(57)【要約】      （修正有）【課題】植物が有する自己防御機構を、植物を薬剤処理することにより活性化し、低温障害、病虫害、連作障害を回避する方法を提供する。【解決手段】セオブロキシドおよびその類縁体から成る群から選ばれる少なくとも1種の化合物を有効成分として含有する植物用自己防御物質誘導剤。セオブロキシドおよびその類縁体から成る群から選ばれる少なくとも1種の化合物を含有する水を植物に供給することを含む、植物における自己防御物質の生成を誘導する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セオブロキシドおよびその類縁体から成る群から選ばれる少なくとも1種の化合物を有効成分として含有する植物用自己防御物質誘導剤。
【請求項２】
セオブロキシドおよびその類縁体が下記(I)〜(VI)で示される化合物である請求項1に記載の自己防御物質誘導剤。
【化１】
2006327995.tif 000008
（式中、Ｒは炭素数１〜６のアルキル基、Ｒ1 〜Ｒ8 は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又はアルキル基の炭素数が１〜５のアルキルカルボニル基を表す。）
【請求項３】
前記化合物がセオブロキシドである請求項1記載の自己防御物質誘導剤。
【請求項４】
自己防御物質が抗菌化合物である請求項1〜3のいずれか１項に記載の自己防御物質誘導剤。
【請求項５】
植物が中性植物である請求項4に記載の自己防御物質誘導剤。
【請求項６】
植物がナス科の植物である請求項4に記載の自己防御物質誘導剤。
【請求項７】
自己防御物質がサリチル酸またはその誘導体である請求項1〜3のいずれか１項に記載の自己防御物質誘導剤。
【請求項８】
植物がイネ科の植物、ナス科の植物、マメ科の植物、バラ科の植物、またはアカザ科の植物である請求項7に記載の自己防御物質誘導剤。
【請求項９】
セオブロキシドおよびその類縁体から成る群から選ばれる少なくとも1種の化合物を含有する水を植物に供給することを含む、植物における自己防御物質の生成を誘導する方法。
【請求項１０】
セオブロキシドおよびその類縁体が下記(I)〜(VI)で示される化合物である請求項9に記載の方法。
【化２】
2006327995.tif 000009
（式中、Ｒは炭素数１〜６のアルキル基、Ｒ1 〜Ｒ8 は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又はアルキル基の炭素数が１〜５のアルキルカルボニル基を表す。）
【請求項１１】
前記化合物がセオブロキシドである請求項9記載の方法。
【請求項１２】
自己防御物質が抗菌化合物である請求項9〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
植物に対する病虫害および／またはカビ由来の病害を低減または防止する請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
植物が中性植物である請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
植物がナス科の植物である請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
自己防御物質がサリチル酸またはその誘導体である請求項9〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
植物に対する病虫害を低減または防止する請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
植物の低温障害を低減または防止する請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
植物がイネ科の植物、ナス科の植物、マメ科の植物、バラ科の植物、またはアカザ科の植物である請求項16〜19のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
セオブロキシドを含有する水を植物の種子および／または根に供給する請求項16〜19のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物用自己防御物質誘導剤および自己防御物質の生成誘導方法に関する。特に本発明は、セオブロキシドを用いる植物用自己防御物質誘導剤および自己防御物質の生成誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
農業を営む上で、低温障害、病虫害は大きな経済的ダメージを与えている。また、連作障害も大きな問題である。しかしながら、これのストレスに対して植物に内在する防御機構を活性化し、これらのストレスを回避させる技術は今のところ見あたらない。
【０００３】
植物が病虫害にさらされた場合、自己防御物質としてファイトアレキシンを2次代謝産物として特異的に生合成する。植物は病原菌による感染を受けたときに、被害を最小限に食い止めるために様々な防御反応を発動させる。その一つにファイトアレキシンがある。ファイトアレキシンは植物が病原菌の感染を受けたときに新たに生合成される低分子量（分子量が100〜500ぐらいのものが多い）の抗菌活性物質であり、イネからはモミラクトンAおよびBを始めとする15種類の化合物がファイトアレキシンとして報告されている。(非特許文献1)
【０００４】
また、植物が低温障害、病虫害にさらされた場合、自己防御機構を発現させるためにシグナル伝達物質を利用している。これらのシグナル伝達物質としてはサリチル酸やサリチル酸グルコシドが知られている。
【０００５】
サリチル酸（サリチル酸メチル）は、病原菌に感染した植物で、感染した葉から感染した信号として産生され、他の葉に病原菌の存在を知らせ、酸性PR蛋白質（pathogenesis-related protein）と呼ばれる抗病菌タンパク質を誘導する。  ジャスミンの木などの植物は、葉などが障害されると、MAPキナーゼホモログが、リン酸化により活性化され、ジャスモン酸（ジャスモン酸メチル）が産生され、塩基性PR蛋白質が、誘導され、他の葉に危険を知らせる。ジャスモン酸の構造は、動物の炎症物質である、プロスタグランジンやロイコトリエンなどの構造と、相似している。サリチル酸とジャスモン酸は、拮抗的に作用し、サリチル酸やアセチルサリチル酸は、ジャスモン酸のような、シグナル伝達物質の合成を、阻害すると言われている。さらに、サリチル酸は、黄色ブドウ球菌の毒性を弱める作用を有し、毒素産生の抑制（α溶血素の分泌抑制）や、宿主組織への接着能力を抑制（フィブロネクチン結合を抑制）する（in vitro）ことを知られている。(非特許文献2)
【０００６】
また、サリチル酸を外部より投与したタバコではウィルスに対する抵抗性を獲得したという報告がなされている(非特許文献3)。
【非特許文献１】Zhao, J., Davis, L. C., and Verpoorte, R., Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites, Biotechnology Advances, 23, 283-333 (2005).
【非特許文献２】Poecke, van R. M. P. and Dicke, M., Indirect defense plants against herbivores: using Arabidopsis thaliana as a model plant, Plant Biology, 6, 387-401 (2004).
【非特許文献３】White, R. F., Acetylsalicylic acid induces resistance to tobacco mosaic virus in tobacco, Virology, 99, 410-412 (1979)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
低温障害、病虫害、連作障害によって植物に引き起こされるストレスに対して、植物に内在する防御機構を積極的に活性化し、これらのストレスを回避させる技術は今のところ見あたらない。
【０００８】
例えば、自己防御物質としてのファイトアレキシンの生成を誘導することで、植物の自己防御機構を活性化し、病虫害や連作障害を回避する方法は知られていない。また、サリチル酸のようなシグナル伝達物質を人為的に誘導することで植物の自己防御機構を活性化し、低温障害、病虫害を回避する方法も知られていない。
【０００９】
そこで本発明の目的は、植物が有する自己防御機構を、植物を薬剤処理することにより活性化し、低温障害、病虫害、連作障害を回避する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、以前から、シクロプロペンエポキシ化合物であるセオブロキシドに注目し、その生理活性について種々検討し、例えば、花芽形成誘導作用があることを見いだしている(日本特許2955239号公報)。今回、このセオブロキシドを播種前の種子や播種後の苗に処理する事で、元来植物に備わっている防御機構を活性化することができ、その結果、低温障害、病虫害、連作障害の回避が可能であることを見いだして本発明を完成した。
【００１１】
［請求項1］セオブロキシドおよびその類縁体から成る群から選ばれる少なくとも1種の化合物を有効成分として含有する植物用自己防御物質誘導剤。
［請求項2］セオブロキシドおよびその類縁体が下記(I)〜(VI)で示される化合物である請求項1に記載の自己防御物質誘導剤。
【化１】
2006327995.tif 000002
（式中、Ｒは炭素数１〜６のアルキル基、Ｒ1 〜Ｒ8 は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又はアルキル基の炭素数が１〜５のアルキルカルボニル基を表す。）
［請求項3］前記化合物がセオブロキシドである請求項1記載の自己防御物質誘導剤。
［請求項4］自己防御物質が抗菌化合物である請求項1〜3のいずれか１項に記載の自己防御物質誘導剤。
［請求項5］植物が中性植物である請求項4に記載の自己防御物質誘導剤。
［請求項6］植物がナス科の植物である請求項4に記載の自己防御物質誘導剤。
［請求項7］自己防御物質がサリチル酸またはその誘導体である請求項1〜3のいずれか１項に記載の自己防御物質誘導剤。
［請求項8］
植物がイネ科の植物、ナス科の植物、マメ科の植物、バラ科の植物、またはアカザ科の植物である請求項7に記載の自己防御物質誘導剤。
［請求項9］セオブロキシドおよびその類縁体から成る群から選ばれる少なくとも1種の化合物を含有する水を植物に供給することを含む、植物における自己防御物質の生成を誘導する方法。
［請求項10］セオブロキシドおよびその類縁体が下記(I)〜(VI)で示される化合物である請求項9に記載の方法。
【化２】
2006327995.tif 000003
（式中、Ｒは炭素数１〜６のアルキル基、Ｒ1 〜Ｒ8 は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又はアルキル基の炭素数が１〜５のアルキルカルボニル基を表す。）
［請求項11］前記化合物がセオブロキシドである請求項9記載の方法。
［請求項12］自己防御物質が抗菌化合物である請求項9〜11のいずれか１項に記載の方法。
［請求項13］植物に対する病虫害および／またはカビ由来の病害を低減または防止する請求項12に記載の方法。
［請求項14］植物が中性植物である請求項12に記載の方法。
［請求項15］植物がナス科の植物である請求項12に記載の方法。
［請求項16］自己防御物質がサリチル酸またはその誘導体である請求項9〜11のいずれか１項に記載の方法。
［請求項17］植物に対する病虫害を低減または防止する請求項16に記載の方法。
［請求項18］植物の低温障害を低減または防止する請求項16に記載の方法。
［請求項19］植物がイネ科の植物、ナス科の植物、マメ科の植物、バラ科の植物、またはアカザ科の植物である請求項16〜19のいずれか１項に記載の方法。
［請求項20］セオブロキシドを含有する水を植物の種子および／または根に供給する請求項16〜19のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、セオブロキシドおよびその誘導体を用いることで、植物に備わっている防御機構を活性化することができ、その結果、低温障害、病虫害、連作障害を回避できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
[自己防御物質誘導剤]
本発明の自己防御物質誘導剤は、セオブロキシドおよびその類縁体から成る群から選ばれる少なくとも1種の化合物を有効成分として含有する。セオブロキシドおよびその類縁体は、公知化合物であり、例えば、日本特許2955239号公報に記載さている。本発明において、セオブロキシドおよびその類縁体は、下記(I)〜(VI)で示される化合物であることができる。
【００１４】
【化３】
2006327995.tif 000004
【００１５】
上記式中、Ｒは炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ1 〜Ｒ8 は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又はアルキル基の炭素数が１〜５のアルキルカルボニル基を表す。Ｒは炭素数１〜３のアルキル基が好ましく、より好ましくはメチル基である。Ｒ1 〜Ｒ8 は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基及びアルキル基の炭素数が１〜２のアルキルカルボニル基が好ましく、より好ましくは水素原子、炭素数１〜３の直鎖状アルキル基及びメチルカルボニル基である。これらの化合物は、糸状菌ラシオジプロディア・テオブロマエ(Lasiodiplodia theobromae)を培養することにより、その培養ろ液から容易に得ることができる。またP-toluguenone を出発物質として２段階で合成が可能である。上記化合物中、下記式（VII)で表されるセオブロキシド及び式（VIII) で表される化合物が好ましく、特に、セオブロキシドであることがさらに好ましい。セオブロキシドは糸状菌ラシオジプロディア・テオブロマエ(Lasiodiplodia theobromae)の培養ろ液から単離されたシクロプロペンエポキシ化合物である。セオブロキシドの精製分離による製造方法は、特開平2004-33088号公報にも記載がある。
【００１６】
【化４】
2006327995.tif 000005
【００１７】
本発明の自己防御物質誘導剤は、上記化合物をそのまま、植物に与えても良いが、上記化合物に加えて、一般の農薬の製剤化に使用される増量剤、界面活性剤、補助剤等のその他の成分と混合し、水和剤、粒剤、粉剤などの固形製剤および乳剤、液剤、懸濁剤などの液状製剤を調製し、施用するのが望ましい。製剤中の活性成分含有量は、塗布濃度が1mM以上になるように製剤中に調整されていることが望ましい。本発明の自己防御物質誘導剤の施用量は、対象植物、気象条件、組成物の製剤形態、施用方法、施用時期等により適宜設定できる。
【００１８】
本発明において、自己防御物質誘導剤により誘導される自己防御物質が抗菌化合物であることができる。自己防御物質が抗菌化合物であるのは、植物が中性植物である場合である。中性植物とは、例えば、ナス科の植物である。ナス科の植物としては、例えば、ナス、タバコ、バレイショ等を挙げることができる。
【００１９】
また、本発明において、自己防御物質誘導剤により誘導される自己防御物質がサリチル酸またはその誘導体であることができる。サリチル酸の誘導体とは、サリチル酸グルコシド等であることができる。
【００２０】
【化５】
2006327995.tif 000006
【００２１】
自己防御物質がサリチル酸またはその誘導体であるのは、植物が、例えば、イネ科の植物（イネ、トウモロコシ、コムギ等）、ナス科の植物（ナス、タバコ、バレイショ等）、マメ科の植物（ダイズ等）、バラ科の植物（イチゴ等）、アカザ科の植物（ホウレンソウ等）である場合である。特に、自己防御物質がサリチル酸またはその誘導体であるのは、植物が、イネ科の植物の場合である。
【００２２】
[自己防御物質の生成を誘導する方法]
本発明の自己防御物質の生成を誘導する方法は、セオブロキシドおよびその類縁体から成る群から選ばれる少なくとも1種の化合物を有効成分として含有する自己防御物質誘導剤を、水を植物に供給することを含む。本発明の自己防御物質誘導剤は、上記化合物を有効成分とし、その他に水などの希釈剤を担体などを含有することができる。又、ツイーン（Tween ２０）などの非イオン界面活性剤を含有するのが好ましい。
【００２３】
自己防御物質が抗菌化合物である場合、本発明の自己防御物質誘導剤は、種々の形態で、例えば、前記中性植物に付与することができるが、葉面散布するのが好ましい。この場合、上記化合物を0.０１〜１０ｍＭ、非イオン界面活性剤を0.０００１〜0.１重量％含有する水溶液又は水分散剤として使用するのが好ましい。葉面散布は常法により行うことができる。葉面散布は地上部が現れてから施してもかまわない。適時は栄養成長が旺盛な時期の間、１週あたり１，２回、施用するのが望ましい。
【００２４】
自己防御物質が抗菌化合物である場合、植物に対する病虫害および／またはカビ由来の病害を低減または防止することができる。
【００２５】
自己防御物質がサリチル酸またはその誘導体である場合、本発明の自己防御物質誘導剤は、種々の形態で使用できるが、種子処理で使用することが好ましい。種子処理は、それぞれの種子の性質に応じ適時間浸漬して、本発明の自己防御物質誘導剤を含む水溶液又は水分散剤を吸水させる。この場合、上記化合物を0.０１〜１０ｍＭ、非イオン界面活性剤を0.０００１〜0.１重量％含有する水溶液又は水分散剤として使用するのが好ましい。
【００２６】
自己防御物質がサリチル酸またはその誘導体であるである場合、植物に対する病虫害を低減または防止することができ、植物の低温障害を低減または防止することもできる。この場合、セオブロキシドを含有する水を植物の種子および／または根に供給することが好ましい。
【００２７】
実施例１
植物の栽培及び処理方法
ピートモスとパーライトを１対１で混合した種苗床にナス（Solanum. abutiloides ）の種子を播種し、人工気象器中で発芽させ、そのまま生育させた。播種からおよそ１ヶ月半後にまず生育の良好なものをポット（小）に移植し、およそ２ヶ月後にもう一度同様の鉢上げを行った。
【００２８】
これを人工気象器中で半月から１ヶ月ほど生育させた後、成長の良好なものから順次植木鉢に移植し温室に移動した。まず植木鉢に0.5 Lのバーミキュライトを敷き、その上に活性炭とバーミキュライトが１対２の混合土を1.5 L入れて丁寧に植物体を植えた。肥料には、500倍に希釈したハイポネックスを用い、１週間に１回の割合で様子を見ながら与えた。これを１年間、温室で栽培した。
【００２９】
このように生育させたS. abutiloidesを温室内で２箇所に分け、１０鉢のS. abutiloidesには葉部にtheobroxideを噴霧し、残りの５鉢にはコントロールとして脱塩水を噴霧した。Theobroxideは1mMの濃度の水溶液を用いた。３ヶ月の間、毎日散布を続けた。３ヶ月後に葉部を0.5 Kg採取し、エーテルを用いて抽出した。
【００３０】
化合物の単離
ナス葉部、0.5 Ｋｇより得られたエーテル抽出液を濃縮後、抗菌活性を指標に、シリカゲルカラム（シリカ、400ｇ；展開溶媒、メタノールークロロホルム）、シリカゲルカラム（シリカ、100ｇ；展開溶媒、酢酸エチルーヘキサン）、HPLC（カラム：Inertsil Prep-ODS、移動層、90％メタノール水溶液）の順で精製し、抗菌化合物(8.1 mg)を単離精製した。
【００３１】
化合物の構造決定
得られた抗菌化合物は、FD-MSにより[M]+が238に、脱水ピークである[M-H2O]+が220に観測された。EI-HR-MSより分子式C15H26O2 ([M]+, calcd. 238.1934, found. 238.1942)と決定した。EI-MSからも、m/z 220 [M-H2O]+のフラグメントピークが観察された。旋光度は、[α]D25  +2.35°(c 0.69、CHCl3) であった。
【００３２】
1H-NMRでは、3.42 ppm（1H, t, J = 3.2 Hz）にオキシメチンプロトンのシグナルが確認され、0.99 ppm（3H, s）、0.97 ppm（3H, s）、0.90 ppm（3H, s）にそれぞれ４級炭素に隣接したメチル基に由来するシグナルが確認された。13C-NMRでは15本のピークが確認され、72.3 ppmと70.7 ppmのシグナル、そしてFD-MSで確認された脱水ピークよりヒドロキシル基が２つあることが想定された。1H-1H-COSY、HMQCおよびHMBCスペクトルの結果から、本化合物の構造はcaryolane-1,9β-diolと推定された。
【００３３】
各スペクトルデータを文献値（Heymann, H., Tezuka, Y., Kikuchi, T., Supriyatna, S., Constituents of Sindrasumatrana MIQ. I. Isolation and NMR spectral analysis of sesquiterpenes from  the dried pods, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 42, 138-146 (1994)）と比較したところ良い一致を示したので、抗菌化合物はcaryolane-1,9β-diolと同定された。
【００３４】
ナスを上記条件で育成し、エーテルをもちいて抽出した。抽出液の粗精製物を、シリカゲルをコーティングしたガラスプレート（30cm x 30cm）をもちいて展開し、さらにこのガラスプレートに病原菌の胞子縣濁液を噴霧し、数日間インキュベート後、抗菌活性を検討した。この結果、セオブロキシド処理した植物体抽出液のみに観察される抗菌スポットを確認した(図1)。また、このスポットに含まれる抗菌物質を単離精製し、下図の化合物、caryolane-1,9β-diolと同定した。抗菌活性に関して比較検討したところナス科植物で一般的にファイトアレキシンとして認められているソラベチボン（下記化学式、solavetivone）と同等の活性を示した。
【００３５】
【化６】
2006327995.tif 000007
【００３６】
実施例２
パーライト：ピートモス＝1：1の混合土500 mlに、脱塩水を250 mlまたは1 mMセオブロキシド水溶液250 mlを浸し、イネの種子を植え、混合土150 mlで被覆し、人工気象器にて25℃、10Ｌ14Ｄの条件で13日間栽培した。途中、４日ごとに水150 mlを与えた。また、種子を植えた入れ物はセオブリキシドが流出しないよう底に穴の開いていないものを使用した。栽培期間終了後、植物内のサリチル酸(sa)、サリチル酸グルコシド(sag)をGC-MSにて定量した。
【００３７】
イネを上記条件で育成し、植物体に含まれるサリチル酸、サリチル酸グルコシドを重水素ラベル化したサリチル酸、サリチル酸グルコシドを内部標準物質として用い定量した(図2)。その結果、セオブロキシド処理区の植物における内性サリチル酸グルコシド量が有意（約3培）に増加していることが明らかとなった。図中、sa waterは、脱塩水を用いた場合のサリチル酸量、sa theoは、セオブロキシド水溶液を用いた場合のサリチル酸量、sa+sag waterは、脱塩水を用いた場合のサリチル酸およびサリチル酸グルコシド量、sa+sag theoは、セオブロキシド水溶液を用いた場合のサリチル酸量およびサリチル酸グルコシド量を示す。
【００３８】
サリチル酸やサリチル酸グルコシドがシグナル伝達物質として応答している低温傷害や病虫害等、実際にはイネなど、実際の圃場に植え付ける前に育苗がなされる作物に関してはその処理が行いやすい。また、セオブロキシドに付随する作用（特願2004-206573）で作物の伸長抑制効果が期待できるため、伸びすぎておらず、堅強な苗の育成も期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、農業のさまざまな分野で低温傷害や病虫害等の対策に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】実施例1の抗菌活性試験結果。白く抜けている部分が菌の成長が抑制されている部分。赤矢印がセオブロキシド処理区。
【図２】実施例2の結果。イネに含まれるサリチル酸及びそのグルコシドの量を示す。
【図１】
2006327995.tif 000010
【図２】
2006327995.tif 000011