(57)【要約】【課題】高価な装置及び複雑な解析を必要とせず、遺伝子の変異の有無のみを迅速に決定するマススクリーニングに適した方法を提供すること。【解決手段】固相上に変異のない検体核酸の塩基配列に対する完全対合プローブスポット、１塩基ミスマッチプローブスポット、及び２塩基若しくはそれ以上のミスマッチプローブスポットが配置されているアレイを用意する工程１；アレイと検体とをハイブリダイゼーション反応させる工程２；及び工程２によって得られたアレイのスポットからのシグナルを、アレイ上の複数のスポットを含む領域内の、複数のスポットからのシグナルの総和として検出する検出装置を用いて検出する工程、を少なくとも行い、前記領域の複数を特定のシグナルの関係が得られるように設け、測定対象検体からの工程２での結果と、変異のない検体からの工程２での結果を対比し、変異の有無を判定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相上に複数のプローブスポットを配置したアレイを用いた、検体核酸中の変異の有無を判定する方法であって、
（ｉ）固相上に変異のない該検体核酸の塩基配列に対する完全対合プローブスポット、１塩基ミスマッチプローブスポット、及び２塩基若しくはそれ以上のミスマッチプローブスポットが配置されているアレイを用意する工程と、
（ｉｉ）該アレイと検体とをハイブリダイゼーション反応させる工程と、
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）によって得られたアレイのスポットからのシグナルを、アレイ上の複数のスポットを含む領域内の、該複数のスポットからのシグナルの総和として検出する検出装置を用いて検出する工程と、
を有するものであり、
該アレイは、前記領域を複数備え、
前記領域の第１に前記完全対合プローブスポットを含み、
前記領域の第２に前記２塩基若しくはそれ以上のミスマッチプローブを含み、前記完全対合プローブ及び該１塩基ミスマッチプローブを含まず、
各領域が含むスポット数は互いに同じであり、
各々の領域内のスポットと標識を付した変異のない前記検体核酸とをハイブリダイゼーション反応させたときに各領域内のスポットの各々が示すシグナルの総和を各領域のシグナル強度としたときの、各スポットと変異のない該検体核酸とを前記所定の条件でハイブリダイズさせた結果として各領域から得るシグナル強度が、該第１の領域で最大となり、且つ該第２の領域で実質的にゼロとなるものであり、
前記工程（ｉｉ）におけるハイブリダイゼーション反応は、前記所定の条件の下で行うものであり、更に
前記工程（ｉｉｉ）は、前記（ｉｉ）によって得られたアレイの各領域のシグナル強度を、該ＤＮＡアレイと変異のない前記検体核酸とを上記所定の条件でハイブリダイズさせた結果として得られる各領域のシグナル強度と対比し、各領域におけるシグナル強度の変化に基づき該検体核酸の変異の有無を判定する工程を含む
ことを特徴とする検体核酸中の変異の有無を判定する方法。
【請求項２】
前記スポットからのシグナルが光である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記検出装置が、エリアセンサーまたはラインセンサーである請求項２記載の方法。
【請求項４】
固相上に複数のプローブスポットを配置したアレイを用いた、検体核酸中の変異の有無を検出する方法であって、
（ｉ）固相上に変異のない該検体核酸の塩基配列に対する完全対合プローブスポット、１塩基ミスマッチプローブスポット、２塩基ミスマッチプローブスポット及び３塩基若しくはそれ以上のミスマッチプローブスポットが配置されているアレイを用意する工程と、
（ｉｉ）該アレイと検体とをハイブリダイゼーション反応させる工程と、
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）によって得られたアレイのスポットからのシグナルを、アレイ上の複数のスポットを含む領域内の、該複数のスポットからのシグナルの総和として検出する検出装置を用いて検出する工程を有するものであり、
該アレイは、前記領域を複数備え、
前記領域の第１に前記完全対合プローブスポットを含み、
前記領域の第２に前記１塩基ミスマッチプローブスポットを含み前記完全対合プローブを含まず、
前記領域の第３に前記２塩基ミスマッチプローブスポットを含み前記完全対合プローブスポットを含まず、
前記領域の第４に前記３塩基若しくはそれ以上のミスマッチプローブを含み前記完全対合プローブスポット及び前記１塩基ミスマッチプローブスポットを含まず、
各領域が含むスポット数は互いに同じであり、
各々の領域内のスポットと標識を付した変異のない前記検体核酸とをハイブリダイゼーション反応させたときに各領域内のスポットの各々が示すシグナルの総和を各領域のシグナル強度としたときの、各スポットと変異のない該検体核酸とを前記所定の条件でハイブリダイズさせた結果として各領域から得るシグナル強度が、該第１の領域で最大となり、該第４の領域で実質的にゼロとなるものであり、
前記工程（ｉｉ）におけるハイブリダイゼーション反応は、前記所定の条件の下で行うものであり、更に
前記工程（ｉｉｉ）は、前記工程（ｉｉ）によって得られたアレイの各領域のシグナル強度を、該アレイと変異の無い該検体核酸とを上記所定の条件でハイブリダイゼーション反応させた結果として得られるアレイの各領域のシグナル強度と対比し、各領域におけるシグナル強度の変化に基づき該検体核酸中の変異の有無を判定する工程を含む
ことを特徴とする検体核酸中の変異の有無を判定する方法。
【請求項５】
前記スポットからのシグナルが光である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記検出装置が、エリアセンサーまたはラインセンサーである請求項５記載の方法。
【請求項７】
固相上に複数のプローブスポットを配置したアレイを用いた、検体核酸中の変異の有無を判定する方法であって、
（ｉ）固相上に変異のない該検体核酸の塩基配列に対する完全対合プローブスポット、１塩基ミスマッチプローブスポット、及び２塩基若しくはそれ以上のミスマッチプローブスポットが配置されているアレイを用意する工程と、
（ｉｉ）該アレイと検体とをハイブリダイゼーション反応させる工程と、
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）によって得られたアレイのスポットからのシグナルを、アレイ上の複数のスポットを含む領域内の、該複数のスポットからのシグナルの総和として検出する検出装置を用いて検出する工程を有するものであり、
該アレイは、前記領域を複数備え、
前記領域の第１に前記完全対合プローブスポットを含み、
前記領域の第２に前記２塩基若しくはそれ以上のミスマッチプローブを含み、前記完全対合プローブ及び該１塩基ミスマッチプローブを含まず、
各々の領域内のスポットと標識を付した変異のない前記検体核酸とをハイブリダイゼーション反応させたときに各領域内のスポットの各々が示すシグナルの総和を各領域のシグナル強度としたときの、各スポットと変異のない該検体核酸とを前記所定の条件でハイブリダイズさせた結果として各領域から得るシグナル強度が、該第１の領域で最大となり、且つ該第２の領域で実質的にゼロとなるものであり、
前記工程（ｉｉ）におけるハイブリダイゼーション反応は、前記所定の条件の下で行うものであり、更に
前記工程（ｉｉｉ）は、前記（ｉｉ）によって得られたアレイの変異のない検体核酸との反応の結果として得られる第１の領域と第２の領域のシグナル強度の関係と、前記検体核酸との反応の結果として得られる第１の領域と第２の領域のシグナル強度の関係との違いから変異の有無を判定する工程を含む
ことを特徴とする検体核酸中の変異の有無を判定する方法。
【請求項８】
前記スポットからのシグナルが光である請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記検出装置が、エリアセンサーまたはラインセンサーである請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の変異のスクリーニングなどに有用な変異検出方法及び変異検出システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸等の物質の配列を決定し、或いはその配列をチェックする手法のひとつにＤＮＡアレイを利用する方法がある。ＵＳＰ５４４５９３４には、１インチ角に１０万個以上のオリゴヌクレオチドプローブを結合したＤＮＡアレイの開示がある。このようなＤＮＡアレイは、少量の検体で一度に多項目を検査できるという利点がある。チップ上に配置したこのようなＤＮＡアレイに対して蛍光標識した調べたい試料を流すと、チップ上のプローブと相補的な配列を有するＤＮＡ断片はプローブと結合してハイブリッド体を形成し、このハイブリッド体が形成された部分だけを蛍光により識別できるようにしておくことでＤＮＡ試料中のＤＮＡ断片の配列を解明することができる。
【０００３】
Sequencing by Hybridization(SBH)法は、このようなＤＮＡアレイを利用し塩基配列を調べる方法で、ＵＳＰ５２０２２３１にその詳細が記載されている。ＳＢＨ法では、ある長さについて可能なオリゴヌクレオチドの全配列を基板上に並べ、検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応によって形成される完全に相補的なハイブリッドを検出するもので、完全に相補的なハイブリッド体のセットを得れば、そのセットは、ある配列について１塩基ずつずれた配列の集合になるはずであり、それらを抽出して判定を行うものである。
【０００４】
ＳＢＨに限らず、オリゴヌクレオチドと検体ＤＮＡの相補性を調べるときには、ひとつの検査項目について１種類のプローブでハイブリッドの有無を判定することは非常に難しい。それは、ハイブリッドの安定性がそれぞれの配列により異なり、完全に相補的であると判定できるシグナルの絶対値というものが存在しないからである。そこで、完全マッチのものと、完全マッチのものより幾分強度が弱くなる１塩基のミスマッチを含むハイブリッド体のシグナル強度を比較して判定する方法がＳｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．２７４ ｐ６１０−６１４，１９９６に記載されている。この方法では、１５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドのプローブ配列の真ん中に１塩基ミスマッチを配した配列を用意し、完全マッチと１塩基ミスマッチとのハイブリッド由来の蛍光強度を比較し、完全マッチの方が強度がある割合以上強いときにポジティブと判定する。
【０００５】
さらに、ＵＳＰ５７３３７２９にはより正確な判定を行うために、得られたハイブリッド体の蛍光強度の比較から検体の塩基配列を知るためのコンピューターを用いた方法に関する記載がある。
【特許文献１】米国特許第５４４５９３４号明細書
【特許文献２】米国特許第５２０２２３１号明細書
【特許文献３】米国特許第５７３３７２９号明細書
【非特許文献１】Science vol.274 p610-614, 1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、実際には各ハイブリッドにおける結合の強さは、それぞれの塩基配列中のＧＣ含量等によっても異なり、完全マッチ配列と１塩基ミスマッチ配列との強度差も配列によってかなり幅がある。そのため、上述のような１５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用い、真ん中に１塩基ミスマッチを有する他の３種類のプローブとの比較を行って完全マッチか否かを判定するという方法は、それぞれの安定性を、理論的に或いは経験的に評価し、それとの比較を行うことによってより精度を得ることができる。
【０００７】
また、これらの正確な判定のためには、シグナルの高精度定量が必要になり、通常、共焦点レーザー顕微鏡のような精密な装置が必要である。さらに、ひとつひとつのプローブに関してそのハイブリッド体の強度を計測し、その値を解析して遺伝子配列を決定、判定するためには、アレイを読みとる検出装置の他に、更に大がかりなコンピューター装置を必要とし、誰もが容易にＤＮＡアレイを利用する場合の障害になる。
【０００８】
一方、このようなＤＮＡアレイを用いた遺伝子診断は、集団検診や個々人の遺伝子検査、或いは、遺伝子多系の研究にも利用しうるが、このような特定項目について大部分が正常な中から変異している検体を探し出すといった大量の検体を迅速に安価に処理するという用途には、必ずしも上述のような精密な測定及び解析は必要ない。しかも、上記のような精密な装置および解析はコストがかかる。そこで、先ずは変異の有無をスクリーニングし、スクリーニングの結果変異が疑われる場合にのみ、詳細な検査を行うという考え方がコスト上でも、時間の上でも節約になる。
【０００９】
本発明はこのような問題点に鑑みなされたものであり、本発明の目的は高価な装置及び複雑な解析を必要とせず、遺伝子の変異の有無のみを迅速に決定するマススクリーニングに適した方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、遺伝子に関する情報により既に正常な遺伝子と変異している遺伝子の塩基配列が確定されている場合について、正常な遺伝子とハイブリッドを形成した場合に強いシグナルを与えるプローブ配列群と、変異している遺伝子とハイブリッドを形成すると予想される配列を持つプローブ群とを別々の領域に配置したＤＮＡアレイを提供する。また、このようなアレイを用いた検出方法を提供することで上記の目的を達成するものである。
【００１１】
本発明の検体核酸中の変異の有無を判定する方法の第１の態様は、
固相上に複数のプローブスポットを配置したアレイを用いた、検体核酸中の変異の有無を判定する方法であって、
（ｉ）固相上に変異のない該検体核酸の塩基配列に対する完全対合プローブスポット、１塩基ミスマッチプローブスポット、及び２塩基若しくはそれ以上のミスマッチプローブスポットが配置されているアレイを用意する工程と、
（ｉｉ）該アレイと検体とをハイブリダイゼーション反応させる工程と、
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）によって得られたアレイのスポットからのシグナルを、アレイ上の複数のスポットを含む領域内の、該複数のスポットからのシグナルの総和として検出する検出装置を用いて検出する工程と、
を有するものであり、
該アレイは、前記領域を複数備え、
前記領域の第１に前記完全対合プローブスポットを含み、
前記領域の第２に前記２塩基若しくはそれ以上のミスマッチプローブを含み、前記完全対合プローブ及び該１塩基ミスマッチプローブを含まず、
各領域が含むスポット数は互いに同じであり、
各々の領域内のスポットと標識を付した変異のない前記検体核酸とをハイブリダイゼーション反応させたときに各領域内のスポットの各々が示すシグナルの総和を各領域のシグナル強度としたときの、各スポットと変異のない該検体核酸とを前記所定の条件でハイブリダイズさせた結果として各領域から得るシグナル強度が、該第１の領域で最大となり、且つ該第２の領域で実質的にゼロとなるものであり、
前記工程（ｉｉ）におけるハイブリダイゼーション反応は、前記所定の条件の下で行うものであり、更に
前記工程（ｉｉｉ）は、前記（ｉｉ）によって得られたアレイの各領域のシグナル強度を、該ＤＮＡアレイと変異のない前記検体核酸とを上記所定の条件でハイブリダイズさせた結果として得られる各領域のシグナル強度と対比し、各領域におけるシグナル強度の変化に基づき該検体核酸の変異の有無を判定する工程を含む
ことを特徴とする。
【００１２】
本発明の検体核酸中の変異の有無を判定する方法の第２の態様は、
固相上に複数のプローブスポットを配置したアレイを用いた、検体核酸中の変異の有無を検出する方法であって、
（ｉ）固相上に変異のない該検体核酸の塩基配列に対する完全対合プローブスポット、１塩基ミスマッチプローブスポット、２塩基ミスマッチプローブスポット及び３塩基若しくはそれ以上のミスマッチプローブスポットが配置されているアレイを用意する工程と、
（ｉｉ）該アレイと検体とをハイブリダイゼーション反応させる工程と、
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）によって得られたアレイのスポットからのシグナルを、アレイ上の複数のスポットを含む領域内の、該複数のスポットからのシグナルの総和として検出する検出装置を用いて検出する工程を有するものであり、
該アレイは、前記領域を複数備え、
前記領域の第１に前記完全対合プローブスポットを含み、
前記領域の第２に前記１塩基ミスマッチプローブスポットを含み前記完全対合プローブを含まず、
前記領域の第３に前記２塩基ミスマッチプローブスポットを含み前記完全対合プローブスポットを含まず、
前記領域の第４に前記３塩基若しくはそれ以上のミスマッチプローブを含み前記完全対合プローブスポット及び前記１塩基ミスマッチプローブスポットを含まず、
各領域が含むスポット数は互いに同じであり、
各々の領域内のスポットと標識を付した変異のない前記検体核酸とをハイブリダイゼーション反応させたときに各領域内のスポットの各々が示すシグナルの総和を各領域のシグナル強度としたときの、各スポットと変異のない該検体核酸とを前記所定の条件でハイブリダイズさせた結果として各領域から得るシグナル強度が、該第１の領域で最大となり、該第４の領域で実質的にゼロとなるものであり、
前記工程（ｉｉ）におけるハイブリダイゼーション反応は、前記所定の条件の下で行うものであり、更に
前記工程（ｉｉｉ）は、前記工程（ｉｉ）によって得られたアレイの各領域のシグナル強度を、該アレイと変異の無い該検体核酸とを上記所定の条件でハイブリダイゼーション反応させた結果として得られるアレイの各領域のシグナル強度と対比し、各領域におけるシグナル強度の変化に基づき該検体核酸中の変異の有無を判定する工程を含む
ことを特徴とする。
【００１３】
本発明の検体核酸中の変異の有無を判定する方法の第３の態様は、
固相上に複数のプローブスポットを配置したアレイを用いた、検体核酸中の変異の有無を判定する方法であって、
（ｉ）固相上に変異のない該検体核酸の塩基配列に対する完全対合プローブスポット、１塩基ミスマッチプローブスポット、及び２塩基若しくはそれ以上のミスマッチプローブスポットが配置されているアレイを用意する工程と、
（ｉｉ）該アレイと検体とをハイブリダイゼーション反応させる工程と、
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）によって得られたアレイのスポットからのシグナルを、アレイ上の複数のスポットを含む領域内の、該複数のスポットからのシグナルの総和として検出する検出装置を用いて検出する工程を有するものであり、
該アレイは、前記領域を複数備え、
前記領域の第１に前記完全対合プローブスポットを含み、
前記領域の第２に前記２塩基若しくはそれ以上のミスマッチプローブを含み、前記完全対合プローブ及び該１塩基ミスマッチプローブを含まず、
各々の領域内のスポットと標識を付した変異のない前記検体核酸とをハイブリダイゼーション反応させたときに各領域内のスポットの各々が示すシグナルの総和を各領域のシグナル強度としたときの、各スポットと変異のない該検体核酸とを前記所定の条件でハイブリダイズさせた結果として各領域から得るシグナル強度が、該第１の領域で最大となり、且つ該第２の領域で実質的にゼロとなるものであり、
前記工程（ｉｉ）におけるハイブリダイゼーション反応は、前記所定の条件の下で行うものであり、更に
前記工程（ｉｉｉ）は、前記（ｉｉ）によって得られたアレイの変異のない検体核酸との反応の結果として得られる第１の領域と第２の領域のシグナル強度の関係と、前記検体核酸との反応の結果として得られる第１の領域と第２の領域のシグナル強度の関係との違いから変異の有無を判定する工程を含む
ことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、高価な装置及び複雑な解析を必要とせず、遺伝子の変異の有無のみを迅速に決定するマススクリーニングに適した方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の検体核酸中の変異の有無を判定する方法に関連する技術として以下の各態様を挙げることができる。
（１）検体核酸中における変異を監視するための変異判定方法であって、検体核酸の被部検出部に対し完全に相補的である完全対合プローブと、該被検出部に対して不対合な塩基を少なくともひとつ備える複数種の不対合プローブとを含む複数種のプローブを、基板上の所定の複数の区分領域中に分配配置して固定したＤＮＡアレイ基板を用意する工程と、該ＤＮＡアレイ基板上のプローブに対して検体核酸を反応させる工程と、前記プローブのいずれかと前記検体核酸とのハイブリッド体の形成に基づくシグナルを、前記複数の区分領域ごとの全シグナルとして測定する工程と、前記複数の区分領域ごとの全シグナルの変化のパターンから前記検体の核酸中の変異を判定する工程とを有することを特徴とする変異判定のための方法。
（２）前記区分領域毎の全シグナルが、前記ハイブリッド体の形成に基づく発光による１つの区分領域全体からの総光量である上記（１）項に記載の方法。
（３）前記発光が蛍光の発光である上記（２）項に記載の方法。
（４）前記発光が化学発光である上記（２）項に記載の方法。
（５）前記複数種のプローブを用いて、正常検体核酸と反応した場合に強いシグナルを与え得る少なくとも１種のプローブを含む区分領域と、正常検体核酸と反応した場合に弱いシグナルを与える得る少なくとも１種のプローブを含む区分領域と、正常検体核酸と反応した場合にハイブリッドを形成しない少なくとも１種のプローブを含む区分領域とをそれぞれを独立して所定の配列で配置した区分領域群を基板上に用意し、該区分領域群に対して正常検体核酸を反応させて、該区分領域群中の測定対象区分領域毎の全シグナルを測定し、該測定対象区分領域の配列に応じた全シグナルの第１の変化パターンを予め得る工程と、該ＤＮＡ基板の区分領域群に対して検体核酸を反応させて、該区分領域群中の測定対象区分領域毎の全シグナルを測定し、該測定対象区分領域の配列に応じた全シグナルの第２の変化パターンを得る工程と、前記第１の変化パターンと前記第２の変化パターンとを比較して、前記検体核酸中の変異の有無を判定する工程と、を有することを特徴とする上記（１）項に記載の方法。
（６）前記測定対象区分領域が、正常検体核酸と反応した場合に全シグナルが最も強い区分領域と、全シグナルが最も弱い（シグナルがない場合を含む）区分領域である上記（５）に記載の方法。
（７）前記区分領域群を構成する各区分領域が、シグナル測定装置の検出部の前記基板に対する相対的な移動方向において、正常検体核酸と反応した場合に全シグナルの最も強い領域から、全シグナルの強度が順に弱くなるように並べてある上記（５）項に記載の方法。
（８）前記区分領域群に正常検体核酸と反応した場合に全シグナルがゼロである区分領域を設け、該区分領域に検体核酸との反応で測定される全シグナルを測定し、シグナルが検出された場合に変異があるとする上記（５）項に記載の方法。
（９）前記正常検体核酸と反応した場合に全シグナルが最も強い区分領域が、正常検体核酸との完全対合プローブと、正常検体核酸と不対合な塩基が１塩基であるプローブを含む上記（５）または（６）項に記載の方法。
（１０）全シグナルの検出がエリアセンサーで行われる上記（５）または（６)項に記載の方法。
（１１）全シグナルの検出がラインセンサーで行われる上記（７）項に記載の方法。
（１２）前記複数種のプローブの長さが８ｍｅｒから３０ｍｅｒの長さである上記（１）〜（１１）項いずれかに記載の方法。
（１３）該複数種のプローブの長さが１２ｍｅｒから２５ｍｅｒの長さである上記（１２）項に記載の方法。
（１４）検体の核酸中における変異を監視するためのＤＮＡアレイ基板であって、基板上に、検体核酸に対し完全に相補的である完全対合プローブと、該検体に対して不対合な塩基を少なくともひとつ備える複数種の不対合プローブとからなる複数種のプローブが配置されており、正常な塩基配列と反応した場合において、強いシグナルを与える少なくとも１種のプローブが配置された区分領域と、弱いシグナルを与える少なくとも１種のプローブが配置された区分領域及びシグナルを与えない少なくとも１種のプローブが配置された区分領域の少なくとも一方がそれぞれが独立して配置されていることを特徴とするＤＮＡアレイ基板。
（１５）前記シグナルが蛍光である上記（１４）項に記載のＤＮＡアレイ基板。
（１６）前記シグナルが化学発光である上記（１４）項に記載のＤＮＡアレイ基板。
（１７）該強いシグナルを与える区分領域が完全対合プローブと、該検体に対して不対合な塩基を１つ備える不対合プローブと、含む上記（１４）項に記載のＤＮＡアレイ基板。
（１８）前記複数の区分領域がシグナル測定装置での測定方向において、正常検体核酸と反応した場合に全シグナルの最も強い領域から、全シグナルの強度が順に弱くなるように並べてある上記（１４）項に記載のＤＮＡアレイ基板。
（１９）前記複数種のプローブの長さが８ｍｅｒから３０ｍｅｒの長さである上記（１４）〜（１８）項のいずれかに記載のＤＮＡアレイ基板。
（２０）該複数種のプローブの長さが１２ｍｅｒから２５ｍｅｒの長さである上記（１９）項に記載の方法。
（２１）上記（１４）〜（２０）項のいずれかに記載のＤＮＡアレイ基板と、該ＤＮＡアレイ基板の区分領域からのシグナルを測定するシグナル測定装置とを有することを特徴とする変異検出システム。
【００１６】
そして、これらの関連する技術に基づいてなされた本発明には、先に挙げた第１〜第３の態様が含まれる。
【００１７】
本発明について、区分領域からのシグナルが蛍光である場合を例として以下に説明を行うが、本発明におけるシグナルは蛍光に限定されたものではなく、他の光学発光によるシグナルでも良く、更に電気的なものでも良い。
【００１８】
まず、ハイブリッド体を構成する核酸鎖間の結合に関しては、その強度は種々の要因によって支配されており、１５ｍｅｒから２０ｍｅｒ程度の長さのプローブを用いた場合に、１塩基ミスマッチを有するハイブリッド体を完全に除くことは実用上困難である。
【００１９】
蛍光といった光による検出においてハイブリッド体がシグナルを発する場合を例に取ると、２塩基ミスマッチを有する配列では、２塩基ミスマッチの位置、連続、不連続にかかわらず、１塩基ミスマッチ体よりは急激に安定性が低くなり、３塩基ミスマッチ体ではほとんどシグナルが観測されない。しかし、１塩基ミスマッチ体では強度が完全マッチの５０％程度有することもあり得る。正常な核酸の場合には、完全対合プローブ（完全マッチプローブ）及び不対合の塩基が１つである不対合プローブ（１塩基ミスマッチプロープ）が配置された領域で際だった光量を示し、一方、ハイブリッドの安定性が低い領域では総光量は限りなくゼロに近い。それに対し、変異を持つ核酸が完全に相補的であるプローブは、正常核酸に対応するプローブとはミスマッチを示し、正常核酸において高い蛍光が期待される区分領域の蛍光強度は弱くなる。また、正常核酸との反応ではシグナルが低いと予想されている区分領域に完全マッチ或いは１塩基ミスマッチに由来する蛍光が出現する。従って、区分された領域毎の蛍光分布を比較することにより正常核酸と変異核酸とを区別することが可能になる。
【００２０】
このような判定をより精度良く行うためのひとつの手段として、本発明では、正常核酸で各プローブとのハイブリダイゼーション反応を行い、その結果得られる各区分領域毎の蛍光強度を基に、強い強度を与えるプローブ群を有する区分領域と、蛍光を与えないプローブ群を有する区分領域と、弱い蛍光を発する中間的な蛍光強度のプローブ群を有する区分領域に区分けし、これらを基板上に所定の配列で配置したＤＮＡ基板を用いる。
【００２１】
検査を同時多項目行おうとする場合には、それぞれの項目のプローブに対して完全マッチ、ミスマッチの蛍光強度を評価し、全て統合してその強度に順番付けを行い、上記グループに分別し並べることが重要になる。このように区分領域を所定に配列で並べることで、この配列に応じた全シグナルの変化のパターンを得ることができ、正常核酸で得られた変化のパターンを予め特定しておき、検出対象である核酸で得られた変化のパターンをこれと比較して変異を検出することができる。
【００２２】
その並べ方はセンサーの種類によって決めることができる。例えば、仮に、各区分領域が、正常核酸と反応した場合に蛍光強度の強い順に基板の左端から並べられている場合には、ラインセンサーを用いて検出すると、蛍光強度は左端で最大で、徐々に減少し、基板の右端に近づくに連れてゼロの領域が続く。また、領域をエリアセンサーで評価する場合には、最大蛍光を与えるプローブ群を有する区分領域と蛍光を与えないプローブ群を有する検出対象としての区分領域の最低２カ所の蛍光光量評価が必要となる。
【００２３】
さらに具体的に説明する。
【００２４】
本発明では、例えば、ＤＮＡアレイ上に正常核酸とハイブリッドを形成するプローブを含む区分領域と、変異遺伝子とハイブリッドを形成するプローブを含む区分領域とを独立して設定し、正常核酸に対応するプローブ群とのハイブリッド体からのシグナルと、変異遺伝子とのハイブリッド体からのシグナルとの比をとることにより、正常か否かを判定する方法が利用される。
【００２５】
しかし、実際には変異核酸として正常核酸と１塩基のみ異なるプローブのみを選択したのではその比は２倍程度にしかならず、一部に変異遺伝子を含んでも総光量としての変化は少なく判定が困難である。
【００２６】
そこで、より正確な判定を行うために、本発明では、マススクリーニングにおいて大部分の検体が示す正常な核酸配列に対して、完全マッチ配列および１塩基ミスマッチ配列であるプローブをＤＮＡアレイ基板上の特定の領域に集めて配置する。さらに、２塩基ミスマッチ、３塩基ミスマッチのような低い安定性を示すプローブを、上記高い安定性を示す領域とは異なる領域に配置する方法が好ましい。そして、このように配置されたＤＮＡアレイ基板を用いてハイブリダイゼーション反応を行ない、各区分領域についてシグナルの総量を測定し、検出対象としての核酸からの測定パターンを正常核酸で得られる測定パターンと対比させて、変異の有無を検定することができる。
【００２７】
例えば１８塩基長のプローブ中に３カ所に異なる塩基を配置した配列６４種（４×４×４＝６４）の場合（表１：各配列は左側が５'末端で右側が３'末端である）には、どのようなサンプルを用いても完全に一致する配列は１種類存在するはずであり、さらに９種が１塩基ミスマッチ、２７種が２塩基ミスマッチ、残り２７種が３塩基ミスマッチとなるはずである。そして、完全マッチ配列と１塩基ミスマッチ配列では蛍光が観察され、３塩基ミスマッチでは蛍光は観察されないようなハイブリダイゼーション反応の条件を設定することは比較的容易である。２塩基ミスマッチに関しては、配列によりハイブリッド体を形成するものとしないものとがある。
【００２８】
【表１】
2006109841.tif 000002
【００２９】
これらの６４種のプローブを強度の強い方から８プローブ毎にグループ分けを行なうと、第１グループの蛍光強度は極めて強く、第６、７、８番目のグループの総蛍光量はゼロになるはずである。このような蛍光強度による分類は、経験的に行っても、計算により理論的に行っても良い。
【００３０】
次に、実際の系についてハイブリダイゼーション反応を行い、分類されたグループ毎の蛍光量の総量を測定する。特に第６、７、８番目のグループの蛍光量は重要な意味を持つ。これらのグループは蛍光量が検出されないことが予想されるが、期待に反し蛍光が検出された場合には、検体は正常ではなくその配列の一部に変異を有することがわかる。蛍光が検出されない場合、その多くは正常な配列の場合である。
【００３１】
しかし、より正確さを期するために第１グループの蛍光量を正常な場合と比較することが必要である。正常な配列のハイブリダイゼーション反応から期待される値より明らかに低い場合には、塩基の変異が疑われる。さらに中間の蛍光強度を持つ領域、つまり第２、３、４グループの蛍光強度分布（蛍光の変化のパターン）を正常なものと比べなければならない。
【００３２】
上記方法のさらに効果的な変異の検出方法として、プローブを片方の端からの完全マッチ、１塩基ミスマッチ、２塩基ミスマッチ、３塩基ミスマッチという具合に、シグナル強度が高い方から低い方へ順番に並べ、完全マッチのプローブが配置されている領域とは反対の領域ではシグナルがゼロになるように配置する方法が考えられる。この場合には全体の蛍光強度分布パターンが判定の基準となる。例えば、図１（ａ）に示す区分領域（縦一列が一つの区分領域となる）の配置を用いた場合、正常な場合には図１（ｂ）に示すような単調減少のパターンを示し、変異がある場合には中間部分にピークを持つようなパターンに変化する。
【００３３】
上記配置方法は多項目検査用プローブが同一基板上に配置された場合でも同様である。すべての項目について、先ず完全にマッチするプローブ配列、１塩基ミスマッチ配列、２塩基ミスマッチ配列といった具合に、蛍光強度が強いと予想される順に並べる。
【００３４】
このような考え方は、単に３塩基についての変異を評価する上記方法に限らず、変異の数に制限なく普遍的に適応できる。
【００３５】
なお、正常核酸とプローブとがハイブリッド体が形成された場合にシグナルが得られる場合について説明したが、シグナルを発生させる方式によっては、ハイブリッド体が形成された場合にシグナルが得られず、ハイブリッド体が形成されない場合にシグナルが得られるようにしてもよい。
【００３６】
検体としての核酸としては、検査対象としての遺伝子から、必要に応じて検出に必要な部分を取出して用いることができる。更に、対照として用いる正常核酸は、既知の配列から合成して用いることができる。
【００３７】
基板上に固定するプローブの長さは、検出に適合した長さとすればよく、例えば８ｍｅｒ〜３０ｍｅｒの範囲が好ましく、１２ｍｅｒ〜２５ｍｅｒの範囲がより好ましい。
【００３８】
基板へのプローブの固定は、種々の方法で行なうことができるが、プローブが固定したスポットを高密度で効率良く、高速で配置するためには、インクジェット方式による液滴付与を利用することが好ましい。また、区分領域内に付与するプローブの量は、各スポットは、７０〜１００μｍが好ましく、間隔は各スポットが連結しない程度にすることが好ましい。
【００３９】
スポット数は、蛍光強度が強いと予想されるスポットのみが、まとめて測定でき、蛍光が全く期待されないスポットが、まとめて一度に測定できるようにセンサの構成を考えて設定する。
【００４０】
本発明の変異検出システムは、複数の区分領域が所定の配列で配置されたＤＮＡアレイ基板と、測定対象区分領域でのシグナルの測定装置とを有する。なお、複数の区分領域を設けたＤＮＡアレイ基板を用いた変異の有無の判定においては、全部の区分領域からのシグナルを検出し、その結果を変異の有無の判定に利用する方法、あるいは変異の有無を検出できるように選択した一部の区分領域からのシグナルを検出する簡便法を用いることができる。
【００４１】
この検出システムでは、コンピュータと接続させて、区分領域の配列に応じた各区分領域からの全シグナルの測定値をコンピュータで解析して全シグナルの変化のパターンを作成させて記憶させて、基準となる正常核酸からの変化のパターンと検体からの変化のパターンを比較させて、変異の可能性の有無の判定を出力させることができる。
【００４２】
シグナル検知用のセンサーとしては、各種フォトダイオード（例えば、浜松ホトニクス社製等）、例えば分割型シリコンフォトダイオードアレイでは、各種ラインセンサ及びエリアセンサとして使用することが可能なものがあり、特に受光面サイズが１ないし２ｍｍ×（２〜３）ｍｍのものが好適に用いられる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。なお、以下における「％」は「質量％」を示す。
実施例１
変異遺伝子検出用のＤＮＡアレイ作製（ラインセンサー用）
１）６４種のプローブが結合したＤＮＡアレイ作製
（１）プローブの設計
癌抑制遺伝子であるｐ５３遺伝子の２４８番目、２４９番目のアミノ酸配列に対応する塩基配列ＣＧＧＡＧＧの中での変異の中で頻度が高いのは、１番目のＣがＴに、２番目のＡがＧに、そして２４９番目のアミノ酸３番目のＧがＴに変異している場合であることが知られている。そこで、この３カ所の塩基配列に着目して６４種のプローブを設計した。
【００４４】
つまり、プローブ全長を１８ｍｅｒとし、その真ん中にこの変異を含む６塩基を位置させ、その前後を共通配列で挟んだ構造で、５'−ＡＴＧＡＡＣＮＮＧＡＧＮＣＣＣＡＴＣ−３'である。ここで、Ｎと表した部分が４種の核酸塩基であるＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔに対応する。プローブＤＮＡは、検出したい配列（上記配列）と相補的な配列であるので、実際には、５'−ＧＡＴＧＧＧＮＣＴＣＮＮＧＴＴＣＡＴ−３'となる。
【００４５】
図２には６４種ＤＮＡプローブのＤＮＡアレイ上での配置図を示した。正常な遺伝子に相当する配列である５'−ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣ−３'は、右から３列目、上から３行目の位置にある４２番のプローブＤＮＡ５'−ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴ−３'とハイブリッドを形成することが期待される。
（２）マレイミド基導入基板の作製
（基板洗浄）
１インチ角のガラス板をラックに入れ、超音波洗浄用洗剤に一晩漫した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。蒸留水ですすいだ後、蒸留水のはいった容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、あらかじめ加温してあった１Ｎ水酸化ナトリウム溶液に１０分間漫した。引き続き水洗、蒸留水洗浄を行った。
【００４６】
（表面処理）
１％シランカップリング剤水溶液（信越化学工業社製、商品名ＫＢＭ６０３）に室温で２０分浸し、その後、窒素ガスを両面に吹き付けて、水分を飛ばし、乾燥させた。１２０℃に加熱したオーブンで１時間ベークしシランカップリング処理を完結させた。続いて、ＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：Ｄｏｊｉｎ社製）を２．７ｍｇ秤量し、ＤＭＳＯ／エタノールの１：１溶液に溶解した（最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌ）。シランカップリング剤処理を行ったガラス基板をこのＥＭＣＳ溶液に２時間浸し、シランカップリング剤のアミノ基とＥＭＣＳ溶液のカルボキシル基を反応させた。この状態でガラス表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が表面に存在することになる。ＥＭＣＳ溶液と反応させたガラス板は蒸留水で洗浄後、窒素ガスで乾燥させ、ＤＮＡとの結合反応に用いられる。
（３）ＤＮＡの基板への結合反応
（６４種ＤＮＡプローブの合成）
５'末端にＳＨ基（チオール基）を有する６４種のプローブ一本鎖ＤＮＡ（先の表１に記載）を定法により合成した。
【００４７】
（ＤＮＡプローブの吐出）
各プローブＤＮＡをそれぞれ水に溶解し、ＳＧクリア（グリセリン７．５％、尿素７．５％、チオジグリコール７．５％、アセチレノールＥＨ １％を含む水溶液）を用いて最終濃度８μＭになるよう希釈した。
【００４８】
少量のサンプルが吐出できるように改造したＢＪプリンター用ヘツドＢＣ６２（キヤノン社製）のノズルにプローブＤＮＡの溶液を１００μｌ充填した。各ヘッドあたり６種のＤＮＡが吐出できるようにして２つヘッドを用い、一度に１２種のＤＮＡを吐出し、ヘッドを６回交換して、６４種のＤＮＡのそれぞれのスポットが独立して形成されるように吐出させた。こうして所定の区分領域が所定の配列で配置されたＤＮＡアレイを得た。この時のプローブアレイを含む各スポットのピッチは２００μｍであった。また８×８のスポットが形成する領域は、約２ｍｍ×２ｍｍであった。
【００４９】
その後、基板を３０分加湿チャンバー中に放置し、プローブＤＮＡを基板に結合させて固定する反応を行い、ＤＮＡアレイ基板を得た。
２）正常なｐ５３配列を用いたときの６４種のハイブリッド体の蛍光強度測定
（１）ハイブリダイゼーション反応
（ブロッキング反応）
１Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にてＤＮＡアレイ基板を洗い、ガラス表面の固定されてないＤＮＡ溶液を完全に洗い流した。その後、２％ウシ血清アルブミン水溶液中に浸し、２時間放置し、ブロツキング反応を行った。
（モデル検体ＤＮＡの合成）
ｐ５３遺伝子の正常な配列（Ｎｏ．４２と相補的）を持ち、プローブＤＮＡと同じ領域で同じ長さの標識ＤＮＡ Ｎｏ．６５（一本鎖）を作製した。配列は下に示す通りで、５'未端にはローダミン（Ｒｈｏ）を結合してある。
Ｎｏ．６５：５'−Ｒｈｏ−ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣ−３'
（ハイブリダイゼーション反応条件）
ＤＮＡアレイ基板の入ったハイブリダイゼーション反応用の容器に１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｎＭモデル検体ＤＮＡ溶液を２ｍｌ入れ、最初に７０℃で３０分加熱後、インキュベーターの温度を４０℃に下げ、そのまま３時間反応させた。
（２）検出
（方法）
検出は、蛍光顕微鏡（ニコン社製）に画像解析処理装置ＡＲＧＵＳ（浜松ホトニクス社製）を接続して行った。
（３）結果
得られた蛍光量の基板上の分布を図３に示す。
【００５０】
実施例２
変異遺伝子検出用のＤＮＡアレイ作製（ラインセンサー用）
（１）変異検出用ＤＮＡアレイの作製
上記結果を基に、これらの６４種のプローブを強度の強い方から８プローブ毎にグループ分けを行ったのが表２及び３である。第１グループの蛍光強度は極めて強く、第６、７、８番目のグループの総蛍光量はゼロになるはずである。
【００５１】
【表２】
2006109841.tif 000003
【００５２】
【表３】
2006109841.tif 000004
【００５３】
次に、基板上をライン状に８分割し、左側から強度の高い順に、第１グループ、第２グループという具合に並べ、右端に第８グループが並ぶように設定した。次に対応するプローブ番号の位置へ実施例１と同様、インクジェット法を用いて図４のようにプローブを並べ、変異検出用ＤＮＡアレイを作製した。各グループが構成するラインは２００μｍの幅である。
（２）変異検出用ＤＮＡアレイを用いた正常遺伝子での検討
実施例１と同様な条件でハイブリダイゼーション反応を行った。その後、ラインセンサー（Ｓ272102；浜松ホトニクス社製）を用いて各グループ毎の総光量を検出した。
【００５４】
結果を図４及び図５に示す。第１グループでの光量が最大で、第２グループではその強度は半分以下に減少する。第６、７、８グループでは蛍光はほとんど観測されない。
（実施例３）
（変異遺伝子検出用のＤＮＡアレイを用いた変異遺伝子の検出（１））
１．変異モデル検体ＤＮＡの合成
ｐ５３遺伝子の正常な配列とはプローブ領域で１塩基異なる配列（Ｎｏ．４６と相補的）を持ち、プローブと同じ長さの標識ＤＮＡ Ｎｏ．６６を作製した。配列は下に示す通りで、５'末端にはローダミンを結合してある。アンダーラインを施したところが変異箇所である。
Ｎｏ．６６：５'−Ｒｂｏ−ＡＴＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣ−３'
（ハイブリダイゼーション反応）
実施例１と同様にハイブリダイゼーション反応を行った。モデル検体ＤＮＡの濃度は５０ｎＭである。
（ラインセンサーによる検出）
実施例２と同様ハイブリダイゼーション反応後のアレイ基板をラインセンサーにより評価した。図６に示す通り、正常遺伝子の時には蛍光が観察されなかった第６、７、８グループに蛍光が観察され、この検体遺伝子が正常ではないことが容易に判断された。また、第１グループと第４グループ（プローブ番号３５−４８）での蛍光強度が高いことから、正常遺伝子と極めて近い配列で図２における右上の領域に変異を有していることが推察される。
【００５５】
この結果から、本発明の変異遺伝子スクリーニング方法が極めて有効であることが示された。
【００５６】
実施例４
（変異遺伝子検出用のＤＮＡアレイを用いた変異遺伝子の検出（２））
ハイブリダイゼーション反応に用いるモデル標的遺伝子の濃度を５ｎＭに変化させ、実施例３と同様の条件によりハイブリダイゼーション反応を行った。結果を図７に示す。
【００５７】
実施例３と同様な結果が得られ、本発明の方法がハイブリダイゼーション反応の条件によらず成り立つことが示された。
【００５８】
実施例５
（変異遺伝子検出用のＤＮＡアレイを用いた変異遺伝子の検出（３））
変異モデル検体ＤＮＡの合成
ｐ５３遺伝子の正常な配列とはプローブ領域で１塩基異なる配列（Ｎｏ．１０と相補的）を持ち、プローブと同じ長さの標識ＤＮＡ Ｎｏ．６７を作製した。配列は下に示す通りで、５'末端にはローダミンを結合してある。アンダーラインを施したところが変異箇所である。
Ｎｏ．６７：５'−Ｒｈｏ−ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＴＣＣＣＡＴＣ−３'
（ハイブリダイゼーション反応）
上記変異モデル検体ＤＮＡを用いて実施例１と同様ハイブリダイゼーション反応を行った。検体濃度は５０ｎＭである。その結果を図８に示す。
【００５９】
正常遺伝子では蛍光が観察されない第６、７グループで蛍光が見られ、正常遺伝子ではないことが判明した。蛍光は正常遺伝子で高い値を示す第１グループよりも第２グループで最大値を示し、第２グループに含まれるプローブ配列領域（図２における左上領域）に変異を有することが推定される。
【００６０】
この結果は、本発明の変異遺伝子のスクリーニング方法が変異の種類によらず可能であることを示している。
【００６１】
実施例６
（変異遺伝子検出用のエリアセンサー用ＤＮＡアレイの作製）
実施例２に示したグループに分けられたプローブをライン状ではなく基板上の区分けされた領域に配置し、図９に示す配置でプローブ溶液を吐出してＤＮＡアレイを作製した。
【００６２】
次に実施例４で用いた変異モデル検体を用いてハイブリダイゼーション反応を行った。その結果、正常遺伝子では蛍光の観察されない第６、７、８グループで蛍光が観察され、この遺伝子が変異遺伝子であることが容易に判断された。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】（ａ）はＤＮＡアレイ基板上の区分領域の配置の一例を示す図であり、（ｂ）は、この基板を用いた測定においてラインセンサーを用いた場合に得られる区分領域の配置に対応した蛍光強度分布（パターン）を示す図である。
【図２】６４種のＤＮＡプローブの配置図である。
【図３】蛍光強度の結果を示す図である。
【図４】蛍光強度の結果を示す図であり、Ｇｒ．Ｎｏ．はグループ番号を表わす。
【図５】ラインセンサーを用いた場合に測定された区分領域の配置に対応して得られる蛍光強度分布（パターン）を示す図である。
【図６】ラインセンサーを用いた場合に測定された区分領域の配置に対応して得られる蛍光強度分布（パターン）を示す図である。
【図７】ラインセンサーを用いた場合に測定された区分領域の配置に対応して得られる蛍光強度分布（パターン）を示す図である。
【図８】ラインセンサーを用いた場合に測定された区分領域の配置に対応して得られる蛍光強度分布（パターン）を示す図である。
【図９】蛍光強度の結果を示す図であり、Ｇｒ．Ｎｏ．はグループ番号を表わす。
【図１】
2006109841.tif 000005
【図２】
2006109841.tif 000006
【図３】
2006109841.tif 000007
【図４】
2006109841.tif 000008
【図５】
2006109841.tif 000009
【図６】
2006109841.tif 000010
【図７】
2006109841.tif 000011
【図８】
2006109841.tif 000012
【図９】
2006109841.tif 000013
【配列表】
2006109841000001.app