(57)【要約】【課題】  試料DNAに含まれるメチル化DNAが微量であっても高感度に検出する。【解決手段】  DNAをメチル化感受性酵素により処理する工程Aと、上記工程Aの後、上記DNAにおける検査対象部位を含む領域を増幅するための増幅反応を行う工程Bと、上記工程Bの後、上記増幅反応により得られたDNA断片を検出する工程Cとを含み、DNA断片の検出結果に基づいて、上記検査対象部位のおけるメチル化の有無を判定する。【選択図】  図１
2006149334.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
DNAをメチル化感受性酵素により処理する工程Aと、
上記工程Aの後、上記DNAにおける検査対象部位を含む領域を増幅するための増幅反応を行う工程Bと、
上記工程Bの後、上記増幅反応により得られたDNA断片を検出する工程Cとを含み、
DNA断片の検出結果に基づいて、上記検査対象部位におけるメチル化の有無を判定することを特徴とするメチル化検出方法。
【請求項２】
上記工程Bは、上記検査対象部位を挟み込むように設計された、少なくとも１以上のプライマーセットを用いることを特徴とする請求項１記載のメチル化検出方法。
【請求項３】
上記工程Bでは、検査対象部位を含む複数の領域を、それぞれ異なるDNA断片長となるように増幅することを特徴とする請求項１記載のメチル化検出方法。
【請求項４】
上記工程Cでは、電気泳動により上記DNA断片長を検出することを特徴とする請求項１記載のメチル化検出方法。
【請求項５】
上記工程Bでは、メチル化感受性酵素認識配列を含まない領域を陽性コントロールDNA断片として増幅し、
上記工程Cでは、上記陽性コントロールDNA断片を検出することにより、上記工程Bにおける増幅反応の進行を検証することを特徴とする請求項１記載のメチル化検出方法。
【請求項６】
上記工程Aでは、メチル化されたメチル化感受性酵素認識配列、及び/又は、メチル化されていないメチル化感受性酵素認識配列を含むコントロールDNA断片に対してメチル化感受性酵素により処理し、
上記工程Bでは、上記コントロールDNA断片に含まれるメチル化感受性酵素認識配列を含む領域を増幅するための増幅反応を行い、
上記工程Cでは、上記コントロールDNA断片を鋳型とする増幅断片を検出することにより上記メチル化感受性酵素による酵素反応の進行を検証することを特徴とする請求項１記載のメチル化検出方法。
【請求項７】
上記工程Cでは、上記工程Aを行わずに上記工程Bを行って得られた増幅断片をマーカーとして使用することを特徴とする請求項１記載のメチル化検出方法。
【請求項８】
上記工程Bでは、標識物質を有するプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅反応を行い、
上記工程Cでは、標識物質を検出することにより、上記工程Bの増幅反応により得られたDNA断片を検出することを特徴とする請求項１記載のメチル化検出方法。
【請求項９】
上記標識物質は、プライマーセット毎に異なる蛍光波長を示す蛍光物質であることを特徴とする請求項８記載のメチル化検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNAにおけるメチル化の有無を検出するメチル化検出方法に関し、特に、メチル化の有無に起因する疾患の検出等に利用できるメチル化検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムは生物の設計図であり、ヒトにおいてはＡ（アデニン）Ｔ（チミン）Ｇ（グアニン）Ｃ（シトシン）の４塩基の組み合わせから成る約３０億塩基対のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）から作られている。これらゲノムＤＮＡの構成塩基の一部はメチル化されている。このメチル化の有無はゲノムの遺伝情報として、また転写調節機構の一部として非常に大事な役割を果たしていることがわかってきた。ヒトをはじめ多くの動物において、ＣＧという塩基配列のＣがメチル化される可能性があり、メチル化の有無は細胞分裂しても基本的に受け継がれること、またメチル化されている領域は基本的に転写が不活性化されていることが知られている。
【０００３】
ゲノムＤＮＡのメチル化は複数箇所で起きており、分化の過程や細胞種、癌細胞などで、そのメチル化パターンが異なる。メチル化の有無と細胞種や癌の進行度合いなど病状との相関の得られた特定のＤＮＡ領域に関して、そのメチル化状態を検査することは、非常に大事な情報となる。複数箇所のメチル化の有無を調べることで、細胞の分化状態やガンの進行状態を診断できる可能性があり、１つのゲノムあたり複数箇所でサンプルの多い場合でも効率良く正確に検査できる必要がある。
【０００４】
ゲノムのメチル化状態を検査する方法は色々と開発されており、現在代表的な原理としては２通りあり、メチル化感受性制限酵素によるゲノムＤＮＡの切断で判断する方法と、重亜硫酸ナトリウムでゲノムＤＮＡを処理し、その脱アミノ化の有無をシーケンス等で解析する方法（特許文献１）がある。メチル化感受性制限酵素を用いる方法では、サザンブロッティングで目的のフラグメントの長さを測定する方法等がある。重亜硫酸ナトリウムを用いる方法では、目的とする領域のシーケンス、またはメチル化部位を含むプライマーを用いて増幅反応が起きるのかを調べる等の方法がある。
【０００５】
また、ゲノムのメチル化状態をマイクロアレイを用いて検査する方法も知られている（特許文献２及び３）。
【０００６】
【特許文献１】国際公開番号WO2002/031186
【特許文献２】特開2003-38183号公報
【特許文献３】特開2003-144172号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、メチル化感受性制限酵素を用い、サザンブロッティングで目的のフラグメントの長さを測定する方法では、メチル化と非メチル化の割合をバンドの濃さから推察できる利点はあるが、微量な試料DNAを用いた検出が難しいといった問題がある。
【０００８】
一方、重亜硫酸ナトリウムを用いる方法では、制限酵素認識配列に依存せずに、あらゆる核酸配列でも網羅的にメチル化状態を調べることができるという利点はあるが、シーケンスの操作等が煩雑であり、サンプルが多い場合の処理が困難であるといった問題がある。
【０００９】
そこで、本発明は上述したような実状に鑑み、試料DNAに含まれるメチル化DNAが微量であっても高感度に検出することができる、優れたメチル化検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した目的を達成した本発明は、以下を包含する。
(1)  DNAをメチル化感受性酵素により処理する工程Aと、
上記工程Aの後、上記DNAにおける検査対象部位を含む領域を増幅するための増幅反応を行う工程Bと、
上記工程Bの後、上記増幅反応により得られたDNA断片を検出する工程Cとを含み、
DNA断片の検出結果に基づいて、上記検査対象部位におけるメチル化の有無を判定することを特徴とするメチル化検出方法。
【００１１】
(2)  上記工程Bは、上記検査対象部位を挟み込むように設計された、少なくとも１以上のプライマーセットを用いることを特徴とする(1)記載のメチル化検出方法。
【００１２】
(3)  上記工程Bでは、検査対象部位を含む複数の領域を、それぞれ異なるDNA断片長となるように増幅することを特徴とする(1)記載のメチル化検出方法。
【００１３】
(4)  上記工程Cでは、電気泳動により上記DNA断片長を検出することを特徴とする(1)記載のメチル化検出方法。
【００１４】
(5)  上記工程Bでは、メチル化感受性酵素認識配列を含まない領域を陽性コントロールDNA断片として増幅し、
上記工程Cでは、上記陽性コントロールDNA断片を検出することにより、上記工程Bにおける増幅反応の進行を検証することを特徴とする(1)記載のメチル化検出方法。
【００１５】
(6)  上記工程Aでは、メチル化されたメチル化感受性酵素認識配列、及び/又は、メチル化されていないメチル化感受性酵素認識配列を含むコントロールDNA断片に対してメチル化感受性酵素により処理し、
上記工程Bでは、上記コントロールDNA断片に含まれるメチル化感受性酵素認識配列を含む領域を増幅するための増幅反応を行い、
上記工程Cでは、上記コントロールDNA断片を鋳型とする増幅断片を検出することにより上記メチル化感受性酵素による酵素反応の進行を検証することを特徴とする(1)記載のメチル化検出方法。
【００１６】
(7)  上記工程Cでは、上記工程Aを行わずに上記工程Bを行って得られた増幅断片をマーカーとして使用することを特徴とする(1)記載のメチル化検出方法。
【００１７】
(8)  上記工程Bでは、標識物質を有するプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅反応を行い、
上記工程Cでは、標識物質を検出することにより、上記工程Bの増幅反応により得られたDNA断片を検出することを特徴とする(1)記載のメチル化検出方法。
【００１８】
(9)  上記標識物質は、プライマーセット毎に異なる蛍光波長を示す蛍光物質であることを特徴とする(8)記載のメチル化検出方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、検査対象部位のおけるメチル化の有無に関し、検査対象部位が複数であっても、効率良く安定した結果を得ることができるメチル化検出方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明に係るメチル化検出方法を、図面を参照して詳細に説明する。本発明に係るメチル化検出方法は、DNAにおける所定の部位に関するメチル化の有無を検出できる方法である。
【００２１】
本発明に係るメチル化検出方法は、DNAをメチル化感受性酵素により処理する工程Aと、上記工程Aの後、上記DNAにおける検査対象部位を含む領域を増幅するための増幅反応を行う工程Bと、上記工程Bの後、上記増幅反応により得られたDNA断片を検出する工程Cとを含む。
【００２２】
工程Aにおいては、先ず、メチル化検査対象部位を含むDNAをメチル化感受性酵素で処理する。ここで、メチル化検出対象部位とは、後述するメチル化感受性酵素が認識して切断する配列（以下、メチル化感受性酵素認識配列と称する）に含まれる塩基であって、メチル化される可能性を有する塩基を意味する。メチル化感受性酵素とは、当該酵素が認識する塩基配列における所定の塩基がメチル化された状態ではDNAを切断できず、当該塩基がメチル化されていない状態ではDNAを切断する酵素を意味する。メチル化感受性制限酵素としては、例えば、HapII、NotI、SfiI、FseI、CspI、MluI、AscI、BssHII、ClaI、XhoI、Eco521、SalI、NarI、NruI、PsrII、PacI、SwaI、SseB387I、PmeIなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
メチル化感受性酵素によるDNAの処理とは、所定の温度、所定のpH、所定の塩濃度で調製したDNA溶液に上記メチル化感受性酵素のうち少なくとも一種を添加してDNA切断反応を進行させることを意味する。ここで、温度、pH及び塩濃度等の諸条件は、使用するメチル化感受性酵素に依存して異なり、使用するメチル化感受性酵素に応じて適宜決定することができる。
【００２４】
次に、工程Bにおいては、メチル化検査対象部位を含む領域を増幅するための増幅反応を行う。ここで、増幅反応としては、一例としてPCR（polymerase chain reaction）法を挙げることができるが、工程Aでメチル化感受性酵素処理が施された後のDNAを鋳型として、メチル化検査対象部位を含む領域を増幅できる方法であればよい。このような増幅反応としては、LCR（ligase chain reaction）法、gap LCR法、SDA（strand displacement amplification）法、Qβreplicase amplification法、TAS（transcription amplification system）法、3SR（self-sustained sequence relication system）法、NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）法、TMA（transcription-mediated amplification）法、ICAN（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid）法、LAMP（loop-mediated isothermal amplification）法を挙げることができる。
【００２５】
増幅反応としてPCR法を適用する場合、使用する一対のプライマーは検査対象部位を挟み込むように設計する。また、本発明に係るメチル化検出方法において、検査対象部位を複数とする場合には、１の検査対象部位を含む複数の領域について一対のプライマーをそれぞれ設計する。PCR反応における温度サイクル及び反応溶液組成等の各種条件は、例えば、設計したプライマーのTm値や増幅領域の個数、増幅箇所等に応じて適宜決定することができる。
【００２６】
また、１の検査対象部位を含む複数の領域を同時に増幅する場合には、増幅断片が異なる長さとなるようにプライマーを設計することが好ましい。増幅断片が異なる長さとなるようにプライマーを設計することによって、後述する工程Cにおいて、増幅断片の有無を容易に判別することができるためである。
【００２７】
さらに、増幅反応に使用するプライマーは、蛍光標識を結合したものであっても良い。蛍光標識を結合したプライマーを使用することによって、後述する工程Cにおいて増幅断片をより容易に検出することができる。増幅反応に一対のプライマーを使用する場合、蛍光標識は、少なくとも一方のプライマーに結合すればよい。増幅反応に複数対のプライマーを使用する場合には、各対ごとに異なる蛍光波長を示す蛍光標識を結合することが好ましい。
【００２８】
工程Bでは、上記工程AにおいてDNAがメチル化感受性酵素によって切断されている場合には増幅反応が進行しないが、上記工程AにおいてDNAがメチル化感受性酵素によって切断されていない場合には増幅反応が進行する。従って、工程Bにおける増幅反応の進行の有無を検出することによって、工程Aで使用したDNAに含まれるメチル化検出対象部位におけるメチル化の有無を検出することができる。
【００２９】
すなわち、工程Cでは、上記増幅反応により得られたDNA断片を検出する。当該DNA断片を検出する手法には何ら限定されないが、例えば、上記工程Bにおける増幅反応後の反応溶液をそのまま使用した電気泳動法を適用することが好ましい。また、工程Cにおいては、電気泳動法を適用してDNA断片の検出に限定されず、例えば、プライマーに結合した蛍光標識の蛍光を検出する方法等を適用することができる。
【００３０】
工程Cの結果、メチル化検出対象部位を含むDNA断片の増幅が確認された場合には、当該メチル化検出対象部位がメチル化されていることを判定することができる。逆に、工程Cの結果、メチル化検出対象部位を含むDNA断片の増幅が確認されない場合には、当該メチル化検出対象部位がメチル化されていないことを判定することができる。
【００３１】
以上で説明した工程A〜Cを含むメチル化検出方法によれば、検査対象部位のおけるメチル化の有無に関し、検査対象部位が複数であっても、効率良く安定した結果を得ることができる。また、工程Aで準備するDNAにおいて、メチル化検出対象部位がメチル化されたDNAとメチル化されていないDNAとが混在している場合においても、メチル化検出対象部位におけるメチル化を確実に検出することができる。
【００３２】
また、上述したメチル化検出方法において、工程Bでメチル化感受性酵素認識配列を含まない領域を陽性コントロールDNA断片として増幅することが好ましい。すなわち、このメチル化感受性酵素認識配列を含まない領域は、メチル化の有無に拘わらず工程Aにおいてメチル化感受性酵素により切断されることがないため、工程Bにおいて確実に増幅される領域である。よって、この場合、工程Cにおいて、上記陽性コントロールDNA断片を検出することにより、工程Bにおける増幅反応の進行を検証することが可能となる。
【００３３】
さらに、上述したメチル化検出方法において、上記工程Aで、検査対象部位を含むDNAの他に、メチル化されたメチル化感受性酵素認識配列を含むコントロールDNA断片を同様にメチル化感受性酵素により処理し、上記工程Bの増幅反応においてコントロールDNA断片に含まれるメチル化感受性酵素認識配列を含む領域を増幅することが好ましい。この場合、コントロールDNA断片は工程Aでは切断されず、工程Bによって上記領域が確実に増幅することとなる。この場合には、工程Cにおいて、コントロールDNA断片に由来する増幅産物を検出できることとなる。したがって、コントロールDNA断片に由来する増幅産物を検出することで、メチル化感受性酵素による酵素反応の進行を検証することが可能となる。
【００３４】
この場合、上記工程Aで、検査対象部位を含むDNA及び上記コントロールDNA断片の他に、メチル化されたメチル化感受性酵素認識配列を含む他のコントロールDNA断片を同様にメチル化感受性酵素により処理し、上記工程Bの増幅反応において当該他のコントロールDNA断片に含まれるメチル化感受性酵素認識配列を含む領域を増幅することが好ましい。この場合、他のコントロールDNA断片は工程Aで切断されるため工程Bによって上記領域が増幅せず、工程Cにおいて、他のコントロールDNA断片に由来する増幅産物は検出されないこととなる。したがって、上記他のコントロールDNA断片に由来する増幅産物が存在しないことを確認することで、メチル化感受性酵素による酵素反応の進行を検証することが可能となる。また、この場合には、メチル化検出対象部位のメチル化について偽陽性と弱い陽性とを確実に判断することができる。
【００３５】
さらにまた、上述したメチル化検出方法において、工程Bは、工程Aにおいてメチル化感受性制限酵素で処理されたDNAに加えて、メチル化感受性制限酵素で処理していない同じ塩基配列からなるDNAを用いて増幅反応することが好ましい。この場合、メチル化感受性制限酵素で処理されていないDNA由来の増幅断片は、工程Aにおいてメチル化感受性制限酵素で処理されたDNA由来の増幅断片のマーカーとして使用することができる。したがって、例えば、工程Cにおいて電気泳動法にて検出する場合には、メチル化感受性制限酵素で処理されていないDNAを用いて工程Bを行った後の試料を異なるレーンで電気泳動することによって、その泳動パターンをマーカーの泳動パターンとして使用することができる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明に係るメチル化検出方法を、実施例を用いて更に詳細に説明する。但し、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３７】
〔実施例１〕
図１は、ゲノムDNAをメチル化感受性制限酵素で処理後、制限酵素認識部位を挟んでPCR反応を行ったときの模式図である。ここではメチル化感受性制限酵素としてHapIIを用いた。図に示したように、制限酵素認識部位がメチル化されている場合は、メチル化感受性制限酵素でDNAを切断することができないため、PCR反応を行うと増幅産物が得られる。逆に制限酵素認識部位がメチル化されていない場合は、メチル化感受性制限酵素でDNAを切断することができるため、PCR反応を行うと増幅産物が得られない。
【００３８】
図２は、本例のメチル化検出方法の具体的な実験の流れである。まずサンプルとなるゲノムDNAに、ポジティブ・コントロールとなる既知配列のメチル化コントロールDNAと、ネガティブ・コントロールとなる既知配列の非メチル化コントロールDNAを加える。次にそれらDNA混合溶液をメチル化感受性制限酵素で処理する。酵素処理済のDNA混合溶液と１サンプルのみ未処理のDNA混合溶液を鋳型として、複数のプライマーセットを用いてPCR反応を行う。ここではa〜hまで８ヶ所の制限酵素認識部位を挟んで設計されたプライマーセット（８セット）とポジティブ・コントロール及びネガティブ・コントロールのプライマーセットで合計１０組のプライマーセットを用いた。もし、ポジティブ・コントロールの鋳型としてメチル化されたDNAが入手できない場合には、ポジティブ・コントロールのプライマーは制限酵素認識部位を挟まない場所に設計すればよい。最後にそれぞれの増幅産物を電気泳動することで、バンドの有無によりメチル化の有無を解析する。
【００３９】
図３は、図２で得られた増幅産物の電気泳動図である。レーン１はメチル化感受性制限酵素で処理をしていないDNA混合溶液を鋳型としたものである。鋳型となるDNAが全く切断されていないため、１０組のプライマーセットは全て増幅され１０本のバンドが見られる。レーン２〜６は、未知サンプルゲノムが含まれる。レーン５はポジティブ・コントロールのバンドがないため、メチル化感受性制限酵素処理で特異性が低く切断されてしまった、もしくはPCR反応での増幅が不完全である可能性が高く、失敗サンプルである。同様にレーン６はネガティブ・コントロールのバンドがあり、メチル化感受性制限酵素処理が不完全である可能性が高いために、失敗サンプルである。レーン２はb, c, e, hのサイトがメチル化されていること、レーン３はa, c, d, gのサイトがメチル化されていること、レーン４はどこのサイトもメチル化されていないことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ゲノムDNAをメチル化感受性制限酵素で処理後、制限酵素認識部位を挟んでPCR反応を行ったときの模式図。
【図２】メチル化検出方法の具体的な実験の流れを示すフローチャート。
【図３】増幅産物の電気泳動図。
【図１】
2006149334.tif 000003
【図２】
2006149334.tif 000004
【図３】
2006149334.tif 000005