(57)【要約】【課題】本発明は、骨髄における造血の調節、化学療法剤による骨髄破壊作用を緩和、及び化学療法剤の障害性の増強において有用な化合物を提供することを課題とする。【解決手段】式              ＹＣＯ−ＮＨＣＨＣＯ−Ｇ＊                          │                                      ＣＨ２−Ｚ−Ｘ  ここに、ＹＣＯはγ−ｇｌｕ又は  β−ａｓｐ；  Ｇ＊は、フェニルグリシン又はグリシン；  Ｚは、ＣＨ２，  Ｏ  又は  Ｓ；  及び  Ｘは、１−２０Ｃの炭化水素基である、で表される化合物若しくはそのエステル、アミド、エステル／アミド又はそれらの塩は、骨髄における造血の調節、化学療法剤による骨髄破壊作用を緩和、及び化学療法剤の障害性の増強において有用である。【選択図】図１１
2006348048.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄若しくは末梢血又はそれらの画分における造血を調節し、或いは被検体に対して投与される破壊的な効果のある化学療法剤又は照射に対して保護的な効果を発揮し、或いは被検体に対して投与される化学療法剤の効果を増強するための医薬組成物において、
該組成物は、活性成分として、有効量の、
式
ＹＣＯ−ＮＨＣＨＣＯ−Ｇ＊
│            
ＣＨ２−Ｚ−Ｘ
ここに、ＹＣＯはγ−ｇｌｕ又は  β−ａｓｐ；
Ｇ＊は、フェニルグリシン又はグリシン；
Ｚは、ＣＨ２，  Ｏ  又は  Ｓ；  及び
Ｘは、１−２０Ｃの炭化水素基である、
で表される化合物若しくはそのアルキル（１−１０Ｃ）、アルケニル（１−１０Ｃ）、若しくはアリールアルキル（７−１２Ｃ）のモノエステル、ジエステル、モノアミド、ジアミド又はエステル／アミド複合体又はそれらの塩；及び
製薬的に可能な賦形剤
を含むこと
を特徴とする経口投与用医薬組成物。
【請求項２】
ＺがＳである請求項１の組成物。
【請求項３】
Ｘがヘキシル、ヘプチル、オクチル、ベンジル又はナフチルである請求項１の組成物。
【請求項４】
Ｘがベンジル又はオクチルである請求項３の組成物。
【請求項５】
ＹＣＯで示されるアミノ酸残基がＬ配位で、ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＺＸ）ＣＯがＬ配位で、Ｇ＊がＤ配位のフェニルグリシンである請求項１〜４何れかの組成物。
【請求項６】
前記化合物が、Ｌ−γ−グルタミル−［Ｓ−（ベンジル）−Ｌ−システイニル］−Ｄ−フェニルグリシンのアルキル（１−１０Ｃ）、アルケニル（１−１０Ｃ）、若しくはアリールアルキル（７−１２Ｃ）のジエステル又はその塩である請求項５の組成物。
【請求項７】
前記化合物が、Ｌ−γ−グルタミル−［Ｓ−（ベンジル）−Ｌ−システイニル］−Ｄ−フェニルグリシンのアルキル（１−３Ｃ）のジエステル又はその塩である請求項６の組成物。
【請求項８】
前記化合物が、Ｌ−γ−グルタミル−［Ｓ−（ベンジル）−Ｌ−システイニル］−Ｄ−フェニルグリシンのジエチルエステル又はその塩である請求項７の組成物。
【請求項９】
錠剤、丸薬、カプセル剤、シロップ、粉剤又は香りのある液剤の形である請求項１〜８何れかの組成物。
【請求項１０】
骨髄若しくは末梢血又はそれらの画分における造血を調節し、或いは被検体に対して投与される破壊的な効果のある化学療法剤又は照射に対して保護的な効果を発揮し、或いは被検体に対して投与される化学療法剤の効果を増強するための経口投与用医薬組成物の製造のための
式
ＹＣＯ−ＮＨＣＨＣＯ−Ｇ＊
│            
ＣＨ２−Ｚ−Ｘ
ここに、ＹＣＯはγ−ｇｌｕ又は  β−ａｓｐ；
Ｇ＊は、フェニルグリシン又はグリシン；
Ｚは、ＣＨ２，  Ｏ  又は  Ｓ；  及び
Ｘは、１−２０Ｃの炭化水素基である、
で表される化合物若しくはそのアルキル（１−１０Ｃ）、アルケニル（１−１０Ｃ）、若しくはアリールアルキル（７−１２Ｃ）のモノエステル、ジエステル、モノアミド、ジアミド又はエステル／アミド複合体又はそれらの塩の使用。
【請求項１１】
ＺがＳである請求項１０の使用。
【請求項１２】
Ｘがヘキシル、ヘプチル、オクチル、ベンジル又はナフチルである請求項１０又は１１の使用。
【請求項１３】
Ｘがベンジル又はオクチルである請求項１２の使用。
【請求項１４】
ＹＣＯで示されるアミノ酸残基がＬ配位で、ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＺＸ）ＣＯがＬ配位で、Ｇ＊がＤ配位のフェニルグリシンである請求項１０〜１３何れかの使用。
【請求項１５】
前記化合物が、Ｌ−γ−グルタミル−［Ｓ−（ベンジル）−Ｌ−システイニル］−Ｄ−フェニルグリシンのアルキル（１−１０Ｃ）、アルケニル（１−１０Ｃ）、若しくはアリールアルキル（７−１２Ｃ）のジエステル又はその塩である請求項１４の使用。
【請求項１６】
前記化合物が、Ｌ−γ−グルタミル−［Ｓ−（ベンジル）−Ｌ−システイニル］−Ｄ−フェニルグリシンのアルキル（１−３Ｃ）のジエステル又はその塩である請求項１５の使用。
【請求項１７】
前記化合物が、Ｌ−γ−グルタミル−［Ｓ−（ベンジル）−Ｌ−システイニル］−Ｄ−フェニルグリシンのジエチルエステル又はその塩である請求項１６の使用。
【請求項１８】
前記組成物が錠剤、丸薬、カプセル剤、シロップ、粉剤又は香りのある液剤の形である請求項１０〜１７何れかの使用。
【請求項１９】
前記組成物が、骨髄若しくは末梢血又はそれらの画分における造血を調節する請求項１０〜１８何れかの使用。
【請求項２０】
前記組成物が、被検体に対して投与される破壊的な効果のある化学療法剤又は照射に対して保護的な効果を発揮する請求項１０〜１８何れかの使用。
【請求項２１】
前記組成物が、被検体に対して投与される化学療法剤の効果を増強する請求項１０〜１８何れかの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも一つのグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ類に作用するある種のグルタチオンアナログに関する。より詳細に述べれば、本発明は、骨髄及び血液における造血の調節や、その他この種のグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤に対する有用な作用に向けられたものである。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍やその他の症状に対する治療に用いられる化学療法剤の副作用が良く知られている。これらの副作用には、好中球、血小板及びリンパ球を含む種々の血球細胞数の変化がある。これらの影響の結果、好中球減少、血小板減少及び免疫抑制が一般に生じうる。これらの副作用は、不快感があるだけでなく、癌治療の効果を減じると共に被検体に感染や制御できない出血といった重大な危険をもたらす。
【０００３】
今日、これらの作用に対して実際的な治療法はほとんどないようである。いくつかの試みがなされているが、協力的介護といったただ一時しのぎ的なものである。その他では、抗生物質の大量投与のように、それ自身が副作用を有するもの、又は移植のように高価であり、健康を損なうものであったりする。その他の試みとしては、顆粒球コロニー促進因子（GCSF）、顆粒球マクロファージコロニー促進因子（GMCSF）及び最近開発された因子たとえば巨核球生育発達因子（MGDF）やトロンボポイエチン（TPO）などのような成長因子の投与があるが、価格が高く、注射により投与しなければならない。これらはまた、それ自身の副作用を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
化学療法的な方法と合わせてまた周期的及び特発的好中球減少、血小板減少及び異型移植の影響のような造血の抑制をもたらすその他の要因に対応して、骨髄を保護し、好中球、血小板及びリンパ球を増殖させうる分子量の小さな剤、できれば経口投与できるものといったより単純な試みが明らかに必要である。
【０００５】
化学療法剤の副作用に対応し、さもなくば造血の抑制を取り扱うための最新の試みと関連するこの問題は、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼの種々のアイソザイムの阻害剤であるある種の単純なトリペプチド化合物の生物活性により少なくとも一部は解決される。
【０００６】
1995年3月30日に発行され、PCT/US94/10797に基づく、PCT出願WO95/08563は、元の出願がここに優先権を主張しているが、グルタチオンの誘導体であるこれらトリペプチド化合物を発表している。それらは一般にグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ活性の阻害剤であり、このグループに含まれる種々の化合物は、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼアイソザイムに関連して多様な特異性を示す。
一般式
ＹＣＯ−ＮＨＣＨＣＯ−Ｇ＊
│            
ＣＨ２−Ｚ−Ｘ
及びそのアミド及びエステルであるこれらアナログの一部は、ここにＹＣＯはγ−ｇｌｕ又はβ−ａｓｐ；Ｇ＊はフェニルグリシン又はグリシンであり、ＣＨ２，Ｏ又はＳ；Ｘは１−２０Ｃの炭化水素基であるが、骨髄及び末梢血において造血を調節する作用があり、従って造血系を破壊する化学療法剤が投与される場合、保護効果を発揮することを見いだした。これらの化合物はまた、化学療法剤の望ましい効果を増強する。このグルタチオン誘導体の同じ系統のものには、πクラス及びある場合には、他のクラスのグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ(GST) の阻害を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、一般に造血の調節に有用である化合物を供給し、毒性がなければ化学療法における有用な剤に関連して、造血系に対して保護効果を発揮させる効果により、腫瘍の化学療法的な治療の助けとなる。これら化合物は、経口でも活性があり、骨髄や末梢血における造血過程を調節し、又は他の骨髄の過程を調節する必要がある場合には、どの様な状況においても用いることができる。
【０００８】
従って、ひとつの見方として、この発明は、式
ＹＣＯ−ＮＨＣＨＣＯ−Ｇ＊
│            
ＣＨ２−Ｚ−Ｘ
ここに、ＹＣＯはγ−ｇｌｕ又は  β−ａｓｐ；
Ｇ＊は、フェニルグリシン又はグリシン；
Ｚは、ＣＨ２，  Ｏ  又は  Ｓ；  及び
Ｘは、１−２０Ｃの炭化水素基である、
で表される化合物若しくはそのエステル、アミド、エステル／アミド又はそれら塩の形で、当該骨髄、末梢血又は、それらの画分における造血を保護するのに有効な量及び時間で、骨髄又は末梢血、若しくはこれらを含む前駆体の画分に接触することを含む、前駆細胞からの造血を調節する方法を意図したものである。
【０００９】
他の観点からいえば、本発明は、照射を含む、被検体に投与される化学療法剤の悪影響に対する保護効果や、そのような影響からの回復の促進が起きるような作用機作を含む当該保護を発揮する方法に向けられており、その方法は、当該保護効果を発揮するのに有効な量や時間に、当該被検体に式１の化合物を投与することを含んでいる。
【００１０】
他の観点からいえば、本発明は、好中球減少、血小板減少、リンパ球減少、及び化学療法、感染又は血液病によって起きる貧血症に対する、及び骨髄移植中における細胞数の増大のための好中球、血小板及びリンパ球の産生の促進、損傷した骨髄の回復、細胞障害性の治療からの骨髄の保護、並びに保護効果の増強ための方法及び製剤に向けられている。さらに、本発明は、治療効果の増強させる腫瘍特異的な化学又は放射線増感剤、一般化された化学的保護剤としての本発明による化合物の使用に向けられている。
【００１１】
本発明はまた、活性成分としては本発明化合物を含む薬剤組成物及び発明化合物の合成法を含んでいる。
【００１２】
他の観点からいえば、本発明は、少なくとも１つのクラスのグルタチオンＳ-トランスフェラーゼアイソザイムを阻害し適度な薬量でπクラスのGSTを全体的に阻害する化合物で骨髄、末梢血、又はそれらの適当な画分に接触することを含む、造血を調節又は化学療法剤の有害な影響に対して保護効果を発揮する方法に向けられる。
【００１３】
本発明は、他の視点によれば、骨髄若しくは末梢血又はそれらの画分における造血を調節し、或いは被検体に対して投与される破壊的な効果のある化学療法剤又は照射に対して保護的な効果を発揮し、或いは被検体に対して投与される化学療法剤の効果を増強するための医薬組成物において、該組成物が、活性成分として、有効量の、
式
ＹＣＯ−ＮＨＣＨＣＯ−Ｇ＊
│            
ＣＨ２−Ｚ−Ｘ
ここに、ＹＣＯはγ−ｇｌｕ又は  β−ａｓｐ；
Ｇ＊は、フェニルグリシン又はグリシン；
Ｚは、ＣＨ２，  Ｏ  又は  Ｓ；  及び
Ｘは、１−２０Ｃの炭化水素基である、
で表される化合物若しくはそのアルキル（１−１０Ｃ）、アルケニル（１−１０Ｃ）、若しくはアリールアルキル（７−１２Ｃ）のモノエステル、ジエステル、モノアミド、ジアミド又はエステル／アミド複合体又はそれらの塩；及び製薬的に可能な賦形剤を含むことを特徴とする経口投与用医薬組成物を提供する。
【００１４】
経口投与用医薬組成物は、更に、ＺがＳであることが好ましい。
【００１５】
経口投与用医薬組成物は、更に、Ｘがヘキシル、ヘプチル、オクチル、ベンジル又はナフチルであることが好ましい。
【００１６】
経口投与用医薬組成物は、更に、Ｘがベンジル又はオクチルであることが好ましい。
【００１７】
経口投与用医薬組成物は、更に、前記化合物において、ＹＣＯで示されるアミノ酸残基がＬ配位で、ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＺＸ）ＣＯがＬ配位で、Ｇ＊がＤ配位のフェニルグリシンであることが好ましい。
【００１８】
経口投与用医薬組成物は、更に、前記化合物が、Ｌ−γ−グルタミル−［Ｓ−（ベンジル）−Ｌ−システイニル］−Ｄ−フェニルグリシンのアルキル（１−１０Ｃ）、アルケニル（１−１０Ｃ）、若しくはアリールアルキル（７−１２Ｃ）のジエステル又はその塩であることが好ましい。
【００１９】
経口投与用医薬組成物は、更に、前記化合物が、Ｌ−γ−グルタミル−［Ｓ−（ベンジル）−Ｌ−システイニル］−Ｄ−フェニルグリシンのアルキル（１−３Ｃ）のジエステル又はその塩であることが好ましい。
【００２０】
経口投与用医薬組成物は、更に、前記化合物が、Ｌ−γ−グルタミル−［Ｓ−（ベンジル）−Ｌ−システイニル］−Ｄ−フェニルグリシンのジエチルエステル又はその塩であることが好ましい。
【００２１】
経口投与用医薬組成物は、更に、錠剤、丸薬、カプセル剤、シロップ、粉剤又は香りのある液剤の形にあることが好ましい。
【００２２】
本発明は、他の視点によれば、骨髄若しくは末梢血又はそれらの画分における造血を調節し、或いは被検体に対して投与される破壊的な効果のある化学療法剤又は照射に対して保護的な効果を発揮し、或いは被検体に対して投与される化学療法剤の効果を増強するための経口投与用医薬組成物の製造のための
式
ＹＣＯ−ＮＨＣＨＣＯ−Ｇ＊
│                  
ＣＨ２−Ｚ−Ｘ
ここに、ＹＣＯはγ−ｇｌｕ又は  β−ａｓｐ；
Ｇ＊は、フェニルグリシン又はグリシン；
Ｚは、ＣＨ２，  Ｏ  又は  Ｓ；  及び
Ｘは、１−２０Ｃの炭化水素基である、
で表される化合物若しくはそのアルキル（１−１０Ｃ）、アルケニル（１−１０Ｃ）、若しくはアリールアルキル（７−１２Ｃ）のモノエステル、ジエステル、モノアミド、ジアミド又はエステル／アミド複合体又はそれらの塩の使用を提供する。
【００２３】
使用においては、更に、ＺがＳであることが好ましい。
【００２４】
使用においては、更に、Ｘがヘキシル、ヘプチル、オクチル、ベンジル又はナフチルであることが好ましい。
【００２５】
使用においては、更に、Ｘがベンジル又はオクチルであることが好ましい。
【００２６】
使用においては、更に、前記化合物において、ＹＣＯで示されるアミノ酸残基がＬ配位で、ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＺＸ）ＣＯがＬ配位で、Ｇ＊がＤ配位のフェニルグリシンであることが好ましい。
【００２７】
使用においては、更に、前記化合物が、Ｌ−γ−グルタミル−［Ｓ−（ベンジル）−Ｌ−システイニル］−Ｄ−フェニルグリシンのアルキル（１−１０Ｃ）、アルケニル（１−１０Ｃ）、若しくはアリールアルキル（７−１２Ｃ）のジエステル又はその塩であることが好ましい。
【００２８】
使用においては、更に、前記化合物が、Ｌ−γ−グルタミル−［Ｓ−（ベンジル）−Ｌ−システイニル］−Ｄ−フェニルグリシンのアルキル（１−３Ｃ）のジエステル又はその塩であることが好ましい。
【００２９】
使用においては、更に、前記化合物が、Ｌ−γ−グルタミル−［Ｓ−（ベンジル）−Ｌ−システイニル］−Ｄ−フェニルグリシンのジエチルエステル又はその塩であることが好ましい。
【００３０】
使用においては、更に、前記組成物が錠剤、丸薬、カプセル剤、シロップ、粉剤又は香りのある液剤の形にあることが好ましい。
【００３１】
使用においては、更に前記組成物が、骨髄若しくは末梢血又はそれらの画分における造血を調節することが好ましい。
【００３２】
使用においては、更に前記組成物が、被検体に対して投与される破壊的な効果のある化学療法剤又は照射に対して保護的な効果を発揮することが好ましい。
【００３３】
使用においては、更に被検体に対して投与される化学療法剤の効果を増強することが好ましい。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、骨髄若しくは末梢血又はそれらの画分における造血を調節し、或いは被検体に対して投与される破壊的な効果のある化学療法剤又は照射に対して保護的な効果を発揮し、或いは被検体に対して投与される化学療法剤の効果を増強するための医薬組成物を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明の方法で有用な多くの化合物は、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼアイソザイムの少なくとも１つのアイソザイムのサブクラスの活性を阻害する。これらの化合物はまた、通常なら造血を支えるのに必要な細胞の大部分を破壊するような薬剤の存在下でも骨髄における造血を調節し、また骨髄や血液細胞にその他の有用な効果を示す。これらの化合物は、式
ＹＣＯ−ＮＨＣＨＣＯ−Ｇ＊
│                  
ＣＨ２−Ｚ−Ｘ
で表され、ここにＹＣＯ，Ｇ＊，Ｚ及びＸは上述のように定義される。インタクトな細胞に作用するため、生体内、又は試験管内で用いる場合、本発明の化合物は、アミド、エステル又はアミド／エステルの複合体である方がよい。
【００３６】
本発明の化合物は、遊離の酸、塩、モノエステル、ジエステル、モノアミド、ジアミド又はエステル／アミド複合体であってもよい。本発明で有用なアミド及びエステルは一般に、アルキル（1-10C）、アルケニル(1-10C)、及びアリールアルキル(7-12C)のアルコール及びアミンのものである。従って、本発明で有用な典型的なエステル及びアミドは、ジメチルエステル、ジエチルエステル、エチル／プロピルエステル複合体、ジヘキシルエステル、ヘキシル／オクチルエステル複合体、ジブチルエステル、ブテニル／ビニルエステル複合体、対応するアミド及びこれらの類似物である。特に好ましいのは、前記化合物のジエチルエステル体である。具体的には、Z はO 又は S、特に Sが好ましく、YCO はγ-gluが好ましい。
【００３７】
Ｘの炭化水素（1-20Ｃ）部分で好ましいのは、ヘキシル、ヘプチル、オクチル(octyl)、ベンジル及びナフチル基である。本発明の特に好ましい化合物は、γE-C(octyl)-φG; γE-C(Hx)-φG; γE-C(naphthyl)-φG; γE-C(Bz)-φG; γE-C(octyl)-G; γE-C(Hx)-G 及びγE-C(Bz)-G; 及び特にそれらのジエステル類、さらに好ましくはそれらのジエチルエステル体である。特に、好ましいのは、γE-C(Bz)-φG ジエチルエステル(TER199)及びγE-C(octyl)-G ジエチルエステル(TER183)である。
【００３８】
本発明のトリペプチドは１つ又は２つのキラル中心を有することは明かである。上に示した命名は、これらのキラル中心の存在によるジアステレオマー類に向けられたものである。しかしながら、特に好ましいことに、YCO （γ-glu 又はβ-asp）で示されるアミノ酸は天然に存在するＬ配位であり、NHCH(CH2ZX)COで示されるシステイン又はシステインアナログもまた天然と同じＬ配位であり、G*がフェニルグリシンの場合、フェニルグリシンは好ましくはＤ配位である。従って、本発明のG*がフェニルグリシンである好ましい化合物は、LLL 及び LLD 体、特にLLD 体である。"Ｘ"の性質によっては、さらなるキラル中心が含まれていることが認められている。
【００３９】
本発明の化合物は、化学治療の添加剤やその他の指示薬として有用である特徴を有する。骨髄の破壊は化学療法剤の一般的な副作用であるが、本発明の化合物は第一に骨髄における造血を調節する。 GSTアイソザイムは腫瘍細胞では特に広く認められているものであるが、化合物は通常、第二にπサブクラスをふくむ少なくとも１つのクラスのGSTアイソザイムを阻害する。第三に、前記化合物は、化学療法剤が腫瘍細胞を破壊する効果を直接増大させる。この特性が組み合わさって、本発明の化合物は、直接的には造血促進剤として、また化学療法の否定的な効果を改良することで、また標的の細胞に対する毒性効果を強めることで、有用となる。生体内又はインタクト細胞と接触させて使用するため製剤される場合には、前記化合物は、エステル、好ましくはジエステル、より好ましくは、1-5C、さらに好ましくは 1-3C を含む飽和アルコールのジエステル、最も好ましくはジエチルエステルとして与えられる。
【００４０】
本発明のトリペプチドの合成は、技術的には良く知られている標準的な方法で行うことができる。本発明のトリペプチドの合成のための特別な技術は、上で引用したPCT 出願WO95/08563 に発表されている。特に好ましい合成経路はこの出願で述べられている。
【００４１】
投与及び使用
「骨髄又は末梢血における造血を調節する」とは、コロニーすなわち分化した細胞を作る能力により測定した血液細胞形成の割合を変えることを意味している。分化した細胞は、好中球、血小板、赤血球、リンパ球、マクロファージ、顆粒球、顆粒球マクロファージ及びそれに類するものを含んでいる。この調節の機構は明かではない。すなわち、細胞自身が本発明化合物により直接促進されるのかされないのか、又は分化した細胞のコロニーの数や大きさの変化が、優先的に生き残ったり、アポトーシスを阻害したりするのか、又は多数の要因のどれか１つによるかどうかについても明らかでない。本出願で使用したように、「骨髄又は末梢血における造血の調節」は、本発明の化合物で処理した骨髄又は血液が、処理されない骨髄の場合と異なったレベルでコロニー形成や分化した細胞の産生を示す能力である。同様に、適当な前駆体を有する骨髄や末梢血の分画はこの効果を示すだろう。ここで「末梢血」と述べているものには臍帯血を含んでいる。
【００４２】
造血を調節するのに加えて、本発明の化合物は骨髄細胞に直接作用し、また骨髄細胞に対して骨髄由来のものよりも有用な効果を発揮する。例えば、これらの化合物は、造骨細胞の形成を促進し骨再生を助ける。従って、骨髄におけるその有用な効果は、造血の調節自体に限られたものではない。
【００４３】
一般に、骨髄や血液の造血に典型的に悪影響を示す薬剤が用いられたとき、本発明の化合物は保護効果を発揮する。「保護効果」とは、化合物が投与された場合、投与されない場合に比べて、骨髄又は血液に対して損傷を少なくすることを意味する。損傷の正味の減少は、保護それ自体、すなわち、正常には起きるような又はそのような損傷からの早めの回復から由来する破壊的な影響を保護することである。従って、「保護効果」には、達成された機構にかかわらず、このような望ましい結果を達成する効果を含んでいる。
【００４４】
多くの場合、本発明の化合物の保護効果は有用である。これらには、副作用として、照射が引きおこす、又は引きおこすことが予想される場合、何らかの理由で被検体が免疫無防備状態になる場合、被検体が腎臓に障害を示す場合、また被検体が化学療法を受ける場合などがある。さらに、本発明の化合物は、移植の際の提供者の骨髄における細胞数を増やすために用いることができ、典型的には、化合物は生体内又は生体外で投与できる。この設定の場合、本発明の化合物は、提供者の末梢血への前駆細胞の移動を促し、したがって提供者における末梢白血球の数を回復する。同様に、本発明の化合物は、被提供者における末梢白血球数の回復を改善する。一般に、本化合物は、生体内又は生体外で化合物を処理した後、移植された細胞が増殖するのを改善し、最終的に定着することを促進する。本発明の化合物は、回復を早めるために提供を受けた者に直接用いることができる。
【００４５】
さらに、腎臓透析を受けている患者には本発明の化合物により、血液を再構成するのを助ける。化合物はまた骨の生育促進にも一般に有用である。
【００４６】
本発明の化合物は、生体内又は試験管内のいずれかで用いることができる。例えば、同種又は 異種移植に先立って、骨髄における造血細胞を増やすかさもなくば調節するために用いることができる。生体外技術、その場合血管から比較的未分化の多くの細胞を用いて被検体に処理することもできる。本発明の化合物は生体内投与のためにも製剤化されている。
【００４７】
生体外投与が採用された場合、骨髄又は末梢血（臍帯血を含む）、又はその両方を発明化合物と接触させるか又は、これら材料の一部を適当な標的の前駆細胞を含むようにして処理することができる。好ましい標的前駆細胞には、CD34*細胞、GEMM 又は BFU-Eがある。
【００４８】
生体内投与のための製剤は、Remington's Pharamaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA の最新号に述べらている標準的な方法を用いる。化合物は、注射、経口投与、粘膜下投与や皮下投与のような種々の方法のために製剤できる。注射は、静脈内、腹腔内、筋肉内投与又はその他の便利な経路がある。下記に示すように、本発明化合物は、経口で投与された場合、直接血管内に投与された場合、又は腹腔内に投与された場合有効である。
【００４９】
経口投与は、特に簡便であり、本発明の化合物は経口で投与しても有効であることから、口からの投与に適した製剤が適している。そのような製剤には、丸薬、錠剤、カプセル剤、シロップ、粉剤、香りのある液剤などが含まれる。種々の製剤には、薬量単位で調製され、必要なら被検体が自分で投与できる。製剤中における活性成分化合物（又は化合物の混合剤）の割合は、約0.5% W/W から 95 % W/Wまで広範囲に変えることができる。活性成分の好ましい割合は、製剤それ自身の性質による。適当な賦形剤には、これらの製剤にフィルター、緩衝剤、安定剤及びその類を含む。
【００５０】
注射による投与が必要なら、好ましい製剤には調和した生理溶液及びリポソームの成分が含まれる。
【００５１】
本発明の化合物の投与が有利な被検体は、単一の化合物かその混合物かは別にして、骨髄前駆細胞がその数や生理状態が不適当で、適切に分化を維持できないような、脊椎動物の被検体、特に哺乳動物やヒトの被検体を含む。被検体が骨髄に破壊作用のある毒剤、例えば化学療法剤、照射、環境中にある毒物などに曝されると、前駆細胞が必要な数のエフェクター細胞になることに失敗する。また、骨髄を破壊する病気や症状が含まれる。従って、本発明の化合物を投与するのに適切な被検体には、化学療法を受けている患者、免疫無防備の患者、貧血、好中球減少、血小板減少、又は適切な量の血小板の欠如を示す患者や、細胞障害剤での処理が見込まれる被検体が含まれる。本発明の化合物は、また、特に悪性細胞について化学療法剤の細胞障害性を強めることから、造血系が化学療法の処理で必ずしも損傷を受けていない場合でも、本発明の化合物による処理は有益である。
【００５２】
上述のように、本発明の単一の化合物は、活性成分として含まれ、又は処置によっては、これら化合物の混合物を用いることも含まれる。さらに、本発明の化合物は、免疫賦活剤や成長因子などの他の有用な剤と混合し、又はこれに加えられる。
【００５３】
必要な薬量は、被検体の状態、症状、投与の方法、治療する内科医や獣医の判断による。適量の範囲は、これらの要素により調整される。一般に、患者当たりの典型的な投与量は、0.1−100mg/kgの10−40日、より好ましくは、1−10mg/kgで14−28日である。これらの範囲は単なる例示であり、正確な薬量は決められた方法で決定される。
【００５４】
もし、発明化合物が、化学療法処理に関して保護剤として投与された場合、投与のタイミングが関係している。しかし、タイミングは、使用した化学療法剤の性質による。下記に示すように、例えば、5 FU を化学療法で用いる場合、5 FU の投与約24時間後が良さそうである。他方、投与のタイミングはシスプラチンが化学療法剤として投与された場合は、シスプラチン投与の約24時間前が効果的である。用いた化学療法剤に最適なタイミングを決めることは、明らかに通常なし得る技術である。
【００５５】
例示的化合物
GST アイソザイム阻害剤として有用な例示的化合物として、以下の物を調製した。
γE-C(Bz)-φG  (TER117);
γE-C(hexyl)-φG  (TER102);
γE-C(naphthyl)-G  (TER211); 及び
γE-C(octyl)-G  (TER143) である。
【００５６】
これらの化合物の中で、TER117 は、GST P1-1に対して、最も高い特異性を示した。TER102 もかなり特異的であった。従って、種々の、TER117 の誘導体が合成された。上述の全ての化合物の中で、γグルタミル及びシステイニル基が天然のＬ配位にあり、TER117 及び TER102ではフェニルグリシンがＤ配位である。
【００５７】
TER117の以下のエステル及びアミドを調製した。
TER199:  γE エチルエステル-C(Bz)-R-(-)-φG エチルエステル;
TER278:  γE エチルアミド-C(Bz)-R-(-)-φG エチルアミド;
及び
TER300:  γE エチルアミド-C(Bz)-R-(-)-φG エチルエステルである。
マウス血液中におけるTER199試験管内の半減期は１分より短く、ヒト血液中では、約90分である。
【００５８】
これらの化合物の試験管内試験は、TER278 及び TER300はマウス血液及びHT-29 培養細胞では、TER199より長いことを示したが、ヒト血液での半減期は、３つの化合物でほぼ同じである。
【００５９】
TER278はTER199に比べて、毒性が低く、クロラムブチルの効果を強める力が低い。
【００６０】
TER300は、マウス血液中及びHT-29培養細胞ではTER199 と TER278との中間の割合で代謝される。クロラムブチルを可能にするには、TER300はTER199の４倍量を必要とする。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例は、本発明を例示するためであって、これに限るものではない。
【００６２】
［実施例１］  ヒト細胞における細胞障害性剤と相乗的に作用する発明化合物の使用例
この実施例では、1)本発明の化合物を含むGST阻害剤による、癌の化学療法に最近用いられたある細胞障害性剤のヒト腫瘍細胞における相乗効果、及び2)これらの化合物のエステル体の強められた細胞内効果、を示している。
【００６３】
HT-29 (ヒト結腸腺悪性腫瘍)細胞は、ロベルト セリアニ博士(コントラコスタカウンティ癌研究基金、ウオルナットクリーク、カリフォルニア)から得たものであり、特に述べない限り、生育の対数期で用いた。クロラムブチル（CMB）はシグマ(セントルイス、ミズーリー)から得、100%エタノールに溶解した。全てのGST阻害剤は、使用直前にエタノール、DMSO、又は水に溶解した。対照として、同量の溶媒を培地に加えた。
細胞障害性のための修正クローン産生性試験では、細胞は溶媒単独又は阻害剤を添加した無血清培地中に2×105 細胞を懸濁させた。阻害剤は、溶媒単独処理した細胞に比較して、阻害剤単独の存在下で90%以上生存した濃度で用いられた。細胞は２時間培養し、CMBの濃度を変えて添加した。２回目の２時間の培養後、血清を含む培地中に、細胞を7.5-10 ×103 /mlに希釈し、マイクロテストIIIマイクロタイタープレートに200μl/ウェルの量を４反復で調製した。
【００６４】
プレートは６日間インキュベートし、修正メチレンブルー法でアッセイした。簡単に述べると細胞をPBS中の1.25 % グルタルアルデヒドで固定し、蒸留水中の0.05 %メチレンブルーで染色した。プレートを数回蒸留水で洗い、保持されない色素を取り去り、保持された色素は0.03 N 塩酸で再溶解させた。プレートは、Molecular Devices Vmax プレートリーダー(Molecular Devices Vmax ,Redwood City, CA) で650 nm で測定した。
その薬剤についての IC50 値（細胞の生存率を50%にする阻害剤の濃度）を、濃度曲線から、阻害剤の存在又は非存在下において求めた。薬量修正係数（DMF）、すなわち細胞障害を強める程度は、各阻害剤ごとに、阻害剤無処理区のCMBのIC50値を、阻害剤処理区のCMBのIC50値で割ることにより得られる。
【００６５】
表1-3に示す結果は、GSHの阻害剤であることが見出されたいくつかのGSHアナログは、種々のGSTに対する基質であるCMBにより培地中のヒト腫瘍細胞を致死力を強めることを示している。HT29細胞におけるいくつかのGST阻害剤における相乗効果試験を表１にまとめている。
【００６６】
【表１】
2006348048.tif 000003
a投与薬量は毒性曲線から求め、アナログはその存在下で起きる≧90 %生存率の薬量で用いた。
b薬量修正係数。値は、2-3試験の平均値±S.D.(標準偏差)。
【００６７】
表１に示されているように、この相乗効果は、GST阻害剤の取込を強めるようデザインされたエステル化により増強される。従って、γE-C(Bz)-φGは100μMでは、CMBによる細胞致死を強めることはなく、1.08 のDMFで、50%細胞致死に必要なCMBの濃度を減らした。一方、γE-C(Bz)-φGのジエチルエステル体(TER199)は、わずか12.5μMで1.65の係数でCMBによる細胞障害性を強めた。
【００６８】
GSTアイソザイムP1-1がヒト腫瘍に対して優れていることが報告されている。本試験では、試験したいくつかのGST阻害剤のCMB協力効果を、ヒトのπクラスGSTアイソザイムである P1-1 で直接比較し、表２に示した。
【００６９】
【表２】
2006348048.tif 000004
aジエチルエステルの薬量修正係数。値は2-3試験の平均±S.D.(標準偏差)
【００７０】
前記化合物のエステル又はアミド化の、HT-29細胞におけるクロラムブチル細胞障害性の相乗効果を測定した。DMFは、γE-C(Bz)-φGのジエチルエステル体、ジアミド体、エステル／アミド体について適当な濃度で測定した。ジエステル体は、12.5μMでクロラムブチル毒性に対し1.65±0.04のDMFを示した。ジアミド体は、200μMでの１回の試験で1.0のDMFを示した。エステル／アミド複合体は50μMの濃度で1.45±0.16のDMFを示した。ジエチルエステル体とエステル／アミド複合体の結果は３回の実験の平均±標準偏差で示す。
【００７１】
γE-C(octyl)-G(TER183)及びγE-C(Bz)-φG(TER199)のジエチルエステル体を３系統の細胞を用いて標準のクロノゲン試験を行った。すなわち、HT-29のサブクローンであるHT-4、子宮癌のSKOV-3及びSKOV-3のビンブラスチン耐性変異系のVLBである。４つの化学療法剤、クロラムブチル、アドリアマイシン、マイトマイシンＣ及びドクソルビシンを毒剤として用いた。これらの試験で、６ウェルプレートに、本発明化合物のジエチルエステル体存在下で2 mlの培地中に１ウェル当たり300細胞を植え付けた。化合物は、対照群に比較して85%以上生存する濃度で使用した。細胞が接着するように1-2時間培養した後、化学療法剤を種々の薬量で加えた。各試験に対して、ウェルには少なくとも３通り植え付け、プレートを２週間インキュベートした。コロニーは95 % エタノール中で固定し、コロニー数を数えるため、クリスタルバイオレットで染色した。IC50値は、本発明化合物の存在、非存在下で化学療法剤に対して決定し、薬量修正係数は、本発明化合物の非存在かにおけるIC50値を発明化合物の存在下におけるIC50値で除算により計算した。各方法で得られた修正係数を表３に示す。
【００７２】
【表３】
2006348048.tif 000005
a薬量修正係数。
bアナログの毒性のため、データ無し。
c試験薬量が左に示したものと異なっている。
d未検。
【００７３】
表３に示したように、クロラムブチルをTER199の25μMの存在下でHT4-1細胞に対する薬剤として用いた場合、有意な変化が認められた。有意な変化はまた、同じ化合物の25μMの存在下でのVLB細胞に、アドリアマイシン又はドクソルビシンで処理した場合にも認められた。
【００７４】
図1aは、クロラムブチルの種々の薬量の結果とγE-C(Bz)-φG (TER199)のジエチルエステル体の修飾効果を示している。空の四角(□)はクロラムブチル単独を示し、閉じた円(●)は、発明化合物の存在下でのクロラムブチルを示す。図１で見られるように、発明化合物が添加されると、生存率は著しく減少する。図1bは、細胞に浸透するのに必要なジエチルエステルが必要であることを確かに示している。γE-C(Bz)-φG (TER117)(閉じた四角, ■)又はそのジエチルエステル体(TER199) (閉じた円, ●)いずれかの存在下でHT4-1細胞の生存試験をした。非エステル体のTER117はこれら細胞にはほとんど影響しなかったが、ジエチルエステル体は明らかに毒性があった。
【００７５】
［実施例２］  生体内におけるメルファランの毒性の増強
雄のシッド(Scid)マウスの皮下にドナーマウスからHT4-1腫瘍を植え付けた。HT4-1はヒト結腸癌であるHT-29のサブクローンである。腫瘍が約100 mm3に達したとき、マウスをランダムに６処理群に分け、７日間以下のように処理した。
１．  5 mg/kg メルファラン
２．  10 mg/kg エタクリン酸
３．  60 mg/kg TER199
４．  5 mg/kgメルファラン + 10 mg/kg エタクリン酸
５．  5 mg/kg メルファラン + 60 mg/kg TER199
６．  溶媒単独
【００７６】
マウスは体重変化を観察し、腫瘍の容積をノギスで測定した。腫瘍の成長は平均の腫瘍の大きさが、メルファランを除く全ての群で約1500 mm3 になるまで観察した。メルファランの群では72日後でもこの容積に達しなかった。
【００７７】
結果は、薬剤処理マウスにおける腫瘍の容積を対照群の容積（すなわち、溶媒のみの投与群）に対する割合で表した。１群では、メルファランのみを投与したが、腫瘍は対照群の約 75 % であった。５群では、TER199をメルファランと共に投与したが、腫瘍の容積は対照の約 55 % であった。４群の、メルファランとエタクリン酸との混合投与では、その容積は対照の約 35 % であった。従って、エタクリン酸及びTER199はメルファランの効果に対して相乗効果がある。（容積は、対照群の腫瘍が1500 mm3 に達した時点で測定した。）
【００７８】
［実施例３］  発明化合物の代謝効果
HT-29細胞に対する本発明化合物の毒性に関連した代謝効果を、Molecular Devices, Inc., Menlo Park, CA により製作され、McConnell, H. M. et al. Science (1992) 257:1906-1912 及びWada, H. G. et al. AATEX (1992) 1:154-164 に述べられているサイトセンサーマイクロフィジオメーターを用いて試験した。培地のpHの変化を、細胞代謝の機能として測定した。細胞の上を流れる少量の液体の酸性化の割合は、反応室における生きている細胞の数に比例しており、酸性度の減少は生存細胞の減少数を反映している。
【００７９】
この例示では、HT-29細胞は、10 % ウシ胎児血清を含む培地中に4 ×105 細胞植え付けられた。16-18 時間後、血清濃度を１％に減らし、細胞をさらに18時間維持した。その後、細胞をエタクリン酸(５０μM)、TER199 (20 μM) 又は溶媒（0.1 % エタノール）のいずれかに曝した。その後、培地を無血清の低緩衝能培地に代え、マイクロフィジオメーター分析を開始した。チャンバーの半分を100 μMクロラムブチルで処理し、残り半分を溶媒（0.1 % エタノール）で処理した。酸性化率は１６時間観測し、データは基本（100 %）酸性化率で示した。
【００８０】
結果を図2に示す。γE-C(Bz)-φGのジエチルエステル(TER199)もエタクリン酸も単独では酸性化率に顕著な効果を示さなかったが、エタクリン酸の前処理及びTER199の前処理はクロラムブチルの効果に相乗効果を示した。図において、開いた記号はクロラムブチルの添加がないもの、閉じた記号はクロラムブチルを添加したもの、四角は溶媒で前処理したもの、三角はエタクリン酸で前処理したもの、円はTER199で前処理したものを示している。
【００８１】
［実施例４］  骨髄顆粒球マクロファージ(GM)前駆体の促進
本発明化合物は、細胞に透過できるようにエステル化すると、哺乳動物に投与した場合骨髄にGM前駆体の生産を促進する。実際のアッセイでは、３頭のB6D2F1 マウスを種々の薬量のベンジルPGで腹腔内に処理した。大腿骨骨髄を24時間後に採取し、East, C.J. et. al. Cancer Chemother Pharmacol (1992) 30:123-126の方法でGM-CFUの試験を行った。コロニーの数が用量依存的にTER199の90 mg/kg まで増加した。対照群では約140コロニー／104 有核細胞であるのに対して、90 mg/kg では約275コロニー／104 有核細胞が得られた。
【００８２】
［実施例５］  マウスGM-CFUに対するTER199の腹腔内及び経口投与の比較
20-24グラムの５週齢の雄B6D2F1 マウスを３頭のマウスの群に分け、TER199の種々の薬量で経口又は腹腔内に投与した。TER199は、滅菌ナノポアー水で調製し、ガベージチューブと1 ccのシリンジで経口投与又は28口径の針を付けた1 ccのシリンジを用いて食塩水で腹腔内に投与した。対照群のマウスは、水又は食塩水を注射した。骨髄細胞は薬剤の投与24時間に採取し、メチルセルロース（0.8 % W/V）,牛胎児血清（20 % V/V）, 脱イオンBSA (1 % W/V), アメリカヤマゴボウミトゲン加用脾臓細胞調整培地（PWM-SCCM） (10 % V/V)及びゲンタマイシン(50 Tg/ml) で調整したアルファー最少培地（アルファーMEM）に加えた。
【００８３】
アメリカヤマゴボウミトゲン添加脾臓細胞調整培地（PWM-SCCM）はGringeri et. al. の方法に従って調製した。脾臓は４頭の雄B&D2F1マウスから個別に取り出し、200 Tm ワイヤーメッシュスクリーンに押しつけて通し、単細胞の懸濁液を得た。10 mlの懸濁液（2-4 ×107 細胞／ml）を、1 % 脱イオンBSA, 50 Tg/ml ゲンタマイシン、0.3 % 新鮮なアメリカヤマゴボウ抗原、10 μM 2-メルカプトエタノール等を補充した90 ml のアルファーMEMに加えた。混合物を5 % CO2下37 ℃で５日間インキュベートし、得られた調製培地は、800 gで１０分間遠心分離し、0.22 Tm のフィルターを通してろ過した。ろ液は使用するまで -200 ℃で凍結して保存した。
【００８４】
図４aは骨髄GM-CFUに対するTER199の経口と腹腔内の１回投与の影響を示している。データは各群3頭の平均±標準偏差である。アスタリスクは、値がP<0.05で対照に比べ統計的に有意であることを示す。図4aに示すように、腹腔内投与（閉じた四角、■）は、60-90 mg/kg で最も効果が高く、経口投与（閉じた円、●）は、120-180 mg/kg で最も効果が高い。この結果は、本発明の化合物が、経口投与の方が高い投与量が必要であるが、経口でも腹腔内でも投与可能であることを示している。
【００８５】
図４bは付加的実験の結果を示し、静脈投与を含む。同様な結果が得られた。
【００８６】
［実施例６］  骨髄マクロファージ(GM)前駆体のTER199刺激による経時変化
実施例５の方法を、０日目にTER199を60 mg/kgで単回腹腔内投与し、投与後種々の時間に骨髄細胞を採取して、繰り返した。TER199 を投与したマウスのGM-CFUを対照と比較し、結果を投与後日数の関数として図５に示した。最大の刺激は、２日目及び５日目に起こることが観察された。
【００８７】
［実施例７］  マウス及びヒト骨髄コロニー形成に及ぼすTER199の効果
TER199の、顆粒球−マクロファージ(CFU-GM)、赤血球(BFU-E)、及び多能性 (CFU-GEMM)前駆細胞によるコロニー形成に及ぼす効果を評価した。TER199は、試験管内でヒト及びマウス前駆細胞の分裂増殖を促進した。効果は、多くの場合GM-CSF, G-CFS, M-CFS, Flt3/Flk-2 及びスチールファクター（ステム細胞ファクター／c-kit リガンド）により刺激された細胞では、通常1.0 から 10 μMの範囲で薬量依存的であった。特に興味深いのは、TER199が、サイトカインとのコンビでコロニー形成を促進することが見いだされたことであった。さらに、促進効果は、マウス骨髄よりもヒトでより促進されることである。これらの結果は、TER199が骨髄ステム細胞及び前駆体の多くの系統に促進効果があることを暗示している。ヒト骨髄により大きな効果があることは、ヒトGST アイソザイムP1-1に対する特異性と一致している。これらの実験の代表的な結果を表４−９に示す。
【００８８】
【表４】
2006348048.tif 000006
*統計的に有意
【００８９】
【表５】
2006348048.tif 000007
*統計的に有意
Flt-3 又は SLF が添加されるか、GM-CSF, G-CSF  IL-3と一緒の場合にのみコロニーを形成した。
【００９０】
【表６】
2006348048.tif 000008
*統計的に有意
【００９１】
【表７】
2006348048.tif 000009
*統計的に有意
+PWMSCM=アメリカヤマゴボウ分裂促進因子添加脾臓細胞調整培地
【００９２】
表８及び９は、TER199をヒト骨髄赤血球及び多能性前駆細胞に接触させた場合にマウスの相当物で得られた結果と比較するために設計した実験結果を示す。これらの表に示すように、ヒト(表８)における生体外における効果は、マウス(表9)の対応するもので示されるより本質的に大きい。
【００９３】
【表８】
2006348048.tif 000010
*無処理と比較して有意に増加、p<0.05
【００９４】
【表９】
2006348048.tif 000011
【００９５】
［実施例８］  TER199の末梢血細胞に及ぼす影響
TER199(90 mg/kg/日 × 5, 腹腔内)の末梢血細胞数に及ぼす影響をスプラグ-ダウリー由来のラットで評価した。ラットを２つの群に分け、２つの群を別々の日に採血した。平均の全白血球、完全な(absolute)リンパ球及び完全な好中球の数は試験期間を通じて増加した。代表的なデータをを図６に示す。TER199は、ラットにおける循環している白血球細胞の数を２倍に増加させている。９日目の血小板数の平均値の増加を除いて（データは示していない）、赤血球や血小板の有意な増加はなかった。さらに、TER199は、これらの動物に何らの悪影響も与えてないことが分かった。
【００９６】
［実施例９］  必要な構造
TER199の種々の誘導体及び構造的なアナログによる骨髄の分化に及ぼす効果を、薬量との関係で試験した。骨髄は、化合物の投与24時間後に採取し、GM-CFUの量を前記の方法により測定した。図７はジエチルエステル体(TER199）が混合エステルアミド体(TER300)より有意に効果が高く、対応するエステル化しない化合物は効果がないことを示している。図７において、開いた円（○）は混合エステルアミド体(TER300)を示す。開いた四角(□)はジエチルエステル体であるTER199の結果を示す。混合エステルアミド体のTER300はTER199より代謝されるのがずっと遅いことが知られている。TER199の代謝により、TER117が生成する。図７の結果は、TER117が細胞内に浸透することができないこと、TER300の代謝が遅いことと一致している。
【００９７】
図８は、TER199とそのアナログでの同様の試験結果を示す。開いた四角(□)はTER199を示し、開いた円(○)は、TER199におけるベンジル基はオクチルに、φGはGに置き換わったTER183を示す。開いた菱形(◇)と開いた三角形(△)はそれぞれ不活性の化合物TER317 及び TER206を示す。TER317においてはTER199のフェニルグリシンが(S+)フェニルグリシンに、TER206 ではTER199のベンジルがナフチル(naphthyl)に、フェニルグリシンがグリシンに置き換わっている。 TER183はP1-1よりA1-1のより良い阻害剤であるが、これら結果は、表10に示すように、TER199 及び TER183によるP1-1 GST アイソザイムの標的化と関連する。
【００９８】
【表１０】
2006348048.tif 000012
* エステル化しない形で測定
** 骨髄分化の増強
【００９９】
［実施例１０］  TER199による化学療法剤の効果の改善
a)  5-フルオロウラシルによるGM-CFU抑制に対するTER199の単回腹腔内投与の影響
実施例５で述べた雄B62F1マウスに、0.9 % 生理食塩水に調製した75 mg/kgの5-フルオロウラシル(5-FU)を腹腔内に投与した。３頭づつのマウスの群には生理食塩水中の60 mg/kg のTER199を、5-FUと同時に、又は5-FU投与の24時間前、1時間前、24時間後に腹腔内に注射した。対照群は、どちらの薬剤も投与しなかった。骨髄を採取し、GM-CFUは最後の注射後、24時間に測定した。総合的な結果を図9a に示す。TER199 @-24, @-1 hr;  @+24 hr はそれぞれ、5-FUの投与24時間前、１時間前、又は24時間後を意味する。5-FU処理だけがGM-CFUを対照のマウスの15 % に減少させている。TER199は、5-FUによるGM-CFUの抑制を有意に減少させている。TER199とフルオロウラシルの同時の注射は、フルオロウラシル単独の注射に比較して、大腿骨当たりのGM-CFUの数を４倍に増加させる結果となった。フルオロウラシルの24時間後のTER199の注射は、大腿骨当たりのGM-CFU数が対照群より大きくなっている。
【０１００】
上述のように、5-FUの投与24時間後のTER199の投与は、骨髄細胞の回復を早め、最終的には5-FUを投与しなかった対照以上にこの能力を高める結果となった。これらの結果は、図9bにまとめているが、5-FU投与4日後までに、5-FUのみを投与したマウス（閉じたバー、■）は対照群とほぼ等しいGM-CFUを示し、一方5-FUを加えたTER199（網目バー）は対照の約２倍であった。5-FUの24時間前にTER199を投与した同様の試験では、図9cに示すように、GM-CFUに効果を示さなかった。
【０１０１】
b)  5-フルオロウラシルによるGM-CFU抑制に及ぼすTER199の単回経口投与の効果
5-FUの注射24時間後のTER199を腹腔内に投与した効果が、TER199を経口投与した場合に得られた。5-FUを腹腔内に75 又は 150 mg/kg で投与48時間後に骨髄を採取した。5-FU (75 - 150 mg/kg 腹腔内)投与24時間後に投与すると、TER199 (150 mg/kg, 経口)は5-FUの低薬量投与で約２倍の増大を示し(90 % 対47 %)、高投与量では９倍に増加した(71 % 対8 %)。図9d参照。値は各点当たり３頭のマウスの平均±標準偏差である。
【０１０２】
c)  シスプラチンによるGM-CFU抑制に及ぼすTER199の効果
マウスにおけるTER199の単回経口又は腹腔内投与の効果を、シスプラチンによるGM-CFU抑制を減少する能力で評価した。TER199(60 mg/kg, 腹腔内)は、シスプラチン(15 mg/kg, 腹腔内)の24時間前、1時間前、又は同時に投与した。骨髄はシスプラチン投与24時間後に採取した。GM-CFUの値は各点当たり、３頭のマウスの平均±標準偏差である。図10は、TER199を前もって投与するとシスプラチン単独投与に比べて、GM-CFUを増加させることを示す（図10）。シスプラチンの24時間前にTER199を注射すると、シスプラチン単独で注射した場合に比べて、大腿骨当たりのGM-CFUが２倍に増大する(対照の 31 %に対して62 %)。
【０１０３】
図11に示す実験結果は、GM-CFU抑制をおこしたシスプラチンに対する24時間前又は24時間後の経口投与の効果を示している。骨髄は２番目の薬剤の投与24時間後に採取した。値は各点当たり、３頭のマウスの平均±標準偏差である。シスプラチン(20 mg/kg, 腹腔内)の24時間前に経口投与すると、TER199(150 mg/kg, 経口)は、GM-CFUを４倍近く増加させた(対照の 14 %に対して52 %)。シスプラチンの24時間後投与では、GM-CFUを2.5倍増加させる(40 % 対 14%)。これらの結果は、TER199がシスプラチンによる好中球減少の予防及び治療に有用であることを示している。
【０１０４】
d)  マウスにおけるカルボプラチンによるGM-CFU抑制に及ぼすTER199の効果
カルボプラチンによるGM-CFU抑制を減少させるTER199の効果を上述と同様な実験で測定した。TER199(120 mg/kg, 腹腔内)を、カルボプラチン(90 mg/kg, 腹腔内)の24時間前、24時間後又は同時に投与した。骨髄は２つ目の薬剤の投与後24時間後に採取した。図12のパネルAは、マウスでTER199がカルボプラチンにより引きおこされたGM-CFUの減少を少なくすることを示している。値は各点当たり、３頭のマウスの平均±標準偏差である。図12のパネルＢは、TER199（150 mg/kg 経口）の経口投与がより効果的であることを示している。
【０１０５】
e)  マウスにおけるシクロフォスファミドによるGM-CFU抑制に及ぼすTER199の効果
図13パネルAは、シクロフォスファミド(200 mg/kg, 腹腔内)の投与24時間後にTER199(120 mg/kg, 腹腔内)の投与が、マウスにおけるGM-CFUの減少を軽減することを示している。TER199 (150 mg/kg, 経口)の経口投与も同様に効果的である（図13パネルB参照）。値は各点当たり、３頭のマウスの平均±標準偏差である。
【０１０６】
f)  マウスにおけるメルファラン誘導GM-CFU抑制に及ぼすTER199の効果
メルファラン誘導GM-CFU抑制を減少させるTER199の効果を上述と同様な実験で測定した。メルファラン（10 mg/kg, 腹腔内）単独の注射は、GM-CFUの残存量がわずか2 % となる。TER199(90 mg/kg, 腹腔内)をメルファランの1時間前に与えると、GM-CFUを対照の４倍の8 % に増大させる（データは示していない。）。
【０１０７】
［実施例１１］  5-FU処理±TER199に対する末梢血の応答
a)  5-FU処理±TER199の腹腔内投与
TER199について、5-FUにより生じる血液の抑制の程度を少なくし、その持続を短くする能力について試験した。スプラーグ-ダウレー由来のラットを以下に示すスケジュールに従って処理した（表11）。この試験の結果を図14に示す。
【０１０８】
【表１１】
2006348048.tif 000013
【０１０９】
TER199を処理した群における白血球、好中球及びリンパ球レベルにおける反応は、5-FU処理した群より早く試験前のレベルに達し、12日目では試験前のレベルを超えた。TER199処理した群でのこれら細胞集団に対する反応におけるパターンは、5-FU処理した対照群とは有意に異なっていた(P<0.05)。これらのデータは、5-FUにより抑制された末梢血中の白血球、好中球及びリンパ球の集団の量は、プラセボ処理した動物との比較で、TER199処理した後回復し、試験前のレベルにまで達した。
【０１１０】
TER199処理動物では、血小板の量は１２日までの試験で正常なレベルにまで回復した。対照的に、5-FU対照動物の血小板のレベルは強く抑えられた状態に留まった。TER199処理した群における血小板の反応は、5-FU処理の対照群とは、明らかに異なっていた（P<0.05）。
【０１１１】
赤血球細胞の数は、この試験期間を通して全ての群で常に減少した。観察された減少は、5-FU処理対照動物に比較して、TER199処理した動物では軽かったが、減少傾向の遅れなのか、どん底における実際の減少なのかを見極めるには、試験を早く終わり過ぎた。
【０１１２】
b)  5-FU処理±TER199の経口投与
5-FUを150 mg/kgで腹腔内に投与24時間後に、TER199の150 mg/kg又は対照としての溶媒を経口で投与し、48時間後にさらに5-FU投与を各群６頭のマウスで繰り返した。マウスは眼窩叢から採血し、血液試料は血球数の変化を分析した。図15a-15d は、5-FU単独投与(開いた円、○)又は5-FUとTER199との処理(閉じた円、●)での各種類の血液細胞数を示す。図15aは、合計の白血球細胞数を示すが、特に有意な差異は認められなかった。図15bは、好中球での結果を示すが、統計的に有意な差違は、9日目にのみ得られた。図15cは、リンパ球での結果を示すが、差違は認められなかった。図15は、単球での結果を示すが、9日目だけで統計的に有意な差違が認められた。
【０１１３】
［実施例１２］  サイトカイン産生の促進
ヒト間質培養細胞を、East, C.J. et al., Blood 5:1172 (1992) に記載されているようにしてヒト骨髄から新たに得た。２日目に、細胞を100 μMのTER199 に１時間処理し、培地を取り除き、新鮮な培地で置き換え、24及び48時間後に、培地上清を集め、インターロイキン-1(IL-1)の存在を試験した。結果を表12に示す。IL-1の量は24及び48時間とも、対照の２倍以上であった。
【０１１４】
【表１２】
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【０１１５】
［実施例１３］  種々のサイトカインの存在下におけるCD+++分化に及ぼすTER199の効果
ヒト臍帯血又は骨髄から得た高度に精製したCD34+++細胞を300細胞/mlで植え付け、種々のサイトカインの存在下で種々の濃度のTER199で処理した。図16は、1 単位/mlの組換え赤血球生成促進因子 100 単位/mlの組換えIL-3及び50 ng/mlの組換えスチール(steel)因子の存在下における、0.1 μM - 10 μM の濃度のTER199の、顆粒球-赤血球-マクロファージ-巨核球コロニー形成(CFU-GEMM)に及ぼす影響を示す。図16はまた、1 単位/mlの組換え赤血球生成促進因子及び100 単位/mlの組換えIL-3の存在下における、これら濃度のTER199の赤血球前駆細胞(BFU-E)に及ぼす影響を示す。これらの濃度では、TER199の最低濃度(0.1 μM)でも、CFU-GEMM 及び BFU-Eの両方に対し中程度のプラスの効果を示す。これらの結果は、２つの別のドナーについても一致していた。
【０１１６】
［実施例１４］  TER199の好ましい合成法
TERの全体の合成法は図17に示す。
【０１１７】
TER199は綿毛様の白色の粉末で、融点は145-150℃、システイン及びγ-グルタミル基は共に天然のL体を示し、フェニールグリシンはD体である。図17で示された方法で合成されたとき、得られた産物を確認するため、通常の技術を用いて分析される。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１ａ】図1aは、種々の濃度のクロラムブチルで処理された腫瘍細胞の生存に及ぼすTER199の効果を示す。
【図１ｂ】図1bは、TER199のHT4-1細胞に対する毒性作用を、その非エステル化形のものとの比較で示す。
【図２】図２は、クロラムブチルの単独又はエタクリン酸又はTER199との組み合わせの効果を示すグラフである。
【図３】図３は、TER199の処理２４時間後のマウスGM-CFUにおける用量依存効果を示すグラフである。
【図４ａ】図4aは、骨髄GM-CFUに対するTER199の経口と静脈内投与の比較を示すグラフである。
【図４ｂ】図4bは、骨髄GM-CFUに対するTER199の経口と静脈内投与の比較を示すグラフである。
【図５】図５は、TER199を腹腔内に投与した際のGM-CFUの促進の経時変化を示す。
【図６】図６は、TER199の好中球及び赤血球細胞数に及ぼす影響を示すグラフである。
【図７】図７は、トリペプチドのエステル化又はアミド化された形態のGN-CFU促進との関連性を示すグラフである。
【図８】図８は、式１の"X"置換基の種類のGM-CFU促進に及ぼす影響を示すグラフである。
【図９ａ】図9aは、マウスにおける5-フルオロウラシル(5-FU)によるGM-CFU抑制におよぼすTER199の効果を示すグラフである。
【図９ｂ】図9bは、5-FUの投与24時間後のTER199の腹腔内投与の骨髄細胞の分化能力の回復に及ぼす経時的効果を示すグラフである。
【図９ｃ】図9cは、5-FUによるGM-CFU抑制に及ぼすTER199（腹腔内）の前処理の効果を示すグラフである。
【図９ｄ】図9dは、5-FUの投与24時間後 TER199を経口及び腹腔内投与のマウスにおけるGM-CFU抑制に及ぼす効果を比較するグラフである。
【図１０】図10は、シスプラチン（腹腔内）が引きおこすマウスにおけるGM-CFU抑制に及ぼすTER199の効果を示すグラフである。
【図１１】図11は、シスプラチンの経口投与が引きおこすマウスにおけるGM-CFU抑制に及ぼすTER199の効果を示すグラフである。
【図１２】図12は、カルボプラチンが引きおこすマウスにおけるGM-CFU抑制に及ぼすTER199の効果を示すグラフである。
【図１３】図13は、シクロフォスファミドが引きおこすマウスにおけるGM-CFU抑制に及ぼすTER199の効果を示すグラフである。
【図１４】図14は、5-FUで処理した後、TER199がラットにおける脊髄やリンパ系に対して回復を促進し、毒性を消失させることを示す一連のグラフである。
【図１５】図15a-15dは、5-FU単独又は5-FU + TER199を投与後の種々の血液細胞数を示している。
【図１６】図16は、CFU-GEMM 及び BFU-Eとの関連で、CD34+++細胞の分化に及ぼすTER199の効果を示している。
【図１７】図17は、TER199の好ましい合成法を示している。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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