(57)【要約】【課題】海産魚で発現するβ−アクチンプロモーター遺伝子、このプロモーター遺伝子を含む発現ベクター、及びこの発現ベクターが導入された遺伝子導入魚類を提供する。【解決手段】高級海産魚であり、養殖魚としても実績のあるマダイのゲノムDNAから、マダイの全細胞で発現するβ−アクチン蛋白質の発現量を制御するプロモーター遺伝子を単離して、発現ベクターに組込み、この発現ベクターを魚類に遺伝子導入した。また、β−アクチン蛋白質をコードする遺伝子の下流側にあるポリアデニレーションシグナルと類似する塩基配列についても合わせて単離し、これについても発現ベクターに組込み、この発現ベクターを魚類に遺伝子導入した。その結果、前記プロモーター遺伝子及びポリアデニレーションシグナルと類似する塩基配列が、プロモーター遺伝子やポリアデニレーションシグナルとして機能し、外来蛋白質を発現することが確認できた。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）又は（ｂ） の塩基配列からなるβ−アクチンプロモーター遺伝子。
（ａ） 配列表の配列番号１で表される塩基配列、
（ｂ） 配列表の配列番号１で表される塩基配列において、１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加され、かつプロモーター活性を有する塩基配列。
【請求項２】
請求項１に記載のプロモーター遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項３】
次の（ｃ）又は（ｄ） の塩基配列を前記プロモーター遺伝子の下流側に含む請求項２に記載の発現ベクター。
（ｃ） 配列表の配列番号２で表される塩基配列、
（ｄ） 配列表の配列番号２で表される塩基配列において、１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加され、かつポリアデニレーションシグナル活性を有する塩基配列。
【請求項４】
前記プロモーター遺伝子の下流側に外来遺伝子を含む請求項２又は３に記載の発現ベクター。
【請求項５】
外来遺伝子がレポーター遺伝子である請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
請求項２から５の何れかに記載の発現ベクターが遺伝子導入された遺伝子導入魚類。
【請求項７】
魚類が海産魚である請求項６に記載の遺伝子導入魚類。
【請求項８】
魚類がマダイである請求項７に記載の遺伝子導入魚類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、マダイなどの海産魚の全身で発現するβ−アクチンプロモーター遺伝子、このプロモーター遺伝子を含む発現ベクター、及びこの発現ベクターが導入された遺伝子導入魚類に関する。
【背景技術】
【０００２】
わが国は魚の一大消費国であり、消費される魚の多くは現在、海面漁業、輸入、及び海面養殖によって賄われている。また、漁業従事者の高齢化や漁業資源の管理などの点から、海面漁業や輸入による魚類の確保は年々困難になってきており、魚の安定した供給源として魚の海面養殖への期待が年々高まっている。
【０００３】
その一方で、海面養殖は、輸入魚や他の食品、例えば食肉との厳しい価格競争に曝されており、これに対応するため、経済効果の高い魚、具体的にはより少ないエサや手間で高品質・高価格の魚を生産することが求められている。また、海面養殖においては、収穫量の増大を目的とした過密養殖や飼餌料の過剰投与による養殖漁場の環境悪化が生じており、これにともなう魚病の発生や品質低下も生じている。
【０００４】
このような課題に対応するため、養殖魚のエサ、飼育用生簀、養殖方法などの研究に加えて、より養殖に適した魚、具体的には成長が速くて肉質がよく、環境耐性があり、病気に罹り難い魚の育種についても研究もなされている。そして、魚の育種については、選抜育種などの従来からある方法に加えて、近年では、バイオテクノロジー技術の進歩の成果を取り入れた遺伝子導入による方法も試みられるようになっている。例えば、低温刺激によって外来遺伝子を発現するプロモーター遺伝子をゼブラフィッシュに導入してGFPなどのレポーター遺伝子を発現すること（特許文献１を参照。）や、β−アクチン遺伝子、β−アクチンプロモーター遺伝子、成長ホルモン遺伝子を含む発現ベクターを泥鯰に遺伝子導入して成長の早い泥鯰を育種すること（特許文献２を参照）などが試みられている。
【０００５】
しかし、これら魚類の遺伝子組換えに関するの研究の多くは、メダカやゼブラフィッシュなどの実験魚を対象とするものであり、これらの実験魚の多くは淡水魚であった。そのため、これらの研究成果は、養殖魚の多くを占める海産魚の遺伝子組換えによる育種には利用することができなかった。
【特許文献１】特開２００３−１５９０７０号公報
【特許文献２】特開２０００−４８８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、この発明は、海産魚で発現するβ−アクチンプロモーター遺伝子、このプロモーター遺伝子を含む発現ベクター、及びこの発現ベクターが導入された遺伝子導入魚類を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
高級海産魚であり、養殖魚としても実績のあるマダイのゲノムDNAから、マダイの全細胞で発現するβ−アクチン蛋白質の発現量を制御するプロモーター遺伝子を単離して、発現ベクターに組込み、この発現ベクターを魚類に遺伝子導入した。また、ポリアデニレーションシグナル配列についてもマダイのゲノムDNAから単離し、発現ベクターに組込んで、この発現ベクターを魚類に遺伝子導入した。
【発明の効果】
【０００８】
海産魚の細胞で発現するβ−アクチン蛋白質のプロモーター遺伝子を単離できたので、この下流側に外来遺伝子、例えば、成長ホルモン、代謝酵素、抗菌・抗ウイルス性因子等の各種蛋白質をコードする遺伝子を導入した発現ベクターを構築できる。そして、この発現ベクターを魚類に導入することによって、優れた性質を備えた海産魚を育種できる。また、海産魚で機能するプロモーター遺伝子や発現ベクターは少ないため、このプロモーター遺伝子は海産魚における遺伝子工学の進展にも寄与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明者らは、マダイの全血からゲノムDNAを抽出してゲノムDNAライブラリを作成するとともに、同じマダイの卵巣から抽出したcDNA を鋳型にしてβ−アクチン遺伝子を含むDNA断片をPCR法により増幅し、ラベリングしてプローブとした。そして、ゲノムDNAライブラリから、プローブを利用してβ−アクチン遺伝子を含むゲノムDNA断片を見つけ出し、その塩基配列を決定した。
【００１０】
その結果、このゲノムDNA断片に含まれるβ−アクチン遺伝子の上流側の塩基配列には、他の生物や他の遺伝子のプロモーター遺伝子に存在するCAAT Box、CarG Box、TATA Boxが存在し、β−アクチン遺伝子の下流側の塩基配列にはポリアデニレーションシグナルと類似する部分を含む塩基配列が存在することが確認できた。
【００１１】
また、前記上流側の塩基配列の下流側にレポーター遺伝子を含む発現ベクターを構築し、この発現ベクターをマダイに遺伝子導入して、そのプロモーター活性を調べたところ、高い転写活性が確認できた。
【００１２】
さらに、この発現ベクターのレポーター遺伝子の下流側に前記下流側の塩基配列を含む発現ベクターを構築し、この発現ベクターをマダイに遺伝子導入して、プロモーター活性を調べたところ、同じく高い転写活性が確認できた。
【００１３】
上記プロモーター遺伝子のうち、上記CAAT Box、CarG Box、TATA Box以外の塩基配列（以下、非必須配列という）については、欠失、置換、又は付加を行ってもプロモーター機能は維持されると考えられるため、このような修飾を行ったプロモーター遺伝子も本発明の特許請求の範囲に含まれる。なお、各非必須配列における欠失、置換は最大その５０％以内が好ましく、各非必須配列に塩基配列を付加する場合でも、付加する塩基配列の長さは元の非必須配列の長さの５０％以内である。なお、ポリアデニレーションシグナルと類似する部分を含む塩基配列についても同様のことが言える。
【００１４】
上記プロモーター遺伝子を含む発現ベクターのもとになるベクターとしては、魚類又はその培養細胞中で複製可能なものであればよい。また、上記プロモーター遺伝子に連結する外来遺伝子についても、その種類や由来は特に限定することない。例えば、変異緑色蛍光タンパク質（EGFP；Enhanced green fluorescent protein）等のレポーター遺伝子、代謝酵素、筋肉タンパク質、各種ホルモン、抗菌・抗ウイルス性因子等をコードする様々な遺伝子を利用することができ、海産魚、淡水魚などの魚類以外の生物に由来する遺伝子についても利用することができる。なお、本発明の外来遺伝子には、マダイから単離した遺伝子を発現ベクターに連結し、これをマダイに遺伝導入する場合の前記単離した遺伝子も含む。また、外来遺伝子は単独の遺伝子だけではなく、複数の遺伝子から構成されていてもよい。
【００１５】
魚類又は培養細胞への遺伝子導入は、受精卵にDNAを顕微注入するマイクロインジェクション法のほか、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム共沈法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法／リポソーム法、ウイルスベクターを用いる方法など当業者に周知の方法により行うことができる。
【００１６】
上記発現ベクターを導入可能な魚としては、マダイなどの海産魚は言うまでもなく、ゼブラフィッシュ、メダカなどの淡水魚も挙げることができる。なお、遺伝子の導入はこれら魚の受精卵だけではなく、株化した培養細胞に対しても行うことができる。
【００１７】
以下、実施例によって本願発明をより詳細に説明するが、この実施例の記載は、如何なる意味においても、請求項に記載した本願発明の技術的範囲を限定しない。
【実施例１】
【００１８】
本実施例では、マダイのβ−アクチンプロモーター遺伝子のクローニングについて説明する。このクローニングは、（１）マダイゲムノムDNAライブラリの調製、（２）DNAライブラリの増幅、（３）β−アクチンプローブの調製、（４）プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニング、（５）in vivo excision（サブクローニング）、（６）塩基配列決定の順番で行った。そこで、以下にこの順番で詳説する。なお、詳細な実験手順、試薬の構成などについては、特に明記しない限りは各種キット類に添付の説明書に従った。
【００１９】
（１）ゲノムDNAライブラリの調製
まず、ホモ接合型クローンマダイ（K. Kato, R. Hayashi, D. Yuasa, S. Yamamoto, S. Miyashita, O. Murata, and H. Kumai, Aquaculture, 207, 19-27, 2002）4尾より0.5mlずつ全血を採取し,ゲノムDNAをSDS-フェノール／クロロホルム法（Andrew S. Harris, Sophie Bieger, Roger W. Doyle and Jonathan M. Wright, Aquaculture, 92, 157-163, 1991）によって抽出した。
【００２０】
つぎに、抽出したゲノムDNA（50μg）を三等分して制限酵素EcoRI（0.01 U /μl）により45, 60および90分間限定分解して約10kbp以下に断片化したのち、断片化したDNAをGENECLEAN（登録商標） Kit（Q-BIO gene）を用いて精製した。
【００２１】
さらに、精製したゲノムDNA断片を Lambda ZAP（登録商標）II Predigested EcoR I / CIAP-Treated Vector Kit（Stratagene）を用いてλファージベクターにライゲーションし、Gigapack（登録商標）III packaging extract（Stratagene）を用いてパッケージングして、ファージ液とした。
【００２２】
ライゲーション・パッケージングの後に、ファージベクターのタイターを調べたところ、タイターは1.115×104pfu /μl，5.575×106pfu /μg vectorであり、非組換えプラークも1/100以下であった。このことから、ゲノムDNAが十分な効率でパッケージングしたことを確認できた。
【００２３】
（２）DNAライブラリの増幅
上記（１）でパッケージングしたファージ液4μlと大腸菌XL1-Blue MRF'（OD600=0.5）0.5mlの懸濁液を37℃で15分間インキュベート後，0.7％のアガロースを含むNZYトップアガー培地6.5mlを混ぜ、NZY培地を含む14×10cmのシャーレ24枚に撒いて7.5時間ほど培養した。培養後、約10mlのSMバッファー（100 mM NaCl，8 mM MgSO4・7H2O， 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)， 0.1 %ゼラチン）を各シャーレに注いで、各シャーレを4℃で8時間ほど静置したのち、各シャーレからファージを含むSMバッファーを回収して、各ライブラリ1−24とした。なお、そのうちの1本のタイターを調べたところ、2.17×107pfu / μlであった。
【００２４】
このライブラリから1mlずつ集めて合わせて混合液をつくり、そのうちの18.6 mlは1.4 mlのDMSOを加えて−80℃で凍結保存した。そして、混合液の残り5.4 mlのうち、2mlからHigh Pure Lambda Isolation Kit （Roche）によってDNAを抽出し、残りの3.4 mlは冷蔵保存した。また、ライブラリ1−24の残りのうち、約4mlにはDMSOを加えて−80℃で凍結保存し、2mlからはHigh Pure Lambda Isolation Kit （Roche）によってDNAを抽出し、さらにその残りである3mlは冷蔵保存した。
【００２５】
（３）β−アクチン遺伝子プローブの調製
上記ホモ接合型クローンマダイの卵巣cDNAをテンプレートにして、これまでに単離されたβ−アクチン遺伝子に共通する配列から設計した2種のプライマー（Act-F1， 5'-AAYTGGGAYGAYATG-3'（配列表配列番号３）及びAct-R1， 5'-CCNCCDATCCANAC-3'（配列表配列番号４））により、Takara Ex Taq（登録商標，宝酒造株式会社）を用いてPCR増幅した。
【００２６】
つぎに、このPCR産物をアガロースゲル電気泳動したところ複数のバンドが出現したので、これまでに単離されたβ−アクチン遺伝子に長さの近い約800 bpのバンドをアガロースゲルから回収して、GENECLEAN（登録商標） Kit（Q-BIO gene）により精製した。この精製DNAをテンプレートにして、上記２つのプライマーよりも内側にある2種類のネステッドプライマー（Act-F2， 5'-GARAARATGACNCA-3'（配列表配列番号５）及びAct-R2， 5'-DATYTCYTTYTGCAT-3'（配列表配列番号６））により、Takara Ex Taq（登録商標，宝酒造株式会社）を用いてPCR増幅した。
【００２７】
このPCR産物をアガロースゲル電気泳動したところ単一のバンドが得られたので、そのバンドを回収しDNAを精製した。精製したDNA断片をTOPO（登録商標）TA Cloning Kit（Invtrogen）を用いてプラスミドにライゲーションし大腸菌に形質転換した。この大腸菌を培養したのち、プラスミドDNAをQIAprep （登録商標）Spin Miniprep Kit（Qiagen）を用いて精製した。精製したプラスミドDNAの挿入塩基配列を、CEQ（登録商標） DTCS-Quick Start Kit（Beckman Coulter）およびBeckman CEQ （登録商標）2000XL（Beckman Coulter）によって決定したところ、その塩基配列からβ−アクチン遺伝子のcDNA断片であることが確認できた。
【００２８】
得られた塩基配列を基に、2種類のプライマー（Act-F3，5'-CAGGTA TTGTGTTGGACTCTGGTG-3'（配列表配列番号７）及びAct-R3， 5'-GATGTCCACGTCGCACTTCATG-3'（配列表配列番号８））を設計し、これらのプライマーを使用して、上記の混合液から抽出したゲノムDNAをテンプレートにPCR増幅した。このPCR産物をアガロースゲル電気泳動したところ単一のバンドが得られた。そこで、このバンドからDNAを精製して、DIG DNAラベリングキット（Roche）を用いてDIG（ジゴキシゲニン）ラベルし、β−アクチン遺伝子を探すプローブとして用いた。
【００２９】
(４)プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニング
まず、上記ゲノムDNAライブラリの中からβ−アクチン遺伝子を含むものを探すため、24本の各ライブラリ液から抽出したDNAをテンプレートにAct-F3およびAct-R3プライマーとしてPCR増幅を行った。そして、このPCR産物をアガロースゲル電気泳動したところ、24本中6本に明瞭な1本のバンドが認められた。そこで、その中でも特にはっきりとしたバンドの認められたライブラリ液を選んで、プラークリフティングに必要なプレートの作成に使用した。
【００３０】
ファージの数が20,000 pfu/plateとなる量の前記ライブラリ液と、大腸菌（XL1−Blue MRF'，OD600=0.5）懸濁液200μlと、2.5mlのNZYトップアガーとをよく混ぜ、直径90mmのNZYアガープレート2枚に注ぎ込んで平らに広げ、トップアガーを固めた。トップアガーが固まったのち、37℃で8時間程度培養して4℃で2時間プレートを冷却した。
【００３１】
このプレートの上にメンブレンフィルタ（Hybond-N+、アマシャムバイオサイエンス ）を１分間のせ、プラークをメンブレンに転写した。転写終了後、メンブレンフィルタをプレートからはがし、濾紙（ワットマン3MM）上に静置して乾燥させたのち、変性溶液（1.5 M NaCl、0.5 M NaOH）に予め浸しておいた濾紙の上に5分間静置して、ファージのタンパク質を変性しそのDNAを露出させた。変性処理の終わったメンブレンフィルタは、濾紙上に静置して乾燥させたのち、中和溶液（ 1.5 M NaCl、1.0 M Tris-HCl (pH 7.5) ）に予め浸しておいた濾紙の上に15分間静置することにより中和した。中和したメンブレンフィルタは、濾紙上に静置して乾燥させたのち、2×SSC（0.3 M NaCl、30 mM クエン酸ナトリウム（pH 7.0））に予め浸しておいた濾紙の上に10分間静置して洗浄し、UVクロスリンカー（120,000 μJ/cm2）によって紫外線を照射し、メンブレンフィルタとDNAとをクロスリンクさせた。このメンブレンフィルタをプロティナーゼK溶液に浸して37℃、1時間で反応させたのち、濾紙で挟んで細胞やアガロースの残骸を除去し、プラークハイブリダイゼーション用のメンブレンフィルタとした。
【００３２】
前記メンブレンフィルタをプレハイブリダイゼーション液（DIG Easy Hyb（Roche））に浸し、42℃で1時間プレハイブリダイゼーションしたあと、上記のDIGラベルプローブを加えて42℃で2時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、メンブレンを2×洗浄液（2×SSC， 0.1% SDS）により5分間ずつ室温で2回洗浄したのち、0.5×洗浄液（0.5×SSC， 0.1% SDS）により15分間ずつ68℃で2回洗浄した。
【００３３】
このようにして、ハイブリダイゼーション及び洗浄の終わったメンブレンフィルタにおけるポジティブプラークの検出は、DIG核酸検出キット（Roche）を使用して行った。具体的には、まず、メンブレンフィルタを洗浄バッファー（100 mM マレイン酸、150 mM NaCl， 0.3% Tween 20，pH 7.5）で1分間平衡化したのち、ブロッキング溶液（1％のブロッキング試薬（Roche）をマレイン酸バッファー（100 mM マレイン酸，150 mM NaCl，pH 7.5）に溶解したもの）中でゆっくり振盪しながら1時間ブロッキングした。つぎに、アルカリフォスファターゼ標識抗DIG抗体を添加したブロッキング溶液中でメンブレンフィルタを30分間保温し、洗浄バッファーで15分間2回洗浄した。最後に、検出バッファー（100 mM Tris-HCl， 100 mM NaCl、 pH 9.5）でメンブレンフィルタを2分間平衡化したのち、NBT/BCIPストック溶液（Roche）を添加した検出バッファーにより12時間暗下で発色させ、TEバッファー（10 mM Tris-HCl， 0.1 mM EDTA， pH 8.0）で洗浄して発色反応を停止した。
【００３４】
上記の操作で得られたポジティブプラークを1 mlのSMバッファーに懸濁し、そのうちの10 μlを用いて二次スクリーニングを行ったところ、明瞭なポジティブプラークが得られた。なお、実験操作は上記に示したものと同様に行った。
【００３５】
（５）in vivo excision（サブクローニング）
まず、アガープレートから目的のプラークの中心を切り取り、500μlのSM bufferおよび20μlのクロロホルムを入れたチューブに懸濁させ、室温で1-2時間培養したのち、4℃で一晩保存してファージストックとした。一方、大腸菌XL1-Blue MRF'株およびSOLR株を0.2%(w/v)マルトースおよび10mM MgSO4を含むLB 培地（1 % NaCl， 1 % Tryptone，0.5 % yeast extract， pH 7.0）で別々に30℃で一晩培養した（第１日目）。
【００３６】
大腸菌を培養した翌日（第２日目）、それらの大腸菌を穏やかに(1000×g)スピンダウンし、10mM MgSO4にOD600=1.0となるように再懸濁した。この大腸菌XL1-Blue MRF'株200 μl、上記のファージストック250 μl及びExAssistヘルパーファージ1 μlをFalcon2059ポリプロピレンチューブに入れて、37℃で15分間保温してファージを大腸菌に感染させた。つぎに、上記チューブに3 mlのLB 培地を加えて37℃で3時間培養したのち、チューブを70℃で20分間加温してファージと大腸菌を溶かした。さらに、これを1000×gで15分間遠心して、その上清を大腸菌SOLR株（OD600=1.0）200 μlが入った1.5 mlマイクロチューブ2本にそれぞれ10μl 及び100μlづつ加え、37℃で15分間保温したのち、LB-アンピシリン（50μg/ml）アガープレートに各チューブから200μlを塗布して37℃で一晩培養した。このアガープレートから得たコロニーをLB-アンピシリン培地で37℃一晩培養したのち、QIAprep （登録商標）Spin Miniprep Kit（Qiagen）を使用してプラスミドDNAを精製した。
【００３７】
（６）塩基配列の決定
得られたプラスミドDNAの挿入塩基配列は、CEQ（登録商標） DTCS-Quick Start Kit（Beckman Coulter）及びBeckman CEQ（登録商標） 2000XL（Beckman Coulter）を用いて決定した。挿入塩基配列の全長は5,300 bpであり、配列番号1に示すプロモーター遺伝子（2,291 bp）と、β−アクチン翻訳領域と、配列番号２に示すポリアデニレーションシグナル（AATAAA）を含む領域（685 bp）とを含んでいた。なお、配列番号1に示すプロモーター遺伝子は、CAATボックス様配列、CArGボックス様配列及びTATAボックス様配列を含んでいた。
【実施例２】
【００３８】
このようにして得られたプロモーター遺伝子の転写活性を、変異型緑色蛍光タンパク質（EGFP）遺伝子をレポーター遺伝子として含むベクター使用して分析した。なお、分析は（７）発現ベクターの調製、（８）転写活性の確認の手順で行った。
【００３９】
（７）発現ベクターの調製
転写活性の測定に使用する発現ベクター１及び２は、アフリカツメガエルのEF-1αプロモーター遺伝子の下流側にEGFP遺伝子およびSimian Virus 40のポリアデニレーションシグナルを含む配列を連結したプラスミドDNAの発現ベクターpXI-EGFP（Knaut H, Steinbeisser H, Schwarz H, Nusslein-Volhard C, Curr Biol., 12(6), 454-66, 2002）から構築した。まず、この発現ベクターと2種類のプライマー（pXI-F2， 5'-ATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAA-3'（配列表配列番号９）及び pXI-R2， 5'-GCCGGTCTCCCTATAGTGA-3'（配列表配列番号１０））から、KOD-Plus-（東洋紡績）を使用するPCR法を行ってDNAを増幅して、このPCR産物を精製したのち、アルカリフォスファターゼ（東洋紡績）で両末端を脱リン酸化して、EF-1αプロモーター部位を含まない発現ベクター由来の平滑末端のDNA断片を調製した。つぎに、配列番号1に示すβ−アクチンプロモーター遺伝子領域を2種類のプライマー（gActP-F1， 5'-AATTCCTAGTGTAAGTTTATGAGTCTTT-3'（配列表配列番号１１）及び gActP-R1， 5'-TTTCTGGACAGAGAGGGAGA-3'（配列表配列番号１２）を用いて、同様の方法によりPCR増幅・精製・脱リン酸化し、プロモーター遺伝子を含む平滑末端のDNA断片を調製した。このようにして調製した発現ベクター由来のDNA断片とプロモーター遺伝子DNA断片とをTaKaRa BKL Kit（宝酒造）を用いて連結して大腸菌XL1-Blue MRF'株に形質転換したのち、定法に従って、この大腸菌を大量培養してプラスミドDNAを精製し発現ベクター1とした。また、EF-1αプロモーター部位を含まない発現ベクター由来の平滑末端のDNA断片について、同様の方法によって、その両端を連結したのちプラスミドDNAを抽出して、ネガティブコントロールとした。なお、参考のため、発現ベクター１の構成を図１に示す。
【００４０】
また、発現ベクター１を２種類のプライマー（pXI-F1， 5'-TATAGTGTCACCTAAATCGTATGTGTAT-3'（配列表配列番号１３）、 pXI-R1， 5'-TTAATTCGAGCTCCACCGC-3'（配列表配列番号１４））を使用して、発現ベクター1と同様の方法によって、PCR法による増幅・精製・両末端脱リン酸化を行い、Simian Virus 40のポリアデニレーションシグナルを含まない平滑末端のDNA断片を調製した。つぎに、配列番号２に示したポリアデニレーションシグナルを含む領域を2種類のプライマー（gActPA-F， 5'-ACGAACTGTCAGTCCCCTC-3'（配列表配列番号１５）、gActPA-R， 5'-AATTCAGCCATCAAGAATTTCTTCTTTAGA-3'（配列表配列番号１６））を用いて同様に増幅・精製・両末端脱リン酸化して、ポリアデニレーションシグナルを含む平滑末端のDNA断片を調製した。このようにして調製したポリアデニレーションシグナルを含まないDNA断片とポリアデニレーションシグナルを含む平滑末端とをTaKaRa BKL Kitを用いて連結して大腸菌XL1-Blue MRF'株に形質転換したのち、定法に従って、この大腸菌を大量培養してプラスミドDNAを精製し発現ベクター２とした。なお、参考のため、発現ベクター２の構成を図２に示す。
【００４１】
（８）転写活性の確認
まず、上記の２種類の発現ベクターを100 ng /μlになるようにリン酸緩衝液（pH 7.4）で希釈した。つぎに、受精して1分後のマダイの受精卵をライボビッツのL-15培地（Invtrogen）で洗浄したのち、アクリルプレート上の約1 mm幅の溝に並べ、希釈した発現ベクターのDNA溶液を実体顕微鏡下でガラスキャピラリーを使用して、マイクロインジェクション法により注入した。また、同様の方法により、発現ベクター１及び２をゼブラフィッシュの受精卵にも導入した。
【００４２】
DNAを導入した卵を20℃の海水中で保温し、受精後19，42および60時間後に、蛍光顕微鏡でEGFPの蛍光発現を観察した。その観察結果の一部を図３から図５に示す。ここで、図３（ａ）は発現ベクター１をマダイの受精卵に遺伝子導入して、19時間後に蛍光顕微鏡により明視野と暗視野で撮影してそれを合成した写真であり、図３（ｂ）は発現ベクター２をマダイの受精卵に遺伝子導入して、42時間後に蛍光顕微鏡により明視野のみを撮影した図であり、図３（ｃ）は42時間後に図３（ａ）と同じように撮影・合成した写真である。また、図４（ａ）及び（ｂ）は、発現ベクター１又は２をそれぞれゼブラフィッシュの受精卵に遺伝子導入して4日後に、図３（ａ）と同じように撮影・合成した写真である。さらに、図５（ａ）及び（ｂ）は、プロモーター遺伝子がないネガティブコントロールをマダイの受精卵に遺伝子導入して、19時間後（ａ）及び42時間後（ｂ）に図３（ａ）と同じように撮影・合成した写真である。
【００４３】
これらの図からも明らかなように、発現ベクター１及び２を遺伝子導入した受精卵（図３及び図４）は、EGFPが発現し蛍光しているのに対して、プロモーター遺伝子を含まないネガティブコントロールを遺伝子導入した受精卵（図５）はEGFPが発現せず蛍光していない。このことから、発現ベクター１及び２に含まれる配列１は、プロモーター遺伝子特有の塩基配列を持っているだけではなく、EGFPを発現させるプロモーター遺伝子としての機能を備えていることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
この発明にかかるβ−アクチンプロモーター遺伝子は、その下流側に任意の外来遺伝子を連結し、これをマダイなどの海産魚に導入することにより、前記外来遺伝子を海産魚の全身で安全かつ強力に発現させることができる。そのため、外来遺伝子として、例えば、成長ホルモンや抗菌性物質の生成に関連する遺伝子を利用すれば、成長が早く、環境耐性があり、病気に罹り難い海産魚を育種することができる。また、海産魚やその培養細胞で機能するプロモーター遺伝子や発現ベクターは少ないため、このプロモーター遺伝子は海産魚における遺伝子工学の進展にも寄与することができる。さらに、このプロモーター遺伝子は、実験魚として利用されてきた淡水魚でも働くため、海産魚と淡水魚における特定遺伝子の働き方の違いを研究する際にも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】発現ベクター１の構成を模式的に示した図である。
【図２】発現ベクター２の構成を模式的に示した図である。
【図３】発現ベクター１又は２を導入したマダイの受精卵中で、EGFPが発現する様子を蛍光顕微鏡により観察した様子を示す写真である。
【図４】発現ベクター１又は２を導入したゼブラフィッシュの受精卵中で、EGFPが発現する様子を蛍光顕微鏡により観察した様子を示す写真である。
【図５】プロモーター遺伝子を含まないネガティブコントロールを導入したマダイの受精卵を、蛍光顕微鏡により観察した様子を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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