(57)【要約】【課題】短時間で高い合成量のタンパク質を、安価に得ることができる簡便な無細胞タンパク質合成方法を提供する。【解決手段】昆虫細胞由来の抽出物を用いて無細胞タンパク質合成を行う方法であって、合成反応を維持する間に、半透性膜を通過しうる成分を半透性膜を介して除去することによって連続合成を行う、無細胞タンパク質合成方法。前記合成反応を維持する間に、ｍＲＮＡを追加供給することが好ましい。また、前記昆虫が、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ卵細胞由来の樹立培養細胞であることが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫細胞由来の抽出物を用いて無細胞タンパク質合成を行う方法であって、合成反応を維持する間に、半透性膜を通過しうる成分を半透性膜を介して除去することによって連続合成を行う、無細胞タンパク質合成方法。
【請求項２】
前記合成反応を維持する間に、ｍＲＮＡを追加供給する、請求項１に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項３】
前記半透性膜を通過しうる成分には、合成中に形成された減成生成物が含まれる、請求項１又は２に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項４】
前記半透性膜は、透析膜、半透膜、限外濾過膜、限外濾過バリア、化学的又は生物学的に目的物質を捕捉することができるものから選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項５】
前記昆虫が、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ卵細胞由来の樹立培養細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成方法に関する。より詳しくは、本発明は、単位時間当たりのタンパク質合成量を簡便な方法にて向上させることができる合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺伝情報が解読されてきている。このような中、ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応用、利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単に合成することが必要となってくる。
【０００３】
現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって酵母や昆虫細胞などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困難なタンパク質も多い。
【０００４】
一方、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系を試験管内に取り揃え、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させることのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質合成が知られている。このような無細胞系タンパク質合成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合成を行うことができる。さらに無細胞系タンパク質合成では、生命体が利用していないアミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な発現方法であると期待されている。しかしながら、無細胞タンパク質合成系は、細胞系に比べ反応時間が短く、合成量が極めて低いという問題点があった。従来の無細胞タンパク質合成法であるバッチ法が抱えるこの問題を克服するために、さまざまな検討が行われてきた。
【０００５】
例えば、  限外ろ過装置に反応液を入れる方法（フロー法）によってタンパク質の連続合成を可能にしたことが、A.S.Spirin et al., Science, 242, 1162-1164(1988) や特公平７−１１０２３６号公報で報告された。しかしながら、フロー法では装置が大掛かりとなり、コストの点で不利である。
【０００６】
特開２００２−５３９８４０号公報には、透析装置を用いる方法（透析法）による無細胞タンパク質合成法が記載されている。この方法においては、小麦胚芽抽出物を用い、翻訳系及び組合せ転写−翻訳系によってＣＡＴの合成が行われている。さらに、合成中にＭｇ＋及びＮＴＰの濃度を連続的に変化させてＣＡＴの収量を向上させている。しかしながら、この方法において得られたＣＡＴの収量は、翻訳系による合成で１７μｇ／ｍｌ程度、Ｍｇ＋及びＮＴＰの濃度を連続的に変化させた組合せ転写−翻訳系による合成でもせいぜい３２μｇ／ｍｌである。
【０００７】
またその一方で、無細胞系のタンパク質合成に供する細胞破砕液や抽出液として、種々の生物由来のものを使用することが検討され、研究が進められている。この中で、昆虫細胞は、多くの哺乳類系の培養細胞と異なり二酸化炭素雰囲気下での培養を必要とせず、無血清培地においても培養が可能で、また細胞系においては翻訳後修飾により、本来の生物活性を保持しつつ大量発現が可能であることから、様々なタンパク質の発現に用いられている。このような昆虫細胞を無細胞系において利用することが可能となれば、糖鎖付加などの翻訳後修飾も充分に期待できるため、その開発が注目されている。
【０００８】
無細胞系タンパク質合成用の抽出液を調製するための方法として、特開２０００−３２５０７６号公報や特開２００４−２１５６５１号公報などに、昆虫細胞から抽出を行う方法が記載されている。特開２０００−３２５０７６号公報には、不活性ガスの雰囲気中、加圧下の昆虫細胞を減圧させることによって、昆虫細胞を破砕して抽出する方法が記載されている。また、特開２００４−２１５６５１号公報には、より調製が容易であり且つタンパク質合成量の高い昆虫細胞抽出液の調製法として、抽出用液中に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有する、無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液の調製方法が記載されている。そして、そのようにして調整された昆虫細胞抽出液を用いた、バッチ法による無細胞タンパク質合成方法が記載されている。
【０００９】
【非特許文献１】Ａ．Ｓ．スピリン（A.S.Spirin）ら著、「サイエンス（Science）」、第２４２巻、１９８８年、ｐ．１１６２−１１６４
【特許文献１】特公平７−１１０２３６号公報
【特許文献２】特開２００２−５３９８４０号公報
【特許文献３】特開２０００−３２５０７６号公報
【特許文献４】特開２００４−２１５６５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで本発明の目的は、短時間で高い合成量のタンパク質を、安価に得ることができる簡便な無細胞タンパク質合成方法を提供することにある。
【００１１】
本発明には、以下の発明が含まれる。
（１）昆虫細胞由来の抽出物を用いて無細胞タンパク質合成を行う方法であって、合成反応を維持する間に、半透性膜を通過しうる成分を半透性膜を介して除去することによって連続合成を行う、無細胞タンパク質合成方法。
（２）前記合成反応を維持する間に、ｍＲＮＡを追加供給する、（１）に記載の無細胞タンパク質合成方法。
（３）前記半透性膜を通過しうる成分には、合成中に形成された減成生成物が含まれる、（１）又は（２）に記載の無細胞タンパク質合成方法。
（４）前記半透性膜は、透析膜、半透膜、限外濾過膜、限外濾過バリア、化学的又は生物学的に目的物質を捕捉することができるものから選ばれる、（１）〜（３）のいずれかに記載の無細胞タンパク質合成方法。
（５）前記昆虫が、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ卵細胞由来の樹立培養細胞である、（１）〜（４）のいずれかに記載の無細胞タンパク質合成方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、短時間で高い合成量のタンパク質を、安価に得ることができる無細胞タンパク質合成方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、昆虫細胞由来の抽出物を用いた無細胞タンパク質合成方法であって、合成反応中に、半透性膜を通過しうる成分を除去することによってタンパク質の連続合成を行う方法である。本明細書において「タンパク質」とは、オリゴペプチド、ポリペプチドをも含む意味で用いる。
【００１４】
昆虫細胞としては、特に制限はなく、たとえば、鱗翅目、直翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目、甲虫目、脈翅目、半翅目などの昆虫由来の細胞を使用することができる。中でも、培養細胞株が多く樹立されていることから鱗翅目、半翅目などの昆虫由来の細胞が好ましい。また、本発明における昆虫細胞としては、いかなる組織由来の細胞であってもよく、たとえば、血球細胞、生殖巣由来細胞、脂肪体由来細胞、胚由来細胞、孵化幼虫由来細胞などを特に制限なく使用することができる。中でも、タンパク質生産能が高いと考えられる生殖巣由来細胞を使用するのが好ましい。特に、細胞系においてタンパク質合成能が高く、また無血清培地にて培養が可能であることから、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵細胞由来の細胞であるＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）やＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｌｐｅｒｄａ卵巣細胞由来の細胞であるＳｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を昆虫細胞として用いるのが好ましい。
なお本発明においては、単一種の昆虫における単一の組織由来の昆虫細胞に限らず、単一種の昆虫における複数種の組織由来であってよく、複数種の昆虫における単一の組織由来であってもよく、無論、複数種の昆虫における複数種の組織由来であってもよい。
【００１５】
本発明の無細胞タンパク質合成系に用いられる昆虫細胞抽出液の調製方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、特開２００４−２１５６５１号公報に記載の方法、すなわち、抽出用液に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させた後に昆虫細胞を破砕し、抽出を行うという方法を用いることができる。この方法は、緩和な状態で細胞破砕を行うことから無細胞タンパク質合成に必須な成分を破壊することなく細胞外に取り出すことができる点、使用器具などからのＲＮａｓｅなどの混入を防ぐことができる点、界面活性剤などの試薬を用いた細胞破砕の場合に懸念される翻訳反応阻害物質の持込がない点などから、好ましく用いられる。
【００１６】
すなわち、昆虫細胞抽出液としては、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ含有するとともに、１０ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは５０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、１μＭ〜５０ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦ、及び、５ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ４〜１０、好ましくは６．５〜８．５）を含有する水溶液として調製され、好ましくはヌクレアーゼ処理を施されたものを用いると良い。
【００１７】
本発明の無細胞タンパク質合成方法においては、通常、上記昆虫細胞抽出液に、無細胞系でのタンパク質合成に要する添加物を添加することによって調製された反応液を用いる。上記添加物に特に制限はなく、無細胞系のタンパク質合成の分野において従来より一般に使用されているものであれば特に制限はない。
【００１８】
なお上記反応液は、昆虫細胞抽出液が１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有されるように調製されるのが好ましい。すなわち、上記反応液の全体において、昆虫細胞由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、目的のタンパク質の合成速度が低下する虞があるためである。
【００１９】
通常、上記反応液としては、昆虫細胞抽出液を除く成分として、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、外来ｍＲＮＡ、緩衝剤を少なくとも含有するものを用いる。これにより、短時間で大量のタンパク質の合成が可能であるというような利点をさらに有する無細胞系タンパク質合成用の反応液を実現できる。
【００２０】
当該反応液中におけるカリウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ましい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００２１】
当該反応液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、反応液中に１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩が１０ｍＭ未満または５００ｍＭを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２２】
上記マグネシウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００２３】
当該反応液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、反応液中０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２４】
上記ジチオトレイトール（以下、「ＤＴＴ」ということがある。）は、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２５】
当該反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００２６】
当該反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００２７】
当該反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００２８】
当該反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００２９】
当該反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００３０】
当該反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在する昆虫細胞由来のＲＮａｓｅによって、本発明の無細胞系タンパク質合成の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００３１】
当該反応液中における外来ｍＲＮＡにおいては、昆虫細胞に由来しないｍＲＮＡであるならば、コードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、毒性を有するタンパク質をコードするものであってもよいし、また糖タンパク質をコードするものであってもよい。反応液に含有されるｍＲＮＡが外来ｍＲＮＡであるか昆虫細胞に由来するｍＲＮＡであるかは、まず、抽出液中より、ｍＲＮＡを単離精製後、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、既知の外来ｍＲＮＡの塩基配列と比較することで判別することができる。
【００３２】
なお用いる外来ｍＲＮＡは、塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならば外来ｍＲＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各外来ｍＲＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
本発明に用いる外来ｍＲＮＡは、市販のものでもよいし、目的とするタンパク質のＯＲＦ（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を市販のベクター、たとえば、ｐＴＮＴ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）の５’−βグロビンリーダー配列の下流に挿入し、これを用いて転写反応で得られたｍＲＮＡを用いても構わない。また、転写反応の際にメチル化されたリボヌクレオチドなどを加えることにより付加されたキャップ構造を有する外来ｍＲＮＡを用いてもよい。
【００３３】
当該反応液中において、外来ｍＲＮＡ（以下、「ｍＲＮＡ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、５μｇ／ｍＬ〜２０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、２０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｍＲＮＡが５μｇ／ｍＬ未満または２０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００３４】
当該反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００３５】
上記緩衝剤は、反応液に緩衝能を付与し、たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こる反応液のｐＨの急激な変化による抽出物及び/又は反応生成物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝剤としては、特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。
【００３６】
緩衝剤は、当該反応液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６．５〜８．５に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。反応液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を使用するのが特に好ましい。
【００３７】
当該反応液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が５ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こし、抽出物及び/又は反応生成物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００３８】
また上記反応液は、ＥＧＴＡを含有するのが好ましい。ＥＧＴＡを含有すると、ＥＧＴＡが抽出液中の金属イオンとキレートを形成することでリボヌクレアーゼ、プロテアーゼ等が不活化することにより、本発明のタンパク質合成に必須な成分の分解を阻害することができるためである。また上記のように抽出液にヌクレアーゼ処理を施した場合であっても、反応液がＥＧＴＡを含有することにより、ヌクレアーゼが無細胞系タンパク質合成に悪影響を及ぼすことを確実に防止することができる。該ＥＧＴＡは、上記反応液中において、上記分解阻害能を好適に発揮し得る観点から０．０１ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることがより好ましい。ＥＧＴＡが０．０１ｍＭ未満であると必須な成分の分解活性を充分に抑えることができない傾向にあるためであり、また、５０ｍＭを越えるとタンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００３９】
すなわち、本発明の無細胞系タンパク質合成方法に用いる反応液は、上記抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．０５ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、２０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を含有する水溶液として実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに０．１ｍＭ〜１０ｍＭのＥＧＴＡを含有するように実現されるのがより好ましい。
【００４０】
本発明の無細胞系タンパク質合成方法においては、上記のような反応液を調製し、適切な反応温度にて合成を開始する。上記反応液は、半透性膜を介して外液と接触させる。これに際しては、例えば、半透性膜に収容した反応液が、外液を収容した反応層内に浸されている形態；底に半透膜を張った容器中に反応液を収容することによりなる第１の反応層が、外液を収容した第２の反応層内に浸されている形態；反応槽内にて、反応液の層と外液の層とが、半透性膜を介して重ねて収容されている形態；その他、半透性膜を介して反応液と外液とが接触していればどのような形態を採用しても良い。このように半透性膜を用いた機構により、合成反応を維持する間に、半透性膜を通過しうる成分を、反応液から半透性膜を介して外液中へ除去する。
【００４１】
半透膜としては特に限定されず、従来公知の種々のものを用いればよい。例えば、透析膜、半透膜、限外濾過膜、限外濾過バリア、化学的又は生物学的に目的物質を捕捉することができる膜から選ばれる。それぞれ、孔の大きさが異なるので、膜を通過させる物質の種類に応じて適宜選択することができるが、分子量３，０００以下、特には１０，０００以下の物質を反応液中から外液中へ除去しうるものであることが好ましい。
【００４２】
具体的には、半透性膜を通過しうる成分には、合成中に形成された減成生成物、すなわちＡＤＰ、ＡＭＰ、ＧＤＰ、ＧＭＰ、リン酸塩、ピロリン酸塩等が含まれる。これらの成分はタンパク質合成の阻害物質であり、本発明の方法においては、無細胞合成系を維持する間に反応液から半透性膜を介して外液へ除去される。このように除去操作を行うことによって、無細胞タンパク質合成をさらに効率よく長時間連続して行うことができる。また、半透膜を通過しうる成分には、合成された比較的小さなタンパク質が含まれることもある。
【００４３】
本発明において用いる外液としては、上述のように半透性膜を通過しうる成分を反応液中から半透膜を介して受け入れることができる組成を有するものであれば特に限定されない。例えば、上記反応液の組成より抽出液、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、クレアチンキナーゼ、ＲＮａｓｅインヒビターを除いたような組成、すなわちＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、ＤＴＴ、アミノ酸、及びＥＧＴＡを上述の反応液中における濃度で含む組成を有する外液を使用することができる。このようにＡＴＰなどのタンパク質合成に必要なエネルギー源を含む外液を用いると、上記減成生成物などを反応液中から外液中に除去するとともに、エネルギー源が外液中から反応液中に供給されるため、タンパク質合成反応時間が延長するという利点がある。
【００４４】
上記した中でも、本発明においては、半透性膜として透析膜を用い、反応液の透析を行いながらタンパク質合成を行うことが好ましい。
【００４５】
なお反応温度としては、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは１５℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を越えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。
【００４６】
本発明においては、合成反応を維持する間に、反応液に対してｍＲＮＡを追加供給することが好ましい。追加供給するｍＲＮＡは、５〜５０μｇ／μＬ水溶液として用いることが好ましい。５μｇ／μＬ未満になると、添加すべき溶液の合計量が増加するとともに反応液自体の容量が増加し、好ましい反応液組成からのずれが極端に大きくなる傾向があるためである。
【００４７】
ｍＲＮＡの追加供給においては、反応液中に、新たに追加されたｍＲＮＡが５μｇ／ｍＬ〜２０００μｇ／ｍＬ含有されるように追加供給されることが好ましく、２０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されるように追加供給されることがより好ましい。追加供給したｍＲＮＡが５μｇ／ｍＬ未満または２０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。このようにｍＲＮＡの追加供給を行うことによって、反応液中のｍＲＮＡの濃度を常に高い状態に保つことができる。本発明の無細胞タンパク質合成法は、このようにｍＲＮＡを追加供給すれば反応を維持することができるため、合成操作が簡便であるという利点を有する。
【００４８】
ｍＲＮＡの追加供給のタイミングは特に限定されず、当業者が適宜決定することができるが、タンパク質合成の反応速度が落ち始めたときに追加することが好ましい。このようなタイミングは、抽出液の組成、反応液の組成、追加供給するｍＲＮＡ量、その他のさまざまな要因にもよるが、例えば、３〜１２時間間隔のタイミングでｍＲＮＡの追加供給を行うことができる。
【００４９】
本発明においては、前記追加供給の操作が自動制御されていても良い。本発明の無細胞タンパク質合成方法は簡便であるため、自動制御のための装置も簡略化することができる。自動制御を行うことは、合成反応操作を確実にすると共にさらなる簡略化を図ることができる点で好ましい。
【００５０】
本発明の無細胞系タンパク質合成方法にて合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。
【００５１】
本発明の無細胞系のタンパク質合成方法にて合成できるタンパク質に特に制限はない。
【実施例】
【００５２】
本実施例１及び２では、昆虫細胞としてＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）由来の抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系にて、透析法によって、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を合成した。
【００５３】
［実施例１］
ＰＲＯＴＥＩＯＳ（東洋紡）のプロトコルに従い、ベクターｐＥＵ（東洋紡製）のΩ配列下流に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を挿入したプラスミドｐＥＵ−ＧＦＰを構築し、環状ＤＮＡを用いてｍＲＮＡを合成した。（なお、ｍＲＮＡ合成においては、環状ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物を用いることにより行うこともできる。）ＲｉｂｏＭＡＸ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）のプロトコルに従い、ｍＲＮＡを合成後、エタノール沈殿及びゲル濾過を行い、紫外吸収法にて定量し、無細胞タンパク質合成に用いた。一方、昆虫細胞抽出液は、特開２００４−２１５６５１号公報に記載された実施例１の方法によって調製した。
【００５４】
反応液は、水中に、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１００ｍＭ  酢酸カリウム、２ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、２０ｍＭ  クレアチンリン酸、２００μｇ/ｍｌ  クレアチンキナーゼ、２ｍＭ  ＤＴＴ、８０μＭ  アミノ酸（２０種類）、０．２５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅインヒビター、２００μｇ/ｍｌ  ｔＲＮＡ（ビール酵母由来）、５０％（ｖ/ｖ）抽出液、及び３２０μｇ/ｍｌ  ｍＲＮＡを含む組成であり、この組成を有する反応液の全量は７０μｌ（すなわちｍＲＮＡ含有量は２２．４μｇ）とした。
【００５５】
外液は、水中に、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１００ｍＭ  酢酸カリウム、２ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、２０ｍＭ  クレアチンリン酸、２ｍＭ  ＤＴＴ、８０μＭ  アミノ酸（２０種類）、及び０．２５ｍＭ  ＥＧＴＡを含む組成であり、この組成を有する外液の全量は１５００μｌとした。
【００５６】
透析装置としては、第一化学製透析カップ（ＭＷＣＯ：３５００）を用いた。底面に透析膜が張られた透析カップ内に反応液７０μｌを入れ、一方でバッファータンクに外液１５００μｌを入れた。バッファータンク内の外液の液面より透析カップ底面の透析膜が下になるように、透析カップをバッファータンク内の外液に浸し、２５℃で反応を行った。
【００５７】
［実施例２］
合成反応開始後、２４０分後、５７０分後、７４５分後及び１４００分後にｍＲＮＡ溶液を新たに添加した以外は、実施例１と同様に反応を行った。
なお、本実施例において追加供給するｍＲＮＡは、５．１μｇ／μＬ水溶液として用いた。このｍＲＮＡ水溶液を、終濃度（すなわち新たに追加したｍＲＮＡの反応液中の濃度）が３２０μｇ／ｍＬとなるように追加した。
【００５８】
［比較例１］
本比較例ではバッチ法による反応を行った。すなわち、実施例１と同様の方法によって得られた反応液４０μｌを用い、２５℃で反応を行った。    
【００５９】
実施例１、２及び比較例１で合成されたＧＦＰは、マイクロプレートリーダーＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて蛍光強度を測定した。別途既知濃度のＧＦＰ希釈系列を調製し蛍光強度を測定することによって作成したＧＦＰ濃度−蛍光強度の検量線から、合成されたＧＦＰ濃度を求めた。本発明の方法（実施例１及び２）によるＧＦＰ合成量と、従来法（比較例１）によるＧＦＰ合成量とを比較したものを図１に示す。図１においては、横軸に時間（分）（Times(min)）、縦軸にＧＦＰ合成量（GFP Productions (μg/ml)）を表す。また、従来法（比較例１）による結果を「バッチ法」の折れ線で示し、本発明の方法のうち、ｍＲＮＡの追加供給をしない透析法（実施例１）による結果を「透析法」の折れ線で、ｍＲＮＡの追加供給をした透析法（実施例２）による結果を「透析法＋ｍＲＮＡ」の折れ線で示す。実施例２の結果を示す折れ線における丸マークは、その時間にｍＲＮＡの追加供給を行ったことを示す。図１が示すように、本発明の方法によるといずれもＧＦＰ合成量の向上が確認され、特に、ｍＲＮＡの追加供給をした透析法（実施例２）の結果によると、従来の方法（比較例１）の結果と比べてＧＦＰ合成量が約３倍となり、大幅な増加を確認することができた。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】従来法（バッチ法）によるタンパク質合成の結果と、本発明の方法（透析法及び透析法＋ｍＲＮＡ）によるタンパク質合成の結果とを示す。
【図１】
2006109779.tif 000003