(57)【要約】【課題】  生体試料への光ダメージを低減するとともに、正確で高速、かつ長時間の観察が可能な生体試料観察システムを提供する。【解決手段】  生体試料を格納および培養する培養容器と、培養容器を保持する保持手段と、生体試料に対して対向配置された対物レンズと、保持手段と対物レンズとを相対的に移動させる焦準駆動部と、対物レンズの合焦を検出するオートフォーカス部と、保持手段と対物レンズとの相対的な移動値を蓄積するとともに、焦準駆動部の制御を行う焦準駆動制御部と、生体試料の複数の被観察領域を観察して情報を取得する観察手段と、を有し、焦準駆動制御部が生体試料の観察（ＳＴＥＰ３１）時間帯とは異なる時間帯に、観察の回数より少ない回数だけオートフォーカス部により少なくとも１以上の被観察領域に対して合焦検出（ＳＴＥＰ２５）を行うことを特徴とする。【選択図】  図１２
2006003653.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被観察体となる生体試料の情報を取得する生体試料観察システムにおいて、
前記生体試料を格納するとともに内部で培養する培養容器と、
前記培養容器を保持するとともに搬送する保持手段と、
前記生体試料に対して前記培養容器を介して対向配置された対物レンズと、
前記保持手段と前記対物レンズとを相対的に移動させる焦準駆動部と、
前記生体試料への前記対物レンズの合焦を検出するオートフォーカス部と、
前記保持手段と前記対物レンズとの相対的な移動値を蓄積するとともに、前記焦準駆動部の制御を行う焦準駆動制御部と、
前記生体試料の複数の被観察領域を観察して情報を取得する観察手段と、を有し、
前記焦準駆動制御部が、前記観察手段による前記生体試料の観察時間帯とは異なる時間帯に、前記観察の回数より少ない回数だけ前記焦準駆動部を駆動して、前記オートフォーカス部により少なくとも１以上の被観察領域に対して合焦検出を行う生体試料観察システム。
【請求項２】
少なくとも、前記培養容器を一定温度に維持することが可能な温度維持部を有する請求項１記載の生体試料観察システム。
【請求項３】
前記温度維持部は、さらに、少なくとも、前記保持手段と、前記対物レンズと、前記焦準駆動部と、前記オートフォーカス部と、前記観察手段と、を一定温度に維持することが可能である請求項２記載の生体試料観察システム。
【請求項４】
前記合焦検出により得られた前記移動値が、前記焦準駆動制御部に順次蓄積されるとともに、
同一の前記被観察領域について得られた前記移動値については、最新の前記移動値に更新され、
前記観察手段が、前記焦準駆動制御部に蓄積された前記移動値に基づいて観察を行う請求項１から３のいずれかに記載の生体試料観察システム。
【請求項５】
前記観察手段が、前記最新の移動値に基づいて観察を行う請求項４記載の生体試料観察システム。
【請求項６】
前記観察時間帯が、前記合焦検出が行われる時間帯の間に配置されている請求項１から５のいずれかに記載の生体試料観察システム。
【請求項７】
前記合焦検出が、一部の被観察領域に対して行われる請求項１から６のいずれかに記載の生体試料観察システム。
【請求項８】
前記合焦検出により得られた一部の被観察領域の前記移動値に基づいて、前記他の被観察領域の前記移動値が直線または曲線補間により算出され、
該他の被観察領域の観察が、算出された移動値に基づいて行われる請求項７記載の生体試料観察システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養している生体試料の反応による情報を検出する装置に利用される培養生体試料へのオートフォーカスに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、顕微鏡を用いた検査装置は、各種機能面の自動化が進んでおり、標本にピント合わせを行うオートフォーカス機能も自動化項目の必須機能となっている。
スライドガラスに封入された標本に対する検査装置にも顕微鏡オートフォーカスが採用されており、例えば、特許文献１において開示されているような、赤外線反射膜を用いたオートフォーカス技術が知られている。さらに、特許文献２において開示されているような、スライドガラスやカバーガラスにアクティブＡＦ方式によりピント合わせをした後、パッシブＡＦ方式を用いて、標本に正確にピント合わせを行う技術が知られている。
【特許文献１】特開平８−８２７４７号公報
【特許文献２】特開２００１−９１８２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上述したような顕微鏡を用いたシステムは、培養容器などで培養過程にある細胞の観察にも多く用いられている。
ここで、培養容器で細胞を育成するためには、温度環境をほぼ３７℃に維持し、培養ガス中の二酸化炭素濃度を５％程度に維持するなどの培養環境を維持する必要が生じていた。そのため、培養環境維持のための温度制御による温度ドリフトや、培養ガスの送風による冷却の影響や、ランプハウスの発熱などにより、本体構成部材や観察体の熱変形などが発生しやすく、特許文献１および２に示した技術では、時間経過とともに合焦位置がずれるデフォーカス現象が多発する恐れがあった。
【０００４】
また、観察される細胞は多種に渡り、平均して５〜１０μｍの厚みをもっており、その観察目的に応じて、非共焦点観察計測または共焦点観察計測などが用いられ、高倍率の対物レンズを使用するケースも多かった。そのため、上述の理由とも合わせて、合焦位置がずれるデフォーカス現象が多発する恐れがあった。
このため、顕微鏡形態をとる観察装置では、デフォーカス現象を防止するため、細胞の観察時に毎回オートフォーカス動作を実施していた。しかしながら、観察時に毎回オートフォーカスを実施すると、オートフォーカス動作が入るため観察に要する時間が長くなるという問題があった。
【０００５】
観察に要する時間が長くなると、例えば、多数の細胞を観察する場合には、最初の細胞観察から最後の細胞観察までの時間間隔が長くなり、同一時間における観察結果として扱えなくなるという問題があった。
つまり、細胞は経時的に変化するため正確な観察を行うためには、観察を行う時間についても正確に管理する必要がある。しかし、上述のように、観察の順序により観察が行われた時間が異なると、観察により得られた情報同士を比較しても正確な結果を得られなくなるという問題があった。
【０００６】
また、アクティブオートフォーカスにレーザを用いる場合には、レーザ光が細胞に常時照射されるため、細胞への光照射時間も増加していた。光の照射時間が長くなると、細胞内の活性酸素の濃度が上昇し、この活性酸素が培養過程の細胞にダメージを与えるという問題があった。
【０００７】
本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであって、生体試料への光ダメージを低減するとともに、正確で高速、かつ長時間の観察が可能な生体試料観察システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、被観察体となる生体試料の情報を取得する生体試料観察システムにおいて、前記生体試料を格納するとともに内部で培養する培養容器と、前記培養容器を保持するとともに搬送する保持手段と、前記生体試料に対して前記培養容器を介して対向配置された対物レンズと、前記保持手段と前記対物レンズとを相対的に移動させる焦準駆動部と、前記生体試料への前記対物レンズの合焦を検出するオートフォーカス部と、前記保持手段と前記対物レンズとの相対的な移動値を蓄積するとともに、前記焦準駆動部の制御を行う焦準駆動制御部と、前記生体試料の複数の被観察領域を観察して情報を取得する観察手段と、を有し、前記焦準駆動制御部が、前記観察手段による前記生体試料の観察時間帯とは異なる時間帯に、前記観察の回数より少ない回数だけ前記焦準駆動部を駆動して、前記オートフォーカス部により少なくとも１以上の被観察領域に対して合焦検出を行うことを特徴とする。
【０００９】
本発明によれば、生体試料の所定位置に対して行う合焦検出動作（以後、オートフォーカス動作と表記する。）を、生体試料の観察時間帯とは異なる時間帯に行うため、生体試料の観察時間帯において、オートフォーカス動作を行う時間を削減することができる。つまり、生体試料の観察に要する時間を短縮できるとともに、観察の高速化を図ることができる。
また、オートフォーカス動作により得られた保持手段と対物レンズとの相対的な移動値が照準駆動制御部に蓄積されるため、オートフォーカス動作と生体試料の観察とが異なる時間帯に行われても、生体試料に対して合焦することができる。
また、観察に要する時間を短縮できるため、生体試料に対する光の照射時間を短縮することができる。そのため、例えば、生体試料が光の照射により活性が落ちる細胞などの場合、細胞の活性低下を抑制することができる。
ここで、移動値とは、保持手段と対物レンズとの相対的な移動量の値であってもよいし、保持手段と対物レンズとの相対的な座標値であってもよい。
【００１０】
さらに、観察に要する時間を短縮できるため、時間経過により大きくなる本発明の構成要素の熱変形による合焦位置のズレを少なくすることができる。例えば、観察手段が生体試料の画像を撮像する素子であれば、焦点の合った生体試料の画像を得ることができる。
また、観察に要する時間を短縮できるため、例えば複数の生体試料を観察する場合、最初の生体試料を観察した時間と、最後の生体試料を観察した時間との時間間隔を短くすることができ、観察により得られた情報同士を比較可能な正確な観察を行うことができる。
対物レンズが培養容器を介して生体試料と対向配置されているため、生体試料を培養容器から取り出すことなく観察することができる。そのため、長時間にわたる観察においても、生体試料の活性が低下することを防止することができる。
【００１１】
また、上記発明においては、少なくとも、前記培養容器を一定温度に維持することが可能な温度維持部を有することが望ましい。
本発明によれば、温度維持部により、少なくとも培養容器の温度を一定に維持・制御することができるため、温度変化による培養容器の伸縮、変形など（熱変形）を軽減することができる。
そのため、熱変形による合焦ズレ（デフォーカス）を軽減することができ、生体試料の正確な観察を行うことができる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記温度維持部は、さらに、少なくとも、前記保持手段と、前記対物レンズと、前記焦準駆動部と、前記オートフォーカス部と、前記観察手段と、を一定温度に維持することが可能であることが望ましい。
本発明によれば、さらに、生体試料への合焦、および観察に係る構成要素の温度を一定に維持・制御することができるため、温度変化による上記構成要素の伸縮、変形など（熱変形）を軽減することができる。
そのため、熱変形による合焦ズレ（デフォーカス）を軽減しやすくなり、生体試料の正確な観察を行いやすくすることができる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記合焦検出により得られた前記移動値が、前記焦準駆動制御部に順次蓄積されるとともに、同一の前記被観察領域について得られた前記移動値については、最新の前記移動値に更新され、前記観察手段が、前記焦準駆動制御部に蓄積された前記移動値に基づいて観察を行うことが望ましい。
さらに好ましくは、前記観察手段が、前記最新の移動値に基づいて観察を行うことが望ましい。
【００１４】
本発明によれば、焦準駆動制御部には、オートフォーカス動作により得られた最新の上記移動値が蓄積されているため、観察手段が蓄積された移動値に基づいて観察を行うことができる。また、観察手段が最新の移動値に基づいて観察を行うことができる。
そのため、生体試料への合焦が時間の経過とともに熱変形などによりズレても、最新の上記移動値に基づいて観察するため、上記移動値を最新の値に更新しない場合と比較して、合焦のズレを少なくすることができる。
【００１５】
さらに、上記発明においては、前記観察時間帯が、前記合焦検出が行われる時間帯の間に配置されていることが望ましい。
本発明によれば、合焦検出が行われる時間帯の間に、生体試料の観察時間帯を１つ入れることもできるし、複数回入れることもできる。つまり、オートフォーカス動作の間に、オートフォーカス動作とは独立して、生体試料の観察を１回以上行うことができる。
そのため、オートフォーカス動作を行いながら生体試料の観察を行う場合と比較して、生体試料の１回の観察に要する時間を短縮することができる。
また、１回のオートフォーカス動作の後に、複数回の生体試料の観察を行うことができ、複数回の生体試料の観察に要する時間を短縮することができる。同時に、オートフォーカス動作の回数が減少するため、生体試料に対する光の照射時間をより短縮することができる。
【００１６】
上記発明においては、前記合焦検出が、一部の被観察領域に対して行われることが望ましい。
本発明によれば、生体試料の一部の被観察領域に対してのみ合焦検出を行うため、全ての被観察領域に対して合焦検出を行う場合と比較して、オートフォーカス動作に要する時間を短縮することができる。
また、例えば、生体試料が光の照射により活性が落ちる細胞などの場合、合焦検出が行われない被観察領域については、オートフォーカス動作において光が照射されないため、細胞の活性低下を防止することができる。
【００１７】
上記発明においては、前記合焦検出により得られた一部の被観察領域の前記移動値に基づいて、前記他の被観察領域の前記移動値が直線または曲線補間により算出され、該他の被観察領域の観察が、算出された移動値に基づいて行われることが望ましい。
【００１８】
本発明によれば、合焦検出が行われなかった上記他の被観察領域の移動値が、上記一部の被観察領域の移動値に基づいて算出されるため、全ての被観察領域について、上記移動値に基づいた観察を行うことができる。
そのため、上記他の被観察領域の移動値の算出を行わなかった場合と比較して、生体試料の観察における合焦ズレの発生を防止することができる。または合焦ズレの量を少なくすることができる。
また、例えば平面度の悪い生体試料を観察する場合でも、上記他の被観察領域の移動値の算出を行うことにより、生体試料の全被観察領域についてオートフォーカス動作を行うことなく、合焦ズレの発生を防止、または合焦ズレの量を少なくすることができる。
【００１９】
上記他の被観察領域の移動値を直線補間により算出する場合、曲線補間と比較して、より早く算出することができるため、オートフォーカス動作または生体試料の観察に要する時間を短縮することができる。
また、上記他の被観察領域の移動値を曲線補間により算出する場合、直線補間と比較して、算出された上記移動値の誤差が少ないため、合焦ズレの発生を防止、または合焦ズレの量をより少なくすることができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の生体試料観察システムによれば、生体試料の観察時間帯とは異なる時間帯に、生体試料の被観察領域に対して合焦検出が行われるとともに、合焦検出が行われる回数が観察の回数より少ないため、観察時間を短縮することができるとともに、観察の高速化を図ることができるという効果を奏する。
また、観察時間を短縮できるため、生体試料へのダメージを低減することができるとともに、温度変化などによる合焦ズレを防止することにより観察の正確性を維持することができるという効果を奏する。
さらに、培養容器を介して生体試料を観察することにより長時間の観察を行うことができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
〔第１の実施の形態〕
以下、本発明の第１の実施形態に係る生体試料観察システムについて図１から図１７を参照して説明する。
図１は、本実施の形態に係る生体試料観察システムの概略を示す斜視図である。図２は、同じく生体試料観察システムのシステム構成を示す概略図である。
【００２２】
生体試料観察システム１０は、図１および図２に示すように、検出ユニット２０と培養ユニット７０とから概略構成されている。これら検出ユニット２０および培養ユニット７０は、接近して配置されることが望ましく、より好ましくは両ユニット２０、７０が接して配置されることが望ましい。
【００２３】
検出ユニット２０は、図１および図２に示すように、細胞（生体試料）ＣＥを内部に収納する保温箱２１と、細胞ＣＥを測定する検出部４０とから概略構成されている。
保温箱２１には、保温箱２１内を所定の温度に保温するヒータ（温度維持部）２１Ｈと、後述するインキュベータボックス（培養容器）１００を保持するステージ（保持手段）２２と、細胞ＣＥに光を照射する透過光源２３と、保温箱２１内の温度を均一にするファン２４と、保温箱２１内を殺菌するＵＶランプ２５と、後述する培養液循環配管７７や培養ガス供給配管９７などを保護するキャリア２６と、インキュベータボックス１００などを保温箱２１から出し入れする際に用いる開閉扉２７と、検出ユニット２０の主電源をＯＮ・ＯＦＦする主電源スイッチ２８が備えられている。
【００２４】
ステージ２２は、互いに直交方向に相対移動するＸ軸動作ステージ（保持手段）２２Ｘと、Ｙ軸動作ステージ（保持手段）２２Ｙと、を有し、ステージ走査部２９により走査制御されている。
ステージ走査部２９は、Ｘ軸動作ステージ２２ＸのＸ軸座標値を検出するＸ軸座標検出部３０と、Ｘ軸動作ステージ２２Ｘの動作（走査）を制御するＸ軸走査制御部３１と、Ｙ軸動作ステージ２２ＹのＹ軸座標値を検出するＹ軸座標検出部３２と、Ｙ軸動作ステージ２２Ｙの動作（走査）を制御するＹ軸走査制御部３３と、から構成されている。
Ｘ軸座標検出部３０およびＹ軸座標検出部３２は、それぞれ検出したＸ軸動作ステージ２２ＸのＸ座標と、Ｙ軸動作ステージ２２ＹのＹ座標と、をコンピュータＰＣに出力するように配置されている。Ｘ軸走査制御部３１およびＹ軸走査制御部３３は、それぞれコンピュータＰＣからの指示に基づきＸ軸動作ステージ２２Ｘの走査と、Ｙ軸動作ステージ２２Ｙの走査とを制御するように配置されている。
【００２５】
なお、Ｘ軸動作ステージ２２ＸおよびＹ軸動作ステージ２２Ｙを駆動する機構としては、例えばモータおよびボールネジの組み合わせを挙げることができる。
コンピュータＰＣは、上述のように、Ｘ軸動作ステージ２２Ｘと、Ｙ軸動作ステージ２２Ｙの走査を制御するとともに、後述するように、細胞ＣＥの検出系の制御、撮像した細胞ＣＥの画像の解析なども行い、Ｘ軸動作ステージ２２Ｘ、Ｙ軸動作ステージ２２Ｙと検出系と解析系とを連動して制御している。
【００２６】
透過光源２３とインキュベータボックス１００との間に、透過光源２３から射出された光を細胞ＣＥに集光するコンデンサレンズ３４が配置されている。
なお、コンデンサレンズ３４とインキュベータボックス１００との間には、シャッタ３５を設けなくても良いし、シャッタ３５を設けても良い。
ファン２４は保温箱２１の壁面に配置されている。このファン２４を動作させることにより、保温箱２１内の空気を対流させ、保温箱２１内の温度を均一かつ一定に保ちやすくすることができる。
【００２７】
ＵＶランプ２５は、検出ユニット２０の壁面に配置されたＵＶランプスイッチ３６と接続され、ＵＶランプ２５とＵＶランプスイッチ３６との間には、ＵＶランプ２５の動作を時間的に制御するタイマ３７が配置されている。さらに、ＵＶランプ２５の点灯を表示する滅菌中表示ランプ（図示せず）が配置されている。
例えば、細胞ＣＥの非測定時にＵＶランプスイッチ３６が押されると、タイマ３７のカウントが開始されるとともに、ＵＶランプ２５に電力が供給され、ＵＶ光（紫外線光）が保温箱２１内に照射される。これと同時に滅菌中表示ランプも点灯する。そして、所定の時間（例えば３０分）が経過して、タイマ３７のカウントが終了すると、タイマ３７はＵＶランプ２５への電力供給を停止し、ＵＶ光の照射が終了される。また、滅菌中表示ランプも消灯される。
なお、ＵＶランプ２５は、主電源スイッチ２８とは別個に制御されており、主電源がＯＦＦされていても動作することができる。
なお、ＵＶランプ２５の点灯時間は、上述した３０分でも良いし、保温箱２１内の雑菌類を死滅させることができる時間であれば、３０分未満でも良いし、３０分よりも長くても良い。
【００２８】
開閉扉２７はアルマイト処理を施されたアルミなどの金属、または遮光性の高い半透明の樹脂により構成されている。開閉扉２７の構造としては、中空の二重構造としたものや、さらには、内側が上記金属とされ外側が樹脂とされるものが考えられる。開閉扉２７の外側に樹脂を用いることにより、開閉扉２７から保温箱２１内の熱が外部に逃げることを防止することができる。また、開閉扉２７の内側をアルマイト処理された金属とすることにより、ＵＶランプ２５により開閉扉２７の寿命が損なわれることを防止することができる。
なお、開閉扉２７が金属または金属と樹脂との二重構造とされたときには、完全に遮光されるため、インキュベータボックス１００を覗く位置に覗き窓を設けることが望ましい。覗き窓には透明樹脂またはガラスがはめ込まれ、外側には、開閉可能なカバーが配置されていることが望ましい。
【００２９】
検出部４０には、図１および図２に示すように、検出部４０内を所定の温度（例えば３７℃）に保温するヒータ（温度維持部）４０Ｈと、検出部４０側から細胞ＣＥを照射する落射光源４１Ａ、４１Ｂと、落射光源４１Ａ、４１Ｂからの光路を切り替える光路切替部４２と、照射光の光量を調節する光量調整機構４３と、照射光を細胞ＣＥに向けて集光するレンズ系４４と、照射光の波長および検出光の波長を制御するフィルタユニット４５と、細胞ＣＥに対して合焦動作を行うオートフォーカス（ＡＦ）ユニット（オートフォーカス部）４６と、複数の倍率や性質の異なる対物レンズ４８を備えたレボルバ４７と、細胞ＣＥからの検出光を検出する検出器（観察手段）４９と、検出光の光量を測定する光量モニタ５０と、検出部４０内の温度を均一にするファン５１と、検出部４０内を冷却する冷却ファン５２と、が備えられている。
【００３０】
落射光源４１Ａ、４１Ｂは、例えば水銀ランプなどからなり、検出部４０の外部に配置されており、それぞれ電力を供給する電源５３に接続されている。
また、通常は１つの落射光源、例えば落射光源４１Ａを用いるが、落射光源４１Ａの光量が所定の規定値以下に減少した場合には、落射光源４１Ｂから照明光が照射され、落射光源４１Ａの電源はＯＦＦされる。
【００３１】
光路切替部４２は、落射光源４１Ａまたは落射光源４１Ｂどちらか一方の照明光を光量調整機構４３に導くように形成されている。また、光路切替部４２には、後述のコンピュータＰＣに接続され、コンピュータＰＣの指示に基づき光路切替部４２を制御する光路制御部５４が配置されている。
光路切替部４２の照明光射出側にはシャッタ４２Ｓが配置され、照明光の透過・遮断制御を行っている。
【００３２】
シャッタ４２Ｓの照明光射出側には光量調整機構４３が配置され、シャッタ４２Ｓを透過した照明光の光量を調整している。その機構としては、例えば公知の絞り機構などを用いても良いし、その他の光量を調節できる公知の機構、技術を用いても良い。
また、光量調整機構４３には、後述のコンピュータＰＣに接続され、コンピュータＰＣの指示に基づき光量調整機構４３を制御する光量制御部５５が配置されている。
光量調整機構４３の照明光射出側にはレンズ系４４が配置されている。レンズ系４４は、一対のレンズ４４Ａ、４４Ｂと、レンズ４４Ａおよびレンズ４４Ｂの間に配置された絞り４４Ｃと、から構成されている。
【００３３】
フィルタユニット４５は、励起フィルタ５６と、ダイクロイックミラー５７と、吸収フィルタ５８とから構成されている。励起フィルタ５６は、照明光の中から細胞ＣＥの蛍光発光に寄与する波長（励起光）を透過するフィルタであり、レンズ系４４から射出された照明光が励起フィルタ５６に入射するように配置されている。ダイクロイックミラー５７は、励起光と蛍光とを分離する光学素子であり、励起フィルタ５６を透過した励起光を、細胞ＣＥに向けて反射するとともに、細胞ＣＥからの蛍光を透過するように配置されている。吸収フィルタ５８は、細胞ＣＥからの蛍光とその他の不要な散乱光とを分離する光学素子であり、ダイクロイックミラー５７を透過した光が入射するように配置されている。
フィルタユニット４５には、後述するコンピュータＰＣの指示に基づき、フィルタユニット４５から射出される励起光や検出光（蛍光）の波長を制御するフィルタ制御部４６Ｃが配置されている。
なお、励起フィルタ５６、ダイクロイックミラー５７、吸収フィルタ５８は１枚ずつ用いられてもよいし、複数枚用いられてもよい。
【００３４】
図３は、ＡＦユニット４６の概略構成を示す図である。
ＡＦユニット４６は、図２および図３に示すように、フィルタユニット４５の励起光射出側に配置されていて、後述するコンピュータＰＣの指示に基づき、励起光を、対物レンズ４８を介して細胞ＣＥに集光させるように配置されている。
より具体的には、ＡＦユニット４６は投光手段を含むアクティブＡＦ受光系として構成されている。ＡＦユニット４６内では、レーザ光源（ＬＤ）１３１から射出されたレーザ光が、コリメートレンズ１３２に入射されて平行光束に変換され、遮蔽板１３３により平行光束の略半分が遮断され、遮蔽板１３３で遮断されなかったレーザ光束のＰ偏光成分は、偏向ビームスプリッタ１３４により結像レンズ系１３５に向けて反射され、Ｓ偏光成分は透過されるように配置されている。
【００３５】
結像レンズ系１３５を透過したＰ偏光は１／４波長板１３６により楕円偏光に変換され、ダイクロイックミラー１３７によりマイクロプレート１２０またはチャンバ１１０に向けて反射されるように配置されている。
ダイクロイックミラー１３７に反射された楕円偏光はマイクロプレート１２０またはチャンバ１１０に照射され、マイクロプレート１２０またはチャンバ１１０により楕円偏光として反射される。反射された楕円偏光は、ダイクロイックミラーに反射され、１／４波長板１３６に入射されＳ偏光に変換され射出される。Ｓ偏光は、結像レンズ系１３５および偏向ビームスプリッタ１３４を透過して結像レンズ１３８に入射される。結像レンズ１３８に入射されたＳ偏光は、アクティブ２分割ディテクタ（ＰＤ）１３９に結像されるように配置されている。
これら光学要素は同一光軸上に設置されるとともに、ダイクロイックミラー１３７については対物レンズ４８の光軸上にも設置されている。
【００３６】
ＰＤ１３９は２つの信号ＰＤ−Ａ、ＰＤ−ＢをアクティブＡＦ信号生成部１４０に出力するように配置され、アクティブＡＦ信号生成部１４０は、２つの信号ＰＤ−Ａ、ＰＤ−Ｂの大きさおよび差分に基づいてデフォーカス量およびデフォーカス方向を示すアクティブＡＦ信号を生成している。
なお、ダイクロイックミラー１３７はＬＤ１３１から射出されたレーザ光およびマイクロプレート１２０またはチャンバ１１０により反射されたレーザ光のみを反射する光学素子を用いている。
なお、上述のように、ＡＦユニット４６はアクティブフォーカスを行う光学系であっても良いし、パッシブオートフォーカスを行う光学系であっても良いし、他の公知の方法により合焦を行うものであっても良い。
【００３７】
レボルバ４７は、図２に示すように、ＡＦユニット４６の励起光射出光側に配置されていて、倍率の異なる複数の対物レンズ４８が配置されている。対物レンズ４８には、Ｚ軸方向（細胞ＣＥとの相対位置を遠近させる方向）に対物レンズ４８を移動させることができる高精度の送り機構を含む対物レンズ制御部（焦準駆動部）５９が配置されている。
対物レンズ制御部（焦準駆動部）５９は、コンピュータ（焦準駆動制御部）ＰＣの指示に基づき、レボルバ４７を駆動することにより、励起光が入射される対物レンズ４８を選択するとともに、送り機構により、対物レンズ４８の合焦位置を制御している。
送り機構としては、例えばクロスローラーガイドとボールネジとステッピングモータにより構成されたものを用いることができるし、圧電素子などの他のアクチュエータを用いる構成であってもよい。
【００３８】
なお、対物レンズ４８は、検出部４０からＸ軸動作ステージ２２Ｘ、Ｙ軸動作ステージ２２Ｙにそれぞれ設けられた孔を通して保温箱２１内のインキュベータボックス内部が観察可能な構造になっている。
Ｘ軸動作ステージ２２Ｘ、Ｙ軸動作ステージ２２Ｙには、ステージが動作する範囲を見込んで孔の大きさは多少余裕を見込んである。
そのため、保温箱２１内において雰囲気を細胞の培養に適した湿度に保っていても、前記孔を通じて雰囲気が検出部４０に対して抜けてしまい、細胞の培養に適した温度を維持できなくなり、細胞の活性低下を引き起こす可能性がある。
そこで、このような細胞培養に適した温度の雰囲気が保温箱２１と検出部４０との間で導通することを抑制する抑制手段９９を設けてもよい。
その抑制手段９９は、レボルバ４７や対物レンズ４８の動きを妨害しないように空気の流れを抑制できればよく、例えばフィルムや透明シートなど柔軟な材料からなるシートを保温箱２１と検出部４０との境目に設けられた孔の周囲に貼り付け、レボルバの周囲に垂らした状態で取り付ける幕状のものが考えられる。
【００３９】
フィルタユニット４５の検出光射出側には、検出光を検出器４９および光量モニタ５０に集光する集光レンズ６０が配置されている。
集光レンズ６０の検出光射出側には、検出光の一部を検出器４９に向けて反射し、残りの検出光を光量モニタ５０に向けて透過するハーフミラー６１が配置されている。
検出器（撮像手段）４９は、ハーフミラー６１から反射された検出光が入射される位置に配置されている。また、検出器４９には、検出器４９からの検出信号を演算して後述するコンピュータＰＣに出力する検出器演算部６２が接続されている。
【００４０】
なお、検出器４９はラインセンサを用いても良いし、エリアセンサを用いても良いし、ラインセンサとエリアセンサとを共用してもよい。また、ＣＣＤを用いてもよいし、フォトマルチプライヤを用いてもよいし、フォトダイオードなどの光強度検出素子を用いてもよい。
光量モニタ５０は、ハーフミラー６１を透過した検出光を測定し、測定した値をコンピュータＰＣに出力するように配置されている。
なお、上述のように、光量モニタ５０を用いて検出光の光量を測定しても良いし、照度計やパワーメータなどを用いて検出光の光量を測定しても良い。
【００４１】
ヒータ４０Ｈは、検出部４０の例えば４つの側面に配置されるとともに、検出部４０内を例えば３０℃から３７℃となるように保温制御している。ファン５１は、検出部４０内の空気を対流させ、検出部４０内の温度を均一化するように配置されている。そのため、検出部４０内の温度が保温箱２１と近い温度に維持され、保温箱２１の温度をより安定化させやすくなる。
冷却ファン５２は、検出部４０内に配置された温度センサ（図示せず）の出力に基づき、検出部４０内の温度を下げるように駆動される。そのため、例えばモータなどの発熱による異常な検出部４０内の温度上昇を防止することができる。
【００４２】
このような構成による検出部４０は、細胞ＣＥの位相差観察や、微分干渉観察や、蛍光観察など、顕微鏡に類する観察を行うことができる。
【００４３】
図４は、本実施の形態に係るインキュベータボックスを示す斜視図である。
インキュベータボックス１００は、図４に示すように、マイクロプレート１２０を格納する筐体１０１と、筐体１０１とともに密閉空間を形成するカバー１０２とから概略構成されている。筐体１０１およびカバー１０２には、外界からの磁場を遮断する防磁処理や、インキュベータボックス１００に発生した静電気を除去する静電除去処理が施されている。
【００４４】
筐体１０１は、底板１０３と側壁１０４とから形成されていて、底板１０３の測定エリアに対応する領域は、ガラスのような透光性を有する材料で形成されている。底板１０３の他の領域および側壁１０４は、例えば、アルマイト処理されたアルミニウムやＳＵＳ３１６のようなステンレススチールなど防食性の高い遮光性の材料で制作するのが好ましく、より好ましくは、保温性の観点から熱伝導率の低い材料を選択するとよい。
また、底板１０３には、マイクロプレート１２０の温度を測定する温度センサ１０６が配置されている。なお、後述するチャンバ（培養容器）１１０をインキュベータボックス１００内に収納するときには、底板１０３とチャンバ１１０との間にアダプタ１０５を配置して、チャンバ１１０を保持してもよい（図５参照）。
【００４５】
また、筐体１０１には、マイクロプレート１２０を口の字状に囲む水槽１２１と、水槽１２１の内側に配置された内部ファン１２２と、培養ガスを供給するコネクタ１２３と、培養ガス中の二酸化炭素ガス濃度を検出する培養ガス濃度センサ１２４と、インキュベータボックス１００内の温度を略３７℃に調節するヒータ（温度維持部）１００Ｈとが配置されている。
【００４６】
温度センサ１０６の出力は、インキュベータ温度検知部１０６Ｓを介してコンピュータＰＣに入力されるとともに、検出ユニット２０の壁面に配置された温度表示部１０７にも入力されている。コンピュータＰＣは、図２に示すインキュベータ温度制御部１０６Ｃを介してヒータ１００Ｈなどを制御して、インキュベータボックス１００内の温度が一定に保たれるように制御するようになっている。
培養ガス濃度センサ１２４は、コンピュータＰＣおよび培養ガス濃度表示部１２４Ｄに二酸化炭素ガス濃度を出力している。
【００４７】
水槽１２１の側壁１２１Ｗは筐体１０１の側壁１０４の高さよりも低く形成されている。また、コネクタ１２３とは、供給された培養ガスが側壁１２１Ｗに当たるように、配置関係が調節されている。水槽１２１には殺菌された滅菌水が貯えられ、インキュベータボックス１００ａ内の湿度を略１００％に調節している。
内部ファン１２２は、その送風方向にマイクロプレート１２０が配置されないよう、水槽１２１の側壁１０４に沿って送風するように配置されている。
なお、培養ガス濃度センサ１２４は、水槽１２１の側壁１２１Ｗ内面に配置されていても良いし、インキュベータボックス１００から配管を外部へ配置し、吸引ポンプによりインキュベータボックス１００内の培養ガスを吸引して培養ガス濃度センサ１２４でその濃度を検出しても良い。
【００４８】
カバー１０２は、照明光を透過するガラス板１１７と、ガラス板１１７を支持する支持部１１７Ａと、から構成されている。ガラス板１１７には、測定エリアに対応する領域に反射防止膜が両面に形成されていても良い。反射防止膜を両面に形成することにより、透過観察・落射観察におけるガラス板１１７による反射を防止するようになっている。
なお、ガラス板１１７の面積は、インキュベータボックス１００の底板１０３と略同じ面積であっても良いし、測定を問題なく行うために必要となる最小限の面積であっても良い。
【００４９】
このようなインキュベータボックス１００を用いる場合には、培養ユニット７０から培養液を供給する必要がなくなるため、培養液ポンプ８０などのポンプ類の動作を停止させている。
【００５０】
図５は、本実施の形態に係るインキュベータボックスの他の実施例を示す斜視図であり、図６は、本実施の形態に係るチャンバの断面図である。
なお、上述のように、インキュベータボックス１００は内部にマイクロプレート１２０（またはウェルプレート）が配置されるものでも良いし、図５に示すように、内部にチャンバ１１０が配置されるものでもよい。
チャンバ１１０は、図６に示すように、対物レンズ４８により観察するための下部ガラス部材１１１と、透過光源２３からの光を透過するための上部ガラス部材１１２と、下部ガラス部材１１１および上部ガラス部材１１２を支持する枠部材１１３とから概略形成されている。
【００５１】
枠部材１１３の対向する辺には、培養液を循環させる流路が形成された継ぎ手１１４が形成されている。継ぎ手１１４には、後述する培養液循環配管７７が接続され、培養ユニット７０との間で培養液が循環されるようになっている。また、後述する培養ガス混合槽９１の培養ガス供給先が、インキュベータボックス１００から培養液瓶７２に変更されている。
枠部材１１３には、培養液の流れを均一化する整流子１１５が一対、培養液の流れに対して略垂直に配置されている。整流子１１５は、例えば小孔がマトリクス状に形成された板部材からなり、培養液が分散して複数形成された小孔を流れることにより、その流れを均一化している。そして、両整流子１１５の間には、細胞ＣＥが播種されたスライドガラス１１６が配置されている。
【００５２】
この場合には、培養ガスを供給するコネクタ１２３を塞ぐとともに、培養ガス濃度センサ１２４を使用しない。また、チャンバ１１０の大きさがマイクロプレート１２０と異なる場合には、アダプタ１０５を用いてインキュベータボックス１００ａにチャンバ１１０を配置してもよい。また、水槽１２１に滅菌水を入れなくてもよく、水槽１２１自体をインキュベータボックス１００から取り外しても良い。また、温度センサ１０６は、チャンバ１１０の温度を測定している。
なお、コネクタ１２３は上述のように塞いでもよいし、培養ガス供給配管９７を接続したまま、インキュベータボックス１００への培養ガスの供給を止めるだけでも良い。
【００５３】
培養ユニット７０は、図１および図２に示すように、培養液を内部に収納する滅菌箱７１と、培養ガスを生成する混合部９０とから概略構成されている。
滅菌箱７１には、滅菌箱７１内を所定の温度に保温するヒータ７１Ｈと、培養液を内部に蓄える培養液瓶７２と、予備の培養液を内部に蓄える予備タンク７３と、使用済みの培養液を入れる廃液タンク７４と、滅菌箱７１内を殺菌するＵＶランプ２５と、培養液瓶７２などを滅菌箱７１から出し入れする際に用いる開閉扉７５と、培養ユニット７０の主電源をＯＮ・ＯＦＦする主電源スイッチ７６が備えられている。
【００５４】
培養液瓶７２は熱伝導性に優れた材料、例えば耐食性ステンレスまたはガラス、から形成され、培養液瓶７２の下部には、培養液瓶用のヒータ（図示せず）が配置されている。培養液瓶７２内の培養液は、培養液瓶用のヒータにより略３７℃に維持されることができる。
培養液瓶７２には、インキュベータボックス１００との間で培養液を循環させる培養液循環配管７７と、予備タンク７３から予備の培養液を供給する補給配管７８と、培養液瓶７２から使用済みの培養液を廃液タンク７４に排出する廃液配管７９とが配置されている。
また、培養液循環配管７７には、培養液を培養液瓶７２からインキュベータボックス１００に送り出し、培養液を循環させる培養液ポンプ８０が配置されている。培養液ポンプ８０によりチャンバ１１０内の培養液を新しいものに交換することができるので、培養液を交換できないものと比較して、細胞ＣＥの培養できる期間をより長くすることができる。
【００５５】
補給配管７８には、予備タンク７３から培養液を培養液瓶７２に送る補給ポンプ８１が配置され、廃液配管７９には、培養液瓶７２から使用済みの培養液を廃液タンク７４に送る廃液ポンプ８２が配置されている。
上述の培養液ポンプ８０、補給ポンプ８１、廃液ポンプ８２としては、例えばベリスタポンプを用いることができ、ベリスタポンプにより所定流量で培養液を送液することができる。
なお、上述のように、使用済みの培養液を貯める廃液タンク７４を用いても良いし、廃液タンク７４を用いないで、直接使用済みの培養液を外部に排出する排出ポートを設けても良い。
【００５６】
培養液瓶７２には、内部の培養液温度を検出する培養液温度センサ（図示せず）が配置され、培養液温度センサの出力は培養液温度検出部８３を介してコンピュータＰＣに入力されるように配置されている。また、コンピュータＰＣに入力された培養液温度のデータは、テキストデータなどとしてメモリに蓄積され、細胞ＣＥの検出結果との比較・検証などに用いることができる。
【００５７】
ヒータ７１Ｈには、コンピュータＰＣからの指示に基づき、滅菌箱７１内の温度を介して培養液の温度を制御する培養液温度制御部８４が配置されている。培養液温度制御部８４により、培養液瓶７２から供給される培養液の温度は、ほぼ３７℃に保たれ、培養液の温度変化による細胞ＣＥの活性低下が防がれている。また、培養ユニット７０の壁面には、前述の培養液温度センサにより検出された培養液温度を表示する温度表示部８５が配置されている。
培養液ポンプ８０には、コンピュータＰＣの指示に基づき、培養液の循環を制御する培養液ポンプ制御部８６が配置されている。また、補給ポンプ８１および廃液ポンプ８２もコンピュータＰＣの指示に基づき、その動作が制御されるように配置されている。
【００５８】
ＵＶランプ２５は、培養ユニット７０の壁面に配置されたＵＶランプスイッチ３６と接続され、ＵＶランプ２５とＵＶランプスイッチ３６との間には、ＵＶランプ２５の動作を時間的に制御するタイマ３７が配置されている。さらに、ＵＶランプ２５の点灯を表示する滅菌中表示ランプ（図示せず）が配置されている。
なお、ＵＶランプ２５は、主電源スイッチ７６とは別個に制御されており、主電源がＯＦＦされていても動作することができるようになっている。
【００５９】
混合部９０には、図１および図２に示すように、混合部９０内を所定の温度に保温するヒータ（図示せず）と、インキュベータボックス１００に供給する培養ガス中の二酸化炭素ガス濃度を調節する培養ガス混合槽９１と、培養ガス混合槽９１に培養ユニット７０の外部に配置されたＣＯ２タンク９２から二酸化炭素ガスを供給するＣＯ２ポンプ９３とが配置されている。
【００６０】
培養ガス混合槽９１には、内部の二酸化炭素ガス濃度を検出するＣＯ２濃度検出部９４が配置され、ＣＯ２濃度検出部９４の出力がコンピュータＰＣに入力されるように配置されている。ＣＯ２ポンプ９３には、コンピュータＰＣの指示に基づいて、培養ガス混合槽９１に供給する二酸化炭素ガス量を制御するＣＯ２濃度制御部９５が配置されている。また、培養ユニット７０の壁面には、ＣＯ２濃度検出部９４により検出された培養ガス混合槽９１内の二酸化炭素ガス濃度を表示するＣＯ２濃度表示部９６が配置されている。
さらには、培養ガス混合槽９１と培養液瓶７２との間に培養ガス供給配管９７が配置されている。そのため、培養ガス供給配管９７を介して培養液に培養ガスが供給され、培養液中に培養ガスを十分に溶け込ませることができる。
また必要に応じて、培養液への二酸化炭素ガスの溶解を促進するために、培養液瓶７２の下方には例えばマグネットターラー（図示せず）が配置されるとともに、培養液瓶７２中には磁界の回転より回転する攪拌子（図示せず）が配置されてもよい。このように、培養液中に二酸化炭素を十分に溶け込ませることにより、培養液のｐＨを一定に保つことができる。
【００６１】
このように、培養液瓶７２内で二酸化炭素ガスの濃度が５％の培養ガスが溶解された培養液を生成することにより、培養気体および細胞ＣＥの育成に必要な栄養素が含まれた培養液が、後述するチャンバ１１０に供給される。また、培養ガスを培養液に溶解させることにより、培養液のｐＨなどを調整することができる。
ＣＯ２濃度検出部９４からコンピュータＰＣに入力された二酸化炭素ガス濃度は、メモリにデータとして蓄積されるとともに、コンピュータＰＣにおいてデータ処理が可能とされている。
【００６２】
次に、上記の構成からなる生体試料観察システム１０における観察方法について説明する。
まず、本実施の形態における走査方法および検出範囲の選択について図７（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）を参照して説明する。
図７（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は、本実施の形態における走査方法および検出範囲の選択例を示す図である。
【００６３】
図７（ａ）に示す例では、表示された画像上において測定対象範囲Ｍの左上の点ａと右下の点ｂとを指定することにより、測定対象範囲Ｍ（図中の破線で囲まれた範囲）を設定している。具体的には、点ａ−点ｂ間をマウスのような機器を用いてドラッグして測定対象範囲Ｍを設定しても良いし、点ａおよび点ｂの座標値を入力して指示しても良い。
検出器４９による測定部分は、図中の矢印で示すように、設定された測定対象範囲Ｍ内を左右方向に走査される。つまり、図中の左から右へ走査される際には、Ｘ軸方向と平行に走査され、右から左へ走査される際には、左斜め下方向に走査される。このうち、左から右へ走査される時に細胞ＣＥの撮像が行われる。
【００６４】
図７（ｂ）は、上述した方法で設定される測定対象範囲Ｍが２つの例である。まず、上述した方法で２つの測定対象範囲ＭＡ、ＭＢが設定される。測定対象範囲ＭＡと測定対象範囲ＭＢとは、図中のＸ軸方向に所定間隔を空けて並ぶとともに、Ｙ軸方向において、その全てが重複するように設定されている。
この例における検出器４９による測定部分は、図中の矢印で示すように、測定対象範囲ＭＡ、ＭＢを並列に測定するように走査される。つまり、図中の左から右へ走査される際に、測定対象範囲ＭＡから測定対象範囲ＭＢへ走査され、右から左へ走査される際には、測定対象範囲ＭＢから測定対象範囲ＭＡへ走査される。
【００６５】
図７（ｃ）は、上述した方法で設定される測定対象範囲が２つの例であって、２つの測定対象範囲ＭＡ、ＭＢの配置が異なっている例である。ここでは、測定対象範囲ＭＡと測定対象範囲ＭＢとは、図中のＸ軸方向に所定間隔を空けて並ぶとともに、図中のＹ軸方向において、その一部分が重複するように設定されている。
この例における検出器４９による測定部分は、図中の矢印で示すように、測定対象範囲ＭＡ、ＭＢのＹ軸方向に重複する部分のみが連続して走査されている。つまり、まず、測定対象範囲ＭＡの重複していない部分の走査が行われる。次に、測定対象範囲ＭＡ、ＭＢの重複している部分の走査が連続して行われる。そして、測定対象範囲ＭＢの重複していない部分の走査が行われる。
【００６６】
図７（ｄ）は、上述した方法で設定される測定対象範囲Ｍが２つの例であって、２つの測定対象範囲ＭＡ、ＭＢの配置が図７（ｂ）と同様であるが、走査方法が異なる例である。
この例における検出器４９による測定部分は、図中の矢印で示すように、測定対象範囲ＭＡ、ＭＢが別個に走査されている。つまり、まず測定対象範囲ＭＡの全範囲の走査が行われた後に、測定対象範囲ＭＢの全範囲の走査が行われる。
【００６７】
また、上述した図７（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）に示す走査方法のうち、トータルの移動距離が最短になる走査方法が、後述する設定されたパラメータおよび測定モードに基づいて、コンピュータＰＣにより自動的に選択される。
【００６８】
次に、細胞ＣＥの測定にかかる手順にについて、各フローチャートを用いながら説明する。
まず、細胞ＣＥの測定の前に、測定パラメータの設定が行われる。そこで、測定パラメータの設定の流れを、図８を参照しながら説明する。
図８は、測定パラメータの設定の流れを説明するフローチャートである。
まず、測定パラメータの設定が行われる（ＳＴＥＰ１）。
その後、デフォルトの条件設定が行われる（ＳＴＥＰ２）。ここで設定される条件は、例えばＣＯ２濃度５％、温度３７℃などの培養条件および測定条件であり、これらの設定条件はユーザによって所定の条件に変更することができる。
【００６９】
次に、測定対象の選択を行う（ＳＴＥＰ３）。測定対象とは、例えばマイクロプレート１２０や、スライドガラス１１６など、細胞ＣＥの容器である。
次に、測定モードの選択を行う（ＳＴＥＰ４）。測定モードには、エリア撮像モードや、ライン撮像モードや、自動モード等がある。自動モードとは他の測定モードの中から測定時間または走査時間の短い測定モードを自動的に選択するモードである。
【００７０】
なお、細胞を培養する範囲を撮像するとき、このように測定対象範囲Ｍを設定するなど複数の領域（検出範囲）に分けて撮像できる構成であれば、必要に応じて必要な部分だけの撮像を行うことが可能となる。
例えば、コンピュータＰＣの設定を変更して、走査対象となる全範囲の走査と、所定の一部の領域の走査とが交互に行われるようにしておけば、短い期間しか起こらない生体試料特有の現象を捉えることができる。一例として、走査対象となる全範囲の走査を３０分ごとに行う場合、その合間に注目すべき細胞が存在する所定の測定対象範囲Ｍの走査が行われるようにしておけば、１５分程度しか発現しない特有の現象が注目すべき細胞に起こったことを捉えることも可能となる。
また、必要なときに必要な測定対象範囲Ｍだけを走査するため、走査時間が短縮できるとともに、他の細胞に対する光の照射時間を短くすることができる。
【００７１】
次に、測定倍率を選択し（ＳＴＥＰ５）、その後、検出波長を選択する（ＳＴＥＰ６）。測定倍率の選択、および検出波長の選択は、それぞれ２種類以上の選択肢の中から選択することも可能である。
ここで、検出波長の選択方法としては、使用する蛍光タンパク、例えば、ＧＦＰ、ＨＣ−Ｒｅｄ等のリストをコンピュータＰＣに予め記憶させておき、記憶させたリストの中から選択する。コンピュータＰＣは、選択された蛍光タンパクに基づいて自動的に観測に最適な励起フィルタ５６や吸収フィルタ５８などを選択する。このようにして、細胞ＣＥから所定の蛍光を検出することができる。
なお、測定中の励起フィルタ５６や吸収フィルタ５８、対物レンズ４８等の変更は、Ｘ軸動作ステージ２２Ｘ、Ｙ軸動作ステージ２２Ｙの駆動に同期して自動的に行なわれる。
【００７２】
次に、測定間隔が設定される（ＳＴＥＰ７）。
そして、プレビュー画面が取り込まれ（ＳＴＥＰ８）、プレビュー画像がモニタに表示される（ＳＴＥＰ９）。ここでは、ユーザがプレビュー画像のモニタへの表示を指示するプレビューボタンなどを用いて指示を出すことにより、プレビュー画像がモニタに表示される。そして、ユーザがモニタに表示されたプレビュー画像を確認することができる。
【００７３】
次に、測定範囲の選択が行われる（ＳＴＥＰ１０）。測定範囲の選択後、再度プレビュー画像をモニタに表示させて、測定範囲が所定の範囲であるか確認してもよい。
次に、設定された複数の測定間隔から所定の測定間隔を選択する（ＳＴＥＰ１１）。
そして、測定開始スイッチ（図示せず）が押されたら（ＳＴＥＰ１２）、細胞ＣＥの測定が開始される（ＳＴＥＰ１３）。測定開始スイッチが押されない場合には、測定開始スイッチが押されるまで待機している（ＳＴＥＰ１２）。
【００７４】
なお、ＳＴＥＰ１２において、測定開始スイッチが押されない場合には、各種設定を再設定できるように、種々所定のＳＴＥＰに戻ることが可能な設定にしてもよい。
【００７５】
測定パラメータの設定が完了したら、次に、細胞ＣＥの観測が行われる。まず、合焦検出が行われる合焦観測エリアの説明と、観察が行われる観察エリア（観察領域）であって合焦検出は行われない観察エリアの移動値の算出について図９から図１１を参照しながら説明する。
図９（ａ）は、スライドガラス１１６の観察エリアを示した図であり、図９（ｂ）は、スライドガラス１１６の合焦測定エリアを示した図である。
【００７６】
スライドガラス１１６の上には、図９（ａ）に示すように、細胞ＣＥが播種されており、生体細胞観察システム１０は、図中の点線で示された矩形領域（観察エリアＭ）を観察するように予め設定されている。
また、合焦検出が行われる観察エリア（合焦観測エリアＦ）は、図９（ｂ）に示すように、間引いて設定されている。ここでは、スライドガラス１１６の四隅の観察エリアＭと、略中央の観察エリアＭの合焦検出が行われ、移動値が取得される。また、合焦観察エリアＦの合焦検出順序は、例えば左上隅、右上隅、略中央、左下隅、右下隅の順に行われる。
【００７７】
図１０（ａ）は、直線補間について説明するスライドガラス１１６の側面視図であり、図１０（ｂ）は、曲線補間について説明するスライドガラス１１６の側面視図である。
上述したように、５点の合焦観測エリアＦの移動値が取得されると、測定値に基づいて合焦検出が行われなかった観察エリアＭの移動値が算出される。算出には、直線補間を用いる算出方法と、曲線補間を用いる算出方法がある。
直線補間を用いる算出方法は、図１０（ａ）に示すように、合焦観測エリアＦの移動値（図中では○で示されている）の間を、直線（図中では実線で示されている）で補間することにより、合焦検出が行われなかった観察エリアＭの移動値が算出される。
曲線補間を用いる算出方法は、図１０（ｂ）に示すように、合焦観測エリアＦの移動値（図中では○で示されている）の間を、曲線（図中では実線で示されている）で補間することにより、合焦検出が行われなかった観察エリアＭの移動値が算出される。なお、算出に用いられる曲線としては、２次曲線でもよいし、３次曲線でもよく、特に限定されるものではない。
【００７８】
図１１は、マイクロプレート１２０における観察エリアおよび合焦観測エリアを示す図である。
マイクロプレート１２０を用いる場合には、図１１に示すように、細胞ＣＥを収めるウェル１２０Ｗが観察エリアＭとなる。また、合焦観測エリアＦは１つ飛ばしに設定されている。
このように合焦観測エリアＦを設定することにより、スライドガラス１１６よりも大きいマイクロプレート１２０であっても、合焦ズレの発生を防止することができるとともに、合焦ズレの量を減少させることができる。
【００７９】
また、全てのウェル１２０Ｗについて合焦検出を行う場合と比較して、一部のウェル１２０Ｗについて合焦検出を行い、合焦検出を行っていないウェル１２０ＷのＺ座標（移動値）は算出により求めたほうがオートフォーカス動作に要する時間を短縮することができる。なお、この合焦検出方法は、観察エリアＭ（ウェル１２０Ｗ）の数が多いほど時間短縮効果を発揮することができる。例えば、マイクロプレート１２０のウェル数は、一般に３８４ウェル以上であるため、オートフォーカス動作の時間短縮効果を発揮しやすくなる。
なお、上述の合焦検出方法では、合焦観測エリアＦを１つ飛ばしに設定しているが、２つ飛ばしに設定してもよいし、マイクロプレート１２０の４隅のウェル１２０Ｗのみを合焦観測エリアＦに設定してもよく、細胞ＣＥの観察時のマイクロプレート１２０の形状に応じて、その設定を変更することができる。
【００８０】
次に、細胞ＣＥの測定の流れを、図１２を参照しながら説明する。
図１２は、本実施の形態に係る測定の流れを説明するフローチャートである。
以下に述べる測定は、コンピュータＰＣにより制御駆動されている。まず、細胞ＣＥの観察が開始されると、Ｘ軸動作ステージ２２ＸおよびＹ軸動作ステージ２２Ｙが、測定位置に移動される（ＳＴＥＰ２１）。ここでは、予め設定された合焦観測エリアＦが対物レンズ４８上に位置するように移動される。
【００８１】
次に、対物レンズ４８が選択される（ＳＴＥＰ２２）。ここでは、レボルバ４７を回転させることにより、所定の対物レンズ４８を選択している。そして、フィルタ５６、５８が選択される（ＳＴＥＰ２３）。ここでは、観察に用いられる測定波長に合わせてフィルタ５６、５８が選択される。
その後、アクティブオートフォーカスが行われ（ＳＴＥＰ２４）、移動値が取得される（ＳＴＥＰ２５）。ここでは、合焦位置となる対物レンズ４８のＺ座標値（移動値）が取得される。
【００８２】
取得された移動値はコンピュータＰＣに保存され（ＳＴＥＰ２６）、予め設定された全ての合焦観測エリアＦの移動値を取得するまで上述の動作を繰り返す（ＳＴＥＰ２７）。
設定された合焦観測エリアＦの移動値取得が完了すると、コンピュータＰＣにより、合焦観測エリアＦ間の観察エリアＭの移動値が、直線補間または曲線補間により算出される（ＳＴＥＰ２８）。
【００８３】
その後、Ｘ軸動作ステージ２２ＸおよびＹ軸動作ステージ２２Ｙが、観測位置に移動される（ＳＴＥＰ２９）。ここでは、観察エリアＭが対物レンズ４８上に位置するように移動される。
そして、ＳＴＥＰ２５およびＳＴＥＰ２８により得られた移動値に基づいて対物レンズ４８が移動され（ＳＴＥＰ３０）、観察エリアＭにおける画像または蛍光量が取得・撮像される（ＳＴＥＰ３１）。
【００８４】
予め設定された観察エリアＭの観察が完了するまで、ＳＴＥＰ２９からＳＴＥＰ３１までの動作を繰り返し（ＳＴＥＰ３２）、全ての観察エリアＭの観察が完了すると、細胞ＣＥの観察が終了する。
【００８５】
細胞ＣＥの観察・撮像が終了すると、次には撮像された画像の処理が行われる。そこで、撮像された画像の処理方法について、図１３を参照しながら説明する。
図１３は、画像の処理方法を説明するフローチャートである。
まず、コンピュータＰＣの画像処理部は、メモリ部に蓄積された撮像画像から、背景画像を抽出する（ＳＴＥＰ７１）と共に、撮像画像から背景画像（バックグラウンド）を除去する（ＳＴＥＰ７２）。
次に、強調できる画像の最大輝度範囲を読み込み（ＳＴＥＰ７３）、最大輝度範囲に応じて、例えば所定係数を掛けて画像を強調する（ＳＴＥＰ７４）。これらの処理により、バックグラウンドを除去した画像から１つ１つの細胞ＣＥを粒状に認識し易いように画像が強調される。
【００８６】
そして、強調された画像から、例えば所定の閾値以上の輝度を有する部分を抽出することで、細胞ＣＥの１つ１つの輝度を明確な粒状として認識する（ＳＴＥＰ７５）。
次に、細胞ＣＥの重心位置や面積等の幾何学的特徴量や、化学的特徴量や、蛍光輝度等の光学的特徴量をより正確に認識するとともに、細胞ＣＥの位置情報とも関連付けて抽出する（ＳＴＥＰ７６）。これら特徴量を抽出することにより、１つ１つの細胞ＣＥを識別することができる。
細胞ＣＥの特徴量を抽出した後、細胞ＣＥを認識するために行った強調作業（ＳＴＥＰ７４）の補正を行う（ＳＴＥＰ７７）。この補正により、画像の強調のために用いられた所定係数の影響が除去される。
次に、補正後の特徴量を、例えばファイルに出力するとともにそのファイルに蓄積する（ＳＴＥＰ７８）。
【００８７】
そのため、コンピュータＰＣの画像処理部は、スライドガラス、マイクロプレートなどの全面の各位置における細胞ＣＥの蛍光量分布等を画像化することができる。また、画像処理部は、１つ１つの細胞ＣＥを正確に追跡可能であるので、例えば、所定の数の細胞ＣＥだけに注目し、培養を行いながら細胞ＣＥ内部の蛍光分布を局所的に長時間測定することも可能である。更に、細胞ＣＥを培養しながら、例えば、一定時間毎にスライドガラスや、マイクロプレートなどの全面を測定し、時間経過に対する細胞ＣＥの蛍光量を自動測定することも可能である。
【００８８】
次に、撮像画像から細胞ＣＥの特徴量などのデータが抽出された後に行われるデータ処理について、図１４を参照しながら説明する。
図１４は、データ処理の流れを説明するフローチャートである。
ここでは、コンピュータＰＣのデータ処理部によって、ファイル内に蓄積された細胞ＣＥのデータ（特徴量）の処理が行われる。
まず、データ処理部は、ファイル内に蓄積された細胞ＣＥの生データ（特徴量）を読み込む（ＳＴＥＰ８１）とともに、細胞ＣＥごとに時系列に並ぶようにデータの並べ替えが行われる（ＳＴＥＰ８２）。データが並べ替えられると、データ処理部は、細胞ＣＥごとに輝度、すなわち発現量の経時的変化をグラフ化する（ＳＴＥＰ８３）。
グラフ化が完了すると、データ処理部は、グラフをプレビュー表示し（ＳＴＥＰ８４）、グラフ化データをファイルに出力する（ＳＴＥＰ８５）。
【００８９】
この処理を行うことにより、細胞ＣＥを長期間培養した場合における１つの細胞の経時的変化を容易に観察することができる。従って、培養中の時間経過に伴う細胞ＣＥの発現量の変化等を正確、かつ容易に測定することができる。
【００９０】
次に、細胞ＣＥの測定時に行われる照射光量の調整について、図１５を参照しながら説明する。
図１５は、光量の調整の流れを説明するフローチャートである。
まず、細胞ＣＥに照射される照射光量が測定される（ＳＴＥＰ９１）。照射光量は、光量モニタ５０の出力から算出されてもよいし、照度計を設けて測定しても良いし、パワーメータを設けてパワーメータの出力から算出してもよい。
【００９１】
測定された照射光量が許容範囲内であれば、再び照射光量の測定（ＳＴＥＰ９１）に戻り、照射光量が許容範囲外になるまで繰り返される（ＳＴＥＰ９２）。
照射光量が許容範囲外になると、光量調整機構４３に含まれるＮＤフィルタ（図示せず）が交換され（ＳＴＥＰ９３）、照射光量が許容範囲内になるように調節される。その後、再び照射光量の測定（ＳＴＥＰ９１）に戻り、照射光量の調節が繰り返される。
【００９２】
次に、チャンバ１１０への培養液の補給・交換の制御方法を、図１６を参照しながら説明する。
図１６は、培養液の補給・交換方法を説明するフローチャートである。
まず、撮像された画像のバックグラウンド（背景）値が解析される（ＳＴＥＰ１０１）。撮像された画像のバックグラウンドには培養溶液の自家蛍光が撮像されており、この培養溶液の自家蛍光の輝度が解析される。
ここで、培養液は古くなるほど自家蛍光の輝度が高くなるため、自家蛍光の輝度を測定することにより、培養液の交換時期を検出することができる。
【００９３】
そして、解析されたバックグラウンド値の経時的変動が所定の規定値以内であれば、再びバックグラウンド値の解析（ＳＴＥＰ１０１）に戻り、バックグラウンド値の経時的変動が所定の規定値より大きくなるまで繰り返される（ＳＴＥＰ１０２）。
バックグラウンド値の経時的変動が所定の規定値より大きくなると、培養液の廃液ポンプ８２が駆動され（ＳＴＥＰ１０３）、次いで培養液の補給ポンプ８１が駆動される（ＳＴＥＰ１０４）。
【００９４】
なお、培養液の補給・交換の時期は、上述のように、培養液の自家蛍光により決定しても良いし、連続して行ってもよいし、予めユーザが指定した時間間隔で自動的に補給・交換を行っても良いし、予め登録されているテーブルから細胞ＣＥを選択することにより、適宜、培養液の交換時期を指定できるようにしてもよい。また、交換する量もユーザが設定しても良いし、培養液の自家蛍光により決定してもよいし、チャンバ１１０内の培養液を一括して全て交換してもよいし、予め登録されているテーブルから細胞ＣＥを選択することにより、適宜、培養液の交換量を指定できるようにしてもよい。
重量などで換算して自動で設定しても良い。
上述したような測定手順により、図１７に示すような、１つ１つの細胞の経時変化を表した細胞追跡画像を取得できる。
【００９５】
上記の構成によれば、観察エリアＭの観察を行う前に、合焦観測エリアＦに対してオートフォーカス動作を行い、その結果取得された移動値に基づいて観察エリアＭの観察を行うため、細胞ＣＥの観察に要する時間を短縮できるとともに、観察の高速化を図ることができる。
また、ヒータ２１Ｈ、４０Ｈ、１００Ｈにより、観察、合焦に係る構成要素の温度環境の変化による伸縮、変形を軽減、制御することにより、合焦位置のズレを防止または少なくすることができ、細胞ＣＥの正確な観察を実現することができる。
【００９６】
合焦観測エリアＦは観察エリアＭの一部であるため、全ての観察エリアＭに対してオートフォーカス動作を行う場合と比較して、オートフォーカス動作に要する時間を短縮することができる。
また、合焦観測エリアＦ以外の観察エリアＭには、オートフォーカス動作において光が照射されないため、例えば細胞ＣＥが光の照射により活性が落ちる細胞などの場合、細胞ＣＥの活性低下を防止することができる。
【００９７】
細胞ＣＥの観察に要する時間を短縮できるため、細胞ＣＥに対する光の照射時間を短縮することができる。例えば、細胞ＣＥが光の照射により活性が落ちる細胞の場合、細胞ＣＥの活性低下を抑制することができ、細胞ＣＥの正確な観察結果を得ることができる。
また、観察に要する時間を短縮できるため、マイクロプレート１２０のように多数の観察エリアＭを測定する場合において、最初の観察エリアＭを観察した時間と、最後の観察エリアＭを観察した時間との時間間隔を短くすることができ、観察により得られた情報同士を比較できる、正確な観察結果を得ることができる。
【００９８】
対物レンズ４８がマイクロプレート１２０またはチャンバ１１０を介して細胞ＣＥと対向配置されているため、細胞ＣＥをマイクロプレート１２０またはチャンバ１１０から取り出すことなく観察することができる。そのため、長時間にわたる観察においても、細胞ＣＥの活性が低下することを防止することができる。
【００９９】
合焦観測エリアＦ以外の観察エリアＭの移動値が、合焦観測エリアＦの移動値に基づいて算出されるため、全ての観察エリアＭについて、移動値に基づいた観察を行うことができる。そのため、算出を行わなかった場合と比較して、観察エリアＭの観察における合焦ズレの発生を防止することができる。または合焦ズレの量を少なくすることができる。
また、例えば平面度の悪いマイクロプレート１２０またはチャンバ１１０を用いて細胞ＣＥを観察する場合でも、算出を行うことにより全観察エリアＭについてオートフォーカス動作を行うことなく、合焦ズレの発生を防止、または合焦ズレの量を少なくすることができる。
【０１００】
〔第２の実施の形態〕
次に、本発明の第２の実施形態について図１８を参照して説明する。
本実施の形態の生体試料観察システムの基本構成は、第１の実施の形態と同様であるが、第１の実施の形態とは、タイムラプス観察を行っている点が異なっている。よって、本実施の形態においては、図１８を用いてタイムラプス観察の手順を説明し、生体試料観察システムの構成等の説明を省略する。
図１８は、本実施の形態におけるタイムラプス観察の手順を示すフローチャートである。
なお、第１の実施形態と同一の観察手順については、同一の符号を付してその説明を省略する。
【０１０１】
まず、細胞ＣＥの観察が開始されると、図１８に示すように、Ｘ軸動作ステージ２２ＸおよびＹ軸動作ステージ２２Ｙが、測定位置に移動される（ＳＴＥＰ２１）。
その後、アクティブオートフォーカスが行われ（ＳＴＥＰ２４）、移動値が取得される（ＳＴＥＰ２５）。
取得された移動値はコンピュータＰＣに保存され（ＳＴＥＰ２６）、予め設定された全ての合焦観測エリアＦの移動値を取得するまで上述の動作を繰り返す（ＳＴＥＰ２７）。
【０１０２】
その後、Ｘ軸動作ステージ２２ＸおよびＹ軸動作ステージ２２Ｙが、観測位置に移動される（ＳＴＥＰ２９）。
次に、対物レンズ４８が選択され（ＳＴＥＰ１１１）、フィルタ５６、５８が選択される（ＳＴＥＰ１１２）。
そして、コンピュータＰＣにより、合焦観測エリアＦ間の観察エリアＭの移動値が、直線補間または曲線補間により算出される（ＳＴＥＰ１１３）。
ＳＴＥＰ２５およびＳＴＥＰ１１３により得られた移動値に基づいて対物レンズ４８が移動され（ＳＴＥＰ１１４）、観察エリアＭにおける画像または蛍光量が取得される（ＳＴＥＰ１１５）。
【０１０３】
予め設定された観察エリアＭの観察が完了するまで、ＳＴＥＰ２９からＳＴＥＰ１１５までの動作を繰り返される（ＳＴＥＰ１１６）。
そして所定時間の経過後に、再びＳＴＥＰ２１に戻り、全合焦観測エリアＦの合焦測定、オートフォーカス動作を実施（ＳＴＥＰ２１からＳＴＥＰ２７）し、コンピュータＰＣに蓄積された移動値を更新する。そして、更新された移動値に基づいて細胞ＣＥの画像または蛍光量を取得する（ＳＴＥＰ１１７）。
タイムラプス観察にて設定された時間の間は、上述の手順を繰り返し（ＳＴＥＰ１１８）、観察を継続する。
【０１０４】
上記の構成によれば、インキュベータボックス１００内で細胞ＣＥを数日から数週間育成することができる。このため、細胞ＣＥを培養しながら長期間のタイムラプス観察を行うことができる。
タイムラプス観察を行う際には上述の手順によりオートフォーカス動作を行うことにより、全観察エリアＭの観察にかかる時間を短縮できる。
【０１０５】
なお、上述の手順のように、オートフォーカス動作の回数と、細胞ＣＥの観察動作の回数とが同数であって、オートフォーカス動作と細胞ＣＥの観察動作とが交互に配置されていてもよいし、オートフォーカス動作の回数が、細胞ＣＥの観察動作の回数よりも少なくてもよい。
例えば、具体的には、朝、昼、夕方、夜にオートフォーカス動作を行って移動値の更新を行い、オートフォーカス動作の間に、予め設定された所定の時間間隔で観察エリアＭの観察を行うことができる。
【０１０６】
また、コンピュータＰＣには、オートフォーカス動作により得られた最も新しい移動値、および算出により求められた最新の移動値が蓄積されているため、最新の移動値に基づいて観察エリアＭの観察を行うことができる。
そのため、検出ユニット２０の構成要素が熱変形などを起こし、観察エリアＭに対する合焦ズレが発生した場合でも、移動値を最新の値に更新しない場合と比較して、合焦のズレを少なくすることができる。
【０１０７】
なお、本発明の技術範囲は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更を加えることが可能である。
例えば、上記の実施の形態においては、細胞を観察する構成に適応して説明したが、細胞を観察する構成に限られることなく、細菌、微生物、卵などその他各種の生体試料を観察する構成に適応することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る生体試料観察システムを示す斜視図である。
【図２】同、生体試料観察システムのシステム構成を示す概略図である。
【図３】同、ＡＦユニット４６の構成を示す概略図である。
【図４】同、インキュベータボックスを示す斜視図である。
【図５】同、インキュベータボックスの他の例を示す斜視図である。
【図６】同、チャンバの断面図である。
【図７】同、走査方法および検出範囲の選択例を示す図である。
【図８】同、測定パラメータの設定の流れを示すフローチャートである。
【図９】同、スライドガラスの観察エリアおよび合焦測定エリアを示す図である。
【図１０】同、直線補間および曲線補間を示す図である。
【図１１】同、マイクロプレートの観察エリアおよび合焦測定エリアを示す図である。
【図１２】同、測定の流れを示すフローチャートである。
【図１３】同、画像の処理方法を示すフローチャートである。
【図１４】同、データ処理の流れを示すフローチャートである。
【図１５】同、光量の調整の流れを示すフローチャートである。
【図１６】同、培養液の補給・交換方法を示すフローチャートである。
【図１７】細胞の経時変化を表した細胞追跡画像を示す図である。
【図１８】本発明の第１の実施形態に係る測定の流れを示すフローチャートである。
【符号の説明】
【０１０９】
１０  生体試料観察システム
２１Ｈ、４０Ｈ、１００Ｈ  ヒータ（温度維持部）
２２  ステージ（保持手段）
２２Ｘ  Ｘ軸動作ステージ（保持手段）
２２Ｙ  Ｙ軸動作ステージ（保持手段）
４６  ＡＦユニット（オートフォーカス部）
４８  対物レンズ
５９  対物レンズ制御部（焦準駆動部）
４９  検出器（観察手段）
１００  インキュベータボックス（培養容器）
１１０  チャンバ（培養容器）
ＣＥ  細胞（生体試料）
ＰＣ  コンピュータ（焦準駆動制御部）
【図１】
2006003653.tif 000003
【図２】
2006003653.tif 000004
【図３】
2006003653.tif 000005
【図４】
2006003653.tif 000006
【図５】
2006003653.tif 000007
【図６】
2006003653.tif 000008
【図７】
2006003653.tif 000009
【図８】
2006003653.tif 000010
【図９】
2006003653.tif 000011
【図１０】
2006003653.tif 000012
【図１１】
2006003653.tif 000013
【図１２】
2006003653.tif 000014
【図１３】
2006003653.tif 000015
【図１４】
2006003653.tif 000016
【図１５】
2006003653.tif 000017
【図１６】
2006003653.tif 000018
【図１７】
2006003653.tif 000019
【図１８】
2006003653.tif 000020