(57)【要約】【課題】  内分泌性疾患治療剤及び代謝性疾患治療剤を提供する。【解決手段】  ヒアルロナンを有効成分として含有する薬剤である。ヒアルロナンとしては-Ｄ-グルクロン酸-β-１,３-D-Ｎ-アセチルグルコサミン-β-１,４-を１単位とし、これを２個含む４糖（HA4）であることが好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロナンを有効成分とする内分泌性疾患治療剤。
【請求項２】
上記ヒアルロナンは、-Ｄ-グルクロン酸-β-１,３-D-Ｎ-アセチルグルコサミン-β-１,４-を１単位とし、これを２個含む４糖であることを特徴とする請求項１記載の内分泌性疾患治療剤。
【請求項３】
ヒアルロナンを有効成分とする代謝性疾患治療剤。
【請求項４】
上記ヒアルロナンは、-Ｄ-グルクロン酸-β-１,３-D-Ｎ-アセチルグルコサミン-β-１,４-を１単位とし、これを２個含む４糖であることを特徴とする請求項３記載の代謝性疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロナンを有効成分とする内分泌性疾患治療剤及び代謝性疾患治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロナンは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとの２糖繰り返し単位から構成されている長鎖の多糖であり、一方、オリゴ糖も知られている。ヒアルロナンは鶏冠、さい体、皮膚、関節液などの生体組織からの抽出液、またはストレプトコッカス属の細菌を用いる発酵法などにより製造され、毒性学的および免疫学的作用が存在しないため、薬剤や化粧品として利用されており、例えばヒアルロナンの関節内注射による関節炎の治療がよく知られている。以下の説明において、４糖のヒアルロナンをHA4と記載する。
【０００３】
HA4には、臓器保存、肝障害および胃潰瘍に対する治療・抑制効果があることが報告されている（特許文献１参照）。また、HA4には、ストレス蛋白発現増強作用および細胞死抑制作用があることが知られている（非特許文献１参照）。
【０００４】
一方、糖尿病は、生活習慣病のひとつで、血糖値が高く（高血糖）、尿中にもブドウ糖が検出される疾患として知られている。糖尿病には自覚症状がないために放置していると、高血糖は全身のさまざまな臓器に障害をもたらす。とくに神経と血管を中心とした臓器が冒されやすく、進行すると、神経障害、腎症および網膜症などの合併症がおこる。
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００２／００４４７１
【非特許文献１】Xu H, Ito T, Tawada A, Maeda H, Yamanokuchi H, Isahara K, Yoshida K, Uchiyama Y, Asari A. Effect of hyaluronan oligosaccharides on the expression of heat shock protein 72. J Biol Chem. 2002 10;277(19):17308-14.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、内分泌性疾患治療剤及び代謝性疾患治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を達成した本発明に係る内分泌性疾患治療剤及び代謝性疾患治療剤は、ヒアルロナンを有効成分として含有する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係る薬剤には、ヒアルロナンを有効成分とするものであるから、比較的安価にかつ容易に大量生産できる利点がある。また、ヒアルロナンは毒性や抗原性がほとんどないこと、生体が元来有している治療作用や疾患の防止作用を増強することから副作用の極めて少ない治療剤として期待される。このように、本発明によれば、内分泌性疾患及び代謝性疾患に有効な新規な薬剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の説明において、本発明に係る治療剤を単に薬剤と称する。
【００１０】
本発明に係る薬剤に含まれるヒアルロナンとしては、基本的にはβ−Ｄ−グルクロン酸の１位とβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンの３位とが結合した２糖単位を少なくとも１個含む２糖以上のものでかつβ−Ｄ−グルクロン酸とβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとから基本的に構成されるものであれば、２糖単位が１個または複数個結合したものにそれらの要素が結合した糖であってもよく、またこれらの誘導体、例えば、アシル基等の加水分解性保護基を有したもの等も使用し得る。該糖は不飽和糖であってもよく、不飽和糖としては、非還元末端糖、通常、グルクロン酸の４，５位炭素間が不飽和のもの等が挙げられる。本発明で使用するヒアルロナンとしては、具体的には動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたもの、化学的もしくは酵素的に合成されたものなどいずれも使用することができる。例えば鶏冠、さい体、皮膚、関節液などの生体組織から公知の抽出法と精製法によって得ることができる。またストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法によっても製造できる。
【００１１】
本発明においては、ヒアルロナンオリゴ糖もヒアルロナンに包含され、上記２糖単位１個からなる２糖およびその誘導体のような低分子量のヒアルロナンから、重量平均分子量４００万程度の高分子量のヒアルロナンまで使用することができる。好ましくは組織における浸透性などの点で優れる重量平均分子量３８０程度〜９００，０００程度のヒアルロナンが挙げられ、より好ましくは２〜２０糖程度のヒアルロナンを挙げることができる。
【００１２】
ヒアルロナンのうち分子量の低いものは、具体的には、酵素分解法、アルカリ分解法、加熱処理法、超音波処理法(Biochem., 33(1994)p6503-6507)等の公知の方法によってヒアルロナンを低分子化する方法、化学的もしくは酵素的に合成する方法(Glycoconjugate J., (1993)p435-439、WO93/20827) などで製造することが好ましい。例えば酵素分解法としては、ヒアルロナン分解酵素（ヒアルロニダーゼ（睾丸由来）、ヒアルロニダーゼ（Streptomyces由来）、ヒアルロニダーゼＳＤなど）、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII 、コンドロイチナーゼＡＢＣなどのヒアルロナンを分解する酵素をヒアルロナンに作用させてヒアルロナンオリゴ糖を生成する方法（新生化学実験講座「糖質II−プロテオグリカンとグリコサミノグリカン−」p244-248、1991年発行、東京化学同人 参照）などが挙げられる。
【００１３】
また、アルカリ分解法としては、例えばヒアルロナンの溶液に１Ｎ程度の水酸化ナトリウム等の塩基を加え、数時間加温して、低分子化させた後、塩酸等の酸を加えて中和して、低分子量のヒアルロナンを得る方法などが挙げられる。本発明で用いるヒアルロナンは、塩の形態を包含し、製剤上の必要に応じて、その薬学上許容できる塩を用いることができる。例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリ（ｎ−ブチル）アミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、アミノ酸塩等のアミン塩などであることができる。
【００１４】
本発明の薬剤は、ある分子量のヒアルロナン単独又は種々の分子量のヒアルロナンを組み合わせたものなど特に限定することなく使用できる。本発明の薬剤は、ヒアルロナンを有効成分とするものであり、その有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって生体に悪影響を与えることなく内分泌性疾患及び/又は代謝性疾患を改善することができる。内分泌性疾患及び代謝性疾患としては糖尿病を挙げることができる。但し、内分泌性疾患としては、糖尿病に限定されず、先天性甲状腺腫、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、下垂体性低身長、先天性副腎過形成、21-水酸化酵素欠損症、11β-水酸化酵素欠損症、3β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ欠損症、コレステロール-デスモラーゼ欠損症、17α-水酸化酵素欠損症、コルチコステロン-18-メチルオキシダーゼ2型欠損症、男性性腺機能低下症及び二次性性腺機能低下症等を挙げることができる。また、代謝性疾患としては、糖尿病に限定されず、ガラクトース血症、先天性アミノ酸代謝異常症、フェニルケトン尿症、高フェニルアラニン血症、ホモシスチン尿症、メープルシロップ症候群、メープルシロップ尿症、嚢胞性線維症、核酸代謝障害、脂質代謝障害、ムコ多糖体代謝異常、ハーラー症候群、Hunter症候群、モルキオ症候群、ガラクトキナーゼ欠損症UDPガラクトース4-エピメラーゼ欠損症、フルクトース代謝異常、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ欠損症、ペントース尿症及びピルビン酸代謝疾患等を挙げることができる。すなわち、ヒアルロナンを有効成分として含む薬剤は、上述した各種の内分泌性疾患及び/又は代謝性疾患に対して治療効果がある。
【００１５】
本発明の薬剤は、ヒアルロナン又はその塩を、そのまままたは必要に応じて担体、賦形剤、その他の添加物と共に、経口的あるいは非経口的に投与（関節内投与、静脈内、筋肉内、皮下などの組織内投与（注射）、経腸投与、経皮投与など）するための医薬品として、任意の剤形に製剤化することが可能であり、任意の投与方法で患者に投与される。
【００１６】
経口製剤としては、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤等の固形製剤；シロップ剤、エリキシル剤、乳剤等の液状製剤を挙げることができる。散剤は、例えば、乳糖、デンプン、結晶セルロース、乳酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水ケイ酸等の賦形剤と混合して得ることができる。顆粒剤は、上記賦形剤のほか、必要に応じ、例えば白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤や、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の結合剤や、カルボキシメチルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤をさらに加え、湿式又は乾式で造粒して得ることができる。錠剤は、上記散剤又は顆粒剤をそのまま、或いはステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤を加えて打錠して得ることができる。また、上記錠剤又は顆粒剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタアクリル酸メチルコポリマー等の腸溶性基剤で被覆し、或いはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油等で被覆し、これらを腸溶性或いは持続性製剤にすることができる。硬カプセル剤は、上記散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填して得ることができる。また軟カプセル剤は、ヒアルロナン又はその塩を、グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油等に混合し、これをゼラチン膜で被覆して得ることができる。シロップ剤は、白糖、ソルビトール、グルセリン等の甘味剤とヒアルロナン又はその塩とを、水に溶解して得ることができる。また、甘味剤及び水のほかに、精油、エタノール等を加えてエリキシル剤とするか、或いはアラビアゴム、トラガカント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウム等を加えて乳剤又は懸濁剤にすることができる。またこれらの液状製剤には必要に応じ、矯味剤、着色剤、保存剤等を加えることができる。
【００１７】
非経口製剤としては、注射剤、直腸投与剤、ペッサリー、皮膚外用剤、吸入剤、エアゾール剤、点眼剤等を挙げることができる。注射剤は、ヒアルロナン又はその塩に塩酸、水酸化ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調節剤；塩化ナトリウムウム、ブドウ糖等の等張化剤；及び注射用蒸留水を加え、滅菌濾過した後、アンプルに充填して得ることができる。また、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチン等を加えて真空凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤とすることができる。またヒアルロナン又はその塩にレシチン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の乳化剤を加えた後、水中で乳化された注射用乳剤とすることもできる。
【００１８】
直腸投与剤は、ヒアルロナン又はその塩にカカオ脂肪酸のモノ、ジ又はトリグリセリド、ポリエチレングリコール等の坐剤用基剤を加えた後、加温して溶解し、これを型に流し込んで冷却するか、或いはヒアルロナン又はその塩をポリエチレングリコール、大豆油等に混合した後、ゼラチン膜で被覆して得ることができる。皮膚外用剤は、ヒアルロナン又はその塩に、白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコール等を加え、必要に応じて加温し、混練して得ることができる。テープ剤は、ヒアルロナン又はその塩を、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体等の粘着剤と混練し、これを不織布等に展延して得ることができる。吸入剤は、例えば薬学的に許容される不活性ガス等の噴射剤に、ヒアルロナン又はその塩を溶解又は分散し、これを耐圧容器に充填して得ることができる。
【００１９】
（投与方法）本発明のヒアルロナンを有効成分とする薬剤の投与方法は、特に限定されないが、筋肉内投与、静脈内投与および経口投与を挙げることができる。
【００２０】
（投与量）投与量は、対象とする疾患、患者の年令、健康状態、体重等に応じ適宜決定するが、一般には０．０５〜５０mg/kg を１日１回あるはそれ以上に分けて投与する。
【００２１】
（毒性）本発明で使用するヒアルロナンは、医薬としての生物活性を示す投与量において細胞毒性はほとんどもしくは全く認められなかった。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明に係る薬剤を、実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２３】
〔実施例１〕
本実施例では、糖尿病モデルであるＫＫ-ＡｙマウスにHA4を投与し、その効果を検討した。
【００２４】
糖尿病モデル動物
７週齢KK-Aｙ系雄性マウスを日本チャールスリバーより購入し、１週間飼育後、８週齢の時点で、血糖値、尿糖値および体重の平均値およびSDが、群間で異ならないようにマウスを群分けした。群構成は、陰性対照（生理食塩水）群（筋肉内投与）、HA4(10mg/kg)筋肉内投与群及びHA4(10mg/kg)腹腔内投与群とした。
【００２５】
被検物質の投与
本実施例では、2mg/ml及び10mg/mlのHA4を調整した。具体的に、HA4は、Tawadaらの方法（Tawada A, Masa T, Oonuki Y, Watanabe A, Matsuzaki Y, Asari A. Large-scale preparation, purification, and characterization of hyaluronan oligosaccharides from 4-mers to 52-mers. Glycobiology. 2002; 12(7):421-6.）により調製し、生理食塩水で濃度を調節した。また、対照としては生理食塩水（生食）を調整した。
【００２６】
本実施例では、糖尿病モデルマウスを群分けした翌日より、１日１回、筋肉内あるいは腹腔内投与を行った。
【００２７】
血糖値測定及び尿糖値測定
血糖値は、群分け時、投与後1週間目及び２週間目に尾より採血し、血糖測定器(エグザテック2A/メディセンスプレジョンプラス＜メディセンス＞)を用いて測定した。尿糖値は、群分け時、投与後1週間目及び２週間目に尿試験紙（ウリエース、テルモ社製）を用いて測定した。なお、血糖値及び尿糖値は、Student’s ｔ-検定あるいはTukey多重比較検定によって統計処理した。
【００２８】
結果
１）血糖値（図１）
投与後１週間及び２週間後、陰性対照群では血糖値の有意な上昇が認められた。HA4投与群では、筋肉内投与群及び腹腔内投与群とも、血糖値上昇は緩やかで群分け時と比べて統計学的に有意ではなかった。図１の結果から、ヒアルロナンを有効成分として含有する薬剤が血糖値の上昇を抑制することが実証された。
【００２９】
２）尿糖値（図２）
投与後１週間及び２週間後、陰性対照群では尿糖値の有意な上昇が認められた。HA4投与群では、筋肉内投与群及び腹腔内投与群とも、尿糖値上昇は緩やかで群分け時と比べて統計学的に有意ではなかった。また、投与１週間後では、HA4群の尿糖値が、陰性対照群の尿糖値に比べ有意に低値であった。図１の結果から、ヒアルロナンを有効成分として含有する薬剤が尿糖値の上昇を抑制するとともに尿糖値を低減することが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】糖尿病モデルマウスに対してHA4又は生理食塩水を投与した時の血中グルコース濃度（血糖値）を測定した結果を示すグラフである。
【図２】糖尿病モデルマウスに対してHA4又は生理食塩水を投与した時の尿中グルコース濃度（尿糖値）を測定した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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