(57)【要約】【課題】  ポリ−γ−グルタミン酸含有免疫補強剤組成物を提供し、前記免疫補強剤および抗原を含むワクチン用組成物を提供する。【解決手段】  前記ポリ−γ−グルタミン酸の分子量は１０〜１０，０００ｋＤａであり、前記抗原性物質は、ペプチド、ポリペプチド、前記ポリペプチドを発現する乳酸菌、タンパク質、前記タンパク質を発現する乳酸菌、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、組み換えバクテリア、および組み換えウイルスで構成された群より選択されたいずれか一つである。【選択図】  図１
2006232799.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ−γ−グルタミン酸と薬学的に許容される担体を含む免疫補強剤組成物。
【請求項２】
請求項１において、ポリ−γ−グルタミン酸の分子量は１０〜１０，０００ｋＤａであることを特徴とする免疫補強剤組成物。
【請求項３】
請求項１の免疫補強剤組成物および抗原性物質を含むワクチン用組成物。  
【請求項４】
請求項３において、前記抗原性物質はペプチド、ポリペプチド、該ポリペプチドを発現する乳酸菌、抗原タンパク質、該抗原タンパク質を発現する乳酸菌、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、組み換えバクテリアおよび組み換えウイルスから構成された群より選択されたいずれか一つであることを特徴とするワクチン用組成物。
【請求項５】
請求項３において、前記抗原性物質は豚伝染性胃腸炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、犬パルボウイルス抗原タンパク質ＶＰ２、またはＢ型肝炎ウイルスの表面抗原（Ｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）であることを特徴とするワクチン用組成物。
【請求項６】
請求項５において、前記核タンパク質（Ｎ）抗原性物質は、核タンパク質（Ｎ）を発現する乳酸菌であり、前記ＶＰ２抗原性物質はＶＰ２を発現する乳酸菌であることを特徴とするワクチン用組成物。
【請求項７】
請求項３において、安定剤、乳化剤、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ｐＨ調整剤、界面活性剤、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）補助剤、合成グリコペプチド、増量剤、カルボキシポリメチレン、細菌細胞壁、細菌細胞壁の誘導体、細菌ワクチン、動物ポックスウイルスタンパク質、ウイルス性物質（ｓｕｂｖｉｒａｌ）、粒子補助剤、コレラ毒素、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパンジアミン、モノホスホリル脂質Ａ、ジメチルジオクタデシル−アンモニウムブロマイドおよびこれらの混合物から構成された群より選択されたいずれか一つ以上の第２補助剤を更に含むことを特徴とするワクチン用組成物。
【請求項８】
請求項３において、前立腺癌、結腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、頭頚部癌、外陰部癌、膀胱癌、脳癌および神経膠腫で構成された群より選択されたいずれか一つ以上の疾患の予防用または治療用であることを特徴とするワクチン用組成物。
【請求項９】
請求項３の組成物を、人間を除いた動物に注入し、抗原に対する抗体産生率を高める方法。
【請求項１０】
請求項９において、前記動物は哺乳類または鳥類であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項９において、注入は皮下注射、筋肉内注射、皮下内注射、腹膜内注射、鼻腔投与、口腔投与、経皮投与および経口投与から構成された群より選択されたいずれか一つの方法で行われることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ−γ−グルタミン酸含有免疫補強剤組成物および該免疫補強剤含有ワクチン用組成物に係り、より詳しくは、免疫原性の弱い抗原と共に動物に投与して抗体産生率を高めることができるポリ−γ−グルタミン酸を含むことを特徴とする免疫補強剤、および該免疫補強剤と抗原とを含むワクチン用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在まで、抗原性タンパク質やペプチドを用いたサブユニットワクチン（ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ）、抗原遺伝子を用いた遺伝子ワクチン（ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ）、および様々な組み換えワクチンに対する研究が盛んに行われている。これらのワクチン候補物質は副作用が少ないという長所がある反面、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が弱く、これらの免疫反応を効率的に増強させる免疫補強剤（アジュバント；ａｄｊｕｖａｎｔ）の開発が当該分野で切望されているのが現状である（非特許文献１参照）。
【０００３】
ここで、免疫補強剤とは、抗原に対する特定の体液および／または細胞反応を増加させることができる物質をいう。免疫補強剤の体液性反応（Ｂ細胞反応）は、特定の抗原に対する強力な抗体反応を現わすもので、その作用は、迅速な分解代謝から抗原を保護する沈着物（ｄｅｐｏｓｉｔ）を形成すること、非特異的に免疫反応を刺激することが知られている。沈着物が形成される場合、これは抗原を取り込んで時間が経つにつれて遊離させることができるため、一定の時間、免疫系に対して刺激を延長することで、極めて少ない容量の抗原でありながら抗体反応をより持続的に維持でき、免疫補強剤自体が非特異的に免疫系の細胞を刺激して含まれた抗原に対する反応を増加させる役目、すなわちリンホカイン（ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ）のレベルを高めることで免疫反応を刺激する作用をも有する。
【０００４】
免疫補強剤の他の特徴である強力なＴ細胞媒介免疫反応（細胞性反応）の惹起は、抗原と共に投与されるとき、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって認識されて免疫系を活性化させ、予防ワクチンおよび治療ワクチンの効能を増加させる用途を有する。
【０００５】
このような免疫補強剤は、感染疾患および癌に対して宿主抵抗性を有する非特異的な刺激作用、予防ワクチンの免疫原性の相乗作用、および治療ワクチンの免疫原性の相乗作用としての用途を有する。
【０００６】
既に報告された免疫補強剤のうち代表的なものとして、フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）が挙げられる。フロイントアジュバントは、鉱物質に界面活性剤であるＡｒｌａｃｅｌ−Ａ（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ  Ｎ．Ｖ．、米国）を加えたもので、これに可溶性抗原をよく混合して懸濁液とし、皮内あるいは皮下に注射して抗体産生力を高めることで、抗体産生率が高くて実験動物に最も広く用いられる免疫補強剤としたものであるが、毒性が強くて人には使用できないという短所がある。その他、バクテリア産物であって免疫刺激効果を現わす様々な成分が同定され、免疫補強剤として開発されており（ＬＰＳ；ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ｍｕｒａｍｙｌ  ｄｅｐｅｐｔｉｄｅ，Ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  Ｂ  ｓｕｂｕｎｉｔ）、植物から分離したサポニン（Ｓａｐｏｎｉｎ）の一種であるＱｕｉｌＡと、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭｓ；ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）の形態として、特に胆汁酸塩とリン脂質などの組み合わせ調剤などが免疫補強剤として開発されている。しかし、これら大部分は安全性が確保されていない製剤である。
【０００７】
現在、免疫補強剤（アジュバント）のうち人体への使用が承認されたものは、アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ）類が唯一であるが、これは他の免疫補強剤に比べて、比較的弱い免疫反応増強効果を持っていることを現わしている。アルミニウム類は、免疫反応面においてＴｈ２免疫反応を刺激し、主に体液性免疫を増強させるため（非特許文献２参照）、細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）、Ｔ細胞免疫反応の増強が必要なワクチンの免疫補強剤として使用するのには限界がある。また、アルミニウムアジュバントを含むワクチンは、生体内でほとんど分解されず、凍結時に凝集沈降するというアルミニウム自体の物性により、凍結乾燥の形で保管することが難しいという短所がある。そして、アルミニウム化合物（硫酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなど）は、人体用ワクチンとして使用可能であるが、製造時に品質が変わりやすく、精製操作が難しいので大量生産には不向きであるという短所がある。
【０００８】
これらの免疫補強剤の他に、より安全で効果的な免疫補強剤の開発が進行されており、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）のような補強剤がワクチン抗原と共に投与されるなどの方法が当該分野で研究されている。しかし、これらのサイトカインにおいても、その安全性の面では大きく改善する必要がある。
【０００９】
大部分の病原体の浸透経路は粘膜表面であり、多くの感染が粘膜および粘膜下組織で優先的に引き起こされる。通常の非経口ワクチンは粘膜免疫反応の誘発に極めて非効率的であり、したがって、最適の粘膜免疫化のための体系の開発に格段の努力が払われてきた。これらの努力のうち、粘膜下組職の兔疫細胞に対する抗原の伝達を向上させる免疫補強剤（リポソーム、免疫刺激複合体、中心体など）の開発も併行されて、開発・実験した例が報告されている（非特許文献３参照）。しかし、粘膜免疫化が様々な状況で効果的であるとしても、多くの感染で効果的な免疫反応の誘発のためには粘膜および非粘膜免疫化の二つの結合が必要となる。
【００１０】
前記技術内容を考慮するとき、商業的に生産可能で有効なワクチンを開発するには、選択された抗原性物質の大規模的な産生をはじめ、この効果を極大化しながら安全に伝達できるような免疫増強剤がコスト面で効果的でなければならない。また、経皮、粘膜または全身投与が可能で免疫反応を適切に調節および集中するための免疫補強剤が必要となる。
【００１１】
ここで、本発明者らはより効果的で安全な免疫補強剤を開発するために鋭意努力した結果、バチルス菌が産生するポリ−γ−グルタミン酸が、様々な抗原およびワクチン候補物質の効果を増強させることを立証することで、ポリ−γ−グルタミン酸が免疫補強剤として有用であることを確認し、本発明を完成した。
【００１２】
【非特許文献１】Ｏ’Ｈａｇａｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５０：１−１０，１９９８
【非特許文献２】Ａｕｄｉｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｌｉｓｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ，１４：２８１−２８４，１９９３
【非特許文献３】Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．６４：７１３−７２３，１９９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の主な目的は、ポリ−γ−グルタミン酸含有免疫補強剤組成物を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記免疫補強剤および抗原を含むワクチン用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するために、本発明は、ポリ−γ−グルタミン酸と薬学的に許容される担体とを含む免疫補強剤組成物を提供する。本発明において、好ましくは、前記ポリ−γ−グルタミン酸の分子量は１０〜１０，０００ｋＤａであることを特徴とする。
【００１６】
本発明は更に、前記免疫補強剤組成物および抗原性物質を含むワクチン用組成物を提供する。本発明において、前記抗原性物質は、好ましくは、ペプチド、ポリペプチド、該ポリペプチドを発現する乳酸菌、タンパク質、該タンパク質を発現する乳酸菌、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、組み換えバクテリア、および組み換えウイルスから構成された群より選択されたいずれか一つであることを特徴とする。
【００１７】
また、前記抗原性物質は、好ましくは、豚伝染性胃腸炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、犬パルボウイルス抗原タンパク質ＶＰ２、またはＢ型肝炎ウイルスの表面抗原（Ｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）であることを特徴とし、好ましくは、前記核タンパク質（Ｎ）抗原性物質は、核タンパク質（Ｎ）を発現する乳酸菌であり、ＶＰ２抗原性物質はＶＰ２を発現する乳酸菌であることを特徴とする。
【００１８】
本発明に係るワクチン用組成物は、好ましくは、安定剤、乳化剤、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ｐＨ調整剤、界面活性剤、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）補助剤、合成グリコペプチド、増量剤、カルボキシポリメチレン、細菌細胞壁、細菌細胞壁の誘導体、細菌ワクチン、動物ポックスウイルスタンパク質、ウイルス性物質（ｓｕｂｖｉｒａｌ）粒子補助剤、コレラ毒素、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパンジアミン、モノホスホリル脂質Ａ、ジメチルジオクタデシル−アンモニウムブロマイドおよびこれらの混合物から構成された群より選択されたいずれか一つ以上の第２補助剤を更に含むことを特徴とする。
【００１９】
本発明に係るワクチン用組成物は、好ましくは、前立腺癌、結腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、頭頚部癌、外陰部癌、膀胱癌、脳癌および神経膠腫で構成された群より選択されたいずれか一つ以上の疾患の予防用または治療用であることを特徴とする。
【００２０】
本発明は更に、前記ワクチン用組成物を、人間を除いた動物に注入し、抗原に対する抗体産生率を高める方法を提供する。本発明において、好ましくは、前記動物は哺乳類または鳥類であることを特徴とし、前記注入は、好ましくは、皮下注射、筋肉内注射、皮下内注射、腹膜内注射、鼻腔投与、口腔投与、経皮投与および経口投与から構成された群より選択されたいずれか一つの方法で行われることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、ポリ−γ−グルタミン酸を含有する免疫補強剤組成物を提供する効果がある。本発明は更に、前記免疫補強剤と抗原とを含むワクチン用組成物を提供する効果がある。
【００２２】
本発明に係る免疫補強剤は、毒性および副作用がほとんどなく、免疫原性の不良な抗原と共に用いても高い抗体価を発揮することができ、癌、特に前立腺癌、結腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、頭頚部癌、外陰部癌、膀胱癌、脳癌および神経膠腫のみならず、非伝染性慢性疾患の予防用あるいは治療用ワクチンを含む医薬組成物に添加して使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明のポリ−γ−グルタミン酸含有免疫補強剤は、薬学的組成物の製造に通常用いられる適切な賦形剤および希釈剤を更に含んでも良い（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）。また、本発明に係るポリ−γ−グルタミン酸含有免疫補強剤は、通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形および滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用することができる。
【００２４】
本発明のポリ−γ−グルタミン酸含有免疫補強剤組成物に含まれることが可能な担体、賦形剤、希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、マルチトール、澱粉、グリセリン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニールピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油が挙げられる。
【００２５】
製剤化する場合は、普段使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤することができる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記ポリ−γ−グルタミン酸に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混合して調剤することができる。また、単純な賦形剤の他にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用できる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁液剤、内用液剤、油剤、シロップ剤などを使用することができ、頻繁に用いられる単純希釈剤である水、液体パラフィンの他に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれても良い。非経口投与のための製剤としては、滅菌された水溶液、非水溶性製剤、懸濁液剤、油剤、凍結乾燥製剤が含まれる。非水溶性製剤、懸濁液剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。
【００２６】
本発明のポリ−γ−グルタミン酸含有免疫増強剤は、投与対象の年齢、性別、体重などによって投与量を変更でき、投与経路、疾患の度合い、性別、体重、年齢などによってもワクチン投与量を増減することができる。
【００２７】
本発明で用いられるポリ−γ−グルタミン酸そのものは、毒性および副作用がほとんどないので、予防目的で安心して使用することができる免疫補強剤である。本発明のポリ−γ−グルタミン酸をワクチン用免疫補強剤として使用し、共に作成することができる抗原性成分としては、免疫原性が不良である抗原やペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはこれらに相応する核酸配列、またはワクチンの関心対象である対象細胞、またはこれらの組み合わせで構成された群、そしてワクチンとして使用可能な組み換えバクテリアやウイルスから選択することができる。
【００２８】
本発明のワクチン用免疫補強剤は、非経口、粘膜（経口や鼻腔など）および経皮性経路によるワクチン投与の際に共に使用することができる。抗原性タンパク質を発現する微生物をワクチンの用途として使用する場合、本発明のポリ−γ−グルタミン酸を免疫補強剤として使用することが好ましい。特に、前記抗原性タンパク質を発現する乳酸菌を経口用ワクチンとして使用する場合、本発明のポリ−γ−グルタミン酸をワクチン用免疫補強剤として共に使用することが好ましい。
【００２９】
また、本発明のポリ−γ−グルタミン酸は癌、特に前立腺癌、結腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、頭頚部癌、外陰部癌、膀胱癌、脳癌および神経膠腫のみならず、非伝染性慢性疾患を予防・治療する目的で用いられる予防用あるいは治療用ワクチンを含む医薬組成物に添加して使用することができる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を通じて本発明を更に詳しく説明する。これらの実施例は専ら本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるとして解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【００３１】
［実施例１］ポリ−γ−グルタミン酸の製造
ポリ−γ−グルタミン酸製造用基本培地（５％のＬ−グルタミン酸が添加されたＧＳ培地；グルコース：５％、（ＮＨ４）２ＳＯ４：４１％、ＫＨ２ＰＯ４：０．２７％、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ：０．４２％、ＮａＣｌ：０．０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．３％、ビタミン溶液：１ｍｌ／Ｌ、ｐＨ：６．８）３Ｌが満たされた５Ｌ発酵器に、バチルス・サブチルス清麹醤（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ．ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ，ＫＣＴＣ０６９７ＢＰ）菌株の培養液を１％接種し、攪拌速度１５０ｒｐｍ、空気注入速度１ｖｖｍにて、３７℃で７２時間培養した後、２Ｎ硫酸溶液を加えてｐＨが３．０になるように調節し、ポリ−γ−グルタミン酸の含まれた試料液を得た。
【００３２】
前記試料液を４℃で１０時間定置させて発酵液内の多糖類を取り除き、これに、エタノールを発酵液の２倍量になるように添加した後、充分に混合した。前記混合液を４℃で１０時間定置した後、遠心分離し、ポリ−γ−グルタミン酸沈殿物を得た。前記沈殿物に蒸留水を加えて溶解させ、タンパク質分解酵素を１００μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃恒温器で６時間定置反応させ、試料に存在する細胞外タンパク質を分解させた。前記ポリ−γ−グルタミン酸の含まれた試料を充分量の蒸留水で透析し、遊離したグルタミン酸を取り除いた後、濃縮させ、純粋なポリ−γ−グルタミン酸を得た。
【００３３】
用途に応じて、必要な場合は、前記製造されたポリ−γ−グルタミン酸を適切な方法で切断し、所定の分子量に製造して使用したり、適切な方法で分離して所定の分子量別に回収して使用することができる。以下の実施例では、分子量が、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、５０ｋＤａ、１，０００ｋＤａおよび２，０００ｋＤａのポリ−γ−グルタミン酸を使用した。
【００３４】
［実施例２］ポリ−γ−グルタミン酸によるＴＧＥウイルス抗原に対する抗体産生
本実施例では、本発明のポリ−γ−グルタミン酸が可溶性抗原に対して特異的免疫増強効果を現わしているか否かを調査するために、抗体特異的な免疫反応中、特に抗体産生と連関のあるＢ細胞による体液性免疫反応（ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）に及ぼす影響を調べた。抗原としては、豚の伝染性消火器疾患を誘発する豚伝染性胃腸炎ウイルス（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ，ＴＧＥ）の核タンパク質（Ｎ）を使用し、実験動物としてはウサギを使用した。
【００３５】
まず、対照群として、ＴＧＥＮ抗原（４００μｇ／ＰＢＳ  ｍｌ）を単独で皮下注射したウサギを使用し、ＴＧＥＮ抗原（４００μｇ／ＰＢＳ  ｍｌ）と、分子量がそれぞれ５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａおよび５０ｋＤａであるポリ−γ−グルタミン酸を混合し、皮下注射で投与して実験群として用いた。
【００３６】
最初の皮下注射してから２週間後、同量の抗原および分子量別のポリ−γ−グルタミン酸を投与した。最初の皮下注射してから２週間毎にウサギの血清を採り、血清中のＴＧＥＮ抗原に対する抗体の力価（ｔｉｔｅｒ）をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法で測定した。
【００３７】
前記ＥＬＩＳＡ法は、ＴＧＥＮ抗原（０．１μｇ／ＰＢＳ  ｍｌ）がコーティングされたプレートをＰＢＳ／５％牛胎児血清を用いてブロッキングした後、対照群および実験群のウサギの血清を様々な一連の希釈率で培養した。その後、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）  が付着されたウサギ抗ＩｇＧ抗体（Ｆｃに対して特異的である。）を添加した。前記すべての培養は３７℃で１時間行い、言及された各段階後にはＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を用いて３回洗浄した。基質としては、ＡＢＴＳ｛２，２−ａｚｉｎｏｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）｝１ｍｇ／ｍｌを添加して反応を展開させ、３０分後４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡ測定装置で測定した。
【００３８】
その結果、図１に示すように、分子量別のポリ−γ−グルタミン酸とＴＧＥＮ抗原とを共に皮下注射したウサギでのＴＧＥＮ抗原に対する抗体力価は、ＴＧＥＮ抗原のみを皮下注射したウサギでのＴＧＥＮ抗原に対する抗体力価より高く現れた。特に、５０ｋＤａのポリ−γ−グルタミン酸を共に処理したウサギの抗体力価が最も高く現れた。そして抗体力価の上昇に対する持続性は、最初の注射後、少なくとも６週間までは、対照群に比べて有意に増強されるような結果を示した。
【００３９】
［実施例３］ポリ−γ−グルタミン酸によるＨＢＶウイルス抗原に対する抗体産生
本実施例では、ポリ−γ−グルタミン酸が他の可溶性抗原に対し、腹腔投与方法によって特異的免疫（体液性免疫反応；ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）増強効果を現わしているか否かを酵母来由Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ，ＨＢＶ）の表面抗原（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ；Ｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）を用いてＢａｌｂ／ｃ  ｍｉｃｅを実験動物として用いて確認した。
【００４０】
まず、対照群は精製されたＨＢｓＡｇ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）Ｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ抗原（１μｇ／ＰＢＳ  ｍｌ）を単独で腹腔注射した６週齢のＢａｌｂ／ｃの雌マウスを用い、実験群はＨＢｓＡｇ  Ｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ抗原（１μｇ／ＰＢＳ  ｍｌ）と、分子量がそれぞれ１０ｋＤａ、５０ｋＤａおよび１，０００ｋＤａであるポリ−γ−グルタミン酸とを混合して腹腔注射した。また、抗原の濃度を変化させて精製されたＨＢｓＡｇ  Ｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ抗原（０．５μｇ／ＰＢＳ  ｍｌ）を単独で腹腔注射したマウスおよびＨＢｓＡｇ  Ｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ抗原（０．５μｇ／ＰＢＳ  ｍｌ）と、分子量がそれぞれ１０ｋＤａ、５０ｋＤａおよび１，０００ｋＤａであるポリ−γ−グルタミン酸とを混合し、腹腔注射で投与した実験群に分けた。前記実験群と対照群とは、腹腔接種してから５週間目に採血し、血清内のＨＢｓＡｇ  Ｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅに対する陽転率および抗体の力価をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法で測定した。
【００４１】
ＥＬＩＳＡは、ＨＢｓＡｇ  Ｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  抗原（１ｍｇ／ｍｌ）がコーティングされたプレートを用いて実施例２と同様の方法で行った。その結果、図２に示すように、本発明の分子量別のポリ−γ−グルタミン酸を複合したＨＢｓＡｇ  Ｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ抗原を腹腔注射したマウスでのＨＢｓＡｇ  Ｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ抗原に対する抗体陽転率および力価は、ＨＢｓＡｇ  Ｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ抗原の量と比例するように、抗原のみを皮下注射したマウスでの抗原に対する抗体陽転率および力価よりも高く現れた。特に、ポリ−γ−グルタミン酸１，０００ｋＤａを共に処理したマウスの抗体陽転率および力価が最も高く現れた。
【００４２】
［実施例４］ポリ−γ−グルタミン酸による犬パルボウイルスの抗原タンパク質が表面発現された乳酸菌のワクチン効果の分析
本実施例では、可溶性抗原の他に抗原性タンパク質を発現する微生物をワクチンの用途として用いる場合、本発明のポリ−γ−グルタミン酸が免疫補強剤として用いられて各抗原に対する特異的免疫｛体液性免疫反応（ｈｕｍｅｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）および粘膜免疫反応（ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）｝増強効果を現わすか否かを確認した。
【００４３】
抗原としては、犬パルボウイルスのカプシド抗原タンパク質であるＶＰ２を使用した。本発明者らは、前記カプシド抗原タンパク質であるＶＰ２を表面発現する乳酸菌を新しい経口ワクチンとして開発しようと試み、これに対する特許を出願した経緯がある（大韓民国特許出願第２００４−００７３２１号）。本実施例では、前記犬パルボウイルスのカプシド抗原タンパク質であるＶＰ２を表面発現する乳酸菌を用い、ポリ−γ−グルタミン酸の抗体産生率が増強されるか否かを調べた。
【００４４】
具体的には、本発明において犬パルボウイルスのカプシド抗原タンパク質であるＶＰ２を表面発現する乳酸菌を一定の細菌濃度になるように獲得した後、細胞を緩衝溶液（ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４）で洗浄し、抗原が表面発現されたラクトバチルス５×１０９菌を４〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの口腔に１日おきに５回、次いで１週間後再び１日おきに５回、そして２週間後再び１日おきに５回投与した。また、抗原が表面発現されたラクトバチルス１×１０９菌をマウスの鼻腔に一日おきに３回、次いで一週間後再び１日おきに３回、そして２週間後再び１日おきに３回投与し、対照群にした。また、前記対照群と同様の群を作成し、この群のマウスにはそれぞれの投与乳酸菌に分子量２，０００ｋＤａのポリ−γ−グルタミン酸１００μｇずつを混合して投与した後、ポリ−γ−グルタミン酸非投与群と混合投与群のマウス内のカプシド抗原タンパク質であるＶＰ２に対する抗体産生率を測定・比較した。
【００４５】
経口、鼻腔投与後、２週間おきにそれぞれのマウス群の血清を採って血清内のカプシド抗原タンパク質に対するＩｇＧ抗体価と、マウスの内腸部位を採って腸の内部を洗浄した浮遊液内および気管支と肺胞の内部を洗浄した浮遊液内でのカプシド抗原タンパク質に対するＩｇＡ抗体価とを、ＥＬＩＳＡ法にて測定した。
【００４６】
図３は、マウス血清内の犬パルボウイルスのカプシド抗原タンパク質であるＶＰ２抗原に対するＩｇＧ抗体価を示したもので、Ａはカプシド抗原タンパク質であるＶＰ２抗原を表面発現する乳酸菌を単独でそれぞれ経口および鼻腔に投与したマウス群の抗体価を示し、Ｂはカプシド抗原タンパク質であるＶＰ２抗原を表面発現する乳酸菌とポリ−γ−グルタミン酸とを混合し、それぞれ経口および鼻腔に投与したマウス群の抗体価を示す。
【００４７】
図４は、腸の内部を洗浄した浮遊液および気管支と肺胞の内部を洗浄した浮遊液内でのカプシド抗原タンパク質であるＶＰ２抗原に対するＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡ法にて示したもので、ＡおよびＣはカプシド抗原タンパク質であるＶＰ２抗原を表面発現する乳酸菌を単独で経口投与および鼻腔投与した群でのＩｇＡ抗体価を示し、ＢおよびＤはカプシド抗原タンパク質であるＶＰ２抗原を表面発現する乳酸菌とポリ−γ−グルタミン酸とを混合し、それぞれ経口および鼻腔に投与したマウス群のＩｇＡ抗体価を示す。
【００４８】
図３および図４に示すように、カプシド抗原タンパク質であるＶＰ２抗原を表面発現する乳酸菌とポリ−γ−グルタミン酸とを共に投与したＣ５７ＢＬ／６マウス群の血清、内腸洗浄液および気管支洗浄液において、犬パルボウイルスのカプシド抗原タンパク質であるＶＰ２抗原に対するＩｇＧ抗体価およびＩｇＡ抗体価が、対照群に比べて非常に高く現れることを確認することができた。
【００４９】
この結果から、本発明に係る犬パルボウイルスのカプシド抗原タンパク質であるＶＰ２抗原を表面発現する乳酸菌と混合され適用されたポリ−γ−グルタミン酸は、経口用粘膜ワクチンの効能を極大化させることのできる免疫補強剤であることが分かった。
【００５０】
［実施例５］ポリ−γ−グルタミン酸による伝染性胃腸炎ウイルスの抗原タンパク質が表面発現された乳酸菌のワクチン効果の分析
本実施例では、豚の伝染性消火器疾患を誘発する豚伝染性胃腸炎ウイルス（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ，ＴＧＥ）の核タンパク質（Ｎ）抗原を表面発現する乳酸菌をポリ−γ−グルタミン酸と共に豚に経口投与するとき、免疫補強剤としての効果があるか否かを調べた。
【００５１】
具体的には、本発明において豚伝染性胃腸炎ウイルスのヌクレオカプシド抗原タンパク質であるＮを表面発現する乳酸菌を一定の細菌濃度になるように獲得した後、細胞を緩衝溶液（ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４）で洗浄し、抗原が表面発現された乳酸菌を粉末化した。対照群は粉末化された乳酸菌を豚の飼料の０．３％になるように混合した後、該混合飼料を３ヶ月齢の豚３匹に２ｋｇ／日になるように４週間摂取させた。ポリグルタミン酸実験群は、粉末化された乳酸菌の３％になるように２，０００ｋＤａのポリ−γ−グルタミン酸を混合した後、該粉末を豚の飼料の０．３％になるように混合し、同様に、該混合飼料を３ヶ月齢の豚３匹に２ｋｇ／日になるように４週間摂取させた。摂取後、２週間おきに血清を採り、血清内のＮ抗原タンパク質に対するＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００５２】
その結果、図５に示すように、ヌクレオカプシド抗原タンパク質であるＮ抗原を表面発現する乳酸菌を単独で与えた豚の血清のＩｇＧ抗体価が、Ｎ抗原を表面発現する乳酸菌にポリ−γ−グルタミン酸を混合して与えた豚の血清でのＩｇＧ抗体価よりも高い数値であることを確認することができた。
【００５３】
上記の結果から、本発明に係るポリ−γ−グルタミン酸は、経口用粘膜ワクチンの効能を極大化させることのできる免疫補強剤であることを確認することができた。
【００５４】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述したが、当業界で通常の知識を有する者にとっては、かかる具体的な技術は単なる好ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された各請求項とそれらの等価物のみによって定義されるものではないと言えよう。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
以上、説明したように、本発明は、ポリ−γ−グルタミン酸を含有する免疫補強剤組成物を提供する効果がある。本発明は更に、前記免疫補強剤と抗原とを含むワクチン用組成物を提供する効果がある。又、本発明に係る免疫補強剤は、毒性および副作用がほとんどなく、免疫原性の不良な抗原と共に用いても高い抗体価を発揮することができ、癌、特に前立腺癌、結腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、頭頚部癌、外陰部癌、膀胱癌、脳癌および神経膠腫のみならず、非伝染性慢性疾患の予防用あるいは治療用ワクチンを含む医薬組成物に添加して使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ポリ−γ−グルタミン酸と豚伝染性胃腸炎ウイルスである核タンパク質（Ｎ）抗原をウサギの皮下に注射した後、一定の時間が過ぎた後、血清内の核タンパク質抗原に対する特異ＩｇＧ抗体価を測定したグラフである。
【図２】ポリ−γ−グルタミン酸とＢ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ，ＨＢＶ）の表面抗原（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ；Ｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）とをマウスの腹腔に注射した後、一定の時間が過ぎた後、血清内のＨＢｓ抗原に対する特異ＩｇＧ抗体価を測定したグラフである。
【図３】ポリ−γ−グルタミン酸と、犬パルボウイルスのカプシド抗原タンパク質であるＶＰ２を表面発現する乳酸菌とをマウスの経口および鼻腔に投与した後、一定の時間が過ぎた後、血清内のＶＰ２抗原に対する特異ＩｇＧ抗体価を測定したグラフである。
【図４】ポリ−γ−グルタミン酸と、犬パルボウイルスのカプシド抗原タンパク質であるＶＰ２を表面発現する乳酸菌とをマウスの経口および鼻腔に投与した後、一定の時間が過ぎた後、マウスの腸、気管支および肺胞洗浄液内でのＶＰ２抗原に対するＩｇＡ抗体価を測定したグラフである。
【図５】ポリ−γ−グルタミン酸と、豚伝染性胃腸炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）抗原を表面発現する乳酸菌とを飼料と共に豚に経口投与した後、一定の時間が過ぎた後、血清内の核タンパク質抗原に対する特異ＩｇＧ抗体価を測定したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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