(57)【要約】【課題】補体インヒビター膜補助因子タンパク質（以下「MCP」）および崩壊促進因子（以下「DAF」）からの配列を含む融合タンパク質の提供。【解決手段】以下の式により表されるタンパク質を含むキメラタンパク質であって：Ａ−Ｒ１−Ｂ−Ｒ２−Ｃ、ここで、ＡおよびＣは０〜25アミノ酸長のペプチド配列であり、そしてグリコサミノグリカンに結合し得；ここで、Ｒ１はMCPまたはDAFを含み；ここで、Ｒ１がMCPである場合Ｒ２成分はDAFであり、そしてＲ１がDAFである場合Ｒ２成分はMCPであり；および、ここで、Ｂはゼロを含む任意の長さのペプチドであり、そして補体阻害活性を包含する生物学的活性を有していてもいなくてもよい、を含む、キメラタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実施例に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、補体インヒビター膜補助因子タンパク質（以下「MCP」）および崩壊促進因子（以下「DAF」）からの配列を含む融合タンパク質に関し、この融合タンパク質はまた少なくとも１つの細胞表面局在化ドメインを含む。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の記載
補体は、感染性因子を防ぐための重要な防御メカニズムである。補体は、微生物および他の抗原を補体受容体を有する細胞に対して標的化し、食細胞を補体活性化が起こっている領域へ補充し、そして標的膜を破壊することによって作用する。
【０００３】
補体は、30を越えるタンパク質のカスケードであり、そして炎症の間、開いている。実際、補体成分C3a、C4a、およびC5aは、マスト細胞由来の炎症性メディエーターの放出を引き起こし、平滑筋収縮を誘導し、血管透過性を増加させ、そして好中球を補充する。いくつかの場合において、炎症および補体の随伴活性化は、宿主組織に対する損傷をもたらす。敗血症、成人呼吸促進症候群（以下「ARDS」）、再潅流傷害、および火傷は、補体活性化の増幅が組織損傷をもたらす臨床的に顕著な症状がある。
【０００４】
補体は、膜補助因子タンパク質（Membrane Cofactor Protein、以下「MCP」）および崩壊促進因子（Decay Accelerating Factor、以下「DAF」）を含む密接に関連した一次配列構造を有する６つのタンパク質によって、一部調節される。MCPおよびDAF、ならびに４つの他の補体調節タンパク質をコードする遺伝子は、ヒト染色体１、バンド1q32の長腕に局在されている。これらの６つのすべてのタンパク質は、約60アミノ酸コンセンサス単位または短いコンセンサス反復（以下「SCR」）を含む共通の構造モチーフを有し、そしてMCPおよびDAFにおける４つの隣接するコピー内に存在する。配列において完全に同一ではないが、SCRは、４つの位置に不変のシステインを有し、そして残りの配列の間に、18までの高度に保存された位置を有する。
【０００５】
MCP（「CD46」としても知られる）は、末梢血細胞（赤血球を除く）、上皮系統の細胞、内皮系統の細胞および線維芽細胞系統の細胞、栄養膜（trophoblast）、および精子を含む多くの細胞型の細胞表面に存在する。MCPは、４つのSCR配列、および重いO-連結グリコシル化が生じるセリン／スレオニン富化領域を有する。MCPはまた、１つの膜貫通および細胞質ドメインを有する。MCPは、細胞表面に存在するC3bおよびC4bに結合し、それにより第Ｉ因子である血漿プロテアーゼによる分解のためにタンパク質を標的化し、それにより何らかのC3またはC4転換酵素活性を破壊することによって作用する。したがって、MCPは「補助因子活性」を有するといわれている。MCPが細胞表面に局在するので、そこに存在する細胞のみを保護し、それゆえ固有の方法で作用するといわれている。ヒトMCPをコードするcDNAの配列は、Lublinら、J.Exp. Med., (1988) 168:181-194により報告されている。
【０００６】
DAFは、末梢血細胞（赤血球を含む）、上皮系統の細胞、内皮系統の細胞および線維芽細胞系統の細胞、栄養膜、ならびに精子を含む多くの細胞型の細胞表面に存在する。DAFは、「崩壊促進活性」により補体機能を調節する。すなわち、DAFは、C4b/C2aおよびC3b/Bbに結合し、そしてC2aまたはBb（プロテアーゼ成分）の会合を不安定にし、そのためC3転換酵素活性を破壊する。DAFは、C4b/C2aおよびC3b/Bb複合体の形成を妨害することがまた報告されている。MCPと同様に、DAFは固有の方法で補体を調節し、そのためDAFが局在する細胞のみを保護する。
【０００７】
ヒトDAFをコードするcDNAの配列は、Medofら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1987) 84:2007、およびCarasら、Nature, (1987) 325:545-549により報告されている。両方の文献の開示は、参考として本明細書に援用される。MCPのように、DAFは、４つのSCR配列、および重いO-連結グリコシル化が生じるセリン／スレオニン富化領域を有する。DAFは、グリコホスファチジルイノシトール部分（以下「GPI」）が共有結合されるそのカルボキシ末端に、細胞表面局在化ドメインを有する。GPIは、細胞表面にDAFを連結し、そしてさらにデタージェントでの細胞膜の可溶化後もなお、DAFを細胞表面へ再接着させる。Carasらは、DAFをコードする２つのmRNAの発見を報告する。一方の種は、細胞表面局在化ドメインとともにDAFをコードする。第２の種は、DAF mRNAの10％の割合を占め、そしてGPIアンカーが接着される細胞表面局在化ドメインを欠いているDAFの分泌される種をコードするようである。
【０００８】
この細胞表面局在化ドメインは、DAFの最適機能に重要なようである。発作性夜間血色素尿症の患者は、GPIで固定されたタンパク質を欠損することが知られており、そしてこの欠損は、補体により溶解される患者の血液細胞の感受性に原因として関連することが知られている。さらに、Moranら、J.Immunol., (1992) 149:1736-1743は、組換え完全長DAFおよび細胞表面局在化ドメインを有さない組換えDAF（seDAF）が両方とも補体に対して細胞を保護するが、mDAFがseDAFよりも50倍以上強力であったことを示した。しかし、mDAFは、より高いレベルの活性を有するように細胞表面膜中に組み込まれなければならず、そして血清リポタンパク質がこの組み込みを妨害するようである。この観察により、MoranらはseDAFが臨床的適用に好ましい分子であるという結論が導かれた。
【０００９】
LublinおよびCoyne、J.Exp. Med. (1991) 174:35-44は、DAF、MCP、ならびにDAFおよびMCPの細胞表面膜局在化ドメイン（DAFのGPIアンカーおよびMCPの膜貫通（TM）ドメイン）が交換されているDAFおよびMCPの改変体の活性を比較した。興味深いことに、DAFおよびDAF/MCP-TM改変体は、ほぼ等しい補体阻害活性を示した。同様に、MCPおよびMCP/DAF-GPIアンカー改変体は、インビトロでほぼ等しい補体阻害活性を示した。
【００１０】
単一のポリペプチド中にDAFおよびMCPを含むハイブリッド補体調節タンパク質が開示されている。Iwataら、J. Immunol., (1994)152:3436-3444を参照のこと。Iwataらは、MCP-DAFハイブリッドが、オルタナティブ経路を通じてC3沈着を阻害する点で、DAF、MCP、またはDAFかつMCPよりも効果的であることを開示する。MCP-DAFハイブリッドはまた、古典的経路を通じてC3沈着を阻害する点で、MCP単独よりも効果的である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（項目１）以下の式により表されるタンパク質を含むキメラタンパク質であって：
Ａ−Ｒ１−Ｂ−Ｒ２−Ｃ
ここで、ＡおよびＣは０〜25アミノ酸長のペプチド配列であり、そしてグリコサミノグリカンに結合し得；
ここで、Ｒ１はMCPまたはDAFを含み；
ここで、Ｒ１がMCPである場合Ｒ２成分はDAFであり、そしてＲ１がDAFである場合Ｒ２成分はMCPであり；および
ここで、Ｂはゼロを含む任意の長さのペプチドであり、そして補体阻害活性を包含する生物学的活性を有していてもいなくてもよい、
を含む、キメラタンパク質。
（項目２）R1がMCPを含みそしてR2がDAFを含む、項目１に記載のキメラタンパク質。
（項目３）Ｂが０アミノ酸長である、項目２に記載のキメラタンパク質。
（項目４）Ａが０アミノ酸長である、項目３に記載のキメラタンパク質。
（項目５）項目４に記載のキメラタンパク質であって、Ｃが式：
ＸＢＢＸＸＢＢＢＸＸＢＢＸにより表されるペプチドであり、
ここで、Ｘは水性アミノ酸を表し、そしてＢは塩基性アミノ酸リジンおよびアルギニンを表す、キメラタンパク質。
（項目６）Ｃが配列番号４である、項目５に記載のキメラタンパク質。
（項目７）項目４に記載のキメラタンパク質であって、Ｃが式：
ＸＢＢＸＢＸにより表されるペプチドであり、
ここで、Ｘは水性アミノ酸を表し、そしてＢは塩基性アミノ酸リジンおよびアルギニンを表す、キメラタンパク質。
（項目８）Ｃが配列番号５である、項目７に記載のキメラタンパク質。
（項目９）Ｃが配列番号６である、項目４に記載のキメラタンパク質。
（項目１０）Ｃが配列番号７である、項目４に記載のキメラタンパク質。
（項目１１）Ｃが配列番号15である、項目４に記載のキメラタンパク質。
（項目１２）キメラタンパク質をコードし得るヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列であって、該キメラタンパク質が以下の式：
Ａ−Ｒ１−Ｂ−Ｒ２−Ｃ
ここで、ＡおよびＣは０〜25アミノ酸長のペプチド配列であり、そしてグリコサミノグリカンに結合し得；
ここで、Ｒ１はMCPまたはDAFを含み；
ここで、Ｒ１がMCPである場合Ｒ２成分はDAFであり、そしてＲ１がDAFである場合Ｒ２成分はMCPであり；および
ここで、Ｂはゼロを含む任意の長さのペプチドであり、そして補体阻害活性を包含する生物学的活性を有していてもいなくてもよい、
により表される、ヌクレオチド配列。
（項目１３）形質転換された宿主細胞であって、該形質転換された宿主細胞がキメラタンパク質をコードし得るヌクレオチド配列を含み、該キメラタンパク質が以下の式：
Ａ−Ｒ１−Ｂ−Ｒ２−Ｃ
ここで、ＡおよびＣは０〜25アミノ酸長のペプチド配列であり、そしてグリコサミノグリカンに結合し得；
ここで、Ｒ１はMCPまたはDAFを含み；
ここで、Ｒ１がMCPである場合Ｒ２成分はDAFであり、そしてＲ１がDAFである場合Ｒ２成分はMCPであり；および
ここで、Ｂはゼロを含む任意の長さのペプチドであり、そして補体阻害活性を包含する生物学的活性を有していてもいなくてもよく、
そして、該ヌクレオチド配列は、該宿主細胞内で発現され得る、
により表される、形質転換された宿主細胞。
発明の要旨
本発明は、MCP、DAF、およびMCP-DAFハイブリッドが分子を細胞表面に標的する細胞表面局在化ドメインとともに産生されるキメラタンパク質を提供し、それによって、補体が媒介する細胞溶解を阻害するように作用し得る細胞表面上でのこれらの分子の濃度を上昇させる。このような分子が、補体が病気の状態の誘発における役割を果たしている病気の状態の、予防および処置に有用であることが理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
MCP-DAFハイブリッドを含む本発明のキメラタンパク質は、以下の式により表され得る：
Ａ−Ｒ１−Ｂ−Ｒ２−Ｃ。
【００１３】
Ｒ１成分はMCPまたはDAFを含み得る。Ｒ１がMCPを含む場合、Ｒ２成分はDAFを含み、そしてＲ１がDAFを含む場合、Ｒ２成分はMCPを含む。Ｂ成分はゼロを含むあらゆる長さのペプチドであり得、そして補体阻害活性を含む生物学的活性を有していてもいなくてもよい。隣接するペプチド配列であるＡおよびＣは、通常６以上のアミノ酸長であり、そして細胞表面局在化特性を有する。あるいは、Ａは、翻訳後に分子から切り離される前駆体配列であり得る。ＡまたはＣがゼロアミノ酸長であり得ることが理解されるが、グリコサミノグリカン結合能を有するペプチド配列は、常に少なくともＡまたはＣの位置に存在する。ペプチド配列がＡおよびＣの位置に存在する場合、ＡおよびＣが同じ配列であってもよいが、そうである必要はなく、そして異なるグリコサミノグリカン結合能力を有し得ることが、さらに理解される。
【００１４】
本明細書で用いられる場合、「MCP」は、Lublinらの184頁の図１に開示されるような成熟MCPの補体阻害活性を有するタンパク質を意味する。（MCP配列を含むタンパク質の補体阻害活性を決定するためのアッセイについての以下の実施例５を参照のこと）。Lublinらの開示は本明細書に参考として援用される。Lublinらにより開示された全体のアミノ酸配列が補体阻害活性に必要とされないことは、当業者に認識される。すなわち、成熟MCP配列の一部が欠失され得、そしてなおタンパク質は補体阻害活性を保持する。欠失され得たMCPの一部の例として、細胞質テールおよび膜貫通ドメインが挙げられる。補体阻害活性を保持するアミノ酸置換を含む天然に存在する対立遺伝子改変体は、MCPの人工的に産生されたムテイン（すなわち、１〜５アミノ酸置換を有するMCP）と同様に定義内に含まれる。Liszewskiら、Ann.Rev. Immunol., (1991) 9:431-455およびWO 91/18097に記載されるような、天然に存在するおよび人工的に産生されたMCPの改変体もまた、MCPの定義内に含まれる。LiszewskiらおよびWO 91/18097の開示は、本明細書に参考として援用される。本発明の分子において有用なMCPの部分は：
【００１５】
【化１】
2006117696.tif 000002
【００１６】
（配列番号１）である。
【００１７】
本明細書で用いられる場合、DAFとは、Carasらの546頁の図1aに開示されたような成熟DAFの補体阻害活性を有するタンパク質を意味する。Carasらの開示は本明細書に参考として援用される。Carasらにより開示された全体のアミノ酸配列が補体阻害活性に必要とされないことが、当業者に認識される。すなわち、成熟DAF配列の一部が欠失され得、そしてなおタンパク質は補体阻害活性を保持する。欠失され得たDAFの一部の例としては、GPIアンカードメインが挙げられる。補体阻害活性を保持するアミノ酸置換を含む天然に存在する対立遺伝子改変体は、DAFの人工的に産生されたムテイン（すなわち、１〜５アミノ酸置換を有するDAF）と同様に定義内に含まれる。ムテインの例はEP 0 244 267に見出され得る。Carasらにより記載される分泌された改変体のような天然に存在する改変体は、DAFの定義内に含まれる。本発明の分子において有用なDAFの部分は：
【００１８】
【化２】
2006117696.tif 000003
【００１９】
（配列番号２）である。
【００２０】
本明細書で用いられるMCP-DAFハイブリッドとは、これらの用語がこの節で定義されるようなMCPおよびDAFを含むポリペプチドを意味する。例えば、MCP-DAFハイブリッドは、両方の分子の完全な配列を含有し得、そしてMCPおよびDAFのそれぞれに由来するSCR領域のみを含み得る。MCP-DAFハイブリッドの一例は、Iwataら、前出により開示された、DAFに共有結合されたMCPの最初の250アミノ酸を有する分子である。MCPおよびDAF部分を分ける配列が同様に導入され得る。MCP-DAFハイブリッド分子はまた以下のアミノ酸配列を有し得る：
【００２１】
【化３】
2006117696.tif 000004
【００２２】
（配列番号３）。
【００２３】
本発明のキメラタンパク質には、補体機能を阻害する配列および細胞表面に存在するグリコサミノグリカンに結合する配列を有するタンパク質、特にヘパリンが含まれる。補体機能を阻害する配列は、MCP、DAF、およびMCP-DAFハイブリッドである。これらのペプチド配列は、好ましくは、グリコサミノグリカン結合能力を有し、そして最も好ましくはヘパリンを結合する。ヘパリンを結合し得るコンセンサス配列は、CardinおよびWeintraub、Arteriosclerosis,(1989) 9:21-32およびSobelら、(1992) J. Biol. Chem. 267:8857-8862により同定されている。コンセンサス配列は以下のように示され得る：
ＸＢＢＸＸＢＢＢＸＸＢＢＸ
ここで、Ｘは水性（hydropathic）アミノ酸を示し、そしてＢは塩基性アミノ酸であるリジンおよびアルギニンを示す。コンセンサスに従うペプチドの一例は、Ala-Lys-Arg-Gly-Leu-Arg-Arg-Arg-Leu-Gly-Arg-Lys-Ala（配列番号４）である。第２のコンセンサス配列は以下により示され得る：
ＸＢＢＸＢＸ
ここで、Ｘは水性アミノ酸を示し、そしてＢは塩基性アミノ酸であるリジンおよびアルギニンを示す。このより短い配列の一例は、Ala-Arg-Arg-Gly-Lys-Leu（配列番号５）である。記載される２つのコンセンサス配列にマッチするあらゆる配列は、ＡもしくはＣの位置で、または細胞表面へMCP-DAFハイブリッドを標的化するための両方に使用され得る。
【００２４】
フィブロネクチン由来の２つの配列はまた、グリコサミノグリカン結合配列として使用され得る。第１のTrp-Gln-Pro-Pro-Arg-Ala-Arg-Ile（配列番号６）は、Woodsら、Molec. Biol. Cell(1993) 4:605-613により同定された。第２のLeu-Ile-Gly-Arg-Lys-Lys（配列番号７）は、Drakeら、J. Biol.Chem., (1993) 268:15859-15867により記載された。
【００２５】
グリコサミノグリカン結合能力を有するペプチド配列は、以下に挙げられるヘパリン結合活性を有するタンパク質に由来し得るが、それらに限定されない：プロテアーゼネキシン-1、プロテアーゼネキシン-2、アンチトロンビンIII、プロテインＣインヒビター、血小板因子４、ヘパリン補因子II、ギランテン関連インヒビター、ウシ膵臓トリプシンインヒビター、組織因子経路インヒビター（以下「TFPI」）（LACI、TFI、およびEPIとしても知られる）、またはTFPI-2。
【００２６】
アンチトロンビンIIIの場合、適切な部分は、Ala Lys Leu Asn Cys Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Lys Ser Ser Lys Leu（配列番号８）であり得る。
【００２７】
アンチトロンビンIIIの適切な部分はまた、Thr Ser Asp Gln Ile His Phe Phe Phe Ala Lys Leu Asn Cys Arg（配列番号９）であり得る。
【００２８】
プロテインＣインヒビターの場合、適切な部分は、Ser Glu Lys Thr Leu Arg Lys Trp Leu Lys Met Phe Lys Lys Arg Glu Leu Glu Glu Tyr（配列番号10）であり得る。
【００２９】
プロテインＣインヒビターの適切な部分はまた、His Arg His His Pro Arg Glu Met Lys Lys Arg Val Glu Asp Leu（配列番号11）であり得る。
【００３０】
ヘパリン補因子IIの場合、適切な部分は、Phe Arg Lys Leu Thr His Arg Leu Phe Arg Arg Asn Phe Gly Tyr Thr Leu Arg（配列番号12）であり得る。
【００３１】
血小板因子４の場合、適切な部分は、Leu Tyr Lys Lys Ile Leu Lys Lys Leu Leu Glu Ala（配列番号13）であり得る。
【００３２】
ギランテン関連インヒビターの場合、適切な部分は、Asn Gly Leu Lys Arg Asp Lys Leu Gly Cys Glu Tyr Cys Glu Cys Arg Pro Lys Arg Lys Leu Ile Pro Arg Leu Ser（配列番号14）であり得る。
【００３３】
TFPIの場合、適切な部分は、Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn Met（配列番号15）であり得る。
【００３４】
TFPI-2の場合、適切な部分は、Lys Lys Lys Lys Lys Met Pro Lys Leu Arg Phe Ala Ser Arg Ile Arg Lys Ile Arg Lys Lys Gln Phe（配列番号16）であり得る。
【００３５】
種々の欠失、置換、および挿入がヘパリンに結合する配列の能力を実質的に妨害することなく上記に列挙した配列に行われ得ることが、当業者には理解される。上記に列挙した配列へのこのような改変は、本発明の範囲内に入ることが理解されるべきである。
【００３６】
本発明のキメラタンパク質の産生
DNAクローニングの当業者ならびにMCP、DAF、および細胞表面局在化ドメインをコードするDNAを所有する当業者は、以下のいずれかに概説される公知のクローニング手順（例えば、MCP、DAF、または細胞表面局在化ドメインをコードするDNAの制限酵素切断、エクソヌクレアーゼ切断、連結、および他の適切な手順）を用いるこのようなキメラタンパク質の産生のために適切なDNA分子を調製し得る：Sambrookら、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 第２版 （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）；DNA CLONING, 第ＩおよびII巻、D.N. Glover編 (IRL Press, 1985)；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS,M.J. Gait編 (IRL Press, 1984)；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, B.D. Hames および S.J.Higgins編(IRL Press, 1984)；TRANSCRIPTION AND TRANSLATION, B.D. HamesおよびS.J.Higgins編 (IRL Press, 1984)；ANIMAL CELL CULTURE, R.I.Freshney編、(IRLPress,1986)IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES, K. Mosbach (IRL Press, 1986)；B.Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING, Wiley (1984)；METHODS IN ENZYMOLOGYのシリーズ, Academic Press, Inc.；GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS, J.H. MillerおよびM.P. Calos編 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1987)；METHODS IN ENZYMOLOGY, 第154および155巻, それぞれWuおよびGrossman編、およびWu編 (Academic Press, 1987)、IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, R.J. MayerおよびJ.H. Walker編 (Academic Press London, Harcourt Brace U.S., 1987)、PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, 第２版 (Springer-Verlag, N.Y. (1987）、およびHANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, 第I-IV巻, D.M. Weirら (Blackwell Scientific Publications, 1986)；Kittsら、Biotechniques,(1993）, 14:810-817；Munemitsuら、Mol. Cell. Biol., (1990) 10:5977-5982。あるいは、上記のタンパク質をコードする核酸配列の全体の配列または一部は、合成的方法により（例えば、DNA合成機を用いて）調製され得る。最後に、記載されたキメラタンパク質をコードする核酸分子を調製する好ましい方法は、PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Innis, Gelfand, Sninsky, およびWhite編（AcademicPress, 1990)に記載されたようなPCR技法、特にオーバーラッピングPCRの使用による。
【００３７】
上記のタンパク質は、限定しないが以下の発現系を含む任意の適切な発現系を用いて調製され得るが、これらに限定されない：哺乳動物組織培養物、昆虫細胞培養物、細菌細胞培養物、および酵母細胞培養物。本発明のタンパク質が、所望のタンパク質を産生するために細胞内で切断され得る前駆*体分子として細胞内に存在し得ることが理解される。あるいは、前駆体タンパク質は、細胞から回収され、そしてさらに所望のタンパク質を回収するためにプロセシングされ得る。哺乳動物発現系が当該分野で公知である。Sambrookら「哺乳動物細胞におけるクローン化遺伝子の発現」MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 第２版 (Cold Spring harbor Laboratory Press, 1989)。発現のための宿主として入手可能な哺乳動物細胞株は当該分野で公知であり、そしてAmerican Type Culture Collection（ATCC）から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。
【００３８】
本発明のタンパク質はまた、バキュロウイルス配列を含むベクターを用いて昆虫細胞中で産生され得る。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、特にInvitrogen, San Diego CA (「MaxBac」キット）からキット形態で市販されている。これらの技法は、当業者に一般的に公知であり、そしてSummersおよびSmith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin 第1555号 (1987)（以下「SummersおよびSmith」）に十分に記載されている。現在、AcNPV中に外来遺伝子を導入するために最も普通に用いられるトランスファーベクターは、pAc373である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた設計されている。これらには、例えば、pVL985（これはポリヘドリン開始コドンをATGからATTへ変更し、そしてATTの32塩基対下流にBamHIクローニング部位を導入する；LuckowおよびSummers,Virology (1989) 17:31を参照のこと）が挙げられる。バキュロウイルス中の所望の部位に異種DNAを導入する方法は、当該分野で公知である。（SummersおよびSmith、前出；Juら(1987)；Smithら, Mol. Cell. Biol., (1983) 3:2156；ならびにLuckowおよびSummers (1989)、前出を参照のこと）。例えば、挿入は、相同二重交差組換えによるポリヘドリン遺伝子のような遺伝子中であり得る；挿入はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子中に操作された制限酵素部位中であり得る。Millerら、Bioassays(1989) 4:91。発現ベクターにおいてポリヘドリン遺伝子の代わりにクローン化される場合、DNA配列は、ポリヘドリン特異的配列の5'および3'の両方に隣接し、そしてポリヘドリンプロモーターの下流に位置する。
【００３９】
組換えバキュロウイルス発現ベクターが、いくつかの昆虫細胞への感染のために開発されている。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に、以下のものについて開発されている：Aedes aegypti、Bombyx mori、Drosophila melanogaster、Spodoptera frugiperda、およびTrichoplusia ni（PCT公開番号WO 89/046699；Carbonellら、J. Virol. (1985)56:153；Wright、Nature (1986) 321:718；Smithら、Mol. Cell. Biol., (1983) 3:2156；および一般的には、Fraserら、Cell.Dev. Biol., (1989) 25:225を参照のこと。細胞および細胞培養培地は、バキュロウイルス／発現系における異種ポリペプチドの直接および融合発現の両方について市販されており：細胞培養技法は、当業者に一般的に公知である。例えば、SUmmersおよびSmith、前出を参照のこと。改変された昆虫細胞は、次いで、適切な栄養培地中で増殖され得る。これは改変された昆虫細胞に存在する１つまたは複数のプラスミドを安定に維持する。このような栄養培地の１つがEP 380 495に記載されている。
【００４０】
多くの細菌発現技法が当該分野で公知である。Sambrookら「Escherichia coliにおけるクローン化遺伝子の発現」MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 第２版 (Cold Spring HArbor Laboratory Press, 1989)。
【００４１】
発現および形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組込みベクターのいずれかであり、これは多くの細菌中での形質転換について開発されている。例えば、発現ベクターは、特に、以下の最近について開発されている：Bacillus subtilis (Palvaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1982) 79:5582；EP 036 259および063 953；PCT WO 84/04541）、E. coli（Shimatakeら、Nature, (1981) 292:128；Amannら、Gene(1985) 40:183；Studierら、J. Mol. Biol., (1986) 189:113；EP公開番号036 776、136 829、および136 907）、Streptococcus cremoris（Powellら、Appl. Environ. Microbiol., (1988) 54:655）；Streptococcus lividans（Powellら、Appl. Environ. Microbiol., (1988) 54:655）、Streptomyces lividans（米国特許第4,745,0556号）。
【００４２】
本発明のタンパク質をコードするDNAは、当該分野での従来の技法を用いて、細菌のペリプラズム腔への成熟タンパク質の輸送または分泌のためのシグナルペプチドに結合され得る。さらに、転写および翻訳は、発現されるべきDNAとプロモーターおよびリボソーム結合部位をコードする配列との間隔を変えることにより、細菌発現系でさらに最適にされ得る。
【００４３】
酵母発現系もまた当該分野で公知である。融合タンパク質は、酵母系における本発明のタンパク質の発現のための１つの手段を提供する。通常、内因性酵母タンパク質または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするDNA配列が、異種コーディング配列の5'末端に融合される。発現時に、この構築物は２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。２つのアミノ酸配列の結合点のDNA配列は、切断可能な部位をコードしてもしなくてもよい。例えば、EP 196 056を参照のこと。このような融合タンパク質の１つは、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼを外来タンパク質からユビキチンを切断させる、プロセシング酵素のための部位を保持し得るユビキチン領域を用いて作成される。したがって、この方法により、確実なアミノ末端を有する外来タンパク質が、酵母細胞内から単離され得る。ユビキチンタンパク質の産生は、同時継続の米国特許出願番号07/806,813および07/957,627に記載される。この方法は、Barrら、RECOMBINANT SYSTEMS IN PROTEIN EXPRESSION (Elsevier Science Publishers B.V., 1991), 37-46頁に概説される。
【００４４】
あるいは、外来タンパク質は、外来タンパク質の酵母での分泌を提供するリーダー配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードするキメラDNA分子を生成することによって、細胞から増殖培地中へ分泌され得る。リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位があり得、これはインビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る。リーダー配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。
【００４５】
適切なシグナル配列をコードするDNAは、酵母インベルターゼ遺伝子（EP 012 873；JPO 62,096,086）、αファクター遺伝子（米国特許第4,588,684号および第4,870,008号；EP116,201）、ならびにEP 324 274および同時係属中の米国特許出願番号07/864,206に記載されるようなαファクター遺伝子の短縮型のような、分泌される酵母タンパク質についての遺伝子に由来し得る。あるいは、インターフェロンリーダーのような非酵母起源のリーダーが存在し、これはまた酵母での分泌を提供する（EP 060 057）。αファクター遺伝子は、本発明のタンパク質の分泌について設計された核酸構築物に用いられ得る。
【００４６】
分泌リーダーの他の有用なクラスは、「プレ」シグナル配列および「プロ」領域の両方を含む、酵母αファクター遺伝子のフラグメントを用いるクラスである。用いられ得るαファクターのフラグメントタイプには、全長プレプロαファクターリーダー（約83アミノ酸残基）および短縮型αファクターリーダー（通常、約25〜約50アミノ酸残基）（米国特許第4,546,083号および第4,870,008号；EP 324 274）が使用される。分泌を与えるαファクターリーダーフラグメントを用いるさらなるリーダーは、第２の酵母αファクター由来のプロ領域のほかに、第１の酵母のプレ配列で作成されるハイブリッドαファクターリーダーを含む分泌を提供する。（例えば、PCT WO 89/02463を参照のこと）。
【００４７】
本発明のタンパク質をコードする発現ベクターは、しばしば、酵母または細菌のような宿主中で安定に維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のようなレプリコンに維持される。レプリコンは、２つの複製系を有し得、そのため、例えば、発現のために酵母中で、およびクローニングおよび増幅のために原核生物宿主中で維持されるようになる。このような酵母-細菌シャトルベクターの例には、YEp24（Botsteinら、Gene, (1979) 8:17-24）、pCl/1（Brakeら、Proc.Natl. Acad. Sci USA, (1984) 81:4642-4646）、およびYRp17（Stinchcombら、J. Mol. Biol.,(1982) 158:157）が挙げられる。さらに、レプリコンは、高または低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般的には、約５〜約200、および通常約10〜約150の範囲コピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、少なくとも約10を有し得、そして少なくとも約20を有し得る。高または低コピー数ベクターは、宿主におけるベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して選択され得る。例えば、Brakeら、前出を参照のこと。タンパク質が酵母細胞内に保持される酵母細胞中での本発明のタンパク質の産生について、pAB24のようなプラスミドが使用され得る。Sabinら、Bio/Technology,(1989) 7:705-709。pAB24は、GAP/ADHハイブリッドプロモーターを含み、このプロモーターは、その制御下で配列の高レベルの発現を指示し得るADHプロモーターの一部を含むが、培養物中の増殖における所望の点で同じ配列を発現し得るGAP調節配列もまた含む。
【００４８】
あるいは、発現構築物は、組込みベクターとともに宿主ゲノムに組み込まれ得る。組込みベクターは、通常、ベクターを組み込ませる宿主染色体に相同な少なくとも１つの配列を含み、そして発現構築物に隣接する２つの相同配列を含み得る。組込みは、ベクターおよび宿主染色体において相同DNA間の組換えから生じるようである。Orr-Weaverら、Meth. Enzymol., (1983) 101:228-245。組込みベクターは、ベクター中に含まれる適切な相同配列を選択することにより、酵母中の特異的遺伝子座に指向し得る。Orr-Weaverら、前出を参照のこと。１つ以上の発現構築物は組込まれ得、おそらく産生される組換えタンパク質のレベルに影響を与える。Rineら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA, (1983)80:6750。ベクターに含まれる染色体配列は、ベクター全体の組込みを生じるベクター中の単一のセグメントとして、または発現構築物のみの安定な組込みを生じ得る、染色体中の隣のセグメントに相同であるおよびベクター中の発現構築物に隣接する２つのセグメントとしてのいずれかが生じ得る。
【００４９】
通常、染色体外および組込み型発現構築物は、形質転換される酵母株の選択を可能にする選択マーカーを含み得る。選択マーカーには、ADE2、HIS4、LEU2、TRP1、およびALG7、ならびにG418耐性遺伝子のような酵母宿主中で発現され得る生合成遺伝子を含み得、これらはそれぞれツニカマイシンならびにG418に対する耐性を酵母細胞に与える。さらに、適切な選択可能マーカーはまた、金属のような毒性化合物の存在下で増殖する能力を有する酵母を提供し得る。例えば、CUP1の存在は、銅イオンの存在下で酵母を増殖させる（Buttら、Microbiol.Rev. (1987) 51:351）。
【００５０】
あるいは、上記の成分のいくつかは形質転換ベクター中に一緒に組み立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコン中に維持されるかまたは組込みベクター中で発現されるかのいずれかの選択可能マーカーを含む。
【００５１】
発現および形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組込みベクターのいずれかであり、多くの酵母中への形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは、特に、以下の酵母について開発されている：Candida albicans (Kurtzら、Mol. Cell. Biol., (1986) 6:142、Candina maltosa(Kunzeら、J. Basic Microbiol., (1985) 25:141）、Hansenula polymorpha(Gleesonら、J. Gen. Mocrobiol., (1986) 132:3459；Roggenkampら、Mol. Gen. Genet.,(1986) 202:302)、Kluyveromyces fragilis (Dasら、J.Bacteriol., (1984) 158:1165)、Kluyoeromyces lactis (De Louvencourtら、J. Bacteriol., (1983) 154:737；Van den Bergら、Bio/Technology,(1990) 8:135）、Pichia guillerimondii (Kunzeら、J. Basic Microbiol., (1985) 25:141）、Pichia postoris (Creggら、Mol. Cell. Biol., (1985) 5:3376；米国特許第4,837,148号および第4,929,555号）、Sacccharomyces cerevisiae (Hinnenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1978) 75:1929；Itoら、J.Bacteriol., (1983) 153:163）、Schizosaccharomyces pombe (BeachおよびNurse, Nature,(1981) 300:706）、およびYarrowia lipolytica (Davidowら、Curr. Genet. (1985) 10:380471およびGaillardinら、Curr.Genet., (1985) 10:49）。
【００５２】
酵母細胞を形質転換するために本明細書中で用いられ得る形質転換手順には、「酵母の遺伝学および分子生物学への指針」第194巻 METHODS IN ENZYMOLOGY, C. GuthrieおよびG.R. Fink, (Academic Press 1991)に記載されるような、エレクトロポレーションが挙げられる。他の手順には、スフェロプラストの形質転換またはアルカリカチオン処理した完全な細胞の形質転換が挙げられる。このような手順は、例えば、Candidaについては、Kurtzら、Mol.Cell. Biol., (1986) 6:142；Kunzeら、J. Basic Microbiol., (1985) 25:141；Hansenulaについては、Gleesonら、J.Gen. Microbiol., (1986) 132:3459；Roggenkampら、Mol. Gen. Genet., (1986) 202:302；Kluyoeromycesについては、Dasら、J.Bacteriol.,(1984) 158:1165；De Louvencourtら、J. Bacteriol., (1983) 154:1165；Van den Bergら、Bio/Technology,(1990) 8:135；Pichiaについては、Creggら、Mol. Cell. Biol. 5:3376 (1985)；Kunzeら、J.Basic Microbiol., (1985) 25:141；米国特許第4,837,148号および同第4,929,555号；Saccharomycesについては、Hinnenら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA, (1978) 75:1929；Itoら、J. Bacteriol., (1983) 153:163；Schizosaccharomycesについては、BeachおよびNurse,Nature, (1981) 300:706；Yarrowiaについては、Davidowら、Curr. Genet., (1985) 10:39；Gaillardinら、Curr.Genet., (1985) 10:49に記載されている。
【００５３】
本発明は、ここで、特定の有利な実施態様を記載する以下の実施例についての参照により例示される。しかし、これらの実施態様は例示であり、そして本発明をどのようにも制限すると解釈されるべきではないことに留意すべきである。
【実施例】
【００５４】
実施例１
本発明のキメラタンパク質は、MCP-DAFハイブリッド分子のカルボキシ末端に結合された以下のアミノ酸配列とともにMCP-DAFハイブリッド分子であるタンパク質（配列番号３）を含んで構築される：Ala-Lys-Arg-Gly-Leu-Arg-Arg-Arg-Leu-Gly-Arg-Lys-Ala（配列番号４）。キメラタンパク質は、オーバーラップPCRを用いて構築される。PCRテンプレートとして用いられるDNAは、MCPシグナルペプチドとともにMCP-DAFハイブリッド（配列番号３）をコードする（配列番号17）である。以下のプライマーは、MCP-DAFハイブリッド分子のカルボキシ末端に（配列番号４）を導入するための3'末端プライマーとして用いられる：
CAGAGAATTCTCAAGCTTTTCTACCTAGTCTTCTTCTTAGACCTCTTTTAGCTCGGGTAGTACCTGAAGTGGT（配列番号18）。
5'末端プライマーは：
CAGAGGTACCATGGAGCCTCCCGGCCGCCGC（配列番号19）である。
上記のような昆虫細胞中でのDNAの発現を可能にするバキュロウイルス配列を含むプラスミドである、予め切断されたpAcC13中への得られたDNAのクローニングを指向するために、5'末端プライマーはKpnIを有し、そして3'末端プライマーはEcoRI部位を有する。PR-3配列を含みかつ本実施例に使用可能であるpAcC13ベクターは、以下に記載されるようにA.T.C.C.に寄託されている。寄託されたプラスミドに存在するインサートが当該分野で公知の方法により取り出され得ることは、当業者において理解される。
【００５５】
あるいは、より短いヘパリン結合配列Ala-Arg-Arg-Gly-Lys-Leu（配列番号５）は、MCP-DAFハイブリッド（配列番号３）のカルボキシ末端に付加され得る。この場合、プライマーは：
CAGAGAATTCTCATAGTTTACCTCTTCTAGCTCGGGTAGTACCTGAAGTGGT（配列番号20）である。
上記のように、3'末端プライマーは、得られたDNAのpAcC13中へのクローニングを指向するためのEcoRI部位を有する。
【００５６】
実施例２
TFPIのヘパリン結合テールもまた、本発明のキメラタンパク質の構築に使用され得る。この場合、ヘパリン結合テールLys-Thr-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Ile-Ala-Tyr-Glu-Glu-Ile-Phe-Val-Lys-Asn-Met（配列番号15）は、MCP-DAFハイブリッド（配列番号３）のカルボキシ末端に結合される。実施例１におけるように、MCPシグナルペプチド（配列番号17）とともにMCP-DAFハイブリッドをコードするDNAは、オーバーラップPCRのためのテンプレートとして用いられ、そして5'末端プライマー（配列番号19）もである。3'末端プライマーはヌクレオチド配列：
CAGAGAATTCTCACATATTTTTAACAAAAATTTCTTCATATGCTATTTTCACTCTCTGCTTCTTTCTTTTTCTTTTGGTTTTTCGGGTAGTACCTGAAGTGGT（配列番号21）を有する。
3'末端プライマーは、昆虫細胞への形質転換および昆虫細胞中での発現のための、得られたPCR産物のpAcC13中への指向されたクローニングを可能にするEcoRI部位を有する。
【００５７】
あるいは、PCRを、以下の5'プライマー：
ACTTCAGGTACTACCCGTAAAACCAAAAGA（配列番号22）
および以下の3'末端プライマー：
TGAAGTCCATGATGGGCATTTTGGTTTTCTTTTTCT（配列番号23）
を用いて２ラウンド行う。
EcoRI部位を導入するために、第２ラウンドのPCRを、同じ5'末端プライマーおよび以下の配列を有する3'末端プライマーを用いて行う：
CAGAGAATTCTCACATATTTTTAACAAAAATTTC（配列番号24）。
【００５８】
実施例３
本実施例において、フィブロネクチン由来の配列Trp-Gln-Pro-Pro-Arg-Ala-Arg-Ile（配列番号６）を、MCP-DAFハイブリッド（配列番号３）に結合する。PCRを、5'末端プライマー（配列番号19）および以下の配列を有する3'プライマーを用いて行う：
CAGAGAATTCTCATATTCTAGCTCTAGGAGGCTGCCATCGGGTAGTACCTGAAGTGGT（配列番号25）。
上記のような昆虫細胞中でのDNAの発現を可能にするバキュロウイルス配列を含むプラスミドである、予め切断されたpAcC13中への得られたDNAのクローニングを指向するために、5'末端プライマーはKpnIを有し、そして3'末端プライマーはEcoRI部位を有する。
【００５９】
実施例４
他のフィブロネクチン配列もまた、本発明に従ってキメラタンパク質を構築するために有用である。アミノ酸配列は、Leu-Ile-Gly-Arg-Lys-Lys（配列番号７）であり、そしてMCP-DAFハイブリッド（配列番号３）のカルボキシ末端に結合される。PCRを、5'末端プライマー（配列番号19）および以下の配列を有する3'プライマーを用いて行う：
CAGAGAATTCTCAGGTTTTTTTTCTACCTATTAGTCGGGTAGTACCTGAAGTGGT（配列番号26）。
上記のような昆虫細胞中でのDNAの発現を可能にするバキュロウイルス配列を含むプラスミドである、予め切断されたpAcC13中への得られたDNAのクローニングを指向するために、5'末端プライマーはKpnIを有し、そして3'末端プライマーはEcoRI部位を有する。
【００６０】
実施例５
本発明のキメラタンパク質の補体阻害活性についてのアッセイ
古典的経路活性化の阻害
ヒト血清を、Gelatin Veronal Buffer (GVB) (Sigma, St. Louis, MO カタログ＃G-6514）中に希釈して、70％最大溶血をもたらすために十分な補体を得た。希釈は、1:10〜1:120の範囲であり得る。IgM感作ヒツジ赤血球（SRBC）懸濁液（Diamedix CH50 Test Kit ＃789-001）を遠心チューブに移し、そして500×gにて１分間（２〜８℃）スピンさせる。２mlの上清液を取り出し、そしてSRBCを残りの１ml中に再懸濁する。次いで、この調製物を氷水浴中に保存する。
【００６１】
次いで、以下のものをＶ底マイクロタイタープレートの２連のウェルに加える：
実験用は
100μl SRBC懸濁液；50ul GVB；50ul 各血清希釈物、を含む
ネガティブコントロールは、
100μl SRBC懸濁液；100μl GVB、を含む
最大溶解コントロールは、
上記のようにスピンダウンされ、そして200μlの水中に再懸濁した100μl SRBC懸濁液を含むプレートを、37℃にて30分間インキュベートする。次いで、プレートを500×gにて１分間（２〜８℃）遠心分離にかけ、そして100ulの得られた上清液を排出する。次いで、各試料の吸光度を405nmで測定する。次いで、各血清希釈物の最大溶解の割合を、以下の式に従って算出する：
{[O.D.試料−O.D.ネガティブコントロール]/[O.D.最大−O.D.ネガティブコントロール]}×100。
約70％の最大溶解が生じる血清希釈が、本発明の分子でのその後のアッセイが行われるべき希釈である。この希釈は、テストされるヒト血清の特定のロットにのみ適用し、そして新規の各血清ロットについて繰り返されなければならない。
【００６２】
本発明の分子を含む標準溶液を、希釈のために0.8μMの濃度でGVB中で調製し得る。（この濃度は、特定の分子の活性に依存して、高くまたは低く調整され得る）。MCPまたはMCP-DAFを用いる標準は、80μM MCPまたは0.8μM MCP-DAFを用いて処方され得る。標準溶液の４つの連続した1:2希釈物を調製する。次いで、アッセイを、以下の成分をＶ底マイクロタイタープレートの２連のウェルに加えることにより行う：
実験用は
100μl SRBC懸濁液；50μl 標準溶液または希釈液；50μlの血清希釈物
ネガティブコントロールは
100μl SRBC懸濁液；50μl 標準溶液；50μl GVB
ポジティブコントロールは
上記のようにスピンダウンされ、そして200μlの水中に再懸濁した100μl SRBC懸濁液
プレートを、37℃にて30分間インキュベートする。次いで、プレートを500×gにて１分間（２〜８℃）遠心分離にかけ、そして100μlの得られた上清液を排出する。次いで、各試料の吸光度を405nmで測定する。次いで、各希釈物のポジティブコントロールSRBC溶解の割合を、以下の式に従って算出する：
{[O.D.試料−O.D.ネガティブコントロール]/[O.D.ポジティブコントロール−O.D.ネガティブコントロール]}×100。
阻害％は、100％−(％ポジティブコントロール)である。
【００６３】
第Ｉ因子アッセイ
標準を、本発明の分子を20μlのアッセイ緩衝液（３mMリン酸ナトリウム、pH 7.2；25mM塩化ナトリウム；0.5％ NP-40）中へ約6.0nMの濃度に希釈することにより調製する。次いで、５つの連続した1:2希釈物を調製する。各アッセイについて、６ulの連続希釈物を、２μlの第Ｉ因子溶液および８μlのiC3溶液に添加する。第Ｉ因子ストック溶液を、１mlアッセイ緩衝液中で１mgのファクターＩ（Quidel、カタログ＃A411）を用いて調製する。使用の直前に、４ulの第Ｉ因子ストック溶液を50μlのアッセイ緩衝液に添加して、第Ｉ因子溶液を調製する。iC3溶液を、１mlアッセイ緩衝液中の0.5mg精製C3（Quidel、カタログ番号A401）を用いて調製する。等量の4.0M臭化カリウムを添加して、そしてiC3溶液を、光から混合物を保護しながら37℃にて１時間インキュベートする。
【００６４】
ネガティブコントロールもまた、８μl iC3溶液、６μlアッセイ緩衝液、および２μl第Ｉ因子溶液を用いて調製する。次いで、試料を37℃にて１時間インキュベートする。反応を、各チューブへのSDS試料緩衝液（20％スクロース；２％ドデシル硫酸ナトリウム；100mM Tris（pH 6.8）；20mM ジチオスレイトール；0.01％ブロモフェノールブルー）の添加により停止する。次いで、試料を100度の水浴中で５分間煮沸し、そして室温に冷却させる。次いで、試料を10％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に供する。ゲルを、50％メタノール；10％酢酸；0.05％クーマシーブリリアントブルー中で１時間染色する。次いで、ゲルを15％メタノールおよび10％酢酸中で一晩脱色し得る。ゲルを乾燥し、そしてゲルのレーンをデンシトメーターを用いてスキャンし得る。C3α鎖は120kDの生来の分子量を有し、そして75kDおよび45kDのフラグメントに切断される。各補体成分に対応する３つのピークの下の面積を決定し、そして各ピークが表す総面積の割合を算出する。α鎖の切断の割合を以下のように算出する：
切断％＝100％−(生来の分子量である総面積の％)。
【００６５】
寄託情報
以下の材料をアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託した：
【００６６】
【化４】
2006117696.tif 000005
【００６７】
上記の材料は、本発明の譲渡人であるChiron Corporationによって、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）、12301 Parklawn Drive, Rockville, Marylandに、特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づいて、寄託された。受託番号は、電話番号(301)881-2600でATCCから入手可能である。
【００６８】
これらの寄託物は、当業者に便利なように提供され、そして寄託が米国特許法第112条により必要とされる承認ではない。これらの寄託物のいずれかの核酸配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書に参考として援用され、そして本明細書に記載された配列中に何らかの誤りがある場合に参照されるべきである。寄託された材料を製造し、使用し、または販売するためにはライセンスが必要であり得、そしてこのようなライセンスは本明細書により与えられない。
【００６９】
【化５】
2006117696.tif 000006
【００７０】
【化６】
2006117696.tif 000007
【００７１】
【化７】
2006117696.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１−１】図１は、MCP-DAFハイブリッド分子のコーディング領域を含むDNA配列である。
【図１−２】図１は、MCP-DAFハイブリッド分子のコーディング領域を含むDNA配列である。
【図１−１】
2006117696.tif 000009
【図１−２】
2006117696.tif 000010