(57)【要約】【課題】  Ｄ−キロ−イノシトールを製造する方法において、安価で効率的に製造できる方法を提供することを課題とする。【解決手段】  イノシトール代謝系遺伝子群において、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子（ｉｏｌＥ遺伝子）の機能と、イノシトール代謝系遺伝子群のリプレッサータンパク質をコードする遺伝子（ｉｏｌＲ遺伝子）の機能とを破壊した２重変異を有する微生物を、ミオ−イノシトールを含有する培養液で培養する工程を含む、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イノシトール代謝系遺伝子群において、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子（ｉｏｌＥ遺伝子）の機能と、イノシトール代謝系遺伝子群のリプレッサータンパク質をコードする遺伝子（ｉｏｌＲ遺伝子）の機能とを破壊した２重変異を有する微生物を、ミオ−イノシトールを含有する培養液で培養する工程を含む、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法。
【請求項２】
前記培養する工程で得られた培養ろ液から微生物を除去する工程と、
微生物を除去した培養ろ液からＤ−キロ−イノシトールを単離する工程と
をさらに含む請求項１に記載のＤ−キロ−イノシトール製造方法。
【請求項３】
前記遺伝子の機能を破壊する前の微生物が、Ｄ−キロ−イノシトールを代謝分解する能力を有する、請求項１または２に記載のＤ−キロ−イノシトール製造方法。
【請求項４】
前記遺伝子の機能の破壊が、物理的及び／又は化学的変異誘発処理または、相同組換えによる一又は複数の塩基の挿入、欠失、及び／又は置換によりなされる、請求項１〜３のいずれかに記載のＤ−キロ−イノシトール製造方法。
【請求項５】
前記微生物が、２重変異枯草菌株（ＹＦ２５６株、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２８６）である、請求項１〜４のいずれかに記載のＤ−キロ−イノシトール製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それ自体が生物活性を有し、ＩＩ型糖尿病に改善効果を有するＤ−キロ−イノシトール（Ｄ−ｃｈｉｒｏ−Ｉｎｏｓｉｔｏｌ、またはＤＣＩ）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−キロ−イノシトールは、経口的、または非経口的に投与されると、細胞内情報伝達を活性化するイノシトールリン脂質系に作用して、ＩＩ型糖尿病に改善効果をもたらすこと（特許文献１参照）、および、多嚢胞性卵巣症候群に改善効果をもたらすこと（特許文献２参照、非特許文献１参照）が提唱されている物質である。Ｄ−キロ−イノシトールは機能的には、広範な代謝系疾患に関与すると考えられ、今後、その適応が拡大する可能性が期待される物質である。
【０００３】
Ｄ−キロ−イノシトールは、９種類あるイノシトール立体異性体の一つであり、動植物中に広く存在する。ヒト血中にも微量存在することが知られている物質である。その製造方法は、これまで、抗生物質であるカスガマイシンの加水分解により製造する方法（特許文献３参照、特許文献４参照、特許文献５参照、特許文献６参照）、マメ科植物に含有されるＤ−ピニトールを加水分解してＤ−キロ−イノシトールを製造する方法（特許文献７参照、特許文献８参照、特許文献９参照）、有機合成によりＤ−キロ−イノシトールを製造する方法（特許文献１０参照、特許文献１１参照、特許文献１２参照、特許文献１３参照）、微生物をミオ−イノシトールに作用させることにより、ミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールへ変換させるＤ−キロ−イノシトールの製造方法（特許文献１４参照）などが知られている。
【０００４】
しかしながら、カスガマイシンやＤ−ピニトールを出発原料とする場合、これらの物質が高価であり、また、有機合成により製造する場合も収率および光学純度が低く、最終産物であるＤ−キロ−イノシトールは高価なものになる。さらに、ミオ−イノシトールに微生物を作用させてＤ−キロ−イノシトールへ変換させる反応は、変換の制御が困難であり、微生物自体の代謝により、他の代謝産物も同時に生産されるため、精製が困難である。
【０００５】
また、近年、アグロバクテリウム属に属し、且つ、ミオ−イノシトールをＤ−キロ−イノシトールに変換できる構成酵素としてのＤ−ミオ−イノシトール  １−エピメラーゼを生産できる能力を有する微生物を利用して、ミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールを製造する方法が知られている（特許文献１５参照、特許文献１６参照）。しかしながら、その細菌を培養しながらミオ−イノシトールに作用させて、Ｄ−キロ−イノシトールに変換する方法では、酵素活性が低く、短時間で変換させることが困難であり、そのため、現実的な製造は困難である。
【０００６】
【特許文献１】特表平４−５０５２１８号公報
【特許文献２】米国特許第５９０６９７９号明細書
【特許文献３】米国特許第５０９１５９６号明細書
【特許文献４】米国特許第５４６３１４２号明細書
【特許文献５】米国特許第５７１４６４３号明細書
【特許文献６】米国特許第６３４２６４５号明細書
【特許文献７】米国特許第５８２７８９６号明細書
【特許文献８】ＷＯ０１／０８７８１号パンフレット
【特許文献９】特開２００１−２６１６００号公報
【特許文献１０】米国特許第５４０６００５号
【特許文献１１】ＷＯ９６／２５３８１号パンフレット
【特許文献１２】特表平８−５０２２５５号公報
【特許文献１３】特開平１１−２８００６８号公報
【特許文献１４】特開平９−１４０３８８号公報
【特許文献１５】特開２００１−８６９４号
【特許文献１６】ＷＯ０２／０５５７１５号パンフレット
【特許文献１７】特開平０５−１９２１６３号公報
【非特許文献１】「ザ  ニュウイングランド  ジャーナル  オブ  メディスン（Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」（アメリカ）、Ｊ．  Ｅ．  Ｎｅｓｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ、１９９９年、３４０巻、１３１４頁
【非特許文献２】「ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」（アメリカ）、２５４巻、７６８４〜７６９０頁（１９７９年）
【非特許文献３】「アーカイブス  オブ  バイオケミストリー  アンド  バイオフィジィックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）」（アメリカ）、Ｊ．  Ｌａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ、６０巻、３５２−３６３頁（１９５６年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
Ｄ−キロ−イノシトールを、安価で効率的に製造できる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、枯草菌のミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ（ｉｏｌＧ遺伝子由来酵素）とシロ−イノソースイソメラーゼ（ｉｏｌＩ遺伝子由来酵素）を混在させた酵素反応系を、ミオーイノシトールに作用させると、Ｄ−キロ−イノシトールを得ることができることに注目した。そして、これらの酵素を過剰に発現させ、かつ、代謝系分解酵素が作用しない枯草菌を用いることにより、ＮＡＤの添加を必要とせずに、より効率的な、培養変換を利用したＤ−キロ−イノシトールの製造が可能と考え、前記課題を解決するために、遺伝子操作を用いてＤ−キロ−イノシトールを製造する方法を鋭意検討した。
【０００９】
本発明者らは、これまでに枯草菌において、ミオ−イノシトール代謝系遺伝子群にコードされる酵素が、どのようにして、ミオ−イノシトールを代謝するのかを解明することに成功した（Ｋｅｎ−ｉｃｈｉ  Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ ａｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５０巻、５７１〜５８０頁（２００４年））。その結果、ミオ−イノシトール  ２−デヒドロゲナーゼ（ｉｏｌＧ遺伝子由来酵素）とシロ−イノソースイソメラーゼ（ｉｏｌＩ遺伝子由来酵素）は、Ｄ−キロ−イノシトールを代謝分解するために、必要であることが推測された。
【００１０】
さらに、上記ミオ−イノシトール  ２−デヒドロゲナーゼ反応に続く代謝系２段階目反応の酵素である２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子（ｉｏｌＥ遺伝子）を薬剤変異により破壊した株において、イノシトール代謝系遺伝子群のリプレッサータンパク質をコードする遺伝子（ｉｏｌＲ遺伝子）を相同組換えによって薬剤耐性マーカー（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を挿入して破壊した２重変異枯草菌株（ＹＦ２５６株）を作成することに成功した。本菌株作成についての詳細は、Ｋｅｎ−ｉｃｈｉ  Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ ａｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５０巻、５７１〜５８０頁（２００４年）に記載されている通りである。
【００１１】
そして、この枯草菌株（名称  Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＹＦ２５６株）を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２８６の受領番号で寄託した（受領日、２００４年１１月４日）。
【００１２】
また、このようにして２重変異操作された枯草菌株（ＹＦ２５６株）では、イノシトール代謝系遺伝子群の転写抑制が常に解除された状態となり、従ってミオ−イノシトール代謝系酵素群が構成的に発現すること、当該菌株がミオ−イノシトールを代謝分解しない（Ｄ−２，３−ジケト−４−デオキシ−エピ−イノシトールに変換せず、結果的に代謝分解しない）ことを確認し、そして、当該菌株をミオ−イノシトールを含む培養液で培養するとＤ−キロ−イノシトールへ変換されることを発見して、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法であって、イノシトール代謝系遺伝子群において、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子（ｉｏｌＥ遺伝子）の機能と、イノシトール代謝系遺伝子群のリプレッサータンパク質をコードする遺伝子（ｉｏｌＲ遺伝子）の機能とを破壊した２重変異を有する微生物を、ミオ−イノシトールを含有する培養液で培養する工程を含む。
【００１４】
前記培養する工程で得られた培養ろ液から微生物を除去する工程と、微生物を除去した培養ろ液からＤ−キロ−イノシトールを単離する工程とをさらに含むことが好ましい。
【００１５】
前記遺伝子の機能を破壊する前の微生物が、Ｄ−キロ−イノシトールを代謝分解する（酸化して、Ｄ−キロ−イノソースとし、さらにシロ−イノソースを経由して代謝分解される）能力を有することが好ましい。
【００１６】
前記遺伝子の機能の破壊が、物理的及び／又は化学的変異誘発処理または、相同組換えによる一又は複数の塩基の挿入、欠失、及び／又は置換によりなされることが好ましい。
【００１７】
前記微生物が、２重変異枯草菌株（ＹＦ２５６株、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２８６）であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、ＩＩ型糖尿病に改善効果をもたらすこと、および、多嚢胞性卵巣症候群に改善効果をもたらすことが提唱されている物質であるＤ−キロ−イノシトールを、効率良く製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、一実施の形態によれば、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法であって、イノシトール代謝系遺伝子群において、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子（ｉｏｌＥ遺伝子）の機能と、イノシトール代謝系遺伝子群のリプレッサータンパク質をコードする遺伝子（ｉｏｌＲ遺伝子）の機能とを破壊した２重変異を有する微生物を、ミオ−イノシトールを含有する培養液で培養する工程を含む。
【００２０】
本実施形態において２重変異操作の対象となる微生物としては、イノシトール代謝酵素が、群を成して存在する（代謝系遺伝子群、または、オペロン）ものを用いることができる。このようなイノシトール代謝系遺伝子群を形成することが知られる微生物としては、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に属する菌が挙げられる。全塩基配列が知られているためである。しかし、イノシトール代謝系遺伝子群を形成することが知られる微生物は、バチルス属、ラルストニア属、サルモネラ属には限定されない。特には、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましく用いられる。
【００２１】
また、２重変異操作の対象となる微生物としては、塩基配列が知られていない微生物であっても、少なくとも、ミオ−イノシトールと、Ｄ−キロ−イノシトールを、どちらも代謝分解する能力を有する微生物を用いることもできる。このような微生物としては、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）に属する菌が挙げられる。クリプトコッカス属、エンテロバクター属、リゾビウム属、シノリゾビウム属などの微生物も同様なイノシトール代謝系遺伝子群を形成することが予想することができるため、利用することが可能である。
【００２２】
本実施形態において、２重変異操作による破壊対象となる目的の遺伝子は、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子（ｉｏｌＥ遺伝子）と、イノシトール代謝系遺伝子群のリプレッサータンパク質をコードする遺伝子（ｉｏｌＲ遺伝子）とである。
【００２３】
ここで、本発明のミオ−イノシトール代謝系遺伝子群にコードされる重要な３つの酵素の作用について説明する。ミオ−イノシトール  ２−デヒドロゲナーゼは、ｉｏｌＧ遺伝子にコードされるミオ−イノシトール代謝の初発酵素であり、ミオ−イノシトール以外にもＤ−キロ−イノシトールに作用し、ＮＡＤ依存の酸化反応により、それぞれ、シロ−イノソース（別名２−ケト−ミオ−イノシトール）、Ｄ−キロ−１−イノソースへ変換する。また、シロ−イノソースイソメラーゼは、ｉｏｌＩ遺伝子にコードされ、シロ−イノソースとＤ−キロ−１−イノソースを相互変換（異性化）する酵素である。２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼは、ｉｏｌＥ遺伝子にコードされ、シロ−イノソースを脱水し、Ｄ−２，３−ジケト−４−デオキシ−エピ−イノシトールへ変換する酵素である。
【００２４】
これらの酵素と物質の関係を図で示すと以下の様になる。
【表１】
2006141216.tif 000002
【００２５】
イノシトール代謝系遺伝子群にコードされる酵素としては、他に、Ｄ−２，３−ジケト−４−デオキシ−エピ−イノシトールをさらに代謝する酵素を含む。しかし、Ｄ−２，３−ジケト−４−デオキシ−エピ−イノシトールが生成しない場合（例えば、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ活性がない場合）、Ｄ−２，３−ジケト−４−デオキシ−エピ−イノシトールの代謝は行なわれず、ミオ−イノシトール、Ｄ−キロ−イノシトール、シロ−イノソース、Ｄ−キロ−１−イノソースの４物質の平衡状態に達する。つまり、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ活性がない場合、過剰にミオ−イノシトールを含む培養液では、Ｄ−キロ−イノシトールを生成する反応が進行する。
【００２６】
しかし、上述したイノシトール代謝系遺伝子群は、培養液にミオ−イノシトールが含まれていても、グルコースなどの糖を同時に含む培地を用いる場合、ほとんど、転写レベルで発現しないことが知られている（Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｋ．  ｅｔ ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓａｒｃｈ、２９巻、６８３〜６９２頁（２００１年））。そのため、通常の培養では、上述した酵素の活性は非常に低く、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ活性がない場合でも、ミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールへの変換反応はほとんど進行しない。
【００２７】
いっぽう、イノシトール代謝系遺伝子群の遺伝子上の上流にある転写制御タンパク（ｉｏｌＲ遺伝子にコードされるリプレッサータンパク質）に、Ｄ−２，３−ジケト−４−デオキシ−エピ−イノシトール以降に存在するイノシトール代謝中間体（恐らくは２−デオキシ５−ケト−Ｄ−グルクロン酸６−リン酸）がインデューサーとして作用して、イノシトール代謝系遺伝子群の転写抑制が解除され、この代謝系遺伝子群の酵素が翻訳誘導されることが知られている（Ｋｅｎ−ｉｃｈｉ  Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ ａｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５０巻、５７１〜５８０頁（２００４年））。しかし、逆に、ｉｏｌＲ遺伝子を破壊することによっても、イノシトール代謝系遺伝子群の転写抑制が解除され、この代謝系遺伝子群が構成的に発現することが、実験的に示されている（Ｋｅｎ−ｉｃｈｉ  Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ ａｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２８５巻、９１７〜９２９頁（１９９９年））。
【００２８】
これらのことから、イノシトール代謝系遺伝子群のうち、ｉｏｌＥ遺伝子の機能とｉｏｌＲ遺伝子の機能とを破壊し、ｉｏｌＩ遺伝子の機能とｉｏｌＧ遺伝子の機能とを保持した菌株を、ミオ−イノシトールを含む培地で培養することにより、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼを発現させることなく、かつ転写抑制を解除した状態で、シロ−イノソースイソメラーゼとミオ−イノシトール  ２−デヒドロゲナーゼとを生合成させることができると考えられる。すなわち、好ましくない反応であるミオ−イノシトールの代謝分解を生じさせることなく、ミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールへの反応を促進することができるのである。
【００２９】
目的の遺伝子の破壊方法は、通常の微生物の変異方法が使用できる。例えば、物理的及び／又は化学的変異誘発処理では、ＵＶ照射、放射線照射などの物理的変異方法の他、Ｎニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル、亜硝酸、メタンスルホン酸メチル、アクリジン色素、ベンゾピレン、硫酸ジメチルなどの変異剤の混合による化学的変異方法が例示される。これらの変異処理は、遺伝子上で塩基の挿入、欠失及び／又は置換が期待される方法である。変異処理においては、遺伝子が破壊される限り、一個の塩基を挿入、欠失及び／又は置換してもよく、複数個の塩基を挿入、欠失、及び／又は置換してもよい。
【００３０】
また、変異処理を施した微生物からの目的の菌を得る方法としては、ミオ−イノシトールの代謝分解能力の欠失を指標にした選抜方法、グルコース添加培地中で生育した菌のイノシトール代謝酵素活性の高さを指標にした選抜方法が挙げられる。これらの選抜方法により、シロ−イノソースイソメラーゼ活性と、ミオ−イノシトール  ２−デヒドロゲナーゼ活性を保持した菌株を選抜することができる。
【００３１】
さらに、目的の遺伝子の別の破壊方法として、相同組換えによる塩基の挿入、欠失及び／又は置換を行なう方法がある。相同組換え法では、人為的に塩基の挿入、欠失及び／又は置換を施した目的の遺伝子と同じ配列を部分的に有する塩基配列を導入し、相同組換えによって変異を行なう方法である。例えば、薬剤耐性遺伝子であるクロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などを挿入した塩基配列を導入した後、相当する薬剤で選抜し、生存する菌を得る方法である。さらに、望むべき部分に挿入されたことをＰＣＲなどの機器を用いて確認することによって、目的の菌を得ることが可能である。
【００３２】
なお、ここで、遺伝子機能の破壊とは、突然変異の導入、又は相同組み換えにより、当該遺伝子の転写を抑制し、又は当該遺伝子にコードされるタンパク質の機能を破壊することをいう。
【００３３】
上記遺伝子の破壊方法を用いて、ｉｏｌＥ遺伝子の機能とｉｏｌＲ遺伝子の機能とを破壊した、２重変異を有する微生物を製造し、選抜する具体的なプロトコルについては、Ｋｅｎ−ｉｃｈｉ  Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ ａｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５０巻、５７１〜５８０頁（２００４年）に詳細に記載されている。かかる文献に開示されたプロトコルにより製造されたのは、２重変異操作された枯草菌株（ＹＦ２５６株、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２８６）であるが、当業者であれば、かかる開示にしたがって、上述のような他の微生物を２重変異操作することができると考えられる。
【００３４】
二重変異菌株を用いてミオ-イノシトールからＤ−キロ−イノシトールへ変換する方法は、ミオ−イノシトールを含有する培養液で、２重変異を有する微生物を培養すれば良い。培地の組成は、目的に達する限り何ら特別の制限はなく、Ｄ−キロ−イノシトールへの変換原料であるミオ−イノシトールに加えて、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含有する培地であればよく、合成培地又は天然培地のいずれも使用できる。
【００３５】
より具体的には、培地全体の重量に対し、ミオ−イノシトールを０．１重量％〜４０重量％、より好ましくは１重量％〜３０重量％添加し、炭素源としては、グリセロール、シュークロース、マルトースあるいは澱粉を０．１重量％〜２０重量％、より好ましくは０．３重量％〜５重量％、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムあるいは尿素等を０．０１重量％〜５．０重量％、好ましくは０．５重量％〜２．０重量％添加するのが望ましい。
【００３６】
その他、必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸などのイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することができる。無機塩類の添加量は、当業者が任意に決定することができる。
【００３７】
培養液中の水素イオン濃度は特に調整する必要は無いが、好ましくはｐＨ４〜１０、より好ましくはｐＨ５〜９に調整し培養することができる。かかるｐＨで効率よくＤ−キロ−イノシトールを得ることができるためである。
【００３８】
培養条件は、菌の種類によっても異なるが、培養温度は１２〜４５℃、好ましくは２７〜４０℃とすることができる。また、培養は液体培地を振とうしたり、液体培地中に空気あるいは酸素ガスを吹き込むなどして好気的に行えば良い。培養期間は、Ｄ−キロ−イノシトールが最大または、必要量の蓄積量を示すまで行えば良く、通常１〜７日、好ましくは１〜２日である。
【００３９】
培養液から目的物を採取する方法は、通常の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用することができる。すなわち、培養液から菌体を除去した後、培養上清液を活性炭やイオン交換樹脂等で処理することにより、イノシトール類以外の不純物をほとんど除くことができる。その後、再結晶等の方法を用いることにより、目的物質を単離することができる。
【００４０】
具体的には、菌体などの不溶物は、遠心分離や膜分離などの一般的に使用される不溶物除去方法によって除去することができる。そして、菌体などの不溶物が除去された溶液は、液中に存在するミオ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトール以外のイオン性の物質を除去する目的で、イオン交換樹脂を用いて精製することができる。この際に使用されるイオン交換樹脂は、強塩基性イオン交換樹脂、又は弱塩基性イオン交換樹脂の何れか１つ、もしくは、強塩基性イオン交換樹脂と弱塩基性イオン交換樹脂との混合物と、強酸性イオン交換樹脂、又は弱酸性イオン交換樹脂の何れか１つ、もしくは、強酸性イオン交換樹脂と弱酸性イオン交換樹脂との混合物が使用できる。イオン交換樹脂の作用のさせ方は、カラム状に詰めたイオン交換樹脂中に溶液を通す方法も使用できるが、バッチ式で攪拌混合し、ろ過することで脱塩することも可能である。
【００４１】
さらに、溶液に色素が混入した場合、活性炭を用いて脱色させることが可能である。活性炭の作用のさせ方は、カラム状に詰めた活性炭中に溶液を通す方法も使用できるが、バッチ式で攪拌混合し、ろ過することで脱色することも可能である。活性炭を用いて脱色することは、Ｄ−キロ−イノシトールの再結晶化前に行うことが好ましい。
【００４２】
このようにして調製された溶液中には、ミオ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトールのみが含まれる。
【００４３】
再結晶を行う際には、ミオ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトールを含む溶液を濃縮するだけで、選択的にミオ−イノシトールだけを析出させることが可能であるが、より効率的には、ミオ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトールを含む溶液に、水と混和する有機溶媒を添加した後に該溶液を濃縮することが好ましい。かかる操作により、ミオ−イノシトールのみをさらに析出させて、Ｄ−キロ−イノシトール含量を上げることができるためである。加える有機溶媒は水と混和すれば特に限定されないが、好ましくは、イソプロパノール、またはｎ−プロパノールが選択的にミオ−イノシトールの析出を促すために利用できる。
【００４４】
カラムクロマトグラフィーによる精製を行なう場合は、強塩基性イオン交換樹脂カラムにてＤ−キロ−イノシトールとミオ−イノシトールとを相互に分けることが可能である。その場合、Ｄ−キロ−イノシトールとミオ−イノシトールのみを含有する溶液を強塩基性イオン交換樹脂（ＯＨ-タイプ）カラムに加え、水で溶出させ、分画することによって、先に溶出するミオ−イノシトールと、後に溶出するＤ−キロ−イノシトールを分けて、Ｄ−キロ−イノシトールを含む画分を濃縮することによって、高純度のＤ−キロ−イノシトールを得ることができる。
【００４５】
上記の様に、Ｄ−キロ−イノシトールを、ミオ−イノシトールとの混合物から単離する方法としては、カラムクロマトグラフィーを用いた分離方法と、結晶化による分離方法を使用することができ、またこれらの方法を組み合わせることもできる。
【実施例１】
【００４６】
２重変異枯草菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓＹＦ２５６株、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０２８６））によるＤ−キロ−イノシトールの製造
ＬＢ寒天培地のスラントで継代維持したＹＦ２５６株を、クロラムフェニコール１０ｐｐｍ含有する変換用液体培地（１重量％ペプトン、０．５重量％酵母抽出物、０．５重量％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）１０ｍｌに１白金耳移植し、好気条件で、３６℃で、７時間培養した。培養後、あらかじめミオ−イノシトール１重量％を含有する上記と同組成の変換用液体培地を１００ｍｌずつ入れた５００ｍｌ容坂口フラスコ６０本のそれぞれに、上記の培養後の液体培地（１０ｍｌ）から０．１ｍｌずつとって加え、同様に好気条件で振幅１２０ｒｐｍ、３６℃で、４５時間培養した。
【００４７】
この培養溶液を経時的にサンプリングし、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、培養２７時間目には、ミオ−イノシトールの９．３％がＤ−キロ−イノシトールになった時点で変換は停止した（最大の変換値は平衡値である１４％）。また、ＨＰＬＣ面積から、ミオ−イノシトールと、Ｄ−キロ−イノシトールの総計値はほとんど、減少しておらず、代謝分解は認められなかった。
【００４８】
培養終了後、培養液を集め、遠心分離し、上清（約５．８Ｌ）を強酸性陽イオン交換樹脂１Ｌ（Ｄｕｏｌｉｔｅ−Ｃ２０（Ｈ+タイプ））カラム、強塩基性陰イオン交換樹脂１．５Ｌ（Ｄｕｏｌｉｔｅ−Ａ１１６（ＯＨ-タイプ））カラム、活性炭２００ｍｌカラムを連続的に通過させた。その後、蒸留水３．０Ｌを３つのカラムに通過させ、カラム内に残留するイノシトール類を溶出し、脱塩精製した。次に、得られた透明な溶液（約８．８Ｌ）を、エバポレーターを用いて、約２００ｍｌまで、減圧濃縮し、これに２００ｍｌのイソプロパノールを加えた。この操作で液体中に存在する大半のミオ−イノシトールは析出した。
【００４９】
さらに、ろ過により固液分離を行ない、ろ液を濃縮し、１７．２ｇの固体を得た。ＮＭＲによる分析では、この固体は、Ｄ−キロ−イノシトール：ミオ−イノシトール＝４５：５５（モル比）の混合結晶であった。
【００５０】
混合結晶からのＤ−キロ−イノシトールの単離は、次のようにして行った。混合結晶１７．２ｇに４０ｍｌの水を加え、溶解した。これを強塩基性陰イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＣＧ−４００（ＯＨ-タイプ）３Ｌを充填したカラム（内径５．５ｃｍ、長さ８５ｃｍ）に供し、さらに蒸留水で溶出し、溶出液を分画して集めた。Ｄ−キロ−イノシトールを含む画分を集め、これらを減圧下で濃縮した。濃縮液１５ｍｌに室温でエタノール３０ｍｌを加え、混合し、徐々に放熱するとともに、結晶を析出させた。結晶を乾燥し、Ｄ−キロ−イノシトール７．６ｇを得た。このようにして得られたＤ−キロ−イノシトールの物理的性質は、比旋光度［α］D25が＋６５℃（Ｃ＝１．０、Ｈ2Ｏ）であり、光学純度９９％以上、融点２３８℃であり、Ｄ−キロ−イノシトール純品を得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本方法による、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法は、天然から微量にしか摂取することができないＤ−キロ−イノシトールを純度良く製造することができ、産業上有用である。
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月1日(2004.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
前記微生物が、２重変異枯草菌株（ＹＦ２５６株、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０２８６）である、請求項１〜４のいずれかに記載のＤ−キロ−イノシトール製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
そして、この枯草菌株（名称  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＹＦ２５６株）を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０２８６の受託番号で寄託した（受領日、２００４年１１月４日）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
前記微生物が、２重変異枯草菌株（ＹＦ２５６株、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０２８６）であることが好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
上記遺伝子の破壊方法を用いて、ｉｏｌＥ遺伝子の機能とｉｏｌＲ遺伝子の機能とを破壊した、２重変異を有する微生物を製造し、選抜する具体的なプロトコルについては、Ｋｅｎ−ｉｃｈｉ  Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５０巻、５７１〜５８０頁（２００４年）に詳細に記載されている。かかる文献に開示されたプロトコルにより製造されたのは、２重変異操作された枯草菌株（ＹＦ２５６株、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０２８６）であるが、当業者であれば、かかる開示にしたがって、上述のような他の微生物を２重変異操作することができると考えられる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
２重変異枯草菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓＹＦ２５６株、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０２８６））によるＤ−キロ−イノシトールの製造
ＬＢ寒天培地のスラントで継代維持したＹＦ２５６株を、クロラムフェニコール１０ｐｐｍ含有する変換用液体培地（１重量％ペプトン、０．５重量％酵母抽出物、０．５重量％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）１０ｍｌに１白金耳移植し、好気条件で、３６℃で、７時間培養した。培養後、あらかじめミオ−イノシトール１重量％を含有する上記と同組成の変換用液体培地を１００ｍｌずつ入れた５００ｍｌ容坂口フラスコ６０本のそれぞれに、上記の培養後の液体培地（１０ｍｌ）から０．１ｍｌずつとって加え、同様に好気条件で振幅１２０ｒｐｍ、３６℃で、４５時間培養した。