(57)【要約】【課題】被検体の中枢神経系（ＣＮＳ）への導入遺伝子を保有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを送達するための方法を提供すること。【解決手段】被検体に組換えＡＡＶビリオンを送達するための方法であって、対流増加送達（ＣＥＤ）を介してｒＡＡＶビリオンを被検体のＣＮＳ内に投与する工程を包含し、ここでｒＡＡＶビリオンが治療用ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、方法。ＣＥＤは、例えば、浸透圧ポンプまたは注入ポンプのいずれかを使用することによって実施され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載される、組換えＡＡＶビリオンを送達するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、ウイルスベクターのＣＮＳへの効率的な送達に関する。より詳細には、本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）障害（特に、神経伝達物質であるドパミンに関与する中枢神経系障害）の処置のための遺伝子治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＣＮＳ障害は、主な公衆衛生問題である。パーキンソン病（ＰＤ）のみで、合衆国において１００万人を超える人々が罹患している。臨床的に、ＰＤは、突発的な運動、歩行困難、体位不安定性、硬直、および震えにおける減少によって特徴付けられる。パーキンソン病は、ドパミンの有効性の減少をもたらす脳の黒質における色素沈着ニューロンの変性によって引き起こされる。ドパミンの変性した代謝はまた、脳の特定領域におけるドパミンの増大を示す神経分裂病患者においても関係している。
【０００３】
現在、多くのＣＮＳ障害（例えば、ＰＤ）は、治療剤の全身投与によって処置される。しかし、全身投与はしばしば、血液脳関門を通過するための薬物の不能性が理由で、そして多くの薬物は末梢性の副作用を引き起こすので、有効ではない。従って、多くの潜在的に有用な化合物（例えば、タンパク質）は、全身的に投与され得ない。これらの化合物が血液脳関門を貫通する際に首尾よい場合、これらはまた、中枢神経系の副作用もまた誘導し得る。現在、ＰＤの処置は、しばしば、ドパをドパミンへと脱カルボキシル化させる酵素である芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）の末梢インヒビターであるカルビドパのような化合物との組み合わせにおける、ドパミン前駆体であるＬ−ドパの経口投与を含む。しかし、患者の大半において、罹患した脳領域におけるＡＡＤＣの生成は、ＰＤの進行につれて減少し、結果として、より多用量のＬ−ドパが必要とされ、患者の治療的効果を減少させ、そして副作用を増大させる。
【０００４】
現在の全身的療法の制限を考慮すると、遺伝子送達は、ＰＤのようなＣＮＳ障害の処置のための有望な方法である。遺伝子移入目的のために多くのウイルスに基いた系が記載されている（例えば、この目的のために現在最も広範に使用されるウイルスベクター系であるレトロウイルス系）。種々のレトロウイルス系の説明については、例えば、特許文献１；非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；ならびに、非特許文献５を参照のこと。
【０００５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系は、遺伝子治療における使用のための優れた候補として存在する。ＡＡＶは、Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属するヘルパー依存性ＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶは、増殖性感染を起こすために、無関係のヘルパーウイルス（アデノウイルス、ヘルペスウイルス、または痘疹のいずれか）との感染を必要とする。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶ複製の大半の工程に必要である付属機能（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を供給する。ＡＡＶの概説については、例えば、非特許文献６を参照のこと。
【０００６】
ＡＡＶは広範な組織に感染し、そして他のウイルスベクターで観察された、動物モデルにおける細胞傷害性効果および有害な免疫反応を誘発しなかった（例えば、非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３を参照のこと）。ＡＡＶは、非分裂組織を形質導入し得るので、ＡＡＶは、遺伝子を中枢神経系（ＣＮＳ）に送達するために十分に適合され得る。特許文献２は、ＡＡＶベクターを作製する方法を記載する。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にある治療用遺伝子を含むＡＡＶベクターは、哺乳動物の脳を形質導入すること、および疾患のモデルにおいて機能的効果を有することが示されている。
【０００７】
導入遺伝子を保有するＡＡＶベクターは、例えば、非特許文献１４；特許文献３（１９９５年１０月２６日公開）；特許文献４（１９９５年１２月２１日公開）；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７に記載されている。しかし、ＡＡＶベクターのＣＮＳへの送達は、困難であることが証明されている。ＡＡＶは、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子をマウスの実験的神経膠腫に移入させるために使用されており、そしてＡＡＶ−ｔｋが、ガンシクロビルの細胞殺傷効果に対してこれらの脳腫瘍を感受性にさせる能力が実証されている。非特許文献１８；非特許文献１９。ヒトチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）遺伝子（アミノ酸チロシンのドパへの変換に関与する酵素）を含むＡＡＶ−ＣＭＶベクターの、成体ラット脳への注入は、ニューロンおよびグリアの両方の形質導入をもたらした（非特許文献２０；非特許文献２１）。同じベクターのサル線条への送達は、２．５ヶ月までの間に強力なＴＨ発現をもたらした（Ｄｕｒｉｎｇら、前出）。さらに、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＴＨは、パーキンソン病のげっ歯目モデルにおいて試験され、ここでこれは６−ヒドロキシドパミン病変ラットの回転挙動において有意な改善を引き起こした（非特許文献２２；非特許文献２３）。
【０００８】
しかし、これらがＣＮＳを標的化するためのＡＡＶの可能性を実証するような報告である一方で、それらはまた、ＣＮＳへのＡＡＶベクターの直接的注射が、限られた数のトランスフェクトされた細胞をもたらし、そしてこのトランスフェクトされた細胞が注射経路付近の狭い領域に集中発生することを実証した（例えば、Ｄｕｒｉｎｇら、前出；Ｆａｎら、前出を参照のこと）。ＣＮＳへの複数回の注射は、所望されない合併症を引き起こすので、最少数の注射部位を使用して脳のより広い領域にＡＡＶベクターを送達する方法についての必要性が残存する。さらに、注射されるベクターの用量と脳組織におけるその得られる分布との間の関係は、以前に報告されていない。
【０００９】
さらに、ＰＤの遺伝子治療は、ドパミン合成に関与する酵素をコードする少なくとも２つの遺伝子（すなわち、ＴＨおよびＡＡＤＣ）の送達に集中されてきた。これらの方法は、上記に議論された送達問題のすべての対象であり、そしてさらに、これらの方法は、両方の遺伝子が適切な量で発現されることを必要とする。従って、Ｌ−ドパと組み合わせてＡＡＶ−ＡＡＤＣを使用するＰＤの処置もまた、実証されていない。
【特許文献１】米国特許第５，２１９，７４０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６７７，１５８号明細書
【特許文献３】国際公開第９５／２８４９３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９５／３４６７０号パンフレット
【非特許文献１】ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０-９９０
【非特許文献２】Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５-１４
【非特許文献３】Ｓｃａｒｐａら、（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８０：８４９-８５２
【非特許文献４】Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８０３３-８０３７
【非特許文献５】Ｂｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ（１９９３）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２−１０９
【非特許文献６】ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅｎｚｋｙ（１９８７）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）３２：２４３−３０７
【非特許文献７】Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９
【非特許文献８】Ｆｌｏｔｔｅら（１９９３）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：１０６１３−１０６１７
【非特許文献９】Ｋａｓｓ−ｅｉｓｅｒら（１９９２）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：３９５−４０２
【非特許文献１０】Ｙａｎｇｅら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：４４０７−４４１１
【非特許文献１１】Ｃｏｎｒａｄら（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６５８−６６８
【非特許文献１２】Ｙａｎｇら（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１３７−１４４
【非特許文献１３】Ｂｒｙｎｅｓら（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：３０４５−３０５５
【非特許文献１４】Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：１４８−１５３
【非特許文献１５】Ｄｕｒｉｎｇら（１９９８）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：８２０−８２７
【非特許文献１６】Ｍａｎｄｅｌら（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：４２７１−４２８４
【非特許文献１７】Ｓｚｃｙｐｋａら（１９９９）Ｎｅｕｒｏｎ  ２２：１６７−１７８
【非特許文献１８】Ｏｋａｄａら（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：９５９−９６４
【非特許文献１９】Ｍｉｚｕｎｏら（１９９８）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８９：７６−８０
【非特許文献２０】Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９５）ＶＩＲＡＬ  ＶＥＣＴＯＲＳ、ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＡＮＤ  ＮＥＵＲＯＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ、ＫａｐｌｉｔｔおよびＬｏｅｗｙ編、１２：１９３−２１０、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ
【非特許文献２１】Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚら（１９９７）Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：１４７−１５６
【非特許文献２２】Ｆａｎら（１９９８）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：２５２７−２５３７
【非特許文献２３】Ｍａｎｄｅｌら（１９９７）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９４：１４０８３−１４０８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
被検体の中枢神経系（ＣＮＳ）への導入遺伝子を保有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを送達するための方法を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、対流増加送達（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（ＣＥＤ）を使用する、被検体（例えば、ヒト）の中枢神経系（ＣＮＳ）への導入遺伝子を保有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンを送達するための方法を提供する。ＣＥＤは、例えば、浸透圧ポンプまたは注入ポンプのいずれかを使用することによって実施され得る。好ましい実施態様において、導入遺伝子は、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）またはその活性フラグメントをコードする。この導入遺伝子がＡＡＤＣをコードする場合、ＣＮＳの線条内へｒＡＡＶビリオンを投与することが好ましい。
【００１２】
別の局面において、本発明は、組換えＡＡＶビリオンをＣＮＳ障害を有する被検体に送達するための方法を提供する。ｒＡＡＶビリオンは、適切な治療用ポリペプチドをコードし、そしてＣＥＤを使用して被検体のＣＮＳに投与される。好ましい実施態様において、ＣＮＳ障害は、パーキンソン病（ＰＤ）であり、ｒＡＡＶビリオンは、ＣＮＳの線条に投与され、そしてこの核酸配列は、ＡＡＤＣをコードする。
【００１３】
別の局面においては、被検体における神経変性疾患を処置するための方法が提供される。形質導入された細胞において発現可能な治療用核酸配列を保有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンの調製物は、対流増加送達（ＣＥＤ）を使用して、ＣＮＳに投与される。１つの実施態様において、神経変性疾患はＰＤであり、そして治療用ポリペプチドはＡＡＤＣである。なお別の実施態様において、神経変性疾患を処置する方法はまた、少なくとも１つのさらなる治療用化合物を被検体に投与する工程、例えば、Ｌ−ドパおよび必要に応じてカルビドパを、全身的に投与する工程を含む。
【００１４】
なお別の局面において、被検体のＣＮＳにおけるドパミン活性のレベルを測定する方法が提供される。標識されたトレーサが、被検体に投与される。トレーサは、好ましくは、ドパミンを利用する細胞に結合する化合物であり、そして標識は、好ましくは、ラジオアイソトープ（例えば、６−［18Ｆ］−フルオロ−Ｌ−ｍ−チロシン（18Ｆ−ＦＭＴ））である。標識の検出は、トレーサの結合を介したドパミン活性の指標である。好ましくは、例えば、陽子射出断層撮影法（ＰＥＴ）走査を使用することによって、被検体のＣＮＳは画像化される。
【００１５】
神経変性疾患を処置する方法における使用のための、第１および第２の医薬の製造における第１および第２の治療用化合物の使用（ここで、第１の医薬は、治療用ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンを含み、この第１の医薬は、対流増加送達（ＣＥＤ）によって被検体に投与され、そしてここでこの第２の医薬は、被検体に全身的に投与される治療用化合物を含む）もまた、提供される。
【００１６】
本発明はさらに、以下の項目を提供する。
（項目１）  被検体に組換えＡＡＶビリオンを送達するための方法であって、この方法は、対流増加送達（ＣＥＤ）を介してｒＡＡＶビリオンを被検体のＣＮＳ内に投与する工程を包含し、ここでｒＡＡＶビリオンが治療用ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、方法。
（項目２）  上記投与する工程が、浸透圧ポンプを使用して実施される、項目１に記載の方法。
（項目３）  上記投与する工程が、注入ポンプを使用して実施される、項目１に記載の方法。
（項目４）  上記核酸配列が、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードする、項目１に記載の方法。
（項目５）  上記被検体がヒトである、項目１に記載の方法。
（項目６）  上記ｒＡＡＶビリオンが、線条内に投与される、項目１に記載の方法。
（項目７）  ＣＮＳ障害を有する患者に組換えＡＡＶビリオンを送達するための方法であって、方法は対流増加送達（ＣＥＤ）を介してビリオンを被検体のＣＮＳ内に投与する工程を包含し、ここでビリオンが治療用ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、方法。
（項目８）  上記ＣＮＳ障害がパーキンソン病であり、上記ｒＡＡＶビリオンが線条内に投与され、ここで上記核酸配列がＡＡＤＣをコードする、項目７に記載の方法。
（項目９）  被検体における神経変性疾患を処置するための方法であって、方法は以下：
（ａ）組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含有する調製物を提供する工程であって、ここで上記ビリオンが形質導入される細胞において発現して、被検体に治療的効果を提供し得る核酸配列を含んでいる、工程；および、
（ｂ）対流増加送達（ＣＥＤ）を使用して被検体のＣＮＳに調製物を送達する工程であって、ここでビリオンが神経細胞を形質導入し、そして核酸配列が発現されて、神経変性疾患を処置するために適切な治療的効果を被検体において提供する、工程、
を包含する、方法。
（項目１０）  上記神経変性疾患がパーキンソン病である、項目９に記載の方法。
（項目１１）  形質導入される細胞において発現され得る上記核酸配列が、ＡＡＤＣまたはその機能的フラグメントをコードする、項目９に記載の方法。
（項目１２）  上記被検体に少なくとも１つのさらなる治療用化合物を投与する工程をさらに包含する、項目９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）  上記少なくとも１つのさらなる治療用化合物が、Ｌ−ドパである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）  Ｌ−ドパ、および必要に応じてカルビドパを上記被検体に投与する工程をさらに包含する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）  被検体の脳におけるドパミン活性のレベルを測定する方法であって、方法は、以下；
（ａ）被検体に標識されたトレーサを投与する工程であって、ここで細胞に対するトレーサの結合がドパミン活性の指標である、工程；および、
（ｂ）標識されたトレーサを結合する細胞の数を測定するために被検体の脳を画像化する工程であって、これによって被検体の脳におけるドパミン活性のレベルを測定する工程、
を包含する、方法。
（項目１６）  上記標識されたトレーサが、６−［18Ｆ］−フルオロ−Ｌ−ｍ−チロシン（18Ｆ−ＦＭＴ）である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）  上記画像化が、陽子射出断層撮影法（ＰＥＴ）画像化である、項目１５に記載の方法。
（項目１８）  組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含む調製物を被検体の頭蓋腔に送達するための、対流増加送達（ＣＥＤ）の使用。
（項目１９）  上記ＣＥＤが浸透圧ポンプまたは注入ポンプである、項目１８に記載の使用。
（項目２０）  神経変性疾患の処置のための第１医薬の調製における導入遺伝子を保有するｒＡＡＶビリオンの使用であって、ここで該第１医薬は、神経変性疾患を患う被験体のＣＮＳ内に対流増加送達（ＣＥＤ）を介して送達される、使用。
（項目２１）  神経変性疾患を処置する方法における使用のための第１医薬および第２医薬の製造における、第１治療化合物および第２治療化合物の使用であって、ここで、この第１医薬は治療性ポリペプチドをコードする導入遺伝子を包含する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンを含み、この第１医薬は対流増加送達（ＣＥＤ）によって被験体に投与され、そしてここで、この第２医薬は被験体に全身性に投与される治療化合物を含有する、使用。
（項目２２）  上記神経変性疾患がパーキンソン病である、項目２１に記載の使用。
（項目２３）  上記導入遺伝子が芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）である、項目２１〜２２のいずれか１つに記載の使用。
（項目２４）第２医薬がＬ−ドパ、および必要に応じてカルビドパを含有する、項目２１〜２３のいずれか１つに記載の使用。
（項目２５）  上記ＣＥＤが浸透圧ポンプまたは注入ポンプである、項目２１〜２４のいずれか１つに記載の使用。
（項目２６）  上記第１医薬が線条に送達される、項目２１〜２５のいずれか１つに記載の使用。
【００１７】
本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書中の開示を考慮して、当業者に容易に考え付く。
【発明の効果】
【００１８】
被検体の中枢神経系（ＣＮＳ）への導入遺伝子を保有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを送達するための方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に指示がなければ、当該分野の技術範囲内のウイルス学、微生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。このような技術は、参考文献に十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（最新版）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、最新版）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編，最新版）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，最新版）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，最新版）；ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，第ＩおよびＩＩ巻（Ｐ．Ｔｉｊｅｓｓｅｎ編）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，第ＩおよびＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）を参照のこと。
【００２０】
本明細書および添付の請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明確に他を指示しない限り、複数の表示を含む。
【００２１】
（定義）
本発明を記載する際に、以下の用語が用いられ、そして以下に示すように定義されることが意図される。
【００２２】
「遺伝子移入」または「遺伝子送達」は、宿主細胞に外来ＤＮＡを確実に挿入するための方法または系をいう。このような方法は、組み込まれていない移入ＤＮＡの一過性発現、移入されたレプリコン（例えば、エピソーム）の染色体外複製および発現、または宿主細胞のゲノムＤＮＡへの移入された遺伝子材料の組み込みを生じ得る。遺伝子移入は、後天性疾患および遺伝性疾患の処置への独特のアプローチを提供する。多くの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。
【００２３】
「ベクター」とは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどのような、任意の遺伝エレメントを意味する。これは適切な制御エレメントと結合した場合に複製可能であり、そして細胞間で遺伝子配列を移入し得る。従って、この用語はクローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。
【００２４】
「組換えウイルス」とは、例えば、粒子への異種核酸構築物の付加または挿入によって、遺伝的に改変されているウイルスを意味する。
【００２５】
「ＡＡＶビリオン」とは、野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子（ＡＡＶキャプシドタンパク質コートと結合した直鎖状の一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む）のような完全なウイルス粒子を意味する。これに関して、相補的センス（例えば、「センス」鎖または「アンチセンス」鎖）のいずれかの一本鎖ＡＡＶ核酸分子は、任意の１つのＡＡＶビリオンにパッケージされ得、そして両鎖は等しく感染性である。
【００２６】
「組換えＡＡＶビリオン」または「ｒＡＡＶビリオン」は、本明細書中では、両側にＡＡＶ  ＩＴＲが隣接している目的の異種核酸配列をキャプシド化している、ＡＡＶタンパク質外皮から構成される感染性の複製欠損性ウイルスとして定義される。ｒＡＡＶビリオンは、その中に導入されるＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー機能、および付属機能を有している適切な宿主細胞において産生される。この様式において、宿主細胞は、引き続く遺伝子送達のために、ＡＡＶベクター（目的の組換えヌクレオチド配列を含む）を感染性組換えビリオン粒子にパッケージするために必要なＡＡＶポリペプチドをコードし得るようにされる。
【００２７】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みをいうために使用され、そして細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内部に導入された場合に「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技術が、一般に当該分野で公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＥｌｓｅｖｉｅｒおよびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照のこと。このような技術は、適切な宿主細胞内に１つ以上の外因性ＤＮＡ部分（例えば、ヌクレオチド組み込みベクターおよび他の核酸分子）を導入するために使用され得る。
【００２８】
用語「宿主細胞」は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶベクタープラスミド、アクセサリ機能ベクター、または他の移入ＤＮＡのレシピエントであり得るか、レシピエントであったか、またはレシピエントとして使用される、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を示す。この用語は、トランスフェクトされた本来の細胞の子孫を含む。従って、本明細書中で使用される「宿主細胞」は、一般に、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞をいう。単一の親細胞の子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な変異に起因して、本来の親細胞と、形態学においてもしくはゲノムにおいて、または全体的なＤＮＡの相補性において必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解される。
【００２９】
本明細書中で使用される用語「細胞株」は、インビトロでの継続的または延長された増殖および分裂を行い得る細胞の集団をいう。しばしば、細胞株は、単一の祖先細胞に由来するクローン集団である。自発的または誘導された変化が、このようなクローン集団の保存または移動の間に核型において生じ得ることは当該分野でさらに公知である。従って、この細胞株由来の細胞は、祖先細胞または培養物と正確に同一でなくてもよいといわれ、そしてこの細胞株は、このような改変体を含むといわれる。
【００３０】
用語「異種」は、コード配列および制御配列のような核酸配列に関する場合、通常はともに連結されていない、および／または特定の細胞と通常は関連していない配列を示す。従って、核酸構築物またはベクターの「異種」領域は、他の分子に関連して天然では見出されない別の核酸分子の内の、またはこれに結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、コード配列に関連して天然では見出されない配列に隣接したコード配列を含み得る。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然で見出されない構築物である（例えば、ネイティブの遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、細胞内に通常は存在しない構築物で形質転換した細胞は、本発明の目的のために異種であると考えられる。対立遺伝子改変または天然に存在する変異事象は、本明細書で使用されるように、異種ＤＮＡを生じない。
【００３１】
「コード配列」または特定のタンパク質を「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下におかれる場合、インビトロまたはインビボでポリペプチドに転写され（ＤＮＡの場合）そして翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端での開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端での翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、原核生物または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、およびさらに合成ＤＮＡ配列を包含し得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常コード配列の３’側に位置する。
【００３２】
「核酸」配列とは、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をいう。この用語は、例えば、以下のＤＮＡおよびＲＮＡの任意の公知の塩基アナログを含むが、これらに限定されない配列を表す：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン（ａｚｉｒｉｄｉｎｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシル−メチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル（ｍｅｔｈｙｌｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン（ｏｘｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。
【００３３】
用語、ＤＮＡ「制御配列」とは、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを集合的にいい、これはレシピエント細胞においてコード配列の複製、転写、および翻訳を集合的に提供する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写、および翻訳され得る限り、これらの制御配列のすべてが常に存在する必要はない。
【００３４】
用語「プロモーター領域」は、通常の意味において、調節配列が、ＲＮＡポリメラーゼと結合し得、そして下流の（３’方向）コード配列の転写を開始し得る遺伝子由来であるＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域をいうために、本明細書中で使用される。
【００３５】
「作動可能に連結される（た）」とは、このように記載された成分がそれらの通常の機能を行うように構成されている、エレメントの配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現をもたらし得る。制御配列は、それらがその発現に指向するように機能する限り、コード配列と連続する必要はない。従って、例えば、介在性の非翻訳であるが転写される配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列は、コード配列となお「作動可能に連結される」と考えられ得る。
【００３６】
「単離される（た）」により、ヌクレオチド配列をいう場合、同じ型の他の生物学的高分子の実質的非存在下で示された分子が存在することが意味される。従って、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子」とは、対象となるポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子をいう；しかし、この分子は、組成物の基本的な特徴に有害な影響を及ぼさない、いくつかのさらなる塩基または部分を含んでいてもよい。
【００３７】
本出願全体を通して、特定の核酸分子におけるヌクレオチド配列の相対的位置を記載する目的で、例えば、特定のヌクレオチド配列が別の配列に関して「上流」、「下流」、「３’」、または「５’」に配置されると記載される場合、これは、当該分野において慣習的にそのようにいわれる、ＤＮＡ分子の「センス」鎖または「コード」鎖における配列の位置であると理解される。
【００３８】
「遺伝子」とは、転写または翻訳された後に、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードし得る少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドをいう。本明細書中に記載される任意のポリヌクレオチド配列を使用して、それらが関連する遺伝子のより大きなフラグメントまたは全長コード配列を同定し得る。より大きなフラグメント配列を単離する方法は当業者に公知である。
【００３９】
２つの核酸フラグメントは、本明細書中に記載されるように「選択的にハイブリダイズ」すると考えられる。２つの核酸分子の間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を及ぼす。部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列が標的分子にハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する。完全に同一の配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイを使用して評価され得る（例えば、サザンブロット、ノザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。このようなアッセイは、選択性の変化する程度を使用して、例えば、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーまで変化する条件を使用して行われ得る。低ストリンジェンシーの条件が使用される場合、非特異的結合の非存在が、部分的程度の配列同一性すら欠如する二次プローブ（例えば、標的分子と約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を使用して評価され得、その結果、非特異的結合事象の非存在下では二次プローブは、標的にハイブリダイズしない。
【００４０】
ハイブリダイゼーションベースの検出系が利用される場合、標的核酸配列に相補的な核酸プローブ、次いで、このプローブおよび標的配列が、ハイブリッド分子を互いに形成するように「選択的にハイブリダイズする」か、または結合する適切な条件の選択により選択される。「中程度にストリンジェント」な条件下で標的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、代表的に、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的に、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％を超える配列同一性を有する、少なくとも約１０〜１４のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ／標的ハイブリダイゼーションのために有用な、プローブおよび標的が特異的程度の配列同一性を有するハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知であるとおり、決定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００４１】
ハイブリダイゼーションについてのストリンジェンシー条件に関しては、多くの等価な条件を使用して、例えば、以下の因子を変化させることにより特定のストリンジェンシーを確立し得ることは、当該分野で周知である：プローブおよび標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、およびポリエチレングリコール）の存在または非存在、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメーター、ならびに洗浄条件を変化させること。特定のハイブリダイゼーション条件のセットの選択は、当該分野で選択された以下の標準的な方法である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
【００４２】
用語「芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ」または「ＡＡＤＣ」とは、ドパをドパミンにカルボキシル基を除去するポリペプチドをいう。従って、この用語は、全長ＡＡＤＣポリペプチド、その活性なフラグメントまたは機能的ホモログを含む。
【００４３】
所定のポリペプチドの「機能的ホモログ」または「機能的等価物」とは、ネイティブなポリペプチド配列から誘導された分子、ならびに組換え生成されたか、または化学合成されたポリペプチドを含む。これらは、所望の結果を達成するように参照分子と類似の様式で機能する。従って、ＡＡＤＣの機能的ホモログは、活性の完全性が残存する限り、それらのポリペプチドの誘導体およびアナログを含む−そのアミノ末端もしくはカルボキシ末端の内部でまたはそれらの末端で生じる任意の単一のまたは複数のアミノ酸の付加、置換および／または欠失を含む。
【００４４】
核酸およびアミノ酸の「配列同一性」または「相同性」を決定するための技術もまた、当該分野で公知である。代表的には、このような技術は、遺伝子についてのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされたアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列と第２のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列とを比較することを含む。一般に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列もしくはポリペプチド配列の、ヌクレオチド対ヌクレオチドもしくはアミノ酸対アミノ酸のそれぞれの正確な対応をいう。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの「パーセント同一性」を決定することにより比較され得る。２つの配列のパーセント同一性（核酸またはアミノ酸の配列にかかわらず）は、２つの整列された配列間の正確なマッチの数をより短い配列の長さで割って、そして１００を乗じた数である。核酸配列の適切な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５増補、３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．ＵＳＡにより開発されたスコアリングマトリクスを使用する事によりアミノ酸配列に適用され得、そしてＧｒｉｂｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により正規化され得る。配列のパーセント同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実行は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティーアプリケーションにおいて提供される。この方法のためのデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ、バージョン８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）に記載される。本発明の文脈でパーセント同一性を確立する好ましい方法は、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈにより著作権保護され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により配給されるＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージを使用することである。総合ソフトウェアパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムは、デフォルトパラメーター（例えば、ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙが１２、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙが１、およびｇａｐが６）がスコアリング表のために使用される場合に利用され得る。生成したデータから、「Ｍａｔｃｈ」値は、「配列同一性」を反映する。配列間のパーセント同一性または類似性を算出するための他の適切なプログラムは、一般的に、当該分野で公知である（例���ば、別の整列プログラムは、ＢＬＡＳＴであり、デフォルトパラメーターが使用される）。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを用いて使用され得る：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ  ｂｙ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００４５】
あるいは、相同性は、相同な領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、次いで、一本鎖特異的ヌクレアーゼで消化し、そして消化したフラグメントのサイズ決定により決定され得る。２つのＤＮＡ配列または２つのポリペプチド配列は、上記の方法を使用して決定されるように、これらの配列が、規定された長さの分子に対して少なくとも約８０〜８５％、好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５〜９８％の配列同一性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される実質的に相同は、特定されたＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に完全な同一性を示す配列もいう。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、特定のシステムについて規定されるストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当業者の技術範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前出を参照のこと。
【００４６】
「対流増加送達（Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」とは、薬剤の任意の非手動送達をいう。本発明の文脈において、ＡＡＶの対流増加送達（ＣＥＤ）の例は、注入ポンプまたは浸透圧ポンプにより達成され得る。
【００４７】
用語「中枢神経系」または「ＣＮＳ」は、脳の全ての細胞および組織ならびに脊椎動物の脊髄を含む。従って、この用語は、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、脳脊髄液（ｃｅｒｅｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）（ＣＦＳ）、間隙腔、骨、軟骨などを含むが、これらに限定されない。「頭蓋腔」とは、頭蓋（ｓｋｕｌｌ）（頭蓋（ｃｒａｎｉｕｍ））の下部の領域をいう。ＣＮＳの領域は、種々の行動および／または機能と関連している。例えば、脳の脳幹神経節は、運動機能（特に随意運動）と関連している。脳幹神経節は、６つの対形成した核から構成される：尾状核、被殻、淡蒼球（ｇｌｏｂｕｓ  ｐａｌｌｉｄｕｓ）（または淡蒼球（ｐａｌｌｉｄｕｍ））、側坐核（ｎｕｃｌｅｕｓ  ａｃｃｕｍｂｅｎｓ）、視床下核および黒質。尾状核および被殻は、内包により分離されているが、細胞構築、化学的特性および生理学的特性を共有し、そしてしばしば、線条体といわれ、または単に「線条」といわれる。黒質は、パーキンソン患者において変性しており、脳幹神経節への主要なドパミン作動性入力を提供する。
【００４８】
用語「被験体」、「個体」または「患者」は、本明細書中で交換可能に使用され、そして脊椎動物、好ましくは、哺乳動物をいう。哺乳動物としては、マウス、類人猿、ヒト、家畜、競技用動物およびペットが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
「有効量」は、有益な、または所望の結果をもたらすに十分な量である。有効量は、１回以上の投与、適用、または投薬において投与され得る。
【００５０】
用語「標識されたトレーサー」とは、インビボでの規定された活性を追跡または検出するために使用され得る任意の分子をいう。例えば、好ましいトレーサーは、ドパミンを利用する細胞に結合するトレーサーである。好ましくは、標識されたトレーサーは、例えば、陽子射出断層撮影法（ＰＥＴ）スキャニングまたは他のＣＮＳ画像化技術により、動物全体で見出され得るトレーサーである。適切な標識としては、放射性同位体、蛍光色素、化学発光化合物、色素、およびタンパク質（酵素を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
（本発明の一般的全体像）
本発明の中心は、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を動物のＣＮＳに効率的に送達することを可能にする方法の開発である。以前、研究者らは、脳の広範な領域にウイルスベクターを送達させることにほとんど成功していなかった。対流増加送達デバイス（例えば、浸透圧ポンプまたは注入ポンプ）を使用すると、ウイルスベクターは脳の大きな領域にわたる多くの細胞に送達され得る。さらに、送達されたベクターは、ＣＮＳ細胞（例えば、ニューロン細胞またはグリア細胞）中で導入遺伝子を効率的に発現する。
【００５２】
本明細書中で記載されるウイルスベクター送達の方法を使用すると、ＣＮＳ障害（例えば、パーキンソン病）のための新規な遺伝子治療処置が考案され得る。１つの実施態様において、パーキンソン病（ＰＤ）は、全身的なＬ−ドパおよび／またはカルビドパ治療と、ＡＡＤＣ（ドパミン代謝に関与する酵素）をコードする導入遺伝子を運ぶＡＡＶベクターのＣＮＳ投与（例えば、ＣＥＤを介して）とを組み合わせることにより処置され得る。
【００５３】
本発明の利点としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）のＣＮＳへの効率的かつ広範な送達；（ｉｉ）ウイルスベクターによって運ばれた核酸（例えば、導入遺伝子）の発現；（ｉｉｉ）プロドラッグの投与と組み合わせた１つの導入遺伝子の送達を含むパーキンソン病の治療レジメンの同定；および（ｉｖ）ＰＥＴスキャンを使用してＣＮＳ遺伝子治療を非侵襲的にモニターする能力。
【００５４】
（ウイルスベクターの構築）
本発明の実施において有用な遺伝子送達ビヒクルは、分子生物学分野で周知の方法論を利用して構築され得る（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓ、前出を参照のこと）。代表的には、導入遺伝子を有するウイルスベクターは、導入遺伝子、適切な調節エレメントおよび細胞形質導入を媒介するウイルスタンパク質の生成に必要なエレメントをコードするポリヌクレオチドからアセンブルされる。例えば、好ましい実施態様において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが使用される。
【００５５】
（一般的方法）
ウイルスベクターのヌクレオチド成分を得る好ましい方法は、ＰＣＲである。ＰＣＲのための一般的手順は、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）に教示されている。各適用反応のためのＰＣＲ条件は、経験的に決定され得る。多くのパラメーターが反応の出来に影響を及ぼす。これらのパラメーターの中には、アニーリング温度および時間、伸長時間、Ｍｇ2+およびＡＴＰ濃度、ｐＨならびにプライマー、テンプレートおよびデオキシリボヌクレオチドの相対的濃度がある。例示的なプライマーは、実施例において以下に記載される。増幅後に、得られるフラグメントをアガロースゲル電気泳動、次いで、エチジウムブロマイド染色および紫外線照射での可視化により検出し得る。
【００５６】
ポリヌクレオチドを得るための別の方法は、酵素消化による。例えば、ヌクレオチド配列は、適切な認識制限酵素を用いた適切なベクターの消化により生成され得る。次いで、得られるフラグメントは、適切であれば、ともに連結され得る。
【００５７】
ポリヌクレオチドは、当該分野で周知の方法を使用してベクターゲノムに挿入される。例えば、挿入ＤＮＡおよびベクターＤＮＡは、適切な条件下で制限酵素と接触させ、互いに対形成し得る各分子上に相補的末端または平滑末端を作製し、そしてこれをリガーゼを用いて連結し得る。あるいは、合成核酸リンカーをポリヌクレオチドの末端に連結し得る。これらの合成リンカーは、ベクターＤＮＡにおける特定の制限部位に対応する核酸配列を含み得る。他の手段は、当該分野で公知であり、かつ利用可能である。
【００５８】
（レトロウイルスおよびアデノウイルスベクター）
多数の、ウイルスに基づく系が遺伝子送達に用いられてきた。例えば、レトロウイルス系が、公知であり、そして一般に組み込まれた欠損プロウイルス（「ヘルパー」）を有するパッケージング株を使用する。このプロウイルスは、ウイルスの全遺伝子を発現するがパッケージングシグナル（ｐｓｉ配列として公知）の欠失により自分自身のゲノムをパッケージし得ない。従って、この細胞株は空のウイルス外殻を生成する。プロデューサー株は、パッケージング株から誘導され得る。このパッケージング株は、ヘルパーに加えて、ウイルスの複製およびパッケージングのためにｃｉｓに必要な配列（長末端反復配列（ＬＴＲ）として公知）を含むウイルスベクターを含む。目的の遺伝子は、ベクターに挿入され得、そしてレトロウイルスヘルパーにより合成されたウイルス外殻にパッケージングされ得る。次いで、この組換えウイルスは、単離されそして被験体に送達され得る。（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号を参照のこと）。代表的なレトロウイルスベクターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えば米国特許第５，２１９，７４０号に記載されるＬＨＬ、Ｎ２、ＬＮＳＡＬ、ＬＳＨＬおよびＬＨＬ２ベクターのようなベクター、ならびに本明細書中に記載される改変Ｎ２ベクターのような、これらのベクターの誘導体。レトロウイルスベクターは、当該分野で周知の技術を用いて構築され得る。例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；Ｍａｎｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：１５３〜１５９を参照のこと。
【００５９】
アデノウイルスに基づく系は、遺伝子送達のために開発されており、そして本明細書に記載の方法による送達のために適切である。ヒトアデノウイルスは、レセプター媒介エンドサイトーシスにより細胞に入る二本鎖ＤＮＡウイルスである。これらのウイルスは、遺伝子移入に特によく適応する。なぜなら、それらは、増殖および操作が容易であり、そしてインビボおよびインビトロにおいて広範な宿主域を示すからである。例えば、アデノウイルスは、造血起源、リンパ起源および骨髄系起源のヒト細胞に感染し得る。さらに、アデノウイルスは、休止状態の標的細胞および複製中の標的細胞に感染する。宿主ゲノムに組み込むレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは染色体外で存続し、これにより挿入変異誘発に関連する危険性が最小になる。このウイルスは、容易に高力価で生成され、そして安定であり、精製されかつ貯蔵され得る。複製コンピテントな形態でさえ、アデノウイルスは、低レベルの罹患率しか生じず、そしてヒトの悪性疾患には関連しない。従って、これらの利点を利用するアデノウイルスベクターが開発されてきた。アデノウイルスベクターおよびそれらの使用の詳細については、例えば、Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７〜２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１〜５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３〜９４０；Ｂａｒｒら（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１〜５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６〜６２９；Ｒｉｃｈら（１９９３）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１〜４７６を参照のこと。
【００６０】
（ＡＡＶ  発現ベクター）
好ましい実施態様において、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。「ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶＸ７などを制限することなく含む、アデノ随伴ウイルス血清型由来のベクターを意味する。ＡＡＶベクターは、全体または部分、好ましくはｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子を欠失し、ただし、隣接する機能的なＩＴＲ配列は保持する、ＡＡＶ野生型遺伝子の１つ以上を有し得る。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングに必須である。従って、ＡＡＶベクターは、本明細書において、ウイルスの複製およびパッケージングのためｃｉｓに必要な少なくともそれらの配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を含むことが規定される。このＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列には必要でなく、そして、この配列が機能的レスキュー、複製およびパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換により変化されてもよい。
【００６１】
ＡＡＶ発現ベクターは、公知の技術を用いて構築され、少なくとも、転写開始領域、目的のＤＮＡおよび転写終結領域を含む制御エレメントを、転写の方向に作動可能に連結された成分として提供する。制御エレメントは、哺乳動物筋細胞において機能的であるように選択される。作動可能に連結された成分を含む生じた構築物は、機能的ＡＡＶ  ＩＴＲ配列に結合（５’および３’）している。
【００６２】
「アデノ随伴ウイルス逆方向末端配列」または「ＡＡＶ  ＩＴＲ」とは、ＡＡＶゲノムのそれぞれの末端で見出される、ＤＮＡ複製起点としておよびウイルスのパッケージングシグナルとしてｃｉｓに一緒に機能する当該分野で認識されている領域を意味する。ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ  ｒｅｐコード配列と一緒に、２つの隣接するＩＴＲに間に挟まれたヌクレオチド配列からの効率的な切除およびレスキューならびに哺乳動物ゲノムへのこの配列の組み込みを提供する。
【００６３】
ＡＡＶ  ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。ＡＡＶ−２配列については、例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５；７９３−８０１；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．「パルボウイルスおよびそれらの複製」、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）を参照のこと。本明細書中に使用される「ＡＡＶ  ＩＴＲ」は、記載された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はないが、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換により、改変され得る。さらに、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶＸ７などを含むがこれらに限定されない、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶベクターにおいて選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、ＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞に存在する場合、ＩＴＲが意図されたように機能（すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターから目的の配列の切除およびレスキューを可能にし、そして異種配列の、レシピエント細胞ゲノムへの組み込みを可能にする）している限り、必ずしも同一であるか、または同一のＡＡＶ血清型もしくは単離物に由来している必要はない。
【００６４】
さらに、ＡＡＶ  ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得、この血清型は、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶＸ７などを含むがこれらに限定されない。さらに、ＡＡＶ発現ベクター中の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、ＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞に存在する場合、ＩＴＲが意図されたように機能（すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的の配列の切除およびレスキューを可能にし、そしてＤＮ分子のレシピエント細胞への組み込みを可能にする）している限り、それらが必ずしも同一であるか、または同一のＡＡＶ血清型もしくは単離物に由来している必要はない。
【００６５】
ＡＡＶベクターにおける使用のための適切なＤＮＡ分子は、約５キロベース（ｋｂ）未満のサイズであり、そして、例えば、レシピエント被験体から欠損または消失しているタンパク質をコードする遺伝子、または所望の生物学的または治療的効果（例えば、抗細菌機能、抗ウイルス機能、または抗腫瘍機能）を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む。好ましいＤＮＡ分子は、ドパミン代謝に関連する分子、例えば、ＡＡＤＣまたはＴＨを含む。ＡＡＶ−ＡＡＤＣベクターおよびＡＡＶ−ＴＨベクターは、例えば、Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚら（１９９７）Ｅｘｐｅｒ’ｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：１４７〜１５６；Ｆａｎら（１９９８）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：２５２７〜２５３５、および国際公開  ＷＯ９５／２８４９３（１９９５年１０月２６日公開）に記載されている。
【００６６】
選択されたヌクレオチド配列（例えば、ＡＡＤＣまたは目的の別の遺伝子）は、被験体においてインビボでその転写または発現を指向する制御エレメントに作動可能に連結される。このような制御エレメントは、選択された遺伝子と通常関連する制御配列を含み得る。あるいは、異種制御配列が用いられ得る。有用な異種制御配列には、一般的に、哺乳動物もしくはウイルスの遺伝子をコードする配列に由来する制御配列が含まれる。例としては、ＳＶ４０早期プロモーター；マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、ＣＭＶ極初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ））；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；合成プロモーター；ハイブリッドプロモーター；などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、非ウイルス遺伝子（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子）由来の配列もまた、本明細書中での使用を見出す。このようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されている。
【００６７】
本発明の目的のためには、異種プロモーターおよび他の制御エレメント（例えば、ＣＮＳ特異的プロモーターおよび誘導性プロモーター、エンハンサーなど）の両方が、特に有用である。異種プロモーターの例としては、ＣＭＢプロモーターが挙げられる。ＣＮＳ特異的プロモーターの例としては、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）由来の遺伝子から単離されたプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例としてはエクジソン、テトラサイクリン、低酸素症およびアウフィン（ａｕｆｉｎ）についてのＤＮＡ応答性エレメントが挙げられる。
【００６８】
ＡＡＶ  ＩＴＲに結合された目的のＤＮＡ分子を有するＡＡＶ発現ベクターは、選択された配列（単数または複数）を、そこから主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）が切り取られているＡＡＶゲノム中に直接挿入することにより構築され得る。複製およびパッケージング機能を可能にするに十分な部分のＩＴＲが残される限り、ＡＡＶゲノムの他の部分もまた欠失させ得る。このような構築物は、当該分野において周知の技術を使用して設計され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開第ＷＯ  ９２／０１０７０号（１９９２年１月２３日公開）および同第ＷＯ  ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）  Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  ８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら（１９９４）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
【００６９】
あるいは、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ウイルスゲノムまたはＡＡＶ  ＩＴＲを含むＡＡＶベクターから切り取られ、そして標準的な連結技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載の連結技術）を使用して、別のベクターに存在する選択された核酸構築物の５’および３’に融合され得る。例えば、連結は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ  ＮａＣｌ、そして４０μＭ  ＡＴＰ、０℃の０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「粘着末端」連結用）か、または１ｍＭ  ＡＴＰ、１４℃の０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「平滑末端」連結用）のいずれか、において達成され得る。分子間「粘着末端」連結は、通常、３０〜１００μｇ／ｍｌの総ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＭの総末端濃度）にて実行される。ＩＴＲを含むＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号に記載されている。特に、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）から、受託番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５、および５３２２６の下で入手可能ないくつかのＡＡＶベクターが上記特許明細書に記載されている。
【００７０】
さらに、キメラ遺伝子は、１つ以上の選択された核酸配列の５’および３’に配置されたＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含むように合成的に産生され得る。哺乳動物ＣＮＳ細胞におけるキメラ遺伝子配列の発現のために好ましいコドンが使用され得る。完全なキメラ配列が、標準的な方法によって調製された重複オリゴヌクレオチドから組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１１を参照のこと。
【００７１】
ｒＡＡＶビリオンを産生するため、ＡＡＶ発現ベクターが、トランスフェクションのような公知の技術を用いて適切な宿主細胞に導入される。多くのトランスフェクション技術が当該分野で一般的に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら  （１９７３）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら  （１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照のこと。特に適切なトランスフェクション方法は、リン酸カルシウム共沈殿（Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６−４６７）、培養した細胞中への直接マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−４８８）、エレクトロポレーション（Ｓｈｉｇｅｋａｗａら  （１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１）、リポソーム媒介遺伝子移入（Ｍａｎｎｉｎｏら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６８２−６９０）、脂質媒介形質導入（Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７）、および高速度マイクロプロジェクタイルを使用する核酸送達（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３）を包含する。
【００７２】
本発明の目的のために、ｒＡＡＶビリオンを産生するために適切な宿主細胞は微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含み、それは、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用され得るか、または使用されている。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。このように、本明細書中に使用される「宿主細胞」は、通常、外因性ＤＮＡ配列によってトランスフェクトされた細胞をいう。安定なヒト細胞株２９３（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションから受託番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３で容易に入手可能）に由来する細胞が本発明の実施において好ましい。特に、ヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型のＤＮＡフラグメントで形質転換したヒト胚腎細胞株であり（Ｇｒａｈａｍら、（１９７７）  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９）、アデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子を発現する（Ａｉｅｌｌｏら（１９７９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９４：４６０）。２９３細胞株は、容易にトランスフェクトされ、そしてｒＡＡＶビリオンを産生するための特に便利なプラットフォームを提供する。
【００７３】
（ＡＡＶヘルパー機能）
上記のＡＡＶ発現ベクターを含む宿主細胞は、ＡＡＶ  ＩＴＲに隣接するヌクレオチド配列を複製しそしてキャプシド形成してｒＡＡＶビリオンを産生するために、ＡＡＶヘルパー機能を提供し得るようにならなければならない。ＡＡＶヘルパー機能は、通常、ＡＡＶ遺伝子産物を提供するために発現され得るＡＡＶ由来コード配列である。次いで、この遺伝子産物は、増殖性ＡＡＶ複製のためにトランスで機能する。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターに欠損している必要なＡＡＶ機能を相補するために本明細書中で使用される。このように、ＡＡＶヘルパー機能は、１つまたは両方の主要なＡＡＶ  ＯＲＦ、つまりｒｅｐおよびｃａｐコード領域、またはその機能的ホモログを含む。
【００７４】
Ｒｅｐ発現産物は、とりわけ、ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合およびニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ならびにＡＡＶ（または、他の異種の）プロモーターからの転写の調節を含む多くの機能を有することが示されてきた。このＣａｐ発現産物は、必須のパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターに欠損しているＡＡＶ機能をトランスで相補するために本明細書中で使用される。
【００７５】
用語「ＡＡＶヘルパー構築物」は、一般に、目的のヌクレオチド配列の送達のための形質導入ベクターを作製するために用いられるＡＡＶベクターに欠失しているＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子をいう。ＡＡＶへルパー構築物は、通常、溶解性のＡＡＶ複製に必須である欠損ＡＡＶ機能を相補するためＡＡＶのｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子の一過性発現を提供するために用いられる。しかし、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ  ＩＴＲを欠き、そしてそれ自身を複製もパッケージングもし得ない。ＡＡＶへルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態であり得る。多数のＡＡＶヘルパー構築物が記載されている。これは、例えば、Ｒｅｐ発現産物およびＣａｐ発現産物の両方をコードする、通常用いられるプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９−４５である。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２８；およびＭｃＣａｒｔｙら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６〜２９４５を参照のこと。Ｒｅｐ発現産物および／またはＣａｐ発現産物をコードする多数の他のベクターが記載されている。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号を参照のこと。
【００７６】
「ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質Ｒｅｐ  ７８、Ｒｅｐ  ６８、Ｒｅｐ  ５２、およびＲｅｐ  ４０をコードするＡＡＶゲノムの当該分野で認識された領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合およびニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ならびにＡＡＶ（または、他の異種の）プロモーターからの転写の調節を含む多くの機能を有することが示されてきた。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムを複製するのに集団的に必要である。ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域の記載については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，  Ｎ．  （１９９２）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：９７−１２９；およびＫｏｔｉｎ，  Ｒ．Ｍ．  （１９９４）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１を参照のこと。ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域の適切なホモログは、ＡＡＶ−２  ＤＮＡ複製を媒介することも知られているヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子（Ｔｈｏｍｓｏｎら、（１９９４）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０４：３０４−３１１）を含む。
【００７７】
「ＡＡＶ  ｃａｐコード領域」とは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、あるいはそれらの機能的ホモログをコードするＡＡＶゲノムの当該分野で認識された領域を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージングするのに集団的に必要とされるパッケージング機能を供給する。ＡＡＶ  ｃａｐコード領域の記載については、例えば、  Ｍｕｚｙｃｚｋａ，  Ｎ．  およびＫｏｔｉｎ，  Ｒ．Ｍ．（上記）を参照のこと。
【００７８】
ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクションの前、または同時のいずれかで、ＡＡＶヘルパー構築物で宿主細胞をトランスフェクトすることにより宿主細胞に導入される。このように、ＡＡＶヘルパー構築物は、増殖性ＡＡＶ感染のために必要な欠損ＡＡＶ機能を相補するために、ＡＡＶ  ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の少なくとも一過性の発現を提供するために使用される。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ  ＩＴＲを欠損しており、そして、自身を複製もパッケージすることをもし得ない。これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態であり得る。ＲｅｐおよびＣａｐの両方の発現産物をコードする、一般に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５のような多くのＡＡＶヘルパー構築物が記載されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＣａｒｔｙら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６−２９４５を参照のこと。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ発現産物をコードする多くの他のベクターが記載されている。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号を参照のこと。
【００７９】
ＡＡＶ発現ベクターおよびＡＡＶヘルパー構築物の両方が、１つ以上の任意の選択マーカーを含むように構築され得る。適切なマーカーには、選択マーカーを含む核酸構築物でトランスフェクトされている細胞が適切な選択培地中で増殖される場合、それらの細胞に抗生物質耐性もしくは感受性を与えるか、色を与えるか、または抗原特徴を変化させる遺伝子が挙げられる。本発明の実施に有用ないくつかの選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯから入手可能）に対する耐性を与えることによって哺乳動物細胞での選択を可能にするハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードする）を含む。他の適切なマーカーは当業者に公知である。
【００８０】
（ＡＡＶ付属機能）
宿主細胞（またはパッケージング細胞）はまた、ｒＡＡＶビリオンを産生するために、非ＡＡＶ由来の機能すなわち「付属機能」を提供し得るようにならなければならない。付属機能は、ＡＡＶがその複製を依存する、非ＡＡＶ由来のウイルスおよび／または細胞機能である。このように、付属機能は、少なくとも、ＡＡＶ遺伝子転写、時期特異的なＡＡＶ  ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ  ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶキャプシドアセンブリの合成の活性化に関連するものを含む、ＡＡＶ複製に必要な非ＡＡＶタンパク質およびＲＮＡを含む。ウイルスベースの付属機能は、公知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。
【００８１】
特に、付属機能は、当業者に公知である方法を使用して宿主細胞に導入され得、次いで発現され得る。一般に、付属機能は、関連のないヘルパーウイルスでの宿主細胞の感染によって提供される。アデノウイルス；単純ヘルペスウイルス１型および２型のようなヘルペスウイルス；ならびにワクシニアウイルスを含む、多くの適切なヘルパーウイルスが公知である。任意の種々の公知の薬剤を使用した細胞同期化により提供される付属機能のような非ウイルス付属機能も、本発明における使用を見出す。例えば、Ｂｕｌｌｅｒら（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４０：２４１−２４７；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９８５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４７：２１７−２２２；Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒら（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５２：１１０−１１７を参照のこと。
【００８２】
あるいは、付属機能は、付属機能ベクターを使用して提供され得る。付属機能ベクターは、１つ以上の付属機能を提供するヌクレオチド配列を含む。付属機能ベクターは、宿主細胞中の効率的なＡＡＶビリオン産生を支持するために、適切な宿主細胞に導入され得る。付属機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、またはコスミドの形態であり得る。付属ベクターはまた、適切な制御エレメントおよび酵素と会合する場合、宿主細胞において転写され得るか、または発現され得て付属機能を提供し得る、１つ以上の線状化ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントの形態であり得る。例えば、１９９７年５月１５日公開の国際公開番号ＷＯ９７／１７５４８を参照のこと。
【００８３】
付属機能を提供する核酸配列は、アデノウイルス粒子のゲノムのような天然源から得られ得るか、または、当該分野で公知の組換え方法または合成方法を使用して構築され得る。この意味で、アデノウイルス由来付属機能は、広範に研究されており、付属機能に関連する多数のアデノウイルス遺伝子が、同定され、そして部分的に特徴づけられている。例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９０）「アデノ随伴ウイルスヘルパー機能」  ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ、第一巻（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編）；およびＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９を参照のこと。特に、初期アデノウイルス遺伝子領域Ｅ１ａ、Ｅａ２、Ｅ４、ＶＡＩ  ＲＮＡおよび、潜在的に、Ｅ１ｂは、付属プロセスに参加していると考えられる。Ｊａｎｉｋら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１９２５−１９２９。ヘルペスウイルス由来付属機能が記載されている。例えば、Ｙｏｕｎｇら（１９７９）Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．２５：１１３を参照のこと。ワクシニアウイルス由来付属機能もまた、記載されている。例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９０）、上記、Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒら、（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５２：１１０−１１７を参照のこと。
【００８４】
宿主細胞のヘルパーウイルスでの感染、または宿主細胞の付属機能ベクターでのトランスフェクションの結果として、ＡＡＶ  Ｒｅｐおよび／またはＣａｐタンパク質を産生するためにＡＡＶヘルパー構築物をトランス活性化する付属機能が発現される。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶ発現ベクターから組換えＤＮＡ（目的のＤＮＡを含む）を切り出す。Ｒｅｐタンパク質はまた、ＡＡＶゲノムを２倍にするために作用する。発現したＣａｐタンパク質はキャプシドへと組み立てられ、そして組換えＡＡＶゲノムはキャプシド中にパッケージされる。このように、増殖性ＡＡＶ複製が起こり、そしてＤＮＡはｒＡＡＶビリオンにパッケージされる。
【００８５】
組換えＡＡＶ複製の後、ｒＡＡＶビリオンは、ＣｓＣｌ勾配のような種々の従来の精製方法を使用して宿主細胞から精製され得る。さらに、感染が付属機能を発現するために用いられる場合、残りのヘルパーウイルスは、公知の方法を使用して不活性化され得る。例えば、アデノウイルスは、例えば、２０分以上、約６０℃の温度まで加熱することによって不活性化され得る。この処理はヘルパーのみを効率的に不活性化する。なぜなら、ＡＡＶは非常に熱安定性であるが、一方ヘルパーアデノウイルスは熱不安定性であるからである。
【００８６】
次いで、得られたｒＡＡＶビリオンは、被験体のＣＮＳ（例えば、頭蓋腔）へのＤＮＡ送達のための使用に用意される。
【００８７】
（ウイルスベクターの送達）
ウイルスベクターの送達方法としては、動脈内経路、筋肉内経路、静脈内経路、経鼻経路および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、ｒＡＡＶビリオンは、インビボ形質導入技術またはインビトロ形質導入技術のいずれかを用いてＣＮＳの細胞中に導入され得る。インビトロで形質導入された場合、所望のレシピエント細胞は、被験体から取り出され、ｒＡＡＶビリオンで形質導入され、そしてその被験体に再導入される。あるいは、同系または異系の細胞が不適切な免疫応答を被験体において産生しない場合、それらの細胞が使用され得る。
【００８８】
形質導入細胞の被験体への送達および導入のための適切な方法が記載されている。例えば、組換えＡＡＶビリオンは、ＣＮＳ細胞と（例えば、適切な培地中で）組み合わせられることによって細胞はインビトロで形質導入され得、そして目的のＤＮＡを有する細胞に対するスクリーニングは、サザンブロットおよび／またはＰＣＲのような従来技術を使用して、または選択マーカーを使用することによってスクリーニングされ得る。次いで、形質導入細胞は、薬学的組成物に処方され得（以下にさらに十分に記載される）、そしてその組成物は、グラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）、筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内注射といった種々の技術により被験体に導入され得る。
【００８９】
インビボ送達については、ｒＡＡＶビリオンが、薬学的組成物に処方され、そして一般に、非経口的に（例えば、骨格筋または心筋への直接的な筋肉内注射によってか、またはＣＮＳへの注射によって）投与される。
【００９０】
しかし、従来の方法（例えば、注射）は、ウイルスベクターの被験体の脳への広範な送達を提供することが示されていないので、ウイルスベクターを対流増加送達（ＣＥＤ：ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）系を介してＣＮＳに効率的に送達する発見が、本発明の中心をなす。本発明者らは、ＣＥＤがウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を動物の脳（例えば、線条体）の広い領域に対して効率的に送達し得ることを初めて記載し、そして初めてそれを実証する。以下に詳細に記載されそして例示されるように、これらの方法は、種々のウイルスベクター、例えば、レポーター遺伝子（例えば、チミジンキナーゼ（ｔｋ））または治療的遺伝子（例えば、ＡＡＤＣおよびｔｋ）を有するＡＡＶベクター、に適している。
【００９１】
任意の対流増加送達デバイスが、ウイルスベクターの送達に適切であり得る。好ましい実施態様において、このデバイスは、浸透ポンプまたは注入ポンプである。浸透ポンプおよび注入ポンプの両方は、種々の供給元から市販されている（例えば、Ａｌｚｅｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｌｚａ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。代表的には、ウイルスベクターは、以下のように、ＣＥＤデバイスを介して送達される。カテーテル、カニューレまたは他の注射デバイスが、選択した被験体のＣＮＳ組織に挿入される。本明細書中の教示から、当業者は、ＣＮＳのどの一般の領域が適切な標的であるかを容易に決定し得る。例えば、ＰＤを処置するためにＡＡＶ−ＡＡＤＣを送達する場合、線条体が、脳の標的にするには適切な領域である。定位マップ（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ｍａｐ）およびポジショニングデバイスが利用可能である（例えば、ＡＳＩ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗａｒｒｅｎ  ＭＩから）。ポジショニングはまた、被験体の脳のＣＴ画像化および／またはＭＲＩ画像化により得られた解剖学的マップを使用して行われ、これは選択した標的への注射デバイスの誘導を補助し得る。さらに、本明細書に記載される方法は、脳の比較的に広い領域がウイルスベクターを吸収するように行われ得るので、注入カニューレをほとんど必要としない。外科的合併症は穿通の回数に関連するので、本明細書に記載される方法はまた、従来の送達技術において見られた副作用を減少させるのに役立つ。
【００９２】
薬学的組成物は、目的のタンパク質の治療的な有効量（すなわち、問題の疾患状態の症状を低減もしくは改善するに充分な量、または所望の有益性を与えるに充分な量）を産生するに充分な遺伝物質を含む。この薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能な賦形剤を含む。このような賦形剤は、それ自身がその組成物を受ける個体にとって有害な抗体の産生を誘導せず、そして過度な毒性なく投与され得る、任意の薬学的薬剤を含む。薬学的に受容可能な賦形剤としては、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ８０、ならびに水、生理的食塩水、グリセロール、およびエタノールのような液体が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に受容可能な塩は、本明細書においては、例えば、塩酸塩、臭酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような無機酸塩；ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸塩を含み得る。さらに、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質は、このようなビヒクル中に存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤の詳細な議論は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（ＭａｃｋＰｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）で入手可能である。
【００９３】
本明細書の教示から当業者に明らかであるように、添加されなければならないウイルスベクターの有効量は経験的に決定され得る。投与は、処置過程を通して連続的または断続的に１用量にて行われ得る。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、当業者に周知であり、そしてウイルスベクター、治療組成物、標的細胞、および処置されている被験体により変化する。単回投与および複数回投与が、処置する医師により選択されている用量レベルおよびパターンで行われ得る。
【００９４】
１より多いトランスジーンが、送達されるウイルスベクターにより発現され得ることが理解されるべきである。あるいは、別々のベクター（各々が１以上の異なるトランスジーンを発現する）がまた、本明細書に記載されるようにＣＮＳに送達され得る。さらに、本発明の方法により送達されるウイルスベクターが、他の適切な組成物および治療と組み合わせられることもまた意図される。例えば、以下の実施例で詳細に記載されるように、パーキンソン病は、ＡＡＤＣを発現するＡＡＶベクターをＣＮＳに（例えば、尾状核または線条体の被殻に）同時投与することによって処置され得、そしてさらなる薬剤（例えば、ドパミン前駆体（例えば、Ｌ−ドパ）、ドパミン合成のインヒビター（例えば、カルビドパ）、ドパミン異化作用のインヒビター（例えば、ＭａＯＢインヒビター）、ドパミンアゴニストもしくはドパミンアンタゴニスト）が、ＡＡＤＣをコードするベクターの投与の前に、それに続いて、またはそれと同時に投与され得る。例えば、Ｌ−ドパ（および必要に応じてカルビドパ）が、全身的に投与され得る。このようにして、ＰＤ患者において自然に枯渇しているドパミンが、Ｌ−ドパをドパミンに変換し得るＡＡＤＣの発現によって明らかに回復される。トランスジーン（例えば、ＡＡＤＣ）が誘導性プロモーターの制御化にある場合、このトランスジーンの発現を調節するために、ムリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎｅ）、ポナステロン（ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎ）、テトラシリン（ｔｅｔｒａｃｙｌｉｎｅ）またはアウフィン（ａｕｆｉｎ）のような、全身送達される特定の化合物が投与され得る。
【００９５】
（ＣＮＳ障害の処置）
治療的トランスジーンを発現するウイルスベクターを使用して、治療的なタンパク質またはペプチドを提供することによって種々のＣＮＳ障害を処置し得る。好ましい実施態様において、ウイルスベクターは、本明細書に記載されるＣＥＤ法を介してＣＮＳに送達される。なぜなら、これらの方法は、広範囲に分布するウイルスベクターの第１の効果的様式をＣＮＳに提供するからである。処置され得る障害の限定されない例としては、腫瘍、発作および神経変性疾患から生じる障害が挙げられる。
【００９６】
（パーキンソン病）
本発明の好ましい実施態様において、酵素ＡＡＤＣを提供するウイルスベクターが、パーキンソン病の処置のために使用される。上記したように、パーキンソン病は、ドパミン作用性黒質線状体ニューロンの選択的な損失から生じ、その結果、黒質からの線条体への入力の損失を生じる。ＰＤの動物モデルが、例えば、ドパミン作用性細胞を破壊する６−ヒドロキシドパミン（６−ＯＨＤＡ）でラットまたは霊長類を処置することによってか、または神経毒である１−メチル−４−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）（これはパーキンソン病様の疾患を生じる）で霊長類を病変させることによって作製されている。
【００９７】
本発明は、パーキンソン病患者（例えば、ＭＰＴＰで病変したサル）のドパミン作用性活性が、ＡＡＤＣのトランスジーンを有するウイルスベクターを、Ｌ−ドパおよび（必要に応じてカルビドパ）の全身的（例えば、経口）投与と組み合わせて投与することによって回復され得るという初めての証拠を提供する。パーキンソン病のための遺伝子治療に関する以前の示唆は、疾患の進行に伴うチロシンヒドロキシラーゼの欠乏について焦点を当ててきた。したがって、これらの示唆により、インサイチュでドパミンを生成するためには、少なくとも３つのトランスジーン（チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子；補因子ビオプリテン（ｂｉｏｐｔｒｅｎｅ）であるＧＴＰ−シクロヒドロキシラーゼ−１の遺伝子；およびＡＡＤＣの遺伝子）の首尾のよい発現による黒質線状体経路におけるドパミン合成の回復が要求される。３つの遺伝子を適切なレベルで送達することに付随する問題に加えて、このアプローチを使用してドパミンレベルの調節を制御することは困難である。
【００９８】
本発明者らは、Ｌ−ドパと組み合わせた１つのトランスジーン（例えば、ＡＡＤＣ）が治療的有用性を提供することを実証した。ＡＡＤＣはドパミン生合成の最終工程に関与する酵素であり、これは、Ｌ−ドパをドパミンに変換する。従って、ドパミン作用性活性を回復するためのＡＡＤＣ治療的アプローチの明らかな利点は、たった１つの遺伝子が送達されなければならず、そしてドパミンレベルの調節がＬ−ドパの末梢レベルを制御することによって可能であることである。さらに、ＡＡＤＣ遺伝子だけを送達することによって、Ｌ−ドパはプロドラッグとして使用され、線条体におけるドパミンレベルを調節し得る。
【００９９】
ＡＡＶベクターによって送達されるＡＡＤＣをコードするヌクレオチドは、主に、線条体ニューロンで発現されるようなので、別の重要な治療的利点は、Ｌ−ドパに関する機構を緩衝する処置の提供である。運動異常症のような多くの副作用が、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ）のヒトの脳の非効率な緩衝作用に起因する。本明細書に記載される方法は、代謝されないＬ−ドパがニューロンに貯蔵されることを可能にすることによってこの問題を回避する。以下に例示されるように、ＭＰＴＰ処置された線条体へのＡＡＤＣの送達が、線条体ニューロンによる、Ｌ−ドパのドパミンへの変換、引き続くＤＯＰＡＣおよびＨＶＡへの代謝を可能にする。ＦＭＴ  ＰＥＴデータに基いて、ＦＭＴが線条体ニューロン領域において可視化されたので、線条体ニューロンはまたドパミンを貯蔵し得るようである。事実、ＡＡＤＣ遺伝子の転入の後でのＬ−ドパのドパミンへの変換速度は、頑強でありかつ正常な線条体で見られたものより優れていた（例えば、図７を参照のこと）。さらに、パーキンソン病は進行性の障害ではあるが、進行中の変性プロセスは、線条体ニューロンでのＡＡＤＣ発現に影響しないようである。なぜなら、これらは、代表的に、特発性パーキンソン病によって影響されないからである。
【０１００】
特発性パーキンソン病に罹患する患者のドパミン作用系の変性は、均一ではない。黒質線状体経路は中脳辺縁系経路より非常に速い速度で変性し、これは、この２つの経路の活性の間の平衡異常を有する患者を残す。この疾患が進行するにつれ、黒質線状体経路の変性を補償するには、より高レベルのＬ−ドパが必要とされるが、これはまた、核の側坐核（ａｃｃｕｍｂｅｎｓ）および中脳辺縁系の他の部分において、さらにより高いドパミンレベルを生じる。このような過剰刺激は、幻覚のようなＬ−ドパ処置に関連するいくつかの副作用の原因となり得る。同様に、ＭＰＴＰは、中脳辺縁系ドパミン作用性系を相対的に乏しくした（例えば、図７を参照のこと、尾状核および被殻においてはドパミン作用性神経支配が存在せず、部分的な病変が核の側坐核に見られる）。図７に示されるように、ＡＡＶ−ＡＡＤＣは、この平衡異常をほぼ正常な均衡まで回復し得る。したがって、ＡＡＤＣ酵素レベルの回復後に、より低用量のＬ−ドパが必要とされ、そしてＬ−ドパのドパミンへの変換速度を改善することが可能である。これは、順々に、中脳辺縁系の過剰刺激を減少し得、その結果、Ｌ−ドパ／カルビドパに関連する副作用をより少なくする。
【０１０１】
上記で説明したように、ＡＡＶ−ＡＡＤＣベクターは、任意の適切な方法によって送達され得る。これらの方法としては、例えば、インジェクション、グラフティング、注入、このベクターを有する細胞の移植などが挙げられる。好ましい実施態様において、このベクターは、本明細書に記載されるＣＥＤ法によって送達される。以下に例示するように、このような送達方法は、ＣＮＳニューロンでの広範囲の分布および発現を提供して、それによってＰＤについての新規な処置レジメを提供する。
【０１０２】
（画像化）
本発明はまた、酵素または他の分子のインビボでの活性を決定する方法を提供する。さらに詳細には、標的とされる活性を特異的に追跡するトレーサーが選択されそして標識される。好ましい実施態様において、このトレーサーは、ドパミン活性（例えば、ドパミンを利用する細胞に結合するフルオロ−Ｌ−ｍ−チロシン（ＦＭＴ））を追跡する。選択したトレーサーに適切な標識としては、分光器的、光化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。本発明において有用な標識としては、放射標識（例えば、18Ｆ、3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、32Ｐなど）、酵素、比色標識、蛍光色素などが挙げられる。好ましい実施態様において、標識18Ｆは、ドパミン活性を定量するためにＦＭＴとともに使用される。
【０１０３】
標識を検出する手段は、当業者に周知である。例えば、放射標識は、画像化技術、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出され得る。好ましい実施態様において、この標識は、画像化技術（例えば、陽子射出断層投影法（ＰＥＴ））によって、被験体の脳においてインビボで検出される。ＰＥＴ技術は、以下の実施例３に詳細に議論される。
【０１０４】
（実施例）
以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の例である。この実施例は、例示の目的のみのために提供され、そしていかなる方法においても本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１０５】
使用される数値（例えば、量、温度など）について正確さを確保するための試みがなされたが、当然、若干の実験的な誤差および偏差は許容されるべきである。
【０１０６】
（実施例１：ＡＡＶ−ｔｋの構築および生成）
ＡＡＶ−ｔｋベクターを、ｐＵＣベースのプラスミド（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能）におけるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターの転写制御下に単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を配置することにより構築した。β−グロブリンのイントロンをｔｋ遺伝子の上流に直接的に配置し、そしてヒト成長ホルモンのポリＡを下流に配置した。このカセット全体を、遺伝子の発現、複製、およびウイルス粒子へのパッケージングに必要とされるＡＡＶの逆方向末端配列（ＩＴＲ）に隣接させた。
【０１０７】
組換えＡＡＶビリオンを、以下のように、ヒト２９３細胞（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（受諾番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）から容易に入手可能）中で産生した。この２９３細胞株を、完全ＤＭＥＭ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）（４．５ｇ／Ｌ  グルコース、１０％  熱失活ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、および２ｍＭ  グルタミンを含む）中で培養した。サブコンフルエントな２９３細胞を、リン酸カルシウム沈殿（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと）により、ＩＴＲに隣接したＡＡＶ−ｔｋ発現カセットならびにＡＡＶ（ｐｗ１９０９（ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含む））とアデノウイルス（ｐＬａｄｅｎｏｌ（Ｅ２ａ、Ｅ４、およびアデノウイルスＶＡ1ＲＮＡ遺伝子およびＶＡ11ＲＮＡ遺伝子を含む））との両方に由来するヘルパープラスミドで同時トランスフェクトした。６時間後、この培地を、血清を含まないＤＭＥＭに交換し、そしてインキュベーションを３７℃、５％  ＣＯ2にて７２時間続けた。ペレット化した細胞を、Ｔｒｉｓ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）中で凍結／融解を３回行って溶解させ、そして溶解物を１０，０００ｇ、１５分間の遠心分離によって細胞片から清澄化した。非ウイルスタンパク質をペレットにするために、ＣａＣｌ2を最終濃度２５ｍＭまで添加し、そして０℃にて１時間インキュベートした後に、この清澄化した溶解物を１０，０００ｇで１５分間遠心分離した。得られた上清にポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ）を添加した（最終濃度＝８％）；この溶液を０℃にて３時間インキュベートし、そして３０００×ｇで３０分間遠心分離した。ベクターを含むペレットを、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  Ｎａ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で可溶化させ、そして１０，０００×ｇで１５分間遠心分離してペレットにし、そして不溶性物質を除去した。
【０１０８】
塩化セシウム等密度（ｉｓｏｐｙｃｎｉｃ）勾配遠心分離を行い、そしてＡＡＶ−ｔｋを、得られた勾配から平均密度１．３８ｇ／ｍｌを有する画分を単離することにより回収した。ベクターを濃縮するためにＰＥＧを再び使用した。次いで、これを２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  Ｎａ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中に再懸濁し、そして記載したように遠心分離して不溶性物質を除去した。このストックをＤＮＡｓｅ処理し、そしてベクター力価を定量的ドットブロットハイブリダイゼーションにより決定した。
【０１０９】
（実施例２：ＡＡＶ−ｔｋのインビボ送達：用量および方法）
脳への導入に適切な用量のＡＡＶを決定するために、以下の研究を行った。ＡＡＶベクターに対する用量応答を試験するために、その比較的に大きな同構造組織の領域ゆえに、ならびに線条体は、神経変性疾患および他の中枢神経系障害の処置に対する標的なので線条体を使用した。
【０１１０】
さらに、ベクターをＣＮＳに送達する効率的な方法を決定した。治療剤の単純な定位的インジェクションは、脳において限られた容積の分布を生じることが示されている（Ｋｒｏｌｌら，（１９９６）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ３８：７４６−７５４）。したがって、頭蓋内送達の間の圧力勾配を維持するために、低速度注入ポンプを使用した。低分子、中程度分子、および大きな分子の脳への送達に関する以前の研究により、低速度注入ポンプが、広範でかつ均質な組織分布を生じることが実証されている。
【０１１１】
ベクターの頭蓋内インジェクションを投与するにはどの方法が最も効率的であるかを研究するために、Ｈａｒｖａｒｄ注入ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）またはＡｌｚｅｔ皮下浸透ポンプ（Ａｌｚａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用することによって、ラットに２．５×１０10粒子のＡＡＶを与えた。雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０〜３００ｇ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から）を、ケタミン（体重１ｋｇあたり１００ｍｇ）およびキシラジン（体重１ｋｇあたり１０ｍｇ）の腹腔内注射により麻酔し、そして手術のために調製した。手術の間、鎮静を、イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）（Ａｔｔｒａｎｅ．Ｏｍｅｄａ  ＰＰＤ  Ｉｎｃ．，Ｌｉｂｅｒｔｙ，ＮＪ）を用いて維持し、そしてＯ2流速を０．３〜０．５Ｌ／ｍで維持した。各々のラットの頭部を耳棒（ｅａｒｂａｒ）で定位装置（Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  Ｆｒａｍｅ；ＡＳＩ  Ｉｎｓｔｒｕｅｍｎｔｓ，Ｗａｒｒｅｎ，ＭＩ）にて固定し、そして皮膚を通じて正中切開して頭蓋骨を露出させた。小さな歯科用ドリルを使用して、ブレグマから１ｍｍ前方および正中線から２．６ｍｍ後方の頭蓋骨に穿孔を作製した。注入ポンプまたは皮下浸透ポンプを使用して、ベクターを左半球の深さ５ｍｍに送達した。
【０１１２】
投薬研究のために、３つの群の動物（一群あたり６匹の動物）が存在した。各々の動物に、ＡＡＶ−ｋｔを、Ｈａｒｖａｒｄ注入ポンプを使用して８μｌ／ｈの速度にて２．５時間連続して投与した。ローディングチャンバー（Ｔｅｆｌｏｎチュービング１／１６ｔｈ「ＯＤ×０．０３」ＩＤ）および付属注入チャンバー（１／１６「ＯＤ×０．０２」ＩＤ）を、総容量２０μｌの人工脳脊髄液（ｃｓｆ）（１４８ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＫＣｌ，１．４ｍＭ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ，０〜８ｍＭ  ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ，１．３ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4・Ｈ2Ｏ，０．２ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4・Ｈ2Ｏ）中２．５×１０8、２．５×１０9、または２．５×１０10粒子のＡＡＶ−ｋｔで満たした。融合シリカ（ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ）にはめ込んだ２７ゲージ針により送達を行い、これを注入の後に徐々に１５ｍで取り除いた。
【０１１３】
あるいは、ベクターを６匹の動物の１つの群に送達するために、皮下浸透ポンプを使用した。各々のラットに、ＡＡＶ−ｔｋをＡｌｚｅｔ浸透ポンプ（モデル番号２００１Ｄ）（ＡＬＺＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して８μｌ／ｈの速度にて２４時間連続して投与した。このポンプのリザーバーおよび付属カテーテル（ポリエチレン６０チュービング）を、総容量２００μｌの人工脳脊髄液（ｃｓｆ）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ）中２．５×１０10粒子のＡＡＶ−ｔｋで満たした。融合シリカにはめ込んだ２７ゲージカニューレにより送達を行った。定位配置の後、このカニューレを小さなステンレス綱ねじおよび歯科用接着剤で頭蓋骨に固定し、そしてポンプを背中の肩甲中央領域（ｍｉｄ−ｓｃａｐｕｌａｒ  ａｒｅａ）の皮下に移植した。手術部位を解剖学的層（ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  ｌａｙｅｒ）にて９ｍｍの創傷クリップを用いて閉じた。２４時間後、カテーテルを留めてそして密封してポンプを除去したが、代わりに移植したカニューレを残した。バーホール（ｂｕｒｒ  ｈｏｌｅ）は骨ろうで充填した。
【０１１４】
全ての外科的手順、動物の世話および飼育、ならびに組織の回収を、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏ．（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）のＲｉｃｈｍｏｎｄの施設にて行った。
【０１１５】
（組織学）
動物を、ペントバルビタール過剰量（用量）で安楽死させ、そして氷冷ＰＢＳおよび４％中性緩衝化パラホルムアルデヒドを用いて上行大動脈を介して灌流した。脳を頭蓋骨から取り出し、同じ固定液中での２４時間の液浸によって次の固定を行い、３０％スクロースで平衡化し、そして−７０℃のイソペンタン中で凍結した。次いで、これらを低温槽に配置し、そして４０ミクロンの切片を前頭葉前部の皮質から中脳まで連続的に収集した。各々の脳は約１５０切片を生じ、これは、前方−後方（ＡＰ）が６〜８ｍｍの長さであった。慣用的な組織学的分析のために、全てのＩＰ切片をＨ＆Ｅで染色した。一般的な細胞密度を測定するために、異なる脳領域を示す、選択した切片をクリスタルバイオレットで染色した。結果を表１に示す。
【０１１６】
【表１】
2006298926.tif 000002
【０１１７】
（ＰＣＲ分析）
１群あたり２匹を有するラットのさらなる２つの群を、ベクターの組織分布を決定する目的のために、２．５×１０10個の粒子のＡＡＶ−ｔｋで処置した。上記のように、一方の群は、注入によってベクターを受け、そして他方は、浸透ポンプによって受けた。動物を、３週間後にＣＯ2吸入を使用して安楽死させ、そして各ラットから、右脳、左脳、脊髄、右目、左目、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、卵巣、胸腺、リンパ節、骨髄、および脚の筋肉を含む１５の器官および組織からサンプルを採集した。滅菌技術を使用し、そして組織を各サンプル間で変化するディスポーザブル縫合糸除去キットを使用して収集した。組織を、液体Ｎ2中で迅速に凍結し、そしてそれらをゲノムＤＮＡについて処理するまで−７０℃で保存した。ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒのＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ、およびｔｋ配列由来の２つの３０マーのオリゴ（５’−ＡＡＧＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＧＧＴＡＣＧＴＡＧＡＣＧＡＴＡＴＣ−３’（配列番号１）および５’−ＡＴＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＡＴＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＴＴＣＴＧＣ−３’（配列番号２））を使用して実施した。反応を、ＰＴＣ−１００熱サイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ，Ｉｎｃ．）において実施し、そしてベクターが存在するサンプル中で生成物あたり１５８ｂｐを得た。
【０１１８】
（免疫組織化学）
免疫組織化学を使用して、Ｈ＆Ｅを用いて染色した直後に、切片毎におけるトランスジーン発現を検出した。従って、全１２個の切片のうち１つをＰＢＳで洗浄し、３％Ｈ2Ｏ2で３０分間処理して内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックして、ｄＨ2ＯおよびＰＢＳで再びリンスし、そしてブロッキング溶液（ＰＢＳ中の１０％ヤギ血清＋０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）中で３０分間インキュベートした。次に、サンプルを、多角形（ｐｏｌｙｇｏｎａｌ）の抗ｔｋ抗体（Ｙａｌｅ）（１：１０００）中で１時間インキュベートし、ＰＢＳ中で３回洗浄し、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ）（１：３００）中で１時間インキュベートし、そして再び洗浄した。抗体結合を、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ西洋ワサビペルオキシダーゼ（１：３００）およびＶＩＰ色原体（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて可視化した。
【０１１９】
（定量分析）
トランスジーン発現を、Ｋｅｎ−ａ−ｖｉｓｉｏｎマイクロプロジェクターを使用して、ＡＲＴＺＩＩグラフタブレット（ｇｒａｐｈｉｃ  ｔａｂｌｅｔ）上でｔｋ−免疫染色した切片を投影することによって各脳について定量した。ＮＩＨ画像１．６プログラムを使用して、画像を獲得および分析した。各脳についての陽性細胞の推定総数を、以下の式を使用して、１００倍の倍率で決定した：
総ｔｋ細胞数＝（ｎ１＋ｎ２＋ｎ３．．．）×１２×ｋ
ｎ＝陽性細胞／切片
ｋ：Ａｍｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅ方程式（１９４６）から誘導される補正係数
ｋ＝Ｔ／（Ｔ＋Ｄ）  Ｔ＝切片の厚さ（４０μ）、Ｄ  細胞直径（１６μ）；ｋ＝０．７１。
ｔｋ−免疫反応性領域の容量を、５０倍の倍率で投影した獲得された画像を使用してｔｋ発現の面積を測定し、そして以下のように算出することによって決定した。
【０１２０】
【数１】
2006298926.tif 000003
【０１２１】
（ここで、Ｌ＝染色のＡＰ距離（μ）＝ｎ×１２×４０ｕかつｎ＝染色した切片の数）。
【０１２２】
どれほどのウイルスが脳組織を効率的に形質導入するために必要であるかを決定するために、Ｈａｒｖａｒｄ注入ポンプを介して２．５×１０8、２．５×１０9、または２．５×１０10個のＡＡＶ−ｔｋ粒子を受けたラット間で、免疫染色した切片の比較を実施した。
【０１２３】
測定される全てのパラメーターを用いて、明瞭な用量応答を観察した。最も高い力価を受けた動物由来の注入された組織は、中程度の用量群についての１０ｍｍ3の容量および低用量群についての１ｍｍ3未満の容量と比較して、平均３００ｍｍ3の組織（すなわち、成体ラット大脳半球の約６０％（Ｌｅｙｄｅｎら（１９９８）Ｂｅｈａｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８７：５９〜６７））において、トランスジーン発現を実証した（図１ａ）。容量を、群間で有意な差もまた共に示した染色の平均面積および距離から算出した（図１ｂ、ｃ）。形質導入した組織の容量における発現は一様ではなかったが、染色の勾配を示した。注入部位を直接的に囲む領域は強力に標識されたが、一方、針管からの距離が増大するにつれ、検出され得る陽性細胞はより少なかった（図２）。最後に、図１ｄは、平均１６９，０００と推定される、高用量群からの切片におけるｔｋ陽性細胞の総数が、中程度の用量群のその総数よりも約１０倍高いことを示す。
【０１２４】
（注入対浸透ポンプ送達）
免疫染色した脳切片の比較は、２つのポンプのベクターを送達する能力における類似性および相違性を実証した。平均容量、面積、ＡＰ距離、および陽性細胞の推定総数によって測定されるように、２つの群間のｔｋ発現における有意な差異は存在しなかった（図３ａ〜ｄ）。浸透ポンプ送達群中での全サンプルの針管の周囲のいくつかの組織の損失が存在したので（データは示さず）、推定される陽性細胞の数についての、この群の真の平均値は、より高いものであり得る。そして、両方の送達方法が著しいトランスジーン発現を生じた間に、標識されるようになる細胞の型において差異が存在した。ベクターを注入された組織は、ニューロンにおいてほとんど独占的にｔｋを発現し（図４ａ、ｂ）、そして浸透ポンプを介してベクターを受けた組織は、ニューロンおよび注入の部位の近傍の反応性グリア細胞において発現を示した（図４ｃ、ｄ）。
【０１２５】
（組織分布）
組換えＡＡＶが頭蓋内送達の部位から離れた位置で検出され得るか否かを決定するために、ＰＣＲ分析を、高用量のベクターを受けた３匹のラットの各々由来の１５の異なる器官および組織において実施した。送達方法（注入または浸透ポンプ）に関わらず、ｔｋ遺伝子から４５８ｂｐのＰＣＲ産物を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎブロット分析を使用して、脊髄、脾臓、および脳の両半球において検出し得た（図６）。このラットのうちの１匹において、ベクターのセットを、腎臓由来の組織においても検出した。
【０１２６】
（毒性）
毒性が任意の送達方法に関連するか否かを評価するために、組織病理学を、各群由来のＨ＆Ｅ切片に対して実施し、そしてその結果を表１に要約する。組織形態全体を十分に保存し、そして凍結または他の人為結果は存在しなかった。注入送達の群において、組織の損傷は、仮に存在したとしても最小であった。細胞性浸潤はなく、針管における壊死はなく、そして数匹の動物において最小の皮質性壊死が存在した。新たな出血を、高用量のラットのうちの１匹において見出し、そしてヘモジデリン沈着（過去における中程度の出血を示す）を、高用量動物のうちの４匹において見出した。あるいは、深刻な損傷が、針管、細胞性浸潤、およびヘモジデリン沈着の周りの大きな壊死性領域を含む浸透ポンプ送達群の全ての動物において見られた。
【０１２７】
従って、２．５×１０10個のＡＡＶ−ｔｋ粒子の、８μｌ／時間で２．５時間での注入は、組織の３００ｍｍ3の容量に対してＡＡＶベクターを部分的に分布させるために十分である。この領域において、発現の勾配は、注入部位の直接的な周囲を強力に染色することによって観察され、そしてより遠くで陽性細胞がより少なくなる。分布は、２つの異なるポンプ送達系が比較される場合、用量（粒子数）の関数であるようであるが、送達時間またはサンプル容量の関数でなないようである：２．５×１０10個の粒子の分布は、浸透ポンプ（容量＝２００μｌ、速度＝８μｌ／時間、時間＝２４時間）か、または注入ポンプ（容量＝２０μｌ、速度＝８μｌ／時間、時間＝２．５時間）によって送達される場合に同じであった。さらに、著しく異なるレベルの発現を、３つの注入送達群の間で観察した。ここで、サンプル容量、速度、および送達時間は、一定に保たれ、そして粒子数のみが可変であった。
【０１２８】
ＡＡＶの対流を増強する送達を用いて得られたこれらの結果は、大きな高分子（例えば、ラット脳に対する超磁性体（ｓｕｐｒａｍａｇｎｅｔｉｃ）粒子）のＣＥＤ研究から得られる結果と一致する（Ｋｒｏｌｌら（１９９６）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．３８：７４６〜７５４、米国特許第５，７２０，７２０号）。磁気共鳴画像および組織化学染色を使用したＫｒｏｌｌらは、組織中の粒子の分布を最大化することにおいて、用量が最も重要な変数であることを実証した。Ｋｒｏｌｌは、注入容量が小さい（２μｌ）かもしくは中程度である（２４μｌ）か否か、または注入速度が低い（６μｌ／時間）かもしくは高い（７２μｌ／時間）か否かに関わらず、５．３から２６．５μｇへの粒子の増加が、組織中のこれらの分布の容量において５倍程度の増加を生じたことを報告した。
【０１２９】
細胞型特異性に関して、ＡＡＶがニューロンを形質導入し得、そして現在の研究がこの知見を確証することは、以前に報告されている。発現がニューロンにおいて非常に顕著であるという事実は、ＣＭＶプロモーターを使用するＡＡＶ遺伝子治療ベクターが、パーキンソン病およびアルツハイマー病のような神経変性疾患の処置において有用であることを示唆する。活性なグリオーシスが存在する乱れた組織の小領域を除いては、成熟グリア細胞において発現は見られなかった。しかし、本発明者らは、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ｔｋベクターがグリア細胞において十分に発現され、そしてプロドラッグガンシクロビルと組合わせて得られる場合、これが、ヌードマウスにおける実験的なグリオームを処置することにおいて有用であることを以前に実証した。ｔｋ「自殺」遺伝子は、分裂細胞に対して毒性であると考えられるので、これは、標的腫瘍細胞に対してのみ危険を引き起こし、ニューロンの周囲に対しては危険を引き起こさないべきである。最後に、本研究に使用されるＣＭＶプロモーターは、ニューロンにおける強力なトランスジーン発現を可能にする一方、細胞型特異的プロモーターの選択は、稀突起膠細胞およびグリア細胞のような他のＣＮＳ成分へのＡＡＶの標的化を可能にする。
【０１３０】
本研究はまた、脳に送達されるＡＡＶが、主に中枢神経系において含まれることを示す。他は、脳の２つの半球の間のウイルスの逆行性輸送、および循環する大脳脊髄液を介して脊髄に至るウイルスの能力を実証した。脾臓におけるベクターの外見は奇妙であり、そして２つの機構を示唆する。１つは、ウイルスが注入プロセスの間の血流に進入することであり、脾臓を介して循環され、ここで、ウイルスは「除去される」。しかし、これが事実ならば、ＡＡＶによって誘導されることが示される他の組織が、ウイルスを取り込むこともまた予測される。別の可能性のある機構は、樹状細胞によって示される機構であり得る。これらの細胞は、主に皮膚において見出され、外来物質を取り込み、循環へ進入し、そして脾臓において濃縮され、ここでこの外来物質はさらなるプロセシングまたは破壊を待ちながら長期間の間存在し得る。いずれの場合において、本発明者らは、送達の経路（筋肉内、静脈内、およびこの頭蓋内を含む）に関わらず、ベクターは、脾臓において常に検出されることを見出した。
【０１３１】
要約すると、高用量のＡＡＶベクターの緩慢な頭蓋内注入は、齧歯類モデルにおける有意な部分または脳を形質導入することが示された。ＡＡＶを使用して、種々の中枢神経障害（腫瘍、発作から生じる損傷、および神経変性疾患を含む）を標的し得る。
【０１３２】
（実施例３：パーキンソン病の遺伝子治療）ＡＡＤＣをコードする導入遺伝子を保有するＡＡＶベクターの対流増加送達は、以下のように、サルにおけるＭＰＴＰ誘導性パーキンソン病において、ドパミン作用系を回復させることを示す。
【０１３３】
（動物）
パーキンソン病症状の進行に基づく移植のための候補としてアカゲザル（ｎ＝４、３〜５ｋｇ）を選択した。安定な過剰に病変したヘミパーキンソン（ｈｅｍｉ−ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ）症候群が達成されるまで、動物に２．５〜３．５ｍｇのＭＰＴＰ−ＨＬＣを、右内頸動脈を通じて注入（同側性といわれる）し、続いて０．３ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰ−ＨＣＬを４Ｉ．Ｖ．用量注入（対側性といわれる）することにより病変させた（Ｅｂｅｒｌｉｎｇ，（１９９８）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８０５：２５９〜２６２）。霊長類ＭＰＴＰモデルは、ヒトへの試行の前に、評価の金本位制モデルであると考えられる（Ｌａｇｓｔｏｎ（１９８５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍｃｏｌ．Ｓｃｉ．６：３７５〜３７８）。ＭＰＴＰは、ＣＮＳ中でモノアミンオキシダーゼＢによりＭＰＰ＋に転換される。ＭＰＰ＋は、パーキンソン病で見られるように、黒質ドパミン作用性ニューロンの退化および黒質線条体ドパミン経路の欠損をもたらす強力な神経毒素である。ＭＰＴＰ病変動物を、手術前の５ヶ月間に、臨床的な評定尺度および活性のモニタリングを使用して、週に一度臨床的に評価した。
【０１３４】
ＭＰＴＰ投与後、これらの動物は、一般的な緩慢、運動緩徐、硬直、平衡障害、および屈曲姿勢により明らかとなるパーキンソン病の臨床的徴候を発症させた。全てのサルにおいて右腕よりも左腕のほうが使用頻度が減少し、そして全て震えの徴候を示した。臨床的な評定尺度を用いて、全てのサルは、ＭＰＴＰ期間の後５ヶ月の間に、重篤で安定なパーキンソン症候群評点（２３±１．７、２３±１．２、２４±１．７、１９±３）に移和した。
【０１３５】
（ベクター産生）
１．ｐＡＡＶ−ＡＡＤＣ：
１．５ｋｂのＢａｍＨＩ／ＰｖｕＩＩヒトＡＡＤＣ  ｃＤＮＡ（Ｆａｎら（１９９８）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：２５２７〜２５３５）をＡＡＶ発現カセットｐＶ４．１ｃ中のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ部位にクローン化した。この発現カセットは、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶスプライスドナーおよびヒトβグロビンスプライスアクセプター部位からなるキメライントロン、ヒト成長ホルモンポリアデニル化配列、および隣接ＡＡＶ  ＩＴＲ（逆方向末端反復）を含む（Ｈｅｒｚｏｇ，Ｒ．Ｗ．ら、（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５：５６〜６３）。
【０１３６】
２．ｐＡＡＶ−ＬａｃＺ：
ベクターｐＡＡＶ−ＬａｃＺを以下のように構築した。ｐＳｕｂ２０１（Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６１：３０９６−３１０１）のＡＡＶコード領域を、ＸｂａＩ部位間でＥｃｏＲＩリンカーと置換して、プラスミドｐＡＳ２０３を生成した。ｐＣＭＶβ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ）のＥｃｏＲＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを平滑末端化し、そしてＫｌｅｎｏｗ処理したｐＡＳ２０３のＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、そしてｐＡＡｖ−ｌａｃＺを生成した。
【０１３７】
３．ｐＨＬｐ１９：
プラスミドＨ１９は、ＡＡＶベクターの産生を増強する一方、複製コンピテントな偽野生型ウイルスの産生を抑制するように設計された改変型ＡＡＶ−２ゲノムをコードする。このプラスミドは、ｃａｐ遺伝子の３’位に移動されたＰ５プロモーターを含み、そしてそのプロモーターは、主にＦＬＰリコンビナーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）認識配列からなる５’非翻訳領域により置換される。ｐＨ１９を、ＡＡＶゲノムの３’末端および５’末端の間の任意の相同性領域を除去するように構築した。さらに、ｐＨ１９  Ｐ５プロモーターの７塩基対のＴＡＴＡボックスを、その配列をＧＧＧＧＧＧＧへ変異させることによって破壊した。
【０１３８】
ｐＨ１９を、ＡＡＶ−２プロウイルスであるｐＳＭ６２０由来のＡＡＶ−２配列を使用して、いくつかの処理工程において構築した。ｐＳＭ６２０を、ＳｍａＩおよびＰｖｕＩＩを用いて消化し、そしてＳｍａＩフラグメントをコードする４５４３ｂｐのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をｐＵＣ１１９のＳｍａＩ部位中にクローン化し、７７０５ｂｐのプラスミドであるｐＵＣｒｅｐｃａｐを生成した。次いで、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子と隣接する残ったままのＩＴＲ配列を、以下のオリゴヌクレオチド：
１４５Ａ；５’−ＧＣＴ  ＣＧＧ  ＴＡＣ  ＣＣＧ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＴＣＧ−３’（配列番号３）
１４５Ｂ；５’−ＴＡＡ  ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＡＣＴ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＣＧＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＴ−３’（配列番号４）
を使用して、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発により欠失させた。
【０１３９】
得られたプラスミド、ｐＵＣＲｅｐＣａｐＭｕｔａｔｅｄ（ｐＵＣＲＣＭ）（７５５９ｂｐ）は、任意のＩＴＲ配列（４３８９ｂｐ）をもたないＡＡＶ−２ゲノム全体を含む。変異誘発性オリゴヌクレオチドにより一部導入されたＳｒｆＩ部位は、この構築物において、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子と隣接する。ＡＡＶ配列は、ＡＡＶ−２の１４６〜４，５３４位に対応する。
【０１４０】
Ｅｃｏ４７ＩＩＩ部位をＰ５プロモーターの３’末端で導入し、Ｐ５プロモーター配列の切除を容易にした。これを行うために、ｐＵＣＲＣＭは、プライマーＰ５４７（５’−ＧＧＴ  ＴＴＧ  ＡＡＣ  ＧＡＧ  ＣＧＣ  ＴＣＧ  ＣＣＡ  ＴＧＣ−３’）（配列番号５）を用いて変異誘発した。得られた７５５９ｂｐのプラスミドは、ｐＵＣＲＣＭ４７ＩＩＩと呼んだ。
【０１４１】
ｐＢＳＩＩｓｋ＋のポリリンカーを、ＢＳＳＨＩＩで元のものからの切除、およびオリゴヌクレオチドｂｌｕｎｔ１およびｂｌｕｎｔ２で置換することにより変えた。得られたプラスミド、ｂｌｕｎｔｓｃｒｉｐｔは、２８３０ｂｐの長さであり、そして新規のポリリンカーは、制限部位ＥｃｏＲＶ、ＨｐａＩ、ＳｒｆＩ、ＰｍｅＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩをコードする。ｂｌｕｎｔ１および２の配列は、以下である：
ｂｌｕｎｔ１；５’−ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＧＣＣ  ＣＧＧ  ＧＣＧ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＣＧＣ  ＴＧＧ−３’（配列番号６）
ｂｌｕｎｔ２；５’−ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＴＡＡ  ＡＣＧ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＣＧＴ  ＴＡＡ  ＣＧＡ  ＴＡＴ  ＣＧＧ−３’（配列番号７）。
【０１４２】
ｐＨ１は、ｐＵＣＲＣＭ由来のＳｍａＩフラグメントをコードする、４３９８ｂｐのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をｐＢｌｕｎｔｓｃｒｉｐｔのＳｍａＩ部位に連結することによって構築され、その結果、ＨｐａＩ部位は、ｒｅｐ遺伝子に近位であった。ｐＨ１は、７２２８ｂｐの長さである。
【０１４３】
ｐＨ２は、ｐＨ１のＰ５プロモーターがｐＧＮ１９０９の５’非翻訳領域により置換されることを除くと、ｐＨ１と同一である。これを行うために、ｐＷ１９０９ｌａｃＺ由来の５’非翻訳領域をコードする３２９ｂｐのＡｓｃＩ（ｂｌｕｎｔ）−ＳｆｉＩフラグメントをｐＨ１の６８３１ｂｐのＳｍａＩ（部分的）−ＳｆｉＩフラグメント中に連結してｐＨ２を作製した。ｐＨ２は、７１５６ｂｐの長さである。
【０１４４】
ｐＵＣＲＣＭ４７ＩＩＩ由来のｐ５プロモーターをコードする、１７２ｂｐのＳｍａＩ−Ｅｃｏ４３ＩＩＩフラグメントのｐＨ２中のＥｃｏ４７ＩＩＩ部位への挿入により、Ｐ５プロモーターをｐＨ２の３’末端に付加した。３つのＡＡＶプロモーター全ての転写方向が同じになるように、このフラグメントを合わせた。この構築物は、７３２７ｂｐの長さである。
【０１４５】
Ｐ５の３’側のＴＡＴＡボックス（ＡＡＶ−２は、２５５〜２６１に位置し、配列は、ＴＡＴＴＴＡＡ）を、変異誘発性オリゴヌクレオチド５ＤＩＶＥ２（５’−ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＣＣＧ  ＡＧＴ  ＧＡＧ  ＣＡＣ  Ｇ−３’）（配列番号８）を用いて、配列をＧＧＧＧＧＧＧに変化させることにより除去した。得られた構築物ｐＨ１９は、７３２８ｂｐの長さである。
【０１４６】
４．プラデノ５（ｐｌａｄｅｎｏ５）：
プラデノ５は、２９３細胞中にトランスフェクトされる場合、ＡＡＶベクター産生のためのアデノウイルスヘルパー機能の完全なセットを提供するプラスミドである。これは、本質的に、アデノウイルス２由来のＥ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ  ＲＮＡ領域およびプラスミド骨格から構成される。このプラスミドを、以下のように構築した。
【０１４７】
ｐＢＳＩＩｓ／ｋ＋を、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発および以下のオリゴヌクレオチド：
５’−ＣＣＧ  ＣＴＡ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＣＡＣ  ＴＣＡ  Ａ−３’（配列番号９）
を使用して、ポリリンカーおよび単一のＥｃｏＲＶ部位を有するα相補性カセットをコードする６３７ｂｐ領域を置換するために改変した。制限部位ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＳｒｆＩ、ＸｂａＩ、ＣｌａＩ、Ｂｓｔｌ１０７Ｉ、ＳａｌＩ、ＰｍｅＩおよびＮｄｅＩをコードするポリリンカーを、次いでＥｃｏＲＶ部位中にクローン化した（５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＣＧＧ  ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＡ  ＴＣＧ  ＡＴＧ  ＴＡＴ  ＡＣＧ  ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＴＡＴ  Ｇ−３’）（配列番号１０）。
【０１４８】
アデノウイルス−２  ＤＮＡを消化し、そしてＥ２Ａ領域（アデノウイルス−２ゲノムの２２，２３３〜２７，５６８位に対応する５，３３５ｂｐのＫｐｎＩ−ＳｒｆＩフラグメント）をコードする制限フラグメント、およびＶＡ  ＲＮＡ（アデノウイルス−２ゲノムの１０，４２６〜１１，１５７位に対応する、７３１ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩＩフラグメント）をコードする制限フラグメントを単離した。Ｅ２ＡフラグメントをポリリンカーのＳａｌＩ部位とＫｐｎＩ部位との間に組込んだ。最初に、アデノウイルス−２の２１，６０６〜３５，４７０位（遺伝子の５’末端をコードする）に対応する１３，８６４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＡｖｒＩＩフラグメント、およびアデノウイルス−２の３５，３７１〜３５，８３３位（遺伝子の３’末端をコードする）に対応する４６２ｂｐのＡｖｒＩＩおよびＳｒｆＩ消化されたＰＣＲフラグメントを、ｐＢＳＩＩ／ｋ＋のＢａｍＨＩ部位とＳｍａＩ部位との間に連結させることによって、ｐＢＳＩＩ／ｋ＋中でＥ４領域をアセンブリした。ＰＣＲフラグメントを産生するために使用されるオリゴヌクレオチドは、Ｅ４プロモーターおよびアデノウイルス末端反復の連結部にＳｒｆＩ部位を導入するように設計した。その連結部は、配列５’−ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＣＣＧ  ＧＧＣ  ＧＴＴ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＣＧＧ  ＡＧＴ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  Ｃ−３’（配列番号１１）および５’−ＡＣＡ  ＴＡＣ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＧＣＧ  ＴＡＧ  ＡＧＡ  Ｃ−３’（配列番号１２）を有する。インタクトなＥ４領域を、ＳｒｆＩおよびＳｐｅＩで切断することによって除去し、そしてアデノウイルス−２の３２，６４４〜３５，８３３位に対応する３，１８９ｂｐフラグメントを、ＳｒｆＩ部位とＸｂａＩ部位との間のＥ２Ａ中間体中にクローン化した。最終には、ＳａｃＩＩ部位のＴ４ポリメラーゼ媒介平滑末端改変の後、ＶＡ  ＲＮＡフラグメントをＢｓｔｌ１０７部位中に挿入した。プラデノ５中の遺伝子を、Ｅ２ＡおよびＥ４プロモーターの５’末端が隣接するように整列させ、これは、互いに逆方向で転写する領域を生じる。このＶＡ  ＲＮＡ遺伝子は、Ｅ４遺伝子の３つのプライム末端に位置し、Ｅ４遺伝子の方向へ転写する。このプラスミドは、１１，６１９ｂｐの長さである。
【０１４９】
（ＡＡＶベクター産生）
ＨＥＫ２９３細胞株（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．、Ｓｍｉｌｅｙ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．，およびＮａｉｖａ，Ｒ．（１９７７）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｔｒａｓｎｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ５．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９〜７２）を、４．５ｇ／リットルのグルコース、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、および２ｍＭのグルタミンを含む完全ＤＭＥＭ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で、空気中５％ＣＯ2において３７℃で培養した。４０のＴ２２５フラスコにそれぞれ２．５×１０6細胞を播種し、そして３日間増殖させて７０〜８０％のコンフルエンシー（フラスコあたり約１．５×１０7細胞）までトランスフェクトさせた。
【０１５０】
Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら（Ｍａｔｓｕｄｈｉｔａ，Ｔ．、Ｅｌｌｉｇｅｒ，Ｓ．、Ｅｌｌｉｇｅｒ，Ｃ．、Ｐｏｄｓａｋｏｆｆ，Ｇ．、Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ，Ｌ．、Ｋｕｒｔｚｍａｎ，Ｇ．Ｊ．、Ｉｗａｋｉ，Ｙ．、およびＣｏｌｏｓｉ，Ｐ．（１９９８）「Ａｄｅｎｏ−ａｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ」Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：９３８〜９４５）によって記載されるトランスフェクション方法および精製方法を、少々改変して、ＡＡＶベクター産生に用いた。このベクター産生過程は、ＨＥＫ２９３細胞の、フラスコあたりそれぞれ２０μｇの以下の３つのプラスミド：ＡＡＶ−ＡＡＤＣプラスミド、ＡＡＶヘルパープラスミド（ｐＨＬＰ１９、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含む）、およびアデノウイルスヘルパープラスミド（プラデノ５、以前ではｐＶＡＥ２ＡＥ４−２（４）として公知であり、そしてＥ２Ａ、Ｅ４および精製アデノウイルス−２由来のＶＡ  ＲＮＡ遺伝子から構成される）での、リン酸カルシウム法（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍら（１９８０）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ  ｄｏｍｉｎａｎｔ−ａｃｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５６７〜３５７０）を用いた、６時間の同時トランスフェクションを含む。トランスフェクションの後、培地を交換し、そして３日後に細胞を採集した。次いで、細胞ペレットを３サイクルの凍結−解凍溶解（断続的にボルテックスしながら、ドライアイス−エタノール槽と３７℃槽との間で交互にする）に供した。細胞細片を遠心分離で除去した（１０，０００ｇ、１５分間）。上清を２回遠心分離して、残っている懸濁物を除去し、そして続いてＢｅｎｚｏｎａｓｅR（２００ｕ／ｍｌ）で３７℃で１時間処理し、細胞ＤＮＡの混入を減少させた。インキュベーションの後、上清をＣａＣｌ2  ２５ｍＭにし、そして氷上に１時間置いた。生じた沈殿物を遠心分離（１０，０００ｇ、１５分間）で除去し、そして廃棄した。次いで、この上清をＰＥＧ（８０００）  １０％にし、そして氷上に３時間置いた。この沈殿物を遠心分離（３０００ｇ、３０分間）で収集し、そして２０  Ｔ２２５フラスコあたり５０ｍＭ  ＮａＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の４ｍｌ中に再懸濁した。固体ＣｓＣｌを添加して、１．４ｇ／ｍｌの密度にし、そしてサンプルをＢｅｃｋｍａｎ  Ｔ１７０ローターで、１５０，０００ｇで２４時間、遠心分離した。ＡＡＶ含有画分をプールし、１．４ｇ／ｍｌのＣｓＣｌ密度に調整し、そしてＢｅｃｋｍａｎ  ＮＶＴ６５ローターで、３５０，０００ｇで１６時間遠心分離した。次いで、ＡＡＶを含む画分を濃縮し、そして賦形剤緩衝液（ＰＢＳ中５％ソルビトール）に対してダイアフィルトレートした。精製したＡＡＶ−ＡＡＤＣベクターの力価を、定量的ドットブロット分析を用いて決定し、そしてベクターストックを、−８０℃で保存した。
【０１５１】
（ウイルス注入）
手術室において滅菌野を作り、注入システムを準備した。注入カニューレを生理食塩水でフラッシュし、針と管材との間の界面の完全性を評価した。滅菌注入カニューレとローディングラインを、そのシステム中での空気泡の集積を妨げるように極度の注意を払って、適切なフィッティングを用いて接続した。非滅菌性オイル注入ラインを、以前に記載されたように用意し、そしてオイルを満たした１ｍｌの気密Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを、Ｈａｒｖａｒｄ注入ポンプに取り付けた。６つの注入カニューレを、微量透析（ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ）ホルダーにはめ込み（１ホルダーあたり３つのカニューレ）、そして定位タワーにマウントした。オイルラインおよびローディングラインの結合後に、針カニューレにＡＡＶをプライムし、そしてこの注入システムを、手術テーブルに移した。最初の注入速度を、０．１ｐｌ／分に設定し、このラインを視覚的に検査して、このシステムを通る液体のスムースな流れを確実にし、そしてこのカニューレを、それらの標的部位にまで手動で下げた。最終的な視覚検査を行い、この注入システム中の任意の空気泡についてチェックした。
【０１５２】
このカニューレシステムは、以下の３つの構成からなった：（ｉ）滅菌注入カニューレ；（ｉｉ）ＡＡＶ−ＡＡＤＣまたはＡＡＶ−ＬａｃＺ（コントロール）を収容した滅菌ローディングライン；および（ｉｉｉ）オリーブオイルを含む非滅菌注入ライン。各ラインの準備を、簡単に本明細書中に記載する。この注入カニューレは、シリカガラス（外径、．０１６”、内径、．００８”；Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ）を備え付けた２７Ｇ針（外径、．０３”；内径、．０６”；Ｔｅｒｕｍｏ  Ｃｏｒｐ．，Ｅｌｋｔｏｎ，ＭＤ）からなり、そしてこれを、そのシリカの遠位端がＴｅｆｌｏｎ管材（．０３”ＩＤ，Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から約１５ｍｍ延びるように、その管材中に置いた。この針を、スーパーグルー（ｓｕｐｅｒｇｌｕｅ）を用いてその管材に固定し、そしてこのシステムを使用前に漏れについてチェックした。この管材の近位端に、Ｔｅｆｚｅｌフィッティングおよびフェルールを取り付け、隣接するローディングラインを接続した。
【０１５３】
ローディングラインおよび注入ラインは、Ｔｅｆｚｅｌ  １／１  ６”フェルール、ユニオン、および雄型Ｌｕｅｒロックアダプター（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏａｋ  Ｈａｒｂｏｒ，ＷＡ）を遠位端に備えた、５０ｃｍに切断したＴｅｆｌｏｎ管材（外径、．０６２”；内径、．０３”）からなった。この滅菌ローディングラインは、１０００ｍｌ容量まで収容し、そして使用前に生理食塩水をプライムした。
【０１５４】
その動物に、最初にＫｅｔａｍｉｎｅ（Ｋｅｔａｓｅｔ；１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）を用いて鎮静させ、挿管し、そして手術の用意をした。静脈ラインを、橈側皮静脈または伏在静脈に位置付けした２２ゲージのカテーテルを用いて確立し、等張液を５〜１０ｍｌ／ｋｇ／時間で送達した。イソフルラン（Ａｅｒｒａｎｅ，Ｏｍｅｄａ  ＰＰＤ  Ｉｎｃ．、Ｌｉｂｅｒｔｙ，ＮＪ）を、その動物が麻酔の安定な水準を維持するまで、１〜３％で送達した。頭部を、ベースラインのＭＲＩスキャンの間に得られたプリセット値に従って、ＭＲＩコンパチブル定位フレーム中に置いた。この動物に、皮下心電図電極、直腸消息子を取り付け、そして身体を循環水ブランケットで覆い、コア温度を３６〜３８℃に維持した。心電図および心拍数（Ｓｉｌｏｇｉｃ  ＥＣＧ−６０、Ｓｔｅｗａｒｔｓｔｏｗｎ，ＰＡを使用する）、ならびに体温を、この手順の間に連続的にモニタリングした。頭部を、Ｂｅｔａｄｉｎｅおよび７０％エタノールで前処理し、滅菌野を作製し、電気焼灼器（Ｓｕｒｇｉｓｔａｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，Ｖａｌｌｅｙｌａｂ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を用いて、皮膚、筋肉および筋膜を通して正中切開を行った。
【０１５５】
筋膜および筋肉の穏やかな収縮は、皮質の侵入部位にわたる頭蓋の露出を可能にした。片側の開頭術を、Ｄｒｅｍｅｌ歯科用ドリルを用いて行い、標的部位の上の硬膜の３ｃｍ×２ｃｍの領域を露出させた。ホルダーに取り付けた複数の針カニューレを、線条体の標的部位に定位的に誘導した。ＩＣＡ  ＭＰＴＡ注入と同側の半球へのＡＡＶの片側注入のための外科的変数を、表２に要約する。
【０１５６】
【表２】
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【０１５７】
注入の約１５分後に、このカニューレアセンブリを、１ｍｍ／分の速度で、皮質を離れるまで上昇させた。この皮質を、生理食塩水でリンスし、骨縁をロンガー（ｒｏｎｇｕｅｒ）で削り取り、そして創傷部位を解剖学的層中に閉じた。鎮痛薬（Ｎｕｍｏｒｐｈａｎ，１Ｍ）および抗生物質（Ｆｌｏｃｉｌｌｉｎ，１Ｍ）を、外科的プロトコルの一環として投与した。動物を、麻酔からの十分な回復についてモニタリングし、それらのホームかご（ｈｏｍｅ  ｃａｇｅ）中に置き、そして手術後約５日間、臨床的に観察（２回／日）した。総神経外科手術時間は、１動物あたり４．５時間であった。
【０１５８】
線条体内ＡＡＶ投与の後、動物を、異常な行動のいずれかの徴候について評価した。動物を、獣医学技術者によって、臨床的観察形態を用いて、１日に２回、観察および評価した。すべてのサルは、手術から２時間以内に回復し、そしてそれら自体を維持し得た（栄養補給および毛づくろいを含む）。手術後の全８週間の間に、いずれの有害な効果の徴候も存在しなかった。
【０１５９】
（磁気共鳴画像法）
標的部位の可視化は、尾状核または被殻内の細胞の正確な配置のために必須である。ＭＲＩと組み合わせた定位的手順を用いて、所望の標的にされた構造内にカニューレを正確に配置した。すべての動物を、手術前にスキャンして、各個々の動物についての標的移植部位の正確な定位座標を作成した。ＰＥＴスキャンニングのために使用される同じ基準マーカーを、ＭＲＩ画像およびＰＥＴ画像の相互重ね合わせ（ｃｏ−ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のためにフレーム上に置いた。手短には、スキャンニング手順の間、この動物を、ケタミン（Ｋｅｔａｓｅｔ，７ｍｇ／ｋｇ、ｉｍ）およびキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ，３ｍｇ／ｋｇ，ｉｍ）の混合物を用いて鎮静させた。この動物を、ＭＲＩコンパチブル定位フレーム中に置き、イヤーバーおよびアイバー測定を記録し、そしてＩＶラインを確立した。６０の冠状画像（１ｍｍ）および１５の矢状画像（３ｍｍ）を、ＧＥ  Ｓｉｇｎａ  １．５  Ｔｅｓｌａ機械を用いて撮影した。磁気共鳴画像を、Ｔ１重み付けし、スポイルグラスシークエンスを、反復時間（ＴＲ）＝７００ｍｓ、エコー時間（ＴＥ）＝２０ｍｓ、およびフリップ角３０’で用いて、３つの平面中に得た。視野は、１９２マトリックスおよび２ＮＥＸ（シグナル情報あたりの平均数）で１５ｃｍであった。ベースラインスキャンニング時間は約２０分であった。標的にされた構造（例えば、尾状核）の前後分布および内側外側分布を、冠状ＭＲ画像を用いて決定した。外科的座標を、尾状核および被殻の拡大した冠状画像（１．５×）から決定した。
【０１６０】
（陽子射出断層撮影法（ＰＥＴ））
全ての４匹の動物は、２つのＰＥＴスキャン、ＭＰＴＰ病変の確立後のベースラインスキャン、およびＡＡＶ−ＡＡＤＣまたはＡＡＶ−ＬａｃＺのいずれかの注入の７〜８週間後での第２のスキャンを受けた。ＰＥＴの前に、各動物は、１．５Ｔマグネットおよび定位フレーム（これは、外部基準マーカーの使用を通じて、ＰＥＴおよびＭＲデータセットの間の相互重ね合わせを可能にした）を用いる磁気共鳴（ＭＲ）画像法を受けた。ＰＥＴ研究を、ＰＥＴ−６００システム、平面中で２．６ｍｍの解像度、ならびに遮断ギャップを低減させることによって、電流研究のために６ｍｍから３ｍｍに増加させた調整可能な軸解像度を有するシングルスライストモグラフで行った。このトモグラフの特徴は、以前に記載されている（Ｂｕｄｉｎｇｅｒら（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２３（６）：６５９〜６６７；Ｖａｌｋ．（１９９０）Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １７６（３）：７８３〜７９０）。サルに挿管し、そしてイソフルランで麻酔し、定位フレーム中に置き、そしてＰＥＴスキャナー中に位置付けし、線条を通過する冠状脳スライスを画像化した。サルを、定位フレームでの前方−後方スケール、およびトモグラフに接続したレーザー光を用いて各研究について同じ方法で位置付けした。スキャナー中に位置付けした後、５分の透過スキャンを得て、フォトン減衰について修正し、そして動物の配置をチェックした。次いで、このサルに、１０〜１５ｍＣｉのＡＡＤＣトレーサー、６−［18Ｆ］フルロ−Ｌ−ｍ−チロシン（ＦＭＴ）を注射し、そして画像化を開始した。画像化を６０分間続け、その時間にこのサルを再配置して、最初に対して尾側の第２のスライス６ｍｍを画像化した。
【０１６１】
ＰＥＴおよびＭＲデータセットを、相互重ね合わせし、そして目的の領域（ＲＯ）を、ＭＲに関して５０〜６０分（スライス１）および６５〜７５分（スライス２）で収集したＰＥＴデータ上に、対側の半球（ＩＣＡ  ＭＰＴＰ注入と反対側）中の線条について描いた。ＲＯの鏡像を、同側（ＭＰＴＰ注入の側）の半球中に作成し、そして放射能カウント（ｃｍ2／秒）を各ＲＯＩについて決定した。線条体カウントを、各研究について２つのスライスについて平均をとった。ＦＭＴ取り込み非対称比を、各動物について各時点で算出した。これは、同側（病変）線条についてのカウントを、対側（非病変）線条についてのカウントから差し引き、そして同側線条および対側線条についての平均カウントで割ることによって算出した。非対称比における動物間の可変性を低減するために、変化スコアを、各動物についてのベースライン研究についての非対称比から、第２のＰＥＴ研究からの非対称比を差し引くことによって算出した。不対ｔ検定を用いて、ＡＡＶ−ＡＡＤＣおよびＡＡＶ−ＬａｃＺサルについてのペット非対称比における変化を比較した。
【０１６２】
予測されるように、すべての４匹のサルは、ベースラインにて、同側線条よりも対側線条（これは、無視できるほどの取り込みを示した）においてより大きなＦＭＴ取り込みを示した。第２のＰＥＴ研究の時点で、ＡＡＶ−ＡＡＤＣ処理したサルは、同側の線条における増加したＦＭＴ取り込みを示したが、ＡＡＶ−ＬａｃＺ処理した動物は、ベースラインからの変化を示さなかった（図７）。ベースラインから第２のＰＥＴ研究へのＦＭＴ取り込み非対称性における変化は、ＡＡＶ−ＬａｃＺサルについて（これは、両方の時点でより大きな対側ＦＭＴ取り込みを示した）よりも、ＡＡＶ−ＡＡＤＣサルについて（これは、第２の研究の時点でほとんど非対称性を示さなかった）有意に大きかった（ｐ＜０．０１）（図８）。
【０１６３】
（剖検）
動物を、ペントバルビタールナトリウム（２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で深く麻酔し、そしてＡＡＶ投与の８〜９週後、および術後のＰＥＴスキャンの１週間後に屠殺した。屠殺の日に、血液サンプルを採取し、そして動物を、Ｌ−ドパ／カルビドパ調製物（Ｓｉｎｅｍｅｔ  ２５０／２５）で処理した。血漿および頸部ＣＳＦを部検の時点で回収した。脳を、Ｓｉｎｅｍｅｔ投与の３０〜４５分後に取り出し、脳基質中に置き、そして３〜６ｍｍスライスに冠状に切片化した。各サル由来の１つの３ｍｍ厚線条体脳スライスを、−７０℃のイソペンタン中ですぐに凍結し、そして生化学分析のために凍結保存した。残りの６ｍｍ厚のスライスを、ホルマリン中に７２時間に後固定し、ＰＢＳ中で１２時間洗浄し、そして上行スクロース勾配（１０〜２０〜３０％）で調整し、そして凍結した。
【０１６４】
（組織学的分析）
ホルマリン固定した脳スライスを、低温槽中で３０μｍ厚冠状切片に切断した。凍結した切片を、尾状核の吻端のレベルで始めて、尾〜黒質のレベルまでの様々の連で回収した。各切片を、７０℃での不凍液中に保存および維持した。連続切片を、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ドパデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ）またはβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）免疫反応性（ＩＲ）について染色した。１２番目毎の切片を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そして３％  Ｈ2Ｏ2中で２０分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。ＰＢＳ中での洗浄の後、この切片をブロッキング溶液（ＴＨについて１０％の正常なウマ血清、またはＤＤＣおよびβ−ｇａｌについて１０％の正常なヤギ血清、ならびにＰＢＳ中０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）中で３０分間インキュベートし、続いて一次抗体溶液−ＴＨ（マウスモノクローナル、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，１：１０００）、ＤＤＣ（ウサギｐｏｌｙｇｏｎａｌ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，１：２０００）、またはβ−ｇａｌ（ウサギｐｏｌｙｇｏｎａｌ，Ｃｏｒｔｅｘ  Ｂｌｏｃｈｅｍ，１：５０００）中で２４時間インキュベートした。次いで、切片を、ＴＨについてビオチン化抗マウスＩｇＧ二次抗体中で１時間、またはＤＤＣおよびβ−ｇａｌ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，１：３００）について抗ウサギＩｇＧ二次抗体中で１時間インキュベートした。抗体結合を、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，１：３００）、およびニッケルを含有するＤＡＢ色素原（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）で可視化した。次いで、切片をカバーガラスで覆い、そして光学顕微鏡下で試験した。組織をパンチングした後、新しく凍結したブロックを、２０ｕｍで切片化した。切片を、ＤＤＣ−ＩＲについてＨ＆Ｅで染色した。
【０１６５】
尾状核、被殻および淡蒼球内のＡＡＶ感染細胞の総数の定量評価を、光学解像手順を用いることによって決定した。光学解像系は、Ｐｒｉｏｒ  Ｈ１２８コンピュータ制御ｘ−ｙ−ｚモーター付ステージに固く連結されたＬｅｉｔｚ  Ｏｔｈｏｌｕｘ  １１顕微鏡、高感度Ｓｏｎｙ  ３ＣＣＤビデオカメラシステム（Ｓｏｎｙ，Ｊａｐａｎ）およびＭａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｇ−３コンピュータを備えるコンピュータ補助画像解析システムからなった。すべての分析を、ＮｅｕｒｏＺｏｏｍソフトウェア（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて行った。各連の測定の前に、装置を較正した。尾状核、被殻および淡蒼球中のポジティブニューロンの領域を、低倍率（２．５×対物レンズ）で概略を取った。線条内のＡＡＶ感染した細胞の分散した存在のために、概略を取った領域の１％を、０．９５開口数を有する６３×ＰＬＡＮ−ＮＥＯＦＬＵＡＲ液浸系対物レンズを使用する、ディセクターカウンティングフレーム（１  ５０５  １ＩＭ２）の系統的ランダム設計で測定した。パイロット実験に基づいて、等間隔に置かれた少なくとも４つの切片をサンプリングした。ディセクター原理を使用することによって、２００までのＡＡＤＣポジティブニューロンを、すべての測定について、一定、系統的、およびランダムな設計手順を使用することによって、光学的スキャンニングによってサンプリングした。切片の平均厚を、２３ミクロンで測定した。一旦切片の頂部の焦点が合うと、ｚ−−平面を１〜２ｇｍ下げた。次いで、３つの５  ｌｉｍ厚ディセクターを通して焦点を下げる間にカウントした。底禁制平面が分析に決して含められないことを確実にするように注意を払った。構造物の容量を、標準的な手順に従って算定した。試験された構造物中の陽性細胞の総数を、式Ｎ＝Ｎｖ×Ｖｓ（ここで、Ｎｖは数値密度であり、そしてＶｓは構造物の容量である）を用いることによって算定した。
【０１６６】
ＴＨ−ＩＲ染色は、全てのサルにおける同側の黒質中の黒質線状体線維および細胞体の確実な減少を示した。対側は、線条および黒質中においてＴＨおよびＡＡＤＣ−ＩＲの可変性の減少を示した。
【０１６７】
ＤＤＣ−ＩＲは、ＡＡＶ−ＬａｃＺで処理したサルにおいてのみ、ＴＨ−ＩＲに類似した。ＡＡＶＡＡＤＣ処理したサルは、同側で強いＡＡＤＣ染色を示した。この染色は、対側で見られた染色に勝った。高密度のＡＡＤＣ−ＩＲ細胞が、ＡＡＶ−ＡＡＤＣ処理動物のうちの１匹中の８０％の線条および１００％の淡蒼球を通じて見られた。立体的解析は、被殻において１ｍｍ3あたり１８，３８４細胞、尾状核において１ｍｍ3あたり１５，１２６細胞、そして淡蒼球において１ｍｍ3あたり９，５１１細胞を示した。ＡＡＶ感染細胞の総数は、少なくとも１６×１０6細胞であると評価された。他のＡＡＶ−ＡＡＤＣ処理したサルにおいて、ＡＡＤＣ−ＩＲ細胞は、６０％を超える同側線条（尾状核において１ｍｍ3あたり７，５１５細胞、そして被殻において１ｍｍ3あたり１５，３５２細胞、そして淡蒼球において１ｍｍ3あたり３，８５０細胞を有する）中で見られた。対側線条においては、ＡＡＤＣ細胞は見られなかった。ＡＡＶ／ＬａｃＺ処理したサルは、同側線条体でも対側線条体でもＡＡＤＣ−ＩＲを示さなかった。
【０１６８】
ＡＡＶに感染した細胞は、神経形態を有するようであった。感染した細胞の平均直径は、被殻において９±２．３μｍ、および１４．６±９μｍであった。多くのＬａｃ−ＺおよびＡＡＤＣ細胞は、典型的な中程度の棘状の神経形態を有した。ＡＡＶ感染した細胞は、ニューロンマーカーＮｅｕ−Ｎについて陽性であった。ＡＡＶ−ＡＡＤＣ処理したサルにおいて、４−６Ｎｅｕ−Ｎ−陽性細胞のうちの１つは、尾状核および被殻においてＡＡＤＣ陽性であり、そして３−４Ｎｅｕ−Ｎ−陽性細胞のうちの１つは、淡蒼球においてＡＡＤＣ陽性であった。Ｌａｃ−ＺまたはＡＡＤＣ処理したサル中のＡＡＶ感染した細胞のどれも、ＧＦＡＰ陽性ではなかった。
【０１６９】
カニューレ路に隣接する領域を、ＮｉｓｓｉおよびＨ＆Ｅ染色で染色した。細胞傷害性の徴候は観察されなかった。カニューレからの距離にかかわらず、血管周囲カフィングは観察されなかった。Ｎｅｕ−Ｎ免疫染色を用いて対側と比較した場合に、注入部位に近くでニューロン細胞減少の徴候は存在しなかった。ＧＦＡＰ免疫染色は、ＡＡＶ処理した線条内で異常なグリア反応を検出し得なかった。
【０１７０】
（生化学分析）
脳領域を、マイクロパンチャーを用いて新しく凍結したブロックから取り出し、Ｌ−ドパおよびドパミン代謝物の組織レベル、ならびにＡＡＤＣの活性およびＡＡＶ−ベクターの存在を評価した。脳領域は、線条および皮質を含んだ。
【０１７１】
凍結したマイクロパンチを回収し、１％エタノールおよび０．０２％ＥＤＴＡ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む０．１Ｍ過塩素酸（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の３００ｐｌ中で超音波処理によってホモジナイズした。５０ｐｌのホモジネートを、タンパク質分析（ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  Ｐｉｅｒｃｅ＃２３２２５）のために取り出し、そして残りを、最大の速度で１．５分間、微量遠心分離中で遠心分離した。３０〜５０ｐｌのホモジネートを、以下を用いるＨＰＬＣによってカテコールアミン分析のために使用した：Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  Ｃ−１８イオン対、５ｐ、４．６×２５０ｍｍカラム（Ｂｅｃｋｍａｎ  ２３５３２９）；Ｗａｔｅｒｓ  ７１７ｐｌｕｓオートサンプラー（４℃）、Ｗａｔｅｒｓ５１０ポンプ（０．９ｍｖ／分）、および電流滴定電気化学検出器（Ｄｅｃａｄｅ）（Ｅｏｘ．０．８２Ｖに設定した）。このカラムおよび検出セルを、３１℃に設定した。移動相は、２Ｌ  ＨＰＬＣグレード水、２．２ｇ１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム塩（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１７ｇ  ＥＤＴＡ、１２ｍｌトリエチルアミン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ｐＨを８ｍｌ  ８５％リン酸（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２．５に調整した、および６０ｍｌアセトニトリル（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）を含んだ。検出器の出力を記録し、Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  ３２  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｍａｎａｇｅｒで分析した。
【０１７２】
（ＡＡＤＣ分析）
ＡＡＤＣ活性を、Ｎａｇａｔｓｕら（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１００：１６０〜１６５の方法の適用によって決定した。手短には、組織（１０ｍｇ／ｍｌ）を、０．０４ｍＭピリキシルホスフェート（ＡＡＤＣ補因子）および０．２ｍＭパルジリンを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中でホモジナイズした。サンプルを、３７℃にて５分間プレインキュベートし、そして反応をＬ−ドパの添加（最終濃度：１００μＭ）によって開始した。インキュベーションを２０分間行い、そして０．０２ｍｌの濃縮した過塩素酸の添加によって反応を停止した。遠心分離の後、上清のドパミン濃度を、電気化学検出を用いるＨＰＬＣを使用して決定した（例えば、Ｂｏｏｍｓａら（１９８８）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ  １７８−５９−６９を参照のこと）。組織ペレット中のタンパク質濃度を、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ＃２３２２５）を用いて決定した。結果を、タンパク質のｎＭ／時間／ｍｇとして表す。凍結した組織パンチは、標準的なプロトコルに従って処理した。
【０１７３】
すべてのサルの皮質領域は、可変のレベルのＬ−ドパを示したが、それらは各サル内で一致した。予測されるように、皮質内でＬ−ドパからドパミンへの脱カルボキシル化は存在しなかったが、ＭＰＴＰ投与の対側での線条において、Ｌ−ドパは、ドパミンに変換され、そしてさらにＨＶＡに代謝された。ＡＡＶ−Ｌａｃ−ＺサルのＭＰＴＰ処理した線条において、Ｌ−ドパはドパミンに変換されず、ＨＶＡにも代謝されなかった。Ｌ−ドパの組織レベルはまた、ＡＡＶ−Ｌａｃ−Ｚ処理したサルの皮質においてと同じレベルのままであった。ＡＡＶ−ＡＡＤＣ処理したサルのＭＰＴＰ処理した線条において、Ｌ−ドパは、ドパミンおよびＨＶＡに変換され、そしてこの領域中のＬ−ドパの組織レベルは、低減された。
【０１７４】
ＡＡＤＣ活性は、ＡＡＶ−ＬａｃＺ処理したサルの皮質領域において、およびＭＰＴＰ処理した線条において非常に低かった。Ｌ−ドパは、対側の線条においてドパミンに変換され、これは、高レベルのＡＡＤＣ活性を示唆する。ＡＡＶ−ＡＡＤＣ感染したサルのＭＰＴＰ処理した線条からの組織パンチは、残されたＬ−ドパのトレースのみを有する非常に高いドパミンレベルを含んだ。
【０１７５】
これらの結果は、注入されたＡＡＶ−ＡＡＤＣベクターおよび全身のＬ−ドパの組合せが、ＰＤの処置のための有望な治療であることを実証する。
【０１７６】
従って、本発明は、ＣＮＳ障害（例えば、パーキンソン病）のための新規かつ効率的な処置方法を提供する。さらに、本発明はまた、インビボでドパミン活性を決定するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】図１（パネルＡ〜Ｄ）は、頭蓋内注入ポンプ送達後のラットにおける用量応答（ＡＡＶ−ｔｋ導入遺伝子の発現）を示す。組織容量（図１Ａ）；平均面積（図１Ｂ）；長さ（図１Ｃ）、および導入遺伝子を発現する細胞の数（図１Ｄ）が示される。
【図２】図２は、ＡＡＶベクターの注入後のラット脳組織の標識を示す、ハーフトーン複写である。
【図３】図３（パネルＡ〜Ｄ）は、注入ポンプ（ＩＰ）または浸透圧ポンプ（ＯＰ）のいずれかを介したＡＡＶ−ｔｋの頭蓋内送達を示す。組織容量（図３Ａ）；平均面積（図３Ｂ）、長さ（図３Ｃ）、および導入遺伝子を発現する細胞の数（図３Ｄ）が示される。
【図４Ａ】図４Ａは、ｔｋ導入遺伝子を保有するベクターを注入されたＣＮＳ組織を示す、ハーフトーン複写である。図４Ａは、ニューロンにおけるｔｋの発現を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ｔｋ導入遺伝子を保有するベクターを注入されたＣＮＳ組織を示す、ハーフトーン複写である。図４Ｂは、ニューロンにおけるｔｋの発現を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ｔｋ導入遺伝子を保有するベクターを注入されたＣＮＳ組織を示す、ハーフトーン複写である。図４Ｃは、浸透圧ポンプ注入の部位付近のニューロンおよびグリアにおける発現を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ｔｋ導入遺伝子を保有するベクターを注入されたＣＮＳ組織を示す、ハーフトーン複写である。図４Ｄは、浸透圧ポンプ注入の部位付近のニューロンおよびグリアにおける発現を示す。
【図５】図５は、ＡＡＶ−ｔｋベクターを注入された被検体由来の組織の、サザンブロット分析を示す、ハーフトーン複写である。
【図６】図６は、ＭＰＴＰ病変サルの脳のＡＡＤＣに対する免疫染色を示す。左側（コントロール）は、制限された染色を示し、一方で右側（ＡＡＶ−ＡＡＤＣ処置）は、広範なＡＡＤＣ免疫染色を示す。
【図７】図７は、１側性のＭＰＴＰ病変サルの脳におけるドパミン活性を示すＦＭＴ  ＰＥＴ走査である。左側（基線）は、病変部位における制限された活性を示し、一方で右側（ＡＡＶ−ＡＡＤＣ投与の８週間後）は、正常なレベルのドパミン活性を示す。
【図８】図８（パネルＡ〜Ｃ）は、ＭＰＴＰ病変サルにおけるＬ−ドパレベルの生化学的分析を示す。パネルＡは、Ｌ−ドパが、ＡＡＣＤ酵素によってドパミンに変換されることを示す。皮質領域においては、ＭＰＴＰ処置にもかかわらず、Ｌ−ドパのドパミンへの変換はわずかであるかまたは全くなかった。線条は、ＡＡＤＣに富み、従って、Ｌ−ドパの大半がこの領域においてドパミンに変換された。ＭＰＴＰ投与に対して同側性線条において、ドパミンへのＬ−ドパの変換は損なわれ、ＡＡＶ−ＬａｃＺ処置サルにおける皮質活性と類似であった。両方のＡＡＶ−ＡＡＤＣ処置動物が、ほぼ正常なＬ−ドパのドパミンへの変換を示す。パネルＢは、ＨＶＡ分析を示す。ＨＶＡは、ドパミン異化代謝産物の代謝産物である。皮質領域は、Ｌ−ドパをドパミンへ変換し得ないので、ＨＶＡレベルは低い。パネルＡにおいて示されるように、線条はＬ−ドパをドパミンへと変換し、従って、ドパミンは、この領域においてＨＶＡへと異化代謝される。ＡＡＤＣ活性は、ＡＡＶ−ＬａｃＺ処置サルにおいて回復されなかったので、ＭＴＰＴ同側性線条におけるＨＶＡレベルは低い。ＨＶＡレベルは、ＭＰＴＰ同側性線条において、ＡＡＶ−ＡＡＤＣ処置サルにおいて有意に上昇した。パネルＣは、異なるＬ−ドパ投与後の組織パンチにおいて測定されたＬ−ドパレベルを示す。異なるＬ−ドパ吸収に起因して、組織レベルではサル間で異なる。しかし、これは、各被検体間で類似である。Ｌ−ドパの組織レベルは、ＡＡＤＣ酵素が回復されたので、ＡＡＶ−ＡＡＤＣ処置サルのＭＰＴＰ同側性線条において劇的に減少した。この領域におけるＡＡＤＣの活性は、非常に強力である。なぜなら、Ｌ−ドパの組織レベルが対側性線条におけるレベルよりも低いからである。
【図９】図９は、インビトロでのＡＡＤＣ酵素の活性を示すグラフである。材料および方法において記載されるように、組織パンチをＬ−ドパと共にインキュベートした。ＡＡＤＣ酵素活性を、Ｌ−ドパのドパミンへの変換の速度を測定することによって決定した。皮質領域は、低レベルのＡＡＤＣを含む。対側性線条におけるＡＡＤＣ活性は高い。しかし、脳のこの側にはいくつかのドパミン作用性病変が存在するので、このレベルは変動し得る。ＭＰＴＰ同側性線条におけるＡＡＤＣ活性は、ＡＡＶ−Ｌａｃ−Ｚ処置サルにおいて有意に減少されるが、これは、ＡＡＶ−ＤＤＣサルにおいて完全に回復される。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【配列表】
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