(57)【要約】【課題】ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）由来の遺伝子から転写されるＲＮＡを、そのＥ６遺伝子領域において、解裂させる際に利用可能なヘアピンリボザイムの提供。【解決手段】合成リボザイム、すなわちヘアピン部分と、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）のそれぞれウイルス塩基４１９および４３４の後に結合する結合部位と、ＨＰＶウイルスを解裂する解裂部位を有するリボザイムを開示する。また、本発明は、ＰＣＲ増幅に基づく組織内ウイルスの検出法を含む。【選択図】図２
2006149387.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘアピン部分と、ヒト乳頭腫ウイルスのヌクレオチド配列に結合する結合部位と、前記配列を解裂する解裂部位とからなり、
前記解裂部位が、前記配列の塩基４３４の後の部位、および前記配列の塩基４１９の後の部位のいずれかである
ことを特徴とする合成リボザイム。
【請求項２】
前記の結合部位が、
４３０−ＡＣＵＧ Ｕ*ＧＵＣ ＣＵＧＡＡＧＡ−４４４（配列識別番号２）、
４３０−ＡＣＵＧ Ｕ*ＧＵＣ ＣＵＧＡＡＧＡＡ−４４５（配列識別番号３）、
４３０−ＡＣＵＧ Ｕ*ＧＵＣ ＣＵＧＡＡＧＡＡＡ−４４６（配列識別番号４）、
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣ−４２８（配列識別番号７）、
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣＣ−４２９（配列識別番号８）、
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣＣＡ−４３０（配列識別番号９）、および
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣＣＡＣ−４３１（配列識別番号１０）
（ここで、＊は解裂部位を示す）のいずれかの配列に結合する
ことを特徴とする請求項１に記載の合成リボザイム。
【請求項３】
前記ヘアピン部分が配列識別番号５からなる
ことを特徴とする請求項１に記載の合成リボザイム。
【請求項４】
前記リボザイムがＨＰＶ−１６のヌクレオチド配列に結合する
ことを特徴とする請求項１に記載の合成リボザイム。
【請求項５】
配列識別番号６の配列からなる
ことを特徴とする請求項４に記載の合成リボザイム。
【請求項６】
配列識別番号１１の配列からなる
ことを特徴とする請求項４に記載の合成リボザイム。
【請求項７】
図２に示すように二次元配位を有する
ことを特徴とする請求項１に記載の合成リボザイム。
【請求項８】
図６に示すように二次元配位を有する
ことを特徴とする請求項１に記載の合成リボザイム。
【請求項９】
請求項１に記載のリボザイムをコードしたＤＮＡ配列からなり、前記ＤＮＡ配列が表現制御配列に機能的にリンクしている
ことを特徴とするベクター。
【請求項１０】
前記ベクターがプラスミッドである
ことを特徴とする請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
宿主細胞が、前記のベクターから前記のリボザイムを表現する
ことを特徴とする請求項９に記載のベクターで変形された宿主細胞。
【請求項１２】
ウイルスゲノム上の解裂部位を識別し、解裂部位のいずれかの側の配列を測定し、合成リボザイム上の結合部位が解裂部位に非相補的な配列と解裂部位のいずれの側の配列に相補的な結合部位とを有することを特徴とするヘアピン合成リボザイムを構築し、
次いで、ヘアピン合成リボザイムをウイルスゲノムと接触させることによりウイルスゲノムを解裂させる工程からなる
リボザイムによるヒト乳頭腫ウイルスを解裂する方法。
【請求項１３】
前記の接触させる工程をin vitroで行う
ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記の接触させる工程をin vivoで行う
ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ヘアピン合成リボザイムの構築工程が、配列識別番号５のテトラループ配列の挿入を含む
ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
ＲＮＡを含むヒトの組織を採取し、前記組織の前記ＲＮＡをＨＰＶ−１６ ＲＮＡ由来のヌクレオチド配列に結合するリボザイムに曝露させて前記組織に存在するＨＰＶ−１６ ＲＮＡを前記リボザイムで解裂させ、
完全長ＨＰＶ−１６トランスクリプトの５’末端、完全長ＨＰＶ−１６トランスクリプトのリボザイム解裂部位のフラグメント５’および完全長ＨＰＶ−１６トランスクリプトのリボザイム解裂部位のフラグメント３’に相補的なプライマーを用いてcＤＮＡを増幅させ、
次いで、増幅されたＤＮＡフラグメントを大きなＤＮＡフラグメントは完全長ＨＰＶトランスクリプトとし、小さなＤＮＡフラグメントは完全長ＨＰＶトランスクリプトのリボザイム解裂により生成したフラグメントとして同定することからなり、
試料中にＨＰＶ−１６ ＲＮＡが存在することを、大きなフラグメントに対する小さなフラグメントの比で判定する
ことを特徴とするヒト組織中のヒト乳頭腫ウイルス−１６（ＨＰＶ−１６）を検出する方法。
【請求項１７】
リボザイムによって解裂されるＨＰＶ−１６ ＲＮＡが、ＨＰＶ−１６のＥ６トランスクリプトである
ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
リボザイムがＲＨＰＶ４３４である
ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
リボザイムがＲＨＰＶ４１９である
ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ヒト組織が子宮頚管組織である
ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
曝露工程と増幅段間の間に、試料中に存在するＲＮＡからｃＤＮＡを生成させる工程を追加した請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
ヘアピン部分と、ヒト乳頭腫ウイルスのヌクレオチド配列に結合する結合部位と、前記配列を解裂する解裂部位とからなり、
前記解裂部位が前記配列の塩基４３４の後の部位および前記配列の塩基４１９の後の部位のいずれかであるあることを特徴とする合成リボザイムを構築し、
合成リボザイムの有効量を子宮頚管組織に投与することからなる子宮頚管癌の処置法。
【請求項２３】
投与の工程が合成リボザイムをリポフェクチンベースのリポソーム運搬系に懸濁させることからなる請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
合成リボザイムを他剤と混合投与することからなり、他剤が免疫賦活剤または化学療法剤のいずれかである
ことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
免疫賦活剤がＬＡＫ細胞である
ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
化学療法剤がシスプラチンである
ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、ＲＮＡ触媒、すなわちヒト乳頭腫ウイルスを５’水酸基を有するフラグメントと２’，３’環状リン酸塩を有するフラグメントに分解するリボザイムに関する。ここに記載する反応の生成物は、ＲＮＡの自然加水分解物に似ている。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
乳頭腫ウイルスは小さなＤＮＡウイルスであり、上皮細胞の過形成を誘導する。ヒトからは、約７０種類のゲノタイプが分離されている。これらゲノタイプの一部（１，２，４および７）はヒトの良性扁平上皮乳頭腫（いぼ；コンジローマ）に関連し、一方少なくとも２種類（１６および１８）はヒトの腫瘍性および前腫瘍性病変と関連があるとされている（DiPaoloら、１９９３、Critical Reviews in Oncogenesis 4: 337-360）。米国では、毎年１００，０００人あたり約８．６人の婦人に子宮頚管癌が発生している。婦人のＨＰＶ−１６は、しばしば良性および前悪性子宮頚管病変（ディスプレシア/ＣＩＮ）および半転移性子宮頚管癌の潜伏性感染と関連がある。男性のＨＰＶ−１６は、無症性疾患または臨床的丘診性病変と関連がある。陰茎のボウエノイド丘診症は、ｉｎ ｓｉｔｕで癌に似ている。子宮頚管癌で死亡する婦人数は全世界で年間少なくとも５００，０００人で、この癌は進行性細胞変化を経由して良性のコンジローマから高度のディスプレシア/ＣＩＮに進展し、さらに転移性癌に進展する。米国では、これらの病変の検出および処置に毎年５百万ドル以上の保健費が支出されている。
【０００３】
疫学的調査で、ヒトの全口腔腫瘍の最高８９％がＨＰＶ型で、ヒトの一次ケラチノサイトを不滅化し、げっ歯類細胞を変形させることが知られている。ＨＰＶの発癌性は、２種類のウイルス遺伝子Ｅ６およびＥ７の産物と関連があると思われる。これらの産物は、変形フェノタイプの導入および維持に必要である。これらの遺伝子によってコードされたタンパクは、腫瘍関連型と高い親和性を有し、Ｒｂおよびｐ５３腫瘍抑制細胞の産物に結合し、それを中和する（Nasseri,1991，Virol．194: 136; Sedmanら，1991，J．Virol．65: 4860-4866; Smotkin & Wettstein，1989，J．Virol．63: 1441-1447; Smotkin & Wettstein，1986，J．Virol．63: 1441-1447; Steeleら，1993，Cancer Res．53: 2330; Storeyら，1991，Nuc．Acids Res．19(15):4109）。
【０００４】
ほかに優れた方法がないため、泌尿科病院では、高度の病変については手術が行われている。子宮頚管レーザー切除治療は、婦人の子宮頚管ヒト乳頭腫ウイルス関連疾患の自然発生に長期の影響はない。インターフェロンは、通常、適時に処置を開始することができないため、それ自体では急性ウイルス感染に関する限り期待はもてない。
【０００５】
したがって、インターフェロンの利点は抗増殖効果であり、抗ウイルス効果ではないと推定されている。
【０００６】
また、癌の治療には混合化学療法も使用され、子宮頚管癌にはシスプラチンが単独または他の化学療法剤と混用されている。しかし、現在化学療法による成功はきわめて低い。第二相試験で、子宮頚管癌患者に対するシスプラチンと５ＦＵの併用効果はわずか２２％であり、一方、同じ併用は、頭部および頚部の扁平上皮癌に対しては、８８％の効果を上げている。
【０００７】
細胞毒性を有する薬剤の癌治療への使用は、毒性副作用および多剤耐性獲得のため、きわめて限られている。したがって、直接的な毒性反応はないが、腫瘍細胞の生育を調整することのできる治療法へのシフトが考えられている。
【０００８】
ＨＰＶ感染の治療法として、現在アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用によるウイルスｍＲＮＡ利用の妨害が注目されている（DiPaoloら，1993，Critical Reviews in Oncogenesis 4: 337-360; Steelsら，1993，Cancer Res．53: 2330; Storeyら，1991，Nuc．Acids Res．19(15):4109）。しかし、アンチセンス治療は、化学量論的観点から限界がある（Sarverら，1990，Gene Regulation and Acids，pp. 305-325）。
【０００９】
リボザイムはＲＮＡ分子であり、標的ＲＮＡの特異的部位を解裂するＲＮＡ触媒能を有する（Cechら,米国特許第4,987,071号参照）。リボザイムによって解裂されるＲＮＡ分子数は、化学量論的に予測される数よりも多い（Hampel & Tritz，1989，Biochem．28: 4929-4933; Uhlenbeck，1987，Nature 328: 596-600）。
【００１０】
これは、アンチセンスを用いた治療法に比較して利点がある。
【００１１】
リボザイムに比較して、アンチセンスによる治療法には２つの欠点がある。（１）アンチセンス分子は、その性質上触媒作用を有さない。（２）アンチセンス分子は、通常リボザイムの標的認識配列よりも長い。これは、同じ遺伝子ファミリー中で認められる同様なｍＲＮＡ配列に対して有害作用を有するアンチセンス分子の可能性を増加させる。
【００１２】
リボザイムは、"ハンマーヘッド"モチーフに基づいて設計されてきた（Sedmanら，1991，J．Virol．65:4860-4866）。しかし、"ハンマーヘッド"モデルに基づいて設計されたような触媒性ＲＮＡはいくつかの制限を有し、in vitroでの使用を制限し、in vivoでの使用を妨害する。例えば、反応最適温度は５０〜５５℃である（Haseloff & Gerlach，1988，Nature 328:585; Uhlenbeck，1987，Nature 328:596-600）。さらに、Ｋｍは０．６μＭであり（Uhlenbeck，1987，Nature 328: 596-600）、反応には高濃度の基質を要求し、不可能ではないにしても、触媒性ＲＮＡが、in vivoで遭遇するような、低濃度の標的ＲＮＡ基質を解裂することを困難にする。
【００１３】
"ヘアピン"モチーフは、"ハンマーヘッド"モチーフに比較して効率が高いといわれている（Hampel & Tritz，1989，Biochem．28:4929-4933; Hampelら，1990，Nuc．Acids Res．18: 299-304）。さらに、ヘアピン リボザイムは、ＨＩＶ上の標的部位を解裂するために使用されている（Ojwangら，1992，Oroc．Batl．Acid Sci．USA 89,10802-10806; Yuら，1993，Proc．Natl．Acid Sci．USA 90:6340-6344）。しかし、１種類のウイルスに対して作用するリボザイムは、一般に別の種類のウイルスを解裂しない。リボザイムは解裂のために特異的標的配列を要求するのみならず、リボザイムの構造自体が特異的標的を効果的に解裂できるように改変される必要がある。現在、ＨＰＶ ＲＮＡを解裂することが知られているヘアピン リボザイムはなく、ヘアピン リボザイムによって解裂されるＨＰＶの部位も知られていない。
【００１４】
従来、リボザイムを運搬するために、ある種の分子的な構成要素が用いられている。例えば、リボザイムを運搬するために、レトロウイルスが使用されている。Pol IIIプロモータおよびPol IIIプロモータを有するレトロウイルスベクターも使用されている。
【非特許文献１】DiPaoloら、１９９３、Critical Reviews in Oncogenesis 4: 337-360
【非特許文献２】Nasseri,1991，Virol．194: 136
【非特許文献３】Sedmanら，1991，J．Virol．65: 4860-4866
【非特許文献４】Smotkin & Wettstein，1989，J．Virol．63: 1441-1447
【非特許文献５】Steeleら，1993，Cancer Res．53: 2330
【非特許文献６】Storeyら，1991，Nuc．Acids Res．19(15):4109
【非特許文献７】DiPaoloら，1993，Critical Reviews in Oncogenesis 4: 337-360
【非特許文献８】Hampel & Tritz，1989，Biochem．28: 4929-4933
【非特許文献９】Uhlenbeck，1987，Nature 328: 596-600
【非特許文献１０】Haseloff & Gerlach，1988，Nature 328:585
【非特許文献１１】Hampel & Tritz，1989，Biochem．28:4929-4933
【非特許文献１２】Hampelら，1990，Nuc．Acids Res．18: 299-304
【非特許文献１３】Ojwangら，1992，Oroc．Batl．Acid Sci．USA 89,10802-10806
【非特許文献１４】Yuら，1993，Proc．Natl．Acid Sci．USA 90:6340-6344
【特許文献１】米国特許第4,987,071号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
発明の要約および利点
本発明に従って、ヘアピン部分と、ウイルス塩基４１９の後または塩基４３４の後の、ヒト乳頭腫ウイルスと結合するための結合部位と、結合部位でウイルスを解裂する解裂部位を有する合成触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイムを構築した。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、一形態において、ヘアピン部分と、ヒト乳頭腫ウイルスのヌクレオチド配列に結合する結合部位と、配列を解裂する解裂部位とからなる合成リボザイムで構成される。解裂部位は、ウイルス配列の塩基４３４の後の部位、またはウイルス配列の塩基４１９の後の部位である。このような合成リボザイムの結合部位は、以下の配列のいずれかと選択的に結合する。すなわち、
４３０−ＡＣＵＧ Ｕ*ＧＵＣ ＣＵＧＡＡＧＡ−４４４（配列識別番号２）、
４３０−ＡＣＵＧ Ｕ*ＧＵＣ ＣＵＧＡＡＧＡＡ−４４５（配列識別番号３）、
４３０−ＡＣＵＧ Ｕ*ＧＵＣ ＣＵＧＡＡＧＡＡＡ−４４６（配列識別番号４）、
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣ−４２８（配列識別番号７）、
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣＣ−４２９（配列識別番号８）、
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣＣＡ−４３０（配列識別番号９）、および
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣＣＡＣ−４３１（配列識別番号１０）。＊は、解裂部位を示す。また、リボザイムのヘアピン部分は、配列識別番号５の配列からなることが好ましい。
【００１７】
好ましい態様では、合成リボザイムはＨＰＶ−１６のヌクレオチド配列と結合する。この態様では、リボザイムが配列識別番号６または配列識別番号１１の配列からなっていることが好ましい。別の実施例では、合成リボザイムは図２に示すように二次元配置を有していてもよいし、図６に示す二次元配置を有していてもよい。
【００１８】
本発明は、別の形態で、上記の合成リボザイムをコードしたＤＮＡ配列からなるベクターを含む。この場合、ＤＮＡ配列は機能的に表現制御配列とリンクしていることが好ましい。例えば、ベクターは、プラスミッドであってもよい。
【００１９】
さらに、本発明は別の形態で、上記のベクターによって変形された宿主細胞からなり、ここで宿主細胞はベクターからリボザイムを表現することができる。また、本発明は別の形態で、リボザイムを用いたヒト乳頭腫ウイルスの解裂法からなる。この方法は、以下の工程からなる。すなわち、
ウイルスゲノム上の解裂部位を決定し、
解裂部位のいずれかの側の配列を測定し、
合成リボザイム上の結合部位が解裂部位を補足しない配列を有し、かつ解裂部位のいずれかの側の配列と相補的な結合領域を有するヘアピン合成リボザイムを構築し、
さらに、ヘアピン合成リボザイムをウイルスゲノムに接触されることによって、ウイルスゲノムを解裂させる。
【００２０】
本発明のかかる形態では、前記接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで行ってもよい。あるいは、前記接触を、ｉｎ ｖｉｖｏで行うこともできる。また、ヘアピン合成リボザイムの構築工程は、配列識別番号５のテトラループ配列をリボザイムに組み込むことを含む。
【００２１】
また、本発明は別の形態では、本発明は、ヒトの組織中に存在するヒト乳頭腫ウイルス−１６（ＨＰＶ−１６）を検出する方法からなる。この方法は、以下の工程からなる。すなわち、
ＲＮＡを含むヒト組織試料を採取し、
ＨＰＶ−１６ＲＮＡ由来のヌクレオチド配列に結合するリボザイムに組織中のＲＮＡを曝露させて、試料中に存在するＨＰＶ−１６ＲＮＡをリボザイムにより解裂し、
完全長ＨＰＶ−１６トランスクリプトの５’末端と、完全長ＨＰＶ−１６トランスクリプトのリボザイム解裂部位のフラグメント５’と、完全長ＨＰＶ−１６トランスクリプトのリボザイム解裂部位のフラグメント３’に相補的なプライマーを用いてｃＤＮＡを増幅させ、
増幅したＤＮＡフラグメントを同定する。
【００２２】
上記の方法では、大きなＤＮＡフラグメントは完全長ＨＰＶトランスクリプトを示し、小さなＤＮＡフラグメントは完全長ＨＰＶトランスクリプトのリボザイム解裂によって生成したフラグメントを示す。試料中にＨＰＶ−１６ＲＮＡが存在すると、大きなフラグメントに比較して小さなフラグメントが多く検出される。一つの態様で、リボザイムで解裂されるＨＰＶ−１６ＲＮＡは、ＨＰＶ−１６のＥ６トランスクリプトである。この方法に用いるリボザイムは、ＲＨＰＶ４３４またはＲＨＰＶ４１９のいずれかであることが好ましく、また、ヒト組織は子宮頚管組織である。この方法は、曝露工程の後、増幅工程に先立ち、さらに試料中に存在するＲＮＡからｃＤＮＡを生成する工程を設けてもよい。
【００２３】
本発明の別の形態は、以下の工程からなる子宮頚管癌の処置法からなる。すなわち、
ヘアピン部分と、ヒト乳頭腫ウイルスのヌクレオチド配列に結合する結合部位と、配列を解裂する解裂部位とからなり、該解裂部位は、配列の塩基４３４の後の部位と配列の塩基４１９の後の部位のいずれかであることを特徴とする合成リボザイムを構築し、
合成リボザイムの有効量を子宮頚管組織に配達する。
【００２４】
この方法では、配達工程は、リポフェクションに基づくリポソーム運搬システムに合成リボザイムを懸濁させることを含んでもよい。さらに、この方法は、免疫賦活剤または化学療法剤等の別の薬剤を合成リボザイムと混合投与する工程を含んでもよい。
【００２５】
好ましくは、免疫賦活剤はＬＡＫ細胞であり、用いる化学療法剤はシスプラチンである。
【００２６】
図面の簡単な説明
本発明のその他の利点は、添付する図面を関連させて、熟視しつつ、以下の記載を参照することによって、容易に理解することができる。
【００２７】
図１は、ヘアピンリボザイムにより解裂のために選んだ標的部位の位置、ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７領域におけるｍＲＮＡ標的部位のオーバーラップ、およびヌクレオチド４３４およびヌクレオチド４１９の後の"＊"で起こるヘアピンリボザイムによるこの標的部位の解裂点を示すＨＰＶ標的部位の模式図である。
【００２８】
図２は、最適リボザイム（ＲＨＰＶ）と基質（ＳＨＰＶ）の配列、標的基質とリボザイム（ヘリックス１およびヘリックス２と表示）の間の塩基対領域、および触媒の"ヘアピン"部分（ヘリックス３および４と表示）に要求される塩基対の領域を示す部分４３４の後のＨＰＶ−１６を解裂するように設計した最適ヘリックス（８ｂｐでなる）を有するヘアピンリボザイムの模式図である。
【００２９】
図３は、本発明によって、図に示すように７ｂｐ，８ｂｐおよび９ｂｐの長さを有するヘリックス１を用いて、４３４部位の後でＨＰＶ基質を解裂した後のオートラジオグラフである。参照対照は、リボザイムＲ５３および基質Ｓ１７（レーン１および２）であり、反応は２５ｎＭのリボザイムと５０ｎＭの基質を用い、３７℃で６０分間行った。前記対照の反応では、表示した時間に対して、未変性の（−）ｓＴＲＳＶ配列Ｓ１７／Ｒ５３を１０ｎＭおよび１００ｎＭとした（Hampel & Tritz，1989，Biochem．28: 4929-4933）。
【００３０】
図４は、ＲＨＰＶ４３４による解裂の経時的変化を示し、図４Ａは、各時間における解裂のオートラジオグラフであり、図４Ｂは、図４Ａの結果を図示したものである。ここで解裂条件は図３と同じとし、表示した各時間に対して、［Ｒ］＝２５ｎＭおよび［Ｓ］＝１００ｎＭであった。
【００３１】
図５は、ＲＨＰＶ４３４による解裂の速度論的解析を示し、図５Ａは、図４Ｂの結果を図示したものであり、図５Ｂは、［Ｓ］の各濃度で１０分間後の解裂のオートラジオグラフである。ここで、解裂条件は、図３と同じとし、［Ｒ］＝２０ｎＭ、ならびに［Ｓ］＝４００ｎＭ（レーン１）、２００ｎＭ（レーン２）、１５０ｎＭ（レーン３）、１００ｎＭ（レーン４）、７５ｎＭ（レーン５）、５０ｎＭ（レーン６）および２５ｎＭ（レーン７）であった。
【００３２】
図６は、位置４１９の後のＨＰＶ−１６を解裂するように設計した、最適ヘリックス１（７ｂｐからなる）を有するヘアピンリボザイムの模式図であり、最適リボザイム（ＲＨＰＶ）および基質（ＳＨＰＶ）の配列、標的基質とリボザイム（ヘリックス１およびヘリックス２と表示）の間の塩基対領域、および触媒の"ヘアピン"部分（ヘリックス３および４と表示）に要求される塩基対の領域を示す。
【００３３】
図７は、図に示すように６ｂｐ，７ｂｐ，８ｂｐおよび９ｂｐの長さを有するヘリックス１を用いて、４１９部位の後でＨＰＶ基質を解裂した後のオートラジオグラフである。参照対照は、リボザイムＲ５３および基質Ｓ１７（レーン１および２）であり、反応は２５ｎＭのリボザイムと５０ｎＭの基質を用い、３７℃で６０分間行った。参照の反応には、表示した時間に対して、未変性の（−）ｓＴＲＳＶ配列Ｓ１７／Ｒ５３を１０ｎＭおよび１００ｎＭとした（Hampel & Tritz，1989，Biochem．28:4929-4933）。
【００３４】
図８は、ＲＨＰＶ４１９による解裂の経時的変化を示し、図８Ａはｍ各時間における解裂のオートラジオグラフであり、図８Ｂｍは図８Ａの結果を図示したものである。ここで解裂条件は図３と同じとし、表示した各時間に対して、［Ｒ］＝２５ｎＭおよび［Ｓ］＝１００ｎＭであった。
【００３５】
図９は、ＲＨＰＶ４１９による解裂速度論的解析を示し、図９Ａは、図９Ｂの結果を図示したものであり、図９Ｂは、［Ｓ］の各濃度で１０分間後の解裂のオートラジオグラフである。ここで解裂条件は図３と同じとし、［Ｒ］＝２０ｎＭおよび［Ｓ］＝２００ｎＭ（レーン１）、１５０ｎＭ（レーン２）、１００ｎＭ（レーン３）、７５ｎＭ（レーン４）、５０ｎＭ（レーン５）および２５ｎＭ（レーン６）であった。反応終了時間の対照は、［Ｓ］＝２０ｎＭで０分（レーン７）および１時間（レーン８）とした。
【００３６】
図１０は、プラスミッドｐＢＫＳ ＬＮＫＲを得るためにpBluescript ＫＳにクローン化したポリリンカー領域の模式図である。
【００３７】
図１１は、ｔＲＮＡvalプロモータ、その上流領域、テトラループ変異体およびｐｏｌｙＴ終了配列を含むプラスミッドｐｔＶ１の模式図である。これは、ｔＲＮＡvalプロモータとその上流領域をｐＢＫＳ ＬＮＫＲにクローン化して調製した。
【００３８】
図１２は、ポリリンカー、ｔＲＮＡvalプロモータ、上流領域、テトラループ、終了領域を含むプラスミッドｐｔＶ１のＤＮＡ配列（配列識別番号１９）を示す。新しいリボザイムをＸｈｏ１／Ｍｌｕ１部位にクローン化することができる。
【００３９】
図１３は、プラスミッドｐｔＶ１にＲＨＰＶ４３４リボザイムを含むプラスミッドｐＢｔＶ１−４３４の模式図である。
【００４０】
図１４は、プラスミッドｐＢｔＶ１−４３４におけるポリリンカーおよびリボザイムのＤＮＡ配列（配列識別番号２０）を示す。
【００４１】
図１５は、"ｓｙｎ"配位のＲＨＰＶ４３４リボザイムを含み、転写がレトロウイルスベクターのレトロウイルスゲノムと同じ方向であるプラスミッドｐＺＩＰＶ１−４３４（ｓｙｎ）の模式図である。
【００４２】
図１６は、プラスミッドｐＺＩＰＶ１−４３４（ｓｙｎ）のデリバリーカセットおよびリボザイムのＤＮＡ配列（配列識別番号２１）を示す。
【００４３】
図１７は、"ａｎｔｉ"配位のＲＨＰＶ４３４リボザイムを含み、転写がレトロウイルスベクターのレトロウイルスゲノムとは逆の方向であるプラスミッドｐＺＩＰＶ１−４３４（ａｎｔｉ）の模式図である。
【００４４】
図１８は、プラスミッドｐＺＩＰＶ１−４３４（ａｎｔｉ）のポリリンカーおよびリボザイムのＤＮＡ配列（配列識別番号２２）を示す。
【００４５】
図１９は、ｐｔＶ１にクローン化した触媒作用を有さない突然変異ＲＨＰＶ４３４リボザイムクローンを含むプラスミッドｐＢ１Ｖ１−４３４（ｉ）の模式図である。
【００４６】
図２０は、プラスミッドｐＢｔＶ１−４３４（ｉ）のデリバリーカセットおよびリボザイムのＤＮＡ配列（配列識別番号２３）の模式図である。
【００４７】
図２１は、トランスクリプトのＲＮアーゼ保護によって検定した変形ヒトＣＸＴ１癌細胞におけるＨＰＶ特異性リボザイムの表現を示す。矢印はpol IIIプロモータからの保護リボザイムトランスクリプトの期待した大きさ１６０ｎｔを示す。
【００４８】
図２２は、ＲＴおよびＰＣＲ法で検定したときのヘアピンリボザイムを含むＣＸＴ１細胞におけるＨＰＶ Ｅ６トランスクリプトの表現を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
発明の詳細な説明
テトラループを改変したヘアピンリボザイムを設計し、試験したところ、ヒト乳頭腫ウイルス１６型からの一次トランスクリプトにおける特異的配列を解裂することが認められた。解裂部位は、このウイルスの配列におけるヌクレオチド４３４および４１９のすぐ後であった。リボザイムの最適化を行ったところ、４３４には８ｎｔのヘリックス１が最適であり、４１９には７ｎｔのヘリックス１が最適であることが確認された。経時的に反応を追跡し、基質がほとんど完全に解裂されることが確認された。
【００５０】
標準的なＭｉｃｈａｅｌｉｓ酵素速度論的解析により、４３４部位の速度論的パラメーターを測定した。反応のＫｍは２１ｎＭであり、リボザイムと基質の強固な結合が確認された。ｋｃａｔまたはターンオーバー数は０．０８３ｍｉｎ-1で、全体的な触媒効果（ｋｃａｔ／Ｋｍ）は４μＭ-1・ｍｉｎ-1であった。また、４１９部位の速度論的パラメーターも測定した。反応のＫｍは９８ｎＭであり、ｋｃａｔまたはターンオーバー数は０．１８ｍｉｎ-1で、全体的な触媒効果（ｋｃａｔ／Ｋｍ）は１．８μＭ-1・ｍｉｎ-1であった。
【００５１】
最適化した標的部位を図１に示す。模式図に示すように、解裂はそれぞれ塩基４３４の後および塩基４１９の後のＧＵＣ配列の前で起こった。この標的配列全体は、ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７領域の一次トランスクリプト（配列識別番号１）の一部である（Nasseri，1991，Virol．194:136; Smotkin & Wettstein，1989，J．Virol．63: 1441-1447）。このｍＲＮＡのキャップは、ｎｔ９７にある。ｎｔ２２６にスプライス供与体が存在し、ｎｔ４０９およびｎｔ５２６に二つのスプライス受容体が存在する。その結果、３種類のＥ６−Ｅ７ ｍＲＮＡ、すなわちＥ６Ｅ７、ＥＢ：（１）Ｅ７およびＥ６（ＩＩ）Ｅ７が生成する。Ｅ６Ｅ７はｎｔ２２６のスプライス供与体が利用されなかった完全長Ｅ６Ｅ７トランスクリプトによるものである。Ｅ６Ｅ７では、Ｅ６の翻訳終了がｎｔ５５７で起こる。主要なトランスクリプトであるＥ６（１）Ｅ７は、ｎｔ２２６のスプライス供与体およびｎｔ４０９のスプライス受容体が利用されたもので、そのＥ６（Ｉ）翻訳終了シグナルはｎｔ４１５に存在する。これによって、トランケートＥ６をコードした領域と完全長Ｅ７が得られる。非主要トランスクリプトであるＥ６（ＩＩ）Ｅ７は、ｎｔ２２６のスプライス供与体およびｎｔ５２６のスプライス受容体が利用されたもので、そのＥ６（ＩＩ）翻訳終了シグナルはｎｔ５４１に存在し、トランケートＥ６をコードした領域と完全長Ｅ７が得られる（Nassari，1991，Virol．194: 136）。
【００５２】
きわめて正確にＨＰＶを解裂することのできるＲＮＡ配列と比較し、ＲＮＡ触媒（リボザイム）が同定されている。リボザイムによる解裂の標的配列は、主要なトランスクリプトである一次トランスクリプトＥ６Ｅ７およびＥ６（Ｉ）Ｅ７に存在する。これらのトランスクリプトの解裂は、ケラチノサイトの変形に重要な役割を果たしていると思われる完全長Ｅ６およびＥ７タンパクの生成を低下させる効果があると考えられている（Sedmanら，1991，J．Virol．65: 4860-4866）。ＨＰＶの４３４部位の後を解裂するように設計されたヘアピンリボザイム（Hampelら，1990，Nuc．Acids Res．18: 299-304）を図２に示し、ＲＨＰＶ４３４と表示する。好ましい態様では、図示するようにこのヘアピンリボザイムのテトラループを改変した（Andersonら，1994，Nuc．Acids Res．22:1096-1100）。
【００５３】
本発明では、基本構造のループ３のＧＵＵ配列をテトラループ配列ＧＧＡＣ （ＵＵＣＧ） ＧＵＣＣで置換し、高い触媒効果を有し、きわめて安定な構造とした。
【００５４】
特に、本発明は、以下の標的配列を含むＲＮＡ基質を解裂することができるある種の合成ＲＮＡ触媒からなる。すなわち、
４３０−ＡＣＵＧ Ｕ*ＧＵＣ ＣＵＧＡＡＧＡ−４４４（配列識別番号２）
４３０−ＡＣＵＧ Ｕ*ＧＵＣ ＣＵＧＡＡＧＡＡ−４４５（配列識別番号３）
４３０−ＡＣＵＧ Ｕ*ＧＵＣ ＣＵＧＡＡＧＡＡＡ−４４６（配列識別番号４）
ＨＰＶの４１９部位の後を解裂するように設計されたヘアピンリボザイムを図６に示し、ＲＨＰＶ４１９と表示する。好ましい態様では、図示するようにこのヘアピンリボザイムのテトラループを改変した。本発明では、基本構造のループ３のＧＵＵ配列をテトラループ配列ＧＧＡＣ （ＵＵＣＧ） ＧＵＣＣで置換し、高い触媒効果を有し、きわめて安定な構造とした。
【００５５】
特に、本発明は、以下の標的配列を含むＲＮＡ基質を解裂することができるある種の合成ＲＮＡ触媒からなる。すなわち、
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣ−４２８（配列識別番号７）
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣＣ−４２９（配列識別番号８）
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣＣＡ−４３０（配列識別番号９）
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣＣＡＣ−４３１（配列識別番号１０）。
【００５６】
ここで用いた"合成ＲＮＡ触媒"は天然のＲＮＡ触媒ではない触媒（リボザイム）を意味するが、"合成触媒"は天然の触媒のトランケートまたは変形であってもよい。"合成触媒"はｉｎ ｖｉｔｒｏで合成された触媒およびｉｎ ｖｉｖｏで合成された触媒を含む。特に、"合成触媒"は触媒をコードした配列を有するベクターによって変形された宿主によって生産された触媒を含む。
【００５７】
ＲＮＡは、その長さおよび種類を問わず、式５’−Ｆ1−ＣＳ−Ｆ2−３’で表される標的配列を含んでいる限り基質として使用することができる。ここで、ＣＳは解裂配列、すなわち触媒によって解裂される基質の部位を含む塩基の配列である。ＣＳは短い配列の塩基であり、リボザイムと塩基対を形成せず、本発明ではＣＳは好ましくは５’−ＮＧＵＣ−３’の配列を有する。ここで、Ｎは塩基であり、基質はリボザイムによってＮとＧの間で解裂され、５’末端にＯＨを有するフラグメントと３’末端に２’，３’環状リン酸塩を有するフラグメントが生成する。
【００５８】
ＣＳは２種類の短い塩基配列Ｆ1およびＦ2によってフランクされ、ＲＮＡ触媒と塩基対を形成しない。好ましくは、Ｆ1の長さは少なくとも３塩基であり、４塩基の長さが最も好ましい。好ましくは、Ｆ2の長さは少なくとも３塩基であり、６〜１２塩基の長さが最も好ましい。
【００５９】
また、本発明によるリボザイムは、基質結合部分と"ヘアピン"部分を含む。
【００６０】
触媒の基質結合部分は、次式で表される。
【００６１】
３’−Ｆ4−Ｌ1−Ｆ3−５’
ここで、
Ｆ3は、触媒が基質と結合したとき、Ｆ3がＦ2と実質的に塩基対を形成するように選んだ塩基の配列であり（ヘリックス１、図２および６）、
Ｆ4は、触媒が基質と結合したとき、Ｆ4がＦ1と実質的に塩基対を形成するように選んだ塩基の配列であり（ヘリックス２、図２および６）、
Ｆ3およびＦ4の配列は、それぞれがＲＮＡ基質とＲＮＡ触媒との結合に必要な十分な数の塩基を含み、それによって基質の解裂が起こるように選び、
Ｌ1は、触媒が基質に結合したとき、Ｌ1がＣＳと塩基対を形成しないように選んだ塩基の配列である（ループ１、図２および６）。
【００６２】
ここで用いたように、”実質的な塩基対の形成”とは、該当する２種類のＲＮＡ配列の塩基の６５％以上が塩基対を形成していることを意味し、また、塩基の７５％以上が塩基対を形成していることが好ましい。
【００６３】
“実質的に塩基が対を形成していない”とは、該当する２種類の配列の塩基の６５％以上が塩基対を形成していないことを意味し、また、７５％以上が塩基対を形成していないことが好ましい。
【００６４】
好ましくは、Ｆ3の長さは少なくとも３塩基であり、６〜１２塩基であることが最も好ましい。Ｆ4の長さは３〜５塩基であることが好ましく、４塩基であることが最も好ましい。
【００６５】
Ｌ1は短い塩基の配列であり、ＣＳの配列が５’−ＮＧＵＣ−３’であるとき、５’−ＡＧＡＡ−３’の配列を有することが好ましい。さらに、Ｌ1が５’−ＡＧＡＡ−３’で、ＣＳが５’−ＮＧＵＣ−３’であるとき、Ｌ1に隣接するＦ1およびＦ4と、ＣＳと間の最初の塩基対は、Ｇ：ＣまたはＣ：Ｇであることが好ましい（図２および６）。したがって、本発明で選んだ基質の好ましい標的配列は５’−ＢＮＧＵＣ−３’の配列を有する（Andersonら，1994，Nuc．Acids Res．22: 1096-1100）。ただし、Ｂは、Ｇ，ＣまたはＵである。
【００６６】
"ヘアピン"部分、最少限のエネルギーでファールディングするように、基質−触媒複合体を二次元状に形成した際、ヘアピン様の配置に折り畳まれている、触媒の一部である。これを、図２および６に示す。"ヘアピン"部分は、"ヘアピン"部分の塩基全てが塩基対を形成しているとは限らないという意味では、絶対的なヘアピンではない。実際に、"ヘアピン"部分は、少なくとも１カ所のかなりの非塩基対領域を有する必要があり、そのため、より優れたまたは最高の触媒活性を発揮するための三次元構造を触媒はとることが可能である。
【００６７】
触媒の"ヘアピン"部分は、以下の配列を有することが好ましい。
【００６８】
【化１】
2006149387.tif 000003
【００６９】
ここで、
Ｐ1およびＰ4は、Ｐ1およびＰ4が実質的に塩基対を形成するように選んだ塩基配列であり（ヘリックス３、図２および６）、
Ｐ1はＦ4と共有結合しており、
Ｓ1およびＳ2は、実質的にＳ1（ループ２）およびＳ2（ループ４）が塩基対を形成しないように選んだ配列であり、
Ｐ2およびＰ3は、Ｐ2およびＰ3が実質的に塩基対を形成するように選んだ塩基配列であり（ヘリックス４、図２および６）、
Ｌ2は、対を形成していない塩基の配列である（ループ３）。
【００７０】
"実質的な塩基対形成"および"実質的に塩基対を形成しない"とは、上記と同じ意味である。
【００７１】
好ましくは、Ｐ1およびＰ4の長さは３〜６塩基であり、そして、Ｐ1は５’−ＡＣＣＡＧ−３’、またＰ4は５’−ＣＵＧＧＵＡ−３’の配列であることが最も好ましい。
【００７２】
５’−ＡＣＣＡＧ−３’の５’末端のＡ（下線で表示）は５’−ＣＵＧＧＵＡ−３’の３’末端のＵ（下線で表示）とは塩基対を形成しないことが発見され、対を形成していないＡは”ヒンジ”の役割をしていると思われる（図２および６）。
【００７３】
Ｓ1およびＳ2の長さは４〜９塩基であることが好ましく、Ｓ1は５’−ＡＧＡＡＡＣＡ−３’、またＳ2は５’−ＧＵＡＵＡＵＵＡＣ−３’の配列であることが最も好ましい。
【００７４】
予想とは異なり、ＨＩＶ標的配列のために構築されたヘアピンリボザイム（Ojwangら，1992，Proc．Natl．Acid Sci．USA，89:10802-10806）は、"テトラループ"の改変で構築したヘアピンリボザイムほどの効果がなかった。
【００７５】
従来の技術においては、好ましいＰ2配列は５’−ＣＡＣ−３’の配列であり、Ｐ3は５’−ＧＵＧ−３’の配列で、Ｌ2は５’−ＧＵＵ−３’の配列であった（Ojwangら，1992，Proc．Natl．Acid Sci．USA，89:10802-10806）。
【００７６】
本発明の好ましい態様によると、Ｌ2、Ｐ2およびＰ3（図２および６、ループ３、ヘリックス４）は安定なＲＮＡヘアピン配列を有するように構築する。
【００７７】
５’−ＧＧＡＣ ＵＵＣＧ ＧＵＣＣ−３’（配列識別番号５）は、"テトラループ"改変となる。その結果、ループ３のＧＵＵ配列は、ＵＵＣＧ配列によって置換される。得られたリボザイムは、非改変リボザイムと比較して活性が高く、熱に安定である。ＲＨＶＰ４３４について図２に示すように、また、上記のように、本発明の構造は、次式によって模式的に表すことができる。
【００７８】
【化２】
2006149387.tif 000004
【００７９】
かかる本発明の好ましい態様の完全な配列は、５’−ＵＵＣＵＵＣＡＧＡＧＡＡＣＡＧＵ ＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＣＧＧＡＣＵＵＣＧＵＣＣＧＵＧＧＵＡＵＡ ＵＵＡＣＣＵＧＧＵＡ−３’（配列識別番号６）である。
【００８０】
ＲＨＶＰ４１９について図６に示すように、また、上記のように、本発明の構造は次式によって模式的に表すことができる。
【００８１】
【化３】
2006149387.tif 000005
【００８２】
かかる本発明の好ましい態様の完全な配列は、５’−ＧＧＵＵＵＵＡＧＡＡＧＵＵＡＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＣＧＧＡＣＵＵＣＧＵＣＣＧＵＧＧＵＡＵＡＵＵＡＣＣＵＧＧＵＡ−３’（配列識別番号１１）である。
【００８３】
本発明のリボザイムは、ＨＰＶのＲＮＡを解裂し、生殖器官のいぼおよび腫瘍に関連したＨＰＶ感染の処置に治療剤として使用することができる。
【００８４】
好ましい態様として、２種類の治療剤投与法がある。すなわち、遺伝子治療法と改良アンチセンス法である。本発明で用いる治療剤は、ＧＭＰに準拠して他剤と混用または単独で投与することができる。この組成物は、各患者の臨床状態、投与の部位および方法、投与計画、医師として知り得たその他の要因を考慮し、ＧＭＰに準拠して投与する。ここでいう"有効量"は、従来公知のことを考慮して決定する。
【００８５】
ヒトの遺伝子治療法
ＨＰＶ１６特異性リボザイムをコードした配列をここに記載し、ヒトの遺伝子治療に使用されているベクター(Mulligan，1993，Science 260: 926-932)にクローン化する。例えば、Ｕ６プロモーターをベクターにクローン化し、リボザイムコード領域のすぐ前に位置させる。Ｕ６プロモーターは、宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼＩＩを用いてリボザイムのトランスクリプトを分割することができる真核細胞性ｐｏｌ IIIプロモータである（Das，1988，EMBO J．7(2): 503-512）。コード化リボザイムの担体としてレトロウイルスを利用すると、リボザイムをコードした配列を細胞のゲノムＤＮＡ内にインテグレーションすることができ、細胞内で長期にわたって抗ＨＰＶ１６リボザイムを生産させることができる（Chatterjee & Wong，1993，Methods: Companion to Methods in Enzymology 5(1): 51-59）。
【００８６】
リボザイムをコードしたベクターを標的細胞に運搬するためには、リポフェクチンベースのリポソーム運搬系を用いる。リポソームはヌクレアーゼに対して保護バリアーとして作用する（Sullivan，1993，Method: Companin to Methods in Enzymology，5(1): 61-66）ので、リポソームを用いると、分解されることなくベクター−リボザイムＤＮＡを細胞に運搬することができる。細胞は、本来有するエンドシトーシスにより、ベクターを含むリポソームを取り込む。リポフェクチン試薬を用いる利点は、一旦細胞に取り込まれたリポソームがエンドシトーシスされた物質の通常の運命であるリポソーム酵素による分解を受けないことである（Felgnerら，1993，Methods: Companion to Methods in Enzymology 5(1): 67-75）。好ましい態様では、Ｅ６およびＥ７のいずれか、またはその両方に対して指向させたリボザイムを、子宮頚管癌の治療に使用されているＬＡＫ細胞等の免疫賦活剤またはシスプラチン等の化学療法剤と併用する。子宮頚管部へのリボザイムの投与は、塗布または注射によって行う。
【００８７】
遺伝子治療には、上記のベクターの他にもＨＰＶ特異的リボザイムの運搬に使用することができる。このようなベクターは、以下にさらに詳しく述べる。
【００８８】
以下の実施例により、本発明に用いた方法および本発明の利用をさらに詳しく示す。
【００８９】
材料および方法
酵素および化学薬品：
使用した制限酵素はすべて、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Bethesda Research Laboratories,ＢＲＬ)、またはベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ(Boehringer Mannhaim Biochemicals)から入手した。制限酵素のための緩衝液はその製造業者から入手した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよび配列決定用キットは、ファルマシア(Pharmacia)から入手した。イン・ビトロ転写キットおよびこれに関係する酵素は、プロメガ(Promega)から入手した。子牛血清、抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびダルベッコ変性イーグル培地(Dulbecco modified Eagle medium,ＤＭＥＭ)は、ジブコ(GIBCO)から購入した。
【００９０】
使用したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、ユー・エス・バイオケミカルズ(US Biochemicals，USB)により製造されたものである。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを除き、使用した酵素のための緩衝液は、その製造業者から入手した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ転写緩衝液は、下記から成っていた。４０ｍＭトリス  ｐＨ８．０、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ スペルミジン、１％ トリトン(Triton)−Ｘ１００。イン・ビトロ転写およびクローニングのために使用した合成ＤＮＡテンプレートは、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)３９２ＤＮＡ合成装置を用いて製造した。
【００９１】
組換えＤＮＡ手法：
特に断らない限り、この手法は、サムブルックら（Sambrook，et al，1989，Molelcular Cloning: A Laboratory Manual(2nd．ed)，Sections 1.25-1.28，1.60-1.61，1.68-1.69，1.82-1.84，6.9-6.13，6.46-6.48）の記載の通りに実施し、その開示内容の全体は、本明細書の引用文献として含まれる。
【００９２】
ＨＰＶ基質の解裂：
解裂は、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ スペルミジンおよび４０ｍＭ トリス  ｐＨ７．５内で、すでに公開の方法(Hampel and Tritz，1989，Biochem．28:4929-4933)を用いて行った。反応は、特に断らない限り、すべて３７℃において２５ｎＭリボザイムおよび５０ｎＭ基質を用い、６０分間行った。基準反応は、天然（−）ｓＴＲＳＶ配列Ｓ１７／Ｒ５３を１０ｎＭおよび１００ｎＭで、記載の時間行った(Hampel and Tritz，1989，Biochem．28:4929-4933)。
【００９３】
Ｐ32標識：
基質とリボザイムとは、すでに公開の文献(Hampel and Tritz，1989，Biochem．28:4929-4933)に従って、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成ＤＮＡテンプレートから転写し、反応生成物を７Ｍ尿素中の１５〜１８％ポリアクリルアミド上で分離して、Ｐ32−ＣＴＰを用いて標識を行った。
【００９４】
リボザイムの構築：
リボザイムは、相補的な合成ＤＮＡテンプレートからＴ７転写により構築した。これはすでに公開の文献(Hampel and Tritz，1989，Biochem．28:4929-4933)に従って行った。
【００９５】
ＲＨＰＶを含むプラスミドおよびベクターの構築：
ＲＨＰＶのためのコード化および非コード化ストランドを合成し、ＨＥＬＣ精製した。このストランドは、ＥｃｏＲＩサイト、リボザイムコード化領域、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのためのポリ−Ｔ終止シグナル、およびＢａｍＨＩサイトを含んでいた。引き続き、このストランド２個は、これらそれぞれの等モル量を加えてアニーリングし、水中、９０℃で５分間インキュベーションし、次いで３０分間でゆっくりと室温に冷却した。得られた二重ストランドを有するフラグメントをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを用いて消化した。消化生成物をアガロース・ゲル上に注ぎ、次いでリボザイムコード化フラグメントを単離、精製した。
【００９６】
プラスミドｐＨＣ(Altschuler，1992，Gene，122:85-90)をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを用いて消化し、フラグメントを上記のようにして単離、精製した。このＲＨＰＶ４３４またはＲＨＶＰ４１９フラグメントを次いでｐＨＣ中に結合し、結合物混合物をコンピテントＤＨ５α菌細胞の形質転換に用いた。一個のコロニーを選出し、Circle Grow細菌培地中で培養し、プラスミドを標準ミニプレッププロトコール(Sambrook，et al，1989，Molelcular Cloning: A Laboratory Manual(2nd．ed)，Sections 1.25-1.28，1.60-1.61，1.68-1.69，1.82-1.84，6.9-6.13，6.46-6.48)を用いて抽出、精製した。このプラスミドを、ＲＨＰＶ４３４またはＲＨＶＰ４１９インサートの組み込みに関して、スクリーニングした。次いで、インサートを組み込んだコロニーをシーケナーゼバージョン２．０酵素および適当なＤＮＡ配列決定を確認するプロトコールを用いて配列決定した。得られたプラスミドをそれぞれｐＨＣ−４３４またはｐＨＣ−４１９と呼ぶ。
【００９７】
これらのリボザイムを、ＨＶＰ−１６を用いて形質転換したヒト細胞中でイン・ビボ試験するためにモロニー・レトロウイルスをベースとする発現ベクター中にクローニングする。このクローン化の手順は以下である。リボザイムオリゴは、Ｐｏｌ III終止シグナルおよびＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ末端を有するように合成した。次いで、これらをｐＨＣ(Altschuler，1992，Gene，122:85-90)中にクローニングし、標準細菌発現ベクターを好ましい実施例中で使用した。このリボザイムは、ＥｃｏＲＩ ＨｉｎｄIIIを用いて切り出し、マウスＵ６プロモーター(Das，1988，EMBO J.，7(2):503-512)を含むBluescriptベクターであるｐＵ６中にクローン化した。次いで、Ｕ６プロモーターを含むインサートをpZIP-NeoSV(X)(Cepko，et al.，1984，Cell 37:1053-1082)のＢａｍＨIサイト中にクローン化した。
【００９８】
ＲＮＡポリメラーゼIIIプロモータ領域(Das，1988，EMBO J．7(2):508-512)を含むｐＨＣＶ−４３４およびｐＭＵ６を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて消化した。ヘアピンカセット領域を保持するこのＲＨＰＶ４３４、およびｐＭＵ６フラグメントを単離し、上記のようにして精製した。２種のフラグメントの結合および形質転換を上記のようにして行った。コロニーをスクリーニングして、上記のようにして配列決定した。得られたプラスミドをｐＭＵ６−４３４と呼んだ。
【００９９】
解裂サイトに関するＨＰＶ配列（配列番号第１番）のスクリーニング：
ＨＰＶ１６配列データは、ゲン・バンク(Gen Bank)から入手した。上記のようにして、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７領域について、見込まれる目標配列を検査した。見込まれる目標配列を含む可能性のあるサイトをすべて試験し、著しい触媒活性を示したリボザイムをさらに展開した。ＲＨＰＶ４３４およびＲＨＶＰ４１９が、著しい触媒活性を示したリボザイムの例である。
【実施例】
【０１００】
本発明の一般原理は、下記の実施例を参照してさらに完全に理解できるが、ただし、これに限定されるものではない。
【０１０１】
実施例１
図２に示した本発明の好ましい態様では、ループ３およびヘリックス４を安定なＲＮＡヘアピン配列を含むように構築している。
【０１０２】
５’−ＧＧＡＣ ＵＵＣＧ ＧＵＣＣ−３’（配列番号第５番）は、「テトラループ」改変となる(Cheong，et al.，1990，Nature，346:680-682; Varani，et al.，1991，Biochem．30:3280-89)。その結果、ヘリックス４は非改変配列にわたって４塩基対ほど伸びる。さらに、ループ３のＧＵＵ配列は配列ＵＵＣＧに置換される。
【０１０３】
リボザイムの活性を測定するために、これを基質ＲＮＡに比率１：３０で加え、パラメーターとして、試験した解裂の時間経過を変化させる。この反応は１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、４０ｍＭトリス  ｐＨ７．５および２ｍＭ スペルミジン中で１５０分間実行する。温度依存性に関して、テトラループ改変を含むリボザイムの解裂速度をある温度範囲で試験し、３７℃の対照反応と比較する。反応生成物をポリアクリルアミド／尿素ゲル上で分析する。バンドを切り出し、液体シンチレーションカウンターで計数する。対照反応では、基質の２％だけが１５０分後に残り、リボザイムの３０倍の基質があるので、リボザイムは反応進行の間に複数の基質と反応したに違いないことを示している。さらに、リボザイムの量は、触媒として予想されるように同じままであり、変化していない。
【０１０４】
従来技術に対して、比較するテトラループ改変の温度依存性試験において、リボザイムの活性を２０℃、２７℃、３３℃、３７℃、４１℃および４５℃で測定した。
【０１０５】
この反応は、塩基対となったＲＮＡ分子を含む反応で予想されるものと同様の温度依存性を示した。データのアレニウス・プロットから、この反応に関して最適温度３７℃となった。高温では速度低下が低下し、約４１℃で著しく急速なに低下し、触媒ＲＮＡ構造の融出と一致する。５０℃においては、いかなる反応も検出できなかった。３７℃以下の温度における反応速度は、温度の逆数に直線的に比例し、これはこの反応に対する活性化エネルギーの古典的低下傾向と一致する。アレニウス・プロットにおける直線の傾斜から、活性化エネルギー  １９ｋｃａｌ／モルとなり、ハンマー・ヘッド型切断機構に適合する触媒で見だされたもの（１３．１ｋｃａｌ／モル）に近い(Uhlenbeck，1987，Nature 328:596-600)。
【０１０６】
この実施例は、テトラループ改変を有するリボザイムが、従来技術のものよりさらに反応性が高く、さらに安定であることを示す。この形のリボザイムは、４５℃でもまだ活性を有するが、非改変リボザイムは大部分の活性をこの温度では失った。
【０１０７】
この実験から、ループ３が保存性または不変性の塩基配列を持たず、また、ヘリックス４はループ３中に少なくとも４塩基対を、活性を低下させないで延長できることが結論される。ヘリックス４中の追加の４塩基対は、この領域におけるヘリックスを安定化する。従来技術の基質における、ヘリックス４およびループ３の二次フォールディングエネルギーは＋０．６ｋｃａｌ／モルであり、一方、本発明の延伸ヘリックス４およびＵＵＧＣ（テトラループ）のループ３を有するリボザイムのエネルギーは、−１１．１ｋｃａｌ／モルと測定された。従って、テトラループ配列の存在は、フォールディングエネルギーを１１．７ｋｃａｌ／モルだけ増加させる。
【０１０８】
実施例２
解裂反応およびＲＨＶＰ４３４のヘリックス１長さの最適化：
ヘリックス１の長さを最適化するために、解裂試験を実施した。図３は、リボザイム、基質および解裂生成物を決定する変性ポリアクリルアミドゲル上のバンドを示す。いずれも、異なるヘリックス１長さを有する３種の基質がリボザイムにより解裂された。これらの基質は下記の通りである。
【０１０９】
【表１】
2006149387.tif 000006
【０１１０】
最も効率的に解裂された基質は、８ｂｐヘリックス１（配列番号第３番）を有する基質であり、これをすべての以後の試験に使用した。これをＳＨＰＶと呼び、これに相当するリボザイムをＲＨＰＶ−４３４と呼ぶ（図２）。
【０１１１】
解裂の時間経過：
ＲＨＰＶ−４３４によるＳＨＰＶの解裂の時間経過は、１８０分間にわたって行った（図４）。リボザイムは８８％の達成率で基質を効率よく解裂した。
【０１１２】
解裂の反応速度パラメーター：
初期速度を測定するために、一定のリボザイム濃度における限定リボザイムおよび過剰の基質を用い、基質濃度を変化させて反応のミカエリス反応速度解析を行った（図５）。反応に対するＫｍは、２１ｎＭであり、ｋｃａｔ、あるいは、回転数は０．０８３ｍｉｎ-1であった。これから、全体的な触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）４μＭ-1ｍｉｎ-1となり、オリジナルの天然ヘアピン配列のもの(Hampel and Tritz，1989，Biochem．28:4929-4933)の約７％である。
【０１１３】
実施例３
解裂反応およびＲＨＶＰ４１９のヘリックス１長さの最適化：
ヘリックス１の長さを最適化するために、解裂試験を実施した。図７は、リボザイム、基質および解裂生成物を決定する変性ポリアクリルアミドゲル上のバンドを示す。４種の基質がリボザイムにより解裂された。これら基質は下記の通りである。
【０１１４】
【表２】
2006149387.tif 000007
【０１１５】
最も効率的に解裂された基質は、７ｂｐヘリックス１（配列番号第８番）を有する基質であり、これをすべての以後の試験に使用した。これをＳＨＰＶと呼び、これに相当するリボザイムをＲＨＰＶ−４１９と呼ぶ（図６）。
【０１１６】
解裂の時間経過：
ＲＨＰＶ−４１９によるＳＨＰＶの解裂の時間経過は、１８０分間にわたって行った（図８）。リボザイムは８８％の達成率で該基質を効率よく解裂した。
【０１１７】
解裂の反応速度パラメーター：
最初の速度を測定するために、一定のリボザイム濃度における限定リボザイムおよび過剰の基質、また一定リボザイム濃度に対して過剰の基質を用い、基質濃度を変化させて反応のミカエリス−メンテン反応速度解析を行った（図９）。反応に対する、Ｋｍは９８ｎＭであり、ｋｃａｔ、あるいは回転数は０．１８ｍｉｎ-1であった。これから、全体的な触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）１．８μＭ-1ｍｉｎ-1となり、オリジナルの天然ヘアピン配列のもの(Hampel and Tritz，1989，Biochem．28:4929-4933)の約３％である。
【０１１８】
我々の改善したベクターの好ましい態様を下記の実施例に記載するが、これに限定されるものではない。
【０１１９】
配達カセット(delivery cassette)を含むベクターｐｔＶ１の構築：
ベクターｐｔＶ１（図１１および１２）は、新しいポリリンカー、ヒト上流領域を有するヒトｔＲＮＡvalｐｏｌ IIIプロモータ(Arnold，et al.，1986，Gene 44:287-297)、テトラループ配列変異、およびポリ−Ｔ配列から成る配達カセットをベクターpBluescript（Stratageneより入手）中にクローニングして調製した。ヒト上流領域は、例えば、図１２に示してある(Arnold and Gross，1987，Gene 51:237-246も参照のこと)。
【０１２０】
ベクター構築の手順は下記である。新しい１１９ｎｔリンカー領域の両方のストランド（図１０）を化学的オリゴヌクレチオド合成法により調製した。このリンカー領域は、種々の制限サイト、上記のテトラループ配列、およびｐｏｌ III転写を終止させるためのポリ−Ｔトラクトを含んでいた。これを、pBluescript ＫＳ(Stratagene)のＡｓｐ７１８（Ｋｐｎ１）／Ｓａｃ１サイト中にクローニングして、ｐＢＫＳＬＮＫＲ（図示せず）を得た。プラスミドｐＨＴＶ１(Arnold，et al.，1986，Gene 44:287-297参照)は、ヒトｔＲＮＡvalプロモータを含んでいる。このｔＲＮＡval遺伝子と追加の上流配列５０ｎｔとを一緒にしたものは、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ末端を有するＰＣＲにより増幅される。これをｐＢＫＳＬＮＫＲのリンカー領域の相当する側の中にクローニングすると、最終的なｐｔＶ１構築体が得られる（図１１および１２）。
【０１２１】
リボザイムをコードする配列は、ｐｔＶ１のＸｈｏＩ／ＭｌｕＩサイト中にクローニングできる。ＤＮＡオリゴヌクレチオドの化学合成は全て、ＡＢＩ３９２ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置の標準方法を用いて行った（製造者の推奨手順を使用）。
【０１２２】
プラスミドの構築は全て、標準の手順を用いて行った(Sambrook et al，1989，Molelcular Cloning: A Laboratory Manual(2nd．ed))。
【０１２３】
リボザイムの３’末端におけるテトラループ変異体は、配列ＣＣＵＧ（ＵＵＣＧ）ＣＡＧＧ（配列番号第１６番）を有する。この配列は、各種の天然ＲＮＡ配列に見だされている(Cheong，et al.，1990，Nature，346:680)高度に安定なテトラループ配列ＧＧＡＣ（ＵＵＣＧ）ＧＵＣＣ（配列番号第５番）の変異体である。天然のテトラループとは異なり、この変異体は、ヘリックスを形成する２種の配列は、オリジナルなものに対して、反転されている。天然テトラループおよびその他の合成ヘアピンリボザイム構築体(Anderson，et al.，1994，Nuc．Acids Res 22:1096-1100)に対する、この差違は、該構築体と天然またはその他の合成配列との間のイン・ビボ組換えの確率を低下させる。また、このベクター構築は、ベクターをＭｌｕＩ／ＢｓｔｘＩを用いて単に消化し、適当な末端を有する他のテトラループ配列体を挿入することにより、このテトラループ変異体は、除去および他のテトラループ配列により置換できるという利点を有する。
【０１２４】
ｐｔＶ１プラスミドは、その構成要素およびその配列に基づく別の利点をも有する。
【０１２５】
ｐｏｌ IIIプロモータは、リボザイムの著しく高いイン・ビボ転写をする(Yamada et al.，1994，Gene Therapy 1:38-45)。上流領域は、リボザイムのイン・ビボ転写レベルを改善する(Arnold and Gross，1987，Gene 51:237-246)。テトラループ変異体は、３’末端を３’エクソヌクレアーゼによる分解から保護して、リボザイムの安定性を改善する。ポリＴ−配列は、ｐｏｌ IIIプロモータを起点とする転写を、効果的に終止させる。ｔＲＮＡコード化領域の後の制限サイト（ＸｈｏＩ／ＭｌｕＩまたはＢｇｌ II／ＭｌｕＩ）は、リボザイムのコード配列の挿入に適している。例えば、Ｂｇｌ IIオーバーハングは、ＢａｍＨI オーバーハングに結合させることができる。転写はｔＲＮＡのコード領域から開始し、ポリＴ−トラクトが、リボザイムのポリ−Ｕ部分中に転写された後に効果的に終止さす。
【０１２６】
配達カセット全体は、ユニットとして、ｐｔＶ１から容易に消化され、モロニー−レトルウイルスをベースとするベクター、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス等を含む、ウイルス発現ベクターの相当する制限サイト中にクローニングされる。この方法は、生体細胞に対してＨＰＶ特異性リボザイムを配達するための一連の構築体を構築するために使用されている。
【０１２７】
ヒト乳頭腫ウイルス特異性リボザイムをヒト細胞に配達するためのベクターの構築：
配達カセット、ヘアピンリボザイム配列およびレトロウイルスベクターを含むわれわれの構築は、ＨＰＶ配列を特異的に解裂するために設計されている。
【０１２８】
リボザイムＲＨＰＶ４３４は、ヒト乳頭腫ウイルスＨＰＶ−１６(GenBank accession #KD2718)の配列中のサイト４３４を解裂するように設計されている。この４３４サイトは、ヒトガン腫に発見されたヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）のＥ６／Ｅ７の配列中にある(DiPaolo，et al，1983，Critical Reviews in Oncogenesis 4:337-380)。使用したレトロウイルスベクターは、ｐＺＩＰ−ＮｅｏＳＶ（Ｘ）１(Cepko，et al.，1984，Cell 37:1053-1062)であり、これはヒトの遺伝子工学に使用される、モロニーレトロウイルをベースとしたベクターである（例えば、the 1994 RCA application of Wong-Stallを参照）。
【０１２９】
ＨＰＶ−１６配列中の４３４サイトに対する、ＨＰＶ−１６特異性ヘアピンリボザイムに相当するＤＮＡを合成し、上記のようにしてベクターｐｔＶ１のＸｈｏＩ／ＭｌｕＩサイト中にクローニングして、プラスミドｐＢｔＶ１−４３４を得た（図１３および１４）。このベクターｐＢｔＶ１−４３４をＳａｕ３Ａ１Ａを用いて消化すると、その挿入されたリボザイムを有する配達カセットを含む２２６ｂｐインサートが、標準方法を用いてアガロースゲル電気泳動により分離して単離された。Ｓａｕ３Ａ１Ａを用いて、プラスミドを消化すると、多数のフラグメントが生成する。２２６ｂｐフラグメント（ＢａｍＨＩとＢｅｌＩサイトの間で切断）は、ｐＢｔＶ１−４３４の消化と平行して、pBluescript ＫＳの対照消化を行って同定した。この２２６ｂｐフラグメントを、ｐＺＩＰ−ＮｅｏＳＶ（Ｘ）１のＢａｍＨIサイト中に、両方向にクローニングして、それぞれプラスミドｐＺＩＰＶ１−４３４（ｓｙｎ）（図１５および１６）およびｐＺＩＰＶ１−４３４（ａｎｔｉ）（図１７および１８）を得た。「ｓｙｎ」配置は、挿入されたｐｏｌ IIIプロモータがレトロウイルスのｐｏｌ IIIプロモータと同じ配置にある構築体のことである。「ａｎｔｉ」配置は、挿入されたｐｏｌ IIIプロモータがレトロウイルスのｐｏｌ IIIプロモータの配置に対して反対の配置にある構築体のことである。
【０１３０】
これらの構築体において、ＲＨＰＶ４３４リボザイムをコードする領域は下流側であり、従って、モロニーレトロウイルスベースベクター中の非常に強力なｐｏｌ IIIプロモータから転写された。このｐｏｌ IIIプロモータは、イン・ビボで有効なリボザイムを非常に高率で転写する(Yamada，et al.，1994，Gene Therapy 1:38-45)。上流領域はリボザイムのイン・ビボ転写レベルを改善する(Arnold and Gross，1987，Gene 51:237-246)。テトラループは、ヌクレアーゼ分解に対してリボザイムの３’末端を保護して安定性を改善する。ポリＴ−配列は、ｐｏｌ IIIプロモータからの転写を終止させる。
【０１３１】
相当する不活性構築体も作製した。不活性構築体は、ｐｔＶ１中にクローニングされたヘアピンリボザイムのループ２中で、ＡＡＡをＣＧＵに変換させる変異を有していた（上記の通り）。触媒として負活性のリボザイムは、ｐＢｔＶ１−４３４（ｉ）プラスミドによりコード化される（図１９および２０）。
【０１３２】
これらおよび類似の構築体がイン・ビボで活性を有することを確認するために、構築体を組織培養細胞中にトランスフェクションさせ、リボザイムの産生を試験した。
【０１３３】
実施例４
イン・ビボ試験：
イン・ビボ試験は、ＨＰＶ−１６特異性構築体を用いて行った。標準方法を用いて、ｐＺＩＰＶ１−４３４（ｓｙｎ）およびｐＺＩＰＶ１−４３４（ａｎｔｉ）ベクターをヒトＣＸＴ１細胞中に安定にトランスフェクションさせた(Sambrook，et al，1989，Molelcular Cloning: A Laboratory Manual(2nd．ed))。ＣＸＴ１細胞系統は、自発性ヒト頸ガン腫瘍に由来しており、ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７タンパクを発現することが知られている。
【０１３４】
リボザイムは、レトロウイルスベクター中の配達カセットによりイン・ビボで発現される。リボザイム発現は、ＲＮアーゼ保護試験により測定された（図２１；Lee and Costlow，1987，Methods Enzymol．152:633-648の方法を使用）。ＣＸＴ１細胞は、ｐＺＩＰ−ＮｅｏＳＶ（Ｘ）、ｐＺＩＰ−Ｖ１４３４（ａｎｔｉ）およびｐＺＩＰ−Ｖ１４３４（ｓｙｎ）構築体を用いてトランスフェクションさせ、形質転換体を薬剤Ｇ４１８に対する耐性により選別した。酸フェノール法を用いて、ＲＮＡをトランスフェクション細胞から単離した(Sambrook，et al，1989，Molelcular Cloning: A Laboratory Manual(2nd．ed))。使用したプローブは、ＢａｍＨＩを用いて予め切断したプラスミドｐＢｔＢ１−４３４（図１３および１４）から、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、このようにして作製した２６５ｎｔのＲＮＡ転写体をプローブとして用いた。ＲＮアーゼ保護を行い、標準方法を用いてゲル電気泳動により産物を分離した(Sambrook，et al，1989，Molelcular Cloning: A Laboratory Manual(2nd．ed))。
【０１３５】
図２１中で、矢印は、ｐｏｌ IIIプロモータから転写された保護リボザイム転写体の１６０ｎｔサイズを示す。リボザイムは、ｐＺＩＰＶ１−４３４（ｓｙｎ）レーン中に認められるが、一方、ｐＺＩＰ−Ｎｅｏ−ＳＶ（Ｘ）およびｐＺＩＰ−Ｖ１４３４（ａｎｔｉ）を用いてトランスフェクションした細胞からのＲＮＡに相当するレーン中には認められない。同様に、トランスフェクションされていない細胞に対する対照レーン（「ＮＴ」レーン）中にも１６０ｎｔフラグメントは認められない。その他のレーンは、32Ｐプローブが不変なこと（「プローブ」レーン）、およびＲＮアーゼが細胞ＲＮＡおよびプローブの消化に対して活性であること（「ＲＮアーゼ＋」レーン）を示す対照である。
【０１３６】
１６０ｎｔバンドだけが認められることも注意すること。これより長い２３０ｎｔバンドが認められる場合には、これは、ベクターのｐｏｌ IIIプロモータから始まった転写を示すのであろう。１６０ｎｔフラグメントだけが存在することは、リボザイム転写は、配達カセットのｐｏｌ IIIプロモータから転写されたのであって、ベクタープロモーターからではなかったことを示す。
【０１３７】
ヘアピンリボザイムは、イン・ビボにおいてＥ６ｍＲＮＡの発現を低下するように見える。リボザイム発現がＨＰＶ発現に影響するか否かを測定するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による逆転写（ＲＴ）および増幅に基づく試験を利用した。ｐＺＩＰ−Ｎｅｏ−ＳＶ（Ｘ）、ｐＺＩＰ−Ｖ１４３４（ａｎｔｉ）およびｐＺＩＰ−Ｖ１４３４（ｓｙｎ）構築体を用いて安定してトランスフェクションされ、Ｇ４１８耐性により選択されたＣＸＴ１細胞は、ＨＰＶｍＲＮＡの生産源として使用した。ｍＲＮＡは酸フェノール法により単離し、標準法を用いて、ポリ−Ａへの結合を用いてさらに精製した(Sambrook，et al，1989，Molelcular Cloning: A Laboratory Manual(2nd．ed))。ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作製し、Ｅ６ｍＲＮＡの損失を検出するために、Ｅ６特異性プライマーを用いてこれをＰＣＲ精製した。Ｅ６ｍＲＮＡの３’末端に相補的である逆転写に用いたプライマー（「１６Ｅ７Ｒ」と呼ぶ）は、５’ＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧ３’（配列番号第１２番）である。
【０１３８】
ＰＣＲプライマーの一つは、Ｅ６ｃＤＮＡに特異性の固定プローブであって、これは、リボザイムにより解裂されているか否かに係わらず、Ｅ６ｃＤＮＡの下部ストランドを増幅する。別の２種のＰＣＲプライマーは、Ｅ６ｃＤＮＡの上部ストランドの増幅に対して特異性を有していた。これらの上部ストランドプライマーの一つは、ｎｔ４３４のリボザイム切断サイトの５’であり、他は、リボザイム切断サイトの３’である。これらの３種のプライマーは、配列５’ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＣＡＣＡＣＡＡＴＴＣＣＴＡＧＴＧ３’（配列番号第１３番）を有する。Ｅ７Ｘと呼ばれる固定プライマー、配列５’ＣＡＣＧＴＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣ３’（配列番号第１４番）を有する、Ｅ６−Ｕ２と呼ばれるリボザイム切断サイトのプライマー３’、および配列５’ＣＡＧＣＡＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＣＣＧ３’（配列番号第１５番）を有する、Ｅ６−１６Ｕと呼ばれるリボザイム切断サイトのプライマー５’である。
【０１３９】
ＰＣＲ増幅は、次の標準条件：メルティングのために１分間９４℃、次いでアニーリングのために４５秒間６５℃、および重合のために１分間７２℃、２５サイクルを用いて、自動熱サイクル装置(Perkin Elmer Model 480)を使用して行った。Ａｍｐｌｉｔａｑポリメラーゼ(Perkin Elmer)５単位、各ＮＴＰを１００μＭ、プライマーＥ６−１６Ｕ（配列番号第１５番）１０ｎｇ、プライマーＥ６−Ｕ２（配列番号第１４番）１０ｎｇおよびプライマーＥ７Ｘ（配列番号第１３番）２０ｎｇを用いた。
【０１４０】
３種のプライマーの組み合わせは、Ｅ６ｍＲＮＡが作用しない細胞中にそれぞれ約３００ｎｔおよび５００ｎｔの２種のＰＣＲ産物を生成させた。しかし、その中でリボザイムがＥ６ｍＲＮＡを切断する細胞中では、２種のＰＣＲ産物中の小さい方の３００ｎｔが大量であったが、これは全長Ｅ６ｍＲＮＡに対するリボザイム切断Ｅ６ｍＲＮＡのモル比率によるものである。産生物をゲル電気泳動で分離した。
【０１４１】
図２２は、ＲＴおよびＰＣＲ試験が感染細胞中のＨＰＶＥ８ｍＲＮＡの存在を検出することを示している。また、この図は、リボザイムを発現するトランスフェクションされた細胞中でリボザイムがＥ６ｍＲＮＡを切断することも示している。矢印は、２種のＰＣＲ増幅産物がゲル上に移動する位置を示し、最も左の矢印は３００ｂｐフラグメントの位置を示し、最も右の矢印は５００ｂｐフラグメントの位置を示しており、これらは分子量マーカー（「ＭＷＭ」レーン）のゲル上の位置から測定した。陽性対照レーン（「ＨＰＶ−１６」）は、ＣＸＴ１細胞中にＥ６ｍＲＮＡが存在し、また試験が有効に両方のフラグメントを増幅していることを示す両方の位置にあるバンドを示す。ｐＺＩＰ−ＮｅｏＳＶ（Ｘ）を用いてトランスフェクションされた細胞も対照の役に立つが、それは、このプラスミドがＨＰＶ−特異性リボザイムをコードせず、また、バンドは両方の位置で認められからである。
【０１４２】
３種のプライマーを用いる増幅は、ヒト組織中のＨＰＶ−１６の存在の確認に使用できる。ヒト組織からのＲＮＡを含む試料は、リボザイムを作用させ、引き続き、３種のプライマーを用いて増幅できる。リボザイムは、ＨＰＶ−１６結合配列を有するＲＮＡだけを切断する。従って、ＨＰＶ−１６ＲＮＡを有する試料は、リボザイムにより切断され、リボザイム切断サイトのプライマー５’により生成するさらに短い生成物の選択的増幅となる。
【０１４３】
実施例５
ＨＰＶ−１６特異性リボザイムを用いる非ＨＰＶ−１６転換細胞系統の選定およびＨＰＶ−１６／Ｅ７発現ベクターを用いるトランスフェクション：
ＨｅＬａ細胞は、ＨＰＶ中のサイト４３４に対して特異的なＨＰＶリボザイムの発現ができる構築体を用いて、安定にトランスフェクションできる。これらの構築体は、マウスＵ６（ＭＵ６）またはヒトｔＲＮＡval（ｔＶ１）のいずれかに由来するｐｏｌ IIIプロモータを用いてリボザイムを発現する。リボザイム発現の確認は、ＲＮＡプローブおよびＲＮアーゼ保護試験を用いて決定できる。
【０１４４】
マウスＵ６（ＭＵ６）またはヒトｔＲＮＡval（ｔＶ１）ｐｏｌ IIIプロモータのいずれかから転写されたリボザイム構築体を用いて、ＨＰＶのサイト４３４に特異性のリボザイムをベクター中にクローニングする。細菌プラスミド構築体およびモロニーレトロウイルスをベースとする構築体の両方を作製する。細菌プラスミド構築体は、pBluescript（ＫＳ）プラスミド（Stratageneから入手できる）中にクローニングしたヒトｔＲＮＡvalプロモータを有する。４３４特異性リボザイムを、マルチ・クローニングサイトにｔＲＮＡvalプロモータを用いて、pBluescript中にクローニングして、ｐＴＢ１−４３４プラスミドが得られる。インサートは、制限酵素Ｓａｕ３Ａ１を用いて切断して、このプラスミドから取り去り、標準ゲル精製法を用いてインサートを含む適当なフラグメント・サイズを単離する。次いで、モロニー・マウス白血病ウイルスベースのプラスミドであるｐＺＩＰ−ｎｅｏのＢａｍＨＩサイトにインサートをサブクローニングすると、「ｓｙｎ」または「ａｎｔｉ」配置のいずれかにインサートを有するプラスミドｐＺＩＰ−４３４が得られる。
【０１４５】
リボザイム構築体を用いて、ＨｅＬａ細胞をトランスフェクションし、Ｇ４１８耐性選択法を用いて、安定な感染体を選出する。細胞を培養し、発現されたリボザイムを同定するためのＲＮアーゼ保護試験に使用するために、細胞からＲＮＡを分離する。リボザイム確認のために用いるプローブは、Ｔ３とＴ７プロモーターの間に挿入されたリボザイムを伴うプラスミドから得られる。これらの２種のプラスミドのうち、Ｕ６プロモーター−リボザイム構築体は、ｐＭＵ６−４３４Ａ、ｔＲＮＡvalプロモーター−リボザイム構築体は、ｐＢＴＶ１−４３４と呼ばれる。
【０１４６】
ＭＵ６プロモータ構築体のためのプローブは、標準法を用いて、ＭＵＢ含有プラスミドのｐＭＵ６−４３４ＡをＥｃｏＲ１と一緒にして直線化し、直線化したプラスミドをＴ３−ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写して生成させる。長さ１００ｎｔのこのプローブをアニーリングして、ｐＺＩＰ−４３４（ｓｙｎ）プラスミドの長い末端重複（ＬＴＲ）およびプラスミドｐＺＩＰ−４３４（ｓｙｎ）およびｐＺＩＰ−４３４（ａｎｔｉ）のｐｏｌ IIIプロモータの両方から生成するリボザイムとなる。ｐＺＩＰ−４３４（ａｎｔｉ）配置からのＬＴＲからはリボザイムは生産できない。アニーリングおよびＲＮアーゼ消化の後、ＬＴＲから生産した保護フラグメントは。長さ７７ｎｔであり、一方、ｐｏｌ IIIプロモータから生産した保護フラグメントは、長さ６４ｎｔである。
【０１４７】
ｔＶ１プロモータ構築体と一緒に使用したプローブは、ＢａｍＨＩと一緒にプラスミドｐＢｔＶ１−４３４を直線化し、標準重合条件を用いてプラスミドＤＮＡから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写して、生産させる。長さ２６５ｎｔのこのプローブをアニーリングすると、ｐＺＩＰＶ１−４３４（ｓｙｎ）のＬＴＲおよびｐＺＩＰＶ１−４３４（ｓｙｎ）およびｐＺＩＰＶ１−４３４（ａｎｔｉ）のｐｏｌ IIIプロモータの両方により生成するリボザイムにとなるが、保護フラグメントの大きさは異なる。ＲＮアーゼ消化の後に、ＬＴＲからの保護フラグメントは長さ２３０ｎｔであり、一方、ｐｏｌ IIIプロモータから生成した保護フラグメントは長さ１６０ｎｔである。
【０１４８】
Ｅ６／Ｅ７遺伝子を発現できるレトロウイルスベクターに細胞を細胞に感染させる。これらの２種のタンパクのための３種のｍＲＮＡ種（Ｅ６Ｅ７、Ｅ６（Ｉ）Ｅ７およびＥ６（II）Ｅ７と呼ぶ。始めの２種は、多量の種であり、最後の種は少量の種である）の比較量は、コルネリッセンら(Cornelissen et al.，J.Gen.Viral.71:1243-1246，1990)に説明してあるようにして、逆転写酵素およびポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）試験を用いて測定する。
【０１４９】
ＲＴ／ＰＣＲ試験に使用するプライマーは、次の、５’ＮＮＮＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＡＣＣＣ３’（配列番号第１７番）のプライマー１および５’ＮＮＮＧＧＡＴＣＣＣＣＡＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣ３’（配列番号第１８番）のプライマー２である。プライマー２は、ＲＴ反応中に使用されるプライマーである。プライマー１および２の両方は、ＰＣＲ反応中に使用される。ＲＴ／ＰＣＲ反応は、下記の大きさを有するフラグメント：Ｅ６Ｅ７産物に相当する７９１ｂｐ、Ｅ６（Ｉ）Ｅ７産物に相当する６０８ｂｐおよびＥ６（II）Ｅ７産物に相当する４９１ｂｐを生成する。
【０１５０】
リボザイム４３４は、２種の大量ｍＲＮＡ（Ｅ６Ｅ７およびＥ６（Ｉ）Ｅ７）を解裂し、また少量の種（Ｅ６（ＩＩ）Ｅ７）は解裂しないので、この少量の種は、この試験で内部対照標準として用いる。少量の種（４９１ｂｐ生成物）対する大量の２種のｍＲＮＡ（７９１ｂｐおよび６０８ｂｐ生成物）の量比率を、４３４リボザイムのイン・ビボ活性を決定するために測定する。リボザイムが発現されると、内部少量種に対して、大量種は１０〜５０％の低下を示す。対照として、リボザイムインサートを含まないリボザイムベクターのみを用いてトランスフェクションされた細胞、および不活性リボザイムを用いてトランスフェクションされた細胞も使用する。これらのプラスミドがトランスフェクションされると、ＲＴ／ＰＣＲ試験では、少量種に対して、２種類の大量種が低下しないことを示す。
【０１５１】
当業者には、４１９サイトに特異性のリボザイムを用いて、同様の構築体および試験が実施できることを了解されるであろう。これらの構築体を使用し、トランスフェクションされた細胞中に４１９特異性リボザイムが生産されると、４１９特異性リボザイムにより解裂されない内部基準少量種に対して、ＨＰＶｍＲＮＡの大量種に同様な低下が認められる。
【０１５２】
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：ハンペル，  アーノルド
ディパオロ，  ヨゼフ
シフコフスキー，  アンドリュー  Ｍ．
（ii）発明の名称：ヘアピンリボザイムによるヒト乳頭腫ウイルスの抑制
（iii）配列の数：
（iv）連絡先：
（Ａ）住所：Knobbe, Martens, Olson & Bear
（Ｂ）通り：620 Newport Center Drive
（Ｃ）市：Newport Beach
（Ｄ）州：California
（Ｅ）国名：USA
（Ｆ）ＺＩＰコード：92660
（ｖ）コンピューター読み取り形式：
（Ａ）媒体の型式：３．５”Disk
（Ｂ）コンピューター：PC compatible
（Ｃ）オペレイティング・システム：PC-DOS/MS-DOS
（Ｄ）ソフトウェア：
（vi）最新の出願情報：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）種別：
（vii）代理人に関する情報：
（Ａ）氏名：アルトマン，  ダニエル  Ｅ．
（Ｂ）登録番号：
（Ｃ）識別番号：NIH113.001QPC
（viii）電気通信に関する情報
（Ａ）電話：(714) 760-0404
（Ｂ）テレファックス：(714) 760-9502
（２）配列識別番号１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：7904 塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の種類：二本鎖
（Ｄ）形態：環状
（ii）分子のタイプ：DNA(genomic)
（iii）仮想的：否
（iv）アンチセンス：否
（ｖ）起源：
（Ａ）生物：ヒト乳頭腫ウイルス
（Ｂ）系統：ＨＰＶ１６
（vi）配列の記載：配列識別番号１：
【０１５３】
【化４】
2006149387.tif 000008
【０１５４】
【化５】
2006149387.tif 000009
【０１５５】
【化６】
2006149387.tif 000010
【０１５６】
【化７】
2006149387.tif 000011
【０１５７】
【化８】
2006149387.tif 000012
【０１５８】
（xi）配列の記載：配列識別番号２：
ACUGUGUCCU GAAGA
（xi）配列の記載：配列識別番号３：
ACUGUGUCCU GAAGAA
（xi）配列の記載：配列識別番号４：
ACUGUGUCCU GAAGAAA
（xi）配列の記載：配列識別番号５：
GGACUUCGGU CC
（xi）配列の記載：配列識別番号６：
UUCUUCAGAG AACAGUACCA GAGAAACACA CGGACUUCGG UCCGUGGUAU
AUUACCUGGU A
（xi）配列の記載：配列識別番号７：
UAACUGUCAA AAGC
（xi）配列の記載：配列識別番号８：
UAACUGUCAA AAGCC
（xi）配列の記載：配列識別番号９：
UAACUGUCAA AAGCCA
（xi）配列の記載：配列識別番号１０：
UAACUGUCAA AAGCCAC
（xi）配列の記載：配列識別番号１１：
GGCUUUUAGA AGUUAACCAG AGAAACACAC GGACUUCGGU CCGUGGUAUA
UUACCUGGUA
（xi）配列の記載：配列識別番号１２：
５’ TTATGGTTTC TGAG ３’
（xi）配列の記載：配列識別番号１３：
５’ CCCTCTAGAGG CACACAATTCCTAGTG ３’
（xi）配列の記載：配列識別番号１４：
５’ CACGTAGAGA AACCCAGC ３’
（xi）配列の記載：配列識別番号１５：
５’ CAGCAATAC AACCCAGC ３’
（xi）配列の記載：配列識別番号１６：
５’ CCUGUUCGCA GG ３’
（xi）配列の記載：配列識別番号１７：
５’ NNNAAGCTTC TGCAATGTT CAGGA CCC ３’
（xi）配列の記載：配列識別番号１８：
５’ NNNGGATCCC CATTGGTACC TGCAGGATC ３’
（xi）配列の記載：配列識別番号１９：
（図１２参照）
（xi）配列の記載：配列識別番号２０：
（図１４参照）
（xi）配列の記載：配列識別番号２１：
（図１６参照）
（xi）配列の記載：配列識別番号２２：
（図１８参照）
（xi）配列の記載：配列識別番号２３：
（図２０参照）
【産業上の利用可能性】
【０１５９】
本発明のヘアピン リボザイムは、ＨＰＶ ＲＮＡを部位特異体的に解裂することできる。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】図１は、ヘアピンリボザイムにより解裂のために選んだ標的部位の位置、ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７領域におけるｍＲＮＡ標的部位のオーバーラップ、およびヌクレオチド４３４およびヌクレオチド４１９の後の"＊"で起こるヘアピンリボザイムによるこの標的部位の解裂点を示すＨＰＶ標的部位の模式図である。
【図２】図２は、最適リボザイム（ＲＨＰＶ）と基質（ＳＨＰＶ）の配列、標的基質とリボザイム（ヘリックス１およびヘリックス２と表示）の間の塩基対領域、および触媒の"ヘアピン"部分（ヘリックス３および４と表示）に要求される塩基対の領域を示す部分４３４の後のＨＰＶ−１６を解裂するように設計した最適ヘリックス（８ｂｐでなる）を有するヘアピンリボザイムの模式図である。
【図３】図３は、本発明によって、図に示すように７ｂｐ，８ｂｐおよび９ｂｐの長さを有するヘリックス１を用いて、４３４部位の後でＨＰＶ基質を解裂した後のオートラジオグラフである。参照対照は、リボザイムＲ５３および基質Ｓ１７（レーン１および２）であり、反応は２５ｎＭのリボザイムと５０ｎＭの基質を用い、３７℃で６０分間行った。前記対照の反応では、表示した時間に対して、未変性の（−）ｓＴＲＳＶ配列Ｓ１７／Ｒ５３を１０ｎＭおよび１００ｎＭとした（Hampel & Tritz，1989，Biochem．28: 4929-4933）。
【図４Ａ】図４は、ＲＨＰＶ４３４による解裂の経時的変化を示し、図４Ａは、各時間における解裂のオートラジオグラフであり、図４Ｂは、図４Ａの結果を図示したものである。ここで解裂条件は図３と同じとし、表示した各時間に対して、［Ｒ］＝２５ｎＭおよび［Ｓ］＝１００ｎＭであった。
【図４Ｂ】図４は、ＲＨＰＶ４３４による解裂の経時的変化を示し、図４Ａは、各時間における解裂のオートラジオグラフであり、図４Ｂは、図４Ａの結果を図示したものである。ここで解裂条件は図３と同じとし、表示した各時間に対して、［Ｒ］＝２５ｎＭおよび［Ｓ］＝１００ｎＭであった。
【図５Ａ】図５は、ＲＨＰＶ４３４による解裂の速度論的解析を示し、図５Ａは、図４Ｂの結果を図示したものであり、図５Ｂは、［Ｓ］の各濃度で１０分間後の解裂のオートラジオグラフである。ここで、解裂条件は、図３と同じとし、［Ｒ］＝２０ｎＭ、ならびに［Ｓ］＝４００ｎＭ（レーン１）、２００ｎＭ（レーン２）、１５０ｎＭ（レーン３）、１００ｎＭ（レーン４）、７５ｎＭ（レーン５）、５０ｎＭ（レーン６）および２５ｎＭ（レーン７）であった。
【図５Ｂ】図５は、ＲＨＰＶ４３４による解裂の速度論的解析を示し、図５Ａは、図４Ｂの結果を図示したものであり、図５Ｂは、［Ｓ］の各濃度で１０分間後の解裂のオートラジオグラフである。ここで、解裂条件は、図３と同じとし、［Ｒ］＝２０ｎＭ、ならびに［Ｓ］＝４００ｎＭ（レーン１）、２００ｎＭ（レーン２）、１５０ｎＭ（レーン３）、１００ｎＭ（レーン４）、７５ｎＭ（レーン５）、５０ｎＭ（レーン６）および２５ｎＭ（レーン７）であった。
【図６】図６は、位置４１９の後のＨＰＶ−１６を解裂するように設計した、最適ヘリックス１（７ｂｐからなる）を有するヘアピンリボザイムの模式図であり、最適リボザイム（ＲＨＰＶ）および基質（ＳＨＰＶ）の配列、標的基質とリボザイム（ヘリックス１およびヘリックス２と表示）の間の塩基対領域、および触媒の"ヘアピン"部分（ヘリックス３および４と表示）に要求される塩基対の領域を示す。
【図７】図７は、図に示すように６ｂｐ，７ｂｐ，８ｂｐおよび９ｂｐの長さを有するヘリックス１を用いて、４１９部位の後でＨＰＶ基質を解裂した後のオートラジオグラフである。参照対照は、リボザイムＲ５３および基質Ｓ１７（レーン１および２）であり、反応は２５ｎＭのリボザイムと５０ｎＭの基質を用い、３７℃で６０分間行った。参照の反応には、表示した時間に対して、未変性の（−）ｓＴＲＳＶ配列Ｓ１７／Ｒ５３を１０ｎＭおよび１００ｎＭとした（Hampel & Tritz，1989，Biochem．28:4929-4933）。
【図８Ａ】図８は、ＲＨＰＶ４１９による解裂の経時的変化を示し、図８Ａはｍ各時間における解裂のオートラジオグラフであり、図８Ｂｍは図８Ａの結果を図示したものである。ここで解裂条件は図３と同じとし、表示した各時間に対して、［Ｒ］＝２５ｎＭおよび［Ｓ］＝１００ｎＭであった。
【図８Ｂ】図８は、ＲＨＰＶ４１９による解裂の経時的変化を示し、図８Ａはｍ各時間における解裂のオートラジオグラフであり、図８Ｂｍは図８Ａの結果を図示したものである。ここで解裂条件は図３と同じとし、表示した各時間に対して、［Ｒ］＝２５ｎＭおよび［Ｓ］＝１００ｎＭであった。
【図９Ａ】図９は、ＲＨＰＶ４１９による解裂の速度論的解析を示し、図９Ａは、図９Ｂの結果を図示したものであり、図９Ｂは、［Ｓ］の各濃度で１０分間後の解裂のオートラジオグラフである。ここで解裂条件は図３と同じとし、［Ｒ］＝２０ｎＭおよび［Ｓ］＝２００ｎＭ（レーン１）、１５０ｎＭ（レーン２）、１００ｎＭ（レーン３）、７５ｎＭ（レーン４）、５０ｎＭ（レーン５）および２５ｎＭ（レーン６）であった。反応終了時間の対照は、［Ｓ］＝２０ｎＭで０分（レーン７）および１時間（レーン８）とした。
【図９Ｂ】図９は、ＲＨＰＶ４１９による解裂の速度論的解析を示し、図９Ａは、図９Ｂの結果を図示したものであり、図９Ｂは、［Ｓ］の各濃度で１０分間後の解裂のオートラジオグラフである。ここで解裂条件は図３と同じとし、［Ｒ］＝２０ｎＭおよび［Ｓ］＝２００ｎＭ（レーン１）、１５０ｎＭ（レーン２）、１００ｎＭ（レーン３）、７５ｎＭ（レーン４）、５０ｎＭ（レーン５）および２５ｎＭ（レーン６）であった。反応終了時間の対照は、［Ｓ］＝２０ｎＭで０分（レーン７）および１時間（レーン８）とした。
【図１０】図１０は、プラスミッドｐＢＫＳ ＬＮＫＲを得るためにpBluescript ＫＳにクローン化したポリリンカー領域の模式図である。
【図１１】図１１は、ｔＲＮＡvalプロモータ、その上流領域、テトラループ変異体およびｐｏｌｙＴ終了配列を含むプラスミッドｐｔＶ１の模式図である。これは、ｔＲＮＡvalプロモータとその上流領域をｐＢＫＳ ＬＮＫＲにクローン化して調製した。
【図１２】図１２は、ポリリンカー、ｔＲＮＡvalプロモータ、上流領域、テトラループ、終了領域を含むプラスミッドｐｔＶ１のＤＮＡ配列（配列識別番号１９）を示す。新しいリボザイムをＸｈｏ１／Ｍｌｕ１部位にクローン化することができる。
【図１３】図１３は、プラスミッドｐｔＶ１にＲＨＰＶ４３４リボザイムを含むプラスミッドｐＢｔＶ１−４３４の模式図である。
【図１４】図１４は、プラスミッドｐＢｔＶ１−４３４におけるポリリンカーおよびリボザイムのＤＮＡ配列（配列識別番号２０）を示す。
【図１５】図１５は、"ｓｙｎ"配位のＲＨＰＶ４３４リボザイムを含み、転写がレトロウイルスベクターのレトロウイルスゲノムと同じ方向であるプラスミッドｐＺＩＰＶ１−４３４（ｓｙｎ）の模式図である。
【図１６】図１６は、プラスミッドｐＺＩＰＶ１−４３４（ｓｙｎ）のデリバリーカセットおよびリボザイムのＤＮＡ配列（配列識別番号２１）を示す。
【図１７】図１７は、"ａｎｔｉ"配位のＲＨＰＶ４３４リボザイムを含み、転写がレトロウイルスベクターのレトロウイルスゲノムとは逆の方向であるプラスミッドｐＺＩＰＶ１−４３４（ａｎｔｉ）の模式図である。
【図１８】図１８は、プラスミッドｐＺＩＰＶ１−４３４（ａｎｔｉ）のポリリンカーおよびリボザイムのＤＮＡ配列（配列識別番号２２）を示す。
【図１９】図１９は、ｐｔＶ１にクローン化した触媒作用を有さない突然変異ＲＨＰＶ４３４リボザイムクローンを含むプラスミッドｐＢ１Ｖ１−４３４（ｉ）の模式図である。
【図２０】図２０は、プラスミッドｐＢｔＶ１−４３４（ｉ）のデリバリーカセットおよびリボザイムのＤＮＡ配列（配列識別番号２３）の模式図である。
【図２１】図２１は、トランスクリプトのＲＮアーゼ保護によって検定した変形ヒトＣＸＴ１癌細胞におけるＨＰＶ特異性リボザイムの表現を示す。矢印はpol IIIプロモータからの保護リボザイムトランスクリプトの期待した大きさ１６０ｎｔを示す。
【図２２】図２２は、ＲＴおよびＰＣＲ法で検定したときのヘアピンリボザイムを含むＣＸＴ１細胞におけるＨＰＶ Ｅ６トランスクリプトの表現を示す。
【図１】
2006149387.tif 000013
【図２】
2006149387.tif 000014
【図３】
2006149387.tif 000015
【図４Ａ】
2006149387.tif 000016
【図４Ｂ】
2006149387.tif 000017
【図５Ａ】
2006149387.tif 000018
【図５Ｂ】
2006149387.tif 000019
【図６】
2006149387.tif 000020
【図７】
2006149387.tif 000021
【図８Ａ】
2006149387.tif 000022
【図８Ｂ】
2006149387.tif 000023
【図９Ａ】
2006149387.tif 000024
【図９Ｂ】
2006149387.tif 000025
【図１０】
2006149387.tif 000026
【図１１】
2006149387.tif 000027
【図１２】
2006149387.tif 000028
【図１３】
2006149387.tif 000029
【図１４】
2006149387.tif 000030
【図１５】
2006149387.tif 000031
【図１６】
2006149387.tif 000032
【図１７】
2006149387.tif 000033
【図１８】
2006149387.tif 000034
【図１９】
2006149387.tif 000035
【図２０】
2006149387.tif 000036
【図２１】
2006149387.tif 000037
【図２２】
2006149387.tif 000038
【配列表】
2006149387000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月30日(2005.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト乳頭腫ウイルス由来の転写ＲＮＡ中に含まれる、標的部位に対する結合能と、当該標的部位中に存在する、塩基４３４の直後の解裂部位における解裂能とを有する合成ヘアピン・リボザイムであって、
前記標的配列は、下記
４３０−ＡＣＵＧ Ｕ*ＧＵＣ ＣＵＧＡＡＧＡ−４４４（配列識別番号２）、
４３０−ＡＣＵＧ Ｕ*ＧＵＣ ＣＵＧＡＡＧＡＡ−４４５（配列識別番号３）、
４３０−ＡＣＵＧ Ｕ*ＧＵＣ ＣＵＧＡＡＧＡＡＡ−４４６（配列識別番号４）
（但し、*は、解裂部位を示す）で示される標的部位からなる群より選択される
ことを特徴とする合成リボザイム。
【請求項２】
前記合成ヘアピン・リボザイムは、ヘアピン部分中に、
ＧＧＡＣ（ＵＵＣＧ）ＧＵＣＣ  （配列識別番号５）からなるテトラループ配列を含む
ことを特徴とする請求項１に記載の合成リボザイム。
【請求項３】
前記合成ヘアピン・リボザイムは、
５’−ＵＵＣＵＵＣＡＧＡＧＡＡＣＡＧＵ ＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＣＧＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＣＧＵＧＧＵＡＵＡＵＵＡＣＣＵＧＧＵＡ−３’  （配列識別番号６）で示される完全配列からなる
ことを特徴とする請求項１または２に記載の合成リボザイム。
【請求項４】
ヒト乳頭腫ウイルス由来の転写ＲＮＡ中に含まれる、標的部位に対する結合能と、当該標的部位中に存在する、塩基４３４の直後の解裂部位における解裂能とを有する合成ヘアピン・リボザイムを構築する方法であって、
前記標的配列は、下記
４３０−ＡＣＵＧ Ｕ*ＧＵＣ ＣＵＧＡＡＧＡ−４４４（配列識別番号２）、
４３０−ＡＣＵＧ Ｕ*ＧＵＣ ＣＵＧＡＡＧＡＡ−４４５（配列識別番号３）、
４３０−ＡＣＵＧ Ｕ*ＧＵＣ ＣＵＧＡＡＧＡＡＡ−４４６（配列識別番号４）
（但し、*は、解裂部位を示す）で示される標的部位からなる群より選択され、
該合成ヘアピン・リボザイムの結合部位は、３’−Ｆ4−Ｌ1−Ｆ3−５’の塩基配列で示され、それぞれ、
該Ｆ4は、前記標的配列中の５’−ＡＣＵＧ−３’部分と相補的な塩基配列、
該Ｌ1は、前記標的配列中の解裂部位を含む５’−Ｕ*ＧＵＣ−３’部分に対して、非相補的な塩基配列、
該Ｆ4は、前記標的配列中の５’−ＣＵＧＡＡＧＡ−３’、５’−ＣＵＧＡＡＧＡＡ−３’、５’−ＣＵＧＡＡＧＡＡＡ−３’の何れかの部分と相補的な塩基配列に選択した上で、
該ヘアピン・リボザイムを構築する工程を含む
ことを特徴とする合成リボザイムの構築方法。
【請求項５】
該ヒト乳頭腫ウイルス由来の転写ＲＮＡの解裂能を有する合成ヘアピン・リボザイムの、ヘアピン部分中に、
ＧＧＡＣ（ＵＵＣＧ）ＧＵＣＣ  （配列識別番号５）からなるテトラループ配列を含むように選択した上で、
該ヘアピン・リボザイムを構築する工程を含む
ことを特徴とする請求項４に記載の合成リボザイムの構築方法。
【請求項６】
前記請求項１〜３の何れか一項に記載のリボザイムをコードするＤＮＡを含んでなるベクターであって、
該ＤＮＡは、発現制御配列に対して機能的に連結されている
ことを特徴とするベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターで形質転換された宿主細胞であって、
該ベクターによりコードされている前記リボザイムの発現能を有する
ことを特徴とする宿主細胞。
【請求項８】
ヒト組織由来の採取試料中のヒト乳頭腫ウイルス−１６（ＨＰＶ−１６）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法であって、下記工程ａ〜工程ｃを含み、
工程ａ：ヒト組織試料より採取されるＲＮＡを、ＨＰＶ−１６のＲＮＡ由来の塩基配列と結合する請求項１〜３の何れか一項に記載のリボザイムに曝して、前記試料中に存在しているＨＰＶ−１６のＲＮＡを前記リボザイムによって解裂する；
工程ｂ：完全長ＨＰＶ−１６の転写ＲＮＡの５’末端、完全長ＨＰＶ−１６転写ＲＮＡの該リボザイム解裂部位の５’側フラグメント、ならびに完全長ＨＰＶ−１６転写ＲＮＡの該リボザイム解裂部位の３’側フラグメントに対して、それぞれ相補的なプライマーを用いて、転写ＲＮＡ由来のｃＤＮＡを増幅させる；そして、
工程ｃ：大きなＤＮＡフラグメントは、完全長ＨＰＶ−１６転写ＲＮＡを示しており、また、小さなＤＮＡフラグメントは、完全長ＨＰＶ−１６転写ＲＮＡのリボザイム解裂に起因する断片を示していると、増幅されたＤＮＡフラグメントの同定を行う；
その際、試料中にＨＰＶ−１６由来のＲＮＡが存在する場合、大きなフラグメントに比較して、小さなＤＮＡフラグメントの優位が確認される
ことを特徴とするｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法。
【請求項９】
該リボザイムによって解裂されるＨＰＶ−１６のＲＮＡは、ＨＰＶ−１６のＥ６の転写ＲＮＡである
ことを特徴とする請求項８に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法。
【請求項１０】
該リボザイムは、
５’−ＵＵＣＵＵＣＡＧＡＧＡＡＣＡＧＵ ＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＣＧＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＣＧＵＧＧＵＡＵＡＵＵＡＣＣＵＧＧＵＡ−３’  （配列識別番号６）で示される塩基配列を含んでなる
ことを特徴とする請求項８または９に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法。
【請求項１１】
該ヒト組織は、子宮頚管組織である
ことを特徴とする請求項８〜１０のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法。
【請求項１２】
更に、前記工程ａの後、工程ｂに先立ち、該試料中に存在している該ＲＮＡに由来するｃＤＮＡを作製する工程を含んでいる
ことを特徴とする請求項８〜１１のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法。
【請求項１３】
医薬治療において使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヘアピン・リボザイム。
【請求項１４】
子宮頚管癌、あるいは子宮頚管の前癌症状の治療において使用するための、請求項１３に記載のヘアピン・リボザイム。
【請求項１５】
該ヘアピン・リボザイムは、リポフェクチンベースのリポソームへの搬送系中に懸濁されている
ことを特徴とする請求項１３または１４に記載のヘアピン・リボザイム。
【請求項１６】
免疫賦活剤または化学療法剤と組み合わされている
ことを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のヘアピン・リボザイム。
【請求項１７】
ＬＡＫ細胞と組み合わされている
ことを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のヘアピン・リボザイム。
【請求項１８】
シスプラチンと組み合わされている
ことを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のヘアピン・リボザイム。
【請求項１９】
ヒト乳頭腫ウイルス由来の転写ＲＮＡ中に含まれる、標的部位に対する結合能と、当該標的部位中に存在する、塩基４１９の直後の解裂部位における解裂能とを有する合成ヘアピン・リボザイムであって、
前記標的配列は、下記
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣ−４２８（配列識別番号７）、
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣＣ−４２９（配列識別番号８）、
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣＣＡ−４３０（配列識別番号９）、４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣＣＡＣ−４３１（配列識別番号１０）
（但し、*は、解裂部位を示す）で示される標的部位からなる群より選択される
ことを特徴とする合成リボザイム。
【請求項２０】
前記合成ヘアピン・リボザイムは、ヘアピン部分中に、
ＧＧＡＣ（ＵＵＣＧ）ＧＵＣＣ  （配列識別番号５）からなるテトラループ配列を含む
ことを特徴とする請求項１９に記載の合成リボザイム。
【請求項２１】
前記合成ヘアピン・リボザイムは、
５’−ＧＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＵＵＡ ＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＣＧＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＣＧＵＧＧＵＡＵＡＵＵＡＣＣＵＧＧＵＡ−３’  （配列識別番号１１）で示される完全配列からなる
ことを特徴とする請求項１９または２０に記載の合成リボザイム。
【請求項２２】
ヒト乳頭腫ウイルス由来の転写ＲＮＡ中に含まれる、標的部位に対する結合能と、当該標的部位中に存在する、塩基４１９の直後の解裂部位における解裂能とを有する合成ヘアピン・リボザイムを構築する方法であって、
前記標的配列は、下記
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣ−４２８（配列識別番号７）、
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣＣ−４２９（配列識別番号８）、
４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣＣＡ−４３０（配列識別番号９）、４１５−ＵＡＡＣ Ｕ*ＧＵＣ ＡＡＡＡＧＣＣＡＣ−４３１（配列識別番号１０）
（但し、*は、解裂部位を示す）で示される標的部位からなる群より選択され、
該合成ヘアピン・リボザイムの結合部位は、３’−Ｆ4−Ｌ1−Ｆ3−５’の塩基配列で示され、それぞれ、
該Ｆ4は、前記標的配列中の５’−ＵＡＡＣ−３’部分と相補的な塩基配列、
該Ｌ1は、前記標的配列中の解裂部位を含む５’−Ｕ*ＧＵＣ−３’部分に対して、非相補的な塩基配列、
該Ｆ4は、前記標的配列中の５’−ＡＡＡＡＧＣ−３’、５’−ＡＡＡＡＧＣＣ−３’、５’−ＡＡＡＡＧＣＣＡ−３’、５’−ＡＡＡＡＧＣＣＡＣ−３’の何れかの部分と相補的な塩基配列に選択した上で、
該ヘアピン・リボザイムを構築する工程を含む
ことを特徴とする合成リボザイムの構築方法。
【請求項２３】
該ヒト乳頭腫ウイルス由来の転写ＲＮＡの解裂能を有する合成ヘアピン・リボザイムの、ヘアピン部分中に、
ＧＧＡＣ（ＵＵＣＧ）ＧＵＣＣ  （配列識別番号５）からなるテトラループ配列を含むように選択した上で、
該ヘアピン・リボザイムを構築する工程を含む
ことを特徴とする請求項２２に記載の合成リボザイムの構築方法。
【請求項２４】
前記請求項１９〜２１の何れか一項に記載のリボザイムをコードするＤＮＡを含んでなるベクターであって、
該ＤＮＡは、発現制御配列に対して機能的に連結されている
ことを特徴とするベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載のベクターで形質転換された宿主細胞であって、
該ベクターによりコードされている前記リボザイムの発現能を有する
ことを特徴とする宿主細胞。
【請求項２６】
ヒト組織由来の採取試料中のヒト乳頭腫ウイルス−１６（ＨＰＶ−１６）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法であって、下記工程ａ〜工程ｃを含み、
工程ａ：ヒト組織試料より採取されるＲＮＡを、ＨＰＶ−１６のＲＮＡ由来の塩基配列と結合する請求項１９〜２１の何れか一項に記載のリボザイムに曝して、前記試料中に存在しているＨＰＶ−１６のＲＮＡを前記リボザイムによって解裂する；
工程ｂ：完全長ＨＰＶ−１６の転写ＲＮＡの５’末端、完全長ＨＰＶ−１６転写ＲＮＡの該リボザイム解裂部位の５’側フラグメント、ならびに完全長ＨＰＶ−１６転写ＲＮＡの該リボザイム解裂部位の３’側フラグメントに対して、それぞれ相補的なプライマーを用いて、転写ＲＮＡ由来のｃＤＮＡを増幅させる；そして、
工程ｃ：大きなＤＮＡフラグメントは、完全長ＨＰＶ−１６転写ＲＮＡを示しており、また、小さなＤＮＡフラグメントは、完全長ＨＰＶ−１６転写ＲＮＡのリボザイム解裂に起因する断片を示していると、増幅されたＤＮＡフラグメントの同定を行う；
その際、試料中にＨＰＶ−１６由来のＲＮＡが存在する場合、大きなフラグメントに比較して、小さなＤＮＡフラグメントの優位が確認される
ことを特徴とするｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法。
【請求項２７】
該リボザイムによって解裂されるＨＰＶ−１６のＲＮＡは、ＨＰＶ−１６のＥ６の転写ＲＮＡである
ことを特徴とする請求項２６に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法。
【請求項２８】
該リボザイムは、
５’−ＧＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＵＵＡ ＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＣＧＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＣＧＵＧＧＵＡＵＡＵＵＡＣＣＵＧＧＵＡ−３’  （配列識別番号１１）で示される塩基配列を含んでなる
ことを特徴とする請求項２６または２７に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法。
【請求項２９】
該ヒト組織は、子宮頚管組織である
ことを特徴とする請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法。
【請求項３０】
更に、前記工程ａの後、工程ｂに先立ち、該試料中に存在している該ＲＮＡに由来するｃＤＮＡを作製する工程を含んでいる
ことを特徴とする請求項２６〜２９のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法。
【請求項３１】
医薬治療において使用するための、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のヘアピン・リボザイム。
【請求項３２】
子宮頚管癌、あるいは子宮頚管の前癌症状の治療において使用するための、請求項３１に記載のヘアピン・リボザイム。
【請求項３３】
該ヘアピン・リボザイムは、リポフェクチンベースのリポソームへの搬送系中に懸濁されている
ことを特徴とする請求項３１または３２に記載のヘアピン・リボザイム。
【請求項３４】
免疫賦活剤または化学療法剤と組み合わされている
ことを特徴とする請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のヘアピン・リボザイム。
【請求項３５】
ＬＡＫ細胞と組み合わされている
ことを特徴とする請求項３１〜３４のいずれか一項に記載のヘアピン・リボザイム。
【請求項３６】
シスプラチンと組み合わされている
ことを特徴とする請求項３１〜３４のいずれか一項に記載のヘアピン・リボザイム。