(57)【要約】【課題】  本発明は、２型糖尿病の予防、治療及び診断する物質を提供することを目的とする。【解決手段】  ２型糖尿病に関する遺伝子の発現量を調節する物質及びその調節を阻害する物質並びにその遺伝子の多型配列を同定する検定方法。ならびに、下記スクリーニング方法。  ａ．ヒトのレジスチン遺伝子の発現を測定する系に試験物質を添加する工程。  ｂ．レジスチン発現を測定する工程。  ｃ．試験物質を添加していない場合と比較して、レジスチン遺伝子の発現が抑制又は阻止されているかを比較判定する工程。  を有することを特徴とする、２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２型糖尿病に関する遺伝子の発現量を調節することを特徴とする物質。
【請求項２】
該遺伝子の発現量を増加させることを特徴とする請求項１に記載の物質。
【請求項３】
発現量を増加させる遺伝子が、ヒトのレジスチン遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２に記載の物質。
【請求項４】
ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質がレジスチン遺伝子の転写調節領域のDNA配列に結合する物質であることを特徴とする請求項１〜３いすれかに記載の物質。
【請求項５】
ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質がレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型を含む配列に結合する物質であることを特徴とする請求項１〜４いずれかに記載の物質。
【請求項６】
ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質が転写調節因子であることを特徴とする請求項１〜５いずれかに記載の物質。
【請求項７】
ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる転写調節因子が結合するレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型が-1093A>G、-1082C>T、-821G>A、 -638G>A、-537A>C、-420C>G、-358G>Aの内少なくとも一つであることを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載の物質。
【請求項８】
ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる転写調節因子が結合するレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型が-420C>Gであることを特徴とする請求項１〜７いずれかに記載の物質。
【請求項９】
請求項６記載の転写調節因子が、Sp1及び又はSp3であることを特徴とする請求項１〜８いずれかに記載の物質。
【請求項１０】
ヒトのレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型を同定することで、２型糖尿病の予防又は治療の必要性を判定する方法。
【請求項１１】
ヒトのレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型が、-1093A>G、-1082C>T、-821G>A、 -638G>A、-537A>C、-420C>G、-358G>Aの少なくとも一つであることを特徴とする請求項1０記載の方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の転写調節領域の多型の少なくとも一つを同定することを特徴とする請求項1０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヒトのレジスチン遺伝子の転写調節領域の、-420C>G多型を同定することを特徴とする請求項1０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ヒトの血清レジスチン濃度を測定することを特徴とする２型糖尿病の予防又は治療の必要性を判定する方法。
【請求項１５】
さらに、ヒトの血清レジスチン濃度を測定することを特徴とする請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ヒトのレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型を同定するキット。
【請求項１７】
ヒトのレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型を同定する試薬を含む２型糖尿病に罹患する危険度を判定するキット。
【請求項１８】
ヒトのレジスチン遺伝子の転写調節領域の、-420C>G多型を同定する試薬を含む２型糖尿病に罹患する危険度を判定する請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
ヒトの血清レジスチン濃度を測定する試薬を含む２型糖尿病に罹患する危険度を判定するキット。
【請求項２０】
２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の調節を阻害する成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【請求項２１】
２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含むことを特徴とする請求項２０に記載の２型糖尿病の予防又は治療剤。
【請求項２２】
２型糖尿病に関する遺伝子が、ヒトのレジスチン遺伝子であることを特徴とする請求項２０又は２１に記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【請求項２３】
ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質がレジスチン遺伝子の転写調節領域のDNA配列に結合する物質であり、該物質がそのDNA配列に結合することを阻害することを特徴とする請求項２０〜２２いずれかに記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【請求項２４】
ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質がレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型を含む配列に結合する物質であり、２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分は該物質が転写調節領域の多型を含む配列に結合することを阻害するものであることを特徴とする請求項２３記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【請求項２５】
ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質が転写調節因子であることを特徴とする請求項２４記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【請求項２６】
ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質が転写調節因子であり、２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分は該転写調節因子に結合することによって該転写調節因子が転写調節領域の多型を含む配列に結合することを阻害することを特徴とする請求項２５記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【請求項２７】
ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質が転写調節因子であり、２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分はヒトのレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型を含む配列に特異的に結合することによって該転写調節因子が転写調節領域の多型を含む配列に結合することを阻害することを特徴とする請求項２５記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【請求項２８】
ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質が転写調節因子であり、２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分は該転写調節因子の活性を変化させて、該転写調節因子が転写調節領域の多型を含む配列に結合することを阻害することを特徴とする請求項２５記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【請求項２９】
ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質が転写調節因子であり、２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分は該転写調節因子が相互作用する物質に作用することによって該転写調節因子が転写調節領域の多型を含む配列に結合することを阻害することを特徴とする請求項２５記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【請求項３０】
転写調節因子が、Sp1及び又はSp3であることを特徴とする請求項２６〜２９に記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【請求項３１】
ヒトのレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型が、-1093A>G、-1082C>T、-821G>A、 -638G>A、-537A>C、-420C>G、-358G>Aから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請求項２４、２６、２７，２８、２９のいずれかに記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【請求項３２】
レジスチン遺伝子の転写調節領域の多型が-420C>Gであることを特徴とする請求項２４、２６、２７，２８、２９のいずれかに記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【請求項３３】
ａ．ヒトのレジスチン遺伝子の発現を測定する系に試験物質を添加する工程。
ｂ．レジスチン発現を測定する工程。
ｃ．試験物質を添加していない場合と比較して、レジスチン遺伝子の発現が抑制又は阻止されているかを比較判定する工程。
を有することを特徴とする、２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【請求項３４】
レジスチン遺伝子がその転写調整領域に-1093A>G、-1082C>T、-821G>A、 -638G>A、-537A>C、-420C>G、-358G>Aから選ばれる少なくとも一つの多型を持つことを特徴とする請求項３３記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【請求項３５】
レジスチン遺伝子がその転写調整領域に-420C>Gの多型を持つことを特徴とする請求項３３記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【請求項３６】
ヒトのレジスチン遺伝子の発現を測定する系が、転写調節因子の作用により発現する系であることを特徴とする請求項３３〜３５のいずれかに記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【請求項３７】
転写調節因子がSp1および／またはSp3であることを特徴とする請求項３６に記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【請求項３８】
レジスチン遺伝子の発現の測定が、転写活性を測定するものであることを特徴とする請求項３３〜３７のいずれかに記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【請求項３９】
レジスチン遺伝子の発現の測定が、発現されたレジスチン発現量もしくはｍＲＮＡ量を測定するものであることを特徴とする請求項３３〜３７に記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【請求項４０】
試験物質を、レジスチン遺伝子の転写調整領域のＤＮＡ配列と該転写調整領域のＤＮＡ配列に結合してレジスチン遺伝子の発現を調整する転写調整因子との結合を測定する系に含有させ、転写調整領域のＤＮＡ配列と転写調整因子との結合の変化を測定することを特徴とする、２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【請求項４１】
試験物質がレジスチン遺伝子の転写調整領域のＤＮＡ配列と結合するか否かを測定することを特徴とする２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【請求項４２】
試験物質が、転写調整領域のＤＮＡ配列に結合してレジスチン遺伝子の発現を調整する転写調整因子と結合するか否かを測定することを特徴とする２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【請求項４３】
レジスチン遺伝子が転写調整領域に-1093A>G、-1082C>T、-821G>A、 -638G>A、-537A>C、-420C>G、-358G>Aから選ばれる少なくとも一つの多型を持ち、転写因子と結合する部位もしくは試験物質が結合する部位が、該塩基多型部位であることを特徴とする請求項４０〜４２のいずれかに記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【請求項４４】
転写調整領域の塩基多型が-420C>Gであることを特徴とする請求項４１に記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【請求項４５】
転写調節因子がSp1および／またはSp3であることを特徴とする、請求項４０〜４４のいずれかに記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【請求項４６】
請求項３３〜４５のいずれかの方法により得られた成分を含有することを特徴とする２型糖尿病の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２型糖尿病の予防、治療及び検出に有用な物質に関する。本発明は、さらに、２型糖尿病に関連する遺伝子の発現量を調節する物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
２型糖尿病 は世界で１億人以上の人が罹患している病気である。２型糖尿病は、末梢組織におけるインスリン抵抗性と膵臓ランゲルハンス島のb細胞の機能障害が原因と考えられているが、正確な原因と機序はいまだ不明である。
糖尿病 の発病と進行には、遺伝的要因が深く関わっていることが知られていて、これまで、若年発症家族性糖尿病（ＭＯＤＹ；ｍａｔｕｒｉｔｙ−ｏｎｓｅｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｏｕｎｇ）やミトコンドリア糖尿病のような特異的な病態を示す糖尿病の原因遺伝子がいくつか同定されている。しかし、これらの遺伝子変異により説明される特異的病態を示す糖尿病は、全体のごくわずかの症例でしかない。すなわち、糖尿病に罹りやすい体質であるかどうかに影響を与える遺伝子は、そのほとんどが同定されていないものと考えられている。特に日本人の糖尿病患者における既知の糖尿病関連遺伝子の関与は低いため、他に未知の関連遺伝子が存在すると考えられる。
【０００３】
２型糖尿病には複数の遺伝子が関与しており、個々の遺伝子の効果が、複雑な遺伝的及 び環境的因子により影響を受けるため、古典的なアプローチでは原因遺伝子を同定することは、非常に困難であると考えられている。
一塩基多型（ＳＮＰ）と呼ばれる、配列決定されたゲノムにおいて高頻度に検出される遺伝的変異が、糖尿病を含む種々の病気の有用なマーカーとなりつつある。
【０００４】
２型糖尿病患者の多くは、遺伝的な要因に、環境因子（肥満、運動不足、脂肪の多い食生活など）が加わって発症すると考えられている。したがって、糖尿病に関与する遺伝因子を事前に診断し、発症前に糖尿病に罹患する可能性が高いとわかった人に対しては食事や運動を注意させることによって、糖尿病の発症を未然に防ぐことが可能となる。そのため、遺伝的に糖尿病に罹患する可能性が高い人を発症前に検出するため、また、糖尿病発症についてのメカニズムを遺伝学的に解明するために、２型糖尿病に関連する多型を検出することが求められている。
【０００５】
レジスチン遺伝子を多量に発現させたマウスにおけるインスリン抵抗性の獲得（非特許文献１）、レジスチン遺伝子を欠失したマウスでの血中グルコースの早期減少（非特許文献２）などの研究により、レジスチン遺伝子発現の変化がマウスにおいて糖尿病を引き起こす可能性が考えられていた。しかし、人においてレジスチン遺伝子と２型糖尿病との関連は明らかにされていなかった。
【０００６】
【非特許文献１】Ｐｒａｖｅｎｅｃら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、第２７８巻、第４５２０９−４５２１５頁、２００３年
【非特許文献２】Ｂａｎｅｒｊｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３０３巻、第１１９５−１１９８頁、２００４年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記の事情に鑑みて達成されたものであり、人におけるレジスチン遺伝子と２型糖尿病との関連を明らかにすると共に、遺伝子の変異に関する情報を提供することを目的とする。さらに、レジスチン遺伝子の発現量の調節を解析することで、２型糖尿病の発症の予防又は治療に有効な物質とそのスクリーニング方法を提供し、発現量の調節に関連する多型を同定することで、２型糖尿病を発症する可能性の高い人を発症前に判定するための方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、２型糖尿病 に関連するレジスチン遺伝子の多型を同定するために、２型糖尿病患者と、健常者のレジスチン遺伝子のプロモーターを含む領域、すなわちレジスチン遺伝子をコードする領域から1kbp上流域の配列を決定した。その結果、-1093A>G、-1082C>T、-821G>A、 -638G>A、-537A>C、-420C>G、-358G>Aの多型を同定し、２型糖尿病との関連について鋭意検討を行った結果、-420C>GのG/G遺伝子型に極めて高い関連を有することを見出した。遺伝学的にも-420G/G型が2型糖尿病感受性を決定する一義的な遺伝子型であることを証明した。更にはこのG/G型を有する患者での血中レジスチン濃度の上昇、および-420Gを含むDNA配列への転写調節因子Sp1及びSp3の特異的結合とそれによるプロモーター活性の上昇を見いだした。
本発明者らは、上記の知見及び考察を基に、さらに検討を重ね、本発明を完成するに至ったものである。即ち、本発明者らは以下の発明を提供するものである。
【０００９】
（１）  ２型糖尿病に関する遺伝子の発現量を調節することを特徴とする物質。
【００１０】
（２）  該遺伝子の発現量を増加させることを特徴とする（１）に記載の物質。
【００１１】
（３）  発現量を増加させる遺伝子が、ヒトのレジスチン遺伝子であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の物質。
【００１２】
（４）  ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質がレジスチン遺伝子の転写調節領域のDNA配列に結合する物質であることを特徴とする（１）〜（３）いすれかに記載の物質。
【００１３】
（５）  ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質がレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型を含む配列に結合する物質であることを特徴とする（１）〜（４）いずれかに記載の物質。
【００１４】
（６）  ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質が転写調節因子であることを特徴とする（１）〜（５）いずれかに記載の物質。
【００１５】
（７）  ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる転写調節因子が結合するレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型が-1093A>G、-1082C>T、-821G>A、 -638G>A、-537A>C、-420C>G、-358G>Aの内少なくとも一つであることを特徴とする（１）〜（６）いずれかに記載の物質。
【００１６】
（８）  ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる転写調節因子が結合するレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型が-420C>Gであることを特徴とする（１）〜（７）いずれかに記載の物質。
【００１７】
（９）  転写調節因子が、Sp1及び又はSp3であることを特徴とする（１）〜（８）いずれかに記載の物質。
【００１８】
（１０）  ヒトのレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型を同定することで、２型糖尿病の予防又は治療の必要性を判定する方法。
【００１９】
（１１）  ヒトのレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型が、-1093A>G、-1082C>T、-821G>A、 -638G>A、-537A>C、-420C>G、-358G>Aのうちの少なくとも一つであることを特徴とする（1０）載の方法。
【００２０】
（１１）記載の転写調節領域の多型の少なくとも一つを同定することを特徴とする（1０）たは（１１）に記載の方法。
【００２１】
（１３）  ヒトのレジスチン遺伝子の転写調節領域の、-420C>G多型を同定することを特徴とする（1０）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
【００２２】
（１４）  ヒトの血清レジスチン濃度を測定することを特徴とする２型糖尿病の予防又は治療の必要性を判定する方法。
【００２３】
（１５）  さらに、ヒトの血清レジスチン濃度を測定することを特徴とする（１０）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
【００２４】
（１６）  ヒトのレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型を同定するキット。
【００２５】
（１７）  ヒトのレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型を同定する試薬を含む２型糖尿病に罹患する危険度を判定するキット。
【００２６】
（１８）  ヒトのレジスチン遺伝子の転写調節領域の、-420C>G多型を同定する試薬を含む２型糖尿病に罹患する危険度を判定する（１７）に記載のキット。
【００２７】
（１９）  ヒトの血清レジスチン濃度を測定する試薬を含む２型糖尿病に罹患する危険度を判定するキット。
【００２８】
（２０）２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の調節を阻害する成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【００２９】
（２１）２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含むことを特徴とする（２０）に記載の２型糖尿病の予防又は治療剤。
【００３０】
（２２）２型糖尿病に関する遺伝子が、ヒトのレジスチン遺伝子であることを特徴とする（２０）又は（２１）に記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【００３１】
（２３）  ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質がレジスチン遺伝子の転写調節領域のDNA配列に結合する物質であり、該物質がそのDNA配列に結合することを阻害することを特徴とする（２０）〜（２２）いずれかに記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【００３２】
（２４）  ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質がレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型を含む配列に結合する物質であり、２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分は該物質が転写調節領域の多型を含む配列に結合することを阻害するものであることを特徴とする（２３）記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【００３３】
（２５）  ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質が転写調節因子であることを特徴とする（２４）記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【００３４】
（２６）  ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質が転写調節因子であり、２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分は該転写調節因子に結合することによって該転写調節因子が転写調節領域の多型を含む配列に結合することを阻害することを特徴とする（２５）記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【００３５】
（２７）  ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質が転写調節因子であり、２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分はヒトのレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型を含む配列に特異的に結合することによって該転写調節因子が転写調節領域の多型を含む配列に結合することを阻害することを特徴とする（２５）記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【００３６】
（２８）  ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質が転写調節因子であり、２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分は該転写調節因子の活性を変化させて、該転写調節因子が転写調節領域の多型を含む配列に結合することを阻害することを特徴とする（２５）記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【００３７】
（２９）  ヒトのレジスチン遺伝子の発現量を増加させる物質が転写調節因子であり、２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分は該転写調節因子が相互作用する物質に作用することによって該転写調節因子が転写調節領域の多型を含む配列に結合することを阻害することを特徴とする（２５）記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【００３８】
（３０）  転写調節因子が、Sp1及び又はSp3であることを特徴とする（２６）〜（２９）に記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【００３９】
（３１）  ヒトのレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型が、-1093A>G、-1082C>T、-821G>A、 -638G>A、-537A>C、-420C>G、-358G>Aから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする（２４）、（２６）、（２７）、（２８）、（２９）のいずれかに記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【００４０】
（３２）  レジスチン遺伝子の転写調節領域の多型が-420C>Gであることを特徴とする（２４）、（２６）、（２７）、（２８）、（２９）のいずれかに記載の２型糖尿病に関する遺伝子の発現量の増加を抑制又は阻止させる成分を含む２型糖尿病の予防又は治療剤。
【００４１】
（３３）
ａ．ヒトのレジスチン遺伝子の発現を測定する系に試験物質を添加する工程。
ｂ．レジスチン発現を測定する工程。
ｃ．試験物質を添加していない場合と比較して、レジスチン遺伝子の発現が抑制又は阻止されているかを比較判定する工程。
を有することを特徴とする、２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【００４２】
（３４）  レジスチン遺伝子がその転写調整領域に-1093A>G、-1082C>T、-821G>A、 -638G>A、-537A>C、-420C>G、-358G>Aから選ばれる少なくとも一つの多型を持つことを特徴とする（３３）記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【００４３】
（３５）  レジスチン遺伝子がその転写調整領域に-420C>Gの多型を持つことを特徴とする（３３）記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【００４４】
（３６）  ヒトのレジスチン遺伝子の発現を測定する系が、転写調節因子の作用により発現する系であることを特徴とする（３３）〜（３５）のいずれかに記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【００４５】
（３７）  転写調節因子がSp1および／またはSp3であることを特徴とする（３６）に記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【００４６】
（３８）  レジスチン遺伝子の発現の測定が、転写活性を測定するものであることを特徴とする（３３）〜（３７）のいずれかに記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【００４７】
（３９）  レジスチン遺伝子の発現の測定が、発現されたレジスチン発現量もしくはｍＲＮＡ量を測定するものであることを特徴とする（３３）〜（３７）に記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【００４８】
（４０）  試験物質を、レジスチン遺伝子の転写調整領域のＤＮＡ配列と該転写調整領域のＤＮＡ配列に結合してレジスチン遺伝子の発現を調整する転写調整因子との結合を測定する系に含有させ、転写調整領域のＤＮＡ配列と転写調整因子との結合の変化を測定することを特徴とする、２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【００４９】
（４１）  試験物質がレジスチン遺伝子の転写調整領域のＤＮＡ配列と結合するか否かを測定することを特徴とする２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【００５０】
（４２）  試験物質が、転写調整領域のＤＮＡ配列に結合してレジスチン遺伝子の発現を調整する転写調整因子と結合するか否かを測定することを特徴とする２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【００５１】
（４３）  レジスチン遺伝子が転写調整領域に-1093A>G、-1082C>T、-821G>A、 -638G>A、-537A>C、-420C>G、-358G>Aから選ばれる少なくとも一つの多型を持ち、転写因子と結合する部位もしくは試験物質が結合する部位が、該塩基多型部位であることを特徴とする（４０）〜（４２）のいずれかに記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
【００５２】
（４４）  転写調整領域の塩基多型が-420C>Gであることを特徴とする（４４）に記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
（４５）
転写調節因子がSp1および／またはSp3であることを特徴とする、（４０）〜（４４）のいずれかに記載の２型糖尿病の予防又は治療剤成分のスクリーニング方法。
（４６）
（３３）〜（４５）のいずれかの方法により得られた成分を含有することを特徴とする２型糖尿病の予防又は治療剤。
【発明の効果】
【００５３】
本発明は２型糖尿病に関する遺伝子の発現量を調節する物質およびその物質の作用を阻害する物質である。例えば２型糖尿病に関与するとされている、レジスチン遺伝子の転写調節領域の多型を含むDNA配列に結合して、レジスチン遺伝子の発現量を上昇させる物質である。またその上昇を抑制または阻止する物質であり、この物質を用いることで、２型      糖尿病の発症の予防もしくは治療に有用な物質である。またこのような機能を有する多型を同定することは、２型糖尿病の予防もしくは治療の必要性の判定に有用である。また、本発明のスクリーニング法により、２型糖尿病の発症の予防もしくは治療に有用な物質を効率よくスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
本発明は、２型糖尿病の関連する遺伝子の発現量の調節する物質に関する。２型糖尿病に関連する遺伝子として、カルパイン１０（Calpain-10）、PPARγ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ）、ATP-sensitive K+ channel Kir6.2、insulin receptor substrate-1、IPF-1、adiponectin PGC-1、SUR1、UCP1、UCP2、PCK1 (phosphoenolpyruvate carboxykinase gene、glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase 2 (GFPT2)、proximal promoter region of the adiponectin (APM1)、Alpha-endosulfine、Protein kinase C/zeta (PRKCZ)、cyclooxygenase-2 gene (PTGS2)、
resistin、fatty acid-binding protein-3 (FABP3)、retinoid-related orphan receptor gamma (RORC)、platelet- surface integrin GPIIb-IIIa、insulin-degrading enzyme、C-reactive protein (CRP)、Lim domain homeobox gene (Isl-1)、Adenylate cyclase activating polypeptide 1 (ADCYAP1)、insulin receptor gene、Vitamin D receptor、KCNJ9、dopamine D2 receptor、FOXC2などが知られているがこれに限定されるものではない。２型糖尿病 患者の多くは、遺伝的な要因に、環境因子（肥満、運動不足、脂肪の多い食生活など）が加わって発症すると考えられている。すなわち、これら遺伝子産物の量の違いや多型による変化した性質およびその量の違いと、環境因子が２型糖尿病の発症に関わっていると考えられる。このような遺伝子産物の違いをその遺伝子の発現量として調節する事で、２型糖尿病をあらかじめ予防または治療することが可能である。
【００５５】
発現量の調節とは、遺伝子から作られる遺伝子産物の作成量の調節を意味し、遺伝子産物であるタンパク質および、タンパク質を作成するmRNAの作成量の調節を含む。具体的には、DNAから転写されるmRNAの転写量の調節を指す。
また、発現量の調節とは、通常発現されている量を増加もしくは減少させることを指す。
【００５６】
発現量を調節する遺伝子としては、２型糖尿病に関する遺伝子であれば特に限定されないが、好ましくはレジスチン遺伝子である。レジスチン遺伝子は、その遺伝子産物であるレジスチンが、脂肪細胞から分泌されるホルモンの１種であり、マウスにおいて、高脂肪食誘導性や遺伝性の肥満によって増加する事が知られている物質をコードする遺伝子である。また、高脂肪食誘導性の肥満マウスに抗レジスチン抗体を投与すると、血糖値およびインスリンの効果が改善される。さらに、組換え型レジスチンを正常マウスに投与すると、グルコース耐性およびインスリンの効果が損なわれる。インスリンに促進される脂肪細胞のグルコース取込みは、レジスチンの中和によって増進し、レジスチンの投与によって減退する。したがって、レジスチンは肥満を糖尿病に結びつける可能性のあるホルモンである。
【００５７】
転写調節領域とは、遺伝子シグナル配列の5'上流領域に多く存在する（第一イントロンに存在するものもある）配列であり、RNAポリメラーゼが遺伝子からRNAを転写する時に、その転写を制御する配列であり、転写効率等を左右しているものである。
【００５８】
転写調節因子とは、転写調節領域もしくは転写制御部位のＤＮＡに結合し、遺伝子の転写を制御する因子であり、Sp1、SP2、Sp3、C/EBP、CTCF、NF-κB、USF、Ets、Stat3、NF-1、AP1、AP2、GATA、YY1、Oct-1、E2F1、NF-E2、NF-Y、ZHXなどが知られているがこれに限定されるものではない。
【００５９】
本発明におけるレジスチン遺伝子の発現量の増加とは、増加を示せるものであれば特に限定はされないが、好ましくは遺伝子産物であるタンパク質および、タンパク質を作成するmRNA増加量を指し、通常発現している量が増加することを指し、その増加量は限定されないが、mRNAの増加量としては、1.1倍〜1000倍、好ましくは1.1倍〜100倍、より好ましくは1.1倍〜10倍が望ましい。また遺伝子産物の増加量としては、1.1倍〜50倍、好ましくは1.1倍〜10倍、より好ましくは1.1倍〜5倍が望ましい。
【００６０】
また、増加を抑制または阻止とは、上記における増加を抑制、阻止することであり、増加量を７０％以下、さらには５０％以下、特には３０％以下にできることが好ましく、最も好ましくは増加量が０％（通常発現している量と同じ）か通常発現している量を下回るものである。
【００６１】
本明細書でいう多型とは、同一集団上において、ある遺伝子座にある対立遺伝子が二種類以上存在し、その頻度が１％以上ある状態をいい、一塩基多型（ＳＮＰ）、制限酵素切断断片長多型 （ＲＦＬＰ）、タンデムリピート多型 、マイクロサテライト多型 、挿入／欠失型多型 などを含む。
【００６２】
本発明における多型は、２型糖尿病 に罹りやすい体質を付与する原因遺伝子の一つである。したがって、このような多型を有するか否かを調べるためのプローブ、プライマー及びキットは、２型糖尿病に罹る可能性の高いグループ及び２型糖尿病 の近縁者への遺伝を調べる遺伝子診断に用いることが可能である。
【００６３】
さらにレジスチン遺伝子の発現量すなわち血清レジスチン濃度を測定することで、２型糖尿病の予防又は治療の必要性を判断することができる。
【００６４】
本発明においては、ヒトレジスチン遺伝子に存在する多型を指し、好ましくは転写調節領域における多型を指す。具体的には、-1093A>G、-1082C>T、-821G>A、 -638G>A、-537A>C、-420C>G、-358G>Aを指す。
【００６５】
本発明におけるレジスチン遺伝子の転写調節領域の多型を含むDNA配列に結合し発現量を増加させる物質としては、転写因子があげられ、前に示す転写調節因子を指す。好ましくはSp1およびまたはSp3である。
【００６６】
２型糖尿病 に関連する多型を同定する方法としては、特に限定されない。多型配列の検出方法としては、たとえばサンガー法、パイロシーケンシングなどにより塩基配列を直接決定してもよいが、サザンブロッティング、ＰＣＲ、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、インベーダーアッセイ、ＴａｑＭａｎＰＣＲ、ＳｉｎＰｅｒ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法、質量分析、ＲＣＡ法、ＤＮＡチップ、ＡＲＭＳ、ＢＡＭＰＥＲ、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＯ、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ、アレル特異的ＰＣＲのように配列を決定することなく間接的に検出してもよい。
また、本発明で言う「同定」とは、目的とする配列を直接的に同定する場合のみならず、目的とする配列と相補的な配列を検出することによる間接的な同定をも含む広い意味で、「同定」という用語を用いることとする。
【００６７】
本発明のキットは、ヒトレジスチン遺伝子の転写調節領域に存在する２型糖尿病に関連する多型を含むDNA配列を特異的にハイブリダイゼーションできるプローブ、またはそのような多型を含むDNA配列を増幅できるプライマーを含む。キットに含まれる試薬としては、塩基の置換を検出できる方法により適宜変更可能である。たとえば、相補鎖を合成するタイプの多型配列の検出方法であれば、ｄｄＮＴＰ、ｄＮＴＰ、ＤＮＡ合成酵素、緩衝液などを含み、ＲＦＬＰのように制限酵素の切断に基づき検出する場合には適当な制限酵素を含む。
【００６８】
なお、本発明の２型糖尿病の多型同定キットにより、早期に２型糖尿病の予防または治療を必要とするか否かを判定するのに有効である。
【００６９】
本発明により多型配列の有無を同定されるＤＮＡは、ヒトの毛髪、血液、体液、唾液、培養細胞、切除された組織などから得ることができ、特に限定されない。
【００７０】
本発明における２型糖尿病に関する、遺伝子発現量の調節を阻害する物質とは、遺伝子の発現量を増加もしくは減少の調節を阻害すれば何でもよく、タンパク質、抗体、遺伝子、DNA、RNAもしくはこれらの修飾体、低分子化合物、有機化合物などが考えられるが、それに限定されない。
【００７１】
レジスチン遺伝子の転写調節領域の多型を含むDNA配列に結合して発現量を増加させる物質による発現量の増加を抑制または阻止する物質とは、発現量の増加を抑制または阻止すれば何でもよく、タンパク質、抗体、遺伝子、DNA、RNAもしくはこれらの修飾体、低分子化合物、有機化合物などが考えられるが、それに限定されない。好ましくは、Sp1およびまたはSp3の結合を阻害する物質で、Sp1およびまたはSp3に結合することで、多型を含むDNA配列への結合を阻害する物質、多型を含む配列DNA配列に特異的に結合し、Sp1およびまたはSp3の同配列への結合を阻害する物質、転写調節活性を変化させる物質またはSp1およびまたはSp3と相互作用する蛋白に影響する物質を指す。
具体的な例としては、文献（Diabetes 53: 1222-1229, 2004）に記載されているPPARg ligand等が挙げられる。
【００７２】
遺伝子発現量の測定は、当業者に公知の方法により行なうことができる（例えば「新遺伝子工学ハンドブック」改定第３版、松村正實、山本雅編集、１９９９年９月１０日、羊土社を参照）。例えば、ノザンブロット法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ルシフェラーゼアッセイ等を用いることができるがこれらに限定されない。
【００７３】
また、本発明のスクリーニング方法は、２型糖尿病が、レジスチン遺伝子の転写領域のＤＮＡ（多型部）に転写調節印紙（Sp1，Sp3等）が結合し、その結果としてレジスチンの発現流尾が増えて引き起こされるという知見から、これら一連の関係を分断する物質であれば２型糖尿病の予防または治療剤となることを利用している。
【００７４】
スクリーニングを行う際に試験物質を添加する系は、レジスチン遺伝子の発現を測定する系、レジスチン遺伝子の転写調整領域と該転写調整領域に結合してレジスチン遺伝子の発現を調整する転写調整因子との結合を測定する系、試験物質がレジスチン遺伝子の転写調整領域と結合するか否かを測定できる系、試験物質が、転写調整領域に結合してレジスチン遺伝子の発現を調整する転写調整因子と結合するか否かを測定できる系に試験物質を含有させて行う。
【００７５】
これらの系は、ＳＬ２等の細胞組織、大腸菌、酵母菌などの微生物内、無細胞でのインビトロ系、ヒトなどの生体内でのインビボ系でも良く、特に限定されない。レジスチン遺伝子はヒトの遺伝子であることが最も好ましいが、マウス、ラット、ブタ、イヌなどヒトに近く、発現系がヒトとほぼ同じと考えられるものであれば限定されるものではなく、これら動物でのインビボ系であっても良い。
言うまでもないが、インビトロ系は初期の一時スクリーニングを行うのに適している。
また、これらの系での発現、結合などの有無の測定は系にあった測定法を採用すれば良い。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【００７７】
参考例１
本発明を完成するにあたり、本発明者等は、愛媛大学医学部付属病院および愛媛県立病院の日本人糖尿病患者200名（パネル１）、197名（パネル2）およびコントロールとして、75g糖負荷試験正常もしくはHbA1cが5.6以下かつ空腹時血漿グルコースレベルが110mg/dl以下で糖尿病罹患歴及び家族歴のない人、200名（パネル１）、206名（パネル２）と、千葉県の糖尿病患者149名（パネル３）およびコントロール158名（パネル３）から得られたサンプルを用いた。表１に臨床所見を示す。
なお、糖尿病の診断は、American Diabetes Association criteria(The expert committee on diagnosis and classification of diabetes mellitus 2003)を用いた。
【００７８】
【表１】
2006062974.tif 000002
【００７９】
実施例１：レジスチン遺伝子の転写調節領域に含まれるＳＮＰの検出
レジスチン遺伝子 を含むゲノム領域のＤＮＡ配列については、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５２：５６２−５６７（２００３）に記載されている方法に従って配列を決定した。以下に簡単に説明する。
ＧｅｎＢａｎｋの情報に基づき（アクセッション番号ＮＴ＿０７７８１２）、ＰＣＲプライマーをデザインし、ゲノムＤＮＡの断片を増幅した後、ダイレクトシークエンス法によりレジスチン遺伝子の５‘上流域のＳＮＰの同定を行った。用いたプライマーは、配列番号１〜5に示されるとおりである。
【００８０】
（１）遺伝子断片増幅用プライマーの合成
配列番号1〜5に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ1〜６）をDNA合成受託会社（（株）Invitrogen等）に依頼した。
【００８１】
（２）ＰＣＲ法によるヒトレジスチン遺伝子断片の増幅
表１のＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトレジスチン遺伝子断片を増幅した。
試薬：以下の試薬を含む２５μl溶液を調製した。
プライマー１                              ５ｐｍｏｌ
プライマー２                              ５ｐｍｏｌ
×１０緩衝液（宝酒造社製）                ２．５μl
ｄＮＴＰ                                    ５nmol
Taq  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）      ０．６２５Ｕ
抽出ＤＮＡ溶液                              ５０ｎｇ
増幅条件
９４℃・３分
９４℃・３０秒、５５℃・３０秒、７２℃・６０秒（３５サイクル）
７２℃・３分
【００８２】
（３）レジスチン遺伝子のシークエンシング
ＰＣＲ増幅産物をミリポア社製のマルチスクリーンＰＣＲフィルターを用いて精製した後、ＡＢＩ社製のジデオキシターミネーターサイクルシークエンシングキットを用いてシークエンス反応を行った。反応条件はキット添付の取扱説明書の方法に従った。以下に簡単に説明する。
【００８３】
試薬：以下の試薬を含む１０μl溶液を調製した。
プライマー1,3,4または5                  １．６ｐｍｏｌ
Terminator Ready reagent mix（ABI社製）  ２μl
【００８４】
反応条件
９６℃・１分
９６℃・１０秒、５０℃・５秒、６０℃・４分（２５サイクル）
【００８５】
反応液を、アマシャム社製のＧ−５０ゲル濾過カラムにて精製した後、ＡＢＩ社製Gene Analyzer 3100 sysytemを用いて配列を決定した。
【００８６】
（４）レジスチン遺伝子の転写調節領域の多型と２型糖尿病との関連解析
関連性、頻度及びハーディ・ワインバーグ平衡を決定するための統計的手法より行った。
【００８７】
表１のパネル１のサンプルを用いた結果、-1093A>G、-1082C>T、-821G>A、-638G>A、-537A>C、-420C>G、-358G>Aの７カ所に多型を検出した。各多型の糖尿病群と対照群においての出現頻度をχ2検定で検討した結果、-420C>Gが２型糖尿病と密接に関連していることが分かった（表２）。更に表１のパネル２及び３のサンプルにおいて、-420C>Gの多型頻度を解析した結果、-420位の遺伝子型がGGの群とCG+CCの群を比較して、GGの群で優位に２型糖尿病との関連が認められた（表３）。
【００８８】
【表２】
2006062974.tif 000003
【００８９】
【表３】
2006062974.tif 000004
【００９０】
実施例２：レジスチンの血清濃度測定
血清レジスチン濃度は、ヒトレジスチンELISAキット(LINCO Reserch Inc.)を用いて行った。測定はキットに添付されている取扱説明書に従って行った。以下に簡単に説明する。
（１）サンプル血清の希釈
表１、パネル１または２の93人の糖尿病患者から得られた血清を測定bufferで10倍に希釈した。
（２）マイクロプレートの洗浄
キットに付属しているマイクロプレートに、300μlの洗浄液を入れ、室温に5分放置後、洗浄液を捨てた。
（３）サンプルの添加
（２）で洗浄したマイクロプレートに、測定bufferを60μl入れた後、標準血清1及び２、検量線用スタンダード及び（１）で希釈したサンプル20μlをn=2で各ウエルに入れ、
マイクロプレートシェーカーで400-500rpmで混合しながら、室温で1.5時間放置。
（４）洗浄
（３）で添加したサンプルを捨て、300μlの洗浄液で３回洗浄。
（５）検出抗体
80μlの検出抗体溶液を各ウエルに入れ、マイクロプレートシェーカーで400-500rpmで混合しながら、室温で1時間放置。
（６）洗浄
（５）で添加した標識液を捨て、300μlの洗浄液で３回洗浄。
（７）酵素標識
80μlの酵素標識溶液を各ウエルに入れ、マイクロプレートシェーカーで400-500rpmで混合しながら、室温で0.5時間放置。
（８）洗浄
（７）で添加した酵素標識溶液を捨て、300μlの洗浄液で３回洗浄。
（９）発色
80μlの発色を各ウエルに入れ、マイクロプレートシェーカーで400-500rpmで混合しながら、室温で8-10分放置。
（８）停止
80μlの停止液を入れ、軽く混合した後、450nmと590nmの吸光度を測定し、検量線をを求め、サンプルのレジスチン濃度を算出した。
【００９１】
その結果、-420C位の遺伝子型がCCの群、CGの群、GGの群の順に増加し、その量はCCの群と比較して優位に多かった（図１）。特に、GG群では20ng/を越え、CG群でも18ng/mlを越えており、この濃度が２型糖尿病の罹患の尺度となると考えることができる。
【００９２】
実施例３：-420多型部位への転写調節因子の結合
-420多型部位への転写因子の結合性は、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３２４：９１７−９２５（１９９７）に記載されている方法に従って、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)により検証した。以下に簡単に説明する。
（１）核抽出液の調整
分化した3T3-L1 adipocyteをbuffer A（5 mM Hepes/KOH, pH 7.8、 60 mM KCl、 15 mM NaCl、14 mM 2-メルカプトエタノール、 0.15 mM スペルミン、0.5 mM スペルミジン、1 mM PMSF 、0.2% ノニデット P40、0.3 M シュークロース）中でガラスホモジナイザーによりホモジナイズし、0.9Mシュークロース入りのbuffer Aの上に重層し、2500gで10分間、４℃で遠心分離した。核の沈殿を0.3Mシュークロース入りbuffer Aに懸濁し、0.9Mシュークロース入りのbuffer Aの上に重層し、同様に遠心分離した。沈殿をbuffer Aに懸濁し、2500gで10分間、４℃で遠心分離した。得られた沈殿を５倍量のbuffer B(20 mM Hepes/NaOH, pH 7.9, 420 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM ジチオスレイトール, 1 mM PMSF and 10% グリセロール)に懸濁し、氷上スターラーでゆっくり回しながら45分懸濁し、2700gで15分間、４℃で遠心分離した。上澄みに1/100量の10%ノニデットP40溶液を添加し、氷上スターラーでゆっくり回しながら10分懸濁し、2700gで5分間、４℃で遠心分離した。上澄みを、50倍量の0.1MKClを含むbuffer C(25 mM Tris/HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 0.1% ノニデット P40, 1 mM ジチオスレイトール、 10% グリセロール)で２時間透析を２回繰り返した。透析した液を2700gで1分間、４℃で遠心分離した。上澄みを核抽出液とした。
【００９３】
（２）EMSA
レジスチン遺伝子の-434/-406の領域を制限酵素KpnＩとBgl IIで切り出し、放射性同位元素32Ｐで標識した。（１）で得られた核抽出液と標識核酸を30分間、１μgのポリ(dA-dT)入りのbufferCで反応させたのち、PAGE (6% gel)で 45 mM Tris/45 mM ホウ酸/1 mM EDTA 中で200 V、60分電気泳動した後、乾燥して、Kodak XAR フィルムに感光した。
【００９４】
図２
CCタイプサンプルから調整した-420Cを含むDNA配列のプローブとGGサンプルから調整した-420Gを含むDNA配列のプローブを32Pで標識し、核抽出液と反応させた。このとき競合物として、-420Cプローブの方には非標識の-420Cプローブを200倍量、-420Gプローブの方には非標識の-420Gプローブを200倍量添加して行った。その結果、標識した-420Gプローブに競合プローブを入れない時にのみDNAと核内物質の複合体を認めた。これにより、-420Gに特異的に結合する物質が、核抽出液中に存在することが示唆された。
【００９５】
図３．
32P標識した-420Gプローブと核抽出液との反応系に、非標識の各種転写因子の結合するDNA配列を200倍量加え、競合を検討した。この結果、SP転写調節因子のみが-420G配列と反応した。すなわち、-420Gプローブに結合する蛋白はSP転写因子結合配列にも結合することが確認された。
【００９６】
図４
32P標識した-420Gプローブと核抽出液との反応系に、抗GST抗体、抗Sp1抗体あるいは抗Sp3抗体を作用させた。この結果-420Gプローブに核内物質が結合しゲルシフトを起こし（矢印A）、更にその複合体にSp1あるいはSp3の抗体が結合した場合、更にゲルシフト（矢印Ｓ）が起こっているのが認められた。これにより、-420Gに結合している核内物質がSp1及びまたはSp3であることが確認された。
【００９７】
実施例４：-420多型部位へのSp1またはSp3の結合による転写活性の上昇
-420多型部位へのSp1またはSp3結合による転写活性の上昇は、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１３０（６）：８８５−８９１（２００１）に記載されている方法に従って、ルシフェラーゼリポーターアッセイにより検証した。以下に簡単に説明する。
レジスチン遺伝子の-450/-206の領域を-420部位がCCのサンプルとGGのサンプルから別々にPCＲで増幅し、pGL3-Basicベクター(Promega)のKpnＩ／Bgl IIサイトに結合させたリポータープラスミドを調整した。
1×106個のシュナイダー  ライン２(SL2)細胞を、60mmの培養皿に培養し、24時間後に、２μgの-420部位を挿入したルシフェラーゼリポータープラスミドと、１００ｎｇのbeta-galactosidase 発現ベクターならびにSp1またはSp3発現プラスミドを燐酸カルシウム法により導入した。更に48時間培養の後、細胞を集めて、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００９８】
その結果、-420部位がCのプラスミドを導入した群より、Gのプラスミドを導入した群の方が有意（p<0.05）にSp1 および Sp3 によりルシフェラーゼ活性が上昇していた（図５）
この結果より、-420部位がGである場合に特異的に転写調節因子（Sp1またはSp3）が結合して転写活性が上昇することが認められた。特にルシフェラーゼが２倍以上、特には３倍以上認められ、Sp３では５倍以上の活性上昇であった。これらの倍率は転写活性が向上した指標として採用することができる。
【００９９】
上述したように、本発明は２型糖尿病に関する遺伝子の発現量を調節する物質およびその物質の作用を阻害する物質である。例えば２型糖尿病に関与するとされている、レジスチン遺伝子の転写調節領域の多型を含むDNA配列に結合して、レジスチン遺伝子の発現量を上昇させる物質である。またその上昇を抑制または阻止する物質であり、この物質を用いることで、２型糖尿病の発症の予防もしくは治療に有用な物質である。またこのような機能を有する多型を同定することは、２型糖尿病の予防もしくは治療の必要性の判定に有用である。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
以上の本発明者の実験により、２型糖尿病に関する遺伝子の発現量を調節する物質およびその物質の作用を阻害する物質、例えば２型糖尿病に関与するとされている、レジスチン遺伝子のプロモ−ターの多型配列に結合して、レジスチン遺伝子の発現量を上昇させる物質でありその上昇を抑制または阻止する物質であり、この物質を用いることで、２型糖尿病の発症の予防もしくは治療を行うことができる。
【０１０１】
またこの多型を調べることが２型糖尿病の予防もしくは治療の必要性の判定に有用であることが示された。したがって、本発明によれば、２型糖尿病患者の早期発見と、２型糖尿病に罹患する可能性の高い人を従来の報告にない高い頻度で検出することができる。本発明の多型配列を同定することによって、糖尿病発症前に２型糖尿病に罹患する可能性の高いグループを検出することができ、糖尿病発症前に予防または早期の治療を行うことができる。さらに、他の糖尿病との関連が示唆されている遺伝子の多型の検出と組み合わせることにより、２型糖尿病に罹る可能性がより高い人をより高い精度で検出することができる。本発明のキットまたは方法を用いて、たとえ糖尿病の発症が確認される前であっても、希望により本発明の多型を有しているかどうかを調べ、２型糖尿病に罹患しやすい形質が遺伝しているかどうかを推定できる点で有益である。
【０１０２】
本発明により、レジスチン遺伝子の転写調節領域の-420C>GのG/G遺伝子型が、２型糖尿病に関連していることが初めて示された。さらに、この転写調節領域の-420Gを含む配列に特異的に転写因子が結合してレジスチン遺伝子の発現量が上昇していることが示された。このことは、本多型が疾患発症に深く関わっていること表している。
この結果によれば、レジスチン遺伝子自体、またはその上流又は下流で機能する遺伝子 、あるいはレジスチン遺伝子の転写調節に関わる因子が２型糖尿病の病因に関与するものと考えられる。さらには、レジスチン遺伝子の発現量を測定することにより２型糖尿病の予備的な診断が行なえることが示唆された。また、レジスチン遺伝子の発現を抑制することにより２型糖尿病の改善が図れることが予測される。
このように、レジスチン遺伝子は、２型糖尿病の治療または予防のための有望なターゲットとなりうるものである。したがって既に２型糖尿病と診断されている患者においても本発明の治療剤を用いることで、その治療に役立てることが可能である。
また、本発明のスクリーニング方法を採用することにより、効率よく２型糖尿病の予防薬または治療薬の有効成分をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】実施例２で測定した血中レジスチン濃度の結果を示す。
【図２】実施例3で測定した多型配列と転写調節因子との結合性の結果を示す。
【図３】実施例3で測定した多型配列と転写調節因子との結合性の結果を示す。
【図４】実施例3で測定した多型配列と転写調節因子との結合性の結果を示す。
【図５】実施例4で測定した多型配列の転写活性測定の結果を示す。
【図１】
2006062974.tif 000005
【図５】
2006062974.tif 000006
【図２】
2006062974.tif 000007
【図３】
2006062974.tif 000008
【図４】
2006062974.tif 000009
【配列表】
2006062974000001.app