(57)【要約】【課題】さらなる血管標的治療のために、インビボでの特異的腫瘍血管破壊を可能にするさらなる標的を同定して、標的オプションの数を増大させ、さらに、腫瘍血管系破壊のための１成分の薬剤の調製を提供すること。【解決手段】アミノリン脂質（例えば、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミン）が、腫瘍血管の管腔表面で接近可能な安定かつ特異的なマーカーであり、そして抗アミノリン脂質抗体単独の投与が、インビボで血栓、腫瘍壊死、および腫瘍後退を誘導するのに十分であるという驚くべき発見が開示される。従って、本発明は、腫瘍血管の特異的破壊における使用、および固形腫瘍の処置における使用のための抗アミノリン脂質抗体に基づく方法および組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍血管内皮細胞を殺傷するか、腫瘍血管系における凝固を誘導するか、または腫瘍血管系を破壊することによって癌を処置するための医薬の製造における使用のための組成物、生物学的に有効な量の抗アミノリン脂質抗体またはその抗原結合領域を含む、組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の背景）
本出願は、第１の仮出願番号第６０／０９２，６７２号（１９９８年７月１３日出願）、および第２の仮出願番号第６０／１１０，６０８号（１９９８年１２月２日出願）に対して優先権を主張し、これらの出願の内容全体および図面は、断りなく本明細書中で参考として援用される。米国政府は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの助成金番号１ＲＯ１ＣＡ７４９５１−０１および５ＲＯ１ＣＡ５４１６８−０５に準じて、本発明における権利を所有する。
【０００２】
（１．発明の分野）
本発明は、一般的に血管および腫瘍生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、アミノリン脂質（例えば、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミン）が、特異的かつ安定した腫瘍血管系のマーカーであり、そして抗アミノリン脂質抗体単独での投与が血栓症および腫瘍後退を誘導するのに十分であるという驚くべき知見を具体的に示す。従って、本発明は、腫瘍血管の特異的標的化および破壊のために、ならびに固形腫瘍の処置のために、安全かつ有効な方法および組成物を提供する。本発明は、種々の有効な組成物およびそれらの組み合わせを提供するが、非結合体化抗ホスファチジルセリン抗体の使用は、特に有効である。
【背景技術】
【０００３】
（２．関連分野の説明）
化学療法剤に対する腫瘍細胞の耐性は、臨床腫瘍学において重要な問題を提示する。実際、これは、化学療法の分野における確実な進展にもかかわらず、最も蔓延した形態のヒトの癌の多くがなお、有効な化学療法の介入に抵抗する主な理由の１つである。
【０００４】
腫瘍処置レジメにおいて見られる重要な問題とは、「全細胞の殺傷」を所望することである。これは、より有効な処置レジメは、いわゆる「クローン原性」悪性細胞（すなわち、治療により除去され得る任意の腫瘍塊を制御せず増殖させ、そして置換する能力を有する細胞）の全細胞の殺傷により接近することを意味する。全細胞の殺傷に接近する処置の開発の目標に起因して、特定の型の腫瘍は、他のものより治療に敏感に反応している。例えば、柔組織腫瘍（例えば、リンパ腫）ならびに血液および血液形成器官の腫瘍（例えば、白血病）は、一般的に固形腫瘍（例えば、癌腫）を有するものより、化学療法治療により反応性である。
【０００５】
柔軟でかつ血液に基づく腫瘍の化学療法に対する感受性についての１つの理由は、リンパ腫細胞および白血病細胞の化学療法介入へのより大きな利用可能性である。簡単に言えば、大部分の化学療法剤は、柔腫瘍および血液に基づく腫瘍であるよりも固形腫瘍塊の全ての細胞に及ぶことがよりずっと困難である。それ故、全細胞の殺傷はずっとより困難である。化学療法剤の用量を増大させることは、最も頻繁に、毒素の副作用をもたらし、これは、一般に従来の抗腫瘍剤の効果を制限する。
【０００６】
別の腫瘍処置の戦略は、「イムノトキシン」の使用であり、これは、抗腫瘍細胞抗体を使用して、毒素を腫瘍細胞に送達する。しかし、上記の化学療法アプローチと共通して、イムノトキシン治療はまた、重大な欠陥に悩まされる。例えば、抗原ネガティブ細胞または抗原欠損細胞が生存し得、そして腫瘍を増殖させるかさらなる転移をもたらし得る。また、固形腫瘍の処置において、腫瘍塊は、一般的に、抗体およびイムノトキシンのサイズの分子に対して不透過性である。物理的拡散距離および腫瘍内の間隙圧の両方は、これらの治療の型に対して有意な制限である。
【０００７】
より近年の戦略は、固形腫瘍の血管系を標的とすることである。腫瘍細胞それ自体よりはむしろ腫瘍の血管を標的とすることは、耐性腫瘍細胞の発生を導きそうにもないこと、および標的化された細胞が容易に利用可能であることにおいて、確かな利点を有する。さらに、多くの腫瘍細胞が、それらの酸素および栄養のための単一血管に依存するため、血管の破壊は、抗腫瘍効果の増幅を導く（非特許文献１）。模範的な血管標的戦略は、特許文献１および米国特許第５，＿，＿号（米国出願第０８／３５０，２１２号、特許証発行料金支払い済）に記載され、ここには、特に抗細胞剤および毒素の、腫瘍血管系への標的化送達を記載する。
【０００８】
血管標的アプローチの別の有効なバージョンは、腫瘍血管系に対して凝固因子を標的とすることである（非特許文献２；特許文献２、米国特許第５，＿，＿号および同第５，＿，＿号（米国出願番号第０８／４８７，４２７号および米国出願番号第０８／４８２，３６９号、特許証発行料金支払い済））。抗体、および凝固剤を腫瘍血管系へ送達するための他の標的剤の使用は、免疫原性の減少および毒素の副作用のさらに低い危険性の利点をさらに有する。特許文献２に開示されるように、そのような腫瘍特異的トロンボゲンすなわち「コアグリガンド」における使用のための好ましい凝固因子は、ヒト凝固誘導性タンパク質、組織因子（ＴＦ）の短縮型バージョンである。ＴＦは、血液凝固の主な開始因子である（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。そのようなコアグリガンドを用いた腫瘍保有マウスの処置は、多くの動物において有意な腫瘍壊死そしてさらに完全な腫瘍後退をもたらす（非特許文献２；特許文献２、米国特許第５，＿，＿号および同第５，＿，＿号（米国出願番号第０８／４８７，４２７号および米国出願番号第０８／４８２，３６９号；特許証発行料金支払い済））。
【０００９】
治療剤（例えば、抗細胞剤）、毒素、および凝固因子の、腫瘍血管への特異的送達は、腫瘍処置プロトコルにおいて重要な進展を示すが、さらなる血管標的治療のための余地がなお存在する。インビボでの特異的腫瘍血管破壊を可能にするさらなる標的の同定は、標的オプションの数を増大するのに当然有益である。より詳細には、以前に記載されるように血管標的構築物およびコアグリガンドは、標的化剤およびエフェクター部分を含む２成分系であり、腫瘍血管系破壊のための１成分の薬剤の開発は、大きな進展を示す。この型の薬剤の調製に可能性があることが分かれば、これはまた、新規の治療剤の単純性を仮定する場合、臨床への抗血管治療の進歩を速めるようである。
【特許文献１】米国特許第５，８５５，８６６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８７７，２８９号明細書
【非特許文献１】Ｄｅｎｅｋａｍｐ、「Ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｔｔａｃｋ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ」，１９９０年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．，第９巻，ｐ．２６７−２８２
【非特許文献２】Ｈｕａｎｇ，Ｍｏｌｅｍａ，Ｋｉｎｇ，Ｗａｔｋｉｎｓ，ＥｄｇｉｎｇｔｏｎおよびＴｈｏｒｐｅ、「Ｔｕｍｏｒ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ」，１９９７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７５巻，ｐ．５４７−５５０
【非特許文献３】Ｒｕｆ，ＲｅｈｅｍｔｕｌｌａおよびＥｄｇｉｎｇｔｏｎ、「Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｓｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」，１９９１年、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２６６巻，ｐ．２１５８−２１６６
【非特許文献４】Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｃｋｍａｎ，ＢｒａｎｄおよびＲｕｆ、「Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ」，１９９１年、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，第６６巻，第１号，ｐ．６７−７９
【非特許文献５】ＲｕｆおよびＥｄｇｉｎｇｔｏｎ、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ，ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」，１９９４年、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，第８巻，ｐ．３８５−３９０
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、特定の腫瘍破壊のための新規の単純化した治療方法を提供することによって、先行技術の必要性に取り組む。本発明は、一部、アミノリン脂質（例えば、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミン）が腫瘍血管系の利用しやすく、安定したマーカーであるという知見に基づく。より詳細には、本発明は、アミノリン脂質成分に対する裸の抗体が腫瘍血管破壊およびインビボでの腫瘍壊死を特異的に誘導し得るという驚くべき発見を具体的に示す。
【００１１】
本発明は、例えば、以下の特徴を提供する。
（項目１）血管化腫瘍を有する動物への投与の際に腫瘍血管内皮細胞を殺傷することにおける使用のための、抗アミノリン脂質抗体またはその抗原結合領域の生物学的有効量を含有する、組成物。
（項目２）前記動物への投与の際に腫瘍血管系における凝固を誘導することにおける使用のための、項目１に記載の組成物。
（項目３）前記動物への投与の際に腫瘍血管系を破壊することにおける使用のための、項目１または２に記載の組成物。
（項目４）血管化腫瘍を有する動物への投与の際に癌を処置することにおける使用のための、項目１〜３のいずれかに記載の組成物。
（項目５）ＩｇＧまたはＩｇＭ抗アミノリン脂質抗体、またはその抗原結合領域を含有する、項目１〜４のいずれかに記載の組成物。
（項目６）抗アミノリン脂質抗体のＦｖ、Ｆａｂ'、ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２抗原結合フラグメントを含有する、項目１〜５のいずれかに記載の組成物。
（項目７）モノクローナル抗アミノリン脂質抗体、またはその抗原結合領域を含有する、項目１〜６のいずれかに記載の組成物。
（項目８）項目７に記載の組成物であって、前記モノクローナル抗アミノリン脂質抗体、またはその抗原結合フラグメントは、以下：
（ａ）抗アミノリン脂質抗体産生細胞を調製する工程；および
（ｂ）該抗体産生細胞から抗アミノリン脂質モノクローナル抗体を得る工程
を包含する調製プロセスにより調製される、組成物。
（項目９）前記抗アミノリン脂質抗体産生細胞が、ヒト患者の細胞であり、該患者が、抗アミノリン脂質抗体の産生に関連する疾患を有する、項目８に記載の組成物。
（項目１０）前記抗アミノリン脂質抗体産生細胞が、混合ヒト末梢血リンパ球の集団を、免疫学的に有効な量のアミノリン脂質サンプルでインビトロ刺激することにより得られる、項目８に記載の組成物。
（項目１１）前記抗アミノリン脂質抗体産生細胞が、免疫学的に有効な量のアミノリン脂質サンプルで非ヒト動物を免疫することにより得られる、項目８に記載の組成物。
（項目１２）前記抗アミノリン脂質抗体産生細胞が、免疫学的に有効な量のアミノリン脂質サンプルで、ヒト抗体ライブラリーを含むトランスジェニックマウスを免疫することにより得られる、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）項目８に記載の組成物であって、前記調製プロセスは、以下：
（ａ）前記抗アミノリン脂質抗体産生細胞を、不死細胞と融合して、抗アミノリン脂質モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製する工程；および
（ｂ）該ハイブリドーマから該抗アミノリン脂質モノクローナル抗体を得る工程を包含する、組成物。
（項目１４）項目８に記載の組成物であって、前記調製プロセスは、以下：
（ａ）非ヒト動物を、免疫学的に有効な量のアミノリン脂質サンプルで免疫する工程；
（ｂ）該免疫された動物から、抗体産生ハイブリドーマのコレクションを調製する工程；
（ｃ）該コレクションから、抗アミノリン脂質抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程；および
（ｄ）該選択されたハイブリドーマを培養して、該抗アミノリン脂質モノクローナル抗体を提供する工程
を包含する、組成物。
（項目１５）前記免疫された動物が、ヒト抗体ライブラリーを持つトランスジェニックマウスであり、前記抗アミノリン脂質モノクローナル抗体が、ヒトモノクローナル抗体である、項目１４に記載の組成物。
（項目１６）項目８に記載の組成物であって、前記調製プロセスは、以下：  （ａ）前記抗アミノリン脂質抗体産生細胞から、抗アミノリン脂質抗体をコードする核酸を得る工程；および
（ｂ）該核酸を発現させて、抗アミノリン脂質モノクローナル抗体を得る工程
を包含する、組成物。
（項目１７）項目８に記載の組成物であって、前記調製プロセスは、以下：
（ａ）免疫学的に有効な量のアミノリン脂質サンプルで、動物を免疫する工程；
（ｂ）該免疫された動物の脾臓から単離されたＲＮＡを発現するコンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーを調製する工程；
（ｃ）抗アミノリン脂質抗体を発現するクローンを、ファージミドライブラリーから選択する工程；および
（ｄ）該選択されたクローンから抗アミノリン脂質抗体をコードする核酸を発現させて、組換え抗アミノリン脂質モノクローナル抗体に提供する工程
を包含する、組成物。
（項目１８）前記免疫された動物が、ヒト抗体ライブラリーを持つトランスジェニックマウスであり、前記組換え抗アミノリン脂質モノクローナル抗体が、ヒトモノクローナル抗体である、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）ヒト、ヒト化、または部分ヒトキメラ抗アミノリン脂質抗体、またはそれらの抗原結合領域を含有する、項目１〜１８のいずれかに記載の組成物。
（項目２０）抗アミノリン脂質抗体またはその抗原結合フラグメントの二量体、三量体、または多量体を含有する、項目１〜１９のいずれかに記載の組成物。
（項目２１）血管化腫瘍の血管の管腔表面上で、ホスファチジルエタノールアミンに結合する、抗アミノリン脂質抗体、またはその抗原結合領域を含有する、項目１〜２０のいずれかに記載の組成物。
（項目２２）血管化腫瘍の血管の管腔表面上で、ホスファチジルセリンに結合する、抗アミノリン脂質抗体、またはその抗体結合領域を含有する、項目１〜２１のいずれかに記載の組成物。
（項目２３）別個のアミノリン脂質に各々が結合する、少なくとも２つの抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントを含有する、項目１〜２２のいずれかに記載の組成物。
（項目２４）前記組成物が、静脈内投与のために処方されている、項目１〜２３のいずれかに記載の組成物。
（項目２５）前記組成物が、ヒトへの投与が意図されている、項目１〜２４のいずれかに記載の組成物。
（項目２６）癌を処置するための医薬の製造における、項目１〜２５のいずれかに記載の組成物の使用。
（項目２７）癌を処置するための医薬の製造における、結合体化していない抗アミノリン脂質抗体またはその抗原結合領域を含有する組成物の使用。
（項目２８）項目１〜２５のいずれか１つに記載の組成物を、アミノリン脂質に結合する検出可能に標識された抗体またはその抗原結合フラグメントの診断的有効量と組み合わせて含有する、キット。
（項目２９）前記検出可能に標識された抗体、またはその抗原結合フラグメントが、X線検出可能な化合物であるビスマス（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、ランタン（ＩＩＩ）、または鉛（ＩＩＩ）を含有する、項目２８に記載のキット。
（項目３０）前記検出可能に標識された抗体またはその抗原結合フラグメントが、検出可能な放射活性イオンである、銅６７、ガリウム６７、ガリウム６８、インジウム１１１、インジウム１１３、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、水銀１９７、水銀２０３、レニウム１８６、レニウム１８８、ルビジウム９７、ルビジウム１０３、テクネチウム９９ｍ、またはイットリウム９０を含有する、項目２８に記載のキット。
（項目３１）前記検出可能に標識された抗体またはその抗原結合フラグメントが、検出可能な核磁気スピン共鳴アイソトープである、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、クロム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）またはイッテルビウム（ＩＩＩ）を含有する、項目２８に記載のキット。
（項目３２）項目１〜２５のいずれか１つに記載の組成物を、生物学的有効量の第２の抗癌剤と組み合わせて含有する、キット。
（項目３３）項目１〜２５のいずれか１つに記載の組成物を、以下：
（ａ）アミノリン脂質に結合する、診断的有効量の検出可能に標識された抗体またはその抗原結合フラグメント；および
（ｂ）治療有効量の第２の抗癌剤
と組み合わせて含有する、キット。
（項目３４）前記組成物および前記第２の抗癌剤が、単一の薬学的組成物内に含有される、項目３２または３３に記載のキット。
（項目３５）前記組成物および前記第２の抗癌剤が、別個の薬学的組成物内に含有される、項目３２または３３に記載のキット。
（項目３６）前記第２の抗癌剤が、化学療法剤、放射線療法剤、抗脈管形成剤、またはアポトーシス誘導化剤である、項目３２〜３５のいずれか１つに記載のキット。
（項目３７）前記第２の抗癌剤が、標的化抗体またはその抗原結合フラグメントを含有し、腫瘍細胞、腫瘍支質または腫瘍血管系の、表面発現成分、表面接触可能成分または表面局在化成分に結合する、抗体−治療剤構築物であり、該標的化抗体またはそのフラグメントは、治療剤に作動可能に連結されている、項目３２〜３５のいずれか１つに記載のキット。
（項目３８）前記標的化抗体またはその抗原結合フラグメントが、腫瘍細胞の細胞表面抗原に結合する、項目３７に記載のキット。
（項目３９）前記標的化抗体またはその抗原結合フラグメントが、腫瘍支質の成分に結合する、項目３７に記載のキット。
（項目４０）前記標的化抗体またはその抗原結合フラグメントが、血管化腫瘍の腫瘍内血管の、表面発現成分、表面接触可能成分、表面局在化成分、サイトカイン誘導性成分、または凝固剤誘導性成分に結合する、項目３７に記載のキット。
（項目４１）前記標的化抗体またはその抗原結合フラグメントが、アミノリン脂質、エンドグリン、ＴＧＦβレセプター、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＳＭＡ、ＶＥＧＦ／ＶＰＦレセプター、ＦＧＦレセプター、ＴＩＥ、αvβ3インテグリン、プレイオトロピン、エンドシアリンならびにＭＨＣクラスＩＩタンパク質からなる群より選択される腫瘍内血管系の表面発現成分に結合する、項目４０に記載のキット。
（項目４２）前記標的化抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＩＥに結合するリガンド、腫瘍関連フィブロネクチンアイソフォーム、散乱因子／肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板因子４（ＰＦ４）、ＰＤＧＦおよびＴＩＭＰからなる群より選択される腫瘍内血管系の表面局在化成分に結合する、項目４０に記載のキット。
（項目４３）前記標的化抗体またはその抗原結合フラグメントが、細胞傷害剤に作動可能に連結されている、項目３７〜４２のいずれか１つに記載のキット。
（項目４４）前記標的化抗体またはその抗原結合フラグメントが、植物由来毒素、真菌由来毒素、または細菌由来毒素に作動可能に連結されている、項目４３に記載のキット。
（項目４５）前記標的化抗体またはその抗原結合フラグメントが、脱グリコシル化リシンＡ鎖に作動可能に連結されている、項目４４に記載のキット。
（項目４６）前記標的化抗体またはその抗原結合フラグメントが、凝固因子、または凝固因子に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメントに作動可能に連結されている、項目３７〜４２のいずれか１つに記載のキット。
（項目４７）前記標的化抗体またはその抗原結合フラグメントが、組織因子、短縮型組織因子もしくはそれらの誘導体、または、組織因子、短縮型組織因子もしくはそれらの誘導体に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメントに作動可能に連結されている、項目４６に記載のキット。
（項目４８）血管化腫瘍を有する動物を処置するための方法であって、該方法は、該動物に、治療有効量の少なくとも１つの第１の薬学的組成物を投与する工程を包含し、該組成物は、血管化腫瘍の血管の管腔表面上でアミノリン脂質に結合する、少なくとも第１の裸の抗体またはその抗原結合フラグメントを含有する、方法。
（項目４９）癌を処置するための方法であって、以下：
（ａ）血管化腫瘍の血管の管腔表面上でアミノリン脂質に結合する、診断的有効量の検出可能に標識された抗体またはその抗原結合フラグメントを、該血管化腫瘍を有する動物に投与することによって、血管化腫瘍の画像を形成し、それによって、該腫瘍血管系の検出可能な画像を形成する工程；および
（ｂ）腫瘍血管管腔表面上で、アミノリン脂質に結合する、少なくとも１つの第１の抗体またはその抗原結合フラグメントの治療有効量を該動物に連続的に投与して、それによって該腫瘍血管系を破壊する工程
を包含する、方法。
（項目５０）癌を処置するための方法であって、該方法は、血管化腫瘍の血管の管腔表面上でアミノリン脂質に結合する、結合体化していない抗体またはその抗原結合フラグメントの治療有効量と、少なくとも１つの第２の抗癌剤とを、該血管化腫瘍を有する動物に同時または連続的に投与する工程を包含する、方法。
【００１２】
本発明の根本的な驚くべき特徴は、アミノリン脂質（例えば、ＰＳ）の、腫瘍血管内皮細胞の表面へのトランスロケーションが、細胞損傷およびアポトーシス機構または他の細胞死機構に独立して、少なくとも有意な部分で生じることである。従って、腫瘍環境におけるＰＳ表面発現は、細胞の死および破壊の結果またはそれらの引き金とはならないが、形態学的にインタクトな血管内皮細胞において生じる。これは、ＰＳ発現は、一過性ではなく、むしろ治療介入のための標的を提供するのに十分安定していることを意味する。
【００１３】
本発明の特定の好ましい局面は、アミノリン脂質、ホスファチジルセリン（ＳＰ）に対する抗体が、固形腫瘍の血管系に特異的に位置し、なおさらに驚くべきことには、この抗体がエフェクター分子（例えば、毒素または凝固剤）への結合体化の非存在下で腫瘍破壊効果をもたらすという発見から発展した。従って、アミノリン脂質に対する単一成分の治療剤は、血管の標的化における躍進を示し、そして固形腫瘍の処置のための安全かつ有効な方法を提供する。
【００１４】
本発明の方法は、腫瘍血管内皮細胞を殺傷、もしくは特異的に殺傷する工程を提供し、そしてこの方法は、血管新生化腫瘍を有する動物または患者に、少なくとも１用量の、生物学的有効量の少なくとも第１の薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここで、この薬学的組成物は、腫瘍血管内皮細胞の管腔表面上で発現される少なくとも第１のアミノリン脂質に結合する裸の抗体もしくは結合していない抗体、またはそれらの抗原結合領域を含む。この「生物学的有効量」は、腫瘍血管内皮細胞の管腔表面で発現されるアミノリン脂質に結合する際、正常な血管の内皮細胞とは対照に、腫瘍血管内皮細胞の少なくとも一部、および好ましくは有意な部分を特異的に殺傷するのに有効な、裸の抗体もしくは結合していない抗体の量である。このように、それは、裸のもしくは結合していない抗アミノリン脂質抗体またはその抗原結合領域の「内皮細胞殺傷量」または「腫瘍血管内皮細胞殺傷量」である。
【００１５】
本願全体を通して使用される場合、用語「ａ」および「ａｎ」は、上限がその後特に規定される場合を除き、参照される成分の「少なくとも１つ」、「少なくとも第１の」、「１以上」または「複数」を意味するという意味で使用される。従って、「抗アミノリン脂質抗体」は、「少なくとも第１の抗アミノリン脂質抗体」を意味する。任意の単一因子の量を用いる場合、組み合わせの実施可能な限定およびパラメーターは、本発明の開示に照らして当業者に公知である。
【００１６】
「ａ」および「ａｎ」の用語はまた、特に規定される場合を除き、引用される方法における「少なくとも１つの」、「少なくとも第１の」、「１以上の」または「複数の」工程を意味するために使用される。これは、処置方法における投与工程に特に関する。従って、本発明とともに異なる用量で使用され得るだけでなく、異なる数の用量（例えば、注射）（複数回までの注射）が使用され得る。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「アミノリン脂質」とは、その構造内に少なくとも第１の一級アミノ基を含むホスホリピドを意味する。好ましくは、用語「アミノリン脂質」は、哺乳動物の細胞膜中に天然に存在する一級アミノ基含有ホスホリピドをいうために使用される。しかし、このことは、この用語がまた、それにもかかわらず本発明において、例えば、哺乳動物の形質膜のアミノリン脂質に結合する抗アミノリン脂質抗体（「交叉反応性抗体」）の産生における免疫原として使用する、天然に存在しないかまたは合成のアミノリン脂質に拡大するので、用語「アミノリン脂質」の意味に限定しない。米国特許第５，７６７，２９８号（これは本明細書中で参考として援用される）のアミノリン脂質は、適切な例である。
【００１８】
哺乳動物生物系において見出される顕著なアミノリン脂質は、負に荷電したホスファチジルセリン（「ＰＳ」）および中性または両性イオン性のホスファチジルエタノールアミン（「ＰＥ」）であり、従って、これらは、本発明による標的化のための好ましいアミノリン脂質である。しかし、アミノリン脂質が腫瘍血管内皮細胞の管腔表面上で発現され、利用しやすく、または複合化される限り、本発明は、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンの標的化に限定せず、そして任意の他のアミノリン脂質標的が使用され得る（Ｗｈｉｔｅら、１９７８；本明細書中で参考として援用される）。
【００１９】
全てのアミノリン脂質に基づく成分、ホスファチジルセリンに基づく成分、およびホスファチジルエタノールアミンに基づく成分が、関与する脂肪酸鎖の型とは無関係に本発明の標的として含まれ、これらの成分は、短鎖、中間鎖または長鎖の脂肪酸を有する型、ならびに飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、および多価不飽和脂肪鎖酸を有する型を含む。本発明の使用のために、抗体を惹起するのに好ましい組成物は、Ｃ１８の脂肪酸、より好ましくはＣ１８：１である脂肪酸を有するアミノリン脂質であり得る（Ｌｅｖｙら、１９９０；本明細書中で参考として援用される）。それらが腫瘍血管内皮細胞において利用しやすい程度まで、２つよりもむしろ１つのみの脂肪酸（溶解（ｌｙｓｏ）誘導体）を有するアミノリン脂質分解産物はまた、標的化され得る（Ｑａｍａｒら、１９９０；本明細書中で参考として援用される）。
【００２０】
潜在的なアミノリン脂質標的の別の群には、例えば、ホスファチド誘導体（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）（プラスマロゲン）、例えば、ホスファチダルセリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｌｓｅｒｉｎｅ）およびホスファチダルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（エステル結合を与えるアシル基よりもむしろエタノール結合を与えるアルケニル基を有する）が含まれる。実際、本発明による治療介入のための標的は、窒素性塩基を含み、そして腫瘍血管内皮細胞（ホスファチジルコリン（「ＰＣ」）を含む）の管腔標的上に存在し、発現し、転位し、提示されたか、またはそうでなければ検出可能な形態で複合体化した、任意の実質的に脂質ベースの成分を含む。グリセロールを含まない脂質はまた、適切な標的（例えば、スフィンゴシンに基づくスフィンゴリピドおよび誘導体）を形成し得る。
【００２１】
標的可能な成分の群における脂質の範囲を含む生物学的基礎は、一部、固有の脂質−タンパク質複合体を形成する膜環境において組み合わさっている脂質とタンパク質の、観察される生物学的現象とともに存在する。そのような脂質−タンパク質複合体は、例えば、β2−糖タンパク質Ｉ、プロトロンビン、キニノーゲンおよびプレカリクレインのようなタンパク質と、抗原性および免疫原性の形態の脂質（例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリン）にわたる。従って、タンパク質およびポリペプチドが１つ以上の遊離の一級アミノ基を有し得る場合、有効な「アミノリン脂質標的」の範囲は、最も厳密な意味においてアミノリン脂質でない脂質成分からインビボで形成され得ることが意図される。それでもやはり、脂質および一級アミノ基を含む全てのこのような標的可能な複合体は、本発明の範囲内の「アミノリン脂質」を構築する。
【００２２】
本発明はまた、腫瘍血管系内で、血流を停止させるか、または特異的に血流を停止させるよう作用する。これは、血管新生化腫瘍を有する動物または患者に、少なくとも１用量の、少なくとも第１の薬学的組成物を投与する工程により達成され、ここで、この薬学的組成物は、凝固誘導量または血管閉塞量の、少なくとも第１の裸のもしくは結合していない抗体、またはそれらの抗原結合領域（これらは、腫瘍血管系の管腔表面に転位したアミノリン脂質、好ましくはホスファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミンに結合する）を含む。
【００２３】
「凝固誘導量」または「血管閉塞量」とは、腫瘍血管の管腔表面に転位されるアミノリン脂質、好ましくはホスファチジルセリンもしくはホスファチジルエタノールアミンに結合する際、正常な血管とは対照的に、腫瘍または腫瘍内血管の少なくとも一部、および好ましくは有意な部分での凝固、ならびにそれゆえそれらの閉塞を特異的に誘導または促進するのに有効な、裸のもしくは結合していない抗体の量である。従って、「血管閉塞量」は、機能的有効量であり、血管の幅を広げるのに十分な抗体の物理的質量ではない。
【００２４】
腫瘍血管系を破壊または特異的に破壊するための方法が、提供される。この方法は、血管新生化腫瘍を有する動物または患者に、１以上の用量の、少なくとも第１の薬学的組成物を投与する工程を含み、ここで、この薬学的組成物は、腫瘍破壊量の少なくとも第１の裸のもしくは結合していない抗体、またはそれらの抗原結合領域（これらは、腫瘍内血管系の管腔表面に提示されるアミノリン脂質、好ましくはホスファチジルセリンもしくはホスファチジルエタノールアミンに結合する）を含む。「腫瘍破壊量」は、腫瘍血管の血管内皮細胞の管腔表面で提示されるアミノリン脂質、好ましくはホスファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミンに結合する際、正常な血管とは対照的に、腫瘍血管の少なくとも一部、および好ましくは有意な部分を特異的に破壊または閉塞するのに有効な、裸のもしくは結合していない抗体の量である。
【００２５】
本発明は、癌および固形腫瘍を処置するための方法をさらに含み、この方法は、血管新生化腫瘍を有する動物または患者に、腫瘍壊死誘導量すなわち少なくとも第１の薬学的組成物の量を投与する工程を包含し、ここで、この薬学的組成物は、少なくとも第１の裸のもしくは結合していない抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント（これは、血管新生化腫瘍の血管もしくは腫瘍内血管の管腔表面上でアミノリン脂質、好ましくはホスファチジルセリンもしくはホスファチジルエタノールアミンに結合する）を含む。「腫瘍壊死誘導量」とは、腫瘍血管の血管内皮細胞の管腔表面で複合体化したアミノリン脂質、好ましくはホスファチジルセリンもしくはホスファチジルエタノールアミンに結合するが、一方、正常な、健常組織において有害な副作用がほとんど示されない際に、腫瘍の少なくとも一部、および好ましくは有意な部分において、出血性壊死を特異的に誘導するのに有効な、裸のもしくは結合していない抗体の量である。
【００２６】
従って、本発明の方法は、血管新生化腫瘍を有する動物または患者を処置するための方法として要約され得、この方法は、この動物または患者に、第１用量の、少なくとも第１の薬学的組成物の治療有効量を投与する工程を包含し、ここでこの薬学的組成物は、血管新生化腫瘍の血液輸送管の管腔表面に存在し、発現され、転位され、提示され、または複合体化したアミノリン脂質（好ましくはホスファチジルセリンもしくはホスファチジルエタノールアミン）に結合する、少なくとも第１の裸のもしくは結合していない抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントを含む。
【００２７】
本発明の本質はまた、腫瘍血管系の破壊における使用のためのおよびヒト腫瘍の処置のための医薬の調製における使用のために、少なくとも第１の裸のもしくは結合していない抗アミノリン脂質抗体、好ましくは抗ホスファチジルセリン抗体もしくは抗アミノホスファチジルエタノールアミン抗体、あるいはそれらの抗原結合フラグメントを含む組成物として規定され得る。これはまた、血管新生化腫瘍の血液輸送管の管腔表面に存在し、発現され、転位され、提示され、または複合体化したアミノリン脂質、好ましくはホスファチジルセリンもしくはホスファチジルエタノールアミンへの結合における使用のため、ならびに腫瘍血管系の破壊の誘導における使用のため、ならびにヒト腫瘍処置のための医薬の調製における使用のために、少なくとも第１の裸のまたは結合していない抗アミノリン脂質抗体、好ましくは抗ＰＳ抗体もしくは抗ＰＥ抗体、あるいはそれらの抗原結合フラグメントを含む組成物として規定され得る。
【００２８】
本発明の方法、医薬および使用において、１つの利点として、単純な裸のもしくは結合していない抗アミノリン脂質抗体組成物、好ましくは抗ホスファチジルセリンもしくは抗ホスファチジルエタノールアミンの、動物または患者の全身的循環への供給が、優先的なまたは特異的な腫瘍血管系の破壊および腫瘍壊死の誘導をもたらすという事実がある。従って、本発明は、先行技術の複数成分の抗血管因子の複雑な調製方法の問題を解決する。
【００２９】
用語「裸の」および「結合していない」抗体は、本明細書中で使用される場合、結合しないか、作動可能に連結されるか、またはそうでなければ物理的もしくは機能的にエフェクター部分（例えば、細胞傷害性因子または凝固因子）と結合する抗体をいうことが意図される。用語「裸の」および「結合していない」抗体は、安定化した、重合化した、ヒト化した、またはエフェクター部分の付着による以外で操作される任意の他の方法での抗体の構築を含むことが理解される。
【００３０】
従って、すべての翻訳後修飾された裸の抗体および結合していない抗体は、本発明に含まれ、これらの抗体としては、改変が天然の抗体産生細胞環境においてなされる場合、組換え抗体産生細胞による場合を含み、そして、これらの抗体は、最初の抗体調製の後、ヒトの手によって導入される。もちろん、用語「裸の」抗体は、身体への投与後、抗体がエフェクター細胞および／または分子と機能的な結合を形成する能力を含む。なぜなら、そのような相互作用のいくつかが生物学的効果を発揮するために必要であるからである。従って、結合したエフェクター基の欠失は、インビボでなく、インビトロでの裸の抗体に対する規定において適用される。
【００３１】
本発明の文脈では、用語「血管化された腫瘍」は、最も好ましくは、血管形成した、悪性腫瘍、固形腫瘍または「癌」を意味する。本発明は、特に、少なくともほぼ中間サイズの血管化腫瘍の処置において、および大血管化腫瘍の処置において−−これは、決して本発明に対する制限ではないが−−有利である。したがって、本発明は、アミノリン脂質陽性血管、好ましくは、ホスファチジルセリン陽性血管および／またはホスファチジルエタノールアミン陽性血管を示す任意の腫瘍の処置で用いられ得る。
【００３２】
好適な実施態様では、本発明によって処置されるべき腫瘍は、殺傷有効数のアミノリン脂質陽性血管を示す。本明細書で用いられるとき、「殺傷有効数のアミノリン脂質陽性血管」は、腫瘍内の血管の総数の少なくとも約３％が、アミノリン脂質発現、好ましくは、ホスファチジルセリンおよび／またはホスファチジルエタノールアミン発現について陽性であることを意味する。好ましくは、腫瘍内の血管の総数の、少なくとも約５％、少なくとも約８％、または少なくとも約１０％またはその程度が、アミノリン脂質発現について陽性である。正常組織内の血管の性質である、アミノリン脂質陰性、特にＰＳ−陰性である場合、この腫瘍血管は、投与された抗体に対して溜（ｓｉｎｋ）として作用する。さらに、腫瘍血管の最小数のみの破壊は、腫瘍細胞死の広く拡散した血栓症、壊死および雪崩を引き起こし得るので、有効な治療介入のために、腫瘍血管のすべての、または大多数でさえの抗体局在化が必要であるわけではない。
【００３３】
しかし、より好ましい実施態様では、本発明により処置されるべき腫瘍は、有意な数のアミノリン脂質陽性血管を示す。本明細書で用いられる「有意な数のアミノリン脂質陽性血管」は、腫瘍内の血管の総数の少なくとも約１０〜１２％が、アミノリン脂質発現、好ましくは、ホスファチジルセリンおよび／またはホスファチジルエタノールアミン発現について陽性であることを意味する。さらにより好ましくは、アミノリン脂質を発現する腫瘍血管のこの％は、腫瘍内の血管の総数の、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％もしくはその程度であり、血管の少なくとも約９０％または、少なくとも約９５％まで、およびそれさえも含む。
【００３４】
本発明における使用のための「治療的に有効な量」は、選択された動物または患者への投与に際し、腫瘍血管内皮細胞の少なくとも一部分を特異的に殺傷するために；腫瘍血管の少なくとも一部分における凝固を特異的に促進するために；腫瘍の血液輸送血管の少なくとも一部分を特異的に閉塞または破壊するために；腫瘍の少なくとも一部分における壊死を特異的に誘導するために；および／または腫瘍後退または緩解を誘導するために有効な、裸のまたは結合していない抗アミノリン脂質抗体、好ましくは抗ＰＳ抗体または抗ＰＥ抗体の量である。このような効果は、正常、健常組織中の血管内皮細胞にはほとんどもしくは全く結合せず、またはほとんどもしくは全くそれを殺傷せず；健常、正常組織では血管の閉塞または破壊における凝固はほとんどもしくは全くなく；そして動物または患者の正常、健常組織に対して無視し得るか、または処理し易い副作用を奏して達成される。
【００３５】
腫瘍血管系における凝固を促進するか、または破壊する文脈において、および／または腫瘍壊死を引き起こす文脈において、本明細書で用いる用語「優先的に」および「特異的に」は、従って、抗アミノリン脂質抗体が、腫瘍血管系および腫瘍部位に実質的に限られる凝固、破壊および／または腫瘍壊死を達成するように機能し、そして動物または被験体の正常、健常組織における凝固、破壊および／または組織壊死を引き起こすことに実質的に及ばないことを意味する。従って、健常細胞および組織の構造および機能は、本発明の実施により維持され、実質的に損傷されない。
【００３６】
治療効果は、少なくとも２、３以上の裸のまたは結合していない抗アミノリン脂質抗体；二重特異的抗体；キメラ抗体；および／または二量体抗体、三量体抗体または多量体抗体の投与により実現され得る。抗アミノリン脂質抗体はまた、他の治療剤と組み合わされて、本明細書中に開示されるような、組合わせた治療有効量を提供し得る。
【００３７】
本発明の抗アミノリン脂質抗体処置の実施に作用機構を理解することは、必要ではないが、この方法は、細胞媒介性の細胞傷害性、相補体媒介性の溶解および／またはアポトーシスを誘導するように作動し得る。細胞傷害性方法はまた、抗体に誘導される細胞のシグナル伝達（直接的シグナル伝達）、またはシグナル伝達経路の模倣もしくは改変（間接的シグナル伝達）に基づき得る。膜の成分それ自体に局在および結合する抗アミノリン脂質抗体の能力はまた、膜の表面それ自体から立体的に異なり得るかまたは遠いと思われるタンパク質成分または複合体への結合を一般的に指向する以前の治療と対照的に、関連し得る。
【００３８】
従って、処置方法は、血管化された腫瘍を有する動物または患者に、腫瘍血管内皮細胞の少なくとも一部分の細胞媒介性細胞傷害性を誘導、または特異的に誘導するために有効な量の少なくとも第１の抗体構築物を含む、少なくとも第１の薬学的組成物を投与する工程を包含する。ここで、この第１の抗体構築物は、正常血管内の内皮細胞に対して、腫瘍血管内皮細胞の管腔表面に存在し、発現し、転移し、提示されるか、または複合体化された、アミノリン脂質、好ましくはホスファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミンに結合し、そして腫瘍血管内皮細胞の少なくとも一部分の細胞媒介性細胞傷害性を誘導する、裸の抗体または非結合抗体、またはその有効なフラグメントである。本明細書で用いられる、「細胞媒介性細胞傷害性または破壊」は、ＡＤＣＣ（抗体依存性、細胞媒介性細胞傷害性）およびＮＫ（ナチュラルキラー）細胞殺傷を含む。
【００３９】
この方法は、さらに、血管化された腫瘍を有する動物または患者に、腫瘍血管内皮細胞の少なくとも一部分の補体媒介性溶解を誘導、または特異的に誘導するために有効な量の少なくとも第１の抗体構築物を含む、少なくとも第１の薬学的組成物を投与する工程を包含する。ここで、この第１の抗体構築物は、正常血管内の内皮細胞に対して、腫瘍血管内皮細胞の管腔表面に存在し、発現し、転移し、提示されるか、または複合体化された、アミノリン脂質、好ましくはホスファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミンに結合し、そして腫瘍血管内皮細胞の少なくとも一部分の補体媒介溶解を誘導する、裸の抗体または非結合抗体、またはその有効なフラグメントである。本明細書で用いられる、「補体媒介性溶解または補体依存性溶解または細胞傷害性」は、補体依存性凝固カスケードを活性化し、多数成分複合体がアセンブルされ、最終的に、直接溶解作用を有し、細胞透過を引き起こす溶解複合体を生成するプロセスを意味する。補体媒介性溶解を誘導することにおける使用のための抗アミノリン脂質抗体は、一般に、抗体のＦｃ部分を含む。
【００４０】
本発明が作動し得る補体に基づく機構は、「補体活性化ＡＤＣＣ」をさらに含む。このような局面では、投与される裸の抗体または非結合抗体、またはそのフラグメントは、正常血管内の内皮細胞に対して、腫瘍血管内皮細胞の管腔表面に存在し、発現し、転移し、提示されるか、または複合体化された、アミノリン脂質、好ましくはホスファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミンに結合し、そして腫瘍血管内皮細胞の少なくとも一部分の補体活性化ＡＤＣＣを誘導する。「補体活性化ＡＤＣＣ」は、抗体Ｆｃ部分それ自身ではなく、それによって、補体が、多成分複合体を一緒に保持し、そしてそこで好中球のような細胞が、標的細胞を溶解するプロセスをいうために用いられる。
【００４１】
その他の実施態様では、この方法は、血管化された腫瘍を有する動物または患者に、腫瘍血管内皮細胞の少なくとも一部分でアポトーシスを誘導、または特異的に誘導するために有効な量の少なくとも第１の抗体構築物を含む、少なくとも第１の薬学的組成物を投与する工程を包含する。ここで、この第１の抗体構築物は、正常血管内の内皮細胞に対して、腫瘍血管内皮細胞の管腔表面に存在し、発現し、転移し、提示されるか、または複合体化された、アミノリン脂質、好ましくはホスファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミンに結合し、そして腫瘍血管内皮細胞の少なくとも一部分にアポトーシスを誘導する、裸の抗体または非結合抗体、またはその抗原結合フラグメントである。本明細書で用いられる、「アポトーシスを誘導する」は、初期ステージの間には、細胞膜の一体性を維持するが、なお、死を誘導するシグナルを、細胞中に伝達するプログラム化された細胞死のプロセスを誘導することを意味する。これは、その間に細胞膜がその一体性を失い、そしてこのプロセスの開始時に漏出性になる細胞壊死の機構とは反対である。
【００４２】
抗アミノリン脂質抗体処置方法は、一般に、静脈内注射を経由するような、動物への全身的な、薬学的に有効な組成物の少なくとも１つの用量の投与を含む。しかし、抗体を、腫瘍内血管内皮細胞に局在化させ、そしてその細胞媒介性細胞傷害性、補体媒介溶解および／またはアポトーシスを誘導することを可能にする任意の投与の経路が受容可能である。
【００４３】
本明細書で用いる、「投与」は、従って、血管化された腫瘍の血液輸送血管の管腔表面に存在し、発現され、転移され、提示され、または複合体化された、アミノリン脂質、好ましくはホスファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミンへの結合を可能にし、そして腫瘍血管系破壊および腫瘍退縮効果を奏するに有効な量および時間、抗アミノリン脂質抗体の提供または送達を意味する。タンパク質性の抗体の受動的投与が、一般に、部分的にその単純さおよび再現性のために好ましい。
【００４４】
しかし、用語「投与」は、それによって抗アミノリン脂質抗体が、腫瘍血管系に送達されるか、またはそうでなければ提供される任意およびすべての手段をいうために本明細書中で用いられる。従って「投与」は、腫瘍血管系への抗アミノリン脂質抗体の送達を生じるために有効な様式で、抗アミノホスホスリピド抗体を産生するハイブリドーマのような細胞の提供、および／またはそのような血管系へのそれらの局在化を含む。このような実施態様では、選択的に透過可能な膜、構造または移植デバイス、一般に治療を止めるために除去され得るものの中に抗体産生細胞を処方またはパッケージすることが所望され得る。
【００４５】
本明細書中で使用される「抗体投与」はまた、それによって、抗アミノリン脂質抗体が患者中で生成され（内因性抗体）、それらを腫瘍血管系まで循環させ、そして局在化させるすべての方法に拡張される。従って、「投与」はまた、免疫学的に有効な量のアミノリン脂質サンプル、抗原または免疫原で患者を能動的に免疫化することを含む。ヒト免疫化のすべての方法が、動物において抗アミノリン脂質抗体応答を生成し、そして動物から抗体を得る意味において以下に記載の実施態様によって例示されるように、このような実施態様における使用に適切である。外来性の抗体投与が、細胞を基礎にした送達および免疫化を基礎にした送達よりもなお一般に好適である。なぜなら、これは、用量が緊密にモニターかつ制御されることを可能にする侵襲性のより少ない方法を示すからである。
【００４６】
本発明の「抗体投与方法」はまた、抗アミノリン脂質抗体をコードする核酸を、腫瘍血管系の近傍における抗アミノリン脂質抗体の発現、および／または腫瘍血管系に局在化し得る抗アミノリン脂質抗体の発現を生じるために有効な様式で提供することまで拡張される。裸のＤＮＡ送達、組換え遺伝子およびベクター、患者の細胞のエクスビボ操作を含む、細胞を基礎にした送達などのような任意の遺伝子治療技法が採用され得る。
【００４７】
本発明の利点の１つは、アミノリン脂質類、特にホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンが、一般に、腫瘍血管じゅうで発現されるかまたは利用可能であることである。確立された腫瘍内血管上のアミノリン脂質発現は有利である。なぜなら、このような血管を標的にしかつ破壊することは、迅速に抗腫瘍効果に至るからである。しかし、投与された抗アミノリン脂質抗体が血液輸送血管の少なくとも一部分に結合する限り、有意な抗腫瘍効果が確実になる。これは問題とはならない。なぜなら、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンのようなアミノリン脂質類が、大きな中央血管上で、そしてまた腫瘍のすべての領域中の静脈、細静脈、動脈、細動脈および血液輸送毛細血管上で発現されるからである。
【００４８】
いずれの事象においても、この抗アミノリン脂質抗体が腫瘍血管系を破壊する能力は、腫瘍静止のみよりもむしろ腫瘍退縮が達成され得ることを意味する。腫瘍静止は、最もしばしば、固形腫瘍の周縁で出芽血管のみを標的とし、そして血管増殖を停止する抗血管形成治療の結果である。たとえ本発明が、特定の腫瘍型における腫瘍の周縁領域より多くを標的にしても、これは、現在そうではないと考えられるが、このような領域における血液輸送血管の破壊はなお広く広がる血栓症および腫瘍壊死に至る。
【００４９】
先行する方法のいずれにおいても、本明細書で用いられる用語抗アミノリン脂質「抗体、裸の抗体および非結合抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナルＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体のような任意の免疫学的結合剤を広くいう。一般に、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭが好ましい。なぜなら、それらは、生理学的状況で最も一般的な抗体であるからであり、そして実験室セッティングで最も容易に作製されるからである。
【００５０】
抗血清から得られたポリクローナル抗アミノリン脂質抗体は、本発明で採用され得る。しかし、モノクローナル抗アミノリン脂質抗体（ＭＡｂ）の使用が一般に好ましい。ＭＡｂは、特定の利点、例えば、それらを臨床処置のために適切にする、再現性および大規模生産性を有することが認識されている。従って、本発明は、マウス、ヒト、サル、ラット、ハムスター、ウサギおよびカエルまたはニワトリ起源でさえあるモノクローナル抗体を提供する。試薬の調製の容易さおよび容易利用可能性に起因して、マウスモノクローナル抗体が、特定の実施態様で用いられる。
【００５１】
当業者により理解されるように、用語「抗アミノリン脂質抗体」により包含される免疫学的結合試薬は、すべての種からのすべての裸の抗アミノリン脂質抗体、および非結合抗アミノリン脂質抗体、およびダイマー、トリマーおよびマルチマー抗体を含む、その抗原結合性フラグメント；２特異性抗体；キメラ抗体；ヒトおよびヒト化抗体；組換えおよび操作抗体、およびそれらのフラグメントに拡張される。
【００５２】
用語「抗アミノリン脂質抗体」は、それ故抗原結合性領域を有する任意の抗アミノリン脂質抗体様分子をいうために用いられ、そしてＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２のような抗体フラグメント、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）などを含む。種々の抗体を基にする構築物およびフラグメントを調製および使用する技法は、当該分野で周知である。
【００５３】
特定の実施態様において、採用される抗体は、「ヒト化」またはヒト抗体である。「ヒト化」抗体は、一般に、マウス、ラット、またはその他の非ヒト種からのキメラモノクローナル抗体であり、ヒト定常および／または可変領域ドメイン（「部分的ヒトキメラ抗体」）を保持する。大部分は、本発明における使用のためのヒト化モノクローナル抗体はキメラ抗体であり、ここで、マウス、ラットまたはその他の非ヒト抗アミノリン脂質モノクローナル抗体の、第１の抗原結合性領域、または相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ヒト抗体定常領域または「フレームワーク」上に作動可能に結合、または「接ぎ木」されている。
【００５４】
本明細書中の使用のための「ヒト化」モノクローナル抗体はまた、非ヒト種からの抗アミノリン脂質モノクローナル抗体であり得、ここで、１つ以上の選択されたアミノ酸が、ヒト抗体中でより一般に観察されるアミノ酸に交換されている。これは、慣用的な組換え技法、特に部位特異的変異誘発の使用により容易に達成され得る。
【００５５】
「ヒト化」よりむしろ完全にヒトの抗アミノリン脂質抗体もまた調製され、そして本発明で用いられ得る。このようなヒト抗体は、抗アミノリン脂質抗体の産生と関連する、任意の１つ以上の種々の疾患、障害または臨床症状を有するヒト患者から得られたような、ポリクローナル抗体であり得る。このような抗体は、本明細書における使用のために、濃縮、部分精製または実質的に精製され得る。
【００５６】
所定の範囲の技法がまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用可能である。抗アミノリン脂質抗体産生疾患を有するヒト患者が存在するので、このような患者からの抗アミノリン脂質抗体産生細胞が、インビトロで得られ、そして操作され、ヒトモノクローナル抗体を提供し得る。このインビトロ操作または技法は、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製するために融合すること、および／または細胞からの抗アミノリン脂質抗体をコードする遺伝子（単数または複数）をクローニングすること（「組換えヒト抗体」）を含む。
【００５７】
ヒト抗アミノリン脂質抗体産生細胞はまた、本発明の文脈において抗アミノリン脂質抗体関連疾患なしのヒト被験体、すなわち「健常被験体」から得られ得る。これを達成するために、抗原提示細胞および抗体産生細胞を含む、ヒト被験体からの混合末梢血リンパ球の集団を単に得、そしてこの細胞集団を、免疫学的に有効な量のアミノリン脂質サンプルと混合することによりインビトロで刺激する。ここで再び、このヒト抗アミノリン脂質抗体産生細胞が一旦得られると、ハイブリドーマおよび／または組換え抗体産生に用いることができる。
【００５８】
ヒトモノクローナル抗体産生のためのさらなる技法は、トランスジェニック動物、好ましくはトランスジェニックマウスを免疫化することを包含し、これは、免疫学的に有効な量のアミノリン脂質サンプルをともなうヒト抗体ライブラリーを含む。これはまた、ハイブリドーマおよび／または組換え抗体産生においてさらなる操作のためのヒト抗アミノリン脂質抗体産生細胞を生成し、末梢血細胞よりもむしろ脾細胞が、トランスジェニック動物またはマウスから容易に得られ得るという利点を持つ。
【００５９】
本明細書で用いられるとき、用語「抗アミノリン脂質抗体」は、「裸のおよび非結合の」とともに用いられ、細胞傷害性薬剤または凝固剤のようなエフェクター分子と結合体化していないか、または作動可能に連結していない、抗アミノリン脂質抗体、およびそれらの抗原結合性フラグメントを意味する。抗体の非エフェクター改変およびインビボ相互作用に加えて、用語「裸の」は、抗体の、本明細書中に詳細に開示されるようなその他の治療剤との組み合わせを決して排除しない。
【００６０】
対照的に、細胞傷害性薬剤または抗細胞薬剤に結合体化、または作動可能に連結された、抗アミノリン脂質抗体、二特異性抗体、およびそれらの抗原結合性フラグメントは、本明細書では、「抗アミノリン脂質イムノトキシン」と呼ぶ。同様に、凝固因子に結合体化、または作動可能に連結された、抗アミノリン脂質抗体、二特異性抗体、およびそれらの抗原結合性フラグメントは、本明細書では、「抗アミノリン脂質コアグリガンド」と呼ぶ。腫瘍処置における抗アミノリン脂質イムノトキシンおよび抗アミノリン脂質コアグリガンドの使用がまた、本発明者らにより意図され、そして各々が参考として詳細に本明細書に援用される、第１および第２の仮出願番号６０／０９２，５８９（１９９８年７月１３日出願）および６０／１１０，６００（１９９８年１２月２日出願）および同時提出の米国およびＰＣＴ特許出願（代理人書類番号第４００１．００２３００、４００１．００２３８２および４００１．００２３８３）に開示され、そして請求の範囲に記載されている。
【００６１】
本発明における使用のために好適な抗アミノリン脂質抗体は、抗ホスファチジルセリン（抗ＰＳ）抗体および抗ホスファチジルエタノールアミン（抗ＰＥ）抗体である。抗ＰＳ抗体は、一般に、腫瘍血管内皮細胞の管腔表面に存在し、発現し、転移し、提示されまたは複合体化されたＰＳ分子を認識し、結合しまたは免疫特異性を有する。従って、適切な抗体は、ホスファチジル−Ｌ−セリンに結合する（Ｕｍｅｄａら、１９８９；本明細書に参考として援用される）。抗ＰＥ抗体は、一般に、腫瘍血管内皮細胞の管腔表面に存在し、発現し、転移し、提示されまたは複合体化されたＰＥ分子を認識し、結合しまたは免疫特異性を有する。
【００６２】
腫瘍を持つ動物に抗アミノリン脂質抗体を投与することは、腫瘍血管の管腔表面に存在し、発現しまたは転移するアミノリン脂質分子への抗体の特異的結合を生じ、すなわち、抗体は、天然の生物学的環境におけるアミノリン脂質分子に結合する。従って、抗体結合を確実にするために、何の特定の操作も必要ではない。
【００６３】
しかし、アミノリン脂質分子が、１つ以上のタンパク質またはその他の非脂質生物学的成分と連結している場合、このアミノリン脂質が、抗アミノリン脂質抗体により、最も頻繁に認識され、または結合され得ることに注意することは科学的に興味深い。例えば、特定の疾患および障害を持つ患者におけるサブセットの抗ホスホリピド（抗ＰＬ）抗体として生じる抗ＰＳ抗体は、今や、β2−糖タンパク質Ｉ（β2−ＧＰＩまたはアポリポタンパク質Ｈ、ａｐｏＨ）およびプロトロンビン（米国特許第５，３４４，７５８号；Ｒｏｔｅ、１９９６；各々は本明細書中に参考として援用される）のようなタンパク質とともにＰＳに結合すると考えられている。同様に、疾患状態で生じる抗ＰＥ抗体は、今や、低分子量および高分子量キニノーゲン（ＨＫ）のようなタンパク質と、そしてプレカリクレインおよび第ＸＩ因子でさえ一緒にＰＥに結合すると考えられる（ＳｕｇｉおよびＭｃＩｎｔｙｒｅ、１９９５；１９９６ａ；１９９６ｂ；各々は本明細書中に参考として援用される）。
【００６４】
本明細書で用いられる、用語、腫瘍血管の管腔表面に「提示され」および「複合体化され」るの意味は、その特定の状態の分子の定義にかかわらず、アミノリン脂質分子が、抗体結合コンピテント状態にある腫瘍血管の表面に存在することである。ＰＳは、第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子および第Ｘ／Ｘａ因子との複合体として、なお標的化され得る。さらに、アミノリン脂質標的の性質は、本発明の実施の間に変化し得る。なぜなら、初期のアミノリン脂質抗体結合、抗内皮細胞および抗腫瘍効果は、アミノリン脂質標的エピトープの数、コンフォメーションおよび／または型を改変する生物学的変化を生じ得るからである。
【００６５】
従って、本発明の文脈で用いられる用語「抗アミノリン脂質抗体」は、好ましくはホスファチジルセリンを基礎にする標的またはホスファチジルエタノールアミンを基礎にする標的である、脂質およびアミノ基含有複合体またはアミノリン脂質標的に少なくとも結合する、任意の裸のまたは非結合抗アミノリン脂質抗体、免疫学的結合剤または抗血清；モノクローナル、ヒト、ヒト化、ダイマー、トリマー、マルチマー、キメラ、二特異性、組換えまたは操作抗体；またはそのＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、ＤＡＢ、ＦｖまたはｓｃＦｖ抗原結合性フラグメントを意味する。
【００６６】
抗体が「アミノリン脂質標的に少なくとも結合する」という要件は、いわゆる「ヘキサゴナル」および「ヘキサゴナルＩＩ相」のＰＳおよびＰＥ（ＨｅｘＩＩ  ＰＳおよびＨｅｘＩＩ  ＰＥ）（Ｒａｕｃｈら、１９８６；ＲａｕｃｈおよびＪａｎｏｆｆ、１９９０；Ｂｅｒａｒｄら、１９９３；各々は参考として援用される）ならびに任意のその他のタンパク質、脂質、膜成分、血漿成分もしくは血清成分、またはそれらの任意の組み合わせとともにあるＰＳおよびＰＥを含む、アミノリン脂質の任意および／またはすべての生理学的に関係ある形態に結合する抗体により満たされる。従って、「抗アミノリン脂質抗体」は、二層またはミセルアミノリン脂質は免疫学的に中性であると考えられ得るという事実にかかわらず、腫瘍血管中のアミノリン脂質に結合する抗体である。
【００６７】
この抗アミノリン脂質抗体は、その他のホスホリピドまたは脂質を排除して、アミノリン脂質分子、またはその免疫原性複合体（ヘキサゴナルアミノリン脂質およびタンパク質の組み合わせを含む）を認識するか、結合するかまたはそれに対して免疫特異性を有し得る。このような抗体は、「アミノリン脂質特異的抗体またはアミノリン脂質制限抗体」と称され得、そして本発明におけるそれらの使用がしばしば好適である。「アミノリン脂質特異的抗体またはアミノリン脂質制限抗体」は、一般に、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびなお特定の実施態様におけるホスファチジルコリン（ＰＣ）のような、他の脂質成分への有意な結合をほとんどまたは全く示さないで、アミノリン脂質への有意な結合を示す。
【００６８】
「ＰＳ特異的抗体またはＰＳ制限抗体」は、一般に、ホスファチジルエタノールアミンおよびカルジオリピン、ならびにＰＣ、ＰＩおよびＰＧのような脂質成分への有意な結合をほとんどまたは全く示さないで、ＰＳへの有意な結合を示す。「ＰＥ特異的抗体またはＰＥ制限抗体」は、一般に、ホスファチジルエタノールセリンおよびカルジオリピン（ＣＬ）、ならびにＰＣ、ＰＩおよびＰＧのような脂質成分への有意な結合をほとんどまたは全く示さないで、ＰＥへの有意な結合を示す。特異的抗アミノリン脂質抗体の調製は、例えば、Ｒａｕｃｈら（１９９６）；Ｕｍｅｄａら（１９８９）；ＲａｕｃｈおよびＪａｎｏｆｆ（１９９０）；およびＲｏｔｅら（１９９３）；各々は参考として本明細書に援用される、に開示されるように、容易に調製される。
【００６９】
さらに、他のホスホリピドまたは脂質成分へのより少ないが、しかし検出され得る結合を示す、アミノリン脂質分子、またはその免疫原性複合体（ヘキサゴナルアミノリン脂質およびタンパク質の組み合わせを含む）を認識するか、結合するかまたはそれに対して免疫特異性を有する「交差反応性抗アミノリン脂質抗体」は、本発明の使用からは決して排除されない。このような「交差反応性抗アミノリン脂質抗体」は、それらが、、腫瘍血管内皮細胞の管腔表面に存在し、発現され、転移し、提示されまた複合体化するアミノリン脂質に結合し、そしてインビボでの投与に際し抗腫瘍効果を発揮する限り採用され得る。
【００７０】
さらに適切なアミノリン脂質特異的抗体またはアミノリン脂質制限抗体は、ＰＳおよびＰＥの両方に結合するような抗アミノリン脂質抗体である。他の脂質成分とは対照的に、アミノリン脂質に明確に特異的または制限されて、本発明の好適な標的の各々に結合する抗体が存在する。本発明の使用のためのそのような抗体の例は、制限されないで、ＰＳ３Ａ、ＰＳＦ６、ＰＳＦ７、ＰＳＢ４、ＰＳ３Ｈ１およびＰＳ３Ｅ１０を含む（Ｉｇａｒａｓｈｉら、１９９１；本明細書中に参考として援用される）。
【００７１】
本発明における使用のために、さらなる例示の抗ＰＳ抗体は、制限されないで、ＢＡ３Ｂ５Ｃ４、ＰＳ４Ａ７、ＰＳ１Ｇ３および３ＳＢ９ｂを含み；ＰＳ４Ａ７、ＰＳ１Ｇ３および３ＳＢ９ｂが一般に好適である。３ＳＢ９ｂ抗体（Ｒｏｔｅら、１９９３；本明細書に参考として援用される）に基づくモノクローナル抗体、ヒト化抗体および／または抗原結合性フラグメントが現在最も好適である。
【００７２】
二分子層またはミセル形態にあるＰＳおよびＰＥのようなアミノリン脂質は、非抗原性もしくは弱い抗原性、または非免疫原性もしくは弱い免疫原性であると報告されているが、科学文献は、抗ＰＳ抗体および抗ＰＥ抗体のような抗アミノリン脂質抗体を生成することに困難はないと報告している。抗アミノリン脂質抗体またはモノクローナル抗体は、従って、以下の工程を包含する調製プロセスおよび方法により容易に調製され得る。
（ａ）抗アミノリン脂質抗体産生細胞を調製すること；および
（ｂ）この抗体産生細胞から抗アミノリン脂質抗体またはモノクローナル抗体を得ること。
【００７３】
抗アミノリン脂質抗体産生細胞を調製し、そしてそこから抗アミノリン脂質抗体を得るプロセスは、所定の患者においてインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で実施され得る。すなわち、患者に、免疫原性的に有効な量の免疫原性アミノリン脂質試料を単に提供することで、抗アミノリン脂質抗体生成を生じる。従って、抗アミノリン脂質抗体は、抗体産生細胞からなお得られるが、宿主から離れて単離され、そして引き続き、患者に提供されなければならないことはなく、自然に腫瘍血管系に局在化し、そしてその生物学的抗腫瘍効果を奏する。
【００７４】
本明細書で開示されるように、抗アミノリン脂質抗体産生細胞が、抗アミノリン脂質抗体産生疾患を有する患者から、インビトロでアミノリン脂質を有する刺激末梢血リンパ球から、そしてまた免疫化プロセスおよび方法により得られ、そして続いて抗体が、単離および／または精製され得る。後者は一般に以下を包含する：
（ａ）動物を、この動物に免疫原性的に有効な量の、免疫原性アミノリン脂質試料（アミノリン脂質のヘキサゴナル、またはヘキサゴナルＩＩ相形態のような）、好ましくは免疫原性ＰＳまたはＰＥ試料の少なくとも１つの用量、および必要に応じて１つより多くの用量を投与することにより免疫すること；および
（ｂ）この免疫化された動物から抗アミノリン脂質抗体産生細胞を得ること。
【００７５】
この免疫学的に有効な量のアミノリン脂質試料（単数または複数）は、サルモネラ被覆アミノリン脂質試料（Ｕｍｅｄａら、１９８９；本明細書中に参考として援用される）；アミノリン脂質ミセル、リポソーム、脂質複合体または脂質処方物試料；またはＳＤＳで製造されたアミノリン脂質試料であり得る。任意のこのようなアミノリン脂質試料を、Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュバントのような任意の適切なアジュバントと組み合わせて投与し得る（Ｒｏｔｅら、１９９３；本明細書中に参考として援用される）。任意の経験的技法または改変法を採用して、免疫原性を増大し得、および／またはアミノリン脂質のヘキサゴナルまたはヘキサゴナルＩＩ相形態が投与され得る。
【００７６】
この免疫化は、免疫学的に有効な量のアミノリン脂質試料の１つ以上の脾臓内注射に基づき得る（Ｕｍｅｄａら、１９８９；本明細書中に参考として援用される）。
【００７７】
免疫プロセスの性質、または免疫される動物の型に関係なく、抗アミノリン脂質抗体産生細胞が、その免疫された動物から入手され、そして好ましくは、人の手でさらに操作される。「免疫された動物」とは、本明細書中で使用される場合、特にそれ以外と述べられない限りは、非ヒト動物である。任意の抗体産生細胞が使用され得るが、最も好ましくは、脾臓細胞が、その抗体産生動物の供給源として入手される。この抗アミノリン脂質抗体産生細胞は、以下を含む調製プロセスにおいて使用され得る：
（ａ）抗アミノリン脂質抗体産生細胞を不死細胞と融合して、抗アミノリン脂質モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製する工程、ならびに
（ｂ）このハイブリドーマから抗アミノリン脂質モノクローナル抗体を得る工程。
【００７８】
従って、ハイブリドーマに基くモノクローナル抗体調製方法は、以下を含むものが挙げられる：
（ａ）その動物に、少なくとも１用量、必要に応じて１を超える用量の、免疫学的に有効な量の免疫原性アミノリン脂質サンプル（例えば、ヘキサゴナル、またはヘキサゴナルＩＩ相形態のアミノリン脂質）、好ましくは免疫原性のＰＳまたはＰＥのサンプルを、投与することによって動物を免疫する、工程；
（ｂ）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのコレクションをこの免疫された動物から調製する工程；
（ｃ）このコレクションから、少なくとも第１の抗アミノリン脂質モノクローナル抗体そして好ましくは少なくとも第１のアミノリン脂質特異的モノクローナル抗体を産生する少なくとも第１のハイブリドーマを選択する工程；ならびに
（ｄ）この少なくとも第１の抗アミノリン脂質抗体産生ハイブリドーマまたはアミノリン脂質特異的ハイブリドーマを培養して、この少なくとも第１の抗アミノリン脂質モノクローナル抗体またはアミノリン脂質特異的モノクローナル抗体を提供する工程；ならびに好ましくは、
（ｅ）この少なくとも第１の抗アミノリン脂質モノクローナル抗体またはアミノリン脂質特異的モノクローナル抗体を、この培養された少なくとも第１のハイブリドーマから得る工程。
【００７９】
非ヒト動物が免疫に使用される場合、このようなハイブリドーマから得られた抗アミノリン脂質モノクローナル抗体は、しばしば非ヒトの性質を有する。必要に応じて、このような抗体は、当業者に公知であり、そして本明細書中にさらに開示されるように、ヒト化プロセス（移植または変異）に供され得る。あるいは、ヒト抗体遺伝子ライブラリーを含むトランスジェニック動物（例えば、マウス）が使用され得る。従って、このような動物の免疫は、ヒト抗アミノリン脂質抗体の産生を直接生じる。
【００８０】
適切な抗体産生細胞、最も好ましくはハイブリドーマの産生後、ヒト抗体を産生しようと、または非ヒト抗体を産生しようと、モノクローナル抗体をコードする核酸がクローン化されて、「組換え」モノクローナル抗体が調製され得る。任意の組換えクローニング技術が利用され得、これには、ＰＣＲを使用してのこの抗体をコードする核酸配列の合成の開始が含まれる。従って、なおさらに適切なモノクローナル抗体調製法としては、以下のように抗アミノリン脂質抗体産性細胞を使用する工程を含むものが挙げられる：
（ａ）少なくとも第１の抗アミノリン脂質抗体をコードする核酸分子またはセグメントを、抗アミノリン脂質抗体産生細胞、好ましくはハイブリドーマから得る工程；ならびに
（ｂ）この核酸分子またはセグメントを組換え宿主細胞中で発現させて、組換え抗アミノリン脂質モノクローナル抗体を得る工程。
【００８１】
しかし、組換えモノクローナル抗体の調製に理想的に適する他の強力な組換え技術が利用可能である。このような組換え技術としては、以下の工程を含む、ファージミドライブラリーに基くモノクローナル抗体調製法が挙げられる：
（ａ）その動物に、少なくとも１用量、必要に応じて１を超える用量の、免疫学的に有効な量の免疫原性アミノリン脂質サンプル（例えば、ヘキサゴナル、またはヘキサゴナルＩＩ相形態のアミノリン脂質）、好ましくは免疫原性のＰＳまたはＰＥのサンプルを、投与することによって動物を免疫する、工程；
（ｂ）この免疫された動物の抗体産生細胞、好ましくは脾臓から単離されたＲＮＡを発現する、コンビナトリアルイムノグロブリンファージミドライブラリーを調製する工程；
（ｃ）このファージミドライブラリーから、少なくとも第１の抗アミノリン脂質抗体を、そして好ましくは少なくとも第１のアミノリン脂質特異的抗体を発現する、少なくとも第１のクローンを選択する工程；
（ｄ）この少なくとも第１の選択されたクローンから抗アミノリン脂質抗体をコードする核酸を得、そしてこの核酸を組換え宿主細胞中で発現させて、この少なくとも第１の抗アミノリン脂質抗体またはアミノリン脂質特異的抗体を提供する工程；ならびに好ましくは、
（ｅ）この少なくとも第１の選択されたクローンから得られた核酸により発現された、この少なくとも第１の抗アミノリン脂質抗体またはアミノリン脂質特異的抗体を得る工程。
【００８２】
また、このようなファージミドライブラリーに基く技術において、ヒト抗体遺伝子ライブラリーを保有するトランスジェニック動物が使用され得、これにより組換えヒトモノクローナル抗体が生成され得る。
【００８３】
第１の抗アミノリン脂質抗体核酸セグメントの調製の様式に関わらず、さらに適切な抗アミノリン脂質抗体核酸セグメントが、標準的分子生物学技術によって、容易に調製され得る。任意の改変体、変異体または第２世代の抗アミノリン脂質抗体核酸セグメントが本発明における使用に適切であることを確認するために、この核酸セグメントが試験されて、アミノリン脂質に結合する抗体の発現が確認される。好ましくは、改変体、変異体または第２世代の抗アミノリン脂質抗体核酸セグメントはまた試験されて、標準的な、より好ましくは標準的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、抗アミノリン脂質抗体核酸セグメントに対するハイブリダイゼーションが確認される。例示的な適切なハイブリダイゼーション条件としては、約７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５Ｍ  ＮａＰＯ4、約１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で約５０℃でのハイブリダイゼーション；そして約４２℃の約１％  ＳＤＳでの洗浄が挙げられる。
【００８４】
種々の組換えモノクローナル抗体が、起源がヒトであろうと非ヒトであろうと、容易に調製され得る場合、本発明の処置方法は、動物または患者に、生物学的に有効な量の少なくとも第１の抗アミノリン脂質抗体をその患者中で発現する、少なくとも第１の核酸セグメントを提供することによって実行され得る。「抗アミノリン脂質抗体を発現する核酸セグメント」は、一般的に、少なくとも発現構築物の形態であり、そしてウイルス中または組換え宿主細胞中に含まれた発現構築物の形態であり得る。本発明の好ましい遺伝子治療ベクターは、一般的に、ウイルスベクターであり、例えば、組換えレトロウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などの中に含まれている。
【００８５】
特定の実施態様において、処置されるべき動物または患者の血管新生された腫瘍の血管系は、まず画像化され得る。一般的にこれは、診断的有効量の少なくとも第１の薬学的組成物を動物または患者に最初に投与することにより達成される。この第１の薬学的組成物は、血管新生された腫瘍の血管の内腔表面に存在し、発現し、トランスロケートされ、提示され、または複合体化されるアミノリン脂質（好ましくは、ホフファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミン）に結合しそして同定する少なくとも第１の検出可能に標識されたアミノリン脂質結合構築物（例えば、抗アミノリン脂質抗体−検出可能薬剤構築物）を含む。従って、本発明はさらに、腫瘍および／または腫瘍内血管と正常な血管との間の識別における使用のための組成物、および識別の方法を提供する。「識別（ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ）」は、記載された１つ以上の検出可能に標識されたアミノリン脂質結合構築物を投与することにより達成される。
【００８６】
検出可能に標識されたアミノリン脂質結合構築物または抗アミノリン脂質抗体−検出可能薬剤構築物は、以下を含み得る：ビスマス（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、ランタン（ＩＩＩ）または鉛（ＩＩ）のようなＸ線検出可能化合物；銅67、ガリウム67、ガリウム68、インジウム111、インジウム113、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、水銀197、水銀203、レニウム186、レニウム188、ルビジウム97、ルビジウム103、テクネチウム99m、またはイットリウム90のような放射活性イオン；コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、クロム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）またはイッテルビウム（ＩＩＩ）のような核磁気スピン共鳴アイソトープ；あるいはローダミンまたはフルオレセイン。
【００８７】
従って、腫瘍処置前の事前画像化は、以下により実行され得る：
（ａ）診断上有効な量の薬学的組成物を動物または患者に投与する工程であって、この薬学的組成物は、血管新生された腫瘍の血管または腫瘍内血管の内腔表面に存在し、発現し、トランスロケートされ、提示され、または複合体化されるアミノリン脂質（好ましくは、ホフファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミン）に結合する抗体、結合タンパク質もしくはリガンド、またはそれらのアミノリン脂質結合フラグメントに作動可能に付着された診断剤を含む少なくとも第１の検出可能に標識されたアミノリン脂質結合構築物を含む、工程；ならびに
（ｂ）腫瘍の血管または腫瘍内血管の内腔表面で、アミノリン脂質（好ましくは、ホフファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミン）に結合する検出可能に標識されたアミノリン脂質結合構築物を引き続き検出し、これにより腫瘍血管系の画像を獲得する、工程。
【００８８】
癌の処置はまた、以下により実行され得る：
（ａ）血管新生された腫瘍を有する動物または患者に、診断上で最少量の少なくとも第１の検出可能に標識されたアミノリン脂質結合構築物を投与することにより血管新生された腫瘍の画像を形成する工程であって、ここで、このアミノリン脂質結合構築物は、血管新生された腫瘍の腫瘍血管または腫瘍内血管の内腔表面上で、アミノリン脂質（好ましくは、ホフファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミン）に結合する抗体、結合タンパク質もしくはリガンド、またはそれらのアミノリン脂質結合フラグメントに作動可能に付着された診断剤を含み、これにより腫瘍血管系の検出可能な画像を形成する、工程；ならびに
（ｂ）引き続き、同じ動物または患者に、腫瘍血管内腔表面で、アミノリン脂質（好ましくは、ホフファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミン）に結合する、診断上で最適化された量の少なくとも第１の裸の抗体、またはその抗原結合フラグメントを投与し、これにより腫瘍血管系を破壊する、工程。
【００８９】
従って、一般的に、以下を含む画像化および処置の、処方物または医薬が提供される：
（ａ）血管新生された腫瘍の腫瘍血管または腫瘍内血管の内腔表面上で、アミノリン脂質（好ましくは、ホフファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミン）に結合する抗体、結合タンパク質もしくはリガンド、またはそれらのアミノリン脂質結合フラグメントに作動可能に付着された検出可能剤を含む、診断上有効量の検出可能に標識されたアミノリン脂質結合構築物を含む、第１の薬学的組成物；ならびに
（ｂ）治療上有効量の少なくとも第２の非結合体化抗アミノリン脂質抗体（好ましくは、抗ホフファチジルセリンまたは抗ホスファチジルエタノールアミン）、またはそれらの抗原結合フラグメントを含む少なくとも第２の薬学的組成物。
【００９０】
このような方法および医薬において、利点が理解される。この利点において、第１の薬学的組成物および第２の薬学的組成物は、同じ標的化剤、例えば、同じ抗体調製物由来の、または好ましくは同じ抗体産生ハイブリドーマ由来の抗アミノリン脂質抗体、もしくはそのフラグメントを含む。
【００９１】
本発明の血管系画像化の局面において、投与された、検出可能に標識されたアミノリン脂質結合構築物または抗アミノリン脂質抗体検出剤それ自体が治療効果を有し得ることが認識される。これは本発明からは除外されないが、投与されるべき検出可能に標識された構築物の量は一般に、代表的には治療的利点に必要な量よりも少ない「診断上有効な量」として選択される。
【００９２】
画像化の実施態様において、標的化剤は抗体ベースまたは結合リガンドベースもしくは結合タンパク質ベースのいずれかであり得る。腫瘍または腫瘍血管系と以前に結合されていないが、検出可能に標識されたアミノリン脂質結合リガンド組成物は、当該分野で公知であり、そしてここで本動機付けおよび本開示に照らして、本発明の画像化の局面および処置の局面の組合せにおいて用いられ得る。従って、米国特許第５，６２７，０３６号；ＷＯ９５／１９７９１；ＷＯ９５／２７９０３；ＷＯ９５／３４３１５；ＷＯ９６／１７６１８；およびＷＯ９８／０４２９４（それぞれ本明細書において参考として援用される）の検出可能に標識されたアネキシンが使用され得る。
【００９３】
上記の画像化および処置の、処方物または医薬はまた、１つ以上の抗癌剤をさらに含み得る。すなわち、本発明は、一般的に以下を含む画像化および組合せ処置の、処方物および医薬を包含する：（ａ）診断的に有効量の検出可能に標識されたアミノリン脂質結合構築物；（ｂ）治療的に有効量の非結合体化抗アミノリン脂質抗体（好ましくは、抗ホスファチジルセリンまたは抗ホスファチジルエタノールアミン）またはそれらの抗原結合フラグメント；ならびに（ｃ）治療的に有効量の少なくとも他の抗癌剤。
【００９４】
なおさらなる実施態様において、本発明により処置される動物または患者は、さらに、手術または放射線療法に供されるか、または治療上有効量の少なくとも第１の抗癌剤を提供される。この文脈において「少なくとも第１の抗癌剤」は、裸の抗アミノリン脂質抗体」（好ましくは、抗ホスファチジルセリンまたは抗ホスファチジルエタノールアミン）に加えて、少なくとも第１の抗癌剤を意味する。従って、「少なくとも第１の抗癌剤」は、「少なくとも第２の抗癌剤」であると考えられ得る。ここで裸の抗アミノリン脂質抗体は、第１の抗癌剤である。しかし、これは、純粋に記号論の問題であり、そして実際の意味は当業者には明白である。
【００９５】
少なくとも第１の抗癌剤は、抗アミノリン脂質抗体またはその抗原結合フラグメントと（例えば、単一の薬学的組成物からまたは近接して一緒に投与される２つの薬学的組成物から）実質的に同時に、動物または患者に投与され得る。
【００９６】
あるいは、少なくとも第１の抗癌剤は、少なくとも第１の抗アミノリン脂質またはその抗原結合フラグメントの投与に引き続く時点で動物または患者に投与され得る。本明細書において用いる場合「引き続く時点」は、「時差的（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）」を意味する。その結果、少なくとも第１の抗癌剤は、少なくとも第１の抗アミノリン脂質抗体の投与と別の時点で動物または患者に投与される。一般に、２つの薬剤は効果的に離れた時間で投与され、２つの薬剤がそのそれぞれの治療効果を発揮することを可能にする。すなわち、それらは「生物学的に効果的な時間間隔」で投与される。
【００９７】
少なくとも第１の抗癌剤は、抗アミノリン脂質抗体またはそのフラグメントの前に、生物学的に効果的な時間で、または抗アミノリン脂質抗体フラグメントに引き続く生物学的に有効な時点で動物または患者に投与され得る。抗アミノリン脂質抗体に引き続く治療的に有効な時点での１つ以上の非アミノリン脂質標的化抗癌剤の投与は、特に所望され得る。ここで、抗癌剤は、腫瘍の最外縁で腫瘍細胞を殺傷するように設計された抗腫瘍細胞イムノトキシンであり、および／または抗癌剤は、任意の残存腫瘍細胞の微小トランスロケートを妨げるように設計された抗血管形成性剤である。このような考察は当業者に公知である。
【００９８】
抗アミノリン脂質抗体の前の治療的有効時点での１つ以上の非アミノリン脂質標的化抗癌剤（抗癌剤はアミノリン脂質発現を増大するように設計される）の投与が、特に使用され得る。これは、腫瘍内皮を損傷するかまたは腫瘍内皮にアポトーシスを誘導する抗癌剤を用いることにより達成され得る。例示的な抗癌剤としては、例えば、以下が挙げられる：タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ネオマイシン、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）、ポドフィロトキシン、ＴＮＦ−α、アンギオスタチン、エンドスタチン、バスキュロスタチン（ｖａｓｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）、αvβ3アンタゴニスト、カルシウムイオノフォア、カルシウム流誘導化剤（ｃａｌｃｉｕｍ−ｆｌｕｘ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、それらの任意の誘導体またはプロドラッグ。
【００９９】
１つ以上のさらなる抗癌剤は、化学療法剤、放射線療法剤、サイトカイン、抗脈管形成剤、アポトーシス誘導化剤または抗癌イムノトキシンもしくはコアグリガンドであり得る。本明細書において用いる場合、「化学療法」は、悪性疾患の処置において用いられる古典的化学療法剤または薬物をいう。この用語は、他の化合物が、抗癌効果を発揮するという点で化学療法剤として技術的に記載され得るという事実にかかわらず簡易に使用される。しかし、「化学療法剤」は、当該分野において異なる意味を有するようになっており、そしてこの標準的意味に従って用いられている。
【０１００】
多数の例示的化学療法剤が本明細書において記載されている。当業者は容易に化学療法剤の使用および適切な用量を理解するが、この用量は本発明と組み合わせて用いられる場合、多分減少され得る。「化学療法剤」とも名付けられ得る新しいクラスの薬物は、アポトーシスを誘導する薬剤である。任意の１つ以上のこのような薬物（遺伝子、ベクターおよびアンチセンス構築物を含む）はまた、適切なように、本発明と組み合わせて用いられ得る。
【０１０１】
抗癌イムノトキシンまたはコアグリガンドはさらに適切な抗癌剤である。「抗癌イムノトキシンまたはコアグリガンド」または標的化剤／治療剤構築物は、標的剤に基く。この標的剤は、腫瘍細胞、腫瘍血管系または腫瘍支質の標的可能な成分に結合し、そして治療剤（一般には、細胞傷害性因子（イムノトキシン）または凝固因子（コアグリガンド））に作動可能に付着する抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントを含む。腫瘍細胞、腫瘍血管系または腫瘍支質の「標的可能成分」は、好ましくは表面発現成分、表面接触可能成分または表面局在化成分であるが、壊死かさもなければ傷害された腫瘍細胞もしくは血管内皮細胞から放出された成分（細胞質ゾル腫瘍細胞抗原および／または核腫瘍細胞抗原を含む）はまた、標的化され得る。
【０１０２】
抗体標的化剤および非抗体標的化剤の両方が用いられ得、これには以下が挙げられる：ＶＥＧＦおよびＦＧＦのような増殖因子；腫瘍血管系に特異的に結合するトリペプチドＲ−Ｇ−Ｄを含有するペプチド；ならびにアネキシンおよび関連するリガンドのような他の標的化成分。
【０１０３】
抗腫瘍細胞イムノトキシンまたはコアグリガンドは、Ｂ３（ＡＴＣＣ  ＨＢ  １０５７３）、２６０Ｆ９（ＡＴＣＣ  ＨＢ  ８４８８）、Ｄ６１２（ＡＴＣＣ
ＨＢ  ９７９６）およびＫＳ１／４からなる群により例証される抗体を含み得る。このＫＳ１／４抗体は、ベクターｐＧＫＣ２３１０（ＮＲＲＬ  Ｂ−１８３５６）またはベクターｐＧ２Ａ５２（ＮＲＲＬ  Ｂ−１８３５７）を含む細胞から得られる。
【０１０４】
抗腫瘍支質イムノトキシンまたはコアグリガンドは、フィブリン、ＲＩＢＳまたはＬＩＢＳへの結合により例証されるように、一般に結合組織成分、基底膜成分、または活性化血小板成分に結合する抗体を含む。
【０１０５】
抗腫瘍血管系のイムノトキシンまたはコアグリガンドは、血管新生された腫瘍の血液輸送血管（好ましくは腫瘍内血管）の表面発現成分、表面接触可能成分、または表面局在化成分に結合するリガンド、抗体またはそれらのフラグメントを含み得る。このような抗体は、血管新生された腫瘍の腫瘍内血管の表面発現成分に結合する抗体を含む。これには、以下が挙げられる：アミノリン脂質自体、および腫瘍内血管系細胞表面レセプター（例えば、エンドグリン（ＴＥＣ−４抗体およびＴＥＣ−１１抗体））、ＴＧＦβレセプター、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＳＭＡ、ＶＥＧＦ／ＶＰＦレセプター、ＦＧＦレセプター、ＴＩＥ、αvβ3インテグリン、プレイオトロピン、エンドシアリンならびにＭＨＣクラスＩＩタンパク質。この抗体はまた、腫瘍内血管のサイトカイン誘導性成分または凝固剤誘導性成分に結合し得る。
【０１０６】
他の抗腫瘍血管系イムノトキシンまたはコアグリガンドは、腫瘍内血管系細胞表面レセプターに結合するリガンドまたは増殖因子に結合する、抗体またはそれらのフラグメントを含み得る。このような抗体は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ（ＧＶ３９およびＧＶ９７抗体）、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＩＥに結合するリガンド、腫瘍関連フィブロネクチンアイソフォーム、散乱因子／肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板因子４（ＰＦ４）、ＰＤＧＦおよびＴＩＭＰと結合する抗体を含む。この抗体またはそれらのフラグメントはまた、リガンド：レセプター複合体または増殖因子：レセプター複合体に結合し得るが、リガンドもしくは増殖因子またはレセプターがリガンド：レセプター複合体または増殖因子：レセプター複合体でない場合、リガンドもしくは増殖因子またはレセプターには結合し得ない。
【０１０７】
抗腫瘍細胞、抗腫瘍支質または抗腫瘍脈管抗体治療剤構築物は、植物由来毒素、真菌由来毒素、または細菌由来毒素（イムノトキシン）のような細胞障害性薬剤を含み得る。リシンＡ鎖および脱グリコシル化リシンＡ鎖が、しばしば好ましい。そしてゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）およびアンギオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）がまた意図される。抗腫瘍細胞、抗腫瘍支質または抗腫瘍脈管抗体治療剤構築物は、凝固因子またはコアグリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）に結合する第二の抗体結合領域を含み得る。組織因子または組織因子誘導体（例えば、短縮された組織因子）との作動可能な結合が、しばしば好ましい。
【０１０８】
本発明は、なおさらに、本発明の方法と組み合わせた使用のための一連の新規な治療キット、医薬および／またはカクテル（混合液）を提供する。このキット、医薬および／またはカクテルは、一般的に組み合わせの有効量の抗癌剤および抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント（アミノリン脂質、好ましくはホスファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミンに結合する）を含む。
【０１０９】
本発明のキットの主な目的が併用療法である場合、このキットは、それにもかかわらずさらに画像化の成分、一般的に診断的有効量の検出可能に標識されたアミノリン脂質結合構築物（例えば、標識した抗アミノリン脂質抗体）またはそれらの抗原結合フラグメントを含み得る。
【０１１０】
このキットおよび医薬は、好ましくは適切な容器手段において、生物学的に有効量の少なくとも第一の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント（アミノリン脂質、好ましくはホスファチジルセリンまたはホスファチジルエタノールアミンに結合する）を、生物学的に有効な量の少なくとも第１の抗癌剤と組み合わせて、含む。このキットおよび医薬の成分は、単一の容器もしくは容器手段に含まれ得るか、また別個の容器または容器手段に含まれ得る。このカクテルは、一般に併用使用のために事前に混合される。
【０１１１】
上記のように、抗アミノリン脂質抗体の全体の範囲が、抗ＰＳ抗体、抗ＰＥ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびモノクローナル抗体、あるいはそれらのフラグメントと組み合わせて、キット、医薬および／またはカクテルに使用され得ることが好ましい。この抗ガン剤はまた、化学療法剤、放射線治療剤、抗脈管形成剤、アポトーシス性剤、イムノトキシンおよびコアグリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）を含む上記のものである。静脈投与のために処方された剤が、しばしば好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１２】
（例示的実施態様の記載）
（Ａ．ＶＣＡＭ−１コアグリガンドを用いる腫瘍破壊）
固形腫瘍および癌腫は、人類における全ての癌の９０％以上の割合を占める。モノクローナル抗体およびイムノトキシンの使用はリンパ腫および白血病の治療において検討されてきた（Ｖｉｔｅｔｔａら、１９９１）が、これらの薬剤は、癌腫および他の固形腫瘍に対する臨床試験では、期待に反して効果がなかった（ＡｂｒａｍおよびＯｌｄｈａｍ、１９８５）。抗体を基礎とする処置が効果が不十分であることの主な理由は、高分子が容易に固形腫瘍に輸送されないことである。腫瘍塊内に一旦はいっても、これらの分子は、腫瘍細胞間の固い結合、線維性支質、間質の圧勾配、および結合部位障壁の存在に起因して均一に分布され得ない（Ｄｖｏｒａｋら、１９９１）。
【０１１３】
固形腫瘍を処置するための新しい戦略の開発において、腫瘍細胞よりもむしろ腫瘍の血管の処置に関する方法が明白な利点を提供する。腫瘍血管の効果的な破壊またはブロックは、腫瘍を通じる血流を停止させ、そして腫瘍細胞死の殺到を生じる。抗体―トキシンおよび抗体−凝集素構築物は、すでに用いられ、特異的な標的化および腫瘍血管の破壊に大きく影響し、腫瘍壊死を生じる（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９２；ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ、１９９３；ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９６／０１６５３；Ｈｕａｎｇら、１９９７；それぞれ、本明細書において参考として援用される）。
【０１１４】
腫瘍血管標的化細胞障害性薬剤は、以下の特許および特許出願に記載される：米国特許番号５，８５５，８６６号；同第５，７７６，４２７号；同第５，８６３，５３８号；および５，６６０，８２７号；ならびに米国特許出願番号０７／８４６，３４９号；０８／２９５，８６８号（特許番号５， ， ；発行料金支払い済み）；０８／３５０，２１２（特許番号５， ， ；発行料金支払い済み）；および０８／４５７，８６９号（特許査定受領）；それぞれ本明細書において参考として援用されている。腫瘍標的化凝固薬は、以下の特許および出願に記載される：米国特許番号５，８５５，８６６号；同第５，８７７，２８９号；米国出願番号０７／８４６，３４９号；同第０８／３５０，２１２号（特許番号５， ， ；発行料金支払い済み）；０８／４８２，３６９（米国特許番号５， ， ；発行料金支払い済み）；０８／４８７，４２７（米国特許番号５， ， ；発行料金支払い済み）；および０８／４７９，７２７号（米国特許番号５， ， ；発行料金支払い済み）；それぞれ本明細書において参考として援用されている。
【０１１５】
抗体、増殖因子または他の結合リガンドが腫瘍血管へ凝固剤を特異的に送達するために用いられる場合、このような薬剤は、「コアグリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄｓ）」と名付けられる。現在、コアグリガンドに用いるのに好ましい凝固剤は、短縮化組織因子（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ（ｔＴＦ）である（Ｈｕａｎｇら、１９９７；ＷＯ  ９６／０１６５３；米国特許５，８７７，２８９号）。ＴＦは、血液凝固の主要な開始因子（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ：イニシエーター）である（Ｒｕｆら、１９９１）。損傷の部位では、血液中の第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子は、脈管周囲組織における細胞の上のＴＦに接触し、そして結合する。ＴＦ：ＶＩＩａ複合体は、リン脂質表面の存在下において、第ＩＸ因子および第Ｘ因子を活性化する。次に、これは、トロンビンおよびフィブリンの形成、そして最終的に血餅の形成を導く（ＲｕｆおよびＥｄｇｉｎｇｔｏｎ、１９９４）。
【０１１６】
組換えの、短縮形態の組織因子（ｔＴＦ）（これは、サイトゾルドメインおよび膜貫通ドメインを欠失する）は、ネイティブなＴＦよりも約５倍低い凝固誘導能力を有する可溶性タンパク質である（Ｓｔｏｎｅら、１９９５：Ｈｕａｎｇら、１９９７）。これは、ＴＦは、ＩＸａまたはＸａを効果的に活性化するために、ＶＩＩａとの複合体についてリン脂質と会合することが必要であるためである。しかし、ｔＴＦが標的化抗体または薬剤の手段により、腫瘍血管内皮に送達される場合、それは脂質表面の近接部位に戻され、そして血液凝固活性を再獲得する（Ｈｕａｎｇら、１９９７；米国特許５，８７７，２８９号、同第５， ， および同第５， ， （米国出願番号０８／４８７，４２７号および同第０８／４８２，３６９号；発行料金支払済み））。選択的に腫瘍血管を血栓形成させるコアグリガンドは、このように作製される。
【０１１７】
短縮ＴＦは、血管標的化コアグリガンドにおけるその使用を推奨するいくつかの利点を有する：ヒトｔＴＦは、容易に利用可能であり、そしてヒトタンパク質は、ヒトにおいてわずかであるかまたは低い免疫原性しか有さない；ヒトｔＴＦは、実験動物（マウスを含む）において完全に機能的であり；そして標的されたｔＴＦは、非常に強力である。なぜなら、それは、大きく増幅された効果をもたらす凝固タンパク質のカスケードの活性化を誘発するからである（米国特許５，８７７，２８９号、同第５， ， および同第５， ， （米国出願番号０８／４８７，４２７号および同第０８／４８２，３６９号；発行料金支払済み））。
【０１１８】
腫瘍内皮で利用可能である（しかし、正常な内皮には大きく欠乏している）適切な標的分子の範囲は、記載されている。例えば、以下のような、発現された標的が、利用され得る：エンドグリン、Ｅセレクチン、Ｐセレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＳＭＡ、ＴＩＥ、ＬＡＭ−１と反応性のリガンド、ＶＥＧＦ／ＶＰＦレセプター、ＦＧＦレセプター、αVβ3インテグリン、プレイトロピンまたはエンドシアリン（米国特許５，８５５，８６６号、同第５，８７７，２８９号；Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９２；ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ，１９９３；Ｈｕａｎｇら，１９９７；Ｌｉｕら，１９９７；Ｏｈｉｚｕｍｉら，１９９７；それぞれは、本明細書において参考として援用される）。
【０１１９】
吸着された標的は、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＨＧＦ、ＰＦ４、ＰＤＧＦ、ＴＩＭＰ、ＴＩＥに結合するリガンド、または腫瘍関連フィブロネクチンアイソフォームのような別の適切なグループである（米国特許５，８７７，２８９、同第５， ， および同第５， ， ；米国出願番号０８／３５０，２１２号および同第０８／４８２，４２７号に対応する；発行料金支払済み；それぞれは、本明細書において参考として援用される）。フィブロネクチンのアイソフォームは、レセプターのインテグリンファミリーに結合するリガンドである。腫瘍関連フィブロネクチンアイソフォームは、腫瘍血管および腫瘍支質の両方の標的化可能な成分である。モノクローナル抗体ＢＣ−１（Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａら、１９８９）は、腫瘍関連フィブロネクチンアイソフォームに特異的に結合する。
【０１２０】
天然の腫瘍環境またはヒトによる以下の介入により誘導可能な他の標的はまた、標的可能な存在である。これは米国特許番号５，７７６，４２７、同第５，８６３，５３８号、および同第５， ， （米国出願番号０８／４７９，７２７、発行料金支払済み；それぞれは本明細書に参考として援用されている）に記載されている。正常組織における事前の抑制および腫瘍血管誘導と組み合わせて用いた場合、ＭＨＣクラスＩＩ抗原はまた、標的として使用され得る（米国特許番号５，７７６，４２７；同第５，８６３，５３８号；同第５， ， 
および同第５， ，      （米国出願番号０８／２９５，８６８号および同第０８／４７９，７２７号；発行料金支払済み）；それぞれは、本明細書において参考として援用される）。
【０１２１】
現在、臨床適用に好ましい標的の１つは、血管内皮接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）（米国特許５，８５５，８６６号、同第５，８７７，２８９号、同第５， 
， および同第５， ， （これは米国出願番号０８／４８２，３６９号および同第０８／４８７，４２７号（発行料金支払済み）に対応する；それぞれは、本明細書において参考として援用される）。ＶＣＡＭ−１は、炎症性サイトカインＩＬ−１α、ＩＬ−４（Ｔｈｏｒｎｈｉｌｌら、１９９０）およびＴＮＦα（Ｍｕｎｒｏ，１９９３）により誘導される細胞接着分子であり、そしてインビボにおけるその役割は、急性の炎症の部位に対して白血球を補充することである（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ、１９９３）。
【０１２２】
ＶＣＡＭ−１は、神経細胞芽腫（Ｐａｔｅｙら、１９９６）、腎癌腫（Ｄｒｏｚら、１９９４）、非小肺癌腫（Ｓｔａａｌ−ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｅｋｅｌら、１９９６）、ホジキン病（Ｐａｔｅｙら、１９９６）、および血管肉腫（Ｋｕｚｕら、１９９３）を含む多数のヒト悪性腫瘍において、ならびに血管腫（ａｎｇｉｏｍａ）（Ｐａｔｅｙら、１９９６）および血管腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｍａ）（Ｋｕｚｕら、１９９３）のような良性腫瘍において血管内皮細胞に存在する。ヒトにおけるＶＣＡＭ−１の構成的発現は、甲状腺、胸腺および腎臓におけるわずかな血管に（Ｋｕｚｕら、１９９３；ＢｒｕｉｊｎおよびＤｉｎｋｌｏ、１９９３）、ならびにマウスにおける心臓および肺の血管（Ｆｒｉｅｓら、１９９３）に限定されている。
【０１２３】
本明細書において提示される特定のデータは、なおさらに以下に提供されるデータを補足する：米国特許５，８５５，８５５号、および同第５，８７７，２８９号、ならびに同第５， ， （これは米国出願番号０８／４８７，４２７号（発行料金支払済み）に対応する；それぞれは、本明細書において参考として援用される）。そして抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンドの投与から生じる血栓および腫瘍梗塞の選択的誘導を示す。提示される結果は、Ｌ５４０ヒトホジキンリンパ腫を保有するマウスを用いて生成された。ＳＣＩＤマウスにおいて異種移植片として増殖した場合、この腫瘍は、炎症性サイトカインの発現（Ｄｉｅｈｌら、１９８５）ならびにその血管上のＶＣＡＭ−１および他の内皮細胞活性化分子の存在に関して、ヒト疾患と非常に類似性を示す。
【０１２４】
共有結合した抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンド（ここでｔＴＦは抗ＶＣＡＭ−１抗体に直接的に結合された）を用いて、コアグリガンドが、固体Ｌ５４０ホジキン腫瘍を保有するマウスにおいて、選択的に腫瘍血管に局在化し、それらの血管の血栓を誘導し、壊死を腫瘍全体に進行させ、そして腫瘍の増殖を遅延することが本明細書において示される。腫瘍は、一般的に、コアグリガンドに応答するには少なくとも約０．３ｃｍの直径であることが必要であった。なぜなら、ＶＣＡＭ−１は、より小さい腫瘍には存在しないからである。おそらく、小さい腫瘍においては、腫瘍に浸潤する腫瘍細胞または宿主細胞により分泌されたサイトカインのレベルは、ＶＣＡＭ−１を誘導するには低すぎる。これは、米国特許５，８５５，８６６号、同第５，８７７，２８９号、同第５，７７６，４２７号、同第５， ， および同第５， ， 号（出願番号０８／４８７，４２７号および同第０８／４７９，７２７号、発行料金支払済み）（ここで本発明は、より大きい固形腫瘍において最も有用であることが見出された）の研究に一致する。
【０１２５】
ＶＣＡＭ−１染色は、最初に腫瘍の末梢において、より多く観察されたが、コアグリガンドは、明らかに血液輸送血管に結合し、そして閉塞させた（そこで、それは、すべての腫瘍領域において、血流を減少し得た）。さらに、本発明者らの１人は、コアグリガンドの最初の投与により生じたトロンビン生成がおそらく、中枢血管にさらなるＶＣＡＭ−１導入を導き、これが、腫瘍内領域の増幅されたシグナルおよび明白な破壊を生じることを予期する（Ｓｌｕｉｔｅｒら、１９９３）。さらなる標的可能マーカーのこの型の凝集素誘導発現、およびこれによるシグナル増幅は、また、米国出願番号０８／４７９，７２７号および同第０８／４８１，９０４号（米国特許５， ， ；発行料金支払済み）に開示される。
【０１２６】
（Ｂ．ＶＣＡＭ−１−標的化腫瘍破壊の機構）
本明細書において示されるように、マウスの心臓および肺におけるＶＣＡＭ−１発現血管への局在化は、抗ＶＣＡＭ−１コアグリガンドの投与の際に観察されたが、この構築物は、このような非腫瘍部位において、血栓を誘導しなかった。さらに、抗ＶＣＡＭ−１コアグリガンドは、無関係の特異性のコントロールのコアグリガンドが毒性であるよりもマウスに対して毒性ではない。再び、このことは、心臓および肺の血管上のＶＣＡＭ−１の構成的発現は、毒性を導かなかったことを示す。ＶＣＡＭ−１がヒトにおける腫瘍血管内皮の天然に存在するマーカーである場合、このデータは、コアグリガンド治療の直後の臨床的進行に重要である。しかし、この現象はまた、発明者らに、特有の見解を提供し、これは腫瘍血管の破壊に対して完全に異なるアプローチを導く。
【０１２７】
本発明者らは、抗ＶＣＡＭ−１コアグリガンドが、心臓および肺における血管上に構成的に発現したＶＣＡＭ−１に対する結合能力、ならびになおこれらの血管において血栓を生じない能力の背後の機構を理解ことを追究した。この経験的な観察についての多数の科学的可能性（一般に腫瘍環境のプロトロンビン的性質と心臓および肺における任意のフィブリン溶解性の素因に関係する）が存在する。
【０１２８】
一般に、凝固系（フィブリン沈着）とフィブリン溶解性系（酵素によるフィブリンの分解）との間に生物学的平衡が存在する。しかし、悪性の疾患、特に癌腫においては、この平衡は崩壊され、これは凝固の異常な活性化（過剰凝固能または「プロトロンビン状態」）を生じる。証拠はまた、これらの経路の種々の成分が悪性の障害的特徴（例えば、増殖、侵入および転移）に寄与し得ることを示す（Ｚａｃｈａｒｓｋｉら、１９９３）。
【０１２９】
Ｄｏｎａｔｉ（１９９５）は、悪性疾患の血栓性の合併症のもともとの臨床的観察と腫瘍細胞活性の細胞生物学および生化学における引き続く進行との間の複雑な相互関係を概説した。しかし、広範な研究にもかかわらず、腫瘍環境のプロトロンビン的性質についての明白な分子的説明は、提供され得なかった（Ｄｏｎａｔｉ、１９９５）。しかし、Ｄｏｎａｔｉは、このプロセスにおける腫瘍細胞の役割を強調している。これにより、腫瘍細胞が凝血促進（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）活性（例えば、組織トロンボプラスチンおよび癌凝血促進（ＣＰ））を発現することが説明された（Ｄｏｎａｔｉ、１９９５）。ＷＯ  ９１／０７１８７はまた、腫瘍細胞の凝固促進活性を報告した。
【０１３０】
多数の他の研究はまた、腫瘍細胞自体が、腫瘍内のプロトロンビン状態の原因であることを確認している。例えば、Ｎａｗｒｏｔｈら（１９８８）は、肉腫細胞により合成された因子が、ＴＮＦの近位の内皮の凝固促進反応を増強することを報告した。これらの著者は、フィブリン形成がＴＮＦ注入３０分後、腫瘍血管ベッド全体に生じたが、フィブリンの沈着および血小板の凝固は正常な血管では観察されなかったことを報告した（Ｎａｗｒｏｔｈら、１９８８）。ＴＮＦは、後に、内皮細胞の表面上で組織因子の発現を増強することが示された（Ｍｕｒｒａｙら、１９９１）。これにより、組換えＴＮＦとインキュベートされた培養内皮細胞が、凝血促進活性、組織因子およびプロテインＣ経路の同時抑制（静止期の内皮細胞の表面で機能する抗トロンビン性機構）を増強したことを示す初期の研究を説明することが提唱される（Ｎａｗｏｒｔｈら、１９８５；ＮａｗｏｒｔｈおよびＳｔｅｍ、１９８６）。
【０１３１】
Ｓｕｇｉｍｕｒａら（１９９４）のデータはまた、腫瘍の凝血促進活性の重要な成分として腫瘍細胞を関連付ける。４つの腫瘍細胞株が凝固の外因性の経路の異なる段階を支持し得ることが報告された（Ｓｕｇｉｍｕｒａら、１９９４）。別の研究は、ヒト卵巣癌腫細胞株であるＯＣ−２００８が構成的に、膜表面組織因子活性を発現し、そして細胞表面依存性プロトロンビナーゼ複合体活性を示したことを報告した（Ｒａｏら、１９９２）。Ｃｏｎｎｏｒら（１９８９）は、さらにそれが凝固を制御する病的細胞であることを示唆した。それらの結果は、腫瘍原性の未分化のマウス赤白血病細胞が、凝血促進活性において力価の７〜８倍の増加を示すことを示した（Ｃｏｎｎｏｒら、１９８９）。
【０１３２】
Ｚａｃｈａｒｓｋｉら（１９９３）はまた、腫瘍細胞に注目し、そして凝固経路（凝固促進因子により開始される）およびフィブリン溶解経路（ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターによって開始される、ｕ−ＰＡ）との卵巣癌腫細胞の相互作用の様態を規定することを探求した。彼らは、腫瘍細胞が組織因子および凝固経路中間物（局所トロンビン生成を生じる）を発現することを報告した（腫瘍結合組織に存在するフィブリノーゲンの、腫瘍小節および個々の腫瘍細胞の表面に沿うことが見出されているフィブリンへの変換により証明されるように）。検出されたフィブリンは、壊死または局所の炎症性細胞浸潤に基いては説明され得なかった（Ｚａｃｈａｒｓｋｉら、１９９３）。これらの著者は、トロンビン生成および過剰凝固能を導く、優勢な腫瘍細胞に関連する凝血促進経路が存在することを結論付けた。
【０１３３】
腫瘍血管がトロンビンの形成をより良好に支持し得、そして／またはフィブリンの溶解をより少なくし得るようにするのは、腫瘍血管における変化であるという他の仮説が提唱されている。例えば、腫瘍血管は、組織因子の上方制御、プラスミノーゲンアクチベーターの下方制御および／またはプラスミノーゲンアクチベーターのインヒビター（ＰＡＩ−１）の上方制御を示すことが報告されている（ＮａｗｒｏｔｈおよびＳｔｅｒｎ、１９８６；Ｎａｗｒｏｔｈら、１９８８）。このような効果は、腫瘍由来の因子（おそらくＶＥＧＦ）により増大されると考えられる（Ｍｕｒｒａｙら、１９９１；Ｏｇａｗａら、１９９０）。
【０１３４】
例えば、Ｏｇａｗａら（１９９０）は、低酸素症が、内皮細胞表面凝固特性を凝固の活性を促進するようにシフトされるようにしたことを報告した。これは、抗凝固補因子であるトロンボモジュリンの抑制および第Ｘ因子の活性化因子の誘導を伴い、古典的な外因性の系および内因性の系とは異なる（Ｏｇａｗａら、１９９０）。また、腫瘍血管内のＴＦと相互作用する第ＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子、Ｘａ因子または他の分子の局所濃度において増加が存在し得、これにより血栓症を促進する。
【０１３５】
さらに、血小板は任意の凝固促進状態の主要な成分である。近年、血小板の凝固促進能力は、原形質膜から凝血促進微粒子を剥離する能力に関連している（Ｚｗａａｌら、１９８９；１９９２；Ｄａｃｈａｒｙ−Ｐｒｉｇｅｎｔら、１９９６）。血小板由来の循環する微粒子、小胞、または膜のフラグメントの割合の増加は、種々の病理学的状態において「プレトロンビン性」（プロトロンビン性）の状態に寄与することが提唱されている（Ｚｗａａｌら、１９８９；１９９２；Ｄａｃｈａｒｙ−Ｐｒｉｇｅｎｔら、１９９６、第１５９頁および本明細書に引用される参考文献）。ＭｃＮｅｉｌら（１９９０）はまた、β2−ＧＰＩが凝固および血小板凝集に対して複数の阻害効果を発揮することを報告した。したがって、腫瘍血小板の生物学は、抗ＶＣＡＭ−１コアグリガンドの有効性を説明する。
【０１３６】
さらなる支持可能な説明は、ＶＣＡＭ−１が、おそらく腫瘍由来サイトカインによる誘導に起因して、心臓および肺における血管よりも、腫瘍血管で高レベルに発現され、そして健常な血管への結合が、持続する血栓症へとバランスを傾け得ないという単純な可能性を含んでいた。また、フィブリン溶解性機構は、増加した組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）、増加したプラスミノーゲンアクチベーター、および／または低下したプラスミノーゲンアクチベーターインヒビターにより例証されるように、心臓において上方制御され得る。心臓および肺の血管のフィブリン溶解性生理学能が、抗ＶＣＡＭ−１コアグリガンドの腫瘍特異的効果の基礎にある主な理由であることが証明されれば、これは一般に腫瘍の生物学の特有の局面を標的とするさらなる抗腫瘍治療の発展を防止する。
【０１３７】
全ての可能性のある選択肢にかかわらず、本発明者らは、正常な組織の血管において血栓症を起こす抗ＶＣＡＭ−１コアグリガンドの失敗は、このような血管の内腔表面に、アミノリン脂質、ホスファチジルセリン（ＰＳ）が存在しないことに起因したと考えた。したがってこの理論を完全にするために、ホスファチジルセリンが、その正常な血管に存在しないことが示されなければならないだけでなく、それが腫瘍関連血管の内腔側に存在することが結論としては実証されなければならない。
【０１３８】
従って、本発明者らは、腫瘍保有マウスに静脈注射されたモノクローナル抗ホスファチジルセリン（抗ＰＳ）抗体の分布を評価するため免疫組織化学染色を用いた。これらの研究は、心臓および肺におけるＶＣＡＭ−１発現血管がＰＳを欠き、一方、腫瘍におけるＶＣＡＭ−１発現血管がＰＳを発現したことを明らかにした。コアグリガンド作用における表面ＰＳ発現の必要性は、ＰＳに結合するアネキシンＶがインビトロおよびインビボの両方において、抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンド作用をブロックするという本発明者らの知見により、さらに示される。
【０１３９】
従って、正常な心臓および肺の血管における抗ＶＣＡＭ−１コアグリガンドの血栓性効果の欠失は、少なくとも部分的には説明され得る：アミノリン脂質、ホスファチジルセリンの非存在は、正常血管が、凝固複合体がアセンブルされ得る凝固促進表面を欠失することを意味する。表面ＰＳの非存在下において、抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦは、ＶＣＡＭ−１を発現する心臓および肺の血管に結合するが、血栓は誘導し得ない。対照的に、腫瘍中のＶＣＡＭ−１発現血管は、表面ＰＳの同時発現を示す。従って、コアグリガンドは、腫瘍血管に結合し、そして凝固因子を局所的に活性化して、閉塞性血栓症を形成する。
【０１４０】
抗ＶＣＡＭ−１コアグリガンドの腫瘍特異的血栓性効果を描写することに加えて、腫瘍血管の内腔表面上でのアミノリン脂質、ホスファチジルセリンの特異的発現により、本発明者らはまた、初期の研究において、観察されたが理解されなかったプロトロンビンの表現型を説明することが可能になった（Ｚａｃｈａｒｓｋｉら、１９９３；Ｄｏｎａｔｉ、１９９５）。本発明者らの研究は、腫瘍血管のプロトロンビン性状態において重大な役割を果たすのは、腫瘍細胞または合成された因子；血小板、凝血促進微粒子または膜フラグメントに主に起因するよりも；またはトロンボプラスチン、トロンボモジュリン、癌凝固促進因子、組織因子、プロテインＣ経路、プラスミノーゲンアクチベーターもしくはプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（例えば、ＰＡＩ−１）の不均衡に起因するよりも、むしろ、ＰＳ発現であることを示す。
【０１４１】
（Ｃ．腫瘍脈管構造のマーカーとしてのアミノリン脂質）
代表的なアミノリン脂質であるホスファチジルセリンが、腫瘍血管の管腔表面で特異的に発現されるが正常血管では発現されないという発見に従って、本発明者らは、アミノリン脂質が、治療的介入のための標的としての可能性を有すると推論した。従って、本発明は、腫瘍の処置における、アミノリン脂質成分、特に、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の標的化を包含する。アミノリン脂質の標的化からの抗腫瘍効果が、当該分野で認められた動物モデルを使用して本明細書中に実証されるが、腫瘍脈管構造の安全でかつ有効な標的化可能マーカーとして作用するアミノリン脂質の能力は、先行研究から予測し得なかった。
【０１４２】
例えば、腫瘍血管は、他の血管とは対照的に、一般的に、本質的に血栓促進性であるが、これは、腫瘍細胞に酸素および栄養分を送達するために、血管ネットワークを維持する腫瘍の固有の特性である。明らかに、腫瘍関連血管は、そのような凝固は必然的に腫瘍に自己破壊を引き起こすので、自発的にかつ容易に凝固を支持するように、血栓症に患いやすくし得ない。従って、標的化による有効な治療的介入を可能にするに十分な量で発現され、そしてそれにもかかわらず腫瘍を介する血流を普通に維持するに十分に低レベルで発現される、任意の血栓症関連腫瘍血管マーカー（例えば、現在同定されているホスファチジルセリン）を発見し得ることは予期されない。
【０１４３】
安全でかつ有効な腫瘍脈管構造標的としてのアミノリン脂質の本発明の同定は、以下を考慮するとなおさらに驚くべきことである：（１）複雑な腫瘍の血栓促進状態（上記で考察されたような）の根底をなす、他の細胞型および／または種々の因子の役割、アクチベーターおよびインヒビターに関する以前の推測；ならびに（２）種々の細胞型における発現および機能の両方に関して、アミノリン脂質生物学に関する当該分野の混乱しかつ矛盾した状態。
【０１４４】
ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンは、通常、異なる細胞の形質膜二重層の内部表面に分離される（Ｇａｆｆｅｔら，１９９５；Ｊｕｌｉｅｎら，１９９５）。対照的に、二重膜の外側リーフレットは、ホスファチジルコリンアナログに富む（Ｚｗａａｌら，１９８９；Ｇａｆｆｅｔら，１９９５）。この脂質分離は、非対称性のトランス二重層を引き起こす。膜非対称性の存在は、特に、血小板以外の細胞において、ここしばらくの間議論されてきたが、その存在理由ならびにその生成および制御の機構は不充分に理解されている（ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ，１９９４）。
【０１４５】
これらのアミノリン脂質が果たし得る可能性のある役割に関しては言うまでもなく、異なる細胞および組織におけるＰＳおよびＰＥの存在または非存在についての実に膨大な矛盾する報告が存在する。例えば、多くのＰＳ研究が、血液凝固における重要な成分である血小板を用いて行われ（Ｄａｃｈａｒｙ−Ｐｒｉｇｅｎｔら，１９９６）、非常に様々な結果をもたらした。Ｂｅｖｅｒｓら（１９８２）は、種々のホスホリパーゼまたはタンパク質分解酵素での処置の後に、非活性化血小板の血小板プロトロンビン変換活性を測定した。彼らは、負に荷電したホスファチジルセリン、およびおそらくホスファチジルイノシトールが、非活性化血小板のプロトロンビン変換活性に関与すると結論づけた（Ｂｅｖｅｒｓら，１９８２）。
【０１４６】
Ｂｅｖｅｒｓら（１９８３）は、次いで、活性化した血小板におけるホスファチジルセリンの露出の増大およびスフィンゴミエリナーゼの露出の減少を報告した。しかし、これらの変更は、コラーゲン＋トロンビン、ジアミド、またはカルシウムイオノフォアとは対照的に、トロンビンまたはコラーゲン単独のいずれかによって活性化された血小板においてなおさら明らかではなかった（Ｂｅｖｅｒｓら，１９８３）。ジアミドに応じたＰＳの表面発現は、ジアミド刺激によるＰＳ露出を示さなかった赤血球での研究により反論された（ｄｅ  Ｊｏｎｇら，１９９７）。それらの以前の結果をおうむ返しに繰り返す一方で、Ｂｅｖｅｒｓおよび共同研究者らは、次いで、形質膜−細胞骨格相互作用における変化、特に、細胞骨格アクチン結合タンパク質の分解の増大は、血小板表面変化に重要であることを後に報告した（Ｂｅｖｅｒｓら，１９８５；３６８−３６９頁）。
【０１４７】
Ｍａｎｅｔａ−Ｐｅｙｒｅｔら（１９８９）はまた、ヒト血小板上でのＰＳの検出を報告した。これらの著者らは、血小板凝血促進表面が、負に荷電したリン脂質（例えば、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミン（一般的に、中性または双性イオン）あるいは両方）により形成され得ることに注目した。ホスファチジルセリンの凝固過程における役割は、ホスファチジルエタノールアミンの方を選んで異論を唱えられている（Ｍａｎｅｔａ−Ｐｅｙｒｅｔら，１９８９；Ｓｃｈｉｃｋら，１９７６；１９７８）。例えば、研究により、１８％のホスファチジルエタノールアミンが、ホスファチジルセリンが０％であるのと対照的に、２時間後に表面利用可能になることが報告された（Ｓｃｈｉｃｋら，１９７６）。
【０１４８】
血小板に関する進行中の研究によってまた、トロンビン処理の後に、ホスファチジルエタノールアミン露出が、ホスファチジルセリンレベルの増加を伴わないでさらに１６％増加することが報告された（Ｓｃｈｉｃｋら，１９７６）。従って、ＰＳは、血小板形質膜の機能表面の成分ではないと述べられていた（Ｓｃｈｉｃｋら，１９７６；１９７８）。それにもかかわらず、現在の証拠は、ＰＳおよびＰＥの両方が、血小板および赤血球の外膜で観察されるリン脂質非対称性に関与すること、およびＰＳが、血小板の凝血促進活性に関与することを示すと考えられる（Ｇａｆｆｅｔら，１９９５；ｄｅ  Ｊｏｎｇら，１９９７；米国特許第５，６２７，０３６号）。
【０１４９】
アミノリン脂質の異なる分布を達成しそして維持することの機能的重要性は言うまでもなく、そうするための機構は、長い間、議論の余地のある推測の対象であった。二重層を横切ったリン脂質移動の調節の総説において、ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ（１９９４）は、細胞内Ｃａ2+の上昇によって、主要なクラスのリン脂質が、二重層を横切って自由に移動することが可能となり、脂質をスクランブルしそして非対称性を消すことを示した。ｄｅ  Ｊｏｎｇら（１９９７）はまた、細胞内カルシウムの増大が、脂質二重層の迅速なスクランブルおよびＰＳの露出を導き、これは、細胞酸化により部分的に阻害され得ることを報告した。アミノリン脂質と細胞骨格タンパク質との相互作用もまた、膜リン脂質非対称性を調節するための機構として提唱された（Ｚｗａａｌら，１９８９）。
【０１５０】
Ｇａｆｆｅｔら（１９９５）は、ヒト血小板活性化の間のリン脂質の横切った再分布は、コリンヘッドリン脂質の迅速な相互の流入による相殺ではなく、アミノリン脂質の特定の方向へ向いた流出（ｖｅｃｔｏｒｉａｌ  ｏｕｔｆｌｕｘ）によって達成される（すなわち、スクランブリングではない）と述べた。彼らは、アミノリン脂質の特異的な特定の方向を向いた流出は、「逆アミノリン脂質トランスロカーゼ」活性によって触媒され得ることを示唆した（Ｇａｆｆｅｔら，１９９５）。代替の仮説は、内向きのトランスロカーゼの活性が阻害されることであった。Ｚｗａａｌら（１９８９）は、アミノリン脂質の外向きおよび内向きの両方の移動を触媒するリン脂質トランスロカーゼの関与を提唱した。
【０１５１】
ホスファチジルエタノールアミンを、脂質二重層の外側のリーフレットから内側のリーフレットへと輸送する、エネルギー依存性かつタンパク質依存性のアミノリン脂質トランスロカーゼ活性の存在が、Ｊｕｌｉｅｎら（１９９３）によって報告された。次いで、彼らは、アミノ脂質トランスロカーゼ活性がまた、ホスファチジルセリンを移動させ得ること、およびその活性は、細胞インキュベーションの条件に依存して、維持され、抑制され、そして回復され得（Ｊｕｌｉｅｎら，１９９３）、そして腫瘍プロモーターである１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）によって阻害され得る（Ｊｕｌｉｅｎら，１９９７）ことを示した。
【０１５２】
ホスファチジルセリンおよび他のリン脂質のＣａ2+依存性の二方向性移動を促進する、３５ｋＤのリン脂質スクランブラーゼ（ｓｃｒａｍｂｌａｓｅ）は、最近、ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた（Ｚｈｏｕら，１９９７）。この「ＰＬスクランブラーゼ」タンパク質は、Ｃ末端近傍に１つの膜貫通セグメントを有する、プロリンリッチのＩＩ型形質膜タンパク質である。後の研究により、このタンパク質は、上昇したサイトゾルカルシウム濃度に曝露された細胞における形質膜の内側のリーフレットから外側のリーフレットへのリン脂質の迅速な移動を担うことが確認された（Ｚｈａｏら，１９９８）。
【０１５３】
Ｊｕｌｉｅｎら（１９９３；１９９７）によって報告されたアミノリン脂質トランスロカーゼ活性（これは、ＰＳおよびＰＥを外側のリーフレットから内側のリーフレットへと輸送する）は、二方向性Ｃａ2+依存性スクランブラーゼと異なる（Ｚｈｏｕら，１９９７；Ｚｈａｏら，１９９８）。スクランブラーゼはＣａ2+によって活性化され、そして大抵、Ｃａ2+レベルの増大に応答して、ＰＳを内側のリーフレットから外側のリーフレットへと移動させるように機能する。アミノリン脂質トランスロカーゼは、正常な状態の間の膜非対称性を維持するが、Ｃａ2+流入によってスクランブラーゼが活性化され、トランスロカーゼに優先し（ｏｖｅｒ−ｒｉｄｉｎｇ）、そしてアミノリン脂質分布を無作為化すると現在一般的に考えられている。
【０１５４】
従って、ＰＳおよびＰＥの形質膜内側表面への正常な分離は、現在、一般的に受け入れられ、そして非対称性過程に関与する特定の膜成分が同定されている。しかし、アミノリン脂質を膜の外側リーフレットに再配置し得る条件、機構、および細胞型、ならびにそのような事象の生物学的意味について疑問が残っている。
【０１５５】
アミノリン脂質発現についての矛盾する報告は、血小板の研究に制限されない。ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンは、一般的に、ヒト動脈、伏在静脈および臍静脈由来の培養ヒト内皮細胞のリン脂質組成のうちの、それぞれ約７％および約１０％である（それぞれ、７．１％および１０．２％；Ｍｕｒｐｈｙら，１９９２）。しかし、文献における矛盾の重要な例は、抗ＰＳ抗体が内皮細胞に結合する能力に関する（Ｌｉｎら，１９９５）。
【０１５６】
再発性妊娠損失に存在する抗ＰＳ抗体（Ｒｏｔｅら，１９９５；Ｒｏｔｅ，１９９６；Ｖｏｇｔら，１９９６；Ｖｏｇｔら，１９９７）は、内皮細胞への結合の証拠なくして、内皮細胞機能を調節すると考えられた。この矛盾を説明する試みにおいて、Ｌｉｎら（１９９５）は、休止している内皮細胞への抗ＰＳ抗体の結合を実証すること試みたが失敗に終わった。彼らは、ＰＳ抗原決定基が、休止している内皮細胞の表面上で発現されないが、ＰＳ依存性抗原決定基は、アセトン固定した細胞の細胞骨格様成分と結合していたと結論付けた（Ｌｉｎら，１９９５）。
【０１５７】
Ｖａｎ  Ｈｅｅｒｄｅら（１９９４）は、血管内皮細胞は、インビトロで、凝血促進複合体がアセンブルし得る結合部位の発現によってトロンビンの形成を触媒し得ることを報告した。活性化された血小板を用いた他の研究（Ｂｅｖｅｒｓら，１９８２；１９８３；１９８５；Ｍａｎｅｔａ−Ｐｅｙｒｅｔら，１９８９；Ｓｃｈｉｃｋら，１９７６；１９７８）とは対照的に、刺激されたＨＵＶＥＣ内皮細胞は、休止細胞と比較した場合、ＰＳ結合部位の増大を示さなかった（Ｖａｎ  Ｈｅｅｒｄｅら，１９９４）。ホスファチジルセリンは、外因性経路ならびに内因性経路を介する第Ｘａ因子形成に必要であることが報告された（Ｖａｎ
Ｈｅｅｒｄｅら，１９９４）。それにもかかわらず、Ｂｒｉｎｋｍａｎら（１９９４）は、負に荷電したリン脂質に加えて他の膜成分も、内皮細胞媒介性の第Ｘ因子の内因性の活性化に関与することを示す、矛盾する結果を公表した。
【０１５８】
Ｒａｖａｎａｔら（１９９２）はまた、精製系において、および刺激後の培養内中の皮細胞表面で、凝血促進性反応および抗凝血性反応におけるリン脂質の触媒能力を研究した。彼らの表面上矛盾する結果により、凝血促進性組織因子活性および抗凝血性活性（トロンビン−トロンボモジュリン複合体および第Ｘａ因子によるプロテインＣの活性化）の両方におけるリン脂質依存性の機構についての役割を確認することが提唱された（Ｒａｖａｎａｔら，１９９２）。Ｒａｖａｎａｔら（１９９２）の結果はまた、Ｖａｎ  Ｈｅｅｒｄｅら（１９９４）によってもＢｒｉｎｋｍａｎら（１９９４）によっても観察されなかった、ヒト内皮細胞の活性化の間のリン脂質曝露の証拠を提供したといわれた。しかし、彼らは、陰イオンリン脂質が、細胞性の組織因子の近傍において、制限された接近性のものであることに注目しなかった。この状況は、組織因子誘導の後でさえ、その細胞下では組織因子が隔絶されたままであるので、他の事象が凝血に必要なようであるのでさらに複雑化される。
【０１５９】
Ｒａｖａｎａｔら（１９９２）は、刺激された内皮細胞上の組織因子活性およびトロンボモジュリン活性の異なる程度の阻害は、補因子環境が、これらの反対の細胞活性の最適な発現について異なることを意味するという示唆に行きついた。しかし、正確な細胞リン脂質環境を再現しようとすることの認知された困難性（Ｒａｖａｎａｔら，１９９２）は、これらのインビトロ研究からの人為的データの可能性を生じる。確かに、Ｒａｖａｎａｔら（１９９２）のデータとは関係なく、一般的に、腫瘍生物学に関する意味のある情報、および特に治療的介入は、本発明者らによって行われた研究のように、腫瘍保有動物におけるインビボ研究からのみ収集され得ることが認められている。
【０１６０】
アミノリン脂質発現に関する不一致に加えて、上記で議論されたように、種々の細胞型におけるアミノリン脂質の機能に関して矛盾する報告もまた存在する。現在、活性化された血小板上でのＰＳ発現が、凝血促進表面と関係することは、一般的に受け入れられているが、血小板および赤血球における膜リン脂質の非対称性の生理学的重要性の議論において、Ｚｗａａｌら（１９８９）は、他の重要な機能を強調した。さらに、Ｔｏｔｉら（１９９６）は、非対称性リン脂質分布の喪失の生理学的関係が、血球以外の細胞型において不充分に理解されているままであることを述べた。
【０１６１】
Ｚｗａａｌら（１９８９）は、血小板および赤血球の膜リン脂質の非対称性は、それらの細胞が種々の方法で活性化される場合、おそらくリン脂質の二重層を横切った移動（ｔｒａｎｓｂｉｌａｙｅｒ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ）の増大によって媒介されて、取り消されることを述べた。シェッド（ｓｈｅｄ）微粒子の放出と結び付いたこれらの変化は、これが局所的な血液凝固反応に役割を果たすことが説明された。類似の現象が、鎌状赤血球において生じることが記載された：可逆的に鎌状化した細胞から分裂したリン脂質小胞は、鎌状赤血球疾患の発症期における血管内凝固に寄与する（Ｚｗａａｌら，１９８９）。
【０１６２】
Ｚｗａａｌら（１９８９）ならびにＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ（１９９４）の両方は、表面リン脂質変化の生理学的重要性は、止血に制限されないことを示した。事実、血球によるＰＳの表面露出は、細網内皮系によるそれらの認識を有意に変更すると言われ、そしてこれは、循環からの血球のクリアランスの止血機構の少なくとも一部を代表するようであった（Ｚｗａａｌら，１９８９）。従って、ＰＳは、出血が停止した後の、活性化された血小板の除去のためのシグナルとして作用する。鎌状細胞上およびマラリアに感染した細胞上に露出したＰＳの食細胞およびマクロファージによる認識は、それらの対病態生理学的効果を説明する（Ｚｗａａｌら，１９８９）。さらに、ＰＳ依存性食作用は、食細胞性取り込みについてウイルス感染細胞に印を付ける（ＷＯ９７／１７０８４）。アミノリン脂質の表面発現はまた、細胞に「融合能力」を付与し得る（ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ，１９９４）。
【０１６３】
ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ（１９９４）はまた、脂質非対称性についてより一般的な存在理由が存在すると推測した。例えば、異なるヘッド基が最も注意を受けるが、脂肪酸非対称性が重要な因子であることが十分にあり得た（ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ，１９９４）。さらなる仮説は、二重層リン脂質を横切っての非対称性分布はそれ自身は全く機能を有さないが、これは、生物学的系に重要である脂質移動の動的過程であることである（ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ，１９９４）。
【０１６４】
多くのグループが、腫瘍細胞が腫瘍のプロトロンビナーゼ活性の原因であると報告している（Ｃｏｎｎｏｒら，１９８９；Ｒａｏら，１９９２；Ｚａｃｈａｒｓｋｉら，１９９３；Ｓｕｇｉｍｕｒａら，１９９４；Ｄｏｎａｔｉ，１９９５）。このことは、ＰＳに起因すると推論され得た（ＷＯ９１／０７１８７）。しかし、Ｓｕｇｉｍｕｒａら（１９９４）の結果は、これに反して論じた：彼らは、腫瘍形成性細胞、ＨｅｐＧ２およびＭＫＮ−２８のプロトロンビナーゼ活性および総凝血促進活性の両方は、コンフルエンシーの到達を経験するが、ＰＳレベルは定常のままであったことを報告した。
【０１６５】
プロトロンビナーゼ活性における腫瘍細胞ＰＳの役割を支持するよりもむしろ、Ｃｏｎｎｏｒら（１９８９）は、腫瘍形成性細胞におけるＰＳの発現の増大は、マクロファージにより認識されそして結合されるそれらの能力に関連することを示唆した。同様に、Ｕｔｓｕｇｉら（１９９１）は、ヒト腫瘍細胞の外膜におけるＰＳの存在が、単球によるそれらの認識を説明することを提唱した。
【０１６６】
Ｊａｍａｓｂｉら（１９９４）は、腫瘍形成性細胞の脂質成分についての全体的に異なる役割を示唆し、その脂質は腫瘍抗原接近性を妨げることを提唱した。従って、腫瘍細胞脂質は、腫瘍細胞表面抗原を改変するように作用し、従って、腫瘍細胞を宿主免疫破壊から保護する（Ｊａｍａｓｂｉら，１９９４）。この仮説は、内皮細胞という点で、Ｑｕら（１９９６）によって提唱されたものと類似する。これらの著者らは、Ｔ細胞は、ＰＳへの結合により、トロンビン処理したヒト臍帯内皮細胞に付着することを示した（Ｑｕら，１９９６）。
【０１６７】
従って、インビボでの内皮細胞へのＰＳ媒介性のＴ細胞付着は、免疫監視機構、およびまたアテローム性動脈硬化症の疾患過程の両方に対して重要であることが提唱されている（Ｑｕら，１９９６；Ｍｏｌｄｏｖａｎら，１９９４）。Ｂｏｍｂｅｌｉら（１９９７）およびＦｌｙｎｎら（１９９７）はまた、アテローム性動脈硬化症の斑の内部の細胞は、ＰＳを露出させることによって疾患進行に寄与し得るが、これは、もっぱらインビトロ研究に基いていたことを示唆した。Ｑｕら（１９９６）およびＭｏｌｄｏｖａｎら（１９９４）は、本発明のアプローチと反対のアプローチを暗示さえした（すなわち、ホスファチジルセリン相互作用の抗凝血アプローチとしての操作）。米国特許第５，６５８，８７７号および同第５，２９６，４６７号は、アネキシン（ａｎｎｅｘｉｎ）（または「アネキシン（ａｎｎｅｘｉｎｅ）」）を抗内毒素および抗凝血剤として使用することを提唱した。米国特許第５，６３２，９８６号（本明細書中に参考として援用される）は、血栓を溶解する成分（例えば、ウロキナーゼ）との結合体としての、ホスファチジルセリン結合リガンドであるアネキシンＶの使用を示唆する。
【０１６８】
Ｔｏｔｉら（１９９６）は、スコット症候群（遺伝性出血障害）は、推定上の外向きのホスファチジルセリントランスロカーゼ、すなわち「スクランブラーゼ」の欠失または変異を反映し得ることを示唆した。興味深い概念であるが、Ｓｔｏｕｔら（１９９７）は、後に、スコット赤血球（これは、外因性ＰＬを有する小胞内で再構成した場合、正常なＰＬスクランブラーゼ活性を示す）から膜タンパク質を単離した。スコット症候群における欠損は、Ｃａ2+と、細胞膜の面内（ｅｎｄｏｆａｃｉａｌ）表面上でのＰＬスクランブラーゼとの変化した相互作用に関連し、これは、インサイチュでのＣａ2+との相互作用を妨げる、このタンパク質に対する内因性制約、または界面活性剤によって解離される、スコット細胞の未同定のインヒビターもしくは補因子（Ｓｔｏｕｔら，１９９７）のいずれかに起因することが示唆された。
【０１６９】
より変動的な結果が、アポトーシスにおけるＰＳの可能性のある役割に関して報告されている。ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ（１９９４）は、ＰＳの主題をプログラムされた細胞死（ＰＣＤまたはアポトーシス）のマーカーとして考察した。プログラムされた細胞死は、少なくとも造血系において、膜統合性の損失、すなわち「破裂」の前に、アポトーシス細胞の食作用の隔離を必要とするということが一般に認められている。アポトーシス細胞における膜非対称性の損失、特に外部リーフレット内のＰＳの出現は、食作用マクロファージによるそれらの認識のトリガーであることが提唱された（ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ，１９９４）。
【０１７０】
Ｍａｒｔｉｎら（１９９５）はさらに、開始刺激に関係なく、種々のマウスおよびヒトの細胞型のアポトーシスの間の初期のかつ広範な事象であるＰＳ外面化を報告した。彼らはまた、アポトーシスの形態学的特徴が妨げられる条件下（高分子合成阻害、Ｂｃｌ−２またはＡｂｌの過剰発現）で、形質膜の外部リーフレット上のＰＳの出現が同様に防止されることを示した（Ｍａｒｔｉｎら，１９９５）。
【０１７１】
しかし、他の分析により、ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ（１９９４）ならびにＭａｒｔｉｎら（１９９５）の提唱に対して、いくらかの議論がなされる（Ｖｅｒｍｅｓら，１９９５）。これらの著者らは、ＰＳの外膜表面へのトランスロケーションは、アポトーシスのマーカーであることを示すが、彼らは、このことはアポトーシスに独特ではなく、細胞壊死の間にも生じると推論する。この２つの細胞死の形態の間の相違は、アポトーシスの初期段階の間、細胞膜はインタクトのままである一方で、壊死が生じるちょうどその時に、細胞膜はその統合性を失いそして漏出性となる点である。それゆえ、この推論によって、細胞表面でのＰＳ発現は、色素排除アッセイが行われて細胞膜統合性が確証されなければ、アポトーシスを示さない（Ｖｅｒｍｅｓら，１９９５）。
【０１７２】
それにもかかわらず、本発明に先立つ文献の中身は、細胞の外表面上のＰＳの出現が、アポトーシス細胞を同定し、そしてその細胞の摂食にシグナルを出すことをまさに示すようである（Ｈａｍｐｔｏｎら、１９９６：ＷＯ９５／２７９０３）。Ｈａｍｐｔｏｎら（１９９６）は、細胞内Ｃａ2+の上昇が、調査した細胞では、アポトーシスの有効な誘因ではなかったが、細胞外Ｃａ2+が、アポトーシスの間の効率的なＰＳ曝露に必要であったと結論付けた。対照的に、内側−外側ＰＳトランスロカーゼの活性化がアポトーシスの間の初期の行き渡った事象であるというＭａｒｔｉｎらの提案（１９９５）は、少なくともいくらかの細胞内Ｃａ2+を必要とするようである（Ｚｈｏｕら、１９９７；Ｚｈａｏら、１９９８）。
【０１７３】
Ｂｌａｎｋｅｎｂｅｒｇら（１９９８）は、ごく最近、ＰＳに対して高親和性を持つ内因性ヒトタンパク質であるアネキシンＶを用いてインビボのアポトーシス細胞死の部位で濃縮し得ることを報告した。放射標識アネキシンＶは、心臓同種移植片拒絶を含む３つのモデルでアポトーシスの部位に局在化した（Ｂｌａｎｋｅｎｂｅｒｇら、１９９８）。外因的に投与されたアネキシンＶに対する心臓同種移植片の染色は、単核浸潤物の周縁で筋細胞を示し、その内の小数がポジティブのアポトーシス核を示した。
【０１７４】
最後に、形質膜中のリン脂質の経二重層移動は、雄ヒツジ精子細胞中ですでに分析されており、そこでは、リン脂質の横断分離の存在が、受精プロセスに関与していた（Ｍｕｅｌｌｅｒら、１９９４）。従って、リン脂質非対称は、この現象の明瞭な理解、または健康もしくは疾患へのその関係は理解されていないけれども、増加する注目を受けている。
【０１７５】
アミノリン脂質の生物学に関する当該分野の混乱した状態にかかわらず、本発明者らは、制御されたインビボ研究で、ＰＳおよびＰＥのようなアミノリン脂質が、腫瘍血管の特異的マーカーであったことを発見した。このことは、アミノリン脂質機能の初期の研究、特に、ＰＳの細胞表面発現は、Ｔ細胞（Ｑｕら、１９９６）、マクロファージ（Ｃｏｎｎｏｒら、１９８９）、単球（Ｕｔｓｕｇｉら、１９９１）または貧食細胞（Ｚｗａａｌら、１９８９；ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ、１９９４）のような循環性細胞の結合をともない、そしてアポトーシス細胞のマーカーであることを示す研究（Ｈａｍｐｔｏｎら、１９９６；Ｍａｒｔｉｎら、１９９５；Ｚｈｏｕら、１９９７；Ｚｈａｏら、１９９８）を考慮すれば驚きである。
【０１７６】
従って、本発明の前には、アミノリン脂質類を、任意の疾患の標的化可能なマーカーとして用いる可能性は、腫瘍血管はもちろんのこと、１つ以上の細胞型の結合によるこれら分子の認知されたマスキング、またはアポトーシス死前のそれらの一過性発現に起因して意図されることはなかったであろう。事実、推測の示唆は、アテローム性動脈硬化症における初期事象である、白血球結合を妨げることにおけるような、ＰＳ−細胞相互作用の破壊に関する（Ｑｕら、１９９６）。
【０１７７】
この発見のその他の驚くべき局面は、形質膜からの凝固促進微粒子の脱粒および貧食作用に対する細胞の分界（ＷＯ９７／１７０８４）に関する先の研究に対する比較において明確である。Ｚｗａａｌら（１９８９；１９９２）およびＤａｃｈａｒｙ−Ｐｒｉｇｅｎｔら（１９９６）は、形質膜へのＰＳ転移は、細胞からの微粒子、マイクロベシクルまたはマイクロスフェアの放出が続くことを説明した。Ｚｗａａｌら（１９８９）、ならびにＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ（１９９４）は、ＰＳ表面発現が、細網内皮系によるクリアランスを促進することを示した。ＰＳ発現細胞のこれらの運命、および種々の記載された二重層トランスロカーゼ活性（Ｊｕｌｉｅｎら、１９９５；Ｚｈｏｕら、１９９７；Ｚｈａｏら、１９９８）を考慮すれば、ＰＳおよびＰＥのような細胞表面アミノリン脂質類が、抗体局在化および結合を可能にするために十分に静的かつ安定なマーカーを形成し得ることは驚きである。
【０１７８】
本発明の前に、表面ＰＳが、アポトーシスプロセスの一部分として出現し、細胞を急速な破壊のために印を付けるという増大する証拠があった（Ｈａｍｐｔｏｎら、１９９６；Ｍａｒｔｉｎら、１９９５）。従って、移植片拒絶のような特定の疾患状態の診断マーカーとしての使用に合理的ではあるが（Ｂｌａｎｋｅｎｂｅｒｇら、１９８８）、表面ＰＳの見かけ上の限られた寿命はまた、治療的介入における標的化のための実行可能なマーカーとしてのその使用に反対する忠告であり得る。
【０１７９】
それにもかかわらず、本研究は、アミノリン脂質類が、標的化に適切な腫瘍血管内皮細胞のマーカーであることをまさに実際発見した。ＰＳ発現が、ＶＣＡＭコアグリガンド作用に必要であったと仮定した後、正常血管ではなく、腫瘍血管上のＰＳの存在が、インビボで証明された。このインビボの観察は、本発明者らに、抗ＶＣＡＭコアグリガンドの安全性および有効性を説明することを可能にした。これは、腫瘍内皮上の標的化マーカー（例えばＶＣＡＭ）およびＰＳの同時発現の要求に起因する。標的分子が、たとえ、正常状態または病的状態にある内皮上に存在しても、表面ＰＳ発現が欠如している場合、血栓症は生じない。
【０１８０】
本発明の価値は、コアグリガンド作用を説明することに限られず、裸の抗体治療の驚くべき開発にも限られない。これらの発見は、本発明者らが、内皮細胞中のＰＳトランスロケーションが有意な細胞損傷または細胞死なくして生じ得ること最初に示すこと（実施例ＸＩＶ）を可能にした。本発明者らのモデルでは、腫瘍血管内皮細胞の表面へのＰＳトランスロケーションが、アポトーシスまたはその他の細胞死機構とは独立に、少なくとも有意な一部分において生じる。従って、腫瘍環境におけるＰＳ表面発現は、細胞死の結果ではないし、即座の細胞破壊のきっかけとなるものでもない。これは、基本的に重要であり、そしてＰＳ生物学、膜トランスロケーション、細胞のシグナル伝達およびアポトーシス経路の科学的理解における大きな進歩を表す。
【０１８１】
アポトーシスからの内皮細胞ＰＳトランスロケーションの分離（実施例ＸＩＶ）はまた、ＰＳ表面発現に基づく治療的介入の方法に欠くことができない。腫瘍血管内皮細胞中の外膜へのＰＳトランスロケーションが、瀕死の細胞でのみ生じるか、またはそれが細胞死の回避不能なきっかけとなる場合、そのときは、ＰＳマーカーは、（裸の抗体または治療的結合体のいずれかを使用する）首尾の良い治療のための標的可能な実体として役立つに十分利用可能でありそうにない。すなわち、特定の腫瘍血管内皮細胞上のＰＳ発現が一過性ではなく、しかも代謝回転および細胞死がこの内皮細胞集団で生じないということではなく、この知見は、有意に安定なＰＳ発現が細胞死なくして達成され得るという、以下に記載の、種々の分野の生物学および新たな治療にとって重要な、画期的な発見である。
【０１８２】
（Ｄ．腫瘍処置のためのアミノリン脂質に対する裸の抗体）
本発明のアミノリン脂質腫瘍脈管構造発現研究は、さらに、固形腫瘍の処置のための選択的な血栓薬剤としての、公知の腫瘍脈管構造マーカーに対して惹起されたコアグリガンドの使用を支持する。本発明の観察はまた、本発明者らが、さらなる腫瘍処置方法を開発することを導いた。例えば、抗アミノリン脂質イムノトキシンおよび抗アミノリン脂質コアグリガンドの腫瘍処置における使用は、第一および第二の仮出願第６０／０９２，５８９号（１９９８年７月１３日出願）および同第６０／１１０，６００号（１９９８年１２月２日出願）、ならびに同時出願された米国特許出願およびＰＣＴ特許出願（代理人整理番号４００１．００２３００、４００１．００２３８２、４００１．００２３８３および４００１．００２２１０）（各々は、特に、本明細書に参考として援用される）において開示されそして請求されている。細胞死を受けていないインタクトな腫瘍関連内皮細胞上での安定なＰＳ発現についての驚くべき発見は、このような方法を実用可能でかつ意外なこととする（もしＰＳ発現が細胞破壊にのみ関連すると考えられていたのならば）。
【０１８３】
しかし、次いで、なおさらにより予期されない腫瘍処置方法が、発見された。アミノリン脂質標的化の潜在的な使用の調査において、毒素もしくはコアグリガンドの腫瘍脈管構造への後の送達の状況において、本発明者らは、裸の抗ＰＳ抗体が、任意の付加的なエフェクター部分を全く伴わないで、インビボで、腫瘍脈管構造に対して破壊的効果を有することを思いがけなく発見した。
【０１８４】
本発明者らのうちの１人が、かなり長い間の治療的使用のための抗腫瘍脈管構造イムノトキシンおよびコアグリガンドを開発した（例えば、米国特許第５，５８５，８６６号および同第５，８７７，２８９号；ならびに米国特許出願第０８／３５０，２１２，同第０８／４８７，４２７号および同第０８／４８２，３６９号を参照のこと；登録料支払済み；各々は、本明細書に参考として援用される）。これらの研究の通常の過程で、種々の抗体（抗クラスＩＩ、抗エンドグリン、抗ＶＣＡＭ−１および抗ＶＥＧＦを含む）を腫瘍保有動物に投与し、そして腫瘍内脈管構造に特異的に局在化することを示した。このような確証に従って、それらの抗体を、毒性もしくは凝固性のエフェクター部分に結合させて、イムノトキシンもしくはコアグリガンドを形成させ、次いで、これを抗腫瘍効果を発揮するように投与する。
【０１８５】
このような研究の間、それ自体で抗腫瘍効果を発揮する裸の抗体は見出されなかった。それゆえ、腫瘍壊死を引き起こす抗アミノリン脂質抗体の、特異的に腫瘍脈管構造に局在化し、そして付随した破壊的効果を発揮する両方の能力は、最も予期されなかった。
【０１８６】
裸の抗体が正確にはどのように機能するかという正確な分子的理解は、本発明を実行するために必要とされないが、本発明者らは、観察された内皮細胞死滅を説明し得るいくつかの機構を考えた。有望な機構としては、細胞媒介性細胞傷害性、補体媒介性溶解および／またはアポトーシスが挙げられるが、抗体誘導性細胞シグナル伝達および／または細胞骨格に対する障害もまた関与し得る。
【０１８７】
裸もしくは未結合の抗アミノリン脂質抗体または抗体フラグメントは、腫瘍血管内皮細胞の表面でアミノリン脂質に結合するので、これらは、管腔表面に抗体被膜を形成する。これは、細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞のような免疫エフェクター細胞を誘引するように機能し得る。次いで、これらの細胞は、血管内皮細胞に対して細胞媒介性細胞傷害効果を発揮する。
【０１８８】
インタクトな抗アミノリン脂質抗体の血管内皮細胞表面への結合はまた、それらの抗体のＦｃ部分が血管管腔に突出することを意味する。抗体Ｆｃフラグメントが補体経路を活性化するので、観察された細胞破壊は、補体により指向される溶解の結果であり得る。従って、抗体の結合によって、補体依存性凝固カスケードが活性化され、多成分複合体の会合を引き起こし、そして最終的に、標的細胞を透過化する溶解複合体を生成する。「補体活性化ＡＤＣＣ」はまた、破壊において作用し得、ここにおいて、補体は、抗体被覆標的細胞に結合し、そして補体に対するレセプターを有する細胞（例えば、好中球）は、この標的細胞を溶解させる。
【０１８９】
抗アミノリン脂質抗体の結合により、腫瘍血管内皮細胞においてアポトーシスもまた誘導され得る。他のグループは、可能性のあるアポトーシスのマーカーとしてＰＳを同定した（ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ，１９９４）。しかし、これらの以前の研究は、他の刺激がアポトーシス事象を開始した後の、外面化されたＰＳの出現と結び付けられ（Ｍａｒｔｉｎら，１９９５）、これは本発明のアポトーシス誘導の提唱と逆であった。ＰＳへの抗体結合が実際にアポトーシスを誘導するという公知の報告は存在しない。それでもやはり、本発明者らは、ほとんど無関係の反対の証拠がごく最近、他のグループ（Ｎａｋａｍｕｒａら，１９９８）によって公表されたという事実にもかかわらず、これが細胞媒介性細胞傷害性または補体媒介性溶解のような機構についてであると考える。
【０１９０】
Ｎａｋａｍｕｒａら（１９９８）は、ループス性抗凝固因子（ＬＡＣ）、動脈および静脈血栓症に関連する障害、血小板減少症、および再発性胎児損失を持つ患者からの抗体画分を分析した。ＬＡＣ活性を持つ血漿は、最初は、内皮細胞においてアポトーシスを誘導することが報告された（Ｎａｋａｍｕｒａら、１９９４）。ＬＡＣ抗血清のアポトーシス活性は、次いで、調べた１０／１０患者中、アネキシンＶ結合抗体画分中に局在化することが報告された（Ｎａｋａｍｕｒａら、１９９８）。アネキシンはＰＳに結合するので、抗アネキシン抗体がアポトーシスを誘導する見かけの能力は、本発明者らにより提唱された破壊的機構（すなわち、抗ＰＳ抗体のアポトーシスを誘導する能力）のうちの１つと反対である。
【０１９１】
ＬＡＣ抗体画分がアポトーシスを誘導する能力は、アネキシンＶとのプレインキュベーションにより阻害されることがさらに報告された（Ｎａｋａｍｕｒａら、１９９８）。対照的に、リン脂質リポソームを用いた患者のＩｇＧ画分からの抗リン脂質抗体の除去は、アポトーシス誘導活性もアネキシンＶ結合をも無くさなかった（Ｎａｋａｍｕｒａら、１９９８）。これらの結果は、ＬＡＣを持つ患者が、しばしば、リン脂質類を結合しないが、なお内皮細胞においてアポトーシスの誘導の原因となる抗体を有するということを合理的に示した（Ｎａｋａｍｕｒａら、１９９８）。
【０１９２】
Ｎａｋａｍｕｒａら（１９９８）のＬＡＣデータを、これらの臨床状態の明らかに異なる性質に起因して、腫瘍および腫瘍脈管構造のインビボ研究からの本発明者らの観察と同一視する必要性なしに、それでもなお、本発明者らは、特定の統一する理論を有する。Ｎａｋａｍｕｒａら（１９９８）は、リン脂質リポソームを用いて患者の抗血清から抗リン脂質抗体を取り除くことを試み、そしてこれはアポトーシス誘導活性を無くさないことを観察した。これらの結果は、Ｎａｋａｍｕｒａら（１９９８）を、この抗リン脂質の抗体は、アポトーシス活性の原因ではあり得ないと結論することに導いた。しかし、今や、本発明者らは、リン脂質リポソームとのインキュベーションは、抗血清から抗リン脂質の抗体を除去しないかもしれないということを示唆する洞察を有している。なぜなら、リン脂質は、二重層およびリポソーム形態では、抗原的に中性であり、そして主としてヘキソゴナル形態で抗体に結合しているのみか（Ｒａｕｃｈら、１９８６；ＲａｕｃｈおよびＪａｎｏｆｆ、１９９０；Ｂｅｒａｒｄら、１９９３；各々は参考として本明細書中に援用される）、または膜タンパク質と会合しているからである。従って、抗リン脂質抗体は、ＬＡＣ抗血清中に残存し得、そして観察されたアポトーシス活性を生じ得るかまたはそれに寄与し得る。
【０１９３】
腫瘍血管内皮細胞表面への抗アミノリン脂質結合が、細胞の細胞骨格構成の妨害を引き起し得ることもまた、考えられ得る。細胞骨格が表面の膜の構成に役割を果たし、そして抗アミノリン脂質結合がその膜を妨害し得る（またはさらに妨害し得る）ので、抗体結合は、二重層と相互作用する細胞骨格タンパク質に変化を伝達し得る。細胞骨格タンパク質の空間的構成が、膜安定性および細胞形状を制御することが既に公知であり、そしていくらかの細胞骨格平衡状態の混乱が、細胞統合性に対して広範な影響を有し得ることが可能である。
【０１９４】
本発明の作用のさらなる機構は、抗アミノリン脂質抗体の内皮細胞表面への結合が、今のところ明らかにされていない経路によるシグナル伝達を開始し得ることであり得る。抗アミノリン脂質抗体の結合はまた、例えば、膜レセプター、シグナル伝達タンパク質、膜チャンネルなどのコンホメーションおよび／または相互作用を変化させることによって、公知のシグナル伝達経路を妨害し得る。細胞破壊（アポトーシス）のためのシグナルを開始し得るかまたは模倣し得、そして／または保存／ホメオスタシスシグナルを阻害し得る。
【０１９５】
科学的関心を引くものではあるものの、裸の抗アミノリン脂質抗体によって達成される血管破壊の正確な性質を決定することは、本発明の実施に必要ではない。もし抗アミノリン脂質抗体の投与が、本明細書中で、インビボで特定の抗腫瘍効果において有利な結果を示すならば、本発明は、この現象の根底にある分子機構と関係なく利用され得る。
【０１９６】
従って、本発明の裸の抗体の使用は、腫瘍治療において有意な進歩を表す。コアグリガンドは腫瘍治療に有利ではあるが、標的化抗体またはリガンドは、やはり、組織因子のようなエフェクター凝固薬に結合体化されるか、または機能的に会合される必要がある。それゆえ、コアグリガンド標的化および腫瘍破壊方法論の実践は、適切な結合体、または配位された分子複合体（二特異性抗体を含む）の調製を必要とするという点で、幾分骨の折れる仕事である。例えば、所望の標的抗原に結合する標的化抗体もしくはリガンドを調製しなければならない；適切な凝固薬を選択しなければならない；その凝固薬をその標的化抗体もしくはリガンドに連結するか、さもなければ、これら２つの成分の機能的会合を形成して、「コアグリガンド」を形成しなければならない；未結合もしくは未複合体化の標的化薬剤および凝固薬からコアグリガンドを分離しなければならない；次いで、処置プロトコルを行わなければならない。
【０１９７】
コアグリガンドに基く方法は、容易にかつ首尾良く実行され得るが、当業者は、より少ない調製工程を含み、そしてそれゆえより費用効果の良い様式で行われ得る、本発明の方法論の開発から得られる利点を理解し得る。さらに、本発明は、規制当局の認可過程を通じて、より迅速に進行される１成分システム（ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ）を提供し、これにより、改善された処置方法を緊急に必要とする診療所に、これらの方法を移動させることが可能となる。
【０１９８】
（Ｅ．抗アミノリン脂質抗体）
（Ｅ１．ポリクローナル抗アミノリン脂質抗体）
抗体を調製および特徴付けるための手段は、当該分野において周知である。（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと；本明細書中で参考として援用される）。ポリクローナル抗血清を調製するために、動物を免疫原性アミノリン脂質組成物で免疫し、そして抗血清をこの免疫した動物から収集する。広範な動物種が、抗血清の産生のために使用され得る。代表的に、抗抗血清の産生のために使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、またはヤギである。ウサギの比較的大容量の血液が理由で、ウサギは、ポリクローナル抗体の産生のために好ましい選択である。
【０１９９】
ポリクローナル抗体の産生において使用される免疫原組成物の量は、免疫原ならびに免疫に使用される動物の性質に依存して変動する。以下の種々の経路が、本発明のアミノリン脂質免疫原を投与するために使用され得る；皮下、筋内、皮内、静脈内、腹腔内、および脾臓内。ポリクローナル抗体の産生は、免疫後の種々の時点で免疫された動物の血液をサンプリングすることによって、モニターされ得る。第２の、追加免疫注射もまた与えられ得る。追加免疫する工程および力価測定する工程のプロセスは、適切な力価が達成されるまで反復される。所望の力価レベルが得られた時点で、この免疫した動物を採血し得、そして血清が単離および保存され得る。動物はまた、モノクローナル抗体を産生するために使用され得る。
【０２００】
当該分野において周知のように、特定の組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の免疫応答の非特異的刺激物質の使用によって増強され得る。例示的なアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（殺傷したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含有する、免疫応答の非特異的刺激物質）；不完全フロイントアジュバント；および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。
【０２０１】
アミノリン脂質をキャリアと連結することによってか、またはアミノリン脂質をキャリアにカップリングすることによって達成され得るように、宿主免疫系を追加免疫することもまた所望され得る。例示的なキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。オボアルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンのような他のアルブミンもまた、キャリアとして使用され得る。
【０２０２】
当該分野においてまた公知であるように、所定の組成は、その免疫原性において変動し得る。しかし、アミノリン脂質に対する抗体の産生は著しくは相違しない。例えば、高度に特異的な抗ホスファチジルセリン抗体は、ホスファチジルセリン含有ポリアクリルアミドゲルの筋内注射およびホスファチジルセリンシトクロムｃ小胞によって免疫されたウサギにおいて惹起された（Ｍａｎｅｔａ−Ｐｅｙｒｅｔら、１９８８；１９８９；各々、本明細書中で参考として援用される）。アクリルアミドインプラントの使用は、抗体の産生を増強した（Ｍａｎｅｔａ−Ｐｅｙｒｅｔら、１９８８；１９８９）。この様式において惹起された抗ホスファチジルセリン抗体は、インサイチュでヒト血小板上のホスファチジルセリンを検出し得る（Ｍａｎｅｔａ−Ｐａｙｒｅｔら、１９８８）。Ｉｎｏｕｅ、ＲｏｔｅおよびＲａｕｃｈのグループはまた、抗ＰＳ抗体および抗ＰＥ抗体を開発した（下記を参照のこと）。
【０２０３】
（Ｅ２．モノクローナル抗アミノリン脂質抗体）
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生するための種々の方法がまた、現在当該分野において十分に周知である。最も標準的なモノクローナル抗体の産生技術は、一般的に、ポリクローナル抗体を調製するための技術と同じ系に沿って開始する（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８；本明細書中で参考として援用される）。ポリクローナル抗体応答は、免疫原性アミノリン脂質組成物を用いて動物を免疫することによって開始され、そして所望の力価レベルが得られる時点で、その免疫した動物を用いてＭＡｂを産生し得る。
【０２０４】
ＭＡｂは、米国特許第４，１９６，２６５号（これは、本明細書中で参考として援用される）に例示される技術のような、周知技術の使用を通して容易に調製され得る。代表的に、この技術は、選択されたアミノリン脂質免疫原組成物を用いて適切な動物を免疫することを含む。免疫する組成物は、抗体産生細胞を刺激するに有効な様式で投与される。マウスおよびラットのような齧歯類は好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジ、およびカエルの細胞の使用もまた可能である。ラットの使用は、特定の利点を与え得る（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６、第６０〜６１頁；本明細書中で参考として援用される）が、マウスが好ましい。そして、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、最も慣用的に使用され、そして一般により高率で安定な融合物を与えるので最も好ましい。
【０２０５】
免疫後に、アミノリン脂質抗体を産生する可能性を有する体細胞（詳細には、Ｂリンパ球（Ｂ細胞））が、ＭＡｂ産生プロトコルにおける使用のために選択される。これらの細胞は、生検された脾臓、扁桃、もしくはリンパ節から、または末梢血サンプルから獲得され得る。脾臓細胞および末梢血細胞が好ましい。前者は、脾臓細胞が分裂形質芽球段階にある抗体産生細胞の豊富な供給源であるからであり、後者は、末梢血が容易に利用可能であるからである。しばしば、一団の動物が免疫され、そして最高の抗体力価を有する動物の脾臓が取り出され、そして注射器でこの脾臓をホモジネートすることによって脾臓リンパ球が得られる。代表的に、免疫したマウス由来の脾臓は、約５×１０7〜２×１０8のリンパ球を含む。
【０２０６】
次いで、免疫した動物由来の抗アミノリン脂質抗体産生Ｂリンパ球は、不死化骨髄腫細胞の細胞（一般的には、免疫された動物と同じ種の細胞）と融合される。ハイブリドーマ産生融合手順における使用に適切な骨髄腫細胞株は、好ましくは非抗体産生であり、高い融合効率を有し、そして、次いで所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地中で増殖し得なくさせる酵素欠損を有する。
【０２０７】
当業者に公知のように、多くの骨髄腫細胞のうちの任意の細胞が使用され得る（Ｇｏｄｉｎｇ、第６５〜６６頁、１９８６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、第７５〜８３頁、１９８４；各々は、本明細書中で参考として援用される）。例えば、免疫した動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳｌ／１．Ａｇ  ４  ｌ、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７、およびＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕｌが使用され得；ラットについて、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、４Ｂ２１０、または上記に列挙されたマウス細胞株のうちの１つが使用され得；そしてＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、およびＵＣ７２９−６はすべて、ヒト細胞融合に関連して有用である。
【０２０８】
抗体産生脾臓細胞または抗体産生リンパ節細胞、および骨髄腫細胞のハイブリッドを生成するための方法は、通常、細胞膜の融合を促進する因子（単数または複数）（化学的または電気的）の存在下で、４：１の比率で体細胞を骨髄腫細胞と混合する工程を包含するが、この比率はそれぞれ約２０：１〜約１：１まで変動し得る。センダイウイルスを使用する融合方法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５；１９７６；各々、本明細書中で参考として援用される）によって記載されており、そしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ）を使用する融合方法は、Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７；本明細書中で参考として援用される）に記載されている。電気的に誘導された融合方法の使用もまた適切である（Ｇｏｄｉｎｇ、第７１〜７４頁、１９８６；本明細書中で参考として援用される）。
【０２０９】
融合手順は通常、低い頻度（約１×１０-6〜１×１０-8）で生存可能なハイブリッドを生成する。しかし、これは問題を提起しない。なぜなら、生存可能な融合ハイブリッドは、選択培地中で培養することによって、親の非融合細胞（特に、通常は無限に分裂しつづける、非融合骨髄腫細胞）から識別されるからである。選択培地は、一般に、組織培養培地中でのヌクレオチドのデノボ合成をブロックする薬剤を含む培地である。例示的かつ好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジンの両方のデノボ合成をブロックし、一方、アザセリンは、プリン合成のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、ヌクレオチドの供給源としてヒポキサンチンおよびチミジンを倍地に補充する（ＨＡＴ培地）。アザセリンが使用される場合、ヒポキサンチンを培地に補充する。
【０２１０】
好ましい選択培地は、ＨＡＴである。ヌクレオチドサルベージ経路を作動し得る細胞のみが、ＨＡＴ培地中で生存し得る。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の重要な酵素（例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を欠損し、そしてそれらは生存し得ない。Ｂ細胞はこの経路を作動し得るが、それらは培養中で限られた寿命を有し、そして一般に約２週間以内に死滅する。従って、選択培地中で生存し得る細胞のみが、骨髄腫細胞およびＢ細胞から形成されたそれらのハイブリッドである。
【０２１１】
この培養は、特定のハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの集団を提供する。代表的に、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート中での単一クローン希釈によって細胞を培養し、次いで所望の抗アミノリン脂質反応性について個々のクローンの上清を試験すること（約２〜３週間後）によって、実施される。このアッセイは、高感度で、単純で、そして迅速であるべきである（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫検定法、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイ（ｄｏｔ  ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）など）。
【０２１２】
次いで、選択されたハイブリドーマを段階希釈し、そして個々の抗アミノリン脂質抗体産生細胞株にクローン化する。次いで、このクローンを無限に増殖して、ＭＡｂを提供する。細胞株は、２つの基本的様式でＭＡｂ産生のために利用され得る。ハイブリドーマのサンプルは、もともとの融合物のための体細胞および骨髄腫細胞を提供するために使用された型の組織適合性動物に注射（しばしば、腹膜腔内へ）され得る。この注射された動物は、融合された細胞ハイブリッドによって産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発症する。次いで、この動物の体液（例えば、血清または腹水）を穿刺して、高濃度でＭＡｂを提供し得る。個々の細胞株はまた、インビトロで培養され得る。ここで、ＭＡｂは培養培地中に自然に分泌され、ここからＭＡｂは高濃度で容易に獲得され得る。
【０２１３】
いずれかの手段によって産生されたＭＡｂは、一般に、例えば、濾過、遠心分離法、および種々のクロマトグラフィー法（例えば、ＨＰＬＣまたはアフィニティークロマトグラフィー）（これらの精製技術はすべて、当業者に周知である）を使用して、さらに精製される。これらの精製技術は各々、混合物の他の成分から所望の抗体を分離するための分別を含む。抗体の調製に特に適切な分析方法としては、例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーおよび／またはプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーが挙げられる。
【０２１４】
Ｕｍｅｄａら（１９８９；本明細書中で参考として援用される）は、ホスファチジルセリンの立体特異的（ｓｔｅｒｅｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）エピトープを認識するモノクローナル抗体の効率的な産生を報告した。Ｕｍｅｄａの系は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａコーティングしたアミノリン脂質サンプルを使用する、マウス脾臓内へのホスファチジルセリンの直接的免疫に基づく（Ｕｍｅｄａら、１９８９；本明細書中で参考として援用される）。Ｕｍｅｄａのプロトコルは、高度な特異性から広範な交差反応性にわたる３つの異なる反応性プロフィールを示す、高頻度の抗ＰＳ  ＭＡｂを提供する。従って、Ｕｍｅｄａ（の文献）はまた、ＰＳに特異的に結合する（例えば、そしてホスファチジルコリンには結合しない）ＭＡｂを同定するためのスクリーニングアッセイをさらに記載するために、本明細書中で参考として援用される。
【０２１５】
Ｕｍｅｄａによって産生された６１個のハイブリドーマのいずれもが、本発明において潜在的に使用され得る。例としては、ＰＳＣ８、ＰＦＳ１１、ＰＳＧ３、ＰＳＤ１１、ＰＳＦ１０、ＰＳ１Ｂ、ＰＳ３Ｄ１２、ＰＳ２Ｃ１１；ＰＳ３Ａ、ＰＳＦ６、ＰＳＦ７、ＰＳＢ４、ＰＳ３Ｈ１；ＰＳ４Ａ７およびＰＳ１Ｇ３である。より好ましくは、ＰＳ３Ａ、ＰＳＦ６、ＰＳＦ７、ＰＳＢ４、およびＰＳ３Ｈ１である。なぜなら、これらは、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンに対してのみ結合するからである。好ましい抗ＰＳ抗体は、ＰＳ４Ａ７（ＩｇＭ）およびＰＳ１Ｇ３（ＩｇＧ3）である。なぜなら、これらはＰＳに対して高度に特異的であり、そして他のリン脂質と全く交差反応性を示さないからである。ＰＳ４Ａ７は、ＰＳ中のセリン残基の立体特異的配置を認識する（Ｕｍｅｄａら、１９８９、図１；本明細書中で参考として援用される）。
【０２１６】
Ｉｇａｒａｓｈｉら（１９９１；本明細書中で参考として援用される）もまた、脾臓内免疫によるＩｇＧアイソタイプの抗ＰＳ抗体の効果的産生を報告した。抗原を再度静脈内に注射した場合には、力価のほんのわずかな増加が観察された。高頻度のＩｇＧアイソタイプの抗ＰＳ  ＭＡｂはまた、ＭＡｂが抗原の脾臓内注射の１０日後に産生された場合でさえ、観察された。これらの抗体はまた、Ｓｃｈｕｕｒｍａｎｓ  Ｓｔｅｋｈｏｖｅｎら（１９９４）によって使用された。
【０２１７】
他の有意な抗ＰＳ抗体の産生は、Ｒｏｔｅおよび共同研究者らによった。Ｒｏｔａら（１９９３；本明細書中で参考として援用される）は、特に、ＰＳミセルをフロイント完全アジュバントと組み合わせて使用して、特異的抗ＰＳ抗体を生成した。Ｒｏｔｅら（１９９３）はまた、カルジオリピン（ＣＬ）とＰＳとの間を識別するモノクローナル抗体を生成した。従って、Ｒｏｔａら（１９９３）（の文献）はまた、フローサイトメトリを使用して、休止している血小板およびトロンビン活性化された血小板に対して試験することによって、ＰＳに対して特異的に結合するＭＡｂを同定するためのスクリーニングアッセイをさらに記載するために、本明細書中で参考として援用される。
【０２１８】
Ｒｏｔｅら（１９９３）により生成された３ＳＢ９ｂ抗体は、ＰＳとのみ反応した。そして３ＳＢ９ｂ抗体は、本発明における使用のための好適な抗体である。ＢＡ３Ｂ５Ｃ４もまた使用され得る。なぜなら、これはＰＳおよびＣＬの両方に反応するからである。これらの抗体はまた、Ｌｉｎら（１９９５）、Ｏｂｒｉｎｇｅｒら（１９９５）およびＫａｔｓｕｒａｇａｗａら（１９９７）に記載される。
【０２１９】
（Ｅ３．ファージミドライブラリー由来の抗アミノリン脂質抗体）
組換え技術は、今や、一定範囲の抗体をコードする組換え遺伝子に由来する所望の特異性を有する抗体の調製を可能にしている（Ｖａｎ  Ｄｉｊｋら、１９８９；本明細書中に参考として援用される）。特定の組換え技術は、免疫した動物の脾臓から単離されたＲＮＡから調製されるコンビナトリアル免疫グロブリンファージ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングによる抗体遺伝子の単離を包含する（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８６；ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９９１；各々が本明細書中に参考として援用される）。
【０２２０】
このような方法のために、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーは免疫した動物の脾臓から単離されたＲＮＡから調製され、そして適切な抗体を発現するファージミドは、抗原を発現する細胞およびコントロール細胞を用いてパニングすることにより選択される。従来のハイブリドーマ技術を超えるこのアプローチの利点は、約１０4倍もの多くの抗体が１回で生成およびスクリーニングされ得ること、ならびに新たな特異性がＨ鎖およびＬ鎖の組み合わせにより生成されることである。このことは、生成される適切な抗体の割合をさらに増大させる。
【０２２１】
細菌中で、多様な抗体分子の大きなレパートリーを生成するための１つの方法は、ベクターとしてバクテリオファージλを利用する（Ｈｕｓｅら、１９８９；本明細書中に参考として援用される）。λベクターを使用する抗体の生成は、ＤＮＡ配列の重鎖および軽鎖集団を別々の開始ベクターへクローニングすることを包含する。このベクターは、引き続きランダムに組み合わされて、抗体フラグメントを形成するために重鎖および軽鎖の同時発現を指向する単一のベクターを形成する。重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列は、選択された抗原で免疫された動物に由来する脾臓細胞（またはそれらのハイブリドーマ）から単離されたｍＲＮＡの増幅により（好ましくは、ＰＣＲTMまたは関連増幅技術により）得られる。重鎖および軽鎖の配列は、代表的には、開始ベクターへの重鎖および軽鎖セグメントのクローニングを容易にするために、増幅されたＤＮＡセグメントの末端に制限部位を組み込むプライマーを使用して増幅される。
【０２２２】
完全にまたは部分的に合成的である抗体結合部位（すなわちパラトープ）の大きなライブラリーを作製およびスクリーニングするための別の方法は、糸状ファージ（例えば、Ｍ１３、ｆｌまたはｆｄ）に由来するディスプレイベクターを利用する。これらの糸状ファージディスプレイベクター（「ファージミド」ともいわれる）は、多様かつ新規な免疫特異性を有するモノクローナル抗体の大きなライブラリーを生じる。この技術は、糸状ファージ複製のアセンブリ段階の間に遺伝子産物および遺伝子を連結するための手段として、糸状ファージコートタンパク質膜アンカードメインを使用し、そしてこれは、コンビナトリアルライブラリーから抗体をクローニングおよび発現するために使用されている（Ｋａｎｇら、１９９１；Ｂａｒｂａｓら、１９９１；各々が本明細書中に参考として援用される）。
【０２２３】
糸状ファージディスプレイのためのこの一般的技術は、米国特許第５，６５８，７２７号（本明細書中に参考として援用される）に記載される。大部分の一般的認識において、この方法は、単一のベクター系を使用して、抗体遺伝子レパートリーから予め選択されたリガンド−結合特異性を同時クローニングおよびスクリーニングするための系を提供する。予め選択されたリガンド−結合能力についてライブラリーの単離されたメンバーをスクリーニングすることにより、ライブラリーに由来するメンバーをコードする遺伝子を単離するための簡便な手段を用いて、発現された抗体分子の結合能力の相関づけが可能になる。
【０２２４】
発現およびスクリーニングの関連づけは、機能的抗体のアセンブリを可能にするための細菌細胞のペリプラズムへの融合ポリペプチドの標的化と、目的のライブラリーメンバーの簡便なスクリーニングを可能にするためのファージアセンブリの間の糸状ファージ粒子のコートへの融合タンパク質の標的化との組み合わせにより達成される。ペリプラズム標的化は、融合ポリペプチド中の分泌シグナルドメインの存在により提供される。ファージ粒子への標的化は、融合ポリペプチド中の糸状ファージコートタンパク質膜アンカードメイン（すなわち、ｃｐＩＩＩ由来か、またはｃｐＶＩＩＩ由来の膜アンカードメイン）の存在により提供される。
【０２２５】
糸状ファージベースのコンビナトリアル抗体ライブラリーの多様性は、重鎖および軽鎖の遺伝子のシャッフリングにより、ライブラリーのクローニングされた重鎖遺伝子の１つ以上の相補性決定領域を改変することにより、または誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ポリメラーゼ連鎖反応によりライブラリーへランダム変異を導入することにより増大され得る。ファージミドライブラリーをスクリーニングするためのさらなる方法は、米国特許第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，４０３，４８４号；および同第５，２２３，４０９号（各々が本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０２２６】
大きなコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングするための別の方法が開発され、この方法は、Ｍ１３、ｆｌまたはｆｄのような糸状バクテリオファージの表面での多様な重鎖および軽鎖配列の集団の発現を利用する（米国特許第５，６９８，４２６号；本明細書中に参考として援用される）。多様な重鎖（Ｈｃ）および軽鎖（Ｌｃ）配列の２つの集団は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲTM）により合成される。これらの集団は、発現のために必要なエレメントを含む、別個のＭ１３ベースのベクターにクローニングされる。重鎖ベクターは、重鎖配列の翻訳がｇＶＩＩＩ−Ｈｃ融合タンパク質を生成するように、遺伝子ＶＩＩＩ（ｇＶＩＩＩ）コートタンパク質配列を含む。２つのベクターの集団は、ＨｃおよびＬｃの配列を含むベクター部分のみが単一の環状ベクターに連結されるように、ランダムに組み合わされる。
【０２２７】
組み合わされたベクターは、Ｍ１３での２つのポリペプチドのアセンブリおよび表面発現のためにＨｃおよびＬｃの配列の両方の同時発現を指向する（米国特許第５，６９８，４２６号；本明細書中に参考として援用される）。組み合わせ工程は、単一のベクターに２つの多様な集団内の異なるＨｃコ−ド配列およびＬｃコード配列をランダムに結びつける。各々の独立したベクターから与えられたこのベクター配列は、生存ファージの生成のために必要である。また、擬ｇＶＩＩＩ配列は２つの開始ベクターのうちの一方のみに含まれるので、Ｌｃ会合ｇＶＩＩＩ−Ｈｃ融合タンパク質としての機能的抗体フラグメントの同時発現は、ベクター配列が単一のベクター内に連結されるまではファージ表面で達成され得ない。
【０２２８】
抗体ライブラリーの表面発現は、アンバーサプレッサー株において行われる。Ｈｃ配列とｇＶＩＩＩ配列との間のアンバー停止コドンは、非サプレッサー株において２つの成分を連結しない。非サプレッサー株から生成されたファージを単離し、そしてサプレッサー株を感染させることは、発現の間に、ｇＶＩＩＩ配列にＨｃ配列を連結させる。感染後にサプレッサー株を培養することは、ｇＶＩＩＩ融合タンパク質（ｇＶＩＩＩ−Ｆａｂ融合タンパク質）としてライブラリー内の全ての抗体種をＭ１３ファージの表面で同時発現させることを可能にする。あるいは、このＤＮＡは、非サプレッサー株から単離され得、次いで、同じ効果を達成するようにサプレッサー株に導入され得る。
【０２２９】
表面発現ライブラリーは、標準的アフィニティー単離手順により予め選択された分子を結合する特異的Ｆａｂフラグメントについてスクリーニングされる。このような方法としては、例えば、パニング（ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ、１９８８；本明細書中に参考として援用される）、アフィニティークロマトグラフィーおよび固相ブロッティング手順が挙げられる。パニングは、高力価のファージが容易に、迅速かつ少容量でスクリーニングされ得るので好ましい。さらに、この手順は、集団内の微量なＦａｂフラグメント種を選択し得る。この微量のフラグメント種は、他の方法では検出不能であり、そして実質的に均質な集団にまで増殖されない。選択されたＦａｂフラグメントは、このファージ集団の増殖後に、ポリペプチドをコードする核酸を配列決定することにより特徴づけられ得る。
【０２３０】
抗体の多様なライブラリーを作製し、所望の結合特異性についてスクリーニングするための別の方法は、米国特許第５，６６７，９８８号および同第５，７５９，８１７号（各々が、本明細書中に参考として援用される）に記載される。この方法は、免疫グロブリン可変重鎖および可変軽鎖の可変ドメインのＣＤＲ領域に縮重、ならびにファージミドの表面での変異誘発したポリペプチドのディスプレイを組み込むために、縮重オリゴヌクレオチドおよびプライマー伸長反応を用いるファージミドライブラリーの形態での、ヘテロダイマーの免疫グロブリン分子のライブラリーの調製を包含する。それ以降、ディスプレイタンパク質は、予め選択された抗原に結合する能力についてスクリーニングされる。
【０２３１】
ヘテロダイマー免疫グロブリン分子を生成するための方法は、一般に、（１）目的の重鎖または軽鎖のＶ領域コード遺伝子をファージミドディスプレイベクターに導入すること；（２）無作為化された結合部位をファージミドディスプレイタンパク質ベクターへ、抗体Ｖ領域遺伝子のＣＤＲに対する相同性の領域を含み、そして無作為化したコード配列を生成するための縮重領域を含むオリゴヌクレオチドでのプライマー伸長により導入して、各々がファージミド表面ディスプレイタンパク質上に提示される異なる推定結合部位を発現し得るディスプレイベクターの大きな集団を形成すること；（３）糸状ファージ粒子の表面でディスプレイタンパク質および結合部位を発現させること；ならびに（４）アフィニティー技術（例えば、予め選択された抗原に対するファージ粒子のパニング）を用いて表面発現したファージ粒子を単離（スクリーニング）し、このことによって、予め選択された抗原に結合する結合部位を含むディスプレイタンパク質を含む１種以上のファージミドを単離することを包含する。
【０２３２】
抗体の多様なライブラリーを作製し、そして所望の結合特異性についてスクリーニングするためのこの方法のさらなるバリエーションは、米国特許第５，７０２，８９２号（本明細書中に参考として援用される）に記載される。この方法においては、重鎖配列のみが用いられ、この重鎖配列は、ＣＤＲＩ超可変領域またはＣＤＲＩＩＩ超可変領域のいずれかをコードする全てのヌクレオチド位置で無作為化され、そしてＣＤＲにおける遺伝的可変性は、任意の生物学的プロセスとは独立して生成される。
【０２３３】
この方法において、２つのライブラリーを操作して、重鎖遺伝子構造の骨格内のオリゴヌクレオチドモチーフを遺伝的にシャッフルする。ＣＤＲＩまたはＣＤＲＩＩＩのいずれかのランダム変異によって、重鎖遺伝子の超可変領域は、高度に多様な配列の収集物を生じるように再構築された。変異した遺伝子配列の収集物によりコードされる重鎖タンパク質は、２つの免疫グロブリン鎖の一方のみを必要とするが、免疫グロブリンの結合特性の全てを有する潜在能力を保有した。
【０２３４】
詳細には、この方法は、免疫グロブリン軽鎖タンパク質の非存在下で行われる。改変した重鎖タンパク質を提示するファージライブラリーは、固定化されたリガンドとともにインキュベートされて、固定化されたリガンドに特異的に結合する組換えタンパク質をコードするクローンが選択される。次いで、結合したファージを固定化されたリガンドから解離し、そして細菌宿主細胞中での増殖により増幅させる。個々のウイルスプラーク（各々が異なる組換えタンパク質を発現する）は拡大され、次いで、個々のクローンは結合活性についてスクリーニングされ得る。
【０２３５】
（Ｅ４．ヒト患者由来の抗アミノリン脂質抗体）
アミノリン脂質（特に、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミン）に対する抗体は、ヒト集団に生じる。ここで、それらは、特定の疾患状態と相関している。抗アミノリン脂質抗体は、異種の抗アミノリン脂質抗体（ａＰＬ）の一部であり、異なる特異性およびクラスのファミリーを有することが観察される。原発性抗アミノリン脂質症候群（ＡＰＳ）ですら抗リン脂質抗体生成と関連した自己免疫疾患の他の形態とは分けられている。
【０２３６】
抗ＰＳ抗体は、特に再発性の妊娠喪失（Ｒｏｔｅら、１９９５；Ｒｏｔｅ、１９９６；Ｖｏｇｔら、１９９６；Ｖｏｇｔら、１９９７；本明細書中に参考として援用される）および自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥまたは「狼瘡」））と関連する（Ｂｒａｎｃｈら、１９８７；本明細書中に参考として援用される）。抗ＰＥ抗体はまた、ヒト患者（特に、自己免疫疾患患者）において報告されている（Ｓｔａｕｂら、１９８９）。Ｂｒａｎｃｈら（１９８７）は、ループス性抗凝固因子（ＬＡまたはＬＡＣ）を有する患者の８０％がＰＥを認識する自己抗体を有したことを報告した；ＤｒｏｕｖａｌａｋｉｓおよびＢｕｃｈａｎａｎ（１９９９）は、自己免疫ＬＡＣ血清から９５％ＰＥポジティブまでこの数を増加させたことを報告した。
【０２３７】
抗リン脂質抗体は、同じ患者において見出され得るが、抗内皮細胞抗体（ＡＥＣＡ）と混同されるべきではない。ＡＥＣＡの存在は、脈管炎と関連する種々の臨床設定（例えば、全身性硬化症（ＳＳ））において実証されている。ＡＥＣＡを研究するために、抗体を、抗リン脂質抗体を有さない患者から得る（ａＰＬネガティブ血清）。
【０２３８】
ＡＥＣＡの病理的役割は、明らかでないままであるが、Ｂｏｒｄｒｏｎら（１９９８）は、ＡＥＣＡが内皮細胞のアポトーシスを開始し得ることをつい最近示唆した。このことは、膜の外表面へのＰＳ転移の前に起こる。彼らは、このことにより、皮膚病変または結合組織疾患を有する患者においてＡＥＣＡと共にときおり見られる抗リン脂質抗体の引き続く生成が説明されると提唱した（Ｂｏｒｄｒｏｎら、１９９８）。しかし、アポトーシス誘導抗原へのＡＥＣＡ結合が前提であったが、これらの研究は、ＡＥＣＡのさらなる特徴づけを導かず、内皮細胞上で異なる（非脂質）構造と反応する抗体の、非常に異質のファミリーを表すことがさらに書かれている（Ｂｏｒｄｒｏｎら、１９９８）。
【０２３９】
抗ホスファチジルセリン抗体は、妊娠喪失、妊娠によって誘導される高血圧症および子宮内成長遅延と密接に関連している。ホスファチジルセリン依存性抗原は、分化中の細胞栄養層細胞の絨毛上皮腫モデル（ＢｅＷｏ）の表面上で発現されることが示された。このことは、循環抗ホスファチジルセリン抗体にインビボで接近させやすいのであろうことを示す（Ｒｏｔｅら、１９９５）。事実、Ｖｏｇｔら（１９９６）は、モノクローナル抗体３ＳＢ９ｂ（これは、カルジオリピンではなくホスファチジルセリンと反応する）が、抗リン脂質抗体症候群のマウスモデルにおいて胎仔および胎盤重量の両方で有意な減少を誘導したことを示した。
【０２４０】
これらの著者らは、抗リン脂質抗体と関連する流産を説明するためのモデルを開発した：抗ホスファチジルセリン抗体は、おそらくアネキシンＶを除去することにより栄養膜の表面でのプロトロンビン結合のための部位を明らかにする（Ｖｏｇｔら、１９９７）。栄養膜分化は、形質膜の内表面から外表面へのホスファチジルセリンの外部移行（ｅｘｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）と関連している。通常は、ホスファチジルセリンの外部移行は、アネキシンＶの結合と同時であり、これは、ホスファチジルセリンリッチ表面が凝固の活性化のための部位として作用することを妨げる。従って、抗リン脂質抗体が存在する場合、それらは、アネキシンＶの結合を妨げ、そして前凝固状態を導く（Ｖｏｇｔら、１９９７）。
【０２４１】
抗ＰＥ抗体は、頻繁に、ループス性抗凝固因子（ＬＡＣ血清）と関連している。ＬＡＣ中のＰＥおよび抗ＰＥの役割は、非常に複雑である。例えば、Ｓｍｉｒｎｏｖら（１９９５；本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。ここで、種々の仮説が述べられている。Ｓｍｉｒｎｏｖら（１９９５）は、活性化プロテインＣおよびＰＥの存在下では、ＬＡＣ血漿凝固が通常の血漿より早いことを報告した。Ｒａｕｃｈら（１９８６）は、ＬＡＣ抗リン脂質抗体をインビトロ抗凝固アッセイにおいて凝固時間を延長すると特徴づけている。
【０２４２】
Ｖｌａｃｈｏｙｉａｎｎｏｐｏｕｌｏｓら（１９９３；本明細書中に参考として援用される）は、健常血液ドナーと比較して、ホスファチジルエタノールアミンおよびカルジオリピンに対する抗体についてＥＬＩＳＡによりＳＬＥ血清およびＡＰＳ血清を試験した。ＳＬＥおよびＡＰＳ患者ともに、正常被験体より高力価のＩｇＭ抗ＰＥ抗体が存在することを報告したが、その一方で、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗ＰＥ反応性は異ならないことが報告された。このことは、ＩｇＡおよびＩｇＧ抗ＰＥ抗体は正常被験体における天然の自己抗体程度の低い力価を生じ得ることを示唆した（Ｖｌａｃｈｏｙｉａｎｎｏｐｏｕｌｏｓら、１９９３；本明細書中に参考として援用される）。
【０２４３】
Ｒａｕｃｈら（１９８６；本明細書中に参考として援用される）は、１３名の全身性エリテマトーデス患者由来のリンパ球とリンパ芽球株とを融合することによりハイブリドーマを生成した。彼らは、凝固時間を延長させた自己抗体がヘキサゴナル相リン脂質（天然および合成形態のホスファチジルエタノールアミンを含む）に結合したことを示した（Ｒａｕｃｈら、１９８６；本明細書中に参考として援用される）。対照的に、ラメラリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン）およびホスファチジルエタノールアミンの合成ラメラ形態は、抗凝固活性に対して全く効果を有さなかった（Ｒａｕｃｈら、１９８６）。
【０２４４】
ＲａｕｃｈおよびＪａｎｏｆｆ（１９９０；本明細書中に参考として援用される）は、ヘキサゴナルＩＩ相（二重層相ではなく）におけるホスファチジルエタノールアミンでのマウスの免疫により、抗リン脂質抗体の誘導を生じたことを続いて示した。これらの抗体は、ホスファチジルエタノールアミンと強く反応性であり、そして自己免疫疾患の患者からの自己抗体の機能的ループス性抗凝固因子活性特徴を有した（ＲａｕｃｈおよびＪａｎｏｆｆ、１９９０）。
【０２４５】
従って、有利には、アミノリン脂質のヘキサゴナルＩＩ相形態を使用して、本発明における使用のための抗体を生成するべきである。事実、Ｔｒｕｄｅｌｌは、ＴＦＡ−（トリフルオロアセチル−）タンパク質付加生成物に対して惹起された抗体が、ヘキサゴナル相のリン脂質ミセルにおけるＴＦＡ−ホスファチジルエタノールアミンに結合するが、ラメラリポソームには結合しないことを報告した（Ｔｒｕｄｅｌｌら、１９９１ａ；本明細書中に参考として援用される）。この著者らは、肝細胞表面上の非ラメラドメインに存在するＴＦＡ−ホスファチジルエタノールアミン付加生成物が、抗ＴＦＡ付加生成物抗体についての認識部位であり得、そして免疫が媒介するハロタン肝臓毒性に潜在的に関与し得ることを示唆した（Ｔｒｕｄｅｌｌら、１９９１ａ）。これらの同じ抗体は、この付加生成物が肝細胞表面に組み込まれる場合にＴＦＡジオレオイルホスファチジルエタノールアミンと交差反応し（Ｔｒｕｄｅｌｌら、１９９１ｂ；本明細書中に参考として援用される）、従って、この仮説を支持することが後に示された。
【０２４６】
Ｂｅｒａｒｄは、さらにアミノリン脂質（例えば、ＰＥ）のヘキサゴナルＩＩ相形態を明らかにした（Ｂｅｒａｒｄら、１９９３；本明細書中に参考として援用される）。二重層において、リン脂質は、一般にゲル構造、結晶格子またはラメラ相をとる（Ｂｅｒａｒｄら、１９９３）。しかし、コレステロール含有量、タンパク質およびイオン環境に依存して、リン脂質は、容易に相を変化させ得、ヘキサゴナルＩＩ相をとる（Ｂｅｒａｒｄら、１９９３；本明細書中に参考として援用される）。免疫原性であると考えられるのは、疾患状況における自己抗体生成について最初に提案されたように、アミノリン脂質のこのヘキサゴナルＩＩ相である（Ｂｅｒａｒｄら、１９９３；本明細書中に参考として援用される）。
【０２４７】
Ｑａｍａｒら（１９９０；本明細書中に参考として援用される）は、ヘキサゴナルアミノリン脂質認識テーマに対するバリエーションを開発した。モデルとしてホスファチジルエタノールアミンを使用して、これらの著者らは、ａＰＬポジティブＳＬＥ血清由来の抗ＰＥ抗体が、ＰＥ、天然のＰＥ分解産物および大部分のＰＥ調製物のありそうな夾雑物に結合しない（しかし実際は、リゾホスファチジルエタノールアミン（ｌＰＥ）に指向される）ことを報告した（Ｑａｍａｒら、１９９０；本明細書中に参考として援用される）。
【０２４８】
他の最近のデータでは、大部分の抗リン脂質抗体がタンパク質付近の状況でリン脂質を認識することが示されている（Ｒｏｔｅ、１９９６；Ｃｈａｍｌｅｙら、１９９１）。形質膜において、リン脂質の大部分は、非抗原性バイラメラ形態で天然に存在するようである（Ｒｏｔｅ、１９９６）。アクセサリ分子は、ヘキサゴナル抗原性形態への遷移を容易にし、そしてそれらの発現の安定化を補助し得る（Ｇａｌｌｉら、１９９３）。例えば、天然に存在する抗リン脂質抗体は、カルジオリピンまたはホスファチジルセリンと、β2−糖タンパク質Ｉ（β2−ＧＰＩもしくはアポリポタンパク質Ｈ（ａｐｏＨ））との複合体を認識することが最初に報告された（Ｇａｌｌｉら、１９９０；１９９３）。β2−ＧＰＩは、純粋なリン脂質には存在しない抗原性コンホメーションでリン脂質を安定化すると考えられる（ＭｃＮｅｉｌら、１９９０；米国特許第５，３４４，７５８号；Ｃｈａｍｌｅｙら、１９９１；Ｍａｔｓｕｕｒａら、１９９４）。プロトロンビンはまた、リン脂質安定化プロセスに関与している（Ｂｅｖｅｒｓら、１９９１）。
【０２４９】
リン脂質結合血漿タンパク質はまた、一般に、電気的に中性または両性イオン性のリン脂質、ホスファチジルエタノールアミンの抗体認識のために必要である。ＳｕｇｉおよびＭｃＩｎｔｙｒｅ（１９９５；本明細書中に参考として援用される）は、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫもしくはＨＫ）および低分子量キニノーゲン（ＬＭＷＫまたはＬＫ）として２つの顕著なＰＥ結合血漿タンパク質を同定した。ＳＬＥおよび／または再発性自然流産の患者に由来する抗ＰＥ抗体は、それらがＥＬＩＳＡプレート上で唯一の抗原として、独立して提示される場合、ＰＥ、ＨＭＷＫまたはＬＭＷＫを認識しないことが示された（ＳｕｇｉおよびＭｃＩｎｔｙｒｅ、１９９５）。ＰＥ−ＨＭＷＫまたはＰＥ−ＬＭＷＫと反応しない他の抗ＰＥポジティブ血清は、第ＸＩ因子またはプレカリクレイン（これは、通常、ＨＭＷＫに結合する）を認識することが示唆された（ＳｕｇｉおよびＭｃＩｎｔｙｒｅ、１９９５；本明細書中に参考として援用される）。
【０２５０】
これらの結果の有効性は、インタクトなＨＭＷＫが種々のリン脂質（例えば、カルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミン）に結合すること；しかし、抗ＰＥ抗体はキニノーゲン−ＰＥ複合体のみを認識し、そして他のリン脂質基質とともに提示されたキニノーゲンを認識しないことを示すことにより確認された（ＳｕｇｉおよびＭｃＩｎｔｙｒｅ、１９９６ａ；本明細書中に参考として援用される）。このことは、ＰＥが、キニノーゲンが他のリン脂質に結合するときには誘導しないキニノーゲンの独特の抗原性のコンホメーション変化を誘導することを示す（ＳｕｇｉおよびＭｃＩｎｔｙｒｅ、１９９６ａ）。
【０２５１】
キニノーゲンが血小板膜において曝露されたＰＥのために、血小板に結合し得ることがさらに示唆される（ＳｕｇｉおよびＭｃＩｎｔｙｒｅ、１９９６ｂ；本明細書中に参考として援用される）。外生的に付加されたキニノーゲン依存抗ＰＥは、インビトロにおけるトロンビン誘導血小板凝固を増加するが、ＡＤＰ誘導凝固は変化しないことが示された（ＳｕｇｉおよびＭｃＩｎｔｙｒｅ、１９９６ｂ；本明細書中に参考として援用される）。対照的に、キニノーゲン非依存抗ＰＥ（ＰＥ自体を認識した）は、トロンビン誘導血小板凝固を増強しないことが報告された。従って、キニノーゲン依存抗ＰＥは、キニノーゲンの通常の抗トロンビン効果を破壊し得ることが提唱された（ＳｕｇｉおよびＭｃＩｎｔｙｒｅ、１９９６ｂ；本明細書中に参考として援用される）。
【０２５２】
従って、ヒト患者由来の抗アミノリン脂質抗体は、一般的に、タンパク質の相互作用により安定化されたアミノリン脂質を認識する抗体の混合物である（Ｒｏｔｅ、１９９６）。抗体は、安定化リン脂質エピトープに結合し得るか、または安定化タンパク質上でのリン脂質とアミノ酸の相互作用から形成されるエピトープに結合し得る（Ｒｏｔｅ、１９９６）。いずれにしても、このような抗体は、ヒトの身体における天然の膜においてアミノリン脂質を明確に認識し、おそらく血漿タンパク質と結合する（ＭｃＮｅｉｌら、１９９０；Ｂｅｖｅｒｓら、１９９１）。従って、これらの抗体は、本発明において使用するための抗体を生成するための出発材料として適切である。
【０２５３】
ヒト患者から抗アミノリン脂質抗体を調製するために、抗アミノリン脂質抗体を有する個体から（例えば、ヒト末梢血、脾臓、リンパ節、扁桃などから）、当業者に周知の技術を用いて、ヒトリンパ球を単に得るだけである。末梢血リンパ球の使用がしばしば好ましい。
【０２５４】
ヒトモノクローナル抗体は、一般に、任意のモノクローナル抗体を生成するために上記されたのと同様の様式で、ヒトリンパ球を不死化することにより所望の抗アミノリン脂質抗体を産生するヒトリンパ球から得られ得る。培養上清中の抗体の反応性は、一般に最初にチェックされ（一つ以上の選択されたアミノリン脂質抗原を使用する）、そして高い反応性を示すリンパ球が増殖される。次いで、得られたリンパ球は、ヒトまたはマウス起源の親株と融合され、そしてさらなる選択が最適なクローンを与える。
【０２５５】
不死化細胞からのモノクローナル抗体の回収は、モノクローナル抗体の産生において一般に使用される任意の方法により達成され得る。例えば、所望のモノクローナル抗体は、限界希釈方法などによって不死化リンパ球をクローニングし、所望の抗体を産生する細胞を選択し、培地または動物の腹腔において選択細胞を増殖し、そして培養上清または腹水から所望のモノクローナル抗体を回収することにより得られ得る。
【０２５６】
このような技術は、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａエピトープ（米国特許第５，１９６，３３７号および同第５，２５２，４８０号、各々は本明細書中に参考として援用される）；ポリリボシルリビトール（ｐｏｌｙｒｉｂｏｓｙｌｒｉｂｉｔｏｌ）リン酸莢膜ポリサッカリド（米国特許第４，９５４，４４９号、本明細書中に参考として援用される）；Ｒｈ（Ｄ）抗原（米国特許第５，６６５，３５６号、本明細書中に参考として援用される）；ならびにウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、ＲＳウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、およびサイトメガロウイルス）（米国特許第５，６５２，１３８号、同５，７６２，９０５号、および同第４，９５０，５９５号、各々本明細書中に参考として援用される）、に対するヒトモノクローナル抗体を単離するために使用されている。
【０２５７】
ヒト抗アミノリン脂質抗体の生成のための前述の技術の適用性は明らかである。Ｒａｕｃｈら（１９８６；本明細書中に参考として援用される）は、一般に、そのような方法を使用して、リンパ芽球株と、ＳＬＥ患者からのリンパ球を融合することによりハイブリドーマを産生した。これは、ホスファチジルエタノールアミンの天然および合成の形態を含む六角相（ｈｅｘａｇｏｎａｌ  ｐｈａｓｅ）リン脂質に結合するヒト抗体を産生した（Ｒａｕｃｈら、１９８６；本明細書中に参考として援用される）。
【０２５８】
さらに、米国特許第５，６４８，０７７号（本明細書中に参考として援用される）に記載される方法を使用して、選択されたアミノリン脂質に対するヒト抗体を産生するトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）またはクアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）を形成し得る。一般的な意味において、親齧歯類不死化細胞（例えば、マウスミエローマ細胞（例えば、ＳＰ−２））を含むハイブリドーマ細胞株は、ヒトのパートナー細胞に融合され、不死化異種ハイブリドーマ細胞を生じる。この異種ハイブリドーマ細胞は、抗アミノリン脂質ヒト抗体を産生し得る細胞に融合され、ヒトにおいてそのような抗原に対して有効なヒト抗体を産生し得るトリオーマ細胞株を生じる。あるいは、より安定であることが所望される場合、好ましくはそれ自体の抗体をもはや産生し得ないトリオーマ細胞株が作製され、次いで、このトリオーマはアミノリン脂質抗原に対して有用な抗体を産生し得るさらなる細胞と融合され、抗原に対する抗体を産生するさらにより安定なハイブリドーマ（クアドローマ）を得る。
【０２５９】
（Ｅ５．ヒトリンパ球由来の抗アミノリン脂質抗体）
ヒト抗アミノリン脂質抗体を生成するために、インビトロ免疫、または抗原刺激もまた使用され得る。このような技術を使用して、抗アミノリン脂質抗体産生ヒト患者由来および正常な健全な被験体由来の両方の末梢血リンパ球を刺激し得る。実際に、Ｖｌａｃｈｏｙｉａｎｎｏｐｏｕｌｏｓら（１９９３；本明細書中に参考として援用される）は、低い力価の抗アミノリン脂質抗体が正常な被験体において存在することを報告した。これが事実でなかったとしても、抗アミノリン脂質抗体は、単にインビトロにおいてアミノリン脂質で抗体産生細胞を刺激することにより健全なヒト被験体から調製され得る。
【０２６０】
このような「インビトロ免疫」は、一般に、リンパ球の混合集団（混合リンパ球培養物、ＭＬＣ）中での非免疫Ｂリンパ球の抗原特異的活性化を含む。インビトロ免疫はまた、Ｂ細胞増殖因子およびＢ細胞分化因子ならびにリンホカインにより支持され得る。これらの方法により産生される抗体は、しばしば、ＩｇＭ抗体である（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋら、１９８６；本明細書中に参考として援用される）。
【０２６１】
別の方法が記載されており（米国特許第５，６８１，７２９号、本明細書中に参考として援用される）、ここで、主にＩｇＧ（またはＩｇＡ）抗体を産生するヒトリンパ球が得られ得る。この方法は、一般的な意味において、ヒトリンパ球が動物の身体内に「生着する（ｔａｋｅ）」ように、免疫不全動物へヒトリンパ球を移植し；抗原に特異的な抗体を産生するヒトリンパ球を生成するように所望の抗原を動物に免疫し；そして動物から抗体を産生するヒトリンパ球を回収する工程を包含する。このように産生されたヒトリンパ球を使用して、抗体を産生するヒトリンパ球を不死化し、抗体を産生する得られた不死化ヒト起源リンパ球をクローニングし、そしてクローニングされた不死化ヒト起源リンパ球から所望の抗原に特異的なモノクローナル抗体を回収することによりモノクローナル抗体を産生し得る。
【０２６２】
この技術において使用され得る免疫不全動物は、動物にヒトリンパ球が移植された場合に拒絶を示さない免疫不全動物である。このような動物は、物理的、化学的、または生物学的な処置により人工的に調製され得る。任意の免疫不全動物が使用され得る。ヒトリンパ球は、ヒト末梢血、脾臓、リンパ節、扁桃などから得られ得る。
【０２６３】
動物における移植されたヒトリンパ球の「生着」は、単に動物にヒトリンパ球を投与することにより達成され得る。投与経路は制限されず、そして例えば、皮下、静脈内、または腹腔内であり得る。ヒトリンパ球の用量は制限されず、そして通常は、動物あたり１０6〜１０8のリンパ球であり得る。次いで、免疫不全動物は、所望のアミノリン脂質抗原で免疫される。
【０２６４】
免疫後、ヒトリンパ球が、任意の従来方法により、血液、脾臓、リンパ節または他のリンパ組織から回収される。例えば、単核細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（比重：１．０７７）遠心法により分離され得、そしてプラスチックディッシュ吸着法により単球が回収され得る。免疫不全動物由来の夾雑細胞は、動物細胞に特異的な抗血清を用いることにより取り除かれ得る。抗血清は、例えば、免疫不全動物の脾臓細胞で第２の異なる動物を免疫し、そして異なる免疫動物から血清を回収することにより得られ得る。抗血清での処置は、任意の段階で実施され得る。ヒトリンパ球はまた、マーカーとして、細胞表面上で発現されるヒト免疫グロブリンを使用する免疫学的方法により回収され得る。
【０２６５】
これらの方法により、一つ以上の選択されたアミノリン脂質に特異的なＩｇＧ抗体およびＩｇＡ抗体を主に産生するヒトリンパ球が得られ得る。次いで、モノクローナル抗体が、不死化、選択、細胞増殖、および抗体産生によりヒトリンパ球から得られる。
【０２６６】
（Ｅ６．ヒト抗体ライブラリーを含有するトランスジェニックマウス）
組換え技術は、今や抗体の調製のために利用可能である。上記に開示されるコンビナトリアル免疫グロブリンファージ発現ライブラリーに加えて、別の分子クローニングアプローチは、抗体をヒト抗体ライブラリーを含有するトランスジェニックマウスから調製することである。このような技術は、米国特許第５，５４５，８０７号に記載され、これは、本明細書に参考として援用される。
【０２６７】
最も一般的な意味において、これらの方法は、その生殖細胞系に、ヒト起源の免疫グロブリンの少なくとも一部をコードする遺伝物質か、または免疫グロブリンのレパートリーをコードするように再編成され得る遺伝物質を挿入したトランスジェニック動物の産生を包含する。挿入された遺伝物質は、ヒト供給源から産生され得るか、または合成により産生され得る。その物質は、公知の免疫グロブリンの少なくとも一部をコードし得るか、または改変された免疫グロブリンの少なくとも一部をコードするように改変され得る。
【０２６８】
挿入された遺伝物質は、トランスジェニック動物において発現され、挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝物質に少なくとも部分的に由来する免疫グロブリンを産生する。たとえ、その挿入された遺伝物質が、生殖系列の誤った位置に、または誤った幾何学で組み込まれたとしても、その一部が挿入された遺伝物質に由来する免疫グロブリンのレパートリーが産生され得るように、その遺伝物質は、トランスジェニック動物において再編成されることが見出される。
【０２６９】
その挿入された遺伝物質は、プラスミドおよび／またはコスミドのような原核生物ベクターにクローン化されたＤＮＡの形態であり得る。より大きなＤＮＡフラグメントは、酵母人工染色体ベクターを使用して（Ｂｕｒｋｅら、１９８７；本明細書中に参考として援用される）、または染色体フラグメントを導入することにより（ＲｉｃｈｅｒおよびＬｏ、１９８９；本明細書中に参考として援用される）挿入される。その挿入された遺伝物質は、従来の様式で宿主に（例えば、注入によって、または他の手順によって、受精卵または胚幹細胞に）導入され得る。
【０２７０】
好ましい局面において、得られるトランスジェニック動物が、免疫グロブリンを産生するときに、挿入されたヒト遺伝物質のみを使用するように、免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝物質をはじめには保有しない宿主動物が利用される。これは、関連する遺伝物質を欠失する天然に存在する変異体宿主を使用して、または人工的に、例えば、細胞株で、関連する遺伝物質が除去されている宿主を究極的に作製するために、変異体を作製することによってのいずれかで、達成され得る。
【０２７１】
宿主動物が免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝物質を保有する場合、トランスジェニック動物は、天然に存在する遺伝物質および挿入された遺伝物質を保有し、そして天然に存在する遺伝物質、挿入された遺伝物質、および両方のタイプの遺伝物質の混合物に由来する免疫グロブリンを産生する。この場合、その所望の免疫グロブリンは、トランスジェニック動物に由来するハイブリドーマを、例えば、抗体遺伝子発現の対立遺伝子排除の現象または示差的染色体損失を利用して、スクリーニングすることによって得られ得る。
【０２７２】
一旦適切なトランスジェニック動物が調製されると、その動物は、所望の免疫原で単に免疫される。挿入される物質の性質に依存して、その動物は、外来起源のその遺伝物質が、免疫グロブリンの一部のみをコードする場合、例えば、混合されたマウス／ヒト起源のキメラ免疫グロブリンを産生し得る；または、その動物は、外来起源の遺伝物質が、免疫グロブリン全体をコードする場合、完全に外来の免疫グロブリン（例えば、完全にヒト起源の）を産生し得る。
【０２７３】
ポリクローナル抗血清は、免疫に続いて、トランスジェニック動物から産生され得る。免疫グロブリン産生細胞は、目的の免疫グロブリンを産生する動物から取り出され得る。好ましくは、モノクローナル抗体は、トランスジェニック動物から、例えば、その動物由来の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合し、そして得られるハイブリドーマをスクリーニングして所望の抗体を産生するものを選択することによって、産生される。このようなプロセスのための適切な技術は、本明細書に記載される。
【０２７４】
代替のアプローチにおいて、その遺伝物質は、所望の抗体が、動物の血清のような体液、またはミルク、初乳もしくは唾液のような外部分泌液において産生されるような様式で、動物に組み込まれ得る。例えば、インビトロでヒト免疫グロブリンの少なくとも一部をコードする遺伝物質を、ミルクタンパク質をコードする哺乳動物の遺伝子にインビトロで挿入し、次いで、その遺伝子をその哺乳動物の受精卵に、例えば、注入により、導入することによって、その卵は、挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝物質に少なくとも部分的に由来する免疫グロブリンを含有するミルクを産生する成体雌性哺乳動物に成長し得る。次いで、所望の抗体は、ミルクから回収され得る。このようなプロセスを行うための適切な技術は、当業者に公知である。
【０２７５】
上記のトランスジェニック動物は、通常、単一のアイソタイプの、より詳細にはＢ細胞成熟に必須であるアイソタイプ（例えば、ＩｇＭおよびおそらくＩｇＤ）のヒト抗体を産生するために使用される。ヒト抗アミノリン脂質抗体を産生するための別の好ましい方法は、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号；および同第５，７７０，４２９号（各々が本明細書に参考として援用される）に記載される。そこでは、Ｂ細胞発達のために必要とされるアイソタイプから他のアイソタイプへ変換し得るトランスジェニック動物が記載される。
【０２７６】
Ｂリンパ球の発達において、その細胞は、まず生産的に再編成されたＶHおよびＶL領域によって決定される結合特異性を有するＩｇＭを産生する。後に、各Ｂ細胞およびその子孫細胞は、同じＬおよびＨ鎖Ｖ領域を有する抗体を合成するが、これらは、Ｈ鎖のアイソタイプを変換し得る。μまたはδ定常領域の使用は、選択的スプライシングによって大部分決定され、ＩｇＭおよびＩｇＤが、単一の細胞において同時発現されることを可能にする。他の重鎖アイソタイプ（γ、α、およびε）は、遺伝子再編成事象が、ＣμエキソンおよびＣδエキソンを削除した後に、ネイティブにおいてのみ発現される。この遺伝子の再編成プロセスは、アイソタイプスイッチングと呼ばれ、代表的には、各重鎖遺伝子のすぐ上流に位置する（δを除く）いわゆるスイッチセグメント間の組換えによって生じる。個々のスイッチセグメントは、２ｋｂと１０ｋｂとの間の長さであり、そして主に短い反復した配列からなる。
【０２７７】
これらの理由により、導入遺伝子は、転写調節配列を、アイソタイプスイッチングに利用されるべき各スイッチ領域の約１〜２ｋｂ上流内に組み込んでいることが好ましい。これらの転写調節配列は、好ましくは、プロモーターおよびエンハンサーエレメントを含み、そしてより好ましくは、スイッチ領域に天然に結合する（すなわち、生殖細胞系の構成において生じる）５’隣接（すなわち、上流）領域を含む。１つのスイッチ領域からの５’隣接配列は、導入遺伝子構築のために異なるスイッチ領域に作動可能に連結され得るが、いくつかの実施態様では、導入遺伝子構築物に組み込まれている各スイッチ領域は、天然に存在する生殖細胞系構成においてすぐ上流に存在する５’隣接領域を有することが好ましい。免疫グロブリンスイッチ領域配列に関連する配列情報は、公知である（Ｍｉｌｌｓら、１９９０；Ｓｉｄｅｒａｓら、１９８９；各々、参考として本明細書に援用される）。
【０２７８】
米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号；および第５，７７０，４２９号に記載される方法では、トランスジェニック動物内に含まれるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、アイソタイプのスイッチングに至るＢ細胞発達の経路を通じて正確に機能する。従って、この方法では、これらの導入遺伝子は、アイソタイプスイッチングおよび以下の１つ以上を生成するように構築される：（１）高レベルおよび細胞型特異的発現、（２）機能的遺伝子再編成、（３）対立遺伝子排除の活性化および対立遺伝子排除に対する応答、（４）十分な一次レパートリーの発現、（５）シグナル伝達、（６）体細胞過剰変異、および（７）免疫応答の間の導入遺伝子抗体遺伝子座の支配。
【０２７９】
導入遺伝子機能に対する重要な要件は、広範な範囲の抗原に対する二次免疫応答の引金となるために十分に多様性である一次抗体レパートリーの生成である。再編成された重鎖遺伝子は、各々がいくつかのエキソンによりコードされる、シグナルペプチドエキソン、可変領域エキソンおよび多ドメイン定常領域の領域のタンデムアレイからなる。これらの定常領域遺伝子の各々は、異なるクラスの免疫グロブリンの定常部分をコードする。Ｂ細胞発達の間に、Ｖ領域近位定常領域は欠失され、新たな重鎖クラスの発現に至る。各重鎖クラスについて、ＲＮＡスプライシングの選択的パターンが、膜貫通免疫グロブリンおよび分泌型免疫グロブリンの両方を生じる。
【０２８０】
ヒト重鎖遺伝子座は、２Ｍｂにまたがるほぼ２００Ｖ遺伝子セグメント、約４０ｋｂにまたがるほぼ３０Ｄ遺伝子セグメント、３ｋｂスパン内でクラスター化された６つのＪセグメント、およびほぼ３００ｋｂにわたって広がる９つの定常領域遺伝子セグメントからなる。全長遺伝子座は、第１４染色体の長腕の遠位部分のほぼ２．５Ｍｂにまたがる。６つの公知のＶHファミリーのすべてのメンバー、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、ならびにμ、δ、γ３、γ１およびα１定常領域を含む重鎖導入遺伝子フラグメントは公知である（Ｂｅｒｍａｎら、１９８８；参考として本明細書に援用される）。ヒト軽鎖遺伝子座からのすべての必要な遺伝子セグメントおよび調節配列を含むゲノムフラグメントは同様に構築される。
【０２８１】
首尾良く再編成された免疫グロブリン重鎖および軽鎖導入遺伝子の発現は、通常、トランスジェニック非ヒト動物において内因性免疫グロブリン遺伝子の再編成を抑制することによって優性効果を有する。しかし、特定の実施態様では、例えば、導入遺伝子と内因性Ｉｇ配列との間のトランススイッチングにより、ヒト可変領域および非ヒト（例えばマウス）定常領域を含むハイブリッド免疫グロブリン鎖が形成され得ないように、内因性Ｉｇ遺伝子座の完全不活性化をもたらすことが所望される。胚幹細胞技術および相同組換えを用いて、内因性免疫グロブリンレパートリーは容易に排除され得る。さらに、内因性Ｉｇ遺伝子の抑制は、アンチセンス技法のような種々の技法を用いて達成され得る。
【０２８２】
本発明の他の局面では、トランススイッチされた免疫グロブリンを生成することが所望され得る。このようなキメラトランススイッチ免疫グロブリンを含む抗体は、例えば、宿主におけるエフェクター機能の保持のために、非ヒト（例えばマウス）定常領域を有することが所望される種々の適用のために用いられ得る。マウス定常領域の存在は、ヒト定常領域に比べ、例えば、このようなキメラ抗体がマウス疾患モデルにおいて試験され得るように、マウスエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、マウス補体固定化）を提供するという利点を与え得る。動物試験の次に、ヒト可変領域コード配列が、例えば、ＰＣＲ増幅または供給源（ハイブリドーマクローン）からのｃＤＮＡクローニングにより単離され、そしてヒト治療使用により適切なヒト配列抗体をコードする所望のヒト定常領域をコードする配列にスプライスされ得る。
【０２８３】
（Ｅ７．ヒト化抗アミノリン脂質抗体）
一般に、ヒト抗体は、ヒト治療における使用に少なくとも３つの可能な利点を有する。第１に、そのエフェクター部分はヒトであるので、例えば、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）によって標的細胞をより効率的に破壊するために、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用し得る。第２に、ヒト免疫系は、異物としてその抗体を認識しないはずである。第３に、ヒト循環中の半減期は、天然に存在するヒト抗体と類似であり、より少なくかつより少ない頻度の用量を与えることを可能にする。
【０２８４】
ヒト抗アミノリン脂質を調製する種々の方法が本明細書中に提供される。ヒト抗体に加えて、「ヒト化」抗体は多くの利点を有する。「ヒト化」抗体は、一般に、ヒト定常および／または可変領域ドメインまたは特定の変更を保持する、マウス、ラット、ハムスター、ウサギまたはその他の種からのキメラまたは変異体モノクローナル抗体である。いわゆる「ヒト化」抗アミノリン脂質抗体を生成するための技法は、当業者に周知である。
【０２８５】
ヒト化抗体もまた、前述の利点を共有する。第１に、エフェクター部分はなおヒトである。第２に、ヒト免疫系は、フレームワークまたは定常領域を異物として認識しないはずであり、そしてそれ故、このような注入抗体に対する抗体応答は、完全に異物であるマウス抗体に対してより少ないはずである。第３に、注入されたヒト化抗体は、注入されたマウス抗体とは対照的に、天然に存在するヒト抗体により類似する半減期を有し、またより少なくかつより少ない頻度の用量を与える。
【０２８６】
ヒト化抗体を産生する多くの方法が記載されている。新たな人工タンパク質分子または「キメラ」抗体を形成するための、タンパク質ジスルフィド結合を通じて連結される抗体ドメインの制御された再編成が利用され得る（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙら、１９８１；本明細書中に参考として援用される）。組換えＤＮＡ技術もまた、マウス抗体可変軽鎖および重鎖ドメインと、ヒト抗体軽鎖および重鎖定常ドメインとをコードするＤＮＡ配列間の遺伝子融合物を構築するために用いられ得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４；本明細書中に参考として援用される）。
【０２８７】
マウスモノクローナル抗体の抗原結合部分または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡ配列は、ヒト抗体重鎖および軽鎖のフレームワークをコードするＤＮＡ配列中に分子手段により挿入され得る（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８；各々は参考として本明細書中に援用される）。発現された組換え産物は、「新形態（ｒｅｓｈａｐｅｄ）」またはヒト化抗体と呼ばれ、そしてヒト抗体軽鎖または重鎖およびマウスモノクローナル抗体の抗原認識部分であるＣＤＲのフレームワークを含む。
【０２８８】
ヒト化抗体を生成する別の方法が、米国特許第５，６３９，６４１号に記載され、本明細書中に参考として援用される。この方法は、新しい表面をつけること（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）により、可変領域におけるヒト表面の提示に起因する改良された治療効力を有するヒト化げっ歯類抗体を提供する。この方法では：（１）抗体重鎖および軽鎖可変領域のプールの位置アラインメントを生成し、重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露位置のセットを与える。ここで、すべての可変領域に対するアラインメント位置は、少なくとも約９８％同一である；（２）重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸残基のセットがげっ歯類抗体（またはそのフラグメント）に対して規定される；（３）このげっ歯類表面曝露アミノ酸残基のセットに最も近接して同一である、重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸残基のセットが同定される；（４）工程（２）で規定された重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸残基のセットが、げっ歯類抗体の相補性決定領域の任意の残基の任意の原子の５Å内にあるアミノ酸残基を除いて、工程（３）で同定された重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸残基のセットで置換される；ならびに（５）結合特異性を有するヒト化げっ歯類抗体が産生される。
【０２８９】
ヒト化抗体の産生についての類似の方法は、米国特許第５，６９３，７６２号；同第５，６９３，７６１号；同第５，５８５，０８９号；および同第５，５３０，１０１号（各々が本明細書中で参考として援用される）に記載される。これらの方法は、１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびドナー免疫グロブリンに由来するさらなるアミノ酸ならびにアクセプトするヒト免疫グロブリンに由来するフレームワーク領域を有するヒト化免疫グロブリンを産生することを包含する。各々のヒト化免疫グロブリン鎖は、通常、ＣＤＲに加えて、ドナー免疫グロブリン中のＣＤＲに直接隣接する１以上のアミノ酸または分子モデリングにより推定される約３Å以内の１以上のアミノ酸のような、ＣＤＲと相互作用して結合親和性をもたらし得るドナー免疫グロブリンフレームワークに由来するアミノ酸を含む。重鎖および軽鎖は、米国特許第５，６９３，７６２号；同第５，６９３，７６１号；同第５，５８５，０８９号；および同第５，５３０，１０１号（各々が本明細書中で参考として援用される）に記載される種々の位置基準の、いずれか１つ、任意の組合せ、または全てを使用することによって、各々設計され得る。インタクトな抗体に組み合わされる場合、ヒト化免疫グロブリンは、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、そして本来の抗原に対するドナー免疫グロブリンと実質的に同じ親和性を保持する。
【０２９０】
ヒト化抗体を産生するためのさらなる方法は、米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，７３３，７４３号（各々が本明細書中で参考として援用される）に記載される。この方法は、抗体をヒト化する概念を、本明細書中にもまた詳細に記載されるファージミドライブラリーと組み合わせる。一般的な意味では、この方法は、目的の抗原に対する抗体または抗体の集団の抗原結合部位に由来する配列を利用する。従って、単一のげっ歯類抗体について、抗体の抗原結合部位の部分を含む配列は、組み合せて完全な抗原結合部位を作製し得るヒト抗体の配列の多様なレパートリーと組み合せられ得る。
【０２９１】
このプロセスにより作製される抗原結合部位は、本来のげっ歯類抗体の配列の部分のみが同様の様式にて抗原と接触するようであるという点で、ＣＤＲグラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）により作製される抗原結合部位とは異なる。選択されたヒト配列は、配列において異なるようであり、そして本来の結合部位のそれらからの抗原と別の接触をなすようである。しかし、抗原に対する本来の配列の部分の結合ならびに抗原およびその抗原結合部位の形状により課される制約は、抗原の同じ領域またはエピトープへのヒト配列の新たな接触を駆動するようである。従って、このプロセスは、「エピトープインプリント選択」（ＥＩＳ）と呼ばれている。
【０２９２】
動物の抗体で開始すると、１つのプロセスは、部分的にヒト抗体である抗体の選択を生じる。このような抗体は、治療において直接的にまたは少数の重要な残基の変更の後に使用されるべきヒト抗体と配列において十分に類似し得る。選択された抗体のげっ歯類成分とヒト配列との間の配列の差異は、ヒト配列の残基を用いて、異なるげっ歯類成分の残基を置換することによって、例えば、個々の残基の部位特異的変異誘発によって、またはループ全体のＣＤＲグラフティングによって、最小化され得る。しかし、完全なヒト配列を有する抗体もまた、作製され得る。従って、ＥＩＳは、それぞれ動物の抗体または部分的なヒト抗体と同じエピトープに結合する、部分的なヒト抗体または完全なヒト抗体を作製するための方法を提供する。ＥＩＳにおいて、抗体フラグメントのレパートリーは、糸状ファージの表面上に提示され得、そして抗原結合活性を有するフラグメントをコードする遺伝子は、抗原へのファージの結合によって選択され得る。
【０２９３】
本発明の使用に意図される抗体をヒト化するためのさらなる方法は、米国特許第５，７５０，０７８号；同第５，５０２，１６７号；同第５，７０５，１５４号；同第５，７７０，４０３号；同第５，６９８，４１７号；同第５，６９３，４９３号；同第５，５５８，８６４号；同第４，９３５，４９６号；および同第４，８１６，５６７号（各々は、本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０２９４】
（Ｅ８．ＰＣＲによる変異誘発）
部位特異的変異誘発は、基礎となるＤＮＡの特異的な変異誘発を通して、個々の抗体の調製において有用な技術である。この技術はさらに、ヒト化しようとしなかろうと、ＤＮＡ内に１以上のヌクレオチド配列の変化を導入することによって、１以上の前述の考慮を組み入れて、配列改変体を調製および試験するすばやい能力を提供する。
【０２９５】
多くの方法が、変異誘発における使用について適切であるが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲTM）の使用は、一般的に現在のところ好ましい。この技術は、所定のＤＮＡ配列中に所望の変異を導入するための迅速かつ効率的な方法を提供する。以下のテキストは、所定の配列によってコードされるアミノ酸を変えるために使用され得るような、配列中に点変異を導入するＰＣＲTMの使用を特に記載する。この方法の適応はまた、ＤＮＡ分子中に制限酵素部位を導入するために適切である。
【０２９６】
この方法において、合成オリゴヌクレオチドは、増幅したセグメントの一方の端に点変異を組み込むために設計される。ＰＣＲTMの後に、増幅したフラグメントは、クレノーフラグメントで処理することによって、平滑末端にされ、次いで、この平滑末端フラグメントは、配列分析を容易にするためにベクター中に連結され、そしてサブクローニングされる。
【０２９７】
変異誘発することが所望されるテンプレートのＤＮＡを調製するために、このＤＮＡは、高コピー数のベクター（例えば、ｐＵＣ１９）中に、変異される領域に隣接する制限部位を使用して、サブクローニングされる。次いで、テンプレートのＤＮＡは、プラスミドのミニプレップを使用して調製される。親配列に基づくが、所望の点変異を含みかつ制限酵素部位によってその５’末端に隣接される、適切なオリゴヌクレオチドプライマーが、自動化合成機を使用して合成される。プライマーは、約１５塩基程度のテンプレートＤＮＡに相同であることが、一般に必要とされる。プライマーは、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製され得るが、これは、ＰＣＲTMの使用について絶対に必要という訳ではない。次いで、このオリゴヌクレオチドの５’末端は、リン酸化されるべきである。
【０２９８】
このテンプレートＤＮＡは、所望の点変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲTMによって増幅されるべきである。増幅緩衝液中のＭｇＣｌ2の濃度は、一般に約１５ｍＭである。一般に、約２０〜２５サイクルのＰＣＲTMが、以下の通りに実行されるべきである：９５℃にて３５秒の変性；５０℃にて２分のハイブリダイゼーション；および７２℃にて２分の伸長。ＰＣＲTMは、一般に、７２℃での約１０分間の最後のサイクルの伸長を含む。最後の伸長工程の後に、約５ユニットのクレノーフラグメントが、反応混合物に添加され、約３０℃にてさらに１５分間インキュベートされるべきである。クレノーフラグメントのエキソヌクレアーゼ活性は、末端を平らにし、そして平滑末端クローニングに適切にするために必要とされる。
【０２９９】
得られた反応混合物は、一般に、この増幅が推定される産物を生じたことを確認するために、非変性アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動によって分析されるべきである。次いで、大部分のミネラルオイルを除去し、クロロホルムで抽出して残っているオイルを除去し、緩衝化フェノールで抽出し、次いで１００％エタノールを用いる沈澱により濃縮することによって、反応混合物を処理する。次に、このオリゴヌクレオチドに使用された隣接配列で切断する制限酵素を用いて、増幅したフラグメントのおよそ半分を消化するべきである。この消化したフラグメントは、低ゲル化／融点アガロースゲル上にて精製される。
【０３００】
このフラグメントをサブクローニングするため、そして点変異を調べるために、平滑末端のライゲーションによって、適切に消化されたベクター中に２つの増幅したフラグメントをサブクローニングする。これは、ミニプレップを使用して、プラスミドＤＮＡが引き続き調製され得るＥ．ｃｏｌｉを形質転換するために使用される。次いで、プラスミドＤＮＡの増幅した部分は、正確な点変異が作製されたことを確認するためにＤＮＡ配列決定によって分析される。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡフラグメント中にさらなる変異を導入し得るので、これは、重要である。
【０３０１】
点変異の導入はまた、一連のＰＣＲTM工程を使用してもたらされ得る。この手順において、この変異を含む２つのフラグメントは、互いにアニールされ、そして相互にプライムされる合成によって伸長される。次いで、このフラグメントは、第２のＰＣＲTM工程によって増幅され、それによって上記のプロトコルに必要とされる平滑末端のライゲーションを回避する。この方法において、テンプレートＤＮＡの調製、オリゴヌクレオチドプライマーの作製および第１のＰＣＲTM増幅は、上記のように実行される。しかし、このプロセスにおいて、選択されたオリゴヌクレオチドは、約１５〜約２０個の間の塩基のストレッチについてテンプレートＤＮＡと相同であるべきであり、そしてまた約１０塩基以上で互いに重複しなければならない。
【０３０２】
第２のＰＣＲTM増幅において、上記の条件を使用して、各々の増幅したフラグメントおよび各々の隣接する配列プライマーを使用して、そして約２０〜約２５の間のサイクルについてＰＣＲTMを実行する。再度、このフラグメントをサブクローニングし、そして上記に概説した工程を使用して点変異が正確であったことを調べる。
【０３０３】
前述の方法のいずれかを使用する際、可能な限り小さなフラグメントを増幅することによって、変異を導入することが一般に好ましい。もちろん、パラメータ（例えば、ＧＣ含量およびこのオリゴの長さによって一般に影響される、オリゴヌクレオチドの融解温度）はまた、注意深く考慮されるべきである。これらの方法の実行、および必要な場合、それらの最適化は、当業者に公知であり、そして本明細書中に参考として援用される、種々の刊行物（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５）にさらに記載される。
【０３０４】
部位特異的変異誘発を実行する場合に、表Ａは、参考として用いられ得る。
【０３０５】
【表Ａ】
2006213734.tif 000002
【０３０６】
（Ｅ９．組換え発現および送達）
多くの方法が、抗体をクローニングするために利用可能である場合、抗アミノリン脂質抗体は、組換え発現の慣用的な方法によって調製され得る。用語「発現構築物」によって、遺伝子産物をコードする核酸を含む任意の型の遺伝的構築物を含むことが意味され、ここで核酸のコード配列の部分または全体は転写され得る。転写物は、一般的に、タンパク質に翻訳される。従って、本明細書中で意図される場合、発現とは、好ましくは、抗アミノリン脂質抗体遺伝子またはＤＮＡの転写、およびｍＲＮＡの抗アミノリン脂質抗体タンパク質産物への翻訳の両方を含む。
【０３０７】
抗アミノリン脂質抗体の発現のために、一旦適切なクローンが得られると、それらがｃＤＮＡベースであろうとゲノムであろうと組換え抗体の産生のための発現系または「構築物」を調製するように進められ得る。原核生物系または真核生物系における発現のためのＤＮＡセグメントの操作は、組換え抗体発現における当業者に一般的に公知の技術によって実施される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；本明細書中で参考として援用される）。構築物が抗アミノリン脂質抗体転写物の発現をもたらすために、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、選択された宿主細胞において発現を促進するプロモーターの転写制御下である。
【０３０８】
組換え的に産生される抗体は、ヒト投与のために精製および処方され得る。あるいは、抗アミノリン脂質抗体をコードする核酸は、遺伝子治療を通して送達され得る。裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドが使用され得るが、リポソームまたはベクターの使用が好ましい。特定ウイルスが、レセプター媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に進入する能力、および宿主細胞ゲノムに組込みそして安定的および効率的にウイルス遺伝子を発現する能力は、それらを、哺乳動物細胞内に外来遺伝子を移入させるための魅力的な候補にさせている。本発明における使用のために好ましい遺伝子治療ベクターは、一般的にウイルスベクターである。
【０３０９】
レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノム中に組込むそれらの能力、大量の外来性遺伝物質を移入させるそれらの能力、広範なスペクトルの種および細胞型に感染するそれらの能力、および特定の細胞株にパッケージングされるそれらの能力に起因して、遺伝子送達ベクターとして見こまれている。他のウイルス（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（例えば、米国特許第５，１３９，９４１号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるウイルス）もまた、遺伝子移入のためのベクターとして作用するように操作され得る。
【０３１０】
外来性遺伝物質を受容し得るいくつかのウイルスは、それらが適応し得るヌクレオチドの数、およびそれらが感染する細胞の範囲において限定されるが、これらのウイルスは、遺伝子発現を首尾良くもたらすことが実証されている。しかし、アデノウイルスは、それらの遺伝産物を宿主ゲノム中に組込まず、従って遺伝子発現のために宿主の複製を必要としない。これは、迅速な遺伝子発現、効率的な遺伝子発現、異種遺伝子発現についてそれらを理想的に適合させる。複製欠損した感染性ウイルスを調製する技術は、当該分野において周知である。
【０３１１】
特定のさらなる実施態様において、遺伝子治療ベクターはＨＳＶである。ＨＳＶを魅力的なベクターにする因子は、ゲノムの大きさおよび組織化である。ＨＳＶは大きいので、複数の遺伝子または発現カセットを組込むことは、より小さな他のウイルス系よりもあまり問題ではない。さらに、種々の性能（例えば、時間的、強度）を有する種々のウイルス制御配列の利用能は、他の系におけるよりも高い程度まで発現を制御することを可能にする。ウイルスが比較的少数でスプライシングされるメッセージを有し、遺伝子操作をさらに容易にすることもまた有利である。ＨＳＶはまた、操作が比較的容易であり、そして高い力価まで増殖され得る。
【０３１２】
もちろん、ウイルス送達系を使用する際には、所望されない夾雑物（例えば、不完全干渉ウイルス粒子または内毒素、および他の発熱物質）を本質的に含まないようにするために十分にビリオンを精製し、その結果、ベクター構築物を受容する細胞、動物、または個体において不都合な反応を全く引き起こさないことが所望される。ベクターを精製する好ましい手段としては、浮遊密度勾配の使用（例えば、塩化セシウム勾配遠心分離）が挙げられる。
【０３１３】
（Ｅ１０．抗体フラグメント）
本来の抗アミノリン脂質抗体の供給源とは無関係に、インタクトな抗体、抗体マルチマー、または抗体の種々の機能的な抗原結合領域のいずれか１つが、本発明において使用され得る。例示的な機能領域は、抗アミノリン脂質抗体のｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントを含む。このような構築物を調製するための技術は、当業者に周知であり、そして本明細書中にてさらに例示される。
【０３１４】
抗体構築物の選択は、種々の因子によって影響され得る。例えば、延長した半減期は、腎臓内のインタクトな抗体の能動的な再吸着（免疫グロブリンのＦｃ片の特性）から生じ得る。従って、ＩｇＧベースの抗体は、それらのＦａｂ’対応物よりも遅い血中クリアランスを示すことが予測される。しかし、Ｆａｂ’フラグメントベースの組成物は、一般に、より良好な組織浸透能力を示す。
【０３１５】
Ｆａｂフラグメントは、非特異的チオールプロテアーゼであるパパインによる免疫グロブリン全体のタンパク質分解によって獲得され得る。パパインはまず、活性部位中のスルフヒドリル基を、システイン、２−メルカプトエタノールまたはジチオトレイトールで還元することによって活性化されなければならない。ストック酵素中の重金属は、最大の酵素活性を保証するために、ＥＤＴＡ（２ｍＭ）でのキレート化によって除去されるべきである。酵素および基質は、通常、１：１００の重量比で一緒に混合される。インキュベーションの後に、この反応は、ヨードアセトアミドを用いるチオール基の不可逆的なアルキル化によってか、または単純に透析によって停止され得る。この消化の完了は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターされ、そして種々の画分は、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅまたはイオン交換クロマトグラフィーによって分離されるべきである。
【０３１６】
ウサギおよびヒト起源のＩｇＧからのＦ（ａｂ’）2フラグメントの調製について通常の手順は、酵素のペプシンによる限定されたタンパク質分解である。この条件（１００×抗体過剰ｗ／ｗ酢酸緩衝液中ｐＨ４．５、３７℃）は、抗体が重鎖間のジスルフィド結合のＣ末端側にて切断されることを示唆する。マウスＩｇＧの消化の速度は、サブクラスで変動し得、そしていくらかの未消化ＩｇＧまたは完全に分解されたＩｇＧを含まない、高収率の活性なＦ（ａｂ’）2フラグメントを得ることは、困難であり得る。特に、ＩｇＧ2bは、完全な分解を高度に受けやすい。他のサブクラスは、最適な結果を生じるために異なるインキュベーション条件（これらの全ては、当該分野で公知である）を必要とする。
【０３１７】
ペプシンによるラットＩｇＧの消化は、０．１Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）、中での透析、次いで１％  ｗ／ｗペプシンを用いる４時間のインキュベーションを含む条件を必要とする；ＩｇＧ1およびＩｇＧ2a消化は、初めに４℃で１６時間の０．１Ｍギ酸緩衝液（ｐＨ２．８）、続いて酢酸緩衝液に対して透析される場合に、改善される。ＩｇＧ2bは、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）中のｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｖ８  プロテアーゼ（３％ｗ／ｗ）における３７℃で４時間のインキュベーションでより一貫した結果を生じる。
【０３１８】
以下の特許および特許出願は、特に、抗アミノリン脂質抗体のｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントを含む抗体の機能的な抗原結合領域の調製および使用に関する本発明の教示をなおさらに補充する目的のために、本明細書中に参考として援用される：米国特許第５，８５５，８６６号および同第５，８７７，２８９号；ならびに米国出願番号第０８／３５０，２１２号（特許第５, ， ；特許料は払われている）；同第０８／４８２，３６９号（米国特許第５， ， ；特許料は払われている）；および同第０８／４８７，４２７号（米国特許第５， ， ；特許料は払われている）。
【０３１９】
（Ｆ．薬学的組成物）
本発明の最も基本的な薬学的組成物は、一般に、少なくとも第１の裸の抗アミノリン脂質抗体またはその抗原結合フラグメント（薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体中に、溶解または分散した）の有効量を含む。組み合わせ治療もまた意図され、そして同じ型の基礎をなす薬学的組成物を、単一医薬および組み合わせ医薬の両方について使用し得る。
【０３２０】
句「薬学的に受容可能、または薬理学的に受容可能」とは、適切なように、動物またはヒトに投与された場合、有害な、アレルギー性のまたは他の不都合な反応を生じない分子実体または組成物をいう。本明細書において使用する場合、「薬学的に受容可能なキャリア」としては、任意のおよび全ての、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸着遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質のための、そのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合である場合を除く限り、治療的組成物中でのその使用が意図される。ヒトへの投与のために、調製物は、ＦＤＡ官庁の生物製剤の基準によって必要とされる、滅菌性、発熱性、一般的安全性および純度の基準を充たすべきである。補助的な活性成分もまた、組成物中に取り込まれ得る。
【０３２１】
（Ｆ１．非経口処方物）
本発明の抗アミノリン脂質抗体は、最もしばしば、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、または他のそのような経路を介する注射のための処方（ぜん動投与および腫瘍もしくは疾患部位（腔内投与）中への直接滴下を含む他）のための処方）のために処方される。抗アミノリン脂質抗体を活性成分として含有する水性組成物の調製は、本明細書の開示に照らして、当業者に公知である。代表的には、そのような組成物は、水溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製され得る；注射前の液体の添加において、溶液または懸濁液を調製するための使用に適切な固体形態もまた調製され得る；そしてその調製物はまた、乳化され得る。
【０３２２】
注射剤での使用に適切な薬学的形態としては、滅菌水溶液または滅菌分散液；ゴマ油、ピーナッツオイル、または水性プロピレングリコールを含む処方物；および滅菌注射可能溶液または滅菌注射可能分散液の即時調製のための滅菌粉末、が挙げられる。全ての場合において、その形態は、滅菌であるべきであり、そして注射可能性が存在する程度に流動性であるべきである。それは、製造および保存の条件下において安定であるべきであり、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の混入作用に対して、保護されるべきである。
【０３２３】
抗アミノリン脂質抗体組成物は、中性または塩の形態において、滅菌水性組成物中に処方され得る。遊離の塩基、または薬理学的に受容可能な塩としての抗アミノリン脂質抗体の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で調製され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸添加塩（タンパク質の遊離のアミノ基を用いて形成される）、および無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸）などを用いて形成される塩が挙げられる。遊離のカルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄（ＩＩＩ））および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン）などから誘導され得る。
【０３２４】
適切なキャリアとしては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含む、溶媒ならびに分散媒体が挙げられる。多くの場合において、等張剤（例えば、糖類または塩化ナトリウム）を含むのが好ましい。適切な流動性は、例えば、コーティング剤（例えば、レシチン）の使用によって、分散の場合において必要とされる粒子サイズの維持によって、および／または界面活性剤の使用によって、維持され得る。
【０３２５】
貯蔵および使用の通常の条件下において、全てのそのような調製物は、防腐剤を含有し、微生物の増殖を防ぐべきである。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。注射可能な組成物の長期の吸着は、吸着を遅延させる薬（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の組成物中での使用によってもたらされ得る。
【０３２６】
処方前、または処方の際に、抗アミノリン脂質抗体は、広範に透析され、所望されない低分子量物質を除去し、および／または、適切な場合、所望のビヒクル中へのより容易な処方のために凍結乾燥されるべきである。滅菌の注射可能溶液は、必要とされる量の活性抗アミノリン脂質抗体を、適切な溶媒中に、上記に列挙した他の種々の成分とともに取り込み、必要に応じて、その後に濾過滅菌されることにより調製される。一般に、分散剤は、種々の滅菌活性成分を、塩基性分散媒体および上記に列挙されたものの中から必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に取り込むことにより調製される。
【０３２７】
滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性抗アミノリン脂質抗体成分、および以前に滅菌濾過されたその溶液由来の任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる減圧乾燥およびフリーズドライ技術である。
【０３２８】
本発明に従う適切な薬学的組成物は、一般に、受容可能な薬学的希釈剤または賦形剤（例えば、滅菌水溶液）と混合された一定の量の抗アミノリン脂質抗体を含み、意図される使用に依存して、一定の範囲の最終濃度を生じる。調製の技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８０（本明細書において参考として援用される）によって例示されるように、一般に当該分野において周知である。エンドトキシンの混入は、安全なレベルに最小限に維持されるべきである（例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満）ことを理解するべきである。さらに、ヒトへの投与のために、調製物は、ＦＤＡ官庁の生物製剤基準によって必要とされる、滅菌性、発熱性、一般的安全性および純度の基準を充たすべきである。
【０３２９】
処方の際に、抗アミノリン脂質抗体溶液は、投薬量処方と適合する様式において、および治療的に有効であるような量において、投与される。処方物は、種々の投薬形態（例えば、上記の注射可能な溶液の型）において容易に投与されるが、他の薬学的に受容可能な形態（例えば、錠剤、ピル、カプセルまたは経口投与のための他の固体、坐剤、腟坐薬、経鼻溶液またはスプレー、エアロゾル、吸入剤、リポソーム形態など）もまた意図される。薬学的「徐放性」カプセルまたは組成物もまた、使用され得る。徐放性処方物は、一般に、長期間にわたって一定の薬物レベルを提供するように設計され、そして本発明に従う抗アミノリン脂質抗体を送達するために使用され得る。
【０３３０】
（Ｆ２．リポソームおよびナノカプセル）
特定の実施態様において、リポソームおよび／またはナノカプセルもまた、抗アミノリン脂質抗体とともに使用され得る。リポソームの処方および使用は、以下に要約されるように、当業者に、一般に公知である。
【０３３１】
リポソームは、水性媒体中に分散されるリン脂質から形成され、そして自発的に多層の同心の二重層ビヒクル（多層ビヒクル（ＭＬＶ）とも称する）を形成する。ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、中心に水溶液を含有する、直径２００〜５００Åの範囲の小さな単層のビヒクル（ＳＵＶ）の形成を生じる。
【０３３２】
リン脂質は、水中に分散される場合、水に対する脂質のモル比に依存して、リポソーム以外の多様な構造を形成し得る。低い比において、リポソームは、好ましい構造である。リポソームの物理学的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。リポソームは、イオンおよび極性物質に対する低い透過性を示し得るが、高温において、その透過性を顕著に変化させる相転移を受ける。相転移は、ゲル状態として公知の密接に充填された、規則正しい構造から、流体状態として公知の疎に充填された、あまり規則正しくない構造への変化を含む。これは、特徴的な相転移温度において生じ、そしてイオン、糖および薬物への透過性の増加を生じる。
【０３３３】
リポソームは、４つの異なる機構を通じて、細胞と相互作用する：マクロファージおよび好中球のような細網内皮系の食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水的な力、もしくは静電的な力のいずれかによるか、または細胞表面成分との特異的な相互作用による細胞表面への吸着；リポソーム含有物の細胞質への同時放出をともなう、リポソームの脂質二重層の形質膜への挿入による形質細胞膜との融合；および、いかなるリポソームの内容物の会合もともなわない、リポソーム脂質の、細胞膜または亜細胞膜への移入、あるいはその逆。１つより多い機構が同時に作動し得るが、リポソームの処方を変化させることは、どの機構が作動するかを変更し得る。
【０３３４】
ナノカプセルは、一般に、安定にかつ再現性のある方法において、化合物を捕獲し得る。細胞内へのポリマーの過剰負荷に起因する副作用を避けるために、そのような超微細粒子（約０．１μｍのサイズ）が、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要求を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子は、本発明における使用が企図され、そしてそのような粒子は、容易に作製され得る。
【０３３５】
（Ｇ．治療用キット）
本発明はまた、本発明の処置方法における使用のための抗アミノリン脂質抗体を含む治療用キットを提供する。そのようなキットは、一般に、適切な容器手段において、少なくとも１つの抗アミノリン脂質抗体の薬学的に受容可能な処方物を含有する。このキットはまた、診断／造影または組み合わせ治療のいずれかのための、他の薬学的に受容可能な処方物を含み得る。例えば、そのようなキットは、化学治療剤または放射線治療剤；抗脈管形成剤；抗腫瘍細胞抗体；および／あるいは抗腫瘍脈管構造性または抗腫瘍支質性のイムノトキシンまたはコアグリガンドのある範囲の任意の１つ以上を含み得る。
【０３３６】
このキットは、任意のさらなる成分を含むかまたは含まない、抗アミノリン脂質抗体を含む１つの容器（容器手段）を有し得るか、あるいは各所望の薬剤のために別々の容器を有し得る。組み合わせ治療剤が提供される場合、単一の溶液が、モル当量の組み合わせにおいてか、または１つの成分が他の成分より過剰においてのいずれかで、予め混合され得る。あるいは、キットの抗アミノリン脂質抗体および他の抗癌剤成分の各々は、患者への投与前に、異なる容器中で別々に維持され得る。
【０３３７】
このキットの成分が、１つ以上の溶液中で提供される場合、溶液は、好ましくは、水溶液であり、特に滅菌水溶液が好ましい。しかし、このキットの成分は、乾燥粉末として提供され得る。試薬または成分が乾燥粉末として提供される場合、この粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成され得る。この溶媒もまた別の容器中で提供され得ることが意図される。
【０３３８】
キットの容器は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段を含み、これらの中で抗アミノリン脂質抗体および任意の他の所望の薬剤が、配置され得、好ましくは適切にアリコートされ得る。別々の成分が含まれる場合、このキットはまた、一般に第２のバイアルまたは他の容器を含み、これらの中にこの成分が配置され、別々に設計された用量での投与を可能にする。このキットは、滅菌の、薬学的に受容可能な緩衝液または他の希釈剤を含むための第２／第３の容器手段もまた、含み得る。
【０３３９】
このキットはまた、抗アミノリン脂質抗体を動物または患者に投与するための手段（例えば、１つ以上の針またはシリンジ、あるいは点眼剤、ピペット、または他のそのような装置でも）を含み得、その手段によって、この処方物が、動物に注入され得るか、または身体の疾患領域に適用され得る。本発明のキットはまた、代表的に、バイアルなど、および他の成分を、市販のために密接な拘束において含む手段（例えば、射出成形またはブロー成形したプラスチック容器）を含み、これらの手段の中で、所望のバイアルおよび他の装置が配置され、そして保持される。
【０３４０】
（Ｈ．腫瘍処置）
本発明の最も重要な使用は、血管化した、悪性腫瘍の処置においてである；ＢＰＨのような良性腫瘍の処置もまた意図される。本発明はまた、疾患の構成要素として、プロトロンビン性血管を有する他の疾患および障害の治療においても使用され得る。そのような脈管関連疾患としては、糖尿病性網膜症、黄斑変性、血管再狭窄（血管形成術後の再狭窄を含む）、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管新生緑内障および乾癬が挙げられ；ならびにまた、血管線維腫、関節炎、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化斑、角膜移植新生血管形成、血友病関節、過形成性瘢痕、オースラー−ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、水晶体後線維増殖、強皮症、トラコーマ、脈管癒着、滑膜炎、皮膚炎、他の種々の炎症性疾患および障害が挙げられ、そして子宮内膜症でさえも挙げられる。
【０３４１】
本発明の抗アミノリン脂質抗体処置は、固形腫瘍の処置のために最も好ましく開発される。そのような使用は、抗アミノリン脂質抗体単独、あるいは化学治療剤、放射線治療剤、アポトーシス剤、抗脈管形成剤および／またはイムノトキシンもしくはコアグリガンドと組み合わせて、使用され得る。本発明によって提供される抗アミノリン脂質抗体の方法は、脈管要素を有する任意の悪性腫瘍の処置において、広範に適用可能である。代表的な血管化腫瘍は、固形腫瘍、特に癌腫であり、これらは、酸素および栄養の支給のために脈管性要素を必要とする。本発明を使用して処置され得る例示的な固形腫瘍としては、肺、胸部、卵巣、胃、膵臓、喉頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆管、結腸、直腸、頚部、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、前立腺、甲状腺の癌腫、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌腫、メラノーマ、グリオーム、神経芽細胞腫などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４２】
本発明は、固形腫瘍を提示する任意の患者の処置における使用に意図される。しかし、本発明が、中程度または大きいサイズの固形腫瘍の処置に特に首尾よいという点で、これらのカテゴリーの患者は、本明細書中に提供される方法および組成物に従う処置から、より有意な利益を受けるようである。
【０３４３】
従って、一般的に、本発明は、約０．３ｃｍ〜０．５ｃｍおよびそれ以上の腫瘍を処置するために使用され得るが、０．５ｃｍより大きいサイズの腫瘍を処置することが、本発明のよりよい用途である。受容可能な動物モデルにおいてすでに行われている研究から、約１．０〜約２．０ｃｍのサイズの腫瘍を提示する患者が、抗アミノリン脂質抗体療法についての患者の好ましい処置群にあると考えられるが、ヒトにおいて見出される最大の腫瘍までを含む腫瘍もまた、処置され得る。
【０３４４】
本発明は、一般的に、予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）または予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）治療として意図されないが、本発明の使用は、中程度または大きいサイズの腫瘍を有する患者の処置のみに正確には限定されない。本発明の広がりのこの局面の根拠となる、多くの理由が存在する。例えば、中程度のサイズまたはより大きい原発性腫瘍を提示する患者はまた、種々の他の転移性腫瘍を有し得、これらの転移性腫瘍は、小さいサイズであるか、または転移性腫瘍播種の初期にあるとさえ考えられている。本発明の抗アミノリン脂質抗体または組み合わせが一般的に患者の全身性循環内に投与される場合、これらは、二次的な、より小さくかつ転移性の腫瘍に対する効果を自然と有するが、このことは、処置の主要な意図でなくてもよい。さらに、腫瘍塊が全体として単一の小さな腫瘍である状況下でさえ、特定の有益な抗腫瘍効果が、本発明の抗アミノリン脂質抗体処置の使用から生じる。
【０３４５】
本発明と関係する使用について最も適切な患者に関して本明細書中に提供されるガイダンスは、特定の患者のプロフィールが、本発明による処置についての患者の選択を補助し得るという教示として意図される。特定の患者の予備選択、または患者のカテゴリーは、血管化腫瘍を有する全ての患者の処置に関係する本発明の基本的有用性を、いかなる方法でも否定しない。さらなる考慮は、本発明の抗アミノリン脂質抗体治療によって提供される腫瘍に対する攻撃が、腫瘍をさらなる治療処置を受けやすくさせ得、その結果、引き続く処置は全体的な相乗効果を生じるか、完全な寛解または治癒を導きさえする。
【０３４６】
任意の特定の型の腫瘍が本発明を使用する処置から除外されることは考えられない。しかし、腫瘍細胞の型は、二次的な治療剤、特に化学療法剤および抗腫瘍細胞イムノトキシンを組合せた本発明の使用に関連し得る。本発明の治療の効果は、腫瘍血管系を破壊することであるため、そしてその血管系は実質的または全体的に全ての固形腫瘍で同じであるために、本発明の抗アミノリン脂質の方法論は、腫瘍細胞自体の特定の表現型または遺伝子型に無関係に、全ての固形腫瘍の処置に広範に、または全体的に適用可能であることが理解される。本明細書中に示されるデータは、壊死に耐性の腫瘍モデルにおける印象的な結果を示すので、特筆すべきものである。
【０３４７】
抗アミノリン脂質抗体の治療的有効用量は、本明細書中に詳述される研究に示されるように、動物モデルからのデータを使用して容易に決定可能である。固形腫瘍を保持する実験動物は、臨床環境に移行する前に適切な治療用量を最適化するために、しばしば使用される。このようなモデルは、効果的な抗癌ストラテジーを予測する際に非常に信頼性があることが公知である。例えば、固形腫瘍を保持するマウス（例えば、本実施例で使用される）は、前臨床試験において広範に使用される。本発明者らは、このような分野で受容されるマウスモデルを使用して、最小の毒性で有益な抗腫瘍効果を与える無改変の（ｎａｋｅｄ）抗アミノリン脂質抗体の作用範囲を決定した。
【０３４８】
当該分野で公知のように、臨床処置を始める前の前臨床試験と関係するガイドラインとして使用され得る、現実的目的が存在する。しかし、受容されるモデルにおいてすでに実証された安全性に起因して、本発明の前臨床試験は、効果を確認することよりもむしろ、最適化の問題により関係する。従って、前臨床試験は、最も有利な抗アミノリン脂質抗体、用量または組み合わせを選択するために利用され得る。
【０３４９】
任意の一貫して検出可能な腫瘍血管系破壊、血栓症および抗腫瘍効果を生じる、任意の抗アミノリン脂質抗体の用量または組合せられた医薬は、さらに有用な発明を規定する。破壊性、血栓性および壊死性の効果は、約１０％と約４０〜５０％の間の腫瘍血管および腫瘍組織において観察され、約５０％と約９９％との間までこのような効果が観察される。本発明はまた、腫瘍の血管下流に対して効果的であり得る。すなわち、本発明は、排出（ｄｒａｉｎｉｎｇ）血管の少なくともサブセットを標的化し、特に、腫瘍から放出されたサイトカインが、これらの血管に作用する場合に、これらの抗原性プロフィールを変化する。
【０３５０】
抗アミノリン脂質抗体の用量または組み合わせ治療の抗腫瘍効果が、この範囲の下端に向かうような状況下でさえ、この治療が、特定の腫瘍標的の状況における他の全ての公知の治療となお等価であるか、またはより効果的でさえあることがあり得ることもまた理解される。特定の腫瘍が中期間または長期間効果的に処置され得ないことは臨床医に不幸にも明らかであるが、特に一般的に提案されている他のストラテジーと少なくともほぼ同様に効果的である場合、それは、本発明の治療の有用性を否定しない。
【０３５１】
血管化腫瘍の処置のための、抗アミノリン脂質抗体または組み合わせの治療薬の適切な用量を設計する際に、当業者は、臨床投与のための適切な用量に到達するために、本明細書中に記載される動物研究から容易に推定し得る。このコンバージョンを達成するために、当業者は、実験動物の単位質量あたり投与される薬剤の質量を計算し、そして好ましくは、実験動物とヒト患者との間の身体表面積の差異を計算する。全てのこのような計算は、当業者に周知でありそして慣用的である。
【０３５２】
例えば、マウス１匹（総体重約２０ｇ）につき２０μｇの抗体の成功用量を採用して、そして質量および表面積に基づく標準的計算を適用すると、ヒト患者における使用に効果的な用量は、患者あたり約１ｍｇ〜約５００ｍｇの抗体であり、そして好ましくは、患者あたり約１０ｍｇ〜約１００ｍｇの抗体である。全ての変動可能な臨床パラメーターおよび治療パラメーターに加え、この変量はまた、壊死に耐性である腫瘍モデルを使用して生成された現在の腫瘍壊死データを説明する。そしてここで、他のモデルにおける染色より少ない腫瘍血管染色が観察された。
【０３５３】
従って、この情報を使用して、本発明者らは、ヒト投与のための有用な低用量の無改変の抗アミノリン脂質抗体が、患者あたり約１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇまたは約３０ｍｇなどであり；そしてヒト投与のための有用な高用量の無改変の抗アミノリン脂質抗体は、患者あたり約２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇまたは約５００ｍｇなどである。ヒト投与のための有用な中程度の用量の無改変の抗アミノリン脂質抗体は、患者あたり約３５ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇまたは約２２５ｍｇなどであることが意図される。上記に引用されたいずれかの実験用量を用いる任意の特定の範囲または特定の記載された範囲の間の任意の中間の値もまた意図される。
【０３５４】
一般に、患者あたり約５〜１００ｍｇ、約１０〜８０ｍｇ、約２０〜７０ｍｇ、約２５〜６０ｍｇ、または約３０〜５０ｍｇなどの抗体の間の投薬量範囲が好ましい。これらの記載の範囲にかかわらず、本明細書中に提示されたパラメーターおよび詳細なガイダンスを考慮して、活性または最適な範囲でのさらなる変更は、本発明の範囲内であることが理解される。患者当たり約５ｍｇまたは１０ｍｇ〜約７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇもしくは１００ｍｇの間および周辺の用量が、現在は好ましいが、より低い用量が、他の薬剤と組み合わせてさらに適切であり得ること、およびより高い用量が、特に、本発明における使用のための結合体化されていない抗アミノリン脂質抗体の安定性が増強される場合、なおさらに許容され得ることが理解される。ヒトまたはヒト化された無改変の抗アミノリン脂質抗体の使用は、本発明を臨床使用のためにさらに安全にし、健常組織における有意な毒性または副作用の機会をさらに減少する。
【０３５５】
本発明の治療レジメの意図は、一般的に、受け入れられない毒性に関連するレベル未満の用量をなお維持しながら、有意な抗腫瘍効果を生成することである。用量自体の変化に加えて、投与レジメはまた、処置ストラテジーを最適化するために採用され得る。現在好ましい処置ストラテジーは、約１〜５００ｍｇの間、および好ましくは、約１０〜１００ｍｇの間の抗アミノリン脂質抗体、またはそれらを含む治療混液を、約７日間以内に約３回投与することである。例えば、約１日目、３日目または４日目、および６日目または７日目に投薬される。
【０３５６】
特定の用量自体の投与において、当業者は、好ましくは薬学的に受容可能な組成物（無菌性、発熱性、純度および一般的な安定性のＦＤＡ基準に従う）を患者に全身的に提供する。静脈内注射は、一般的に好ましく、そして最も好ましい方法は、約１時間または２時間などの期間にわたって連続注入を使用することである。本発明を使用する処置の前にこのようなパラメーターを決定する必要はないが、本明細書中に詳述された研究が、注射の約１２〜２４時間以内に固形腫瘍の血管において特異的に観察される、少なくともいくつかの血栓を生じること、および腫瘍細胞自体が約２４〜７２時間内に死滅し始めることに留意すべきである。広範な腫瘍壊死は、一般に、次の約４８〜９６時間に観察され、そして６０％以上の壊死が観察される。
【０３５７】
当然、広範な使用の前に、臨床試験が実施される。臨床試験の実行の種々のエレメント（患者の処置およびモニタリングを含む）は、本発明の開示を鑑みて当業者に公知である。以下の情報は、このような治験を確立する際の使用のための一般的なガイドラインとして提示されている。
【０３５８】
第１の抗アミノリン脂質抗体の処置研究について選択される患者は、従来の治療の少なくとも１つの過程に応答せず、そして身体検査、実験技術、および／またはＸ線撮影手段によって決定されるような客観的に測定可能な疾患を有する。いずれの化学療法も、本研究に入る少なくとも２週間前に停止する。マウスモノクローナル抗体または抗体部分を使用する場合、患者はマウス免疫グロブリンに対するアレルギーの病歴を有さない。
【０３５９】
特定の利点は、三管腔ポート（ｔｒｉｐｌｅ  ｌｕｍｅｎ  ｐｏｒｔ）を有する中心静脈カテーテルの留置を使用する際に見出される。抗アミノリン脂質抗体は、例えば、０．２２μフィルターを使用して濾過され、そして適切に（例えば、生理食塩水で）１００ｍｌの最終用量に希釈される。使用の前に、この試験サンプルはまた、同様の様式で濾過され、そしてＡ280を測定することによって濾過の前後でその濃度を評価される。予想される回収率は、８７％〜９９％の範囲内であり、次いで、タンパク質の損失についての調整が評価され得る。
【０３６０】
これらの抗アミノリン脂質抗体は、約４〜２４時間の期間にわたって投与され得、各患者は、２〜７日間の間隔で２〜４回の注入を受ける。投与はまた、７日間にわたって一定速度の注入によって実施され得る。任意の用量レベルで与えられる注入は、観察される任意の毒性に依存する。従って、グレードＩＩの毒性が、任意の単回注入後または一定速度注入の間の特定の期間で達した場合、毒性が改善されない限り、さらなる用量を中止するか、またはその一定速度注入を停止する。漸増用量の抗アミノリン脂質抗体は、約６０％の患者が、任意のカテゴリーにおいて、受け入れられないグレードＩＩＩまたはＩＶの毒性を示すまで、患者群に投与される。この値の２／３である用量が、安全用量として定義される。
【０３６１】
身体検査、腫瘍測定、および実験室試験は、もちろん、処置前および１ヶ月後までの間隔で実施される。実験室試験としては、全血球数、血清クレアチニン、クレアチニンキナーゼ、電解質、尿素、窒素、ＳＧＯＴ、ビリルビン、アルブミン、および全血清タンパク質が挙げられる。処置後６０日までに採取された血清サンプルは、投与された抗アミノリン脂質抗体、およびそのいずれかの部分に対する抗体の存在について放射免疫アッセイによって評価される。任意の標準的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡのような）を使用する、血清の免疫学的分析は、抗アミノリン脂質治療剤の薬物動態およびクリアランスの評価を可能にする。
【０３６２】
抗腫瘍応答を評価するために、患者を、最後の注入の、４８時間後〜１週間後に、そして再び３０日後に試験するべきである。触知可能な疾患が存在した場合、全ての塊の二つの垂直直径（ｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）を、処置の間毎日、治療完了後１週間以内、および３０日で測定すべきである。触知可能でない疾患を測定するために、連続ＣＴスキャンが、胸部、腹部、および骨盤の全体を通して、１ｃｍ間隔で、４８時間〜１週間で、そして３０日で再び実施され得る。組織サンプルはまた、組織学的におよび／あるいはフローサイトメトリーにより、疾患部位から、または適切であれば血液もしくは体液サンプルからの生検を用いて評価されるべきである。
【０３６３】
臨床応答は、受容可能な基準により規定され得る。例えば、完全な応答は、処置の１カ月後、全ての測定可能な腫瘍がみられないことにより規定され得る。これに対し、部分的な応答は、処置の１カ月後に、増大を示す腫瘍部位なしでの、全ての評価可能な腫瘍小節の垂直直径の積の和の５０％またはそれ以上の減少により規定され得る。同様に、混合応答は、処置の１カ月後に、一つ以上の部位での進行を伴った、全ての測定可能な病巣の垂直直径の積の５０％以上の減少により規定され得る。
【０３６４】
上記のような臨床試験の結果を鑑みて、さらにより正確な処置レジメンが処方され得る。そうであったとしても、投与量におけるいくらかのバリエーションは、処置される被験体の状態に依存して、後で必要であり得る。投与に責任をもつ医者は、本開示に鑑みて、個々の被験体に適切な用量を決定し得る。このような最適化および調節は、当該分野において慣用的に実施され、そして過剰な実験量をけっして反映しない。
【０３６５】
（Ｉ．腫瘍の画像化）
本発明はさらに、腫瘍処置と抗アミノリン脂質結合リガンドに基づく組み合わせた腫瘍処置および画像化方法を提供する。一つ以上の検出可能な因子に結合させた抗アミノリン脂質結合タンパク質または抗体は、腫瘍のプレ画像化に使用することが構想され、処置の前に信頼性のある画像を形成し、その画像自体が、アミノリン脂質マーカーを標的化する。抗体に加えて、検出可能に標識されたアネキシンおよび他のアミノリン脂質結合リガンドの使用が意図され、これは第一および第二の仮出願番号６０／０９２，５８９号（１９９８年７月１３日出願）および同第６０／１１０，６００号（１９９８年、１２月０２日出願）ならびに同時出願された米国特許出願およびＰＣＴ特許出願（代理人番号４００１．００２３００、４００１．００２３８２、４００１．００２３８３および４００１．００２２１０）（各々が本明細書中に参考として特に援用される）に開示および特許請求される。
【０３６６】
抗アミノリン脂質画像化リガンドもしくは抗体、またはそれらの結合体は、一般的に、検出可能な標識に作動可能に付着したかもしくは結合した抗アミノリン脂質抗体または結合リガンドを含む。「検出可能な標識」は、それらの特異的な機能特性、または化学的特徴のために検出され得る化合物あるいはエレメントであり、その使用により、それらが付着する成分を検出可能になり、そして所望であれば、さらに定量可能にする。好ましくは、検出可能な標識は、非侵襲的方法を用いてインビボで検出可能なものである。
【０３６７】
診断剤として使用のための抗体および結合タンパク質結合体は、一般的に二つのクラスに分類される（インビトロでの診断（例えば、種々の免疫アッセイ）における使用のためのもの、およびインビボでの診断的プロトコルでの使用のためのもの）。インビボでの画像化方法が、本発明での使用のために特に意図される。
【０３６８】
抗体および結合リガンドにそれらを付着させる方法のような多くの適切な画像化剤が、当該分野において公知である（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号および同第４，４７２，５０９号を参照のこと。いずれも本明細書中に参考として援用される）。特定の付着方法は、例えば、抗体に付着されたＤＴＰＡのような有機キレート剤を使用する金属キレート複合体の使用を含む（米国特許第４，４７２，５０９号）。モノクローナル抗体はまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩のような結合剤の存在下で酵素と反応され得る。フルオレセインマーカーとの結合体は、これらの結合剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応により調製される。
【０３６９】
検出可能な標識の例は、常磁性イオンである。この場合、適切なイオンとしては、以下が挙げられる：クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、およびエルビウム（ＩＩＩ）（ガドリニウムが特に好ましい）。
【０３７０】
他の状況（例えば、Ｘ線画像化）において有用なイオンは、以下を含むがそれらに限定されない：ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）および特にビスマス（ＩＩＩ）。蛍光標識には、ローダミン、フルオレセイン、およびレノグラフィンが挙げられる。ローダミンおよびフルオレセインは、しばしば、イソチオシアネート中間体を介して結合される。
【０３７１】
診断的適用のための放射活性アイソトープの場合、適切な例としては、以下が挙げられる：14炭素、51クロム、36塩素、57コバルト、58コバルト、銅67、152Ｅｕ、ガリウム67、3水素、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、インジウム111、59鉄、32リン、レニウム186、レニウム188、75セレニウム、35硫黄、テクネチウム99m、およびイットリウム90。125Ｉは、しばしば、特定の実施態様において使用するために好ましく、そしてテクネチウム99mおよびインジウム111はまた、しばしば、それらが低エネルギーでありかつ広範囲での検出に適しているために好ましい。
【０３７２】
本発明における使用のための放射能標識された抗アミノリン脂質抗体および結合リガンドは、当該分野で周知の方法により生成され得る。例えば、ラジオアイソトープ性金属イオンを抗体に結合するために、しばしば使用される中間体官能基は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）およびエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【０３７３】
モノクローナル抗体はまた、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウム、および次亜塩素酸ナトリウムのような化学的酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼのような酵素酸化剤と接触することによりヨウ素化され得る。本発明による抗アミノリン脂質抗体は、リガンド交換プロセスにより、例えば、二価のスズの溶液で過テクネチウム酸（ｐｅｒｔｅｃｈｎａｔｅ）を還元し、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム上でその還元されたテクネチウムをキレート化し、そしてこのカラムに抗体を適用することにより、テクネチウム99mで標識され得る；または直接的標識技術により、例えば、過テクネチウム酸、ＳＮＣｌ2のような還元剤、ナトリウム−カリウムフタレート溶液のような緩衝溶液、および抗体をインキュベートすることにより、標識され得る。
【０３７４】
検出可能に標識された抗アミノリン脂質抗体およびアミノリン脂質結合リガンドの上記の型のいずれも、本発明の画像化の局面において使用され得る。腫瘍画像化と処置の組み合わせにおいて使用するために今までに提案されていないが、米国特許第５，６２７，０３６号；ＷＯ９５／１９７９１；ＷＯ９５／２７９０３；ＷＯ９５／３４３１５；ＷＯ９６／１７６１８；およびＷＯ９８／０４２９４の検出可能に標識されたアネキシンがまた、使用され得る；各々が本明細書中に参考として援用される。
【０３７５】
ＷＯ９５／２７９０３（本明細書中に参考として援用される）は、アポトーシス細胞の検出において使用するためのアネキシンを提供する。ＷＯ９５／２７９０３の任意のアネキシン検出可能剤マーカーは、本発明において使用され得るが、これらの特定のいくつかはインビトロにおける使用のためにより適切であることが理解される。ＷＯ９５／２７９０３はまた、本発明の治療薬と組み合わせた使用に適合され得る検出可能なキットを提供する目的のために特に本明細書中に参考として援用される。
【０３７６】
ＷＯ９５／１９７９１；ＷＯ９５／３４３１５；ＷＯ９６／１７６１８；およびＷＯ９８／０４２９４；の各々はまた、診断的画像化のための放射標識されたアネキシン結合体をさらに記載する目的で本明細書中に参考として援用される。前述の文書の各々の意図は、血管の血栓症、特に心臓内のもしくは心臓付近の血栓症（例えば、深部の血管血栓症、肺の塞栓症、心筋梗塞、心房性細動、人工心臓弁材料（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ）での問題、発作など）の画像化において使用するための放射標識されたアネキシンを提供することである。これらの放射性標識されたアネキシンはまた、活性化された血小板の画像化（例えば、膿瘍、再狭窄、関節の炎症、大脳動脈における血餅などの状態）において使用するために提唱された。
【０３７７】
米国特許第５，６２７，０３６号（本明細書中に参考として援用される）はまた、一般的に、血小板のホスファチジルセリンの分析において使用するための「アネキシン」結合リガンドに関する。動脈の血栓症、冠状動脈血栓症、および静脈血栓症のような止血性の障害（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）が、通常、突発性であり、これが、予測および予防を困難にすることが米国特許第５，６２７，０３６号において説明される。そのような止血性の障害を早期に認識するために、活性化された血小板の検出が提案される。従って、検出可能に標識されたアネキシン組成物が、止血性の障害において活性化された血小板を検出するために開示される（米国特許第５，６２７，０３６号）。
【０３７８】
広範な診断用途が提唱されているが、ＷＯ９５／１９７９１；ＷＯ９５／３４３１５；ＷＯ９６／１７６１８；またはＷＯ９８／０４２９４のいずれも、固形腫瘍の血管系の画像化に言及していない。米国特許第５，６２７，０３６号も何らそのような示唆をしていない。それでもなお、開示された検出可能な放射性標識されたアネキシン組成物それ自体が今や、本明細書中に開示された驚くべき発見に照らして、この点に関して利用するために使用され得る。
【０３７９】
特に、米国特許第５，６２７，０３６号は（本明細書中に参考として援用される）、フルオレセインイソチオシアネート；ハロゲン、テクネチウム、鉛、水銀、タリウムまたはインジウムのラジオアイソトープ；および常磁性造影剤、で検出可能に標識されたアネキシンを開示する。
【０３８０】
ＷＯ９５／１９７９１（本明細書中に参考として援用される）は、キレートに放射性核種を複合体化することにより放射性標識され得るＮ2Ｓ2キレートに結合されたアネキシンの結合体を提供する。ＷＯ９５／３４３１５（本明細書中に参考として援用される）は、Ｎ2Ｓ2キレートを有する一つ以上のガラクトース残基を含むアネキシン結合体を提供する。このガラクトース部分は、環化から放射性標識された結合体の急速な除去を促進し、非標的組織への放射線によるダメージおよびバックグラウンド「ノイズ」を減少するといわれる。
【０３８１】
次いで、ＷＯ９６／１７６１８（本明細書中に参考として援用される）は、ガラクトース残基およびＮ2Ｓ2キレートのクラスターを有するアネキシンを含む診断用画像化剤で放射性標識するために適切なアネキシン結合体を提供する。これらは、前述の放射標識されたアネキシンガラクトース結合体よりも、より短い環化半減期および標的部位に対するより高い結合親和性を有することが報告される。
【０３８２】
なおさらに放射性標識されたアネキシン結合体は、ＷＯ９８／０４２９４（本明細書中に参考として援用される）により提供される。これらの結合体は、哺乳動物の肝臓レセプターにより認識されるヘキソース部分に結合された接近可能なスルヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）基を提供するように改変されたアネキシンを含む。エステラーゼ感受性結合を介して結合されるアネキシンマルチマー結合体およびキレート化化合物がまた提供される。
【０３８３】
ＷＯ９５／１９７９１；ＷＯ９５／３４３１５；ＷＯ９６／１７６１８；およびＷＯ９８／０４２９４の各々はまた、「コールドキット（ｃｏｌｄ  ｋｉｔｓ）」（すなわち、成分が、別々のバイアル中に提供される）中のパッケージングに受け入れられる放射性標識するためのアネキシン結合成分を提供するために、特に本明細書中に参考として援用される。米国特許第５，６２７，０３６号は同様に、本明細書中で使用に適用し得る検出可能に標識されたアネキシンを受けるように区分化されたキャリアを含むキットを提供する。
【０３８４】
インビトロ診断に使用するために適切であるが、本発明のアミノリン脂質検出方法は、治療剤−標的化剤構築物で処置する前に、患者の腫瘍の血管系の画像を形成するためにむしろ意図される。インビボ診断方法または画像化方法は、一般的に、非侵襲的方法により検出可能であるマーカーに結合された抗アミノリン脂質抗体または結合リガンドの診断的有効量を患者に投与する工程を含む。抗体−マーカー結合体または結合リガンド−マーカー結合体を腫瘍血管系の管腔表面上で発現されるアミノリン脂質に対して十分な時間局在化させ、そして結合させる。次いで、患者は、検出可能なマーカーを同定するために検出デバイスに曝露され、それにより、腫瘍血管系の画像を形成する。
【０３８５】
核磁気スピン共鳴アイソトープ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｐｉｎ−ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｓｏｔｏｐｅ）（例えば、ガドリニウム）は、核磁気画像化デバイスを用いて検出され；そして放射活性物質（例えば、テクネチウム99mまたはインジウム111）は、γシンチレーションカメラまたは検出装置を用いて検出される。米国特許第５，６２７，０３６号はまた、そのような検出可能に標識された構築物の個体の血液への安全かつ効率的な導入に関するさらなる手引き、および検出可能に標識されたアネキシンの分布を体外的に、例えば、γシンチレーションカメラを用いて、または磁気共鳴測定により決定するための手段を提供するために、本明細書中に参考として特に援用される。
【０３８６】
画像化の実施態様のための投与量は、一般的に、治療のためのものよりは少ないが、これもまた患者の年齢および体重に依存する。患者あたり、約０．１、０．５、または約１ｍｇと約９または１０ｍｇの間、およびより好ましくは約１ｍｇと約５〜１０ｍｇの間の、抗アミノリン脂質抗体−結合体またはアミノリン脂質結合リガンド−結合体の１回用量が、有用であると考えられる。米国特許第５，６２７，０３６号；およびＷＯ９５／１９７９１（本明細書中に参考として援用される）はまた、検出可能に標識されたアネキシンの用量に関する教示である。
【０３８７】
（Ｊ．組み合わせ治療）
本発明の抗アミノリン脂質抗体処置方法は、患者が示す特定の腫瘍、疾患または障害の処置において、一般的に使用されるほかの任意の方法と組み合わせられ得る。特定の治療的アプローチが、患者の状態に、それ自体で有害であることが公知でなく、そして抗アミノリン脂質抗体の処置を有意に阻害しない限り、本発明とのその組み合わせが意図される。
【０３８８】
固形腫瘍処置と関連して、本発明は、古典的なアプローチ（例えば、手術、放射線治療、化学療法など）との組み合わせにおいて使用され得る。それゆえ、本発明は、組み合わせ治療を提供し、そこでは、抗アミノリン脂質抗体が、手術、または放射線治療と、同時に、その前に、またはその後に使用される；または従来の化学療法剤、放射線療法剤、または抗血管形成剤、あるいは標的化イムノトキシンまたは凝固剤とともに、その前に、またはその後に、患者に投与される。
【０３８９】
他の血管疾患のための組み合わせ治療がまた、意図される。そのような特定の例は、当該分野において現在実施されている他の治療との組み合わせにおいて、抗アミノリン脂質抗体で処置され得る良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）である。例えば、ＢＰＨ内に局在化されたマーカー（例えば、ＰＳＡ）に対するイムノトキシンの標的化。
【０３９０】
１つ以上の薬剤が抗アミノリン脂質抗体治療との組み合わせにおいて使用される場合、組み合わされた結果が、各処置が別々に実施されるときに観察される効果の相加である要件はない。少なくとも相加的効果が、一般的に、望ましいが、単一の治療の任意の１つを超える増加した抗腫瘍効果が有益である。また、組み合わせ治療が相乗効果を示す特定の要件は存在しないが、これは、もちろん可能であり、かつ有利である。潜在的に相乗的な効果を達成する際の使用が特に意図される薬剤は、腫瘍内皮に傷害を与えるか、またはアポトーシスを誘導する薬剤である。なぜなら、そのような傷害またはアポトーシスが、全体的な治療効果を増幅するからである。
【０３９１】
組み合わせられた抗腫瘍治療を実施するために、動物内でそれらの組み合わされた抗腫瘍作用を生じるに効果的な様式で別の抗癌剤と組み合わせて、抗アミノリン脂質抗体を動物に単に投与する。従って、その薬剤は、腫瘍血管系内にそれらを組み合わせて存在させ、かつ腫瘍環境においてそれらの組み合わされた作用が生じるに、有効な量および有効な時間で提供される。この目的を達成するために、抗アミノリン脂質抗体および抗癌剤が、同時に、単一の組成物または異なる投与経路を用いる２つの異なる組成物のいずれかにおいて、動物に投与され得る。
【０３９２】
あるいは、抗アミノリン脂質抗体処置は、抗癌剤処置の前に、または続いて、例えば、数分から数週間にわたる間隔でなされ得る。特定の実施態様において、抗癌剤および抗アミノリン脂質抗体が動物に別々に適用される場合、有意な期間が、各送達期間の間の失効しないこと（抗癌剤および抗アミノリン脂質抗体組成物が、なお腫瘍に対する有利な組み合わされた効果を発揮し得るように）を保証する。そのような場合、腫瘍と両方の薬剤とを、互いの間約５分から約１週間で、より好ましくは互いの間約１２〜７２時間で接触させることが意図され、約１２〜４８時間のみの時間の遅延が最も好ましい。
【０３９３】
抗アミノリン脂質抗体の前に投与される抗癌剤の例は、腫瘍血管系内でアミノリン脂質の発現を誘導する薬剤である。例えば、局在化されたカルシウム産生を刺激する、および／またはアポトーシスを誘導する薬剤は、一般的に、ＰＳ発現の増加を生じ、次いでこれは、続いて抗ＰＳ抗体を使用して標的化され得る。抗アミノリン脂質抗体は、まず、他の状況において腫瘍の破壊を引き起こすために投与され、次いで、抗血管形成治療または壊死腫瘍細胞の標的化に関する治療がなされる。
【０３９４】
ガンの処置における物質の組み合わせの一般的な使用は、周知である。例えば、米国特許第５、７１０、１３４号（本明細書中に参考として援用される）は、非毒性物質または「プロドラッグ」との組み合わせにおいて腫瘍において壊死を誘導する成分を開示する。壊死プロセス切断により放出された酵素は、非毒性の「プロドラッグ」を切断して、毒性の「薬物」にし、これは、腫瘍細胞死を導く。また、米国特許第５，７４７，４６９号（本明細書中に参考として援用される）は、ｐ５３およびＤＮＡ損傷因子（ＤＮＡ  ｄａｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）をコードするウイルスベクターの組み合わされた使用を開示する。任意のこのような類似のアプローチが、本発明とともに使用され得る。
【０３９５】
いくつかの状況において、有意に処置期間を延長（それぞれの投与間に数日（２、３、４、５、６または７）、数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）あるいはさらに数ヶ月（１、２、３、４、５、６、７または８）の経過）することは、望ましくさえあり得る。これは、１つの処置が、実質的に腫瘍を破壊することを意図し（例えば、抗アミノリン脂質抗体処置）、そして別の処置が、微小転移巣または腫瘍の再増殖を予防することを意図する（例えば、抗血管形成剤の投与）状況において、有利である。Ｈａｇｅｍｅｉｅｒら（１９８６）のＥＮ７／４４抗体は、有効な抗血管形成剤とは考えられておらず、これは欠損の中でとりわけ、表面に接近可能な抗原への結合を欠く。
【０３９６】
抗アミノリン脂質抗体または抗癌剤のいずれかの一つ以上の投与が利用され得ることがまた、想定される。抗アミノリン脂質抗体および抗癌剤は、１日おきまたは１週間おきに、交換可能に投与され得る；または一連の抗アミノリン脂質抗体処置が行われ、次いで、一連の抗癌剤治療が行なわれ得る。いずれにせよ、組み合わせ治療を用いて腫瘍の後退を達成するために、必要とされる全ては、投与時間にかかわらず、抗腫瘍効果を発揮するに有効な組み合わされた量で両方の薬剤を送達することである。
【０３９７】
手術に関して、任意の外科的介入が、本発明との組み合わせにおいて実施され得る。放射線療法と関連して、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘導する任意の機構（例えば、γ−照射、Ｘ線、ＵＶ−照射、マイクロ波、およびさらに電子発光（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ）など）が意図される。腫瘍細胞への指向されたラジオアイソトープの送達がまた意図され、そしてこれは、標的化抗体または他の標的化手段との関連において使用され得る。
【０３９８】
サイトカイン治療はまた、組み合わされた治療レジメンの有効なパートナーであることが実証された。種々のサイトカインは、そのような組み合わせアプローチにおいて使用され得る。サイトカインの例には、以下が挙げられる：ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ。サイトカインは、臨床的な指標（例えば、患者の状態、および／またはサイトカインの相対的な毒性）と一致する標準的なレジメンに従って投与される。ウテログロビン（ｕｔｅｒｏｇｌｏｂｉｎ）をまた使用して、転移を予防または阻害し得る（米国特許第５，６９６，０９２号；本明細書中に参考として援用される）。
【０３９９】
（Ｊ１．化学療法剤）
特定の実施態様において、本発明の抗アミノリン脂質抗体は、化学療法剤と組み合わせて投与され得る。化学療法薬は、増殖する腫瘍細胞を殺傷し、処置全体によって作製される壊死領域を増強し得る。従って、薬物は、抗アミノリン脂質抗体の血栓作用を増強し得る。
【０４００】
腫瘍管における血栓の形成を誘導することによって、抗アミノリン脂質抗体は、腫瘍内の薬物の保持または捕獲によって化学療法剤の作用を増強し得る。従って、化学療法剤は、腫瘍内に保持される一方、薬物の残物は、身体から一掃される。従って、腫瘍細胞は、より長期間の間、より高濃度の薬物に曝露される。この腫瘍内の薬物の捕捉は、薬物の用量の減少を可能にし、このことは、処置をより安全かつ効果的にする。
【０４０１】
潜在的な機構には無関係に、種々の化学療法剤が、本明細書中に開示される組合せ処置方法において使用され得る。例示として意図される化学療法剤には、例えば、タモキシフェン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６)、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシン  Ｃ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）ならびにそれらの誘導体およびプロドラッグが挙げられる。
【０４０２】
当業者に理解されるように、適切な用量の化学療法剤は、一般に、臨床治療においてすでに利用されてきており、ここで、この化学療法剤は、単独で、または他の化学療法剤と組み合わせて投与される。例示のみのために、シスプラチンのような薬剤、および他のＤＮＡアルキル化剤が使用され得る。シスプラチンは、癌を処置するために広範に使用されており、臨床適用において使用される有効な用量は、３つの経路について、総計３週間毎に５日間２０ｍｇ／ｍ2である。シスプラチンは、経口で吸収されず、従って、注射を介して、静脈内で、皮下で、腫瘍内で、または腹腔内で送達されねばならない。
【０４０３】
さらに有用な薬剤は、ＤＮＡ複製、有糸分裂、および染色体分離および／またはチューブリン活性に干渉する化合物を含む。このような化学療法剤化合物には、アドリアマイシン（ドキソルビシンとしてもまた公知である）、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシン、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）などが挙げられる。新形成の処置のための臨床設定において広範に使用されるので、これらの化合物は、静脈内では、アドリアマイシンについて２１日間隔で２５〜７５ｍｇ／ｍ2からエトポシドについては３５〜５０ｍｇ／ｍ2までの範囲の用量で、静脈内にボーラス注射を通じて、または経口的に静脈内用量の２倍で、投与される。
【０４０４】
ポリヌクレオチド前駆体の合成および忠実度を崩壊させる薬剤もまた使用され得る。特に有用なものは、広範な試験を受け、そして容易に利用可能な薬剤である。そのようなものとして、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような薬剤は，新形成組織によって優先的に使用され、このことは、新形成細胞に対する標的化について、この薬剤を特に有用にさせる。非常に毒性の５−ＦＵは、広範囲のキャリア（局所を含む）において適用可能であるが、３〜１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量を有する静脈内投与が一般に使用される。
【０４０５】
組合せ治療に関して有用である例示的な化学療法剤は、表Ｂにおいて列挙される。そこで列挙される各薬剤は、例示的であり、そして限定することを意味しない。当業者は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、第３３章（特に６２４頁〜６５２頁）に指向される。投薬量におけるいくつかの改変は、必要に応じて、処置されるべき被験体の状態に依存して生じる。投与に責任のある医師は、個々の被験体について適切な用量を決定し得る。
【０４０６】
【表Ｂ】
2006213734.tif 000003
【０４０７】
2006213734.tif 000004
【０４０８】
2006213734.tif 000005
【０４０９】
（Ｊ２．抗新脈管形成）
用語「新脈管形成」は、一般に、組織または器官への新たな血管の生成をいう。正常な生理学的条件下では、ヒトまたは動物は、非常に特異的な制限された状況においてのみ新脈管形成を受ける。例えば、新脈管形成は、通常、創傷治癒、胎児および胚発生、ならびに黄体、子宮内膜および胎盤の形成において観察される。制御されていない（持続性のおよび／または調節されていない）新脈管形成は、種々の疾患状態に関連し、ならびに腫瘍増殖および転移の間に生じる。
【０４１０】
制御された新脈管形成および制御されていない新脈管形成はともに、類似の様式において進行すると考えられている。内皮細胞および周皮細胞（基底膜によって囲まれる）は、毛細血管を形成する。新脈管形成は、内皮細胞および白血球により放出される酵素によって基底膜の侵食で開始する。次いで、内皮細胞（これは、血管の内腔に沿う）は、基底膜を通って突出する。新脈管形成刺激因子は、内皮細胞を、腐食された基底膜を通じて遊走するように誘導する。遊走する細胞は、親血管から「新芽」を形成し、ここで、この内皮細胞は有糸分裂を受け、そして増殖する。内皮新芽は、互いに合わせられて、新たな血管を作製する毛細血管のループを形成する。
【０４１１】
持続性の調節されていない新脈管形成は、腫瘍発生および転移の間に生じるので、本発明の処置方法は、任意の１つ以上の「抗新脈管形成」治療と合わせて使用され得る。組合せ治療に関して有用である例示的な抗新脈管形成剤は、表Ｃに列挙される。ここで列挙される各薬剤は、例示であり、決して限定ではない。
【０４１２】
【表Ｃ】
2006213734.tif 000006
【０４１３】
2006213734.tif 000007
【０４１４】
新脈管形成を阻害することにおいて使用するための特定の好ましい成分は、「アンギオスタチン」と命名されたタンパク質である。この成分は、米国特許第５，７７６，７０４号；同第５，６３９，７２５号および同第５，７３３，８７６号において開示されている。これらの各々は、本明細書中に参考として援用される。アンギオスタチンは、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定される場合、約３８ｋＤａ〜約４５ｋＤａの分子量を有するタンパク質であり、これは、プラスミノーゲン分子のほぼクリングル領域１〜４を含む。アンギオスタチンは、一般に、インタクトなマウスプラスミノーゲン分子のアミノ酸番号９８から開始するマウスプラスミノーゲンのフラグメントと実質的に類似のアミノ酸配列を有する。
【０４１５】
アンギオスタチンのアミノ酸配列は、種の間でわずかに変化する。例えば、ヒトアンギオスタチンにおいて、このアミノ酸配列は、上記のマウスプラスミノーゲンフラグメントの配列と実質的に類似であるが、活性なヒトアンギオスタチン配列は、インタクトなヒトプラスミノーゲンアミノ酸配列のアミノ酸番号９７または９９のいずれかで開始し得る。さらに、ヒトプラスミノーゲンは、類似の抗脈管形成活性を有するので、マウス腫瘍モデルにおいて示されるように使用され得る。
【０４１６】
特定の抗脈管形成治療は、腫瘍後退を生じることがすでに示されており、そしてアンギオスタチンは、その１つの薬剤である。エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩの２０ｋＤａ  ＣＯＯＨ−末端フラグメント）、細菌性ポリサッカリドＣＭ１０１、および抗体ＬＭ６０９もまた、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）活性を有する。しかし、これらの他の特性を考慮して、これらは、新脈管形成を阻害するだけでなくほとんど規定されていない機構を通じて腫瘍管の破壊を開始するので、これらは抗血管治療または腫瘍管毒素といわれる。本発明のこれらの組合せは、明白に想到される。
【０４１７】
アンギオスタチンおよびエンドスタチンは、マウスにおいて、腫瘍増殖を阻害するだけでなく腫瘍後退もまたもたらす能力が実証された最初の新脈管形成インヒビターであるので、これらは熱心な研究の焦点となる。エラスターゼ、マクロファージメタロエラスターゼ（ＭＭＥ）、マトリリシン（ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）（ＭＭＰ−７）、および９２ｋＤａゼラチナーゼＢ／ＩＶ型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−９）を含む、プラスミノーゲンからアンギオスタチンを生成することが示される複数のプロテアーゼが存在する。
【０４１８】
ＭＭＥは、腫瘍においてプラスミノーゲンからアンギオスタチンを生成し得、そして顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）は、アンギオスタチンの生成を誘導するマクロファージによってＭＭＥの発現をアップレギュレートする。アンギオスタチン生成におけるＭＭＥの役割は、ＭＭＥが患者由来の肝細胞癌の臨床サンプルにおいて実際に発現されるという知見によって支持される。アンギオスタチンを生成し得ると考えられる別のプロテアーゼは、ストロメライシン−１（ＭＭＰ−３）である。ＭＭＰ−３は、インビトロにおいてプラスミノーゲンからアンギオスタチン様フラグメントを生成することが示されている。
【０４１９】
アンギオスタチンについての作用機構は現在のところ明らかではなく、アンギオスタチンは、プログラム化された細胞死または有糸分裂の停止を受けるように内皮細胞を誘導する内皮細胞上の同定されていない細胞表面レセプターに結合すると推定されている。エンドスタチンは、さらにより強力な抗新脈管形成および抗腫瘍剤であるようであるが、その生物学がほとんど明らかではない。エンドスタチンは、マウスにおける多くの腫瘍モデルにおいて後退を生じることにおいて有効である。腫瘍は、エンドスタチンに対する耐性を発生させず、そして複数のサイクルの処置後に、腫瘍は、休眠状態に進入し、この間、これらは容量において増加しない。この休眠状態において、アポトーシスを受ける腫瘍細胞の割合は増加し、そして本質的に同じサイズをとどめる集団を生じた。エンドスタチンはまた、同定されていない内皮細胞表面レセプターに結合し、その効果を媒介すると考えられている。
【０４２０】
ＣＭ１０１は、細菌性ポリサッカリドであり、これは、腫瘍において新血管炎症を誘導する能力において十分に特徴付けられている。ＣＭ１０１は、補体系の活性化を刺激する脱分化した内皮上で発現されるレセプターに結合し、そして架橋する。それはまた、腫瘍を選択的に標的するサイトカイン駆動化炎症応答を開始する。これは、発現ＶＥＧＦおよびそのレセプターをダウンレギュレートする独特の抗病理新脈管形成剤である。ＣＭ１０１は、現在、抗癌剤として臨床試験中であり、そしてこれと組み合わせて使用され得る。
【０４２１】
トロンボスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）（ＴＳＰ−１）および血小板因子４（ＰＦ４）もまた、本発明と合わせて使用され得る。これらはともに、へパリンと会合する新脈管形成インヒビターであり、そしてまた血小板α−顆粒において見出される。ＴＳＰ−１は、細胞外マトリクスの構成成分である、大きな４５０ｋＤａのマルチドメイン糖タンパク質である。ＴＳＰ−１は、ＨＳＰＧ、フィブロネクチン、ラミニン、および種々の型のコラーゲンを含む、細胞外マトリクスにおいて見出される多くのプロテオグリカン分子に結合する。ＴＳＰ−１は、インビトロにおいて内皮細胞遊走および増殖、ならびにインビボにおいて新脈管形成を阻害する。ＴＳＰ−１はまた、形質転換された内皮細胞の悪性表現型および腫瘍形成を抑制し得る。腫瘍抑制遺伝子ｐ５３は、ＴＳＰ−１の発現を直接的に調節することが示されており、その結果、ｐ５３活性の損失は、ＴＳＰ−１生成における劇的な減少、およびそれに付随する、腫瘍が開始する新脈管形成の増大を生じる。
【０４２２】
ＰＦ４は、ケモカインのＣＸＣ  ＥＬＲファミリーのメンバーである７０アミノ酸のタンパク質であり、これはインビトロでの内皮細胞増殖およびインビボでの新脈管形成を強力に阻害し得る。アデノウイルスベクターによって腫瘍内投与または送達されたＰＦ４は、腫瘍増殖の阻害を引き起こし得る。
【０４２３】
インターフェロンおよびメタロプロテイナーゼインヒビターは、本発明と併用され得る、２つの他のクラスの天然に存在する脈管形成インヒビターである。インターフェロンの抗内皮活性は、１９８０年代初期から公知であるが、阻害の機構は、未だ明確でない。これらが内皮細胞の移動を阻害し得ること、およびこれらが、腫瘍細胞による新脈管形成プロモーターの産生を阻害する能力によっておそれく媒介される、インビボでのいくつかの抗新脈管形成活性を有することは公知である。血管腫瘍は特に、インターフェロンに感受性であり、例えば、増殖中の血管腫はＩＦＮαで首尾よく処置され得る。
【０４２４】
メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）は、天然に存在するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のインヒビターのファミリーであり、これもまた、新脈管形成を阻害し得、そして本発明との併用処置プロトコルにおいて使用され得る。ＭＭＰは、新脈管形成プロセスにおいて重要な役割を果たす。なぜなら、これらは、血管網を拡大または再構築する場合、内皮細胞および線維芽細胞が移動するマトリックスを分解するからである。実際、ＭＭＰの１つのメンバーであるＭＭＰ−２は、おそらくこの目的のためにインテグリンαｖβ３を介して活性化された内皮と会合することが示されている。この相互作用がＭＭＰ−２のフラグメントによって崩壊されられる場合、次いで新脈管形成はダウンレギュレートされ、そして腫瘍増殖において阻害される。
【０４２５】
新脈管形成を阻害する多くの薬理学的物質が存在し、これらの任意の１以上が本発明と併用して使用され得る。これらの物質としては、ＡＧＭ−１４７０／ＴＮＰ−４７０、サリドマイド、およびカルボキシアミドトリアゾール（ＣＡＩ）が挙げられる。フマギリンは、１９９０年に新脈管形成の強力なインヒビターであることが見出されており、そしてそれ以来、フマギリンの合成アナログである、ＡＧＭ−１４７０およびＴＮＰ−４７０が開発されてきた。これら両方の薬物は、インビトロでの内皮細胞増殖およびインビボでの新脈管形成を阻害する。ＴＮＰ−４７０は、ヒトの臨床試験で広範に研究され、そのデータは長期の投与が最適であることを示唆する。
【０４２６】
サリドマイドは、元来鎮静薬として使用されていたが、強力な催奇形物質であることが見出され、そして中止された。１９９４年に、サリドマイドは新脈管形成インヒビターであることが見出された。サリドマイドは現在、抗癌剤および血管性の眼疾患の処置として臨床試験されている。
【０４２７】
ＣＡＩは新脈管形成の低分子量の合成インヒビターであり、これは、アクチンの再組織化、内皮細胞の移動およびコラーゲンＩＶ上での延展を妨げる、カルシウムチャネルブロッカーとして作用する。ＣＡＩは生理学的に達成可能な濃度で新生血管形成を阻害し、そして癌患者によって経口的に十分許容される。ＣＡＩを用いた臨床試験によって、処置前に進行性の疾患を有する癌患者の４９％において疾患の安定化を生じた。
【０４２８】
ヘパリンまたはヘパリンフラグメントの存在下のコルチゾンは、内皮細胞増殖をブロックすることによってマウスにおいて腫瘍増殖を阻害することが示された。ステロイドおよびヘパリンの相加的な阻害効果に関与する機構は明らかでないが、ヘパリンが内皮細胞によるステロイドの取り込みを増加させ得ると考えられる。この混合物は、新しく形成された毛細血管の下の基底膜の溶解を増加させることが示されており、そしてこれはまた、相加的な血管抑制（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）効果についての可能性のある説明である。ヘパリン−コルチゾール結合体はまた、インビボでの強力な血管抑制効果活性および抗腫瘍効果活性を有する。
【０４２９】
さらに特定の新脈管形成インヒビター（抗侵襲性因子（Ａｎｔｉ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｆａｃｔｏｒ）、レチノイン酸およびパクリタキセル（米国特許第５，７１６，９８１号；参考として本明細書中に援用される）；ＡＧＭ−１４７０（Ｉｎｇｂｅｒら、１９９０；参考として本明細書中に援用される）；サメ軟骨抽出物（米国特許第５，６１８，９２５号；参考として本明細書中に援用される）；アニオン性ポリアミドオリゴマーまたはアニオン性ポリ尿素オリゴマー（米国特許第５，５９３，６６４号；参考として本明細書中に援用される）；オキシンドール（ｏｘｉｎｄｏｌｅ）誘導体（米国特許第５，５７６，３３０号；参考として本明細書中に援用される））；エストラジオール誘導体（米国特許第５，５０４，０７４号；参考として本明細書中に援用される）；およびチアゾールピリミジン誘導体（米国特許第５，５９９，８１３号；参考として本明細書中に援用される）を含むが、これらに限定されない）はまた、本発明の併用使用のための、抗新脈管形成組成物としての使用が意図される。
【０４３０】
αvβ3インテグリンのアンタゴニストを含む組成物はまた、本発明と併用して新脈管形成を阻害するために使用され得る。米国特許第５，７６６，５９１号（参考として本明細書中に援用される）に開示されるように、ＲＧＤ含有ポリペプチドおよびその塩（環状ポリペプチドを含む）は、αvβ3インテグリンアンタゴニストの適切な例である。
【０４３１】
αvβ3インテグリンに対する抗体ＬＭ６０９もまた、腫瘍後退を誘導する。インテグリンαvβ3アンタゴニスト（例えば、ＬＭ６０９）は、新脈管形成性内皮細胞のアポトーシスを誘導して、静止状態の血管を影響を受けないままにする。ＬＭ６０９または他のαvβ3アンタゴニストはまた、αvβ3とＭＭＰ−２（ＭＭＰ−２は、内皮細胞および線維芽細胞の移動に重要な役割を果たすと考えられるタンパク質分解性の酵素である）との相互作用を阻害することによって作用し得る。
【０４３２】
この場合の新脈管形成性内皮のアポトーシスは、残りの血管網に対するカスケード効果を有し得る。腫瘍の拡大しようとするシグナルに対して腫瘍血管網が完全に応答するのを阻害することは、実際には、その血管網の部分的または完全な崩壊を開始して、腫瘍細胞の死および腫瘍容積の減少を生じる。エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）およびアンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）が類似の様式で機能することが可能である。ＬＭ６０９が静止状態の血管に影響を与えないが腫瘍後退を引き起こし得るという事実は、腫瘍中の全ての血管が、抗腫瘍効果を得るために処置の標的とされる必要があるわけではないということを強く示唆する。
【０４３３】
標的化されたまたは標的化されなていないアンギオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）（好ましくは、アンギオポエチン−２）は、本発明と併用しても使用され得る（標的化されたアンギオポエチンについては以下の議論を参照のこと）。アンギオポエチン−２（配列番号３および配列番号４）は、Ｔｉｅ２のリガンドであり、そして一般に、アンギオポエチン−１によって媒介される血管の成熟／安定性を妨げる。従って、これは、アンギオポエチン−１のアンタゴニストであり、毛細血管構造を破壊するよう作用する。別の新脈管形成シグナル（例えば、ＶＥＧＦ）の非存在下では、アンギオポエチン−２は、血管を不安定にさせ、そして未成熟にさせる（Ｈｏｌａｓｈら、１９９９；参考として本明細書中に援用される）。従って、本発明の方法と共に標的化されたまたは標的化されていないアンギオポエチン−２を提供することは、特に低いＶＥＧＦレベルを有する腫瘍において、および／またはＶＥＧＦ阻害との組み合わせにおいて意図される。アンギオポエチン−１および２つの新規なアンギオポエチンである、アンギオポエチン−３（マウス）およびアンギオポエチン−４（ヒト）の操作は、本発明と共に使用され得る。
【０４３４】
Ｔｉｅ２レセプターを介するシグナル伝達を変更することに基づく治療介入の他の方法はまた、例えば、Ｔｉｅ２活性化をブロックし得る可溶性Ｔｉｅ２レセプター（Ｌｉｎら、１９９８）を使用して、本発明と併用して使用され得る。組換えアデノウイルス遺伝子治療を使用する、このような構築物の送達は、癌の処置および転移の低減に効果的であることが示されている（Ｌｉｎら、１９９８）。
【０４３５】
（Ｊ３．アポトーシス誘導剤）
治療剤標的化剤処置はまた、腫瘍内の任意の細胞（腫瘍細胞および腫瘍血管内皮細胞を含む）においてアポトーシスを誘導する処置方法と併用され得る。多くの抗癌剤は、これらの作用機構の一部として、アポトーシス誘導効果を有するが、特定の薬剤が、以下に記載するような主要な機構としてこの機構と共に発見、設計または選択されている。
【０４３６】
アポトーシス、すなわちプログラムされた細胞死を阻害する多くの癌遺伝子が記載されている。この範疇における例示的な癌遺伝子としては、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｂｃｌ−２（ｂｃｌ−１、サイクリンＤ１と異なる；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１４７４５，Ｘ０６４８７；米国特許第５，６５０，４９１号；および同第５，５３９，０９４号；各々は、参考として本明細書中に援用される）およびＢｃｌ−ｘ１、Ｍｃｌ−１、Ｂａｋ、Ａ１、Ａ２０を含むファミリーのメンバーが挙げられるがこれらに限定されない。ｂｃｌ−２の過剰発現は、Ｔ細胞リンパ腫において最初に発見された。ｂｃｌ−２は、Ｂａｘ（アポトーシス経路中のタンパク質）に結合し、そしてＢａｘを不活性化することによって癌遺伝子として機能する。ｂｃｌ−２機能の阻害は、Ｂａｘの不活性化を妨げ、そしてアポトーシス経路を進行させる。従って、このクラスの癌遺伝子の阻害（例えば、アンチセンスヌクレオチド配列を使用する）は、アポトーシスの増強が所望される局面において、本発明での使用が意図される（米国特許第５，６５０，４９１号；同第５，５３９，０９４号および同第５，５８３，０３４号；各々は、参考として本明細書中に援用される）。
【０４３７】
多くの形態の癌において、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｐ５３）における変異が報告されている。ｐ５３の不活性化は、アポトーシスの促進の不全を生じる。この不全によって、癌細胞は、細胞死へと運命付けられるよりむしろ、腫瘍形成を進行させる。従って、腫瘍抑制因子の提供もまた、細胞死を刺激するために本発明での使用が意図される。例示的な腫瘍抑制因子としては、ｐ５３、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｒｂ）、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）、ｂａｘα、インターロイキン−１ｂ−変換酵素およびファミリー、ＭＥＮ−１遺伝子、神経芽細胞腫Ｉ型（ＮＦ１）、ｃｄｋインヒビターｐ１６、結腸直腸癌遺伝子（ＤＣＣ）、家族性腺腫症ポリポーシス遺伝子（ＦＡＰ）、多発性腫瘍抑制遺伝子（ＭＴＳ−１）、ＢＲＣＡ１ならびにＢＲＣＡ２が挙げられるがこれらに限定されない。
【０４３８】
使用のために好ましいのは、ｐ５３（米国特許第５，７４７，４６９号；同第５，６７７，１７８号；および同第５，７５６，４５５号；各々は、参考として本明細書中に援用される）、網膜芽細胞腫、ＢＲＣＡ１（米国特許第５，７５０，４００号；同第５，６５４，１５５号；および同第５，７１０，００１号；同第５，７５６，２９４号；同第５，７０９，９９９号；同第５，６９３，４７３号；同第５，７５３，４４１号；同第５，６２２，８２９号；および同第５，７４７，２８２号；各々は、参考として本明細書中に援用される）、ＭＥＮ−１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ９３２３６号）およびアデノウイルスＥ１Ａ（米国特許第５，７７６，７４３号；参考として本明細書中に援用される）の遺伝子である。
【０４３９】
使用され得る他の組成物としては、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬと称される）をコードする遺伝子、およびＴＲＡＩＬポリペプチド（米国特許第５，７６３，２２３号；参考として本明細書中に援用される）；米国特許第５，６０５，８２６号（参考として本明細書中に援用される）２４ｋＤアポトーシス関連プロテアーゼ；Ｆａｓ関連因子１、ＦＡＦ１（米国特許第５，７５０，６５３号；参考として本明細書中に援用される）が挙げられる。インターロイキン−１β−変換酵素およびファミリーのメンバー（これらもまた、アポトーシスを刺激することが報告されている）の提供もまた、本発明のこれらの局面における使用のために意図される。
【０４４０】
以下のような化合物もまた使用され得る；カルボスチリル（ｃａｒｂｏｓｔｙｒｉｌ）誘導体（米国特許第５，６７２，６０３号；および同第５，４６４，８３３号；各々は、参考として本明細書中に援用される）；分枝状アポトーシス原性（ａｐｏｇｅｎｉｃ）ペプチド（米国特許第５，５９１，７１７号；参考として本明細書中に援用される）；ホスホチロシンインヒビターおよび非加水分解性ホスホチロシンアナログ（米国特許第５，５６５，４９１号；および同第５，６９３，６２７号；各々は、参考として本明細書中に援用される）；ＲＸＲレチノイドレセプターのアゴニスト（米国特許第５，３９９，５８６号；参考として本明細書中に援用される）；さらには、抗酸化剤（米国特許第５，５７１，５２３号；参考として本明細書中に援用される）。チロシンキナーゼインヒビター（例えば、ゲニステイン）もまた、細胞表面レセプターを標的化するリガンドに連結され得る（米国特許第５，５８７，４５９号；参考として本明細書中に援用される）。
【０４４１】
（Ｊ４．イムノトキシンおよびコアグリガンド（Ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ））
本発明の裸の抗アミノリン脂質抗体処置方法は、イムノトキシン（ＩＴ）および／またはコアグリガンドと併用して使用され得、ここで、その標的化をする部分（例えば、抗体またはリガンド）は、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造または腫瘍支質の比較的特異的なマーカーに指向される。上記に議論した化学療法剤および抗新脈管形成剤に共通して、標的化された毒素または凝固剤と併用した抗アミノリン脂質抗体の使用は、一般に、異なる薬剤がその腫瘍環境内の異なる標的に対して指向されることを生じる。これは、相加的な、相加的よりも顕著により大きな、またはさらには相乗的な抗腫瘍の結果を生じるはずである。
【０４４２】
一般的に言えば、本発明のこれらのさらなる局面での使用のための抗体またはリガンドは、好ましくは、接近可能な腫瘍抗原を認識し、これらは、優先的に、または具体的には腫瘍部位で発現される。抗体またはリガンドはまた、好ましくは高い親和性の特性を示し；そして抗体、リガンド、またはそれらの結合体は、生存を持続させる正常細胞（例えば、心臓、腎臓、脳、肝臓、骨髄、結腸、乳房、前立腺、甲状腺、胆嚢、肺、副腎、筋肉、神経線維、膵臓、皮膚、またはヒト体内の他の生存を維持させる器官もしくは組織）から選択される１以上の組織に対するインビボでの有意な副作用を発揮しない。本明細書中で使用される場合、用語「有意な副作用」は、インビボで投与される場合に、無視可能なまたは臨床的に管理し得る副作用（例えば、化学療法の間に通常遭遇する副作用）のみを生じる、抗体、リガンドまたは抗体結合体をいう。
【０４４３】
本発明の抗アミノリン脂質抗体と併用して使用されるこれらの第二の抗癌剤の少なくとも１つの結合領域は、腫瘍領域への毒素または凝固因子を送達し得る（すなわち、腫瘍部位内へ局在し得る）成分である。このような標的化する薬剤は、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造または腫瘍支質の成分に対して指向され得る。この標的化する薬剤は、一般に、腫瘍細胞、腫瘍脈管構造または腫瘍支質の、表面に発現されるか、表面に接近可能か、または表面に局在される成分に結合する。しかし、一旦、腫瘍脈管構造および腫瘍細胞の破壊が始まると、内部成分は放出され、実質的に任意の腫瘍成分のさらなる標的化を可能にする。
【０４４４】
多くの腫瘍細胞抗原が記載されており、そのいずれの抗原も、本発明の併用される局面と関連して標的として使用され得る。さらなるイムノトキシンおよびコアグリガンドの標的化のための適切な腫瘍細胞抗原は、抗体Ｂ３（米国特許第５，２４２，８１３号；参考として本明細書中に援用される；ＡＴＣＣ  ＨＢ  １０５７３）；ＫＳＩ／４（米国特許第４，９７５，３６９号；参考として本明細書中に援用される；ベクターＮＲＲＬ  Ｂ−１８３５６および／またはＮＲＲＬ
Ｂ−１８３５７を含む細胞から得られる）；２６０Ｆ９（ＡＴＣＣ  ＨＢ  ８４８８）；およびＤ６１２（米国特許第５，１８３，７５６号；参考として本明細書中に援用される；ＡＴＣＣ  ＨＢ  ９７９６）によって認識される抗原を含む。当業者は、抗腫瘍細胞抗体を産生する他の適切な細胞株を同定するために、任意の後年のＡＴＣＣカタログもまた調べ得る。
【０４４５】
腫瘍脈管構造標的化のために、標的化する抗体またはリガンドは、しばしば、血管形成された腫瘍の腫瘍内血管によって発現されるか、それに吸着されるか、その上に誘導されるか、またはさもなければそこに局在されるマーカーに結合する。適切に発現される標的分子としては、例えば、エンドグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＳＭＡ（Ｌｉｕら、１９９７）、ＴＩＥ、ＬＡＭ−１に反応性のリガンド、ＶＥＧＦ／ＶＰＦレセプター、ＦＧＦレセプター、αvβ3インテグリン、プレイオトロピン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｎ）、およびエンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）が挙げられる。吸着される適切な標的は、例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＨＧＦ、ＰＦ４、ＰＤＧＦ、ＴＩＭＰ、ＴＩＥに結合するリガンド、および腫瘍関連フィブロネクチンアイソフォームのような標的である。例えば、以下のような、サイトカインおよび凝固剤によって自然におよび人工的に誘導され得る抗原もまた標的化され得る；ＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＬＡＭ−１に反応性のリガンド、エンドグリン、さらにＭＨＣクラスＩＩ（例えば、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４および／またはＴＮＦ−βによって、サイトカイン誘導性）；ならびにＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＰＤＧＦおよびＩＣＡＭ−１（例えば、トロンビン、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子および／またはプラスミンによって、凝固剤誘導性）。
【０４４６】
以下の特許および特許出願は、腫瘍脈管構造の発現された、吸着された、誘導された、または局在されたマーカーに対して指向されるイムノトキシンの調製および使用に関する本発明の教示をなおさらに補完する目的のために、参考として本明細書中に特に援用される：米国特許第５，８５５，８６６号；同第５，７７６，４２７号；同第５，８６３，５３８号；同第５，６６０，８２７号；同第５，８５５，８６６号および同第５，８７７，２８９号；ならびに米国特許出願第０７／８４６，３４９号；同第０８／２９５，８６８号（米国特許第５，＿，＿号；登録料支払済）；同第０８／３５０，２１２号（米国特許第５，＿，＿号；登録料支払済）；同第０８／４５７，８６９号（特許許可通知受理済）；同第０８／４８２，３６９号（米国特許第５，＿，＿号；登録料支払済）；同第０８／４８７，４２７号（米国特許第５，＿，＿号；登録料支払済）；および同第０８／４７９，７２７号（米国特許第５，＿，＿号；登録料支払済）。
【０４４７】
適切な腫瘍支質標的としては、腫瘍細胞外マトリクスもしくは支質の成分、またはその中に結合される以下を含む成分が挙げられる；基底膜マーカー、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸、プロテオグリカン、フィブロネクチン、活性化血小板、ＬＩＢＳおよびテネイシン。このような使用に好ましい標的は、ＲＩＢＳである。
【０４４８】
以下の特許および特許出願は、腫瘍支質を標的する薬剤の調製および使用に関する本発明の教示をなおさらに補完する目的のために、参考として本明細書中に特に援用される：米国特許第５，８７７，２８９号ならびに米国特許出願第０８／４８２，３６９号（米国特許第５，＿，＿号；登録料支払済）；同第０８／４８７，４２７号（米国特許第５，＿，＿号；登録料支払済）；および同第０８／４７９，７２７号（米国特許第５，＿，＿号；登録料支払済）。
【０４４９】
特定の適用において、第二の抗癌治療剤は、内皮細胞の増殖または細胞分裂を殺傷または抑制する能力を有する、細胞傷害性薬剤または他の抗細胞性薬剤に作動可能に結合される、抗体あるいはリガンドである。適切な抗細胞性薬剤としては、化学療法剤および放射性同位体、ならびに細胞毒が挙げられる。例示的な化学療法剤としては、以下が挙げられる：ステロイド；サイトカイン；代謝拮抗物質（例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサートまたはアミノプテリン）；アントラサイクリン；マイトマイシンＣ；ビンカアルカロイド；抗生物質；デメコルチン；エトポシド；ミトラマイシン；および抗腫瘍アルキル化薬剤（例えば、クロラムブシルまたはメルファラン）。
【０４５０】
多くの組み合わせの治療適用において、毒素部分が、他の可能な薬剤と比較して、ほとんどの毒素が細胞殺傷効果を送達する大いに優れた能力に起因して、好ましい。従って、第二の治療剤のために好ましい抗細胞性薬剤は、植物由来毒素、真菌由来毒素または細菌由来毒素である。例示的毒素としては、以下が挙げられる：エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）；細菌性エンドトキシンまたは細菌性エンドトキシンの脂質Ａ部分；リボソーム不活化タンパク質（例えば、サポリンまたはゲロニン）；α−サルシン；アスペルギリン；レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、リボヌクレアーゼ（例えば、胎盤リボヌクレアーゼ）；ジフテリア毒素およびｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素。
【０４５１】
特定の好ましい毒素は、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）およびＡ鎖毒素（例えば、リシンＡ鎖）である。最も好ましい毒素部分は、しばしば、炭水化物残基を修飾または除去するように処理されたリシンＡ鎖、いわゆる「脱グリコシル化Ａ鎖」（ｄｇＡ）である。脱グリコシル化リシンＡ鎖が、好ましい。なぜなら、その極度の効能（より長い半減期）のため、そしてそれを臨床グレードまたは臨床規模で製造することが、経済的に可能であるからである。組換えおよび短縮型リシンＡ鎖もまた使用され得る。
【０４５２】
腫瘍の血管構造または腫瘍支質を標的化するための免疫結合体と共に使用するための他の薬剤は、アンギオポエチンである。アンギオポエチンは、ＶＥＧＦファミリーのメンバーと同様に、主に血管内皮に特異的な増殖因子である（ＤａｖｉｓおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ、１９９９：Ｈｏｌａｓｈら、１９９９；本明細書中で参考として援用される）。最初に記載されたアンギオポエチンは、天然に存在するアゴニストであるアンギオポエチン−１（Ａｎｇ−１；配列番号１および配列番号２）、および天然に存在するアンタゴニストであるアンギオポエチン−２（Ａｎｇ−２；配列番号３および配列番号４）であった。この両方は、内皮細胞チロシンキナーゼレセプターＴｉｅ２によって作用する。
【０４５３】
２つの新しいアンギオポエチンである、アンギオポエチン−３（マウス）およびアンギオポエチン−４（ヒト）もまた同定された（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、１９９９）。アンギオポエチン−３は、アンタゴニストとして作用するようであるが、アンギオポエチン−４は、アゴニストとして機能するようである（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、１９９９）。アンギオポエチン−３と呼ばれるタンパク質はまた、ヒト心臓からクローニングされ、そして内皮細胞に対してマイトジェン効果を有さないと報告された（Ｋｉｍら、１９９９）。アンギオポエチン−１およびアンギオポエチン−２の融合タンパク質もまた、配列番号５として本明細書中に含まれる安定なＡｎｇ−１−Ａｎｇ−２融合タンパク質によって例示されるように、作製されている。
【０４５４】
ＶＥＧＦは、血管発達の早期の段階のために必要であるが、アンギオポエチン−１は、一般に、血管リモデリングのより後期の段階に必要とされる。従って、アンギオポエチン−１は、成熟因子または安定化因子であり、これは、未成熟の血管を成熟した血管に変換する。
【０４５５】
アンギオポエチン−１は、虚血性組織において血管再生を増強すること（Ｓｈｙｕら、１９９８）、およびＶＥＧＦまたはａＦＧＦの形態のいずれかに曝露された血管網の生存を増加すること（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓら、１９９９）が示されている。これらの著者らはまた、アンギオポエチン−１が、同じ形態のａＦＧＦの撤退によって誘発されるＨＵＶＥＣにおけるアポトーシス死を妨げることを示した（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓら、１９９９）。そのようなデータは、ヒト内皮細胞に対するアンギオポエチン−１の直接的な役割、および分化した内皮細胞の生存を促進することによって血管構造を安定化する他の血管形成分子との相互作用と一致する。
【０４５６】
アンギオポエチン−２は、標的化された組み合わせ治療、特に、低いＶＥＧＦレベルを有し、そして／またはＶＥＧＦ阻害と組み合わされた腫瘍における使用のための好ましい薬剤である。アンギオポエチン−２はまた、Ｔｉｅ２についてのリガンドであるが、一般にアンギオポエチン−１によって媒介される血管成熟／安定性を中和する。従って、アンギオポエチン−２は、アンギオポエチン−１のアンタゴニストであり、そして毛細管構造を不安定にするように作用する。しかし、アンギオポエチン−２は、内皮細胞を血管形成刺激に対して応答性にするので、アンギオポエチン−２は、他の適切なシグナル（特に、ＶＥＧＦ）と組み合わせて新生血管形成を開始し得る（Ａｓａｈａｒａら、１９９８；Ｈｏｌａｓｈら、１９９９；本明細書中で参考として援用される）。
【０４５７】
別の血管形成シグナルの非存在下では、アンギオポエチン−２は、血管が脱安定化し、そして未成熟になるのを引き起こす。刺激（例えば、ＶＥＧＦ）の存在下では、アンギオポエチン−２は血管形成を促進する。実際に、多くのレギュレーターの血管形成効果は、少なくとも一部には、微小血管内皮細胞におけるアンギオポエチン−２活性の自己分泌ループの調節を介して達成されると考えられている（ＭａｎｄｒｉｏｔａおよびＰｅｐｐｅｒ，１９９８）。
【０４５８】
腫瘍組織におけるアンギオポエチン−２発現が報告されており（Ｔａｎａｋａら、１９９９）、ここでアンギオポエチン−２は、おそらく、ＶＥＧＦと組み合わせて血管形成を促進するように作用する（Ｓｔｒａｔｍａｎｎら、１９９８；Ｈｏｌａｓｈら、１９９９）。しかし、ＶＥＧＦが低いまたは存在しない場合には、アンギオポエチン−２はネガティブシグナルを提供するので、アンギオポエチン−２の供給は、有用な治療アプローチであり得る。アンギオポエチン−２はまた、タンパク質治療剤としてまたは遺伝子治療（上記を参照のこと）を介して、あるいは腫瘍標的化形態で投与され得る。全ての型の標的化されたアンギオポエチン−２構築物は、本発明の組み合わせ治療局面における使用を想定されるが、アンギオポエチン−２を腫瘍に標的化するための本発明の好ましい薬剤は、アミノリン脂質（抗ＰＳ抗体およびアネキシンを含む）に結合する薬剤である。
【０４５９】
イムノトキシンを用いた腫瘍標的化および処置のために、以下の特許および特許出願が、抗細胞性薬剤および細胞傷害性薬剤に関する本教示をよりさらに補完する目的のために、参考として本明細書中で特に援用される：米国特許第５，８５５，８６６号；同第５，７７６，４２７号；同第５，８６３，５３８号；および同第５，６６０，８２７号；ならびに米国特許出願第０７／８４６，３４９号；同第０８／２９５，８６８号（特許第５,  ,  、（特許証発行料納付済み））；同第０８／３５０，２１２号（特許第５,  ,  、（特許証発行料納付済み））；および同第０８／４５７，８６９号（特許査定通知受領済み）。
【０４６０】
第２に、本発明の抗アミノリン脂質抗体を用いる必要に応じた使用のための標的化剤はまた、凝固を促進し得る標的化成分（すなわち、「コアグリガンド」）を含み得る。ここで、標的化抗体またはリガンドは、凝固を直接または間接的に刺激する因子に、例えば、別の抗体を介して、直接または間接的に連結され得る。
【０４６１】
このような用途のための好ましい凝集因子は、組織因子（ＴＦ）およびＴＦ誘導体（例えば、短縮ＴＦ（ｔＴＦ）、二量体および多量体ＴＦ、ならびに変異体ＴＦ（第ＶＩＩ因子を活性化する能力を欠く））である。他の適切な凝固因子としては、ビタミンＫ依存性凝固剤（例えば、第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子および第Ｘ／Ｘａ因子）；Ｇｌａ改変を欠くビタミンＫ依存性凝固因子；ラッセルクサリヘビ蛇毒第Ｘ因子活性化因子；血小板活性化化合物（例えば、トロンボキサンＡ2およびトロンボキサンＡ2シンターゼ）；ならびにフィブリン溶解のインヒビター（例えば、α２抗プラスミン）が挙げられる。
【０４６２】
コアグリガンドを用いた腫瘍標的化および処置は、以下の特許および特許出願（それぞれは、コアグリガンドおよび凝固因子に関する本教示をなおさらに補充する目的のために、参考として本明細書において詳細に援用される）に記載される：米国特許第５，８５５，８６６号および同第５，８７７，２８９号；米国出願番号０７／８４６，３４９号；同第０８／３５０，２１２号（特許番号５， 
，      ；特許証発行料納付済み）；同第０８／４８２，３６９号（米国特許５，      ，      ；特許証発行料納付済み）；同第０８／４８７，４２７号（米国特許５，      ，      ；特許証発行料納付済み）；および同第０８／４７９，７２７号（米国特許５，      ，      ；特許証発行料納付済み）。
【０４６３】
凝固剤のいくらか広範な分布は、重篤な副作用と関連しないので、コアグリガンドの標的化エレメントに課されるストリンジェント要件はイムノトキシンでよりも低ストリンジェントである。従って、特定の標的化を達成するとは、非腫瘍部位における血管系に比較して腫瘍血管系において凝固が促進されることを意味する。従って、コアグリガンドの特異的標的化は、標的化剤の生体分布特性に関する純粋に物理的な用語というよりも機能的な用語である。有用な標的は、完全に腫瘍に制限されなくてもよく、そしてそれにもかかわらず、腫瘍特異的凝固を促進するに有効な標的化リガンドは、ＶＣＡＭ−１で生じるように、投与後の身体の他の部位で安全に見出され得ることは起こりそうにないことではない。
【０４６４】
イムノトキシンの調製は、一般に当該分野で周知である（例えば、米国特許第４，３４０，５３５号（本明細書において参考として援用される）を参照のこと）。以下の特許および特許出願のそれぞれは、イムノトキシンの生成、精製および使用に関する本教示をなおさらに補充する目的のために、本明細書において参考としてさらに援用される：米国特許第５，８５５，８６６号；同第５，７７６，４２７号；同第５，８６３，５３８号；および同第５，６６０，８２７号；ならびに米国特許出願番号０７／８４６，３４９；同第０８／２９５，８６８号（特許番号５，      ，      ；特許証発行料納付済み）；同第０８／３５０，２１２号（特許番号５，      ，      ；特許証発行料納付済み）；および同第０８／４５７，８６９号（特許査定受領済み）。
【０４６５】
イムノトキシンの調製において、特定のリンカーの使用を通じて利点が達成され得る。例えば、立体的に「障害」となるジスルフィド結合を含むリンカーが、インビボでのそのより大きい安定性（従って、作用部位での結合の前の毒素部分の放出を防ぐ）に起因して、しばしば、好ましい。意図される作用部位（この部位では、結合体が良好な「放出」特徴を有することが所望される）を除く身体内のいずれでも見られる条件下ではインタクトなままである結合体を有することが一般に所望される。
【０４６６】
用いられる特定の毒素化合物に依存して、標的化剤および毒素化合物に作動可能に付着するペプチドスペーサーを提供することが必要であり得る。ここでペプチドスペーサーは、ジスルフィド結合されたループ構造に折り畳まれ得る。次いで、ループ内のタンパク質分解性切断は、ヘテロ二量体性のポリペプチドを生じる。ここで標的化剤および毒素化合物は、１つのジスルフィド結合によってのみ連結される。
【０４６７】
特定の他の毒素化合物が利用される場合、切断不能なペプチドスペーサーは、標的化剤および毒素化合物に作動可能に付着するように提供され得る。切断不能なペプチドスペーサーと組み合わせて使用され得る毒素は、それ自体が、タンパク質分解性切断により細胞傷害性ジスルフィド結合形態に転換され得る毒素である。このような毒素化合物の例はＰｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ外毒素化合物である。
【０４６８】
種々の化学療法剤および他の薬理学的因子もまた、抗体または標的化リガンドに首尾良く結合体化され得る。抗体に結合体化された例示的な抗腫瘍性の薬剤としては、ドキソルビシン、ダウノマイシン、メトトレキサートおよびビンブラスチンが挙げられる。さらに、ネオカルジノスタチン、マクロマイシン、トレニモン（ｔｒｅｎｉｍｏｎ）およびαアマニチンのような他の薬剤の付着は、記載されている（米国特許第５，８５５，８６６号；および特許番号５，      ，    
；（出願番号０８／３５０，２１２号（特許証発行料納付済み）、およびそこに援用されている参考文献を参照のこと）。
【０４６９】
本発明者らの初期の研究の１つに照らして、いまやコアグリガンドの調製はまた、容易に実施される。１つ以上の凝固因子と標的化剤との作動可能な会合は、イムノトキシンについて上記されたような、直接の連結であり得る。あるいは、作動可能な会合は、標的化剤が、第２の結合領域、好ましくは、および抗体または抗体の抗原結合領域（凝固因子に結合する）に作動可能に付着されるような、間接的な付着であり得る。凝固因子は、その機能的凝固部位と異なる部位（特に共有結合が分子の結合に用いられる部位）で標的化剤に付着されるはずである。
【０４７０】
間接的に連結されたコアグリガンドは、もっともしばしば二重特異性抗体に基づく。二重特異性抗体の調製はまた当該分野で周知である。１つの調製的方法は、一方では標的化された腫瘍成分、および他方では、凝固剤について特異性を有する抗体の別個の調製を含む。次いで、２つの選択抗体からのペプシンＦ（ａｂ’γ）2フラグメントを生成し、続いてそれぞれを還元させて別個のＦａｂ’γSHフラグメントを提供する。次いで、カップリングされる２つのパートナーの１つのＳＨ基が架橋試薬（例えば、ｏ−フェニレンジマレイミド）でアルキル化され、１つのパートナー上に遊離のマレイミド基を提供する。次いで、このパートナーは、チオエーテル結合により他方のパートナーと結合体化され、所望のＦ（ａｂ’γ ）2異種結合体を生じ得る（Ｇｌｅｎｎｉｅら、１９８７；参考として本明細書に援用される）。他のアプローチ（例えば、ＳＰＤＰまたはプロテインＡとの架橋）もまた実行され得る。
【０４７１】
二重特異性抗体を生成するための別の方法は、クアドローマを形成するための２つのハイブリドーマの融合による。本明細書において用いる場合、用語「クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）」は、２つのＢ細胞ハイブリドーマの生産的な融合を記載するために用いられる。現在の標準的技術を用いて、２つの抗体産生ハイブリドーマが融合され娘細胞が得られる。次いで、クローン型の免疫グロブリン遺伝子の両方のセットの発現を維持した細胞が選択される。
【０４７２】
クアドローマを生成する好ましい方法は、親ハイブリドーマの少なくとも一方の酵素欠損変異体の選択を含む。次いで、この第１の変異体ハイブリドーマ細胞株は、致死的に例えば、ヨードアセトアミドに曝露され、その連続した生存を妨げた第２のハイブリドーマの細胞に融合される。細胞融合は、致死的に処理されたハイブリドーマからその酵素欠損遺伝子を得ることにより第１のハイブリドーマのレスキューを可能にし、そして第１のハイブリドーマに対する融合を通じて第２のハイブリドーマのレスキューを可能にする。同じアイソタイプだが異なるサブクラスの免疫グロブリンの融合が好ましいが、必須ではない。混合したサブクラスの抗体は、好ましいクアドローマの単離のための代替アッセイの使用を可能にする。
【０４７３】
マイクロタイター同定の実施態様、ＦＡＣＳ、免疫蛍光染色、イディオタイプ特異的抗体、抗原結合競合アッセイおよび抗体特徴付けの分野で通常の他の方法は、好ましいクアドローマを同定するために用いられ得る。クアドローマの単離後、二重特異性抗体が、他の細胞産物から精製される。これは、免疫グロブリン精製の当業者に公知の種々の抗体単離手順により達成され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８８を参照のこと；本明細書において参考として援用される）。プロテインＡまたはプロテインＧセファロースカラムが好ましい。
【０４７４】
イムノトキシンおよびコアグリガンドの両方の調製において、組換え発現が使用され得る。選択される標的化剤および毒素または凝固剤をコードする核酸配列が発現ベクターにインフレームで付着される。従って、組換え発現は、核酸の翻訳を生じ、所望の標的化剤−毒素／凝固剤化合物を生じる。
【０４７５】
以下の特許および特許出願は、それぞれ、コアグリガンド（二重特異性抗体コアグリガンドを含む）の調製、精製および使用に関する本教示をなおさらに補足する目的のために参考として本明細書に援用される：米国特許第５，８５５，８６６号および同第５，８７７，２８９号；米国出願番号０７／８４６，３４９号；同第０８／３５０，２１２号（特許番号５，      ，      ；特許証発行料納付済み）；同第０８／２７３，５６７号；同第０８／４８２，３６９号；同第０８／４８５，４８２号；および同第０８／４７２，６３１号（米国特許５， 
，      ；特許証発行料納付済み）；同第０８／４８７，４２７号（米国特許５，      ，      ；特許証発行料納付済み）；ならびに同第０８／４７９，７２７号および同第０８／４８１，９０４号（米国特許５，      ，      ；特許証発行料納付済み）。
【０４７６】
癌の処置における裸の抗アミノリン脂質抗体との併用使用のためのイムノトキシンおよびコアグリガンドの有効用量は、１週間あたり約１回の頻度でＩＶ経路を介して投与する場合、約０．１ｍｇ／ｋｇと約２ｍｇ／ｋｇとの間、そして好ましくは約０．８ｍｇ／ｋｇと約１．２ｍｇ／ｋｇとの間である。用量決定におけるいくらかの変動が、処置される被験体の状態に依存して必ず生じる。投与の責任を負う医師は、個々の被験体について適切な用量を決定する。
【０４７７】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明者らによって、本発明の実施において良好に機能することが見出された技術を表し、従って、本発明の実施の好ましい態様を構成するとみなされ得ることが当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、多くの変更が、開示された特定の実施態様において行われ得、そして本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様もしくは類似の結果が依然として入手され得ることを認識すべきである。
【実施例】
【０４７８】
（実施例Ｉ：腫瘍血管および正常血管でのＶＣＡＭ−１発現）
（Ａ．材料および方法）
（１．材料）
Ｎａ125Ｉを、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）から入手した。ダルベッコ改変イーグル組織培養培地（ＤＭＥＭ）ならびにＣａ2+およびＭｇ2+を含有するダルベッコＰＢＳを、Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から入手した。ウシ胎仔血清を、Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）から入手した。Ｏ−フェニレンジアミン、過酸化水素、３−アミノプロピルトリエトキシ−シランおよび無菌のエンドトキシン非含有生理食塩水（１００ｍｌの水中０．９％  ＮａＣｌ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からであった。ＳＭＰＴは、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）からであった。第ＶＩＩ因子（７４ＩＵ／ｍｌ）、第Ｘ因子および第ＩＸ因子（１７ＩＵ／ｍｌ）を含有するＰｒｏｐｌｅｘ  Ｔを、Ｂａｘｔｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（ＭｃＧｒａｗ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）から購入した。第Ｘａ因子タンパク質分解活性を測定するための色素形成性基質であるＳ−２７６５を、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＯＨ）から入手した。精製した第Ｘａ因子を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ（Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）から購入した。９６ウェル平底マイクロタイタープレートおよび４８ウェル平底マイクロタイタープレート（９６  ａｎｄ  ４８  ｆｌａｔ  ｂｏｔｔｏｍ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅｓ）を、Ｆａｌｃｏｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）から入手した。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧビーズおよびＳ２００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入した。組換えマウスＩＬ−１αを、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。
【０４７９】
（２．抗体）
マウスＶＣＡＭ−１に対するラットＩｇＧ１抗体を分泌する、ＭＫ２．７ハイブリドーマを、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １９０９）から入手した。この抗ＶＣＡＭ−１抗体の特徴付けは、Ｍｉｙａｋｅら（１９９１、本明細書中に参考として援用される）によって報告された。マウスウイルスタンパク質ｐ３０  ｇａｇに対するラットＩｇＧ１抗体を分泌するＲ１８７ハイブリドーマもまた、ＡＴＣＣから入手し、そして抗ＶＣＡＭ−１抗体についてアイソタイプが適合したコントロールとして用いた。
【０４８０】
ヒト組織因子に対するマウスモノクローナル抗体１０Ｈ１０を、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら（１９８８）および米国出願第０８／４８２，３６９号（各々本明細書中に参考として援用される）に記載される通りに調製した。
【０４８１】
汎抗マウス血管内皮細胞抗体であるＭＥＣＡ  ３２を、Ｌｅｐｐｉｎｋら（１９８９、本明細書中に参考として援用される）によって記載される通りに調製した。マウスエンドグリンと反応性のＭＪ  ７／１８ラットＩｇＧを、ＧｅおよびＢｕｔｃｈｅｒ（１９９４、本明細書中に参考として援用される）によって記載される通りに調製した。ＭＥＣＡ  ３２抗体およびＭＪ  ７／１８抗体は、免疫組織化学的研究のためのポジティブコントロールとして役立った。
【０４８２】
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合体化したウサギ抗ラット二次抗体およびラット抗マウス二次抗体を、Ｄａｋｏ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）から購入した。
【０４８３】
（３．抗体精製）
抗ＶＣＡＭ−１ハイブリドーマＭＫ２．７および無関係なコントロールハイブリドーマＲ１８７を、バイオリアクター（Ｈｅｒａｅｕｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で１２日間増殖させた。上清を遠心分離し、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、そしてＳｅｐｈａｒｏｓｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムにローディングした。ＩｇＧを、クエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）を用いて溶出させ、ＰＢＳ中で透析し、そしてその後、同じ緩衝液中で４℃にて保存した。純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって見積もり、そしてその純度は慣用的には９０％を超えていた。精製した抗ＶＣＡＭ−１抗体の結合能を、本明細書中で以下に記載される通りに、Ｌ４５０腫瘍の凍結切片上で免疫組織化学的に、およびＩＬ−１α刺激ｂＥｎｄ．３細胞を用いる細胞に基づくＥＬＩＳＡによって評価した。
【０４８４】
（４．腫瘍保有マウスおよび免疫組織化学）
約２５ｇの体重の雄性ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に、１×１０7個のＬ５４０ホジキンリンパ腫細胞を右側腹部に皮下注射した。腫瘍を、０．４ｃｍ3〜０．７ｃｍ3のサイズになるまで増殖させた。動物をメタファン（ｍｅｔａｆａｎｅ）で麻酔し、そしてその動物の血液循環をＢｕｒｒｏｗｓら（１９９２、本明細書中に参考として援用される）によって記載される通りに、ヘパリン処理した生理食塩水を用いて灌流した。腫瘍および主要な器官を取り出し、そして液体窒素中で急速凍結した。
【０４８５】
組織のクライオスタット凍結切片を切断し、抗ＶＣＡＭ−１抗体とともにインキュベートし、そして免疫組織化学的に染色して、ＶＣＡＭ−１を検出した。ラットＩｇＧを、ＨＲＰに結合体化したウサギ抗ラットＩｇＧを用い、続いてカルバゾールを用いる発色によって検出した（Ｆｒｉｅｓら、１９９３）。
【０４８６】
（Ｂ．結果）
皮下Ｌ５４０ヒトホジキン腫瘍を保有するマウス由来の主要な組織および腫瘍の血管を、抗ＶＣＡＭ−１抗体を用いてＶＣＡＭ−１発現について免疫組織化学的に調べた。腫瘍血管でのＶＣＡＭ−１発現は、中枢よりも末梢で多かった。しかし、実施例ＶＩおよび実施例ＶＩＩで実証されるように、抗ＶＣＡＭ−１抗体およびコアグリガンドは、コアグリガンドが全ての腫瘍領域における血流を止める能力および腫瘍内領域の破壊を引き起こす能力によって明らかに示されるように、血液輸送血管に明らかに結合した。
【０４８７】
全体的に見て、ＶＣＡＭ−１発現は、抗エンドグリン抗体ＭＪ  ７／１８によって染色された総腫瘍血管の２０〜３０％に観察された。腫瘍血管のＶＣＡＭ−１染色は、大部分が細静脈に観察された。ＶＣＡＭ−１発現は、１５００ｍｍ3までの腫瘍において類似したが、より大きな腫瘍は、減少した染色を有するようであり、５〜１０％のＭＪ  ７／１８ポジティブ血管がＶＣＡＭ−１についてポジティブであった。
【０４８８】
ＶＣＡＭ−１の構成的血管発現は、腫瘍保有動物および正常動物の両方において心臓および肺において見出された（表１）。心臓では、強力な染色が、細静脈および静脈に観察された。約１０％のＭＥＣＡ  ３２ポジティブ血管がＶＣＡＭ−１についてポジティブであった。肺内皮における染色は、心臓および腫瘍と比較して弱く、そしていくつかの大きな血管に制限されていた。強力な間質染色が精巣において観察され、精巣では、ＶＣＡＭ−１発現は、厳密に言えば、血管外であった。げっ歯類の肺および精巣における構成的ＶＣＡＭ−１発現に関する類似の知見が、以前に報告された（Ｆｒｉｅｓら、１９９３）。
【０４８９】
【表１】
2006213734.tif 000008
【０４９０】
（実施例ＩＩ：抗ＶＣＡＭ−１抗体のインビボでの局在化)
（Ａ．方法）
雄性ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）（体重およそ２５ｇ）に、１×１０7のＬ５４０ホジキンリンパ腫細胞を右側腹部に皮下注射した。腫瘍を、０．４〜０．７ｃｍ3のサイズにまで増殖させた。
【０４９１】
マウスに、２００μｌの生理食塩水中の、３０μｇ／２５ｇ体重の抗ＶＣＡＭ−１抗体、Ｒ１８７抗体または対応するコアグリガンドを静脈内注射した。２時間後、動物をメタファンを用いて麻酔し、そしてその血液循環を、記載されるようなヘパリン処理した生理食塩水（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９２；本明細書において参考として援用される）で灌流した。腫瘍および主要な器官を取り出し、そして液体窒素で瞬間冷凍した。
【０４９２】
これらの組織のクライオスタット凍結切片を切断し、そしてラットＩｇＧまたはＴＦの存在について免疫組織化学的に染色した。ラットＩｇＧを、ＨＲＰに結合体化したウサギ抗ラットＩｇＧを用い、続いてカルバゾールで発色して検出した（Ｆｒｉｅｓら、１９９３）。コアグリガンドを、ヒト組織因子を認識する１０Ｈ１０抗体、続いてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧを用いて検出した。１０Ｈ１０抗体は、マウス組織因子（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、１９８８、本明細書において参考として援用される）とも、他のマウスタンパク質とも検出可能には交叉反応しない。
【０４９３】
（Ｂ．結果）
皮下にＬ５４０腫瘍を有するマウスに、抗ＶＣＡＭ−１抗体を静脈内注射し、そして２時間後、そのマウスを放血させた。腫瘍および正常な器官を取り出し、そして凍結切片を調製し、そして免疫組織化学的に試験してその抗体の配置を決定した。この組織の連続切片を試験した。局在化したラットＩｇＧを、ＨＲＰ標識抗ラットＩｇを用いて検出し、そしてマウス血管を、汎内皮抗体ＭＥＣＡ３２によって同定した。
【０４９４】
抗ＶＣＡＭ−１抗体を、腫瘍、心臓および肺の内皮において検出した（表１）。染色された血管の強度および数は、抗ＶＣＡＭ−１抗体を用いて直接染色された同じ組織の連続切片における強度および数と同一であった（表１）。染色は特異的であった。なぜなら、無関連の特異性の種アイソタイプが適合した抗体Ｒ１８７を注射したマウスの腫瘍および器官には内皮の染色が観察されなかったからである。抗ＶＣＡＭ−１抗体の局在化は、精巣にも、心臓および肺を除くどの正常器官にも見出されなかった。
【０４９５】
（実施例ＩＩＩ：抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンドの調製）
抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦ結合体、すなわち「コアグリガンド」を、以下のように調製した。短縮型組織因子（ｔＴＦ）（これは、Ｎ末端に導入されたさらなる付加システインを有する（米国特許出願番号０８／４８２，３６９、本明細書において参考として援用される））を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そしてＳｔｏｎｅら（１９９５、本明細書において参考として援用される）に記載されるように精製した。精製後、Ｎ’システイン−ｔＴＦのスルフヒドリル基を、Ｅｌｌｍａｎ試薬を用いる反応によって保護した。このｔＴＦ誘導体を、少容量で−７０℃で保存した。
【０４９６】
抗ＶＣＡＭ−１コアグリガンドを調製するために、５ｍｌの、ＰＢＳ中の抗ＶＣＡＭ−１抗体ＩｇＧ（２ｍｇ／ｍｌ）と、無水ＤＭＦ中に溶解した３６μｌのＳＭＰＴ（１０ｍＭ）とを混合し、そして室温で１時間インキュベートした。この混合物を１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中に平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５のカラムを通して濾過した。ＳＭＰＴ誘導体化抗体を含む画分を、１０，０００Ｄａカットオフフィルターを装着したＡｍｉｃｏｎセル中における限外濾過によって４ｍｌにまで濃縮した。新たに解凍したｔＴＦ誘導体を、１０分間、室温でＨ2Ｏ中の３０μｌのＤＴＴ（１０ｍＭ）とインキュベートし、そして１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中に平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５のカラムを通して濾過した。還元されたｔＴＦを含む溶出画分を、窒素下での限外濾過によって最終容積３ｍｌにまで濃縮した。
【０４９７】
還元されたｔＴＦを、ＳＭＰＴ誘導体化した抗体と混合し、そしてこの混合物を、２４時間室温で反応させた。インキュベーションの終わりに、その反応混合物を、ＰＢＳ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００のカラムでのゲル濾過によって分離した。１８０，０００のＭrを有し、そしてｔＴＦの１つの分子に連結した抗体の１つの分子に対応する抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦを含む画分を収集した。
【０４９８】
（実施例ＩＶ：活性化した内皮細胞への抗ＶＣＡＭ−１コアグリガンドの結合）
（Ａ．方法）
（１．１０Ｈ１０抗体のヨウ素化）
抗ヒト組織因子抗体である１０Ｈ１０を、Ｂｏｃｃｉ（１９６４、本明細書において参考として援用される）に記載されるようにＣｈｌｏｒａｍｉｎｅ  Ｔを用いて125Ｉで放射標識した。比活性は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６）によって測定されるようなタンパク質決定から計算されるように約１０，０００ｃｐｍ／μｇであった。
【０４９９】
（２．細胞）
Ｌ５４０ホジキン細胞（Ｌ５４０Ｃｙ）（これは、末期疾患の患者に由来する）を、Ｄｉｅｈｌら（１９８５、本明細書において参考として援用される）に記載されるように調製し、そしてＶｏｌｋｅｒ  Ｄｉｅｈｌ教授（Ｋｌｉｎｉｋ  ｆｕｒ  Ｉｎｎｅｒｅ  Ｍｅｄｉｚｉｎ  ｄｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ  Ｋｏｅｌｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ｂＥｎｄ．３細胞（マウス脳内皮腫）を、Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏら（１９９１）およびＭｏｎｔｅｓａｎｏら（１９９０）（これらは各々、本明細書において参考として援用される）に記載されるように調製し、そしてＷｅｒｎｅｒ  Ｒｉｓａｕ教授（Ｍａｘ  Ｐｌａｎｃｋ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂａｅｄ  Ｎａｕｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
【０５００】
（３．組織培養）
ｂＥｎｄ．３細胞およびハイブリドーマを、１０％仔ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２単位／ｍｌペニシリンＧおよび２μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で維持した。Ｌ５４０細胞を、同じ添加物を含むＲＰＭＩ１６４０中で維持した。全ての細胞を、１週間に１回継代培養した。ｂＥｎｄ．３トリプシン処理を、０．２％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液中で０．１２５％トリプシンを用いて行った。結合研究について、細胞を、５×１０4細胞／ｍｌの密度で、４８ウェルプレート中の０．５ｍｌの培地中で播種し、そして４８〜９６時間インキュベートした。培地を、各研究の２４時間前に新しいものにした。
【０５０１】
（４．活性化内皮細胞へのコアグリガンドの結合）
活性化されたｂＥｎｄ．３細胞における抗ＶＣＡＭ−１抗体およびコアグリガンドのＶＣＡＭ−１への結合を、Ｈａｈｎｅ（１９９３、本明細書において参考として援用される）に記載されるように、細胞ベースのＥＬＩＳＡを用いて決定した。ｂＥｎｄ．３細胞を、１０単位／ｍｌのＩＬ−１αと、４時間３７℃で９６ウェルのマイクロタイタープレート中でインキュベートした。このインキュベーションの終わりに、培地をＤＰＢＳ（これは、２ｍＭ  Ｃａ2+およびＭｇ2+ならびにキャリアタンパク質として０．２％（ｗ／ｖ）ゼラチンを含む）に置き換えた。同じ緩衝液を、抗体の希釈および工程の間の細胞単層の洗浄のために使用した。
【０５０２】
細胞を、４μｇ／ｍｌの抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦ結合体、抗ＶＣＡＭ・１抗体またはコントロール試薬と２時間インキュベートし、次いで洗浄し、そしてウサギ抗ラットＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（１：５００希釈）と１時間インキュベートした。全ての工程を室温で行った。ＨＲＰ活性を、クエン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ５．５中のＯ−フェニレンジアミン（０．５ｍｇ／ｍｌ）および過酸化水素（０．０３％、ｗ／ｖ）を添加することによって測定した。３０分後、１００μｌの上清を、９６ウェルプレートに移し、１００μｌの０．１８Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を添加し、そして４９２ｎｍでの吸光度を測定した。各研究を、二連で行い、そして少なくとも２回反復した。
【０５０３】
（５．内皮細胞に結合したコアグリガンドの検出）
抗ＶＣＡＭ−１コアグリガンドおよび適切なコントロールを、上記のように、９６ウェルマイクロタイタープレート中で、ＩＬ−１αで刺激したｂＥｎｄ．３細胞とインキュベートした。結合したコアグリガンドを、ｂＥｎｄ．３細胞に結合した、組織因子成分およびラットＩｇＧ成分の両方を同定することによって検出した。
【０５０４】
過剰の結合していない抗体を除いた後、細胞を、結合緩衝液中の１００μｌ／ウェルの125Ｉ標識した１０Ｈ１０抗体（０．２μｇ／ｍｌ）または125Ｉ標識したウサギ抗ラットＩｇ（０．２μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。室温で２時間のインキュベーション後、細胞を徹底的に洗浄し、そして０．５ＭのＮａＯＨ中に溶解した。総容量０．５ｍｌをプラスチックチューブに移し、そしてγカウンター中で計数した。各研究を二連で行い、そして少なくとも２回反復した。
【０５０５】
（Ｂ．結果）
抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンドがＩＬ−１α活性化マウスｂＥｎｄ．３細胞に結合する能力を、放射性同位体標識した抗ＴＦ抗体の、コアグリガンド処理した細胞への結合をインビトロで測定することによって決定した。ｂＥｎｄ．３細胞によるＶＣＡＭ−１発現は、ＩＬ−１αにより一過的に誘導可能である。ここで、ＶＣＡＭ−１発現のピークは、サイトカインの添加の４〜６時間後に得られる（Ｈａｈｎｅら、１９９３）。コアグリガンドの、活性化したｂＥｎｄ．３細胞への強力な結合が観察された（図１Ａ）。
【０５０６】
飽和において、８．７ｆｍｏｌの抗ＴＦ抗体が、その細胞に結合し、これは、１細胞あたり５４０，０００分子の抗ＴＦ抗体と等価である。このコアグリガンドの結合は特異的であった。無関係な特異性のアイソタイプが適合したコントロールコアグリガンドを用いてはバックグランドを超える検出可能な結合は観察されなかった。コアグリガンドの、刺激していない細胞の結合は、活性化した細胞のものの凡そ半分であった。そして、これは、培養した内皮腫細胞による構成性のＶＣＡＭ−１発現におそらく起因し得る。
【０５０７】
さらなる研究において、抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンドは、このアッセイにおいてペルオキシダーゼ標識した抗ラットＩｇＧによる検出を用いて、活性化したｂＥｎｄ．３細胞に対して、結合体化していない抗ＶＣＡＭ−１抗体と同じ強さで結合することが見出された。これを、飽和濃度および飽和未満の濃度の両方で行った。従って、結合体化手順（実施例ＩＩＩ）は、インタクトな内皮単層上のＶＣＡＭ−１への抗体の結合能を減少させなかった。
【０５０８】
（実施例Ｖ：内皮細胞に結合したコアグリガンドによる第Ｘ因子の活性化）
（Ａ．方法）
活性化したｂＥｎｄ．３細胞に結合した抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンドの活性を、第Ｘａ因子を検出する発色アッセイ（Ｓｃｈｏｒｅｒら、１９８５；Ｎａｗｒｏｔｈら、１９８５；これらは各々本明細書において参考として援用される）を用いることにより間接的に決定した。ＩＬ−１α刺激したｂＥｎｄ．３細胞および刺激していないｂＥｎｄ．３細胞を、上記のように９６ウェルマイクロタイタープレート中で特異的なコアグリガンドおよびコントロールコアグリガンドとインキュベートした。この細胞を、２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＰＢＳを用いて洗浄し、そして１５０μｌ／ウェルの新たに調製したＰｒｏｐｌｅｘ  Ｔ溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（組織培養等級、無エンドトキシン）および２．５ｍＭ中に１：２０に希釈）とインキュベートした。６０分、３７℃でのインキュベート後、１００μｌを、各ウェルから採取し、９６ウェルプレートへと移し、そして１００μｌの同じ緩衝液（１２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．１）を含む）と混合した。
【０５０９】
第Ｘａ因子のタンパク質分解活性を測定するための発色基質Ｓ２７６５を、５０μｌ中に加え、これを、３００μＭの最終濃度とした。その基質の分解を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）中で２時間かけて４０５ｎｍでの吸光度を読み取ることによって決定した。
【０５１０】
発色産物の産生は、Ｐｒｏｐｌｅｘ  Ｔおよび特異的なコアグリガンドと予めインキュベートしたｂＥｎｄ．３細胞の存在に完全に依存した。細胞の非存在下でのＰｒｏｐｌｅｘ  Ｔによるその基質のバックグラウンド加水分解は、最大値の約１０％であり、そしてこれを、各測定から減じた。Ｐｒｏｐｌｅｘ  Ｔ溶液中に希釈した遊離のコアグリガンドは、第Ｘａ因子を生成し得なかった。生成したＸａの量を、精製した第Ｘａ因子の既知濃度を用いた構築した標準曲線を参照して算出した。
【０５１１】
この研究の終わりに、細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて剥離し、そして計数した。その結果を、１０4細胞あたりに生成した第Ｘａ因子の量として表す。各研究を、二連で行い、そして少なくとも３回反復した。
【０５１２】
（Ｂ．結果）
（１．第Ｘ因子の活性化）
ＩＬ−１α活性化したｂＥｎｄ．３細胞に結合した抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンドは、第Ｘ因子を特異的に活性化し得た。抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコーティングした細胞による第Ｘａ因子の生成速度は１時間、１０4細胞あたり、３．２ｎｇであった。これは、無関係の特異性のコントロールコアグリガンドまたはｔＴＦ単独で処理した活性化細胞を用いて観察されたものの７〜１０倍高かった（図１Ｂ）。細胞の非存在下では抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦは、検出不可能な第Ｘ因子の活性化活性を有した。このことは、この細胞結合がコアグリガンドの活性に必須であることを確認する。
【０５１３】
刺激していないｂＥｎｄ．３細胞に結合した抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦは、１時間、１０4細胞あたり１．６ｎｇの速度で第Ｘ因子を活性化した。この速度は、ＩＬ−１α刺激した細胞を用いて観察されたもののおよそ半分である。これは、刺激された細胞と比較して、刺激されていない細胞に結合するコアグリガンドの５０％少ない量と一致する。図１Ｂに示すものと類似する結果が、３つの別個の研究において観察された。
【０５１４】
（２．内皮細胞透過化の効果）
抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンドを用いて処置した後の、サポニンでのｂＥｎｄ．３単層の透過化によって、結合したコアグリガンドが第Ｘ因子を活性化する能力が約３０倍増加した（表２）。抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦを用いて処理した、刺激されていない細胞による第Ｘａ因子の生成速度は、透過化後に１時間、１０4細胞あたり１．６ｎｇから４９．２ｎｇに増加し、他方、ＩＬ−１α刺激した細胞による第Ｘａ因子の生成速度は、１時間、１０4細胞あたり３．２ｎｇから９８．８ｎｇに増加した。透過化した細胞の第Ｘａ因子生成活性は、内因性ＴＦではなく、結合したコアグリガンドに起因していた。なぜなら、透過化した処理していない細胞または無関連の特異性のコントロールコアグリガンドを用いて処理した細胞は、低い第Ｘａ因子生成活性を有していたからである（２ｎｇ／１０4細胞／時間）。
【０５１５】
これらの結果は、このコアグリガンドが透過化した細胞の環境下でより効率的に機能し得ることを示す。おそらく、透過化は、凝固開始複合体の形成を加速する細胞内から負に荷電したリン脂質を露出させるか、またはＴＦＰＩによるそのような複合体の不活化を防ぐ。
【０５１６】
【表２】
2006213734.tif 000009
【０５１７】
（実施例ＶＩ：抗ＶＣＡＭ−１コアグリガンドによる腫瘍血管血栓症）
（Ａ．方法）
Ｌ５４０腫瘍（０．４〜０．７ｃｍ3）を有するＳＣＩＤマウスに、４０μｇ（総タンパク質）の抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦまたはＲ１８７・ｔＴＦを静脈内注射した。この用量は、３２μｇの抗体および８μｇのｔＴＦに対応する。他の動物には、等量の遊離抗体、遊離ｔＴＦまたはその両方の混合物を与えた。動物に、４または２４時間後麻酔をし、その血液循環をヘパリン含有生理食塩水を用いて灌流した。腫瘍および主要な器官を取り出し、そしてホルマリン中に固定し、そしてパラフィンに包埋または凍結切片化のために瞬間凍結した。切片をその組織もしくは腫瘍の中心を通して切断した。５つの横断切片における血栓が形成された血管または血栓が形成されていない血管の数を計数した。血栓が形成された血管のパーセンテージを算出した。
【０５１８】
（Ｂ．結果）
（１．腫瘍血管の血栓症）
この研究は、抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンドの静脈内投与が、腫瘍保有マウスにおいて、正常組織における血管とは異なり、腫瘍血管の選択的血栓症を誘導することを示す。
【０５１９】
抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンドを、０．４〜０．６ｃｍの直径の皮下Ｌ５４０腫瘍を有するマウスに投与した。コアグリガンド注射の前に、腫瘍は健常であり、壊死領域を欠いた均一な形態を有した。この腫瘍は充分に脈管化しており、そして自然に血栓形成した血管も出血も完全になかった。実施例Ｉに示される腫瘍血管の２０〜３０％のみが最初に染色されたが、コアグリガンド注射４時間以内に、４０〜７０％の血管に血栓形成された。血栓形成された血管は、閉塞性血小板凝集物、充填された赤血球およびフィブリンを含んでいた。いくつかの領域において、血管は断裂しており、赤血球が腫瘍の間隙に滲出していた。
【０５２０】
コアグリガンド注射の２４時間後、血管はなお閉塞されており、過剰な出血は、その腫瘍じゅうに広がっていた。腫瘍細胞は、互いに分離され、核濃縮核を有しており、そして細胞溶解を受けつつあった。７２時間までに壊死の進行は、腫瘍じゅうに明らかになった。壊死は、腫瘍の腫瘍間領域に明らかに存在し、ここでは、血管におけるＶＣＡＭ−１発現はもともとは顕著ではなかった。コアグリガンド結合は、すべての腫瘍領域において血流を縮減するに明らかに有効であった。このことは、広汎な腫瘍破壊をもたらした。さらに、初期のコアグリガンド誘導トロンビン沈着は、中枢の血管においてＶＣＡＭ−１標的抗原の誘導の増加をもたらし、従って、標的化および腫瘍破壊を増幅したようである。
【０５２１】
腫瘍血管に対する抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦの血栓作用は、抗原特異的であった。等量で投与したコントロール試薬（ｔＴＦ単独、抗ＶＣＡＭ−１抗体単独、ｔＴＦおよび抗ＶＣＡＭ−１抗体または無関連の特異性のコントロールコアグリガンド）は、血栓症を引き起こさなかった（表３）。
【０５２２】
【表３】
2006213734.tif 000010
【０５２３】
（２．正常な血管の血栓症の欠如）
腫瘍血管の血栓症に加えて、本研究はまた、抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンドの静脈内投与が正常器官内での血管の血栓症を誘発しないことを示す。
【０５２４】
正常なマウスまたはＬ５４０腫瘍保有マウスの心臓および肺の中の血管におけるＶＣＡＭ−１の発現（表１）にもかかわらず、血栓症は、抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンド投与の後には起こらなかった。血栓症、組織損傷または変化した形態の徴候は、４時間前または２４時間前に５〜４５μｇのコアグリガンドを注射した２５匹のマウスには見られなかった。主要な腫瘍血栓症を有した同じマウスからは、心臓および肺の正常な組織学的外見が存在した。すべての他の主要な器官（脳、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、腸、精巣）もまた、変化していない形態を有した。
【０５２５】
コアグリガンド処理したマウスからの器官および腫瘍の凍結した切片は、抗ＴＦ抗体、１０Ｈ１０または抗ラットＩｇＧ抗体のいずれかを用いて発色した場合、一致した染色パターンを与え、これは、そのコアグリガンドが心臓、肺および腫瘍における血管に局在化されたことを確認した。染色の強度は、コアグリガンドが高濃度でその切片に直接適用され、続いて抗ＴＦまたは抗ラットＩｇＧで発色した場合に見られるものと等価であり、このことは、結合の飽和がインビボで達成されたことを示した。
【０５２６】
これらの研究は、心臓および肺における正常血管系上のＶＣＡＭ−１に対するコアグリガンドの結合が血栓症を誘発するに不十分であること、および腫瘍血管系が凝固を支持するさらなる因子を提供することを示す。
【０５２７】
（実施例ＶＩＩ：抗ＶＣＡＭ−１コアグリガンドによるインビボ腫瘍破壊）
（Ａ．方法）
雄性ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスに、１×１０7  Ｌ５４０細胞を上記のように皮下注射をした。その腫瘍が０．４〜０．６ｃｍ3の容量に達したときに、そのマウスに２０μｇの抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦ、１６μｇの抗ＶＣＡＭ−１抗体、４μｇのｔＴＦ、１６μｇの抗ＶＣＡＭ−１抗体および４μｇのｔＴＦの混合物、２０μｇのコントロールＩｇＧ・ｔＴＦまたは生理食塩水のいずれかを静脈内注射した。いくつかの研究において、この処置を、０日目、４日目および８日目の３回行った。最低８匹の動物を各群において処置した。
【０５２８】
動物を、腫瘍測定および体重について毎日モニターした。マウスを、腫瘍が２ｃｍ3の直径に達したときに屠殺したか、または腫瘍が壊死または潰瘍化の徴候を示した場合にはそれより早く屠殺した。腫瘍の容量を公式：π／６×Ｄ×ｄ2（ここで、Ｄは、より大きな腫瘍直径であり、そしてｄは、より小さな直径である）に従って算出した。腫瘍増殖速度における差を、非パラメータ検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定（ｒａｎｋ  ｓｕｍ  ｔｅｓｔ））を用いて統計学的有意性について検定した。これは、腫瘍の大きさが正規に分布するという仮定を行わない（Ｇｉｂｂｏｎｓ，１９７６）。
【０５２９】
（Ｂ．結果）
抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンドの抗腫瘍活性を、０．３〜０．４ｃｍ3のＬ５４０腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおいて決定した。この薬物を、４日の間隔をおいて３回静脈内投与した。３つの異なる研究からプールした結果を、図２および表４に示す。抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦで処置したマウスの平均腫瘍容積は、すべての他の群に比較して処置の２１日目で有意に減少していた（Ｐ＜０．００１）。特異的なコアグリガンドで処置した合計１５匹のマウスのうち９匹は、腫瘍容積において５０％を超える減少を示した。この効果は、特異的であった。なぜなら、結合体化していないｔＴＦ，コントロールＩｇＧコアグリガンドおよび遊離の抗ＶＣＡＭ−１抗体およびｔＴＦの混合物は、腫瘍増殖に影響を与えなかったからである。
【０５３０】
【表４】
2006213734.tif 000011
【０５３１】
（実施例ＶＩＩＩ：腫瘍血管におけるホスファチジルセリンの発現）
（Ａ．方法）
（１．抗体）
抗ホスファチジルセリン（抗ＰＳ）および抗カルジオリピン抗体（両方ともマウスモノクローナルＩｇＭ抗体）を、Ｒｏｔｅ（Ｒｏｔｅら、１９９３）に記載されるように生成した。
【０５３２】
抗ＰＳ抗体および抗カルジオリピン抗体の特性の詳細はまた、Ｒｏｔｅら（１９９３、本明細書において参考として援用される）に報告された。
【０５３３】
（２．液胞内皮におけるＰＳ発現の検出）
Ｌ５４０腫瘍保有マウスに、２０μｇの抗ＰＳマウスＩｇＭ抗体または抗カルジオリピンマウスＩｇＭ抗体のいずれかを静脈内投与した。１０分後、マウスに麻酔をかけ、そしてその血液循環をヘパリン化した生理食塩水で灌流した。腫瘍および正常組織を取り出し、そして瞬間凍結した。器官および腫瘍の連続切片を、抗ＰＳ抗体の検出のためのＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＭ、または抗ＶＣＡＭ−１抗体に続いてＨＲＰ標識した抗ラットＩｇのいずれかで染色した。
【０５３４】
凍結切片上の膜リン脂質を保存するために、以下のプロトコルを開発した。動物を、２．５ｍＭ  Ｃａ2+を含むＤＰＢＳで灌流した。組織を、３−アミノプロピルトリエトキシシランでコーティングしたスライド上にマウントし、そして２４時間以内に染色した。スライドの固定または洗浄には、有機溶媒も、ホルムアルデヒドも、界面活性剤も使用しなかった。スライドを、２．５ｍＭ  Ｃａ2+および０．２％ゼラチンを含むＤＰＢＳによって再水和した。同じ溶液をまた使用して、切片を洗浄して、過剰な試薬を除去した。切片を、ＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＭとともに室温にて３．５時間インキュベートして、抗ＰＳ  ＩｇＭを検出した。
【０５３５】
（Ｂ．結果）
心臓および肺におけるＶＣＡＭ−１陽性脈管構造に対する抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦの血栓効果の欠如を説明するために、本発明者らは、正常血管と腫瘍血管との間の差次的なＰＳの局在化の概念を開発した。具体的には、本発明者らは、血栓反応に関与し得ない場合、正常組織における内皮細胞は、ＰＳを原形質膜リン脂質二重層の内部表面に隔離し、一方、コアグリガンドの凝固反応を支持し得る場合、腫瘍における内皮細胞は、ＰＳを原形質膜の外部表面に転位すると仮定した。細胞表面におけるＰＳの発現は、凝固を可能にする。なぜなら、凝固因子の膜への付着が可能であり、そして凝固開始複合体のアセンブリを統合させるからである（Ｏｒｔｅｌら、１９９２）。
【０５３６】
本明細書中で開発されるような、腫瘍血管内皮細胞の表面へのＰＳの転位の本発明者らのモデルは、ＰＳの発現が細胞死の後に起こらず、そして細胞死を回避不能には誘発しない点で驚くべきことである。従って、腫瘍内皮細胞表面でのＰＳの発現は、ＰＳが治療的介入のための標的可能な実体として作用するに十分に安定である。
【０５３７】
腫瘍血管内皮が原形質膜の管腔表面でＰＳを発現するという仮説を確認するために、本発明者らは、免疫組織化学を使用して、Ｌ５４０保有マウスへの静脈内注射後の抗ＰＳ抗体の分布を決定した。抗ＰＳ抗体は、１０分以内に、腫瘍血管（ＶＣＡＭ−１を欠如し得る腫瘍の中心領域における血管を含む）の大部分に局在化した。ＶＣＡＭ−１に対して陽性であった血管はまた、ＰＳに対しても陽性であった。従って、腫瘍におけるＶＣＡＭ−１を発現する血管上にＰＳの同時発現が存在する。
【０５３８】
インビボ局在化研究において、正常器官における血管（心臓および肺のＶＣＡＭ−１陽性脈管構造を含む）が染色されなかったことは、ＰＳが内皮細胞の外部表面に不在であることを示す。対照的に、正常組織および腫瘍の切片を、抗ＰＳ抗体でインビトロにて直接染色した場合、正常の内皮細胞または他の細胞型と、腫瘍の内皮細胞または他の細胞型との間の可視の差異はなく、このことは、ＰＳがこれらの細胞内に存在するが、腫瘍における内皮細胞の表面にのみ発現されることを示す。
【０５３９】
ＰＳの検出の特異性を、２つの独立した研究によって確認した。第１に、異なる負に荷電した脂質であるカルジオリピンに対して指向されるマウスＩｇＭモノクローナル抗体は、腫瘍またはいずれの器官にもインビボではホーミングしなかった。第２に、凍結切片のアセトンでの前処置は、抗ＰＳ抗体での染色を消失させた。なぜなら、その処置は、おそらく、結合した抗ＰＳ抗体とともにその脂質を抽出するからである。
【０５４０】
（実施例ＩＸ：アネキシンＶは第Ｘ因子のインビトロでのコアグリガンド活性化をブロックする）
（Ａ．方法）
アネキシンＶがコアグリガンドによって誘導される第Ｘａ因子形成に影響を与える能力を、上記の実施例Ｖに記載した色素生産性アッセイによって決定した。ＩＬ−１α刺激したｂＥｎｄ．３細胞を、抗ＶＣＡＭ−・ｔＴＦとともにインキュベートし、そしてサポニンで透過化処理した。アネキシンＶを、０．１〜１０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加し、そして細胞を、希釈したＰｒｏｌｅｘＴの添加前に３０分間インキュベートした。アネキシンＶの存在下または非存在下で生成した第Ｘａ因子の量を、実施例Ｖに記載の通りに決定した。各処置を２連で行い、そして少なくとも２回繰り返した。
【０５４１】
（Ｂ．結果）
コアグリガンド作用における表面ＰＳ発現の必要性はさらに、アネキシンＶ（これは、高親和性でＰＳに結合する）が、ｂＥｎｄ．３細胞に結合される抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦがインビトロで第Ｘａ因子を生成する能力をブロックするという本発明者らの発見によって示される。
【０５４２】
抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦとともにプレインキュベートされた、透過化処理された細胞に添加されたアネキシンＶは、用量依存性様式で第Ｘａ因子の形成を阻害した（図３）。アネキシンＶの非存在下で、細胞結合コアグリガンドは、６０分、１０，０００細胞あたり９５ｎｇの第Ｘａ因子を産生した。漸増量のアネキシンＶ（１ｍｌあたり１μｇの範囲で）の添加は、第Ｘａ因子の産生を阻害した。１ｍｌあたり１０μｇでは、アネキシンＶは、第Ｘａ因子の産生を５８％阻害した（図３）。アッセイの間のアネキシンＶの濃度の増加によるさらなる阻害は観察されず、このことは、アネキシンＶが、１ｍｌあたり１０μｇで全ての利用可能な結合部位を飽和したことを示す。
【０５４３】
（実施例Ｘ：アネキシンＶはインビボでコアグリガンド活性をブロックする）
（Ａ．方法）
アネキシンＶのインビボでコアグリガンド誘導性血栓症を阻害する能力を、Ｌ５４０ホジキン腫保有ＳＣＩＤマウスにおいて試験した。腫瘍を、上記の実施例ＩＩに記載のようにマウスにおいて増殖させた。１群あたり２匹のマウス（直径０．５ｃｍの腫瘍サイズ）を、以下の試薬のいずれか１つで尾静脈を介して静脈内注射した：ａ）生理食塩水；ｂ）１００ｇのアネキシンＶ；ｃ）４０μｇの抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦ；ｄ）１００μｇのアネキシンＶ、続いて２時間後に４０μｇの抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦ。
【０５４４】
最後の注射の４時間後、マウスを麻酔し、そしてヘパリン化生理食塩水で灌流した。腫瘍を取り出し、４％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、そしてヘマトキシレン−エオシンで染色した。血栓が形成された血管および血栓が形成されていない血管の数を計数し、そして血栓の割合を算出した。
【０５４５】
（Ｂ．結果）
アネキシンＶはまた、インビボでの抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンドの活性をブロックする。腫瘍保有マウスの群を、方法に記載の通りに、コントロールまたは試験試薬の１つで処置した。マウスに以下を与えた：（ａ）生理食塩水；（ｂ）１００ｇのアネキシンＶ；（ｃ）４０μｇの抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンド；または（ｄ）１００のアネキシンＶ、続いて２時間後に４０μｇの抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンド。同一の結果が、１群あたり両方のマウスで得られた。
【０５４６】
自発的な血栓、出血または壊死は、生理食塩水を注射したマウス由来の腫瘍において観察されなかった。アネキシンＶ単独での処置は、腫瘍形態を変更しなかった。
【０５４７】
本明細書中で示される他のデータによれば、４０μｇの抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンドは、全腫瘍血管の７０％において血栓を生じた。血管の大部分は固まった赤血球および血餅で閉塞し、そして腫瘍細胞は互いに分離した。コアグリガンド誘導性抗腫瘍効果（すなわち、静脈内血栓）および腫瘍細胞形態における変化の両方は、マウスをアネキシンＶで前処置することによって完全に消失した。
【０５４８】
これらの知見は、コアグリガンドの抗腫瘍効果が、腫瘍脈管構造の妨害によって媒介されることを確認する。これらのデータはまた、ＰＳが、インビボでのコアグリガンド誘導性血栓に必須であることを実証する。
【０５４９】
（実施例ＸＩ：外部移行（ｅｘｔｅｒｎａｌｉｚｅ）したホスファチジルセリンは腫瘍血管のグローバルマーカーである）
（Ａ．方法）
腫瘍および正常血管内皮上のＰＳの露出を、３つの動物腫瘍モデルにおいて試験した：Ｌ５４０ホジキンリンパ腫、ＮＣＩ−Ｈ３５８非小細胞肺癌腫、およびＨＴ２９結腸腺癌（ＡＴＣＣ）。インビボでの腫瘍を成長させるために、２×１０6細胞を、ＳＣＩＤマウスの右側腹部に注射し、そして０．８〜１．２ｃｍの直径に到達させた。大きな腫瘍（８００ｍｍ3を超える容量）を保有するマウスを、２０μｇの抗ＰＳ抗体または抗カルジオリピン抗体のいずれかで尾静脈を介して静脈内注射した。抗カルジオリピン抗体は、全ての研究についてのコントロールとしての役目をした。なぜなら、両方の抗体は、負に荷電した脂質に対して指向され，そして同じクラスのイムノグロブリン（マウスＩｇＭ）に属するからである。
【０５５０】
注射の１時間後、マウスを麻酔し、そしてその血液循環をヘパリン化生理食塩水で灌流した。腫瘍および正常器官を取り出し、そして瞬間凍結した。凍結切片を、抗マウスＩｇＭ−ペルオキシダーゼ結合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）で染色し、続いてカルバゾールで発色させた。
【０５５１】
（Ｂ．結果）
抗ＰＳ抗体は、マウスＩｇＭの検出によって示されるように、全ての３つの腫瘍（ＨＴ２９、Ｌ５４０およびＮＣＩ−Ｈ３５８）の脈管構造にインビボで特異的にホーミングした。腫瘍において染色された血管の平均割合は、ＨＴ２９については８０％、Ｌ５４については３０％、そしてＮＣＩ−Ｈ３５８については５０％であった。腫瘍の全ての領域における血管を染色し、そして小さな毛細血管および大きな血管の両方が染色された。
【０５５２】
血管の染色は、いずれの正常組織においても、抗ＰＳ抗体を用いて観察されなかった。腎臓において、細管は、抗ＰＳおよび抗ＣＬの両方で染色され、そしてこれは、この器官によるＩｇＭの分泌に関するようである（表５）。抗カルジオリピン抗体は、いずれの腫瘍または正常組織（腎臓を除く）においても検出されなかった。
【０５５３】
これらの知見は、腫瘍内皮のみが、ＰＳを原形質膜の外側部位に露出することを示す。
【０５５４】
【表５】
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【０５５５】
腫瘍脈管構造が、ＰＳを膜の内側に隔離する能力を欠失する時間を見積もるために、本発明者らは、１４０〜１，６００ｍｍ3の容量の範囲で、Ｌ５４０腫瘍における抗ＰＳ局在化を実験した。マウスを、その腫瘍サイズによって３群に分割した：１４０〜３００ｍｍ3、３５０〜８００ｍｍ3および８００〜１，６００ｍｍ3。抗ＰＳ  Ａｂは、小さなＬ５４０腫瘍（３００ｍｍ3まで）を保有する３匹のマウスにおいて検出されなかった。抗ＰＳ  Ａｂは、中間サイズのＬ５４０腫瘍群の５匹のうち３匹の動物において、および大きなＬ５４０腫瘍を保有する全てのマウス（４匹のうち４匹）において局在化した（表６）。合計からのＰＳ陽性血管の割合（汎内皮マーカーＭｅｃａ３２によって同定した）は、Ｌ５４０中間群において１０〜２０％、および大きなＬ５４０腫瘍群において２０〜４０％であった（表６）。
【０５５６】
【表６】
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【０５５７】
（実施例ＸＩＩ：結合体化されていない抗ホスファチジルセリン抗体の抗腫瘍効果）
（Ａ．方法）
抗ＰＳ抗体の効果を、同系腫瘍モデルおよび異種腫瘍モデルにおいて実験した。同系モデルについて、１×１０7細胞のマウス結腸直腸Ｃｏｌｏ２６（Ｉａｎ
Ｈａｒｔ博士、ＩＣＲＦ、Ｌｏｎｄｏｎから得た）を、Ｂａｌｂ／ｃマウスの右側腹部に皮下注射した。異種モデルにおいて、ヒトホジキンリンパ腫Ｌ５４０異種移植片を、雄ＣＢ１７ＳＣＩＤマウスの右側腹部に、１×１０7の細胞を皮下注射することによって確立した。腫瘍を、処置前に、約０．６〜０．９ｃｍ3のサイズまで増殖させた。
【０５５８】
腫瘍保有マウス（１群あたり４匹の動物）を、２０μｇの裸の抗ＰＳ抗体（ＩｇＭ）、コントロールマウスＩｇＭまたは生理食塩水でｉ．ｐ．注射した。処置を、４８時間間隔で３回繰り返した。動物を、腫瘍測定および体重について毎日モニターした。腫瘍容量を、実施例ＶＩＩに記載の通りに計算した。マウスを、腫瘍が２ｃｍ3に達した場合、または腫瘍が壊死もしくは潰瘍化の徴候を示した場合にはより早く、屠殺した。
【０５５９】
（Ｂ．結果）
同系および異種腫瘍の両方の増殖は、裸の抗ＰＳ抗体を用いる処置によって有効に阻害された（図４Ａおよび図４Ｂ）。抗ＰＳ抗体は、血栓に付随する腫瘍血管損傷および腫瘍壊死を引き起こした。血餅の存在および腫瘍塊の周りのブロックされた血管の崩壊が顕著であった。
【０５６０】
定量的に、この裸の抗ＰＳ抗体処置は、大きなＣｏｌｏ２６腫瘍（図４Ａ）およびＬ５４０腫瘍（図４Ｂ）を保有するマウスにおけるコントロール腫瘍容量の６０％まで、腫瘍増殖を阻害した。生理食塩水またはコントロールＩｇＭで処置したマウスにおいて、腫瘍増殖の遅延は見出されなかった。抗ＰＳ抗体で処置したマウスにおいて毒性は観察されず、正常な器官は、もとのままの形態を保存し、処置していないマウスまたは生理食塩水で処置したマウスと区別できなかった。
【０５６１】
腫瘍後退は最初の処置の２４時間後に開始し、そして腫瘍は、次の６日間サイズが減少し続けた。このことは、同系および免疫無防備状態腫瘍モデルの両方において観察された。このことは、この効果が、免疫状態依存性機構によって媒介されることを示す。さらに、腫瘍負荷における減少は、１５００ｍｍ3より大きな腫瘍を保有するコントロールマウスと比較して、動物の機敏さおよび一般に健常な外見の増加に関連した。腫瘍の再増殖は、最初の処置の７〜８日後に生じた。
【０５６２】
Ｌ５４０腫瘍の抗ＰＳ処置で得られた結果はさらに、以下の理由を強制する。特に、Ｌ５４０腫瘍処置において観察された腫瘍壊死は、Ｌ５４０腫瘍においてＰＳについて陽性に染色された血管の割合がＨＴ２９およびＮＣＩ−Ｈ３５８腫瘍における割合より少なかったという事実にもかかわらず、生じる。このことは、さらにより迅速な壊死が他の腫瘍型を処置した場合に生じるようであることを意味する。さらに、Ｌ５４０腫瘍は、一般的に、実験モデルとして選択される。なぜなら、これらは、きれいな組織学的切片を提供し、そして実際に、壊死に対して抵抗性であることが知られているからである。
【０５６３】
（実施例ＸＩＩＩ：アネキシン結合体の抗腫瘍効果）
アミノリン脂質が腫瘍脈管構造の安定なマーカーであるという驚くべき知見はまた、抗体−治療剤構築物が癌治療に使用され得ることを意味する。標的剤としての抗体の使用に加えて、本発明者らは、アネキシン、および他のアミノリン脂質結合タンパク質もまた、治療剤を腫瘍脈管構造に特異的に送達するのに使用され得ると結論付けた。以下のデータは、アネキシン−ＴＦ構築物のインビボ投与から生じる抗腫瘍効果を示す。
【０５６４】
（Ａ．方法）
アネキシンＶ−ｔＴＦ結合体を調製し、そして固形腫瘍を有するｎｕ／ｎｕマウスに投与した。この腫瘍は、少なくとも約１．２ｃｍ3の腫瘍を形成したヒトＨＴ２９結腸直腸腺癌細胞から形成された。アネキシンＶ−ｔＴＦコアグリガンド（１０μｇ）を静脈内投与し、そして２４時間循環させた。生理食塩水で処置したマウスを、コントロールマウスとして別々に維持した。１日の処置期間の後、このマウスを屠殺し、そして放血させ、そしてこの腫瘍および主な器官を分析のために採取した。
【０５６５】
（Ｂ．結果）
アネキシンＶ−ｔＴＦ結合体が、ＨＴ２９腫瘍保有マウスにおいて特定の腫瘍血管凝固を誘導することを見出した。アネキシンｖ−ｔＴＦ結合体処置した動物における腫瘍血管の約５５％が、１回の注射後に血栓形成した。対照的に、コントロール動物の腫瘍脈管構造において血栓、最小限に現れた。
【０５６６】
（実施例ＸＩＶ：腫瘍環境にけるホスファチジルセリン転位）
腫瘍血管内皮細胞に独特のインビボ表面マーカーとしてのＰＳの発見は、本発明者らに、ＰＳの転位および外膜発現に対する腫瘍環境の効果のさらなる調査を促した。本実施例は、腫瘍においてそれらを模倣する特定の状態にインビトロで内皮細胞を曝露させることは、インタクトな生細胞において観察されたＰＳの表面発現を複製することを示す。
【０５６７】
（Ａ．方法）
マウスｂＥｎｄ３内皮細胞を、５０，０００細胞／ウェルの開始密度で播種した。２４時間後、細胞を、漸増濃度のＨ2Ｏ2（１０μＭ〜５００μＭ）とともに、３７℃にて１時間インキュベートするか、または未処理のままにした。インキュベーションの終わりに、細胞を、０．２％ゼラチンを含有するＰＢＳで３回洗浄し、そして０．２５％グルタルアルデヒドで固定した。同一のウェルを、抗ＰＳ  ＩｇＭで染色、またはトリプシン処理のいずれかをし、そしてＴｒｙｐａｎ
Ｂｌｕｅ排除試験によって生存度について評価した。抗ＰＳ染色について、２％ゼラチンで１０分間ブロックした後、細胞を、２μｇ／ｍｌの抗ＰＳ抗体とともにインキュベートし、続いて抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ結合体で検出した。
【０５６８】
マウスｂＥｎｄ．３内皮細胞を播種したウェルもまた、異なるエフェクターとともにインキュベートし、そして３７℃にて同じ期間インキュベートした後に、コントロールの未処理ウェルと比較した。試験したエフェクターのパネルは、ＴＮＦ、ＬＰＳ、ｂＦＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびトロンビンを含んだ。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、そして固定し、そして再度、上記のように、抗ＰＳ  ＩｇＭで染色、またはＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ排除試験のいずれかを用いて生存度について評価した。
【０５６９】
（Ｂ．結果）
（１．Ｈ2Ｏ2によるＰＳの誘導）
内皮細胞を１００μＭより高い濃度でＨ2Ｏ2に曝露することにより、約９０％の細胞においてＰＳの転位を引き起こした。しかし、このことは、支持層からの細胞の剥離および約５０〜６０％の細胞生存度の減少を付随した。表面ＰＳ発現の細胞生存度の減少との関連は理解できるが、約９０％のＰＳの転位は細胞生存度において５０〜６０％の減少のみが観察されるということに注目することはなお興味深い。
【０５７０】
１００μＭ未満の濃度のＨ2Ｏ2を使用すると、細胞生存度における認識し得る減少を全く伴わずに有意なＰＳの発現を生じた。例えば、ＰＳは、２０μ程度の濃度のＨ2Ｏ2を用いてＨ2Ｏ2処理した全てのウェルにおいて、約５０％の細胞の細胞表面で検出された。これらの低いＨ2Ｏ2濃度の下で、この細胞がプラスチックにそして互いに密接に付着されたままであり、形態学的な変化を示さず、そして細胞傷害性の徴候を有さなかったことに注目することは重要である。詳細な分析により、本質的に１００％の細胞−細胞接触、適切な細胞形状およびインタクトな細胞骨格の保持が明らかにされた。
【０５７１】
従って、低レベルのＨ2Ｏ2によって誘導される５０％のＰＳ表面発現が、細胞生存度がコントロール（未処理の細胞）と同一（すなわち、９５％）である細胞集団において観察された。高濃度のＨ2Ｏ2に関連するＰＳ発現は、細胞損傷を付随し、そして１００μＭを超えるＨ2Ｏ2に曝露されたＰＳ陽性細胞は、剥離し、浮遊し、そして細胞骨格が破壊された。
【０５７２】
低濃度のＨ2Ｏ2の存在下での細胞生存度の維持は、他の研究室からのデータと一致する。例えば、Ｓｃｈｏｒｅｒら（１９８５）は、１５μＭのＨ2Ｏ2で処理したヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）が、平均して９０〜９５％の生存度（５％〜１０％の損傷として報告された）であるのに対し、１５００μＭのＨ2Ｏ2に曝露されたものは、０％〜５０％のみ生存する（５０％〜１００％の損傷）ことを示した。
【０５７３】
インビトロで腫瘍環境を模倣するためのＨ2Ｏ2の使用もまた、この腫瘍環境が、Ｈ2Ｏ2および他の反応性酸素種を生成する炎症性細胞（例えば、マクロファージ、ＰＭＮおよび顆粒球）中に富むという点で適切である。以前には安定な腫瘍血管マーカーと結合されるものはなかったが、炎症性細胞は、Ｈ2Ｏ2の存在を必要とする反応性酸素種が関与する機構によって内皮細胞損傷を媒介することが知られている（Ｗｅｉｓｓら、１９８１；Ｙａｍａｄａら、１９８１；Ｓｃｈｏｒｅｒら、１９８５）。実際に、研究により、インビトロでのＰＭＮの刺激が、細胞死（クロム放出アッセイによって測定される）または細胞の剥離を引き起こさずに致死以下の内皮細胞損傷を引き起こすに十分な濃度のＨ2Ｏ2を産生することが示された；そしてこれらのＨ2Ｏ2濃度が、インビボで局所的に達成し得ることが示された（Ｓｃｈｏｒｅｒら、１９８５）。
【０５７４】
本発明のインビトロ転位データは、抗ＰＳ抗体がインビボで腫瘍血管内皮細胞に特異的に局在し、そして正常組織のおける細胞に結合しないことを示す初期の結果と相関する。インビボ様濃度のＨ2Ｏ2が細胞完全性を破壊せずに内皮細胞表面へのＰＳの転位を誘導するという知見は、もともとのインビボデータおよび本発明者らの治療的アプローチの確証に加えて重要な意味を有する。
【０５７５】
ヒト、ウシおよびマウスの内皮細胞は全て、正常条件下でＰＳ陰性であることが公知である。以前に実証されたＰＳの発現は常に、細胞損傷および／または細胞死を伴っていた。このことは単に、本研究においてはそうではない。本発明においては，正常な生存度が維持される。このことは、腫瘍血管内皮におけるＰＳの転位が、細胞損傷に関連しない生化学的機構によって媒介されることを示す。このことは、形態学的にインタクトな内皮細胞におけるＰＳ表面発現の最初の実証であり、そしてＰＳの発現がアポトーシス経路（単数または複数）から切断され得ることの最初の徴候であると考えられる。本発明の実施可能性に戻ると、これらの観察は、再度、ＰＳが一過性というよりはむしろ持続可能な、腫瘍血管のマーカーであり、そして治療的介入のための適切な候補であることを確認する。
【０５７６】
（２．ＰＳの発現は細胞活性化と相関しない）
このインビトロデータの腫瘍環境に対する関連性はまた、他の一般的な細胞アクチベーターが内皮細胞におけるＰＳの転位に対する効果を伴わないという事実によって強化される。例えば、本発明者らは、同様のコントロール研究においてＴＮＦを試験し、そしてＥ−セレクチンおよびＶＣＡＭ発現における増加が予測されるにもかかわらず。ＰＳ表面発現を誘導し得ないことを見出した。同様に、ＬＰＳ、ｂＦＧＦ、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは全て、適切なコントロール研究におけるＰＳ発現に対して効果を伴わなかった。
【０５７７】
（３．トロンビンによるＰＳの誘導）
他の細胞アクチベーターの効果の欠如とは対照的に、トロンビンは、ＰＳの発現を増加するが、Ｈ2Ｏ2と同程度ではないことが観察された。このデータはまた、本発明者らによって開発されたＰＳの発現の腫瘍誘導モデルの欠くことのできない部分である（正常組織におけるトロンビン誘導性ＰＳ表面発現はまた、ＰＳ発現が凝固開始複合体のアセンブリを統合させるので、凝固をさらに促進する（Ｏｒｔｅｌら、１９９２））。
【０５７８】
腫瘍環境はプロ血栓性であり、そのために、腫瘍脈管構造は、凝固の素因になることが知られている（米国特許第５，８７７，２８９号）。トロンビンは凝固カスケードの産物であるので、腫瘍脈管構造に存在する。実際、トロンビンの存在がＶＣＡＭ発現を誘導し、ＶＣＡＭを腫瘍脈管構造の検出可能なマーカーとして活用する本発明者らの能力に寄与する（米国特許第５，８５５，８６６号；同第５，８７７，２８９号）。従って、トロンビンもまたＰＳの発現を誘導することを示す本発明のデータは、裸の抗体および治療用結合体を用いるアミノリン脂質の標的化の両方に関連し、そしてさらに、組織因子を含有する抗ＶＣＡＭコアグリガンドの有益な効果を説明する（実施例ＶＩＩ）。
【０５７９】
本明細書中に開示されそして特許請求される全ての組成物および方法は、本発明の開示に照らして過度の実験なく作製され得、そして実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施態様に関して記載されているが、本明細書中に記載される組成物および方法ならびに本発明の方法の工程または一連の工程に、本発明の概念、趣旨および範囲を逸脱せずに、改変が適用され得ることは当業者には明らかである。より詳細には、同じまたは類似の結果が達成しながら、化学的および生理学的の両方に関連する特定の試薬が本明細書中に記載される薬剤と置き換えられ得ることが明らかである。当業者には明らかである全てのこのような類似の置き換えおよび改変は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨、範囲および概念内にあるとみなされる。
【０５８０】
（参考文献）
以下の参考文献は、本明細書に示される手順に対して補助的な例示的な手順またはその他の詳細を提供する程度まで、参考として本明細書中に特に援用される。
【０５８１】
【表７】
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【０５８２】
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【０５８３】
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【０５８４】
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【０５８５】
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【０５８６】
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【０５８７】
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【０５８８】
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【０５８９】
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【０５９０】
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【０５９１】
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【０５９２】
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【０５９３】
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【０５９７】
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【０５９８】
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【０５９９】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書において示される特定の実施態様の詳細な説明と組み合わせて、１つ以上のこれらの図面を参考にして、より良好に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０６００】
【図１Ａ】インビトロにおける細胞結合抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦの活性。刺激されていない（コントロール）細胞およびＩＬ−１α活性化ｂＥｎｄ．３細胞に対する抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンドの結合。
【図１Ｂ】インビトロにおける細胞結合抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦの活性。細胞結合抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦコアグリガンドによる第Ｘａ因子の生成。
【図２】抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦで処置したマウスにおけるＬ５４０腫瘍の増殖遅延。Ｌ５４０腫瘍保有マウスに、生理食塩水、２０μｇの抗ＶＣＡＭ−１・ｔＴＦ、４μｇの非結合ｔＴＦ、または２０μｇのコントロールＩｇＧ・ｔＴＦのいずれかを静脈内注射した。注射は、最初の処置の４日後、および８日後に反復した。腫瘍は日測定した。１グループあたり８匹のマウスの平均腫瘍容積およびＳＤを示す。
【図３】アネキシンＶ（ＡｎｎｅｘｉｎＶ）は、インビトロにおいて、第Ｘ因子のコアグリガンド活性をブロックする。ＩＬ−１αで刺激されたｂＥｎｄ．３細胞を、実施例Ｖに記載のように、９６ウェルマイクロタイタープレート中で抗ＶＣＡＭ−・ｔＴＦコアグリガンドとともにインキュベートした。アネキシンＶを０．１〜１０μｇ/ｍｌの範囲の濃度で添加した（示す）。そして、細胞を３０分間インキュベートした後、希釈したＰｒｏｐｌｅｘＴを添加した。アネキシンＶの存在下または非存在下で生成された第Ｘａ因子の量を、実施例Ｖ記載のように発色性基質を用いて、決定した。
【図４Ａ】同種遺伝子腫瘍および異種遺伝子腫瘍を有する動物における裸の抗ＰＳ抗体の抗腫瘍効果。マウスの結腸直腸ガンＣｏｌｏ２６の１×１０7個の細胞（図４Ａ）またはヒトホジキンリンパ腫Ｌ５４０（図４Ｂ）を、それぞれＢａｌｂ／ｃマウス（図４Ａ）または雄性ＣＢ１７ＳＣＩＤマウス（図４Ｂ）の右わき腹に皮下注射した。腫瘍を、約０．６〜０．９ｃｍ3の大きさに増殖させ、次いで、このマウス（１群あたり４動物）に２０μｇの裸の抗−ＰＳ抗体（白四角）または生理食塩水（白丸）を腹腔内注射した（コントロールマウスのＩｇＭは生理食塩水と類似の結果であった）。処置を、４８時間間隔で３回繰り返した。動物を、腫瘍測定および体重について毎日モニターした。腫瘍容積は、実施例ＶＩＩに記載のように算出した。マウスを、腫瘍が２ｃｍ3に達したときか、または腫瘍が壊死もしくは潰瘍化の兆候を示した場合には、それより早く屠殺した。
【図４Ｂ】同種遺伝子腫瘍および異種遺伝子腫瘍を有する動物における裸の抗ＰＳ抗体の抗腫瘍効果。マウスの結腸直腸ガンＣｏｌｏ２６の１×１０7個の細胞（図４Ａ）またはヒトホジキンリンパ腫Ｌ５４０（図４Ｂ）を、それぞれＢａｌｂ／ｃマウス（図４Ａ）または雄性ＣＢ１７ＳＣＩＤマウス（図４Ｂ）の右わき腹に皮下注射した。腫瘍を、約０．６〜０．９ｃｍ3の大きさに増殖させ、次いで、このマウス（１群あたり４動物）に２０μｇの裸の抗−ＰＳ抗体（白四角）または生理食塩水（白丸）を腹腔内注射した（コントロールマウスのＩｇＭは生理食塩水と類似の結果であった）。処置を、４８時間間隔で３回繰り返した。動物を、腫瘍測定および体重について毎日モニターした。腫瘍容積は、実施例ＶＩＩに記載のように算出した。マウスを、腫瘍が２ｃｍ3に達したときか、または腫瘍が壊死もしくは潰瘍化の兆候を示した場合には、それより早く屠殺した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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