(57)【要約】【課題】水酸基を有する化合物を蛍光標識する技術を提供する【解決手段】下記式（Ｉ）【化１】2006298799.tif 000006（式中、RはCH2CH2Si(R1)2Cl、CH2CH2B(OH)2またはB(R2)Xで表される基を示す。R1は低級アルキル基を示す。R2は、置換基を有していてもよいフェニル基またはハロゲン原子を示す。Xはハロゲン原子を示す。）で表される化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
2006298799.tif 000005
（式中、RはCH2CH2Si(R1)2Cl、CH2CH2B(OH)2またはB(R2)Xで表される基を示す。R1は低級アルキル基を示す。R2は、置換基を有していてもよいフェニル基またはハロゲン原子を示す。Xはハロゲン原子を示す。）
で表される化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物からなる蛍光試薬。
【請求項３】
水酸基を有する生理活性物質を請求項２で表される蛍光試薬と反応させることを特徴とする、生理活性物質を蛍光標識する方法
【請求項４】
生理活性物質がHODE及びFCOHからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピレン系の新規化合物及び該化合物からなる蛍光試薬に関する。
【０００２】
また、本発明は、該蛍光試薬により生理活性物質、特にHODEなどの水酸基を有する生理活性物質を蛍光標識する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ピレン系の化合物は、蛍光を有するため、核酸、蛋白質等の生理活性物質のアミノ基を介して導入される蛍光標識として使用されている（例えば特許文献１〜２）。
【０００４】
しかしながら、水酸基を有する生理活性物質、特にカルボキシル基（ＣＯＯＨ）と水酸基（ＯＨ）を有する脂質酸化物（特にHODE）を有効に標識する化合物は知られていない。
【特許文献１】ＷＯ２００２／０５１７９７
【特許文献２】特開2004-081057
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、水酸基を有する化合物を蛍光標識する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下のピレン系化合物、蛍光試薬、生理活性物質を蛍光標識する方法に関する。
【０００７】
１．  下記式（Ｉ）
【０００８】
【化１】
2006298799.tif 000002
【０００９】
（式中、RはCH2CH2Si(R1)2Cl、CH2CH2B(OH)2またはB(R2)Xで表される基を示す。R1は低級アルキル基を示す。R2は、置換基を有していてもよいフェニル基またはハロゲン原子を示す。Xはハロゲン原子を示す。）
で表される化合物。
【００１０】
２．  項１に記載の化合物からなる蛍光試薬。
【００１１】
３．  水酸基を有する生理活性物質を項２で表される蛍光試薬と反応させることを特徴とする、生理活性物質を蛍光標識する方法
４．  生理活性物質がHODE及びFCOHからなる群から選ばれる少なくとも１種である項３に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、水酸基を有する化合物を蛍光標識することで、測定対象化合物が微量であっても高感度に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、蛍光標識として、以下の一般式（I）の化合物を使用する：
【００１４】
【化２】
2006298799.tif 000003
【００１５】
（式中、RはCH2CH2Si(R1)2X、CH2CH2B(OH)2またはB(R2)Xで表される基を示す。R1は低級アルキル基を示す。R2は、置換基を有していてもよいフェニル基またはハロゲン原子を示す。Xはハロゲン原子を示す。）
R2で表される置換基を有していてもよいフェニル基の置換基としては、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、モノアルキルアミノメチル基、ジアルキルアミノメチル基などが挙げられる。
【００１６】
ハロゲン原子としては、Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉが挙げられ、好ましくは、Ｃｌ，Ｂｒ、より好ましくはＣｌである。
【００１７】
低級アルキル基としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチルなどの炭素数１〜４の直鎖又は分枝を有するアルキル基が挙げられる。
【００１８】
低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシなどの炭素数１〜４の直鎖又は分枝を有するアルキル基が挙げられる。
【００１９】
モノアルキルアミノ基としては、メチルアミノ、エチルアミノ、n-プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、n-ブチルアミノ、イソブチルアミノ、sec-ブチルアミノ、tert-ブチルアミノなどが挙げられる。
【００２０】
ジアルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジn-プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジn-ブチルアミノ、ジイソブチルアミノ、ジsec-ブチルアミノ、ジtert-ブチルアミノなどが挙げられる。
【００２１】
モノアルキルアミノメチル基としては、メチルアミノメチル、エチルアミノメチル、n-プロピルアミノメチル、イソプロピルアミノメチル、n-ブチルアミノメチル、イソブチルアミノメチル、sec-ブチルアミノメチル、tert-ブチルアミノメチルなどが挙げられる。
【００２２】
ジアルキルアミノメチル基としては、ジメチルアミノメチル、ジエチルアミノメチル、ジn-プロピルアミノメチル、ジイソプロピルアミノメチル、ジn-ブチルアミノメチル、ジイソブチルアミノメチル、ジsec-ブチルアミノメチル、ジtert-ブチルアミノメチルなどが挙げられる。
【００２３】
R2で表される置換基を有していてもよいフェニル基の置換基の数は、１〜３個，好ましくは１〜２個、より好ましくは１個である。また置換基の位置は、ホウ素（Ｂ）に対してオルト位又はパラ位が好ましい。
【００２４】
本発明のピレン系化合物は、測定対象となる化合物の水酸基を好ましく蛍光標識できる。水酸基を有する測定対象化合物としては、例えばリノール酸の過酸化生成物であるＨＯＤＥ（ヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド）、FCOH類などの酸化ストレスのマーカーが挙げられる。HODEとしては、具体的には9-hydroxyoctadecadienoic acid (9-HODE), 13-hydroxyoctadecadienoic acid (13-HODE), 10-hydroxyoctadecadienoic acid (10-HODE), 12-hydroxyoctadecadienoic acid (12-HODE)が挙げられ、これらは(E, E)体、(E, Z)体、(Z, E)体のいずれであってもよい。蛍光標識の対象となる好ましいHODEは、9-(E, E)-HODE, 13-(E, E)-HODE, 9-(E, Z)-HODE, 13-(Z, E)-HODE, 10-(E,Z)-HODEおよび12-(Z, E)-HODEである。FCOH類としては、７α−ヒドロキシコレステロール(7α-FCOH)および７β−ヒドロキシコレステロール(7β-FCOH)などの7-FCOH類が挙げられ、これらの少なくとも１種を蛍光標識できる。
【００２５】
例えば、血漿、血清、尿、唾液などの生体サンプルを必要に応じて前処理し、本発明の蛍光試薬で処理することで、HODE、FCOH類などの生理活性物質を蛍光標識することができる。
【００２６】
本発明の一般式（I）の化合物は、例えば以下のスキーム１のようにして製造することができる：
スキーム１
【００２７】
【化３】
2006298799.tif 000004
【００２８】
（式中、R1、R2、Xは前記に定義される通りである）
一般式（IA）の化合物は、臭化ピレンとトリメチルビニルシラン(CH2=CHSiMe3)をC3H5PdCl2の存在下に反応させ、次に、HSi(R1)2Clと反応させて得ることができる。臭化ピレンとトリメチルビニルシランの反応は、アルゴンガス気流下にて市販の臭化ピレン１モルに対しトリメチルビニルシランを１モル程度使用し、室温〜７０℃の温度下に終夜反応させることで有利に進行する。
【００２９】
次のビニルピレンとHSi(R1)2Cl との反応は、ビニルピレン１モルに対しHSi(R1)2Cl を１モルから過剰量使用し、密閉状態で室温〜７０℃の温度下に終夜反応させることで有利に進行する。
【００３０】
一般式（IB）の化合物は、ピレニルリチウムとB(O-iPr)3を反応させて得ることができる。ピレニルリチウムとB(O-iPr)3の反応は、ピレニルリチウム１モルに対しB(O-iPr)3を１モルから過剰量使用し、−７８〜０℃の温度下に１〜２４時間反応させることで有利に進行する。
【００３１】
一般式（IC）の化合物は、ピレニルリチウムとB(R2)X2を反応させて得ることができる。ピレニルリチウムとB(R2)X2の反応は、ピレニルリチウム１モルに対しB(R2)X2を１モルから過剰量使用し、−７８〜０℃の温度下に１〜２４時間反応させることで有利に進行する。
【００３２】
一般式（ID）の化合物は、ビニルピレン１モルに対しHB(O-iPr)2 を１モルから過剰量使用し、室温〜５０℃の温度下に終夜反応させることで有利に進行する。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない、
実施例１：１−ピレニルボロン酸（化合物１B）
１−ブロモピレン１部をアルゴン気流下、テトラヒドロフラン１０部に溶かし、−７８℃へ冷却した。次にこの溶液にブチルリチウム（ヘキサン溶液）を1.1 mol eq滴下し、そのまま２時間撹拌した。さらにこの溶液にホウ酸トリイソプロピルを2.0 mol加え、溶液を室温まで昇温した。室温で２時間撹拌後、１N塩酸１０部を加えて室温にて終夜撹拌した。得られた溶液にジクロロエタン３０部を加え、有機層を抽出した。さらに有機層に水を加え、加熱還流させ、熱時水層を回収した。最後に水を濃縮することで目的物を得た（収率１５％）。得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲのデータを以下に示す。
３００MHz 1H NMR in CDCl3（ppm）= 4.84 (2H, br, s) 7.88-8.15 (9H, m)
実施例２：１−ピレニルフェニルクロロボラン
１−ブロモピレン１部をアルゴン気流下、テトラヒドロフラン１０部に溶かし、−７８℃へ冷却した。次にこの溶液にブチルリチウム（ヘキサン溶液）を1.1 mol eq滴下し、そのまま２時間撹拌した。さらにこの溶液にジクロロフェニルボラン1.0 molを加え、室温まで自然昇温して終夜撹拌した。最後に反応後溶液を濃縮し、得られた粗体を塩化メチレンに溶かした。析出した固体を除去して、濾液から次に析出した結晶を取り出した（収率１０％）。
得られた化合物の構造は、ＮＭＲ，元素分析等で確認できる。