(57)【要約】      （修正有）【課題】生体内におけるヒトレトロウイルスＨＩＶ−２の感染のある時期に限って存在する抗原の形成または解離を遮断することによってＨＩＶ−２の感染を抑制できるワクチンの製造のための、また該抗原を認識する抗体を使用したＨＩＶ−２型感染診断薬を製造するための該抗原を有する該抗原−抗体複合体の提供。【解決手段】ＨＩＶ−２型ヒトレトロウイルスのトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質の抗原及び該抗原に免疫類似性を有する抗原、特にヒトレトロウイルスＨＩＶ−２ｇｐ３６を二重体化させてなる、ｇｐ８０抗原、及び該抗原を認識する抗体、該抗原及び該抗体を含有する抗原−抗体複合体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗原−抗体型免疫複合体であって、該抗原が、
−分子量約８０ｋＤａを有する、
−ＨＩＶ−２型ヒトレトロウイルスの糖たんぱく質ｇｐ３００に対するポリクローナル抗体によって認識される、
−ヒトのＳＬＡまたはＡＩＤＳを発症させ得るＨＩＶ−２型ヒトレトロウイルスのゲノムによってコードされたトランスメンブレンエンベロープ糖タンパク質ｇｐ３６を二量体化させてなる、
ｇｐ８０糖タンパク質であることを特徴とする、前記免疫複合体。
【請求項２】
単離された抗原−抗体型免疫複合体であって、該抗原が、
−ＨＩＶまたはＳＩＶレトロウイルスのトランスメンブレンエンベロープ糖タンパク質の二量体からなり、
−請求項１に記載の抗原性糖タンパク質ｇｐ８０に対する抗体と抗原−抗体型免疫複合体を形成することができる、
−約６５ｋＤａから約８０ｋＤａの分子量を有する、
糖タンパク質であることを特徴とする、前記免疫複合体。
【請求項３】
該抗原が、ＶＴＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧＣＡＦＲＱＶＣＨの配列で表されるペプチドｐ３９’である、請求項２に記載の単離された抗原−抗体型免疫複合体。
【請求項４】
ＨＩＶ−２型レトロウイルスに感染した細胞中に存在するｇｐ３００、ｇｐ１４０、ｇｐ１２５およびｇｐ８０を特異的に認識し、且つＨＩＶ−２型レトロウイルスの抽出物中に存在するｇｐ１２５、ｇｐ８０およびｇｐ３６を特異的に認識するが、健常細胞またはＨＩＶ−１型レトロウイルスに感染した細胞中に存在するタンパク質または糖タンパク質を認識しないことを特徴とするモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離された免疫複合体。
【請求項５】
請求項１または２に記載の糖タンパク質と反応するモノクローナル抗体を含むことを特徴とする、単離された免疫複合体。
【請求項６】
ＶＴＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧＣＡＦＲＱＶＣＨの配列で表されるペプチドｐ３９’に含まれるエピトープに対するモノクローナル抗体を含むことを特徴とする、請求項５に記載の単離された免疫複合体。
【請求項７】
モノクローナル抗体１Ｈ８を含むことを特徴とする、請求項５に記載の単離された免疫複合体。
【請求項８】
複合体を形成する抗体が、ＨＩＶ−２型レトロウイルスに感染することによって産生された抗体を含む生物学的試料に由来するものであることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離された免疫複合体。
【請求項９】
複合体を形成する抗原が、ＨＩＶ−２型ヒトレトロウイルスに感染した細胞の溶解物から派生したことを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離された免疫複合体。
【請求項１０】
免疫後において、請求項１に記載の糖タンパク質ｇｐ８０に反応する抗体の産生を誘導し得る、ＶＴＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧＣＡＦＲＱＶＣＨの配列で表されるペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶ−２型ヒトレトロウイルスのトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質の抗原、及び、該抗原に免疫類似性（ｐａｒｅｎｔｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｑｕｅ）を有する抗原、特にヒトレトロウイルスＨＩＶ−２の感染のｉｎ  ｖｉｖｏ経過のいくつかの時期に限って存在する抗原に係る。これらの抗原は、該レトロウイルスのトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質の形成及び成熟プロセスに特徴的であり、従ってレトロウイルスＨＩＶ−２の発生及び増殖に関与し、感染の伝播に関与する。
【０００２】
本発明はまた、これらの抗原を認識する抗体、及び、該抗体を含有する免疫原性組成物に係る。
【０００３】
本発明は更に、上記抗原の製造、及び、ヒトレトロウイルスＨＩＶ−２の感染を診断するための該抗原の使用に係る。
【背景技術】
【０００４】
リンパ節障害症候群（ＳＬＡ）を発症させる主因もしくは一因となる病因物質または後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を発症させる主因となる病因物質は単離され、同定され、特性決定も行なわれた。
【０００５】
ある種の条件下でヒトＳＬＡを発症させ場合によってはＡＩＤＳを併発させ得るいくつかのヒトレトロウイルスはＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）と命名されている。
【０００６】
最初に単離されたウイルスはＬＡＶ−１またはＨＩＶ−１と命名され、英国特許出願８３／２４，８００及び欧州特許出願８４／４０１，８３４（１４／０９／８４）などに記載されている。このウイルスはまたＦ．Ｂａｒｒｅ  Ｓｉｎｏｕｓｓｉ他によって記載されている（１）。
【０００７】
ＬＡＶ  ＥＬＩ及びＬＡＶ  ＭＡＬと命名されたウイルスＨＩＶ−１の変種も単離されて特性決定された。これは欧州特許出願８４／４０１，８３４に記載されている。
【０００８】
上記ウイルスとの免疫類似性が小さい別のクラスに所属するレトロウイルスの単離及び特性決定は、欧州特許出願８７／４００，１５１．４（欧州特許第２３９，４２５号）に記載されている。ＨＩＶ−２という名称で分類された該レトロウイルスは、リンパ節障害またはＡＩＤＳの症状を示すアフリカ人患者から単離された。
【０００９】
このようなＨＩＶレトロウイルスの研究、その単離及びそれらのヌクレオチド配列の分析、それらの抗原性タンパク質の特性決定などに基づいて、得られた種々の菌株間の構造的及び機能的な類似性または逆に特異性の比較研究が可能である。
【００１０】
また、レトロウイルスＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２を、サル由来のレトロウイルス（ＳＩＶまたはＳＴＬＶ−III）と比較研究することもできる。この研究の結果、レトロウイルスＨＩＶ−２及びその変種とレトロウイルスＳＩＶとの間にタンパク質及び糖タンパク質のある程度の類似性があることが判明した。
【００１１】
各ウイルスのエンベロープタンパク質の処で類似性が特に顕著である。実際、レトロウイルスＳＩＶのエンベロープ糖タンパク質とレトロウイルスＨＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質に対する抗体との間では交差免疫反応が観察されるが、レトロウイルスＳＩＶとレトロウイルスＨＩＶ−１との間、及びレトロウイルスＨＩＶ−１とＨＩＶ−２との間ではこのような交差免疫反応が生じない。
【００１２】
前出の欧州特許出願８７／４００，１５１．４は、レトロウイルスのゲノムのｅｎｖ遺伝子によってコードされるレトロウイルスＨＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質に関して得られた結果を示している。該欧州特許出願は、分子量約１４０，０００ｄを有することに基づいてこの糖タンパク質をｇｐ１４０と命名した。分子量の計算には±１０％の誤差が見込まれていることは理解されよう。また、前出のフランス特許出願（出願第８６／０３８８１号、公告第２，５９６，０６３号）は、ｇｐ１６０（分子量１６０Ｋｄ±１０％）と命名したｇｐ１４０の前駆物質を記載している。
【００１３】
発明者等は、レトロウイルスＨＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質に関する研究を更に進展させ、上記の分子量の範囲に基づいて、これまで与えられていた分子量とは別の測定値を得ることに成功し、より精密な結果を得ることに成功した。本発明の処理条件下では、ＨＩＶ−２のウイルス粒子の外層エンベロープ糖タンパク質は分子量約１２５，０００ｄを有していた（この糖タンパク質をｇｐ１２５と命名した）。同じ処理条件を用いた最新の結果によれば、フランス特許出願８６／０３８８１で既に証明されｇｐ１６０と命名されていた前駆物質は分子量約１４０，０００ｄであった。従って本発明ではこれを「ｇｐ１４０」と命名する。
【００１４】
外層エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２５とトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質ｇｐ３６とを含む成熟形エンベロープ糖タンパク質が得られるまでに複数の増殖段階が存在することはこれまでに既に判明していた。即ち、ヒトレトロウイルスＨＩＶ−２に感染した後で病原体性疾患が進行する際にウイルス複製サイクルが出現しこのサイクルの経過中に複数の段階が存在することが確認されていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ＨＩＶ−２の外層エンベロープ糖タンパク質の前駆物質ｇｐ３００の存在及び特性決定に関する最初の結果が得られた。この糖タンパク質は参考文献（２９）に記載されている。説明の便宜上、以後の記載ではこの糖タンパク質をｇｐ３００と呼ぶ。発明者等は、ＨＩＶ−２のウイルスサイクルに関与する新しい糖タンパク質を発見しその特性を決定した。
【００１６】
発明者等は同時に、レトロウイルスＨＩＶ−１及びＳＩＶのウイルスサイクルに対しても同様の研究を行なった。これらの研究で、レトロウイルスＨＩＶ−２及びＳＩＶに共通で逆にＨＩＶ−１のウイルス複製サイクルには明らかに存在しない極めて特異的な新しい特性が判明した。
【００１７】
従って本発明は、ヒトレトロウイルスＨＩＶ−２または近縁ウイルスの感染を検出しヒトレトロウイルスＨＩＶ−２型のレトロウイルスの属性を決定するための新しい手段に係る。
【００１８】
得られた結果から判断すると、レトロウイルスＨＩＶ−２及びＳＩＶに特有のウイルスサイクルは、複合連鎖反応プロセスとして出現し、これらのプロセス全体によって最終形態のレトロウイルスＨＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質が形成される。このプロセスにおいて新しい抗原性タンパク質または糖タンパク質を認識し単離し同定した。
【００１９】
従って本発明は、ヒトレトロウイルスＨＩＶ−２に感染した後に産生され、トランスメンブラン糖タンパク質ＧＰ３６と共通のペプチド骨格を有しウイルスサイクルの進展中に２つのトランスメンブラン糖タンパク質ｇｐ３６に解離し得る抗原性糖タンパク質に係る。
【００２０】
二量体の形態のかかる糖タンパク質は、最適の形態及びコンホーメーションに対応し、細胞膜とウイルス膜とを融合させ得る。
【００２１】
従って本発明は、以下の特性を有すること、即ち、
−分子量約８０ｋＤａを有する、
−糖タンパク質ｇｐ３００に対するポリクローナル抗体によって認識される、
−ヒトのＳＬＡまたはＡＩＤＳを発症させ得るＨＩＶ−２型ヒトレトロウイルスのゲノムによってコードされたトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質ｇｐ３６の２つの完全体を二量体の形態に会合させて含む、または、
−ｇｐ８０に対する抗体と共に抗原−抗体型の免疫複合体を形成し得る同程度の分子量のすべての糖タンパク質を含む、ことを特徴とする抗原性糖タンパク質ｇｐ８０に係る。
【００２２】
前述の糖タンパク質ｇｐ３００は参考文献（１３）に記載された糖タンパク質であり、分子量約３００ｋＤａを有し、特にＳＬＡまたはＡＩＤＳを発症させ得るヒトレトロウイルスＨＩＶ−２のゲノムのｅｎｖ遺伝子によってコードされたエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２５の前駆物質ｇｐ１４０が２つ会合して形成されたものである。
【００２３】
発明者等はこのタンパク質を単離し特性決定した後で、ＨＩＶ−２の抗原に対して陽性の患者の血清が細胞抽出物またはウイルス抽出物中の糖タンパク質ｇｐ８０を認識することを知見した。ｇｐ８０は、感染性でありまた病原性にもなるウイルス粒子の形成段階の１つで必要なトランスメンブラン糖タンパク質の成熟産物である。従って発明者等は、ＨＩＶ−２型粒子が形成される正常ウイルスサイクルを、特にｇｐ８０の形成または解離の処で遮断することによって感染の伝播を妨害し得ると判断した。かかる感染遮断は、糖タンパク質ｇｐ８０の成熟を阻害し得るキャスタノスペルミン（ｃａｓｔａｎｏ−ｓｐｅｒｍｉｎｅ）の使用によって強化された。
【００２４】
本発明の糖タンパク質ｇｐ８０の特徴は、更に以下の特性を有すること、即ち、
−ＨＩＶ−２型ヒトレトロウイルスに感染した細胞及び／またはＨＩＶ−２型のビリオン及び／またはウイルスに会合し得る、
−１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような非イオン性界面活性剤の存在下ではｉｎ  ｖｉｔｒｏで解離せず、弱酸性ｐＨの１％のＳＤＳのようなイオン性界面活性剤の存在下ではＨＩＶ−２型レトロウイルスのトランスメンブラン糖タンパク質を形成すべくｉｎ  ｖｉｔｒｏで解離する、
−ＨＩＶ−２血清−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイムノアフィニティカラムで精製でき、（ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析すると）感染細胞の標識開始の３〜４時間後に出現する、
ことである。
【００２５】
また、上記に定義した糖タンパク質ｇｐ８０に由来し、該糖タンパク質ｇｐ８０の非グリコシル化ペプチド骨格に対応するタンパク質も本発明の範囲に包含される。
【００２６】
ｇｐ８０のグリコシル化基が除去された上記タンパク質はｇｐ８０と共通の特性をいくつか有しており、これらの特性によって本発明において重要であると考えられている。
【００２７】
サルレトロウイルスＳＩＶとレトロウイルスＨＩＶ−１とのウイルスサイクルを同時に研究することによって、ＳＩＶのサイクルが分子量約６５ｋＤａの糖タンパク質ｇｐ６５の形態の二量体化段階を含み、この二量体化の後で２つのトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質ｇｐ３２が形成されることが判明した。
【００２８】
逆にＨＩＶ−１感染した生物サンプル中では、トランスメンブランエンベロープ糖タンパク質のこのような二量体化プロセスが観察されなかった。
【００２９】
従って、二量体の形態のトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質が得られることは、ＨＩＶ−２型レトロウイルスによる感染または該レトロウイルスと免疫学的に近縁のレトロウイルスによる感染に特異的に関連すると考えられる。従って、この糖タンパク質は、ＨＩＶ−２レトロウイルスまたは近縁レトロウイルスによる特異感染の検出に特に適した手段を構成する。
【００３０】
本発明はまた、一方でＨＩＶ−２型レトロウイルスに感染した細胞中に存在するｇｐ３００、ｇｐ１４０、ｇｐ１２５及びｇｐ８０を特異的に認識し、他方でＨＩＶ−２型レトロウイルスの抽出物中に存在するｇｐ１２５、ｇｐ８０及びｇｐ３６を特異的に認識し、健常細胞またはＨＩＶ−１型レトロウイルス感染細胞中に存在するタンパク質または糖タンパク質を認識しないポリクローナルまたはモノクローナル抗体に係る。
【００３１】
また、糖タンパク質ｇｐ８０と特異的に反応しＨＩＶ−１型レトロウイルス感染細胞のタンパク質またはＨＩＶ−１のウイルス集塊とは反応しないことを特徴とするモノクローナル抗体も本発明の範囲に包含される。
【００３２】
本発明の別のモノクローナル抗体の特徴は、更にＨＩＶ−２の糖タンパク質ｇｐ３００ｇｐ、ｇｐ１４０及びｇｐ３６を認識することである。
【００３３】
上記の定義に適う特に有利な第３のモノクローナル抗体の特徴は、糖タンパク質ｇｐ８０とペプチドｐ３９′のアミノ酸配列
ＶＴＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧＣＡＦＲＱＶＣＨ
とに共通のエピトープを認識することである。
【００３４】
本発明の目的はまた、ｇｐ８０に由来しグリコシル基が除去されたタンパク質に対する抗体を提供することである。
【００３５】
上記モノクローナル抗体は、免疫原性及び中和性を有し、ｇｐ８０の形成プロセスに作用してレトロウイルスＨＩＶ−２の増殖を妨害し得る。
【００３６】
上記抗体を産生する種々の方法も本発明の範囲に包含される。例えば、動物、特にマウスのごとき齧歯類の腹水培養を利用してもよい。また、固定または被包または懸濁させた細胞培養物から抗体を産生させてもよい。特に、レトロウイルスＨＩＶ−２を予め接種した動物のリンパ球の融合によってハイブリドーマを得る方法の使用が適当であろう。感染動物のリンパ球を採取し選択されたミエローマ細胞と融合させてハイブリッドを形成し、次に前記の抗原性タンパク質または糖タンパク質に対する特異的抗体を産生し得る能力に基づいて選択する。
【００３７】
本発明のモノクローナル抗体の好ましい製造方法は以下の段階を含む。
−精製した糖タンパク質ｇｐ８０を必要に応じて複数回腹腔内注射することによってＢＡＬＢ−Ｃ型マウスを免疫する、
−免疫マウスの細胞特に脾臓細胞をミエローマ細胞例えばＮＳ１型細胞とＫｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１０）の方法で融合させる、−所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し回収する。
【００３８】
所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択するためのハイブリドーマのスクリーニングはＲＩＰＡテストまたはウェスターン法（ａｎａｌｙｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ）で行なう。
【００３９】
本発明の実施に特に適したモノクローナル抗体は、上記の方法のいずれかによって得られる。またｇｐ８０または上記の定義に対応する類似のタンパク質に対するモノクローナル抗体の特性を、モノクローナル抗体１Ｈ８（Ｍａｂ  １Ｈ８）に関して記載された結果との比較によって試験できる。
【００４０】
本発明の目的はまた、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供することである。
【００４１】
産生されるこれらのモノクローナル抗体は例えば、タンパク質及び／または糖タンパク質と共に免疫複合体を形成してこれらのタンパク質及び／または糖タンパク質を失活させるために使用される。あるいは、ＨＩＶ−２の最終エンベロープ糖タンパク質が形成されるまでのプロセスの正常な進行を阻止するモノクローナル抗体の能力が利用される。
【００４２】
これらの抗体はまた、例えば生物製剤中のウイルス抗原の検出に使用されてもよく、または例えばアフィニティカラムでのタンパク質及び／または糖タンパク質の精製に使用されてもよい。
【００４３】
発明者等は、ｇｐ８０の存在を知見しこれを単離し特性決定することによって、ＨＩＶ−２型ヒトレトロウイルス感染の診断手段の開発に成功した。
【００４４】
従って本発明は、ＨＩＶ−２型ヒトレトロウイルスの感染を、該レトロウイルス感染後に形成される抗体を含む疑いのある生物サンプルからｉｎ  ｖｉｔｒｏで特異的に診断し得る抗原性組成物を提供する。本発明組成物の特徴は、前記に定義した糖タンパク質ｇｐ８０を少なくとも含むことである。
【００４５】
生物サンプルは、生物体液、特に血液もしくは血清でもよくまたは生物組織抽出物でもよい。本発明組成物は、このような生物サンプル中の抗体を検出するために有効である。
【００４６】
従って本発明の目的はまた、ＨＩＶ−２型レトロウイルスによる特異感染のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法を提供することである。本発明方法の特徴は、以下の段階、即ち、
−ＨＩＶ−２型レトロウイルス感染後に産生する抗体を含むと予想される生物サンプルと前記に定義した糖タンパク質ｇｐ８０または前記の抗原性組成物とを抗原−抗体型の免疫複合体が形成され得る適当な条件下に接触させ、
−場合によっては形成される抗原−抗体複合体を検出する段階を含むことである。
【００４７】
本発明は更に、少なくとも糖タンパク質ｇｐ８０を、ワクチン成分として許容される医薬ベヒクルと共に含有する免疫原性組成物に係る。
【００４８】
これらの組成物はＨＩＶ−２型レトロウイルスに対するワクチンを製造するために使用され得る。
【００４９】
このように調製された免疫原性組成物は、体重１ｋｇあたり１０〜１００μｇの薬用量で投与されるように定量されたタンパク質及び／または糖タンパク質を含有する。
【００５０】
本発明はまた、ｇｐ８０の製造方法を提供する。この方法は以下の段階、即ち、
−ＨＩＶ−２ヒトレトロウイルスに感染した細胞を溶解し上清と感染細胞とを分離するか、または調製されたウイルス集塊を遠心によって溶解し、
−細胞抽出物及び／またはウイルス抽出物を、例えばヒトレトロウイルスＨＩＶ−２感染患者の血清即ちＨＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質と強力に反応する能力を有する血清から得られた精製抗体を好ましくは適当な担体に固定させて含む免疫吸着剤を収容したイムノアファニティカラムで、バッファの存在下に抗原−抗体免疫複合体が形成される十分な時間インキュベートし、
−カラムをバッファで洗浄して担体に保持されなかった分子を除去し、
−所望の抗原性タンパク質を回収する段階を含む。
【００５１】
第１の実施態様によれば、糖タンパク質を回収するために、タンパク質を電気泳動及び電気溶出によって処理する。
【００５２】
感染細胞は、ＨＩＶ−２感染細胞培養物から、特にＨＩＶ−２に感染したＴ４リンパ球の培養物からｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られた。このような細胞培養にはＣＥＭ細胞系を用いる。
【００５３】
別の実施態様によれば、糖タンパク質は以下の手順、即ち、
−イムノアフィニティカラムに固定されたタンパク質を溶出させ、
−分離担体に固定されたｇｐ８０認識モノクローナル抗体を含むカラムクロマトグラフィーで溶出産物を精製する手順によって回収する。
【００５４】
本発明方法の１つの実施態様によれば、感染細胞を界面活性剤溶液中で溶解させ、免疫吸着剤に含まれた抗体をアガロースビーズに固定し、バッファ（ｔａｍｐｏｎ  ｄ′ａｃｃｒｏｃｈａｇｅ）の存在下に処理する。
【００５５】
本発明はまた、ヒトレトロウイルスＨＩＶ−２に感染した疑いのある患者の血清またはその他の生物サンプル中で抗体を検出するためのキットを提供する。本発明のキットの特徴は、
−少なくとも１つの抗原性糖タンパク質ｇｐ８０またはタンパク質組成物、または、上記の種々の成分の混合物と、
−被検生物サンプル中に場合によっては存在する抗体と抗原との間の免疫複合体の形成反応を生じさせる手段、特に必要に応じて１種または複数のインキュベーションバッファと、
−陰性対照サンプルと、
−形成された抗原−抗体複合体の顕示（ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ）手段とを含む。
【００５６】
本発明はまた、好ましくは、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識または発色団によって標識された糖タンパク質ｇｐ８０及びｇｐ６５に係る。
【００５７】
本発明はまた、ＨＩＶ−２ウイルス感染細胞の検出方法を提供する。この方法は、ＨＩＶ−２感染の疑いがある細胞を含む生物サンプルを細胞内タンパク質が露出するように処理し、露出したタンパク質中のＨＩＶ−２の糖タンパクｇｐ８０の存在を検出する。露出した細胞内タンパクの試験には、例えば電気泳動を用いるか、または、ＨＩＶ−２のｇｐ８０と免疫的に反応性の抗体を用いて免疫検定する。かかる抗体の例は前述した。
【００５８】
１つの実施態様では、抗原ｇｐ８０の存在を診断するための生物サンプルとして細胞破片を除去したサンプルを用いる。
【００５９】
本発明はまた、ＨＩＶ−２抗原を含むと予想される細胞からＨＩＶ−２の特異感染を検出しＨＩＶ−１の感染と識別する手段を提供する。この方法では、試験すべき生物サンプルの処理細胞から得られた細胞内タンパク質を含む生物サンプルとｇｐ８０に対する抗体とを接触させる。次いで、ＨＩＶ−２感染の存在を検出するために抗原−抗体型反応の有無を試験する。
【００６０】
本発明の別の特徴及び利点を実施例及び図面に基づいて説明する。
【００６１】
図面の簡単な説明
図１：ＨＩＶ−１に陽性の１つの血清とＨＩＶ−２に陽性の３つの血清（Ａ，Ｂ，Ｃ）とを使用しウェスターン法で分析したＨＩＶ−２感染細胞中の８０ｋＤａの特異タンパク質の同定。非感染ＣＥＭ細胞（２列目）、ＨＩＶ−１感染ＣＥＭ細胞（１列目）及びＨＩＶ−２感染ＣＥＭ細胞（３列目）の（１０４細胞の産物に対応する）細胞抽出物をウェスターン法テストの前に７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。オートラジオグラムを示す。左側の矢印は、ＨＩＶ−１の細胞外糖タンパク質（ｇｐ１２０）及びｇａｇ前駆物質ｐ５５及びｐ４０の位置を示す。図の右側にＨＩＶ−２の特異タンパク質ｇｐ３００、ｇｐ１４０及びｇｐ８０の位置を示す。
【００６２】
図２：ＨＩＶ−２に関連した糖タンパク質の合成。ＨＩＶ−２感染細胞を［３Ｈ］グルコサミン（２００μＣｉ／ｍｌ；４×１０６細胞／ｍｌ）で２、３、４、６及び８時間標識した。種々の時点で抽出物（１０７細胞の産物）を感染細胞及び（１００，０００ｇで培地を遠心して調製した）ウイルス集塊から調製した。（２×１０６細胞に対応する）これらの抽出物のアリコートをＨＩＶ−２血清−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで精製し、標識タンパク質を、（１２．５％）のポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。フルオログラムを示す。左側に種々の分子量のタンパク質マーカー、即ち、ミオシン：２００，０００、ホスフォリラーゼＢ：９７，０００、ウシ血清アルブミン：６８，０００、オボアルブミン：４３，０００及び炭酸脱水酵素：３０，０００の位置を示す。
【００６３】
図３：ポリクローナル抗体によるｇｐ３００のウェスターン法分析。左側に非感染ＣＥＭ細胞（−）及びＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２感染ＣＥＭ細胞の抽出物を示す。右側にＨＩＶ−２感染ＣＥＭ細胞の抽出物、即ち細胞抽出物（Ｃ列）及びウイルス集塊（Ｖ列）を示す。マウスのポリクローナル抗体（抗ｇｐ３００）を用いて精製タンパク質ｇｐ３００をウェスターン法で分析する前に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（左側では７．５％のゲル、右側では１２．５％のゲル）でサンプルを分析した。オートラジオグラムを示す。各サンプルは１０６細胞の産物に対応する。
【００６４】
図４：モノクローナル抗体ｍＡｂ  １Ｈ８を用いたウェスターン法分析。抗体ｍＡｂ  １Ｈ８を用いてウェスターン法でテストする前に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２感染細胞の抽出物（Ｃ列）及びウイルス集塊の抽出物（Ｖ列）を１２．５％ポリクローナル電気泳動で分析した。オートラジオグラムを示す。モノクローナル抗体はＨＩＶ−２  ＲＯＤのトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質に対する抗体である。
【００６５】
図５：抗体ｍＡｂ  １Ｈ８とｇｐ８０との間の結合を遮断するペプチドｐ３９′。抗体１Ｈ８（セクションｍＡｂ）または抗ｇｐ３００ポリクローナル抗体（セクションＳ）を用いたウェスターン法によってＨＩＶ−２のウイルス集塊の抽出物を分析した。１μｇ／ｍｌのペプチドｐ３９′の非存在（−列）または存在（＋列）下に各抗体と共にインキュベートした。オートラジオグラフィーの結果を示す。
【００６６】
図６：ＨＩＶ−２感染細胞中のｇｐ８０の産生を示すパルスチェイス実験（ラベルによる標識、ラベルの追跡）。ＨＩＶ−２感染ＣＥＭ細胞を［３５Ｓ］メチオニン（２００μＣｉ／ｍｌ；４×１０６細胞／ｍｌ）で３０分間標識した（０列）。５ｍＭの低温メチオニンを含む培地で放射性標識を２〜４時間追跡した（２列及び４列）。４時間後に培地を１００，０００ｇで遠心し、集塊を抽出した。抗ｇｐ３００抗体または抗体ｍＡｂ  １Ｈ８を使用して全部のサンプルを免疫沈降させた。免疫複合体の調製物から標識タンパク質を電気泳動バッファに溶出させ７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。フルオログラムを示す。フルオログラムのＣ及びＶは夫々、細胞抽出物及びウイルス抽出物に対応する。各サンプルは１０６細胞の産物を示す。
【００６７】
図７：（ａ）ｇｐ８０による標識グルコサミン及びフコースの取込み。［３Ｈ］グルコサミン（２００μＣｉ／ｍｌ）または［３Ｈ］フコース（２００μＣｉ／ｍｌ）で標識したＨＩＶ−２感染ＣＥＭ細胞を、抗ｇｐ３００ポリクローナル抗体（Ｓ列）またはモノクローナル抗体ｍＡｂ  １Ｈ８（Ｍ列）を用いた免疫沈降によって試験した。全部のサンプルを１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。フルオログラムを示す。
（ｂ）ｇｐ１２５及びｇｐ８０の産生に対するキャスタノスペルミンの効果。キャスタノスペルミン（１ｍＭ）の非存在下（−列）または存在下（＋列）にＨＩＶ−２感染細胞を［３５Ｓ］メチオニン（２００μＣｉ／ｍｌ；４×１０６細胞／ｍｌ）で（１６時間）標識した。ＨＩＶ−２血清−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたイムノアフィニティカラムでウイルス粒子を含む培地の抽出物を精製し、精製したタンパク質を１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって試験した。対応するフルオログラムを示す。
【００６８】
図８：ｇｐ８０の解離。セクションＣ：［３５Ｓ］メチオニンで標識したＨＩＶ−２感染ＣＥＭ細胞抽出物をモノクローナル抗体ｍＡｂ  １Ｈ８を用いた免疫沈降によって試験した（列１）。この調製細胞抽出物の別のアリコートをまず１％ＳＤＳの存在下に（９５℃で５分間）加熱した。次いで、免疫沈降試験の前にＲＩＰＡバッファで１０倍に希釈した（列２）。免疫複合体の調製物を電気泳動によって分析した。各サンプルは、１０６細胞の抽出物に対応する。セクションＶ：［３５Ｓ］メチオニンで標識した細胞から得られたＨＩＶウイルスの集塊（各々が１０７細胞の産物に対応する）を種々のバッファ、即ち、（１）Ｔｒｉｔｏｎ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び１００単位／ｍｌのアプロチニン）を含む溶解バッファ；（２）（バッファ（１）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の代わりに１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳを含み次いでバッファ（１）同様に加熱した）ＳＤＳを含む溶解バッファ；（３）ＳＤＳを含み次いで９５℃で５分間加熱した溶解バッファ；（４）バッファ（１）に０１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳと０．２％（ｖ／ｖ）のデオキシコレートとを加えて改質した）ＲＩＰＡバッファに懸濁させた。次いで抗体ｍＡｂ  １Ｈ８を用いてこれらのサンプル全部を免疫沈降させ、１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって標識タンパク質を分析した。フルオログラムを示す。
【００６９】
図９：精製ｇｐ８０のｇｐ３６への解離。ＨＩＶ−２感染ＣＥＭ細胞を［３５Ｓ］メチオニンで（１７時間）標識し、Ｔｒｉｔｏｎを含む溶解バッファにウイルス集塊を懸濁させた。これらのウイルス抽出物（２×１０７細胞に対応する産物）を抗体ｍＡＢ  １Ｈ８を用いて免疫沈降させ、分離用ゲル電気泳動によってｇｐ８０を精製した。精製したｇｐ８０調製物の等量ずつのアリコートを凍結乾燥し、１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳと１００単位／ｍｌのアプロチニンと５ｍＭのＥＧＴＡ（カルシウム依存性タンパク質分解を阻止する成分）とを含むｐＨ６．８、５．８及び４．８の１００ｍＭの酢酸塩に再懸濁させた。濃縮した電気泳動バッファで２倍に希釈する前に全部のサンプルを３０℃で６０分間インキユベートした。（１２．５％）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってサンプルを分析した。フルオログラムを示す。
【００７０】
図１０：二量体の形態で存在するＳＩＶのトランスメンブラン糖タンパク質。セクションＣｅｌｌ（細胞）：ＳＩＶ−ｍａｃに感染したＨＵＴ−７８細胞及びＨＩＶ−２に感染したＣＥＭ細胞を［３Ｈ］グルコサミン（２００μＣｉ／ｍｌ：４×１０６細胞／ｍｌ）で１５時間標識した。（Ｔｒｉｔｏｎを含む溶解バッファ中で調製した）感染細胞の抽出物（列Ｃ）及びウイルス集塊の抽出物（列Ｖ）をｍＡｂ  １Ｈ８を用いた免疫沈降によって精製し、標識タンパク質を１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。フルオログラムを示す。
【実施例】
【００７１】
材料及び方法
材料
Ｌ−［３５Ｓ］メチオニン（比活性＞１０００μＣｉ／ｍｍｏｌ）、Ｌ−［６−３Ｈ］フコース（比活性：４５〜７０μＣｉ／ｍｍｏｌ）、Ｄ−［６−３Ｈ］グルコサミン（比活性：２０〜４０μＣｉ／ｍｍｏｌ）はＡｍｅｒｓｈａｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）の製品である。キャスタノスペルミン及びツニカマイシンはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、西独）の製品である。ポリ（Ａ）．ポリ（Ｕ）はパリのＩｎｓｔｉｔｕｔ  Ｃｕｒｉｅから入手し、Ｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ他の方法（１９８２，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈｖｏｌ．２−ｐ．２０９〜２１６）に従って調製した。
【００７２】
ウイルス及び細胞
これらの実施例では、１型のヒト免疫不全ウイルスの単離物ＨＩＶ−１  ＢＲＵ（１２）及び２型のヒト免疫不全ウイルスの単離物ＨＩＶ−２  ＲＯＤ（４，５）、及び、サルの免疫不全ウイルスＳＩＶ  ｍａｃ１４２（６）を使用した。
【００７３】
１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０懸濁培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、フランス）で種々の細胞系及びヒトリンパ球を培養し、ＨＩＶ感染細胞を培養するために２μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を添加した。クローンＣＥＭ細胞１３はヒトリンパ球ＣＥＭ細胞系（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ１１９）に由来し、Ｔ４抗原を高レベルで発現する。ＨＩＶ−１  ＢＲＵまたはＨＩＶ−２  ＲＯＤの単離物で感染させた５日後に約８０〜９０％の細胞がウイルス粒子を産生する。これは細胞の液胞形成に対応する細胞障害作用及びシンシチウムによって確認された。ＨＵＴ−７８細胞系は、ＳＩＶ  ｍａｃ１４２の複製（Ｄａｎｉｅｌ他，１９８５）を十分に許容するＴ４レセプター（Ｇａｚｄａｌ他，１９８０）に対して陽性の別のヒトリンパ球細胞系である。健康な供血者の末梢血液のリンパ球を、１０％のウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で０．２％（ｗ／ｖ）のフィトヘマグルチニン分画Ｐ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，米国）と共に３日間刺激した。１０％（ｖ／ｖ）のＴ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ，Ｂｉｏｔｅｓｔ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で細胞を培養した。ＨＩＶ−２に感染させたリンパ球を、１０％（ｖ／ｖ）のＴＣＧＦ及び２μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下に培養した。
【００７４】
細胞の代謝標識
タンパク質の代謝標識のためには、Ｌ−メチオニン及び血清を除去し２００μＣｉ／ｍｌの［３５Ｓ］メチオニンを補充したＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；最小必須培地）中で、感染細胞を３７℃で１６時間インキュベートした。糖タンパク質の代謝標識のためには、血清及びグルコースを除去し２００μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−フコースまたは２００μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−グルコサミンを補充したＭＥＭ培地で感染細胞を３７℃で１６時間インキュベートした。
【００７５】
細胞及びウイルスの抽出物
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６と１５０ｍＭのＮａＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡと０．２ｍＭのＰＭＳＦと１００単位／ｍｌのアプロチニン（Ｉｎｉｐｒｏｌ，Ｃｈｏａｙ）とを含む１００μｌのバッファに１０７細胞に対応する細胞集塊を再懸濁させ、次いで２％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１００μｌの同じバッファを添加した。
【００７６】
細胞抽出物を１２，０００ｇで１０分間遠心し、使用するまで上清を−８０℃で保管した。ウイルス抽出物を調製するためには、上記同様に処理した感染ＣＥＭ細胞の透明上清１ｍｌあたり１００μｌの割合で１０倍の溶解バッファ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、１．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１００単位／ｍｌのアプロチニン）を添加した。ウイルス集塊から抽出物を調製するためには、感染細胞の培地をまず１２，０００ｇで１０分間遠心し、次いで１００，０００ｇで１５分間高速遠心した（ＢｅｃｋｍａｎのＴＬ１００遠心機）。次にウイルス集塊（１０７細胞から得られた産物）を２００μｌの溶解バッファ中で可溶化した。
【００７７】
ＨＩＶ−２に血清陽性の患者から得られた抗体を用いた免疫吸着剤の調製
ＨＩＶ−２に血清陽性の患者の血清の免疫グロブリンを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）に溶解した５０％の（ＮＨ４）２ＳＯ４で沈降させ、次いで、ＤＥＡＥセルロースカラム（ＤＥ５２、Ｗｈａｔｍａｎ）で２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）で溶出させることによって精製した。このようにして精製された免疫グロブリンは純度９０％であると考えてよい。次いでＢｅｒｇによって記載された方法（２）に従ってＣＮＢｒで活性化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ  ４Ｂカラムに抗体を結合させた。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ  ４Ｂ  １ｍｌあたり２ｍｇのＩｇＧが結合した。以後の記載ではこの免疫吸着剤を「ＨＩＶ−２血清−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ」と呼ぶ。
【００７８】
イムノアフィニティカラムにおけるＨＩＶ−２のタンパク質の調製
まず、ＨＩＶ−２を産生するＣＥＭ細胞の細胞抽出物を２倍容の結合バッファ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、５０ｍＭのＫＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、７ｍＭのβメルカプトエタノール、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、１００単位／ｍｌのアプロチニン）に希釈し、等容のＨＩＶ−２血清−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとインキュベートした。細胞外ウイルスを１０倍に濃縮した１／１０容の結合バッファでＨＩＶ−２産生細胞の上清と同様に処理した。結合処理を１晩継続し、カラムを結合バッファで十分に洗浄した。電気泳動バッファ（１２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８、１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、２Ｍの尿素、２０％のグリセロール、０．５％のβメルカプトエタノール）中で沸騰処理することによってカラムに結合したタンパク質を溶出させた。溶出したタンパク質を、６Ｍの尿素と０．２％（ｗ／ｖ）でなく０．１％（ｗ／ｖ）のビスアクリルアミドとを含む７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって回収した。
【００７９】
分離用電気泳動
アフィニティカラムから溶出したＨＩＶ−２の糖タンパク質（ｇｐ３００及びｇｐ８０）を前記同様にポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて回収し、ウイルス糖タンパク質を含むゲルの領域を所定分子量のタンパク質マーカー（ＢＲＬ）の位置に基づいて切断した。
【００８０】
糖タンパク質ｇｐ３００を、溶出バッファ（０．１ＭのＮａＨＣＯ３、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、０．２ｍＭのＰＭＳＦ）中に４℃で１６時間インキュベーションすることによって溶出させた。このようにして得られた糖タンパク質の分画を凍結乾燥し、使用するまで冷蔵庫に保存した。ｇｐ８０は４ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、２ｍＭの酢酸ナトリウム及び２ｍＭのＥＤＴＡを含むバッファ中で電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）した。
【００８１】
ｇｐ３００に対するマウスのポリクローナル抗体の調製
ＨＩＶ−２血清−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたイムノアフィニティクロマトグラフィー及び分離用電気泳動（１３）を順次行なうことによって感染ＣＥＭ細胞（３×１０８細胞）の抽出物からＨＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質ｇｐ３００を精製した。ｇｐ３００の精製調製物を０．５Ｍの尿素と１ｍｇ／ｍｌのマウス血清タンパク質とを含む１０ｍｌの１５０ｍＭのＮａＣｌに溶解し、１５０ｍＭのＮａＣｌと０．５Ｍの尿素とを含む溶液と接触させて２４時間透析した。次いで透析産物を遠心し、２ｍｌのアリコートを−８０℃で保存した。（８週齢）の５匹のマウスに３５０μｌのｇｐ３００調製物（約１μｇのｇｐ３００含有）を腹腔内注射によって１２日おきに５回投与した。各免疫中にポリ（Ａ）．ポリ（Ｕ）アジュバント（２００μｇ；１５０ｍＭのＮａＣｌ中に１ｍｇ／ｍｌ）を静注によって投与した（１７）。最終注射の５日後にマウスに１０６サルコーマ１８０／ＴＧ細胞の懸濁液を腹腔内に注射して超免疫腹水を調製した（８）。注射の８日後にマウスを殺し、腹水を収集した。腹水の細胞を遠心（２００ｇ、５分間）によって除去し、腹腔液を収集した。
【００８２】
モノクローナル抗体ｍＡｂ  １Ｈ８の調製
ＨＩＶ−２ビリオンをＣＥＭ細胞中で培養し、ショ糖濃度勾配でバンドを形成させることよって濃縮培養上清から精製した。精製ウイルスを、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ８．０、０．１％のアプロチニン（Ｓｉｇｍａ）で可溶化し、超遠心によって清澄化した。次いでウイルス抽出物をＬｅｎ−ｔｉｌ−Ｌｅｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）アフィニティカラムに通し、カラムを洗浄し、付着した糖タンパク質を０．５Ｍのメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Ｓｉｇｍａ）によって溶出させ、リン酸緩衝生理的塩類溶液（ＰＢＳ）と接触させて１晩透析した。
【００８３】
Ｌｅｎｔｉｌ−Ｌｅｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（５０〜１００μｌ）に再付着した２〜５μｇの精製糖タンパク質を含む０．３ｍｌの腹腔内注射によってＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。４〜６週毎に同じ免疫原をマウスに２４時間ブースター投与した。これらのマウスを追跡し、その抗体産生を、［３５Ｓ］メチオニンで標識したＨＩＶ−２ビリオンの抽出物のＲＩＰＡテストによって定性的に検出し、可溶化ビリオンのＥＩＡテストによって定量的に検出した（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ）。
【００８４】
最終注射の３日後にＫｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎの方法（１０）で脾臓細胞をミエローマＮＳ１細胞と融合させた。Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍの可溶化ビリオンのＥＩＡテストを使用して抗ＨＩＶ−２抗体を分泌するハイブリドーマの存在を検出するために、９６ウェルの融合プレートをスクリーニングした。クローンハイブリドーマを増殖及び安定させる方法と腹水の産生方法は既に記載されている（７）。次いで、ハイブリドーマの培養上清をＲＩＰＡ分析及びウェスターン法によってスクリーニングした。糖タンパク質と反応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）１Ｈ８の特性は、合成ペプチドに基づくＥＩＡテスト（１６）において、対応するＨＩＶ−２のトランスメンブラン糖タンパク質のアミノ酸配列５７９〜６０４によって決定される。アミノ酸配列５７９〜６０４は、配列決定済みのすべてのＨＩＶ−２及びＳＩＶの単離物中に十分に維持されており、モノクローナル抗体１Ｈ８は、試験されたこのようなＨＩＶ−２及びＳＩＶ単離物のすべてと交差反応を生じた。使用した合成ペプチドｐ３９′は、ＨＩＶ−２  ＲＯＤのエンベロープのヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列５７９〜６０４に従って合成されたものである。合成ペプチドｐ３９′のアミノ酸配列は以下の通りである。
ＶＴＡＩＥＫＹＬＱＤＱＡＲＬＮＳＷＧＣＡＦＲＱＶＣＨ
【００８５】
放射性免疫沈降検定（ＲＩＰＡ）
（２０μｌの）細胞またはウイルスの抽出物（１０６の感染細胞に対応する産物）をまず倍容のＲＩＰＡバッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｖ／ｖ）、０．２％（ｗｔ／ｖ）のナトリウムデオキシコレート、０．１％（ｗｔ／ｖ）のＳＤＳ、７ｍＭの２β−メルカプトエタノール、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、１００μ／ｍｌのアプロチニン（Ｉｎｉｐｒｏｌ，Ｃｈｏａｙ）及び２０％（ｖ／ｖ）のグリセロール）に希釈した。次に希釈抽出物を、（２５μｌの）ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体と共に（４℃で４５分間）インキュベートした。次いでプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを添加し、サンプルを４℃で３時間インキュベートした。次にこれらのサンプルをＲＩＰＡバッファで洗浄した。免疫沈降によって回収したタンパク質を、電気泳動バッファ（１２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８、１％（ｗｔ／ｖ）のＳＤＳ、２０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．５％のβ−メルカプトエタノール）中で（９５℃で５分間）加熱して溶出させた。溶出したタンパク質を０．２％（ｗｔ／ｖ）でなく０．１％（ｗｔ／ｖ）のビス−アクリルアミドを含む７．５％または１２．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で回収した。
【００８６】
電気泳動後のイムノブロット分析：ウェスターン法
タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、次いで（３）に記載のごとき電極バッファ（２０ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１５０ｍＭのグリシン、２０％（ｖ／ｖ）のメタノール）中で０．４５μｍのニトロセルロースシート（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，西独）に電気泳動転移させた。電気泳動斑を、ＰＢＳに乳濁させた５％（ｗ／ｖ）の粉末ミルクで飽和した。次いで１０％のＦＣＳを含むＰＢＳ中のＨＩＶ−１陽性血清もしくはＨＩＶ−２陽性血清（希釈度１：１００）またはマウスのポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体（希釈度１：２００）と共に密封バッグ中で（４℃で１晩）インキュベートした。次いで、シートをＰＢＳ、５％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を含むＰＢＳで洗浄し、（５％の）乳濁ミルクを含むＰＢＳで再度飽和させた。洗浄したシートを、ＨＩＶ−１血清またはＨＩＶ−２血清中のヒトポリクローナル抗体を顕示させるＩ１２５で標識したプロテインＡ製剤（Ａｍｅｒｓｈａｍ，＞３０ｍＣｉ／ｍｇ）、または、Ｉ１２５で標識した抗マウスヤギ免疫グロブリン製剤（Ａｍｅｒｃｈａｍ；２〜１０μＣｉ／μｇ）と共に密封バッグにいれて（室温で２時間）インキュベートした。シートをバッグから取り出して再度洗浄し、乾燥して２４〜４８時間オートラジオグラフ（Ｋｏｄａｋ  ＲＰ  Ｒｏｙａｌ，Ｘ−Ｒａｙ  Ｆｉｌｍｓ）にかけた。
【００８７】
結果
ＨＩＶ−２感染細胞及びビリオンにおける８０ｋＤａの糖タンパク質の検出
ＨＩＶ−２の糖タンパク質の前駆物質は１４０ｋＤａのタンパク質（ｇｐ１４０）であり、これは、成熟産物、即ち細胞外糖タンパク質（ｇｐ１２５）及びトランスメンブラン糖タンパク質（ｇｐ３６）に変態するときに相同な二量体を形成する必要があることは既に判明していた（１３）。本発明では更に、トランスメンブラン糖タンパク質がポリアクリルアミドゲル上の８０ｋＤａのタンパク質に対応する位置に電気泳動移動度を有するホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｅ）の形態で存在することを証明した（図１から図６）。このタンパク質はグリコシル化されており、便宜上これをｇｐ８０と呼ぶ。
【００８８】
ＨＩＶ−１  ＢＲＵまたはＨＩＶ−２  ＲＯＤに感染したＣＥＭ細胞または非感染のＣＥＭ細胞の粗抽出物を、ＡＩＤＳ罹患患者から採取した１つのＨＩＶ−１陽性血清サンプル及び３つのＨＩＶ−２陽性血清サンプルを用い、電気泳動転移後にイムノブロットテスト（ウェスターン法）で分析した（図１）。ＨＩＶ−２特異血清はエンベロープ前駆物質（ｇｐ１４０及びｇｐ３００）を認識し、更に、８０ｋＤａの糖タンパク質（ｇｐ８０）を強力に認識した。これらの血清は、ＨＩＶ−１特異血清によって検出可能なＨＩＶ−１タンパク質、即ちＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質の前駆物質ｇｐ１２０及びｇａｇタンパク質の前駆物質（ＨＩＶ−１ではｐ５５及びｐ４０）を認識しないので、ＨＩＶ−２のタンパク質特異的であった。ＨＩＶ−２の感染とｇｐ８０との関連性は、ＨＩＶ−１血清によってｇｐ８０が認識されないという結果、ＨＩＶ−１感染細胞中でも認識されないという結果がいくつも得られたことによって証明される。
【００８９】
感染培地の遠心（１００，０００ｇで３０分間）によって調製されたウイルス集塊をウェスターン法で分析すると、ｇｐ８０がまた、ＨＩＶ−２粒子中で細胞外糖タンパク質ｇｐ１２５と同時に検出され得ることが判明した。
【００９０】
ＨＩＶ−２感染細胞中のｇｐ８０の合成
予備実験は、すべてのＨＩＶ−２陽性血清が、ｇｐ８０並びにエンベロープのｇａｇ前駆物質ｇｐ１４０及びｇｐ３００、並びに細胞外糖タンパク質ｇｐ１２５を免疫沈降させ得ることを証明した。特性決定によってｇｐ８０の合成を確認するために、エンベロープタンパク質と強力に反応するＨＩＶ−２陽性血清を使用した。この血清から精製した抗体を、エンベロープ糖タンパク質精製用のイムノアフィニティカラムとして使用されるＣＮＢｒによって活性化したＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＨＩＶ−２血清−Ｓｅ−ｐｈａｒｏｓｅ）に結合させた。ＨＩＶ−２感染細胞を［３Ｈ］グルコサミンで標識し、種々の時点（２、３、４、６及び８時間後）に感染細胞抽出物及びウイルス集塊抽出物を調製した。全部のサンプルをＨＩＶ−２血清−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで精製し、標識タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した（図２）。２時間後に、感染細胞中の検出可能な標識タンパク質はｇｐ１４０及びｇｐ３００だけであった。ｇｐ１２５及びｇｐ８０は標識開始の３または４時間後に検出可能になり、また、培地から調製されたウイルス集塊中でも検出可能になった。標識開始の６から８時間後にはｇｐ１２５及びｇｐ８０がはっきりと検出された。これらの結果は、ｇｐ８０がウイルス粒子と関連性を有すること、及びｇｐ８０が未成熟な前駆物質の成熟産物であることを示唆する。
【００９１】
これらの実験においては［３Ｈ］グルコサミンで標識されたｇｐ３６も検出されたが、細胞内タンパク質として検出されたものではない。図２では２００ｋＤａのタンパク質も出現しているが、これは、別のＨＩＶ−２陽性血清によって免疫沈降しなかったので、細胞性タンパク質であろうと考えられる。
【００９２】
ＨＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質の合成に関する反応理論の結果は、既存の結果と一致する。ＨＩＶ−２感染細胞中で、ｇｐ１４０は標識（パルスラベリング）の１５分後に検出可能な最初のエンベロープ産物である。トレーサー追跡（チェース）期間中、二量体形のエンベロープ前駆物質（ｇｐ３００）は３０分後に検出されたが、成熟細胞外糖タンパク質（ｇｐ１２５）は１．５〜３時間後にようやく検出可能になった（１３）。
【００９３】
ＨＩＶ−２のエンベロープ前駆物質に対するポリクローナル抗体によるｇｐ８０の認識
ＨＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質の特性決定のために、精製した二量体前駆物質ｇｐ３００に対するポリクローナル抗体を調製した。このためにｇｐ３００をまず、ＨＩＶ−２血清陽性患者の抗体と共に免疫吸着剤によって部分的に精製し、次いで分離用電気泳動によって精製した。５μｇのこの精製ｇｐ３００調製物を５匹のマウスに１０日おきに５回腹腔内投与することによってマウスを免疫した。（２００μｇの）ポリ（Ａ）．ポリ（Ｕ）をアジュバントとして使用し、抗原と混合して投与した（材料及び方法の項参照）。全部のマウスでｇｐ３００に対する抗体が発生した。これらの抗体はｇｐ３００に対するポリクローナル抗体（抗ｇｐ３００抗体）である。図３は、１匹の免疫マウスの抗体を使用したウェスターン法による分析結果を示す。抗ｇｐ３００抗体はｇｐ３００と特異反応したが、ＨＩＶ−２感染細胞中に存在するｇｐ１４０、ｇｐ１２５及びｇｐ８０とも反応した。ＨＩＶ−１に感染したＣＥＭ細胞または非感染のＣＥＭ細胞中で特異信号は全く観察されなかった。６０ｋＤａのタンパク質が抗ｇｐ３００抗体によって標識されることもしばしば観察されたが、これは、ウイルス感染に無関係な細胞抽出物（図３；細胞セクション「ＣＥＬＬ」）中でも観察されいくつかの実験では全く観察されなかったので恐らく非特異的である。これらのポリクローナル抗体はまた、ＨＩＶ−２感染細胞の抽出物及びウイルス集塊を使用する同様のウェスターン法テストでも使用された。抗体は細胞抽出物中のｇｐ３００、ｇｐ１４０及びｇｐ８０（図３、セクションＨＩＶ−２、列３）を認識した。抗体はまた、ウイルス抽出物中のｇｐ１２５、ｇｐ８０及びトランスメンブラン糖タンパク質であろうと推定される３６ｋＤａのタンパク質を認識した（図３、セクションＨＩＶ−２、列Ｖ）。長時間の接触（ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ）によって、細胞抽出物中のｇｐ３６の位置に対応する信号を検出することが可能であった。また、ウイルス集塊中のｇｐ８０及びｇｐ３６のレベルが細胞抽出物中でのレベルに比較してはるかに高かったことにも注目する必要がある。
【００９４】
これらの結果は、エンベロープ糖タンパク質の前駆物質に対するポリクローナル抗体が、ｇｐ８０を認識し、また同時にＨＩＶ−２のエンベロープのすべての成分を認識することを示しており、従ってｇｐ８０はＨＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質と関係があると考えられる。糖タンパク質ｇｐ８０はウイルスと関連があり、成熟産物であろうと推定される。
【００９５】
モノクローナル抗体１Ｈ８によるＨＩＶ−２のトランスメンブラン糖タンパク質ｇｐ８０の特異的認識
どのウイルス糖タンパク質を認識できるかを決定するために、モノクローナル抗体ｍＡｂ  １Ｈ８を使用したウェスターン法テストを行なった。ＨＩＶ−２感染細胞中で、ｍＡｂ  １Ｈ８はｇｐ３００、ｇｐ１４０及びｇｐ８０を認識したが、ＨＩＶ−２粒子中では主としてｇｐ８０を認識し、ｇｐ３６及びｇｐ３００もわずかに認識した（図４）。ウイルス集塊中に少量のｇｐ３００が存在する理由は恐らく、ｇｐ３００が細胞性タンパク質なので溶解した細胞から混入するためであろう（１３）。ｇｐ３６に関する信号が弱い理由は恐らく、このタンパク質のレベルが低いためであろう。ｍＡｂ  １Ｈ８は細胞外糖タンパク質ｇｐ１２５を認識しなかった（図４）。また、ＨＩＶ−１感染細胞の抽出物またはウイルス集塊のいかなるタンパク質も認識しなかった。これらの結果は、ＨＩＶ−２のエンベロープ前駆物質（ｇｐ１４０及びｇｐ３００）及びトランスメンブラン糖タンパク質（ｇｐ３６）に対して抗体ｍＡｂ  １Ｈ８が特異性を有することを示す。ｍＡｂ  １Ｈ８の反応性がＨＩＶ−２のトランスメンブラン糖タンパク質のアミノ酸配列５７９〜６０４に存在することを合成ペプチドｐ３９′を用いて試験した。
【００９６】
ｍＡｂ  １Ｈ８とｇｐ８０との反応特異性を証明するために、ＨＩＶ−２のウイルス集塊抽出物を使用してウェスターン法テストを行なった。タンパク質の転移後、ニトロセルロースシートをｍＡｂ  １Ｈ８抗体またはｇｐ３００に対するポリクローナル抗体と共に、ペプチド３９′の存在または非存在下にインキュベートした（図５）。ｍＡｂ  １Ｈ８はｇｐ８０と共に強い信号を与えた。更に、ｇｐ３６に対する信号が観察されたが、この信号は長時間露光後のオートラジオグラムにのみ観察された。抗ｇｐ３００抗体はｇｐ１２５、ｇｐ０及びｇｐ３６と反応した。６０ｋＤａのタンパク質によって得られた信号は（図３に示すごとく）特異的でない。ペプチドｐ３９′を添加するとｍＡｂ  １Ｈ８で得られる信号は完全に消滅したが、抗ｇｐ３００抗体で得られる信号は消滅しなかった（図５）。これらの観察から、ｍＡｂ  １Ｈ８の反応性がＨＩＶ−２のトランスメンブラン糖タンパク質の配列５７９〜６０４に対応する２６個のアミノ酸残基に特異的であることが確認された。即ち、ペプチドｐ３９′の配列に対応する配列がｇｐ８０に存在すると推定される。抗ｇｐ３００抗体の反応性はペプチドｐ３９′によって変性しなかった。その理由は、これらのポリクローナル抗体がペプチドｐ３９′に対応するエピトープ以外のエピトープと相互作用するからであろう。
【００９７】
抗ｇｐ３００ポリクローナル抗体及びｍＡｂ  １Ｈ８によるｇｐ８０の免疫沈降
ポリクローナル抗体はｇｐ３００、ｇｐ１４０、ｇｐ１２５及びｇｐ８０を免疫沈降させ、ｍＡｂ  １Ｈ８はｇｐ３００、ｇｐ１４０及びｇｐ８０を免疫沈降させた（図６）。２つの細胞性タンパク質（６０及び４５ｋＤａ）も、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の双方を含む免疫複合体調製物と会合していた（図６、０時間及び２時間の列）。タンパク質６０及び４５ｋＤａは、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに付着することによって免疫複合体調製物中に存在していた。プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは、種々の抗体と共に形成される免疫複合体を回収するために使用されたものである。
【００９８】
ＨＩＶ−２感染細胞を「パルス法」で３０分間標識しマーカーを２及び４時間追跡（チェイス）した。標識細胞の抽出物（０、２及び４時間）及びウイルス集塊を４時間追跡（チェイス）後に回収し、ｇｐ３００に対するポリクローナル抗体及び抗体ｍＡｂ  １Ｈ８を用いた免疫沈降アッセイで分析した（図６）。標識（パルス）中はｇｐ８０はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体によって検出されなかった。２時間追跡（チェイス）後に感染細胞中でｇｐ８０がはっきりと検出された。４時間追跡（チェイス）後に感染性細胞中で［３５Ｓ］メチオニン標識したｇｐ８０が検出できなくなる。４時間後の産生ウイルス集塊を分析すると、細胞外糖タンパク質ｇｐ１２５と同様にｇｐ８０がウイルス粒子に会合していることが判明した（図６）。ｇｐ８０はＨＩＶ−２のエンベロープの成熟産物であると考えることができる。ｇｐ８０がＨＩＶ−２のトランスメンブラン糖タンパク質の特異モノクローナル抗体によって認識されたことは、このタンパク質がｇｐ３６の二量体形に対応することを示唆する（図８及び図９に示した結果で確認された）。ｇｐ８０は感染ＣＥＭ細胞だけから検出されたのでなく、ＨＩＶ−２に感染したＴ４リンパ球からも検出された。
【００９９】
ウェスターン法による分析及び免疫沈降アッセイによって得られた結果を比較すると、ＨＩＶ−２に陽性のヒト血清、マウスポリクローナル抗体及び抗体ｍＡｂ  １Ｈ８が、ｇｐ８０及びｇｐ１２５の天然形よりも変性形を認識し易いことが判明する（図１、図２、図３、図４及び図６）。これらの成熟糖タンパク質の天然形は、種々の抗体によって認識されるエピトープを隠蔽するようなコンホーメーションを有しているのであろうと推定される。
【０１００】
ｇｐ８０によるグルコサミン及びフコースの取込み
［３Ｈ］グルコサミン及び［３Ｈ］フコースで代謝的に標識したＨＩＶ−２ウイルス感染細胞の抽出物を、抗体ｍＡｂ  １Ｈ８及び抗ｇｐ３００ポリクローナル抗体を用いて免疫沈降させた。先の結果（図３〜６）と同様に、抗ｇｐ３００抗体は、糖で標識された糖タンパク質、即ちｇｐ３００、ｇｐ１４０、ｇｐ１２５及びｇｐ８０を免疫沈降させ、ｍＡｂ  １Ｈ８は、ｇｐ３００、ｇｐ１４０及びｇｐ８０を免疫沈降させた。［３Ｈ］グルコサミンはこれらの全部のタンパク質によって取り込まれていたが、［３Ｈ］フコースは概してｇｐ１２５及びｇｐ８０によって取り込まれていることが判明した（図７Ａ）。これらの実験で、［３Ｈ］フコースで標識されたｇｐ３６は長時間露光後のオートラジオグラムにも微弱にしか観察されなかった。ｇｐ８０はまた、ｇｐ３００、ｇｐ１４０及びｇｐ１２５と同様に［３Ｈ］マンノースを取り込むことができる。ｇｐ８０及びその他の糖タンパク質によるこのような標識糖の取込みは、抗生物質であるツニカマイシン（１５）によって阻害される。ツニカマイシンは窒素に結合したタンパク質のグリコシル化を阻止する。
【０１０１】
（Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース及びグルコースを含む）アスパラギンに結合した糖タンパク質のオリゴ糖は、天然タンパク質に結合した後により顕著に成熟する（１１）。オリゴ糖鎖の末端が、フコース残基及びシアル酸の転移前に小胞体及びゴルジ体に結合する。その理由は、フコース残基の取込みがグリコシル化段階よりはるかに後で生じるからである。ＨＩＶ−２感染細胞中では［３Ｈ］フコースの大部分が、ＨＩＶ−２のエンベロープの前駆物質の成熟産物に対応する（図６）２つのタンパク質ｇｐ１２５及びｇｐ８０に取り込まれる（図７）。エンベロープの前駆物質の成熟中にｇｐ１２０が産生されたことを確認するために、ＨＩＶ−２感染細胞をグルコシダーゼインヒビターであるキャスタノスペルミン（１４）の存在下または非存在下に［３５Ｓ］メチオニンで標識した。次に、複数のウイルスタンパク質を認識したＨＩＶ−２陽性患者の血清を用い、培養上清を免疫沈降によって試験した。キャスタノスペルミンの存在下では、ｇｐ８０及びｇｐ１２５の産生はかなり減少したが、ヌクレオキャプシドの主要（コア）タンパク質（ｐ２６）は有意な影響を受けなかった（図７ｂ）。
【０１０２】
ｇｐ８０からｇｐ３６への解離
ｇｐ８０の解離に最適な条件を知るための実験を行なった。これらの条件は、極めて生理的塩類溶液に近い培地、酸性ｐＨ、イオン性界面活性剤ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ、などに対応した。文献（１３）に記載された方法を用い、弱酸性バッファ中でのインキュベーションによってｇｐ３００の解離試験を行なった。この方法は、６より小さいｐＨ値を有するバッファによるｇｐ８０の解離には適しているが、糖タンパク質ｇｐ８０の大部分が分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）した。どの実験においても、非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む溶菌バッファを使用して感染細胞抽出物またはウイルス集塊を調製した。これらの条件ではｇｐ３００及びｇｐ８０は解離せず、イオン性界面活性剤ＳＤＳを添加した後でも解離しなかった。ＳＤＳの効果、即ちＴｒｉｔｏｎの代わりにＳＤＳを使用して抽出物を調製した場合についても試験した。ＨＩＶ感染細胞を［３５Ｓ］メチオニンで標識し、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または１％のＳＤＳを含む溶菌バッファで可溶化することによって抽出物を調製した。次に、これらの抽出物を、界面活性剤を含まない溶菌バッファで１０倍に希釈し、ｍＡｂ  １Ｈ８を用いて免疫沈降させた。Ｔｒｉｔｏｎによる抽出物から得られた免疫複合体調製物は、［３５Ｓ］メチオニンで標識されたバンド、即ちｇｐ３００、ｇｐ１４０及びｇｐ８０に対応するバンドと、ｇｐ３６に対応する弱いバンド（図８、セクションＣの列１）との存在を示した。更に、抽出物をＳＤＳで調製したとき、ｇｐ３００及びｇｐ８０は実質的に検出不能であったが、ｇｐ１４０及びｇｐ３６のレベルは増加していた（図８、セクションＣ、列２）。従って、イオン性界面活性剤の存在下では二量体形のｇｐ３００及びｇｐ８０は解離して夫々ｇｐ１４０及びｇｐ３６になる。［３５Ｓ］メチオニンで標識した精製ｇｐ３００は解離によってｇｐ１４０だけを産生した（１３）。従ってｇｐ３６はｇｐ８０の解離後にのみ存在する。標識されたタンパク質ｇｐ３００及びｇｐ８０が解離タンパク質から全く回収されなくなると、ＳＤＳの存在下ではタンパク質の分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が生じることが観察された（図８、セクションＣ）。２００単位／ｍｌのアプロチニン及び０．２ｍＭのＰＭＳＦの存在は、ＳＤＳとのインキュベーション中のかかる分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を妨害しなかった。二量体形のタンパク質がタンパク質分解に抵抗するコンホーメーションを有するとも考えられる。ｇｐ３００及びｇｐ８０の解離はタンパク分解部位をアクセス可能にするコンホーメーション的修飾を生じる。
【０１０３】
ＨＩＶ−２のウイルス集塊に対して同様の解離実験を行なった。［３５Ｓ］メチオニンで標識したウイルスタンパク質を１％のＴｒｉｔｏｎまたは１％のＳＤＳを含む溶菌バッファまたは０．１％のＳＤＳと１％のデオキシコレートとを含むＲＩＰＡバッファで可溶化した。１％のＳＤＳを含む溶菌バッファ中の抽出物を更に９５℃に加熱した。次に、全部の抽出物をｍＡｂ  １Ｈｂによって免疫沈降させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した（図８、セクションＶ）。
【０１０４】
Ｔｒｉｔｏｎによる抽出物から調製した免疫複合体中では、抗体１Ｈ８によって免疫沈降する主要タンパク質はｇｐ８０及びｇｐ３６であった。また、ＳＤＳによる抽出物中では、ｇｐ８０は検出不能になったが、ｇｐ３６のレベルは顕著に増加した。ＳＤＳ抽出物中では標識成分の大部分が消滅したので、極めて高度な分解が生じたものと推定される。ＲＩＰＡバッファを用いた結果は更に良好であり、ｇｐ８０の大部分が解離しラベルの約３０％がｇｐ３６に検出された（図８、セクションＶ）。ｇｐ８０がｇｐ３６のみから成ることを証明するために、抗体ｍＡｂ  １Ｈ８による免疫沈降と分離用ゲル電気泳動とによって精製した［３５Ｓ］メチオニン標識ｇｐ８０の解離実験を行なった。凍結乾燥したｇｐ８０の調製物をｐＨ６．８、５．８及び４．８のＳＤＳを含む酢酸塩バッファ中に直接懸濁させた。ｐＨ４．８においては全部のｇｐ８０がｇｐ３６に転化した（図９）。
【０１０５】
ＳＩＶ−ｍａｃ中の二量体形トランスメンブラン糖タンパク質の特性決定
トランスメンブラン糖タンパク質がＳＩＶサンプル中で二量体形で検出されるか否かを試験した。
【０１０６】
ＳＩＶ及びＨＩＶ−２に感染した細胞を［３Ｈ］グルコサミンで標識し、Ｔｒｉｔｏｎを含む溶菌バッファで抽出物を調製し、次いで抗体ｍＡｂ  １Ｈ８で免疫沈降させた。図７に示すように、モノクローナル抗体はＨＩＶ−２感染細胞のｇｐ３００、ｇｐ１４０及びｇｐ８０を沈降させ、ウイルス粒子中ではｇｐ８０だけが検出された（図１０）。ＳＩＶ感染細胞中ではモノクローナル抗体は３つのグリコシル化タンパク質、即ちエンベロープ前駆物質ｇｐ１４０、二量体形前駆物質ｇｐ３００及びＨＩＶ−２のｇｐ８０に恐らく対応する６５ｋＤａのタンパク質（ｇｐ６５）を沈降させた。ｇｐ８０と同様に、
ｇｐ６５はＳＩＶのウイルス粒子と会合していた（図１０）。
【０１０７】
これらの実験において、ＨＩＶ−２  ＲＯＤ及びＳＩＶ−ｍａｃのトランスメンブラン糖タンパク質の単量体形は検出できなかった。ＨＩＶ−２  ＲＯＤのアミノ酸配列５７９〜６０４はＳＩＶ−ｍａｃのアミノ酸配列５９５〜６２０に対応する（１９，７）。これらの２つの配列は高度な相同性を有し、抗体ｍＡｂ  １Ｈ８はＨＩＶ−２  ＲＯＤ及びＳＩＶ−ｍａｃの双方のエンベロープ糖タンパク質に交差反応する。
【０１０８】
従って発明者は分子量約６５ｋＤａのタンパク質がＳＩＶ−ｍａｃウイルスのｇｐ３２の二量体形に対応することを証明した。
【０１０９】
理論
二量体形タンパク質（ｇｐ３００及びｇｐ８０）の解離は弱酸性ｐＨで生じ得る。従って、ｇｐ１４０の二量体化はｐＨ依存性であり、前駆物質ｇｐ１４０の２分子の融合に有利な小胞体のコンパートメントで生じると推定される。
【０１１０】
ＨＩＶ−２の二量体形エンベロープ前駆物質ｇｐ３００の分子量を非変性条件下にポリアクリルアミドゲル電気泳動で算出した（１３）。０．２％（ｗｔ／ｖ）の代わりに０．１％（ｗｔ／ｖ）のビスアクリルアミドを含む５％のポリアクリルアミドゲル中でこの二量体形前駆物質は２８０ｋＤａのタンパク質に対応する位置に泳動した。天然条件下の二量体の分子量を確認するために、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラムを用い且つＴｒｉｔｏｎを含む溶菌バッファで調製した［３５Ｓ］メチオニン標識ＨＩＶ−２感染細胞抽出物を用いてゲル濾過実験を実施した。これらの実験条件でｇｐ３００は集塊タンパク質のピークの後の第２のピークの形態で溶出した。トランスメンブラン糖タンパク質の二量体はｇｐ１２５のピークの後及びマーカーとして使用したウシ血清アルブミン（６８ｋＤａ）のピークの前の分子量７５〜８０ｋＤａを有する溶出タンパク質に対応した。これらの観察は、二量体ｇｐ３００及びｇｐ８０の分子量が天然形及び変性形で同等であることを示す。これらの二量体形のｉｎ  ｖｉｔｒｏ解離は、酸性ｐＨで生じ、またイオン性界面活性剤ＳＤＳの存在下でも生じた。Ｔｒｉｔｏｎを含有する溶菌バッファによって抽出物を調製すると、二量体形ｇｐ３００及びｇｐ８０はＳＤＳによって解離しなかった。従って非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎはエンベロープｇｐ３００及びｇｐ８０の天然形二量体を維持する。
【０１１１】
二量体形のエンベロープ前駆物質ｇｐ３００及びトランスメンブラン糖タンパク質はまた、ＳＩＶ感染細胞でも観察されたがＨＩＶ−１感染細胞では観察されなかった。特に、ＨＩＶ−２の二量体形トランスメンブラン糖タンパク質（ｇｐ８０）及びＳＩＶの二量体形トランスメンブラン糖タンパク質（ｇｐ６５）は還元剤の存在下に解離しない。従って、トランスメンブランエンベロープ糖タンパク質の二量体化はＨＩＶ−２及びＳＩＶのエンベロープ遺伝子に特異的な特性であると考えられる。この特性は、新しいＨＩＶ単離物を特性決定するときに、検出された単離物とＨＩＶ−１型またはＨＩＶ−２型との関係を説明するための適当なマーカーとして利用され得る。成熟エンベロープ糖タンパク質を産生するべく前駆物質が成熟するためには、エンベロープ前駆物質の二量体化が必須である。二量体形のトランスメンブラン糖タンパク質は、最適なビリオン構造の形成に必須であり、また細胞膜と融合する能力及び感染させる能力にも必須であるが、トランスメンブラン二量体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ解離は極度の分解を生じさせる。その理由は、この糖タンパク質の二量体形がタンパク質分解に抵抗し得るコンホーメーションを有するためであろう。
【０１１２】
実施例で説明した本発明のいくつかの特徴を、ＨＩＶ−２の糖タンパク質ｇｐ１２５及びｇｐ８０を示す表及びそれらの産生段階を示す図にまとめる。
【０１１３】
【表１】
2006213702.tif 000002
【０１１４】
【表２】
2006213702.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】ＨＩＶ−１に陽性の１つの血清とＨＩＶ−２に陽性の３つの血清（Ａ，Ｂ，Ｃ）とを使用しウェスターン法で分析したＨＩＶ−２感染細胞中の８０ｋＤａの特異タンパク質の同定。
【図２】ＨＩＶ−２に関連した糖タンパク質の合成。
【図３】ポリクローナル抗体によるｇｐ３００のウェスターン法分析。
【図４】モノクローナル抗体ｍＡｂ  １Ｈ８を用いたウェスターン法分析。
【図５】抗体ｍＡｂ  １Ｈ８とｇｐ８０との間の結合を遮断するペプチドｐ３９′。
【図６】ＨＩＶ−２感染細胞中のｇｐ８０の産生を示すパルスチェイス実験（ラベルによる標識、ラベルの追跡）。
【図７】（ａ）ｇｐ８０による標識グルコサミン及びフコースの取込み。及び（ｂ）ｇｐ１２５及びｇｐ８０の産生に対するキャスタノスペルミンの効果。
【図８】ｇｐ８０の解離。
【図９】精製ｇｐ８０のｇｐ３６への解離。
【図１０】二量体の形態で存在するＳＩＶのトランスメンブラン糖タンパク質。
【図１】
2006213702.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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