(57)【要約】      （修正有）【課題】ヘリコバクター・ピロリ関連疾患の治療または予防ワクチンの提供。【解決手段】Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陰性個体においてそれに対する免疫反応性が検出される少なくとも１つのヘリコバクタータンパク質、特にヘリコバクター・ピロリタンパク質を含むワクチン。ヘリコバクタータンパク質は好ましくは３０ｋＤａ以下であり、ワクチンは特に２４〜２５ｋＤａおよび／または１８〜１９ｋＤａのタンパク質を含む。ワクチンはアジュバントとしてインターロイキン（１２）を含んでもよい。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陰性個体においてそれに対する免疫反応性が検出される少なくとも一つのヘリコバクタータンパク質、その誘導体、フラグメント、前駆体または変異体を含むワクチン。
【請求項２】
免疫反応性が抗体をベースとする請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
タンパク質がヘリコバクター・ピロリタンパク質である請求項１または２のワクチン。
【請求項４】
タンパク質が単一のタンパク質または３０ｋＤａ以下の分子量を有するタンパク質の混合物である請求項１〜３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項５】
タンパク質が２９ｋＤａ以下の分子量を有する請求項４記載のワクチン。
【請求項６】
タンパク質が２８ｋＤａ以下の分子量を有する請求項４または５記載のワクチン。
【請求項７】
タンパク質が２７ｋＤａ以下の分子量を有する請求項４〜６のいずれかに記載のワクチン。
【請求項８】
２４〜２５ｋＤａのタンパク質、その誘導体、フラグメント、前駆体または変異体を含む請求項１〜７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項９】
２４〜２５ｋＤａのタンパク質が配列番号１に記載のＮ末端アミノ酸配列またはその一部を有する請求項８記載のワクチン。
【請求項１０】
２４〜２５ｋＤａのタンパク質が配列番号Ａに記載の内部アミノ酸配列またはその一部を有する請求項８または９記載のワクチン。
【請求項１１】
タンパク質が１８〜１９ｋＤａのタンパク質、その誘導体、フラグメント、前駆体または変異体を含む請求項１〜１０のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１２】
１８〜１９ｋＤａのタンパク質が配列番号２に記載のＮ末端アミノ酸配列またはその一部を有する請求項１１記載のワクチン。
【請求項１３】
１８〜１９ｋＤａのタンパク質が配列番号３に記載の内部アミノ酸配列またはその一部を有する請求項１１または１２記載のワクチン。
【請求項１４】
１８〜１９ｋＤａのタンパク質が配列番号６に記載のＮ末端アミノ酸配列またはその一部を有する請求項１１〜１３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１５】
医薬的に許容できる担体を含む請求項１〜１４のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１６】
薬理学的に適当なアジュバントと組み合わせた請求項１〜１５のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１７】
アジュバントがインターロイキン１２である請求項１６記載のワクチン。
【請求項１８】
アジュバントが熱ショックタンパク質である請求項１６または１７記載のワクチン。
【請求項１９】
少なくとも１つの他の医薬品を含む請求項１〜１７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２０】
医薬品が抗生物質である請求項１９記載のワクチン。
【請求項２１】
抗生物質がメトロニダゾール、アモキシシリン、テトラサイクリンまたはエリスロマイシン、クラリスロマイシンまたはタニダゾールの一つ以上から選択される請求項２０記載のワクチン。
【請求項２２】
医薬品がビスマス塩のような抗菌剤を含む請求項１９〜２１のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２３】
経口投与のための形態にある請求項１〜２２のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２４】
鼻腔内投与のための形態にある請求項１〜２２のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２５】
静脈内投与のための形態にある請求項１〜２２のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２６】
筋肉内投与のための形態にある請求項１〜２２のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２７】
ペプチドデリバリーシステムを含む請求項１〜２２のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２８】
ヘリコバクター・ピロリ感染またはヘリコパクター・ピロリ関連疾患を治療または予防するための請求項１〜２７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２９】
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陰性個体においてそれに対する免疫反応性が検出されるヘリコバクタータンパク質、その誘導体、フラグメント、前駆体または変異体。
【請求項３０】
免疫反応性が抗体をベースとする請求項２９記載のヘリコバクタータンパク質。
【請求項３１】
ヘリコバクター・ピロリタンパク質である請求項２９または３０記載のヘリコバクタータンパク質。
【請求項３２】
タンパク質が３０ｋＤａ以下の分子量を有する請求項３１記載のヘリコバクター・ピロリタンパク質。
【請求項３３】
タンパク質が２９ｋＤａ以下の分子量を有する請求項３２記載のヘリコバクター・ピロリタンパク質。
【請求項３４】
タンパク質が２８ｋＤａ以下の分子量を有する３２または３３記載のヘリコバクター・ピロリタンパク質。
【請求項３５】
タンパク質が２７ｋＤａ以下の分子量を有する請求項３２〜３４のいずれかに記載のヘリコバクター・ピロリタンパク質。
【請求項３６】
タンパク質が２４〜２５ｋＤａのタンパク質、その誘導体、フラグメント、前駆体または変異体である請求項３１〜３５のいずれかに記載のヘリコバクター・ピロリタンパク質。
【請求項３７】
２４〜２５ｋＤａのタンパク質が配列番号１に記載のＮ末端アミノ酸配列またはその一部を有する請求項３６記載のヘリコバクター・ピロリタンパク質。
【請求項３８】
２４〜２５ｋＤａのタンパク質が配列番号４に記載の内部アミノ酸配列またはその一部を有する請求項３６または３７記載のへリコバクター・ピロリタンパク質。
【請求項３９】
タンパク質が１８〜１９ｋＤａのタンパク質、その誘導体、フラグメント、前駆体または変異体である請求項３２〜３５のいずれかに記載のヘリコバクター・ピロリタンパク質。
【請求項４０】
１８〜１９ｋＤａのタンパク質が配列番号２に記載のＮ末端アミノ酸配列またはその一部を有する請求項３８記載のヘリコバクター・ピロリタンパク質。
【請求項４１】
１８〜１９ｋＤａのタンパク質が配列番号３に記載の内部アミノ酸配列またはその一部を有する請求項３９または４０記載のヘリコバクター・ピロリタンパク質。
【請求項４２】
１８〜１９ｋＤａのタンパク質が配列番号６に記載のＮ末端アミノ酸配列またはその一部を有する請求項３９〜４１のいずれかに記載のヘリコバクター・ピロリタンパク質。
【請求項４３】
ヘリコバクター・ピロリ関連疾患の治療または予防用薬剤の製造のための、請求項２８〜４２のいずれかに記載の一つ以上のヘリコバクタータンパク質の使用。
【請求項４４】
請求項２８〜４２のいずれかに記載のタンパク質様物質に対するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項４５】
請求項２８〜４２のいずれかに記載のワクチンで動物を免疫化することにより得られる精製抗体または血清。
【請求項４６】
免疫学的に有効な量の請求項３６〜３８および／または３９〜４２のヘリコバクター・ピロリタンパク質、インターロイキン１２のようなアジュバント、および抗生物質を含む、ヘリコバクター・ピロリ関連疾患の治療または予防のためのワクチン。
【請求項４７】
アジュバントとしてのインターロイキン１２と組み合わせた、免疫学的に有効な量のヘリコバクター、そのサブユニット、フラグメント、誘導体、前駆体または変異体を含む、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対するワクチン。
【請求項４８】
ヘリコバクターがヘリコバクター・ピロリである請求項４７記載のワクチン。
【請求項４９】
抗生物質を含む請求項４７または４８記載のワクチン。
【請求項５０】
抗菌剤を含む請求項４７〜４９のいずれかに記載のワクチン。
【請求項５１】
ヘリコバクターワクチンにおけるアジュバントとしてのインターロイキン１２の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ヘリコバクター・ピロリ関連疾患の治療または予防のためのワクチンまたは治療組成物およびそのワクチンに使用するタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】  ヘリコバクター・ピロリは、４０歳以下の集団の約３０％において胃の生検に広く見出されている生物であり、年齢がそれより増加するにつれその発生率も上がる。この生物は、ヒトの慢性胃炎の原因因子である（例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＆  Ｗａｒｒｅｎ  １９８４１；Ｂｌａｓｅｒ，１９９０２）。疫学的研究により、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉは胃炎と関連して見出されることが非常に多いことが示されてきた。血清学的探索により、現在または過去に感染した証拠がランダムに選択した給血者集団の３０〜５０％に見出されうることが示されてきた。十二指腸潰瘍疾患に対する直接の因果関係の証明は決定的なものではない。しかしながら、この生物は十二指腸潰瘍の患者の９５％に見出される。さらに、この生物を除去すれば、潰瘍が迅速に癒されることになる（例えば、Ｒａｕｗｓ  ＆  Ｔｙｔｇａｔ，１９９０３）。これらのデータは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉが十二指腸潰瘍の進展における最有力の因子であることの強力な証拠である。これらの症状の発病にＨ．ｐｙｌｏｒｉが関与しているさらなる証拠が、ノトバイオートの子豚を用いた研究（Ｌａｍｂｅｒｔら、１９８７４）およびヒトボランティアでのＫｏｃｈの必要条件の遂行（Ｍａｒｓｈａｌｌら、１９８５５；Ｍｏｒｒｉｓ  ＆  Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，１９８７６）により、提供された。【０００３】  さらに、今では、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉが胃癌の病因であることを暗示する強力な状況証拠がある（例えば、Ｊｉａｎｇら、１９８７７；Ｌａｍｂｅｒｔら、１９８６８；Ｃｒａｂｔｒｅｅら、１９９２９；１９９３１０；Ｆｏｒｍａｎら、１９９０１１，１９９１１２；Ｎｏｍｕｒａら、１９９１１３；Ｐａｒｓｏｎｎｅｔら、１９９１１４）。つい最近、ＦｏｒｍａｎをリーダーとするＥｕｒｏｇａｓｔ研究グループ（１９９３１５）は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの血清陽性と胃癌の死亡率および発生率との有意な関係を明らかにした。実際のところ、今や、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉによる感染が上部胃腸罹患率とかなり比例していることを暗示する説得力のある一連の文献がある。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉが誘導する胃十二指腸疾患の病因機構としていくつかの仮説が示唆されており、その中に、細胞毒の生産や上皮の機構の破壊というもの（例えば、Ｂｌａｓｅｒ、１９９２１６）がある。しかしながら、興味深いことに、多くの感染者は、病原体が持続的に存在するにも拘わらず、自覚症状がない（Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｂｌａｓｅｒ、１９９１１７）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】  本発明により、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陰性個体においてそれに対する免疫反応性が検出される少なくとも一つのヘリコバクタータンパク質、その誘導体、フラグメント、前駆体または変異体を含むワクチンが提供される。好ましくは、免疫反応性は抗体をベースとする。【０００５】  本発明の好ましい態様において、タンパク質はヘリコバクター・ピロリタンパク質である。【０００６】  本発明の好ましい態様において、タンパク質は、３０ｋＤａ以下、とりわけ２９ｋＤａ以下、特に２８ｋＤａ以下、そして理想的には２７ｋＤａ以下の分子量を有する。【０００７】  本発明の特に好ましい態様において、ワクチンは２４〜２５ｋＤａのタンパク質、その誘導体、フラグメント、前駆体または変異体を含む。【０００８】  ２４〜２５ｋＤａのタンパク質は、配列番号２に記載のＮ末端アミノ酸配列、またはその一部を有することをさらに特徴とする。【０００９】  ２４〜２５ｋＤａのタンパク質は、配列番号４に記載の内部アミノ酸配列、またはその一部を有することをさらに特徴とする。【００１０】  本発明の特に好ましい態様において、ワクチンは１８〜１９ｋＤａのタンパク質、その誘導体、フラグメント、前駆体または変異体を含む。【００１１】  最も好ましくは、１８〜１９ｋＤａのタンパク質は、配列番号１に記載のＮ末端アミノ酸配列、またはその一部を有する。【００１２】  また、１８〜１９ｋＤａのタンパク質は、配列番号３に記載の内部アミノ酸配列、またはその一部を含む。【００１３】  本発明の特に好ましい態様において、１８〜１９ｋＤａのタンパク質は、配列番号６に記載のＮ末端配列、またはその一部を有する。【００１４】  ワクチンは、医薬的に許容できる担体を含んでもよい。【００１５】  ワクチンは、インターロイキン１２、熱ショックタンパク質またはその両者のような適当なアジュバントと組み合わせてもよい。【００１６】  ワクチンは、抗生物質および／または抗菌剤（例えば、ビスマス塩）のような少なくとも一つの他の医薬品を含んでもよい。典型的には、この抗生物質は、メトロニダゾール、アモキシシリン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、クラリスロマイシンまたはタニダゾールの一つ以上から選択される。【００１７】  ワクチンは、経口、鼻腔内、静脈内または筋肉内投与のための形態であってもよい。【００１８】  ワクチンはペプチドデリバリーシステムを含んでもよい。【００１９】  ワクチンは、理想的には、ヘリコバクター・ピロリ感染またはヘリコバクター・ピロリ関連疾患の治療または予防のためのものである。【００２０】  本発明のもう一つの見地によれば、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陰性個体においてそれに対する免疫反応性が検出されるヘリコバクタータンパク質、その誘導体、フラグメント、前駆体または変異体が提供される。好ましくは、免疫反応性は抗体をベースとする。【００２１】  好ましくは、ヘリコバクター・ピロリはヘリコバクター・ピロリタンパク質である。【００２２】  本発明の好ましい態様において、タンパク質は、３０ｋＤａ以下、とりわけ２９ｋＤａ以下、特に２８ｋＤａ以下、そして理想的には２７ｋＤａ以下の分子量を有する。【００２３】  本発明の特に好ましい態様において、ヘリコ��クター・ピロリタンパク質は２４〜２５ｋＤａのタンパク質、その誘導体、フラグメント、前駆体または変異体である。【００２４】  ２４〜２５ｋＤａのヘリコバクター・ピロリタンパク質は、配列番号２に記載のＮ末端アミノ酸配列、またはその一部を含むことを特徴とする。【００２５】  ２４〜２５ｋＤａのヘリコバクター・ピロリタンパク質は、配列番号４に記載の内部アミノ酸配列、またはその一部を含むことをさらに特徴とする。【００２６】  本発明のもう一つの好ましい態様において、ヘリコバクター・ピロリは１８〜１９ｋＤａのタンパク質、その誘導体、フラグメント、前駆体または変異体である。【００２７】  １８〜１９ｋＤａのヘリコバクター・ピロリは、配列番号１に記載のＮ末端アミノ酸配列、またはその一部を含むことを特徴とする。【００２８】  １８〜１９ｋＤａのヘリコバクター・ピロリは、配列番号３に記載の内部アミノ酸配列、またはその一部を含むことをさらに特徴とする。【００２９】  １８〜１９ｋＤａのヘリコバクター・ピロリは、配列番号６に記載のＮ末端アミノ酸配列を含むことをさらに特徴とする。【００３０】  本発明は、また、免疫学的に有効な量の一つ以上の本発明のヘリコバクタータンパク質を宿主に投与することを含む、宿主におけるヘリコバクター・ピロリ関連疾患の治療または予防方法を提供する。【００３１】  好ましくは、ヘリコバクター・ピロリタンパク質は、少なくとも一つの他の医薬と組み合わせて投与される。【００３２】  好ましい態様において、医薬は抗生物質である。【００３３】  理想的には、抗生物質は、メトロニダゾール、アモキシシリン、テトラサイクリンまたはエリスロマイシン、クラリスロマイシン、タニダゾールの一つ以上から選択される。【００３４】  典型的には、医薬はビスマス塩のような抗菌剤を含む。【００３５】  本発明の好ましい態様において、アジュバントがヘリコバクタータンパク質と組み合わせて投与される。好ましくは、アジュバントはインターロイキン１２、熱ショックタンパク質またはその両者である。【００３６】  本発明は、また、ヘリコバクター・ピロリ関連疾患の治療または予防用薬剤の製造のための、一つ以上の本発明のヘリコバクタータンパク質の使用を提供する。【００３７】  本発明は、さらに、本発明のタンパク質様物質に対するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはそのフラグメント、および本発明のワクチンで動物を免疫化することにより得られる精製抗体または血清を提供する。【００３８】  本発明は、また、ヘリコバクター関連疾患、特にヘリコバクター・ピロリ関連疾患の治療または予防における上記血清および抗体の使用を提供する。【００３９】  本発明は、また、免疫学的に有効な量の本発明の２４〜２５ｋＤａのヘリコバクター・ピロリタンパク質および／または１８〜１９ｋＤａのヘリコバクター・ピロリタンパク質、アジュバント（例えば、インターロイキン１２）、および抗生物質を含む、ヘリコバクター・ピロリ関連疾患の治療または予防のためのワクチンを提供する。【００４０】  ワクチンは、ビスマス塩のような抗菌剤を含んでもよい。【００４１】  本発明は、また、１８〜１９ｋＤａのタンパク質、２４〜２５ｋＤａまたは他��いずれかのＨ．ｐｙｌｏｒｉサブユニットと組み合わせたインターロイキン１２のアジュバント療法としての使用を含む。【００４２】  従って、もう一つの見地において、本発明は、アジュバントとしてのインターロイキン１２と組み合わせた免疫学的に有効な量のヘリコバクター、そのサブユニット、フラグメント、誘導体、前駆体または変異体を含む、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対するワクチンを提供する。好ましくは、ヘリコバクターはヘリコバクター・ピロリである。【００４３】  本発明の一つの態様において、ワクチンは抗生物質を含み、その代わりにあるいはさらに抗菌剤を含んでもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】  本発明者らは、感染および未感染のヒトの両者におけるＨ．ｐｙｌｏｒｉに対する免疫反応性の普及を検討し、未感染のヒトがそのＢ細胞およびＴ細胞系の両方においてＨ．ｐｙｌｏｒｉに対する高い応答性を示すことを見い出した。特に、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対するＴ細胞免疫応答は、この生物について陰性のヒトにおいてより強いようである。この点に関して、本発明者らは、マクロファージによる微生物の殺傷に極めて重要であるサイトカイン−インターフェロンの分泌について検討した。Ｔ細胞がこの生物に晒されたとき、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに感染した患者のＴ細胞による−インターフェロンの分泌は、未感染者による分泌よりもかなり少なかった（Ｆａｎら、１９９３１８）。従って、これらのデータは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陰性であるヒトがこの生物に晒されて、この生物を排除した可能性があることを示唆している。さらに、この生物に対する応答は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陽性の患者におけるよりもこの群のヒトにおいてかなり強い。【００４５】  “Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陰性の個体ないしはヒト”という用語は、急速ウレアーゼ試験法（ｒａｐｉｄ  ｕｒｅａｓｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ）、組織学的検討または胃生検の培養の一つ以上のような技術により測定したときにＨ．ｐｙｌｏｒｉの胃コロニー形成の証拠を示さない、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対して免疫反応性を有する個体ないしはヒトを意味する。【００４６】  第２の成分は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陰性の個体におけるＨ．ｐｙｌｏｒｉに対する抗体反応に関する。簡単に言うと、本発明者らは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陰性のヒトの大多数が２つのＨ．ｐｙｌｏｒｉタンパク質に対する検出可能な抗体を有することを感度の高い検出系を用いて明らかにした。詳細には、これらのタンパク質はＭＷ１８〜１９および２４〜２５ｋＤａのものである。かくして、これらの抗原に対する強力な免疫応答により、この生物に対する保護免疫が得られることが提案される。さらに、本発明者らは、これらのタンパク質を部分的に配列決定した。【００４７】  多くの場合、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対する抗体がＥＬＩＳＡにより検出される。【００４８】  ＥＬＩＳＡをベースとする検出系の設計に固有の制約は、この閾値以下のすべての試料は陰性であるとみなされるようなカットオフポイントを確立することの制約である。明らかに、多くの血清陽性なヒトはこの状況で検出されないでいるために、この生物と過去に接触したことがあることを評価することは軽んじられる。この方法において、本発明者らは、ウェスタンブロッティングを用いて、健常人およびＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染者の両方におけるＨ．ｐｙｌｏｒｉに対する全身的な応答の抗原特異性を研究し、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陰性のヒトにおいて血清陽性であることは、以前から示されてきたものよりもはるかに多いことを示した。さらに、本発明者らは、２４〜２５ｋＤａタンパク質に対する抗体がＨ．ｐｙｌｏｒｉ陰性のヒトの大多数で検出可能であることを明らかにした。これらのことは、本発明者らがいわゆる増強化学発光（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を改良した技術を用いて見つけた。ウェスタンブロット分析上での増強化学発光により、未感染者の大多数は、Ｈ．ｐｙｌｏ��ｉに特異的で他の微生物上に存在しない抗原を認識する抗体を持っていることがわかった。これらの抗原のうち、認識される最も共通性の高いものは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに特異的であると思われる２４〜２５ｋＤａのタンパク質である。従って、これらのデータは、２４〜２５ｋＤａのタンパク質またはそのサブユニットで免疫化することにより、この生物に未感染であるか、あるいは、この生物が抗細菌処理により排除されたヒトに保護免疫を与えることができることを示唆している。第２のタンバク質はまた、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陰性のヒトの大きなサブグループで１８〜１９ｋＤａに同定された。同様に、このタンパク質またはそのサブユニットで免疫化すると、保護免疫を与えることができる。【００４９】  本発明者らは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対する抗体を検出するための新規なアッセイを開発した。このアッセイは、ウェスタンブロッティングと増強化学発光（ＥＣＬ）を使用する。このアッセイを用いて、本発明者らは、急速ウレアーゼ試験のようなルーチン試験法でＨ．ｐｙｌｏｒｉについて陰性であるヒトの約７５％が実際にＨ．ｐｙｌｏｒｉに対する検出可能な抗体を獲得していることを明らかにした（第１図）。【００５０】  さらに、これらの抗体はＣ．ｊｅｊｕｎｉまたはＥ．ｃｏｌｉによって吸収されず、このことは、これが特異的な抗体応答であることを示唆している（第２図）。特に注目すべきことは、本発明者らが、ＥＣＬウェスタンブロッティングを用いて、これらの抗体により認識される抗原の分子量による特性決定を行ったことである。未感染者からの血清はＨ．ｐｙｌｏｒｉ上の一連の抗原を認識する。認識される最も共通性の高い抗原は、急速ウレアーゼ試験法においてこの生物について陰性であるヒトの７０％以上で認識される２４〜２５ｋＤａのタンパク質である。従って、このことは、この２４〜２５ｋＤａのタンパク質が、この生物について陰性であるヒトにおける強力な免疫応答を引き起こす免疫優性な抗原であるかもしれないことを示唆している。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陰性の小児における有意な抗体応答を引き起こす第２のタンパク質は１８〜１９ｋＤａに同定された。これらのタンパク質については、さらにＮ末端および内部配列決定により特性決定したが、それは付録にまとめてある。【００５１】  最後に、マクロファージにより産生されたサイトカインであるいわゆるインターロイキン１２は、抗原に対する応答においてγインターフェロンの産生を有意に増強する可能性がある。以前に述べたように、抗原特異的インターフェロンの産生はＨ．ｐｙｌｏｒｉ陽性のヒトについて減少している。２５ｋＤａのタンパク質を用いる免疫化の計画にＩＬ−１２を加えると、γインターフェロン応答を増強することにより、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対する宿主の免疫化を高めることが予想される。【００５２】材料  すべて抗体は、Ｄａｋｏ  Ｌｔｄ．，Ｈｉｇｈ  Ｗｙｃｏｍｂｅ，Ｂｕｃｋｓ．，Ｕ．Ｋ．から得た。すべての他の化学薬品および溶媒は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ．，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ，Ｕｎｉｔｅｄ  ＫｉｎｇｄｏｍまたはＢＤＨ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ��ら得た。【００５３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  不連続ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、本質的にＬａｅｍｍｌｉ（１９７０）１９に記載されているように行った。全部で５ｍｇのアセトン沈殿Ｈ．ｐｙｌｏｒｉタンパク質を各ウェルに置いた。ゲルはクーマシーブルーＲ−２５０で染色するか、イムノブロッティング用の処理を行った。広範囲の分子量マーカーをＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，３３００  Ｒｅｇａｔｔａ  Ｂｌｖｄ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ  ９４８０４から購入した。分子質量はｋＤａで表す。【００５４】ウェスタンブロッティング  本質的にＴｏｗｂｉｎら、（１９７９）に記載のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（３０％  Ｔ／２．６７％  Ｃ）からのタンパク質を半乾燥ブロッティング装置（ＬＫＢ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてＰＶＤＦ膜に電気ブロットした（０．８ｍＡ／ｃｍ２、１時間）。増強化学発光と組み合わせた、１／５，０００希釈の抗ヒトＩｇＧ（ホースラデッシュペルオキシダーゼ結合）を用いて、一次抗体（ヒト血清；１／５０〜１／１００希釈）を検出した。ブロットを脂肪不含の乾燥脱脂乳（５％、ｗ／ｖ）とＴｗｅｅｎ−２０（０．０５％、ｖ／ｖ）を含有するＰＢＳ中で洗浄した。ブロットをＫｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴ  Ｓフィルムに１〜１０秒間感光した。感光したフィルムをＫｏｄａｋ  ＬＸ−２４現像機において現像し、Ｋｏｄａｋ歯科用Ｘ線固定機において固定した。【００５５】血清  血清試料は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｏｕｒ  Ｌａｄｉｅｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｆｏｒ  Ｓｉｃｋ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ，Ｃｒｕｍｌｉｎ，Ｄｕｂｌｉｎから得た。すべての被験者は胃腸病学的疾患以外の医学的症状のために看護されていた。さらに、血液試料は、ランダムに選択した小児のコホート（群）（Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｓｔｒｅｅｔ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｄｕｂｌｉｎ）またはＳｔ．Ｊａｍｅｓ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｄｕｂｌｉｎで胃腸病学ユニットに通っている成人から得た。すべての患者には急速ウレアーゼ（ＣＬＯ試験）が行われた。患者は、急速ウレアーゼ試験における陽性または陰性の応答に基づいて、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陽性または陰性と定義された。【００５６】抗Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗血清  抗Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗血清は、Ｂ．Ｄｒｕｍｍ教授とＭ．Ｃｌｙｎｅ博士から好意により無償で提供されたものである。ニュージーランド白ウサギにおいて、常法の免疫化および追加免疫化手法を用いて、全Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対する抗血清を作製した。【００５７】タンパク質の測定  タンパク質は、Ｍａｒｋｗｅｌｌら（１９７８）２０の方法により、タンパク質標準としてウシ血清アルブミンを用いて測定した。【００５８】血清の吸収  細菌の懸濁液を患者血清と一緒に２時間室温で穏やかに攪拌しながらインキュベートすることにより、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｊｅｊｕｎｉのいずれかで抗血清を吸収させた。細菌は懸濁液から遠心（１２，０００ｘ  ｇ、３分間）により取り除いた。【００５９】細菌株および増殖条件  この研究に使用した臨床単離物であるＨ．ｐｙｌｏｒｉは、Ｓｔ．Ｊａｍｅｓ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｄｕｂｌｉｎの胃腸病学診察室に通っている患者から得た洞生検から単離した。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉは、微好気性条件下で４日間７％溶解ウマ血液寒天上で３７℃で増殖させた。ＰＭＳＦ（１ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）、およびロイペプチン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）に細胞を回収した。この細胞を使用前にこの緩衝液中で遠心（１０，０００ｘ  ｇ、５分間、４℃）により２回洗浄した。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ腸炎の患者の大便からの臨床単離物であり、インキュベーション温度が４２℃であった他は正確に上記の方法で２日間増殖させた。この研究に用いたＥ．ｃｏｌｉの株は市販の（Ｇｉｂｃｏ）ＮＴＣＣ１１６３７であり、Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｄｕｂｌｉｎ大学薬学部のＣｉａｒａｎ  Ｃｒｏｎｉｎ博士が好意で提供してくれた。【００６０】ヘリコバクター・ピロリからの２つの新規な抗原の同定および部分精製に用いた方法
方法
ウェスタンブロッティング。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（３０％  Ｔ／２．６７％  Ｃ）からのタンパク質を半乾燥ブロッティング装置（ＬＫＢ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてＰＶＤＦ膜に電気ブロットした（０．８ｍＡ／ｃｍ２、１時間）。増強化学発光（以下を参照のこと）と組み合わせて、１／５，０００希釈の抗ヒトＩｇＧ（ホースラデッシュペルオキシダーゼ結合）を用いて、一次抗体（ヒト血清；１／５０〜１／１００希釈）を検出した。ブロットを脂肪不含の乾燥脱脂乳（５％、ｗ／ｖ）とＴｗｅｅｎ−２０（０．０５％、ｖ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）において洗浄した。ブロットをＫｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴ  Ｓフィルムに１〜１０秒間感光した。感光したフィルムをＫｏｄａｋ  ＬＸ−２４現像機において現像し、Ｋｏｄａｋ歯科用Ｘ線固定機において固定した。【００６１】増強化学発光（ＥＣＬ）
色素原を使用したときに見られるよりも検出感度が高くなる（約１０倍）ことが報告されているという主な理由により、検出試薬として色素原基質を採用する常套の手法の代わりに、ウェスタンブロッティングにおいて抗体を検出するために化学発光を使用することにした。酸化ルミノールは可視光を放射し、この光放出の強度は化学増強剤（例えば、ヨードフェノール）の存在下で１０００倍増加する。この方法を以下に記載する。【００６２】  基質                      濃度／量
ルミノール            １．２ｍＭ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（５０ｍｌ）、ｐＨ８．８中）
４−ヨードフェノール  ０．４ｍＭ（使用前にＤＭＳＯに溶解）
過酸化水素            １７μｌの３０％（ｖ／ｖ）溶液
上記の混合物中で１分間ブロットをインキュベートし、その後、上記のようにＸ線フィルムに感光させた。【００６３】１８および２５ｋＤａのタンパク質の部分精製
両タンパク質を４９１型Ｐｒｅｐ−Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分取連続溶出ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分子量を基準として全ヘリコバクター・ピロリから部分精製した（第２図）。この方法により、溶液の形態の分取量のタンパク質を定量的に精製することができる。【００６４】精製方法
２５ｍｇのＨ．ｐｙｌｏｒｉを氷冷アセトンで沈殿させ、アセトン中で１回洗浄し、その後、この沈殿を３．８ｍｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（６２ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８；グリセロール（１０％，ｖ／ｖ）；ＳＤＳ（２％，ｖ／ｖ）；２−メルカプトエタノール（５％，ｖ／ｖ）；ブロムフェノールブルー（０．００２％，ｖ／ｖ）に可溶化した。試料の作製は、非常に些細な変更はあるものの、公表されている電気泳動法に従った。【００６５】ローディング：  試料緩衝液中のタンパク質混合物を１２．５％ポリアクリルアミドチューブゲル（３０％  Ｔ／２．６７％  Ｃ）にローディングした。チューブゲルの大きさは、２８ｍｍ内径；上部表面３．６ｃｍ２；濃縮用ゲル２ｃｍ；分解ゲル１０ｃｍであった。【００６６】ランニング条件：  電気泳動を４０ｍＡ（定電流）で一晩室温で行った。画分（１ｍｌ）を０．１ｍｌ／分で回収した。各画分（５μｌ）の試料を分析ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、各タンパク質の純度と抗原性を評価した。個々の免疫原性のタンパク質を単離して特性決定する試みにおいて、目的の分子質量領域内のすべての画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（純度を評価するため）とウェスタンブロッティング（抗原性を評価するため）の両方でスクリーニングした。この手法の分離度は、ひとたび最適な電気泳動条件が確立されれば単一のタンパク質の純粋な調製品が得られるという程度である。予備最適化プロトコールには、低分子量タンパク質が高精度で分離されるのに都合のよいように設定された条件下でＨ．ｐｙｌｏｒｉタンパク質の混合物を電気泳動することが必要であった。選択されたタンパク質の部分精製を達成するために用いられる最終の電気泳動条件は方法のセクションで詳細に述べる。これらの厳密な条件を用いることにより、１８ｋＤａのタンパク質が１１〜１４ｍｌの間に溶出し、２５ｋＤａのタンパク質が１６〜２０ｍｌの間に溶出した。一連の低分子量マーカータンパク質（範囲：１４．５ｋＤａ〜６６ｋＤａ；コード：Ｓｉｇｍａ  ＳＤＳ−７）を用いた分析ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、このタンパク質の分子量を測定し、ウェスタンブロッティングでこれらのタンパク質が相的の免疫原であることを確認した。【００６７】  第１図は、急速ウレアーゼ試験法でＨ．ｐｙｌｏｒｉについて陰性のヒトにおけるＨ．ｐｙｌｏｒｉに対する抗体応答のウェスタンブロット分析を示す。ウェスタンブロッティングは、増強化学発光検出系を用いて前述のように行った。急速ウレアーゼ試験法でＨ．ｐｙｌｏｒｉ陰性であるヒトにおいて、広範囲のＨ．ｐｙｌｏｒｉタンパク質に対する抗体が見られた。抗体が検出された最も共通性の高い抗原は２５ｋＤａのタンパク質であった。第３図は、２５ｋＤａおよび１８ｋＤａのタンパク質の分取ＳＤＳゲル溶出プロフィールを示す。これらのタンパク質は、付録にまとめてあるように、Ｎ末端および内部配列決定によりさらに特性決定してある。【００６８】実施例１
ＣＬＯ陰性の成人
同様に、１９人の成人血清のコホートを抗Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ  ＩｇＧ抗体に対してスクリーニングした。これらの被験者の各々はＣＬＯ陰性であり、さらに８３％はＨ．ｐｙｌｏｒｉに対する検出可能な抗体（ＩｇＧ）を有していた（第１図）。まとめると、これらのデータは、多くが過去にＨ．ｐｙｌｏｒｉと接触していたことを示唆している。抗体が検出された最も共通性の高い抗原は２５ｋＤａのものであった。【００６９】ＣＬＯ陰性の小児
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対する全身の体液性免疫応答（ＩｇＧ）を２群の小児においても研究した。これらの被験者はいずれもいかなる形態の抗Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ治療を受けたことがない。しかしながら、ほとんどすべての場合、これらの小児はＨ．ｐｙｌｏｒｉに対して特異的な抗体応答を示した。第一のコホート研究は、ＣＬＯ試験でＨ．ｐｙｌｏｒｉについて陰性の２０人の小児（年齢：４〜１５歳）からなっていた。これらのうち、７５％がＨ．ｐｙｌｏｒｉに対する検出可能なＩｇＧ抗体を有していた（第４図）。【００７０】  第二のコホートの小児（ｎ＝２０）は無症候で、病院では胃腸疾忠以外の症状を呈していた。しかし、１３／１８（７２％）は、いくつかのＨ．ｐｙｌｏｒｉ特異的抗原に対する検出可能なＩｇＧ抗体を有していた。しかしながら、この応答の強度から、これらのデータは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陽性のヒトについて観察されたかなり強い応答と比較したとき、抗体応答が過去におけるこの細菌との接触による可能性が高いことを示唆している。【００７１】実施例２
他の細菌との交差反応性
多くの細菌は共通の抗原決定基を有しているので、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉとこれに非常に近いＣ．ｊｅｊｕｎｉ、さらにＥ．ｃｏｌｉとの間の交差反応性の程度を２つのコンプリメンタリーな（Ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）方法を用いて検討した。まず始めに、抗Ｈ．ｐｙｌｏｒｉポリクローナル抗血清がＣ．ｊｅｊｕｎｉおよびＥ．ｃｏｌｉの両方にある抗原を認識する能力をウェスタンブロッティングにより検討した（第２図）。【００７２】  抗Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗血清はＥ．ｃｏｌｉおよびＣ．ｊｅｊｕｎｉの両方にあるいくつかの抗原決定基を認識した。詳細には、この抗血清は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉにある分子質量７２、５０、４０、３６、および２５ｋＤａのタンパク質並びにＥ．ｃｏｌｉにある分子質量２００、１１６、４５、および３８ｋＤａのタンパク質を認識する（第５図）。これらのうち、３つのタンパク質（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来の７０、２５ｋＤａのもの、およびＥ．ｃｏｌｉ由来の２００ｋＤａのもの）だけが抗Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗血清との顕著な交差反応性を示す。従って、観察された交差反応性が広いものでないことは明らかである。第二に、吸収実験により、この交差反応性の抗原認識はあまり重要ではないことが示された。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉおよびＣ．ｊｅｊｕｎｉの臨床単離物、さらに市販のＥ．ｃｏｌｉ株で吸収された血清試料は、血清反応性がＨ．ｐｙｌｏｒｉでの吸収により消失しうるが、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉまたはＥ．ｃｏｌｉでの吸収によっては消失しえないことが明らかとなった（第２図）。第２図は代表的な実験である。吸収の研究は、ここに示した結果と同様の結果を示した本研究においてスクリーニングした血清試料の約半分について行った。この１８および２５ｋＤａのタンパク質は、試験したすべての臨床株の他にＨ．ｐｙｌｏｒｉ対照株ＮＴＣＣ１１６３７および１１６３８においても検出された。【００７３】  第３図に示したような分取連続溶出電気泳動により２４〜２６ｋＤａのタンパク質を部分精製し、精製した２４〜２６ｋＤａタンパク質のウェスタンブロットを未感染者からの血清で釣り上げることにより、この２４〜２６ｋＤａのタンパク質の抗原性を確認した（第６図）。第６図に示した例は、このブロットをＨ．ｐｙｌｏｒｉに未感染のヒトからの血清とともにインキュベートした代表的な実験である。明らかに、この血清試料は２４〜２６ｋＤａのタンパク質を特異的に認識する抗体を含有しており、さらに、この実験の結果は、この抗原調製品においてはこのタンパク質が高度に純化されており、この調製品には他の免疫原性タンパク質が存在しないことを示している。１８〜２０ｋＤａのタンパク質についても同様の結果が得られた。【００７４】実施例３
全無傷ヘリコバクター・ピロリのビオチン化
寒天増殖Ｈ．ｐｙｌｏｒｉをリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）中に回収して、この緩衝液で２回洗浄してから、表面露出タンパク質をビオチン化した。細菌（〜２ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳ（１ｍｌ）中に再懸濁し、３７℃に予備加温した。その後、ビオチン−Ｘ−ＮＨＳ（スルホサクシンイミジル−６（ビオチンアミド）−ヘキサノエート；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を最終濃度１ｍＭまで添加し、使用の直前に調製した。１０分間３７℃で混合した後、１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８）を最終濃度１０ｍＭまで添加することにより標識化反応を停止させた。この懸濁液を遠心（１０，０００ｇ、１分間）により氷冷ＰＢＳ中で３回洗浄した。標識化と洗浄操作の後にこの細菌を光学顕微鏡で観察して検討したところ、細胞がまだ無傷で運動性であることがわかった。【００７５】ビオチン化タンパク質の分析
ビオチン化したＨ．ｐｙｌｏｒｉを分析および分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでウェスタンブロッティングにかけ、ビオチン化タンパク質を同定した。ウェスタンブロットをＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）で発色させた。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉタンパク質へのビオチンエステルのかなりの程度の取り込みが観察された（第７図）。さらに、１８〜２４ｋＤａの領域のタンパク質がいくつかの他のタンパク質と同じようにビオチン化されることは明らかであり（第１表）、このことは、これらのタンパク質がこの細菌の表面に存在することを示している。【００７６】
【表１】
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【００７７】方法の記載
ヘリコバクター・ピロリに対するＴ細胞免疫応答
チミジン取り込みアッセイを用いて、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対するＴリンパ球増殖応答について検討した。簡単に説明すると、フィコール−ハイパック勾配上での密度勾配遠心分離法によりリンパ球を単離した。リンパ球を９６ウェルマイクロタイタープレートに１０５細胞／ウェルの密度で１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地に蒔いた。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの超音波および照射処理した調製品を３μｇ／ｍｌの濃度で添加した。対照ウェルには培地だけを添加した。さらに、インターロイキン１２（Ｒ＆Ｄ  ｓｕｐｐｌｉｅｒｓ）を５００ｐｇ／ｍｌの濃度で添加した。その後、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター中で４日間３７℃で培養した。４日目に、力価測定したチミジン１μＣｉ／ｍｌを添加し、培養をさらに２４時間続けてから、多数自動試料回収機を用いて回収を行った。追加の実験においては、上記のようなＨ．ｐｙｌｏｒｉ調製品の存在および不存在下で、ＣＤ３  Ｔ細胞レセプター結合複合体に対するＯＫＴ３抗体を用いて、細胞を刺激した。これらの検討において、インターロイキン１２を同様に添加した。インターロイキン１０に対する抗体をいくつかの実験において添加した。【００７８】実施例４
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対するＴ細胞応答はインターロイキン１２により有意に増大する
方法論のところで記載したように、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対するリンパ球増殖応答を検討した患者のコホートにおいて、インターロイキン１２はＨ．ｐｙｌｏｒｉの末梢血単核細胞集団の増殖を高めた（ｎ＝１２，ｐ＜．０５）（第８図）。これらのデータは、明らかに、インターロイキン１２がＨ．ｐｙｌｏｒｉ免疫原性に対してアジュバント性を有することを示している。【００７９】インターロイキン１２はＨ．ｐｙｌｏｒｉにより誘導されたＴ細胞応答の抑制を抑える。【００８０】  Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗原調製品は、Ｔ細胞マイトジェンＯＫＴ３により誘導された増殖を有意に抑制する。この抑制は、インターロイキン１０（これは、細胞増殖に関与するＴヘルパー１細胞経路を抑制することが知られているＴヘルパー２細胞により生産されるサイトカインである。）に対する抗体を用いることにより解除することができた。従って、これらのデータは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉにより誘導されたＴ細胞増殖の抑制がインターロイキン１０によりＴヘルパー２経路を通じて達成されることを示唆している。インターロイキン１２もＨ．ｐｙｌｏｒｉにより誘導されたＴ細胞応答の抑制を解除し、増殖応答をベースラインのＯＫＴ３誘導応答以上に有意に増大させたが、このことは、このサイトカインがＨ．ｐｙｌｏｒｉ  Ｔヘルパー２経路の作用を抑えることができることを示唆している。【００８１】  第８図は、インターロイキン１２の存在および不存在下でのＨ．ｐｙｌｏｒｉに対する応答におけるリンパ球のチミジン取り込みを説明する。インターロイキン１２は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに応答して末梢血単核細胞の増殖を有意に高めた。【００８２】  第９図は、抗インターロイキン１０または組換えインターロイキン１２とともにあるいはなしでの、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの存在および不存在下での末梢血単核細胞のチミジン取り込みを説明する。インターロイキン１２と抗インターロイキン１０のどちらも、リンパ球増殖のＨ．ｐｙｌｏｒｉ誘導抑制を有意に解除した。【００８３】  インターロイキン１２はアジュバントとしても、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉタンパク質、その誘導体またはフラグメントのいずれかとともに使用できることが理解されよう。その使用は、先に言及した特定の２５ｋＤａまたは１８ｋＤａのタンパク質に限定されるものではない。インターロイキン１２は、例えば、消化性ペプチドや胃の酵素／またはウレアーゼにより、このインターロイキンがｉｎ  ｖｉｖｏで放出されるように、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉユニットと結合するのかもしれない。【００８４】  ２４〜２５ｋＤａおよび１８〜１９ｋＤａの分子質量について言及してきたが、この分子質量は２４〜２６ｋＤａおよび１７〜１９ｋＤａの範囲にあるかもしれないことが当業者により理解されよう。Ｈ．ＦｅｌｉｓやＨ．ｍｕｓｔｅｌｉｓのような他の関連生物も動物モデルにおいて胃の疾患を生じしめるかもしれない。【００８５】  ヘリコバクター種からのタンパク質間の交差反応性は、個々の細菌種からの抗原が通常の宿主ではない動物における保護を与えることができることを意味しているのかもしれない。【００８６】  抗体がヘリコバクター・ピロリ陰性の個体において検出される有力な抗原は１８〜１９および２４〜２５ｋＤａの抗原である。従って、３０ｋＤａ以下、好ましくは２９ｋＤａ以下、理想的には２８ｋＤａ以下、好ましくは２７ｋＤａ以下のすべての抗原を含有する抗原調製品を使用したり、これらの抗原を免疫優性の抗原中で純化して、推定のワクチンに使用する。【００８７】  サイトカインであるインターロイキン１２はアジュバントとして作用してＨ．ｐｙｌｏｒｉの免疫原性を高めるようである。特に、それは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの３０ｋＤａ以下のタンパク質画分、とりわけ１８ｋＤａおよび２５ｋＤａタンパク質画分の免疫原性を高める。【００８８】  インターロイキン１２をアジュバントとしてもＨ．ｐｙｌｏｒｉタンパク質、その誘導体またはフラグメントとともに使用できるかもしれないことが理解されよう。その使用は、先に言及した特定の２５ｋＤａまたは１８ｋＤａのタンパク質に限定されるものではない。インターロイキン１２は、例えば、消化性ペプチドや胃の酵素／またはウレアーゼにより、このインターロイキンがｉｎ  ｖｉｖｏで放出されるように、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉユニットと結合するのかもしれない。【００８９】  ２４〜２５ｋＤａおよび１８〜１９ｋＤａの分子質量について言及してきたが、この分子質量は２４〜２６ｋＤａおよび１７〜１９ｋＤａの範囲にあるかもしれないことが当業者により理解されよう。Ｈ．ＦｅｌｉｓやＨ．ｍｕｓｔｅｌｉｓのような他の関連生物も動物モデルにおいて胃の疾患を生じしめるかもしれない。【００９０】  ヘリコバクター種からのタンパク質間の交差反応性は、個々の細菌種からの抗原が通常の宿主ではない動物における保護を与えることができることを意味しているのかもしれない。【００９１】  抗体がヘリコバクター・ピロリ陰性の個体において検出される有力な抗原は１８〜１９および２４〜２５ｋＤａの抗原である。従って、３０ｋＤａ以下、好ましくは２９ｋＤａ以下、理想的には２８ＫＤａ以下、好ましくは２７ｋＤａ以下のすべての抗原を含有する抗原調製品を使用したり、これらの抗原を免疫優性の抗原中で純化して、推定のワクチンに使用する。【００９２】ヘリコバクター・ピロリからの２つの抗原の部分配列決定
Ｎ末端配列分析
精製した１８および２４ｋＤａのタンパク質を、１２．５％ポリアクリルアミドゲルから、それぞれ、ＰＶＤＦおよびＰｒｏＢｌｏｔｔに電気ブロットした。０．１％アミドブラック（１％酢酸、４０％メタノール中）で１５秒間染色し、次いで蒸留脱イオン水を数回取り替えて脱染することにより、これらのタンパク質を膜の上に見いだした。この膜をよく風乾し、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ（１９８９２１）に記載のようにエドマン分解法を用いて配列分析するために提供した。【００９３】  ２５および１８ｋＤａのタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１および２に記載する。【００９４】ペプチドマッピング
ＬｉｓｃｈｗｅおよびＯｃｈｓ（１９８２）２２のＮ−クロロサクシンイミドペプチドマッピング法を少々変更して用いた。ゲルを０．１％クーマシーブルーＲ２５０（５０％メタノール、１０％  酢酸中）で簡単に染色することにより目的のバンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２．５％  Ｔ）上に見いだし、次いで、解剖用メスの刃で切り出した。ゲル片に存在するタンパク質を酢酸／尿素／水（１：１：１，ｖ／ｗ／ｖ）中のＮ−クロロサクシンイミド（１５ｍＭ）で３０分間２０℃で消化した。その後、処理したゲル片を水を数回取り替えて洗浄し、ＬｉｓｃｈｗｅおよびＯｃｈｓが記載したとおりにＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で平衡化した。最後に、このゲル片を１５％ポリアクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの試料ウェルに置き、電気泳動した。電気泳動に続き、ウェスタンブロッティングにより分離ペプチドをＰＶＤＦまたはＰｒｏＢｌｏｔｔのいずれかに移した。膜を酢酸（１％）およびメタノール（４０％）中の０．１％アミドブラックで染色することにより、ペプチドを視覚化した。水でよく洗浄した後、ペプチドをさらなる変更なしに配列決定するために提供した。【００９５】  すべてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動操作の間、メルカプト酢酸（２ｍＭ）を上部電極に含ませた。この移動性チオールは、フリーラジカル捕捉剤としてふるまうので、Ｎ−ブロッキングを防止する。【００９６】  １８および２５ｋＤａのタンパク質からの内部ペプチドのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３および４に記載する。【００９７】ヘリコバクター・ピロリ染色体ＤＮＡの抽出
記載される（Ｓｉｌｈａｖｙら，１９８４．遺伝子融合を用いた実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎｓ）．Ｃ．Ｓ．Ｈ．ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）ように、染色体ＤＮＡを抽出した。【００９８】縮重プライマーを用いた１８〜１９ｋＤａタンパク質遺伝子の配列の増幅
縮重ＤＮＡ配列を配列番号２および３に記載のアミノ酸配列から推定した。２段階の重ね合わせ（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ反応のために、４つの縮重プライマーをこれらの配列から設計した。続くこのフラグメントのクローニングのために、Ｅａｇ１制限酵素部位を各プライマーに構築した。３つ以上の塩基がある部位で可能な場合には、すべての可能な塩基が含まれているときにその部位がプライマーの３’（３プライム）末端から４つ以下の塩基である場合を除き、すべての可能な塩基の代わりにイノシンを組み入れた。また、このＥａｇ１部位のすぐ隣の位置ではイノシンを避けた。【００９９】遺伝子ｐ１８用の縮重プライマー【０１００】
【化１】
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【０１０１】  外部のセットのプライマー（プライマー１＆２）を用いて、１８〜１９ｋＤａタンパク質遺伝子ｐ１８のゲノムＤＮＡを以下のようにして増幅した。試料を９４℃に３分間加熱してＤＮＡを変性させ、次いで、９４℃で３０秒間、５６℃で４０秒間、そして７２℃で３０秒間の３５サイクルで処理した。２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．２ｍＭ  ｄＮＴＰの存在下、５０μｌの反応容積で、１００ｐｍｏｌの各プライマーを使用した。この反応物１μｌを重ね合わせ反応の基質として使用した。この反応は、外部のプライマーを内部のプライマー（プライマー３＆４）に置き変え、濃度２．０ｍＭのＭｇＣｌ２を用いた以外は、概要を説明した上記の反応と同じであった。反応産物を電気泳動したところ、大きさが約１２０ｂｐ（分子サイズラダーで判定して）と評価される、２％アガロースゲル上のはっきりと目に見えるバンドが得られた。【０１０２】増幅ＤＮＡ配列の配列決定
１８〜１９ｋＤａタンパク質遺伝子に対応する重ね合わせＰＣＲフラグメントをＥａｇ１で消化し、これをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中のユニークなＥａｇ１部位に連結することにより、このフラグメントをクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を（標準的な方法に従って）形質転換し、プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ．Ｅｄ．，ＣＳＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を用いて回収し、次いで、ＲＮＡａｓｅ消化工程、フェノール／クロロホルム抽出および２．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび２容のエタノールを用いて沈殿を行った。正（ｆｏｒｗａｒｄ）および逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）ユニバーサルシークエンシングプライマーを用いて、２つの独立のプラスミドＤＮＡ単離物の配列決定を行った。ｐ１８遺伝子由来の挿入ＤＮＡを正および逆方向で配列決定した。配列決定は、ＡＢＩ自動シークエンサーおよびＧｅｎｐａｋ  ＰＣＲをベースとする蛍光ジデオキシ鎖終結末端シークエンシングキットを用いて行った。【０１０３】  内部のＰＣＲプライマーの末端間の塩基の配列は、次の通りである。【０１０４】
【化２】
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【０１０５】  この塩基配列は配列番号５に記載のアミノ酸配列に翻訳される。【０１０６】  この配列（配列番号５）は、配列番号２に記載の１８ｋＤａタンパク質Ｎ末端アミノ酸配列と配列番号３に記載の１８ｋＤａタンパク質内部アミノ酸配列の両方と重ねて、配列番号６に記載の拡大Ｎ末端アミノ酸配列とする。【０１０７】  記載した特定の態様における多くの変更が容易にわかるであろう。従って、本発明は細部において変更可能なこれまでに記載した態様に限定されることはない。【０１０８】参考文献リスト
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９．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｆｉｇｕｒａ，Ｎ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｂｕｇｎｏｌｉ，Ｍ．，Ａｒｍｅｌｌｉｎｉ，Ｄ．およびＴｏｍｐｋｉｎｓ，Ｄ．Ｓ．（１９９２）．１２０ｋＤａのタンパク質の発現とヘリコバクター・ピロリにおける細胞毒性（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  １２０  ｋＤａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ．）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４５，７３３−７３４．
１０．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｗｙａｔｔ，Ｊ．Ｉ．，Ｓｏｂａｌａ，Ｇ．Ｍ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．，Ｔｏｍｐｋｉｎｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，Ｊ．Ｍ．およびＭｏｒｇａｎ，Ａ．Ｇ．（１９９３）．胃癌におけるヘリコバクター・ピロリに対する全身性および粘膜性体液性応答（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎｄ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．）Ｇｕｔ  ３４，１３３９−１３４３．
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１７．Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．Ｎ．およびＢｌａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．（１９９１）．ヘリコバクター・ピロリ感染の疫学（Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．）Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｒｅｖ．１３，４２−５９．
１８．Ｆａｎ，Ｘ．Ｊ．，Ｃｈｕａ，Ａ．Ｓｈａｈｉ，Ｃ．Ｎ．，ＭｃＤｅｖｉｔｔ，Ｊ．，Ｋｅｅｌｉｎｇ，Ｐ．Ｗ．Ｎ．およびＫｅｌｌｅｈｅｒ，Ｄ．（１９９４）．ヘリコバクター・ピロリのコロニー形成に対する胃のＴリンパ球の応答（Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｔｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｃｏｌｏｎｉｓａｔｉｏｎ．）Ｇｕｔ  ３５，１３７９−１３８４．
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【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】  抗Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ  ＩｇＧ抗体の存在についてスクリーニングした成人血清（ＣＬＯ陰性）。この図は、ＣＬＯ陰性のヒトから得られた血清で釣り上げたＨ．ｐｙｌｏｒｉのウェスタンブロットを示す。すべての血清は、脂肪不含の乾燥脱脂乳（５％、ｗ／ｖ）を含有するＰＢＳにおいて１：１００に希釈した。タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからＰＶＤＦ膜に移した。抗原抗体複合体は、増強させた化学発光検出系を用いて洗浄膜上で検出した。各トラックは異なる血清試料を表す。
【図２】  第２図：吸収血清：Ｈ．ｐｙｌｏｒｉについて陰性の二人のヒトからの血清を全Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ（トラックＡ）、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ（トラックＢ）、またはＥ．ｃｏｌｉ（トラックＣ）のいずれかで吸収させた。
【図３】  第３図：１８および２５ｋＤａのタンパク質の部分精製：両タンパク質を４９１型Ｐｒｅｐ−Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分取連続溶出ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分子量を基準として全ヘリコバクター・ピロリから精製した。
【図４】  抗Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ  ＩｇＧ抗体の存在についてスクリーニングしたＣＬＯ陰性の小児から得られた血清。この図は、ＣＬＯ陰性の小児から得られた血清で釣り上げたＨ．ｐｙｌｏｒｉのウェスタンブロットを示す。すべての血清は、脂肪不含の乾燥脱脂乳（５％、ｗ／ｖ）を含有するＰＢＳにおいて１：５０に希釈した。各トラックは異なる血清試料を表す。
【図５】  抗Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗血清により認識されたＣ．ｊｅｊｕｎｉおよびＥ．ｃｏｌｉ上の抗原。この図は、ウサギ抗Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ抗血清で釣り上げたＨ．ｐｙｌｏｒｉ（トラックＡ）、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ（トラックＢ）、およびＥ．ｃｏｌｉ（トラックＣ）のウェスタンブロットを示す。各細菌（５μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでイムノブロッティングにかけた。
【図６】  Ｈ．ｐｙｌｏｒｉについて陰性のヒトからの血清を用いて明らかにした精製２５ｋＤａタンパク質のウェスタンブロット。精製２５ｋＤａタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにかけた。このブロットをＨ．ｐｙｌｏｒｉに未感染の被験者から得られた血清で釣り上げた。
【図７】  ヘリコバクター・ピロリの表面に存在するタンパク質のビオチン化。寒天増殖Ｈ．ｐｙｌｏｒｉをリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）中に回収し、この緩衝液中で２回洗浄してから表面露出タンパク質をビオチン化した。細菌（〜２ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳ（１ｍｌ）に再懸濁し、３７℃に予備加温した。その後、ビオチン−Ｘ−ＮＨＳ（スルホサクシンイミジル−６（ビオチンアミド）−ヘキサノエート；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を最終濃度１ｍＭまで添加し、使用の直前に調製した。１０分間３７℃で混合した後、１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８）を最終濃度１０ｍＭまで添加することにより標識化反応を停止させた。この懸濁液を氷冷ＰＢＳ中で遠心（１０，０００ｇ、１分）することにより３回洗浄した。標識化と洗浄操作の後に細菌を光学顕微鏡により観察して検討したところ、細胞がまだ無傷で運動性であることがわかった。ビオチン化したＨ．ｐｙｌｏｒｉを分析ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでウェスタンブロッティングにかけ、ビオチン化タンパク質を同定した。ウェスタンブロットをＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）で発色させた。
【図８】  インターロイキン１２の存在および不存在下でのＨ．ｐｙｌｏｒｉに対する応答におけるリンパ球のチミジン取り込みを説明する。
【図９】  抗インターロイキン１０または組換えインターロイキン１２とともにあるいはなしでの、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの存在および不存在下での末梢血単核細胞のチミジン取り込みを説明する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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