(57)【要約】      （修正有）【課題】  有機溶媒を使用しないで、効率よくリポソームを得る方法、及びこの方法を用いた安定なキトサン修飾リポソームを得る方法、及びこの製法により得られたリポソームの用途を提供する。【解決手段】リン脂質及び／または糖脂質を膜脂質として用い、親水性薬効成分及び／または親油性薬効成分の1種以上を内包物とし、水、内包物、リポソームを修飾する低分子ないし高分子の修飾物質、及び／またはそれらに１種類以上の溶解助剤を溶解ないし分散した水溶液と、炭酸ガスとを圧力容器に封入して、温度０〜１００℃、圧力３０〜５００  気圧、０．５〜５時間保持しながら撹拌し、水中に二酸化炭素のエマルションが分散したＣＯ２／Ｈ２Ｏのエマルションを得、圧力容器中から炭酸ガスを抜くことにより残留ないし同伴して流出する水相中にリポソームが分散した懸濁液を得ることを特徴とするリポソームの製造方法及びこの製法により得られたリポソームの用途。【選択図】図１８
2006131567.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質及び／または糖脂質を膜脂質として用い、親水性薬効成分及び／または親油性薬効成分の1種以上を内包物とし、その調製に際し、水、内包物、リポソームを修飾する低分子ないし高分子の修飾物質、及び／またはそれらに１種類以上の溶解助剤を溶解ないし分散した水溶液と、炭酸ガスとを圧力容器に封入して、温度０〜１００℃、圧力３０〜５００  気圧、０．５〜５時間保持しながら撹拌し、水中に二酸化炭素のエマルションが分散したＣＯ２／Ｈ２Ｏのエマルションを得、次いで、圧力容器中から炭酸ガスを抜くことにより残留ないし同伴して流出する水相中にリポソームが分散した懸濁液を得ることを特徴とするリポソームの製造方法。
【請求項２】
リポソームを修飾する低分子ないし高分子の修飾物質が「中性水では水溶せず、酸性水に溶解する物質」である請求項１に記載したリポソームの製造方法。
【請求項３】
「中性水では水溶せず、酸性水に溶解する物質」がキトサン、コラーゲン、生体ポリアミン、ポリ-L-リシン、プルラン、コレステロールの１種類以上であることを特徴とする請求項２に記載したリポソームの製造方法。
【請求項４】
リポソームに内包される親水性薬効成分又は親油性薬効成分が、抗酸化剤、抗菌剤、抗炎症剤、血行促進剤、美白剤、肌荒れ防止剤、老化防止剤、発毛促進剤、保湿剤、ホルモン剤、ビタミン類、色素、およびタンパク質類からなる群れより選ばれる1種以上であることを特徴とする請求項１に記載したリポソームの製造方法。
【請求項５】
リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、卵黄レシチン、水添卵黄レシチン、大豆レシチン、水添大豆レシチン等のグリセロリン脂質類、スフィンゴエミリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロールから選ばれるスフィンゴリン脂質類、プラスマローゲン類、及び／またはこれらのからなる群より選ばれる１種類以上の混合物であることを特徴とする請求項１に記載したリポソーム製造方法。
【請求項６】
糖脂質が、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステル等のグリセロ脂質類、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4等のスフィンゴ糖脂質類、およびまたはこれらの混合物であることを特徴とする請求項１に記載したリポソームの製造方法。
【請求項７】
溶解助剤が、グリコール、グリコールエーテル、グリコールエステル、炭酸アルキルの1種以上であることを特徴とする請求項１に記載したリポソームの製造方法。
【請求項８】
親水性薬効成分が、アスコルビン酸、およびアスコルビン酸誘導体の任意の1種以上であることを特徴とする請求項１に記載したリポソームの製造方法。
【請求項９】
請求項１ないし請求項８に記載した製造方法により得られるリポソームを用いたリポソーム製剤、これらを含有する化粧品、内服医薬品、外用医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソームの製造方法、より詳しくはエタノール、クロロホルム等の有機溶剤を用いない効率的なリポソームの製造方法および製造されたリポソームを用いた用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソーム（liposome）は、図１に示すように、リン脂質と水とを混合して得られるリン脂質の単層あるいは複数層からなる閉鎖小胞体であり、内部の水層あるいは脂質層に種々の物質を内包できる。例えば、水溶性薬剤はその中心部または2重層の間に存在でき、一方、親油性薬剤は2重層中に含有される。
リポソームは生体膜と類似の脂質から構成されているため、細胞膜と結合しやすく、生体親和性がある。このため、医薬品としては癌治療や遺伝子治療の際のDNAのキャリヤーとしてや、薬物徐放機能を持つ薬剤の担体として利用できる。また、化粧品としては水分や種々の薬効成分を角質層に運搬できる。また、リポソーム化によって、本来不安定で失活しやすい薬効成分を長期間安定に保つことができる。また、バイオセンサーなどへも広く利用することが出来る、
【０００３】
薬効成分を封入したリポソームを調製する方法は、以下に示すように多くの方法が開示されている。
Bangham法（薄膜法）：
図２に示したように脂質をクロロホルム等の有機溶媒に溶解した後、減圧下、有機溶媒を留去し脂質薄膜を得る。
ここに封入物質の水溶液を加えて、更に、超音波乳化機やvortexミキサー等の機械力で水和分散させることでリポソームを得る。この方法で、親油成分を内包させる場合は、それらを有機溶剤中にリン脂質とともに溶解させておく。このときの封入物質の内包率は数％程度である。
【０００４】
逆相蒸発法：
図３に示したように、脂質をジエチルエーテルやクロロホルムに溶解し、封入物質を含む水溶液を加えてW/Oエマルジョンとする。減圧下、エマルジョン中の有機溶媒を除去し、更に、水を添加しリポソームを得る。
この他に、脂質のエタノール溶液を、注射器を用いて相転移温度以上で、水溶液中に注入する方法（エタノール注入法）、エーテルに溶解した脂質を、50〜60℃に保った封入物を含有する水溶液に一定速度で注入することで、エーテルを蒸発させながらリポソームを得る方法（エーテル蒸発法）等が知られている。
また、脂質を、封入物を含む水相中に、予め、ホモミキサーで混合分散しておき、更に、高圧ホモジナイザーや超音波乳化機などの、高エネルギーを印加できる乳化機で2次処理することでもリポソームを得ることができる。
【０００５】
以上のすでに開示されているリポソームの調製方法と、これらにより得られたリポソーム製剤には、実用上、特に、これらを医薬品や化粧料や皮膚外用剤として使用する場合に、次の問題がある。
リン脂質を溶解する場合に有機溶剤を使用するので、最終製品からこれらを完全に除去することが困難であり、化粧料や皮膚外用剤に応用する場合、安全性の面で支障をきたす。
有機溶媒を使用する方法は、調製中に有機溶媒が飛散し、環境に影響を与える。また、これを回避するための溶媒回収装置等にコストがかかる。
工程が煩雑で工業スケールでの製造が困難である。特に、薄膜法は、有機溶剤を除去してリン脂質薄膜を得る工程が、工業スケールでは、実用上不可能である。
超音波乳化機や高圧ホモジナイザー等の強い機械力を使用して、リン脂質と、場合によりそこに親油性の内包物を予め混合した油相を、直接水相に分散させる方法は、工程が簡便で、工業スケールでの製造に適するが、リポソームの生成率が十分でなく、内包率も小さい。
また、攪拌の際に発生する熱や高せん断力により、不安定な薬効成分を封入する場合、分解や変性の問題が生ずる。
上記の方法は、簡便で工業スケールでの製造に適するので汎用されている方法であるが、得られたリポソームの安定性が低く、これを化粧料や皮膚外用剤として直接応用することは困難である。特に、このリポソームを化粧料や皮膚外用剤の製剤に配合すると、乳化剤等他の成分の影響で、安定性が著しく低下することが知られている。
【０００６】
超臨界流体を用いる方法では、図４に示すフレデリクソン等が提唱する製造法がある。この製造法の代表例は、脂質と超臨界炭酸ガスとメタノールの混合物を、減圧弁で減圧しながら、水溶液を混合し、リポソームを生成する。本発明者がこれを改良した発明は、すでに出願している（特許文献３参照）。
さらに、本発明者が過去に提唱した方法の概要を図５に示す。これは、脂質／補助溶媒（代表的にはエタノール）／ｓｃＣＯ２の均一な混合物（必要な場合には親油性物質、リポソームを修飾する低分子ないし高分子の修飾物質を含む）を作成し、そこに内包物質を含んだ水溶液を滴下して、二酸化炭素中に水の粒が分散したＨ２Ｏ／ｓｃＣＯ２エマルションを作成し、さらに水溶液を滴下して相を反転させ、ｓｃＣＯ２／Ｈ２Ｏエマルションを作成する。次いで減圧してリポソーム水溶液を得るものである（特許文献１及び特許文献２参照）。しかし、この方法では、エタノールが必要であるばかりか、水溶液の滴下に時間がかかるため、効率が悪いものであった。
【０００７】
【特許文献１】特願2000-313599（特開２００４−１５０８３９）
【特許文献２】特願2002-535796
【特許文献３】特願2004-117262
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、医薬品、化粧料や皮膚外用剤として実用に耐えうる安定性と、親水性薬効成分や親油性薬効成分を安定かつ高率で内包したリポソームを製造するために、次の課題を解決することを目的としている。
薬効成分の安定性を損なうことのない程度の少ない機械力で、リポソームを調製する。かつ、工業スケールでの製造に適する方法とする。
リポソームの生成率と薬効成分の内包率をできるだけ高める。リポソームと内包成分の安定性を確保する。
製品中に残留する懸念のある有機溶媒を使用しない調製方法とする。有機溶媒が環境に排出されない方法とする。
リポソームの安定性を向上させ、また、DNAなどのアニオン性物質との結合状態を安定化させるために、表面にカチオンを持ったリポソームを、有機溶媒を使用せず、工業スケールで、効率よく製造する方法とする
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために本発明は、図６に示すように、1種以上の膜脂質と、内包したい物質が溶けているか分散している水溶液を、圧力容器に入れ、圧力容器中に炭酸ガスとを導入すると、水溶液中に脂質を界面活性剤とした。ＣＯ２／Ｈ２Ｏのエマルションが得られる。次いで、圧力容器中から炭酸ガスＣＯ２を抜くと、リポソーム懸濁液が得られる。
すなわち、本発明は、リン脂質及び／または糖脂質を膜脂質として用い、親水性薬効成分及び／または親油性薬効成分の1種以上を内包物とし、その調製に際し、水、内包物、リポソームを修飾する低分子ないし高分子の修飾物質、及び／またはそれらに１種類以上の溶解助剤を溶解ないし分散した水溶液と、炭酸ガスとを圧力容器に封入して、温度０〜１００℃、圧力３０〜５００  気圧、０．５〜５時間保持しながら撹拌し、水中に二酸化炭素のエマルションが分散したＣＯ２／Ｈ２Ｏのエマルションを得、次いで、圧力容器中から炭酸ガスを抜くことにより残留ないし同伴して流出する水相中にリポソームが分散した懸濁液を得ることを特徴とするリポソームの製造方法である。
さらに、本発明は、内包物のほかにリポソームを修飾する低分子ないし高分子の修飾物質「中性水では水溶せず、酸性水に溶解する物質」を添加することができる。
また、本発明においては、二酸化炭素は高圧で水に溶解し、水を酸性にする。従って、中性水では水溶せず中性水には溶解しない物質も、酸性水中では解離して溶解させることができる。このようにして溶解した低分子、およびまたは高分子はリポソームに取り込まれ、リポソーム表面をプラスに帯電させカチオンリポソームを形成する。
カチオンリポソームは通常のリポソームに比べても安定である。また、負に帯電するDNAなどと強く相互作用し、遺伝子治療などにおける有力な遺伝子ベクターとなる。
このような物質としては、キトサン、コラーゲン、生体ポリアミン、ポリ-L-リシン、プルラン、コレステロールの１種類以上を挙げることができる。
さらに、本発明は、リポソームに内包される親水性薬効成分又は親油性薬効成分が、抗酸化剤、抗菌剤、抗炎症剤、血行促進剤、美白剤、肌荒れ防止剤、老化防止剤、発毛促進剤、保湿剤、ホルモン剤、ビタミン類、色素、およびタンパク質類からなる群れより選ばれる1種以上とすることができる。
【００１０】
また、本発明は、リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、卵黄レシチン、水添卵黄レシチン、大豆レシチン、水添大豆レシチン等のグリセロリン脂質類、スフィンゴエミリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロールからなる群より選ばれるスフィンゴリン脂質類の１種以上、プラスマローゲン及び／またはこれらの混合物であることができる。
さらに本発明は、糖脂質が、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステル等のグリセロ脂質類、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4等のスフィンゴ糖脂質類、およびまたはこれらの混合物であることができる。
また、本発明は、溶解助剤が、グリコール、グリコールエーテル、グリコールエステル、炭酸アルキルの1種以上であることができる。
さらに本発明は、親水性薬効成分が、アスコルビン酸、およびアスコルビン酸誘導体の任意の1種以上であることができる。
また、さらに本発明は、これらの各製造方法により得られるリポソームを用いたリポソーム製剤、これらを含有する化粧品、内服医薬品、外用医薬品でもある。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のリポソーム懸濁液の製造方法は、有機溶媒を使用しないで、一段階で、高濃度のリポソーム懸濁液、修飾リポソーム懸濁液を効率よく大量にを得ることができる。また、この方法を用いて安定なキトサン修飾リポソームリポソーム懸濁液を得ることができる。
本発明の製造方法により得られたリポソームは、そのままで、また既存の製剤に混合することで、医薬品、化粧料や皮膚外用剤として使用することができる。
既存の製剤に混合する場合は、製剤の最終段階で混合しても良く、製剤の途中、例えば、水相を添加する際に、混合しても良い。混合条件は、通常の化粧料や皮膚外用剤を製造する条件がそのまま適用できる。
さらに、薬効成分を内包した本発明の製造方法により得られたリポソームは、既存の製剤に混合してもリポソームが安定に保たれ、内包成分の安定性が損なわれることがない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明においては、脂質膜の成分として、天然あるいは人工のリン脂質、およびまたは糖脂質の任意の1種以上が好適に使用できる。発明において用いることが出来るリン脂質としては、大豆、卵黄等から得られるレシチン、リゾレシチンおよびまたはこれらの水素添加物、水酸化物等の誘導体が挙げられる。更には、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン等が挙げられる。その際に、構成リン脂質は、特に限定されず、また、構成脂肪酸は、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸のどちらでもよく特に限定されない。
発明において用いることが出来る糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステル等のグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4等のスフィンゴ糖脂質等が好適に使用できる。
【００１３】
本発明のリポソームを調製するには、1種以上の膜脂質と、内包したい物質が溶けている水溶液を、圧力容器に入れ、圧力容器中に炭酸ガスとを導入すると、水溶液中に脂質を界面活性剤とした。ＣＯ２／Ｈ２Ｏのエマルションが得られる。次いで、圧力容器中から炭酸ガスＣＯ２を抜くと、リポソーム懸濁液が得られる。その際に、水溶液中にグリコール、グリコールエーテル、グリコールエステル、炭酸アルキルの1種以上を併用すると、リポソームの形成がさらに促される場合があることが判明した。
好ましいグリコール、グリコールエーテル、グリコールエステルとしては、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、1.3-ブタンジオール、エチルカービトール、ブチルカービトール、ジエチレングリコールジエチルエーテル、これらグリコール類のアルキルエステル等が挙げられる。
好ましい炭酸アルキルとしては、プロピレンカーボネート、ジエチルカーボネート等の炭酸アルキルが挙げられる。
本発明のリポソームには、親水性薬効成分、およびまたは親油性薬効成分を内包させることで、化粧料、皮膚外用剤に好適に使用できる。好適な薬効成分としては、抗酸化剤、抗菌剤、抗炎症剤、血行促進剤、美白剤、肌荒れ防止剤、老化防止剤、発毛促進剤、保湿剤、ホルモン剤、ビタミン類、色素、およびタンパク質類が挙げられる。
【００１４】
本発明において用いることが出来るリポソームを修飾する低分子ないし高分子の修飾物質「中性水では水溶せず、酸性水に溶解する物質」としては、キトサン、コラーゲン、生体ポリアミン、ポリ-L-リシン、プルラン、コレステロール等があげられる。好適にはキトサンを挙げることができる。
発明において用いることが出来る好適な抗酸化剤としては、トコフェロール類、天然ビタミンE類およびそれらの脂肪酸エステル類、BHT、BHA、ヒドロキシアニソール、t-ブチルハイドロキノン、ノルジヒドログアヤレチン、没食子酸アルキルエステル類、チオジプロピオン酸ジラウリル、トリルビグアナイド、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、エリソルビン酸およびその塩類、L-アスコルビン酸およびその塩類、脂肪酸アスコルビル類、茶エキス、リンゴエキス等のカテキン類、カテキン誘導体類、およびポリフェノール類等が挙げられる。また、チオタイン、グルタチオン、チオタウリン、ヒポタウリン等の還元性基を有するアミノ酸も好ましい。
また、発明において用いることが出来る好適な抗菌剤としては、安息香酸、ウンデシレン酸、サリチル酸、ソルビン酸、デヒドロ酢酸、パラオキシ安息香酸アルキルエステル等の有機酸およびその塩類や誘導体類、イソプロピルメチルフェノール、クロルヘキシジン、グルコン酸クロルヘキシジン、フェノール、クレゾール、チモール、トリクロサン等のフェノール類、ヒノキチオール、ヒバオイル、茶エキス、リンゴエキス、グレープフルーツ種子エキス等の植物抽出油類、植物抽出物類、カテキン類、カテキン誘導体類、およびポリフェノール類等が挙げられる。また、クロラミンＴ、ジンクピリチオン等も好ましい。
【００１５】
また、発明において用いることが出来る好適な抗炎症剤としては、ε―アミノカプロン酸、トラネキサム酸、トラネキサム酸アルキルエステル、グルチルリチン酸、グリチルリチン酸アルキルエステル、グリチルレチン酸、グリチルレチン酸アルキルエステル、塩化リゾチーム、グアイアズレン、ヒドロコルチゾン、シソエキス、イチョウエキス、海藻エキス等の植物抽出物等が挙げられる。
またさらに、発明において用いることが出来る好適な血行促進剤としては、イチョウエキス、センブリエキス、セリコサイド、マロニエエキス等の植物抽出物、トコフェロール類、およびビタミンＥとその誘導体、γ−オリザノール等が挙げられる。
またさらに、発明において用いることが出来る好適な美白剤としては、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸リン酸エステルナトリウム、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム、アスコルビン酸硫酸エステルナトリウム、アスコルビン酸グリセリル（ポリグリセリル）エーテル類、アスコルビン酸グリセリル（ポリグリセリル）エステル類、アスコルビン酸グルコシド（グリコシド）類、アスコルビン酸アルキルエステル類、アスコルビン酸アルキルエーテル類等のビタミンC類およびその誘導体、コウジ酸、アルブチン、プラセンタエキス、イオウ等が挙げられる。また、油溶性甘草エキス、クワエキス、シャクヤクエキス、トウキエキス、ワレモコウエキス、マロニエ樹皮エキス、カミツレエキス等の植物抽出物、更には、リノール酸、リノレン酸、乳酸、トラネキサム酸等も好ましい。
【００１６】
またさらに、発明において用いることが出来る好適な肌荒れ防止剤、保湿剤としては、グリセリン、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール等の多価アルコール、トレハロース、マルトース等の糖類、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、キチン・キトサン等の生体高分子、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、ヒドロキシプロリン等のアミノ酸類、乳酸ナトリウム、尿素、スフィンゴ脂質、セラミド類、コレステロールおよびその脂肪酸エステルやポリオキシエチレン付加物等の誘導体
が挙げられる。また、スクワラン、スクワレン等の炭化水素油、ククイナッツ油、ボラジ油、ローズヒップ油等のグリセライド類も好適に使用できる。
さらに、発明において用いることが出来る好適な老化防止剤としては、前述した抗酸化剤、保湿剤、血行促進剤、肌荒れ防止剤が挙げられる。また、α−ヒドロキシ酸、ビタミンA酸およびその誘導体、ビタミンAアルコールおよびその誘導体が好適に使用できる。
またさらに、発明において用いることが出来る好適な発毛促進剤としては、トウガラシチンキ、トウキンセンカエキス、オウゴウエキス、センブリエキス等の植物抽出物、ステロール類およびステロール配糖体類、リノール酸、リノレン酸、ペンタデカン酸等の脂肪酸類およびそのグリセライド等の誘導体、エチニルエストラジオール等のホルモン、また、ミノキシジル等が挙げられる。
またさらに、発明において用いることが出来る好適なホルモン剤としては、コルチコステロン、アンドステロン、ハイドロコルチゾン、β-エストランジオール等のステロイドホルモン、プロスタグランジン等が挙げられる。
また、発明において用いることが出来る好適なビタミン類としては、ビタミンＡ群、ビタミンＢ群、ビタミンＣ群、ビタミンＥ群、ビタミンＫ群より任意に選択された1種以上が使用でき、これらの親油性および親水性誘導体も好適である。
また、ユビキノン類のような補酵素、カルニチン、フェルラ酸、γ-オリザノール、α-リポ酸、オロット酸等のビタミン用作用因子も好適に使用できる。
【００１７】
また、発明において用いることが出来る好適な色素としては、法定色素（タール色素）、および、フラボノイド、カロチノイド、キノン、ポリフィリン、ジケトン、ビオフラボノイド、フラビン、ベタシアニジン等の骨格を有する天然色素から任意に選択した1種以上が好適に使用できる。
また、発明において用いることが出来る好適なタンパク質類としては、アミノ酸類、および、加水分解エラスチン、水溶性エラスチン、加水分解コラーゲン、小麦ペプチド、大豆ペプチド、カチオン化ペプチド、アシルペプチド等のタンパク質変性物、また、カゼイン、グルタチオン等が挙げられる。
本発明において好適な条件として、圧力容器中に、温度として0〜100℃、好ましくは、31℃〜100℃、より好ましくは、35℃〜80℃の範囲にある水、あるいは場合により、親水性薬効成分の水溶液、およびまたは親油性役構成分を溶解、分散、混合した水溶液、およびまたは補助物質を溶解、分散、混合した水溶液をいれ、圧力として50〜500気圧、好ましくは、75〜500気圧、より好ましくは、100〜400Kg/cm2になるまで二酸化炭素を圧入し、時間として0.5〜5時間攪拌する。これにより、二酸化炭素が水中に分散したCO2／H2Oエマルションができる。所定時間後、二酸化炭素を圧力容器から減圧してゆくと、圧力容器内に残った水相、およびまたは二酸化炭素に同伴して圧力容器外に流出した水相中に、リポソームが懸濁液した溶液が得られる。
【００１８】
上記の好適な条件のもとに本発明において用いることが出来るリポソームを修飾する低分子ないし高分子の修飾物質「中性水では水溶せず、酸性水に溶解する物質」として、好適にはキトサンを入れる。圧力として30〜500気圧、好ましくは、75〜500気圧、より好ましくは、100〜400Kg/cm2になるまで二酸化炭素を圧入し、時間として0.5〜5時間攪拌する。これにより、キトサンは水相に溶解し、二酸化炭素が水中に分散したCO2／H2Oエマルションができる。所定時間後、二酸化炭素を圧力容器から減圧してゆくと、圧力容器内に残った水相、およびまたは二酸化炭素に同伴して圧力容器外に流出した水相中に、カチオンリポソームが懸濁液した溶液が得られる。
参考として本発明のリポソーム懸濁液の製造方法の一例を、膜脂質としてジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）を、水溶性の内包物質としてグルコースを用いて、従来のリポソーム懸濁液の製造方法と比較したものを、図７に示す。
Bangham法（薄膜法）に比べ、本発明の水溶性物質内包率は９倍弱である。
さらに、圧力容器に封入すべき脂質と内包物を溶解した水溶液と炭酸ガスの他にエチルアルコールを添加させることによる効果を確認したところ、図８に示すように、従来の超臨界逆相蒸発法ほど効果がなく、逆に本発明のリポソーム懸濁液の製造方法では、エチルアルコールの添加が、保持効率（リポソームに内包すべき物質がリポソームに内包される）をかえって減少させる。
また、本発明において、炭酸ガスの影響を調べたところ、図９のようになった。ちなみに、窒素ガスは、ほとんど影響が無いことが解る。
【００１９】
本発明の製造方法により得られたリポソームを適用できる医薬品、化粧料や皮膚外用剤は、遺伝子治療薬、抗ガン剤、抗炎症剤、乳液、ローション、クリーム、サンスクリーン等の基礎化粧料、洗顔料、ボディーソープ等の洗浄料、シャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、育毛料、整髪料、ヘアトニック、パーマネント・ウェーブ剤、ヘアカラー・ヘアブリーチ等の頭髪用化粧料、リキッドファンデーション、口紅等のメークアップ化粧料、軟膏等の皮膚外用剤等が挙げられる。
【００２０】
また、本発明において、脂質濃度の影響を調べたところ、図１０のようになった。図１０において、Bangham法では炭酸ガスに対してエタノール７ｗ％を添加したものである。
さらに、本発明において、「中性水では水溶せず、酸性水に溶解する物質」として、キトサンを用いた場合の水溶液について、水溶液のｐＨが及ぼす影響について調べた結果を図１１に示す。
炭酸ガス／水へのキトサンの溶解度測定方法は、水１００ｇに対してキトサン（１〜５ｍｇ、１０〜５０ｐｐｍ）を入れ、炭酸ガスで加圧し、４０分で解けるかどうかを調べた。また、参考として希塩酸１００ｇにキトサン（１〜６ｍｇ）を加えて、粉末がなくなるまでの時間を測定した。
【実施例１】
【００２１】
本発明について実施例を用いてさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例−１  リポソームの製造）
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC） 0.2ｇ、グルコース水溶液２０ｇ（グルコース濃度0.15ｍＭ）を入れた圧力容器に、炭酸ガスを導入して２００気圧になるように封入し、６０℃で４０分撹拌した。炭酸ガスを抜いて常圧まで減圧し、リポソーム懸濁液を得た。
グルコース溶液に対する脂質濃度は、13.6mM/Lであった。
保持効率（内包率）17.0％  原料からの製造時間は約２時間であった。参考までに、同じ脂質濃度を用いてBangham法（薄膜法）でリポソームを製造した場合、保持効率（内包率）は2.0％程度、所要時間24時間程度である。
【実施例２】
【００２２】
（実施例−２  リポソームの製造）
ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）を膜脂質とし、それぞれ5〜20mMをグルコース溶液20g（グルコース濃度０．１５ｍＭ）に加え、これを圧力容器に入れて、炭酸ガスを導入して２００気圧になるように封入し、６０℃で４０分撹拌した。炭酸ガスを抜いて常圧まで減圧し、リポソーム懸濁液を得た。
図１２に示すように、用いる膜脂質で差が見られるものの、保持効率は脂質濃度に比例して増加し、DOPCの場合で30%に達した。
【実施例３】
【００２３】
（実施例−２  キトサン修飾リポソームの製造）
ＤＰＰＣ  0.2ｇ、グルコース水溶液２０ｇ（グルコース濃度０．１５ｍＭ）、キトサン１〜５ｍｇを入れた圧力容器に、炭酸ガスを導入して２００気圧になるように封入し、６０℃で４０分撹拌した。炭酸ガスを抜いて常圧まで減圧し、リポソーム懸濁液を得た。
グルコース溶液に対する脂質濃度は、１３．６ｍＭ／Lであった。
保持効率（内包率）１７．０％  製造時間は約２時間であった。得られたカチオンリポソームの表面電位（ζ電位）は、キトサン添加量が1mgのときに最も高く約25mVであった。図１３に、キトサンの量と保持効率の関係、およびキトサンの量と表面電荷の関係を、Bangham法、超臨界逆相蒸発法、および本申請で提案する方法で調整したリポソームについて示した。
キトサン修飾リポソームは安定であり、室温（25℃）で１ヶ月保存しても、保持効率はほとんど変化しなかった。キトサン修飾リポソームの安定性を図１４に示す。
【実施例４】
【００２４】
（実施例−２  キトサン修飾リポソームの製造、攪拌時間の影響）
ＤＰＰＣ  0.2ｇ、グルコース水溶液２０ｇ（グルコース濃度０．１５ｍＭ）、キトサン１〜５ｍｇを入れた圧力容器に、炭酸ガスを導入して２００気圧になるように封入し、６０℃で４０分、および２時間、撹拌した。炭酸ガスを抜いて常圧まで減圧し、リポソーム懸濁液を得た。
グルコース溶液に対する脂質濃度は、１３．６ｍＭ／Lであった。攪拌時間によらず保持効率（内包率）は１７．０％  であり、また、キトサンの料にも依存しなかった。撹拌時間の影響を図１５に示す。
【００２５】
（比較例１）
従来法によるキトサン修飾リポソーム懸濁液の代表例としてBangham法によるものを示す。
（Bangham法によるキトサン修飾リポソームの製造）
ｐＨ３．０に調整したキトサン水溶液（濃度２０ｐｐｍ）中に、Bangham法により調整したリポソームを滴下して撹拌する。冷暗所で１２時間放置して、上澄みを除去し、同量のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＳＢ）を添加し、ミキサーで再分散させる。さらに、冷暗所で１２時間放置して、上澄みを除去し、同量のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＳＢ）を添加し、ミキサーで再分散させる。この工程をさらにくり返し、合計３回再分散させる。最後に得られた分散液を注射用蒸留水を用いて分散させた。その概略を図１７に示す。
【００２６】
（キトサン修飾リポソーム懸濁液の特性比較）
実施例２で得たキトサン修飾リポソーム懸濁液と比較例１で得たキトサン修飾リポソーム懸濁液を、ゼータポテンシャル電位及び保持効率についてテストし、その結果を図１３に示す。
本発明の製造方法により得られたキトサン修飾リポソーム懸濁液は、保持効率が高く、ゼータポテンシャル電位が高いのが特徴であることが解る。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明の製造方法により得られたリポソーム懸濁液、及びキトサン修飾リポソームリポソーム懸濁液は、製造が簡単でしかも、保持効率が高いため、多くの内包物質を包み込むことが出来、癌治療、遺伝子治療、機能性化粧品、バイオセンサーなどに広く利用することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】リポソームの概要
【図２】典型的なリポソーム調製法（Bangham法）
【図３】典型的なリポソーム調製法（逆相蒸発法）
【図４】フレデリクソンが提唱するリポソーム調製法
【図５】超臨界逆相蒸発法
【図６】本発明の概要
【図７】各種のリポソーム調製法の比較
【図８】エタノールの影響
【図９】炭酸ガスの影響
【図１０】脂質濃度の影響
【図１１】キトサンの水溶性とｐＨの関係
【図１２】リン脂質の相違による保持効率
【図１３】キトサン修飾リポソームの保持効率と表面電荷の比較
【図１４】キトサン修飾リポソームの安定性
【図１５】撹拌時間の影響
【図１６】キトサン及び脂質の化学構造
【図１７】Bangham法によるキトサン修飾リポソームの調整
【図１８】本発明の製造方法と従来の製造方法との比較
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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