(57)【要約】  【課題】  分子量3000以上で且つ低極性の分子もイオン化することができると共に、タンパク質複合体をほとんど解離させることなくイオン化及び質量分析することのできる質量分析装置を提供する。  【解決手段】  複数の波長のパルス光を発生する光源部と、光源部からの光を試料に照射することにより試料分子をイオン化するイオン化部１６と、イオン化部１６において生成されたイオンを電荷質量比に応じて分離する質量分析部１８とを備える質量分析装置とする。光源部としては、第１に、互いに異なる波長の超短光パルスレーザ光を発する複数の超短光パルスレーザ光源１１ａ〜１１ｄを含むもの、第２に、超短光パルスから生成される白色連続スペクトル光を分光することにより、近赤外線から紫外線領域の複数の波長を含む超短パルス光を発生するもの、を用いることができる。【選択図】  図１
2006003167.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の波長のパルス光を発生する光源部と、
該光源部からの光を試料に照射することにより試料分子をイオン化するイオン化部と、
イオン化部において生成されたイオンを電荷質量比に応じて分離する質量分析部と、
を備えることを特徴とする生体試料分析用質量分析装置。
【請求項２】
上記光源部が、互いに異なる波長の超短光パルスレーザ光を発する複数の超短光パルスレーザ光源を含むことを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析用質量分析装置。
【請求項３】
上記光源部が、超短光パルスをターゲット物質に照射することにより生成される白色連続スペクトル光を分光し、所定の波長のパルス光のみを取り出すものであることを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析用質量分析装置。
【請求項４】
上記光源部が、超短光パルスをフォトニック結晶ファイバーに通すことにより生成される白色連続スペクトル光を分光し、所定の波長のパルス光のみを取り出すものであることを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析用質量分析装置。
【請求項５】
複数のパルス光を取り出す際、それらを波長毎に時間的にずらせる波長パルス分離機構を有することを特徴とする請求項２又は４に記載の生体試料分析用質量分析装置。
【請求項６】
異なる波長の超短光パルスの組を複数設け、分析のシーケンスに応じて該組のうちのいずれかを照射することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の生体試料分析用質量分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ脱離イオン化法を用いた質量分析装置に関する。本発明に係る質量分析装置は、特に、タンパク質やペプチド、タンパク質複合体等の解析に適している。
【背景技術】
【０００２】
近年、ポストゲノム研究として遺伝子産物であるタンパク質の網羅的解析を目指したプロテオミクス研究が盛んに行われており、タンパク質の発現、機能、構造の点から種々の研究が進められている。タンパク質は、細胞の増殖、分化、アポトーシスなど、ほぼ全ての生命活動において、他の分子（タンパク質・核酸等）と非共有結合（水素結合、イオン結合、及び疎水性相互作用）による相互作用を行うことでその機能を発揮している。従って、タンパク質の機能を解明するためには、個々のタンパク質がどのような分子と相互作用するかを知ることが重要となる。
【０００３】
近年の質量分析装置の著しい進歩に伴い、タンパク質、核酸等の生体分子の同定や構造解析において質量分析は欠かせない解析手法となっている。これらの生体分子の質量分析による解析には、MALDI-TOFMS（Matrix Assisted Laser Desorption／Ionization - Time Of Flight mass spectrometry：マトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間型質量分析装置）やFAB-MS（Fast Atom Bombardment-MS：高速原子衝撃質量分析装置）が威力を発揮する。MALDI法は、解析対象サンプルをマトリックスと呼ばれる化合物と混合し、パルスレーザ光を照射することでイオン化する方法であり、レーザ光を吸収したマトリックスが急速に加熱され気化するのに伴って、サンプル分子が脱着及びイオン化される。すなわち、MALDI法はマトリックスの吸収したエネルギーをサンプルが間接的に受け取ることによるソフトなイオン化法であり、そのため巨大分子を断片化することなくイオン化することが可能となる。MALDI法には、一般に波長337nmの窒素レーザが使用され、当該波長を吸収する物質がマトリックスとして用いられる。
【０００４】
MALDI-TOFMS及びFAB-MSは共に、難揮発性物質の分析に効果を発揮しているが、FAB-MSと比較した場合のMALDI-TOFの特徴は、親水性巨大分子をイオン化することができるという点にある。これにより、MALDI-TOFMSはタンパク質、ペプチドの分子量測定等に威力を発揮している。一方、MALDI-TOFMSは低極性分子のイオン化が困難であるという欠点を持つ。これは、マトリックスとの親水的ななじみが悪いため、水素付加等の効率が悪いことが原因である。FAB-MSではグリセリン様の粘度の高いマトリックスを使用するため、この高粘性が低極性分子を捉え、H+を付加することにより、低極性分子も比較的容易にイオン化することができる。
【０００５】
【特許文献１】特開2004-037128号公報（[0009]〜[0011]）
【特許文献２】特開2003-172702号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の通り、MALDI-TOFMS及びFAB-MSはそれぞれ長所及び欠点を持つが、FAB-MSで扱うことのできない分子量3000以上の分子で、且つ低極性の分子をMALDI-TOFMSによりイオン化することができるようになれば、高分子物質の質量解析に広い応用を拓くことができる。
【０００７】
また、タンパク質−タンパク質複合体やタンパク質−核酸複合体（以下、タンパク質複合体と総称する）では、タンパク質同士又はタンパク質と核酸とが非共有結合により弱い結合を形成しているが、窒素レーザ等を用いた従来のMALDI法によってイオン化しようとした場合、タンパク質複合体がその箇所で分解してしまい、複合体を形成した状態のままでイオン化することができないという問題があった（特許文献１）。
【０００８】
さらに、MALDI法は、サンプルが直接レーザー光を吸収する必要がないため、極めて多様な分子をイオン化することができる反面、サンプルの中から特定の分子種のみ（例えばDNAのみ或いはペプチドのみ）を選択的にイオン化することはできないという問題がある。特定の分子種のみをイオン化しようとする場合には、マトリックスによって間接的にエネルギを与えるのではなく、目的分子種に固有の吸収波長を持つレーザー光を該分子に直接吸収させる必要があるが、目的とする分子種に応じて照射する波長を変更することのできるレーザーを備えた質量分析装置はこれまで存在せず、そのため複合体に含まれる複数の分子種を別々にイオン化することはできなかった。
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、分子量3000以上で且つ低極性の分子もイオン化することができると共に、タンパク質複合体を分解することなくイオン化及び質量分析することができ、さらにはマトリックスに依存することなく、目的とする分子種のみを狙って分析を行うことのできる質量分析装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために成された本発明に係る質量分析装置は、
複数の波長のパルス光を発生する光源部と、
該光源部からの光を試料に照射することにより試料分子をイオン化するイオン化部と、
イオン化部において生成されたイオンを電荷質量比に応じて分離する質量分析部と、
を備えることを特徴とする。
【００１１】
上記質量分析装置で用いられる光源部としては、具体的には次のようなものを用いることができる。
第１に、互いに異なる波長の超短光パルスレーザ光を発する複数の超短光パルスレーザ光源を含むものである。
第２に、超短光パルスから生成される白色連続スペクトル光を分光することにより、可視光域から赤外線領域の複数の波長を含む超短パルス光を発生するものである。
超短光パルスから白色連続スペクトル光を生成する方法としては、超短光パルスをガラス等のターゲット物質に照射する方法、及び、超短光パルス光をフォトニック結晶ファイバーに通す方法等がある。
【００１２】
これらの光源から複数の波長の超短パルスレーザ光を試料に照射する場合、各波長の光の相互の干渉を防ぐために、それらを波長毎に時間的にずらすことが望ましい。
【００１３】
イオン化部では、光源部からの上記パルス光を試料に照射し、試料分子をイオン化する。本発明に係る質量分析装置では、生体の各部から取り出した試料をそのまま測定対象とすることができる。試料に含まれるタンパク質複合体は、その種類に応じた波長のレーザ光が照射された場合、壊れることなく、そのままの形（ホール）でイオン化される。
【００１４】
本発明に係る質量分析装置では、複数の波長のレーザを試料に照射するが、これは次の効果を狙っているものである。
(a) 複数の波長のうち、１つの波長を１光子モードでの動作に用いる。すなわち、この波長をマトリックスの光吸収帯域とする。マトリックスは少なくとも一つ以上の吸収帯を持つ分子の混合物であり、この光源により試料の気化が行われる。そして、同時に、イオン化のための紫外／可視レーザ（例えばAr+イオンレーザ、波長477nm等）を用いる。
(b) 複数の波長のうち、１つの波長を１光子モードでの動作に用いる。そして、他の波長を、非線形対象によって生じる２光子過程を惹起する1/n波長(n=2, 3, ...)とする。基本の１光子モードで、少なくとも１つ以上から成る吸収体波長を含むマトリックスを気化させ、２光子過程以上で生じる波長光によってイオン化を行う。
(c) 目的とする複数の分子種にそれぞれ対応した波長のレーザを試料に照射し、目的の分子種のみの分析を行う。従来、複数の分子種に対応するためには、使用マトリックスを変更したり、レーザ光源自体を交換する必要があった。
【００１５】
従来より用いられているMALDIでは、波長337nmの窒素ガスレーザで試料を含むマトリックスを照射していたため、試料に含まれる特にタンパク質複合体にフラグメント化が生じていた。フラグメント化は、分子の結合エネルギよりも高いエネルギを有する光子をその分子に与えることにより生じるものであるため、まず、そのタンパク質複合体のタンパク質同士又はタンパク質と核酸との非共有結合のエネルギよりも低いエネルギを有する長波長の光を照射する必要がある。
【００１６】
MALDIによるイオン化の物理的プロセスは、単純化すると、試料の気化と気体分子のイオン化に分かれる。本発明では、可視域（600nmより長波長）及び近赤外（波長1.1μmまで）の波長を気化源とし、しかもマトリックスとしての吸収体を複数の吸収波長を用いることにより、単一マトリックスのみならず、吸収ピーク波長の異なる複数成分の混合物をマトリックスとして利用し、気化の効率を高める。そして、気化と共に進行するイオン化を同時に円滑に行うため、試料の気化と、試料のイオン化を補助するための高粘性物質の光気化を、波長により分担する。これにより、気化の効率化及びイオン化の効率化をより最適にする。
【００１７】
前記の通り、FAB-MSでは低極性分子をイオン化するためにマトリックスに粘性の高いグリセリン様の物質を用いている。MALDIにおいても同様に、マトリックスの成分の一つにこのような粘度の高いグリセリン様物質を含めることにより、低極性分子も良好にイオン化することができる。すなわち、気化のためにはそれに適した特定のマトリックスを使用し、イオン化のためにはそれとは別にイオン化に適したマトリックス成分を使用する。これらを混合したものを使用することにより、それぞれ役割を分担させ、双方の目的を同時に達成することができる。ただし、グリセリン様の物質は紫外吸収が高く、例えば窒素レーザを用いれば解離によるフラグメント化が深刻になるため、イオン化用のレーザ照射の強度はフラグメンテーションが多大にならぬよう、波長選択と強度調節が必要である。
【００１８】
質量分析部では、そのようにして生成されたイオンを、その電荷質量比（m/z）に応じて分離する。本発明に係る質量分析装置の質量分析部には、飛行時間（TOF）型、イオントラップ型、四重極型等、種々の形式のものを使用することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る質量分析装置では、近赤外線から紫外線領域に亘る複数の波長のパルス光がそれぞれ役割を分担し、一つの波長のレーザ光が試料をフラグメント化することなく気化し、他の波長のレーザ光が気化した試料を１光子過程又は２光子（多光子）過程によりイオン化する。これにより、試料に含まれるタンパク質複合体もほとんど解離することなく、そのままの形（ホール）でイオン化され、質量分析が行われる。
【００２０】
また、装置の設定を大幅に変更することなく、種々の態様で複数の分子種の分析を行うことができる。例えば、異なる波長の超短光パルスの組を複数設け、分析のシーケンスに応じて該組のうちのいずれかを照射するという方法をとることにより、分析を定型化することができ、分析に習熟していない者でも容易に迅速な分析を行うことができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明を実施した第１の形態の質量分析装置の概略構成を図１に示す。図１では質量分析部には飛行時間（TOF）型のものを用いているが、これは他の形式のものでも構わない。本実施例では、光源部は４個の超短光パルスレーザ発生器１１ａ〜１１ｄを備えている。各超短光パルスレーザ発生器１１ａ〜１１ｄからは互いに異なる中心波長を有する狭帯域の超短光パルスレーザが発射され、それらは反射鏡１２ａ、半透鏡１２ｂ〜１２ｄ、１３により回折格子１４に入射される。回折格子１４は各パルスレーザを波長により空間的に分離し、波長選択器１５に送る。波長選択器１５には、複数の所定の波長の箇所に反射率可変の反射鏡１５ａ〜１５ｃが設けられており、各反射鏡１５ａ〜１５ｃの反射率を制御することにより、任意の波長を選択して回折格子１４側に戻すことができる。戻された１つ又は複数の波長のパルスは、半透鏡１３を通過してイオン化部１６の試料１７に照射される。
【００２２】
イオン化部１６では、こうして照射された超短光パルスのうち長波長光によりマトリックス及び試料が気化され、更に、短波長光により試料がイオン化される。また、マトリックスに複数の成分が含まれている場合は、各成分の吸収ピーク波長に相当する波長の超短光パルスを照射することにより、マトリックス及び試料の気化の効率を高めることができる。イオン化された試料は加速電圧により質量分析部１８に送られ、そこで電荷質量比に応じて分離される。
【００２３】
図２は、本発明の別の実施例である質量分析装置の光源部を描いたもので、イオン化部及び質量分析部は上記実施例と同様、どのような形式のものであっても構わない。本実施例の質量分析装置の光源部には、１個の超短光パルス光源２１、フォトニック結晶ファイバー２２、回折格子２４、波長パルス分離器２５等が備えられている。超短光パルス光源２１で生成された超短光パルスはフォトニック結晶ファイバー２２に入射され、そこを通過する間に白色超短光パルスに変換される。生成された白色超短光パルスは半透鏡２３により回折格子２４に送られ、そこで波長分散されて波長パルス分離器２５に送られる。波長パルス分離器２５では、複数の所定の波長の箇所に、光軸方向に移動可能な反射鏡（移動鏡）２５ａ、２５ｂ、２５ｃが設けられており、回折格子２４で分光された光のうち所定の波長の光のみが反射して戻り、半透鏡２３を通過してイオン化部（図１）に送られる。この際、複数の波長のパルスが同時に照射されると、波長間の干渉による非線形効果により差周波数成分光が発生する可能性がある。このような差周波数成分光は、目的とするもの以外のマトリックスを気化したり目的以外の成分をイオン化する可能性がある。そこで、各移動鏡２５ａ〜２５ｃの位置を適宜ずらせることにより各波長の光の光路長を変え、各波長のパルスを時間的に分離することが望ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の第１の実施形態である質量分析装置の概略構成図。
【図２】本発明の第２の実施形態である質量分析装置の光源部の概略構成図。
【符号の説明】
【００２５】
１１ａ〜１１ｄ…超短光パルスレーザ発生器
１２ａ…反射鏡
１２ｂ〜１２ｄ、１３…半透鏡
１４…回折格子
１５…波長選択器
１５ａ〜１５ｃ…反射鏡
２１…超短光パルス光源
２２…フォトニック結晶ファイバー
２３…半透鏡
２４…回折格子
２５…波長パルス分離器
２５ａ〜２５ｃ…移動鏡
【図１】
2006003167.tif 000003
【図２】
2006003167.tif 000004