(57)【要約】【課題】 ミトコンドリア病や老化に伴い、大きな欠失変異を持つmtDNAが正常なmtDNAよりも優先的に複製する現象であるミトコンドリアの不均一化を制御する方法を提供すること。【解決手段】 NTG1遺伝子又はその産物を用いて、ミトコンドリアＤＮＡの不均一化を制御する方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
NTG1遺伝子又はその産物を用いて、ミトコンドリアＤＮＡの不均一化を制御する方法。
【請求項２】
NTG1遺伝子を含む発現ベクターを細胞内に導入してNTG1遺伝子産物を細胞内に発現させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
NTG1遺伝子が酵母由来のNTG1遺伝子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
細胞が酵母である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
ミトコンドリアＤＮＡの不均一化の制御が、ミトコンドリアＤＮＡの不均一化の促進である、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
NTG1遺伝子産物を用いて、下記塩基配列中の下線部の両側を切断する方法。
5'-CAAATATATAAGTAATAGGGGG-3'
3'-GTTTATATATTCATTATCCCCC-5'
【請求項７】
NTG1遺伝子産物から成る、下記塩基配列中の下線部の両側を切断するための酵素。
5'-CAAATATATAAGTAATAGGGGG-3'
3'-GTTTATATATTCATTATCCCCC-5'
【請求項８】
NTG1遺伝子産物を用いてミトコンドリアDNAのoriのプロモーターを切断する方法。
【請求項９】
NTG1遺伝子産物から成る、ミトコンドリアDNAのoriのプロモーターを切断するための酵素。
【請求項１０】
NTG1遺伝子が破壊されていることによりミトコンドリアＤＮＡの不均一化が抑制されている細胞系。
【請求項１１】
酵母である、請求項１０に記載の細胞系。
【請求項１２】
NTG1遺伝子を発現していることによりミトコンドリアＤＮＡの不均一化が促進している細胞系を被験物質の存在下で培養し、ミトコンドリアＤＮＡの不均一化を抑制させることができる被験物質を選択することを含む、ミトコンドリアＤＮＡの不均一化を抑制するための薬剤をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリアＤＮＡの不均一化を抑制する方法に関する。より詳細には、
本発明は、NTG1遺伝子を用いてミトコンドリアＤＮＡの不均一性を抑制する方法に関する
。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞は、細胞機能に必要なエネルギーの大半をミトコンドリアでの酸化呼吸によっ
て得ている。ミトコンドリアは、数百から数千コピーのミトコンドリアDNA（mtDNA）を含
み、これらは呼吸装置およびタンパク質合成に必須なミトコンドリア成分をコードしてい
る。一般的に、すべてのミトコンドリア対立遺伝子は栄養細胞増殖（「栄養分離」）期に
分離され、mtDNAの全コピーが細胞内または個体内で同一配列を有するように維持される
（これを、「ホモプラスミー」と言う）。ヘテロプラスミー化した細胞の一部では、大き
な欠失のあるmtDNAの割合が、正常mtDNAよりも次第に増加するが、これがミトコンドリア
ミオパシー（非特許文献１）、カーンズセイアー症候群（KSS）、慢性進行性外眼筋麻痺
症（CPEO）、およびピアソン症候群などの重大なミトコンドリア病と関連している（非特
許文献２）。欠失のあるmtDNAの優性的な遺伝はその優性複製によって生じると考えられ
ているが、哺乳動物では母親からの遺伝が厳密に行われるために、異なるmtDNAクローン
の複製における競合に関する研究は阻まれている。これに反し、酵母Saccharomyces cer
evisiaeは、mtDNAが二親性の遺伝を示すとともに様々な遺伝的材料が利用可能であるため
、モデルシステムに適している（非特許文献３）。
【０００３】
欠失を有するmtDNAの偏った遺伝は、S.cerevisiaeにも生じる。酵母S.cerevisiaeの栄
養プチー変異（ρ-）は、欠失のあるmtDNAを含む呼吸欠損細胞である。呼吸熟達細胞（r
espiration-proficient cell）（ρ+細胞）はρ-一倍体細胞と交配した場合、子孫は一般
的にρ+であるが、ρ-の細胞もある（「抑圧性」と呼ばれる現象）。ρ+細胞をρ-mtDNAに属する細胞と交配させた場合、ほぼ全ての子孫が呼吸欠損であり、このように強く偏ったρ-mtDNAの遺伝性は、「超抑圧現象」と呼ばれている（非特許文献４）。超抑圧現象は対立遺伝子の優性分離の結果ではなく、ρ+mtDNAに対する超抑圧性ρ-mtDNA（HSρ-mtDNA）
の優性複製によるものである（非特許文献５）。超抑圧性ρ-mtDNAは、ρ+DNA（70kbpから85kbp、非特許文献４；及び非特許文献６）の数種のmtDNA複製起点（rep/ori）のうちのいずれかを有するmtDNAの小さな領域（約1kbp以下）を含む断片が縦に並んだものである。小さなレプリコンは、同じ複製起点を有するより大きなレプリコンと比べると、複製が優性であると考えられることから、このHSρ-mtDNAの構造的特徴から、ρ+mtDNAに対する優性複製が説明される。
【０００４】
現在のところ、酵母ではmtDNA複製開始モデルとして２つが考えられている。1つは、ミ
トコンドリアの転写RNAポリメラーゼ（RPO41）により開始されるDNA複製であり、これは
哺乳動物のミトコンドリアで認められるものと同じである。同メカニズムを裏付けること
として、各mtDNArep/oriには必須成分として活性転写プロモータが含まれ、哺乳動物mtD
NAのrep/oriと同一のヌクレオチド配列を有している。RPO41 RNAポリメラーゼによってM
tDNA-rep/oriのプロモータから合成されるRNAが検出され、酵母は、RNAからDNA合成への
転位のマッピング位置と一致する領域には、RNAを切断するエンドリボヌクレアーゼを含
んでいる（非特許文献７〜９）。活性rep/oriプロモータは、超抑圧性に必要とされる（
非特許文献５）。しかし、rep/oriおよびRPO41の双方ともρ-mtDNAを維持する上で必須と
いうわけではないため、この転写依存性は、mtDNA複製開始における唯一のメカニズムで
はない（非特許文献１０）。超抑圧性あるいは（rep/oriを欠如した）非超抑圧性ρ-mtD
NAを超える超抑圧性ρ-mtDNAの優性遺伝においてRPO41が必須でないと主張する報告もあ
るが（非特許文献１１）、ρ+mtDNA複製機能の維持には活性RPO41が必要であることから
（非特許文献９）、超抑圧性におけるRPO41の必要性を批判的に評価することは不可能で
ある。
【０００５】
mtDNA複製開始の他方のメカニズムは、DNA組換えに仲介され（非特許文献１２）、ロー
リングサークル型複製を開始するというものである（非特許文献１３）。CCE1遺伝子は、
相同DNA組換えに必須な分子機能をインビトロで提示するタンパク質をコードする。すな
わち、Cce1タンパク質は、一般的な組換え中間体であるホリディ中間体を変換する。CCE
1（MGT1）の完全欠失変異体では、抑圧性が完全に消失する。完全欠失したcce1変異体は
、ホリディー構造によって結合しているmtDNA分子の大きなネットワークの形成を引き起
こす。しかしcce1完全欠失変異体は、ρ+mtDNA遺伝およびmtDNA組換えの双方で通常のレ
ベルを示し、母親細胞から菌芽へのρ-mtDNA（ρ+mtDNAでない）の伝達は部分的に阻害さ
れる。すなわち、超抑圧性に対するcce1完全欠失変異の影響は、ρ-mtDNA複製の欠如より
もむしろ、ρ-mtDNAの娘細胞への伝達（すなわちパーティショニング）が優先的に阻害さ
れることに起因するといえる（非特許文献１４）。
【０００６】
MHR1は、ρ+mtDNAの組換えに必要であるとして特定された最初の遺伝子である（非特許
文献１５）。本発明者らは、MHR1が「相同DNA対合」を促進するタンパク質をコードし（
非特許文献１６）、相同mtDNA組換えおよびmtDNAの組換え修復に必要とされること（非特
許文献１５及び１７）を以前に報告した。さらに本発明者らは、コンカテマー（直列に連
結したマルチマー）がρ+およびρ-mtDNA（rep/oriを伴わない）の分配に欠かせない中間
体であり、娘細胞へのコンカテマーの伝達の間およびその直後にコンカテマーがモノマー
の環状mtDNAにプロセシングされることを見出している。コンカテマーは、Mhr1タンパク
質の相同DNA対合活性に依存するローリングサークルモードの複製によって主に形成され
る（非特許文献１６及び１８）。これは、環状mtDNAと対合する一本鎖端の3'末端がmtD
NA複製を開始するプライマーとして作用することを示唆するものである。コンカテマーが
数種類の選択された鋳型に基づいたローリングサークル複製によって形成されるように、
栄養分離におけるMhr1タンパク質の役割から、mtDNAクローンの選択的遺伝はホモプラス
ミー確立のメカニズムであることが示唆される（非特許文献１８）。
【０００７】
相同的組換えは、二本鎖DNA切断の正確な修復、および減数分裂における相同染色体の
正確な分離のために必要である。減数分裂の相同組換えは、染色体DNA上の特定部位での
二本鎖切断によって開始される（非特許文献１９）。2本鎖切断後、断端から誘導される
一本鎖3'端が、ヘテロ二重結合形成のために同一または類似の配列を有する完全な二本
鎖DNA（相同DNA）と相互作用（「相同DNA対合」）するが、これは、一般にはRecA/Rad51
ファミリータンパク質によって触媒される（非特許文献２０〜２２）。ヘテロ二本鎖ＤＮ
Ａ分子において対をなす一本鎖の3'端で開始されるDNA合成は、切断によって失われる配
列を保存する。この中間体はホリディ中間体の形成を経てプロセシングされ、組換えDNA
分子に変換される（非特許文献１９）。相同DNA対合の部位で開始されるDNA合成（UvsXタ
ンパク質によって触媒される）は、大腸菌ファージT4におけるDNA複製の開始メカニズム
である（非特許文献２３及び２４）。
【０００８】
【非特許文献１】Holt, I. J., 他 (1988). Nature (London) 331, 717-719
【非特許文献２】Ozawa, T., (1997). Physiol Rev. 77, 425-464）
【非特許文献３】Dujon, B. (1981). Mitochondrial genetics and function.  In The molecular biology of the yeast Saccharomyces: life cycle and inheritance, J.N.Strathern, E.W.Jones, and J.R.Broach, eds. (New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press), pp.505-635
【非特許文献４】Blanc, H., 他 (1980). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 3942-3946
【非特許文献５】MacAlpine, D. M., 他 (2001). EMBO J. 20, 1807-1817
【非特許文献６】de Zamaroczy, M., 他 (1981). Nature(London) 292, 75-78
【非特許文献７】Baldacci, G., 他 (1984). EMBO J. 3, 2115-2120
【非特許文献８】Stohl, L. L., 他 (1992). Mol. Cell. Biol. 12, 2561-2569
【非特許文献９】Van Dyck, E., 他 (1998). Mol. Cell. Biol. 18, 2976-2985.
【非特許文献１０】Fangman, W. L., 他 (1990). Mol. Cell. Biol. 10, 10-15
【非特許文献１１】Lorimer, H. E. 他 (1995). Mol. Cell. Biol. 15, 4803-4809
【非特許文献１２】Preiser, P. R., 他 (1996). EMBO J. 15, 684-693
【非特許文献１３】Maleszka, R., 他 (1991). EMBO J. 10, 3923-3929
【非特許文献１４】Lockshon, D., 他 (1995). Cell. 81, 947-955
【非特許文献１５】Ling, F., 他 (1995). EMBO J. 14, 4090-4101
【非特許文献１６】Ling, F., 他 (2002). EMBO J. 21, 4730-4740
【非特許文献１７】Ling, F., 他 (2000). Nucleic Acids Res. 28, 4956-4963
【非特許文献１８】Ling, F., 他 (2004). Mol. Biol. Cell. 15, 310-322 Epub 2003 Oct 2017
【非特許文献１９】Szostak, J. W., 他 (1983). Cell 33, 22-35
【非特許文献２０】McEntee, K., 他 (1979). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 2615-2619
【非特許文献２１】Shibata, T., 他 (1979). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1638-1642
【非特許文献２２】Sung, P. (1994). Science 265, 1241-1243
【非特許文献２３】Mosig, G. (1998). Annu. Rev. Genet. 32, 379-413
【非特許文献２４】Yonesaki, T., 他 (1985). EMBO J. 4, 3321-3321
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
健常人や酵母において、ミトコンドリア(mt)DNAは、各細胞のみならず全身で同一の塩
基配列を持つ状態、ホモプラスミーが基本である。ミトコンドリア病や老化に伴い、大き
な欠失変異を持つmtDNAが正常なmtDNAよりも優先的に複製し、ヘテロプラスミー化（不均
一化）する現象が知られている。そのような不均一化を抑制することができれば、健康維
持やそれに必要な研究、検査に大きな寄与ができるが、現在のところその手段がない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、パン酵母（Saccharomyc
es cerevisiae）においてNtg1蛋白質とMhr1蛋白質とのそれぞれが、mtDNAの複製開始配列
（rep/ori）に働いて、子孫への分配に必要な直鎖状配列多量体（コンカテマー）合成を
誘導することを発見した。これにより、Ntg1蛋白質とMhr1蛋白質の何れか又は両方の機能
を制御することで、欠失変異を持つmtDNAと正常なmtDNAの子孫への伝達比を制御できるこ
とが明らかになり、mtDNAの不均一化を制御できるようになった。本発明はこれらの知見
に基づいて完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明によれば、NTG1遺伝子又はその産物を用いて、ミトコンドリアＤＮＡの不均一化を制御する方法が提供される。
【００１２】
好ましくは、NTG1遺伝子を含む発現ベクターを細胞内に導入してNTG1遺伝子産物を細胞内に発現させることにより、ミトコンドリアＤＮＡの不均一化を制御することができる。好ましくは、NTG1遺伝子が酵母由来のNTG1遺伝子である。好ましくは、細胞は酵母である。好ましくは、ミトコンドリアＤＮＡの不均一化の制御は、ミトコンドリアＤＮＡの不均一化の促進である。
【００１３】
本発明の別の側面によれば、NTG1遺伝子産物を用いて、下記塩基配列中の下線部の両側を切断する方法が提供される。
5'-CAAATATATAAGTAATAGGGGG-3'
3'-GTTTATATATTCATTATCCCCC-5'
本発明のさらに別の側面によれば、NTG1遺伝子産物から成る、下記塩基配列中の下線部の両側を切断するための酵素が提供される。
5'-CAAATATATAAGTAATAGGGGG-3'
3'-GTTTATATATTCATTATCCCCC-5'
本発明のさらに別の側面によれば、NTG1遺伝子産物を用いてミトコンドリアDNAのoriのプロモーターを切断する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、NTG1遺伝子産物から成る、ミトコンドリアDNAのoriのプロモーターを切断するための酵素が提供される。
【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、NTG1遺伝子が破壊されていることによりミトコンドリアＤＮＡの不均一化が抑制されている細胞系が提供される。好ましくは、細胞系は酵母である。
【００１５】
本発明のさらに別の側面によれば、NTG1遺伝子を発現していることによりミトコンドリアＤＮＡの不均一化が促進している細胞系を被験物質の存在下で培養し、ミトコンドリアＤＮＡの不均一化を抑制させることができる被験物質を選択することを含む、ミトコンドリアＤＮＡの不均一化を抑制するための薬剤をスクリーニングする方法が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
Ntg1蛋白質は、本来、パン酵母ＤＮＡの障害を認識し、損傷塩基を除去する機能をもつ
蛋白質として見つかり、その後mtDNAの修復にも働くことが分かった。人にも同様な機能
を持つ蛋白質群の存在が知られている。一方、Mhr1蛋白質は、パン酵母mtDNAの組換え、
あるいは組換え修復に、「相同DNA対合」活性をもって働く蛋白質として本発明者らが発
見した。さらに、本発明者らはこれまでに、mtDNAの子孫への伝達には、環状単量体では
なく、直鎖状直列多量体構造（コンカテマー）が必要であること、そしてその開始には、
Mhr1蛋白質の相同DNA対合活性が必要なことを明らかにしてきた。今回、mtDNAの開始に優
先的に働くＤＮＡ配列（rep/ori）にNtg1蛋白質がDNA二本鎖切断を入れ、その末端をMhr
1蛋白質が無傷の環状mtDNAと相同DNA対合を行うことで、コンカテマー合成を誘導した。
また、これらの蛋白質が、この機能によって、共通のrep/oriを使う正常なmtDNAと大きな
欠失変異をもつmtDNAが共存すると、後者を優先的に複製する結果となることを発見した
。さらに、Mhr1蛋白質やNtg1蛋白質の活性を減増することで、欠失変異とrep/oriとを同
時に持つmtDNAの子孫への伝達比を人為的に減増できることを明らかにし、初めて、この
伝達比を制御する手段を提供することができた。これは、mtDNAコンカテマー合成開始に
は、rep/oriに依存しない機構も働くためである。
【００１７】
従来、ミトコンドリア病や、老化にともなってミトコンドリアの呼吸機能退行と大きな
欠失変異をもつmtDNAの比率が大きくなることが知られていたが、その増大とミトコンド
リア機能退行と欠失変異mtDNAの増大との間の因果関係は、それを人為的に制御する手段
がなかったため、未だ明らかになっていない。今回、少なくとも酵母では、また、少なく
ともNtg1蛋白質はヒトにも同様な蛋白質がすでに見つかっていることから、ヒトの細胞に
おいても、両者の因果関係を解く手段を提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明の実施例においては、部位特異的な二本鎖切断がNtg1タンパク質刺激性メカニズムにより、mtDNA複製起点（rep/ori）で生じることが示された。またMhr1タンパク質に加えてNtg1タンパク質がローリングサークル複製産物（コンカテマー）および交叉型組換え産物（大きさが不連続な環状マルチマー）の形成において重要な役割を担うことが示された。また、Ntg1とMhr1の両タンパク質がHSρ-mtDNAのrep/ori依存性に偏った遺伝において重要な役割を担うことを示した。特に、本発明では、Mhr1蛋白質の機能欠損、またはNtg1蛋白質の欠失はρ-細胞の生成率の減少をもたらし、rep/oriを有する欠失変異ミトコンドリアDNAの優性複製を抑制することが示された（図４）。
【００１９】
S.cerevisiaeの各mtDNAのrep/oriは3種類のGCクラスタおよび活性転写プロモーターから構成される。酵母のmtDNAにおけるGCクラスタ（またはGCリッチ配列）は「プチー」ゲノム（ρ-mtDNA）除去および分子間組換えにおける分子内組換えの「ホットスポット」として知られている。相同的組換えは一般的に二本鎖切断または一本鎖ギャップによって開始される。プチット株（ρ-2-33）のvar1対立遺伝子はいくつかのGCクラスタを含み、インビボでの二本鎖切断が制限フラグメントの電気泳動移動度分析により、var1のGCクラスタ近辺に検出される。var1のGCクラスタまたはその近辺における二本鎖切断とGCクラスタにおける組換えとの間での相関関係は遺伝的子研究から特定されていないが、var1ρ-mtDNAを含む細胞（非超抑圧性）はローリングサークル複製産物とともに乗換え産物を産生する。極度の組換えホットスポットは、酵母mtDNAの1組のrep/ori（ori2およびori7）配列に位置する除去配列として報告されている。本発明の実施例では、rep/ori（rep2/ori5）配列におけるNtg1タンパク質刺激による部位特異的な二本鎖切断、およびMhr1タンパク質の相同対合活性に加えてNtg1タンパク質が、どのようにしてHSρ-mtDNA乗換え産物の最適な形成に必要とされるのかについて報告した。実施例の結果で述べたように、rep/oriまたはGCクラスターを伴わないρ-mtDNAを含む細胞（mt-pMK2）ではmtDNA種の大半がコンカテマー（すなわちローリングサークル複製の産物）であり、交叉型組換え産物は稀であった（LingおよびShibata、2004）。すなわち、GCクラスター近辺またはrep/oriにおける二本鎖切断はmtDNA交叉型相同的組換えの開始に寄与している。
【００２０】
rep/oriを含まないρ-mtDNAは安定に維持されて遺伝するため、さらにローリングサー
クル複製産物はrep/oriの欠如したρ-mtDNAについても形成されることから（例えばmt-p
MK2）、rep/oriはmtDNA複製に不可欠であるとはいえない。しかし、HSρ-mtDNAの場合、
Ntg1タンパク質およびMhr1タンパク質の相同対合活性がローリングサークル複製産物の最
適形成（図3Eおよび3I）、mtDNAの最適量、そして完全なrep2/ori5に依存するHSρ-mtDN
Aの優性複製（図4、MacAlpineら、2001参照）のために必要とされる。これらの結果から
、HSρ-mtDNAの優性複製がrep/oriにおける部位特異的な二本鎖切断によって開始される
ローリングサークル複製に依存していることが示される。Ntg1刺激メカニズムによるrep
2/ori5の切断部位について単一塩基レベルで分析したところ、切断がGCクラスタではなく
ATの豊富なプロモーター領域で生じることが示されたことから（図１）、超抑圧性におい
て活性プロモーターの存在が必要であることが分かる。活性rep/oriプロモータの必要性
は、転写によって開始されるmtDNA複製のためであると考えられる。
【００２１】
本発明では、NTG1遺伝子産物を細胞内に発現することによって、ミトコンドリアＤＮＡ
不均一化を促進することができる。具体的には、NTG1遺伝子を含む発現ベクターを細胞内
に導入してNTG1遺伝子産物を細胞内に発現する。NTG1遺伝子は、EMBL登録番号L05146, A
lseth, I., 他(1998) Mol.Cell.Biol.19, 3779-3787に記載されている遺伝子を使用する
ことができる。好ましくは、NTG1遺伝子は酵母由来のNTG1遺伝子であり、細胞（宿主）は
酵母である。
【００２２】
発現ベクターとしては、宿主細胞内でNTG1遺伝子を発現できるベクターであれば任意の
ベクターを使用することができる。具体的には、NTG1遺伝子を宿主細胞中で発現させるた
めに、該遺伝子を発現ベクター中のプロモーターの下流に挿入し、次いでこの組み換え発
現ベクターを、当該発現ベクターに適合した宿主細胞（好ましくは、酵母細胞）に導入す
る。
【００２３】
宿主の種類に適合した各種の発現ベクターが当業者に入手可能であり、例えば、ＰＨＯ
５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａ
ｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、
ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等の酵母用プロモーターを含む発現ベクタ
ーを使用することができる。組換え発現ベクターの宿主への導入方法は、例えば、リン酸
カルシウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢
酸リチウム法、リポフェクション法などが挙げられ、宿主細胞の種類に応じて適宜選択す
ることができる。
【００２４】
また、本発明では、NTG1遺伝子産物を用いてミトコンドリアDNAのoriのプロモーターを
切断する方法が提供される。即ち、NTG1遺伝子産物は、ミトコンドリアDNAのoriのプロモ
ーターを切断するための酵素として使用することができることから、本発明によれば、N
TG1遺伝子産物から成る、ミトコンドリアDNAのoriのプロモーターを切断するための酵素
が提供される。
また、本発明によれば、NTG1遺伝子産物を用いて、下記塩基配列中の下線部の両側を切
断する方法、
5'-CAAATATATAAGTAATAGGGGG-3'
3'-GTTTATATATTCATTATCCCCC-5'
及びNTG1遺伝子産物から成る、下記塩基配列中の下線部の両側を切断するための酵素
5'-CAAATATATAAGTAATAGGGGG-3'
3'-GTTTATATATTCATTATCCCCC-5'
が提供される。
上記酵素の用途としては、oriプロモーターを切断するということだけではなく、oriプ
ロモーターと同じ配列を含むリンカーを切断する制限酵素として利用することもできる。
上記酵素の認識配列自体はミトコンドリアDNA由来であるので、ゲノムDNAでは頻度の少な
い配列である可能性が高いと考えられる。その場合、クローニングしたゲノムDNA配列自
体は切断せず、リンカー部分だけを特異的に切断する制限酵素として特に有用である。
【００２５】
さらに本発明によれば、NTG1遺伝子が破壊されていることによりミトコンドリアＤＮＡ
の不均一化が抑制されている細胞系が提供される。NTG1遺伝子が破壊されている細胞系は
、相同組み換え法など通常の遺伝子破壊法を用いて作製することができる。
【００２６】
上記のようにして得られるNTG1遺伝子を発現していることによりミトコンドリアＤＮＡ
の不均一化が促進している細胞系は、ミトコンドリアＤＮＡの不均一化を抑制するための
薬剤のスクリーニング系として使用することができる。即ち、被験物質の存在下又は非存
在下において、上記したNTG1遺伝子を発現していることによりミトコンドリアＤＮＡの不
均一化が促進している細胞系を培養し、被験物質の有無の場合について、ミトコンドリア
ＤＮＡの不均一化の程度を比較することにより、被験物質の存在しない場合と比較して、
ミトコンドリアＤＮＡの不均一化を抑制することができる被験物質を選択することができ
る。このようにして選択された被験物質は、ミトコンドリアＤＮＡの不均一化を抑制する
ための薬剤の候補物質となり得るものである。
【００２７】
本発明で用いる被験物質としては任意の物質を使用することができる。被験物質の種類
は特に限定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合
物でもよく、合成ペプチドでもよい。あるいは、被験化合物はまた、化合物ライブラリー
、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。
被験物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ま
しい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリー
を使用することもできる。例えば、本発明のスクリーニング方法で選択される薬剤は、ミ
トコンドリア病の治療・予防剤、又は老化防止剤などとして使用することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定
されるものではない。
【実施例】
【００２８】
（Ａ）材料と方法
（１）酵母株、培地、および一般的遺伝子技術
本実施例で使用した酵母株を表１に示す。培地は、既報の通りである（Ling, F., 他 (1995). EMBO J. 14, 4090-4101；及びLing, F., 他 (2002). EMBO J. 21, 4730-4740）。酵母細胞の培養ならびに接合型a-および(-一倍体細胞の交配は既報の方法（Kaiser, C., 他 (1994). Methods in yeast genetic: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual (Pkainview, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press)）に従って実施した。酵母の形質転換は酢酸リチウム法（Ito, H., 他 (1983). J. Bacteriol. 153, 163-168）を用いて実施した。
【００２９】
【表１】
2006141350.tif 000002
【００３０】
（２）超抑圧性ρ-変異細胞の単離
超抑圧性ρ-変異細胞の単離、および野生型細胞に対するρ-変異体の抑圧性試験は既報の方法（Blanc, H., 他 (1980). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 3942-3946）の変法を用いて実施した。YPG1y培地で生育したYKN1423細胞（接合型α）を、臭化エチジウム（10μg/ml）を含有するYPD培地に移して、30℃で3時間培養した。臭化エチジウム処理した細胞をYPDプレートに加えて、30℃で4日間コロニーを形成させた。次に、コロニーをOP11c-55R5細胞と交配させた（接合型a）。必要なアミノ酸を加えたSDプレート上に形成させた二倍体コロニーをYPG1yプレート上にレプリカを取り、30℃で4日間培養した。超抑圧性ρ-変異由来コロニーは、YPG1yプレートにわずかな痕跡を形成したに過ぎなかった。
【００３１】
（３）超抑圧性ρ-mtDNAのクローニングおよびシークエンス
超抑圧性ρ-細胞のmtDNA（HSC-1）は、YKN1423細胞から既報の方法（Hudspeth, M. E.
, 他 (1980). Biochim. Biophys. Acta 610, 221-228）に従い、塩化セシウムを用いた密
度勾配遠心分離によって精製し、この超抑圧性ρ-mtDNA中に単一の切断部位を有する制限
エンドヌクレアーゼBglIIまたはEcoRVで消化した。
【００３２】
BglIIまたはEcoRVで消化したHSC-1のmtDNAフラグメントをpUC119ベクターのBamHIまた
はHincII部位にクローニングし、それぞれpUC119HSC-1BglIIおよびpUC119HSC-1EcoRVを構
築し、既報の方法（Sanger, F., 他 (1977). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-54
67）でシークエンスした。
【００３３】
（４）単一ヌクレオチドレベルでのHSρ-mtDNAのrep/ori領域における切断部位のマッピ
ングセンスおよびアンチセンスDNA鎖の配列ラダーは、BACSETシークエンシングキット（Takara、日本）、及びpUC119HSC-1BglIIおよびpUC119HSC-1EcoRVに対する一本鎖HSρ-mtDNA（HSC-1）テンプレートを用いてそれぞれ作製した。シークエンシングキットは、ジデオキシヌクレオチド−チェインターミネーション法（Sanger, F., 他 (1977). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467）に基づいている。
【００３４】
HSρ-mtDNAのrep2/ori5領域における切断部位を決定するために、センスDNA用のプライ
マー１（GATCTATTAGAACCTAAAAAG：1-21、図1AのBglII部位からの番号）（配列番号２）、
およびアンチセンスDNA用のプライマー２（ATCTTCGTTTATCATTTATT：1-20、図1AのEcoRV部
位からの番号）（配列番号３）を合成し、5'末端標識キット（Takara、日本）を用いて
32P-(-dATPで標識した。次に、HSC-1配列ラダーの位置を、電気泳動後のシークエンシングゲル上でBglII消化からの二本鎖切断由来の0.3kbpフラグメント上、およびEcoRV消化からの二本鎖切断由来の0.2kbpフラグメント上でそれぞれテンプレートとして32P標識したプライマー1および2から合成したDNAと比較することによって、切断部位を決定した。DNAフラグメントの合成はKOD DNAポリメラーゼ（Toyobo、日本）を用いて実施した。
【００３５】
（５）遺伝子破壊
YEp13由来の2.8kbpのBglII-LEU2フラグメントを、MHR1（0.94kbp）の平滑Nco1部位およ
びNUC1（0.99kbp）の唯一のBamH1部位にライゲーションした。YKN1423C-1細胞はmhr1：：
LEU2、またはnuc1：：LEU2を含む直鎖DNAフラグメントで形質転換した。YKN1423C-1(mhr
1およびYKN1423C-1(nuc1をLeu+形質転換細胞として選別した。
【００３６】
2.2kbpのHpaI-LEU2フラグメントをCCEI（1.06kbp）の平滑Spe1部位、あるいはNTG1（1
.2kbp）の唯一のHincII部位にライゲーションした。cce1：：LEU2およびntg1：：LEU2直
鎖DNAフラグメントをYKN1423C-1細胞に導入し、それぞれcce1完全欠失単独変異体（YKN1
423C-1(cce1）およびntg1完全欠失単独変異体（YKN1423C-1(ntg1）を構築した。
【００３７】
RPO41の破壊は、既報の通り（Longtine, M. S., 他 (1998). Yeast 14, 953-961）、P
CRで増幅したrpo41：：KanRカセットで酵母細胞を形質転換することにより行った。rpo4
1：：KanRカセットはYKN1423C-1細胞に導入した。G418硫酸塩（Geneticin、Invitrogene
社）（100μg/ml）を含有するYPDプレートで生育したコロニーを、rpo41：：KanRカセッ
トを含む形質転換体（YKN1423C-1(rpo41）として選別した。OGG1およびNGL1は、RPO41の
破壊と同じ方法でKanRカセットの挿入により破壊した（それぞれYKN1423C-1(ogg1および
YKN1423C-1(ngl1）。
【００３８】
各株における破壊された遺伝子の存在を、相応する遺伝子のオープンリーディングフレ
ームをプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーション分析、あるいは破壊のために
遺伝子の完全なオープンリーディングフレームの増幅に用いたプライマーによるPCRによ
って検証した。
【００３９】
（６）サザンハイブリダイゼーション分析
全酵母DNAおよび制限エンドヌクレアーゼで消化したDNAは、2.0％MetaPhoreアガロース
ゲル（Cambrex Bio Science、米国）または1.0％アガロース（FMC、米国）を用いて、室
温において、TAE（40mMトリス−酢酸、10mM EDTA、pH 8.0）緩衝液中、2.0V/cmでの標準
的なゲル電気泳動により分析した。ゲル中のDNAは、キャピラリーブロッティングによっ
て10 ( SSC（1.5M NaCl、0.15Mクエン酸ナトリウム）中でHybond-N+膜（Amersham）によ
って移した。HSρ-mtDNAフラグメントのシグナルは32P標識HSρ-mtDNAフラグメントをプロ
ーブとして用いたサザンハイブリダイゼーションにより検出した。HSρ-mtDNAフラグメン
トは、前述のようにpUC119HSC-1ベクターから除去し、Ready-TO-GO DNA標識キット（Pha
rmacia）を用いて[(-32P]dCTP（Amersham）で標識した。0.1％SDS溶液中で5分間沸騰する
ことにより32Pを除去した後、32P標識したNUC1 DNAフラグメントをプローブとして用いたハイブリダイゼーションのために同一の膜を再使用した。シグナルの検出および定量は既報の通り行った（Ling, F., 他 (2002). EMBO J. 21, 4730-4740）。細胞中のHSρ-mtDNAの相対量は、HSρ-mtDNAシグナルを核遺伝子NUC1シグナルに対する比として計算した。
【００４０】
（７）標準的な一次元または二次元ゲル電気泳動
二次元ゲル電気泳動は既報の方法（Ling, F., 他 (2004). Mol. Biol. Cell. 15, 310
-322, Epub 2003 Oct 2017）に従って実施した。一次元目は、TBE緩衝液（45mMトリス、
45mMホウ酸、1mM EDTA、pH 8.0）を用いて0.4％アガロースゲルに1V/cmで23℃で6時間泳
動した。( HindIII DNAサイズマーカーを用いてDNA電気泳動の位置を確認した（Bio-Rad
）。二次元目は、臭化エチジウム（0.3μg/ml）を含有するTBE緩衝液を用いて、1.0％ア
ガロースゲルに5V/cmで4℃で泳動した。ゲル中のDNAは上記と同様にHybond-N+膜に移した
。HSρ-mtDNAからのシグナルは、pUC119HSC-1ベクターから切り出した32P標識HSρ-mtDNAフラグメントを用いたサザンハイブリダイゼーションによって検出した。二次元ゲル上のDNA種は、既報の方法で特定した（Lorimer, H. E. (2002). Methods Mol Biol. 197, 187
-196）。二次元ゲル電気泳動の直鎖コンカテマー、超らせんまたはニックの入った環状モ
ノマー、およびマルチマーに相応する図３Ａの囲われた領域に認められる全32Pシグナルを、既報の方法（Ling, F., 他 (2004). Mol. Biol. Cell. 15, 310-322 Epub 2003 Oct 2017；及びLorimer, H. E. (2002). Methods Mol Biol. 197, 187-196）に従って、計測し、バックグランドを差し引いて補正した。コンカテマーのモノマーに対する正味のシグナル比、およびマルチマーのモノマーに対する正味のシグナル比を計算して、HSρ-mtDNAのコンカテマーおよび環状マルチマーの形成を評価した。
【００４１】
（Ｂ）結果
（１）超抑圧性ρ-mtDNA（HSC-1）のrep/oriにおける二本鎖切断
mtDNA複製はS.cerevisiaeのrep/oriで優先的に開始し、超抑圧性ρ-mtDNAにはrep/ori
のいずれかが含まれる。そこでまず、ρ+株の細胞（OPI1c-55R5；約90％の二倍体子孫が
ρ-である）と交配した際に超抑圧性を示す5種類のρ-変異体を、臭化エチジウム処理した約5千個の細胞から得た。本実施例では1つの変異体（YKN1423C-1）を使用した。YKN1423C-1の精製した超抑圧性ρ-mtDNA（「HSC-1」と呼び、「HSρ-mtDNA」と表記する）をBglII、EcoRV、NdeI、またはEcoRI酵素で消化した結果、アガロースゲル電気泳動で検出した場合に1.1kbpの共通する単一DNAフラグメントが得られた。これにより、HSρ-mtDNAが1.1kbp単位の直列反復（コンカテマー）として存在することが示された。HSρ-mtDNAの塩基配列を決定した（図1A；DDB/EMBL/GenBank、登録番号AB182994）。Blast配列分析（ HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）
から、HSρ-mtDNAには、別の超抑圧性ρ-mtDNAであるHS416のrep2/ori5と完全に一致する
配列領域が含まれることが示された。新たに単離されたHSρ-mtDNA（HSC-1）のこの領域
には、3種類のGCクラスタ（A、B、およびC）を含む野生型mtDNA（ρ+）のrep2/ori5必須
成分の全てが含まれており、クラスタCの前にプロモーター配列が含まれている（図1A）
。
【００４２】
Mhr1タンパク質に仲介された相同DNA対合は、二本鎖切断によって開始されるmtDNA相同
組換えに不可欠である。また、Mhr1タンパク質による相同DNA対合が、ローリングサーク
ルmtDNA複製を開始するために必要であることが判明している。環状DNAにおける相同DNA
対合産物（ヘテロ二本鎖結合）の3'末端はローリングサークルDNA複製を開始するための
プライマーとして作用できるため、二本鎖切断によってrep/oriでのHSρ-mtDNA複製が開
始されるものと考えられる。BglIIまたはEcoRVで消化した、50μgを超える全細胞DNAを電
気泳動で分離し、消化したHSρ-mtDNAシグナルをサザンハイブリダイゼーションによって
検出した（図1B）。1.1kbpのHSρ-mtDNA単位フラグメントからの主なシグナルに加え、B
glII消化による0.8kbpおよび0.3kbpのDNAフラグメント、ならびにEcoRV消化による0.9kb
pおよび0.2kbpのDNAフラグメントから2種類の弱いシグナルが検出されたことから、イン
ビボにおけるHSρ-mtDNAの部位特異的な二本鎖切断が示された。EcoR1、BglII、NdeI、お
よびEcoRVの制限エンドヌクレアーゼによって消化されたmtDNAから得られる二本鎖切断由
来のDNAフラグメントのサイズを用いて、HSρ-mtDNAのrep2/ori5における二本鎖切断部位
をマッピングした（図1C）。次に、図1Dに示すように、切断部位を単一ヌクレオチドレベ
ルで分析した。1本のみの大きなシグナルが各鎖で検出された（図1D）。切断シグナルは
、rep2/ori5に各鎖のその他の小さな切断部位が含まれる可能性を除外できるほど強くは
なかったが、本結果から、二本鎖切断の大半は図1D下部に示す配列の2つの矢印で示され
た部位で生じていることが示される。切断部位の中心位置はHSρ-mtDNAのrep2/ori5のク
ラスターC近辺にあるプロモーター領域に存在する（図1Aに枠で囲んだ配列および図1Dに
示す配列）。これらの結果から、rep2/ori5のプロモーター領域は、相同mtDNA組換えの開
始部位および関連事象として作用することが示される。この知見は、相同的組換えにおけ
る転写プロモーターの一般的役割をミトコンドリアにまで拡大する。その理由は、S.cer
evisiaeの核染色体DNAでは相同的組換えのほとんどのホットスポット（染色体IIIで90％
）およびホットスポットでの部位特異的な二本鎖切断がプロモーター領域に位置している
ためである。
【００４３】
（２）Ntg1タンパク質がHSρ-mtDNAのrep/ori特異的二本鎖切断において担う役割
部位特異的な二本鎖切断はエンドヌクレアーゼによって直接的に導入されるか、あるい
は部位特異的な一本鎖切断から間接的に誘導される。HSρ-mtDNAのrep2/ori5におけるプ
ロモーターでの部位特異的な二本鎖切断への影響について、数種類のミトコンドリアエン
ドヌクレアーゼを試験した。すなわちNuc1およびNgl1の2種類のデオキシリボヌクレアー
ゼ、ならびにNtg1およびOgg1の2種類の塩基除去修復酵素をSaccharomycesデータベース検
索（http://www.yeastgenome.org/）によって選択した。それぞれ前述のタンパク質をコ
ードするNUC1、NGL1、NTG1、およびOGG1遺伝子を、HSρ-（YKN1423C-1）およびρ+（OP11
c-55R5）細胞内で破壊した。HSρ-mtDNAの1.1kbp単位の量に対するrep2/ori5での二本鎖
切断に由来する0.8kbpのDNAフラグメント量を測定し、二本鎖切断に対する遺伝子破壊の
影響を評価した。試験した変異体の中では、NTG1遺伝子の破壊のみが二本鎖切断の相対シ
グナルを半分未満に低下させた（図２）。次に、Ntg1タンパク質を過剰発現させ、これに
よってrep2/ori5での二本鎖切断が高められた。したがって、Ntg1タンパク質はHSρ-mtD
NAのrep2/ori5特異的な二本鎖切断において重要な役割を担うと考えられる。
【００４４】
（３）Ntg1およびMhr1タンパク質依存性HSρ-mtDNAコンカテマー形成
コンカテマーの形成がMhr1タンパク質の相同DNA対合活性に主に依存していることが示
されている。ρ-酵母株の増殖細胞から、rep/oriとGCクラスターのいずれも含まれないρ
-mtDNA（mt-pMK2）を二次元ゲル電気泳動（一次元は重量で分離し、二次元は重量と構造
で分離）で分析した場合、主要なmtDNA種はコンカテマーであり、これらρ-細胞では、大
きさが不連続な環状マルチマー（ダイマー、トリマー、テトラマーなど）の種類が非常に
少なかった。大きさが不連続な環状マルチマーは、交叉型の相同的組換えによってモノマ
ーまたはコンカテマーのいずれかから形成される。このようなρ-細胞とは異なり、HSρ
-細胞には2種類の型のmtDNAが含まれており、ローリングサークル複製産物（コンカテマ
ー）および交叉（crossing-over）産物（大きさが不連続な環状mtDNAマルチマー）である
。この結果から、rep2/ori5は相同的組換えの開始を広範囲に刺激することが示唆される
。
【００４５】
HSρ-mtDNA種のモノマーの量に対するローリングサークル複製産物と交叉型組換え産物
の相対量はともに、MHR1の破壊によって著しく減少していることから（図3B、3G、および
3H）、Mhr1タンパク質がHSρ-mtDNAにおけるローリングサークル複製ならびに相同組換え
の開始に必要であることが示される。
【００４６】
rep2/ori5での二本鎖切断がローリングサークル複製開始および／または相同組換えに
関与しているか否かを決定するために、モノマー性HSρ-mtDNAに対するローリングサーク
ル複製産物および交叉型組換え産物の量に及ぼすNTG1破壊の影響を、二次元電気泳動を用
いて試験した。その結果、NTG1（(ntg1）の破壊によって、モノマーに対するコンカテマ
ーおよび交叉型組換え産物の相対量が大きく低下した（図3E、3G、および3H）。上記結果
から、rep2/ori5での二本鎖切断は、ローリングサークル複製及び交叉型組換え型相同組
換えの開始において重要な役割を担うことが示された。
【００４７】
ミトコンドリアの転写RNAポリメラーゼであるRPO41をコードする遺伝子の破壊でもHSρ
-mtDNAのモノマーに対するコンカテマーの相対量が大きく低下する（図3Dおよび3G）とい
う予期せぬ結果が対照実験から得られたが、その低下はMHR1およびNTG1の破壊によって生
じる減少よりはるかに少なかった。PRO41の破壊はMHRI破壊の結果と比べ、細胞のHSρ-m
tDNAの総量への影響が軽度（野生型でのレベルの約79±3％）であった（野生型の量の50
％未満）。このことから、rep2/ori5でのRNA合成がHSρ-mtDNAのローリングサークル複製
開始に寄与していることが示唆されるが、Mhr1タンパク質依存型モードによる方法では、
通常量のHSρ-mtDNAが十分維持される。
【００４８】
（４）超抑圧性は活性NTG1およびMHR1が必要
超抑圧性は、ミトコンドリアのrep/oriの存在に依存するHSρ-mtDNAの優性複製を反映
する。部位特異的切断のゲル電気泳動測定は高感度であるが、ランダムな二本鎖切断を検
出できるほどではなく、Ntg1タンパク質の配列特異的なDNA切断活性は認められていない
。このため、rep2/ori5でのNtg1タンパク質依存性の部位特異的二本鎖切断が実際にHSρ
-mtDNAの優性複製に実際に寄与しているかどうかが疑問となるかもしれない。HSρ-mtDNA
の優性複製におけるNtg1タンパク質の役割を裏付ける確定的な証拠を得るために、超抑圧
性に対するNTG1およびMHR1破壊の影響を試験した。対照としてρ+細胞を通常のρ-株（YK
N1423A-3）の細胞と交配させると、二倍体子孫のうちρ-細胞の割合が約30％（中程度の
抑圧性）となり、このρ-子孫の産生量が本実験のバックグランドとなる（図４）。ρ+細
胞を活性MHR1の非存在下でHSρ-mtDNAを含む細胞と交配させた場合（mhr1-1 ( (mhr1）、
二倍体の子孫のうちでρ-の数は通常のρ-細胞と交配させた場合の数よりも低下したため
、相同DNA対合への超抑圧性の依存性が示された（図４）。ρ+細胞を活性NTG1の非存在下
でHSρ-mtDNAを含む細胞と交配させた場合、二倍体の子孫のうちのρ-細胞の割合は約50％に低下したため、超抑圧性が少なくとも部分的には活性NTG1に依存していることが示された（図４）。これらの結果から活性Mhr1およびNtg1タンパク質がともにrep2/ori5依存性でρ-mtDNAの優性複製を与えるように特異的に機能することが明確に示される。従って、（相同組換えに加えて）HSρ-mtDNAの優性複製は、rep2/ori5でのNtg1刺激による二本鎖切断によって開始され、Mhr1タンパク質による相同DNA対合（完全な環状HSρ-mtDNAを有する）がこれに続くローリングサークルに依存している可能性が非常に高い。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図1は、HSρ-mtDNA（HSC-1）の塩基配列およびrep/ori領域における二本鎖切断を示す。（A）HSρ-mtDNAの塩基配列（配列表の配列番号１）  282bpのrep2/ori5配列を下線で示す（ヌクレオチド313から594）。rep2/ori5における3種類のGCクラスターを枠内に示す；C（ヌクレオチド329から345）、B（ヌクレオチド546から554）、およびA（ヌクレオチド582から594）。転写開始のプロモーター領域（ヌクレオチド316から325）を枠内に示す。HSρ-mtDNA上に1つの切断部位を有する制限エンドヌクレアーゼを示す。（B）HSρ-mtDNAにおける二本鎖切断の検出  BglIIまたはEcoRVで消化したYKN1423C-1の全細胞DNAを2％アガロースゲル（MetaPhorアガロース、Cambrex Bio Science,Inc.、ロックランド、米国メーン州）による電気泳動によって分離した。HSρ-mtDNAのシグナルを32P標識HSρ-mtDNAを用いたサザンハイブリダイゼーションによって検出した。BglII消化による0.8kbpフラグメントおよび0.3kbpフラグメント、およびEcoRV消化による0.9kbpフラグメントおよび0.3kbpフラグメントを矢印で示す。（C）二本鎖切断部位のマップ  HSρ-mtDNA上に1か所の特有な切断部位を有する制限エンドヌクレアーゼを用いた処理によって生じたフラグメントサイズに基づいて、インビボにおける二本鎖切断部位をrep2/ori5にマッピングし、DSBと表示した矢印で示した。赤色の太い線は0.28kbpのrep2/ori5配列を示す。制限エンドヌクレアーゼBglII、EcoRI、NdeI、およびEcoRVによる特有な切断部位を示す。BglIIおよびEcoRVの切断部位における半分の矢印は、rep2/ori5領域における二本鎖切断部位の単一ヌクレオチドレベルでの分析のために使用したプライマーを示す。（D）単一ヌクレオチドレベルで分析したHSρ-mtDNAの二本鎖切断部位  HSρ-mtDNAのBglIIまたはEcoRVフラグメントのいずれかを含むpUC119ベクターから得た一本鎖DNAをテンプレートとして用い、BcaBESTジデオキシシークエンシングキット（Takara）と5'端で32P標識したプライマーを用いて配列ラダーを調製した。ジデオキシ-G、A、T、およびCとのチェインターミネーション反応をそれぞれ左パネルの2〜5レーン、および右パネルの6〜9レーンに示す。  レーン1、BglII消化による二本鎖切断由来の0.3kbpフラグメントをテンプレートとして、5'端が32Pで標識されたプライマー1から合成されたDNA。レーン10、EcoRV消化による二本鎖切断に誘導された0.2kbpフラグメントをテンプレートとして、5'端が32Pで標識されたプライマー2から合成されたDNA。これらの分析物から推定される切断されたバンドをゲル像に矢印で示し、配列を図の下部に示す。レーン1および10にそれぞれシングルバンドが認められる。
【図２】図２は、HSρ-mtDNAのrep2/ori5領域における二本鎖切断に対する、NTG1の欠失および過剰発現の影響（A）欠失遺伝子および過剰発現したNTG1を含む細胞における二本鎖切断のゲル分析  全細胞DNAを、野生型の早期対数増殖期培養細胞、およびYPD中30(Cで生育させた欠失遺伝子（図示）を含む細胞から単離した。Ntg1タンパク質の量を増加した場合における二本鎖切断の形成に対する影響を調べるため、ラフィノース培地で生育させたYKN1423C-1およびYKN1423C-1Gal-NTG1の早期対数増殖期細胞を、GAL1プロモータを誘発するため、ガラクトース含有培地に移した。全細胞DNA約10(gをBglIIで消化し、2％アガロースゲルによる電気泳動で分離し、N+ナイロン膜に移した。膜上のHSρ-mtDNAを32P標識HSρ-mtDNAプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションによって検出した。BglII消化によって得られる0.8kbpのDNAフラグメント（矢印で示す）および各BglII消化によるrep2/ori5領域における特有な二本鎖切断が認められる（レーン1〜8）。欠失遺伝子（および菌株）は以下の通りである。WT（野生型）；親株（YKN1423C-1）；(ntg1、NTG1（YKN1423C-1(ntg1）、(ogg1、OGG1（YKN1423C-1(ogg1）；(rpo41、RPO41（YKN1423C-1(rpo41）；(nuc1、NUC1（YKN1423C-1(nuc1）；(ngl1、NGL1（YKN1423C-1(ngl1）。Gal-NTG1はNTF1を過剰発現する細胞。（B）細胞内mtDNAの二本鎖破壊の定量分析  各サンプルにおけるHSρ-mtDNAの二本鎖切断の程度を0.8kbpのDNAフラグメントおよび単位サイズが1.1kbpのDNAフラグメント（Aの図に矢印で示す）のシグナルから計算した。各DNAフラグメントのバックグランドは、フラグメントのバンドの直前直後に位置している同一サイズの領域から平均シグナルを差し引くことによって補正した。0.8kbpのDNAフラグメントの正味シグナルを1.1kbpのDNAフラグメント正味シグナルと比べた値を「相対シグナル」として図示した。
【図３】図３は、HSρ-mtDNAのローリングサークル複製産物および乗換え産物の生成におけるMHR1およびNTG1の必要性を示す。  対象遺伝子を破壊した細胞をYPD培地中30℃で1.0 ( 105細胞/mlから2.0 ( 107細胞/mlの範囲で生育させた。細胞の全DNA約20μgを二次元ゲル電気泳動で分離し、N+ナイロン膜に移した。膜上のHSρ-mtDNAを32P標識HSρ-mtDNAを用いたサザンハイブリダイゼーションによって検出した。（A）概念図  一次元目は重量によりDNA種を分離し、二次元目は重量と形状によって分離する。DNA種の位置を図示する。コンカテマー、様々な連続した長さを有する直鎖マルチマー；1N、開環状モノマー；2〜7N、開環状マルチマー（ニックの入った環状mtDNA：2N、ダイマー；3N、トリマー；4N、テトラマー；5N、ペンタマー；6N、ヘキサマー；7N、ヘプタマー）；SC、超らせん（自然閉環）モノマー、ダイマーおよびトリマー。二次元電気泳動後の枠で囲んだ領域のコンカテマー、環状モノマーおよびマルチマーのシグナルを測定して、放射活性のない同じ大きさの領域のバックグランドを差し引いて補正した。（B、C、D、E、およびF）対象の破壊された遺伝子を含む細胞から分離したHSρ-mtDNAの二次元ゲル像（GおよびI）ローリングサークル複製産物量の環状モノマー（ニックの入った環状モノマーと超らせんモノマー）に対する相対量。相対的シグナルはコンカテマーの正味シグナルを環状モノマーのシグナルによって除した。（HおよびJ）乗換え産物量の環状モノマーに対する相対量。相対的なシグナルは大きさが不連続な環状マルチマーの正味シグナルを環状モノマーのシグナルによって除した。  それぞれの棒グラフは少なくとも2回以上個別に実施した実験の平均を示す。破壊された遺伝子：WT（野生型）、親株（YKN1423C-1）、(mhr1、YKN1423C-1(mhr1；(rpo41、YKN1423C-1(rpo41；(ntg1、YKN1423C-1(ntg1；(ogg1、YKN1423C-1(ogg1
【図４】図４は、MHR1およびNTG1はともに超抑圧性に必要であることを示す。  HSρ-mtDNAを含むρ-細胞（HSC-1）および試験する破壊された遺伝子を含む細胞を、親型（野生型）ρ+細胞または同じ破壊された遺伝子を含むρ+細胞と交配した。交配から得られる二倍体細胞を必要なアミノ酸を添加したSD培地で約20継代にわたって選択的に生育させた。次に、細胞を採取してSDプレートに加えて30℃で3日間コロニーを形成させた。コロニーはYPG1yプレートでレプリカ培養して酸化呼吸能を試験した。各交配から得られる呼吸欠如した（ρ-）二倍体細胞はSDプレート上にコロニーを形成するが、YPG1yプレート上には形成しない。各交配におけるρ-接合体の割合を計算してプロットした。交配に使用した菌株：WT ( WT、OP11C-55R5（親のa接合型、ρ+株）とYKN1423C-1（HSρ-mtDNA［HSC-1］を含む親株）の交配；MHR1 ( (mhr1、OP11C-55R5とYKN1423C-1(mhr1の交配（mhr1：：LEU2［HSC-1］）；mhr1-1 ( (mhr1、FL67-2c（mhr1-1）とYKN1423C-1(mhr1の交配（mhr1：：LEU2［HSC-1］）；NTG1 ( (ntg1、OP11C-55R5とYKN1423C-1(ntg1の交配（ntg1：：LEU2［HSC-1］）；(ntg1 ( (ntg1、OP11C-55R5(ntg1（ntg1：:LEU2、ρ+）とYKN1423C-1(ntg1（ntg1：：LEU2［HSC-1］）の交配。ρ+と非超抑圧性ρ-のコントロールとなる交配（「WT ( WT（ρ+ ( コントロールρ-）として示す」）をOP11C-55R5とYKN1423A-3との間で実施した。
【図５】図５は、mtDNAにおける二本鎖切断誘発性相同DNA対合依存複製および交叉型組換え型相同組換えのモデルを示す。  Ntg1タンパク質に刺激されたmtDNAのrep/oriにおける二本鎖切断が2つの一本鎖3'端でプロセシングされる。Mhr1タンパク質が片方の一本鎖3'端のみを完全な環状mtDNAの相同部位と対を形成してヘテロ二重結合を形成する場合に、ローリングサークル複製が開始され、mtDNAの娘細胞へのパーティショニングに欠かせないコンカテマー（両端まで直列な多数のmtゲノム単位；図の上部経路）が産生する。Mhr1タンパク質が両方の一本鎖の3'端を同じ完全な環状mtDNAの相同部位と対を形成してヘテロ二重結合を形成する場合は、二本鎖切断修復プロセスが開始し、遺伝子転化産物だけでなくホリディ中間体によって乗換え産物（ダイマー、トリマー、テトラマーなどの不連続部位を有する環状mtDNAマルチマー；図の下部経路）を形成する。ホリディ中間体の乗換え産物への変換にはCce1タンパク質が必要である。乗換えによって形成された環状マルチマーはρ-mtDNA遺伝のためのバックアップ経路としてパーティショニングのための基質を生成するように直線化される可能性がある。超抑圧性ρ-mtDNAはρ+mtDNA（70〜85kbp）のrep/oriを含む非常に小さな領域（1kbp未満）である。小さなレプリコンは同じ複製起点を有するはるかに大きなレプリコンよりも優性複製を有しているので、超抑圧性ρ-mtDNAが超抑圧性ρ-細胞とρ+細胞の交配の接合体において優性である。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
SEQUENCE LISTING
<110> Riken
<120> A method for controlling mitochondria DNA heteroplasmy
<130> A41795A
<160> 5
<210> 1
<211> 1140
<212> DNA
<213> S.cerevisiae
<400> 1
gatctattag aacctaaaaa gaatattaat atatctatta taaaataata ataataaata 60
taaatataaa aataaattgt aatatttata aataataata aaaaataaat aaggaatata 120
ttaattatta ataataaata aattatatta aaatataata ttattattaa attaaagaat 180
tatattaaat atatttatta aaattttata aataagttaa tattttatta aataatattt 240
ataaataata aaaaaaaata agtatataat tattaatata ttaatttatt atgttatata 300
tttatatatt tcaaatatat aagtaatagg gggagggggt gggtgataat aaccagaata 360
ttaaataaat acagagcaca catttgttaa tatttaataa tataatcaat aaatatatta 420
taataatata atataattaa taatagatat aaagtataaa caatataata aattatataa 480
aataaatata aattaaaaat aaaaaccaaa taattaatat aataaatgat aaacaagaag 540
atatccgggt cccaataata attattattg aaaataataa ttgggacccc cacaatagaa 600
taaaaaataa aaagaattaa taatatataa ataatataaa atatattata tatatatata 660
atatatatat atatataata aaaaaaaata tataatataa tatatatata taaaataata 720
aattatatat atatatataa aataataaaa aataataatc atatgaattt tataaatata 780
attattatta ataataataa taataataat aaaaaaatag aaaagaataa tttttattat 840
tttagtatat ataagaattt aataagttat attattgcgg acaccgttcg cggagtgggg 900
actattatat tttacctata tatattaata ttattataat ttccttcttt aaaagaaaaa 960
aggaattcga gaacttatta ttatattaat atattaataa taaataataa taaataataa 1020
aaaagtaaat aattataaat tatataaaaa tataatttta ttattaagaa aggagtttaa 1080
atataaaata taatattatc attaagttct aataaaggta tataatgaag atcctctaga 1140
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 2
gatctattag aacctaaaaa g          21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 3
atcttcgttt atcatttatt            20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> S.cerevisiae
<400> 4
caaatatata agtaataggg gg         22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> S.cerevisiae
<400> 5
gtttatatat tcattatccc cc         22
【図４】
2006141350.tif 000003
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
2006141350.tif 000007