(57)【要約】      （修正有）【課題】  ポリグルタミン病に対する新規な薬剤（医薬）を提供する。【解決手段】下記式に示すゲラニルゲラニルアセトン(GGA)を有効成分として抗ポリグルタミン病剤を構成する。ポリグルタミン病は、遺伝性の神経変性疾患であり、球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病及び脊髄小脳変性症が含まれる。2006063012.tif 000003【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲラニルゲラニルアセトンを有効成分として含有する抗ポリグルタミン病剤。
【請求項２】
ポリグルタミン病が球脊髄性筋萎縮症である、請求項１に記載の抗ポリグルタミン病剤。
【請求項３】
抗ポリグルタミン病剤を製造するための、ゲラニルゲラニルアセトンの使用。
【請求項４】
ゲラニルゲラニルアセトンを対象に投与するステップを含む、ポリグルタミン病の予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリグルタミン病に対する薬剤（抗ポリグルタミン病剤）及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリグルタミン病は、CAG繰り返し配列の異常延長を原因とする遺伝性の神経変性疾患であり、球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病および脊髄小脳変性症などが含まれる。いずれの疾患も成人で発症し、進行性の神経障害を呈し死に至るが、病態を抑制する有効な治療薬はない。これら一群の疾患では、原因遺伝子の産物である、異常延長したポリグルタミン鎖を含有する変異蛋白が主として神経細胞の核内に蓄積して凝集し、転写障害を惹起することなどによって細胞の機能障害ひいては細胞死が生じる。我々は既に、球脊髄性筋萎縮症のモデル動物であるトランスジェニックマウスを用い、病因蛋白である変異アンドロゲン受容体のテストステロン依存性核内集積がその病態の根幹をなしていることを見いだし（Neuron 35: 843-854, 2002）、黄体形成ホルモン刺激ホルモン（LHRH）アナログによるテストステロン分泌の抑制が劇的な治療効果につながることを発表してきた（Nat Med 9: 768-773, 2003、WO2004/016083）。同治療薬については現在臨床試験を実施中である。
【０００３】
一方、変異蛋白の凝集を阻害する分子として熱ショック蛋白質（heat shock protein：HSP）が知られている。熱ショック蛋白質は熱などのストレスによって発現が誘導される分子シャペロンであり、構造変化を来した異常蛋白の形状を元に戻し（refolding）、その凝集を阻害するのみならず、プロテアゾームにおける変異蛋白の分解を促進すると考えられている。我々は、熱ショック蛋白質のひとつであるHSP70の発現を増強することで変異アンドロゲン受容体の核内凝集を抑制することを球脊髄性筋萎縮症の培養細胞モデルにおいて確認し（J Biol Chem 275: 8772-8778, 2000）、神経症状を改善することを球脊髄性筋萎縮症のモデルマウスとHSP70高発現マウスとを交配することにより見いだした（J Neurosci 23: 2203-2211, 2003）。同様の効果は球脊髄性筋萎縮症のショウジョウバエモデルや（Hum Mol Genet 11: 2895-904, 2002）、脊髄小脳変性症のショウジョウバエやマウスモデルにおいても確認されており（Nat Genet 19: 148-154, 1998；Hum Mol Genet 10: 1511-1518, 2001）、有望な治療戦略と考えられる。
また、転写機能を改善する作用を有するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤についても、このマウスでの治療効果を確認しており（Hum Mol Genet 13:1183-1192）、同様の結果がハンチントン病のモデルマウスにおいても報告されている（Proc Natl Acad Sci U S A 100:2041-2046, 2003；J Neurosci 23:9418-9427, 2003）。この他、ハンチントン病のモデルマウスにおいては、変異蛋白の凝集抑制効果を有するcongo redやtrehalose、変異蛋白の分解を促進する効果のあるrapamycinなどの治療効果も報告されているが、いずれも臨床応用には至っていない。
【０００４】
【特許文献１】特開昭５３−１４５９２２号公報
【特許文献２】特開平６−１９２０７３号公報
【特許文献３】国際公開第２００４／０１６０８３号パンフレット
【非特許文献１】Katsuno M, Adachi H, Kume A, Li M, Nakagomi Y, Niwa H, Sang C, Kobayashi Y, Doyu M, Sobue G (2002) Testosterone reduction prevents phenotypic expression in a transgenic mouse model of spinal and bulbar muscular atrophy. Neuron 35: 843-854.
【非特許文献２】Katsuno M, Adachi H, Doyu M, Minamiyama M, Sang C, Kobayashi Y, Inukai A, Sobue G (2003) Leuprorelin rescues polyglutamine-dependent phenotypes in a transgenic mouse model of spinal and bulbar muscular atrophy. Nat Med 9： 768-773.
【非特許文献３】Kobayashi Y, Kume A, Li M, Doyu M, Hata M, Ohtsuka K, Sobue G (2000) Chaperones Hsp70 and Hsp40 suppress aggregate formation and apoptosis in cultured neuronal cells expressing truncated androgen receptor protein with expanded polyglutamine tract. J Biol Chem 275: 8772-8778.
【非特許文献４】Adachi H, Katsuno M, Minamiyama M, Sang C, Pagoulatos G, Angelidis C, Kusakabe M, Yoshiki A, Kobayashi Y, Doyu M, Sobue G (2003) Heat shock protein 70 chaperone overexpression ameliorates phenotypes of the spinal and bulbar muscular atrophy transgenic mouse model by reducing nuclear-localized mutant androgen receptor protein. J Neurosci 23: 2203-2211.
【非特許文献５】Chan HY, Warrick JM, Andriola I, Merry D, Bonini NM (2002) Genetic modulation of polyglutamine toxicity by protein conjugation pathways in Drosophila. Hum Mol Genet 11: 2895-2904.
【非特許文献６】Cummings CJ, Mancini MA, Antalffy B, DeFranco DB, Orr HT, Zoghbi HY (1998) Chaperone suppression of aggregation and altered subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1. Nat Genet 19: 148-154.
【非特許文献７】Cummings CJ, Sun Y, Opal P, Antalffy B, Mestril R, Orr HT, Dillmann WH, Zoghbi HY (2001) Over-expression of inducible HSP70 chaperone suppresses neuropathology and improves motor function in SCA1 mice. Hum Mol Genet 10: 1511-1518.
【非特許文献８】Minamiyama M, Katsuno M, Adachi H, Waza M, Sang C, Kobayashi Y, Tanaka F, Doyu M, Inukai A, Sobue G (2004) Sodium butyrate ameliorates phenotypic expression in a transgenic mouse model of spinal and bulbar muscular atrophy. Hum Mol Genet 13: 1183-1192.
【非特許文献９】Hockly E, Richon VM, Woodman B, Smith DL, Zhou X, Rosa E, Sathasivam K, Ghazi-Noori S, Mahal A, Lowden PA, Steffan JS, Marsh JL, Thompson LM, Lewis CM, Marks PA, Bates GP (2003) Suberoylanilide hydroxamic acid, a histone deacetylase inhibitor, ameliorates motor deficits in a mouse model of Huntington's disease. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 2041-2046.
【非特許文献１０】Ferrante RJ, Kubilus JK, Lee J, Ryu H, Beesen A, Zucker B, Smith K, Kowall NW, Ratan RR, Luthi-Carter R, Hersch SM (2004) Histone deacetylase inhibition by sodium butyrate chemotherapy ameliorates the neurodegenerative phenotype in Huntington's disease mice. J Neurosci 23: 9418-27.
【非特許文献１１】Mangiarini L, Sathasivam K, Seller M, Cozens B, Harper A, Hetherington C, Lawton M, Trottier Y, Lehrach H, Davies SW, Bates GP (1996) Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. Cell 87: 493-506.
【非特許文献１２】Clark HB, Burright EN, Yunis WS, Larson S, Wilcox C, Hartman B, Matilla A, Zoghbi HY, Orr HT (1997) Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci 17: 7385-7395.
【非特許文献１３】Vonsattel JP, Myers RH, Stevens TJ, Ferrante RJ, Bird ED, Richardson EP Jr (1985) Neuropathological classification of Huntington's disease. J Neuropathol Exp Neurol 44: 559-577.
【非特許文献１４】Steffan JS, Kazantsev A, Spasic-Boskovic O, Greenwald M, Zhu YZ, Gohler H, Wanker EE, Bates GP, Housman DE, Thompson LM (2000) The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 6763-6768.
【非特許文献１５】Nucifora FC Jr, Sasaki M, Peters MF, Huang H, Cooper JK, Yamada M, Takahashi H, Tsuji S, Troncoso J, Dawson VL, Dawson TM, Ross CA (2001) Interference by huntingtin and atrophin-1 with cbp-mediated transcription leading to cellular toxicity. Science 291: 2423-2428.
【非特許文献１６】Niwa, H., Yamamura, K., and Miyazaki, J. (1991). Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108, 193-199
【非特許文献１７】Kobayashi, Y., Miwa, S., Merry, D.E., Kume, A., Mei, L., Doyu, M., and Sobue, G. (1998). Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 145-150.
【非特許文献１８】Adachi, H., Kume, A., Li, M., Nakagomi, Y., Niwa, H., Do, J., Sang, C., Kobayashi, Y., Doyu, M., and Sobue, G. (2001). Hum. Mol. Genet. 10, 1039-1048.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
球脊髄性筋萎縮症に対するLHRHアナログ治療は動物モデルを用いた研究が臨床応用に向かいつつあるが、この治療法は球脊髄性筋萎縮症以外のポリグルタミン病には効果が期待しづらい。一方、ハンチントン病のモデルマウスで治療効果が報告されているヒストン脱アセチル化酵素阻害剤などの薬剤については、人体への安全性が確立されておらず、臨床で患者に使用するにはその毒性を評価し克服することが必要であると考えられる。こうしたことから、臨床応用可能な、低毒性化合物の探索が急務とされている。そこで本発明は、このような要求に応えることができる、ポリグルタミン病に対する新規な薬剤（医薬）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以上の目的の下、本発明者らは患者に投与可能な低毒性物質として、HSPの発現を増強する効果のあるゲラニルゲラニルアセトン(geranylgeranylacetone: GGA)に注目した。本物質は消化性潰瘍の治療薬として臨床で使用されているものであり、消化管粘膜・心筋・肝などにおいてHSPの発現を増加させることが報告されている。また、経口投与にて中枢神経をはじめ全身の組織への分布が確認されており、臨床応用は容易であると考えられる。本発明者らはGGAのポリグルタミン病に対する効果を検討するため、球脊髄性筋萎縮症などの培養細胞モデルにおいてGGAによる細胞死抑制及び変異アンドロゲン受容体の凝集抑制効果を検討した。まず予備的な実験として、球脊髄性筋萎縮症の培養細胞モデルを用いて細胞レベルでのGGAの作用を調べた。その結果、GGAの使用によって(1)細胞死が抑制される現象及び(2)変異アンドロゲン受容体の凝集が抑制される現象が観察された（第４５回日本神経学会総会で発表）。
【０００７】
ここで、球脊髄性筋萎縮症をはじめとするポリグルタミン病では機能障害（例えば、球脊髄性筋萎縮症における運動機能の低下等）が認められ、その改善が治療ターゲットとなる。これまでの研究によって、SBMAマウスを含め多くのポリグルタミン病のモデル動物では顕著な神経障害が症状として認められるにも関わらず病理学的には神経細胞脱落が観察されないことが判明している（Mangiarini L, et al. Cell 1996; 87: 493-506.；Clark HB, et al. J Neurosci 1997; 17: 7385-7395.）。これは、細胞死に至らずとも、細胞の機能障害のみでも神経症状が顕在化することを示唆しておりハンチントン病患者の剖検所見においても１割近くで細胞脱落がほとんど観察されないという報告にも一致する（Vonsattel JP, et al. J Neuropathol Exp Neurol 1985; 44: 559-577.）。こうした所見を総合すると、ポリグルタミン病の発症初期には病態の可塑性が保持されている可能性があり、この時期こそが治療にとって重要と考えられる。従って、この時期、即ち細胞死（脱落）に至る前の段階において有効な薬理効果が得られることが抗ポリグルタミン病剤に求められることとなる。このことを考慮すれば、上記のように細胞レベルの実験の結果、細胞死に対する抑制効果がGGAに認められたからといって、直ちにGGAがポリグルタミン病の治療に有効であるとは到底言えない。換言すれば、ポリグルタミン病に特徴的な機能障害に対する作用の有無を、少なくとも動物レベルの実験において調べなければ実際の臨床における薬剤としてのGGAの適正は判断できない。そこで本発明者らはさらに球脊髄性筋萎縮症のモデルマウスを用い、機能障害に対するGGAの作用を調べた。その結果、驚くべきことにGGAの経口投与によって運動機能の有意な改善が認められ、生存期間の延長も確認された。一方で細胞レベルの実験で得られた結果と同様に、GGAが脊髄運動ニューロンにおけるHSP70の発現増強、及び変異アンドロゲン受容体タンパク質の核内凝集の抑制という作用を奏することが確認された。
以上のように、本発明者らの鋭意検討の結果、GGAが球脊髄性筋萎縮症に対する薬剤として有効であることが判明した。
【０００８】
ここで、球脊髄性筋萎縮症をはじめとするポリグルタミン病では、特定の遺伝子におけるCAGリピートの異常延長が原因であること、CAGリピート長が長いほど発症年齢が若年化し重症化すること、表現促進現象（世代を経るごとに発症年齢が若年化する現象）が認められること、神経組織が選択的に障害を受けること、及び神経細胞内に変異タンパク質の凝集が認められるとともに核内封入体が観察されることなど、多くの共通点が認められる。尚、核内に集積した変異タンパク質はCBP（c-AMP response element binding protein-binding protein）などの転写調節因子の機能を障害し、これがポリグルタミン病における神経細胞障害の主因と考えられている（Steffan JS, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97: 6763-6768.；Nucifora FC Jr, et al. Science 2001; 291: 2423-2428.）。以上のような、疾患原因をはじめとした多くの共通点から、ポリグルタミン病の一つである球脊髄性筋萎縮症のモデル動物を用いた実験で得られた上記知見は他のポリグルタミン病についても適用できる可能性が極めて高い。即ち、球脊髄性筋萎縮症のみならず他のポリグルタミン病に対してもGGAが有効な薬理作用を奏することが当然として予測される。
【０００９】
本発明は以上の知見に基づき完成されたものであり、ゲラニルゲラニルアセトンのポリグルタミン病に関する医用用途を提供するものである。具体的には本発明は以下の構成を提供する。
即ち本発明の一形態は、ゲラニルゲラニルアセトンを有効成分として含有する抗ポリグルタミン病剤である。本発明の好ましい態様ではポリグルタミン病が球脊髄性筋萎縮症であり、従って球脊髄性筋萎縮症に対する薬剤（医薬）が提供されることとなる。
本発明の他の形態は、抗ポリグルタミン病剤を製造するためにゲラニルゲラニルアセトンを使用すること、及びゲラニルゲラニルアセトンを用いたポリグルタミン病の医療的処置（ポリグルタミン病の予防及び治療）に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の抗ポリグルタミン病剤はゲラニルゲラニルアセトンを有効成分として含有することを特徴とする。ここで「ゲラニルゲラニルアセトン(GGA)」とは一般名がテプレノン（Teprenone）であって、以下の構造式で表される6, 10, 14, 18−テトラメチル−5,9, 13, 17−ノナデカテトラエン−2−オンをいう。
【化１】
2006063012.tif 000002
GGAには種々の光学異性体が存在するが、本発明では特に(5E, 9E, 13E) 6,10,14,18-テトラメチル−5, 9, 13, 17−ノナデカテトラエン−2−オン、又は(5Z, 9E, 13E) 6,10,14,18−テトラメチル−5, 9, 13, 17−ノナデカテトラエン−2−オンを用いることが好ましい。これらの化合物を単独で用いることができることは言うまでもないが、任意の比率で組み合わせて用いてもよい。例えば、(5E, 9E, 13E) 6,10,14,18−テトラメチル−5, 9, 13, 17−ノナデカテトラエン−2−オンと、(5Z, 9E, 13E) 6,10,14,18−テトラメチル−5, 9, 13, 17−ノナデカテトラエン−2−オンとを３：２のモル比で混合して用いることができる。
GGAは、胃潰瘍や胃炎の治療薬として広く使用されており、薬剤グレードものを容易に入手可能である。また、GGAの合成法は公知であり、例えば特開昭５３−１４５９２２号公報や特開平６−１９２０７３号公報に開示される方法に従って合成することもできる。
GGAとして、塩の形態のものを使用することもできる。塩の例としてはハロゲン化水素酸塩（具体的にはフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等）、無機酸塩（具体的には硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩等）、有機カルボン酸塩（具体的には酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等）、有機スルホン酸塩（具体的にはメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩等）、アミノ酸塩（具体的にはアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（具体的にはナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（具体的にはマグネシウム塩、カルシウム塩等）を挙げることができる。
尚、無水物のGGA、又は水和物のGGAを用いることもできる。
【００１１】
本発明において「抗ポリグルタミン病剤」とは、ポリグルタミン病の発症を抑制するために使用される薬剤（医薬）、又はポリグルタミン病の症状を改善（部分的又は完全な治癒を含む）するために使用される薬剤（医薬）のことをいう。したがって本発明の抗ポリグルタミン病剤には、ポリグルタミン病の予防的処置に使用可能な薬剤、及びポリグルタミン病の治療に使用可能な薬剤が含まれる。
「ポリグルタミン病」とは神経変性疾患の一種であって、遺伝子のコード領域においてCAGリピートの伸長（異常伸長）が認められることを特徴とする。これまでにポリグルタミン病として球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、脊髄小脳変性症１型(SCA1)、脊髄小脳変性症２型(SCA2)、Machado-Joseph病(MJD、SCA3)、脊髄小脳変性症６型(SCA6)、脊髄小脳変性症７型(SCA7)、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)が見出されている。ポリグルタミン病の患者には表現促進現象（anticipation）やCAGリピート数のばらつき（体細胞モザイク）、主に神経組織が選択的に障害されるという共通の病態が観察される。本発明の薬剤はこれらのポリグルタミン病の予防薬又は治療薬として用いられ得るが、特に球脊髄性筋萎縮症に対して好適に適用される。
【００１２】
GGAの製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、溶解補助剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、酸化防止剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、生理食塩水など）を含有させることができる。
賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。結合剤としてはポリビニルピロリドン、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アラビアゴム等を用いることができる。溶解補助剤としては生理食塩水、乳酸化リンゲル溶液、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ニコチン酸アミド等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。酸化防止剤としてはアスコルビン酸、αトコフェノール等を用いることができる。滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム等を用いることができる。
【００１３】
製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、点眼剤、点鼻剤、吸入剤、及び座剤などとして調製できる。
このように製剤化した本発明の薬剤はその形態に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射など）によって対象に適用され得る。ここでの「対象」は特に限定されず、ヒト、及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウズラ等である）を含む。好適には、本発明の薬剤はヒトに対して適用される。
本発明の薬剤中における有効成分（GGA）の含量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように例えば約0.01重量％〜約90重量％とする。
【００１４】
本発明の他の局面では上記薬剤を使用したポリグルタミン病の予防方法又は治療方法（以下、これら二つの方法をまとめて「治療方法等」という）が提供される。本発明の治療方法等は、GGAを有効成分として含む薬剤を対象に投与するステップを含む。投与経路は特に限定されず例えば経口、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜などを挙げることができる。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる（例えば、経口投与と同時に又は所定時間経過後に静脈注射等を行う等）。尚、投与が容易である点から経口投与によることが好ましい。
【００１５】
薬剤の投与量は症状、患者の年齢、性別、及び体重などによって異なるが、当業者であれば適宜適当な投与量を設定することが可能である。例えば、成人（体重約60kg）を対象として一日当たりの有効成分量が約100mg〜約10g、好ましくは約150mg〜約5gとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの設定においては、患者の病状や薬剤の効果持続時間などを考慮することができる。
【００１６】
以下の実施例における材料・試薬及び実験方法は特に記載しない限り次の通りとした。
（アデノウイルスベクター）
GFPを有する24ないし97CAGのtrunvated アンドロゲン受容体(AR)コンストラクトをpShuttleベクター（BDサイエンス社、カリフォルニア、アメリカ）にクローニングし、I-CeuIとPI-SceIにて切り出した後、BD Adeno-X Expression system（BDサイエンス社、カリフォルニア、アメリカ）を用い、アデノウイルスベクターコンストラクトを作成した。ウイルスをHEK239細胞に感染、増殖させた後、BD Adeno-X Rapid Titer Kitを用いてウイルス力価を測定した。
【００１７】
（球脊髄性筋萎縮症(SBMA)培養細胞モデル）
ヒトneuroplastoma cell(SHSY-5Y)を、レチノイン酸10μMを含むメディウムで分化誘導後、24ないし97CAGを有するTruncated ARを含むアデノウイルスベクターをM.O.I. 20にて感染させた。GGA（(5E, 9E, 13E) 6,10,14,18−テトラメチル−5, 9, 13, 17−ノナデカテトラエン−2−オンと、(5Z, 9E, 13E) 6,10,14,18−テトラメチル−5, 9, 13, 17−ノナデカテトラエン−2−オンの混合物（３：２））は0.2%tocopherol-ethanolに溶解し、メディウムに加えた。細胞死の観察はpropidium Iodine(PI)染色により施行した。
【００１８】
（SBMAトランスジェニックマウス）
CMVエンハンサー及びチキンβアクチンプロモーターの制御下に97CAGを有する完全長ARを発現するコンストラクトを導入したトランスジェニックマウス(AR-97Q)を用いた。当該トランスジェニックマウスの作製方法の概要は次の通りである。まず、pCAGGSベクター(Niwa, H., Yamamura, K., and Miyazaki, J. (1991). Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108, 193-199.)内にNheI部位を作製した後(pCAGGS-NheI)、97CAGを有する全長ヒトAR遺伝子 (Kobayashi, Y., Miwa, S., Merry, D.E., Kume, A., Mei, L., Doyu, M., and Sobue, G. (1998). Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 145-150.)をこのpCAGGS-NheIにサブクローニングする。次に、SalI-NheI で処理し、AR断片を切り出す。この断片をBDF1受精卵（日本エスエルシー、静岡、日本）にマイクロインジェクションする。注入操作を終了した受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植し、所定期間飼育することで仔マウス（F0、AR-97Qマウス）を得る。これらF0マウスをC57BL/6J（日本エスエルシー、静岡、日本）に交配することで維持を行った。尚、AR-97Qの作製方法の詳細についてはWO2004/016083を参照されたい。
【００１９】
（薬剤投与）
トランスジェニックマウスへのGGAの投与は次のように行った。GGA10%細粒4.8gを粉末状飼料36.6gに混和し、ad libitumで経口投与した。7-8週齢におけるマウスの１日飼料摂取量は2.6±0.4gであり、GGA摂取量は30.1±4.6mg/日であった。
【００２０】
（表現型解析）
Rotarod taskをGGA投与開始から毎週行い、運動機能を解析した。Rotarod taskにはEconomex Rotarod (Colombus Instruments、アメリカ)を用い、毎週12時間ごとの明暗サイクルの明時に、以前の報告と同様に行った (Adachi, H., Kume, A., Li, M., Nakagomi, Y., Niwa, H., Do, J., Sang, C., Kobayashi, Y., Doyu, M., and Sobue, G. (2001). Hum. Mol. Genet. 10, 1039-1048.)。試行は3回行い、各々のマウスが回転バーにもっとも長く乗ることのできた時間を記録した。マウスがバーから落下した時ないし180秒に達した時にタイマーを停止し、その時間を記録した。
マウスの1日の行動量であるcage activityは、マウスを透明なケージ(16 x 30 x 14 cm)に入れ、AB system (ニューロサイエンス、日本)を用い、赤外線センサーを使って測定した。測定は10分間隔で24時間行った。
また、HSP70の発現を、誘導型HSP70に対する抗体（ASPA810,Stressgene,1:1000）を一次抗体としたウエスタンブロット、及びHSP70に対する抗体(K-20,Santa cruz,1:500)を一次抗体とした免疫組織化学を用いて解析した。
【実施例１】
【００２１】
＜培養細胞モデルにおけるゲラニルゲラニルアセトン(GGA)の効果：予備実験＞
上記の方法で、球脊髄性筋萎縮症の培養細胞モデルに対しGGAを10-6〜10-12μMの濃度で投与したところ、10-9μMの濃度において細胞死が最も抑制された（図１）。GGAを加えなかった際の細胞死は培養4日目において37.2％であったが、GGA 10-9μMの投与により22.1%に改善した（図２）。抗HSP70抗体を用いたウエスタンブロットでは、GGA投与によるHSP70発現の増加が認められた（図３）。抗アンドロゲン受容体抗体を用いたウエスタンブロットでは、GGA投与による変異アンドロゲン受容体の凝集抑制が認められた（図４）。
以上のように、GGAが細胞死を抑制する作用、及び変異アンドロゲン受容体の凝集を抑制する作用を有することが認められた。また、これらの作用はHSP70の発現を促進することによって得られると考えられた。
【実施例２】
【００２２】
＜動物モデルにおけるゲラニルゲラニルアセトン(GGA)の効果＞
動物モデルにおける治療効果の検討として、上記の方法に従い、GGA細粒を各種の濃度で粉末状の飼料に混和し、これを球脊髄性筋萎縮症のトランスジェニックマウス（SBMAトランスジェニックマウス）に随意的に摂取させ、投与によるHSPの発現誘導、神経症状および病理所見などの変化を観察した。運動機能解析として体重、rotarod taskおよびcage activityを毎週測定し、病理学的解析として抗HSP70抗体および抗ポリグルタミン抗体を用いた免疫染色を行った。
球脊髄性筋萎縮症のトランスジェニックマウスでは、GGAの経口投与により運動機能の有意な改善が認められ、生存期間は約4週間延長した（図５）。抗HSP70抗体を用いたウエスタンブロット及び免疫組織化学では主として脊髄運動ニューロンにおけるHSP70の発現増強が認められた（図６）。抗ポリグルタミン抗体を用いた免疫組織化学では脊髄運動ニューロンなどにおける変異アンドロゲン受容体蛋白の核内凝集がGGAにより著明に抑制された（図７）。
【００２３】
以上のように、GGAの経口投与によって、SBMAモデルマウスの運動機能の有意な改善が認められ、生存期間の延長も確認された。即ち、動物レベルの実験において、SBMAに対する有効な薬理効果をGGAが有することが実証された。
一方、培養細胞モデルの実験で得られた結果と同様に、HSP70の発現増強、及び変異アンドロゲン受容体タンパク質の核内凝集の抑制が認められた。このことから、GGAはHSP70の発現を増加させ、それによって変異蛋白の核内凝集を抑制することで神経細胞の機能障害を抑制するものと考えられた。
GGAはすでに消化性潰瘍の治療薬として臨床で広く使用されており、その毒性が低いことも判明していることから、ポリグルタミン病の新規治療薬として極めて有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明はポリグルタミン病の予防ないし治療に有用である。ポリグルタミン病の中でも特に球脊髄性筋萎縮症の予防ないし治療に対して本発明を好適に利用することができる。
【００２５】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】GGAが細胞死を抑制する作用があることを示すグラフである。球脊髄性筋萎縮症の培養細胞モデルに対し種々の濃度でGGAを投与した場合の死細胞の割合が示される（PI染色）。
【図２】GGAが細胞死を抑制する作用があることを示すグラフである。10-9μMの濃度でGGAを投与した場合の２日後、４日後、及び６日後における死細胞の割合が示される。24Qは、24CAGを有するtruncated ARを含むアデノウイルスベクターを感染させた細胞を用いた結果、97Qは、97CAGを有するtruncated ARを含むアデノウイルスベクターを感染させた細胞を用いた結果をそれぞれ示す。右欄はGGA添加後２日目の組織像である。
【図３】球脊髄性筋萎縮症の培養細胞モデルに対しGGA（10-9μM）を投与した場合（＋）及び投与しない場合（−）のHSP70の発現量を示す図（抗HSP70抗体を用いたウエスタンブロットの結果）である。
【図４】球脊髄性筋萎縮症の培養細胞モデルに対しGGA（10-9μM）を投与した場合（＋）及び投与しない場合（−）の変異アンドロゲン受容体の凝集量を示す図（抗アンドロゲン受容体抗体を用いたウエスタンブロットの結果）である。
【図５】球脊髄性筋萎縮症のトランスジェニックマウスに対しGGAを投与した場合（＋）及び投与しない場合の運動機能（左）、及び生存期間（右）を示すグラフである。
【図６】球脊髄性筋萎縮症のトランスジェニックマウスに対しGGAを投与した場合（＋）及び投与しない場合（−）のHSP70の発現量を示す図である（左：抗HSP70抗体を用いたウエスタンブロットの結果、右：抗HSP70抗体を用いた免疫組織化学の結果）。野生型マウス(WT)を用いて同様の実験を行った結果を併せて示す。
【図７】球脊髄性筋萎縮症のトランスジェニックマウスに対しGGAを投与した場合（＋）及び投与しない場合（−）の変異アンドロゲン受容体蛋白の核内凝集量を示す図である（抗ポリグルタミン抗体を用いた免疫組織化学の結果）。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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