(57)【要約】【課題】リアルタイム核酸増幅データから初期核酸濃度を定量化する方法を提供する。【解決手段】生物またはウイルスなどから抽出した核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を酵素を利用して増幅した後、背景蛍光信号を除外した最大蛍光信号の強度の半分に該当する増幅サイクル数または増幅時間と、最大増幅効率に該当する増幅サイクル数または増幅時間と、背景蛍光信号を除外した核酸の増幅前蛍光信号の強度とを算出して核酸の初期濃度を求める。これにより、微分／積分方法を使用せずとも核酸の初期濃度を求めることができる。【選択図】図１
2006068011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）核酸を増幅するステップと、
（ｂ）前記核酸の増幅サイクル数または増幅時間によってリアルタイムに表れる前記核酸の増幅量による蛍光信号間の相関関係を表す関数を生成するステップと、
（ｃ）前記関数を利用し、前記核酸の背景蛍光信号を除外した前記核酸の蛍光信号の最大値の半分に該当する増幅サイクル数または増幅時間を算出するステップと、
（ｄ）前記算出した増幅サイクル数または増幅時間から前記核酸の初期濃度を求めるステップと、を含むことを特徴とする初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項２】
前記（ａ）ステップは、
酵素を利用し、前記核酸を増幅するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項３】
前記（ａ）ステップは、
熱的サイクルを必要とする核酸増幅法により前記核酸を増幅するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項４】
前記（ａ）ステップは、
等温核酸増幅法により前記核酸を増幅するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項５】
前記（ｂ）ステップは、
前記相関関係をシグモイドモデルを利用し、関数で表すステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項６】
前記（ｃ）ステップは、
前記シグモイドモデルを利用した関数について、非線形最小二乗フィッティングを使用し、前記関数から前記核酸の背景蛍光信号を除外した前記核酸の蛍光信号の最大値の半分に該当する増幅サイクル数または増幅時間を算出するステップを含むことを特徴とする請求項５に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項７】
前記（ｄ）ステップは、
前記核酸の背景蛍光信号を除外した前記核酸の蛍光信号の最大値の半分に該当する増幅サイクル数または増幅時間と核酸の初期濃度との関係を表す補正曲線を利用し、前記（ｃ）ステップで算出した増幅サイクル数または増幅時間から前記核酸の初期濃度を求めるステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項８】
（ａ）核酸を増幅するステップと、
（ｂ）前記核酸の増幅サイクル数または増幅時間によってリアルタイムに表れる前記核酸の増幅量による蛍光信号の強度との相関関係を表す関数を生成するステップと、
（ｃ）前記関数を利用し、前記核酸の背景蛍光信号を除外した前記核酸の増幅前蛍光信号の強度を算出するステップと、
（ｄ）前記算出した増幅前蛍光信号の強度から前記核酸の初期濃度を求めるステップと、を含むことを特徴とする初期の核酸濃度を定量化する方法。
【請求項９】
前記（ａ）ステップは、
酵素を利用し、前記核酸を増幅するステップを含むことを特徴とする請求項８に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項１０】
前記（ａ）ステップは、
熱的サイクルを必要とする核酸増幅法により前記核酸を増幅するステップを含むことを特徴とする請求項８に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項１１】
前記（ａ）ステップは、
等温核酸増幅法により前記核酸を増幅するステップを含むことを特徴とする請求項８に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項１２】
前記（ｂ）ステップは、
前記相関関係をシグモイドモデルを利用し、関数で表すステップを含むことを特徴とする請求項８に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項１３】
前記（ｃ）ステップは、
前記シグモイドモデルを利用した関数について、非線形最小二乗フィッティングを使用し、前記関数から前記核酸の背景蛍光信号を除外した前記核酸の増幅前蛍光信号の強度を算出するステップを含むことを特徴とする請求項１２に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項１４】
前記（ｄ）ステップは、
前記核酸の背景蛍光信号を除外した前記核酸の増幅前蛍光信号の強度と核酸の初期濃度との関係を表す補正曲線を利用し、前記（ｃ）ステップで算出した核酸サンプルの初期蛍光信号の強度から前記核酸の初期濃度を求めるステップを含むことを特徴とする請求項８に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項１５】
（ａ）核酸を増幅するステップと、
（ｂ）前記核酸の増幅サイクル数または増幅時間によってリアルタイムに表れる前記増幅サイクルまたは増幅時間の間の増幅効率を表す関数を生成するステップと、
（ｃ）前記関数を利用し、前記増幅効率の最大値に該当する増幅サイクル数または増幅時間を算出するステップと、
（ｄ）前記算出した増幅サイクル数または増幅時間から前記核酸の初期濃度を求めるステップと、を含むことを特徴とする初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項１６】
前記（ａ）ステップは、
酵素を利用し、前記核酸を増幅するステップを含むことを特徴とする請求項１５に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項１７】
前記（ａ）ステップは、
熱的サイクルを必要とする核酸増幅法により前記核酸を増幅するステップを含むことを特徴とする請求項１５に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項１８】
前記（ａ）ステップは、
等温核酸増幅法により前記核酸を増幅するステップを含むことを特徴とする請求項１５に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項１９】
前記（ｂ）ステップの増幅効率を表す関数は、次の数式であることを特徴とする請求項１５に記載の初期核酸濃度を定量化する方法：
【数１】
2006068011.tif 000019
ここで、Ｒｎは、ｎ番目の増幅サイクルでの蛍光信号の強度、Ｒｎ−１は、（ｎ−１）番目の増幅サイクルでの蛍光信号の強度、Ｅｎは、ｎ番目の増幅サイクルでの増幅効率を表す。
【請求項２０】
前記（ｂ）ステップの増幅効率を表す関数は、次の数式であることを特徴とする請求項１５に記載の初期核酸濃度を定量化する方法：
【数２】
2006068011.tif 000020
ここで、Ｒｎは、ｎ番目の増幅サイクルでの蛍光信号の強度、Ｒｎ−１は、（ｎ−１）番目の増幅サイクルでの蛍光信号の強度、Ｒｂは、０でない定数、Ｅｎは、ｎ番目の増幅サイクルでの増幅効率を表す。
【請求項２１】
前記Ｒｂは、初期蛍光信号の強度に該当する値であることを特徴とする請求項２０に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項２２】
前記Ｒｂは、最初の増幅サイクルでの蛍光信号の強度（Ｒ１）であることを特徴とする請求項２０に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項２３】
前記Ｒｂは、前記核酸の増幅サイクル数または増幅時間によってリアルタイムに表れる前記核酸の増幅量による蛍光信号間の相関関係を表す関数から求めた前記核酸の背景蛍光信号の強度であることを特徴とする請求項２０に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項２４】
前記Ｒｂは、−（Ｒｂ）ｓｉｇｍｏｉｄａｌであり、これはシグモイドモデルに対する全ての増幅サイクルでの核酸の蛍光強度の最小二乗フィッティングによるものであることを特徴とする請求項２３に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項２５】
前記Ｒｂは、前記増幅効率の最大値（Ｅｎ）を１にする値であることを特徴とする請求項２０に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項２６】
前記（ｃ）ステップは、
前記関数からカーブフィッティングを利用し、前記最大増幅効率に該当する増幅サイクル数または増幅時間を算出するステップを含むことを特徴とする請求項１５に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項２７】
前記カーブフィッティングは、
ｎ次多項式（ｎは、２以上の整数）を使用することを特徴とする請求項２６に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項２８】
前記カーブフィッティングは、
サイン関数やコサイン関数を使用することを特徴とする請求項２６に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項２９】
前記カーブフィッティングは、
ガウス分布関数を使用することを特徴とする請求項２６に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項３０】
前記カーブフィッティングは、
三次スプライン補間法を使用することを特徴とする請求項２６に記載の初期核酸濃度を定量化する方法。
【請求項３１】
前記（ｄ）ステップは、
最大増幅効率に該当する増幅サイクル数または増幅時間と核酸の初期濃度との関係を表す補正曲線を利用し、前記（ｃ）ステップで算出した増幅サイクル数または増幅時間から前記核酸の初期濃度を求めるステップを含むことを特徴とする請求項１５に記載の初期の核酸濃度を定量化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸の初期濃度を求める方法に係り、さらに詳細には核酸増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ−Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）など）を使用して得たリアルタイム核酸増幅データから核酸の初期濃度を求める方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を検出して定量化するための多様な分析法のうち、ＰＣＲは、最も広く使われる方法であって、特許文献１及び特許文献２にその原理が開示されている。
【０００３】
既存のＰＣＲは、単に終末点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）でゲル電気泳動（ＡｇａｒｏｓｅＧｅｌ）を利用して増幅されたＤＮＡの定性的な結果だけを示すものであり、ＤＮＡの定量的な検出の正確性などに多くの問題点を有していた。かかる問題点を解決するために、光学的検出システムを利用して増幅されたＤＮＡの濃度に比例する蛍光信号の強度をリアルタイムで検出することにより、ＤＮＡの定量分析を可能にするリアルタイムＰＣＲが開発された。
【０００４】
核酸増幅データから核酸の初期濃度を定量化する従来の方法として、特許文献３及び特許文献４がある。ここでは、核酸を増幅して増幅の各サイクルでの核酸増幅量を表す関数を求めた後、その関数をｎ次微分し、その結果から核酸の初期濃度を求める方法を提供する。前記特許文献３は、微分の最大値をＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）とする定量分析法、前記特許文献４は、微分の最大値、最小値、ゼロ値をＣｔとする定量分析法を開示する。
【０００５】
また、核酸増幅データから核酸の初期濃度を定量化する従来の他の方法として、特許文献５がある。ここでは、微分の特定値を利用して核酸の濃度を定量化する方法を提供する。
【特許文献１】米国特許第４６８３１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４６８３２０２号明細書
【特許文献３】米国特許第６３０３３０５号明細書
【特許文献４】米国特許第６５０３７２０号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００２−００３１７６８号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明がなそうとする技術的課題は、リアルタイム核酸増幅データから核酸の初期濃度を微分／積分を使用せずに定量化する方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の技術的課題を達成するための、本発明による初期核酸濃度を定量化する方法の一実施例は、（ａ）核酸を増幅するステップと、（ｂ）前記核酸の増幅サイクル数または増幅時間によってリアルタイムに表れる前記核酸の増幅量による蛍光信号との相関関係を表す関数を生成するステップと、（ｃ）前記関数を利用し、前記核酸の背景蛍光信号を除外した前記核酸の蛍光信号の最大値の半分に該当する増幅サイクル数または増幅時間を算出するステップと、（ｄ）前記算出した増幅サイクル数または増幅時間から前記核酸の初期濃度を求めるステップと、を含む。
【０００８】
上記の技術的課題を達成するための、本発明による初期核酸濃度を定量化する方法の他の実施例は、（ａ）核酸を増幅するステップと、（ｂ）前記核酸の増幅サイクル数または増幅時間によってリアルタイムに表れる前記核酸の増幅量による蛍光信号の強度との相関関係を表す関数を生成するステップと、（ｃ）前記関数を利用し、前記核酸の背景蛍光信号を除外した前記核酸の増幅前蛍光信号の強度を算出するステップと、（ｄ）前記算出した増幅前蛍光信号の強度から前記核酸の初期濃度を求めるステップと、を含む。
【０００９】
上記の技術的課題を達成するための、本発明による初期核酸濃度を定量化する方法のさらに他の実施例は、（ａ）核酸を増幅するステップと、（ｂ）前記核酸の増幅サイクル数または増幅時間によってリアルタイムに表れる前記増幅サイクルまたは増幅時間の間の増幅効率を表す関数を生成するステップと、（ｃ）前記関数を利用し、前記増幅効率の最大値に該当する増幅サイクル数または増幅時間を算出するステップと、（ｄ）前記算出した増幅サイクル数または増幅時間から前記核酸の初期濃度を求めるステップと、を含む。
【００１０】
これにより、微分／積分を使用せずに核酸の初期濃度を定量化できる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、リアルタイム核酸増幅（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ−Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）など）データから核酸の初期濃度を求める方法において、核酸の増幅量と増幅サイクルとの間の相関関係についての数学的モデルを基に、微分／積分を使用せずに背景蛍光信号を除外した最大蛍光信号の強度の半分に該当する増幅サイクル数または増幅時間、最大増幅効率に該当する増幅サイクル数または増幅時間、背景蛍光信号を除外した核酸の増幅前蛍光信号の強度から、核酸の初期濃度を求めることができる。
【００１２】
特に、最大増幅効率を使用する場合、リアルタイム核酸増幅データからリアルタイムに増幅効率を求めることができるので、他の方法に比べて一層速く核酸の初期濃度を求めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、添付された図面を参照し、リアルタイム核酸増幅、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）データから初期核酸濃度を定量化する方法について詳細に説明する。
【００１４】
図１は、核酸の増幅量による蛍光信号の強度と増幅サイクル数との相関関係をモデリングしたグラフである。
【００１５】
酵素を利用した核酸増幅は、ＰＣＲ、ポリメラーゼ逆転写連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ：Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの熱的サイクルを必要とする核酸増幅法によるか、またはＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ−Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの等温核酸増幅法によって行われる。ここで、核酸は、生物やウイルスなどから抽出可能である。
【００１６】
リアルタイムＰＣＲデータから核酸増幅量による蛍光信号の強度と増幅サイクル数とを測定して測定したデータを、図１に図示されたようなグラフにモデリング可能である。図１に図示されたシグモイドモデルは、次の数式１で表すことができる。
【００１７】
【数１】
2006068011.tif 000003
【００１８】
ここで、Ｒは、核酸の蛍光信号の強度、Ｒｂは、核酸蛍光信号の背景強度、Ｒｍａｘは、核酸の最大蛍光信号強度、ｎは、増幅サイクル数、ｎ１／２は、核酸蛍光信号強度の背景強度を除外した核酸蛍光信号強度の最大値の半分に該当する増幅サイクル数、ｋは、蛍光信号の増加に対する傾きを表す。
【００１９】
数学的モデルと実際のＰＣＲ実験データとの誤差は、数式２から求めることができる。
【００２０】
【数２】
2006068011.tif 000004
【００２１】
ここで、Ｒｎは、ｎ番目のサイクルで実際に実験で得た核酸の蛍光信号の強度である。
【００２２】
図１に図示された数学的モデルに対するそれぞれのパラメータ（Ｒｂ、Ｒｍａｘ、ｎ１／２、ｋ）値を求めるために、最小二乗フィッティング方法を使用すれば、数式３及び数式４（ａ）から数式４（ｄ）の非線形方程式を得るが、これをＮｅｗｔｏｎ−Ｒａｐｈｓｏｎ法で解く。
【００２３】
【数３】
2006068011.tif 000005
【００２４】
ここで、ε２は、数式２で定義されている。
【００２５】
【数４（ａ）】
2006068011.tif 000006
【００２６】
【数４（ｂ）】
2006068011.tif 000007
【００２７】
【数４（ｃ）】
2006068011.tif 000008
【００２８】
【数４（ｄ）】
2006068011.tif 000009
【００２９】
そして、核酸の背景蛍光信号Ｒｂを除外した前記核酸の増幅前蛍光信号の強度は、数式１でｎ＝０である場合であるから、数式５のように定義される。
【００３０】
【数５】
2006068011.tif 000010
【００３１】
図２Ａから図２Ｆは、図１に図示された数学的モデルと実際の実験結果とを図示したグラフである。
【００３２】
図２Ａは、初期核酸濃度が１０７ｃｏｐｙ／ｒｘｎ（反応溶液内のｃｏｐｙ数）である場合、図２Ｂは、１０６ｃｏｐｙ／ｒｘｎ、図２Ｃは、１０５ｃｏｐｙ／ｒｘｎ、図２Ｄは、１０４ｃｏｐｙ／ｒｘｎ、図２Ｅは、５×１０５ｃｏｐｙ／ｒｘｎ、そして、図２Ｆは、２．５×１０６ｃｏｐｙ／ｒｘｎの初期核酸濃度を有している場合である。核酸の初期濃度により、核酸が急激に増幅されるサイクル数がそれぞれ異なるということが分かる。
【００３３】
そして、核酸の増幅量による蛍光信号の強度と増幅サイクル数との相関関係の実験結果と、図１で求めた数学的モデルのグラフとがほとんど似ていることが分かる。
【００３４】
図３は、増幅効率と増幅サイクル数との関係を図示したグラフである。
【００３５】
図３は、ＰＣＲの増幅効率を図示した図面である。図３を参照すれば、ＰＣＲ過程で増幅効率が常に一定ではないことが分かる。この増幅効率を数学的モデルでモデリングすれば、次の数式６（ａ）及び数式６（ｂ）のようである。
【００３６】
【数６（ａ）】
2006068011.tif 000011
【００３７】
ここで、Ｒｎは、ｎ番目の増幅サイクルでの蛍光信号の強度、Ｒｎ−１は、（ｎ−１）番目の増幅サイクルでの蛍光信号の強度、Ｅｎは、ｎ番目の増幅サイクルでの増幅効率を表す。Ｅｎで数式６（ａ）をさらに整理すれば数式６（ｂ）のようである。
【００３８】
【数６（ｂ）】
2006068011.tif 000012
【００３９】
図４は、図３で増幅効率が最大であるときの増幅サイクル数を求める方法を説明するための図面である。
【００４０】
図４を参照すれば、曲線上の三ヵ所でのデータを知っている。このとき、ｙ軸の最大値に該当するｘ値を求めるために、放物線カーブフィッティングを使用する数学的方法は、次の通りである。
【００４１】
まず、３つの座標点（ｘ１，ｙ１）、（ｘ２，ｙ２）、（ｘ３，ｙ３）について、次の数式７（ａ）を立てる。
【００４２】
【数７（ａ）】
2006068011.tif 000013
【００４３】
数式７（ａ）をさらに行列で整理すれば、数式７（ｂ１）のようである。
【００４４】
【数７（ｂ１）】
2006068011.tif 000014
【００４５】
ここで、数式７（ｂ２）とすれば、定数ａ，ｂ，ｃは、次の通り求めることができる。
【００４６】
【数７（ｂ２）】
2006068011.tif 000015
【００４７】
【数７（ｃ）】
2006068011.tif 000016
【００４８】
次の数式７（ｄ）から、ｘｍａｘは次の通り求めることができる。
【００４９】
【数７（ｄ）】
2006068011.tif 000017
【００５０】
これまで、核酸の増幅量による蛍光信号の強度と増幅サイクル数との関係を数学的モデルを介して具現し、数学的モデルのそれぞれのパラメータを求める方法について述べた。以下で、数学的モデルの特定パラメータが核酸の初期濃度といかなる関連性があるか述べ、かかる関連性を基に核酸の初期濃度を定量化する方法について述べる。
【００５１】
図５は、図１の数学的モデルで、核酸の背景蛍光信号を除外した核酸の最大蛍光強度の半分に該当する増幅サイクル数（ｎ１／２）、及び図３の数学的モデルで、最大増幅効率（ｎＥｍａｘ）と核酸の初期濃度との関係を図示したグラフである。
【００５２】
図５を参照すれば、核酸の初期濃度（ｌｏｇ［ｃｏｐｙ／ｒｘｎ］）が高いほど、最大蛍光強度の半分に該当する増幅サイクル数（ｎ１／２）及び最大増幅効率（ｎＥｍａｘ）が低くなることが分かる。そして、従来の微分値を利用して初期核酸濃度を求める方法での傾き（図５の二次微分による補正曲線（ＣＴ））と、本発明で使用するｎ１／２及びｎＥｍａｘの傾きとがほとんど同一であることが分かる。ただし、ｎＥｍａｘがｎ１／２より下方に位置するので、ｎＥｍａｘを利用する場合、ｎ１／２よりさらに少ない増幅サイクル数で核酸の初期濃度を定量化できる。
【００５３】
図６は、図１の数学的モデルから得た数式５でのＲ０と初期核酸濃度との関係を図示したグラフである。図６を参照すれば、ｌｏｇ（初期核酸濃度）とｌｏｇ（Ｒ０）とが線形的な比例関係であることが分かる。
【００５４】
したがって、図５及び図６の線形的な比例関係を利用し、核酸の初期濃度を求めることができる３つの方法が提示される。第一に、核酸の背景蛍光信号を除外した核酸の最大蛍光強度の半分に該当する増幅サイクル数を利用する方法（ｎ１／２）、第二に、核酸増幅効率が最大になる増幅サイクル数または時間を利用する方法（ｎＥｍａｘ）、第三に、核酸の背蛍光信号強度を除外した増幅前核酸サンプルの蛍光信号の強度を利用する方法（Ｒ０）である。
【００５５】
以上の方法を利用し、初期濃度の分からない所定の核酸サンプルに対し、初期核酸濃度を定量化する方法は次の通りである。
【００５６】
まず、初期濃度を知っている所定の核酸標準サンプルに対し、核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＲＣＡ）を行い、図１または図３で提示した数学的モデルのそれぞれのパラメータを求め、そのパラメータを利用し、図５または図６に図示されたような比例関係を表すグラフ、すなわち補正曲線を求める。
【００５７】
そして、所定の核酸サンプルについても同じ核酸増幅法を行い、ｎ１／２、ｎＥｍａｘ、またはＲ０を求め、図５または図６のような補正曲線から核酸の初期濃度を求める。特に、ｎＥｍａｘを利用する場合は、非常に簡単な計算で核酸の初期濃度の定量化が可能であり、リアルタイムで増幅効率を求めて定量できるので、増幅サイクル数を減らすことができる。
【００５８】
図７Ａから図７Ｃは、本発明による核酸の初期濃度を求める方法と従来の結果とを図示した表である。
【００５９】
図７Ａは、図５及び図６に図示されたような線形グラフを得るために、初期値を知っている核酸に対するモデリング及びモデリングの各パラメータの算出値を示す（６回反復）。図７Ｂ及び図７Ｃは、図７Ａで求めた補正曲線を利用し、本発明による方法で核酸の初期濃度を求めた場合と、従来の微分により初期濃度を求めた場合とを比較した値を示す。図７Ｂ及び図７Ｃで分かるように、ｎ１／２、ｎＥｍａｘ、またはＲ０がＣｔの代わりに核酸の定量分析因子として使われうることが分かる。図７Ｂで、Ｅｒｒｏｒは、［（補正曲線から求めたｃｏｐｙ／ｒｘｎ値）−（真のｃｏｐｙ／ｒｘｎ値）］の絶対値／（真のｃｏｐｙ／ｒｘｎ値）の百分率であるが、例えばＥｒｒｏｒ（Ｃｔ）は、［５．４Ｅ＋０５−５．０Ｅ＋０５］／５．０Ｅ＋０５の百分率であり、８．０８％である。図７Ｃで、Ａｖｇ  ｅｒｒｏｒ  ａｔ５．０Ｅ０５は、５．００Ｅ＋０５  ｃｏｐｙ／ｒｘｎの６回反復結果のＥｒｒｏｒ（図７Ｂ）の平均値を表す。
【００６０】
図８は、核酸の増幅量による蛍光信号の強度と増幅サイクル数との相関関係を図示したグラフ及び増幅効率と増幅サイクル数との関係を図示したグラフを共に図示した図面である。
【００６１】
図８を参照すれば、核酸の増幅量による蛍光信号の強度と増幅サイクル数との相関関係のグラフは、核酸の背景蛍光信号（数式１で、Ｒｂ＝０）を除外した場合のグラフである。図１１を介し、蛍光信号の強度と増幅サイクル数との相関関係グラフは、蛍光信号の強度が初期０でない値から始まって０に減っていって、再び増加する形であることが分かるが、それは、蛍光染料が表す一般的な光漂白効果によるものである。また、背景蛍光信号を除外した場合の増幅効率グラフは、図８に図示されているように、形が尖っていて鋭い。
【００６２】
図９は、図８の実験結果のグラフから得た最大増幅効率を有する増幅サイクル数と核酸の初期濃度との関係を図示したグラフである。
【００６３】
図９を参照すれば、初期濃度が１Ｅ＋０３から１Ｅ＋０８の場合は、濃度による最大増幅効率が線形的であり、本発明による初期濃度を求めるための標準曲線として使用可能であるが、初期濃度が１Ｅ＋３以下である場合は、濃度による最大増幅効率が不規則である。
【００６４】
図１０は、核酸の背景蛍光信号を考慮した増幅効率と増幅サイクル数との関係を図示した図面である。
【００６５】
背景蛍光信号の強度Ｒｂを考慮した増幅効率と増幅サイクル数との相関関係関数は、次の数式８のようである。
【００６６】
【数８】
2006068011.tif 000018
【００６７】
ここで、Ｒｎは、ｎ番目の増幅サイクルでの蛍光信号の強度、Ｒｎ−１は、（ｎ−１）番目の増幅サイクルでの蛍光信号の強度、Ｒｂは、背景蛍光信号の強度、Ｅｎは、ｎ番目の増幅サイクルでの増幅効率を表す。
【００６８】
図１０は、核酸の初期濃度が１．０Ｅ＋０７  ｃｏｐｙ／ｒｘｎである場合について６回反復実験し、四種の異なるＲｂの定義による増幅効率を図示したグラフである。Ｒｂの値が０である場合、すなわち増幅による蛍光信号強度の最小値（Ｒｍｉｎ）が０である場合は、図８で図示されているように、形が非常に尖っていて鋭い。また、Ｒｂの値が０である場合の最大増幅効率が現れる時点は、一定しているが、Ｒｂの値が０ではない場合よりは、最大増幅効率が現れる時点が早く、最大増幅効率の値もまた一定ではない。
【００６９】
一方、Ｒｂの値が０ではない場合（すなわち、Ｒ１，０．０１，−（Ｒｂ）ｓｉｇｍｏｉｄａｌ）は、最大増幅効率が現れる時点及び最大増幅効率の値が一定であることが分かる。
【００７０】
以下で、まず、Ｒｂの値として使用可能な定数について述べた後、Ｒｂの値を考慮した場合の向上された点については、図１５ないし図１７を参照して述べる。
【００７１】
第一に、核酸の増幅量による蛍光信号の強度と増幅サイクル数との相関関係の実験データをカーブフィッティングして得た図１のシグモイドモデル（数式１）を介して算出した背景蛍光信号の強度（−（Ｒｂ）ｓｉｇｍｏｉｄ）をＲｂの値として使用可能である。
【００７２】
第二に、増幅サイクルによる蛍光信号の強度が初期に０ではない値から出発して０に減っていて、再び増加する場合（図１１参照）、初期蛍光信号の強度（増幅サイクル＝０である場合）値を実験的に測定し、Ｒｂの値として使用可能である。例えば、初期蛍光信号の強度を図示した図１１を参照すれば、初期蛍光信号の強度は、初期核酸濃度によって多少差があるが、平均的に０．０１であるから、Ｒｂの値として０．０１を使用できる。この方法は、試薬、蛍光染料及び蛍光染料の光露出時間などが変わらない限り、初期蛍光信号の強度は、一定であるために、最初の一回だけ実験的に測定した後には、続けてＲｂを定数として固定させて使用できるという長所がある。ただし、試薬、蛍光染料及び蛍光染料の光露出時間などが変わるならば、最初の一回は、実験的に初期蛍光信号の強度を測定し、定数Ｒｂの値を求めねばならない。
【００７３】
第三に、最初のサイクルでの核酸蛍光信号の強度（Ｒ１）をＲｂの値として使用可能である。この方法は、試薬、蛍光染料及び蛍光染料の光露出時間などが変わっても、実験ごとに自動的に初期蛍光信号の強度を補正する方法であり、前記の第二の方法に比べて長所を有するが、初期蛍光信号の強度が０に非常に近い場合には、誤差が大きくなるという短所がある。
【００７４】
第四に、数式８の増幅効率関数で最大増幅効率の値を「１」とする値をＲｂの値として使用可能である。この方法は、最大増幅効率が１になるＲｂを求めるために、反復的にＲｂの値を変化させつつ、Ｒｂを求める方法であり、原理的に最も妥当な方法であるが、反復計算をしなければならない。
【００７５】
以上で述べたように、背景蛍光信号の強度は、大きく見て、１）図１のシグモイドモデル（数式１）を介して得た背景蛍光信号の強度（−（Ｒｂ）ｓｉｇｍｏｉｄａｌ）、２）初期蛍光信号の強度に該当する値（図１１では、ほぼ０．０１）、３）最初のサイクルでの蛍光信号の強度（Ｒ１）、４）最大増幅効率の値を「１」とする値に設定できる。
【００７６】
ここで、−（Ｒｂ）ｓｉｇｍｏｉｄａｌ値を使用する場合は、カーブフィッティングを介してその値を求めるという不便さがあるが、その他の値（初期蛍光信号の強度、Ｒ１など）はカーブフィッティングを使用せずともよい。
【００７７】
Ｒｂの値として、以上で説明した４つの定数以外にさらに大きい正数、または負数の値を使用する場合にも、増幅効率グラフは、一定の形態として表される。これを図１２Ａから図１２Ｃで説明する。
【００７８】
図１２Ａ及び図１２Ｂは、背景蛍光信号の強度による増幅効率の変化を図示したグラフである。
【００７９】
図１２Ａを参照すれば、Ｒｂの値が０．０１、０．１、１、１０、１００、１０００である場合がそれぞれ図示されている。それぞれのグラフは、初期濃度によって一定のパターンを有するので、本発明による初期濃度を定量化するのに使用可能である。しかし、Ｒｂの値が０．１以上である場合に、増幅効率の最大値は、１よりはるかに小さくなる。増幅効率が１よりはるかに小さな値を有するということは、増幅されていないということを意味するので、増幅効率の意味を考慮するならば、物理的意味がない。しかし、図１２Ａに図示されたＲｂの値による増幅効率と増幅サイクル数との関係を見れば、初期核酸の濃度により、それぞれの増幅効率関数が最大値を有する増幅サイクルが一定の間隔に置かれるために、いずれも初期核酸濃度を定量化する方法として使用可能である。ただし、図１２Ａに図示されたＲｂの値のうちには、増幅効率が０と１との間に存在する場合である、Ｒｂの値が０．０１である場合（すなわち、初期核酸の蛍光信号強度）を使用することが望ましい。
【００８０】
図１２Ｂを参照すれば、Ｒｂの値が−０．０１、−０．１、−１、−１０、−１００、−１０００である場合がそれぞれ図示されている。Ｒｂの値が−０．０１と−０．１である場合は、増幅効率関数（数式８）の分母が０に近づいて一定のパターンのグラフが現れないが、それより絶対値が大きい値の場合は、核酸初期濃度により、一定のパターンに示される。特に、Ｒｂの値が−１以下である場合には、増幅効率の値が負数として示される。増幅効率は、０と１との間で物理的意味を有するので、図１２Ｂで図示した値を使用して核酸の初期濃度を定量化することはできるが、増幅効率の物理的意味はない。しかし、図１２Ｂで、Ｒｂの値による増幅効率と増幅サイクル数との関係を見れば、Ｒｂが−１以下である場合（−１、−１０、−１００、−１０００）、初期核酸濃度によってそれぞれの増幅効率の関数が最小値を有する増幅サイクルが一定の間隔に置かれるために、いずれも初期核酸濃度を定量化する方法として使用可能である。
【００８１】
図１２Ｃは、図１２Ａ及び図１２Ｂで述べたＲｂの値の大きさ変化による最大増幅効率を有する増幅サイクル数と核酸の初期濃度との関係を図示したグラフ及び最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶと核酸の初期濃度との関係を図示したグラフをそれぞれ図示した図面である。
【００８２】
図１２Ｃを参照すれば、Ｒｂの値が正数に増加（図１２Ａ）、または負数に減少（図１２Ｂ）すれば、最大増幅効率を有する増幅サイクル数と核酸の初期濃度との関係を図示した曲線は、一定の曲線に収斂する。また、Ｒｂの値が０及び−０．０１である場合を除外すれば、最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶは、核酸の初期濃度が１．０Ｅ＋０３と１．０Ｅ＋０８とである範囲内で５％以内に入ることが分かる。最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶと核酸の初期濃度のｅｒｒｏｒとの関係は、図１７を参照して述べる。
【００８３】
Ｒｂの値が一定以上ならば、％ＣＶ値は、特別に変化がないので、増幅効率の値が０と１との間に位置しつつ、％ＣＶ値を向上しようとする場合、図１０で説明した四種の定数のうち、Ｒｂ＝０を除外した残り、すなわちＲ１、０．０１、−（Ｒｂ）ｓｉｇｍｏｉｄａｌをＲｂの値として使用することが望ましい。
【００８４】
図１３及び図１４は、背景蛍光信号の強度による蛍光信号強度と増幅サイクル数との相関関係を図示したグラフである。
【００８５】
図１３及び図１４を参照すれば、Ｒｂの値が０である場合には、蛍光信号強度の最低値がほぼ０になり（すなわち、Ｒｂ＝Ｒｂｍｉｎ＝０）、数式８の分母（Ｒｎ−１）が０に近づくので、増幅効率（Ｅｎ）が現実と合わないほどに大きくなり、Ｅｍａｘピークは、非常に鋭くなり、ノイズの影響を非常に受ける。Ｒｂの値が０でない場合は、増幅効率が一定のパターンで示される。ただし、図１４で、Ｒｂ＝Ｒ１を使用した場合、増幅サイクルの初期（サイクル数≦５）に、１より大きい最大増幅効率が現れ、そのピークの形が非常に鋭いが、一般的な核酸増幅法では、かように初期に核酸が急激に増幅されることは発生せず、増幅効率が１より大きいことは、物理的に意味がないので、そのピークを無視しなければならない。
【００８６】
図１５は、背景蛍光信号の強度が０である場合と０．０１の場合の最大増幅効率を有する増幅サイクル数と核酸の初期濃度との関係を図示したグラフである。そして、図１６は、図１５のグラフを介して最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶを求めた結果を図示した図面である。
【００８７】
図１５を参照すれば、背景蛍光信号の強度が０である場合のグラフと背景蛍光信号の強度が０．０１である場合のグラフは、１Ｅ＋０３と１Ｅ＋０８との間の濃度にて線形的である。ただし、背景蛍光信号の強度が０．０１である場合のグラフが上側に位置する。
【００８８】
図１６を参照し、図１５の分析結果について述べれば、背景蛍光信号の強度が０．０１である場合に最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶ（＝Ｓｔ．Ｄｅｖ（標準偏差）／Ａｖｇ（平均））が非常に向上することが分かる。
【００８９】
図１７は、最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶによる核酸の初期濃度のｅｒｒｏｒを図示したグラフである。
【００９０】
図１７を参照すれば、最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶが０．５から５．０に変わるとき、ｅｒｒｏｒ（ｉｎ  ｃｏｐｙ）は、６．８５％から４８．５％に非常に大きい変化していくことが分かる。すなわち、最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶの値が若干大きくなっても、実際の核酸の初期濃度の定量値に大きい誤差を有していることもあるために、非常に正確な定量方法が要求され、図１６で図示されているように、背景蛍光信号の強度が０．０１である場合、０である場合に比べ、核酸の初期濃度定量の正確度が非常に高いということができる。
【００９１】
本発明は、またコンピュータで読み取り可能な記録媒体にコンピュータで読み取り可能なコードとして具現することが可能である。コンピュータで読み取り可能な記録媒体は、コンピュータシステムによって読み込み可能なデータが保存されるあらゆる種類の記録装置を含む。コンピュータで読み取り可能な記録媒体の例としては、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ−Ｏｎｌｙ  Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）、ＣＤ−ＲＯＭ、磁気テープ、フロッピーディスク、光データ保存装置などがあり、またキャリアウエーブ（例えば、インターネットを介した伝送）の形で具現されるものも含む。また、コンピュータで読み取り可能な記録媒体は、ネットワークに連結されたコンピュータシステムに分散され、分散方式でコンピュータで読み取り可能なコードが保存されて実行可能である。
【００９２】
以上、本発明についてその望ましい実施例を中心に説明した。本発明が属する技術分野で当業者は、本発明が本発明の本質的な特性から外れない範囲で変形された形態で具現できることを理解できるであろう。従って、開示された実施例は、限定的な観点でなくして説明的な観点で考慮されるものである。本発明の範囲は、前述した説明ではなくして特許請求の範囲に示され、それと同等な範囲内にあるあらゆる差異点は、本発明に含まれていると解釈されねばならない。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明のリアルタイム核酸増幅データから初期核酸濃度を定量化する方法は、所定のＤＮＡサンプルをＰＣＲを利用して増幅する過程でリアルタイムに初期拡散濃度を検出できるので、例えば大量のＤＮＡ定量分析関連の技術分野に効果的に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】核酸の蛍光信号の強度と増幅サイクル数との相関関係をモデリングしたグラフである。
【図２Ａ】図１に図示された数学的モデルと実際実験結果とを図示したグラフである。
【図２Ｂ】図１に図示された数学的モデルと実際実験結果とを図示したグラフである。
【図２Ｃ】図１に図示された数学的モデルと実際実験結果とを図示したグラフである。
【図２Ｄ】図１に図示された数学的モデルと実際実験結果とを図示したグラフである。
【図２Ｅ】図１に図示された数学的モデルと実際実験結果とを図示したグラフである。
【図２Ｆ】図１に図示された数学的モデルと実際実験結果とを図示したグラフである。
【図３】増幅効率と増幅サイクル数との関係を図示したグラフである。
【図４】図３で増幅効率が最大であるときの増幅サイクル数を求める方法を説明するための図面である。
【図５】図１の数学的モデルの最大蛍光強度の半分に該当する増幅サイクル数（ｎ１／２）及び図３の最大増幅効率（ｎＥｍａｘ）と核酸の初期濃度との関係を図示したグラフである。
【図６】図１の数学的モデルで、背景蛍光信号を除外した増幅前蛍光信号の強度Ｒ０と初期核酸濃度との関係を図示したグラフである。
【図７Ａ】本発明による核酸の初期濃度を求める方法と従来の結果をと図示した表である。
【図７Ｂ】本発明による核酸の初期濃度を求める方法と従来の結果をと図示した表である。
【図７Ｃ】本発明による核酸の初期濃度を求める方法と従来の結果をと図示した表である。
【図８】核酸の増幅量による蛍光信号の強度と増幅サイクル数との相関関係を図示したグラフ、及び増幅効率と増幅サイクル数との関係を図示したグラフを共に図示した図面である。
【図９】図８の実験結果のグラフから得た最大増幅効率を有する増幅サイクル数と核酸の初期濃度との関係を図示したグラフである。
【図１０】核酸の背景蛍光信号を考慮した増幅効率と増幅サイクル数との関係を図示した図面である。
【図１１】初期蛍光信号の強度を図示した図面である。
【図１２Ａ】背景蛍光信号の強度による増幅効率の変化を図示したグラフである。
【図１２Ｂ】背景蛍光信号の強度による増幅効率の変化を図示したグラフである。
【図１２Ｃ】図１２Ａ及び図１２Ｂで説明したＲｂの値の大きさ変化による最大増幅効率を有する増幅サイクル数と核酸の初期濃度との関係を図示したグラフ、及び最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶと核酸の初期濃度との関係を図示したグラフをそれぞれ図示した図面である。
【図１３】背景蛍光信号の強度による蛍光信号強度と増幅サイクル数との相関関係を図示したグラフである。
【図１４】背景蛍光信号の強度による蛍光信号強度と増幅サイクル数との相関関係を図示したグラフである。
【図１５】背景蛍光信号の強度が０の場合と０でない場合の最大増幅効率を有する増幅サイクル数と核酸の初期濃度との関係を図示したグラフである。
【図１６】図１５のグラフを介して最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶを求めた結果を図示した図面である。
【図１７】最大増幅効率を有する増幅サイクル数の％ＣＶによる核酸の初期濃度のｅｒｒｏｒを図示したグラフである。
【図１】
2006068011.tif 000021
【図２Ａ】
2006068011.tif 000022
【図２Ｂ】
2006068011.tif 000023
【図２Ｃ】
2006068011.tif 000024
【図２Ｄ】
2006068011.tif 000025
【図２Ｅ】
2006068011.tif 000026
【図２Ｆ】
2006068011.tif 000027
【図３】
2006068011.tif 000028
【図４】
2006068011.tif 000029
【図５】
2006068011.tif 000030
【図６】
2006068011.tif 000031
【図７Ａ】
2006068011.tif 000032
【図７Ｂ】
2006068011.tif 000033
【図７Ｃ】
2006068011.tif 000034
【図８】
2006068011.tif 000035
【図９】
2006068011.tif 000036
【図１０】
2006068011.tif 000037
【図１１】
2006068011.tif 000038
【図１２Ａ】
2006068011.tif 000039
【図１２Ｂ】
2006068011.tif 000040
【図１２Ｃ】
2006068011.tif 000041
【図１３】
2006068011.tif 000042
【図１４】
2006068011.tif 000043
【図１５】
2006068011.tif 000044
【図１６】
2006068011.tif 000045
【図１７】
2006068011.tif 000046