(57)【要約】      （修正有）【課題】ＩｇＡ腎症の発症に関係する新規ヒト内在性レトロウイルスのｅｎｖ遺伝子を提供する。【解決手段】ヒト内在性レトロウイルスＨＣ２のｅｎｖ遺伝子を開示する。このうち１個若しくは数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加していてもよい。ＩｇＡ腎症の発症は、このＨＣ２ｅｎｖ遺伝子が発現して、その発現産物であるＨＣ２ＥＮＶタンパク質が生じ、自己免疫機序によりこのＨＣ２ＥＮＶタンパク質と反応する抗体をヒトが持つ場合に、前記抗体の免疫反応複合体が糸球体メサンジウム領域に沈着して慢性炎症反応が引き起こされるというメカニズムである。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト内在性レトロウイルスＨＣ２のｅｎｖ遺伝子であって、下記（１）から（６）のいずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子。
（１）配列表の配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）配列表の配列番号１において、１個若しくは数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、前記（１）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３）配列表の配列番号１において、１個若しくは数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が８０％以上であるポリヌクレオチド。
（４）配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（５）配列表の配列番号２において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、マウスモノクローナル抗体である抗ｇｐ７０抗体１２Ｈ５．１、又は抗Ｒａｕｓｃｈｅｒ白血病ウイルスｇｐ７０抗体と抗原抗体反応するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（６）前記（１）から（５）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列表の配列番号１の塩基配列において、第６９番目（Ｔ→Ａ）、第５２４番目（Ｔ→Ｃ）、第５８６番目（Ｃ→Ｇ）、第５９２番目（Ｇ→Ｔ）、第８８７番目（Ｃ→Ｔ）、第９７０番目（Ｃ→Ｔ）、第１０００番目（Ｃ→Ｔ）、第１１４０番目（Ａ→Ｇ）、第１１４３番目（Ｔ→Ｃ）及び第１２１２番目（Ｃ→Ａ）からなる群から選択される少なくとも一つの一塩基多型を含む請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ及びＲＮＡの少なくとも一方である請求項１又は２に記載の遺伝子。
【請求項４】
ポリヌクレオチドであって、請求項１に記載の前記（１）から（６）のいずれかのポリヌクレオチドの全部又は一部からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
ポリヌクレオチドであって、請求項１又は２に記載の遺伝子のプライマー又はプローブとして使用する請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ポリヌクレオチドであって、請求項１又は２に記載の遺伝子の全部又は一部を増幅又は検出するためのプライマー又はプローブとして使用する配列表の配列番号３から２４及び３０から３６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項２記載の遺伝子を検出するためのプローブであって、前記（１）から（６）のいずれかのポリヌクレオチドの全部若しくは一部と相補的であり、かつ配列番号１における前記一塩基多型の塩基を含む塩基配列からなるプローブ。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の遺伝子の発現産物であるタンパク質であって、下記（７）又は（８）のタンパク質。
（７）配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（８）配列表の配列番号２において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、マウスモノクローナル抗体である抗ｇｐ７０抗体１２Ｈ５．１、又は抗Ｒａｕｓｃｈｅｒ白血病ウイルスｇｐ７０抗体と抗原抗体反応するタンパク質。
【請求項１０】
ＩｇＡ腎症マーカーであって、請求項１又は２に記載の遺伝子、請求項８記載のｍＲＮＡ、請求項９記載のタンパク質、及び、請求項９記載のタンパク質を抗原として抗原抗体反応するヒト抗体からなる群から選択される少なくとも一つからなるＩｇＡ腎症マーカー。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の遺伝子の遺伝子発現の測定方法であって、請求項８記載のｍＲＮＡ量又は請求項９記載のタンパク質を測定する遺伝子発現測定方法。
【請求項１２】
前記ｍＲＮＡの測定が、プライマー又はプローブとして請求項４から６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを用いた測定である請求項１１記載の測定方法。
【請求項１３】
前記タンパク質の測定が、請求項９記載のタンパク質を抗原とする抗体を用いた測定である請求項１１記載の遺伝子発現測定方法。
【請求項１４】
請求項９記載のタンパク質を抗原とするヒト抗体の測定方法であって、請求項９記載のタンパク質と前記ヒト抗体とを抗原抗体反応させ、さらに、前記ヒト抗体と、前記ヒト抗体を抗原とする標識抗体とを抗原抗体反応させて請求項９記載のタンパク質と前記ヒト抗体と前記標識抗体との複合体を測定するヒト抗体測定方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が、固相に固定化されている請求項１４記載のヒト抗体測定方法。
【請求項１６】
前記ヒト抗体が、血漿中のヒト抗体である請求項１４又は１５に記載のヒト抗体測定方法。
【請求項１７】
請求項１１から１３のいずれか一項に記載の遺伝子発現測定方法により請求項１又は２に記載の遺伝子の遺伝子発現を測定するＩｇＡ腎症の検査キットであって、プライマー若しくはプローブとして使用する請求項４から６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は、請求項９記載のタンパク質を抗原とする抗体を含むＩｇＡ腎症の検査キット。
【請求項１８】
請求項１４から１６のいずれか一項に記載のヒト抗体測定方法により請求項９記載のタンパク質を抗原とするヒト抗体を測定するＩｇＡ腎症の検査キットであって、請求項９記載のタンパク質と、前記ヒト抗体を抗原とする標識抗体とを含むＩｇＡ腎症の検査キット。
【請求項１９】
前記請求項９記載のタンパク質が、固相に固定化されている請求項１８記載のＩｇＡ腎症の検査キット。
【請求項２０】
ＩｇＡ腎症の治療若しくは予防のための医薬品であって、請求項１又は２に記載の遺伝子の全部若しくは一部と相補的な塩基配列からなり、請求項１又は２の遺伝子の転写若しくはタンパク質の発現を抑制可能なポリヌクレオチドを含む医薬品。
【請求項２１】
ＩｇＡ腎症の治療若しくは予防のための医薬品であって、請求項９記載のタンパク質のアミノ酸配列における、ヒト内在性レトロウイルスＨＣ２のｅｎｖ遺伝子の発現産物を抗原とするヒト抗体に対する抗原決定基（エピトープ）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含有する医薬品。
【請求項２２】
請求項１又は２に記載の遺伝子の全部又は一部を含む遺伝子を標的細胞に導入するための発現ベクターであって、請求項１又は２に記載の遺伝子の全部又は一部を含む遺伝子と、前記遺伝子の発現に必要な調節配列とを含み、前記遺伝子が前記調節配列に発現可能に作動的に連結されている発現ベクター。
【請求項２３】
遺伝子導入用レトロウイルスベクターであって、前記ウイルス粒子の被膜タンパク質が、請求項９記載のタンパク質の全部又は一部を含む遺伝子導入用レトロウイルスベクター。
【請求項２４】
遺伝子導入用レトロウイルスベクターを使用した遺伝子導入方法であって、前記遺伝子導入用レトロウイルスベクターが、請求項２３記載の遺伝子導入用レトロウイルスベクターである遺伝子導入方法。
【請求項２５】
遺伝子導入細胞の製造方法であって、請求項２４記載の遺伝子導入方法により目的遺伝子を標的細胞に導入する工程を含む遺伝子導入細胞の製造方法。
【請求項２６】
遺伝子導入用キットであって、請求項２２記載の発現ベクターにより形質転換されたパッケージング細胞と、Ψ配列を有する遺伝子導入プラスミドとを含む遺伝子導入用キット。
【請求項２７】
遺伝子導入用キットであって、請求項２２記載の発現ベクターと、Ψ配列を有する遺伝子導入プラスミドとを含む遺伝子導入用キット。
【請求項２８】
さらに、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子の少なくとも一方を発現するプラスミドを含む請求項２７記載の遺伝子導入用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なヒト内在性レトロウイルスＨＣ２のｅｎｖ遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性糸球体腎炎の一型であるＩｇＡ腎症は、糸球体メサンジウム領域の細胞性及び基質性増殖反応と、同領域への免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）沈着を特徴とする疾患である。ＩｇＡ腎症は、日本の慢性糸球体腎炎のうち、成人で３０％以上、小児で２０％以上を占める（非特許文献１参照）。本症は、日本を含むアジア太平洋地域諸国とフランスなど南欧諸国で多発するが、北欧や北米では少ない。この点で、日本を含む本症多発国において、本症についての研究は、特に重要視されるべきである。また、本症の予後は、従来想定されていたよりもはるかに不良であり、腎生検後の２０年間に３８％前後が末期腎不全に陥るとされる（同文献参照）。
【０００３】
ＩｇＡ腎症の成因は、未だ不明のままである。本症の成因としては、ＩｇＡを含む流血中の免疫複合体が糸球体メサンジウム領域に沈着して慢性炎症反応が引き起こされるという説が有力であるが、ＩｇＡ免疫複合体を形成する抗原の同定は未だ成功していない（非特許文献２及び３参照）。また、ＩｇＡ腎症の治療は、対症療法に終始するのみであり、最終的に患者腎機能が低下した場合には、透析療法に頼る以外に無いのが現状である。
【０００４】
一方、ＩｇＡ腎症の診断は、蛍光抗体法を用いた腎臓生検によりＩｇＡ沈着を確認することで行われているが、腎臓生検は、患者侵襲が極めて大きく、生命に関わる危険性もあり、反復実施は困難であるという問題もある。
【非特許文献１】財団法人  難病医学研究財団  難病情報センター、『診断・治療指針  ＩｇＡ腎症』、［online］、２００４年５月１２日検索、インターネット＜URL:http://www.nanbyou.or.jp/sikkan/001_i.htm＞
【非特許文献２】Rantala, I., J. Mustonen, M. Hurme, J. Syrjanen, & H. Helin.  Pathogenetic aspects of IgA nephropathy.『ＩｇＡ腎症の病原性の観点』  Nephron 88: 193-198, 2001.
【非特許文献３】Smith, A. C., & J. Feehally.  New insights into the pathogenesis of IgA nephropathy.『ＩｇＡ腎症の病因に関する新たな見識』  Springer Semin. Immunopathol. 24: 477-493, 2003.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、ＩｇＡ腎症の発症に関係する遺伝子及びその発現産物であるタンパク質の提供を、その目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明は、ヒト内在性レトロウイルスＨＣ２のｅｎｖ遺伝子（以下、ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子ともいう。）であって、下記（１）から（６）のいずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子を提供する。
（１）配列表の配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）配列表の配列番号１において、１個若しくは数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、前記（１）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３）配列表の配列番号１において、１個若しくは数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が８０％以上であるポリヌクレオチド。
（４）配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（５）配列表の配列番号２において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、マウスモノクローナル抗体である抗ｇｐ７０抗体１２Ｈ５．１、又は抗Ｒａｕｓｃｈｅｒ白血病ウイルスｇｐ７０抗体と抗原抗体反応するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（６）前記（１）から（５）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【０００７】
また、前記目的を達成するために、本発明は、ヒト内在性レトロウイルスＨＣ２のｅｎｖ遺伝子の発現産物であるタンパク質（以下、ＨＣ２ＥＮＶタンパク質ともいう。）であって、下記（７）又は（８）のタンパク質を提供する。
（７）配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（８）配列表の配列番号２において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、マウスモノクローナル抗体である抗ｇｐ７０抗体１２Ｈ５．１、又は抗Ｒａｕｓｃｈｅｒ白血病ウイルスｇｐ７０抗体と抗原抗体反応するタンパク質。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者らは、ＩｇＡ腎症等の原発性糸球体疾患について鋭意研究を重ね、その過程で、本症患者の血液中には慢性的にＩｇＡ免疫複合体が存在するから、ＩｇＡが反応する抗原分子は、外来抗原であるよりむしろ一種の自己抗原ではないかという着想を得た。この着想に基づきさらに研究を重ねた結果、本発明者らは、新規なヒト内在性レトロウイルスＨＣ２のｅｎｖ遺伝子及びそのＨＣ２ｅｎｖ遺伝子産物であるタンパク質を発見し、このタンパク質が、ＩｇＡ腎症と関係があることを突き止め、本発明に到達した。したがって、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子やそのＨＣ２ｅｎｖ遺伝子産物タンパク質を検出若しくは測定することにより、又は、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子産物タンパク質と免疫反応する抗体を検出若しくは測定することにより、ＩｇＡ腎症の診断が可能となる。また、本発明者らは、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子には、一塩基多型が存在することも突き止めており、この多型分析によって、例えば、ＩｇＡ腎症の発症予測診断や、発症のタイプの診断等が可能となる。そして、本発明の遺伝子の転写や発現を抑制したり、若しくは本発明のタンパク質とヒトＩｇＡ抗体との免疫反応を阻害することにより、ＩｇＡ腎症の発症予防若しくは治療が可能となる。さらに、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子産物タンパク質は、ヒト内在性ウイルス由来のものであるから、ヒトに反復投与しても免疫反応（中和抗体産生）が起こらないと予想され、これを遺伝子治療用のレトロウイルスベクターに利用することも可能である。
【０００９】
なお、後述するとおり、本発明は、従来の常識に反してなされたものであり、かつ本発明者らのみがなしえたものである。すなわち、過去２０年間以上にわたり、ヒトのＩｇＡ腎症を含む、いわゆる自己免疫疾患に類似した腎糸球体病変や血管病変を自然発症するハツカネズミ（マウス）に関する研究が行われ、その過程で、病変部糸球体や血管壁に沈着しているマウス内在性レトロウイルスの遺伝子産物が病変形成に関与するのか、それとも血清中に検出される細胞核成分に対する抗体（抗核抗体）が病原性を持つのかが議論されてきた。しかし、内在性レトロウイルス遺伝子産物に対する自己抗体が病変形成能を持つことを直接証明した者はいなかった。本発明者らは、自己免疫性の糸球体腎炎を自然発症するマウス系統から、内在性レトロウイルスｅｎｖ遺伝子産物と反応する多数の単クローン性抗体を樹立することに世界で初めて成功し、それらの大半が、病変を自然発症することのない正常マウスへの静脈内移入により糸球体病変を誘発しうることを証明した（文献［Tabata, N., M. Miyazawa, R. Fujisawa, Y. A. Takei, H. Abe, and K. Hashimoto. Establishment of monoclonal anti-retroviral gp70 autoantibodies from MRL/lpr lupus mice and induction of glomerular gp70 deposition and pathology by transfer into non-autoimmune mice.『ＭＲＬ／ｌｐｒループスマウスからの抗レトロウイルスｇｐ７０モノクローナル自己抗体の樹立と、非自己免疫マウスへの導入による糸球体のｇｐ７０沈着と病変の誘導』 J. Virol. 74: 4116-4126, 2000.］参照）。
【００１０】
本発明は、この際樹立された抗体の一つを用い、これがヒトＩｇＡ腎症の病変部に存在する未知抗原と反応することを見出したことに端を発するものである。従来、ヒト内在性レトロウイルスがヒト病変の形成に関与する可能性については、レトロウイルスの専門家であればあるほど否定的な考え方が支配的である。例えば、マウス内在性レトロウイルス研究の第一人者で、ヒト内在性レトロウイルス遺伝子解析の権威でもある英国国立医学研究所（National Institute for Medical Research）のＪｏｎａｔｈａｎ  Ｐ．Ｓｔｏｙｅや、長年にわたるマウスレトロウイルス研究で名高い米国国立アレルギー感染症研究所（National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases）のＪｏｈｎ  Ｌ．Ｐｏｒｔｉｓが、何れもヒトの自己免疫疾患における内在性レトロウイルスの関与について、強く否定的な見解を表明している（文献［Stoye, J. P. The pathogenic potential of endogenous retroviruses: a skeptical view．『内在性レトロウイルスの病原可能性：懐疑的見解』 Trends Microbiol. 7: 430, 1999.,  Portis, J. L. Perspectives on the role of human endogenous retroviruses in autoimmune diseases.『ヒト内在性レトロウイルスの自己免疫疾患における役割についての見解』 Virology 296:1-5, 2002.］参照）。
【００１１】
また、従来ヒト内在性レトロウイルスＨＣ２にはｅｎｖ遺伝子が存在しないと考えられていたが、本発明者らはこの常識を疑い、本発明者らが作製したマウス内在性レトロウイルスｅｎｖ遺伝子産物に反応するモノクローナル抗体が、ヒト組織と反応するとの驚愕すべき事実から、ヒトゲノム上に存在するマウス内在性レトロウイルス類似遺伝子を詳細に調べた結果、本発明のヒト内在性レトロウイルスＨＣ２のｅｎｖ遺伝子を見出したのである。したがって、たとえマウス内在性レトロウイルス及びそのｅｎｖ遺伝子等が従来公知であったとしても、ヒト内在性レトロウイルスＨＣ２にはｅｎｖ遺伝子が無いとの先入観が一般に流布しているので、当業者にとって、従来の常識に反してヒトにマウス内在性レトロウイルスのそれに類似したｅｎｖ遺伝子の存在を予想することは困難であり、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子を取得することは困難であるといえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子は、配列表の配列番号１の塩基配列において、第６９番目（Ｔ→Ａ）、第５２４番目（Ｔ→Ｃ）、第５８６番目（Ｃ→Ｇ）、第５９２番目（Ｇ→Ｔ）、第８８７番目（Ｃ→Ｔ）、第９７０番目（Ｃ→Ｔ）、第１０００番目（Ｃ→Ｔ）、第１１４０番目（Ａ→Ｇ）、第１１４３番目（Ｔ→Ｃ）及び第１２１２番目（Ｃ→Ａ）からなる群から選択される少なくとも一つの一塩基多型を含む遺伝子であってもよい。また、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子において、前記（１）から（６）のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。但し、ＲＮＡにおいては、配列表上の塩基配列は、ｔ（チミン）塩基を、ｕ（ウラシル）塩基に読み替えるものとする。
【００１３】
本発明のポリヌクレオチドは、前記（１）から（６）のいずれかのポリヌクレオチドの全部又は一部からなるポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子のプライマー又はプローブとして使用することができる。
【００１４】
本発明のポリヌクレオチドは、その他の態様として、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の全部又は一部を増幅又は検出するためのプライマー又はプローブとして使用するポリヌクレオチドであって、配列表の３から２４及び３０から３６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００１５】
また、本発明のプローブは、前記一塩基多型を検出するためのプローブであって、前記（１）から（６）のいずれかのポリヌクレオチドの全部若しくは一部と相補的であり、かつ配列表の配列番号１における前記一塩基多型の塩基を含む塩基配列からなるプローブである。
【００１６】
本発明のｍＲＮＡは、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の転写産物ｍＲＮＡである。
【００１７】
本発明のＩｇＡ腎症マーカーは、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子、本発明のｍＲＮＡ、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質、及び、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を抗原として抗原抗体反応するヒト抗体からなる群から選択される少なくとも一つからなるＩｇＡ腎症マーカーである。
【００１８】
本発明の遺伝子発現測定方法は、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の遺伝子発現を測定する方法であって、本発明のｍＲＮＡ量又は本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を測定する測定方法である。前記本発明のｍＲＮＡ量の測定は、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子のプライマー又はプローブとして使用する本発明のポリヌクレオチドを用いて行うことが好ましい。また、前記本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質の測定は、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を抗原とする抗体を用いて行うことが好ましい。
【００１９】
本発明のヒト抗体測定方法は、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を抗原とするヒト抗体の測定方法であって、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質と前記ヒト抗体とを抗原抗体反応させ、さらに、前記ヒト抗体と、前記ヒト抗体を抗原とする標識抗体とを抗原抗体反応させて本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質と前記ヒト抗体と前記標識抗体との複合体を測定する方法である。本発明のヒト抗体の測定方法において、前記本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質は、固相に固定化されていることが好ましい。また、本発明のヒト抗体測定方法において、前記ヒト抗体は、血漿中のヒト抗体であることが好ましい。
【００２０】
本発明のＩｇＡ腎症の検査キットは、本発明の遺伝子発現測定方法により本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の遺伝子発現を測定するＩｇＡ腎症の検査キットであって、プライマー若しくはプローブとして使用する本発明のポリヌクレオチド、又は、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を抗原とする抗体を含むＩｇＡ腎症の検査キットである。
【００２１】
本発明のＩｇＡ腎症の検査キットは、その他の態様として、本発明のヒト抗体の測定方法により本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を抗原とするヒト抗体を測定するＩｇＡ腎症の検査キットであって、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質と、前記ヒト抗体を抗原とする標識抗体とを含むＩｇＡ腎症の検査キットである。本発明のＩｇＡ腎症の検査キットにおいて、前記本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質は、固相に固定されていることが好ましい。
【００２２】
本発明の医薬品は、ＩｇＡ腎症の治療及び予防の少なくとも一方のための医薬品であって、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の全部又は一部を含む遺伝子と相補的な塩基配列からなり、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の転写若しくはタンパク質の発現を抑制可能なポリヌクレオチドを含む医薬品である。
【００２３】
本発明の医薬品は、その他の態様として、ＩｇＡ腎症の治療及び予防の少なくとも一方のための医薬品であって、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質のアミノ酸配列における、ヒト内在性レトロウイルスＨＣ２のｅｎｖ遺伝子の発現産物を抗原とするヒト抗体に対する抗原決定基（エピトープ）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含有する医薬品である。
【００２４】
本発明の発現ベクターは、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の全部又は一部を含む遺伝子を標的細胞に導入するための発現ベクターであって、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の全部又は一部を含む遺伝子と、前記遺伝子の発現に必要な調節配列とを含み、前記遺伝子が前記調節配列に発現可能に作動的に連結されている発現ベクターである。
【００２５】
本発明の遺伝子導入用レトロウイルスベクターは、前記ウイルス粒子の被膜タンパク質が、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質の全部又は一部を含む遺伝子導入用レトロウイルスベクターである。
【００２６】
本発明の遺伝子導入方法は、遺伝子導入用レトロウイルスベクターを使用した遺伝子導入方法であって、前記遺伝子導入用レトロウイルスベクターが、本発明の遺伝子導入用レトロウイルスベクターである遺伝子導入方法である。
【００２７】
本発明の遺伝子導入細胞の製造方法は、本発明の遺伝子導入方法により目的遺伝子を標的細胞に導入する工程を含む遺伝子導入細胞の製造方法である。
【００２８】
本発明の遺伝子導入用キットは、本発明の発現ベクターにより形質転換されたパッケージング細胞と、Ψ配列を有する遺伝子導入プラスミドとを含む遺伝子導入用キットである。
【００２９】
本発明の遺伝子導入用キットは、その他の態様として、本発明の発現ベクターと、Ψ配列を有する遺伝子導入プラスミドとを含む遺伝子導入用キットである。本発明の遺伝子導入用キットにおいて、さらに、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子の少なくとも一方を発現するプラスミドを含むことが好ましい。
【００３０】
次に、本発明について詳細に説明する。
【００３１】
まず、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子について説明する。本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子は、前述のとおり、下記（１）から（６）のいずれかに記載のポリヌクレオチドからなる遺伝子である。
（１）配列表の配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）配列表の配列番号１において、１個若しくは数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、前記（１）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３）配列表の配列番号１において、１個若しくは数個の塩基が、欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が８０％以上であるポリヌクレオチド。
（４）配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（５）配列表の配列番号２において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、マウスモノクローナル抗体である抗ｇｐ７０抗体１２Ｈ５．１、又は抗Ｒａｕｓｃｈｅｒ白血病ウイルスｇｐ７０抗体と抗原抗体反応するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（６）前記（１）から（５）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００３２】
配列表の配列番号１の塩基配列は、本発明者らが見出したヒト内在性レトロウイルスＨＣ２のｅｎｖ遺伝子の塩基配列の一例である。なお、配列表の配列番号１の塩基配列は、ヒトゲノムデータベースに存在するが、この塩基配列が本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子であるという報告は従来なく、本発明者らが初めて見出したものである。図４に示すとおり、本発明者らは、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子が、ヒト第１９染色体短腕の１９ｐ１３．１付近に存在することを同定した。
【００３３】
前記ヒト内在性レトロウイルスＨＣ２は、文献［Kabat, P., M. Tristem, R. Opavsky, & J. Pastorek.  Human endogenous retrovirus HC2 is a new member of the S71 retrovirus subgroup with a full-length pol gene.『ヒト内在性レトロウイルスＨＣ２は、完全長ｐｏｌ遺伝子をもつＳ７１レトロウイルスのサブグループである』Virology 226: 83-94, 1996.］に開示されているが、従来は、ｅｎｖ遺伝子を持たないＨＣ２のグループに属するプロウイルスであるとされていた。同様に、これまでの報告においては、ＨＣ２グループのプロウイルスは全て不完全であり、ｅｎｖ遺伝子は欠失したものであると考えられていた。しかし、本発明者らの研究によって、同文献において誤って３’ＬＴＲ（末端反復配列）とされていた部分に、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子が存在することが確認された。本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子のヒト染色体上の位置は、これまで報告されたＨＣ２及びそのグループの内在性レトロウイルスの位置と異なる。これらのことより、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子は、ＨＣ２グループに属する新規のプロウイルスの一部であるといえる。
【００３４】
さらに、本発明者らは、後述の実施例に示すとおり、ヒト染色体上において、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の終始コドンの下流に真の３’ＬＴＲが存在し、ｇａｇ-ｐｏｌ遺伝子領域の上流に５’ＬＴＲが存在することを新たに見出し、更に、これらの新たなＬＴＲが機能することを確認した（実施例１、図５及び６参照）。これらの事実も、従来、ヒト内在性レトロウイルスＨＣ２の３’ＬＴＲと考えられていた部分は真のＬＴＲではなく、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の一部であり、本発明の遺伝子が、ＨＣ２プロウイルスのｅｎｖ遺伝子であることを明確に示している。
【００３５】
本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子において、前記（２）のポリヌクレオチドの配列表の配列番号１の塩基配列における欠失、置換もしくは付加が可能な塩基数としては、例えば、１個〜３７６個であり、１個〜２８２個が好ましく、より好ましくは１個〜１８８個である。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、２つのＤＮＡ断片がＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊらによって記載されたような標準的なハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する（文献［Expression of cloned genes in E. coli(Molecular Cloning:A laboratory manual(1989))Cold Spring harbor Laboratory Press, New York, USA, 9. 47-9. 62及び11.45-11.61］参照）。より具体的には、例えば、下記式で求められるＴｍ値を基準としてハイブリダイゼーション及び洗浄（例えば、約２．０×ＳＳＣ、５０℃）を行うことを意味する。
Ｔｍ＝８１．５−１６．６(ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］)＋０．４１(％Ｇ＋Ｃ)−(６００／Ｎ)
（式中、Ｎはポリヌクレオチドの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはポリヌクレオチド中のグアニン及びシトシン残基の含有量である。）
【００３６】
また、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子において、前記（３）のポリヌクレオチドの前記相同性としては、例えば、８０％以上であり、８５％以上が好ましく、より好ましくは、９０％以上である。
【００３７】
また、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子において、前記（４）及び（５）のポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、後述する本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質である。前記（５）のポリヌクレオチドがコードするタンパク質について、配列表の配列番号２のアミノ酸における欠失、置換もしくは付加が可能な残基数としては、コードされるタンパク質が、マウスモノクローナル抗体である抗ｇｐ７０抗体１２Ｈ５．１、又は抗Ｒａｕｓｃｈｅｒ白血病ウイルスｇｐ７０抗体と抗原抗体反応するものであれば、特に制限されないが、例えば、１個〜１２５個であり、１個〜９４個が好ましく、より好ましくは１個〜６２個であり、さらにより好ましくは１個〜３１個である。
【００３８】
本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子において、前記ポリヌクレオチドは、特に限定されず、例えば、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。但し、ＲＮＡにおいては、前記ポリヌクレオチドの配列表の塩基配列は、ｔ（チミン）塩基を、ｕ（ウラシル）塩基に読み替えるものとする。
【００３９】
本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の製造方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の方法により前記（１）から（６）のポリヌクレオチドを化学合成して製造してもよく、酵素的にインビボ又はインビトロで製造してもよい。また、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子は、例えば、以下のようにしてクローニングすることができる。まず、例えば、公的ヒトゲノム計画の公認クローン配布者（例えば、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）から本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子を含む細菌人口染色体（ＢＡＣ）クローン（クローン名：ＣＴＣ−５７５Ｃ１３）を入手する。そして、定法により前記ＢＡＣのＤＮＡを精製し、例えば、下記プライマー０１１２９５ＯＲＦ−Ｌ及び０１１２９５ＯＲＦ−Ｒ（配列表の配列番号３及び４）を用いてＨＣ２ｅｎｖ遺伝子全長をＰＣＲ法で増幅し、適当なプラスミドベクター（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ等）挿入することでクローニングできる。必要に応じて挿入した配列の塩基配列決定を行い、配列表の配列番号１と完全に同一であることを確認することが好ましい。
【００４０】
【化１】
2006068004.tif 000003
【００４１】
また、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子をより選択的に増幅するＰＣＲ法に用いることができるプライマー対としては、下記フォワードプライマーＰｒｉｍｅｒ  ＬとリバースプライマーＰｒｉｍｅｒ  Ｒとの組合せ（配列表の配列番号５及び６）があげられる。
【００４２】
【化２】
2006068004.tif 000004
【００４３】
本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子は、配列表の配列番号１の塩基配列において、第６９番目（Ｔ→Ａ）、第５２４番目（Ｔ→Ｃ）、第５８６番目（Ｃ→Ｇ）、第５９２番目（Ｇ→Ｔ）、第８８７番目（Ｃ→Ｔ）、第９７０番目（Ｃ→Ｔ）、第１０００番目（Ｃ→Ｔ）、第１１４０番目（Ａ→Ｇ）、第１１４３番目（Ｔ→Ｃ）及び第１２１２番目（Ｃ→Ａ）に、それぞれ括弧内に示す一塩基多型が存在する。しがたがって、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子は、これらの一塩基多型を含む遺伝子であってもよい。
【００４４】
本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の前記一塩基多型を検出する方法としては、特に制限されないが、例えば、まず、ヒト染色体ＤＮＡ上に多数散在する類似遺伝子を避けて本発明の遺伝子のみを選択的にＰＣＲ法を用いて増幅し、そして、本発明の遺伝子領域内にハイブリダイズするプライマーを用いて前記ＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、前記一塩基多型を検出する方法等があげられる。また、前記一塩基多型を検出する他の方法としては、前記（１）から（６）のいずれかのポリヌクレオチドの全部若しくは一部と相補的であり、かつ配列表の配列番号１における前記一塩基多型の塩基を含む塩基配列からなるプローブを使用し、ハイブリダイゼーションにより検出する方法があげられる。
【００４５】
本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子をより選択的に増幅できるプライマー対である前記Ｐｒｉｍｅｒ  Ｌ及びＰｒｉｍｅｒ  Ｒ（配列表の配列番号５及び６）を用いた前記一塩基多型の検出方法の一例を、図１４に示す。同図に示すとおり、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｌは、本発明の遺伝子５’末端のＡをその配列５’末端に有し、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒは、本発明の遺伝子の３’フランキング領域にハイブリダイズする。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒがハイブリダイズする領域は、繰り返し配列を含まない領域であり、ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴデータベース検索により、配列解析済みのヒト染色体ＤＮＡ上に完全同一の配列は存在しないことが判明している。すなわち、前記プライマー対を用いることにより、本発明の遺伝子のみを選択的に増幅することが出来る。次に、こうして増幅したＨＣ２ｅｎｖ遺伝子を含むＤＮＡを鋳型として、本発明の遺伝子領域内にハイブリダイズするプライマーを用いた塩基配列決定を行い、得られた塩基配列を相互に比較することにより、一塩基多型を検出することが出来る。塩基配列決定に用いる前記プライマーとしては、例えば、配列表の配列番号９から１６の塩基配列かならるコード鎖用プライマー及び配列表の配列番号１７から２４の塩基配列からなる非コード鎖用プライマーがあげられる。これらのプライマーを下記表１に示す。
【００４６】
【表１】
2006068004.tif 000005
【００４７】
次に、本発明のポリヌクレオチドについて説明する。本発明のポリヌクレオチドは、前記（１）から（６）のいずれかのポリヌクレオチドの全部又は一部からなるポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、特に限定されず、例えば、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。但し、ＲＮＡにおいては、配列表上の塩基配列は、ｔ（チミン）塩基を、ｕ（ウラシル）塩基に読み替えるものとする。また、本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖であってもよく、二本以上の複数鎖であってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、前記（１）から（６）のいずれかのポリヌクレオチドの一部からなるオリゴヌクレオチドを含む。ここで、オリゴヌクレオチドとは、通常、数個〜数十個のヌクレオシドが３’，５’−ホスホジエステル結合によって重合したものをいうが、本発明において、オリゴヌクレオチドの長さは、特に制限されず、例えば、１０ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであって、好ましくは、１２ｍｅｒ〜３２ｍｅｒである。これらのオリゴヌクレオチドは、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子を検出するためのプライマー若しくはプローブや、後述するとおり、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の遺伝子転写産物ｍＲＮＡを検出・測定するためのプライマー若しくはプローブとして使用することができる。
【００４８】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、前記（１）から（６）のいずれかのポリヌクレオチドの塩基配列以外からなる配列であって、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の全部又は一部を増幅又は検出するためのプライマー又はプローブとして使用できるポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００４９】
本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の全部又は一部を増幅又は検出するためのプライマー又はプローブとして使用できる本発明のポリヌクレオチドの具体例としては、配列表の配列番号３から２４及び配列番号３０から３６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。これらのポリヌクレオチドのプライマー又はプローブとしての使用方法は、特に制限されないが、例えば、前述又は後述のとおりである。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドをプライマー又はプローブとして使用して本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子を検出する方法としては、例えば、サザンブロット法、ノザンブロット法、ＰＣＲ法、塩基配列決定による方法等があげられる。本発明のポリヌクレオチドは、それぞれの検出方法に応じ、必要に応じて、標識物質等で修飾されても良い。本発明のポリヌクレオチドを遺伝子検出用プローブとして使用する場合、例えば、配列表の配列番号１の塩基配列からなる本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子全長を鋳型として、ランダムプライマー法にて標識を加えることで作製できる。前記プローブの標識物質としては、例えば、３２Ｐのような放射性物質、ジゴキシゲニンのような非放射性化学物質等があげられる。
【００５１】
次に、本発明のｍＲＮＡについて説明する。本発明のｍＲＮＡは、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の転写産物のｍＲＮＡである。本発明のｍＲＮＡは、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の転写活性の指標となるから、本発明のｍＲＮＡの発現量を測定することにより、例えば、後述のとおり、ＩｇＡ腎症の病勢を判定したり、予後の予測を行うことができる。
【００５２】
次に、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質について説明する。本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質は、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の発現産物のタンパク質であって、下記（７）又は（８）のタンパク質である。
（７）配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（８）配列表の配列番号２において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、マウスモノクローナル抗体である抗ｇｐ７０抗体１２Ｈ５．１、又は抗Ｒａｕｓｃｈｅｒ白血病ウイルスｇｐ７０抗体と抗原抗体反応するタンパク質。
【００５３】
前記（８）のタンパク質について、配列表の配列番号２のアミノ酸における欠失、置換もしくは付加が可能な残基数としては、前記（８）のタンパク質が、マウスモノクローナル抗体である抗ｇｐ７０抗体１２Ｈ５．１、又は抗Ｒａｕｓｃｈｅｒ白血病ウイルスｇｐ７０抗体と抗原抗体反応するものであれば、特に制限されないが、例えば、１個〜１２５個であり、１個〜９４個が好ましく、より好ましくは１個〜６２個であり、さらにより好ましくは１個〜３１個である。
【００５４】
本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質は、後述の実施例に示すように、抗ｇｐ７０マウスモノクローナル抗体１２Ｈ５．１、あるいは公知の抗Ｒａｕｓｃｈｅｒ白血病ウイルスｇｐ７０抗体と抗原抗体反応する。したがって、前記１２Ｈ５．１抗体又は抗Ｒａｕｓｃｈｅｒ白血病ウイルスｇｐ７０抗体を用いれば、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を検出、測定できる。前記１２Ｈ５．１抗体は、後述のように、マウス内在性異種指向性レトロウイルスｅｎｖ遺伝子産物ｇｐ７０に特異的に反応するモノクローナル抗体であり、前記抗Ｒａｕｓｃｈｅｒ白血病ウイルスｇｐ７０抗体は、内在性及び外来性のマウスレトロウイルスｅｎｖ遺伝子産物ｇｐ７０と特異的に反応するポリクローナル抗体である。本発明のタンパク質の製造及び精製方法としては、特に制限されず、従来公知の方法で製造及び精製できるが、例えば、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子のＣ末端に（Ｈｉｓ)６等の標識ペプチドを融合させた発現ベクターを培養細胞株等に導入して発現させ、前記標識ペプチドに対するアフィニティーカラム等を用いて精製する方法があげられる。
【００５５】
次に、本発明のＩｇＡ腎症マーカーについて説明する。本発明のＩｇＡ腎症マーカーは、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子、本発明のｍＲＮＡ、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質、及び、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を抗原として抗原抗体反応するヒト抗体からなる群から選択される少なくとも一つからなるＩｇＡ腎症マーカーである。
【００５６】
本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子からなるＩｇＡ腎症マーカーは、前記一塩基多型を遺伝子マーカーとして、例えば、多型分析に基づくＩｇＡ腎症の発症予測診断や、発症のタイプの診断等に利用することができる。また、本発明のｍＲＮＡ及び本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質からなるＩｇＡ腎症マーカーは、前記ｍＲＮＡの発現量の多寡により血中のＨＣ２ＥＮＶタンパク質抗原の濃度が変化し、また、ＨＣ２ＥＮＶタンパク質の濃度によりこれに対する抗体産生量が変化しそれにより病勢が憎悪したり軽快したりすると考えられるから、被験者の病勢を判定し、又は予後の予測を行って、例えば、強力な治療を行うべきか、経過観察にとどめるべきか等の治療方針の決定に利用できる。
【００５７】
さらに、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を抗原として抗原抗体反応するヒト抗体（以下、抗ＨＣ２ＥＮＶタンパク質抗体ともいう。）からなるＩｇＡ腎症マーカーは、例えば、ＩｇＡ腎症や、その他の原発性糸球体疾患、多発性硬化症、糖尿病等の自己免疫機序の関与が疑われる疾患を有する患者を、血清等の体液中に前記抗ＨＣ２ＥＮＶタンパク質抗体が存在する群とそうでない群とに分類することでき、この分類に基づいて、治療薬・治療法に対する患者の反応性や治療効果を比較することで、前記抗ＨＣ２ＥＮＶタンパク質抗体を有する患者群と、そうでない患者群とのそれぞれにおいて、有効性の高い治療薬・治療法の選定や開発を可能とする。また、この本発明の抗ＨＣ２ＥＮＶタンパク質抗体からなるＩｇＡ腎症マーカーは、その抗体価もしくは反応特異性に基づき、被験者の病態の重篤度・活動度と比較対照することで、新規の病勢指標として利用できる。
【００５８】
次に、本発明の遺伝子発現測定方法について説明する。本発明の遺伝子発現測定方法は、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の遺伝子発現を測定する方法であって、本発明のｍＲＮＡ又は本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を測定する遺伝子発現測定方法である。
【００５９】
本発明のｍＲＮＡを測定する本発明の遺伝子発現測定方法は、例えば、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子のプライマー又はプローブとして使用する本発明のポリヌクレオチドを用いて行うことが好ましい。そのプライマーの具体例としては、前記０１１２９５ＯＲＦ−Ｌと前記０１１２９５ＯＲＦ−Ｒ（配列表の配列番号３と４）の対、前記Ｐｒｉｍｅｒ  Ｌと前記Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ（配列表の配列番号５と６）の対、及び、下記ＨＣ２ｅｎｖ０１１Ｌ１と下記ＨＣ２ｅｎｖ０１１Ｒ（配列表の配列番号７と８）の対等があげあられる。これらの中でも、前記プライマー対としては、ＨＣ２ｅｎｖ０１１Ｌ１とＨＣ２ｅｎｖ０１１Ｒの対が好ましい。前記ＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡの測定は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法や、コンペティティブＲＴ−ＰＣＲ法等であってもよく、その方法及び試薬は、特に制限されず従来公知のものを利用できる。また、前記ノーザンブロット法には、例えば、配列表の配列番号１７〜２４の塩基配列からなる本発明のポリヌクレオチドをプローブとして使用でき、使用する試薬等は、特に制限されず従来公知のものを利用できる。
【００６０】
【化３】
2006068004.tif 000006
【００６１】
測定対象となるＨＣ２ｅｎｖ遺伝子のｍＲＮＡは、例えば、被験者の末梢血単核球から回収することができる。その回収方法は、特に制限されず、例えば、前記末梢血単核球からＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いた通常の方法により総ＲＮＡの一部として抽出する方法や、前記末梢血単核球をフィトヘマグルチニン等のレクチンにより刺激した後に、上記と同様にして抽出する方法があげられる。
【００６２】
本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を測定する本発明の遺伝子発現測定方法は、例えば、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を抗原とする抗体を用いて、従来公知の免疫学的測定方法により行うことができる。前記免疫学的測定方法としては、特に制限されないが、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、サンドウィッチＥＬＩＳＡ等があげられる。前記本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を抗原とする抗体は、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を用いて従来公知の方法で作製してもよいが、前記抗ｇｐ７０マウスモノクローナル抗体１２Ｈ５．１、又は、抗Ｒａｕｓｃｈｅｒ白血病ウイルスｇｐ７０抗体を使用してもよい。
【００６３】
本発明のｍＲＮＡの発現量の多寡により、血中のＨＣ２ＥＮＶタンパク質抗原の濃度や、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質に対する抗体産生量が変化し、それにより病勢が憎悪したり軽快したりすると考えられる。したがって、本発明の遺伝子発現測定方法によれば、被験者の病勢を判定し、あるいは、予後の予測を行って、例えば、強力な治療を行うべきか、経過観察にとどめるべきか等の治療方針に役立てることができる。
【００６４】
次に、本発明のヒト抗体測定方法について説明する。本発明のヒト抗体測定方法は、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を抗原とするヒト抗体（抗ＨＣ２ＥＮＶタンパク質抗体）の測定方法であって、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質と前記ヒト抗体とを抗原抗体反応させ、さらに、前記ヒト抗体と、前記ヒト抗体を抗原とする標識抗体とを抗原抗体反応させて本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質と前記ヒト抗体と前記標識抗体との複合体を測定する方法である。
【００６５】
本発明のヒト抗体測定方法において、具体的な測定方法は、従来公知の方法を利用でき、特に制限されないが、例えば、前記本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質は、固相に固定化されていることが好ましい。この測定方法の一例を図１５に示す。同図に示すとおり、前記本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を抗原１として一般的な方法によりプラスチックプレートやフィルター膜等の固相に固定化し、この固定化抗原１と前記試料中の測定対象であるヒト抗体２とを反応させた後、標識化抗体（標識化二次抗体）３を、前記ヒト抗体２と免疫反応させて結合させる。そして、前記標識化抗体３の標識を測定することにより、試料中の前記抗原１に反応する前記ヒト抗体２の有無やその定量を行うことができる。前記試料としては、例えば、ヒトの血液、血清、血漿、唾液、関節液、脳脊髄液等のヒト免疫グロブリンが存在する体液を用いることができる。前記標識化抗体３の標識（標識化抗体を用いた測定法）としては、例えば、放射性標識（放射免疫測定法（ＲＩＡ））、酵素標識（酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ））又は蛍光標識（蛍光免疫測定法（ＦＩＡ））等があげられる。
【００６６】
本発明のヒト抗体測定方法により、例えば、前記抗ＨＣ２ＥＮＶタンパク質抗体の検出や前記抗ＨＣ２ＥＮＶタンパク質抗体の抗体価の定量等を実施できる。さらに、本発明のヒト抗体測定方法によれば、例えば、ＩｇＡ腎症や、その他の原発性糸球体疾患、多発性硬化症、糖尿病等の自己免疫機序の関与が疑われる疾患を有する患者を、血清等の体液中に抗ＨＣ２ＥＮＶタンパク質抗体が存在する群とそうでない群とに分類することができる。この分類に基づいて、治療薬・治療法に対する患者の反応性や治療効果を比較することで、前記抗ＨＣ２ＥＮＶタンパク質抗体を有する患者群と、そうでない患者群とのそれぞれにおいて、有効性の高い治療薬・治療法の選定や開発が可能となる。また、本発明の測定方法により、被験者の抗ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子産物抗体の抗体価もしくは反応特異性を得ることができるが、これを被験者の病態の重篤度・活動度と比較対照し、新規の病勢指標とすることができる。
【００６７】
次に、本発明のＩｇＡ腎症検査キットについて説明する。本発明のＩｇＡ腎症検査キットは、本発明の遺伝子発現測定方法により本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の遺伝子発現を測定する検査キットであって、プライマー若しくはプローブとして使用する本発明のポリヌクレオチド、又は、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を抗原とする抗体を含むＩｇＡ腎症の検査キットである。本発明のＩｇＡ腎症検査キットは、必要に応じ、前記本発明の遺伝子発現測定方法に必要な従来公知の試薬、例えば、総ＲＮＡ抽出試薬、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、標識化合物、バッファー等を含むことが好ましい。
【００６８】
本発明のＩｇＡ腎症検査キットは、その他の態様として、本発明のヒト抗体測定方法により抗ＨＣ２ＥＮＶタンパク質抗体を測定するＩｇＡ腎症検査キットであって、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質と、前記ヒト抗体を抗原とする標識抗体とを含むＩｇＡ腎症の検査キットである。本発明のＩｇＡ腎症検査キットは、必要に応じ、前記本発明のヒト抗体測定方法に必要な従来公知の試薬、例えば、標識化合物、発色試薬、バッファー等を含むことが好ましい。
【００６９】
次に、本発明の医薬品について説明する。本発明の医薬品は、ＩｇＡ腎症の治療及び予防の少なくとも一方のための医薬品であって、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の全部又は一部を含む遺伝子と相補的な塩基配列からなり、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の転写若しくはタンパク質の発現を抑制可能なポリヌクレオチドを含む医薬品である。すなわち、この医薬品は、例えば、アンチセンス法、ｓｉＲＮＡ法、ｍｉＲＮＡ法等のＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を適用した医薬品である。本発明の医薬品において、薬学的に許容できる補助剤や賦形剤を含むことが好ましい。
【００７０】
本発明の医薬品は、その他の態様として、ＩｇＡ腎症の治療及び予防の少なくとも一方のための医薬品であって、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質のアミノ酸配列における、抗ＨＣ２ＥＮＶタンパク質抗体に対する抗原決定基（エピトープ）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含有する医薬品である。なお、本発明の医薬品は、前記ポリペチドに加え又はそれに代えて、抗ＨＣ２ＥＮＶタンパク質抗体と抗原抗体反応する低分子化合物を含んでいても良い。本発明の医薬品において、薬学的に許容できる補助剤や賦形剤を含むことが好ましい。
【００７１】
次に、本発明の発現ベクターについて説明する。本発明の発現ベクターは、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の全部又は一部を含む遺伝子を標的細胞に導入するための発現ベクターであって、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の全部又は一部を含む遺伝子と、前記遺伝子の発現に必要な調節配列とを含み、前記遺伝子が前記調節配列に発現可能に作動的に連結されている発現ベクターである。本発明の発現ベクターを用いれば、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質の全部又は一部を発現するように標的細胞を形質転換することができる。そして、前記形質転換により製造される形質転換細胞は、例えば、後述するとおり、本発明の遺伝子導入用レトロウイルスベクターを製造するためのパッケージング細胞として利用できる。この場合、本発明の発現ベクターにおいて、前記本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の一部としては、特に制限されないが、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質のレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）が含まれることが好ましい。
【００７２】
本発明の発現ベクターは、例えば、一本鎖、二重鎖、環状又はスーパーコイルのＤＮＡ分子やＲＮＡ分子等であってよい。また、本発明の発現ベクターの製造方法は、特に制限されず、例えば、公知の調節配列を備えた発現ベクターに、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の全部又は一部を含む遺伝子を前記調節配列に発現可能に挿入する方法があげられる。前記公知の発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等のウイルスベクターや、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社製）等の非ウイルスベクターがあげられる。前記調節配列とは、細胞内において、作動的に連結された本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の全部又は一部を含む遺伝子の発現に必要な塩基配列をであって、例えば、真核細胞に適した調節配列としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー等があげられる。前記作動的に連結とは、各構成要素が機能を果たすことができるように並置していることを意味する。
【００７３】
次に、本発明の遺伝子導入用レトロウイルスベクターについて説明する。本発明の遺伝子導入用レトロウイルスベクターは、前記ウイルス粒子の被膜タンパク質が、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質の全部又は一部を含む遺伝子導入用レトロウイルスベクターである。前記本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質の一部としては、特に制限されないが、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質のレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）が含まれることが好ましい。本発明の遺伝子導入用レトロウイルスベクターは、後述のとおり、例えば、遺伝子治療に使用することができる。また、その他、研究目的や医薬品等の生産のために標的細胞に遺伝子を導入することに使用できる。
【００７４】
レトロウイルスは、その粒子中のＲＮＡゲノムを逆転写酵素により二本鎖ＤＮＡへと変換し、ＤＮＡ化したウイルスゲノムは、プロウイルスとして感染宿主細胞染色体に組込まれる。したがって、ウイルスゲノム中に異種遺伝子を組込んだ遺伝子組換えレトロウイルスを用いて、任意の目的遺伝子を標的細胞染色体に組込み、この遺伝子を永続的に保有する形質転換細胞を得ることが可能である。レトロウイルスは、安定した遺伝子導入の手段として、研究目的や治療目的等に広く活用されている。遺伝子導入用レトロウイルスは、ＲＮＡのウイルス粒子への取込みに必要なΨ配列と目的遺伝子とを含んだ組換えＲＮＡゲノムを、ウイルス粒子形成に必要なタンパク質、ならびに、感染宿主細胞内のＲＮＡゲノム逆転写及び染色体組込みに必要なタンパク質を産生している細胞内で発現させることにより作製できる。ウイルス粒子の形成に必要なタンパク質がｇａｇ遺伝子産物であり、ＲＮＡゲノムの逆転写及び染色体組込みに必要なタンパク質がｐｏｌ遺伝子産物ある。ｅｎｖ遺伝子産物は、ウイルス産生細胞から出芽した感染性ウイルス粒子がどのような標的細胞に吸着・侵入できるかを決定する。
【００７５】
従来の遺伝子導入用レトロウイルスベクターは、マウス細胞に遺伝子導入を行う場合には、同種指向性マウスレトロウイルス、中でもモロニー白血病ウイルス等のｅｎｖ遺伝子が、粒子表面タンパク質の形成に用いられている。また、ヒト細胞に遺伝子導入しようとする場合には、異種指向性（ｘｅｎｏｔｒｏｐｉｃ）あるいは両指向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）マウスレトロウイルスのｅｎｖ遺伝子が用いられており、さらに、より広範囲の細胞への感染性を確保するため、ウシ水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）のウイルス粒子表面タンパク質を用いることもある。しかしながら、このような組換えウイルスベクターをヒトに接種する場合、接種されるウイルスベクターの粒子表面タンパク質である異種由来レトロウイルスのｅｎｖ遺伝子産物又はＶＳＶウイルス粒子表面タンパク質に対して、免疫反応が起こることが知られている。また、ウイルス粒子表面タンパク質をヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）やヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のヒトレトロウイルスのものに置換した場合であっても、これらの感染症ヒトレトロウイルスは内在性のものではなく、体外から感染するものであるため、そのｅｎｖ遺伝子産物に対しては免疫反応が起こる。実際、ＨＴＬＶやＨＩＶの感染に対して中和抗体産生を含む宿主免疫反応が生じることが知られている。
【００７６】
それに対し、本発明の遺伝子導入用レトロウイルスベクターでは、粒子表面タンパク質としてＨＣ２ＥＮＶタンパク質が発現する。ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子が元々ヒト染色体上に存在しているため、ＨＣ２ＥＮＶタンパク質に対しては、自己免疫性疾患患者を除き、通常免疫反応は起こらない。したがって、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を粒子表面タンパク質として有する本発明の遺伝子導入用レトロウイルスベクターは、たとえ同ベクターを反復投与しても中和抗体産生等の免疫反応は起こらず、同一ベクターを用いて繰返し遺伝子導入することが可能となる。
【００７７】
本発明の遺伝子導入用レトロウイルスベクターの製造方法は、特に制限されず、ウイルス粒子表面タンパク質が本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質の全部又は一部を含むものとする他は従来公知の方法で製造でき、例えば、図１６に示すようにして製造できる。まず、導入したい遺伝子４、パッケージングシグナル（Ψ配列）及びＬＴＲ等を含む遺伝子導入プラスミド５を作製する。前記遺伝子導入プラスミド５としては、例えば、ｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を使用できる。次に、この遺伝子導入プラスミド５をパッケージング細胞６に導入する。前記パッケージング細胞６は、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の全部又は一部を含む遺伝子を有し、同遺伝子産物であるＨＣ２ＥＮＶタンパク質の全部又は一部を含むタンパク質を表面タンパク質７として発現する細胞である。そして、前記パッケージング細胞６から発芽した本発明の遺伝子導入用レトロウイルスベクター８を回収する。前記パッケージング細胞６は、さらに、ｇａｇ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子を発現することが好ましい。前記導入目的遺伝子４の種類は、特に制限されない。
【００７８】
次に，本発明の遺伝子導入方法について説明する。本発明の遺伝子導入方法は、本発明の遺伝子導入用レトロウイルスベクターを使用した遺伝子導入方法である。本発明の遺伝子導入方法は、特に制限されず、従来のレトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入方法において、前記レトロウイルスベクターに代えて、本発明の遺伝子導入用レトロウイルスベクターを使用して行うことができる。本発明の遺伝子導入方法によれば、例えば、前述のとおり、中和抗体産生等の免疫反応を抑制しつつ繰り返し遺伝子導入することができ、例えば、遺伝子治療に有用である。
【００７９】
次に、本発明の遺伝子導入細胞の製造方法について説明する。本発明の遺伝子導入細胞の製造方法は、本発明の遺伝子導入方法により目的遺伝子を標的細胞に導入する工程を含む遺伝子導入細胞の製造方法である。前記目的遺伝子は特に制限されない。また、前記標的細胞も特に制限されず、例えば、インビボ又はインビトロのヒト細胞があげられる。
【００８０】
次に、本発明の遺伝子導入用キットについて説明する。本発明の遺伝子導入用キットは、本発明の発現ベクターにより形質転換されたパッケージング細胞と、Ψ配列を有する遺伝子導入プラスミドとを含む遺伝子導入用キットである。
【００８１】
また、本発明の遺伝子導入用キットは、その他の態様として、本発明の発現ベクターと、Ψ配列を有する遺伝子導入プラスミドとを含む遺伝子導入用キットであってもよい。本発明の遺伝子導入用キットにおいて、さらに、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子の少なくとも一方を発現するプラスミドを含むことが好ましい。例えば、本発明の発現ベクターと前記ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を発現するプラスミドとにより適当な細胞を形質転換することで、本発明の遺伝子導入用ウイルスベクターを製造するためのパッケージング細胞を製造することができる。
【００８２】
以下に、本発明の実施例によりさらに本発明について説明する。これらの実施例は、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００８３】
（ＩｇＡ腎症患者糸球体沈着抗原の検出）
ＩｇＡ腎症確定診断のために施行された腎生検により採取された患者組織の一部を、直ちにドライアイスを加えたイソペンタン中で凍結固定し、凍結保存した。クリオスタットで作製された凍結組織切片は、９５％エタノールで再固定後、免疫複合体中の抗原構造露出化のため６Ｍ尿素液（６Ｍ  ｕｒｅａ，０．１Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，ｐＨ３．５）で４℃、１時間処理したのち、各種既知ウイルス抗原に特異的なマウスのモノクローナル抗体と反応させた。各抗ウイルス抗体の腎組織との反応は、ＦＩＴＣ標識抗マウス免疫グロブリン二次抗体により検出した。陰性対照として、一次抗体の代わりに希釈液のみと反応させ、その後、前記蛍光標識二次抗体を反応させた切片を用意した。その結果、マウス内在性異種指向性レトロウイルスｅｎｖ遺伝子産物ｇｐ７０に対するモノクローナル抗体１２Ｈ５．１のみが、ＩｇＡ腎症患者由来の組織の一部（約３０％）と反応した。その結果を図１に示す。同図の３つの写真は、ＩｇＡ腎症患者糸球体内に沈着する抗原分子を、前記１２Ｈ５．１抗体及びＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体により検出した代表的な３例を示している。同図に示すとおり、糸球体メサンジウム領域に強い顆粒状の蛍光が認められた。
【００８４】
前記抗ｇｐ７０抗体クローン１２Ｈ５．１は、文献［Tabata, N.et al  Establishment of monoclonal anti-retroviral gp70 autoantibodies from MRL/lpr lupus mice and induction of glomerular gp70 deposition and pathology by transfer into non-autoimmune mice.『ＭＲＬ／ｌｐｒループスマウスからの抗レトロウイルスｇｐ７０モノクローナル自己抗体の樹立と、非自己免疫マウスへの導入による糸球体のｇｐ７０沈着と病変の誘導』 J. Virol. 74: 4116-4126, 2000.］に開示されるものであり、糸球体腎炎を含む自己免疫病変を自然発症するＭＲＬ／ＭｐＪ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスから多数のハイブリドーマ細胞を作製し、ワクシニアウイルスベクターを用いて強制発現させたマウス内在異種指向性レトロウイルスｅｎｖ遺伝子産物（ｇｐ７０）との反応性により、抗ｇｐ７０抗体産生クローンとして単離したものである。
【００８５】
（前記マウスｅｎｖ遺伝子（ｇｐ７０）に相同なヒトゲノム遺伝子の検出）
ヒトＩｇＡ腎症患者の糸球体病変に存在する、マウスレトロウイルスｅｎｖ遺伝子産物と特異的に反応する抗体により検出される抗原をコードする遺伝子を確認するため、前記マウスレトロウイルスｅｎｖ遺伝子配列に基づき作製したプローブを用い、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーに対するサザンブロット解析を行った。
【００８６】
前記プローブは、１２Ｈ５．１抗体のスクリーニングに用いたマウス内在性異種指向性レトロウイルスｃＤＮＡクローン（ｐＧＰ６−８）由来のｅｎｖ遺伝子全長を含むプラスミドをテンプレートとし、配列番号２５（gga aga aga agg aca aga ctg）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして作製した３２Ｐ標識ＤＮＡプローブを使用した。図２に、前記マウス内在性異種指向性レトロウイルスｅｎｖ遺伝子産物のアミノ酸配列及び同遺伝子の塩基配列を示す。同図における下線部を付した塩基配列が、前記プローブの配列である。
【００８７】
また、前記ＤＮＡライブラリーは、ＩｇＡ腎症患者及び健常人ボランティアより、書面による説明の上、署名・捺印入りの同意書を得て、末梢血約２０ｍｌの提供を受け作製した。前記末梢血を比重遠心法により単核球を分離し、従来公知の方法により、タンパク質分解酵素による消化とクロロフォルム・フェノール抽出との反復によりゲノムＤＮＡを調製し、これを、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩの限定分解後、λＥＭＢＬ３ファージベクターに組込むことで、前記ヒトゲノムＤＮＡライブラリーとした。
【００８８】
前記ヒトゲノムＤＮＡライブラリーに対して行ったサザンブロットの結果を、図３に示す。同図において、上に示す番号はファージのクローン名であり、Ｂ及びＥは、同クローンをそれぞれＢａｍＨＩ（同図においてＢ）及びＥｃｏＲＩ（同図においてＥ）で完全分解した試料であることを示す。同図に示すとおり、マウス内在性異種指向性レトロウイルスｅｎｖ遺伝子と極めて高い相同性を示すごく少数の遺伝子配列が、ヒトゲノムＤＮＡ中に存在することが確認できた。
【００８９】
（データベース検索によるヒト内在性レトロウイルスＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の同定）
マウス内在性異種指向性レトロウイルスｅｎｖ遺伝子産物のアミノ酸配列と相同性を示すアミノ酸配列をコードするヒトゲノムＤＮＡ中の配列を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に登録されているヒト染色体の細菌人工染色体（ＢＡＣ）コンティグ塩基配列データベースを利用し、ＴＢＡＳＴＮにより検索した。前記検索条件は、前記マウスｅｎｖ遺伝子産物ｇｐ７０のアミノ酸配列と全体として３０〜４０％の相同性を示し、その中でも、前記１２Ｈ５．１抗体のエピトープを含むＮ−末端領域により高い相同性を示すものを選択した。その結果、配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子として、配列表の配列番号１の塩基配列からなるヒト内在性異種指向性レトロウイルスＨＣ２ｅｎｖ遺伝子を同定した。前記データベースを利用して検索した結果、配列表の配列番号１の塩基配列からなる完全長の前記ヒトＨＣ２ｅｎｖ遺伝子は、図４に示すとおり、第１９染色体短腕の１９ｐ１３．１領域付近に存在することが示された。一連の作業を以下により詳細に記す。
【００９０】
マウス内在性異種指向性レトロウイルスｅｎｖ遺伝子産物のアミノ酸配列をＱｕｅｒｙとして、ＮＣＢＩに登録されているヒトゲノムコンティグ塩基配列データベースをＴＢＬＡＳＴＮにより相同性検索した。この際、Ｑｕｅｒｙとして用いた配列は、前記１２Ｈ５．１抗体が反応することが示された、マウス内在性異種指向性レトロウイルスｅｎｖ遺伝子産物（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５９３０５）のＮ末端１９１アミノ酸であり、そのアミノ酸配列は以下の通りである（配列表の配列番号２６）。
【００９１】
【化４】
2006068004.tif 000007
【００９２】
その結果、３６個の塩基配列がリストアップされた。これらの塩基配列のなかに、ガンマレトロウイルス（マウス内在性異種指向性レトロウイルスも、この仲間に分類される）のｅｎｖ遺伝子産物に特徴的な配置をとったシステイン残基、及びアミノ酸モチーフ（ＦＹＬＣＰ）を有する配列が複数見出された。
【００９３】
次に、見出した塩基配列が、既知のいかなるウイルス遺伝子産物に類似した蛋白質をコードするのかを知るため、検索によって得られたアミノ酸配列をＱｕｅｒｙとして、ＧｅｎＢａｎｋのｎｒデータベースをＴＢＬＡＳＴＮ検索した。その結果、見出した塩基配列は、文献［Kabat, P., M. Tristem, R. Opavsky, & J. Pastorek.  Human endogenous retrovirus HC2 is a new member of the S71 retrovirus subgroup with a full-length pol gene.『ヒト内在性レトロウイルスＨＣ２は、完全長ｐｏｌ遺伝子をもつＳ７１レトロウイルスのサブグループである』Virology 226: 83-94, 1996.］において記載された、ヒト内在性レトロウイルスＨＣ２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｚ７０６６４）の「３’−ＬＴＲ領域」に極めて類似することが判明した。この結果から、従来ｅｎｖ遺伝子を持たないと報告されたＨＣ２の、「３’−ＬＴＲ領域」と報告された部分が、実はｅｎｖ遺伝子領域に相当し、マウス内在性異種指向性レトロウイルスｅｎｖ遺伝子産物と類似したアミノ酸配列をもつ分子をコードする可能性が示唆された。
【００９４】
Ｋａｂａｔらが報告したＨＣ２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｚ７０６６４）において誤って「３’−ＬＴＲ領域」とされた部分に存在するオープンリーディングフレームを、ＯＲＦ  Ｆｉｎｄｅｒ（ＮＣＢＩ）にて検索したところ、以下のようなアミノ酸配列を持つタンパク質をコード出来ることが判明した（配列表の配列番号２７）。
【００９５】
【化５】
2006068004.tif 000008
【００９６】
そこで、ヒト染色体ＤＮＡ上の類似塩基配列を系統的に探索するために、この配列をＱｕｅｒｙとして、ＮＣＢＩヒトゲノムコンティグ塩基配列データベースを、再度ＴＢＬＡＳＴＮにより相同性検索した。その結果、９６個の塩基配列がリストアップされた。これらの塩基配列及びその３’側２ｋｂｐを含む領域のオープンリーディングフレームを探索したところ、ヒトゲノムコンティグデータベースに含まれる第１９番染色体ゲノムコンティグ上に、６２６アミノ酸からなる、マウス白血病ウイルスｅｎｖ遺伝子産物類似のポリペプチドをコード出来る塩基配列（すなわち、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子）を新規に同定した。なお、この塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＴ＿０１１２９５（ｒｅｇｉｏｎ：１１７４３０４３−１１７４４９２３）として、ＮＣＢＩから入手することが出来る。但し、この塩基配列から翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列については、これまで一切報告がなされていない。
【００９７】
（ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンの入手）
ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子が、ＢＡＣクローンＣＴＣ−５７５Ｃ１３の挿入ヒト染色体断片上に存在することが、ＮＣＢＩヒトゲノムコンティグ塩基配列データベースの記載により判明したので、このＢＡＣクローンを公的ヒトゲノム計画の公認クローン配布者であるＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から購入した。ＢＡＣ  ＤＮＡの精製は、Ｌａｒｇｅ  Ｃｏｎｓｔｒａｃｔ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｋ．  Ｋ．，  Ｔｏｋｙｏ）にて行った。精製したＢＡＣ  ＤＮＡは、その挿入配列両端の塩基配列を決定し、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録済みのＢＡＣクローンＣＴＣ−５７５Ｃ１３インサート塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７８８９９）に照合して、間違いのないことを確認した。この際用いたベクター上の配列決定用プライマーＴ７及びＳｐ６は、下記のとおりである（配列表の配列番号２８及び２９）。
【００９８】
【化６】
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【００９９】
（ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の単離）
上記のように調製したＢＡＣ  ＤＮＡをテンプレートとし、下記プライマー対０１１２９５ＯＲＦ−Ｌ及び０１１２９５ＯＲＦ−Ｒ（配列表の配列番号３及び４）を用いてＨＣ２ｅｎｖ遺伝子オープンリーディングフレーム全長をＰＣＲ法にて増幅し、プラスミドベクターｐＳＣ１１−ＭＣＳ／Ｈｉｓにサブクローニングした。このようにして得たプラスミドクローンのうち、独立した５クローンに関してインサート全長の塩基配列を決定した。その結果、それらのインサート配列が互いに１００％一致すること、また、配列表の配列番号１に記載したＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の塩基配列と１００％一致することが確認された。
【０１００】
【化７】
2006068004.tif 000010
【０１０１】
（真性３’ＬＴＲ及び５’ＬＴＲの同定と確認）
上述のとおり、過去の報告において３’ＬＴＲとされていた部分が実際にはＬＴＲではなく、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子が存在することを支持する証拠として、本発明者らは、ヒト染色体上における本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の終始コドンの下流に、その塩基配列の特徴から真性のＬＴＲであると判断される構造、すなわち、３’ＬＴＲを見出し、さらに、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子と同じ染色体上のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子領域上流に、前記３’ＬＴＲと９６％の相同性を持つ５’ＬＴＲを確認した。これらのＬＴＲの配列及びその構造を図５に示す。同図に示すとおり、新たに見出した３’ＬＴＲ及び５’ＬＴＲには、レトロウイルスＬＴＲの特徴であるＣＣＡＡＴボックスやＴＡＴＡボックス、及びポリアデニル化シグナルが存在する。
【０１０２】
次に、新たに見出された前記３’ＬＴＲ及び５’ＬＴＲが、実際に機能しているＬＴＲであることを、ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の３’ＲＡＣＥ（rapid amplification of cDNA ends）法、５’ＲＡＣＥ法、及びｃＤＮＡ全長増幅により確認した。その結果をまとめたものを図６に示す。同図に示すとおり、ＨＣ２プロウイルスから発現するｍＲＮＡの３’末端の構造は、新たに見出された前記３’ＬＴＲ内のポリアデニル化シグナル部位と一致し、５’末端の構造も新たに見出された前記５’ＬＴＲ内の転写開始部位構造と一致した。さらに、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子が発現するに際しては、新たに同定した５’ＬＴＲより転写されたｍＲＮＡ前駆体が、ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の上流でスプライシングを受けて本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子配列全体を含む成熟ｍＲＮＡが形成されることも確認された（図６参照）。
【０１０３】
ここで、各ＲＡＣＥ反応に用いたｃＤＮＡは、ヒト甲状腺総ＲＮＡからＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて作製した。ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ法のマニュアルに従ってＰＣＲ反応を行い、得られた各断片をＴＯＰＯクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて同キットのプラスミドベクターにサブクローニングし、各挿入断片の塩基配列をベクター上に設定したプライマーを用いて解析した。また、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子発現産物全長の増幅に用いたｃＤＮＡは、ヒト甲状腺総ＲＮＡからＳｕｐｅｒ  ｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて作製した。ｅｎｖ遺伝子の３’ＲＡＣＥ法に用いたプライマーは、ＨＣ２ｅｎｖ３ＲＡＣＥ１であり、ｐｏｌ遺伝子の３’ＲＡＣＥ法に用いたプライマーは、ＨＣ２ｐｏｌ３ＲＡＣＥ１であり、５’ＲＡＣＥ法に用いたプライマーは、５ＲＡＣＥｐｏｌ−ｅｎｖであり、ｃＤＮＡの全長増幅に用いたプライマー対は、ＨＣ２ＰＶ−Ｌ及びＨＣ２ＰＶ−Ｒであり、それぞれのプライマーの塩基配列は、下記のとおりである（配列番号３０〜３４）。
【０１０４】
【化８】
2006068004.tif 000011
【０１０５】
このように、従来ヒト内在性レトロウイルスＨＣ２の３’ＬＴＲと考えられていた部分は、真のＬＴＲではなく、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の一部であり、また、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子全体を含むｍＲＮＡの発現が認められた。したがって、本発明の遺伝子が、ＨＣ２プロウイルスのｅｎｖ遺伝子であることは疑いを容れない。
【実施例２】
【０１０６】
（ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子発現産物ｍＲＮＡの検出）
本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子がヒト組織において発現していることを、ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子発現産物ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により検出して確認した。各種ヒト組織より通常の方法によって抽出した総ＲＮＡを鋳型として、Ｓｕｐｅｒ  ｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によりｃＤＮＡを作製した。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、下記プライマー対ＨＣ２ｅｎｖ０１１Ｌ１及びＨＣ２ｅｎｖ０１１Ｒ（配列表の配列番号７及び８）を使用した通常のＲＴ−ＰＣＲ法によりＨＣ２ｅｎｖ遺伝子ｃＤＮＡの増幅を行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分離後、エチジウム・ブロマイド染色により検出した。
【０１０７】
【化９】
2006068004.tif 000012
【０１０８】
その結果を図７に示す。同図において、ＲＴａｓｅの行に＋又は−で示されているのは、それぞれの試料となる各組織の総ＲＮＡにＳｕｐｅｒ  ｓｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素を加えた場合と加えない場合であり、ゲノムＤＮＡの混入によるＰＣＲ産物検出を否定するための陰性対照である。同図に示すとおり、ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子発現産物であるｍＲＮＡが、腎臓、前立腺、肺等に特異的に検出できた。
【実施例３】
【０１０９】
（ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子産物タンパク質であるＨＣ２ＥＮＶタンパク質の発現）
実施例１でクローニングされた前記ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子を、図８に示すワクシニアウイルストランスファーベクターｐＳＣ１１−ＭＣＳ／Ｈｉｓに挿入し、前記ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の全長を発現する組換えワクシニアウイルスを作製した。前記ｐＳＣ１１−ＭＣＳ／Ｈｉｓは、文献［Sugahara, D., S. Tsuji-Kawahara, and M. Miyazawa. Identification of a protective CD4+ T-cell epitope in p15gag of Friend murine leukemia virus and role of the MA protein targeting to the plasma membrane in immunogenicity.『フレンドマウス白血病ウイルスのｐ１５ｇａｇにおける防御性ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの同定と、ＭＡタンパク質の細胞膜への局在がその免疫原性に果たす役割』J. Virol. 78: in press, 2004.］に開示されるワクシニアウイルストランスファーベクターであって、Ｃ−末端に（Ｈｉｓ)６標識を融合させることが可能なワクシニアウイルス発現ベクターである。前記ベクターに、前記ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の３’側末端が前記ポリヒスチジン［（Ｈｉｓ)６］残基とインフレームとなるように挿入し、ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスベクターを得た。
【０１１０】
組換えＨＣ２ＥＮＶタンパク質の発現確認は、上記組換えワクシニアウイルスを感染させたサルＣＶ−１細胞株を、（Ｈｉｓ)６に対する市販抗体を用いて染色する間接蛍光抗体法によって行った。即ち、上記組換えワクシニアウイルスを感染させたＣＶ−１細胞を、３．７％フォルムアルデヒドで固定し、０．４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で細胞膜除去処理する。（Ｈｉｓ）６に対する抗体（商品名Ｈｉｓ−ｐｒｏｂｅ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を反応させ、洗浄後、さらにＦＩＴＣ標識抗ウサギ免疫グロブリン抗体（Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，  Ｈ＋Ｌ  ｃｈａｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ，  ＦＩＴＣ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製）を反応させた。洗浄後、蛍光顕微鏡にて観察した。その結果を図９に示す。同図に示すとおり、同図中央から右上半分の領域のウイルス感染細胞において強い蛍光が検出され、前記組換えＨＣ２ＥＮＶタンパク質の発現が確認された。一方、同図左下のウイルス非感染細胞には、抗体の結合による蛍光の局在は見られなかった。
【０１１１】
前記組換えワクシニアウイルスが感染したＣＶ−１細胞内で発現する組換えＨＣ２ＥＮＶタンパク質の精製は、次のように行った。まず、前記感染細胞を回収した後、細胞可溶化バッファー（例えば、６Ｍ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ，２０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７．８，５００ｍＭ  ＮａＣｌ）で処理し、細胞を可溶化した。次に、注射針を通して細胞ゲノムＤＮＡを細断し、さらに遠心して上清を回収した。そして、回収した上清から、市販のニッケルキレート・レジンを充填したカラムを用いて、（Ｈｉｓ)６標識ＨＣ２ＥＮＶタンパク質を精製した。
【実施例４】
【０１１２】
（ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子のキメラ遺伝子産物の発現と検出）
ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子全長を含むプラスミドをテンプレートとし、下記プライマー対ＨＣ−ｓｔａｒｔ−ＲＩ及びＨＣ２−Ｓｍａ−３（配列表の配列番号３５及び３６）を用いて、ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の開始コドンからレセプター結合ドメイン（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ＢｉｎｄｉｎｇＤｏｍａｉｎ：ＲＢＤ）までを含む領域（配列表の配列番号２の第１〜２１７番目のアミノ酸配列をコードする配列表の配列番号１の第１〜６５１番目の塩基配列）をＰＣＲ法により増幅した。
【０１１３】
配列表の配列番号２に示すＨＣ２ｅｎｖ遺伝子産物のアミノ酸配列を、公知の異種指向性マウス白血病ウイスル及び両指向性マウス白血病ウイルスのｅｎｖ遺伝子産物のアミノ酸配列と比較すると、７５番目のシステイン（Ｃｙｓ）を含むＡｓｐ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ-Ｖａｌ(又はＡｓｐ)-Ｌｅｕの配列が、マウス白血病ウイスルに共通して保存されている配列と等しいこと、１３２番目のＣｙｓを含むＡｓｐ-Ｐｈｅ-Ｔｙｒ-Ｌｅｕ(又はＶａｌ)-Ｃｙｓ-Ｐｒｏ-Ｇｌｙの配列も、マウス白血病ウイルスに共通して保存されている配列と等しいこと、１８６番目のＣｙｓの下流に続くＡｓｎ-Ｐｒｏ-Ｌｅｕの配列も、Ｃｙｓを含めてマウス白血病ウイルスと全く共通であること、２０６番目のＳｅｒから始まるＳｅｒ-Ｔｒｐ-Ｇｌｙ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ-Ｌｅｕ-Ｔｙｒの配列と、その下流で２２０番目のＴｈｒから始まるＴｈｒ-Ｍｅｔ-Ｐｈｅの配列も、マウス白血病ウイルスと完全に一致すること、更に、２３５番目のＰｒｏから始まるＰｒｏ-Ｌｙｓ(又はＡｒｇ)-Ｐｒｏ-Ｉｌｅ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏの配列、２９２番目のＡｓｎから始まるＡｓｎ-Ｌｅｕ-Ｔｈｒの配列、そしてそのすぐ下流で３０２番目のＣｙｓから始まるＣｙｓ-Ｔｒｐ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ-Ｌｅｕの配列も、マウス白血病ウイルスと共通であることが分かる。これらの特徴的なアミノ酸配列から、ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子産物のうち７５番目のＣｙｓと１１４番目のＣｙｓに囲まれた領域が、マウス白血病ウイルスのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）中の標的レセプター特異性の決定に重要なＶＲＡ領域に相当すること、１８６番目のＣｙｓが、マウス白血病ウイルスでＲＢＤのカルボキシル末端側境界に相当するＣｙｓに対応すること、及び、２３５番目のＰｒｏからが、プロリン・リッチ領域（ＰＲＲ）であることが容易に推測できる。なお、これら特徴的アミノ酸配列の保存されたＣｙｓ残基、及びＶＲＡ領域やＰＲＲ領域の定義については、文献［Battini JL, Heard JM, Danos O. Receptor choice determinants in the envelope glycoproteins of amphotropic,xenotropic, and polytropic murine leukemia viruses.『両指向性、異種指向性、及び多指向性マウス白血病ウイルスの被膜糖タンパク質におけるレセプター選択の決定基』J Virol.66(3):1468-75,1992］を参照できる。
【０１１４】
後述の実施例６で示すとおり、実際に、配列表の配列番号２のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子産物における２１７番目のグリシンまで、即ち、ＲＢＤと推定される領域までを含んだ組換えタンパク質は、標的霊長類細胞表面に結合する。また、ＰＲＲ領域と推測される部分のアミノ酸配列が実際にプロリン残基に富むことも、配列表の配列番号２のアミノ酸配列から明らかである。
【０１１５】
【化１０】
2006068004.tif 000013
【０１１６】
前記ＰＣＲ法により得られた増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｍａＩとで消化後、クローニングベクターｐＢＳＩＩ−ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組込んだ。一方、フレンドマウス白血病ウイルス（Ｆ−ＭｕＬＶ）のｅｎｖ遺伝子を含むプラスミド（文献［Iwashiro, M., T. Kondo, T. Shimizu, H. Yamagishi, K. Takahashi, Y. Matsubayashi, T. Masuda, A. Otaka, N. Fujii, A. Ishimoto, M. Miyazawa, M. N. Robertson, B. Chesebro, and K. Kuribayashi.  Multiplicity of virus-encoded helper T-cell epitopes expressed on FBL-3 tumor cells.  J. Virol. 67: 4533-4542, 1993.］に記載のｐ２０−８参照）から制限酵素ＳｍａＩを用いてＲＢＤの下流から終始コドンまでの領域を切り出し、上記のＨＣ２ｅｎｖＲＢＤの下流に組込んだ。こうして作製したプラスミド（ｐＢＳ／ＨＣ２／Ｆ−Ｍｕｌｖ）から制限酵素ＮｏｔＩを用いてＨＣ２−ＲＢＤ／Ｆ−ＭｕＬＶｅｎｖキメラ遺伝子全長を含むＤＮＡ断片を切り出し、発現ベクターｐＣＭＶβ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＢｉｏｓｉｃｅｎｃｅ社製）に組込んで、ｐＣ．ＨＣ２．ｖｅｒ１とした。この発現プラスミドは、下記に示すキメラｅｎｖ遺伝子産物タンパク質を発現する。
【０１１７】
【化１１】
2006068004.tif 000014
【０１１８】
上記キメラｅｎｖ遺伝子産物タンパク質において、Ｍは、開始コドンに対応するメチオニン残基を示し、ＰＲＲは、レトロウイルスｅｎｖ遺伝子産物に特徴的なプロリン残基に富んだ領域（ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｇｉｏｎ）を示し、ＴＭは、細胞膜貫通領域（Ｔｒａｎｓ−Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｉｏｎ）示し、ＳＴＯＰは、終始コドンを示す。
【０１１９】
同様にして、フレンドマウス白血病ウイルスＦ−ＭｕＬＶｅｎｖ遺伝子全長を含む前記プラスミドｐ２０−８をテンプレートとし、下記プライマー対ｃｌｏｎｅ５７−５ｋｐｎ及びｃｌｏｎｅ５７−３ｋｐｎ（配列表の配列番号３７及び３８）を用いて、Ｆ−ＭｕＬＶｅｎｖ遺伝子の開始コドンからＲＢＤの直前までを含む領域をＰＣＲ法により増幅した。
【０１２０】
【化１２】
2006068004.tif 000015
【０１２１】
こうして得られた増幅断片と、前記ｐＢＳ／ＨＣ２／Ｆ−Ｍｕｌｖの制限酵素ＫｐｎＩ処理断片（ＨＣ２ＥＮＶタンパク質のＲＢＤを含む配列表の配列番号２の第６３〜２１７番目のアミノ酸配列をコードする断片）とを連結して得られたプラスミドから、再び制限酵素ＮｏｔＩを用いてＦ−ＭｕＬＶ／ＨＣ−ＲＢＤ／Ｆ−ＭｕｌＶｅｎｖ遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し、前記発現ベクターｐＣＭＶβに組込み、ｐＣ．ＨＣ２．ｖｅｒ２とした。この発現プラスミドは、下記に示すキメラｅｎｖ遺伝子産物タンパク質を発現する。
【０１２２】
【化１３】
2006068004.tif 000016
【０１２３】
上記キメラｅｎｖ遺伝子産物タンパク質において、Ｍ、ＰＲＲ、ＴＭ、及びＳＴＯＰは、前述と同様である。また、上記キメラｅｎｖ遺伝子産物タンパク質において、開始コドンからリーダーペプチド部分を経てＲＢＤ直前までと、ＰＲＲからＴＭを経て終始コドンまでとがＦ−ＭｕＬＶｅｎｖ遺伝子由来であり、ＲＢＤを含む部分がＨＣ２ｅｎｖ遺伝子由来である。
【０１２４】
これらのキメラｅｎｖ遺伝子のタンパク質としての発現を確認するために、ウエスタンブロット法による解析を行った。陰性対照の空のｐＣＭＶβプラスミド、ｐＣ．ＨＣ２．ｖｅｒ１、ｐＣ．ＨＣ２.ｖｅｒ２、及び陽性対照のＦ−ＭｕＬＶｅｎｖ遺伝子全長を含むｐＣ．Ｆ−ＭｕＬＶを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたリポフェクション法で、サル由来Ｃｏｓ７細胞株に導入し、２４時間培養後細胞を回収した。回収した細胞を、リン酸緩衝平衡塩類溶液にて洗浄後、細胞溶解液（１％  ＮＰ４０、プロテアーゼ阻害剤カクテル、ＰＭＳＦを含むＴＮＥ緩衝液）により溶解し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）を行った。得られた各上清サンプルを８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）膜に転写した。転写後の膜を１０％スキムミルク液でブロッキングした後に、一次抗体として抗Ｒａｕｓｃｈｅｒ白血病ウイルスｇｐ７０抗体の２，０００倍希釈液を反応させ、さらに、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヒツジＩｇＧ抗体の１０，０００倍希釈液を反応させた後、ＥＣＬｐｌｕｓ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＣｏｒｐ．社製）を用いたケミルミネセンス法により、発現タンパク質への抗体の結合を検出した。その結果を図１０に示す。同図に示すとおり、精製Ｆ−ＭｕＬＶ粒子中のｇｐ７０分子と同じ位置に、抗Ｒａｕｓｃｈｅｒ白血病ウイルスｇｐ７０抗体の反応するタンパク質の発現を検出することができ、いずれのキメラｅｎｖ遺伝子からも、キメラｅｎｖ遺伝子産物のタンパク質が翻訳されることが示された。
【実施例５】
【０１２５】
（ＩｇＡ腎症患者血漿中の抗ＨＣ２ＥＮＶタンパク質抗体の検出）
実施例３で得た組換えＨＣ２ＥＮＶタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルス発現ベクターを感染させた細胞を３．７％フォルムアルデヒドで固定後、０．４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理して細胞膜を除去し、これに、ＩｇＡ腎症患者の血漿を１４倍に希釈した試料を反応させ、洗浄後、さらに、蛍光標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応させることで、ＩｇＡ腎症患者血漿中に存在する抗ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子産物タンパク質抗体、すなわち、抗ＨＣ２ＥＮＶタンパク質抗体を検出した。その結果の一例を図１１に示す。同図に示すとおり、同図中央部の組換えウイルス感染細胞集団に、ＩｇＡ患者血漿中の抗体の結合による強い蛍光の集積が認められた。
【０１２６】
（比較例１）
実施例３で得た組換えＨＣ２ＥＮＶタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスベクターを感染させた細胞に代え、前記ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子とは全く無関係なヒト細胞内シグナル伝達分子ＨＳ−１の断片を発現する組換えワクシニアウイルスベクターの感染細胞を用いたほかは、実施例５と同様にして、ＩｇＡ患者血漿中の抗体の結合を検出した。その結果を図１２に示す。同図に示すとおり、同図左側に一部ごく弱い蛍光が認められるほかは、実施例５とは異なり、強い蛍光の集積は認められなかった。
【０１２７】
実施例１、３、５及び比較例１の結果からわかるように、ＩｇＡ腎症患者の血漿中には、本発明の遺伝子の発現産物であるタンパク質と免疫反応を起こす抗体（ＩｇＡ）が存在する。したがって、ＩｇＡ腎症の発症は、本発明の遺伝子が発現して、その発現産物であるタンパク質が生じ、自己免疫機序によりこのタンパク質と反応する抗体をヒトが持つ場合に、前記抗体の免疫反応複合体が糸球体メサンジウム領域に沈着して慢性炎症反応が引き起こされるというメカニズムであるといえる。
【実施例６】
【０１２８】
（ＨＣ２ＥＮＶタンパク質のＲＢＤのヒト細胞への結合）
ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子を発現するウイルスベクターが、ヒト細胞に対する遺伝子導入用ベクターとして実用性を持つためには、当該ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子産物であるＨＣ２ＥＮＶタンパク質に、ヒト又は霊長類細胞表面への結合性があることが必要である。そこで、ＨＣ２ＥＮＶタンパク質が霊長類細胞に対して表面結合活性を有することを確認した。
【０１２９】
実施例４に記載の方法と同様にして、前記プライマー対ＨＣ−ｓｔａｒｔ−ＲＩ及びＨＣ２−Ｓｍａ−３（配列表の配列番号３５及び３６）を用いてＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の開始コドンからレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）までを含む領域をＰＣＲ法により増幅した。次に、前記増幅断片の３’末端（アミノ酸配列のＣ末端）を、緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰ遺伝子の５’末端にインフレームで続くように、ｐＣＳＩ．ＥＧＦＰベクター（文献［Manel, N., Kim, F.J., Kinet, S., Taylor, N., Sitbon, M., and Battini, J.L. The ubiquitous glucose transporter GLUT-1 is a receptor for HTLV.  Cell 115(4): 449-59, 2003.］参照。）に組み込み、ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子のＲＢＤ部分がＥＧＦＰに結合したキメラタンパク質を発現するプラスミドを作製した。
【０１３０】
陰性対照として、ＥＧＦＰのみを発現するｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を準備し、陽性対照として、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＨＴＬＶ−ＩＩｅｎｖ遺伝子のＲＢＤ部分がＥＧＦＰに結合したキメラタンパク質を発現するｐＨＴＬＶ２−ＥＧＦＰ（同文献参照）を準備した。
【０１３１】
これらのプラスミドを、それぞれ単独で、リン酸カルシウム法によるトランスフェクションによりヒト２９３ＦＴ細胞に導入して４８時間培養を続けた後、細胞を剥離して遠心分離し、得られた遺伝子導入細胞のペレットをタンパク質分解酵素抑制剤カクテル（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を含むリン酸緩衝生理食塩水に浮遊させて、液体窒素と４２℃の温浴とによって４回凍結融解を繰り返した。その後、細胞由来ゲノムＤＮＡを、浮遊液を繰り返し注射針に通すことにより粉砕し、氷上で３０秒ずつ２回超音波処理を行った後、７，０００×ｇ、１０分間遠心した上清を可溶性細胞抽出物とした。これら抽出物のタンパク質濃度は、ＥＧＦＰの蛍光強度により平準化し、前記Ｍａｎｅｌ，Ｎらの文献に記載されている方法に従って標的細胞への結合を行った。標的細胞としては、霊長類ＣＶ−１細胞及びＣＯＳ７細胞を例として使用した。
【０１３２】
蛍光セルソータによる解析の結果を、図１３に示す。同図に示すとおり、ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子産物であるＨＣ２ＥＮＶタンパク質のＲＢＤ部分にＥＧＦＰによる標識を施した分子は、標的細胞であるＣＶ−１細胞及びＣＯＳ７細胞に対して、明らかに有意な表面結合活性を示すことが確認された。
【実施例７】
【０１３３】
（ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子を発現するウイルスベクターによるヒト細胞への遺伝子導入）
ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子を発現するウイルスベクターが、ヒト細胞への遺伝子導入に利用できることを確認した。遺伝子導入用レトロウイルスベクターは、図１６に示すようにして作製した。すなわち、まず、導入したい遺伝子４、パッケージングシグナル（Ψ配列）及びＬＴＲ等を含む遺伝子導入プラスミド５を作製する。次に、この遺伝子導入プラスミド５をパッケージング細胞６に導入する。前記パッケージング細胞６は、ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の全部又は一部を含む遺伝子を有し、同遺伝子産物であるＨＣ２ＥＮＶタンパク質の全部又は一部を含むタンパク質を表面タンパク質７として発現する細胞である。そして、前記パッケージング細胞６から発芽した組換えレトロウイルスベクター８を回収する。
【０１３４】
図１６に示すレトロウイルスベクター構築系において、パッケージング細胞６に導入するＨＣ２ｅｎｖ遺伝子発現ベクターとして、実施例４に記載のプラスミドｐＣ．ＨＣ２．ｖｅｒ２を準備し、ｇａｇ／ｐｏｌ発現ベクターとして、文献［Kim, F.J., Manel, N., Boublik, Y., Battini, J.-L., and Sitbon. M.  Human T-cell leukemia virus type 1 envelope-mediated syncytium formation can be activated in resistant mammalian cell lines by a carboxy-terminal truncation of the envelope cytoplasmic domain.  J. Virol. 77: 963-969, 2003］に記載されるマウス白血病ウイルス由来のｐＣＬＥｃｏ-(ΔＳｃａＣｌａ）を準備した。また、導入する遺伝子４が組込まれた遺伝子導入プラスミド５として、同文献に記載のβ-ガラクトシダーゼ発現プラスミドｐＣＬＬａｃＺを準備した。ここで、導入するＨＣ２ｅｎｖ遺伝子発現ベクターとして実施例４に記載のプラスミドｐＣ．ＨＣ２．ｖｅｒ２を使用したのは、ＰＲＲ以下の領域がＦ−ＭｕＬＶのｅｎｖ遺伝子産物の同領域と交換されることによりＳＵ／ＴＭ切断部位の配列が最適化されたＨＣ２ＥＮＶタンパク質７を使用するためである。
【０１３５】
これら３つのプラスミドをリン酸カルシウム法によって２９３Ｔ細胞へコトランスフェクションし、翌日、培養液を交換して、さらに一日培養後、培養上清を回収してウイルス液とした。予め１２穴培養プレートに播き込んでおいたヒトＨｅＬａ又は２９３Ｔ細胞に、前記ウイルス液をポリブレンと共に加え、翌日培養液を交換した。更に一日培養した後、細胞を０．５％グルタルアルデヒドにて固定・洗浄後、ＬａｃＺ染色液を加えて３７℃にて一晩反応させ、水洗・乾燥後、実体顕微鏡にて観察した。その顕微鏡写真を図１７に示す。同図において矢印で示すとおり、ＬａｃＺの酵素活性により細胞質に写真上黒い色の付いた発色細胞が多数出現し、ＨＣ２ｅｎｖ遺伝子産物であるＨＣ２ＥＮＶタンパク質を粒子表面に発現したレトロウイルスベクターが、ヒトＨｅＬａ細胞に遺伝子導入活性を持つことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子及びその発現産物であるＨＣ２ＥＮＶタンパク質は、例えば、ＩｇＡ腎症の診断、治療に利用することができ、その他、遺伝子導入用レトロウイルスベクターにも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図１は、ＩｇＡ腎症患者糸球体内に沈着する抗原分子をマウスモノクローナル抗体１２Ｈ５．１で検出した蛍光顕微鏡写真の一例を示す図である（実施例１）。
【図２】図２は、マウス内在性異種指向性レトロウイルスｅｎｖ遺伝子産物のアミノ酸配列及び同遺伝子の塩基配列を示す図である（実施例１）。
【図３】図３は、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーに対して行ったサザンブロットの結果を示す図である（実施例１）。
【図４】図４は、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子のヒトゲノムにおける位置を示すデータベース検索結果の一例を示す図である。
【図５】図５は、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子が存在するＨＣ２プロウイルスの３’ＬＴＲ及び５’ＬＴＲの配列と構造を示す図である。
【図６】図６は、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子について、５’ＲＡＣＥ、３’ＲＡＣＥ及び全長ｃＤＮＡ増幅を行った結果をまとめた図である（実施例１）。
【図７】図７は、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子のヒト組織における発現をＲＴ−ＰＣＲ法により確認した結果の一例の写真である（実施例２）。
【図８】図８は、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子を組込んだ組換えワクシニアウイルス発現ベクターを示す模式図である。
【図９】図９は、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の発現を間接蛍光抗体法で検出した蛍光顕微鏡写真の一例を示す図である（実施例３）。
【図１０】図１０は、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質を含むキメラＥＮＶタンパク質の発現をウエスタンブロット法で確認した結果の一例の写真である（実施例４）。
【図１１】図１１は、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の発現を間接蛍光抗体法で検出した蛍光顕微鏡写真のその他の例を示す図である（実施例５）。
【図１２】図１２は、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の発現を間接蛍光抗体法で検出した蛍光顕微鏡写真のさらにその他の例を示す図である（比較例１）。
【図１３】図１３は、本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質の霊長類細胞に対する表面結合活性の一例を示す図である（実施例６）。
【図１４】図１４は、本発明のＨＣ２ｅｎｖ遺伝子の一塩基多型を検出する方法の一例を示すフロー図である。
【図１５】図１５は、本発明のヒト抗体測定方法の一例の模式図である。
【図１６】図１６は、本発明の遺伝子導入用レトロウイルスベクターの製造方法の一例を示す模式図である。
【図１７】図１７は、本発明の遺伝子導入用レトロウイルスベクターによりヒト細胞に遺伝子が導入された結果の一例を示す写真である（実施例７）。
【符号の説明】
【０１３８】
１：本発明のＨＣ２ＥＮＶタンパク質又はその一部
２：被験者の血清又は体液中の抗体
３：標識二次抗体
４：遺伝子導入目的遺伝子
５：遺伝子導入プラスミド
６：パッケージング細胞
７：表面タンパク質
８：本発明の遺伝子導入用レトロウイルスベクター
【配列表フリーテキスト】
【０１３９】
配列番号３：プライマー  ０１１２９５ＯＲＦ−Ｌ
配列番号４：プライマー  ０１１２９５ＯＲＦ−Ｒ
配列番号５：プライマー  Ｌ
配列番号６：プライマー  Ｒ
配列番号７：プライマー  ＨＣ２ｅｎｖ０１１Ｌ１
配列番号８：プライマー  ＨＣ２ｅｎｖ０１１Ｒ
配列番号９〜１６：コード鎖プライマー
配列番号１７〜２４：非コード鎖プライマー  
配列番号２５：ｅｎｖプローブ用プライマー
配列番号２８：プライマー  Ｔ７
配列番号２９：プライマー  Ｓｐ６
配列番号３０：プライマー  ＨＣ２ｅｎｖ３ＲＡＣＥ１
配列番号３１：プライマー  ＨＣ２ｐｏｌ３ＲＡＣＥ１
配列番号３２：プライマー  ５ＲＡＣＥｐｏｌ−ｅｎｖ
配列番号３３：プライマー  ＨＣ２ＰＶ−Ｌ
配列番号３４：プライマー  ＨＣ２ＰＶ−Ｒ
配列番号３５：プライマー  ＨＣ２−ｓｔａｒｔ−ＲＩ
配列番号３６：プライマー  ＨＣ２−Ｓｍａ−３
配列番号３７：プライマー  ｃｌｏｎｅ５７−５ｋｐｎ
配列番号３８：プライマー  ｃｌｏｎｅ５７−３ｋｐｎ
【図１】
2006068004.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2006068004.tif 000021
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2006068004.tif 000031
【図１６】
2006068004.tif 000032
【図１７】
2006068004.tif 000033
【配列表】
2006068004000001.app