(57)【要約】      （修正有）【課題】任意の与えられた標的部位を認識するジンクフィンガードメインを提供する。【解決手段】ジンクフィンガードメインをコードするアミノ酸配列、ＸaーＸ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5ーＣｙｓーＸ3−Ｘa−Ｘ−ＣｙｓーＸーＳｅｒ−ＡｓｎーＸbーＸーＡｒｇ−ＨｉｓーＸ3-5ーＨｉｓ（ここでＸaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド、および該ポリペプチドをコードする配列を含む核酸を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号６８）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項３】
アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号６９）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項４】
請求項３に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項５】
アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７０）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項６】
請求項５に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項７】
アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｘb−Ｘ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７１）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載されたポリペプチドをコードする配列を含有する核酸。
【請求項９】
アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｖａｌ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘｃ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７２）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基であり、Ｘｃは、セリンまたはスレオニンである）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項１０】
請求項９に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項１１】
アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７３）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項１３】
アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７４）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項１５】
アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘｃ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７５）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項１７】
配列番号６５で示されるアミノ酸配列と６０％相同性なアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項１９】
配列番号２９、１２７、１２９、１３１、１３３及び１３５からなる群より選択されたアミノ酸配列と６０％相同なアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項２１】
アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５０）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項２２】
請求項２１に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項２３】
アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５１）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項２５】
アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５２）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項２６】
請求項２５に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項２７】
アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５３）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２７に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項２９】
アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５４）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項３０】
請求項２９に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項３１】
アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５５）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項３２】
請求項３１に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項３３】
アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５６）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項３４】
請求項３３に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項３５】
アミノ酸配列、Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５７）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項３６】
請求項３５に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項３７】
アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｘb−Ｘ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５８）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項３８】
請求項３７に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項３９】
アミノ酸配列、Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５９）（ここで、Ｘaは、フェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは、疎水性残基である）を含む精製されたポリペプチド。
【請求項４０】
請求項３９に記載されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項４１】
配列番号１３７で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有する精製されたポリペプチド。
【請求項４２】
請求項４１に記載されたポリペプチドをコードする配列を含有する核酸。
【請求項４３】
配列番号１４５で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有する精製されたポリペプチド。
【請求項４４】
請求項４３に記載されたポリペプチドをコードする配列を含有する核酸。
【請求項４５】
配列番号１４９で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有する精製されたポリペプチド。
【請求項４６】
請求項４５に記載されたポリペプチドをコードする配列を含有する核酸。
【請求項４７】
配列番号１４１で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有する精製されたポリペプチド。
【請求項４８】
請求項４７に記載されたポリペプチドをコードする配列を含有する核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写因子のようなＤＮＡ−結合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
大部分の遺伝子は、通常プロモーターまたはエンハンサー領域内にある、特定のＤＮＡ部位に結合するポリペプチド転写因子により転写レベルが調節される。これらのタンパク質は、プロモーター部位でＲＮＡポリメラーゼにより転写開始を活性化または抑制し、それにより標的遺伝子の発現を調節する。活性化因子であれ抑制因子であれ、多くの転写因子は、構造的にモジュールである。そのようなモジュールは、構造的に別個のドメインとして組み合わせ可能であり、ＤＮＡ結合、二量体化または転写機構（transcriptional machinary）との相互作用のような特異的な機能を有する。活性化ドメインまたは抑制ドメインのような効果ドメインは、非相同のＤＮＡ結合ドメインに転移されても、その機能を維持する〔Brent and Ptashne、(1985)Cell 43:729-36; Dawson et al.,(1995)Mol. Cell Biol. 15:6923-31〕。ジンクフィンガードメイン（zinc finger domain）、ホメオドメイン（homeodomain）、及びヘリックス−ターン−ヘリックス（helix-turn-helix）ドメインを含む多くのＤＮＡ結合ドメインの３次構造がＮＭＲ及びＸ線結晶構造解析データから決定されている。
【０００３】
〔要約〕
本発明は、キメラ転写因子を同定し、製造するための、迅速で大規模な細胞的方法を提供する。そのような転写因子は、例えば、生物医学及び生物工学的応用において内生遺伝子の発現を変化させるために使用され得る。転写因子は、生体内、すなわち、無傷の生細胞内で検査される。また、本発明は、本発明の方法を、例えばゲノム配列のスクリーニングに適用することにより発見され得る新規核酸結合ドメインをも含む。
【０００４】
本発明は、ＤＮＡ上の標的部位を認識するペプチドドメインを同定する方法に関する。このような同定方法は本願において「ドメイン選別法」または「生体内スクリーニング法」ということもある。前記方法は（１）リポーター構築物（reporter construct）を含有する細胞及び（２）複数のハイブリッド核酸を提供することを含む。リポーター構築物は、プロモーターに作動可能に連結されたリポーター遺伝子を有し、プロモーターは、招集部位（recruitment site）及び標的部位（target site）を有する。リポーター遺伝子は、転写因子がプロモーターの招集部位及び標的部位を全て認識する場合（すなわち、基準を越える程度の結合時）には所定のレベルを超過して発現するが、転写因子がプロモーターの招集部位のみを認識する場合にはその限りでない。複数のハイブリッド核酸のそれぞれは、（ｉ）転写活性化ドメイン、（ii）招集部位を認識するＤＮＡ結合ドメイン、及び（iii）試験ジンクフィンガードメインのような要素を含む非天然のタンパク質をコードする。試験ジンクフィンガードメインのアミノ酸配列は、複数のハイブリッド核酸のメンバー中で互いに異なる。前記選択方法は次を更に含む：複数のハイブリッド核酸中の一つ以上が一つ以上の細胞に入るようにする条件下で、複数の核酸を細胞と接触させること；細胞内でハイブリッド核酸が発現できるようにする条件で細胞を維持すること；細胞が、標的部位を認識する試験ジンクフィンガードメインをコードするハイブリッド核酸を含むことの指示として、所定レベル以上にリポーター遺伝子を発現する細胞を同定すること。
【０００５】
ＤＮＡ結合ドメイン、すなわち、招集部位を認識し、複数のハイブリッド構成員の中で変化しないないドメインは、例えば、一つ、二つ、三つ、またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含むことができる。前記方法に利用される細胞は原核生物細胞または真核生物細胞であっても良い。真核生物細胞の例には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、または、ピッチア パステウリス（Pichia pasteuris）のような酵母細胞；Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；及び繊維芽細胞またはリンパ球のような哺乳動物細胞を挙げることができる。
【０００６】
ここで、「所定レベル（given level）」は、転写因子が招集部位は認識するが、標的部位は認識しない場合に観察される発現量である。ある場合には、「所定レベル」は０であっても良い（少なくとも使用される検定法の検出限度内で）。
【０００７】
前記方法は、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ混合物、またはｃＤＮＡ混合物のような核酸から試験ジンクフィンガードメインをコードする核酸源（source nucleic acid）を増幅し、増幅された断片を生産する付加的な工程を含むことができる。核酸源はオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅することができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、ドメインの保存された境界をコードする核酸にアニールされる縮重オリゴヌクレオチド（例えば、相異する核酸配列を有する特定オリゴヌクレオチドのプール、またはイノシンのような非天然の塩基を有する特定オリゴヌクレオチド）のセット中の一つであり得る。また代替的に、前記プライマーは特定オリゴヌクレオチドであっても良い。増幅された断片は、前記方法に使用された複数のハイブリッド核酸に含まれるハイブリッド核酸を生産するために利用される。
【０００８】
前記方法は、次の工程を更に含むことができる：（ｉ）配列データベース中の候補ジンクフィンガードメインのアミノ酸配列を同定すること；（ii）候補ジンクフィンガードメインのアミノ酸配列をコードする候補核酸を提供すること；及び（iii）候補核酸を利用し、前述の方法に使用された複数のハイブリッド核酸に含まれるハイブリッド核酸を製作すること。前記データベースは、公知及び（または）予測されるタンパク質のような複数のアミノ酸配列に関する記録のみならず、ｃＤＮＡ、ＥＳＴｓ、ゲノムＤＮＡ、または予測されるイントロンを除去するためにコンピュータ処理されたゲノムＤＮＡのような複数の核酸配列に対する記録を含むことができる。
【０００９】
所望であれば、前記方法は第２標的部位（例えば、第１試験ジンクフィンガードメインにより認識される配列と異なる配列）を認識する第２試験ジンクフィンガードメインを同定するために反復することができる。続いて、同定された第１及び第２試験ジンクフィンガードメインの両方をコードする核酸を製作することができる。生成されるハイブリッドタンパク質は、第１試験ジンクフィンガードメインの標的部位及び第２ジンクフィンガードメインの標的部位の両方を含む標的部位を特異的に認識できるはずである。
【００１０】
本発明はまた、試験ジンクフィンガードメインがプロモーター内の標的部位を認識するか否かを決定する方法に関する。本願では、この方法を「部位選別法」とも称する。前記方法はリポーター構築物及びハイブリッド核酸を提供する工程を含む。リポーター遺伝子は、招集部位及び標的部位を含むプロモーターに作動可能に連結され、転写因子がプロモーターの招集部位及び標的部位の両方を認識する場合、所定レベルを超過するレベルにリポーター遺伝子を発現させるが、転写因子がプロモーターの招集部位のみを認識する場合にはその限りでない。ハイブリッド核酸は、（ｉ）転写活性化ドメイン、（ii）招集部位を認識するＤＮＡ結合ドメイン、及び（iii）試験ジンクフィンガードメインの要素を有する非天然生成タンパク質をコードする。前記方法は次のような工程を更に含む：リポーター構築物が細胞内に入るようにする条件下でリポーター構築物を細胞と接触させる工程；前記工程以前、以後、または前記工程と同時に、ハイブリッド核酸が細胞内に入るようにする条件下でハイブリッド核酸を細胞と接触させる工程；前記細胞をハイブリッド核酸が細胞内で発現できるようにする条件下で維持する工程；及び細胞内リポーター遺伝子の発現を検出する工程。リポーター遺伝子の発現が所定レベルより高いということは試験ジンクフィンガードメインが標的部位を認識するという指標である。
【００１１】
前記リポーター構築物及びハイブリッド核酸は、別のプラスミドにそれぞれ含まれてもよい。二つのプラスミドは細胞に同時にまたは連続的に導入することができる。一つのプラスミドまたは２つのプラスミドの両方は、選別可能マーカーを含むことができる。また、リポーター構築物とハイブリッド核酸は、同一のプラスミド中に含まれてもよく、この場合には、リポーター構築物とハイブリッド核酸を細胞に導入するために単一回の接触工程のみが必要である。また他の実施態様では、リポーター構築物及びハイブリッド核酸中の一つまたは両者が、細胞のゲノムに安全に挿入される。前記方法の場合、本願に記述された任意の生体内方法において、転写活性化ドメインは転写抑制ドメインで代替することができ、この場合には、リポーター遺伝子の発現レベルが所定レベル未満に減少する細胞を同定するようになる。
【００１２】
本発明の更なる他の方法は、２つの細胞の融合により、試験ジンクフィンガードメインの結合優先性の迅速な決定を容易にする。この方法は、リポーター遺伝子を含有する第１細胞を提供する工程；ハイブリッド核酸を含有する第２細胞を提供する工程；第１細胞及び第２細胞を融合させて融合細胞を形成する工程；融合細胞を融合細胞内でハイブリッド核酸の発現を可能にする条件下で維持する工程；及び融合細胞内リポーター遺伝子の発現を検出する工程を含み、ここで、リポーター遺伝子の発現レベルが所定レベルより高いということは試験ジンクフィンガードメインが標的部位を認識することを表す指標である。例えば、第１細胞及び第２細胞は組織培養細胞または真菌細胞であり得る。本方法の例示的な一実施態様では、酵母（S. cerevisiae）細胞が利用される。第１細胞は第１交配型（例えば、ＭＡＴａ）を有し、第２細胞は第１交配型と異なる交配型（例えば、ＭＡＴα）を有する。２つの細胞を相互に接触させれば、酵母交配（yeast mating）により第１細胞及び第２細胞の両方のゲノムを含有する核を有する単一細胞（例えば、ＭＡＴａ/α）が作られる。本方法では、全て同一な第１交配型であり、それぞれの第１細胞が相異する標的部位を有するリポーター構築物を有する、複数の第１細胞を提供することを含んでもよい。全て同一な第２交配型であり、それぞれが相異する試験ジンクフィンガードメインを有する複数の第２細胞も提供される。全ての可能な対交配（pair-wise mating）のような複数の対交配でマトリックスを作る。この方法は、複数の結合部位（例えば、可能な標的部位の全ての完全なセット）に対する複数の試験ジンクフィンガードメインの結合優先性を決定するのに利用される。
【００１３】
本発明はまた、試験ジンクフィンガードメインの結合優先性を検査する方法を提供する。本方法は、（１）本質的に全ての細胞がハイブリッド核酸を含有する細胞を提供する工程及び（２）複数のリポーター構築物を提供する工程を含む。複数のリポーター構築物のそれぞれは招集部位及び標的部位を含むプロモーターに作動可能に結合されたリポーター遺伝子を有する。リポーター遺伝子は転写因子がプロモーターの招集部位及び標的部位の両方を認識する場合には所定レベルを超過して発現されるが、転写因子が単にプロモーターの招集部位のみに結合する場合はその限りでない。複数のリポーター構築物の成員において、第２の標的部位は多様に変化する。ハイブリッド核酸は、以下の要素、すなわち、（ｉ）転写活性化ドメイン、（ii）招集部位を認識するＤＮＡ結合ドメイン、及び（iii）試験ジンクフィンガードメイン、を有するハイブリッドタンパク質をコードする。本方法は、次の工程：複数のリポーター構築物中の少なくとも一つが、少なくとも一つの細胞に入るようにする条件下で、複数のリポーター構築物を細胞と接触させる工程；細胞内の核酸発現が可能な条件で細胞を維持する工程；細胞内にリポーター構築物を含有し、所定レベル以上にリポーター構築物を発現させる細胞（リポーター構築物が所定レベル以上に発現されるということは、細胞内のリポーター構築物がジンクフィンガードメインにより認識される標的部位を有するということを表す）を同定する工程、を更に含む。
【００１４】
試験ジンクフィンガードメインが１つより多い標的部位に対して結合優先性を有する場合は、それぞれ異なる標的部位を有する複数の細胞を前記方法により同定することができる。前記方法は、最高レベルのリポーター遺伝子発現を示す細胞を同定することを更に含むことができる。別法として、リポーター遺伝子発現の臨界レベル（例えば、リポーター遺伝子発現が２、４、８、２０、５０、１００、１０００倍またはそれ以上増加するレベル）を決定し、臨界レベルを超えてリポーター遺伝子を発現させる全ての細胞を選択することもある。
【００１５】
標的結合部位は、例えば、２〜６ヌクレオチド長であり得る。複数のリポーター構築物は標的結合部位の２、３、または４またはそれ以上の位置にＡ、Ｔ、Ｇ及びＣヌクレオチドの全ての可能な組合を含むことができる。
【００１６】
また他の側面において、本発明は複数のジンクフィンガードメインを同定する方法であることをその特徴とする。この方法は、第１試験ジンクフィンガードメインを同定するためにドメイン選別法を遂行し、また第１試験ジンクフィンガードメインの標的部位とは異なる標的部位を認識する第２試験ジンクフィンガードメインを同定するためにドメイン選別法を再遂行することを含む。更に他の特徴は、キメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を生成する方法であり、この方法は第１及び第２試験ジンクフィンガードメインを同定するためにドメイン選別法を２回遂行し、第１及び第２試験ジンクフィンガードメインを含むポリペプチドをコードする核酸を構築することを含む。その核酸は、二つの下位部位（subsite）からなる部位を特異的に認識する二つのドメインを含むハイブリッドタンパク質をコードすることができる。下位部位は、それぞれ第１試験ジンクフィンガードメインの標的部位及び第２試験ジンクフィンガードメインの標的部位である。
【００１７】
また他の側面において、本発明は、ジンクフィンガードメインにより認識されるＤＮＡ配列を同定する方法に関する。本方法は、第１試験ジンクフィンガードメインに対する第１結合優先配列を同定するための部位選別法の遂行、及び第２試験ジンクフィンガードメインに対する第２結合優先配列を同定するための部位選別法の再遂行を含む。同定された第１及び第２試験ジンクフィンガードメインを全てコードする核酸を構築することができる。その核酸は、第１試験ジンクフィンガードメインの標的部位及び第２試験ジンクフィンガードメインの標的部位を含む部位を特異的に認識する２つのドメインを含むハイブリッドタンパク質をコードすることができる。
【００１８】
本発明はまた、ＤＮＡ上の標的部位を認識するペプチドドメインを同定する方法を提供する。この方法は、（１）リポーター構築物を含有する細胞及び（２）複数のハイブリッド核酸を提供することを含む。リポーター構築物は、プロモーターに作動可能に連結されたリポーター遺伝子を有し、プロモーターは、招集部位及び標的部位を有する。リポーター遺伝子は、転写因子がプロモーターの招集部位及び標的部位を全て認識する場合（すなわち、基準を越える程度の結合時）には所定レベル未満で発現されるが、転写因子がプロモーターの招集部位のみを認識する場合にはその限りでない。複数のハイブリッド核酸のそれぞれは、以下の要素、（ｉ）転写抑制ドメイン、（ii）招集部位を認識するＤＮＡ結合ドメイン、及び（iii）試験ジンクフィンガードメイン、と一緒に非天然のタンパク質をコードする。試験ジンクフィンガードメインのアミノ酸配列は、複数のハイブリッド核酸の成員中で変化がある。その方法は、次の工程：複数の核酸中の少なくとも一つが、少なくとも一つの細胞に入るようにする条件下で、複数の核酸を細胞と接触させる工程；細胞内でハイブリッド核酸が発現できるようにする条件で細胞を維持する工程；細胞が標的部位を認識する試験ジンクフィンガードメインをコードするハイブリッド核酸を含む指標として、リポーター遺伝子を所定レベル未満に発現させる細胞を同定する工程。本方法の追加実施態様も転写活性化ドメインを利用する方法と類似している。同様に、本願に記述された他のいかなる選別法も、転写活性化ドメインの代りに転写抑制ドメインを用いて遂行することができる。
【００１９】
また他の側面において、本発明の特徴は、特定の精製されたポリペプチド及び単離された核酸である。本発明の精製されたポリペプチドは、下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む：
【００２０】
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号６８）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号６９） 
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７０）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｘb−Ｘ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７１）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｖａｌ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘｃ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７２）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７３、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７４）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘｃ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号７５）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５０）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５１）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５２）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５３）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５４）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５５）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５６）、
Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５７）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｘb−Ｘ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５８）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１５９）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１６１）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１６２）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１６３）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１６４）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１６５）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１６６）、
Ｘa−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ2-5−Ｃｙｓ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｘb−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ3-5−Ｈｉｓ（配列番号１６７）、
（ここで、Ｘaはフェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘbは疎水性残基であり、Ｘｃはセリンまたはスレオニンである。）本発明の核酸は上記のポリペプチドをコードする核酸を含む。
【００２１】
また、本発明の精製されたポリペプチドは、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、１０３、１０５、１０７、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、または１５１と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９３％、９５％、９６％、９８％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を有することができる。前記ポリペプチドはポリペプチドの核酸接触残基に相応するアミノ酸位置において、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、１０３、１０５、１０７、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、または１５１と同一であり得る。または、前記ポリペプチドは、ポリペプチドの核酸接触残基に相当する残基中の少なくとも一つ以上の残基が、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、１０３、１０５、１０７、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、または１５１と異なることができる。精製されたポリペプチドはまた、非相同のＤＮＡ結合ドメイン、核局在化シグナル、小分子結合ドメイン（例、ステロイド結合ドメイン）、エピトープタグまたは精製のための配列（精製ハンドル）、触媒ドメイン（例、核酸改質ドメイン、核酸切断ドメイン、またはＤＮＡ修復触媒的ドメイン）及び／または転写機能的ドメイン（例、活性化ドメイン、抑制ドメインなど）中の一つ以上を含むことができる。本発明はまた、前記ポリペプチドをコードする単離された核酸配列、及び配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、１０２、１０４、１０６、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８または１５０、またはこれらの相補体からなるプローブ配列の単一鎖のプローブに厳しい条件下でハイブリダイズする単離された核酸配列を含む。本発明は、非相同の核酸結合ドメインに融合された本発明のポリペプチドを細胞内で発現させる方法を、更に含む。この方法は、前記融合タンパク質をコードする核酸を細胞に導入することを含む。このような本発明の核酸は、誘導可能プロモーター（例、ステロイドホルモン調節性プロモーター、小分子調節性プロモーター、またはテトラシクリンTet-On及びTet-Offシステムのような操作された誘導性システム）のような非相同の核酸配列により作動可能に調節され得る。
【００２２】
「塩基接触位置」という用語は、配列番号２１のアミノ酸、アルギニン７３、アスパラギン酸７５、グルタミン酸７６、及びアルギニン７９に構造的に対応するジンクフィンガードメインの４つのアミノ酸の位置をいう。これらの位置はまた−１、２、３、及び６位と称されることもある。問合せ配列において、塩基接触位置に相応する位置を同定するためには、問合せ配列のシステイン及びヒスチジン残基がＺｉｆ２６８のフィンガー３のシステイン及びヒスチジン残基と並ぶように問合せ配列を問題のジンクフィンガードメインと整列させる。ヨーロッパ生物情報研究所（European Bioinformatics Institute）のＣｌｕｓｔａｌＷ  ＷＷＷサービス （http://www2.ebi.ac.uk/clustalw；Thompson et al（1994））Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）は、配列整列の一つの簡単な方法を提供する。
【００２３】
「非相同の（heterologous）」という用語は、人為的に構成に導入されたポリペプチドであり、その構成に天然のには存在しないポリペプチドをいう。内生のものとの区別においては、非相同のポリペプチドは、いかなる天然に生じるポリペプチド中の側面に位置しない少なくとも１つの側面に位置するポリペプチド配列を有していてもよい。「ハイブリッド」という用語は、（ｉ）少なくとも２つの天然に存在する異なった配列；（ii）少なくとも一つの人工配列（すなわち、天然に存在しない配列）及び一つの天然に存在する配列；または（iii）少なくとも二つの人工配列中のいずれか一つから由来するアミノ酸配列を含有するポリペプチドを指す。人工配列の例には、天然のに存在する配列の突然変異及び新たに設計された配列がある。
【００２４】
本願で使用された「厳しい条件下でハイブリダイズする」という用語は、４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（６×ＳＳＣ）中でハイブリダイズさせ、次いで、６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄する条件を指す。
【００２５】
「結合優先性（binding preference）」という用語は、ポリペプチドが、他の結合部位に比べて一つの核酸結合部位を選別的に選択する識別力を指す。例えば、核酸結合部位に比較してポリペプチドが量的に制限されている場合、本願に記述された生体内または生体外の検査法で選好されない部位より選好される部位に更に多量のポリペプチドが結合するはずである。
【００２６】
本願で使用される「認識（する）」という用語は、一つの核酸結合部位と第２の競合部位とを識別するポリペプチドの能力を指し、したがって、例えば、本願に記述された検査では第２の部位の過剰存在下において、ポリペプチドが、第１の結合部位に結合したままで残るようになる。このポリペプチドは、単独で第１の結合部位に対して十分な親和性を有しなくてもよいが、本発明のハイブリッドポリペプチドとして、隣接する招集部位に結合する他の核酸結合ドメインと融合された場合には、検査され得る。
【００２７】
本願において用いられる「縮重オリゴヌクレオチド」とは、（ａ）相異するオリゴヌクレオチドの集団、及び（ｂ）一つ以上の配列にアニーリングできる単一種のオリゴヌクレオチド（例えば、イノシンのような非自然的ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド）の両方を意味する。
【００２８】
本発明は、多様な利点を提供する。特定配列を認識するＤＮＡ結合ドメインを選別できる能力は、ＤＮＡの特定部位に結合する新規ポリペプチドの設計を可能にする。したがって、本発明は選択された標的の発現を調節することができる（例えば、病源体が必要とする遺伝子を抑制することができ、癌増殖が必要とする遺伝子を抑制することができ、または発現が良くできない遺伝子または突然変異タンパク質をコードする遺伝子を活性化または過剰発現することができる）新規ポリペプチドの必要に応じた生産を容易にする。
【００２９】
ジンクフィンガードメインの使用は特に有利である。第一に、ジンクフィンガーモチーフは、非常に多様なＤＮＡ配列を認識する。第二に、自然発生的ジンクフィンガータンパク質の構造は、単位モジュール性である。例えば、「Ｅｇｒ−１」とも呼ばれるＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質は三つのジンクフィンガードメインが直列で構成されている。図１は、ＤＮＡと複合体をなした三つのフィンガーからなるＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質のＸ線決定構造である〔Pavletich and Pabo, (1991)Science 252:809-817〕。各フィンガーはＤＮＡ認識部位の３−４塩基対と独立に接触する。したがって、それぞれのフィンガーと接触した下位部位（subsite）は、独立的な分子的認識と見なされ得る。同一なポリペプチド鎖において複数のジンクフィンガー単位モジュールが協同効果を発揮することにより高親和度結合が達成される。
【００３０】
生体内選別工程の使用は、細胞内環境でＤＮＡの特定部位に結合するポリペプチドの直接的同定を可能にする。細胞、特に真核細胞において、認識に関連した因子らは、試験官内の選別シナリオ中に存在する因子らとは大いに異なる。例えば、真核細胞核において、ポリペプチドは特定核酸結合部位に対して無数に多くの異なる核タンパク質と競争しなければならない。ヌクレオソーム（nucleosome）またはその他のクロマチンタンパク質が結合部位を占めたり閉鎖したり、またはこの結合部位に競争的に作用できる。たとえ結合されていないとしても、細胞内の核酸構造は、折りたたみ、スーパーコイリング、捩れ、及び解捩に付される。反面、ポリペプチド自体は、その他の因子の中で、プロテアーゼ及びシャペロンに、露出されている。その上、ポリペプチドは、全体遺伝子の結合可能な部位と直面するようになり、そのようにして選別工程で選別されるためには所望の部位への高い特異性がなければならない。生体内の選別とは対照的に、生体外の選別は最高の特異性を有する結合物よりも、最高の親和性を有する結合物を選択することができる。
【００３１】
発現されたポリペプチドキメラの結合能力を示すためにリポーター遺伝子を使用することは効果的で簡単であるのみならず、タンパク質−核酸接触面のエネルギー学、結合接触面に影響を与える周辺残基及びヌクレオチドのような数多くの周辺因子を計算に入れた複雑な相互作用コードを開発する必要がないため有利である〔Segal et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2758-2763〕。
【００３２】
本発明は、それ自体でヒトゲノム、または他のいかなるゲノムに存在する全てのジンクフィンガードメインを有用にする。この、ジンクフィンガードメインの構造的フォルディングが占有する配列空間の多様なサンプリングは、自然選択の永年に本来備わった更なる利点を有することができる。その上、宿主種からのドメインを利用することにより、本願に記述された方法による遺伝子治療適用のために設計されたＤＮＡ結合タンパク質は宿主免疫応答によって非自己と取扱われる可能性が減少する。
【００３３】
一つ以上の本発明の詳細な実施態様を添付図面及び下記説明により提示する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、この説明及び図面、及び請求項から明白になるであろう。
【００３４】
詳細な説明
本発明は、試験ジンクフィンガードメインの核酸結合優先性を決定するための新たなスクリーニング法に関する。この方法は、多様なＤＮＡ結合ドメイン、これらドメインの多様な源泉及び数多くのライブラリー設計、数多くのリポーター遺伝子、及び数多くの選別及びスクリーニングシステムに適用することができる。このスクリーニング方法は高効率の基盤として遂行できる。このスクリーニング方法から得た情報は人工核酸結合タンパク質を設計する方法に直ちに利用され得る。この設計方法は、試験ジンクフィンガードメインの結合優先性を利用してキメラ核酸結合タンパク質のモジュラー組立に導く。設計されたタンパク質は、前記スクリーニング方法で更に最適化されたり、または変形され得る。
【００３５】
ＤＮＡ結合ドメイン
本発明は、相異する結合特異性を有する核酸結合ドメインの集合体を利用する。高い親和性及び高い特異性で、核酸に結合する多様なタンパク質構造が知られている。これらの構造は、核酸の機能を特異的に制御するために、無数の異なるタンパク質において繰り返し用いられる（二重螺旋ＤＮＡを認識する構造的モチーフ検討のために、例えば文献〔Pabo and Sauer (1992) Annu. Rev. Biochem. 61:1053-95; Patikoglou and Burley (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 289-325;及びNelson (1995) Curr Opin Genet Dev. 5:180-9〕参照）。核酸結合ドメインに対する幾つかの非制限的な例は次の通りである。
【００３６】
ジンクフィンガー。ジンクフィンガーは、約３０個のアミノ酸残基からなる小さいポリペプチドドメインであり、その中には、システインまたはヒスチジンである４個のアミノ酸が、亜鉛イオンと配位結合をすることができるように、適切に間隔を置いて配置されている（図１参照；検討のために例えば文献〔Klug and Rhodes (1987) Trends Biochem. Sci. 12: 464-469 (1987); Evans and Hollenberg (1988) Cell 52: 1-3; Payre and Vincent (1988) FEBS Lett. 234: 245-250; Miller et al. (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Berg (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:99-102;及びRosenfeld and Margalit (1993) J. Biomol. Struct. Dyn. 11: 557-570〕参照）。したがって、ジンクフィンガードメインは、亜鉛イオンと配位結合をする残基の種類により、例えば、Ｃｙｓ2−Ｈｉｓ2類、Ｃｙｓ2−Ｃｙｓ2類、Ｃｙｓ2−ＣｙｓＨｉｓ類などに分類できる。Ｃｙｓ2−Ｈｉｓ2ジンクフィンガーで亜鉛と配位結合する残基は典型的に  Ｘa−Ｘ−Ｃ−Ｘ2-5−Ｃ−Ｘ3−Ｘa−Ｘ5−Ψ−Ｘ2−Ｈ−Ｘ3-5−Ｈ（ここで、ψ（プサイ）は疎水性残基である）のように配置されており〔Wolfe et al., (1999) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 3:183-212〕（配列番号７６）、ここで「Ｘ」は任意のアミノ酸を表し、Ｘaはフェニルアラニンまたはチロシンであり、下付き添字はアミノ酸の個数を指し、二つの下付き添字は介入するアミノ酸の典型的な範囲を指す。逆平行（anti-parallel）βシートが短いか、非理想的であるか、又は存在しなくてもよいが、典型的に、介入するアミノ酸は折りたたまれ、αヘリックスに対して充填される逆平行βシートを形成する。この折りたたみは、亜鉛と配位結合する側鎖が、亜鉛イオンと配位結合するのに適合した四面体構造中にあるように配置される。塩基接触残基はフィンガーのＮ−末端にあり、かつ、先行するループ領域にある（図２）。ジンクフィンガーＤＮＡ−結合タンパク質は、通常、三つ以上のジンクフィンガードメインの直列配置で構成される。
【００３７】
ジンクフィンガードメイン（「ＺＦＤ」）は、最もありふれた真核生物ＤＮＡ−結合モチーフ中の一つであり、酵母から高等植物及びヒトに至る多様な種で発見される。ヒトゲノムのみにも少なくとも数千種のジンクフィンガードメインが存在することと推測される。ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガータンパク質から単離することができる。ジンクフィンガータンパク質の非制限的な例には、ＣＦ２−II、クルペル（Kruppel）、ＷＴ１、バソヌクリン（basonuclin）、ＢＣＬ−６／ＬＡＺ−３、赤芽球クルペル−様転写因子、転写因子Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３及びＳｐ４、転写抑制剤ＹＹ１、ＥＧＲ１／Ｋｒｏｘ２４、ＥＧＲ２／Ｋｒｏｘ２０、ＥＧＲ３／Ｐｉｌｏｔ、ＥＧＲ４／ＡＴ１３３、Ｅｖｉ−１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＬＩ３、ＨＩＶ−ＥＰ１／ＺＮＦ４０、ＨＩＶ−ＥＰ２、ＫＲ１、ＺｆＸ、ＺｆＹ及びＺＮＦ７などがある。
【００３８】
下記電算的方法は、配列決定されたゲノム中の、または核酸データベース中の、全てのジンクフィンガードメインを同定するために用いられ得る。任意のジンクフィンガードメインを利用することができる。また、人工ジンクフィンガードメインが、例えば、電算的方法により設計された〔例えば、Dahiyat and Mayo(1997) Science 278:82-7〕。Dahiyat and Mayoのジンクフィンガーは、ジンクフィンガーの折りたたみは採択するが、その核に亜鉛イオンを含有しない。したがって、これは亜鉛イオンと配位結合するという機能的能力というよりは、そのポリペプチド骨格の、天然ジンクフィンガーの折りたたみとの構造的な類似性によるジンクフィンガーである。
【００３９】
ホメオドメイン。ホメオドメインは、ＤＮＡの小さい溝（minor groove）と接触するＮ−末端腕及び続いて大きい溝（major groove）と接触する３個のαヘリックスで構成される単純な真核生物ドメインである〔例えば、Laughon、(1991) Biochemistry 30:11357-67参考〕。第三のαヘリックスは大きい溝中に位置し、決定的なＤＮＡ−接触側鎖を含有する。ホメオドメインは第三のαヘリックスに引導するターンに存在する高度に保存された特徴的なモチーフを有する。このモチーフはドメインの疎水性コア内に存在する不変トリプトファンを含む。このモチーフはプロサイト（Prosite）データベース（http://www.expasy.ch/参考）にＰＤＯＣ０００２７として公知となっている（〔Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｆ／Ｙ／Ｇ〕−〔Ａ／Ｓ／Ｌ／Ｖ／Ｒ〕−Ｘ（２）−〔Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ａ／Ｃ／Ｎ〕−Ｘ−〔Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ〕−Ｘ（４）−〔Ｌ／Ｉ／Ｖ〕−〔Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｅ／Ｓ／Ｔ／Ａ／Ｉ／Ｙ〕−〔Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｋ／Ｈ〕−Ｗ−〔Ｆ／Ｙ／Ｖ／Ｃ〕−Ｘ−〔Ｎ／Ｄ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｈ〕−Ｘ（５）−〔Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ａ／Ｉ／Ｍ／Ｗ〕；配列番号７７）。ホメオドメインは、細胞同一性を決定し、有機体の発生過程で位置的な情報を提供する転写因子でしばしば発見される。そのような古典的なホメオドメインは、ゲノム中にクラスターで発見することができ、クラスター中のホメオドメインの順番は、ボディー軸（body axis）に沿ったホメオドメインの発現パターンに大体相当している。ホメオドメインは、例えば、Ｈｏｘ−１のようなホメオドメインとのアラインメントにより、またはホメオドメインプロファイルまたはホメオドメイン隠れマルコフモデル（hidden Markov Model；ＨＭＭ；下記参照）、例えば、PfarmデータベースのＰＦ０００４６またはＳＭＡＲＴデータベースの「ＨＯＸ」との整列により（http://smart.embl-heidelberg.de/）、または前記のプロサイトモチーフＰＤＯＣ０００２７により同定可能である。
【００４０】
ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質。このＤＮＡ結合モチーフは、多くの原核生物転写因子中でしばしば発見される。例えば、ＬａｃＩ族、ＡｒａＣ族など、多くの亜族がある。名称において二つのヘリックスはＤＮＡの大きい溝に対して位置し、第二のαヘリックスをＤＮＡの大きい溝内に配置する第一のαヘリックス及びこのようにＤＮＡの大きい溝に位置する第二のαヘリックスである。これらドメインはＨＭＭ、例えば、ＳＭＡＲＴデータベースから得られるＨＴＨ＿ＡＲＡＣ、ＨＴＨ＿ＡＲＳＲ、ＨＴＨ＿ＡＳＮＣ、ＨＴＨ＿ＣＲＰ、ＨＴＨ＿ＤＥＯＲ、ＨＴＨ＿ＤＴＸＲ、ＨＴＨ＿ＧＮＴＲ、ＨＴＨ＿ＩＣＬＲ、ＨＴＨ＿ＬＡＣＩ、ＨＴＨ＿ＬＵＸＲ、ＨＴＨ＿ＭＡＲＲ、ＨＴＨ＿ＭＥＲＲ及びＨＴＨ＿ＸＲＥプロファイルとのアラインメントにより同定される（http://smart.embl-heidelberg.de/）。
【００４１】
ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質。このＤＮＡ結合ドメインは、例えば、ＭｙｏＤ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、Ｅ１１及びミオゼニンのようなホモ−及びヘテロ−二量体転写因子間に共通的に発見される。このドメインは、二量体及びその間のループからなり、各単量体は二つのαヘリックスにかけて結合する。このドメインは、例えば、ＳＭＡＲＴデータベース（http://smart.embl-heidelberg.de/）で利用可能な「ＨＬＨ」プロファイルのようなＨＭＭとのアラインメントにより同定できる。たとえヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質は、典型的に二量体性であるが、ポリペプチドリンカーを二つのサブユニット間に設計して単一オープンリーディングフレーム（open reading frame）が二つのサブユニット及びリンカーをコードさせることにより単量体性バージョンを構築することができる。
【００４２】
ＤＮＡ−結合ドメインの同定
多様な方法を使用して構造ドメインを同定することができる。
電算的方法（Computational Method）。本明細書に記述された方法により単離されたＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列を公知配列のデータベース、例えば、タンパク質配列の注釈をつけたデータベースまたは核酸結合ドメインに対する記入を含む注釈をつけたデータベースと比較できる。また他の実施面では、非特性化された配列、例えば、注釈を付けていないゲノム配列、ＥＳＴまたは全長ｃＤＮＡ配列；特性化された配列、例えば、SwissProtまたはＰＤＢ；及びドメイン、例えば、Pfarm、ProDom（http://www.tooulouse.inra.fr/）、及びＳＭＡＲＴ（Simple Modular Architecture Research Tool, http://smart.embl-heidelberg.de/）のデータベースが核酸結合ドメイン配列の源泉を提供できる。問合せアミノ酸配列と比較するために核酸配列データベースを全ての６個の読み枠（reading frame）に翻訳することができる。候補核酸結合ドメインをコードするという標識をされた核酸配列は、適当な核酸源、例えば、ゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡから増幅できる。そのような核酸配列は、発現ベクタにクローニングできる。コンピュータに基づいたドメイン同定の前記手順は、オリゴヌクレオチド合成器及びロボットシステムと連係させて高い効率でドメインをコードする核酸を生産することができる。候補ドメインをコードするクローン化された核酸は、宿主発現ベクタに貯蔵し、制限酵素媒介サブクローニングまたは部位−特異的組換え酵素媒介サブクローニング（米国特許第５,８８８,７３２号参照）によりＺｉｆ２６８フィンガー１及び２と共に発現ベクタ、例えば、翻訳融合ベクタ内に導入させることができる。高い作業処理量のため、相異する候補核酸結合ドメインをコードする核酸を含有する複数のマイクロタイタープレートを生成するため、高効率の基盤（platform）を用いることができる。
【００４３】
出発配列またはプロファイルからドメインを同定する細詳な方法は、当業界に周知である。例えば、プロサイト（〔Hofmann et al.,(1999) Nucleic Acids Res. 27:215-219〕参照）、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ（〔Altschul et al.,(1990) J.Mol.Biol. 215:403-10〕参照）などが参照できる。簡単なストリング検索を遂行して問合せ配列または問合せプロファイルに対する同一性を有するアミノ酸配列を見出すことができ、例えば、Perl（http://bio.perl.org/）を使用してテキストファイルをスキャニングすることができる。このように同定された配列は、初期入力配列に対して約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の同一性を表すことができる。
【００４４】
問合せドメインと類似したドメインを公共データベース、例えば、文献〔Altschul et al.,(1990)J.Mol.Biol. 215:403-10〕のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して同定することができる。例えば、スコア＝５０、単語長＝３のＸＢＬＡＳＴ変数を使用してＢＬＡＳＴタンパク質検索を遂行することができる。文献〔Altschul et al.,(1997) Nucleic Acids Res.25(17): 3389-3402〕に記述されているように、問合せ配列または検索された配列に間隔を導入することができる。ＸＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムに対するディフォルト変数はhttp://www.ncbi.nlm.nih.govサイトで求めることができる。
【００４５】
プロサイトプロファイルＰＳ０００２８及びＰＳ５０１５７を使用してジンクフィンガードメインを同定することができる。ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ公表の８０,０００個のタンパク質配列において、これらプロファイルはそれぞれ３１８９及び２３１６個のジンクフィンガードメインを見出した。多様な相異する技法を使用して関連したタンパク質の多重配列アラインメントからプロファイルが構築できる。グリブスコフ（Gribskov）及びその同僚ら〔Gribskov et al.,(1990)Meth.Enzymol.183:146-159〕は記号比較表を利用し、残基頻度分布が提供された多重配列アラインメントを各位置に対する重さに転換した。例えば、プロサイトデータベース及び文献〔Luethy et al.,(1994) Protein Sci.3:139-1465〕の作業が参照できる。
【００４６】
関心のあるＤＮＡ結合ドメインを代表する隠れマルコフモデル（Hidden Markov Models；HMM's）は、例えば、パーム（Pfarm）データベース、リリース２．１のようなそのようなモデルのデータベースから生成され又は得ることができる。追加的なドメインを見出すために、例えば、前記ディフォルト変数を使用してＨＭＭでデータベースを検索することができる（例えば、ディフォルト変数のためにhttp://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search参照）。または、使用者は前記変数を最適化させることができる。境界スコアを選択して配列データベースを濾過することにより、境界以上のスコアを有する配列が候補ドメインとして表示されるようにすることができる。Pfarmデータベースの説明は、文献〔Sonhammer et al.,(1997) Proteins 28(3):405-420〕で見出すことができ、ＨＭＭに関する詳細な説明は、例えば、文献〔Gribskov et al.,(1990) Meth.Enzymol.183:146-159; Gribskovetal., (1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4355-4358; Krogh et al.,(1994) J.Mol.Biol.235:1501-1531;及びStultz et al.,(1993) Protein Sci.2:305-314〕で見出すことができる。
【００４７】
ＨＭＭのＳＭＡＲＴデータベース（Simple Modular Architecture Research Tool, http://smart.embl-heidelberg.de/;文献〔Schultz et al.,(1998) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 95:5857;及びSchultz et al.,(2000) Nucl.Acids Res 28:231〕）は、ＨＭＭｅｒ２検索プログラム（文献〔Durbin et al.,(1998) Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press.〕;http://hmmer.wustl.edu/）のヒドン・マルコフモデルでプロファイルすることにより同定されたジンクフィンガードメインのカタログ（ＺｎＦ＿Ｃ２Ｈ２；ＺｎＦ＿Ｃ２Ｃ２；ＺｎＦ＿Ｃ２ＨＣ；ＺｎＦ＿Ｃ３Ｈ１；ＺｎＦ＿Ｃ４；ＺｎＦ＿ＣＨＣＣ；ＺｎＦ＿ＧＡＴＡ；及びＺｎＦ＿ＮＦＸ）を提供する。
【００４８】
ハイブリダイゼーションに基づいた方法。多様な形態のＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸集合体を分析してアミノ末端及びカルボキシ末端の保存された境界配列をコードする配列プロファイルを得ることができる。そのような保存された境界配列をコードする核酸配列に混成化できる縮重オリゴヌクレオチドが設計できる。また、そのような縮重オリゴヌクレオチドの有効性はそれらの組成と公知となったゲノム配列上の可能なアニーリング部位の頻度を比較することにより評価され得る。複数反復された設計により縮重オリゴヌクレオチドを最適化することができる。例えば、公知のＣｙｓ2−Ｈｉｓ2ジンクフィンガーを比較することにより、天然配列中の隣接フィンガー間のリンカー地域の共通配列が明らかになった（文献〔Agata et al.,(1998) Gene 213:55-64〕参照）。そのような縮重オリゴヌクレオチドは、複数のＤＮＡ結合ドメインを増幅させるのに使用される。増幅されたドメインを試験ジンクフィンガードメインとしてハイブリッド核酸に挿入し、後続的に、本明細書に記述された方法により標的部位への結合を分析する。
【００４９】
ライブラリー設計
この方法は、ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸の集合体（例えば、プラスミド、ファージミドまたはフアージライブラリーの形態）において機能的核酸結合特性のスクリーニングを可能にする。前記集合体は、多様な群のＤＮＡ結合ドメインがコードでき、更には相異する構造的折りたたみを有するドメインもコードできる。一例として、前記集合体はジンクフィンガードメインのような単一の構造的折りたたみのドメインをコードする。下記方法が、ジンクフィンガードメインに関して記述されたが、当業者であれば、これを他の類型の核酸結合ドメインに応用できるはずである。
【００５０】
ドメイン突然変異。さらに一例において、前記核酸集合体は、縮重パターンライブラリーから組立てられる構造ドメインをコードする核酸で構成される。例えば、ジンクフィンガーの場合、公知ジンクフィンガーのアラインメントを、各位置における最も適合したアミノ酸を同定するために用いることができる。別法として、構造的研究及び突然変異誘発（mutagenesis）実験を、各位置のアミノ酸の望ましい特性を決定するために用いることができる。任意の核酸結合ドメインを、突然変異を導入するための構造的基盤として用いることができる。特に、核酸と結合する部位に非常に近接した位置またはそのような位置に隣接した位置を突然変異誘発のための標的にすることができる。パターン化された縮重ライブラリーを使用することにより、突然変異した試験ジンクフィンガードメインを、突然変異位置における可能なアミノ酸の小集団に限定することができる。各位置に前記プロファイルをコードするために縮重コドンセットを使用することができる。例えば、疎水性残基のみを、脂肪族残基のみをまたは親水性残基のみをコードするコドンセットが利用可能である。折りたたまれたポリペプチドをコードする全長クローンについて、前記ライブラリーを選別することができる。文献〔Cho et al.,(2000) J.Mol.Biol. 297(2):309-19〕では、縮重オリゴヌクレオチドを使用してそのような縮重ライブラリーを製造する方法を提供し、また全長ポリペプチドをコードするライブラリー核酸を選別する方法を提供する。このような核酸は本明細書に記載された選別法のために、便利な制限酵素切断部位または転位酵素（transposase）または組換え酵素（recombinase）認識部位を使用して発現プラスミドに容易に挿入することができる。
【００５１】
適当なコドン及び所定の位置における各ヌクレオチドの相対比率の選択は、遺伝子コードを表す表を簡単に調査したり、または電算的アルゴリズムにより決定できる。例えば、前記チョー（Cho）らの文献には、要望される縮重タンパク質配列を受け付け、その配列をコードする望ましいオリゴヌクレオチド設計を出力する電算プログラムが記載されている。
【００５２】
天然の種類のドメインの単離。ドメインライブラリーをヒトのような真核生物のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから構築することができる。このために複数の方法が可能である。例えば、前記したように、利用可能なアミノ酸配列のコンピューター検索によりドメインが同定できる。各ドメインをコードする核酸を単離し、例えば、プロモーター、活性化ドメイン及び選別マーカーを含有するベクターのような、細胞内での発現に適当なベクターに挿入することができる。また他の例において、保存されたモチーフにハイブリダイズする縮重オリゴヌクレオチドを、例えば、ＰＣＲによりこのモチーフを含有する複数の関連ドメインを増幅するために用いることができる。例えば、クルペル様Ｃｙｓ2Ｈｉｓ2ジンクフィンガーを、文献〔Agata et al.,(1998) Gene 213:55-64〕の方法により増幅することができる。この方法はまた、例えば、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（Ｇｌｕ／Ｇｌｎ）−（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）−Ｐｒｏ−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ）（配列番号７８）のようなパターンを有する配列である、ジンクフィンガードメインの自然発生的リンカーペプチド配列を保持する。さらに、この方法は関心のあるドメインに限定された集合体のスクリーニングであるゆえに、選択されていないゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡ配列のライブラリーのスクリーニングとは異なり、ライブラリーの複雑性が非常に減少され、大規模ライブラリーを完全にスクリーニングすることの様的な困難のために望ましい配列を逃す可能性を減少させる。
【００５３】
ヒトゲノムは、多様なジンクフィンガードメインを含有し、このうちの多くは特徴づけされず、かつ同定されていない。ジンクフィンガードメインを有するタンパク質をコードする数千個の遺伝子があると推定される〔Pellegrino and Berg,(1991) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:671-675〕。これらヒトジンクフィンガードメインは、新規のＤＮＡ−結合タンパク質が構築され得る多様なドメインの広範囲な集合体である。各ジンクフィンガードメインが独特の３−乃至４−ｂｐ配列を認識する場合、全ての可能な３−乃至４−ｂｐ配列に結合するのに必要なドメインの総数は単に６４乃至２５６（４3乃至４4）個である。ヒトゲノムの天然レパートリーが、全ての可能な認識部位に及ぶために、充分な数の独特のジンクフィンガードメインを含有している可能性がある。これらジンクフィンガードメインは人工キメラＤＮＡ結合タンパク質を構築するための価値あるソースである。自然発生のジンクフィンガードメインは、ヒトゲノムに由来する人工的突然変異とは異なり、自然選択圧下で進化したものであり、したがって、特定のＤＮＡ配列への結合及び生体内機能のために自然的に最適化されたものであり得る。
【００５４】
ヒトジンクフィンガードメインは、例えば、遺伝子治療の応用において、人体に導入された場合に免疫応答を誘導する可能性が遥かに少ない。
【００５５】
特定ＤＮＡ結合特性を有するジンクフィンガードメインの生体内選別
所望のＤＮＡ認識特性を有するジンクフィンガードメインを次のような生体内スクリーニングシステムを使用して同定することができる。問題の複合結合部位をリポーター遺伝子の上流に挿入し、複合結合部位に転写活性化ドメインを誘引・招集することにより、リポーター遺伝子の転写が所定レベル以上に増加するようにした。固定されたＤＮＡ結合ドメインに融合された試験ジンクフィンガードメイン及び転写活性化ドメインで構成されたハイブリッドタンパク質をコードする発現プラスミドを構築した。
【００５６】
複合結合部位は、少なくとも二つの要素、すなわち、招集部位及び標的部位からなる。このシステムで固定されたＤＮＡ結合ドメインが招集部位を認識するように設計される。しかし、招集部位に対する固定されたＤＮＡ結合ドメインの結合親和度は、生体内で単独にはリポーター遺伝子を転写活性化させるのに不充分な程度である。これは、対照群の実験により確認することができる。
【００５７】
例えば、細胞内で発現された場合、固定されたＤＮＡ結合ドメインは（試験ジンクフィンガードメインの不在、または非機能的であると知られたり、または公知となったＤＮＡ接触残基がアラニンのような代替アミノ酸で置換された試験ジンクフィンガードメインの存在下では）リポーター遺伝子の転写を通常のレベル以上に活性化させられてはならない。他の手段により（例えば、リポーターに対する競争的抑制剤の使用により）システムの敏感度を増加させることができるため、若干の漏出または低いレベルの活性化は許容される。固定されたＤＮＡ結合ドメインは、招集部位に安定的に結合しないことと予想される。例えば、固定されたＤＮＡ結合ドメインは約０．１nM、１nM、１μM、１０μM、１００μMまたはそれ以上の解離定数（Ｋd）で招集部位に結合することができる。標的部位に対するＤＮＡ結合ドメインのＫdは、試験ジンクフィンガードメインの不在下でまたは第２標的部位に対する特異性を有する試験ジンクフィンガードメインの不在下で、電気泳動移動検定（electrophoretic mobility shift assay；ＥＭＳＡ）により試験管内で測定可能である。
【００５８】
したがって、ハイブリッドタンパク質が細胞内複合結合部位に安定的に結合し、これによりリポーター遺伝子を活性化させるためには、例えば、複合結合部位の多様な部位等の標的部位を認識する機能的（functional）試験ジンクフィンガードメインの付着が必要である。標的部位に対する試験ジンクフィンガードメインの結合優先度により所定レベルに比べて増加したリポーター遺伝子発現をもたらす。例えば、観察された発現レベルを所定レベルで割って得られるリポーター遺伝子発現の増加倍数は約２、４、８、２０、５０、１００、１０００倍またはそれ以上であり得る。試験ジンクフィンガードメインが標的部位を認識する場合、ＤＮＡ結合ドメイン及び試験ジンクフィンガードメインを含む転写因子のＫdは、例えば、標的部位に対する特異性を有する試験ジンクフィンガードメインを欠如した転写因子に比べて増加する。例えば、特異性を有する標的部位と複合体を成した転写因子の解離定数（Ｋd）は約５０nM、１０nM、１nM、０．１nM、０．０１nMまたはそれ未満であり得る。Ｋdは試験管内ＥＭＳＡにより決定され得る。
【００５９】
試験ジンクフィンガードメインが固定ＤＮＡ結合ドメインの生体内結合親和性を増大させる能力を測定することにより、敏感で正確にＤＮＡ結合特異性が検査できるこのような発見は、ヒトゲノムから新規ジンクフィンガードメインの迅速な単離及び特性化を可能にする。
【００６０】
固定されたＤＮＡ結合ドメインは、すなわち、例えば、複数のドメインを有するか、またはオリゴマーである自然発生的ＤＮＡ−結合タンパク質等の自然発生のＤＮＡ−結合タンパク質から単離された単位的ドメインを含む。例えば、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及び２のような二つの公知のジンクフィンガーの両方を、固定されたＤＮＡ結合ドメインとして使用することができる。当業者であれば、数多くの核酸結合ドメイン（例えば、ホメオドメイン、ヘリックス−ターン−ヘリックスドメインまたはヘリックス−ループ−ヘリックスドメインのような本明細書に記載されたドメインファミリー、または当業界で特性が知られた核酸結合ドメイン）からシステムに好適な固定ＤＮＡ結合ドメインを同定することができるはずである。固定されたＤＮＡ結合ドメインにより認識される招集部位の適切な選択が更に要求される。招集部位は、固定されたＤＮＡ結合ドメインが得られた自然発生のＤＮＡ結合タンパク質に対する天然の結合部位内の下位部位（subsite）であり得る。必要に応じて、固定ドメインまたは招集部位に突然変異を導入してシステムの敏感性を増加させることができる。
【００６１】
生体内のスクリーニングシステムに適合した細胞には真核細胞及び原核細胞全てが含まれる。例示的な真核細胞には、例えば、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ポムベ（Saccharomyces pombe）及びピッチア・パストリス（Pichia pastoris）細胞のような酵母細胞などがある。
【００６２】
前記スクリーニングシステムを使用してジンクフィンガードメインを選択するために、サッカロマイセス・セレビジエを使用する酵母ワン−ハイブリッドシステムを変形させた。まず、ＨＩＳ３リポーター遺伝子をコードするリポータープラスミドを調製した。予め決定された４−ｂｐ標的ＤＮＡ配列を、切断された結合配列に連結させてＤＮＡ−結合ドメインについての複合結合配列を提供し、それぞれの複合結合配列を別個のプラスミド上のリポーター遺伝子に作動可能に連結させた。
【００６３】
ハイブリッド核酸配列は、切断されたＤＮＡ結合ドメイン及びジンクフィンガードメインを含むＤＮＡ結合ドメインに連結された転写活性化ドメインをコードする。
【００６４】
本願で使用された結合部位は、隣接した（連続的な）部位が頻繁に使用されるが、必ずしも隣接する必要はない。隣接していない部位を認識するタンパク質を調製するためには、核酸結合ドメイン間に伸縮性があるか、及び／又は、伸張性があるリンカーを使用し得る。
【００６５】
本発明の一態様によれば、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２で構成され、フィンガー３が欠如されたポリペプチドを固定されたＤＮＡ結合ドメインとして使用することができる（Ｚｉｆ２６８の３個のジンクフィンガー中、フィンガー１はＮ−末端、フィンガー２は中間、フィンガー３はＣ−末端に位置するジンクフィンガードメインを指す）。また、結合部位が特徴づけられた如何なる２個のジンクフィンガードメインでも固定されたＤＮＡ結合ドメインとして使用することができる。
【００６６】
他の有用な固定されたＤＮＡ結合ドメインは他のジンクフィンガータンパク質、例えば、Ｓｐ１、ＣＦ２−II、ＹＹ１、クルペル（Kruppel）、ＷＴ１、Ｅｇｒ２、またはＰＯＵ−ドメインタンパク質、例えば、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ２、及びＰｉｔ１から由来し得る。しかし、これらは例として提供されたものであり、本発明はこれらに限定されない。
【００６７】
本発明の一具体的な実施例によれば、最適のＺｉｆ２６８認識配列（５′−ＧＣＧ  ＴＧＧ  ＧＣＧ−３′）の５′末端から４−ｂｐを欠損させて生成された５′−ＧＧＧＣＧ−３′塩基配列が招集部位として使用され得る。３乃至４ｂｐのいかなる標的配列でも、これら招集部位に連結されて複合結合配列が生成できる。
【００６８】
活性化ドメイン。本発明で使用することができる転写活性化ドメインは、酵母のＧａｌ４活性化ドメイン及びヘルペスシンプルレックスウイルスのＶＰ１６ドメインを含むが、これに限定されない。バクテリアにおいて活性化ドメインの機能は、野生型ＲＮＡポリメラーゼαサブユニットＣ−末端ドメインまたは突然変異体αサブユニットＣ−末端ドメインを招集できる融合ドメイン（例えば、タンパク質相互作用ドメインに融合されたＣ−末端ドメイン）により摸倣できる。
【００６９】
抑制ドメイン。所望であれば、活性化ドメインの代りに抑制ドメインがＤＮＡ結合ドメインに融合され得る。真核細胞抑制ドメインの例には、オレンジ（ORANGE）、グローチョー（groucho）、及びＷＲＰＷ〔Dawson et al (1995) Mol.Cell Biol. 15:6923-31〕が含まれる。抑制ドメインを使用する時は、毒性リポーター遺伝子及び（または）非選択性マーカーを使用して減少した発現を示す個体をスクリーニングすることができる。
【００７０】
リポーター遺伝子。リポーター遺伝子は、例えば、薬物耐性を付与する遺伝子、または栄養要求性マーカーのような選択性マーカーであり得る。薬物耐性遺伝子の例には、サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）シクロヘキサミド耐性遺伝子（ＣＹＨ）、サッカロマイセス・セレビシエカナバニン耐性遺伝子（ＣＡＮ１）、及びハイグロマイシン耐性遺伝子などがある。サッカロマイセス・セレビシエ栄養要求性マーカーには、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＡＤＥ２及びＴＲＰ１遺伝子などがある。栄養要求性マーカーがリポーター遺伝子である時は、栄養要求性遺伝子の機能的コピーが欠けているため、特定代謝物質が生産できる能力が欠如された細胞が使用される。代謝物質が欠如した培地で細胞を維持することにより、標的部位に結合する試験ジンクフィンガードメインをコードする構築物の選択が可能である。例えば、ＨＩＳ３遺伝子はｈｉｓ３−酵母菌株と共に選択性マーカーとして使用され得る。ハイブリッド転写因子をコードする構築物の導入後に、細胞をヒスチジン欠乏培地上で成長させる。哺乳類細胞の選択可能マーカーには、例えば、チミジンキナーゼ、ネオマイシン耐性、及びHPRTが当業者によく知られている。
【００７１】
別法として、リポーター遺伝子がコードするタンパク質の存在を容易に確認し、及び／又は定量化することができる。そのようなリポーター遺伝子の例には、ｌａｃＺ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシファラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、青色蛍光タンパク質（BFP）及び例えば、変更されたり向上した蛍光特性を有するＧＦＰ誘導体〔Clontech Laboratories,Inc., CA〕などがある。lａｃＺを発現する細胞のコロニーは比色基質Ｘ−ｇａｌを含むプレートでコロニーを成長させることにより検出することができる。ＧＦＰ発現は、励起の上、蛍光放出を測定して検出することができる。個々のＧＦＰ発現細胞は蛍光活性化細胞分類機（ＦＡＣＳ）を使用して同定され、分離され得る。
【００７２】
このシステムは、２種類のリポーター遺伝子（例えば、選択可能リポーター遺伝子及び選択不可能リポーター遺伝子）を利用して構築され得る。選択可能マーカーは、適当な成長条件下で所望のドメインを有する細胞のみが成長するようにするので、所望のドメインの迅速な同定を容易にする。選択不可能リポーターは、例えば、偽陽性を区別するための確認手段、及び結合程度を定量化する手段を提供する。前記二つのリポーターは、ゲノムの互いに異なる位置に挿入されることができ、ゲノムに直列に挿入されることができ、同一の染色体外の要素（例えば、プラスミド）に含まれたり、または互いに異なる染色体外要素に含まれることができる。
【００７３】
図５は、所望のジンクフィンガードメインを選別するために使用された変形したワン−ハイブリッドシステムの原理を示す。ハイブリッド転写因子のＤＮＡ結合部位は（ａ）Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２からなる切断されたＤＮＡ結合部位と（ｂ）ジンクフィンガードメインＡまたはＢで構成される。リポーター遺伝子のプロモーター領域に位置した結合部位の塩基配列は、４ｂｐの標的配列（ヌクレオチド１−４，５′−ＸＸＸＸ−３′）及び切断された結合配列（ヌクレオチド５−９，５′−ＧＧＧＣＧ−３′）からなる複合結合配列（５′−ＸＸＸＸＧＧＧＣＧ−３′）である。
【００７４】
ハイブリッド転写因子内の試験ジンクフィンガードメイン（図５のＡ）が標的配列を認識するならば、ハイブリッド転写因子は複合結合配列に安定に結合できる。このような安定した結合はハイブリッド転写因子の活性化ドメインの作用（図５のＡＤ）を通じてリポーター遺伝子の発現をもたらす。その結果、ＨＩＳ３がリポーター遺伝子として使用された時、形質転換酵母はヒスチジンが欠如された培地で成長する。または、lａｃＺがリポーター遺伝子として使用された時には、形質転換酵母はlａｃＺタンパク質の基質であるＸ−gａlを含む培地で青色コロニーとして育つ。しかし、ハイブリッド転写因子のジンクフィンガードメイン（図５のＢ）が標的配列を認識するのに失敗すれば、リポーター遺伝子の発現は誘導されない。その結果、形質転換酵母はヒスチジンを欠如した培地で成長できないか（ＨＩＳ３がリポーター遺伝子として使用された時）、またはＸ−gａlを含む培地で白色コロニーとして成長するようになる（lａｃＺがリポーター遺伝子として使用された時）。
【００７５】
この改変されたワン−ハイブリッドシステムを利用する選別法は、この過程を通じて選別されたジンクフィンガードメインが細胞内環境で機能的であると立証されたため、有利である。したがって、このドメインは恐らく折りたたまれ、核に入ることができ、細胞内プロテアーゼ及び損傷が与えられる他の可能な細胞内物質に対して耐えられると推測される。その上、本願で開示された改変されたワン−ハイブリッドシステムは、所望のジンクフィンガードメインの簡単で迅速な単離を可能にする。本願の改変されたワン−ハイブリッドシステムでは、所望のジンクフィンガードメインを単離するために単１回の酵母形質転換のみを必要とする。
【００７６】
本願で記述された選別法は、例えば、植物または動物（例えば、哺乳類、例えば、ヒト）種のゲノム等のゲノムからジンクフィンガードメインを同定するのに使用することができる。また、本方法は、例えば、無作為突然変異法により調製された突然変異ジンクフィンガードメインのライブラリーからジンクフィンガードメインを同定するのに使用することができる。また、前記２つの方法は一緒に使用され得る。例えば、特定３−ｂｐまたは４−ｂｐＤＮＡ配列に対するジンクフィンガードメインがヒトゲノムから単離されなかった場合に、無作為または部位指示的突然変異誘導により調製されたジンクフィンガードメインのライブラリーを前記ドメインについてスクリーニングすることができる。
【００７７】
酵母における改変されたワン−ハイブリッドシステムが与えられた標的配列を認識し、結合するジンクフィンガードメインを選別するために望ましい方法であるが、当業者ならば酵母ワン−ハイブリッド選別法以外に他のシステムが使用され得ることが明らかなはずである。例えば、真核生物体のゲノムから由来した自然的に発見されるジンクフィンガードメインのライブラリーをスクリーニングするのにファージディスプレイ選別法が使用されることもある。
【００７８】
本発明は、多様な培養細胞にワン−ハイブリッド法を使用することを含む。例えば、標的配列に作動可能に連結されたリポーター遺伝子を培養中の原核細胞または動物または植物細胞に導入でき、そして、培養細胞をジンクフィンガードメインのライブラリーをコードするプラスミド、ファージ、またはウイルスで形質移入することができる。その後、リポーター遺伝子が活性化された単離された細胞から、標的配列を認識する所望のジンクフィンガードメインを得ることができる。
【００７９】
下記に示された実施例は、前記方法が関心のある結合部位を認識するジンクフィンガードメインが同定できることを証明する。フィンガー３に位置した多様なジンクフィンガードメインを有するハイブリッド転写因子のライブラリーを調製した。前記ライブラリーから選別された新規なジンクフィンガードメイン（例えば、ＨＳＮＫ、ＱＳＴＶ、及びＶＳＴＲジンクフィンガー；後述する）中、いずれのものも相当する親フィンガータンパク質ではＣ−末端に天然には位置しなかった。これは、ジンクフィンガードメインは単位的（モジュール性）ということと、ジンクフィンガードメインを適切に混合し、配列して新規なＤＮＡ結合ドメインが構成できるということを明確に証明する。
【００８０】
本発明の方法により選別されたジンクフィンガードメインは、適切な再配列及び組換えにより新規なＤＮＡ結合タンパク質を作るための組立単位として使用され得る。例えば、ＨＩＶ−１の共受容体であるヒトＣＣＲ５のプロモーター領域を認識する新規なＤＮＡ結合タンパク質を次のように構築することができる。ヒトＣＣＲ５のプロモーター領域は、５′−ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  Ｔ−３′（配列番号４）（図６）の１０−ｂｐ配列を含む。本願で開示された改変されたワン−ハイブリッドシステムを使用し、特異的にそれぞれ５′−ＡＧＧＧ−３′、５′−ＧＴＧＧ−３′、及び５′−ＧＡＧＴ−３′の４−ｂｐ標的配列中の一つを認識する３個のジンクフィンガードメインが単離できる。これら標的配列はＣＣＲ５標的配列中、オーバーラップする４−ｂｐ断片である。これら３個のジンクフィンガードメインを適切なリンカーで連結し、調節ドメイン（例えば、ＶＰ１６ドメイン及びＧＡＬ４）または抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ）に付着させ、ＣＣＲ５プロモーターに特異的に結合する新規の転写因子が生成できる。これらジンクフィンガータンパク質はＨＩＶ−１増殖の防止を助けるために遺伝子治療に使用されることができる。
【００８１】
高効率スクリーニング
下記方法は、複数の可能性のあるＤＮＡ結合部位や、更には全ての可能なＤＮＡ結合部位に対する集合体内の各ドメインの相対的生体内結合親和性の迅速な測定を可能にする。核酸結合ドメインをコードする核酸の大規模集合体を製造した。各核酸結合ドメインはハイブリッド核酸構築物で試験ジンクフィンガードメインとしてコードされ、一つの交配型の酵母菌株で発現される。これにより、全ての可能なまたは所望のドメインを発現する第１セットの酵母菌株が製造される。リポーター構築物内に前記ドメインの推定標的部位についてのリポーター構築物を含有する酵母菌株の第２セットを反対の交配型で製造する。それぞれ異なる試験ジンクフィンガードメインと異なる標的部位リポーター構築物を有する、融合された細胞のマトリックスを生成するために、本方法は、複数のまたは全ての可能性のある対交配の遂行を要求する。それぞれの融合された細胞について、リポーター遺伝子の発現が測定される。これにより本方法は迅速で難しくなく試験されるドメインらの結合優先性を決定する。
【００８２】
例えば、与えられたプロファイルに一致する推定ドメインをゲノムデータベースを調査することにより、ドメインの集合体が同定された。前記集合体は、例えば、１０〜２０個のドメイン、または全ての同定されたドメイン、可能には、数千個またはそれ以上を含む。データベースで同定された、ドメインをコードする核酸は、合成オリゴヌクレオチドを使用して増幅する。前記合成オリゴヌクレオチドを設計する手作業のまたは自動化された方法は、本技術分野で通常のことである。追加的なドメインをコードする核酸は縮重プライマーで増幅され得る。前記集合体のドメインをコードする核酸を前記記述された酵母発現プラスミドにクローニングして、このドメインとＺｉｆ２６８の初めの二つのフィンガー及び転写活性ドメインとの融合タンパク質が生成できる。複数のドメインをコードする核酸をクローニングするために増幅及びクローニング工程をマイクロタイタープレート形式で行う。
【００８３】
または、酵母発現ベクタに前記ドメインをコードする複数の増幅された核酸を速かに挿入するために組換えクローニング方法を使用することができる。この方法は、米国特許第５，８８８，７３２及び「ゲートウェイ」マニュアル（Life Technologies-Invitrogen、CA、USA）に記述されており、増幅プライマー端に位置−特異的組換え酵素（recombinase）のための必要に応じた部位を含めることを必要とする。発現ベクターは、ドメインをコードする増幅された核酸が挿入される位置に追加的な部位を含む。これらの部位は終結コドンが欠如されるように設計された。増幅産物、発現ベクター、及び部位特異的な組換え酵素の添加は、組換え反応による増幅された配列のベクターへの挿入をもたらす。例えば、首尾のよい挿入で毒性遺伝子が置換される等の追加的な特徴は、この方法を効率の高いものとし、高効率の生体内スクリーニングに好適なものとする。
【００８４】
制限酵素媒介の及び／又は組換えのクローニングは、それぞれの確認されたドメインをコードする核酸を発現ベクターに挿入するのに使用され得る。このベクターはバクテリア中で増殖でき、索引されたマイクロタイタープレートで凍結できるため、それぞれのウェルが互いに異なる、唯一無二なＤＮＡ結合ドメイン中の一つをコードする一つの核酸を有している一つの細胞を含めることができる。
【００８５】
それぞれのドメインについて単離されたプラスミドＤＮＡを得て、一つの酵母細胞、例えば、サッカロマイセス・セレビシエＭＡＴａ細胞に形質転換させる。発現ベクタが選択可能マーカーを有しているため、形質転換された細胞はマーカーが選別できる栄養条件の最小培地で育つことができる。前記細胞を後日の使用のために、例えば、マイクロタイタープレートで凍結貯蔵することができる。
【００８６】
酵母菌株の第２セットを、例えば、サッカロマイセス・セレビシエＭＡＴα細胞に構築する。この酵母菌株セットは多様な相異するリポーターベクターを含む。その後、唯一なＤＮＡ結合ドメインを有する発現ベクタを含有するそれぞれの酵母菌株を前記リポーター遺伝子セットのそれぞれの酵母菌株と交配させる。これら２菌株は互いに反対の交配型であり、互いに異なる栄養要求性を有するように遺伝子操作されたため、二倍体が容易に選別できる。このような二倍体はリポーター及び発現ベクターの両方を有する。この細胞はまた、リポーター及び発現プラスミドの両方共が選別できる栄養条件下で維持される。ユエツら（2000, Nature 403:623-7）は、このような酵母交配のマトリックスを作製し、全ての酵母タンパク質の完壁なツー−ハイブリッド地図を記述している。
【００８７】
リポーター遺伝子発現は、高容量の形式（例えば、マイクロタイタープレート）でも感知できる。例えば、ＧＦＰをリポーターとして使用する時、交配された細胞のマトリックスを含むプレートを蛍光についてスキャンできる。
【００８８】
新規なＤＮＡ結合タンパク質の単位体の組立
適切なジンクフィンガードメインを混合し、配合して目的の９−ｂｐまたはそれ以上のＤＮＡ配列を認識する新たなＤＮＡ結合タンパク質を合理的に構築することができる。ジンクフィンガードメインの単位体的構造は、新たなＤＮＡ結合タンパク質を構築するためのそれらの再配列を容易にする。図１に示されているように、天然に生成されるＺｉｆ２６８タンパク質におけるジンクフィンガードメインはＤＮＡ二重螺旋に沿って一列で位置する。それぞれのドメインは相異する３−４ｂｐＤＮＡセグメントを独立に認識する。
【００８９】
ジンクフィンガードメインのデータベース。前述のワン−ハイブリッド選別システムは可能な３−４塩基対結合部位のそれぞれに対し、一つ以上のジンクフィンガードメインを同定するのに使用され得る。その結果は、マトリックスまたはデータベース（例えば、相関的なデータベース）として貯蔵され得る。データベースはそれぞれの部位に結合するジンクフィンガードメインの相対的な親和性についての指示事項を含んでいてもよい。
【００９０】
また、前記ジンクフィンガードメインらの標的配列特異性を立証するために、これらを複数の相異する融合タンパク質に融合された状況で検査できる。さらに、少量のドメインのみが利用可能な特定の結合部位は、追加的な選別スクリーニングの標的となり得る。このような選別のためのライブラリーは、類似しているが明確に区別される結合部位に結合するジンクフィンガードメインに突然変異を誘導して調製できる。可能性のあるドメインを最大に活用するために、標的結合部位に対してドメインを交叉させることができるため、それぞれの可能な結合部位に対するジンクフィンガードメインの完全なマトリックスは必須なものではない。このような交叉は、最も有用な３−４塩基対結合部位における結合部位を分析し、更にまたジンクフィンガードメイン間のリンカーの長さを変化させることにより達成できる。設計されたポリペプチドが部位選択性及び高い親和度を全て有するようにするためには、所望の部位に対し、高い特異性を有するジンクフィンガードメインの両側を、更に高い親和度を有するが、特異性が劣る他のドメインと接するように連結させることができる。本願で記述された生体内スクリーニング方法は、人工的に組立てられたジンクフィンガータンパク質及びこれらの誘導体の生体内機能、親和性、及び特異性を試験するのに利用できる。同様に、本方法は、例えば、多様なリンカー組成のライブラリー、ジンクフィンガードメイン単位体のライブラリー、ジンクフィンガードメイン組成のライブラリーなどのライブラリーを製造すること等により、組立されたタンパク質を最適化するのに使用され得る。
【００９１】
標的部位の分解。標的９−ｂｐまたはそれ以上のＤＮＡ配列は、３−４ｂｐのセグメントに分解される。それぞれの分解された３−４ｂｐセグメントを認識するジンクフィンガードメインを同定する（例えば、前記にて言及のデータベースから）。例えば、２０ｂｐ乃至５００ｂｐ配列の、より長い標的配列も、その配列内で９ｂｐ、１２ｂｐ、及び１５ｂｐ下位配列を同定することができるため、標的配列として適している。特に、データベースによく現れている部位に分解できる下位配列は、最初の設計標的として機能できる。
【００９２】
組立された単位体の製造。隣接した３−４ｂｐ下位部位または近傍の下位部位を認識する複数のジンクフィンガードメインを含むようにポリペプチドを設計する。設計されたポリペプチド配列をコードする核酸配列は、合成することができる。合成遺伝子を構築することは、この技術分野では日常的なことである。そのような方法には、必要に応じて合成されたオリゴヌクレオチド、ＰＣＲ媒介されたクローニング、及びメガプライマーＰＣＲからの遺伝子構築などがある。例えば、ライブラリーを形成するため、複数の核酸配列を合成することができる。その認識特異性が前記位置に適合する異なったジンクフィンガードメインをコードするように任意の与えられた位置で変化するドメインをコード核酸ライブラリーを設計できる。各位置でジンクフィンガードメインの同一性を変化させるために、セクシュアル（Sexual）ＰＣＲ及び「ＤＮＡシャッフリングTM」（Maxygen, Inc., CA）が使用され得る。
【００９３】
ペプチドリンカー。ＤＮＡ結合ドメインは、多様なリンカーにより連結され得る。リンカーの有用性と設計はこの技術分野でよく知られている。特に有用なリンカーは核酸によりコードされるペプチドリンカーである。したがって、第一のＤＮＡ結合ドメイン、ペプチドリンカー、及び第二のＤＮＡ結合ドメインをコードする合成遺伝子を構築することができる。このような設計は大規模の人工の複数−ドメインＤＮＡ結合タンパク質を構築するために反復できる。PCT WO 99/45132及びキム及びパボ（1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2812-7）は、ジンクフィンガードメインらを連結するのに好適なペプチドリンカーの設計を記述している。
【００９４】
ランダムコイル、α−ヘリックス、又はβ−プリーツの３次構造を形成する追加的なペプチドリンカーが使用できる。好ましい柔軟性のあるリンカーを形成するポリペプチドは、この技術分野でよく知られている〔例えば、Robinson and Sauer(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:5929-34参照〕。柔軟性のあるリンカーは、典型的にグリシンを含むが、これはグリシンアミノ酸が側鎖が欠如されていて回転自由度のある唯一なアミノ酸であるためである。親水性を増加させるために、セリンまたはトレオニンをリンカーに挿入することができる。併せて、結合親和性を増加させるためにＤＮＡのリン酸骨格と相互作用可能なアミノ酸が使用され得る。前記アミノ酸の賢明な使用により、親和性を上げることと配列特異性が減少することの間のバランスを取ることができる。仮りに、リンカーとして、厳格な伸張性が望ましいのであれば、文献〔Pantoliano et al.(1991) Biochem. 30:10117-10125〕に記述された螺旋リンカーのようなα−ヘリックスリンカーを使用することができる。また、リンカーはコンピュータモデリングにより設計できる（米国特許第４,９４６,７７８参照）。分子モデリングのためのソフトウェアを購入して使用することができる〔例えば、Molecular Simulations, Inc., San Diego, CAから〕。このようなリンカーは、標準的な突然変異誘導技術及びタンパク質工学の技術分野で用いられる生物理学的テストを利用し、本願に記述された機能的分析を使用し、任意に最適化、すなわち、例えば、抗原性を減少させるか、及び／又は安定性を増加させることができる。
【００９５】
ジンクフィンガードメインを活用した実施のために、ジンクフィンガー間で天然に生成されるタンパク質を、フィンガーを互いに連結するのに使用することができる。前記天然に生成されるリンカーとして典型的なものは、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ）−（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）−Ｐｒｏ−（Ｔｙｒ−Ｐｈｅ）（配列番号７８）である（agata et al. 前記参照）。
【００９６】
二量体化ドメイン。ＤＮＡ結合ドメインを連結する他の方法は、二量体化ドメイン、特に異種二量体化ドメイン〔Pomerantz et al.(1998) Biochemistry 37:965-970参照〕を使用することである。この実施態様では、ＤＮＡ結合ドメインが別個のポリペプチド鎖中に存在する。例えば、第一のポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインＡ、リンカー及びドメインＢをコードする反面、第二のポリペプチドは、ドメインＣ、リンカー及びドメインＤをコードする。当業者は、特性が明らかになった多くの二量体化ドメインから一つの二量体化ドメインを選択することができる。同種二量体が望ましくないとすれば、異種二量体化を好むドメインを使用することができる。特に適用可能な二量体化ドメインは、コイル化されたコイルモチーフ（例えば、二量体平行または逆平行コイル化されたコイル）である。優先的に異種二量体を形成するコイル化されたコイルをまた利用することができる〔Lumb and Kim、(1995) Biochemistry 34:8642-8648〕。二量体化ドメインの他の種類であって二量体化が小分子により、または信号伝達経路を通じて誘発されるものがある。例えば、ＦＫ５０６の二量化形態は、二つのＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインを二量体化するのに使用され得る。このような二量体化ドメインは追加的な調節工程を提供するために利用され得る。
【００９７】
機能性検査（Functional Assays）及び使用
生化学的検査に加えて、核酸結合ドメインまたは本願で記述された方法（例えば、単位体組立）により設計されたタンパク質の機能を生体内で検査できる。例えば、標的部位（例えば、細胞増殖に必要な遺伝子のプロモーター部位）に結合するドメインが選択され得る。単位体組立により、（１）標的プロモーター部位にまたがる下位部位にそれぞれ結合するように選択されたドメイン及び（２）ＤＮＡ抑制ドメイン（例えば、ＷＲＰＷドメイン）を含むタンパク質が設計できる。
【００９８】
設計されたタンパク質をコードする核酸配列は、例えば、Kang及びKimの文献〔2000, J. Biol. Chem. 275:8742〕により記述された誘導性発現ベクターなどの発現ベクターにクローニングできる。このような構造体を組織培養細胞または胚性幹細胞に形質感染させることにより、対象モデルとしてのトランスジェニック組織が生成できる。このようなトランスジェニック動物モデルでタンパク質の発現を誘導し、組織培養細胞の細胞増殖を調査したり、または発生学的変化及び（または）腫瘍成長を調査して、設計されたタンパク質の効率が決定できる。併せて、標的にした遺伝子の発現レベルは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットのようなｍＲＮＡを検出する一般的な方法により検査できる。更に完壁な測定のためには設計されたタンパク質を発現する細胞と発現しない細胞からｍＲＮＡを精製する。このようなｍＲＮＡの二つのプールを利用して、大規模な遺伝子集合物（例えば、関心のある条件（例えば、癌）に関係した遺伝子の集合物または生物体のゲノムで同定された遺伝子の集合物）に対するプローブを含有するマイクロアレイを探知する。このような検査は、設計されたタンパク質の特異性を決定するのに特に有用である。万が一、設計されたタンパク質が高い親和度を有するものの、低い特異性を有すれば、予想される標的遺伝子以外に遺伝子の発現にも影響を与えて多面的で望ましくない効果を持たらすことがある。このような効果は転写物の全体的な分析により明らかになる。
【００９９】
加えて、設計されたタンパク質は、内生の遺伝子を調節するために、対象細胞又は対象組織中で産生することができる。設計されたタンパク質は、内生の遺伝子の領域に結合させるため、及び転写活性化又は抑制機能を与えるために、上記のように改変される。Kang及びKim（上記）に記載されているように、プロモーターの誘導物質の濃度を調整することにより、内生の遺伝子の発現を、濃度依存的方法で調節することができる。
【０１００】
結合部位優先性検査
各ドメインの結合部位優先性は、ＥＭＳＡ、ＤＮａｓｅフットプリント法（footprinting）、表面プラスモン共鳴法、またはカラム結合のような生化学的検査により確認することができる。結合に必要な基質には、標的部位を含む合成オリゴヌクレオチドを使用することができる。このような検査は、非特定ＤＮＡを競合物として、または特定ＤＮＡ配列を競争体として含むことができる。特定競争体ＤＮＡには、一つ、二つ、または三つの核酸突然変異を有する認識部位が使用され得る。したがって、生化学的検査により所定部位に対するドメインの親和度のみならず、他の部位に対する所定部位の相対的親和性も測定できる。レバー及びパボ〔Rebar and Pabo, 1994, Science 263:671-673〕は、ＥＭＳＡからジンクフィンガードメインに対する絶対Ｋd常数を得る方法を記述している。
【０１０１】
本発明は、下記実際的な実施例を通じて更に具体的に記述されるはずである。しかし、これら実施例は本発明の範囲を制限しようとする意図から提供されたものでないことに留意すべきである。
【０１０２】
実施例１：ハイブリッド転写因子発現のためのプラスミドの製造
ジンクフィンガー転写因子を発現する発現プラスミドを、ｐＰＣ８６〔Chevray & Nathans(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793〕を改変して調製した。以下に記述されるＤＮＡ操作は文献〔Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (1998), John Wiley & Sons, Inc.〕に提示された一般的な方法により遂行した。ｐＰＣ８６内のＳａlIとＥｃｏＲＩ認識場所間にＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入してｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆを作った。このクローニング工程の結果は、酵母Ｇａｌ４転写活性化ドメインにＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質が連結された翻訳融合タンパク質をもたらす。ｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆを酵母菌細胞に形質転換させれば、Ｇａｌ４活性化ドメインとＺｉｆ２６８ジンクフィンガーを含むハイブリッド転写因子が発現される。ｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆ内にクローニングされたＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質をコードするＤＮＡ配列を図９に表した。
【０１０３】
ジンクフィンガードメインのライブラリーを構築するためのベクターとして、ｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆプラスミドを利用した。ｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆは、ｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆのフィンガー３コーディング部位前に終止コドンとＰｓｔＩ認識配列を含むオリゴヌクレオチドカセットの挿入により構築される。前記オリゴヌクレオチドカセットは、二つの合成オリゴヌクレオチド、すなわち、５′−ＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＴＴＧＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＴＴＴＧ−３′（配列番号７９）及び５′−ＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴＴＡＡＧＧＣＴＴＣＴＣＧＣＣＧＧＴＧ−３′（配列番号８０）をアニーリングして形成される。終止コドンの挿入は、Ｚｉｆ２６８のフィンガー３をコードするプラスミドライブラリーの生成を防止する。
【０１０４】
下記「実施例２」に記載のとおり、プラスミドはジンクフィンガードメインライブラリーの作成のためのべクターとして用いた。
【０１０５】
加えて、個別のジンクフィンガードメインをコードするＤＮＡ配列のギャップ修復クローニングを、ハドソンら（１９９７、Genome Research 7:1169-1173）記載に細部の改変を施して行った。
【０１０６】
個別のジンクフィンガードメインをクローン化するため、オーバーラップした２つのオリゴヌクレオチドを合成した。それぞれのオリゴヌクレオチドは、第２ラウンドのＰＣＲ（再ＰＣＲ）のための２１ヌクレオチド長の共通の尾部を５′末端に含み、当該個別のジンクフィンガードメインをコードする核酸にアニーリングする特異的配列を含む。順向き及び逆向きのプライマーは、それぞれ、５′−ＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＧＣＣＡＧＡＡＡＣＣＣＮ48-51−３′（配列番号１０８）及び、５′−ＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＡＣＣＧＧＴＮ42-45−３′（配列番号１０９）（ここで、Ｎ48-51及びＮ42-45は、ジンクフィンガードメインをコードする核酸にアニーリングさせるための必要に応じた配列に相当する）である。二本鎖ＤＮＡは、テンプレートの核酸を、２つのオリゴヌクレオチドの等モルの混合物と一緒に増幅することによって調製した。ＰＣＲ条件は、９４℃３分での第１サイクルに続き、９４℃１分、５０℃１分及び７２℃３０秒での５サイクルからなる。
【０１０７】
その後、それぞれのジンクフィンガードメインをコードする二本鎖ＤＮＡを、第２ラウンドＰＣＲにおいてテンプレートとして用いた。再ＰＣＲプライマーは２つの領域を有し、１つの領域は、酵母ベクターｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆと同一であり、第二の領域は、上記２１ヌクレオチド長の共通の尾部配列と同じである。順向きプライマーの配列は、
５′−ＴＧＴＣＧＡＡＴＣＴＧＣＡＴＧＣＧＴＡＡＣＴＴＣＡＧＴＣＧＴＡＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＴＣＣＧＧＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＧＣＣＡＧＡＡＡＣＣＣ−３′（配列番号１３８）
及び逆向きプライマーの配列は、
５′−ＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＴＡＣＴＴＡＧＡＧＣＴＣＧＡＣＧＴＣＴＴＡＣＴＴＡＣＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＡＣＣＧＧＴ−３′（配列番号１３９）
である。反応混合液は、２５ul中に、それぞれのプライマーを２．５pmol、Ｍｇ2+を１．５mM、Ｔａｑポリメラーゼ２unit及びＰｆｕポリメラーゼ０．０１unitを含む。反応は、９４℃３分、その後９４℃１分、６５℃１分及び７２℃３０秒で２０サイクルを回して行った。ギャップ修復クローニングは、再ＰＣＲ産物の混合物及び、ＭｓｃＩ及びＥｃｏＲＩで消化した直線化したｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆベクターを酵母ＹＷ１細胞に形質移入することによって行った。酵母ベクターｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆと同一の領域は、細胞中のベクターでの相同的組換えを可能にする。
【０１０８】
実施例２：ジンクフィンガードメインライブラリーの製造
天然に存在するジンクフィンガードメインのプラスミドライブラリーをヒトのゲノムからジンクフィンガードメインをクローニングすることにより製造した。縮重プライマー及びＰＣＲを利用してヒトのゲノムＤＮＡ（Promega Corporation；米国ウィスコンシン州マジソン）からジンクフィンガードメインをコードするＤＮＡ断片を増幅した。ヒトジンクフィンガードメインをクローニングするために使用された縮重ＤＮＡプライマーのＤＮＡ配列は次の通りである。
【０１０９】
５′−ＧＣＧＴＣＣＧＧＡＣＮＣＡＹＡＣＮＧＧＮＳＡＲＡ−３′（配列番号８１）及び
【０１１０】
５′−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＮＮＢＲＷＡＮＧＧＹＹＴＹＴＣ−３′（配列番号８２）
【０１１１】
（ここで、ＲはＧ及びＡを表し、ＢはＧ、Ｃ及びＴを表し、ＳはＧ及びＣを表し、ＷはＡ及びＴを表し、ＹはＣ及びＴを表し、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ及びＴを表す）。
【０１１２】
前記塩基配列は、多くの天然に生成されるジンクフィンガータンパク質のジンクフィンガードメイン間の接合点で発見されるアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ／Ｇｌｎ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ／Ｐｈｅ（配列番号 ８３）をコードする核酸配列にアニーリングする〔Agata et al.(1998) Gene 213:55-64〕。
【０１１３】
ＰＣＲのバッファ組成は、ＫＣｌ  ５０mM、ＭｇＣｌ2  ３mM、Ｔｒｉｓ（pH８．３）１０mMである。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添加した後、９４℃で３０秒、４２℃で６０秒、７２℃で３０秒を３５回反復した後、７２℃で１０分間の最終温置をした。
【０１１４】
前記ＰＣＲ産物を次の通りｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆにクローニングした。ＰＣＲ産物を電気泳動して１２０ｂｐに相当するＤＮＡ断片を単離した。ＢｓｐＥＩとＥｃｏＲＩで消化した後、これをｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆに連結した。結果的に、このプラスミドライブラリーがコードするハイブリッド転写因子のＤＮＡ−結合ドメインはＺｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２とヒトゲノムから由来したジンクフィンガードメインで構成される。全１０6個の大腸菌形質転換体からプラスミドライブラリーを調製した。前記ライブラリー製造方法によれば、ジンクフィンガードメイン間で発見される天然に存在するリンカー配列が維持される。
【０１１５】
実施例３：ジンクフィンガードメインライブラリーの製造
無作為突然変異生成により突然変異ジンクフィンガードメインのライブラリーを調製した。Ｚｉｆ２６８のフィンガー３をポリペプチド骨格（framework）として使用した。無作為突然変異は、配列番号２１（Ｚｉｆ２６８のフィンガー３）の７３位（アルギニン）、７５位（アスパラギン酸）、７６位（グルタミン酸）、７７位（アルギニン）、７８位（ライシン）及び７９位（アルギニン）にそれぞれ該当する、αヘリックスに沿って−１、２、３、４、５、６位のアミノ酸に無作為突然変異を導入した。
【０１１６】
これらアミノ酸をコードする核酸配列位置のそれぞれに無作為化コドン、すなわち、５′−（Ｇ／Ａ／Ｃ）（Ｇ／Ａ／Ｃ／Ｔ）（Ｇ／Ｃ）−３′のコドンを導入した。この無作為化コドンは２０個のアミノ酸のうち、トリプトファン、チロシン、システイン、フェニルアラニンを除いた１６個のアミノ酸中の一つをコードする。前記無作為化コドンは、可能な終止コドン三種を除外させる。突然変異が挿入された位置を除いた残りの部分はＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質のフィンガー３と同一である。前記無作為化コドンは、下記二つのオリゴヌクレオチド
５′−ＧＧＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＡＴＧＴＣＣＡＧＴＣＧＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＴＡＧＡＡＧＡＴＴＣ−３′（配列番号８４）
５′−ＣＴＣＣＣＣＧＣＧＧＴＴＣＧＣＣＧＧＴＧＴＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＡＴＧＳＮＢＳＮＢＡＡＧＳＮＢＳＮＢＳＮＢＳＮＢ
【０１１７】
ＴＧＡＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣＡＣＡＡＧ−３′（配列番号８５）（ここで、ＢはＧ、Ｔ及びＣを表し、ＳはＧ及びＣを表し、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ及びＴを表す。）から製造されたオリゴヌクレオチドカセットとして導入される。
【０１１８】
前記二つのオリゴヌクレオチドをアニーリングした後、常温で３０分間クレノウポリメラーゼを使用して二重鎖にした後、ＡｖａＩとＳａｃIIで処理し、これをＳｇｒＡＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃIIで処理したｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆ（実施例１参照）に挿入した。総１０9個の形質転換された菌株からプラスミドを分離し、ジンクフィンガー転写因子を指定するプラスミドのライブラリーを製造した。
【０１１９】
実施例４：リポータープラスミドの製造
酵母ＨＩＳ３遺伝子を含むリポータープラスミドを、ｐＲＳ３１５Ｈｉｓ（Wang & Reed(1993), Nature 364, 121-126）を改変して調製した。前記リポータープラスミドはまた、このプラスミドを有する形質転換体の選別のための目的でＬＥＵ２マーカーをその天然のプロモーター下に含む。まず、ｐＲＳ３１５Ｈｉｓ内のSａlI認識配列を除去するためにｐＲＳ３１５ＨｉｓをSａlIとＢａｍＨＩで処理した後得られた小さい断片と、同じプラスミドをＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処理した後得られた大きい断片を結合させてｐＲＳ３１５ＨｉｓΔＳａｌを作った。その後、オリゴヌクレオチドデュプレックスをＢａｍＨＩとＸｍａＩ間のｐＲＳ３１５ＨｉｓΔＳａｌに挿入してＨＩＳ３遺伝子のプロモーター部位にＳａｌＩ認識配列を導入した。互いにアニーリングされて挿入されるデュプレックスを形成する二つのオリゴヌクレオチド配列は
５′−ＣＴＡＧＡＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＧ−３′（配列番号８６）
５′−ＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＴ−３′（配列番号８７）
である。その結果生成されたプラスミドをｐＲＳ３１５ＨｉｓＭＣＳと命名した。
【０１２０】
ｐＲＳ３１５ＨｉｓＭＣＳに所望の複合配列を挿入して多様なリポータープラスミドを作った。前記複合配列は複合配列の４コピーを含む直列配列（tandem array）として挿入される。前記標的配列はＨＩＶ−１のＬＴＲで発見される１０−ｂｐＤＮＡ配列
５′−ＧＡＣＡＴＣ  ＧＡＧ  Ｃ−３′（配列番号１）ＨＩＶ−１ＬＴＲ（−１２４／−１１５）
５′−ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  Ｔ−３′（配列番号２）ＨＩＶ−１ＬＴＲ（−２３／−１４）
５′−ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＧＡＣ  Ｔ−３′（配列番号３）ＨＩＶ−１ＬＴＲ（−９５／−８６）
及びヒト遺伝子ＣＣＲ５のプロモーターに存在する１０ｂｐ配列（図６参照）
５′−ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  Ｔ−３′（配列番号４）ヒトＣＣＲ５（−７０／−７９）
５′−ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＡＣＡＴ−３′（配列番号５）ヒトＣＣＲ５（＋７／＋１６）
から由来したものである。
【０１２１】
これらそれぞれの１０−ｂｐＤＮＡ配列のうち、４−ｂｐ標的部位成分を分析することにより、この部位を認識するジンクフィンガードメインを同定した。モジュール性組合せ方法を利用し、このようなジンクフィンガードメインをカップリングすることにより、生体内で前記部位が認識できるＤＮＡ結合タンパク質を調製することができる。
【０１２２】
図６において、下線部分は４−ｂｐの標的塩基配列の例を表す。これらそれぞれの４−ｂｐ標的配列はＺｉｆ２６８のフィンガー１及び２により認識される塩基配列である５′−ＧＧＧＣＧ−３′の５−ｂｐ招集配列に連結される。このように生成された９−ｂｐ配列は複合結合配列を構成する。それぞれの複合結合配列は５′−ＸＸＸＸＧＧＧＣＧ−３′の形式を有するが、ここで、ＸＸＸＸは４−ｂｐ標的配列であり、隣接した５′−ＧＧＧＣＧ−３′は招集配列である。
【０１２３】
図７は、ｐＲＳ３１５ＨｉｓＭＣＳ内のリポーター遺伝子に作動可能に連結された、複合結合部位の直列配列が挿入された塩基配列を示す。それぞれの直列配列は複合結合部位の塩基配列の４コピーが配置されている。それぞれの結合部位に対し、二つのオリゴヌクレオチドを合成してアニーリングした後、ｐＲＳ３１５ＨｉｓＭＣＳのSａlIとＸｍａI場所に連結してリポータープラスミドを作った。
【０１２４】
実施例５：具体的リポータープラスミドの製造
３塩基対の微小部位に対し、それぞれ一対のリポーター（すなわち、一つはlａｃＺ、他の一つはＨＩＳ３）を含むリポータープラスミドのセットを次のように構築した。リポータープラスミドは所望の標的配列をｐＲＳ３１５ＨｉｓＭＣＳ及びｐＬａｃＺｉに挿入して製造した。それぞれの３塩基対の標的部位に対して二つのオリゴヌクレオチドを合成し、互いにアニーリングさせた後、これをｐＲＳ３１５ＨｉｓＭＣＳ及びｐＬａｃＺｉのＳａｌＩ及びＸｍａＩ部位間に挿入した。前記オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は次の通りである：５′−ＣＣＧＧＴ  ＮＮＮＴＧＧＧＣＧＴＡＣＮＮＮＴＧＧＧＣＧ  ＴＣＡ  ＮＮＮＴＧＧＧＣＧ−３′（配列番号８８）及び５′−ＴＣＧＡＣＧＣＣＣＡＮＮＮ  ＴＧＡ  ＣＧＣＣＣＡＮＮＮＧＴＡＣＧＣＣＣＡＮＮＮ  Ａ３′（配列番号８９）。全６４対のオリゴヌクレオチドを合成し、前記二つのリポータープラスミド内に挿入した。
【０１２５】
実施例６：所望のＤＮＡ−結合特異性を有するジンクフィンガードメインの選択
与えられた標的塩基配列に特異的に結合するジンクフィンガードメインを選択するために、酵母をリポータープラスミドとハイブリッド転写因子を発現するジンクフィンガーライブラリープラスミドで形質転換させた。以下記述される酵母の形質転換方法と生体内スクリーニング方法は文献〔Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel et al.(1998), John Wiley & Sons, Inc., 米国ニュージャジー州イングルウッド〕に提示された一般的な方法により行われた。酵母菌株には、ｙＷＡＭ２（ＭＡＴα  Δｇａｌ４  Δｇａｌ８０ＵＲＡ３：：ＧＡＬ１−ｌａｃＺ  ｌｙｓ２８０１  ｈｉｓ３−Δ２００  ｔｒｐ１−Δ６３  ｌｅｕ２  ａｄｅ２−１０１ＣＹＨ２）を使用した。
【０１２６】
一例として、まずリポーター遺伝子に作動可能に連結された塩基配列５′−ＧＡＧＣＧＧＧＣＧ−３′（４ｂｐの標的配列に下線を付す）の複合結合部位を含むリポータープラスミドで酵母を形質転換させた。その後、無作為突然変異法で製造された突然変異ジンクフィンガードメインのプラスミドライブラリーを前記形質転換された酵母に導入した。約１０6個程度のコロニーをロイシン及びトリプトファンが全て欠如された培地で得た。リポータープラスミド及びジンクフィンガードメイン発現プラスミドはマーカー（marker）としてそれぞれＬＥＵ２遺伝子とＴＲＰ１遺伝子を有していて、２種類のプラスミドで全て形質転換された酵母はロイシンとトリプトファンが欠如された培地で育つことができる。
【０１２７】
１つの実施態様において、ヒトゲノムから由来するジンクフィンガードメインのライブラリーをリポータープラスミドを含有する細胞に形質転換した。このような形質転換は、５種類の相異する宿主細胞菌株に対して行われ、それぞれの株は、リポーター遺伝子に作動可能に連結された相異する５種類の標的配列中の一つを含有する。ロイシン及びトリプトファンが全て欠如された培地で各形質転換から約１０5個程度のコロニーを得た。
【０１２８】
形質転換体をロイシン及びトリプトファンが欠如された合成培地を含有するペットリディッシュ上で成長させた。インキュベーション後、プレートに１０％グリセロール溶液を加えた後、細胞をかき集めてグリセロール溶液中に凍結保管した。単一のアリコートをロイシン、トリプトファン、及びヒスチジンが欠乏した培地に撒いた。ジンクフィンガー転写因子の作用なしにも微細な量のＨＩＳ３が発現できるため、これによる細胞成長を抑制するために一部の成長培地にはＨＩＳ３の抑制剤である３−アミノトリアゾール（ＡＴ）をそれぞれ０、０．０３mM、０．１mM、０．３mM添加した。ＡＴは、Ｈｉｓ３の競合阻害剤であり、ＨＩＳ３選択系の感度を滴定する。ＡＴは、Ｈｉｓ３の基礎的な活性を抑制した。そのような基礎的な活性は、レポータープラスミド上のＨＩＳ３遺伝子の少量の発現から生じ得る。培地上に展開した約１０7個の酵母細胞うち、ＡＴを欠く選択培地では数百個のコロニーが育った。ＡＴの濃度の増加につれて、コロニーの数字が減った。０．３mMのＡＴを含む選択培地では、１０のオーダーでコロニーが育った。ＡＴを欠いた培地と０．３mMのＡＴを含む培地からそれぞれ数個ずつのコロニーを無作為に選定してこれらを培養した。プラスミドを酵母から分離し、大腸菌菌株ＫＣ８（pyrF leuB600 trpC hisB463）を形質転換した。これからジンクフィンガー転写因子をコードするプラスミドを分離して選択されたジンクフィンガードメインのＤＮＡ塩基配列を決定した。
【０１２９】
各選択されたジンクフィンガードメインのアミノ酸配列を、前記決定されたＤＮＡ塩基配列から演繹的に誘導した。各ジンクフィンガードメインは、塩基−接触部位における４つのアミノ酸残基、すなわち、αヘリックスに沿って−１、２、３、６位のアミノ酸残基の名を取って命名した。結果を表１に表した。同定されたジンクフィンガードメインは塩基−接触部位で発見される４個のアミノ酸によって命名された。塩基配列を分析した結果、同じジンクフィンガードメインが反復的に得られる場合があることが分かる。表１において括弧内の数字は、同一のジンクフィンガードメインがどれだけ多く得られたかを表す。例えば、４塩基接触部位にＣＳＮＲを有する二つのジンクフィンガーが、ＧＡＧＣ核酸部位に結合することが同定された（カラム３の「ＧＡＧＣ／ヒトゲノム」参照）。
【０１３０】
【表１】
2006149395.tif 000002
【０１３１】
選択されたヒトジンクフィンガードメインをコードする全長ＤＮＡ配列と、これを翻訳して得られたアミノ酸配列を図１１に表した。ヒトゲノムにおいてジンクフィンガードメインをコードするＤＮＡセグメントを増幅させるために使用した縮重ＰＣＲプライマーに相補的な配列を下線で表示した。対立因子の相異又は増幅における改変の導入のため、この部分の塩基配列は報告されたヒトゲノム配列の元来塩基配列と異なり得る。
【０１３２】
本発明によるスクリーニングで同定されたほとんどのヒトジンクフィンガードメインは、新規なポリペプチドであるか、又は不明のオープンリーディングフレームに相当した。例えば、ＨＳＮＫ（GenBank accession numberＡＦ１５５１００で報告された配列に含まれる）、ＱＳＴＶ（GenBank accession numberＡＬ１１０２１７）、ＶＳＴＲ（GenBank accession numberＡＦ０２５７７２で報告された配列に含まれる）として設計されたジンクフィンガードメインは、その機能がまだ知られていないタンパク質中に発見された。ここに記載された結果は、これらのジンクフィンガードメインが、配列特異的ＤＮＡ結合ドメインとして機能することができるということを示すだけでなく、キメラタンパク質の中で好ましい、それらの好適な結合部位を立証するものである。
【０１３３】
また、本願発明では、ヒトゲノムから得た前記ジンクフィンガードメインが組立式で作用して新規なＤＮＡ−結合タンパク質を構築するための構成ブロックとして使用され得ることを明らかにした。本願発明のヒトジンクフィンガードメインは、これをＺｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２に次いでＣ末端に配置した時、生体内でこれらが特定な標的配列を認識する能力に基づいて選択された。したがって、同定されたジンクフィンガードメインは人工的な文脈で特定配列が認識でき、合成転写因子を設計するためのモジュール性構成ブロックとして適している。
【０１３４】
実施例７：酵母の対交配（pairwise mating）
３塩基対の標的部位に結合するジンクフィンガードメインの同定を容易にするために、酵母細胞の反復的な形質転換を避け、一回の形質転換で６４個のリポーター構築物のそれぞれに対して結合する陽性結合形質転換体を探すために、酵母の交配を利用した。ＹＷ１（ＭＡＴα交配型）及びＹＰＨ４９９（ＭＡＴａ交配型）の２種の酵母菌株を使用した。ＹＷ１はｙＷＡＭ２から由来したもので、５−フルオロオロチックアクシド（ＦＯＡ）耐性であるクローンを選択することにより、ｙＷＡＭ２のｕｒａ３−誘導体を生成した。
【０１３５】
ジンクフィンガードメインのプラスミドライブラリーを酵母形質転換によりＹＷ１に導入した。約１０6個の形質転換されたコロニーから１０％グリセロール溶液でプレートをかき集めて細胞を収集し、小分画で冷凍させた。６４個のリポータープラスミドの各対（ｐＬａｃＺｉまたはｐＲＳ３１５Ｈｉｓから由来）を酵母菌株ＹＰＨ４９９に共同形質感染させた。それぞれのリポータープラスミド対を含有する形質転換体を回収して冷凍させた。
【０１３６】
冷凍させた細胞を溶かした後、これら酵母細胞を最小培地で中間−ログ成長期まで成長させた。次いで、この２つの細胞類型を混合し、ＹＰＤで５時間交配されるようにした。Ｘ−gａl及びＡＴ（１mM）を含有し、トリプトファン、ロイシン、ウラシル及びヒスチジンが欠如した最小培地で二倍体細胞を選択した。数日後、選択用プレートで成長した青色コロニーを単離し、これからジンクフィンガードメインをコードするプラスミドを単離し、選択されたジンクフィンガードメインのＤＮＡ配列を決定した。
【０１３７】
青色コロニーから単離された核酸をＹＷ１細胞に個別的に再形質転換させた。それぞれの単離された核酸に対し、再形質転換されたＹＷ１細胞を６４  ＬａｃＺリポータープラスミドをそれぞれ含有するＹＰＨ４９９細胞と９６ウェルプレートで交配させ、Ｘ−gａlを含有してトリプトファン及びウラシルが欠けた最小培地上にばら撒いた。６４個の標的配列に対するジンクフィンガードメインのＤＮＡ結合の親和度及び特異性は青色相の強度により決定された。Ｚｉｆ２６８ジンクフィンガードメインとの対照群実験結果、ジンクフィンガードメインと結合部位間の陽性相互作用は、濃い青乃至薄い青のコロニーを作り（ここで、青色の強度は結合親和性に比例する）、陰性相互作用は白色コロニーを作った。
【０１３８】
実施例８：同定されたジンクフィンガードメインと相互作用コードの比較
選択されたジンクフィンガードメインのアミノ酸配列から塩基と相互作用をすることと予想されるアミノ酸残基と、ジンクフィンガー−ＤＮＡ相互作用コード表（図３）から予測したアミノ酸残基との同一性及び類似性を比較した。大部分のジンクフィンガードメインは、期待されたパターン、すなわちコードから予測したものとよく合致する決定的な部位のアミノ酸残基を示した。
【０１３９】
例えば、無作為突然変異を通じて製造されたライブラリーから選択されたジンクフィンガードメイン内の共通的アミノ酸残基は、−１位ではＲ（アルギニン）（１４個中、７個）またはＫ（ライシン）（１４個中、２個）、３位ではＮ（アスパラギン）（１４個中、６個）及び６位ではＲ（１４個中、９個）であった（表１参照）。これらのジンクフィンガードメインは、ＧＡＧＣプラスミドで選択された。（リポーター遺伝子に作動可能に連結された複合結合配列５′−ＧＡＧＣＧＧＧＣＧ−３’を有するリポータープラスミドをＧＡＧＣプラスミドと呼ぶことにする。以下類似に、リポーター遺伝子に作動可能に連結された複合結合配列５′−ＸＸＸＸＧＧＧＣＧ−３’を含むリポータープラスミドをＸＸＸＸプラスミドと呼ぶ）。決定的な塩基−接触部位のこれらのアミノ酸残基は、コードから予想されたものと正確に合致する。〔ヒトゲノム内の大部分のジンクフィンガードメインらは、２位にＳ（セリン）を有しており、セリンは４個の塩基中、いずれのものとも水素結合が形成できる。したがって、２位における影響は以下で考慮しないこととする。また、一般的に、２位の残基は塩基認識において、単に補助的な役割しか果たさないことも知られている（Pavletich及びPabo(1991) Science 252, 809-817）。
【０１４０】
ヒトのゲノムから由来したジンクフィンガードメイン中のアミノ酸残基も、コードから予想されるものと非常によく一致した。例えば、ＧＡＧＣプラスミドを使用して得たジンクフィンガードメイン内−１、３、６位の共通アミノ酸残基らは、それぞれＲ、Ｎ、Ｒである（表１カラム３参照）。これらのアミノ酸は、コードから予想できるアミノ酸と正確に一致した。ＧＣＴＴプラスミドを使用して得たジンクフィンガードメイン中の−１、３、６位のアミノ酸残基は、それぞれＶ、Ｔ、Ｒであった（表１カラム４）。このうち、Ｔ及びＲ残基は、コードから予想したものと一致する。３ｂｐの塩基配列において３′末端に位置するＴと相互作用をすることと期待されるコードの−１位から予想されたのアミノ酸は、Ｌ、Ｔ、又はＮである。ＧＣＴＴプラスミドで選択されたＶＳＴＲジンクフィンガードメインは、この位置にＬ（ロイシン）と類似した疎水性アミノ酸であるＶ（バリン）を含んでいた。
【０１４１】
全体的に、選択されたジンクフィンガードメイン内のアミノ酸残基は、三つの位置中、少なくとも二つの位置ではコードから予想されるアミノ酸と一致した。表１において、コードから予想されるジンクフィンガードメイン中のアミノ酸を下線で表示した。これらの結果は、ここに開示された生体内選択システムが予想通り機能していることを強力に示唆している。
【０１４２】
実施例９：再形質転換（retransformation）及び相互形質転換（cross-transformation）
上記のジンクフィンガータンパク質らが誤って得られた陽性結果である可能性を排除し、また前記ジンクフィンガータンパク質らの配列特異性を調査するために、単離されたプラスミドを利用し、酵母の再形質転換（retransformation）及び相互形質転換（cross-transformation）を遂行した。
【０１４３】
まず、リポータープラスミドとジンクフィンガードメインをコードするハイブリッド転写因子プラスミドを一対にして酵母を同時−形質転換した。酵母形質転換体をロイシン及びトリプトファンが欠如された最小培地に接種して３６時間培養した。成長培地中の細胞約１,０００個をロイシン、トリプトファン、ヒスチジンが欠如された固体培地（図１０で−ヒスチジンと表記）とロイシン、トリプトファンが欠如された固体培地（図１０で＋ヒスチジンと表記）上にばら撒いた後、５０時間３０℃で培養した。その結果を図１０に示した。
【０１４４】
ハイブリット転写因子のジンクフィンガー部分が、複合結合配列と結合し、ハイブリット転写因子がＨＩＳ３レポーター遺伝子を活性化させる場合は、ヒスチジンを欠く培地中でコロニーが成長することができると予測される。ジンクフィンガー部分がこの複合結合配列に結合できないならば、コロニーは、ヒスチジンが欠如された培地では育長することができない。
【０１４５】
図１０に示したように、単離されたジンクフィンガードメインは、相当する標的配列に結合する能力を有し、Ｚｉｆ２６８とは明らかに異なる配列特異性を示した。Ｚｉｆ２６８は、ＧＣＧＴプラスミドとの場合に、他の５つのプラスミドとの場合よりも高い活性を示し、ＧＡＧＴプラスミドとの場合には比較的高い活性を示した。他の結合部位を含むレポーターを有し、Ｚｉｆ２６８タンパク質を発現する株によっては、コロニーは形成されなかった。
【０１４６】
無作為突然変異ライブラリーから単離されたジンクフィンガードメインＫＴＮＲは、ＧＡＧＣリポータープラスミドで元来選択されたものである。予想通り、ＧＡＧＣプラスミドのみでコロニーが形成された。ヒトゲノム由来のライブラリーから得られたジンクフィンガードメインも期待した通りの特異性を示した。例えば、ＧＡＣＴプラスミドで選択されたＨＳＮＫジンクフィンガードメインは、酵母細胞に形質転換した場合、ＧＡＣＴプラスミドの場合のみで細胞成長を可能とした。ＧＣＴＴプラスミドで選択されたＶＳＴＲは、予想した通りＧＣＴＴプラスミドで最大の活性を示した。ＧＡＧＴプラスミドで選択されたＲＤＥＲは、Ｚｉｆ２６８のフィンガー３と同一の４つの塩基−接触部位に同一のアミノ酸残基配列を有する。予想通り、このジンクフィンガードメインは、Ｚｉｆ２６８のフィンガー３と類似の配列特異性を示した。ＧＡＧＣとＧＡＧＴプラスミドで選択されたＳＳＮＲは、ＧＡＧＣプラスミドとはヒスチジン欠乏培地で細胞成長を可能としたが、ＧＡＧＴプラスミドとは細胞成長を可能としなかった。ＡＣＡＴプラスミドで得られたＱＳＴＶは、この検定で試験されたいかなるプラスミドとも細胞成長を可能としなかった。しかし、後述の如く、試験管内実験ではこのジンクフィンガードメインはＡＣＡＴ配列と強く結合することができた。
【０１４７】
実施例１０：ゲルシフト分析（gel shift assay）
改変ワンハイブリッドシステムを用いて選択されたジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現させ、精製し、ゲルシフト分析で用いた。ハイブリッドプラスミド中のジンクフィンガータンパク質をコードするＤＮＡセグメントを、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで消化して得、ｐＧＥＸ−４Ｔ２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のＳａｌＩ及びＮｏｔＩ部位の間に挿入した。ジンクフィンガードメインをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１株中で、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）に連結された融合タンパク質として発現させた。発現されたタンパク質をグルタチオンに対する親和性（glutathione affinity）クロマトグラフィー（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を利用して精製した後、ＧＳＴとジンクフィンガータンパク質の連結部位を切断するトロンビンで消化した。精製されたジンクフィンガータンパク質は、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２、およびＣ末端に選択されたジンクフィンガードメインを含有する。
【０１４８】
下記配列のプローブＤＮＡを合成し、アニーリングさせ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで32Ｐ標識し、ゲル移動分析に使用した。
ＧＣＧＴ；  ５′−ＣＣＧＧＧＴＣＧＣ  ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ  ＧＴＡＣＣＧ−３′  （配列番号９０）
３′−ＣＡＧＣＧ  ＣＧＣＡＣＣＣＧＣ  ＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴ−５′  （配列番号９１）
ＧＡＧＣ；  ５′−ＣＣＧＧＧＴＣＧＣ  ＧＡＧＣＧＧＧＣＧ  ＧＴＡＣＣＧ−３′  （配列番号９２）
３′−ＣＡＧＣＧ  ＣＴＣＧＣＣＣＧＣ  ＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴ−５′  （配列番号９３） 
ＧＣＴＴ；  ５′−ＣＣＧＧＧＴＣＧＴ  ＧＣＴＴＧＧＧＣＧ  ＧＴＡＣＣＧ−３′  （配列番号９４）
３′−ＣＡＧＣＡ  ＣＧＡＡＣＣＣＧＣ  ＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴ−５′  （配列番号９５）
ＧＡＣＴ；  ５′−ＣＣＧＧＧＴＣＧＧ  ＧＡＣＴＧＧＧＣＧ  ＧＴＡＣＣＧ−３′  （配列番号９６）
３′−ＣＡＧＣＣ  ＣＴＧＡＣＣＣＧＣ  ＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴ−５′  （配列番号９７）
ＧＡＧＴ；  ５′−ＣＣＧＧＧＴＣＧＧ  ＧＡＧＴＧＧＧＣＧ  ＧＴＡＣＣＧ−３′  （配列番号９８）
３′−ＣＡＧＣＣ  ＣＴＣＡＣＣＣＧＣ  ＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴ−５′  （配列番号９９）
ＡＣＡＴ；  ５′−ＣＣＧＧＧＴＣＧＧ  ＡＣＡＴＧＧＧＣＧ  ＧＴＡＣＣＧ−３′  （配列番号１００）
３′−ＣＡＧＣＣ  ＴＧＴＡＣＣＣＧＣ  ＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴ−５′  （配列番号１０１）
【０１４９】
多様な量のジンクフィンガータンパク質を、２０mM Ｔｒｉｓ（pH７．７）、１２０mM ＮａＣｌ、５mM ＭｇＣｌ2、２０μM ＺｎＳＯ4、１０％グリセロール、０．１％ Nonidet Ｐ−４０、５mM ＤＴＴ、及び０．１０mg/ml ＢＳＡ（牛血清アルブミン）中で標識されたプローブＤＮＡと室温で１時間培養させた後、この反応混合物をゲル電気泳動させた。放射能シグナルをホスホイメージャー（Phosphor Imager TM）解析（Molecular Dynamics）、文献〔Rebar and Pabo(1994) Science 263:671-673〕に記載されたことにより解離定数を計算した。その結果を表２に示す。２回以上の別途の実験によりすべての常数を決定し、平均からの標準誤差を表示した。表２にはヒスチジン欠乏培地における酵素形質転換体の細胞成長（図１０）も表した。
【０１５０】
【表２】
2006149395.tif 000003
【０１５１】
ヒスチジン欠乏培地において、細胞成長を可能にするジンクフィンガータンパク質らは相当するプローブＤＮＡと強く結合した。例えば、対照群として使用したＺｉｆ２６８タンパク質の場合、これは、ＧＣＧＴ及びＧＡＧＴリポータープラスミドと共に再形質転換させる場合に細胞成長を可能にしたが、これらリポータープラスミドに相応するＤＮＡプローブを利用して試験管内で測定した解離定数はそれぞれ２４pM、１７０pMであった。対照的に、Ｚｉｆ２６８タンパク質は、他のリポータープラスミドとは細胞成長を可能にせず、相応するＤＮＡプローブで測定した解離定数も１nMよりも高かった。
【０１５２】
新規ジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質も類似した結果を示した。例えば、ＫＴＮＲタンパク質はＧＡＧＣプローブＤＮＡに対して１７０ｐＭの解離定数での高い親和性を示すが、ＧＣＧＴ又はＧＡＣＴプローブＤＮＡに対しては、それぞれ５．５nM又は３０nMの解離定数を表した。このタンパク質は、ＧＡＧＣプラスミドとのみ、細胞成長を可能にした。ＨＳＮＫタンパク質は、ＧＡＣＴプローブＤＮＡと強く結合することができるが（Ｋd＝０．３２ｎM）、ＧＣＧＴ又はＧＡＧＴプローブＤＮＡとは結合しない。すなわち、ＱＳＴＶは、ＧＣＴＴ又はＧＣＧＴプローブＤＮＡと結合するよりも、それぞれ１３倍又は４．３倍強くＡＣＡＴプローブＤＮＡと結合する。
【０１５３】
一般的に、例えば３つのジンクフィンガードメインを有するもののように、１nM未満の解離定数でＤＮＡ配列に結合するジンクフィンガータンパク質である場合、酵母の成長を可能にするが、ジンクフィンガータンパク質が、１nMより高い解離定数でＤＮＡ配列に結合する場合、細胞成長を可能にしない。１nMより大きく５nM未満の解離定数でＤＮＡ配列に結合するジンクフィンガータンパク質も、例えば、４個のジンクフィンガードメインを有するキメラジンクフィンガータンパク質の文脈において、有用であり得る。
【０１５４】
実施例１１：ＴＧ−ＺＦＤ−００１「ＣＳＮＲ１」
ＴＧ−ＺＦＤ−００１「ＣＳＮＲ１」は、ヒトゲノム配列から生体内（in vivo）スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＫＱＣＧＫＡＦＧＣＰＳＮＬＲＲＨＧＲＴＨ（配列番号２３）である。それは下記ヒト核酸配列
【０１５５】
５′−ＴＡＴＡＡＡＴＧＴＡＡＧＣＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＴＧＴＣＣＣＴＣＡＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＧＡＣＴＣＡＣ−３′（配列番号２２）
によりコードされる。
【０１５６】
ＴＧ−ＺＦＤ−００１「ＣＳＮＲ１」は、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及び２との融合ポリペプチドとして、３−ｂｐ標的配列ＧＡＡ、ＧＡＣ、及びＧＡＧを特異的に認識する。生体内スクリーニング結果とＥＭＳＡによれば、ＴＧ−ＺＦＤ−００１「ＣＳＮＲ」の結合部位配列に対する選好度は、ＧＡＡ＞ＧＡＣ＞ＧＡＧ＞ＧＣＧである。ＥＭＳＡにおいて、ＴＧ−ＺＦＤ−００１「ＣＳＮＲ」とＺｉｆ２６８のフィンガー１、フィンガー２、及びＧＳＴ精製ハンドルとの融合は、ＧＡＣを含む部位に対しては０．１７nM、ＧＡＧを含む部位に対しては０．４６nM、そしてＧＣＧを含む部位に対しては２．７nMの解離定数（Ｋd）を示す。
【０１５７】
ＴＧ−ＺＦＤ−００１「ＣＳＮＲ１」は、例えば、ＧＡＡ、ＧＡＣまたはＧＡＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインを含むキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１５８】
実施例１２：ＴＧ−ＺＦＤ−００２「ＨＳＮＫ」
ＴＧ−ＺＦＤ−００２「ＨＳＮＫ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＫＥＣＧＫＡＦＮＨＳＳＮＦＮＫＨＨＲＩＨ（配列番号２５）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＴＡＡＡＣＡＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＡＣ−３′（配列番号２４）。
【０１５９】
ＴＧ−ＺＦＤ−００２「ＨＳＮＫ」は、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及び２との融合ポリペプチドとして、３−ｂｐ標的配列ＧＡＣを特異的に認識する。生体内スクリーニング結果とＥＭＳＡによれば、ＴＧ−ＺＦＤ−００２「ＨＳＮＫ」の結合部位配列に対する選好度は、ＧＡＣ＞ＧＡＧ＞ＧＣＧである。ＥＭＳＡにおいて、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１、フィンガー２、及びＧＳＴ精製ハンドルとＴＧ−ＺＦＤ−００２「ＨＮＳＫ」融合は、ＧＡＣを含む位置に対しては０．３２nM、ＧＡＧを含む位置に対しては３．５nM、そしてＧＣＧを含む位置に対しては４２nMの解離定数（Ｋd）を有する。
【０１６０】
ＴＧ−ＺＦＤ−００２「ＨＳＮＫ」は、例えば、ＧＡＣ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として使用され得る。
【０１６１】
実施例１３：ＴＧ−ＺＦＤ−００３「ＳＳＮＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−００３「ＳＳＮＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＫＥＣＧＫＡＦＳＳＧＳＮＦＴＲＨＱＲＩＨ（配列番号２７）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＡＡＴＧＴＡＡＧＧＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＧＴＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣ−３′（配列番号２６）。
【０１６２】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及び２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−００３「ＳＳＮＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＧに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果とＥＭＳＡによれば、ＴＧ−ＺＦＤ−００３「ＳＳＮＲ」の結合部位配列に対する選好度は、ＧＡＧ＞ＧＡＣ＞ＧＣＧである。ＥＭＳＡにおいて、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１、フィンガー２、及びＧＳＴ精製ハンドルとＴＧ−ＺＦＤ−００３「ＳＳＮＲ」との融合は、ＧＡＧを含む位置に対しては０．４５nM、ＧＡＣを含む位置に対しては０．６１nM、そしてＧＣＧを含む位置に対しては３．８nMの解離定数Ｋdを示す。
【０１６３】
ＴＧ−ＺＦＤ−００３「ＳＳＮＲ」は、例えば、ＧＡＧまたはＧＡＣ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１６４】
実施例１４：ＴＧ−ＺＦＤ−００４「ＲＤＥＲ１」
ＴＧ−ＺＦＤ−００４「ＲＤＥＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＶＣＤＶＥＧＣＴＷＫＦＡＲＳＤＥＬＮＲＨＫＫＲＨ（配列番号２９）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＴＡＴＧＣＧＡＴＧＴＡＧＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＧＴＧＧＡＡＡＴＴＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＧＡＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＣＡＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣＡＣ−３′（配列番号２８）。
【０１６５】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及び２と融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−００４「ＲＤＥＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＣＧに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果とＥＭＳＡによれば、ＴＧ−ＺＦＤ−００４「ＲＤＥＲ」の結合部位配列に対する選好度は、ＧＣＧ＞ＧＴＧ、ＧＡＧ＞ＧＡＣである。ＥＭＳＡにおいて、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１、フィンガー２、及びＧＳＴ精製ハンドルとＴＧ−ＺＦＤ−００４「ＲＤＥＲ」との融合は、ＧＣＧを含む位置に対しては０．０２７nM、ＧＡＧを含む位置に対しては０．１８nM、そしてＧＡＣを含む位置に対しては２８nMの解離定数Ｋdを有する。
【０１６６】
ＴＧ−ＺＦＤ−００４「ＲＤＥＲ」は、例えば、ＧＣＧ、ＧＴＧまたはＧＡＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１６７】
実施例１５：ＴＧ−ＺＦＤ−００５「ＱＳＴＶ」
ＴＧ−ＺＦＤ−００５「ＱＳＴＶ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＮＥＣＧＫＡＦＡＱＮＳＴＬＲＶＨＱＲＩＨ（配列番号３１）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＡＡＴＧＡＡＴＧＣＧＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＧＣＣＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＣＴＣＴＣＡＧＡＧＴＡＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣ−３′（配列番号３０）。
【０１６８】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−００５「ＱＳＴＶ」は、３−ｂｐ標的配列ＡＣＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果とＥＭＳＡによれば、ＴＧ−ＺＦＤ−００５「ＱＳＴＶ」の結合部位配列に対する選好度はＡＣＡ＞ＧＣＧ＞ＧＣＴである。ＥＭＳＡにおいて、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１、フィンガー２、及びＧＳＴ精製ハンドルとＴＧ−ＺＦＤ−００５「ＱＳＴＶ」との融合は、ＡＣＡを含む位置に対しては２．３nM、ＧＣＧを含む位置に対しては９．８nM、そしてＧＣＴを含む位置に対しては２９nMの解離定数Ｋdを有する。
【０１６９】
ＴＧ−ＺＦＤ−００５「ＱＳＴＶ」は、例えば、ＡＣＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１７０】
実施例１６：ＴＧ−ＺＦＤ−００６「ＶＳＴＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−００６「ＶＳＴＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＮＹＣＧＫＴＦＳＶＳＳＴＬＩＲＨＱＲＩＨ（配列番号３３）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＡＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＣＣＴＴＴＡＧＴＧＴＧＡＧＣＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＴＴＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＴＣＣＡＣ−３′（配列番号３２）。
【０１７１】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−００６「ＶＳＴＲ」は、３−ｂｐ標的配列ＧＣＴに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果とＥＭＳＡによれば、ＴＧ−ＺＦＤ−００６「ＶＳＴＲ」の結合部位配列に対する選好度はＧＣＴ＞ＧＣＧ＞ＧＡＧである。ＥＭＳＡにおいて、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１、フィンガー２、及びＧＳＴ精製ハンドルとＴＧ−ＺＦＤ−００６「ＶＳＴＲ」との融合は、ＧＣＴを含む位置に対しては０．５３nM、ＧＣＧを含む位置に対しては０．７６nM、そしてＧＡＧを含む位置に対しては１．４nMの解離定数Ｋdを有する。
【０１７２】
ＴＧ−ＺＦＤ−００６「ＶＳＴＲ」は、例えば、ＧＣＴまたはＧＣＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１７３】
実施例１７：ＴＧ−ＺＦＤ−００７「ＣＳＮＲ２」
ＴＧ−ＺＦＤ−００７「ＣＳＮＲ２」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＱＣＮＩＣＧＫＣＦＳＣＮＳＮＬＨＲＨＱＲＴＨ（配列番号３５）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＣＡＧＴＧＣＡＡＣＡＴＴＴＧＣＧＧＡＡＡＡＴＧＴＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＣＧＣＡＣ−３′（配列番号３４）。
【０１７４】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−００７「ＣＳＮＲ２」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−００７「ＣＳＮＲ２」の結合部位配列に対する選好度はＧＡＡ＞ＧＡＣ＞ＧＡＧである。
【０１７５】
ＴＧ−ＺＦＤ−００７「ＣＳＮＲ２」は、例えば、ＧＡＡ、ＧＡＣまたはＧＡＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１７６】
実施例１８：ＴＧ−ＺＦＤ−００８「ＱＳＨＲ１」
ＴＧ−ＺＦＤ−００８「ＱＳＨＲ１」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＡＣＨＬＣＧＫＡＦＴＱＳＳＨＬＲＲＨＥＫＴＨ（配列番号３７）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＣＴＣＡＧＡＧＴＴＣＴＣＡＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣ−３′（配列番号３６）。
【０１７７】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−００８「ＱＳＨＲ１」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡ、ＧＡＡ、ＡＧＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−００８「ＱＳＨＲ１」の結合部位配列に対する選好度は、ＧＧＡ＞ＧＡＡ＞ＡＧＡである。
【０１７８】
ＴＧ−ＺＦＤ−００８「ＱＳＨＲ１」は、例えば、ＧＧＡ、ＧＡＡまたはＡＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１７９】
実施例１９：ＴＧ−ＺＦＤ−００９「ＱＳＨＲ２」
ＴＧ−ＺＦＤ−００９「ＱＳＨＲ２」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＧＱＣＧＫＦＹＳＱＶＳＨＬＴＲＨＱＫＩＨ（配列番号３９）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＡＡＡＴＧＣＧＧＣＣＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＴＴＣＴＡＣＴＣＧＣＡＧＧＴＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＡＴＣＣＡＣ−３′（配列番号３８）。
【０１８０】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−００９「ＱＳＨＲ２」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡに対する認識特異性を表す。
【０１８１】
ＴＧ−ＺＦＤ−００９「ＱＳＨＲ２」は、例えば、ＧＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１８２】
実施例２０：ＴＧ−ＺＦＤ−０１０「ＱＳＨＲ３」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１０「ＱＳＨＲ３」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＡＣＨＬＣＧＫＡＦＴＱＣＳＨＬＲＲＨＥＫＴＨ（配列番号４１）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＣＴＣＡＧＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣ−３′（配列番号４０）。
【０１８３】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０１０「ＱＳＨＲ３」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡ、ＧＡＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０１０「ＱＳＨＲ３」の結合部位配列に対する選好度はＧＧＡ＞ＧＡＡである。
【０１８４】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１０「ＱＳＨＲ３」は、例えば、ＧＧＡまたはＧＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１８５】
実施例２１：ＴＧ−ＺＦＤ−０１１「ＱＳＨＲ４」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１１「ＱＳＨＲ４」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＡＣＨＬＣＡＫＡＦＩＱＣＳＨＬＲＲＨＥＫＴＨ（配列番号４３）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣ−３′（配列番号４２）。
【０１８６】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０１１「ＱＳＨＲ４」は、３−ｂｐ標的配列ＧＧＡ、ＧＡＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０１１「ＱＳＨＲ４」の結合部位配列に対する選好度はＧＧＡ＞ＧＡＡである。
【０１８７】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１１「ＱＳＨＲ４」は、例えば、ＧＧＡまたはＧＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１８８】
実施例２２：ＴＧ−ＺＦＤ−０１２「ＱＳＨＲ５」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１２「ＱＳＨＲ５」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＶＣＲＥＣＧＲＧＦＲＱＨＳＨＬＶＲＨＫＲＴＨ（配列番号４５）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＴＴＴＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＴＧＧＧＣＧＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＴＴＣＡＣＡＣＣＴＧＧＴＣＡＧＡＣＡＣＡＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＴ−３′（配列番号４４）。
【０１８９】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０１２「ＱＳＨＲ５」は、３−ｂｐ標的配列ＧＧＡ、ＡＧＡ、ＧＡＡ、及びＣＧＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０１２「ＱＳＨＲ５」の結合部位配列に対する選好度はＧＧＡ＞ＡＧＡ＞ＧＡＡ＞ＣＧＡである。
【０１９０】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１２「ＱＳＨＲ５」は、例えば、ＧＧＡ、ＡＧＡ、ＧＡＡまたはＣＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１９１】
実施例２３：ＴＧ−ＺＦＤ−０１３「ＱＳＮＲ１」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１３「ＱＳＮＲ１」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＦＥＣＫＤＣＧＫＡＦＩＱＫＳＮＬＩＲＨＱＲＴＨ（配列番号４７）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＴＴＧＡＧＴＧＴＡＡＡＧＡＴＴＧＣＧＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＡＣ−３′（配列番号４６）。
【０１９２】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０１３「ＱＳＮＲ１」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＡに対する認識特異性を表す。
【０１９３】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１３「ＱＳＮＲ１」は、例えば、ＧＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１９４】
実施例２４：ＴＧ−ＺＦＤ−０１４「ＱＳＮＲ２」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１４「ＱＳＮＲ２」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＶＣＲＥＣＲＲＧＦＳＱＫＳＮＬＩＲＨＱＲＴＨ（配列番号４９）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴＧＴＡＧＧＣＧＡＧＧＴＴＴＴＡＧＣＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＴＣＴＣＡＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＧＣＡＣ−３′（配列番号４８）。
【０１９５】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０１４「ＱＳＮＲ２」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＡに対する認識特異性を表す。
【０１９６】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１４「ＱＳＮＲ２」は、例えば、ＧＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０１９７】
実施例２５：ＴＧ−ＺＦＤ−０１５「ＱＳＮＶ１」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１５「ＱＳＮＶ１」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＮＴＣＲＫＴＦＳＱＫＳＮＬＩＶＨＱＲＴＨ（配列番号５１）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＡＡＴＧＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＡＡＡＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＴＣＴＣＡＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＣＡＣＡＣ−３′（配列番号５０）。
【０１９８】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０１５「ＱＳＮＶ１」は３−ｂｐ標的配列ＡＡＡ、ＣＡＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０１５「ＱＳＮＶ１」の結合部位配列に対する選好度はＡＡＡ＞ＣＡＡである。
【０１９９】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１５「ＱＳＮＶ１」は、例えば、ＡＡＡまたはＣＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２００】
実施例２６：ＴＧ−ＺＦＤ−０１６「ＱＳＮＶ２」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１６「ＱＳＮＶ２」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＶＣＳＫＣＧＫＡＦＴＱＳＳＮＬＴＶＨＱＫＩＨ（配列番号５３）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＴＴＴＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＣＴＣＡＧＡＧＴＴＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＣＣＡＣ−３′（配列番号５２）。
【０２０１】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０１６「ＱＳＮＶ２」は３−ｂｐ標的配列ＡＡＡ、ＣＡＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０１６「ＱＳＮＶ２」の結合部位配列に対する選好度はＡＡＡ＞ＣＡＡである。
【０２０２】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１６「ＱＳＮＶ２」は、例えば、ＡＡＡまたはＣＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２０３】
実施例２７：ＴＧ−ＺＦＤ−０１７「ＱＳＮＶ３」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１７「ＱＳＮＶ３」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＤＥＣＧＫＮＦＴＱＳＳＮＬＩＶＨＫＲＩＨ（配列番号５５）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＡＣＧＡＡＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＣＣＴＣＣＡＡＣＣＴＴＡＴＴＧＴＡＣＡＴＡＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴ−３′（配列番号５４）。
【０２０４】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０１７「ＱＳＮＶ３」は３−ｂｐ標的配列ＡＡＡに対する認識特異性を表す。
【０２０５】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１７「ＱＳＮＶ３」は、例えば、ＡＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２０６】
実施例２８：ＴＧ−ＺＦＤ−０１８「ＱＳＮＶ４」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１８「ＱＳＮＶ４」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＤＶＣＧＫＴＦＴＱＫＳＮＬＧＶＨＱＲＴＨ（配列番号５７）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＡＡＴＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＣＣＴＴＣＡＣＧＣＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＡＴ−３′（配列番号５６）。
【０２０７】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０１８「ＱＳＮＶ４」は３−ｂｐ標的配列ＡＡＡに対する認識特異性を表す。
【０２０８】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１８「ＱＳＮＶ４」は、例えば、ＡＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２０９】
実施例２９：ＴＧ−ＺＦＤ−０１９「ＱＳＳＲ１」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１９「ＱＳＳＲ１」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＰＤＣＧＫＳＦＳＱＳＳＳＬＩＲＨＱＲＴＨ（配列番号５９）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＡＡＧＴＧＣＣＣＴＧＡＴＴＧＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＴＡＧＴＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＣＡＣＡＣ−３′（配列番号５８）。
【０２１０】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０１９「ＱＳＳＲ１」は３−ｂｐ標的配列ＧＴＡ、ＧＣＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０１９「ＱＳＳＲ１」の結合部位配列に対する選好度はＧＴＡ＞ＧＣＡである。
【０２１１】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１９「ＱＳＳＲ１」は、例えば、ＧＴＡまたはＧＣＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２１２】
実施例３０：ＴＧ−ＺＦＤ−０２０「ＱＳＳＲ２」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２０「ＱＳＳＲ２」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＱＤＣＧＲＡＦＮＱＮＳＳＬＧＲＨＫＲＴＨ（配列番号６１）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＡＧＧＡＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＣ−３′（配列番号６０）。
【０２１３】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０２０「ＱＳＳＲ２」は３−ｂｐ標的配列ＧＴＡに対する認識特異性を表す。
【０２１４】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２０「ＱＳＳＲ２」は、例えば、ＧＴＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２１５】
実施例３１：ＴＧ−ＺＦＤ−０２１「ＱＳＴＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２１「ＱＳＴＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＥＥＣＧＫＡＦＮＱＳＳＴＬＴＲＨＫＩＶＨ（配列番号６３）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＣＴＡＧＡＣＡＴＡＡＧＡＴＡＧＴＴＣＡＴ−３′（配列番号６２）。
【０２１６】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０２１「ＱＳＴＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＴＡ、ＧＣＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０２１「ＱＳＴＲ」の結合部位配列に対する選好度はＧＴＡ＞ＧＣＡである。
【０２１７】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２１「ＱＳＴＲ」は、例えば、ＧＴＡまたはＧＣＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２１８】
実施例３２：ＴＧ−ＺＦＤ−０２２「ＲＳＨＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２２「ＲＳＨＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＭＥＣＧＫＡＦＮＲＲＳＨＬＴＲＨＱＲＩＨ（配列番号６５）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＴＧＧＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＧＣＴＴＴＴＡＡＣＣＧＣＡＧＧＴＣＡＣＡＣＣＴＣＡＣＡＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＴＴＣＡＣ−３′（配列番号６４）。
【０２１９】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０２２「ＲＳＨＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＧに対する認識特異性を表す。
【０２２０】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２２「ＲＳＨＲ」は、例えば、ＧＧＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２２１】
実施例３３：ＴＧ−ＺＦＤ−０２３「ＶＳＳＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２３「ＶＳＳＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＴＣＫＱＣＧＫＡＦＳＶＳＳＳＬＲＲＨＥＴＴＨ（配列番号６７）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＡＣＡＴＧＴＡＡＡＣＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＧＴＧＴＴＴＣＣＡＧＴＴＣＣＣＴＴＣＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＡＡＣＣＡＣＴＣＡＣ−３′（配列番号６６）。
【０２２２】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０２３「ＶＳＳＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＴＴ、ＧＣＧ、ＧＴＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０２３「ＶＳＳＲ」の結合部位配列に対する選好度はＧＴＴ＞ＧＴＧ＞ＧＴＡである。
【０２２３】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２３「ＶＳＳＲ」は、例えば、ＧＴＴ、ＧＣＧまたはＧＴＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２２４】
実施例３４：ＴＧ−ＺＦＤ−０２４「ＱＡＨＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２４「ＱＡＨＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＫＥＣＧＱＡＦＲＱＲＡＨＬＩＲＨＨＫＬＨ（配列番号１０３）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＡＡＴＧＴＧＧＧＣＡＧＧＣＣＴＴＴＡＧＡＣＡＧＣＧＴＧＣＡＣＡＴＣＴＴＡＴＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＡＡＡＣＴＴＣＡＣ−３′（配列番号１０２）。
【０２２５】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０２４「ＱＡＨＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡに対する認識特異性を表す。
【０２２６】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２４「ＱＡＨＲ」は、例えば、ＧＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２２７】
実施例３５：ＴＧ−ＺＦＤ−０２５「ＱＦＮＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２５「ＱＦＮＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＨＱＣＧＫＡＦＩＱＳＦＮＬＲＲＨＥＲＴＨ（配列番号１０５）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＡＡＧＴＧＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＴＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＣＡＣ−３′（配列番号１０４）。
【０２２８】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０２５「ＱＦＮＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＣに対する認識特異性を表す。
【０２２９】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２５「ＱＦＮＲ」は、例えば、ＧＡＣ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２３０】
実施例３６：ＴＧ−ＺＦＤ−０２６「ＱＧＮＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２６「ＱＧＮＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＦＱＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨ（配列番号１０７）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＴＣＣＡＧＴＧＴＡＡＴＣＡＧＴＧＴＧＧＧＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＣＡＧＡＡＡＧＧＴＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＡＣＡＴＴＡＡＡＣＴＧＣＡＣ−３′（配列番号１０６）。
【０２３１】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０２６「ＱＧＮＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＡに対する認識特異性を表す。
【０２３２】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２６「ＱＧＮＲ」は、例えば、ＧＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２３３】
実施例３７：ＴＧ−ＺＦＤ−０２８「ＱＳＨＴ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２８「ＱＳＨＴ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＫＣＥＥＣＧＫＡＦＲＱＳＳＨＬＴＴＨＫＩＩＨ（配列番号１１１）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＧＧＣＡＧＴＣＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＡＣＴＡＣＡＣＡＴＡＡＧＡＴＡＡＴＴＣＡＴ−３′（配列番号１１０）。
【０２３４】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０２８「ＱＳＨＴ」は３−ｂｐ標的配列ＡＧＡ、ＣＧＡ、ＴＧＡ、ＧＧＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０２８「ＱＳＨＴ」の結合部位配列に対する選好度は（ＡＧＡ、ＣＧＡ）＞ＴＧＡ＞ＧＧＡである。
【０２３５】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２８「ＱＳＨＴ」は、例えば、ＡＧＡ、ＣＧＡ、ＴＧＡまたはＧＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２３６】
実施例３８：ＴＧ−ＺＦＤ−０２９「ＱＳＨＶ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２９「ＱＳＨＶ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＤＨＣＧＫＳＦＳＱＳＳＨＬＮＶＨＫＲＴＨ（配列番号１１３）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＧＡＴＣＡＣＴＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＡＧＣＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＴＣＴＧＡＡＴＧＴＧＣＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＣ−３′（配列番号１１２）。
【０２３７】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０２９「ＱＳＨＶ」は３−ｂｐ標的配列ＣＧＡ、ＡＧＡ、及びＴＧＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０２９「ＱＳＨＶ」の結合部位配列に対する選好度はＣＧＡ＞ＡＧＡ＞ＴＧＡである。
【０２３８】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２９「ＱＳＨＶ」は、例えば、ＣＧＡ、ＡＧＡ、ＴＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２３９】
実施例３９：ＴＧ−ＺＦＤ−０３０「ＱＳＮＩ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３０「ＱＳＮＩ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＭＣＳＥＣＧＲＧＦＳＱＫＳＮＬＩＩＨＱＲＴＨ（配列番号１１５）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＣＡＴＧＴＧＣＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＡＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＣ−３′（配列番号１１４）。
【０２４０】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０３０「ＱＳＮＩ」は３−ｂｐ標的配列ＡＡＡ、ＣＡＡに対する認識特異性を表す。
【０２４１】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３０「ＱＳＮＩ」は、例えば、ＡＡＡまたはＣＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２４２】
実施例４０：ＴＧ−ＺＦＤ−０３１「ＱＳＮＲ３」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３１「ＱＳＮＲ３」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＥＫＣＧＫＡＦＮＱＳＳＮＬＴＲＨＫＫＳＨ（配列番号１１７）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＴＡＧＡＣＡＴＡＡＧＡＡＡＡＧＴＣＡＴ−３′（配列番号１１６）。
【０２４３】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０３１「ＱＳＮＲ３」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＡに対する認識特異性を表す。
【０２４４】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３１「ＱＳＮＲ３」は、例えば、ＧＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２４５】
実施例４１：ＴＧ−ＺＦＤ−０３２「ＱＳＳＲ３」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３２「ＱＳＳＲ３」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＮＥＣＧＫＦＦＳＱＳＳＳＬＩＲＨＲＲＳＨ（配列番号１１９）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＡＧＴＧＣＡＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＧＴＴＴＴＴＴＡＧＣＣＡＧＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＡＧＡＣＡＴＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＡＣ−３′（配列番号１１８）。
【０２４６】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０３２「ＱＳＳＲ３」は３−ｂｐ標的配列ＧＴＡ、ＧＣＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０３２「ＱＳＳＲ３」の結合部位配列に対する選好度はＧＴＡ＞ＧＣＡである。
【０２４７】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３２「ＱＳＳＲ３」は、例えば、ＧＴＡまたはＧＣＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２４８】
実施例４２：ＴＧ−ＺＦＤ−０３３「ＱＴＨＱ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３３「ＱＴＨＱ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＨＤＣＧＫＳＦＲＱＳＴＨＬＴＱＨＲＲＩＨ（配列番号１２１）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＴＴＴＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＣＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＣ−３′（配列番号１２０）。
【０２４９】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０３３「ＱＴＨＱ」は３−ｂｐ標的配列ＡＧＡ、ＴＧＡ、ＣＧＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０３３「ＱＴＨＱ」の結合部位配列に対する選好度はＡＧＡ＞（ＴＧＡ、ＣＧＡ）である。
【０２５０】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３３「ＱＴＨＱ」は、例えば、ＡＧＡ、ＴＧＡ、ＣＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２５１】
実施例４３：ＴＧ−ＺＦＤ−０３４「ＱＴＨＲ１」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３４「ＱＴＨＲ１」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＥＣＨＤＣＧＫＳＦＲＱＳＴＨＬＴＲＨＲＲＩＨ（配列番号１２３）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＴＴＴＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＡＣＴＣＧＧＣＡＣＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＣ−３′（配列番号１２２）。
【０２５２】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０３４「ＱＴＨＲ１」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡ、ＧＡＡ、ＡＧＡに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０３４「ＱＴＨＲ１」の結合部位配列に対する選好度はＧＧＡ＞（ＧＡＡ、ＡＧＡ）である。
【０２５３】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３４「ＱＴＨＲ１」は、例えば、ＧＧＡ、ＧＡＡ、ＡＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２５４】
実施例４４：ＴＧ−ＺＦＤ−０３５「ＱＴＨＲ２」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３５「ＱＴＨＲ２」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＨＫＣＬＥＣＧＫＣＦＳＱＮＴＨＬＴＲＨＱＲＴ（配列番号１２５）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＣＡＣＡＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＧＴＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＡＴＣＴＧＡＣＴＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＧＣＡＣＣＣＡＣ−３′（配列番号１２４）。
【０２５５】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０３５「ＱＴＨＲ２」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡに対する認識特異性を表す。
【０２５６】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３５「ＱＴＨＲ２」は、例えば、ＧＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２５７】
実施例４５：ＴＧ−ＺＦＤ−０３６「ＲＤＥＲ２」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３６「ＲＤＥＲ２」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＨＣＤＷＤＧＣＧＷＫＦＡＲＳＤＥＬＴＲＨＹＲＫＨ（配列番号１２７）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＣＣＡＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＡＡＡＴＴＣＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＴＡＣＣＧＴＡＡＡＣＡＣ−３′（配列番号１２６）。
【０２５８】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０３６「ＲＤＥＲ２」は３−ｂｐ標的配列ＧＣＧ、ＧＴＧに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０３６「ＲＤＥＲ２」の結合部位配列に対する選好度はＧＣＧ＞ＧＴＧである。
【０２５９】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３６「ＲＤＥＲ２」は、例えば、ＧＣＧ、ＧＴＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２６０】
実施例４６：ＴＧ−ＺＦＤ−０３７「ＲＤＥＲ３」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３７「ＲＤＥＲ３」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＲＣＳＷＥＧＣＥＷＲＦＡＲＳＤＥＬＴＲＨＦＲＫＨ（配列番号１２９）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＣＡＧＡＴＧＣＴＣＡＴＧＧＧＡＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＴＧＧＣＧＴＴＴＴＧＣＡＡＧＡＡＧＴＧＡＴＧＡＧＴＴＡＡＣＣＡＧＧＣＡＣＴＴＣＣＧＡＡＡＧＣＡＣ−３′（配列番号１２８）。
【０２６１】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０３７「ＲＤＥＲ３」は３−ｂｐ標的配列ＧＣＧ、ＧＴＧに対する認識特異性を表す。
【０２６２】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３７「ＲＤＥＲ３」は、例えば、ＧＣＧ、ＧＴＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２６３】
実施例４７：ＴＧ−ＺＦＤ−０３８「ＲＤＥＲ４」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３８「ＲＤＥＲ４」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＦＳＣＳＷＫＧＣＥＲＲＦＡＲＳＤＥＬＳＲＨＲＲＴＨ（配列番号１３１）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＴＣＡＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＧＡＡＡＧＧＴＴＧＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＡＴＧＡＡＣＴＧＴＣＣＡＧＡＣＡＣＡＧＧＣＧＡＡＣＣＣＡＣ−３′（配列番号１３０）。
【０２６４】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０３８「ＲＤＥＲ４」は３−ｂｐ標的配列ＧＣＧ、ＧＴＧに対する認識特異性を表す。
【０２６５】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３８「ＲＤＥＲ４」は、例えば、ＧＣＧ、ＧＴＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２６６】
実施例４８：ＴＧ−ＺＦＤ−０３９「ＲＤＥＲ５」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３９「ＲＤＥＲ５」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＦＡＣＳＷＱＤＣＮＫＫＦＡＲＳＤＥＬＡＲＨＹＲＴＨ（配列番号１３３）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＴＣＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＴＴＣＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＧＣＧＧＣＡＣＴＡＣＣＧＣＡＣＡＣＡＣ−３′（配列番号１３２）。
【０２６７】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０３９「ＲＤＥＲ５」は３−ｂｐ標的配列ＧＣＧに対する認識特異性を表す。
【０２６８】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３９「ＲＤＥＲ５」は、例えば、ＧＣＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２６９】
実施例４９：ＴＧ−ＺＦＤ−０４０「ＲＤＥＲ６」
ＴＧ−ＺＦＤ−０４０「ＲＤＥＲ６」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＨＣＮＷＤＧＣＧＷＫＦＡＲＳＤＥＬＴＲＨＹＲＫＨ（配列番号１３５）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＣＣＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＣＧＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＣＴＣＡＣＧＣＧＣＣＡＣＴＡＣＣＧＡＡＡＧＣＡＣ−３′（配列番号１３４）。
【０２７０】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０４０「ＲＤＥＲ６」は３−ｂｐ標的配列ＧＣＧ、ＧＴＧに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０４０「ＲＤＥＲ６」の結合部位配列に対する選好度はＧＣＧ＞ＧＴＧである。
【０２７１】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４０「ＲＤＥＲ６」は、例えば、ＧＣＧ、ＧＴＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２７２】
実施例５０：ＴＧ−ＺＦＤ−０４１「ＲＤＨＲ１」
ＴＧ−ＺＦＤ−０４１「ＲＤＨＲ１」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＦＬＣＱＹＣＡＱＲＦＧＲＫＤＨＬＴＲＨＭＫＫＳＨ（配列番号１３７）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＴＣＣＴＣＴＧＴＣＡＧＴＡＴＴＧＴＧＣＡＣＡＧＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＧＡＴＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＧＴＣＡＣ−３′（配列番号１３６）。
【０２７３】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０４１「ＲＤＨＲ１」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＧ、ＧＧＧに対する認識特異性を表す。
【０２７４】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４１「ＲＤＨＲ１」は、例えば、ＧＡＧ、ＧＧＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２７５】
実施例５１：ＴＧ−ＺＦＤ−０４３「ＲＤＨＴ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０４３「ＲＤＨＴ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＦＱＣＫＴＣＱＲＫＦＳＲＳＤＨＬＫＴＨＴＲＴＨ（配列番号１４１）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＴＣＣＡＧＴＧＴＡＡＡＡＣＴＴＧＴＣＡＧＣＧＡＡＡＧＴＴＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＧＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴ−３′（配列番号１４０）。
【０２７６】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０４３「ＲＤＨＴ」は３−ｂｐ標的配列ＴＧＧ、ＡＧＧ、ＣＧＧに対する認識特異性を表す。
【０２７７】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４３「ＲＤＨＴ」は、例えば、ＴＧＧ、ＡＧＧ、ＣＧＧ、ＧＧＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２７８】
実施例５２：ＴＧ−ＺＦＤ−０４４「ＲＤＫＩ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０４４「ＲＤＫＩ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＦＡＣＥＶＣＧＶＲＦＴＲＮＤＫＬＫＩＨＭＲＫＨ（配列番号１４３）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＴＴＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＴＴＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＧＧＡＡＣＧＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＣＡＣＡＴＧＣＧＧＡＡＧＣＡＣ−３′（配列番号１４２）。
【０２７９】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０４４「ＲＤＫＩ」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＧに対する認識特異性を表す。
【０２８０】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４４「ＲＤＫＩ」は、例えば、ＧＧＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２８１】
実施例５３：ＴＧ−ＺＦＤ−０４５「ＲＤＫＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０４５「ＲＤＫＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＶＣＤＶＥＧＣＴＷＫＦＡＲＳＤＫＬＮＲＨＫＫＲＨ（配列番号１４５）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＧＴＡＴＧＣＧＡＴＧＴＡＧＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＧＴＧＧＡＡＡＴＴＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＡＡＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＣＡＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣＡＣ−３′（配列番号１４４）。
【０２８２】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０４５「ＲＤＫＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＧ、ＡＧＧに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０４５「ＲＤＫＲ」の結合部位配列に対する選好度はＧＧＧ＞ＡＧＧである。
【０２８３】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４５「ＲＤＫＲ」は、例えば、ＧＧＧ、ＡＧＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２８４】
実施例５４：ＴＧ−ＺＦＤ−０４６「ＲＳＮＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０４６「ＲＳＮＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＩＣＲＫＣＧＲＧＦＳＲＫＳＮＬＩＲＨＱＲＴＨ（配列番号１４７）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＡＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＧＴＧＴＧＧＡＣＧＧＧＧＣＴＴＴＡＧＴＣＧＧＡＡＧＴＣＣＡＡＣＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＣ−３′（配列番号１４６）。
【０２８５】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０４６「ＲＳＮＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＧ、ＧＴＧに対する認識特異性を表す。生体内スクリーニング結果によれば、ＴＧ−ＺＦＤ−０４６「ＲＳＮＲ」の結合部位配列に対する選好度はＧＡＧ＞ＧＴＧである。
【０２８６】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４６「ＲＳＮＲ」は、例えば、ＧＡＧ、ＧＴＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２８７】
実施例５５：ＴＧ−ＺＦＤ−０４７「ＲＴＮＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０４７「ＲＴＮＲ」は、ヒトゲノム配列から生体内スクリーニングにより同定された。そのアミノ酸配列は、ＹＬＣＳＥＣＤＫＣＦＳＲＳＴＮＬＩＲＨＲＲＴＨ（配列番号１４９）である。それは、次のヒト核酸配列によりコードされる。
５′−ＴＡＴＣＴＡＴＧＴＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＡＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＡＣＣＴＣＡＴＡＡＧＧＣＡＴＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＣ−３′（配列番号１４８）。
【０２８８】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２との融合ポリペプチドとして、ＴＧ−ＺＦＤ−０４７「ＲＴＮＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＧに対する認識特異性を表す。
【０２８９】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４７「ＲＴＮＲ」は、例えば、ＧＡＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するために、複数のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を作るための単位として利用され得る。
【０２９０】
本発明に関する多くの実施態様を記述した。それにも拘わらず、本発明の精神と範囲を逸脱しない多くの多様な変形が可能であることを理解するはずである。したがって他の実施態様も後述する請求項の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２９１】
【図１】三つのジンクフィンガードメインで構成され、ＤＮＡ配列５′−ＧＣＧ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  Ｔ−３′と結合しているＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質の３次元構造を表す図面である。黒色円は亜鉛イオンの位置を表す。
【図２】Ｚｉｆ２６８のアミノ酸残基とＤＮＡ塩基間の水素結合相互作用を表す。αヘリックスに沿った−１、２、３及び６位のアミノ酸残基らは、特定位置の塩基と相互作用する。太線は理想的な水素結合を表し、点線は潜在的な水素結合を表す。
【図３】ジンクフィンガードメインのαヘリックスに沿った−１、２、３及び６位のアミノ酸残基とＤＮＡ塩基間の相互作用を要約した認識コード（recognition code）表を表す。
【図４】アミノ酸残基及びこれらの相当する３塩基トリプレットの位置を表す図面である。太線は観察される主要相互作用を表し、点線は補助相互作用を表す。
【図５】本明細書に開示された生体内（in vivo）選別システムの原理を説明する図面である。多様なジンクフィンガー突然変異のうち、ジンクフィンガードメインＡは標的配列（ＸＸＸＸで表示）を認識し、ＨＩＳ３リポーター遺伝子の転写を活性化する。結果的に、酵母コロニーはヒスチジンが欠乏した培地で育つ。これと対照的に、ジンクフィンガードメインBは標的配列を認識せず、したがって、リポーター遺伝子は抑圧されるようになる。その結果、ヒスチジンが欠乏した培地でコロニーが育たない。ADは転写活性化ドメインを表す。
【図６】ＨＩＶの末端反復配列（ＬＴＲ）で及びＨＩＶ−１の共受容体（coreceptor）をコードするヒト遺伝子であるＣＣＲ５のプロモーター部位で発見される１０−ｂｐ配列の目録である（それぞれ配列番号１−５）。下線部分は本発明の選別で使用された４−ｂｐ標的配列を表す。
【図７】リポーター遺伝子に連結された結合部位の塩基配列を表す（それぞれ配列番号s：６−１７）。それぞれの結合部位は４つの複合結合配列の直列配置で構成されている。それぞれの複合結合配列はＺｉｆ２６８のフィンガー１及びフィンガー２により認識される切断された結合配列５′−ＧＧ  ＧＣＧ−３’を４−ｂｐ標的配列に連結させて構築された。
【図８】ハイブリッドプラスミドのライブラリー構築に使用可能なプラスミドであるｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆ（配列番号１８及び１９）の図面である。
【図９】ｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆに挿入されたＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質をコードする遺伝子に対する塩基配列及び相応する翻訳されたアミノ酸配列を表す（それぞれ配列番号２０及び２１）。制限酵素により認識される部位に下線を引いた。
【図１０】生体内選別システムにより選択されたジンクフィンガータンパク質を使用して再形質転換（retransformation）及び交差形質転換（cross-transformation）から得た酵母細胞を有する培養プレートの写真である。
【図１１】ヒトゲノム由来のジンクフィンガーライブラリーから生体内システムにより選択されたジンクフィンガードメインの特定ＤＮＡ配列及びこのＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列の目録である（配列番号２２−３３）。ヒトゲノムからジンクフィンガードメインをコードするＤＮＡセグメントを増幅させるのに使用される縮重（degenerate）ＰＣＲプライマーに相応するＤＮＡ配列に下線を引いた。４個の潜在的な塩基−接触位置を表示し、アミノ酸残基を太く表した。亜鉛イオンと配位結合することと予想される二つのＣｙｓ残基及び二つのＨｉｓ残基をイタリック体で表した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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