(57)【要約】【課題】光学活性２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３‐フェニル‐プロパン酸骨格を持つ化合物は各種医薬化合物の中間体として有用な物質である。その合成法としてはこれまでに光学分割法、光学活性化合物を用いて化学的に不斉合成する方法、２‐クロロ‐２‐ベンゾイル酢酸エステルを微生物で不斉還元する方法などが知られている。しかし、それらは反応条件、収率、製造コストなどの面で問題があり、光学活性２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３‐フェニル‐プロパン酸骨格を持つ化合物の新たな製造法が求められていた。【解決手段】２‐クロロ‐３‐オキソ‐３‐フェニル‐プロパン酸アニリドをピキア属に属す菌体に接触させることにより、光学活性な２‐クロロ‐３‐ヒドロシキル‐３、Ｎ‐ジフェニル‐プロパン酸アミドを製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2006232788.tif 000008
（式中、Ｒ1、Ｒ2は同一か異なっていてもよく、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子または水素原子を表し、２位がＳの配置であり、３位がＲの配置を示す。）で示される光学活性な２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３、Ｎ‐ジフェニル‐プロパン酸アミド。
【請求項２】
Ｒ1、Ｒ2がともに水素原子である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
一般式（２）
【化２】
2006232788.tif 000009
（式中、Ｒ1、Ｒ2は同一か異なっていてもよく、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子または水素原子を表わす。）で示される化合物をピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属す菌体に接触させて還元することを特徴とする請求項１に記載の化合物の製造法。
【請求項４】
使用する微生物がピキア属ミヌタ種（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｍｉｎｕｔａ）である請求項３に記載の製造法。
【請求項５】
使用する微生物がピキア属ミヌタ種（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｍｉｎｕｔａ）ＮＢＲＣ  Ｎｏ．０９７５である請求項４に記載の製造法。
【請求項６】
Ｒ1、Ｒ2がともに水素原子である請求項３〜５のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物を低級アルコール中で塩化水素ガスを吹き込み反応させて得られる下記一般式（３）で示される光学活性な２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３‐フェニル‐プロパン酸エステルの製造法。
【化３】
2006232788.tif 000010
（式中、Ｒ1は、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子または水素原子を表し、Ｒ3は低級アルキル基を示し、２位がＳの配置であり、３位がＲの配置を示す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
光学活性な２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３，Ｎ‐ジフェニル‐プロパン酸アミドの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３‐フェニル‐プロパン酸骨格を持つ化合物は各種医薬化合物の中間体として有用な物質である。
【０００３】
光学活性２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３‐フェニル‐プロパン酸骨格を持つ化合物の合成法としては不斉化学合成法と生化学反応を利用する方法が知られている。不斉化学合成法としては、特許文献１に、光学活性なＮ‐アセチルオキサゾリジノンとベンズアルデヒドとの反応により光学活性な２‐ハロゲノ‐３‐ヒドロキシル‐３‐フェニル‐プロパン酸アミドを合成する方法が記載されている。
また非特許文献１には、光学活性なＮ‐アセチルオキサゾリジンチオンとベンズアルデヒドとの反応により、光学活性な２‐ハロゲノ‐３‐ヒドロキシル‐３‐フェニル‐プロパン酸アミドを合成する方法が記載されている。
特許文献２には、ジホスフィン化合物を配位子とする遷移金属錯体により２‐クロロ‐３‐オキソ‐３‐フェニル‐プロパン酸エステルを不斉水素化し２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３‐フェニル‐プロパン酸エステルを得ることが出来る旨が記載されている。
【０００４】
生化学反応を利用する方法としては酵素法と微生物還元法が知られている。特許文献３には、ｓｙｎ体の２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３‐フェニル‐プロパン酸エステルをリパーゼで立体選択的に加水分解し光学活性な２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３‐フェニル‐プロパン酸を得ることが出来る旨が記載されている。特許文献４には、２‐クロロ‐３‐オキソ‐３‐フェニル‐プロパン酸エステルを例えばカンジダ属に属する微生物によりに接触させることにより光学活性な２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３‐フェニル‐プロパン酸エステルを合成する方法が開示されている。
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−７６６８号公報
【特許文献２】特開２００４−１９６７９３号公報
【特許文献３】特表２０００−５１０８３２号公報
【特許文献４】特開平３−２７２６９１号公報
【非特許文献１】Ｙｉｎｇ−Ｃｈｕａｎ、テトラへドロン：アシンメトリ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）、イギリス、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｌｃ．１９９９年１０巻３２４９−３２５１頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
不斉化学合成では高価な光学活性試薬や不斉触媒、低温反応装置、高圧反応装置などを使用しなければならない。また、多くの場合、不斉化学合成方法、生化学的方法ともに収率が低いという問題があり、温和な条件下安価に収率良く２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３‐フェニル‐プロパン酸骨格を持つ化合物を製造する方法が望まれている。特許文献４では、２‐クロロ‐３‐オキソ‐３‐フェニル‐プロパン酸エステルが微生物のエステラーゼ等により加水分解されそれに引き続き脱炭酸反応が起きてしまうため、収量が低下してしまうという欠点がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意研究の結果、２‐クロロ‐３‐オキソ‐３‐フェニル‐プロパン酸アニリドをピキア属の菌体に接触させることにより、光学活性な２‐（Ｓ）‐クロロ‐３‐(Ｒ)‐ヒドロキシル‐３、Ｎ‐ジフェニル‐プロパン酸アミドを得て、さらに、アルコール中で反応させることにより２‐（Ｓ）‐クロロ‐３‐(Ｒ)‐ヒドロキシル‐３‐フェニル‐プロパン酸エステルが得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、
【０００８】
（１）一般式（１）
【０００９】
【化１】
2006232788.tif 000002
【００１０】
（式中、Ｒ1、Ｒ2は同一か異なっていてもよく、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子または水素原子を表し、２位がＳの配置であり、３位がＲの配置を示す。）で示される光学活性な２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３、Ｎ‐ジフェニル‐プロパン酸アミド、
（２）Ｒ1、Ｒ2がともに水素原子である前項（１）に記載の化合物、
（３）一般式（２）
【００１１】
【化２】
2006232788.tif 000003
【００１２】
（式中、Ｒ1、Ｒ2は同一か異なっていてもよく、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子または水素原子を表わす。）で示される化合物をピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属す菌体に接触させて還元することを特徴とする前項（１）に記載の化合物の製造法、
（４）使用する微生物がピキア属ミヌタ種（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｍｉｎｕｔａ）である前項（３）に記載の製造法、
（５）使用する微生物がピキア属ミヌタ種（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｍｉｎｕｔａ）ＮＢＲＣ  Ｎｏ．０９７５である前項（４）に記載の製造法、
（６）Ｒ1、Ｒ2がともに水素原子である前項（３）〜（５）のいずれか一項に記載の製造法、
（７）前項（１）に記載の化合物を低級アルコール中で塩化水素ガスを吹き込み反応させて得られる下記一般式（３）で示される光学活性な２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３‐フェニル‐プロパン酸エステルの製造法、
【００１３】
【化３】
2006232788.tif 000004
【００１４】
（式中、Ｒ1は、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子または水素原子を表し、Ｒ3は低級アルキル基を示し、２位がＳの配置であり、３位がＲの配置を示す。）
に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のピキア属に属す菌体を用いる方法は、温和な条件下、高価な不斉試薬を使用せず収率よく高純度の光学活性な２‐（Ｓ）‐クロロ‐３‐(Ｒ)‐ヒドロキシル‐３、Ｎ‐ジフェニル‐プロパン酸アミドおよび２‐（Ｓ）‐クロロ‐３‐(Ｒ)‐ヒドロキシル‐３‐フェニル‐プロパン酸エステルを製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
式（１）及び式（２）のＲ1およびＲ2は低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子または水素原子を表す。低級アルキル基とは炭素数１〜４のアルキル基が挙げられ、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ターシャリーブチル基などが挙げられる。低級アルコキシ基とは、炭素数１〜４のアルキル基が挙げられ、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、シクロプロポキシ基、ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、ターシャリーブチルオキシ基などが挙げられる。ハロゲン原子としてはフッ素、塩素、臭素が挙げられる。
また、式（３）のＲ3における低級アルキル基とは、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐のアルキル基を表し、例えば、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等が挙げられる。
【００１７】
前記一般式（１）で表される本発明化合物の製造法を下記に示す。
一般式（２）で表される２‐クロロ‐３‐オキソ‐３‐フェニル‐プロパン酸アニリドは、下記一般式（４）で示される２‐ベンゾイル酢酸アニリドを塩化スルフリルやＮ‐クロロフタルイミドなどの塩素化剤でクロル化して得られる（参考例１を参照）。Ｒ1、Ｒ2がともに水素である２‐ベンゾイル酢酸アニリドは東京化成より購入できる。またはそれ以外の式（４）で表される２‐ベンゾイル酢酸アニリドはオーガニック・シンセシス（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）１９６３年４巻４１５頁に記載の製造法で所望の２‐ベンゾイル酢酸エステルを合成し、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー１９９１年５６巻１７１３−１７１８頁に記載の製造法でアニリンと反応させ得ることが出来る。
【００１８】
【化４】
2006232788.tif 000005
【００１９】
（式中、Ｒ1、Ｒ2は同一か異なっていてもよく、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子または水素原子を表す。）
【００２０】
次いで本発明によれば、一般式（２）で表される２‐クロロ‐３‐オキソ‐３‐フェニル‐プロパン酸アニリドをピキア属に属す微生物の培養液、菌体、菌体処理物を接触させることにより前記式（１）で表される光学活性２‐（Ｓ）‐クロロ‐３‐(Ｒ)‐ヒドロキシル‐３、Ｎ‐ジフェニル‐プロパン酸アミドを製造することができる。本発明において使用される微生物は一般式（２）で表される２‐クロロ‐３‐オキソ‐３‐フェニル‐プロパン酸アニリドを還元するピキア属に属す微生物であれば特に限定されないが、例えばＰｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｍｉｎｕｔａ（ピキア  ミヌタ  バー  ミヌタ）  ＮＢＲＣ  Ｎｏ．０９７５が挙げられる。該菌株は独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門から入手することが出来る。また、使用する菌株は、それらの野生株や変異株であってもよく、更にはこれらの微生物から遺伝子組換え、細胞融合などの生物工学的手法により誘導されたものであってもよい。
【００２１】
微生物の培養手段は増殖可能なら特に限定されず一般的な培養方法を用いればよい。例えば、炭素源としてはグルコース、フラクトース、ラクトース、マルトース、シュークロース等の糖類、グルタミン酸、スレオニン等のアミノ酸類、あるいはフマル酸、リンゴ酸、コハク酸の有機酸、もしくはグリセリンなどが使用できる。窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素などが使用できる。有機栄養源として酵母エキス、トリプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、麦芽エキスなどが使用できる。そして無機塩として塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素カリウムなどを含み、ｐＨ３〜８好ましくはｐＨ４〜７に調製した培地に微生物を接種し、常温ないしは加温下、好ましくは２０〜４０℃で培養すればよい。また、かかる微生物菌体の処理物としては凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体などが挙げられる。さらに微生物菌体あるいは菌体処理物を公知の方法により固定化して使用することもできる。
【００２２】
本発明の微生物を用いた不斉還元反応に使用できる反応溶媒は水溶液、もしくは非水溶性の有機溶剤と水溶液の二相系溶媒を用いることが可能である。一般式（２）で表される２‐クロロ‐３‐オキソ‐３‐フェニル‐プロパン酸アニリドは０．０５％〜１０％加えることが可能である。添加方法は一度に加えてもよいし逐次添加をしてもよい。一般式（２）で表される２‐クロロ‐３‐オキソ‐３‐フェニル‐プロパン酸アニリドの溶解補助剤としジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エタノール、メタノールなどの使用も可能である。また、微生物不斉還元反応の副反応である脱クロル化を押さえるために、１‐クロロ‐酢酸エチルなどを加えることも可能である。反応終了後、トルエン、ジクロロメタン、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒の濃縮、再結晶、クロマトグラフィーなどにより立体選択的に一般式（１）で表される２‐（Ｓ）‐クロロ‐３‐(Ｒ)‐ヒドロキシル‐３、Ｎ‐ジフェニル‐プロパン酸アミドを取得することが出来る。
【００２３】
【化５】
2006232788.tif 000006
【００２４】
（式中、Ｒ1、Ｒ2は同一か異なっていてもよく、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子または水素原子を表し、式（１）において、２位がＳの配置であり、３位がＲの配置を示す。）
【００２５】
一般式（１）で表される２‐（Ｓ）‐クロロ‐３‐(Ｒ)‐ヒドロキシル‐３、Ｎ‐ジフェニル‐プロパン酸アミドは、低級アルコール中で塩化水素ガス通気下５〜１００時間還流または８５℃〜２４０℃で反応させることで立体構造を保持したままアミド体から下記式（３）で表されるエステル体に変換することが出来る。
低級アルコールとしては、直鎖もしくは分岐の炭素数２〜８のアルコール例えばエタノール、プロパノール、ブタノール、イソブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、へプタノール、オクタノールなどが挙げられる。
【００２６】
【化６】
2006232788.tif 000007
【００２７】
（式中、Ｒ1は、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子または水素原子を表し、Ｒ3は低級アルキル基を示し、２位がＳの配置であり、３位がＲの配置を示す。）
【実施例】
【００２８】
以下に実施例および参考例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例において部は重量部を、％は重量％をそれぞれ意味する。
【００２９】
参考例１
２‐クロロ‐３‐オキソ‐３‐フェニル‐プロパン酸アニリド（式（２）の化合物）の製造
２−ベンゾイル酢酸アニリド１０ｇをテトラヒドロフラン１００ｍｌに溶解し、氷冷下塩化スルフリル５．６４ｇを滴下した。滴下終了後室温に戻し１８時間反応させた。これを減圧濃縮し２‐クロロ‐３‐オキソ‐３‐フェニル‐プロパン酸アニリド（白色結晶）  １１．２ｇを得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3、δ）５．８１（１Ｈ，ｓ）、７．１７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）７．３５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、７．６６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、８．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）８．３４（１Ｈ，ｂｓ）
【００３０】
実施例１
２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３、Ｎ‐ジフェニル‐プロパン酸アミド（式（１）の化合物）の製造
酵母エキス２．５ｇ、大豆ペプトン２．５ｇ、麦芽エキス５ｇ、グルコース１０ｇを水５００ｍｌに溶解し６Ｎ−塩酸水溶液でｐＨ６．０に調製した。これを直径２１ｍｍの試験管１０本に１０ｍｌ分注し、１２０℃で２０分間滅菌した。この培地にＰｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ  ＮＢＲＣ  Ｎｏ．０９７５を１白金耳接種し、２７℃２２０ｒｐｍで４１時間振盪培養した。その培養液にそれぞれ１０％グルコースを１００μＬずつ添加しさらに２時間培養を継続した。その１０本の培養液にそれぞれ１０ｍｇの２‐クロロ‐３‐オキソ‐３‐フェニル‐プロパン酸アニリドを含むジメチルスルホキシド１００μｌを添加し、２７℃２２０ｒｐｍで２４時間振盪反応させた。この反応液を集めて酢酸エチル１２０ｍｌで２回抽出し有機層を合わせて水で３回洗浄、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ろ過、減圧濃縮した。得られた結晶を高速液体クロマトグラフィーにより定量した。分析条件は、カラムがジーエルサイエンス株式会社製のＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、移動相はアセトニトリル：水＝４５：５５を用い、流速０．８ｍｌ／分、カラム温度３５℃で行なった（リテンションタイム：２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３、Ｎ‐ジフェニル‐プロパン酸アミド  ｓｙｎ体１３．６分、ａｎｔｉ体１７．３分）。２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３、Ｎ‐ジフェニル‐プロパン酸アミドの生成量は６６ｍｇ（収率６５．５％）であった。さらに薄層クロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３、Ｎ‐ジフェニル‐プロパン酸アミド５８ｍｇ（収率５７．６％）を単離しＮＭＲ測定した。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3、δ）３．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）、４．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ）、５．４８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）７．１５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）７．２５−７．４８（９Ｈ，ｍ）８．３０（１Ｈ，ｓ）
この単離した２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３、Ｎ‐ジフェニル‐プロパン酸アミドを高速液体クロマトグラフィーで光学純度の分析したところ、２Ｓ，３Ｒ体９７．６％ｅｅ、ｓｙｎ体：９０．９％ｄｅであった。ｓｙｎの定義はアンゲバンテ・へミー・インターナショナル・エディション・イン・イングリッシュ（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．）１９巻、５５７〜５５８頁（１９８０年）の記載のＳａｔｏｒｕ  Ｍａｓａｍｕｎｅらに従った。絶対配置分析条件は、カラムはダイセル化学工業株式会社製のキラルセルＯＤ−Ｈ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、移動相はｎ−ヘキサン：イソプロパノール＝９：１を用い、流速１．０ｍｌ／分、カラム温度３５℃で行なった（リテンションタイム：２Ｒ，３Ｒ体７．８分、２Ｓ，３Ｓ体９．１分、２Ｓ，３Ｒ体９．９分、２Ｒ，３Ｓ体１０．９分）。
【００３１】
実施例２
２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３‐フェニル‐プロパン酸ブチルエステル（式（３）の化合物）の合成
実施例１のＰｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ  ＮＢＲＣ  Ｎｏ．０９７５による還元で得られた２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３、Ｎ‐ジフェニル‐プロパン酸アミド２５０ｍｇをｎ−ブタノール５０ｍｌに溶解し、塩化水素ガスを吹き込みながら９時間還流した。室温に戻し、酢酸エチルと水を加え分液抽出し、有機層を水洗、飽和食塩水洗浄し、減圧濃縮し褐色オイル２６２ｍｇを得た。これをシリカゲルカラム（ヘキサン：酢酸エチル＝８５：１５）で精製した。２‐クロロ‐３‐ヒドロキシル‐３‐フェニル‐プロパン酸ブチルエステル２１０ｍｇを得た。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明で得られた２‐クロロ‐３‐ヒドロシキル‐３、Ｎ‐ジフェニル‐プロパン酸アミドは、例えば医薬品であるタキソール側鎖の合成に用いることが出来る。