(57)【要約】【課題】  標的物質との結合機能の経時に伴う劣化を抑制し、標的物質を確実に検出し、また分離でき、長期の保管後であってもプローブの劣化が抑制され、長寿命化を図ったプローブ担体や、その製造方法を提供すること。【解決手段】標的物質検出用プローブを支持体に固定したプローブ担体において、支持体上のプローブの固定領域がロジンを含有する。また、標的物質検出用プローブを支持体に固定したプローブ担体において、支持体上のプローブの固定領域が樹脂酸および／またはその類縁体を含有し、樹脂酸がアビエチン酸、デヒドロアビエチン酸化合物などのアビエチン酸類であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質検出用プローブを支持体に固定したプローブ担体において、支持体上の少なくともプローブの固定領域がロジンを含有することを特徴とするプローブ担体。
【請求項２】
標的物質検出用プローブを支持体に固定したプローブ担体において、支持体上の少なくともプローブの固定領域が樹脂酸および／またはその類縁体を含有することを特徴とするプローブ担体。
【請求項３】
樹脂酸が、アビエチン酸類であることを特徴とする請求項２記載のプローブ担体。
【請求項４】
アビエチン酸類が、アビエチン酸を含むことを特徴とする請求項３記載のプローブ担体。
【請求項５】
アビエチン酸類が、デヒドロアビエチン酸化合物を含むことを特徴とする請求項３記載の塩基配列プローブ担体。
【請求項６】
デヒドロアビエチン酸化合物が、デヒドロアビエチン酸グリシジルエステル、アクリル化デヒドロアビエチン酸、デヒドロアビエチン酸クロライド、デヒドロアビエチルアミン、デヒドロアビエチン酸金属塩、デヒドロアビエチン酸ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）不加体から選ばれる１または２種以上を含むことを特徴とする請求項５記載のプローブ担体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のプローブ担体の製造方法であって、プローブを支持体の固定領域に固定する工程と、支持体のプローブの固定領域にロジンまたは樹脂酸および／またはその類縁体を含有させる工程とを有することを特徴とするプローブ担体の製造方法。
【請求項８】
支持体のプローブの固定領域にロジンまたは樹脂酸および／またはその類縁体を含有させる工程が、塗布、浸漬、噴霧、蒸着のいずれかの工程を含むことを特徴とする請求項７記載のプローブ担体の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか記載のプローブ担体を室温環境で保存することを特徴とするプローブ担体の保存方法。
【請求項１０】
プローブ担体を緩衝液に浸漬することを特徴とする請求項９記載のプローブ担体の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸プローブなど標的物質検出に使用されるプローブを担持したプローブ担体やプローブ担体の製造方法に関し、より詳しくは、長期保管後においても検出能を維持できるプローブ担体やプローブ担体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが、これと相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと、適当な条件下においてハイブリダイズして二重鎖を形成することを利用した核酸プローブが知られている。核酸プローブにおいては、被検体の特定の塩基配列を有する核酸などと、これと相補的な塩基配列を有するプローブとハイブリダイゼーションさせることにより、被検体を検出、若しくは分離し、また、塩基配列の決定、細菌などの同定を、迅速、かつ正確に行うことができる。この核酸プローブでは、プローブとして被検体の標的塩基配列とハイブリダイズする相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドや、ポリヌクレオチドなどを用い、これらのプローブを固相支持体に多数固着した塩基配列プローブ担体（プローブアレイ）が使用されている。
【０００３】
このような核酸プローブにおける被検体の標的塩基配列の検出等は、通常、水溶液中に存在する被検体について行われるため、塩基配列プローブ担体において、水溶性のオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドなどのプローブが水溶液中へ溶出するのを抑制して支持体に固定する必要がある。かかるプローブを支持体に固定する方法として、固相支持体上においてプローブの逐次合成を行うことにより固定する方法（オン・チップ法）、予め用意されたプローブをピンもしくは、スタンプなどにより基材上に付与することにより固定する方法などを挙げることができる。具体的には、基体の選択された領域からアクチベーターによって保護基を除去し、除去可能な保護基を有するモノマーを前記領域に結合させることを繰返すことにより、基体上で種々の塩基配列を有するポリマーを合成する方法（例えば、特許文献１参照）や、基材及び該基材上に担持されたカルボジイミド基を有する高分子化合物よりなる固定用の材料と、カルボジイミド基との反応性を有する生物学的に活性な物質を接触させることにより固定する方法（例えば、特許文献２参照）などが報告されている。また、末端部にチオール基を導入したＤＮＡ断片と、一端を固相担体に結合させ、末端にチオール基と反応して共有結合を形成し得る反応性置換基を導入した鎖状分子とを液相にて接触させることにより、該ＤＮＡ断片と鎖状分子との間で共有結合を形成させることによるＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法（例えば、特許文献３参照）や、ＤＮＡ断片と親水性ポリマーとを水性媒体に溶解あるいは分散してなる水溶液を、固相担体表面に点着することによって、ＤＮＡ断片と固相担体表面との結合を安定化させること（例えば、特許文献４参照）などが報告されている。
【０００４】
一方、被検体の標的塩基配列がハイブリダイズするプローブ以外のプローブ支持体に非特異的に吸着することによる検出誤差を少なくするため、プローブ支持体において標的塩基配列の非特異的吸着を抑制する表面処理が行われている。このようなプローブ支持体の表面処理としては、試料核酸の膜への固定後、スキムミルクなどを用いたブロッキング処理や、水溶性高分子溶液に浸漬するブロッキング処理などが知られている。かかるブロッキング処理として、例えば、試料核酸の膜への固定後、この膜をスキムミルクとＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネートとを反応させた溶液で処理する方法（例えば、特許文献５参照）や、試料核酸のニトロセルロース膜への固定後、ＰＶＡ又は／及びＰＶＰを含有する溶液に浸して処理する方法（例えば、特許文献６参照）などが報告されている。
【特許文献１】米国特許第５１４３８５４５号明細書
【特許文献２】特開平８−２３９７５号公報
【特許文献３】特開２００１−１７８４４２号公報
【特許文献４】特開２０００−２９５９９０号公報
【特許文献５】特公平０６−０３４７５６号公報
【特許文献６】特許第２７９４７２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このようなプローブ担体において、プローブに蛍光標識した標的物質（ターゲット）をハイブリダイズさせてその蛍光強度を測定した場合、蛍光標識した標的物質のハイズリダイズ後、経過時間に伴い蛍光強度が低下していく現象が観察される。プローブ担体をバッファー中に保管した場合には、この蛍光強度の経時的劣化現象は緩和されるものの、数ヶ月経過後の蛍光強度はほぼ半減し、乾燥状態で保管した場合には、更に顕著に現れる。このため、プローブ担体を長期間保存した場合、原因が明確にわかっているわけではないが、プローブが劣化したり、あるいはプローブ自体のハイブリダイゼーション機能が低下するなどにより、プローブ担体としてのハイブリダイゼーション機能が損なわれてしまう。しかしながら、プローブの寿命について言及した文献はほとんどなく、プローブとしてｃＤＮＡを用いたｃＤＮＡチップで数週間、オリゴＤＮＡを用いたオリゴＤＮＡ担体ではさらに長期間であること（例えば、特許文献４参照）が報告されているにすぎない。
【０００６】
本発明の課題は、標的物質との結合機能の経時に伴う劣化を抑制し、標的物質を確実に検出し、また分離でき、長期の保管後であっても、その特性を維持し、長寿命化を図ったプローブ担体や、その製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意研究の結果、プローブの支持体の固定領域にロジンを含有させることにより、プローブ担体を長期間保存した後であっても、プローブのハイブリダイゼーション機能が損なわれず、かかる効果は、樹脂酸やその類縁体を支持体に含有させることによっても得ることができ、安定して被検体の検出等を行うことができることの知見を得て、かかる知見に基づき本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、標的物質検出用プローブを支持体に固定したプローブ担体において、少なくとも支持体上のプローブの固定領域がロジンを含有することを特徴とするプローブ担体や、標的物質検出用プローブを支持体に固定したプローブ担体において、少なくとも支持体上のプローブの固定領域が樹脂酸および／またはその類縁体を含有することを特徴とするプローブ担体に関する。
【０００９】
また、本発明は、本発明のプローブ担体の製造方法であって、プローブを支持体の固定領域に固定する工程と、支持体のプローブの固定領域にロジンまたは樹脂酸類を含有させる工程とを有することを特徴とするプローブ担体の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のプローブ担体は、標的物質と特異的に結合する性質を利用して、標的物質の検出に使用されるプローブを用いたプローブ担体を、長期間に亘って保管した後であっても、プローブが標的物質と特異的に結合する機能を安定して保持することができ、プローブ担体の長寿命化を図ることができる。本発明のプローブの担体の製造方法は、本発明のプローブ担体を容易に、効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のプローブ担体は、標的物質検出用プローブを支持体に固定したプローブ担体において、支持体上の少なくともプローブの固定領域がロジンを含有するものであれば、特に制限されるものではない。
【００１２】
本発明のプローブ担体に用いるプローブとしては、被検体が有する標的物質との組み合わせにおいて、標的物質と特異的に結合するものであれば、いずれのものであってもよく、塩基配列のハイブリダイゼーション機能を利用できるタンパク質（複合タンパク質を含む）や核酸などの他、糖鎖（複合糖質を含む）、脂質（複合脂質を含む）等の生体高分子など生体物質も用いることができる。具体的には、酵素、ホルモン、フェロモン、抗体、抗原、ハプテン、ペプチド、合成ペプチド、ｃＤＮＡなどであってもよいＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどであってもよいＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ＰＮＡ、合成ＰＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどの核酸、ガングリオシド、レクチンなどを例示することができる。これらは被検体から得たものであっても、また別途合成されたものであってもよい。また、このようなプローブを合成する場合、特定の官能基を有する標的物質の検出を容易にするためプローブへチオール基を導入してもよい。この場合、チオールモディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ：グレンリサーチ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）社製）を用いることができる。これらのプローブはその用途に応じて、１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００１３】
プローブの支持体の固定領域における固定形態としては、支持体全面に亘り均一に固着したり、スポット形状とすることができる。プローブを２種以上組み合わせて用いる場合は、各プローブを混合して支持体に全面に亘り均一に固着したり、同種のプローブ毎にスポット状としたり、また、２種以上のプローブを混合してスポット状とすることができる。プローブがスポット状の場合は、スポットの配置、大きさ、数などは必要に応じて適宜変更することができる。
【００１４】
本発明のプローブ担体に用いるプローブを固定する支持体としては、プローブが水溶液へ溶出するのを抑制することができるプローブの固定領域を有するものであれば、その材質、形状などいずれのものであってもよい。支持体の材質としては、石英、ガラス、シリカ、アルミナ、タルク、クレー、アルミニウム、水酸化アルミニウム、鉄、マイカなどの無機材質を具体的に挙げることができるが、酸化チタン、亜鉛華、酸化鉄などの酸化物などであってもよい。また、標的物質の検出や材料としての汎用性を考慮すると、これらの無機材質のうちアルカリ成分などが含まれない無アルカリガラスや、石英などの材質が好ましい。このような無機材質の支持体を用い、プローブが塩基配列を有するものである場合、支持体の少なくともプローブの固定領域表面をプローブを固定可能なアミノ基などを有するシランカップリング剤で処理して用いることができる。シランカップリング剤は、プローブと結合し得るアミノ基などの有機官能基と、支持体を構成する無機材質と結合し得る基、例えば支持体の材質がガラスの場合、ガラスとシロキサン結合を形成し得るアルコキシシリル基などとを併有し、プローブを支持体に固定可能とする化合物を含有するものである。このようなシランカップリング剤としては、Ｎ−β−アミノエチル−γ−アミノプロピルトリアルコキシシラン、Ｎ−β−アミノエチル−γ−アミノプロピルメチルジアルコキシシラン、γ−アミノプロピルトリアルコキシシラン、γ−アミノプロピルメチルジアルコキシシランなどのアルコキシシラン化合物を挙げることができ、かかるアルコキシシラン化合物におけるアルコキシシリル基としては、加水分解が速やかに進行するメトキシシリル基またはエトキシシリル基を好ましいものとして例示することができる。このようなシランカップリング剤を用いて支持体表面を処理する方法としては、後述するように支持体の形状が微粒子、フィルター状、繊維状などの場合は、シランカップリング剤に浸漬したり、シランカップリング剤を噴霧する方法もしくはシランカップリング剤の気相処理方法などを挙げることができ、支持体の形状が基板の場合は、基板表面にシランカップリング剤をコーティングする方法などを挙げることができる。基板状支持体表面にシランカップリング剤をコーティングする方法としては、浸漬法（ディッピング法）、スピンコート法、スプレーコート法などを挙げることができ、このうち、特にシランカップリング剤を簡便且つ均一にコーティングすることができる浸漬法が好ましい。
【００１５】
このようなシランカップリング剤のコーティングにおいては、コーティングに先立ち、支持体を予め洗浄しておくことが好ましい。支持体の洗浄方法としては、水による洗浄、薬液による洗浄、プラズマによる洗浄、ＵＶオゾンによる洗浄などを挙げることができ、このうち薬液による洗浄方法が簡単に確実に行うことができるため好ましい。薬液による洗浄方法としては、支持体の材質によって薬剤を適宜選択し、例えば、支持体の材質がガラスの場合は、所定濃度の水酸化ナトリウム水溶液中で支持体をワイピングするかもしくは水酸化ナトリウム水溶液をシャワーリングしながらブラッシングした後、余分な水酸化ナトリウムを除去し、窒素ガスなどの不活性ガスでブローして乾燥する方法などを挙げることができる。洗浄した支持体を、０．１〜２．０重量％のシランカップリング剤水溶液に浸漬し、余分なシランカップリング剤を含む溶液を洗い流し、１００〜１２０℃程度の温度で乾燥させることにより、反応性の官能基を導入した支持体を得ることができる。
【００１６】
この他、支持体の材質としては、ニトロセルロース、ナイロン、ラテックスなどの有機材質であってもよいが、プローブと結合し得るアミノ基などの塩基性基を有する高分子化合物や、塩基性基を容易に導入できる高分子化合物などの有機材質を挙げることができる。このような有機材質の支持体を用いる場合、例えば、末端にアミノ基を持つポリアミドや、保護したアミノ基とビニル基を持つ物質を重合させ、その後保護基を外したものなどを利用することができる。
【００１７】
かかる支持体の形状は、特に限定されるものではなく、適用される核酸プローブや、支持体の材質により適宜選択することができ、ニトロセルロース製やナイロン製のメンブランフィルターや、ラテックス製の不溶固体微粒子状などであってもよいが、検出を容易に高精度で行うことができ、プローブの固定が容易な基板状とすることができ、その表面が平滑であることが好ましい。かかる支持体の大きさは被検体の物質、検出量、適用するプローブなどにより適宜選択することができる。
【００１８】
本発明における支持体に含有されるロジンは、天然樹脂由来のものであり、アビエチン酸、無水アビエチン酸、ジヒドロアビエチン酸、デヒドロアビエチン酸、レポピマル酸、ピマル酸、イソピマル酸、デキストロピマル酸や、これらの塩若しくはエステル化合物などを含有する。ロジンとしては、いずれを産地とするものであってもよく、例えば、市販されているもの（（株）関東化学社製）などを用いることができる。ロジンの支持体における含有量としては、支持体の形状や、保管期間などにより適宜選択することができる。
【００１９】
また、本発明の塩基配列プローブ担体に用いられる樹脂酸やその類縁体としては、特に限定されるものではないが、天然樹脂中の含有物や天然樹脂の含有物からの合成物、または天然樹脂に由来しない合成物であってもよいが、ロジンの含有物やロジンの含有物からの合成物などを用いることができる。合成物の場合は公知の方法により合成することができる。かかる樹脂酸としては、ジテルペン酸、アビエチン酸、ネオアビエチン酸、ピマル酸、安息香酸、桂皮酸などを挙げることができる。樹脂酸の類縁体としてはこれら樹脂酸の塩、エステル化合物など挙げることができるが、これらのうちアビエチン酸類を好ましいものとして挙げることができる。アビエチン酸類としては、アビエチン酸、アビエチン酸塩やアビエチン酸エステル、デヒドロアビエチン酸化合物などを例示することができる。デヒドロアビエチン酸化合物としては、具体的に、デヒドロアビエチン酸、デヒドロアビエチン酸グリシジルエステル、アクリル化デヒドロアビエチン酸、デヒドロアビエチン酸クロライド、デヒドロアビエチルアミン、デヒドロアビエチン酸金属塩、デヒドロアビエチン酸ＰＥＧ不加体などを挙げることができ、上記の化合物の１種または２種以上を適宜選択して使用することができる。樹脂酸類の支持体における含有量としては、支持体の形状や、保管期間などにより適宜選択することができる。
【００２０】
ロジンや樹脂酸類を含有した支持体を用いたプローブ担体は、長期保管した後でも、プローブの標的物質との結合能、即ちハイブリダイゼーション機能を保持することができると共に、プローブ担体が劣化するのを抑制することができる。このハイブリダイゼーション機能の保持のメカニズムはまだ明らかになっていないが、樹脂酸やその類縁体の二重結合（特に共役二重結合の場合）およびその独特な構造に起因すると思われる。その一つは酸化防止効果が考えられ、すなわち、樹脂酸やその類縁体において二重結合に隣接する水素分子が酸素ラジカルの攻撃を受け、水素と酸素のラジカル置換反応により酸素と樹脂酸やその類縁体が化学的に結合し、プローブの酸化が抑制されることが考えられる。このことから、支持体に酸化防止剤を含有させた場合、プローブ担体の長期保存後においても、ハイブリダイゼーション機能が保持されることが考えられる。
【００２１】
本発明のプローブ担体の製造方法としては、プローブを支持体の固定領域に固定する工程と、支持体のプローブの固定領域にロジンまたは樹脂酸および／またはその類縁体を含有させる工程とを有する方法を挙げることができ、後述するようにプローブをロジンまたは樹脂酸やその類縁体を含有する被膜で被覆する場合はプローブを支持体に固定する工程を先行させるが、支持体のプローブの固定領域にロジンまたは樹脂酸および／またはその類縁体を含有させる工程の後に、ロジンまたは樹脂酸および／またはその類縁体を含有させた固定領域にプローブを固定する工程を行なってもよい。
【００２２】
本発明のプローブの製造方法におけるプローブを支持体に固定する工程では、上述のプローブを溶媒に溶解または分散させたプローブ液を調製し、このプローブ液を上述の支持体に供給し、供給されたプローブが支持体の官能基などと結合することにより、支持体の固定領域へのプローブの固定が行われる。
【００２３】
プローブ液の調製においては、プローブを溶解または分散させる溶媒としては、水や、アルコールなどの有機溶媒を用いることができるが、プローブ液の支持体への供給方法に応じて適宜選択することができる。かかるプローブ液の濃度としては、プローブが核酸の場合、安定性を考慮すると、重合度が２ｍｅｒ〜５００ｍｅｒ、より好ましくは２ｍｅｒ〜８０ｍｅｒの核酸の０．０５〜５００μＭであることが好ましく、より好ましくは０．５〜５０μＭである。
【００２４】
プローブ液の固定領域への供給方法としては、支持体が粒子状、フィルター状、繊維状などの場合は、浸漬などの方法によることができ、支持体が基板状などの場合は、インクジェット法、ピン法あるいはピンアンドリング法などにより支持体にスポッティングする方法によることができる。これらのうち、特にインクジェット法は高密度で、正確なスポッティングができることから好ましい。インクジェット法は、ごく細いノズルの中にプローブ液を入れ、ノズルの先端近くを瞬間的に加圧ないし加熱し、ノズルの先端から正確に極微量の一定量のプローブ液を飛び出させ、空間を飛翔させて支持体の固定領域面に付着させる方法である。このようなインクジェット法においては、プローブ液の溶媒または分散媒としてはインクジェットヘッドから吐出させたときにプローブに実質的に影響を与えないものであって、且つインクジェットヘッドから正確にプローブ液の一定量を吐出させ得るものが好ましく、インクジェットヘッドが、例えば、液を加熱して吐出させる機構を備えるバブルジェットヘッドである場合、グリセリン、チオジグリコール、イソプロピルアルコール、アセチレンアルコールなどを含む溶媒が好ましい。具体的には、グリセリン５〜１０重量％、チオジグリコール５〜１０重量％、アセチレンアルコール０．５〜１重量％を含む溶媒を挙げることができる。また、インクジェットヘッドが圧電素子を用いて液を吐出させるピエゾジェットヘッドである場合、プローブ液の溶媒または分散媒はエチレングリコール、イソプロピルアルコールなどを含むものが好ましく、具体的には、エチレングリコール５〜１０重量％、イソプロピルアルコール０．５〜２重量％を含む溶媒を挙げることができる。このような溶媒に上述のような濃度となるようにプローブを溶解または分散させたプローブ液をインクジェットヘッドより吐出させ支持体にスポッティングすると、スポットの形状が円形となり、また吐出された範囲が拡大することがないため、高密度にスポッティングしたときも、隣接するスポット同士の連結を有効に抑制することができる。
【００２５】
上記プローブ液にはさらに支持体に供給したプローブの乾燥を抑制するために、高沸点の物質を添加することもできる。かかる高沸点の物質としては、プローブ液に溶解または分散可能であって、プローブ液を高粘性としない物質であることが好ましい。このような物質としては、グリセリン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、チオジグリコール、ジメチルスルホキシドや、低分子の親水性ポリマー、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、パオゲン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、デキストラン、プルラン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができ、これらのうち、エチレングリコール、ジエチレングリコールがより好ましい。これらの高沸点の物質のプローブ液における濃度は、０．１〜１０容量％の範囲であることが好ましい。更に、支持体に供給したプローブの乾燥を抑制するため、プローブ液を供給した支持体を湿度９０％以上、２０〜５０℃の温度範囲の環境下に保存することもできる。
【００２６】
支持体の固定領域に供給されたプローブの固定は、放置、必要に応じて加熱し、プローブが支持体の固定領域の塩基性基などの官能基と結合することにより達成される。プローブと支持体の結合に要する時間は、プローブや支持体の種類により異なり、例えば、チオール基を導入した一本鎖ＤＮＡプローブのシランカップリング処理を行ったガラス製支持体への結合の場合、プローブ液のスポッティング後1分以内である。プローブが固定領域に固定された後、支持体に過剰に供給され、支持体に固定されていないプローブを除去することがノイズを減少できるため好ましい。過剰のプローブの除去は、プローブが支持体に完全に固定された後、例えば、１０分〜３０分経過後、支持体をリン酸系緩衝液および水に浸漬して行うことが好ましく、上記チオール基を導入した一本鎖ＤＮＡプローブの場合、プローブ液のスポッティング後１０分以上放置した後に行うことが好ましい。
【００２７】
また、本発明におけるプローブを支持体に固定する工程において、無機材質の支持体を用いる場合、支持体の固定領域の処理と、シランカップリンブ剤による支持体へのプローブ液の供給を同時に行ってもよい。すなわち、プローブ液とシランカップリング剤とを混合して混合液を調製し、プローブとシランカップリンブ剤との結合を進行させ、これを支持体に供給し、シランカップリンブ剤と支持体との結合により、プローブを支持体の固定領域に固定することができる。
【００２８】
プローブを支持体に固定した後、標的物質がプローブ以外の支持体への非特異的な結合を抑制するため、必要に応じて支持体のブロッキング処理を行うことができる。支持体のブロッキング処理により、標的物質が支持体に固定されたプローブ以外の部分に付着することによるノイズを除去し、検出精度（Ｓ／Ｎ比）の向上を図ることができる。ブロッキング処理は、塩基配列を有するプローブを用いたプローブ担体の場合、検出を行う直前に、プローブ担体を、例えば、１〜２％ウシ血清アルブミン水溶液中に、２時間程度浸すことにより行うことができる。このブロッキング処理は、支持体の材質、表面の状態、使用する特定のプローブなど種々の条件を、必要に応じて調整して行うことができ、標的物質が各スポット状プローブにスポッティングにより供給される場合や、特定のプローブなどを用いる場合などブロッキング処理は省略することができる。
【００２９】
本発明のプローブ担体の製造方法における支持体のプローブの固定領域にロジンまたは樹脂酸および／またはその類縁体を含有させる工程では、上述のロジンまたは樹脂酸やその類縁体を含有する溶液を調製し、上記工程によりプローブを固定した支持体の固定領域にまたはプローブ固定前の支持体の固定領域に調製したロジンまたは樹脂酸やその類縁体を含有する液を供給し、プローブ固定領域にロジンまたは樹脂酸やその類縁体を含有させることができる。
【００３０】
ロジンまたは樹脂酸やその類縁体を含有する液の調製においては、ロジンまたは樹脂酸やその類縁体を溶解または分散させる溶媒または分散媒としては、ロジンまたは樹脂酸やその類縁体の支持体への供給方法に応じて、水、アルコールなど適宜選択することができる。また、かかるロジンまたは樹脂酸やその類縁体を含有する液の濃度としては、後述するように、支持体への供給方法により適宜選択することができる。
【００３１】
支持体にロジンまたは樹脂酸やその類縁体を含有させる方法として、例えば、プローブを固定した支持体と共にロジンまたは樹脂酸やその類縁体溶液を容器に封入したり、またはロジンまたは樹脂酸やその類縁体を混合した樹脂材料で形成した容器にプローブを固定した支持体を封入したり、支持体のプローブの固定領域をロジンまたは樹脂酸やその類縁体を含有する被膜で被覆する方法を挙げることができ、特に、プローブを固定した固定領域をロジンまたは樹脂酸やその類縁体を含有する被膜で被覆することが、標的物質との特異的結合機能を保持しつつ長期に亘ってプローブの劣化を抑制できるため好ましい。このようなプローブの固定領域にロジンまたは樹脂酸やその類縁体を含有させる工程は、調製したロジンまたは樹脂酸やその類縁体を含有する液を、支持体の少なくともプローブの固定領域に塗布、浸漬、噴霧する方法によることができる。固定領域にプローブが既に固定されている場合は、プローブをロジン若しくは樹脂酸やその類縁体を含有する被膜で被覆することができるため好ましい。支持体にロジンまたは樹脂酸やその類縁体を含有する液を塗布、浸漬、噴霧する方法としては、ディップコート、スプレーコート、スピンコートなどの液相プロセスや、真空蒸着などの気相プロセスなどを挙げることができる。液相プロセスによる塗布膜形成において使用するロジンまたは樹脂酸やその類縁体の塗布溶液の濃度は、０．１〜８０容量％が好ましく、この濃度の塗布溶液を用いることにより長期保管後の標的物質の検出機能を保持することができる。また、真空蒸着による塗布膜形成において、最適蒸発温度としては設定減圧下におけるロジンまたは樹脂酸やその類縁体の蒸発温度以上、且つ分解温度以下を挙げることができる。ロジンまたは樹脂酸類の被膜の膜厚は、０．０１〜１．０μｍであることが好ましい。
【００３２】
また、前述のプローブ溶液にロジンまたは樹脂酸やその類縁体を更に含有させてプローブ担体を製造してもよい。
【００３３】
このようして得られた本発明のプローブ担体の保存方法としては、室温環境で保存すればよい。室温環境とは、具体的に、温度２５±２℃、湿度５０±１０％ＲＨなどを挙げることができ、本発明のプローブ担体を、室温環境で梱包しない状態で１ヶ月保管しても、プローブの劣化が抑制される。さらに、本発明のプローブ担体をリン酸系などの緩衝液に浸漬して保存することにより、１年経過後であっても、ハイブリダイゼーション機能など標的物質の検出能が低下することがない。
【００３４】
本発明のプローブ担体を用いて、標的物質の検出を行う場合、ロジンまたは樹脂酸やその類縁体の被膜などプローブ固定領域に含有されるロジンまたは樹脂酸やその類縁体を除去して用いることが好ましい。ロジンまたは樹脂酸やその類縁体の除去には、ロジンまたは樹脂酸やその類縁体を溶解または分散するのに用いた溶媒や分散媒を、ロジンまたは樹脂酸やその類縁体に接触させることにより除去することができる。
【００３５】
本発明のプローブ担体を用いて検出等を行なうことができる標的物質としては、特に限定されるものではなく、本発明のプローブ担体に用いられるプローブとの関連において、プローブと特異的に結合する物質について検出、分離、特定などを行うものを挙げることができる。塩基配列を有するプローブとハイブリダイズする相補的構造を有する核酸などをその被検体として例示することができる。被検体としては、具体的には、酵素、ホルモン、フェロモン、抗体、抗原、ハプテン、ペプチド、合成ペプチド、ｃＤＮＡなどであってもよいＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどであってもよいＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ＰＮＡ、合成ＰＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどの核酸、細菌、ガングリオシド、レクチンなどを例示することができる。
【００３６】
本発明のプローブ担体の使用方法を以下に説明する。
【００３７】
本発明のプローブ担体を用いて既知の構造の標的物質の有無または含有量の検出を行う場合、標的物質の特定の構造に対して相補的な構造を有するプローブとして用い、このプローブを含む複数のスポットを支持体上に配置したプローブ担体を用意する。検出に先立ち、プローブの固定領域に含有されたロジンまたは樹脂酸やその類縁体の除去を行なうことが好ましい。ロジンまたは樹脂酸やその類縁体の除去は、例えば、プローブ担体を水またはアルコールに、１〜１２０分間浸漬させる方法、洗浄する方法などによることができる。その後、プローブ担体の各スポットに、標的物質を水などの溶媒に溶解、分散させたサンプルを所定量供給し、標的物質とプローブとが結合する条件下に置く。例えば、塩基配列のハイブリダイゼーションにより標的物質を検出する条件としては、室温〜７０℃の温度範囲で、２〜２０時間の範囲などを例示することができる。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応のサンプルを除去することが好ましい。洗浄に使用する界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を挙げることができ、緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を挙げることができ、このうちクエン酸緩衝液が好ましい。また、ハイブリダイゼーション完了後、各スポットにおけるハイブリッドの有無やその量を、例えば蛍光、電波、磁力等を適用した既知の方法で測定し、サンプル中における標的物質の有無や、その含有量を検出することができる。
【００３８】
また、本発明のプローブ担体を用いて標的物質の特定を行う場合、標的物質の複数の候補を設定し、候補として設定した物質に対して各々相補的な構造を有する物質をプローブとして用い、このプローブを含む複数のスポットを支持体上に配置したプローブ担体を用意する。検出に先立ちプローブの固定領域に含有されるロジンまたは樹脂酸やその類縁体の除去は、上記使用方法の場合と同様に行なうことができる。その後、プローブ担体の各スポットに、サンプルを所定量供給し、標的物質とプローブとが結合する条件下に置く。標的物質としてＤＮＡチップを適用した場合、標識した核酸断片の使用量が非常に少ないため、プローブの支持体に固定するＤＮＡ断片の鎖長や標識した標的物質の核酸断片の種類により、ハイブリダーゼーションの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。１塩基ミスマッチ（１塩基変異）の検出には、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互いに異なる蛍光物質によって標識した標的物質の核酸断片を２種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比較や定量ができる。ハイブリダイゼーション終了後の洗浄、測定、検出などは上記と同様に行い、標的物質の特定を行うことができる。
【００３９】
本発明のプローブ担体は、この他、例えばＤＮＡ結合蛋白質が認識する特異的な塩基配列のスクリーニングやＤＮＡに結合する性質を有する化学物質のスクリーニングなどに適用することができる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明の実施例を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
[参考例１]
プローブの調製
ＤＮＡ自動合成機（チオールモディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（グレンリサーチ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）社製）を用い、末端にメルカプト（ＳＨ）基を導入した配列番号１の一本鎖ＤＮＡを合成し、通常の脱保護を行ない、ＤＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、塩基配列プローブとした。
配列番号：１
5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3'
[参考例２]
標的物質（ターゲット）の調製
ＤＮＡ自動合成機を用いて、参考例１で得た配列番号１の一本鎖ＤＮＡと相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを合成し、５’末端にＣｙ３を結合させて蛍光物質で標識化し、ターゲットとした。この蛍光物質で標識したターゲットを１Ｍ−ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）に最終濃度５ｎＭとなるように溶解し、サンプル液を調製した。
【００４１】
[プローブ担体の調製]
（１）支持体の洗浄
支持体として、１インチ×３インチ角の合成石英ガラス基板を用い、この支持体について純水ブラシ洗浄、純水リンス、アルカリ性洗剤超音波洗浄、純水リンス、純水超音波洗浄、純水リンス、窒素ブロー乾燥を順次行い、石英ガラス基板を洗浄した。
（２）表面処理
アミノシランカップリング剤（商品名：KBM−６０３：信越化学工業（株）社製）を１重量％になるように水に溶解し、３０分間撹拌してメトキシ基を加水分解させた水溶液に、上記洗浄を行った石英ガラス基板を温浴にて８０℃に加温し、３０分間浸漬した後、純水で洗浄し、１２０℃のオーブン中で１時間加熱し、アミノ基を導入した石英ガラス基板を得た。次いで、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（Ｄｏｊｉｎ社製）（以下、ＥＭＣＳと略す。）２．７ｍｇを秤量し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１溶液に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、ＥＭＣＳ溶液を調製した。このＥＭＣＳ溶液にアミノ基を導入した石英ガラス基板を室温で２時間浸漬した後、ＤＭＳＯ／エタノール混合溶液、エタノールで順次洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥させ、アミノ基を導入した石英ガラス基板にマレイミド基を導入し、表面処理石英ガラス基板を得た。
（３）プローブ固定
参考例１で調製した一本鎖ＤＮＡをグリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、アセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥ１００：川研ファインケミカル（株）社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液に、０．６ＯＤになるよう溶解しプローブ溶液を調製した。このプローブ溶液をインクジェット法により、上記表面処理石英ガラス基板にスポッティングした後、基板を３０分間、恒温恒湿チャンバー内に静置して、基板表面のマレイミド基と一本鎖ＤＮＡ末端のチオール基とを反応させた。次いで、１Ｍ−ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）で洗浄し、純水で軽く洗浄した後、窒素ブロー乾燥して塩基配列プローブ担体を得た。
（４）プローブ担体への樹脂酸類膜の成形
ロジン（（株）関東化学社製）（実施例１）、アビエチン酸（（株）関東化学社製）（実施例２）、デヒドロアビエチン酸を主成分とする各種ヒドロアビエチン酸やピマル酸の混合物（製品名；ＫＲ−６１０：(株)荒川化学社製）（実施例３）、デヒドロアビエチン酸グリシジルエステル（(株)荒川化学社製）（実施例４）、アクリル化デヒドロアビエチン酸（(株)荒川化学社製）（実施例５）、デヒドロアビエチン酸クロライド（(株)荒川化学社製）（実施例６）、デヒドロアビエチルアミン（(株)荒川化学社製）(実施例７)、デヒドロアビエチン酸ナトリウム（(株)荒川化学社製）（実施例８）、デヒドロアビエチン酸ＰＥＧ（３００）付加体（(株)荒川化学社製）（実施例９）を用い、ロジン、アビエチン酸、デヒドロアビエチン酸については各５ｇ秤量し、それぞれエタノール４９５ｇに攪拌しながら加えて、エタノール中に完全に溶解させて、濃度１．０ｗｔ％の溶液を調製した。デヒドロアビエチン酸グリシジルエステル、アクリル化デヒドロアビエチン酸、デヒドロアビエチルアミンについては、各５ｇ秤量し、それぞれテトラヒドロフラン４９５ｇに攪拌しながら加えて、テトラヒドロフラン中に完全に溶解させて、濃度１．０ｗｔ％の溶液を調製した。デヒドロアビエチン酸クロライド、デヒドロアビエチン酸ナトリウム、デヒドロアビエチン酸ＰＥＧ３００付加体については、各５ｇ秤量し、それぞれ純水４９５ｇに攪拌しながら加えて、純水中に完全に溶解させて、濃度１．０ｗｔ％の水溶液を調製した。
【００４２】
得られた樹脂酸類溶液をスピンコーターにより、回転数３０００ｒｐｍ、回転時間１秒でプローブ担体へ塗布し、塩基配列プローブ担体を得た。
[塩基配列プローブ担体の特性評価]
（１）保管
得られた塩基配列プローブ担体を室温環境（温度２５±２℃、湿度５０±１０％ＲＨ）下、梱包しない状態で１ヶ月保管した。
（２）特性評価試験
実施例と比較例について、保管前と、保管後について、プローブ担体におけるハイブリダイゼーション機能を評価した。ハイブリダイゼーション機能の評価は以下のように行った。プローブ担体に塗布した樹脂酸やその類縁体溶液の溶媒に１時間浸漬した後、純水で洗浄し、プローブ担体に塗布した樹脂酸やその類縁体を除去した。参考例２で調製したサンプル液中に、樹脂酸やその類縁体を除去したプローブ担体を４５℃で２時間浸漬し、ハイブリダイゼーションを行った。その後、プローブ担体を１Ｍ−ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）、純水を用いて順次洗浄し、窒素ブローにて乾燥した。蛍光スキャナー（商品名：GenePix4000B：Axon Instruments , Inc.製）を用いて、波長５３２ｎｍにおけるプローブ担体のスポットの蛍光強度を測定した。
（３）特性の評価
実施例において、樹脂酸やその類縁体液塗布直後に行った上記特性評価試験（初期特性）におけるプローブ担体の蛍光強度（各実施例のプローブ担体３枚、合計２７枚の平均と標準偏差）は、スポット蛍光強度２２５８８±１７３０、バックグランド蛍光強度８９であり、比較例（樹脂酸やその類縁体の塗布を行わないプローブ担体３枚の平均と標準偏差）の蛍光強度は２１９９１±１５７０、バックグランド蛍光強度９３であった。
【００４３】
保管後における実施例１〜９および比較例の蛍光強度を測定値し、各実施例および比較例の初期特性との比率を求めて評価した。結果を表１に示す。表中、保管後のプローブ担体の蛍光強度が初期の蛍光強度に対して、８０％以上の場合は「Ａ」、６０〜８０％の場合は「Ｂ」、６０％未満の場合は「Ｃ」で表示している。保管後の比較例１は６０％未満であり、いずれの樹脂酸を含有させたプローブ担体より保管特性が劣った。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
結果から、支持体に樹脂酸やその類縁体を含有させたものは保管後において、特性の劣化が抑制されることがわかる。特に、アビエチン酸含有プローブ担体の保管後の特性が良好であることから、ロジン含有プローブ担体の保管後の特性が良好なのは、ロジンの主成分であるアビエチン酸の寄与するところであると思われる。プローブ固定担体の保管による特性の劣化を抑制し、塩基配列プローブ担体の長寿命化を図るためには、ロジン、望ましくは有効成分と思われるアビエチン酸をプローブ担体に含有させることが有効であることがわかる。
[環境変化による特性試験]
実施例２のアビエチン酸を塗布したプローブ担体を容器に収納し、その容器を防湿アルミニウム・パッケージに入れて減圧シーリング加工を施し、４０℃、６０℃、８０℃の恒温槽でそれぞれ保管したときの蛍光強度の経時変化を測定した。この蛍光強度は湿度、酸素、紫外線の影響を排除した特性を示すものであり、初期の蛍光強度に比べ７０％まで蛍光強度が低下するまでの時間を「保管寿命」とし、経時変化のグラフから内挿して保管寿命を求めた。その結果をアレニウス・プロットとして、図１に示す。このグラフから外挿すると、実施例２のプローブ担体は防湿アルミニウム・パッケージに入れて減圧シーリング加工を施すことによって、２５℃環境保管で、約１年（３２５日）の保管寿命であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の塩基配列プローブ担体の保管寿命を示す図である。
【図１】
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【配列表】
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