(57)【要約】【課題】  サンプル液を電極付キュベットに移しかえることなく、また、サンプル量が多くても極微量であってもその量にかかわらず電気穿孔処理を行うことができ、しかも、ウェルプレートなどに自動分注する既存の分注器にも組込可能なエレクトロポレーション装置を提案する。【解決手段】  サンプル液（Ｓ）に浮遊する細胞に電気穿孔処理を施すエレクトロポレーション装置（１）は、所定量のサンプル液（Ｓ）を一時貯留して任意の容器に注液するニードル（２）を備え、該ニードル（２）の内面（６Ａ、６Ｂ）に沿ってサンプル液（Ｓ）に浮遊する細胞に電気パルスを印加する電極（７Ａ、７Ｂ）を配した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル液に浮遊する細胞に電気穿孔処理を施すエレクトロポレーション装置であって、所定量のサンプル液を一時貯留して任意の容器に注液するニードルを備え、該ニードルの内面に沿って前記サンプル液に浮遊する細胞に電気パルスを印加する電極が設けられたことを特徴とするエレクトロポレーション装置。
【請求項２】
前記ニードル内に貯留される所定量のサンプル液を、その前後に空気または所定のシース液を介して前記ニードルの後端側からニードル内に間欠的に供給するサンプル液供給系を備えた請求項１記載のエレクトロポレーション装置。
【請求項３】
サンプル液に浮遊する細胞に電気穿孔処理を施すエレクトロポレーション用ニードルであって、所定量のサンプル液を一時貯留して任意の容器に注液するニードル管の内面に沿って、前記サンプル液に浮遊する細胞に対して電気パルスを印加する電極が設けられたことを特徴とするエレクトロポレーション用ニードル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル液中に浮遊する細胞に電気穿孔処理を施して任意の容器に注液するエレクトロポレーション装置とそれに使用するニードルに関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、細胞内へ蛍光色素分子を導入して原形質を染色したり、ＤＮＡを導入する方法として、エレクトロポレーション法を用いるようになっている。エレクトロポレーション法は、細胞を懸濁するサンプル液に電気パルスをかけることにより細胞膜上に微小孔をあけ、その微小孔を通して導入しようとする物質を細胞内へ送り込む手法である。
細胞膜上に穿設された微小孔は塞がれるまでに数ミリ秒〜数十ミリ秒間かかるので、サンプル液中に細胞内に導入しようとする蛍光色素分子を混入させた場合、電気穿孔処理を施すことにより、その微小孔を通じて蛍光色素分子が細胞内へ取り込まれ、細胞の蛍光染色を行うことができる。
【特許文献１】特開２００１−２８６２８５
【０００３】
現在、電気穿孔処理を行う場合、一般には電極付キュベットが用いられている。
これは、所定容積のプラスチック容器の内部両側に一対のアルミ電極が１〜数ｍｍ程度のギャップをもって配されており、キュベット内にサンプルを注入し、電極間に高電圧を印加して電気パルスを発生させて電気穿孔処理を行うようになされている。
【特許文献２】特開２００４−０４１４３４
【０００４】
しかしながら、電極付キュベットを用いる場合、処理しようとするサンプル量がキュベットの容積に依存し、例えば、数ｍｌ〜数十ｍｌのサンプル量に対しては有効であるが、サンプル量が少なすぎると使用できないという問題がある。
特に近年では、サンプル液がマイクロリットル（μｌ）オーダーの場合に、そのサンプル液中の細胞に電気穿孔処理することが要請されており、電極付キュベットではこれに対応できない。
また、電気穿孔処理されたサンプル液を最終的にウェルプレート等へ分注する場合でも、一旦は、処理前のサンプル液を電極付キュベット内に貯留した後、これを吸い取って分注しなければならない。
したがって、これを手作業で行う場合は極めて面倒であり、自動分注する場合もサンプル液を電極付キュベット内に入れたり出したりする時間が無駄であるという問題があった。
【０００５】
また、サンプル液を自動的に電極付キュベット内に送液できるように、電極付キュベットをサンプル液流路中に配し、サンプル液を流しながら電気穿孔処理を行う装置も提案されているが、これも十分なサンプル量が確保できる場合のみ使用可能である。
【特許文献３】特開平１−２９１７８２
【特許文献４】特開平１１−５０２１３３
【特許文献５】特表２００２−５１６６７８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、サンプル液を電極付キュベットに移しかえることなく、また、サンプル量が多くても極微量であってもその量にかかわらず電気穿孔処理を行うことができ、しかも、ウェルプレートなどに自動分注する既存の分注器にも組込可能なエレクトロポレーション装置を提案することを技術的課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、サンプル液に浮遊する細胞に電気穿孔処理を施すエレクトロポレーション装置であって、所定量のサンプル液を一時的に貯留して任意の容器に注液するニードルを備え、該ニードルの内面に沿って、前記サンプル液に浮遊する細胞に電気パルスを印加する電極が設けられたことを特徴としている。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のエレクトロポレーション装置によれば、サンプル液を注液するニードルにエレクトロポレーション用の電極が配されているので、処理前のサンプル液をニードル先端から吸引したり、または、ニードル後端側から送液したりすることにより、処理しようとする細胞をニードル内に取り込むことができる。
この状態で電極間にパルス電圧を印加すれば、ニードル内に取り込まれた細胞に電気パルスが作用し、細胞膜に微小孔が穿設される。
したがって、蛍光色素分子やＤＮＡなどをサンプル液の中に混在させておけば、その微小孔を通りこれらを細胞内に導入させることができる。
【０００９】
これにより、ニードル内に貯留されたサンプル液に浮遊する細胞は処理済となるので、その後、ニードル先端から任意の容器に注液すればよい。
このように、本発明によれば、注液用のニードル内に電極が配されているので、サンプル液を電極付キュベットのような別容器に移し替えることなく、電気穿孔処理が可能となる。
また、注液用のニードルは細く、その容量が極めて限定されていることから、サンプル量がマイクロリットルオーダーであっても電気穿孔処理を行うことができる。
【００１０】
さらに、大量のサンプル液に対して電気穿孔処理する場合も、最終的には処理済みのサンプル液をウェルプレート等の個々のウェルへ分注する操作を伴うのが普通であるから、ニードル内で電気パルスをかけることができれば、分注する途中で所定量ずつ電気穿孔処理を施すことができサンプルを無駄に浪費することもない。
【００１１】
この場合に、ニードル内に貯留される所定量のサンプル液を、その前後に空気または所定のシース液を介してニードルの後端側からニードル内に間欠的に供給するようにすれば、ニードル内に貯留されたサンプル液と、次にニードル内に貯留されるサンプル液は、空気またはシース液を介して分断されているので、処理済みのサンプル液と処理前のサンプル液を明確に区別することができ、サンプル液を二度処理したり、未処理のまま注液したりという誤操作がおきにくいというメリットがある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本例では、サンプル液を電極付キュベットに移しかえることなく、また、サンプル量が多くても極微量であってもその量にかかわらず電気穿孔処理を行うことができ、しかも、ウェルプレートなどに自動分注する既存の分注器にも組込可能にするという目的を、極めて簡単な構成により達成した。
【００１３】
図１は本発明に係るエレクトロポレーション装置を示す説明図、図２はサンプル液の流れを示す概略図である。
【００１４】
本例のエレクトロポレーション装置１は、サンプル液Ｓに浮遊する細胞に電気穿孔処理を施した後、処理済のサンプル液を分注ニードル２から例えば９６穴ウェルプレート３などの任意の容器に分注するものである。
分注ニードル２は、ＸＹＺに位置制御可能なロボットアーム４に取り付けられ、所定量のサンプル液Ｓを一時貯留するテフロン（デュポン社の商品名）製の角型ニードル管５の内側対向壁面（内面）６Ａ、６Ｂに沿って平行平板電極７Ａ、７Ｂが配されている。
【００１５】
電極７Ａ、７Ｂは電源装置８に接続され、スイッチＳＷ１を短絡させた状態で直流電源９からコンデンサ１０に電荷をチャージさせ、スイッチＳＷ１を開いてスイッチＳＷ２を短絡させることによりコンデンサ１０にチャージされた電荷を放電させて、パルス電圧を電極７Ａ、７Ｂ間に印加させるようになっている。
これにより、ニードル２に貯留された所定量のサンプル液Ｓに浮遊する細胞に１回又は複数回の電気パルスを作用させ、その細胞膜に電気穿孔処理を施して微小孔を穿設することができる。
【００１６】
また、本例では、ニードル２内に貯留される所定量のサンプル液Ｓを、その前後に空気または所定のシース液Ｌを介してニードル２の後端側からニードル２内に間欠的に供給するサンプル液供給系１１を備えている。
【００１７】
このサンプル液供給系１１は、サンプル液ボトル１２Ｓからサンプル液Ｓを吸い上げて送り出すシリンジ型の精密ポンプ１３Ｓを介装したサンプル液配管１４Ｓと、シース液ボトル１２Ｌからシース液Ｌを吸い上げて送り出すシリンジ型の精密ポンプ１３Ｌを介装したシース液配管１４Ｌが、流路切換弁１５を介して合流された後、その合流配管１６がニードル２の後端側に接続されている。
なお、サンプル液ボトル１２Ｓ内のサンプル液Ｓには、電気穿孔処理する染色しようとする細胞と、その細胞に導入する蛍光色素分子が懸濁されている。
【００１８】
これによれば、図２に示すように、流路切換弁１５を切り換えて、サンプル液配管１４Ｓとシース液配管１４Ｌを合流配管１６に交互に導通／遮断させることにより、ニードル２内に貯留される所定量のサンプル液Ｓを、その前後にシース液Ｌを介してニードル２の後端側からニードル２内に間欠的に供給することができる。
【００１９】
以上が本発明にかかるエレクトロポレーション装置の一構成例であって、次にその作用について説明する。
サンプル液供給系１１から供給された所定量のサンプル液Ｓがニードル２に到達すると、電源装置８からパルス電圧が出力されて、ニードル２内のサンプル液Ｓに浮遊する細胞に電気パルスが作用して電気穿孔処理が施される。
これにより、細胞膜に数ミリ秒〜数十ミリ秒間だけ微小孔が穿設されるので、その間にサンプル液Ｓ内の蛍光色素分子が細胞内に取り込まれて細胞が染色される。
【００２０】
このとき、合流配管１６を介して供給されるサンプル液Ｓは、ニードル２の内側と外側でシース液Ｌを介して分断されているので、電気パルスを作用させたときにニードル２内に貯留されているサンプル液Ｓに浮遊する細胞のみに電気穿孔処理が施され、ニードル２外のサンプル液Ｓに浮遊する細胞に電気穿孔処理が施されることがない。
【００２１】
次いで、処理済みのサンプル液を９６穴のウェルプレートに分注する。
このとき、ロボットアーム４によりニードル２を任意のウェルに位置決めしながら、サンプル液供給系１１の精密ポンプ１３Ｓまたは１３Ｌによりサンプル液Ｓまたはシース液Ｌを所定流量で送給することにより、ニードル２内の処理済みのサンプル液Ｓが送り出されて分注される。
【００２２】
そして、シース液Ｌがニードル２の先端に達してニードル２内のサンプル液Ｓの分注が完了すると、ロボットアーム４によりニードル２が廃液ボトル（図示せず）に移動し、シース液Ｌが排出されると、ニードル２内は再びサンプル液Ｓで満たされるので、再び電極７Ａ、７Ｂ間にパルス電圧を印加すれば、サンプル液Ｓに浮遊する細胞に電気パルスが作用して電気穿孔処理が施される。
【００２３】
本例では、このように、ニードル２に貯留される所定量のサンプル液Ｓを所定量ずつニードル２に貯留した状態で、そのサンプル液Ｓに確実に電気パルスを作用させて電気穿孔処理を施すことができる。
サンプル液Ｓを連続して供給する場合は、処理済みのサンプル液Ｓがニードル２に残っているとそのサンプル液Ｓに対しては再度電気穿孔処理が施されることになり、また、分注量が多いと電気穿孔処理が施されていないサンプル液Ｓが分注されることになるので、処理条件が一定せず、また、サンプル液も無駄になるという問題がある。
しかし、本例のようにシース液Ｌを挟んでサンプル液Ｓを供給すれば処理条件を一定に維持することができると共に、サンプル液が無駄になることもない。
【００２４】
なお、上述の説明では、サンプル液供給系１１によりサンプル液Ｓとシース液Ｌを交互に供給する場合について説明したが、サンプル液Ｓが微量の場合には、分注ニードル２で吸い込んで、電気穿孔処理をした後、任意の容器に吐出させるようにすればよい。
この場合、分注ニードル２の先端までシース液を充填し、ニードル２の先端をサンプル液Ｓにつけてシース液配管１４Ｌに介装された精密ポンプ１３Ｌにより吸引すればサンプル液Ｓを必要量だけニードル２内に取り込むことができる。
この状態で、電極７Ａ、７Ｂ間にパルス電圧を印加すれば、ニードル２内に取り込んだサンプル液Ｓに電気パルスを作用させて、電気穿孔処理を施すことができる。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明は、細胞内に蛍光色素分子やＤＮＡを導入する場合に、その細胞を懸濁させているサンプル液が多くても少なくてもその量に拘らず、確実に電気穿孔処理を施して任意の容器に注液する用途に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明に係るエレクトロポレーション装置の一例を示す説明図。
【図２】サンプル液の流れを示す説明図。
【符号の説明】
【００２７】
１  エレクトロポレーション装置
Ｓ  サンプル液
Ｌ  シース液
２  分注ニードル
３  ウェルプレート
５  角型ニードル管
６Ａ、６Ｂ  内側対向壁面（内面）
７Ａ、７Ｂ  平行平板電極
１１  サンプル液供給系
【図１】
2006149309.tif 000003
【図２】
2006149309.tif 000004