００４２】
＜試験例５＞
酪酸によるTLR4 mRNA転写抑制の機構解明のため、TLR4 の転写因子であるPU.1とそのプローブの結合親和性に及ぼす酪酸添加による影響をEMSA試験により経時的に検証した。なお、酪酸を1〜10mM添加した細胞から抽出したタンパク試料をサンプルとした。
【００４３】
［EMSA (Electrophoretic‐Mobility Shift Assay) 試験］
EMSA試験はゲル  シフト  アッセイの1種であり、フリーDNA 鎖とDNA-タンパク質複合体の泳動移動速度の違いによって、DNA と相互作用するタンパク質を迅速に同定する手法である。バンドの出現位置を見ることで、タンパクとDNA鎖の結合の特異性を判断した。
【００４４】
［方法］
本試験での目的タンパク質‥‥TLR4の転写因子PU.1
本研究での目的タンパク質が結合するDNA probe‥‥PU.1結合塩基配列の一部
（１）biotinで標識したDNA probe(標識プローブ)と標識しないDNA probe(非標識プローブ)を作成する。
（２）タンパク質溶液に標識プローブを添加し、DNA-タンパク複合体を形成させる(A液)。
（３）A液に非標識プローブを過剰に添加、同様にDNA-タンパク複合体を形成させる(B液)。
（４）標識プローブ、A液、B液を電気泳動し、標識プローブのバンド位置を検出する。
【００４５】
(Control)
目的タンパクと複合体を形成しなかった場合の標識プローブのバンド位置を確認する。
【００４６】
(A液)
目的タンパクがプローブと結合、複合体を形成。分子量が大きくなった分移動度が減少、標識プローブのみに比べ上部にバンドを形成する。
【００４７】
(B液) 
目的タンパクとプローブとの結合が特異的である場合、過剰に添加された非標識DNA プローブが標識されたDNA プローブと目的タンパクを取り合う。その結果、目的タンパクのほとんどが非標識プローブとの複合体を形成することになるが、非標識プローブであるためバンドは検出されなかった。一方、複合体を形成できなかった標識プローブは、Controlと同様のバンド位置まで泳動され、検出される。
【００４８】
［結果］
電気泳動の写真を図５に示す。
【００４９】
［酪酸添加0hr後］
今回使用した目的タンパクは転写因子PU.1であることを確認。
【００５０】
［酪酸添加6hr後］(酪酸添加0hr後との比較)
A液において、複合体のバンド位置のバンド強度が減少し、プローブのみのバンド位置にバンドが現われた。これは、0hrで検出されていた標識プローブと目的タンパクの複合体の一部が6hrの間に解離したことを意味する。つまり、酪酸添加により転写因子PU.1と、PU.1が結合する塩基配列との結合安定性が弱まったということであり、結合が弱まればTLR4の転写頻度も減少、その結果、TLR4 mRNA発現量が抑制されるという機構が明らかとなった。
【００５１】
＜試験例６＞
CB培養上清または酪酸溶液をヒト腸管粘膜上皮細胞株HT-29に添加した後、ウェスタン  ブロティング法によりTLR4タンパクを染色し、TLR4タンパク発現量の変化を観察した。
【００５２】
図６に示すように、CB培養上清または酪酸溶液添加により、TLR4タンパク発現量が減少する傾向が見られた。
【００５３】
以上試験例１〜６の結果より、酪酸の添加により、TLR4プロモーターの転写活性が抑制され、TLR4 mRNA量減少し、その結果TLR4 タンパク量減少し、TLR4 過剰発現が抑制され、炎症反応が抑制されることが解明された。
【００５４】
＜試験例７＞
軽症あるいは中等症の潰瘍性大腸炎患者６名に対し，酪酸菌，乳酸菌および糖化菌配合製剤を４週間投与し，臨床症状，大腸内視鏡所見，UC-DAI（潰瘍性大腸炎臨床スコア）などについて検討した．ここでいうUC-DAIとは排便回数，血便の有無，大腸内視鏡所見，全般的評価，患者の印象など，潰瘍性大腸炎の重症度を数値化したもので，高値ほど重症を示す．患者は１８歳から５４歳，男性４名，女性２名であった．１日の排便回数は，２から８回で，６例中５例で血便が観察された．腹痛は４例であった．酪酸菌，乳酸菌および糖化菌配合製剤の錠剤および食物繊維を試験終了後まで連日服用した。
【００５５】
投与後，内視鏡所見はほとんどで特有の炎症所見は軽症化あるいは改善され，図７に示すようにUC-DAIも投与前8.00±1.83に対し，投与後では3.83±1.46（p=0.015）と有意に改善した。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明のＴＬＲ４転写因子活性抑制剤により、潰瘍性大腸炎の緩解期導入または緩解期維持に効果を示すことが期待され、潰瘍性大腸炎の治療に寄与するところ大である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】試験例１の結果を示すグラフ
【図２】試験例２の結果を示すグラフ
【図３】試験例３の結果を示すグラフ
【図４】試験例４の結果を示すグラフ
【図５】試験例５の結果を示す電気泳動写真
【図６】TLR4タンパク発現量を示す図
【図７】試験例７の結果を示すグラフ
【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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