(57)【要約】      （修正有）【課題】トロンボポエチン（ＴＰＯ）は化学療法に起因する血小板減少症の軽減に有用であるが、一部患者に逆に血小板減少を来す事がある。その処置および診断に有用な、ＴＰＯ由来ペプチドを提供する。【解決手段】ＴＰＯに対する液性および細胞性免疫応答を誘導する、５種のＴＰＯ由来ペプチドを見出した。これらのペプチドを認識する抗体の有無を患者血漿において調べることにより、ＴＰＯ投与の危険性の判断を行う。また、ＴＰＯに対する自己免疫応答を減弱させるため、そのペプチドを含む医薬組成物を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答を誘導するトロンボポエチン由来ペプチドまたは機能的に同等の性質を有するその誘導体。
【請求項２】
免疫応答が液性免疫応答である、請求項１記載のペプチドまたは機能的に同等の性質を有するその誘導体。
【請求項３】
免疫応答が液性免疫応答および細胞性免疫応答である、請求項１記載のペプチドまたは機能的に同等の性質を有するその誘導体。
【請求項４】
配列番号：１から５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むペプチドまたは機能的に同等の性質を有するその誘導体。
【請求項５】
血小板減少症患者に対するＴＰＯ投与の危険性を判断するためのデータを収集する方法であって、請求項１から４のいずれかに記載のペプチドまたは誘導体を認識する抗体の存在を血小板減少症患者から採取した血漿において調べることを含む方法。
【請求項６】
該データが、該抗体が存在する場合にＴＰＯ投与が危険であると判断するためのデータとなる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＴＰＯに対する自己免疫応答を減弱させるための、請求項１から４のいずれかに記載のペプチドまたは誘導体を含有する医薬組成物。
【請求項８】
悪性腫瘍を処置するための、請求項１から４のいずれかに記載のペプチドまたは誘導体を含有する医薬組成物。
【請求項９】
請求項１から４のいずれかに記載のペプチドまたは誘導体を認識する抗体。
【請求項１０】
免疫応答を誘導するトロンボポエチン由来ペプチドを認識する抗体を検出するための、配列番号：１から５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むトロンボポエチン由来ペプチドまたは機能的に同等の性質を有するその誘導体を含むキット。
【請求項１１】
血小板減少症患者に対するＴＰＯ投与の危険性を判断するための、請求項１０記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板減少症の治療において有用なトロンボポエチン由来ペプチドに関する。詳細には、本発明は、免疫応答を誘導するトロンボポエチン由来ペプチド、そのペプチドを含む医薬組成物およびそのペプチドに対する抗体を検出するためのキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
トロンボポエチン（ＴＰＯ）は、血小板産生の重要な調節因子であり、血小板を産生する巨核球の成長および巨核球からの血小板の産生を刺激する（非特許文献１）。ＴＰＯは、肝臓において３５３アミノ酸の前駆タンパク質として合成され、２１アミノ酸のシグナルペプチドが切断されて成熟分子となる。その成熟分子は、エリスロポエチンと相同性の高い２つのドメインと、そのタンパク質の安定性に重要な高度にグリコシル化されたカルボキシ末端より構成される（非特許文献２）。ある種の血小板減少性障害の患者においてはＴＰＯの産生が上昇することが観察されているが、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の患者では上昇がみられない（非特許文献３、４）。これまでに、２種類の組換えＴＰＯが大規模な臨床試験に用いられた。１つは、天然のＴＰＯと同じアミノ酸配列を有するグリコシル化分子である組換えヒトＴＰＯ（ｒＨｕＴＰＯ）であり、もう１つは、天然のＴＰＯの生物活性ドメインに相当する１−１６３アミノ酸を含む非グリコシル化分子であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合組換えヒト巨核球成長および発達因子（ＰＥＧ−ｒＨｕＭＧＤＦ）である（非特許文献１、２、５）。両ＴＰＯはヒトにおける血小板産生の強力な刺激物質であり、化学療法に起因する血小板減少症を軽減する能力を有し、血小板輸血の必要性を減少させ得る点で有益である（非特許文献６、７）。しかしながら過去１０年間に行われた臨床研究において、ＰＥＧ−ｒＨｕＭＤＧＦが内生のＴＰＯと交差反応する抗体を誘導し、健常人の４％および集中的な化学療法を受けた癌患者の０．６％において血小板減少症を誘発した（非特許文献５）。注目すべきは、健常人が２、３回のＴＰＯ投与後に血小板減少症を示したのに対して、癌患者はより多くの回数の投与を受けた後に血小板減少症を示したことである（非特許文献２）。言いかえれば、免疫機能が正常に維持されている被験者は、低用量のＴＰＯにより血小板減少症を示すようであることである。このことは、自己免疫反応が血小板減少症に関与することを示唆する。しかしながら、被験者のＴ細胞に認識されるＴＰＯの免疫原性エピトープはいまだ同定されていない。
【０００３】
【非特許文献１】Kaushansky K. Thrombopoietin. N Engl J Med 1998; 339:746-754.
【非特許文献２】Kuter DJ, and Begley CG. Recombinant human thrombopoietin: basic biology and evaluation of clinical studies. Blood 2002; 100:3457-3469.
【非特許文献３】Yang C, Li YC, and Kuter DJ. The physiological response of thrombopoietin (c-Mpl ligand) to thrombocytopenia in the rat. Br J Haematol 1999; 105:478-485.
【非特許文献４】Kappers-Klunne MC, de Haan M, Struijk PC et al. Serum thrombopoietin levels in relation to disease status in patients with immune thrombocytopenic purpura. Br J Haematol 2001; 115:1004-1006.
【非特許文献５】Kuter DJ. Future directions with platelet growth factors. Semin Hematol 2000; 37:41-49.
【非特許文献６】Vadhan-Raj S, Verschraegen CF, Bueso-Ramos C et al. Recombinant human thrombopoietin attenuates carboplatin-induced severe thrombocytopenia and the need for platelet transfusions in patients with gynecologic cancer. Ann Intern Med 2000; 132:364-368.
【非特許文献７】Vadhan-Raj S, Patel S, Bueso-Ramos C et al. Importance of predosing of recombinant human thrombopoietin to reduce chemotherapy-induced early thrombocytopenia. J Clin Oncol 2003; 21:3158-3167.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、血小板減少症の分子機構を解明して血小板減少症の治療に寄与し得るＴＰＯ由来ペプチドを同定することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記目的を達成するために、ＨＬＡ−Ａ２抗原結合モチーフに基づいて１８個のＴＰＯ由来ペプチドを作成し、それらペプチドに特異的な抗体が血小板減少症患者および健常人の血漿中に存在するかについて検討した。その結果、液性免疫応答を誘導するＴＰＯ由来ペプチドが同定された。次に、液性免疫応答を誘導するＴＰＯ由来ペプチドが、血小板減少症患者および健常人由来の末梢血単核球からペプチド特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るかについて検討し、液性免疫および細胞性免疫応答の両方を誘導する５つのペプチド（ＴＰＯ−８９、−１０１、−１０９、−１６２および−１６４）を同定した。更に、これらのペプチドにより誘導されたＣＴＬが、ＴＰＯを産生する肝細胞癌細胞株を傷害することを見出した。また、本発明者らは、血小板減少症患者は健常人と比較してＴＰＯに対する自己抗体保有率が高く、自己抗体を有する被験者では抗ペプチド抗体が多く検出されることを見出した。これらの結果に基づいて、本発明が完成した。
【０００６】
即ち、本発明は以下のものを提供する；
（１）免疫応答を誘導するトロンボポエチン由来ペプチドまたは機能的に同等の性質を有するその誘導体；特に、免疫応答が液性免疫応答であるペプチドまたは誘導体、あるいは、免疫応答が液性免疫応答および細胞性免疫応答であるペプチドまたは誘導体；具体的には、配列番号１から５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むペプチドまたは機能的に同等の性質を有するその誘導体；
（２）血小板減少症患者に対するＴＰＯ投与の危険性を判断するためのデータを収集する方法であって、（１）記載のペプチドまたは誘導体を認識する抗体の存在を血小板減少症患者から採取した血漿において調べることを含む方法；特に、該データが、該抗体が存在する場合にＴＰＯ投与が危険であると判断するためのデータとなる方法；
（３）ＴＰＯに対する自己免疫応答を減弱させるための、（１）記載のペプチドまたは誘導体を含有する医薬組成物；
（４）悪性腫瘍を処置するための、（１）記載のペプチドまたは誘導体を含有する医薬組成物；
（５）（１）記載のペプチドまたは誘導体を認識する抗体；および、
（６）免疫応答を誘導するトロンボポエチン由来ペプチドを認識する抗体を検出するための、配列番号：１から５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むトロンボポエチン由来ペプチドまたは機能的に同等の性質を有するその誘導体を含むキット；特に、血小板減少症患者に対するＴＰＯ投与の危険性を判断するためのキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のＴＰＯ由来ペプチドに対する免疫応答の有無を血小板減少症患者において調べることにより、ＴＰＯ投与時に自己免疫応答によりＴＰＯ中和抗体である自己抗体を産生し血小板減少を来す危険性について判断することができる。また、本発明のＴＰＯ由来ペプチドは、減感作療法によりＴＰＯに対する自己免疫応答を減弱させることができる。更に、ＴＰＯ産生癌細胞を標的とする悪性腫瘍を処置することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
１．ペプチド
本発明は、免疫応答を誘導するＴＰＯ由来ペプチドを提供する。本発明において「ＴＰＯ由来ペプチド」とは、ＴＰＯのアミノ酸配列（配列番号：６）の一部である連続したアミノ酸配列を含むペプチドを意味する。「ＴＰＯのアミノ酸配列の一部である連続したアミノ酸配列」は、ＨＬＡ抗原との結合モチーフに基づき、例えば Bioinformatics and Molecular Analysis Section（NIH, Bethesda, MD）等のコンピューター解析により決定される。本発明のＴＰＯ由来ペプチドは、抗原提示細胞表面のＨＬＡ抗原と結合して提示されうる長さ、好ましくは８から１１残基、より好ましくは９から１０残基である。また、本発明のペプチドは、細胞内のプロテアソームで分解されて抗原提示細胞表面のＨＬＡ抗原と結合して提示されうる長さとなるより長いペプチド、例えば８から５０残基、好ましくは８から３０残基、より好ましくは８から１５残基の長さのペプチドであってもよい。本発明のＴＰＯ由来ペプチドは、好ましくは配列番号：１から５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むペプチドであり、より好ましくは配列番号：１から５のいずれかに示されるアミノ酸配列であるペプチドである。
【０００９】
本発明のＴＰＯ由来ペプチドが誘導する免疫応答には、液性免疫応答および細胞性免疫応答が含まれる。好ましい態様において、本発明のＴＰＯ由来ペプチドは液性免疫応答を誘導し、より好ましくは、液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を誘導する。本発明において、「液性免疫応答を誘導する」か否かは、被験者の血漿中にそのペプチドに特異的なＩｇＧが存在するか否かにより判断することができる。血漿中のＩｇＧは、常套的ＥＬＩＳＡ法により検出することができる。「細胞性免疫応答を誘導する」か否かは、そのペプチドが末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導するか否かにより判断することができる。例えば、インビトロにおいて候補ペプチドで刺激したＰＢＭＣがペプチド提示標的細胞に反応して産生する種々のサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）をＥＬＩＳＡ法等で検出することによりＣＴＬの誘導を調べ、さらにそのＣＴＬの細胞傷害性を５１Ｃｒ放出アッセイにより検討する。
【００１０】
本発明のペプチドの「誘導体」とは、本発明のペプチドのアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加などを含む改変されたアミノ酸配列を有し、かつそのペプチドの有する免疫応答誘導能を備えるペプチドを意味する。
【００１１】
本発明のペプチドおよび誘導体は、通常のペプチド合成により調製することができる。そのような方法として、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York，1966； The Proteins, Vol2, Academic Press Inc.,New York, 1976；ペプチド合成、丸善（株）、1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）、1985；医薬品の開発続 第十四巻・ペプチド合成、広川書店、1991）などに記載されている方法が挙げられる。
【００１２】
本発明のＴＰＯ由来ペプチドに対する免疫応答が観察される被験者は、既に内因性のＴＰＯの抗原性部分で感作されていると考えられる。従って、本発明のペプチドおよび誘導体は、被験者がＴＰＯ投与を受けた場合にＴＰＯに対する自己抗体を産生し血小板減少を来す危険性、即ちＴＰＯ投与の危険性を判断するために使用することができる。また、本発明のペプチドおよび誘導体は、以下に記載する医薬組成物の製造に用いることができる。
【００１３】
２．データ収集方法
本発明は、血小板減少症患者に対するＴＰＯ投与の危険性を判断するためのデータを収集する方法を提供する。本方法は、血小板減少症患者から採取した血漿に存在する、本発明のペプチドまたは誘導体を認識する抗体を調べることを含む。本発明の方法には、本発明のＴＰＯ由来ペプチドおよび誘導体から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のペプチドおよび／または誘導体について抗体の存在を調べることが包含される。特に、配列番号：１から５に示される５つのＴＰＯ由来ペプチドまたはその誘導体を認識する抗体の存在を調べることが好ましい。抗体の存在は、常套的ＥＬＩＳＡ法により調べることができる。上記抗体が１つでも存在すれば既に内因性のＴＰＯの抗原性部分に感作されていると考えられ、ＴＰＯ投与が危険であると判断できる。
【００１４】
３．医薬組成物
本発明は、本発明のペプチドまたは誘導体を含有する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドまたは誘導体を１つ、２つまたはそれ以上含むことができ、更に、製薬的に許容される担体、および／または賦形剤等の添加剤を含むことができる。本発明の医薬組成物は通常の製剤化技術により製造することができ、その剤型には、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤など、外因性のペプチドをＨＬＡ抗原へ効率良く抗原提示させ得る製剤が含まれる。
【００１５】
本発明の医薬組成物は、減感作療法によりＴＰＯに対する自己免疫応答を減弱させることができる。減感作療法とは、免疫応答を誘導する物質をはじめは少量、低濃度で投与し、徐々に大量、高濃度に変化させてその物質に対する過敏性を減弱させることを目的とした治療法である。本発明のＴＰＯ由来ペプチドは、ＴＰＯの抗原性を決定している部分の一部である可能性がある。従って、内因性のＴＰＯに対する自己免疫応答を示す被験者では、上記の「免疫応答を誘導する物質」として本発明のＴＰＯ由来ペプチドを用いて、ＴＰＯに対する免疫応答を減弱できる可能性がある。医薬組成物の投与方法としては、皮内投与、皮下投与または静脈注射が挙げられる。その投与量は、処置対象の疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、医薬組成物中の本発明のペプチドまたは誘導体の量として通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇの範囲内で投与量を変化させ、数日、数週または数ヶ月に１回の投与を１〜３年継続することが好ましい。
【００１６】
また、本発明の医薬組成物は、例えば癌ワクチンとして、ＴＰＯ産生癌細胞を標的とした悪性腫瘍の処置に用いることができる。ＴＰＯ産生癌細胞としては、肝癌細胞、腎癌細胞が挙げられる。本発明の医薬組成物は、液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を効率的に誘導するように、アジュバントとともに投与することができる。その投与方法としては、皮内投与、皮下投与または静脈注射が挙げられる。医薬組成物の投与量は、処置対象の疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、医薬組成物中の本発明のペプチドまたは誘導体の量で通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数週に１回投与するのが好ましい。
【００１７】
４．抗体
本発明は、本発明のペプチドまたは誘導体を認識する抗体を提供する。本発明の抗体には、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。本発明はまた、本発明のペプチドまたは誘導体を認識するＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖのような抗体断片をも包含する。本発明の抗体は、例えば”Antibodies: A Laboratory Manual”, Lane, H. D. et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989 に記載される方法に従い容易に調製することができる。本発明の抗体は、本発明のペプチドまたは誘導体の精製に使用することができ、本発明のペプチドまたは誘導体を認識する抗体の検出において、標準品として使用することもできる。
【００１８】
５．キット
本発明は、免疫応答を誘導するＴＰＯ由来ペプチドを認識する抗体を検出するのに用いる、配列番号：１から５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むＴＰＯ由来ペプチドまたは機能的に同等の性質を有するその誘導体を含むキットを提供する。本発明のキットはまた、適当な緩衝液、発色剤、反応停止剤等を含むことができる。本発明のキットは、血小板減少症患者から採取した血漿を試料として、ＴＰＯ投与の危険性を判断するために用いることができる。
【実施例】
【００１９】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれら実施例に限定されない。
【００２０】
１．方法
１．１  ペプチド合成
コンピューター解析（Bioinformatics and Molecular Analysis Section, NIH, Bethesda, MD）により、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子に結合する能力に基づいて１８個のＴＰＯ由来ペプチドを合成した（株式会社バイオロジカ、名古屋、日本）。これらペプチドを表２に示す。ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを有するＨＩＶペプチド（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ）を陰性対照として使用した（１１）。ペプチドは全て、ジメチルスルホキシドに濃度１０ｍｇ／ｍｌで溶解した。
【００２１】
１．２  被験者
ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染が陰性である血小板減少症患者２４人および健常人（ＨＤ）２４人が本研究に参加した。血小板減少症患者およびＨＤの特性を表１に示す。
【表１】
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血小板減少症患者は、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）患者１４人、再生不良性貧血患者（ＡＡ）６人、骨髄異形成症候群患者（ＭＤＳ）２人、前立腺癌関連骨転移患者１人および原発性脾腫患者１人であり（表１）、平均年齢は５７．４歳であった。血小板数および疾患分類に関して有意な差異は存在しなかった。ＩＴＰおよびＡＡの群では通常通り女性の割合が大きかった。ＡＡ患者では他の患者および健常人と比較して血清ＴＰＯレベルが高かったが、これも既報の観察結果から予想されることであった（Emmons RV, Reid DM, Cohen RL et al. Human thrombopoietin levels are high when thrombocytopenia is due to megakaryocyte deficiency and low when due to increased platelet destruction. Blood 1996; 87:4068-4071）。患者およびＨＤから血液を採取し、ヘパリン処理した血液２０ｍｌからＦｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ密度勾配遠心法により血漿および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。ＰＢＭＣ上のＨＬＡ−Ａ２分子の発現は、既報のように（Matsueda S, Kobayashi K, Nonaka Y et al. Identification of new prostate stem cell antigen-derived peptides immunogenic in HLA-A2(+) patients with hormone-refractory prostate cancer. Cancer Immunol Immunother 2004; 53:479-489）フローサイトメトリーにより測定した。
【００２２】
１．３  抗ペプチド抗体の検出
血漿中の抗ペプチド抗体（ＩｇＧ）は、既報のように（Ohkouchi S, Yamada A, Imai N et al. Non-mutated tumor-rejection antigen peptides elicit type-I allergy in the majority of healthy individuals. Tissue Antigens 2002; 59:259-272）ＥＬＩＳＡにより測定した。具体的には、ペプチド（２０μｇ／ウェル）を固定化したプレートをブロックエース（雪印、東京、日本）によりブロックし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにより洗浄した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ブロックエースで希釈した血漿を、１００μｌ／ウェルにてそのプレートに添加した。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、さらに１：１０００希釈ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（γ鎖特異的：DAKO, Glostrup, Denmark）と２時間インキュベートした。そのプレートを再び洗浄し、１：１００希釈ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇ抗体（ＤＡＫＯ）１００μｌを各ウェルに添加し、プレートを４０分間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、テトラメチルベンジン基質溶液（KPL, Guildford, UK）を１００μｌ／ウェルでプレートに添加し、その後１Ｍリン酸を添加して反応を停止させた。抗ペプチド抗体のレベルを評価するため、各試料の吸光度（ＯＤ）を段階希釈した標準試料と比較した。その値をＯＤユニットで示す。カットオフ値は、ＨＤの抗ＨＩＶペプチドＩｇＧの平均＋２ＳＤが０．０２＋０．０４であることに基づき、血漿希釈１：１００でＯＤ値０．０６（平均＋２標準偏差）とした。抗ペプチド抗体のペプチド特異性を確認するため、ペプチドをコートしたウェル中で試料１００μｌをインキュベートしてペプチド特異的な抗ペプチドＩｇＧを吸収し、得られた試料中の抗ペプチドＩｇＧのレベルを測定した。抗ペプチド抗体が完全長のＴＰＯを認識するか否かについては、組換えヒトＴＰＯ（ｒｈＴＰＯ）およびヒトアルブミン（陰性対照）を用いて吸収試験により検討した。
【００２３】
１．４  ＴＰＯ由来ペプチドによるペプチド反応性ＣＴＬの誘導
ＰＢＭＣ（１ｘ１０５細胞／ウェル）を各ペプチド（１０μＭ）とＵ底９６ウェルマイクロカルチャープレート（Nunc, Roskilde, Denmark）にて培養培地２００μｌ中でインキュベートした。培地は、４５％ＲＰＭＩ−１６４０、４５％ＡＩＭ−Ｖ（Invitrogen, Carlsbad, California）、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２および０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Invitrogen）より構成された。第３、６および９日目に、培地の半分を除去し、同じペプチド（２０μｇ／ｍｌ）を含有する新しい培地と置き換えた。培養第１２日目に細胞を回収し、対応ペプチドまたは陰性対照のＨＩＶペプチドのいずれかを事前にロードしたＨＬＡ−Ａ２発現Ｔ２細胞に応答してＩＦＮ−γを産生する能力について試験した。各ペプチドにつき４つのウェルを準備し、デュプリケートでアッセイを行った。データでは、得られた値からＨＩＶペプチドに対するバックグラウンドのＩＦＮ−γ産生を差し引いた。ペプチド反応性ＣＴＬの誘導は、対応ペプチドに応答してペプチド刺激ＰＢＭＣより産生されたＩＦＮ−γの平均値が、ＨＩＶペプチドに応答して産生されたものより有意に（Ｐ＜０．０５）高かった場合に、ＣＴＬの誘導が陽性とした。ＩＦＮ−γの産生は、既報のように（Matsueda S, Kobayashi K, Nonaka Y et al. Identification of new prostate stem cell antigen-derived peptides immunogenic in HLA-A2(+) patients with hormone-refractory prostate cancer. Cancer Immunol Immunother 2004; 53:479-489）ＥＬＩＳＡにより検討した。
【００２４】
１．５  細胞傷害性アッセイ
ペプチド反応性ＣＴＬを上記培地中でペプチドなしでさらに培養し、細胞傷害性アッセイを行うのに十分な数の細胞を得た。これら細胞の細胞傷害性について、既報のように（Matsueda S, Kobayashi K, Nonaka Y et al. Identification of new prostate stem cell antigen-derived peptides immunogenic in HLA-A2(+) patients with hormone-refractory prostate cancer. Cancer Immunol Immunother 2004; 53:479-489）標準的５１Ｃｒ放出アッセイにより試験した。ペプチド反応性ＣＴＬの細胞傷害性を調べるため、標的細胞として事前に対応ペプチドまたはＨＩＶペプチドをロードしたＴ２細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１９９２）を使用した。また、細胞内機構により分解されＭＨＣクラスＩ分子に提示された内因性のＴＰＯに由来するペプチドに対する反応性を検討するため、２種類のＴＰＯ産生肝細胞癌細胞株、Ｈｅｐ−Ｇ２細胞（ＨＬＡ−Ａ  ０２０１／２４０２、Ｂ  ３５／５１０５、Ｃ  ０４０１／１６０２、ＤＲ  １３０２／１６０２、ＤＱＡ１  ０１０２、ＤＱＢ１  ０６０４／０５０２）（ＡＴＣＣ番号：ＨＢ−８０６５）およびＫＹＮ−１細胞（ＨＬＡ−Ａ  ２４０２、Ｂ  ５４０１、Ｃ  ０１０２、ＤＲＢ１  ０４０５、ＤＱＡ１  ０３０１、ＤＱＢ１  ０４０１）、および陰性対照としてＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＨＤ由来のＰＨＡ刺激ＰＢＭＣ（ＰＨＡ幼若化Ｔ細胞）を使用した。既報のように（Sasaki Y, Takahashi T, Miyazaki H et al., Production of thrombopoietin by human carcinomas and its novel isoforms. Blood 1999; 94:1952-1960）、培養細胞の上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＴＰＯレベル（Ｆｍｏｌ／ｍｌ）を調べた。ＴＰＯ産生肝細胞癌細胞株のＴＰＯレベルは、Ｈｅｐ−Ｇ２細胞およびＫＹＮ−１細胞でそれぞれ１．３６および０．８３Ｆｍｏｌ／ｍｌであった。また、ペプチド反応性ＣＴＬによる細胞傷害性の機構を検討するため、Ｈｅｐ−Ｇ２細胞を標的細胞として使用して、既報のように（Matsueda S, Kobayashi K, Nonaka Y et al. Identification of new prostate stem cell antigen-derived peptides immunogenic in HLA-A2(+) patients with hormone-refractory prostate cancer. Cancer Immunol Immunother 2004; 53:479-489）遮断試験および非放射性阻害試験（cold inhibition assay）を行った。
【００２５】
１．６  抗ＴＰＯ抗体の検出
血小板減少症患者およびＨＤの血漿中に存在するＴＰＯに対する自己抗体をＤｏｔ  ｐｌｏｔ法により検出した。既報の結果（非特許文献１、２および５）に基づき、ＴＰＯ１−１６３を認識する抗体を検出した。はじめに、ＰＤＶＦメンブラン（Miliipore, MA, USA）を１００％メタノールに１５秒間浸した。そのメンブランを超純水で洗浄し、ＰＢＳ中で１５分間平衡化した。メンブランをＰＢＳで湿らした３ＭＭ紙上に置き、組換えヒトＴＰＯ（ｒｈＴＰＯ  Ｋｉｒｉｎ、０．４ｍｇ／ｍｌ）を２μｌずつドットプロットした。メンブランを乾いた３ＭＭ紙上に置き、２時間乾燥させた。メタノールで１５秒間再び湿らし、超純水ですすぎ、そしてＢｌｏｃｋＡｃｅ（雪印、東京、日本）で一晩ブロッキングした。その後ブロック溶液を吸引し、血清試料１００μｌ（洗浄液６ｍｌおよびＢｌｏｃｋＡｃｅ４ｍｌ中）を加え、振盪しながら３時間インキュベートした。メンブランをＰＢＳ−Ｔで簡単に２回すすぎ、洗浄パットに入れ、パット中でＰＢＳ−Ｔ３０ｍｌにより３回洗浄した（１５分−５分−５分）。ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体１０μｌ（洗浄液６ｍｌおよびＢｌｏｃｋＡｃｅ４ｍｌ中）を加え、振盪しながら３時間インキュベートした。その後上記と同様にして４回（１５分−５分−５分−５分）洗浄した。ＥＣＬプラス（ＲＰＮ２１３２、Amersham Biosciences）の検出液（Ａ液５ｍｌ＋Ｂ液１２５μｌ／メンブラン）を調製し、メンブランにのせて１分間放置した。メンブランをラップで包み、３０秒から１分間露出し、写真を撮影した。
【００２６】
１．７  統計学的解析
両測スチューデントｔ検定を使用し、抗体レベル、ＩＦＮ−γ産生および標的細胞の溶解（％）を比較した。０．０５未満のＰ値を有意と判断した。
【００２７】
２．結果
２．１  抗ＴＰＯ由来ペプチド抗体の検出
１８種類のＴＰＯ由来ペプチドに反応する抗体（ＩｇＧ）のレベルを患者およびＨＤにおいて検討した結果を表２に示す。
【表２】
2006232697.tif 000003
【００２８】
ＴＰＯ−１０１（アミノ酸位置１０１−１１０）に反応するＩｇＧが、患者８人（３３％）およびＨＤ７人（２９％）において有意なレベルで検出された。ＴＰＯ−８９（同８９−９８）、ＴＰＯ−１０９（１０９−１１８）、ＴＰＯ−１６２（１６２−１７１）およびＴＰＯ−１６４（１６４−１７３）に反応するＩｇＧは、それぞれ５、６、５および７人の患者において検出され、ＨＤではそれぞれ１、０、２および２人で見られた。他のペプチドに反応するＩｇＧもまた、数人の患者においてＨＤよりも高い頻度で検出された。ＴＰＯ−３５に対するＩｇＧはＨＤにおいてのみ検出され、患者では検出されなかった。ＩｇＧが検出されたＴＰＯ由来ペプチドの患者あたりの平均数は、ＩＴＰ患者で２．２、ＡＡ患者で１．０、他の血小板減少性障害の患者で３．８およびＨＤで０．８であった。代表的結果を図１に示す。ＥＬＩＳＡの吸光度（ＯＤ）と血漿希釈との間に直線性相関が観察され、結果が妥当であることが示された。この結果に基づき、以下の実験では、ＴＰＯ−３５、−８９、１０１、−１０９、−１６２および−１６４の６つのペプチドについて検討した。
【００２９】
図２は、抗ペプチド抗体の特異性を検討した代表的結果を示す。６つのペプチド（ＴＰＯ−３５、−８９、−１０１、−１０９、−１６２および−１６４）に反応するＩｇＧは対応ペプチドで吸収されたが、無関係な対照ペプチド（ＨＩＶペプチド）では吸収されなかった。他のペプチド（ＴＰＯ−６０、−９４、−１１９、−１９１および−２０１）に反応するＩｇＧも、対応ペプチドにより吸収されたが対照ペプチドでは吸収されなかった（データ非提示）。これにより抗ペプチド抗体のペプチド特異性が確認された
【００３０】
図３は、上記の抗ペプチド抗体が親タンパク質であるＴＰＯを認識するか否かについて検討した結果を示す。抗ＴＰＯ抗体はｒｈＴＰＯにより吸収され、陰性対照であるヒトアルブミンによっては吸収されなかった（図３Ａ）。一方、抗ペプチド抗体は、未変性のｒｈＴＰＯ（Ｄｏｔ  ｐｌｏｔ法）および変性したｒｈＴＰＯ（ウェスタンブロット法）のいずれとも反応せず（データ非提示）、さらに吸収試験においては、対応ペプチドによっては吸収されたが、ｒｈＴＰＯによっては吸収されなかった。６つのペプチド（ＴＰＯ−３５、−８９、−１０１、−１０９、−１６２および−１６４）を認識するＩｇＧの代表的結果を図３Ｂに示す。以上のように、本研究においては、抗ペプチド抗体は完全長のＴＰＯを認識しなかった。
【００３１】
２．２  ＴＰＯ由来ペプチドによるペプチド反応性ＣＴＬの誘導
６つのペプチド（ＴＰＯ−３５、−８９、−１０１、−１０９、−１６２および−１６４）のペプチド反応性ＣＴＬ誘導能を、血小板減少症患者およびＨＤにおいて検討した結果を表３および４に示す。
【表３】
2006232697.tif 000004
【表４】
2006232697.tif 000005
ＴＰＯ−８９、−１０１、−１０９、−１６２および−１６４ペプチドは、６人の血小板減少症患者のうち０人または１人において、および１０人のＨＤのうち１から３人においてペプチド反応性ＣＴＬを誘導した。一方、ＴＰＯ−３５ペプチドは、いずれの血小板減少症患者およびＨＤからもＣＴＬを誘導しなかった。ＨＩＶペプチドに反応した患者およびＨＤはいなかった。
【００３２】
これらペプチド反応性ＣＴＬの細胞傷害性について調べた結果を図４に示す。ペプチド反応性ＣＴＬは、対応ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対して、ＨＩＶペプチドをパルスしたＴ２細胞に対してよりも高レベルの細胞傷害性を示した（図４Ａ）。また、Ｈｅｐ−Ｇ２細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋、ＴＰＯ＋）に対して強い細胞傷害性を示したが、ＫＹＮ−１細胞（ＨＬＡ−Ａ２−、ＴＰＯ＋）に対しては細胞傷害性は見られないかまたは弱かった（図４Ｂ）。図５は、ペプチド反応性ＣＴＬの細胞傷害性の機構について、遮断試験および非放射性阻害試験により検討した結果を示す。Ｈｅｐ−Ｇ２細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋、ＴＰＯ＋）に対する細胞傷害性は、抗ＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体および抗ＣＤ８モノクローナル抗体の添加によって有意に遮断されたが、試験した他のモノクローナル抗体（抗ＨＬＡクラスＩＩ、抗ＣＤ４および抗ＣＤ１４モノクローナル抗体）によっては遮断されなかった（図５Ａ）。また、その細胞傷害性は、対応ペプチドをロードした非標識Ｔ２細胞によって有意に遮断されたが、ＨＩＶペプチドをロードした非標識Ｔ２細胞（陰性対照）によっては遮断されなかった（図５Ｂ）。以上の結果は、ペプチド反応性ＣＴＬの細胞傷害性はペプチド特異的であり、主としてＨＬＡ−Ａ２拘束性にＣＤ８＋Ｔ細胞によって仲介されたことを示唆する。
【００３３】
２．３  ＴＰＯに対する自己抗体と抗ペプチド抗体との相関
血小板減少症患者およびＨＤの血漿中に存在するＴＰＯに対する自己抗体（抗ＴＰＯ抗体）をＤｏｔ  ｐｌｏｔ法により調べた結果を図６に示す。抗ＴＰＯ抗体を有するＨＤは２３人中１人（４％）であったのに対して、血小板減少症患者では２３人中６人（２６％）が抗ＴＰＯ抗体陽性であり、血小板減少症患者はＨＤと比較して抗ＴＰＯ抗体陽性率が高かった。また、抗ＴＰＯ抗体陽性および陰性被験者それぞれの、抗ＴＰＯ由来ペプチド抗体数を表５−１および２に示す。
【表５−１】
2006232697.tif 000006
【表５−２】
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抗ＴＰＯ抗体陰性被験者における抗ペプチド抗体の平均数は１．２６であったのに対して、陽性被験者では平均数は３．２９であった。抗ＴＰＯ抗体を有する被験者はより多くの抗ペプチド抗体を有することから、ＴＰＯ由来ペプチドはＴＰＯに対する自己抗体の産生と何らかの関係がある可能性がある。
【００３４】
３．  結論
本研究により、免疫応答を誘導するＴＰＯ由来ペプチドが同定された。ＴＰＯ由来ペプチドによりＰＢＭＣから誘導されたペプチド特異的ＣＴＬは、ＴＰＯ産生癌細胞株を傷害した。また、ＴＰＯ由来ペプチドとＴＰＯに対する自己抗体との関係が示唆された。これらペプチドに対する免疫応答を示す被験者は、既に内因性ＴＰＯの抗原性部分に感作されているということができる。従って、ＴＰＯ由来ペプチドに対する免疫応答は、ＴＰＯに対する自己免疫応答を示唆しうる。また、免疫応答を誘導するＴＰＯ由来ペプチドはＴＰＯの抗原性を決定する部分の一部である可能性があり、減感作療法によるＴＰＯに対する免疫応答の減弱に用いることで、抗ＴＰＯ抗体を有する患者またはペプチド抗体を有し自己免疫応答誘導の可能性のある患者の治療に役立つと考えられる。また、本発明者らは以前に、ある種のＣＴＬエピトープペプチドが液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導する能力を有し、ペプチドワクチン投与後の癌患者の血漿中のペプチド特異的ＩｇＧのレベルが患者の全体的生存率とよく一致することを報告した（Mine T, Sato Y, Noguchi M et al. Humoral responses to peptides correlate with overall survival in advanced cancer patients vaccinated with peptides based on pre-existing, peptide-specific cellular responses. Clin Cancer Res 2004; 10:929-937）。よって、免疫応答を誘導するＴＰＯ由来ペプチドは、癌ワクチンとしてＴＰＯ産生癌細胞を処置しうることが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、血小板減少症患者およびＨＤ由来の血漿中の抗ペプチド抗体をＥＬＩＳＡにより検討した結果を示す。
【図２】図２は、吸収試験により、抗ペプチド抗体の特異性を検討した結果を示す。抗ペプチド抗体は、対応ペプチドでは吸収されたが、陰性対照であるＨＩＶペプチドでは吸収されなかった。
【図３】図３は、完全長のＴＰＯに対する抗ペプチド抗体の反応性について検討した結果を示す。抗ペプチド抗体は対応ペプチドでは吸収されたが、ｒｈＴＰＯでは吸収されなかった。
【図４】図４は、ＴＰＯ由来ペプチドによりＰＢＭＣから誘導されたペプチド反応性ＣＴＬの細胞傷害性について検討した結果を示す。ペプチド反応性ＣＴＬは、対応ペプチドをパルスしたＴ２細胞（Ａ）およびＨＬＡ適合ＴＰＯ産生癌細胞株（Ｂ）に対して細胞傷害性を示した。
【図５】図５は、ペプチド反応性ＣＴＬによる細胞傷害性の機構について、遮断試験（Ａ）および非放射性阻害試験（Ｂ）を用いて検討した結果を示す。ペプチド反応性ＣＴＬの細胞傷害性は、ペプチド特異的に、ＨＬＡクラスＩ拘束性にＣＤ８＋Ｔ細胞により仲介されていることがわかった。
【図６】図６は、血小板減少症患者およびＨＤの血漿中の抗ＴＰＯ抗体をＤｏｔ  ｐｌｏｔ法により調べた結果を示す図面代用写真である。矢印は抗ＴＰＯ抗体が検出されたことを表す。血小板減少症患者は、ＨＤと比較して抗ＴＰＯ抗体陽性率が高かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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