(57)【要約】【課題】治療対象となる癌細胞が難治性であるか否かをより短期間で判断し得る方法を提供すること。【解決手段】被検対象である癌細胞の難治性を生体外で診断する方法であって、該癌細胞をカスパーゼ活性誘導能を有する化合物で処理し、該化合物処理後の癌細胞のカスパーゼ活性を測定することを含む方法、及び少なくともカスパーゼ活性誘導能を有する化合物とカスパーゼの基質とを含む、癌細胞の難治性を診断する為のキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検対象である癌細胞の難治性を生体外で診断する方法であって、該癌細胞をカスパーゼ活性誘導能を有する化合物で処理し、該化合物処理後の癌細胞のカスパーゼ活性を測定することを含む、方法。
【請求項２】
カスパーゼ活性誘導能を有する化合物がドキソルビシンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
被検対象の癌細胞が神経芽腫又は大腸癌由来である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
カスパーゼ活性誘導能を有する化合物がオキザリプラチンである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
被検対象の癌細胞が血液系細胞である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
対照と比較して、化合物処理後のカスパーゼ活性の誘導が抑制されている癌細胞を難治性であると判断することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
カスパーゼがカスパーゼ３である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
カスパーゼ活性が、該癌細胞から産生されるカスパーゼとカスパーゼの発色性基質とを反応させた場合に遊離される発色団の量によって定義される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
カスパーゼ活性が、カスパーゼとカスパーゼの発色性基質とを反応させた場合に癌細胞タンパク質１μｇあたり１時間に放出される発色団の量として表現される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
発色団がｐ−ニトロアニリンである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
カスパーゼ活性が１０ｐｍｏｌ／ｈｒ／μｇタンパク質未満である場合を難治性と判断することを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程を含む難治性癌の治療に有用な化合物のスクリーニング方法；
（１）難治性癌由来の癌細胞を試験化合物で処理する工程、
（２）処理後の癌細胞のカスパーゼ活性を測定する工程、及び
（３）対照と比較してカスパーゼ活性が有意に上昇した化合物を選別する工程。
【請求項１３】
難治性癌が、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって難治性と診断されたものである、請求項１２記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
対照がドキソルビシン、オキザリプラチン及びシスプラチンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１２又は１３記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
カスパーゼがカスパーゼ３である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
少なくともカスパーゼ活性誘導能を有する化合物とカスパーゼの基質とを含む、癌細胞の難治性を診断する為のキット。
【請求項１７】
カスパーゼ活性誘導能を有する化合物が、ドキソルビシン、オキザリプラチン及びシスプラチンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
カスパーゼの基質が、アセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｐ−ニトロアニリド又はアセチル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ｐ−ニトロアニリドである、請求項１６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難治性癌の診断方法に関する。より詳細には被検対象となる癌細胞をカスパーゼ誘導薬で処理した際のカスパーゼ活性を測定することによって、当該癌細胞が由来する癌が難治性であるか否かを判断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、癌の化学療法の選択は遡及的な考え方に基づいて行われてきた。即ち、これまでの研究成果や治療成績に基づいて癌の種類毎に治療プロトコルが定められ、担当医はこれらに従って患者の治療に当たるというのが通例であった。
最近、「オーダーメイド」治療と称する治療方法の試み、即ち、個々の患者の癌に適した治療法を開発し、確立しようとする試みが行われている。比較的多く試みられている薬剤感受性試験は３〜５種類程度の抗癌薬に対して患者から摘出した癌細胞の感受性を調べ、細胞毒性を示す抗癌薬を優先して用いるという方法である。また、遺伝子発現のパターンと治療応答性との相関を調べ、最も適した治療方法を採用しようとする試みもある。
例えば、神経芽腫、特に進行性神経芽腫の治療成績は近年の治療法の進歩により大幅に向上した。しかしながら、術後や治療後の再発癌に関しては捗々しくない例も少なくない。これまでにこれらの難治性癌の本質を探るために、樹立細胞株を用いて抗癌薬によるｐ５３タンパクの核内蓄積やゲノム不安定性との関連について検討されてきた。
しかしながら、依然として癌細胞が薬剤耐性や放射線への抵抗性を獲得する機構は明らかにされておらず、対象とする癌細胞が難治性であるか否かを判定するには上記のように各種類の薬剤を用いた薬剤感受性試験を行い、また放射線感受性試験を行うことを余儀なくされていた。
近年、抗癌薬に対する抵抗性を引き起こす機序のひとつとして、ＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）機構の異常が報告されている（非特許文献１及び２を参照）。
【非特許文献１】A. loeb, Adv. Cancer Res. 72 (1998) 25-56
【非特許文献２】M. T. Hawn, et al., Cancer Res. 55 (1995) 3721-3725
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、治療対象となる癌細胞が難治性であるか否かをより短期間で判断し得る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、ＭＭＲ遺伝子発現の有無による薬剤耐性感受性の違いを２組のヒト大腸癌由来細胞株（ＨＣＴ１１６及びＨＣＴ１１６＋ｃｈ３、ＬｏＶｏ及びＬｏＶｏ＋ｃｈ２）を用いて調べた。ＨＣＴ１１６及びＬｏＶｏがＭＭＲ欠損細胞株でありＨＣＴ１１６＋ｃｈ３及びＬｏＶｏ＋ｃｈ２が正常細胞株である。ＭＭＲ非欠損株と比べた場合のＭＭＲ欠損株の薬剤感受性を調べた結果を図１に示す。欠損細胞に対する感受性を調べた結果を図１に示す。ＭＭＲ欠損により引き起こされる薬剤耐性は臨床の現場で汎用されている多くの抗癌薬で観察される（図１、抵抗性の欄）が、等感受性を示す薬剤もあることから、ＭＭＲ機構は一部の抗癌薬の抵抗性に関与していると考えられた。即ち、高感受性の機構を明らかにすることが重要であると考え、どのような機構で高感受性薬がＭＭＲ欠損細胞を死に導くかという細胞死機構の解明を試みた。この過程で抵抗性薬剤及び等感受性薬剤がカスパーゼ３活性を誘導することを発見し（図１、太字の化合物）、さらにこの特性を利用して被検対象癌が難治性であるか否かを迅速に判断し得ることを見出して本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち、本発明は下記の通りである。
〔１〕  被検対象である癌細胞の難治性を生体外で診断する方法であって、該癌細胞をカスパーゼ活性誘導能を有する化合物で処理し、該化合物処理後の癌細胞のカスパーゼ活性を測定することを含む、方法。
〔２〕  カスパーゼ活性誘導能を有する化合物がドキソルビシンである、前記〔１〕記載の方法。
〔３〕  被検対象の癌細胞が神経芽腫又は大腸癌由来である、前記〔２〕記載の方法。
〔４〕  カスパーゼ活性誘導能を有する化合物がオキザリプラチンである、前記〔１〕記載の方法。
〔５〕  被検対象の癌細胞が血液系細胞である、前記〔４〕記載の方法。
〔６〕  対照と比較して、化合物処理後のカスパーゼ活性の誘導が抑制されている癌細胞を難治性であると判断することをさらに含む、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７〕  カスパーゼがカスパーゼ３である、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８〕  カスパーゼ活性が、該癌細胞から産生されるカスパーゼとカスパーゼの発色性基質とを反応させた場合に遊離される発色団の量によって定義される、前記〔１〕記載の方法。
〔９〕  カスパーゼ活性が、カスパーゼとカスパーゼの発色性基質とを反応させた場合に癌細胞タンパク質１μｇあたり１時間に放出される発色団の量として表現される、前記〔８〕記載の方法。
〔１０〕  発色団がｐ−ニトロアニリンである、前記〔９〕記載の方法。
〔１１〕  カスパーゼ活性が１０ｐｍｏｌ／ｈｒ／μｇタンパク質未満である場合を難治性と判断することを特徴とする、前記〔１０〕記載の方法。
〔１２〕  以下の工程を含む難治性癌の治療に有用な化合物のスクリーニング方法；
（１）難治性癌由来の癌細胞を試験化合物で処理する工程、
（２）処理後の癌細胞のカスパーゼ活性を測定する工程、及び
（３）対照と比較してカスパーゼ活性が有意に上昇した化合物を選別する工程。
〔１３〕  難治性癌が、前記〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項に記載の方法によって難治性と診断されたものである、前記〔１２〕記載のスクリーニング方法。
〔１４〕  対照がドキソルビシン、オキザリプラチン及びシスプラチンからなる群より選択される少なくとも１種である、前記〔１２〕又は〔１３〕記載のスクリーニング方法。
〔１５〕  カスパーゼがカスパーゼ３である、前記〔１２〕〜〔１４〕のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
〔１６〕  少なくともカスパーゼ活性誘導能を有する化合物とカスパーゼの基質とを含む、癌細胞の難治性を診断する為のキット。
〔１７〕  カスパーゼ活性誘導能を有する化合物が、ドキソルビシン、オキザリプラチン及びシスプラチンからなる群より選択される少なくとも１種である、前記〔１６〕記載のキット。
〔１８〕  カスパーゼの基質が、アセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｐ−ニトロアニリド又はアセチル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ｐ−ニトロアニリドである、前記〔１６〕記載のキット。
【発明の効果】
【０００６】
カスパーゼ誘導薬で処理した癌細胞のカスパーゼ活性を測定することにより、当該癌細胞が由来する癌の抗癌薬や放射線に対する感受性を予測することが可能となり、近年問題になっている難治性癌の迅速な検出が可能となる。癌難治性が判定できれば、治療方針の決定への寄与、無駄な薬剤や放射線の使用を回避できるという経済的効果、患者の精神的・肉体的負担の軽減等多方面にわたる有益性を期待することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法の対象となる癌細胞は、難治性を判断することが所望される細胞であって、株化された細胞であっても、患者から採取された細胞であってもよい。好ましくは、臨床上の有用性に鑑みれば患者から採取された細胞である。株化された細胞は商業的に入手可能であり、また患者からは外科的手術の際に、あるいは生検を行った際に得ることができる。患者からの細胞の採取方法として、固形癌であれば手術摘出ないし内視鏡等による生検検体を滅菌したハサミ及びピンセットで０．０１〜０．１ｇ程度の塊に細分化し、更に、できるだけ細かくする。血液系の腫瘍であれば末梢血からの採血ないしは骨髄穿刺により得られた白血球を用いる。
株化細胞としては、神経芽腫株、大腸癌細胞株、血液系細胞株、その他卵巣がん由来の細胞等が挙げられる。
【０００８】
本発明の方法においては、難治性であるか否かを判断することが所望される癌細胞(乃至は当該癌細胞が由来する癌)、すなわち被検対象となる癌細胞（乃至は癌）をカスパーゼ活性誘導能を有する化合物、例えばドキソルビシン、オキザリプラチン及びシスプラチン等で処理し、処理後の癌細胞を用いてそのカスパーゼ活性を測定することを特徴とする。以下、本発明の方法において用いるカスパーゼ活性誘導能を有する化合物をカスパーゼ誘導薬とも称し、カスパーゼ誘導薬で処理した後の癌細胞におけるカスパーゼ活性をカスパーゼポテンシャル（ｃａｓｐａｓｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）ともいう。カスパーゼポテンシャルとは、カスパーゼ誘導薬により細胞のカスパーゼ活性、特にカスパーゼ３活性がどれくらい上昇するかという細胞側の潜在的能力を意味する。カスパーゼ誘導薬で癌細胞を処理する方法、すなわちカスパーゼポテンシャルの測定方法は、後述する実施例で詳細に説明するが、一例の概要を以下に示す。癌細胞（１０ｍｇ〜１００ｍｇ程度）を３〜５ｍＬの抗生物質入りの培地に懸濁し、更に、カスパーゼ誘導薬（使用する化合物の種類によってその使用量は異なるが、例えばドキソルビシンであれば３〜５μＭ程度、オキザリプラチンであれば１００〜２００μＭ程度）を加え、２４時間、３７℃で培養する。尚、培養時間はカスパーゼ誘導薬による細胞のカスパーゼ活性の上昇が認められる範囲で任意に増減することができるが、１６〜４０時間の範囲で実施することが好ましい。この際、カスパーゼ誘導薬無添加の癌細胞を対照とする。培養後、細胞を破砕し、タンパク質量を定量する。カスパーゼ活性は合成基質であるアセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｐ−ニトロアニリド（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡ；配列番号１）乃至はアセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−７−アミド−４−メチルクマリン（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ；配列番号２）等を細胞破砕液２０〜１００μｇとともに３７℃、４時間インキュベートし、吸光度（ＯＤ値）を分光光度計にて測定する。カスパーゼ誘導薬添加時と無添加時の値を比較しカスパーゼポテンシャルの有無及びその程度を測定する。ＯＤ値が高い程カスパーゼポテンシャルが高い。高カスパーゼポテンシャルを示した細胞は一般の化学療法剤及び放射線に対し感受性が高いことが予測され、また、低カスパーゼポテンシャルを示した細胞は感受性が低い、すなわち抵抗性(難治性)であることが予測される。
【０００９】
Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡやＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ以外にアセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−７−アミド−４−トリフルオロメチルクマリン（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ；配列番号３）、アセチル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ｐ−ニトロアニリド（Ａｃ−ＶＡＤ−ｐＮＡ）、アセチル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−７−アミド−４−トリフルオロメチルクマリン（Ａｃ−ＶＡＤ−ＡＦＣ）等の基質を利用してもよい。
【００１０】
カスパーゼは、プロテアーゼの一種でアポトーシスのシグナル伝達の基幹となる。少なくとも１３種類が知られている（Fuentes-Prior P, Salvesen GS., Biochem J. 2004 Sep 27; Pt[Epub ahead of print]）。カスパーゼを介するアポトーシス経路の模式図を図２に示す。本発明において測定の対象となるカスパーゼは難治性の判断となる、よりアポトーシス誘導能に密接に関与しているカスパーゼ３であることが好ましい。カスパーゼ３活性誘導能を有する化合物は即ちアポトーシス誘導能を有することを意味する。本発明において診断される難治性癌は、カスパーゼ３誘導能（アポトーシス誘導能）を有する化合物で処理した場合でも該癌細胞のカスパーゼ３活性が上昇しない細胞であり、そのような癌細胞では抗癌薬によるアポトーシス誘導が困難であると考えられ、従って抗癌薬に抵抗性である。
【００１１】
本発明において、各被検対象となる癌細胞のカスパーゼ活性は具体的には、カスパーゼ誘導薬で処理した後の癌細胞から産生されるカスパーゼの発色性基質（上述）とを反応させた場合に遊離される発色団（基質がＡｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡであればｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ））の量によって定義される。
即ち、処理後の癌細胞から得られるタンパク質量１μｇあたり１時間に放出される発色団の量として表現される。本発明において難治性の癌細胞とは、カスパーゼ活性が１０ｐｍｏｌ／ｈｒ／μｇタンパク質、好ましくは８ｐｍｏｌ／ｈｒ／μｇタンパク質未満である癌細胞をいう。
【００１２】
カスパーゼポテンシャルが癌細胞の難治性の診断基準になり得るという本発明で得られた知見は、癌細胞の難治性を診断する為の新しいキットを提供することを可能とする。本発明の癌細胞の難治性を判断する為のキットは、少なくともカスパーゼ、好ましくはカスパーゼ３活性誘導能を有する化合物とカスパーゼの基質とを含む。これらの要素は別個に包装されていることが好ましい。さらに必要な緩衝液や溶液（細胞を洗浄する為の緩衝液や細胞からカスパーゼを抽出する為の抽出液や培養液等）や容器等も同時に梱包しておくことも癌の難治性の診断を速やかに実施する上で好ましい態様である。カスパーゼ３活性誘導能を有する化合物としては、カスパーゼ活性を誘導し得る化合物であれば特に限定されないが、実施例で示されるように比較的高いカスパーゼ活性誘導能を有するドキソルビシン、オキザリプラチン、シスプラチン等が好適に用いられる。カスパーゼの基質としてはＡｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ、Ａｃ−ＶＡＤ−ｐＮＡ、Ａｃ−ＶＡＤ−ＡＦＣ等が用いられる。
【００１３】
本発明のキットを用いて癌細胞の難治性を判断する具体的な手順は、上記した本発明の癌細胞の難治性を判断する方法におけるカスパーゼポテンシャルの測定に準じる。
【実施例】
【００１４】
以下実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を何ら限定するものではない。
【００１５】
実施例１：ＭＭＲ欠損によって細胞障害能が影響を受ける抗癌薬
１．材料・実験手順
ヒト大腸癌由来細胞株ＨＣＴ１１６及びＨＣＴ１１６＋ｃｈ３を用いた。ＨＣＴ１１６はｈＭＬＨ遺伝子（ＭＭＲ遺伝子のひとつ）欠損ヒト大腸癌細胞株であり、ＡＴＣＣより入手した。ＨＣＴ１１６＋ｃｈ３は正常細胞株（ＭＭＲ非欠損）であり、ＨＣＴ１１６にｍｉｃｒｏｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ法を用いてヒト第３染色体を転移して調製した（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（１９９５）３７２１−３７２５）。ＨＣＴ１１６は１０％のウシ胎児血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ，ＵＳＡ）を添加したイーグル最少必須培地（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｓａｌｔ：ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で維持した。ＨＣＴ１１６＋ｃｈ３は、上記培地に１ｍＬあたり４００μｇのゲネチシン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を含有する培地中で維持した。いずれの細胞も５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。
用いた抗癌薬の種類と入手先及びその使用濃度（濃度範囲）の一覧を下記表１に示す。
【００１６】
【表１】
2006141225.tif 000002
【００１７】
参考文献：
*1: Cancer Res., 56, 5375-5379 (1996)
*2: Cancer Res., 55, 3721-3725 (1995)
*3: Clin. Cancer Res., 3, 1763-1767 (1997) 
*4: Int. J. Cancer, 93, 571-576 (2001)
*5: Cancer Res., 56, 4881-4886 (1996)
*6: Br. J. Cancer, 77, 703-708 (1998)
【００１８】
細胞毒性アッセイは以下のようにして行った。各細胞を１ウェルあたり２×１０２細胞となるように６ウェルプレートにまいた。２４時間培養後、各薬剤を添加した。１時間ないし２４時間処理後、培地で２回洗浄した。あるいは洗浄なしに処理を続けた。さらに７〜１４日培養しコロニーを形成させた。形成したコロニーを細胞染色液（０．０５％クリスタルバイオレット、４．２％の中性ホルマリン、１０％エタノール）で固定染色し、乾燥後、その数を計測した。各濃度につき３重測定で行った。
【００１９】
２．結果
各抗癌薬についてＭＭＲ欠損細胞（ＨＣＴ１１６）及びＭＭＲ非欠損細胞（ＨＣＴ１１６＋ｃｈ３）におけるＩＣ５０（μＭ）を細胞毒性アッセイにより求め（Ｐ＜０．０１、ｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）、下記式によりＩＣ５０  Ｉｎｄｅｘを算出した。
算出式：
Ｉｎｄｅｘ＝ＭＭＲ非欠損細胞のＩＣ５０の平均値／ＭＭＲ欠損細胞のＩＣ５０の平均値
Ｉｎｄｅｘが小さい程ＭＭＲ欠損細胞の薬剤に対する抵抗性が大きい（低感受性）ことを意味する。Ｉｎｄｅｘが１．０５より大きいものを高感受性、０．９５〜１．０５のものを等感受性、０．９５未満のものを抵抗性（低感受性）とした。
【００２０】
結果を図１に示す。ＭＭＲ欠損により引き起こされる薬剤耐性は臨床の現場で汎用されている多くの抗癌薬で観察された。シスプラチン（ＣＤＤＰ）やドキソルビシン（ＤＯＸ）は抵抗性（低感受性）、オキザリプラチンやネオカルチノスタチン等は等感受性、Ａｒａ−Ｃやゲムシタビンは高感受性を示した。
【００２１】
実施例２：カスパーゼ３活性と細胞毒性発現との関連性
実施例１で用いた各種薬剤の有効濃度においてアポトーシスの指標であるカスパーゼ３活性を測定した。
１．材料・実験手順
実施例１と同様にヒト大腸癌由来細胞株ＨＣＴ１１６及びＨＣＴ１１６＋ｃｈ３を用いた。
用いた抗癌薬の有効濃度を下記表２に示す。
【００２２】
【表２】
2006141225.tif 000003
【００２３】
以下の手順でカスパーゼ３活性を測定した。
ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１１６＋ｃｈ３を３×１０５細胞／２５ｃｍ２フラスコとなるように播き、２４時間、３７℃で培養した後、それぞれの抗癌薬を添加した。さらに２４時間培養した後トリプシン処理により細胞を回収し、ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ＣａｓｐＡＳＥ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）添付のｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを用いてｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅを調製した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いてタンパク質濃度を測定した。反応液１００μＬにｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ  ５０μｇ、０．２ｍＭ  Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡ（シグマ  Ａ−２５５９）を加えて、３７℃で反応させた。４時間後の吸光度（４０５ｎｍ）を測定し、生成したｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）量からカスパーゼ３活性を算出した。カスパーゼ３活性の測定は３重測定で行った。
従ってカスパーゼ３活性は、１μｇタンパク質あたり１時間で放出されるｐＮＡの量（ｐｍｏｌ）として表現される。
尚、抗癌薬非投与の細胞のカスパーゼ３活性を対照とした（図３中；ｎｏｎｅ）。
【００２４】
２．結果
結果を図３に示す。対照に比べ、ほとんどの薬剤がアポトーシスを誘導していたことから、これらの薬剤の抗癌作用がアポトーシス経路を介するものであることがわかった。また実施例１で確認された抵抗性の薬剤ではＭＭＲ非欠損細胞株よりもＭＭＲ欠損細胞株でカスパーゼ３活性が低くなる傾向があった。等感受性の薬剤では同程度であった。
さらに、ドキソルビシンやシスプラチン、オキザリプラチン等がカスパーゼ３誘導活性が高いことがわかった。
【００２５】
実施例３：ドキソルビシン及びオキザリプラチンによるカスパーゼ３活性誘導
実施例２よりドキソルビシンあるいはオキザリプラチンで処理した場合にヒト大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６及びＨＣＴ１１６＋ｃｈ３においてカスパーゼ３活性が誘導されることがわかった。
本実施例で、各薬剤の濃度を種々に変えてそのカスパーゼ３活性誘導能を調べた。
１．材料・実験手順
実施例１と同様にヒト大腸癌由来細胞株ＨＣＴ１１６及びＨＣＴ１１６＋ｃｈ３を用いた。実施例２と同様にして各種濃度のドキソルビシン（０〜１０μＭ）及びオキザリプラチン（０〜２００μＭ）でＨＣＴ１１６又はＨＣＴ１１６＋ｃｈ３を処理して、処理２４時間後の細胞のカスパーゼ３活性を測定した。
２．結果：
結果を図４に示す。同濃度のドキソルビシン処理では、高感受性を示すＨＣＴ１１６＋ｃｈ３（実施例１参照）の方が抵抗性を示すＨＣＴ１１６（実施例１参照）よりもカスパーゼ３活性が高く、等感受性薬剤であるオキザリプラチンではカスパーゼ３活性はほぼ同じに誘導された。これらの結果から細胞毒性の程度（効き方）とカスパーゼ３活性との間に関連性があることが示唆された。
【００２６】
実施例４：ヒト骨髄性白血病細胞株（Ｕ−９３７）における各種抗癌薬によるカスパーゼ３活性誘導能
細胞の種類を違えて各種抗癌薬によるカスパーゼ３活性を測定した。
１．材料・実験手順
ヒト骨髄性白血病由来細胞株Ｕ−９３７を用いた。Ｕ−９３７はＡＴＣＣより入手し、１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ，ＵＳＡ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中にて維持した。５％ＣＯ２存在下３７℃にて培養した。
下記表３に示す濃度で各種抗癌薬を用いた。
【００２７】
【表３】
2006141225.tif 000004
【００２８】
抗癌薬で処理する細胞として４〜５×１０５細胞／２５ｃｍ２フラスコとなるように播いたＵ−９３７を用いた以外は実施例２と同様にして各抗癌薬のＵ−９３７におけるカスパーゼ３活性誘導能を測定した。抗癌薬非投与の細胞のカスパーゼ３活性を対照とした（図５中；ｎｏｎｅ）。
２．結果：
結果を図５に示す。ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６あるいはＨＣＴ１１６+ｃｈ３の場合にはドキソルビシン＞シスプラチン＞オキザリプラチンの順でカスパーゼ３活性が高かった（図４参照）が、ヒト骨髄性白血病細胞株であるＵ−９３７の場合にはオキザリプラチン＞シスプラチン＞ドキソルビシンの順でカスパーゼ３活性が高く、細胞の種類により誘導能が若干異なることがわかった。
【００２９】
実施例５： ヒト細胞株におけるカスパーゼポテンシャル
比較的カスパーゼ３活性誘導能の高いドキソルビシンを用いて、種々のヒト細胞株についてカスパーゼ３活性（カスパーゼポテンシャル）を測定した。
１．材料・実験手順
下記表４に示す１６種類のヒト細胞株を用いた。
【００３０】
【表４】
2006141225.tif 000005
【００３１】
ヒト大腸癌由来細胞株ＬｏｖｏはｈＭＳＨ２遺伝子（ＭＭＲ遺伝子のひとつ）欠損ヒト大腸癌細胞株である。Ｌｏｖｏ＋ｃｈ２は正常細胞株（ＭＭＲ非欠損）であり、Ｌｏｖｏにｍｉｃｒｏｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ法を用いてヒト第２染色体を転移して調製した。Ｌｏｖｏの培養液はＨＣＴ１１６と同様であり、Ｌｏｖｏ＋ｃｈ２はＨＣＴ１１６＋ｃｈ３と同様である。
全ての細胞株は２５ｃｍ２フラスコ当たり４×１０５細胞となるように播きこみ２４時間培養し、実施例２と同様にして３又は３．６μＭのドキソルビシンで２４時間処理した。処理後、細胞を回収し、カスパーゼ３活性を測定した。また対照として抗癌薬未処理の各細胞におけるカスパーゼ３活性も測定した。
【００３２】
２．結果：
結果を表５に示す。
【００３３】
【表５】
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【００３４】
実施例６：ヒト神経芽腫細胞株におけるカスパーゼポテンシャル
ヒト神経芽腫細胞株を用いてカスパーゼ３活性誘導能の高いドキソルビシンとシスプラチンで処理した場合のカスパーゼポテンシャルを測定した。
１．材料・実験手順
ヒト神経芽腫細胞株１２株（表６参照）を用いた。これら細胞株のうち、ＮＡは２００１年日赤医療センターにて未治療腫瘍から樹立された。ＮＡ２はＮＡと同一患者で骨髄移植も含めた手術後化学療法６ヶ月目に前回の腫瘍床に再発した腫瘍から２００２年に樹立された。
ＧＯＴＯ、ＴＧＷはＪＣＲＢ、ＮＢ−１は東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター、ＳＫ−Ｎ−ＳＨはＡＴＣＣより、ＣＨＰ１３４、ＮＧＰ、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ、ＮＭＢ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥは千葉県立がんセンター中川原章博士より、ＮＢＬ−Ｓはワシントン大学（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のＤｒ．Ｇ．Ｍ．Ｂｒｏｄｅｕｒより供与された。培養方法は培地として１０％ウシ胎児血清含有ＰＲＭＩ１６４０を用い、他の実施例と同様に培養した。
カスパーゼポテンシャルの測定のためにはドキソルビシン（３．６μＭ）を、ＩＣ５０値の測定のためにはドキソルビシン（０．１８〜１８μＭ）及びシスプラチン（１〜５０μＭ）を用いた。ＩＣ５０の測定は以下のようにして行った。
９６ウェルマイクロプレートに１ウェルあたり、１０４細胞を播きこみ、１８ないしは３０時間培養し、様々な濃度のドキソルビシン（０．１８〜１８μＭ）またはシスプラチン（１〜５０μＭ）を加え、さらに２４時間培養を続けた。培養後、発色試薬ＷＳＴ−８（キシダ化学）を加え、４時間インキュベートし、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。未処理の吸光度を１００％として、各濃度での阻害率を計算し、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した。
２．結果
結果を表６に示す。
【００３５】
【表６】
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【００３６】
実施例７： カスパーゼポテンシャルと薬剤感受性
実施例６の結果より、カスパーゼ活性高誘導株（高カスパーゼポテンシャル細胞株）及びカスパーゼ活性低誘導株（低カスパーゼポテンシャル細胞株）を選んで薬剤感受性について調べた。
１．材料・実験手順
高カスパーゼポテンシャル細胞株としてはＮＡを、低カスパーゼポテンシャル細胞株としてはＮＢ−１、ＴＧＷ、ＮＭＢ、ＮＧＰ、ＧＯＴＯを用いた。抗癌薬としてはカスパーゼ活性高誘導薬剤であるドキソルビシン（０．１８〜１４．４μＭ）、シスプラチン（１〜２５μＭ）、オキザリプラチン（１〜３００μＭ）及びＭＭＲ欠損細胞が高感受性を示すクロラムブシル（５〜５０μＭ）を用いた。
カスパーゼ３活性の測定は実施例２と同様な方法によって行った。
２．結果
結果を図６に示す。カスパーゼ３活性高誘導薬剤であるドキソルビシン、シスプラチン、オキザリプラチンに対する感受性はカスパーゼ３活性高誘導株ＮＡでは高く、カスパーゼ活性低誘導株ＮＢ−１、ＴＧＷ、ＮＭＢ、ＮＧＰ、ＧＯＴＯでは約１０〜５０倍の抵抗性を示した。しかしながら、ＭＭＲ欠損細胞が高感受性を示すクロラムブシルはそれらの細胞株間で２倍程度の感受性の差しか見られなかった。
【００３７】
実施例８：大腸癌患者の手術摘出検体におけるカスパーゼポテンシャル
ヒト大腸癌患者の手術摘出検体３例を用いてカスパーゼ３活性誘導能の高いドキソルビシンとオキザリプラチンで処理した場合のカスパーゼポテンシャルを測定した。
１．材料・実験手順
ヒト大腸癌患者の手術摘出検体ＣＲ４３４、ＣＲ４３５、ＣＲ４３６の各組織片０．０１〜０．１ｇを滅菌したハサミとピンセットでできるだけ細かくし、培養方法は、培地として１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０を用い、実施例４及び５に準じてカスパーゼポテンシャルを測定した。
２．結果
結果を図７に示す。図７より、ＣＲ４３４は高ＣＰ、ＣＲ４３５及びＣＲ４３６は低ＣＰと判定された。
【００３８】
実施例９：カスパーゼ基質又は抗癌薬による活性の違い
アセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｐ−ニトロアニリド（カスパーゼ３に対する合成基質）及び汎カスパーゼ基質であるアセチル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ｐ−ニトロアニリド（カスパーゼ一般に対する合成基質）を用いて、実施例３あるいは実施例４と同様にしてＨＣＴ１１６についてそのカスパーゼポテンシャルを測定した。また、ＨＣＴ１１６をオキザリプラチン（２００μＭ）またはドキソルビシン（３．６μＭ）でそれぞれ２４時間処理し、抗癌剤の違いによるカスパーゼポテンシャルを測定した。これらの結果を図８に示す。
【００３９】
図８より、ドキソルビシンは、汎カスパーゼ基質よりもカスパーゼ３に対する基質を用いた方がカスパーゼ誘導能の差が大きいのに対して、オキザリプラチンは、基質を変えてもカスパーゼ誘導能を同程度に示すことがわかる。
【００４０】
以上の結果からカスパーゼ誘導能、即ち、カスパーゼポテンシャルを測定することにより、多くの抗癌薬や放射線の感受性を予測可能であり、近年問題になっている難治性癌のあぶり出しにも有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、ＭＭＲ欠損によって細胞障害能が影響を受ける抗癌薬についてまとめたものである。各抗癌薬を抵抗性（低感受性）、等感受性及び高感受性の３群に分類した。
【図２】図２は、カスパーゼを介するアポトーシス経路を模式的に示した図である。
【図３】ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６及びＨＣＴ１１６＋ｃｈ３における各種抗癌薬によるカスパーゼ３活性誘導能を調べた結果を示す図である。
【図４】ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６及びＨＣＴ１１６＋ｃｈ３におけるドキソルビシン及びオキザリプラチンによるカスパーゼ３活性誘導を調べた結果を示す図である。
【図５】ヒト骨髄性白血病細胞株Ｕ−９３７における各種抗癌薬によるカスパーゼ３活性誘導能を調べた結果を示す図である。
【図６】高カスパーゼポテンシャル細胞株及び低カスパーゼポテンシャル細胞株における薬剤感受性（ＩＣ５０）を比較した結果を示す図である。
【図７】大腸癌患者の手術摘出検体についてカスパーゼポテンシャルを調べた結果を示す図である。
【図８】カスパーゼ基質又は抗癌薬によるカスパーゼポテンシャルの違いを示した図である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図２】
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【配列表】
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