(57)【要約】      （修正有）【課題】膵嚢胞性線維症（ＣＦ）もしくは慢性閉塞性肺疾患（COPD）の治療方法の提供。【解決手段】セクレチンの放出を刺激する作用があるカモスタットを投与することにより、セクレチン受容体の活性化を介して呼吸組織中の陰イオンの流出を誘発することが可能となり、ＣＦもしくはＣＯＰＤを治療することができる。セクレチン受容体が人の肺の遠位部分に存在する組織中に発現されるため、CFの患者では、その受容体のレベルは正常組織に比較すると上昇している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵嚢胞性線維症(CF)またはCOPDの治療のための薬剤の製造のためのカモスタットの使用。
【請求項２】
治療が膵嚢胞性線維症(CF)の治療である請求項１記載のカモスタットの使用。
【請求項３】
治療がCOPDの治療である請求項１記載のカモスタットの使用。
【請求項４】
薬剤が吸入によって投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
吸入による投与が噴霧投与である、請求項４記載の使用。
【請求項６】
カモスタットと共に膵嚢胞性線維症(CF)に対して活性を有する少なくとも１種の他の化合物を含んでなる組成物。
【請求項７】
カモスタットと共にCOPDに対して活性を有する少なくとも１種の他の化合物を含んでなる組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はホルモンであるセクレチンもしくはその他のセクレチン受容体リガンドを用いた、またはそれらの活性化による膵嚢胞性線維症(CF)および慢性閉塞性肺疾患(COPD)の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵嚢胞性線維症(CF)
膵嚢胞性線維症(CF)は、常染色体劣性遺伝病では最もよく見られ、致死性のものであり、英国のみで7000例を超え、米国では約30,000例の患者がいる。CFの発症率は人種的な背景に強く依存している。北ヨーロッパの祖先を持つコーカシアンは最も危険性が高く、ヘテロ接合体のキャリアー率が約25人中1人であることに基づけば、約2500人に1人の確率である。
【０００３】
CFは全身に存在する膵嚢胞性線維症膜貫通調節因子(CFTR)クロライドチャネルの遺伝子における遺伝的変異の結果として生ずる。CFTR中のそのような変異はそのタンパク質の誤った折りたたみおよび/もしくは転写されたタンパク質の小胞体から上皮の原形質膜への移動の欠失をもたらし、それに引き続きクロライド(Cl-)チャネルの喪失がもたらされる。このことは、CFに罹患した肺の下部呼吸器の体液および電解質の輸送および量の細胞と内腔との不均衡をもたらし、それによって粘液の構成成分を低減させ、それが今度は粘液線毛のクリアランスの障害をもたらし、CF患者の肺に不可避で持続的な感染が始まる。種々の変異が様々な重症度のCF症状を引き起こし、それぞれに応じて患者の生存率が変わる。
【０００４】
過去10年間にわたって、薬物療法および物理療法が改良され患者の生存期間の顕著な延長がもたらされたが、平均余命は依然として短く、現在のところ約30年である。従って、この病態に対するより良い治療法が常に求められている。
【０００５】
COPD
COPDの臨床的特徴には、慢性気管支炎および肺気腫(遠位の肺の気室の膨張)の結果としての慢性気道閉塞および肺の過度膨張を伴う、無呼吸、咳、および喀痰が含まれる。気管支喘息で顕著な、慢性気管支過剰反応性もCOPDで認められる。
【０００６】
COPDにおける気道の再構築によって持続的で不可逆的な気道の狭窄および粘液の過剰分泌がもたらされる。気道狭窄と過剰反応性の直接的原因については、一般的には気道の平滑筋機能の異常が気道の弛緩の低下もしくは障害をもたらすか、または収縮性の増大をもたらすという説はあるが、不明である。
【０００７】
徐放性の経口テオフィリンとβ2アゴニスト吸入(例えば、イプラトロピウム、サルブタモール、サルメテロールなど)を組み合わせた気道拡張剤による治療計画、ならびに高投与量のステロイド吸入は現在COPDの治療に用いられている治療法であるが、それはCOPD患者では気道閉塞の多少の改善でも有益であるからである。β2アゴニストは、特異的Gタンパク質であるGsと共役している特異的受容体の刺激を介して気道の気管支拡張をメディエートし、それが今度は第2のメッセンジャーであるcAMPの細胞内レベルの増加をもたらす。
【０００８】
最近、Cl−イオンの移動が上皮依存性の気道の弛緩に関与していることが示され(Fortnerら, 2001)、それはCl−イオン分泌のブロックが、アゴニストが誘発する弛緩の顕著な低下をもたらすほどのものである。さらに、いくつかの研究では、フロセミド、Cl−依存性Na＋/ K＋/2 Cl−同時輸送阻害剤などの化合物は、喘息患者の気管支の過剰反応性を低減させることが示されている(Pendinoら, 1998)。さらに、粘液の過剰分泌および気管・気管支粘液の不連続的クリアランスも、持続的な気道閉塞プラグに寄与し、それが気道の反応性と同時に存在しうる。粘液のプラグは小さい気道(例えば、区気管支)の閉塞をもたらし、最大呼気流量の低減とゆっくりとした強制的な肺空虚化が起こる。
【０００９】
セクレチン 
セクレチンは近位小腸(特に十二指腸および回腸)のS細胞から、胃から出た酸性の内容物に応答して分泌されるペプチドホルモンである。ブタのセクレチンの構造はしばらく前から知られており、ブタセクレチンはブタの腸から単離され27個のアミノ酸残基からなるペプチドで構成されていることが見出されている(Muttら, 1970)。さらに、ウシおよびブタのセクレチンは同一であり、イヌのセクレチンとも類似していることが見出されている。
【００１０】
ウシとブタのセクレチンはいくつかの点ではヒトのセクレチンと全く同じ挙動を示すが構造的には同一ではない。これらの動物セクレチンはヒトセクレチンとは15および16の位置で異なっている。ヒト、ブタ、およびイヌのセクレチンのアラインメントは図1に示している。
【００１１】
セクレチンの生理学的役割は膵臓からの水(H2O)および重炭酸(HCO3−)分泌を刺激して酸性の粥状液の中和を行うことである。セクレチンの作用は7回膜貫通ドメイン、Gタンパク質と共役した受容体(GPCR)、構造的にGPCRスーパーファミリーに関連しているグルカゴン-セクレチン-血管作動性腸管ペプチドのメンバーを介してメディエートされ(IUPHAR Receptor Compendium, 1998)、ペプチドはナノモラーのレベルのアフィニティーを示す。セクレチン受容体を刺激することによって細胞内cAMPの増加およびプロテインキナーゼA(PKA)の活性化をメディエートする。
【００１２】
セクレチンは現在ガストリン腫瘍の診断および膵臓機能の評価のためのものとしてFDAに認可されている。小児自閉症でのセクレチンの「承認外適応」への使用の逸話的な報告ではセクレチンが自閉症に伴う生理学的および行動的症状の双方が改善されることを示唆しているが、自閉症とはコミュニケーション、社会的なスキル、および発達の障害が重篤であることによって特徴づけられる障害である(例えば、WO98/52593、米国特許第6,020,310号、米国特許第6,020,314号を参照せよ)。2000年3月にRepligen Corporation(米国)は自閉症の小児に対するセクレチンの効果を調べる第II相の臨床試験を開始したと発表し、その第II相の試験施設としてはメイヨークリニック(Mayo Clinic)、ロチェスター大メディカルセンター(the University of Rochester Medical Center)、およびフェニックス小児病院(Phoenix Children's Hospital)が含まれ、サウスウエスト自閉症研究センター(the Southwest Autism Research Center)と協働している。これらの試験の初期の結果はセクレチンの輸注が重症自閉症の小児の群において有用であることを示唆している。
【００１３】
セクレチンは吸引性肺炎症候群の予防に用いることも提案されている(例えば、EP0150760；AU3806485)。
【００１４】
非常に多数の合成および/もしくは天然のセクレチンペプチド類似体および断片(本明細書では「セクレチン受容体リガンド」と呼ぶ)があり、それらはセクレチン受容体に対して広範な効力、有効性および選択性を示す。そのようなものとしては、限定はされないが、モノ/ポリ置換セクレチン類似体、セクレチン断片、置換セクレチン断片、還元ペプチド結合類似体(非特許文献１〜７を参照)、ならびに天然および合成のVIP/セクレチンファミリーの類似体、断片、およびキメラペプチド(VIP(血管作動性腸管ペプチド)、胃抑制ペプチド(GIP)、PACAP(脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド)、アドレノメデュリン、カルシトニン、CGRP(α、β、および皮膚のカルシトニン遺伝子関連ペプチド)、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド(GLP)、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン(PTH)およびその関連タンパク質(PTHrP)、副腎皮質ホルモン放出ホルモン(CRH)、ならびにアミリンを含む)が含まれる。これらのペプチドの多くは(グルカゴン、GLP、PACAP、およびVIPを含む)、著しいアミノ酸の相同性があり、特にセクレチンとはアミノ末端に相同性がある。これらのペプチドの全ては類似の2次構造の特徴をとっており、それには両親媒性のα-ヘリカル２次構造を有する1もしくは2つの領域が含まれ、よく保存された様式でそれらの受容体と相互作用するものと思われる(非特許文献８参照)。
【００１５】
既知のものとしてはまた、セクレチン関連受容体ペプチド、および関連類似体および断片があり、セクレチン受容体に対してアフィニティーを示す。
【非特許文献１】Gardner, J.D. et al,(1976) Gastroenterology 71:965-70
【非特許文献２】Gardner, J.D. et al., (1979)  Biochim. Biophys. Acta. 583;491-503
【非特許文献３】Waelbroeck, M. et al., (1981) Effect of 12 secretin analogues and 12 secretin fragments" Biochim. Biophys. Acta 678:83-90
【非特許文献４】Konig, W. et al.,(1984) Peptides 5:189-193 Konig, W., Bickel, Wissmann, H., Sandeur, J. (1986) 「セクレチンの新しい類似体」"New analogues of secretin" Peptides 7:61-67
【非特許文献５】Staun-Olsen, P. et al., (1986) Peptides 7 Suppl l:181-186
【非特許文献６】Robberecht, P. et al., (1988) Pancreas 3:529-535
【非特許文献７】Haffer, B.M. et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:316-322
【非特許文献８】Sexton, P.M. (1999) Curr. Opin. Drug Disc. Dev. 2:440-448
【発明の開示】
【００１６】
我々はCFおよびCOPDの患者から得た組織中のセクレチン受容体の発現レベルを調べた。我々は正常人およびこれらの疾患の患者の双方で、セクレチン受容体が肺の遠位領域、特に三次的気管支(tertiary bronchus)および肺実質で発現されているが、肺のより近位の領域ではmRNAの発現はほとんど、もしくは全く認められないことを見出した。これらの組織でのセクレチン受容体の発現はこれまでに報告されたことのないものである。
【００１７】
我々はさらに、CF患者の三次的気管支中のセクレチン受容体mRNAのレベルが著しく高いという驚くべきことを見出した。この高値はCFに特異的である、その他の肺疾患の患者では見られない。この高値は三次的気管支の組織に特異的であった。
【００１８】
特定の理論に拘束されることは意図していないが、我々は、セクレチンの細胞内のイオンの移動に対する作用(下記参照)は、CFに伴うCTFR欠損の影響に対して反対に作用するものと考えている。さらに、本発明の作用は特定の1つの理論に依存したものではないが、三次的気管支組織中のセクレチン受容体mRNAの高いレベルの１つの説明は、これらの細胞中で起こったイオンの不均衡に応答したものであろう、ということである。
【００１９】
さらに、COPDの患者では、患者の肺のイオン流出の役割は介入的治療を行うための非常に重要な標的であるとの認識が深まりつつある。セクレチン受容体はGタンパク質と結合してGsとなり、従ってセクレチン受容体は、本明細書で遠位のヒト気管支の内面の上皮細胞上で同定された機能を有するセクレチン受容体の活性化が細胞内cAMPの蓄積、およびそれに引き続く気管支拡張をもたらすものと考えることができる(Ngら, 1999をも参照せよ)。そのうえ、他の粘液過剰分泌性の肺疾患、例えば膵嚢胞性線維症およびCOPDなどでは、Cl−の流出の低減によって粘液の水分およびイオン性組成およびそれに引き続いて粘液の粘性と粘液分泌に変化を与え、それによって濃厚な風味のない粘液がもたらされ、それが肺の粘液毛様体(mucociliary)クリアランスを障害する。
【００２０】
従って、本発明は膵嚢胞性線維症に罹患している患者に対してのCFの治療方法を提供し、その方法は、該患者に対して、セクレチン受容体の活性化を介して呼吸組織中の陰イオンの流出を誘発する作用物の有効量を投与することを含んでなるものである。
【００２１】
本発明はさらに、COPDに罹患している患者に対してのCOPDの治療方法を提供し、その方法は該患者に対して、セクレチン受容体の活性化を介して呼吸組織中の陰イオンの流出のトリガーとなる作用物の有効量を投与することを含んでなるものである。
【００２２】
本発明は部分的にはCF患者の三次的気管支中のセクレチン受容体mRNAレベルが高いという本発明者らの驚くべき知見に基づいたものであり、膵嚢胞性線維症の治療におけるセクレチンの新規の使用法に関する。本発明の好ましい1態様はCF患者に対してセクレチン受容体リガンドを投与することによってCFを治療しようとするものである。しかし、セクレチンがセクレチン受容体リガンドそれ自体を直接的に投与すること以外の方法によって、患者に有効量のセクレチンを送達することができるということを発明者らは考えてきた。セクレチンを投与する代替法とは、セクレチン産生のアップレギュレーションおよび/または肺の細胞内での内因性セクレチンの放出を刺激する薬剤、もしくはセクレチン関連ペプチドを用いることによる方法である。
【００２３】
本発明はまた、膵嚢胞性線維症の治療用の医薬品の製造のために、セクレチン受容体の活性化を介して呼吸組織中での陰イオンの流出を誘発する薬剤の使用をも提供する。
【００２４】
本発明はさらにまた、慢性閉塞性肺疾患の治療用の医薬品の製造のために、セクレチン受容体の活性化を介して呼吸組織中での陰イオンの流出を誘発する作用物の使用をも提供する。
【００２５】
好ましくは、該薬剤はセクレチン受容体リガンドであり、より特定すればセクレチン、とりわけヒトセクレチンである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
セクレチン受容体の活性化を介して呼吸組織中の陰イオンの流出を誘発する薬剤
セクレチン受容体が活性化されることとなる機作は多数ある。例えば、セクレチンの発現が小腸内のS型の腸管内分泌細胞および大腸の腸管内分泌細胞、ならびに発達途上の膵臓のインスリンを産生するβ細胞に限定されていることは広く報告されている。腸管内分泌細胞および膵島細胞は双方とも原腸内胚葉から生ずる。さらに、分枝形態発生と呼ばれるプロセスを経て一次気道が形成され、それによって胚の原腸内胚葉の底面に内側を覆う上皮から2つの腹側肺芽が伸びている。次いで、気道の形成は2本の長い肺芽の伸長性で反復性の分枝によって行われる。肺神経内分泌(PNE)細胞は一次肺上皮から分化する細胞のうちの最初のものであり、通常は胎児および新生児の肺の気道中に最も豊富に存在するものである。これらの細胞は、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、セロトニンおよびエンドセリンを含む多数のペプチドを発現することで知られており、これらのペプチドに対しての、およびシナプトフィジン、クロモグラニン、およびタンパク質遺伝子産物9.5などの一般的な内分泌マーカーに対してのこれらの細胞の免疫応答性を利用して可視化することができる。CFに罹患した気管支では、内分泌細胞内部のカルシトニンの免疫応答性の増大が示されている(Wolfら, 1986)。
【００２７】
我々はCFの三次的気管支の切片ではCFでない肺と比較してクロモグラニンAの免疫応答性が増大していることを見出したが、このことはCFの肺中での孤立性の内分泌細胞数の増加を示唆している。CFの肺の三次的気管支内の内分泌細胞の発現の増加は、セクレチンを含む内分泌ペプチドの存在の増加と相関していることが期待されるであろう。従って、肺内で内分泌細胞を直接的もしくは間接的に刺激して局所的にセクレチンを放出させること(および/もしくは、セクレチン放出ペプチドもしくはセクレチン受容体に対するアフィニティーを示すようなペプチド)は、外因性のセクレチンもしくは疑似体を用いてセクレチン受容体を刺激してCFでの治療上の利点を提供することに対しての代替しうるアプローチであることを示すものであろう。
【００２８】
さらに、セクレチン遺伝子は、その遺伝子の転写のレベルを増加させる薬剤を、例えばプロモーターもしくはエンハンサーによる調節を介して与えることによりアップレギュレートすることができる。セクレチン遺伝子のエンハンサー領域はEボックスとして知られているシス作用性DNAコンセンサス配列(CAGCTG)を含んでおり、それは転写因子のbasic helix-loop-helix(bHLH)ファミリーに属しているタンパク質と結合する。BETA2/NeuroDとして知られているbHLHタンパク質はセクレチン遺伝子の転写の組織特異的な調節をもたらすことが示されている(Mutohら, 1997)。ノックアウトマウスではBETA2/NeuroD欠損マウスは腸管内分泌細胞もしくは膵臓β細胞を発達させることができず、このことは腸の内胚葉から生ずるいくつかの特別な細胞の正常な発達におけるこの転写因子のきわめて重要な役割を示している。BETA2/NeuroD発現はトランスジェニックマウスの内分泌細胞でのみ行われていることが示されている(Rhindiら, 1999)。
【００２９】
さらに、内因性のセクレチン産生のアップレギュレーションは当業界では既知の他の種々の方法によっても行うことができ(例えば、Jiangら, 2001; Yangら, 1998; Morseら, 2001; Lewisら, 1997; WestとRodman, 2001; AltonとKitson, 2000を参照せよ)、そのようなものとしては限定はされないが、遺伝子治療(セクレチン受容体もしくはセクレチン受容体の細胞シグナル伝達経路を直接的に、もしくは間接的に刺激することのできるペプチドをコードする、ウイルス性のもしくは非ウイルス性のベクター中に入れたDNAもしくはRNAの送達)、もしくは遺伝子ターゲティング(セクレチンもしくは関連ペプチドをコードする遺伝子の調節配列、もしくはプロモーター領域上の転写因子結合部位を標的とする薬剤の送達を行い、それによってセクレチン受容体を直接的もしくは間接的に刺激することのできるセクレチンもしくは関連ペプチドの産生が行われるようにスイッチを入れる)が含まれる。
【００３０】
セクレチンの放出を刺激する多数の機作が知られており、それらには次のものが含まれる：
ジブチリルサイクリック-3',5'-アデノシン一リン酸、フォルスコリン、4β-12-O-テトラデカノイルホルボール-13-酢酸、合成セリンプロテアーゼインヒビター、カモスタット、およびカルシウムイオノホアであるA2318などの作用物、これらはCa2＋およびサイクリック-3',5'-アデノシン一リン酸依存性のセクレチンの放出を刺激する(Xueら, 1993)；
固有のセクレチン放出活性を有していることが示されている膵臓ホスホリパーゼA(PLA2)の活性は消化酵素としての活性とは無関係のものである(Changら、1999)；
神経ペプチドであるボンベシン、ガストリン放出ペプチド、VIP、およびガラニンもセクレチン産生細胞中でのセクレチンの放出をモジュレートさせることが示されている(Changら, 1998)；ならびに、
長鎖脂肪酸、例えばオレイン酸ナトリウムなどは内分泌細胞からのセクレチンの放出の強力な刺激剤である。長鎖脂肪酸の刺激作用は内因性のプロテインキナーゼAによって増強され、L型チャネルを通るCa2＋の流入の活性化、ならびにプロテインキナーゼCおよびCa2＋/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIの活性化によってメディエートされる(Changら, 2000)。
【００３１】
さらに、受容体活性修飾タンパク質、すなわちRAMPは新規の1回膜貫通ドメインのタンパク質でこれらはセクレチン受容体GPCRファミリーの少なくとも2つのメンバーの発現および/もしくは活性をモジュレートすることができるものである。現在までのところ３種類のRAMPアイソフォームがあり、それらの相互作用が受容体の細胞表面への移動をもたらして受容体の糖鎖付加の程度を改変し、および/もしくは細胞表面での受容体との会合を通じてリガンド結合部位に寄与している可能性が示唆されている(Sexton, 1999)。
【００３２】
RAMPは、セクレチンGPCRファミリーの特定の受容体に対するあるペプチドの選択性に間接的に変化を与えることができる。例えば、PTH1受容体の点突然変異は受容体に対してセクレチンへの応答性を付与し、一方、復帰突然変異はセクレチン受容体にPTHへの応答性を付与し(Turnerら, 1996)、RAMPの受容体との特定の相互作用が変化を受けたことによるのであろうと示唆されている(Sexton, 1999)。
【００３３】
従って、セクレチン受容体のアゴニズムはセクレチン受容体ファミリーのペプチド類似体もしくは断片と特異的RAMPの同時のもしくは順次の適用を介してメディエートされうる。
【００３４】
セクレチン受容体が活性化される呼吸組織としては、特に、三次的気管支および肺実質から選択された肺の遠位領域内の組織を含む。
【００３５】
セクレチン受容体リガンド
上述のとおり、好ましいセクレチン受容体リガンドはヒトセクレチン(hSN)である。しかし、その他の哺乳類のセクレチン、例えば密接に関連しているウシ、ブタのセクレチン、またはイヌ、げっ歯類、ニワトリ、およびウサギのセクレチン(これらはヒトセクレチンに対して種々の程度の相同性を示す)を用いることができ、その他の天然のもしくは合成のセクレチンの断片もしくは類似体、例えば本明細書で特定されているものなども用いることができる。
【００３６】
その他の種々のセクレチン受容体リガンドは当業界ではよく知られている。そのようなリガンドの多くは天然のセクレチンの配列(例えばヒトもしくはブタのセクレチン)に基づくものであるが、１個から７個(より一般的に見られるのは１個から５個で、１、２、もしくは３個のことが多い)のアミノ酸の置換もしくは欠失を、特にそれに限るわけではないがN末端領域に含んでいる。
【００３７】
例えば、Gespachら(1986)は４種類の合成セクレチン類似体について報告しており、それらには血管作動性腸管ペプチド(VIP)の配列の一部でN末端を置換したブタのセクレチンに対応するもの、すなわち、Ala4-Val5-pSN、ならびにTyr1-Ala2-Glu3-pSN、Gln3-pSN、Phe1-Phe2-Trp3-Lys4-pSNを含む。Konigら(1977)はAla4-pSNを報告している。Gardenerら(1976)はセクレチン断片SN5-27およびそれの３種類の変異体(9Gln-SN5-27、15Asn-SN5-27、および9Gln-15Asn-SN5-27)を報告している。15-Lys-SNも当業界では報告されている(Gardenerら,1979)。Hafferら(1991)はN末端の８個のペプチド結合のうちの1つが還元されたペプチド結合を有する8種類のセクレチン変異体を報告している(-CONH-結合を-CH2-HN-で置換したもの)。Robberechtら(1988)はセクレチン断片2-27、3-27、5-27、および7-27を報告しており、セクレチン受容体に対する活性を観察した。Konigら(1986)はセクレチンのN末端の５個のアミノ酸をヒトソマトトロピン放出因子のN末端ペンタペプチド配列と交換して1-Tyr-2,4-ジAla-5-Ile-SNを作り、これはセクレチン活性を示した。作成された他の活性変異体としては、3-L-システイン酸-SN、6-D-Phe-SN、5-アロ-Thr-SN、および1-Cys-6-Cys-SNがある。
【００３８】
セクレチン受容体に対してアフィニティーを示すセクレチン類似体のさらに別の例としては、[Ala4, Val5]および[D-Ala4, Val5]セクレチン；(D-Ala4)セクレチン；(D-Phe6)セクレチン；セクレチン5-27、セクレチン14-27、[Val5]セクレチン、[D-Ala4, Val5]セクレチン(Waelbroeckら, 1981)；例えば[Gln9, Asn15]セクレチン(5-27)などの置換された断片(Staun-Olsenら, 1986)；フェノール基含有のブタセクレチンの類似体、それにはNα-チロシルセクレチン、[Tyr1]セクレチン、およびNα-β-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニルセクレチン(Yanaiharaら, 1977)；セクレチンのカルボキシ末端トリコサペプチド類似体の(S5-27)、(9-Gln-S5-27, 15-Asn-S5-27)、および9-Gln-15-Asn-S5-27)(Gardnerら, 1976)が含まれる。
【００３９】
血管作動性腸管ペプチド(VIP)、PACAP、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、ならびにそれらの天然のおよび合成の類似体および断片はセクレチンとかなりの相同性を示す。そのようなものの例としては限定はされないが、(D-Ala4)VIP; (D-Phe4)VIP; (D-Phe2)VIP, ミリスチル-、パルミチル-、およびステアリル-[Nlel7]VIPを含むVIPの脂肪族アシル誘導体(Gourletら, 1998)、VIP 2-28; VIP 1-14; VIP 2-14; VIP 14-28; VIP 15-28; VIP 20-28; VIP 21-28、N末端のVIP 1-6もしくはVIP 1-9が共有結合でC末端のVIP 20-28もしくはVIP 21-28と結合している２つの配列(Couvineauら, 1984); VIP 7-27、VIP Il-28、VIP 1-22-NH２、VIP 16-28 (Staun-Olsenら, 1986)、VIP[l0-28]およびVIP[16-28] が含まれる。セクレチンおよびVIPの類似体で、vasectrinと呼ばれるものもBeyermanら, 1981によって報告されている。PACAP(1-27; l-38)および類似体の例としては、PACAP(1-23, VIP-24-28)、PACAP(1-24,Cys-25)、PACAP(1-23)、PACAP(3-27)、PACAP(1-19)、PACAP(3-19)、PACAP(1-12)、およびPACAP(18-38)(Schmidtら, 1993)、グルカゴン、ならびにGLP-1、およびそれらに関連した類似体および断片で、そのようなものとしてはGLP-1 (7-37) GLP-1-(1-37)アミド、-(6-37)アミド、-(8-37)アミド、-(7-36)アミド(Suzukiら, 1989)、N末端の１の位置に変更を加えたもの、そのようなものとしてはN-メチル化- (N-me-GLP-1)、α-メチル化(α-me-GLP-1)、脱アミド化-(デスアミノ-GLP-1) およびイミダゾール-乳酸置換GLP-1 (イミ-GLP-1)が含まれる(Gallwitzら, 2000)。
【００４０】
上述の文献、それらは本明細書中に参照により組み入れているものであるが、それらの文献で報告されているセクレチン受容体リガンドは、その全てを本発明で用いることができるが、当業者であれば上記の参照文献が全てを尽くしたものではなく他のセクレチン受容体リガンドを用いることもできることが判ることであろう。
【００４１】
候補リガンドの適合性は実験的に定めることができる。例えば、Charltonら(1983)はラットの大脳の脳室内に注射されたセクレチンは排便を著しく増加させ、新規の対象物への接近を減少させたが、ステレオタイプの挙動に対しては顕著な影響を示さなかった。このような試験をラットでセクレチン受容体リガンドを用いてそのリガンドが本発明に適しているかを定めるために行うことができる(すなわち、セクレチン受容体のアゴニズムを介して類似の効果を示すリガンドを選択することができる)。
【００４２】
セクレチンは市販のもの(例えばPeninsula Laboratories Inc, 米国)を入手することができ、もしくはセクレチンと上述のリガンドは容易に入手しうる公表文献を参照することにより得ることができる。
【００４３】
本発明の組成物
本明細書に報告した新規の知見から、セクレチン受容体リガンド、ならびにCFもしくはCOPDに対して活性のあるその他の化合物の少なくとも１種を含んでなる新規の組成物が見出された。
【００４４】
CFの場合には、そのような化合物としてはアセチルシステインなどの粘液溶解性薬剤、デオキシリボヌクレアーゼI(ドルナーゼ)、もしくはエルドステイン（erdosteine）、ならびにその他の抗CF薬剤、例えばネドクロミルもしくはイブプロフェンなどが含まれる。
【００４５】
COPDの場合には、そのような化合物としてはテオフィリンなどの気管支拡張剤、イプラトロピウム、サルブタモル(salbutamol)もしくはサルメテロール(salmeterol)のようなβ2アゴニストまたはステロイドなどの抗炎症剤が含まれる。
【００４６】
そのような化合物中のセクレチン受容体リガンドの量は、例えば、活性成分(すなわち、担体もしくは溶剤を除外して)の総量に対しての重量比で１%から99%、例えば重量比で10%から90%とすることができる。
【００４７】
関連する１態様においては、本発明はセクレチン受容体リガンド、および、CFもしくはCOPDのそれぞれの治療に同時にもしくは順次用いるための、CFもしくはCOPDに対して活性のある第2の化合物の組み合わせたものを提供する。「同時に」という用語は２つの化合物が同時に投与されることを意味するが、必ずしも同一の組成物中になくとも良い。「順次」という用語は２つの化合物が、その２つの化合物のうちの第２のものの投与が行われるときにその２つの化合物のうちの第１のものが患者の体内で依然として活性を示している様な時間内に、その２つの化合物を投与することを意味する。好ましくは、「順次」とは24時間以内を意味し、好ましくは12時間以内、例えば６時間、３時間、１時間、30分、15分以内の時間を意味する。
【００４８】
製剤化および投与
本発明での患者の治療は、患者にセクレチン受容体リガンドを医薬組成物の形態で、さらに別の活性成分(下記の組成物を参照すれば双方の成分のタイプを含んでいることが理解されようが、ここでは簡潔にすることのみを目的としてセクレチン受容体リガンドについてのみ特定して述べる)の共存もしくは不在のいずれかで、投与することによって行うことができる。組成物は無毒の製薬上許容される担体と組み合わせることができる。本発明のこの文脈では、本発明の治療上有効な量のセクレチン受容体リガンドもしくは本発明の組成物を治療対象の患者に投与することを含んでなる、CFを治療する方法をも包含する。
【００４９】
臨床の現場では本発明の組成物は、該ホルモンはペプチドであるので生物学的に活性な環境に対して敏感であるという事実から、非経口的に投与することができる。しかし、経口もしくは直腸投与は、例えば徐放性タイプの組成物を用いると活性成分を主たる対象部位、すなわち三次的気管支の部位へ到達させることを可能とすることができる。
【００５０】
セクレチン受容体リガンドは、吸入(例えばエアロゾルを介して)、もしくは通気(口もしくは鼻のいずれかを経由して)、または非経口投与(腸管経路以外の経路によって導入)による投与のために適切な形態中に製剤化することができる。
【００５１】
吸入によるタンパク質もしくはペプチドの送達はセクレチン受容体リガンドの液状もしくは固形の製剤を用いて行うことができる。従って、本発明は、医薬組成物および治療用製剤の呼吸管への送達のためにデザインされた様々な器具で用いるための、セクレチン受容体リガンドを含んでなる製剤を意図している。本発明の１態様においては、セクレチン受容体リガンドはエアロゾルもしくは吸入剤の形態で投与される。セクレチン受容体リガンドは分散剤と組み合わせて乾燥粉末として、もしくは溶剤を用いて溶液もしくは懸濁液としてエアロゾルの製剤中に含ませて投与することができる。
【００５２】
適切な分散剤は当業界ではよく知られており、そのようなものとしては、限定はされないが、界面活性剤およびそれに類似のものが含まれる。界面活性剤は当業界では、液状のエアロゾルを形成している溶液の微粒化によって生ずる、表面が誘発するタンパク質の凝集を低減させるために、通常用いられる。そのような界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、ならびにポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが挙げられる。用いられる界面活性剤の量は様々であるが、通常は製剤の重量の約0.001%から4%の範囲である。特別な１態様においては、界面活性剤はモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンもしくはトリオレイン酸ソルビタンである。
【００５３】
液状のエアロゾル製剤はセクレチン受容体リガンドおよび分散剤を生理学的に許容される溶剤中に含んでいる。本発明の乾燥粉末のエアロゾル製剤はセクレチン受容体リガンドおよび分散剤、ならびに任意で賦形剤、例えば乳糖、ソルビトール、ショ糖、もしくはマンニトール、などを粉末が容易に分散するように微細に砕いた固体の形態からなっている。液状または乾燥粉末のエアロゾル剤型を用いて、その剤型をエアロゾル化しなければならない。すなわち、エアロゾル化された薬剤の投与された量が実際に気管支および/もしくは肺胞に所望のとおり到達することを確実なものとするためには、その剤型を液状もしくは固体の粒子としなければならないということである。通常は動力学的粒径は、薬剤粒子が肺の気管支もしくは肺胞に到達することを確実なものとするために5μm以下である(Wearleyら、1991)。
【００５４】
送達用器具の構築に関しては、当業界で既知のエアロゾル化のいかなる形態を用いてもよく、そのようなものとしては限定はされないが、噴霧化、微粒子化、もしくは液状剤型のポンプエアロゾル化、および乾燥粉末剤型のエアロゾル化が含まれ、それらは本発明の実施に際して用いることができる。固形剤型の投与のために特別にデザインされた送達器具も考えられる。液状もしくは乾燥粉末剤型のエアロゾル化には高圧ガスを必要とすることが多い。高圧ガスは当業界で通常用いられているものであればどのようなものでも良い。有用な高圧ガスの例としては、クロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、および、トリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および1,1,1,2-テトラフルオロエタンを含む炭化水素、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００５５】
本発明の好ましい１態様においては、エアロゾル化のための器具は１回量を測り取れる吸入器である。その１回量を測り取れる吸入器は投与の度に変わる投与量ではなく、投与の際にある特定の投与量を提供するものである。そのような１回量を測り取れる吸入器は液状もしくは乾燥粉末エアロゾル剤型で用いることができる。
【００５６】
エアロゾルでの送達のシステム、例えば加圧されている１回量を測り取れる吸入器および乾燥粉末吸入器については、Newman, 「エアロゾルと肺」"Aerosols and the Lung", Clarke, S.W.とDavia, D.編、pp197-22で述べられており、本発明と関連させて用いることができる。
【００５７】
本発明のアンタゴニストの作用時間を制御するために別の製薬上の方法を用いることができる。アンタゴニストはマイクロカプセル中に、コアセルベーション技法を用いておよび界面重合を用いてマイクロカプセル中に(例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン-マイクロカプセル、およびポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル)、コロイド状薬剤送達システム中に(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェアー、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセルなど)、またはマクロエマルジョン中に捕捉することができる。そのような技法についてはRemington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, Osol, A.編(1980)に述べられている。
【００５８】
鼻腔内投与には、１回量を測り取れる、もしくはユニットを投与できる適切な器具を介して投与するための溶液として、または適切な送達器具を用いて投与するための適切な担体と混合された粉末としてセクレチン受容体リガンドを剤型化することができる。あるいはまた、セクレチン受容体リガンドは同様な様式で経鼻的に送達することができよう。例えば、セクレチンの経鼻的投与についてはJP60123426に述べられている。
【００５９】
非経口投与のための製剤としては滅菌した水性もしくは非水性溶液、懸濁液、もしくは乳剤が含まれる。非水性溶剤もしくは懸濁用溶媒の例としては、プロピレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射が可能な有機エステルが挙げられる。これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤を含むことができる。これらの組成物は例えば細菌を捕捉するフィルターでのろ過、組成物中への殺菌剤の添加、放射線照射、もしくは加熱によって滅菌することができる。これらの組成物はまた、滅菌済みの固形の組成物の形態とすることができ、それは滅菌した注射用の溶媒中に使用直前に溶解させることができる。通常よく行われる静脈内および筋肉内経路のみならず、これらの組成物を関節内注射によって投与することもできる。
【００６０】
本発明の組成物中の活性成分のパーセンテージは、膵臓に対しての所望の刺激作用のために適した投与量が得られるような比率をなしている限りは、変更を加えることができる。ほぼ同時にいくつかのユニット投与量の形態のものを投与することができるのは明らかである。一般的には、これらの組成物は活性成分を重量比で約0.1%から80%含有することとなろう。
【００６１】
用いられる投与量は所望の刺激作用、投与経路、および治療の期間の如何によって変わる。典型的な投与量はヒトの患者についてはおそらく10−8から10−3mg/day、好ましくは10−6から10−4mg/dayとなろう。セクレチン受容体リガンドは毎日、もしくは医療の実施者の意図に従ってより低頻度に、例えば週１回、もしくは所望の治療効果が達成されるまでとすることができる。
【実施例】
【００６２】
下記の実施例は本発明を説明するものである。
【００６３】
実施例１  RNA発現プロフィール
セクレチン受容体(タンパク質アクセッション番号  P47872；ヌクレオチドアクセッション番号  U28281)のメッセンジャーRNA発現プロフィールを調べた。市販のフェノールとイソチオシアン酸グアニジンの溶液であるTriZolＴＭを、その製造者(Life Technologies)が記載したプロトコールに従って用いて、5例の対象のドナーおよび5例のCFのドナーから得た三次的気管支/第四次気管支および肺実質から総RNAを単離した。RNAのサンプルは、インタクトな18sおよび28sリボソームRNAがゲル電気泳動によって検出され、ゲノムDNAが総核酸サンプルの10%未満である場合にのみ用いた。総RNAサンプルはプライマープローブ配列とグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH; アクセッション番号P04406)プライマーに対してアニールし、MuLV逆転写酵素を用いて逆転写した。その結果得られたcDNAについて定量的配列検出を行った。
【００６４】
本出願者は、ABI プリズム7700 Sequence Detection System(Perkin Elmer)を用いた定量分析のためのプロトコールを開発した。そのシステムの詳細はWO 00/05409に述べている。簡潔に述べれば、このシステムは、PCRを行っている間に配列特異的蛍光シグナルを作成するために蛍光原性(fluorogenic)プローブを用いるものである。そのプローブは蛍光リポーターおよびクエンチャー色素を付加させたオリゴヌクレオチドである。プローブがインタクトなものである一方、リポーターの蛍光の強度はクエンチャーによって抑制される。あるプローブがPCRプロセスの間に複製複合体の一部分を形成する場合には、クエンチャーはリポーター色素から分離されて蛍光の増加をもたらし、次いでその蛍光はABI 7700配列検出器で検出される。ABI 7700はビルトインの熱サイクラー、および双方向性の光ファイバーケーブルを介して96個のサンプルウエルの各々に向けられたレーザーを有している。ケーブルを通じて検出器に放射された蛍光は、その検出器で520nmから660nmの間の放射を数秒ごとに集める。このシステムのソフトウエアは各成分色素の実験スペクトルに対する寄与を分析し、内部標準色素に対してシグナルを規準化する。次いで、これらの規準化された「リポーター」値(Rn)のピークを熱サイクル数に対してプロットして増幅プロットを作成し、PCR産物作製の程度の可視化ができる。
【００６５】
標的配列(Cn)の開始時のコピー数は、PCR産物が最初に検出されるときの断片的PCRサイクル数fractional PCR cycle number(Ct)を測定することによって定められる−最初に検出されるときとは、蛍光シグナルが閾値のベースラインを超えた時である。従って、Ct値が低くなるにつれてCnが大きくなる。各サンプル中の標的mRNAの量の定量は実験で得られたCt値を各実験毎に作られた標的配列についての標準曲線と比較することによって求められる。
【００６６】
プライマープローブのセットはセクレチンリポーターmRNAの検出のために特別にデザインされたものを用いた。オフラインでの相同性検索ではGenbankにある遺伝子配列との間に顕著なマッチは認められなかった。セクレチン受容体用のフォワードおよびリバースプライマーならびにプローブ配列は次のとおりとした：
フォワード  GACCAGCATCATCTGAGAGGCT (配列番号１)
リバース    CCTTCGCAGGACCTCTCTTG  (配列番号２)
プローブ    TCTCTGTCCGTGGGTGACCCTGCT  (配列番号３)
GAPDHプライマープローブセットは次のとおりとした：
フォワード  GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC  (配列番号４)
リバース    CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT  (配列番号５)
プローブ    TTTGGTCGTATTGGGCGCCT  (配列番号６)
反応条件は、鋳型としてのゲノムDNA、およびプライマープローブ濃度グリッド、その後プローブ濃度勾配実験を行うことによって最適化した。プライマー濃度は最も効率的な遺伝子産物の増幅が行われるような、すなわち低い閾値のサイクルで比較的高い蛍光の蓄積が作られるような濃度を選択した。これらの最適なプライマー濃度が最適なプローブ濃度を選択するために用いられた。
【００６７】
セクレチン受容体が関与する呼吸器疾患は次の呼吸器障害を有することが病理学的および組織学的に診断された5例の完全に同意の得られたドナーから得た三次的気管支および肺の実質中でのセクレチン受容体mRNA発現のプロフィールを作ることで示した：非喫煙者(対照)、喫煙者、喘息、膵嚢胞性線維症、肺炎、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患(COPD)。CFの肺組織は心臓および肺移植を受ける5例の完全に同意の得られた患者から得た。
【００６８】
図２は対照とCF肺領域におけるセクレチン受容体のmRNA発現が異なることを示しており、CFの三次的気管支中ではセクレチン受容体の発現が増加していることを示している。データは肺の各領域における、5例の対照および5例の膵嚢胞性線維症組織のドナーからの平均±s.e.m QRT-PCR閾値サイクル数を示している。＊p＝0.0246はunpaired Studentのt検定で統計学的に有意であることを示している。対照として、図3は対照およびCF肺の領域でのGAPDHのmRNAの発現を示している。データは肺の各領域における、5例の対照および5例の膵嚢胞性線維症組織のドナーからの平均±s.e.m QRT-PCR閾値サイクル数を示している。群内もしくは群間で統計学的有意差は観察されなかった。
【００６９】
5例のCOPDのドナーから得た肺実質においては5例の対照のドナーの肺実質と比較するとセクレチン受容体の発現の低下を示していた(p＝0.0465)。しかし、その他のドナー群ではいずれもセクレチン受容体mRNAの発現の相異は示さなかった。
【００７０】
しかし、全例において、肺の遠位領域の組織中でのセクレチン受容体発現がどの程度のレベルであれ観察されたことは新たな発見であり、このことは本発明の基礎を提供している。
【００７１】
図４は引き続いて行われた、25例のCFドナーと16例の非喫煙者の対照ドナー由来の組織を用いて行った発現に関する研究の結果を示している。データは肺の各領域における、25例のCFドナーおよび16例の非喫煙者の対照ドナーからの平均±s.e.mean QRT-PCR閾値サイクル数を示している。＊＊p＝0.009は二元配置分散分析で統計学的に有意であることを示している。ここで得られた結果は図２で得られた結果と類似であり、すなわち、CFの区気管支中では対照と比較してセクレチン受容体の発現が有意に増加していたが、肺実質中では発現のレベルは両群で同様であった。
【００７２】
実施例１で示したデータは本発明の基礎となる事項を提供している。すなわち、呼吸管内の細胞からのCl−の気道内腔への流出の障害はCFの病因となる問題であることを示している。しかし、このようなCl−チャネルおよびイオンの移動の喪失は細胞からの重炭酸塩(HCO３−)分泌をも障害し、上皮のアミロライド感受性Na＋チャネルを介するナトリウムイオン(Na＋)の細胞内への再吸収を増大させる。
【００７３】
健康な肺の洗浄液は主としてH２O(約95%)からなり、内腔のHCO３−で粘液および消化酵素などの分泌されたタンパク質を可溶性で不活性な状態に維持する。しかし、CFの気道上皮は細胞内のNa＋およびCl−の濃度が高いために、異常に高い比率で表面の液体吸収を示し、それ故にCF患者はその気道内の水分含量が非常に低い。このことは粘液の顕著な肥厚化とそれに引き続くCF肺からの粘液線毛性クリアランスの障害をもたらす。
【００７４】
肺の上皮細胞の頂側膜を横切るHCO3−の移動は主として起電性Cl−/HCO3−変換機構を介して生じ、それは単純な浸透性拡散もしくはアクアポリン(AQP)水チャネルタンパク質のファミリーのメンバーによってメディエートされる水の疎水性の原形質膜の横断を伴って起こる。現在ではHCO3−とCl−が主としてH2Oの浸透性の移動に関与していると考えられている。
【００７５】
セクレチンおよびその受容体の十二指腸および膵臓でのイオン調節における生理学的役割に基づいて、本出願者は、本発明での知見に基づいて、セクレチン受容体のmRNAの増加および機能的な発現が、CFTRでの欠陥を補償するための人体の進化の上での、および病態生理学的な応答を示すものであることを示唆している。セクレチンペプチドの合成が十二指腸内で起こるので、肺の内部のセクレチン受容体はセクレチンペプチドに暴露されないであろう。特定の理論に拘束されるものではないが、薬理学的介入によるセクレチン受容体のアゴニズムは、CFに伴う、基礎をなす生化学的な呼吸器の問題点を治療するものとなるであろうとの考え方を提出するが、それは次の事項うちのいくつかもしくはその全てによるものである：
(a)  cAMP依存性のCl−チャネルの活性化を介して三次的気管支の呼吸細胞からのCl−の流出を刺激すること。セクレチン受容体の刺激もしくはフォルスコリンがメディエートするcAMPの増加が、ラット膵管細胞の頂側膜を横切る、小さな単一のチャネルのCl−選択的伝導度を約4pS刺激する(Grayら, 1988)。セクレチンはCFでないヒトの上皮細胞の頂側膜を横切るCFTRおよびCl−の流出を刺激し(例えば胆嚢；Dray-Charierら, 1995)、このCl−の伝導度は6〜12pSと報告されている。従ってこのCl−はcAMP依存性のCl−伝導度の代替となるものを示している。
【００７６】
(b)  刺激を受けてのcAMPの増加、プロテインキナーゼが活性化されること、ならびにそれによってリン酸化およびそれに引き続く呼吸器細胞における上皮Na＋チャネルもしくはNa＋-K＋-ATPaseの調節がもたらされること、それによるNa＋の再吸収および肺の液の動きの刺激が減少すること。そのような機作はラットの肺胞上皮細胞中で、cAMPが共役するβアドレナリン作動性受容体刺激を用いて示されている(Minakataら, 1998)。
【００７７】
(c)  それに続く内腔でのCl−のレベルの増加はセクレチンで活性化されたCl−/HCO3−交換体の基質として作用し、HCO3−の気道内腔への起電性の移動を可能とする。セクレチンは、機能的に頂側の上皮上のcAMP依存性Cl−チャネル(CFTR)と共役しているCl−/HCO3−交換体の活性を刺激することが広く示されている(例えば、胆管上皮細胞中, Alvaroら, 1993; 1997)。このセクレチンによってメディエートされるイオンの移動は起電性Na＋/HCO3−の同時輸送を刺激し、細胞内pHの是正をもたらす(Ishiguroら, 1993)。
【００７８】
(d)  さらに、HCO3−のレベルが増加すると粘液中の分泌されたタンパク質を可溶性で不活性な状態に維持することが知られている(Leeら, 1999)。
【００７９】
(e)  AQPの原形質膜への移転と挿入を誘発し、水の気道内腔への移動を可能とすること。ラットの胆管細胞では、セクレチンはAQP-1水チャネルの移転を誘発することによって濃度依存性の浸透性H2O透過性の60%の増加を起こすことが示されている(Marinelliら, 1997)。このプロセスも気管支細胞および気道内腔における前述の機作を介するNa＋、Cl−、HCO3−、およびpHの是正によって原形質膜を横切るH2Oの浸透性の拡散によって援助される。
【００８０】
これらの説を支持するために、我々は三次的気管支組織サンプルに対してのセクレチンの作用を調べた。
【００８１】
実施例２：    三次的気管支でのセクレチン受容体の機能的活性
セクレチン受容体の機能的活性を正常組織の三次的気管支由来の三次的気管支および上皮細胞で調べた。
【００８２】
簡潔に記せば、CFでないドナーから得たヒト三次的気管支の非分枝領域を切片とし、縦に切り、気管支壁を横切る短絡回路電流(short circuit current)を測定するための改変型Ussingチャンバーの2つのコンパートメントの間にマウントした。内腔(気道)の膜および基底側部の膜の双方とも酸素化されたクレブス(Krebs)細胞外液に浸し、組織電位をゼロに固定しセクレチンに応答する短絡回路電流の変化を測定できるようにした。アミロライドを10μMの濃度で最初に内腔膜に添加し(図５,ポイントa)(当業者によって報告されているとおり)、優勢なナトリウムイオン電流をブロックし、基礎にあるイオンの電流の正体を表に出した。安定なベースラインが達成されれば、3μMのヒトセクレチン(Sigmaから供給を受けたもの、カタログNo.S714)を内腔膜に添加した(図５、ポイントb)。
【００８３】
セクレチンは負に荷電したイオン(Cl−および/もしくはHCO3−)の移動と一致した様式でイオンの移動を刺激することが見出された(図５)。セクレチンと同様に、10μMのATPもしくはUTPの肺上皮の頂側膜への添加が(図5,ポイントc)同様なイオンの移動を同程度に刺激することが示された。これらのATPおよびUTPがメディエートする効果が、P2Y2プリン受容体(purinoceptor)を介するCa2＋が活性化するCl−電流の刺激によるということが文献では広く報告されている。報告されているアゴニストの双方とも高濃度では同程度の応答を示す。
【００８４】
ヒト三次的気管支由来の上皮細胞におけるセクレチン受容体の機能的な効果を探索した。簡潔に述べれば、三次的気管支上皮をプロテアーゼ消化を一晩行うことによって単離し、次いでコンフルエンシーとなるまでSnapwell(Costar)透過性支持体上で培養した。その支持体を改変型Ussingチャンバー中にマウントし、内腔の膜および基底側部の膜を酸素化したクレブス細胞外液中に浸した。細胞の電位をゼロに固定しセクレチンに応答する短絡回路電流の変化を測定できるようにした。前述したとおり、10μMのアミロライドを最初に内腔膜に添加し(図６,ポイントa)、100nMのセクレチンを内腔膜に添加した(図６、ポイントb)。三次的気管支での観察結果と一致して、セクレチンは負に荷電したイオン(Cl−および/もしくはHCO3−)の移動と一致した様式でイオンの移動を刺激した。さらに、500μMのグリベンクラミド、これはCFTRの阻害剤として知られているものであるが、これの添加によっても、セクレチンがメディエートするイオンの移動を抑制することはできず、このことは、CF患者の三次的気管支の上皮細胞においても類似のイオンの移動が観察されるであろうということを示唆している。
【００８５】
実施例３：CF患者の気管支中でのイオンの移動の刺激
上述の実験をヒトCFの三次的気管支を用い、セクレチンを1μM用いて再度行った。得られた結果は図７に示している。ポイント(a)では、アミロライドの添加は、基礎をなしているナトリウムの流れをブロックする。ポイント(b)でのセクレチン1μMの添加は負に荷電したイオンのナトリウムの流れをブロックする。ポイント(b)での1μMのセクレチンの添加は負に荷電したイオンの移動を刺激するが、これはCFでない気管支で実験的に観察されたことを確認するものである。
【００８６】
実施例４：三次的気管支におけるセクレチンによる塩素イオン流出の刺激
三次的気管支上皮細胞でのイオンの移動をCl−特異的蛍光プローブであるMQAE(n-(エトロキシカルボニルメチル)-6-メトキシキノリニウムブロマイド：Molecular Probes)を用いてさらに特徴を調べた。簡潔に述べれば、一次ヒト三次的気管支上皮細胞を前述したとおり単離し96ウエルのプレート中で培養した。コンフルエンシーに達した時点で、細胞に４mMのMQAEを一晩ロードした。細胞を塩素含有のHEPESバッファー中で洗い、その後Cl−を含有していないバッファーの添加によって受動的なCl−の流出を開始させた。セクレチンをナノモラーの濃度で添加すると、MQAEの蛍光の変化で測定するとき、Cl−の流出を刺激した。セクレチンがメディエートする蛍光の変化は、非選択的Cl−チャネルブロッカーであるNPPB(5-ニトロ-2-(3-フェニルプロピル-アミノ)安息香酸；100μM)の添加によって失われる。結果は図８に示しているが、その図では2種類の濃度でのセクレチンの効果を示している(白の菱形 12.5nM；黒丸 100nM)。100nMのセクレチンがメディエートするCl−の流出は非選択的Cl−ブロッカーであるNPPB(白丸)によって阻害された。刺激を受けていないCl−の流出は黒四角で示されている。
【００８７】
実施例５：CFの三次的気管支におけるクロモグラニンAの免疫応答性
５例のCFおよび３例の非CFの三次的気管支のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した切片からクライオスタット切片(５〜７μm)を切り出し、マウスモノクローナルクロモグラニンA抗体(Vector Laboratories Ltd; カタログNo.NCL-CHROM)で染色し、その後IgG二次抗体で染色した。抗体の結合を検出するためにVector Universal Elite ABCキットを用いた。隣接する切片を陰性対照は用いずにインキュベートし、非特異的結合はないものと考えられた。正常組織および対照ではクロモグラニンA抗体で染色された細胞がほとんどもしくは全く認められなかったことに比較して、CF組織では、染色された多数の孤立した内分泌細胞が観察された。このことは、セクレチン発現のモジュレーターにとって標的となるS型の腸管内分泌細胞が存在することを示している。従ってそのような細胞でセクレチンの産生を刺激する薬剤はCFの治療に用いることができる。
【００８８】
実施例６：セクレチン産生の内因性調節
17例の正常ドナーおよび25例のCF肺のドナーの三次的気管支および肺実質におけるNeuroDのmRNAの発現を調べた。プライマープローブのセットはNeuroD(アクセッション番号BAA76603)の検出のために特別にデザインされたものを用いた。オフラインでの相同性検索ではGenbankにある遺伝子配列との間に顕著なマッチは認められなかった。転写因子BETA2/NeuroD用のフォワードおよびリバースプライマーならびにプローブ配列は次のとおりとした：
フォワード  GAACGCGGCGCTAGACA (配列番号７)
リバース    GTCTCGATTTTGGACAGCTTCTG  (配列番号８)
プローブ    AGCAAGGCACCACCTTGCGCA  (配列番号９)
データ(図９)はQRT-PCR閾値サイクル数の平均±s.e.で示しており、閾値サイクル数が高くなれば100ngのtRNAあたりの遺伝子のコピー数が少なくなる。
【００８９】
NeuroD mRNA発現の顕著な低減がCFの肺実質で観察され、三次的気管支では対照およびCFドナーの双方とも類似の低いアバンダンスレベルを示した。機能的には、このCF肺実質でのNeuroDの低減は内因性セクレチンの調節および合成の減少と相関しているのかもしれない。従ってNeuroDの機能を有する形での発現の増大は肺の内部でのセクレチンの内因性レベルの増大をもたらし、セクレチン受容体のアゴニズムを用いた膵嚢胞性線維症の治療のための間接的機作となる。
【００９０】
要約すると、セクレチン受容体を刺激することはCFのイオンおよびH2Oが関わる問題点を是正し、粘液層の厚さを低減し、肺からの粘液線毛のクリアランスを可能とする。
【００９１】
参照文献
Alton, E., Kitson, C. (2000) 「膵嚢胞性線維症の遺伝子治療」"Gene therapy for cystic fibrosis" Expert Opin Investig Drugs. 9:1523-35. 総説
Alvaro, D., Cho, W.K., Mennone, A. およびBoyer, J.L. (1993) 「単離ラット胆管上皮細胞における細胞内pH調節に及ぼすセクレチンの影響」"Effects of secretin on intracellular pH regulation in isolated rat bile duct epithelial cells" J. Clin. Invest. 92:1314-1325
Alvaro, D., Gigliozzi, A., Fraioli, F., Romeo, R., Papa, E., Delle, Monache, M.およびCapocaccia, L. (1997) 「胆嚢上皮における重炭酸分泌のホルモ
ンによる調節」"Hormonal regulation of bicarbonate secretion in the biliary epithelium" Yale J. Biol. 70:417-426
Beyerman, H.C., Buijen van Weelderen, A.W., Chang, T.M., Chey, W.Y., Grossman, M.1., Kranenburg, P., Scratcherd, T., Solomon, T.E., Voskamp, D. (1981) 「セクレチンおよびvasoactive intestinal peputide(VIP):vasectrinの類似体の合成、生物学的および免疫化学的性質」"Synthesis, biological and immunochemical properties of analogues of secretin and vasoactive intestinal peptide (VIP) : the vasectrins . Life Sci. 29:895 -902  . 
Chang, C.H., Chey, W.Y., Chang, T.M. (2000). 「オレイン酸ナトリウムによって刺激されるコレシストキニンおよびセクレチンの分泌の細胞性機作」"Cellular mechanism of sodium oleate-stimulated secretion of cholecystokinin and secretin" Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 279:G295-303 Chang, C.H., Chey, W.Y,, Erway, B., Coy, DH, Chang TM (1998) 「セクレチン産生細胞における神経ペプチドによるセクレチン放出のモジュレート」"Modulation of secretin release by neuropeptides in secretin-producing cells" Am J Physiol 275:G192-202 
Chang, T., Chang, C.H., Wagner, D.R. およびChey, W. (1999) 「ブタ膵臓ホスホリパーゼA2はセクレチン産生細胞からのセクレチンの放出を刺激する」"Porcine pancreatic Phospholipase A2 Stimulates Secretin Release from Secretin-producing Cells" J. Biol. Chem. 274:10758-10764 
Charlton, C. G.ら(1983) 「ラットの行動および生理学的機能のセクレチンによるモジュレート」"Secretin modulation of behavioral and physiological functions in the rat" Peptides, 4:73942 
Couvineau, A., Rouyer-Fessard, C., Fournier, A., St Pierre, S., Pipkorn, R., Laburthe, M. (1984) 「ヒトおよびラットの腸の膜におけるVIPの特異的受容体との相互作用のための構造的要求性：9つの部分配列の影響」"Structural requirements for VIP interaction with specific receptors in human and rat intestinal mernbranes: effect of nine partial sequences" Biochem Biophys Res Commun. 121:493-8 
Dray-Charier N., Paul, A., Veissiere, D., Mergy M., Scoazec, J.Y., Capeau, J., Brahimi-Horn, C. およびHousset, C. (1995) 「ヒト胆嚢上皮細胞における膵嚢胞性線維症の膜貫通伝導レギュレーターの発現」"Expression of cystic fibrosis transmernbrane conductance regulator in human gallbladder epithelial cells" Lab. Invest. 73:828-836 
Fortner, C.N., Lorenz, J.N. および Paul, R.J. (2001) 「クロライドチャネル機能は上皮依存性の気道の弛緩に関連している」"Chloride channel function is linked to epithelium-dependent airway relaxation" Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol . 280:L334-L341 
Gallwitz, B., Ropeter, T., Morys-Wortmann, C., Mentlein, R., Siegel, E.G., Schmidt, W.E. (2000) 「in vitroでのジペプチジルペプチダーゼIVによる分解に対して抵抗性のGLP-1類似体」"GLP-1-analogues resistant to degradation by dipeptidyl-peptidase IV in vitro" Regul. Pept. 86:103-11 
Gardner, J.D., Conlon, T.P., Fink, M.L., Bodanszky, M. (1976) 「セクレチン関連ペプチドの膵臓腺房細胞上のホルモン受容体との相互作用」"Interaction of peptides related to secretin with hormone receptors on pancreatic acinar cells" Gastroenterology 71:965-70 
Gardner, J.D., Rottman, A.J., Natarajan, S. およびBodansky, M. (1979) 「セクレチン5-27およびその類似体と膵臓腺房上のホルモン受容体との相互作用」"Interaction of secretin 5-27 and its analogues with hormone receptors on panareatic acini" Biochim. Biophys. Acta. 583;491-503 
Gespach, C., Bataille, D., Vauclin. N., Moroder, I., Wonsch, E., Rosselin, G. (1986)  「ラット胃腺におけるセクレチン受容体活性、結合研究、cAMPの生成および薬理学」"Secretin receptor activity in rat gastric glands . Binding studies, cAMP generation and pharmacology" Peptides 7:155-163 
Gourlet. P., Rathe, J., De Neef, P., Cnudde, J., Vandermeers-Piret, M.C., Waelbroeck, M., Robberecht, P. (1998) 「脂肪親和性VIP誘導体の組換えVIP1/PACAPおよびVIP2/PACAP受容体との相互作用」"Interaction of lipophilic VIP derivatives with recombinant VIPl/PACAP and VIP2/PACAP receptors" Eur. J. Pharmacol. 354:105-11 
Gray. M.A., Greenwell, J.R. および Argent, B.E. (1988) 「膵管細胞の頂側膜上のセクレチンによって調節されるクロライドチャネル」"Secretin-regulated chloride channel on the apical membrane of pancreatic duct cells" J. Memb. Biol. 105:131-142 
Haffer, B.M., Hocart, S.J., Coy, D.H., Mantey, S., Chiang, H.C. および Jensen, R.T. (1991) 「セクレチンのペプチド結合の数を減らしたシュードペプチド類似体。新規のクラスのセクレチン受容体アンタゴニスト」"Reduced peptide bond pseudopeptide analogues of secretin. A new class of secretin receptor antagonists" J. Biol. Chem. 266:316-322 
Ishiguro, H., Steward, M.C., Lindsay, A.R. および Case, R.M. (1996) 「モルモット膵臓小葉間の管における細胞内HCO3−のNa＋/ HCO3−の同時輸送による蓄積」"Accumulation of intracellular HC03− by Na＋/HC03− cotransport in interlobular ducts from guinea-pig pancreas" J. Physiol . 495:169-178 
Jiang, JG., Johnson, C., Zarnegar, R. (2001) 「PPARγがメディエートする肝細胞増殖因子遺伝子プロモーターの新規のコンポジットシス作用性エレメントを介する転写のアップレギュレーション」  "PPAR gamma-mediated transcriptional upregulation of the hepatocyte growth factor gene promoter via a novel composite cis-acting element" J. Biol. Chem. Apr 5 
Konig, W., Bickel, M., Karch, K., Teetz, V. および Uhmann. (1984) 「セクレチンの類似体と断片」"Analogues and fragments of secretin" Peptides 5:189-193 Konig, W., Bickel, Wissmann, H., Sandeur, J. (1986) 「セクレチンの新しい類似体」"New analogues of secretin" Peptides 7:61-67 
Konig et al (Gastroenterology, 1977, 72:797-800) Lee, M.G., Wigley, W.C., Zeng. W., Noel, L.E., Marino, C.R., Thomas, P.J. および Muallem, S. (1999) 「NIH3T3細胞およびHEK293細胞で発現されている膵嚢胞性線維症膜貫通伝達調節因子によるCl−/ HCO3−の交換の調節」"Regulation of Cl−/HC03− exchange by cystic fibrosis transmembrane conductance regulator expressed in NIH3T3 and HEK293 cells" J. Biol. Chem. 274:3414-3421 
Lewis, BS., Flugelman, MY., Weisz, A., Keren-Tal, I., Schaper, W. (1997)「遺伝子治療による血管新生：心筋血管再開通に対する新たな地平となるか？」" Angiogenesis by gene therapy: a new horizon for myocardial revascularization?" Cardiovasc. Res. 35:490-7 
Marinelli, R.A., Pham, L., Agre, P. および LaRusso, N.F. (1997) 「セクレチンは原形質膜のアクアポリン-1 水チャネルを増加させることによってラット胆管細胞の浸透性の水輸送を促進する」"Secretin promotes osmotic water transport in rat cholangiocytes by increased aquaporin-1 water channels in plasma membrane" J. Biol. Chem. 272:12984-12988 
Minakata, Y., Suzuki, S., Grygorczyk, C., Dagenais, A および Berthiaume, Y. (1998) 「肺胞II型細胞におけるNa＋チャネルおよびNa＋-K＋-ATPase発現に及ぼすβアドレナリン作動性アゴニストの影響」"Impact of beta-adrenergic agonist on Na＋ channel and Na＋-K+-ATPase expression in avleolar type II cells" Am. J. Physiol. 275:414-422
Morse, MA. (2001) 「技術評価：VEGF165  遺伝子治療」"Technology evaluation: VEGF165 gene therapy" Valentis Inc. Curr. Opin. Mol. Ther. 3; 97-10l, 総説
Mutoh. H., Fung, B.P., Naya, F.J., Tsai, M.J., Nishitani, J. および Leiter. A.B. (1997) 「basic helix-loop-helix転写因子BETA/NeuroDは哺乳類腸管内分泌細胞中で発現され、セクレチン遺伝子の発現を活性化する」"The basic helix-loop-helix transcription factor BETA/NeuroD is expressed in mammalian enterendocrine cells and activates secretin gene expression" Proc. Natl. Acad. Sci. 94:3560-3564 
Mutt, V., Jorpes, J.E., Magnusson, S. (1970) 「ブタセクレチンの構造：アミノ酸配列」"Structure of porcine secretin. The amino acid sequence" Eur. J. Biochem. 15:513-519 
Ng, S.S., Pong, R.T., Chow, B.K., Cheng, C.H. (1999) 「Cytosensorマイクロフィジオメトリーを用いたヒトセクレチン受容体活性のリアルタイムでの評価」"Real time evaluation of human secretin receptor activity using cytosensor microphysiometry" J. Cell. Biochem. 72:517-527 
Pendino, J.C., Nannini, L.J., Chapman, K.R., Slutsky, A. および Molfino, N.A. (1998) 「吸入させたフロセミドの急性喘息における効果」"Effect of inhaled furosemide in acute asthma" J. Asthma 35:89-93 
Robberecht, P., De Neef, P., Waelbroeck, M., Conius, J.C., Scemamal J.L., Fourmy, D., Pradayrol, L., Vaysse, N., Christophe, J. (1988) 「ヒト膵臓膜におけるセクレチン受容体」"Secretin receptors in human pancreatic membranes" Pancreas 3:529-535 
Schmidt, WE., Seebeck, J., Hocker, M., Schwarzhoff, R., Schafer, H., Fornefeld, H., Morys-Wortmann, C., Folsch, UR., Creutzfeldt, W. (1993) 「PACAPおよびVIPはラット膵臓腺房細胞の酵素の分泌をVIP/PACAP-2受容体との相互作用を介して刺激する：CCK/カルバコルで誘導される酵素の放出の付加的増大」"PACAP and VIP stimulate enzyme secretion in rat pancreatic acini via interaction with VIP/PACAP-2 receptors: additive augmentation of CCK/carbachol-induced enzyme release" Pancreas 8:476-87 
Sexton, P.M. (1999) 「ペプチドホルモン受容体およびRAMPSについての我々の理解の最近の進展」"Recent advances in our understanding of peptide hormone receptors and RAMPS" Curr. Opin. Drug Disc. Dev. 2:440-448 
Staun-Olsen, P., Ottesen, B., Gammeltoft, S. および Fahrenkrug, J. (1986) 「ラット大脳皮質から得たシナプトソーム上のVIP結合部位：構造-結合関連性」"VIP binding sites on synaptosomes from rat cerebral cortex: structure-binding relationship" Peptides 7 Suppl l:181-186 
Suzuki, S., Kawai, K., Ohashi, S., Mukai, H., Yamashita, K. (1989) 「単離灌流ラット膵臓からのインスリンおよびグルカゴンの放出に及ぼすグルカゴン様ペプチド-1の種々のC末端およびN末端断片ペプチドの影響の比較」"Comparison of the effects of various C-terminal and N-terminal fragment peptides of glucagon-like peptide-1 on insulin and glucagon release from the isolated perfused rat pancreas" Endocrinology 125:3109-14 
Turner, P.R., Bambino, T. および Nissencon, R.A. (1996) 「副甲状腺ホルモンおよびセクレチンに対するGタンパク質がカプルした受容体における推定上の選択的フィルター」"A putative selectivity filter in the G-protein-coupled receptors for parathyroid hormone and secretin" J.Biol. Chem. 271:9205-9208 
Waelbroeck, M., Robberecht, P., De Neef, P., Chatelain, P. および Christophe, J. (1981) 「ラット肝の膜における2つのクラスの受容体を通しての血管作動性ペプチドの結合およびそのアデニル酸シクラーゼの刺激」"Binding of vasoactive intestinal peptide and its stimulation of adenylate cyclase through two classes of receptors in rat liver membranes. Effect of 12 secretin analogues and 12 secretin fragments" Biochim. Biophys. Acta 678:83-90 
Wearly, L.L (1991) 「非侵襲的方法によるタンパク質およびペプチドの送達における最近の進歩」"Recent progress in protein and peptide delivery by non-invasive methods" Crit. Rev. Ther. Drug . Carrier System 8:333 
West J, Rodman DM. (2001) 「肺疾患の遺伝子治療」Gene therapy for pulmonary diseases . Chest. I19; 613-7 
Xue, W., Chey, W.Y., Sun, Q., Chang, T.M. (1993) 「イヌの十二指腸粘膜から単離したセクレチン細胞に富んだ標品中のセクレチン放出の特徴」"Characterisation of secretin release in secretin cell-enriched preparation isolated from canine duodenal mucosa" Dig. Dis. Sci. 38:344-52 
Yanaihara, N., Kubota, M., Sakagami, M., Sato, H., Mochizuki, T. (1977) 「ブタセクレチンのフェノール基含有類似体の合成およびその免疫学的性質」"Synthesis of phenolic group containing analogues of porcine secretin and their immunological properties" J. Med. Chem. 20:648-55 
Yang, Y., Quitschke, WW., Briewer, GJ. (1998) 「ラット一次海馬ニューロン中のアミロイド前駆体タンパク質遺伝子プロモーターのホルボールエステル、IL-1およびレチノイン酸によるアップレギュレーション、しかし活性酸素種では起こらない」Upregulation of amyloid precursor protein gene promoter in rat primary hippocampal neurons by phorbol ester, IL-1 and retinoic acid, but not by reactive oxygen species. Brain Res. Mol. Brain Res. 60:40-9. 
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１はヒト、ブタ、およびイヌのセクレチンのアラインメントを示す。
【図２】図２はCF肺領域および対照の領域でのセクレチン受容体のmRNAの示差発現を示している。
【図３】図３はCF肺領域および対照の領域でのGAPDHのmRNAの発現を示している。
【図４】図４は16例の対照組織のドナーおよび25例のCF組織のドナーのサンプルから得たCF肺領域および対照の領域でのセクレチン受容体のmRNAの示差発現を示している。
【図５】図５はCFでない三次的気管支中でのイオンの移動をセクレチンが刺激することを示している。
【図６】図６はCFでないドナー由来の一次ヒト三次的気管支上皮細胞のコンフルエントな単層中でのCTFRに依存しないイオンの移動をセクレチンが刺激することを示している。
【図７】図７はヒトCF三次的気管支中のイオンの移動をセクレチンが刺激することを示している。
【図８】図８はCFでないドナー由来の一次ヒト三次的気管支上皮細胞中での塩素イオンの流出に対するセクレチンの影響を示している。
【図９】図９はCF患者の三次的気管支および肺の実質中のNeuroD mRNAのレベルを示している。
【図１】
2006213728.tif 000002
【図２】
2006213728.tif 000003
【図３】
2006213728.tif 000004
【図４】
2006213728.tif 000005
【図５】
2006213728.tif 000006
【図６】
2006213728.tif 000007
【図７】
2006213728.tif 000008
【図８】
2006213728.tif 000009
【図９】
2006213728.tif 000010
【配列表】
2006213728000001.app