(57)【要約】【課題】  エンドセリンアンタゴニストおよびエンドセリン受容体アンタゴニストの新たな用途を開発する。【解決手段】  哺乳動物における肥満の抑制に使用されるエンドセリンアンタゴニスト、哺乳動物における肥満を抑制するための、エンドセリンアンタゴニストもしくはエンドセリン受容体アンタゴニストを含有する医薬組成物、ならびに抗肥満活性を有するエンドセリンアンタゴニストもしくはエンドセリン受容体アンタゴニストのスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における肥満の抑制のための、エンドセリンアンタゴニストもしくはエンドセリン受容体アンタゴニストを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項２】
哺乳動物における肥満を抑制するための医薬を製造するための、ＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストの使用。
【請求項３】
抗肥満活性を有するエンドセリンアンタゴニストもしくはエンドセリン受容体アンタゴニストのスクリーニング方法であって、下記工程：
ヒトを除く哺乳動物に候補物質を投与しつつ、該動物における肥満パラメーターをモニターする
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満を抑制するためのエンドセリンアンタゴニストもしくはエンドセリン受容体アンタゴニストの使用、それらを含む医薬組成物、ならびに抗肥満活性を有するエンドセリンアンタゴニストもしくはエンドセリン受容体アンタゴニストのスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドセリン（ＥＴ）は、１９８８年に血管内皮細胞から単離・同定された強力な血管収縮作用を有する物質である（Yanagisawa M, et al: Nature (Londan) 332: 411-415, 1988）。ＥＴは血管内皮細胞のみならず肺、腎臓等の様々な組織により産生される２１個のアミノ酸からなるペプチドであり、これまでＥＴ−１、ＥＴ−２およびＥＴ−３の３種が同定されており、ＥＴ−１の血管収縮活性が最も強力である。ＥＴは、その強力な血管収縮活性を有することから、高血圧、心不全などの各種循環器疾患の病態に関与することが示唆され、またこれらの循環器病疾患の新たな治療ターゲットとして注目されてきた。
【０００３】
ＥＴはその受容体に結合することにより機能を発揮する。ＥＴ受容体にはＥＴＡ受容体とＥＴＢ受容体があり、ＥＴＡ受容体はＥＴ−１およびＥＴ−２に対する親和性が高く、ＥＴＢ受容体はＥＴ−１、ＥＴ−２およびＥＴ−３のいずれに対しても同等の親和性を有する。高いＥＴレベルによる障害を抑制あるいは除去するためには、ＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストにより、ＥＴの作用あるいはＥＴ受容体の作用をブロックすることが必要となる。これまで多種多様な化合物がＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストとして同定されてきた。現在、ＥＴ受容体アンタゴニストは米国で２００１年に認可されたのを皮切りに多くの国で、肺血管性肺高血圧症の治療薬として臨床の場で使用されており、本邦でも極めて近い将来、使用の認可がおりることが期待されている。
【０００４】
これまでの研究の大部分はＥＴと高血圧との関係に関連するものであり、具体的には高血圧の治療および予防を目的としたものが多かった。しかしながら、ＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニスト以外にも優れた高血圧抑制薬がすでに存在するため、ＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストの用途は肺血管性肺高血圧の抑制に限定されてしまうのが実情である。
【０００５】
近年、動脈硬化性疾患の基盤となる病態として、高血圧、耐糖能異常、脂質代謝異常、肥満といった危険因子が合併する代謝症候群（Metabolic syndrome）の存在が注目されている。したがって、動脈硬化性疾患に起因する各種循環器疾患の病態の解明および新たな治療戦略の確立のためには、代謝症候群の分子病態の解明は不可欠である。
【０００６】
これまで肥満患者における血中ＥＴレベルの上昇や、脂肪細胞から産生されるアディポサイトカインであるレプチン、アディポネクチン、レジスチンの発現にＥＴの関与を示唆する報告は散見されるものの（非特許文献１、２等参照）、ＥＴと肥満あるいは脂肪組織量、さらには肥満に伴うインスリン抵抗性との関連を示す報告はなされていない。
【非特許文献１】Ferri C, et al. Exp Clin Endoclinol Diabetes. 1997;105 Suppl 2:38-40.
【非特許文献２】Xiong Y, et al. J Biol Chem. 2001 Jul 27;276(30):28471-7. Epub 2001 May 18.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の事情に鑑みると、ＥＴアンタゴニストの新たな用途、特に、肥満およびその関連疾患ならびに代謝症候群に対する用途を開発することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねたところ、驚くべきことに、ＥＴの機能を抑制した動物において肥満が抑制されること見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は：
（１）哺乳動物における肥満の抑制のための、エンドセリンアンタゴニストもしくはエンドセリン受容体アンタゴニストを有効成分として含有する医薬組成物；
（２）哺乳動物における肥満を抑制するための医薬を製造するための、ＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストの使用；ならびに
（３）抗肥満活性を有するＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストのスクリーニング方法であって、下記工程：
ヒトを除く哺乳動物に候補物質を投与しつつ、該動物における肥満パラメーターをモニターする
を含む方法
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、哺乳動物における肥満の抑制に使用されるＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニスト、哺乳動物における肥満の抑制のための、ＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストを含有する医薬組成物、ならびに抗肥満活性を有するＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストのスクリーニング方法が提供される。したがって、肥満およびその関連疾患ならびに代謝症候群の治療および予防のための新規かつ効果的なアプローチが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明者は、血管内皮細胞においてＥＴ−１をノックアウトしたマウスにおいて、対照マウスと比較して体重増加が抑制されることを初めて見出した（実施例を参照のこと）。この結果は、ＥＴの機能を抑制することにより肥満を抑制できることを示すものである。ＥＴの機能を抑制するには、ＥＴ自体あるいはＥＴ受容体の機能を抑制し、ＥＴとＥＴ受容体との結合を抑制すること、あるいはＥＴの生成を抑制すること等が必要である。ＥＴの機能を抑制する物質としてはＥＴアンタゴニスト、抗ＥＴ抗体、ＥＴのアンチセンスＤＮＡ、ＥＴ変換酵素阻害剤等が挙げられるが、本明細書においてはこれらを「ＥＴアンタゴニスト」と総称する。また、ＥＴ受容体の機能を抑制する物質としてはＥＴ受容体アンタゴニスト、抗ＥＴ受容体抗体、ＥＴ受容体のアンチセンスＤＮＡ等が挙げられるが、本明細書においてはこれらを「ＥＴ受容体アンタゴニスト」と総称する。これらを哺乳動物に投与することにより、肥満を抑制することができる。
【００１２】
したがって、１の態様において、本発明は、哺乳動物における肥満の抑制に使用されるＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストに関するものである。ＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストとしては既知のアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストを使用してもよく、本発明の方法によりスクリーニングして見出されたＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストを使用してもよい。ＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストの種類は特に限定されず、あらゆるＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストを使用することができる。例えば、ペプチド性あるいは蛋白性のものを使用してもよく、芳香族環を有するような非ペプチド性のものを使用してもよい。本発明のＥＴアンタゴニストは天然界（例えば生体等）から単離されたものであってもよく、ペプチド合成や有機合成等の手法により合成されたものであってもよい。
【００１３】
本発明における使用に際して、ＥＴアンタゴニスト、ＥＴ受容体アンタゴニストのいずれを使用してもよく、両方を使用してもよい。さらに使用するＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストは１種類であってもよく、複数のものであってもよい。ＥＴアンタゴニストおよびＥＴ受容体アンタゴニストは種々のものが見出されており、それらの特性等についてもよく研究されており、適宜選択して用いることができる。また、本発明のスクリーニング方法により見出されたＥＴアンタゴニストおよびＥＴ受容体アンタゴニストを用いてもよい。
【００１４】
また、本発明のＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストは特異性の面からも特に制限はなく、ＥＴアンタゴニストはＥＴ−１、ＥＴ−２、ＥＴ−３のいずれの作用を抑制するものであってもよく、ＥＴ受容体アンタゴニストはＥＴＡ受容体、ＥＴＢ受容体のいずれの作用を抑制するものであってもよい。好ましくは、ＥＴのうち最も強力な作用を有するＥＴ−１もしくはＥＴ−１受容体に対する特異性の高いアンタゴニストが好ましい。
【００１５】
ＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストのほかに、１種類またはそれ以上の他の薬効成分、例えば、抗肥満物質、抗高血圧物質、心疾患治療物質等を併用してもよい。
【００１６】
対象哺乳動物の種類についても特に制限はなく、霊長類（ヒトやサル）、家畜類（ウシ、ウマ、ブタ等）、ペット動物（イヌ、ネコ等）いずれの哺乳動物においても肥満抑制効果が得られる。なお、本明細書において「肥満の抑制」、「肥満抑制」あるいは「抗肥満」とは、肥満のみならず肥満関連疾患（心疾患、高血圧、糖尿病など）ならびに代謝症候群の予防および治療を包含する。
【００１７】
もう１つの態様において、本発明は、哺乳動物における肥満の抑制のための、ＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストを有効成分として含有する医薬組成物に関するものである。通常には、本発明の医薬組成物は医薬上許容される担体と混合されたＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストを含有するものである。医薬上許容される担体は当業者に公知である。本発明の医薬組成物の剤形は特に限定されず、固形（例えば、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤など）、半固体（例えば、クリーム、パスタなど）、液体（例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシルなど）、エアロゾル等、いずれの剤形であってもよい。また、坐薬の形態であってもよい。本発明の医薬組成物の投与形態は、経口投与であっても、非経口投与（例えば、静脈注射、皮内注射、輸液、経粘膜経路、経皮的経路などによる）であってもよい。静脈注射または輸液による投与が、血管内皮に対する直接的作用の面から好ましい。本発明の医薬組成物の製造は、通常の製薬方法に従って行うことができる。例えば、錠剤の場合には、ＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストを適当な固体担体と混和し、打錠することにより製造することができる。注射や輸液用剤形は、ＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストを適当な液体担体に溶解させ、例えば濾過により滅菌して製造することができる。個々の剤形に適合した医薬上許容される担体は、多種多様なものが知られており、適宜選択して使用することができる。固体担体としては、例えば、デンプン、タルク、セルロース、乳糖、砂糖などが挙げられる。半固体担体としては、寒天、水飴などが挙げられる。液体担体としては、水、油脂（食用油等）、アルコール、糖蜜などが挙げられる。本発明の医薬組成物には、必要に応じて、希釈剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、甘味料、香料、着色料、保存料などが含まれていてもよい。
【００１８】
有効成分としてのＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストの用量、投与回数および投与期間は、個々のＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストの活性および性質、投与方法、患者の症状、体重、性別、年齢、既往症、患者が他に投与を受けている薬剤等の因子を考慮して、医師が通常の方法により定めることができる。一般的には、ＥＴアンタゴニストの１日の用量は、体重７０ｋｇの成人に対し、内服の場合は０．５〜５００ｍｇ、好ましくは２．５〜５０ｍｇ、静脈内投与（輸液）の場合には０．１〜１００ｍｇ／ｈ、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｈであろう。またＥＴ受容体アンタゴニストの１日の用量は、体重７０ｋｇの成人に対し、内服の場合は０．５〜５００ｍｇ、好ましくは２．５〜５０ｍｇ、静脈内投与（輸液）の場合には０．１〜１００ｍｇ／ｈ、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｈであろう。１日に１回ないし数回に分けて投与して、１日の所要用量を投与することができる。
【００１９】
本発明に従ってＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストあるいはそれを含有する組成物を使用した場合、肥満抑制効果が見られる他に、ＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストとしての既知の効果、例えば、高血圧抑制作用なども期待できる。このことは、肥満と高血圧を同時に治療できるという利点にもなる。肥満や高血圧が抑制されることから、それらに伴う種々の疾病、例えば、心疾患（心不全、心臓肥大、心筋梗塞など）や血管障害（例えば、狭心症、動脈硬化、脳血管障害（脳梗塞、脳出血等）など）ならびに代謝症候群等も有効に抑制されうる。ＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストの肥満抑制効果と高血圧抑制等の既知の効果との割合はＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストの種類によって異なる。これらの割合は既知の試験方法により確認することができ、用途に応じてＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストを適宜選択して用いることができる。
【００２０】
本発明の組成物における使用に際して、ＥＴアンタゴニスト、ＥＴ受容体アンタゴニストのいずれかを使用してもよく、両方を使用してもよい。さらに使用するＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストは１種類であってもよく、複数のものであってもよい。ＥＴアンタゴニストおよびＥＴ受容体アンタゴニストは種々のものが見出されており、それらの特性等についてもよく研究されており、適宜選択して用いることができる。また、本発明のスクリーニング方法により見出されたＥＴアンタゴニストおよびＥＴ受容体アンタゴニストを用いてもよい。
【００２１】
有効成分たるＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストのほかに、１種類またはそれ以上の他の薬効成分、例えば、抗肥満物質、抗高血圧物質、心疾患治療物質等が本発明の医薬組成物中に含まれていてもよい。
【００２２】
また本発明は、ＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における肥満の抑制方法にも関する。さらに本発明は、哺乳動物において肥満を抑制するための医薬の製造のための、ＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストの使用にも関する。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、抗肥満活性を有するＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストのスクリーニング方法に関するものである。該方法は、ヒトを除く哺乳動物に候補物質を投与しつつ、該動物における肥満パラメーターをモニターすることを含む。本発明の候補物質は、高血圧抑制等の作用を有する既知のＥＴアンタゴニストおよびＥＴ受容体アンタゴニストのほか、ＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニスト作用を有する可能性のある物質も含まれる。ＥＴアンタゴニスト作用もしくはＥＴ受容体アンタゴニストを有する可能性のある物質は、例えば、既知のＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストとの構造的関連性に基づいて選択してもよく、あるいは、一般的なＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストの同定方法、例えば高血圧抑制作用を指標に同定を行ってもよい。したがって、本発明のスクリーニング方法は、さらに、候補物質を選択あるいは同定する工程を含んでいてもよい。本発明のスクリーニング方法におけるＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストの動物への投与はいかなる方法で行ってもよく、アンタゴニストの特性、動物の種類等により適宜決定することができる。使用動物は、ヒトを除く哺乳動物であればいずれの動物であってもよい。食餌は通常の食餌であってもよいが、肥満を誘発する食餌、例えば、高脂肪食、高糖食、高脂肪・高糖食などが好ましい。肥満パラメーターも種々のものが知られており、例えば、体重、体脂肪率（皮下脂肪率、内臓脂肪率をＣＴにて測定もしくは解剖して重量を測定）、血中レプチン濃度、脂肪細胞のサイズ（解剖後、脂肪組織から脂肪細胞を調製し、その大きさを測定）などが挙げられる。いずれの肥満パラメーターであっても本発明のスクリーニング方法に使用できる。一般的には、対照実験として、候補物質を投与しない系で同様の実験を行い、ＥＴアンタゴニスト候補物質もしくはＥＴ受容体アンタゴニスト候補物質の効果を評価することができる。このようにしてスクリーニングされた抗肥満活性を有する物質を本発明のＥＴアンタゴニストもしくはＥＴ受容体アンタゴニストとして使用することができる。
【００２４】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００２５】
Ｔｉｅ２−Ｃｒｅトランスジェニックマウス（Kisanuki YY, et al. Dev Biol. 2001;230:230-42）とＥＴ−１  Ｆｌｏｘｅｄマウス（Shohet RV, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101:2088-93）を交配することにより血管内皮細胞でのみＥＴ−１を欠損したマウス（ＶＥＥＴＫＯマウス）を作成し、以下の実験を行った。これら２系統のマウスは、Professor Masaaki Yanagisawa, Howard Hughes Medical Institute, Department of Molecular Genetics, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX 75235, U.S.A.から入手した。
【００２６】
雄のＶＥＥＴＫＯマウス（ｎ＝７）、野生型マウス（ＷＴマウス）（ｎ＝７）に対し、図１に示すスキームに従って、生後９週目において通常食（ＮＤ）から高脂肪食（ＨＦＤ）に切り替え、８週間にわたり高脂肪食負荷を行い、体重の推移、食事摂取量を毎週測定した。なお、通常食はマウス・ラット・ハムスター用飼料：ＭＦ（飼育用）（オリエンタル酵母工業株式会社製）であった。
【００２７】
負荷開始直後よりＷＴマウスでは顕著な体重増加を認めたが、ＶＥＥＴＫＯマウスにおける体重増加は乏しく、負荷開始１週後より全負荷期間を通じて両群間での体重差は統計学的に有意差を認めた（図２、図５）。負荷期間中の食事摂取量は両群間に有意差は認めなかった（図３）。負荷８週後、生後１７週齢の外見写真を図４に示す。ＷＴマウスは明らかな肥満を呈しておりＶＥＥＴＫＯマウスとの違いは明瞭である。８週間に渡る高脂肪食負荷の体重増加は両群間で約２倍の差を認めた（図４）。また、負荷後の血糖値は、通常食群と高脂肪食群とでは大きな差が見られたが、高脂肪食負荷ＶＥＥＴＫＯマウスの血糖値は高脂肪食ＷＴマウスのそれよりも明らかに低かった（図５）。負荷後の身長の有意差は実験群間で認められなかった（図５）。
【００２８】
高脂肪食負荷後の各組織の重量を測定し、同期間通常食で過ごした両群と比較したところ（図６、図７）、高脂肪食負荷により脂肪組織量の著明な増加が両群で認められたが、ＷＴマウスの増加に比較しＶＥＥＴＫＯマウスの増加は統計学的有意に軽度であった。また肝臓重量は高脂肪食負荷後のＷＴマウスにおいてのみ増加を認め、骨格筋重量は両群とも増加を認めたが両群間での有意差は認めなかった。心臓、腎臓重量に変化はなかった。
【００２９】
このように、血管内皮細胞特異的ＥＴ−１ノックアウトマウスにおいて、高脂肪食負荷にて肥満の抑制、特に脂肪組織量の増加の抑制が示された。これらの結果は、ＥＴの活性を抑制することにより、肥満を抑制できることを示すものである。すなわち、これらの結果は、ＥＴアンタゴニストおよびＥＴ受容体アンタゴニストが抗肥満作用を発揮し、さらには同時に循環動態を改善することを示すものである。それゆえ、ＥＴアンタゴニストおよびＥＴ受容体アンタゴニストが代謝症候群に対する全く新規の治療薬となることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、哺乳動物における肥満の抑制に使用されるＥＴアンタゴニスト、哺乳動物における肥満の抑制のための、ＥＴアンタゴニストを含有する医薬組成物、ならびに抗肥満活性を有するＥＴアンタゴニストのスクリーニング方法を提供するものであるので、肥満およびその関連疾患ならびに代謝症候群の新規治療および予防用医薬の製造、ならびにそれらの病理の研究用の試薬の製造等の分野などにおいて利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、投餌スキームを示す図である。
【図２】図２は、ＶＥＥＴＫＯマウスおよびＷＴマウスの体重変化を示すグラフである。
【図３】図３は、ＶＥＥＴＫＯマウスおよびＷＴマウスの摂餌量を示すグラフである。折れ線グラフは、ＨＦＤ負荷期間中の１日の平均摂餌量（１週間ごと）を示し、棒グラフはＨＦＤ負荷期間中の総摂餌量を示す。
【図４】図４は、ＨＦＤ負荷後のＶＥＥＴＫＯマウスおよびＷＴマウスの外観を示す写真および体重増加量を示す棒グラフである。
【図５】図５は、ＨＦＤ負荷後の各群の体重、身長および血糖値を比較した棒グラフである。実験群は、ＨＦＤ／ＶＥＥＴＫＯ（ＨＦＤを与えたＶＥＥＴＫＯマウス）、ＨＦＤ／ＷＴ（ＨＦＤを与えたＷＴマウス）、ＮＤ／ＶＥＥＴＫＯ（ＮＤを与えたＶＥＥＴＫＯマウス）およびＮＤ／ＷＴ（ＮＤを与えたＷＴマウス）であった。
【図６】図６は、ＨＦＤ負荷後の各群の脂肪組織量を比較した棒グラフである。実験群は図５と同じである。
【図７】図７は、ＨＦＤ負荷後の各群の主要器官重量を比較した棒グラフである。実験群は図５と同じである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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