(57)【要約】  【課題】  本発明の目的は、耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶構造を解明することである。  【解決手段】    ホモ二十量体であり、それぞれのサブユニットは二量体を一単位として、５個の二量体により構成されたリング構造が積層してなるダブルリング構造が形成されている耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホモ二十量体であり、それぞれのサブユニットは二量体を一単位として、５個の二量体により構成されたリング構造が積層してなるダブルリング構造が形成されている耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶。
【請求項２】
以下の(a)、(b)又は(c)の性質を有する、請求項１に記載の耐熱性チオレドキシンペル
オキシダーゼの結晶：
(a)空間群P1に属し、a=126.3Å、b=126.3Å、c=213.8Å、α=80.3°、β=80.4°、γ=70.6°の単位格子定数を有する。
(b)空間群P1に属し、a=76.2Å、b=103.1Å、c=104.5Å、α=106.0°、β=105.1°、γ=92.9°の単位格子定数を有する。
(c)空間群P1に属し、a=76.2Å、b=103.1Å、c=103.9Å、α=105.8°、β=105.3°、γ=92.9°の単位格子定数を有する。
【請求項３】
耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼがAeropyrum pernix K1由来のものである、請求
項１又は２に記載の耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶。
【請求項４】
耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶の以下の(1)及び(2)の特徴の少なくとも1つを利用する耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの作用を調節する分子の設計方法
：
(1)ホモ２０量体であり、１０個のサブユニットからなるリング構造が積層したダブルリ
ング構造が形成されている。
(2) 以下の(a)、(b)又は(c)の性質を有する：
(a)空間群P1に属し、a=126.3Å、b=126.3Å、c=213.8Å、α=80.3°、β=80.4°、γ=70.6°の単位格子定数を有する。
(b)空間群P1に属し、a=76.2Å、b=103.1Å、c=104.5Å、α=106.0°、β=105.1°、γ=92.9°の単位格子定数を有する。
(c)空間群P1に属し、a=76.2Å、b=103.1Å、c=103.9Å、α=105.8°、β=105.3°、γ=92.9°の単位格子定数を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶に関する。また、本発明は、耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの作用を調節する分子の設計方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞には、酸化ストレスから自らを防御するシステムがいくつか存在することが知られている。その中に、過酸化水素等の活性酸素を除去するチオレドキシンシステムと呼ばれる機構がある。チオレドキシンシステムにおいて、過酸化水素がまずペルオキシレドキシン(Prx)と総称される蛋白質のチオール基によって還元される。次に、酸化型となったPrxのジスルフィド結合がチオレドキシンにより還元される。そして、酸化型チオレドキシンはチオレドキシン還元酵素（補酵素NADPHを用いる）により還元される。このように、チ
オレドキシンシステムにおいては、NADPHを還元剤として蛋白質のチオール基のネットワ
ークを介して、活性酸素が無毒化される。
【０００３】
「古細菌」と分類される生物群の中には、超好熱性のものなど極限条件で生育するものが多く含まれ、ゲノム解析のターゲットとなる種も多く存在する。超好熱性古細菌Aeropyrum pernix K1は、ゲノム情報が公開されているものでは最も生育温度が高い好気性微生
物である。古細菌においてチオレドキシンシステムの存在は長らく確認されていなかったが、本発明者等は好気性のA. pernix K1をターゲットとすることにより、古細菌としては初めてチオレドキシンシステムに関与する蛋白質（チオレドキシンペルオキシダーゼ（ペルオキシレドキシンの一種）、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素）の存在を見出し、その活性を確認した（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
A. pernix K1由来のチオレドキシンペルオキシダーゼは、他の常温性のペルオキシレドキシンに比して、耐熱性が高く有用である。従って、A. pernix K1由来のチオレドキシンペルオキシダーゼの結晶構造が解明されて、その耐熱性や酵素反応メカニズムに寄与する構造的知見が得られれば、ペルオキシレドキシンの耐熱性等の作用を調節する分子の設計に役立てることができる。
【特許文献１】特開２００３−１８０３５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明の目的は、耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶構造を解明し、耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの作用を調節する分子の設計方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、超好熱性古細菌Aeropyrum pernix K1から単離された耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶化に成功し、その
結晶構造の解析を行い、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、下記に掲げる耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶、及び耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの作用を調節する分子の設計方法を提供する。
項１．  ホモ二十量体であり、それぞれのサブユニットは二量体を一単位として、５個の二量体により構成されたリング構造が積層してなるダブルリング構造が形成されている耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶。
項２．  以下の(a)、(b)又は(c)の性質を有する、項１に記載の耐熱性チオレドキシンペ
ルオキシダーゼの結晶：
(a)空間群P1に属し、a=126.3Å、b=126.3Å、c=213.8Å、α=80.3°、β=80.4°、γ=70.6°の単位格子定数を有する。
(b)空間群P1に属し、a=76.2Å、b=103.1Å、c=104.5Å、α=106.0°、β=105.1°、γ=92.9°の単位格子定数を有する。
(c)空間群P1に属し、a=76.2Å、b=103.1Å、c=103.9Å、α=105.8°、β=105.3°、γ=92.9°の単位格子定数を有する。
項３．  耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼがAeropyrum pernix K1由来のものであ
る、項１又は２に記載の耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶。
項４．  耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶の以下の(1)及び(2)の特徴の少なくとも1つを利用する耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの作用を調節する分子の設
計方法：
(1)ホモ２０量体であり、１０個のサブユニットからなるリング構造が積層したダブルリ
ング構造が形成されている。
(2) 以下の(a)、(b)又は(c)の性質を有する：
(a)空間群P1に属し、a=126.3Å、b=126.3Å、c=213.8Å、α=80.3°、β=80.4°、γ=70.6°の単位格子定数を有する。
(b)空間群P1に属し、a=76.2Å、b=103.1Å、c=104.5Å、α=106.0°、β=105.1°、γ=92.9°の単位格子定数を有する。
(c)空間群P1に属し、a=76.2Å、b=103.1Å、c=103.9Å、α=105.8°、β=105.3°、γ=92.9°の単位格子定数を有する。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
(I)耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶
１．耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼ
チオレドキシンペルオキシダーゼは、還元型チオレドキシンの存在下に、過酸化水素を水に還元できる酵素である。耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼとは、１００℃で０．５時間熱処理した場合に５０％以上の活性が残存するものであり、好ましくは１００℃で０．５時間熱処理した場合に６０％以上の活性が残存するものである。本明細書において、チオレドキシンペルオキシダーゼの活性は次の方法で測定される。即ち、基質としての1mM過酸化水素、0.2mM NADPH、0.1μMの精製チオレドキシン還元酵素、５μMの精製チ
オレドキシンを含む50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）中に、活性測定対象のチオレド
キシンペルオキシダーゼ２μgを添加し、NADPHの濃度の指標である340nmにおける吸光度
の減少速度を５分間測定することによりチオレドキシンペルオキシダーゼの活性を測定する。
【０００８】
本発明において、耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼとして、具体的には、(a)配
列番号１に示されるアミノ酸配列、及び(b)配列番号１に示されるアミノ酸配列において
１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼ活性を有するものが例示される。
【０００９】
本明細書において、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼを「チオレドキシンペルオキシダーゼ野生体」；及び配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第２０７位のシステインがセリンに置換されている耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼを「チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体」と表
記する。
【００１０】
２．耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの調製
本発明において、結晶構造に解析に使用される耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼは、超好熱性古細菌であるA. pernix から公知の蛋白質精製法に従って得ることができる。また、遺伝子工学的手法を用いて、A. pernix からチオレドキシンペルオキシダーゼを
コードする遺伝子を取得し、これを大腸菌等の適当な宿主に形質転換させ発現させて、大量に取得することもできる。チオレドキシンペルオキシダーゼをコードする遺伝子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に基づいて取得できる。また、上記A. pernixとして、
好ましくはA. pernix K1（NBRC 100138）が使用され、該菌株からチオレドキシンペルオ
キシダーゼ野生体をコードする遺伝子が取得できる。
【００１１】
また、結晶構造に解析に使用される耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼは、蛋白質中のメチオニンがセレノメチオニンに置換されていてもよい。このセレノメチオニンへの置換は、公知の方法により行うことができる。なお、以下、本明細書において、メチオニンがセレノメチオニンに置換されている耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼを「Ｓｅ置換型チオレドキシンペルオキシダーゼ」と表記する。
【００１２】
３．結晶化
耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶化は、例えば、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法、透析法、シーディング法等の方法により実施することができる。好ましくは、ハンギングドロップ法である。
【００１３】
ハンギングドロップ法による耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶化において、耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼ含有溶液（以下、Ｔｐｘ含有溶液と表記する）の濃度、リザーバーの種類、Ｔｐｘ含有溶液とリザーバーの混合比、温度等の条件については適宜設定すればよいが、具体例として下記条件が例示される。
＜結晶化条件１＞
チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体の結晶化の場合
Ｔｐｘ含有溶液の耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼ濃度：２０〜２５ｍｇ／ｍＬ
リザーバー：０．４Ｍ酒石酸カリウムナトリウム水溶液
混合比：  Ｔｐｘ含有溶液：リザーバー（容量比）＝１：１
温度：２０〜２５℃。
【００１４】
＜結晶化条件２＞
チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体の結晶化の場合
Ｔｐｘ含有溶液の耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼ濃度：２０〜２５ｍｇ／ｍＬ
リザーバー：０．４Ｍ酒石酸カリウムナトリウム及び１５重量％エチレングリコール含有水溶液
混合比：  Ｔｐｘ含有溶液：リザーバー（容量比）＝１：１
温度：２０〜２５℃。
【００１５】
＜結晶化条件３＞
Ｓｅ置換型チオレドキシンペルオキシダーゼ野生体又はC207S変異体の結晶化の場合
Ｔｐｘ含有溶液の耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼ濃度：２０〜２５ｍｇ／ｍＬ
リザーバー：０．１Ｍイミダゾール-塩酸緩衝液（pH 6.5）及び０．６Ｍ酢酸ナトリウム
含有水溶液
混合比：  Ｔｐｘ含有溶液：リザーバー（容量比）＝１：１
温度：２０〜２５℃
【００１６】
このような方法によって、Ｘ線構造解析によって、立体構造を解明し得る品位の結晶を得ることができる。
【００１７】
４．結晶の構造解析
上記で得られた耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶をＸ線結晶構造解析に供することにより、結晶学的パラメーターを特定することができる。本発明の耐熱性チオレ
ドキシンペルオキシダーゼの結晶は、(a)空間群P1に属し、a=126.3Å、b=126.3Å、c=213.8Å、α=80.3°、β=80.4°、γ=70.6°の単位格子定数；(b)空間群P1に属し、a=76.2Å、b=103.1Å、c=104.5Å、α=106.0°、β=105.1°、γ=92.9°の単位格子定数；又は(c)空間群P1に属し、a=76.2Å、b=103.1Å、c=103.9Å、α=105.8°、β=105.3°、γ=92.9
°の単位格子定数を有する。上記(a)で示される結晶学的パラメーターは、上記結晶化条
件１により得られるチオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体の結晶から特定される
ものであり、上記(b)で示される結晶学的パラメーターは、上記結晶化条件２により得ら
れるチオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体の結晶から特定されるものであり、更
に上記(c)で示される結晶学的パラメーターは、上記結晶化条件３により得られるＳｅ置
換型チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体の結晶から特定されるものである。こ
こで、上記の格子定数は、同じタイプのものでも１％程度の違いがあることがあり、上記格子定数と１％程度の相違がある結晶も本発明に含まれる。
【００１８】
耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの電子顕微鏡観察（図１参照）により、同蛋白質がダブルリング構造をとっていることが明らかになっている。また、ゲル濾過による分子量測定から、ダブルリング当たりのサブユニットの数は１５から２０程度と見積もられている。しかし、電子顕微鏡の分解能やゲル濾過の精度ではリングを形成するサブユニットの正確な数や、サブユニットの配向までは明らかではない。以上の２点につき、同蛋白質の自己回転関数を解析することによって明らかにした。自己回転関数の解析とは、結晶の格子を形成する蛋白質の原子座標がわからなくても、回転対称操作を加えることにより分子の対象性を明らかにする解析手法である。上記(a)で示される結晶学的パラメーター
を示す結晶の自己回転関数を計算すると、１個の５回軸と、それに直交する方向に１０個の２回軸が見つかった（図２参照）。これは、リングを形成するサブユニットの数が５の倍数であること、それぞれのサブユニットは２量体がひとつの単位としてリングを形成していること、を示している。
【００１９】
以上により、該結晶を形成する蛋白質は、ホモ二十量体であり、それぞれのサブユニットは二量体を一単位として、５個の二量体により構成されたリング構造が積層してなるダブルリング構造が形成されていること、即ち、該結晶を形成する蛋白質は(((α)2)5)2の
ダブルリング構造を有していることが明らかになった。
【００２０】
常温のペルオキシレドキシンには、ダブルリング構造のものは存在していないので、このダブルリング構造が酵素の耐熱性に寄与していると推定される。
【００２１】
(II)耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの作用を調節する分子の設計方法
本発明の耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの作用を調節する分子の設計方法は、上述した本発明の耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶構造の特徴を利用して、この酵素の作用に影響を与える分子を設計する方法である。結晶状態の耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼに対して影響を及ぼすと考えられる分子は、工業的に利用される溶液状態の耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼに対して同様の影響を及ぼすことが予測される。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶構造が初めて解明された。これにより、耐熱性の高いチオレドキシンペルオキシダーゼのの設計や、耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの作用を調節する分子の設計を行うことができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
実施例１
１．耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの調製
チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体の調製
（大腸菌の培養）
チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体を発現するプラスミドを保持した大腸菌Rosetta(DE3)をLB培地で37℃で培養し、OD=0.6となったところでイソプロピル-β-チオガ
ラクトピラノシド（IPTG）を1 mMとなるように添加し、25℃で約15時間更に振とうした。（蛋白質の精製）
上記により得られた大腸菌を超音波破砕して、遠心分離により水溶性画分（上清）を得る。85℃30分の熱処理の後、遠心分離により熱に不安定な蛋白質を除き、上清を得た。最終濃度2重量％となるようにストレプトマイシン硫酸塩を添加して、遠心分離により核酸
を除き、上清を得た。それを、緩衝液（20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM DTT）に対して透析を行った。次いで、それを、Hi-TrapQ (Amersham Biotech)を用いた陰イオン交換クロ
マトグラフィーに供し、目的の蛋白質を含む画分を回収した。該画分を更にSuperdex-200(Amersham Biotech)を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより分離し、目的の蛋白質を含む画分をもって最終精製標品とした。斯くして、チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体を製した。なお、得られたチオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体は、Ｎ末端にある第１位のメチオニンが欠落したアミノ酸配列からなるものであった。
Ｓｅ置換型チオレドキシンペルオキシダーゼ野生体及びC207S変異体の調製
（大腸菌の培養）
文献（Sylvie Doublie (1997) Methods in Enzymology 276, 523-530）を参照した。耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼ野生体又はC207S変異体を発現するプラスミドを保
持した大腸菌Rosetta(DE3)をM9培地で37℃で培養した。OD=0.3となったところで、Lys, Phe, Thr, Ile, Leu, Val, 及びSeMetを終濃度（0.1 mg/ml Lys, 0.1 mg/ml Phe, 0.1 mg/ml Thr, 0.05 mg/ml Ile, 0.05 mg/ml Leu, 0.05 mg/ml Val, 0.06 mg/ml SeMet）となるように添加した。更に、OD=0.6となったところで、1 mM IPTGを適量添加し、25℃で約15
時間更に振とうした。
略語：Lys, リジン; Phe, フェニルアラニン; Thr, スレオニン; Ile, イソロイシン; Leu, ロイシン; Val, バリン; SeMet, セレノメチオニン
（蛋白質の精製）
上記チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体の調製における蛋白質の精製と同様
の方法で、チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体を精製した。斯くして、Ｓｅ置
換型チオレドキシンペルオキシダーゼ野生体及びC207S変異体をそれぞれ製した。なお、
得られたＳｅ置換型チオレドキシンペルオキシダーゼ野生体及びC207S変異体は、それぞ
れＮ末端にある第１位のメチオニンが欠落したアミノ酸配列からなるものであった。
【００２４】
２．結晶化
チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体の結晶化
(1)結晶化条件１
チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体含有溶液とリザーバーを等量（2マイクロリットル）ずつ混合してドロップを作り、ハンギングドロップ法により25℃で結晶化した。ここで、チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体含有溶液として、チオレドキシ
ンペルオキシダーゼC207S変異体の濃度を20〜25mg/mlに調整したものを使用し、リザーバーとして0.4M 酒石酸カリウムナトリウム水溶液を使用した。
【００２５】
斯くして、0.2×0.2×0.5ｍｍのサイズの耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体の結晶を得た。得られた結晶の写真を図３に示す。
【００２６】
(2)結晶化条件２
チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体含有溶液とリザーバーを等量（2マイクロリットル）ずつ混合してドロップを作り、ハンギングドロップ法により25℃で結晶化した。ここで、チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体含有溶液として、チオレドキシ
ンペルオキシダーゼC207S変異体の濃度を20〜25mg/mlに調整したものを使用し、リザーバーとして0.4M 酒石酸カリウムナトリウム及び15重量％エチレングリコールを含有する水
溶液を使用した。
【００２７】
斯くして、0.1×0.2×0.2ｍｍのサイズのの耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体の結晶を得た。得られた結晶の写真を図４に示す。
【００２８】
Ｓｅ置換型チオレドキシンペルオキシダーゼ野生体及びC207S変異体の結晶化
(3)結晶化条件３
Ｓｅ置換型チオレドキシンペルオキシダーゼ野生体含有溶液とリザーバーを等量（2マ
イクロリットル）ずつ混合してドロップを作り、ハンギングドロップ法により25℃で結晶化した。ここで、Ｓｅ置換型チオレドキシンペルオキシダーゼ野生体含有溶液として、Ｓｅ置換型チオレドキシンペルオキシダーゼ野生体の濃度を20〜25mg/mlに調整したものを
使用し、リザーバーとして０．１Ｍイミダゾール-塩酸緩衝液（pH 6.5）及び０．６Ｍ酢
酸ナトリウム含有水溶液を使用した。
【００２９】
斯くして、0.1×0.2×0.2ｍｍのサイズのＳｅ置換型チオレドキシンペルオキシダーゼ
野生体の結晶を得た。得られた結晶の写真を図５に示す。
【００３０】
また、Ｓｅ置換型チオレドキシンペルオキシダーゼ野生体の代わりにＳｅ置換型チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体を使用する以外は、上記と同様の方法で、Ｓｅ置
換型チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体の結晶化を行い、0.1×0.2×0.2ｍｍのサイズの結晶が得られた。得られた結晶の写真を図６に示す。
【００３１】
３．結晶構造解析
上記で得られた結晶について結晶構造解析し、少なくとも分解能2.5Åの回析データが
得られた。
【００３２】
この結果、上記結晶化条件１で得られたチオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体
の結晶を常温で測定したところ、空間群P1に属し、a=126.3Å、b=126.3Å、c=213.8Å、
α=80.3°、β=80.4°、γ=70.6°の単位格子定数を有することが明らかとなった。
【００３３】
また、上記結晶化条件２で得られたチオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体の結
晶を100ケルビンで測定したところ、空間群P1に属し、a=76.2Å、b=103.1Å、c=104.5Å
、α=106.0°、β=105.1°、γ=92.9°の単位格子定数を有することが明らかとなった。
【００３４】
更に、上記結晶化条件３で得られたＳｅ置換型チオレドキシンペルオキシダーゼC207S
変異体の結晶を100ケルビンで測定したところ、空間群P1に属し、a=76.2Å、b=103.1Å、c=103.9Å、α=105.8°、β=105.3°、γ=92.9°の単位格子定数；或いは空間群P1に属し、a=76.2Å、b=102.8Å、c=103.7Å、α=105.6°、β=105.5°、γ=93.0°の単位格子定
数を有することが確認された。
【００３５】
４．構造決定
耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼについては、電子顕微鏡観察（図１参照）により同蛋白質がダブルリング構造をとっていることが明らかになっている（Jeon, S.J. and
Ishikawa K. (2003) J. Biol. Chem. 278, 24174-27180参照）。また、ゲル濾過による
分子量測定結果から、ダブルリング当たりのサブユニットの数は１５から２０程度と推定されている。
【００３６】
また、上記結晶化条件１で得られたチオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体の結
晶について、自己回転関数を計算した結果、１個の５回軸と、それに直交する方向に１０個の２回軸が認められた（図２参照）。この結果は、(1)リングを形成するサブユニット
の数が５の倍数であること、及び(2)それぞれのサブユニットは２量体がひとつの単位と
してリングを形成していることを示している。
【００３７】
以上の結果を総合すると、耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの結晶は、ホモ二十量体であり、それぞれのサブユニットは二量体を一単位として、５個の二量体により構成されたリング構造が積層してなるダブルリング構造（即ち、(((α)2)5)2のダブルリング
構造）を有している耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼにより形成されていることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１中、Ａは、報告されている耐熱性チオレドキシンペルオキシダーゼの電子顕微鏡写真である。Ｃは、リングを縦方向から撮影した写真である。Ｅは、リングを横方向から撮影した写真である。Ｅからダブルリング構造であることが確認される。
【図２】実施例の結晶化条件１で得られたチオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体の結晶の自己回転関数を示す図である。左図には５回転軸の場所を、右図には２回転軸の場所を示す。２回転軸は、紙面の裏側に隠れているものを含めて１０個確認される。
【図３】実施例の結晶化条件１で得られたチオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体の結晶の写真である。
【図４】実施例の結晶化条件２で得られたチオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体の結晶の写真である。
【図５】実施例の結晶化条件３で得られたＳｅ置換型チオレドキシンペルオキシダーゼ野生体の結晶の写真である。
【図６】実施例の結晶化条件３で得られたＳｅ置換型チオレドキシンペルオキシダーゼC207S変異体の結晶の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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