(57)【要約】【課題】  サンプル液を電極付キュベットに移し変えることなく、しかも、サンプル液を無駄にすることもなく、処理された細胞の評価をリアルタイムで行えるようにする。【解決手段】  蛍光色素分子と細胞を懸濁させたサンプル液（Ｓ）を流すサンプル流路（８）中に、その流れを停止させた状態でサンプル液（Ｓ）に含まれる細胞に対して電気穿孔処理を施す対向電極（１０Ａ，１０Ｂ）を配した処理部（２）を形成すると共に、その下流側に電気穿孔処理されたサンプル液（Ｓ）に含まれる個々の細胞を評価するフローサイトメータ（３）を接続し、処理部（２）で一度に処理される所定量のサンプル液（Ｓ）をその前後に空気または所定のシース液を挟んで間欠的に供給するサンプル供給系（７）にサンプル流路（８）を接続した。【選択図】図１
2006149310.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素分子と細胞を懸濁させたサンプル液に電気パルスを作用させて細胞に電気穿孔処理を施すことにより、細胞内に蛍光色素分子を導入するエレクトロポレーション装置であって、
サンプル液を流すサンプル流路中に、その流れを停止させた状態でサンプル液に含まれる細胞に対して電気穿孔処理を施す対向電極を配した処理部が形成されると共に、その下流側に電気穿孔処理されたサンプル液に含まれる個々の細胞を評価するフローサイトメータが接続され、
前記サンプル流路が、前記処理部で一度に処理される所定量のサンプル液をその前後に空気または所定のシース液を挟んで間欠的に供給するサンプル供給系に接続されたことを特徴とするエレクトロポレーション装置。
【請求項２】
前記処理部で一度に処理される所定量のサンプル液が、前記処理部の容量以下に設定されてなる請求項１記載のエレクトロポレーション装置。
【請求項３】
前記処理部が、所定量のサンプル液を一時貯留するニードル管で形成され、その内面に沿って前記サンプル液に含まれる細胞に対して電気パルスを印加する電極を設けて成る請求項1記載のエレクトロポレーション装置。
【請求項４】
前記フローサイトメータで蛍光色素分子の導入の適否を評価し、その評価結果に基づいて細胞を選別する細胞選別装置を備えたことを特徴とする請求項1記載のエレクトロポレーション装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光色素分子と細胞を懸濁させたサンプル液に電気パルスを作用させて細胞に電気穿孔処理を施すことにより、細胞内に蛍光色素分子を導入するエレクトロポレーション装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、細胞内へ蛍光色素分子を導入して原形質を染色したり、蛍光標識のついたＤＮＡを導入する方法として、エレクトロポレーション法を用いるようになっている。
エレクトロポレーション法は、細胞を懸濁するサンプル液に電気パルスをかけることにより細胞膜上に微小孔をあけ、その微小孔を通して導入しようとする物質を細胞内へ送り込む手法である。
細胞膜上に穿設された微小孔は塞がれるまでに数ミリ秒〜数十ミリ秒間かかるので、サンプル液中に細胞内に導入しようとする蛍光色素分子を混入させておけば、電気穿孔処理を施すことにより、その微小孔を通じて蛍光色素分子が細胞内へ取り込まれ、細胞の蛍光染色を行うことができる。
【特許文献１】特開２００１−２８６２８５
【０００３】
現在、電気穿孔処理を行う場合、一般には電極付キュベットが用いられている。
これは、所定容積のプラスチック容器の内部両側に一対のアルミ電極が１〜数ｍｍ程度のギャップをもって配されており、キュベット内にサンプルを注入し、電極間に高電圧を印加して電気パルスを発生させて電気穿孔処理を行うようになされている。
【特許文献２】特開２００４−０４１４３４
【０００４】
しかしながら、電極付キュベットを用いる場合、処理しようとするサンプル量が比較的多いため電気穿孔処理を施してもサンプル液に含まれる全ての細胞に適正に蛍光色素分子が導入されて染色されているとは限らず、導入不良の細胞も分注されてしまうという問題があった。
また、電気穿孔処理されたサンプル液を最終的にウェルプレート等へ分注する場合でも、一旦は、処理前のサンプル液を電極付キュベット内に貯留した後、これを吸い取って分注しなければならない。
したがって、これを手作業で行う場合は極めて面倒であり、自動分注する場合もサンプル液を電極付キュベット内に入れたり出したりする時間が無駄であるという問題があった。
【０００５】
なお、電極付キュベットをサンプル流路中に配し、サンプル液をキュベット内に流入させて電気穿孔処理を行う装置も提案されている。
この場合は、サンプル液を自動的に電極付キュベット内に送液することができ、自動分注器に接続すれば処理済みのサンプル液をそのまま分注できるので、分注の手間はなくなる。
しかしながら、処理済みのサンプル液がキュベット内に残っているとそのサンプル液に含まれる細胞に対して、電気穿孔処理が二度施されることになるので電気穿孔を行う処理条件が一定しない。
また、これを避けるためには、処理済みのサンプル液を未処理のサンプル液で確実に排出させる必要があるからサンプル液が無駄になるという問題がある。
しかも、いずれの場合も、導入不良の細胞が分注されてしまう点は何ら解決されていない。
【特許文献３】特開平１−２９１７８２
【特許文献４】特開平１１−５０２１３３
【特許文献５】特表２００２−５１６６７８
【０００６】
全ての細胞に適正に蛍光色素分子を導入させるためには、適正電圧、適正パルス回数、細胞と蛍光色素分子の適正量など様々の条件を最適化する必要があるが、この条件を決めるために、従来は、電極付キュベットで処理した細胞を９６穴ウェルプレートなどに分注して、別途、蛍光顕微鏡などにより個々の細胞を観察することによりその条件が適正であるか否かを評価しなければならない。
したがって、大量のサンプルを消費しなければ最適条件を定めることができず、条件設定にも長時間を要した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明は、サンプル液を電極付キュベットに移し変えることなく、しかも、サンプル液を無駄にすることもなく、処理された細胞の評価をリアルタイムで行えるようにすることを技術的課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、蛍光色素分子と細胞を懸濁させたサンプル液に電気パルスを作用させて細胞に電気穿孔処理を施すことにより、細胞内に蛍光色素分子を導入するエレクトロポレーション装置であって、サンプル液を流すサンプル流路中に、その流れを停止させた状態でサンプル液に含まれる細胞に対して電気穿孔処理を施す対向電極を配した処理部が形成されると共に、その下流側に電気穿孔処理されたサンプル液に含まれる個々の細胞を評価するフローサイトメータが接続され、前記サンプル流路が、前記処理部で一度に処理される所定量のサンプル液をその前後に空気または所定のシース液を挟んで間欠的に供給するサンプル供給系に接続されたことを特徴としている。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のエレクトロポレーション装置によれば、電気穿孔処理を施す処理部で一度に処理される所定量のサンプル液が、その前後に空気または所定のシース液を挟んでサンプル流路に間欠的に供給されるので、電気穿孔処理を施したときに処理部に貯留されているサンプル液以外のサンプル液に電気パルスの影響が及ぶことはない。
また、処理が終了したときは、未処理のサンプル液を過剰に流すまでもなく、処理済みのサンプル液はシース液で送り出されるので、未処理サンプル液の無駄を生じることがなく、処理部に処理済みのサンプル液が残存して複数回の電気穿孔処理が施されることもない。
そして、処理済みのサンプル液はフローサイトメータに送られ、個々の細胞についての評価をリアルタイムで行うことができるので、その評価に基づいて、最適条件を逸早く設定したり、適正に処理された細胞のみを選別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本例では、サンプル液を電極付キュベットに移し変えることなく、しかも、サンプル液を無駄にすることなく、処理済みの細胞をリアルタイムで評価するという目的を、サンプル流路にフローサイトメータを組み込むと同時に、サンプル液の流し方を工夫することにより達成した。
【００１１】
図１は本発明に係るエレクトロポレーション装置を示す説明図、図２はサンプル液の流れを示す概略図である。
【００１２】
本例のエレクトロポレーション装置１は、蛍光色素分子と細胞を懸濁させたサンプル液Ｓを処理部２に供給して電気パルスを作用させ、細胞膜に電気穿孔処理を施した後、フローサイトメータ３で個々の細胞を評価し、その評価結果に基づき適正に蛍光色素分子が導入された細胞を細胞選別装置４で選別して、自動分注装置５により例えば９６穴ウェルプレート６などの任意の容器に分注するものである。
【００１３】
処理部２は、サンプル供給系７からサンプル液Ｓが供給されるサンプル流路８中に介装され、その流れを停止させた状態で所定量のサンプル液Ｓを一時貯留するニードル管９の内面に沿って、サンプル液Ｓに含まれる細胞に対して電気穿孔処理を施す対向電極１０Ａ、１０Ｂが設けられている。
【００１４】
電極１０Ａ、１０Ｂは電源装置１１に接続され、スイッチＳＷ１を短絡させた状態で直流電源１２からコンデンサ１３に電荷をチャージさせ、スイッチＳＷ１を開いてスイッチＳＷ２を短絡させることによりコンデンサ１３にチャージされた電荷を放電させて、パルス電圧を電極１０Ａ、１０Ｂ間に印加させるようになっている。
これにより、処理部２のニードル管９に貯留された所定量のサンプル液Ｓに含まれる細胞に１回又は複数回の電気パルスを作用させ、その細胞膜に電気穿孔処理を施して微小孔を穿設することができる。
【００１５】
また、サンプル供給系７は、処理部２のニードル管９に一時貯留される所定量のサンプル液Ｓを、その前後に空気または所定のシース液を挟んでサンプル流路８を介して間欠的に供給する。
本例では、サンプル液ボトル１５Ｓからサンプル液Ｓを吸い上げて送り出すシリンジ型の精密ポンプ１６Ｓを介装したサンプル液配管１７Ｓと、シース液ボトル１５Ｌからシース液Ｌを吸い上げて送り出すシリンジ型の精密ポンプ１６Ｌを介装したシース液配管１７Ｌが流路切換弁１８を介してサンプル流路８に合流されている。
なお、サンプル液ボトル１５Ｓ内のサンプル液Ｓには、電気穿孔処理により蛍光色素分子を導入しようとする細胞と、その細胞に導入すべき蛍光色素分子が懸濁されている。
【００１６】
流路切換弁１８は、図２拡大図に示すように、機械的に流路を切換えるものではなく、サンプル液配管１７Ｓ及びシース液配管１７Ｌからサンプル流路８に流入するサンプル液Ｓ及びシース液Ｌの流体圧により夫々の流路を切換えるように成されており、サンプル液Ｓを供給すると共にシース液の供給を停止しているときはその流体圧によりサンプル液Ｓがサンプル流路８に流入し、サンプル液Ｓの供給を停止すると共にシース液Ｌを供給しているときはその流体圧によりシース液Ｌがサンプル流路８に流入する。
したがって、流路切換弁１８を交互に切り換えることにより、図２に示すように、処理部２に貯留される所定量のサンプル液Ｓが、その前後にシース液Ｌを挟んでサンプル流路８を通り処理部２に間欠的に供給される。
【００１７】
処理部２で電気穿孔処理されたサンプル液Ｓはフローサイトメータ３に送られて、個々の細胞について蛍光色素分子導入の適否等の評価がなされる。
フローサイトメータ３は、処理部２から供給される処理済のサンプル液Ｓを吐出するサンプルノズル２１が、そのサンプル液Ｓに含まれる細胞をシース液により一つずつ分離して細管状観察部２２に案内するノズルホルダ２３内に配されてなる。
また、細管状観察部２２を流れる細胞に対して蛍光色素分子励起用のレーザ光を照射するレーザ光源２４と、レーザ光が照射された細胞の散乱光及び蛍光を検出する光電子倍増管２５Ａ及び２５Ｂと、これら各光電子倍増管２５Ａ及び２５Ｂのデータを分析するデータ処理装置２５Ｃを備えている。
なお、ノズルホルダ２３には、サンプル液Ｓに含まれる細胞を一つずつ分離するためのシース液を供給するシース液供給系２６が接続されている。
【００１８】
これにより、処理部２で電気穿孔処理された細胞は、フローサイトメータ３でリアルタイムで評価され、処理部２で電気穿孔処理する場合の処理条件を順次変えながら評価することにより最適な処理条件を短時間で設定することができる。
また、フローサイトメータ３でモニタすることにより、最適な処理条件が設定される前でも蛍光色素分子が適正に導入された細胞はこれを無駄にすることなく自動分注装置５に送り、最適な処理条件が設定された後でも蛍光色素分子導入不良の細胞はこれを廃棄することができる。
【００１９】
細胞選別装置４は、データ処理装置２５Ｃから出力される識別信号とサンプル流量に基づき所定のタイムラグで流路を切換えることにより細管状観察部２２を通過した細胞を選別するもので、蛍光色素分子が適正に導入された細胞が分注装置５に供給され、導入不良の細胞は廃液ボトル２７に排出されるようになっている。
【００２０】
そして、自動分注装置５は、ロボットアーム２８により、ＸＹＺの三方向に位置制御される分注ニードル２９を備え、該ニードル２９をウェルプレート６上の任意の位置に移動させて処理済みのサンプル液Ｓを各ウェルに分注できるようになされている。
【００２１】
以上が本発明の一構成例であって、次にその作用について説明する。
サンプル供給系７から供給された所定量のサンプル液Ｓが処理部２に到達すると、電源装置１１からパルス電圧が出力され、処理部２内のサンプル液Ｓに浮遊する細胞に電気パルスが作用して電気穿孔処理が行われる。
これにより、細胞膜に数ミリ秒〜数十ミリ秒間だけ微小孔が穿設されるので、サンプル液Ｓに予め懸濁させておいた蛍光色素分子が細胞内に取り込まれて細胞が染色される。
【００２２】
このとき処理部２に供給されたサンプル液Ｓは、その前後にシース液Ｌを挟んで送給されているので、電極１０Ａ、１０Ｂ間にパルス電圧を印加させて電気パルスを作用させたときに処理部２内に貯留されているサンプル液Ｓに懸濁された細胞のみに電気穿孔処理が施され、その前後のサンプル液Ｓに懸濁する細胞に電気穿孔処理が施されることがない。
【００２３】
そして、処理が終了するとサンプル液Ｓ及びシース液Ｌの供給に伴い処理済みのサンプル液Ｓはシース液Ｌで送り出されるので、未処理サンプル液の無駄を生じることがない。
また、処理部２に処理済みのサンプル液Ｓが残存して細胞に複数回の電気穿孔処理が施されることもないので、どの細胞に対しても等しい処理条件で電気穿孔処理を施すことができる。
【００２４】
そして、処理済みのサンプル液Ｓはフローサイトメータ３に送られ、サンプルノズル２１からノズルホルダ２３に吐出され、シース液により個々の細胞が一つずつ分離されて細管状観察部２２に案内される。
各細胞は細管状観察部２２を通過する際にレーザ光源２４から励起光が照射され、光電子倍増管２５Ａ及び２５Ｂにより得られた散乱光及び蛍光に関するデータがデータ処理装置２５Ｃで分析される。
例えば、処理部２における電気穿孔処理の条件を１回ごとに変えながら、サンプル中に含まれる全細胞数と、適正に処理された細胞数を分析し、適正処理数／全細胞数＝１に最も近い処理条件を最適条件として設定する。
このとき、フローサイトメータ３には処理部２から処理済みのサンプル液Ｓがインラインで供給されるため、別途、蛍光顕微鏡等で観察するまでもなく、個々の細胞についての評価をリアルタイムで行うことができる。
したがって、最適条件の設定も逸早く行うことができ、条件設定に要する手間と時間を節約することができる。
【００２５】
次いで、細管状観察部２２を通過した細胞は細胞選別装置４に送られ、自動分注装置５と廃液ボトル２７に振り分けられる。
細胞選別装置４は、フローサイトメータ３のデータ処理装置２５Ｃから出力される識別信号とその流量に応じて所定のタイムラグで流路切換を行うことにより細胞を選別する。
すなわち、蛍光色素分子が適正に導入された細胞が細管状観察部２２を通過したときにデータ処理装置２５Ｃから出力される識別信号に応じて、その細胞が分岐部４ａに達するタイミングで流路を自動分注装置５側に切換え、導入不良の細胞が細管状観察部２２を通過したときにデータ処理装置２５Ｃから出力される識別信号に応じて、その細胞が分岐部４ａに達するタイミングで流路を廃液ボトル２７側に切換える。
【００２６】
したがって、最適な処理条件が設定される前でも適正に導入された細胞はこれを無駄にすることなく自動分注装置５に送ることができ、最適な処理条件が設定された後でも導入不良の細胞はこれを廃棄することができる。
このように、自動分注装置５には蛍光色素分子が適正に導入された細胞のみが送られ、これを９６穴ウェルプレート６に分注すれば、ウェルに分注された全ての細胞には蛍光色素分子が導入されているので、次工程での作業は適正に染色された細胞に対してのみなされ、導入不良の細胞に対して行われることがないので作業に無駄がなく、作業効率を向上させることができる。
【００２７】
なお、上述の説明では、蛍光色素分子を細胞内に導入することにより細胞を染色する場合について説明したが、蛍光色素分子として蛍光標識が付されたＤＮＡを用いれば細胞に電気穿孔処理を施すことによりこれを細胞核内に導入することもできる。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明は、電気穿孔処理により細胞内に蛍光色素分子を導入して染色したり、蛍光標識の付されたＤＮＡを導入する場合に、電気穿孔処理の最適条件を逸早く設定する用途に適用することができると同時に、適正に導入された細胞のみを選別して次工程へ送る用途に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明に係るエレクトロポレーション装置の一例を示す説明図。
【図２】サンプル液の流れを示す説明図。
【符号の説明】
【００３０】
１  エレクトロポレーション装置
Ｓ  サンプル液
２  処理部
３  フローサイトメータ
４  細胞選別装置
７  サンプル供給系
８  サンプル流路
９  ニードル管  
【図１】
2006149310.tif 000003
【図２】
2006149310.tif 000004