(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト成長ホルモンの安定性、血中滞留性、抗原性を改善する。【解決手段】少なくとも１つのポリ（エチレングリコール）分子が、生物学的に活性なヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチドまたはそのアゴニスト変異体の少なくとも１つのアミノ酸残基に共有結合したものを含むコンジュゲート。該コンジュゲートは、非修飾ｈＧＨの持続的ｈＧＨ活性よりもはるかに長い持続的活性を有し、投与量及び回数の軽減を可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのポリ（エチレングリコール）分子が、生物学的に活性なヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチドまたはそのアゴニスト変異体の少なくとも１つのアミノ酸残基に共有結合したものを含むコンジュゲートであって、アミノ酸残基が遊離アミノ基を有し、且つポリ（エチレングリコール）分子が式：ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨＯのアルデヒドからなる官能基を有し、ポリ（エチレングリコール）が２０ｋＤａ又は３０ｋＤａの分子量を有する、前記コンジュゲート。
【請求項２】
構造：ｍＰＥＧ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｒ
を有し、Ｒがヒト成長ホルモンポリペプチドであり、ポリ（エチレングリコール）が２０ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
構造：ｍＰＥＧ−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｒ
を有し、Ｒがヒト成長ホルモンポリペプチドであり、ポリ（エチレングリコール）が３０ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記ポリ（エチレングリコール）の少なくとも９０％がアミノ末端α−アミノ基に結合している、請求項１〜３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記ｈＧＨポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲートおよび少なくとも１つの薬剤的に受容できるキャリアを含む組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のｈＧＨコンジュゲートを含有する、成長または発育障害の治療のための医薬組成物。
【請求項８】
前記成長または発育障害が成長ホルモン欠乏症（ＧＨＤ）である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記成長または発育障害がターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）症候群である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記成長または発育障害が慢性腎不全症である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記成長または発育障害が胎内発育遅延（ＳＧＡ）である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記成長または発育障害が成人成長ホルモン欠乏症である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
以下の工程を含む、高レベルの生物学的活性を持続する請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲートの作製方法：
ａ）ヒト成長ホルモンポリペプチドまたはそのアゴニスト変異体の不活性化を避けるために、ヒト成長ホルモンポリペプチドまたはそのアゴニスト変異体と活性化ポリ（エチレングリコール）との間の結合反応を溶液中で温和な条件下で実施する工程；および
ｂ）コンジュゲートを未反応種から分離する工程。
【請求項１４】
前記温和な条件が、反応溶液のｐＨを３〜１０、且つ反応温度を０℃〜３７℃に維持することを含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の化学的および／または生理学的性質を変化させることができる、ｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体の化学的修飾に関する。ペグ化ｈＧＨは延長した血清中滞留期間、低下したクリアランス速度、改善された安定性、低下した抗原性またはそれらの組み合わせを有するであろう。また、本発明はｈＧＨ修飾の方法に関する。さらに、本発明は修飾されたｈＧＨを含む医薬組成物に関する。別の態様は、成長および発達障害の治療のための修飾されたｈＧＨの使用である。
【背景技術】
【０００２】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は２つのジスルフィド結合により架橋された１９１アミノ酸の１本鎖を含む蛋白質であり、その単量体は分子量２２ｋＤａを有する。ヒトＧＨは脳下垂体から分泌され、そしてそれは組換え遺伝子操作によっても作製することができる。ｈＧＨは増殖することができるすべての体組織に増殖を引き起こすことができる。組換えｈＧＨは数年前から市販されている。以下に挙げた治療的に有用な２種の組換えｈＧＨ製剤が市販されている：真正なもの、たとえばＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（登録商標）、またはＮｕｔｒｏｐｉｎ（登録商標）およびＮ‐末端に付加的なメチオニン残基を有する類似体、たとえばＳｏｍａｔｏｎｏｒｍ（登録商標）。ｈＧＨは成長ホルモン欠乏症（ＧＨＤ）またはターナー症候群とも呼ばれる脳下垂体機能不全小人症の患者において線形成長を刺激するために使用されるが、胎内発育不全（ＳＧＡ）で生まれた子供における成長障害の長期治療、Ｐｒａｄｅｒ‐Ｗｉｌｌｉ症候群（ＰＷＳ）、慢性腎機能不全症（ＣＲＩ）、ＡＩＤｓ衰弱、および加齢患者の治療を含む他の適用も提案されている。
【０００３】
成長ホルモン（ＧＨ）の主要な生物学的作用は、若年哺乳動物における成長促進および老年哺乳動物における組織の維持を促進することである。影響を受ける器官系には、骨格、結合組織、筋肉、ならびに肝臓、腸、および腎臓のような内臓が挙げられる。成長ホルモンは標的細胞の膜にある特定の受容体との相互作用を通じてその作用を発揮する。ｈＧＨは、胎盤ラクトジェン、プロラクチン、ならびに成長ホルモンの遺伝的および種変異体を含む相同ホルモンファミリーのメンバーである（Ｎｉｃｏｌｌ，Ｃ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｅｎｄｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ７：１６９）。ｈＧＨはこれらの間では独特で、広範な種特異性を示し、クローン化体細胞起源（Ｌｅｕｎｇ、Ｄ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，［１９８７］Ｎａｔｕｒｅ  ３３０；５３７）またはプロラクチン受容体（Ｂｏｕｔｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，［１９８８］Ｃｅｌｌ；５３：６９）のいずれかに結合する。ｈＧＨのクローン化遺伝子は大腸菌に分泌型で発現され（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，［１９８７］Ｇｅｎｅ  ５５：１８９）、そのＤＮＡおよびアミノ酸配列が報告されている（Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，［１９７９］Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４；Ｇｒａｙ，ｅｔ  ａｌ．，［１９８５］Ｇｅｎｅ  ３９：２４７）。
【０００４】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は正常なヒト成長および発達の調節の大部分に関与する。この脳下垂体ホルモンは、とりわけ線形成長（体形成）、乳汁分泌、マクロファージの活性化、インスリン様および糖尿病誘発作用を含む、多数の生物学的作用を示す（Ｃｈａｗｌａ，Ｒ．Ｋ．（１９８３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．３４，５１９；Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，７６９；Ｔｈｏｍｅｒ，Ｍ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１：７４５）。小児の成長ホルモン欠乏症は小人症を引き起こし、そしてそれはｈＧＨを外部から投与することにより、１０年以上前から首尾よく治療されてきた。
【０００５】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は１９１アミノ酸からなる１本鎖ポリペプチド（分子量２１，５００）である。ジスルフィド結合は５３位と１６５位および１８２位と１８９位を連結する。Ｎｉａｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２３０：９０（１９７１）．ｈＧＨは、とりわけ窒素、リン、カリウム、およびカルシウムを保持するため、強力な同化剤である。ＧＨによる下垂体切除ラットの処置により、少なくともラットの成長速度の一部を回復させることができる。Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２２：２９２０−２９２６（１９８８）。骨‐成長‐平板‐軟骨の線形成長が促進され、結果として身長の伸びを生じることは、下垂体機能不全（ＧＨ‐欠乏）対象におけるもっとも際だった作用の１つである。Ｋａｐｌａｎ，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｄｅｎ  ａｎｄ  Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｃ．Ｔｈｏｍａｓ，１９６４）．
ｈＧＨは線形骨成長、乳汁分泌、マクロファージの活性化、インスリン様および糖尿病誘発作用などを含む多様な生理的および代謝的作用を各種動物に引き起こす（Ｒ．Ｋ．Ｃｈａｗｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．３４，５１９（１９８３）；Ｏ．Ｇ．Ｐ．Ｉｓａｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４７，４８３（１９８５）；Ｃ．Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，７６９（１９８８）；Ｍ．Ｏ．Ｔｈｏｍｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｌ．Ｖａｎｃｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８２，７４５（１９８８）；Ｊ．Ｐ．Ｈｕｇｈｅｓ  ａｎｄ  Ｈ．Ｇ．Ｆｒｉｅｓｅｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４７：４６９（１９８５））。とりわけ閉経後の婦人においてＧＨ分泌が年齢と共に減少することが報告されている。Ｍｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，１１：２２９−２３５（１９９０）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  Ｍ，Ｌ６−１３７−１４２（１９８７）．Ｒｕｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６７：１３６１−１３６９（１９８１）およびＢｌａｃｋｍａｎ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ，１６：９８１（１９８７）も参照されたい。さらに、減少した除脂肪体重、増加した脂肪組織質量、および皮膚の薄化を含む加齢のいくつかの徴候は週３回のＧＨ処理により軽減することができる。たとえば、Ｒｕｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２３：１−６（１９９０）およびＤｒ．Ｖａｎｃｅによる同じ雑誌の号の添付記事（ｐｐ．５２−５４）を参照されたい。これらの生物学的作用はｈＧＨと特定の細胞受容体間の相互作用に由来する。２種の異なるヒト受容体、ｈＧＨ肝受容体（Ｄ．Ｗ．Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：５３７（１９８７））およびヒトプロラクチン受容体（Ｊ．Ｍ．Ｂｏｕｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．３：１４５５（１９８９））がクローニングされている。しかし、ヒト胎盤乳汁分泌ホルモン受容体を含む他のものである可能性がある（Ｍ．Ｆｒｅｅｍａｒｋ，Ｍ．Ｃｏｍｅｒ，Ｇ．Ｃｏｍｅｒ，ａｎｄ  Ｓ．Ｈａｎｄｗｅｒｇｅｒ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２０：１８６５（１９８７））。これらの相同性受容体はグリコシル化細胞外ホルモン結合ドメイン、単一膜貫通ドメイン、ならびに配列およびサイズがかなり異なる細胞質ドメインを含む。１以上の受容体がｈＧＨに対する生理的反応において明確な役割を果たしていると考えられる。
【０００６】
通例、体内に投与された生理的に活性な蛋白質は、体内における速いクリアランス速度のため、短期間しかそれらの薬理学的活性を示すことができないと言われる。さらに、これらの蛋白質の相対的な疎水性はそれらの安定性および／または溶解性を限定するであろう。
【０００７】
クリアランス速度を低下させ、治療蛋白質の安定性改善または抗原性を消失させるために、蛋白質を水溶性ポリマーで化学的に修飾した、いくつかの方法が提案されている。この型の化学的修飾は、蛋白質分解酵素と蛋白質骨格自体との物理的接触を効果的に妨げて分解を防ぐであろう。ある種の水溶性ポリマーを化学的に結合すると、分子の流体力学的容積が増加するため、腎クリアランスは効果的に減少するであろう。別の利点としては、ある環境下における治療蛋白質の安定性および循環時間の増大、溶解性増大、ならびに免疫原性の低下が挙げられる。ポリ（アルキレンオキシド）、とりわけ、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）は治療蛋白質製品の製造に使用されているそのような化学的部分のひとつである（“ペグ化する”という動詞は少なくとも１ＰＥＧ分子を結合させることを意味する）。ポリ（エチレングリコール）の結合は蛋白質分解から保護することが示されていて、Ｓａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｍｔａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７１：１３７−１３９（１９９１）、ある種のポリ（エチレングリコール）部分の結合のための方法が利用できる。米国特許第４，１７９，３３７号、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｎｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ“１９７９年、１２月１８日公開；および米国特許第４，００２，５３１号、Ｒｏｙｅｒ，”Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  Ｔｈｅｒｅｂｙ“、１９７７年１月１１日公開を参照されたい。総説としては、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，のＥｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ．（Ｊ．Ｓ．Ｈｏｌｃｅｒｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓ編、ｐｐ．３６７−３８３（１９８１））を参照されたい。
【０００８】
他の水溶性ポリマー、たとえばエチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（−１，３−ジオキソラン）、ポリ（−１，３，６−トリオキサン）、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ−アミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）が使用されている。
【０００９】
多数のペグ化治療蛋白質の例が記載されている。アデノシンデアミナーゼのペグ化製剤、ＡＤＡＧＥＮ（登録商標）は重症複合免疫不全病を治療するために認可される。ペグ化Ｌ−アスパラギナーゼのＯＮＣＡＳＰＡＲ（登録商標）は、過敏性ＡＬＬ患者の治療に認可されている。ペグ化スーパーオキシドジスムターゼは頭部外傷治療のための臨床試験中である。ペグ化α‐インターフェロン（米国特許第５，７３８，８４６号、第５，３８２，６５７号）は肝炎の治療に認可されている；ペグ化グルコセレブロシダーゼおよびペグ化ヘモグロビンは前臨床試験中であると報告されている。別の例としては、ＩＬ−６に添加されたポリ（エチレングリコール）分子を開示する“修飾ｈＩＬ−６”という題名のＥＦ  ０  ４４２  ７２４のペグ化ＩＬ−６が挙げられる。
【００１０】
化学的に修飾されている別の具体的な治療蛋白質としては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が挙げられる。Ｇ−ＣＳＦは好中性顆粒球の速やかな増殖および血流への放出を誘導し、それによって感染と戦う治療効果を提供する。“Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ”という題名のヨーロッパ特許公開公報ＥＰ  ０  ４０１  ３８４（１９９０年１２月１２日公開）はポリ（エチレングリコール）分子が結合するＧ−ＣＳＦを製造するための材料および方法を記載する。また、修飾されたＧ−ＣＳＦおよびその類似体が“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｔｏ  Ａ  Ｗａｔｅｒ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ”という題名のヨーロッパ特許第  ０  ４７３  ２６８号（１９９２年３月４日公開）に報告され、水溶性粒子ポリマー、たとえばポリ（エチレングリコール）に共有結合した各種Ｇ−ＣＳＦおよび誘導体の使用について述べている。ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する修飾ポリペプチドは、ヨーロッパ特許第  ０  ３３５  ４２３号（１９８９年１０月４日公開）に報告されている。Ｎ末端が修飾された蛋白質またはその類似体、および化学的にＮ末端が修飾された新規Ｇ−ＣＳＦ組成物を含む、それらから生じる組成物のための方法は米国特許第５，８２４，７８４号に提供される。米国特許第５，８２４，７７８号は化学的に修飾されたＧ−ＣＳＦを開示する。
【００１１】
ポリ（エチレングリコール）に関しては、蛋白質にポリ（エチレングリコール）を結合するために多様な手段が使用されている。一般に、ポリ（エチレングリコール）分子は蛋白質上に見出される反応基を介して蛋白質に結合する。
【００１２】
リシン残基上またはＮ末端にあるようなアミノ基は、そのような結合に好都合である。たとえば、Ｒｏｙｅｒ（米国特許第４，００２，５３１号、上記）は還元アルキル化を酵素へのポリ（エチレングリコール）分子の結合に使用したと述べている。ヨーロッパ特許第０  ５３９  １６７号（１９９３年４月２８日公開）、Ｗｒｉｇｈｔ、“Ｐｅｇ  Ｉｍｉｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ”は遊離アミノ基（単数又は複数）を有するペプチドおよび有機化合物はＰＥＧのイミデート誘導体または関連する水溶性有機ポリマーにより修飾されると述べている。米国特許第５，２９８，６４３号および米国特許第５，６３７，７４９号はＰＥＧアリールイミデートを開示する。
【００１３】
Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０（１９９４）は、還元アルキル化を介したモノメトキシポリ（エチレングリコール）アルデヒドによるＣＤ４イムノアドヘシンの修飾を報告する。著者らは、ペグ化全体にわたって制御できる条件下で、ＣＤ４−Ｉｇの５０％がＭｅＰＥＧ修飾されたことを報告する。同上、ｐ１３７。また、著者らは修飾ＣＤ４−Ｉｇの（蛋白質ｇｐ１２０に対する）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合能力はＭｅペグ化の程度に相関した割合で低下したことを報告している。同書中。米国特許第４，９０４，５８４号（１９９０年２月２７日公開）は反応アミノ基を介したポリ（エチレングリコール）分子の結合のための蛋白質中のリシン残基数の修飾に関する。
【００１４】
蛋白質にポリマーを結合する多くの方法は、結合基として作用する部分の使用を包含する。しかし、そのような部分は抗原性であるかもしれない。結合基を含まないトレシルクロリド（tresyl chloride）法は利用できるが、トレシルクロリドの使用は毒性の副産物を生じる可能性があるため、この方法は治療薬を製造するために使用することは難しいかもしれない。Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，のＳｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（Ａｈｅｒｎ，Ｔ．ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｍ．Ｃ．編，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）を参照されたい。また、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８９  ｐｐ．２１１−２１３のＤｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ＰＥＧ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｙ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｔｒｅｓｙｌ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ”を参照されたい。
【００１５】
また、蛋白質基質（インスリン）のＣ末端カルボキシル基へのリンカー基カルボヒドラジドの選択的結合を報告するＲｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２：１５４−１５９（１９９１）を参照されたい。
【００１６】
ＷＯ９３／００１０９は、３日間以上、継続的に効果的な血漿中ＧＨ濃度を維持することを含む、哺乳動物またはニワトリのＧＨ反応性組織を刺激する方法に関する。そのような血漿中濃度を得るための１方法は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような高分子物質に結合したＧＨの使用であると述べている。高分子物質への結合は結果として半減期を改善することになると述べている。ｍＰＥＧアルデヒド‐５０００およびｍＰＥＧ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ｍＰＥＧ‐ＮＨＳ‐５０００）を使用した、ペグ化ヒト成長ホルモンがＷＯ９３／００１０９に報告されている。ｍＰＥＧ‐ＮＨＳの使用は、多様にペグ化されたｈＧＨ型の異種混合物を生じた。また、ＷＯ９３／００１０９はペグ化システイン変異体へのｍＰＥＧ‐マレイミドの使用を開示する。
【００１７】
ＷＯ９９／０３８８７はペグ化されたシステイン変異体成長ホルモンを開示する。このコンジュゲートはＢＴ−００５と呼ばれ、成長ホルモン欠乏ラットにおける体重増加の刺激においてより効果的であり、ｈＧＨより長い半減期を有すると主張する。
【００１８】
また、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステルを使用した、ペグ化ヒト成長ホルモンがＣｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．により報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１：２１９６９−２１９７７，１９９６）。Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．は、選択的に第１アミンに結合するｍＰＥＧ‐ＮＨＳ−５０００を使用した、サイズの増大したｈＧＨ誘導体を記載する。増大したＰＥＧ修飾レベルはその受容体への親和性を低下させ、セルベースアッセイにおいてＥＣ５０を１５００倍まで増加させた。Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ  ３８：５６８−５６９，１９９７は多重ペグ化ｈＧＨ種を得るためのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）ＰＥＧの使用を開示する。
【００１９】
ＷＯ９４／２００６９は予言的に、肺送達のための製剤の一部としてペグ化されたｈＧＨを開示する。
米国特許第４，１７９，３３７号は、生理的に活性な非免疫原性、水溶性ポリペプチドコンジュゲートを得るために酵素およびホルモンをペグ化する方法を開示する。ＧＨはペグ化されるホルモンの一例として言及されている。
【００２０】
ヨーロッパ特許第４５８０６４  Ａ２号はソマトトロピンに導入されるか、または天然に存在するシステイン残基のペグ化を開示する。ヨーロッパ特許第４５８０６４  Ａ２号はさらに、野生型ウシソマトトロピンの残基１０２−１１２に位置すると言われるオメガループといわれるループにおける２つのシステイン残基の取込について述べ、より具体的にはヨーロッパ特許第４５８０６４  Ａ２号は、ウシソマトトロピンの１０２番および１１２番の残基のＳｅｒからＣｙｓ、およびＴｙｒからＣｙｓへのそれぞれの置換を開示する。
【００２１】
ＷＯ９５／１１９８７は、親分子に存在するか、または部位特異的変異誘発による導入のいずれかである、システイン残基のチオール基へのＰＥＧの結合を提案する。ＷＯ９５／１１９８７はプロテアーゼのネキシン‐１のペグ化に関するが、一般にｈＧＨおよび他の蛋白質のペグ化も提案する。
【００２２】
ＷＯ９９／０３８８７は、たとえばセリン残基のかわりに付加的なシステインの挿入により修飾した成長ホルモン、および導入したシステイン残基へのＰＥＧの結合を開示する。
【００２３】
ＷＯ００／４２１７５は、ＰＥＧの結合のために遊離システイン残基を含む蛋白質を作製する方法に関する。ＷＯ００／４２１７５は、以下のｈＧＨ修飾蛋白質：Ｔ３Ｃ、Ｓ１４４ＣおよびＴ１４８Ｃならびにそれらのシステインペグ化を開示する。
【００２４】
ＷＯ９７１１１７８（ならびに米国特許第５８４９５３５号、米国特許第６００４９３１号、および米国特許第６０２２７１１号）は、ｈＧＨのアゴニストまたはアンタゴニストとしてのＧＨ変異体の使用に関する。ＷＯ９７１１１７８はまた、リシンペグ化およびリシンの導入または置換（たとえばＫ１６８ＡおよびＫ１７２Ｒ）を含む、ｈＧＨのペグ化を開示する。ＷＯ９７１１１７８はまた、置換体Ｇ１２０Ｋを開示する。
【００２５】
ペグ化ｈＧＨの以前の報告は、（Ｋｎａｕｆ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５０６４−１５０７０，１９８８）に記載のように複数のＰＥＧの結合を必要とし、そのことが産物の望ましくない不均一性を生じ、流体力学的容積は腎濾過の７０Ｋ分子量カットオフより大きい。
【００２６】
循環半減期が長いＧＨ分子は必要な投与回数を減らし、潜在的に最適な治療ｈＧＨレベルを提供し、それに伴って治療効果が促進されるであろう。
本発明は化学的に修飾されたｈＧＨコンジュゲートを提供し、それらは減少した不均一性、減少したクリアランス速度、増大した血漿中滞留時間、改善された溶解度、増大した安定性、低下した抗原性、またはそれらの組み合わせを有する。
【発明の開示】
【００２７】
発明の概要
本発明は、化学的に修飾されたｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体に関し、それらは減少したクリアランス速度、増大した血漿中滞留時間、増大した安定性、改善された溶解度、および低下した抗原性から選択されるがそれらに限定されない、少なくとも１つの改善された化学的または物理的性質を有する。したがって、より詳細に以下に記載のように、本発明は化学的に修飾しているｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体、ならびに多様なポリ（エチレングリコール）部分を使用した具体的な修飾に関する多数の側面を有する。
【００２８】
また、発明は化学的に修飾されたｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体を製造する方法に関する。
また、本発明は化学的に修飾されたｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体を含む組成物に関する。
【００２９】
本発明の修飾されたｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体は、以下の障害に限定しないが、小人症（ＧＨＤ）、成人ＧＨＤ、ターナー症候群の治療；胎内発育不全（ＳＧＡ）で生まれた小児の成長障害の長期治療；Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群（ＰＷＳ）、慢性腎機能不全症（ＣＲＩ）、Ａｉｄｓ衰弱、加齢、末期腎不全、および嚢胞性線維症患者の治療に有用であってよい。
【００３０】
発明の詳細な説明
米国特許第４，６５８，０２１号および米国特許第５，６３３，３５２号に記載のｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体は組換え蛋白質ファミリーのメンバーである。それらの組換え産物および使用の方法は、米国特許第４，３４２，８３２号、第４，６０１，９８０号；米国特許第４，８９８，８３０号；米国特許第５，４２４，１９９号；および米国特許第５，７９５，７４５号に記載される。
【００３１】
遺伝子組換え技術を使用して形質転換またはトランスフェクションした大腸菌および動物細胞のような宿主細胞により産生される、いかなる精製、単離したｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体も本発明において使用することができる。付加的なｈＧＨ変異体は米国特許出願番号第０７／７１５，３００号（１９９１年６月１４日出願）および第０７／７４３，６１４号（（１９９１年８月９日出願）、ならびにＷＯ９２／０９６９０（１９９２年６月１１日公開）に記載される。それらの中で、形質転換された大腸菌により産生されるｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体がとりわけ好ましい。そのようなｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は高い純度および均一性で、大量に得ることができる。たとえば、上記のｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は米国特許第４，３４２，８３２号、第４，６０１，９８０号；米国特許第４，８９８，８３０号；米国特許第５，４２４，１９９号；および米国特許第５，７９５，７４５号に従って製造することができる。“実質的に以下のアミノ酸配列を有する”という句は、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体に対して不都合な機能の相違を全く引き起こさない限り、１以上のアミノ酸の変異（欠失、付加、挿入または置換）を包含してよいことを意味する。少なくとも１リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、不対システイン残基、遊離Ｎ末端α‐アミノ基または遊離Ｃ末端カルボキシル基が包含されるアミノ酸配列を実質的に有するｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を使用することがより好ましい。
【００３２】
本発明に従って、ポリ（エチレングリコール）はｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のアミノ酸残基を介して共有結合を形成する。多数の異なる官能基、リンカー、立体配置、および分子量を有する多様な活性化ポリ（エチレングリコール）が当業者に公知であり、それらをＰＥＧ‐ｈＧＨコンジュゲートまたはＰＥＧ‐ｈＧＨアゴニスト変異体コンジュゲートを作製するために使用することができる（総説としては、Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．５４：４５９−４７６，２００２）、Ｈａｒｒｉｓ  Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ４０：５３８−５５１，２００１を参照されたい）。アミノ酸残基は、たとえば遊離アミノ、カルボキシル、スルフヒドリル（チオール）、ヒドロキシル、グアニジニル、またはイミジゾイル基を有するどんな反応性のものであってもよく、活性化されたポリ（エチレングリコール）の末端反応基がそれに結合することができる。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基は、リシン残基、および／またはＮ末端アミノ酸残基を包含してよく、遊離カルボキシル基を有するものはアスパラギン酸、グルタミン酸および／またはＣ末端アミノ酸残基を包含してよく、遊離スルフヒドリル（チオール）を有するものはたとえばシステイン、遊離ヒドロキシルを有するものはたとえばセリンまたはチロシン、遊離グアニジニルを有するものはたとえばアルギニン、そして遊離イミジゾイル基を有するものはたとえばヒスチジンを包含してよい。
【００３３】
別の態様において、オキシム化学（Ｌｅｍｉｅｕｘ＆Ｂｅｒｔｏｚｚｉ  Ｔｉｂ  Ｔｅｃｈ  １６：５０６−５１３，１９９８）はＮ末端セリン残基を標的にするために使用される。
【００３４】
本発明で使用するポリ（エチレングリコール）はいずれの具体的な形状または分子量にも限定されない。ポリ（エチレングリコール）分子量は５００〜１００，０００の間であってよい。通常、分子量５００〜６０，０００が使用される。より好ましくは、分子量は５，０００以上４０，０００までである。
【００３５】
別の態様において、ポリ（エチレングリコール）は１以上の結合したＰＥＧ部分を有する分枝ＰＥＧである。分枝ＰＥＧの好ましい例は、米国特許第５，９３２，４６２号；米国特許第５，３４３，９４０号；米国特許第５，６４３，５７５号；米国特許第５，９１９，４５５号；米国特許第６，１１３，９０６号；米国特許第５，１８３，６６０号；ＷＯ０２／０９７６６；Ｋｏｄｅｒａ  Ｙ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：２８３−２８８（１９９４）；およびＹａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５２：２１２５−２１２７，１９９８に記載される。好ましい態様では、分枝ＰＥＧのそれぞれのポリ（エチレングリコール）の分子量は５，０００〜２０，０００である。
【００３６】
ポリ（アルキレンオキシド）、とりわけポリ（エチレングリコール）は末端の反応基を介してｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体に結合し、ＰＥＧと蛋白質間の結合部分（スペーサー）を残しておいても残さなくてもよい。本発明のｈＧＨコンジュゲートまたはそのアゴニスト変異体を形成するために、ポリ（アルキレンオキシド）のようなポリマーは活性型に変換され、そのような用語は当業者には公知である。たとえば、反応基は末端反応基であり、そしてそれはアミノ、カルボキシルまたはチオール基のような、蛋白質上の化学部分とポリ（エチレングリコール）間の結合を媒介する。一般に末端のポリマーヒドロキシル末端基（すなわち、アルファおよびオメガ末端ヒドロキシル基）の１つまたは両方は反応性官能基に変換され、共有結合を形成する。この過程はしばしば“活性化”と呼ばれ、反応基を有するポリ（エチレングリコール）産物は以後“活性化ポリ（アルキレンオキシド）”と呼ばれる。αおよびε結合基を両方含むポリマーは“ビス‐活性化ポリ（アルキレンオキシド）”と呼ばれ、そして“二官能性”と呼ばれる。αおよびε末端ヒドロキシル上に同じ反応基を含むポリマーは時々“ホモ二官能性”または“ホモビス‐活性化”と呼ばれる。αおよびε末端ヒドロキシル上に異なる反応基を含むポリマーは、時々“ヘテロ二官能性”（たとえばＷＯ０１／２６６９２を参照されたい）または“ヘテロビス‐活性化”と呼ばれる。単一の反応基を含むポリマーは“モノ活性化”ポリアルキレンオキシドまたは“単官能性”と呼ばれる。他の実質的に非抗原性のポリマーは同様に“活性化”または“官能性化”される。
【００３７】
したがって、活性化ポリマーは、たとえばαもしくはε‐アミノ、カルボキシルまたはチオール基のような、蛋白質上の化学部分とポリ（エチレングリコール）間の結合を媒介するために適切である。ビス‐活性化ポリマーはこのようにして２つの蛋白質分子または１蛋白質分子と別の態様における反応性小分子と反応して、架橋により蛋白質ポリマーまたは蛋白質‐小分子コンジュゲートを効果的に形成することができる。
【００３８】
ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体上に見出される、アミノ末端α‐アミノ基またはリシンのε‐アミノ基のいずれかと反応できる官能基には以下のものが挙げられる：Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、ｐ−ニトロフェニル、またはスクシニミジルのようなカーボネート（米国特許第５，８０８，０９６号、第５，６１２，４６０号、米国特許第５，３２４，８４４号、米国特許第５，５，１２２，６１４号）；カルボニルイミダゾール；アズラクトン（米国特許第５，３２１，０９５号、米国特許第５，３４９，００１号）；環状イミドチオン（米国特許第５，４０５，８７７号、第５，３４９，００１号）；イソシアネートまたはイソチオシアネート（Ｇｒｅｅｍｗａｌｄ  Ｒ．Ｂ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：３３１−３３６，１９９５）；トレシルクロリド（ヨーロッパ特許第７１４  ４０２号、ヨーロッパ特許第４３９  ５０８号）；ハロゲンホルミエート（ＷＯ９６／４０７９２）、およびアルデヒド。
【００３９】
ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体上のカルボン酸基、反応性カルボニル基および酸化糖質部分と反応可能な官能基には以下のものが挙げられる：第１アミン；ならびにヒドラジンおよびアシルヒドラジドのようなヒドラジド官能基、カルバゼート、セミカルバメート、チオカルバゼートなど（ＷＯ０１／７０６８５）。
【００４０】
また、メルカプト基はｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体上で利用可能な場合は、チオール；マレイミド、スルホン、およびフェニルグリオキサールのような反応基を有する適切に活性化されたポリマーのための結合部位として使用できる：たとえば米国特許第５，０９３，５３１号を参照されたい。その開示は参照として本明細書に援用する。求電子中心と反応することができる別の求核試薬としてはたとえばヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、チオール、活性メチレンなどが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４１】
また、米国特許第５，３５９，０３０号および米国特許第５，６８１，８１１号；米国特許第５，４３８，０４０号；および第５，３５９，０３０号に開示された、親油性および親水性部分を含むポリマーが挙げられる。
【００４２】
さらにアミノ、チオール基、および芳香族ヒドロキシ基と反応することができるハロゲン化ＰＥＧがＷＯ９８／３２４６６に開示され、それらはＰＥＧを直接蛋白質に共有結合する。
【００４３】
本発明の好ましい一態様では、Ｎ末端α‐アミノ基またはｈＧＨもしくはそのアゴニスト変異体のリシンのε‐アミノ基および活性化ＰＥＧを使用して、第２アミンまたはアミド結合が形成される。
【００４４】
本発明の別の好ましい一側面では、Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０（１９９４）および米国特許第５，８２４，７８４号に記載のように、ＮａＣＮＢＨ３、ＮａＢＨ３、ピリジンボランなどのような適切な還元剤による還元により、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のＮ‐末端第１α‐またはε‐アミノ基と直鎖または分枝鎖ＰＥＧアルデヒド間に第２アミン結合が形成される。
【００４５】
好ましい態様では、ポリ（エチレングリコール）の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、そして最も好ましくは少なくとも９８％のポリ（エチレングリコール）がアミノ末端α‐アミノ基上にある。
【００４６】
本発明の別の好ましい態様では、スクシニミジルエステル、環状イミドチオンなどのようなアミド形成リンカーにより活性化されたポリマーが、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体とポリマーを結合するために使用される。たとえば米国特許第５，３４９，００１号；米国特許第５，４０５，８７７号；およびＧｒｅｅｎｗａｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓｙｓｔ．１７：１０１−１６１，２０００を参照されたい。それらは参照として本明細書に援用する。ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の遊離アミノ基に結合することができる、１つの好ましい活性化ポリ（エチレングリコール）は、直鎖または分枝鎖Ｎ−ヒドロキシスクシニルイミドポリ（エチレングリコール）を含み、Ｎ−ヒドロキシスクシニルイミドを持つポリ（エチレングリコール）のコハク酸エステルを活性化することにより作製することができる。
【００４７】
本発明の別の好ましい態様は、別の活性化ポリマーを使用してε‐アミノまたは他の基を介したｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体とポリマーの共有結合を形成することを含む。たとえば、末端が活性化されたポリマーのイソシアネートまたはイソチオシアネート型を使用して、リシンアミノ基と尿素またはチオ尿素を基にした結合を形成することができる（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  Ｒ．Ｂ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：３３１−３３６，１９９５）。
【００４８】
本発明の別の好ましい態様では、米国特許第５，１２２，６１４号、第５，３２４，８４４号、および第５，６１２，６４０号（それらは参照として本明細書に援用する）に記載のように、蛋白質アミノ基とカルバメート（ウレタン）結合が形成される。例としては、Ｎ−スクシニミジルカーボネート、パラ−ニトロフェニルカーボネート、およびカルボニルイミダゾール活性化ポリマーが挙げられる。本発明の別の好ましい態様では、ＰＥＧのベンゾトリアゾールカーボネート誘導体はｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体上のアミノ基に結合する。
【００４９】
本発明の別の側面は、機能的リンカーによりｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体分子に結合した、水溶性ポリマー、たとえばポリ（エチレングリコール）からなるｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のプロドラッグまたは徐放型を提示し、それは酵素またはｐＨに制御された加水分解により予想通りに分解して遊離ｈＧＨもしくはそのアゴニスト変異体、または別のｈＧＨもしくはそのアゴニスト変異体誘導体を放出することができる。また、プロドラッグは、カスケード潜伏（ｌａｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）の使用を含む“ダブルプロドラッグ”（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３：３９−６５，１９８９）であってもよい。そのような系では、加水分解反応は、初めの律速的な（遅い）酵素またはｐＨに制御された段階、および初めの段階が起こった後にだけ起こる、迅速な非酵素加水分解を含む第２段階を含む。そのような放出性ポリマーは蛋白質コンジュゲートを提供し、それらは一時的であって、貯蔵所としての役割を果たし、継続的にｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を放出することができる。そのような機能的リンカーは、以下のものに記載される：米国特許第５，６１４，５４９号；米国特許第５，８４０，９００号；米国特許第５，８８０，１３１号；米国特許第５，９６５，１１９号；米国特許第５，９６５，５６５号；米国特許第６，０１１，０４２号；米国特許第６，１５３，６５５号；米国特許第６，１８０，０９５号  Ｂ１；米国特許第６，４１３，０４２号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  Ｒ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：３６５７−３６６７，１９９９；Ｌｅｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １２：１６３−１６９，２００１；Ｇａｒｍａｎ  Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２３：３６１−３６５，１９８７；Ｗｏｇｈｉｒｅｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．４：３１４−３１８，１９９３；Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７；１４４０−１４４５，１９９８；Ｚｈａｏ  Ｘ．ｉｎ  Ｎｉｎｔｈ  Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔ．１９９；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  Ｒ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：４７５−４８７，２０００；およびＧｒｅｅｎｗａｌｄ  Ｒ．Ｂ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１７：１０１−１６１，２０００．Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２８ｔｈ  Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １；７３−７４，２００１．
ペグ化と表現される結合反応は、歴史的にモル過剰ポリマーで、ポリマーが蛋白質のどこに結合するかにかかわりなく、溶液中で行われた。しかし、そのような一般的な技術は十分な生理活性を保持しながら非抗原性ポリマーに生理活性蛋白質を結合するためには概して不適切であることが証明されている。ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の生理活性を維持するための一方法は、ポリマーカップリング過程において、受容体結合部位に関連したそれらのｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の反応基の結合を実質的に避けることである。本発明の別の側面は、高レベルの保持活性を維持するｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体にポリ（エチレングリコール）を結合させる方法を提供することである。
【００５０】
共有結合を介した化学的修飾は、生理活性物質の反応において一般に用いられる任意の適切な条件下、活性化ポリ（エチレングリコール）を用いて行うことができる。結合反応は、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を不活性化させることを避けるために比較的緩和な条件下で行われる。緩和な条件とは、反応溶液をｐＨ３〜１０および反応温度を約０℃〜３７℃の範囲内に維持することを含む。ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の反応性アミノ酸残基が遊離アミノ基を有する場合、リン酸、ＭＥＳ、クエン酸、酢酸、コハク酸またはＨＥＰＥＳを含む、限定的でない適切なリストのバッファー（ｐＨ３〜１０）中で、１〜４８時間、４°〜３７℃で上記の修飾が行われる。ＰＥＧアルデヒドのような試薬がＮ−末端アミノ基を標的とする場合、好ましくはｐＨ４〜８を維持する。活性化ポリ（エチレングリコール）は、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の遊離アミノ基数のモル量の約０．０５〜１００倍、好ましくは約０．０１〜２．５倍使用することができる。一方、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の反応性アミノ酸残基が遊離カルボキシル基を有する場合、上記の修飾は好ましくはｐＨ約３．５〜約５．５で行われ、たとえばポリ（オキシエチレンジアミン）による修飾はカルボジイミド存在下（ｐＨ３．５〜５）、１〜２４時間、４°〜３７℃で行われる。活性化されたポリ（エチレングリコール）は、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の遊離カルボキシル基数のモル量の０．０５〜３００倍を使用することができる。
【００５１】
別の態様では、結合反応に含まれるポリマー量の上限は、約１：１を上回り、実質的な量の高分子量種を形成せずに活性化ポリマーとｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を反応させることが可能な程度までとなり、言い換えるとコンジュゲートの約２０％以上がｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体１分子につきポリマー約１本鎖以上を含む。たとえば、本発明のこの側面では、約６：１までの比を使用して、有意な量の所望するコンジュゲートを形成することが可能で、それらはその後任意の高分子量種から単離できることを企図する。
【００５２】
本発明の別の側面では、二官能性に活性化されたＰＥＧ誘導体を使用して、高分子ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体‐ＰＥＧ分子を作製することが可能であり、その中では複数のｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体分子がＰＥＧによって架橋されている。本明細書に記載の反応条件により有意な量の非修飾ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体が生じてもよいが、非修飾ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は、付加的な結合反応のための後のバッチに容易に再利用することができる。本発明の方法は驚くべきことに、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体につきポリマー１本鎖以上を含む高分子量種を非常に少量、すなわち約３０％未満、そしてより好ましくは約１０％未満しか生成しない。これらの反応条件は、活性化ポリマーが標的に対して数倍のモル過剰で存在する、ポリマー結合反応に一般に使用される条件と対比されることになる。本発明の別の側面では、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の等量につき、ポリマーは約０．１／アミノ基から約５０等量までの量で存在する。本発明の別の側面では、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の等量につき、ポリマーは約１から約１０等量までの量で存在する。
【００５３】
本発明の結合反応は、モノ‐およびジ‐ＰＥＧ‐ｈＧＨコンジュゲート、未反応ｈＧＨ、未反応ポリマー、および通例約２０％未満の高分子量種を含む、反応混合物またはプールを提供する。高分子量種には、１以上のポリマー鎖および／または重合したＰＥＧ‐ｈＧＨもしくはそのアゴニスト変異体種を含むコンジュゲートが挙げられる。未反応種および高分子量種を除去後、主にモノ‐およびジ‐ポリマー‐ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体コンジュゲートを回収する。大部分のコンジュゲートが１本のポリマー鎖を含むという事実を考慮すると、コンジュゲートは実質的に均質である。標準ＦＤＣ−Ｐ１細胞増殖アッセイ、（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１：２１９６９−２１９７７，１９９６）、受容体結合アッセイ（米国特許第５，０５７，４１７号）、または脳下垂体切除ラット成長（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１：２１９６９−２１９７７，１９９６）を使用して測定したように、これらの修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は、天然または非修飾ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏの生理活性の少なくとも約０．１％を有する。しかし本発明の好ましい側面において、修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は約２５％のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生理活性を有し、より好ましくは、修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は約５０％のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生理活性を有し、より好ましくは約７５％のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生理活性を有し、そして最も好ましくは、修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は等価であるか、または改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ生理活性を有する。
【００５４】
本発明の手順は、かなり限定されたポリマー対ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の比を含む。したがって、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体コンジュゲートは主として、１本のポリマーだけを含む種に限定されていることが見出されている。さらに、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体反応基へのポリマーの結合は、さらにモル過剰のポリマーリンカーを使用する場合ほど実質的にランダムではない。結合反応が停止した後に反応プールに存在する非修飾ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は、イオン交換もしくはサイズ排除クロマトグラフィーまたは類似の分離技術を使用して、後の反応に再利用することができる。
【００５５】
ポリ（エチレングリコール）‐修飾ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体、すなわち、本発明に記載の化学的に修飾された蛋白質は、蛋白質の精製に使用する慣用の方法、たとえば透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ゲルクロマトグラフィーおよび電気泳動により反応混合物から精製することができる。イオン交換クロマトグラフィーは、未反応ポリ（エチレングリコール）およびｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の除去にとりわけ効果的である。本発明の別の態様では、モノ‐およびジ‐ポリマー‐ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を反応混合物から分離して、高分子量種、および非修飾ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を除去する。分離は、バッファー溶液中にｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体‐ポリマーコンジュゲートを約０．５〜１０ｍｇ／ｍＬ含む混合種を加えることにより行う。適切な溶液は、約４〜約８までのｐＨを有する。溶液は好ましくはＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＮａＢＯ４、ＣＨ３ＣＯ２Ｈ、およびＮａＯＨから選択される１以上のバッファー塩を含む。
【００５６】
反応バッファーに依存して、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体ポリマーコンジュゲート溶液は初めにバッファー交換／限外濾過を行い、未反応のどんなポリマーも除去する必要がある。たとえば、ＰＥＧ‐ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体ポリマーコンジュゲートは、低分子量カットオフ（１０，０００〜３０，０００ダルトン）膜を通して限外濾過し、未反応のポリマー、界面活性剤などのような大部分の不要な物質を、もしそれらが存在すれば、除去することができる。
【００５７】
所望する種を含むプールへのコンジュゲートの分画は、好ましくはイオン交換クロマトグラフィー媒体を使用して行う。そのような媒体は、ある程度予言可能な様式で変化する荷電の差により、ＰＥＧ‐ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体ポリマーコンジュゲートを選択的に結合することができる。たとえば、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の表面荷電は、蛋白質表面上の利用可能な荷電基の数により決定する。これらの荷電基は、一般にポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの潜在的な結合部位として役立つ。したがって、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は別の種とは異なる荷電を有し、選択的に分離されることになる。
【００５８】
第４アミンまたはスルホプロピルレジンのような、強い極性アニオンまたはカチオン交換レジンがそれぞれ本発明の方法に使用される。イオン交換レジンがとりわけ好ましい。本発明の使用に適切な市販のカチオン交換レジンのリストには、ＳＰ−ｈｉｔｒａｐ（登録商標）、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）およびＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ｆａｓｔ  ｆｌｏｗが挙げられるが、それらに限定されない。他の適切なカチオン交換レジン、たとえばＳおよびＣＭレジンも使用することができる。本発明の使用に適切な、市販のアニオン交換レジンを含む、アニオン交換レジンのリストには、Ｑ−ｈｉｔｒａｐ（登録商標）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）およびＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ｆａｓｔ  ｆｌｏｗが挙げられるが、それらに限定されない。他の適切なアニオン交換レジン、たとえばＤＥＡＥレジンも使用することができる。
【００５９】
たとえば、アニオンまたはカチオン交換レジンは好ましくはカラムに充てんされ、慣用の手段により平衡化される。ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体に結合したポリマー溶液と同じｐＨおよび重量モル浸透圧濃度を有するバッファーが使用される。溶出バッファーは好ましくはＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＮａＢＯ４、および（ＮＨ４）２ＣＯ３から選択される１以上の塩を含む。その場合、コンジュゲートを含む溶液はカラムに吸着され、未反応ポリマーおよび高分子種は保持されない。負荷終了時に、塩濃度が漸増する溶出バッファーの勾配流をカラムに流し、ポリアルキレンオキシド‐結合ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の所望する画分を溶出する。溶出されたプール画分は、カチオンまたはアニオン交換分離手順後に、好ましくは均一なポリマーコンジュゲートに限定される。いずれの非結合ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体も慣用の技術によりカラムから洗浄して流し出すことができる。所望する場合は、モノおよび多重ペグ化ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体種は、付加的なイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに別々に分離することができる。
【００６０】
塩濃度およびｐＨが増大する、複数のアイソクラティック手順を利用した技術も使用することができる。濃度が増大する複数のアイソクラティック溶出手順は、ジ‐およびモノ‐ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体ポリマーコンジュゲートを逐次溶出させることになる。
【００６１】
溶出の温度範囲は、約４℃〜約２５℃の間である。好ましくは、溶出は約４℃〜約２２℃までで行われる。たとえば、ＰＥＧ‐ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体画分の溶出は、２８０ｎｍのＵＶ吸収により検出される。画分の回収は、単純な時間溶出特性によって行うことができる。
【００６２】
ポリ（エチレングリコール）ポリマーとｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体部分を結合させる手順において、界面活性剤を使用することができる。適切な界面活性剤には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のようなイオン型物質が挙げられる。他のイオン性界面活性剤、たとえばドデシル硫酸リチウム、４級アンモニウム化合物、タウロコール酸、カプリル酸、デカンスルホン酸なども使用できる。非イオン性界面活性剤も使用することができる。たとえば、ポリ（オキシエチレン）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎｓ）、ポリ（オキシエチレン）エーテル（Ｔｒｉｔｏｎｓ）を使用することができる。Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９２）Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐも参照されたい。本発明の方法において使用する界面活性剤に関するただ１つの制限は、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を実質的に不可逆的に変性させずに、ポリマー結合を完全に阻害しない条件下および濃度でそれらを使用することである。界面活性剤は約０．０１％〜０．５％；好ましくは０．０５％〜０．５％；そしてもっとも好ましくは約０．０７５％〜０．２５％の量で反応混合物中に存在する。界面活性剤の混合物も企図する。
【００６３】
界面活性剤は、ポリマー結合過程において一時的で、可逆的な保護系を提供すると考えられる。界面活性剤は、リシンを基礎にした、またはアミノ末端を基礎にした結合を進行させながら、ポリマー凝集を選択的に妨害することに効果的であることが示されている。
【００６４】
本発明のポリ（エチレングリコール）‐修飾ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体はより持続的な薬理学的作用を有し、かかる作用はおそらくｉｎ  ｖｉｖｏでの延長した半減期に起因すると考えることができる。
【００６５】
さらに、本発明のポリ（エチレングリコール）‐修飾ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は脳下垂体機能不全小人症（ＧＨＤ）、成人成長ホルモン欠乏症、ターナー症候群、胎内発育不全（ＳＧＡ）で生まれた子供における成長障害、Ｐｒａｄｅｒ‐Ｗｉｌｌｉ症候群（ＰＷＳ）、慢性腎機能不全症（ＣＲＩ）、ＡＩＤｓ衰弱、および加齢の治療に有用であってよい。
【００６６】
本発明のポリ（エチレングリコール）‐修飾ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は医薬品に製剤することが可能であり、それらを患者に投与するために、薬剤的に受容できる希釈剤、等張性溶液調製剤、ｐＨ調整剤などを含む。
【００６７】
上記の医薬品は、治療の目的に依存して、皮下、筋肉内、静脈内、肺、皮内、または経口的に投与することができる。また、投与量は治療される患者の疾患の種類および状態に基づき、通常成人に注射する場合は０．１ｍｇ〜５ｍｇ、そして経口投与の場合は０．１ｍｇ〜５０ｍｇであってよい。
【００６８】
また、含まれるポリマーは好ましくは室温で水溶性である。そのようなポリマーのリストには、ポリ（アルキレンオキシド）ホモポリマー、たとえばポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）、ポリ（オキシエチレン化ポリオール）、それらの共重合体、およびブロック共重合体の水溶性が維持される場合はそれらのブロック共重合体が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６９】
ＰＥＧを基礎にしたポリマーの代わりとしては、効果的な非抗原性物質、たとえばデキストラン、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ビニルアルコール）、糖質を基礎にしたポリマーなどを使用することができる。実際、これらのポリマーのα‐およびω‐末端基の活性化は、ポリ（アルキレンオキシド）を変換させるために使用する様式と類似した様式で行うことが可能であり、したがって当業者には明白であろう。
当業者は上記のリストが単に説明のためであり、本明細書に記載の特性を有するすべてのポリマーを企図することを理解するであろう。本発明の目的では、“効果的に非抗原性である”とは、哺乳動物に毒性でなく、明らかな免疫反応を引き起こさないとして当技術分野で理解されているすべての物質を意味する。
【００７０】
定義
以下は、本明細書で互換性のある略語およびそれに対応する意味のリストである：
ｇ              ｇｒａｍ（ｓ）  グラム
ｍｇ            ｍｉｌｌｉｇｒａｍ（ｓ）  ミリグラム
ｍｌまたはｍＬ  ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒ（ｓ）  ミリリットル
ＲＴ            ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  室温
ＰＥＧ          ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ポリ（エチレングリコール）
本開示に引用されたすべての公開公報、特許、および特許出願は、それぞれ個々の公開公報、特許、または特許出願がまるで明確にそして、個々に参照として援用されることを示しているように、そのまま本明細書に参照として援用する。
【００７１】
本発明は明確に理解できるように、説明および実施例によりかなり詳細に記載されているが、本発明の意図および範囲から逸脱せずに変更および修飾を行えることは本発明の教示の観点から当業者には容易に明白であろう。以下の実施例は例示の目的のためだけに提供され、先に適用範囲の広い表現で記載されている本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００７２】
以下の実施例において、ｈＧＨはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１である。ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のポリペプチドファミリーの他のメンバーも、以下の実施例で例示された様式と類似の様式でペグ化することができると理解すべきである。
【００７３】
本明細書に引用されたすべての参考文献、特許または特許出願はまるで本明細書に記載されたように、それらをそのまま参照として援用する。
本発明は以下の実施例を参照することによりさらに説明されることになるが、それらは本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例１】
【００７４】
直鎖２０，０００ＭＷ  ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ
【００７５】
【化１】
2006321808.tif 000002
【００７６】
本実施例は、還元アルキル化による実質的に均質なＮ−末端モノペグ化ｈＧＨの製剤作製のための方法である。Ｎ−末端の第１アミンの相対的ｐＫａ値対リシン残基のε‐アミノ位の第１アミンのｐＫａ値の差を利用して、約２０，０００ＭＷのメトキシ‐直鎖ＰＥＧ‐プロピオンアルデヒド試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．）を還元アミノ化により、ｈＧＨのＮ−末端に選択的に結合した。２５ｍＭ  ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ７．０、または１０ｍＭ  酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ４．５に溶かして１０ｍｇ／ｍＬとしたｈＧＨ蛋白質を、メトキシ‐ＰＥＧ‐プロピオンアルデヒド、Ｍ−ＰＥＧ−ＡＬＤ、（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）の添加によりＭ−ＰＥＧ−ＡＬＤと反応させ、１アミンにつき０．１：０．７の相対的ＰＥＧ：ｈＧＨモル比を得た（場合により８％アセトニトリルを添加してもよい）。反応は、保存した１ＭのＮａＣＮＢＨ４（（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をＨ２Ｏに溶かして最終濃度１０〜５０ｍＭしたものを添加することにより触媒した。反応は、暗所で、４℃からＲＴにおいて１８〜２４時間行った。反応は、最終Ｔｒｉｓ濃度が５０ｍＭになるまで１Ｍ  Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、約ｐＨ７．６を添加することにより停止するか、または直接の精製のために適切なバッファーで希釈した。
【実施例２】
【００７７】
直鎖３０，０００ＭＷ  ＰＥＧ−ＡＬＤ  ｈＧＨ
実施例１に記載の手順を使用して、メトキシ直鎖３０，０００ＭＷ  ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ）をｈＧＨのＮ−末端に結合した。
【実施例３】
【００７８】
直鎖５，０００ＭＷ  ＰＥＧ−ＡＬＤ  ｈＧＨ
実施例１に記載の手順を使用して、メトキシ直鎖５，０００ＭＷ  ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド試薬（Ｆｌｕｃａ）をｈＧＨのＮ−末端に結合した。
【実施例４】
【００７９】
分枝鎖４０，０００ＭＷ  ＰＥＧ−ＡＬＤ  ｈＧＨ
【００８０】
【化２】
2006321808.tif 000003
【００８１】
実施例１に記載の手順を使用して、メトキシ分枝４０，０００ＭＷ  ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＥＧ２−ＡＬＤ）試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ）をｈＧＨのＮ−末端に結合した。
【実施例５】
【００８２】
分枝鎖２０，０００ＭＷ  ＰＥＧ−ＡＬＤ  ｈＧＨ
アミンにつきＰＥＧ対ｈＧＨのモル比０．１〜０．５を使用し、実施例１に記載の手順を使用して、メトキシ分枝２０，０００ＭＷ  ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＥＧ２−ＡＬＤ）試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ）をｈＧＨのＮ−末端に結合した。
【実施例６】
【００８３】
直鎖３０，０００ＭＷ  ＳＰＡ―ＰＥＧ  ｈＧＨ
【００８４】
【化３】
2006321808.tif 000004
【００８５】
この実施例はＮ−ヒドロキシスクシニミジル（ＮＨＳ）活性エステルを使用して、実質的に均質のモノペグ化ｈＧＨ製剤を作製する方法を示す。ｈＧＨ蛋白質保存溶液は０．２５Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．２に溶解して１０ｍｇ／ｍＬとした（場合により８％アセトニトリルを添加してもよい）。次に溶液をメトキシ‐ＰＥＧ‐スクシニミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）の添加によりＳＰＡ―ＰＥＧと反応させ、アミンにつき０．１：０．６５の相対的ＰＥＧ：ｈＧＨモル比を得た。反応は、４℃からＲＴにおいて５分から１時間行った。反応は０．１Ｎ  酢酸でｐＨを４．０に低下させるか、または５Ｘモル過剰のＴｒｉｓ  ＨＣｌの添加により停止した。
【実施例７】
【００８６】
直鎖２０，０００ＭＷ  ＳＰＡ―ＰＥＧ  ｈＧＨ
実施例６に記載の手順を使用して、直鎖２０，０００ＭＷ  ＳＰＡ―ＰＥＧ  ＰＥＧ試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．）をｈＧＨのＮ−末端に結合した。
【実施例８】
【００８７】
直鎖３，４００ＭＷ  ビオチン−ＳＰＡ―ＰＥＧ−ｈＧＨ
【００８８】
【化４】
2006321808.tif 000005
【００８９】
実施例６に記載の手順を使用して、３，４００ＭＷ  ビオチン−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＮＨＳ試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．）をｈＧＨに結合させる。
【実施例９】
【００９０】
分枝１０，０００ＭＷ  ＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨ
【００９１】
【化５】
2006321808.tif 000006
【００９２】
実施例６に記載の手順を使用して、１０，０００ＭＷ分枝ＰＥＧ２−ＮＨＳ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．）をｈＧＨに結合させる。
【実施例１０】
【００９３】
分枝２０，０００ＭＷ  ＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨ
実施例６に記載の手順を使用して、２０，０００ＭＷ分枝ＰＥＧ２−ＮＨＳ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．）をｈＧＨに結合させる。
【実施例１１】
【００９４】
分枝４０，０００ＭＷ  ＮＨＳ−ＰＥＧ−ｈＧＨ
実施例６に記載の手順を使用して、４０，０００ＭＷ分枝ＰＥＧ２−ＮＨＳ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．）をｈＧＨに結合した。
【実施例１２】
【００９５】
直鎖２０，０００ＭＷ  ＰＥＧ−ＢＴＣ−ｈＧＨ
【００９６】
【化６】
2006321808.tif 000007
【００９７】
実施例６に記載の手順を使用して、２０，０００ＭＷ  ＰＥＧ−ＢＴＣ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．）をｈＧＨに結合させる。この実施例は、ＰＥＧのベンゾトリアゾールカーボネート誘導体を使用して、実質的に均質なペグ化ｈＧＨ製剤を作製するための方法を示す。
【実施例１３】
【００９８】
直鎖５，０００ＭＷ  ＰＥＧ−ＳＳ−ｈＧＨ
【００９９】
【化７】
2006321808.tif 000008
【０１００】
実施例６に記載の手順を使用して、５，０００ＭＷ  スクシニミジルスクシネート−ＰＥＧ（ＳＳ−ＰＥＧ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．）をｈＧＨに結合させる。この実施例は、加水分解性結合を使用して、実質的に均質なペグ化ｈＧＨ製剤を作製するための方法を示す。
【実施例１４】
【０１０１】
直鎖２０，０００ＭＷ  ＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ｈＧＨ
【０１０２】
【化８】
2006321808.tif 000009
【０１０３】
実施例６に記載の手順を使用して、２０，０００ＭＷ  カルボキシメチル−ヒドロキシ酪酸−ＰＥＧ（ＣＭ−ＨＢＡ−ＰＥＧ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．）をｈＧＨに結合した。この実施例は、加水分解性結合を使用して、実質的に均質なペグ化ｈＧＨ製剤を作製するための方法を示す。
【実施例１５】
【０１０４】
直鎖２〜４ｘ５，０００ＭＷ  ＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ｈＧＨ
実施例１３に記載の手順を使用して、５，０００ＭＷ  ＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．）をｈＧＨに結合した。
【実施例１６】
【０１０５】
直鎖２０，０００ＭＷ  ＨＺ−ＰＥＧ  ｈＧＨ
【０１０６】
【化９】
2006321808.tif 000010
【０１０７】
この実施例は２０，０００ＭＷ  メトキシ−ＰＥＧ−ヒドラジド、ＨＺ−ＰＥＧ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．）を使用して、実質的に均質なペグ化ｈＧＨ製剤を作製するための方法を示す。ｈＧＨ蛋白質保存溶液は１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ４．０に溶解して１０ｍｇ／ｍＬとした。次に溶液を固体の添加によりＨＺ−ＰＥＧと反応させ、カルボキシル基につき、相対的ＰＥＧ：ｈＧＨモル比０．１〜５．０を得た。反応は最終濃度２ｍＭ〜４ｍＭのカルボジイミド（ＥＤＣ、ＥＯＡＣ、ＥＤＥＣ）で触媒した。反応は４℃で２時間から一晩、または室温で１０分から一晩行った。反応は非結合ＰＥＧとカルボジイミドをカチオン交換による精製により除去することにより停止した。
【実施例１７】
【０１０８】
多重ペグ化種
２以上の結合したＰＥＧを有する（多重ペグ化）修飾ＰＥＧも実施例１および４から得られ、アニオン交換クロマトグラフィーを使用してモノ‐ペグ化種から分離した。また、２以上の結合したＰＥＧを有する（多重ペグ化）修飾ＰＥＧはカチオン交換クロマトグラフィーを使用してモノ‐ペグ化種から分離する。さらに、２以上の結合したＰＥＧを有する（多重ペグ化）修飾ＰＥＧが実施例２、３、５〜１３で得られ、実施例１および４と同様の様式で精製する。
【実施例１８】
【０１０９】
ペグ化ｈＧＨ種は一回のイオン交換クロマトグラフィー工程を使用して、反応混合物から＞９５％（ＳＥＣ分析）に精製した。
アニオン交換クロマトグラフィー
ＰＥＧ  ｈＧＨ種は一回のアニオン交換クロマトグラフィー工程を使用して、反応混合物から＞９５％（ＳＥＣ分析）に精製した。モノ‐ペグ化ｈＧＨは、非修飾ｈＧＨおよび多重ペグ化ｈＧＨ種からアニオン交換クロマトグラフィーを使用して精製した。先に記載の代表的２０Ｋ  アルデヒドｈＧＨ反応混合物（５〜１００ｍｇ蛋白質）は２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３（バッファーＡ）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｔｒａｐカラム（１または５ｍＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）またはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗカラム（２６／２０、７０ｍＬ  ベッド容積）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上で精製した。反応混合物はバッファーＡで５〜１０倍に希釈し、流速２．５ｍＬ／分でカラムに流した。カラムは、カラム容積の８倍のバッファーＡで洗浄した。次にカラム容積の８０〜１００倍のバッファーＡおよび０〜１００ｍＭの直線ＮａＣｌ勾配で各種ｈＧＨ種をカラムから溶出させた。溶離液は２８０ｎｍ（Ａ２８０）における吸光度でモニターし、５ｍＬ画分を集めた。画分は、ペグ化の程度、たとえば（実施例１５で評価したように）、モノ、ジ、トリなどに応じてプールした。プールはその後Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ１０濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）で０．５〜５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。この手順により精製したモノ２０Ｋ  ＰＥＧ−アルデヒド  ｈＧＨの総収率は２５〜３０％であった。
【０１１０】
カチオン交換クロマトグラフィー
カチオン交換クロマトグラフィーは、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ４．０（バッファーＢ）で平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高速カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＸＫ  ２６／２０，７０ｍＬ  ベッド容積）上で行う。反応混合物はバッファーＢで１０倍に希釈し、流速５ｍＬ／分でカラムに流す。次に、カラムをカラム容積の５倍のバッファーＢ、続いてカラム容積の５倍の１２％バッファーＣ（１０ｍＭ  酢酸  ｐＨ４．５、１Ｍ  ＮａＣｌ）で洗浄する。次にカラム容積の２０倍の１２％〜２７％バッファーＣの直線勾配でＰＥＧ−ｈＧＨ種を溶出する。溶離液は２８０ｎｍでモニターし、１０ｍＬ画分を集める。画分はペグ化の程度（モノ、ジ、トリなど）に応じてプールし、１０ｍＭ  酢酸  ｐＨ４．５バッファーに交換し、Ａｍｉｃｏｎ  ＹＭ１０膜のついた撹拌セル中で１〜５ｍｇ／ｍＬに濃縮する。プールの蛋白質濃度は吸光係数０．７８を使用してＡ２８０ｎｍで測定する。この手順から得られたモノペグ化ｈＧＨの総収率は１０〜５０％である。
【実施例１９】
【０１１１】
生化学的性決定
精製したペグ化ｈＧＨプールは、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非変性および変性サイズ排除クロマトグラフィー、分析アニオン交換クロマトグラフィー、Ｎ−末端シークエンシング、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および逆相ＨＰＬＣにより性状を決定した。
【０１１２】
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣ
非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用して、各種結合化学、サイズ、リンカー、および形状のメトキシ‐ＰＥＧとｈＧＨとの反応物、アニオン交換精製物プールおよび最終精製産物を評価した。分析非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、Ｔｏｓｏｈａａｓ  Ｇ４０００ＰＷＸＬカラム、７．８ｍｍＸ３０ｃｍ、（Ｔｏｓｏｈａａｓ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＬ）またはＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＬ）を使用して、２０ｍＭ  リン酸  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中、流速０．５ｍＬ／分で行った。ペグ化は蛋白質の流体力学的容積を非常に増し、より早い保持時間の方にシフトする。新しい種は非修飾ｈＧＨと共にＰＥＧ  アルデヒド  ｈＧＨ反応混合物中に観察された。これらのペグ化および非ペグ化種はＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー上で分離し、得られた精製モノＰＥＧ−アルデヒド  ｈＧＨ種はその後非変性ＳＥＣ上の単一ピークとして溶出することが示された（＞９５％純度）。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー手順はモノ‐ペグ化ｈＧＨから遊離ＰＥＧ、ｈＧＨ、および多重ペグ化ｈＧＨ種を効率的に除去した。非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、各種ペグ化ｈＧＨの効果的なサイズがそれらのそれぞれの理論的分子量よりかなり大きいことを示した（表１）。
【０１１３】
【表１】
2006321808.tif 000011
【０１１４】
変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣ
変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用して、各種メトキシ‐ＰＥＧとｈＧＨとの反応物、アニオン交換精製物、および最終精製産物を評価した。分析変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣはＴｏｓｏｈａａｓ  ３０００ＳＷＸＬカラム、７．８ｍｍｘ３０ｃｍ、（Ｔｏｓｏｈａａｓ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＬ）を使用して１００ｍＭ  リン酸ｐＨ６．８、０．１％  ＳＤＳ中、流速０．８ｍＬ／分で行った。ペグ化は蛋白質の流体力学的容積を非常に増し、より早い保持時間の方にシフトする。新しい種は非修飾ｈＧＨと共に２０Ｋ  ＰＥＧ  アルデヒド  ｈＧＨ反応混合物中に観察された。これらのペグ化および非ペグ化種はＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー上で分離し、得られた精製モノ２０Ｋ  ＰＥＧ−アルデヒド  ｈＧＨはその後変性ＳＥＣ上の単一ピークとして溶出することが示された（＞９５％純度）。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー手順はモノ‐ペグ化ｈＧＨから遊離ＰＥＧ、ｈＧＨ、および多重ペグ化ｈＧＨ種を効率的に除去した。
【０１１５】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ／ＰＶＤＦ転写
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、各種ＰＥＧ試薬とｈＧＨとの反応物、および最終精製産物を評価した。この技術の例としてはモノ２０Ｋ  直鎖ならびに分枝２０Ｋおよび４０Ｋ  ＰＥＧ  アルデヒド、および４Ｘ６  ５Ｋ  ＳＰＡ  ＰＥＧについて示す（図１＆２）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは還元および非還元条件下、厚さ１ｍｍの１０〜２０％Ｔｒｉｓトリシンゲル上で行い、Ｎｏｖｅｘ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）Ｇ−２５０染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して染色した。精製したモノＰＥＧ−アルデヒド  ｈＧＨ種はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で１つの主要バンドとして移動する。バンドはＰＶＤＦ膜上にブロットし、その後Ｎ−末端配列決定を行った。
【０１１６】
分析アニオン交換ＨＰＬＣ
分析アニオン交換ＨＰＬＣを使用して、各種ｍＰＥＧとｈＧＨとの反応物、アニオン交換精製画分および最終精製産物を評価した。分析アニオン交換ＨＰＬＣは、Ｔｏｓｏｈａａｓ  Ｑ５ＰＷまたはＤＥＡＥ−ＰＷアニオン交換カラム、７．５ｍｍｘ７５ｍｍ、（Ｔｏｓｏｈａａｓ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＬ）を使用して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐｈ８．６中、流速１ｍＬ／分で行った。試料は５〜２００ｍＭ  ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。
【０１１７】
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
ＰＥＧ−ＧＨ反応混合物および精製したペグ化産物はＲＰ  ＨＰＬＣを使用して分析し、ｈＧＨ種、モノおよび多重ペグ化ｈＧＨ種を評価し、そして酸化ｈＧＨ型、および異なる部位（たとえばＮ−末端対リシンε‐アミノ基）に結合した単一ＰＥＧを有するＰＥＧ  ｈＧＨイソ型をモニターした。ＲＰ−ＨＰＬＣはＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−ＣＮ  １５０または２５０ｍｍｘ４．６ｍｍ（３．５ｍｍまたは５ｍｍ）逆相ＨＰＬＣカラムを使用して行った。実験は周囲温度で、試料につき標準的な１０ｍｇ蛋白質負荷で行った。バッファーＡは水中０．１％トリフルオロ酢酸であり；バッファーＢはアセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸である。１分につきＢに１／２％増加を生じるグラジエントは以下のとおりである：
【０１１８】
【表２】
2006321808.tif 000012
【０１１９】
Ｎ−末端配列およびペプチドマッピング
自動Ｅｄｍａｎ分解化学を使用して、ＮＨ２−末端蛋白質配列を決定した。分解には、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４９４  Ｐｒｏｃｉｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）を使用した。それぞれのＰＴＨ−ＡＡ誘導体は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ｂｒｏｗｎｌｅｅ  ２．１ｍｍ  ｉ．ｄ．ＰＴＨ−Ｃ１８カラムが付いたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  １４０Ｃ  ＰＴＨ  ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、オンライン様式でＲＰ−ＨＰＬＣ分析により同定した。ＰＶＤＦ膜に転写した２０Ｋ  直鎖ならびに２０および４０Ｋ分枝ＰＥＧ−ＡＬＤ  ｈＧＨ蛋白質バンド、または精製した２０Ｋ直鎖ならびに分枝２０および４０Ｋ  ＰＥＧ−ＡＬＤ  ｈＧＨの溶液を配列決定した。主要シグナル（約８８％収率）を生じる精製した２０Ｋ直鎖ＰＥＧ−ｈＧＨが観察され、それはＮ−末端アミノ酸がないことを除いてｈＧＨに予想された配列を有した。この結果はアルデヒド化学により蛋白質のＮ−末端がペグ化されたものに予想されたものと同じである。初めのサイクルの残留物は結合したＰＥＧ部分のために回収不能である。主要でないシグナル（約１２％  収率）は正しいＮ−末端配列を有した。ＲＰ−ＨＰＬＣから集めたピークが１００％ペグ化されていることを考慮すると、これらのデータはＰＥＧ修飾の約８８％はＮ−末端であり、残りは明らかにいくつかの可能性のあるリシン残基の１つに結合していることを示唆する。
【０１２０】
トリプシン消化は濃度１ｍｇ／ｍＬで行い、一般に消化ごとに材料５０ｕｇを使用する。トリプシン対ＰＥＧ−ｈＧＨ比が１：３０（ｗ／ｗ）になるようにトリプシン消化を行った。Ｔｒｉｓバッファーは３０ｍＭ、ｐＨ７．５で存在した。試料は室温で１６±０．５時間インキュベートした。反応は消化液１ｍＬにつき１Ｎ  ＨＣｌを５０μＬ添加することにより停止した。オートサンプラーに試料を入れる前に、６．２５％  アセトニトリル中で最終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌになるように試料を希釈した。初めにアセトニトリル（１９．８％  アセトニトリルに）を添加して、穏やかに混合し、次に最終容積（出発容積の４倍）まで水を添加する。余分の消化液は取り除き、−２０℃で１週間まで保存することができる。
【０１２１】
Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５  ＨＰＬＣ系を分析に使用したが、他の系でも同様の結果が生じるはずである。使用したカラムは５μｍ粒子のＡｓｔｅｃ  Ｃ−４高分子２５ｃｍｘ４．６ｍｍカラムであった。実験は周囲温度で、試料につき蛋白質５０μｇの標準的な負荷で行った。バッファーＡは水中０．１％トリフルオロ酢酸であり；バッファーＢはアセトニトリル中０．０８５％トリフルオロ酢酸である。グラジエントは以下のとおりである：
【０１２２】
【表３】
2006321808.tif 000013
【０１２３】
カラムはヒートジャケットを使用して４０℃に加熱する。２１０および３００ｎｍ間のデータを集め、ピークはＷａｔｅｒｓ  ９９６  ＰＤＡ検出器を使用して検出し、２１０〜３００ｎｍ間のデータを集めた。表２に示すように、２１４ｎｍで抽出したクロマトグラムを試料分析に使用し、ｎ−末端ペグ化（Ｔ−１フラグメントの損失）の程度を測定した。
【０１２４】
【表４】
2006321808.tif 000014
【実施例２０】
【０１２５】
薬力学的検討
脳下垂体切除ラットにおける有効性試験
Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｓで脳下垂体切除した雌Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットは７〜１０日間、成長速度をプレスクリーニングした。その後成長試験を１１日間行った。ラットは６〜８の群に分割した。１群は毎日か、または０日目と６日目にベヒクルを皮下投与したラットからなっていた。２群には、ＧＨ（０．３ｍｇ／ｋｇ／投与）を毎日皮下投与した。３群には０日目と６日目にＧＨ（１．８ｍｇ／ｋｇ／投与）を皮下投与した。４群には０日目と６日目にＰＥＧ−ＧＨ（１．８ｍｇ／ｋｇ／投与）を皮下投与した。脳下垂体切除ラットは試験中、少なくとも１日おきに体重を測定することにより体重増加をモニターした。週に１度投与した２０Ｋ  ＰＥＧ−ＡＬＤ  ｈＧＨ、２０Ｋおよび４０Ｋ  分枝ＰＥＧ−ＡＬＤ  ｈＧＨ、および４〜６ｘ５ＰＥＧ−ＳＰＡ  ｈＧＨに対する体重増加（平均＋／−ＳＥＭ）はｈＧＨの毎日投与に対するものと同様であった（図３＆４）。表３は、各種ペグ化ｈＧＨ分子の毎日投与に比べたｈＧＨの週１回投与に対する１１日目の総体重増加（平均±ＳＥＭ）を比較したものを要約する。
【０１２６】
【表５】
2006321808.tif 000015
【０１２７】
それぞれの成長試験終了後、動物を死に至らせ、骨（脛骨）長を分析した。図６は０日目と６日目に投与した各種ＰＥＧ−ＧＨコンジュゲート、または毎日投与したｈＧＨに対する反応における１１日目の脛骨長（平均＋／−ＳＥＭ）の変化を示す。
【０１２８】
脳下垂体切除ラットにおけるＩＧＦ−１レベル
実験は上記の体重増加試験と同じように行ったが、血液試料は０、１、２、３、４、５日目および９日目の動物の致死時に採取した。ＩＧＦ−１レベルはＥＬＩＳＡにより測定した。図７は、ｈＧＨの毎日投与またはｈＧＨの単回投与またはペグ化ｈＧＨの０、６日目投与のいずれかの後の血清中ＩＧＦ−１レベル（平均＋／−ＳＥＭ）の上昇を比較する。
【０１２９】
薬力学的試験
薬力学的試験は正常なＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット、マウス、およびカニクイザルで行った。１群につき６匹のラットおよび６０匹までのマウスを使用し、ラットおよびマウスにおけるＧＨまたはＰＥＧ−ＧＨの１．８ｍｇ／ｋｇの単回ボーラス投与、または１．０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与として注射を行った。カニクイザルでは、１群につき２〜４頭のサルを使用し、単回皮下ボーラス投与および静脈内投与の両方に対して０．１８ｍｇ／ｋｇのＧＨまたはＰＥＧ−ＧＨ投与量を使用した。血液試料は、適切なＰＫパラメータの評価のために１〜５日目まで適宜採取した（表４）。（ｔ１／２）＝末期半減期（terminal halftime）、（Ｃｌ）＝クリアランス、（Ｔｍａｘ）＝最大濃度までの時間、Ｖｓｓ＝定常状態における（みかけの）容積分布、および（Ｃｍａｘ）＝最大濃度ＧＨおよびＰＥＧ−ＧＨ血中レベルは、イムノアッセイを使用してそれぞれの採取毎にモニターした。
【０１３０】
ｈＧＨイムノアッセイ
ラット、マウス、およびカニクイザル血漿中のｈＧＨおよびペグ化ｈＧＨ蛋白質濃度レベルは、ｈＧＨ  ＡｕｔｏＤＥＬＦＩＡ  ｋｉｔ蛍光イムノアッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、標準曲線を作製するために適切なＰＥＧ  ｈＧＨを使用して測定した。
【０１３１】
【表６】
2006321808.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】ｈＧＨおよび２０Ｋ  ＰＥＧ‐ＡＬＤおよびアニオン交換精製２０Ｋ  ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨの反応生成物の還元および非還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析の複写物である。レーン１．ＭＷ蛋白質標準物質；レーン２．還元ｈＧＨ‐１０μｇ；レーン３．還元２０Ｋ  直鎖ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ反応混合物‐１０μｇ；レーン４．還元アニオン交換精製２０Ｋ  直鎖ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ‐１０μｇ；レーン５．ブランク；レーン６．非還元ｈＧＨ‐１０μｇ；レーン７．非還元２０Ｋ  直鎖ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ反応混合物‐１０μｇ；レーン８．非還元アニオン交換精製２０Ｋ直鎖ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ‐１０μｇ；レーン９．ブランク；レーン１０．ＭＷ蛋白質標準物質
【図２】各種アニオン交換精製ペグ化ｈＧＨ分子の非還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析の複写物である。レーン１．ＭＷ蛋白質標準物質；レーン２．ｈＧＨ‐１０μｇ；レーン２．４〜６ｘ５Ｋ  ＰＥＧ‐ＳＰＡ  ｈＧＨ‐１０μｇ；レーン３．２０Ｋ  直鎖ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ‐１０μｇ；レーン４．２０Ｋ  分枝ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ‐１０μｇ；レーン５．４０Ｋ  分枝ＰＥＧ  ｈＧＨ‐１０μｇ。
【図３】ｈＧＨ、４０Ｋ  Ｂｒ  ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨおよび４０Ｋ  Ｂｒ  ＰＥＧ‐ＮＨＳ  ｈＧＨのトリプシン消化物のＲＰ‐ＨＰＬＣ溶出特性の複写物である。ｈＧＨのＮ末端に主に結合したＰＥＧ（４０Ｋ  Ｂｒ  ＡＬＤ  ｈＧＨに示される）はＮ末端（Ｔ１）フラグメントピークが減少し、新規ペグ化Ｔ１ピークが生じる
【図４】脳下垂体切除ラットの１１日間の体重増加を示すことにより、毎日投与した（０．３ｍｇ／ｋｇ／日）非ペグ化ｈＧＨのｉｎ  ｖｉｖｏ生理活性と６日毎に１回皮下（ＳＣ）投与したモノペグ化ｈＧＨを比較する。
【図５】脳下垂体切除ラットの１１日間の体重増加を示すことにより、毎日皮下（ＳＣ）投与した（０．３ｍｇ／ｋｇ／日）非ペグ化ｈＧＨのｉｎ  ｖｉｖｏ生理活性と、それぞれ６日に１回ＳＣ投与した、４〜６ｘ５Ｋ  ＰＥＧ‐ＳＰＡ‐ｈＧＨ、モノ‐ペグ化２０Ｋ  分枝ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ、モノ‐ペグ化４０Ｋ  分枝ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨを比較する。
【図６】脳下垂体切除ラットの１１日間の頸骨成長の増大を示すことにより、毎日ＳＣ投与された（０．３ｍｇ／ｋｇ／日）非ペグ化ｈＧＨのｉｎ  ｖｉｖｏ生理活性と、それぞれ６日に１回ＳＣ投与した、４〜６ｘ５Ｋ  ＰＥＧ‐ＣＭＨＢＡ‐ｈＧＨ、モノ‐ペグ化２０Ｋ  直鎖ＡＬＤ、モノ‐ペグ化３０Ｋ  直鎖ＡＬＤ、モノ‐ペグ化２０Ｋ  分枝ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ、およびモノ‐ペグ化４０Ｋ  分枝ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨを比較する。
【図７】脳下垂体切除ラットの９日間の血漿中ＩＧＦ‐１レベルの増大を示すことにより、１．８ｍｇ／ｋｇを単回ＳＣ投与した非ペグ化ｈＧＨ、モノ‐ペグ化５Ｋ  直鎖ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ、モノ‐ペグ化２０Ｋ  直鎖ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ、モノ‐ペグ化２０Ｋ  分枝ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ、モノ‐ペグ化２０Ｋ  直鎖ＰＥＧ‐ヒドラジド  ｈＧＨ、モノ‐ペグ化３０Ｋ  直鎖ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ、モノ‐ペグ化４０Ｋ  分枝ＰＥＧ−ＡＬＤ  ｈＧＨ、４〜６ｘ５Ｋ  ＰＥＧ  ＳＰＡ  ｈＧＨ、４〜６ｘ５Ｋ  ＰＥＧ‐ＣＭＨＢＡ‐ｈＧＨのｉｎ  ｖｉｖｏ生理活性を比較する。
【図３】
2006321808.tif 000017
【図４】
2006321808.tif 000018
【図５】
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【図６】
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【図７】
2006321808.tif 000021
【図８】
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【図１】
2006321808.tif 000023
【図２】
2006321808.tif 000024
【配列表】
2006321808000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月3日(2006.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
【図１】ｈＧＨおよび２０Ｋ  ＰＥＧ‐ＡＬＤおよびアニオン交換精製２０Ｋ  ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨの反応生成物の還元および非還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析の複写物である。レーン１．ＭＷ蛋白質標準物質；レーン２．還元ｈＧＨ‐１０μｇ；レーン３．還元２０Ｋ  直鎖ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ反応混合物‐１０μｇ；レーン４．還元アニオン交換精製２０Ｋ  直鎖ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ‐１０μｇ；レーン５．ブランク；レーン６．非還元ｈＧＨ‐１０μｇ；レーン７．非還元２０Ｋ  直鎖ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ反応混合物‐１０μｇ；レーン８．非還元アニオン交換精製２０Ｋ直鎖ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ‐１０μｇ；レーン９．ブランク；レーン１０．ＭＷ蛋白質標準物質
【図２】各種アニオン交換精製ペグ化ｈＧＨ分子の非還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析の複写物である。レーン１．ＭＷ蛋白質標準物質；レーン２．ｈＧＨ‐１０μｇ；レーン２．４〜６ｘ５Ｋ  ＰＥＧ‐ＳＰＡ  ｈＧＨ‐１０μｇ；レーン３．２０Ｋ  直鎖ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ‐１０μｇ；レーン４．２０Ｋ  分枝ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ‐１０μｇ；レーン５．４０Ｋ  分枝ＰＥＧ  ｈＧＨ‐１０μｇ。
【図３】ｈＧＨ、４０Ｋ  Ｂｒ  ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨおよび４０Ｋ  Ｂｒ  ＰＥＧ‐ＮＨＳ  ｈＧＨのトリプシン消化物のＲＰ‐ＨＰＬＣ溶出特性の複写物である。ｈＧＨのＮ末端に主に結合したＰＥＧ（４０Ｋ  Ｂｒ  ＡＬＤ  ｈＧＨに示される）はＮ末端（Ｔ１）フラグメントピークが減少し、新規ペグ化Ｔ１ピークが生じる
【図４】脳下垂体切除ラットの１１日間の体重増加を示すことにより、毎日投与した（０．３ｍｇ／ｋｇ／日）非ペグ化ｈＧＨのｉｎ  ｖｉｖｏ生理活性と６日毎に１回皮下（ＳＣ）投与したモノペグ化ｈＧＨを比較する。
【図５】脳下垂体切除ラットの１１日間の体重増加を示すことにより、毎日皮下（ＳＣ）投与した（０．３ｍｇ／ｋｇ／日）非ペグ化ｈＧＨのｉｎ  ｖｉｖｏ生理活性と、それぞれ６日に１回ＳＣ投与した、４〜６ｘ５Ｋ  ＰＥＧ‐ＳＰＡ‐ｈＧＨ、モノ‐ペグ化２０Ｋ  分枝ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ、モノ‐ペグ化４０Ｋ  分枝ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨを比較する。
【図６】脳下垂体切除ラットの１１日間の頸骨成長の増大を示すことにより、毎日ＳＣ投与された（０．３ｍｇ／ｋｇ／日）非ペグ化ｈＧＨのｉｎ  ｖｉｖｏ生理活性と、それぞれ６日に１回ＳＣ投与した、４〜６ｘ５Ｋ  ＰＥＧ‐ＣＭＨＢＡ‐ｈＧＨ、モノ‐ペグ化２０Ｋ  直鎖ＡＬＤ、モノ‐ペグ化３０Ｋ  直鎖ＡＬＤ、モノ‐ペグ化２０Ｋ  分枝ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ、およびモノ‐ペグ化４０Ｋ  分枝ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨを比較する。
【図７】脳下垂体切除ラットの９日間の血漿中ＩＧＦ‐１レベルの増大を示すことにより、１．８ｍｇ／ｋｇを単回ＳＣ投与した非ペグ化ｈＧＨ、モノ‐ペグ化５Ｋ  直鎖ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ、モノ‐ペグ化２０Ｋ  直鎖ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ、モノ‐ペグ化２０Ｋ  分枝ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ、モノ‐ペグ化２０Ｋ  直鎖ＰＥＧ‐ヒドラジド  ｈＧＨ、モノ‐ペグ化３０Ｋ  直鎖ＰＥＧ‐ＡＬＤ  ｈＧＨ、モノ‐ペグ化４０Ｋ  分枝ＰＥＧ−ＡＬＤ  ｈＧＨ、４〜６ｘ５Ｋ  ＰＥＧ  ＳＰＡ  ｈＧＨ、４〜６ｘ５Ｋ  ＰＥＧ‐ＣＭＨＢＡ‐ｈＧＨのｉｎ  ｖｉｖｏ生理活性を比較する。
【図８】薬力学的試験の結果である。