(57)【要約】      （修正有）【課題】老化臭の原因物質をつくる単子葉植物の９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子を解明すること。【解決手段】イネ由来ｃＤＮＡをオオムギ１３−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子をプローブとしてクローニングを行ない、そのクローンを発現させ機能を検査したところ、二つの新らしい９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子を分離することができた。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示す塩基配列からなる９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子。
【請求項２】
配列番号２に示すアミノ酸配列からなる９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼをコードする脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子。
【請求項３】
配列番号５に示す塩基配列からなる９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子。
【請求項４】
配列番号６に示すアミノ酸配列からなる９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼをコードする脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品及び食品の原料として利用される穀類は脂質や脂肪酸を含んでいる。これらの脂質及び脂肪酸は、加工や保存の際に、穀類に含まれるリポキシゲナーゼ又は空気中の酸素による自動酸化によって酸化され、脂質ヒドロペルオキシドや脂肪酸ヒドロペルオキシドを生ずる。これらのヒドロペルオキシドは熱分解、化学的な分解及び酵素による分解などによってアルデヒドを生ずるが、生成したアルデヒドは青臭みや脂肪酸臭を有するため、穀類の香味を著しく損なう（非特許文献１）。
【０００３】
アルデヒドの中でも、トランス−２−ノネナールは臭いを感じる閾値の低いアルデヒドとして知られており、長期間保存して劣化したビールの老化臭の原因物質（非特許文献２）や、加工や保存によって品質の劣化した米が有する嫌な臭いの原因物質（非特許文献３及び４）であると考えられている。
【０００４】
例えば、ビールにおけるトランス−２−ノネナールの生成メカニズムは以下の通りである（非特許文献５）。ビール醸造では麦芽を糖化させて麦汁を得る仕込工程があるが、この工程において脂肪酸ヒドロペルオキシドの一種である９−リノール酸ヒドロペルオキシドが生成する。そして、生成した９−リノール酸ヒドロペルオキシドは、麦芽等のビール原料に含まれる９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼによる開裂分解を受け、トランス−２−ノネナールが生成する。
【０００５】
植物生体中でのアルデヒド合成はオキシリピン合成系が担っていることが双子葉植物で詳しく研究されている（非特許文献６）。アルデヒドは、リポキシゲナーゼと脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼのカスケード反応により生成するが、脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼがこの反応系の律速段階を触媒する酵素であると考えられている。アルデヒドのうち、トランス−２−ノネナールは、９−リノール酸ヒドロペルオキシドが９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼの開裂分解反応触媒作用により生成することが解明されており（非特許文献７）、９−リノール酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子の構造も明らかにされている（非特許文献８）。
【０００６】
一方、イネ、小麦などの単子葉植物では研究が不十分であり、唯一、大麦において脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子が単離されている。しかし、この脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼは９−リノール酸ヒドロペルオキシドを基質とすることができず、したがって、トランス−２−ノネナールの生成には全く関与しない（非特許文献９）。
【０００７】
【非特許文献１】J. Bruce German, Food Processing and Lipid Oxidation. Impact of Processing on Food Safety Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York, 1999
【非特許文献２】Drost, B. W. et al., Flavor stability. J. Am. Soc. Brew. Chem., 48, 124-131. 1990
【非特許文献３】Suzuki et al., Volatile components in stored rice (Oryza sativa (L.)) of varieties with and without lipoxygenase-3 in seeds., J. Agric. Food Chem., 47:1119, 1999
【非特許文献４】Lam.H.S. and Proctor A., Milled Rice Oxidation Volatiles and Odor Development, Journal of Food Science, 68: 2676-2681, 2003
【非特許文献５】Kuroda et al., Characterization of factors involved in the production of 2(E)-nonenal during mashing, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67:691-697, 2003
【非特許文献６】Blee, E., Phytooxylipins and plant defence reactions. Prog. Lipid Res., 37, 33-72, 1998
【非特許文献７】Matsui et al., Fatty acid 9- and 13-hydroperoxide lyases from cucumber., FEBS Lett. 481, 183-8, 2000
【非特許文献８】Matsui, K. et al., Bell pepper fruit fatty acid hydroperoxide lyase is a cytochrome P450 (CYP74B). FEBS Lett., 394, 21-24, 1996
【非特許文献９】Koeduka et al., Kinetics of barley FA hydroperoxide lyase are modulated by salts and detergents., Lipids, 38:1167-1172, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
単子葉植物の９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子が解明されれば、制限酵素切断片長多型（ＲＦＬＰ）や一塩基多型（ＳＮＰ）を見出し、９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼを欠失した品種、又は９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼの安定性や活性が低い品種の選抜が可能になる。また、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に代表される遺伝子抑制技術などにより、９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ活性が抑制された品種を作出することができる。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、単子葉植物の９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子を解明することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
近年のゲノム技術の進展により遺伝子情報は充分に蓄積されつつあり、既知の遺伝子情報を基にしてそれに類似する遺伝子を抽出することは可能であるが、触媒作用、特に生成物を特定することは現在の技術でも非常に難しい。脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼは、チトクロームＰ−４５０ファミリーに属するが、このファミリーは数千種類の類似遺伝子群からなっており、遺伝子配列の類似性から酵素タンパク質の機能を推定することは不可能である。
【００１１】
そこで、本発明者らは、イネに関する遺伝子公開情報を元に、脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼと類似性のある遺伝子を多数スクリーニングし、各遺伝子を発現させ、その機能を調査した結果、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子及び配列番号５に示す塩基配列からなる遺伝子が、９−リノール酸ヒドロペルオキシドをトランス−２−ノネナールに変換することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、配列番号１に示す塩基配列からなる９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子を提供する。また、本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼをコードする９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子を提供する。
【００１３】
本発明は、さらに、配列番号５に示す塩基配列からなる９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子を提供する。また、本発明は、配列番号６に示すアミノ酸配列からなる９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼをコードする９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の遺伝子を指標にすれば、９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼの安定性や活性が低い品種の選抜が可能である。また、本発明の遺伝子の発現を制御又は改変することにより、９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼの安定性や活性が低い品種を作出することが可能である。その結果、香味の維持された食品を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子は、イネに由来し、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなる。また、当該遺伝子がコードするポリペプチドである９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼは、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなる。さらに、本発明の９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子は、イネに由来し、配列表の配列番号５に示す塩基配列からなる。また、当該遺伝子がコードするポリペプチドである９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼは、配列表の配列番号６に示すアミノ酸配列からなる。９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼは、９−リノール酸ヒドロペルオキシドを老化臭の原因物質であるトランス−２−ノネナールに変換する。そのため、本発明の遺伝子の発現を抑制したり、本発明の遺伝子を改変したりすることにより、穀類の香味を維持することが可能であり、そのような目的に本発明の遺伝子を利用できる。
【００１６】
例えば、ＲＮＡｉやアンチセンスＲＮＡを利用することにより、本発明の遺伝子の発現を制御し、穀類の香味を維持させる方法がある。また、部位特異的変異誘発等を利用して、トランス−２−ノネナール生成活性の低下した９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子を作成し、穀類に当該遺伝子を導入することにより、香味を維持可能な穀類を作ることも可能である。導入方法としては、アグロバクテリウム法、プロトプラスト法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。
【００１７】
本発明の遺伝子は、当該遺伝子を発現しているイネ（例えば、日本晴れなどの品種）の種子等からＲＴ−ＰＣＲ法を利用して得られる。より具体的には、イネの種子からＡＧＰＣ法やグアニジン・塩化セシウム超遠心法などによりＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００１８】
さらに、部位特異的突然変異誘発法等によって、本発明の遺伝子の変異型であって９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼをコードする遺伝子を合成することもできる。核酸に変異を導入する方法として、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の方法が挙げられる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（Mutan-KやMutan-Gなど；TAKARA）などを用いて、あるいは、LA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（TAKARA）を用いて変異の導入が行われる。
【実施例】
【００１９】
（実施例１）
機能既知の遺伝子であるオオムギ１３−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ（ＣＡＣ８２９８０）、オオムギイネアレンオキシド合成酵素（ＣＡＢ８６３８３、ＣＡＢ８６３８４）及びイネアレンオキシド合成酵素（Ｑ８ＶＺＸ５、Ｑ９４０Ｄ７）を利用して、これらと相同性のあるタンパク質を、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）及びＫＯＭＥ（Knowledge-based Oryza Molecular biological Encyclopedia）のデータベース上でprotein-protein BLASTプログラムを利用してE-value = e-10を閾値として設定し抽出した。
【００２０】
その結果、イネｃＤＮＡのＡＫ１０５９６４及びＡＫ１０７１６１が新たに抽出された。ExPASy Molecular Biology Server上でClastaIWを利用して分子系統樹を作成したところ、図１に示す分子系統樹が得られた。図１に示すとおり、新たに抽出された２つの遺伝子は、アレンオキシド合成酵素遺伝子（ＡＯＳ）と１３−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ（１３−ＨＰＬ）とは明確に異なるグループに分類され、ＡＯＳ及び１３−ＨＰＬとは異なる酵素機能を有すると予想された。ＡＫ１０５９６４及びＡＫ１０７１６１は非常によく似た構造を有していたので、ＡＫ１０５９６４についてさらに機能解析を進めた。
【００２１】
（実施例２）
イネ種子（品種：日本晴れ）からTripure Isolation Reagent（ロシュ）を利用して全ＲＮＡを抽出後、Oligotex-dT30 mRNA Purification Kit（タカラバイオ）を利用してPolyA+RNAを生成した。二つのプライマー（5'-gcggatccatggcgcgccgccgcgagccaa-3'（配列番号３）及び5'-gcgaattcccgcaccaacactcgccgctc-3'（配列番号４））を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、ｐＵＣ１１８にサブクローニングした。全長配列の決定を行い、配列がＡＫ１０５９６４と一致することを確認した。次に、ＡＫ１０５９６４の構造遺伝子をpRSETA（インビトロジェン）のBamHI部位及びEcoRI部位の間にサブクローニングし、大腸菌株BL21(DE3)pLysに導入した。
【００２２】
大腸菌での発現及び粗抽出液の調製は、Kuroda et al., Characterization of factors that trasnform linoleic acid into di- and trihydroxyoctadecenoic acids in mash, J. Biosci. Bioeng., 93: 73-77, 2002に記載の方法を利用した。具体的には、まず１６℃で前培養した培養液５０ｍＬ（ＯＤ６００＝０．５）にイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを終濃度１ｍＭとなるように添加した。さらに１６時間培養し、大腸菌細胞を遠心分離にて回収後、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）を５ｍＬ加えて懸濁させた。細胞懸濁液を超音波破砕により細胞を可溶化し、３０分間遠心した後（１５，０００ｇ、４℃）、上清を回収し粗抽出液とした。対照サンプルとして、pRSETAを導入したBL21(DE3)pLysを用意し、上述と同じ条件で粗抽出液を調製した。
【００２３】
脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼの活性測定はKuroda et al., Characterization of factors involved in the production of 2(E)-noneal during mashing, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67:691-697, 2003に記載の方法で行った。具体的には、粗抽出液５μＬに０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて１００μＬとし、エタノールに溶解した９−リノール酸ヒドロペルオキシド（２ｍＭ）を５μＬ添加し、３０℃にて５分間インキュベートした後、エタノールを９００μＬ加えて反応を停止した。３ｇの塩化ナトリウム及び５ｍＬの蒸留水を添加したバイアルに反応物を移し、内部標準として１ｐｐｍの１−ノナノール（エタノール溶液）を加えてキャップした。
【００２４】
ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）による定量と化合物の同定は以下のように行った。ポリジメチルシロキサンＳＰＭＥファイバー（スペルコ社）をバイアルに挿入し、４０℃にて１０分間インキュベートした後、ガスクロマトグラフィー（Hewlett Packard HP6890/MSD system）のインジェクションポート（２６０℃）に供試した。キャピラリーカラムはＤＢ−１（３０ｍ×０．２５ｍｍ、フィルム厚１μｍ、Ｊ＆Ｗ社）を用い、キャリアガスはヘリウム（１ｍＬ／分）を用いた。オーブン条件は１２０℃で１分間保持、５℃／分で１５０℃まで昇温、４０℃／分で３００℃まで昇温及び３００℃で２分間保持とした。トランス−２−ノネナールと１−ノナノールの定量は、セレクトイオンモード（ｍ／ｚ）の条件で解析した。トランス−２−ノネナール及び１−ノナノールの保持時間は、それぞれ７．６分及び７．８分であった。ＧＣ−ＭＳ分析は、上述の通りガスクロマトグラフィーを実施し、HP-Chemistationのソフトウェアと化合物ライブラリーを利用して、生成物のＭＳ／ＭＳ解析と化合物の同定を行った。
【００２５】
図２（ａ）は、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子を発現させて得られたタンパク質と９−リノール酸ヒドロペルオキシドとの反応生成物のＧＣ−ＭＳの結果を表す図（トータルイオンクロマトグラム）である。また、図２（ｂ）は、ネガティブコントロールのトータルイオンクロマトグラムである。保持時間７．６分のピーク１は、トランス−２−ノネナールを表し、保持時間７．８分のピーク２は、内部標準物質の１−ノナノールを表す。図２に示したように、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子を発現させた場合にのみ、トランス−２−ノネナールのピークが認められた。なお、図３は、ピーク１のマススペクトログラムであり、このマススペクトログラムから、ピーク１がトランス−２−ノネナールを表すことが分かる。
【００２６】
図４は、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子を発現させた得られたタンパク質と９−リノール酸ヒドロペルオキシドとを反応させて生成したトランス−２−ノネナールを示すグラフである。縦軸は、大腸菌タンパク質（ｍｇ）あたりのトランス−２−ノネナールの活性を表している。図４から、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子を発現させた場合にのみ、トランス−２−ノネナールが生成しているのが分かる。
【００２７】
ＡＫ１０７１６１についても、ＡＫ１０５９６４と同様に解析を行った。プライマーに5'-gccggatccatggcgccaccgccagt-3'（配列番号７）及び5'-gccgaattccgcaattaaaacatccaccaacct-3'（配列番号８）を用いてｐＵＣ１１８にサブクローニングした。全長配列の決定を行い、配列がＡＫ１０７１６１と一致することを確認した。次に、ＡＫ１０７１６１の構造遺伝子をpRSETAのBamHI部位及びEcoRI部位の間にサブクローニングし、大腸菌株BL21(DE3)pLysに導入した。以下、ＡＫ１０５９６４と同様の方法により、大腸菌で発現させ、粗抽出液を調製し、その酵素活性を測定し、ＡＫ１０７１６１はＡＫ１０５９６４と同様の活性を有していることを確認した。
【００２８】
以上の結果から、配列番号１に示した塩基配列からなる遺伝子及び配列番号５に示した塩基配列からなる遺伝子は、９−リノール酸ヒドロペルオキシドをトランス−２−ノネナールに変換する、９−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子であることが明らかになった。
【００２９】
（実施例３）
次に、ＡＫ１０５９６４（及びＡＫ１０７１６１）の以下の脂肪酸ペルオキシド（いずれの脂肪酸ペルオキシドもイネに含まれている）に対する触媒作用を解析した：１３（Ｓ）−ヒドロペルオキシ−９（Ｚ），１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸（１３−ＨＰＯＤ）、９（Ｓ）−ヒドロペルオキシ−１０（Ｅ），１２（Ｚ），１５（Ｚ）−オクタデカトリエン酸（９−ＨＰＯＴ）及び１３（Ｓ）−ヒドロペルオキシ−９（Ｚ），１１（Ｅ），１５（Ｚ）−オクタデカトリエン酸（１３−ＨＰＯＴ）。実施例２と同様に、酵素抽出液と脂肪酸ペルオキシドとを反応させ、得られた生成物をＧＣ−ＭＳで分析した。
【００３０】
得られたクロマトグラムを図５に示す。（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、それぞれ、１３−ＨＰＯＤ、９−ＨＰＯＴ及び１３−ＨＰＯＴと反応させて得られた生成物のＧＣ−ＭＳのクロマトグラムである。図５（ａ）〜（ｃ）に示したように、１３−ＨＰＯＤからはヘキサナールが生成し、９−ＨＰＯＴからは（２，６）−ノナジエナールが生成し、１３−ＨＰＯＴからは（３Ｚ）−ヘキセナール及び（２Ｅ）−ヘキセナールが生成した。生成したこれらのアルデヒドは食品のオフフレーバーの原因物質となる場合があり、遺伝子抑制技術によりＡＫ１０５９６４（及びＡＫ１０７１６１）の発現を抑制することなどによって米の品質を向上させることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＡＫ１０５９６４及びＡＫ１０７１６１に関する分子系統樹である。
【図２】（ａ）は、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子を発現させて得られたタンパク質と９−リノール酸ヒドロペルオキシドとの反応生成物のＧＣ−ＭＳのトータルイオンクロマトグラムである。（ｂ）は、ネガティブコントロールのトータルイオンクロマトグラムである。
【図３】ピーク１のマススペクトログラムである。
【図４】配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子を発現させた得られたタンパク質と９−リノール酸ヒドロペルオキシドとを反応させて生成したトランス−２−ノネナールを示すグラフである。
【図５】（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、それぞれ、１３−ＨＰＯＤ、９−ＨＰＯＴ及び１３−ＨＰＯＴと配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子を発現させて得られたタンパク質との反応生成物のＧＣ−ＭＳのトータルイオンクロマトグラムである。
【符号の説明】
【００３２】
１…トランス−２−ノネナール、２…１−ノナノール（内部標準物質）。
【図１】
2006149341.tif 000002
【図２】
2006149341.tif 000003
【図３】
2006149341.tif 000004
【図４】
2006149341.tif 000005
【図５】
2006149341.tif 000006
【配列表】
2006149341000001.app