(57)【要約】 【課題】細胞分裂、細胞増殖及び血管生成過程で重要な役割をするＲａｓ信号伝達経路を標的にするチモシンβ１０（ｔｈｙｍｏｓｉｎβ１０）タンパク質の血管新生、細胞増殖または細胞転移抑制剤としての新しい用途を提供する。 【解決手段】チモシンβ１０タンパク質は、Ｒａｓ−ＧＴＰと結合してそれを隔離させたりＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆとの結合を妨害してＲａｓ−ＧＴＰ／Ｒａｆ複合体の量を減少させ血管内皮生成因子の発現を抑制することにより人体組織で起きる血管新生、細胞転移及び／または細胞増殖を抑制できる。したがって、本発明のチモシンβ１０タンパク質は、Ｒａｓ信号伝達経路の活性による血管新生、細胞増殖及び／または細胞転移と関連した疾病、例えば、卵巣癌、子宮頚部癌、胃癌及び肺癌等のような各種固形癌、リューマチ関節炎、乾癬及び糖尿病性網膜症等の治療に効果的に使用できる。【選択図】図９
2006348006.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒａｓ信号伝達経路を標的にするチモシンβ１０遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を有効成分として含む血管新生、細胞増殖または細胞転移抑制剤。
【請求項２】
チモシンβ１０遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質が、哺乳類由来であることを特徴とする請求項１記載の抑制剤。
【請求項３】
チモシンβ１０遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質が、ヒト由来であることを特徴とする請求項２記載の抑制剤。
【請求項４】
チモシンβ１０遺伝子が、配列番号１、及びそれによりコードされるタンパク質が配列番号２で記載されることを特徴とする請求項３記載の抑制剤。
【請求項５】
血管新生、細胞増殖または細胞転移が、固形癌と関連した症状であることを特徴とする請求項１記載の抑制剤。
【請求項６】
固形癌が、胃癌、肺癌、子宮頚部癌または卵巣癌であることを特徴とする請求項５記載の抑制剤。
【請求項７】
血管新生が、リューマチ性関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎臓病、高血圧、子宮内膜症及び脂肪症等を含む疾患と関連した症状であることを特徴とする請求項１記載の抑制剤。
【請求項８】
Ｒａｓ信号伝達経路を標的にすることが、チモシンβ１０とＲａｓとの直接的相互作用によるものであることを特徴とする請求項１乃至請求項７のいずれか一項に記載の抑制剤。
【請求項９】
チモシンβ１０とＲａｓとの直接的相互作用が、Ｒａｓ−ＧＴＰの隔離及びＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆへの結合妨害、またはＲａｓ−ＧＴＰの隔離またはＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆへの結合妨害を招来することを特徴とする請求項８記載の抑制剤。
【請求項１０】
Ｒａｓ−ＧＴＰの隔離及びＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆへの結合妨害が、Ｒａｓ−ＧＴＰ／Ｒａｆ複合体の量を減少させることを特徴とする請求項９記載の抑制剤。
【請求項１１】
Ｒａｓ−ＧＴＰ／Ｒａｆ複合体の量の減少が、血管内皮生成因子（ＶＥＧＦ）の発現を抑制することを特徴とする請求項１０記載の抑制剤。
【請求項１２】
チモシンβ１０遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を有効成分として含むＲａｓ活性抑制剤。
【請求項１３】
Ｒａｓ活性の抑制が、チモシンβ１０とＲａｓとの直接的相互作用によるものであることを特徴とする請求項１２記載のＲａｓ活性抑制剤。
【請求項１４】
チモシンβ１０とＲａｓとの直接的相互作用が、Ｒａｓ−ＧＴＰの隔離及びＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆへの結合妨害、またはＲａｓ−ＧＴＰの隔離またはＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆへの結合妨害を招来することを特徴とする請求項１３記載のＲａｓ活性抑制剤。
【請求項１５】
Ｒａｓ−ＧＴＰの隔離及びＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆへの結合妨害が、Ｒａｓ−ＧＴＰ／Ｒａｆ複合体の量を減少させることを特徴とする請求項１４記載のＲａｓ活性抑制剤。
【請求項１６】
ＲＡＳ−ＧＴＰ／Ｒａｆ複合体の量の減少が、血管内皮生成因子（ＶＥＧＦ）の発現を抑制することを特徴とする請求項１５記載のＲａｓ活性抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｒａｓ信号伝達経路を標的にするチモシンβ１０（ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β１０）を有効成分として含む血管新生、細胞増殖または細胞転移抑制剤に関するものである。より詳細には、チモシンβ１０は、Ｒａｓ−ＧＴＰと結合してそれを隔離させたりそのＲａｆとの結合を妨害したりすることにより、Ｒａｓ−ＧＴＰ／Ｒａｆ複合体の量を減少させ血管内皮生成因子の発現を抑制することを特徴とする血管新生または細胞増殖抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、既存の血管から新しい血管が生成されることを言うもので、細胞増殖及び細胞転移とも密接に関連している（非特許文献１）。血管新生は次の二つの経路により起こるものと考えられている。第一は既存の血管から刺激により新しい血管が生成されるもので、第二は血管前駆細胞の血管母細胞（ａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）が分裂と分化により新しい血管を形成するデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）血管生成経路である（非特許文献２）。
【０００３】
このような血管新生は、組織の新生成長において非常に重要な過程であり、成人または成熟した組織では月経及び傷の治癒過程を除いて普通は起きない。これは、正常的組織では、血管新生因子（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）と血管新生抑制因子（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）が相互に作用して血管新生を精巧に調節しているからである。したがって、血管新生の非正常的調節による血管新生の過多は、疾患の発生により起こり得る。それを通常的に血管新生成疾病という（非特許文献３〜５）。このような血管新生成疾病には、悪性固形癌、リューマチ関節炎、乾癬及び糖尿病性網膜症等があり、様々な種類のヒト癌組織で形成された毛細血管の数と密度は、癌の転移可能性と密接な相関関係があると報告された。
【０００４】
したがって、前記血管新生成疾病の治療には、血管新生の抑制が根本的な治療として好ましいものと考えられている。例えば、予後が良くない悪性固形癌の場合、原発癌が外科的に除去されたとしても医学的診断が不可能な微細サイズの癌細胞が血管を通じて転移して条件さえ整えば何時でも新しい器官や組織内に増殖して新しい癌を誘発する可能性があるため、外科的手術だけでは限界があり、またその他の抗癌療法は適用可能な癌の種類、治療時機、または患者の状態によって非常に制限的であるため、癌の成長と転移に必須的な新生血管形成過程を調節することが新しい癌治療療法として認識されてきている。
【０００５】
前記血管新生成疾病の発生及び進行には、新しい血管生成が必須的でその調節には多数の成長因子、例えば、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）及び血管内皮生成因子（ＶＥＧＦ）が重要な媒介因子として知られている（非特許文献６）。
【０００６】
その中で特に血管内皮生成因子（ＶＥＧＦ）及びそれに相応する受用体が血管新生の一次的原因であると提案された（非特許文献７）。このようなＶＥＧＦの発現及び分泌は、Ｒａｓのような腫瘍遺伝子の活性により刺激される（非特許文献８）。したがって、内皮細胞でのＶＥＧＦ誘導されたＲａｓ信号伝達経路が血管新生に重要であると考えられた（非特許文献９）。それのため、Ｒａｓ信号伝達経路の抑制が血管新生調節の多くの標的にされてきた。 
【０００７】
Ｒａｓは、２１ｋＤａタンパク質で、グアニンヌクレオチドと結合して活性化され細胞内の特異的なＧＴＰａｓｅ回路を調節する分子スイッチとして細胞の成長及び分化にいたる細胞信号伝達経路で重要な役割をし（非特許文献１０）、ヒトに発生する癌の３０％以上で発見されるＲａｓの突然変異がそれを証明している。
【０００８】
したがって、従来からＲａｓの信号伝達経路を遮断して癌の治療及び血管新生を調節しようとする研究が多く進められてきた。 
【０００９】
特許文献１は、Ｒａｓ信号伝達の下流段階であるＲａｆの活性を調節して血管新生を抑制する方法を開示している。
【００１０】
特許文献２は、Ｒａｓのアンチセンス転写体を使用してＲａｓを抑制する方法を開示している。
【００１１】
特許文献３は、化合物を使用したＲａｓ及びその下流段階タンパク質の抑制を通じた癌の治療方法を開示している。
【００１２】
特許文献４は、Ｒａｓの発現量を増加させて細胞増殖を調節する方法を開示している。
【００１３】
特許文献５は、ＶＥＧＦ抑制化合物を使用した血管新生による増殖性疾病治療方法を開示している。
【００１４】
特許文献６は、Ｒａｓのファネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）を調節してＲａｓの活性を抑制する化合物を開示している。
【００１５】
特許文献７は、チモシンβ１０の卵巣癌の遺伝子治療法剤を開示している。
【００１６】
前記特許文献で言及されたことを含み、現在までＲａｓ信号伝達経路の上流及び下流段階の過程に関与する２０種以上の治療剤が開発されたが、Ｒａｓの活性に対して制限された効果だけを有している。
【００１７】
さらに、前記のどの文献及び発明もＲａｓと直接結合して活性化したＲａｓを隔離したりそのＲａｆとの結合を妨害したりして効果的にＲａｓの活性を抑制したりして血管新生、細胞増殖及び／または細胞転移を抑制する方法及び物質に関しては開示していない。
【００１８】
それで、本発明者らは、Ｒａｓ活性及びそれによるＲａｓ信号伝達経路を効果的に抑制できるタンパク質を探索中に、チモシンβ１０がＲａｓ活性を効果的に抑制することを発見した。
【００１９】
チモシンβ１０は、アクチン単量体を隔離してアクチンの重合を妨害するタンパク質であり、チモシン−β４と共に哺乳類細胞に最も多く発見されるチモシンβタンパク質である。
【００２０】
詳細には、チモシンβ１０は小さなアクチン−結合タンパク質で、アクチンモノマーを隔離して細胞内Ｆ−アクチンネットワークの脱重合反応（ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を誘導する（非特許文献１１〜１３）。チモシンβ１０発現の変化は、アクチンストレス繊維（ｓｔｒｅｓｓ  ｆｉｂｅｒ）を変化させて細胞内基本構造に影響を与え、細胞成長、アポトーシス、細胞付着及び細胞移動の均衡を変化させる（非特許文献１２）。チモシンβ１０は、また発生過程中に非常に多く発現され（非特許文献１４）、細胞脱着誘導にも関与するものであると報告された（非特許文献１５）。
【００２１】
本発明者らは、前記チモシンβ１０  の既存の報告された機能以外にチモシンβ１０が  Ｒａｓとの直接相互作用を通じてＲａｓ信号伝達経路を遮断して血管新生、細胞増殖及び細胞転移を抑制することを発見して本発明を完成した。
【特許文献１】ＷＯ０１／０１２２１０
【特許文献２】ＷＯ９７／０１６５４７
【特許文献３】ＷＯ０３／０８６４６７
【特許文献４】ＷＯ０３／０１８７５５
【特許文献５】ＷＯ０５／０２７９７２
【特許文献６】ＷＯ０２／１２８３８１
【特許文献７】韓国特許第０４５４８７１号
【非特許文献１】Ｒｉｓａｕ  Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９７年，第３８６巻，６７１−４頁
【非特許文献２】Ｂｌｏｏｄ等，Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０年，第１０３２巻，８９−１１８頁
【非特許文献３】Ｆｏｌｋｍａｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７年，第２３５巻，４４２−４４７頁
【非特許文献４】Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｃｅｌｌ，１９９６年，第８６巻，３５３−３６４頁
【非特許文献５】Ｆｉｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｓ，Ｃｅｌｌ，１９９４年，第７９（２）巻，１８５−１８８頁
【非特許文献６】Ｆｏｌｋｍａｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２年，第２６７巻，１０９３１−１０９３４頁
【非特許文献７】Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃａｎｃｅｒ，２００２年，第ｌ２巻，７９５−８０３頁
【非特許文献８】Ｒａｋ  Ｊ．等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０００年，第６０巻，４９０−４９８頁
【非特許文献９】Ｍｅａｄｏｗｓ  ＫＮ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００１年，第２７６巻，４９２８９−４９２９８頁
【非特許文献１０】Ｂｏｕｒｎｅ，Ｈ．Ｒ．，等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９１年，第３４９巻，１１７−１２７頁
【非特許文献１１】Ｎａｃｈｍｉａｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９９５年，第５巻，５６−６２頁
【非特許文献１２】Ｙｕ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３年，第２６８巻，５０２−５０９頁
【非特許文献１３】Ｙｕ等，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ．Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，１９９４年，第２７巻，１３−２５頁
【非特許文献１４】Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｏ等，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９６年，第３９４巻，１０３−６頁
【非特許文献１５】Ｉｇｕｃｈｉ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８年，第２５３巻，７６６−７７０頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、チモシンβ１０の血管新生、細胞増殖及び細胞転移抑制剤としての新規な用途を提供するものである。詳細には、本発明は、チモシンβ１０がＲａｓ−ＧＴＰと結合してそれを隔離させたり及び／またはそのＲａｆとの結合を妨害したりすることによりＲａｓ−ＧＴＰ／Ｒａｆ複合体の量を減少させて血管内皮生成因子の発現を抑制することを特徴とする血管新生、細胞増殖または細胞転移抑制剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
前記目的をするために本発明は、Ｒａｓ信号伝達経路を標的にするチモシンβ１０遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を有効成分として含む血管新生、細胞増殖または細胞転移抑制剤を提供する。
【００２４】
本発明はまた、前記血管新生、細胞増殖または細胞転移が固形癌と関連した症状であることを特徴とする抑制剤を提供する。
【００２５】
本発明はまた、前記固形癌は胃癌、肺癌、子宮頚部癌または卵巣癌であることを特徴とする抑制剤を提供する。
【００２６】
本発明はまた、前記血管新生はリューマチ関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎臓病、高血圧、子宮内膜症及び脂肪症等を含む疾患と関連した症状であることを特徴とする抑制剤を提供する。
【００２７】
本発明はまた、Ｒａｓ信号伝達経路を標的にすることがチモシンβ１０とＲａｓとの直接的相互作用によるものであることを特徴とする抑制剤を提供する。
【００２８】
本発明はまた、前記チモシンβ１０とＲａｓとの直接的相互作用がＲａｓ−ＧＴＰの隔離及びＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆへの結合妨害、またはＲａｓ−ＧＴＰの隔離またはＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆへの結合妨害を招来することを特徴とする抑制剤を提供する。
【００２９】
本発明はまた、前記Ｒａｓ−ＧＴＰの隔離及びＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆへの結合妨害が、Ｒａｓ−ＧＴＰ／Ｒａｆ複合体の量を減少させることを特徴とする抑制剤に関するものである。
【００３０】
本発明はまた、前記Ｒａｓ−ＧＴＰ／Ｒａｆ複合体の量の減少が血管内皮生成因子（ＶＥＧＦ）の発現を抑制することを特徴とする抑制剤を提供する。
【００３１】
本発明はまた、チモシンβ１０遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を有効成分として含むＲａｓ活性抑制剤を提供する。
【００３２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、Ｒａｓ信号伝達経路を標的にするチモシンβ１０遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を有効成分として含む血管新生、細胞増殖または細胞転移抑制剤に関するものである。
【００３３】
本発明のチモシンβ１０は、前記Ｒａｓとの直接的相互作用を通じてＲａｓ信号伝達経路の下流段階の活性を抑制して血管新生、細胞増殖及び細胞転移を効果的に抑制できる。チモシンβ１０は、アクチン−結合タンパク質でアクチンモノマーを隔離して細胞内Ｆ−アクチンネットワークの脱重合反応（ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を誘導（非特許文献１１〜１３）すると報告されたことがある。その配列が相異した種間に非常に良く保存された小さなペプチドで種々の類型が存在する。その中でチモシンβ４及びβ１０が哺乳類細胞で最も多く発現される。特に、チモシンβ１０は、膵臓、胸線、前立腺、睾丸及び結腸等の組織で多く発現される。
【００３４】
本発明のチモシンβ１０タンパク質またはそれをコードする遺伝子は、本発明による血管新生、細胞増殖及び細胞転移効果を示し得る限り、ヒトを含む多様な哺乳類由来のもの及びそれと機能的に同等な変異体がすべて本願発明の範囲に含まれる。例えば、チモシンβ１０遺伝子及びそれをコードするタンパク質は、ヒトの場合遺伝子バンク・アクセス番号（ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）Ｍ９２３８１及びＰ６３３１３；ネズミの場合Ｍ１７６９８及びＰ６３３１２で公知されていて、本発明では各々配列番号１乃至４で記載している。  
【００３５】
本発明のチモシンβ１０タンパク質を暗号化する遺伝子は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び化学合性ＤＮＡを含む。ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡは、当業界の公知の方法により製造できる。ゲノムＤＮＡは、例を挙げると、チモシンβ１０遺伝子を有する細胞からゲノムＤＮＡを抽出してゲノムライブラリー（ベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ等が使用できる）を製作して、前記ライブラリーを本発明のタンパク質を暗号化するＤＮＡ（例を挙げると、配列番号１）を基礎に製作したプローブを使用してコロニーまたはプラーグ混成化を行ったり、本発明のタンパク質を暗号化するＤＮＡ（例を挙げると、配列番号１）に特異的なプライマーを製作したりし、それを使用してポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）を行なうことにより製造することもできる。ｃＤＮＡは、例を挙げると、チモシンβ１０遺伝子を有する細胞から抽出したｍＲＮＡを基礎にｃＤＮＡを合性して、前記合性したｃＤＮＡをλＺＡＰ等のベクターで挿入してｃＤＮＡライブラリーを製作し、前記ｃＤＮＡライブラリーを展開し、前記と同様にコロニーまたはプラーク混成化を行ったりまたはＰＣＲを行ったりして製造できる。
【００３６】
「機能的に同等な変異体」という用語は、特定種由来の野生型タンパク質またはその遺伝子配列と比較して変異があるがＲａｓと相互作用して抗血管新生、細胞増殖及び／または細胞転移抑制を誘導できる機能を有するものを言う。したがって、例えば、本発明のチモシンβ１０タンパク質またはそれをコードする遺伝子はヒト由来の配列番号２のチモシンβ１０タンパク質またはそれをコードする配列番号１の遺伝子と機能的に同等な変異体を含む。このような遺伝子には、例を挙げると配列番号２のアミノ酸配列で一つ以上のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質を暗号化する突然変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）、誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅｓ）、変形体（ｖａｒｉａｎｔｓ）及び同質体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）を含む。
【００３７】
アミノ酸配列が変化したタンパク質を暗号化する遺伝子は、当業者に良く知られている方法、例を挙げると部位誘導性突然変異法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｋｒ  ａｍｅｒ，Ｗ．＆  Ｆｒｉｔｚ，Ｈ−Ｊ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｖｉａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｕｘ  ＤＮＡ． Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８７年，第１５４巻，３５０−３６７頁）等により製造できる。また塩基配列の変異による暗号化するタンパク質のアミノ酸配列変異は、自然的状態でも発生する。
【００３８】
このように、野生型チモシンβ１０タンパク質を暗号化するアミノ酸配列で一つ以上のアミノ酸が置換、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を暗号化する遺伝子も野生型チモシンβ１０（配列番号２）と同等な機能を有するタンパク質を暗号化する限り、本発明の遺伝子に含まれる。さらに、例を挙げると、塩基配列変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）が存在し、このような縮重変異体（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ  ｍｕｔａｎｔｓ）も本発明の遺伝子に含まれる。
【００３９】
配列番号２のチモシンβ１０タンパク質と機能的に同一なタンパク質を暗号化する遺伝子は、当業界の公知の方法、例えば、混成化技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７５年，第９８巻，５０３頁）やＰＣＲ方法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５年，第２３０巻，１３５０−１３５４頁；Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８年，第２３９巻，４８７−４９１頁）を使用して製造できる。例えば、当業者であればチモシンβ１０遺伝子の塩基配列（配列番号１）からチモシンβ１０遺伝子に特異的に混成化できるプライマーを考案してチモシンβ１０遺伝子と高い相同性を有する多様な哺乳類由来のチモシンβ１０遺伝子を分離できる。このような混成化技術やＰＣＲ技術により分離されるチモシンβ１０タンパク質と同一な機能を有するタンパク質を暗号化する遺伝子もまた本発明の遺伝子に含まれる。
【００４０】
このように分離された遺伝子は、アミノ酸水準において、チモシンβ１０タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性というのは、アミノ酸配列全体で少なくても５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例を挙げると、９５％以上）の配列の同一性を示している。
【００４１】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国，１９９３年，第９０巻，５８７３−５８７７頁）に基づいて開発されたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０年，第２１５巻，４０３−４１０頁）を使用して分析できる。詳細な方法は、ウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に公開されている。
【００４２】
本発明の抑制剤は、血管新生、細胞増殖及び細胞転移の抑制にすべて使用できる。血管新生、細胞増殖及び細胞転移はお互いに密接に関連したもので、従来、Ｒａｓ及びＲａｆで結ばれるＲａｓ信号伝達経路が血管新生に重要なものであると報告された。血管新生は、前記背景技術で言及したように多くの増殖性疾患と関連していて、このような疾患における血管新生は、疾患組織の成長に必須的なものである。したがって、血管新生を抑制すると疾患での細胞の増殖及び／または細胞転移を効果的に抑制できる。
【００４３】
したがって、本発明のチモシンβ１０  遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質は、血管新生、細胞増殖及び／または細胞転移と関連したすべての疾患に制限されるものではなく、例えば、固形癌、リューマチ関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎臓病、高血圧、慢性肝炎、子宮内膜症及び脂肪症（非特許文献３〜５；Ｓｐａｒｍａｎｎ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２００４年，第６（５）巻，４４７−４５８頁；Ｌｉｓｔ，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，２００２年，第７  Ｓｕｐｐｌ１巻，３９−４９頁；Ｇｒｉｆｆｉｏｅｎ１  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｍａ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００１年，第５２巻，２３７−２６８頁）等に使用できる。
【００４４】
このような増殖性疾患の共通的特徴は、血管新生を随伴し、による血管新生の抑制がこのような疾患の治療及び予防に有用であることが提示された（Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ．等，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１９９５年，第１巻，２７−３１頁）。したがって、本発明のチモシンβ１０を有効成分として含む抑制剤は血管新生が随伴するすべての疾患の治療に効果的に使用できる。
【００４５】
例えば、固形癌は調節不可能な細胞増殖及び転移で特徴され、腫瘍が一定の大きさになると、継続的な成長及び転移により血管新生が必要であることは確立された事実で（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．等，Ｃｅｌｌ，１９９６年，第８６巻，３５３−３６４頁）、固形癌、特に悪性腫瘍の場合、一般的に血管新生、細胞増殖及び細胞転移すべてが随伴する。したがって、本発明のチモシンβ１０遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を含む抑制剤は、すべての固形癌、例えば、Ｒａｓの持続的活性による固形癌の治療に制限されず、例えば、胃癌、肺癌、子宮頚部癌または卵巣癌の治療に効果的に使用できる。本発明の実施例ではその例として卵巣癌の抑制に効果的であることを確認した（実施例９参照）。
【００４６】
血管新生で特徴されるまた一つの疾病が糖尿病性網膜症で、ここで血管新生はＶＥＧＦに起因するものであると報告された（Ｂａｒｉｎａｇａ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５年，第２６７巻，４５２−４５３頁；Ｎｏｍａ  Ｈ．等，Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，２００２年，第１２０（８）巻，１０７５−１０８０頁）。したがって、本発明のチモシンβ１０を有効成分として含む抑制剤は、糖尿病性網膜症の治療及び予防に効果的に使用できる。
【００４７】
さらに、血管新生で特徴されるまた一つの疾病がリューマチ性関節炎で、血管新生抑制剤がリューマチ性関節炎の新しい治療法として提示されている（Ｐａｌｅｏｌｏｇ  ＥＭ等，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，１９９８年，第２０（１−２）巻，７３−９４頁）。リューマチ性関節炎は究明されていない原因の免疫反応により誘導された潤滑組織内への白血球の浸透及び血管新生で特徴され、免疫反応による炎症性パンヌス（ｐａｎｎｕｓ）の発生に血管新生が必須的であることが報告された（Ｋｏｃｈ，Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ，２０００年，第５９（Ｓｕｐｐｌ１）巻，１６５−１７１頁）。したがって、本発明のチモシンβ１０遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を含む抑制剤は、すべてのリューマチ性関節炎の治療に効果的に使用できることもまた明白である。
【００４８】
その他に、当業者であれば前記文献及び当業界の常識から、チモシンβ１０を有効成分として含む本願発明の抑制剤が乾癬、糖尿病性腎臓病、高血圧、慢性肝炎、子宮内膜症及び脂肪症等の治療に効果的に使用できることが分かる。
【００４９】
本発明のＲａｓ信号伝達経路を標的にする血管新生、細胞増殖または細胞転移抑制剤は、チモシンβ１０タンパク質またはそれをコードする遺伝子を含むことができる。
【００５０】
遺伝子を含む場合、チモシンβ１０をコードする遺伝子は、組換えＤＮＡ技術等の公知の方法により標的細胞、例えば、血管新生と関連した疾患が発生した人体または動物細胞でチモシンβ１０遺伝子を発現できる限り、それに制限されるものではない。例えば、線形ＤＮＡ、プラスミドベクターまたはその他のＤＮＡ伝達用ベクターの形態で使用できる。このようなベクターは、好ましくは非ウイルス性で真核細胞でチモシンβ１０遺伝子を発現できる限り、特別に制限されるものではなく、例えばＣＭＶプロモーターを使用してクローニングされた遺伝子を発現できるｐＣＤＮＡ３または４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）を挙げることができる。
【００５１】
タンパク質を含む場合、例えば、前記ベクターを公知の方法により細胞培養システムで適切な細胞にトランスフェクションして発現させた後、チモシンβ１０タンパク質を精製して使用できる。このような本発明のチモシンβ１０タンパク質は例えば、精製されたタンパク質、水溶性タンパク質、または標的細胞への伝達または投与により担体に結合された形態のタンパク質またはアミノ酸残基と融合した形態のものを含む。
【００５２】
また、本発明のチモシンβ１０遺伝子は、遺伝子治療システム等に使用される発現ベクター例えば、ウイルスベクターに導入され公知の方法により伝達体としてウイルス粒子に含めて使用できる。前記のウイルスベクターは、本発明のチモシンβ１０タンパク質を目的とする組織内に導入できるものであれば制限されず、好ましくはアデノウイルスベクターで、前記ウイルス性ベクターは、真核細胞でそれに含まれる遺伝子を発現できる限り特別に制限されるものではない。例えば、Ａｄ−ＧＦＰ−Ｔβ１０（特許文献１）及びＡｄＴβ１０（Ｌｅｅ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５年，第６５巻，１３７−１４７頁）を挙げられる。
【００５３】
本発明の血管新生、細胞増殖及び細胞転移抑制剤が標的にするＲａｓ信号伝達経路のＲａｓは、ＧＴＰａｓｅファミリーに属する２１ｋＤａのタンパク質で３個の遺伝子（Ｈ−Ｒａｓ，Ｋ−Ｒａｓ及びＮ−Ｒａｓ）が４種類のイソ形態タンパク質をコードする。その中のＫ−Ｒａｓが細胞内発現される総Ｒａｓの９５％以上を占めるが、イソ形態間機能の特異性は明らかにされなかった（Ｓｈａｒｐｅ  Ｃ等，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，２０００年，第１１巻，１６００−１６０６頁）。
【００５４】
本発明のチモシンβ１０タンパク質と相互作用するＲａｓタンパク質は、活性及び非活性の多様な形態のＲａｓを含み、三種イソ形態のＲａｓ、即ちＮ−、Ｋ−、及びＨ−Ｒａｓをすべて含むもので、好ましくはＫ−Ｒａｓを意味するものである。さらに、本発明のチモシンβ１０タンパク質と相互作用するＲａｓタンパク質は、野生型またはＲａｓの突然変異配列、特にＲａｓを活性化する突然変異配列を有するものを含む。ヒトのＲａｓをコードする遺伝子配列は、Ｎ−、Ｋ−、及びＨ−Ｒａｓに対して各々遺伝子バンク・アクセス番号（ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＡＦ４９３９１９、ＡＦ４９３９１６及びＭ５４９６８で公知されている。
【００５５】
本発明のＲａｓタンパク質をコードする遺伝子は、当業界の公知の多様な方法により製造できる。例えば、Ｒａｓ遺伝子は前記公知の配列から当業者なら適切なプライマーまたはプローブを製作してｃＤＮＡクローニング方法により容易に製造できる。Ｒａｓを活性化する突然変異は、好ましくはアミノ酸残基１２、１３及び６１中のいずれか一つまたはそれらの組み合わせ部位に位置した突然変異を含む。前記代表的突然変異は例えば、Ｒａｓタンパク質の１２番目のグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）がバリン（Ｖａｌｉｎｅ）に置換されたものを含む。
【００５６】
本発明のチモシンβ１０は、Ｒａｓタンパク質との直接的相互作用を通じてＲａｓ−ＧＴＰを隔離させたり及び／またはＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆへの結合を妨害したりしてＲａｓ信号伝達経路のＲａｓ−ＧＴＰ／Ｒａｆ複合体の量を減少させる。このようなＲａｓ−ＧＴＰ／Ｒａｆ複合体の量の減少は、さらに血管内皮生成因子（ＶＥＧＦ）の発現を抑制して血管新生及び細胞増殖を抑制できる。
【００５７】
細胞の信号伝達系は、外部の信号を細胞内部に伝達して細胞の成長分化等の生命現象の維持のために根本的に必要な過程を調節するもので、信号伝達系の異常は種々の疾病と連携している。本発明は、このような信号伝達系中、特に血管新生及び細胞増殖と関連あるＲａｓ−ＭＡＰＫ信号伝達経路と関連したものである。
【００５８】
Ｒａｓを含んだ多くの癌遺伝子（ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ）の異常は、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ信号伝達系内の色々な工程で信号伝達物質の活性状態を持続させることにより癌を誘発するものであると報告されている（Ｇｕ，Ｚ．，等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９５年，第６９（１２）巻，８０５１−８０５６頁）。細胞においてＲａｓ−ＭＡＰＫ信号伝達経路でＲａｓにより伝達された信号は、Ｒａｆ→ＭＡＰＫＫＫ（ＭＡＰＫ  ｋｉｎａｓｅ  Ｋｉｎａｓｅ）→ＭＡＰＫＫ（ＭＡＰＫ  ｋｉｎａｓｅまたはＭＥＫ）→ＭＡＰＫの順序により伝達される（Ｎｅｉｍａｎ，Ａ．，ＴＩＧＳ，１９９３年，第９（１１）巻，３９０−３９４頁）。ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ）は、細胞質内のＲａｓ−ＭＡＰＫ信号伝達系末端に作用する酵素で、細胞外の信号を核内部に伝達する重要な媒介体の役割をする。ＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ）は、高等生物に存在する代表的なＭＡＰＫで、外部信号によりスレオニン（Ｔｈｒ）とチロシン（Ｔｙｒ）残基をリン酸化させる。それにより活性化される代表的なタンパク質がＶＥＧＦで、それにより血管新生及び細胞増殖が誘導される。
【００５９】
ＶＥＧＦは、内皮細胞に対して非常に特異的な分裂促進活性を有するタンパク質で、胚血管形成の間の新しい血管の形成及び成人の血管形成において重要な調節機能をする（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９６年，第３８０巻，４３５−４３９頁）。
【００６０】
新しい血管の形成は、背景技術で言及したように二種の相異した過程である血管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）または血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）により発生し得る（Ｒｉｓａｕ  Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９７年，第３８６巻，６７１−６７４頁）。血管形成は、初期胚芽で一次血管総形成時に発生するものと同様に内皮細胞前駆体の成熟した内皮細胞への元の場所での分化及び新生血管を形成するためのそれら細胞の会合を特徴とする。反対に、血管新生はすでに存在している血管の成長及び分岐による血管成長が原因である。血管新生は内皮細胞の増殖、細胞外マトリクスの退化、新生血管の分岐及びそれにつながる細胞癒着を含む生理学的に複雑な過程である。
【００６１】
ＶＥＧＦは主に後者に関与し、血管新生のためには内皮細胞でのＶＥＧＦ発現が必須的で、癌細胞の場合、ＶＥＧＦを分泌して血管新生のための内皮細胞を癌腫に誘導して癌を増殖及び転移させる（Ｐｌａｔｅ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９２年，第２９巻，８４５−８４８頁）。
【００６２】
本発明のチモシンβ１０は、Ｒａｓと直接相互作用することによりＲａｓ信号伝達経路のＶＥＦＧの発現及び分泌を抑制して血管新生、細胞増殖及び細胞転移を抑制できることを本発明で明らかにした。チモシンβ１０とＲａｓとの直接的相互作用は、チモシンβ１０のＲａｓへの直接結合を意味するもので、実施例６に記載したようにイーストツーハイブリッド分析法（Ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）等を通じて両タンパク質の結合を証明した。
【００６３】
チモシンβ１０は、活性化されたＲａｓ、即ちＲａｓ−ＧＴＰと結合して前記で言及したＲａｓ信号伝達経路上のＲａｆと結合するＲａｓ−ＧＴＰの隔離及び／またはＲａｓ−ＧＴＰとＲａｆとの結合を妨害する。それはＲａｆと結合するＲａｓ−ＧＴＰ量の減少につながり結局、Ｒａｆ／Ｒａｓ−ＧＴＰ複合体量の減少を招来する（実施例７及び図７参照）。さらに、図７に記載したようにチモシンβ１０は、細胞膜及び細胞質すべてに位置するので、チモシンβ１０は細胞膜に存在するＲａｓとの相互作用及び細胞質に存在するＲａｆとＲａｓ−ＧＴＰとの結合を妨害できることを提示する。
【００６４】
このような本発明のチモシンβ１０は、内皮細胞、例えば、ＨＵＶＥＣで過発現された場合、ＶＥＧＦにより誘導された細胞の増殖、移動及び浸透を顕著に減少させた（図１及び２参照）。このような細胞の増殖、移動及び浸透は悪性固形癌の転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）に必須的なものである。したがって、本願発明の抑制剤がこのような癌細胞の転移抑制に効果的に使用できる。
【００６５】
さらに、本発明のチモシンβ１０は、固形癌の形成及び増殖と密接な関連があるチューブ形成及び血管新生を抑制するものと現れた（図３及び４参照）。このような血管新生に対する抑制活性は、抗血管新生活性を有する薬物であるタキソール（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）よりさらに効果的にＶＥＧＦ−誘導された血管新生を抑制した（図４のＥ及びＦ参照）。
【００６６】
本発明のチモシンβ１０によるＶＥＧＦ誘導された細胞増殖、移動、浸透及び血管新生抑制効果は、Ｒａｓとの直接的相互作用、即ちＲａｓとの結合を通じて下流段階の信号伝達に関与するタンパク質の活性を抑制するもので、両タンパク質間の相互作用はイーストツーハイブリッド分析法等を使用して証明した（図５及び実施例６参照）。
【００６７】
このようなチモシンβ１０とＲａｓとの結合は、Ｒａｓ−ＧＴＰの量を減少させたり及び／またはＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆ結合を妨害したりしてＲａｓ信号伝達経路の下流段階タンパク質の活性を順に抑制して本願発明の効果を達成することを証明した（図７参照）。
【００６８】
詳細には、チモシンβ１０は、Ｒａｓ信号伝達経路の下流段階のＭＡＰＫＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ，ＭＥＫとしても公知）及びＥＲＫ活性化を抑制することを観察した（図７のＥ参照）。即ち、ＭＥＫ及びＥＲＫはリン酸化により活性化される。このようなＶＥＧＦ−誘導されたＭＡＰＫＫ及びＥＲＫリン酸化が過発現されたチモシンβ１０により顕著に減少した。さらに、過発現されたチモシンβ１０は、内皮細胞でのＶＥＧＦ発現及び癌細胞でのＶＥＧＦの発現及び分泌を抑制した（図７のＦ及びＧ参照）。これは、チモシンβ１０が内皮細胞でＶＥＧＦの自己分泌を抑制するだけではなく、癌細胞でのＶＥＧＦ分泌による傍分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）効果を抑制して直接的な抗血管新生効果を有することを示している。
【００６９】
このようなチモシンβ１０の血管新生及び細胞増殖抑制効果は、生体内実験を通じても証明された。本発明の実施例で例として皮膚に移植された卵巣癌細胞株により発生した腫瘍及び卵巣に誘発された同所腫瘍にチモシンβ１０を処理した結果、腫瘍成長及び血管新生が陰性対照群と比較して顕著に抑制された（図８及び図９参照）。一方、チモシンβ１０投与による体重減少及び肝毒性は観察されず、本発明のチモシンβ１０は生体内の腫瘍抑制及び増殖に効果的に使用できる。
【００７０】
前記で言及したように本発明の血管新生及び細胞増殖抑制剤は、チモシンβ１０とＲａｓとの相互作用を通じてＲａｓの活性を抑制してその効果を達成した。本発明はまた、チモシンβ１０遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を有効成分として含むＲａｓ活性抑制剤に関するものである。ここで、Ｒａｓ活性抑制はチモシンβ１０との相互作用によるＲａｓ−ＧＴＰの隔離及び／またはＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆへの結合を妨害することを特徴とし、それはＲａｓ−ＧＴＰ／Ｒａｆ複合体の量の減少及びＶＥＧＦの発現を抑制する。
【００７１】
本発明のチモシンβ１０遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を有効成分として含む血管新生、細胞増殖または細胞転移抑制剤は、組成物総重量に対して前記有効成分を０．０００１乃至５０重量％で含む。
【００７２】
チモシンβ１０遺伝子を含む組換えウイルスの場合、１０乃至１０１２ｐｆｕを含むことが好ましい。
【００７３】
前記組換えウイルスは、アデノウイルスであることが好ましく、ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）は実際に細胞に感染し得るウイルス数を示す。
【００７４】
本発明のチモシンβ１０遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を有効成分として含む抑制剤は、臨床投与時に非経口投与、例えば、静脈注射、筋肉注射、または病巣への直接注入が可能で、レミングトン文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（最近版），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に開示されている方法を参照して各疾患の程度、種類または有効成分により一般的な医薬品製剤の形態で製造できる。
【００７５】
本発明の治療用抑制剤は、様々な非経口剤形で製造して投与され得るが、製剤化する場合には、前記記載した有効成分以外に追加に製薬的に許容可能な担体を１種以上含むことができる。
【００７６】
製薬的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、モルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポゾーム及びこれらの成分中の１成分以上を混合して使用できる。必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、制菌剤等、他の通常の添加剤を添加できる。非経口剤形は、例えば、稀釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、油濁液等のような主に使用される剤形に製剤化でき、標的器官に特異的に作用できるように標的器官特異的抗体またはその他リガンドを前記担体と結合させて使用できる。
【００７７】
前記治療剤の一日投与量は、約０．００５乃至１０ｍｇ／ｋｇで、好ましくは０．０５乃至１ｍｇ／ｋｇで、組換えウイルスの場合には、１０３乃至１０１２ｐｆｕ／ｋｇで、１０８乃至１０１１ｐｆｕ／ｋｇが好ましく、日に２乃至３回に分けて投与できる。投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によりその範囲が多様であり、患者の状態及び疾患の発病程度によれ変えられる。
【００７８】
本発明のチモシンβ１０遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質をマウスに静脈注射により投与して毒性実験を行なった結果、毒性試験による５０％致死量（ＬＤ５０）は、少なくても１，０００ｍｇ／ｋｇ以上の安全な物質であると判断された。
【００７９】
さらに、本発明の治療用抑制剤は、血管新生、細胞増殖及び／または細胞転移と関連した疾患の治療のために単独で、または手術、ホルモン治療、薬物治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法等と併用して使用できる。
【００８０】
本発明（１）は、Ｒａｓ信号伝達経路を標的にするチモシンβ１０遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を有効成分として含む血管新生、細胞増殖または細胞転移抑制剤である。
本発明（２）は、チモシンβ１０遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質が、哺乳類由来であることを特徴とする本発明（１）の抑制剤である。
本発明（３）は、チモシンβ１０遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質が、ヒト由来であることを特徴とする本発明（２）の抑制剤である。
本発明（４）は、チモシンβ１０遺伝子が、配列番号１、及びそれによりコードされるタンパク質が配列番号２で記載されることを特徴とする本発明（３）の抑制剤である。
本発明（５）は、血管新生、細胞増殖または細胞転移が、固形癌と関連した症状であることを特徴とする本発明（１）の抑制剤である。
本発明（６）は、固形癌が、胃癌、肺癌、子宮頚部癌または卵巣癌であることを特徴とする本発明（５）の抑制剤である。
本発明（７）は、血管新生が、リューマチ性関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎臓病、高血圧、子宮内膜症及び脂肪症等を含む疾患と関連した症状であることを特徴とする本発明（１）の抑制剤である。
本発明（８）は、Ｒａｓ信号伝達経路を標的にすることが、チモシンβ１０とＲａｓとの直接的相互作用によるものであることを特徴とする本発明（１）乃至本発明（７）のいずれか一発明の抑制剤である。
本発明（９）は、チモシンβ１０とＲａｓとの直接的相互作用が、Ｒａｓ−ＧＴＰの隔離及びＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆへの結合妨害、またはＲａｓ−ＧＴＰの隔離またはＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆへの結合妨害を招来することを特徴とする本発明（８）の抑制剤である。
本発明（１０）は、Ｒａｓ−ＧＴＰの隔離及びＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆへの結合妨害が、Ｒａｓ−ＧＴＰ／Ｒａｆ複合体の量を減少させることを特徴とする本発明（９）の抑制剤である。
本発明（１１）は、Ｒａｓ−ＧＴＰ／Ｒａｆ複合体の量の減少が、血管内皮生成因子（ＶＥＧＦ）の発現を抑制することを特徴とする本発明（１０）の抑制剤である。
本発明（１２）は、チモシンβ１０遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を有効成分として含むＲａｓ活性抑制剤である。
本発明（１３）は、Ｒａｓ活性の抑制が、チモシンβ１０とＲａｓとの直接的相互作用によるものであることを特徴とする本発明（１２）のＲａｓ活性抑制剤である。
本発明（１４）は、チモシンβ１０とＲａｓとの直接的相互作用が、Ｒａｓ−ＧＴＰの隔離及びＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆへの結合妨害、またはＲａｓ−ＧＴＰの隔離またはＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆへの結合妨害を招来することを特徴とする本発明（１３）のＲａｓ活性抑制剤である。
本発明（１５）は、Ｒａｓ−ＧＴＰの隔離及びＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆへの結合妨害が、Ｒａｓ−ＧＴＰ／Ｒａｆ複合体の量を減少させることを特徴とする本発明（１４）のＲａｓ活性抑制剤である。
本発明（１６）は、ＲＡＳ−ＧＴＰ／Ｒａｆ複合体の量の減少が、血管内皮生成因子（ＶＥＧＦ）の発現を抑制することを特徴とする本発明（１５）のＲａｓ活性抑制剤である。
【発明の効果】
【００８１】
本発明のチモシンβ１０は、Ｒａｓとの直接相互作用によりＲａｓの活性による信号伝達経路を抑制して血管新生、細胞増殖及び細胞転移を効果的に抑制できるので、これらの症状と関連した疾患の治療及び予防に効果的に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記の実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００８３】
チモシンβ１０遺伝子のクローニング及び発現ベクターの製造
本発明のチモシンβ１０の血管新生及び細胞増殖抑制効果の試験のための各種ベクターを下記のように製造した。
実施例１−１：チモシンβ１０を発現するアデノウイルスベクター及びアデノウイルスの製造
アデノウイルスベクターへのクローニングのためのチモシンβ１０及びβ４  ｃＤＮＡは従来の文献（Ｌｅｅ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１年，第２０巻，６７００−６７７６頁；Ｌｅｅ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５年，第６５巻，１３７−１４７頁）に記載されているとおり製造した。続いて、前記各々のｃＤＮＡをアデノウイルスベクターに従来の記載どおり導入して、チモシンβ１０を発現するＧＦＰ−ＡｄＴβ１０及びＡｄＴβ１０アデノウイルスベクター及びそれら各々を含むアデノウイルスを収得した（Ｌｅｅ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１年，第２０巻，６７００−６７７６頁；Ｌｅｅ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５年，第６５巻，１３７−１４７頁；特許文献７）。
【００８４】
実施例１−２：チモシンβ１０を発現する非ウイルス性ベクターの製造  
本発明のチモシンβ１０及び陰性対照群としてβ４をＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）との融合タンパク質で発現するためにＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）融合タンパク質発現ベクターのｐＧＥＸ４Ｔ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，米国）で実施例１−１のｃＤＮＡを各々従来記載の方法で導入した（Ｌｅｅ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１年，第２０巻，６７００−６７７６頁；Ｌｅｅ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５年，第６５巻，１３７−１４７頁）。ヒスチジン残基とＲａｓの融合タンパク質発現のためにヒトＫ−Ｒａｓ  ｃＤＮＡをヒスチジン（Ｈｉｓ）融合タンパク質発現ベクターのｐｃＤＮＡ４ＨｉｓＭａｘベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）に製造者のプロトコール及び従来文献（Ｌｅｅ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５年，第６５巻，１３７−１４７頁）に記載されたとおり導入した。Ｒａｓ  ｃＤＮＡ増幅に使用したプライマーは、次の通りである：正方形（５’−ＧＡＧＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴ−３’）；逆方向（５’−ＣＣＡＣＴＴＧＴＡＣＴＡＧＴＡＴＧＣＣＴＴＡＡＧＡＡ−３’）。前記ＧＳＴまたは６個のヒスチジン残基と融合した融合タンパク質はタンパク質の分離、精製及びタンパク質間の相互作用分析に容易に使用できる。
【００８５】
実施例１−３：ｓｉＲＮＡ構築
チモシンβ１０遺伝子の細胞内発現時に誘発される効果がチモシンβ１０によるものかどうかを確認するために、その発現を遮断できるチモシンβ１０配列を標的にするｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）オリゴヌクレオチド配列（ＡＡＧＣＧＧＡＧＵＧＡＡＡＵＵＵＣＣＵＡＡ）を使用してチモシンβ１０遺伝子の発現を遮断した。 前記ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ構築キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，米国）を製造者のプロトコールにしたがって合成した。ＲＮＡｉシャトル（Ｏｒｂｉｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）を使用して製造者の勧告どおり細胞株でトランスフェクションされた（Ｌｅｅ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１年，第２０巻，６７００−６７７６頁；Ｌｅｅ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５年，第６５巻，１３７−１４７頁）。
【実施例２】
【００８６】
細胞培養及びトランスフェクション
本発明のチモシンβ１０発現のために細胞培養に使用した各細胞株の培養培地及び条件を下記に示す：ＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，米国）は、ＥＧＭ−２キット（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，米国）を使用して０．３％ゼラチンコーティングした皿で培養した。ヒト卵巣癌細胞株２７７４（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，米国）及びアデノウイルスの製造のための２９３  細胞株（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，米国）は各々１０％ＦＢＳ及び抗生剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，米国）を添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅａｇｌｅｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）とＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）で培養し、前記細胞は３７℃の５％の湿ったＣＯ２大気で培養した。
【００８７】
前記細胞株へのＤＮＡトランスフェクション及びアデノウイルスの感染は、従来の記載どおりに行なった（Ｌｅｅ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１年，第２０巻，６７００−６７７６頁；Ｌｅｅ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５年，第６５巻，１３７−１４７頁）。
【実施例３】
【００８８】
チモシンβ１０の細胞増殖抑制効果分析
チモシンβ１０の発現が細胞増殖に及ぼす影響を分析するために下記の実験を行なった。実施例２に記載した方法によりＨＵＶＥＣを各々チモシンβ１０を発現しないアデノウイルス（Ａｄ）、チモシンβ１０を発現するアデノウイルス（ＡｄＴβ１０）またはチモシンβ１０に特異的ｓｉＲＮＡトランスフェクションと共にチモシンβ１０を発現するアデノウイルス（ＡｄＴβ１０＋ｓｉＲＮＡ）で感染させた。前記ｓｉＲＮＡは、実施例１−３に記載したとおり製造し、ＨＵＶＥＣ細胞にトランスフェクションした後、その細胞をＡｄＴβ１０を含むアデノウイルスで感染させた。
【００８９】
感染１８時間後に各々の細胞に１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，米国）を２４時間処理して細胞増殖を刺激した。細胞増殖は、各々の実験群で［３Ｈ］メチルチミジン混入分析（ｍｅｔｈｙｌｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）で測定した。［３Ｈ］メチルチミジン（０．５μＣｉ／ｍｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を分析４時間前に細胞に添加し、細胞のゲノムＤＮＡで混入されたチミジンのｃｐｍ（ｃｏｕｎｔ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）値をリキッドシンチレーションカウンター（ｌｉｑｕｉｄ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で測定した。独立的に３回反復実験を行ない、各々の値は３回サンプルの平均±標準偏差で示した。
【００９０】
結果は、図１に示し、チモシンβ１０を含むアデノウイルスで感染したＨＵＶＥＣ（ＡｄＴβ１０）は、ウイルスで感染していないＨＵＶＥＣ（Ｕｎ）、チモシンβ１０を含まないアデノウイルスで感染したＨＵＶＥＣ（Ａｄ）と比較して、［３Ｈ］チミジン混入度（ｃｐｍ）が非常に低かった（図１のＡ）。このような効果は、チモシンβ１０ＲＮＡに結合してそのタンパク質発現を抑制するｓｉＲＮＡを使用したＨＵＶＥＣ（ＡｄＴβ１０＋ｓｉＲＮＡ）細胞では観察されなかったことから、前記細胞増殖抑制効果がチモシンβ１０に特異的なものであることが分かる。したがって、チモシンβ１０の過発現はＶＥＧＦ−誘導されたＤＮＡ合成、即ち細胞増殖を効果的に抑制することを確認した。
【実施例４】
【００９１】
チモシンβ１０の細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）及び浸透（ｉｎｖａｓｉｏｎ）抑制効果分析
チモシンβ１０の発現が血管新生と関連した内皮細胞移動及び浸透に及ぼす影響を調査するために、従来に記載された方法によりトランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）（８−μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ，Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して移動及び浸透分析を行なった（Ｌｅｅ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１９９９年，第２６４巻，７４３−７５０頁）。
【００９２】
要約すると、移動分析の場合、フィルターの裏表面を１０μｇゼラチンでコーティングした。下部ウェルにはＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及び１％ＦＢＳを含んだＭ１９９（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，米国）を入れた。最終濃度１×１０４細胞／１００μｌで非感染ＨＵＶＥＣ及び各々Ａｄ、ＡｄＴβ１０、ＡｄＴβ１０＋ｓｉＲＮＡ（トランスフェクション）アデノウイルスで感染されたＨＵＶＥＣを上部ウェルに植え２４時間培養し、Ｈ＆Ｅ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ及びＥｏｓｉｎ）（ＢｉｏＲａｄ，米国）で固定及び染色した。フィルターの表表面に非移動細胞は綿棒で擦って除去した。続いてフィルターの下部面に移動した細胞を光学顕微鏡でカウントして各々の平均値を決定した。前記ｓｉＲＮＡは実施例１−３に記載したとおり製造してＨＵＶＥＣ細胞でトランスフェクションした後、その細胞をＡｄＴβ１０を含むアデノウイルスで感染させた。
【００９３】
浸透分析の場合、フィルターの下表面及び上表面を各々１０μｇゼラチン及び１０μｇ  マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）でコーティングした。ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）と１％ＦＢＳを含んだＭ１９９中で非感染のＨＵＶＥＣ、Ａｄ、ＡｄＴβ１０及びＡｄＴβ１０＋ｓｉＲＮＡ（トランスフェクション）を含むアデノウイルスで感染したＨＵＶＥＣを各々最終細胞濃度１×１０４細胞／１００μｌで各々上部ウェルに植えて３０時間培養した。続けて移動分析の場合と同様に固定及び定量した。
【００９４】
結果は図２に示し、チモシンβ１０を発現しない場合、ＶＥＧＦ処理されたＨＵＶＥＣ  細胞（Ｕｎ及びＡｄ）では内皮細胞の移動（図２Ａ）及び浸透（図２Ｂ）が向上した。しかし、チモシンβ１０を発現する場合、ＶＥＧＦ処理されたＨＵＶＥＣ細胞（ＡｄＴβ１０）は陰性対照群（チモシンβ１０を発現しないＨＵＶＥＣ細胞（Ｕｎ及びＡｄ））と比較して移動及び浸透した細胞の数が顕著に減少した。さらに、このような細胞の移動及び浸透抑制効果は、チモシンβ１０ＲＮＡに結合してそのタンパク質発現を抑制するｓｉＲＮＡを使用したＨＵＶＥＣ細胞（ＡｄＴβ１０＋ｓｉＲＮＡ）では観察されなかったことから、内皮細胞の移動及び浸透に対する抑制効果がチモシンβ１０に特異的なものであるこが分かった。したがって、チモシンβ１０はＶＥＧＦ−誘導された内皮細胞の移動及び転移を抑制することが分かり、それは血管新生が随伴する腫瘍の転移を効果的に抑制できることを提示するものである。
【実施例５】
【００９５】
チモシンβ１０のチューブ形成及び生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）血管新生抑制分析
チモシンβ１０の直接的な抗血管新生効果を確認するためにチモシンβ１０の過発現が内皮細胞のチューブ形成及び血管新生に及ぼす影響を下記のように調査した。
【００９６】
実施例５−１：チモシンβ１０のチューブ形成抑制効果
チモシンβ１０のチューブ形成抑制効果は従来の記載どおりに行なった（Ｌｅｅ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５年，第６５巻，１３７−１４７頁）、要約すると、成長因子が減少したマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を２４−ウェル組織培養プレートに添加し、３７℃で３０分間重合した。続いて、実施例４に記載した方法で非感染ＨＵＶＥＣ（Ｕｎ）及びＡｄ、ＧＦＰ−ＡｄＴβ１０及びＧＦＰ−ＡｄＴβ１０＋ｓｉＲＮＡ（トランスフェクション）アデノウイルスで感染したＨＵＶＥＣ細胞を準備して１×１０５細胞を前記準備したプレートのマトリゲルの表面に植えた後、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在及び不在下で１％ＦＢＳを含んだＭ１９９を入れて４８時間培養した。その後、前記細胞の形態変化を光学顕微鏡（×４００）下で観察した。ＨＵＶＥＣチューブ長さはデジタルＣＣＤカメラ（Ｚｅｉｓｓ）を装着した倒立顕微鏡及びイメージラボ（ＩｍａｇｅＬａｂ）イメージソフトウェア（ＭＣＭ  Ｄｅｓｉｇｎ）を使用して測定した。
【００９７】
結果は図３に示した。チモシンβ１０を発現しないＨＵＶＥＣ（Ｕｎ＋ＶＥＧＦ及びＡｄ＋ＶＥＧＦ、各々図３Ｂ及びＣ）は、ＶＥＧＦ刺激によりマトリゲル上で内皮細胞の組織化したネットワークを形成した。一方、ＶＥＧＦで刺激されたＨＵＶＥＣはチモシンβ１０を過発現する場合（ＧＦＰ−ＡｄＴβ１０＋ＶＥＧＦ、図３Ｄ）、ＶＥＧＦで刺激されない陰性対照群（Ｕｎ、図３Ａ）と同一水準で、チューブ形成が顕著に抑制されたことを見ることができた（図３Ｄ）。このようなチモシンβ１０のチューブ形成抑制効果は、ｓｉＲＮＡのトランスフェクション（ＧＦＰ−ＡｄＴβ１０＋ＶＥＧＦ＋ｓｉＲＮＡ、図３Ｅ）によって無くなることから、このような抑制効果がチモシンβ１０に特異的なものであることが分かった。前記の結果は、図３Ｆのチューブ長さを測定した結果と一致するもので、チモシンβ１０の発現によりＶＥＧＦによるチューブ形成が顕著に抑制されたことが分かった。したがって、このような効果は本発明のチモシンβ１０が血管新生の抑制に効果的に使用できることを証明する。
【００９８】
実施例５−２：チモシンβ１０の生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）血管新生抑制分析
チモシンβ１０の生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）血管新生抑制分析は、従来の記載どおりにマトリゲル上に骨格筋肉を体外培養する生体外移植法（ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐｌａｎｔ）で行なった（Ｊａｎｇ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００４年，第９（３）巻，４６４〜４７４頁）。
【００９９】
要約すると、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを麻酔した後、四肢を剃って前脛骨筋肉を抽出してＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄した。次に、前記抽出した筋肉をマトリゲルが入っている２４−ウェルプレートに入れ３７℃で３０分間重合した後、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ存在または不在下に１％ＦＢＳを含有したＭ１９９を添加した後、培養した。６日後、毛細血管類似構造物の成長が観察され、その後タキソール（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）１０ｎｍｏｌ／Ｌまたは２×１０８ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）のチモシンβ１０を発現したり発現しないアデノウイルスを含む新しい培地を添加した。培地は毎日交換した。５日後、毛細血管の平均面積は光学イメージ技術で測定し、イメージラボ（ＩｍａｇｅＬａｂ）イメージソフトウェアを使用して定量した。独立的に３回反復実験を行ない、各々の値は３回サンプルの平均±標準偏差で示した。
【０１００】
結果は図４に示した。チモシンβ１０で処理されていない場合（Ｕｎ＋ＶＥＧＦ及びＡｄ＋ＶＥＧＦ、各々図４Ｂ及び４Ｃ）は、ＶＥＧＦ刺激により多数の毛細血管を形成した。一方、チモシンβ１０で処理した場合は（ＶＥＧＦ＋ＡｄＴβ１０、図４Ｄ）ＶＥＧＦで刺激された場合にも、ＶＥＧＦで刺激されない陰性対照群（Ｕｎ、図４Ａ）と比較に値する水準で毛細血管の形成が顕著に抑制されたことが見られた（図４Ｄ）。前記の結果は、図４Ｆの血管面積を測定した結果と一致するもので、図４Ｆでチモシンβ１０を発現した場合（ＡｄＴβ１０＋ＶＥＧＦ）毛細血管面積が、チモシンβ１０を発現しない場合（Ｕｎ、Ｕｎ＋ＶＥＧＦ、Ｕｎ−Ａｄ＋ＶＥＧＦ）の毛細血管面積と比較して顕著に減少した。さらに、このようなチモシンβ１０の毛細血管形成抑制は血管新生抑制剤として広く使用されているタキソール（商標名Ｔａｘｏｌ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ，米国）の抑制効果（ＶＥＧＦ＋Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、図４Ｅ）よりさらに優れたものである。
【０１０１】
したがって、前記チモシンβ１０によるチューブ形成及び毛細血管形成の効果的な抑制は、チモシンβ１０が従来の血管新生抑制剤を代替できる強力な候補物質であることを示すものである。
【実施例６】
【０１０２】
チモシンβ１０とＲａｓとの結合分析
実施例６−１：イーストツーハイブリッド分析法
前記のようにチモシンβ１０による血管新生、細胞増殖及び／または細胞転移抑制効果に至る機序を糾明するためにチモシンβ１０と相互作用するタンパク質をイーストツーハイブリッド分析法（Ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して調査した。
【０１０３】
イーストツーハイブリッド分析法は、一定タンパク質と相互作用するタンパク質を糾明するための方法で、その原理は、フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ），Ｓ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９年，第３４０巻，２４５−３６頁を参照する。本発明のチモシンβ１０と相互作用するタンパク質の糾明のために前記文献及びリー（Ｌｅｅ）等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５年，第６５巻，１３７−１４７頁；グロッセル（Ｇｒｏｓｓｅｌ），Ｍ等，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ，１９９９年，第１７巻，１２３２−１２３３頁に記載された方法によって行なった。
【０１０４】
要約すると、イーストツーハイブリッド分析には、餌（Ｂａｉｔ）タンパク質をコードする遺伝子を含むｌｅｘＡ融合タンパク質発現ベクターと前記餌タンパク質を使用してスクリーニングするｃＤＮＡライブラリー遺伝子を含むトランス活性融合タンパク質発現ベクター（ｐｒｅｙ）が必要で、それはクリエーターアクセプターベクターコンストラクションキット（Ｃｒｅａｔｏｒ  Ａｃｃｅｐｔｏｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，米国）を使用して構築した。実施例１−１のｃＤＮＡ及びヒト卵巣ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を製造者の勧告に従い各々前記キットに提供されたベクターシステムにクローニングしてＬｅｘＡ−ヒトチモシンβ４またはチモシンβ１０融合タンパク質を発現するベクター（ＬｅｘＡ−チモシンβ４及びＬｅｘＡ−チモシンβ１０）、及びトランス活性ｃＤＮＡ融合タンパク質を発現するベクター（Ｔｒａｎｓ−ｃＤＮＡ）を構築して前記文献に記載された方法でスクリーニングしてチモシンβ１０と結合するタンパク質を糾明した結果、Ｒａｓであると確認した。
【０１０５】
次に、Ｒａｓとチモシンβ１０との直接的な相互作用分析は、従来の記載どおり（Ｌｅｅ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５年，第６５巻，１３７−１４７頁；Ｎａｈｖｉ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４年，第３（１）巻，３５−４０頁）行なった。結果は、図５に示した。この場合、チモシンβ４またはチモシンβ１０とＲａｓとの相互作用活性はそれらを含む細胞でのβ−ガラクトシダーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）の相対的発現水準を測定することにより決定された。β−ガラクトシダーゼの活性は［１０００×（Ａ４２０−１．７５×Ａ５５０）］／（反応時間×培地体積×Ａ６００）の公式を使用して計算した。Ａ４２０及びＡ５５０は、各々４２０ｎｍ及び５５０ｎｍでの吸光度を示す。
【０１０６】
結果は、図５に示した。チモシンβ１０（図５Ａ）の場合、陰性対照群（Ｍｏｃｋ）に対してβ−ガラクトシダーゼの活性が非常に高いことが分かり、一方同一ファミリーに属しているが血管新生の効果を示さないチモシンβ４（図５Ｂ）の場合、β−ガラクトシダーゼの活性が陰性対照群と差が無いことを示している。
【０１０７】
前記の結果は、チモシンβ１０がＲａｓとの結合を通してＲａｓ信号伝達経路を抑制できるということを示している。
【０１０８】
実施例６−２：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）プルダウン分析
実施例１−２により製造したＧＳＴ−融合チモシンβ１０（ＧＳＴ−Ｔβ１０）及びＨｉｓ−融合Ｋ−Ｒａｓ（Ｈｉｓ−Ｋ−Ｒａｓ）は、各々グルタチオンセパローズ４Ｂ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）及びＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して製造者の勧告どおり精製した。同量のグルタチオンセパローズビーズ（ｂｅａｄ）に固定されたＧＳＴまたはＧＳＴ−Ｔβ１０をＨｉｓ−Ｋ−ＲａｓとインキュベーションしてＲａｓを分離するプルダウン分析をした後、抗−Ｈｉｓ抗体を使用してウエスタンブロットでチモシンβ１０と結合するＲａｓを検出した（Ｌｅｅ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５年，第６５巻，１３７−１４７頁）。
【０１０９】
結果は、図６に示した。陰性対照群（ＧＳＴ、ＧＳＴ−Ｔβ１０、Ｈｉｓ−Ｋ−Ｒａｓ及びＧＳＴ／Ｈｉｓ−Ｋ−Ｒａｓ）と比較してチモシンβ１０及びＲａｓをすべて含んだレーン（ＧＳＴ−Ｔβ１０  ／Ｈｉｓ−Ｋ−Ｒａｓ）でだけＲａｓタンパク質が検出された。これはチモシンβ１０がＲａｓと直接的に相互作用することを示している。
【実施例７】
【０１１０】
チモシンβ１０とＲａｓとの相互作用がＶＥＧＦ誘導されたＲａｓ信号伝達経路に及ぼす影響分析
前記のようにチモシンβ１０のＲａｓとの結合は、チモシンβ１０がＲａｓ信号伝達経路に影響を及ぼす血管新生及び細胞増殖を抑制できることを示す。ＶＥＧＦからはじまるＲａｓ信号伝達経路でＲａｓの活性化及びその下流段階因子に続く活性化は血管新生及び細胞増殖等に非常に重要である。
【０１１１】
この過程でＲａｓは、ＧＴＰと結合して活性化（Ｒａｓ−ＧＴＰ）され、続いて下流段階因子のＲａｆと結合してＲａｆを活性化させる。Ｒａｓ−ＧＴＰは、Ｒａｓ−ＧＤＰで非活性化され、活性化されたＲａｆは次に下流段階因子のＭＥＫ（ＭＡＰＫＫ）及びＥＲＫを活性化させる。したがって、Ｒａｓ信号伝達経路でのチモシンβ１０のＲａｓとの相互作用が下流段階に及ぼす具体的影響を調査するために下記の実験を行なった。
【０１１２】
実施例７−１：チモシンβ１０によるＶＥＧＦにより誘導されたＲａｆ／Ｒａｓ−ＧＴＰ量の減少
実施例２に記載した方法でウイルスで感染しないＨＵＶＥＣ（Ｕｎ）、チモシンβ１０を発現しないアデノウイルス（Ａｄ）またはチモシンβ１０を発現するアデノウイルス（ＡｄＴβ１０）で感染したＨＵＶＥＣを一晩の間、血清欠乏させた後、ホスファートフリー（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｆｒｅｅ）培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，米国）で１％ＦＢＳを含むＭ１９９で５分間ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で刺激または刺激しなかった。
【０１１３】
前記細胞からＭｅａｄｏｗ  ＫＮ．等，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００１年，第２７６巻，４９２８９−４９２９８頁に記載されたとおり細胞を融解して融解物を抽出してＲａｓ信号伝達経路の下流段階にあるＲａｆタンパク質のＲａｓ結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤと共にインキュベーションした後、グルタチオンディスク（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｄｉｓｃ：Ｐｉｅｒｃｅ，米国）を使用した分析で、ＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤに結合したＲａｓタンパク質を分離した後、抗−ｐａｎ−Ｒａｓ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，米国）を使用してウエスタンブロットで検出した（Ｌｅｅ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５年，第６５巻，１３７−１４７頁）。
【０１１４】
結果は、図７Ａに示した。ＶＥＧＦでＨＵＶＥＣを刺激した場合（Ａｄ＋ＶＥＧＦ）はＶＥＧＦで処理されない陰性対照群と比較してＲａｓ−ＧＴＰの増加を示した。ＶＥＧＦ処理された細胞でのチモシンβ１０の過発現（ＡｄＴβ１０＋ＶＥＧＦ）は、Ｒａｓの量には変化がなかった反面、Ｒａｓ−ＧＴＰ不在と現れた（図７Ａ）。これは活性化されたＲａｓがチモシンβ１０と直接結合してＲａｓ−ＧＴＰを隔離（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）することによりＲａｆと結合するＲａｓ−ＧＴＰの量を減少させ、結局はＲａｆ／Ｒａｓ−ＧＴＰ複合体量の減少を招来してＲａｓ信号伝達経路による効果を抑制できることを示す。
【０１１５】
実施例７−２：チモシンβ１０によるＶＥＧＦにより誘導されたＲａｓ−ＧＴＰのＲａｆ結合の妨害
Ｒａｓに結合したＧＴＰ及びＧＤＰ分析は、従来の記載どおり行なった（Ｄｏｗｎｗａｒｄ  Ｊ．等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０年，第３４６巻，７１９−７２３頁）。要約すると、ウイルスで感染しないＨＵＶＥＣ（Ｕｎ）、チモシンβ１０を発現しないアデノウイルス（Ａｄ）またはチモシンβ１０を発現するアデノウイルス（ＡｄＴβ１０）で感染したＨＵＶＥＣを一晩の間、血清欠乏させた後、ホスファートフリー（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｆｒｅｅ）培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３時間０．２ｍＣｉ／ｍｌ［３２Ｐ］オルソホスファート（ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）でラベリングした後、５分間ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で刺激または刺激しなかった（Ｕｎ）。次に前記細胞を融解して融解物を獲得した。前記融解物で抗−Ｒａｓ抗体及び陰性対照群としてＩｇＧ抗体でＲａｓを沈澱させ分離した。次に前記抗−Ｒａｓ及びＩｇＧ抗体で沈澱した沈澱物からそれに結合したヌクレオチドを抽出してポリエチレンイミンセルロースプレート（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｐｌａｔｅｓ，Ｓｉｇｍａ）を使用して薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で分離した。Ｒａｓに結合したＧＴＰ（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びＧＤＰ（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  Ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の存在は放射線写真（図７Ｂ）で評価した。ＧＴＰとＧＴＰ＋ＧＤＰの比率は、デンシトメトリー（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）により測定（図７Ｃ）した。独立的に３回の反復実験を通じて類似な結果を得た。
【０１１６】
結果は、図７Ｂに示した。陰性対照群（Ｕｎ）と比べてＶＥＧＦで刺激した場合、Ｒａｓ−ＧＴＰの量が増加した（ＶＥＧＦ＋Ａｄ及びＶＥＧＦ＋ＡｄＴβ１０）。特に、チモシンβ１０を発現させた場合、Ｒａｓ−ＧＴＰの量がさらに増加することが分かった。
【０１１７】
前記結果は、チモシンβ１０がＲａｓ−ＧＴＰに結合してＲａｆと結合するＲａｓ−ＧＴＰ自体の量を減少させるだけではなく（実施例７−１）、Ｒａｆへの結合を妨害してＲａｓ−ＧＴＰのＲａｓ−ＧＤＰへの転換を抑制してＲａｓ−ＧＴＰの量を増加させる二通りのメカニズムを通じてＲａｓ信号伝達経路を遮断できることを示唆するもので、これはすべてＲａｓ−ＧＴＰ／Ｒａｆ複合体量の減少からなるものである。
【０１１８】
実施例７−３：チモシンβ１０の細胞内位置
実施例２によりウイルスで感染しないＨＵＶＥＣ（Ｕｎ）、チモシンβ１０を発現しないアデノウイルス（Ａｄ）またはチモシンβ１０を発現するアデノウイルス（ＧＦＰ−ＡｄＴβ１０）で感染したＨＵＶＥＣを５分間ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で刺激及び刺激しないで（Ｕｎ）、前記細胞を細胞質、細胞膜及び核分画に分離して各分画から総タンパク質を分離して抗チュブリン抗体（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）、抗ＧＦＰ及び抗Ｒａｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）  （図６Ｄ）でウエスタンブロットを行なった（Ｌｅｅ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５年，第６５巻，１３７−１４７頁；Ｌｅｅ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１年，第２０巻，６７００−６７７６頁）。
【０１１９】
結果は、図７Ｄに示した。チモシンβ１０は、細胞質及び細胞膜にすべて存在し、従来に公知されたとおりＲａｓは細胞膜、α−チュブリンは細胞質に存在することが分かる。これはチモシンβ１０の発現がＲａｓの細胞内位置には影響がないが、チモシンβ１０が細胞膜に存在するＲａｓと相互作用できることを示すものである。
【実施例８】
【０１２０】
チモシンβ１０のＲａｓ信号伝達経路の下流段階に及ぼす影響分析
下記に示す事項を除外して実施例７−３と同一な試験をした。ＨＵＶＥＣ細胞を各分割別に分離しないで総細胞抽出物を分離して使用した。抗ＧＦＰ、抗ｐＭＥＫ、抗ｐＥＲＫ、抗ＥＲＫ及び抗ＶＥＧＦ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、及び抗チュブリンに対する抗体を使用してウエスタンブロットを行なった。
【０１２１】
前記と同一な実験を卵巣癌細胞株の２７７４細胞株を使用して行なった。この場合は、総細胞分画でのＶＥＧＦ発現以外に培地（ＣＣＭ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）で分泌されたＶＥＧＦも測定した。
【０１２２】
結果は、図７Ｅ乃至Ｇに示した。図７Ｅによると、過発現したチモシンβ１０がＨＵＶＥＣでＲａｓ信号伝達経路の下流段階にあるタンパク質のＭＥＫ及びＥＲＫのリン酸化による活性を抑制し、一方、活性化されないＥＲＫの発現及びα−チュブリンには影響が無く、チモシンβ１０がこれらタンパク質の活性化に特異的に作用してＲａｓ信号伝達経路を抑制することが分かった。さらに、チモシンβ１０の発現は、陰性対照群のα−チュブリンの発現には影響がなかったが、内皮細胞でのＶＥＧＦ発現（図７Ｆ）、及び卵巣癌細胞株（２７７４細胞）でのＶＥＧＦの発現及び分泌を抑制した。
【０１２３】
前記の結果は、チモシンβ１０が内皮細胞でのＶＥＧＦの発現を抑制して自己分泌を抑制するだけではなく、癌細胞でのＶＥＧＦの発現及び分泌抑制を通じて癌細胞で分泌されたＶＥＧＦによる傍分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）効果を抑制して血管新生を効果的に抑制できることを示している。
【実施例９】
【０１２４】
チモシンβ１０の抗腫瘍活性分析
チモシンβ１０が直接的な抗腫瘍活性を有することを確認するために、マウスに腫瘍を誘導した後、チモシンβ１０を処理してその効果を分析した。
【０１２５】
実施例９−１：腫瘍マウスモデルの製造
本実験に使用したＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）ＢＡＬＢ／ｃ及びｎｕ／ｎｕマウスは、各々バイオジェノミクス（Ｂｉｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，ソウル，韓国）及びカレスリバーラボ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から得て従来公知の方法（Ｌｅｅ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５年，第６５巻，１３７−１４７頁）で製造した。
【０１２６】
要約すると、前記マウスで腫瘍を確立するために、１×１０６個の２７７４腫瘍細胞を中背（ｍｉｄ−ｄｏｒｓａｌ）部位に皮下注射して平均体積１００ｍｍ３になるまで腫瘍を１４日間成長させた。
【０１２７】
同所（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）腫瘍の確立のために、１×１０６個のＧＦＰ−２７７４細胞を脂肪パッドを通じて右側卵巣に注射した。安定的ＧＦＰ−２７７４細胞は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するｐＥＧＦＰ−Ｃｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，米国）を２７７４細胞株に安定的（ｓｔａｂｌｅ）トランスフェクションして製造した（Ｌｅｅ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５年，第６５巻，１３７−１４７頁）。
【０１２８】
実施例９−２：チモシンβ１０抗腫瘍活性分析
（１）腫瘍抑制活性
チモシンβ１０の直接的な抗腫瘍活性を確認するために下記の実験を従来の記載どおりに行なった（Ｌｅｅ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５年，第６５巻，１３７−１４７頁）、要約すると、実施例９−１のマウスに実施例１により製造した１×１０９ｐｆｕ／４０μｌのＡｄＴβ１０を含むアデノウイルスを３日に一回ずつ３回腫瘍内に注射した。腫瘍の大きさは３日毎にカリパー（ｃａｌｉｐｅｒ）測定法により評価した。マウスは、最終ウイルス注射後、２７日目に犠牲にして免疫組織化学分析で血管数の変化を調べるために腫瘍を切開して血管内皮細胞に特異的な抗−マウスＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色した。血管密度は、グループ当り３個の別個腫瘍横断面で血管数をカウントして計算した。
【０１２９】
結果は、図８に示した。図８Ａは、腫瘍が生成されたマウスにチモシンβ１０を処理していない（Ａｄ）か、処理後マウスでの（ＡｄＴβ１０）腫瘍大きさを示す。図８のＢは、陰性対照群（Ａｄ）及び処理群（ＡｄＴβ１０）の腫瘍体積変化をグラフに示したものである。図８Ｃは、腫瘍断片を抗ＣＤ１３で免疫組織染色したもので、図８Ｄは図８Ｃで観察された血管数をグラフに示したものである。チモシンを発現しないアデノウイルス（Ａｄ）だけで処理された陰性対照群と比較してチモシンβ１０を発現するアデノウイルス（ＡｄＴβ１０）で処理された腫瘍は、その大きさが陰性対照群と比較して７７％減少し（図８Ａ及びＢ）、腫瘍断片の血管の数も陰性対照群と比較して８８％減少したことが分かる（図８Ｃ及びＤ）。前記結果は、生体内でチモシンβ１０が血管新生を抑制して卵巣癌腫瘍を効果的に抑制できることを示している。
【０１３０】
さらに、腫瘍が誘導されたマウスにチモシンβ１０の処理による体重損失または肝毒性は観察されなかった。
【０１３１】
（２）同所腫瘍への影響
チモシンβ１０が、生体内の実際の癌発生部位で発生した腫瘍の抑制に及ぼす影響を分析するために同所腫瘍マウスモデルを実施例９−１により製造し、同所腫瘍マウスでＧＦＰ−発現腫瘍をイルマツールツナブルライトシステム（Ｉｌｌｕｍａｔｏｏｌ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ：Ｌｉｇｈｔｏｏｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）を使用して確認した。さらに前記腫瘍に１×１０９ｐｆｕ／２０μｌのＡｄＴβ１０を注射して、１０日目に犠牲にして腫瘍抑制の有無を確認した。卵巣腫瘍の大きさ及び血管数は実施例９−１と同様に分析した。
【０１３２】
結果は、図９に示した。チモシンβ１０の抗腫瘍及び抗血管新生効果は、同所腫瘍でも確認された。図９Ａで各マウス腹部の蛍光部位は注入した腫瘍細胞を示し、チモシンβ１０処理マウス（ＡｄＴβ１０）のＧＦＰ−２７７４誘導された卵巣腫瘍の大きさがチモシンβ１０で処理されない陰性対照群（Ａｄ）と比較して顕著に減少した（図９Ａ）。腫瘍の体積は、対照群マウスのものより５４％減少した（図９Ｂ）。チモシンβ１０処理マウスの場合、腫瘍断片の血管の数も陰性対照群と比較して７７％減少した（図９Ｃ及びＤ）。これらの結果は、過発現したチモシンβ１０が生体内で血管新生及び腫瘍成長を抑制できることを示している。
【０１３３】
前記データーは、同一実験を４−６匹のマウスで行なって得た実験結果を分析したもので、統計資料分析値は平均±標準偏差（ＳＤ）または標準誤差（ＳＥ）で示した。グループ間の統計数値比較は、スチューデントｔテスト（ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）を使用して行なった。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明のチモシンβ１０は、Ｒａｓとの直接相互作用によりＲａｓの活性による信号伝達経路を抑制して血管新生、細胞増殖及び細胞転移を効果的に抑制できるので、これらの症状と関連した疾患の治療及び予防に効果的に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】チモシンβ１０によるＶＥＧＦ−誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の増殖抑制を示したグラフで、各略語の定義を下記に示す：Ｕｎ：陰性対照群、アデノウイルスで感染しないＨＵＶＥＣ；Ａｄ：チモシンβ１０を含まないアデノウイルスで感染したＨＵＶＥＣ；ＡｄＴβ１０：チモシンβ１０を含むアデノウイルスで感染したＨＵＶＥＣ；ＡｄＴβ１０＋ｓｉＲＮＡ：ＡｄＴβ１０と共にチモシンβ１０に対するｓｉＲＮＡを導入したＨＵＶＥＣ、＊及び＊＊＊は、ＶＥＧＦで処理された陰性対照群（Ｕｎ）と比較して有意性が各々０．０５未満（Ｐ＜０．０５）及び０．００１未満（Ｐ＜０．００１）であることを示す。
【図２】チモシンβ１０によるＶＥＧＦ−誘導されたＨＵＶＥＣ細胞の移動（図２Ａ）及び浸透（図２Ｂ）抑制効果を示すグラフで、略語は前記で定義したのと同様である。＊、＊＊及び＊＊＊は、ＶＥＧＦで処理された陰性対照群（Ｕｎ）と比較して有意性が各々０．０５未満（Ｐ＜０．０５）、０．０１未満（Ｐ＜０．０１）及び０．００１未満（Ｐ＜０．００１）であることを示す。
【図３】チモシンβ１０の試験管内でのチューブ形成（図３Ａ乃至Ｅ）に対する抑制活性を示した写真及び生成されたチューブの長さ（図３Ｆ）を示したグラフで、略語は前記で定義したのと同様で、図３Ｄ内の矢印はチモシンβ１０で処理されていない対照群（図３Ｂ及び図３Ｃ）と比較して分節して細くなった血管を示す。
【図４】チモシンβ１０（図４Ａ乃至Ｄ）及びタキソール（図４Ｅ）の血管形成に対する抑制活性を示す生体外移植された筋肉の横断面写真（倍率；×１２．５（上）；×４０（下）で、各写真の矢印は形成された管構造を示し、横棒は５００μＭで、図４Ｆは生成された血管の平均面積を示すグラフで、略語は前記の定義と同様である。
【図５】細胞内でのチモシンβ１０（図５Ａ）及びβ４（図５Ｂ）各々とＲａｓとの相互作用をイーストツーハイブリッド分析法を使用したガラクトシダーゼの活性を通じて分析した結果である。
【図６】試験管内でのチモシンβ１０とＲａｓとの相互作用を分析したもので、ＧＳＴと融合したチモシンβ１０（ＧＳＴ−Ｔβ１０）を使用したプルダウン分析を通じてチモシンβ１０と相互作用するＲａｓをヒスチジン残基と融合したＲａｓ（Ｈｉｓ−Ｋ−Ｒａｓ）に対する抗−Ｈｉｓ抗体を使用してウエスタンブロットで検出した結果である。
【図７】チモシンβ１０がＨＵＶＥＣ細胞でＶＥＧＦ−媒介されたＲａｓ−ＥＲＫ信号伝達を妨害してＶＥＧＦ生産を減少させる結果を示した図である。図７のＡは、ＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤフルダウン分析を使用してＨＵＶＥＣにチモシンβ１０処理時の活性Ｒａｓ（Ｒａｓ−ＧＴＰ）の量に及ぼす影響をウエスタンブロットで検出した結果で、図７のＢは、チモシンβ１０で処理または未処理のＨＵＶＥＣから免疫沈澱法により分離したＲａｓから抽出したＧＤＰ及びＧＴＰの薄膜クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ  ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＴＬＣ）の結果で、図７のＣは、７のＢのシグナルを定量したグラフで、図７のＤは、ＨＵＶＥＣの細胞質、細胞膜及び核の各抽出物からＧＦＰ−Ｔβ１０、Ｒａｓ及びα−チュブリンの細胞内位置をウエスタンブロットで確認した結果で、図７のＥは過発現したチモシンβ１０がＨＵＶＥＣでＲａｓ信号伝達経路の下流段階にあるタンパク質のＭＥＫ及びＥＲＫに及ぼす影響を各々のタンパク質に対する抗体を使用してウエスタンブロットで分析した結果で、図７のＦは、図７のＤのＨＵＶＥＣ細胞の全体融解物で細胞内ＶＥＧＦをウエスタンブロットで検出した結果で、図７のＧは、チモシンβ１０で処理または未処理の２７７４卵巣癌細胞株及び培地（ＣＣＭ）でのＶＥＧＦをウエスタンブロットで検出した結果で、図７のＤの各番号の内容を下記に示す：１：陰性対照群、ＶＥＧＦ未処理及びアデノウイルスで感染しないＨＵＶＥＣ；２：陰性対照群、ＶＥＧＦ処理及びチモシンβ１０を含まないアデノウイルス（Ａｄ）で感染したＨＵＶＥＣ；３：ＶＥＧＦ処理及びチモシンβ１０を含むアデノウイルス（ＧＦＰ−ＡｄＴβ１０）で感染したＨＵＶＥＣ。
【図８】チモシンβ１０の生体内での腫瘍増殖及び血管新生抑制を示した図である。図８のＡは、チモシンβ１０（ＡｄＴβ１０）で処理または処理されていない（Ａｄ）腫瘍の大きさを比較した写真で、図８のＢは前記腫瘍の体積をグラフに示した結果で、図８のＣは前記腫瘍内の血管形成を血管内皮細胞に特異的抗−ＣＤ３１抗体を使用したウエスタンブロットで比較した写真で、図８のＤは腫瘍切片当り生成された血管数をグラフに示した結果である。
【図９】チモシンβ１０の生体内で同所腫瘍の増殖抑制及び血管新生抑制を示している。図９のＡはチモシンβ１０（ＡｄＴβ１０）で処理または未処理（Ａｄ）腫瘍の大きさを比較した写真で、下の写真は摘出した卵巣腫瘍（白色矢印）及び正常卵巣（白色矢印の頭）を示し、図９のＢは前記腫瘍の体積をグラフに示した結果で、図９のＣは前記腫瘍内の血管形成を血管内皮細胞に特異的抗−ＣＤ３１抗体を使用したウエスタンブロットで比較した写真で、図９のＤは腫瘍切片当り生成された血管数をグラフに示した結果である。図８のＣ及び図９のＣで横棒は５０μｍで、＊、＊＊及び＊＊＊はアデノウイルスベクターだけで感染した陰性対照群（Ａｄ）と比較して有意性が、各々０．０５未満（Ｐ＜０．０５）、０．０１未満（Ｐ＜０．０１）、０．００１未満（Ｐ＜０．００１）であることを示す。
【図１】
2006348006.tif 000003
【図２】
2006348006.tif 000004
【図３】
2006348006.tif 000005
【図４】
2006348006.tif 000006
【図５】
2006348006.tif 000007
【図６】
2006348006.tif 000008
【図７】
2006348006.tif 000009
【図８】
2006348006.tif 000010
【図９】
2006348006.tif 000011
【配列表】
2006348006000001.app