(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子多型の検出において、簡単に遺伝子変異を検出できる技術およびそれに用いる試薬を提供する。【解決手段】Exo-proofreading 活性を利用して、核酸試料に含まれる遺伝子変異の検出を可能にするＳＮＰタイピング法であり、増幅用プライマーを用いて特定の変異を含む標的核酸またはその断片を増幅させる工程、変異検出用プライマーを用いて前記増幅した核酸配列上のＳＮＰを蛍光偏光法等で検出する工程を含み、さらに検出されたＳＮＰが変異型か野生型かヘテロ型かを同定することを特徴とする、核酸試料中の変異を検出する方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むことを特徴とする核酸試料中の変異を検出する方法。
（ａ）核酸試料中の特定の変異部位を含む標的核酸またはその断片に、増幅用プライマー、変異検出用プライマーおよび少なくとも３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する１種以上の核酸合成酵素を作用させ、前記標的核酸またはその断片を増幅させる工程、
（ｂ）変異検出用プライマーの３’末端に検出剤が標識されている塩基が、標的核酸上の対応する塩基と相補的でなければ、検出剤と共に塩基が遊離し、前記プライマーが伸長する工程、または変異検出用プライマーの３’末端に検出剤が標識されている塩基が、標的核酸上の対応する塩基と相補的であれば、検出剤と共に塩基は遊離せずに、前記プライマーが伸長する工程、
（ｃ）変異検出用プライマーの３’末端の検出剤が標識されている塩基の遊離の有無によって、変異を検出する工程。
【請求項２】
増幅用プライマーが、標的核酸またはその断片の、変異部位を含まない塩基配列領域と相補的な塩基配列を有している請求項１記載の方法。
【請求項３】
増幅用プライマーが、標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という塩基配列領域を選択し、それぞれに相補的な塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＲ３ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列、
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列、
（ｃ）標的核酸のＲ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＲ１ｃ領域を有する塩基配列、
（ｄ）標的核酸のＲ３領域を有する塩基配列。
【請求項４】
変異検出用プライマーが、変異部位を検出する塩基を３’末端に有し、かつ前記３’末端の塩基が検出剤で標識されている請求項１記載の方法。
【請求項５】
変異検出用プライマーが、標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という塩基配列領域を選択し、それぞれに相補的な塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＲ３ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ１ｃとしたときに、標的核酸のＦ２ｃ領域とＲ２領域の間の塩基配列と同一または相補的であり、かつ前記プライマーの３’末端の塩基に検出剤が標識されていることを特徴とする請求項１または４記載の方法。
【請求項６】
変異検出用プライマーが、野生型検出用プライマーおよび／または変異型検出用プライマーである請求項１、４または５記載の方法。
【請求項７】
核酸試料中の配列特異的塩基を含む標的核酸またはその断片中に、増幅用プライマーおよび核酸合成酵素を作用させ、前記標的核酸またはその断片を増幅し、請求項４〜６記載の変異検出用プライマーによって、増幅産物中の配列特異的塩基を検出する方法。
【請求項８】
核酸合成酵素が、鎖置換型活性を有するＤＮＡポリメラーゼである請求項１または７記載の方法。
【請求項９】
核酸合成酵素が、鎖置換型活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの混合物として使用される請求項１または７記載の方法。
【請求項１０】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼが、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼまたはＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼからなる群より選ばれる請求項９記載の方法。
【請求項１１】
標的核酸またはその断片を増幅させる工程が、等温増幅法である請求項１または７記載の方法。
【請求項１２】
等温増幅法が、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法およびＳＤＡ法からなる群より選ばれた請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
検出剤が、蛍光剤である請求項１、４または５記載の方法。
【請求項１４】
蛍光剤が、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ、ＲＯＸ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ５、Ｃｙ３または量子ドットからなる群より選ばれる請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
検出工程が、蛍光偏光法、蛍光分光相関法、ポリエチレンイミン分離法、蛍光共鳴エネルギー移動法または表面プラズモン共鳴法からなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項１６】
変異が、多型である請求項１記載の方法。
【請求項１７】
多型が、一塩基多型である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５記載の検出工程により、変異の有無を検出する方法。
【請求項１９】
請求項１５記載の検出工程により、一塩基多型が、野生型、変異型もしくはヘテロ型のいずれかを同定する方法。
【請求項２０】
増幅用プライマー、変異検出用プライマー、少なくとも３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する１種以上の核酸合成酵素、基質および反応緩衝剤を含むことを特徴とする遺伝子変異の検出用試薬キット。
【請求項２１】
増幅用プライマーが、標的核酸またはその断片の、変異部位を含まない塩基配列領域と相補的な塩基配列を有する請求項２０記載の試薬キット。
【請求項２２】
変異検出用プライマーの３’末端の塩基に蛍光剤が標識されている請求項２０記載の試薬キット。
【請求項２３】
変異検出用プライマーが、野生型検出用プライマーおよび／または変異型検出用プライマーである請求項２０または２２記載の試薬キット。
【請求項２４】
核酸合成酵素が、鎖置換型活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む請求項２０記載の試薬キット。
【請求項２５】
核酸合成酵素が、鎖置換型活性を有するＤＮＡポリメラーゼおよび３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの混合物である請求項２０記載の試薬キット。
【請求項２６】
請求項２０記載の試薬キットにより、変異の有無を検出する方法。
【請求項２７】
請求項２１記載の試薬キットにより、一塩基多型が、野生型、変異型もしくはヘテロ型のいずれかを同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝的変異や遺伝子多型の検出法に関する。さらには、野生型と変異型の同時検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほ乳類等の多細胞生物、あるいは細菌やウイルス等の生物の遺伝子レベルにおいて、一定の頻度で見出される核酸の塩基配列上の何らかの差異は、遺伝子変異と呼ばれている。核酸の塩基配列上での差異とは、置換、挿入、欠失あるいは組み換えによって生じ、その塩基配列上の差異のうち、ある集団内で１％以上の頻度で存在する変異は、特に遺伝子多型と呼ばれている。
【０００３】
遺伝子多型の中でも、塩基配列上の一塩基の置換、挿入、欠失によって起きる多型を、特に一塩基多型（以下「 ＳＮＰ（；Single Nucleotide Polymorphism ) 」と省略）と呼ばれている。ＳＮＰは、ヒトゲノムの中で最も出現頻度が高いため注目されている。すなわち、遺伝子多型の位置と変動に関する情報を集積し、個体の遺伝子を通常の表現型を有している野生型の遺伝子と比較した場合に、両者の遺伝子が同一かまたは異なるか等の表現型との関連性を解析することによって、多くの情報が得られる可能性があると期待されているからである。
【０００４】
また、遺伝子多型は、一定の頻度で集団に広がっていることから、全く形質の変化を伴わないものか、特に生存（生殖）に不利な形質ではなく、いわば体質といえる形質を左右しているものとして注目されている。例えば、糖尿病、高血圧症、肥満等の生活習慣病、リュウマチ、アレルギー等の免疫疾患、あるいは癌等の疾患に対する罹りやすさが、多型によって左右されていることが知られており、さらに、薬剤代謝（薬の効き方）やヒト白血球組織適合型抗原等も多型によって支配されていると考えられている。
【０００５】
医療現場では、個人の薬剤代謝に対する副作用に関連するＳＮＰすなわち遺伝子の個人差を明らかにすることができれば、個人の遺伝子のタイプに応じた最適な薬剤を投与する治療法が確立でき、その結果、治療ミスや副作用を未然に防ぐことが可能となる。このような試みは、テーラーメード医療として位置付けられている。
【０００６】
テーラーメード医療の実現には、簡易・迅速・精確に遺伝子のＳＮＰを検出する方法が求められており、これまでに様々な検出法が提案されている。遺伝子のＳＮＰを検出することはＳＮＰタイピング法と呼ばれており、これは、ＳＮＰが存在する位置の塩基を判別する方法であるが、ＳＮＰが未知かまたは既知かによって検出法が異なってくる。
【０００７】
ここで、ＳＮＰタイピング法の代表的なものを列挙する。
（１）対立遺伝子特異的プライマー（ Allele Specific Primer ；以下「ＡＳＰ」と省略）によるＰＣＲ法
変異型ＤＮＡでは増幅できないＡＳＰを、３’末端にＳＮＰを感知するように設計されたＰＣＲプライマーを用いて増幅させ、野生型と変異型のＤＮＡにおけるＰＣＲ増幅産物を電気泳動によって区別する方法である。
（２）変性勾配ゲル電気泳動法
変性勾配ゲル（尿素等の無荷電の変性剤の濃度勾配をつけたゲル）において、変異型は野生型と異なる位置に電気泳動するという性質を利用する方法である。これは、核酸の変性剤による変性が、２本鎖ＤＮＡ中にミスマッチが存在すると起こりやすくなり、それが電気泳動の移動度に反映するということを利用したものである。
（３）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ Single Strand Conformation Polymorphism ）法
標識されたＰＣＲプライマーによって点変異近傍のＤＮＡ断片を増幅後加熱して変性 (１本鎖化) し、点変異によって変化している１本鎖ＤＮＡの立体構造をゲル電気泳動の差異によって検出する方法である。
（４）ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ Restriction Fragment Length Polymorphism ）法
ＰＣＲ増幅産物を、特定のＤＮＡ配列だけを切断する制限酵素の特徴を利用し、切断されるかされないかで、電気泳動により変異を検出する方法である。
（５）ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法
野生型または変異型にハイブリダイズする２種類のＴａｑＭａｎプローブを鋳型核酸にハイブリダイズさせ、別にＰＣＲプライマーによって増幅させて、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によりプローブに標識した蛍光剤を遊離させる方法である。これは、各プローブの５’末端に結合している蛍光剤が異なるため、ＤＮＡが野生型または変異型かによって異なった蛍光を発することで、変異の検出が可能となる。
（６）Ｉｎｖａｄｅｒ法
２種類の非蛍光標識プローブと１種類の蛍光標識プローブを用いた検出法である。ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法では、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用して蛍光標識プローブを切断するが、Ｉｎｖａｄｅｒ法では、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有するクリーバーゼを利用する。この方法は、ＰＣＲ等のようにＤＮＡを増幅する必要がなく、クリーバーゼがＳＮＰの検出およびシグナル増幅の両者の役割を担う。
（７）ＤＮＡチップによる検出法
オリゴヌクレオチドの塩基配列を少しずつ変化させて、数多くの類似する塩基配列を微小な区画に整列させることができるＤＮＡチップを使用し、試料中のＤＮＡの中から、チップ上のＤＮＡとハイブイリダイズするものを蛍光標識により検出する。
【０００８】
このように、幾つかの検出法は、遺伝子増幅法として代表的なＰＣＲ法を利用した方法である。しかし、１塩基の違いのプライマーを用いた場合、完全に相補的なプライマーに比べて、塩基配列がプライマーと完全に相補的な塩基配列でなくてもしばしば相補鎖の合成が起きてしまう。そのため、１塩基の違いを区別するには、人為的にもう１ヶ所にミスマッチをいれる必要がある。しかし、この場合も配列の違いにより厳密な条件設定が必要であり、汎用技術には至っていない。また、ＰＣＲプライマーは、原理上２つの領域にしか設定できないため、類似した塩基配列からなる複数の遺伝子が同一の試料中に存在する場合、各遺伝子における変異や多型をＰＣＲ法に基づく増幅生成物の有無を指標として確認することはきわめて困難である。さらに、電気泳動を組み合わせた方法は簡易性の面からまた、ＴａｑＭａｎプローブを用いた方法では、２種類の蛍光標識されたプローブの作製のためのコストが高いという課題がある。
【０００９】
ＤＮＡチップを利用した技術では、確かに、ＤＮＡチップ上の微細な空間の反応環境を制御することによって、わずかな塩基配列の相違に基づくハイブリダイズの有無を、検出できる。しかし、現実には、解析データの再現性が最大の課題とされている。ＤＮＡチップ上でのハイブリダイズの条件は、反応空間が微細なために、繊細な条件設定が求められる。一定の水準で再現性を維持するには、高度な技術と、細心の注意が要求される。加えて、現状ではＤＮＡチップの価格が高いことも、解決が望まれる課題である。
【００１０】
近年、記述した技術とは別の対立遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲ法が開示されている（特許文献１）。従来の、ＳＮＰを検出するためのＰＣＲプライマーは、３’末端の塩基が鋳型と一致しない場合には増幅されないという性質を利用して、プライマーの３’末端に変異を感知できるように設計されたものであるが、この技術で使用するプライマーは、３’末端から２番目に変異を有するように設計され、さらに校正活性の強いα型ＤＮＡポリメラーゼと変異部位以外に人偽的ミスマッチ配列の導入等を組み合わせることで、飛躍的に高い多型識別能力を可能としている。
【００１１】
また、Exo-proofreading 活性を利用したＰＣＲ法が開示されている（非特許文献１、２）。Exo-proofreading 活性とは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性による校正機能であり、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成途中において、ミスマッチが起きた場合、ＤＮＡポリメラーゼのもつエキソヌクレアーゼ活性が、３’側からそのミスマッチ部分を取り除き、再びＤＮＡ合成を再開させるというものである。そこで、ＰＣＲプライマーの一方の３’側に蛍光剤を標識したプライマーを伸長させ、ミスマッチがあった場合、蛍光剤が遊離するという原理に基づいている。この方法では、該ＰＣＲプライマーがＳＮＰタイピング用プライマーとなるが、このプライマーからミスリーディングした場合、その産物はさらにタイピング用プライマーの鋳型となってしまう。したがって、ＰＣＲ法を利用する限り、根底となる問題は依然解決されず、さらに検出法に蛍光偏光を用いた場合には再現性が劣るため、増幅産物を精製して蛍光分析するという煩雑性がある。
【００１２】
我々は、近年開発された遺伝子増幅法であるＬＡＭＰ（ Loop−mediated isothermal amplification ）法を利用したＳＮＰタイピング法を開発した（特許文献２、非特許文献３）。これらの方法は、ＬＡＭＰ用に設計された対立遺伝子特異的プライマーを使用し、熱処理した血液検体からでも直接鋳型として検出することが可能であり、検体を採取してから３０分程度で結果が得られるという簡易かつ迅速な方法である。しかし、対立遺伝子特異的プライマーの塩基配列の選定には多くの検討を要することから、多数のＳＮＰをタイピングする系を確立するのにかなりの時間と労力を要する。
【００１３】
このように、従来のＳＮＰを検出する技術は一長一短があり、精度の維持や経済的な面で解決が望まれていた。
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ０１／０４２４９８号パンフレット
【特許文献２】ＷＯ０１／０３４８３８号パンフレット
【非特許文献１】B. Wegmuller, et al.「 Nucleic Acids Research 」1995年、23巻、2号、p.311-312
【非特許文献２】P. Cahill, et al.「 Genome Res. 」2003年、13巻、p.925-931
【非特許文献３】岩崎匡臣等「 GENOME LETTERS 」2003年、2巻、3号、p.119-126
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、従来のような煩雑な操作を必要とせず、簡単に遺伝子変異を検出できる技術およびそれに用いる試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、上記問題を解決するために鋭意研究を行った結果、Exo-proofreading 活性を利用した、特にＬＡＭＰ法による遺伝子多型の検出法を見出し、本発明を完成させた。本発明は、通常のＬＡＭＰ法で使用されるプライマーに蛍光剤を標識させるだけで、他の特殊なプライマーを必要とせず、また、ＬＡＭＰ法の簡易・迅速性を維持したまま遺伝子変異特にＳＮＰを検出することができる、Exo-proofreading 活性とＬＡＭＰ法の組み合わせによる新規なＳＮＰタイピング法である。 
【００１７】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）以下の工程を含むことを特徴とする核酸試料中の変異を検出する方法。
（ａ）核酸試料中の特定の変異部位を含む標的核酸またはその断片に、増幅用プライマー、変異検出用プライマーおよび少なくとも３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する１種以上の核酸合成酵素を作用させ、前記標的核酸またはその断片を増幅させる工程、
（ｂ）変異検出用プライマーの３’末端に検出剤が標識されている塩基が、標的核酸上の対応する塩基と相補的でなければ、検出剤と共に塩基が遊離し、前記プライマーが伸長する工程、または変異検出用プライマーの３’末端に検出剤が標識されている塩基が、標的核酸上の対応する塩基と相補的であれば、検出剤と共に塩基は遊離せずに、前記プライマーが伸長する工程、
（ｃ）変異検出用プライマーの３’末端の検出剤が標識されている塩基の遊離の有無によって、変異を検出する工程。
（２）増幅用プライマーが、標的核酸またはその断片の、変異部位を含まない塩基配列領域と相補的な塩基配列を有している（１）記載の方法。
（３）増幅用プライマーが、標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という塩基配列領域を選択し、それぞれに相補的な塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＲ３ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列を有することを特徴とする（１）記載の方法。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列、
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列、
（ｃ）標的核酸のＲ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＲ１ｃ領域を有する塩基配列、
（ｄ）標的核酸のＲ３領域を有する塩基配列。
（４）変異検出用プライマーが、変異部位を検出する塩基を３’末端に有し、かつ前記３’末端の塩基が検出剤で標識されている（１）記載の方法。
（５）変異検出用プライマーが、標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という塩基配列領域を選択し、それぞれに相補的な塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＲ３ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ１ｃとしたときに、標的核酸のＦ２ｃ領域とＲ２領域の間の塩基配列と同一または相補的であり、かつ前記プライマーの３’末端の塩基に検出剤が標識されていることを特徴とする（１）または（４）記載の方法。
（６）変異検出用プライマーが、野生型検出用プライマーおよび／または変異型検出用プライマーである請求項１、４または５記載の方法。
（７）核酸試料中の配列特異的塩基を含む標的核酸またはその断片中に、増幅用プライマーおよび核酸合成酵素を作用させ、前記標的核酸またはその断片を増幅し、（４）〜（６）記載の変異検出用プライマーによって、増幅産物中の配列特異的塩基を検出する方法。
（８）核酸合成酵素が、鎖置換型活性を有するＤＮＡポリメラーゼである（１）または（７）記載の方法。
（９）核酸合成酵素が、鎖置換型活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの混合物として使用される（１）または（７）記載の方法。
（１０）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼが、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼまたはＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼからなる群より選ばれる（９）記載の方法。
（１１）標的核酸またはその断片を増幅させる工程が、等温増幅法である（１）または（７）記載の方法。
（１２）等温増幅法が、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法およびＳＤＡ法からなる群より選ばれた（１１）記載の方法。
（１３）検出剤が、蛍光剤である（１）、（４）または（５）記載の方法。
（１４）蛍光剤が、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ、ＲＯＸ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ５、Ｃｙ３または量子ドットからなる群より選ばれる（１３）記載の方法。
（１５）検出工程が、蛍光偏光法、蛍光分光相関法、ポリエチレンイミン分離法、蛍光共鳴エネルギー移動法または表面プラズモン共鳴法からなる群より選ばれる（１）記載の方法。
（１６）変異が、多型である（１）記載の方法。
（１７）多型が、一塩基多型である（１６）記載の方法。
（１８）（１５）記載の検出工程により、変異の有無を検出する方法。
（１９）（１５）記載の検出工程により、一塩基多型が、野生型、変異型もしくはヘテロ型のいずれかを同定する方法。
（２０）増幅用プライマー、変異検出用プライマー、少なくとも３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する１種以上の核酸合成酵素、基質および反応緩衝剤を含むことを特徴とする遺伝子変異の検出用試薬キット。
（２１）増幅用プライマーが、標的核酸またはその断片の、変異部位を含まない塩基配列領域と相補的な塩基配列を有する（２０）記載の試薬キット。
（２２）変異検出用プライマーの３’末端の塩基に蛍光剤が標識されている（２０）記載の試薬キット。
（２３）変異検出用プライマーが、野生型検出用プライマーおよび／または変異型検出用プライマーである（２０）または（２２）記載の試薬キット。
（２４）核酸合成酵素が、鎖置換型活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む（２０）記載の試薬キット。
（２５）核酸合成酵素が、鎖置換型活性を有するＤＮＡポリメラーゼおよび３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの混合物である（２０）記載の試薬キット。
（２６）（２０）記載の試薬キットにより、変異の有無を検出する方法。
（２７）（２０）記載の試薬キットにより、一塩基多型が、野生型、変異型もしくはヘテロ型のいずれかを同定する方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、Exo-proofreading 活性をＬＡＭＰ法に利用して、核酸試料に含まれる遺伝子変異の検出を可能にする方法であり、それにより個体の遺伝子変異の有無を、あるいは変異が多型の場合は、個体の遺伝子型が、野生型か変異型かあるいはヘテロ型を判定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明において使用される「核酸試料」とは、動植物例えばヒトや家畜の遺伝子等の内在性のＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸を含む生体試料や、細菌あるいはウイルスを含む微生物等の外来性の核酸を含む試料であり、血液、頭髪、細胞組織、汗、尿・糞等の排泄物、培養物等が挙げられる。また、部分的にあるいは完全に人工的の合成された核酸も本発明の核酸試料に含まれる。
【００２０】
本発明における「変異」とは、体細胞変異のみならず多型も含み、塩基配列のある部位において、個体間または個体内で２種以上の塩基が存在することをいい、一方を野生型、それとは異なる塩基を有するものを変異型という。そして、核酸の組合せにおいて、ある特定の塩基が相補的でない場合は、「ミスマッチ」という。
【００２１】
本発明において使用される「核酸試料」中の「変異」を含む標的核酸は、目的の配列情報を担う「変異」部位を含むものであれば、特に限定されず、例えば、特定遺伝子のエキソン、イントロンまたはプロモーターやゲノム配列等が挙げられる。
【００２２】
本発明の「 Exo-proofreading 活性 」とは、核酸増幅過程におけるＤＮＡポリメラーゼの有する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性による校正機能であり、合成または増幅工程途中において、ミスマッチが起きた場合、ＤＮＡポリメラーゼのもつエキソヌクレアーゼ活性が、３’側からそのミスマッチ部分を取り除き、再び増幅を開始させる。
【００２３】
本発明における核酸増幅法には、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法等の等温増幅法が挙げられるが、特にＬＡＭＰ法が好適である。「ＬＡＭＰ法」は、本発明者らが開発した技術であり、鋳型となるヌクレオチドに自身の３’末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とすると共に、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、ＬＡＭＰ法では、プライマーの３’末端が常に試料に由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能する。その結果、特異性の高い遺伝子配列の増幅反応を可能となる。
【００２４】
ＬＡＭＰ法で使用される「増幅用プライマー」は、鋳型核酸の塩基配列上の計６領域の塩基配列を認識する少なくとも４種類のオリゴヌクレオチドからなるプライマー（「インナープライマーＦ」、「インナープライマーＲ」、「アウタープライマーＦ」および「アウタープライマーＲ」）が使用されるが、増幅反応の進行に伴い、自己を鋳型としながら合成起点となる３’末端を有した、両端にそれぞれループ構造を有することを特徴とするダンベル型のヌクレオチドが形成される。そして、さらに、このダンベル構造の５’末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマー（「ループプライマー」）を用いた場合、核酸合成の起点が増え、反応時間の短縮と検出感度の上昇を図ることができる。
【００２５】
ここで、「増幅用プライマー」の塩基配列は、標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＲ３ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ１ｃとしたときに、インナープライマーＦは「５’−Ｆ１ｃ−Ｆ２−３’」、インナープライマーＲは「５’−Ｒ１ｃ−Ｒ２−３’」、アウタープライマーＦは「５’−Ｆ３−３’」、そしてアウタープライマーＲは「５’−Ｒ３−３’」となる。
【００２６】
本発明において、例えば、ＬＡＭＰ法によってＳＮＰを検出する場合、前出の「ダンベル型」ヌクレオチドのループ構造またはステム構造を構成する塩基配列の領域に、ＳＮＰとして検出されるようにプライマーを設計する。すなわち、このプライマーにＳＮＰ検出用の塩基を挿入する。そして、このＳＮＰ検出用の塩基を挿入されたプライマーを「変異検出用プライマー」と呼ぶ。
【００２７】
本発明で使用される「変異検出用プライマー」は、「野生型検出用プライマー」または「変異型検出用プライマー」を意味し、「野生型検出用プライマー」とは、野生型の一塩基多型を含む塩基配列にアニールすることができ、かつ少なくとも３’末端の塩基が対応する野生型核酸の塩基と相補的な塩基を有するプライマーであり、また、「変異型検出用プライマー」とは、「野生型検出用プライマー」の少なくと３’末端の塩基のみが対応する野生型核酸の塩基と相補的でない塩基を有するプライマーである。
【００２８】
そして、「野生型検出用プライマー」と「変異型検出用プライマー」は、いずれもの３’末端の塩基に蛍光剤が標識されており、前記蛍光剤の種類としては、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ、ＲＯＸ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ５、Ｃｙ３または量子ドット等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００２９】
ＬＡＭＰ法による増幅反応には、 Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ等の鎖置換型活性を有するＤＮＡ合成酵素が必要であるが、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼは、 Exo-proofreading に必要な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が存在しないため、 Exo-proofreading 反応と増幅反応と同時に行うためには、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性のあるＤＮＡ合成酵素を共存させる必要がある。本発明で使用するＬＡＭＰ法においては、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼが好適であるが、予め３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ合成酵素、例えば、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼまたはＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ等の中からスクリーニングし、好適なＤＮＡ合成酵素を適宜選択することが望ましい。また、鎖置換型のＤＮＡ合成酵素のうち、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼであれば、１種類の酵素を使用しても構わない。
【００３０】
Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼと Exo-proofreading 活性の高いＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼの２種類のＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼは、３’末端の塩基が標識されている変異検出用プライマーからはほとんど伸長反応を行うことができず、変異検出用プライマーからの伸長反応はほとんどＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼで行われるため、ミスリーディングの確率は非常に低いという利点がある。
【００３１】
ここで、Exo-proofreading によるＳＮＰタイピングの原理を図１に示す。変異検出用プライマーは、３’末端の塩基のＮ部位が検出剤で標識されており、ＤＮＡポリメラーゼを作用させると伸長反応が起こるが、該プライマーの３’末端の塩基が、鋳型ＤＮＡ上の塩基とミスマッチの場合には、ＤＮＡポリメラーゼの Exo-proofreading 活性（すなわち３’−５’エキソヌクレアーゼ活性による修復機構）により、該プライマーの３’末端の塩基が検出剤と共に切り出されるため、検出剤が標識されたヌクレオチドが遊離し、その結果、検出剤を含まないＤＮＡが合成されることになる。一方、該プライマーの３’末端がマッチする塩基であれば修復機構は働かないため、検出剤が標識されたヌクレオチドは遊離せず、検出剤を含んだＤＮＡが合成されることになる。
【００３２】
さらに、Exo-proofreadingによるＳＮＰタイピングをＬＡＭＰ法に適用させた場合の原理図を図２に示す。図２に示す通り、例えば、ＳＮＰ（図中★印）部分が、ループ領域に存在できるようにプライマー配列を設計する。
【００３３】
本発明における増幅産物の検出は、ＬＡＭＰ法の簡易性を生かすために、均一系の検出が可能な蛍光偏光法が好適であるが、例えば、蛍光分光相関法、ポリエチレンイミン分離法、蛍光共鳴エネルギー移動法または表面プラズモン共鳴法等の他の核酸増幅検出法も適用可能である。蛍光偏光の数値は、その蛍光物質を含む分子の分子量を反映しているため、プライマーの３’末端に蛍光標識された塩基が、伸長したＤＮＡに含まれているか、あるいは含まれてないかで判定できることになる。すなわち、鋳型がミスマッチの場合には、プライマーの蛍光剤は遊離するため、反応終了後の溶液には、「未反応の蛍光標識プライマー」と「（遊離した）蛍光標識された塩基」が含まれており、 「未反応の蛍光標識プライマー」しか含まない陰性対照（ Negative Control；以下「ＮＣ」と省略)と比較すると蛍光偏光は同程度または小さくなる。一方、マッチした場合には、「未反応の蛍光標識プライマー」と「蛍光剤をＤＮＡ上に含む合成ＤＮＡ」とが含まれているため、ＮＣと比較すると蛍光偏光が大きくなる。
【実施例】
【００３４】
Exo-proofreading とＬＡＭＰ法を組み合わせたＳＮＰタイピング法を検証するするために、モデルとして、ヒトのアルコール代謝と密接な関係に関連するアセトアルデヒド脱水素酵素（以下「ＡＬＤＨ２」と省略）遺伝子のｅｘｏｎ１２に存在するＳＮＰをターゲットとした検出法を検討した。以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００３５】
実施例１．プラスミドを鋳型としたＬＡＭＰ法によるＳＮＰｓの検出
（１）プラスミドＤＮＡ試料の調製
ＡＬＤＨ２*１遺伝子はヒトゲノムを鋳型としてＰＣＲ法によって増幅し、pBluescript ＩＩ にクローニングした。ＡＬＤＨ２*２遺伝子は、ＡＬＤＨ２*１遺伝子をもとに、site-directed mutagenesis により作製した。
（２）プライマーの合成
ＬＡＭＰ用プライマーとして、（配列番号１）で示される塩基配列から選ばれた塩基配列、またはそれと相補的な配列から選ばれた塩基配列として、以下の５種類のプライマーを設計した。また、タイピング用プライマーとして２種類を設計した。プライマーの合成は、ＤＮＡ合成を専門に取り扱う機関に委託した。なお、野生型または変異型をタイピングするプライマーの３’末端の塩基には、各々蛍光物質ＴＡＭＲＡが塩基標識されている。
・ＬＡＭＰ用プライマー
インナープライマーＦ：5'-CCCCCAGCAGGCTGCAGGCATACACT-3'     （配列番号２）
インナープライマーＲ：5'-CTGTTGGGGCTCAACAGACCCCAATCC-3'    （配列番号３）
アウタープライマーＦ：5'-GGAGTTGGGCGAGT-3'                 （配列番号４）
アウタープライマーＲ：5'-TCCTGAACCTCTGGC-3'                （配列番号５）
ループプライマー  Ｒ：5'-TCTGCTGGTGGCTC-3'                 （配列番号６）
・タイピング用プライマー
Ｗ（１５）Ｔ（野生型）：5'-CACAGTTTTCACTT*-3'(*：dC-TAMRA)      （配列番号７）
Ｍ（１５）Ｔ（変異型）：5'-CACAGTTTTCACTT*-3'(*：dT-TAMRA)      （配列番号８）
ここで、図３にＡＬＤＨ２遺伝子のＳＮＰを検出するためのプライマー設計の概念図を示すが、図中★印で示したＳＮＰ塩基は、ＡＬＤＨ２*１ではＧ、ＡＬＤＨ２*２ではＡとなる。したがって、ＡＬＤＨ２*１にマッチするプライマーはＷ（１５）Ｔで、ＡＬＤＨ２*２マッチするプライマーはＭ（１５）Ｔとなる。
（３）試薬組成及び濃度
ＬＡＭＰ最終反応溶液２５μＬ中の各試薬濃度が下記になるよう調整した。
・２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ ｐＨ８．８ ）
・１０ｍＭ ＫＣｌ
・  ４ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4
・  ４ｍＭ ＭｇＳＯ4
・０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
・０．４ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ
・０．６Ｍ Ｂｅｔａｉｎ
・  ８Ｕ   Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ( New England Biolab 社 )
・  ２Ｕ   Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ( New England Biolab 社 )
・  １ｎｇ 鋳型核酸
・ＬＡＭＰ用プライマー
１．６μＭ インナープライマーＦ（配列番号２）及びＲ（配列番号３）
０．２μＭ アウタープライマーＦ（配列番号４）及びＲ（配列番号５）
０．８μＭ ループプライマー  Ｒ（配列番号６）
・タイピング用プライマー
０．８μＭ Ｗ（１５）Ｔ（配列番号７）またはＭ（１５）Ｔ（配列番号８）
（４）ＬＡＭＰ法による反応
０．２ｍＬの専用チューブに、（１）で作製した鋳型核酸すなわちＡＬＤＨ２*１（Ｇ）遺伝子、ＡＬＤＨ２*２（Ａ）遺伝子、そしてＡＬＤＨ２*１（Ｇ）遺伝子とＡＬＤＨ２*２（Ａ）遺伝子両方を１：１で混在したもの（Ｇ／Ａ）を各々８サンプルずつ、ＬＡＭＰ反応溶液２５μＬと共に加え、リアルタイム濁度検出装置ＬＡ−２００（ テラメックス社製 ）で６０℃で３０分間インキュベーションし、ＬＡＭＰ反応を行った。次いで、反応を終了させるために８０℃で５分間加熱処理を行った。なお、鋳型核酸を添加しないものをＮＣ（陰性対照）とした。
（５）蛍光偏光による検出法
ＬＡＭＰ反応終了液に各反応液にメタノール８μＬを添加したものを、３８４穴のプレートに移し、ＰＯＬＡＲＩＯＮ（ TECAN 社 ）を用い、５３０〜５９４ｎｍにおける蛍光偏光度を測定した。
【００３６】
その結果を図４および図５に示す。図４は、各タイピング用プライマーを用いて、各鋳型核酸の増幅産物の蛍光偏光度を測定した結果である。タイピング用プライマーとしてＷ（１５）Ｔ（Ｇ検出用プライマー）を用いて、Ｇ、Ａを鋳型として測定した結果は、それぞれ１４６±１０．２、１６±５．８でであり、Ｍ（１５）Ｔ（Ａ検出用プライマー）を用いて、Ｇ、Ａを鋳型として測定した結果は、それぞれ２１±８．３、１２１±６．３であった。また、ＧとＡの混合物を鋳型にした場合、Ｇ検出用では１２７±７．４、Ａ検出用では９３±６．７であり、再現性よくＳＮＰの検出が可能であった。図５は、図４で、各鋳型核酸において、Ｇ検出用プライマーとＡ検出用プライマーから得たれた蛍光偏光度を、ＮＣで規格化（ＮＣに対する比）し、さらに各プライマーの比率したものである。その結果、算出された値からカットオフ値は、野生型（Ｇ／Ｇ）は０．５未満、ヘテロ型（Ｇ／Ａ）は０．５以上１．５未満、変異型（Ａ／Ａ）は１．５以上と決定した。なお、カットオフ値の設定理由は、ＡＬＤＨ２*１を鋳型にした場合、Ａ検出用プライマーで測定した蛍光偏光度は、Ｇ検出用プライマーで測定した蛍光偏光度の１／２以下であり、ＡＬＤＨ２*２を鋳型にした場合には、２倍以上であり、また、ＡＬＤＨ２*１とＡＬＤＨ２*２の混合物を鋳型にした場合には、ほぼ同等であったことによる。
【００３７】
実施例２．ヒトゲノムＤＮＡを鋳型としたＬＡＭＰ法によるＳＮＰの検出
（１）ヒトゲノム遺伝子の調製
インフォームドコンセントに同意した健常人ボランティアから集められた頭髪サンプルからヒトゲノムＤＮＡを抽出・精製した。なお、ＤＮＡの抽出は、ＩＳＯＨＡＩＲ ＤＮＡ 抽出キット（ NIPPON GENE 社製 ）を使用し、キットに添付されたプロトコールに基づいて実施した。
（２）プライマーの合成
実施例１．（２）と同様に実施した。
（３）試薬組成及び濃度
実施例１．（３）のプラスミドＤＮＡの代わりに、ヒトゲノムＤＮＡを用いた。その他は、同様に実施した。
（４）ＬＡＭＰ法による反応
ヒトゲノムＤＮＡ １ｎｇについて、実施例１．（４）と同様にＬＡＭＰ反応を実施した。
（５）蛍光偏光による検出法
実施例１．（５）と同様に実施した。
【００３８】
その結果を図６および図７に示す。図６は、各タイピング用プライマーを用いて、各ボランティアのヒトゲノムの増幅産物の蛍光偏光度を測定した結果である。また、図７は、実施例１．同様に、蛍光偏光度をＮＣで規格化し、比率を求めたものである。実施例１．で設定したカットオフ値から変異型、ヘテロ型または変異型を判定すると、Ｎｏ１．および４はヘテロ型（Ｇ／Ａ）、Ｎｏ．２は野生型（Ｇ／Ｇ）、Ｎｏ．３（Ａ／Ａ）は変異型と判定された。
【００３９】
比較例  ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法との比較
従来法Ｃｈａｏ等の方法（ Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ、「ＨＥＰＡＴＯＬＯＧＹ」、２５巻、ｐ１１２、１９９７年 ）によるＡＬＤＨ２遺伝子のタイピングを実施した。ヒトゲノムＤＮＡを、ポリメラーゼ（ TaKaRa ExTaq ）を用い、キットに添付されたプロトコールに基づいて増幅した。すなわち、ゲノム試料４０ｎｇ含むＰＣＲ反応液２５μＬを作製し、熱変性９４℃で１分、アニーリング５１℃で３分、ポリメラーゼ伸長反応７２℃で１分を１サイクルとして計３０サイクルの条件で、行った。反応装置は、MJ Research PTC-200 Thermocycler（ MJ Research 社製 ）を使用した。反応終了後、ＰＣＲ増幅産物のうち２μＬ、３７℃で１時間、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、４％アガロースゲル電気泳動を行い、反応産物の確認を行った。なお、バンドの蛍光染色は、ＳＹＢＲ-ＧｒｅｅｎIを用いた。
【００４０】
その結果を表１に示すが、実施例２．で得られた結果は、比較例と完全に一致していた。このことより、本発明は、ＳＮＰタイピング法の一つとして有効と判断される。
【００４１】
【表１】
2006141255.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００４２】
以上のように、本発明は、遺伝子変異を検出する場合において、従来のような煩雑な操作を必要とせず、簡単で、特異的に、変異を検出できる技術およびそれに用いる試薬を提供することによって、個体の遺伝子が、野生型か変異型かあるいはヘテロ型を判定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】Exo-proofreading によるＳＮＰタイピングの原理図である。
【図２】Exo-proofreading によるＳＮＰタイピングをＬＡＭＰ法に適用させた場合の原理図である。
【図３】ＡＬＤＨ２遺伝子のＳＮＰを検出するためのプライマー設計の概念図である。
【図４】クローン化したＡＬＤＨ２遺伝子を鋳型として、 Exo-proofreading ＬＡＭＰ反応を行った後の増幅産物の蛍光偏光度を測定したグラフである。
【図５】遺伝子型のカットオフ値を決定するためのグラフである。
【図６】ＡＬＤＨ２遺伝子タイピングを、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、 Exo-proofreading ＬＡＭＰ反応を行った後の増幅産物の蛍光偏光度を測定したグラフである。
【図７】ヒトゲノムＤＮＡの遺伝子型を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2006141255.tif 000008
【図７】
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【配列表】
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