(57)【要約】      （修正有）【課題】  製パン性に関与するタンパク質を蓄積するコムギ代替植物の提供。【解決手段】  コムギグルテニンタンパク質GluD1 yタイプ10番をコードする以下の(a)又は(b)の遺伝子を含有する、形質転換イネ。(a) 特定の塩基配列を有するDNAからなる遺伝子、又は(b) 特定のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コムギグルテニンタンパク質GluD1 yタイプ10番をコードする以下の(a)又は(b)の遺伝子を含有する、形質転換イネ。
(a) 配列番号１に示される塩基配列を有するDNAからなる遺伝子、又は
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
【請求項２】
イネの品種が日本晴である、請求項１に記載の形質転換イネ。
【請求項３】
コムギグルテニンタンパク質GluD1 yタイプ10番をコードする以下の(a)又は(b)の遺伝子を、イネ細胞に導入することを特徴とする、高製パン性の形質転換イネの作出方法。
(a) 配列番号１に示される塩基配列を有するDNAからなる遺伝子、又は
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
【請求項４】
コムギグルテニンタンパク質GluD1 yタイプ10番をコードする以下の(a)又は(b)の遺伝子を含有する、イネに高製パン性を付与するための組換えベクター。
(a) 配列番号１に示される塩基配列を有するDNAからなる遺伝子、又は
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製パン性に関与するコムギ由来タンパク質であるグルテニン・サブユニットの1つGluD1 yタイプ10番を蓄積する品種改良イネの作出に関する。
【背景技術】
【０００２】
コムギの穀実から生産される小麦粉は、パンの主たる原料である。小麦粉に含まれるタンパク質としてはグルテニン、グリアジン、アルブミンなどがあるが、このうち、良質のパンを作るために一番重要な成分はグルテニンであると考えられている。グルテニンは、低分子及び高分子の各種グルテニン・サブユニットから構成される重合体であり、高い弾力性を有する。なお小麦粉に含まれる上記タンパク質をコードする遺伝子については、既に各種タイプの塩基配列が決定され、報告されている（例えば、非特許文献１）。
【０００３】
近年、日本ではパン食が普及したが、一方でパンの原料であるコムギの自給率は非常に低率に留まっている。これは日本の気候がコムギの栽培にあまり適していないことが一因である。日本では、コムギは北海道の一部を除いて秋に蒔かれ、春先の3月の中旬頃から伸び始める。しかし6月上旬にはもう梅雨に入るため、コムギが成長し、花を開き、実を充実させる期間が正味3ヶ月しかなく、このため日本におけるコムギの収量増加が困難になっている。日本において良質な小麦粉を安定的に生産するためには、高製パン性であり日本の気候でも高収量が期待できるコムギ新品種の作出、あるいは高製パン性であり日本の気候でも高収量のコムギ代替植物の作出が望まれる。
【０００４】
従来、植物新品種の作出は、交配育種あるいは突然変異育種などを基盤としていた。しかし、交配や突然変異による育種では、基本的には個体差や偶然に期待せざるを得ないため、品種改良の成功率が必ずしも高くなく、目的の品種を得るために多大な費用と時間を要していた。この問題を解決すべく、近年では、遺伝子工学的手法を利用した植物新品種の作出が行われている。さらに、遺伝子工学的手法の発達により、交配不可能な品種間での機能付与も可能になってきた。例えば、イネに外来遺伝子産物を発現・蓄積させる試みとして、ダイズグリシニンタンパク質を発現させる研究など、多数の報告がある（特許文献1）。しかし高製パン性と高収量とが達成されたコムギ新品種又はコムギ代替植物は、これまで報告されていない。
【特許文献１】特開２０００−５０８７１号公報
【非特許文献１】Anderson O.D. et al., Nucleic Acids Research (1989) 17 (1), p.461-462
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、製パン性に関与するタンパク質を蓄積するコムギ代替植物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
水田による湛水栽培は、畑作にはない多くの特長をもつ。畑作では、特定の成分が欠乏したり、老廃物が溜まったり、病害を起こす生物が増えたりする連作障害を生じる可能性が高い。一方、水田では、灌漑水によって欠けた成分が運び込まれ、老廃物が洗い流される。病害を起こす生物も水をかぶった土中では生き残るのが難しい。水田はまた気温の変動を和らげ、洪水の緩和に役立つ。逆に、畑地では、表土は雨水や風によって運び去られ、土壌の侵食・亡欠が起こる。
【０００７】
また、日本では現在、水田をフルに使ってイネを育てると1年に1500万トンの米が生産できるにもかかわらず、最近の米の消費量の低下により、水田の約40％（600万トン相当）がイネの作付け制限を受けている。一方、コムギに関しては、日本の単位面積当たりの生産量が極めて低く、輸入量が年間600万トンに達する。この輸入量は、ちょうど、イネの作付け制限を受けている面積に相当する。
【０００８】
さらに日本では、イネは、コムギより寒さに弱く、水田に移植するのは5月の初めになるが、夏中かかって茎葉を育て、9月中旬までゆっくり実を充実させる。従ってイネは正味5ヶ月間にわたって生育することになるため、正味3ヶ月程度の生育期間となるコムギに比べて収量が多いのは、自明のことである。
【０００９】
そこで本発明者らは、このような栽培上の様々な利点を有するイネを利用して高製パン性のコムギ代替植物を作出できれば、コムギの栽培には一般に適さない日本の気候の下でも小麦粉代替品を効率的に生産することが可能になるばかりか、イネの作付け制限を受けている水田を有効活用することができ、農業振興の上でも有用であろうと考えた。
【００１０】
本発明者らは、このような考えの下に、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、コムギのDゲノムに座乗するGluD1 yタイプ10番のグルテニン・サブユニットタンパク質（コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番）をコードする遺伝子を選び、それをコムギゲノムから単離して植物形質転換用ベクター中に挿入し、アグロバクテリウム法にてイネ細胞に導入し形質転換し、ハイグロマイシン耐性イネを選別後、米粒内へのグルテニンタンパク質の蓄積の有無を検証したところ、米粒中にコムギグルテニンタンパク質を蓄積する形質転換イネを取得することに成功した。この形質転換イネは、高製パン性を示す良質な小麦粉の原料となる穀実（ブレッドライス）を生産することが示されたことから、本発明は完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[1] コムギグルテニンタンパク質GluD1 yタイプ10番をコードする以下の(a)又は(b)の遺伝子を含有する、形質転換イネ。
(a) 配列番号１に示される塩基配列を有するDNAからなる遺伝子、又は
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
[2] イネの品種が日本晴である、上記[1]に記載の形質転換イネ。
[3] コムギグルテニンタンパク質GluD1 yタイプ10番をコードする以下の(a)又は(b)の遺伝子を、イネ細胞に導入することを特徴とする、高製パン性の形質転換イネの作出方法。
(a) 配列番号１に示される塩基配列を有するDNAからなる遺伝子、又は
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
[4] コムギグルテニンタンパク質GluD1 yタイプ10番をコードする以下の(a)又は(b)の遺伝子を含有する、イネに高製パン性を付与するための組換えベクター。
(a) 配列番号１に示される塩基配列を有するDNAからなる遺伝子、又は
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る形質転換イネは、米粒中に、高製パン性を示すコムギグルテニンタンパク質を蓄積することができる。すなわち本発明に係る形質転換イネは、良質な小麦粉代替品の原料となる穀実（ブレッドライス）を生産できる。そして、本発明に係る高製パン性の形質転換イネの作出方法を用いれば、コムギの栽培に適さない気候条件の土地でも栽培可能な高製パン性のコムギ代替植物を、容易に作製することができる。そのような方法において、本発明に係るイネに高製パン性を付与するためのコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を含有する組換えベクターは、遺伝子導入用に非常に好適に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
１．コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子
本発明では、GluD1 yタイプ10番のグルテニン・サブユニットタンパク質（コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番）をコードする遺伝子を、イネに導入する。
【００１４】
本発明に係るコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子は、限定するものではないが、典型的には、コムギのDゲノム上のGlu-D1遺伝子座に存在するグルテニン・サブユニットをコードする対立遺伝子の１つである。好ましくは、本発明に係るコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列を有するDNAからなる遺伝子であるか、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列（648アミノ酸）からなるタンパク質をコードする遺伝子である。配列番号１に示すコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子の塩基配列は、国際塩基配列データベースにおけるアクセッション番号X12929として既に報告されている（非特許文献１）。配列番号１の塩基配列において、塩基番号617〜619が開始コドンであり、塩基番号2561〜2563は終止コドンである。本発明のコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子は、GluD1 yタイプ10番タンパク質のグルテニン物性を保持する限り、配列番号２に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個（例えば2〜10個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また本発明のコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつGluD1 yタイプ10番のグルテニン物性を保持するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子であってもよい。
【００１５】
本発明において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成される条件をいう。例えば、相同性が高い核酸同士、すなわち90％以上、好ましくは95％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が15〜750mM、好ましくは50〜750mM、より好ましくは300〜750mM、温度が25〜70℃、好ましくは50℃〜70℃、より好ましくは55〜65℃、ホルムアミド濃度0〜50％、好ましくは20〜50％、より好ましくは35〜45％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が15〜600mM、好ましくは50〜600mM、より好ましくは300〜600mM、温度が50〜70℃、好ましくは55〜70℃、より好ましくは60〜65℃である。
【００１６】
本発明において「遺伝子」には、DNAおよびRNAが含まれるものとする。また、DNAには少なくともゲノムDNA、cDNAが含まれ、RNAには、mRNAなどが含まれる。本発明の「遺伝子」は、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする配列以外に、非翻訳領域（UTR）の配列などの配列を含むものであってもよい。
【００１７】
本発明に係るコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子は、例えば配列番号１又は２の配列に基づいて設計したプライマーを用いて、高製パン性を示すコムギ（好ましくは品種Max）由来の核酸を鋳型としたPCR増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また本発明のコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子は、高製パン性を示すコムギ（好ましくは品種Max）由来の核酸を鋳型とし、上記コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子の一部であるDNA断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。これらの方法において鋳型として用いる核酸は、例えば、高製パン性を示すコムギ品種、例えばMax、Cheyenneなどから、常法により抽出したゲノムDNAであってよいし、常法により抽出したmRNAから逆転写合成したcDNA等であってもよい。鋳型として用いる核酸は、精製ゲノムDNA、精製cDNA、cDNAライブラリー又はゲノムDNAライブラリー等であってもよい。あるいは本発明のコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子は、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
【００１８】
さらに、部位特異的突然変異誘発法等によって、得られたコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子の塩基配列（ひいてはコードされるアミノ酸配列）に所望の突然変異を導入してもよい。遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutan-K（TAKARA社製）やMutan-G（TAKARA社製））などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異の導入が行われる。
【００１９】
なお本発明において用いるmRNAの調製、cDNAの作製、PCR、RT-PCR、ライブラリーの作製、ベクター中へのライゲーション、細胞の形質転換、DNAの塩基配列の決定、核酸化学合成、タンパク質のN末端側のアミノ酸配列決定、突然変異誘発、タンパク質の抽出等の実験は、通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。そのような実験書としては、例えば、SambrookらのMolecular Cloning, A laboratory manual, 2001, Eds., Sambrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Pressを挙げることができる。
【００２０】
本発明においては「高製パン性」との用語は、植物、植物組織、細胞、小麦粉、小麦粉の成分であるグルテニン等に対して用いられる。本発明において「高製パン性」とは、当該植物若しくは植物組織を原料として得られる小麦粉、当該小麦粉、又は当該グルテニンを高い割合で含む小麦粉を用いてパンを製造したときに、対照サンプルと比較して、そのパン体積が増大することを意味する。例えば、ある小麦粉を用いて、パン酵母としてドライイーストを使用する中種生地法によりパンを製造したときに、市販の強力粉（例えば日本製粉社  専門店高級パン用粉）を代わりに用いた対照のパン体積を100％として、パン体積が108％以上、好ましくは110〜200％に増大する場合、その小麦粉又はその小麦粉の原料たる植物等は「高製パン性」である。「高製パン性」の判断においては、パン体積の増大に加えて、官能評価の向上が確認されることが好ましい。
【００２１】
２．宿主植物
本発明において、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を導入する宿主植物としては、イネ（Oryza sativa）を用いることが好ましい。イネの品種は特に限定されないが、好ましいイネ品種の例としては、「日本晴（Nihonbare）」、「ほしのゆめ（Hoshinoyume）」、「きらら３９７(Kirara397)」、「ゆきひかり(Yukihikari)」、「ゆきまる(Yukimaru)」、「ほのか２２４(Honoka224)」、「どんとこい(Dontokoi)」、「コシヒカリ(Koshihikari)」、「ササニシキ(Sasanishiki)」、「ヒトメボレ(Hitomebore)」、「あきたこまち(Akitakomachi)」、「はえぬき(Haenuki)」、「キヌヒカリ(Kinuhikari)」、「むつほまれ(Mutsuhomare)」、「ヒノヒカリ(Hinohikari)」、「津軽おとめ(Tsugaruotome)」、「つがるロマン(Tsugaruroman)」、「ゆめあかり(Yumeakari)」、「ハナエチゼン(Hanaechizen)」、「夢つくし(Yumetsukushi)」、「ハツシモ(Hatsushimo)」、「どまんなか(Domannaka)」、「かけはし(Kakehashi)」、「いわてっこ(Iwatekko)」、「まなむすめ(Manamusume)」、「めんこいな(Menkoina)」、「チヨニシキ(Chiyonishiki)」、「ふくみらい(Fukumirai)」等が挙げられる。これらのイネ品種は、例えば独立行政法人農業生物資源研究所  ジーンバンクから入手することができる。
【００２２】
３．コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を含有する組換えベクター
上記１のようにして得られた本発明の遺伝子をベクター中に挿入して、組換えベクターを作製することができる。
【００２３】
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を連結（挿入）することにより作製することができる。ベクターにコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してリガーゼを用いて連結する方法などが採用される。遺伝子を挿入するベクターは、特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられるが、リゾビウム由来のプラスミドDNA、バイナリーベクターなどの、植物形質転換用のベクターであることが好ましい。本発明では、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を含有する組換えベクターとしては、当該遺伝子を、導入したイネ細胞のゲノム中に組み込むことができるベクターがより好ましい。本発明のこのような組換えベクターは、イネにコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を導入し、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をイネ細胞中で発現させることにより、イネに高製パン性を付与することができる。従って本発明は、イネに高製パン性を付与するための、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を含有する組換えベクターにも関する。
【００２４】
コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を含有する本発明の組換えベクターには、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする配列の他に、当該遺伝子を発現させるための構成性または一過性のプロモーター配列（カリフラワーモザイクウイルス由来の35Sプロモーターや熱ショック誘導タンパク質のプロモーターなど）、形質転換体の選抜を容易にする選択マーカー遺伝子、リゾビウムのバイナリーベクター系を使用するための複製開始点（TiまたはRiプラスミド由来の複製開始点など）等を含んでもよい。選択マーカーとしては、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。
【００２５】
４．コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子の導入による形質転換イネの作製
本発明の形質転換イネを作製するには、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子をイネ細胞に導入して、形質転換イネ細胞を取得すればよい。またその形質転換イネ細胞を再生させることにより、形質転換イネの植物体を作製することができる。
【００２６】
本発明において「遺伝子の導入」とは、例えば公知の遺伝子工学的手法により、当該遺伝子を、上記宿主植物（すなわち、イネ）の細胞内に発現可能な形で導入することを意味する。ここで導入された遺伝子は、宿主植物のゲノムDNA中に組み込まれてもよいし、外来ベクターに含有されたままで存在していてもよい。
【００２７】
コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を植物細胞中に導入する方法としては、限定するものではないが、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール（PEG）法、マイクロインジェクション法、プロトプラスト融合法などの、すでに確立され、本願発明の技術分野において広く用いられている植物形質転換法を用いることができる。これらの植物形質転換法は、『島本功、岡田清孝  監修  「新版  モデル植物の実験プロトコール  遺伝学的手法からゲノム解析まで」（2001） 秀潤社』などの一般的な教科書の記載に従って行うことができる。例えばアグロバクテリウム法を用いる場合は、上記３のようにして作製したコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を組み込んだアグロバクテリウム由来のプラスミドベクター（例えばpBI101やpBI121）又はバイナリーベクター（pPZP2H-lac）を、リゾビウム、例えばリゾビウム・ラジオバクター(Rhizobium radiobactor)に導入し、この土壌細菌をイネのカルスに接種して感染させ、イネの形質転換体を得ることができる。アグロバクテリウム法は、近年いくつかのバリエーションが開発されているが（例えば、Hiei Y, et al., Plant J., 6: 271 (1994)；国際公開WO 01/06844に開示された土岐らの方法など）、一例としては、形質転換しようとするイネの完熟種子を滅菌し、その種子からカルスを誘導し培養し、これとバイナリーベクターを導入したリゾビウム・ラジオバクターを共培養させて感染させる方法により、イネ細胞にコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を導入することができる。続いて、カルスに付着したリゾビウムを洗浄し、選択培地でカルスを培養し、生存したカルスを再分化培地（適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）を含む）で培養すれば、形質転換されたイネ細胞から選択的に植物体を再生することができる。
【００２８】
ポリエチレングリコール法を用いる場合には、まず細胞壁を酵素で溶かして取り除き、プロトプラストにしてから、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を、ポリエチレングリコールを用いて細胞内に導入してから、植物体に再生すればよい（Datta SK: In Gene Transfer To Plants（Potrykus I and Spangenberg, Eds）pp. 66-74 (1995)）。この方法では、遺伝子を導入するイネは、インド型イネ品種がより適している。
【００２９】
エレクトロポレーション法を用いる場合には、まず細胞壁を酵素で溶かして取り除き、プロトプラストにしてから、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を、電気パルスをかけることにより細胞内に導入し、その後植物体に再生すればよい（Toki S, et al., Plant Physiol., 100: 1503 (1992)）。この方法では、遺伝子を導入するイネは、日本型イネ品種がより適している。エレクトロポレーション法では、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子は、遺伝子そのものの形態であってもよいし、ベクター中に組み込まれたものでもよい。
【００３０】
パーティクルガン法を用いる場合には、イネ植物体、イネ器官、イネ組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい（Christou P, et al., Biotechnology 9: 957 (1991)）。このように調製した試料に対し、遺伝子導入装置（例えばPDS-1000(BIO-RAD社)等）を用いて、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子でコーティングした金やタングステンなどの微粒子（径約1〜2μm）を高圧ガスで噴射することにより、当該遺伝子をイネ細胞内に導入する。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は450〜2000psi程度の圧力、4〜12cm程度の距離で行う。パーティクルガン法では、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子は、遺伝子そのものの形態であってもよいし、ベクター中に組み込まれたものでもよい。
【００３１】
コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子がイネ細胞に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等の周知の方法により行うことができる。例えば、形質転換イネからゲノムDNAを調製し、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を特異的に増幅できるプライマーを用いて、PCRを行う。増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を期待されるサイズのバンドとして検出することにより、そのイネ細胞にムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子が導入されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。またマイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。さらに、そのイネ細胞からタンパク質を抽出し、２次元電気泳動を行って分画し、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番と思われるタンパク質のバンドを検出することにより、イネ細胞に導入されたコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番が発現されていること、すなわちそのイネ細胞が形質転換されていることが示唆される。続いて、検出されたタンパク質についてエドマン分解等によりN末端のアミノ酸配列を決定し、配列番号２のN末端の配列と一致するかどうかを確認することにより、そのイネ細胞の形質転換をさらに実証することができる。
【００３２】
本発明において、「形質転換イネ」とは、導入されたコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を、発現されているか若しくは発現されうる状態で細胞内に有するイネの形質転換細胞でありうる。あるいは本発明の形質転換イネは、そのような形質転換細胞を少なくとも一部に含むイネの植物体全体又は器官(例えば葉、花弁、茎、根、穀実（種子）等)、組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等)若しくは培養細胞（例えばカルス）であってもよい。本発明の形質転換イネとしては、その穀実（種子）にコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番が蓄積されるものが好ましい。「形質転換イネ」には、遺伝子を導入した形質転換細胞だけではなく、それが増殖したカルス、そこから再生させた植物体、再生した植物体の一部をも包含するものとする。また本発明の形質転換イネには、当該遺伝子を導入した植物体（形質転換された細胞やカルスから再生された植物体を含む）の有性生殖又は無性生殖により得られる子孫の植物体、及びその子孫植物体の組織や器官等の一部（種子、プロトプラストなど）も包含するものとする。本発明の形質転換イネは、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を導入して形質転換したイネ植物体から、穀粒（種子）、プロトプラストなどの繁殖材料を取得し、それを栽培又は培養することによって量産することができる。
【００３３】
本発明の形質転換イネの穀粒に蓄積するコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番は、高製パン性を付与するグルテニン・サブユニットである。従って本発明の形質転換イネの穀粒は、良質な小麦粉代替品の原料として用いることができる。すなわち本発明の形質転換イネの穀粒は、製パン用の穀粒として使用されうる。
【００３４】
上記のような本発明の成果は、作付け制限を受けている日本国内の水田を利用して、輸入に依存している小麦粉の代替植物（ブレッドライス）を国内生産する手段を提供することにより、製パン粉の安定供給をもたらすものである。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
(1) コムギグルテニンGluD1yタイプ10番をコードする遺伝子の単離
高製パン性を示すコムギ品種Max（Triticum aestivum；ホクレン農業協同組合連合会から分与）から、常法に従いゲノムDNAを抽出した。次に、これを鋳型にして、PCR法にてコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子（3275塩基対）を増幅した。このPCRに用いたプライマー配列は以下の通りであった。
【００３６】
フォワード・プライマー GluD1-2b-2321U:   CGC GTC ACA GAA CAG ATA（配列番号３）
リバース・プライマー GluD1-2b-5579L:   TAT GCG TTA TTC AGT AAG（配列番号４）
このPCR反応条件は、以下の通りであった：94℃で1分→ 61℃で1分→ 72℃で2分（30サイクル）。
【００３７】
このようにして得られた3275塩基対の増幅断片を、常法により、pCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン株式会社）中にサブクローンし、得られたクローンをTOPO-GluDly10と命名した。次いでTOPO-GluDly10中の増幅断片全体の塩基配列を決定し、その増幅断片が、すでに塩基配列が報告されているコムギグルテンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子（非特許文献１、アクセッション番号X12929）に相当することを確認した。単離されたコムギグルテンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号１に示す。
【００３８】
(2) コムギグルテニンGluD1yタイプ10番をコードする遺伝子を導入した形質転換イネの作製
クローンTOPO-GluDly10をEcoR1で切断し、GluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を含むゲノム断片を切り出して、それを植物形質転換用バイナリーベクターであるpPZP2H-lac（Plant Biotechnology 18, 219-222, 2001）のSmaIサイトに挿入した。こうして得られたバイナリーベクターをGluD1yMfullと命名した。このバイナリーベクターをリゾビウム・ラジオバクターEHE101（理研ジーンバンクから分与）に導入した後、アグロバクテリアを介する形質転換法（土岐らの方法：国際公開WO 01/06844）に従い、イネ品種日本晴（Oryza sativa；  独立行政法人農業生物資源研究所  ジーンバンク  遺伝資源管理課から分与）のカルスに感染させ、ハイグロマイシン存在下で再生個体を選別した。
【００３９】
(3) 形質転換イネの穀実に蓄積されたコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番タンパク質の確認
形質転換イネ植物体から穀実を採種し、その胚乳部分から常法により全タンパク質を抽出した。抽出したタンパク質を、10-20％グラジエントポリアクリルアミドゲルによるSDS-PAGE電気泳動にかけ、全タンパク質を染色試薬CBB-R250によりタンパク質染色することにより、形質転換イネにだけ特異的に蓄積しているタンパク質を確認した（図１中、矢印）。
【００４０】
図１中、（Ａ）は電気泳動写真の全体図である。コムギグルテニンと予想されるタンパク質のバンドを矢印で示した。（Ｂ）は、コムギグルテニンタンパク質が蓄積している付近の電気泳動写真（Ａ）の拡大図である。＊印は、コムギグルテニンと推定されるバンドを示している。図（Ａ）及び（Ｂ）ともに、最も左側のレーン（ＮＢ）のサンプルは、形質転換していない日本晴の種子から抽出した全タンパク質（対照サンプル）である。また写真上部に線で示した1〜6レーンのサンプルは、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を導入した形質転換イネの植物体に結実した種子から抽出した全タンパク質である。これらの結果から分かる通り、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を導入した形質転換イネでは、コムギグルテニンと推定されるバンドが検出された。一方、形質転換していないイネでは、そのバンドは検出されなかった。
【００４１】
このコムギグルテニンと推定されるバンドのタンパク質が、真に導入した当該遺伝子由来の翻訳産物であることを確認するために、この画分をゲルから抽出し、2次元電気泳動にかけてさらに高精度に分画した。図２は、図１で示したコムギグルテニン(GluD1 yタイプ10番)と推定されたバンドのタンパク質を溶出させ、それをさらに2次元電気泳動により分画した結果を示す。遺伝子を導入したイネ由来のサンプルでのみ検出された、コムギグルテニン(GluD1 yタイプ10番)と推定されるタンパク質を、矢印で示した。このように、2次元電気泳動の結果からも、コムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を導入したイネでだけ検出されるタンパク質の存在が示された。
【００４２】
さらに、2次元電気泳動で分画したコムギグルテニンと推定されるタンパク質をゲルから抽出し、エドマン分解法によりＮ末端アミノ酸配列を解析した。その結果、このタンパク質のＮ末端配列が、
Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ  （配列番号５）
であることが示された。この配列中、Ｘは同定できなかったアミノ酸を指す。この配列は、遺伝子導入したコムギグルテニン（GluD1 yタイプ10番）のアミノ酸配列（配列番号２）のＮ末端と一致した。
【００４３】
以上の結果から、形質転換イネで特異的に発現し、その穀実に蓄積されるタンパク質が、導入したコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子の遺伝子産物であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のコムギグルテニンGluD1 yタイプ10番をコードする遺伝子を含有する形質転換イネは、日本の気候条件下でも、コムギグルテニンタンパク質を蓄積したイネ穀粒を高収量で生産することができる植物として、有利に使用することができる。本発明の形質転換イネを用いれば、減反によりイネの作出を制限されている水田で、コムギ粉の代替品となりうる穀実（ブレッドライス）を収穫できる。すなわち本発明は、イネの新品種を提供するのみならず、畑作農法に致命的な連作障害などに起因するコムギの不作に対しても、その代替植物を提供するものである。従って本発明は、国内の農業振興に寄与するだけでなく、国際的な視点に立って、コムギを利用する産業への新しい農業資源の供給を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】イネ種子より抽出した全タンパク質をSDS-PAGE電気泳動にかけ、分画された全タンパク質をタンパク質染色した結果を示す写真である。
【図２】図１で示したコムギグルテニン（GluD1 yタイプ10番）と推定されたバンドのタンパク質を溶出させ、それをさらに2次元電気泳動により分画した結果を示す写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００４６】
配列番号３及び４の配列は、プライマーである。
【図１】
2006109735.tif 000002
【図２】
2006109735.tif 000003
【配列表】
2006109735000001.app