(57)【要約】      （修正有）【課題】  伸長反応温度が高く、また、熱変性工程を繰り返すサイクルシークエンス反応においても、ＤＮＡポリメラーゼ反応の伸張性を改善でき、更には、プライマーの標的核酸への塩基配列特異性を向上できる、正確かつ効率的な核酸の塩基配列決定方法を提供する。【解決手段】  高度好熱菌由来ＲｅｃＡタンパク質の存在下で、サイクルシークエンス反応を行うことにより標的核酸の塩基配列を決定する核酸塩基配列決定方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
高度好熱菌由来ＲｅｃＡタンパク質の存在下で、サイクルシークエンス反応を行うことにより標的核酸の塩基配列を決定する核酸塩基配列決定方法。
【請求項２】
前記標的核酸が増幅産物であり、増幅後ダイレクトにシークエンス反応に供する請求項１に記載の核酸塩基配列決定方法。
【請求項３】
前記標的核酸が阻止的または抑制的２次構造の区域を有する請求項１又は２に記載の核酸塩基配列決定方法。
【請求項４】
前記ＲｅｃＡタンパク質がサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来である請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸塩基配列決定方法。
【請求項５】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、
アデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの夫々に対応する４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸、
アデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの夫々に対応する４種類の終結ヌクレオチド、および、
高度好熱菌由来のＲｅｃＡを含む、標的核酸のサイクルシークエンス用の核酸塩基配列決定キット。
【請求項６】
前記ＲｅｃＡタンパク質がサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来である請求項５に記載の核酸塩基配列決定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸塩基配列決定方法並びに核酸塩基配列決定キットに関し、詳細には、高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質の存在下でのサイクルシークエンス反応を行うことによって核酸の塩基配列を決定する核酸塩基配列決定方法並びに核酸塩基配列決定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
今日のヒトゲノムプロジェクトに代表されるゲノム解析、遺伝子診断等において、核酸の塩基配列決定方法は非常に重要な技術である。
そして、核酸の塩基配列決定法としてサンガー（Sanger）等によって開発されたジデオキシ法がある。かかる方法は、操作の簡便性と高い再現性から、現在の塩基配列決定法の代表的なものとなっている。かかるジデオキシ法は、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成反応がジデオキシヌクレオチド三リン酸（以下、「ｄｄＮＴＰ」と略する場合がある。）の取り込みによって停止すること利用するものである。具体的には、塩基配列決定対象となる標的核酸（以下、「標的核酸」と略する場合がある。）を鋳型とし、標的核酸に相補性を有するプライマーを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成を行う。この際、基質類似体としてｄｄＮＴＰを少量添加しておくと、ｄｄＮＴＰが取り込まれた位置で相補鎖の合成が停止する。４種の塩基夫々に対応するｄｄＮＴＰを用いて反応を行い、その鎖長に従って産物を分離することにより配列を読み取るものである。
【０００３】
そして、上記ジデオキシ法に基づくシークエンス反応において、ある種の核酸結合タンパク質が、鋳型となる標的核酸の問題によって生じる反応阻害に有効であることが報告されている（例えば、非特許文献１、２、３、４および５を参照のこと。）。そのようなタンパク質として、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（以下、「ＳＳＢ」と略する場合ある。）、Ｔ４ gene 32タンパク質、大腸菌由来のＲｅｃＡタンパク質（以下、「ＲｅｃＡ」と略する場合ある。）等がある。かかる報告について更に以下に説明を加える。シークエンス反応中において、鋳型核酸が二本鎖ＤＮＡである場合に、一本鎖ＤＮＡに変性する必要がある。このとき、上記タンパク質が変性した一本鎖ＤＮＡに結合することで一本鎖ＤＮＡ同士の再結合が抑制され、一本鎖ＤＮＡで高頻度に発生する二次構造が解消される。その結果、シークエンス反応におけるＤＮＡポリメラーゼ反応の伸張性を改善する。また、大腸菌由来ＲｅｃＡを用いたＤＮＡ解析の方法論が報告されている（例えば、特許文献４、５を参照のこと。）。
【０００４】
近年、このジデオキシ法の応用として、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」と略する場合がある。）を利用したサイクルシークエンス法が開発された。かかる方法により、微量の標的核酸をも配列決定を行うことが可能となった。更には、サンガー等のジデオキシ法では適しなかったＰＣＲ産物の直接的な配列決定、所謂、ダイレクトシークエンスが可能となった。そして、現在において自動シークエンサーとの組み合わせにおいて大規模、迅速かつ安全なシークエンス法として確立されている。サイクルシークエンス法は、ジデオキシ法の反応をサーマルサイクラーで繰り返し行うことを基本原理としている。詳細には、鋳型核酸の熱変性、プライマーのアニーリング、耐熱性ポリメラーゼによる伸長反応とｄｄＮＴＰによる反応停止を１サイクルとして、これを３０サイクル程度繰り返す。これによって、様々なシークエンス反応産物が合成され、これを解析することにより塩基配列を決定するものである。
【０００５】
【非特許文献１】Kowalozykowski S.C.等著、The Enzymes、第３版、Academic press、1981年、米国、ニューヨーク、14、373
【非特許文献２】Quin Chou等著、Minimizing deletion mutagenesis artifact during Taq DNA polymerase PCR by E.coli SSB.（E.coli SSBによってTaq ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲにおける欠失突然変異生成物を最小限にする。) Nucleic Acids Research、1992年、第20巻、第16号、第4371頁
【非特許文献３】K.Schwarz等著、An improved double stranded DNA sequencing method using gene 32 protein.(Gene 32タンパク質を使用する、改善された２本鎖ＤＮＡの配列決定方法)、Nucleic Acids Res. Nucleic Acids Res.、1990年２月、第18巻、第４号、第1079頁
【非特許文献４】Rigas B, Welcher AA, Ward DC, Weissman SM.Rapid plasmid library screening using RecA-coated biotinylated probes.（ＲｅｃＡコートされたビオチン化プローブを用いる迅速なプラスミドライブラリーのスクリーニング）、Proc Natl Acad Sci 、米国、1986年12月、第83巻、第24号、第9591〜9595頁
【非特許文献５】Honigberg SM, Rao BJ, Radding CM著、Ability of RecA protein to promote a search for rare sequences in duplex DNA.（ＲｅｃＡタンパク質の二本鎖ＤＮＡ中におけるレアな配列の探索を促進する能力）、Proc Natl Acad Sci U S A. 1986年12月、第83巻、第24号、第9586〜9590頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、サイクルシークエンス反応はＰＣＲの原理を利用していることから、伸長反応温度が高く、また、熱変性工程を繰り返すため、上記したタンパク質をサイクルシークエンス反応に適応することはできない。なぜならば、ＰＣＲ中にそれらのタンパク質は、その生物学的機能が熱変性により失活するからである。そして、かかる変性は鋳型ＤＮＡに結合した状態で生じる。その結果、鋳型ＤＮＡに強固な高次構造が形成され、シークエンス反応におけるＤＮＡポリメラーゼの反応が阻害されるという問題点があった。更に、上記したタンパク質はいずれもプライマーの鋳型となる標的核酸への塩基配列特異性の向上には効果はなく、任意のプライマーを使用するダイレクトシークエンスに対しては、その効果は認められないという問題点もあった。
【０００７】
そこで、本発明は、伸長反応温度が高く、また、熱変性工程を繰り返すサイクルシークエンス反応においても、ＤＮＡポリメラーゼ反応の伸張性を改善でき、更には、プライマーの標的核酸への塩基配列特異性を向上できる、正確かつ効率的な核酸の塩基配列決定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意研究した結果、サイクルシークエンス反応を高度好熱菌由来のＲｅｃＡの存在下で行った場合に、ＤＮＡポリメラーゼ反応の伸張性を改善できるとの知見を見出した。更に、ＤＮＡポリメラーゼによる塩基の読み間違いをも改善できるとの知見を得、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、上記目的を達成するため、本発明は、高度好熱菌由来ＲｅｃＡタンパク質の存在下で、サイクルシークエンス反応を行うことにより標的核酸の塩基配列を決定する核酸塩基配列決定方法を提供する。
そして、前記標的核酸が増幅産物であり、増幅後ダイレクトにシークエンス反応を行うことが好ましい。
また、前記標的核酸が阻止的または抑制的２次構造の区域を有する場合に好ましく実施される。
更に、好ましくは、前記ＲｅｃＡタンパク質がサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来である。
【００１０】
また、上記目的を達成するため、本発明はサイクルシークエンス用の核酸塩基配列決定キットを提供する。本発明の核酸塩基配列決定キットは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、アデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの夫々に対応する４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸、アデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの夫々に対応する４種類のジデオキシヌクレオチド三リン酸、および、高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質を含んでなる。
また、好ましくは、前記ＲｅｃＡタンパク質がサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来である。
【発明の効果】
【００１１】
高度好熱菌由来のＲｅｃＡの存在下でサイクルシークエンス反応を行うことにより、反応全体の効率化を図ることが可能となった。つまり、高度好熱菌由来のＲｅｃＡは耐熱性であるため、高温条件を繰り返すサイクルシークエンス反応中においても変性することなく、安定してその活性を維持できる。それにより、プライマーの標的核酸への結合の塩基配列特異性が向上して任意プライマーを利用するダイレクトシークエンスにも好適に利用できる。また、一本鎖状態にあるプライマーと標的核酸の高次構造の生成を抑制することができ、その結果、ＤＮＡポリメラーゼの伸張性が向上させることが可能となった。更に、ＤＮＡポリメラーゼによる塩基の読み間違いをも低減すると共に、サイクルシークエンス反応効率の向上により正確な塩基配列解読が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、具体的な本発明の実施の形態について説明するが、これはあくまでも本発明を例示するに留まり、本発明を限定するものではない。
【００１３】
本発明は、高度好熱菌由来のＲｅｃＡの存在下で、サイクルシークエンス反応を行うことにより、核酸の塩基配列を決定するものである。
【００１４】
ここで、サイクルシークエンス法について説明する。サークルシークエンス法は、ジデオキシ法とＰＣＲを組み合わせた核酸の塩基配列決定技術である。典型的には、反応系に鋳型となる配列決定すべき標的核酸、プライマー１種類、デオキシヌクレオチド三リン酸（以下、「ｄＮＴＰ」と略する場合がある。）と終結ヌクレオチドとしてｄｄＮＴＰを添加し、そして耐熱性のポリメラーゼを添加する。反応は、鋳型核酸の熱変性、プライマーのアニーリング、伸長反応を１サイクルとする反応を適当なサイクル繰り返すことにより行われる。このとき、ｄｄＮＴＰはデオキシリボースの３´位の−ＯＨ基が−Ｈ基になっているｄＮＴＰのアナログであることから、ＰＣＲ中にｄｄＮＴＰが取り込まれると、相補鎖の伸長が止まる。そのため、結果として、３´末端が同一の塩基の核酸が合成される。そして、ｄｄＮＴＰの取り込みはランダムに起こるため様々な鎖長の核酸が合成される。これらシークエンス産物を分離することにより、標的核酸の塩基配列を決定するというものである。
【００１５】
本発明の塩基配列決定法に使用する反応液は、高度好熱菌由来ＲｅｃＡの存在の下、標的核酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、一種類のプライマーＤＮＡ、ｄＮＴＰ、終結ヌクレオチド並びに適当な緩衝液を含んで調製される。
【００１６】
ここで、ＲｅｃＡとは、単鎖核酸に協同的に結合し、該単鎖核酸と二本鎖拡散との間で相同領域を検索し、核酸の相同組換えを行うタンパク質である。本発明において使用されるＲｅｃＡは、高度好熱菌由来タンパク質である。本発明の使用に適したＲｅｃＡとしては、サーマス（Thermus）属、サーモコッカス（Thermococcus）属、ピロコッカス（Pyrococcus）属、Thermotoga（サーモトーガ）属等由来のＲｅｃＡが例示される。具体的にはサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、サーマス・アクアティカス（Thermusaquaticus）由来のＲｅｃＡが好ましく例示される。特に、好ましくは、サーマス・サーモフィラス由来のＲｅｃＡ（以下、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡと略する場合がある。）である。
【００１７】
これらのＲｅｃＡは、天然由来のＲｅｃＡの他、化学合成的もしくは遺伝子工学的に人工的に合成されたＲｅｃＡも包含する。具体的には、常法に従って、高度好熱菌から抽出したものを利用することができる。更に、既知の大腸菌等の宿主・発現ベクター系を利用して、容易に精製することができる。例えば、当該ＲｅｃＡをコードする遺伝子を公知の方法により導入した発現ベクターにより宿主である大腸菌を形質転換して培養し、当該ＲｅｃＡを発現させる。そして、宿主の大腸菌を破砕して熱処理を行うことにより、当該ＲｅｃＡ以外の大腸菌由来タンパク質は熱変性して熱凝集するため、遠心分離等により分離除去できる。これにより熱変性しない当該ＲｅｃＡを可溶画分として大腸菌由来タンパク質と分離し、親和性クロマトグラフィー等を用いて精製できる。
【００１８】
このとき、当該ＲｅｃＡは高度好熱菌由来であるため室温で構造が安定しており、さらに有機溶剤に対しても高い安定性を有している。そのため、上記精製工程は室温で行うことが可能である。
【００１９】
尚、宿主細胞は大腸菌に限らず、例えば、酵母（Saccharomyces cerevisiae）や昆虫（Ｓｆ９細胞）などの真核生物細胞を利用することが可能である。また、発現ベクターは、プロモーター配列、高度好熱菌のＲｅｃＡをコードする遺伝子を挿入できる少なくとも１つの制限酵素サイトを有するマルチクローニングサイト等の配列を含み、かつ、上記宿主細胞で発現できるものであれば、何れの発現ベクターを用いることができる。好適なプロモーターとしては、例えば、Ｔ７ｌａｃプロモーターを利用するのが好ましい。
【００２０】
さらに、この発現ベクターには他の公知の塩基配列が含まれていてもよい。他の公知の塩基配列としては特に限定されない。例えば、発現産物の安定性を付与する安定性リーダー配列、発現産物の分泌を付与するシグナル配列、及び、ネオマイシン耐性遺伝子・カナマイシン耐性遺伝子・クロラムフェニコール耐性遺伝子・アンピシリン耐性遺伝子・ハイグロマイシン耐性遺伝子等の形質転換された宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等が挙げられる。このような発現ベクターは、市販の大腸菌用発現ベクター（例えばｐＥＴタンパク質発現システム：ノバジェン社製）を用いることが可能である。さらに、適宜所望の配列を組み込んだ発現ベクターを作製して使用することが可能である。
【００２１】
更に、上記したようなＲｅｃＡと類似の構造を有し、かつ、機能的に同等なタンパク質をも含む。したがって、自然界に存在するＲｅｃＡ類似タンパク質の他、人為的な変異誘発または遺伝子組換えにより改変されたタンパク質をも含むことが意図される。例えば、上記した天然由来のＲｅｃＡのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加されたアミノ酸配列を有し、かつ上記したＲｅｃＡと生物学的機能が同等である改変体が包含し得る。なお、アミノ酸配列における変異の数は、もとのタンパク質の生物学的機能が維持される限り制限されない。
【００２２】
ここで、アミノ酸配列に対する改変は、改変しようとするアミノ酸配列に部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10、pp6487、1982年）等の公知の変異操作手段を用いて人工的に行うことができる。更には、自然界におけるアミノ酸の変異によって生じた改変体をも含む。
【００２３】
本発明において配列決定される標的核酸は、その起源、長さ及び塩基配列等に対する制限はない。また、一本鎖、二本鎖、また、環状、直鎖状を問わず、いかなる核酸であってもよい。具体的には、生物のゲノムＤＮＡでもよく、或いは、該ゲノムＤＮＡを物理的手段若しくは制限酵素消化により切断された断片であっても良い。更に、ＤＮＡ断片をプラスミド、ファージ等に挿入したものに対しても好適に利用できる。さらに、核酸を含む可能性のある試料から調製、あるいは単離したものであってもよい。また、当該技術分野で常用されているＤＮＡ自動合成機等を使用して合成されたＤＮＡ断片、ｍＲＮＡを鋳型にして合成したｃＤＮＡ断片、ＰＣＲ等の増幅技術により増幅されたＤＮＡ断片等の人工的産物等、いずれも標的核酸となり得る。特に、増幅産物の塩基配列を直接決定するダイレクトシークエンス法に本発明の方法は好適に適用できる。また、増幅産物は適当な精製方法により精製した後、シークエンス反応に供しても良く、そのような精製は公知の手段により行うことができる。例えば、そのような精製はQIAquick ＰＣＲ Purification Kit（QIAGEN社製）等の市販のキットを用いて行うこともできる。
【００２４】
ここで、ダイレクトシークエンス法とは、ＰＣＲ等で増幅された核酸断片をベクターにクローニングすることなく、鋳型として使用して核酸の塩基配列を決定することをいう。
【００２５】
更に、本発明の方法は、一般的なＰＣＲを行った場合に核酸の増幅が阻止又は抑制される二次構造を形成する区域を有する核酸の増幅にも好適に利用できる。
例えば、ＧＣ含量が高い鋳型核酸や短い繰り返し配列を有する鋳型核酸等を挙げられる。これらは、熱変性により一本鎖となると高次構造を生じ核酸増幅の際の阻害要因となっていた。本発明の方法によれば、ＲｅｃＡが鋳型核酸に結合することで、このような高次構造を解き、効率的に鋳型核酸の塩基配列を決定することができる。
【００２６】
プライマーは、標的核酸の特定部分の配列と相補的な任意の塩基配列を有するものであることが好ましい。核酸配列を決定すべき標的位置のすぐ５´側の配列と適切な相補性を有するものが好適に利用できる。例えば、標的核酸がベクターにサブクローニングされてある状態にある場合には、Ｍ１３ Universal、Reverseプライマー、Ｔ７、Ｔ３プライマー等の公知のプライマーを使用できる。また、標的核酸がＰＣＲ産物の場合には、ＰＣＲで利用される片側のプライマーを使用できる。
【００２７】
プライマーは、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法、既に標的となる核酸が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。化学合成法に基づきプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいて設計される。プライマーは合成後、ＨＰＬＣ等の手段により精製される。また、化学合成を行う場合には市販の自動合成装置を利用することも可能である。ここで、相補的とは、プライマーと標的核酸が塩基対合則に従って特異的に結合し安定な二重鎖構造を形成できることを意味する。したがって、完全な相補性のみならず、プライマーと標的核酸が互いに安定な二重鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。その塩基数は、標的核酸を特異的に認識するために十分に長くなければならないが、長すぎると逆に非特異的反応を誘発するので好ましくない。したがって、適当な長さはＧＣ含量等の標的核酸の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件など多くの因子に依存して決定されるが、好ましくは、１５〜３０塩基である。
【００２８】
ここで、使用されるＤＮＡポリメラーゼは、通常、サイクルシークエンス反応において使用できる耐熱性のＤＮＡポリメラーゼであれば、特に制限はない。例えば、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のＴａｑポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来のＴ．ｔｈ．  ポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus Stearothermophilus）由来のＢｓｔポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcuslitoralis）由来のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ等の好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼ他、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcusfuriosus）由来のＰｆｕポリメラーゼ等の好熱古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００２９】
ｄＮＴＰとしては、アデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの各塩基に対応する４種類のｄＮＴＰが使用される。特には、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰの混合物が好ましく使用される。更に、ここでの使用におけるｄＮＴＰには、サイクルシークエンス反応で合成され伸長されるＤＮＡ分子中に、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれ得る限りにおいては、デオキシヌクレオチドの誘導体をも含み得る。そのような誘導体として、７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ等が例示され、例えば、夫々ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰに代えて、若しくは、双方を共在させて使用することができる。したがって、核酸合成に必要なアデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの各塩基に対応する４種類が含まれる限り、いかなる誘導体の使用を排除するものではない。
【００３０】
また、終結ヌクレオチドとしては、アデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの各塩基に対応する４種類の終結ヌクレオチドが使用される。そして、典型的にはｄｄＮＴＰである。ｄｄＮＴＰとしては、特に、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰが好ましく使用されるが、これに限定されるものではない。したがって、サイクルシークエンス反応で合成され伸長されるＤＮＡ分子中に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれ得る一方、その後の重合反応を停止する、その他の終結ヌクレオチドも使用することが可能である。そのようなヌクレオチドとして、３´アミノヌクレオチド等を例示することができる。したがって、核酸合成に必要なアデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの各塩基に対応する４種類である限り、いかなる誘導体の使用を排除するものではない。
【００３１】
緩衝液としては、一般的には、適当な緩衝成分およびマグネシウム塩等を含んで調製される。緩衝成分としては、トリス酢酸、トリス塩酸、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム等のリン酸塩が好適に使用でき、特にはトリス酢酸の使用が好ましい。緩衝成分の最終濃度は５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で、ｐＨ６．０〜９．５の範囲内で調製される。また、マグネシウム塩としては特に制限はないが、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム等を適宜使用でき、特には酢酸マグネシウムが好ましい。更に、必要に応じて、ＫＣｌ等のカリウム塩、ＤＭＳＯ、グリセロール、ベタイン、ゼラチン、Triton等を添加することができる。また、市販のサイクルシークエンスの用耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに添付の緩衝液を用いることができる。緩衝液の組成は、使用するＤＮＡポリメラーゼの種類等に応じて適宜変更することができる。特には、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ等のイオン強度の影響、ＤＭＳＯ、グリセロール等のＤＮＡの融解温度に影響を与える各種添加物並びにそれらの濃度を勘案して、適宜設定することができる。
【００３２】
そして、反応液は容量１００μｌ以下、特には、１０〜５０μｌの範囲で調製することが好ましい。各成分の濃度として、ＲｅｃＡは好ましくは反応溶液中に０．００４〜０．０２μｇ／μｌの濃度で含まれるよう使用される。ＲｅｃＡ以外の各成分の濃度は、サイクルシークエンス反応は公知であることから、当業者は適宜設定することができる。例えば、標的核酸は、好ましくは１００μl当り１０ｐｇ〜１μｇの濃度で、プライマーＤＮＡは好ましくは、最終濃度０．０１〜１０μＭ、特には０．１〜１μＭの濃度に調製される。更に、ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは１００μｌあたり０．１〜５０Ｕｎｉｔ、特には１〜５Ｕｎｉｔの範囲の濃度で使用する。そして、ｄＮＴＰは、好ましくは最終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍに、ｄｄＮＴＰは好ましくは１〜５μＭの濃度で調製する。そして、ｄｄＮＴＰは、ｄＮＴＰに対して１００対１〜１０００対1の割合で使用することが好ましい。また、マグネシウム塩は最終濃度で０．１〜５０ｍＭ、特には、１〜５ｍＭの範囲に調製することが好ましい。
【００３３】
そして、プライマー、ｄＮＴＰ、若しくはｄｄＮＴＰは検出のため標識物質により標識されることが好ましい。サイクルシークエンス法は、標識化の対象により、標識プライマーを使用するプライマー標識法と、標識ｄＮＴＰを使用するインターナル標識法、標識ｄｄＮＴＰを使用するターミネーター標識法に大別される。本発明の方法は、上記いずれにも適用することができる。
【００３４】
ここで、標識に用いられる標識物質は、プライマー、ｄＮＴＰ並びにｄｄＮＴＰがサイクルシークエンス反応において必要とされる安定性と機能性を保持できる限りは、公知のいずれをも使用できる。具体的には、放射性同位体元素、蛍光色素、或いはジゴキシゲニンやビオチン等の有機化合物等が挙げられる。なかでも、蛍光色素の使用が特に好ましいが、これらに限定されるものではない。ここで、適切な放射性同位元素としては、３２Ｐ、３５Ｓ、１３１Ｉ、４５Ｃａ、３Ｈ等が例示されるがこれらに限定するものではない。また、適切な蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＣＡ）、テキサスレッド、４´、５´−ジクロロ−２´、７´−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラゾン（ＮＢＤ−Ｆ）、シアニン３（Ｃｙ３）およびシアニン５（Ｃｙ５）等のシアニン色素等が例示されるが、これらに限定されるものではない。また、標識を導入する位置についても、サイクルシークエンス反応において、ｄＮＴＰ取り込みによるプライマーの伸長反応並びにｄｄＮＴＰによる伸長の停止を阻害しない限りにおいては、特に制限はない。
【００３５】
プライマーを標識する場合においては、５´末端及び／又は鎖中の塩基が標識されたものが好適に用いられる。標識プライマーの調製は常法に従って行うことができる。上記標識物質が付加された標識ヌクレオチドをヌクレオチド伸長反応の際に取り込ませる方法が例示される。更には、ヌクレオチド伸長反応後、酵素化学的、若しくは、化学的に標識物質を導入する方法であっても良い。具体的には、標識物質として放射性同位体元素を使用する場合には、例えば、５´末端のリン酸基をアルカリフォスファターゼで除き、ポリヌクレオチドキナーゼで〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰのγ−リン酸基をオリゴヌクレオチド鎖の５´末端にトランスファーすることにより行うことができる。また、標識物質として蛍光物質を使用する場合には、蛍光アミダイドを使用してＤＮＡ合成機上で蛍光物質を直接オリゴヌクレオチドの５´末端にカップリングさせることにより行うことができる。さらに、市販の核酸標識用キット、例えば、５´oligolabelling kit for the FluorImager（Amersham社製）等を利用することもできる。
【００３６】
ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰを標識する場合においては、５´リン酸部のＯＨ基、塩基のＯＨ基、アミノ基が好適である。標識プライマーの調製は常法に従って行うことができる。例えば、標識物質を、スペーサーを介してヌクレオチドに共有結合的に結合させることをより行うことができる。一例を挙げると、ヌクレオチドに、例えば、チオエステル基等のスペーサーを導入し、該スペーサー（ここでは、−ＳＨ基である。）に反応性を有する蛍光標識分子を結合させることができる。また、標識ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ等は、市販の標識ヌクレオチドを利用することができる。更に、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit V3.1（アプライドバイオシステムズジャパン社製）等のシークエンシスのためのキットを利用することも可能である。
【００３７】
そして、ターミネーター標識法を行う場合、４種の塩基毎に夫々異なる発光波長の蛍光色素を用いることが好ましい。このように塩基毎に異なる発光波長の蛍光色素で標識されたｄｄＮＴＰを使用することにより、３´末端の塩基の種類応じた４種類の異なる蛍光を発するシークエンス産物を得ることができる。これを電気泳動により分離する場合には、１のＤＮＡ配列に対して１レーンの電気泳動で解析でき、結果的に一度に大量のシークエンス解析が可能となる。また、ｄｄＮＴＰはすべての塩基に関して、同一の色素で標識することもできる。この場合には、同じ鋳型から異なる塩基毎に別々に合成反応を行って得られたサンプルを異なる４つのレーンで泳動し、その相対位置に基づいて塩基配列を決定することができる。
【００３８】
本発明の核酸の塩基配列決定方法は、以下の工程に従って実行される。
（１）鋳型核酸の熱変性
（２）プライマーのアニーリング
（３）耐熱性ポリメラーゼによる伸長反応、および、
ｄｄＮＴＰによる伸長反応の停止
（４）塩基配列の決定
【００３９】
上記（１）〜（３）を１サイクルとする反応を、適切なサイクルを繰り返すことによって、様々な鎖長のシークエンス反応産物が合成される。サーモサイクル数は、鋳型核酸の種類、量およびその純度等に応じて決定され、約２０〜４０サイクル行うことが好ましい。
【００４０】
以下に各工程について詳細に説明する。
（１）鋳型核酸の熱変性
二本鎖の核酸を加熱により、変性させ一本鎖に解離させる。好ましくは、９２〜９８℃で１０〜６０秒行われる。また、ゲノムＤＮＡ等の長いＤＮＡを鋳型核酸とする場合は、鋳型核酸の変性を完全にするため、一番初めの熱変性のみを長め（１０分程度）に設定することができる。
【００４１】
（２）プライマーのアニーリング
温度を下げることにより上記（１）において熱変性され一本鎖となった鋳型核酸とプライマーとのハイブリッドを形成する。アニーリングは、好ましくは３０〜６０秒間行われる。また、アニーリング温度はプライマーに用いるオリゴヌクレオチドのＴｍを推定し、このＴｍをアニーリング温度として設定することが好ましい。通常は、５０〜７０℃で行われる。
【００４２】
（３）耐熱性ポリメラーゼによる伸長反応およびｄｄＮＴＰによる伸長反応の停止
耐熱性ポリメラーゼによりプライマーからの核酸鎖の伸長反応が３´末端において行われる。この核酸の伸長反応は、ランダムにｄｄＮＴＰが取り込まれた時にその塩基で停止する。これにより様々な長さのシークエンス反応産物が得られる。温度は、耐熱性ポリメラーゼの種類に応じて、適宜設定されるものであるが、６５〜７５℃で行うことが好ましい。また、伸長時間は、標的配列が１ｋｂ以下のときは１分程度で十分であり、それより長い場合には、１ｋｂにつき１分の割合で長くすることが好ましい。
【００４３】
（４）塩基配列の決定
上記工程（１）〜（３）のサーモサイクル反応後のシークエンス反応産物の分離を行い、核酸配列の読み取りを行う。シークエンス反応産物の分離は、分子量の異なる複数の反応産物の分子量に応じて分離することができる方法により適宜行うことができる。このとき、一塩基の差で分けられる分離能を有することが好ましい。このような分離手段としては、電気泳動を挙げることができる。その他に、ＨＰＬＣ等も用いることができる。電気泳動により分離する場合、電気泳動法の条件は特に制限はなく、例えば、アクリルアミド電気泳動等、常法に従って行うことができる。そして、反応産物を電気泳動に付することにより得られるバンド（核酸ラダー）から核酸配列を読み取ることができる。
【００４４】
核酸ラダーの読み取りは、シークエンス反応産物が有する標識を検出することにより行うことができる。検出は、標識物質の種類に応じて、公知の方法により行うことができる。例えば、放射性物質で標識した場合には放射能を検出することにより行うことができ、電気泳動後、Ｘ線フィルムに露光してオートラジオグラフィーを行い、画像解析装置で解析する方法が例示される。また、蛍光色素で標識した場合には発光を検出することで読み取ることができ、レーザー光を照射して励起された色素分子が発する蛍光シグナルを蛍光検出器により検出し解析する方法が例示される。更に、市販のＤＮＡシークエンスに用いる装置等を適宜用いて行うことができる。そのような装置としては、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（アプライドバイオシステムズジャパン社製）等が好適に利用できる。
【００４５】
以上のように本発明の核酸の塩基配列決定法を構成することにより、効率的かつ正確な核酸の塩基配列決定が可能となる。つまり、高度好熱菌由来のＲｅｃＡは耐熱性であるため、高温条件下での変性反応を繰り返すサイクルシークエンス反応中においても安定であり、その生物学的機能を保持できる。そして、高度好熱菌由来のＲｅｃＡの存在下でサイクルシークエンス反応を行うことにより、一本鎖状態にあるプライマーと標的核酸の高次構造の生成を抑制することができＤＮＡポリメラーゼの伸張性が向上する。更に、高度好熱菌由来ＲｅｃＡの働きにより、プライマーの標的核酸への結合の塩基配列特異性が向上する。そのため、シークエンス反応の効率化が図れる。特にダイレクトシークエンス等の任意プライマーを使用する場合において顕著にその効果が認められる。更に、ＤＮＡポリメラーゼによる塩基の読み間違いをも低減し、より正確な塩基配列解読が可能となる。つまり、一般に、読み取り方向末端側である５´末端のラダーシグナル強度は低くなり塩基配列の解読が困難となる場合が多い。しかしながら、本発明の方法によれば、全配列領域に亘って鮮明なラダーシグナル並びに塩基配列解読像を得られる事から、効率的かつ正確な塩基配列の決定が達成できる。
【００４６】
また、本発明はサイクルシークエンス用の核酸塩基配列決定キットを提供する。本発明の核酸塩基配列決定キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、高度好熱菌由来ＲｅｃＡ、終結ヌクレオチドを含んで構成される。更に、適当な緩衝液、マグネシウム塩等のＤＮＡポリメラーゼの活性に必要な成分を適宜含んで構成してもよい。また、標的核酸のサイクルシークエンス反応用の任意プライマー等を含ませてもよい。このとき、プライマー、ｄＮＴＰ若しくは終結ヌクレオチドは検出のため適当な標識物質によって標識されていることが好ましい。このように塩基配列の決定に必要な成分をキットして構成することにより、簡便且つ迅速なサイクルシークエンス反応が可能となる。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例を示し、さらに本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４８】
実施例１：高度好熱菌由来ＲｅｃＡの存在下でのサイクルシークエンス反応によ
る核酸塩基配列のラダーシグナルの向上−１
高度好熱菌由来ＲｅｃＡの存在下で、サイクルシークエンス反応を実行することにより核酸の塩基配列のラダーシグナルを向上できることを、従来法と比較する実験を行った。
【００４９】
（方法）
ステップ１：鋳型ＤＮＡのＰＣＲ増幅
ヒトゲノムＤＮＡ（Promega社製：Human genomic DNA  カタログ番号G3041）を鋳型として、プライマー１およびプライマー２を用いてＰＣＲ増幅反応を行った。ＰＣＲ反応液の組成は、最終濃度０．６μＭの各プライマー、２０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、０．６３UnitのＥｘ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Takara−Bio社製）、最終濃度２００μＭのｄＮＴＰ混合物を含むよう、１×ＤＮＡ Polymerase bufferに混合して、全量２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。上記反応液を９８℃、１０秒、５５℃、３０秒、７２℃、６０秒を１サイクルとした３５サイクルの増幅反応を行った後、１サイクルの７２℃、３分での最終伸長反応により増幅反応を終了した。増幅後の反応液をQIAquick ＰＣＲ Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製し、精製後の増幅産物を２０μｌ  Mili-Q水に溶解させた。
【００５０】
ステップ２：サイクルシークエンス反応
ステップ１で得られたＤＮＡ溶液１μｌを鋳型ＤＮＡとして、プライマー１を用いて、０．２μｇのＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡの存在下でサイクルシークエンス反応を行った。Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡは、Masui R, Mikawa T, Kato R, Kuramitsu S.著、Characterization of the oligomeric states of RecA protein: monomeric RecA protein can form a nucleoprotein filament.,Biochemistry.1998年１０月２０日、第37巻、第４２号、第14788〜14797頁の記載を参照して本発明の発明者が調製したものを使用した。サイクルシークエンス反応は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit V3.1（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて、製造業者の指示手順に従って行った。反応後の反応液の半分量を塩基配列決定に供した。塩基配列の決定は、ＤＮＡ蛍光シーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７：アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて行った。結果を図１レーン３に示す。
【００５１】
また、同様の手順に従い、ステップ１においてプライマー１及び２の組合せに代えてプライマー３及び４を使用し、ステップ２において、プライマー１に代えてプライマー３を使用した結果をレーン４に示す。
【００５２】
コントロールとして、ステップ２において、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加せずにサイクルシークエンス反応を行った。このとき、ステップ１において、プライマー１及び２を使用し、ステップ２においてプライマー２を使用した結果を図１レーン１に示す。また、ステップ１において、プライマー３及び４を使用し、ステップ２においてプライマー３を使用した結果を図１レーン２に示す。
【００５３】
ここで、用いたプライマーの塩基配列は以下の通りである。
プライマー１：
5’- GACTACTCTAGCGACTGTCCATCTC -3’（配列認識番号１）
Human S100 protein beta-subUnit gene
GenBank ACCESSION No. M59486 J05600
プライマー２：
5’- GACAGCCACCAGATCCAATC -3’ （配列認識番号２）
Human S100 protein beta-subUnit gene
GenBank ACCESSION No. M59486 J05600
プライマー３：
5’- TTTCGAGGCCCTGTAATTGG -3’ （配列認識番号３）
Human 18S rRNA gene
GenBank ACCESSION No. M10098
プライマー４：
5’- AACAAAATAGAACCGCGGTC -3’ （配列認識番号４）
Human 18S rRNA gene
GenBank ACCESSION No. M10098
【００５４】
（結果）
以上の実験により得られた蛍光ラダーシグナルを図１に示す。各レーンは以下の通りである
レーン１・・・ステップ２において、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加せずステップ１において、プライマー１及び２を使用し、ステップ２においてプライマー２を使用した結果を示す。（コントロール）
レーン２・・・ステップ２において、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加せずステップ１において、プライマー３及び４を使用し、ステップ２においてプライマー３を使用した結果を示す。
レーン３・・・ステップ２において、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加して、ステップ１において、プライマー１及び２を使用し、ステップ２においてプライマー２を使用した結果を示す。
レーン４・・・ステップ２において、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加して、ステップ１において、プライマー３及び４を使用し、ステップ２においてプライマー３を使用した結果を示す。
上記実験を６回繰り返し行ったが、いずれも同様の結果が得られた。
【００５５】
Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加して反応を行った場合、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加せずに反応を行った場合（コントロール）に比べて、鮮明なラダーシグナルが確認された（レーン３とレーン１、レーン４とレーン２の比較）。つまり、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡをサイクルシークエンス反応に添加することにより、ラダーシグナル強度が向上した。特に読み取り方向末端側においてラダーシグナルの鮮明度に顕著な差が認められた。
以上の結果から、Ｔ．ｔｈ．Ｒｅｃタンパク質の添加によりサイクルシークエンス反応全体の効率が向上することが判明した。これは、Ｔ．ｔｈ．Ｒｅｃタンパク質は耐熱性であるため、高温条件を繰り返すサイクルシークエンス反応中においても変性することなく、安定してその活性を維持していることを意味する。その結果、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡの働きにより、プライマーの標的核酸への結合の塩基配列特異性が向上していることが理解される。また、同時に一本鎖状態にあるプライマーと標的核酸の高次構造の生成を抑制することができＤＮＡポリメラーゼの伸張性が向上していることが理解される。更に、ＤＮＡポリメラーゼによる塩基の読み間違いをも低減し、より正確な塩基配列解読が可能となるものと理解される。また、一般に、読み取り方向末端側である５´末端のラダーシグナル強度は低くなり塩基配列の解読が困難となる場合が多い。そのためコントロールにおいては末端側においてそのラダーシグナル強度の低下が認められたが、ＲｅｃＡの添加により末端側においても解析に好適な強度が保持された。このことから、本発明の方法によれば、効率的かつ正確な塩基配列の決定が達成できることが判明した。
【００５６】
実施例２：高度好熱菌由来ＲｅｃＡの存在下でのサイクルシークエンス反応によ
り核酸の塩基配列解析度の向上
（方法）
実施例１で得られた図１レーン１並びにレーン３の塩基配列の蛍光ラダーシグナルから、塩基配列を解読することにより、シグナル解像度への効果を確認した。
【００５７】
（結果）
以上の実験により得られたラダーシグナルの塩基配列の解読像を図２に示す。
図２（Ａ）は、図１レーン１の塩基配列の蛍光ラダーシグナルから、塩基配列を解読した場合の解読像を示す。即ち、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加せずにサイクルシークエンスを行った場合の結果を示す（コントロール）。
図２（Ｂ）は、図１レーン３の塩基配列の蛍光ラダーシグナルから、塩基配列を解読した場合の解読像を示す。即ち、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加してサイクルシークエンス反応を行った場合の結果を示す。
【００５８】
Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加して反応を行った場合、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加せずに反応を行った場合（コントロール）に比べて、解読度の向上が確認された（図２（Ｂ）と図２（Ａ）との比較）。特に、読み取り方向末端側である５´末端においてその差は顕著に認められた。つまり、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡをサイクルシークエンス反応に添加することにより、塩基配列の解読度が向上する。
以上の結果から、Ｔ．ｔｈ．Ｒｅｃタンパク質の添加によりシークエンス反応全体の効率が向上し、ひいては、塩基配列解読の正確性が向上することが判明した。
【００５９】
実施例３：種々のＤＮＡ結合性タンパク質のサイクルシークエンス反応への影響
の検討
種々のＤＮＡ結合性タンパク質のサイクルシークエンス反応への影響を検討した。ここで、検討を行ったタンパク質は以下の通りである。
・大腸菌由来ＲｅｃＡ
・Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡ
・大腸菌由来ＳＳＢ
・Ｔ４ gene ３２タンパク質
【００６０】
（方法）
以下の実験は、実施例１、２の手順に従い、上記タンパク質存在下での塩基配列の蛍光ラダーシグナルの解読像を比較することにより行った。詳細には、実施例１のステップ１においてプライマー１、２を用いて鋳型ＤＮＡの増幅を行った。増幅後、実施例１のステップ２においてプライマー１を用い、0.2μgの上記各タンパク質の存在下でサイクルシークエンス反応を行った。そして、実施例１のステップ２の手順に従って得られた蛍光ラダーを実施例２の手順に従って塩基配列を解読した。
【００６１】
（結果）
以上の実験により得られたラダーシグナルの解読像を図３に示す。
図３（Ａ）は、ステップ２においてタンパク質を添加せずに塩基配列を決定した場合における解読像を示す（コントロール）。この図は、図２（Ａ）と同じである。
図３（Ｂ）は、ステップ２においてＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加して塩基配列を決定した場合における解読像を示す。この図は、図２（Ｂ）と同じである。
図３（Ｃ）は、ステップ２において大腸菌由来ＲｅｃＡを添加して塩基配列を決定した場合における解読像を示す。
ここでは、図示しないが大腸菌由来ＳＳＢ若しくはＴ４gene ３２タンパク質を添加して反応を行った場合には、ＤＮＡラダーは得られず塩基配列の解読を行うことができなかった。
上記実験を６回繰り返し行ったが、いずれも同様の結果が得られた。
【００６２】
Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加して反応を行った場合、いずれのタンパク質をも添加せずに反応を行った場合（コントロール）に比べて、鮮明な解読像が確認された（図３（Ｂ）と図３（Ａ）との比較）。この結果は、実施例１、２において得られた結果を追認するものであった。また、大腸菌由来ＲｅｃＡを添加して反応を行った場合には、いずれのタンパク質をも添加せずに反応を行った場合（コントロール）に比べて解読度が低下することが確認された（図３（Ｃ）と図３（Ａ）との比較）。上記したように、大腸菌由来ＳＳＢ若しくはＴ４gene ３２タンパク質を添加して反応を行った場合には、ＤＮＡラダーは得られず塩基配列の解読を行うことができなかった。つまり、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡをサイクルシークエンス反応に添加することにより、塩基配列の解読度が向上する。しかしながら、他のタンパク質の添加ではそのような解読度の向上は認められないばかりか、シークエンス反応の進行を阻害する。
以上の結果から、Ｔ．ｔｈ．Ｒｅｃタンパク質の添加によりシークエンス反応全体の効率、ひいては、塩基配列解読の正確性が向上するが、そのような効果は、他のタンパク質では見出せないものであることが判明した。これは、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡ以外のタンパク質は、高温条件を繰り返すサイクルシークエンス反応中において変性してＤＮＡポリメラーゼの反応を阻害していることに起因するものと考えられる。
【００６３】
実施例４：高度好熱菌由来ＲｅｃＡの存在下でのサイクルシークエンス反応によ
る核酸塩基配列の解読像の向上
高度好熱菌由来ＲｅｃＡの存在下で、サイクルシークエンス反応を実行することにより核酸の塩基配列の解読像を向上できることを、従来法と比較する実験を行った。ここでは、実施例１〜３で検討した標的核酸とは異なった鎖長および由来の核酸を用いてその効果を確認した。
【００６４】
（方法）
ステップ１：鋳型ＤＮＡのＰＣＲ増幅
ＰｈｉＸ１７４  ＲＦ  Ｉ  ＤＮＡ（Takara-Bio社製：phiX174 RF I DNA カタログ番号3040）を鋳型として、プライマー５およびプライマー６を用いてＰＣＲ増幅反応を行った。ＰＣＲ反応液の組成は、最終濃度０．６μＭの各プライマー、５ｎｇの鋳型ＤＮＡ、０．６３UnitのＥｘ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Takara−Bio社製）、最終濃度２００μＭのｄＮＴＰ混合物、０．４μｇのＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡを含むよう、１×ＤＮＡ Polymerase BUFFERに混合して、全量２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。上記反応液を９４℃、１０秒、５５℃、３０秒、７０℃、５分を１サイクルとした３５サイクルの増幅反応を行った後、１サイクルの７０℃、３分での最終伸長反応により増幅反応を終了した。増幅後の反応液をQIAquick ＰＣＲ Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製し、精製後の増幅産物を２０μｌ  Mili-Q水に溶解させた。
【００６５】
ステップ２：サイクルシークエンス反応
ステップ１で得られたＤＮＡ溶液２μｌを鋳型ＤＮＡとして、プライマー５を用いて、0.2μgのＲｅｃＡの存在下でサイクルシークエンス反応を行った。サイクルシークエンス反応は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit V3.1（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて、製造業者の指示手順に従って行った。反応後の反応液の半分量を塩基配列決定に供した。塩基配列の決定は、ＤＮＡ蛍光シーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７：アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて行った。
【００６６】
また、コントロールとして、ステップ２において、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加せずにサイクルシークエンス反応を行った。
【００６７】
ここで、用いたプライマーの塩基配列は以下の通りである。
プライマー５：
5’- CCTTGCTATTGACTCTACTGTAGAC -3’（配列認識番号５）
Coliphage phi-X174, complete genome
GenBank ACCESSION No. J02482 
M10348 M10379 M10714 M10749 M10750 M10866 M10867 M24859 V0112
プライマー６：
5’- CCTAACGACGTTTGGTCAGTTCCAT -3’（配列認識番号６）
Coliphage phi-X174, complete genome
GenBank ACCESSION No. J02482
M10348 M10379 M10714 M10749 M10750 M10866 M10867 M24859 V0112
【００６８】
（結果）
以上の実験により得られたラダーシグナルの解読像を図４、図５に示す。
図４は、ステップ２においてＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加せずに塩基配列を決定した場合における解読像を示す（コントロール）。
図５は、ステップ２においてＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加して塩基配列を決定した場合における解読像を示す。
上記実験を６回繰り返し行ったが、いずれも同様の結果が得られた。
【００６９】
Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加して反応を行った場合、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡを添加せずに反応を行った場合（コントロール）に比べて、解読度の向上が確認された（図５と図４との比較）。特に、読み取り方向末端側である５´末端においてその差は顕著に認められた。ここで使用した標的核酸は、実施例１、２で使用したものよりも長いものであったためコントロールにおいて、その解析度は特に末端側において著しく低下している（図４）。一方、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡ存在下では、全シークエンスにわたって良好な解析度が維持された（図５）。つまり、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡをサイクルシークエンス反応に添加することにより、塩基配列の解読度が向上する。
以上の結果から、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の添加によりサイクルシークエンス反応全体の効率が向上することが判明した。Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡの働きにより、プライマーの標的核酸への結合の塩基配列特異性が向上し、また、プライマーと標的核酸の高次構造の生成を抑制することができＤＮＡポリメラーゼの伸張性が向上していることが理解される。更に、ＤＮＡポリメラーゼによる塩基の読み間違いをも低減し、より正確な塩基配列解読が可能となるものと理解される。そして、かかる効果は配列決定される標的核酸の鎖長、由来等には影響されず、いずれの核酸の配列決定にも好適に利用できることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、分子生物学、医療分野、食品分野等において有用な、核酸の塩基配列決定方法および塩基配列決定キットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】高度好熱菌由来ＲｅｃＡの存在下で、サイクルシークエンス反応を実行することにより核酸の塩基配列のラダーシグナルを向上できることを確認した実施例１の結果を示す核酸ラダー
【図２】図１の核酸ラダーの塩基配列を解読した実施例２の結果を示す塩基配列解読像
【図３】種々のＤＮＡ結合性タンパク質のサイクルシークエンス反応への影響を検討した実施例３の結果を示す塩基配列解読像
【図４】Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡの存在下で、サイクルシークエンス反応を実行することにより核酸の塩基配列の解読度を向上できることを従来法比較確認した実施例４の結果を示す塩基配列解読像（コントロール）
【図５】Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡの存在下で、サイクルシークエンス反応を実行することにより核酸の塩基配列の解読度を向上できることを従来法と比較確認した実施例４の結果を示す塩基配列解読像（＋Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡ）
【図２】
2006141347.tif 000003
【図３】
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【図４】
2006141347.tif 000005
【図５】
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【図１】
2006141347.tif 000007
【配列表】
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