(57)【要約】      （修正有）【課題】  哺乳動物の体に移植したとき、移植部位において血管形成、無機質化、および骨の骨髄分化を含む軟骨性骨形成の完全な発生のカスケードを誘導することができる、骨形成の蛋白質および骨形成具を提供すること。【解決手段】  活性な骨形成蛋白質を生産する方法であって、該骨形成蛋白質が、酸化状態で結合している一対のポリペプチド鎖を含み、該一対のポリペプチド鎖は軟骨性骨形成を誘導し得る構造のダイマー種を形成し、該一対のポリペプチド鎖の少なくとも一方は、１１４またはそれ以上のアミノ酸を有する特定なポリペプチドを含む、方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレプロ−またはプロ−ＯＰ１をコードする単離されたＤＮＡ配列であって、配列番号１の核酸残基１〜１８２２に対応するヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は「骨形成具」という名称の米国特許出願第４２２，６９９号（１９８９年１０月１７日出願）および「移植のための骨コラーゲンマトリックス」という名称の米国特許出願第４８３，９１３号（１９９０年２月２２日出願）の一部継続出願である。
【０００２】
本発明は骨形成具、哺乳動物において新しい骨の形成を誘導することができる蛋白質をコードする遺伝子、および組み換えＤＮＡ技術を用いた哺乳動物におけるこれらの蛋白質の生産のための方法に関する。本発明はまた、同種移植あるいは異種の移植に有用なマトリックス物質および新しい骨の形成を誘導する骨形成蛋白質のキャリアーとして働くマトリックス物質、および骨形成具を使用する骨および軟骨の修復方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
哺乳動物の骨組織はおそらく成長および本来の骨の治療の間活性があり、軟骨性骨の形成を引き起こす細胞の出来事の発生のカスケードを誘発しうる、ひとつあるいは幾つかの蛋白様物質を含むことが知られている。この活性因子は文献の中で骨形態形成あるいは形態発生蛋白質、骨誘導蛋白質（ｂｏｎｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、骨形成蛋白質、オステオジェニン、あるいは骨誘導蛋白質（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とさまざまに呼ばれている。
【０００４】
骨分化の発生のカスケードは間葉細胞の漸増、始原細胞の増殖、軟骨のカルシウム沈着、血管の侵入、骨の形成、改造、および骨髄分化からなる（Ｒｅｄｄｉ  （１９８１）  Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｒｅｌ．  Ｒｅｓ．  １：２０９−２２６）。
【０００５】
これらの表現型形質転換の基礎となる詳細な機構は明らかでないが、本来の骨マトリックスの軟骨性骨への分化の活性が分離的に抽出され、そして不活性な残存コラーゲン様マトリックスとともに再構成されて十分な骨の誘導活性を回復させる（Ｓａｍｐａｔｈ  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｉ  （１９８１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ７８：７５９９−７６０３）。これはｉｎ ｖｉｖｏにおいて蛋白質抽出物の軟骨性骨を誘導する活性を分析する実験方法を提供する。哺乳動物の幾つかの種は種間の移植実験により証明されているような密接に関連した蛋白質を生産する（Ｓａｍｐａｔｈ  ａｎｄ  Ｒｅｄｄ  ｉ  （１９８１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８０：６５９１−６５９５）。
【０００６】
これらの蛋白質の潜在的な利用性は広く理解されてきた。その蛋白質の有用性は整形法の薬、ある種の形成外科、および歯根膜および脳顔面頭蓋の再生方法に大変革をもたらすと予期されている。
【０００７】
これらの蛋白質画分の観察された特性は、骨形成に必須な純粋の因子を単離し同定するために幾つかの研究室における精力的検索の努力を誘発してきた。哺乳動物の骨からの骨形成蛋白質の精製技術の現在の状況はサンパス（Ｓａｍｐａｔｈ）ら（１９８７）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８０により開示された。ウリスト（Ｕｒｉｓｔ）ら（１９８４）Ｐｒｏｃ．  Ｓｏｃ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  １７３：１９４−１９９は、塩化カルシウム−尿素無機−有機溶液混合物により脱イオン化された皮質性の骨から抽出され、そして塩酸グアニジンでの分別沈澱および調製用ゲル電気泳動により回収されたヒト骨形成蛋白質画分を開示している。著者はその蛋白質画分が酸性ポリペプチドからなるアミノ酸組成および１７−１８ｋＤの範囲の分子量をもつことを報告している。
【０００８】
ウリスト（Ｕｒｉｓｔ）ら（１９８４）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８１：３７１−３７５は酸性ポリペプチドで約１８ｋＤの分子量という特性をもつウシの骨形態形成蛋白質抽出物を開示している。著者はその蛋白質がヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより分離された画分に存在し、マウス後部筋肉における骨の形成およびラットおよびイヌの頭蓋中の管錘欠損における骨の再生を誘導することを報告した。骨からの抽出物を得るこれらの方法は十分に限定されない不純な調製物を与える。
【０００９】
ヨーロッパ特許出願第１４８，１５５号（１９８５年１０月７日公開）はウシ、ブタおよびヒトの系統に由来する骨形成蛋白質を開示することを目的としている。発明者によりＰ３蛋白質と命名された２２−２４ｋＤの分子量の蛋白質のうちの一つが本質的に均質な状態に精製された事が示されている。この物質は哺乳動物に移植されたとき、骨の形成を誘導すると報告されている。
【００１０】
ＰＣＴ出願第８７／０１５３７号（１９８８年１月１４日公開）（国際公開第ＷＯ８８／００２０５）は骨の誘発の性質をもつウシの骨からの不純な画分を開示している。その出願人は組み換えＤＮＡ技術により生産された仮想上の「骨誘発因子」もまた開示している。４つのＤＮＡ配列がヒトおよびウシのゲノミックあるいはｃＤＮＡライブラリーから回収されそして組換え体宿主細胞内において発現された。出願人は、発現された蛋白質が骨形態発生蛋白質であろうと陳述しているが、骨の誘発は証明されておらず、組換え体蛋白質が骨形成蛋白質でないことを示唆している。同じグループが引き続いて（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４２：１５２８，  Ｄｅｃ．  １９８８）４つの因子のうちの３つが軟骨の形成を誘導し、そして骨の形成活性が「制御分子の混合物による」ことおよび「骨の形成はこれらの分子との相互関係により制御されている可能性が強い」と仮定すると報告している。再び、骨の誘導はｃＤＮＡの発現の生産物によるものでなくなった。骨形態発生剤という名称のウリスト（Ｕｒｉｓｔ）らのヨーロッパ特許出願第２１２，４７４号もまた参照せよ。
【００１１】
ワング（Ｗａｎｇ）ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８５：９４８４−９４８８は軟骨および骨の形成活性をもつ脱イオン化された骨のグアニジン抽出物からウシの骨形態形成蛋白質を、ゲル抽出により決定された３０ｋＤの分子量に等しい塩基性蛋白質として精製したことを開示している。その蛋白質の精製は分離されると不活性な３０，１８，および１６ｋＤの蛋白質を生じた。この結果から見て、著者は活性のある物質の厳密な同定はまだ決定されていない事を認めている。
【００１２】
ワング（Ｗａｎｇ）ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８７：２２２０−２２２７はＰＣＴ出願第８７／０１５３７号に記述されているｃＤＮＡ配列のうちの一つの発現および部分精製を記述している。これらの蛋白質を用いる場合の確実な軟骨および／または骨の形成は最小限６００ｎｇの５０％純粋な材料を必要とする。
【００１３】
ＰＣＴ出願第８９／０４４５８号（１９９０年４月１９日公関）（国際公開第ＷＯ９０／００３７３３号）はＰ３０Ｆ  ３１−３４と呼ばれる骨形成因子ファミリーの精製および分析を記述している。その蛋白質ファミリーはペプチド断片の配列により特徴づけられた少なくとも４つの蛋白質を含む。不純な混合物Ｐ３  ＯＦ  ３１−３４の骨形成活性も分析された。しかしながら個別の蛋白質の活性は評価も議論もされなかった。
【００１４】
骨形成の因子の移植の成功には使用されるｉｎ ｖｉｖｏの領域において蛋白質を維持することができる有用なキャリアー材料と蛋白質との結合を必要とする。キャリアーは生
物的に適合性があり、生物的に分解されそして細胞浸潤に十分な多孔性であることが望まれる。粉末化された骨のグアニジン抽出および脱脂後に残る不溶性のコラーゲン粒子は幾つかの種の異質遺伝子型の移植において通常は効果的であった。しかしながら、骨誘導蛋白質（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は種を通じて有効であるが、通常軟骨性骨形成を誘導するのに使用されるコラーゲン様骨マトリックスは種特異的であることが研究により示された（Ｓａｍｐａｔｈ  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｉ  （１９８３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８０：６５９１−６５９４）。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて移植された脱イオン化され、脱脂され、抽出された外因牲の骨マトリックスキャリアーは、おそらく骨マトリックス中における阻害性あるいは免疫原性成分のために骨形成を誘導することができない。多くの種においては、骨形成用具において同種の骨マトリックスを使用しても骨誘導の骨形成（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）には不十分であろう。例えば、脱イオン化され、脱脂されたサルの骨のマトリックスの皮下へ同種の移植物はサルにおいて骨の形成を誘導しないと報告されている。（Ａｓｐｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．  （Ｂｒ）  ７０−Ｂ：６２５−６２７）。
【００１５】
米国特許出願第４，５６３，３５０号（１９８６年１月７日発行）は、トリプシン処理されたウシの骨のマトリックスが、抽出され、部分精製された骨−誘導蛋白質の調製物を用いた移植のときに骨形成活性に影響する異種のマトリックスとして使用されることを開示している。骨の形成は少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％の非繊維状コラーゲンの存在を必要とすることが示されている。著者らは、コラーゲンの調製物の免疫原性に一部関係するテロペプチドの除去が異種性の移植において、より有効であると主張している。
【００１６】
ヨーロッパ特許出願第３０９，２４１号（１９８９年３月２９日公開）は、骨形成蛋白質調製物、および無機成分あるいは骨コラーゲン粉末６０−９８％からなるマトリックスキャリアーおよび２−４０％のアテロペプチド低免疫原性コラーゲンからなる軟骨性骨の形成の誘導具を開示している。
【００１７】
デセラージ（Ｄｅｔｈｅｒａｇｅ）ら（１９８７）Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｒｅｌ．  Ｒｅｓ． ７：２２２５−２２３１は、一回のイオン交換カラムにより最小限に精製されたウシの骨のマトリックス抽出物および再構成され、高度に精製されたヒトＴｙｐｅ−Ｉ胎盤コラーゲンからなる明白な外因性移植具を開示すると主張している。
【００１８】
米国特許出願第３，３９４，３７０号（１９８３年７月１９日発行）は、異種性の移植において有用であると紹介されている再構成されたコラーゲンのマトリックスを記述している。コラーゲン繊維は免疫原性をもつ可能性があるテロペプチド（繊維内部の交差結合の主な原因でもある）を除去するために酵素により処理されそして付随している非コラーゲン組成物を除去するために溶解された。再構成されたコラーゲンを酢酸中で分散させることにより基本コラーゲン分子の無秩序なマトリックスを形成し、これを次に骨形成因子と混合し、そして凍結乾燥して、好ましくは交差結合している「半硬性のフォームあるいはスポンジ」を形成することによりマトリックスを組み立てた。組み立てられたマトリックスはｉｎ ｖｉｖｏにおいて試験されない。
【００１９】
米国特許出願第４，１７２，１２８号（１９７９年１０月２３日発行）は、骨様材料を分解しそして低い免疫原性をもつように再生する方法を記述し、その方法が種を越えて有用であるとしている。脱イオン化された骨の粒子は付随している全てのムコ多糖（グリコサミノグリカン）を溶解するために膨張剤で処理され、そして引き続いてコラーゲン繊維を均質なコロイド溶液を形成するために溶解される。次に、生理学的に活性のないムコ多糖および繊維形成の促進のための電解質を使用して再構成された繊維のゲルを形成するこ
とができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、組換え体ＤＮＡから生産され、そして同種および異種性の移植において骨を誘導することができる、分散された骨形成蛋白質を含むマトリックスからなる骨形成具を提供することである。もう一つの目的は、哺乳動物細胞から発現され、そして軟骨性骨の形成を誘導することができる、組換え体骨形成蛋白質を提供することである。さらにもう一つの目的は、骨形成蛋白質をコードする遺伝子および組み換えＤＮＡ技術を使用したそれらの生産方法を提供することである。なおさらにもう一つの目的は、骨誘導蛋白質（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と組み合わせて、軟骨性骨の形成をすることができる、生物的に適合性があり、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生物的に分解されうるマトリックスを提供することである。
【００２１】
本発明の、これらのおよび他の目的および特徴は以下の説明、図面、および請求の範囲から明らかにされる。
【００２２】
本発明は、哺乳動物の体に移植したとき、移植部位において血管形成、無機質化、および骨の骨髄分化を含む軟骨性骨形成の完全な発生のカスケードを誘導することができる、骨形成の蛋白質および骨形成具を提供する。この骨形成具は、ここではマトリックスと呼ばれ、以下に開示された特徴をもち、そして組み換えＤＮＡ技術を使用して生産されそして真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞から発現された骨形成蛋白質を分散して含んだキャリアー材料からなる。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
ここに開示されたマトリックス中に分散した組換え体蛋白質の好ましい態様は、天然の材料から抽出されそして同種の脱イオン化された骨粉のマトリックス材料中で再構成された天然の形の蛋白質の生理学的な活性と密接に類似している。好ましい蛋白質は、従来報告された生合成されたどのような材料よりもはるかに高い比活性を有し、すなわち活性分析法の精度の限度内において米国特許出願第１７９，４０６号（１９８８年４月８日発行）（ＰＣＴ  ＵＳ／８９  ０１４５３）において述べられたようにして生産された実質的に純粋な材料と本質的に同一と認められる活性をもつ。したがって、本出願は天然の骨の治療において起こるのと本質的に同様な軟骨性骨の完全な発生のカスケードを誘導する骨形成具の製造方法および使用方法を開示する。
【００２４】
これらの開発の鍵は、アミノ酸配列の推定および天然の骨形成蛋白質の構造データである。一つのプロトコルを作成し、それにしたがって、骨形成活性の半最大活性値が移植片１ｍｇあたり約０．８から１．０ｎｇの哺乳動物の骨からの実質的に純粋な骨形成蛋白質を回収した。その材料を入手できたことにより、本発明者らは骨形成を達成するために必要な蛋白質の詳細な全構造を推定することができた。蛋白質のアミノ酸配列および他の構造的な特徴の知識により天然の遺伝子を同定およびクローニングすることができた。
【００２５】
部分的な配列データおよび引例において開示された制御蛋白質との間の観察された相同性に基づいたコンセンサスＤＮＡ配列をゲノミックおよびｃＤＮＡライブラリーから骨形成蛋白質をコードする遺伝子を抽出するためのプローブとして使用した。コンセンサス配列のプローブの内の一つが、これまでに未同定のＤＮＡ配列を単離した；その一部分を連結したときコードするタンパク質は、正確に修飾され、適切なマトリックスに取り込まれそしてここに開示されたように移植されるときに、軟骨性骨の形成を誘導することができる領域を有していた。ここでＯＰ１と呼ばれている蛋白質並びにさまざまに欠失させた型および融合物を完全長のｃＤＮＡ配列およびさまざまに欠失させた合成ＤＮＡから大腸菌
およびさまざまな哺乳動物において発現させ、そしてホモダイマーとしてあるいはＢＭＰ２、すなわちコンセンサス配列のプローブによるヒトＤＮＡライブラリーから抽出された他の骨形成蛋白質とのヘテロダイマーとして骨形成活性を示すことを見い出した。
【００２６】
ＯＰ１遺伝子の特徴決定および活性に必要なＤＮＡおよびアミノ酸配列の同定により哺乳動物細胞においてその遺伝子を発現させることができた。哺乳動物の蛋白質の哺乳動物細胞における発現、特に治療のための使用を意図とした組換え体蛋白質の発現は通常天然の材料構造によく似た構造をもった蛋白質を生じると考えられている。このことは、原核細胞生物系において行われることがないグリコシル化のような特定の後翻訳修飾を必要とする分泌蛋白質においては特に真実である。大腸菌内におけるＯＰ１遺伝子の発現により、グリコシル化されていない型の蛋白質は骨形成活性をもつことが示されたが、例えば、蛋白質の安定性、溶解性、あるいは免疫原性に関連したまだ決定されていないオリゴサッカロイドの機能のような他のものがあるかも知れない。さらに、培養液中に分泌された蛋白質の精製は、原核生物細胞の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｉｅｓ）から誘導された蛋白質を抽出する方法に代替する方法を提供する。
【００２７】
遺伝子の哺乳動物細胞における発現は、成熟蛋白質のＮ末端の決定もまた可能にした。ＯＰ１の成熟型であると信じられるもののアミノ酸配列は次のとおりである（Ｓｅｑ．  ＩＤ  Ｎｏ．１）：
【００２８】
【数１】
2006068018.tif 000002
【００２９】
組み替えにより生産されたＯＰ１は蛋白質のＮ末端を欠失させた幾つかの型においても活性をもっている。欠失させたＯＰ１の内の主要な一種は次のものである（Ｓｅｑ．  ＩＤ  Ｎｏ．２）：
【００３０】
【数２】
2006068018.tif 000003
【００３１】
４つの他の活性のある短いＯＰ１配列は：
【００３２】
【数３】
2006068018.tif 000004
【００３３】
【数４】
2006068018.tif 000005
【００３４】
【数５】
2006068018.tif 000006
【００３５】
【数６】
2006068018.tif 000007
【００３６】
これらの６種のＯＰ１のｉｎ ｖｉｖｏにおける骨形成活性を調べそしてすべてが可溶性マトリックスと一緒に哺乳動物において移植したときに薬剤量に依存した様式で軟骨性骨形成を誘導することが示された。これらの種の比活性は実質的に純粋な、天然物を源とする骨形成蛋白質の比活性に近い。さらに、これらの蛋白質は従来報告された他の骨形成蛋白質調製物よりも天然物を源とする材料の活性とより密接に似ている。
【００３７】
組換え体により生産されたＯＰ１は哺乳動物内においてグリコシル化されたホモダイマーとして発現される。ＯＰ１−１８のホモダイマーはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定すると、酸化された時には約３６ｋＤ、還元された時には約１８ｋＤの見かけ分子量である。ＯＰ１−１６Ｓ，ＯＰ１−１６Ｖ，ＯＰ１−１６Ｍ，ＯＰ１−１６ＡおよびＯＰ１−１６ＬはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定すると還元された時には約１６ｋＤであり、そしてこれらの蛋白質のホモダイマー並びにＯＰ１−１８とのヘテロダイマーは酸化された時に約３０−３６ｋＤの範囲内の見かけ分子量である。還元された状態においては、これらの蛋白質は検出できるような骨の形成活性を示さない。
【００３８】
ＯＰ１は今日迄に多くのさまざまな哺乳動物において発現され、それらすべての細胞は翻訳後に蛋白質をグリコシル化しそしてプロセスする。オリゴサッカロイドの側鎖の詳細な構造はセルラインの種類により異なるであろうが、すべての場合において発現された配列は特異的なそして薬剤依存性の様式において骨形成の活性をもつ。
【００３９】
本発明はそれらの特異的な構成物に限定されない。したがって、本発明の骨形成蛋白質は宿主の真核生物細胞において組換え体ＤＮＡの発現により生産されたさまざまなグリコシル化のパターン、Ｎ末端の変化、アミノ酸相同性領域をもった関連する蛋白質のファミリー、および天然のアミノ酸配列を欠失させたり変異を起こさせたものを含む。本発明の骨形成具において有用な活性配列は、ＯＰ１−１６Ｖとの間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、の配列相同性をもった骨形成蛋白質を含む。これは長い型の蛋白質や対立遺伝子の変異物および変異蛋白質をも含む。
【００４０】
したがって、本開示からみて、遺伝子工学の当業者は適切なアミノ酸をコードするｃＤＮＡあるいはゲノミックライブラリーから遺伝子を単離、あるいはオリゴヌクレオチドからＤＮＡをつくることができる。そして骨の形成を誘導することができる活性型蛋白質を大量に生産するために、さまざまなタイプの宿主真核生物細胞においてそれらを発現することができる。
【００４１】
骨形成蛋白質は適切な送達剤あるいは支持系（マトリックス）とともに、臨床の応用において有用である。マトリックスは、生物的に適応でき、蛋白質を抽出され、無機塩類を含まず、脱脂された不溶性のＴｙｐｅ−Ｉ骨コラーゲン粒子からなり、これは宿主にとって同種あるいは異種であり得る。粒子は好ましくは、粒子の形態を変えるために、すなわち粒子内部の多孔性および粒子の表面の領域を増加させるために、お湯あるいは他の繊維修飾溶剤のような繊維修飾剤で処理される。粒子は共にマトリックスを形成させるために詰め込まれる。粒子間の空間は先祖細胞の移動そして引き続く細胞の分化および増殖のための範囲でなければならない。粒子の大きさは７０−８５０μｍ、好ましくは１５０μｍ−４２０μｍの範囲内がよい。マトリックスは骨の欠損にまたがる形に粒子をぴったりと詰め込むことにより、あるいは粒子を望まれる形に他の方法で詰め込んでかたちづくることにより作り上げる。マトリックスはｉｎ ｖｉｖｏにおいて生物的に適応し（炎症性のない）、そして生物的に分解され得る、そして「一時的骨格」および移動性の先祖細胞を呼び集める土台として、およびそれらの引き続く固着および増殖のための基礎として用いられる。ここに開示されたように、マトリックスは哺乳動物体内において確実にそして再現性よく軟骨性骨の形成を誘導する骨形成蛋白質と組み合わせることができる。
【００４２】
このマトリックスの材料の開発は異種性の骨のマトリックスおよび骨形成蛋白質の移植の成功のために必要な鍵となる特徴の発見の結果として開発された。実質的に純粋な骨形成蛋白質および同種の脱イオン化され、脱脂された蛋白質−抽出骨マトリックスからなる骨形成具は、移動する先祖細胞の流入、増殖および分化のための寸法の間隙をもつ必要があるということを研究が示唆した。異種性の骨マトリックスからなる骨形成具がｉｎ ｖｉｖｏにおいてほとんどあるいは全く軟骨性骨形成を誘導しないということもまた観察された。異種性のマトリックスによる骨の形成がないことは、一般的にマトリックス中にまだ存在している成分（例えば、コラーゲンテロペプチドあるいは付随する非コラーゲン性糖蛋白質）に対する免疫原性あるいは阻害的な応答によると考えられてきた。
【００４３】
粒子の総合的比表面積（表面領域／単位物質量）、多孔性および微小なくぼみの程度、およびマトリックス粒子のくぼみおよび穴の大きさが異種性移植、および特定の種においては同種移植にさえも重要であることが今日発見されている。
【００４４】
図１のパネルＡおよびＢはそれぞれラットおよび子ウシからの脱イオン化され、グアニジン抽出された骨マトリックスの粒子構造を示す走査電子顕微鏡写真である。これらの写真から観察され得るように、子ウシの骨マトリックスにおいてよりもラットの骨マトリックスにおいて顕著なより大きい生来の多孔性、あるいは表面積がある。骨マトリックスの多孔性および粒子内部の表面の領域を増加させることは、ラットのコラーゲン性骨マトリ
ックスの移植により明らかにされたように、骨形成の誘導を促進することができる。このことは、その形態を変えるために一定の溶剤又は加熱によりコラーゲン性骨マトリックスを処理することにより達成される。この目的に適する薬剤はここで開示されそしてコラーゲン繊維−修飾剤と呼ばれる。
【００４５】
したがって、本発明の一つの局面は表面積およびマトリックスのコラーゲン粒子の多孔性を実質的に増加させるために処理されたマトリックスからなる骨形成具を含む。
【００４６】
本発明の骨形成具において有用な、現時点で好ましい繊維−修飾剤は熱せられた水性溶媒で、最も好ましくは水である。脱イオン化され脱脂されグアニジン抽出された骨のコラーゲンを水中で高温にて（３７°−６５°、好ましくは４５°−６０℃）約１時間熱することは、望まれた表面の形態を得るのに通常は十分である。機構は明らかでないが、熱処理はコラーゲン繊維を変化させ、その結果粒子の表面積を増加させると仮定される。したがって、骨のマトリックスは水中（１ｇ／３０ｍｌ）で撹拌しながらさまざまに高めた温度で処理し、そして濾過することができる。水中で温度を上昇させることにより不溶性のコラーゲンを処理することにより、らせん構造から非らせん構造への完全な遷移の１／４から３／４に達するのに必要な温度である溶解遷移（Ｔｍ）に最初に到達する。その後繊維は収縮温度（Ｔｓ）と呼ばれるいくらか高い温度において突然に何分の一かに収縮する。Ｔｓは通常より高く、分子の詰め込みにより更に安定性が高まることを反映する。約５以下のｐＨにおいては、熱せられたコラーゲンのＴｍおよびＴｓの両値は減少する。
【００４７】
溶剤で処理された骨のコラーゲン性マトリックスの実験は、脱イオン化されグアニジン−抽出された異種性の子ウシの骨はさらに別の物質の混合物も含むことを示し、そしてこれらの物質を抽出するとマトリックスの特性を改良できることを示している。抽出物中の成分をクロマトグラフィーにより分離し、続いてクロマトグラフィーのピークに対応するさまざまな抽出画分を活性マトリックスに加え戻すことにより、骨形成の誘導効果（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｎｅ  ｅｆｆｅｃｔ）を阻害できる活性があることが示唆された。この阻害画分内の物質の正体はまだ決定されていない。本発明の一つの局面において、上述されたタイプのＴｙｐｅ−Ｉ骨コラーゲン粒子からなりさらに該コラーゲン粒子が阻害作用を示す成分を除去されている点において特徴づけられるマトリックスが提供される。
【００４８】
本明細書の開示から見て、当業者は骨形成具を確立するのに有用な、そして例えば骨の誘導を促進するためのパッキンとして、あるいは生物的に分解される徐放性の耐えられる放出移植片として他の移植可能な材料として有用な望まれた多孔性および表面の微小構造をもつ、生物的に適応できる特別上質のマトリックスを創ることができる。
【００４９】
ここに開示された骨形成蛋白質および移植可能な骨形成具により、医師は例えば、後天性および先天性の脳顔面頭蓋のおよび他の骨格あるいは歯の奇形を矯正するために最善の予測できる骨の形成をすることができる（Ｇｌｏｗａｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ｌａｎｃｅｔ １：９５９−９６３）。この骨形成具は動物実験において証明されたような癒着不良骨折において、および骨の形成が必要な歯周の適用を含む他の治療の適用において、局部の軟骨性骨の形成を誘導するのに使用される。他の潜在的な治療の適用は例えば、骨関節炎の処理における軟骨の修復においてである。
【発明の効果】
【００５０】
本発明により、哺乳動物の体に移植したとき、移植部位において血管形成、無機質化、および骨の骨髄分化を含む軟骨性骨形成の完全な発生のカスケードを誘導することができる、骨形成の蛋白質および骨形成具が提供される。この骨形成具は、ここではマトリックスと呼ばれ、以下に開示された特徴をもち、そして組み換えＤＮＡ技術を使用して生産されそして真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞から発現された骨形成蛋白質を分散して
含んだキャリアー材料からなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
哺乳動物の骨からの蛋白質の粗抽出物に存在する骨形成の蛋白質の単離を可能にした精製のプロトコルが最初に開発された。（ＰＣＴ第ＵＳ８９／０１４５３号、および米国特許出願第１７９，４０６号（１９８８年４月８日出願）を参照）。新鮮な子ウシの骨を入手できたことと、上記方法が開発されたことにより、実質的に純粋なウシの骨形成蛋白質（ＢＯＰ）を単離できた。ＢＯＰは有意に同定された；ネコ、うさぎ、およびラットにおける軟骨および最後の軟骨性骨を誘導するその能力は証明され、そして研究された；従来は不均質な骨の抽出物内の未知の蛋白質によると見なされていた骨の形成の発生カスケードを誘導することが可能であることが示された。この薬剤量依存性および高い特異活性は、蛋白質がグリコシル化されていてもいなくても存在した（米国特許出願第２３２，６３０号（１９８８年８月１５日出願）およびＳａｍｐａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ． ２６５：ｐｐ．  １３１９８−１３２０５を参照せよ）。ウシの材料から得られた配列データはプローブの構想を与え、ヒトの遺伝子を単離するために使用された。ヒトのＯＰに相当する蛋白質は今日発現されそして十分に同定されている。
【００５２】
ホモダイマーとして個々にそしてヘテロダイマーとして別の種と結合した全体的に新規な、非天然蛋白質構成物をコードするＤＮＡを調製することを可能にしたこれらの発見は、真の軟骨性骨を生産することが可能である（ＰＣＴ出願第８９／０１４６９号（１９８９年４月７日出願）および米国特許出願第３１５，３４２号（１９８９年２月２３日出願）を参照せよ）。それらは、ここに開示された技術を使用してそして自動化され市販されている装置を使用することにより生産された合成ＤＮＡからあるいは天然源から回収されたｃＤＮＡおよびゲノミックＤＮＡから、天然の材料、欠失させた型、変異蛋白質、アナログ、融合蛋白質、そしてさまざまな他の由来物および構成物を発現させることもまた可能にした。ＤＮＡは原核生物細胞および真核生物生物細胞においてよく確立された分子生物学および組み替えＤＮＡ技術を使用して発現され、そして必要ならば、生物学的に活性のある蛋白質を生産するためにｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて酸化されそして再びおりたたまれる。
【００５３】
ゲノミックおよびｃＤＮＡライブラリーから単離されたＤＮＡ配列のうちの一つはここでＯＰ１と呼ばれる、これまで未同定の遺伝子をコードしていた。単離されたＤＮＡによりコードされている蛋白質はＴＧＦ−βファミリー内の蛋白質とのアミノ酸相同性から最初に同定された。コンセンサスなスプライスシグナルはエクソンとイントロンの境界と呼ばれているアミノ酸相同性が終わるところで見いだされた。７つのシステインを含む機能的なＴＧＦ−β様ドメインを得るために、３つのエクソンを結合させた。（例えば、米国特許出願第３１５，３４２号（１９８０年２月２３日出願）、あるいはＯｚｋａｙｎａｋ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）  ＥＭＢＯ．  Ｊ．  ９：ｐｐ．  ２０８５−２０９３）。
【００５４】
ＯＰ１の完全長のｃＤＮＡ配列はそれがコードするアミノ酸配列を含めて図２に示されている。ＯＰ１の完全長のｃＤＮＡ配列、さらにこの遺伝子をさまざまに欠失させた型、および融合させた遺伝子を大腸菌において発現させ、そしてマトリックスと結合させて哺乳動物において移植したときに骨の形成活性をもつことが示された。
【００５５】
天然の型の蛋白質は蛋白質の適切な分泌のためのシグナルペプチド配列を含む「プレプロ」型として最初に発現される。シグナルペプチドが切断される部位は図２において下線が引かれている。シグナルペプチドの除去により蛋白質の「プロ」型を生じ、これが分泌時にプロセスされて成熟蛋白質を生じる。成熟配列を生じる切断部位は図２において矢印
で示されている。成熟型であると信じられているアミノ酸配列は次のとおりである（Ｓｅｑ．  ＩＤ  Ｎｏ．１）：
【００５６】
【数７】
2006068018.tif 000008
【００５７】
正しくダイマーにされ、おりたたまれ、マトリックスに吸収され、そして移植された時に、プロ型およびプレプロ型の両者は骨形成活性を示すが、これはおそらく分割および成熟型の蛋白質あるいは活性のある欠失されたアナログ蛋白質を生じるような分解酵素による分解のためである。
【００５８】
活性型のＯＰ１はまた蛋白質のＮ末端部分がない、欠失された型で精製されうる。ＯＰ１の活性をもつ欠失された型の一つは次のものである（Ｓｅｑ．  ＩＤ  Ｎｏ．２）：
【００５９】
【数８】
2006068018.tif 000009
【００６０】
ＯＰ１の活性のある欠失された型の他の４つは次のものである：
【００６１】
【数９】
2006068018.tif 000010
【００６２】
【数１０】
2006068018.tif 000011
【００６３】
【数１１】
2006068018.tif 000012
【００６４】
【数１２】
2006068018.tif 000013
【００６５】
前述のアミノ酸およびＤＮＡ配列の情報により、さまざまなＤＮＡが融合蛋白質、成熟蛋白質の他の欠失型、および類似の構成物に加えて、ＯＰ１の少なくとも最小限の活性ドメイン、および、それらのさまざまなアナログをコードするよに構成されうる。これらのＤＮＡは、ゲノミックＤＮＡおよびｃＤＮＡの単離、合成されたオリゴヌクレオチドからの合成ＤＮＡの構成、およびカセット変異導入技術を含む、よく知られたＤＮＡ操作を使用して当業者により製造されうる。１５−１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドはバイオサーチＤＮＡモデル８６００合成機により合成され、そしてＴｒｉｓ−ほう酸−ＥＤＴＡ緩衝液においてポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製される。そしてＤＮＡをゲルから電気的に溶出する。オーバーラップするオリゴマーをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化しそしてＰＡＧＥによっても精製されるより大きなブロックに連結する。
【００６６】
そしてｃＤＮＡあるいは合成ＤＮＡを蛋白質の発現のために発現ベクターに挿入しそして適切な宿主細胞内にトランスフェクトする。原核細胞生物は蛋白質をグリコシル化できないが蛋白質の骨形成活性は壊さないから、宿主は原核細胞生物あるいは真核細胞生物を使用する。有効な宿主細胞には大腸菌、酵母、昆虫／バキュロウイルス細胞系、ミエローマ細胞、およびさまざまな哺乳動物細胞が含まれる。本発明の蛋白質はここに開示されたように、好ましくは哺乳動物において発現される。ベクターは付加的に複写プロモーターおよび終結配列、エンハンサー配列、好ましいリボソーム結合部位配列、好ましいｍＲＮ
Ａリーダー配列、蛋白質の分泌のための好ましいシグナル配列、および類似物を含む組換え体蛋白質の正確な発現を促進するさまざまな配列をコードしていてもよい。興味のある遺伝子をコードするＤＮＡ配列はまた、潜在的に阻害をする配列を除去するためにあるいは望まれない二次構造の形成を最小限にするために操作される。組換え体骨形成蛋白質はまた、融合蛋白質としても発現されうる。翻訳された後に、蛋白質は細胞自身から精製あるいは培養液から回収されうる。すべての生物学的に活性のある蛋白質の型は、個々のサブユニットの発現後に適切な真核生物細胞内あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、さまざまな組換え体蛋白質のひとつあるいはいくつかが酸化およびおりたたまれることにより、ジスルフィド結合により連結されるか他の方法で結合されて生産されるダイマー種からなる。
【００６７】
前述したように、治療における使用のための哺乳動物の組換え体蛋白質の生産は、その構造が天然の物質に最も近い蛋白質を生産するために、好ましくは哺乳動物細胞培養系において発現されるということが通常は考えられている。哺乳動物細胞内における組換え体蛋白質の生産は、トランスフェクトが簡単で、外来のＤＮＡを並び方が変化していない配列で安定に維持し、そして転写、翻訳、後翻訳修飾、および蛋白質の分泌に十分な必要な細胞の成分をもった適切な細胞および細胞ラインの確立を必要とする。さらに、興味のある遺伝子を運ぶ適用なベクターもまた必要である。哺乳動物細胞へのトランスフェクションのためのＤＮＡベクターの構成はコザックコンセンサス配列のような翻訳効率を高める配列に加えて、適切な転写の開始、終結、およびエンハンサー配列を含む上述されたような興味ある遺伝子の発現を促進する適切な配列を含むべきである。好ましいＤＮＡはまたマーカー遺伝子および興味ある遺伝子のコピー数を増幅する手段を含む。
【００６８】
哺乳動物細胞の発現系の発展における実質的な進歩はこの十年間につくられそしてこの系の多くの局面は十分に特徴づけられた。有用な細胞、蛋白質発現−プロモーター配列、マーカー遺伝子、および遺伝子増幅法を含む、哺乳動物における外来蛋白質の生産の技術の状況の詳細な論評は、ベンディグ（Ｂｅｎｄｉｇ）、マリー（Ｍａｒｙ）  Ｍ．，（１９８８）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ７：９１−１２７に開示されている。
【００６９】
簡潔に言えば、特定の哺乳動物内において外来の遺伝子を発現するのに有用な最もよく特微づけられた転写プロモーターはＳＶ４０前期プロモーター、アデノウイルスプロモーター（ＡｄＭＬＰ）、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター（ｍＭＴ−Ｉ）、ニワトリ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端重複（ＬＴＲ）、マウス乳癌ウイルス長末端重複（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、およびヒトサイトメガロウイルス主要中間−前期プロモーター（ｈＣＭＶ）である。すべてのそれらプロモーターのＤＮＡ配列はその分野においてわかっており市販されている。
【００７０】
哺乳動物系においてよりよく特徴づけられた遺伝子増幅の方法の一つはｄｈｆｒ−セルラインにおける誘導可能なＤＨＦＲ遺伝子の使用である。通常、ＤＨＦＲ遺伝子は興味ある遺伝子を運ぶベクター中に供給され、そして細胞毒性薬剤メトトレキセートの付加による誘導により、関連した興味ある遺伝子のコピー数に加えてＤＨＦＲ遺伝子のコピー数も増幅される。トランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣セルライン（ＣＨＯ細胞）における誘導可能な、増幅マーカー遺伝子としてのＤＨＦＲはその分野において特によく特徴づけられている。誘導可能な遺伝子増幅器として有用な他の遺伝子は、アデノシン脱アミノ酵素（ＡＤＡ）およびグルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子である。
【００７１】
細胞あるいはセルラインの選択もまた重要であり実験者の必要に依存している。サル腎細胞（ＣＯＳ）は高いレベルの一過性の遺伝子発現を提供し、ベクター構成物およびクローン化された遺伝子の発現の迅速な試験に有用な手段を提供する。ＣＯＳ細胞は興味ある遺伝子を運ぶシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ベクターでトランスフェクトされる。トランスフェクトされたＣＯＳ細胞はやがて死滅し、そのため望まれた蛋白質の長期間の生産は妨げられる。しかしながら、一過性の発現は安定なセルラインの開発に必要な時間を消費する過程（しばしば数週間）を必要としない。
【００７２】
確立されたセルラインの間で、ＣＨＯ細胞は今日まで最も特徴がよくわかっている。それらはまた広い範囲の細胞型由来の蛋白質を発現させることが可能である。ＣＨＯ細胞の一般的応用可能性および関係のない細胞型由来の各種のヒト蛋白質の生産が成功している事実は、すべての哺乳動物細胞における根源的な類似性を強調する。そして、哺乳動物発現系において生産された組換え体蛋白質のグリコシル化パターンは天然の蛋白質と同一でないかも知れないが、オリゴサッカライドの側鎖のちがいは発現された蛋白質の生物活性に本質的でないことがしばしばある。
【００７３】
さまざまな哺乳動物細胞から組換え体ＯＰ１を発現させそして精製する方法、天然の異種性マトリックス、および請求された主題の性格、有用性およびそれぞいかに作りそして使用するかということに関する他の観点は、本発明の実施のために現在最良であると知られた方法を構成する以下の記載からさらに理解されるであろう。
【００７４】
Ｉ．哺乳動物細胞における組換え体蛋白質の発現
いくつかの違った哺乳動物細胞の発現系が、本発明の組換え体ＯＰ１蛋白質の発現に使用された。特に、ＣＯＳ細胞はＣＯＳ細胞中にＤＮＡ配列をトランスフェクトするためにＳＶ４０ベクターを使用して、ベクターの構築および遺伝子の発現の迅速な評価のために使用される。安定なセルラインはＯＰ１蛋白質の長期間の生産のためにＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）およびＢＳＣ細胞の高温感受性株（サルの腎細胞、ＢＳＣ４０−ｔｓＡ５８、（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７−１１９６）を使用して開発される。２つの違ったプロモーターをＯＰ１の転写に使用する：ラウス肉腫ウイルスＬＴＲからのエンハンサーにより増幅されたＣＭＶプロモーター、およびｍＭＴプロモーター（マウスメタロチオネインプロモーター）。いくつかの選択マーカー遺伝子、例えば、ｎｅｏ（ネオマイシン）およびＤＨＦＲ、もまた使用される。ＤＨＦＲ遺伝子はまたＣＨＯ細胞の遺伝子増幅計画の一部として使用されうる。他の遺伝子増幅計画はＳＶ４０ベクターでトランスフェクトされたＢＳＣ４０−ｔｓＡ５８の温度感受性（ｔｓ）を利用する。３３℃への温度の低下は、ｔｓ  ＳＶ４０  Ｔ抗原を安定化し、それによって挿入された、トランスフェクトされたベクターＤＮＡの切り出しおよび増幅が生じ、したがって結合された興味ある遺伝子もまた増幅する。
【００７５】
安定なセルラインはＢＳＣ４０−ｔｓＡ５８細胞（以下「ＢＳＣ細胞」と呼ぶ）に加えてＣＨＯ細胞でも確立された。本発明のＯＰ１蛋白質の哺乳動物細胞の発現のために選択されたさまざまなセルラインおよびＤＮＡ配列は遺伝子工学の分野においてよく特徴づけられており容易に入手できる。他のプロモーター、選択可能なマーカー、遺伝子増幅法および細胞も本発明のＯＰ１蛋白質並びに他の骨形成蛋白質の発現に利用されうる。トランスフェクション、発現、および組換え体蛋白質の精製の特別な詳細はその分野においてよく書物に記載されそして当業者によって理解されている。哺乳動物発現系における外来遺伝子の組み換え体の生産において使用されたそれぞれの段階のさまざまな技術的な側面のさらなる詳細は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７のようなその分野における多くのテキストおよび実験マニュアルに見出されうる。
【００７６】
１．発現ベクターの例
図３は哺乳動物におけるＯＰ１蛋白質の発現のために考案されたさまざまな発現ベクタ
ーの例の制限地図を開示している。これらのベクター構成物のそれぞれは最初にヒトｃＤＮＡライブラリー（ヒト胎盤）から単離され、そして引き続いて挿入部位においてｐＵＣポリリンカー配列を使用して慣用的なｐＵＣベクター（ｐＵＣ−１８）にクローン化された完全長のｃＤＮＡ配列を使用している。これらの構成物のそれぞれにクローン化されたＯＰ１  ｃＤＮＡ断片は図２に描かれた完全なＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ  ＯＰ１  ｃＤＮＡ断片（Ｓｅｑ．  ＩＤ  Ｎｏ．７）、あるいはこの断片から標準的な分子生物学方法論を使用して、周辺のコードしていない５’および／または３’配列を再度切り取った修飾断片である。それぞれのベクターはまた霊長類細胞（例えば、ＣＯＳおよびＢＳＣ細胞）においてプラスミドの複製を伝達するのに有用なＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ）も使用している。さらに、前期ＳＶ４０プロモーターをベクター上のマーカー遺伝子（例えば、ｎ  ｅｏおよびＤＨＦＲ）の転写の制御に使用している。
【００７７】
ｐＨ７１７発現ベクター（図３Ａ）は、誘導可能な選択マーカーとしてネオマイシン（ｎｅｏ）遺伝子を含む。このマーカー遺伝子は遺伝子工学の分野においてよく特徴づけられており市販されている。一方、他の選択可能なマーカーも使用可能である。ｐＨ７１７のためのｎｅｏ遺伝子ＤＮＡ断片の提供に使用される特定のベクター（ｐＭＡＭ−ｎｅｏ−ｂｌｕｅ）は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡから入手できる。ｐＨ７１７において、ＯＰ１  ＤＮＡの転写はＲＳＶ−ＬＴＲおよびＭＭＴＶ−ＬＴＲ（マウス乳癌ウイルス）エンハンサー配列により増幅されるＣＭＶプロモーターにより制御されている。これらの配列はその分野においてよく知られており、そして市販されている。例えば、このプロモーター／エンハンサー配列を含むベクター（例えば、ｐＣＤＭ８）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  からえられる。
【００７８】
発現ベクターｐＨ７３１（図３Ｂ）はＯＰ１の転写を制御するためにＳＶ４０後期プロモーターを利用している。上で述べられたように、このプロモーターの配列および特徴はまたその分野においてよく知られている。一方、ｐＨ７３１はｐＥＵＫ−Ｃｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）にＯＰ１のＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片を挿入することにより生産される。
【００７９】
ｐＨ７５４発現ベクター（図３Ｃ）は，選択マーカーとしておよび誘導可能な遺伝子増幅器としてＤＨＦＲ配列を含む。ＯＰ１はＣＭＶ制御下にある、ＤＨＦＲのＤＮＡ配列は遺伝子工学の分野においてよく特徴づけられており、市販されている。一方、ｐＨ７５４はｎｅｏ遺伝子（ＢａｍＨＩ分解物）をＤＨＦＲ遺伝子を含むＢａｍＨＩ断片（例えば、ｐＳＶ５−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ＃３７１４８）から得られる）に置き換えることにより、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）から生産できる。そしてＯＰ１  ＤＮＡはＭＭＴＶＬＴＲ配列（マウス乳癌ウイルスＬＴＲ）の下流のポリリンカー部位に挿入され得、ｐＨ７５２を生じる（図３Ｄ）。そしてＣＭＶプロモーター配列を、ＣｌａＩ−ＸｂａＩ断片（例えば、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ  ｂｌｕｅ，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．から）としてｐＨ７５２（ＣｌａＩ−ＮｈｅＩにおいて開かれた）に挿入できる。
【００８０】
ｐＷ２４ベクター（図３Ｅ）はｎｅｏがＤＨＦＲの代わりにマーカー遺伝子（ｐＨ７１７を参照）として使用されていることを除いてｐ７５４の配列と本質的に同一である。
【００８１】
同様にして、ｐＨ７８３（図３Ｆ）は増幅可能なマーカーＤＨＦＲを含むが、ここではＯＰ１はｍＭＴ（マウスメタロチオネインプロモーター）制御下にある。ｍＭＴプロモーターは遺伝子工学の分野においてよく特徴づけられており市販されている。一方、ｍＭＴプロモーター配列（Ａｌｌｅｇｒｏ  Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｓａｎ  Ｊｕａｎ  Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ，  ＣＡから手に入る）を含
むＣｌａＩ−ＮｈｅＩ断片はｐＨ７８３を生産するためにｐＨ７５２に挿入され得る。
【００８２】
試験されたすべてのベクターはＯＰ１を発現するために使用されたさまざまな細胞において安定であり、そしてある範囲内のＯＰ１発現レベルを提供する。
【００８３】
２．哺乳動物細胞の例
組換え体ＯＰ１は３つの違った細胞発現系において発現された：  さまざまな発現ベクター構成物の機能性を迅速にスクリーニングするためのＣＯＳ細胞、安定なセルラインの確立のためのＣＨＯ細胞、およびＯＰ１蛋白質を生産する他の手段としてのＢＳＣ４０−ｔｓＡ５８細胞。
【００８４】
Ａ．ＣＯＳ細胞
ＣＯＳ細胞（サルの腎細胞）はベクター構成物の迅速なスクリーニングおよびＯＰ１蛋白質の迅速かつ小スケールの生産に使用される。ＣＯＳ細胞はその分野においてよく特徴づけられており市販されている。ここに記述された特定のセルライン（ＡＴＣＣ  ＃ＣＯＳ−１，  ＣＲＬ−１６５０）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを通じて得られる。
【００８５】
ノーザンおよびウエスタンブロットにより分析された種々のベクターからのＯＰ１発現レベルは以下の表１に比較されている。
【００８６】
【表１】
2006068018.tif 000014
【００８７】
ｐＨ７５４でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞は今日最も高い収率でＯＰ１を生産することが明らかになっている。しかしながら、トランスフェクトされたＣＯＳ細胞は分裂せずにトランスフェクション後に数日で死ぬので、個々のスケールアップされた形質転換には大量のプラスミドＤＮＡが必要となる。
【００８８】
トランスフェクトされたＣＯＳ細胞からのＯＰ１の大スケールでの調製は慣用的なローラーボトル技術を使用して生産される。簡潔に言えば、１４×１０６の細胞がそれぞれのボトルに接種するのに使用される。２４時間の成育後に、ＤＥ  ＡＥ−デキストラン法を使用して、１０６細胞あたり１０μｇのベクターＤＮＡ（例えば、ｐＨ７１７）で細胞をトランスフェクトする。そして、蛋白質の分析のために培地を採取する前に１２０時間血清を含まない培地で処理する。このプロトコルに従うと、ＯＰ１の収率は約２−６ｎｇ／ｍｌになる。
【００８９】
Ｂ．ＣＨＯ細胞
ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）は長期間のＯＰ１の生産に使用される。ＣＨＯセルラインは外来遺伝子の小および大スケールの生産のためによく特徴づけられておりそして市販されている。ここに記述された特定のセルラインはＣＨＯ−ＤＸＢｌｌ、（Ｌａｕｒｅｎｃｅ  Ｃｈａｓｉｎ，  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  ＮＹ）である。以下の表２はさまざまな発現ベクターで得られるＯＰ１の収率例を表す。
【００９０】
【表２】
2006068018.tif 000015
【００９１】
ＣＨＯ細胞は慣用的なリン酸カルシウム法によりトランスフェクトできる。ＣＨＯ細胞を好ましくはｐＨ７５４あるいはｐＨ７５２でトランスフェクトし、そしてＯＰ１の収率を高めると思われるので、血清蛋白質を含んだ培地において処理される。有用な培地は０．１−０．５％の透析された胎児のウシの血清を含む培地を含む。
【００９２】
Ｃ．ＢＳＣ細胞
ＢＳＣ４０−ｔｓＡ５８セルライン（ＢＳＣ細胞）はＣＯＳ細胞に関連した幾つかの問題に打ち勝つサルの腎細胞の温度感受性株である（１９８８，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９２−１１９６）。これらのＢＳＣ細胞は、潜在的に有毒な薬剤を外部から添加することを必要としないで温度を下げることにより迅速に大スケールで遺伝子配列を増幅することができる利点をもっている。さらに、細胞は再利用されうる。すなわち、ＯＰ１発現の誘導および刺激後、細胞を新しい成育培地に移し変え、３９．５℃において飽和状態（コンフルエンス）まで成育させ、そして温度を３３℃に下げることにより再び誘導することが可能である。ＢＳＣ細胞は蛋白質を産生する安定なセルラインを迅速に確立するために使用されうる。
【００９３】
トランスフェクトされたＢＳＣ細胞は１０％のＦＣＳを含む培地において温度を３３℃に低下させることにより誘導され、そしてインキュベーションから９６時間後に処理された培地を収穫する。ＣＨＯ細胞と比較して同定度の量（例えば、ｐＨ７１７でトランスフェクトされたＢＳＣクローンから産生培地１ｍｌあたり１００〜１５０ｎｇのＯＰ１）ＯＰ１  ＲＮＡおよび蛋白質が得られる。
【００９４】
３．ＯＰ１でトランスフェクトされた細胞の評価
トランスフェクトされたＯＰ１配列の発現レベルは総細胞ＲＮＡおよび慣用的なハイブリダイゼーション方法を使用して、ｍＲＮＡのレベル（ノーザンブロット）を分析することにより種々の系において測定される。通常、約１×１０６の細胞がｍＲＮＡの分析に必要である。個々のセルライン間のデータの比較は、細胞の総数およびｍＲＮＡの総量を内部スタンダードとしてｒＲＮＡを使用して標準化することにより行うことができる。リボソームＲＮＡは、ハイブリダイゼーションのために該ＲＮＡをニトロセルロースフィルターに転写する前に、エチヂウムブロマイドでアガロースゲルを染色することにより可視化される。リボソームＲＮＡはまたＲＮＡの調製に、完全さの指示指標を提供する。
【００９５】
ＯＰ１蛋白質のレベルはヒトＯＰ１に対するウサギの抗血清を使用してウエスタンブロット（イムノブロット）により測定することもできる。図４は：ＣＯＳ細胞−（Ａ）ｐＨ７１７，（Ｂ）ｐＨ７３１；ＣＨＯ細胞−（Ｃ）ｐＨ７５４，（Ｄ）ｐＨ７５２；およびＢＳＣ細胞−（Ｅ）ｐＨ７１７および（Ｆ）ｐＷ２４におけるＯＰ１の生産を表すイムノブロットである。
【００９６】
サザンブロットは挿入されたＯＰ１配列の状態およびそれらのコピー数増幅の範囲を評価するために使用できる。温度を変化させたＢＳＣ細胞における切り出されたプラスミドのコピー数もまたサザンブロット分析を使用して決定されうる。
【００９７】
ＩＩ．蛋白質の精製
本発明の組換え体骨形成蛋白質を精製するために開発された精製計画は迅速で高い効果を示す。プロトコルは３つのクロマトグラフィーステップ（Ｓ−セファロース、フェニルセファロースおよびＣ−１８  ＨＰＬＣ）を含み、そして約９０％純粋なＯＰ１を産生する。
【００９８】
０．５％  ＦＣＳによって処理されたトランスフェクトされたＢＳＣ細胞の典型的な２Ｌの調製物において、総蛋白質は７００ｍｇである。ウエスタンブロットにより見積もられる培地中のＯＰ１量は約８０μｇである。ＯＰ１培地は６Ｍ尿素、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、１３ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０に希釈され、そして亜硫酸基を持ちそして強カチオン交換体として働くＳ−セファロースカラム上に載せられる。ＯＰ１は低塩濃度でカラムに結合し、そして血清蛋白質は除去される。カラムは引き続き２段階の塩溶出で展開される。最初の溶出（０．１Ｍ塩化ナトリウム）は混在物および約１０％の結合したＯＰ１を除去する。そして残りの９０％のＯＰ１は６Ｍ尿素、０．３Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中に溶出される。
【００９９】
この０．３Ｍ塩化ナトリウム画分に硫酸アンモニウムを加えて、６Ｍ尿素、１Ｍ硫酸アンモニウム、０．３Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０の最終的な溶液状態を得る。そしてサンプルをフェニルセファロースカラム（疎水性結合クロマトグラフィー）に載せる。ＯＰ１は高濃度の弱いカオトロピック塩（例えば、１Ｍ硫酸アンモニウム）存在下においてフェニルセファロースに結合させる。ＯＰ１を結合させた後、カラムを、硫酸アンモニウムの濃度を下げて使用して２段階の溶出で展開する。最初の溶出（０．６Ｍの硫酸アンモニウムを含む）は最初に混在物を除去する。そして結合したＯＰ１は硫酸アンモニウムを含まない６Ｍ尿素、０．３Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０緩衝液で溶出する。
【０１００】
フェニルセファロースカラムから溶出されたＯＰ１を水で透析し、さらに３０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）で透析し、そしてＣ−１８逆相ＨＰＬＣカラムに載せる。図５Ａ、Ｂ、およびＣは（Ａ）Ｓ−セファロース、（Ｂ）フェニルセファロース、および（Ｃ）Ｃ−１８カラムから溶出したものの（１）クロマトグラムおよび（２）ヂチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元後画分のクマジー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。酸化されそして還元されたＯＰ１サンプルのゲルによる分離は、還元されたサブユニットが約１８ｋＤの見かけ分子量をもつこと、および図６に示されるように、ダイマーは約３６ｋＤの見かけ分子量をもつことを表す。このサブユニットの大きさは、天然源のｂＯＰの大きさに加えて、ＣＯＳ細胞から精製されたものの大きさとも同一であることが明らかになった。現在のプロトコルは、ゲルスキャニングにより見積もったところ２Ｌの産生培地で約３０μｇのＯＰ１、すなわち約２５％の回収、の収量を得た。
【０１０１】
別法のクロマトグラフィープロトコルは、６Ｍ尿素非存在下においてＳ−セファロースクロマトグラフィーを行う。そして結合したタンパク質は塩のステップ溶出（例えば、１００−４００ｍＭ塩化ナトリウム）で溶出される。ＯＰ１のほとんどは約３００ｍＭの塩化ナトリウムで溶出される。そして残りのＯＰ１はさらに６Ｍ尿素存在下の３００ｍＭの塩化ナトリウムで溶出されうる。１段階で最大の回収を達成するために、尿素を使用しない溶出に代えて６Ｍ尿素の溶出を使用してもよい。
【０１０２】
ＯＰ１はまたヒドロキシアパタイトに効果的に結合する、ただし６Ｍ尿素非存在下および低リン酸濃度（リン酸５ｍＭ以下）においてのみである。結合したＯＰ１は、１ｍＭから０．５Ｍのステップ溶出（０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０中で）でカラムから除去されうる。ＯＰ１は約２５０ｍＭのリン酸で溶出される。さらに、溶出ステップの間に尿素（６Ｍ）を加えてもよい。
【０１０３】
他の関連したクロマトグラフィー方法もまた哺乳動物細胞系からＯＰ１を精製するのに有用である。例えば、ヘパリンセファロースをＳ−セファロースカラムと組み合わせて使用できる。あるいは、Ｃｕ２＋−固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）は、６Ｍの尿素を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でＯＰ１を結合する。
【０１０４】
ＩＩＩ．マトリックスの調製
本発明の実施には骨、好ましくは哺乳動物、例えばウシの骨の入手性を必要とする。骨を洗浄し、骨髄を取り除き、脱脂され、脱イオン化され、適当な大きさの粒子に砕かれ、可溶性蛋白質を除去するために抽出され、殺菌され、そしてさまざまな臨床の使用に有用な移植できる材料を生産するようなここに開示されたような方法で処理される。
【０１０５】
本発明の材料から製造されたさまざまな形のマトリックスはさまざまな目的で外科的に移植される。これらの目的中の主要なものは、さまざまな整形法の、歯周の、および再構成の方法における骨の形成のマトリックスとして、徐放剤のキャリアーとして、あるいは移植片のためのコラーゲン性コーティング剤として働かせることである。マトリックスは外科手術において期待される所望の形とし、あるいは外科手術の間の医者あるいは技術者により型づくられてよい。すなわち、局所性の、皮下の、腹腔内の、あるいは筋肉内の移植片として使用できる；骨折の癒着不良を補うようにあるいは骨の欠失を満たすように型づくられる。骨の形成あるいは誘導方法において、材料はゆっくりと体に吸収されそして移植片の形であるいはほとんど移植片に近い形で骨と置き換えられる。
【０１０６】
さまざまな成長因子、ホルモン、酵素、治療用組成物、抗生物質、および身体に処理する他の薬剤もまた、キャリアー物質に吸収させそして移植すると、マトリックスの材料がゆっくりと吸収されるにつれて時間をかけて放出させる。こうして、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦアルファ、およびＴＧＦベータのようなさまざまな既知の成長因子をｉｎ ｖｉｖｏにおいて吸収させうる。材料は化学療法剤、インスリン、酵素、あるいは酵素の阻害剤を放出させるために使用されうる。
【０１０７】
本発明の材料をいかにして作るかおよび使用するかの詳細を以下に開示する。
【０１０８】
１．脱イオン化された骨の調製
脱イオン化されたウシの骨のマトリックスは、以前に公表された方法により調製される（Ｓａｍｐａｔｈ  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｉ  （１２９８３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８０：６５９１−６５９５）。ウシの骨幹（１−１０日齢）は屠殺場から得られ新鮮なうちに使用される。骨は筋肉と脂肪を取り去り、骨膜を洗い、冷水による水圧で骨髄を取り除き、冷やした無水アルコールに浸し、そして−２０℃で貯蔵する。そして乾燥しそして破壊により断片化しそして大きな製粉機により粉にされる。注意を要することは液体窒素を使用することにより発熱を防ぐことである。粉にされた骨は７０−８５０μｍ、好ましくは１５０μｍ−４２０μｍの範囲の粒子の大きさの粉にされ、そして３倍容のクロロホルムおよびメタノール（３：１）で約２時間、２度洗浄することにより脱脂する。そして微粒子状の骨を等容の無水エタノールで洗浄し、そして脱脂された骨の粉を生じさせるために等容の無水エーテルで乾燥させる。そして脱脂された骨の粉を１０倍容の０．５Ｎ  ＨＣｌで４℃において４０分間、４回連続して処理して脱イオン化する。最後に、中和のための洗浄を大量の水を用いて脱イオン化された骨の粉に行う。
【０１０９】
２．グアニジン抽出
このようにして調製された脱イオン化された骨のマトリックスは５倍容の４Ｍグアニジン−ＨＣｌ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０で１６時間４℃において抽出される。懸濁液をフィルターでこす。不溶性の物質を集めそしてマトリックスを組み立てるのに使用する。この物質は基本的に大部分コラーゲン性であり、それは骨形成および軟骨形成活性を持たない。
【０１１０】
３．マトリックスの処理
すべての骨のマトリックスの主要な成分はＴｙｐｅ−Ｉコラーゲンである。コラーゲンに加えて、上で開示されたように抽出された脱イオン化された骨は総量の５％の割合を示す非コラーゲン性蛋白質を含む。異種性のマトリックス中の、これらの非コラーゲン様蛋白質はそれ自身潜在的な抗原として存在し、そして免疫原性および／あるいは阻害成分を構成する。そのような成分は同種型の移植片においてもまた、骨の分化の発生カスケードを妨げることにより骨形成を阻害する。マトリックス粒子をコラーゲン繊維修飾剤で処理することにより、潜在的に望ましからぬ成分がマトリックスから抽出され、そしてマトリックスの材料の表面の構造が変えられる事が本発明により見いだされた。
【０１１１】
今日最も好ましい繊維修飾剤は加熱した水性溶媒で、最も好ましくは水である。さまざまな量の脱脂され、脱イオン化されグアニジンで抽出された骨のコラーゲンを湯浴中のガラスのフラスコで一定の速度で撹拌しながら水中（１ｇ／３０ｍｌ）で加熱し、そして指示された温度において１時間保つ。幾つかの例においては、水は加熱前にコラーゲンを膨張させることを助けるために０．１Ｍ酢酸で置き換えられる。温度は室温、および約３７℃、４５、５５、６５、７５において一定に保たれる。熱処理後、マトリックスをフィルターで濾過しそして凍結乾燥して移植に使用する。
【０１１２】
マトリックス材料の形態に対するお湯の処理の効果は図６と図１の光学顕微鏡写真の比較から明らかである。図６は（ａ）  ３７℃、（ｂ）  ４５℃、（ｃ）  ５５℃、（ｄ）
６５℃において処理された、効果的に変化したコラーゲンの表面の形態を表す。図１の光学顕微鏡写真は非処理のラットおよびウシの骨のマトリックスの形態を表す（それぞれＡ、およびＢ）。写真から明らかなように、お湯の処理は粒子の表面の微小なくぼみの程度を少なくとも約１０倍増加させ、実質的に粒子の多孔性をも増加させる（図１のＢおよび図５のＣ，Ｄを比較せよ）。マトリックス粒子のこの形態の変化は実質的に粒子の表面積を増加させる。穴およびくぼみの大きさを注意深く測定すると、マトリックス粒子への熱い水性溶媒の処理は１μｍから１００μｍの範囲の粒子の穴およびくぼみの直径を生じさせることが明らかである。
【０１１３】
お湯の処理により産生された抽出物の特性から、この処理はまたそのマトリックス中への共存がｉｎ ｖｉｖｏにおいて新しい骨の形成を妨げるような成分を除去していることも明らかにしている。図８はお湯で処理したウシのマトリックスから単離された抽出物の２１４ｎｍにおける吸光のトレースであり、それぞれのピーク（もしくは画分）のｉｎ ｖｉｖｏの骨の形成に対する効果を示す。
【０１１４】
大スケールの調製作業（１００ｇウシマトリックス、お湯処理）からの抽出物を集め、０．１％  ＴＦＡにより酸性化し、そしてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｄｅｌｔａ  Ｐｒｅｐ  Ｃａｒｔｒｉｇｅを使用してＣ−１８  ＨＰＬＣカラムで測定した。画分を２５ｍｌ／分の流速で５０ｍＬの間隔で集め、適当にプールしてトレースされた各ピークを分離した。そしてこれらの画分のそれぞれを組換え体ＯＰ１および適切なラットのマトリックスキャリアー（後記参照）とともに移植し、そしてその骨形成活性に対する効果を測定した。第
１２画分のみが、同種型の移植における骨の形成を阻害するようである。その阻害活性は用量に依存するようである。このピークに存在する阻害成分の除去は異種性の移植における骨形成活性の維持に必要である可能性がある。図９は１２日目の移植片においてアルカリホスファターゼ活性およびカルシウム含有量で調べた、お湯で処理されたマトリックスからの完全な溶剤抽出物の骨形成活性に対する影響を表す。どのような抽出も行われないで移植されたラットのキャリアーマトリックスおよびＯＰ１をポジティブコントロールとして使用する。お湯で処理されたウシのマトリクス１００グラムから得られた溶剤抽出物を蒸発させそして６Ｍの５０％アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ中に溶解させた。その１００−３００μｌのアリコートを既知量の組換え体ＯＰ１、および２５ｍｇのラットマトリックスキャリアーと混合し、そししてアッセイした（以下を参照せよ）。結果は抽出物が用量に依存して新しい骨の形成を阻害することを明らかに示している。
【０１１５】
繊維修飾剤に接触させた後、処理されたマトリックスを、以下の手続きの形にしたがって洗浄し、どのような抽出成分をも除去する：
１．ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝塩）に１ｇ／２００ｍｌで懸濁させそして４℃において２時間撹拌する；あるいは６Ｍ尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０（ＵＴＢＳ）あるいは水に懸濁させそして室温（ＲＴ）で３０分間撹拌する（ｐＨ値を中和状態にするのに十分な時間）；
２．遠心しそして洗浄ステップを繰り返す；そして
３．遠心して；上清を捨てて；残渣を水で洗い；そして凍結乾燥する。
【０１１６】
他の有用な繊維修飾剤はトリフルオロ酢酸およびフッ化水素のような酸、およびジクロロメタン、アセトニトリル、イソプロパノール、およびクロロホルムのような有機溶媒およびそれらの薬剤の組み合わせを含む。これらの他の繊維修飾剤を使用したマトリックスの処理は、これらの繊維修飾剤が脱イオン化され、グアニジン抽出された骨のコラーゲン粒子に対して及ぼす効果の詳細な物理的な分析とともに、米国特許出願第４２２，６１３号（１９８９年１０月１７日出願）に開示され、その開示は引用により本明細書に含まれる。
【０１１７】
コラーゲンのマトリックスの材料は、好ましくは水に不溶性の、非接着性粒子からなる微粉末の形をとる。新しい骨の成育あるいは持続した放出が望まれる所で単に所定の容積に圧縮して、周辺組織によってその場所に保持して使用される。あるいは、この粉末は身体に素早く吸収されるような例えば、ゼラチンあるいはポリ乳酸コーティングのカプセルに入れてもよい。この粉末は与えられた寸法の容積に形づくりそして該粒子を例えば可溶性の、種に関して生物的に適合できるコラーゲンを使用して内部接着することによりその形状に維持することもできる。この粉末材料はまたシート状、棒状、ビーズ状、あるいは他の肉眼で見える形につくることもできる。
【０１１８】
ＩＶ．骨形成具の構成
上で説明されたような組換え体蛋白質および他の構成物は以下に記述される任意の方法を用いて、適当なマトリックス調製物中に混合および分散させうる。
【０１１９】
１．エタノール沈澱
マトリックスをグアニジン−塩酸に溶解している骨形成蛋白質に加える。サンプルを回転運動により撹拌して低温においてインキュべートする。そしてサンプルをさらに回転運動により撹拌する。混合物に冷たい無水のエタノールを加え、撹拌およびインキュベートする。遠心後（微量遠心管、高遠）上清を除去する。マトリックスを、冷やした濃縮エタノール水溶液により洗浄し、そして凍結乾燥する。
【０１２０】
２．アセトニトリル  トリフルオロ酢酸での凍結乾燥
この方法において、アセトニトリル  トリフルオロ酢酸（ＡＣＮ／ＴＦＡ）溶液中の骨形成蛋白質をキャリアー材料に加えた。サンプルを何度も激しく渦巻き撹拌してその後凍結乾燥する。骨形成蛋白質をさまざまな濃度で、そして幾つかの精製段階において加える。この方法は今日好まれている。
【０１２１】
３．尿素での凍結乾燥
尿素緩衝液中において調製された骨形成蛋白質については、蛋白質をマトリックス材料と混合し、何度も渦巻き撹拌し、そして凍結乾燥する。凍結乾燥された材料は「そのまま」移植に使用される。
【０１２２】
４．緩衝化塩溶液からの凍結乾燥
生理学的塩溶液中のＯＰの調製物もまたマトリックスを渦巻き撹拌しそして骨形成活性のある材料を生産するために凍結乾燥する。
【０１２３】
これらの方法はまた、持続された放出の目的のために他の活性のある治療剤、ホルモン、およびさまざまな生物的に活性のある成分を吸着させるために使用されうる。
【０１２４】
Ｖ．バイオアッセイ
さまざまなマトリックスの機能はｉｎ ｖｉｖｏにおけるラットのバイオアッセイにより評価される。ラットにおける研究は、適切なマトリックス中での骨形成の効果が、マトリックス内に分散された骨形成蛋白質の量に依存していることを示している。もしもマトリックスだけが移植されたならば、活性は観察されない。もしも上に開示されたように処理されずに移植されたときは、文献に記述されたタイプの脱イオン化され、グアニジン抽出された異種性の骨マトリックス材料はキャリアーとして効果がなく、骨を誘導できず、そして炎症性の免疫応答を生じる。多くの同種型マトリックス材料もまたキャリアーとして有効でない。以下は、対照マトリックスおよび上で述べられたように調製されたマトリックス材料から骨形成具を作成するために、およびそれらの骨形成の利用性を評価するためにさまざまな方法を示す。
【０１２５】
移植
本明細書に引用して取り入れられている、Ｓａｍｐａｔｈ  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｉ  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９８３）  ８０：６５９１−６５９５）により記述されている骨の誘導のバイオアッセイは、軟骨性骨の分化の活性を監視するために使用できる。このアッセイは、エーテルの知覚麻痺下における受容ラットの皮下部位への異種性のウシ試験サンプルを移植することからなる。オスのＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラット、２８−３２日齢、を使用した。水平な切れ込み（１ｃｍ）を胸部の領域の上の皮膚に滅菌状態でつくり、そしてくぼみを鋭い切開によりつくる。約２５ｍｇの試験サンプルをくぼみの中に深く移植しそして切れ込みを金属製の皮膚クリップで閉じる。移植の日を実験の日と呼ぶ。移植片は１２日目に除去した。異所性部位は、正所性部位の使用により起こりうるあいまいさなしに骨の誘導の研究を可能とする。
【０１２６】
細胞の変化
移植の成功は：（１）一日目の多核性白血球による一過的な浸潤；（２）二日目および三日目の間充組織細胞の遊走および増殖；（３）五日目および六日目の軟骨細胞の出現；（４）七日目の軟骨のマトリックスの形成；（５）八日目の軟骨のカルシウム沈着；（６）九日目および十日目の血管の侵入、造骨細胞の出現、および新しい骨の形成；（７）十二日目から十八日目の造骨細胞および骨の改造の出現および移植されたマトリックスの溶解；そして（８）二十一日目の小骨における造血骨の骨髄分化を含むマトリックス誘導軟骨性骨の発育の段階を経由して制御された発達をもたらす。その結果は、新しい骨の形は移植されたマトリックスの形をとるということを表す。
【０１２７】
組織学的な評価
組織学切片の作成および染色が、移植片の骨形成の程度を決定するために好ましい。移植片をブアン溶液で固定し、パラフィンで包み、そして６−８μｍの切片に切断する。トルイジン  ブルーあるいはヘモトキシリン／エオシンによる染色は軟骨性骨の究極的発育を明らかに証明している。十二日目の移植片は、移植片が新しく誘導された骨を含んでいるかどうかを決定するのに通常十分である。
【０１２８】
生物学的マーカー
アルカリ  ホスファターゼ活性は骨形成のマーカーとして使用できる。この酵素活性は移植片のホモジェナイズ化の後に、分光光度法により測定できる。活性はｉｎ ｖｉｖｏにおいて９−１０日目に最大に達しそしてその後ゆっくりと減少する。組織学的な検査で骨の形成を示さない移植片は、この分析条件において、ほとんどあるいは全くアルカリ  ホスファターゼ活性を示さない。この分析は移植片がラットから除去された後に、素早く骨形成の評価を得ることおよび定量することに有用である。あるいは、骨の形成量は移植片のカルシウム含有量を測定することにより決定され得る。
【０１２９】
結果
種々の細胞源からのおよび種々の程度に精製された（１−５％純粋から３０−９０％純粋）ＯＰ１で、約２５ｍｇのマトリックスを使用して上述のようにｉｎ ｖｉｖｏにおいて骨形成活性を試験した。以下の表３は全部の３つの細胞タイプにおいて発現されたＯＰ１の組織学的な点数を示す。
【０１３０】
【表３】
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【０１３１】
表３に詳細に示されている組織学的点数は、ＯＰ１が細胞源にかかわらず活性をもち、そしてその活性は天然のウシＯＰ１ににているということを表す。骨誘導活性は高度に再現性があり、用量に依存している。組換え体ＯＰ１の骨形成活性のさらなる証明は図１０および図１１の写真により提供される。
【０１３２】
図１０Ａ−ＦはＣＯＳ、ＢＳＣ、およびＣＯＳ細胞から発現された組換え体ＯＰ１を使用した同種型の移植片の組織を記録した写真である。マイクログラフ（２２０×に拡大）は本発明の骨形成蛋白質により誘導された完全な発生カスケードの図による証明を提供し、このことはマトリックスと一緒に移植されたときに、組換え体により生産されたＯＰ１だけで軟骨性骨の形成を誘導するのに十分であることを確認するものである。図１０Ａで証明されたように、ＯＰ１を含まない同種型の移植片は移植後１２日目に新しい骨の形成を示さない。移植された骨のマトリックス（ｍ）および周辺の間充組織だけが見られる。逆に、ＯＰ１を含んだ移植片は移植後７日目に既に広範囲な軟骨形成の証明を示している（図１０Ｂ、５５０ｎｇ  ＢＳＣ生産蛋白質、３０％純粋）。ここで、新しく形成された軟骨、軟骨芽細胞（Ｃｂ）、軟骨細胞（Ｃｙ）はマトリックス（ｍ）にぴったりと接触している。９日目の移植片の軟骨の分化により、軟骨のカルシウム沈着、軟骨細胞の肥大、血管の侵入、および新しい骨の形成の開始が全て明らかになった（図１０Ｃ、２２０ｎｇ  ＣＯＳ生産蛋白質、約５％純粋）。キャピラリーの侵入（ｃ）および血管内皮の近くの好塩基性の造骨細胞の出現（矢印で示された）は特に明らかである。移植の１２日後までに広範囲な骨形成および改造がおきた（図１０Ｄ（２２０×）、および図１０Ｅ（４００×）、ＣＨＯ生産蛋白質、約６０％純粋）。造骨細胞によりつくられて新しく形成された骨は多核の造骨細胞（Ｏｃ）により改造されつつあり、移植されたマトリックスは再吸収されつつあり、そして改造された骨により取り替えられつつある。新しく形成された小骨の骨の骨髄の出現もまた明らかである。最後に、小骨内部の造血骨の骨髄の分化は、移植後２２日目に観察され得る（図１０Ｆ、５００ｎｇのＢＳＣ生産蛋白質、３０％純粋）。このときまでに、ほとんどの移植されたマトリックス（  ｍ）は再吸収されそして赤血球および顆粒細胞系および巨核細胞を含んだ骨の骨髄の要素で満たされた小骨を含む新しく形成された骨により占められている。同様な組織学的な観察が、９０％よりも純粋なＯＰ１蛋白質の調製物を取り込んだ移植片でも見られた。
【０１３３】
図１１はお湯で処理されたウシマトリックスおよびＯＰ１（ＢＳＣで生産された）を使用した異種性の移植片の移植後１２日目の組織学を表す顕微鏡写真である。造血骨の骨髄の要素の出現は、ＯＰ１をもちいた異種性移植の骨形成活性が同種型の移植のそれとパラレルである事を表す、マイクロ写真において明らかである（図１１と図１０Ｄおよび図１０Ｅを比較せよ）。
【０１３４】
ＯＰ１のマトリックスの移植により示されそして図１０および図１１において明らかにされた細胞の変化は、胎児の発生の間に起こる軟骨性骨の分化に本当ににている。軟骨性骨の分化は優勢なルートであったが、移植片の外側の表面の膜内部の骨の形成の証明もある。
【０１３５】
図１２および図１３は本発明の同種型の移植片（図１２）および本発明の異種性移植（図１３）のアルカリホスファターゼ特異的活性およびカルシウム含有量により決定されるような、移植後１２日目の骨形成活性の用量依存性を表す。すべての場合において、ＯＰ１蛋白質の濃度（イムノブロット染色あるいはゲルスキャニングにより定量された）はナノグラムで表されている。それぞれの場合において、骨の誘導活性はすべての細胞において用量依存的にＯＰ１に対して特異的である。
【０１３６】
本発明はその精神または必須の特性から離れることない他の特定の形で具体化されうる。したがって本明細書中の態様はすべての面において例示的な限定されないものとして考えられ、本発明の範囲は前述の記述よりもむしろ添付された請求の範囲により決定され、請求の範囲と均等の目的および範囲内において生じるすべての変化はしたがってここに包含されることを意図されている。
【０１３７】
本発明自身、さらにそのさまざまな特徴、本発明の前述のおよび他の目的は添付の図面とともに解釈されるとき、以下の説明からより完全に理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１Ａ】脱イオン化され、脱脂されたラットの骨コラーゲン粒子の電子顕微鏡写真（５０００ｘ）である。
【図１Ｂ】脱イオン化され、脱脂されたウシの骨コラーゲン粒子の電子顕微鏡写真（５０００ｘ）である。
【図２Ａ】ヒトＯＰ１遺伝子のプレプロフォームの完全長のｃＤＮＡおよびコードされるアミノ酸配列（Ｓｅｑ．  ＩＤ  Ｎｏ．７）を表す図である。
【図２Ｂ】図２Ａの続きを示す図である。
【図３Ａ】ＯＰ１の哺乳動物細胞における発現のために考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図である。
【図３Ｂ】ＯＰ１の哺乳動物細胞における発現のために考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図である。
【図３Ｃ】ＯＰ１の哺乳動物細胞における発現のために考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図である。
【図３Ｄ】ＯＰ１の哺乳動物細胞における発現のために考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図である。
【図３Ｅ】ＯＰ１の哺乳動物細胞における発現のために考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図である。
【図３Ｆ】ＯＰ１の哺乳動物細胞における発現のために考案されたさまざまな発現ベクターの制限地図を示す図である。
【図４】ＣＯＳ細胞−（Ａ）ｐＨ７１７，（Ｂ）ｐＨ７３１；ＣＨＯ細胞−（Ｃ）ｐＨ７５４，（Ｄ）ｐＨ７５２およびＢＳＣ細胞−（Ｅ）ｐＨ７１７，（Ｆ）ｐＷ２４；から発現されたＯＰ１を比較するウエスタンブロット（イムノブロット）を示す電気泳動写真である。
【図５Ａ−１】ＢＳＣ細胞から発現され、Ｓ−セファロースで精製されたＯＰ１の溶出図である。
【図５Ｂ−１】ＢＳＣ細胞から発現され、フェニルセファロースで精製されたＯＰ１の溶出図である。
【図５Ｃ−１】ＢＳＣ細胞から発現され、Ｃ−１８カラムで精製されたＯＰ１の溶出図である。
【図５Ａ−２】ＢＳＣ細胞から発現され、Ｓ−セファロースで精製されたＯＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの電気泳動写真である。
【図５Ｂ−２】ＢＳＣ細胞から発現され、フェニルセファロースで精製されたＯＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの電気泳動写真である。
【図５Ｃ−２】ＢＳＣ細胞から発現され、Ｃ−１８カラムで精製されたＯＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの電気泳動写真である。
【図６】ヂチオスレイトールで還元後（１８ｋＤ，レーン５）の酸化状態の完全なダイマー（３６ｋＤ，レーン１）および対応するモノマーと分子量スタンダード（レーン２−４）を比較したＢＳＣ細胞から精製されたＯＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動写真である。
【図７Ａ】水中で３７℃において熱処理された、脱イオン化され、脱脂されたウシの骨のマトリックスの走査電子顕微鏡写真（約１０００ｘ）である。
【図７Ｂ】水中で４５℃において熱処理された、脱イオン化され、脱脂されたウシの骨のマトリックスの走査電子顕微鏡写真（約１０００ｘ）である。
【図７Ｃ】水中で５５℃において熱処理された、脱イオン化され、脱脂されたウシの骨のマトリックスの走査電子顕微鏡写真（約１０００ｘ）である。
【図７Ｄ】水中で６５℃において熱処理された、脱イオン化され、脱脂されたウシの骨のマトリックスの走査電子顕微鏡写真（約１０００ｘ）である。
【図８】湯で処理された子ウシのマトリックスから単離された抽出物の２１４ｎｍにおける吸光の記録を示すグラフであり、個々の画分はｉｎ ｖｉｖｏの骨の形成への阻害効果を同定した。
【図９Ａ】お湯で処理されたマトリックスの抽出物のＯＰ１活性に対する阻害効果をアルカリホスファターゼ活性を抽出溶媒の濃度の増加との関連で測定することにより表した棒グラフである。
【図９Ｂ】お湯で処理されたマトリックスの抽出物のＯＰ１活性に対する阻害効果を１２日目の移植片のカルシウム含有量を抽出溶媒の濃度の増加との関連で測定することにより表した棒グラフである。
【図１０Ａ】ＣＯＳ，ＢＳＣおよびＣＨＯ細胞から発現され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の同種の移植片の光学顕微鏡写真（２００×）である。
【図１０Ｂ】ＣＯＳ，ＢＳＣおよびＣＨＯ細胞から発現され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の同種の移植片の光学顕微鏡写真（２００×）である。
【図１０Ｃ】ＣＯＳ，ＢＳＣおよびＣＨＯ細胞から発現され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の同種の移植片の光学顕微鏡写真（２００×）である。
【図１０Ｄ】ＣＯＳ，ＢＳＣおよびＣＨＯ細胞から発現され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の同種の移植片の光学顕微鏡写真（２００×）である。
【図１０Ｅ】ＣＯＳ，ＢＳＣおよびＣＨＯ細胞から発現され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の同種の移植片の光学顕微鏡写真（２００×）である。
【図１０Ｆ】ＣＯＳ，ＢＳＣおよびＣＨＯ細胞から発現され、そして軟骨形成の発生カスケードに続くＯＰ１の同種の移植片の光学顕微鏡写真（２００×）である。
【図１１】ＢＳＣ細胞から発現されたＯＰ１およびお湯で処理された外因性ウシマトリックスを使用した本発明の異種性移植物の組織構造（１２日目）の光学顕微鏡写真である。
【図１２】ＣＯＳ，ＢＳＣおよびＣＨＯ細胞から発現されたＯＰ１を含む同種移植片のアルカリホスファターゼ活性およびカルシウム含有量により測定された１２日目の同種移植片の薬剤量依存性を表すグラフである。
【図１３Ａ】ＣＯＳおよびＢＳＣ細胞において発現されたＯＰ１の薬剤量に対する依存性を蛋白質の濃度の増加に対する（ｎｇで表される薬剤量曲線）アルカリホスファターゼ活性を測定することにより表した棒グラフである。
【図１３Ｂ】ＣＯＳおよびＢＳＣ細胞において発現されたＯＰ１の薬剤量に対する依存性を蛋白質の濃度の増加に対する（ｎｇで表される薬剤量曲線）異種性移植片（１２日目）におけるカルシウム含有量を測定することにより表した棒グラフである。
【０１３９】
（配列表）
配列番号：１
配列の長さ：１３９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列
【０１４０】
【数１３】
2006068018.tif 000017
【０１４１】
配列番号：２
配列の長さ：１３２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列
【０１４２】
【数１４】
2006068018.tif 000018
【０１４３】
配列番号：３
配列の長さ：１１９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列
【０１４４】
【数１５】
2006068018.tif 000019
【０１４５】
配列番号：４
配列の長さ：１１７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列
【０１４６】
【数１６】
2006068018.tif 000020
【０１４７】
配列番号：５
配列の長さ：１１６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列
【０１４８】
【数１７】
2006068018.tif 000021
【０１４９】
配列番号：６
配列の長さ：１１４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列
【０１５０】
【数１８】
2006068018.tif 000022
【０１５１】
配列番号：７
配列の長さ：１８２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ
ハイポセティカル：なし
アンチセンス：なし
起源
生物名：ウシ
組織の種類：骨
直接の起源
ライブラリー名：ヒト胎盤
配列
【０１５２】
【数１９】
2006068018.tif 000023
【０１５３】
【数２０】
2006068018.tif 000024
【０１５４】
【数２１】
2006068018.tif 000025
【０１５５】
【数２２】
2006068018.tif 000026
【０１５６】
【数２３】
2006068018.tif 000027
【図１Ａ】
2006068018.tif 000028
【図１Ｂ】
2006068018.tif 000029
【図２Ａ】
2006068018.tif 000030
【図２Ｂ】
2006068018.tif 000031
【図３Ａ】
2006068018.tif 000032
【図３Ｂ】
2006068018.tif 000033
【図３Ｃ】
2006068018.tif 000034
【図３Ｄ】
2006068018.tif 000035
【図３Ｅ】
2006068018.tif 000036
【図３Ｆ】
2006068018.tif 000037
【図４】
2006068018.tif 000038
【図５Ａ−１】
2006068018.tif 000039
【図５Ｂ−１】
2006068018.tif 000040
【図５Ｃ−１】
2006068018.tif 000041
【図５Ａ−２】
2006068018.tif 000042
【図５Ｂ−２】
2006068018.tif 000043
【図５Ｃ−２】
2006068018.tif 000044
【図６】
2006068018.tif 000045
【図７Ａ】
2006068018.tif 000046
【図７Ｂ】
2006068018.tif 000047
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2006068018.tif 000049
【図８】
2006068018.tif 000050
【図９Ａ】
2006068018.tif 000051
【図９Ｂ】
2006068018.tif 000052
【図１０Ａ】
2006068018.tif 000053
【図１０Ｂ】
2006068018.tif 000054
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
2006068018.tif 000056
【図１０Ｅ】
2006068018.tif 000057
【図１０Ｆ】
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【図１１】
2006068018.tif 000059
【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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