(57)【要約】【課題】  パクリタキセルの投与前に薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ８の代謝能に関連する遺伝子多型を検出し、個々の患者に応じた量のパクリタキセルを投与することで、その副作用を避けることを可能とするプライマーセット、プローブ及びそれらを含む検査薬、並びに検査方法を提供する。【解決手段】  本発明に係る、プライマーセット、プローブ及びそれらを含む検査薬、並びに検査方法により、薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ８の代謝能に関連する遺伝子多型を検出できる。検出された遺伝子多型をもとに薬物代謝異常の判定を行った上で、個々の患者のＣＹＰ２Ｃ８代謝活性に応じた量のパクリタキセルを投与することにより、パクリタキセルの副作用を避けることが可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の多型を検出するプライマーセットであって、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上の第５５６番目を含む領域に対応するＤＮＡを増幅させることを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
前記ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の多型が一塩基多型である請求項１記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記一塩基多型が、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上の第５５６番目の塩基シトシン（Ｃ）が、チミン（Ｔ）又はグアニン（Ｇ）に変異しているものである請求項２記載のプライマーセット。
【請求項４】
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の多型が、ＣＹＰ２Ｃ８の第１８６番目のアミノ酸変異をもたらすものである請求項１乃至３いずれか記載のプライマーセット。
【請求項５】
配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーと、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーとを含む、請求項１乃至４いずれか記載のプライマーセット。
【請求項６】
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の多型を検出するプローブであって、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上の第５５６番目の塩基を決定するように設計されたプローブ。
【請求項７】
前記ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の多型が一塩基多型である請求項６記載のプローブ。
【請求項８】
前記一塩基多型が、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上の第５５６番目の塩基シトシン（Ｃ）が、チミン（Ｔ）又はグアニン（Ｇ）に変異しているものである請求項７記載のプローブ。
【請求項９】
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の多型が、ＣＹＰ２Ｃ８の第１８６番目のアミノ酸変異をもたらすものである、請求項６乃至８いずれか記載のプローブ。
【請求項１０】
配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなる請求項６乃至９いずれか記載のプローブ。
【請求項１１】
配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなる請求項６乃至９いずれか記載のプローブ。
【請求項１２】
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上の第５５６番目を含む領域に対応するＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
【請求項１３】
請求項１乃至１２いずれか記載のプライマーセット又はプローブを含む、ＣＹＰ２Ｃ８により代謝される薬物に対するＣＹＰ２Ｃ８代謝活性の検査薬。
【請求項１４】
前記ＣＹＰ２Ｃ８により代謝される薬物が、パクリタキセル、カルバマゼピン、アミオダロン、トログリタゾン、セリバスタチンからなる群より選択されるいずれか一つである請求項１３記載の検査薬。
【請求項１５】
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上の第５５６番目の塩基シトシン（Ｃ）が、塩基チミン（Ｔ）又はグアニン（Ｇ）に変異していることを確認する工程を含む、ＣＹＰ２Ｃ８により代謝される薬物に対するＣＹＰ２Ｃ８代謝活性の検査方法。
【請求項１６】
前記ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の一塩基多型が、ＣＹＰ２Ｃ８の第１８６番目のアミノ酸変異をもたらすものである請求項１５記載の検査方法。
【請求項１７】
以下の(ａ)〜(ｃ)の工程を含む、請求項１５又は１６記載の検査方法。
（ａ）被検者から調製されたＤＮＡ試料よりＣＹＰ２Ｃ８遺伝子を含むDNAを単離する工程、（ｂ）単離したDNA試料の塩基配列を決定する工程、（ｃ）工程（ｂ）において決定したDNAの塩基配列を対照と比較する工程。
【請求項１８】
前記ＣＹＰ２Ｃ８により代謝される薬物が、パクリタキセル、カルバマゼピン、アミオダロン、トログリタゾン、セリバスタチンからなる群より選択されるいずれか一つである請求項１５乃至１７いずれか記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の多型を検出するプライマーセット及びプローブ、並びに該酵素の代謝活性の検査薬及びその検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗癌剤パクリタキセルは、卵巣癌、非小細胞肺癌、乳癌及び胃癌に対して効果を有することが知られており、その使用の承認もされている。
しかしながら、骨髄抑制、嘔吐、脱毛、関節痛、神経障害等の副作用も報告されている。
このような副作用は、生体内でパクリタキセルの代謝に働く酵素の活性の高低により、影響を受けると考えられている。
【０００３】
パクリタキセルの代謝に重要な役割をはたしている薬物代謝酵素として、ＣＹＰ２Ｃ８が知られている。
薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ８により、パクリタキセルは生体内で、６α-ヒドロキシパクリタキセルに酸化され胆汁中へ排泄されるが、ＣＹＰ２Ｃ８の代謝活性が低い場合、パクリタキセルを代謝する速度が遅い為に、血中及び臓器におけるパクリタキセル濃度が上昇し、高い濃度が持続されることとなる。
その結果、パクリタキセル使用による副作用が強くあらわれると考えられる。
【０００４】
従って、パクリタキセルによる副作用の程度を把握する為には、薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ８の代謝活性について正確に知ることが重要となる。
しかし、ＣＹＰ２Ｃ８の代謝活性は個々の患者に応じてそれぞれ異なることが知られている。
【０００５】
個々の患者におけるＣＹＰ２Ｃ８の代謝活性については、最近の遺伝子解析の進歩に伴い、個々の患者の遺伝的要因により支配されていることが知られている。
例えば、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の多型により、ＣＹＰ２Ｃ８の代謝活性が弱められたり、増強されたりすることなどが報告されている（非特許文献１、２）。
【０００６】
このことから、パクリタキセルの投与前にＣＹＰ２Ｃ８の代謝能に関連する前記ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の多型を調べ、個々の患者のＣＹＰ２Ｃ８代謝能に応じた量のパクリタキセルを投与することにより、パクリタキセルによる副作用を避けることができると考えられる。
【０００７】
その為、パクリタキセルの投与前にＣＹＰ２Ｃ８の代謝能に関連する遺伝子多型を検出し、個々の患者に応じた量のパクリタキセルを投与し、パクリタキセルによる副作用を避けることを可能とするプライマーセット、プローブ及びそれらを含む検査薬、並びに検査方法の開発が強く望まれていた。
【０００８】
尚、パクリタキセル同様、ＣＹＰ２Ｃ８により代謝されることで知られる抗てんかん薬カルバマゼピン、抗不整脈薬アミオダロン、抗糖尿病薬トログリタゾン及びHMG-CoAレダクターゼ阻害剤セリバスタチン等の治療薬に関しても、副作用があらわれるという問題があり、これらの副作用を避けることを可能とするプライマーセット、プローブ及びそれらを含む検査薬、並びに検査方法の開発も強く望まれていた。
【０００９】
【非特許文献１】Goldstein JA, Br. J. Clin. Pharmacol. 52(4):349-355 (2001).
【非特許文献２】Akiko Soyama et al., Drug Metabol. Pharmacokin. 17(4):SNP7(374)-SNP10(377) (2002).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、パクリタキセルの投与前に薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ８の代謝能に関連する遺伝子多型を検出し、個々の患者に応じた量のパクリタキセルを投与することで、パクリタキセルによる副作用を避けることを可能とするプライマーセット、プローブ及びそれらを含む検査薬、並びに検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
即ち、請求項１は、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の多型を検出するプライマーセットであって、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上の第５５６番目を含む領域に対応するＤＮＡを増幅させることを特徴とするプライマーセットに関する。
請求項２は、前記ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の多型が一塩基多型である請求項１記載のプライマーセットに関する。
請求項３は、前記一塩基多型が、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上の第５５６番目の塩基シトシン（Ｃ）が、チミン（Ｔ）又はグアニン（Ｇ）に変異しているものである請求項２記載のプライマーセットに関する。
請求項４は、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の多型が、ＣＹＰ２Ｃ８の第１８６番目のアミノ酸変異をもたらすものである請求項１乃至３いずれか記載のプライマーセットに関する。
請求項５は、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーと、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーとを含む、請求項１乃至４いずれか記載のプライマーセットに関する。
請求項６は、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の多型を検出するプローブであって、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上の第５５６番目の塩基を決定するように設計されたプローブに関する。
請求項７は、前記ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の多型が一塩基多型である請求項６記載のプローブに関する。
請求項８は、前記一塩基多型が、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上の第５５６番目の塩基シトシン（Ｃ）が、チミン（Ｔ）又はグアニン（Ｇ）に変異しているものである請求項７記載のプローブに関する。
請求項９は、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の多型が、ＣＹＰ２Ｃ８の第１８６番目のアミノ酸変異をもたらすものである、請求項６乃至８いずれか記載のプローブに関する。
請求項１０は、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなる請求項６乃至９いずれか記載のプローブに関する。
請求項１１は、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなる請求項６乃至９いずれか記載のプローブに関する。
請求項１２は、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上の第５５６番目を含む領域に対応するＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブに関する。
請求項１３は、請求項１乃至１２いずれか記載のプライマーセット又はプローブを含む、ＣＹＰ２Ｃ８により代謝される薬物に対するＣＹＰ２Ｃ８代謝活性の検査薬に関する。
請求項１４は、前記ＣＹＰ２Ｃ８により代謝される薬物が、パクリタキセル、カルバマゼピン、アミオダロン、トログリタゾン、セリバスタチンからなる群より選択されるいずれか一つである請求項１３記載の検査薬に関する。
請求項１５は、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上の第５５６番目の塩基シトシン（Ｃ）が、塩基チミン（Ｔ）又はグアニン（Ｇ）に変異していることを確認する工程を含む、ＣＹＰ２Ｃ８により代謝される薬物に対するＣＹＰ２Ｃ８代謝活性の検査方法に関する。
請求項１６は、前記ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の一塩基多型が、ＣＹＰ２Ｃ８の第１８６番目のアミノ酸変異をもたらすものである請求項１５記載の検査方法に関する。
請求項１７は、以下の(ａ)〜(ｃ)の工程、即ち、（ａ）被検者から調製されたＤＮＡ試料よりＣＹＰ２Ｃ８遺伝子を含むDNAを単離する工程、（ｂ）単離したDNA試料の塩基配列を決定する工程、（ｃ）（ｂ）において決定したDNAの塩基配列を対照と比較する工程、を含む請求項１５又は１６記載の検査方法に関する。
請求項１８は、前記ＣＹＰ２Ｃ８により代謝される薬物が、パクリタキセル、カルバマゼピン、アミオダロン、トログリタゾン、セリバスタチンからなる群より選択されるいずれか一つである請求項１５乃至１７いずれか記載の検査方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る、プライマーセット、プローブ及びそれらを含む検査薬、並びに検査方法により、薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ８の代謝能に関連する遺伝子多型を検出できる。
検出された遺伝子多型をもとに薬物代謝異常の判定を行った上で、個々の患者のＣＹＰ２Ｃ８代謝活性に応じた量のパクリタキセルを投与することにより、パクリタキセルの副作用を避けることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明者らは、パクリタキセル等の医薬品の生体内代謝に関与するＣＹＰ２Ｃ８における遺伝子多型を検出することを目的とし、日本人のパクリタキセル投与患者１０５人由来ゲノムＤＮＡにつき、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子のエクソン領域を中心にシーケンシング解析し、アミノ酸置換を引き起こす新規遺伝子多型を二種発見した。
即ち、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子（GenBank Accession No. NM_000770; NM_000770のヌクレオチド配列中24-26番目のATGのAを1番目の塩基とし、これに対応するメチオニンを１番目のアミノ酸残基とする）上の第５５６番目の塩基がシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）、若しくはチミン（Ｔ）に変異した新規遺伝子多型である。
【００１４】
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子は、染色体１０ｑ２４．１に位置し、９個のエクソンから構成される遺伝子である。該遺伝子は、肝臓、並びに、腎臓、副腎、脳、子宮等を含む多くの組織で発現されている。
ＣＹＰ２Ｃ８は、抗癌剤パクリタキセル、抗てんかん薬カルバマゼピン、抗不整脈薬アミオダロン、抗糖尿病薬トログリタゾン及びHMG-CoAレダクターゼ阻害剤セリバスタチン等の治療薬の代謝に重要な役割を果たしている。
【００１５】
多型とは、遺伝学的には、人口中１％以上の頻度で存在している1遺伝子におけるある塩基の変化と一般的には定義される。
しかしながら、本発明の「多型」はこの定義に制限されず、１％未満の塩基の変化であっても「多型」に含む。
本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型（single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）から数十塩基が欠失、置換あるいは挿入されている多型等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
更に、多型部位の数についても特に制限はなく、１個以上の多型を有していてもよい。
【００１６】
以下、パクリタキセルをもとに本発明を説明するが、ＣＹＰ２Ｃ８により代謝される薬物は、パクリタキセル及び前記例示に限定されるものではない。
【００１７】
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の第５５６番目の塩基ＣがＧに変異することにより、１８６番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からグリシン（Ｇｌｙ）に変異したＣＹＰ２Ｃ８が発見された（以下、「556C>G (Arg186Gly)」と略記する場合がある）。
この変異の結果、パクリタキセルの生体内での代謝が、ＣＹＰ２Ｃ８量および酵素活性の低下により下がり、それらの薬物が生体内に蓄積し、副作用が発現しやすいと考えられる。
従って、パクリタキセル投与前に、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の変異、即ち、該一塩基多型（ＳＮＰ）について検査することにより、薬物代謝異常の判定を行い、個々の患者のＣＹＰ２Ｃ８代謝活性に応じた量のパクリタキセルを投与することが可能となる。
その結果、個々の患者に応じて、パクリタキセルの投与量を調節することにより、副作用を避けることができる。
【００１８】
もう一つは、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の第５５６番目の塩基ＣがＴに変異することにより、第１８６番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）から終止コドンに変異したＣＹＰ２Ｃ８が発見された（以下、「556C>T (Arg186Stop)」と略記する場合がある）。
この変異の結果、約６２％の蛋白部分を欠失することにより、酸化反応に必須のヘム結合領域及び６カ所ある基質認識部位の中の５カ所を喪失するため、活性は喪失すると考えられる。
従って、パクリタキセル投与前に、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の変異、即ち、該一塩基多型（ＳＮＰ）について検査することにより、薬物代謝異常の判定を行い、個々の患者のＣＹＰ２Ｃ８代謝活性に応じた量のパクリタキセルを投与することが可能となる。
その結果、個々の患者に応じて、パクリタキセルの投与量を調節することにより、副作用を避けることができる。
【００１９】
前記ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）を利用する薬物代謝異常の判定に用いられる、本発明に係るプライマーセット、プローブ、及びそれらを含むＣＹＰ２Ｃ８代謝活性の検査薬、並びにＣＹＰ２Ｃ８代謝活性の検査方法について、以下、詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、本発明の技術分野における通常の変更ができることは言うまでもない。
【００２０】
薬物代謝異常の判定において、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の第５５６番目の塩基における多型を決定し、その塩基の種類に基づいて、薬物代謝異常の判定、即ち、ＣＹＰ２Ｃ８の代謝活性を判定する。
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の第５５６番目の塩基がシトシン（Ｃ）である場合には、問題ないが、前記塩基がグアニン（Ｇ）、若しくはチミン（Ｔ）に変異している場合には、アミノ酸変異をもたらすものとなり、それぞれ、ＣＹＰ２Ｃ８の第１８６番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からグリシン（Ｇｌｙ）に、ＣＹＰ２Ｃ８の第１８６番目のアミノ酸残基がＡｒｇから終止コドンに変異したＣＹＰ２Ｃ８が発現する。その結果、ＣＹＰ２Ｃ８の代謝活性が低いと判断することができる。
【００２１】
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の第５５６番目の塩基を決定する方法としては、被検者から調製されたＤＮＡ試料よりＣＹＰ２Ｃ８遺伝子を含むDNAを単離する工程、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと称する）により、第５５６番目の塩基を含むＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の部分断片を増幅する工程を経た後、単離したDNA試料の塩基配列を決定する工程、例えば、その部分断片（ＰＣＲ産物）の塩基配列を直接決定するダイレクトシークエンス法による工程を経ることにより行うことができる。
【００２２】
前記方法においては、最初に被検者からＤＮＡ試料を調製する。
ＤＮＡ試料は、例えば被検者の末梢血白血球、肝臓、腎臓、副腎、脳、子宮等の組織または細胞から抽出した染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを基に調製することができる。
【００２３】
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子を含むＤＮＡ、さらにはＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の第５５６番目の塩基を含むＤＮＡを単離する。
第５５６番目の塩基を含むＤＮＡ領域は、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子を構成する９個のエクソンの内、エクソン４に存在する（図４）。
【００２４】
第５５６番目の塩基を含むＣＹＰ２Ｃ８遺伝子を含むＤＮＡ領域をＰＣＲ法により増幅する際に使用するプライマーは、第５５６番目の塩基を含むＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の部分断片を増幅可能なプライマーである限り、特に限定されるものではなく、当業者であれば、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の塩基配列に基づいて容易に決定することができる。
このようなプライマー、即ち、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の多型を検出するプライマーセットとしては、例えば、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーと、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーまたは当該プライマーよりも１〜１０塩基分短いプライマーとを含むプライマーセットをあげることができる。
これらのプライマーセットを用いてＰＣＲ法を実施すると、第５５６番目の塩基を含むＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の部分断片を得ることができる。
【００２５】
第５５６番目の塩基を含むＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の部分断片の塩基配列を決定する。
単離した遺伝子断片の塩基配列の決定は、マクサムギルバート法やサンガー法など、当業者に公知の方法で行うことができる。
塩基配列を決定するにあたり使用するプローブとしては、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上の第５５６番目の塩基を決定するように設計されたものであれば、特に限定されるものではなく、当業者であれば、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の塩基配列に基づいて容易に決定することができる。
ＰＣＲ法により得られるＰＣＲ産物のダイレクトシークエンス法においては、ＰＣＲに用いたプライマーと同じ塩基配列を有するプローブを用いることができる。
例えば、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなるプローブ、若しくは、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたは当該オリゴヌクレオチドよりも１〜１０塩基分短いオリゴヌクレオチドからなるプローブを使用して実施することができる。
【００２６】
決定したＤＮＡの塩基配列を対照と比較する。
本法における対照とは、正常な（野生型）ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の配列を言う。
一般に健常人のＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の配列は正常であるものと考えられることから、上記工程の「対照と比較する」とは、通常、健常人のＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の配列と比較することを意味するが、GenBankに野生型として登録されているＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の配列（NM_000770）と比較してもよい。
【００２７】
このような比較の結果、被検者のＣＹＰ２Ｃ８遺伝子、第５５６番目の塩基配列が対照と異なっていた場合、即ち、対照のＣＹＰ２Ｃ８遺伝子、第５５６番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるのに対し、被検者のＣＹＰ２Ｃ８遺伝子、第５５６番目の塩基がグアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）である場合、当該一塩基多型（ＳＮＰ）により、被検者はパクリタキセル等のＣＹＰ２Ｃ８により代謝される薬物に対する代謝能が低く、それらの薬物の投与による副作用が生じやすいと考えられる。
即ち、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の第５５６番目の塩基ＣがＧに変異することにより、ＣＹＰ２Ｃの１８６番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からグリシン（Ｇｌｙ）へと変異し、パクリタキセルの生体内での代謝が、ＣＹＰ２Ｃ８量および酵素活性の低下により下がり、それらの薬物が生体内に蓄積し、副作用が発現しやすいと考えられる。
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の第５５６番目の塩基ＣがＴに変異することにより、第１８６番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）から終止コドンに変異し、約６２％の蛋白部分を欠失することにより、酸化反応に必須のヘム結合領域及び６カ所ある基質認識部位の中の５カ所を喪失するため、ＣＹＰ２Ｃ８の代謝活性は喪失し、副作用が発現しやすいと考えられる。
【００２８】
上述の一塩基多型により、ＣＹＰ２Ｃ８量および酵素活性が減少しているかどうかを調べる手段としては、以下のような工程を含む方法を例示することができる。
（１）多型を含むＣＹＰ２Ｃ８遺伝子を発現する発現ベクターを構築する、
（２）該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入する、
（３）該宿主細胞をＣＹＰ２Ｃ８が発現される条件下で培養する、
（４）ＣＹＰ２Ｃ８の発現レベルを調べ、野生型のＣＹＰ２Ｃ８遺伝子を導入した場合の結果と比較する発現レベルは、ＣＹＰ２Ｃ８に対する抗体を用いたウエスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法（ELISA）及び免疫蛍光法等により決定することができる。
（５）また多型を含むＣＹＰ２Ｃ８遺伝子を導入した（３）の細胞よりミクロソーム画分を調製し、これを用いてパクリタキセルを基質として代謝活性を調べ、野生型のＣＹＰ２Ｃ８遺伝子を導入した場合の結果と比較することにより、酵素活性レベルを決定することができる。
（４）および（５）の結果、ＣＹＰ２Ｃ８量および酵素活性が減少していれば、被検者はパクリタキセル等のＣＹＰ２Ｃ８により代謝される薬物に対する代謝能が低く、それらの薬物の投与による副作用が生じやすいと判定される。
【００２９】
本発明の検査方法は、上記の如く直接被検者由来のＤＮＡの塩基配列を決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
例えば、本発明における多型の検出は、以下の方法によっても行うことができる。
被検者からＤＮＡ試料を調製した後、該試料を制限酵素により切断する。
ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離した後、検出されたＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する。
【００３０】
他の一つの態様においては、被検者からＤＮＡ試料を調製した後、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子を含むＤＮＡを増幅する。
増幅したＤＮＡを制限酵素により切断し、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離した後、検出されたＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する。
【００３１】
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。
具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。
変異を含む部分をＰＣＲ法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することにより、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。
あるいは、染色体ＤＮＡをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明に係るプローブ、例えばＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上の第５５６番目を含む領域に対応するＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。
用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。
この方法では、ゲノムＤＮＡ以外にも被検者から調製したＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。
このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲでＣＹＰ２Ｃ８遺伝子を含むＤＮＡを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。
【００３２】
さらに別の方法においては、被検者からＤＮＡ試料を調製した後、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子を含むＤＮＡを増幅する。
増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させた後、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。
分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００３３】
該方法としては、例えばＰＣＲ-ＳＳＣＰ(single-strand conformation polymorphism、一本鎖高次構造多型)法が挙げられる。
この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のＤＮＡ試料をスクリーニングするのに好適である。
その原理は次の通りである。
二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。
この解離したＤＮＡ鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡが異なる位置に移動する。
一塩基の置換によってもこの一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。
従って、この移動度の変化を検出することによりＤＮＡ断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異が存在することを検出することができる。
【００３４】
具体的には、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の第５５６番目の塩基を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅する。
増幅される範囲としては、通常200〜400bp程度の長さが好ましい。
ＰＣＲは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。
ＰＣＲの際に、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することができる。
あるいはＰＣＲ反応液に32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてＰＣＲを行うことにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することも可能である。
ＰＣＲ反応後にクレノウ酵素等を用いて、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅ＤＮＡ断片に付加することによっても標識を行うことができる。
こうして得られた標識ＤＮＡ断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。
この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（5から10％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離の条件を改善することができる。
泳動条件は各ＤＮＡ断片の性質により変動するが、通常、室温（20〜25℃）で行い、好ましい分離が得られないときには4〜30℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。
電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。
移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、ＰＣＲによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。
標識したＤＮＡを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
【００３５】
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。
変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料ＤＮＡでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。
それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等により検出することができる。
リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法による検出も可能である。
具体的には、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだＣＹＰ２Ｃ８遺伝子ｃＤＮＡ等から調製した標識ＲＮＡとハイブリダイゼーションを行う。
変異が存在する部分においてはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボヌクレアーゼAによって切断し、これをオートラジオグラフィー等で検出することによって変異の存在を検出することができる。
【００３６】
本発明に係る、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上の第５５６番目の塩基を同定し得る、プライマー及びプローブは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。
プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【００３７】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。
標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの5'端を32Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００３８】
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチド以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（BSAやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【００４０】
（実施例１）ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子多型の検出
〔ＤＮＡ抽出〕
日本人のパクリタキセル投与患者105人より、文書による同意の上、末梢静脈血を採血し、含まれる白血球よりゲノムＤＮＡを調製した。
本研究は国立がんセンターおよび国立医薬品食品衛生研究所の研究倫理審査委員会の承認のもとに行った。
得られたＤＮＡの濃度は、紫外線吸収により測定し、ＤＮＡ溶液はシーケンシング解析時まで4℃で保存した。
【００４１】
〔ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の配列解析〕
ゲノムコンティグ配列(Genbank登録番号NT_008769.11)に基づき、遺伝子増幅用およびシーケンシング用プライマーを設計した（表１）。
【００４２】
【表１】
2006141314.tif 000002
【００４３】
２種類のプライマーセット（表１，1st ＰＣＲ; 各0.2 μM）とZ-Taq酵素(1.25 units; Takara Bio. Inc., Shiga, Japan)を用いて、ゲノムＤＮＡ(200 ng)について、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の全長（エクソン1から5まで、およびエクソン6から9まで）を増幅した。
この際のＰＣＲの条件としては、98℃で5秒、55℃で5秒および72℃で190秒を、30サイクル行った。
各エクソンのＰＣＲ増幅用プライマーセット（表１、2nd ＰＣＲ; 各０．２ μＭ）を用いて、第一段ＰＣＲの産物であるＤＮＡ断片より、各エクソンを含むＤＮＡ断片をEx-Taq酵素（0.625 units; Takara Bio. Inc.）を用いて増幅した。
但し、エクソン2及び3は１つの断片として増幅した。
この際ＰＣＲの条件は、94℃で5分処理後、94℃で30秒、60℃で1分および72℃で2分を30サイクル行い、その後72℃で7分処理した。その後、ＰＣＲ Product Pre-Sequencing Kit (USB Co., Cleveland, OH)を用いて精製したＰＣＲ産物を両鎖について、ABI BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用い、シーケンシング用プライマー（表１、シーケンシング、０．１μＭ）で直接配列決定した。過剰な色素をDyeEx96 plate (Qiagen)を用いて除去した。
溶出液をABI Prism 3700 ＤＮＡ Analyzer (Applied Biosystems)により分析した。
見いだした遺伝子多型は、上記ゲノムＤＮＡからの増幅及びシーケンシング作業の繰り返し実験により、その存在を確認した。
【００４４】
上記ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子のシーケンシング解析により、ＣＹＰ２Ｃ８の第１８６番目のアミノ酸置換を引き起こす新規遺伝子多型を二種見いだした。
即ち、対照のＣＹＰ２Ｃ８遺伝子、第５５６番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるのに対し、被検者のＣＹＰ２Ｃ８遺伝子、第５５６番目の塩基がグアニン（Ｇ）に変異することにより、ＣＹＰ２Ｃ８の第１８６番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）からグリシン（Ｇｌｙ）へと変異した新規遺伝子多型（556C>G (Arg186Gly)）及び対照のＣＹＰ２Ｃ８遺伝子、第５５６番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるのに対し、被検者のＣＹＰ２Ｃ８遺伝子、第５５６番目の塩基がチミン（Ｔ）に変異することにより、ＣＹＰ２Ｃ８の第１８６番目のアミノ酸残基がアルギニン（Ａｒｇ）から終止コドンに変異した新規遺伝子多型（556C>T (Arg186Stop)）である（塩基番号は翻訳開始コドンであるATGのAを1とした）。
図１に両多型のシーケンシング結果を示した。
アリル頻度は両者とも0.005であった。
このうち、556C>T (Arg186Stop)は約６２％の蛋白部分を欠失することにより、酸化反応に必須のヘム結合領域及び6カ所ある基質認識部位の中の5カ所を喪失するため、活性は喪失すると考えられた。
【００４５】
［実施例２］異型ＣＹＰ２Ｃ８酵素の発現
（プラスミド構築）
完全長野生型ＣＹＰ２Ｃ８断片をｐＣＲ3.1ベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）に組み込んだものを野生型とした。
Quick Change Multi Site-Directed Mutagenesis Kit （Stratagene, La Jolla, CA）及び野生型ＣＹＰ２Ｃ８/ｐＣＲ3.1プラスミドを鋳型として用いて、異型酵素である556C>G（Arg186Gly）を構築した。
野生型及びそのArg186Gly置換体の全配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【００４６】
〔細胞培養及びトランスフェクション〕
アフリカミドリザルの腎臓細胞株COS-1細胞を10％ウシ血清を加えたダルベッコ改変イーグルス培地中、５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。
トランスフェクションの前日、細胞を5.5×106細胞/cm2 となるよう10cm培養皿に接種した。細胞を無血清OPTI MEM 培地(Invitrogen)で洗浄した後、本培地を加え、14μgの野生型ＣＹＰ２Ｃ８またはArg186Gly置換体、または、空のｐＣＲ3.1プラスミドをLipofectAMINE 2000 試薬(Invitrogen)を用いて、該試薬添付のプロトコールに従ってトランスフェクトした。
４８時間後、細胞をミクロソーム調製、または、RNase kit (Quiagen)による総ＲＮＡ調製に供した。
ミクロソーム調製はEkins S.らの方法に従って行い、10% Glycerolを含む１００ｍＭ カリウムリン酸緩衝液(pH 7.4)に懸濁してミクロソーム画分とし、使用まで−80℃で保存した。
ミクロソーム画分の蛋白量は、ウシ血清アルブミンを標準としてローリー法により定量した。
【００４７】
〔発現ＣＹＰ２Ｃ８蛋白質の定量〕
ＣＹＰ２Ｃ８及びArg186Gly置換体のCOS-1 細胞における発現のレベルを決定するため、ミクロソーム画分(蛋白質30μg)をＳＤＳサンプルバッファー中に溶解し、１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、さらにＰＶＤＦ膜（Atto, Tokyo, Japan）に電気的に転写した。
免疫染色のため、ウサギ抗ヒトＣＹＰ２Ｃ８ポリクローナル抗体（2000倍希釈、Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ）、または、ウサギ抗カルネキシンポリクローナル抗体（StressGen Biotechnologies Corp., Victoria, BC, Canada）のどちらかを一次抗体とし、西洋わさびのペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）を二次抗体として使用し、Enhanced Chemiluminescence-Plus Reagents (Amersham Bioscience)を用いた化学発光をTyphoon 9400 (Amersham Bioscience) により検出・定量した。
ミクロソーム画分中のＣＹＰ２Ｃ８含有量は、バンド強度を標準ヒトＣＹＰ２Ｃ８発現昆虫細胞ミクロソーム（BD Gentest Corporation, Woburn, MA）のバンド強度と比較して算出した。
【００４８】
図２Ａに空のプラスミド(Mock)、野生型(WT)、または、Arg186Gly置換体(R186G)プラスミドでトランスフェクトしたCOS-1細胞のミクロソーム画分中のＣＹＰ２Ｃ８蛋白質の発現レベルを示す。
Arg186Gly置換体の発現レベルは野生型の発現レベルと比べて有意に減少していた。
図２ＢはＣＹＰ２Ｃ８発現レベルをｍｇミクロソーム蛋白質当たりで表したもので、Arg186Gly置換体の発現レベルは野生型の約４５％に減少していた。
ＣＹＰ２Ｃ８は小胞体膜上に発現するが、ミクロソーム画分中の小胞体含有量を小胞体固有蛋白質カルネキシンのイムノブロットにより評価したが、上記3種のプラスミドでトランスフェクトしたCOS-1細胞のミクロソーム画分間で、差は認められなかった。
【００４９】
〔発現ＣＹＰ２Ｃ８ ｍＲＮＡの定量〕
1 μgの総RNAをHigh capacity cＤＮＡ archive kit（Appllied Biosystems）を用いて、ランダムプライマー法によりcＤＮＡに逆転写した。
Real-time ＰＣＲ反応は、Assay-on demand kit(Applled Biosystems)を用いて、以下の通り行った。
即ち、２５０μｌのTaqMan universal ＰＣＲ master mix (Applled Biosystems)、２ｎｇの総ＲＮＡに相当する4 μlの逆転写反応液、250 ｎＭのTaqMan probe および９００ｎＭのforwardおよびreverseプライマー(Applled Biosystems)を含む５０μｌの反応液につき、ABI Prism 7000 sequence detection system (Applled Biosystems)により増幅・検出反応を行った。
増幅ＰＣＲ反応は、50℃で2分を1サイクル、さらに95℃で10分を1サイクルの後、さらに「95℃を15秒と60℃を1分」の反応を40サイクル行い、増幅されてくるフラグメント量を定量した。
標準ｍＲＮＡとしてTaqMan β-actin control reagents (Applled Biosystems)により定量されるβ-actinを用い、ＣＹＰ２Ｃ８ ｍＲＮＡ量はβ-actin量に対する相対量として算出した。
ネガティブコントロールとして逆転写酵素を添加していないものを用いた。
【００５０】
COS-1細胞にトランスフェクトした野生型ＣＹＰ２Ｃ８およびArg186Gly置換体のmRNAレベルを調べたところ、Arg186Gly置換体のｍＲＮＡ発現レベルは野生型のレベルとほぼ同じであった（図２Ｃ）。
【００５１】
これらの結果は、Arg186Gly置換体の蛋白質発現レベルの減少は、このプラスミドの低トランスフェクション効率によるのではないことを示唆する。
この様なmRNAレベルの減少を伴わない蛋白質発現レベルの減少は、変異体CYP2D6*10において示唆されるように、成熟蛋白質の安定性がこのアミノ酸置換により減少した可能性が考えられる。
【００５２】
［実施例３］ＣＹＰ２Ｃ８変異体のパクリタキセル６α-ヒドロキシラーゼ活性
野生型ＣＹＰ２Ｃ８及びArg186Gly置換体のパクリタキセル6α-ヒドロキシラーゼ活性を、それぞれの発現プラスミドをトランスフェクトしたCOS-1細胞のミクロソーム画分を用いて決定した。
【００５３】
〔パクリタキセル６α-ヒドロキシラーゼ活性の分析〕
パクリタキセル６α-ヒドロキシラーゼの活性を以下の方法により測定した。
インキュベーション反応液は基質として０．５または２０μＭのパクリタキセル、２００μｇのミクロソーム蛋白質及び１ｍＭ ＮＡＤＰＨ （Roche  Diagnostics, Tokyo, Japan）を最終容量０．５ ｍｌの５０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ 7.4）中に含んでいた。
NADPHを含まない上記溶液を３７℃で1分間処理により加温した後、反応をNADPHの添加により開始した。
反応液を３７℃で３０分間インキュベートした後、３ ｍｌの酢酸エチルの添加により反応を止めた。
反応液に内部標準（800 pmolの7,13-ジアセチルバカチン III（Alexis Biochemicals, San Diego, CA））を加え、30秒間激しく攪拌した。
6,000×gで１５分間遠心した後、有機画分を４０℃下での穏やかな窒素噴射により蒸発させた。
残余物を２５０μｌの５０％（v/v）メタノールに再溶解した後、この中５０μｌをＨＰＬＣに供した。
即ち、Inertsil ODS-80A カラム（内径4.6mm×150mm;  GL Sciences, Tokyo , Japan）を備えたLC-10AVPシステム（Shimadzu, Kyoto, Japan）を用いてＨＰＬＣ分析を行った。
パクリタキセルの6α-ヒドロキシル化物は水-アセトニトリル-メタノール（50:40:10, v/v/v）で、流速1.0 ml/分のもと、アイソクラティック的に溶出した。
溶出物はカラム温度４０℃下、２３０ ｎｍのＵＶ吸収により検出した。
【００５４】
野生型ＣＹＰ２Ｃ８及びArg186Gly置換体のパクリタキセル6α-ヒドロキシラーゼ活性を比較したところ、Arg186Gly置換体ではパクリタキセル濃度が０．５と２０μＭのいずれの場合でも大幅な活性低下が認められた（図３）。
この活性低下は、代謝活性をミクロソーム蛋白量当たり(図３Ａ)およびＣＹＰ２Ｃ８蛋白量当たり（図３Ｂ）で表したいずれの場合でも認められた。
即ち、基質濃度０．５μＭではArg186Gly置換体の活性は検出限界以下であり、また２０μＭではミクロソーム蛋白量あたりで約９５％減の、ＣＹＰ２Ｃ８蛋白量あたりで約８０％減の、それぞれ大幅な活性の低下が認められた。
本結果から、Arg186Gly置換体におけるパクリタキセル代謝活性の低下は、蛋白質発現レベルの低下に加え、ＣＹＰ２Ｃ８蛋白質当たりの代謝活性の低下が関与していることが示唆された。
【００５５】
〔結果のまとめ〕
今回の結果は、新規に見いだされたＣＹＰ２Ｃ８の遺伝子多型、556C>T (Arg186Stop)及び556C>G (Arg186Gly)が活性の大幅な低下を引き起こすことを示したものである。
これらの遺伝子多型を有するヒトでは、ＣＹＰ２Ｃ８活性は低いことが予想され、ＣＹＰ２Ｃ８により代謝される薬物の投与前に、これらの多型を調べることによりＣＹＰ２Ｃ８により代謝される薬物の投与量を調節し、副作用の発現を抑制することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明に係る一塩基多型のシーケンシング結果を示した図である。
【図２】空のプラスミド(Mock)、野生型(WT)、又はArg186Gly置換体(R186G)プラスミドでトランスフェクトしたCOS-1細胞のミクロソーム画分中のＣＹＰ２Ｃ８蛋白質の発現レベルを示したものである（Ａ）。ＣＹＰ２Ｃ８発現レベルをmgミクロソーム蛋白質当たりで表したものである（Ｂ）。COS-1細胞にトランスフェクトした野生型ＣＹＰ２Ｃ８およびArg186Gly置換体のmRNAレベルを測定したものである（Ｃ）。
【図３】野生型ＣＹＰ２Ｃ８及びArg186Gly置換体のパクリタキセル6α-ヒドロキシラーゼ活性を比較した図である。詳しくは、代謝活性をミクロソーム蛋白量当たり(Ａ)およびＣＹＰ２Ｃ８蛋白量当たり（Ｂ）で、パクリタキセル6α-ヒドロキシラーゼ活性を比較した図である。
【図４】ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の構造を示した図である。
【図１】
2006141314.tif 000003
【図２】
2006141314.tif 000004
【図３】
2006141314.tif 000005
【図４】
2006141314.tif 000006
【配列表】
2006141314000001.app