(57)【要約】      （修正有）【課題】特にＭＭＰの亢進が原因として起こる疾患（ガンの転移等）を予防または改善しうる安全性の高いＡＰ−１活性阻害剤、遺伝子発現阻害剤、および医薬組成物の提供。【解決手段】アスコクロリン、４−Ｏ−メチルアスコクロリン、４−Ｏ−カルボキシメチルアスコクロリン、４−Ｏ−メトキシカルボニルオキシアスコクロリン、４−Ｏ−（２−エトキシカルボニルオキシ）エチルアスコクロリン、４−Ｏ−ニコチノイルアスコクロリン、アスコフラノン、４−Ｏ−メチルアスコフラノン、４−Ｏ−カルボキシメチルアスコフラノン、４−Ｏ−メトキシカルボニルオキシアスコフラノン、４−Ｏ−（２−エトキシカルボニルオキシ）エチルアスコフラノンまたは４−Ｏ−ニコチノイルアスコフラノンで示される化合物もしくは生体内でこの化合物を生じうる化合物またはその薬理学的に許容できる塩を有効成分とする、ＡＰ−１活性阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）：
【化１】
2006213644.tif 000010
または一般式（II）：
【化２】
2006213644.tif 000011
（式中、Ｒ１は、−ＣＨＯまたは−ＣＯＯＨを表し；Ｒ２は、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、−（ＣｎＨ２ｎ）ＣＯＯＲ’（ここで、ｎは１〜５の整数、Ｒ’は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す）または−ＣＯＲ''（ここで、Ｒ''はピリジル基、炭素数１〜３のアルキル基で置換されたアミノ基、ベンゼン環上にハロゲン原子を有するフェノキシアルキル基、またはベンゼン環上に炭素数１〜３のアルコキシ基もしくは炭素数１〜３のアルコキシカルボニル基を有するフェニル基を表す）を表す）
で示される化合物もしくは生体内でこの化合物を生じうる化合物またはその薬理学的に許容できる塩を有効成分とする、アクチベータープロテイン１（ＡＰ−１）活性阻害剤。
【請求項２】
下記の一般式（Ｉ）：
【化３】
2006213644.tif 000012
または一般式（II）：
【化４】
2006213644.tif 000013
（式中、Ｒ１は、−ＣＨＯまたは−ＣＯＯＨを表し；Ｒ２は、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、−（ＣｎＨ２ｎ）ＣＯＯＲ’（ここで、ｎは１〜５の整数、Ｒ’は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す）または−ＣＯＲ''（ここで、Ｒ''はピリジル基、炭素数１〜３のアルキル基で置換されたアミノ基、ベンゼン環上にハロゲン原子を有するフェノキシアルキル基、またはベンゼン環上に炭素数１〜３のアルコキシ基もしくは炭素数１〜３のアルコキシカルボニル基を有するフェニル基を表す）を表す）
で示される化合物もしくは生体内でこの化合物を生じうる化合物またはその薬理学的に許容できる塩を有効成分とする、ＡＰ−１によって発現調節される遺伝子の発現阻害剤。
【請求項３】
前記ＡＰ−１によって発現調節される遺伝子が、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）遺伝子である、請求項２記載の阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の阻害剤を含有する、ＭＭＰ亢進性疾患またはＡＰ−１亢進性疾患の予防または治療のための医薬組成物。
【請求項５】
前記ＭＭＰ亢進性疾患またはＡＰ−１亢進性疾患が、変形性関節症、関節リウマチ、角膜潰瘍、歯周炎、ウイルス感染症、閉塞性動脈硬化症、動脈硬化性動脈瘤、粥状動脈硬化症、再狭窄、敗血症、敗血症ショック、冠状血栓症、異常血管新生、強膜炎、多発性硬化症、開放角緑内障、網膜症、増殖性網膜症、血管新生緑内障、翼状皮膚、角膜炎、水泡性表皮剥離、乾癬、糖尿病、腎炎、神経性疾患、炎症、骨粗鬆症、骨吸収、歯肉炎、腫瘍増殖、腫瘍血管新生、眼腫瘍、血管線維腫、血管腫、熱病、出血、凝固、悪液質、食欲不振、急性感染症、ショック、自己免疫症、マラリア、クローン病、髄膜炎、心不全、喘息性気道炎、動脈硬化症、ガンの転移、潰瘍形成、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、歯周炎、皮膚の老化、胃腸潰瘍、腎疾患（糸球体腎炎）、脳梗塞、虚血性神経系疾患、中枢興奮性疾患、てんかん、アルツハイマー病、骨代謝疾患、ガン、虚血性心疾患、心筋梗塞からなる群から選択される１以上の疾患である、請求項４記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスコクロリン、アスコフラノンおよびその誘導体を含有するアクチベータープロテイン１（以下「ＡＰ−１」ということがある）阻害剤に関し、詳しくは、腎疾患（糸球体腎炎）、脳梗塞などの虚血性神系疾患、中枢興奮性疾患（てんかんなど）、アルツハイマー病、骨代謝疾患、ガン、虚血性心疾患（心筋梗塞等）など、ＡＰ−１の亢進が原因で起こる各種疾患の予防、抑制または症状の改善に有効であり、かつ安全性の高いＡＰ−１阻害剤に関する。
また、本発明は、アスコクロリン、アスコフラノンおよびその誘導体を含有するＡＰ−１によって発現調節される遺伝子、特にマトリックスメタロプロテアーゼ（以下「ＭＭＰ」ということがある）の発現阻害剤に関し、詳しくは、ガンの転移、潰瘍形成、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、歯周炎、皮膚の老化等、ＭＭＰ等の亢進が原因で起こる各種疾患の予防、抑制または症状の改善に有効であり、かつ安全性の高いＭＭＰ等の発現阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンは、ほとんどの先進諸国における主要死亡原因の１つであり、我が国では、およそ３割の人がガンで亡くなっている状況である。近年の外科療法、放射線療法の発達により、ガンの原発巣自体はほぼ取り除けるようになった。しかし、それでもなお死亡率が高いのは、ガンが転移を起こす性質を有しているためと考えられており、転移が多発するようになったガンを治療することは、現状では非常に困難であると言わざるをえない。したがって、従来の原発巣の治療法に加えて、転移を抑制する方法を確立することが、ガン治療の大きな目的の１つであると考えられている。
【０００３】
このような現況の中、徐々にではあるが転移のメカニズムが分子レベルで明らかになりつつあり、最近では、その転移プロセスの１つとして細胞外基質の分解系が注目されている。
【０００４】
腫瘍細胞の浸潤のステップとしては、１）細胞の遊走および正常組織への接着、２）ＭＭＰを介した正常組織の融解、３）正常組織内への遊走および衛星病変での細胞の増加という段階があることが知られている。
【０００５】
ガンの転移とは、原発部位から離脱したガン細胞が血流に乗って全身に散布され、他の臓器に生着し、その組織で再び増殖をはじめることである。一般に、腫瘍組織は、密な細胞外基質に囲まれているため、ガン細胞が原発部位からの移動を行うためには細胞外基質の酵素分解を必要とする。細胞外基質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン等の多様な高分子によって構成されている。これら細胞外基質の分解に関わる主要な酵素群が、ＭＭＰである。少なくとも２０種のメンバーがＭＭＰとして知られており、これらは、構造および基質特異性に応じて４つのファミリー（コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメリシン、および膜結合ＭＭＰ）に分けられる。例えば、ＭＭＰ−９は、ゼラチナーゼ−Ｂとも呼ばれ、IV型コラーゲンを分解する重要な酵素の一つである。
【０００６】
ＭＭＰについては、ガン組織中で血管が新生される際またはガンが転移する際に、発現量が上昇し、酵素の活性化が起こることが、例えば「腫瘍湿潤およびマトリックスメタロプロティナーゼ合成のレチノイド媒介性阻害」（Schoenermark M P等、『Annals New York Academy of Sciences』、Vol.878、第466-486頁、1999年；非特許文献１）に記載されている。したがって、これらの酵素の発現量の低下や活性阻害は、ガン細胞の浸潤性を抑制し、転移を抑えることに繋がると考えられる。また、ＭＭＰ−９のプロモーターには、ＡＰ−１結合部位を含む、いくつかのシス作用性調節因子が存在することが知られている。
ＡＰ−１は、ＪｕｎとＦｏｓとのヘテロダイマーからなる転写制御因子であり、ＭＭＰのほかにも多数の遺伝子の発現の調節に関与している。
【０００７】
ガン細胞による高分子群の浸潤過程において、とりわけコラーゲンの分解は重要なステップである。例えば、ガン細胞が血管内へ侵入、および血管外へ脱出するためには、血管の基底膜に存在するIV型コラーゲンを分解する必要があるが、Liottaらはガン細胞が分泌するIV型コラーゲン分解酵素の作用がガンの転移能を決定する重要な因子であることを、「転移可能性と基底膜コラーゲン酵素分解との相関」（Liotta LA等、『Nature』、Vol.284、第67-68頁、1980年；非特許文献２）において示している。ＭＭＰに属するゼラチナーゼは、線維芽細胞や内皮細胞、ガン細胞等によって産生される酵素であり、IV型コラーゲン、ゼラチン、エラスチン等の基質を分解する。したがって、例えばゼラチナーゼに対して阻害活性を有する物質は、ガン組織における血管新生やガンの転移を抑制する効果が期待され、ガン疾患の予防、治療に有用であると考えられる。
【０００８】
さらに、ＭＭＰは、ガン疾患のみならず、潰瘍形成、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、歯周炎等の種々の病態での細胞外基質の分解に中心的な役割を果たすことが、「組織破壊性プロテアーゼとしてのマトリックスメタロプロテアーゼ」（中田光俊、岡田保典 『呼吸』、Vol.18、No.4、第365-371頁、1999年；非特許文献３）に報告されている。また、皮膚においては、紫外線等の外部刺激によって活性の亢進したＭＭＰが皮膚の構造維持に重要な成分を分解することから、紫外線によって活性化する老化促進因子として、最近特に注目されている。
【０００９】
ＭＭＰの阻害剤は、ＭＭＰの亢進が原因で起こる上記疾患の治療および改善に有用であると考えられることから、各方面で盛んにスクリーニングが行われてきた。こうした阻害剤については、特開平９−４０５５２号公報（特許文献１）、特開平１１−１４７８３３号公報（特許文献２）、特開２０００−２２６３１１号公報（特許文献３）に記載されている。
【００１０】
アスコクロリンおよびアスコフラノンは、本発明者らによって糸状菌Ascochyta visiaeの生産物より見いだされた抗ウイルス性および抗腫瘍性を有する物質である（特公昭４５−９８３２号公報；特許文献４）。また、その誘導体が血糖低下作用を有することが特公平１−４１６２４号公報（特許文献５）および特公平３−６１３８号公報（特許文献６）に記載されている。しかし、これまでアスコクロリン、アスコフラノンまたはその誘導体のＭＭＰ発現阻害作用またはＡＰ−１阻害作用については記載されていない。
【００１１】
【特許文献１】特開平９−４０５５２号公報
【特許文献２】特開平１１−１４７８３３号公報
【特許文献３】特開２０００−２２６３１１号公報
【特許文献４】特公昭４５−９８３２号公報
【特許文献５】特公平１−４１６２４号公報
【特許文献６】特公平３−６１３８号公報
【非特許文献１】Schoenermark M P等、『Annals New York Academy of Sciences』、Vol.878、第466-486頁、1999年
【非特許文献２】Liotta LA等、『Nature』、Vol.284、第67-68頁、1980年
【非特許文献３】中田光俊、岡田保典 『呼吸』、Vol.18、No.4、第365-371頁、1999年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、高転移性悪性腫瘍細胞株により産生されるＭＭＰに対して、その発現を阻害し、ガンの転移等、ＡＰ−１によって発現調節される遺伝子の発現の亢進、特にＭＭＰの亢進が原因として起こる疾患を予防または改善しうる安全性の高い遺伝子発現阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ＭＭＰ発現阻害活性を有する化合物のスクリーニングを行った。その結果、本発明者らは、アスコクロリン、アスコフラノンおよびその誘導体が、ＭＭＰ発現阻害効果を有することを見出し、さらに、これらの化合物によるＭＭＰ発現阻害機構の解明の際、アスコクロリン、アスコフラノンおよびその誘導体が、ＡＰ−１阻害剤としての活性を示すことをも見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
したがって、本発明は、
〔１〕下記の一般式（Ｉ）：
【化５】
2006213644.tif 000002
または一般式（II）：
【化６】
2006213644.tif 000003
（式中、Ｒ１は、−ＣＨＯまたは−ＣＯＯＨを表し；Ｒ２は、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、−（ＣｎＨ２ｎ）ＣＯＯＲ’（ここで、ｎは１〜５の整数、Ｒ’は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す）または−ＣＯＲ''（ここで、Ｒ''はピリジル基、炭素数１〜３のアルキル基で置換されたアミノ基、ベンゼン環上にハロゲン原子を有するフェノキシアルキル基、またはベンゼン環上に炭素数１〜３のアルコキシ基もしくは炭素数１〜３のアルコキシカルボニル基を有するフェニル基を表す）を表す）
で示される化合物もしくは生体内でこの化合物を生じうる化合物またはその薬理学的に許容できる塩を有効成分とする、アクチベータープロテイン１（ＡＰ−１）活性阻害剤；
〔２〕下記の一般式（Ｉ）：
【化７】
2006213644.tif 000004
または一般式（II）：
【化８】
2006213644.tif 000005
（式中、Ｒ１は、−ＣＨＯまたは−ＣＯＯＨを表し；Ｒ２は、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、−（ＣｎＨ２ｎ）ＣＯＯＲ’（ここで、ｎは１〜５の整数、Ｒ’は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す）または−ＣＯＲ''（ここで、Ｒ''はピリジル基、炭素数１〜３のアルキル基で置換されたアミノ基、ベンゼン環上にハロゲン原子を有するフェノキシアルキル基、またはベンゼン環上に炭素数１〜３のアルコキシ基もしくは炭素数１〜３のアルコキシカルボニル基を有するフェニル基を表す）を表す）
で示される化合物もしくは生体内でこの化合物を生じうる化合物またはその薬理学的に許容できる塩を有効成分とする、ＡＰ−１によって発現調節される遺伝子の発現阻害剤；
〔３〕前記ＡＰ−１によって発現調節される遺伝子が、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）遺伝子である、前記〔２〕記載の阻害剤；
〔４〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか記載の阻害剤を含有する、ＭＭＰ亢進性疾患またはＡＰ−１亢進性疾患の予防または治療のための医薬組成物；
〔５〕前記ＭＭＰ亢進性疾患またはＡＰ−１亢進性疾患が、変形性関節症、関節リウマチ、角膜潰瘍、歯周炎、ウイルス感染症、閉塞性動脈硬化症、動脈硬化性動脈瘤、粥状動脈硬化症、再狭窄、敗血症、敗血症ショック、冠状血栓症、異常血管新生、強膜炎、多発性硬化症、開放角緑内障、網膜症、増殖性網膜症、血管新生緑内障、翼状皮膚、角膜炎、水泡性表皮剥離、乾癬、糖尿病、腎炎、神経性疾患、炎症、骨粗鬆症、骨吸収、歯肉炎、腫瘍増殖、腫瘍血管新生、眼腫瘍、血管線維腫、血管腫、熱病、出血、凝固、悪液質、食欲不振、急性感染症、ショック、自己免疫症、マラリア、クローン病、髄膜炎、心不全、喘息性気道炎、動脈硬化症、ガンの転移、潰瘍形成、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、歯周炎、皮膚の老化、胃腸潰瘍、腎疾患（糸球体腎炎）、脳梗塞、虚血性神経系疾患、中枢興奮性疾患、てんかん、アルツハイマー病、骨代謝疾患、ガン、虚血性心疾患、心筋梗塞等からなる群から選択される１以上の疾患である、前記〔４〕記載の医薬組成物、
を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ガンの転移、潰瘍形成、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、歯周炎、皮膚の老化等、ＭＭＰの亢進が原因で起こる各種疾患の予防、抑制または症状の改善に有効であり、かつ安全性の高いＭＭＰ発現阻害剤が提供される。また、腎疾患（糸球体腎炎）、脳梗塞などの虚血性神経系疾患、中枢興奮性疾患（てんかんなど）、アルツハイマー病、骨代謝疾患、ガン、虚血性心疾患（心筋梗塞等）など、ＡＰ−１の亢進が原因で起こる各種疾患の予防、抑制または症状の改善に有効であり、かつ安全性の高いＡＰ−１阻害剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明において有効成分として使用されるアスコクロリン、アスコフラノンおよびその誘導体は、以下の一般式（Ｉ）または（II）によって示される化合物を含む：
一般式（Ｉ）：
【化９】
2006213644.tif 000006
一般式（II）：
【化１０】
2006213644.tif 000007
（式中、Ｒ１は、−ＣＨＯまたは−ＣＯＯＨを表し；Ｒ２は、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、−（ＣｎＨ２ｎ）ＣＯＯＲ’（ここで、ｎは１〜５の整数、Ｒ’は水素原子または炭素数１〜３のアルキル基を表す）または−ＣＯＲ''（ここで、Ｒ''はピリジル基、炭素数１〜３のアルキル基で置換されたアミノ基、ベンゼン環上にハロゲン原子を有するフェノキシアルキル基、またはベンゼン環上に炭素数１〜３のアルコキシ基もしくは炭素数１〜３のアルコキシカルボニル基を有するフェニル基を表す）を表す）
【００１７】
上記一般式（Ｉ）および（II）中のＲ''に関して、アミノ基上のアルキル基、フェノキシアルキル基を構成するベンゼン環上のハロゲン原子、フェニル基を構成するベンゼン環上のアルコキシ基もしくはアルコキシカルボニル基は、それぞれ少なくとも１以上存在すればよく、２以上存在する場合、相互に同じであっても異なっていてもよい。
【００１８】
一般式（Ｉ）で示される化合物の具体的な例としては、以下の化合物が挙げられる：
【００１９】
【表１】
2006213644.tif 000008
【００２０】
一般式（II）で示される化合物の具体的な例としては、以下の化合物が挙げられる：
【００２１】
【表２】
2006213644.tif 000009
【００２２】
上記のうち、好ましくはアスコクロリン、４−Ｏ−メチルアスコクロリン、４−Ｏ−カルボキシメチルアスコクロリン、アスコフラノン、４−Ｏ−メチルアスコフラノン、４−Ｏ−カルボキシメチルアスコフラノンである。
【００２３】
また、本発明において使用されるアスコクロリン、アスコフラノンおよびその誘導体は、薬理的に許容される塩またはその水和物であってもよい。このような塩としては、例えば、アルカリ金属（リチウム、ナトリウム、カリウム等）、アルカリ土類金属（マグネシウム、カルシウム等）、アンモニウム、有機塩基またはアミノ酸との塩、または無機酸（塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸等）または有機酸（酢酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等）との塩が挙げられる。これらの塩は、通常行われる方法によって形成させることができる。また、これらの化合物が水和物を形成する場合は、任意の数の水分子と配位していてもよい。本発明において使用される化合物は、これらの化合物を生体内で代謝によって生じうる化合物（プロドラッグ）であってもよい。
【００２４】
さらに、本発明において使用されるアスコクロリン、アスコフラノンおよびその誘導体は、特定の異性体に限定されるものではなく、全ての可能な異性体やラセミ体を含むものであり、それらもまた、後述する実施例に記載のとおり、ＭＭＰ−９などのＡＰ−１支配下の遺伝子の優れた発現阻害活性およびＡＰ−１阻害活性を示す。
【００２５】
本発明において使用されるアスコクロリン、アスコフラノンおよびその誘導体は、ＭＭＰ遺伝子のプロモーター領域中の主にＡＰ−１（結合）サイトに作用し、その結果、ＭＭＰの発現を阻害することができる。また、同様にして、ＡＰ−１によって発現を調節されている他の遺伝子の発現を阻害することができる。
ＡＰ−１によって発現調節される遺伝子としては、ＣｙｃｌｉｎＤ１、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１９、ｐ１６遺伝子などが挙げられる。
【００２６】
したがって、これらの化合物は、ＭＭＰ遺伝子発現阻害剤、ＡＰ−１によって発現調節される他の遺伝子の発現阻害剤またはＡＰ−１活性阻害剤等として研究用試薬として使用できることはもちろん、生体に投与することにより、ガンの転移等、ＭＭＰの亢進が原因として起こる疾患（「ＭＭＰ亢進性疾患」ということがある）を予防および改善しうる。さらに、ＡＰ−１の亢進が原因として起こる疾患（「ＡＰ−１亢進性疾患」ということがある）を予防および改善しうる。なお、本発明に関して、「予防」は未だ罹患していない疾患に対して罹患を防止することを意味し、「治療」は罹患している疾患のあらゆる改善（症状の軽減、抑制、完全な治癒などを含む）を意味する。
【００２７】
ＭＭＰ亢進性疾患としては、具体的には、変形性関節症、関節リウマチ、角膜潰瘍、歯周炎、ウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ感染症）、閉塞性動脈硬化症、動脈硬化性動脈瘤、粥状動脈硬化症、再狭窄、敗血症、敗血症ショック、冠状血栓症、異常血管新生、強膜炎、多発性硬化症、開放角緑内障、網膜症、増殖性網膜症、血管新生緑内障、翼状皮膚、角膜炎、水泡性表皮剥離、乾癬、糖尿病、腎炎、神経性疾患、炎症、骨粗鬆症、骨吸収、歯肉炎、腫瘍増殖、腫瘍血管新生、眼腫瘍、血管線維腫、血管腫、熱病、出血、凝固、悪液質、食欲不振、急性感染症、ショック、自己免疫症、マラリア、クローン病、髄膜炎、心不全、喘息性気道炎、動脈硬化症、ガンの転移、潰瘍形成、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、歯周炎、皮膚の老化および胃腸潰瘍等が挙げられる。
【００２８】
ＡＰ−１亢進性疾患としては、具体的には、腎疾患（糸球体腎炎）、脳梗塞などの虚血性神経系疾患、中枢興奮性疾患（てんかんなど）、アルツハイマー病、骨代謝疾患、ガン、虚血性心疾患（心筋梗塞等）、慢性関節リウマチ、動脈硬化症などが挙げられる。
【００２９】
本発明の遺伝子発現阻害剤を、上記の疾患の予防または治療を目的としてヒトに投与する場合は、製薬技術分野で当業者に公知の方法によって医薬組成物とすることができる。
【００３０】
例えば、有効量の本発明の遺伝子発現阻害剤に、所望の剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤等の医薬用添加剤を必要に応じて添加・混合し、製剤化することができる。注射剤の場合には、適当な担体と共に滅菌処理を行って製剤とする。剤型及び投与経路は、当業界で公知のいずれのものであってもよく、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、液剤等として経口的に、または注射剤、坐剤、経皮吸収剤、吸入剤等として非経口的に投与することができる。
【００３１】
本発明の医薬組成物に含有される有効成分である上記化合物の投与量は、疾患の種類、疾患の状態、投与経路、患者の年齢・体重等によっても異なるが、例えば成人に経口で投与する場合、通常は０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましくは１〜２０ｍｇ／ｋｇ／日であることができる。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
以下の例において、特に示さない限り、下記の材料を使用した：
Ｃａｋｉ−１細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｕ２ＯＳ細胞およびＭＸ−１細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した。これらの細胞は、１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１００μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシンを含有するDulbecco’s Modified Eagle's Medium（ＤＭＥＭ； Gibco, Grand Island）中で培養した。アスコクロリンおよびアスコフラノンは、（株）ＮＲＬファーマ（川崎市、日本）から入手した。
リポフェクタミン試薬は、Life Technologies, Inc.（Rockville, MD）から入手した。ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼアッセイ系は、Promega（Madison, WI）から入手した。フォルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）は、SIGMA（St. Louis, USA）から入手した。
【００３３】
実施例１：アスコクロリンによるＣａｋｉ−１細胞の浸潤活性の抑制
ヒト腎臓ガン細胞であるＣａｋｉ−１細胞を用い、アスコクロリンによる浸潤活性の抑制効果を検討した。
トランズウェル(「Transwell」、登録商標；Corning Coastar社製、Cambridge, MA, USA)の上側部分を、マトリゲル（商標、ベクトン・ディッキンソン、米国）：リン緩衝食塩水（ＰＢＳ）、１：２の混合液３０μｌで被覆した。マトリゲルで被覆したトランスウェルに、１チェンバーあたり５×１０４個のＣａｋｉ−１細胞を、５０ｎＭ  ＰＭＡの存在下および非存在下において、各種の濃度のアスコクロリン（１、１０、３０、５０μＭ）存在下でプレーティングした。その後、これらのインサートを３７℃で２４時間培養した。膜の下側表面に浸潤した細胞を、メタノールで固定し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色して、光学顕微鏡下で計数した。
【００３４】
結果を、図１に示す。ＰＭＡで処理したＣａｋｉ−１細胞（「Ｂ」）は、ＰＭＡ非存在下の対照（「Ａ」）と比べて浸潤が約５倍促進された。これに対し、アスコクロリンは、濃度依存的にＰＭＡ依存性の浸潤を阻害し、１０〜３０μＭのアスコクロリン濃度において、ＰＭＡ非存在下の対照のレベルに到達した（「Ｃ」〜「Ｆ」）。
【００３５】
実施例２：アスコフラノンによるＵ２ＯＳ細胞の浸潤活性の抑制
実施例１と同様の方法により、ヒト骨肉種細胞Ｕ２ＯＳ細胞を用い、アスコフラノンによる浸潤活性の抑制効果を検討した。その結果、アスコフラノンは、１〜５０μＭの濃度範囲において、濃度依存的な浸潤の抑制を示した。
【００３６】
実施例３：アスコクロリンによる、ＰＭＡにより誘導されたＭＭＰ−９活性の阻害
Ｃａｋｉ−１細胞を、１０％  ＦＢＳを含む培地に懸濁し、３５ｍｍディッシュ１個あたり３×１０５の細胞をプレーティングした。このディッシュを、細胞が８０％コンフルエントの状態に到達するまで培養した。次いで、培地を新鮮な無血清培地に交換し、１、１０または３０μＭのアスコクロリン存在下および非存在下でさらに２４時間培養後、上清を回収した。これらの培地を、１ｍｇ／ｍｌのゼラチン共存下で調製した１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ電気泳動に供した。電気泳動後、ゲルを２．５％トライトンＸ−１００（Triton‐X100）を含む５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．６緩衝液中で、数回、室温にて1時間洗浄した。それから、ゲルを５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１μＭ  ＺｎＣｌ２を含む同緩衝液中で、３７℃で２４時間振蕩した。その後、ゲルを、０．２５％  クマシー・ブリリアント・ブルーＲ２５０（Coomassei Brilliant Blue R250；Bio-Rad社製、California, USA）で１時間染色し、その後、脱色した。タンパク分解活性の存在は、染色されたゼラチンの青色の背景に対し、透明なバンドとして検出される。
【００３７】
同様の実験を、Ｃａｋｉ−１細胞の代わりにＣｈａｎｇ（ヒト肝細胞）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳腺ガン）およびＵ２ＯＳ細胞（ヒト骨肉腫）を用いて行った。
【００３８】
結果を図２に示す。Ｃａｋｉ−１細胞は、無血清培地中で培養すると、前駆型ＭＭＰ−２(ｐｒｏＭＭＰ−２）および前駆型ＭＭＰ−９（ｐｒｏＭＭＰ−９）を放出する。Ｃａｋｉ−１細胞をＰＭＡ（５０ｎＭ）で２４時間処理すると、前駆型ＭＭＰ−２(ｐｒｏＭＭＰ−２）発現レベルに変化は認められないが、前駆型ＭＭＰ−９（ｐｒｏＭＭＰ−９）は誘導される。ＰＭＡにより誘導された前駆型ＭＭＰ−９（ｐｒｏＭＭＰ−９）活性は、１〜５０μＭのアスコクロリン処理により、濃度依存的に減少した。
【００３９】
アスコクロリンによる前駆型ＭＭＰ−９（ｐｒｏＭＭＰ−９）活性抑制が、一般的な現象であるのかを確認するため、Ｃｈａｎｇ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＵ２ＯＳ細胞を用いて、アスコクロリン感受性について同様の検討を行ったところ、いずれの細胞においてもアスコクロリンによる前駆型ＭＭＰ−９（ｐｒｏＭＭＰ−９）活性の抑制が認められた。このことは、アスコクロリンによる本効果は、細胞タイプ特異性がないことを示している。
【００４０】
実施例４：アスコフラノンによる、ＰＭＡにより誘導されたＭＭＰ−９活性の阻害
実施例３と同様の方法により、Ｕ２ＯＳ細胞を用い、アスコフラノンによるＭＭＰ−９活性に及ぼす効果について検討した。その結果、アスコフラノンは、１μＭ以上の濃度において、濃度依存的にＭＭＰ−９活性を抑制した。
【００４１】
実施例５：アスコクロリンによる、ＰＭＡにより誘導されたＭＭＰ−９酵素発現の阻害
アスコクロリンによる、ＰＭＡにより誘導されたＭＭＰ−９酵素活性の阻害が、ＭＭＰ−９酵素タンパクの発現の阻害によるものかどうかを検討した。
３５ｍｍディッシュ１個あたり３×１０５個のＣａｋｉ−１細胞を、５０ｎＭ  ＰＭＡでＭＭＰ−９を誘導し、各種の濃度のアスコクロリン（１、１０、３０、５０ｎＭ）存在下で培養した細胞を用いた。細胞を、３０μｌのリシス緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％  ＮＰ−４０、１００μＭ  フェニルメチルスルフォニルフロリド（phenylmethylsulfonyl fluoride）、２０μＭ  アプロチニン（aprotinin）および２０μＭ  ロイペプチン；ｐＨは８．０に調整した）に懸濁し、４℃にて３０分処理し、細胞溶解液を調製した。タンパク質を、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎ−Ｐ膜（Millipore Corporation, Bredford, USA）に電気泳動的に転写した。ＭＭＰ−９酵素の検出は、ウサギ抗ＭＭＰ−９ポリクロ―ナル抗体（Santa Cruz Biotechnology社、Santa Cruz, California, USA）を用いて、強化化学発光法（enhanced chemiluminescence）により業者のマニュアル（Amersham, UK）にしたがって行った。
【００４２】
その結果、ＭＭＰ−９タンパク質の発現レベルは、アスコクロリンの濃度に依存して低下していることがわかった。このことは、アスコクロリンによる前駆型ＭＭＰ−９（ｐｒｏＭＭＰ−９）活性抑制は、ＭＭＰ−９タンパク質の減少によることを示している。
【００４３】
実施例６：アスコクロリンによるＭＭＰ−９遺伝子発現の抑制におけるＡＰ−１の関与
ＭＭＰ−９遺伝子のプロモーター領域には、２カ所のＡＰ−１サイトおよび１カ所のＮＦ−κＢサイトが存在する。これらの何れかが、Ｃａｋｉ−１細胞におけるＭＭＰ−９遺伝子の発現の調節に関与しているかどうかをルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによって検討した。
【００４４】
この目的のために、野生型のＭＭＰ−９プロモーター（ｐＧＬ２−ＭＭＰ−９ＷＴ）、１カ所または２カ所のＡＰ−１プロモーターに変異を入れた変異型プロモーター（それぞれ、ｐＧＬ２−ＭＭＰ−９ｍＡＰ−１−１およびｐＧＬ２−ＭＭＰ−９ｍＡＰ−１−２）、またはＮＦ−κＢサイトに変異を入れたプロモーター（ｐＧＬ２−ＭＭＰ−９ｍＮＦκＢ）の下流にレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）をもったプラスミドを、Clonetech（Palo Alto, CA, USA）から購入した。これらを、Ｃａｋｉ―１細胞に一過性にトランスフェクトした。細胞を、３５ｍｍディッシュ１個あたり３×１０５細胞の密度でプレーティングし、一晩生育させた。細胞を、リポフェクタミン試薬を業者の指示にしたがって用いて、２μｇのプラスミドおよび１μｇのｐＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼプラスミドとで５時間同時トランスフェクションした。
【００４５】
次に、上記のＣａｋｉ−１細胞を、各種濃度（１〜５０μＭ）のアスコクロリンを含む培地中で２４時間培養した後、業者の指示にしたがってルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性を、細胞溶解液中のβ−ガラクトシダーゼ活性に関して標準化し、３回の別個の実験の平均として表した。
【００４６】
その結果を、図３に示す。ＡＰ−１サイトに変異を導入したプロモーターにおいては、ＰＭＡによる誘導が極端に減少し、２カ所のプロモーターに変異があるものでは、ＰＭＡによる誘導が完全に消失した。ＮＦ−κＢに変異を導入した場合も、ＰＭＡによる誘導は、減少したが、ＡＰ−１の変異による影響よりは、弱かった。アスコクロリン１０μＭの存在下で、ＰＭＡによる誘導を調べたところ、変異を持ったＡＰ−１、ＮＦκＢプロモーターの下においてもルシフェラーゼ活性の低下が認められた。アスコクロリンの濃度に依存したルシフェラーゼ活性の低下が認められる。
【００４７】
また、同様の実験を、ＮＦκＢ結合サイトを有するレポーター遺伝子についても行ったところ、図４に示すように、有意なアスコクロリンによる影響は、観察されなかった。
したがって、ＭＭＰ−９プロモーター中のＡＰ−１およびＮＦ−κＢ結合サイトの両方が、プロモーター活性に寄与しており、ＡＰ−１サイトがＭＭＰ−９プロモーターのＰＭＡ依存性の活性化中のアスコクロリンに対する調節応答に関して主要な部位であることがわかった。
【００４８】
実施例７：アスコフラノンによるＭＭＰ−９遺伝子発現の抑制におけるＡＰ−１の関与
Ｕ２Ｏ２細胞を用いて、実施例６と同様の方法で、アスコフラノンによる、ＡＰ−１活性に及ぼす影響について検討した。その結果、アスコフラノンは、１〜５０μＭの濃度範囲において、濃度依存的にＡＰ−１プロモーターにコントロールされたレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）の活性を、減弱させた。結果を図５に示す。
【００４９】
実施例８：アスコクロリンによるＡＰ−１支配下の遺伝子発現の抑制
エストロジェンレセプターを欠損したヒト乳ガン細胞ＭＸ−１（１×１０５／ｍｌ）を一晩培養した後、ＡＰ−１プロモーター下流にレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を結合したプラスミド（ｐＴＲＥ−ｌｕｃ）、［これはY. Janssen-Heininger（バーモント大学、カナダ）より入手した。］および発現ベクターｐＣＭＶ−β−ｇａｌを感染し、さらに２０時間培養した。アスコクロリンを１μＭ添加し、３０分処理した後、ＰＭＡを１０ｎｇ／ｍｌ添加し、ＡＰ−１活性を誘導するため、さらに２０時間培養した。その結果、アスコクロリンは、ＰＭＡで誘導していないケースでのルシフェラーゼ活性を有意に抑制し、また、ＰＭＡによる誘導がかかっている条件では、完全に阻害した。
したがって、アスコクロリンは、ＭＭＰ−９のみでなく、ＡＰ−１の支配下にある遺伝子の発現を阻害しうることが判明した。
【００５０】
以上のとおり、アスコクロリン、アスコフラノンおよびその誘導体は、ＭＭＰをはじめとしてＡＰ−１に支配された遺伝子の発現を阻害することができるので、ＡＰ−１亢進性またはＭＭＰ亢進性疾患の予防または治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、アスコクロリンによるＣａｋｉ−１細胞の浸潤活性の抑制を示す図である。
【図２】図２は、アスコクロリンによる、ＰＭＡにより誘導されたＭＭＰ−９活性の阻害を示す図である。
【図３】図３は、アスコクロリンによるＭＭＰ−９遺伝子発現の抑制にＡＰ−１が関与していることを示すルシフェラーゼアッセイの結果を示す図である。ＭＭＰ−９プロモーターとして、（Ａ）は野生型、（Ｂ）は１ヵ所のＡＰ−１部位に変異を有するもの、（Ｃ）はＮＦ−κＢ部位に変異を有するもの、（Ｄ）は２ヵ所のＡＰ−１部位に変異を有するものを用いた場合の結果である。
【図４】図４は、図３に示したものと同様の実験を、ＡＰ−１結合サイトを有する遺伝子およびＮＦ−κＢ結合サイトを有するレポーター遺伝子について行った結果を示す図である。（Ａ）はＡＰ−１、（Ｂ）はＮＦ−κＢについての結果を示す。
【図５】図５は、図３および４に示したものと同様の実験を、アスコフラノンおよび別の細胞（Ｕ２Ｏ２細胞）を用いて行った結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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