(57)【要約】      （修正有）【課題】イヌＩgＥとそのレセプターとの結合を拮抗的に阻害することができ、イヌのアレルギー疾患の治療薬成分等として有用な、また、抗原特異的イヌＩgＥの検出試薬のイヌ組換え可溶性ＩgＥレセプターα鎖が固相化されたプレート作製のための、さらに、イヌＩgＥの単離・精製のための、新規の組換えイヌＩgＥレセプターの提供。【解決手段】イヌＩgＥレセプターα鎖ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞の培養上清から単離・精製されたイヌ組換え可溶性ＩgＥレセプターα鎖。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌＩgＥレセプターα鎖ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞の培養上清から単離・精製されたイヌ組換え可溶性ＩgＥレセプターα鎖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、イヌ・アレルギー疾患の治療薬等の有効成分として有用なイヌ組換え可溶性ＩgＥレセプターに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＩgＥ（immunoglobulin E）はアレルギーの標的臓器である気道、消化管の粘膜や皮膚、その所属リンパ節等で産生され、ＩgＥレセプターに結合することによって即時型アレルギーを惹起する。ＩgＥレセプターは、α、β、γの３つのサブユニットから構成され、ＩgＥはα鎖を介して特異的に、しかも高い親和性（ＫA＝1010Ｍ-1）でＩgＥレセプターに結合する。ＩgＥレセプターは、アレルギーの中心的なエフェクター細胞であるマスト細胞や好塩基球において恒常的に発現しており、抗原によってこれらの細胞上のレセプター／ＩgＥが架橋されると様々なケミカルメディエーター（炎症性サイトカインやケモカイン等）がエフェクター細胞から放出され、アレルギー反応が誘導される。また、アトピー性皮膚炎患者のこれらの細胞や皮膚に浸潤した好酸球、ランゲルハンス細胞等ではＩgＥレセプターの発現増強が認められることから、ＩgＥレセプターはアレルギー患者において重要なキー・ファクターと考えられている。
【０００３】
獣医学領域においても、アレルギー性皮膚炎をはじめとするアレルギー疾患蓄数は年々増加しており、日常的に接する一般的な疾患となっている。動物のアレルギー疾患は、ヒトでの症例と同様に、慢性の経過をたどり、根治が困難であることが問題となっている。
【０００４】
動物のアレルギー疾患に対しては、様々な治療薬が開発、応用されているが、効果や投薬期間、副作用、耐性などの克服すべき問題点が多く、高い治療効果を上げることが困難である。
【０００５】
その理由として、例えばイヌの場合には、血清ＩgＥを正確に測定できる方法が開発されておらず、またその測定のたのめイヌＩgＥやその特異的抗体が入手困難であったことが挙げられる。また、イヌＩgＥ抗体の精製は様々に試みられているが、精製過程の複雑さや精製標品の純度等に問題点が多く残されているのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、イヌＩgＥとそのレセプターとの結合を拮抗的に阻害することができ、イヌのアレルギー疾患の治療薬成分等として有用な新規の組換え分子を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の(1)〜(9)の発明を提供する。
(1)  イヌＩgＥレセプターα鎖ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞の培養上清から単離・精製されたイヌ組換え可溶性ＩgＥレセプターα鎖。
(2)  発明(1)のイヌ組換え可溶性ＩgＥレセプターα鎖とイヌ血清ＩgＥとを接触させて両者を結合させ、この結合体に標識抗イヌＩgＥ抗体を結合させ、その標識のシグナル強度を測定することによってイヌ血清ＩgＥ値を特定することを特徴とするイヌＩgＥの検出方法。
(3)  イヌ組換え可溶性ＩgＥレセプターα鎖が固相化されている発明(2)の方法。
(4)  少なくとも、以下の要素：
(a)イヌ組換え可溶性ＩgＥレセプターα鎖が固相化されたプレート；および
(b)標識抗イヌＩgＥ抗体を含む試薬
を有することを特徴とするイヌＩgＥの検出キット。
(5)  発明(1)のイヌ組換え可溶性ＩgＥレセプターα鎖とイヌＩgＥとを接触させて両者を結合させ、この結合体にビオチン化抗原を結合させ、さらにこのビオチンに標識アビジンを結合させ、その標識のシグナル強度を測定することによって抗原特異的ＩgＥ値を特定することを特徴とする抗原特異的イヌＩgＥの検出方法。
(6)  イヌ組換え可溶性ＩgＥレセプターα鎖が固相化されている発明(5)の方法。
(7)  少なくとも、以下の要素：
(a)イヌ組換え可溶性ＩgＥレセプターα鎖が固相化されたプレート；
(b)ビオチン化抗原をを含む試薬；および
(c)標識アビジンを含む試薬
を有することを特徴とする抗原特異的イヌＩgＥの検出キット。
(8)  発明(1)のイヌ組換え可溶性ＩgＥレセプターα鎖を結合させた担体を充填させたカラムに、イヌＩgＥを含む試料を供給し、担体に結合したイヌＩgＥを溶出することを特徴とするイヌＩgＥの単離・精製方法。
(9)  発明(1)のイヌ組換え可溶性ＩgＥレセプターα鎖を結合させた担体を充填させたカラム。
【０００８】
以下、この出願の前記発明(1)〜(9)について、実施形態を詳しく説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
この出願の発明(1)の可溶性ＩgＥレセプターα鎖（以下、「可溶性α」と記載することがある）は、イヌＩgＥレセプターα鎖ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞の培養上清から単離・精製されたタンパク質分子である。
【００１０】
イヌＩgＥレセプターα鎖ｃＤＮＡは公知（Immunogenetics 49:580-582, 1999：GenBank Accession No. AB017553）であり、この公知の配列に基づいて化学合成する方法や、イヌｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法によってクローン化することができる。ｃＤＮＡライブラリーから目的のｃＤＮＡをクローン化するには、公知のイヌＩgＥレセプターα鎖ｃＤＮＡの任意部分の塩基配列に基づいてオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用いて、公知の方法によりコロニーあるいはプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行えばよい。また、目的とするｃＤＮＡ断片の両末端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして用いて、イヌ細胞から単離したｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により、イヌＩgＥレセプターα鎖ｃＤＮＡ断片を調製することもできる。
【００１１】
そして、このイヌＩgＥレセプターα鎖ｃＤＮＡを公知の方法により適当な発現ベクターに組換えることにより、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞等の真核細胞で、発明(1)の可溶性αを大量に発現させることができる。
【００１２】
可溶性αを大腸菌などの微生物でＤＮＡ断片を発現させて生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、前記ｃＤＮＡを組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、その培養上清から可溶性αを単離することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢluescript II、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００１３】
また、可溶性αを真核細胞でｃＤＮＡを発現させて生産させる場合には、例えば前記ｃＤＮＡ断片を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに組換え、真核細胞内に導入し、この細胞の培養上清から可溶性αを単離することができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。また、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１などを発現ベクタ−として用いれば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合蛋白質として可溶性αを発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、前記発明(1)の可溶性αを発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００１４】
前記発明(1)の可溶性αを原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養上清から目的蛋白質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ーなどがあげられる。
【００１５】
このようにして単離したイヌ組換え可溶性αは、マスト細胞上のＩgＥレセプターと同じ高親和性でイヌＩgＥと結合する。従って、この可溶性αをイヌの体内に過剰量投与すれば、ＩgＥはこの可溶性αに補足されてしまい、マスト細胞上のＩgＥレセプターに結合することができず、アレルギー反応が誘導されることはない。
【００１６】
次に、この出願の前記発明(2)のイヌＩgＥ検出方法について説明する。
【００１７】
この方法は、前記発明(1)のイヌ組換え可溶性αとイヌ血清とを接触させて両者を結合させ、この結合体に標識抗イヌＩgＥ抗体を結合させ、その標識のシグナル強度を測定することによってイヌ血清ＩgＥ値を特定することを特徴とするものである。
【００１８】
この方法は、いわゆる免疫学的測定法における一次抗体として、発明(1)の可溶性αを用いることを特徴としている。この発明(2)の方法は、液相系で実施することもできるが、極微量定量と操作の簡便化のためには、可溶性αをプレートに固定化した固相系（発明(3)）で実施することが好ましい。また、固相系で実施する場合には、発明(4)のキットを用いることがさらに好ましい。
【００１９】
固相系の方法は、樹脂プレート等に可溶性αを固定化し、この可溶性αにイヌＩgＥを結合させ、非結合ＩgＥを洗浄した後、プレート上に残った結合ＩgＥに標識抗ＩgＥ抗体を結合させ、このこの標識のシグナル強度を測定する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、標識として酵素を用いる場合には、「ELISA（enzyme linked immuno specific assay）」として広く用いられている方法である。
【００２０】
標識としては酵素、放射性同位体、蛍光色素等を用いることができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合ＩgＥ量に換算し、標準値との比較からＩgＥ値が算出される。標識として放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。
【００２１】
酵素は、turn over numberが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のEIAに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗ＩgＥ抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3.3'5.5'−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。
【００２２】
放射性同位体としては、125Ｉや3Ｈ等の通常のRIAで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。
【００２３】
なお、これらによって標識化された抗イヌＩgＥ抗体としては、市販の抗イヌＩgＥ特異的ポリクローナル抗体（米国Bethly社）を用いることができる。
【００２４】
この出願の前記発明（5）の抗原特異的イヌＩgＥ検出方法は、発明(1)のイヌ組換え可溶性ＩgＥレセプターα鎖とイヌＩgＥとを接触させて両者を結合させ、この結合体にビオチン化抗原を結合させ、さらにこのビオチンに標識アビジンを結合させ、その標識のシグナル強度を測定することによって抗原特異的ＩgＥ値を特定することを特徴とするものである。
【００２５】
この発明(5)の方法の場合にも、固相系における実施（発明(6)）が好ましく、この固相系の方法は発明(7)のキットによって行うことができる。
【００２６】
固相系の方法は、樹脂プレート等に可溶性αを固定化し、この可溶性αにイヌＩgＥを結合させ、非結合ＩgＥを洗浄した後、プレート上に残った結合ＩgＥにビオチン化抗原を結合させ、非結合抗原を洗浄した後、さらに標識アビジンをビオチンに結合させ、この標識のシグナル強度を測定する方法である。この方法によって、使用した抗原に特異的に反応するイヌＩgＥを特定することができる。
【００２７】
アビジンへの標識物質は、前記発明(2)と同様の酵素、放射性同位体、蛍光色素等を用いることができる。
【００２８】
なお、発明(4)および(6)のキットにおいては、洗浄液を備えるようにしてもよい。また、標識として酵素を使用する場合には、酵素活性によって発色する基質を含む試薬を備えるようにしてもよい。
【００２９】
この出願の前記発明(8)のイヌＩgＥ単離・精製方法は、発明(1)のイヌ組換え可溶性ＩgＥレセプターα鎖を結合させた担体を充填させたカラムに、イヌＩgＥを含む試料を供給し、担体に結合したイヌＩgＥを溶出することを特徴とするものである。カラムは、通常のアファニティーカラムを用いることができ、担体もアファニティーカラムに用いられるビーズ等を用いることができる。
【００３０】
この方法を実施する場合には、可溶性αを結合した担体を充填したカラム（発明(9)）に、イヌ血清等の試料を供給し、試料中のＩgＥを可溶性αに結合させる。次いで、非結合分子を洗い流した後、適当なバッファーで可溶性αに結合したＩgＥを分離し、溶出させればよい。
【００３１】
以下、実施例を示してこの出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
イヌＩgＥレセプターα鎖の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ（Immunogenetics 49:580-582, 1999）をベクターpMKIT neo（ネオマイシン耐性）に挿入し、この組換えベクターを電気穿孔法によりＣＯＳ７細胞にトランスフェクトし、形質転換細胞群を調製した。これらの細胞の発現産物を対象としてＲＴ−ＰＣＲおよび抗イヌＩgＥレセプターα鎖抗体を用いたウエスタンブロットによるスクリーニングを行い、可溶性α産生細胞株を樹立した。
【００３３】
この細胞株を培養し、培養上清から、抗イヌＩgＥレセプターα鎖抗体を用いたアファニティークロマトグラフィーにより可溶性αを分離・精製した。
【００３４】
イヌ・マスト細胞へのＩgＥ結合に対する可溶性αの拮抗作用をフローサイトメーターで測定した。その結果、図１に示したとおり、この組換え可溶性αはマスト細胞へのＩgＥの結合を完全に阻害した。
【００３５】
また、マスト細胞に[3H]5-hydroxytriptamine（5-HT）を取り込ませ、様々な条件下で脱顆粒を検討した。その結果、図２に示したとおり、可溶性αの共存下ではＩgＥによるマスト細胞からの5-HTの放出が有意に抑制された。
【００３６】
以上の結果から、この発明のイヌ可溶性αは、ＩgＥレセプターを介したイヌ・アレルギー反応の抑制に有効に作用することが確認された。
【実施例２】
【００３７】
96穴ELISAプレートに可溶性αを固定化し、マウス、ラット、ウサギ、ヒトおよびイヌの各血清を流し込み、一定時間反応させたのち、プレートを洗浄し、次いで、酵素（horseradish peroxidase）で標識したヤギ抗イヌＩgＥ epsilon抗体を反応させ、酵素の基質（o-フェニレジアミン）を反応させ、酵素の発色を吸光度測定した。
【００３８】
結果は図３に示したとおりである。この図３から明らかなように、イヌ血清に対してのみシグナルが得られ、マウス、ラット、ウサギ、ヒトのＩgＥとは交叉反応を示さなかった。
【００３９】
以上の結果から、この発明の方法は、イヌＩgＥを高精度で検出可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
以上詳しく説明したとおり、この出願によって、イヌＩgＥとそのレセプターとの結合を拮抗的に阻害することができるイヌ組換え可溶性ＩgＥレセプターαと、これを用いたイヌＩgＥ検出方法、並びにイヌＩgＥ分離・精製方法が提供される。これらの発明によって、イヌ・アレルギー疾患の有効な治療薬、治療方法等の開発が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】この発明の可溶性αの存在下および非存在下におけるイヌマスト細胞へのＩgＥの結合の程度を測定したフローサイトメーターの結果である。
【図２】マスト細胞からの5-HT放出率を、様々な条件下で測定した結果である。
【図３】この発明のＩgＥ検出方法において、各種動物血清を用いた場合の吸光度である。
【図１】
2006321803.tif 000002
【図２】
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【図３】
2006321803.tif 000004