(57)【要約】【課題】  細胞と導入物質の組合せの制限を受けず、成功率の高いインジェクション方式を採用しながら、細胞の損傷や作業の効率性を改善する捕獲装置及び方法を提供する。【解決手段】  液体中に浮遊する複数の微小物体を捕獲するための捕獲装置であって、それぞれ各物体を吸引可能な複数の吸引口を含む捕獲部を有し、前記複数の吸引口による吸引は独立して動作可能であることを特徴とする捕獲装置を提供する。【選択図】    図１
2006149226.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体中に浮遊する複数の微小物体を捕獲するための捕獲装置であって、それぞれ各物体を吸引可能な複数の吸引口を含む捕獲部を有し、前記複数の吸引口による吸引は独立して動作可能であることを特徴とする捕獲装置。
【請求項２】
液体中に浮遊する複数の微小物体を捕獲するための捕獲装置であって、
それぞれ各物体を吸引可能な複数の吸引口を含む捕獲部と、
前記複数の吸引口による吸引を個別に制御する制御部とを有することを特徴とする捕獲装置。
【請求項３】
前記物体を前記吸引口のうちの所定の吸引口に誘導する誘導口を有する誘導部を更に有することを特徴とする請求項１又は２記載の捕獲装置。
【請求項４】
液体中に浮遊する複数の微小物体を捕獲するための捕獲方法であって、
前記複数の微小物体のうち目的の物体を吸引可能な複数の吸引口のうち前記物体に最も近い目的の吸引口を決定するステップと、
前記目的の吸引口に前記物体を誘導する一又は複数の目的の誘導口を複数の誘導口の中から選択するステップと、
前記目的の吸引口の吸引力と前記目的の誘導口の吸引力及び／又は吐出力を設定するステップとを有することを特徴とする捕獲方法。
【請求項５】
前記第４のステップの設定内容で前記目的の物体の捕獲を開始した後で、前記物体の位置情報に基づいて前記第４のステップの前記設定内容を変更する第５のステップを更に有することを特徴とする請求項４記載の捕獲方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体中に拡散させた微小な浮遊物体の捕獲に関する。本発明は、例えば、医療分野において、白血球が持つ抗体生成など、生体細胞の反応を使った創薬システムにおいて微小浮遊細胞を捕獲する捕獲装置及び方法に好適である。ここで、創薬システムとは、一般には、細胞内に外来の遺伝子溶液及び薬剤溶液を微小針を用いて注入するなどの処理を施し、その後に、各細胞を培養し、個別的に評価又は処理（スクリーニングや抗体抽出など）するためのシステムをいう。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療やゲノム創薬等の分野において、遺伝子及び薬剤を導入した細胞を利用する機会が増加している。このような医療用途では、研究用途とは異なり、細胞と導入物質の組合せを予め決定し、単一細胞について効果発現の有無を観察するなど、各細胞の個別的評価が必要となる。また、医療用途では、大量の細胞の処理に対して所定のスループットを維持することが要求される。
【０００３】
遺伝子注入の方法としては、ベクター法などの生物的手法、トランスフェクションなどの化学的手法、電気穿孔法、パーティクルガン、インジェクションなどの物理的手法がある。このうち生物的手法や化学的手法は細胞と導入物質の組合せに制限があるために医療用途には適さない。一方、物理的手法は、細胞と注入物質の組合せの制限を受けない方法として知られており、特に、インジェクション法（例えば、特許文献１及び２を参照のこと）は、人工授精に広く使われているように、高い注入成功率を有して遺伝子注入方法として有力視されている。従来のインジェクション法は、熟練作業者が細胞にダメージを最低限に抑えた状態で顕微鏡を利用して針先から物質を細胞に導入する。細胞が、シャーレ中で自由に移動可能であると注入作業が困難になるため、微細孔の空いた膜をフィルターの裏から多数の細胞を一括して吸引及び固定する方法が提案されている（例えば、特許文献３を参照のこと）。
【特許文献１】特開平９−１８７２７８号公報
【特許文献２】特開２０００−２３６５７号公報
【特許文献３】特開平２−１１７３８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献３による細胞の一括吸着方法では、全ての吸引口に対して細胞がほぼ等距離にあるときは細胞を同時に吸引して作業性が向上するが、細胞の分布が吸引口間でばらついていれば、所定時間の吸引の結果、ある吸引口には細胞が吸引されるが、他の吸引口には細胞が吸引されないことになる。すると、全ての吸引口に細胞が吸引されてそれらに物質が注入されるまで吸引を継続しなければならない。長時間の吸引を行うことにより細胞が吸引口内に引きずり込まれて損傷するおそれがある。また、注入が終わった細胞だけを順次個別的に次段の後処理に回すこともできず処理の効率が悪い。一方、細胞の吸引口における吸引時間を一定にして細胞の損傷を防止しようとすれば細胞を吸引しない吸引口が存在することになり、スループットが低下する。
【０００５】
そこで、本発明は、細胞と導入物質の組合せの制限を受けず、成功率の高いインジェクション方式を採用しながら、細胞の損傷や作業の効率性を改善する捕獲装置及び方法を提供することを例示的な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一側面としての捕獲装置は、液体中に浮遊する複数の微小物体を捕獲するための捕獲装置であって、それぞれ各物体を吸引可能な複数の吸引口を含む捕獲部を有し、前記複数の吸引口による吸引は、独立して動作可能であることを特徴とする。かかる捕獲装置によれば、複数の吸引口による微小物体（例えば、細胞）の吸引が独立して（例えば、手動で）動作可能であるので、長時間の吸引による物体の損傷を防止したり、所定の処理が終了した物体の捕獲を解除して新しい物体の捕獲を行って処理の効率やスループットを高めたりすることができる。
【０００７】
本発明の別の側面としての捕獲装置は、液体中に浮遊する複数の微小物体を捕獲するための捕獲装置であって、それぞれ各物体を吸引可能な吸引口を含む複数の吸引口と、前記複数の吸引口による吸引を個別に制御する制御部とを有することを特徴とする。かかる捕獲装置によれば、制御部が吸引口による微小物体の吸引を個別に制御するので、長時間の吸引による物体の損傷を防止したり、所定の処理が終了した物体の捕獲を解除して新しい物体の捕獲を行って処理の効率やスループットを高めたりすることができる。
【０００８】
前記捕獲装置は、前記吸引口と前記物体を検出する検出部を更に有し、前記制御部は、前記検出部による検出結果に基づいて前記複数の吸引口による吸引を個別に制御してもよい。これにより、吸引口が吸引可能な範囲に物体があることを確認して吸引口に物体を吸引することができる。また、物体を所定の位置の所定の吸引口に捕獲させたい場合に他の吸引口による吸引が物体を引き付けて前記所定の吸引口への迅速な吸引を妨げることを防止することができる。前記制御部は、各吸引口によって吸引された前記物体に所定の処理が終了したかどうかに基づいて、前記複数の吸引口による吸引又は吐出を個別に制御してもよい。これにより、所定の処理が終了した物体の捕獲を解除して新しい物体の捕獲を行って処理の効率やスループットを高めたりすることができる。
【０００９】
前記吸引口は前記物体の吐出が可能であり、前記制御部は、例えば、各吸引口によって吸引された前記物体に所定の処理が終了したかどうかに基づいて、前記複数の吸引口による吐出を個別に制御してもよい。これにより、処理済みの物体を吐出し、新しい物体の捕獲を行って処理の効率やスループットを高めたりすることができる。また、前記吸引口は前記液体に陽圧を加えて細胞を所望の吸引口に誘導する誘導口として作用させることができる。また、かかる作用は、複数の前記物体が密集又は凝集している場合にそれに近接した吸引口から液体を吐出して物体を分散させる。
【００１０】
前記捕獲装置は、前記物体を前記吸引口のうちの所定の吸引口に誘導する誘導口を含む誘導部を更に有してもよい。誘導部が積極的に物体を吸引口に導入することにより、物体が複数の吸引口に対して均一に分布していない場合に捕獲の効率を高めることができる。また、前記捕獲装置は、前記物体の位置を検出する検出部を更に有し、前記制御部は、前記検出部による検出結果に基づいて前記誘導部による誘導を制御してもよい。例えば、前記制御部は、前記物体が移動したかどうか、前記物体の移動方向、前記物体が吸引された吸引口の位置が所定位置であるかどうか、などによって前記誘導部による誘導を制御してもよい。更に、前記捕獲装置は、前記液体の吸引及び吐出が可能な複数の誘導口を含む誘導部を有し、前記制御部は、前記複数の吸引口の吸引及び前記複数の誘導口の吸引及び吐出を個別に制御してもよい。前記誘導口が前記物体を誘導するために加える力の方向は限定された方向であり、当該方向は変更可能に構成されていてもよい。誘導口からの力の方向を限定することにより、かかる力が等方的に広がって他の細胞の誘導に悪影響を与えないようにすることができる。また、かかる方向の変更は制御部が行ってもよい。
【００１１】
本発明の別の側面としての捕獲方法は、液体中に浮遊する複数の微小物体を捕獲するための捕獲方法であって、前記複数の微小物体のうち目的の物体を吸引可能な複数の吸引口のうち前記物体に最も近い目的の吸引口を決定するステップと、前記目的の吸引口に前記物体を誘導する一又は複数の目的の誘導口を複数の誘導口の中から選択するステップと、前記目的の吸引口の吸引力と前記目的の誘導口の吸引力及び／又は吐出力を設定するステップとを有することを特徴とする。かかる捕獲方法によれば、誘導部が積極的に物体を吸引口に導入することにより、物体が複数の吸引口に対して均一に分布していない場合に捕獲の効率を高めることができる。
【００１２】
前記設定ステップは、例えば、前記目的の物体の重心から前記目的の吸引口の中心とを結ぶ方向に前記物体が移動するように前記吸引力及び／又は吐出力を設定してもよい。前記設定ステップは、前記複数の吸引口のうちで前記目的の吸引口以外の吸引口を誘導用の吸引口として選択するステップと、前記誘導用の吸引口の吸引力及び／又は吐出力を設定するステップとを有してもよい。吸引口を物質誘導用に使用することによって物質の目的の吸引口への誘導を更に確実にすることができる。前記誘導用の吸引口を選択するステップは、前記物体を中心に配置するマトリックスを設定し、当該マトリックスに含まれる吸引口の中から前記誘導用の吸引口を選択してもよい。前記捕獲方法は、前記設定ステップの設定内容で前記目的の物体の捕獲を開始した後で、前記物体の位置情報に基づいて前記設定内容を変更するステップを更に有してもよい。これにより、物体の捕獲の実効を確保することができる。
【００１３】
本発明の更なる目的又はその他の特徴は、以下、添付図面を参照して説明される好ましい実施例によって明らかにされるであろう。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、細胞と導入物質の組合せの制限を受けず、成功率の高いインジェクション方式を採用しながら、細胞の損傷や作業の効率性を改善する捕獲装置及び方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、添付図面を参照して、本発明の第１の実施例の細胞処理装置１００について説明する。細胞処理装置１００は、本発明に適用可能な微小物体に対して所定の処理（例えば、微小針（キャピラリ）を用いた物体の注入処理）を施す。微小物体は、液体（例えば、細胞懸濁液及び培地）Ｌに分散し、浮遊可能な細胞Ｃである。ここで、図１は、細胞処理装置１００の概略斜視図である。細胞処理装置１００は、図１に示すように、シャーレなどの容器１０２と、捕獲基材１１０と、複数の吸引部１２０とを有する。
【００１６】
容器１０２は、液体Ｌ及びそれに浮遊する複数の細胞Ｃを収納する円筒形状の水槽であり、例えば、プラスチックから構成される。容器１０２は流路であっても構わない。容器１０２には、細胞Ｃ及び液体Ｌが供給される図示しない一又は複数の供給部に接続されている。容器１０２に満たされる液体Ｌの量は、通常時は細胞Ｃが捕獲基材１１０に接触せずに浮遊することができ、吸引時には細胞Ｃが捕獲基材１１０上に拘束される量である。また、後述する吸引口１１２ｂから液体Ｌは捕獲基材１１０内に流入するため、その後も細胞Ｃが捕獲基材１１０に接触せずに浮遊することができるのに十分な量が容器１０２に供給される必要がある。例えば、容器１０２には液体Ｌの高さを検知するセンサが設けられ、液体の量が一定の高さ以下になった場合には図示しない供給部から液体Ｌが供給される構成としてもよい。また、容器１０２は、後述する捕獲部によって捕獲された複数の細胞に微小針を用いて所定の物質を注入する図示しない処理部が接続可能である。更に、容器１０２には、ＤＮＡなどの所定の物質が注入された細胞（即ち、処理済の細胞）を後段の回収部に搬送する流路が接続されていてもよい。
【００１７】
捕獲基材１１０は、容器１０２の内面に適合する円筒形状の部材であり、吸引部１２０と共に捕獲部として機能する。捕獲基材１１０は、液体Ｌ及び細胞Ｃよりも比重が大きく、液体Ｌを汚染しない材料（例えば、プラスチック）から構成される。捕獲基材１１０は、容器１０２の内面に適合するので、容器１０２内で捕獲基材１１０が移動することはない。これにより、配管１２４の移動を防止することができ、吸引動作を安定化することができる。また、かかる構造により、容器１０２と捕獲部材１１０との間には液体Ｌが入らない。なお、捕獲基材１１０は、容器１０２の一部であってもよい。捕獲基材１１０は、３つの接続口１１２ａと、３つの吸引口１１２ｂと、３つのトンネル１１４とを有する。
【００１８】
接続口１１２ａは吸引部１２０の配管１２４が接続される穴である。接続口１１２ａの内面にはネジ切りされ、配管１２４の外面のネジ山に適合するように構成されてもよい。これにより、配管１２４が動作中に捕獲基材１１０から分離することを防止することができる。
【００１９】
吸引口１１２ｂは細胞Ｃを吸引及び捕獲するためのφ数μｍ程度の複数の穴である。吸引口１１２ｂの数は同時に捕獲可能な細胞の最大数であり、本実施例の３つは例示的である。予め吸引口１１２ｂを碁盤の目のように自動機で取り扱い易い配置にしておけば、例えば、ＤＮＡの注入などの後工程を自動化にスループットが低下することを防止することができる。
【００２０】
トンネル１１４は、図２に示すように、接続口１１２ａと吸引口１１２ｂを連通するＵ字形状の穴である。ここで、図２は、捕獲基材１１０と吸引部１２０との関係を示す部分概略斜視図である。トンネル１１４の形状は例示的であり、例えば、後述するように、接続口１１２ａが捕獲基材１１０の底面に形成されれば、トンネル１１４は直線形状になる。
【００２１】
吸引部１２０は、細胞Ｃの吸引・吐出、液体Ｌの吐出が可能であり、３つのポンプ１２２と３つの配管１２４とを含む。本実施例のように、吸引部１２０は、吸引口１１２ｂの数に対応した数のポンプ１２２を有してもよいし、各吸引口１１２ｂに制御弁が設けられていれば、少なくとも一つのポンプ１２２が設けられていれば足りる。本実施例では、捕獲部は捕獲基材１１０と吸引部１２０から構成されているが、捕獲基材１１０を設けるかどうかは選択的である。例えば、吸引部１２０の配管１２４をトンネル１１４の形状に倣ってＵ字形状にするなどである。
【００２２】
ポンプ１２２は、少なくとも吸引が可能（好ましくは吐出も可能）であればその種類は問わない。例えば、シリンダとその軸方向に摺動可能なプランジャよりなる吸引／吐出装置であってもよい。また、本実施例では、ポンプ１２２の吸引力、吐出力は調節可能としている。細胞Ｃを損傷しない程度に捕獲する吸引力や処理済みの細胞Ｃを解放する吐出力はシミュレーションや実験で予め設定されているが、細胞Ｃを吸引口１１２ｂに引き寄せる際の吸引力や凝集した細胞Ｃを分散させるための液体Ｌの吐出力は調節可能であり、これにより、捕獲動作の効率を高めることができる。
【００２３】
配管１２４は、捕獲基材１１０の接続口１１２ａに接続されている。本実施例では、各ポンプ１２２は独立して動作可能である。配管１２４は直角に折れ曲がっているが、かかる形状は例示的である。また、吸引部１２０を捕獲基材１１０の下方に設ければ、接続口１１２ａは捕獲基材１１０の底面に形成される。但し、この場合は、液体Ｌがポンプ１２２に流入しないような手段を設ける必要がある。
【００２４】
かかる吸引部１２０によれば、複数の吸引口による細胞Ｃの吸引が独立して（例えば、手動で）動作可能であるので、長時間の吸引による細胞Ｃの損傷を防止することができる。各ポンプ１２２は独立して動作可能であるが同時に細胞Ｃを捕獲するように吸引動作を行ってもよいことはいうまでもない。図２に、捕獲・拘束されている細胞Ｃを示す。かかる状態で、作業者は、微小針を細胞Ｃに突き刺してＤＮＡなどの所定の物質を細胞Ｃに注入することができる。細胞Ｃが固定されているので作業性が向上する。
【００２５】
捕獲部は、注入済の細胞Ｃの、複数の吸引口１１２ｂによる捕獲を個別に解除して新しい細胞Ｃを捕獲して注入処理の効率やスループットを高めることができる。例えば、図３に示すように、後工程の処理が終わった細胞Ｃを捕獲・拘束している中央の吸引口１１２ｂのみを個別に吸引停止又は吐出すれば、中央の細胞Ｃは自由に移動可能になるため、他の細胞移動手段（例えば、容器１０２を傾けるなど）で下に移動し、拘束されている他の細胞Ｃと分離することができる。これにより、細胞Ｃの処理・未処理などが識別できれば、一連の流れとして全体として自動化することができる。加えて、新しい細胞Ｃを目的の吸引口１１２ｂに個別に吸引して捕獲・拘束することもできる。
【００２６】
以下、図４乃至６を参照して、本発明の第２の実施例の細胞処理装置１００Ａについて説明する。ここで、図４は、細胞処理装置１００Ａの概略斜視図である。図４において、図１と同一の部材には同一の参照符号を付して説明を省略する。細胞処理装置１００Ａは、細胞処理装置１００と比較して、検出部１３０と、制御部１４０とを有して捕獲部による捕獲を自動化した点が異なっている。
【００２７】
検出部１３０は、捕獲基材１１０を撮影する視野を有し、細胞Ｃと吸引口１１２ｂの状態を撮影することができる。検出部１３０は、例えば、ＣＣＤカメラから構成される。
【００２８】
制御部１４０は、検出部１３０の検出結果により、細胞Ｃの位置（例えば、細胞Ｃの形状、大きさ、位置、移動の有無、移動方向）及び状態（例えば、細胞Ｃが吸引口１１２ｂに捕獲されているかどうか）を検出する画像処理機能を備えている。制御部１４０は、かかる検出結果に応じて吸引部１２０による複数の吸引口１１２ｂの吸引及び吸引停止を個別に制御する機能を有する。これにより、吸引可能な範囲に細胞Ｃがあるときのみ吸引口１１２ｂは吸引を行うことができ、無駄な吸引を防止すると共に細胞Ｃを所定の位置の所定の吸引口１１２ｂに捕獲させたい場合に他の吸引口１１２ｂによる吸引が細胞Ｃを引き付けて所定の吸引口１１２ｂへの迅速な吸引を妨げることを防止することができる。なお、本実施例では、制御部１４０は画像処理機能を備えているが、画像処理装置を制御部１４０とは別体に設け、制御部１４０は画像勝利装置からデータ通信を行ってもよい。
【００２９】
以下、図５及び図６を参照して、細胞処理装置１００Ａの動作を説明する。ここで、図５は、細胞処理装置１００Ａの動作を説明するためのフローチャートである。図６は、細胞処理装置１００Ａの概略斜視図である。まず、制御部１４０は、検出部１３０による検出結果に基づいて、細胞Ｃの位置や吸引口１１２ｂの状態を検出し（ステップ１００２）、細胞Ｃが全ての吸引口１１２ｂで捕獲されているかどうかを判断する（ステップ１００４）。制御部１４０は、ステップ１００４で捕獲されていると判断すれば処理を終了する。
【００３０】
一方、制御部１４０は、ステップ１００４で捕獲されていないと判断すれば、細胞Ｃと最も近い、未捕獲の吸引口１１２ｂを特定する（ステップ１００６）。例えば、制御部１４０は、ステップ１００４で、図６に示すように、右端の吸引口１１２ｂに細胞Ｃが捕獲されていないと判断し、右端の吸引口１１２ｂを特定する（ステップ１００６）。次に、制御部１４０は、特定された右端の吸引口１１２ｂの吸引を行うポンプ１２２を駆動する信号を当該ポンプ１２２に送出する（ステップ１００８）。この結果、右端の吸引口１１２ｂの吸引が開始して細胞Ｃを引き寄せて捕獲・拘束する（ステップ１０１０）。検出部１３０からの情報によって細胞Ｃが右端の吸引口１１２ｂに捕獲されたことを認識すると（ステップ１０１２、１０１４）、制御部１４０はポンプ１２２による吸引力を停止又は調節してステップ１００２に帰還する（ステップ１０１６）。ステップ１０１４において、特定された右端の吸引口１１２ｂが細胞Ｃを捕獲するまでポンプ１２２は設定された吸引力を生成するように駆動される（ステップ１０１４から１００８のループ）。なお、捕獲・拘束している細胞Ｃを個別に解放する場合は、解放すべき細胞Ｃに対応するポンプ１２２に対して制御部１４０は吸引停止を命令する信号を送出する。
【００３１】
以下、図７を参照して、本発明の第３の実施例の細胞処理装置１００Ｂについて説明する。ここで、図７は、細胞処理装置１００Ｂの概略斜視図である。図７において、図１と同一の部材には同一の参照符号を付して説明を省略する。細胞処理装置１００Ｂは、細胞処理装置１００Ａと類似しているが、制御部１４０Ａは、吸引部１２０による複数の吸引口１１２ｂによる吸引、吸引停止に加え、吐出及び吐出停止を個別に制御する機能を有する点で異なっている。吸引口１１２ｂの吐出機能により、ある吸引口１１２ｂ細胞Ｃを目的の吸引口１１２ｂに誘導する誘導部として機能させることができる。また、複数の細胞Ｃが凝集している場合にそれに近接した吸引口１１２ｂから圧力を印加することによって細胞を分散させることができる。
【００３２】
以下、図８及び図９を参照して、細胞処理装置１００Ｂの動作を説明する。ここで、図８は、細胞処理装置１００Ｂの動作を説明するためのフローチャートである。図９（ａ）は、細胞Ｃの誘導開始状態における吸引吐出条件を示す概略平面図であり、図９（ｂ）は、細胞Ｃがある程度誘導された後における吸引吐出条件を示す概略平面図である。本実施例は、例示的に菱形の頂点に配置された４つの吸引口１１２ｂ１乃至１１２ｂ４を利用し、これらの吸引吐出条件を細胞Ｃの誘導状態に応じて変化させている。また、本実施例では、説明の便宜上、図９（ａ）に示すように、細胞Ｃと吸引口１１２ｂ１及び１１２ｂ２は一直線上に整列すると仮定している。
【００３３】
まず、制御部１４０Ａは、細胞Ｃが吸引されるべき目的の吸引口１１２ｂ（以下、図９（ａ）に示す「吸引口１１２ｂ１」とする）を特定する（ステップ１１０２）。次に、検出部１３０による検出結果に基づいて、細胞Ｃの位置や目的の吸引口１１２ｂ１の状態を検出し（ステップ１１０４）、細胞Ｃが目的の吸引口１１２ｂ１で捕獲されているかどうかを判断する（ステップ１１０６）。制御部１４０Ａは、ステップ１１０６で捕獲されていると判断すれば処理を終了する。
【００３４】
一方、制御部１４０Ａは、細胞Ｃが目的の吸引口１１２ｂ１に捕獲されていないと判断すれば（ステップ１１０６）、目的の吸引口１１２ｂ１から見て細胞Ｃの真後ろに位置する誘導用の吸引口１１２ｂ（以下、図９（ａ）に示す「吸引口１１２ｂ２」とする）を特定する（ステップ１１０８）。次に、制御部１４０Ａは、目的の吸引口１１２ｂ１の吸引を行うポンプ１２２を駆動する信号を当該ポンプ１２２に送出する（ステップ１１１０）。この結果、細胞Ｃには目的の吸引口１１２ｂ１に吸引される吸引力が、図９（ａ）に示す矢印のように、発生する。また、誘導用の吸引口１１２ｂ２の吐出を行うポンプ１２２を駆動する信号を当該ポンプ１２２に送出する（ステップ１１１２）。この結果、細胞Ｃには誘導用の吸引口１１２ｂ２から細胞Ｃを目的の吸引口１１２ｂ１に向かって押出す吐出力が、図９（ａ）に示す矢印のように、発生する。なお、吸引力と吐出力は吸引口１１２ｂから等方的に広がるが、図９（ａ）は、便宜上、細胞Ｃの誘導に影響する一方向のみを示している。
【００３５】
次に、細胞Ｃがある程度進むと吸引口１１２ｂ３及び１１２ｂ４を結んだ直線を超えるようになる。この状態において、細胞Ｃの誘導を更に促進するために、吸引口１１２ｂ３及び１１２ｂ４による誘導を行う。
【００３６】
制御部１４０Ａは、図９（ａ）の状態において予め細胞Ｃの前方に位置する吸引口１１２ｂ（以下、図９に示す「吸引口１１２ｂ３及び１１２ｂ４」とする）を特定しておき（ステップ１１１４）、検出部１３０による検出結果を利用して細胞Ｃが吸引口１１２ｂ３及び１１２ｂ４を結んだ直線を越えたかどうかを判断する。制御部１４０Ａは、細胞Ｃが吸引口１１２ｂ３及び１１２ｂ４を結んだ直線を越えたと判断するまでは、図９（ａ）に示す吸引と吐出を維持し、吸引口１１２ｂ３及び１１２ｂ４による吐出があれば、細胞Ｃの流れを妨げないようにこれを停止する（ステップ１１１６）。
【００３７】
一方、制御部１４０Ａは、細胞Ｃが吸引口１１２ｂ３及び１１２ｂ４を結んだ直線を越えたと判断すると、目的の吸引口１１２ｂ１と誘導用の吸引口１１２ｂ２を結ぶ直線に細胞Ｃの移動が沿うように、吸引口１１２ｂ３及び１１２ｂ４の補助的吐出を行う（ステップ１１２０）。この結果、目的の吸引口１１２ｂ１に細胞Ｃをより迅速に引き寄せて捕獲・拘束することができる。なお、吸引力と吐出力は吸引口１１２ｂから等方的に広がるが、図９（ｂ）も、便宜上、細胞Ｃの誘導に影響する一方向のみを示している。
【００３８】
検出部１３０からの情報によって細胞Ｃが目的の吸引口１１２ｂ１に捕獲されたことを認識すると（ステップ１１２４、１１２６）、制御部１４０Ａは全吸引口１１２ｂ１乃至１１２ｂ４の吸引及び吐出を停止して処理を終了する（ステップ１１２６）。ステップ１１２４において、目的の吸引口１１２ｂ１が細胞Ｃを捕獲するまで複数のポンプ１２２は設定された吸引力を生成し、他の吸引口１１２ｂ２乃至１１２ｂ４は所定の吐出力を生成するように駆動される（ステップ１１２４から１１１４のループ）。
【００３９】
以下、図１０を参照して、本発明の第４の実施例の細胞処理装置１００Ｃについて説明する。ここで、図１０は、細胞処理装置１００Ｃの概略斜視図である。図１０において、図１と同一の部材には同一の参照符号を付して説明を省略する。細胞処理装置１００Ｃは、細胞処理装置１００と類似しているが、より多くの吸引口１１２ｂがマトリックス状に捕獲基材１１０Ａに配置され、吸引部１２０Ａはより多くのポンプ１２２と配管１２４を有している点で異なっている。
【００４０】
なお、吸引口１１２ｂからの吸引力が増加し続ければ、細胞Ｃが吸引口１１２ｂ中に引きずり込まれたり、破壊したりするおそれがあるので、吸引力の制御は重要である。細胞Ｃの各吸引口１１２ｂにおける吸引は個別でも同時でも構わないが、それぞれの吸引口１１２ｂに一番近い細胞Ｃまでの距離は吸引口１１２ｂ毎に異なるため、手動で行う場合は、目視確認しながら個別に吸引する方が細胞Ｃの損傷を防止し、細胞Ｃが目的の吸引口１１２ｂ以外に移動することを防止する上で好ましい。
【００４１】
以下、図１１乃至図１４を参照して、本発明の第５の実施例の細胞処理装置１００Ｄについて説明する。ここで、図１１は、細胞処理装置１００Ｄの概略断面図である。細胞処理装置１００Ｄは、捕獲基材１１０Ｂと制御部１４０Ｂと誘導部１５０とを有する点において細胞処理装置１００Ａと相違する。
【００４２】
即ち、捕獲基材１１０Ｂに吸引部１２０が接続されて吸引口１１２ｂが設けられている点は細胞処理装置１００Ａと同様であるが、捕獲基材１１０Ｂには更に接続口１１４ａと誘導口１１４ｂが設けられ、接続口１１４ａには誘導部１５０が接続されている。
【００４３】
捕獲基材１１０Ｂにおいて、後述する図１３（ａ）に示すように、複数の吸引口１１２ｂと誘導口１１４ｂはそれぞれマトリックス状に配置され、複数の吸引口１１２ｂと複数の誘導口１１４ｂとは対角方向にずれている。吸引口１１２ｂは細胞Ｃを吸引するためのもので、必要があれば、処理済の細胞Ｃを吐出したり、細胞Ｃを所望の吸引口１１２ｂに導入するために吐出したりしてもよいことは上述の通りである。一方、誘導口１１４ｂは、細胞Ｃを所望の吸引口１１２ｂに導入するために吸引及び吐出を行う。
【００４４】
本実施例では、誘導口１１４ｂの構成は吸引口１１２ｂと同様に捕獲基材１１０Ｂの上面にほぼ垂直に開口する形状を有する。しかし、吸引口１１２ｂが捕獲基材１１０Ｂの上面にほぼ垂直に開口しているのは細胞Ｃを固定しやすいからであるが、誘導口１１４ｂは細胞Ｃを誘導できれば足りる。従って、代替的な実施例では、誘導口１１４ｂが一定方向に強い吸引力や吐出力を加えられるように、誘導口１１４ｂを捕獲基材１１０Ｂの上面に斜めに配置したり、誘導口１１４ｂを捕獲基材１１０Ｂの上面にほぼ垂直に開口するように設けてその周りの一定領域に遮蔽壁を立設したりしてもよい。更に、このような一定方向に強い吸引力や吐出力を加えることが可能な誘導口１１４ｂを捕獲基材１１０Ｂに対して回転可能に構成し、上記一定方向を制御部１４０Ｂにより変更可能としてもよい。このように誘導口１１４ｂからの力の方向を限定することにより、かかる力が等方的に広がって他の細胞の誘導に悪影響を与えることを防止することができる。
【００４５】
制御部１４０Ｂは、検出部１３０と複数のポンプ１２２に接続され、検出部１３０の検出結果に基づいて吸引部を駆動制御する点は細胞処理装置１００Ａと同様であるが、制御部１４０Ｂには誘導部１５０が更に接続され、検出部１３０の検出結果に基づいて吸引部を駆動制御する点において細胞処理装置１００Ａと異なる。図１１は、吸引部１２０を省略し、検出部１３０と制御部１４０Ｂと誘導部１５０との関係のみを示している。
【００４６】
図１１に示すように、制御部１４０Ｂは、パーソナル・コンピュータ（ＰＣ）などから構成され、検出部１３０から送られる画像情報を格納する画像メモリ１４２と、画像情報から吸引部１２０及び誘導部１５０の画像処理部１４４とを有する。画像処理部１４４では、細胞検出、目標ベクトルの算出、吸引吐出条件の算出、駆動情報へ変換を行い、かかる駆動情報に基づいて誘導部１５０を制御する。
【００４７】
誘導部１５０は、吸引部と同様の構成を有し、本実施例では、４組のアクチュエータ１５２と、シリンダ１５４と、プランジャ１５６と、配管１５８とを含むが、組数は例示的である。アクチュエータ１５２はプランジャ１５６を図１１の左右方向に駆動する。プランジャ１５６は、シリンダ１５４の軸に接続されてシリンダ１５４の軸方向に移動すると共に液体Ｌを吐出か圧力を印加する。アクチュエータ１５２がプランジャ１５６を図１１の左方向に駆動すれば、配管１５８を通じて陽圧が液体Ｌ（中の細胞Ｃ）に作用し、アクチュエータ１５２がプランジャ１５６を図１１の右方向に駆動すれば、配管１５８を通じて陰圧が液体Ｌ（中の細胞Ｃ）に作用する。
【００４８】
以下、図１２乃至図１４を参照して、細胞処理装置１００Ｄの動作について説明する。ここで、図１２は、細胞処理装置１００Ｄの動作を説明するためのフローチャートである。まず、制御部１４０の画像処理部１４４は、検出部１３０から細胞Ｃの映像を画像メモリ１４２を介して取得する（ステップ１２０２）。細胞Ｃは、図１３（ａ）に示す細胞投入前画像と、図１３（ｂ）に示す細胞投入後画像の差分を取り、図１３（ｃ）に示すように、検出することができる。ここで、図１３は、細胞検出方法を説明するための概略平面図である。
【００４９】
次に、画像処理部１４４は、細胞Ｃの映像から細胞Ｃがどの吸引口１１２ｂに最も近いかを決定する（ステップ１２０４）。まず、図１４（ａ）の×印に示すように、図１３（ｃ）に示す細胞Ｃの重心を算出する。次いで、細胞Ｃの重心の座標を決定する。重心の座標は、図１３（ａ）の初期状態において予め捕獲基材１１０Ｂに設定した座標系を用いてもよいし、図１４（ｂ）に示すように局所的な座標を設定してもよい。図１４（ａ）では、吸引口１１２ｂを基準に予め画像内に設けられたマーキングに基づくマトリックスによって細胞の重心位置を表す。例えば、細胞Ｃの位置を５行Ｂ列とするなどである。
【００５０】
次いで、図１４（ｃ）に示すように、細胞Ｃに最も近い吸引口１１２ｂを特定する（ステップ１２０６）。図１４（ｃ）では、細胞Ｃの外形を点線で示すように順次拡大して、拡大した細胞Ｃの輪郭が最初に交差する吸引口１１２ｂを検出している。図１４（ｃ）では、吸引口１１２ｂＭが細胞Ｃに最も近い。次いで、細胞Ｃの重心の座標（ｘ０，ｙ０）から吸引口１１２ｂＭの座標（ｘ１，ｙ１）に至るベクトルＶを設定する（ステップ１２０８）。なお、図１４（ａ）乃至図１４（ｃ）は、細胞Ｃに最も近い吸引口１１２ｂを決定する方法を説明するための概略平面図である。
【００５１】
次に、画像処理部１４４は、細胞Ｃを吸引口１１２ｂＭに吸引するために吸引口１１２ｂＭと周囲の吸引吐出条件を算出する（ステップ１２１０）。まず、図１５に示すように、細胞Ｃの現在位置を含んだマスを中心としたマトリックス領域を設定する。ここで、図１５は、吸引口１１２ｂを中心とする３×３のマトリックス領域を示す平面図であり、同図においては、３×３のマトリックスの２行２列の位置に細胞Ｃが配置されるようにする。また、各マスの中心は吸引口１１２ｂ又は誘導口１１４ｂの中心と一致するようにする。
【００５２】
図１５においては、１行２列に吸引口１１２ｂＬがあり、２行１列と２行３列に誘導口１１４ｂＳと１１４ｂＴがあり、３行２列に目的の吸引口１１２ｂＭがある。図９（ａ）と同様に、目的の吸引口１１２ｂＭは吸引、目標と反対側の吸引口１１２ｂＬは吐出に設定される。また、図１５においては、細胞Ｃの重心は誘導口１１４ｂＳ及び１１４ｂＴの中心を結んだ線よりも下側に位置しているとする。
【００５３】
画像処理部１４４は、吸引口１１２ｂＭからの距離に応じて吐出量を決定する。即ち、吸引口１１２ｂＭの吸引、吸引条件はベクトルＶの大きさに比例させ、基本条件はユーザーが入力する。ここで、吸引口１１２ｂＭの座標（ｘ３２，ｙ３２）は上述の（ｘ１，ｙ１）に対応する。ｘ３２とｙ３２は、それぞれ、図１５における３行２列の位置のｘ（横）座標、ｙ（縦）座標という意味である。
【００５４】
Φ１０〜２０μｍの細胞Ｃの場合、吸引条件として１００Ｐａ〜１０００Ｐａが適当である。ここで基本条件を１００Ｐａとし、移動させるベクトルＶの大きさを行列マス（正方形）の１辺の長さで割った値を倍率として決定する。吸引口１１２ｂＬと誘導口１１４ｂＳと１１４ｂＴの吸引吐出は補助的であり、目的の吸引口１１２ｂＭよりも弱く設定することが有効である。そのため、強弱を制御する補正係数ｋを導入することが好ましい。
【００５５】
制御部１４０Ｂは、誘導口１１４ｂＳの吐出力を誘導口１１４ｂＳの位置と細胞Ｃの位置を比較することによって決定する。誘導口１１４ｂＳから吸引口１１２ｂＭを結ぶベクトル（斜辺）と移動させたいベクトルＶの成分を比較する。細胞Ｃの重心の座標（ｘ０，ｙ０）、誘導口１１４ｂＳの座標（ｘ２１，ｙ２１）、及び、吸引口１１２ｂＭの座標（ｘ３２，ｙ３２）に関し、Ｘ方向においては、ｘ２１＜ｘ０＜ｘ３２が成立し、Ｙ方向においてはｙ３２＜ｙ０＜ｙ２１が成立する。細胞Ｃを吸引口１１２ｂＭに移動させるには、誘導口１１４ｂＳから見て細胞ＣをＸＹ両方向に関して外側に移動させなければならない。このため、制御部１４０Ｂは、誘導口１１４ｂＳを吐出に設定し、吐出量は基本吐出条件を行列マス（正方形）の１辺の長さに対する細胞Ｃと誘導口１１４ｂＳとの距離の比だけ掛け合わせ、更に、強弱制御係数（補正係数）ｋを掛け合わせることによって決定する。
【００５６】
誘導口１１４ｂＴについては、細胞Ｃの重心の座標（ｘ０，ｙ０）、誘導口１１４ｂＴの座標（ｘ２３，ｙ２３）、及び、吸引口１１２ｂＭの座標（ｘ３２，ｙ３２）に関し、Ｘ方向においては、ｘ０＜ｘ３２＜ｘ２３が成立し、Ｙ方向においては、ｙ３２＜ｙ０＜ｙ２３が成立する。細胞Ｃを吸引口１１２ｂＭに移動させるには、誘導口１１４ｂＳから見て細胞ＣはＹ方向には外側に移動させなければならないがＸ方向に関しては内側に移動させなければならない。そこで、本実施例の制御部１４０Ｂは、誘導口１１４ｂＴを吸引に設定し、吸引量は基本吐出条件を行列マス（正方形）の１辺の長さに対する細胞Ｃと誘導口１１４ｂＴとの距離の比だけ掛け合わせ、更に、強弱制御係数（補正係数）ｋを掛け合わせることによって決定する。代替的に、制御部１４０Ｂは、誘導口１１４ｂＴを吐出に設定するが、吐出量は誘導口１１４ｂＳよりも弱く設定して細胞Ｃが図１５の右側に移動するようにしてもよい。
【００５７】
吸引口１１２ｂＬについては、Ｘ方向はｘ０＜ｘ３２＝ｘ１２でＹ方向はｙ３２＜ｙ０＜ｙ１２である。吸引口１１２ｂＭとの間に細胞Ｃがあるため吐出となる。吸引口１１２ｂＬの吐出量は基本吐出条件を行列マス（正方形）の１辺の長さに対する細胞Ｃと吸引口１１２ｂＬとの距離の比だけ掛け合わせ、更に、強弱制御係数（補正係数）ｋを掛け合わせることによって決定すればよい。
【００５８】
再び図１２に戻って、制御部１４０Ｂは、検出部１３０による検出結果に基づいて、細胞Ｃが移動を開始したかどうかを判断し（ステップ１２１２）、細胞Ｃが移動しなければ吸引吐出条件を変更する（ステップ１２１４）。また、制御部１４０Ｂは、細胞Ｃが移動したと判断した場合（ステップ１２１２）、それが、ベクトルＶにほぼ沿った所定の方向かどうかを判断し（ステップ１２１６）、ほぼ沿っていないと判断すれば吸引吐出条件を変更する（ステップ１２１８）。この場合、制御部１４０Ｂは、所定の方向とベクトルＶとのずれが許容範囲かどうかを判断するが、かかる許容範囲はユーザーが自由に決定することができる。なお、図９（ａ）及び図９（ｂ）と同様に、細胞Ｃの位置に応じて制御部１４０Ｂは吸引吐出条件を変更することができることは言うまでもない。
【００５９】
次いで、制御部１４０Ｂは、細胞Ｃの移動が所定の方向に沿っていると判断すれば（ステップ１２２０）、細胞Ｃが捕獲及び固定されたかどうかを判断する（ステップ１２２０）。次いで、制御部１４０Ｂは、細胞Ｃを捕獲した吸引口１１２ｂ（又は誘導口１１４ｂ）が目的の吸引口１１２ｂＭであるかどうかを判断し（ステップ１２２２）、そうでなければ細胞Ｃを吸引口から吐出し（ステップ１２２４）、ステップ１２０２に帰還する。一方、制御部１４０Ｂは、細胞Ｃが目的の吸引口１１２ｂＭに捕獲及び固定されたと判断すれば（ステップ１２２２）、ＤＮＡの注入など所定の処理を細胞Ｃに施す。
【００６０】
例えば、図示しない注入装置が、細胞Ｃの細胞膜に穿孔して微小針（キャピラリ）を介して遺伝子溶液及び薬剤溶液を注入する。微小針が遺伝子溶液及び薬剤溶液を細胞Ｃに注入するタイミング、注入量、注入角度、注入深さなどは注入装置の制御部によって制御される。微小針は、細胞Ｃを穿孔するのに十分な鋭利な先端部を有し、その直径は、例えば、１μｍ程度である。このようなインジェクション方式を採用することによって、細胞と導入物質の組合せの制限を受けずに、注入の成功率を高めることができる。
【００６１】
以上説明したように、本実施例によれば、複数の吸引口１１２ｂが、細胞Ｃを個別に吸引、吸引停止、ある実施例では更に吐出と吐出停止を行うことができ、捕獲処理の効率を向上することができる。また、細胞処理装置はインジェクション方式を採用しているので、細胞と導入物質の組合せの制限を受けず、また、注入の成功率を高く維持することができる。
【００６２】
本発明は更に以下の事項を開示する。
【００６３】
（付記１）  液体中に浮遊する複数の微小物体を捕獲するための捕獲装置であって、それぞれ各物体を吸引可能な複数の吸引口を含む捕獲部を有し、前記複数の吸引口による吸引は、独立して動作可能であることを特徴とする捕獲装置。（１）
（付記２）  液体中に浮遊する複数の微小物体を捕獲するための捕獲装置であって、それぞれ各物体を吸引可能な吸引口を含む複数の吸引口と、前記複数の吸引口による吸引を個別に制御する制御部とを有することを特徴とする捕獲装置。（２）
（付記３）  前記捕獲装置は、前記吸引口と前記物体を検出する検出部を更に有し、前記制御部は、前記検出部による検出結果に基づいて前記複数の吸引口による吸引を個別に制御することを特徴とする付記２記載の捕獲装置。
【００６４】
（付記４）  前記制御部は、各吸引口によって吸引された前記物体に所定の処理が終了したかどうかに基づいて、前記複数の吸引口による吸引を個別に制御することを特徴とする付記１記載の捕獲装置。
【００６５】
（付記５）  前記吸引口は前記物体の吐出が可能であり、前記制御部は、前記複数の吸引口による吐出を個別に制御することを特徴とする付記２記載の捕獲装置。
【００６６】
（付記６）  前記制御部は、各吸引口によって吸引された前記物体に所定の処理が終了したかどうかに基づいて、前記複数の吸引口による吐出を個別に制御することを特徴とする付記５記載の捕獲装置。
【００６７】
（付記７）  前記制御部は、各吸引口によって吸引された前記物体に所定の処理が終了したかどうかに基づいて、前記複数の吸引口による吸引を個別に制御することを特徴とする付記１記載の捕獲装置。
【００６８】
（付記８）  前記物体を前記吸引口のうちの所定の吸引口に誘導する誘導口を含む誘導部を更に有することを特徴とする付記１又は２記載の捕獲装置。（３）
（付記９）  前記捕獲装置は、前記物体の位置を検出する検出部を更に有し、前記制御部は、前記検出部による検出結果に基づいて前記誘導口による誘導を制御することを特徴とする付記８記載の捕獲装置。
【００６９】
（付記１０）  前記液体の吸引及び吐出が可能な複数の誘導口が設けられ、前記制御部は、前記複数の吸引口の吸引及び前記複数の誘導口の吸引及び吐出を個別に制御することを特徴とする付記８又は９記載の捕獲装置。
【００７０】
（付記１１）  前記誘導口が前記物体を誘導するために加える力の方向は限定された方向であり、当該方向は変更可能に構成されていることを特徴とする付記８乃至９のうちいずれか一項記載の捕獲装置。
【００７１】
（付記１２）  液体中に浮遊する複数の微小物体を捕獲するための捕獲方法であって、前記複数の微小物体のうち目的の物体を吸引可能な複数の吸引口のうち前記物体に最も近い目的の吸引口を決定するステップと、前記目的の吸引口に前記物体を誘導する一又は複数の目的の誘導口を複数の誘導口の中から選択するステップと、前記目的の吸引口の吸引力と前記目的の誘導口の吸引力及び／又は吐出力を設定するステップとを有することを特徴とする捕獲方法。（４）
（付記１３）  前記設定ステップは、前記目的の物体の重心から前記目的の吸引口の中心とを結ぶ方向に前記物体が移動するように前記吸引力及び／又は吐出力を設定することを特徴とする付記１２記載の捕獲方法。
【００７２】
（付記１４）  前記設定ステップは、前記複数の吸引口のうちで前記目的の吸引口以外の吸引口を誘導用の吸引口として選択するステップと、前記誘導用の吸引口の吸引力及び／又は吐出力を設定するステップとを有することを特徴とする付記１２記載の捕獲方法。
【００７３】
（付記１５）  前記誘導用の吸引口を選択するステップは、前記物体を中心に配置するマトリックスを設定し、当該マトリックスに含まれる吸引口の中から前記誘導用の吸引口を選択することを特徴とする付記１２記載の捕獲方法。
【００７４】
（付記１６）  前記設定ステップの設定内容で前記目的の物体の捕獲を開始した後で、前記物体の位置情報に基づいて前記設定内容を変更するステップを更に有することを特徴とする付記１２記載の捕獲方法。（５）
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明の第１の実施例としての細胞処理装置の概略斜視図である。
【図２】図１に示す細胞処理装置の捕獲部の概略斜視図である。
【図３】図１に示す細胞処理装置の動作の一例を示す概略斜視図である。
【図４】本発明の第２の実施例としての細胞処理装置の概略斜視図である。
【図５】図４に示す細胞処理装置の動作を示すフローチャートである。
【図６】図４に示す細胞処理装置の動作の一例を示す概略斜視図である。
【図７】本発明の第３の実施例としての細胞処理装置の概略斜視図である。
【図８】図７に示す細胞処理装置の動作を示すフローチャートである。
【図９】図９（ａ）は、図８に示す細胞処理装置において細胞の誘導を開始した直後の状態を示す概略平面図であり、図９（ｂ）は、図８に示す細胞処理装置において細胞がある程度誘導された後の状態を示す概略平面図である。
【図１０】本発明の第４の実施例としての細胞処理装置の概略斜視図である。
【図１１】本発明の第５の実施例としての細胞処理装置の概略斜視図である。
【図１２】図１１に示す細胞処理装置の動作を説明するためのフローチャートである。
【図１３】図１３（ａ）乃至図１３（ｃ）は、図１１に示す細胞処理装置において、細胞検出方法を説明するための概略平面図である。
【図１４】図１４（ａ）乃至図１４（ｃ）は、図１１に示す細胞処理装置において、細胞を捕獲すべき吸引口の設定とその誘導を説明するための平面図である。
【図１５】図１１に示す細胞処理装置において、細胞を誘導するための吸引口と誘導口の吸引吐出条件の決定方法を説明するための概略平面図である。
【符号の説明】
【００７６】
１００、１００Ａ−Ｄ      細胞処理装置
１１０                    捕獲基材
１２０、１２０Ａ          吸引部
１３０                    検出部
１４０、１４０Ａ−Ｂ      制御部
１５０                    誘導部
【図１】
2006149226.tif 000003
【図２】
2006149226.tif 000004
【図３】
2006149226.tif 000005
【図４】
2006149226.tif 000006
【図５】
2006149226.tif 000007
【図６】
2006149226.tif 000008
【図７】
2006149226.tif 000009
【図８】
2006149226.tif 000010
【図９】
2006149226.tif 000011
【図１０】
2006149226.tif 000012
【図１１】
2006149226.tif 000013
【図１２】
2006149226.tif 000014
【図１３】
2006149226.tif 000015
【図１４】
2006149226.tif 000016
【図１５】
2006149226.tif 000017