(57)【要約】      （修正有）【課題】生体物質検査デバイス、特に搭載するプローブを適宜変更することにより多項目検査を高い信頼性で可能とする生体物質検査用マイクロリアクタおよびデバイスを提供する。【解決手段】生体物質検査デバイスは、検体ごとの試薬類・送液系エレメント搭載マイクロリアクタと、制御・検出コンポーネントとを別個にするシステム構成となっている。ポンプおよびバルブを含む流路系がシンプルな構成であるため、気泡が入りにくく、デッドボリュームも小さいため送液精度が高い。このため微量分析、増幅反応に対し、クロス・コンタミネーション、キャリーオーバー・コンタミネーションといった深刻な問題が生じにくい。マイクロリアクタは、コンタミネーション、バックグラウンドの上昇などによる影響を排除するために、コントロールも同時に分析できる流路構成を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体を輸送する微細流路から分岐した複数の微細流路と、
前記複数の微細流路の各々に、前記複数の微細流路を流れる液体の逆流を防止する逆流防止部と、
圧力が予め設定された圧力に達するまで液体の通過を遮断し、その予め設定された圧力以上では液体の通過を許容する送液制御部と、
からなる送液分割手段を有し、
前記微細流路から送液された液体が前記送液制御部で阻止され、前記の逆流防止部と送液制御部との間で規定される一定量の前記液体が充填されることにより、前記複数の微細流路に予め設定された量の前記液体を分割することを特徴とする生体物質検査用マイクロリアクタ。
【請求項２】
検体収容部、試薬収容部、コントロール収容部、マイクロポンプ接続部および分岐した微細流路を有しており、
封入した試薬またはその混合液を、マイクロポンプおよび送液分割手段により少なくとも２以上に分岐した該微細流路中に送液し、分岐したそれぞれの微細流路の下流で、反応部位を構成する流路、次いで検出部位を構成する流路へ流すことにより、
検体、コントロールを同時測定することができる、請求項1に記載の生体物質検査用マイ
クロリアクタ。
【請求項３】
前記マイクロポンプは、
流路抵抗が差圧に応じて変化する第一流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化の割合が該第一流路よりも小さい第二流路と、
該第一流路および該第二流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部の圧力を変化させるためのアクチュエータと
を備えたピエゾポンプであることを特徴とする請求項１に記載の生体物質検査用マイクロリアクタ。
【請求項４】
前記微細流路に、送液制御部と逆流防止部とが設けられ、前記マイクロポンプ、送液制御部および逆流防止部によって、分岐した流路内における液体の送液、送液量の定量および各液体の混合を制御することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の生体物質検査用マイクロリアクタ。
【請求項５】
少なくとも前記検出部位の流路がポリスチレンで形成されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の生体物質検査用マイクロリアクタ。
【請求項６】
前記検出部位に吸着されたビオチン親和性タンパク質が、プローブ物質に標識されたビオチン、または遺伝子増幅反応に使用されるプライマーの５’末端に標識されたビオチンと結合することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の生体物質検査用マイクロリアクタ。
【請求項７】
前記ビオチン親和性タンパク質が、ストレプトアビジンであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の生体物質検査用マイクロリアクタ。
【請求項８】
前記生体物質検査用マイクロリアクタとその微細流路の反応部位で、ビオチン含有プローブと結合した生体物質を、該微細流路の検出部位に吸着させたビオチン親和性タンパク質に結合させ、次いで該プローブを発色させて光学的にその検出を行う検出装置と
を備えることを特徴とする生体物質検査デバイス。
【請求項９】
前記検出装置とともにマイクロポンプおよび温度制御装置が一体化された装置本体と、この装置本体に装着可能なマイクロリアクタとからなり、装置本体に該マイクロリアクタを装着することにより、生体物質の前記の結合とプローブの発色、その検出を自動的に行うことを特徴とする請求項８に記載の生体物質検査デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質検査用マイクロリアクタおよびこのマイクロリアクタを含む生体物質検査デバイスに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段（例えばポンプ、バルブ、流路、センサーなど）を微細化して１チップ上に集積化したシステムが開発されている。これは、μ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ  ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）、バイオリアクタ、ラブ・オン・チップ（Ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐｓ）、バイオチップとも呼ばれ、医療検査・診断分野、環境測定分野、農産製造分野でその応用が期待されている。とりわけ遺伝子検査に見られるように、煩雑な工程、熟練した手技、機器類の操作が必要とされる場合には、自動化、高速化および簡便化されたミクロ化分析システムは、コスト、必要試料量、所要時間のみならず、時間および場所を選ばない分析を可能とすることによる恩恵は多大と言える。
【０００３】
臨床検査を始めとする各種検査の現場では、場所を選ばず迅速に結果を出すこれらの分析用チップにおける分析の定量性、解析の精度、経済性などが重要視される。分析チップではそのサイズ、形態からの厳しい制約を受けるため、シンプルな構成で、高い信頼性の送液システムを確立することが課題となる。そのため精度が高く、信頼性に優れるマイクロ流体制御素子が求められている。これに好適なマイクロポンプシステムを本発明者らはすでに提案している（特許文献１および２）。
【０００４】
また、試料の必要量を極少量とし、必要とされる試薬量も少なくて済む分析の微量化を図ることは、マイクロリアクタに求められる最大課題である。これを実現するには、混合流路もしくは反応室で液体（検体および試薬）同士を効率よく混合する必要がある。加えて微量の反応生成物を高感度でしかも簡便に検出、または定量できる機構もまたチップに設置することが必要とされる。遺伝子の検出では、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法による増幅反応を利用するのが通例であり、その有用性は広く認められている。しかしながら、ＰＣＲ法は検体中に存在する微量の遺伝子を数十万〜数百万倍以上にも増幅できることから、クロスコンタミネーション、キャリーオーバーコンタミネーションによる影響もまた著しく深刻となる。またＤＮＡの増幅中に頻繁に読み間違いを起こすことも指摘されている。イムノアッセイにおいても、非特異的な相互作用の可能性を排除する必要がある。このような分析上の潜在的な陥穽にも配慮しないと、不正な結果に基づいて誤った結論を導きかねない。マイクロリアクタにおいても適切に対応した分析システムを構築する必要性がある。
【０００５】
さらに大量の測定検体、とりわけ汚染または感染のリスクのある臨床検体を対象とするチップに対しては、ディスポーサブルであることが望まれ、さらに多用途対応性、製造コストなどの問題点を克服する必要がある。
【０００６】
このように簡便かつ迅速な検査手段を提供するマイクロリアクタには、実用上依然として解決すべき具体的な問題が提起され、その解決が望まれている。
【特許文献１】特開２００１−３２２０９９号公報
【特許文献２】特開２００４−１０８２８５号公報
【非特許文献１】「ＤＮＡチップ技術とその応用」、「蛋白質  核酸  酵素」４３巻、１３号（１９９８年）君塚房夫、加藤郁之進、共立出版（株）発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の生体物質検査用マイクロリアクタおよびこれを含むＤＮＡ検査デバイスは、上記の実状に鑑みてなされたものであり、シンプルな構成と高精度の送液システムを組み込み、しかも精度の高い分析を少なくとも１以上の項目について可能とするマイクロリアクタを提供することを目的とする。
【０００８】
ディスポーサルタイプのマイクロリアクタおよびその機能の制御および検出・処理手段を備えた生体物質検査装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、
液体を輸送する微細流路から分岐した複数の微細流路と、
前記複数の微細流路の各々に、前記複数の微細流路を流れる液体の逆流を防止する逆流防止部と、
圧力が予め設定された圧力に達するまで液体の通過を遮断し、その予め設定された圧力以上では液体の通過を許容する送液制御部と、
からなる送液分割手段を有し、
前記微細流路から送液された液体が前記送液制御部で阻止され、前記の逆流防止部と送液制御部との間で規定される一定量の前記液体が充填されることにより、前記複数の微細流路に予め設定された量の前記液体を分割することを特徴とする生体物質検査用マイクロリアクタである。
【００１０】
さらに本発明は、
検体収容部、試薬収容部、コントロール収容部、マイクロポンプ接続部および分岐した微細流路を有しており、
封入した試薬またはその混合液を、マイクロポンプおよび送液分割手段により少なくとも２以上に分岐した該微細流路中に送液し、分岐したそれぞれの微細流路の下流で、反応部位を構成する流路、次いで検出部位を構成する流路へ流すことにより、
検体、コントロールを同時測定することができる生体物質検査用マイクロリアクタでもある。
【００１１】
前記マイクロポンプは、好ましくは
流路抵抗が差圧に応じて変化する第一流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化の割合が該第一流路よりも小さい第二流路と、
該第一流路および該第二流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部の圧力を変化させるためのアクチュエータと
を備えたピエゾポンプである。
【００１２】
上記の生体物質検査用マイクロリアクタは、前記微細流路に、送液制御部と逆流防止部とが設けられ、前記マイクロポンプ、送液制御部および逆流防止部によって、分岐した流路内における液体の送液、送液量の定量および各液体の混合を制御することを特徴としている。
【００１３】
少なくとも前記検出部位の流路がポリスチレンで形成されていることが望ましい。
前記検出部位に吸着されたビオチン親和性タンパク質は、好ましくはプローブ物質に標識されたビオチン、または遺伝子増幅反応に使用されるプライマーの５’末端に標識されたビオチンと結合する。
【００１４】
前記ビオチン親和性タンパク質は、好ましくはストレプトアビジンである。
また本発明は、
前記生体物質検査用マイクロリアクタと
その微細流路の反応部位でビオチン含有プローブと結合した生体物質を、該微細流路の検出部位に吸着させたビオチン親和性タンパク質に結合させ、次いで該プローブを発色させて光学的にその検出を行う検出装置と
を備えることを特徴とする生体物質検査デバイスである。
【００１５】
前記生体物質検査デバイスは、前記検出装置とともにマイクロポンプおよび温度制御装置が一体化された装置本体と、この装置本体に装着可能なマイクロリアクタとからなり、装置本体に該マイクロリアクタを装着することにより、生体物質の前記の結合とプローブの発色、その検出を自動的に行うことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の生体物質検査デバイスは、試薬類・送液系用のエレメントを搭載した、検体ごとのチップコンポーネントと、検査デバイス本体として、制御・検出コンポーネントとを別個にするシステム構成である。さらにポンプおよびバルブを含む流路系がシンプルな構成であるため、気泡が入りにくく、デッドボリュームも小さいため送液精度が高い。したがって、微量分析、増幅反応に対し、クロス・コンタミネーション、キャリーオーバー・コンタミネーションといった深刻な問題が生じにくい。本発明のマイクロリアクタは、反応阻害、コンタミネーション、バックグラウンドの上昇などによる影響を排除するために、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールも同時に分析できる流路構成を有する。
【００１７】
本発明のマイクロリアクタは、材料および構成要素を含めて大量生産に向く構成であり、しかも検出に使用するプローブ、試薬が容易に入手できるものであるために、低コストで製造できる。本発明の生体物質検査デバイスおよびマイクロリアクタは、多項目の同時測定も可能であり、かつ、多目的に対応する汎用性がある。
［発明の詳細な説明］
以下、本発明のマイクロリアクタおよびこのマイクロリアクタとマイクロポンプ、各種制御装置、検出装置とからなる生体物質検査デバイスについて説明する。なお本明細書において、「遺伝子」とは、何らかの機能を発現する遺伝情報を担うＤＮＡまたはＲＮＡをいうが、単に化学的実体であるＤＮＡ、ＲＮＡとして言及することもある。「エレメント」とは、マイクロリアクタに設置される機能部品をいう。「微細流路」は、本発明のマイクロリアクタに形成された流路のことである。
マイクロリアクタおよび生体物質検査デバイスの概要
本発明は、
液体を輸送する微細流路から分岐した複数の微細流路と、
前記複数の微細流路の各々に、前記複数の微細流路を流れる液体の逆流を防止する逆流防止部と、
圧力が予め設定された圧力に達するまで液体の通過を遮断し、その予め設定された圧力以上では液体の通過を許容する送液制御部と、
からなる送液分割手段を有し、
前記微細流路から送液された液体が前記送液制御部で阻止され、前記の逆流防止部と送液制御部との間で規定される一定量の前記液体が充填されることにより、前記複数の微細流路に予め設定された量の前記液体を分割することを特徴とする生体物質検査用マイクロリアクタである。
【００１８】
本発明の生体物質検査用マイクロリアクタは、検体収容部、試薬収容部、検体前処理手段、マイクロポンプ接続部および分岐した微細流路を有しており、該前処理手段により前
処理した検体を、マイクロポンプおよび送液分割手段により少なくとも２以上に分岐した該微細流路中に送液し、分岐したそれぞれの微細流路の下流で、反応部位を構成する流路、次いで検出部位を構成する流路へ流すことにより、検体分析において多項目を同時測定することができるマイクロリアクタである。
【００１９】
さらに本発明のマイクロリアクタは、検体収容部、試薬収容部、コントロール収容部、マイクロポンプ接続部および分岐した微細流路を有しており、封入した試薬またはその混合液を、マイクロポンプおよび送液分割手段により少なくとも２以上に分岐した該微細流路中に送液し、分岐したそれぞれの微細流路の下流で、反応部位を構成する流路、次いで検出部位を構成する流路へ流すことにより、検体、コントロールを同時測定することができることを特徴としている。
【００２０】
図１は、本発明の生体物質検査用マイクロリアクタと装置本体とからなる生体物質検査デバイス（「生体物質検査装置」ともいう）の一実施形態における概略図、図２は、本発明の一実施形態における前記マイクロリアクタの概略図である。
【００２１】
図１および２に示したマイクロリアクタ１は、プラスチック樹脂、ガラス、シリコン、セラミックスなどの部材を適宜組み合わせて作製される一枚のチップからなる。好ましくは、マイクロリアクタの微細流路および躯体は、加工成型が容易で安価であり、焼却廃棄が容易なプラスチック樹脂で形成される。なかでもポリスチレン樹脂は成型性に優れ、後述するようにストレプトアビジンなどを吸着する傾向が強く、容易に微細流路上に検出部位を形成することができるために望ましい。また、そうしたマイクロリアクタにおいて、蛍光物質または呈色反応生成物などを光学的に検出するために、マイクロリアクタ表面のうち少なくとも微細流路の検出部位を覆うその検出部分は透明であること、好ましくは透明なプラスチックとなっていることが必要である。
【００２２】
図２は、本発明のマイクロリアクタの典型的な流路構成の一例を示すものである。図２の流路および送液エレメントの配置では、最上流部の試薬収容部１８および試薬分割への流路１５から、基本的に３本の分析流路（３つの流路に分岐してからそれぞれの廃液貯留部２３まで至る流路であり、このような基本骨格の微細流路を、以下において「分析流路」とも言及する）へ試薬が流れるように構成されている。左側の分析流路は、検体の分析のための流路であり、図２では１項目の分析に対応する。中央の分析流路は、ポジティブコントロール用の流路、右側の分析流路は、ネガティブコントロール用の流路である。図２では、検体分析用の流路は１本となっているが、多項目分析のためには、少なくとも２本以上の分析流路が検体分析用に形成される必要がある。その本数は、項目数のみならずチップのサイズ、布置されるエレメントの個数と配置によっても制限される。
【００２３】
本発明の生体物質検査デバイスは、マイクロポンプ、マイクロポンプを制御する制御装置、反応温度を制御する温度制御装置および検出装置が一体化された装置本体２と、この装置本体２に装着可能なマイクロリアクタ１とからなる。予め試薬が封入されたマイクロリアクタ１に検体を注入して、そのマイクロリアクタを装置本体２に装着すると、送液ポンプを作動させるための機構的連結、必要であれば制御用の電気的接続もなされ、生体物質のプローブとの結合、プローブの発色、その検出が自動的に行われる。
【００２４】
本発明のマイクロリアクタおよび生体物質検査デバイスは、特に遺伝子または核酸の検査に好適に用いることができる。その場合、ＰＣＲ増幅のための機構がマイクロリアクタ上に搭載される。以下の明細書では、主に遺伝子検査に使用されるマイクロリアクタおよび生体物質検査デバイスを中心にして詳述する。しかしながら、遺伝子以外の生体物質、例えばタンパク質、酵素などの分析用マイクロリアクタについても基本的な構成は、ほぼ同一になるといえる。通常は検体前処理部２０ａ、試薬類、プローブ類などを変更すれば
よく、その場合、送液エレメントの配置、数などは変化するであろう。当業者であれば、例えばイムノアッセイ法のために必要なエレメントなどをマイクロリアクタ上に搭載し、若干の流路変更、仕様の変更を含む修正を施すことにより、分析の種類を容易に変更することができる。
【００２５】
遺伝子検査用のマイクロリアクタ・チップには、検体収容部、試薬収容部、プローブＤＮＡ収容部、コントロール収容部、流路、ポンプ接続部、送液制御部、逆流防止部、試薬定量部、混合部の各エレメントが、機能的に適当な位置に微細加工技術により設置されている。さらに必要であれば、逆転写酵素部を布置してもよい。検体収容部は、検体注入部に連通し検体の一時収容および混合部への検体供給を行う。必要であれば血球分離、検体液の粘度調整などの作用を担わせてもよい。試薬と試薬との混合、および検体と試薬との混合は、単一の混合部で所望の比率で混合してもよく、あるいは何れかもしくは両方を分割して複数の合流部を設け、最終的に所望の混合比率となるように混合しても構わない。
【００２６】
血液などの検体をマイクロリアクタの上記検体収容部に注入し、装置本体に該マイクロリアクタを装着することにより、チップ内で遺伝子増幅反応およびその検出に必要な処理を自動的に行い、多項目について同時に、且つ短時間で遺伝子検査ができるように構成されている。本発明の遺伝子検査用マイクロリアクタの好ましい態様では、必要な試薬類があらかじめ所定の量、マイクロリアクタ内に封入されており、検体のＤＮＡまたはＲＮＡと所定の増幅反応、ならびに増幅産物の検出を行うチップとして、該マイクロリアクタが検体ごとに使用される。
【００２７】
これに対し、送液、温度、反応の各制御に関わる制御系、光学検出、データの収集および処理を受け持つユニットは、マイクロポンプおよび光学装置とともに本発明の生体物質検査デバイスの本体を構成する。このデバイス本体は、これに上記チップを装着することにより検体サンプルに対して共通で使用される。したがって多数の検体があっても、効率よく迅速に処理できる。従来技術では、内容の異なる分析または合成などを行う場合に、変更される内容に応じたマイクロ流体デバイスをその都度構成する必要があった。これとは異なり、本発明では脱着可能な上記チップのみ交換すればよい。各デバイスエレメントの制御変更も必要であれば、装置本体に格納された制御プログラムを適宜改変すればよい。
【００２８】
本発明の遺伝子検査デバイスは、いずれのコンポーネントも小型化され、持ち運びに便利な形態としているために、使用する場所および時間に制約されず、作業性、操作性が良好である。場所、時間を問わず迅速に測定することができるために、緊急医療での利用や、在宅医療での個人的な利用も可能である。送液に使用する多数のマイクロポンプユニットなどが装置本体側に組み込まれているので、チップはディスポーサブルタイプとして使用できる。
【００２９】
以上、本発明の生体物質検査用マイクロリアクタおよび生体物質検査デバイスを、遺伝子検査の場合についての概要を述べたが、本発明は、種々の実施の形態において、本発明の趣旨に沿って任意の変形、変更が可能であり、それらは本発明に含まれる。すなわち、本発明のマイクロリアクタおよび検査装置の全体または一部について、構造、構成、配置、形状形態、寸法、材質、方式、方法などを本発明の趣旨に合致する限り、種々のものにすることができる。したがって、以下、主に遺伝子検査用のマイクロリアクタ、検査デバイスについて述べる。
【００３０】
生体物質検査用マイクロリアクタの好ましい態様
本発明の生体物質検査用マイクロリアクタとして好ましい態様は、
一つのチップ内に、
検体もしくは検体から抽出した生体物質（例えばＤＮＡ）が注入される検体収容部と、
プローブ結合反応、検出反応（遺伝子増幅反応または抗原抗体反応なども含む）などに用いる試薬が収容される試薬収容部と、
ポジティブコントロールが収容されるポジティブコントロール収容部と、
ネガティブコントロールが収容されるネガティブコントロール収容部と、
プローブ（例えば、遺伝子増幅反応により増幅された検出対象の遺伝子にハイブリダイズさせるプローブ）が収容されるプローブ収容部と、
これらの各収容部に連通する流路と、
前記各収容部および流路内の液体を送液する別途のマイクロポンプに接続可能なポンプ接続部とが設けられ、
前記チップにポンプ接続部を介してマイクロポンプを接続し、検体収容部に収容された検体もしくは検体から抽出した生体物質（例えばＤＮＡまたはそれ以外の生体物質）と、試薬収容部に収容された試薬とを流路へ送液し、微細流路の反応部位、例えば遺伝子増幅反応（タンパク質の場合、抗原抗体反応など）の部位で混合して反応させた後、その下流側流路にある検出部へこの反応液を処理した処理液と、プローブ収容部に収容されたプローブとを送液し、流路内で混合してプローブと結合（またはハイブリダイゼーション）させ、この反応生成物に基づいて生体物質の検出を行い、
ポジティブコントロール収容部に収容されたポジティブコントロールおよびネガティブコントロール収容部に収容されたネガティブコントロールについても同様に、試薬収容部に収容された試薬と流路内で反応させた後、プローブ収容部に収容されたプローブと流路内で結合（または遺伝子分析の場合にはハイブリダイゼーション）させ、この反応生成物に基いて該反応の検出を行うように構成されていることを特徴としている。
【００３１】
試薬分割および検体分割
・マイクロポンプおよびポンプ接続部
本実施形態では、検体収容部２０、試薬収容部１８、ポジティブコントロール収容部２１ｈ、およびネガティブコントロール収容部２１ｉのそれぞれについて、これらの収容部の内容液を送液するマイクロポンプ１１が設けられている。マイクロポンプ１１は試薬収容部１８の上流側に接続され、マイクロポンプ１１により駆動液を試薬収容部側へ供給することによって、試薬を流路へ押し出して送液している。マイクロポンプユニットは、マイクロリアクタとは別途の装置本体（生体物質検査デバイス）に組み込まれており、マイクロリアクタを装置本体に装着することによって、ポンプ接続部１２からマイクロリアクタに接続されるようになっている。
【００３２】
本実施形態では、マイクロポンプとしてピエゾポンプを用いている。すなわち、
流路抵抗が差圧に応じて変化する第一流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化の割合が該第一流路よりも小さい第二流路と、
該第一流路および該第二流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部の圧力を変化させるためのアクチュエータと
を備えたピエゾポンプである。その詳細は、上記特許文献１および２に記載されている。・送液分割手段
本発明において、１つの検体について多項目の分析を行う場合、ならびにポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを同時に分析する場合には、試薬類および検体を２以上に分割して、それぞれの分析流路へ送液する必要がある。送液分割手段はそのために設置される。具体的には図２および図３に示すように、前記送液分割手段は、分岐した微細流路、送液制御部１３および逆流防止部１６から構成される。
【００３３】
送液制御部１３は、正方向への送液圧力が所定圧に達するまで液体の通過を遮断し、所定圧以上の送液圧力を加えることにより液体の通過を許容する。また流路内の液体の逆流を防止する逆流防止部１６は、逆流圧により弁体が流路開口部を閉止する逆止弁か、ある
いは弁体変形手段により弁体を流路開口部へ押圧して該開口部を閉止する能動弁からなる。
【００３４】
本発明のマイクロリアクタの微細流路においては、前記マイクロポンプ、そのポンプ圧により液体の通過を制御可能な送液制御部と、流路内の液体の逆流を防止する逆流防止部とによって、分岐した流路内における液体の送液、送液量の定量および各液体の混合を制御されている。したがってかかる送液分割手段およびマイクロポンプ１１の働きにより、試薬類および検体は適当な比率で分割される。すなわち、送液制御部１３を開通させる圧力より低い圧力においては、分岐した微細流路のそれぞれにおける送液制御部１３はすべてが遮断状態になり、各微細流路の送液制御部１３と逆流防止部１６の間には、予め設定した量（所定量）の送液が充填される。したがって、本発明の送液分割手段によれば、所定量の液体を各微細流路に分割することが可能である。
また、逆流防止部１６の下流部に連通した流路から液体を流入させることにより、分割された所定量の液体を、送液、定量および混合することが可能である。
・検体収容部
本発明のマイクロリアクタの検体収容部２０は、図４および５に示されるような構成を有する。検体収容部２０に注入された検体は、マイクロポンプ１１およびポンプ接続部１２と接続しており、これらの作用により、検体前処理部２０ａへ送液される。検体前処理部２０ａでは、検体処理液収容部２０ｂから送られてくる処理液で前処理される。このような検体前処理部２０ａは必要に応じて布置されるものである。検体前処理の具体例とは、分析対象物質の分離または濃縮、除タンパクなどが含まれる。したがって検体前処理部２０ａは、分離フィルター、吸着用樹脂、ビーズなどを含んでもよい。
【００３５】
次いで、前処理された検体は、必要であれば上記の送液分割手段により、２以上の検体分析用の微細流路に分割されて、連通する下流の分析流路へ送液される。分割された検体は、図４に示すサンプルポート１９から、試薬類が流れる微細流路へ入って合流する。この場合、検体を３以上の分析流路に流すように送液を分割して試薬類と合流させるためには、検体が流れ出るポートと合流される分析流路とは、高さを相違させる必要が生じる。このような位置関係となる理由は次の通りである。
【００３６】
図４に示す、検体収容部２０、検体前処理部２０ａなどのエレメント類は、好ましくは、図２に示されるように検体分析のための分析流路（左側の微細流路）上、試薬収容部１８よりも下流側の位置に配置される。すなわち、図２において、検体の測定項目が、１つの場合には、図示されるように、検体収容部２０および検体貯留部１７ｂが１つあればよい。これに対し、２以上の測定項目がある場合には、上記のように検体を測定項目数に応じて分割し、それぞれの分析流路へ合流させる必要があるため、上記エレメント類は、複数の分析流路上の適当な位置（直上でなくともよい）に配置される。その位置関係は、例えば図５および図６にも示されている。測定項目が３つ以上であって、検体を３つ以上の分析流路に流すように検体液を分割して試薬類と合流させるためには、検体と試薬とが合流する前に、ポート１９からの検体が流れる流路は、試薬の流れる流路と、それら両流路の液が合流することなく、上下で交差しなければならない。なお、図示されるように、特に検体前処理部２０ａをも設置するときには、不要な液を廃液貯留部２３に捨てるため、検体前処理部２０ａを検体収容部２０より下位に置くほうが好都合である。測定項目が２つであって、検体液を２つの分析流路に流すように分割する場合には、図６に示すようにその２つの分析流路の間に検体収容部２０、サンプルポート１９などを配置すればよい。
【００３７】
反応部位
測定対象である生体物質を含む検体の溶液と、試薬（混合液）とを合流させる合流部の上流側の各流路に、前記検体が収容される検体収容部と、前記試薬液体が収容される試薬収容部とが設けられるとともに、これらの各収容部の上流側にポンプ接続部が設けられ、
これらのポンプ接続部に前記マイクロポンプを接続し、各マイクロポンプから駆動液を供給することにより前記各収容部内の前記検体の溶液および前記試薬を押し出してこれらを合流させることによって遺伝子増幅反応または抗原抗体反応といった分析に必要な反応を開始するように構成されている。そうした反応部位の態様は特に限定されるものではなく、様々な形態および様式が考えられる。基本的には
反応試薬を含む少なくとも２種類の液体を、マイクロポンプにより送液して合流させる合流部と、
前記合流部から先に設けられ、前記各液体が拡散混合される微細流路と、
前記微細流路の下流側端部から先に設けられ、該微細流路よりも広幅の空間と
からなり、該微細流路で拡散混合された混合液を貯留して反応を行う液溜部とを備えることが好ましい。
【００３８】
・試料
本発明の測定対象となる検体は、遺伝子検査の場合、増幅反応の鋳型となる核酸として遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡである。このような核酸を含む可能性のある試料から調製または単離したものであってよい。そのような試料から遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡを調製する方法は、特に限定されず、従来技術を使用することができる。試料自体にも特に制限はないが、例えば全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、唾液、喀痰など生体由来のほとんどの試料；細胞培養物；ウィルス、細菌、カビ、酵母、植物、動物などの核酸含有試料；微生物などが混入または含有する可能性のある試料、その他核酸が含有されている可能性のあるあらゆる試料などが対象となる。
【００３９】
ＤＮＡは、試料から常法に従い、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により、分離精製できる。ＲＮＡの場合、適当な逆転写酵素を利用してｃＤＮＡに変換してから分析すればよい。逆転写酵素は容易に入手することができる。
【００４０】
本発明のマイクロリアクタは、従来の装置を使用して行う手作業の場合に比べて、必要とされる検体量は極めて少ない。例えば、遺伝子の場合、ＤＮＡとして０．００１〜１００ｎｇである。このため、微量の試料しか得られない場合も含めて、本発明のマイクロリアクタは、検体面からの制約は少なく、必然的に試薬類も少ない量で済み、検査コストの低減となる。試料は、上記「検体収容部」の注入部から導入される。
【００４１】
遺伝子以外の生体物質を含む検体の処理などについても、従来技術を適用して必要に応じ行なわれる。
・遺伝子増幅法
本発明のマイクロリアクタでは、増幅方法を限定されない。例えばＤＮＡ増幅技術は、多方面で盛んに利用されているＰＣＲ増幅法を使用することができる。その増幅技術を実施するための諸条件が詳細に検討され、改良点も含めて各種文献などに記載されている。ＰＣＲ増幅においては、３つの温度間で昇降させる温度管理が必要になるが、マイクロチップに好適な温度制御を可能とする流路デバイスが、すでに本発明者らにより提案されている（特開２００４−１０８２８５号）。このデバイスシステムを本発明のチップの増幅用流路に適用すればよい。これにより、熱サイクルが高速に切り替えられ、微細流路を熱容量の小さいマイクロ反応セルとしているため、ＤＮＡ増幅は、手作業によりマイクロチューブ、マイクロバイアルなどで行なう従来の方式よりはるかに短時間で行うことができる。
【００４２】
ＰＣＲ反応のように複雑な温度管理を必要としない、最近開発されたＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｐｒｉｍｅｒ  ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ）法は、５０〜６５℃における任意の一定温度の下にＤＮＡ増幅を短時間で実施できる特徴を有する（特許第３４３３９２９号）。し
たがって、ＩＣＡＮ法は、本発明のマイクロリアクタでは、簡便な温度管理で済むために好適な増幅技術である。手作業では、１時間かかる本法は、本発明のバイオリアクタにおいては、１０〜２０分、好ましくは、１５分で解析まで終わる。
【００４３】
ＤＮＡ増幅反応は、その他のＰＣＲ改良法、ＰＣＲ変法であってもよく、本発明のマイクロリアクタは、流路の設計変更などによりいずれにも対応できる柔軟性がある。いずれのＤＮＡ増幅反応を使用する場合にも、その技術の詳細は開示されており、当業者は容易に導入することができる。
・試薬類
検体中の生体物質を分析する場合、測定に必要な試薬は、通常それぞれ公知である。例えば、検体に存在する抗原を分析する場合、それに対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含有する試薬が使用される。抗体は、好ましくはビオチンおよびＦＩＴＣで標識されている。次に遺伝子検査に必要な試薬類について述べる。
（ｉ）  プライマー
ＰＣＲプライマーは、増幅したい特定部位のＤＮＡ鎖の両端に相補的な２種のオリゴヌクレオチドである。その設計は、すでに専用のアプリケーションが開発されており、当業者であればＤＮＡシンセザイザー、化学合成などにより容易に作成できる。ＩＣＡＮ法用のプライマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡのキメラプライマーであるが、このものの調製法もすでに技術的に確立されている（特許第３４３３９２９号）。プライマーの設計、選択は、増幅反応の成否、効率を左右するため最も適切なものを使用することが重要である。
【００４４】
また、プライマーの５’末端に標識としてビオチンを結合させておくと、増幅産物のＤＮＡを、基板上のストレプトアビジンとの結合を介して基板上に固定化でき、増幅産物の定量に供し得る。その他のプライマー標識物質としてジゴキシゲニン、各種蛍光色素などが例示される。
（ｉｉ）  増幅反応用試薬類
増幅反応に使用する酵素をはじめとする試薬類は、ＰＣＲ用、ＩＣＡＮ法のいずれも容易に入手できる。
【００４５】
ＰＣＲ法における試薬類として、少なくとも２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸のほか、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
【００４６】
ＩＣＡＮ法における試薬類は、少なくとも２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸、検出したい遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションできるキメラプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼのＲＮａｓｅを含む。
（ｉｉｉ）  コントロール
インターナルコントロールは、標的核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）について、増幅のモニタリング、あるいは定量の際の内部標準物質として使用される。インターナルコントロールの配列は、検体とは異なる配列の両側に、検体用プライマーと同じプライマーがハイブリダイズできる配列を有するために検体と同様に増幅できるものである。ポジティブコントロールの配列は、検体を検出する特異的な配列で、プライマーがハイブリダイズする部分とその間の配列が検体と同じものである。コントロールに使用する核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）は、公知技術文献に記載されているものを使用すればよい。ネガティブコントロールは、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）以外の試薬などをすべて含み、コンタミネーションの有無のチェック、バックグラウンド補正用に用いる。
（ｉｖ）  逆転写用試薬
ＲＮＡの試料の場合、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための逆転写酵素、逆転写プライマーなどであり、これらも市販され容易に入手できる。
【００４７】
これらの増幅用基質（２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸）、遺伝子増幅用試薬などは、一枚のマイクロリアクタの上記試薬収容部に、それぞれ予め所定量封入されている。したがって本発明のマイクロリアクタは使用時にその都度、試薬を必要量充填する必要はなく、即使用可能の状態になっている。
検出部位
本発明の生体物質検査用マイクロリアクタでは、微細流路の反応部位よりも下流上に、生体物質、例えば増幅された遺伝子を検出するための検出部位が設けられている。少なくともそのマイクロリアクタの検出部分は、光学的測定を可能とするために透明、好ましくは透明なプラスチックとなっている。さらに微細流路上の検出部位に吸着されたビオチン親和性タンパク質が、プローブ物質に標識されたビオチン、または遺伝子増幅反応に使用されるプライマーの５’末端に標識されたビオチンと結合する。これにより、ビオチンで標識されたプローブまたは増幅された遺伝子が本検出部位でトラップされる。少なくとも検出部位の微細流路は、ポリスチレンで形成されていることが望ましい。
【００４８】
増幅された目的遺伝子のＤＮＡまたはそれ以外の生体物質を検出する方法として、一般的には可視分光側光法、蛍光測定法、発光ルミネッセンス法といった検出方法が用いられる。さらに、電気化学的方法、表面プラズモン共鳴、水晶発振子マイクロバランスなどの手法も挙げられる。
【００４９】
分離された生体物質または増幅された目的遺伝子のＤＮＡを検出する方法は特に限定されないが、好ましい態様として基本的には以下の工程で行なわれる。すなわち上記マイクロリアクタを用い、
（１ａ）検体もしくは検体から抽出したＤＮＡ、あるいは検体もしくは検体から抽出したＲＮＡから逆転写反応により合成したｃＤＮＡと、５’位置でビオチン修飾したプライマーとを、これらの収容部から下流の微細流路へ送液する。反応部位の微細流路内で、遺伝子を増幅する工程、微細流路内で増幅された遺伝子を含む増幅反応液と変性液とを混合し、増幅された遺伝子を一本鎖に変性処理する工程、増幅された遺伝子を一本鎖に変性処理した処理液を、ビオチン親和性タンパク質（好ましくはストレプトアビジン）を吸着させた微細流路内の検出部位に送液し、前記増幅遺伝子をトラップする工程を経て、増幅遺伝子をトラップした微細流路内の検出部位に、末端をＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で蛍光標識したプローブＤＮＡを流し、これを固定化した遺伝子にハイブリダイズさせる。（予め増幅遺伝子と蛍光標識したプローブＤＮＡとをハイブリダイズさせたものを検出部位でトラップしてもよい。）
（１ｂ）検体に存在する抗原に対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含有する試薬を検体と混合する。その場合、抗体は、ビオチンおよびＦＩＴＣで標識されている。したがって抗原抗体反応により得られる生成物は、ビオチンおよびＦＩＴＣを有する。これをビオチン親和性タンパク質（好ましくはストレプトアビジン）を吸着させた微細流路内の検出部位に送液し、ビオチン親和性タンパク質とビオチンとの結合を介して該検出部位に固定化する。
（２）上記微細流路内にＦＩＴＣに特異的に結合する抗ＦＩＴＣ抗体で表面を修飾した金コロイド液を流し、これにより固定化した抗原抗体反応物のＦＩＴＣに、あるいは遺伝子にハイブリダイズしたＦＩＴＣ修飾プローブに、その金コロイドを吸着させる。
（３）上記微細流路の金コロイドの濃度を光学的に測定する。
【００５０】
上記ビオチン親和性タンパク質として、アビジン、ストレプトアビジン、エクストラアビジン（Ｒ）などが挙げられる。これらのアビジン類は、ビオチン結合部位として４箇所有するが、好ましくはストレプトアビジンがより高度の特異性であることから望ましい。このＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉ由来のタンパク質を微細流路内に吸着させる好適な条件が本発明者らにより明らかにされた。ポリスチレン基板に形成された微細流路内にストレプトアビジンを固定化する際、特別な化学的処置を行うことは必要とし
ない。単にビオチン親和性タンパク質をＳＳＣ緩衝液または生理食塩水に溶解して１０〜３５μｇ／ｍＬ、好ましくは２０〜３０μｇ／ｍＬの濃度の溶液を調製し、これをポリスチレン製の増幅反応部位よりも下流の微細流路上に適用して該流路上にビオチン親和性タンパク質を吸着させるだけでよい。このようにストレプトアビジンを固定化させることにより、増幅遺伝子のトラップを行う検出部位を極めて簡便に設けることができる。ストレプトアビジン吸着量を多くするためには、ポリスチレンの吸着部分に微細な凹凸、例えば線条を設けて該検出部位の表面積を拡大してもよい。このようにして検出部位に吸着されたビオチン親和性タンパク質は、プローブ物質に標識されたビオチン、または遺伝子増幅反応に使用されるプライマーの５’末端に標識されたビオチンと結合する。
【００５１】
プローブは、生体物質に結合させるものであり、測定対象がタンパク質では、検出用の蛍光標識であるＦＩＴＣを上記ビオチンとともに結合している抗体が相当する。また、遺伝子検査用のプローブＤＮＡとして、蛍光標識されたオリゴデオキシヌクレオチドが好ましく用いられる。そのＤＮＡ塩基配列は、検出目的の遺伝子塩基配列の一部分と相補的である配列が選択される。プローブＤＮＡの塩基配列を適切に選択することにより、目的の遺伝子に特異的に結合し、共存するＤＮＡ、バックグラウンドに影響されることなく高感度の検出が可能となる。
【００５２】
プローブを標識する蛍光色素として、公知の蛍光色素を用いることができる。例えば、一般的なＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ（ローダミンイソチオシアネート）、ＮＢＤ、Ｃｙ３、Ｃｙ５などの蛍光物質などが示されるが、特にＦＩＴＣが、抗ＦＩＴＣ抗体、例えば金コロイド抗ＦＩＴＣ抗マウスＩｇＧを入手できることから望ましい。蛍光色素の代わりにステロイドハプテンのジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を、プローブＤＮＡに標識させてもよい。この場合、抗ＤＩＧ−アルカリホスファターゼ標識抗体を抗ＦＩＴＣ抗体の代替として用いる。
【００５３】
蛍光色素ＦＩＴＣの蛍光を測定することも可能である。しかしながら、蛍光色素の光褪色、バックグラウンドノイズなどを考慮する必要がある。このため最終的に可視光により、高感度で測定できる方式が好ましい。
【００５４】
本発明の生体物質検査デバイスでは、金コロイド抗ＦＩＴＣ抗マウスＩｇＧを用いた金コロイドの光学検出を利用する。あるいは、上記蛍光色素の代わりに上記プローブを西洋わさびパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識してもよい。この酵素が触媒する発色反応を利用することもできる。そのための典型的な発色物質として、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ｐ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−アミノサリチル酸（５ＡＳ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、４−クロロ−１−ナフトール（４Ｃ１Ｎ）、４−アミノアンチピリン、ｏ−ジアニシジンなどが知られている。
【００５５】
パーオキシダーゼの他に、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼなどの酵素・発色系も使用できる。
このような可視光の吸光分析が優れるのは、蛍光測光より、機器が汎用的であり、妨害因子が少なくデータ処理も容易であるためである。好ましくは、そのための光学検出装置が、上記マイクロポンプを含む送液手段およびマイクロリアクタの流路内における各反応の反応温度を制御する温度制御装置とともに組み込まれて、一体化した構成を有している本発明の生体物質検査デバイスを用いて検出が行われる。
【００５６】
好ましくは、前記各工程の間に、必要に応じてストレプトアビジンを吸着させた前記流路内に洗浄液を送液する工程を含む。そのような洗浄液としては、例えば各種の緩衝液、塩類水溶液、有機溶媒などが好適である。なお上記工程において、変性液は、遺伝子ＤＮ
Ａを１本鎖にするための試薬で、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが挙げられる。
コントロールの測定
生体物質の分析では、通例、分析にネガティブコントロールを加え、検体の分析と並行して行われる。コンタミネーション、例えば試薬等に混在する物質の発色、蛍光などの補正に必須であるためである。さらに分析結果の信頼性を増すためには、ポジティブコントロールも加えることも必要である。添加する試薬等における妨害因子の検出、設定した条件の適切性、非特異的な相互作用などの検証に有用である。同様にインターナルコントロールを加えることも往々必要とされ、特に定量分析には有用である。
【００５７】
ポジティブコントロール、インターナルコントロールを同時に行うことは、特にＰＣＲ法による遺伝子増幅、抗原抗体反応では重要である。ＰＣＲ反応、抗原抗体反応が正しく起きていることのチェックも特に必要とされるためである。例えば何らかの問題が生じた場合、それが設定条件、試薬類、操作、分析系に由来するか、あるいは検体に由来するかの検証に最適である。とりわけＰＣＲ法は検体中に存在する微量の遺伝子を数十万〜数百万倍以上にも増幅できることから、クロスコンタミネーションといった汚染による影響は著しく深刻である。
【００５８】
偽陽性および偽陰性の判定に有用なこれらのコントロールの設定は、従来の分析技術の慣行に従う。本発明のマイクロリアクタの流路構成によれば、検体とは別個の分析流路において、同一試薬、同一条件のもとで、同時進行で行うことができる。
【００５９】
上記の増幅などの反応および検出は、送液順序、容量、タイミングなどについて予め設定された条件として、マイクロポンプおよび温度の制御、光学的検出のデータ処理とともにプログラムとして生体物質検査デバイスのソフトウェアに組みこまれている。生体物質検査デバイス本体と、この装置本体に対し脱着可能な上記マイクロリアクタとを接合させるとマイクロリアクタの流路も作動状態となる。好ましくは自動的に分析が開始され、試料および試薬類の送液、混合に基づく遺伝子増幅などの反応、反応物の検出および光学的測定が、一連の連続的工程として自動的に実施され、測定データが、必要な条件、記録事項とともにファイル内に格納される。
マイクロリアクタによる検査
本発明の生体物質検査デバイスおよびそのマイクロリアクタにおいて、検出方法として採用された遺伝子増幅技術及びハイブリダイゼーション技術から、主に２つの遺伝子検査の側面が形成される。まず遺伝子増幅反応に使用するプライマーとして、ある特定の遺伝子に特異的な配列を有するプライマーを用いることにより、増幅の有無または増幅効率を測定することにより、試料中の遺伝子由来のＤＮＡが、その特別の遺伝子と同一か、異なるかの判定に利用することができる。特に、感染病の原因ウィルス、細菌を遺伝子から迅速に同定または判定するのに有効である。アレル特異的オリゴヌクレオチドをＰＣＲオリゴマーとして使用する対立遺伝子特異的ＰＣＲとして行うと、相同染色体上の対立遺伝子間の僅かな突然変異も検出できる。本マイクロリアクタは多項目同時測定にも対応するため、遺伝子検査において使用するプライマーは、適宜、塩基配列を変更した複数のプライマーを用意して、例えば同一種の細菌、ウィルスの間における変異株の同定、識別にも好適に用いられる。
【００６０】
さらに増幅された遺伝子ＤＮＡにハイブリダイズするプローブＤＮＡのヌクレオチド配列を目的の遺伝子と相補的になるように設計することで検出の精度を高めている。あるいはハイブリダイゼーションにおける合成プローブとのミスマッチを指標とする遺伝子変異の検出にも応用が可能である。
【００６１】
あるいは、特定の疾患に対する罹患感受性を示す遺伝性素因の判定、医薬に対する副作
用などに関与する遺伝子変異、コーディング領域のほか、調節遺伝子のプロモーター領域における変異も本発明のマイクロリアクタを用いる遺伝子検査により検出することができる。その場合、変異の部分を含む核酸配列を有するプライマーを利用する。なお、上記遺伝子変異とは、遺伝子のヌクレオチド塩基における変異の意味である。さらに本発明の検査装置を使用することによる遺伝子多型の解析は、疾患感受性遺伝子の同定にも役立つ。
【００６２】
本発明の検査装置を用いることによる各種遺伝子検査法は、従来の核酸配列分析、制限酵素分析、核酸ハイブリダイゼーション分析と比べ、はるかに少ない検体量、僅かな手間と簡便な装置により高い精度の結果を得ることができることは装置の構成と分析原理から明らかである。
【００６３】
上記遺伝子検査の他にも、本発明のマイクロリアクタにおける多項目同時測定は、使用するプローブおよび検出方法の設計により、例えば臨床検体について抗原、ホルモン、代謝物質などの多項目分析についても実現することができる。
【００６４】
本発明の生体物質検査用マイクロリアクタ、生体物質検査用装置などは、遺伝子発現解析、遺伝子機能解析、１遺伝子多型解析（ＳＮＰ）、臨床検査・診断、医薬スクリーニング、医薬、農薬あるいは各種化学物質の安全性・毒性の検査、環境分析、食品検査、法医学、化学、醸造、漁業、畜産、農産製造、農林業等の分野で利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
以下、本発明の好ましい実施態様の一例として示された図面を参照しながら、遺伝子検査を例としてさらに説明する。本発明は、かかる態様および例に限定されるものではない。
【００６６】
図２に示す、樹脂製の一枚のチップからなるマイクロリアクタは、血液または喀痰から抽出された遺伝子検体を注入することにより、チップ内でＩＣＡＮ法による遺伝子増幅反応およびその検出を自動的に行い、複数の遺伝子について同時に遺伝子診断ができるように構成されている。例えば、縦横の長さが数ｃｍのチップに２〜３μＬ程度の血液検体を滴下するだけで、図１の装置本体２にチップを装着することにより増幅反応およびその検出ができるようになっている。
【００６７】
図２の検体収容部２０に注入された検体と、試薬収容部１８ａ〜１８ｃに予め封入された遺伝子増幅反応に用いる試薬（検出対象である遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションするビオチン修飾したキメラプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、およびエンドヌクレアーゼを含む）は、図１の装置本体に組み込まれたマイクロポンプ（図示せず）によって各収容部に連通する流路へ送液され、Ｙ字流路を介して流路内で検体と試薬とが混合され、増幅反応が行われる。微細流路は、例えば幅１００μｍ、深さ１００μｍ程度に形成される。このようにして増幅されたＤＮＡは、金コロイドを 結合させた
濃度を光学的に測定することにより検出される。具体的には図１の装置本体２に組み込まれた光学検出装置（図示せず）によって検出される。例えば、ＬＥＤなどから検査項目ごとの分析流路上の検出部位に対して測定光を照射し、フォトダイオード、ＣＣＤカメラ、光電子増倍管などの光検出手段で透過光もしくは反射光を検出する。これによりハイブリダイズさせたプローブＤＮＡを介して標識された増幅ＤＮＡ（遺伝子）を検出できるようになっている。
【００６８】
本実施形態では、１枚のチップで高精度かつ迅速に信頼性の高い遺伝子検査を行うために、マイクロリアクタを次のような態様に構成している。
第１に、１枚のチップにコントロールがすべて一体化されており、インターナルコントロール、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールが予めマイクロリアクタ
に封入されている。マイクロリアクタの作動により試薬類が分割されて、検体の増幅反応および検出操作と同時に、これらのコントロールの増幅反応および検出のための所定の工程が実施される。これによって、迅速に信頼性の高い遺伝子検査を行うことができる。
【００６９】
第２に、流路の各所定位置には、正方向への送液圧力が予め設定された圧に達するまで液体の通過を遮断し、予め設定された圧以上の送液圧力を加えると液体の通過を許容するというように、マイクロポンプのポンプ圧により液体の通過を制御する送液制御部と、流路内の液体の逆流を防止する逆流防止部とを配設している。流路内における液体の送液がマイクロポンプ、送液制御部および逆流防止部の働きによって制御される。すなわち試薬、検体が送液中に分割され、試薬などを高精度に定量送液することができ、さらに分岐流路から導入された複数の試薬を迅速に混合することができる。
【００７０】
次に、本実施形態のマイクロリアクタを用いた増幅反応およびその検出操作を、このマイクロリアクタの主要な構成要素と関連づけて説明する。
・試薬収容部
マイクロリアクタ１には、各試薬を収容するための複数の試薬収容部１８が設けられ、遺伝子増幅反応に用いる試薬、増幅された遺伝子を変性する変性液、増幅された遺伝子とハイブリダイズさせるプローブＤＮＡなどが収容される。
【００７１】
試薬収容部１８には、場所や時間を問わず迅速に検査ができるように、予め試薬が収容されていることが望ましい。チップ内に内蔵される試薬類は、蒸発、漏失、気泡の混入、汚染、変性などを防止するため、その試薬収容部の表面が密封処理されている。さらにマイクロリアクタの保管時に、試薬収容部から試薬が微細流路内に勝手に漏出して試薬が反応してしまうことなどを防止するために封止材により封入されている。マイクロリアクタに予め試薬を収容しておく場合、試薬の安定性上、マイクロリアクタを冷蔵保管することが望ましい。この封止剤は、使用前、マイクロリアクタが保管される冷蔵条件下では、固化もしくはゲル化しており、使用時、室温にすると融解し流動状態となるものである。試薬と、試薬収容部１８に連通する流路１５との間に封止剤を充填することにより、試薬を試薬収容部に封じ込めることが好ましい。なお、封止剤と試薬との間には空気が介在しても差し支えないが、定量送液の観点から介在する空気の量は（試薬量に対して）充分に少ないことが好ましい。
【００７２】
このような封止剤としては、水に対して難溶性の可塑性物質を使用することができ、好ましくは水に対する溶解度が１％以下の油脂が好適である。なお、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを収容する各収容部とこれに連通する流路との間にも、同様に封止剤を充填してもよい。
・試薬定量部
上記の送液制御部および逆流防止部を用いて、試薬を定量的に送液することができる。試薬定量部の構成として、逆流防止部１６と送液制御部１３ａとの間の流路（試薬充填流路１５ａ）には、所定量の試薬が充填される。また、この試薬充填流路１５ａから分岐し、駆動液を送液するマイクロポンプ１１に連通する分岐流路が設けられている。なお、試薬充填流路１５ａに、大容積の貯留部１７ａを設けることによって、定量のバラツキが小さくなる。
【００７３】
試薬の混合は、２つの試薬をＹ字流路により混合する。この場合、各試薬を同時に送液したとしても、液の先頭部分では混合比率が安定しない。そこでこの先頭部分を切り捨てて、混合比率が安定してから混合液を次工程へ送液するようにすることが望ましい。
・反応部位
検出対象の遺伝子に特異的にハイブリダイズするビオチン修飾したキメラプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、およびエンドヌクレアーゼなどの試薬は、図３
の試薬収容部１８ａ、１８ｂ、１８ｃに収容され、各試薬収容部の上流側には、マイクロリアクタとは別途の装置本体に内蔵されたピエゾポンプ１１がポンプ接続部１２で接続され、各試薬収容部から下流側の流路１５ａへこれらのポンプにより試薬が送液される。
【００７４】
流路１５ａと、流路１５ａから分岐した次工程への流路と、送液制御部１３ａ、１３ｂは、各試薬収容部から送液された試薬の混合液の先端部を切り捨て、混合状態が安定した後に試薬混合液を次工程へ送液するような流路を構成する。各試薬収容部には、合計で７．５μＬ超の試薬が収容されており、先端を切り捨てた計７．５μＬの試薬混合液が、２．５μＬずつ３本に分岐した流路１５ｂ、１５ｃ、１５ｄへ送液される。流路１５ｂは検体との反応、検出系２２へ（図２および図３）、流路１５ｃはポジティブコントロールとの反応、検出系２２へ（図２および図３）、流路１５ｄはネガティブコントロールとの反応、検出系２２へ（図２および図３）、それぞれ連通している。
【００７５】
流路１５ｂに送液された混合試薬は、図２の貯留部１７ａに充填される。なお、貯留部１７ａの上流側の逆止弁１６と、下流側の送液制御部１３ａとの間で、試薬充填流路が構成され、駆動液を送液するポンプ１１に連通する分岐流路に設けられた送液制御部１３ｂとともに、前述した試薬定量部を構成している。
【００７６】
血液もしくは喀痰から抽出した検体は、図２の検体収容部２０から注入され、貯留部１７ｂに、上記の試薬定量部と同じ機構で検体が定量に充填され（２．５μＬ）、後続する流路へ定量送液される。各貯留部１７に充填された検体と試薬混合液は、Ｙ字流路を介して流路１５ｅ（容積５μＬ）に送液され、この流路１５ｅ内で混合およびＩＣＡＮ反応が行われる。ここで、検体と試薬との送液は、交互に各ポンプ１１を駆動して流路１５ｅへ輪切り状に検体と試薬混合液とを交互に導入し、迅速に検体と試薬とが拡散、混合するようにしている。
【００７７】
増幅反応は、５μＬの反応液と、停止液収容部２１ａに収容された１μＬの反応停止液とを容積６μＬの流路１５ｆに送液してこれらを混合することにより停止される。次いで、変性液収容部２１ｂに収容された変性液（１μＬ）と、反応液と停止液との混合液（０．５μＬ）とを、容積１．５μＬの流路１５ｇへ送液して混合し、増幅された遺伝子を１本鎖に変性する。次いで、ハイブリダイゼーションバッファー収容部２１ｃに収容された、ハイブリダイゼーションバッファー（２．５μＬ）と、変性処理した処理液（１．５μＬ）とを、容積４μＬの流路１５ｈへ送液して混合する。
・検出部位
次いで、この処理液を、流路内にストレプトアジビンを吸着させた検出部位２２ａ、２２ｂに２μＬずつ送液し、上記増幅遺伝子をこの流路内に固定化する。この増幅遺伝子が固定化された流路２２ａ内へ、単一のポンプ１１により、各収容部２１ｄ、２１ｆ、２１ｅに収容された洗浄液、末端をＦＩＴＣで蛍光標識したプローブＤＮＡ溶液および抗ＦＩＴＣ抗体で標識した金コロイドの溶液を、図２に示した順序で送液する。同様に、増幅遺伝子が固定化された流路２２ｂ内へ、単一のポンプ１１により、各収容部２１ｄ、２１ｇ、２１ｅに収容された洗浄液、インターナルコントロール用プローブＤＮＡ溶液および抗ＦＩＴＣ抗体で標識した金コロイドの溶液を、同図に示した順序で送液する。固定化された一本鎖の増幅遺伝子にプローブＤＮＡをハイブリダイズさせる。なお、洗浄液収容部２１ｄには、必要とされる洗浄液が適宜収容されている。
【００７８】
金コロイド溶液を送液することにより、固定化された増幅遺伝子にプローブＤＮＡのＦＩＴＣを介して金コロイドが結合され、固定化される。この固定化された金コロイドを光学的に検出することにより、増幅の有無または増幅効率を測定する。
【００７９】
図３の流路１５ｃ、１５ｄは、ポジティブコントロールの反応、検出系、およびネガテ
ィブコントロールの反応、検出系に連通され、試薬混合液をこれらに送液することにより、上述した検体の反応、検出系における場合と同様に、試薬と流路内で増幅反応させた後、プローブＤＮＡ収容部に収容されたプローブＤＮＡとハイブリダイズさせて、この反応生成物に基づいて増幅反応が検出される。
【実施例】
【００８０】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明する。本発明は、かかる実施例によりなんら限定されるものではない。
用いた試薬類
・ストレプトアビジン；ナカライテスク社製を使用した。
・ビオチン化金コロイド；Ａｌｂｕｍｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｇｏｌｄ  Ｌａｂｅｌｅｄ  ２０ｎｍ（シグマ社、品番Ａ４４１７）
これを下記の５×ＳＳＣで５０倍に希釈して用いた。
・緩衝液（調製後、０．２μｍのフィルターでろ過滅菌した）
５×ＳＳＣ；７５０ｍＭ  塩化ナトリウムおよび７５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム
生理食塩水；０．９％  塩化ナトリウム
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；  Ｔｒｉｓは、２−ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｄｉｏｌである。
【００８１】
純水
検出
極大波長が、５２０〜５３０ｎｍの発光ダイオードと、フォトダイオードとを対向させて、その間にサンプルの測定部分を置き、フォトダイオードの出力を測定した。すなわち、発光ダイオードとフォトダイオードとの間に何もないときの数値をＩ0、吸着させてい
ない素ベースの数値をＩb、金コロイドを反応させたときの数値をＩgとした場合、吸着強度は、
ｌｏｇ  （Ｉ0 ／  （Ｉ0 ＋  （Ｉg−Ｉb）  ）で算出される。
手順
ポリスチレンのシートに、直径４ｍｍの穴の空いたシリコーンゴムを貼り付ける。上記の穴に、各種の緩衝液（Ｔｒｉｓバッファー、ＳＳＣバッファー、ハイブリバッファー、生理食塩水）で調製した、種々の濃度（１０〜５０μｇ／ｍＬの範囲で９種類）のストレプトアビジン溶液をそれぞれ１２μＬ充填する。シリコーンゴムの穴をシリコーンゴムの蓋を載せて塞ぎ、室温に１時間静置した。ストレプトアビジン溶液を抜き取り、各種緩衝液で３回、穴を洗浄した。次いでシリコーンの穴にビオチン標識金コロイドを２μＬ充填した。ビオチン標識金コロイドを抜き取り、各種緩衝液で３回、穴を洗浄した。シリコーンゴムを外して、ポリスチレンシートを乾燥させた。
【００８２】
その後、ポリスチレンシートの穴の部分とその他の部分の光学濃度を測定し、金コロイド部分の吸着強度を上記式に従い、算出した。得られた結果を表１に示す。
ストレプトアビジンの濃度としては、２５μｇ／ｍＬが最適である。使用する緩衝液として、生理食塩水＞ＳＳＣ＞Ｔｒｉｓ＞純水の順で好ましい。
【００８３】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、マイクロリアクタと装置本体とからなる生体物質検査デバイスの概略図である。
【図２−１】図２−１は、本発明の一実施形態における生体物質検査用マイクロリアクタの概略図である。なおマイクロポンプ１１は、本マイクロリアクタとは別途の装置に属する。
【図２−２】図２−２は、図２−１の流路から連通する、検体と試薬との反応、検出を行う部分の構成を示す図である。送液制御部１３は省略してある。また、マイクロポンプ１１は、本マイクロリアクタとは別途の装置に属する。
【図３】図３は、本発明の一実施形態におけるマイクロリアクタの試薬混合部および試薬分割の構成を示した図である。
【図４】図４は、検体収容部２０、検体前処理部２０ａ及び検体分割を示した図である。
【図５】図５は、マイクロリアクタの一部の断面図である。試薬収容部からの流路、図４の検体前処理部２０ａ、サンプルポート１９からの合流の位置関係を示している。なお点線で表示したエレメントは、実線のエレメントとは同一断面の位置にはないことを示す。
【図６】図６は、測定項目数が２個の場合、検体収容部２０、サンプルポート１９などの配置位置の一例を示す。
【符号の説明】
【００８５】
１  マイクロリアクタ
２  装置本体
１１  マイクロポンプ
１２  ポンプ接続部
１３  送液制御部
１５  流路
１６  逆流防止部
１７ａ  試薬貯留部
１７ｂ  検体貯留部
１８  試薬収容部
１９  サンプルポート
２０  検体収容部
２０ａ  検体前処理部
２０ｂ  検体処理液収容部
２１ａ  停・止液収容部
２１ｂ  変性液収容部
２１ｃ  ハイブリダイゼーションバッファー収容部
２１ｄ  洗浄液収容部
２１ｅ  金コロイド収容部
２１ｆ  プローブＤＮＡ収容部
２１ｇ  インターナルコントロール用プローブＤＮＡ収容部
２１ｈ  ポジティブコントロール収容部
２１ｉ  ネガティブコントロール収容部
２２  ストレプトアジビン吸着部
２３  廃液貯留部
６４  弁部
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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