(57)【要約】      （修正有）【課題】治療剤産物に有用である可能性がある抗体を同定するために、エピトープ認識特性および結合親和性に基づいて抗体をスクリーニングし、分類し、ランク付けし、ランク付けした抗体を評価して、治療剤産物に有用であるかどうかを判定する方法の提供。【解決手段】(i)タンパク質標的の治療上の潜在的有用性をこのようなタンパク質標的と相互作用する分子との関連において明らかにすると同時に、(ii)そのようなタンパク質標的と相互作用し、こうした治療上の有用性を実現する分子を同定する方法である。この方法では、タンパク質標的を複数の分子に対してスクリーニングして、それらのうちの相互作用する分子を見つける。相互作用する分子を、あらかじめ定義した基準に従って分類し、このタンパク質標的を含むあらかじめ選択したアッセイに使用するために代表的なメンバーを選択する。アッセイで確認された作用を記録し、解析する。【選択図】図１
2006322940.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原に対する抗体の相対的結合親和性を測定する方法であって、
標的抗原に結合する参照抗体を準備する工程；
前記参照抗体に対する前記標的抗原の限界濃度を測定する工程であって、前記限界濃度は、一連の試験抗体溶液に対して所定の濃度範囲内で検出可能な範囲の抗体親和性を最大化するものである工程；
前記一連の抗体溶液を準備する工程であって、各試験抗体溶液中の抗体の濃度が、所定の濃度範囲内である工程；
前記一連の試験抗体溶液中の各試験抗体溶液と限界濃度の抗原をインキュベートする工程；
各試験抗体溶液中の抗体が限界濃度の抗原に結合する相対的度合いを測定する工程；及び
前記抗原に対する各試験抗体の相対的結合親和性を測定するために、前記限界濃度の抗原に対する結合親和性に基づいて、各試験抗体溶液において前記抗体を格付けする工程
を含む方法。
【請求項２】
前記抗体が哺乳動物、ヒト、ヒト化、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、モルモット、ヒツジ、ウシ、及びキメラの各抗体からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記試験抗体が組換え抗体である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記試験抗体が抗体断片である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記相対的度合いを測定する工程が、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光結合イムノソルベント検定法、放射性元素アッセイ（ＲＩＡ）、及び表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイからなる群から選択されるアッセイを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記各試験抗体の濃度が10ng/mlから100ng/mlの間である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記各試験抗体の濃度が10ng/mlから50ng/mlの間である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記各試験抗体の濃度が10ng/mlから25ng/mlの間である、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記一連の試験抗体溶液が一連のハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体を含む一連の上清を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記一連の試験抗体溶液が100から5000の間の抗体溶液である、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記一連の試験抗体溶液が2500から5000の間の抗体溶液である、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
各試験抗体溶液がポリクローナル抗体溶液である、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
各試験抗体溶液がモノクローナル抗体溶液である、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
抗原に対する一連の抗体の相対的結合親和性を測定する方法であって、
第一の標識でラベルされた抗原の第一の希釈物と、第二の標識でラベルされた抗原の第二の希釈物とを含む抗原溶液を準備する工程；
一連の抗体溶液を準備する工程であって、各抗体溶液は前記抗体の実質的に同じ相対的濃度を有する工程；
前記抗原の第一の希釈物に対する前記抗体の結合を測定する工程；
前記抗原の第二の希釈物に対する前記抗体の結合を測定する工程；及び
前記抗原に対するより高い相対的親和性を持って相対的により希釈された抗原調製物に結合する前記一連の抗体溶液中の抗体と、前記抗原に対する相対的により低い結合親和性をもってより濃縮された抗原調製物にのみ実質的に結合する抗体とを格付けする工程
を含む方法。
【請求項１５】
前記第一の標識と前記第二の標識が着色されたビーズである、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が哺乳動物、ヒト、ヒト化、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、モルモット、ヒツジ、ウシ、及びキメラの各抗体からなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体が組換え抗体である、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
前記異なる抗体が抗体断片である、請求項14に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程の結合を測定する工程が、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光結合イムノソルベント検定法、放射性元素アッセイ（ＲＩＡ）、及び表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイからなる群から選択されるアッセイを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項２０】
前記各抗体の濃度が10ng/mlから100ng/mlの間である、請求項14に記載の方法。
【請求項２１】
前記各抗体の濃度が10ng/mlから50ng/mlの間である、請求項14に記載の方法。
【請求項２２】
前記各抗体の濃度が10ng/mlから25ng/mlの間である、請求項14に記載の方法。
【請求項２３】
前記一連の抗体溶液が一連のハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体を含む一連の上清を含む、請求項14に記載の方法。
【請求項２４】
前記一連の抗体溶液が100から5000の間の抗体溶液である、請求項14に記載の方法。
【請求項２５】
前記一連の抗体溶液が2500から5000の間の抗体溶液である、請求項14に記載の方法。
【請求項２６】
各抗体溶液がポリクローナル抗体溶液である、請求項14に記載の方法。
【請求項２７】
各抗体溶液がモノクローナル抗体溶液である、請求項14に記載の方法。
【請求項２８】
分子結合パートナーに対する一連の分子の相対的結合親和性を測定する方法であって、
標的分子結合パートナーに結合する参照分子を準備する工程；
前記参照分子に対する前記標的分子結合パートナーの限界濃度を測定する工程であって、前記限界濃度は、一連の試験分子溶液に対して所定の濃度範囲内で検出可能な範囲の分子親和性を最大化するものである工程；
一連の試験分子溶液を準備する工程であって、各試験分子溶液中の分子の濃度が、所定の濃度範囲内である工程；
前記一連の試験分子溶液中の各試験分子溶液と限界濃度の分子結合パートナーをインキュベートする工程；
各試験分子溶液中の分子が限界濃度の分子結合パートナーに結合する相対的度合いを測定する工程；及び
前記分子結合パートナーに対する各試験分子の相対的結合親和性を測定するために、前記限界濃度の分子結合パートナーに対する結合親和性に基づいて、各試験分子溶液において前記分子を格付けする工程
を含む方法。
【請求項２９】
前記分子が工程であり、前記分子結合パートナーが抗原である、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体が哺乳動物、ヒト、ヒト化、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、モルモット、ヒツジ、ウシ、及びキメラの各抗体からなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
前記分子がリガンドであり、前記分子結合パートナーがレセプターである、請求項28に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療剤産物の発見に関する。本発明は、治療剤産物に有用である可能性がある抗体を同定するために、エピトープ認識特性および結合親和性に基づいて抗体をスクリーニングし、分類し、ランク付けする方法を提供する。本発明の方法によってスクリーニングし、分類し、ランク付けした抗体を評価して、治療剤産物に有用であるかどうかを判定する方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、変異性と特異性が混在するために、有効な治療剤産物を開発するための重要な手段と見なされている。すなわち、抗体は、多種多様な標的抗原に対して誘発され、標的抗原上の単一のエピトープを認識することができる。この特異性は、癌細胞にのみ存在する表面抗原、病原生物に特異的な表面抗原など特異的疾患症状に限定されていると考えられる標的抗原に対して最適に利用される。抗体は、抗癌剤の開発に特に重要であり、抗癌剤開発が成功するかどうかの鍵は、癌細胞を選択的に死滅させ、正常組織に対してはあったとしても比較的わずかな有害効果しか及ぼさない薬剤を設計できるかどうかにある。このため、化学療法と診断の両方に対する免疫学的標的として役立ち得る癌細胞特異的マーカー抗原を同定することに多くの研究が焦点を合わせている。
【０００３】
抗体は、治療剤産物における様々な機序によって機能し得る。最も簡単なモデルでは、細胞表面の標的抗原に結合した抗体は、細胞の破壊、機能不全または中和を引き起こす。抗体の結合は、アポトーシス、ネクローシスによる細胞破壊を引き起こし、またはマクロファージなどの他の細胞を誘発して細胞、特に癌細胞を破壊し、消滅させることによって細胞破壊を引き起こし得る。抗体は、正常なプロセスを妨害することによって、疾患細胞、特に癌細胞の機能不全を起こし得る。例えば、抗体は、癌細胞でのみ発現する、または癌細胞において過剰発現する受容体もしくはキナーゼに結合してこれを阻害し得る。抗体は、中和効果も有し、毒性抗原、ウイルス抗原、または転写、信号伝達などの様々な基本的細胞プロセスに関与する抗原に結合し、これらの抗原の作用を遮断することができる。治療用抗体は、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、補体依存性細胞溶解などのエフェクター機構を誘発し得る。
【０００４】
別のモデルでは、抗体を、細胞毒と結合させて免疫毒素として知られる治療剤産物を生成する。この手法は、時折「魔法の弾丸」としても知られる手法において標的細胞に細胞毒を送達する抗体の特異性および親和性を利用するものである。抗体、一般に、腫瘍特異的抗体または抗体断片を、標的細胞に対して効力のある細胞毒または毒性成分と結合させる。抗体は、標的抗原を有する細胞を発見しそれに結合するターゲティング剤として働き、それによって標的抗原を有する細胞を選択的に死滅させる毒素が運ばれる。最近、望ましくない反応を防止することによって、様々な悪性疾患を処置する安定で寿命が長い免疫毒素が開発された。例えば、脱グリコシルされたリシンA鎖は、肝臓による免疫毒素のため込みおよび肝毒性を防止すると考えられる。必要に応じて、免疫毒素にインビボでの高い安定性を付与する架橋剤を選択することができる。
【０００５】
治療剤産物としての抗体は、例えば、治療薬に結合した抗体を含む免疫毒素(免疫複合体)を開示している米国特許第6,319,500号、受容体を活性化させる抗体または抗体断片の使用を開示している米国特許第6,319,499号、成長因子受容体の細胞外ドメインに対する抗体を開示している米国特許第6,316,462号、腫瘍壊死因子受容体ファミリーの腫瘍特異的メンバーを活性化させる抗体を開示している米国特許第6,312,691号、および腫瘍中のフィブリンを標的とする免疫毒素を開示している米国特許第6,294,173号に記載されている。
【０００６】
免疫毒素は、マウスおよびヒトのリンパ腫および白血病を処置するのに極めて有効であることが証明されている。腫瘍細胞は血液由来の免疫毒素の影響を比較的受け易いので、リンパ系新形成(Lymphoid neoplasia)は特に免疫毒素治療に適している。また、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)に結合するモノクローナル抗体を含む免疫毒素は、多数の神経芽細胞腫患者において骨髄(BM)疾患を完全に寛解させた。Kushner等、2001、J Clin Oncol 19: 4189〜4194。その一方で、免疫毒素は、癌腫などの固形腫瘍に対して比較的無効であることが証明されている。その理由は、固形腫瘍が一般には抗体サイズの分子に対して不透過性であり、腫瘍塊に入った抗体は腫瘍細胞および繊維腫の間質の物理的障壁のために均等に分布せず、ほとんどの腫瘍における血管分布はまとまりがなく不均一であり、腫瘍に入った抗体はすべて最初に遭遇した腫瘍細胞によって血管周囲領域に吸収され、より遠位の部位にある腫瘍細胞には1つも到達しないことがあるからである。
【０００７】
それでも、抗体を主体とする治療剤産物は、試験され、発売され続けており、モノクローナル抗体は最も重要である。ヒトに導入されるモノクローナル抗体としては、T細胞表面の分子に結合し、器官の急性拒絶を防止するために使用されるOKT3、いくつかのB細胞白血病で見られる分子であるCD22に結合するLymphoCide、ほとんどのB細胞上に存在するCD20分子に結合してB細胞リンパ腫の処置に使用されるRituximab(商品名、Rituxan)、リンパ腫細胞上で高度に発現され、HLA-DRによってコードされる組織適合性抗原に結合するLym-1(商品名、Oncolym)、活性化されたT細胞の表面に生成するIL-2受容体の一部に結合し、移植腎臓の急性拒絶を防止するために使用されるDaclizumab(商品名、Zenopax)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-アルファ)に結合し、リウマチ様関節炎などのいくつかの炎症性疾患に対して効果が期待されるInfliximab、ある種の乳癌およびリンパ腫を含めていくつかの腫瘍細胞上に存在する成長因子受容体であるHER-2/neuに結合し、固形腫瘍に有効と考えられる最初の治療用モノクローナル抗体として有名なHerceptin、正常組織に供給する血管ではなく腫瘍の血管に存在する血管インテグリン(anb3)に結合するVitaxin、通常はフィブリノゲンが結合する表面受容体に結合することによって血小板の凝集を抑制するAbciximab(商品名、Reopro)などがある。免疫毒素化合物CMA-676は、急性骨髄性白血病(AML)において癌細胞によって発現される細胞表面分子であるCD33に結合するモノクローナル抗体と、転写因子がDNAに結合するのを遮断し、それによってAML癌細胞における転写を阻害するオリゴ糖であるカリキアマイシンとの複合体である。
【特許文献１】米国特許第6,319,500号
【特許文献２】米国特許第6,319,499号
【特許文献３】米国特許第6,316,462号
【特許文献４】米国特許第6,312,691号
【特許文献５】米国特許第6,294,173号
【非特許文献１】Kushner等、2001、J Clin Oncol 19: 4189〜4194
【非特許文献２】Singleton等、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.、J. Wiley & Sons (New York、NY 1994)
【非特許文献３】Sambrook等、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor、NY 1989)
【非特許文献４】Chothia等 J. Mol. Biol. 186: 651 (1985)
【非特許文献５】NovotnyおよびHaber、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 4592(1985)
【非特許文献６】Chothia等、Nature 342: 877〜883(1989)
【非特許文献７】Kohler等、Nature、256: 495(1975)
【特許文献６】米国特許第4,816,567号参照
【非特許文献８】Clackson等、Nature、352: 624〜628(1991)
【非特許文献９】Marks等、J. Mol. Biol.、222: 581〜597(1991)
【特許文献７】米国特許第5,500,362号
【特許文献８】米国特許第5,821,337号
【特許文献９】Clynes等 PNAS(USA) 95: 652〜656(1988)
【非特許文献１０】Eisen等(1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95: 14863〜14868
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
疾患のマーカーまたはエフェクターとして役立ち得る標的抗原は多数あり、これらの抗原に対する治療剤産物として可能性がある抗体を同定する迅速かつ効率的で有効な方法が求められている。しかし、特定の標的抗原に対して産生される多数の抗体は、実質的に、抗原に結合する強さ、および標的抗原上の結合する特定のエピトープの点で異なり得る。生成した多数の抗体候補から治療に有用な抗体を同定するためには、結合親和性およびエピトープ認識特性について多数の抗体をスクリーニングする必要がある。このため、特定の標的抗原に対して産生される抗体をスクリーニングして、治療効果を有する可能性が最も高い抗体を同定する迅速な方法を有することは有利なはずである。また、産生された抗体をその標的エピトープ結合部位に応じて分類する機序を提供することは有利なはずである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、抗体をそのエピトープ認識特性および結合親和性に基づいてスクリーニングし、分類し、ランク付けする方法、およびスクリーニングし、分類し、ランク付けされた抗体を本発明の方法によって評価し、治療剤産物におけるまたは治療剤産物としてその潜在的有用性を決定する方法を提供する。本発明の一実施形態は、(i)タンパク質標的の治療上の潜在的有用性をこのようなタンパク質標的と相互作用する分子との関連において明らかにすると同時に、(ii)そのようなタンパク質標的と相互作用し、こうした治療上の有用性を実現する分子を同定する方法である。この方法では、タンパク質標的を複数の分子に対してスクリーニングして、それらのうちの相互作用する分子を見つける。相互作用する分子を、あらかじめ定義した基準に従って分類し、このタンパク質標的を含むあらかじめ選択したアッセイに使用するために代表的なメンバーを選択する。アッセイで確認された作用を記録し、解析する。アッセイにおけるポジティブな作用は、タンパク質標的の治療上の潜在的有用性を示すものであり、このような有用性を可能にする相互作用分子が同定される。
【００１０】
相互作用分子には、小分子、タンパク質、ペプチド、抗体などが含まれることを理解されたい。好ましい実施形態においては、相互作用分子は、抗体、好ましくはヒト抗体である。標的タンパク質は、一般に既知の機能または有用性を有する既知のタンパク質とすることができる。あるいは、標的タンパク質は、新規で機能が比較的未知なものとすることができる。相互作用分子の分類に関して、一般に、様々な結合部位が抗原標的上に存在し、その標的に対する結合親和性が最適化されることが好ましい。アッセイは、考慮される治療上の有用性に基づいて選択される。場合によっては、例えば、腫瘍学、炎症などに関係するアッセイを利用することができる。
【００１１】
本発明の一実施形態は、抗原に対する抗体をスクリーニングし、抗体が認識するエピトープによって抗体を分類し、抗体の結合親和性によって抗体をランク付けする方法であり、それによって、治療剤産物において潜在的有用性を有する抗体を迅速かつ効率的に同定する方法を提供する。また、抗体を評価して治療剤産物における潜在的有用性を明らかにする方法も提供する。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、抗体をスクリーニングし、抗体が認識するエピトープによって分類または「ビンニング(bin)」し、次いで結合親和性についての限界抗原希釈アッセイを用いてエピトープに対する抗体親和性に応じて各カテゴリまたは「ビンニング」の範囲内で抗体をランク付けする、エピトープビンニングを利用した方法である。この方法は、抗原に対して産生される抗体のパネルを、パネルのエピトープ認識特性を識別する競合結合アッセイを用い、次いでパネル中の抗体をビンニングするクラスター化プロセスを用い、次いで限界抗原希釈アッセイを用いて結合親和性に基づいてパネル中の抗体を動力学的にランク付けして、スクリーニングするために使用されることが好ましい。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態は、目的とする抗原に対する高親和性抗体であることがエピトープビンニングおよび限界抗原希釈によって確認された抗体の潜在的治療能力を明らかにする方法である。抗体は、細胞に直接作用して所望の効果をもたらすかどうかを評価することができ、かつ/または免疫毒素などの複合体として使用するのに適しているかどうかを評価することができる。抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける障害または病態を処置する治療剤産物において潜在的有用性があるかどうかを評価することができ、あるいは細胞機能を高め、または哺乳動物、好ましくはヒトに対して薬効を与える治療剤産物において潜在的有用性があるかどうかを評価することができる。
【００１４】
本発明の実施形態は、抗原の様々なエピトープに対して産生される抗体の不均質なパネルをスクリーニングし、分類し、ランク付けする方法を提供し、特定の抗原に対する治療剤産物のより良好な標的となるエピトープを同定する方法を提供する。
【００１５】
また、本発明の実施形態は、複合抗体をスクリーニングし、分類し、ランク付けして、治療剤産物におけるその潜在的有用性を明らかにする方法を提供する。
【００１６】
また、本明細書に記載する方法を使用して、疾患特異的抗原に対する抗体、好ましくは癌抗原、特に固形腫瘍に関連する抗原に対する抗体を評価して、抗腫瘍治療剤産物における抗体の潜在的有用性を評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の実施形態は、新しい治療剤産物を発見し、抗体などの相互作用分子を用いたタンパク質標的による治療介入能力の検証を可能にする方法を提供する。
【００１８】
一般に、本発明の一実施形態は、(i)タンパク質標的の治療上の潜在的有用性をこのようなタンパク質標的と相互作用する分子との関連において明らかにすると同時に、(ii)そのようなタンパク質標的と相互作用し、こうした治療上の有用性を実現する分子を同定する方法である。この方法では、タンパク質標的を複数の分子に対してスクリーニングして、それらのうちの相互作用する分子を見つける。相互作用する分子を、あらかじめ定義した基準に従って分類し、このタンパク質標的を含むあらかじめ選択したアッセイに使用するために代表的なメンバーを選択する。アッセイで確認された作用を記録し、解析する。アッセイにおけるポジティブな作用は、タンパク質標的の治療上の潜在的有用性を示すものであり、このような有用性を可能にする相互作用分子が同定される。
【００１９】
相互作用分子には、小分子、タンパク質、ペプチド、抗体などが含まれることを理解されたい。好ましい実施形態においては、相互作用分子は、抗体、好ましくはヒト抗体である。標的タンパク質は、一般に既知の機能または有用性を有する既知のタンパク質とすることができる。あるいは、標的タンパク質は、新規で機能が比較的未知なものとすることができる。相互作用分子の分類に関して、一般に、様々な結合部位が抗原標的上に存在し、その標的に対する結合親和性が最適化されることが好ましい。アッセイは、考慮される治療上の有用性に基づいて選択される。場合によっては、例えば、腫瘍学、炎症などに関係するアッセイを利用することができる。
【００２０】
ある種の腫瘍学上の標的と類似していると考えられるタンパク質標的の場合、この標的との相互作用が、治療上の有用性をもたらすかどうかは不明であることを理解されたい。例えば、標的は正常組織において発現されることもあり、ある種の相互作用分子との相互作用は、非腫瘍特異的効果を有する可能性もあるので、このような標的は治療上有用でないことになる。一方、このような場合でも、ある種の相互作用分子は、腫瘍特異的応答を示すと判断することができる。このようにして、判定基準となる相互作用分子を利用すると、標的が治療上の潜在的有用性を有するかどうかが明らかになるはずである。この過程においては、タンパク質標的の治療上の潜在的有用性と、相互作用分子のタイプおよび判定基準との両方が検証される。
【００２１】
腫瘍学、炎症などにおける活性に対する関連アッセイおよびスクリーニングは、当業者には周知である。
【００２２】
本発明は、相互作用分子としての抗体の利用と産生に関連して上で考察した発見を開示する。相互作用分子としての抗体に関する本発明の好ましい実施形態においては、発見方法は、エピトープビンニングと限界抗原希釈アッセイの併用を含む。この発見方法を用いて、タンパク質標的(または抗原)に対する抗体をスクリーニングし、抗体が認識するエピトープによって抗体を分類し、抗体の結合親和性によって抗体をランク付けすることができ、それによって、治療剤産物における潜在的有用性を有する抗体を迅速かつ効率的に同定する方法を提供する。本発明の方法によってスクリーニングし、分類し、ランク付けした抗体を評価して、治療剤産物におけるその潜在的有用性を明らかにする方法も提供する。
【００２３】
本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける障害または病態を処置する治療剤産物に使用する抗体を同定し評価する方法を提供する。本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて標的細胞機能を高める治療剤産物に使用する抗体を同定し評価する方法も提供する。本発明の方法を使用して、自然抗体、抗体断片、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性(multispecific)抗体を同定し評価することができる。本発明の方法は、単離抗体を用いて実施することが好ましい。
【００２４】
本発明の一態様は、エピトープビンニングによって抗体パネルをスクリーニングし、抗体が認識するエピトープによって抗体を分類しまたは「ビンニング」する方法を提供する。ビンニングに関連して、各カテゴリまたは「ビン」内の抗体は、結合親和性に対する限界抗原希釈アッセイによって、エピトープに対する抗体の親和性に従いランク付けされる。一実施形態においては、抗体パネルを、パネルのエピトープ認識特性を識別する競合結合アッセイを用いてスクリーニングし、次いでパネル中の抗体をビンニングするクラスター化プロセスを用いて分類し、次いでパネル中の抗体の結合親和性を決定する限界抗原希釈アッセイによって動力学的にランク付けすることができる。
【００２５】
本発明の別の態様は、エピトープビンニングおよび限界抗原希釈によって目的抗原に対する高親和性抗体であることが確認された任意の抗体の潜在的治療能力を明らかにする方法を提供する。抗体は、細胞に直接作用して所望の効果を引き出せるかどうかを評価することができ、かつ/または免疫毒素などの複合体での使用に適しているかどうかを評価することができる。
【００２６】
エピトープビンニングおよび限界抗原希釈によって目的抗原に対する高親和性抗体であることが確認された抗体は、標的細胞に直接的な効果を有するかどうかなどの諸特性を評価することができる。このような抗体は、補体を固定し、補体依存性細胞溶解を誘発できるかどうか、または抗体依存性細胞傷害(ADCC)を誘発できるかどうかを試験することができる。抗体は、標的細胞に、例えばアポトーシス(プログラム細胞死)を誘導することによって直接作用するかどうか、または増殖を含めた細胞代謝を阻害するかどうかを試験することもできる。
【００２７】
抗体は、宿主の免疫エフェクター機構と相乗的に働き、例えば、抗体依存性細胞傷害(ADCC)および補体依存性細胞溶解を促進させるかどうかを評価することもできる。疾患プロセスに関与する受容体の細胞外ドメインなどのエフェクターに結合する抗体は、受容体を直接活性化させるかどうか、かつ/または受容体へのリガンド結合を遮断するかどうかを試験することができる。(ここで、リガンドは、受容体活性に影響を及ぼす作用薬、拮抗薬または小分子とすることができる。)抗体は、抗原を中和し、または病態に関与する基本的細胞プロセスに対して中和効果を及ぼすことによって中和抗体として作用するかどうかを試験することができる。
【００２８】
本発明の別の態様は、エピトープビンニングおよび限界抗原希釈によって、疾患症状に関連する抗原に対する高親和性抗体として同定された任意の抗体の免疫毒素適性を判定する方法を提供する。これらの抗体は、細胞毒と結合して免疫毒素を形成すると、有用な治療剤産物になり得る。ここで、抗体は、標的細胞上の特定の抗原に高い精度と高い親和性で細胞毒を送達することができ、細胞毒は、標的細胞を阻害し、または破壊することができる。免疫毒素の一部として、抗体は、抗体が結合する細胞毒の増強剤、ターゲティング化合物、担体および/または送達剤として作用する。
【００２９】
分化マーカー、成長因子受容体、腫瘍脈管構造の表面マーカー、糖脂質、糖タンパク質を含めた疾患特異的炭水化物分子、ウイルス表面タンパク質、表面免疫グロビンなどの疾患関連抗原に対する高親和性抗体は、細胞毒と結合して免疫毒素を形成することができ、標的細胞を選択的に死滅させる免疫毒素能力を試験することができる。受容体、イオンチャネル、他の膜貫通タンパク質などの考えられるエフェクターに結合する抗体は、エフェクターを選択的に不能にする薬剤を送達できるかどうかを評価することができる。抗体を用いて様々な細胞毒を試験し、最大の効果をもたらす組み合せを見つけることもできる。
【００３０】
別の実施形態においては、エピトープビンニングおよび限界抗原希釈によって目的抗原に対する高親和性抗体であることが確認された抗体は、標的細胞機能を高め、または哺乳動物、好ましくはヒトに対する薬効を与えるように設計された治療剤産物におけるその潜在的有用性について評価することができる。抗体は、細胞に直接作用して所望の効果を引き出せるかどうかを評価することができ、かつ/または複合体での使用に適しているかどうかを評価することができる。例えば、抗体は、受容体への毒素の結合を防止するように受容体へ結合できるかどうかを試験することができ、または毒素に結合し、中和できるかどうかを試験することができる。交互に、抗体は、標的細胞において、またはエフェクターが循環分子である場合には生物体全体に所望の効果をもたらすように、エフェクター分子に結合しそれを刺激することができるかどうかを試験することができる。抗体は、標的細胞に刺激薬を送達し、刺激薬が標的細胞に対してその所望の効果を及ぼし得るかどうかを、評価することができる。
【００３１】
本発明の有利な態様は、複合抗体をスクリーニングし、分類し、ランク付けすることによって免疫毒素に使用される抗体の潜在的有用性を評価する方法を提供する。抗体を回収してからエピトープビンニングおよび限界抗原希釈アッセイを実施するまでの間に、抗体を細胞毒または別の標識に結合させることができる。複合抗体を使用して本発明の方法を実施することによって、この方法は、抗体を同定し単離する有効な方法を提供する。その際、高親和性エピトープ結合が毒素または他の標識の存在によって妨げられることはない。一実施形態においては、抗体を含有するハイブリドーマ上清を用いて結合反応を実施し、抗体を目的とする細胞毒に結合させる。次いで、複合抗体パネルを「ビンニング」し、動力学的にランク付けして、目的とするエピトープに対して高い親和性を有する複合抗体を同定する。他の実施形態においては、ハイブリドーマ上清中の抗体をタンパク質または炭水化物標識に結合させることができ、さらには架橋基のみに結合させることができる。
【００３２】
本発明の別の有利な態様は、単一抗原に曝すことによって産生される抗体の不均質なパネルをスクリーニングし、ビンニングし、ランク付けする方法を提供する。その結果、不均質なパネルは、同じ抗原の異なるエピトープに対する抗体グループに分類される。これによって、同じ抗原の異なるエピトープに対して最高の親和性を有する各抗体の諸特性を同時に試験することが可能になる。様々なエピトープに対する抗体の効果を比較することによって、特定の抗原に対する治療剤産物の標的としてどのエピトープが優れているかを明確にすることが可能になり得る。一実施形態においては、数百パネルの抗体が、成長因子受容体ファミリーの腫瘍特異的メンバーの細胞外ドメインに対して産生される。エピトープビンニングおよび限界抗原希釈アッセイを使用して、受容体の様々なエピトープに対して最高の親和性を有する抗体を同定し、受容体へのリガンド結合を阻害できるかどうかによってスクリーニングし、比較して、受容体機能を最も阻害し得る抗体を決定する。
【００３３】
異なるソースに由来する抗体を、本発明の方法に併用することができる。例えば、同じ抗原に曝された異なる個体または細胞培養物から得られる各抗体、または同じ抗原に対して産生されたポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を併用し、本発明の方法によって抗体をスクリーニングし、分類し、ランク付けし、評価することができる。
【００３４】
本発明の方法を使用して、ヒト抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体をスクリーニングして、ヒト患者に使用したときに拒絶されない治療剤産物を提供することが好ましい。マウスは、免疫化に好都合であり、ほとんどのヒト抗原を異質と認識して、ヒト標的に対して潜在的治療能力を有するネズミ抗体を産生することができるが、高用量を必要とすること、循環半減期が短いこと、ネズミ抗体に対するヒト抗体を誘発する可能性があることなどの欠点によってこれらの利点は覆い隠されてしまう。ヒト抗体またはヒト化抗体は、利用可能なクローニング媒体によって維持されたトランスジェニックXenoMouse(商標)を用いて産生させることが好ましい。酵母人工染色体(YAC)クローニングベクターを使用することによって、ヒトIg遺伝子座の大きな生殖系列断片をトランスジェニック哺乳動物に導入する方法が得られる。本質的に、ヒトゲノムおよびヒト定常領域中に存在し等間隔で並ぶヒトV、DおよびJ領域遺伝子の大部分を、YACを用いてマウスに導入した。このようなトランスジェニックマウスの1つはXenoMouseとして知られ、Abgenix,Inc.(Fremont CA)から市販されている。
【００３５】
XenoMouseは、マウスIgHおよびIgΚ遺伝子座が不活化され、機能的メガベースサイズのヒトIgHおよびIgΚ導入遺伝子が導入されたマウスである。また、XenoMouseは、実質的にあらゆる所望の抗原を用いた免疫化に反応して、所望のIgG1アイソタイプの親和性が高い完全なヒト抗体を産生可能なトランスジェニックマウスである。このようなmAbを使用して、補体依存性細胞傷害または抗体依存性細胞毒性を標的細胞に誘導する。
【００３６】
癌
本発明の一態様は、癌抗原、好ましくは固形腫瘍に関連する抗原に対する治療用抗体候補を同定する方法を提供する。好ましい様々な実施形態においては、本発明の方法を使用して、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、肺癌、結腸癌および卵巣癌に関連する抗原、特に前立腺幹細胞抗原(PSCA)に対する抗体を同定することができる。
【００３７】
本発明の別の態様は、癌抗原に対して親和性が高く、癌抗原由来の解離速度が低い抗体を同定し、分類し、ランク付けすることによって、癌治療のための治療剤産物を同定する方法を提供する。一実施形態においては、関連する抗原に高い親和性で結合することによって、例えばアポトーシス(プログラム細胞死)または細胞増殖阻害を誘発させて癌細胞に直接作用する抗体を、同定することができる。別の実施形態においては、抗体は、宿主の免疫エフェクター機構と相乗的に働き、例えば抗体依存性細胞傷害(ADCC)および補体依存性細胞溶解を促進させることができる。別の実施形態においては、本発明の方法を使用して、免疫毒素に使用可能な抗体を同定することができ、癌関連抗原に対する抗体の特異性および高親和性によって複合毒素を癌細胞に送達することができる。抗体は、固形腫瘍、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、肺癌、結腸癌または卵巣癌に関連する抗原、特に前立腺幹細胞抗原(PSCA)に特異的であることが好ましい。
【００３８】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。例えば、Singleton等、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.、J. Wiley & Sons (New York、NY 1994); Sambrook等、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor、NY 1989)を参照されたい。本発明では、下記の用語を以下で定義する。
【００３９】
「抗体」(Ab)および「免疫グロブリン」(Ig)は、同じ構造上の諸特性を有する糖タンパク質である。抗体は特異的抗原に対して結合特異性を示すものの、免疫グロブリンは、抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパシステムによって低レベルで、骨髄腫によって高レベルで産生される。
【００４０】
「自然抗体および免疫グロブリン」は、通常、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、同じ2つの軽(L)鎖と同じ2つの重(H)鎖で構成される。各軽鎖は、1つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖および軽鎖には、一様な間隔をおいて並ぶ鎖間ジスルフィド架橋も存在する。各重鎖は、一端に可変ドメイン(VH)を有し、その後にいくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(VL)を有し、もう一端に定常ドメインを有する。軽鎖定常ドメインは、重鎖の第1の定常ドメインと並列し、軽鎖可変ドメインは重鎖可変ドメインと並列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの境界面を形成すると考えられている(Chothia等 J. Mol. Biol. 186: 651 (1985; NovotnyおよびHaber、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 4592(1985); Chothia等、Nature 342: 877〜883(1989))。
【００４１】
本明細書の「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、所望の生物活性を示す、完全モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの完全抗体で形成される多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、キメラ抗体および抗体断片を包含する。「抗体」という用語は、すべてのクラスおよびサブクラスの完全免疫グロブリンを含む。
【００４２】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、完全抗体を異なる「クラス」に割り当てることができる。完全抗体には主要な5つのクラス、すなわちIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、これらのうちいくつかはさらに「サブクラス」(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAおよびIgA2に分類することができる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。あらゆる脊椎動物種から得られる抗体(イムノグロブルン(immunoglobuln))の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づく2つの明らかに特徴的なタイプκおよびλのどちらかに割り当てることができる。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置が周知である。
【００４３】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る可能な天然突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は極めて特異的であり、単一抗原の単一エピトープを対象にする。モノクローナル抗体は、他の抗体に汚染されずに合成し得る点で本発明の使用に有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体の特性を示し、特定の方法によって抗体を産生する必要があるものと解釈すべきではない。例えば、本発明によって使用されるモノクローナル抗体は、Kohler等、Nature、256: 495(1975)が最初に記述したハイブリドーマ法によって作製することができ、または組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号参照)によって作製することができる。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等、Nature、352: 624〜628(1991)およびMarks等、J. Mol. Biol.、222: 581〜597(1991)に記載された技術を使用してファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【００４４】
本明細書で使用する「キメラ抗体」という用語は、複数のソースに由来する材料を含む抗体、または複数のソースに由来する材料でコードされた抗体を意味する。例えば、キメラ抗体は、ある所望の諸特性を有する抗体を産生する、マウス抗体に由来する領域とヒト抗体に由来する領域とを含むことができる。交互に、キメラ抗体は、ある所望の諸特性を有する遺伝子産物を産生するために、異なる種から得られるコード領域、同じ種の異なるメンバーから得られるコード領域、または同じゲノムの異なる領域から得られるコード領域を含み得るキメラ遺伝子によってコードされる抗体とすることができる。ヒト化抗体は、この定義内のキメラ抗体と見なすことができる。
【００４５】
「単離」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離および/または回収された抗体である。本明細書で使用する単離抗体は、抗体産生細胞の培養、例えば、B細胞培養またはハイブリドーマ培養の培地に分泌される抗体とすることができる。培養細胞は遠心分離され、抗体を含む培地が上清として回収されることが好ましい。
【００４６】
「中和抗体」は、それが結合する標的抗原のエフェクター機能を消滅またはかなり減弱させることが可能な抗体分子を意味する。したがって、「中和」抗体として作用する治療剤産物は、エフェクター機能を消滅またはかなり減弱させることが可能である。
【００４７】
「抗体依存性細胞傷害」および「ADCC」は、Fc受容体(FcR)を発現する非特異的細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球およびマクロファージ)が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞を溶解させる細胞性反応を意味する。目的分子のADCC活性を評価するために、米国特許第5,500,362号または同5,821,337号に記載のものなどのインビトロでのADCCアッセイを実施することができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞などがある。別法として、またはこれに加えて、目的分子のADCC活性は、インビボ、例えば、Clynes等 PNAS(USA) 95: 652〜656(1988)に開示されたものなどの動物モデルで評価することができる。
【００４８】
「エピトープ」という用語は、タンパク質抗原上の(モノクローナルまたはポリクローナル)抗体結合部位を意味するために使用される。
【００４９】
「治療剤産物」という用語は、哺乳動物の障害または病態を処置するために使用される産物、および明白な障害または病態のない状態でその薬効のために投与される産物を意味する。本明細書で使用する「治療剤産物」は、抗体または抗体断片を含有する。治療剤産物は、抗体または抗体断片、および必要であれば、担体、緩衝剤、賦形剤などを含有する治療用抗体とすることができる。交互に、治療剤産物は、細胞毒、刺激薬などの少なくとも1つの生理活性物質に結合した抗体または抗体断片、および必要であれば、担体、緩衝剤、賦形剤などを含むことができる。「免疫毒素」という用語は、少なくとも1つの細胞毒に結合した抗体を含有する治療剤産物を意味する。ここで、抗体とサイトキシン(cytoxin)は、架橋剤を使用して、または使用しないで任意の適切な手段によって結合または化合させることができる。免疫毒素を使用して、標的細胞を破壊または阻害するために、毒素を標的細胞に送達することができる。刺激薬に結合または化合した抗体を含有する治療剤産物を使用して、標的細胞の機能を刺激し、または高めることができる。
【００５０】
「病態」という用語は、細胞または体の機能、システムまたは器官の中断、休止または障害が起こった細胞または哺乳動物全体の生理学的状態を意味する。
【００５１】
「処置する」または「処置」という用語は、治療処置および予防薬または予防策を意味し、その目的は、癌の発生、拡大などの望ましくない生理学的変化または障害を防止し、あるいは遅延(減弱)させることである。有利なまたは所望の臨床結果としては、検出可能または検出不可能な、症候の軽減、疾患範囲の縮減、疾患状態の安定化(すなわち、悪化しないこと)、疾患進行の遅延または緩徐化、病態の回復または緩和、(部分的または全体的)寛解などがあるが、これらだけに限定されない。「処置」は、処置を受けない場合に予測される生存よりも延命させることも意味する。処置が必要なものとしては、病気や障害にすでに罹患しているもの、ならびに病気や障害に罹患しやすいもの、病気や障害を予防すべきものなどがある。
【００５２】
「障害」は、本発明の処置の利点が得られるあらゆる病気である。これには、問題となる障害の素因を哺乳動物に与える病的症状を含めて、慢性および急性の障害または疾患が含まれる。本明細書で扱う障害の非限定的な例は、良性腫瘍および悪性腫瘍、白血病およびリンパ様悪性腫瘍、特に乳癌、直腸癌、卵巣癌、胃癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、結腸癌、甲状腺癌、すい臓癌、前立腺癌または膀胱癌である。本発明によって処置することが好ましい障害は、頚癌、頚部扁平上皮癌、腺腫瘍、腎細胞癌(RCC)、食道腫瘍、癌腫由来の細胞系などの悪性腫瘍である。
【００５３】
本明細書で使用する「腫瘍」は、悪性または良性のすべての新生物細胞成長および増殖、およびすべての前癌細胞および癌細胞ならびに前癌組織および癌組織を意味する。
【００５４】
「癌」および「癌性」という用語は、一般に無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的病気を意味し、または記述するものである。癌の例は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ様悪性腫瘍であるがこれらだけに限定されない。このような癌のより詳細な例は、扁平上皮細胞癌(例えば、上皮扁平上皮細胞癌(epithelial squamous cell cancer))、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌を含めた肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含めた胃(gastric)癌または胃(stomach)癌、膵癌、グリア芽細胞腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓(kidney)または腎臓(renal)癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、ならびに頭部癌および頚部癌である。
【００５５】
処置を目的とした「哺乳動物」とは、ヒト、家畜、およびイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどの動物園の動物、スポーツ用動物またはペット動物を含めて、哺乳動物として分類されるあらゆる動物を意味する。哺乳動物はヒトであることが好ましい。
【００５６】
エピトープビンニング
各ハイブリドーマ細胞融合実験からより多くの抗原特異的抗体を産生させる融合効率が高くなるにつれて、多数の抗体を管理し優先順位をつけるスクリーニング方法がより一層重要になる。1セットのモノクローナル抗体が標的抗原に対して産生されたとき、セット中の異なる抗体は異なるエピトープを認識し、結合親和性も異なるはずである。したがって、多数の抗体を効果的にスクリーニングするために、各抗体が結合するエピトープを決定し、各抗体の結合親和性を明らかにすることは重要である。
【００５７】
本明細書に記載するエピトープビンニングは、抗体が認識するエピトープに基づいて抗体をグループ分けするプロセスである。より詳細には、エピトープビンニングは、様々な抗体のエピトープ認識特性を識別し、抗体のエピトープ認識特性に基づいて抗体をクラスター化するコンピュータプロセスと併用されて、特徴的な結合特異性を有する抗体を明らかにする方法およびシステムを含む。したがって、実施形態は、抗体のエピトープ結合特性を明らかにするアッセイ、およびこのようなアッセイから得られるデータを解析するプロセスを含む。
【００５８】
一般に、本発明は、(抗体などの)試験成分が(他の抗体などの)他の試験成分と競合して(抗原などの)被験物(test object)に結合するかどうかを判定するアッセイを提供する。捕捉成分を用いて被験物および/または試験成分を処理可能な方式で捕捉し、検出成分を利用して他の試験成分と被験物の結合を処理可能なように検出する。試験成分が、分析される試験成分と同じまたはほぼ同じ試験対象(test subject)上の場所に結合すると結合は検出されないのに対し、試験成分が、分析される試験成分とは異なる試験対象(test subject)上の場所に結合すると結合が検出される。各場合において、結合または結合の欠如は処理可能であり、試験成分と被験物の相対的相互作用を容易に確認し、分類することができる。
【００５９】
本発明の一実施形態は、抗原に対して産生された1セットの抗体を分類する競合に基づく方法である。この方法は、セットの各抗体をセットの他の抗体すべてに対する競合結合について試験する一連のアッセイを実施することに依拠している。したがって、各抗体は、2つの異なるモードで使用される。すなわち、少なくとも1つのアッセイにおいては、各抗体は、「検出」モードで、セット中の他の抗体すべてに対して試験される「プローブ抗体」として使用され、他のアッセイにおいては、抗体は、「捕捉」モードで、分析される基準抗体(reference antibody)セット内の「基準抗体」として使用される。基準抗体セット内で、各基準抗体は、基準抗体の混合物中で各基準抗体を検出し識別できるように一義的に標識されている。この方法は、基準抗体、抗原およびプローブ抗体を含む「サンドイッチ」または複合物を形成させ、これら複合物の形成または非形成を検出することに依拠している。セット中の各基準抗体は一義的に標識されているので、分析する基準抗体セット中に存在する各基準抗体に対して複合物が形成されたかどうかを処理可能に判定することが可能である。
【００６０】
抗体アッセイ概要
この方法は、抗原に対する抗体セットから抗体を選択することによって開始される。選択された抗体は、セットの他の抗体すべてに対する競合結合について試験される「プローブ抗体」として働く。すべての抗体を含む混合物は、1セットのアッセイ用「基準抗体」として働く。ここで、混合物中の各基準抗体は一義的に標識されている。アッセイでは、標的抗原の存在下でプローブ抗体を基準抗体セットと接触させる。したがって、プローブ抗体と、そのセット中で標的抗原上の同じエピトープに対して競合しない他の任意の抗体との複合物が形成される。プローブ抗体と、そのセット中で標的抗原上の同じエピトープに対して競合する他の任意の抗体との複合物は形成されない。複合物の形成は、プローブ抗体に結合する標識検出抗体によって検出される。混合物中の各基準抗体は一義的に標識されているので、基準抗体がプローブ抗体と複合物を形成したかどうかを各基準抗体について判定することができる。したがって、混合物中のどの抗体がプローブ抗体と競合し、プローブ抗体と同じエピトープに結合するのかを明らかにすることができる。
【００６１】
各抗体は、少なくとも1つのアッセイにおいてプローブ抗体として使用される。セット中の各個々の抗体を抗体セット全体に対して試験する方法を繰り返すことによって、抗原に対して抗体セット全体の競合結合親和性を得ることができる。このような親和性測定から、セット中のどの抗体がセット中の他の抗体と類似した結合特性を有しているかを明らかにすることができ、そのエピトープ結合プロファイルに基づいて各抗体をグループ化または「ビンニング」することができる。競合結合親和性測定の表は、アッセイ結果を表示する適切な方法である。この方法の好ましい実施形態は、抗体のハイスループットスクリーニングのための多重競合抗体ビンニング(MCAB)アッセイである。
【００６２】
この実施形態は、抗原に対して産生される抗体セット全体に対して単一の抗体を試験する抗体競合試験に依拠しているので、この方法を実施する上での課題の1つは、この単一抗体とセット中の他の抗体のいずれか1つとで形成される複合物を一義的に同定し、定量するために使用される機序に関係している。この定量測定によって、2つの抗体が抗原上の同じエピトープに対して競合するかどうかを推定することが可能になる。
【００６３】
以下に示すように、本発明の実施形態は、すべての抗体の混合物を調製する前にセット中の各基準抗体を一義的に標識することに関する。この一義的な標識は、以下で考察するように、どんな特定の機序にも限定されない。逆に、混合物中の各基準抗体を同定する仕方を提供し、セット中の各基準抗体をセット中の他の基準抗体すべてから識別できるようにするあらゆる方法が適切であると考えられる。例えば、各基準抗体を比色分析できるように標識して、セット中の各抗体の特定の色を測定することができる。あるいは、セット中の各基準抗体を、異なる放射性同位体を用いて放射能標識することができる。基準抗体は、ビーズまたは他の表面などの被標識物に抗体を結合、連結または付着させることによって標識することができる。
【００６４】
セット中の各基準抗体を一義的に標識した後、すべての基準抗体を含有する混合物を形成させる。この混合物に抗原を添加し、プローブ抗体を添加する。結合プローブ抗体を含む複合物を検出するために検出標識が必要である。検出標識は、標識検出抗体とすることができ、またはプローブ抗体に結合する別の標識とすることができる。例えば、1セットのヒトモノクローナル抗体を試験するとき、マウス抗ヒトモノクローナル抗体は、検出抗体として使用するのに適切である。検出標識は、基準抗体を標識するために使用する混合物中の他のすべての標識とは異なるように選択される。例えば、標識検出抗体は、一義的な色で標識することができ、または放射能標識することでき、またはフィコエリトリン(PE)などの特定の蛍光マーカーで標識することができる。
【００６５】
実験の設計は、検出抗体がプローブ抗体のみに結合し、基準抗体には結合しないように諸条件を選択しなければならない。基準抗体が抗体を介してビーズまたは他の材料に結合する実施形態においては、基準抗体をビーズに結合させる抗体(「捕捉抗体」)は、検出抗体と同じ抗体である。本発明のこの実施形態によれば、検出抗体は、検出抗体がプローブ抗体のみに結合し基準抗体には結合しないように特異的に選択され、または改変される。検出と捕捉に同じ抗体を使用することによって、それぞれの標的に結合するのを互いに妨害するはずである。したがって、捕捉抗体が基準抗体に結合しているとき、基準抗体上の同じエピトープに検出抗体が結合するのが妨害され、偽陽性の結果を生じるのが防止される。検出抗体としての使用に適した抗体は、Calbiochemから入手可能なマウス抗ヒトIgG2、IgG3およびIgG4抗体(カタログ番号411427、Southern Biotechnology Associates,Inc.から入手可能なマウス抗ヒトIgカッパ(カタログ番号9220-01および9220-08、およびPharMingenから入手可能なマウス抗hIgG(カタログ番号555784および555785)などである。
【００６６】
標識検出抗体を混合物に添加した後、混合物全体を分析して、標識検出抗体、結合プローブ抗体、抗原および一義的な標識基準抗体の複合物を検出することができる。検出方法は、混合物中の一義的に標識された各基準抗体によって複合物(またはその欠如)を検出できるものでなければならない。
【００６７】
複合物がセット中のプローブ抗体と各基準抗体との間で形成されるかどうかを検出することによって、各基準抗体について、基準抗体が同じ(または近傍の)エピトープとの結合に対してプローブ抗体と競合するかどうかが示される。基準抗体の混合物は、プローブ抗体として使用される抗体を含むので、これによって陰性対照が提供されると考えられる。複合物の形成を検出することによって、試験セット中の抗体の競合親和性を測定することが可能になる。次いで、この競合親和性の測定を使用して、標的抗原上の同じエピトープに各抗体が結合する強弱に基づいてセット中の各抗体を分類する。これによって、結合特性に基づいてセット中の抗体を迅速にグループ化する方法が提供される。
【００６８】
一実施形態においては、以下に示すように、本発明の実施形態に従い単一の実験で多数の抗体をそれらのエピトープ認識特性によって同時にスクリーニングすることができる。一般に、「実験」という用語は、個々の抗体アッセイと適切な対照の集合を示すために本明細書で非限定的に使用される。「アッセイ」という用語は、個々のアッセイ、例えば、マイクロタイタープレートの単一のウェルにおいて単一のプローブ抗体を用いて実施される反応を意味するために本明細書で非限定的に使用され、またはアッセイの集合を意味するため、または本明細書に記載する抗体結合および競合を測定する方法を意味するために使用することができる。
【００６９】
一実施形態においては、セット中の各基準抗体が一義的に標識された「捕捉」抗体に結合している1セットの基準抗体を使用するサンドイッチアッセイを用いて、多数の抗体をそれらのエピトープ認識特性によって同時にスクリーニングする。捕捉抗体は、例えば、セット中の抗体に対して強い親和性を有する比色分析可能な標識抗体とすることができる。一例として、捕捉抗体を、標識マウス、ヤギ、ウシ抗ヒトIgG抗体または抗ヒトIgカッパ抗体とすることができる。本明細書に記載する実施形態はマウスモノクローナル抗ヒトIgG抗体を使用するが、試験する抗体に結合する他の類似の捕捉抗体も本発明の範囲内にある。したがって、当業者は、試験する抗体セットの起源に基づいて適切な捕捉抗体を選択することができる。
【００７０】
したがって、本発明の一実施形態は、例えば、標的抗原に対して産生された50種の異なる抗体が標的抗原上のどのエピトープに結合するかを分類する方法を提供する。50種の抗体が標的抗原に対してある程度の親和性を有すると判定された後に、下記方法を使用して50種のグループのうちのどの抗体が同じエピトープに結合するかを決定する。これらの方法は、50種の抗体の各々をプローブ抗体として用いて50種の抗体(基準抗体)すべての混合物に対して交差競合(cross-compete)させることによって実施される。混合物中の50種の一義的標識基準抗体は、それぞれ捕捉抗体で標識されている。同じエピトープを認識するこれらの抗体は互いに競合し、一方、競合しない抗体は同じエピトープに結合しないと考えられる。多数の抗体を単一の反応で一義的に標識化することによって、以下に示すように、これらの方法は、あらかじめ選択した抗体を、10、25、50、100、200、300種またはそれ以上の抗体に対して一度に競合させることができる。このため、1回の実験において50種の抗体を試験するかどうかは任意であり、本発明を限定するものと見なすべきではない。
【００７１】
多重競合抗体ビンニング(MCAB)アッセイを使用することが好ましい。MCABアッセイは、図1に示す方法を用いて最高100種の抗体を同時にビンニングすることができるLUMINEXシステム(Luminex Corp.、Austin TX)を利用して実施することがより好ましい。MCABアッセイは、単一の抗原分子に対する2つの抗体の競合結合に基づいている。特徴を明らかにしようとする抗体セット全体をMCABアッセイでは2回、すなわちMCABサンドイッチアッセイにおける「捕捉」と「検出」モードで使用する。
【００７２】
一実施形態においては、各捕捉抗体は一義的に標識される。捕捉抗体を一義的に標識した後、それを試験抗体セットの1つに曝し、一義的に標識された基準抗体を形成させる。これをセットの残りの抗体に対しても繰り返して、各抗体を異なる色の捕捉抗体で標識する。例えば、50種の抗体を試験するとき、50種の一義的標識基準抗体を単一の反応ウェルに混合することによって標識基準抗体混合物を調製する。このため、各標識は、他の標識と混合されたときにそれを識別または検出可能な特徴的性質を有することが有用である。好ましい一実施形態においては、各捕捉抗体は、特徴的な蛍光色素パターンで標識され、比色測定によって互いに識別することができる。
【００７３】
試験抗体混合物を調製した後、それを複数のウェル、例えば、マイクロタイタープレートに入れる。この例では、同じ抗体混合物を50個のマイクロタイターウェルの各々に入れ、次いで、競合アッセイの第1の段階として各ウェル中の混合物を標的抗原とともにインキュベートする。標的抗原とともにインキュベートした後、最初の50種の抗体セットから選択した単一のプローブ抗体を各ウェルに添加する。この例では、1つのプローブ抗体のみを各基準抗体混合物に添加する。ウェル中のいずれかの標識基準抗体がプローブ抗体と同じ標的抗原エピトープに結合する場合、それらはエピトープ結合部位に対して互いに競合する。
【００７４】
本発明の実施形態は、単一のプローブ抗体を各ウェルに添加することのみに限定されるものではないことを当業者は理解されたい。各々が互いに識別可能に標識された複数のプローブ抗体を混合物に添加する別の方法も企図される。
【００７５】
プローブ抗体がウェル中の50種の標識基準抗体のどれかに結合したかどうかを判定するために、標識検出抗体を50種の反応物の各々に添加する。一実施形態においては、標識検出抗体は、捕捉抗体として使用するのと同じ抗体に異なる標識をした抗体である。したがって、例えば、検出抗体をマウス抗ヒトIgG抗体または抗ヒトIgカッパ抗体とすることができる。検出抗体は、ウェルに入れられたプローブ抗体に結合しそれを標識する。
【００７６】
検出抗体の標識によって、基準抗体、抗原およびプローブ抗体によって形成された複合物に結合するプローブ抗体を検出しその量を測定することが可能になる。この複合物は、プローブ抗体と基準抗体の競合を測定するのに役立つ。検出抗体は、二次抗体の検出を容易にする任意の適切な標識で標識することができる。例えば、検出抗体をビオチンで標識することができ、それによって、ストレプトアビジン-フィコエリトリン(PE)を添加したときにプローブ抗体の蛍光検出が容易になる。検出抗体は、ビオチン、ジゴキシゲニン、レクチン、放射性同位体、酵素、他の標識など複合物の一部としてその有無を一義的に決定する任意の標識で標識することができる。所望であれば、標識によって、抗体-抗原複合物が結合したビーズまたは他の表面の単離を容易にすることもできる。
【００７７】
各一義的標識基準抗体に結合した標識検出抗体の量は、結合プローブ抗体の量を示し、標識検出抗体は、標識基準抗体に結合した抗原に結合したプローブ抗体に結合する。50種の標識基準抗体の各々に結合した標識検出抗体の量を測定することによって、結合プローブ抗体の量が示される。結合プローブ抗体量は、2つの抗体(プローブおよび基準)のエピトープ認識特性の類似または相違の指標である。測定可能な量の標識検出抗体が標識基準抗体-抗原複合物上に検出される場合、プローブ抗体と基準抗体が抗原の同じエピトープに結合していないことを示していると理解される。逆に、標識基準抗体-抗原複合物上に検出抗体がほとんどまたはまったく検出されない場合、その反応のプローブ抗体は抗原上の極めて類似したエピトープ、または同じエピトープに結合していることを示していると理解される。基準抗体-抗原複合物で少量の検出抗体が検出される場合、基準抗体およびプローブ抗体は、類似しているが異なるエピトープ認識特性を有している可能性があり、例えば、エピトープに対する基準抗体の結合が、そのエピトープに対するプローブ抗体の結合を妨害するが完全には阻害しないことを示していると理解される。
【００７８】
本発明の別の態様は、基準抗体、および抗原に結合したプローブ抗体量の両方を検出する方法を提供する。異なる基準抗体を含む抗体複合物を混合した場合、捕捉抗体上の一義的標識によってもたらされる独特な性質を使用して、そのビーズに結合した基準抗体を同定することができる。特徴的な性質は、一義的な発光スペクトルであることが好ましい。
【００７９】
任意の基準抗体に結合したプローブ抗体の量は、複合物に結合した検出標識の量を測定することによって求めることができる。検出標識は、複合物に結合したプローブ抗体に結合した標識検出抗体とすることができ、またはプローブ抗体に結合した標識とすることができる。したがって、基準抗体とプローブ抗体の両方のエピトープ認識特性は、エピトープに対するこの2つの抗体の競合を比較測定することによって求めることができる。
【００８０】
手順を最適にする諸条件は当業者の経験的な方法および知見によって決定することができる。インキュベーション時間、温度、緩衝剤、試薬および他の要因は、十分強いまたは明確な信号が得られるまで変えることができる。例えば、様々な抗体の最適濃度は、当業者が、異なる濃度の抗体および抗原を試験し、最も強い信号または他の所望の結果を生じる濃度を見つけることによって経験的に決定することができる。一実施形態においては、一次抗体および二次抗体、すなわち、ビンニングすべき抗体の最適濃度を、抗原を認識しない陰性対照抗体の存在下で同じ抗原の異なるエピトープに対して産生される2つの抗体を2回滴定することによって決定する。
【００８１】
着色ビーズを使用したアッセイ
好ましい実施形態においては、単一の管またはウェル中の複数の反応を区別するようにカラーコードで識別されたミクロスフェアまたはビーズを用い、好ましくはLuminex Corporation(Luminex Corp、Austin TX)から入手可能なシステムを用いて、最も好ましくはLuminex 100システムを用いて、単一のアッセイで多数の抗体をそれらのエピトープ認識特性に基づいて同時にスクリーニングする。MCABアッセイをLuminex技術を用いて実施することが好ましい。別の好ましい実施形態では、最高100種の様々な試験抗体を100種の特徴的な色のLuminexビーズに結合させる。このシステムは、埋め込まれた蛍光色素の量が異なる100種の様々なポリスチレンビーズセットを提供している。これによって、各ビーズセットに特徴的な蛍光発光スペクトルが付与され、したがって特徴的なカラーコードが付与される。
【００８２】
抗体の結合特性をLuminex 100システムを用いて明らかにするために、各ビーズに共有結合する捕捉抗体でビーズを被覆する。マウス抗ヒトIgGまたは抗ヒトIgカッパモノクローナル抗体を使用することが好ましい。次いで、特性を明らかにする基準抗体を含む(例えば、ハイブリドーマ上清を含む)ウェル中で各ビーズセットを、複合物が、ビーズ、捕捉抗体、およびその基準抗体に対して一義的な標識を付与する特徴的な蛍光発光スペクトル、したがって、カラーコードを有する基準抗体との間で形成される(以後、「基準抗体-ビーズ」複合物)ようにインキュベートする。
【００８３】
この好ましい実施形態では、各基準抗体との各反応から得られる各基準抗体-ビーズ複合物を他の基準抗体-ビーズ複合物と混合して、すべての基準試験抗体を含有する混合物を形成させる。各基準抗体は、ビーズに結合することによって一義的に標識される。この混合物を、96ウェルプレートのうちの実験に必要な数のウェルに等分する。一般に、ウェルの数は、様々な対照とプローブ試験抗体の数によって決まる。一定分量の基準抗体-ビーズ複合物の混合物を含むこれらのウェルの各々を、最初に抗原と、次いでプローブ抗体(特性を明らかにしようとする抗体の1つ)と、次いで検出抗体(本来の捕捉抗体を標識した抗体)とインキュベートする。ここで、検出抗体は、結合プローブ抗体の検出に使用される。好ましい実施形態においては、検出抗体は、ビオチン化マウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体である。このプロセスを図1に示す。
【００８４】
図1に示す説明のための実施形態では、各基準抗体は、特徴的な発光スペクトルを有するビーズに結合する。ここで、この基準抗体は、マウス抗ヒトモノクローナル捕捉抗体を介して結合し、一義的な標識基準抗体を形成する。一義的標識基準抗体セット全体をマルチウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れる。基準抗体セットを抗原とともにインキュベートし、次いでプローブ抗体をウェルに添加する。プローブ抗体は、様々なエピトープを認識する基準抗体に結合している抗原にのみ結合する。抗原へのプローブ抗体の結合によって、捕捉抗体を介してビーズに結合している基準抗体、抗原および結合プローブ抗体からなる複合物が形成される。結合プローブ抗体を検出するために標識検出抗体を添加する。ここで、検出抗体はビオチンで標識されており、結合プローブ抗体は、ストレプトアビジン-PEとビオチン化検出抗体の相互作用によって検出される。図1に示すように、抗体#50はプローブ抗体として使用され、基準抗体は抗体#50および抗体#1である。抗体は様々なエピトープに結合するので、プローブ抗体#50は、基準抗体#1に結合している抗原に結合し、標識複合物が検出される。プローブ抗体#50は、基準抗体#50が結合した抗原には結合しない。というのは、同じエピトープに対して両方の抗体が競合し、その結果標識複合物が形成されないからである。
【００８５】
この実施形態においては、インキュベーションステップ終了後に、所与のウェルのビーズをキュベット中の1本の列に配列させ、一度に1個のビーズを2つのレーザに通す。第1のレーザは、ビーズに埋め込まれた蛍光色素を励起させ、各ビーズに結合した基準抗体を同定する。第2のレーザは、ビーズ複合物に結合した蛍光分子を励起させ、結合検出抗体、したがって、基準抗体-ビーズ複合物の抗原に結合しているプローブ抗体を定量する。検出抗体の強い信号がビーズ上に測定されるときには、そのビーズに結合している基準抗体とプローブ抗体が、抗原の異なる部位に結合し、したがって、抗原の異なるエピトープを認識していることをそれは示している。結合検出抗体の弱い信号がビーズ上で測定されるときには、対応する基準抗体とプローブ抗体が同じエピトープに対して競合していることをそれは示している。これを図1に示す。この実施形態の主要な利点は、ハイスループットモードで実施できることにあり、複数の競合アッセイを単一のウェル中で同時に実施することができ、時間と資源を節約することができる。
【００８６】
本明細書に記載するアッセイは、特性を明らかにする一次抗体および二次抗体のエピトープ認識特性の少なくとも1つの追加パラメータ、例えば、温度効果、イオン濃度、(洗浄剤を含めた)溶媒または任意の他の目的とする要因の測定を含めることができる。当業者は、本開示を利用して、少なくとも1つの追加要因を試験可能な実験設計を作成することができる。必要に応じて、アッセイを複数回繰り返すことができ、温度、イオン濃度、溶媒などの要因を実験設計に応じて変えることができる。追加要因を試験するときには、分析に追加要因を含めるようにそれに応じてデータ解析方法を調整することができる。
【００８７】
データ解析 
本発明の別の態様は、類似したエピトープ認識特性および異なるエピトープ認識特性を有する抗体を同定するために、少なくとも1つのアッセイ、好ましくは少なくとも1つのハイスループットアッセイから生成するデータを解析するプロセスを提供する。抗体の集合のエピトープ認識特性の比較をもとにした比較手法によって、類似したエピトープ認識特性を有し、同じエピトープに対して競合する可能性が高い抗体を同定することが可能になり、ならびに異なるエピトープ認識特性を有し、異なるエピトープに結合する可能性が高い抗体を同定することが可能になる。このようにして、抗体が認識するエピトープに基づいて抗体を分類し、または「ビンニングする」。好ましい実施形態は、ハイスループットアッセイによって生成するデータを解析する競合パターン認識(CPR)プロセスを提供する。CPRを用いて、多重競合抗体ビンニング(MCAB)ハイスループット競合アッセイから生成するデータを分析することがより好ましい。本明細書に開示し特許請求するデータ解析プロセスを適用して、MCABアッセイなどのアッセイによって特徴付けられる抗原特異性抗体のプール内で示される特徴的な結合特異性を明らかにすることによって、冗長性を排除することができる。
【００８８】
本発明の好ましい実施形態は、抗原標的に対して特徴的な結合特異性を示す「ビン」またはカテゴリに抗体をクラスター化するプロセスを提供する。さらに別の好ましい実施形態では、CPRプロセスが、抗原分子の結合部位に対してどの抗体もそれ以外のすべての抗体と競合するMCABハイスループット競合アッセイの結果を表すデータに適用される。XenoMouse動物から産生される様々な抗体データセットを用いて実施した実施形態は、本発明のプロセスを適用すると一貫した再現性のある結果が得られることを示している。
【００８９】
実験から生成するデータの分析は、一般に、アッセイを実施した様々なウェルにわたるデータを正規化し、試験抗体の競合パターンを明らかにし分類することによってデータをクラスター化する多段階の操作を必要とする。次いで、抗体をクラスター化する行列ベースのコンピュータプロセスを、それらの競合パターンの類似性に基づいて実施する。ここで、プロセスは、抗体、好ましくはハイブリドーマ細胞から産生される抗体のセットを分類するために適用される。
【００９０】
競合パターンの類似性に基づいてクラスター化される抗体は、同じエピトープまたは類似したエピトープに結合すると考えられる。これらのクラスターは、場合によっては、行列形式、または樹状図として「ツリー」形式、またはコンピュータ読み取り可能な形式、またはあらゆるデータ入力装置に適合した形式で表示することができる。クラスターに関する情報は、行列、樹状図から、またはコンピュータもしくは他のコンピュータ装置によって収集することができる。データ収集は、視覚、手動、自動またはそれらの任意の組み合せとすることができる。
【００９１】
本明細書で使用する「ビン」という用語は、本発明の方法によって類似した競合を有すると判定された抗体のクラスターを意味する名詞として使用することができる。「ビン」という用語は、本発明の方法を実施することを意味する動詞としても使用することができる。本明細書で使用する「エピトープビンニングアッセイ」という用語は、本明細書に記載する競合によるアッセイを意味し、このアッセイによって生成されるデータのあらゆる分析を含む。
【００９２】
データ解析ステップを以下の開示で詳細に記述する。データを参照して実際の指針を提供する。結果を実施例2に示す。実施例2のデータ、特に様々なデータ解析ステップを実施例2の入力データに対して実施して生成する行列または樹状図の参照は、単に説明のためだけのものであり、決して本発明の範囲を限定するものではない。
【００９３】
多数かつ多量のデータセットが生成するとき、信号強度の行列を解析して類似した信号強度パターンを有する抗体を求める系統的な方法が必要である。例として、m行m列を含む2つの行列が単一の実験で生成される。mは試験抗体の数である。1つの行列は、抗原が存在する競合アッセイセットに対する信号強度を含む。第2の行列は、抗原が存在しない陰性対照実験での対応する信号強度を含む。行列の各行は、マルチウェルマイクロタイタープレート中の一義的なウェルを表し、一義的なプローブ抗体を同定するものである。各列は、一義的なビーズスペクトルコードであり、一義的な基準抗体を同定するものである。行列中の各セルの検出信号強度は、基準抗体とプローブ抗体を含む個々の競合アッセイの結果である。行列の最後行は、プローブ抗体の代わりにブロッキング緩衝剤を添加したウェルに対応する。同様に、行列の最終列は、基準抗体の代わりにブロッキング緩衝剤を添加したビーズスペクトルコードに対応する。ブロッキング緩衝剤は、陰性対照として働き、(基準抗体-プローブ抗体対の)1つの抗体しか存在しないときの信号量を決定する。
【００９４】
2つの行の信号強度パターンが類似していることは、この2つのプローブ抗体が類似した結合挙動を示し、したがって、同じエピトープに対して競合する可能性が高いことを示している。同様に、2つの列の信号強度パターンが類似していることは、この2つの基準抗体が類似した結合挙動を示し、したがって、同じエピトープに対して競合する可能性が高いことを示している。異なる信号パターンを有する抗体は、異なるエピトープに結合する可能性が高い。抗体は、類似した信号パターンを有する行をグループ化し、または類似した信号パターンを有する列をグループ化することによって、認識するエピトープによってグループ分けまたは「ビンニングする」ことができる。上述したこのようなアッセイをエピトープビンニングアッセイと称する。
【００９５】
競合パターン認識(CPR)プロセスを適用するためのプログラム
本発明の一態様は、2つの主ステップ、すなわち、(1)信号強度の正規化と、(2)相違行列(dissimilarity matrices)の作成および正規化信号強度に基づいた抗体のクラスター化とを含むCPRプロセスを適用するためのプログラムを提供する。「主ステップ」という用語は、使用する実験材料の性質および所望のデータ解析の性質に応じて、必要に応じて実施することができる複数のステップを包含すると理解される。追加ステップを本発明の一部として実施できることも理解されたい。
【００９６】
信号強度のバックグラウンド正規化
入力データを、意味のあるパターンの検出能力を向上させる一連の前処理ステップにかける。入力データは、二次元行列に保存された信号強度を含み、クラスター化分析前に一連の正規化ステップを実施してノイズ源または信号バイアス源を取り除くことが好ましい。
【００９７】
解析する入力データは、エピトープ認識特性の完全なアッセイの結果を含む。結果は、標識二次抗体を用いて実施したアッセイで測定される信号強度を含むことが好ましい。MCABアッセイによる結果を、本明細書に記載するように解析することがより好ましい。2つの入力ファイル、すなわち、抗原が添加されたアッセイから得られる1つの入力ファイル、および抗原がないアッセイから得られる第2の入力ファイルが作成される。抗原がない実験は陰性対照として役立ち、抗原に対するものではない標識抗体によって結合を定量することが可能になる。試験する一次抗体と二次抗体の各組み合せを、抗原の存在下および非存在下で解析し、各組み合せを両方の入力データセットで表すことが好ましい。本開示に開示するマルチウェル形式によって複数の抗体のエピトープ認識特性を評価する手順を使用して、アッセイを実施することがさらに好ましい。
【００９８】
入力データは、通常、二次元行列に保存された信号強度を含む。まず、抗原(陰性対照)実験のない実験に対応する行列ABを、抗原を含む実験に対応する行列AEから減算して、AN = AE - ABで与えられるバックグラウンド正規化行列を得る。この減算ステップによって、抗原に対する抗体の結合によるものではないバックグラウンド信号を除去する。上記行列は、(m + 1)x(m + 1)次であり、ここで、mはクラスター化される抗体の数である。最終行および最終列は、それぞれプローブ抗体または基準抗体の代わりにブロッキング緩衝剤が添加された実験の強度を含む。
【００９９】
説明のための実施形態においては、図8Aおよび8Bは、実施例2に開示した実施形態で作成された強度行列を示し、データ解析の後続ステップのための入力データ行列として使用される。図8Aは、抗原存在下で実施した実験の強度行列であり、図8Bは、抗原なしで実施した同じ実験の強度行列である。行列中の各行は、1つのウェル中の異なるビーズに対する信号強度に対応し、各ウェルは、一義的な検出抗体を表している。各列は、一義的な一次抗体と二次抗体の各々との競合に対応する信号強度である。行列中の各セルは、一次抗体と二次抗体の様々な対に対する個々の競合アッセイを表す。エピトープ認識特性のアッセイにおいて、1つの抗体の代わりにブロッキング緩衝剤を添加することは陰性対照として機能する。図8Aおよび8Bによって示される実施形態においては、行列の最終行は、二次抗体の代わりにブロッキング緩衝剤を添加したウェルに対応し、行列の最終列は、一次抗体の代わりにブロッキング緩衝剤を添加したビーズに対応する。行列中の別なセル配列も、本発明の態様を実施するために使用することができ、したがって、当業者は他の形式のデータ行列を設計し、これらのデータ行列の後続操作を、選択した特定の形式を反映するようにすることができる。
【０１００】
抗原を含む実験で得られる値に対応する行列から、抗原なしの実験で得られる値に対応する行列を差し引くことによって、様々な行列を作成することができる。このステップは、抗原に対する標識プローブ抗体の結合に帰属されない信号の量を全信号から差し引くために実施される。この減算ステップによって、図9に示す差行列が作成される。この減算に続いて、他の対角値よりも異常に強度の高い対角値を有する抗体には印がつけられる。対角に沿いかつはずれた列の値が高いことは、この特定のビーズに関連するデータが信頼できない恐れがあることを示唆している。これらの列に対応する抗体は、このステップで印が付けられ、個別のビンとして考慮される。
【０１０１】
非特異的結合によるバックグラウンド信号の除去:行列の行内または列内の信号強度の正規化。
いくつかの場合においては、バックグラウンド正規化信号強度行列中の異なる行間または列間の総信号強度にかなりの相違がある。行間の変動は、ウェル間の強度変動による可能性が高く、列間の変動は、異なるプローブ抗体の親和性および濃度の変化による可能性が高い。本発明の一態様によれば、行または列のブロッキング緩衝剤値と行または列の平均信号強度には線形相関のあることが多い。強度変化が観測された場合、行および/または列の正規化の追加ステップを以下に示すように実施する。
【０１０２】
行の正規化。行の正規化は、有意なウェル特異的信号バイアスが存在するときに実施され、さもなければデータ解析に持ち込まれるあらゆる「人為的信号」を除去するために実施される。当業者は、このステップが望ましいかどうかをブロッキング緩衝剤の陰性対照の強度分布に基づいて決定することができる。説明のために示すと、図2Aにおいては、各行のブロッキング緩衝剤強度を、対応する行の(ブロッキング緩衝剤値を除く)平均強度に対してプロットしている。図2Aのプロットは、行のブロッキング緩衝剤値と平均強度の間に明らかな線形相関があることを示している。この図は、分析試料にウェル特異的信号バイアスがあることを示しており、ブロッキング緩衝剤強度が、行内の総信号強度と相関していることを示している。異なる行に見られる異なる強度バイアスは、抗原に対する二次抗体の親和性の変化、およびこれらの二次抗体の濃度変化に一部起因している可能性が高い。同じ実施形態の図2Bでは、列のブロッキング緩衝剤強度と平均列強度に弱い相関しかないことを示していることに留意されたい。
【０１０３】
行の強度変化の場合、行列中の各行の強度は、行中の各値をその行のブロッキング緩衝剤強度で除算して調整される。ブロッキング緩衝剤データが存在しない場合、各行の値を行の平均強度で除算する。CPRプロセスを適用する実施形態においては、強度正規化行列は、
【０１０４】
【数１】
2006322940.tif 000003
【０１０５】
で与えられる。式中、Iは、ブロッキング緩衝剤または平均強度を含むベクトルであり、行に関して正規化する場合はk = iである。
【０１０６】
列の正規化。この最後の前処理ステップでは、(差行列を作成したステップで印を付けられなかった)行正規化行列の各列を、その対応する対角値で除算する。対角に沿うセルは、一次抗体と二次抗体が同じである競合アッセイを表す。理想的には、対角に沿う値は、同じ抗体の2つのコピーが同じエピトープに対して競合するように小さい必要がある。その対応する対角による各列の除算は、競合を反映することが知られている強度に対して各強度を測定する、すなわち、それ自体に対する抗体の競合のために行われる。
【０１０７】
列の強度変化の場合、行列中の各列の強度は、列中の各値をその行のブロッキング緩衝剤強度で除算して調整される。ブロッキング緩衝剤データが存在しない場合、各列の値を列の平均強度で除算する。CPRプロセスを適用する実施形態においては、強度正規化行列は、
【０１０８】
【数２】
2006322940.tif 000004
【０１０９】
で与えられる。式中、Iは、ブロッキング緩衝剤または平均強度を含むベクトルであり、列に関して正規化する場合はk = jである。
【０１１０】
行または列の正規化前のしきい値の設定。この正規化ステップにおける低信号値の人為的な上昇を防止するために、最低ユーザー定義しきい値未満のすべてのブロッキング緩衝剤値に印を付け、次いで、行または列の除算前に、信頼できる最低信号強度であるユーザー定義しきい値に対して調整する。このしきい値は、信号強度のヒストグラムに基づいて設定される。この正規化ステップは、ウェル間の強度変化に合わせて調整するものである。
【０１１１】
例として、図17に、実施例2のデータを調整した差行列を示す。信頼できる最低信号強度は、200強度単位(intensity unit)に設定されている。行列中の各行は、それを行中の最終強度で除算することによって調整される。上述したように、各行の最終強度は、一次抗体の代わりにブロッキング緩衝剤を添加したビーズの強度に対応する。このステップは、行全体の強度におけるウェル間の変化に合わせて調整するものである。図18に実施例2のデータの行正規化行列を示す。
【０１１２】
さらに、例として、図2Aに、各行のブロッキング緩衝剤強度を、対応する行の平均強度に対してプロットした実施形態のデータを示す。このプロットは、ブロッキング緩衝剤値と行の平均強度との間の線形相関を示しており、ウェル特異的強度バイアスがあることを示唆している。これらのバイアスは、抗原に対するプローブ抗体の親和性の変化およびプローブ抗体の濃度変化におそらくは一部起因している。図2Bに、各列のブロッキング緩衝剤強度を、対応する列の平均強度に対してプロットした実施形態のデータを示す。
【０１１３】
説明のための別の実施形態において、図2Cは、バックグラウンド正規化された差行列の強度を、抗原を用いた実施形態の結果の行列の強度に対してプロットした散布図を示す。このプロットは、1000を超える信号値に対する密な線形相関(傾き=1)を示しており、これよりも低い信号値に対してはより分散した相関を示す。図2Cにおけるこれらのポイントには、抗原を含む実験の信号で減算信号を除算して計算した割合に応じて陰影が付けられている。割合が小さい(ゼロに近い)ほど、バックグラウンドの寄与が大きく、図2Cの陰影は薄い。割合が大きい(1に近い)ほど、バックグラウンドの寄与が小さく、陰影は濃い。図2Cにおいて、この割合が小さい値の大部分が散布図の左下領域に分布していることは、1000を超える減算信号値ではバックグラウンドの寄与がより小さくなることを示唆している。
【０１１４】
この実施形態の場合、1000を超えるバックグラウンド正規化行列の強度は、抗原結合による信号よりもバックグラウンド信号の寄与が小さいことを図2Cに示すプロットは示唆している。これらの行列セルは、同じエピトープに対して競合しない抗体対に対応している可能性が高い。逆に、1000未満の強度は、同じエピトープに結合する抗体対に対応している可能性が高い。本発明の一態様によれば、対角に沿う強度は、同じ基準抗体とプローブ抗体が同じエピトープに対して競合するので小さいはずであると予想される。図2Cに示す実施形態においては、バックグラウンド正規化信号強度行列の対角の値は1つを除いてすべてが1000未満の強度である。
【０１１５】
プローブ抗体のベースライン信号に対する信号強度の正規化
最終ステップにおいては、データは、各列または各行をその対応する対角の値で除算して次式で与えられる最終正規化行列を作成することによって調整される。
【０１１６】
【数３】
2006322940.tif 000005
【０１１７】
再度、この正規化ステップにおける低信号値の人為的増加を防止するために、最低ユーザー定義しきい値未満のすべての対角の値を、対角の除算を行う前のしきい値に調整する。このステップは、列または行において他の値よりもかなり高い対角の値を有するものを除いて、すべての列または行に対して実施される。このステップは、基準抗体とプローブ抗体が同じである個々の競合アッセイに対応する強度に対して各強度を正規化する。この強度は、小さく、理想的には列または行のベースライン信号強度を反映すべきである。というのは、2つの同じ抗体は、同じエピトープに対して競合するはずであり、したがって同時に同じ抗原に結合できないからである。異常に大きな対角の値を有する列は外れ値と判断され、解析から除外される。対角強度が高いことは、抗原が同じエピトープの2つのコピーを有することをおそらくは示している。例えば、抗原がホモ二量体であるときである。
【０１１８】
パターン認識分析: 相違行列
本発明の別の態様によれば、データ解析の第2のステップは、正規化強度行列から2段階で相違行列を作成することを含む。まず、バックグラウンドのユーザー定義しきい値未満である正規化強度をゼロに設定し(したがって、競合を示す)、残りの値を抗体が2つの異なるエピトープに結合していることを示す1に設定する。したがって、対角値の強度を掛けたこのしきい値に等しい強度未満の強度は、同じエピトープに対する抗体対による競合を表すのに十分な低さと考えられる。所与のしきい値に対する相違行列または距離行列は、行の各対が異なる位置の数を求めることによってゼロと1の行列から計算される。i行j列のエントリは、行iおよびjで表される二次抗体と競合パターンが異なる一次抗体の総数の割合に対応する。
【０１１９】
例として、図14は、(全22個のうち)任意の2つの抗体パターンが異なる位置の数を示している。この実施形態においては、相違は、列の代わりに行に関して計算される。というのは、行強度はすでにウェル特異的強度バイアスに対して調整されており、したがって、異なる二次抗体親和性および濃度の望ましくない効果が除外されているからである。また、一次抗体の濃度および親和性は、行間で整合性がある。しかし、列の場合、平均強度とバックグラウンド強度の間に明白で一貫した傾向がなく、可変一次抗体濃度および親和性の望ましくない影響を除外する明確な方法がないことを示唆している。したがって、列間の信号を比較することはあまり妥当ではないと考えられる。
【０１２０】
CPRを用いた相違行列。CPRプロセスを適用した実施形態においては、ゼロと1のしきい値行列ATは、以下に示すように作成される。しきい値未満またはしきい値に等しい正規化値を、対応する抗体対が同じエピトープに対して競合することを示すためにゼロに設定する。しきい値行列は、次式で与えられる。
【０１２１】
【数４】
2006322940.tif 000006
【０１２２】
残りの正規化強度を1に設定する。この値は、抗体対が異なるエピトープに結合することを示す。
【０１２３】
相違行列は、ゼロと1の行列においてiとjの2つの行の異なる位置の割合に、相違行列のi行j列の値を設定することによって、しきい値行列から計算される。指定されたしきい値Tに対する相違行列は、
【０１２４】
【数５】
2006322940.tif 000007
【０１２５】
で与えられる。式中、N1はi行とj行を合計したときに存在する1の数である。
【０１２６】
例として、下記表1に示す行列の場合、第1行と第2行に対応する相違値は、これら2つの行の異なる位置の数が5つのうち2つであるので0.4である。理想的な実験の場合、初期の信号強度行列の行の比較に基づいて作成される相違行列は、列の比較に基づいて作成される相違行列と同じはずである。
【０１２７】
【表１】
2006322940.tif 000008
【０１２８】
複数のしきい値で相違行列を計算する効果。
所望であれば、強度のしきい値下限およびしきい値上限の2つのユーザー定義しきい値間(両数値を含む)で増分されるバックグラウンドしきい値に対して、相違行列を作成するプロセスを繰り返す(ここで、しきい値は上述したとおりである)。一連のバックグラウンドしきい値にわたって作成される相違行列を平均し、クラスター化アルゴリズムに対する入力を使用した。いくつかのしきい値にわたる平均化プロセスは、選択した特定のしきい値のいずれか1つに対する最終相違行列の感度を最低にするために実施される。見掛けの相違点(apparent dissimilarity)に対するしきい値変化の効果を図4に示す。図4は、1対の抗体(2.1と2.25)の相違割合を、1.5〜2.5のしきい値範囲のしきい値の関数として示している。しきい値が1.8から1.9に変わると、2つの抗体に対する信号パターン間の相違量は、15%からほぼ0%に大きく変化する。この図は、1対の抗体に対する信号パターン間の相違量が、異なるしきい値に対して大きく変わり得るので、選択した特定の1カットオフ値にどれほど敏感であり得るかを示している。この感度は、広範な様々なしきい値にわたる平均相違値を取ることによって減少する。
【０１２９】
複数のしきい値におけるCPRによる相違行列の計算。好ましい実施形態においては、CPRによる相違行列の計算プロセスを、ユーザー定義範囲内のいくつかの漸増しきい値に対して繰り返す。これらの相違行列の平均を計算し、クラスター化ステップへの入力として使用する。ここで、この平均は、
【０１３０】
【数６】
2006322940.tif 000009
【０１３１】
として計算される。式中、NTは、平均される異なるしきい値の数である。
【０１３２】
いくつかのしきい値にわたるこの平均化プロセスは、しきい値の特定のカットオフ値に対する相違行列の感度を最低にするために実施される。
【０１３３】
複数の実験から得られる相違行列
複数の実験に対する入力データセットが存在する場合、正規化強度行列を、まず、上述したように各個々の実験に対して作成する。次いで、しきい値(一般に、4に設定)を超える正規化値を、このしきい値に設定する。高い強度をしきい値に設定することによって、単一の強度が、そのセルに対して平均正規化強度を計算したときに過度の重みを持たないようにする。平均強度行列は、入力データセットの少なくとも1つに含まれる抗体からなるグループの各抗体対の全データポイントにわたる個々の平均を取ることによって計算される。強度がない抗体対に印を付ける。相違行列の作成は、両方の行が強度を有する位置の総数のうちiとjの2つの行の異なる位置の割合にi行j列のエントリが対応する以外は上述したとおりである。2つの行にこのような位置がない場合、相違値は、任意の高い値に設定され、印が付けられる。
【０１３４】
正規化信号強度に基づく抗体のクラスター化
本発明の別の態様は、複合物データの基礎をなすパターンを明らかにする様々なコンピュータ手法を用いて、正規化信号強度に基づいて抗体をクラスター化するプロセスを提供する。このようなプロセスは、多次元空間内の点をクラスター化するために開発されたコンピュータ手法を利用することが好ましい。これらのプロセスを直接実験データに適用し、サンプリングしたn個の基準抗体におけるn個のプローブ抗体のn2競合アッセイに対する信号レベルを、n次元空間中のn個の点を定義するものと見なすことによって、抗体セットのエピトープ結合パターンを明らかにすることができる。これらの方法は、n個の異なる一次抗体のすべてを含む各二次抗体の競合アッセイにおける信号レベルを、n次元空間中の点を定義するものと見なすことによって、エピトープビンニングに直接適用することができる。
【０１３５】
クラスター化分析の結果は、画像表示によって表すことができる。それに加え、あるいはそれとは別に、クラスター化分析の結果を取り込み、画像表示とは無関係に保存することができる。画像表示は、エピトープビンニングアッセイの結果を少なくともひとりの人に伝えるのに有用である。画像表示は、定量データを取り込み保存するための手段としても使用することができる。好ましい一実施形態においては、クラスターを行列形式で表示し、クラスターに関する情報を行列から取り込む。行列のセルは、各セルの数値を示すために異なる陰影強度またはパターンを有することができる;交互に、行列のセルにカラーコードを付けて各セルの数値を示すことができる。別の好ましい実施形態においては、クラスターを樹状図または「ツリー」として表示し、クラスターに関する情報を樹状図から枝の長さおよび枝の高さ(距離)をもとに取り込む。さらに別の好ましい実施形態においては、クラスターを自動化手段によって同定し、コンピュータまたは任意のデータ入力装置を用いた自動データ解析プロセスによってクラスターに関する情報を取り込む。
【０１３６】
大きな生物学的データセットの解析に有益であることが証明された一手法は、階層クラスタリングである(Eisen等(1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95: 14863〜14868)。この方法を適用すると、相違値に基づいて入れ子サブセット(nested subset)の厳密な階層に抗体を押し込むことができる。説明のための実施形態においては、最低相違値を有する抗体対をまずグループ化する。次いで、次に小さな相違点(または平均相違点)値を有する抗体の対またはクラスターをグループ化する。このプロセスを、残りのクラスターが1つになるまで繰り返す。このようにして、抗体を他の抗体と比較して、競合パターンの類似度に応じてグループ分けする。一実施形態においては、2つの抗体の結合パターン間の類似度を枝の長さで示す樹状図(「系統樹」と呼ばれることもある)に抗体をグループ化する。2つの抗体間の枝が長いことは、異なるエピトープに結合する可能性が高いことを示している。枝が短いのは、2つの抗体が同じエピトープに対して競合する可能性が高いことを示している。
【０１３７】
好ましい実施形態においては、行列中の行に対応する抗体を、マンハッタン距離を平均相違行列の入力相違行列とともに組み込んだ集積的入れ子サブルーチン(agglomerative nesting subroutine)を用いて、平均相違行列の値に基づいて階層クラスタリングによってクラスター化する。特に好ましい実施形態においては、マンハッタン距離を平均相違行列の入力相違行列とともに使用したSPLUS 2000集積的入れ子サブルーチンを用いて、平均相違行列の値に基づいて階層クラスタリングによって抗体をクラスター化する(SPLUS 2000 Statistical Analysis Software、Insightful Corporation、Seattle、WA)。
【０１３８】
本発明の別の態様によれば、2つの樹状図間の類似度は、CPRプロセスを応用するプログラムによって実施される解析の首尾一貫性の指標になる。類似性および整合性に関する非限定的な理論から、同じバックグラウンド正規化信号強度行列の行をクラスター化することによって作成される樹状図と、列をクラスター化することによって作成される樹状図とは同一、またはほぼ同一であると予想される。というのは、抗体#1と抗体#2が同じエピトープに対して競合する場合、抗体#1が基準抗体であり、抗体#2がプローブ抗体であるとき、ならびに抗体#2が基準抗体であり、抗体#1がプローブ抗体であるときには、強度は低いはずだからである。同様に、2つの抗体が異なるエピトープに結合するとき、強度は一様に高いはずである。このため、信号強度行列の2つの行間の類似度は、類似行列(similarity matrix)の2つの列間と同じはずである。行クラスター化と列クラスター化の間の首尾一貫性のレベルが高いことは、所与の実験に対し、本発明のプロセスを応用するプログラムで実行した本明細書に記載する実験手順が、確固とした結果を生じることを示唆している。
【０１３９】
本発明の別の態様によれば、2つのエピトープの重複度は、樹状図のクラスターを接続する最も長い枝の長さをもとに推測することもできる。例えば、標的抗原が2つの異なるまったく重複していないエピトープを有する場合、エピトープの1つへの抗体結合は、別のエピトープへの抗体結合とは逆の信号強度パターンを有すると予想される。このため、結合部位が重複していない場合、1つのエピトープを結合する抗体セットの信号パターンは、他のエピトープを認識する抗体セットの信号パターンとは完全に逆相関するはずである。したがって、2つの異なるクラスターに対する1に近い相違値は、対応するエピトープが互いに干渉せず、または抗原の結合部位が重複しないことを示唆している。
【０１４０】
下記実施例2に記載した実施形態は、クラスター化の結果を樹状図(図5)として、または行列形式(図16および17)でどのように表示できるかを示している。データポイント(ANTIGEN14標的に対する抗体の値)をグループ化して、枝の長さが2つの抗体間の類似度を表す樹状図にした。この樹状図は、SPLUS 2000統計解析ソフトウエアのAgglomerative Nestingモジュールを用いて作成された。比較を容易にするために、図16および17では、行列の行と列における抗体の順序は、図5の樹状図の下に左から右に示した抗体の順序と同じである。個々のセルは、それらの数値に応じてセルに陰影を付けることによって視覚的にコード化される。図16においては、低い方のしきい値未満の値を有するセルはより濃い陰影が付けられている。低い方のしきい値および高い方のしきい値未満の値を有するセルは陰影が付けられていない。高い方のしきい値を超える値を有するセルは薄い陰影が付けられている。陰影のないセルを含むブロックまたは濃い陰影のあるセルを含むブロックは、そのブロックに対応する抗体のすべてが同じエピトープを認識することを示している。陰影の薄いセルは、異なるエピトープを認識する抗体に対応する。図17においては、セルは、正規化強度であり、それらの値に応じて視覚的にコード化されてもいる。陰影の薄いセルは、強度が低い方のしきい値未満であり、陰影の付いていないセルは、強度が低い方のしきい値と高い方のしきい値の間にあり、陰影の濃いセルは、強度が高い方のしきい値よりも大きい。陰影の薄いセルは、その対応する行と列の抗体が同じエピトープに対して競合することを示す(強度が低いので)。陰影の濃いセルは、より高い強度に対応し、対応する行と列の抗体が異なるエピトープに結合することを示している。
【０１４１】
説明のためのこの実施形態(実施例2)の結果は、本発明のプロセスによって、2つの抗体が同じエピトープに対して競合するかどうかを明示するデータに高いレベルの首尾一貫性が付与されることを示している。図16および17における対角の陰影の対称性は、この首尾一貫性を明らかに示している。というのは、行Aと列Bの各抗体は、行Bと列Aと同じ対であるからである。したがって、抗体対が同じエピトープに対して競合する場合、抗体Aが一次抗体であり、抗体Bが二次抗体であるとき、ならびに抗体Bが一次抗体であり、抗体Bが二次抗体であるとき、強度は低いはずである。したがって、i行j列のセルの強度とj行i列のセルの強度はともに低いはずである。同様に、これら2つの抗体が異なるエピトープを認識する場合、対応する両方の強度は高いはずである。図17の約200対のセルのうち、ただ1対のみが、対の一方が1.5未満の強度であり他方が2.5を超える強度である不一致を示した。アルゴリズムによって得られた正規化行列の首尾一貫性のレベルは、作成したデータとデータのアルゴリズム解析の両方の信頼性の指標になる。ANTIGEN14標的に対する抗体のデータセットに対する(99%を超える)高い首尾一貫性レベルは、本明細書に開示し特許請求するデータ解析プロセスが信頼できる結果をもたらすことを示唆している。
【０１４２】
複数の実験に由来する抗体のクラスター化
本発明の別の態様は、抗体のスクリーニングに使用する実験システムの限界を克服するためにデータセットを組み合わせる方法を提供する。各実験が他の各実験と同じように少なくともx抗体を含む複数の実験を実施し、得られた複数のデータセットをクラスター化プロセスの入力として提供することによって、極めて多数の抗体を信頼性よくクラスター化することが可能になるはずである。1セットのm抗体をm個の実験で同じように含むことによって、他の抗体すべてに対して試験しなくても、抗体が属する可能性があるクラスターを推定することが可能になる。これは、このデータ解析方法を複数のデータセットとともに用いて、より少ないアッセイでさらに多い処理量を得られるかもしれないことを示している。
【０１４３】
例として、Luminex技術は、100種の一義的な蛍光色素を提供し、したがって、最高100種の抗体を単一の実験で試験することが可能である。個々のデータセットおよび混合データセットに対するクラスター化ステップによって得られる結果の整合性は、エピトープおよび/または抗体を他の抗体すべてに対して試験しなくても、どのエピトープがどの抗体によって認識されるかを推定することが可能であることを示している。好ましい実施形態においては、CPRプロセスを用い、重複する抗体セットを用いて複数の実験を実施することによって、100種を超える抗体の結合パターンの特徴を明らかにすることができる。各実験が他の実験と同じように1セットの抗体を含むように実験を設計することによって、組み合わせた平均行列にデータの欠損はないはずである。
【０１４４】
別の態様は、所与の抗体セットに対するデータ解析結果が有用であって、後続の実験の合理的設計に資することを規定する。例えば、第1の実験のデータセットが明確なクラスターの出現を示す場合、第2の実験の抗体セットは、第1の抗体セットから得られる代表的な抗体、および未試験抗体を含むべきである。この手法によって、確実に、2つのエピトープを定義する十分な材料を各抗体セットが有し、これら各セットがセット間の比較が可能なように十分重複するようになる。第2の実験における未試験抗体セットの競合パターンを、第1の実験から得られる既知の抗体試料セットと比較することによって、第1の抗体セットが認識したのと同じエピトープを未試験抗体が認識するかどうかを判定することが可能なはずである。この重複実験設計によって、第1のセットと第2の抗体セットの各競合パターンの信頼できる比較が可能になり、第2の実験の抗体が既存のエピトープを認識するかどうか、またはそれらが1つまたは複数の全く新規なエピトープを認識するかどうかを明らかにすることが可能になる。また、実験は最適な方法で繰り返し設計することができ、したがって、複数の抗体セットを既存のクラスターおよび新しいクラスターに対して試験することができる。
【０１４５】
複数の実験から得られるデータの解析。
ANTIGEN39標的に対する抗体を用いて、下記実施例3に記載した実施形態から得られる結果は、本明細書に開示し特許請求するプロセスが、複数の実験から得られるデータの解析に適していることを示している。この実施形態においては、ANTIGEN39抗体が、細胞表面のANTIGEN39抗原に結合するかどうかを試験した。ANTIGEN39抗原は、細胞表面タンパク質である。まず、各個々の実験に対して正規化強度行列を作成する。この際、選択したしきい値を超える正規化値を選択したしきい値に設定して、単一の正規化強度が抗体対の平均値に過度の影響を及ぼさないようにする。データが利用可能な各抗体対に対してすべての実験にわたる正規化強度の平均をとることによって、個々の正規化行列から単一の正規化行列を作成した。次いで、iとjの2つの行の異なる位置の割合が、或る強度を有する両方の行の位置の数のみを考慮する以外は上述のとおりにして、単一の相違行列を作成した。
【０１４６】
ANTIGEN39抗体を用いた5つの実験の場合、5つの入力データセットに対するクラスター化の結果は、類似度の異なる多数のクラスターがあることを示し、いくつかの異なるエピトープが存在し、その一部は重複していることを示唆した。これを、図6A、図18、図19および図30に示す。例えば、抗体1.17、1.55、1.16、1.11および1.12を含むクラスターと、1.21、2.12、2.38、2.35および2.1を含むクラスターは、2.35と1.11を除いて各抗体の対がせいぜい25%しか異ならず、かなり近い関係にある。2つのクラスター間のこの高い類似度は、2つの異なるエピトープが高い類似度を有することを示唆している。
【０１４７】
ANTIGEN39抗体を用いて別個の実験から得られる5つのデータセットも、個々にクラスター化され、本明細書に開示し特許請求するプロセスが一貫したクラスター化結果をもたらすことが実証された。クラスター化結果を図6B〜6Fおよび図20〜30に要約する。ここで、図30は、個々のデータセットの各々に対するクラスター、および5つの実験に対する抗体のすべてを含む混合データセットに対するクラスターを要約したものである。図6Bは、実験1のANTIGEN39抗体の樹状図である。抗体1.12、1.63、1.17、1.55および2.12はともに、この実験でも別の実験でも一貫してクラスターを形成し、抗体1.46、1.31、2.17および1.29も同様である。図6Cは、実験2のANTIGEN39抗体の樹状図である。抗体1.57および1.61はともに、この実験でも別の実験でも一貫してクラスターを形成する。
【０１４８】
図6Dは、実験3のANTIGEN39抗体の樹状図である。抗体1.55、1.12、1.17、2.12、1.11および1.21はともに、この実験でも別の実験でも一貫してクラスターを形成する。図6Eは、実験4のANTIGEN39抗体の樹状図である。抗体1.17、1.16、1.55、1.11および1.12はともに、この実験でも別の実験でも一貫してクラスターを形成し、抗体1.31、1.46、1.65および1.29、ならびに抗体1.57および1.61も同様である。図6Fは、実験5のANTIGEN39抗体の樹状図である。抗体1.21、1.12、2.12、2.38、2.35および2.1はともに、この実験でも別の実験でも一貫してクラスターを形成する。
【０１４９】
一般に、クラスター化アルゴリズムは、個々の実験でも、混合データセットと個々のデータセットとの間でも整合性のある結果をもたらした。複数の個々のデータセットに対してともにクラスターを形成する抗体または隣接クラスター中に存在する抗体は、混合データセットに対してもともにクラスターを形成しまたは隣接クラスター中に存在する。例えば、陰影の薄いセルは、混合データセットおよび抗体が存在するすべてのデータセットにおいてともに一貫してクラスターを形成する抗体を示す(実験1、3、4および5)。これらの結果は、このアルゴリズムが複数の個々の実験にわたって一貫したクラスター化結果をもたらし、複数のデータセットを結合しても整合性を保持していることを示している。
【０１５０】
最後に、同じエピトープに対して2つの抗体が競合するかどうかを明らかにすることに関して、データには高いレベルの首尾一貫性がある。抗体対が同じエピトープに対して競合するかどうかをデータが一貫して示す抗体対の割合を、各データセットに対して下記表2に要約する。表2から、5つの個々のデータセットのうちの4つおよび混合データセットの整合性はほぼ90%であることが判明した。
【０１５１】
【表２】
2006322940.tif 000010
【０１５２】
エピトープビンニングの結果とフローサイトメトリー(FACS)の結果との整合性
ANTIGEN39標的に対する抗体を用いて、下記実施例3に記載した実施形態から得られる結果は、さらに、本発明の方法によるエピトープビンニングによって得られる結果が、フローサイトメトリー(蛍光活性化細胞選別装置、FACS)を用いて得られる結果と一致していることを示している。ANTIGEN39を発現する細胞をFACSにより選別し、ANTIGEN39陰性細胞をやはりFACSによって選別された陰性対照として使用した。異なるビンからの抗体によって認識される細胞表面結合部位は、異なるエピトープである。図3に、抗ANTIGEN39抗体を用いた抗体実験の結果を、FACSによる結果と比較して示す。図3に示すように、所与のビン中の抗体は、FACSにおいてすべて陽性(ビン1、4、5)またはすべて陰性(ビン2および3)であり、抗体エピトープビンニングアッセイが、実際にエピトープ結合特性に基づいて抗体をビンニングしていることを示している。したがって、エピトープビンニングは、本明細書に記載するように、抗体のエピトープ認識特性を明らかにし、抗体が認識するエピトープに基づいて抗体を選別し、分類する効率的で迅速な信頼性の高い方法を提供する。
【０１５３】
オルターナティブデータ解析プロセス、およびエピトープビンニングと配列結果の整合性。
オルターナティブデータ解析プロセスは、抗原を含まない実験のデータ行列から、抗原存在下で実施した実験のデータ行列を減算して正規化バックグラウンド強度行列を作成する必要がある。次いで、各対角セルの値をバックグラウンド値として用いて、対応する列の抗体の結合親和性を決定する。列の対角セルの値よりもかなり高い値を有する正規化バックグラウンド強度行列(減算行列)の各列中のセルを強調表示し、またはセルに注釈をつける。一般に、対応する対角の約2倍の値は「かなり高い」と見なされるが、当業者は、使用する試薬および諸条件、ならびに入力データの「ノイジネス」を考慮して、バックグラウンドの何倍の増加が特定の実施形態において「かなり高い」に相当するしきい値であるかを決定することができる。類似した結合パターンを有する列は、ビンとしてグループ化され、ビン内の小さな差はサブビンとして区別される。このデータ解析を、所与の入力データセットに対して自動的に実施することができる。例えば、入力データを、コンピュータデータベースアプリケーション中に保存することができ、そこで、対角のセルが自動的にマークされ、各列のセルが対角の数字と比較されて強調表示され、類似した結合パターンの列がグループ化される。
【０１５４】
抗原54に対する52種の抗体を用いた好ましい実施形態においては、上記データ解析プロセスによるビンニング結果は、MCAB競合抗体アッセイによりビンニングされた抗体のCDR領域の配列分析と相関した。52種の抗体は、20種の細胞系に由来する2、3種のクローンからなる。予想したとおり、同じ系から得られるクローンの配列は同一であり、したがって、各系の代表的な1つのクローンの配列のみを決定した。エピトープビンニング結果とこの方法によってビンニングした抗体の配列分析とが対応することは、この手法が、結合パターンの類似した抗体を同定するのに適していることを示している。また、エピトープビンニング結果とこの方法によってビンニングした抗体の配列分析とが対応することは、抗体結合のエピトープ特異性を決定するのにどの抗体配列が重要であるかについての情報および指針を、エピトープビンニング方法が提供することを意味している。
【０１５５】
限界希釈アッセイ
中間濃度から高濃度の標的を用いた標準アッセイ中に、同じ標的抗原に対して異なる親和性を有する様々な抗体の集合は、同じかほぼ同じ強度の信号を生成することができる。しかし、抗原の量を希釈すると、抗体間の親和性を識別することが可能になる。本開示の教示よるアッセイにおいて限界濃度の標的抗原を使用すると、同じ標的抗原に対する抗体の集合を動力学的にランク付けすることが可能になる。
【０１５６】
同じ抗原に対する抗体の集合は、高レベルから中レベルの抗原を用いた本来のアッセイで、これらの抗体の一部がほぼ同じ見かけ強度の信号を生成するとしても、限界量の抗原の条件下では、高い信号から低い信号、または無信号までの広範な信号を生じる。したがって、本開示の教示に従って実施される限界抗原アッセイにおける信号強度によって抗体を親和性によってランク付けすることができる。
【０１５７】
本発明の実施形態は、1セットの抗体内の様々な結合特性を迅速に決定する方法に関する。したがって、標的に結合する最適な抗体を迅速に決定することができる。特定の標的抗原に対して産生される抗体セットは、抗原上の様々なエピトープに結合することができる。また、抗体は、1つの特定のエピトープに様々な親和性で結合することができる。本発明の実施形態は、抗体が、抗原に対して産生される他の抗体よりもどれだけ強くまたは弱く特定のエピトープに結合するかを決定する方法を提供する。
【０１５８】
本発明の一実施形態は、1セットの希釈抗原試料を調製し、その後1セットの抗体中の各抗体の希釈抗原試料に対する結合を測定するものである。それによって、特定濃度の抗原に対する各抗体の相対親和性を比較することができる。したがって、この方法は、各セット中の抗体の相対親和性の比較アッセイの一部として、より薄い濃度の抗原、またはより濃い濃度の抗原試料にどの抗体が結合するかを見分ける。
【０１５９】
本発明の別の実施形態は、1セットの希釈抗体試料を調製し、その後、希釈抗体試料の各々に対する抗原の結合を測定するものである。それによって、特定の抗原に対する各抗体の相対親和性を比較することができる。したがって、この方法は、各セット中の抗体の相対親和性の比較アッセイの一部として、特定の濃度の抗原がより薄い濃度の抗体試料に結合するのか、またはより濃い濃度の抗体試料に結合するのかを判別する。
【０１６０】
抗体の相対親和性を決定することができるプロセスを開示したが、他のものに対して親和性を有する高親和性抗体断片、タンパク質リガンド、小分子、または任意の他の分子を同定する類似の手順を予見することができる。したがって、本発明は、抗原に対する抗体の結合を分析することだけに限定されない。
【０１６１】
本発明の一実施形態は、抗体の動力学的諸特性を解析して、所望の動力学的諸特性を有する抗体をランク付けし、選択することが可能な方法を提供する。本明細書で定義する親和性は、1つの分子が別の分子に結合する速度と(結合定数Kon)複合物が解離する速度(解離定数、Koff)との関係を反映するものである。抗体と標的を適切な条件下で混合すると、抗体は、標的抗原と結合する。その標的への抗体の結合とその標的からの抗体の遊離の量比は、ある時点で平衡に達する。この平衡を、「親和定数」または単に「親和性」と称する。
【０１６２】
同一濃度の抗体と標的分子を含む結合反応を比較するとき、より親和性の高い抗体を含む反応は、より親和性の低い抗体を含む反応よりも、平衡においてより多くの抗体が標的に結合する。
【０１６３】
信号を発生する複合物の形成によって1つの分子の別の分子への結合が測定されるアッセイにおいては、信号量は、分子の濃度、および相互作用の親和性に比例する。本開示では、抗体と(抗原上の)その標的との複合物の形成を測定するアッセイが使用され、このようなアッセイで測定される信号は、抗体濃度、標的抗原濃度、および相互作用の親和性に比例し得る。抗体-標的複合物の形成を測定する適切なアッセイ方法としては、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、(Luminexシステム、FMATおよびFACSシステムを含めた)蛍光結合免疫吸着アッセイ(fluorescence-linked immunosorbent assays)、放射性同位体分析(RIA)、当業者によって選択可能な他の方法などがある。
【０１６４】
本発明の別の態様は、標的または抗原が限界濃度で与えられたときに、上記アッセイなどのアッセイの信号強度に基づいた親和性によって抗体を動力学的にランク付けする方法を含む。抗体と抗原が結合し、この結合反応が平衡に進み、平衡に達した後に、アッセイを実施して標的または抗原に結合した抗体の量を決定する。本発明の一態様によれば、アッセイによって検出される結合抗体の量は、標的または抗原に対する抗体の親和性に直接比例する。極めて低い抗原濃度においては、親和性が低い一部の抗体は、結合抗体の量が不十分なため、検出可能な信号を発生しない。同じ抗原濃度においては、中程度の親和性を有する抗体は弱い信号を発生し、高い親和性を有する抗体は強い信号を発生する。
【０１６５】
中間濃度から高濃度の標的を用いた標準アッセイ中に、同じ標的抗原に対して異なる親和性を有する様々な抗体の集合は、同じかほぼ同じ強度の信号を生成することができる。しかし、抗原の量を希釈すると、抗体間の親和性を識別することが可能になる。本開示の教示によるアッセイにおいて限界濃度の標的抗原を使用すると、同じ標的抗原に対する抗体の集合を動力学的にランク付けすることが可能になる。
【０１６６】
同じ抗原に対する抗体の集合は、高レベルから中レベルの抗原を用いた本来のアッセイで、これらの抗体の一部がほぼ同じ見かけ強度の信号を生成するとしても、限界量の抗原の条件下では、高い信号から低い信号、または無信号までの広範な信号を生じる。したがって、本開示の教示に従って実施される限界抗原アッセイにおける信号強度によって抗体を親和性によってランク付けすることができる。
【０１６７】
本発明の別の態様は、特性が明らかな既知の抗体よりも高い親和性を有する抗体を同定する方法である。この方法は、特性が明らかな抗体を動力学的標準として使用するものである。次いで、複数の試験抗体を動力学的標準抗体に対して測定して、標準抗体よりも希薄な抗原試料に結合する抗体を同定する。次いで、複数の試験抗体を動力学的標準抗体に対して測定して、所与の希釈抗原試料に結合する抗体をより多く含む抗体を同定する。これによって、抗原に対して動力学的標準抗体よりも高い親和性を有する抗体を迅速に発見することが可能になる。
【０１６８】
好ましい一実施形態においては、本開示による限界抗原アッセイにELISAを使用する。
【０１６９】
培養B細胞の上清は、一般に20 ng/ml〜800 ng/mlの濃度範囲の抗体を分泌することが経験的に明らかになった。これらの培養物から得られる上清の量は限られていることが多いので、B細胞培養物上清は、一般に、ほとんどのアッセイで10倍に希釈され、親和性決定アッセイに使用される使用濃度は2 ng/ml〜80 ng/mlである。本発明の一態様においては、ELISAプレートを被覆するために使用される標的抗原の適切な濃度を、濃度100 ng/mlのモノクローナル抗体から得られる基準溶液を用いて決定する。この数値は、試験抗体の濃度、および基準抗体の親和性に応じて変化し得るので、抗体/抗原結合のELISAによる測定において最大半減(half-maximal)信号を発生するのに必要な標的抗原濃度を経験的に決定することができる。この決定については以下でさらに詳細に考察する。
【０１７０】
経験的に決定された最適被覆濃度の抗原を親和性測定アッセイに使用して、基準モノクローナル抗体よりも高いELISA値を与える様々なB細胞培養物によって産生される抗体を識別した。本発明の方法によれば、基準抗体を用いて得られるよりも高い信号を得る唯一の方法は、(1)抗体が基準抗体よりも親和性が高いかどうか、または(2)抗体が同じ親和性を有するが、基準モノクローナル抗体よりも高い濃度で存在するかどうかである。上述したように、B細胞培養物上清中の抗体は、通常、20〜800 ng/mlの濃度であり、2〜80 ng/mlの使用濃度に希釈される。一実施形態においては、2〜80 ng/mlの濃度の試験抗体を、基準抗体濃度が100 ng/mlのアッセイに使用する。試験抗体から得られる信号は、100 ng/mlの基準抗体の信号と比較される。試験グループ内の抗体が、より高い信号を有すると判明した場合、抗体は、基準抗体よりも親和性が高いと考えられる。
【０１７１】
別の実施形態においては、ハイブリドーマから産生される抗体を、限界動力学的抗原アッセイ(limiting kinetic antigen assay)によって、ELISAを用いた手順でランク付けした。これらの抗体の結合親和性を、Biacoreシステムを用いて抗体を定量し動力学的にランク付けすることによって確認した。既知のとおり、Biacoreシステムは、各抗体と抗原の結合係数に対して正式な動力学値を与える。本開示が教示する限界抗原アッセイによる抗体の動力学的ランク付けは、以下に示すように、Biacore法によって決定されるこれらの抗体の正式な動力学値と密接に相関することが確認された。
【０１７２】
手短に述べると、Biacore技術は、表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて、様々な抗原濃度および既知の抗体濃度において、抗原からの抗体の崩壊(decay)を測定する。例えば、チップに抗体を載せ、洗浄し、そのチップを抗原溶液に曝して抗体に抗原を載せる。次いで、抗原を含まない溶液でチップを連続洗浄する。抗体と抗原の複合物が形成されると最初にSPRが増加する。次いで、崩壊により抗原-抗体複合物が解離する。この信号の崩壊は、抗体親和性に直接比例する。同様に、この方法によって、チップ上に塗布された限定濃度(limited concentration)の抗体を用いてリバースアッセイ(reverse assay)を実施することができる。
【０１７３】
Luminex(MiraiBio,Inc.、Alameda、CA)技術を用いて、抗体が複数の異なる抗原で被覆されたビーズをどのように結合したかを分析する。このアッセイにおいては、各ビーズセットは、様々な濃度の抗原で被覆されていることが好ましい。Luminexリーダーは、すべてのビーズセットを多重化することができるので、ビーズセットを混合し、異なるビーズセットの各々に対する抗体結合を測定する。次いで、示差的に被覆されたビーズ上の抗体の挙動を追跡することができる。抗体濃度に対して正規化した後、非抗原限界濃度(non-antigen limiting concentration)から限定抗原濃度に移るときに高い結合度を維持している抗体は、高い親和性に良好に関連付けられる。これらの示差的なシフトを使用して抗体親和性を相対的にランク付けすることが有利である。例えば、シフトの小さい試料は親和性の高い抗体に対応し、シフトの大きい抗体は親和性の低い抗体に対応する。
【０１７４】
【表３】
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【０１７５】
本発明の別の実施形態においては、一連の限定濃度の試験抗体を、抗体標準液と比較する。限界抗体濃度を用いたこのような方法は、限界抗原濃度を用いた方法の「リバース」であると考えられるが、1セットの抗体を迅速にスクリーニングして標的抗原に対する各抗体の相対親和性を明らかにするのと類似した機序を備えている。共有結合被覆または受動被覆(passive coating)が可能なように化学改変された、または化学改変可能な他のプレートを使用することもできる。当業者は、本明細書に提示する方法をさらに改変して、限界抗体希釈によるアッセイを実施し、試験抗体をスクリーニングし動力学的にランク付けすることができる。
【０１７６】
最適結合抗原濃度の決定
限界抗原アッセイ方法の実施形態を、後続操作の前に抗原を固定表面に結合または付着させる方法を用いて実施する。この表面は、後続操作を行うことができる容器の一部であることが好ましく、フラスコまたは試験管内にあることがより好ましく、96ウェルプレート、384ウェルプレート、864ウェルプレートなどのマイクロタイタープレートのウェル中にあることがさらにより好ましい。交互に、抗原が結合している表面は、スライド、ビーズなどの表面の一部とすることができ、結合抗原を含む表面は、後続の抗体結合ステップおよび検出ステップで処理することができる。抗原を表面に結合または付着させるプロセスは、抗体の標的抗原認識能力および結合能力を妨害しないことが好ましい。
【０１７７】
一実施形態においては、表面はストレプトアビジンで被覆されており、抗原はビオチン化されている。特に好ましい実施形態においては、プレートはマイクロタイタープレートであり、好ましくは各ウェル中の少なくとも1つの表面がストレプトアビジン被覆された96ウェルプレートであり、抗原はビオチン化されている。最も好ましくは、プレートはSigma SA 96ウェルプレートであり、抗原はPierce EZ-link Sulpho-NHSビオチン(Sigma-Aldrich Canada、Oakville Ontario、CANADA)でビオチン化されている。ビオチン分子を他の成分に付着させるビオチン化の別法も使用可能である。
【０１７８】
万一、抗原をビオチン化できない場合には、抗原が結合できる別の表面で置換することができる。例えば、UV照射により引き抜くことができ、炭素-炭素結合を生じる水素を介した共有結合によって生体分子を固定するようになされたCostar(登録商標) Universal-BIND(商標)表面(Corning Life Sciences、Corning、NY)。プレート、例えば、Costar(登録商標) Universal-BIND(商標)96ウェルプレートを使用することができる。当業者は、Costar(登録商標) Universal-BIND(商標)などの代替表面を使用して、アッセイ時間が延び、かつ/またはより多くの抗原の使用が必要な場合には、後続の操作を修正することができる。
【０１７９】
本発明の一実施形態においては、「チェッカーボード」アッセイ設計を使用して、結合抗原の最適濃度を見つける。一例を下記表5に示す。以下の記述は、ストレプトアビジンで被覆された96ウェルプレートを用いて、ビオチン化抗原の最適被覆濃度を決定するステップの開示を含む。この開示は、単に本発明の様々な態様を実施する一方法を示すにすぎない。本発明の範囲は、上記および下記アッセイ方法に限定されず、当業者は、多種多様な材料および操作によって本発明の方法を実施することができる。1つのファージ当たり異なるコピー数の抗原を発現するファージを用いた細胞上での抗原の(一過性のまたは安定な)発現を含む、ただしこれらだけに限定されない方法。
【０１８０】
抗原希釈および分散。
試験すべき抗原を選択する。このような抗原は、例えば、抗体による治療標的を提供することができる任意の抗原とすることができる。例えば、腫瘍マーカー、細胞表面分子、リンホカイン、ケモカイン、病原体関連タンパク質、および免疫調節薬はこのような抗原の非限定的な例である。
【０１８１】
初期濃度、好ましくは約1 ug/mlの抗原溶液を、一連の段階的希釈で希釈する。次いで、希釈試料を、マイクロタイタープレートのウェル中などの表面に置き、各試料の複製も表面に分散させる。抗原溶液は、所望であれば遮断薬を含有することができる。好ましい実施形態においては、抗原の連続希釈物を、96ウェルプレートの列全体に分散させる。具体的には、異なる抗原希釈物を各列に入れ、その列の各行に複製試料を入れる。96ウェルプレートにおいては、各希釈の複製を各列の行A〜Hに入れる。標準希釈は抗原によって変わるが、典型的な希釈系列は、1 ug/mlから始まり、最終濃度約900 pg/mlまで連続的に1:2希釈される。
【０１８２】
一実施形態においては、ビオチン化抗原を、96ウェルプレートの水平方向に1 ug/ml〜900 pg/mlの濃度で希釈する。好ましいブロッキング緩衝剤はPBS/乳溶液であるが、BSAのPBS溶液などの他の緩衝剤で置換することができる。別の実施形態においては、ビオチン化抗原を、1%脱脂乳/1X PBS pH 7.4で1 ug/ml〜900 pg/mlの濃度に希釈し、Sigma SA(ストレプトアビジン)マイクロタイタープレートの列1〜11のウェルにピペットで入れ、各希釈の8つの複製物を各列の行A〜Hに入れる。列12はブランクで残し、「抗体のみ」の対照とする。各ウェルの最終体積は50 ulである。抗原が表面に付着するのに適切な時間、抗原を(例えば、プレートのウェル中の)表面でインキュベートする。インキュベーション時間、温度および他の諸条件は、使用する表面の製造者の指示および/または標準手順によって決定することができる。インキュベーション後、過剰の抗原溶液を除去する。次いで、必要であれば、プレートを例えば、脱脂乳、粉末乳、BSA、ゼラチン、洗浄剤、または他の適切な遮断薬を含む適切なブロッキング溶液で遮断して、後続のステップ中の非特異的結合を防止する。
【０１８３】
次いで、ビオチン化抗原を含むプレートを、抗原が表面に結合または付着するのに適切な時間インキュベートする。Sigma SAプレートのビオチン化抗原を室温で30分間インキュベートする。次いで、過剰のビオチン化抗原溶液をプレートから除去する。この実施形態においては、Sigma SAプレートはあらかじめ遮断されているのでブロッキングは不要である。
【０１８４】
Costar(登録商標) Universal-BIND(商標)プレートを用いた別の実施形態においては、抗原を4℃で1X PBS pH 7.4、0.05%アジド中終夜受動吸着させる。一般に、Costar(登録商標) Universal-BIND(商標)プレートを使用する場合、初期抗原濃度は、やや高濃度であり、好ましくは2〜4 ug/mlである。翌朝、過剰の抗原溶液をCostar(登録商標) Universal-BIND(商標)プレートから、好ましくは「指弾(flicking)」によって除去し、各プレートを365 nmのUV光に4分間曝す。次いで、各プレートを1%脱脂乳/1X PBS pH 7.4を用いて1つのウェル当たり100 ulのブロッキング溶液で30分間遮断する。
【０１８５】
抗原とともにインキュベーションし、過剰の抗原溶液を除去し、必要に応じて遮断した後、プレートを水道水で4回洗浄する。プレートは、手で洗浄することができ、マイクロプレート洗浄器または他の適切な洗浄具を使用することができる。
【０１８６】
基準抗体希釈および分散。
次いで、抗原を認識しそれに結合する基準抗体を添加する。基準抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗体、天然リガンドまたは可溶性受容体、抗体断片または小分子とすることができる。
【０１８７】
好ましくは約1μg/mlの初期濃度の抗抗原抗体(anti-antigen antibody)としても知られる基準抗体溶液を、一連の段階希釈で希釈する。希釈試料を、マイクロタイタープレートのウェル中などの表面に置き、各試料の複製物も表面に分散させる。基準抗体の連続希釈物を、96ウェルプレートの行全体に分散させる。具体的には、各基準抗体希釈物を行に入れ、その行の各列に複製試料を入れる。96ウェルプレートにおいては、異なる基準抗体希釈物を各行に入れ、各希釈の複製を各行全体にわたって各列に入れ、初期濃度約1μg/mlで開始し、一連の7つのウェルに対して漸次1:2で7回希釈する。約30 ng/mlの最終濃度を標準液系列として使用する。基準抗体溶液を結合抗原とともに、使用する材料および試薬によって決まる適切な諸条件下で、好ましくは室温で約24時間インキュベートする。当業者は、長時間または短時間、あるいは高温または低温のインキュベーションが、特定の実施形態に適切かどうかを判断することができる。
【０１８８】
任意のステップ:振とうしながらのインキュベーション。所望であれば、プレートを密封することができ、基準抗体と結合抗原のインキュベーションを振とうしながら実施して混合およびより効率的な結合を促進させることができる。基準抗体および結合抗原を含むプレートを、例えばLab Line Microplate Shakerを3に設定して、終夜振とうしながらインキュベートすることができる。
【０１８９】
検出抗体の添加。
プレートを、好ましくは約5回(5X)水で洗浄して未結合基準抗体を除去する。次に、基準抗体を認識しそれに結合する標識検出抗体を添加し、その溶液をインキュベートして検出抗体を基準抗体に結合させる。検出抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。検出抗体は、基準抗体に結合した抗体を検出できる任意の方法で標識することができる。標識は、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)などの酵素標識、またはビオチン、ジゴキシゲニンなどの非酵素標識とすることができ、32P、3H、14Cなどの放射性標識とすることができ、利用可能な試薬、材料および検出方法に基づいたアッセイに適切な任意の他の標識とすることができる。
【０１９０】
標識後、濃度0.5μg/mlのヤギ抗ヒトIgG Fc HRPポリクローナル抗体(Pierce Chemical Co、Rockford IL、カタログ番号31416)の1%脱脂乳、1X PBS pH 7.4溶液50μlをマイクロタイタープレートの各ウェルに添加する。次いで、プレートを室温で1時間インキュベートする。
【０１９１】
すべての未結合検出抗体を除去するために、検出抗体を含有する過剰の溶液を除去し、プレートを水で繰り返し、好ましくは少なくとも5回洗浄する。
【０１９２】
結合検出抗体の測定。
基準抗体に結合する検出抗体の量を、存在する標識の量を測定し定量する適切な方法によって決定する。選択した標識に応じて、測定方法は、添加した基質に対する酵素活性の測定、(例えば、ビオチンに対する)検出可能な結合相手への結合の測定放射能を測定するシンチレーションカウンティング、または当業者によって決定される任意の他の適切な方法を含むことができる。
【０１９３】
検出抗体としてヤギ抗ヒトIgG Fc HRPポリクローナル抗体を用いた上記実施形態においては、色素原HRP基質テトラメチルベンジジン(TMB)50 ulを各ウェルに添加する。基質溶液を室温で約30分間インキュベートする。1Mリン酸50 ulを各ウェルに添加してHRP/TMB反応を停止させる。
【０１９４】
定量。
次いで、結合標識量を、反応生成物または結合複合物の形成の分光光度測定、検出された放射性標識の量の計算などの適切な方法によって定量する。本明細書に開示する諸条件下で、このステップで測定される標識量は、基準抗体に結合した標識検出抗体量の指標となる。
【０１９５】
ヤギ抗ヒトIgG Fc HRPポリクローナル抗体およびTMB基質を用いた上記実施形態においては、基準抗体に結合する検出抗体の量を、プレートの各ウェルの450 nmにおける吸光度(光学濃度、すなわち「OD」)を読み取ることによって定量する。
【０１９６】
最適抗原濃度を決定するデータ解析。
既知の基準抗体濃度を選択し、選択した抗体濃度および様々な抗原量を有するウェルから得られる結果を検討する。所望の信号強度、または標準信号を発生する抗原濃度を、後続の実験のための最適抗原濃度として選択する。この標準信号は、他の反応から得られる信号を比較する基準点として働くので、特定の実施形態に使用する諸条件および材料に応じて経験的に決定することができる。色素原生成物を生成する検出方法の場合、望ましい標準信号は、ELISAリーダーまたは他の検出器の最も動的な領域にあるものであり、約0.4〜1.6 OD単位の光学濃度(OD)とすることができ、このシステムの場合、0.2から3.0 OD単位を超える範囲の信号を得ることができるが、好ましくは約1.0 OD単位である。標準信号として任意のOD値を選択することができるが、約1.0 OD単位のOD値によって、1.0 OD単位を超える試験信号および1.0 OD単位未満の試験信号の一連の試験信号を正確に測定することが可能であり、さらに、他の試験信号および基準信号との比較も容易である。標準信号を発生する濃度と認められる抗原濃度を後続の実験に使用して、抗体をスクリーニングし、動力学的にランク付けする。
【０１９７】
96ウェルプレートを用いた好ましい実施形態においては、基準抗体濃度を100 ng/mlとする。システムで使用する感度および抗体濃度に応じて、他の基準抗体濃度を使用することも可能である。次いで、100 ng/mlの抗体を含む行のすべての列中のウェルにおける検出抗体反応から得られる信号を検討して、約1.0のOD値を生成する抗原濃度を見つける。ヤギ抗ヒトIgG Fc HRPポリクローナル抗体およびTMB基質を用いた上記好ましい実施形態においては、100 ng/mlの抗体を含む行中のウェルを検討して、吸光度を450 nmで測定したときに、OD値が約1.0の反応を生じる抗原濃度を決定する。次いで、この抗原濃度を後続の実験に使用して、抗体をスクリーニングし、動力学的にランク付けする。最適抗原密度を求める同様の手法を、Luminexビーズを用いたシステムに使用した。
【０１９８】
限界抗原濃度を使用した抗体スクリーニング
最適抗原濃度での表面被覆
抗体スクリーニングの実施に使用する表面を、あらかじめ決定した最適濃度の抗原で被覆する。好ましい実施形態においては、この表面は、Sigma SA プレートなどの96ウェルストレプトアビジンプレートのウェルであり、ビオチン化抗原が最適濃度でウェルに添加される。より好ましい実施形態においては、抗原の1%脱脂乳、1X PBS pH 7.4溶液50μlおよびプレートを30分間インキュベートする。別の好ましい実施形態においては、上述したように、製造者の指示および/または標準手順に従って、未改変抗原をCostar(登録商標) Universal-BIND(商標)プレートに添加し、インキュベーションおよびUVによって抗原を結合させる。
【０１９９】
抗原溶液とともに適切な時間インキュベーションした後、プレートを好ましくは少なくとも4回(4X)洗浄して未結合抗原を除去する。
【０２００】
スクリーニングしランク付けすべき試験抗体の添加
限界抗原アッセイによってスクリーニングしランク付けすべき抗体を試験抗体と称する。試験抗体は、抗体産生細胞の周囲の溶液から回収することができる。試験抗体は、抗体産生B細胞培養培地、ハイブリドーマ上清、任意のタイプの細胞から発現される抗体または抗体断片から回収されることが好ましく、より好ましくはB細胞培養物の上清から回収される。試験抗体含有溶液、例えばB細胞培養上清は、一般に、追加の処理を必要としないが、試験抗体を濃縮し、単離し、または精製する追加のステップも、開示する方法に適合している。
【０２０１】
試験抗体を含有する各溶液を希釈して濃度を所望の範囲とし、抗原が付着した表面に試料を添加する。一般に、試験抗体の所望の濃度範囲は、上述したように、最大濃度が、最適抗原濃度を選択するために使用する基準抗体濃度よりも低い。本発明の一態様は、試験抗体が(a)抗原に対してより高い親和性を有し、あるいは(b)類似した親和性を有するが基準抗原よりも高濃度で存在する場合に、同じ抗原濃度に対して試験抗体が基準抗体の信号よりも大きい信号を発生することを規定する。したがって、スクリーニングアッセイに使用する抗原濃度を選択するために使用する基準抗体濃度よりも低い濃度で試験抗体を使用すると、抗原に対して高い親和性を有する試験抗体のみが、基準抗体信号よりも大きな信号を発生することになる。
【０２０２】
(上述したように)100 ng/mlの基準抗体濃度を使用して最適抗原濃度を選択する一実施形態においては、経験的に決定された約20 ng/ml〜800 ng/mlの試験抗体濃度範囲を有するB細胞培養上清を、一般に1/10に希釈して約2 ng/ml〜80 ng/mlの使用アッセイ試験抗体濃度とする。各希釈B細胞培養上清の少なくとも2つの2つ組試料を試験することが好ましい。希釈B細胞培養上清をマイクロタイタープレートのウェルに添加することが好ましい。ここで、ウェルは抗原および基準抗体を用いてあらかじめ決定した最適濃度の抗原で被覆されている。
【０２０３】
スクリーニングの一部として陽性対照を含むべきであり、最適抗原濃度を決定することによってアッセイを最適化するために使用する基準抗体を希釈し、抗原と反応させる。この陽性対照は、内部対照として、また、試験抗体スクリーニングから得られる結果が陽性対照の予想結果と同等であり、以前の最適化結果と整合性があることを確認し、保証し、実証するために以前の最適化結果とも比較するのにも有用な1セットの測定値を提供する。
【０２０４】
一実施形態においては、試験する各B細胞培養上清を1%脱脂乳/1X PBS pH 7.4/.05%アジドで1:10に希釈し、50 ulを96ウェルプレートの2つの抗原で被覆されたウェルの各々に添加することによって、各96ウェルプレート中に48種の異なる試料を用意する。基準抗体の希釈系列を含む陽性対照を、96ウェルプレートの約半分のウェルに添加して、陽性対照と並行して実施したB細胞培養上清中の試験抗体のスクリーニング結果が、内部的に整合性があり、以前の最適化結果とも整合性があることを確認し実証することが好ましい。
【０２０５】
試験抗体を、適切な諸条件下で抗原とともにインキュベートする。陽性対照として使用される基準抗体を同じ諸条件下で並行してインキュベートする。好ましい一実施形態においては、プレートを、例えばプラスチックラップまたはパラフィンフィルムで密封し、振とうしながら室温で24時間インキュベートする。
【０２０６】
試験抗体への検出抗体の添加
プレートを、好ましくは約5回(5X)水で洗浄して未結合基準抗体を除去する。次に、基準抗体を認識しそれに結合する標識検出抗体を添加し、その溶液をインキュベートして検出抗体を基準抗体に結合させる。検出抗体を陽性対照にも添加して、基準抗体と検出抗体が相互作用することを確認する。検出抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。検出抗体は、基準抗体に結合した抗体を検出できる任意の方法で標識することができる。標識は、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)などの酵素標識、またはビオチン、ジゴキシゲニンなどの非酵素標識とすることができ、32P、3H、14Cなどの放射性標識、または蛍光とすることができ、利用可能な試薬、材料および検出方法に基づいたアッセイに適切な任意の他の標識とすることができる。
【０２０７】
一実施形態においては、ヒト試験抗体を用いて、濃度0.5μg/mlのヤギ抗ヒトIgG Fc HRPポリクローナル抗体(Pierce Chemical Co、Rockford IL、カタログ番号31416)の1%脱脂乳、1X PBS pH 7.4溶液50μlを、試験抗体および(陽性対照として)基準抗体を含むマイクロタイタープレートの各ウェルに添加する。次いで、プレートを室温で1時間インキュベートする。
【０２０８】
すべての未結合検出抗体を除去するために、検出抗体を含有する過剰の溶液を除去し、プレートを水で繰り返し、好ましくは少なくとも5回洗浄する。
【０２０９】
結合検出抗体の測定。
試験抗体に結合する(および対照の基準抗体に結合する)検出抗体の量を、存在する標識の量を測定し定量する適切な方法によって求める。選択した標識に応じて、測定方法は、添加した基質に対する酵素活性の測定、(例えば、ビオチンに対する)検出可能な結合相手への結合の測定放射能を測定するシンチレーションカウンティング、または当業者によって決定される任意の他の適切な方法を含むことができる。
【０２１０】
検出抗体としてヤギ抗ヒトIgG Fc HRPポリクローナル抗体を用いた上記方法においては、色素原HRP基質テトラメチルベンジジン(TMB)50 ulを各ウェルに添加する。基質溶液を室温で約30分間インキュベートする。1Mリン酸50μlを各ウェルに添加してHRP/TMB反応を停止させる。
【０２１１】
定量。
次いで、結合標識量を、反応生成物または結合複合物の形成の分光光度測定、検出された放射性標識の量の計算などの適切な方法によって定量する。本発明の一態様によれば、標識量は、試験抗体に結合した(または、陽性対照においては、基準抗体に結合した)標識検出抗体の量の指標になる。本発明の別の態様によれば、標識量は、抗原に結合した試験抗体の量の指標になる。したがって、標識量を検出し定量することによって、試験抗原に対する試験抗体の結合を測定する手段が提供される。標準信号を、抗原に結合した試験抗体の量を数量化する信号と比較することによって、基準よりも大きな信号を与える試験抗体を検索して親和性の高い試験抗体を同定することが可能になる。
【０２１２】
ヤギ抗ヒトIgG Fc HRPポリクローナル抗体およびTMB基質を用いた上記実施形態においては、試験抗体(および陽性対照における基準抗体)に結合する検出抗体の量を、プレートの各ウェルの450 nmにおける吸光度(光学濃度、OD)を読み取ることによって定量する。
【０２１３】
目的抗体を同定しランク付けするデータ解析。
各試験抗体の結果を平均し、標準範囲を決定する。HRP標識検出抗体を用いて各試験抗体の2つの試料を分析する好ましい実施形態においては、450 nmにおけるOD値を平均し、標準偏差を計算する。試験抗体の平均OD値を、標準信号のOD値と比較する。陽性対照のアッセイから得られる値も計算し、アッセイの信頼性を検討する。
【０２１４】
平均OD値および複製間のOD値の範囲を考慮することによって、試験抗体を動力学的にランク付けする。平均OD値は、抗原に対する試験抗体の親和性の指標となる。ここで、親和性は、標準信号、または陽性対照における基準抗体のOD値と比較することによって決定される。この範囲は、アッセイの信頼性の指標になり、範囲が狭いことは、OD値が、抗原に結合した試験抗体の量の正確な測定値である可能性が高いことを示し、範囲が広いことは、OD値が、結合の正確な測定値ではないかも知れないことを示している。許容標準偏差は、一般に、相互の5〜15%の間のOD値である。最高OD値を与える試験抗体は、平均値の標準偏差が小さい場合、最高の動力学的ランクにある。
【０２１５】
標準信号が1.0 OD単位である一実施形態においては、1.0 OD単位よりも大きな平均ODと、許容し得る低い標準偏差を有するあらゆる試験抗体は、抗原に対して基準抗体の親和性よりも高い親和性を有すると考えられる。
【０２１６】
別の実施形態においては、異なる抗原で被覆されたビーズを用いたLuminexベースのアッセイを使用した。このアッセイにおいては、抗体は、高い抗原密度で、次いで低い抗原密度で抗原をどのように結びつけるのかによってランク付けされる。
【実施例】
【０２１７】
(実施例1)
エピトープ認識特性のアッセイ
抗体の産生および予備的なキャラクタリゼーション。
ビンニングに使用する抗原特異性ヒトIgGモノクローナル抗体を含有するハイブリドーマ上清を、融合プレートから24ウェルプレートに移した培養ハイブリドーマ細胞から収集した。上清を、ビンニング分析用に24ウェルプレートから収集した。目的抗原に特異的な抗体を、その抗原に対するELISAスクリーニングを用いたハイブリドーマスクリーニングによって選択した。抗原に対する結合が陽性である抗体を、96ウェルプレート親和性ランキング方法とBIAcore親和性測定法を併用してその結合親和性によってランク付けした。目的抗原に対する親和性が高い抗体をエピトープビンニング用に選択した。これらの抗体を、アッセイにおける基準抗体およびプローブ試験抗体として使用する。
【０２１８】
Luminexビーズを用いたアッセイ
まず、基準抗体を捕捉する捕捉抗体として使用するマウス抗ヒトIgG(mxhIgG)モノクローナル抗体の濃度を測定し、mxhIgG抗体を、PBS中で透析して、結合プロセスを妨害する恐れがあるアジドまたは他の防腐剤を除去した。次いで、mxhIgG抗体を、Luminex User Manual、75〜76ページの製造者の指示に従って、Luminexビーズ(Luminex 100 System、Luminex Corp.、Austin TX)に結合させた。手短に述べると、50μg/mlのmxhIgG捕捉抗体の500μl PBS溶液を、1.25×107ビーズ/mlのビーズ300μlと混合した。結合後、血球計を用いてビーズを数え、その濃度を1×107ビーズ/mlに調整した。
【０２１９】
上述したように、抗原特異性抗体を収集しスクリーニングし、それらの濃度を求めた。最高100個の抗体をエピトープビンニング用に選択した。この抗体を以下の式に従って希釈し、最高100個の一義的に標識されたビーズに結合させて標識基準抗体を形成させた。
【０２２０】
各管中の試料の全体積: Vt =(n+1)×100μl + 150μl、
式中、n = 対照も含めた試料の総数。
希釈に要する個々の試料の体積: Vs = C×Vt/Cs、Cs = IgG
各試料の濃度。C = 0.2〜0.5μg/ml。
【０２２１】
試料を上式に従って調製し、基準抗体を含有する各希釈試料150μlを96ウェルプレートのウェルに等分した。別の一定分量を、アッセイの後段でプローブ抗体として使用するために保存した。mxhIgG結合ビーズ原料を撹拌し、濃度2500ビーズ/ウェルまたは0.5×105/mlに希釈した。基準抗体をmxhIgG結合ビーズとともに暗所中振とう機上で終夜室温でインキュベートした。
【０２２２】
96ウェルフィルタープレートを、200μl洗浄緩衝剤を添加し吸引してあらかじめ湿らせた。終夜インキュベーションした後、(この時点では、ビーズに結合したmxhIgGに結合した基準抗体を有する)ビーズをプールし、100μlを96ウェルマイクロタイターフィルタープレートの各ウェルに濃度2000ビーズ/ウェルで等分した。一定分量のビーズの総数は、試験する試料の数の2倍であり、それによって、抗原を含む実験と抗原を含まない実験を並行させることができる。緩衝剤を素早く吸引して未結合基準抗体を除去し、ビーズを3回洗浄した。
【０２２３】
抗原を1セットの試料に添加した(50μl)。ビーズを抗原とともに濃度1μg/mlで1時間インキュベートした。緩衝剤対照を他のセットの試料に添加して、抗原を含まない陰性対照とする。
【０２２４】
次いで、プローブ抗体として使用したすべての抗体をすべての試料(抗原を含む試料および抗原を含まない試料)に添加した。この実験においては、すべての組み合わせを試験するために、基準抗体として使用する各抗体をプローブ抗体としても使用した。プローブ抗体を基準抗体と同じ希釈溶液から採取して、抗体が確実に同じ濃度で使用されるようにすべきである。プローブ抗体(50μl/ウェル)をすべての試料に添加し、混合物を暗所中振とう機上で2時間室温でインキュベートした。試料を3回洗浄して未結合プローブ抗体を除去した。
【０２２５】
検出抗体: ビオチン化mxhIgG(50μl/ウェル)を1:500希釈して添加し、その混合物を暗所中振とう機上で1時間インキュベートした。ビーズを3回洗浄して未結合ビオチン化mxhIgGを除去した。1:500希釈のストレプトアビジン-PEを50μl/ウェル添加した。混合物を暗所中振とう機上で15分間室温でインキュベートし、次いで3回洗浄して未結合成分を除去した。
【０２２６】
製造者の指示に従い、Luminex 100およびXYPベースをLuminexソフトウエアによって立ち上げた。新しいセッションを開始し、アッセイに使用する試料数およびビーズのデジグネイション番号を入力した。
【０２２７】
各ウェル中のビーズを80μl希釈緩衝剤中で再懸濁させた。96ウェルプレートをLuminexベース中に配置し、各ウェルの蛍光発光スペクトルを読み取り記録した。
【０２２８】
アッセイの最適化
アッセイを最適化するために、Luminex User's Manual Version 1.0をビーズ濃度、抗体濃度、およびインキュベーション時間の指針として始めに使用した。インキュベーション時間が長いほど結合が確実に飽和し、アッセイで使用するナノグラム抗体濃度にとってより適切であることが経験的に確認された。
【０２２９】
(実施例2)
単一データセットの分析: ANTIGEN14抗体
データ入力
抗体を実施例1に記載したように分析し、結果を得た。ANTIGEN14標的の単一実験に対応するデータセットの入力ファイルは、図8A(抗原あり)および図8B(抗原なし)に示した入力行列からなる。
【０２３０】
ANTIGEN14標的データの正規化
まず、抗原を含まない実験(陰性対照、図8B)実験に対応する行列を、抗原を含む実験(図8A)に対応する行列から減算して、標識抗体の非特異的結合によるバックグラウンド信号量を除去した。2つの行列の差を図9に示す。抗体2.42に対応する列は、対角の値もそれ以外の値も異常に大きく、上述したように印が付けられ、データ解析においては別個に処理される。
【０２３１】
行の正規化
図10に示すように、ユーザー定義しきい値の200未満の値をこのしきい値に設定することによって差行列を調整した。この調整は、(上述したように)後続の正規化ステップにおける低い信号値の大きな人為的増加を防止するために行った。次いで、行列中の各行の値をブロッキング緩衝剤に対応する行の値で除算して各行の強度を正規化した(図11)。これによって、上で考察し図2Aに示したウェルごとの強度変化が調整される。
【０２３２】
列の正規化
上述したように抗体2.42に対応する列以外のすべての列を列正規化し、図12に示した。
【０２３３】
相違行列
相違(または距離)行列を多段階の操作で作成した。まず、ユーザー定義しきい値(対角強度の2倍に設定)未満の強度をゼロに設定し、残りの値を1に設定した(図13)。これは、対角強度の2倍未満の強度は、同じエピトープに対する抗体対の競合を表すのに十分低いと考えられることを意味する。i行j列のエントリをiおよびjの2つの行の異なる位置の割合に設定することによって、相違行列をゼロと1の行列から作成する。図14は、ANTIGEN14標的に対して産生される抗体セットの任意の2つの抗体パターンが異なる位置の数(全22個のうち)を示している。
【０２３４】
相違行列を、(対角値の)1.5〜2.5倍の範囲にあるいくつかのしきい値の各々から作成されるゼロと1の行列から0.1の増分で作成した。これらの相違行列の平均を計算し(図15)、クラスター化アルゴリズムへの入力値として使用した。いくつかの相違行列の平均を取る意義を図4に示す。図4は、1対の抗体(2.1と2.25)の相違割合を、1.5〜2.5の範囲のしきい値に対するしきい値の関数として示している。しきい値が1.8および1.9から変化すると、2つの抗体の信号パターン間の相違量は、実質的に0%からほぼ15%に変化する。この図は、1対の抗体の信号パターン間の相違量が1つの特定のカットオフ値選択にいかに敏感であり得るかを示しており、この相違量はしきい値が異なると大きく変わり得る。
【０２３５】
クラスター化:
階層クラスタリング
SPLUS 2000統計分析ソフトウエアの集積的入れ子サブルーチンによって、上述した平均相違行列を入力として用いて抗体をグループ化(またはクラスター化)した。このアルゴリズムにおいては、入れ子サブセットの厳密な階層に抗体を押し込んだ。まず、行列全体において最小の対応する相違値を有する抗体対をグループ化した。次いで、第2の最小相違(または平均相違)値を有する抗体対または抗体クラスターをグループ化した。このプロセスをクラスターが1つになるまで繰り返した。
【０２３６】
クラスターの樹状図表示
ANTIGEN14標的に対して計算した樹状図を図5に示す。2つの抗体を結ぶ枝の長さ(または高さ)は、ANTIGEN14標的が結合する抗体間の類似度に逆比例する。この樹状図は、これらの抗体によって認識される2つの極めて特徴的なエピトープが存在したことを示している。1つのエピトープは、抗体2.73、2.4、2.16、2.15、2.69、2.19、2.45、2.1および2.25によって認識された。別のエピトープは、抗体2.13、2.78、2.24、2.7、2.76、2.61、2.12、2.55、2.31、2.56および2.39によって認識された。抗体2.42は、他のいずれの抗体とも近似したパターンを持たないが、第2のクラスターに対して注目すべきある類似性を有しており、第2のエピトープと部分的に重複する第3のエピトープをまだ認識できることを示している。
【０２３７】
クラスターの行列表示
これらの抗体のクラスター化は図16および図17でも見ることができる。図16では、相違行列の行と列を、図5に示した樹状図の「葉」または分岐群の順に再配列させ、相違度に応じて個々のセルを視覚的に符号化した。陰影の濃いセルは、極めて類似した(10%未満の相違)抗体対に対応する。陰影の付いていないセルは、ほぼ類似している(10%〜25%の相違)抗体に対応する。陰影の薄いセルは相違が25%を超えた抗体対に対応する。陰影の濃いブロックは、抗体の異なるクラスターに対応する。ブロッキング緩衝剤を除いて、上述した抗体グループに対応するブロックが2つ、場合によっては3つ存在すると考えられる。図16は、やや大きな相違も許容すると、抗体2.42を第2のクラスターのメンバーと考えることができることも示している。
【０２３８】
図17では、正規化強度行列の行と列を、樹状図の葉の順に再配列させ、それらの正規化強度に応じて個々のセルを視覚的に符号化した。陰影の濃いセルは、大きな強度(バックグラウンドの少なくとも2.5倍)を有する抗体対に対応する。陰影の付いていないセルは、強度がックグラウンドの1.5〜2.5倍であった。陰影の薄いセルは、バックグラウンドの1.5倍未満の強度に対応する。この行列の行の視覚によるマーキングを比較すると、上記2つのエピトープに対応する2つの極めて特徴的なパターンが現れた。また、視覚による符号化は、対角に関して極めて対称的であることに注目されたい。これは、同じエピトープに対して2つの抗体が競合するかどうかを明らかにする上で、データが極めて首尾一貫していることを示している。これは、抗体Aと抗体Bが同じエピトープに対して競合した場合、抗体Aが一次抗体であり抗体Bが二次抗体であるとき、ならびに抗体Bが一次抗体であり抗体Bが二次抗体であるときの両方で、強度は低いはずだからである。したがって、i行j列およびj行i列のセルの強度は両方とも低いはずである。同様に、これら2つの抗体が異なるエピトープを認識する場合、対応する両方の強度は高いはずである。約200個のセルの対のうち、1対のみでその対の1メンバーが1.5未満の強度であったのに対し、もう一方のメンバーの強度が2.5を超えた。アルゴリズムから得られた正規化行列の首尾一貫性のレベルは、作成されたデータとデータのアルゴリズム分析の両方の信頼性の指標となった。ANTIGEN14データセットの(99%を超える)高レベルの首尾一貫性は、このデータセットに対するアルゴリズムの結果を高い信頼レベルで信用できることを示唆している。
【０２３９】
(実施例3)
複数のデータセットの分析:ANTIGEN39
複数の実験に対して入力データセットが存在する場合、上述したように各個々の実験に対する正規化強度行列をまず作成する。しきい値(一般に4に設定)を超える正規化値を対応するしきい値に設定する。これによって、単一の正規化強度が抗体対の平均値に過度の影響を及ぼさないようにする。データが存在する各抗体対に対してすべての実験にわたる単一の正規化強度の平均をとることによって、個々の正規化行列から単一の正規化行列を作成する。対応する強度がない抗体対に印を付ける。iとjの2つの行の異なる位置の割合が、両方の行が或る強度を有する位置の数のみを考慮する以外は上述のとおりにして、相違行列を作成した。2つの行にこのような位置がない場合、相違値を任意の高い値に設定し印を付ける。
【０２４０】
ANTIGEN39抗体を用い、実施例1および2、ならびに本明細書を通して記載した方法によって、5つの実験を実施した。ANTIGEN39抗体の5つの入力データセットに対するクラスター化の結果を図6A、図18、図19および図30に要約する。この結果は、様々な類似度の多数のクラスターが存在したことを示している。これは、いくつかの異なるエピトープが存在し、その一部は重複しているかもしれないことを示唆している。例えば、抗体1.17、1.55、1.16、1.11および1.12を含むクラスター、および1.21、2.12、2.38、2.35および2.1を含むクラスターは、かなり密接に関係している(2.35と1.11を除いた各抗体対はせいぜい25%しか異ならない)。この2つのクラスター間の高度な類似性は、2つの異なるエピトープが極めて類似していることを示唆している。
【０２４１】
アルゴリズムが整合性のあるクラスター化結果をもたらすかどうかを試験するために、5つのデータセットを独立にもクラスター化した。異なる実験に対するクラスター化結果を図6B〜6Fおよび図20〜30に要約する。図30は、個々のデータセットの各々に対するクラスター、および5つの実験の抗体すべてを含む混合データセットに対するクラスターを要約したものである。図6Bは、実験1のANTIGEN39抗体の樹状図である。抗体1.12、1.63、1.17、1.55および2.12はともに、この実験でも別の実験でも一貫してクラスターを形成し、抗体1.46、1.31、2.17および1.29も同様である。図6Cは、実験2のANTIGEN39抗体の樹状図である。抗体1.57と1.61はともに、この実験でも別の実験でも一貫してクラスターを形成した。
【０２４２】
図6Dは、実験3のANTIGEN39抗体の樹状図である。抗体1.55、1.12、1.17、2.12、1.11および1.21はともに、この実験でも別の実験でも一貫してクラスターを形成した。図6Eは、実験4のANTIGEN39抗体の樹状図である。抗体1.17、1.16、1.55、1.11および1.12はともに、この実験でも別の実験でも一貫してクラスターを形成し、抗体1.31、1.46、1.65および1.29、ならびに抗体1.57と1.61も同様である。図6Fは、実験5のANTIGEN39抗体の樹状図である。抗体1.21、1.12、2.12、2.38、2.35および2.1はともに、この実験でも別の実験でも一貫してクラスターを形成した。
【０２４３】
一般に、クラスター化アルゴリズムは、個々の実験間でも、混合データセットと個々のデータセットとの間でも整合性のある結果をもたらした。複数の個々のデータセットに対してともにクラスターを形成する抗体または隣接クラスター中に存在する抗体は、混合データセットでもともにクラスターを形成しまたは隣接クラスター中に存在する。例えば、陰影の薄いセルは、混合データセットおよび抗体が存在するすべてのデータセットにおいてともに一貫してクラスターを形成する抗体に対応する(実験1、3、4および5)。これらの結果は、このアルゴリズムが複数の個々の実験にわたって一貫したクラスター化結果をもたらし、複数のデータセットを結合しても整合性を保持していることを示している。
【０２４４】
最後に、同じエピトープに対して2つの抗体が競合するかどうかを明らかにすることに関して、データには高いレベルの首尾一貫性がある。抗体対が同じエピトープに対して競合するかどうかをデータが一貫して示す抗体対の割合を、各データセットについて上記表2に要約する。表2(上記)から、5つの個々のデータセットのうちの4つおよび混合データセットの整合性はほぼ90%であることが判明した。
【０２４５】
(実施例4)
競合パターン認識データ解析プロセスによる小さなIL-8ヒトモノクローナル抗体セットの解析
炎症誘発性メディエータであるIL-8に対して発生し特性が明らかなヒトモノクローナル抗体の小セットを使用して、CPRプロセスを用いたプログラムを評価した。すでに、プレートを使用したELISAによって、セット内の抗体が2つの異なるエピトープHR26、a215に結合し、D111は1つのエピトープを認識するのに対し、K221とa33は第2のエピトープに対して競合することが判明している。エピトープマッピング試験によるさらに詳細な解析によって、HR26、a809およびa928が同じまたは重複したエピトープに結合し、一方a837は異なるエピトープに結合することが判明した。
【０２４６】
CPRプロセスが抗体を正確にクラスター化できるかどうかを判定する新しい実験では、上記モノクローナル抗体の一部を含めて7つのIL-8抗体の1セットについてプロセスを試験した。結果を図7Aに示す樹状図に要約する。左側の樹状図はバックグラウンド正規化信号強度行列のクラスター化列から作成され、右側の樹状図はクラスター化行から作成された。両方の樹状図は、0.25の相違カットオフに対して2つのエピトープが存在することを示す。すなわち、1つのエピトープは、HR26、a215、a203、a393およびa452によって認識され、第2のエピトープは、K221およびa33によって認識された。
【０２４７】
CPRプロセスによって抗体をクラスター化したこれらの結果は、上に要約したプレートを用いたELISAアッセイのデータと整合性があった。CPRプロセスによって得られる結果は、標的抗原に2つの特徴的なエピトープがあることを示唆しており、プレートを用いたELISAアッセイによる結果を裏付けるものである。クラスター化にCPRプロセスを使用することによって、HR26とa215がともにクラスター化され、K221とa33もともにクラスター化され、プレートを用いたELISAアッセイの結果とやはり整合性があることが示された。
【０２４８】
2つの樹状図間の類似度は、このプロセスによって実施される解析の首尾一貫性の指標となった。2つの樹状図(クラスター化列から作成された左側の図と、クラスター化行から作成された右側の図)は、以下の理由によって同一であることが理想的である。すなわち、抗体#1と抗体#2は同じエピトープに対して競合し、抗体#1が基準抗体であり抗体#2がプローブ抗体であるとき、ならびに抗体#2が基準抗体であり抗体#1がプローブ抗体であるとき強度は低いはずである。同様に、2つの抗体が異なるエピトープに結合するとき、各強度は一様に高いはずである。このため、信号強度行列の2つの行間の類似度は、類似行列の2つの列間と同じはずである。この例では、図7Aの左側と右側の各樹状図はほぼ同じである。それぞれの場合で、2つのクラスター中に同じ抗体が出現した。行クラスター化と列クラスター化のこの高レベルの首尾一貫性は、この実験手順とプロセスが、確固とした結果をもたらすことを示唆した。
【０２４９】
(実施例5)
競合パターン認識(CPR)データ解析プロセスによる複数のIL-8抗体データセットの解析
IL-8抗体を用いた複数のスクリーニング実験を実施し、複数のデータセットを作成した。上述したように、まず、正規化強度行列を、各個々の実験の行列に対して作成した。ユーザー定義しきい値よりも大きい正規化値をユーザー定義しきい値に設定した。高い強度をしきい値に指定して、後続のステップにおいて特定の抗体対に対して平均正規化強度を計算したときに、任意の単一強度が過度の重みをもたないようにした。平均正規化強度行列の行および列は、本発明の方法によって同定される「一義的」抗体セットに対応した。これらの「一義的」抗体を、すべての実験に使用する全抗体の中から同定した。少なくとも1つの強度値が存在するこの行列中の各セルに対して平均強度を計算した。データがない抗体対に対応するセルを欠落データポイントとした。両方の行が強度を有する位置の総数に対する2つの行が異なる位置の数に基づいて割合を決定した以外は、上述したとおりに相違行列を作成した。2つの行に共通データがない場合、対応するセルの相違値に印を付け、任意の高い値に設定したため、対応する抗体が人為的結果としてともにグループ化されてはいないはずである。
【０２５０】
モノクローナル抗体の5つの重複セットからの1セットのモノクローナル抗体に対するクラスター化結果を図7Bおよび表4(下記)に要約する。これらの樹状図は、標的抗原上に2つの異なるエピトープが存在することを示す結果を裏付けている。第1のエピトープは、モノクローナル抗体a809、a928、HR26、a215およびD111によって規定され、第2のエピトープはモノクローナル抗体a837、K221、a33、a142、およびa358、a203、a393、およびa452によって規定される。クラスターを連結する枝の長さから、第1のクラスターが他の2つとは極めて異なるのに対し、第2および第3のクラスターが互いに類似していることが示された。
【０２５１】
CPRプロセスが別個の実験にわたって一貫した結果をもたらすかどうかを試験するために、5つのデータセットを個々にもクラスター化した。異なる実験に対するクラスター化結果を図7A、7Bおよび7Cに示す樹状図に要約する。これらの樹状図から、CPRクラスター化プロセスは、個々の実験間でも、混合データセットと個々のデータセットとの間でも整合性のある結果をもたらすことが示された。各樹状図は、2つの主要な枝を有し、2つのエピトープを示唆している。複数の個々のデータセットに対してともにクラスター化された抗体は、やはりともにクラスター化され、結合データセットの隣接クラスター中に存在した。下記表4に示すように、異なる実験間の、または個々の実験と混合データセット間のクラスター化結果には2つのわずかな違いしかなかった。これらの違いを、表4に太字で示す。実験3で生成したデータセットにおいては、D111は、HR26およびa215に代わり、抗体a33およびK221とクラスターを形成した。実験4で生成したデータセットにおいては、抗体a203、a393およびa452が第1のクラスターに出現し、一方、別の実験においては(ならびに、混合データセットにおいては)、第2のクラスターに出現した。このわずかな違いは、抗体をプローブ抗体として使用する実験と同じ抗体を基準抗体として使用する実験との個々の抗体親和性の違いに起因している可能性が高い。親和性の低い抗体は、基準抗体として使用したときに溶液から抗原を捕捉する能力が低いのかもしれない。しかし、クラスター化結果、ならびに抗原のグループ化の全体的類似性から、プロセスが、整合性があり複数の個々の実験にわたり他の実験から得られる結果と一致するクラスター化結果をもたらし、その結果が複数のデータセットを結合しても整合性を保持していることが示された。
【０２５２】
最後に、このプロセスを用いて個々のデータセットおよび混合データセットに対して行と列をクラスター化したときに、これらのデータセットの各々に対するクラスター化結果に高い整合性があった。行クラスター化と列クラスター化のクラスター化結果の唯一の違いは、第3のデータセット中のD111とのクラスターであり、D111は、行クラスター化を実施したときには抗体HR26およびa215とクラスターを形成し、列クラスター化を実施したときには抗体a33およびK221とクラスターを形成した。
【０２５３】
【表４】
2006322940.tif 000012
【０２５４】
(実施例6)
最適抗原濃度の決定
抗原調製 
副甲状腺ホルモン(PTH)を、Pierce EZ-Link Sulpho-NHSビオチンを用いて、製造者の指示に従ってビオチン化した(Pierce EZ-link Sulpho-NHSビオチン、(Pierce Chemical Co.,Rockford、IL、カタログ番号21217)。抗原をビオチン化できない場合、Costar UVプレートを取り替えた。Costar UVプレートを使用すると、アッセイ時間が長くなり、一般に、かなり多くの抗原を使用する必要があった。
【０２５５】
チェッカーボードELISA
「チェッカーボード」配列で設計されたアッセイを以下に示すように実施して抗原の最適被覆濃度を決定した。アッセイを、ストレプトアビジン被覆96ウェルプレート(Sigma SAマイクロタイタープレート、Sigma-Aldrich Chemicals、St Louis MO、カタログ番号M5432)を用いて以下のように実施した。
【０２５６】
副甲状腺ホルモン(PTH)抗原を、Pierce EZ-link Sulpho-NHSビオチン((Pierce Chemical Co、Rockford IL、カタログ番号21217)を用いて、製造者の指示に従ってビオチン化した。1%脱脂乳/1X PBS pH7.4で初期濃度500 ng/mlから最終濃度0.5 ng/mlまで一連の段階希釈によって希釈したビオチン化抗原。希釈ビオチン化抗原を、96ウェルSigma SAマイクロタイタープレート(Sigma Aldrich Chemicals、カタログ M-5432)の水平方向に分布させ、列1〜11の各々のウェルに各希釈物50μlを入れ、これを各列の行A〜Hの各ウェルで繰り返した。列12には抗原を添加しなかった。プレートを室温で30分間インキュベートした。Sigma SAプレートはあらかじめ遮断されているのでブロッキングステップを実施しなかった。
【０２５７】
プレートを水道水で4回洗浄した。プレートを手で、または利用可能なときにはマイクロプレート洗浄装置で洗浄した。
【０２５８】
親和性が既知の抗PTH抗体を基準抗体として用いた。抗PTH抗体15g2を1%脱脂乳/1X PBS pH 7.4/0.05%で希釈した。最終初期希釈(final initial concentration)1 ug/mlを連続1:2希釈し、7つのウェルを最終濃度15 ng/mlにした。各希釈物50 ulを行A〜行Gの各ウェルに分布させ、これを列1〜12の各ウェルで繰り返した。行Hには抗体を添加しなかった。抗原および基準抗体を含むプレートを室温で約24時間インキュベートした。
【０２５９】
プレートをプラスチックラップまたはパラフィンフィルムで密封し(「気密」)、Lab Line Titer Plate Shakerを3の設定で用いて振とうしながら終夜インキュベートした。
【０２６０】
プレートを水で5回洗浄して未結合基準抗体を除去した。結合基準抗体を、0.5 ug/mlのヤギ抗ヒトIgG Fc HRPポリクローナル抗体(Pierce Chemical Co、Rockford IL、カタログ番号31416)の1%脱脂乳/1X PBS pH 7.4溶液50マイクロリットル(50 ul)を各ウェルに添加し、プレートを室温で1時間インキュベートして検出した。(Gt抗ヒトFc HRP-Pierceカタログ番号31416)。
【０２６１】
プレートを水で少なくとも5回(5X)洗浄して未結合ヤギ抗ヒトIgG Fc HRPポリクローナル抗体を除去した。
【０２６２】
HRP基質TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories,Inc、Gaithersberg、MD)50マイクロリットル(50 ul)を各ウェルに添加し、プレートを室温で0.5時間インキュベートした。1Mリン酸50 ulを各ウェルに添加してHRP-TMB反応を停止させた。プレートの各ウェルについて450 nmの光学濃度(吸光度)を測定した。
【０２６３】
データ解析
表2に、抗原としてPTH、および基準抗体として15g2抗PTHを使用した基準アッセイからの結果を示す。基準抗体濃度100 ng/mlに対応する試料の行から得られるOD測定値を検討して、約1.0のODを与える抗原濃度を見つけた。この濃度は、約15 ng/ml PTHと求められた。この抗原濃度を最適抗原濃度と考え、後続の実験に使用する。
【０２６４】
【表５】
2006322940.tif 000013
【０２６５】
(実施例7)
試験抗体の限界抗原アッセイ
SAマイクロタイタープレートを、実施例6で決定した最適濃度15 ng/mlのビオチン化抗原PTHで被覆した。濃度15 ng/mlのビオチン化抗原の1%脱脂乳/1X PBS pH 7.4溶液50マイクロリットル(50 ul)を、実施例1に記載した希釈パターンで各ウェルに添加した。プレートを30分間インキュベートした。
【０２６６】
プレートを水で4回(4X)洗浄し、試験抗体の1%脱脂乳/1X PBS pH 7.4/.05%アジド1:10希釈溶液を含むB細胞培養上清、および各試料50 ulを2つのウェルの各々に添加した。96ウェルプレート当たり48個の異なる試料を添加した。別のプレート上で、最適抗原濃度を決定するのに使用した濃度の基準抗体15g2抗PTHをプレートの少なくとも半分で希釈除去した。これによって、試験抗体のアッセイ結果を確実に最適化結果と同等にする陽性対照が提供された。
【０２６７】
プレートをプラスチックラップまたはパラフィンフィルムで密封し、振とうしながら室温で24時間インキュベートした。
【０２６８】
翌日、すべてのプレートを5回(5X)洗浄し、濃度0.5 ug/mlのヤギ抗ヒトIgG Fc HRPポリクローナル抗体の1%乳、1X PBS pH 7.4溶液50 ulを各ウェルに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。
【０２６９】
プレートを少なくとも5回(水道水で5X)洗浄した。HPR基質TMB50マイクロリットルを各ウェルに添加し、プレートを30分間インキュベートした。1Mリン酸50 ulを各ウェルに添加してHRP-TMB反応を停止させた。450 nm における光学濃度(吸光度)をプレートの各ウェルについて測定した。
【０２７０】
データ解析
試験抗体のOD値を平均し、その範囲を計算した。最も強い信号と許容される低い標準偏差を有する抗体を、抗原に対して基準抗体よりも高い親和性を有する抗体として選択した。
【０２７１】
表6に、PTHをリガンドとして用いた限界抗原希釈アッセイの結果を示す。
抗体を様々なPTH抗原に対するその相対親和性によってランク付けし、そのウェル番号で識別する。
【０２７２】
【表６】
2006322940.tif 000014
【０２７３】
(実施例8)
インターロイキン-8(IL-8)に対する抗体の希釈
IL-8の適切な被覆濃度を上述したように決定してODが約1になるIL-8濃度を求めた。次いで、IL-8で免疫したXenoMouse動物に由来する様々な抗IL-8抗体上清とともに最適濃度のものをインキュベートした。表4に、IL-8に対するその親和性に基づいてスクリーニングした抗体の典型的な結果およびランキングを示す。列「一次OD」および「二次OD」は、非限定量のIL-8を結合ELISAに使用したときに得られた一次および二次結合スクリーンODを意味する。限定抗原(limited antigen)項セクションに記録したOD値は、限定抗原においてなされた2つの結合ELISAの平均である。表7で示されるように、上位3つの抗体は、限定濃度においても抗原に対するその結合を維持することができる。一次および二次非限定抗原結合ELISAにおいてやはり高いODが得られる他の抗体は、抗原濃度が限られると同じ信号を得ることができなかった。
【０２７４】
【表７】
2006322940.tif 000015
2006322940.tif 000016
【０２７５】
【表８】
2006322940.tif 000017
【０２７６】
【表９】
2006322940.tif 000018
【０２７７】
(実施例9)
親和性ランキング
抗原の調製
抗体親和性ランキングプロセスの有効処理量を増加させるために、本発明者らは、様々な濃度の抗原を様々な着色ビーズで標識した。この例では、Luminexシステムのビーズを使用した。知られているように、各ビーズは、活性化されると、様々な波長の光を発する。Luminexリーダーに入れると、各ビーズのアイデンティティを容易に確認することができる。
【０２７８】
この例では、異なる色のストレプアビジン(strepavidin)luminexビーズを、4つの濃度のビオチン化抗原(1ug/ml、100ng/ml、30ng/ml、および10ng/ml)の各々に結合させた。すなわち、各濃度の抗原を異なる着色ビーズで表した。4つの濃度物(concentrations)を混合して、4つの着色物に結合した濃度物(color-bound concentrations)すべてを含有する単一溶液にした。
【０２７９】
次いで、抗体試料のすべてを、Luminex定量結果またはLuminexによるワンポイント定量によって、同じ濃度(約500ng/ml)に希釈した。次いで、すべての試料を連続希釈(1:5)して全部で4つの希釈ポイントを得た。それと同時に、2つのプレート、すなわち定量プレートおよびランキングプレートに十分な試料を希釈することが好ましい。
【０２８０】
抗体のランキング
抗体をランク付けするために、luminexビーズ-抗原試料の約2000個の各混合物をluminexプレートの各ウェルに入れ、次いでウェルを吸引した。次いで、各抗体試料(合計24個の試料)50 ulを各ウェルに入れ、振とうしながら4℃で終夜放置した。プレートを洗浄用緩衝剤で3回(3X)洗浄した。次いで、室温で20分間振とうしながら、50ul/ウェルを結合させる蛍光性抗ヒト抗体(hIgG-フィコエリトリン(PE)(1:500希釈))を用いて検出した。次いで、プレートを洗浄用緩衝剤で3回(3X)洗浄した。プレートを80ulブロッキング緩衝剤で再懸濁した。次に、プレートをLuminex装置に装填した。
【０２８１】
データ解析
各ウェルは、色によって識別可能な4つの異なる濃度の同じ抗原を含んでいるので、様々な抗体の結合親和性を迅速にランク付けすることが可能である。例えば、抗原に対して極めて強い結合親和性を有する抗体は、最も弱い抗体希釈物にさえ結合した。これは、最も低濃度の抗原(the weakest antigen concentration)に付着した着色ビーズに結合した蛍光性抗ヒト抗体結合の量を分析することによって測定することができる。一方、強く結合しない抗体は、1ug/mlおよび100ng/mlの濃度の抗原との結合のみ検出され、30ng/mlまたは1Ong/ml濃度の抗原との結合は検出されないかもしれない。
【０２８２】
SoftMax Proを使用して定量データをデータ解析した。いくつかの濃度で試験した試料のLuminex信号を比較した。次いで、それに応じて試料をランク付けした。
【０２８３】
(実施例10)
絶対的なBiacore KD測定に対する限界抗原出力の比較
以下の動力学的ランキング技術をELISAにより実施し、正式なBiaCore動力学と比較した。下記表8は、典型的な限界抗原出力と、Biacoreから得られる絶対的なKD測定との比較である。手短に述べると、ランク付けされた限定抗原を用いて、68個の抗体を(相互に)ランク付けした。68個の抗体から17個を、BiaCore技術による正式な親和性測定に十分な量にスケールアップした。
【０２８４】
【表１０】
2006322940.tif 000019
【０２８５】
データ解析
全般的に、高度の限定抗原ランクと正式なKDとには高度の相関がある。さほど相関がない抗体の場合、このような相違が存在する理由がいくつかある。例えば、抗原はELISAプレートに低密度で被覆されるが、結合力効果を完全に除外することはできない。また、限定抗原ランキング技術のためにアッセイ材料を被覆するとき、あるエピトープが覆われ、または改変される恐れがある。Biacore分析では、抗体で被覆されたチップ上に抗原が流出した場合、抗原上のこれらのエピトープが異なる配置で存在することがあり、したがって、異なる相対濃度で存在することがある。これは、2つの方法間で動力学的なランキングが異なる結果になり得る。
【０２８６】
Biacoreから得られる親和性が低い抗体は、試験試料中に存在する抗原特異的抗体の濃度が平均よりも極めて高いために、高い限定抗原ランクを与えることもあり得る。これは、人為的に高い限定抗原スコアをもたらす。
【０２８７】
限定抗原動力学方法によって、相対親和性の迅速な決定が可能になり、このパネル中の試験抗体の正式な最高親和性を有する抗体が同定されることは重要である。また、限定抗原動力学的相対ランキング方法は容易にスケールアップして数千の抗体を抗体産生の初期段階で調べることができるので、同様の規模の利点がない他の技術よりもかなり有利である。
【０２８８】
当業者は、本発明の精神から逸脱することなく、多数の様々な改変形態が可能であることを理解されたい。したがって、本発明の形態は説明のためだけのものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは明らかなはずである。
【図面の簡単な説明】
【０２８９】
【図１】マイクロタイタープレートの単一のウェルにおける標識ビーズ技術を用いたエピトープビンニングアッセイの一実施形態の概略図である。ここに示すように、各基準抗体は、特徴的な発光スペクトルを有するビーズに結合する。基準抗体は、マウス抗ヒトモノクローナル捕捉抗体を介して結合して、一義的に標識された基準抗体を形成する。一義的標識基準抗体のセット全体は、マルチウェルマイクロタイタープレートのウェル中に配置される。基準抗体セットは、抗原とともにインキュベートされ、次いでプローブ抗体がウェルに添加される。プローブ抗体は、異なるエピトープを認識する基準抗体に結合した抗原にのみ結合する。抗原へのプローブ抗体の結合によって、捕捉抗体を介してビーズに結合している基準抗体、抗原、および結合したプローブ抗体からなる複合物が形成される。結合プローブ抗体を検出するために標識された検出抗体が添加される。ここで、検出抗体は、ビオチンで標識され、結合プローブ抗体は、ストレプトアビジン-PEとビオチン化検出抗体との相互作用によって検出される。図1に示すように、抗体#50はプローブ抗体として使用され、基準抗体は抗体#50および抗体#1である。抗体は様々なエピトープに結合するので、プローブ抗体#50は、基準抗体#1に結合している抗原に結合し、標識複合物が検出される。プローブ抗体#50は、基準抗体#50が結合した抗原には結合しない。というのは、同じエピトープに対して両方の抗体が競合し、その結果標識複合物が形成されないからである。
【図２Ａ】ブロッキング緩衝剤強度と平均強度との相関を示すグラフである。図2Aは、ブロッキング緩衝剤強度と行内の平均強度との相関を示すグラフである。ブロッキング緩衝剤値を除いた行の平均強度(x軸)に対してプロットした各行のブロッキング緩衝剤強度(y軸)。データに線をフィッティングさせると、ブロッキング緩衝剤値と残りの行の平均強度とに強い線形相関があることが判明した。
【図２Ｂ】ブロッキング緩衝剤強度と平均強度との相関を示すグラフである。図2Bは、ブロッキング緩衝剤強度と列内の平均強度との相関を示すグラフである。ブロッキング緩衝剤値を除いた列の平均強度(x軸)に対してプロットされた各列のブロッキング緩衝剤強度(y軸)。データに線をフィッティングさせると、ブロッキング緩衝剤値と残りの列の平均強度とに比較的弱い線形相関があることが判明した。
【図２Ｃ】ブロッキング緩衝剤強度と平均強度との相関を示すグラフである。図2Cは、抗原を含む行列とバックグラウンド正規化行列の各強度の散布図である。このプロットは、高い減算信号値に対して密な線形相関(傾き約1.0)を示しており、バックグラウンド信号が抗原存在下での信号よりも極めて小さいことを示している。各点は、抗原が存在する実験の信号で減算信号を除算して計算した割合に応じて陰影が付けられている。割合が小さい(ゼロに近い)ほど、バックグラウンドの寄与が大きいことを示しており、陰影は薄い。割合が大きい(1に近い)ほど、バックグラウンドの寄与が小さく、陰影は濃い。割合が小さい値の大部分が散布図の左下領域に分布していることは、1000を超える減算信号値ではバックグラウンドの寄与がより小さくなることを示唆している。
【図３】エピトープビンニングの結果とFACSの結果を比較した表である。ANTIGEN39抗体を用いた抗体実験の結果を、本明細書に記載するエピトープビンニング方法を用いた結果とフローサイトメトリー(蛍光活性化細胞選別装置、FACS)を用いた結果とを比較して示す。抗体は、エピトープビンニングアッセイによって、左端の列の行1〜15で示されるビン1〜15に割り当てられる。セル中の陰影は、ANTIGEN39を発現する細胞(細胞系786-0)に対して、FACSが陽性である抗体を示し、陰影のないものはANTIGEN39を発現しない細胞(細胞系M14)に対して陰性である抗体を示す。
【図４】相違点とバックグラウンド値:しきいカットオフ値の選択効果を示すグラフである。この図は、様々なしきい値で計算された抗体2.1と2.25の相違量を示している。相違量は、異なるしきい値を用いて計算される一連の相違行列に対する2つの抗体、Ab 2.1およびAb 2.25に対応するエントリに対する相違行列の値である。ここで、x軸はしきい値であり、y軸はしきいカットオフ値を用いて計算された相違値である。
【図５】ANTIGEN14抗体の樹状図である。2つの抗体を結ぶ枝の長さは、2つの抗体の類似度に比例する。この図は、これらの抗体によって認識される2つの極めて特徴的なエピトープが存在することを示している。1つのエピトープは、抗体2.73、2.4、2.16、2.15、2.69、2.19、2.45、2.1および2.25によって認識される。別のエピトープは、抗体2.13、2.78、2.24、2.7、2.76、2.61、2.12、2.55、2.31、2.56および2.39によって認識される。抗体2.42は、他のいずれの抗体とも近似したパターンを持たないが、それでも第2のエピトープと部分的に重複する第3のエピトープをまだ認識することができ、第2のクラスターに対して注目すべきある類似性を有する。
【図６Ａ】ANTIGEN39抗体の樹状図である。図6Aは、5つの入力実験データセットに対するANTIGEN39抗体の樹状図である。番号oの独特な抗体クラスターは、いくつかの異なるエピトープが存在し、その一部は重複し得ることを示唆している。例えば、抗体1.17、1.55、1.16、1.11および1.12を含むクラスターと、1.21、2.12、2.38、2.35および2.1を含むクラスターは、2.35と1.11を除いて各抗体の対がせいぜい25%しか異ならず、かなり近い関係にあると考えられる。2つのクラスター間のこの高い類似度は、2つの異なるエピトープ自体が高い類似度を有することを示唆している。
【図６Ｂ】ANTIGEN39抗体の樹状図である。図6Bは、実験1のANTIGEN39抗体の樹状図である。抗体1.12、1.63、1.17、1.55および2.12はともに、この実験でも別の実験でも一貫してクラスターを形成し、抗体1.46、1.31、2.17および1.29も同様である。
【図６Ｃ】ANTIGEN39抗体の樹状図である。図6Cは、実験2のANTIGEN39抗体の樹状図である。抗体1.57と1.61はともに、この実験でも別の実験でも一貫してクラスターを形成する。
【図６Ｄ】ANTIGEN39抗体の樹状図である。図6Dは、実験3のANTIGEN39抗体の樹状図である。抗体1.55、1.12、1.17、2.12、1.11および1.21はともに、この実験でも別の実験でも一貫してクラスターを形成する。
【図６Ｅ】ANTIGEN39抗体の樹状図である。図6Eは、実験4のANTIGEN39抗体の樹状図である。抗体1.17、1.16、1.55、1.11および1.12はともに、この実験でも別の実験でも一貫してクラスターを形成し、抗体1.31、1.46、1.65および1.29、ならびに抗体1.57と1.61も同様である。
【図６Ｆ】ANTIGEN39抗体の樹状図である。図6Fは、実験5のANTIGEN39抗体の樹状図である。抗体1.21、1.12、2.12、2.38、2.35および2.1はともに、この実験でも別の実験でも一貫してクラスターを形成する。
【図７Ａ】IL-8モノクローナル抗体クラスターの樹状図である。図7Aは、7つのIL-8モノクローナル抗体のクラスターの樹状図である。左側の樹状図はバックグラウンド正規化信号強度行列のクラスター化列から作成され、右側の樹状図はクラスター化行から作成された。両方の樹状図は、0.25の相違カットオフを用いると、2つのエピトープが存在することを示している。すなわち、1つのエピトープは、モノクローナル抗体HR26、a215、a203、a393およびa452によって認識され、第2のエピトープは、モノクローナル抗体K221およびa33によって認識される。
【図７Ｂ】IL-8モノクローナル抗体クラスターの樹状図である。図7Bは、5つの異なる実験データセットを合わせた混合クラスター分析から得られるIL-8モノクローナル抗体の樹状図である。左側の樹状図はバックグラウンド正規化信号強度行列のクラスター化列から作成され、右側の樹状図はクラスター化行から作成された。両方の樹状図は、0.25の相違カットオフを用いると、2つのエピトープが存在することを示している。すなわち、1つのエピトープは、モノクローナル抗体a809、a928、HR26、a215およびD111によって認識され、第2のエピトープは、モノクローナル抗体a837、K221、a33、a142、a358、ならびにa203、a393およびa452によって認識される。
【図７Ｃ】IL-8モノクローナル抗体クラスターの樹状図である。図7Cは、9つのIL-8モノクローナル抗体のクラスターの樹状図である。左側の樹状図はバックグラウンド正規化信号強度行列のクラスター化列から作成され、右側の樹状図はクラスター化行から作成された。両方の樹状図は、0.25の相違カットオフを用いると、2つのエピトープが存在することを示している。すなわち、1つのエピトープは、モノクローナル抗体HR26およびa215によって認識され、第2のエピトープは、モノクローナル抗体K221、a33、a142、a203、a358、a393およびa452によって認識される。
【図８Ａ】ANTIGEN14に対する1セットの抗体を用いて実施例2に開示した実施形態で得られた強度行列を示す表である。図8Aは、抗原存在下で実施した実験の強度行列を示す表である。
【図８Ｂ】図8Bは図8Aの続きである。
【図８Ｃ】ANTIGEN14に対する1セットの抗体を用いて実施例2に開示した実施形態で得られた強度行列を示す表である。図8Cは、抗原なし(対照)で実施した同じ実験の強度行列を示す表である。これらの行列は、データ解析における部分配列ステップ用の入力データ行列に使用される。
【図８Ｄ】図8Dは図8Cの続きである。
【図９Ａ】ANTIGEN14標的に対する抗体の差行列(Difference matrix)を示す表である。差行列は、実施例2に開示した抗原を含む実験から得られる値に対応する行列(図8A及びB参照)から、抗原を含まない実験から得られる値に対応する行列(図8C及びD参照)を差し引いて作成される。
【図９Ｂ】図9Bは図9Aの続きである。
【図１０Ａ】最低しきい値で調整された差行列を示す表である。実施例2の強度の場合、信頼できる最小の信号強度は、200強度単位に設定され、この最低しきい値未満の値はしきい値の200に設定される。
【図１０Ｂ】図10Bは図10Aの続きである。
【図１１Ａ】行が正規化された行列を示す表である。図10の調整された差行列の各行は、それを行の最後の強度で割ることによって調整される。行の最後の強度は、一次抗体の代わりにブロッキング緩衝剤が付加したビーズの強度に相当する。ウェルごとの強度に対して調整される。
【図１１Ｂ】図11Bは図11Aの続きである。
【図１１Ｃ】図11Cは図11Bの続きである。
【図１２Ａ】対角に正規化された行列を示す表である。抗体2.42に対応する列を除くすべての列が列正規化された(column-normalized)。各列をその対応する対角で割って、競合を反映することが知られている強度に対して各強度を測定する。すなわち、それ自体に対する競合である。
【図１２Ｂ】図12Bは図12Aの続きである。
【図１３Ｃ】図12Cは図12Bの続きである。
【図１３Ａ】抗体パターン認識行列を示す表である。実施例2に開示した実施形態から得られるデータに対して、ユーザー定義しきい値未満の強度をゼロに設定した。ユーザー定義しきい値を、対角の強度の2倍に設定した。残りの値を1に設定した。
【図１３Ｂ】図13Bは図13Aの続きである。
【図１４Ａ】相違行列を示す表である。実施例2に開示した実施形態から得られるデータの場合、相違行列は、図13に示す0と1の行列から、i行j列のエントリを2つの行iとjが異なる位置の割合として設定することによって作成される。図14は、ANTIGEN14標的に対して産生される抗体セットについて、任意の2つの抗体パターンの異なる位置が、全22個のうちいくつかあるかを示している。
【図１４Ｂ】図14Bは図14Aの続きである。
【図１５Ａ】平均相違行列を示す表である。別個の相違行列を、対角の値の1.5〜2.5倍であるいくつかのしきい値の各々から作成した後、これらの相違行列の平均を計算し(図15)、クラスター化プロセスへの入力値として使用した。
【図１５Ｂ】図15Bは図15Aの続きである。
【図１５Ｃ】図15Cは図15Bの続きである。
【図１６Ａ】順序を変えた平均相違行列を示す表である。実施例2に開示した実施形態から得られるデータの場合、クラスターを行列化することができる。図16では、相違行列の行と列を、図5に示した樹状図の「葉」または分岐群の順に再配列させ、相違度に応じて個々のセルを視覚的に符号化した。
【図１６Ｂ】図16Bは図16Aの続きである。
【図１６Ｃ】図16Cは図16Bの続きである。
【図１７Ａ】順序を変えた正規化強度行列を示す表である。実施例2に開示した実施形態から得られるデータの場合、正規化強度行列の行と列を、図5に示す樹状図の葉の順序に応じて再配列させ、正規化強度に応じて個々のセルを視覚的に符号化した。
【図１７Ｂ】図17Bは図17Aの続きである。
【図１７Ｃ】図17Cは図17Bの続きである。
【図１８Ａ】5つのANTIGEN39入力データセットに対する、順序を変えた平均相違行列を示す表である。ANTIGEN39標的に対する抗体を用いて実施した5つの実験のデータ(実施例3参照)から5つの入力データセットを得た。各入力データセットに対する相違行列を作成し、平均相違行列を作成し、図6に示す対応する樹状図の配列に応じて行および列を並べた(順序を変えた)。
【図１８Ｂ】図18Bは図18Aの続きである。
【図１８Ｃ】図18Cは図18Bの続きである。
【図１８Ｄ】図18Dは図18Cの続きである。
【図１８Ｅ】図18Eは図18Dの続きである。
【図１８Ｆ】図18Fは図18Eの続きである。
【図１８Ｇ】図18Gは図18Fの続きである。
【図１８Ｈ】図18Hは図18Gの続きである。
【図１８Ｉ】図18Iは図18Hの続きである。
【図１８Ｊ】図18Jは図18Iの続きである。
【図１９Ａ】5つのANTIGEN39入力データセットに対する、順序を変えた正規化強度行列を示す表である。ANTIGEN39標的に対する抗体を用いて実施した5つの実験のデータ(実施例3参照)から5つの入力データセットを得た。この5つの入力データセットに対する正規化強度行列を作成し、図6に示す対応する樹状図の配列に応じて行および列を並べた(順序を変えた)。
【図１９Ｂ】図19Bは図19Aの続きである。
【図１９Ｃ】図19Cは図19Bの続きである。
【図１９Ｄ】図19Dは図19Cの続きである。
【図１９Ｅ】図19Eは図19Dの続きである。
【図１９Ｆ】図19Fは図19Eの続きである。
【図１９Ｇ】図19Gは図19Fの続きである。
【図１９Ｈ】図19Hは図19Gの続きである。
【図１９Ｉ】図19Iは図19Hの続きである。
【図１９Ｊ】図19Jは図19Iの続きである。
【図２０Ａ】ANTIGEN39標的に対する1セットの抗体を用いた実験1の順序を変えた平均相違行列を示す表である。実験1(実施例3)で分析した抗体セットのデータを分析した。図6Bに示す樹状図を参照されたい。
【図２０Ｂ】図20Bは図20Aの続きである。
【図２１Ａ】ANTIGEN39標的に対する1セットの抗体を用いた実験1の順序を変えた正規化強度行列を示す表である。実験1(実施例3)で分析した抗体セットのデータを分析した。図6Bに示す樹状図を参照されたい。
【図２１Ｂ】図21Bは図21Aの続きである。
【図２２】ANTIGEN39標的に対する1セットの抗体を用いた実験2の順序を変えた平均相違行列を示す表である。実験2(実施例3)で分析した抗体セットのデータを分析した。図6Cに示す樹状図を参照されたい。
【図２３】ANTIGEN39標的に対する1セットの抗体を用いた実験2の順序を変えた正規化強度行列を示す表である。実験2(実施例3)で分析した抗体セットのデータを分析した。図6Cに示す樹状図を参照されたい。
【図２４Ａ】ANTIGEN39標的に対する1セットの抗体を用いた実験3の順序を変えた平均相違行列を示す表である。実験3(実施例3)で分析した抗体セットのデータを分析した。図6Dに示す樹状図を参照されたい。
【図２４Ｂ】図24Bは図24Aの続きである。
【図２５Ａ】ANTIGEN39標的に対する1セットの抗体を用いた実験3の順序を変えた正規化強度行列を示す表である。実験3(実施例3)で分析した抗体セットのデータを分析した。図6Dに示す樹状図を参照されたい。
【図２５Ｂ】図25Bは図25Aの続きである。
【図２６Ａ】ANTIGEN39標的に対する1セットの抗体を用いた実験4の順序を変えた平均相違行列を示す表である。実験4(実施例3)で分析した抗体セットのデータを分析した。図6Eに示す樹状図を参照されたい。
【図２６Ｂ】図26Bは図26Aの続きである。
【図２７Ａ】ANTIGEN39標的に対する1セットの抗体を用いた実験4の順序を変えた正規化強度行列を示す表である。実験4(実施例3)で分析した抗体セットのデータを分析した。図6Eに示す樹状図を参照されたい。
【図２７Ｂ】図27Bは図27Aの続きである。
【図２８Ａ】ANTIGEN39標的に対する1セットの抗体を用いた実験5の順序を変えた平均相違行列を示す表である。実験5(実施例3)で分析した抗体セットのデータを分析した。図6Fに示す樹状図を参照されたい。
【図２８Ｂ】図28Bは図28Aの続きである。
【図２８Ｃ】図28Cは図28Bの続きである。
【図２９Ａ】ANTIGEN39標的に対する1セットの抗体を用いた実験5の順序を変えた正規化強度行列を示す表である。実験5(実施例3)で分析した抗体セットのデータを分析した。図6Fに示す樹状図を参照されたい。
【図２９Ｂ】図29Bは図29Aの続きである。
【図２９Ｃ】図29Cは図29Bの続きである。
【図３０】ANTIGEN39標的に対する抗体セットを用いた実験1〜5で同定されたクラスターを示す表である。図30は、5つの個々のデータセットの各々に対して同定されたクラスター、および実施例3に開示する5つの実験すべてで産生されるすべての抗体の混合データセットに対して同定されるクラスターを要約したものである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2006322940.tif 000026
【図６Ｂ】
2006322940.tif 000027
【図６Ｃ】
2006322940.tif 000028
【図６Ｄ】
2006322940.tif 000029
【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
2006322940.tif 000031
【図７Ａ】
2006322940.tif 000032
【図７Ｂ】
2006322940.tif 000033
【図７Ｃ】
2006322940.tif 000034
【図８Ａ】
2006322940.tif 000035
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
2006322940.tif 000041
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１８Ｉ】
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【図１８Ｊ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図１９Ｈ】
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【図１９Ｉ】
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【図１９Ｊ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０】
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【図３】
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