(57)【要約】      （修正有）【課題】より簡便に、物質が有する嫌気的解糖系阻害活性を検定する方法等を提供すること。【解決手段】物質が有する嫌気的解糖系阻害活性の検定方法において、（１）ミトコンドリアDNAを欠損させてなる培養細胞に、被験物質を接触させる第一工程、（２）第一工程後の前記培養細胞の生存率を測定する第二工程、（３）第二工程により測定された生存率と対照における生存率とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の嫌気的解糖系阻害活性の有無又はその程度若しくはその量を評価する第三工程、を有することを特徴とする検定方法等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質が有する嫌気的解糖系阻害活性の検定方法において、
（１）ミトコンドリアDNAを欠損させてなる培養細胞に、被験物質を接触させる第一工程、
（２）第一工程後の前記培養細胞の生存率を測定する第二工程、
（３）第二工程により測定された生存率と対照における生存率とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の嫌気的解糖系阻害活性の有無又はその程度若しくはその量を評価する第三工程、
を有することを特徴とする検定方法。
【請求項２】
物質が有する嫌気的解糖系阻害活性の検定のための試薬としての、ミトコンドリアDNAを欠損させてなる培養細胞の使用。
【請求項３】
物質が有する嫌気的解糖系阻害活性の検定のための試薬であって、ミトコンドリアDNAを欠損させてなる培養細胞を含有することを特徴とする試薬。
【請求項４】
請求項１記載の方法により検定された、物質が有する嫌気的解糖系阻害活性の有無又はその程度若しくはその量に基づき嫌気的解糖系阻害活性を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする嫌気的解糖系阻害活性を有する物質の探索方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法により検定された、物質が有する嫌気的解糖系阻害活性の有無又はその程度若しくはその量に基づき嫌気的解糖系阻害活性を有する物質若しくはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする悪性腫瘍治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質が有する嫌気的解糖系阻害活性の検定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
嫌気的解糖系はグルコースを代謝してクエン酸回路による酸化へと導く主要な経路であり、また食餌に由来するフルクトース等を代謝する主要な経路でもある。この嫌気的解糖系は、被験物質による毒性発現の標的の一つとなる（例えば、非特許文献１参照）のみならず、ある種の癌細胞が正常細胞と比較してより嫌気的解糖系にATP産生を依存していることに着目し、この嫌気的解糖系を阻害する物質を悪性腫瘍治療薬として用いる試みも行われている（例えば、非特許文献２、３及び４参照）。従って、被験物質が有する嫌気的解糖系阻害活性を検定することは、被験物質による毒性発現機序の解明や、悪性腫瘍治療薬の化合物スクリーニングにとって重要なステップとなる。
【０００３】
嫌気的解糖系活性の測定方法としては、従来より嫌気的解糖系を構成する個々の酵素（例えば、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、エノラーゼ等）活性を測定する方法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。また赤血球におけるグルコース消費又は乳酸生成を指標として測定する方法が知られている（例えば、非特許文献５参照）。
【０００４】
【非特許文献１】Chemico−Biological Interactions，140(3)，279−291，2002
【非特許文献２】Acta Oncologica，34(3)，429−433，1995
【非特許文献３】Cancer Research，55(15)3278−3285，1995
【非特許文献４】Biochemical Pharmacology，63(3)，455−462，2002
【非特許文献５】生化学実験講座12、日本生化学会編、東京化学同人、p.101-108、1974
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記の測定方法のうち、嫌気的解糖系を構成する個々の酵素活性を測定する方法については、個々の酵素の嫌気的解糖系に対する寄与度等も加味する必要があり、嫌気的解糖系全体の活性に対する被験物質の影響を評価するには必ずしも充分ではなく、また個々の酵素に対する複数の独立した測定系を用意する必要があり、測定が煩雑である等の問題点があった。さらには、前記の酵素系への影響は基本的にCell Free系での測定であり、被験物質の細胞内への移行性等も含めた総合的な評価が困難である等の問題点があった。
【０００６】
また赤血球におけるグルコース消費又は乳酸生成を指標として測定する方法については、毎回ヒト又は実験動物等から採血して赤血球を調製する必要があり、さらには複数の測定日にまたがって測定される場合には、得られた赤血球自身が有する嫌気的解糖系活性にばらつきを生じ、実験間で得られる測定結果の比較が必ずしも容易ではない等の問題点があった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような状況下、本発明者らは、物質が有する嫌気的解糖系阻害活性をより簡便に検定するための方法について鋭意検討した結果、ミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞を用い、当該細胞に既知の嫌気的解糖系阻害活性を有する物質を接触させると当該培養細胞の生存率が低下すること等を見出し、本発明に至った。
【０００８】
即ち、本発明は、
１．物質が有する嫌気的解糖系阻害活性の検定方法において、
（１）ミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞に、被験物質を接触させる第一工程、
（２）第一工程後の前記培養細胞の生存率を測定する第ニ工程、
（３）第ニ工程により測定された生存率と対照における生存率とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の嫌気的解糖系阻害活性の有無又はその程度若しくはその量を評価する第三工程
を有することを特徴とする検定方法（以下、本発明方法と記載することもある。）；
２．物質が有する嫌気的解糖系阻害活性の検定のための試薬としての、ミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞の使用；
３．物質が有する嫌気的解糖系阻害活性の検定のための試薬であって、ミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞を含有することを特徴とする試薬；
４．前項１記載の方法により検定された、物質が有する嫌気的解糖系阻害活性の有無又はその程度若しくはその量に基づき嫌気的解糖系阻害活性を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする嫌気的解糖系阻害活性を有する物質の探索方法；
５．前項１記載の方法により検定された、物質が有する嫌気的解糖系阻害活性の有無又はその程度若しくはその量に基づき嫌気的解糖系阻害活性を有する物質若しくはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする悪性腫瘍治療薬；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、物質が有する嫌気的解糖系阻害活性をより簡便に検定するための方法が提供可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明方法において用いられる培養細胞としては、ミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞であれば特に限定されるものではなく、例えば、種々の正常な初代培養細胞や株化培養細胞等を種々の公知な方法により当該培養細胞が有するミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞等をあげることができる。
ミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる細胞を得る代表的な方法としては、例えば、Methods in Cell Biology Vol.65 Mitochondria （ACADEMIC PRESS，2001）等に記載される方法等をあげることができる。具体的には、例えば、培養細胞を5ｎＭ〜5μＭ程度の臭化エチジウム（Ethidium Bromide）の存在下、１０℃〜４０℃程度（好ましくは２０℃〜４０℃）、５％CO2・９５％Airの条件下で4〜12週間程度培養することにより、ミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞を調製する。
【００１１】
次いで、このようにして調製された培養細胞におけるミトコンドリアＤＮＡ欠損を確認する。確認のための方法としては、ミトコンドリアＤＮＡを増幅するために設定されたプライマーを用いてPCR(polymerase chain reaction)を実施する方法や、ミトコンドリアＤＮＡに少なくともその一部がコードされる酵素（等）の組織化学的染色を実施する方法等を用いることができる。例えば、Blood， 98， 296-302，2001等に記載された方法により、上記の調製された培養細胞から抽出されたDNAを鋳型として用いる場合には、PCRによってもDNA増幅が起きないことを利用して、ミトコンドリアＤＮＡの欠損を確認することができる。また例えば、Methods in Cell Biology Vol.65 Mitochondria （ACADEMIC PRESS，2001）等に記載された方法により、チトクロームCオキシダーゼ（cytochrome c oxidase， 以下、COXと記載することもある。）の組織化学的染色等により、ミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞ではCOX活性が消失していることを利用して、ミトコンドリアＤＮＡの欠損を確認することもできる。
【００１２】
本発明検定方法の第一工程は、ミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞と被験物質とを接触させればよい。
当該培養細胞と被験物質との接触時間として、例えば、1日間以上を、好ましくは1日間以上10日間以内をあげることができる。当該接触系における保温温度としては、例えば、20℃〜40℃程度を、好ましくは25℃〜40℃程度をあげることができる。
【００１３】
本発明方法の第一工程における接触系内での被験物質の濃度としては、例えば、0.01〜100μg/mL程度で、好ましくは0.1〜30μg/mL程度をあげることができる。
本発明方法の第一工程における接触系内での前記培養細胞の密度としては、例えば、1×103cell／cm2〜1×105cell／cm2程度で、好ましくは3×103cell／cm2〜3×104cell／cm2程度をあげることができる。
【００１４】
本発明方法の第二工程において前記培養細胞の生存率を測定する方法としては、例えば、細胞トキシコロジー試験法(日本組織培養学会編、朝倉書店、1991、pp.73-75)等に記載されるような公知な方法をあげることができる。例えば、クリスタルバイオレット染色を用いた方法等を使用することができ、具体的には、まず被験物質処理済みの培養細胞にグルタールアルデヒドを最終濃度5%となるように添加することにより、細胞を固定した後、当該培養細胞を水で洗浄する。次にメタノールに溶解された0.4%クリスタルバイオレットを添加することにより前記培養細胞を染色した後、再度当該培養細胞を水で洗浄する。洗浄された培養細胞を風乾した後、590nmの吸光度を測定し、例えば、下記の計算式に従って培養細胞の生存率を求めることができる。
【００１５】
生存率（％）＝｛被験物質における吸光度−ブランク（細胞を含まない条件）における吸光度｝×１００／｛対照（ネガティブコントロール）における吸光度−ブランク（細胞を含まない条件）における吸光度｝
【００１６】
本発明方法の第三工程において、上記のようにして測定された生存率と対照における生存率（即ち、基準物質、ネガティブコントロール等）における生存率とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の嫌気的解糖系阻害活性の有無又はその程度若しくはその量を評価する。この場合、被験物質における生存率が対照（基準物質）における生存率よりも低い値であれば、当該被験物質は当該基準物質よりも嫌気的解糖系阻害活性が高いと評価する。すなわち、当該被験物質は当該基準物質よりも嫌気的解糖系阻害物質として優れていることになる。このようにして被験物質が有する嫌気的解糖系阻害活性の検定（本発明検定方法）を行うことができる。
本発明方法において、測定された活性と対照における活性とを比較する場合には、異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質が嫌気的解糖系阻害活性を有さない物質（例えば、溶媒、バックグランドとなる試験系溶液等のネガティブコントロールであってもよい。）とすることで、他方の被験物質が有する嫌気的解糖系阻害活性を評価してもよいし、また前記異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質（例えば、基準物質）が有する嫌気的解糖系阻害活性を基準としながら他方の被験物質が有する嫌気的解糖系阻害活性を評価してもよい。もちろん両者で評価してもよい。
【００１７】
より具体的には、例えば、下記の式に従って生存率に係る減少率を求めるとよい。
生存率に係る減少率（％）＝被験物質における生存率×１００／対照（ネガティブコントロール）における生存率
【００１８】
例えば、対照としてネガティブコントロールを用いた場合には、嫌気的解糖系阻害活性を評価するための指標となる生存率に係る減少率が、統計学的に有意な値を示す物質、具体的に好ましくは、例えば、上記の式における生存率に係る減少率が20％以上を示す物質、より好ましくは40％以上を示す物質を、嫌気的解糖系阻害活性を有する物質として選抜する。
【００１９】
嫌気的解糖系阻害活性を有する物質を探索するには、本発明方法により評価された嫌気的解糖系阻害活性に基づき嫌気的解糖系活性を有する物質を選抜すればよい。尚、当該物質は、嫌気的解糖系阻害活性を有する限り、低分子化合物、蛋白質又はペプチド等のいかなる物質であってもよい。
【００２０】
本発明のミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞は、上記のように、嫌気的解糖系阻害活性を検定するための試薬として使用することができる。
【００２１】
さらに本発明方法は、嫌気的解糖系阻害活性を有する物質の探索等に利用することができる。具体的には、本発明方法により検定された、物質が有する嫌気的解糖系阻害活性の有無又はその程度若しくはその量に基づき嫌気的解糖系阻害活性を有する物質を選抜することによって、嫌気的解糖系阻害活性を有する物質を探索することができる。勿論、本発明方法は悪性腫瘍治療薬における有効成分となりうる物質の探索等にも応用することもできる。
選抜された嫌気的解糖系阻害活性を有する物質若しくはその薬学的に許容される塩は、悪性腫瘍治療薬の有効成分として用いてもよい。当該有効成分を薬学的に許容される担体中に製剤化することにより、悪性腫瘍治療薬を製造することができる。
尚、選抜された嫌気的解糖系阻害活性を有する物質は、例えば、各種の腺癌等の抗がん剤としても利用することも期待される。
【００２２】
上記の嫌気的解糖系阻害活性を有する物質は、前述のように、当該物質の薬学的に許容される塩（例えば、酸付加塩又は塩基付加塩）の形で悪性腫瘍治療薬の有効成分として利用してもよい。酸付加塩としては、例えば、無機酸付加塩又は有機酸付加塩が挙げられ、無機酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、燐酸塩等が挙げられ、有機酸付加塩としては、例えば、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩等が挙げられる。塩基付加塩としては、例えば、無機塩基付加塩又は有機塩基付加塩が挙げられ、無機塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が挙げられ、有機塩基付加塩としては、例えば、アルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸付加塩等が挙げられる。かかる塩は公知の手段によって製造することができる。
また、上記の嫌気的解糖系阻害活性を有する物質は、当該物質の薬学的に許容される塩の水和物等の溶媒和物の形で悪性腫瘍治療薬の有効成分として利用してもよい。
【００２３】
当該悪性腫瘍治療薬の投与は、通常の投与経路、例えば経口、筋肉内、静脈内、皮下、腹腔内、鼻孔内等により行うことができる。投与量及び投与回数は投与経路、症状の程度、年齢、体重等によって異なるが、通常は成人１日当たり約１ｍｇ乃至１ｇを１日１回又はそれ以上の回数で投与される。投与剤形としては、例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、座剤、注射剤、経鼻剤等が挙げられる。製剤化の際は、通常の製剤担体を用い、常法により製造することができる。即ち、経口用製剤を調製する場合には、必要に応じて結合剤、崩壊剤、潤滑剤、着色剤等を加えた後、常法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等とする。注射剤を調製する場合には、必要に応じてｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤等を添加し、常法により注射剤とすることもできる。
【００２４】
本発明は、本発明方法に基づくシステム工程を有する、物質が有する嫌気的解糖系阻害活性を検定するための装置も含み、また本発明方法により検定して得られた毒性情報を有する電子情報記録媒体等も含むものである。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例１
１．ミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞の調製
大日本製薬（株）から購入したヒト肝由来細胞株HepG2を使用した。当該培養細胞を以下の培養液で、37℃、5%CO2・95%Airの条件下で12週間培養した。
培養液としては、Minimum Essential Medium (Earle’s， GIBCO社製) 500mLに下記の成分が添加されたものが用いられた。
・Fetal Bovine Serum (HyClone社製)  10% (V／V)
・グルコース （最終濃度：4500mg／Lとなるように追加で添加された。）
・GIBCO社製MEM非必須アミノ酸溶液 (最終濃度：0.1mM)
・GIBCO社製MEMピルビン酸ナトリウム溶液 (最終濃度：1mM)
・ペニシリン (最終濃度：100U／mL)-ストレプトマイシン(最終濃度：100μμg／mL)
・ウリジン (最終濃度：50μg／mL)
・ピルビン酸 (最終濃度：1mM)
・臭化エチジウム (最終濃度：5μM)
【００２７】
上記の培養終了後、得られたコロニーを、クローニングリングを用いてクローニングし、これを前記の培養液から臭化エチジウムのみを除いた培養液でさらに37℃、5%CO2・95%Airの条件下で2週間培養した。
このようにして、ミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞を調製した。
【００２８】
２．ミトコンドリアＤＮＡの欠損の確認
正常HepG2細胞及びミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞を用いて、ミトコンドリアＤＮＡの欠損の確認をPCR法及びチトクロームCオキシダーゼ(COX)の組織化学染色法を利用して実施した。
（１）PCR法によるミトコンドリアＤＮＡの欠損の確認
正常HepG2細胞及びミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞より、GenomicPrep Cell and Tissue DNA Isolation Kit（アマシャムファルマシアバイオテク（株））を用いてDNAを抽出した。さらに得られたDNAを鋳型とし、ミトコンドリアＤＮＡを増幅するために設計されたプライマー（配列番号１及び配列番号２）及びpuReTaq Ready-To-Go PCR Beads（200μLチューブ(総反応液量：25μL)、アマシャムファルマシアバイオテク（株）)を用いて、下記の条件でPCRを実施した。
【００２９】
・鋳型DNA量：1μg／mL (25ng／tube)
・プライマー：配列番号１又は配列番号２で示されるオリゴヌクレオチド、最終濃度0.5mM
・PCR条件：熱変性：95℃、アニーリング：68℃、伸長：72℃、反応時間：1分(初回熱変性のみ5分)、サイクル数：30
【００３０】
PCR実施後、PCR反応液（3μL）を1.5%アガロースゲルで電気泳動した。電気泳動終了後、臭化エチジウムにてアガロースゲルを染色することにより、DNA増幅の有無を観察した。その結果、正常HepG2細胞から抽出されたDNAを鋳型とした場合にはPCRでDNA増幅が認められたが、ミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞から抽出されたDNAを鋳型とした場合には同様の増幅が生じないことが確認された（図1参照）。
【００３１】
（２）チトクロームCオキシダーゼ(COX)の組織化学染色法によるミトコンドリアＤＮＡ欠損の確認
上記の方法でミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなるrho0細胞及び正常HepG2細胞をスライドガラス上で培養した。培養終了後、これら細胞に下記のCOX反応液を添加し、37℃で約2時間インキュベートした。
COX反応液は0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.4)に下記のものを添加した；
・3，3‘−ジアミノベンジジン 4塩酸塩、0.1% (W／V)
・チトクロームC (Cytochrome C， Equine Heart)、0.1% (W／V)
・カタラーゼ、0.02% (W／V)
・ジギトニン、1μg／mL
インキュベート後のスライドガラスを水で洗浄した後、これをグリセリンで封入し、各培養細胞の組織化学的染色状態を光学顕微鏡で観察した。その結果、正常HepG2細胞では細胞内にCOX活性が認められたのに対し、ミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞では細胞内にCOX活性が認められないことが確認された（図2参照）。
【００３２】
３．ミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞及び正常HepG2細胞の生存率に対する、既知の嫌気的解糖系阻害剤の影響
正常HepG2細胞及びミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞を用い、既知の嫌気的解糖系阻害剤であるフッ化ナトリウムを0.3〜10μg／mL及びヨード酢酸を0.1〜10μg／mLの濃度でそれぞれ処理した。尚、前記の被験物質処理としては、前記培養細胞の場合には実施例１に記載された培養液の組成から臭化エチジウムのみを除いた培養液の中に、また正常HepG2細胞の場合には実施例１に記載された培養液の組成からウリジン、ピルビン酸及び臭化エチジウムを除き、さらにグルコース濃度を1000mg／Lとした培養液の中に、それぞれ被験物質を溶解させることにより供試薬剤を調製した。このようにして調製された供試薬剤を実施例１に記載された培養液に添加した後、当該培養液で前記培養細胞をさらに37℃、5%CO2・95%Airの条件下で３日間培養を続けることにより実施した。
【００３３】
培養終了後、当該培養細胞の生存率を、クリスタルバイオレット染色法を用いた方法により測定した（図3及び図4参照）。
図3及び図4から明らかなように、正常HepG2細胞では既知の嫌気的解糖系阻害剤であるフッ化ナトリウム又はヨード酢酸の処理によっても、当該培養細胞の生存率の低下を生じることはなかった。一方、ミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞ではフッ化ナトリウム又はヨード酢酸の処理によっても、当該培養細胞の生存率の低下が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明により、物質が有する嫌気的解糖系阻害活性をより簡便に検定するための方法が提供可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、正常HepG2細胞又はミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞由来のDNAを鋳型とし、ミトコンドリアＤＮＡを増幅するためのPCR法を実施した後、得られたPCR反応液をアガロースゲル電気泳動した後、臭化エチジウムにてアガロースゲルを染色することにより、DNA増幅の有無を観察した結果を示す図である。図中のレーン1及び4は、分子量マーカー（（株）ニッポンジーン、Marker 5（φX174／HincII digest））を表す。図中のレーン２は、正常HepG2細胞から抽出されたDNAを鋳型とした場合のDNA増幅物を表す。また図中のレーン3は、ミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞から抽出されたDNAを鋳型とした場合のDNA増幅物を表す。
【図２】図２は、正常HepG2細胞又はミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞を用いて、チトクロームCオキシダーゼ(COX)の組織化学的染色法によりCOX活性の有無を観察した結果を示す図である。図中の（A）は正常HepG2細胞の染色結果を表す。（B）はミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞の染色結果を表す。
【図３】図３は、被験物質として嫌気的解糖系阻害活性を有するフッ化ナトリウムを用いた本発明方法において、正常HepG2細胞及びミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる細胞の各培養細胞の生存率変化を示す図である。図中の三角（▲）は正常HepG2細胞を用いた場合における培養細胞の生存率を表し、バツ（×）はミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞を用いた場合における培養細胞の生存率を表す。
【図４】図４は、被験物質として嫌気的解糖系阻害活性を有するヨード酢酸を用いた本発明方法において、正常HepG2細胞及びミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる細胞の各培養細胞の生存率変化を示す図である。図中の三角（▲）は正常HepG2細胞を用いた場合における培養細胞の生存率を表し、バツ（×）はミトコンドリアＤＮＡを欠損させてなる培養細胞を用いた場合における培養細胞の生存率を表す。
【配列表フリーテキスト】
【００３６】
配列番号１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【図１】
2006109769.tif 000002
【図２】
2006109769.tif 000003
【図３】
2006109769.tif 000004
【図４】
2006109769.tif 000005
【配列表】
2006109769000001.app