(57)【要約】 【課題】  本発明は、リンパ球へも分化可能な造血幹細胞株を提供することを課題とする。【解決手段】  マウスES細胞から、自己複製可能であり、かつリンパ球へも分化可能な造血幹細胞株、B-2細胞株を単離した。該細胞はbFGF存在下で増殖可能であり、かつ分化誘導条件下での培養により、赤血球、マクロファージおよびリンパ球細胞のいずれにも分化可能である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスES細胞由来の造血幹細胞株
【請求項２】
マウスES細胞に由来する、bFGFの存在下で自己複製可能な造血幹細胞株。
【請求項３】
赤血球、顆粒球、マクロファージ、Ｂリンパ球およびNK細胞のいずれにも分化可能なことを特徴とする、請求項１または２記載の造血幹細胞株。
【請求項４】
増殖培養条件下での培養中では、c-kit、CD34、FMS様チロシンキナーゼ3/胎児肝臓キナーゼ2（Flt3/Flk2）、PgP-1、熱安定性抗原（heat stable antigen: HSA）、GATA2、PU.1、T細胞急性白血病遺伝子1/幹細胞性白血病遺伝子（Tal1/SCL）、アンジオポエチン-1、急性骨髄性白血病遺伝子1（AML-1）、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）、IkarosおよびVasaからなる群より選択される１以上のタンパク質をコードする遺伝子の発現が認められることをさらなる特徴とする、請求項１〜３のいずれか1項記載の造血幹細胞株。
【請求項５】
増殖培養条件下での培養中ではc-kit、CD34、Flt3/Flk2、PgP-1、HSA、GATA2、PU.1、Tal1/SCL、アンジオポエチン-1、AML-1、TdT、IkarosおよびVasaの全てのタンパク質をコードする遺伝子の発現が認められることをさらなる特徴とする、請求項１〜４のいずれか1項記載の造血幹細胞株。
【請求項６】
受領番号FERM AP-20276である、請求項１〜５のいずれか1項記載の造血幹細胞株。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか1項記載の造血幹細胞株を分化誘導条件下で培養することにより得られる、分化したＢリンパ球。
【請求項８】
請求項７記載のＢリンパ球であって、分化誘導前の該造血幹細胞株に比べて、B220遺伝子、βメジャーグロビン遺伝子、Ikaros遺伝子、λ5遺伝子、Rag-1遺伝子およびPax-5遺伝子からなる群より選択される少なくとも1以上の遺伝子の発現誘導が認められることを特徴とする、Ｂリンパ球。
【請求項９】
B220遺伝子、Ikaros遺伝子、λ5遺伝子、Rag-1遺伝子およびPax-5遺伝子の全ての遺伝子の発現誘導が認められることを特徴とする、請求項８記載のＢリンパ球。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか1項記載の造血幹細胞株からＢリンパ球へと分化させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ES細胞から誘導された造血幹細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞は、生物個体の生涯にわたって、自己複製によって自身を維持しながら、すべての血液細胞を生産し、供給し続けるきわめて重要な幹細胞である。その性質を利用した幹細胞移植は白血病など重篤な病気に対する根本的な治療法である。しかし造血幹細胞を培養下で純粋に培養する技術は、依然として完成していないために移植用のドナー細胞の不足が大きなネックとなっている。現在行われている造血幹細胞の培養・増幅は、主にストローマ細胞との共培養によるものであり、短期間であれば造血幹細胞を培養・維持できるが、純粋に造血幹細胞のみを増殖させるものではなく、また造血幹細胞の絶対数を必ずしも十分に増幅できるわけではない。
【０００３】
そこで造血幹細胞を培養下で限りなく増殖させ続け最終的には造血幹細胞株を樹立する方法の確立が目指されてきたが、今日に至るまで成功していない。以前は白血病細胞の株で多分化能を示すものが造血幹細胞株のモデルとして使用されてきたが、元々異常な細胞であるために、応用範囲はきわめて限定的であった。最近では、増殖や分化に作用する遺伝子を人工的に操作することによって、造血幹細胞株を得たという報告がある。しかし増殖や分化に作用する遺伝子発現を変化させることは幹細胞自身の性質を変質させる可能性が高く、直ちに正常の造血幹細胞へと応用することはやはり困難である。したがって、これまで造血幹細胞の株は増殖や分化に関わる遺伝子を人工的に操作して得られた細胞株であり正常な造血幹細胞のモデルとしては不十分である。またこれまで得られた造血幹細胞株は、大部分が培養下では赤血球・顆粒球・マクロファージなどへ分化することができても、リンパ球には分化できなかった。
【０００４】
【非特許文献１】出願公開公報第特開平10-113171号
【非特許文献１】Schickwann Tsai, Stephen Bartelmez, Ema Sitnika, and Steven Collins. (1994). Genes and Development 8:2831-2841.
【非特許文献２】Perpetua Pinto do O, Asa Kolterud and Leif Carlsson. (1998). EMBO J. 17:5744-5756.
【非特許文献３】Rita C.R. Perlingeiro, Michael Kyba, and George Q. Daley. (2001). Development 128:4597-4604
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、遺伝子改変を行うことなく、リンパ球へも分化可能な造血幹細胞株を提供することを課題とする。該造血幹細胞株は、遺伝子改変により細胞の本来の性質に変化をきたしている可能性が少なく、また癌化した細胞でもないため、より正常の造血幹細胞に酷似した細胞である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明は以下の態様：
１．マウスES細胞由来の造血幹細胞株；
２．マウスES細胞に由来する、bFGFの存在下で自己複製可能な造血幹細胞株；
３．赤血球、顆粒球、マクロファージ、Ｂリンパ球およびNK細胞のいずれにも分化可能なことを特徴とする、上記１または２記載の造血幹細胞株；
４．増殖培養条件下での培養中では、c-kit、CD34、FMS様チロシンキナーゼ3/胎児肝臓キナーゼ2（Flt3/Flk2）、PgP-1、熱安定性抗原（heat stable antigen: HSA）、GATA2、PU.1、T細胞急性白血病遺伝子1/幹細胞性白血病遺伝子（Tal1/SCL）、アンジオポエチン-1、急性骨髄性白血病遺伝子1（AML-1）、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）、IkarosおよびVasaからなる群より選択される１以上のタンパク質をコードする遺伝子の発現が認められることをさらなる特徴とする、上記１〜３のいずれかに記載の造血幹細胞株；
５．増殖培養条件下での培養中ではc-kit、CD34、Flt3/Flk2、PgP-1、HSA、GATA2、PU.1、Tal1/SCL、アンジオポエチン-1、AML-1、TdT、IkarosおよびVasaの全てのタンパク質をコードする遺伝子の発現が認められることをさらなる特徴とする、上記１〜４のいずれかに記載の造血幹細胞株；
６．受領番号FERM AP-20276である、上記１〜５のいずれかに記載の造血幹細胞株；
７．上記１〜６のいずれかに記載の造血幹細胞株を分化誘導条件下で培養することにより得られる、分化したＢリンパ球；
８．上記７記載のＢリンパ球であって、分化誘導前の該造血幹細胞株に比べて、B220遺伝子、βメジャーグロビン遺伝子、Ikaros遺伝子、λ5遺伝子、Rag-1遺伝子およびPax-5遺伝子からなる群より選択される少なくとも1以上の遺伝子の発現誘導が認められることを特徴とする、Ｂリンパ球；
９． B220遺伝子、Ikaros遺伝子、λ5遺伝子、Rag-1遺伝子およびPax-5遺伝子の全ての遺伝子の発現誘導が認められることを特徴とする、上記８記載のＢリンパ球；ならびに
１０．上記１〜６のいずれかに記載の造血幹細胞株からＢリンパ球へと分化させる方法；
に関する。
【０００７】
さらに、本発明は、分化誘導条件下で10日間培養することによりMac-1およびGr-1遺伝子、TER119遺伝子の発現誘導が認められること、分化誘導条件下で30日間培養することによりB220遺伝子の発現誘導が認められること、分化誘導条件下で30日間培養することによりB220遺伝子、Ikaros遺伝子、λ5遺伝子、リコンビネーションアクティベーティング遺伝子1（Rag-1）およびペアードボックス遺伝子5（Pax-5）からなる群より選択される少なくとも１以上遺伝子の発現誘導が認められること、分化誘導条件下で30日間培養することによりIkaros遺伝子、λ5遺伝子、Rag-1遺伝子およびPax-5遺伝子の全ての遺伝子の発現誘導が認められること、およびNK細胞分化誘導条件下で10日間培養することにより、NK1.1の発現誘導が認められること、のいずれか１つを特徴とする、上記造血幹細胞株をも包含する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、リンパ球へも分化可能な造血幹細胞株が提供される。本発明の造血幹細胞株は、自己複製が可能であり、かつリンパ球へも分化可能であるという性質を有していることから、造血幹細胞に関わる研究のツールとして、非常に有用である。本発明の造血幹細胞はさらに、遺伝子改変を行わないで樹立したものであることから、その性質は正常の造血幹細胞に非常に酷似していると考えられ、人為的な遺伝子改変または癌化等による正常な造血幹細胞の性質を逸脱した性質を有する可能性がなく、本発明の造血幹細胞は造血幹細胞の研究ツールとして非常に信頼性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、マウスES細胞に由来する造血幹細胞株に関する。該幹細胞株は自己複製が可能であり、かつリンパ球への分化が可能である。
【００１０】
本発明者らは、以下の手法により、上記造血幹細胞株を得た。
C3Hマウス胚盤胞から樹立されたH-1 ES細胞はマイトマイシンC処理によって増殖能をなくしたマウス胎仔の線維芽細胞との共培養によって未分化状態で増殖させた。培地はDMEM培地に20％牛胎仔血清、1000単位のLIF、100μMの2メルカプトエタノールを加えたものを用いた。H-1 ES細胞は、LIFおよびマウス胎仔線維芽細胞が存在しない条件で培養すると分化が誘導される。DME/F12培地に10μg/mlのトランスフェリン、10μg/mlのインシュリン、10％ウシ胎仔血清、100μMの2メルカプトエタノールを添加して7日間培養し、様々な細胞に分化させた。その後、細胞をトリプシン/EDTA処理で解離させ、新しい培養液とともにディッシュに播種した。数時間静置培養すると、血球系以外の細胞はディッシュに付着するので浮遊している細胞を集めて、1．2％のメチルセルロースを加えた半固形培地にIL-3、SCF、BFGFおよび2メルカプトエタノールを加えてまいた。2週間後10前後の細胞からなるごく小さなコロニーがいくつか形成された。同様の培養条件で2回継代した後、メチルセルロースを含まない液体培地で培養した。それ以降はDME/F12培地に10μg/mlのトランスフェリン、10μg/mlのインシュリン、10％ウシ胎仔血清、10ng/mlの塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を加えた培地用いた。形態的にほぼ均一の小型で突起を持った細胞が順調に増殖した。それらの細胞を再度メチルセルロースを含む半固形培地に低細胞密度にてまき、単一細胞由来のクローン化細胞株を単離した。そのうちの１つがB-2株である。該B-2株細胞は、これは、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1丁目1番地１中央第６）に受領番号FERM AP-20276として、2004年10月28日に寄託されている。
【００１１】
該B-2株細胞は、CD34、c-kitなどの造血幹細胞マーカーを発現し、分化した血液細胞のマーカー（B220、TER119、Gr-1、Mac-1、CD4）は全く発現していない。メイギュリュンワルド・ギムザ染色によって、形態観察するとB-2細胞は細胞核が非常に大きく、細胞質は比較的少なくかつ均一であり、顆粒等は観察されない。多くの細胞が特徴的な細胞質の突起を有しており、特有の形態学的特徴を有している。
【００１２】
上記で得られた細胞は、適切な動物細胞培養用培地、好ましくはDME/F12 （1：1）に、10％ウシ胎仔血清、10μg/mlトランスフェリン、10μg/mlインシュリン、および10ng/ml bFGFを添加した培地で増殖可能であり、自己複製能を維持したまま継代培養することができる。かかる培地中での培養を、本明細書中「増殖培養条件下での培養」と称する。
【００１３】
上記で得られた細胞は、c-kit、CD34、FMS様チロシンキナーゼ3/胎児肝臓キナーゼ2（Flt3/Flk2）、PgP-1、HSA、GATA2、PU.1、T細胞急性白血病遺伝子1/幹細胞性白血病遺伝子（Tal1/SCL）、アンジオポエチン-1、急性骨髄性白血病遺伝子1（AML-1）およびターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）などの造血幹細胞特異的マーカー遺伝子の発現を検出することにより特定することが可能である。c-kit、CD34、Flt3/Flk2、PgP-1、HSA、GATA2、PU.1、Tal1/SCL、アンジオポエチン-1、AML-1およびTdTからなる群から選択される１つ以上、好ましくは3つ以上、より好ましくは５つ以上、特に好ましくは全てについて検出されることが好ましい。c-kit、CD34、Flt3/Flk2、PgP-1およびHSAは細胞表面マーカーであるため、細胞表面での該タンパク質の発現をFACS等で解析することにより、その遺伝子発現を検出することもできる。本明細書中、「遺伝子（の）発現誘導が認められる」とは、該遺伝子の転写産物であるmRNAが検出されることまたは増加していること、および該遺伝子の発現産物であるタンパク質が検出されることまたは増加していることのいずれをも包含する。mRNAの存在は、ノーザンブロット法、RT-PCR法、定量的RT-PCR法など、当技術分野で公知の方法を用いて検出できる。該遺伝子がコードするタンパク質の存在は、ウェスタンブロット法等の免疫化学的手法等、当技術分野で公知の種々の方法を用いて検出できるが、検出するタンパク質が細胞表面に存在するタンパク質である場合は、特異抗体を用いてFACSにより検出することが特に好ましい。
【００１４】
上記で得られた細胞は、正常の造血幹細胞と同様、適切なストローマ細胞（例えばOP-9細胞など）と共培養することにより、様々な種の血液細胞へと分化を誘導することができる。ストローマ細胞の培養およびB-2とストローマ細胞との共培養は、アルファMEM培地に20％ウシ胎仔血清を加えて行うとよい。この際の細胞密度等の条件は当業者が適宜決定することが可能であるが、例えば、直径10cmの培養ディッシュ中のコンフレントな状態の単層のストローマ細胞の上に、１ディッシュあたり104個のB-2細胞をまくとよい。さらに、インターロイキン7（10ng/ml）、FLT-3リガンド（10ng/ml）、2メルカプトエタノール（100μM）を培地に添加して(かかる培地中での培養を、本明細書中「分化誘導条件下での培養」と称する)、約１〜2週間、好ましくは約10日間培養すると、赤血球および顆粒球への分化が開始される。その培養を約20日間以上継続すると、Ｂリンパ球への分化が起こる。ここで、培養中、適当な間隔（例えば、３日ごとに）、培地交換を行うとよい。
【００１５】
また、上記分化誘導用の培地にインターロイキン2（10ng/ml）をさらに添加して、同様にストローマ細胞と共培養すると、約１〜2週間、好ましくは約10日間で、NK細胞への分化が起こる。
【００１６】
上記各種の細胞への分化は、それぞれに特異的な公知のマーカー遺伝子の発現を検出することにより、確認することができる。上記同様、該「マーカー遺伝子の発現の検出」とは、該マーカー遺伝子の転写産物であるmRNAを検出すること、および該マーカー遺伝子の発現産物であるタンパク質を検出することのいずれをも包含する。特に、細胞表面マーカーをFACSにより検出することが簡便であり、FACSで検出するのに好ましい細胞表面マーカーとしては、赤血球についてはTER119、顆粒球についてはGr-1、マクロファージについてはMac-1、Ｂリンパ球についてはB220、NK細胞についてはNk1.1などが挙げられるがこれらに限定されることはない。各種の細胞に特異的な細胞表面マーカーは種々のものが公知であり、いずれのマーカーを検出してもよい。FACSによる検出は、周知の方法に従って抗体染色にて実施するとよい。また、RT-PCR解析に好ましいマーカーとしては、赤血球については、成体型赤血球で発現しているβメジャーグロビン、リンパ球についてはリンパ球特異的であるインターロイキン7受容体、リコンビネーションアクティベーテイング遺伝子1（Rag-1）、Ｂリンパ球についてはペアードボックス遺伝子5（Pax-5）およびλ5、NK細胞についてはNK1.1などが挙げられるが、上記FACSについてのマーカーと同様、これらに限定されることはなく、当業者が適宜公知のマーカーを選択できる。これらの特異的マーカーの遺伝子発現をRT-PCRで検出するためには、各マーカーに特異的なプライマーを設計する必要があるが、該設計もまた当業者に公知の方法で達成可能である。RT-PCRの条件についても、公知技術に基づいて当業者が容易に設定可能である。
【００１７】
例えば、上記B-2細胞の場合、分化誘導前は、造血幹細胞のマーカーであるc-kit、CD34、Flt3/Flk2、PgP-1およびHSAを発現していることがFACS解析により明らかにされている。一方、マクロファージのマーカーであるMac-1、顆粒球のマーカーであるGr-1遺伝子およびTER119遺伝子、Ｂリンパ球マーカーであるB220遺伝子、T細胞マーカーであるCD4遺伝子、およびNK細胞マーカーであるNk1.1遺伝子の発現はFACSによって検出されず、造血幹細胞の表現型を有していることが示されている。
【００１８】
さらに、分化誘導前のB-2細胞の各種マーカー遺伝子発現をRT-PCRにより調べると、造血幹細胞マーカーであるGATA-1、PU.1、Tall/SCL、AML-1およびTER119の発現が認められ、ES細胞由来の造血幹細胞の表現型を有していることが示されている。
【００１９】
一方、B-2細胞を分化誘導条件下、すなわちインターロイキン7（10ng/ml）、FLT-3リガンド（10ng/ml）、2メルカプトエタノール（100μM）含有20％ウシ胎仔血清添加アルファMEM培地中にて、B-2細胞をOP-9細胞と共培養した場合、共培養10日目ではMac-1遺伝子、Gr-1遺伝子およびTER119遺伝子の発現がFACSによって検出されるが、B220遺伝子の発現はFACSによって検出されない。かかる共培養を30日間行った場合、B220の発現がFACSによって顕著に検出される。
【００２０】
さらに、上記同様の条件で30日間分化を誘導したB-2細胞の各種マーカー遺伝子発現をRT-PCRにより調べると、分化誘導前のB-2細胞に比べて、λ5、Rag-1およびPax-5の遺伝子発現が有意に上昇している。以上より、B-2細胞はリンパ球への分化が可能な造血幹細胞株であることが実証される。
【００２１】
また、上記分化誘導用培地にインターロイキン2（10ng/ml）を添加した条件（本明細書中、「NK細胞分化条件」と称する）で、B-2細胞をOP-9細胞と共培養した場合、共培養10日目でNK1.1の発現がFACSおよびRT-PCRによって検出される。すなわち、B-2細胞はNK細胞への分化が可能な造血幹細胞株であることが実証される。
【００２２】
このようにして得られたB-2細胞から分化した血液細胞を、分化させたB-2細胞の集団から各種マーカーを指標にセルソーターにより所望の細胞種に分化した細胞を単離することができる。かかる方法は当業者には公知である。単離した細胞は、その細胞種のモデル細胞として用いることができ、種々の研究における有用性が高い。
【００２３】
本発明の細胞株は、リンパ球へも分化可能であるという、正常の造血幹細胞に非常に酷似した性質を有していることから、各血液細胞への分化過程の解析研究においても有用性が高い。
【００２４】
例えば、リンパ球細胞を必要とする場合、分化誘導前に比べて、Ikaros遺伝子、λ5遺伝子、Rag-1遺伝子およびPax-5遺伝子からなる群より選択される少なくとも１以上遺伝子の発現誘導が認められることを指標として、該当する細胞を単離するとよいが、この際、B220遺伝子の発現、すなわち細胞表面のB220タンパク質の存在を指標として、B220タンパク質に対する抗体で標識化される細胞をセルソーターにより単離することが可能である。
【実施例】
【００２５】
B-2細胞の増殖
DME/F12培地に10μg/mlのトランスフェリン、10μg/mlのインシュリン、10％ウシ胎仔血清、10ng/m1の塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を加えた培地中で、37℃5％CO2環境下にて培養する。かかる条件下で培養した場合、B-2細胞は自己複製を行い、増殖しつづける。細胞がサブコンフレントな状態になったら、希釈して継代培養を行う。なお、培養中の培地交換は適宜行う。
【００２６】
形態学的解析
B-2細胞を顕微鏡下で観察したところ、特有の突起を有する形態であった（図１左上）。明らかに、顆粒球、赤血球およびマクロファージ（図１それぞれ右上、左下および右下）の形態とは異なっていることがわかる。
【００２７】
B-2細胞の分化誘導
B-2細胞はOP-9ストローマ細胞と共培養すると様々な血液細胞へと分化を誘導できる。アルファMEM培地に20％ウシ胎仔血清を加えた培地中で培養してコンフレント状態に達したOP-9細胞の単層の上に、104個のB-1細胞を播種し、培地中にインターロイキン7（10ng/ml）、FLT-3リガンド（10ng/ml）、2メルカプトエタノール（100μM）を加えて、37℃ 5％CO2環境下にて培養する。培養中の培地交換は、適宜行う。
【００２８】
上記条件で、10〜30日間培養する。分化する細胞種によって、分化に要する培養時間が異なり、10日前後で赤血球、顆粒球、マクロファージへの分化が始まり、30日以上でＢリンパ球やNK細胞へと分化してくるが、これらの分化はFACSまたはRT-PCRにて、各種血液細胞特異的マーカーの発現を検出することにより確認した。
【００２９】
FACSによる各種マーカーの発現解析
まず、分化誘導していないB-2細胞について、FACSによる解析を行い、その表現型を調べた。
用いた抗体はすべてファーミンジェン製である。造血幹細胞マーカー（c-kit、Flt3/Flk2、PgP-1、HSA）、血管内皮細胞マーカー（CD31）、マクロファージマーカー（Mac-1）、顆粒球マーカー（myeloid differentiation antigen Gr-1: Gr-1）、Ｂリンパ球マーカー（B220）、Ｔ細胞マーカー（CD4）、NK細胞マーカー（NK1.1）に対する抗体はFITC標識されたものを用いた。B-2細胞を集め、5×105個の細胞に3％牛胎仔血清を含むリン酸緩衝液中に、Fc受容体Block抗体(CD16/CD32) (終濃度5μg/ml)を加えて、10分間反応させた。その後、それぞれのマーカーに対する抗体を、10μg/mlの濃度で、20分間反応させた。その後、リン酸緩衝液で細胞を2回洗浄し、5μg/mlのPropidium Iodide (PI)を加えて10分間染色反応させた後、FACSにて解析した。赤血球マーカー（TER119）および造血幹細胞マーカー（CD34）に対する抗体はビオチン標識されたものを用いた。各抗体を10μg/mlの濃度で20分間反応させた後、細胞を2回洗浄後FITC標識のアビジンを更に20分反応させた。再度細胞を2回洗浄後、5μg/ml PIを加えて10分間反応させた後FACSにて解析した。OP-9との共存培養で分化させた細胞は、ピペッティングでディッシュから剥離させ、上記同様に抗体を反応させ、FACS解析に供した。FACSの解析は、PIで染まらない細胞5000個について解析した。各抗体と同じアイソタイプの精製抗体をそれぞれ陰性コントロールとして使用した。
【００３０】
その結果を、図２に示す。コントロールは特異抗体を反応させていない細胞である。c-kit、CD34、Flt3/Flk2、PgP-1、HSAの発現が、コントロールに対して有意に検出されたが、CD31、Mac-1、Gr-1、TER119、B220、CD4およびNK1.1については、コントロールの細胞に比べて発現量の増加は認められなかった。
【００３１】
この結果から、分化誘導前のB-2細胞株は造血幹細胞としての表現型を有していることが示された。
【００３２】
次いで、分化誘導のための条件下で10日間培養したB-2細胞について、Mac-1、Gr-1およびTER119について同様にFACS解析を行った。Mac-1、Gr-1およびTER119の発現誘導が認められた（図３左上、右上および左下）。さらに、分化誘導のための条件下で30日間培養したB-2細胞について、B220の発現を調べたところ、顕著な発現誘導が認められた（図３右下）。
【００３３】
RT-PCR解析
細胞からのRNAは、TRIZOL reagent(GIBCO)で精製した。RNAからのcDNAの作製にはSuperScript（商標） Preamplification System(GIBCO)を使用した。PCRはアニーリング温度63℃、サイクル数30回の条件で実施した。PCRの産物は2%アガロースゲルを用いての電気泳動で分離し、エチジウムブロマイドで染色させて同定した。インターナルコントロールとして、G3PDHを用いた。
【００３４】
各PCRプライマーとしては以下の配列のものを使用した：
GATA-2
CGGAATTCGACACACCACCCGATACCCACTAT（配列番号１）
CGGAATTCGCCTACGCCATGGCAGTCACCATGCT（配列番号２）
Tal1/SCL
AACCGGGTGAAGAGGAGGCCCTCC（配列番号３）
AAGCACGTCCTGTAGAAGGTC（配列番号４）
Angiopoietin-1
CAGTGGCTGCAAAAACTTGA（配列番号５）
TCTGCACAGTCTCGAAATGG（配列番号６）
AML-1
CCAGCAAGCTGAGGAGCGGCG（配列番号７）
CGGATTTGTAAAGACGGTGA（配列番号８）
TdT
GAAGATGGGAACAACTCGAAGAG（配列番号９）
CAGGTGCTGGAACATTCTGGGAG（配列番号１０）
Ikaros
GGAGGCACAAGTCTGTTGAT（配列番号１１）
CATTTCACAGGCACGCCCATTCTCT（配列番号１２）
Vasa
AGGTGATGAAAGAACTATGG（配列番号１３）
TAATTCTTCCTCGTGTCAAC（配列番号１４）
λ5
ATGAAGCTCAGAGTAGGACAGAC（配列番号１５）
CTAAGAACACTCAGCAGGTGAC（配列番号１６）
Rag-1
CCAAGCTGCAGACATTCTAGCACTC（配列番号１７）
CAACATCTGCCTTCACGTCGATCC（配列番号１８）
Pax-5
TCAGGACAGGACATGGAGGAG（配列番号１９）
GATCCTGTTGATGGAGCTGACG （配列番号２０）
PU.１
TGCTGTCCTTCATGTCGCCG（配列番号２１）
TGGAAGGGTTTTCCCTCACC（配列番号２２）
G3PDH
ACCACAGTCCATGCCATCAC（配列番号２３）
TCCACCACCCTGTTGCTGTA（配列番号２４）。
【００３５】
分化誘導していないB-2細胞株について各種マーカー遺伝子の発現を検出した結果を図４に示す。B-2株と同様の手法で得られた他の細胞株（B-1、B-3、C-1およびA-6）およびA-6株を分化誘導したSIL6/1株を対照とした。
【００３６】
B-2細胞株では、造血幹細胞マーカーであるGATA-1、PU.1、Tall/SCLおよびAML-1のmRNAが有意に検出され、B-2細胞株が造血幹細胞としての表現型を有していることが示された(図４)。さらに、胎児性幹細胞のマーカーであるアンジオポエチン-1 mRNAも検出された。また、興味深いことに、生殖細胞にのみ発現が確認されているVasa遺伝子も発現していた。このことより、胎仔の発生過程で形成されてくる最初の造血幹細胞は生殖細胞系列の細胞に由来する可能性が考えられる。
【００３７】
次いで、分化誘導のための培養を行ったB-2細胞について各種マーカー遺伝子の発現を検出した結果を図５に示す。図３に示すように、赤血球マーカーTER119、マクロファージマーカーMac-1、顆粒球マーカーGr-1、Ｂリンパ球マーカーB220の発現がFACSで確認できたが、Bリンパ球への分化に関しては、更にλ5、Rag-1およびPax-5のmRNAがRT-PCRによって確認された。なお、TdTとIkarosは、未分化B-2細胞でも発現していた。
【００３８】
NK細胞への分化
B-2細胞を、分化誘導用の培地にインターロイキン２（10ng/ml）を加えたNK細胞分化誘導条件下にて、OP-9細胞と共培養すると、10日目には、NK細胞マーカーであるNK1.1の発現が、FACS解析およびRT-PCR解析により検出された（図６）。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】増殖培養条件下での培養中のB-2細胞を顕微鏡下で観察したところ、特有の突起を有する形態であった（図１左上）。参考のために、顆粒球、赤血球、マクロファージ（図１それぞれ右上、左下および右下）の形態を示す。
【図２】増殖培養条件下での培養中のB-2細胞の、各種細胞特異的マーカーによるFACS解析の結果である。グレイの部分は、コントロールとして、マーカーに対する抗体と反応させていない細胞の結果である。
【図３】分化誘導条件下での培養中のB-2細胞の、Mac-1、Gr-1、TER119、B220によるFACS解析の結果である。分化誘導条件下での培養期間は、図中に示す通りである。グレイの部分は、コントロールとして、分化誘導条件下での培養前の細胞の結果である。
【図４】分化誘導前のB-2細胞のRT-PCRによるマーカーのmRNAの検出結果である。B-1、B-3、C-1、A-6は、B-2同様の方法で得られた、別個の独立した細胞株である。SIL6/1は、A-6を分化誘導条件下で培養した細胞である。
【図５】B-2細胞をインターロイキン７(10ng/ml)、Flt-3リガンド(10ng/ml)、２メルカプトエタノール(10μM)存在下でOP-9細胞と30日間共培養して、Ｂリンパ球に分化誘導した場合のマーカー遺伝子のmRNAの発現をRT-PCRによって検出した結果である。未分化のB-2細胞(未分化)と分化誘導後のB-2細胞(分化)を比較した。
【図６】B-2細胞を、インターロイキン２（10ng/ml）、インターロイキン７（10ng/ml）、FLT-3リガンド（10ng/ml）、2メルカプトエタノール（100μM）存在下でOP-9細胞と10日間共培養した場合の、NK1.1の発現を検出した結果である。左パネルは、RT-PCRにより検出した結果であり、G3PDHはインターナルコントロールとして用いた。未分化は、分化誘導条件下で培養していないB-2細胞であり、骨髄細胞はポジティブコントロールとして用いた。右パネルは、FACSによりNK1.1の発現を検出したものである。グレイの領域は、ネガティブコントロールとして抗体非染色のものであり、白抜きの領域がNK細胞への分化を誘導したB-2細胞のものである。白抜きの領域がグレイの領域に比べて右側にシフトしている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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