(57)【要約】【課題】  鱗翅目昆虫を始めとする絹糸腺を有する節足動物個体から、絹糸腺を迅速、簡便、且つ一度に多量に分離し、タンパク質を製造する。【解決手段】  節足動物を圧搾して絹糸腺を分離し、該絹糸腺よりタンパク質を抽出することを特徴とするタンパク質の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
節足動物を圧搾して絹糸腺を分離し、該絹糸腺よりタンパク質を抽出することを特徴とするタンパク質の製造方法。
【請求項２】
節足動物が、鱗翅目昆虫、または、クモ目である請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項３】
鱗翅目昆虫がカイコガである請求項２に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項４】
ローラーを用いて節足動物を圧搾することを特徴とする請求項１〜３に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項５】
該ローラーの表面が平滑であることを特徴とする請求項４に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項６】
節足動物を圧搾することを特徴とする絹糸腺分離方法。
【請求項７】
該節足動物が鱗翅目昆虫、またはクモ目である請求項６に記載の絹糸腺分離方法。
【請求項８】
鱗翅目昆虫がカイコガである請求項７に記載の絹糸腺分離方法。
【請求項９】
ローラーを用いることを特徴とする請求項６〜８に記載の絹糸腺分離方法。
【請求項１０】
節足動物を圧搾する機構を有することを特徴とする絹糸腺の分離装置。
【請求項１１】
該圧搾装置がローラーを具備することを特徴とする請求項１０に記載の絹糸腺の分離装置。
【請求項１２】
該圧搾装置が一対の対峙するローラーを具備することを特徴とする請求項１０に絹糸腺の分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、節足動物の絹糸腺を利用したタンパク質の製造方法、絹糸腺分離方法及び分離装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子組み換え技術を利用した組み換え型タンパク質の製造に関する検討が精力的に行われ、得られた組み換え型タンパク質は、医薬、診断薬、食品、化成品製造など幅広い分野で活用されている。特に、昆虫または昆虫細胞を用いた遺伝子組み換えタンパク質の生産系は、細菌や酵母の系では問題となるタンパク質の翻訳後修飾機能、フォールディング機能を有することから多くの生理活性タンパク質の発現が可能である。一方、哺乳類を利用した系と比べ細胞または個体の増殖・育種が簡便・安価であるという特徴がある。このような、昆虫または昆虫細胞を用いた遺伝子組み換えタンパク質の生産では、主に鱗翅目昆虫とバキュロウイルスの組み合わせによる生産系が利用されてきた。具体的には、外来タンパク質遺伝子を組み込んだバキュロウイルスを、昆虫または昆虫細胞に感染させる方法で組み換えタンパク質が製造可能であり、医薬品として製品化された生理活性タンパク質も知られている（特許文献１、特許文献２参照）。
【０００３】
一方、近年、昆虫染色体への外来遺伝子の導入が試みられ、特に鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるｐｉｇｇｙ  ｂａｃを利用することで、高効率に外来遺伝子がカイコ染色体へ導入され、更に導入遺伝子が交配により子孫へと安定に伝わることが確認されている（非特許文献１参照）。
【０００４】
本技術を応用し、カイコフィブロインＨ鎖プロモーターを利用して絹糸中にネコ・インターフェロン遺伝子を発現するカイコおよびネコ・インターフェロンの製造方法（特許文献３、特許文献４参照）、またショウジョウバエの熱ショックプロモーターを利用して体液中にタンパク質を製造する方法（特許文献５参照）が開示されている。特に、特許文献３及び特許文献４では、組み換えタンパク質が絹糸腺で発現される所に特徴がある。即ち、鱗翅目昆虫の幼虫絹糸腺は絹糸を製造することに特化しており、その遺伝子発現産物の多くは絹糸を構成するフィブロインＨ鎖、Ｌ鎖、及びセリシンであり、培養細胞や、幼虫体液を利用した系に比べ外来遺伝子を導入した場合、夾雑タンパク質が非常に少なく、その後の導入タンパク質の精製が簡便になるという利点がある。
【０００５】
鱗翅目昆虫の幼虫個体から絹糸腺を分離するには、従来、一頭ずつ幼虫を解剖皿上で解剖し摘出する方法、または一度頭部をハサミなどで切断し、一頭ずつ腹部を指で挟んで絹糸腺を絞り出す方法が取られてきた。しかしながらこのような従来の方法では一度に多数の幼虫から絹糸腺を摘出することは出来ず、また要する時間も長いことから目的タンパク質の活性も失われかねない。
【０００６】
一方で、幼虫表皮を刃物などで傷つける方法や、すりつぶす方法（特許文献６参照）、回転刃を用いて迅速に幼虫を切開する方法（特許文献７参照）、赤外線レーザーを利用する方法（特許文献８参照）、幼虫の自発収縮現象を利用した方法（特許文献９参照）があるが、これらの方法は、幼虫の体液の回収を目的としたものである為、絹糸腺を傷つけてしまうことや、絹糸腺の分離が迅速に行われず、絹糸腺に発現させた目的タンパク質の活性を失いかねない。加えて、昆虫廃棄物の分離・選別装置（特許文献１０参照）は、乾燥した昆虫廃棄物を風選により選別する分離法であり、生理活性タンパク質の活性を保持することは出来ず、遠心管による分離方法（特許文献１１）においても、要する時間が長いことや一度に処理できる頭数が少ない、加えて分離対象が液状フィブロインタンパク質のみであることから、発現タンパク質の活性を失いかねない。
【０００７】
すなわち、遺伝子組み換え技術による鱗翅目昆虫の幼虫絹糸腺への目的タンパク質の発現・製造方法に関して、従来の絹糸腺の摘出方法では生産された組み換えタンパク質を安定、且つ迅速に回収することが困難であり、加えて一度に大量の幼虫を処理することが困難であるという課題がある。
【特許文献１】特開昭６１−９２８８号公報
【特許文献２】特開昭６１−９２９７号公報
【特許文献３】特開２００３−３２５１８８号公報
【特許文献４】特開２００４−２５４６８１号公報
【特許文献５】特開２００３−５１２０５１号公報
【特許文献６】特開平７−２８９２７０公報
【特許文献７】特開２００３−２２５０３６号公報
【特許文献８】特開２００１−３５２８６１号公報
【特許文献９】国際公開第Ｗ０９８／４８６１７号
【特許文献１０】特開２００３−２６６０１９号公報
【特許文献１１】特開平６−１８４８０９号公報
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １８，８１−８４，２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
鱗翅目昆虫染色体上へ遺伝子を導入し、幼虫絹糸腺特異的なプロモーターを利用した組み換え型タンパク質の生産技術は、精力的に研究されているが、発現タンパク質の活性を保持するために、発現部位である絹糸腺を安定、且つ迅速に回収する必要があり、加えて大量の幼虫を処理することが求められている。本発明はこのような実情を鑑みてなされたものであり、鱗翅目昆虫を始めとする絹糸腺を有する節足動物個体から、絹糸腺を迅速、簡便、且つ一度に多量に分離し、タンパク質を製造することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のタンパク質の製造方法、及び絹糸腺の分離方法は、
１．節足動物を圧搾して絹糸腺を分離し、該絹糸腺よりタンパク質を抽出することを特徴とするタンパク質の製造方法、
２．節足動物が鱗翅目昆虫、またはクモ目である前項１に記載のタンパク質の製造方法、
３．鱗翅目昆虫がカイコガであるところの前項２に記載のタンパク質の製造方法、
４．ローラーを用いて節足動物を圧搾することを特徴とする前項１〜３のいずれかに記載のタンパク質の製造方法、
５．該ローラーの表面が平滑であることを特徴とする前項４に記載のタンパク質の製造方法、
６．節足動物を圧搾することを特徴とする絹糸腺分離方法、
７．該節足動物が鱗翅目昆虫、またはクモ目である前項６に記載の絹糸腺分離方法、
８．鱗翅目昆虫がカイコガである前項７に記載の絹糸腺分離方法、
９．ローラーを用いることを特徴とする前項６〜８のいずれかに記載の絹糸腺分離方法、
１０．節足動物を圧搾する機構を有することを特徴とする絹糸腺の分離装置、
１１．該圧搾装置がローラーを具備することを特徴とする前項１０に記載の絹糸腺の分離装置、
１２．該圧搾装置が一対の対峙するローラーを具備することを特徴とする前項１０に絹糸腺の分離装置、からなる。
【発明の効果】
【００１０】
圧搾する事により、絹糸腺を有する節足動物、好ましくはカイコガから迅速・簡便、更に一度に多数の絹糸腺を分離することが可能となり、該絹糸腺からタンパク質を抽出することで、絹糸タンパク質や、目的タンパク質を製造することが可能となる。
【００１１】
さらに、ローラー、好ましくは表面が平滑なローラー、更に好ましくは表面が平滑で一対のローラーを用いて圧搾する事により、絹糸腺を有するカイコガ、鱗翅目、クモ目などの節足動物から迅速・簡便、且つ一度に多数の絹糸腺を分離することが可能となり、該絹糸腺からタンパク質を抽出することで、絹糸タンパク質や、目的タンパク質を製造することが可能となる。
【００１２】
また、絹糸腺の分離装置は、圧搾する機構を有する事で、絹糸腺を有する節足動物、好ましくはカイコガから迅速・簡便、更に一度に多数の絹糸腺を分離する装置が作製可能となる。
【００１３】
さらに、絹糸腺の分離装置は、ローラー、好ましくは表面が平滑なローラー、更に好ましくは表面が平滑で一対のローラーによって圧搾する機構を有する事で、絹糸腺を有するカイコガ、鱗翅目、クモ目などの節足動物から、絹糸腺を分離する装置が作製可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明の望ましい実施態様を説明する。
【００１５】
本発明は、節足動物を圧搾して絹糸腺を分離し、該絹糸腺よりタンパク質を抽出することを特徴とするタンパク質の製造方法である。
【００１６】
本発明は、圧搾によって節足動物から絹糸腺を効率よく分離することを目的とするものであり、本発明が使用できる節足動物としては、絹糸腺を有する鱗翅目昆虫、クモ目が挙げられる。鱗翅目昆虫としては、ヒトリガ科、ヤママユガ科、スズメガ科、ヤガ科、カイコガ科が挙げられ、クモ目としてはコガネグモ科、アシナガグモ科が挙げられ、特に好適なものとしてカイコガが挙げられる。
【００１７】
本発明で言う圧搾とは、絹糸腺を有する節足動物を圧力や重みにより潰すことであり、圧力や重みをかける為には、例えば、ローラーや板を用いることが出来るが、特に好適なものとして一対の対峙するローラーが挙げられる。また、ローラーの表面は平滑であることが好ましい。
【００１８】
さらに、本発明は、節足動物を圧搾することを特徴とする絹糸腺分離方法である。本発明の絹糸腺分離方法において、節足動物は、鱗翅目昆虫、またはクモ目であることが好ましく、鱗翅目昆虫は、カイコガであることがより好ましい。本発明の絹糸腺分離方法において、好ましくは、ローラーを用いる。
【００１９】
さらに、本発明は、節足動物を圧搾する機構を有する絹糸腺の分離装置である。本発明の圧搾装置は、ローラーを具備することが好ましく、一対の対峙するローラーを具備することがより好ましい。
【００２０】
図１は、本発明による絹糸腺分離装置の一形態を例示している。図１において、２及び３は圧搾の為のローラーを示している。
【００２１】
図１の絹糸腺分離装置において、分離目的の節足動物は、まず図１における２及び３で示された一対の対峙するローラー間へと投入される。ローラーによる圧搾は温和である事が好ましく、回転速度は、図１における４で示されたハンドルと５で示されたマルチタイミングベルトによって自由に設定できるが、回転速度を一定に保つために、マルチタイミングベルトにモーターを取り付け、連続的に絹糸腺を分離する事も可能である。また、長いローラーを用いることで、投入個体は一頭ずつに限られたものではなく、一度に多量の個体群から絹糸腺を分離することが可能である。
【００２２】
図１における２及び３のローラーは平滑な形状であることが望ましい。平滑であることによって、圧搾された節足動物の絹糸腺や表皮がローラー本体へ付着する事がなく、連続的な絹糸腺の分離が可能となる。
【００２３】
図１における２及び３のローラーの下部には、予め緩衝液を加えた受け皿を設置しておくことが望ましい。緩衝液の添加は、絹糸腺から所望の組み換えタンパク質が浸透圧の変化により溶出することを防ぐ為であり、用いる緩衝液に関しては特に限定されるものではないが、一般的には生理食塩水やリンガー溶液が挙げられる。
【００２４】
受け皿に落下した絹糸腺は、圧搾個体より既に分離されており、ピンセットなどで容易に絹糸腺を回収することが可能である。
【００２５】
回収した絹糸腺は数回緩衝液を用いて洗浄し、絹糸腺の表面に付着した夾雑タンパク質を除去した後、メスやハサミを用いて切断する。その後、適量の緩衝液に浸漬することで絹糸腺の管の内部のタンパク質が溶出し、組み換えタンパク質の抽出が可能である。切断部位や浸漬する時間に制限はないが、カイコガの絹糸腺であれば、３カ所の切断の後、５分間リン酸緩衝液に浸漬する事で絹糸腺内の８０％のタンパク質が溶出される。
【００２６】
上記に示した分離方法によって、絹糸腺の分離が可能となる。本発明による絹糸腺の分離方法は、要する時間が１秒ないしは数秒と迅速であること、簡便であり技術の習得を要しないこと、一度に多量の個体群を処理できることから、特に遺伝子組み換え技術によって絹糸腺内に生理活性タンパク質を発現した場合に活性を失いにくく有効である。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。
【００２８】
実施例１（５齢３日目カイコガ幼虫からの絹糸腺の分離）
５齢３日目となるカイコガ幼虫（錦秋×鐘和）５０頭を、図１における２及び３で示されるローラー間へ投入した。ローラーには日本ピローブロック社製の金属（鉄）製平滑ローラー（ＦｅＳ）、及び１ｍｍの凹凸が１ｍｍ間隔で入っているローラー（ＦｅＲ）、１ｍｍの凹凸が１ｍｍ間隔で入っているゴム製ローラー（ＲＵＢ）、三井武田ケミカル社製タケネートＬ１１５７を使用した平滑ポリウレタンローラー（ＰＵＲ）、ＪＳＲ社製の平滑天然ゴムローラー（ＮＢＲ）を使用した。５齢３日目となるカイコガ幼虫の絹糸腺の直径が０．６ｍｍであるため、ローラー間の距離は０．６ｍｍに固定した。ローラーによって圧搾された幼虫個体と分離された絹糸腺はバットの中へ落下する様に、ローラー下部には生理食塩水を予め満たしたバットを設置した。ローラーの回転速度は１８ｍ／分とし、幼虫個体から切断などの損傷が無く分離された絹糸腺の数を計測した。その結果、ＰＵＲ、及びＮＢＲを用いた場合、６割以上の絹糸腺を分離回収することが出来た（図２参照。実験は三度行い、標準偏差をグラフ上に示した。）。一方で、ＦｅＲ、及びＲＵＢでは未分離絹糸腺の３割がローラーの凹凸部分に付着していた。これらの結果から、５齢３日目のカイコガ幼虫から絹糸腺を分離する際、図１に示された圧搾法が有効であり、また、用いたローラーの材質による分離効果に関して特に違いは認められなかったが、ローラーの表面は平滑である方が分離効果が高いことが示された。
【００２９】
実施例２（熟蚕カイコガ幼虫からの絹糸腺の分離）
５齢６日目となるカイコガ幼虫（錦秋×鐘和）は摂食を停止した熟蚕となっており、これら熟蚕５０頭を、図１における２及び３で示されるローラー間へ投入した。ローラーには実施例１と同様の５種類のローラー（ＦｅＳ、ＦｅＲ、ＲＵＢ、ＰＵＲ、ＮＢＲ）を使用した。熟蚕カイコガ幼虫の絹糸腺の直径が１．０ｍｍであったため、ローラー間の距離は１．０ｍｍに固定した。ローラーによって圧搾された幼虫個体と分離された絹糸腺はバットの中へ落下する様に、ローラー下部には生理食塩水を予め満たしたバットを設置した。ローラーの回転速度は１８ｍ／分とし、幼虫個体から切断などの損傷が無く、分離された絹糸腺の数を計測した。その結果、ＦｅＳ、ＰＵＲ、ＮＢＲを用いた場合、７割以上の絹糸腺を分離回収することが出来た（図４参照。実験は三度行い、標準偏差をグラフ上に示した。）。これは実施例１における５齢３日目カイコガ幼虫を用いた分離実験に比べて高い分離効果であった。一方で、ＦｅＲ、及びＲＵＢでは未分離絹糸腺の５割以上がローラーの凹凸部分に付着していた。これらの結果から、５齢熟蚕のカイコガ幼虫から絹糸腺を分離する際、図１に示された圧搾法が有効であり、また、用いたローラーの材質による分離効果に関して特に違いは認められなかったが、ローラーの表面は平滑である方が分離効果が高いことが示された。
【００３０】
実施例３（ネコインターフェロンω遺伝子組み換えカイコからの絹糸腺分離、及び分離した絹糸腺からのネコインターフェロンωの検出）
ネコインターフェロンω遺伝子組み換えカイコ（特開２００４−２５４６８１に記載のＨＵＰ・ＩＣ・ＨＡ形質転換カイコ）、及びコントロールとして非遺伝子組み換えカイコ（ｗ１ｐｎｄ）の熟蚕幼虫を、図１における２及び３で示されるローラー間へ投入し、ローラー間の距離を０．６ｍｍ、回転速度を１８ｍ／分に設定しローラーを回転することで幼虫を圧搾し絹糸腺を分離した。ローラーには実施例１における平滑ポリウレタンローラー（ＰＵＲ）を用いた。分離した絹糸腺はリン酸緩衝液中にてカッターによって三カ所切断し、軽く遠心分離することで液状のフィブロインを回収し、液状フィブロインサンプルとした。
【００３１】
一方で、ネコインターフェロンω遺伝子組み換えカイコ、及び非遺伝子組み換えカイコの繭を各１０ｍｇ量り採り、６０％ＬｉＳＣＮ４ｍｌを加え攪拌後、終夜室温に静置し、繭を溶解した。これを８Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノールで１０倍希釈し、繭溶液サンプルとした。
【００３２】
これら液状フィブロインサンプルと繭溶液サンプルをECL PlusTM Western blotting Kit （アマシャムファルマシア社製）、及び抗ネコインターフェロンω抗血清を用い、添付のプロトコールに従ってネコインターフェロンの検出を行った。その結果、ローラーを用いて圧搾した遺伝子組み換えカイコの絹糸腺からは、ネコインターフェロンωが抽出された（図６参照）。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、各種ローラーを用いた圧搾を利用した絹糸腺分離機の一例を三角法で表した図である。
【図２】図２は、５齢３日目となるカイコガ幼虫（錦秋×鐘和）５０頭から、図１に示された絹糸腺分離機によって分離された絹糸腺数を示す。
【図３】図３は、５齢３日目となるカイコガ幼虫（錦秋×鐘和）５０頭を、図１に示された絹糸腺分離機によって分離した際に、分離されなかった絹糸腺の中で、各種ローラーへ絹糸腺が付着したまま、受け皿へと落下しなかった絹糸腺の割合を示す。
【図４】図４は、５齢６日目となる熟蚕カイコガ幼虫（錦秋×鐘和）５０頭から、図１に示された絹糸腺分離機によって分離された絹糸腺数を示す。
【図５】図５は、５齢６日目となる熟蚕カイコガ幼虫（錦秋×鐘和）５０頭を、図１に示された絹糸腺分離機によって分離した際に、分離されなかった絹糸腺の中で、各種ローラーへ絹糸腺が付着したまま、受け皿へと落下しなかった絹糸腺の割合を示す。
【図６】図６は、遺伝子組み換えカイコの発現するネコインターフェロンωタンパク質をウェスタン解析した結果である。レーン１、２，３，４はそれぞれ、遺伝子組み換えカイコからローラー圧搾によって分離した絹糸腺の液状フィブロインサンプル、非遺伝子組み換えカイコからローラー圧搾によって分離した絹糸腺の液状フィブロインサンプル、遺伝子組み換えカイコの繭サンプル、非遺伝子組み換えカイコの繭サンプルを示す。矢印は検出されたネコインターフェロンωタンパク質を示す。
【符号の説明】
【００３４】
１  カバー
２  ローラー１
３  ローラー２、
４  ハンドル
５  マルチタイミングベルト
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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