(57)【要約】【課題】  軸索再生を阻害する物質の存在下であっても脊髄等の中枢神経を再生することが可能な軸索再生剤を提供すること。【解決手段】  Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を主成分とする軸索再生剤とする。【選択図】図１
2006327942.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を主成分とする軸索再生剤。
【請求項２】
前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、Ｙ−２７６３２又はファスジルであることを特徴とする請求項１記載の軸索再生剤。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脊髄等の中枢神経を再生することが可能な軸索再生剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊髄等の中枢神経が交通事故等に起因する傷害あるいは脳血管障害等で損傷を受けると、神経機能は失われたまま再生することはできない。末梢神経が再生するのとは対照的である。中枢神経は損傷すると再生できないので、中枢神経を損傷するとしばしば部分的又は完全な麻痺が起きる。したがって、損傷した中枢神経を再生させることは医療分野における重要な課題である。
【０００３】
一方、成人の中枢神経の軸索が末梢神経のグラフトを介して再生することに関する報告（非特許文献１参照）があり、成人の中枢神経が再生しない主な原因は、神経細胞を取り巻く局所的な環境にあることが示唆されている。
【０００４】
そしてこれまでに成人の中枢神経系において、軸索再生を阻害する物質としてミエリン由来のタンパク質が３つ発見されている（非特許文献２参照）。それらは、Ｎｏｇｏ、ミエリン結合糖タンパク質（ＭＡＧ）及び乏突起神経膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）であり、すべてｐ７５を介して機能する（非特許文献３〜４参照）。
【０００５】
ｐ７５の下流のシグナル伝達機構を解明する上で、鍵となる細胞内物質の１つはスモールＧＴＰアーゼのＲｈｏＡである。ＲｈｏＡが活性化することで、アクチン骨格系は不活化し、結果的に軸索伸展を阻害し、成長円錐の崩壊を引き起こす。すなわち、ｐ７５を介してＮｏｇｏ、ＭＡＧ、ＯＭｇｐがＲｈｏＡを活性化すると、神経細胞の突起伸展が抑制されると考えられている（非特許文献３〜４参照）。なおこのｐ７５を介したＭＡＧ、ＮｏｇｏによるＲｈｏＡの活性化は、ｐ７５によりＲｈｏＡとＲｈｏ  ＧＤＩが解離することで導かれる（非特許文献５参照）。なお、ＲｈｏＡだけでなく、そのエフェクターであるＲｈｏキナーゼも軸索伸展を制御する重要な役割を果たすと考えられているが、まだどのように軸索伸展を制御しているか解明されていない。
【０００６】
なお軸索伸展には、細胞骨格のダイナミックな再配列が必要であるとの報告があり（非特許文献６参照）、軸索の遠位端である成長円錐では細胞骨格タンパク質の微小管やアクチンが激しく構造を変化させ、軸索伸展に関わっているとの報告（非特許文献７参照）、軸索伸展にはアクチンと微小管の相互作用が必要であるとの報告（非特許文献７〜１０参照）もある。したがって、ダイナミックなアクチンが微小管の輸送、重合を促進することで、軸索伸展を促していると考えられる（非特許文献１１参照）。したがって、微小管は軸索伸展を制御する上で重要であると考えられる。
【０００７】
ところで、ＣＲＭＰ−２は軸索伸展における微小管の動きを制御する重要な因子の１つであり、ＣＲＭＰ−２はチューブリンと結合して微小管形成を促すとの報告がある（非特許文献１３）。なおこの報告ではＣＲＭＰ−２を過剰発現させると軸索伸展が促進し、微小管重合活性を欠落させた突然変異体は軸索伸展を抑制したと報告されている。以上より、軸索の遠位端にＣＲＭＰ−２とチューブリンの複合体が集まり、微小管重合を調節し、軸索伸展に関与していることが示唆されている。
【０００８】
【非特許文献１】Ｓ．  Ｄａｖｉｄ，  Ａ．  Ｊ．  Ａｇｕａｙｏ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１４，  ９３１−３  （Ｎｏｖ  ２０，  １９８１）．
【非特許文献２】Ｌ．  ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ，  Ｍ．Ｊ．  Ｗｉｎｔｏｎ，  Ｎｅｕｒｏｎ  ３６，  ３４５−８  （Ｏｃｔ  ２４，  ２００２）．
【非特許文献３】Ｔ．  Ｙａｍａｓｈｉｔａ，  Ｈ．  Ｈｉｇｕｃｈｉ，  Ｍ．  Ｔｏｈｙａｍａ，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５７，  ５６５−７０  （Ｍａｙ  １３，  ２００２）．
【非特許文献４】Ｋ．Ｃ．  Ｗａｎｇ，  Ｊ．Ａ．  Ｋｉｍ，  Ｒ．  Ｓｉｖａｓａｎｋａｒａｎ，  Ｒ．  Ｓｅｇａｌ，  Ｚ．  Ｈｅ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，  ７４−８  （Ｎｏｖ  ７，  ２００２）．
【非特許文献５】Ｔ．  Ｙａｍａｓｈｉｔａ，  Ｍ．  Ｔｏｈｙａｍａ，  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ６，  ４６１−７  （Ｍａｙ，  ２００３）．
【非特許文献６】Ｐ．Ｗ．  Ｂａａｓ，  Ｌ．  Ｌｕｏ，  Ｎｅｕｒｏｎ  ３２，  ９８１−４  （Ｄｅｃ  ２０，  ２００１）．
【非特許文献７】Ｐ．Ｒ．  Ｇｏｒｄｏｎ−Ｗｅｅｋｓ，  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ１３，  ２３５−９，  （Ｍａｙ，  １９９１）．
【非特許文献８】Ｐ．Ｒ．  Ｇｏｒｄｏｎ−Ｗｅｅｋｓ，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ  ２２，  ７１７−２５  （Ｓｅｐ，  １９９３）．
【非特許文献９】Ｃ．Ｈ．  Ｌｉｎ，  Ｐ．  Ｆｏｒｓｃｈｅｒ，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２１，  １３６９−８３  （Ｊｕｎ，  １９９３）．
【非特許文献１０】Ｊ．Ｆ．  Ｃｈａｌｌａｃｏｍｂｅ，  Ｄ．Ｍ．  Ｓｎｏｗ，  Ｐ．Ｃ．  Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １０９，  ２０３１−４０  （Ａｕｇ，  １９９６）．
【非特許文献１１】Ｆ．  Ｂｒａｄｋｅ，  Ｃ．Ｇ．  Ｄｏｔｔｉ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３，  １９３１−４  （Ｍａｒ  １９，  １９９９）．
【非特許文献１２】Ｙ．  Ｆｕｋａｔａ，  Ｔ．Ｊ．  Ｉｔｏｈ，  Ｔ．  Ｋｉｍｕｒａ，  Ｃ．  Ｍｅｎａｇｅｒ，  Ｔ．  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｔ．  Ｓｈｉｒｏｍｉｚｕ，  Ｈ．  Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｎ．  Ｉｎａｇａｋｉ，  Ａ．  Ｉｗａｍａｔｓｕ，  Ｈ．  Ｈｏｔａｎｉ，  Ｋ．  Ｋａｉｂｕｃｈｉ，  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４，  ５８３−９１  （Ａｕｇ，  ２００２）．
【非特許文献１３】Ｎ．  Ｉｎａｇａｋｉ，  Ｋ．  Ｃｈｉｈａｒａ，  Ｎ．  Ａｒｉｍｕｒａ，  Ｃ．  Ｍｅｎａｇｅｒ，  Ｙ．  Ｋａｗａｎｏ，  Ｎ．  Ｍａｔｓｕｏ，  Ｔ．  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｍ．  Ａｍａｎｏ，  Ｋ．  Ｋａｉｂｕｃｈｉ，  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ４，  ７８１−２  （Ａｕｇ，  ２００１）．
【非特許文献１４】Ｐ．  Ｄｏｈｅｒｔｙ，  Ｍ．  Ｆｒｕｎｓ，  Ｐ．  Ｓｅａｔｏｎ，  Ｇ．  Ｄｉｃｋｓｏｎ，  Ｃ．Ｈ．  Ｂａｒｔｏｎ，  Ｔ．Ａ．  Ｓｅａｒｓ，  Ｆ．Ｓ．Ｗａｌｓｈ  ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４３，  ４６４−６  （Ｆｅｂ  １，  １９９０）
【非特許文献１５】Ｚ．  Ｌｉ，  Ｃ．Ｄ．  Ａｉｚｅｎｍａｎ，  Ｈ．Ｔ．  Ｃｌｉｎｅ，  Ｎｅｕｒｏｎ  ３３，  ７４１−５０  （Ｆｅｂ  ２８，  ２００２）．
【非特許文献１６】Ｍ．  Ａｍａｎｏ，  Ｍ．  Ｉｔｏ，  Ｋ．  Ｋｉｍｕｒａ，  Ｙ．  Ｆｕｋａｔａ，  Ｋ．  Ｃｈｉｈａｒａ，  Ｔ．  Ｎａｋａｎｏ，  Ｙ．  Ｍａｔｓｕｕｒａ，  Ｋ．  Ｋａｉｂｕｃｈｉ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，  ２０２４６−９  （Ａｕｇ  ２３，  １９９６）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記ＣＲＭＰ−２に関する報告は、ＣＲＭＰ−２の微小管形成に関する報告であるが、ＭＡＧやＮｏｇｏといった軸索再生を阻害する物質との関係についてまで考慮されておらず、軸索再生を阻害する物質の存在下であっても軸索再生を可能とすることについてまでは考慮されていない。
【００１０】
そこで本発明は、上記課題を鑑み軸索再生を阻害する物質の存在下であっても脊髄等の中枢神経を再生することが可能な軸索再生剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題につき鋭意検討を行ったところ、ＭＡＧ、Ｎｏｇｏが幼若ラットの小脳顆粒細胞においてＣＲＭＰ−２をリン酸化すること、また小脳顆粒細胞においてＣＲＭＰ−２の非リン酸化型を発現させると、ＭＡＧ又はＮｏｇｏによる突起伸展阻害作用が失われることも発見した。そして更に鋭意検討を行ったところ、このリン酸化がＲｈｏキナーゼ依存性を有していることを確認し、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を用いることにより、軸索再生に対する阻害を抑制することができることに想到し、本発明にいたった。
【００１２】
即ち本発明は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を主成分とする軸索再生剤とする。また、後述の実験例で説明するとおり、この場合においてＲｈｏキナーゼ阻害剤は、Ｙ−２７６３２又はファスジルであることが望ましい。
【発明の効果】
【００１３】
以上、本発明により、軸索再生を阻害する物質の存在下であっても脊髄等の中枢神経を再生することが可能な軸索再生剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明に係る軸索再生剤の形態の一つは、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を主成分とする。ここでＲｈｏキナーゼ阻害剤とはＲｈｏキナーゼの活性を下げるものをいい、ＲｈｏキナーゼとはＲｈｏＡによって活性化されるタンパク質リン酸化酵素をいう。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の例については特段に限定されるわけではないが、Ｙ−２７６３２、ファスジルが好ましい。本軸索再生剤は、患部に対しより有効である。
【００１５】
本形態に係る軸索再生剤の投与方法としては、静脈内投与等がある。静脈内投の場合は、1回30mgを1日2〜3回のように投与することができる。
【００１６】
また本実施形態に係る軸索再生剤については、Ｙ−２７６３２の場合はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社より、またファスジルの場合は旭化成より入手が可能である。
【００１７】
このようにすることで、軸索再生を阻害する物質の存在下であっても脊髄等の中枢神経を再生することが可能な軸索再生剤を提供することができる。
【００１８】
以下、本発明の構成及び効果の立証のため、行った実験について詳細に説明する。
【００１９】
（Ａ）材料及び方法
（１）細胞培養
後根神経節細胞は、生後６−１０日のラットからの後根神経節を０．０２５％トリプシン溶液中で１つにし、粉砕し、３７℃で５分間インキュベートした。また、小脳顆粒細胞は、ラットからの小脳を５ｍｌの０．０２５％トリプシン溶液中で１つにし、粉砕し、３７℃で１０分間インキュベートした。
【００２０】
次にそれぞれ１０％  ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加し、１０００ｒｐｍで遠心して細胞を回収し、この細胞をポリ−Ｌ−リジンでコートしたチャンバースライド上のＳａｔｏ培地（非特許文献１５）中にプレートした。成長アッセイのために、プレートした細胞を２４時間インキュベートし、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ニューロンに特異的なβチューブリンＩＩＩタンパク質を認識する目的でモノクローナル抗体（ＴｕＪ１、Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，アメリカ）で免疫染色した。そして最長の突起（軸索）の長さ又はβチューブリンＩＩＩ陽性ニューロンの総神経突起長を測定した。なお軸索再生を評価するため、ＭＡＧ（２５μｇ/ｍｌ）、Ｎｏｇｏをプレート後の培地に添加した。ｍｙｃタグを付けた非リン酸化型ＣＲＭＰ−２プラスミドあるいは、ＣＲＭＰ−２欠落突然変異体プラスミドを小脳顆粒細胞に形質移入した。形質移入後２４時間でリプレートし、さらに２４時間インキュベートした。形質移入した細胞を確認するために、抗ｍｙｃ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）で染色した。
【００２１】
（２）ウェスタンブロット
細胞を培養していた３．５ｃｍディッシュをＰＢＳで３回洗った後、溶解バッファー（１％  ＮＰ−４０（商品名、非イオン界面活性剤）、０．１％  ＳＤＳ、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  [ｐＨ  ７．４]、２  ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  オルソバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ  フッ化ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製））により、４℃で１０分間、細胞を溶解した。その後１５分間遠心分離を行い、溶解液はタンパク質アッセイキット（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてタンパク質濃度を一定にした後、サンプルバッファーを加え、５分間煮沸してからＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、常法によりウェスタンブロット分析を行なった。なお抗体として、ポリクローナル抗リン酸化ＣＲＭＰ−２抗体（貝淵研究室製）、ポリクローナル抗ＣＲＭＰ−２抗体（貝淵研究室製）、ポリクローナル抗リン酸化コフィリン抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ポリクローナル抗コフィリン抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ポリクローナル抗リン酸化ＭＬＣ抗体（旭化成製）、ポリクローナル抗ＭＬＣ抗体（旭化成製）を用いた。
【００２２】
（３）免疫染色
単量体チューブリンを除外するために、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ＰＢ）、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ  ６．９）、４％パラホルムアルデヒド、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）で神経細胞を３０分間固定した。ＥＢ１の固定は５分間、−２０℃のメタノールで行った。その他の染色は、４％パラホルムアルデヒドと０．１ＭのＰＢで行った。固定した神経細胞は、ＰＢＳで洗った後、５％仔牛血清、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％アルブミンでブロッキング後、１次抗体と反応させた。微小管の染色には、抗βチューブリンＩＩＩ抗体を用いた。ＡＰＣとＥＢ１の分布を評価するために、ポリクローナル抗ＡＰＣ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ポリクローナル抗ＥＢ１抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と同時に、ＴｕＪ１あるいは抗神経線維抗体を用いて二重染色した。次に２次抗体を反応させ、蛍光顕微鏡で観察した。蛍光を定量化するのに、露光時間やカメラの設定は固定した。
【００２３】
（４）Ｒｈｏアッセイ
Ｒｈｏアッセイは、ＧＳＴ−Ｒｈｏ結合領域を用いて、以前記載されている通りに行った（非特許文献１４）。即ち、４％パラホルムアルデヒドと０．１ＭのＰＢ（ｐＨ７．４）で組織を１時間室温で固定した。ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳに５％アルブミン、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えたブロッキングバッファーで１時間ブロッキングを行い、１５  ｕｇ/ｍｌのＧＳＴ−Ｒｈｏ結合領域を含むブロッキングバッファーを４℃で一晩反応させた。ＰＢＳで洗浄後、再び２％パラホルムアルデヒドと０．１ＭＰＢで１０分間室温で固定し、ＰＢＳで洗浄した。１次抗体として、モノクローナル抗ＧＳＴ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）とともに、Ｒｈｏの分布を評価するべく抗神経線維抗体を用いて二重染色した。培養神経細胞の固定は、４％パラホルムアルデヒドで行い、同様にモノクローナル抗ＧＳＴ抗体と抗神経線維抗体で染色した。２次抗体を反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。
【００２４】
（５）画像解析と統計
抗ＡＰＣ抗体、抗ＥＢ１抗体、抗βチューブリンＩＩＩ抗体を用いて、それぞれの分布を定量化した。成長円錐あるいは軸索の中間を選択し、蛍光密度を測定した。同時に背景の蛍光密度も測定し、それらを差し引きすることで最終的な平均蛍光密度を得た。データはすべて平均値±標準誤差で表し、対応のないスチューデントのｔ検定を行った。
【００２５】
（６）外科的手技
ラットは２％のハロセンで麻酔した。メスのウィスターラット（２５０−３００グラム）に対し、胸髄レベル９〜１０で椎弓切除を行い、脊髄を露出した。メスで脊髄を完全損傷させ、損傷部位を中心に１０ｍｍから１５ｍｍの脊髄を取り出した。ＰＢＳに溶解した１ｍｇ/ｍｌのＹ−２７６３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を１０ｕｌだけ小さなゲルに染み込ませ、脊髄損傷部位に留置した。
【００２６】
（７）組織標本
損傷を加えていない組織と損傷後２時間の組織を新鮮凍結組織として得た。ラットに十分深い麻酔を施し、頚を切断して脊髄を取り出した。Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ内に組織を埋め込み、ドライアイスを用いて−８０℃で凍結した。切片は、クリオスタットで２０μｍの厚さで矢状断とした。切片は４％パラホルムアルデヒドと０．１ＭのＰＢ（ｐＨ７．４）で１時間室温で固定した後、ＰＢＳで洗浄し、５％アルブミンと０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングした。単量体チューブリンを除外するために、０．１ＭＰＢ、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２  （ｐＨ  ６．９）、４％パラホルムアルデヒド、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で組織を１時間固定した。
【００２７】
（Ｂ）結果
まず、生後７日の幼若ラットの小脳顆粒細胞に対するウェスタンブロットによる結果を図１（Ａ）〜（Ｃ）に示す。
【００２８】
図１（Ａ）は培養した小脳顆粒細胞をＮｏｇｏで刺激しない場合、図中の上部に示した濃度（１０、３０、１００、３００ｎＭ）で１０分間刺激した場合のそれぞれにおける結果を示すものである。溶解液は抗リン酸化ＣＲＭＰ−２抗体（ｐ−ＣＲＭＰ２）、抗リン酸化コフィリン抗体（ｐ−ｃｏｆｉｌｉｎ）、抗リン酸化ＭＬＣ抗体（ｐ−ＭＬＣ）でウェスタンブロットしている。また、２段目は、全ＣＲＭＰ−２を示している。
【００２９】
この図によると、この神経細胞ではＣＲＭＰ−２が多く発現していることが確認でき（２段目）、ＣＲＭＰ−２のリン酸化されたものも確認できた。またＣＲＭＰ−２のリン酸化はＮｏｇｏに対し用量依存性を有していることが確認できた。
【００３０】
図１（Ｂ）は培養小脳顆粒細胞にＲｈｏキナーゼ阻害剤であるＹ−２７６３２（Ｙ）、ファスジル（ＨＡ）を加えた場合の結果である。ここではＹ−２７６３２（Ｙ）、ファスジル（ＨＡ）を加えることでＮｏｇｏによるＣＲＭＰ−２のリン酸化が減じていることが確認できた。即ちこのＣＲＭＰ−２のリン酸化はＲｈｏキナーゼ依存性を有することが確認できた。
【００３１】
図１（Ｃ）は培養小脳顆粒細胞をＭＡＧで刺激しない場合、所定の時間で刺激した（１０分、３０分、６０分、各２５ｕｇ／ｍｌ）場合の結果である。ＭＡＧによりＣＲＭＰ−２がリン酸化していることを確認できる一方、コフィリンのリン酸化レベルは変化していないことが確認できた。またＭＡＧは１０分以内にＣＲＭＰ−２をリン酸化しており、ＭＡＧとＮｏｇｏは幼若小脳顆粒細胞において、Ｒｈｏキナーゼ依存性を有してＣＲＭＰ−２をリン酸化することが分かった。
【００３２】
なおＲｈｏキナーゼは、様々な物質をリン酸化すること、例えばミオシン軽鎖（ＭＬＣ）を直接リン酸化し活性化することが知られているが（非特許文献１６）、この神経細胞においてＮｏｇｏはＭＬＣをリン酸化していないことが確認できた（図１（Ａ））。更に、Ｒｈｏキナーゼによって活性化されるＬＩＭキナーゼ（哺乳類においてＬＩＭキナーゼはコフィリンをリン酸化し、それによってアクチンが脱重合する。特にショウジョウバエにおいてコフィリンは軸索成長に必須である。）についても確認したが、小脳顆粒細胞では、ＮｏｇｏもＭＡＧもコフィリンのリン酸化レベルに変化をきたしていなかった。以上より、ＭＡＧ、Ｎｏｇｏを介した軸索伸展抑制では、ＣＲＭＰ−２が重要な役割を果たしている示唆を得た。
【００３３】
図２（Ａ）は、非リン酸化型のｍｙｃタグを付けたＣＲＭＰ−２を形質移入した小脳顆粒細胞（ＷＴ）、ＣＲＭＰ−２が発現していない突然変異体を形質移入した小脳顆粒細胞（ΔＣ）をそれぞれ２４時間培養及びリプレートし、Ｎｏｇｏで刺激、あるいは刺激せず、さらに２４時間培養した場合それぞれに免疫染色した結果を示すものである。図中ａの写真はＧＦＰを発現している細胞を、ｂの写真はＧＦＰを発現している細胞をＮｏｇｏで処理したものを、ｃの写真は非リン酸化型ＣＲＭＰ−２を発現している細胞を、ｄの写真は非リン酸化型ＣＲＭＰ−２を発現している細胞をＮｏｇｏで処理したものを、ｅの写真はＣＲＭＰ−２が発現していない細胞を、それぞれ示している。なお用いた幼若ラットの小脳顆粒細胞は生後７日のものである。
【００３４】
また図２（Ｂ）は小脳顆粒細胞の軸索成長アッセイを示すものであり、図中「ＧＦＰ」は、ＧＦＰを発現している細胞を、「ＷＴ」は非リン酸化型ＣＲＭＰ−２を発現している細胞を、「ΔＣ」はＣＲＭＰ−２が発現していない細胞を、「ＧＦＰ＋Ｎｏｇｏ」はＧＦＰを発現している細胞に１００ｎＭでＮｏｇｏを添加した場合を、「ＷＴ＋Ｎｏｇｏ」は、ＷＴに１００ｎＭでＮｏｇｏを添加した場合を、それぞれ示している。なおデータは平均値±標準誤差を示している。
【００３５】
この結果、Ｎｏｇｏ刺激で突起成長が抑制されることを確認したが、ｍｙｃタグを付けた非リン酸化型のＣＲＭＰ−２を小脳顆粒細胞に形質移入し、このＣＲＭＰ−２を過剰発現させると、著明に突起伸展を促進することを確認した。そして更にこの細胞にＮｏｇｏを加えたが、突起伸展抑制はなかった。ＣＲＭＰ−２を発現していない突然変異体を形質移入した小脳顆粒細胞は、微小管重合活性を欠落していたが、上記と似た結果を示した。したがって、ＣＲＭＰ−２の不活化はＭＡＧ、Ｎｏｇｏの効果を阻害することに関係していることが確認できた。
【００３６】
図３（Ａ）は、幼若ラットの後根神経節細胞をＭＡＧで刺激しない場合（ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｙ−２７６３２）、或いはＭＡＧで刺激した後固定したもの（ＭＡＧ、ＭＡＧ＋Ｙ２７６３２）についての免疫染色の結果を示す。なお、ここでは細胞の固定と同時に単量体チューブリンを除去して重合した微小管だけを染色し、神経突起で重合した微小管を直接観察できるようにしている。また、図３（Ｂ）はそれぞれの状態において、相対的な微小管密度（コントロールとの比較）を定量化したものである。＊印は統計学的に有意（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定におけるｐ<０．０５）であることを示す。また、図３（Ａ）、（Ｂ）と同様の実験とほぼ同様であるが単量体チューブリンを除去せず、全チューブリン量について行った実験の結果を図３（Ｃ）、（Ｄ）に示す。
【００３７】
図３（Ａ）、（Ｂ）で示される結果によると、ＭＡＧで刺激しない場合は、軸索に沿って重合した微小管が分布していることを確認したが、ＭＡＧで処理すると著明に軸索における重合した微小管の密度が減少してしまった。しかし、ＭＡＧで処理した場合であってもＹ−２７６３２の存在下では、コントロールのレベルまで重合した微小管の密度が回復していることを確認した。但し、Ｙ−２７６３２単独では、何の効果も示さないことが確認できた。なお全チューブリンのレベルは、ＭＡＧあるいはＹ−２７６３２によって有意な変化を示していないことが確認できた（図３（Ｃ）、（Ｄ））。したがって、ＭＡＧはＣＲＭＰ−２活性を阻害し、Ｒｈｏキナーゼの下流で微小管レベルを減らすように制御していると考えることができた。なお、上記についてＭＡＧの代わりにＮｏｇｏで処理した場合も同様の結果を得ることができた（図示省略）。
【００３８】
ここまでの結果より、軸索成長には軸索の微小管の制御が関与していることが考えられる。おそらく、ＭＡＧあるいはＮｏｇｏによってＣＲＭＰ−２が不活化された結果、微小管重合を阻害するのと考えられる。
【００３９】
ところで、微小管の制御には様々な分子が関与しており、軸索における微小管の重合を制御している可能性がある他の物質として、ＡＰＣに注目し、検討した。
【００４０】
ＡＰＣは、基本領域を介して直接に、あるいはＥＢ１結合領域を介して間接的に微小管のプラス端に結合する。軸索先端におけるＡＰＣ、ＥＢ１の局在は、ＮＧＦによる軸索成長に関わっている。以上より、ミエリン由来因子による軸索伸展阻害作用には、これらの分子が関与しているかもしれないと考えた。小脳顆粒細胞では小さく、このアッセイには不適切であるので、幼若ラットの後根神経節細胞を用いて、神経突起におけるＡＰＣとＥＢ１の局在を免疫染色で視覚化した。図４（Ａ）にＡＰＣ、β−チューブリンについて行った二重染色の結果を、図４（Ｂ）に成長円錐におけるＡＰＣの相対的な平均蛍光密度を、図４（Ｃ）に神経線維、ＥＢ１の二重染色の結果を、図４（Ｄ）に成長円錐におけるＥＢ１の相対的な平均密度を、それぞれ示す。なお、図４（Ｂ）、（Ｄ）のデータは平均値±標準誤差を示すものである。
【００４１】
図４（Ａ）に示す結果によると、ＡＰＣは細胞体、神経突起、軸索遠位端に強く染色されていることが確認できた（図４（Ａ）中矢頭）。またＭＡＧで処置した場合も、神経突起の先端では、同様のＡＰＣの局在が観察された（図４（Ａ）、（Ｂ））。またＥＢ１に関しても、神経突起の先端で染色されていることが確認できた（図４Ｃ、矢頭）。但し、この局在は、ＭＡＧ処置によって変化しなかった（図４Ｃ、Ｄ）。したがって、ＭＡＧを介した突起伸展抑制にＡＰＣとＥＢ１は関与していないことを確認した。
【００４２】
次に、ＲｈｏＡが、損傷を受けた軸索においてどのような役割を果たしているかを評価するために、脊髄損傷後の軸索におけるＲｈｏの活性を調べた。ここではＭＡＧで刺激しない又は３０分間刺激（２５μｇ／ｍｌ）した後根神経節細胞を固定し、ＧＳＴ−Ｒｈｏ結合領域を反応させた後、抗ＧＳＴ抗体で活性化ＲｈｏＡを染色し、視覚化した。この結果の写真を図５（Ａ）に示すとともに、図５（Ｂ）に成長円錐における活性化ＲｈｏＡの相対的な平均蛍光密度を示す（データは平均値±標準誤差である。）。なお更に図５（Ａ）においては活性化ＲｈｏＡを染色した結果を上段に、神経の目印として神経線維を染色した結果を下段に示す。
【００４３】
図５（Ａ）、（Ｂ）によると、ＭＡＧで刺激していない細胞では神経突起は殆ど染色されていない（ＲｈｏＡの活性が弱い）が、ＭＡＧで刺激した細胞では成長円錐でも軸索でもＲｈｏＡの著明な活性が確認できた。この現象は成長している軸索や、成長円錐で観察されることから、ＲｈｏＡとＲｈｏキナーゼが活性化することにより、微小管の重合が減じていることを示すものと考えられる。なお図５（Ｂ）中、＊印は統計学的に有意（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定におけるｐ<０．０５）であることを示している。
【００４４】
そして今度はラットの脊髄を損傷させ、２時間後に損傷部位周辺の組織を取り出し、上記と同様に染色した結果を図５（Ｃ）に示す。なお図５（Ｃ）は損傷した脊髄の矢状段を示すものであって、損傷部位から約１５ｍｍ口側の白質を拡大したものである。脊髄損傷後では神経線維陽性の軸索でＲｈｏＡが活性化している（右図、ＳＣＩ  ２ｈ）のに対し、コントロールはそうでないことが確認できた（左図、ｃｏｎｔｒｏｌ）。このように、ＲｈｏＡは損傷された軸索周辺で非常に活性化していることが分かった。
【００４５】
今までの結果により、ＭＡＧとＮｏｇｏはＣＲＭＰ−２をリン酸化して不活化することで、神経細胞における微小管重合を減じていることが示され、これに一致して、ＲｈｏＡが脊髄損傷後に活性化していることも示された。
【００４６】
そこで、脊髄損傷後に、重合したチューブリンのレベルを調査し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察されたことがｉｎ  ｖｉｖｏでも観察されるかどうかを検証した。脊髄損傷後２時間で新鮮凍結切片を作成し、Ｔｕｊ１抗体で染色した。この結果を図６に示す。なお図６（Ａ）は単量体のβチューブリンＩＩＩを除去せず全チューブリン量について行った場合であり、図６（Ｂ）は単量体のβチューブリンＩＩＩを除去し、重合した微小管だけを染色したものである。
【００４７】
この結果、図６（Ａ）において、損傷部位に隣接した部位では、白質にβチューブリンＩＩＩが存在しており、脊髄損傷後２時間でβチューブリンレベルは変化しなかった（ＳＣＩ  ２ｈ）。Ｙ−２７６３２を損傷部位に作用させても染色様式に影響なかった（Ｙ−２７６３２）。
【００４８】
一方、図６（Ｂ）において、重合した微小管は白質の軸索に沿って分布していることが確認でき（ｃｏｎｔｒｏｌ）、脊髄損傷後２時間では損傷部位に隣接した部位で重合した微小管のレベルが著明に減少しており、損傷部位の口側でも尾側でも観察された（ＳＣＩ）が、損傷部位にＹ−２７６３２を染み込ませたゲルを留置すると、重合した微小管の減少は、完全にコントロールレベルまで戻ることが確認できた（Ｙ−２７６３２+ＳＣＩ）。即ち、重合した微小管の減少は、脊髄損傷によってＲｈｏＡとＲｈｏキナーゼが活性化したために起こったと考えられる。なお、ＣＲＭＰ−２についても、Ｔｕｊ１抗体を用いて二重染色し、白質の軸索と灰白質の細胞体に発現していることを確認した。以上より、脊髄損傷後の微小管の脱重合にＣＲＭＰ−２の不活化が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】（Ａ）培養小脳顆粒細胞に対しＮｏｇｏで刺激しない又は所定の濃度で１０分間刺激し、溶解液を抗リン酸化ＣＲＭＰ−２抗体、抗リン酸化コフィリン抗体、抗リン酸化ＭＬＣ抗体でウェスタンブロットした図。（Ｂ）培養小脳顆粒細胞に対し、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤であるＹ−２７６３２（Ｙ）、ファスジル（ＨＡ）を加えた場合におけるウェスタンブロットの結果を示す図。（Ｃ）培養小脳顆粒細胞をＭＡＧで刺激しない、あるいは示した時間で刺激した場合におけるウェスタンブロットの結果を示す図。
【図２】（Ａ）非リン酸化型のｍｙｃタグを付けたＣＲＭＰ−２を形質移入した小脳顆粒細胞（ＷＴ）又はＣＲＭＰ−２を発現していない突然変異体を形質移入した小脳顆粒細胞（ΔＣ）を２４時間培養及びリプレートし、Ｎｏｇｏで刺激又は刺激せず、さらに２４時間培養した場合における免疫染色の結果を示す図。（Ｂ）小脳顆粒細胞の軸索成長アッセイ結果を示す図。
【図３】（Ａ）幼若ラットの後根神経節細胞はＭＡＧで刺激しない、あるいは３０分間刺激及び固定し、更に単量体チューブリンを除去した場合における免疫染色の結果を示す図。（Ｂ）それぞれの状態で、相対的な微小管密度（コントロールとの比較）を定量化した結果を示す図。（Ｃ）幼若ラットの後根神経節細胞はＭＡＧで刺激しない、あるいは３０分間刺激した後固定した場合における免疫染色の結果を示す図。（Ｄ）それぞれの状態で、相対的な微小管密度（コントロールとの比較）を定量化した結果を示す図。
【図４】（Ａ）β−チューブリンとＡＰＣの二重染色の結果を示す図。（Ｂ）成長円錐におけるＡＰＣの相対的な平均蛍光密度を示す図。（Ｃ）神経線維とＥＢ１の二重染色の結果を示す図。（Ｄ）成長円錐におけるＥＢ１の相対的な平均蛍光密度を示す図。
【図５】（Ａ）後根神経節細胞はＭＡＧで刺激しない又は３０分間（２５μｇ/ｍｌ）刺激した後、活性化ＲｈｏＡ、神経線維を染色した結果を示す図。（Ｂ）成長円錐における活性化ＲｈｏＡの相対的な平均蛍光密度を示す図。（Ｃ）損傷した脊髄の矢状断を示す図。
【図６】（Ａ）Ｔｕｊ１抗体を用いてニューロンに特異的なβチューブリンＩＩＩを染色した図。（Ｂ）組織固定時に単量体チューブリンを除去し、重合した微小管だけを染色した場合の結果を示す図。
【図７】矢状断の切片に対し抗ＣＲＭＰ−２抗体（上図）とＴｕｊ１抗体（下図）を用いた二重染色を行った結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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