(57)【要約】【課題】  油脂の分解特性に優れた新規微生物及びこの新規微生物を用いて油脂含有廃棄物を処理する方法を提供すること。【解決手段】  バチルス属（Bacillus）に属する新規微生物（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２４０）及びこの新規微生物によって油脂含有廃棄物を分解してコンポスト化することを特徴とする油脂含有廃棄物の処理方法とする。この油脂含有廃棄物の処理方法では、油脂含有廃棄物の分解が４０〜７０℃の温度条件下において行われる。【選択図】  図１
2006109780.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス属（Bacillus）に属する新規微生物（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２４０）。
【請求項２】
バチルス属（Bacillus）に属する新規微生物（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２４０）によって油脂含有廃棄物を分解することを特徴とする油脂含有廃棄物の処理方法。
【請求項３】
バチルス属（Bacillus）に属する新規微生物（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２４０）によって油脂含有廃棄物を分解してコンポスト化することを特徴とする油脂含有廃棄物の処理方法。
【請求項４】
バチルス属（Bacillus）に属する新規微生物（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２４０）を含む微生物群によって油脂含有廃棄物を分解してコンポスト化することを特徴とする油脂含有廃棄物の処理方法。
【請求項５】
前記油脂含有廃棄物の分解が、４０〜７０℃の温度条件下において行われることを特徴とする請求項２乃至４のいずれかに記載の油脂含有廃棄物の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規微生物及び油脂含有廃棄物の処理方法に関する。本発明の目的は油脂の分解特性に優れた新規微生物及びこの新規微生物を用いて油脂含有廃棄物を処理する方法を提供することにある。
【背景技術】
【０００２】
生ごみなどの有機物含有廃棄物を好気的に発酵させて堆肥化（コンポスト化）する方法が、焼却や埋め立てなどに変わる廃棄物処理方法として注目されている。廃棄物をコンポスト化して処理すれば、廃棄物を焼却或いは埋め立てて処理する場合とは異なり、無公害で処理することができる。
一方、近年、食生活の変化から、廃棄物中に含まれる油脂の量が増加している。廃棄物中の油脂含有量が増加すると、油脂自体が微生物によって分解され難いとともに、油脂が油脂以外の廃棄物表面を被覆することで好気条件の維持を困難にするために、微生物が有機物に接触する機会を奪い、その結果、廃棄物全体の分解を困難にして、コンポスト化を困難にする。このために、廃棄物中の油脂含有量が多い場合、廃棄物の分解速度が著しく低下して、廃棄物を良好に分解することが困難になる。
【０００３】
そこで、油脂の含有量が比較的多い廃棄物であってもコンポスト化することができるコンポスト化装置やコンポスト化方法が提案されている。
例えば、特許文献１には、油脂を含有する厨芥を好気的に発酵させコンポスト化する方法において、該好気的発酵をレシチンと高級脂肪酸ナトリウムの一方もしくは両方の存在下で行うことを特徴とする油脂含有厨芥のコンポスト化方法が開示されている。
特許文献２には、魚腸類含有厨芥を連続的に醗酵槽に投入して好気的醗酵させ、前記厨芥を連続的にコンポスト化する方法において、前記厨芥とともに５〜２０重量部の副資材（前記厨芥１００重量部に対して）を前記醗酵槽に投入することを特徴とする魚腸類含有厨芥のコンポスト化処理方法が開示されている。
特許文献３には、生ごみ供給口とコンポスト排出口を有する発酵槽と、該発酵槽内に設置した回転軸に複数の撹拌腕を固定した撹拌手段と、該撹拌手段を駆動する駆動手段と、該発酵槽の内壁に固定刃とを設けて、生ごみをあらかじめ該発酵槽内に充填した好気性菌を含む発酵床と混合しながらコンポスト化するようにした生ごみ処理装置において、該発酵槽の長さの半分よりも後方の前記発酵槽の内壁に該固定刃を配置したことを特徴とする生ごみ処理装置が開示されている。
【０００４】
【特許文献１】特開平７−３３５７０号公報
【特許文献２】特開平１１−２７８９７０号公報
【特許文献３】特開平１１−２２１５４６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したようなコンポスト化装置やコンポスト化方法によれば、通常のコンポスト化に比べて油脂分解能力が向上する可能性がある。しかし、廃棄物中の油脂を分解するのは微生物自体であるので、微生物自体の油脂分解能力が低い場合、上述したようなコンポスト化装置やコンポスト化方法によっても、十分満足することができる結果を得ることはできなかった。
本発明の解決しようとする課題は、油脂の分解能力に優れた微生物を提供すること、さらにこの微生物を用いて油脂を含有する廃棄物の処理方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は上記した課題を解決するためになされた発明であって、請求項１に係る発明は、バチルス属（Bacillus）に属する新規微生物（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２４０）に関する。
請求項２に係る発明は、バチルス属（Bacillus）に属する新規微生物（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２４０）によって油脂含有廃棄物を分解することを特徴とする油脂含有廃棄物の処理方法に関する。
請求項３に係る発明は、バチルス属（Bacillus）に属する新規微生物（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２４０）によって油脂含有廃棄物を分解してコンポスト化することを特徴とする油脂含有廃棄物の処理方法に関する。
請求項４に係る発明は、バチルス属（Bacillus）に属する新規微生物（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２４０）を含む微生物群によって油脂含有廃棄物を分解してコンポスト化することを特徴とする油脂含有廃棄物の処理方法に関する。
請求項５に係る発明は、前記油脂含有廃棄物の分解が、４０〜７０℃の温度条件下において行われることを特徴とする請求項２乃至４のいずれかに記載の油脂含有廃棄物の処理方法に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に係る新規微生物は油脂の分解性能に優れる。従って、油脂含有廃棄物を分解処理する微生物として、具体的には油脂含有廃棄物のコンポスト化において利用される微生物として、好適に用いることができる。
本発明に係る油脂含有廃棄物の処理方法によれば、バチルス属（Bacillus）に属する新規微生物を使用して油脂含有廃棄物を処理するので、廃棄物中に油脂が大量に含まれている場合であっても、短期間で効率良く廃棄物を処理することができる。しかも、アンモニアなどの悪臭の発生量を低減することができる。
特に本発明に係る油脂含有廃棄物の処理方法は、油脂含有廃棄物のコンポスト化に好適に適用することができ、廃棄物中に油脂が大量に含まれている場合であっても、廃棄物の分解速度を低下させることがなく、短期間で廃棄物をコンポスト化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に係る新規微生物について詳述する。
本発明に係る新規微生物は、油脂分解性を有するバチルス（Bacillus）属に属する、Bacillus sp. LT1株である。Bacillus sp. LT1株は、平成１６年１０月７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。受領番号はＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２４０である。
【０００９】
Bacillus sp. LT1株は４０〜７０℃の温度条件下で生育する。至適温度は６０℃である。
Bacillus sp. LT1株はｐＨ６〜９の条件下で生育する。至適ｐＨは７．３である。
【００１０】
Bacillus sp. LT1株を培養する際に使用される培地は、通常の微生物の培養に用いられる培地であれば、特に限定されることなく使用することができる。
培地の栄養源としては、炭素源、窒素源、無機塩類などの細菌の成育に必要な栄養源であればよい。炭素源としては、グルコース、ショ糖、糖蜜、澱粉等を例示することができる。窒素源としては、有機窒素源、無機窒素源のいずれも用いることができ、有機窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、大豆分解物、尿素等を、無機窒素源としては、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等を例示することができる。無機塩類としては、リン酸塩、硫酸マグネシウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、銅、マンガン、亜鉛、塩化カルシウム、硫酸第一鉄等を例示することができる。
【００１１】
本発明に係る新規微生物は油脂の分解特性に優れるので、例えば、油脂含有廃棄物の処理に好適に使用することができる。特に、本発明に係る新規微生物は油脂の分解特性に優れるので、油脂の含有量が比較的多い廃棄物をコンポスト化する際の廃棄物を発酵分解する微生物として好適に利用することができる。
【００１２】
次いで、上述した新規微生物によって油脂含有廃棄物を処理する方法について説明する。
本発明に係る処理方法で分解処理される廃棄物は、牛脂、豚脂、鶏脂、魚脂などの動物性油脂、大豆油、菜種油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ひまわり油、パーム油、落花生油、やし油、亜麻仁油、カカオ油、ごま油、米糠油などの植物性油脂、或いは硬化油、マーガリン、バター、ショートニングなどの加工油脂を含有する廃棄物である。
油脂含有廃棄物の例としては、一般家庭、飲食店、食品工場などから排出される、魚介類などの水産廃棄物、家畜などの肉、脂肪分や臓器などの畜産廃棄物、揚げ物、揚げかす、廃油などの廃棄物、或いは排水処理で発生するスカムや汚泥などが挙げられる。
【００１３】
廃棄物中に含まれる油脂の含有量は特に限定されないが、廃棄物の乾燥重量中、０．１〜６７重量％、好ましくは１〜３３重量％程度とされる。
また油脂含有廃棄物の含水率は特に限定されないが、油脂を除く湿重量当り、２０〜６５重量％、好ましくは４０〜６０重量％程度とされる。含水率が低い場合は、水を添加して油脂含有廃棄物の含水率を調節することが好ましい。
【００１４】
本発明に係る油脂含有廃棄物では、廃棄物を分解処理する際に副資材を添加することができる。副資材としては、樹皮、おが屑、籾殻、米糠、ふすまなどを例示することができる。
副資材の添加量は特に限定されないが、油脂含有廃棄物の乾燥重量の１０〜９０重量％、好ましくは５０〜７０重量％とされる。
【００１５】
油脂含有廃棄物の分解には、Bacillus属に属する新規微生物（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２４０）が用いられる。本発明では、少なくともBacillus属に属する新規微生物（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２４０）が含まれていれば、この他の通常のコンポスト化において利用されている酵母、放線菌などの微生物を含む微生物群を利用することもできる。
【００１６】
油脂含有廃棄物と微生物とを接触させることにより、油脂含有廃棄物の分解が行われる。油脂含有廃棄物と微生物とを接触させる方法は特に限定されず、例えば、強制攪拌を行いながら油脂含有廃棄物と微生物とを接触させて発酵分解する方法（混合攪拌法）や、油脂含有廃棄物に微生物を加えてこれらを静置状態で発酵分解する方法（堆積法）などを例示することができる。
微生物による油脂含有廃棄物の分解が良好に行われるために、微生物による廃棄物の分解温度を４０〜７０℃、好ましくは５５〜６５℃に調節することができる。
また微生物による油脂含有廃棄物の分解が好気的な条件下で行われるために、必要に応じて空気を供給することもできる。
【００１７】
本発明に係る油脂含有廃棄物の処理方法では、Bacillus属に属する新規微生物（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２４０）が利用されるので、廃棄物中に油脂が含まれていた場合であっても廃棄物を分解処理することができる。即ち、Bacillus属に属する新規微生物（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２４０）が廃棄物中に含まれる油脂を分解することで、微生物と油脂以外の廃棄物とを接触した状態にすることができ、好気性条件下で廃棄物を効率良く短期間で分解することができる。
油脂含有廃棄物を好気性条件下で効率良く短期間で処理することができるので、アンモニア臭などの悪臭の発生も抑えることができる。
本発明に係る油脂含有廃棄物の処理方法を廃棄物のコンポスト化に適用すれば、アンモニアなどの悪臭の発生も無く、廃棄物を短期間で効率的にコンポスト化することができる。
【実施例１】
【００１８】
油脂含有廃棄物のコンポスト化において、油脂が良好に分解されているときの油脂分解過程を解明するとともに、油脂分解に関与する微生物を特定するために、以下の試験を行った。
【００１９】
１．コンポスト原料
コンポスト原料の主材料としては、再現性のあるデータを得ることができる点を考慮して、市販のドッグフード（商品名「New Vita-One Soft」、日本ペットフード株式会社製）を使用した。ドッグフードの炭素の元素分析値は47.03％であり、窒素の元素分析値は5.28％であり、Ｃ／Ｎ比は8.91であった。
市販のドッグフードの成分はメーカー分析値で、粗タンパク質27.8％以上、粗脂質8.9％以上、粗繊維4.4％以上であった。
コンポスト原料は、主材料である市販のドッグフードを挽肉機で１ｍｍ程度に磨砕し、通気性原料であるおが屑及び市販の種菌を、乾燥重量比で１０：９：１の割合で混合して、コンポスト原料（以下、Ａ原料という場合がある。）とした。
また主材料である市販のドッグフードの粗脂質は8.9％以上であるが、17％程度の脂肪を含有する生ごみも存在することから、ドッグフードのみでは脂肪含有量が少ないと考えられるので、市販のラードを加えたコンポスト原料も調製した。即ち、上記Ａ原料に市販のラード（商品名「マリンピュアラード」、マリンフード株式会社製）を、ドッグフードの乾燥重量５に対して２の割合で添加して、ラード添加コンポスト原料（以下、Ｂ原料という場合がある。）を調製した。
Ａ原料及びＢ原料ともに、消石灰を用いてｐＨを約8.5に調整した。またＡ原料及びＢ原料の含水率は、ラードを添加しない状態で蒸留水を加えて約60％とした。
【００２０】
２．コンポスト化操作
この試験で使用した実験装置の概略図を図１に示す。図１に示す実験装置（１０）は、フローメータ（１１）と、炭酸ガストラップ（１２）と、バブラー（１３）と、小型コンポスト化装置（１４）と、から構成されており、フローメータ（１１）で流量を調節された空気は、炭酸ガストラップ（１２）及びバブラー（１３）を通過した後、フィルター（１４１）を介して小型コンポスト化装置（１４）に供給される。小型コンポスト化装置（１４）内を通過して、小型コンポスト化装置（１４）から排出された空気は、フィルター（１４６）を介してテドラーバッグ（１５）内に回収される。
炭酸ガストラップ（１２）と、バブラー（１３）と、小型コンポスト化装置（１４）と、テドラーバッグ（１５）は、インキュベータ（１６）内に置かれている。
小型コンポスト化装置（１４）は、ガラス製筒体（１４４）の上端開口部と下端開口部がそれぞれシリコーンゴム栓（１４２，１４５）によって密封されることにより構成されている。小型コンポスト化装置（１４）内にはステンレス製スクリーン（１４３）が設けられており、このステンレス製スクリーン（１４３）上にコンポスト原料（Ｘ）が充填される。
【００２１】
コンポスト原料は、容量105ｍＬの小型コンポスト化装置（１４）に充填して実験を開始した。インキュベータ（１６）内の温度は60℃の一定温度となるように調整した。また通気速度は、小型コンポスト化装置（１４）内を好気条件に維持するのに十分である約5.0mL／分に調整した。
小型コンポスト化装置（１４）からの排気ガスは、テドラーバッグ（１５）に捕集し、12時間毎に取り換えた。ガス検知管によって、排気ガス中の炭酸ガス濃度とアンモニア濃度を定量するとともに、排気ガスの容量を積算ガス流量計により測定して、12時間毎の炭酸ガス発生量及びアンモニア発生量を算出した。
さらに、算出した炭酸ガス発生量及びアンモニア発生量から、炭酸揮散率及び窒素揮散率をそれぞれ算出した。炭酸揮散率は、ラードの添加の有無に関わらず元素分析で求めた投入ドッグフード中の全炭酸量に対して、その時間までに炭酸ガスとして発生した炭酸量の比と定義した。このために、添加したラードが活発に分解されれば、炭酸揮散率が100％を超えることもあり得る。窒素揮散率も炭酸揮散率と同様の方法で算出した。
なお、コンポスト化にともない変化するラードの分解率は、Ａ原料とＢ原料の炭酸ガス発生量の差をラードの分解に伴って発生した炭酸ガス量とし、これをラードの元素分析値から求めた添加ラード中の炭素量で除して算出した。
【００２２】
コンポスト化の均一な進行を目的として、一日に一度、小型コンポスト化装置（１４）のシリコーンゴム栓（１４５）を開けて、コンポスト原料（Ｘ）を混合攪拌した。混合攪拌の際に、サンプルを採取して、含水率、ｐＨ及び微生物濃度を測定した。
微生物濃度は、全菌及び脂肪分解菌を測定した。それぞれ、TS培地及びLBTR培地を用い、希釈平板法を適用した。混合攪拌時に採取したサンプルは、まず、９倍量の滅菌水を加え、ホモジナイズ処理をした。次いで、サンプル懸濁液を希釈して、TS培地及びLBTR培地に植菌した。60℃で３日間培養した後、コロニー数を計算した。なお、脂肪分解菌はLBTR培地上でコロニー周囲にハローを形成したものとした。
【００２３】
［TS(Trypticase-soy)培地］
Trypticase peptone (BBL社製)        17g
Phytone peptone (BBL社製)            3g
NaCl (和光純薬工業社製)              5g
K2HPO4 (和光純薬工業社製)          2.5g
Glucose (和光純薬工業社製)         2.5g
Agar (和光純薬工業社製)             20g
Distilled water                  1000mL
pH＝7.3
【００２４】
［LBTR培地組成］
Phytone peptone (BBL社製)           10g
Yeast extract (BBL社製)              5g
NaCl (和光純薬工業社製)              5g
Tributyrin (和光純薬工業社製)       5mL
Brij 58 (Aldrich Chemical)           5g
Gellen gum (和光純薬工業社製)       10g
Distilled water                  1000mL
pH＝7.3
【００２５】
３．コンポスト中の微生物叢の測定
コンポスト中の微生物叢は、PCR−RFLP法を用いて測定した。コンポストサンプルを滅菌水に懸濁し、遠心分離により菌体を回収した。回収した菌体は、溶菌した後、タンパク質及び脂質を除去した。
次いで、得られた上清にエタノールを添加してDNAを沈殿回収し、精製した。
精製したDNAは16S rDNA領域をTaKaRa LA Taqを用いてPCRで増幅した。PCRのプライマーには、26Fおよび1393Rを用い、増幅条件は、まず92℃２分の変性を行った後、94℃１分（変性）、68℃１分（アニーリング）、72℃２分（伸長）を36サイクル行った。ただし、アニーリングの温度は68℃から１サイクル毎に２℃ずつ下げ、56℃に達した後は一定とするタッチダウン法を用いた。PCR増幅産物は制限酵素Hae IIIで切断して、サブマリン型の電気泳動装置で50V、210分泳動し、その泳動パターンを測定した。またマーカーとしては、100bp DNA Ladder（インビトロゲン）を使用した。
【００２６】
４．考察
（１）炭酸ガス発生量
Ａ原料及びＢ原料によるコンポスト化におけるそれぞれの炭酸ガス発生量、アンモニアガス発生量の経時変化を示すグラフを図２に示す。
炭酸ガス発生量は、いずれの原料を用いた場合でも、コンポスト化開始36時間付近でピークに達した。Ａ原料によるコンポスト化では、その後、炭酸ガス発生量が速やかに低下したが、Ｂ原料によるコンポスト化では、72時間付近までＡ原料によるコンポスト化と同様の低下傾向にあるものの、その後再上昇し、Ａ原料と顕著な差異が確認された。
コンポスト化初期に、Ａ原料によるコンポスト化と、Ｂ原料によるコンポスト化で差異が殆ど確認されないのは、Ｂ原料程度の脂肪添加量では、ドッグフードの分解を阻害する影響は小さいためと考えられる。
また、コンポスト化84時間以降になるとＢ原料によるコンポスト化がＡ原料によるコンポスト化に比べて炭酸ガス発生量が大きくなるので、この時間付近から脂肪の分解が活発化しているものと考えられる。
【００２７】
（２）アンモニアガス発生量
Ａ原料によるコンポスト化では、72時間後にアンモニア発生量がピークに達した後、速やかに低下したが、コンポスト化終了までアンモニアは発生し続けた。
Ｂ原料によるコンポスト化では、Ａ原料によるコンポスト化と同様に72時間後にアンモニア発生量がピークに達した後、アンモニア発生量は低下し、96時間を経過する付近から全く発生しなくなった。Ｂ原料によるコンポスト化において、アンモニア発生量が低下した理由としては、ラードの分解にともなって生成した有機酸によるアンモニアの中和作用やアンモニアがラード分解菌の菌体合成のための窒素源として利用されたことなどが考えられる。
【００２８】
（３）炭素揮散率
Ａ原料及びＢ原料によるコンポスト化におけるそれぞれの炭素揮散率の経時変化を示すグラフを図３に示す。
炭酸ガス発生速度の差がコンポスト化84時間以降に大きくなることを反映して、84時間以降にＡ原料によるコンポスト化とＢ原料によるコンポスト化との間で炭素揮散率に大きな差が生じた。
【００２９】
（４）ラード分解率
Ｂ原料によるコンポスト化におけるラード分解率の経時変化を示すグラフを図４に示す。
コンポスト化84時間付近からラードの分解率が上昇し、240時間後には、ラード分解率は約60％に達した。
Ｂ原料によるコンポスト化の条件で、ラードが良好に分解されることが確認された。
【００３０】
（５）菌体濃度
Ｂ原料によるコンポスト化における菌体濃度の経時変化を示すグラフを図５に示す。なお、図中には、全菌数とLBTR培地で計数した脂肪分解菌濃度を記入した。
Ｂ原料によるコンポスト化では、全菌数はコンポスト化48時間まで速やかに増加し、コンポスト化終了時には、約2.8×10９CFU/g-dsの高濃度に達した。
脂肪分解菌はコンポスト化全般にわたって全菌の約10％程度となっており、濃度変化の傾向も全菌濃度とよく類似していた。ラードの活発な分解がコンポスト化84時間付近から始まるにも関わらず、脂肪分解菌の増殖はコンポスト化開始直後から速やかに起っている。この時間の不一致は、脂肪分解菌がコンポスト中で脂肪だけを分解するのではなく、糖やタンパク質など他の基質があるときにはそれらも利用できるばかりでなく、むしろそれらの物質を優先して取り込むためと考えることで説明することができる。
なお、Ｂ原料によるコンポスト製品からLBTR培地上で脂肪分解菌LT1株を単離した。LT1株は数種類存在する脂肪分解菌の中でも数的に圧倒的に優勢であった。LT1株の生理的性状、形態学的特徴については、後述する。
【００３１】
（６）PCR−RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）パターン
Ａ原料及びＢ原料によるコンポスト化におけるそれぞれのPCR−RFLPパターンを示す写真を図６に示す。
Ａ原料によるコンポスト化とＢ原料によるコンポスト化では、RFLPパターンに変化が生じたが、中でも、原料Ｂによるコンポスト化では、コンポスト化後半におよそ700bp付近のバンド（バンド１）の輝度が上昇し、この遺伝子断片を有する微生物が増殖していることが分かる。
またＡ原料によるコンポスト化では、コンポスト後半に特徴的な300bp〜400bpｂｐの３本のバンド（バンド２、バンド３、バンド４）は、Ｂ原料によるコンポスト化では輝度が極めて低いことから、ラードを添加することで、微生物叢変化に影響することが確認された。
【００３２】
尚、バンド１は脂肪分解菌に由来するものであることが推定されるので、LBTR培地上でハローを形成し、脂肪分解菌であることが確認されているLT1株のRELPパターンを検定した。Ｂ原料によるコンポスト化におけるPCR−RELPパターンとともに、図７に示す。
図７に示すように、LT1株とＢ原料によるコンポスト化後半において輝度が上昇するバンドは一致しており、原料Ｂによるコンポスト化において、脂肪分解微生物の増殖は、RFLPの解析によっても確認された。
【実施例２】
【００３３】
実施例１で単離された脂肪分解菌LT1株を同定するために、以下の試験を行った。
【００３４】
（１）形態的性質及び生理・生化学的性質
検体を平板培地に植菌し、55℃で２日間培養した。その後、この培養検体を分析の供試菌株とした。
光学顕微鏡BX50F4（オリンパス社）によって、細胞形態、グラム染色性、胞子の有無、鞭毛による運動性の有無を観察した（撮影倍率×1500、引き伸ばし倍率×2000）（BARROW,(G.I.) and FELTHAM,(R.K.A.):Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rd edition. 1993, Cambridge University Press.)）。
培地平板上でコロニー形態を観察した。また、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス産生、ブドウ糖の酸化／発酵（０／Ｆ）について試験を行った（BARROW,(G.I.) and FELTHAM,(R.K.A.):Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rd edition. 1993, Cambridge University Press.)）。
結果は以下の通りである。
【００３５】
［形態的性質及び生理・生化学的性質］
培養温度：５５℃
細胞形態：桿菌（0.8×2.0〜3.0μｍ）
グラム染色性：＋
胞子の有無：＋
運動性：−
コロニー性状：培養時間、48時間
不規則、周縁波状、低くて平ら、やや光沢あり、淡黄色
生育温度試験（37℃）：−
生育温度試験（45℃）：＋
カタラーゼ反応：＋
オキシダーゼ反応：＋
グルコースからの酸／ガス産生（酸産生／ガス産生）：−／−
Ｏ／Ｆテスト（酸化／発酵）：−／−
嫌気での生育性：−
【００３６】
分類学的比較性状を調べるために、APIシステム（ビオメリュー社）を用いて、検体の生理・生化学的性状を調べた。操作はAPIシステムの測定方法（API50CHBの測定方法（50430））に従った。結果は以下のとおりである。
【００３７】
［発酵性試験］
グリセロール：−
エリスリトール：−
Ｄ−アラビノース：−
Ｌ−アラビノース：＋
リボース：＋
Ｄ−キシロース：＋
Ｌ−キシロース：−
アドニトール：−
β−メチル−Ｄ−キシロース：−
ガラクトース：−
グルコース：＋
フラクトース：＋
マンノース：＋
ソルボース：＋
ラムノース：−
ズルシトール：−
イノシトール：−
マンニトール：＋
ソルビトール：−
α−メチル−Ｄ−マンノース：−
α−メチル−Ｄ−グルコース：−
Ｎ−アセチルグルコサミン：＋
アミグダリン：−
アルブチン：−
エスクリン：＋
サリシン：−
セオビオース：＋
マルトース：＋
乳糖：−
メリビオース：−
白糖：＋
トレハロース：＋
イヌリン：−
メレチトース：＋
ラフィノース：−
澱粉：＋
グリコーゲン：−
キシリトール：−
ゲンチオビオース：−
Ｄ−ツラノース：＋
Ｄ−リキソース：−
Ｄ−タガトース：＋
Ｄ−フコース：−
Ｌ−フコース：−
Ｄ−アラビトール：−
Ｌ−アラビトール：−
グルコネート：−
２−ケトグルコン酸：−
５−ケトグルコン酸：＋
【００３８】
［生化学試験］
β−ガラクトシダーゼ：−
アルギニンジヒドロラーゼ：−
リシンデカルボキシラーゼ：−
オルニチンデカルボキシラーゼ：−
クエン酸の利用性：−
Ｈ２Ｓ産生：−
ウレアーゼ：−
トリプトファンデアミナーゼ：−
インドール産生：−
アセトイン産生（ＶＰ）：−
ゼラチナーゼ：＋
硝酸塩還元：−
【００３９】
（２）16S rDNA塩基配列解析
ゲノムDNAの抽出には、InstaGene Matrix（Bio Rad、米国）を使用し、操作はBIO RAD社のプロトコールに従った。
抽出したゲノムDNAを鋳型として、PCRにより16S rRNA遺伝子（16S rDNA）の全塩基配列1500〜1600bpの領域を増幅した。その後、増幅された16S rDNAをシーケンシングし、検体の16S rDNA塩基配列を取得した。
PCRには、AmpliTaq Gold PCR Master Mix（Applied Biosystems社、米国）と、プライマー9F及び1541Rを使用した。
サイクルシーケンスには、ABI Prism BigDye Terminator v3.1 Kit（Applied Biosystems社、米国）とシーケンスプライマー８種を使用した。
サーマルサイクラーには、GeneAmp PCR System 9600（Applied Biosystems社、米国）を使用した。
DNAシーケンサーには、ABI PRISM 3100 DNA Sequencer（Applied Biosystems社、米国）を使用し、得られた塩基配列断片の結合には、AutoAssembler 2.1（Applied Biosystems社、米国）を使用した。
尚、PCRからサイクルシーケンスまでの基本的操作は各キットのプロトコールに従った。
【００４０】
解析ソフトウェアとして、MicroSeq Microbial Identification System Software V.1.4.1（Applied Biosystems社、米国）を使用し、塩基配列を解析した。結果を配列番号１に記載する。
【００４１】
次いで、２種類の塩基配列データベースに対し相同性検索を実施した。また、得られた配列を基に分子系統樹を推定した。
相同性検索の対象データベースとしては、MicroSeq Bacterial Full Gene Library v.0001（Applied Biosystems社、米国）を使用した。具体的には、BLAST（ALTSCHUL,(S.F.), MADDEN,(T.F.), SCHAFFER,(A.A.), ZHANG,(J.), ZHANG(Z.), MILLER,(W.), and LIPMAN,(D.J.): Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database serch programs. Nucleic Acids Res. 1997. 25, 3389-3402）を用いて前記データベースに対し相同性検索を実施し、相同率が上位10位までの配列を取得した。その後、検体の16S rDNA塩基配列と検索された上位10配列を用いて近接結合法（SAITOU,(N.) and NEI,(M.):The neighbor-joining method:a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 1987, 4, 406-425）により分子系統樹を推定した。
相同性検索の結果を表１に、推定された分子系統樹を図８に、それぞれ示す。
【００４２】
【表１】
2006109780.tif 000003
【００４３】
さらに、より多くの情報を得るため国際塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL）に対して相同性検索を実施した。具体的には、米国NCBIが提供するオンラインサービスにより、BLASTを用いて国際塩基配列データベースに対して相同性検索を実施した。相同性検索では相同率が上位20位までの配列についてデータを取得した。
相同性検索の結果検索された上位20位のエントリーを図９に示す。また本検体の塩基配列とエントリー上位５位の塩基配列との相同性の比較を表２に示す。
【００４４】
【表２】
2006109780.tif 000004
【００４５】
（３）結果
形態観察及び生理・生化学性状試験の結果、本検体はグラム染色陽性、桿菌、芽胞形成、好気条件下での生育性、カタラーゼ反応陽性など、Bacillus（SNEATH,(P.H.A.), MAIR,(N.S.) SHARPE,(M.E.) and HOLT,(J.G.):Bergey's manual of Systematic Bacteriology. Vol.2. 1984, Williams and Wilkins, Baltimore.）やPaenibacillus（SHIDA(O.), TAKAGI(H.), KADOWALI(K.), NAKAMURA(L.K.), and KOMAGATA(K.): Transfer of Bacillus alginilyticus, Bacillus chondroitinus, Bacillus curdlanolyticus, Bacillus glucanolyticus, Bacillus kobensis, and Bacillus thiaminolyticus to the genus Paenibacillus and emended description of the genus Paenibacillus. Int.J.Syst.Bacteriol., 1997, 47, 289-298）などBacillales目（SKERMAN,(V.B.D.), MCGOWAN,(V.), and SNEATH,(P.H.A.)(editors): Approved lists of bacterial names. Int. J. Syst. Bacteriol. 1980, 30, 225-420）（GARRITY,(G.M.), and HOLT,(J.G.), "Taxonomic Outline of the Archaea and Bcteria." In:Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed., vol.1 (The Archaea and the deeply branching and phototrophic Bacteria) (D.R. Boone and R.W. Castenholz, eds.), Springer-Verlag, New York. 2001. pp.155-166））に属する有芽胞桿菌に類似の性状を示した。
APIシステムを使用した生理・生化学性状試験の結果、本検体は、Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、グルコース、フラクトース、マンノース、ソルボース、マンニトール、Ｎ−アセチルグルコサミン、エスクリン、セオビオース、マルトース、白糖、トレハロース、メレチトース、澱粉、Ｄ−ツラノース、Ｄ−タガトース、５−ケトグルコン酸、ゼラチナーゼの試験項目で陽性を示した。本検体の嫌気的生育性は確認されず、本検体は好気性の細菌であると考えられた。
MicroSeq Bacterial Full Gene Libraryに対する相同性検索の結果、本検体の16S rDNA塩基配列は相同率89.97％でBacillus pallidus（VALIDATION LIST N24. Int. J. Syst. Bacteriol., 1988, 38, 136-137. [SCHOLZ (T.), DEMHARTER(W.), HENSEL(R.) and KANDLER(O.):Bacillus pallidus sp. nov., a new thermophilic species from sewage. Syst. Appl. Microbiol., 1987, 9, 91-96.]）の16S rDNAに対し最も高い相同性を示した。また分子系統樹上でも本検体の16S rDNAはBacillus pallidusの16S rDNAとクラスターを形成した。
国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果、本検体の16S rDNAは相同率99.9％でBacillus sp. TAT105の16S rDNAに対し最も高い相同性を示した。
高い相同率を示す既知種基準株由来の配列は検索されなかったが、上位に検索された配列の大半は、Bacillus由来の16S rDNA塩基配列と考えられ、本検体のBacillusへの帰属が示唆された。
近年の細菌分類学では、ほとんどの場合新種の記載時にその基準株について16S rDNAの塩基配列がGenBank/EMBL/DDBJなどのデータベースに登録される。よって、相同性検索で高い相同率を示す配列が検索されない場合、現時点ではそのような分類群が報告されていない可能性が高い。このような検体については詳細な帰属分類群の推定が困難である場合があり、本検体についても種レベルの帰属を推定することはできないと考えられる。形態観察、生理・生化学性状試験、分子系統解析の結果を総合すると、本検体のBacillusへの帰属が示唆され、現時点では本検体をBacillus sp.とすることが妥当であると考えられる。
本検体をBacillus sp. LT1株（RunB 192A-L）と命名して、平成１６年１０月７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。受領番号はＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２４０である。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明に係る新規微生物は優れた油脂分解特性を有するので、油脂含有廃棄物の処理に使用する微生物として用いることができる。特に油脂含有廃棄物をコンポスト化する際に好適に利用することができる。
本発明に係る油脂含有廃棄物の処理方法は、油脂を多く含む廃棄物の処理方法として、具体的には、油脂を多く含む廃棄物をコンポスト化する処理方法として、好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】実施例１で使用した実験装置の概略図である。
【図２】炭酸ガス発生量、アンモニアガス発生量の経時変化を示すグラフである。
【図３】炭素揮散率の経時変化を示すグラフである。
【図４】Ｂ原料によるコンポスト化におけるラード分解率の経時変化を示すグラフである。
【図５】Ｂ原料によるコンポスト化における菌体濃度の経時変化を示すグラフである。
【図６】（Ａ）はＡ原料によるコンポスト化におけるPCR−RFLPパターンを示す写真であり、（Ｂ）はＢ原料によるコンポスト化におけるPCR−RFLPパターンを示す写真である。
【図７】LT1株のRFLPパターンと、Ｂ原料によるコンポスト化におけるPCR−RFLPパターンを示す写真である。
【図８】本検体と近縁株との近縁接合法による分子系統樹である。
【図９】国際塩基配列データベースに対して実施した相同性検索の結果検索された上位20位のエントリーである。
【符号の説明】
【００４８】
１０            実験装置
１１            フローメータ
１２            炭酸ガストラップ
１３            バブラー
１４            小型コンポスト化装置
１４１          フィルター
１４２          シリコーンゴム栓
１４３          ステンレス製スクリーン
１４４          ガラス製筒体
１４５          シリコーンゴム栓
１４６          フィルター
１５            テドラーバッグ
１６            インキュベータ
Ｘ              コンポスト原料
【図１】
2006109780.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2006109780.tif 000009
【図６】
2006109780.tif 000010
【図７】
2006109780.tif 000011
【図８】
2006109780.tif 000012
【図９】
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【配列表】
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