(57)【要約】【課題】  イノシトールリン酸の各々の構造異性体がいかなる性質を有しているのかを明確にして、有用な適用形態を明らかにする。【解決手段】  イノシトールリン酸の各々の構造異性体を科学的手段により構造を決定するとともに、各々が有する効果を追試し得る実験系を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イノシトール３リン酸を含有する、大腸癌を処置するための組成物。
【請求項２】
遊離リン酸基を中和し得る物質をさらに含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
食用組成物または医薬組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
イノシトール６リン酸、イノシトール５リン酸またはイノシトール４リン酸を含有する、大腸癌を処置するための組成物。
【請求項５】
フィターゼをさらに含有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
遊離リン酸基を中和し得る物質をさらに含有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
腸内細菌を活性化させる物質をさらに含有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
食用組成物または医薬組成物である、請求項４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イノシトールリン酸を含む、大腸癌を処置するための組成物およびキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム研究の成果としてテーラーメード医療が求められている。しかし、疾病に最適な医薬品が開発する事が出来たとしても、それらの多くはオーファンドラッグとなり、経済的な意味で現実的とは言い難く、むしろゲノム研究の成果は病気の予防に向かうべきと考えるほうが自然である。すなわち遺伝子診断で生活習慣病に罹患する可能性、リスクを予測し、リスクの高い人は病気にかかりにくい生活習慣を身につける事が大切である。そしてそのためには、開発コストが高く、疾病罹患後を対象とする医薬品よりも、健康の維持や病気予防の目的を備えた保健機能を有する食品の方が期待は高い。そして近年、医科学の進歩とともに癌の治癒率向上には目を見張るものがあるが、まだまだ満足すべきものではない。
【０００３】
ガンの予防または治癒に効果を有する保健機能物質としてイノシトールリン酸が知られている（例えば、非特許文献１〜５を参照のこと）。さらに、特許文献１には、ＩＰ３を含むガン転移抑制剤、腫瘍増殖抑制剤、腫瘍血管形成抑制剤が記載されている。また、特許文献２には、ＩＰ６、ＩＰ５またはＩＰ４を含む抗腫瘍剤が記載されている。
【特許文献１】特表平１０−５１１６７７号公報（平成１０年１１月１０日公表）
【特許文献２】特開２００３−２３８４１４公報（平成１５年８月２７日公開）
【非特許文献１】Ｅ．Ｇｒａｆ，Ｊ．Ｗ．Ｅａｔｏｎ：Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８：６１（１９９０）
【非特許文献２】Ｆ．Ｓ．Ｍｅｎｎｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  ＴＩＢＳ  １８−ＦＥＢＲＵＡＲＹ，５８（１９９３）
【非特許文献３】Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：３１５（１９８４）
【非特許文献４】Ｖａｌｌｅｊｏ  Ｍ．ｅｔ．ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：６５６（１９８７）
【非特許文献５】Ａ．Ｍ．Ｓｈａｍｓｕｄｄｉｎ：ＩＰ６  ＤＩＳＣＯＶＥＲ  ＴＨＥ  ＮＥＷ  ＡＮＴＩＯＸＩＤＡＮＴ  ＷＩＴＨ  ＴＨＥ  ＰＯＷＥＲ  ＴＯ  ＰＲＥＶＥＮＴ  ＡＮＤ  ＦＩＧＨＴ  ＣＡＮＣＥＲ（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、イノシトールリン酸が非常に多くの構造異性体が存在するにもかかわらず、非特許文献１〜５は、有効とするイノシトールリン酸がどの構造であるのか、その構造であることをどのようにして特定したのか、天然にはそのままでは存在しない構造異性体をどのようにして取得したのかについて何ら説明がなされていない。また、特許文献１および２では、イノシトールリン酸をどのようにして取得したのかについては何ら記載されていない。このような開示は、漠然とした見解にすぎず、当業者は文献記載事項を容易に追試・検証することができなかった。すなわち、これらの文献は、生化学的データを細胞学的または動物学的に採取されておらず、理論的証明または実証的証明と認識するには極めて不十分なものであった。
【０００５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、イノシトールリン酸のどの構造異性体が所望の性質を有しているのかを明確にし、有用な適用形態を明らかにすることにある。すなわち、本発明は、合成したイノシトールリン酸の各種構造異性体を科学的手段により構造を決定し、その効果を追試可能な実験系において実証して、食品として使用可能な抗腫瘍活性物質を得ることを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明に係る大腸癌を処置するための組成物は、イノシトール３リン酸（ＩＰ３）を含有することを特徴としている。
【０００７】
本発明に係る組成物は、遊離リン酸基を中和し得る物質をさらに含有することが好ましい。
【０００８】
本発明に係る組成物は、食用組成物または医薬組成物であることが好ましい。
【０００９】
また、本発明に係る大腸癌を処置するためのキットは、イノシトール３リン酸（ＩＰ３）を備えることを特徴としている。
【００１０】
本発明に係るキットは、遊離リン酸基を中和し得る物質をさらに備えることが好ましい。
【００１１】
また、本発明に係る大腸癌を処置するための方法は、イノシトール３リン酸（ＩＰ３）を含有する溶液を患部に適用する工程を包含することを特徴としている。
【００１２】
本発明に係る方法は、上記溶液が遊離リン酸基を中和し得る物質をさらに含有することが好ましい。
【００１３】
すなわち、本発明に係る大腸癌を処置するための組成物は、イノシトール６リン酸（ＩＰ６）、イノシトール５リン酸（ＩＰ５）またはイノシトール４リン酸（ＩＰ４）を含有することを特徴としている。
【００１４】
本発明に係る組成物は、フィターゼをさらに含有することが好ましい。
【００１５】
本発明に係る組成物は、遊離リン酸基を中和し得る物質をさらに含有することが好ましい。
【００１６】
本発明に係る組成物は、腸内細菌を活性化させる物質をさらに含有することが好ましい。
【００１７】
本発明に係る組成物は、食用組成物または医薬組成物であることが好ましい。
【００１８】
また、本発明に係る大腸癌を処置するためのキットは、イノシトール６リン酸（ＩＰ６）、イノシトール５リン酸（ＩＰ５）またはイノシトール４リン酸（ＩＰ４）を備えることを特徴としている。
【００１９】
本発明に係るキットは、フィターゼをさらに備えることが好ましい。
【００２０】
本発明に係るキットは、遊離リン酸基を中和し得る物質をさらに備えることが好ましい。
【００２１】
本発明に係るキットは、腸内細菌を活性化させる物質をさらに備えることが好ましい。
【００２２】
また、本発明に係る大腸癌を処置するための方法は、イノシトール６リン酸（ＩＰ６）、イノシトール５リン酸（ＩＰ５）またはイノシトール４リン酸（ＩＰ４）を含有する溶液を患部に適用する工程を包含することを特徴としている。
【００２３】
本発明に係る方法は、フィターゼを患部に適用する工程をさらに包含することが好ましい。
【００２４】
本発明に係る方法は、上記溶液が遊離リン酸基を中和し得る物質をさらに含有することが好ましい。
【００２５】
本発明に係る方法は、腸内細菌を活性化させる物質を腸内に適用する工程をさらに包含することが好ましい。
【発明の効果】
【００２６】
本発明を用いれば、大腸癌を処置することができる食品組成物または医薬組成物を容易に取得することができる。また、本発明を用いれば、大腸癌を容易に処置することができる。さらに本発明を用いれば、腸内細菌の活性が落ちている場合であっても、有意に大腸癌を処置することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
ＩＰ６は、穀類、豆類に多く含まれる食品成分で、その強いキレート作用により亜鉛、鉄、カルシウムなどの欠乏しやすいミネラル吸収を阻害することが知られている。一方で、ＩＰ６摂取は、大腸癌発症を抑制するとする実験動物モデルを使った報告がなされている。大腸癌は、近年日本でも食事の西欧化に伴い増加しており、多くの遺伝子変異が、段階的に起こって悪性化する。これら初期段階での対処は重要であるが、これには薬物や外科手術では不可能であり、ここに大腸癌リスクを減らす食品の重要性がある。ＩＰ６の作用機作として、その強いキレート作用により大腸内容物中の鉄などの酸化触媒をマスクする、抗酸化剤としての作用が挙げられているが、大腸内の腸内細菌は強いＩＰ６分解（フィターゼ）活性を持ち、先の仮説には疑問がある。本発明者らは、大腸で産生されるＩＰ６部分分解物が活性本体であると考え、ＩＰ６の部分分解物のスクリーニングにより、これを実証し、ミネラル吸収阻害活性を軽減しかつ大腸癌発症抑制作用をより強くした食品素材の開発を目指している。
【００２８】
穀類のぬか中に含まれている有機リン化合物（フィチン酸（ＩＰ６））は、カルシウムをキレートして不溶性の塩を形成し、その結果小腸でのカルシウムの吸収を阻害すると考えられている。また、家畜の排泄物に起因するリン（Ｐ）などの環境負荷物質は、環境汚染の原因となるが、ブタ、ニワトリなどの単胃動物においては、植物性飼料原料中に存在するフィチン酸を加水分解して無機リンとして遊離させる酵素（フィターゼ）の活性が低いことが知られている。
【００２９】
フィターゼは、微生物、カビ類（特に麹菌類）、麦類などの植物、下等脊椎動物などに分布することが知られており、遺伝子組換え技術によってフィターゼ産生能を改善した菌を用いる製品もまた開発されている。また遺伝子組み換え技術を使用せずに、黒麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）を育種改良して得たフィターゼ高生産株も利用されている（例えば、再表９７／０３８０９６（平成１１年６月２２日公表）を参照のこと）。このグループにより生産されたフィタ−ゼは、飼料添加物としての指定を受けてすでに商品化され、飼料中に含まれるフィチン酸を分解させる目的でフィターゼを混合した飼料がすでに市販されている。
【００３０】
本発明者らは、イノシトールリン酸の原料として、穀類中などの天然に豊富に存在するフィチン酸（ＩＰ６）を用い、これに酵素フィターゼを作用させてＩＰ６にエステル結合しているリン酸基を部分的に加水分解して除去し、イノシトールリン酸の各種構造異性体を合成した。この酵素反応生成物は、種々のイノシトールリン酸構造異性体を含むので、カラムクロマトグラフィーを用いて構造の異なる異性体同士を分画して、純正な単一構造のイノシトールリン酸を得た。
【００３１】
本発明者らはまた、上記方法によって純粋で単一な物質として得られたイノシトールリン酸を、ＮＭＲ（Ｎｕｃｒｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，核磁気共鳴）を用いて構造決定した。
【００３２】
本発明者らはさらに、細胞レベルまたは動物レベルでの実験系を用いて、イノシトールリン酸の腫瘍に対する効果を確認し、イノシトールリン酸の内でもＩＰ３が抗腫瘍活性を強く有することを確認し、本発明を完成するに至った。
【００３３】
すなわち、本発明者らは、フィチン酸（ＩＰ６）の加水分解産物であるＩＰ３が抗大腸癌作用を有し、しかも、遊離した無機リンが共存しない場合には、このＩＰ３の効果が格段に向上し、用量を低減させることができることを見出した。また、本発明者らは、遊離した無機リンが共存する場合であれば、対数増殖期にあるガン細胞に対して、ＩＰ３が非常に効果的であることも見出した。さらに、本発明者らは、腸内細菌の活性を向上させてやればフィターゼを共存させなくても経口投与したＩＰ６が腸内細菌の存在する部位にてＩＰ３に加水分解されて、その下流側に生じている大腸癌を有意に処置し得ることを見出した。
【００３４】
本発明は、上述したような本発明者らの独自の新知見に基づいて完成されてものであり、従来の技術水準からは容易にはなし得なかった画期的な発明である。
【００３５】
〔１〕イノシトールリン酸
本発明は、大腸癌を処置するために有効であるイノシトールリン酸を提供する。「イノシトールリン酸」は、６員環であるイノシトール基に１〜６個のリン酸基が結合したものである。本発明は、イノシトール３リン酸、すなわち、ＩＰ３が大腸癌を処置するために有効であることを見出して完成されたものであり、本明細書中において使用される場合、「イノシトールリン酸」は好ましくはＩＰ３である。しかし、ＩＰ４、ＩＰ５またはＩＰ６はフィターゼ活性によって加水分解されてリン酸基を遊離させると同時にＩＰ３を生じさせる。よって、本明細書中において、加水分解によりＩＰ３を生成させる局面において使用される場合、イノシトールリン酸は好ましくはＩＰ４、ＩＰ５またはＩＰ６である。
【００３６】
ＩＰ６またはＩＰ５が細胞増殖を抑制すること、ＩＰ４が非興奮性細胞において形質膜を介するＣａ２＋流入の促進作用を有すること、およびクロライドチャンネル活性を抑制すること、ならびにＩＰ３（１，４，５）が細胞内カルシウムストアからＣａ２＋を放出させることなどがこれまでに報告されている。このようにイノシトールリン酸とはいえ、リン酸基の数およびその結合部位によってその機能は全く異なり、特定の構造異性体の機能を推定することは非常に困難である。さらにＩＰ３（１，４，５）の機能以外は、実際にはまだまだ明確には検証されていないというべきである。
【００３７】
本明細書中においてイノシトールリン酸がＩＰ３であることが意図される場合、イノシトールリン酸は、ＩＰ３（１，４，５）であってもよいが、ＩＰ３（１，４，５）以外の構造異性体（例えば、ＩＰ３（１，２，６））であってもよい。なぜなら、後述する実施例において示すように、ＩＰ３により惹起される活性は、ＩＰ３（１，４，５）レセプターのブロッカーによって抑制し得るものと抑制し得ないものとがあるからである。
【００３８】
〔２〕イノシトールリン酸の利用
（１）組成物
本発明は、大腸癌を処置するための組成物を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「処置」は、症状の軽減または排除が意図され、予防的（発症前）または治療的（発症後）に行われ得るもののいずれもが包含される。
【００３９】
一般に組成物は、物質Ａ単独を含有する組成物、物質Ａと物質Ｂとを含有する単一の組成物、または物質Ａ単独を含有する組成物と物質Ｂ単独を含有する組成物のいずれかであり得る。これらの組成物は、物質Ａおよび物質Ｂ以外に他の成分（例えば、薬学的に受容可能なキャリア）を含有してもよい。本発明に係る組成物は、物質Ａとしてイノシトールリン酸を含有することを特徴としているので、イノシトールリン酸を含有する組成物を他の成分（物質Ｂ）を含有する組成物と併用する場合は、これらを全体として一組成物として認識し得ないが、この場合は、後述する「キット」の範疇に入り得、組成物としてではなくキットとして提供され得ることを当業者は容易に理解する。
【００４０】
本明細書中において使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、組成物を受容した個体において有害な抗体の産生をそれ自体は誘導しない任意のキャリアが意図される。適切なキャリアとしては、代表的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子のような、大きな、穏やかに代謝される高分子である。このようなキャリアは当業者に周知である。また、薬学的に受容可能な賦形剤については、当該分野において公知であり、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ‘Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，  Ｎ．Ｊ．１９９１）に十分に記載されている。薬学的に受容可能なキャリアは、塩（例えば、無機酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）；および有機酸塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など））を含み得る。
【００４１】
本明細書中において「イノシトールリン酸」がＩＰ４、ＩＰ５またはＩＰ６であることが意図されて使用される場合、本発明に係る組成物は、イノシトールリン酸を加水分解させ得る酵素をさらに含有することが好ましい。上記酵素は、好ましくはフィターゼである。植物由来の飼料には、リンが含まれているが、そのうち５０〜７０％がフィチン酸（すなわち、ＩＰ６）として存在しており、フィチン酸は、リン酸の主要な貯蔵物質として植物種子に多量に存在している。よって、植物飼料を用いれば、ＩＰ６を容易に供給することができる。
【００４２】
また、腸内細菌の活性を向上させてやればフィターゼを共存させなくても経口投与されたＩＰ６が腸内細菌の存在する部位にてＩＰ３に加水分解されて、その下流側に生じている大腸癌を有意に処置し得るという知見に基づけば、本発明に係る組成物は、腸内細菌の活性を向上させる物質をさらに含有することが好ましい。腸内細菌の活性を向上させる物質としては、公知の物質であれば特に限定されない。
【００４３】
さらに、本発明に係る組成物は、水、生理食塩水、グリセロール、またはエタノールのような１つ以上の成分をさらに含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質、安定化剤、抗酸化剤などのような補助物質が、本発明に係る組成物中に存在し得る。
【００４４】
本発明に係る組成物は、液体溶液もしくは懸濁液、または注射のための液体ビヒクル中の溶液もしくは懸濁液のために適切な固体形態、あるいは局所的に塗布されるクリームとしてとして調製され得る。また、本発明に係る組成物は、経口投与に好ましい錠剤、カプセルなどの形態として調製され得る。
【００４５】
本発明に係る組成物の直接送達は、一般に、注射（皮下、皮内、腹腔内、管腔内、胃内、腸内、静脈内または筋肉内）により達成されるが、本発明に係る組成物の標的部位は大腸であるので、本発明に係る組成物は、経口、坐剤、または塗布の様式で幹部に送達されることが好ましい。
【００４６】
一実施形態において、本発明に係る組成物は、リン酸基を中和させる目的で、陽性電荷を有するキャリアをイノシトールリン酸とともに含有することが好ましい。
【００４７】
本実施形態に係る組成物が含有する陽性電荷を有するキャリアとしては、例えば、塩基性タンパク質（例えば、ヒストン、プロタミン、リボヌクレアーゼ、リゾチームなど）、ポリアミン（スペルミン、スペルミジン、プトレッシンなど）などが挙げられるが、特に限定されない。また、上記キャリアの用量は、細胞または生体に対して毒性を示さない程度であれば特に限定されないが、イノシトールリン酸とキャリアとのモル比は、「イノシトールリン酸」がＩＰ４である場合は１：１、「イノシトールリン酸」がＩＰ５である場合は１：２、「イノシトールリン酸」がＩＰ６である場合は１：３であることが好ましい。
【００４８】
特許文献２は、陽性電荷を有する担体としてのヒストンを開示しており、ヒストンがＩＰ６の有するリン酸基の陰性電荷を中和してＩＰ６を細胞内に取り込まれやすくすることを目的とし、イノシトールリン酸と担体とのモル比は１：１が好ましいことを記載している。しかし、このような記載からは、本実施形態に係る組成物の奏する効果および含有される成分の好ましいモル比は全く予想することができない。
【００４９】
本実施形態において、本発明に係る組成物中に含有され得る他の成分は、リンを含まない（いわゆる、ホスフェートフリーである）ことが最も好ましい。
【００５０】
（１−１）食用組成物
本発明は、イノシトールリン酸を含有する、大腸癌を処置するための食用組成物を提供する。本発明は、イノシトールリン酸を含有、添加および／または希釈してなる食用組成物（すなわち、食品、飲料または飼料）を提供する。本発明に係る食用組成物は、イノシトールリン酸の生理作用によって癌の処置、特に大腸癌の処置に極めて有用である。
【００５１】
本発明において、「含有」とは、食用組成物（すなわち、食品、飲料、または飼料）中にイノシトールリン酸が含まれるという態様を、「添加」とは、食用組成物の原料に、イノシトールリン酸を添加するという態様を、「希釈」とはイノシトールリン酸を、食用組成物の原料で希釈するという態様をいう。また、上述した本発明に係る化粧用組成物についての記載における「含有」の語は、本発明の態様にいう含有、添加、希釈の意を包含する。
【００５２】
本発明に係る食用組成物の製造法は特に限定されるものではなく、調理、加工および一般に用いられている食品または飲料の製造法による製造を挙げることができ、製造された食品または飲料に本発明に係るイノシトールリン酸が含有、添加および／または希釈されていればよい。
【００５３】
本発明に係る食用組成物としては特に限定はないが、公知のイノシトールリン酸含有食品と同様の食品が挙げられることを当業者は容易に理解する。具体的には、本発明に係る食用組成物としては、菓子類、乳製品（例えば、ヨーグルト）、健康食品（例えば、カプセル、タブレット、粉末）、飲料（例えば、清涼飲料、乳飲料、野菜飲料など）、ドリンク剤などが挙げられるがこれらに限定されない。菓子類は、携行利便性の観点から好ましく、乳製品は、菓子類と比較すると1回当たりの摂取量が多く、毎日摂取しやすいという観点からより好ましい。
【００５４】
本発明に係る食用組成物におけるイノシトールリン酸の含有量は特に限定されず、その官能と作用発現の観点から適宜選択できる。
【００５５】
本発明に係る食品、飲料または飼料としては、イノシトールリン酸が含有、添加および／または希釈されており、その生理作用を発現させるための有効量が含有されていれば特にその形状が限定されることはなく、タブレット状、顆粒状、カプセル状などの経口的に摂取可能な形状物も包含する。なお、本発明に係る食品、飲料または飼料は、当該生理作用と食物繊維機能とを有する健康食品素材として極めて有用である。
【００５６】
（１−２）医薬組成物
本発明は、イノシトールリン酸を含有する、大腸癌を処置するための医薬組成物を提供する。
【００５７】
本発明に係る医薬組成物中に使用される医薬用担体は、医薬組成物の投与形態および剤型に応じて選択することができる。本明細書中で使用される場合、用語「医薬組成物」は、上述した食用組成物として提供される組成物以外の形態を有する組成物が意図される。
【００５８】
経口剤の場合、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などが医薬用担体として利用される。また経口剤を調製する際、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合してもよい。
【００５９】
非経口剤の場合、当該分野において公知の方法に従って、本発明の有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに溶解または懸濁させ、所望により殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製することができる。
【００６０】
本発明に係る医薬組成物は、製薬分野における公知の方法により製造することができる。本発明に係る医薬組成物におけるイノシトールリン酸の含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、当該医薬組成物を用いて後述の投与量範囲でイノシトールリン酸を投与できるような量であれば特に限定されない。
【００６１】
本発明に係る医薬組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。一般には、製剤中に含有される有効成分の投与量で、好ましくは成人１日当り０．１〜２０００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。また、本発明に係る医薬組成物はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【００６２】
（２）キット
本発明はまた、イノシトールリン酸を備える、大腸癌を処置するためのキットを提供する。本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは該材料を使用するための指示書を備える。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備える」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明に係るキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得、ここで、組成物の形態は上述したような形態であり得、溶液形態の場合は容器中に内包されていてもよい。本発明に係るキットは、物質Ａおよび物質Ｂを同一の容器に混合して備えても別々の容器に備えてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、CD-ROMなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明に係るキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。
【００６３】
上記イノシトールリン酸がＩＰ３である場合は、本発明に係るキットは、少なくともＩＰ３のみを備えていればよい。上記イノシトールリン酸がＩＰ６、ＩＰ５またはＩＰ４である場合は、本発明に係るキットは、さらにフィターゼを備えることが好ましい。また、上述したように、リン酸基が存在しなければより低用量のＩＰ３によって効果が奏せられるので、本発明に係るキットは、患部およびその周囲のリン酸基を中和することのできる物質をさらに備えることが好ましい。このような物質は、イノシトールリン酸と同一容器に内包されても別々の容器に内包されてもよい。
【００６４】
本発明に係るキットにおけるイノシトールリン酸およびその他の物質の使用方法は、上述した組成物の使用形態に準じればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００６５】
（３）大腸癌を処置する方法
本発明はさらに、大腸癌を処置するための方法を提供する。本発明に係る方法は、イノシトールリン酸を含有する溶液を患部に適用する工程を包含する。
【００６６】
上記イノシトールリン酸がＩＰ３である場合は、少なくともＩＰ３のみを患部に適用すればよい。上記イノシトールリン酸がＩＰ６、ＩＰ５またはＩＰ４である場合は、患部およびその周囲にフィターゼを適用することが好ましい。また、上述したように、リン酸基が存在しなければより低用量のＩＰ３によって効果が奏せられるので、患部およびその周囲のリン酸基を中和することのできる物質がさらに患部に適用されることが好ましい。このような物質は、イノシトールリン酸と同時に適用されても別々に適用されてもよい。
【００６７】
本発明に係る方法におけるイノシトールリン酸およびその他の物質の適用は、上述した組成物の使用形態に準じればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００６８】
なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【００６９】
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。
【実施例】
【００７０】
イノシトールリン酸化合物であるフィチン酸（ＩＰ６）は、消化管内で、カルシウムおよび／または亜鉛などと不溶性塩を形成し、これらの吸収を阻害するとされている。フィチン酸が大腸ガン発症抑制作用を示すこともまた報告されているが、その作用機構は解明されていない。本発明者らは、フィチン酸の部分分解物（ＩＰｘ）が作用本体であると考えて、細胞内Ｃａシグナルを指標にした培養ガン細胞での実験およびＩＰｘ投与動物実験を用いて、これを検証した。
【００７１】
以下に詳述するように、細胞レベルの実験を、ヒト大腸ガン由来細胞株Ｃａｃｏ−２細胞、ヒト結腸腺ガン由来細胞株ＨＴ−２９細胞をカバースリップ上に培養し、蛍光カルシウム指示薬であるｆｕｒａ−２−ＡＭをローディングし、ＣＡＦ−１１０型細胞内イオン測定装置を用いて二波長励起法により細胞内カルシウム濃度を測定することによって行った。また、ＩＰｘ添加培地によるＨＴ−２９増殖を細胞数の変動を測定することによって調べた。
【００７２】
その結果、細胞外からのＩＰｘ刺激により、培養２日目のＣａｃｏ−２細胞では、早く強いＣａシグナルが引き起こされたが、培養７日目にかけてシグナルは減弱し、分化期には消失した。ＨＴ−２９細胞株ではより強いシグナルが惹起され、培地へのＩＰｘの添加により増殖が抑制された。細胞外液のＣａを除いてもシグナルは影響を受けず、シグナルは細胞内Ｃａストアに依存した。細胞内Ｃａストアに直接関与する、ＩＰ３レセプターのアンタゴニスト処理により、初期のＣａ濃度上昇は消失したが、シグナルの主要部は残存した。このことより、細胞外からのＩＰｘのよる細胞内Ｃａシグナルの惹起には、ＩＰ３レセプター及びそれへの情報伝達経路が一部関与していることが示された。
【００７３】
なお、Ｃａｃｏ−２細胞は、ヒト大腸癌由来の株細胞で、７日間程度の対数増殖期の後、コンフルエントに達し極性のある単層膜を形成、ａｐｉｃａｌ側（管腔側）には微絨毛が発現し、細胞間にはＴｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎが形成され小腸上皮様に分化する。Ｃａｃｏ−２細胞は、主に分化後ヒトの小腸上皮モデルとして用いられている。ＨＴ−２９細胞は、主に結腸がん細胞モデルとして用いられており、より広汎な大腸癌への作用を確かめるために用いた。
【００７４】
〔実施例１：イノシトールリン酸の調製〕
本研究において使用する原料のイノシトールリン酸を、以下のように調製した。
【００７５】
小麦粕（麸）２５０ｇに水中に１時間以上浸した後、塩酸を用いてｐＨを１以下に調整した。サンプルを９０℃以上に加温して、できるだけ高温で維持した。サンプルを１〜２時間放置した後、室温まで温度を下げ、液体画分と残渣とを濾別した。液体画分にＣａ（ＯＨ）２を添加してｐＨを１２．５に調整し、生じた沈渣としてイノシトールリン酸のカルシウム塩を得た（乾燥重量にて１６．５ｇ）。
【００７６】
〔実施例２：イノシトールリン酸の分離精製〕麸
実施例１において取得したイノシトールリン酸画分を、ダイヤイオンＰＫ２１６樹脂を充填して予め調製しておいた直径５５ｍｍ，長さ５５０ｍｍのイオン交換樹脂カラムにアプライして脱塩した。ＨＯＲＩＢＡ  ＤＳ−１４を用いて伝導度を測定し、脱塩の程度を測定した。この脱塩溶液を、ロータリーエバポレータを用いて５０ｍｌまで濃縮した後、ｐＨを２．５に調整し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｃｕｍ由来のフィターゼ（シグマ社）６ｍｇを添加して３７℃の恒温槽中にて４時間インキュベートした。反応液を１００℃で２０分間加熱失活させた後、ダウケミカル社のＧ１Ｘ８樹脂を充填したカラム（直径３２ｍｍ，長さ１４５０ｍｍ）にアプライし、塩酸（０．１Ｎ〜１Ｎの直線濃度勾配）によって溶出してイノシトールリン酸の各構造異性体を分離分画した。ダウ樹脂カラムからの溶出画分は２００μＬずつ小試験管に採取し、５Ｎ硫酸および０．１Ｎ硝酸で分解および酸化した後、遊離生成したリン酸を常法に従ってＦｉｓｋｅ−Ｓｕｂｂａｒｏｗの方法で分析した（図１）。
【００７７】
〔実施例３：イノシトールリン酸構造異性体の構造解析〕
実施例２において得られたクロマトグラムからのピーク画分を回収した後に濃縮したイノシトールリン酸の各構造異性体を、ＮＭＲを用いる常法に従って構造を決定した。
【００７８】
〔実施例４：ヒト大腸がん細胞に対するイノシトールリン酸の効果〕
ヒト大腸がん細胞Ｃａｃｏ−２を、５％ＣＯ２存在下で１５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて７５ｃｍ２の培養フラスコにて３７℃で培養した。３日毎に培地交換を行い、８０〜９０％コンフルエントの段階で細胞を継代した。対数増殖期のＣａｃｏ−２細胞に対するイノシトールリン酸の効果を、細胞内カルシウム濃度の変動を指標に観察した。細胞内カルシウム濃度を、カルシウム蛍光指示薬Ｆｕｒａ  ２を用いる従来法に従って測定した。
【００７９】
コラーゲンコートしたカバーグラス（直径１３．２ｍｍ）を２４ウェル細胞培養プレート内に置き、その上で５．０×１０４個のＣａｃｏ−２細胞を２日間培養した。各細胞にＦｕｒａ−２溶液（ＤＭＥＭ中１０μｍｏｌ／Ｌ  Ｆｕｒａ  ２−ＡＭおよび０．１ｇ／Ｌ  ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬを含む）をロードして３７℃で２０分間インキュベートした後、カバーグラスを、２ｍｌの測定用溶液（ＨＢＳＳ（ｐＨ７．４））をいれた石英セルに移した。イノシトールリン酸を含有する溶液２０μｌを石英セル内の測定用溶液に添加して、細胞内イオン濃度測定装置（ＣＡＦ‐１１０、日本分光）を用いてＣａｃｏ−２細胞の細胞内カルシウム濃度の変化を測定した。測定を、２５℃にて４００ｒｐｍで攪拌しながら行った。
【００８０】
なお、本実施例にて使用したイノシトールリン酸は、イノシトール３リン酸（ＩＰ３）である。
【００８１】
図２に示したように、対数増殖期のＣａｃｏ−２細胞において、イノシトールリン酸の添加に伴う細胞内カルシウム動態の変化が強く生じた。イノシトールリン酸の作用は、１ｍＭ〜１０ｍＭまでの濃度範囲で観察されたが、この反応性は、３ｍＭの時に最も強く、３ｍＭを超える濃度では低下した。
【００８２】
これらの結果より、イノシトールリン酸は、増殖期のヒト大腸癌細胞に直接作用することがわかった。
【００８３】
〔実施例５：ヒト結腸腺癌細胞に対するイノシトールリン酸の効果〕
ヒト結腸腺癌細胞ＨＴ−２９を、５％ＣＯ２存在下で１５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて７５ｃｍ２の培養フラスコにて３７℃で培養した。３日毎に培地交換を行い、８０〜９０％コンフルエントの段階で細胞を継代した。対数増殖期のＨＴ−２９細胞に対するイノシトールリン酸の効果を、細胞内カルシウム濃度の変動を指標に観察した。細胞内カルシウム濃度を、カルシウム蛍光指示薬Ｆｕｒａ  ２を用いる従来法に従って測定した。
【００８４】
コラーゲンコートしたカバーグラス（直径１３．２ｍｍ）を２４ウェル細胞培養プレート内に置き、その上で５．０×１０４個のＨＴ−２９細胞を２日間培養した。各細胞にＦｕｒａ−２溶液（ＤＭＥＭ中１０μｍｏｌ／Ｌ  Ｆｕｒａ  ２−ＡＭおよび０．１ｇ／Ｌ  ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬを含む）をロードして３７℃で２０分間インキュベートした後、カバーグラスを、２ｍｌの測定用溶液（ＨＢＳＳ（ｐＨ７．４））をいれた石英セルに移した。イノシトールリン酸を含有する溶液２０μｌを石英セル内の測定用溶液に添加して、細胞内イオン濃度測定装置（ＣＡＦ‐１１０、日本分光）を用いてＨＴ−２９細胞の細胞内カルシウム濃度の変化を測定した。測定を、２５℃にて４００ｒｐｍで攪拌しながら行った。
【００８５】
なお、本実施例にて使用したイノシトールリン酸は、イノシトール３リン酸（ＩＰ３）である。
【００８６】
図３に示したように、対数増殖期のＨＴ−２９細胞において、イノシトールリン酸の添加に伴う細胞内カルシウム動態の変化が強く生じた。この変化は、実施例４において観察されたＣａｃｏ−２細胞における細胞内カルシウム動態の変化より強かった。
【００８７】
この結果より、イノシトールリン酸は、増殖期のヒト結腸腺癌細胞に直接作用することがわかった。
【００８８】
〔実施例６：ヒト癌細胞に対するイノシトールリン酸の作用機構の解析〕
実施例４および５において観察された対数増殖期のヒト癌細胞における細胞内カルシウム動態の変化を引き起こす機構を、カルシウム蛍光指示薬Ｆｕｒａ  ２を用いて解析した。
【００８９】
コラーゲンコートしたカバーグラス（直径１３．２ｍｍ）を２４ウェル細胞培養プレート内に置き、その上で５．０×１０４個のＣａｃｏ−２細胞またはＨＴ−２９細胞を５日間培養した。各細胞にＦｕｒａ−２溶液（ＤＭＥＭ中１０μｍｏｌ／Ｌ  Ｆｕｒａ  ２−ＡＭおよび０．１ｇ／Ｌ  ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬを含む）をロードして３７℃で２０分間インキュベートした後、カバーグラスを、２ｍｌの測定用溶液（ＨＢＳＳ（ｐＨ７．４））をいれた石英セルに移した。イノシトールリン酸を含有する溶液２０μｌを石英セル内の測定用溶液に添加して、細胞内イオン濃度測定装置（ＣＡＦ‐１１０、日本分光）を用いてＣａｃｏ−２細胞またはＨＴ−２９細胞の細胞内カルシウム濃度の変化を測定した。測定を、２５℃にて４００ｒｐｍで攪拌しながら行った。
【００９０】
なお、本実施例にて使用したイノシトールリン酸は、イノシトール３リン酸（ＩＰ３）である。また、細胞外カルシウムの影響を取り除くために、Ｃａ−ｆｒｅｅの測定用溶液を用いた（図４）。さらに、細胞内セカンドメッセンジャーであるイノシトール３リン酸（１，４，５−ＩＰ３）の関与を検討するために、細胞内カルシウムストアからのＣａ動員を生じさせる細胞内ＩＰ３（１，４，５−ＩＰ３）のレセプターに対するブロッカーである２−ＡＰＢを石英セル中の測定用溶液に測定前に添加して、細胞を５分間前処理した（図５）。
【００９１】
図４に示したように、対数増殖期のＣａｃｏ−２細胞（Ａ）またはＨＴ−２９細胞（Ｂ）において、イノシトールリン酸の添加に伴う細胞内カルシウム動態の変化が強く生じたが、Ｃａ−ｆｒｅｅの影響はなかった。また、図５に示したように、２−ＡＰＢによる細胞の前処理によって、イノシトールリン酸によって惹起される細胞内カルシウム動態の変化のうち初期の早い反応が消失したが、約半分の反応は残存した（ＨＴ−２９細胞のみ示す）。
【００９２】
これらの結果より、ヒト癌細胞においてイノシトールリン酸によって惹起される反応は、細胞内カルシウムストアに依存すること、およびヒト癌細胞においてイノシトールリン酸によって惹起される反応は、ＩＰ３（１，４，５−ＩＰ３）依存性のものと非依存性のものとが共存しているということがわかった。
【００９３】
〔実施例７：ヒト癌細胞の増殖に対するイノシトールリン酸の効果〕
１．０×１０３個のＨＴ−２９細胞を９６穴マイクロプレートに播種し、２日後、イノシトールリン酸を添加した培地と交換した。本実施例にて使用したイノシトールリン酸は、イノシトール３リン酸（ＩＰ３）、または対照実験としてのイノシトール６リン酸である。培地交換後２日目および４日目のＨＴ−２９細胞数を測定した。細胞数の測定には、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学）を使用し、キットの指示書に従って４５０ｎｍ（参照波長：６５５ｎｍ）の吸光度を測定した。
【００９４】
図６に示したように、イノシトール６リン酸を用いた対照群においては細胞数に差異はかったが、イノシトールリン酸は明らかに減少していた（図６Ａ）。しかもこの効果は、高濃度（１０ｍＭ）においてよりむしろ低濃度（５ｍＭ）の方が顕著であった。しかし、５ｍＭのイノシトールリン酸ではアポトーシスを生じた細胞数に差異はなく１０ｍＭでは増加していた（図６Ｂ）。
【００９５】
このことより、５ｍＭのイノシトールリン酸による細胞数の減少は、アポトーシスによる細胞数の減少ではなくイノシトールリン酸による細胞増殖抑制に起因することがわかった。また、イノシトールリン酸を高濃度で使用すると、ヒト癌細胞のアポトーシスを誘導することもわかった。
【００９６】
〔実施例８：ヒト癌細胞に対するＩＰ３特異性〕
Ｃａｃｏ−２細胞を、５％ＣＯ２存在下で１５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて７５ｃｍ２の培養フラスコにて３７℃で培養した。３日毎に培地交換を行い、８０〜９０％コンフルエントの段階で細胞を継代した。対数増殖期のＣａｃｏ−２細胞に対するイノシトールリン酸の効果を、細胞内カルシウム濃度の変動を指標に観察した。細胞内カルシウム濃度を、カルシウム蛍光指示薬Ｆｕｒａ  ２を用いる従来法に従って測定した。
【００９７】
コラーゲンコートしたカバーグラス（直径１３．２ｍｍ）を２４ウェル細胞培養プレート内に置き、その上で５．０×１０４個のＣａｃｏ−２細胞を２日間培養した。各細胞にＦｕｒａ−２溶液（ＤＭＥＭ中１０μｍｏｌ／Ｌ  Ｆｕｒａ  ２−ＡＭおよび０．１ｇ／Ｌ  ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬを含む）をロードして３７℃で２０分間インキュベートした後、カバーグラスを、２ｍｌの測定用溶液（ＨＢＳＳ（ｐＨ７．４））をいれた石英セルに移した。イノシトールリン酸を含有する溶液２０μｌを石英セル内の測定用溶液に添加して、細胞内イオン濃度測定装置（ＣＡＦ‐１１０、日本分光）を用いてＣａｃｏ−２細胞の細胞内カルシウム濃度の変化を測定した。測定を、２５℃にて４００ｒｐｍで攪拌しながら行った。
【００９８】
用いたイノシトールリン酸は、ミオイノシトール（ＩＰ０）、イノシトール２リン酸（ＩＰ２）、イノシトール３リン酸（ＩＰ３）、イノシトール４リン酸（ＩＰ４）、またはフィチン酸（ＩＰ６）であり、いずれも高度に精製されたものである。イノシトールリン酸のセルへの添加量はいずれも２０μｌとした。
【００９９】
図７に示したように、対数増殖期のＣａｃｏ−２細胞において、ＩＰ０およびＩＰ６によって細胞内カルシウム濃度の変化は生じなかったが、ＩＰ２、ＩＰ３、ＩＰ４によって細胞内カルシウム濃度の変化は生じた。特に、５ｍＭの濃度で使用した場合、ＩＰ３が最も高い細胞内カルシウム濃度の変化を生じさせた。
【０１００】
これらの結果より、特定のイノシトールリン酸だけが増殖期のヒト癌細胞に対して効果的であり、特にＩＰ３が顕著な効果を惹起することがわかった。
【０１０１】
〔実施例９：大腸がんモデル動物におけるイノシトールリン酸の効果〕
Ｗｉｓｔａｒ／ＳＴ系雄ラットをステンレスケージに個別に入れて飼育し、飼料および水（水道水）を自由に摂取させた。毎朝同一時刻に体重および摂食量を計測した。成長の良否について、脱毛および／または下痢などを指標にして判定した。飼料を毎日、水を３日毎に交換した。なお、飼育室を、室温２３±１℃、湿度６０％前後、明暗周期を１２時間（明期８：００〜２０：００、暗期２０：００〜８：００）に設定した。
【０１０２】
ＡＩＮ９３Ｇ標準精製飼料で一週間ラット飼育した後、化学発がん剤ジメチルヒドラジン２０ｍｇを含有する溶液（中性に調整済）を、一週間ごとに３回ラット皮下に投与した。１％のＩＰ６またはＩＰ３を添加したＡＩＮ９３Ｇ標準精製飼料（試験飼料群）または対照群としての無添加標準飼料を、各群８匹ずつに、３度目の投与の翌日以降に自由に摂取させた。
【０１０３】
これらのラットを２ヶ月間飼育した後にエーテル麻酔後放血屠殺した。ラットから結腸全長を摘出し、結腸を生理食塩水で管腔内を洗浄した後、展開して台に貼り付け、その直後に、２％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ固定液を用いて固定した。固定した結腸をＰＢＳで洗浄した後、０．２％メチレンブルーにて結腸の粘膜表面を染色した。結腸をＰＢＳで数回洗浄した後に台よりはずし、光学顕微鏡下にて結腸全長にわたってクリプトを観察した。
【０１０４】
観察したクリプトのうち、周囲が濃く染まり、直径が正常クリプトの２倍以上に拡大したものを、異常クリプト（Ａｂｅｒｒａｎｔ  ｃｒｙｐｙ：ＡＣ）と判定した。また、異常クリプトが重なった状態のものを、多重の異常クリプト（Ａｂｅｒｒａｎｔ  ｃｒｙｐｙ  ｆｏｃｉ：ＡＣＦ）と判定した。
【０１０５】
表２に示すように、対照群に対して、ＩＰ６含有試験飼料群では、ＡＣおよびＡＣＦともに減少しており、ＩＰ３含有試験飼料群では、ＡＣおよびＡＣＦともにさらに減少していた。
【０１０６】
【表１】
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【０１０７】
以上より、ＩＰ６含有飼料によって大腸前癌病変を抑制することができるが、ＩＰ３含有飼料によって大腸前癌病変をより抑制することができることがわかった。
【０１０８】
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明によって、高度に精製したイノシトールリン酸を供給することができるので、医薬の開発に大いに貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、カラムクロマトグラフィーを用いて分離分画したイノシトールリン酸を示すグラフである。
【図２】図２は、対数増殖期のＣａｃｏ−２細胞における、イノシトール３リン酸の添加に伴う細胞内カルシウム動態の変化を示すグラフである。
【図３】図３は、対数増殖期のＨＴ−２９細胞における、イノシトール３リン酸の添加に伴う細胞内カルシウム動態の変化を示すグラフである。
【図４】図４は、対数増殖期のＣａｃｏ−２細胞（Ａ）またはＨＴ−２９細胞（Ｂ）における、イノシトール３リン酸の添加に伴う細胞内カルシウム動態の変化に対するＣａ−ｆｒｅｅの影響を示すグラフである。
【図５】図５は、対数増殖期のＨＴ−２９細胞における、イノシトール３リン酸の添加に伴う細胞内カルシウム動態の変化に対する２−ＡＰＢによる細胞の前処理の影響を示すグラフである。
【図６】図６は、対数増殖期のＨＴ−２９細胞における、イノシトール６リン酸またはイノシトール３リン酸の添加に伴う細胞数の変化（Ａ）およびアポトーシス細胞数の変化（Ｂ）を示すグラフである。
【図７】図７は、対数増殖期のＣａｃｏ−２細胞における、イノシトールリン酸（ＩＰ０、ＩＰ２、ＩＰ３、ＩＰ４、ＩＰ６）の添加に伴う細胞内カルシウム動態の変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2006232725.tif 000007
【図６】
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【図７】
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