(57)【要約】【課題】            哺乳動物細胞を用いた無細胞タンパク質合成系において、高いタンパク質合成活性と糖鎖付加能力を有するタンパク質の製造方法を提供する。【解決手段】        増強されたタンパク質分泌能を有する不死化哺乳動物細胞株の培養細胞から細胞抽出液を調製し、前記抽出液に糖タンパク質をコードするｍＲＮＡを添加することを特徴とする無細胞タンパク質合成系において翻訳後修飾されたタンパク質を製造する。【選択図】            なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
増強されたタンパク質分泌能を有する不死化哺乳動物細胞株の培養細胞から細胞抽出液を調製し、前記抽出液に糖タンパク質をコードするｍＲＮＡを添加することを特徴とする無細胞タンパク質合成系における翻訳後修飾されたタンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記培養細胞が、浮遊細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養細胞が、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ハイブリドーマ細胞がヒト由来の細胞である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記糖タンパク質をコードするｍＲＮＡがウイルス由来のＲＮＡである請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
増強されたタンパク質分泌能を有する不死化哺乳動物細胞株の培養細胞から調製した細胞抽出液を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成用組成物。
【請求項７】
さらにアミノ酸と、緩衝液と、塩と、ヌクレオチド三リン酸と、エネルギー物質とを含む請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記培養細胞が、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞である請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ハイブリドーマ細胞がヒト由来の細胞である請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
糖タンパク質の製造のための請求項６〜９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞系におけるタンパク質の合成方法に関し、さらに詳細には、哺乳動物細胞由来の抽出液を用いた糖タンパク質合成システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物のタンパク質の三分の一には糖鎖が付加されていると考えられている。タンパク質に付加された糖鎖は、発生、分化、増殖、そして癌化に深く関わっていることが数多くの研究により示されている。そのため医薬品などで使用される多くのタンパク質は、その活性を発現するために糖鎖の付加が必須である。また、糖タンパク質を生化学的に解析するために組換えＤＮＡ技術を用いて調製することが必要となる。生きた細胞で糖タンパク質を発現させて、それを精製する方法があるが、無細胞系で糖タンパク質を合成できればもっと手軽に手に入れることができる。無細胞タンパク質合成系における糖タンパク質の合成は、従来より、ウサギ網状赤血球の抽出液（reticulocyte lysate）にイヌ膵臓マイクロソーム（糖付加をする細胞内器官）を添加して行うことが一般的である（例えば、非特許文献１参照）。イヌ膵臓マイクロソームは市販されているものの、高価でかつロットによる活性のばらつきが大きい。また、通常の研究者がイヌの膵臓を得ることは難しく、ほとんどの人にとって自前で調製することは不可能である。このため、組織細胞や培養した株細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）から糖鎖付加反応を含む翻訳後修飾機構（小胞体、ゴルジ体、細胞膜等）を調製し、これらを上記ウサギ網状赤血球の抽出液に添加して糖タンパク質を合成する無細胞完全翻訳後修飾タンパク質の製造方法が報告されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
一方、糖タンパク質を用いた研究や医薬品開発において、簡便かつ安定的に糖タンパク質を製造することはきわめて重要である。特に、感染症対策のための研究においてはこの点が重要となる。ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）やヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は糖タンパク質であるエンベロープを持ち、エンベロープの糖鎖が感染に重要であると考えられている。ＨＣＶ、ＨＩＶは、共にヒト細胞にのみ感染するため、これらエンベロープを生化学的に解析するためにはヒト由来の細胞で合成することが望ましい。
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２３８５９５
【非特許文献１】Walter, P. and Blobel, G. (1983) Method. Enzymol., Vol. 96, pp.84
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来技術において用いられているイヌ膵臓マイクロソームや培養細胞由来の翻訳後修飾機構の調製には手間と時間がかかる。また、これらをウサギ由来の抽出液成分と組み合わせた無細胞タンパク質合成系は、不均一な系であるため、ある種の翻訳後修飾のための成分が欠損しているかもしれない。本発明は、哺乳動物細胞を用いた無細胞タンパク質合成系において、高いタンパク質合成活性と糖鎖付加能力を有するタンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、無細胞タンパク質合成系としてモノクローナル抗体生産用ハイブリドーマの細胞抽出液を用いることによって効率良く糖タンパク質が合成できることを見出し、かかる知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、第一の視点において、本発明の無細胞タンパク質合成系における翻訳後修飾されたタンパク質の製造方法は、増強されたタンパク質分泌能を有する不死化哺乳動物細胞株の培養細胞から細胞抽出液を調製し、前記抽出液に糖タンパク質をコードするｍＲＮＡを添加することを特徴とする。前記培養細胞は浮遊細胞であることが好ましく、さらに好ましくはモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞である。前記糖タンパク質をコードするｍＲＮＡはウイルス由来のＲＮＡを用いることができる。
【０００８】
本発明の他の視点において、増強されたタンパク質分泌能を有する不死化哺乳動物細胞株の培養細胞から調製した細胞抽出液を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成用組成物が提供される。この組成物は、さらにアミノ酸と、緩衝液と、塩と、ヌクレオチド三リン酸と、エネルギー物質とを含むことが好ましい。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態において、前記培養細胞はモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞であり、特に好ましくは、ヒト由来のハイブリドーマ細胞（ヒト−ヒトハイブリドーマ）である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、タンパク質分泌機能が増強された培養細胞の抽出液を用いることによって、翻訳後修飾を受けるタンパク質、特に糖鎖が付加されたタンパク質を効率よく製造することができる。また、不死化した哺乳動物細胞株の培養細胞を用いることによって細胞抽出液の調製が容易になる。特に、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは浮遊細胞であるため大量培養が容易であり、その多くは無血清培地で手軽に増やすことができる。さらに、ヒト細胞由来のハイブリドーマを用いることによって、ヒト型の糖鎖構造を有する糖タンパク質を容易に調製することができる。このような合成方法は、ヒト細胞における糖タンパク質の構造と機能の研究に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
［無細胞タンパク質合成系］
本明細書において、無細胞タンパク質合成系とは、タンパク質の翻訳に必要なタンパク質因子を細胞抽出液として取り出し、試験管内でこの反応を再構成することで目的とするタンパク質を合成させる系である。さまざまな生物種に由来する抽出液を利用して無細胞系を構成することができ、例えば、大腸菌や好熱性細菌等の細菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞及び出芽酵母等の、高いタンパク質合成活性の状態の真核細胞、及び原核細胞の抽出液が用いられている(Clemens, M.J., Transcription and Translation - A Practical Approach, (1984), pp. 231-270, Henes, B.D. et al. eds., IRL Press, Oxford)。
【００１２】
本発明の方法において、無細胞タンパク質合成用の細胞抽出液は、増強されたタンパク質分泌能を有し、かつ不死化した哺乳動物細胞株の培養細胞から調製される。哺乳動物細胞としては特に制限されないが、例えば、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞などを用いることができる。これらのうち、タンパク質分泌能が高い細胞か、又はそのように人工的に改変された細胞が好ましい。このような細胞として、特に好ましくは以下に述べるようなモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞が挙げられる。この細胞は糖タンパク質である抗体分子を分泌することから糖鎖の付加機構である細胞内の小胞体やゴルジ体などの膜器官がよく発達していると考えられる。ハイブリドーマ細胞は浮遊細胞として培養しやすく、また多くの場合無血清培地を用いて効率よく培養することができる。
【００１３】
［モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞株の作製］
ハイブリドーマ細胞株の作製は、常法により例えば、Koehler and Milstein, "Nature, Vol. 256, pp. 495-497(1975)及び、European Journal of Immunol., Vol. 6, pp. 511-519 (1976)等の方法により製造される。具体的には、まず、免疫原として使用する抗原は特に限定されず、免疫動物にとっての異種タンパク質又はペプチド等を用いる。低分子化合物の場合は、そのまま免疫しても抗体ができにくいため、通常、ＫＬＨやアルブミンのようなキャリアータンパク質と結合させる。免疫動物としては、哺乳類動物であれば特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ハムスターなどを用いることができる。例えば、マウスの場合は、十分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が形成されるように、マウス１匹に約２５μｇの抗原を２週間間隔で腹腔に３回程度免疫後、さらに２５μｇを静脈に投与する。最終免疫の数日後に融合のため脾臓細胞を取り出す。
【００１４】
上記のように免疫した哺乳動物の個体から脾臓を無菌的に取り出し、そこから単細胞懸濁液を調製する。この脾臓細胞（抗体産生細胞）を適当なミエローマ細胞と適当な融合促進剤の使用により細胞融合させる。ミエローマ細胞としては免疫動物と同種の哺乳動物に由来するものが望ましいが、ラット、ハムスター等の脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合させることもできる。好ましい細胞融合促進剤としては、例えば平均分子量１０００〜４０００のポリエチレングリコールである。
【００１５】
未融合の脾臓細胞、未融合のミエローマ細胞及び融合細胞の混合物を未融合のミエローマ細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死滅させるのみ十分な時間（約１時間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば、８−アザグアニン抵抗性）で未融合のミエローマ細胞を支持しないもの（例えばＨＡＴ培地）が使用される。この選択培地中では未融合のミエローマ細胞は死滅する。また、未融合の脾臓細胞は非腫瘍性細胞なので、ある一定期間（例えば１週間）後に死滅する。こうして残った細胞は、親細胞であるミエローマの腫瘍性と抗体を産生する脾臓細胞の性質を併せ持つため選択培地中で生存でき、しかも増強されたタンパク質分泌能を有するのである。さらに適当な方法、例えば、限界希釈法でクローン化することにより抗体分泌能の高い株を選択することもできる。
【００１６】
ヒト染色体のみを有する親細胞株とヒト抗体産生株の融合によるヒト−ヒトハイブリドーマ の作製の試みは、1980年にオルソンとカプラン、及びクローチェら(L.Olsson とH.S.Kaplan, Proc.Natl.Acad.Sci., 77, 5429 (1980)及びC.M.Croce ら、Nature, 288. 488 (1980))が報告し、その後、多くのヒト−ヒトハイブリドーマ の作製の報告があるが、例えば、生体由来のヒトＢリンパ球とミエローマ細胞を融合させたハイブリドーマ、あるいは、ＥＢウイルス等で細胞株化したヒトＢリンパ球とミエローマ細胞とを融合させたハイブリドーマなどが挙げられる。ここで用いるミエローマ細胞は、例えば、Ｕ２６６で代表されるヒトミエローマ細胞、Ｐ３Ｕ１で代表されるマウスミエローマ細胞などが含まれるが、その他のヒトミエローマ細胞やヒトリンパ芽球細胞樹立株のナマルバ細胞等でもよく、さらには、他の動物種由来のミエローマ細胞でもよい。
【００１７】
［無細胞タンパク質合成用組成物の調製］
株化されたハイブリドーマ細胞は、当業者に公知の培養装置によって容易に培養することができる。次に、培養した細胞は、例えばホモジナイザー等の公知の方法を用いて機械的に破砕することができる。抽出液はミクロコッカスヌクレアーゼ及びＣａＣｌ２処理して内因性ｍＲＮＡを破壊し、その結果バックグラウンド翻訳を減少させて最小にする。次いで、ＥＧＴＡを加えてＣａＣｌ２をキレートさせ、それによってヌクレアーゼを不活化する。
【００１８】
本発明の１つの実施形態において、上記哺乳動物の培養細胞を圧縮した不活性ガス（例えば、窒素ガス）に接触させて圧力をかけ、続いて減圧（除圧）することによって破砕する。このための装置として、例えば、Ｍｉｎｉ−Ｂｏｍｂ細胞破砕チャンバがＫＯＮＴＥＳ社から販売されている。この方法は、機械的な方法や超音波処理の場合などに見られる温度の上昇を伴わず、細胞は膨張するガスによって冷却される。圧力や平衡時間を変えることによって細胞の破砕の程度を調節できる。例えば、中程度の圧力で短時間処理することによって細胞内の小器官を壊すことなく外部の細胞膜のみを破砕することもできる。この装置を用いて昆虫細胞の抽出液を調製することによって、高い糖タンパク質合成活性が得られることが報告されている(Tarui, H. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol.55, pp.446-453, 2001参照)。
【００１９】
この抽出液はタンパク質合成に必要な成分を含有しており、例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アミノ酸並びに開始因子、延長及び終結因子が含まれる。さらに、ホスホクレアチンキナーゼ及びホスホクレアチンからなるエネルギー再生系を添加することによってｍＲＮＡ翻訳が最適化される。さらにアミノ酸混合物を添加してもよい。酢酸カリウム及び酢酸マグネシウムは翻訳反応に適した濃度となるように調整して添加される。
【００２０】
これらの無細胞タンパク質合成用反応混合物又はアミノ酸混合物は、それぞれ別に、若しくはあらかじめ混合した状態で、使用しやすいように一定量ごと分注して製品として配送することができる。これらの製品は凍結又は乾燥状態で保存することができ、保存及び輸送に適した容器に収容してキットとして販売される。キットには取扱説明書や陽性コントロールＤＮＡ、ベクターＤＮＡ等を添付することができる。
【００２１】
［糖タンパク質の合成］
無細胞タンパク質合成用の鋳型ｍＲＮＡは、発現したい所望の糖タンパク質をコードするものであれば特に限定されないが、細胞から直接ｍＲＮＡを単離するか、前記糖タンパク質をコードするＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼプロモータを有するベクターにクローン化してインビトロ転写反応を行うことにより合成することができる。ファージポリメラーゼプロモータの後ろにクローン化されたＤＮＡのインビトロ転写方法が知られている(Krieq, P. and Melton, D., Nucl. Acids Res., Vol.12, p.7057, 1984)。この方法は、発現したい遺伝子を、ＳＰ６、Ｔ７、及びＴ３ＲＮＡポリメラーゼのいずれか１つのプロモーターを有するベクターにクローン化する。次いで、このベクターのクローン化された遺伝子の３’末端で制限酵素を使用して線状化され、インビトロ転写反応によってｍＲＮＡへの転写を行う。ＳＰ６、Ｔ７及びＴ３ＲＮＡポリメラーゼプロモータを有する多数のベクターは市販されており、容易に入手可能である。このようにして合成した鋳型ｍＲＮＡは、５’末端にキャップ構造を有するか、又は有しないもののいずれでもよい。５’末端にキャップを付加する場合は、キャップアナログと呼ばれるキャップ類似体を基質にして、ＲＮＡポリメラーゼの酵素反応でキャップを持ったｍＲＮＡを合成することができる。鋳型ｍＲＮＡがコードする糖タンパク質としては、医薬用、及び研究用の糖タンパク質が挙げられ、例えば、成長ホルモン類、顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン、インターフェロン、トロンボポエチン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト化モノクローナル抗体などが含まれるがこれらに限定されない。
【００２２】
本発明の１つの実施形態において、ウイルス由来のｍＲＮＡを鋳型とすることができる。例えば、ＨＩＶのエンベロープタンパク質であるｇｐ１２０をコードするｍＲＮＡは５６ｋＤａのポリペプチド鎖と潜在的な２１個のＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を有し、全体として１００〜１２０ｋＤａの分子量を有する。従って、上記無細胞タンパク質合成系で合成されたｇｐ１２０をエンドグリコシダーゼＨで処理することによる分子量の変化を測定することにより、糖鎖が付加されているか否かを検出することができる。
【００２３】
他の実施形態として、鋳型ｍＲＮＡの５’末端にピコルナウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を付加してもよい。ピコルナウイルスのｍＲＮＡは内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を使用して翻訳反応を開始することが知られている。ピコルナウイルスのＩＲＥＳの構造には大きく２つに分けられ、１つは、エンテロウイルス（例えば、ポリオウイルス）やライノウイルスであり、他の１つは、カルジオウイルス（例えば、Encephalomyocarditis virus（ＥＭＣＶ））やアフトウイルス（例えば、口蹄疫ウイルス）である。例えば、ＥＭＣＶのＲＮＡは５’非翻訳領域に存在するＩＲＥＳから開始され、大きなポリプロテインが合成される。このポリプロテインは、ウイルス由来のプロテアーゼ３Ｃｐｒｏ又は３ＡＢＣｐｒｏによって切断され、成熟したウイルスタンパク質へとプロセッシングされる。ＥＭＣＶゲノムの完全な塩基配列は、例えばGenBank Accession No.NC_001497及びX87335等に登録されている。このＩＲＥＳは、ＥＭＣＶのＲＮＡゲノムの５’非翻訳領域に存在し、例えば、ＥＭＣＶゲノムの２８１〜８４８番目の塩基配列をＰＣＲにより増幅してクローン化することができる。
【実施例１】
【００２４】
以下に記載するヒトハイブリドーマＨＦ１０Ｂ４細胞株を用いた実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これらの実施例は１つの具体例であって本発明の範囲を何ら限定するものではない。
［細胞培養］
シャーレを用いたＨＦ１０Ｂ４細胞（理研バイオリソースセンターCell No. RCB0708）の培養は、炭酸ガスインキュベーター（ＣＯ２濃度５％、３７℃）内にて行った。培地はＥ−ＲＤＦ培地（極東）に加熱処理を施した１０％子ウシ血清（ICN Biomedicals, Inc）、２ｍＭのＬ−グルタミン溶液を添加したものを用いた。
【００２５】
１Ｌスケールでの攪拌培養は、細胞培養コントローラーシステム（セルマスター モデル１７００、和研薬社）を取り付けたスピンナーフラスコを用いて行った。温度、ｐＨ、溶存酸素濃度、及び攪拌スピードは、それぞれ３７℃、ｐＨ７．０、６．７ｐｐｍ、及び２０ｒｐｍに設定した。
【００２６】
ＨｅＬａ  Ｓ３細胞のシャーレでの培養にもＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２濃度５％、３７℃）を用いた。培地には、イーグルＭＥＭ培地（SIGMA）に、加熱処理を施した１０％子ウシ血清（ICN Biomedicals, Inc）、２ｍＭのＬ−グルタミン溶液、１ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したものを用いた。攪拌培養は、ｐＨ、攪拌スピードをそれぞれ７．２、５０ｒｐｍに設定した点以外はＨＦ１０Ｂ４細胞と同様の方法で行った。
【００２７】
［細胞抽出液の調製］
細胞濃度１．０〜１．５×１０６個／ｍｌに達した時点で、培養液中のＨＦ１０Ｂ４細胞を３６０×ｇ、４℃、１０分間の遠心によって回収した。培地は、アスピレーターを用いて除き、培養液１Ｌ分から得られた細胞に対して８０ｍｌの緩衝液（３５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（２５℃でのｐＨ７．５）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１１ｍＭグルコース）で軽く懸濁した後、２本の５０ｍｌチューブに移し替え、３６０×ｇ、４℃、５分間の遠心を行った。この操作を３回繰り返した後、細胞容積の１．５倍量の抽出ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（２５℃でのｐＨ７．５）、４５ｍＭ酢酸カリウム、４５ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭ酢酸マグネシウム）を加え、細胞濃度が約２．５×１０８個／ｍｌになるように懸濁したものをMini-Bomb cell disruption chamber (KONTES)に封入した。細胞の破砕は、窒素ガス圧１．０Ｍｐａ、氷中にて静置した状態で行った。３０分後、アウトレットポートをゆっくりと開口し、流速約３〜１０滴／秒にて細胞破砕液を回収した。得られた細胞破砕液は、７００×ｇ、４℃、５分間の遠心を２回繰り返し、沈澱画分を除いたもの（２〜２．５ｍｌ）を、予め２５ｍｌの抽出ｂｕｆｆｅｒにて平衡化しておいたＰＤ−１０カラム（Amersham社）へ添加した。自然落下にてサンプルをカラム内に入り込ませた後、さらに抽出ｂｕｆｆｅｒを添加し、カラム下から落下している溶液が透明から乳白色に変わった時点で、約１．７〜２．０ｍｌまで採取したものを細胞抽出液とした。得られた抽出液は均等に小分けし、液体窒素で瞬間凍結後、マイナス８０℃にて保存した。ＨｅＬａＳ３細胞の抽出液もＨＦ１０Ｂ４細胞と同様の方法で調製した。
【００２８】
［プラスミドとｍＲＮＡの調製］
ＨＩＶ及びＨＣＶの各エンベロープタンパク質をコードするｍＲＮＡを合成するために、プラスミドpSP72-EMCV-HIVgp120-poly-A、pSP72-EMCV-HCV-E1-E2-poly-A、及びpSP72-EMCV-HCV-E2-poly-Aを作製した。各プラスミドの作製法およびｍＲＮＡ合成法は以下の通りである。
【００２９】
ＨＩＶのｇｐ１２０の発現ベクターであるpSP72-EMCV-HIVgp120-poly-Aは、プラスミドpNM3rM(Kuwata, et al.(1995)J. Gen. Virol. 76: 2181-2191)をテンプレートにして、プライマー5'-CCGGGAGCTCCAGAGTGAAGGAGAAGTATCAGCACTTG-3'（配列番号１）と5'-TCTCGATATCTCATCTTTTTTCTCTCTGCACCACTCTTCT-3'（配列番号２）を用いてｇｐ１２０をコードするＤＮＡフラグメント（ｇｐ１６０の２〜５０９までのアミノ酸に相当する）をＰＣＲ法によって増幅した。次に、そのＤＮＡフラグメントをプラスミドpSP72-EMCV-Luc-poly-A(Svitkin, et al. (2001) RNA  7:1743-1752)のルシフェラーゼをコードする領域と入れ替える操作を行った。作製したpSP72-EMCV-HIVgp120-poly-Aの構造を概略的に表わしたものを図１（Ａ）に示す。
【００３０】
EMCV-HIVgp120-poly-A ｍＲＮＡの合成は、プラスミドpSP72-EMCV-HIVgp120-poly-A 内のポリＡ配列の３’側を制限酵素ＸｂａＩで切断したものを鋳型とし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (Promega) の方法に従って行った。
【００３１】
ＨＣＶのＥ１−Ｅ２発現ベクターであるpSP72-EMCV-HCV-E1-E2-poly-Aは、プラスミドpCMV-980（Marusawa et al. (1999) J. Virol. 73: 4713-4720）をテンプレートにして、プライマー5'-CCGGCCGAGCTCGGCAACAGGGAATCTGCCCGGTTGC-3'（配列番号３）及び5'-TCTCGATATCTCAGGCCTCAGCCTGGGCTATCAGCAGCAT-3'（配列番号４）を用いてＥ１−Ｅ２をコードするＤＮＡフラグメント（ＨＣＶ全長ポリペプチドの１６５〜７４６までのアミノ酸に相当する）をＰＣＲ法によって増幅した。次にそのＤＮＡフラグメントを上記と同様にプラスミドpSP72-EMCV-Luc-poly-Aのルシフェラーゼをコードする領域と入れ替える操作を行った。
【００３２】
ＨＣＶのＥ２の発現ベクターであるpSP72-EMCV-HCV-E2-poly-Aは、２種のプライマー  5'-CCGGCCGAGCTCGGTGGGGAACTGGGCTAAGGTCTTG-3'（配列番号５）及び5'-TCTCGATATCTCAGGCCTCAGCCTGGGCTATCAGCAGCAT-3'（配列番号６）を用いてＥ２をコードするＤＮＡフラグメント（ＨＣＶ全長ポリペプチドの３６５〜７４６までのアミノ酸に相当する)を上記と同様に増幅、そしてプラスミドpSP72-EMCV-Luc-poly-Aのルシフェラーゼをコードする領域と入れ替える操作を行った。作製したpSP72-EMCV-HCV-E1-E2-poly-A およびpSP72-EMCV-HCV-E2-poly-Aの構造を概略的に表わしたものを図１（Ｂ）及び（Ｃ）に示す。
【００３３】
ｍＲＮＡ、ＥＭＣＶ−ＨＣＶ−Ｅ１Ｅ２−ｐｏｌｙ−Ａ及びＥＭＣＶ−ＨＣＶ−Ｅ２−ｐｏｌｙ−ＡのｍＲＮＡの合成は、プラスミドpSP72-EMCV-HCV-E1-E2-poly-A及びプラスミドpSP72-EMCV-HCV-E2-poly-Aのポリ−Ａ配列の３’側を制限酵素ＸｂａＩで切断したものをそれぞれ鋳型とし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたRiboMAX Large Scale RNA Production Systems (Promega)の方法に従って行った。合成した各ｍＲＮＡは、波長２６０ｎｍの吸光度から濃度を定量した後、マイナス８０℃にて保存した。
【００３４】
［無細胞タンパク質合成］
ウイルス由来エンベロープタンパク質をコードする各ｍＲＮＡの翻訳反応を行う前に、抽出液に含まれている内因性のＲＮＡの分解と除去を行った。方法については以下の通りである。抽出液１００μｌ（タンパク質濃度２０〜２６ｍｇ／ｍｌ）に対し、１μｌの７５００ユニット／ｍｌヌクレアーゼＳ７、１００ｍＭＣａＣｌ２を添加し、５分間、２０℃の処理を施した後、８μｌの３０ｍＭ  ＥＧＴＡを加え反応を停止した。次にその抽出液１１０μｌへ、エネルギーミックス溶液（１８４ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１３．２ｍＭのＡＴＰ、１．３２ｍＭのＧＴＰ、１９８ｍＭクレアチンリン酸、３．３ｍＭスペルミジン、１３．２ｍＭ酢酸マグネシウム）を１６．４μｌ、３．３ｍｇ／ｍｌ牛肝臓由来ｔ−ＲＮＡを４．９２μｌ、６．０ｍｇ／ｍｌクレアチンリン酸キナーゼを１．８μｌ、２．０ＭのＫＣｌを９μｌ、５０ｍＭ酢酸マグネシウムを１．８μｌ、Ｈ２Ｏを１６．２μｌ加え混合液を調製した。さらに混合液を透析チャンバー（ＭＷＣＯ５０ｋＤａ、再生セルロース製)へ充填し、４．８ｍｌの外部液（エネルギーミックス溶液４９０μｌ、抽出ｂｕｆｆｅｒ３．０ｍｌ、２．０ＭのＫＣｌを２７０μｌ、１００ｍＭ酢酸マグネシウム２７μｌ、４００ｍＭのＥＧＴＡ１６．２μｌを含む）に対し１．５〜３時間の透析を２７℃にて行った。
【００３５】
翻訳反応は、混合液８μｌをエッペンドルフチューブに移し、そこへ２．５ｍＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニン、０．６μｇ／μｌの各ｍＲＮＡ溶液を順に０．５μｌずつ添加、混合した後（最終容量９μｌ）、１時間、２７℃のインキュベーションを行った。反応液に含まれる各組成の最終濃度は以下の通りである。１１〜１４ｍｇ／ｍｌ抽出液由来タンパク質、２７ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１５μＭアミノ酸（メチオニンを除く）、３５Ｓ−メチオニン０．１４ｍＣｉ／ｍｌ、１．２ｍＭのＡＴＰ、１２０μＭのＧＴＰ、１８ｍＭクレアチンリン酸、０．３ｍＭスペルミジン、１．５ｍＭ酢酸マグネシウム、２５ｍＭ酢酸カリウム、１２５ｍＭＫＣｌ、１．３３ｍＭのＥＧＴＡ、９０μｇ／ｍｌ牛肝臓由来ｔ−ＲＮＡ、６０μｇ／ｍｌクレアチンリン酸キナーゼ、０．３μｇ／９μｌｍＲＮＡ。
【００３６】
反応後、合成された各翻訳産物について糖鎖有無の確認をするためグリコシダーゼ処理を施した。反応には、Ｅｎｄｏ−Ｈ（endoglycosidase H (NEW ENGLAND BioLabs)）を用いた。まず反応液に対して添付されていた変性ｂｕｆｆｅｒ（１０ｘ）を１／１０倍量添加し、５０℃にて１０分間インキュベートした。次に室温に戻した変性サンプルに０．５Ｍリン酸ナトリウム（２５℃でのｐＨ７．５）、１０％ＮＰ−４０をそれぞれ１／１０倍量添加した後、５００，０００ユニット／ｍｌのＥｎｄｏ−Ｈを１μｌ加え反応を開始した。コントロール実験では、Ｅｎｄｏ−Ｈの代わりに水を加えた。２時間、３７℃の反応後、それぞれの検体をＳＤＳ化、ポリアクリルアミドゲル濃度１２．５％のＳＤＳゲルにて泳動した。アイソトープラベルされた産物の検出には、ＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ）を用いた。
【００３７】
その結果を図２及び３に示した。図２は、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０をコードするEMCV-HIVgp120-poly-AをＨｅＬａＳ３細胞（左パネル）又はＨＦ１０Ｂ４細胞（右パネル）の抽出液を用いて翻訳反応を行った後、さらにＥｎｄｏ−Ｈ存在下、または非存在下にてインキュベートを施した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。矢印はそれぞれ糖鎖付加された翻訳産物（ｇｐ１２０）、Ｅｎｄｏ−Ｈ消化を受けたｇｐ１２０（ｄｇｐ１２０）を示す。＊は糖鎖付加のおこらなかった産物を示す。検出されたバンドの濃さから、ＨｅＬａＳ３細胞では、ほとんど糖鎖付加が起こらなかったのに対し、ＨＦ１０Ｂ４では８０％以上の産物に糖鎖付加が認められた。また、それぞれの産物についてＥｎｄｏ−Ｈグリコシダーゼ処理を行うと、切断された糖鎖の分だけ分子量が低下したことが分かる（ｄｇｐ１２０）。
【００３８】
図３は、ＨＣＶエンベロープタンパク質をコードするEMCV-HCV-E2-poly-A およびEMCV-HCV-E1-E2-poly-AについてＨＦ１０Ｂ４細胞の抽出液を用いて翻訳反応を行った。反応後、図２と同様、さらにＥｎｄｏ−Ｈ存在下、または非存在下にてインキュベートを施した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す。それぞれの反応で糖鎖付加された翻訳産物（Ｅ１、Ｅ２）とＥｎｄｏ−Ｈ消化を受けたＥ１、Ｅ２（ｄＥ１、ｄＥ２）を矢印で示す。その結果、いずれの産物についても糖鎖付加が認められた。Ｅ１−Ｅ２の産物については、両者がつながった状態で検出されるのではなく、Ｅ１、Ｅ２単独で検出された。したがって、エンベロープタンパク質は、適切な翻訳後修飾（プロセッシング）を経て糖鎖付加されたと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の実施例で用いた各種ｍＲＮＡを合成するためのプラスミドＤＮＡの構造を表わした模式図である。
【図２】ヒト由来無細胞翻訳反応によるＨＩＶエンベロープタンパク質の合成をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果である。
【図３】ヒト由来無細胞翻訳反応によるＨＣＶエンベロープタンパク質の合成をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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