(57)【要約】【課題】被験体におけるＣＤＡＤ、ＰＭＣ、下痢、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢによって媒介される別の状態を処置または予防する組成物を提供すること。【解決手段】被験体におけるＣＤＡＤ、ＰＭＣ、下痢、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢによって媒介される別の状態を処置または予防する組成物であって、該組成物は、薬学的に受容可能な不活性な支持体に、非ペプチジル適合性リンカーアームを介して共有結合した少なくとも１つのトキシンＢ結合性オリゴ糖配列の有効量を含み、ここで、該オリゴ糖配列はトキシンＢを結合し、そして該組成物が胃腸管から排出され得る、組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体におけるＣＤＡＤ、ＰＭＣ、下痢、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢによって媒介される別の状態を処置または予防する組成物であって、該組成物は、薬学的に受容可能な不活性な支持体に、非ペプチジル適合性リンカーアームを介して共有結合した少なくとも１つのトキシンＢ結合性オリゴ糖配列の有効量を含み、ここで、該オリゴ糖配列はトキシンＢを結合し、そして該組成物が胃腸管から排出され得る、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連性下痢（ＣＤＡＤ）および偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）およびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に関連する他の状態を含む、抗生物質関連性下痢の処置に関する。より詳細には、本発明は、ＣＤＡＤ、ＰＭＣ、およびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにより引き起こされる他の状態に関連するサイトトキシンであるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢの中和に関する。
【０００２】
（参考文献）
以下の参考文献は、本出願において、本出願の関連する部分に角括弧中の番号として引用される。
【０００３】
【表２】
2006213735.tif 000002
【０００４】
2006213735.tif 000003
【０００５】
2006213735.tif 000004
【０００６】
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【０００７】
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【０００８】
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【０００９】
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【００１０】
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【００１１】
2006213735.tif 000010
【００１２】
2006213735.tif 000011
【００１３】
上記の刊行物、特許、および特許出願の開示は、あたかも個々の刊行物、特許、および特許出願のそれぞれの用語が本明細書中に特にそして個々に包含されるような同じ程度に、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【００１４】
（発明の背景）
嫌気性生物Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、病院および長期療養施設において、主に年配の患者間で、抗生物質が関連する細菌性下痢および偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）の主要な原因となる因子である［１（非特許文献１）、２（非特許文献２）］。この生物は、成人の結腸において正常な微生物叢とうまく競合し得ないが、正常な腸微生物叢が、例えば、抗生物質処置によって変えられる場合、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、腸に多数のコロニーを形成し得る。抗生物質治療はＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連性下痢（ＣＤＡＤ）の全ての症例の９８％を占める。しかし、正常な腸叢を変える任意の素因のある状態（広範な免疫抑制処置を必要とする任意の状態を包含する）はまた、ＣＤＡＤの発生を導き得る。例えば、近年の証拠は、ＡＩＤＳ患者が、ＣＤＡＤを獲得する高い危険性のある候補者でもあることを示唆する［３（非特許文献３）、４（非特許文献４）］。
【００１５】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、ＣＤＡＤを引き起こすのに重要な役割を担うようである２つのエキソトキシンである、トキシンＡ（エンテロトキシン）およびトキシンＢ（サイトトキシン）を生成する。トキシンＡは、この疾患の主要な原因であると長年の間考えられている。トキシンＡは、腸において上皮細胞に結合することによって作用し、これらの細胞の破壊をもたらし、そして腸中へ液の分泌を引き起こす。トキシンＡによるこれらの保護上皮細胞の破壊は、下痢の発生を導く決定的な工程を示す。一旦、上皮細胞に損傷が生じると、次いで、強力なサイトトキシンＢは、下層の感受性組織への接近が増加し得、そしてさらなる臨床症状を開始し得る［５〜１０（非特許文献５〜１０）、１３（非特許文献１１）、１９〜２０（非特許文献１２〜１３）、５３〜５６（非特許文献１４〜１７）、５７〜５９（非特許文献１８〜２０）、６１〜６４（非特許文献２１〜２４）］。しかし、近年のインビトロでの研究［４６（非特許文献２５）］では、トキシンＢは、ヒトの結腸上皮を損傷する際にはトキシンＡよりも強力であることが見出された。このことは、トキシンＢが、以前に考えられていたよりも重要な役割をＣＤＡＤにおいて果たし得ることを示唆する。
【００１６】
トキシンＡは、上皮細胞上でオリゴ糖レセプターに結合することを可能にする、レクチン様活性を示すことが見出されている。いくつかのオリゴ糖配列はトキシンＡの潜在的なレセプターとして同定されている［６０（非特許文献２６）、６６（特許文献１）］。トキシンＢの細胞レセプターは決定されていないが、トキシンＢが赤血球に結合するといういくつかの指摘が存在し、このことは、炭水化物レセプターがトキシンＢ結合に関与し得ることを暗示する［４７（非特許文献２７）、４８（非特許文献２８）］。ステロイドはまた、トキシンＢの潜在的なレセプターとして提案されている［４７（非特許文献２７）］。
【００１７】
ＣＤＡＤまたはＰＭＣを罹る患者の現在の治療は、傷害を与える薬物を除去し、そして、液を置換しながら抗生物質メトロニダゾールまたはバンコマイシンの経口投与を開始することである［３（非特許文献３）、１４（非特許文献２９）］。バンコマイシンは患者が我慢し得ない、またはメトロニダゾール処置に応答しないという特定の状況においてのみ使用される。さらに、バンコマイシンはコストが高いので、そしてバンコマイシンの濫用はバンコマイシン耐性微生物の発生を助長し得る可能性があるので、日常的には使用されない。メトロニダゾール治療は、ＣＤＡＤまたはＰＭＣに罹る約８０％の患者において有効である。約２０％の患者においては、抗生物質処置を中止した後に下痢が再発する［１５（非特許文献３０）］。このような個体において、正常な腸叢が再確立されてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ生物の数が減少するまで、この症状の発現は再発し続ける。正常な腸叢のバランスを崩すメトロニダゾールのような抗生物質が、下痢が生じる度に投与されるので、これは遅いプロセスである。
【００１８】
ＣＤＡＤおよびＰＭＣに対する、腸管からトキシン活性を除去する唯一の他の処置は、抗生物質と組み合わせて経口的に与えられる、コレスチラミンおよびコレスチポールのような、陰イオン交換樹脂を多グラム量で使用することを包含する。このアプローチは、軽度から中度の病気の患者、ならびに下痢の複数の病状の発現を患う個体を処置するために使用されてきた［１６（非特許文献３１）、１７（非特許文献３２）］。この形態の治療は、疾患の処置において中程度にのみ成功している［１８（非特許文献３３）］。イオン交換樹脂の効力の欠如に加えて、イオン交換樹脂の使用に関連するいくつかの他の不都合がある。イオン交換樹脂は、トキシンＡにもトキシンＢにも特異的に結合しない。従って、イオン交換樹脂は、抗生物質を結合し得、腸内で抗生物質が最適以下のレベルになる。これはまた、患者が関連のない状態に関して受けている他の薬物についても生じ得る。イオン交換樹脂のさらなる不都合は、これらの化合物の経口投与に関連する不愉快な後味である。
【００１９】
診断方法に関して、サンプル中のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを検出するための１つの方法は、サンプルを培養することである。この方法の不都合は、結果を得るために必要とされる時間の長さ、および非病原性（すなわち、トキシンを産生しない）Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株による干渉を包含する。他の方法は、特異的な抗血清またはモノクローナル抗体の使用を包含する。これらの方法は、臨床サンプル中のトキシンＡまたはトキシンＢの検出に基づく。米国特許第４，８６３，８５２号（特許文献２）および同第５，０９８，８２６号（特許文献３）は、αＧａｌ（１−３）βＧａｌ（１−４）βＧｌｃＮＡｃ、Ｘ抗原およびＹ抗原のオリゴ糖配列を含む、支持体に結合された、トキシンＡについての生物学的レセプターを含有する試薬の使用によるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＡの検出方法を記載する。米国特許第５，６３５，６０６号（特許文献１）は、生体適合性の固体支持体（例えば、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  ＰＴＭ）に共有結合した特定の合成オリゴ糖配列が、トキシンＡに結合するように用いられ得ることを教示する。
【００２０】
上記を考慮すると、抗生物質関連性下痢のための有効な処置についての必要性がある。詳細には、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＢならびに／またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡおよびトキシンＢの両方を中和し得る化合物が必要である。好ましい化合物は、適切な薬学的処方物中で、非侵襲的に（例えば、経口的に）投与される。
【特許文献１】米国特許第５，６３５，６０６号明細書
【特許文献２】米国特許第４，８６３，８５２号明細書
【特許文献３】米国特許第５，０９８，８２６号明細書
【非特許文献１】Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｇ．ら，「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｔｏｘｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ」，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ，２９８：５３１−５３４（１９７８）
【非特許文献２】Ｌｙｅｒｌｙ，Ｄ．Ｍ．，「Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｎｅｗｓ，１５：４９−５３（１９９３）
【非特許文献３】Ｃｏｚａｒｔ，Ｊ．Ｃ．，ら，「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅｄｉａｒｒｈｅａ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＡＩＤＳ  ｖｅｒｓｕｓ  ｎｏｎ−ＡＩＤＳ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１６：１９２−４（１９９３）
【非特許文献４】Ｂａｒｂｕｔ，Ｆ．ら，「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  ｓｅｒｏｇｒｏｕｐｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ＡＩＤＳ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１：７４０−２（１９９３）
【非特許文献５】Ｋｒｉｖａｎ，Ｈ．Ｃ．，ら，「Ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｃｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  αＧａｌ（１−３）βＧａｌ（１−４）βＧｌｃＮＡｃ」，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５３：５７３−８１（１９８６）
【非特許文献６】Ｃｌａｒｋ，Ｇ．Ｆ．ら，「Ｔｏｘｉｎ  Ａ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｃｉｌｅ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｒａｂｂｉｔ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ  ｗｉｔｈ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  αＧａｌ（１−３）βＧａｌ（１−４）βＧｌｃＮＡｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５７：２１７−２９（１９８７）
【非特許文献７】Ｔｕｃｋｅｒ，Ｋ．Ｄ．ら，「Ｔｏｘｉｎ  Ａ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｃｉｌｅ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｉ，Ｘ，  ａｎｄ  Ｙ」，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９：７３−８（１９９１）
【非特許文献８】Ｋｒｉｖａｎ，Ｈ．Ｃ．ら，「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｏｘｉｎ  Ａ  ｂｙ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｎ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ」，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５５：１８７３−７（１９８７）
【非特許文献９】Ｋａｍｉｙａ，Ｓ．ら，「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｕｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｃｉｌｅ  ｔｏｘｉｎ  Ａ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｂｙ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｎ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ」，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，５６：３３１−６（１９８８）
【非特許文献１０】Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｇ．Ｄ．ら，「Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｉｇａ−ｌｉｋｅ  ｔｏｘｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６４：１１６０−７（１９９１）
【非特許文献１１】Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｎ．Ｍ．ら，「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｘｉｎ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ」，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，３５：１０３２−４０（１９８３）
【非特許文献１２】Ｏｎｄｅｒｄｏｎｋ，Ａ．Ｂ．ら，「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｌｉｔｉｓ」，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍ．，８：３８３−９３（１９８１）
【非特許文献１３】Ｔｒｉａｄｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．ら，「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｏｘｉｎ  ａ  ａｎｄ  ｂ  ｏｎ  ｒａｂｂｉｔ  ｉｌｅｕｍ”，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９３：２７３−９（１９８７）
【非特許文献１４】Ｒｏｌｆｅ，Ｒ．Ｄ．，「Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｏｘｉｎ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｔｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｂｒｕｓｈ  ｂｏｒｄｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｆａｎｔ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｈａｍｓｔｅｒｓ」，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９：１２２３−１２３０（１９９１）
【非特許文献１５】Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｇ．，「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ：ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ａｓ  ａｎ  ｅｎｔｅｒｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ａｂｏｕｔ  ｔｈｅ  ｏｒｇａｎｉｓｍ」，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１８（Ｓｕｐｐｌ  ４）：Ｓ２６５−２７２（１９９４）
【非特許文献１６】Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｇ．，Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｗ．，Ｇｕｒｗｉｔｈ，Ｍ．，Ｇｏｒｂａｃｈ，Ｓ．Ｌ．，Ｏｎｄｅｒｄｏｎｋ，Ａ．Ｂ．，「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｔｏｘｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ」，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２９８：５３１−５３４（１９７８）
【非特許文献１７】Ｔｒｉａｄａｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．，Ｐｏｔｈｏｕｌａｋｉｓ，Ｃ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｍ．Ｊ．，ＬａＭｏｎｔ，Ｊ．Ｔ．，「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｏｘｉｎｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｏｎ  ｒａｂｂｉｔ  ｉｌｅｕｍ」，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９３：２７３−２７９（１９８７）
【非特許文献１８】Ｌｙｅｒｌｙ，Ｄ．Ｍ．，Ｓａｕｍ，Ｋ．Ｅ．，ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｄ．Ｋ．，Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｔ．Ｄ．，「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｏｘｉｎｓ  ｇｉｖｅｎ  ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃａｌｌｙ  ｔｏａｎｉｍａｌｓ」，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４７：３４９−３５２（１９８５）
【非特許文献１９】Ｔｏｒｒｅｓ，Ｊ．，Ｊｅｎｎｉｓｃｈｅ，Ｅ．，Ｌａｎｇｅ，Ｓ．，Ｌｏｎｎｒｏｔｈ，Ｉ．，「Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ；ｄｉａｒｒｈｏｅｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ」，Ｇｕｔ，３１：７８１−７８５（１９９０）
【非特許文献２０】Ｆｌｅｇｅｌ，Ｗ．Ａ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｆ．，Ｄａｕｂｅｎｅｒ，Ｗ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｇ．，Ｈａｄｄｉｎｇ，Ｕ．，Ｎｏｒｔｈｏｆｆ，Ｈ．，「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｏｘｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｎ  Ｂ」，Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．，５９：３６５９−３６６６（１９９１）
【非特許文献２１】Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ＮＭ．，Ｐｅｌｌｅｔ，Ｓ．ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｔ．Ｄ．，「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｘｉｎ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ」，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，３５：１０３２−１０４０（１９８２）
【非特許文献２２】Ｌｉｍａ，Ａ．Ａ．，Ｌｙｅｒｌｙ，Ｄ．Ｍ．，Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｔ．Ｄ．，Ｉｎｎｅｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｇｕｅｒｒａｎｔ，Ｒ．Ｌ．，「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｏｘｉｎｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔ  ｓｍａｌｌ  ａｎｄ  ｌａｒｇｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｖｉｔｒｏ」，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５６：５８２−５８８（１９８８）
【非特許文献２３】Ｄｏｎｔａ，Ｓ．Ｔ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｎ．，Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｔ．Ｄ．，「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｏｘｉｎｓ  ｏｎ  ｔｉｓｓｕｅ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１５：１１５７−１１５８（１９８２）
【非特許文献２４】Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｉ，Ｃ．，Ｔｈｅｌｅｓｔａｍ，Ｍ．，「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｏｘｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｃｅｌｌｓ」，Ｔｏｘｉｃｏｎ，２９：５４３−５６７（１９９１）
【非特許文献２５】Ｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｓｅｄｉｖｙ，Ｒ．，Ｐｏｔｈｏｕｌａｋｉｓ，Ｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｇ．，Ｚａｃｈｅｒｌ，Ｊ．，Ｂｉｓｃｈｏｆ，Ｇ．，Ｃｏｓｅｎｔｉｎｉ，Ｅ．，Ｆｅｉｌ，Ｗ．，Ｓｃｈｉｅｓｓｅｌ，Ｒ．，ＬａＭｏｎｔ，Ｊ．Ｔ．，Ｗｅｎｚｌ，Ｅ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９５：２００４−２０１１（１９９５）
【非特許文献２６】Ｈｅｅｒｚｅ，Ｌ．Ｄ．，Ｋｅｌｍ，Ｍ．Ａ．，Ｔａｌｂｏｔ，Ｊ．Ａ．，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｇ．Ｄ．，「Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｔｔａｃｈｅｄ  ｔｏ  ａｎ  ｉｎｅｒｔ  ｓｕｐｐｏｒｔ  （ＳＹＮＳＯＲＢ）  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ａｎｄ  ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｃｏｌｉｔｉｓ」，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６９：１２９１−１２９６（１９９４）
【非特許文献２７】Ｃｈａｎｇ  Ｔ．Ｗ．，Ｇｏｒｂａｃｈ，Ｓ．Ｌ．，Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｇ．，「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｏｘｉｎ  ｂｙ  ｓｔｅｒｏｉｄｓ」，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１４２：１１３（１９８０）
【非特許文献２８】Ｌｙｅｒｌｙ，Ｄ．Ｍ．，Ｋｒｉｖａｎ，Ｈ．Ｃ．，Ｗｉｌｋｅｎｓ，Ｔ．Ｄ．，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ：Ｉｔｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｎｓ」，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｒｅｖ．，１：１−１８（１９８８）
【非特許文献２９】Ｆｉｎｅｇｏｌｄ，Ｓ．Ｍ．ら，「Ｔｈｅｒａｐｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｃｉｌｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｏｘｉｎｓ．Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ」．Ｒｏｌｆｅ，Ｒ．Ｄ．ら（編）Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ：Ｉｔ’ｓ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，３４１−５７（１９８８）
【非特許文献３０】Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｇ．ら，「Ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｒｅｌａｐｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｏｒａｌ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｃｏｌｉｔｉｓ」，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，７８：４３１−４（１９８９）
【非特許文献３１】Ｔｅｄｅｓｃｏ，Ｆ．Ｊ．，「Ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｃｏｌｉｔｉｓ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ，６６：６５５−６４（１９８２）
【非特許文献３２】Ｋｅｉｇｈｌｅｙ，Ｍ．Ｒ．Ｂ．，「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｃｏｌｉｔｉｓ：  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ」，Ｄｒｕｇｓ，２０：４４９−５６（１９８０）
【非特許文献３３】Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｄ．，「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｃｏｌｉｔｉｓ」，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，６，Ｓｕｐｐｌ．１：１−５５（１９８４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
抗生物質関連性下痢のための有効な処置を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する：
（項目１）  Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢを含む疑いのあるサンプルから該トキシンＢを結合し、そして除去する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）該サンプルと、不活性な支持体に、非ペプチジル適合性リンカーアームを介して共有結合した少なくとも１つのトキシンＢ結合性オリゴ糖配列とを接触させる工程であって、ここで、該トキシンＢが該支持体に吸収される条件下で、該オリゴ糖配列がトキシンＢを結合する、工程；および
ｂ）該サンプルから、吸収されたトキシンＢを含む該支持体を分離する工程、を包含する、方法。
（項目２）  前記オリゴ糖配列が２〜１０の糖単位を有する、項目１に記載の方法。
（項目３）  前記オリゴ糖配列が２〜４の糖単位を有する、項目１に記載の方法。
（項目４）  前記オリゴ糖配列が、αＧｌｃ（１−２）βＧａｌ、αＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ、βＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ、αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ、αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ、およびβＧｌｃＮＡｃ（１−４）βＧｌｃＮＡｃからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目５）  前記リンカーアームが、−（ＣＨ2）8Ｃ（Ｏ）−および−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−からなる群より選択され、ここでｍが約２〜約１０の整数である、項目１に記載の方法。
（項目６）  被験体においてＣＤＡＤ、ＰＭＤ、下痢、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢによって媒介される別の状態を処置または予防する方法であって、該方法は、薬学的に受容可能な不活性な支持体に、非ペプチジル適合性リンカーアームを介して共有結合した少なくとも１つのトキシンＢ結合性オリゴ糖配列を含有する有効量の組成物を、このような処置または予防が必要な被験体に投与する工程であって、ここで、該オリゴ糖配列はトキシンＢを結合し、そして該組成物が胃腸管から排出され得る、工程を包含する、方法。
（項目７）  前記オリゴ糖配列が２〜１０の糖単位を有する、項目６に記載の方法。
（項目８）  前記オリゴ糖配列が２〜４の糖単位を有する、項目６に記載の方法。
（項目９）  前記オリゴ糖配列が、αＧｌｃ（１−２）βＧａｌ、αＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ、βＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ、αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ、αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ、およびβＧｌｃＮＡｃ（１−４）βＧｌｃＮＡｃからなる群より選択される、項目６に記載の方法。
（項目１０）  前記リンカーアームが、−（ＣＨ2）8Ｃ（Ｏ）−および−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−からなる群より選択され、ここでｍが約２〜約１０の整数である、項目６に記載の方法。
（項目１１）  ＣＤＡＤおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢによって開始される関連状態を処置または予防するに有用な薬学的組成物であって、該組成物が、以下：
ａ）薬学的に受容可能な不活性な支持体に、非ペプチジル適合性リンカーアームを介して共有結合した少なくとも１つのオリゴ糖配列であって、ここで該オリゴ糖配列がトキシンＢを結合する、配列；および
ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、
を含有し、ここで、該組成物が胃腸管から排出され得る、組成物。
（項目１２）  前記オリゴ糖配列が２〜１０の糖単位を有する、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）  前記オリゴ糖配列が２〜４の糖単位を有する、項目１１に記載の組成物。
（項目１４）  前記オリゴ糖配列が、αＧｌｃ（１−２）βＧａｌ、αＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ、βＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ、αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ、αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ、およびβＧｌｃＮＡｃ（１−４）βＧｌｃＮＡｃからなる群より選択される、項目１１に記載の組成物。
（項目１５）  前記リンカーアームが、−（ＣＨ2）8Ｃ（Ｏ）−および−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−からなる群より選択され、ここでｍが２〜１０の整数である、項目１１に記載の組成物。
（項目１６）  Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡおよびトキシンＢを含む疑いのあるサンプルから該トキシンＡおよび該トキシンＢを結合し、そして除去する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）該サンプルと、不活性な支持体に非ペプチジル適合性リンカーアームを介して共有結合した、少なくとも１つのトキシンＡ結合性オリゴ糖配列および少なくとも１つのトキシンＢ結合性オリゴ糖配列とを接触させる工程であって、ここで、該トキシンが該支持体に吸収される条件下で、該オリゴ糖配列が該トキシンを結合する、工程；ならびに
ｂ）該サンプルから、吸収されたトキシンを含む該支持体を分離する工程、
を包含する、方法。
（項目１７）  前記オリゴ糖配列が２〜１０の糖単位を有する、項目１６に記載の方法。
（項目１８）  前記オリゴ糖配列が２〜４の糖単位を有する、項目１６に記載の方法。
（項目１９）  前記オリゴ糖配列が、αＧｌｃ（１−２）βＧａｌ、αＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ、βＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ、αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ、αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ、βＧｌｃＮＡｃ（１−４）βＧｌｃＮＡｃおよびαＧａｌ（１−３）βＧａｌ（１−４）βＧｌｃからなる群より選択される、項目１６に記載の方法。
（項目２０）  前記リンカーアームが、−（ＣＨ2）8Ｃ（Ｏ）−および−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−からなる群より選択され、ここでｍが約２〜約１０の整数である、項目１６に記載の方法。
（項目２１）  
（項目２２）  少なくとも２つのオリゴ糖配列が用いられ、該オリゴ糖配列の少なくとも１つがトキシンＡを結合し、そして該オリゴ糖配列の少なくとも１つがトキシンＢを結合する、項目１６に記載の方法。
（項目２３）  被験体においてＣＤＡＤ、ＰＭＣ、下痢、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡおよびトキシンＢによって媒介される別の状態を処置または予防する方法であって、該方法は、不活性な支持体に非ペプチジル適合性リンカーアームを介して共有結合した、少なくとも１つのトキシンＡ結合性オリゴ糖配列および少なくとも１つのトキシンＢ結合性オリゴ糖配列を含有する有効量の組成物を、このような処置または予防が必要な被験体に投与する工程であって、ここで、該オリゴ糖配列は該トキシンを結合し、そして該組成物が胃腸管から排出され得る、工程を包含する、方法。
（項目２４）  前記オリゴ糖配列が２〜１０の糖単位を有する、項目２３に記載の方法。
（項目２５）  前記オリゴ糖配列が２〜４の糖単位を有する、項目２３に記載の方法。
（項目２６）  前記オリゴ糖配列が、αＧｌｃ（１−２）βＧａｌ、αＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ、βＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ、αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ、αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ、βＧｌｃＮＡｃ（１−４）βＧｌｃＮＡｃおよびαＧａｌ（１−３）βＧａｌ（１−４）βＧｌｃからなる群より選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２７）  前記リンカーアームが、−（ＣＨ2）8Ｃ（Ｏ）−および−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−からなる群より選択され、ここでｍが約２〜約１０の整数である、項目２３に記載の方法。
（項目２８）  前記オリゴ糖配列がトキシンＡおよびトキシンＢの両方を結合する、項目２３に記載の方法。
（項目２９）  少なくとも２つのオリゴ糖配列が用いられ、該オリゴ糖配列の少なくとも１つがトキシンＡを結合し、そして該オリゴ糖配列の少なくとも１つがトキシンＢを結合する、項目２３に記載の方法。
（項目３０）  ＣＤＡＤおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡおよびトキシンＢによって開始される関連状態を処置または予防するに有用な薬学的組成物であって、該組成物が、以下：
ａ）薬学的に受容可能な不活性な支持体に非ペプチジル適合性リンカーアームを介して共有結合した少なくとも１つのオリゴ糖配列であって、ここで該オリゴ糖配列が該トキシンＡおよび該トキシンＢの両方を結合する、配列；ならびに
ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、
を含有し、ここで、該組成物が胃腸管から排出され得る、組成物。
（項目３１）  前記オリゴ糖配列が２〜１０の糖単位を有する、項目３０に記載の組成物。
（項目３２）  前記オリゴ糖配列が２〜４の糖単位を有する、項目３０に記載の組成物。
（項目３３）  前記オリゴ糖配列が、αＧｌｃ（１−２）βＧａｌ、αＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ、βＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ、αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ、αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ、βＧｌｃＮＡｃ（１−４）βＧｌｃＮＡｃおよびαＧａｌ（１−３）βＧａｌ（１−４）βＧｌｃからなる群より選択される、項目３０に記載の組成物。
（項目３４）  前記リンカーアームが、−（ＣＨ2）8Ｃ（Ｏ）−および−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−からなる群より選択され、ここでｍが約２〜約１０の整数である、項目３０に記載の組成物。
（項目３５）  前記オリゴ糖配列がトキシンＡおよびトキシンＢの両方を結合する、項目３０に記載の組成物。
（項目３６）  少なくとも２つのオリゴ糖配列が用いられ、該オリゴ糖配列の少なくとも１つがトキシンＡを結合し、そして該少なくとも１つの少なくとも１つがトキシンＢを結合する、項目３０に記載の組成物。
（発明の要旨）
本発明は、抗生物質関連性下痢、偽膜性大腸炎、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢによって引き起こされる他の状態の予防および処置のための組成物および方法を提供する。
【００２３】
１つの局面では、本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢを含む疑いのあるサンプルから上記トキシンＢを結合し、そして除去する方法を提供し、この方法は、トキシンＢがこの支持体に吸収されるような条件下で、このサンプルと、不活性な支持体に非ペプチジル適合性リンカーアームを介して共有結合される少なくとも１つのトキシンＢ結合性オリゴ糖配列とを接触させる工程；および、このサンプルから、吸収されたトキシンＢを含むこの支持体を分離する工程を包含する。
【００２４】
別の局面では、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢにより媒介される１以上の状態を罹患しているかまたはこの状態に感受性の患者において、この状態を予防または緩和する方法を提供し、この方法は、薬学的に受容可能な不活性な支持体に、非ペプチジル適合性リンカーアームを介して共有結合した少なくとも１つのトキシンＢ結合性オリゴ糖配列を含有する有効量の組成物を、この患者に投与する工程を包含し、ここで、上記オリゴ糖配列はトキシンＢを結合し、そしてこの組成物は胃腸管から排出され得る。
【００２５】
さらなる局面では、本発明は、ＣＤＡＤおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＢによって開始される関連状態を処置または予防するに有用な薬学的組成物を提供し、この組成物は、薬学的に受容可能な不活性な支持体に、非ペプチジル適合性リンカーアームを介して共有結合した少なくとも１つのオリゴ糖配列であって、上記オリゴ糖配列がトキシンＢを結合する、配列；および、薬学的に受容可能なキャリアを含有し、ここで、上記組成物は胃腸管から排出され得る。
【００２６】
なお別の局面では、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡおよびトキシンＢを含む疑いのあるサンプルから上記トキシンＡおよび該トキシンＢを結合し、そして除去する方法を提供し、この方法は、これらのトキシンが支持体に吸収される条件下で、このサンプルと、不活性な支持体に、非ペプチジル適合性リンカーアームを介して共有結合した少なくとも１つのトキシンＡ結合性オリゴ糖配列および少なくとも１つのトキシンＢ結合性オリゴ糖配列とを接触させる工程；ならびにこのサンプルから、吸収されたトキシンを含む支持体を分離する工程、を包含する。
【００２７】
なおさらなる局面では、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡおよびトキシンＢによって媒介される１以上の状態を患っているかまたはこの状態に感受性である患者においてこの状態を予防または緩和する方法を提供し、この方法は、薬学的に受容可能な不活性な支持体に、非ペプチジル適合性リンカーアームを介して共有結合した少なくとも１つのトキシンＡ結合性オリゴ糖配列および少なくとも１つのトキシンＢ結合性オリゴ糖配列を含有する有効量の組成物を、この患者に投与する工程を包含し、ここで、上記オリゴ糖配列はトキシンＡおよびトキシンＢを結合し、そして上記組成物は胃腸管から排出され得る。
【００２８】
なおさらなる局面では、本発明は、ＣＤＡＤおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡおよびトキシンＢによって開始される関連状態を処置または予防するに有用な薬学的組成物を提供し、この組成物は、薬学的に受容可能な不活性な支持体に、非ペプチジル適合性リンカーアームを介して共有結合した少なくとも１つのオリゴ糖配列であって、ここで上記オリゴ糖配列はトキシンＡおよびトキシンＢの両方を結合する、配列；ならびに薬学的に受容可能なキャリア、を含有し、ここで、上記組成物は胃腸管から排出され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
（発明の詳細な説明）
（Ａ．定義）
本明細書で使用される場合、以下の用語は以下の意味を有する。
【００３０】
用語「抗生物質関連細菌性下痢」とは、抗生物質治療が腸の微生物叢のバランスを崩し、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのような病原性生物が繁茂することを可能にする状態をいう。これらの生物は、下痢を引き起こす。抗生物質関連細菌性下痢は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連性下痢（ＣＤＡＤ）および偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）のような状態を包含する。
【００３１】
用語「生体適合性」とは、ヒト組織または体液に関する化学的不活性をいう。
【００３２】
用語「適合性リンカーアーム」または「リンカーアーム」とは、オリゴ糖構造を生体適合性の支持体から間隔をあけるために役立つ部分であって、一方の官能基が支持体の逆の官能基に結合し得、そして他方の官能基がオリゴ糖構造の逆の官能基に結合し得る二官能性である部分をいう。本発明において好ましい適合性リンカーアームは、非ペプチジルスペーサーアームである。オリゴ糖は、８−メトキシカルボニルオクチルリンカーを介して、または別の適切な非ペプチジルリンカー（例えば、式−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−の尿素様リンカーアーム、ここで、ｍは約２〜約１０の整数である）を介して連結され得る。
【００３３】
用語「オリゴ糖」とは、１〜約２０個の糖部分を含む糖を意味する。糖誘導体はまた、用語オリゴ糖に含まれる糖部分として用いられ得る［６７〜６９］。
【００３４】
用語「偽膜性大腸炎」（ＰＭＣ）は、偽膜性腸炎（ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｓまたはｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）としても知られ、糞便における偽膜性物質（フィブリン、粘液、壊死上皮細胞、および白血球から構成される）の形成および排泄を伴う、小腸および大腸の両方の粘膜の炎症をいう。
【００３５】
用語「支持体」とは、オリゴ糖配列が適合性リンカーアームを介して結合または固定化され得る不活性な物質をいう。用途がインビボにおいてである場合、支持体は生体適合性である。
【００３６】
用語「ＳＹＮＳＯＲＢ」とは、誘導体化したシリカ粒子材料であるＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  ＰTM（Ｍａｎｖｉｌｌｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｄｅｎｖｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）［１２］に共有結合される８−メトキシカルボニルオクチルオリゴ糖構造物をいう。示される場合、ＳＹＮＳＯＲＢは、８−メトキシカルボニルオクチルリンカーではなく尿素様リンカーアームを用い得る。
【００３７】
用語「トキシンＡ」とは、ＣＤＡＤおよび関連する状態を開始するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのエンテロトキシンをいう。このトキシンはレクチン様活性を有する。
【００３８】
用語「トキシンＢ」とは、小腸細胞の破壊を引き起こし、かつ炎症性メディエーターの放出を誘導する、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのサイトトキシンをいう。
【００３９】
本出願の目的のために、全ての糖は、従来の３文字命名法を使用して参照される。Ｌ型であるフコースを除く全ての糖は、他に示さない限りはＤ型であると想定する。さらなる全ての糖は、ピラノース形態である。
【００４０】
（Ｂ．薬理）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのグルカン結合タンパク質におけるオリゴ糖結合を担う配列と類似する、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシンＡおよびトキシンＢにおけるアミノ酸配列は、報告されている［４９〜５１］。上記のように、トキシンＢについてのレセプターは未知であるが、これらのグルカン結合タンパク質についてのこのオリゴ糖結合特異性は、以下に示す通りに共に連結された反復グルコース単位についてである［５２］：
αＧｌｃ（１→６）αＧｌｃ（１→６）αＧｌｃ．．．。
【００４１】
オリゴ糖イソマルトトリオース（αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ（１−６）Ｇｌｃ）を、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  Ｐにリンカーアームを用いる結合により固定化し、そしてトキシンＢ中和実験において試験した。これらの実験からの結果を、図１Ａおよび図１Ｂにグラフとして示す。この図では、固定化されたイソマルトトリオースＳＹＮＳＯＲＢ（ｎ＝３）を用いるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢ細胞傷害性活性の濃度依存性および時間依存性の中和を示す。濃度中和実験を、固定化されたイソマルトトリオース（１０、２０、または４０ｍｇ）を１ｍＬのトキシンＢと共に室温にて２時間インキュベートすることにより行った。各サンプルにおけるトキシン活性の量を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いて測定した。
【００４２】
結果を、ＳＹＮＳＯＲＢと共にインキュベートしていないコントロールのトキシン溶液と比較して残存する活性パーセントとして表す。時間依存性中和実験を、トキシンＢを、固定化したイソマルトトリオースＳＹＮＳＯＲＢの２０ｍｇのサンプルと共に室温にて１、２、および４時間インキュベートすることにより行った。トキシンＢとＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  Ｐとのコントロールのインキュベーション（４時間）を、この支持体に対するバックグラウンドの結合の程度を決定するために含めた。結果を、ＳＹＮＳＯＲＢと共にインキュベートしていないコントロールのトキシン溶液と比較して残存する活性パーセントとして表し、そしてこの結果は、トキシンＢが、イソマルトトリオースＳＹＮＳＯＲＢに濃度依存性および時間依存性の様式で結合したことを示す。この結果はまた、トキシンＢがこの支持体にゆっくりと結合し、これらの条件下で有意なトキシンＢ結合を達成するためには４時間までが要求されることを示した。さらに、これらのデータは、グルコースのα（１−６）連結反復単位を含むオリゴ糖が、トキシンＢを結合する際に有効であり、そしてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ媒介性下痢についての治療剤として役立ち得ることを示す。
【００４３】
グルコースまたはＮ−アセチルグルコサミンで終結するオリゴ糖を取り込んでいるＳＹＮＳＯＲＢをまた、ＣＨＯ細胞においてＳＹＮＳＯＲＢありまたはなしでのトキシンＢの細胞傷害性活性を測定することにより、トキシンＢ結合について調べた。これらの研究の結果を、表１に示し、ここで、★は、尿素様リンカーアームを用いたＳＹＮＳＯＲＢを示す。
【００４４】
【表１】
2006213735.tif 000012
【００４５】
ＳＹＮＳＯＲＢ  ２３以外の試験した全てのＳＹＮＳＯＲＢは、トキシンＢ細胞傷害性を効果的に中和した。比較すると、トシキンＡは、ＳＹＮＳＯＲＢ  ５−１２８（イソマルトトリオース）および１７９Ａ（イソマルトース）に結合しなかった。表１における他のＳＹＮＳＯＲＢは、トキシンＡに対して試験されなかった。この観察は、２つのトキシンの間にいくらかのアミノ酸相同性（６０％アミノ酸相同性）が存在するとはいえ、トキシンＡの結合特異性とトキシンＢの結合特異性とに差異が存在することを確認する。トキシンＡを結合するオリゴ糖が同定されている［６５〜６６］。
【００４６】
本発明者らはまた、２つの異なるオリゴ糖リガンドを取り込んだＳＹＮＳＯＲＢ誘導体を利用した。Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  ＰTMの二重標識のために選択したリガンドは、トキシンＡおよびトキシンＢについての示差的なオリゴ糖結合特異性を示した以前の結果に基づいていた。オリゴ糖αＧａｌ（１−３）βＧａｌ（１−４）βＧｌｃ（Ｃｄ）は、トキシンＡを結合するがトキシンＢを結合しないので、このオリゴ糖を、トキシンＡ中和成分として用いるために選択し、そして８−メトキシカルボニルオクチルリンカーアームを用いてアミノ誘導体化Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  Ｐ上に固定化した。トキシンＢはイソマルトース（αＧｌｃ（１−６）Ｇｌｃ）に結合するが、トキシンＡは結合しない。Ｃｄオリゴ糖を既に取り込んだアミノ誘導体化したＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂを利用して、イソマルトースを、ＰＣＴ／ＣＡ９７／００８５１［７０］に開示される通りの近年開発された「Ｉｎｓｔａｓｏｒｂ」リンカーアーム技術を用いてこの支持体上に固定化した。次いで、得られるＳＹＮＳＯＲＢ（ＳＹＮＳＯＲＢ  ５１７４、これは、それらのそれぞれのリンカーにより共有結合された両方のオリゴ糖を有する）を、トキシンＡ結合およびトキシンＢ結合について試験した。ＳＹＮＳＯＲＢ  ＣｄおよびイソマルトースＳＹＮＳＯＲＢ（ＳＹＮＳＯＲＢ  １７９Ａ）を、コントロールとして含めた。図３に表す、この結果は、ＳＹＮＳＯＲＢ  ５１７４がトキシンＡ活性およびトキシンＢ活性の両方を中和したことを示す。この結果はまた、ＳＹＮＳＯＲＢ  ５１７４のトキシン中和能力が、ＳＹＮＳＯＲＢ  ＣｄおよびＳＹＮＳＯＲＢ  １７９Ａに匹敵したことを示す。従って、１より多くのオリゴ糖リガンドを含む支持体は、トキシンＡおよびトキシンＢの両方を結合するために用いられ得る。
【００４７】
（Ｃ．合成）
オリゴ糖構造物の化学的合成方法は、当該分野において公知の方法によって達成され得る。これらの物質は、一般的に、適切に保護された個々の単糖を使用して組み立てられる。
【００４８】
用いられる特定の方法は、一般的に、合成すべき個々の構造のそれぞれに適合され、そして最適化される。一般的に、全てまたは一部のオリゴ糖グリコシドの化学的合成は、第一に、還元糖または単糖のアノマー炭素原子でのグリコシド結合の形成を包含する。特に、天然に生じる糖構造または化学的に改変される糖構造（グリコシルドナー）の適切に保護された形態は、ハライド、トリクロロアセトイミデート、アセチル、チオグリコシドなどを包含する脱離基を導入するように、還元単位のアノマー中心で選択的に改変される。次いで、ドナーは、当該分野において周知の触媒条件下で、グリコシド結合が確立されるべき位置に１つの遊離水酸基を有する、アグリコンまたは適切な形態の炭水化物アクセプターと反応する。
【００４９】
非常に多様なアグリコン部分は当該分野において公知であり、そして還元単位のアノマー中心に適切な配置で結合し得る。適合性ブロッキング基の適切な使用は、炭水化物合成の分野において周知であり、合成された構造物の選択的改変、またはさらなる糖単位のさらなる結合、またはアクセプター構造物に対する糖ブロックを可能にする。
【００５０】
グリコシド結合の形成後、糖グリコシドはさらなる糖単位の結合を達成するために使用され得るか、または選択された位置で化学的に改変され得るか、あるいは従来の脱保護の後の酵素的合成に用いられ得る。一般的に、天然に生じる糖単位または化学的に改変された糖単位の、糖グリコシドへの化学結合は、文献［２１−３７］中に十分に記載されている確立された化学を使用することによって達成される。
【００５１】
本発明のオリゴ糖構造が結合または固定化される支持体は、当該分野で公知の広範な種々の生体適合性材料を包含する。水溶性生体適合性ポリマー（例えば、ヒドロゲル、カルボキシメチルセルロース、合成ポリマーなど）が特に好ましい。詳細には、これらの支持体は、胃への送達、特に長期の送達のために有用である。有用な支持体は、非吸収性であり、すなわち、支持体は、身体によって吸収されない限り、可溶性または不溶性であり得る。
【００５２】
固体支持体は、特定の適用のために特に有用である。本発明のオリゴ糖構造が結合されるこのような固体支持体は、シートまたは粒子の形態であり得る。非常に多様な生体適合性の固体支持体材料は当該分野において公知である。その例は、シリカ、多孔質ガラスなどの合成シリケート、珪藻土などの生体シリケート、カオリナイトなどのシリケート含有鉱物、ならびにポリスチレン、ポリプロピレン、および多糖などの合成ポリマーである。好ましくは、支持体は、インビボでの使用のために、約１０ミクロン〜５００ミクロンの粒子サイズを有する。特に、１００ミクロン〜２００ミクロンの粒子サイズが好ましい。
【００５３】
オリゴ糖構造物は、固定化されるように、支持体上に共有結合されるかまたは非共有結合的に（受動的に）吸着される。共有結合は、支持体上の官能基とオリゴ糖構造物の適合性リンカーアームとの間の反応を介し得る。生体適合性支持体への適合性連結アームを介するオリゴ糖構造物の結合が、固体支持体にも関わらず、トキシンを有効に除去する産物を提供することが思いがけなく見出された。間接的結合に使用される結合部分は、好ましくは、適切な長さ（少なくとも１つの炭素原子）の有機二官能性分子であり、これは、支持体の表面からオリゴ糖構造物を遠ざけるためだけに役立つ。
【００５４】
本発明の組成物は、好ましくは以下の式で表される：
（オリゴ糖−Ｙ−Ｒ）n−支持体、
ここで、オリゴ糖は、少なくとも１つの糖単位のオリゴ糖基を表し、この基は、トキシンＢまたはトキシンＡおよびトキシンＢに結合し、Ｙは、酸素、硫黄、または窒素であり、Ｒは少なくとも１つの炭素原子のアグリコン連結アームであり、支持体は、上記の定義の通りであり、そしてｎは１以上の整数である。約２〜１０の糖単位を含有するオリゴ糖配列が使用され得る。約２〜４の糖単位を有する配列が好ましい。いくつかの例では、１より多くのオリゴ糖基（例えば、トキシンＢを結合する１つのオリゴ糖基およびトキシンＡを結合する別のオリゴ糖基）が支持体に連結されて、１より多くのトキシン部分に結合する組成物を提供し得る。
【００５５】
多くのアグリコン連結アームが当該分野において公知である。例えば、パラニトロフェニル基（すなわち、−ＯＣ6Ｈ4ｐＮＯ2）を含有する連結アームが開示されている［３８］。合成の間の適切な時間で、ニトロ基は還元されて、Ｎ−トリフルオロアセトアミドとして保護され得るアミノ基になる。支持体に結合する前に、トリフルオロアセトアミド基は除去され、それによって、アミノ基を露出させる。
【００５６】
硫黄を含有する連結アームは、開示されている［３９］。特に、連結アームは２−ブロモエチル基に由来し、これは、チオ求核試薬との置換反応において、−ＯＣＨ2ＣＨ2ＳＣＨ2ＣＯ2ＣＨ3および−ＯＣＨ2ＣＨ2ＳＣ6Ｈ4−ｐＮＨ2のような種々の末端官能基を有する連結アームになることが示されてきた。これらの末端官能基は、支持体上の相補的な官能基に対する反応を可能にし、それによって、支持体への共有結合を形成する。このような反応は当該分野で周知である。
【００５７】
６−トリフルオロアセトアミド−ヘキシル連結アーム（−Ｏ−（ＣＨ2）6−ＮＨＣＯＣＦ3）は、開示されており［４０］、この中でトリフルオロアセトアミド保護基は除去され得、結合に使用される一級アミノ基を露出させる。
【００５８】
公知の連結アームの他の具体例としては、７−メトキシカルボニル−３，６，ジオキサへプチル連結アーム［４１］（−ＯＣＨ2−ＣＨ2）2ＯＣＨ2ＣＯ2ＣＨ3）；２−（４−メトキシカルボニルブタン−カルボキサミド）エチル［４２］（−ＯＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ2）4ＣＯ2ＣＨ3）；適切なモノマーとのラジカル共重合により、コポリマーになる、アリル連結アーム［４３］（−ＯＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2）；が挙げられ、他のアリル連結アーム［４４］（−Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2）が公知である。さらに、アリル連結アームは、２−アミノエタンチオール［４５］の存在下で誘導されて、連結アーム−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2を提供し得る。他の適切な連結アームもまた開示されている［２１〜２３、２５、２６］。オリゴ糖基を支持体に共有結合させるために使用される特定の連結は、重要ではない。
【００５９】
好ましくは、アグリコン連結アームは、疎水性基であり、そして最も好ましくは、アグリコン連結アームは以下からなる群から選択される疎水性基である：
【００６０】
【化１】
2006213735.tif 000013
【００６１】
発明者らは、生体適合性支持体（例えば、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  ＰTM（ＳＹＮＳＯＲＢ））に共有結合される合成オリゴ糖配列が、トキシンＢを結合するために使用され得ることを見出した。これらの組成物は、ＣＤＡＤ、ＰＭＣ、およびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に関連する他の状態を処置または予防するために有用である。固体支持体が用いられる場合、これらの組成物についてはＳＹＮＳＯＲＢが特に好ましい。なぜなら、ＳＹＮＳＯＲＢは無毒性であり、そして機械的破壊および化学的破壊に耐えるからである。
【００６２】
ラット（ヒトの応答の予測となるので前臨床研究に広く受け入れられるモデル）を使用する研究において、ＳＹＮＳＯＲＢは、影響を受けずにラットの胃腸管を通過することが見出された。ＳＹＮＳＯＲＢは、経口投与後、完全にかつ迅速に排出されることが見出された（７２時間で９９％排出された）。さらに、ＳＹＮＳＯＲＢ上の高密度のオリゴ糖部分は、炭水化物結合親和性を有するトキシンを結合するために特に有用である。例えば、トキシンＡは、複数のオリゴ糖結合部位を有すると考えられる［１１］。
【００６３】
非ペプチジル連結アームは、本発明の適合性連結アームとして使用するに好ましい。グリコペプチドは、いくつかの、しばしば異なる、同じタンパク質に連結されるオリゴ糖を含有するので、グリコペプチドの使用は、望ましくない。グリコペプチドはまた、大量に得ることが困難であり、そして高価でかつ長い精製を必要とする。同様に、ＢＳＡ結合体またはＨＳＡ結合体の使用は、経口投与された場合、胃腸管における安定性が疑わしいことに起因して望ましくない。
【００６４】
トキシンＢ結合単位を含むオリゴ糖基が、非ペプチジルスペーサーアームを介して、不活性な支持体に共有結合することにより、トキシンＢ（もしくはトキシンＡおよびトキシンＢ）の存在について分析されるべきサンプルから、またはＣＤＡＤ、ＰＭＣ、もしくはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に関連した別の状態に罹っている患者もしくはそれらに感受性の患者の腸から、トキシンＢを、またはトキシンＡおよびトキシンＢを効率的に結合し、そして効率的に除去することが可能である。この適合性リンカーアームが（非誘導化形態で）結合したオリゴ糖が合成される場合、種々の支持体と結合し得る高純度の組成物が達成され得る。
【００６５】
（Ｄ．薬学的組成物）
本発明の方法は、支持体に結合されたトキシンＢを結合する、１つ以上のオリゴ糖構造物を含有する薬学的組成物を使用することによって達成される。
【００６６】
経口投与（これは好ましい）に使用される場合、これらの組成物は種々の方法で処方され得る。組成物は、好ましくは、液体形態または半固体形態であり得る。水のような液体の薬学的に不活性なキャリアを含む組成物は、経口投与が考慮され得る。他の薬学的に適合性の液体または半固体もまた使用され得る。このような液体および半固体の使用は、当業者に周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，１９９０を参照のこと）。
【００６７】
腸内栄養乳児用調合乳（ｅｎｔｅｒａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｆｏｒｍｕｌａ）、アップルソース、アイスクリーム、またはプリンのような液体または半固体の食物と混合され得る組成物もまた好適であり得る。ＳＹＮＳＯＲＢのような、不愉快な味または後味を有さない処方物が好ましい。経鼻胃チューブもまた、組成物を胃に直接送達するために使用され得る。
【００６８】
固体組成物もまた使用され得、そして必要に応じておよび便利好く、薬学的に不活性なキャリア（ラクトース、デンプン、デキストリン、またはステアリン酸マグネシウムのような従来の固体キャリアを含む）を含有する処方物において使用され得、これらは便利好く、錠剤またはカプセル剤の形態で与えられる。（オリゴ糖−Ｙ−Ｒ）n−支持体組成物自体はまた、不活性な薬学的キャリアを添加せずに使用され得、特にカプセル形態で使用され得る。
【００６９】
用量は、影響を受けたかまたは危険性のある被験体の腸内において見出されるトキシンＢの中和および除去を提供するために選択される。有用な用量は、１日当たり、体重１ｋｇ当たり約０．２５〜１．２５マイクロモルのオリゴ糖であり、好ましくは、１日当たり、体重１ｋｇ当たり約０．５〜１．０マイクロモルのオリゴ糖である。ＳＹＮＳＯＲＢ組成物を使用する場合、このことは１日当たり、体重１ｋｇ当たり約０．５〜１．０グラムのＳＹＮＳＯＲＢを意味し、これは腸内に約２０ｍｇ／ｍｌのＳＹＮＳＯＲＢの濃度を与える。臨床的症状を有する被験体については、投与は、１週間の期間にわたって、または臨床症状が消散されるまで、毎日３回または４回であることが期待される。危険性のある被験体については、例えば、腸内栄養乳児用調合乳における長期の予防的投与が示される。用量レベルおよび投与スケジュールは、使用される特定のオリゴ糖構造ならびに被験体の年齢および状態のような要素に依存して変化し得る。
【００７０】
以前に論じたように、経口投与が好ましいが、直腸についてのような他の投与手段についての処方物もまた考慮され得る。これらの処方物の有用性は、使用される特定の組成物および処置を受ける特定の被験体に依存し得る。これらの処方物は、液体キャリア（これは、油性液であり得るか、水性であり得るか、乳化され得る）を含み得るか、または投与の態様に適切な特定の溶媒を含み得る。
【００７１】
組成物は、単位用量形態で、または複数用量あるいはサブユニット用量で処方され得る。以前に記載された期待される用量のために、経口投与される液体組成物は、好ましくは、１ｍｌ当たり約１マイクロモルのオリゴ糖を含有するべきである。
【００７２】
（Ｅ．方法論）
本発明者らは、トキシンを結合する特定のオリゴ糖配列によりＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢが中和され得ることを見出した。特に、非ペプチジル適合性リンカーアームを介して支持体に共有結合される合成オリゴ糖は、トキシンＢまたはトキシンＡおよびトキシンＢを効果的に中和することが見出されている。このような組成物の例は、トキシンＢまたはトキシンＡおよびトキシンＢの活性を中和する、特定のＳＹＮＳＯＲＢである。
【００７３】
本発明者らは、８−メトキシルカルボニルオクチル（ＭＣＯ）または尿素様スペーサーアームを介してＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  Ｐに結合されるいくつかのオリゴ糖配列がトキシンＢまたはトキシンＡおよびトキシンＢを中和する能力を試験した。本発明において有用な支持体に結合されるオリゴ糖配列は、トキシンＢに結合するオリゴ糖配列であり、そしていくつかの場合にはトキシンＡおよびトキシンＢの両方に結合するオリゴ糖配列である。
【００７４】
トキシンＢに対するオリゴ糖の結合親和性は、単純なインビトロ試験によって容易に検出可能であり、例えば、以下の実施例３において記載される。本発明の目的のために、トキシンＢを結合する支持体に結合されるオリゴ糖配列とは、ＣＨＯ細胞アッセイにおける細胞傷害性を少なくとも５０％まで減少させる組成物を意味する。
【００７５】
適合性リンカーアームを介して支持体に結合されるいくつかの異なるオリゴ糖配列は、トキシンＢ活性を（そしていくつかの場合には、トキシンＡおよびトキシンＢ活性を）中和する能力を有することが見出されている。これらの配列、およびトキシンＢをまた結合する他の配列は、ＣＤＡＤ、ＰＭＣ、およびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に関連した他の状態を処置または予防するために使用され得る。トキシンＢ活性を完全に除去するための最適時間は、１ｍｌサンプル中２０ｍｇのＳＹＮＳＯＲＢの濃度で使用して、３７℃で約４時間であることが見出された。各グラムのＳＹＮＳＯＲＢが、約０．２５マイクロモル〜１．０マイクロモルのオリゴ糖を含有するので、１日の用量において与えられるべきオリゴ糖の総量は、４リットルの腸容積を使用して、７．５〜３０マイクロモルの範囲である。
【００７６】
ＣＤＡＤ、ＰＭＣ、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に関連する他の状態の処置または予防は、適合性のリンカーアーム（例えば、ＳＹＮＳＯＲＢ）を介して支持体に共有結合されたオリゴ糖配列を含有する組成物の経口投与によって、達成され得る。例えば、ＳＹＮＳＯＲＢは、ラットの胃をインタクトなまま通り抜けることが見出されている。このことは、ＳＹＮＳＯＲＢが、腸管においてトキシンＢと接触する場合にインタクトであることを意味する。トキシンＢが結合したインタクトなＳＹＮＳＯＲＢの続いて起こる排出により、患者からトキシンＢが排出される。
【００７７】
適合性リンカーアームを介して支持体（例えば、ＳＹＮＳＯＲＢ）に共有結合したオリゴ糖配列は、下痢の複数の病状の発現を被る個体を処置するために有用である。下痢の最初の再発時に、患者は、ＳＹＮＳＯＲＢで処置されて、腸からトキシンＢまたはトキシンＡおよびトキシンＢの両方が除去される。トキシンＡの除去は、最初の組織損傷が胃の管壁に及ぶことを防止し、このことが下痢の防止または減少を導く。トキシンＢの除去は、腸の細胞および結腸の細胞に対するこのトキシンの細胞傷害性を妨害し、このことはまた、下痢の予防または減少を導く。抗生物質でのさらなる処置を与える必要はなく、腸内で正常な腸の微生物叢の再確立を可能にする。このような処置の利点は、それが正常な微生物叢による腸管の再コロニー形成に影響を与えないことである。下痢が停止するまでの処置は、完全な回復を可能にする。
【００７８】
再発する下痢を患う患者におけるその有用性の他に、支持体（例えば、ＳＹＮＳＯＲＢ）に適合性リンカーアームを介して共有結合されるオリゴ糖配列での処置は、ＣＤＡＤ、ＰＭＣ、もしくはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に関連する他の状態を患う全個体、またはＣＤＡＤ、ＰＭＣ、もしくはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に関連する他の状態を発症する傾向のある全個体を処置するために使用され得る。抗生物質治療と組み合わせた本発明のオリゴ糖−支持体組成物の使用は、下痢をより効果的に減少させ得、より迅速な回復を導く。
【００７９】
任意の適切な検出システムを使用して、トキシンＢおよび／またはトキシンＡは、オリゴ糖含有支持体の表面で直接測定され得る。例えば、放射性標識、ビオチン標識、または蛍光標識した、トキシンに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて、支持体に結合したトキシンの量を測定し得る。標準的なイムノアッセイ技術に類似する、特異的結合複合体の形成を検出のための広範で多様なプロトコルが、当該分野において周知である。
【実施例】
【００８０】
（実施例）
以下の方法は、以下の実施例における研究を実施するために使用された。用語および略号は、当該分野で現在用いられている用語および略語と一致する。
【００８１】
（１．トキシンの精製）
以前に記載された通りにＳｕｌｌｉｖａｎらの方法［２、２１］を少し改変して使用して、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのトキシン産生株（ＡＴＣＣ  ４３２５５、ＶＰＩ株１０４６３）から、トキシンＡおよびトキシンＢを単離した。トキシンＢ含有画分がウサギ赤血球を凝集できないことにより決定した場合、トキシンＢ画分は、トキシンＡ活性を欠いていた。
【００８２】
（２．ウサギ赤血球を使用したトキシンＡ赤血球凝集アッセイ）
新鮮なウサギ赤血球を、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ、ｐＨ７．４）中で１回洗浄し、そしてＴＢＳ中に４％（ｖ／ｖ）の濃度で再懸濁した。トキシンＡ溶液の連続２倍希釈液（５０μＬ）をＵ型マイクロタイターウェルにおいてＴＢＳ中で作製した。次いで、等容量（５０μｌ）のウサギ赤血球を各ウェルに添加し、そしてマイクロタイタープレートを穏やかに混合した。トキシンＡ赤血球凝集アッセイを４℃にて４時間インキュベートした。次いで、赤血球凝集力価を可視的に評価した。全てのアッセイを二連で行った。
【００８３】
（３．チャイニーズハムスター卵巣細胞を用いたトキシンＢ活性のアッセイ）
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、３７℃で５％ＣＯ2雰囲気中、１０％ウシ胎仔血清を補充したＨａｍのＦ１２培地中で維持した。トキシンＢ活性について試験されるべきサンプルを、Ｈａｍの培地で１：１０に希釈し、そして０．２２ミクロンシリンジフィルターを通して濾過滅菌した。サンプルを培地中に連続３倍希釈し、そして１００μＬの各希釈液をＣＨＯ細胞のコンフルエントな単層を有するウェルに添加し、そして３７℃／５％ＣＯ2にて２４時間インキュベートした。
【００８４】
各サンプルを２回分析した。２４時間インキュベーションした後、試験サンプルのウェルを、トキシンＢを含まないコントロールのウェルと比較することにより、細胞障害性効果を記録した。２４時間後、細胞を９５％メタノールで固定し、そしてギームザ（Ｇｅｉｍｓａ）染料で染色した。中和実験からのサンプルを、類似の様式で処理した。中和のパーセントを、ＳＹＮＳＯＲＢ処理を含むサンプルの終点希釈物と、ＳＹＮＳＯＲＢ処理を含まないサンプルの終点希釈物とを比較することにより、決定した。
【００８５】
（４．トキシンＡおよびトキシンＢ中和アッセイ）
精製したトキシンＢおよび／またはトキシンＡ（０．５ｍＬ）をを含有する、０．５％  ＢＳＡを有するかまたは有さないＰＢＳ溶液を、０．５ｍＬ微量遠心チューブ中のＳＹＮＳＯＲＢ（１０ｍｇ）に添加し、そしてエンドオーバーエンドローター（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ  ｒｏｔａｔｏｒ）で室温にて１時間インキュベートした。インキュベーションした後、ＳＹＮＳＯＲＢをチューブの底に沈降させ、そして上清を注意深く取り出した。上清の連続２倍希釈液をＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）中に調製し、そして赤血球凝集アッセイまたはＣＨＯ細胞アッセイにおける終点力価を、上記の通り決定した。トキシンＢおよび／またはトキシンＡのいずれかの結合パーセントを、ＳＹＮＳＯＲＢを有さないでインキュベートしたトキシン溶液または非ペプチジルリンカーアームのみを含有するＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  Ｐを有してインキュベートしたトキシン溶液の終点力価に対して算出した。
【００８６】
（実施例１：イソマルトトリオースＳＹＮＳＯＲＢに対するトキシンＢ結合についての条件の決定）
トキシンＢ結合のために必要な条件を、イソマルトトリオースＳＹＮＳＯＲＢ（５−１２８）またはＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂの２０ｍｇのサンプルを、１ｍＬの精製したトキシンＢ溶液とともに１．５ｍＬ微量遠心チューブ中で室温にて１、２、および４時間、エンドオーバーエンドローターにおいてインキュベートすることにより決定した。トキシンＢ溶液を含有するがＳＹＮＳＯＲＢもＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂも含有しないコントロールのチューブを同時にインキュベートした。最大のトキシンＢ中和のために必要とされる最適量のイソマルトトリオースＳＹＮＳＯＲＢの決定を、固定化されたイソマルトトリオース（１０、２０、または４０ｍｇ）を１ｍＬのトキシンＢとともに室温にて２時間インキュベートすることにより行った。各サンプルにおけるトキシン活性の量を、ＣＨＯ細胞を用いて測定した。インキュベーション後、ＳＹＮＳＯＲＢを、チューブの底に沈降させ、そして上清を注意深く取り出した。上清の連続５倍希釈液を調製し、そして細胞傷害性の終点を上記の通りに決定した。各実験を、少なくとも二連で行った。ＳＹＮＳＯＲＢの存在下での終点における減少の程度を、ＳＹＮＳＯＲＢを添加しなかったコントロールと比較することにより決定した。これらの実験の結果を、図１Ａおよび図１Ｂに表し、そしてＳＹＮＳＯＲＢ  ５１７４がトキシンＢ活性を中和するのに有効であることを示す。
【００８７】
（実施例２：トキシンＢ中和についてのオリゴ糖のスクリーニング）
精製したトキシンＢを含有する溶液（１ｍＬ）を、１．５ｍＬ微量遠心チューブ中の、異なるオリゴ糖配列を含む、表１に列挙した種々のＳＹＮＳＯＲＢ（２０ｍｇ）に添加し、そして室温にて４時間、エンドオーバーエンドローターにおいてインキュベートした。各サンプル中の中和の量を、ＳＹＮＳＯＲＢを有するサンプルからのＣＨＯ細胞アッセイの細胞傷害性の終点力価と、ＳＹＮＳＯＲＢを有さないサンプルからのＣＨＯ細胞アッセイの細胞傷害性の終点力価とを比較することにより決定した。
【００８８】
表１に示すように、βＧｌｃ以外の試験した全てのオリゴ糖は、トキシンＢ細胞傷害性を有効に中和した。従って、オリゴ糖αＧｌｃ（１−２）βＧａｌ、αＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ（マルトース）、βＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ（セロビオース）、αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ（イソマルトトリオース）、αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ（イソマルトース）、およびβＧｌｃＮＡｃ（１−４）βＧｌｃＮＡｃ（キトビオース）は、トキシンＢに結合した。
【００８９】
（実施例３：イソマルトースＳＹＮＳＯＲＢおよびイソマルトトリオースＳＹＮＳＯＲＢを用いるトキシンＡ中和アッセイ）
精製したトキシンＡを含有する溶液（０．５ｍＬ）を、０．５ｍＬ微量遠心チューブ中の、イソマルトースＳＹＮＳＯＲＢまたはイソマルトトリオースＳＹＮＳＯＲＢ（１０ｍｇまたは２０ｍｇ）に添加し、そして４℃または室温のいずれかで１時間、エンドオーバーエンドローターにおいてインキュベートした。インキュベーションした後、ＳＹＮＳＯＲＢをチューブの底に沈降させ、そして上清を注意深く取り出した。上清の連続２倍希釈液をＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）中に調製し、そして赤血球凝集の終点力価を、上記の通り決定した。いずれかのＳＹＮＳＯＲＢの存在下での終点における減少の程度を、ＳＹＮＳＯＲＢを添加しなかったコントロールと比較することにより決定した。本発明者らは、イソマルトースＳＹＮＳＯＲＢまたはイソマルトトリオースＳＹＮＳＯＲＢのいずれに対してもトキシンＡ結合を全く検出しなかった。このことは、トキシンＡが、トキシンＢとは異なる結合特異性を有することを示した。
【００９０】
（実施例４：トキシンＡおよびトキシンＢの両方の中和）
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＡ赤血球凝集活性およびトキシンＢ細胞傷害性活性の中和実験を、Ｃｄオリゴ糖（αＧａｌ（１−３）βＧａｌ（１−４）βＧｌｃ）およびイソマルトースの両方を有し、各々がそのそれぞれのリンカーにより結合されている（ｎ＝２）、「二重標識」ＳＹＮＳＯＲＢ（すなわち、ＳＹＮＳＯＲＢ  ５１７４）を用いて行った。中和実験を、ＳＹＮＳＯＲＢ  ５１７４、ＳＹＮＳＯＲＢ  １７９Ａ（イソマルトース）、またはＳＹＮＳＯＲＢ  Ｃｄのいずれかを２０ｍｇ／ｍＬの濃度で、トキシンＡと１時間またはトキシンＢと４時間、室温にてインキュベートすることにより行った。各サンプルにおけるトキシン活性の量を、ＣＨＯ細胞またはウサギ赤血球を用いて測定した。結果を、ＳＹＮＳＯＲＢとともにインキュベートしなかったコントロールのトキシン溶液と比較した残存活性パーセントとして表す。
【００９１】
図２に表す結果は、ＳＹＮＳＯＲＢ  ５１７４が、トキシンＡ活性およびトキシンＢ活性の両方を中和したことを示す。これらの結果はまた、ＳＹＮＳＯＲＢ
５１７４のトキシン中和能力が、ＳＹＮＳＯＲＢ  ＣｄおよびＳＹＮＳＯＲＢ
１７９Ａに匹敵したことを示す。従って、１より多くのオリゴ糖リガンドを含む支持体を用いて、トキシンＡおよびトキシンＢの両方を結合し得る。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、ＳＹＮＳＯＲＢ  ５−１２８を用いるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢ活性の、時間依存性および濃度依存性の中和を例示する。
【図２】図２は、それらのそれぞれのリンカーにより共有結合したＣｄおよびイソマルトースオリゴ糖の両方を有するＳＹＮＳＯＲＢ  ５１７４が、トキシンＡ活性およびトキシンＢ活性の両方を中和したことを例示する。
【図１】
2006213735.tif 000014
【図２】
2006213735.tif 000015