(57)【要約】【課題】  高倍率で、回収率が高く、でんぷんやタンパク質等水溶性の夾雑物や水に親和性が高い夾雑物は濃縮しないという特異性を有する微生物濃縮方法を提供する。【解決手段】  微生物を含む溶液に、界面活性剤と親水性有機溶媒とを加え均一溶液を形成し、次いで、上記溶液のｐＨを低下させ、上記溶液を、微生物と界面活性剤と親水性有機溶媒と水とが混合している析出相と、上澄み相との二相に分離し、上記析出相中に微生物を濃縮することとした。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を含む溶液に、界面活性剤と親水性有機溶媒とを加え均一溶液を形成し、
次いで、上記溶液のｐＨを低下させ、
上記溶液を、微生物と界面活性剤と親水性有機溶媒と水とが混合している析出相と、上澄み相との二相に分離し、
上記析出相中に微生物を濃縮することを特徴とする微生物濃縮方法。
【請求項２】
上記界面活性剤がフルオロカルボン酸であることを特徴とする請求項１記載の微生物濃縮方法。
【請求項３】
上記親水性有機溶媒がアルコール、エーテル、ケトン、アミド、ニトリル、スルホキシドのうち少なくとも１種を含むことを特徴とする請求項１記載の微生物濃縮方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品、医療、製薬、環境等の分野で、細菌、酵母、かび、ウイルス等の微生物を、簡便に高倍率で濃縮可能とする微生物濃縮方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌、酵母、かび、ウイルス等の微生物を濃縮、分離することは、微生物に関する情報を得たり、微生物を回収・利用したり、又は排除（除菌）を行う上で重要である。
例えば、病原性微生物の場合には、微生物の濃縮・分離は、診断や治療に用いられる。また、有用微生物の場合には、微生物を濃縮したものを分離除去して上清液中の有用成分を取得することができる。また、濃縮した有用微生物自体を取得することもできる。
【０００３】
一方、従来、食品分野や環境分野等の微生物検査では、試料中の微生物の存在を確認するために、培養による分離検出、生化学的試験による検出、又は核酸の検出等が行われている。しかしながら、これらの試験では、微生物検査を行う試料について、試料の一部分中の菌を抽出して培養したり、試料の部分的特徴を増幅・検出しているに過ぎない。すなわち、試料の部分的特徴を検査しているのに過ぎず、試料全体の性状を全体として把握することは必ずしもできていない。
【０００４】
このため、大量の試料を検査するために、試料中の微生物の濃縮が行われてきた。微生物を濃縮する方法としては、古くから遠心分離や、セルロース、ナイロン、ポリエステル等の有機高分子繊維のフィルターを用いたろ過等が行われてきた。
しかし、これらの古典的な微生物濃縮方法では、高い濃縮倍率を得ることができない。さらに、遠心分離機や高分子繊維のフィルター等高価な器具を必要とし、コストがかかる。
【０００５】
このような問題を解決するものとして、特許文献１に示す菌体濃縮方法及び菌体濃縮試薬が提案された。この方法では、まず、微生物が含まれる水性溶媒に対して、陰イオンと陽イオンとを存在させて、水難溶性物質を生成させる。次に、この水難溶性物質に微生物を吸着させて微生物を回収する。さらに、微生物が吸着した水難溶性物質を溶解剤により溶解することで微生物を回収している。
【特許文献１】特開２０００−１４３８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記従来の方法には以下の問題があった。
（１）微生物が吸着した水難溶性物質を溶解剤で溶解することにより、微生物を含む相の体積が増え、数十倍程度しか濃縮することができない。
（２）微生物の回収率が約９０％であり、約１０％はロスしてしまう。
（３）吸着に特異性がないため、微生物以外の夾雑物も濃縮してしまう。
本発明は、このような問題を解決し、高倍率で、回収率が高く、でんぷんやタンパク質等水溶性の夾雑物や水に親和性が高い夾雑物は濃縮しないという特異性を有する微生物濃縮方法を提供するものである。本発明は、特に、生きているが通常の方法では培養が困難な状態な細菌（ＶＢＮＣ、ｖｉａｂｌｅ  ｂｕｔ  ｎｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ）に適している。このような状態の細菌は、培地上にコロニーを形成せず、従来の培養法では検出できなかった。したがって、これまでは、「存在しない」ものとして取り扱われ、衛生管理の対象から外されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、微生物濃縮方法であって、微生物を含む溶液に、界面活性剤と親水性有機溶媒とを加え均一溶液を形成し、次いで、上記溶液のｐＨを低下させ、上記溶液を、微生物と界面活性剤と親水性有機溶媒と水とが混合している析出相と、上澄み相との二相に分離し、上記析出相中に微生物を濃縮する。
【０００８】
本発明に係る微生物濃縮方法は、その一の実施の形態で、上記界面活性剤がフルオロカルボン酸であることを特徴とする。
【０００９】
本発明に係る微生物濃縮方法は、別の実施の形態で、上記親水性有機溶媒がアルコール、エーテル、ケトン、アミド、ニトリル、スルホキシドのうち少なくとも１種を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、高倍率で、回収率が高く、でんぷんやタンパク質等水溶性の夾雑物や水に親和性が高い夾雑物は濃縮しないという特異性を有する微生物濃縮方法が提供される。
後述するように、本発明に係る微生物濃縮方法によれば、以下のような効果を期待することができる。
１．大容量の試料を微量の体積に濃縮することができるため、微生物を数万倍濃縮することができる。
２．試料中の微生物を約１００％の回収率で濃縮することができる。
３．でんぷんやタンパク質等水溶性の夾雑物や水に親和性が高い夾雑物は、濃縮されないので、これらを微生物と分離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明に係る微生物濃縮方法について、その実施の形態を参照しながらさらに詳細に説明する。
【００１２】
本発明に係る微生物濃縮方法は、界面活性剤と、親水性有機溶媒と、ｐＨを低下させる試薬とを用いて実施され、少なくとも以下のステップを含んでいる。
１．微生物を含む溶液に、界面活性剤と親水性有機溶媒とを加え均一溶液を形成するステップ（ステップ１）。
２．上記溶液のｐＨを低下させ、上記溶液を、微生物と界面活性剤と親水性有機溶媒と水とが混合している析出相と、上澄み相との二相に分離するステップ（ステップ２）。
本発明に係る微生物濃縮方法では、細菌、酵母、かび、ウイルス等を対象としており、以上のステップを順次実行し、上記析出相中に微生物を濃縮することとしている。各ステップについて、以下にさらに説明を加える。
【００１３】
ステップ１
このステップ１では、微生物を含む溶液に、界面活性剤と親水性有機溶媒とを加え、均一溶液を形成する。
このような「均一溶液」は、完全な溶液の他、ミセルが形成されたような擬均一溶液も含む概念である。界面活性剤と親水性有機溶媒とは、相溶性を有することが好ましく、ステップ１では、微生物を含む溶液、界面活性剤、親水性有機溶媒が全体として単一の液相を形成させる。
界面活性剤としては、フルオロカルボン酸が好適であり、各炭素原子に結合している水素原子の少なくとも１個がフッ素原子で置換されているカルボン酸を用いることが好適である。
【００１４】
フルオロカルボン酸は対応するカルボン酸よりもプロトンが解離しやすく、また疎水性である。したがって、フルオロカルボン酸は、著しく低いｐＨでない限り、対応するカルボン酸よりも容易にプロトンを解離して水に溶解し、かつ一部の低級なものを除き、これに鉱酸を添加してｐＨを低下させると、容易に非解離状態となって水相から分離する。このような傾向はフッ素化の程度が大きいほど著しい。したがって、本発明では、ペルフルオロデカン酸、ペルフルオロオクタン酸等完全にフッ素化されたカルボン酸を用いるのが好ましい。
【００１５】
以上の界面活性剤のうち、例えば、ペルフルオロオクタン酸は、常温で固体である。したがって、ペルフルオロオクタン酸を含む水溶液のｐＨを低下させるとペルフルオロオクタン酸は固体として析出する。しかし、ペルフルオロオクタン酸を含む水溶液にアセトン又はテトラヒドロフラン等のこれと相溶性のある親水性有機溶媒を共存させておくと、ペルフルオロオクタン酸は、親水性有機溶媒と水と共に析出相を形成して水溶液から分離する。
【００１６】
本発明で用いる界面活性剤が、特に、下記の一般式（１）で示されるフルオロカルボン酸の場合、鉱酸や有機酸を添加してｐＨを６以下の酸性にすれば、微生物と界面活性剤と親水性有機溶媒と水とが混合する析出相として微生物を濃縮することができる。すなわち、フルオロカルボン酸を界面活性剤として用いれば、ｐＨを６以下程度として、あまり下げずに済む。したがって、微生物を生きたまま濃縮したり、遺伝子を損傷せずに濃縮するのに好適である。
【００１７】
【化１】
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【００１８】
ここでＲはフルオロアルキル基であり、各炭素原子に結合している水素原子の少なくとも１個がフッ素原子で置換されているものである。また、通常Ｘはフッ素を含有しない二価の有機基である。具体的には炭素数１〜４個程度のアルキレン基、オキシアルキレン基あるいは炭素鎖中に酸素、窒素、硫黄などのヘテロ原子を有するアルキレン基である。例えば、−ＣＨ2ＣＨ2ＳＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−などが挙げられる。
【００１９】
親水性有機溶媒としては、アルコール、エーテル、ケトン、アミド、ニトリル、スルホキシドの中の１種類以上が好適である。例えば、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド等が好適である。
【００２０】
親水性有機溶媒がエーテル、アミド、アルコール、ケトンの中から選択される場合、微生物をその形態を保ったまま析出相に濃縮することが可能である。エーテルとしては、特にテトラヒドロフランが、アミドとしては、特にジメチルホルムアミドが、アルコールとしては、特にエタノールが、ケトンとしては、特にアセトンが好適である。
【００２１】
ステップ２
このステップでは、ステップ１で得られる溶液のｐＨを低下させ、この溶液を、微生物と界面活性剤と親水性有機溶媒と水とが混合している析出相と、上澄み相との二相に分離する。
【００２２】
ｐＨを低下させる試薬としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸を用いることが好ましい。
本発明の微生物濃縮方法によれば、微生物と共に水溶性物質や親水性物質が共存する場合、微生物は析出相へ、水溶性物質や親水性物質は上澄み相へ分離することができる。これによって、微生物を濃縮することができる。
【００２３】
界面活性剤と親水性有機溶媒と微生物と水とからなる溶液に、ｐＨを低下させるための試薬を添加する時、一般的には、添加後そのまま放置するのではなく、軽く攪拌してから放置する方が好ましい。すなわち、攪拌により混合しないと、酸が均一に拡散するまでに時間がかかり、その分反応が遅れることで、相分離が遅くなることが起こるため、攪拌プロセスを設けることが好ましい。
【００２４】
攪拌は、手で振るか、又はスターラ、ボルテックスミキサー等を用いることが好ましい。
ステップ２で、析出相を形成させる際、反応液全体の温度を低下させると析出速度が速くなる。これは、温度が低下することで水中に溶ける親水性有機溶媒の溶解度が低下するためと考えられる。
【００２５】
なお、界面活性剤と親水性有機溶媒と微生物と水とからなる溶液のｐＨを低下させた後、遠心分離を行うと、放置して析出相を形成させる時間に比べて短い時間で析出相を形成させることができる。
【実施例】
【００２６】
図１（ａ）に示すように、供試菌株としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ：１０７９８）（一般名：大腸菌）を３７℃のＬＢ培地中で１８時間振蕩培養した菌液を１０μＬ（大腸菌数は約１０7個）入れた純水１（７６９ｍｌ）に、０．１Ｍペルフルオロオクタン酸２を２．５ｍＬ添加した。次にテトラヒドロフラン３を３８ｍＬ添加した。さらに、６．０Ｍ塩酸４を１９２ｍＬ添加し、容器の蓋を閉めて上下に３０回振り、溶液が均一になるように攪拌した。これを３時間室温で放置し、図１（ｂ）に示すように容器底面に析出相５を形成させた。析出相の体積を、ピペットを用いて計量した後、上澄み相６と形成した析出相５を５μＬずつとり、各々をスライドグラス上に乗せ、さらにカバーガラスを被せて顕微鏡を用いて、単位面積あたりの菌数を数えることにより、菌数を測定した。
【００２７】
その結果、上澄み相中の大腸菌数は０個／５μＬであったのに対し、析出相中の大腸菌数は５．８×１０6個／５μＬであった。形成した析出相の体積は約２０μＬであったため、析出相中の大腸菌数は以下の計算式で求めた。
【００２８】
【数１】
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【００２９】
析出相中の大腸菌数は、始めに添加した大腸菌数とほぼ同じであり、更に上澄み相に大腸菌は見られなかったことから、大腸菌の回収率はほぼ１００％であることが分かった。
【００３０】
また、本実施例の濃縮倍率は以下の式で求めた。
【数２】
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【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明に係る微生物濃縮方法の一実施例を説明する概念図である。
【符号の説明】
【００３２】
１  大腸菌と純水の混合溶液
２  ペルフルオロオクタン酸
３  テトラヒドロフラン
４  塩酸
５  大腸菌を含む析出相
６  上澄み相
【図１】
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