(57)【要約】【課題】  ヒトのシナプス小胞モノアミントランスポーター２遺伝子の遺伝子多型を検出することにより、薬物依存症、特にメタンフェタミン依存症に対する発症危険性や進行度、重症度などの遺伝的感受性を予測することができるようにする。【解決手段】  ヒトのシナプス小胞モノアミントランスポーター２遺伝子の遺伝子多型を検出することにより、該遺伝子多型からメタンフェタミン依存性の遺伝的素因を解析・判定する。また、ヒトのシナプス小胞モノアミントランスポーター２遺伝子における薬物依存性に関連する遺伝子多型であって、NCBI登録配列AC005880による３５８６８番目の塩基に存在する一塩基多型であるシナプス小胞モノアミントランスポーター２遺伝子の遺伝子多型。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトのシナプス小胞モノアミントランスポーター２遺伝子の遺伝子多型を検出することにより、該遺伝子多型からメタンフェタミン依存性の遺伝的素因を解析・判定することを特徴とするメタンフェタミン依存性の判定方法。
【請求項２】
前記遺伝子多型がNCBI登録配列AC005880による３５８６８番目の塩基に存在する一塩基多型であることを特徴とする請求項１に記載のメタンフェタミン依存性の判定方法。
【請求項３】
前記遺伝子多型がNCBI登録配列AC005880による３５８６８番目の塩基のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換が検出された時に、メタンフェタミン依存性の程度が低いと判定することを特徴とする請求項１に記載のメタンフェタミン依存性の判定方法。
【請求項４】
ヒトのシナプス小胞モノアミントランスポーター２遺伝子における薬物依存性に関連する遺伝子多型であって、
NCBI登録配列AC005880による３５８６８番目の塩基に存在する一塩基多型であることを特徴とするシナプス小胞モノアミントランスポーター２遺伝子の遺伝子多型。
【請求項５】
前記薬物がメタンフェタミンであることを特徴とする請求項４に記載のシナプス小胞モノアミントランスポーター２遺伝子の遺伝子多型。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタンフェタミン依存性の判定方法に関し、さらに詳しくは、ヒトのシナプス小胞モノアミントランスポーター２遺伝子の遺伝子多型を検出することによりメタンフェタミン依存性の遺伝的素因を判定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
メタンフェタミン(MAP)は精神興奮作用を持ち、強い依存性薬物である。MAPの使用により強い精神依存に陥り、反復使用により精神症状を来すようになる。この症状は妄想型の統合失調症様である。MAPはモノアミンの神経伝達を変化させる。中でもドーパミン(DA)は最も直接的に報酬効果に関わっている。ドーパミン神経伝達系は報酬の神経回路において重要な部位を占めている。MAPを急性投与するとDAはトランスポーター依存に逆輸送され、さらにMAPはシナプス小胞のプロトンの濃度勾配を変化させシナプス小胞より細胞内にDAを放出させ、細胞外のDA濃度は上昇する。MAPを反復投与すると逆耐性が起こるがこれはヒトにおける精神症状や依存と同じような神経系の可塑的変化が起こったためと考えられる。この逆耐性に関わる生化学的な機能は十分には明らかにされていないが、逆耐性には多くの生化学的なステップが関わっていると思われる。
【０００３】
ヒトのシナプス小胞モノアミントランスポーター２(VMAT2)は、染色体上10q25に位置する。VMAT2はドーパミン、ノルエピネフリン、セロトニン、ヒスタミンを含むモノアミンを細胞質からシナプス小胞にシナプス小胞膜にあるプロトンの濃度勾配を利用してくみ上げる。アンフェタミンとその誘導体はVMAT2によりくみ上げられたモノアミンをシナプス小胞から放出させる。
【０００４】
マウスのVMAT2がクローニングされ、VMAT2遺伝子欠損マウスが作成された。しかしホモ遺伝子欠損マウスは生後数日以内に死亡した。ヘテロ遺伝子欠損マウスでは、アンフェタミンによる報酬行動は場所嗜好性試験で抑制されたが、運動量はむしろ増加した（非特許文献１参照）。線条体での細胞外ドーパミン濃度、カリウムやアンフェタミンによるドーパミンの放出は、ヘテロ遺伝子欠損マウスで減少していた（非特許文献２参照）。アンフェタミンによる逆耐性や致死性も変化していた（非特許文献３参照）。
【０００５】
VMAT2遺伝子多型と精神神経疾患との相関解析は多剤薬物依存ばかりではなく、統合失調症やパーキンソン病でも行われた。VMAT2はレセルピンの標的であるが、この薬剤は高血圧や統合失調症の治療薬として使われている。PersicoらはVMAT2遺伝子のTaqI RFLP多型について、統合失調症圏にある16家系の156名を用いて解析した（非特許文献４参照）。彼らは近い相関性があるという可能性がないという結果を得た。しかし、中から低い程度の相関について解析するには統計的なパワーがなく、統合失調症発症リスクのVMAT2遺伝子多型の可能性を残した。Kunugiらは、エキソンとその近傍のイントロンについて解析し、それぞれエキソンに２カ所、イントロンに４カ所のSNPを見いだした。日本人の統合失調症家系について解析したが、相関は見いだせなかった（非特許文献５参照）。多剤薬物依存とパーキンソン病についてエキソン１の5’上流5kbpにある不完全な繰り返し多型(CA)の７あるいは１４繰り返しとGAGAAA配列を挟んだ（GA）の１１あるいは９繰り返しについて解析された。しかし結果は有意ではなかった（非特許文献３参照）。
【０００６】
多くの依存性薬剤があるものの、その作用部位は様々である。MAPとその誘導体はVMAT2に作用する。従って、VMAT2遺伝子の多型がMAP依存の個人間の脆弱性に関わっていることが考えられ、この多型は多剤薬物依存よりもMAP依存で見いだされると思われる。
【０００７】
【非特許文献１】Takahashi,N.,L.L.Miner,et al.(1997)."VMAT2 knockout mice:heterozygotes display reduced amphetamine-conditioned reward,enhanced amphetamine locomotion,and enhanced MPTP toxicity."Proc Natl Acad Sci USA 94(18):9938-43.
【非特許文献２】Wang,Y.M.,R.R.Gainetdinov,et al.(1997)."Knockout of the vesicular monoamine transporter 2 gene results in neonatal death and supersensitivity to cocaine and amphetamine."Neuron 19(6):1285-96
【非特許文献３】Uhl,G.R.,S.Li,et al.(2000)."The VMAT2 gene in mice and humans:amphetamine responses,locomotion,cardiac arrhythmias,aging,and vulnerability to dopaminergic toxins."Faseb J 14(15): 2459-65.
【非特許文献４】Persico,A.M.,Z.W.Wang,et al.(1995)."Exclusion of close linkage between the synaptic vesicular monoamine transporter locus and schizophrenia spectrum disorders."Am J Med Genet 60(6):563-5.
【非特許文献５】Kunugi,H.,S.Ishida,et al.(2001)."Exon/intron boundaries,novel polymorphisms, and association analysis with schizophrenia of the human synaptic vesicle monoamine transporter(SVMT) gene."Mol Psychiatry 6(4):456-60.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
メタンフェタミンは日本における最もありふれた非合法薬剤であり、近年患者も急増している。そこで、メタンフェタミン依存性に対する遺伝的素因マーカーとなりうる遺伝子多型を特定することができれば、疾患の進行度や予後をある程度予測でき、より効果的な治療が可能となる。そこで本発明は、メタンフェタミン依存の遺伝的素因マーカーとなりえる遺伝子多型を見出し、メタンフェタミン依存性を判定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、本発明では、VMAT2遺伝子のエキソン１およびその5’上流を含む5.7kbpにわたって日本人の遺伝子多型を解析し、VMAT2遺伝子と日本人のMAP依存患者について相関を解析し、メタンフェタミン依存性の判定方法について新しい知見を得た。
【００１０】
すなわち本発明は、ヒトのシナプス小胞モノアミントランスポーター２遺伝子の遺伝子多型を検出することにより、該遺伝子多型からメタンフェタミン依存性の遺伝的素因を解析・判定することを特徴とするメタンフェタミン依存性の判定方法である（請求項１）。
【００１１】
また本発明においては、前記遺伝子多型がNCBI（National Center for Biotechnology Information、米国）登録配列AC005880による３５８６８番目の塩基に存在する一塩基多型であることが望ましく、さらに、前記遺伝子多型がNCBI登録配列AC005880による３５８６８番目の塩基のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換が検出された時に、メタンフェタミン依存性の程度が低いと判定するものであることが好ましい（請求項２および請求項３）。
【００１２】
さらに本発明によれば、ヒトのシナプス小胞モノアミントランスポーター２遺伝子におけるメタンフェタミン依存性に関連する遺伝子多型であって、
NCBI登録配列AC005880による３５８６８番目の塩基に存在する一塩基多型であることを特徴とするシナプス小胞モノアミントランスポーター２遺伝子の遺伝子多型が提供され、特に前記薬物がメタンフェタミンであることを好適とする（請求項４および請求項５）。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ヒトのシナプス小胞モノアミントランスポーター２遺伝子の遺伝子多型を検出することにより、薬物依存症、特にメタンフェタミン依存症に対する発症危険性や進行度、重症度などの遺伝的感受性を予測することができ、より効果的な治療が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の具体的な実施の形態について説明する。
メタンフェタミン(MAP)は精神興奮活性を持ち、依存性である。MAP依存におけるドーパミン神経伝達の関与は多くの研究から示唆されている。脳に発現するシナプス小胞モノアミントランスポーター（VMAT2）は、ドーパミン、ノルエピネフリン、セロトニン、ヒスタミンといったモノアミンを細胞質からシナプス小胞へ取り込むことから、我々はVMAT2遺伝子変異がMAP依存に関連するのではないかと考えた。この仮説を検証するため、我々はまず１３人のMAP依存患者群及び１２人のコントロール群についてVMAT2遺伝子のエキソン１から5’上流域にわたる5.7kbpについて遺伝子変異を検索した。19カ所の１塩基多型（SNP）と２カ所の２塩基多型（DNP）を見いだした。このうち16SNPは新規であり、３SNPは報告されていた。２DNPはすでに知られている(CA)mGAGAAA(GA)n多型を構成する。SNPとDNPの一部について著しい連鎖不平衡(LD)を見いだした。169人の患者群と212人のコントロール群を用いて見いだした多型について相関解析を行った。NCBI登録配列AC005880による35868番目のSNPとMAP依存についてアレル頻度でP=0.0002、ジェノタイプ頻度でP=0.0008といった強い相関を見いだした。このNCBI登録配列AC005880による３５８６８番目の塩基に存在する一塩基多型は少なくとも32389番目と37506番目の間に広いLDを有していた。これらの結果はVMAT2遺伝子多型はMAP依存の脆弱性因子であることを示唆する。
【実施例】
【００１５】
実施例１
（対象）
169人の患者群サンプルと212人のコントロール群のサンプルを用いた。患者群（男性137名、女性32名、37.6±12.0才）はMAP依存でありICD-10DCRを満たす精神疾患(F15.2及びF15.5)を持っており、入院および外来患者である。患者は静脈内注射や吸入によってMAPを摂取した。MAPの依存症患者と精神疾患を持った患者を区別しなかった。殆どの患者は精神症状を伴っていた。患者群は統合失調症や精神疾患、その他の身体的精神疾患の診断があれば除外した。コントロール群（男性111名、女性101名、41.2±12.5才）は問診により過去や家族歴に薬物依存や精神疾患のない健常人とし、大半は医療関係者であった。全てのサンプルは日本人であり、生まれと居住は九州北部、瀬戸内、中京、東海、関東地域と日本のうちでも限られた地域とした。
【００１６】
本研究は、JapaneseGenetics Initiative for Drug Abuse(JGIDA)の各施設において倫理委員会の承認を得て実施し、全ての被験者についてDNAサンプルを本研究に用いることについて書面による同意を得た。被験者から同意を得たのち、DNA抽出のために血液を採取した。ゲノムDNAはフェノール／クロロフォルム法により末梢血から得た。
【００１７】
（VMAT2遺伝子多型部位の同定）
まず最初に、MAPサンプル１３名分とコントロール群１２名分について、VMAT2遺伝子（NCBI登録配列AC005880）内の遺伝子多型を検索した。5.7kbpにわたる5’上流とエキソン1の領域について２カ所に分けて解析した。一つ目の部分は、エキソン１と5’プロモータ部分を含む2.4kbpの断片で、3Fと6RプライマーでPCR法により増幅した。それぞれのプライマー配列は次の表１に示すとおりである。
【００１８】
【表１】
2006141330.tif 000002
【００１９】
PCR産物はBigDye ターミネーター法によりABI3100遺伝子解析装置により両側から配列解析した。プライマーには3F,3R,4F,4R,5F,5R,6F,6Rを用いた。二つ目の部分は、エキソン１よりさらに上流側で、4.0kbpの断片である。PCR法により1Fと３Rプライマーにより増幅した。PCR産物は1F,1R,2F,2R,3F,3R,7F,7R,8F,8R,9F,9R,10F,10R,11F,11Rの各プライマーにより配列解析を行った。35645,35744,35858 SNPの遺伝型の決定には、3F-6RプライマーでPCR産物の増幅を行い、3Fおよび3Rでシークエンスした。
【００２０】
（患者の症状によるサブグループ化）
症状別に検討する場合、４つの指標について、２−３のサブグループに分けて行った。(A)初回MAP摂取から発症するまでの期間：MAPによる精神症状過程は患者により異なり、患者によっては初回MAP摂取からの発症が短い。発症期間の中間値は３年である。そこで、初回MAP摂取から発症までの期間について２つに分けた。即ち、３年未満（N=64,平均0.76年）、３年以上(N=68,平均9.4年)。（B）最後にMAPを摂取した後からの幻覚妄想の生じている期間：患者によってはMAPを止めても継続的に幻覚妄想が出現してくる。幻覚妄想の出現しやすさは少なくても部分的には遺伝子変化によって規定されている。我々は以前ドーパミントランスポーター遺伝子の変異が幻覚妄想の出現しやすさに関わっていることを報告している。そこでMAPを止めてから短い期間で終わるタイプと長いタイプの２群に分けた。短いタイプはMAPを止め、神経学的な治療を開始後１ヶ月以内に改善するタイプであり、長いタイプは１ヶ月以上続くタイプである。(C)自然再燃：MAPによる精神病を発病した場合、MAPを摂取しなくても緩解期に再燃しやすいことが知られている。MAPによる精神病の患者の脳内ではMAPの繰り返し摂取により逆耐性が起こっており、これが再発の神経化学的な基礎となっている。そこで、患者群を自然再燃のある群とない群に分けた。(D)多剤乱用：薬剤を使用する内容によって３群に分けた。MAPのみ（N=52）,MAPと入手しやすい合法薬剤（アルコール、鎮静剤、睡眠剤など,N=58）、MAPと日本では入手しにくい非合法薬剤（コカイン、ヘロインなど,N=52）。日本では、MAPは非合法薬剤の中で比較的入手しやすい。そこで、薬剤の探索行動の強さに応じて多剤薬物依存の状態をMAPのみ、MAPと合法薬剤、MAPと非合法薬剤の３群に分けた。
【００２１】
（統計解析）
各遺伝子多型部位の連鎖不平衡の解析にはhttp://anthropologie.unige.ch/arlequinから入手したarlequinプログラムを用いた。NCBI登録配列AC005880による35645,35744,35858番目の各一塩基多型（SNP）についてカイ平衡検定によりHardy-Weinberg平衡を検定した。患者―コントロール群間のアレル頻度とジェノタイプ頻度の比較には、カイ平方検定を用いた。統計解析の有意水準はα=0.05とした。
【００２２】
（結果）
VMAT2遺伝子多型解析
VMAT2遺伝子多型を同定するため、我々はMAP患者１３名とコントロール群１２名分のゲノムDNAについてエキソン１と5’プロモータ領域の5.7kbpにわたる部分について解析した。表２に示す19カ所の一塩基多型（SNP）と２カ所の二塩基多型(DNP)が見いだされ、うち5カ所はNCBIデーターベースに登録されていた。二カ所のDNPは(CA)mGAGAAA(GA)n多型を構成するが、これはUhlらによって報告されていた。
【００２３】
【表２】
2006141330.tif 000003
【００２４】
MAP患者群とコントロール群のアレル頻度について比較したところ、表３に示すように頻度に違いが認められた。例えば、NCBI登録配列AC005880による35868番目のSNPはMAP患者群では42%であり、コントロール群では17%であった。多型部位は、NCBIデータベース番号AC005880中の配列番号に従った。
【００２５】
【表３】
2006141330.tif 000004
【００２６】
さらにこの領域について連鎖不平衡(LD)を解析するために、サンプル数が少ないためMAP患者群とコントロール群の結果を合わせalrequinプログラムによりLDを解析した。その結果を表４に示した。
【００２７】
【表４】
2006141330.tif 000005
【００２８】
表４から分かるように、NCBI登録配列AC005880による35868番目のSNPは32389番目から37506番目の領域について9SNPと1DNPについて連鎖不平衡にあった。35645は32369と37506の領域で４SNPと1DNPについて連鎖不平衡にあった。この連鎖不平衡の結果とアレル頻度を参考にして、35645,35744,35858番目のSNPについてさらに解析することにした。
【００２９】
VMAT2遺伝子多型とMAP依存の相関解析
VMAT2遺伝子多型とMAP依存の相関を解析するため、我々は代表的な3SNPについて、169例のMAP患者群と212例のコントロール群を比較した。MAP患者群とコントロール群の  遺伝子多型のジェノタイプ頻度とアレル頻度を表５に示す。患者群とコントロール群のSNPのジェノタイプ頻度はHardy-Weinberg平衡にあり、サンプルにバイアスはなかった。35868番目のSNPではジェノタイプ頻度（P=0.0008）、アレル頻度（P=0.0002）ともに患者−コントロール群の比較で著しい違いが認められた。
【００３０】
【表５】
2006141330.tif 000006
【００３１】
NCBI登録配列AC005880による35868番目のSNPは32389番目の二塩基多型（DNP）,33051,33291,33713,35064,35459,36841,37465,37497,と37506番目の各SNPと連鎖不平衡にあった(表４参照)。DNPとSNPの半分は連鎖不平衡にあり、5’領域では広い範囲にわたって連鎖不平衡にあることが示唆された。
【００３２】
さらにNCBI登録配列AC005880による35868番目のSNPについて臨床パラメーター（発症までの期間、幻覚妄想の期間、自然再燃、多剤乱用）との相関を検討した。その結果を表６に示す。
【００３３】
【表６】
2006141330.tif 000007
【００３４】
精神症状を引き起こすまでの期間では、初回MAP摂取から３年以上で精神症状の起こる、長い群(P=0.0015)に相関が認められた。幻覚妄想の期間については、最後にMAPを摂取してから１ヶ月以内に消失する群(P=0.0005)に相関が認められた。自然再燃の有無で分けた場合、無い群（P=00016）で相関が認められた。多剤薬物依存で分けた場合、MAPと合法薬剤を使用した群（P=0.0006）で相関が認められた。
【００３５】
（考察）
我々はVMAT2遺伝子のエキソン１とプロモータ領域の5.7kbpにわたる部分について遺伝子多型を検索した。(CA)mGAGAAA(GA)nを含む５カ所の遺伝子多型部位を追試し、新たに１６カ所のSNPを見いだした。そしてSNPとDNPの一部は連鎖不平衡にあることを明らかにした。NCBI登録配列AC005880による35868番目のSNPとMAP依存について強い相関を見いだした。NCBI登録配列AC005880による35868番目のSNPは32389番目のDNP,33051,33291,33713,35064,35459,36841,37465,37497,37506番目の各SNPと連鎖不平衡にあった。35868番目のSNPの特徴を調べるために、患者群を症状に分けて解析したところ、精神症状発症までの長い（３年以上）、幻覚妄想が長続きしない（１ヶ月未満）、自然再燃のない、また、合法薬剤とMAPを使用している群で相関が認められた。
【００３６】
プロモーター領域に広い連鎖不平衡を見いだした。我々はこの連鎖不平衡がエキソンやイントロンまでわたっているかは解析していない。エキソンとイントロンの多型に注目した相関解析は２つのグループにより統合失調症のサンプルを用いて行われた。しかし両グループとも相関を認めなかった。彼らの解析した多型部位と我々の部位が連鎖不平衡にあるかは分からないが、35868番目のSNPが統合失調症と相関する可能性は残っている。
【００３７】
多剤依存と(CA)mGAGAAA(GA)n多型との間に相関が認められなかったことはUhlらによって報告された。我々は(CA)mと(GA)nを別々に評価した。この部分についてサンプル数を増やして解析はしていない。(CA)mと(GA)nはそれぞれ35645番目のSNPと35868番目のSNPと連鎖不平衡にある。35645番目のSNPはMAP依存と相関は見られないが、35868番目のSNPはMAP依存と相関が認められた。このことは時には別々に解析することが必要であることを示唆する。
【００３８】
35868番目のSNPと相関する臨床症状である精神症状発症までの長い期間、短い幻覚妄想期間そして自然再燃のないことは、MAPによる精神症状に対してこのSNPは耐性側に働いていることを示唆する。35868番目のSNPとMAPおよび合法薬剤の使用が相関することは、薬物探索行動における強さを示唆していると思われる。２から３のサブグループに分けたことから、Bonferroniによる修正を行っても相関は有意であった。
【００３９】
ドーパンミントランスポーターとMAP依存の相関はUjikeにより報告された。ドーパミントランスポーターはドーパミンを細胞外から細胞質に取り込む。VMAT2もドーパミンを取り込むがその部位は細胞質からシナプス小胞へである。ドーパミントランスポーターとVMAT2はいずれもMAPの標的分子である。これらの結果はドーパミン神経系内においてもMAP依存において多くの生化学的過程が関与していることを支持する。
まとめると、VMAT2は我々の日本人のサンプルにおいてMAP依存の脆弱性因子であることが強く示唆された。