(57)【要約】      （修正有）【課題】  Ｇタンパク質共役型レセプターのサブファミリーを形成するチンパンジーの微量アミン関連レセプター（ＴＡＡＲ）を提供する。【解決手段】Ｇタンパク質共役型レセプターのサブファミリーのメンバーとして同定された新しいチンパンジーのＴＡＡＲポリペプチド、該ＴＡＡＲポリペプチドに特異的で選択的なフィンガープリント配列を提供する。また、該ＴＡＡＲポリペプチドをコードする核酸、および該ファミリーメンバーを含むベクターと宿主細胞も提供する。加えて、チンパンジーのＴＡＡＲを同定する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１４を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１６を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドの、薬物標的としての使用。
【請求項５】
請求項１〜３記載のポリペプチドの、統合失調症治療に有用な化合物を同定するための薬物標的としての使用。
【請求項６】
請求項１〜３記載のポリペプチドの、片頭痛治療に有用な化合物を同定するための薬物標的としての使用。
【請求項７】
請求項１〜３記載のポリペプチドの、うつ病治療に有用な化合物を同定するための薬物標的としての使用。
【請求項８】
請求項１〜３記載のポリペプチドの、摂食障害の治療に有用な化合物を同定するための薬物標的としての使用。
【請求項９】
請求項１〜３記載のポリペプチドの、注意欠陥多動性障害の治療に有用な化合物を同定するための薬物標的としての使用。
【請求項１０】
配列番号２を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号１３を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号１５を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１０〜１２のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含む、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項１６】
配列ＮＳＸＸＮＰＸＸＹＸＸＸＹＸＷＦを含み、配列中、Ｘは自然に存在するいずれかのアミノ酸である、チンパンジーのフィンガープリントモチーフ。
【請求項１７】
請求項１６記載のフィンガープリントモチーフを含む配列の、チンパンジーのＴＡＡＲを同定するための使用。
【請求項１８】
請求項１６記載のフィンガープリントモチーフを含む配列を有する、単離されたまたは組換え型のチンパンジーのポリペプチド。
【請求項１９】
薬物標的としての、請求項１８記載のポリペプチド。
【請求項２０】
統合失調症治療、片頭痛治療、うつ病治療、摂食障害の治療、または注意欠陥多動性障害の治療に役立つ化合物を同定するための薬物標的としての、請求項１８記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ａ）請求項１〜３のいずれか１項または請求項１８記載のポリペプチドを、候補化合物に接触させること、および
ｂ）化合物が前記ポリペプチドに結合するか否かを決定すること、
を含む、請求項１〜３のいずれか１項または請求項１８記載のポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法。
【請求項２２】
ａ）請求項１〜３のいずれか１項または請求項１８記載のポリペプチドを、候補化合物に接触させること、および
ｂ）前記化合物が前記ポリペプチドの機能または活性をモジュレーションしたか否かを決定すること、を含む、請求項１〜３のいずれか１項または請求項１８記載のポリペプチドの生物学的活性に対し刺激または阻害効果を有する化合物を同定するための方法。
【請求項２３】
特に上記の実施例を参照して上に十分に記載した、方法、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、核酸プライマー、および、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体のサブファミリーを形成するチンパンジーの微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）に特異的で選択的なフィンガープリント配列を提供する。本発明はまた、このファミリーのメンバーとして同定されたポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、および新しいファミリーメンバーを含むベクター、宿主細胞、およびヒト以外の動物を提供する。さらに本発明は、ＴＡＡＲを同定する方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
微量アミン（ＴＡ）は、構造的に生体アミンに関連する内因性化合物であり、哺乳動物神経系で微量見出される。ＴＡは、神経末端に貯えられ、古くから知られている生体アミンと共に放出される。現在までに、ＴＡを唯一の伝達物質として用いるシナプスが存在するという証拠は無い。最近、特異的に微量アミンを結合する受容体が、Borowski et al.（Trace amines: identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2001)98(16): 8966-8971.）および、Bunzow et al.（Amphetamine, 3,4-methylenedioxymethamphetamine, lysergic acid diethylamide, and metabolites of the catecholamine neurotransmitters are agonists of a rat trace amine receptor. Mol. Pharmacol.2001, 60(6): 1181-1188.）によって報告された。これらの受容体は、明らかに新しいＧＰＣＲファミリーである。
【０００３】
微量アミンの調節不全は、種々の精神障害、即ち、うつ病（Sandler M.et al.,Decreased cerebrospinal fluid concentration of free phenylacetic acid in depressive illness. Clin. Chim. Acta, 1979, 93(l): 169-171; Davis BA and Boulton AA. The trace amines and their acidic metabolites in depression--an overview. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry, 1994, 18(1): 17-45.）、統合失調症（Potkin SG. et al. Phenylethylamine in paranoid chronic schizophrenia. Science. 1979, 206(4417): 470-471; Sandler M and Reynolds GP. Does phenylethylamine cause schizophrenia?  Lancet, 1976, 1(7950): 70-71.）および、双極性障害（Boulton AA.: Some aspects of basic psychopharmacology: the trace amines. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry, 1982; 6(4-6): 563-570; Sabelli HC et al., Clinical studies on the KM/29.04. 2005; phenylethylamine hypothesis of affective disorder: urine and blood phenylacetic acid and phenylalanine dietary supplements. J. Clin. Psychiatry, 1986 Feb; 47(2): 66-70.）に関連付けられた。さらに、微量アミンの調節不全は、注意欠陥多動性障害（Baker et al. Phenylethylaminergic mechanisms in attention-deficit disorder. Biol. Phychiatry, 1991, 29(1): 15-22）、パーキンソン病（Heller B and Fischer E., Diminution of phenethylamine in the urine of Parkinson patients. Arzneimittelforschung, 1973, 23(6): 884-886.）、片頭痛（D'Andrea G. et al. Elusive amines and primary headaches: historical background and prospectives. Neurol. Sci. 2003, 24 Suppl. 2.: S65-7; D'Andrea, G. et al., Elevated levels of circulating trace amines in primary headaches. Neurology, 2004, 62(10): 1701-1705.）、および、摂食障害（Wolf ME and Mosnaim AD. Phenylethylamine in neuropsychiatric disorders. Gen. Pharmacol,1983, 14(4): 385-390;  Branchek TA and Blackburn TP. Trace amine receptors as targets for novel therapeutics: legend myth and tact. Curr. Opin. Pharmacol. 2003, 3(l): 90-97.）、即ち、ＰＥＡがこれまでに知られているもっとも強力な食欲低下化合物であるアンフェタミンと非常に高い構造上の類似性を有することから示唆されて、肥満症と食欲低下のような障害（Samanin R, and Garattini S.: Neurochemical mechanism of action of anorectic drugs. Pharmacol. Toxicol. 1993 Aug; 73(2): 63-68; Popplewell DA et al., A behavioural and pharmacological examination of phenylethylamine-induced anorexia and hyperactivity--comparisons with amphetamine. Pharmacol. Biochem. Behav. 1986 Oct; 25(4): 711-716.）、と関連付けられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、微量アミン受容体に関する知見の増加、特に、さらなる微量アミン受容体の同定に、広い関心が存在する。しかし、文献と公開データベースのエントリの調査から、微量アミン受容体の命名についての不整合が明らかになった。例えば、ヒト受容体ＧＰＲ１０２（Lee et al. Discovery and mapping of ten novel G protein-coupled receptor genes. Gene, 2001, 275(1): 83-91.)は、またTA5(Borowski et al. Trace amines: identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2001)98(16): 8966-8971）とも呼ばれ、ヒト５−ＨＴ４Ψ（Liu et al., A serotonin-4 receptor-like pseudogene in humans. Brain Res. Mol. Brain Res. 1998, 53(1-2): 98-103.）は、またＴＡ２Ψとも名付けられている（Borowski et al. Trace amines: identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2001)98(16): 8966-8971）。さらに、ＧＰＲ５７（Lee et al. Cloning and characterization of additional members of the G protein-coupled receptor family. Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1490(3): 311-323.）、ＧＰＲ５８（Lee et al. Cloning and characterization of additional members of the G protein-coupled receptor family. Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1490(3): 311-323.）およびＰＮＲ（Zeng et al. Cloning of a putative human neurotransmitter receptor expressed in skeletal muscle and brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 242(3): 575-578.）は、これまで、一般にＴＡ受容体とは認められなかった。この不整合は、混乱と不確実性を引き起こす。したがって、この受容体ファミリーの明確な定義が強く求められる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
現行の命名法の曖昧さを解決するため、これらの受容体を微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）と呼ぶ新しい統一的な命名法を、本発明と共に提案する。この新しい命名法は、少なくともあるＴＡＡＲはＴＡに全く応答しないという発見を反映したものであり、それゆえ「関連」という用語を用いる。この命名法は、このＧＰＣＲファミリーの全ての受容体をカバーし、種々の種のいろいろな数の受容体遺伝子に適合している。新しい命名法は、厳密に各ヒト染色体上の受容体遺伝子の配列順序に基づいており、また同時に、さまざまな種に亘る受容体遺伝子の詳細な系統学的解析（図３）にも基づいている。この命名法は、次の規則を堅守する：
【０００６】
ａ）２つ（または３つ）のオーソログ遺伝子、即ち種形成事象により生じた遺伝子には、どれも同じ番号を付する。逆に、２つの遺伝子がもしオーソログでなければ、同じ番号を付してはならない。
【０００７】
ｂ）パラログ、即ち、１つの種の系統内で遺伝子重複事象により生じた遺伝子は、１字の添字によって区別する。
【０００８】
ｃ）例：遺伝子ｈＴＡＡＲ５、ｒＴＡＡＲ５、ｍＴＡＡＲ５は、全てオーソログである。
マウスの遺伝子ｍＴＡＡＲ８ａ、ｂ、ｃは、パラログである。
遺伝子ｍＴＡＡＲ８ａ、ｂ、ｃは、全てｈＴＡＡＲ８のオ−ソログである。
【０００９】
さらに、チンパンジーＴＡＡＲタンパク質をヒトの同等物と比較することにより、ヒトのタンパク質の機能についての示唆が得られる可能性がある。ヒトとチンパンジーの両方で機能しているＴＡＡＲタンパク質は、たぶん生理的に重要な役割を果たしている。一方、ヒトにおいてのみ機能的でチンパンジーでは機能的でないＴＡＡＲタンパク質は、ヒトとチンパンジー間の特異的な相違を説明する可能性がある。
【００１０】
本発明は、ＴＡＡＲファミリーのメンバーとして同定されたチンパンジーの新しいポリペプチド、該ポリペプチドの薬物標的としての利用、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および、該ポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、およびヒト以外の動物を提供する。さらに本発明は、ＴＡＡＲファミリーに特異的で選択的なフィンガープリントモチーフと、これの利用に関する。
【００１１】
本発明は、配列ＮＳＸＸＮＰＸＸＹＸＸＸＹＸＷＦ（配列番号１）を含むフィンガープリント配列を提供する；配列中、Ｘは自然に存在するいずれのアミノ酸である。ここで用いる「フィンガープリント」、「フィンガープリントモチーフ」、「フィンガープリント配列」という用語は、チンパンジーＧＰＣＲサブファミリーＴＡＡＲに特異的で選択的なアミノ酸配列に関するものである。フィンガープリントモチーフは、機能的ＴＡＡＲに特異的であることが好ましい。トリプトファン残基は、フィンガープリントモチーフではもっぱらＴＡＡＲ中だけで見出され、どの他の既知のＧＰＣＲ中でも見出されない；むしろ他のＧＰＣＲ  中では、対応する配列位置は、ほとんど必ず極性を有する、または電荷さえ有するアミノ酸で占められている。フィンガープリントモチーフは、ＴＡＡＲ、好ましくは機能的ＴＡＡＲを同定するために用いることができる。
【００１２】
本発明はまた、フィンガープリント配列（配列番号１）を用いてチンパンジーＴＡＡＲを同定する方法を提供する。チンパンジーＴＡＡＲファミリーのメンバーとして同定されるためには、ポリペプチドはフィンガープリント配列と１００％の同一性を持つ配列を含んで良い。
【００１３】
さらに、本発明は、フィンガープリント配列（配列番号１）を用いて、他の種、好ましくは哺乳類ＴＡＡＲを同定する方法に関する。ＴＡＡＲファミリーのメンバーとして同定されるためには、ポリペプチドは少なくとも、フィンガープリント配列と７５％の同一性、好ましくは８７％以上の、より好ましくは１００％の同一性を持つ配列を含んで良い。
【００１４】
フィンガープリント配列は、例えばＴＡＡＲファミリーメンバーを同定するための検索を、配列データベースに対して行うための「問い合わせ配列」として用いることができる。そのような検索は、例えばＥＭＢＯＳＳのｆｕｚｚｐｒｏ（Rice et al., EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite. Trends in Genetics, 2000, 16(6): 276-277）のようなパターン認識プログラムを用いて行うことができる。チンパンジーＴＡＡＲに対する検索は、ｆｕｚｚｐｒｏを用い、ＮＳＸＸＮＰＸＸＹＸＸＸＹＸＷＦを必要配列とし、ミスマッチ数＝０、データベース＝ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ（リリース４３）、として実行できる。
【００１５】
チンパンジーＴＡＡＲファミリーは、９メンバー（ｐｔＴＡＡＲ１〜ｐｔＴＡＡＲ９）を含み、その中の５つは偽遺伝子：ｐｔＴＡＡＲ２Ψ、ｐｔＴＡＡＲ３Ψ、ｐｔＴＡＡＲ４Ψ、ｐｔＴＡＡＲ８Ψ、ｐｔＴＡＡＲ９Ψである。チンパンジーＴＡＡＲファミリーメンバーをコードする全ての遺伝子が、チンパンジーの第５染色体に位置する。２個のエクソンでコードされるｐｔＴＡＡＲ２を例外として、チンパンジーのＴＡＡＲ遺伝子をコードする配列が、単一のエクソン中に存在する。
【００１６】
ここで用いる「遺伝子」という用語は、生物学的機能に関連したＤＮＡの任意のセグメントを表す。遺伝子は、特定の染色体上の特定の位置に存在し、特定の機能的生産物をコードするヌクレオチドの順序づけられた配列である。
【００１７】
ここで用いる「偽遺伝子」という用語は、活性を有する祖先遺伝子から突然変異事象によって進化した可能性のある不活性な遺伝子のことである。不活性であるとは、遺伝子が機能を有するポリペプチドに翻訳されないことを意味する。
【００１８】
本発明は、配列番号３の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）として同定され、ｐｔＴＡＡＲ１と命名された。
【００１９】
ここで用いる「ポリペプチド配列」（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、など）という用語は、自然に存在するアミノ酸から成るアミノ酸のポリマーをいう。
【００２０】
「単離された」との用語は、「人間の手によって」自然状態から変えられたことを意味する。もし、「単離された」組成物または物質が、自然界に見いだされる場合、それは変化させられたか、元の環境から移されたか、またはその両方である。例えば、生きている動物内に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」ていないが、しかし自然の状態で共存する材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ここで採用した用語に従って、「単離され」ている。
【００２１】
「組換え型」という用語は、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関連して用いられた場合、概して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、異種（または外来）の核酸の導入または天然の核酸の改変によって修飾されたこと、またはタンパク質またはポリペプチドが、異種アミノ酸の導入によって修飾されたこと、を示す。
【００２２】
本発明はさらに、ポリペプチドｐｔＴＡＡＲ１をコードする配列番号２を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００２３】
ここで用いる「ポリヌクレオチド配列」（例えば、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、など）という用語は、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、Ｇを含むヌクレオチドのポリマーについて用いられる。
【００２４】
本発明はさらに、配列番号１４の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、微量アミン関連受容体として同定され、ｐｔＴＡＡＲ５と命名された。
【００２５】
本発明はまた、ポリペプチドｐｔＴＡＡＲ５をコードする配列番号１３を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００２６】
本発明はさらに、配列番号１６の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、微量アミン関連受容体として同定され、ｐｔＴＡＡＲ６と命名された。
【００２７】
本発明はまた、ポリペプチドｐｔＴＡＡＲ６をコードする配列番号１５を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００２８】
本発明はまた、ｐｔＴＡＡＲ２Ψ（配列番号４）のヌクレオチド配列を提供する。さらにまた本発明は、ｐｔＴＡＡＲ２Ψの修復されたポリヌクレオチド配列（ｐｔＴＡＡＲ２Ψｆ，配列番号５）を提供する。本発明はさらに、修理されたヌクレオチド配列ｐｔＴＡＡＲ２Ψｆによってコードされるポリペプチド配列（配列番号６）を提供する。ここで用いる「修復された遺伝子」または「修理された遺伝子」という用語は、遺伝子が活性型になるように配列が変えられた偽遺伝子を指す。すなわち、ｈＴＡＡＲ３のポリヌクレオチド配列は、早期終止コドンを生じた突然変異によって不活性である。この配列は、１３３〜１３４の位置（図３参照）の２個のヌクレオチドの挿入により修復された。
【００２９】
本発明はまた、ｐｔＴＡＡＲ３Ψ（配列番号７）のヌクレオチド配列を提供する。さらにまた本発明は、ｐｔＴＡＡＲ３Ψの修復されたポリヌクレオチド配列（ｐｔＴＡＡＲ３Ψｆ，配列番号８）を提供する。本発明はさらに、修理されたヌクレオチド配列ｐｔＴＡＡＲ３Ψｆによってコードされるポリペプチド配列（配列番号９）を提供する。
【００３０】
本発明はまた、ｐｔＴＡＡＲ４Ψ（配列番号１０）のヌクレオチド配列を提供する。さらに本発明は、ｐｔＴＡＡＲ４Ψの修復されたポリヌクレオチド配列（ｐｔＴＡＡＲ４Ψｆ，  配列番号１１）を提供する。本発明はさらに、修理されたヌクレオチド配列ｐｔＴＡＡＲ４Ψｆによってコードされるポリペプチド配列（配列番号１２）を提供する。
【００３１】
本発明はまた、ｐｔＴＡＡＲ８Ψ（配列番号１７）のヌクレオチド配列を提供する。さらにまた本発明は、ｐｔＴＡＡＲ８Ψの修復されたポリヌクレオチド配列（ｐｔＴＡＡＲ８Ψｆ，配列番号１８）を提供する。本発明はさらに、修理されたヌクレオチド配列ｐｔＴＡＡＲ８Ψｆによってコードされるポリペプチド配列（配列番号１９）を提供する。
【００３２】
本発明はまた、ｐｔＴＡＡＲ９Ψ（配列番号２０）のヌクレオチド配列を提供する。さらにまた本発明は、ｐｔＴＡＡＲ９Ψの修復されたポリヌクレオチド配列（ｐｔＴＡＡＲ９Ψｆ，配列番号２１）を提供する。本発明はさらに、修理されたヌクレオチド配列ｐｔＴＡＡＲ９Ψｆによってコードされるポリペプチド配列（配列番号２２）を提供する。
【００３３】
その上、本発明はまた、フィンガープリント配列（配列番号１）を含むアミノ酸配列を含む、単離されたまたは組換え型のチンパンジーのポリペプチドを提供する。
【００３４】
さらに本発明は、本発明のポリペプチドの薬物標的としての使用に関する。本発明のポリペプチドは、うつ病治療、統合失調症治療、片頭痛治療、または注意欠陥多動性障害や、食欲低下や肥満症のような摂食障害の治療、に有用な化合物を同定するための薬物標的として用いられるのが好ましい。この薬物標的は、薬学的に活性のある化合物の設計、スクリーニング、および開発にとって適切なものであり得る。
【００３５】
本発明の１つの実施形態は、薬物標的としての、配列番号３、６、９、１２、１４、１６、１９または２２のポリペプチド配列を有するポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドは、うつ病治療、統合失調症治療、片頭痛治療、または注意欠陥多動性障害や、食欲低下や肥満症のような摂食障害の治療、に有用な化合物を同定するための薬物標的として用いられるのが好ましい。
【００３６】
本発明のもう１つの実施形態は、フィンガープリント配列（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する、薬物標的としてのチンパンジー受容体に関する。これらの受容体は、うつ病治療、統合失調症治療、片頭痛治療、または注意欠陥多動性障害や、食欲低下や肥満症のような摂食障害の治療、に有用な化合物を同定するための薬物標的とするのが好ましい。
【００３７】
「本発明のポリペプチド」という用語は、本発明によって提供される新しいポリペプチド、即ちｐｔＴＡＡＲ１〜ｐｔＴＡＡＲ９を指す。
【００３８】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターによって形質導入された宿主細胞、および組換技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。ベクターは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、又は配列番号２１を含むポリヌクレオチドを含むことが好ましく、そして、宿主細胞は該ベクターによって形質導入されていることが好ましい。
【００３９】
宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチドの発現系または発現系の一部を組み込むために、遺伝子工学による操作（例えば、形質導入、形質転換、またはトランスフェクション）がされていてもよい。ベクターの宿主細胞への導入は、Davis et al. Basic methods in molecular biology. Elsevier, New York(1986); Davis JM(ed.): Basic cell culture: a practical approach, sec. edition. Oxford University Press(2002); R. Ian Freshney: Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, fourth edition. John Wiley & Sons(Sd)1999; and Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2. Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989),のような、多くの標準実験室マニュアルに記載されている方法、即ち、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染などのような方法によって、実現できる。
【００４０】
宿主細胞は、ＨＥＫ２９３，ＣＨＯ，ＣＯＳ，ＨｅＬａのような哺乳動物細胞；ＳＨ−ＳＹ５Ｙ，ＰＣ１２，ＨＮ−１０（Lee HJ, Hammond DN, Large TH, Roback JD, Sim JA, Brown DA, Otten UH, Wainer BH.: Neuronal properties and trophic activities of immortalized hippocampal cells from embryonic and young adult mice. J. Neurosci. 1990 Jun; 10(,6): 1779-1787.）、ＩＭＲ−３２，ＮＢ４１Ａ３，Ｎｅｕｒｏ−２ａ，ＴＥ  ６７１のような、神経、神経内分泌、神経芽腫、またはグリアの細胞系統；ラット、マウスのような哺乳動物の一次神経またはグリア細胞；アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞；連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌（E. coli）、放線菌（Streptomyces）および枯草菌（Bacillus subtilis）の細胞のようなバクテリア細胞；酵母（Saccharomyces cerevisiae）やコウジカビ（Aspergillus）細胞のような真菌類細胞；ショウジョウバエ（Drosophila）Ｓ２、ヨトウガ（Spodoptera）Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；および植物細胞でよい。
【００４１】
非常に多様な発現系を用いることができる。そのような発現系には、他のものの中に、染色体、エピゾーム、および、ウイルスから導かれる系、即ち、バクテリアのプラスミドから、バクテリオファージから、トランスポゾンから、酵母のエピゾームから、酵母の染色体要素から、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、牛痘ウイルス、アデノウイルス、鳥類ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス）から、導かれるベクターが含まれる。また、これらの結合から導かれるベクター、即ちコスミドおよびファージミドのような、プラスミドとバクテリオファージの遺伝要素から導かれるベクターも含まれる。発現系は、発現を生じさせると共に制御する制御領域を含んでもよい。一般に、宿主中でポリペプチドを産生するためのポリヌクレオチドを維持し、伝播し、または発現するのに適した系またはベクターは、どれでも使用できる。適切なヌクレオチド配列は、種々の周知・慣用技術のいずれによっても、例えば、Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2. Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, N.Y.(1989)or Borowski et al Trace amines: identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors. Proc Natl Acad Sci USA(2001)98(16): 8966-71）に記載されているような技術によっても、発現系に挿入することが可能である。
【００４２】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。ヒト以外のトランスジェニック動物は、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、または配列番号２１を含むポリヌクレオチドを含むのが好ましい。
【００４３】
ヒト以外のトランスジェニック動物は、周知のヒト以外の動物であればよい。好ましくは、ヒト以外のトランスジェニック動物は、哺乳動物であり、より好ましくは、ヒト以外のトランスジェニック動物は齧歯類である。最も好ましくは、本発明のトランスジェニック動物はマウスである。
【００４４】
ヒト以外のトランスジェニック動物を作り出す方法は周知技術であり、例えば、Hogan, B.C., F; Lacy, E, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 1986, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press;  Hogan, B., et al., Manipulating the mouse embryo. 1994, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, および Joyner, A.(ed.): Gene Targeting - A Practical Approach, Second Edition. Practical Approach Series, Oxford University Press 1999, に記載されているような方法である。
【００４５】
本発明のポリペプチドは、受容体に結合する化合物および本発明の受容体ポリペプチドを活性化し（アゴニスト）または活性化を阻害する化合物（アンタゴニスト）、または例えば受容体の輸送に作用することによって受容体の機能を調節する化合物、をスクリーニングする過程において採用することができる。
【００４６】
本発明は、本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法であって：
ａ）本発明のポリペプチドを候補化合物と接触させること、および
ｂ）該化合物が本発明のポリペプチドと結合するか否かを決定すること、
を含む方法を提供する。
【００４７】
本発明はまた、本発明のポリペプチドの生物学的活性またはその発現に対して、刺激または阻害作用を有する化合物を同定するための方法であって、
ａ）本発明のポリペプチドを候補化合物と接触させること、および
ｂ）該化合物が本発明のポリペプチドの機能または活性をモジュレーションしたか否かを決定すること、
を含む方法を提供する。
【００４８】
一般に、上述のようなスクリーニングの手順は、本発明の受容体ポリペプチドを表面に発現する適当な細胞の産生を必要とするが、しかし、適当な細胞に発現した受容体は、細胞内に局在してもよい。そのような細胞は、哺乳動物、アフリカツメガエル、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞を含む。次に、受容体を発現している細胞（または、発現した受容体を含む細胞膜）をテスト化合物と接触させ、結合、または機能的応答の刺激または阻害を測定する。
【００４９】
一つのスクリーニング技術は、本発明の受容体の発現細胞（例えば、トランスフェクションされたＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３）を、受容体活性化に起因する細胞外ｐＨ変化または細胞内カルシウム変化を測定するシステムにおいて使用することを特徴とする。この技術では、化合物を本発明の受容体ポリペプチドを発現している細胞と接触させる。次に、セカンドメッセンジャー応答、例えば、信号変換、ｐＨ変化、ＰＩ加水分解、ＧＴＰ−γ−［３５Ｓ］放出、またはカルシウムレベル変化を測定し、候補化合物が受容体を活性化するか阻害するかを決定する。
【００５０】
もう１つの方法は、受容体阻害剤のスクリーニングを、受容体が媒介するｃＡＭＰおよび／またはアデニル酸シクラーゼ蓄積の阻害または刺激の測定によって行うことを特徴とする。この方法では、真核細胞に本発明の受容体をトランスフェクションして、受容体を細胞表面に発現させることが必要である。その細胞は次に、本発明の受容体存在下で、候補アンタゴニストに晒される。次にｃＡＭＰの蓄積量を測定する。もし候補アンタゴニストが受容体に結合し、その結果受容体結合を阻害すれば、受容体に媒介されたｃＡＭＰまたはアデニル酸シクラーゼ活性のレベルは減少するか増加することになる。
【００５１】
本発明の受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストを検出するもう１つの方法は、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  ５，４８２，８３５記載の酵母を基礎にした技法である。
【００５２】
測定は、単に候補化合物の結合をテストすればよく、受容体を有する細胞への付着を、候補化合物と直接または間接的に関連するラベルを用いて、またはラベルされた競合物との競争を含む測定によって検出する。さらに、これらの測定法では、候補化合物が、受容体の活性化によって信号を発生させる結果になるか否かを、受容体を表面に有する細胞に適切な検出システムを用いてテストしてもよい。活性化阻害剤は、一般に、既知のアゴニスト存在下で検定し、候補化合物の存在がアゴニストによる活性化に与える影響を観測する。そのようなスクリーニング検定実施の標準的方法は、従来技術においてよく理解されている。
【００５３】
本発明のポリペプチドの候補アンタゴニストの例としては、抗体、または、ある場合には、本発明のポリペプチドのリガンドと密接に関連したオリゴヌクレオチドまたはタンパク質で、例えば、リガンドの断片、または例えば神経伝達物質の、またはアミノ酸の代謝物のような小分子量の分子であって、受容体に結合するが応答を出さないために受容体の活性が阻止されるもの、を含む。
【００５４】
さらに、本発明は、特に次の実施例を参照して十分に上に記載したような、方法、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、核酸プライマー、および、使用、を提供する。
【００５５】
ここまで一般的に本発明を記述してきたが、同じことが具体的な実施例を参照することでより良く理解できるようになる。実施例は説明のみの目的でここに含まれており、特にそうではないと断らない限り、図に関連づけて限定することを意図したものではない。
【００５６】
【表１】
2006068001.tif 000002
【００５７】
表１：  チンパンジーＴＡＡＲファミリーのメンバー
ｐｔ＝Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、ｎｔ＝ヌクレオチド配列、ｎｔ  ｆｉｘｅｄ＝修復されたヌクレオチド配列、ａａ＝アミノ酸配列。ｐｔＴＡＡＲ２、ｐｔＴＡＡＲ３、ｐｔＴＡＡＲ４、ｐｔＴＡＡＲ８、およびｐｔＴＡＡＲ９のアミノ酸配列は、修復されたヌクレオチド配列の対応物である。
【実施例】
【００５８】
実施例において言及する市販の試薬は、特に明記しない限りメーカーの指示に従って用いた。
【００５９】
ＴＡＡＲファミリーメンバーの同定
以前に公表されたＴＡＡＲレセプター遺伝子と、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能なチンパンジーのゲノム配列情報とを、ＢＬＡＳＴのような標準アルゴリズムを使用して比較することにより、ＴＡＡＲ遺伝子を同定した。チンパンジーのゲノム配列情報を利用できない箇所については、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能なヒトゲノム配列から情報を外挿した。
【００６０】
この配列情報に基づき、ＴＡＡＲ遺伝子を、チンパンジーのゲノムＤＮＡから、ＰＣＲにより増幅した。さらに指定しない場合は、すべての手順を基本的には、Sambrook, J., Fritsch, E.F.,und Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A laboratory manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)の記載に従って実施した。全ての試薬は、入手可能な最高純度のものであり、全ての溶液および試薬は、特に明記しない限り使用前に滅菌した。
【００６１】
この目的のため、オリゴヌクレオチドプライマ−（表２）を、Ｇｅｎｂａｎｋで利用できるゲノム配列情報から導かれるＴＡＡＲコーディング配列に基づいて設計した。プライマーは、アンプリコンが読み枠全体を含むように設計した。プライマーを、主にＶｅｃｔｏｒＮＴ１  ソフトウエア（VectorNT1、version 9.0.0, Informax）を用い、ＰＣＲプライマーの標準規則に従って設計した：ａ）プライマーは、１８〜２５ヌクレオチドの長さを有するべきであり、ｂ）約５０％のＧ／Ｃ含量を持ち、ｃ）３ヌクレオチド以上長い逆方向の反復を含むべきでなく、ｄ）少なくとも５’端にＧかＣを有するべきであり、ｅ）３個より多くの同じヌクレオチドの単純な繰り返しを有するべきでなく、そして、ｆ）同じＰＣＲ反応で用いられるプライマーのアニーリング温度（ＴＭ）の違いはできる小さくすべきである（詳しくは、例えば、McPherson M.J., Hames B.D., Taylor G.R.(eds.): PCR 2 - A Practical Approach. The practical approach series, Oxford University Press, 1995, ISBN: 0-19-963424-6 を参照のこと）。プライマーオリゴヌクレオチドのアニーリング温度を、Breslauer KJ, Frank R, Blocker H, Marky LA.: Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986 Jun;83(11): 3746-3750、に記載された規則に基づいて計算した（この規則は、配列が対称的でなく、少なくとも１個のＧまたはＣを含み、最小８ヌクレオチドの長さを有することを仮定している）。オリゴヌクレオチドは、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ社（Microsynth AG, Schutzenstrasse 15, 9436 Balgach, Switzerland）にＨＰＬＣ精製品質のものを注文した。
【００６２】
チンパンジーのゲノム配列公開がよい品質でないため、いくつかのｐｔＴＡＡＲ遺伝子の配列、またはその部分が利用できなかった。したがって、いくつかのプライマーは、対応するヒトのゲノム配列に基づいて設計しなければならなかった。その場合には、そして可能な場合にはいつでも、プライマーをコード領域の外側に配置した（表２）。
【００６３】
【表２】
2006068001.tif 000003
【００６４】
表２：ｐｔＴＡＡＲクローニング用プライマー
ｐｔＴＡＡＲ２：ヒトの遺伝子における知見からＧＰＲ５８をコードすると予測されるこの遺伝子の２つのエクソンを、別々にゲノムＤＮＡからクローニングした；  ヒト：プライマーを、対応するヒトゲノム配列に基づいて設計した。（Ｔｍ：℃で表した融解温度であって、Breslauer KJ, Frank R, Blocker H, Marky LA.: Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986, Jun;83(11):3746-3750、に従い計算した；プライマー名中の５は、５’プライマー（即ち、ｓｃｈＴＡＲ３＿５＿０１）を示し、プライマー名中の３は、３’プライマーを示す）。
【００６５】
実際のＰＣＲ反応物は、総体積５０μｌで次の組成であった：５〜１００ｎｇゲノムＤＮＡ（入手先は以下で特定）相当の鋳型、２００ｎＭオリゴヌクレオチドプライマー、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Invitrogen）、２００ｍＭ各ｄＮＴＰ（Invitrogen）、１×濃縮ＰＣＲ反応緩衝液（Invitrogen）、および５Ｕ／反応物の組換えＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）。ＰＣＲ反応物を、ＵＶ照射装置を有する殺菌作業ベンチ下で集め、ａ）鋳型材料の調製、ｂ）ＰＣＲ反応物のアセンブリ、ｃ）ＰＣＲ反応とアガロースゲル電気泳動の実施、およびｄ）プラスミドの調製、を、それぞれ別々の部屋で行った。これは、試薬と、ＰＣＲで増幅した材料またはプラスミドＤＮＡとの間で起こりうる交差汚染を避けるためである。ＰＣＲ反応物を、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む２００μｌのＰＣＲカップ（Eppendorf）に室温（ＲＴ）で集め、９５℃に予熱したサーモサイクラー（Geneamp 9700 金ブロック付き、Applied Biosystems）に移した。温度条件を次のように調整した。
【００６６】
９５℃      ２分
（９５℃：３０秒、アニーリング温度：３０秒、７２℃：伸長時間）×サイクル数：
７２℃      ５分
４℃        最長６時間
【００６７】
アニーリング温度：低い方のＰＣＲ反応Ｔｍ（融解温度）値（上に特定した方法で計算したもの）を有するオリゴヌクレオチドプライマーのＴｍ−１℃を、アニーリング温度として用いた。例：プライマー１のＴｍ＝５５℃、プライマー２のＴｍ＝５７℃である２つのプライマー⇒アニーリング温度：５４℃。
【００６８】
伸長時間を、アンプリコンの長さ（ｋｂ単位）×１分、で計算した。
【００６９】
サイクル数：各遺伝子に対して、いくつかのＰＣＲ反応をサイクル数２５〜４０で平行して行った。その後全てのＰＣＲ反応物を、アガロースゲル電気泳動で分析し、明らかに視認できる正しいサイズのＰＣＲ産物が生産されている中で、最低のサイクル数のＰＣＲ反応物を、次のクローニングに用いた。
【００７０】
ＰＣＲ産物を、１％超純粋アガロース（GibcoBRL）を用いてＴＡＥ緩衝液（Invitrogen）中で作成したアガロースゲルの電気泳動によって分析した。アガロースゲル泳動を、PerfectBlue Horizontal Mini Electrophoresis System(Pequlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany)を用い、標準プロトコル（Sambrook et al., 1989）に従って行った。アガロースゲルを臭化エチジウムで染色し、ＰＣＲ産物をＵＶトランスイルミネーター（Syngene, Cambridge, UK）で可視化し、ＰＣＲ産物のサイズを、分子量標準１ｋｂ  ＤＮＡラダー（Invitrogen）と比較して解析した。予想サイズのＰＣＲ産物を、ゲルから滅菌したメス（Bayha, Tuttlingen, Germany）で切り取り、アガロースゲル切片からQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN AG, Basel, Switzerland）を用い、メーカーの指示に従って抽出した。
【００７１】
抽出したＰＣＲ産物を、冷エタノール／酢酸ナトリウム沈殿（Sambrook et al., 1989）によって沈殿させ、ＤＮＡペレットを１０μｌの１０ｍＭトリス／塩酸ｐＨ７．５に溶解した。次に、この溶液中のＰＣＲ産物を、配列決定用ＴＯＰＯクローニングキット（Invitrogen；ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターとｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターを含むキットを使用）を用い、メーカーの指示に従ってクローニングした。ライゲーション産物を、ＴＯＰ１０の化学的にコンピテントなバクテリア（配列決定用ＴＯＰＯクローニングキットに含まれる）中にメーカーの指示に従って入れて形質転換し、次いで１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Sigma, Division of FLUKA Chemie GmbH, Buchs, Switzerland）を含むＬＢ寒天プレートにプレートし、３７℃１晩インキュベートした。バクテリアのコロニーを「miniprep PCR」と呼ばれる方法によって分析した。すなわち：コロニーを滅菌した接種ループ（Copan Diagnostic S.P.A., Brescia, Italy）を用いて採取し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む新しいＬＢ寒天プレートに移した。次に同じ接種ループを、それぞれ１．５ｍｌ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカップ（Eppendorf）中の５０μｌの１０ｍＭトリス／塩酸ｐＨ７．５に入れ、ループ上に残っているバクテリアを溶液中に移した。次にこのバクテリア懸濁液を９５℃５分間熱し、得られる溶菌液の、ＰＣＲ反応物５０μｌ当たり１μｌを、ＰＣＲ反応の鋳型に用いた。プライマーには、プラスミドｐＣＲ４−ＴＯＰＯとｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯの複数クローニング部位の両側に接着するプライマー（Ｔ７と逆Ｍ１３、配列：プライマー“Ｔ７”：５’−ｃｇｇｇａｔａｔｃａｃｔｃａｇｃａｔａａｔ−３’、プライマー“逆Ｍ１３”：５’−ｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃ−３’）を用いた。ＰＣＲ反応物を、上述のように集成し、次の温度概要で実施した：
【００７２】
９５℃      ２分
（９５℃：３０秒，  ５０℃：３０秒，  ７２℃：１分）×３０サイクル
７２℃      ５分
４℃        最長６時間
【００７３】
ＰＣＲ産物を、上述通り、アガロースゲル電気泳動によって分析した。上に概説した方法によって、予想サイズのクローニングされたＤＮＡ断片が検出されたバクテリアのコロニーを、次のプラスミドの調製のために用いた。
【００７４】
プラスミドの調製のため、「miniprep PCR」によって予想サイズの挿入を有すると同定されたバクテリアのコロニーを、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地のバクテリア液体培養液への植付けに用い、培養液は水平シェイカーで、３７℃、一晩インキュベートした（Sambrook et al. 1989）。プラスミドを、バクテリア液体培養液からHiSpeed Plasmid Maxi Kit（QIAGEN AG, Basel, Switzerland）を用い、メーカーの指示に従って単離した。プラスミド濃度をＵＶ／可視分光光度計ultrospec 3300 pro（Amersham Biosciences Europe GmbH, Otelfingen, Switzerland）を用い、２６０ｎｍのＯＤを測定して決定した。単離したプラスミド中の挿入のサイズを、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲｌ（New England Biolabs, products distributed in Switzerland by Bioconcept, Allschwil, Switzerland）を用いた制限酵素消化によって解析した；ＥｃｏＲＩの制限部位がｐＣＲ４−ＴＯＰＯとｐＣＲ２．ｌ−ＴＯＰＯの両ベクターの複数クローニング部位の両側にあり、それ故、クローニングされた挿入を、ＥｃｏＲＩ制限酵素消化によりプラスミドから切り離すことができる。各プラスミドの０．５μｇを、ＥｃｏＲＩを用い、全容積２０μｌ中でメーカーの推奨に従って消化した。制限酵素消化産物を、上記通りアガロースゲル電気泳動により分析した。予想サイズの挿入を有することが制限酵素解析によって明らかになったプラスミドは、外部会社（Microsynth社、Schutzenstrasse 15,9436 Balgach、Switzerland）によるＤＮＡ配列分析に付した。
【００７５】
ＤＮＡ配列分析で明らかになった、クローニングされたＴＡＡＲ遺伝子読み枠のＤＮＡ配列を、これまでに公表された配列、および／または、ゲノム配列情報から検索したＴＡＡＲ遺伝子の配列と比較した。ＰＣＲ反応によって導入された可能性があるＤＮＡ配列情報のエラーを、各ＴＡＡＲ遺伝子ごとに、独立したＰＣＲ反応によってクローンニングされた２〜３のＤＮＡプラスミドの配列を比較して、除去した。：独立なＰＣＲ反応において同じＰＣＲエラーが全く同じ位置で起こる確率は基本的にゼロであるので、各々の遺伝子に対する独立の配列が一致することによって、きわめて正しいＤＮＡ配列が明らかになった。
【００７６】
鋳型材料：チンパンジー（pan troglodytes）のゲノムＤＮＡをSouthwest National Primate Research Center（SNPRC, P.O.Box 760549, San Antonio, Texas, USA）から購入した。ＤＮＡ濃度を、上述のように２６０ｎｍのＯＤを測定して決定し、ＤＮＡ濃度を１００ｎｇ／μｌに調整した。ＤＮＡを小分けして４℃で保存した。
【００７７】
細胞培養
ａ）サブクローニング：哺乳類の細胞系統でＴＡＡＲ受容体を発現させるために、ＴＡＡＲの全読み枠を所持しているＤＮＡ断片を、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯまたはｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）から、ｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２（Rees S et al., Bicistronic vector for the creation of stable mammalian cell lines that predisposes all antibiotic-resistant cells to express recombinant protein. Biotechniques,1996 Jan;20(1): 102-4, 106, 108-110）へサブクローニングした。
【００７８】
この目的のため、ＴＡＡＲの全読み枠を有するＤＮＡ断片を、それぞれのＴＯＰＯベクターから、ＥｃｏＲＩを用いた制限酵素消化および、それに続く上述のような〜１ｋｂの断片のアガロースゲル電気泳動による精製およびゲルからの抽出により切り離した。平行して、ｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２ベクターを、ＥｃｏＲＩによって線状化し、エビのアルカリフォスファターゼ（Roche）によりメーカーの指示書に従って脱リン酸化した。ＴＡＡＲの全読み枠を有するＤＮＡ断片を、線状化したｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２ベクターにＴ４  ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）を用いてライゲーションした。線状化したｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２ベクター３０ｎｇ、各ＴＡＡＲコーディング配列を有するＤＮＡ断片１００〜３００ｎｇ、１×ライゲーション緩衝液（最終濃度；酵素を１０×濃縮物として加えた）および、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１μｌを、全容量２０μｌに混合した。反応は、室温で２〜３時間進行させ、ライゲーション産物を、化学的にコンピテントなＴＯＰ１０細胞中に、ＴＯＰＯライゲーションの項に記載したようにしてトランスフォームした。形質転換されたバクテリアのプレートおよびバクテリアのクローン採取を、先にゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡからのＴＡＡＲ遺伝子のＰＣＲクローニングの項で述べた通りに行った。採取したバクテリアクローンを、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ  ５ｍｌ中の液体培養に接種するために使用した。この液体培養物を、QlAprep Miniprep Kit（QIAGEN）を用いた小規模なプラスミド調製のために、メーカーの指示書に従って用いた。精製したｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２由来のプラスミドの構成物を、予想サイズの挿入の存在を確認するため、ＥｃｏＲＩとアガロースゲル電気泳動を用いた制限酵素分析によって分析した。予想サイズの挿入を有することを確認したプラスミドについては、挿入の正しい方向性と配列を確かめるために、ＤＮＡ配列解析がMicrosynth社により行われた。正しい方向の正しい挿入を有するプラスミドを、哺乳類細胞系統でそれぞれのＴＡＡＲを発現させるために用いた。
【００７９】
ｂ）細胞培養：  使用した基本的な細胞培養操作と技術は、Davis JM(ed.): Basic cell culture, sec. edition. Oxford University Press 2002, ISBN: 0199638535、に記載されている。TAARを、HEK細胞(ATCC number: CRL-1573; described in Graham, F.L., Smiley, J., Russell, W.C., und Nairn, R.(1977)Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. Journal of General Virology 36, 59-74)中で発現させた。培地を、Invitrogen Cat.#31966-021の、Glutamax I、ピルビン酸ナトリウム、ピリドキシン、およびグルコース４，５００ｍｇ／Ｌを加えたＤＭＥＭ；ペニシリン／ストレプトマイシン；および熱不活性化されたウシ胎児血清１０％、で構成した。細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ（Invitrogen Cat. # 25300-062）を用い、１：１０〜１：３０の比率で、継代した。
【００８０】
ヒトとチンパンジーのＴＡＡＲの比較
ヒトとチンパンジーのヌクレオチド配列の間の平均的差は、わずか１．２％である（Clark et al., Science 2003, 302:1960-1963）。ヒトとチンパンジーの機能的ＴＡＡＲのヌクレオチド配列間の差異は、０．９〜１．３％である（表３）。高い同一性が、チンパンジーＴＡＡＲタンパク質とそれと同等なヒトＴＡＡＲタンパク質のアミノ酸配列の間にも見出される（表１、図５）。チンパンジーＴＡＡＲの薬理学は、ヒトＴＡＡＲのそれと同一であることが期待される。
【００８１】
【表３】
2006068001.tif 000004
【００８２】
表３：ヒトとチンパンジーのＴＡＡＲ配列の比較（Ψ＝偽遺伝子）
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、全ての機能的なチンパンジーＴＡＡＲの配列を示す。チンパンジー、ヒト、ラット、およびマウスのＴＡＡＲ全てにおいて保存されているアミノ酸残基を、黒い影を付けて強調してある。特徴的なチンパンジーＴＡＡＲフィンガープリントモチーフが、ＴＭ  ＶＩＩに局在している。
【図２】図２は、偽遺伝子ｐｔＴＡＡＲ２Ψを模式的に示す。制限部位を図の上部に示す。
【図３】図３は、偽遺伝子ｈＴＡＡＲ３（古い名称ＧＰＲ５７Ψ）の「修復」を示す：修理された読み枠の１３３〜１３４位置の２塩基対ＣＣが付加され、それによって、修復前は早期終止コドンＴＣＡであったものが修復された。
【図４】図４は、機能的なチンパンジーＴＡＡＲのリガンドポケットベクターを示す。ヒトのオーソログとの相違を灰色のボックスで示す。
【図５】図５は、ヒトとチンパンジーのＴＡＡＲ１のアラインメントを示す。
【図１】
2006068001.tif 000005
【図２】
2006068001.tif 000006
【図３】
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【図４】
2006068001.tif 000008
【図５】
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【配列表】
2006068001000001.app
【外国語明細書】
1. Title of Invention
Chimpanzee trace amine associated receptors
2. Detailed Description of Invention
2006068001.tif 000010
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3. Brief Description of Drawings
2006068001.tif 000029
1.Claims
2006068001.tif 000030
2006068001.tif 000031
1. Abstract
2006068001.tif 000032
2. Representative Drawing
None
Fig. 1
2006068001.tif 000033
Fig. 2
2006068001.tif 000034
Fig. 3
2006068001.tif 000035
Fig. 4
2006068001.tif 000036
Fig. 5
2006068001.tif 000037
【配列表】
2006068001000002.app