(57)【要約】【課題】  簡便な操作でかつ工業的規模で大量生産可能な方法で、植物原料からセレブロシドを効率的に抽出して、従来法による抽出物と比べて高濃度のセレブロシドを含有する抽出物を製造する技術を提供する。【解決手段】  植物原料（小麦、大豆、米、綿実、菜種、トウモロコシ、サトウキビ、ゴマ、ピーナッツ等）またはその由来物をアルカリ性エタノールで加水分解し、次いでヘキサン、アセトンおよび水の混合溶媒による抽出工程に付すことを特徴とする、セレブロシド含有抽出物の製造方法。  上記の方法により得られるセレブロシド含有抽出物は、通常セレブロシドを１２〜５０重量％含有する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物原料をアルカリ性エタノールで加水分解し、次いでヘキサン、アセトンおよび水の混合溶媒による抽出工程に付すことを特徴とする、セレブロシド含有抽出物の製造方法。
【請求項２】
植物原料が小麦、大豆、米、綿実、菜種、トウモロコシ、サトウキビ、ゴマ、ピーナッツ、およびこれらの由来物からなる群から選択されるものである、請求項１に記載のセレブロシド含有抽出物の製造方法。
【請求項３】
植物原料が小麦またはその由来物である、請求項１または２に記載のセレブロシド含有抽出物の製造方法。
【請求項４】
植物原料が小麦胚芽、小麦脱脂胚芽、小麦胚芽油または小麦胚芽油の製油工程で生じる副産物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のセレブロシド含有抽出物の製造方法。
【請求項５】
セレブロシド含有抽出物が、セレブロシドを１２〜５０重量％含むものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のセレブロシド含有抽出物の製造方法。
【請求項６】
アセトンと水との割合が１：０．５〜０．８（容積比）であり、ヘキサンとアセトンとの割合が、１：０．８〜０．９５（容積比）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のセレブロシド含有抽出物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セレブロシド含有抽出物の製造方法に関し、より具体的には、食品分野で使用可能な溶媒を用いて、簡便な操作で植物原料からセレブロシドを効率的に抽出して、従来の方法による抽出物と比較して高濃度のセレブロシドを含む抽出物の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脂質は、一般にアシルグリセロール（モノ、ジ、およびトリグリセリド）、リン脂質、糖脂質、高級エステル（ワックス）、構成脂質（脂肪酸等）、イソプレノイド（ステロール等）に分けられる。この中の糖脂質はさらにグリセロ糖脂質とスフィンゴ糖脂質に分けられる。グリセロ糖脂質は分子中にグリセロールを含み、スフィンゴ糖脂質は分子中にスフィンゴイド（長鎖塩基）を含む糖脂質である。スフィンゴ糖脂質のうち、セラミドにグルコースやガラクトースなどの糖が付加されたものが一般に糖セラミド（セレブロシド）と称される。小麦には、セラミドは主にグルコースが付加したグリコシルセラミドとして存在する。
【０００３】
グリコシルセラミドに関しては、分析標準品の入手が困難なことや分析操作が煩雑であり、再現性のある分析法の観点から、現在、光散乱検出−高速液体クロマトグラフィー（HPLC−ELSD）法（例えば、J. Oleo. Sci., Vol.51, No.5, p.347-353 (2002)）、あるいはＴＬＣ−デンシトメトリー法（例えば、Res. Bull. Obihiro Univ., 20, 199-206 (1997)）が信頼された定量方法として確立されている。上記のHPLC−ELSD法で得られた測定値とＴＬＣ−デンシトメトリー法で得られた測定値とはほぼ対応しており、そのまま直接比較することができる。
【０００４】
グリコシルセラミド等の糖脂質は、食品素材、あるいは化粧品素材等の分野に一般に利用されはじめている（特開２００２−３８１８３号公報（特許文献４））。これらは、カラムクロマトグラフィーにより抽出することができるが、抽出方法が煩雑なため、大量生産には向かない。また、これらは、食品分野で使用されない塩素系溶媒（クロロホルムなど）により抽出することができるが、食品素材として用いることはできないという欠点を有している。
糖脂質の抽出方法としては、以下のような方法が知られている。
【０００５】
特開２００２−３００９３号公報（特許文献１）には、植物原料からアルカリ性含水エタノールを用いて、アルカリ加水分解可能な脂質をアルカリ分解して水溶性として除去し、アルカリ分解されない他の脂質を抽出した後、アセトンを用いてグリコシルセラミドを沈殿として得ることを特徴とするグリコシルセラミドの精製方法が開示されている。この方法により、ＴＬＣ−デンシトメトリー法の測定で純度８．８重量％のグリコシルセラミドが得られている。
【０００６】
特許第３５０２９９０号公報（特許文献２）には、植物由来の糖脂質、リゾホスホリピド、スフィンゴ脂質およびセラミドを含有する化合物を分離する方法として、穀物粉またはその抽出物からなる植物化合物をエタノールと接触させ、エタノールを分離して残留物を回収し、これをアセトンと室温で接触させ、得られた粉末を乾燥させることを特徴とする方法が開示されている。この方法により、３〜６％のセラミドを含有するペースト状残留物を得ることができ、また、第２の変形例においてセラミドを８０〜９０％とリン脂質１０〜２０％、糖脂質１０〜２０％を含有する脂質粉末が得られたことが開示されている。しかしながら、この文献には、グリコシルセラミドの純度、得られた脂質の分析方法についてもなんら記載されておらず、また実施例等に具体的な製造方法も開示されていない。
【０００７】
特開平１１−２７９５８６号公報（特許文献３）には、米糠に対して水、エタノール、アセトン、ヘキサンから選択される溶媒の２種以上の混合溶媒を加えて抽出した後、固形物を分離し、得られた抽出液を濃縮した後不溶物を除去し、さらに抽出液を濃縮して得られるスフィンゴ脂質を含有する米糠抽出物の製造方法が開示されている。この方法により、ＴＬＣ−デンシトメトリー法の測定で純度３．５重量％のスフィンゴ脂質が得られている。
【０００８】
特開２００２−３８１８３号公報（特許文献４）には、芋類または油粕に、アルコール類等の極性を有する有機溶媒を添加し、スフィンゴ糖脂質を抽出することを特徴とするスフィンゴ糖脂質含有物の製造方法が開示されている。この方法により、ＴＬＣ−デンシトメトリー法の測定で純度１０．１重量％のスフィンゴ脂質が得られている。
【０００９】
しかしながら上記の方法では特に、得られる糖脂質の純度は、信頼しうる定量方法（ＴＬＣ−デンシトメトリー法）で３〜１０重量％程度の低いものであった。
【特許文献１】特開２００２−３００９３号公報
【特許文献２】特許第３５０２９９０号公報
【特許文献３】特開平１１−２７９５８６号公報
【特許文献４】特開２００２−３８１８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、食品分野で使用可能な溶媒（エタノール、アセトン、ヘキサン等）を用いて、カラムクロマトグラフィー等の煩雑な方法を使用せずに簡便な操作でかつ工業的規模で大量生産可能な方法で、植物原料からセレブロシドを効率的に抽出して、従来法による抽出物と比べて高濃度のセレブロシドを含有する抽出物を製造する技術を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、植物原料をアルカリ性エタノールで加水分解した後、これをヘキサン、アセトンおよび水で抽出操作を行うことにより、高濃度のセレブロシドを含有する抽出物を得ることができることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、下記の構成を要旨とするセレブロシド含有抽出物の製造方法に関するものである。
（１）植物原料をアルカリ性エタノールで加水分解し、次いでヘキサン、アセトンおよび水の混合溶媒による抽出工程に付すことを特徴とする、セレブロシド含有抽出物の製造方法。
（２）植物原料が小麦、大豆、米、綿実、菜種、トウモロコシ、サトウキビ、ゴマ、ピーナッツ、およびこれらの由来物からなる群から選択されるものである、上記(1)に記載のセレブロシド含有抽出物の製造方法。
（３）植物原料が小麦またはその由来物である、上記(1)または(2)に記載のセレブロシド含有抽出物の製造方法。
（４）植物原料が小麦胚芽、小麦脱脂胚芽、小麦胚芽油または小麦胚芽油の製油工程で生じる副産物である、上記(1)〜(3)のいずれかに記載のセレブロシド含有抽出物の製造方法。
（５）セレブロシド含有抽出物が、セレブロシドを１２〜５０重量％含むものである、上記(1)〜(4)のいずれかに記載のセレブロシド含有抽出物の製造方法。
（６）アセトンと水との割合が１：０．５〜０．８（容積比）であり、ヘキサンとアセトンとの割合が、１：０．８〜０．９５（容積比）である、上記(1)〜(5)のいずれかに記載のセレブロシド含有抽出物の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、特に、アルカリ性エタノールによる加水分解と、食品分野で使用可能な特定の溶媒の組合せ（ヘキサン、アセトンおよび水）による抽出工程との組合せにより、植物原料から、簡便な操作でかつ工業的規模で大量生産可能な方法で、植物原料からセレブロシドを効率的に抽出して、従来の方法による抽出物と比較して高濃度のセレブロシドを含有するセレブロシド含有抽出物を提供することができる。また、本発明の方法で得られるこの抽出物は、そのまま食品素材あるいは化粧品素材等に使用できるが、その後必要に応じて、通常の精製手段（カラムクロマトグラフィー等）によるさらなる精製に中間物として使用する場合にも精製効率が良いという利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明において、セレブロシド（グリコシルセラミド）は、前述のようにスフィンゴ糖脂質のうち、スフィンゴシン塩基に脂肪酸がアミド結合したセラミドの１位の一級水酸基に糖（主としてグルコース）がグリコシド結合した物質をいう。
【００１５】
本発明における植物原料は、目的のセレブロシドを含有するものであれば特に限定されず、例えば小麦、大豆、米、綿実、菜種、トウモロコシ、サトウキビ、ゴマ、ピーナッツ等があげられる。これらの植物原料は、原料そのものを未加工のまま用いてもよいし、例えば種子全粒を使用してもよいし、その由来物であってもよい。ここで由来物とは、該当する植物原料をもとにして得られるものであり、未加工の植物原料から分取したものや抽出したもの等を意味する。植物原料の由来物の例示としては、種子粒の一部分、例えば胚芽（小麦胚芽等）、糠（米糠等）、あるいは粉末化したもの、種子製油、種皮、製油残渣（製油工程で生じる副産物、例えば、脱ガム時に生じるガム質等の油滓）等があげられる。植物原料としては、小麦あるいはその由来物が好ましく、小麦胚芽、小麦脱脂胚芽、小麦胚芽油または小麦胚芽油の製油工程で生じる副産物がより好ましく、小麦胚芽、小麦脱脂胚芽がさらに好ましく、小麦脱脂胚芽が特に好ましい。また、小麦脱脂胚芽は、製油工程の副産物の再利用の点からも好ましい原料である。
【００１６】
本発明によるセレブロシド含有抽出物の製造方法は、植物原料をアルカリ性エタノールで加水分解し、次いでヘキサン、アセトンおよび水の溶媒による抽出工程に付すことを特徴とするものであることは前記した通りである。本発明において、アルカリ性エタノールによる加水分解工程は、アルカリ性エタノール可溶性成分を抽出し、アルカリ性エタノール不溶性成分を除去するものである。そして、セレブロシド等のエタノールに溶解する脂質を植物原料から抽出すると共に、アルカリ加水分解可能な脂質（リン脂質等）を加水分解するものである。この工程に使用するアルカリ性エタノールとしては、アルカリの種類及び濃度やエタノール濃度に特に限定はなく、通常、エタノールまたは含水エタノールにアルカリを溶解させた弱アルカリ性溶液が好ましく使用される。エタノールは、一般に市販されているものを使用することができる。アルカリとしては、通常、水酸化カリウムあるいは水酸化ナトリウム等を用い、これをエタノールに溶解させてアルカリ性エタノールとする。アルカリ性エタノールのアルカリの濃度は、特に限定はないが、通常０．０３〜５N程度であり、０．０５〜１Ｎが好ましく、０．０５〜０．５Ｎがより好ましく、０．１〜０．４Nがさらに好ましく、０．４Ｎが最も好ましい。アルカリ性エタノールの使用量は、特に限定はないが、通常、植物原料１重量部に対して１〜２０重量部、好ましくは３〜１０重量部程度である。前記した通り、アルカリ性エタノールは水を含まなくてもよい。水を含む場合、アルカリ性含水エタノールの水分含量は、特に限定されないが、水／エタノールの容積比は、通常０．０１／９９．９９〜５０／５０、好ましくは０．５／９９．５〜２０／８０である。この水分含量としては、植物原料中の水分量を考慮に入れても構わない。
【００１７】
加水分解工程は、通常反応容器中で植物原料にアルカリ性エタノールを加えて十分撹拌後、適当な温度および時間で反応・抽出を行う。反応・抽出中に攪拌を加えると効率的である。加水分解時の温度は特に限定はないが、通常２０℃〜アルカリ性エタノールの沸点未満の温度であり、好ましくは４０℃〜アルカリ性エタノールの沸点未満の温度、より好ましくは５５℃〜アルカリ性エタノールの沸点未満の温度、特に好ましくは６０℃〜アルカリ性エタノールの沸点未満の温度で行う。加水分解工程では、加熱により蒸気が発生することはあるが、アルカリ性エタノールが著しく減少するほどの沸騰状態にはさせず、また還流はしないことが望ましい。アルカリ性エタノールの沸点は、アルカリの濃度や種類、エタノール（沸点７８．４℃）や水の濃度により異なるため、特に限定することはできない。アルカリ性エタノールの沸点未満の温度としては、例えば７０℃が挙げられる。加水分解時の反応時間は特に限定はないが、通常１時間以上、好ましくは１〜２０時間、より好ましくは２〜１２時間、さらに好ましくは４〜６時間、最も好ましくは５時間程度反応を行なう。
【００１８】
加水分解の後、必要に応じて中和操作を行ってもよい。最終的に得られたものが中和されていれば、ビスケット等の食品や化粧品等に加工しやすいという利点はあるが、中和しなくても構わない。中和工程は、加水分解の後であれば、どこの段階で行っても構わない。加水分解後、反応液は通常弱酸性溶液を加えて中和する場合、弱酸性溶液としては希塩酸水溶液等を使用するのが好ましく、また弱酸性溶液の濃度は、一般に０．０３〜１N程度であり、０．１〜０．８Nがより好ましい。中和工程は、反応液のｐＨが６．５〜７．５程度の範囲になるように調整することが好ましい。
【００１９】
加水分解後の反応液または中和後の反応液は、通常濾紙およびロート等を用いて濾過を行い、濾液を回収する（残渣は不要物として廃棄できる）。回収した濾液は、通常エバポレーター、薄膜濃縮器等を用いて溶媒をできる限り除いて濃縮する（アルカリ性エタノール抽出物）。濃縮終了の目安は、例えば濾液量が少量の場合、黄褐色の粘状になった時点である。次の抽出工程で水を含む溶媒を用いるため、水分は残っていても構わない。  
【００２０】
上記のようにして得られた濃縮物（アルカリ性エタノール抽出物）は、次いで本発明における抽出工程に付す。抽出は水、アセトンおよびへキサンの溶媒を用いて行なう。これら３種の溶媒による抽出工程としては、水、アセトンおよびへキサンをあらかじめ混合した混合溶媒を植物原料に加えて抽出を行なう方法が通常であるが、必要に応じて、これらの各溶媒を植物原料に順次加えて（混合溶媒の状態で）抽出を行なってもよく、両者の方法で最終的に得られるセレブロシドの純度は同程度である。抽出工程に使用するヘキサン、アセトン、水の最終的な使用もしくは混合割合は、セレブロシドが抽出される条件で任意に設定でき、例えば１〜７：１〜２．３：１（容積比）の範囲の中で選択できる。抽出されるセレブロシドの量（濃度）を考慮した場合、アセトンと水との割合が１：０．５〜０．８（容積比）であり、かつヘキサンとアセトンとの割合が１：０．８〜０．９５（容積比）である場合が好ましく、アセトンと水との割合が１：０．５〜０．７（容積比）であり、かつヘキサンとアセトンとの割合が１：０．８〜０．９５（容積比）である場合がより好ましい。さらに好ましい態様において、アセトンと水との割合が１：０．５〜０．６７（容積比）であり、かつヘキサンとアセトンとの割合が１：０．８〜０．９５（容積比）である場合が好ましく、また、アセトンと水との割合が１：０．５〜０．６３（容積比）であり、かつヘキサンとアセトンとの割合が１：０．８〜０．９５（容積比）である場合がより好ましい。
【００２１】
抽出操作は通常、あらかじめヘキサン、アセトン、水の各溶媒を上記所定の割合で混合した混合溶媒を上記濃縮物に加える。また、これらの各溶媒を順次加えて抽出を行なう場合は、例えば上記濃縮物にまず水を加え、次いでアセトンおよびへキサンを順次加えることが挙げられる。後者の場合は、最終的に３種の溶媒の割合が上記所定の割合になるようにすればよい。抽出中は静置状態でも構わないが、攪拌器等で撹拌することにより抽出効率を高めて抽出時間を短縮させることができる。
【００２２】
抽出における抽出温度は、特に限定はないが、通常１５〜３０℃、好ましくは２０〜３０℃で行う。抽出時間は、十分に攪拌混合される条件であれば特に限定はなく、抽出スケールによってもその時間が異なるため、一概に規定することはできないが、例えば、実験室レベルのような小スケールの場合、通常１〜１０分間であり、大量生産するような大スケールの場合、通常３０分〜２時間である。抽出方法は、特に限定はないが、通常ミキサー等の攪拌器を用いて行う。抽出工程終了の目安は、通常有機溶媒層（上層）と水層（下層）の良好な分離がなされたときである。
【００２３】
３種の溶媒による抽出工程の後、上層を分取する。上層を分取する方法は特に限定はなく、例えば、静置後デカントしてもよいし、遠心分離（例えば１５℃、７００×ｇ、５〜１０分間）してもよい。３種の溶媒による抽出工程の後、不溶物が存在する場合はこれを除去することが好ましい。不溶物の除去は、これを除去できる条件であれば任意の方法が使用できるが、例えば１５℃で５〜１０分程度遠心分離（１００〜７００×ｇ程度）を行なうか、あるいは静置分離後に濾過等を行えばよい。
【００２４】
必要に応じて不溶物を除去した抽出液（上層）は、通常エバポレーター等で溶媒を除去することにより、抽出物量が少量の場合、無色透明な乾固物として目的のセレブロシドを高含有量で得ることができる（セレブロシド含有抽出物）。溶媒除去の目安は、例えば抽出物量が少量の場合、乾固物が出現した時点である。このようにして最終的に得られる本発明のセレブロシド含有抽出物（組成物）は、通常セレブロシド１２〜５０重量％、好ましくは１２〜２５重量％、より好ましくは１５〜２５重量％、さらに好ましくは１５〜２０重量％含有するものであり、具体的には後記実施例に示されるように、セレブロシド１２重量％以上を含有している。本発明により得られるセレブロシド含有抽出物には、セレブロシドとは別に、ステリルグリコシドも含まれており、この抽出物に濃縮されている。
【００２５】
前述のように、従来の抽出方法では、溶媒抽出によって得られるセレブロシドの濃度もしくは純度は３〜１０重量％（ＴＬＣデンシトメトリー法）程度であったことからすれば、本発明においては、特に、アルカリ性エタノールによる加水分解抽出工程と、水、アセトンおよびへキサンの溶媒での抽出工程を組合せることにより、セレブロシドを１２重量％以上、さらには１５重量％以上、あるいは１５〜２０重量％（ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ法）という極めて高い純度で含む抽出物を得ることができるといえる。このようにして得られた本発明によるセレブロシド含有抽出物は、工業的規模で大量生産が可能であり、そのまま食品（例えばビスケット等）あるいは化粧品（例えばハンドクリーム等）の素材等として使用できる。セレブロシドを高濃度に含む抽出物を得る利点は、例えば、少量の添加でセレブロシドを高濃度に含む食品や化粧品が得られるところにある。その後必要に応じて、通常の精製手段（種々のクロマトグラフィー等）によりさらなる精製に中間物として使用する場合にも精製効率が良いという利点を有する。本発明は、カラムクロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー等のような操作を必要とせず、簡便な方法でかつ工業的規模で大量生産可能な方法で実現していることに利点を有する。また、本発明は、塩素系溶媒（クロルホルムなど）等を用いず、食品分野で使用可能な溶媒（エタノール、アセトン、ヘキサン等）を使用して実現していることにおいても利点を有する。
【００２６】
本発明において、セレブロシドの測定は、窒素ガスで試料中の溶媒を乾固し、乾固物の脂質をクロロホルム／メタノール混液（２：１）で抽出後、セレブロシドの測定法として、ＴＬＣデンシトメトリー法と共に最も信頼性がありかつこの方法と測定値を直接比較できる光散乱検出−高速液体クロマトグラフィー（HPLC−ELSD）法で行れたものである。HPLC−ELSD法については、例えばJ. Oleo. Sci. Vol.51, No.5, p.347-353 (2002)を参照することができるが、後記実施例にも具体的に記載されている。
【００２７】
本明細書において、％表示は特に断りのない限り重量％を意味する。
【実施例】
【００２８】
以下の実施例において、セレブロシドの測定は、J. Oleo. Sci. Vol.51, No.5, p.347-353 (2002)）に記載された方法に準じて行った。具体的には以下の方法を使用した。
【００２９】
脂質含量：試料（０．２ｇ）を正確に量り取り、２．５mLのクロロホルム／メタノール混液（２：１（v/v））と０．５mLの水を加えて混和した。これを遠心分離（約５００×ｇ、１５分）し、下層のクロロホルム層を採取した。上層の水／メタノール層に１．８mLのクロロホルム：メタノール混液（１０：１（v/v））を加えて混和し、これを遠心分離（５００×ｇ、１５分）し、下層のクロロホルム層を採取した。得られた下層を統合し、２．４ｍＬのクロロホルム／メタノール／水混液（３：４８：４７（v/v/v））にて水洗して、水洗後のクロロホルム層をＮ２ガスで除去した。１００℃のブロックヒーターにて乾燥後、重量法で脂質含量を測定した。
【００３０】
セレブロシド定量：上記と同様の方法で総脂質抽出し、抽出物の一部（２００μｇ総脂質）をHPLC−ELSDに供してセレブロシドを定量分析した。定量値は、セレブロシドの標準品（J. Oleo. Sci. Vol.51, No.5, p.347-353 (2002)）と比較して求めた。
分析条件は以下の通りである。
・カラム：シリカ（ＳＧ１２０−５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、資生堂）
・移動相：１００％クロロホルムとメタノール／水（９５：５）による２液グラジエント
・流速：１mL／min（カラム温度,３５℃）
・検出：光散乱検出器（ELSD, ＳＥＤＥＸ５５, ＳＥＤＥＲＥ）
・検出条件：ドリフトチューブ温度６０℃、ガス流量２．０ Ｂａｒ
ステリルグリコシド定性：セレブロシド定量と同じ方法で定性し、チャート上に（セレブロシドとは別の）ピークとして確認した。
【００３１】
［実験例１］小麦脱脂胚芽のセレブロシド含量の確認
小麦脱脂胚芽（リノール油脂（株）製造）について、上記の脂質含量の測定法およびセレブロシドの定量法によりセレブロシドを定量した。その結果、小麦脱脂胚芽100 g当たりの総脂質量は0.48 g （0.48 重量%）であり、セレブロシド量は0.025 g（0.025 重量%）であることがわかった。
【００３２】
［実験例２］セレブロシドの抽出条件（アルカリ処理条件）の検討 
植物原料として小麦脱脂胚芽５ｇをとり、３種のＫＯＨエタノール溶液（(1)０．１mol／L ＫＯＨ、(2)０．４mol／L ＫＯＨ、(3)０．８mol／L ＫＯＨ）２０ｍｌを加えた後、６０℃で１２時間インキュベートした。インキュベーション後に、このアルカリ処理物を、濾紙（No.2）とブフナーロートを用いて濾過した。得られた濾液について、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、濃縮・乾固した（アルカリ性アルコール抽出物）。乾固物にクロロホルム：メタノール：水（２：１：１）を５ｍＬ加えて攪拌後、下層を分離した。下層を分取後、窒素ガスで溶媒を除去し、乾固した。乾固物をクロロホルム：メタノール（２：１）で溶解後、HPLC−ＥＬＳＤでセレブロシドの定量を行った。表１に示すように、０．１mol／Lと０．４mol／LのＫＯＨエタノール溶液を使用した場合が相対的に良い結果であったが、得られたクロマトグラムを比較したとき、０．４mol／LのＫＯＨエタノール溶液を使用した場合に後半部分（１５分以降）にピークが確認できなかったことから、すなわちリン脂質等の不純物が少なかったことから、後者のKOH濃度条件が最も良好であった。また、ステリルグリコシドの存在を確認し、濃縮されていることがわかった。実施例において、エタノールは濃度９９．５％のものを使用した。なお、ＫＯＨ１mol／Lは、ＫＯＨ １Ｎである。
【００３３】
表１：KOH濃度の違いによる収量への影響                        
KOH濃度          ｍｇ／１．０ｍｇ乾固物        濃度（重量％）
０．１mol／L        ０．０７６±０．００３      ７．６±０．３
０．４mol／L        ０．０７６±０．００３      ７．６±０．３
０．８mol／L        ０．０３４±０．００３      ３．４±０．３ 
平均値±標準偏差（ｎ＝３）
【００３４】
［実験例３］セレブロシドの抽出条件（抽出温度）の検討 
小麦脱脂胚芽５ｇをとり、２０mLのＫＯＨエタノール溶液（０．４mol／L ＫＯＨ）を加えた後、２５℃、３７℃、および６０℃で１２時間インキュベートした。インキュベーション後に、このアルカリ処理物を、濾紙（No.2）とブフナーロートを用いて濾過した。得られた濾液について、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、濃縮・乾固した（アルカリ性アルコール抽出物）。乾固物にクロロホルム：メタノール：水（２：１：１）を５ｍＬ加えて攪拌後、下層を分離した。下層を分取後、窒素ガスで溶媒を除去し、乾固した。乾固物をクロロホルム：メタノール（２：１）で溶解後、HPLC／ＥＬＳＤでセレブロシドの定量を行った。表２に示すように、６０℃で抽出した場合が最も良好な結果であった。また、ステリルグリコシドの存在を確認し、濃縮されていることがわかった。
【００３５】
表２：抽出温度の違いによる収量への影響                        
抽出温度          ｍｇ／１．０ｍｇ乾固物       濃度（重量％） 
２５℃            ０．０２２±０．００８      ２．２±０．８
３７℃            ０．０２７±０．００２      ２．７±０．２
６０℃            ０．０７６±０．００３      ７．６±０．３  
平均値±標準偏差（ｎ＝３）
【００３６】
［実験例４］セレブロシドの抽出条件（抽出時間）の検討
小麦脱脂胚芽５ｇをとり、ＫＯＨエタノール溶液（０．４mol／L ＫＯＨ）を２０mL加えた後、６０℃で２時間、５時間および１２時間インキュベートした。インキュベーション後に、このアルカリ処理物を、濾紙（No.2）とブフナーロートを用いて濾過した。得られた濾液について、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、濃縮・乾固した（アルカリ性アルコール抽出物）。乾固物にクロロホルム：メタノール：水（２：１：１）を５ｍＬ加えて攪拌後、下層を分離した。下層を分取後、窒素ガスで溶媒を除去し、乾固した。乾固物をクロロホルム：メタノール（２：１）で溶解後、HPLC−ＥＬＳＤでセレブロシドの定量を行った。その結果、表３に示すように、５時間以降の場合が良好な結果であった。１２時間でも良好であったが、５時間と比較して大きな違いはなかった。また、ステリルグリコシドの存在を確認し、濃縮されていることがわかった。
【００３７】
表３：エタノール（０．４mol／L ＫＯＨ）２０mL使用の場合      
抽出時間          ｍｇ／１．０ｍｇ乾固物       濃度（重量％）
２時間            ０．０３５±０．０１６      ３．５±１．６
５時間            ０．０７２±０．０１０      ７．２±１．０
１２時間          ０．０７６±０．００３      ７．６±０．３ 
平均値±標準偏差（ｎ＝３）
【００３８】
［実施例１］セレブロシドの抽出条件（溶媒分配）の検討
小麦脱脂胚芽５ｇをとり、２０mL ＫＯＨエタノール溶液（０．４mol／L ＫＯＨ）を加えた後、６０℃で５時間インキュベートした。インキュベーション後に、このアルカリ処理物を、濾紙（No.2）とブフナーロートを用いて濾過した。得られた濾液について、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、濃縮・乾固した（アルカリ性エタノール抽出物）。乾固物に３種の混合溶媒（(1)ヘキサン／アセトン／水、(2) ヘキサン／アセトン／水／エタノール、(3) ヘキサン／アセトン／水）をそれぞれ５ｍＬ加えて攪拌後、上層を回収した。上層を分取後、窒素ガスで溶媒を除去し、乾固した（セレブロシド抽出物）。乾固物をクロロホルム：メタノール（２：１）で溶解後、HPLC−ＥＬＳＤでセレブロシドの定量を行った。また、ステリルグリコシドの存在を確認し、濃縮されていることがわかった。
【００３９】
表４：へキサン／エタノール／水の検討                                    
へキサン        エタノール        水      mg/1.0mg乾固物    濃度（重量％）
４              ３．５          ２        ０．０２３         ２．３     
【００４０】
表５：へキサン／アセトン／水／エタノールの検討                          
へキサン    アセトン    水    エタノール  mg/1.0mg乾固物    濃度（重量％）
１６      １４        ８      ５          ０．０１６         １．６
１６      １４        ８      ３          ０．０３６         ３．６
６        ４        １      ３              −               −       
（−）：セレブロシドが検出されなかったか、または、エリア面積が小さかった。
【００４１】
表６：へキサン／アセトン／水の検討（溶媒比率）                            
へキサン  アセトン  水      濃度（重量％）  水／アセトン  アセトン／ヘキサン
１０      ３      ３        −            １．０００    ０．３００
６      ４      ６        −            １．５００    ０．６６７
６      ２      ３        −            １．５００    ０．３３３
３      ２      ６        −            ３．０００    ０．６６７
２      ５      ２        −            ０．４００    ２．５００
１      １      １        １．３        １．０００    １．０００
５      ２      ２        １．５        １．０００    ０．４００
８      ４      ３        １．７        ０．７５０    ０．５００
５      ３．５  ２        ８．３        ０．５７１    ０．７００
６      ４      ３        ９．７        ０．７５０    ０．６６７
４      ３．５  ３        ９．７        ０．８５７    ０．８５７
５      ４．５  ２      １０．８        ０．４４４    ０．９００
４      ３      ２      １２．０        ０．６６７    ０．７５０
５      ４      ２      １５．５        ０．５００    ０．８００
４      ３．８  ２      １５．７        ０．５２６    ０．９５０
３．８  ３．５  ２      １６．３        ０．５７１    ０．９２１
４      ３．２  ２      １７．８        ０．６２５    ０．８００
４      ３．５  ２      １９．０        ０．５７１    ０．８７５        
（−）：セレブロシドが検出されなかったか、または、エリア面積が小さかった。
【００４２】
結果
(1)へキサン／エタノール／水の混合溶媒  
エタノールは、アセトンに比べてやや極性が高いので、アセトンの代わりに使用した。しかし、セレブロシドは溶出されるものの期待されるほどの効果は無かった（表４）。
(2)へキサン／アセトン／水／エタノールの混合溶媒  
エタノール量を調節しつつ、セレブロシドの溶出量を調べた。この混合溶媒の使用は、エタノールで抽出後なるべく濃縮作業を容易にすることが目的であった。しかし、エタノールを少量にしても、セレブロシドの溶出量は増加しなかった（表５）。
(3)へキサン／アセトン／水の混合溶媒  
上記(1)及び(2)と比較して、セレブロシドの溶出量が高いことがわかった（表６）。そして、高い純度のセレブロシド（約１２重量％以上、約１５重量％以上、あるいは約１５〜２０重量％／抽出物（組成物））が得られた。
(4) へキサン／アセトン／水の混合溶媒の配合比率の検討
混合溶媒の検討では、へキサン／アセトン／水の組合せが最も良好であり（表６）、その配合比率としては、アセトンと水との割合が１：０．５〜０．８（容積比）（好ましくは１：０．５〜０．６７）であり、かつヘキサンとアセトンとの割合が１：０．８〜０．９５（容積比）の場合に極めて高い純度のセレブロシド（約１２重量％以上、約１５重量％以上、あるいは約１５〜２０重量％／抽出物（組成物））が得られた（表６）。また、ステリルグリコシドの存在を確認し、濃縮されていることがわかった。
【００４３】
［実施例２］酸処理（中和）による抽出率への影響
小麦脱脂胚芽５ｇをとり、２０mL ＫＯＨエタノール溶液（０．４mol／L ＫＯＨ）を加えた後、６０℃で５時間インキュベートした。インキュベーション後に、１mol／L  のHClを約１mL加え、ｐHを７．４に調整した（HCl無添加のものを対照とした）。このアルカリ処理物を、濾紙（No.2）とブフナーロートを用いて濾過した。得られた濾液について、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、濃縮・乾固した（アルカリ性エタノール抽出物）。乾固物にヘキサン／アセトン／水の混合溶媒（４：３．５：２）を５mL加えて攪拌後、１５℃で７００×ｇで遠心分離を行い、上層を分離・回収した。上層を分取後、窒素ガスで溶媒を除去し、乾固した（セレブロシド含有抽出物）。乾固物をクロロホルム：メタノール（２：１）で溶解後、HPLC／ＥＬＳＤでセレブロシドの定量を行った。
【００４４】
結果
表７に示されるように、酸処理をすることによりセレブロシドの純度に実質的な影響はみられず、通常中性の状態で添加する食品（例えばビスケット等）への応用にも十分使用できることが確認できた。また、ステリルグリコシドの存在を確認し、濃縮されていることがわかった。
【００４５】
表７：酸処理による影響                                       
酸処理      ｍｇ／１．０ｍｇ乾燥物      濃度（重量％ ）  
なし        ０．１９±０．０２８       １９±２．８
あり        ０．１８±０．０４         １８±４．０     
平均値±標準偏差（ｎ＝３）
【００４６】
［実施例３］抽出溶媒の添加形態による抽出率への影響
小麦脱脂胚芽５ｇをとり、２０mL ＫＯＨエタノール溶液（０．４mol／L ＫＯＨ）を加えた後、６０℃で５時間インキュベートした。インキュベーション後に、１mol／L  のHClを約１ｍＬ加え、ｐHを７．４に調整した。このアルカリ処理物を、濾紙（No.2）とブフナーロートを用いて濾過した。得られた濾液について、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、濃縮・乾固した（アルカリ性エタノール抽出物）。乾固物にヘキサン／アセトン／水の混合溶媒（(1)４：３．2：２、(2) ４：３．５：２、(2) ４：３．８：２）を５ｍＬ加えて攪拌後、１５℃および４℃で７００×ｇで遠心分離を行い、上層を分離・回収した。上層を分取後、窒素ガスで溶媒を除去し、乾固した（セレブロシド含有抽出物）。乾固物をクロロホルム：メタノール（２：１）で溶解後、HPLC−ＥＬＳＤでセレブロシドの定量を行った。また、上記抽出方法の溶媒添加において、はじめに水１mLを加え、次いでアセトン３．５mL、ヘキサン４mLを個別に加え、最後に水１mLを加える方法について同様に実施した。
【００４７】
結果
表８の結果から、混合溶媒の形態で使用した場合と、各抽出溶媒を別々に添加した場合（抽出時には最終的に混合溶媒）と比べてほとんど変わらなかったことから、溶媒抽出工程は、混合溶媒および個別溶媒のいずれの形態でも使用することができることがわかった。なお、個別溶媒の形態において、水ははじめにあるいは最後にまとめて添加してもほとんど影響はなかった。また、ステリルグリコシドの存在を確認し、濃縮されていることがわかった。
【００４８】
表８：抽出溶媒の添加形態の影響                                   
溶媒分配          ｍｇ／１．０ｍｇ乾固物        濃度（重量％）   
混合溶媒(1)        ０．１６±０．０１４          １６±１．４
混合溶媒(2)        ０．１８±０．０２            １８±２．０
混合溶媒(3)        ０．１７±０．０４            １７±４．０    
個別溶媒           ０．１８±０．０４            １８±４．０    
平均値±標準偏差（ｎ＝３）