(57)【要約】      （修正有）【課題】肺の気道中の粘液および痰の粘膜毛様体クリアランスの速度を刺激するクニッツファミリーのセリンプロテアーゼ阻害剤の使用方法の提供。【解決手段】膿胞性腺維症等の粘膜腺毛機能不全に罹った対象の気道中の粘液および痰の粘膜腺毛クリアランスの速度を刺激するために、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型（クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）−ｔｙｐｅ）セリンプロテアーゼ阻害剤、例えば、アプロチニンまたはビクニンを含有させ、その組成物を患者に使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤が、アプロチニンである請求項１に記載の使用法。
【請求項２】
クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤が、アミノ酸配列：
【化１】
2006232810.tif 000067
（配列番号：４９）
を含む請求項１に記載の使用法。
【請求項３】
クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤が、アミノ酸配列：
【化２】
2006232810.tif 000068
（配列番号：２）、
【化３】
2006232810.tif 000069
（配列番号：４５）、
【化４】
2006232810.tif 000070
（配列番号：４７）、
【化５】
2006232810.tif 000071
（配列番号：７０）、
または
【化６】
2006232810.tif 000072
（配列番号：７１）
を含む請求項１に記載の使用法。
【請求項４】
クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤が、アミノ酸配列：
【化７】
2006232810.tif 000073
（配列番号：４）、
【化８】
2006232810.tif 000074
（配列番号：５）、
【化９】
2006232810.tif 000075
（配列番号：６）、
【化１０】
2006232810.tif 000076
（配列番号：７）、
【化１１】
2006232810.tif 000077
（配列番号：３）、
【化１２】
2006232810.tif 000078
（配列番号：５０）、
【化１３】
2006232810.tif 000079
（配列番号：１）
または
【化１４】
2006232810.tif 000080
（配列番号：５２）
を含む請求項１に記載の使用法。
【請求項５】
クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤が、アミノ酸配列：
【化１５】
2006232810.tif 000081
（配列番号：８）
を含む請求項１に記載の使用法。
【請求項６】
クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤が、グリコシル化されている請求項１２、１３、１４または１５に記載の使用法。
【請求項７】
クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤が、少なくとも１つの鎖内システイン−システインジスルフィド結合を含む請求項１２、１３、１４または１５に記載の使用法。
【請求項８】
クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤が、ＣＹＳ１１−ＣＹＳ６１、ＣＹＳ２０−ＣＹＳ４４、ＣＹＳ３６−ＣＹＳ５７、ＣＹＳ１０６−ＣＹＳ１５６、ＣＹＳ１１５−ＣＹＳ１３９、およびＣＹＳ１３１−ＣＹＳ１５２からなるシステイン−システイン対の群から選択される少なくとも１つの鎖内システンイ−システインジスルフィド結合を含み、前記システイン残渣が、生来のヒト胎盤ビクニンのアミノ酸配列によって数えられる請求項１２、１３、１４または１５に記載の使用法。
【請求項９】
薬剤が、以下：
【化１６】
2006232810.tif 000082
（配列番号：４９）
に示されるような有効な粘膜腺毛クリアランス刺激量のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤および生理学上許容し得る担体を含む、そのような治療を必要とする対象に粘膜腺毛クリアランスの速度を促進するための薬剤を生成するためのクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤の使用法。
【請求項１０】
薬剤が、以下：
【化１７】
2006232810.tif 000083
（配列番号：２）、
【化１８】
2006232810.tif 000084
（配列番号：４５）、
【化１９】
2006232810.tif 000085
（配列番号：４７）、
【化２０】
2006232810.tif 000086
（配列番号：７０）、
または
【化２１】
2006232810.tif 000087
（配列番号：７１）
に示されるような有効な粘膜腺毛クリアランス刺激量のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤および生理学上許容し得る担体を含む、そのような治療を必要とする対象に粘膜腺毛クリアランスの速度を促進するための薬剤を生成するためのクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤の使用法。
【請求項１１】
薬剤が、以下：
【化２２】
2006232810.tif 000088
（配列番号：４）、
【化２３】
2006232810.tif 000089
（配列番号：５）、
【化２４】
2006232810.tif 000090
（配列番号：６）、
【化２５】
2006232810.tif 000091
（配列番号：７）、
【化２６】
2006232810.tif 000092
（配列番号：３）、
【化２７】
2006232810.tif 000093
（配列番号：５０）、
【化２８】
2006232810.tif 000094
（配列番号：１）、
または
【化２９】
2006232810.tif 000095
（配列番号：５２）
に示されるような有効な粘膜腺毛クリアランス刺激量のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤および生理学上許容し得る担体を含む、そのような治療を必要とする対象に粘膜腺毛クリアランスの速度を促進するための薬剤を生成するためのクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤の使用法。
【請求項１２】
薬剤が、以下：
【化３０】
2006232810.tif 000096
（配列番号：８）
に示されるような有効な粘膜腺毛クリアランス刺激量のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤および生理学上許容し得る担体を含む、そのような治療を必要とする対象に粘膜腺毛クリアランスの速度を促進するための薬剤を生成するためのクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤の使用法。
【請求項１３】
クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤が、グリコシル化されている請求項１９、２０、２１または２２に記載の使用法。
【請求項１４】
クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤が、少なくとも１つの鎖内システイン−システインジスルフィド結合を含む請求項１９、２０、２１または２２に記載の使用法。
【請求項１５】
クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤が、ＣＹＳ１１−ＣＹＳ６１、ＣＹＳ２０−ＣＹＳ４４、ＣＹＳ３６−ＣＹＳ５７、ＣＹＳ１０６−ＣＹＳ１５６、ＣＹＳ１１５−ＣＹＳ１３９およびＣＹＳ１３１−ＣＹＳ１５２からなるシステイン−システイン対の群から選択される少なくとも１つの鎖内システンイ−システインジスルフィド結合を含み、前記システイン残渣が、生来のヒト胎盤ビクニンのアミノ酸配列によって数えられる請求項１９、２０、２１または２２に記載の使用法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、１９９８年１２月２２日に提出された米国特許出願号第０９／２１８，９１３号の一部継続である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、肺気道中の粘液および痰の粘液毛様体クリアランスの速度を促進するセリンプロテアーゼ阻害剤タンパク質を含む組成物に関する。本発明は、哺乳類における粘膜線毛クリアランスの速度を刺激する方法にも関する。
【０００３】
発明の背景
委ねられた問題
肺気道での粘液および痰を排除する線毛上皮の不能によって特徴づけられる粘膜線毛機能不全は、慢性気管支炎（ＣＢ）、気管支拡張症（ＢＥ）、喘息および特に膿胞性腺維症（ＣＦ）等の慢性の閉鎖性肺疾患の重大な合併症である。粘膜線毛機能不全に罹っている患者は、二次的細菌感染に対して特に傷つきやすい。
【０００４】
粘膜線毛機能不全に関連したＣＦおよび呼吸器疾患についての治療および維持適用様式および治療の必要が記載された。例えば、Ｂｒａｇａ「Ｄｒｕｇｓ  ｉｎＢｒｏｎｃｈｉｎａｌ  Ｍｕｃｏｌｏｇｙ（気管支の粘液学における薬剤）」、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｌｅｔｈｅｒｍら、Ａｍ  Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１４２：１０５３−１０５８、１９９０；米国特許第５，８３０，４３６号参照。
【０００５】
膿胞性腺維症
膿胞性腺維症（ＣＦ）は、外分泌上皮中の流動体および電解質輸送での異常を引き起こす常染色体劣性疾患である。膿胞性腺維症膜貫通コンダクタンスレギュレータ（ＣＦＴＲ）と称されるタンパク質をコードするＤＮＡ内での突然変異が、事実上全てのＣＦ患者で見られた。肺の細胞は、特に影響される。Ｄｉ  Ｓａｎｔａｇｒｅｓｅら、Ａｍ  Ｊ．Ｍｅｄ．６６：１２１−１３２（１９７９）。
【０００６】
ＣＦでは、気道粘膜細胞の層の境界は、膜の塩化物チャネルのｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ活性化に反応性でない。Ｃｌ−に対する細胞透過性は、損傷を受け、そして細胞を超えたＮａ＋吸収は促進される。これらの電解質不均衡の両方は、気道粘膜の水和のレベルを減少させる傾向にあり、したがって、これによりＣＦの粘性肺分泌特性に貢献する。Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｓｔ．Ｍｅｄ．１１：７５（１９８６）。外因性細菌およびマイコプラズマは、肺気道に入り、そしてその粘膜内にコロニーを確立する。ＣＦに関連した厚い粘膜は、免疫系からこれらの病原体を単離する。粘膜毛様体クリアランスは、ＣＦ患者で減じられるので、細菌クリアランスも減じられる。したがって、肺うっ血および感染は共通する。これらの病原体の長期化した存在は、肺機能を危うくする炎症反応を常に開始する。Ｂｅｄｒｏｓｓｉａｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．７：１９５−２０４、１９７６。
【０００７】
ＣＦ肺での粘膜粘性は、一部には、気道粘膜毛様体クリアランス（ＭＣＣ）の速度を変化させる気道表面流動体（ＡＳＬ）でのＣｌ−チャネル機能不全およびナトリウム（Ｎａ−）イオン濃度の修正に関連したときに粘膜の水和が減少されることによる。粘膜輸送に関与した機構は、インビトロおよびインビボで研究されてきた。ＣＢ、ＣＦおよびＢＥ痰は、粘膜除去ウシ気管（ＭＤＥＴ）の哺乳類の線毛上皮によってゆっくりと輸送される（Ｗｉｌｌｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７（１）：９−１３、１９９５）。ＭＤＳＴ上の減少した痰の輸送能力がゆっくりなのは、その電解質／透過溶解物の含有量が低いことに関連し得る（Ｗｉｌｌｓら、Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５１（４）：１２５５−１２５８、１９９７）。実際に、病気の痰は、血漿に対して低い電解質含有量を示すことが知られている（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．８８：１９９−２０４、１９６３；Ｐｏｔｔｅｒら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．６７（１）：８３−８７、１９６７；Ｔｏｍｋｉｅｗｉｃｚら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．１４８（４、Ｐｔ．１）：１００２−１００７、１９９３）。
【０００８】
ＭＤＥＴにおけるさらなる研究は、病気の痰の輸送能力が、塩化ナトリウムを用いた以下の治療を改善するということを示した（Ｗｉｌｌｓら、１９９５）。
【０００９】
さらに、臨床研究は、高張性生理食塩水の、または上皮のナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）ブロッカーアミロライドの吸入は、病気の患者におけるＭＣＣを明らかに増大させ得ることを示した（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｔｈｏｒａｘ  ５２（１０）：９００−９０３、１９９７；Ａｐｐら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．１４１、６０５−６１２、１９９０）。最近、気管の粘膜速度（ＴＭＶ）のモルモット・モデルでのインビボでの粘膜クリアランスとそのイオン性組成物との関係が解明された。インビボでの研究は、高張性生理食塩水の５分間のエアロゾルが、ＴＭＶを一過的に増大することを示した。ＴＭＶでの増大が、高張性生理食塩水（１４．４％）エアロゾルの１分後に観察された。ＴＭＶは、高張性生理食塩水露出動物で５．１±１．０ｍｍ．ｍｉｎ−１（ｎ＝９）であった（ｎ＝９；ｐ≦０．００１）（Ｎｅｗｔｏｎ  ＆  Ｈａｌｌ、１９９７）。吸入されたアミロライドも、ＴＭＶでの増大を引き起こした。ＴＭＶでの明らかな増大は、アミロライド（１０ｍＭ）の２０分のエアロゾルの１５分後に観察された。ＴＭＶは、アミロライド露出動物（ｎ＝８；ｐ≦０．０５）で８．１±０．３ｍｍ．ｍｉｎ−１に比較して３．２±２．５ｍｍ．ｍｉｎ−１（ｎ＝９）であった（Ｎｅｗｔｏｎら、Ｐｅｄ．Ｐｕｌｍ．Ｓ１７、Ａｂｓ．３６４、１９９８）。これらの剤は、気道表面流動体（ＡＳＬ）のイオン性含有量を増大させることによって作用するようである。
【００１０】
全身性の偽性アルドステロン低下症（ＳＰＨＡ）を有する対象からの臨床上の遺伝的証拠も、気道上皮のナトリウムチャネルの活性の下降調節が、肺での粘膜毛様体クリアランスを増大するという見解を支持する。上皮のナトリウムチャネル副単位についての遺伝子での機能突然変異の損失を示すＳＰＨＡ患者は、気道表面からのナトリウム吸収を示さず、それらは、正常な対象に比較して鼻内表面流動体でのナトリウムイオン濃度を増大させ、そしてそれらは、４倍の増大した肺粘膜毛様体クリアランス速度を示した（Ｋｅｒｅｍら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．３４１、１５６−１６２、１９９９）。
【００１１】
最近、チャネル活性化プロテアーゼ（ＣＡＰ−１）と称されるセリンプロテアーゼは、両生類のツメガエルの腎臓上皮細胞（Ａ６細胞）の先端膜で見出された（Ｖａｌｌｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８９（６６５１）：６０７−６１０、１９９７）。ＣＡＰ−１は、これらの細胞でのＮａ＋チャネル活性を調節するようである。始原型ウシクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）阻害剤であるアプロチニンに対する先端膜の露出は、上皮間のＮａ＋チャネルを減少させた（Ｖａｌｌｅｔら、１９９７；Ｃｈｒａｉｂｉら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏ．１１１（１）：１２７−１３８、１９９８）。Ｂｕｋｉｎｉｎ（１−１７０）の効果、２つのクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインヒト相同性のウシアプロチニン（Ｄｅｌａｒｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１８）：１２２０９−１２２１４、１９９７；Ｍａｒｌｏｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１８）：１２２０２−１２２０８、１９９７）を、インビトロでの正常な培養ヒト気管支の上皮細胞（ＨＢＥ）の短電流（Ｉｓｃ）を用いて評価した（ＭｃＡｕｌａｙら、Ｐｅｄ．Ｐｕｌｍ．Ｓ１７、Ａｂｓ．１４１、１９９８）。ビクニン（１５ｕｇ．ｍｌ−１：７０ｎＭ）は、正常なＨＢＥ細胞（ｎ＝５−８；ｐ≦０．０５）で５４％Ｎａ＋Ｉｓｃを明らかに阻害した。
【００１２】
全体的に、ビクニン（７０ｎＭ）は、９０分で基本線Ｉｓｃの５８％を阻害した。別の研究では、ビクニン（５ｕｇ．ｍｌ−ｌ）は、正常なＨＢＥ細胞（ｎ＝６；ｐ≦０．０１）で８４％Ｎａ＋Ｉｓｃを明らかに阻害した一方で、セルピンファミリーのセリンプロテアーゼ阻害剤アルファ（１）−プロテアーゼ阻害剤（α１−ＰＩ）（５０μｇ・ｍｌ−１）は、明白な効果がなかった。インビトロで培養されたヒト膿胞性腺維症の気道上皮細胞で、Ｉｓｃは、ビクニン（１−１７０）（１μｇ／ｍＬ）によって阻害され、そしてアプロチニン（２０μｇ／ｍＬ）によって阻害された。
【００１３】
単独の研究群による２つの最近の研究では、ＴＭＶにおけるプロテアーゼ阻害剤で誘導される効果が示された。抗原感作の３０分前、または感作の１時間後のいずれかに示されるα１−ＰＩ（１０ｍｇ）は、感作の６時間後に、アレルギーのヒツジでのＴＭＶにおける抗原誘導還元の力を減じた（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．９７（５）：１５２２−１５２８、１９９７）。図１で、Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら、１９９７年の文献で、著者らは、それ自体（非抗原感作）で、アレルギーのヤギの気道に投与されたα１−ＰＩは、６時間の期間中基本線ＴＭＶでの効果を示さなかった。第２の研究で、α１−ＰＩは、抗原感作の６時間後に付与され、そして感作の２４時間後に、抗原誘導の明らかな逆行によってのみ引き起こされた（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら、Ａｐｐ．Ｐｈｙｓｉｏ．８５（３）：１０８６−１０９１、１９９８）。著者らは、α１−ＰＩの効果についての機構は、それの抗神経親和性エラスターゼ特性に関連し、神経親和性エラスターゼは、それらのモデルでの粘膜毛様体クリアランスの速度を減少させる原因である酵素であると考えられる。それらは、α１−ＰＩは、喘息におけるアレルギー誘引神経親和性エラスターゼ放出によって引き起こされる粘膜毛様体機能不全を治療するために使用され得ると結論づけた（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら、１９８８）。かれらは、他の呼吸器疾病で潜在的役割を推測しなかった。
【００１４】
発明の簡単な要約
本発明は、肺の気道中の粘液および痰の粘膜毛様体クリアランス（ＭＣＣ）の速度を刺激するクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ファミリーのセリンプロテアーゼ阻害剤の使用に向けられる。クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型プロテアーゼ阻害剤は、粘膜の滞留および蓄積が、主要な臨床問題である膿胞性腺維症（ＣＦ）、慢性気管支炎（ＣＳ）および気管支拡張症（ＢＥ）等の肺疾病を治療するために使用され得る。現在まで、先行技術は、基本線速度より上のＭＣＣの速度を増大する能力を有するプロテアーゼ阻害剤に関連しなかった。クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤は、粘液の滞留および蓄積が臨床的問題である慢性副鼻腔炎および粘性耳を治療するためにも使用できる。
【００１５】
本発明は、ＭＣＣを刺激する方法に使用するためのクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインまたはクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインを含むセリンプロテアーゼ阻害剤タンパク質の使用を意図する。本発明の１つの実施形態では、アプロチニン等のウシセリンプロテアーゼ阻害剤タンパク質、および１９９８年１月２８日に刊行されたＥＰ８２１００７号に記載されるもののような変異体およびその断片が、本発明を実施する上で使用され得る。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、ヒトセリンプロテアーゼ阻害剤は、ＭＣＣの速度を刺激する方法に使用することが意図される。ヒトのセリンプロテアーゼ阻害剤の代表例としては、ビクニンおよび１９９７年９月１８日に刊行されたＷＯ９７／３３９９６（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．）、および１９９５年４月１８日に発行された米国特許第５，４０７，９１５号（Ｂａｙｅｒ  ＡＧ）に記載されるもののような変異体およびその断片が挙げられ、そしてそれは全体的にここに組み込まれる。
【００１７】
本発明は、図面と共に以下の詳細な説明および特許請求の重要性からよりよく理解される。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、肺気道中の粘液および痰の粘膜線毛クリアランスの速度を刺激するクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤タンパク質およびそれの断片を含む組成物に関する。組成物は、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）クラスの２つのセリンプロテアーゼ阻害ドメインを含むここでヒト胎盤ビクニンと称される、新たに同定されたヒトタンパク質も含む。
【００１９】
本発明はまた、生物学的に匹敵するビヒクルでの、有効量の本発明の開示セリンプロテアーゼ阻害剤を、患者に投与することを特徴とする、粘膜線毛機能不全を示す患者における粘膜線毛クリアランスの速度を刺激する方法を提供する。
【００２０】
胎盤ビクニン、単離ドメイン、および他の異性体の好ましい使用は、疾病療法および管理の一部としてＣＦ患者での粘膜線毛クリアランスを刺激するためのものである。これらの方法および組成物は、慢性閉鎖性肺疾病を示す患者において肺気道で粘液および痰連続発生を減少または排除し、それにより二次肺感染および他の有害な副作用の危険を減少させ、同様に、ＣＦ患者における肺移植手術の必要性を避けるか、または遅延させる。
【００２１】
本発明の方法は、ＭＣＣを刺激するためのアプロチニンの使用を意図する。アプロチニンは、両生類ツメガエルの腎臓上皮細胞（Ａ６細胞）の先端膜での上皮内Ｎａ＋輸送を減少させることが示された（Ｖａｌｌｅｔら、１９９７：Ｃｈｒａｉｂｉら、１９９８）。アプロチニン作用の機構は、Ａ６細胞でのＮａ＋チャネル活性を調節することに関与されるプロテアーゼである、ＣＡＰ−１の阻害に関与することが提案された。ウシアプロチニンの２つのクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインヒト相同体（Ｄｅｌａｒｉａら、１９９７：Ｍａｒｌｏｒら、１９９７）であるビクニン（１−１７０）は、インビトロで正常の培養ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥ）短い電流（Ｉｓｃ）を明らかに阻害することも示された（ＭｃＡｕｌａｙら、１９９８）。ビクニン（１．５ｕｇ．ｍｌ−１：７０ｎＭ）が、正常なＨＢＥ細胞での５４％Ｎａ＋Ｉｓｃを明らかに阻害した（ｎ＝５−８；ｐ≦０．０５）。
【００２２】
全般に、ビクニン（７０ｎＭ）は、９０分間で基本線Ｉｓｃの５８％を阻害した。別の研究では、ビクニン（５０ｕｇ．ｍｌ−ｌ）は、正常なＨＢＥ細胞での８４％Ｎａ＋Ｉｓｃを明らかに阻害した（ｎ＝６；ｐ≦０．０１）一方で、セルピンファミリーのセリンプロテアーゼ阻害剤アルファ（１）−プロテアーゼ阻害剤（α１−ＰＩ）（５０ｕｇ．ｍｌ−ｌ）は、有為な効果がなかった。インビトロでの培養ヒト膿胞性腺維症気道上皮細胞で、Ｉｓｃは、ビクニン（１−１７０）（１ｕｇ／ｍＬ）によって阻害され、そしてアプロチニン（２０ｕｇ／ｍＬ）によって阻害された。
【００２３】
これらの観察の観点で、アプロチニン、胎盤ビクニンおよびその断片等のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリン阻害剤は、膿胞性腺維症を含めた粘膜線毛の機能不全を治療するための治療薬として意図される。
【００２４】
「クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）阻害剤」によって、プロテアーゼの阻害剤が意図される；構造的に、「クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）阻害剤」または「クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメイン」は、特徴的には、長さ約６０個のアミノ酸で、そして３個のジスルフィド結合を含むタンパク質、またはタンパク質ドメインである。（ＬａｓｋｏｗｓｋｅおよびＫａｔｏ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９、５９３−６２６、１９８０参照）。
【００２５】
本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤ビクニンおよび断片およびその類似体のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインの明らかな利点は、それらが、ヒトタンパク質であり、そしてＴｒａｓｙｌｏｌ（商標）（実施例１）より正に負荷されことが少なく、それにより大用量のタンパク質の投与で腎臓損傷の危険を減少させることである。ヒト起源のものであるので、したがって、本発明のタンパク質は、Ｔｒａｓｙｌｏｌ（商標）の同様の用量の投与と比較して、望まれていない免疫学的反応の危険を著しく減少させながら、ヒト患者に投与される。さらに、ビクニン（１０２−１５９）、ビクニン（７−６４）、およびビクニン（１−１７０）が、インビトロでＴｒａｓｙｌｏｌ（商標）より血漿カリクレインの著しく、いっそう強力な阻害剤であることが分かった（実施例３、４および１０）。したがって、ビクニンおよびその断片は、アプロチニンに対応してインビボでいっそう有効であることが予測される。使用されるべき医薬阻害剤の量は、治療されるべき享受者および症状に依存する。必要量は、当業者に知られるプロトコルによる不都合な経験なしに決定され得る。代替的に、必要量は、症状を治療するために阻害されるべきプラスミン、カリクレイン、またはプロスタシンのような標的プロテアーゼの量の測定に基づいて計算され得る。本発明で意図される活性材料として、活性剤の任意に必要とされる量の過剰を投与することに好ましく関与する毒性のない治療と考えられる。
【００２６】
慢性の閉鎖性肺疾患を示す患者における粘膜線毛クリアランスの速度を刺激するために、本発明のタンパク質は、アプロチニンＴｒａｓｙｌｏｌ（商標）のように使用できる一方で、大量に取った場合、効力が異なる。Ｔｒａｓｙｌｏｌ（商標）の使用は、Ｔｒａｓｙｌｏｌ（商標）補足Ａについて列記しているＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（医師の机上参照）、１９９５年で概説される。簡便には、スピン位置にある患者で、胎盤ビクニン、単離ドメインまたは他の変異体の負荷用量は、約２０から３０分かけてゆっくりと流入することによって付与される。一般に、約２×１０６ＫＩＵ（カリクレイン阻害単位）および約８×１０６ＫＩＵの間の総用量が、患者の体重および症状のような因子によって、使用される。好ましい負荷用量は、１００から２００カリクレイン阻害単位（ＫＩＵ）の総量を含むものである。
【００２７】
本発明のタンパク質は、当業者に知られる方法で処方された医薬組成物で使用される。このような組成物は、意図される投与態様および投薬によって、活性成分（類）に加えて１つまたはそれ以上の医薬上許容し得る担体、希釈剤、充填剤、結合剤、および他の賦形剤を含有する。当業者に知られる治療上不活性な無機または有機担体の例は、それに限定されないが、ラクトース、コーンスターチ、またはその誘導体、タルク、植物性油、蝋、脂肪、ポリエチレングリコール等のポリオール、水、サッカロース、アルコール、グリセリン等が挙げられる。種々の防腐剤、乳化剤、分散剤、香料、湿潤剤、抗酸化剤、甘味料、着色剤、安定剤、塩、緩衝剤等も、処方の安定性で補助すること、または活性成分（類）の生物利用性を増大する上で補助すること、または経口、鼻内または肺投与の場合に許容し得る風味および臭いの処方を生じるが必要とされる場合、添加され得る。このような組成物で使用される阻害剤は、元来の化合物それ自体の形態であるか、または任意に、医薬上許容し得る塩の形態であり得る。そのように処方された組成物は、当業者に知られる任意の適切な態様によって、阻害剤の投与のために必要とされる場合に選択される。
【００２８】
非経口投与態様としては、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、および筋肉内（ｉ．ｍ．）経路が挙げられる。静脈内投与は、必要とされ得る場合に、薬剤の頂上の血漿中濃度の急性調節を得るために使用され得る。
【００２９】
代替的には、薬剤は、静脈内（ｉ．ｖ．）カテーテルによって連続して所望の速度で投与され得る。適切なビヒクルとしては、注射用の滅菌水、滅菌緩衝溶液または滅菌生理食塩水のような無菌で、非発熱物質性水性希釈剤が挙げられる。得られる組成物は、静脈内注射または注入によって、実験の前におよび／または間に患者に投与される。
【００３０】
炎症に関与した好中球およびマクロファージのような食胞に対する薬剤の半減期および標的を改善して、リポソーム中の薬剤の捕捉によって援助され得る。胃腸管および肺のような標的器官／組織に特異的な巨大分子に結合するリポソームリガンドの外側に組み込むことによって、リポソームのターゲティングの選択性を改善することは可能であるにちがいない。代替的に、薬剤の分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−クリコライドを含むもの）への封入を有するかまたは有しないｉｍまたはｓｃ沈降注射またはコラーゲンを含有する保護処方は、長期化した持続薬剤放出を得るために使用され得る。投薬の便宜が改善されるために、腹腔内移殖されたリザーバおよび打診システムのような中隔を使用することが可能である。便宜および患者の苦情が改善されるのも、注射ペン（例えば、Ｎｏｖｏ  ｐｉｎまたはＱ−ｐｅｎ）または針のないジェット注入（例えば、Ｂｉｏｊｅｃｔ、ＭｅｄｉｊｅｃｔまたはＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから得られる）のいずれかの使用によって達成され得る。正確に制御された放出も、カニューレを介して所望の部位への送出を伴う移殖可能なポンプを用いて達成され得た。実施例としては、ＡＬＺＥＴ浸透ポンプのようなＡＬＺＡから入手可能な皮下で移殖された浸透ポンプが挙げられる。
【００３１】
経口送出は、薬剤を、消化性プロテアーゼ活性が低い回腸に薬剤を放出するように設計された錠剤、被覆錠剤、糖衣錠、硬質および軟質ゼラチンカプセル、溶液、乳液、懸濁液または腸溶カプセルに組み込むことによって達成され得た。後者の例としては、ＡＬＺＡのＯＲＯＳ−ＣＴ／Ｏｓｍｅｔ（商標）システム、およびＳｃｈｅｒｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＳｙｓｔｅｍｓのＰＵＬＳＩＮＣＡＰ（商標）システムが挙げられる。他のシステムは、コロニー特異的アゾレダクターゼによって分解されるアゾ架橋高分子、または回腸でのｐＨでの上昇によって達成されるｐＨ感受性ポリアクリル酸高分子を使用する。上のシステムは、広汎な利用可能な吸収増強剤と接合して使用され得る。直腸送出は、薬剤を、坐剤に組み込むことによって達成され得る。
【００３２】
鼻内送出は、薬剤を、リン脂質またはアシルカルニチンのような適切な吸収強化剤と接合して、セルロース、ポリアクリレートまたはポリカルボフィルを含むもののような生物的粘着性粒子担体（＜２００ｍｍ）に組み込むことによって達成され得た。市販で入手可能なシステムとしては、Ｄａｎ  Ｂｉｏｓｙｓ  ａｎｄ  Ｓｃｉｏｓ  Ｎｏｖａによって開発されたものが挙げられる。
【００３３】
粘膜線毛クリアランスの速度を刺激するために、本発明の胎盤ビクニン変異体の投与の好ましい態様は、肺送出である。ここに開示されるクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤は、任意の適切な手段によって対象の肺に投与され得るが、しかし好ましくは、対象が吸い込む、活性化合物からなる吸引可能な粒子のエアロゾル懸濁液を投与することによって投与され得る。吸引可能な粒子は、液体または固体であり得る。マンニトール、ショ糖またはラクトース等の適切な担体中に医薬品を含有する微細サイズの乾燥粉末は、Ｉｎｈａｌｅ（商標）、Ｄｕｒａ（商標）、Ｆｉｓｏｎｓ（Ｓｐｉｎｈａｌｅｒ（商標））、およびＧｌａｘｏ（Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（商標））またはＡｓｔｒａ（Ｔｕｒｂｏｈａｌｅｒ（商標））噴射剤基本のメータ測定用量吸入器等の乾燥粉末吸入器を用いて肺気道表面に送出され得る。リポソームを有するか、または有しない溶液処方は、ネブライザを使用して送出され得る。
【００３４】
タンパク質を含む液体粒子のエアロゾルは、圧力起動エアロゾルネブライザまたは超音波ネブライザを用いるような任意の適切な手段によって生成され得る。
【００３５】
例えば、米国特許第４，５０１，７２９号参照。ネブライザは、狭い換気口を介して圧縮気体、主に空気または酸素を促進する手段によるか、また超音波曝気の手段によるかのいずれかによって、活性成分の溶液または懸濁液を、治療用エアロゾルミストに変換する市販で入手可能なデバイスである。ネブライザに使用するための適切な処方は、液体担体中の活性成分からなる。担体は、主に水（および最も好ましくは滅菌した発熱物質不含の水）または希釈水性アルコール溶液であり、好ましくは、例えば、塩化ナトリウムを添加することによって、体液と等張で作られる。任意の添加剤としては、処方が、無菌にならない場合、ヒドロキシ安息香酸メチル等の防腐剤、抗酸化剤、風味剤、揮発性油、緩衝剤および界面活性剤が挙げられる。
【００３６】
そのタンパク質を含む固形粒子のエアロゾルは、同様に、任意の固形粒子医薬品エアロゾル発生装置で製造され得る。固形粒子医薬品を対象に投与するためのエアロゾル発生装置は、上に例示されるとおり、吸入可能であり、そしてヒト投与に適切な速度で、予め決められた計測用量の医薬品を含む多量のエアロゾルを発生する粒子を生成する。１つの例示型の固形粒子エアロゾル発生装置は、注入器である。注入器による投与のために適切な処方は、注入器の手段によって送出されるか、またはスナッフの手段で鼻内空洞に取り込まれ得る微細に粉砕した粉末が挙げられる。注入器で、粉末（例えば、ここに記載される治療を行うのに有効なその測定した用量）は、カプセルまたはカートリッジに含有され、主に、その場所に貫入されるか、または開放されるかのいずれかであるゼラチンまたはプラスチック、そして吸入によりデバイスを通して、または手動で操作されるポンプの手段によって引き込まれる空気によって送出される粉末から作られる。注入器に使用される粉末は、タンパク質唯一、またはタンパク質、ラクトース等の適切な粉末希釈剤、および任意の界面活性剤を含む粉末ブレンドからなる。第２の型の例示エアロゾル発生装置は、計測した用量吸入器を含む。計測した用量吸入器は、エアロゾル分散剤、主に液体噴射剤中の活性成分の懸濁物または溶液処方を含む加圧エアロゾル投薬器である。これらのデバイスを使用する間に、特に１０から２００ｕＬまでの計測した量を送出して、タンパク質を含有する微細な粒子スプレーを生じるのに適合した値を通して処方を放出する。適切な噴射剤としては、特定のクロロフルオロカーボン化合物、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンおよびその混合物が挙げられる。処方は、さらに、エタノール等の１つまたはそれ以上の共溶媒、オレイン酸またはトリオレイン酸ソルビタン等の界面活性剤、抗酸化剤および適切な風味剤を含み得る。
【００３７】
計測用量注入器または乾燥粉末注入器デバイスとして、エアロゾルは、固形または液体粒子から形成されるかにかかわらず、分当たり約５から１５０リットル、さらに好ましくは分当たり約１０から１００リットルまで、そして最も好ましくは、計測用量吸入器については、分当たり約１０から５０リットル、そして最も好ましくは、乾燥粉末吸入器については、分当たり約６０リットルの速度で、エアロゾル発生装置によって生成され得る。ネブライザ、ジェットまたは超音波によって発生されたエアロゾルは、分当たり約１から約１００リットル、さらに好ましくは分当たり約４から１０リットルまでの速度でエアロゾル発生装置によって生成され得る。多量のタンパク質を含有するエアロゾルは、いっそう迅速に投与され得る。
【００３８】
プロテアーゼ阻害剤の投与量は、治療されるべき症状、および対象の状態によって変化する。毎日用量は、１または数単位用量投与の中で分割され得る。重量による毎日用量は、対象の年齢および症状によって、ヒト対象に対して約０．０１から２０ミリグラムまでの吸入可能な粒子の範囲にあり得る。
【００３９】
本発明のプロテアーゼ阻害剤を含有する固体または液体粒子の医薬処方は、吸入可能なサイズの粒子、すなわち、吸入による口および喉頭を通して、そして肺の気管支および肺胞まで通過するのに十分に小さなサイズの粒子を包含すべきである。一般に、サイズで約１から８ミクロンまで（さらに詳細には、サイズで約６ミクロンより低い）の範囲にある粒子は、吸入し得る。エアロゾル中に含まれる非吸入可能なサイズの粒子は、喉に沈着され、そして飲み込まれる傾向にあり、そしてエアロゾル中の非吸入可能な粒子の量は、好ましくは最小限である。鼻内投与については、１０−５００ミクロンの範囲内の粒子サイズは、鼻内空洞中の滞留を確保することが好ましい。
【００４０】
本発明による処方の製造で、プロテアーゼ阻害剤は、典型的に、とりわけ許容し得る担体と混和される。もちろん、担体は、処方中の任意の他の成分に匹敵するという点で許容し得るべきであり、そして患者に有毒であってはならない。担体は、固体または液体、またはその両方でありえ、そして好ましくは、単位用量処方、例えばカプセルとして化合物で処方され、そしてそれは、０．５重量％から９９重量％の活性化合物を含み得る。１つまたはそれ以上の活性化合物は、その処方が、基本的に、成分を混和することからなる薬学のよく知られた技術のうちのいずれかによって製造され得る本発明の処方に組み込まれ得る。
【００４１】
プロテアーゼ阻害剤の吸入可能な乾燥粒子を含む組成物は、乳鉢と乳棒で阻害剤を粉砕し、そしてその後、微細化組成物に４００メッシュのスクリーンを通過させて、大きな凝塊を破壊または分離することによって製造され得る。医薬組成物は、任意に、エアロゾルの形成を促進するために働く分散剤を含有し得る。
【００４２】
適切な分散剤は、ラクトースであり、そしてそれは、任意の適切な速度（例えば、重量で１対１の比）で活性剤とブレンドされ得る。
【００４３】
所望の場合、一般のエクスビボおよびインビボでの遺伝子療法攻略法は、ＷＯ９７／３３９９６（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．）および米国特許第５，４０７，９１５号（Ｂａｙｅｒ  ＡＧ）に記載されるもののような、ビクニン、アプロチニンまたはその断片および変異体のようなクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤タンパク質をコードする核酸構築物を送出するために使用され得る。初発的にウイルス基本である遺伝子療法技術は、肺中のＣＦの徴候を治療するための手段として、そして外部肺組織に関連した肺細胞を形質転換するために使用された。
【００４４】
１９９３年３月３日に刊行された、ＣＦ患者でのＣＦＴＲ遺伝子の適切な発現について、レトロウイルスおよび非レトロウイルス性ベクター（例えば、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）の使用を記載するＷＯ９８／０３７０９参照。代替的には、外因性核酸の送出するための非細菌性方法も、知られており、そして本発明に使用することが意図される。哺乳類で機能する配列を調節するために操作的に連結されるＣＦＴＲ分子についてのコーディング配列を含む転写または発現カセットを記載する、１９９３年６月２４日に刊行されたＷＯ９３／１２２４０、そしてそこに引用される文献参照。その後、核酸構築物は、エアロゾル化送出単独、または液体基本の複合体、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）と組合せて含む多数の方法で、気道および肺の肺胞に供給される。１９９５年１０月５日に刊行されたＷＯ９５／２６３５６では、形質移入に有用な液体の個々の例が記載される。したがって、本発明で、ビクニン、アプロチニンまたはその変異体および断片のようなクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型セリンプロテアーゼ阻害剤をコードする核酸分子が、このような治療の必要である対象で、粘膜および痰の粘膜線毛クリアランスの速度を刺激する手段のような任意の適切な遺伝子療法によって肺気道に同様に投与され得ることが意図される。
【００４５】
ヒト配列データの検索
アプロチニンに対する機能で相同な区別できるヒトタンパク質の存在は、ＮＣＢ１（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（生物学情報のための国立センター）、Ｍａｒｙｌａｎｄ）で発現配列タグのデータベース（以降、ｄｂＥＳＴと称される）への配列進入の特徴的な分析に従って推定された。ＴＢｌａｓｔＮアルゴリズム（ＢＬＡＳＴ、または、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を使用するのは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）の、Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５、００  ４０３−４１０の方法を使用して、任意の組合せで、データベースのタンパク質または核酸中の照会配列と全ての配列との間の類似性について調べる）を使用して、データベースを、ウシの前−後アプロチニンＴｒａｓｙｌｏｌ（商標）の配列に相同性を持っているヌクレオチド配列について試験した。膨大なクローンのこの調査は、アプロチニンに対する機能で類似性のあるヒトタンパク質に対応する推定アミノ酸配列をおそらくコードし得る２つの特定のクローンに選択的に範囲を限定した。選択された核酸配列は、ヒト胎盤核酸ライブラリーから発生されたＲ３５４６４（配列番号：１２）およびＲ７４５９３（配列番号：１４）であった。Ｒ３５４６４についての最長のオープンリーディングフレームでの翻訳タンパク質配列（配列番号：１３）は、クリッツドメイン共有結合構造の形成に重要である６つのシステインのうちの１つを欠失しており、そしてそれは、Ｒ３５４６４の核酸配列が、機能性阻害剤を生じ得ないことを意味した。同様に、クローンＲ７４５９３（配列番号：１５）から得られる最長翻訳オープンリーディングフレームは、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様タンパク質をコードする領域に対する終止コドン５’を含み、それによりこの配列が翻訳されて、機能性分泌クリッツドメインを生じえないことが意味された。これらの配列単独の有為性は、不明瞭であった。それらが、ａ）偽遺伝子の産物、ｂ）未翻訳ｍＲＮＡの領域、またはｃ）不正確に配列決定された信頼性のあるｍＲＮＡの産物を表すことが可能であった。
【００４６】
ヒトビクニンの知見
実際のヒト配列を特異的に単離および測定するために、ｃＤＮＡプライマーは、Ｒ３５４６４およびＲ７４５９３内に見られる我々の提案したクリッツ様配列をコードするｃＤＮＡのセグメントに対して５’および３’に配置される配列にハイブリッド形成する能力があるように設計された。Ｒ７４５９３のクリッツ様配列をコードする断片を増幅するために使用されるプライマーは、
（化１）
ＣＧＡＡＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＣＣＡＧＡＣＧ
（ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する３’プライマー；配列番号３３）および
（化２）
ＡＧＧＡＴＣＴＡＧＡＣＡＡＴＡＡＴＴＡＣＣＴＧＡＣＣＡＡＧＧＡ
（ＸｂａＩ部位を有する５’プライマー；配列番号：３４）であった。
【００４７】
これらのプライマーは、ＰＣＲ（３０サイクル）によって、Ｃｌｏｎｔｅｃｈからヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ、カタログ番号ＨＬ４００３ＡＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から得た５００塩基対産物を増幅するために使用され、そしてそれは、ブルースクリプト−ＳＫ＋にサブクローニングされ、そしてＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）キット、バージョン２．０を有するＴ３プライマーで配列決定した。驚くべきことに、我々のプライマーを用いて得られた断片の配列は、クローンＲ７４５９３についてのｄｂＥＳＴデータベースに列記される配列と異なった。特に、我々の新たな配列は、推定終止コドンに３’で挿入されるが。クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様配列をコードするセグメントに５’で挿入される追加のグアノシン塩基を含有した（図３）。追加のＧの挿入は、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインについてのリーディングフレームの外に終止コドンを移行させた（Ｒ７４５９３についての訂正配列の塩基対１１４でＧ；図３）。
【００４８】
Ｒ７４５９３のクリッツ様ペプチド配列に相同な配列についてのｄｂＥＳＴの連続照会は、ヒト網膜ライブラリーから誘導されるＨ９４５１９およびＮ３９７９８を生じた。これらの配列は、特徴的システインのうちの全ての６つを含有すること以外は、Ｒ３５４６４でコードされるクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインにほとんど一致するクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様配列を含んだ。Ｒ７４５９３（塩基対１１４でＧの挿入により訂正された）およびＲ３５４６４のものとの各々のヌクレオチド配列の重複は、部分的ヒト胎盤ビクニン（配列番号：９；図３）についての共通ヌクレオチド配列を生じるために使用した。翻訳共通配列は、それぞれ、アミノ酸残渣１７−６４および１０２−１５９の領域内に、２つの完全なクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメイン配列を含有した残渣―１８と＋１７９からから拡張するオープンリーディングフレームを生じた（図３；全翻訳配列番号：１０）。
【００４９】
さらなる努力は、ｄｂＥＳＴをＲ３５４６４の配列と照合することによって別の５’配列を得るために試みられた。その後、別の５’配列を保持する各調査から可能なマッチは、ｄｂＥＳＴを再照会するために順次使用された。このような反復の形態では、Ｈ１６８６６、Ｔ６６０５８、Ｒ３４８０８、Ｒ８７８９４、Ｎ４０８５１およびＮ３９８７６を含めた一連の重複５’配列が同定された（図４）。これらの配列のうちのいくつかの配列は、共通翻訳タンパク質配列の合成のための出発部位として働き得る５’ＡＴＧの存在が示唆された。この選択された情報から、ここで選択的にスクリーニングし、そしてアプロチニンと相同なヒトタンパク質の核酸およびポリペプチド配列を決定することが可能であった。
【００５０】
ｄｂＥＳＴの再取り調べは図４Ｂに模式図で示される、多くの新たなＥＳＴを表した。これらの追加のＥＳＴとの重複は、我々に、図３で描かれる元来のオリゴヌクレオチド配列に属す５’および３’の両方を延長するより大きな共通オリゴヌクレオチド配列（図４Ｃ）を構築させた。実際に、総長さ１．６キロ塩基の新たな配列は、３’ポリ−Ａ尾部まで全ての方法を拡張した。各塩基対位置で、ＥＳＴを重複する増大した数は、ＥＳＴ  Ｒ７４５９３の３’末端と重複する配列のような特定の領域での信頼のレベルを改善した（図３）。この領域でのいくつかの重複ＥＳＴは、Ｒ７４５９３に対する２つの重要な塩基欠失を確証した（図４Ｃで下線付の太字として配置され、地図の位置９９４および１００５）。枠をコードするビクニンでの新たな共通配列（図４Ｄ）の翻訳は、生来の共通（配列番号：１）からコードされる成熟配列（１７９アミノ酸）より大きい（２４８アミノ酸）である胎盤ビクニンの形態を生じ、そしてオリゴヌクレオチド共通内の枠内終止コドンによって終了された。サイズ増大は、ＥＳＴ  Ｒ７４５９３に特徴的な２つの塩基挿入を取除くことから生じる３’コーディング領域での枠シフトによった。枠シフトは、別のアミノ酸配列をコードする新規の枠に読み取ることができる枠の外に生来の共通の終止コドン（図３）を移動した。新たな翻訳産物（図４Ｄ）は、（クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインをコードする）残渣＋１から＋１７５までの間の生来のタンパク質共通配列（配列番号：１）に一致したが、推定２４の残渣の長い粘膜貫通ドメイン（図４Ｄに下線付き）、続いて短い３１残渣の細胞質ドメインを示す新たなＣ末端延長を含んだ。開始メチオニンおよびシグナルペプチドの回りの精密な配列は、この領域での重複ＥＳＴはもとより、相当の異質性によりある程度一次的であった。
【００５１】
Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ（商標）によるタンパク質配列の分析は、推定Ｎ−結合グリコシル化についての共通部位として位置３０および６７でアスパラギン残渣を目立たせた。アスパラギン３０は、グリコシル化されるべきものと一致して、ヒト胎盤から単離される全長のタンパク質のＮ−末端配列決定の間には観察されなかった。
【００５２】
ヒトビクニンのクローニング
図３の分析から結論される推定ヒトビクニンヌクレオチド配列に対応するヒトｍＲＮＡの存在は、以下のとおり確認された。図３の胎盤ビクニン配列をコードするｃＤＮＡ共通ヌクレオチド配列から予測されるサイズ（約６７０塩基対）の断片である、Ｃｌｏｎｔｅｃｈのヒト胎盤ライブラリーから得られる、Ｒ３５４６４のｃＤＮＡ配列（図３中で共通ヌクレオチド配列の塩基対３−２７）をコードするクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）に５’をハイブリッド形成する核酸プライマー：
（化３）
ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＧＧＴＣＧＴＴＴＣＴＣＧＣＣＴＧＧＣＴ
ＧＧＧＡ
（Ｘｂａｌ部位を有するＲ３５４６４配列から誘導される５’プライマー；配列番号：３５）、およびＲ３５４６４のｃＤＮＡ配列（図３中で共通ヌクレオチド配列の塩基対６８０−７００）をコードするクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）に３’をハイブリッド形成する核酸プライマーが、ＰＣＲ増幅に使用された（図４Ａで概略的に示された）。上に使用されるとおり、Ｒ７４５９３に同じ３’プライマーに加えて、上に開示される推定ＡＴＧ出発部位に対する５’で１２６塩基対であるＲ３５４６４での配列にハイブリッド形成する５’プライマーを使用して、ＥＳＴ重複によって推定される予測サイズ（およそ８７２塩基対）のＣｌｏｎｔｅｃｈのヒト胎盤ライブラリーから得られる断片を増幅することが可能である（図４で概略的に示された）。
【００５３】
８７２塩基対の断片の配列決定は、それの５’末端でＥＳＴ  Ｒ８７８９４の塩基対１１０から２１８まで、そしてその３’末端で（図３の）ＥＳＴ重複分析から結論づけられる胎盤ビクニンについての共通配列の３１０から５４２塩基対に対応するヌクレオチドセグメントを含有することを示した。この３’ヌクレオチド配列は、胎盤ビクニン（１０２−１５９）によってクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインの全てを含んだ。
【００５４】
タンパク質の全体の細胞外領域をコードするｃＤＮＡを得るために、ＥＳＴ  Ｒ３４８０８内の配列にハイブリッド形成するように設計された以下の５’ＰＣＲプライマー：
（化４）
ＣＡＣＣＴＧＡＴＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＣ
（配列番号：３６）は、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから得られるおよそ７８０塩基対のｃＤＮＡ産物を増幅（３０サイクル）するＥＳＴ７４５９３と同じ３’プライマーと共に使用した。この産物は、ゲル精製され、そしてジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ  Ｆ．ら、（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）、７４、５４６３−５４６７頁）によって、以下のプライマー：
【化５】
2006232810.tif 000002
【化６】
2006232810.tif 000003
【００５５】
を用いてＤＮＡ配列決定のためのＴＡベクター（インビトロゲン）にクローン化した。
【００５６】
生じるｃＤＮＡ配列は、その翻訳産物と共に図４Ｅに描かれる。ヌクレオチド濃度で、配列は、共通ＥＳＴ配列（図４Ｄ）からわずかな差異のみを示した。その配列の翻訳は、枠内開始剤ＡＴＧ部位、シグナルペプチドおよび成熟した胎盤ビクニン配列および膜貫通ドメインを含むコーディング配列を生じた。ＰＣＲ産物の翻訳配列は、ＰＣＲ増幅についての３’プライマーの選択の選択の結果として細胞質ドメインから最後の１２のアミノ酸残渣を欠失していた。３’ＰＣＲプライマー（Ｒ７４５９３の配列に基づいて設計された）のこの選択は、翻訳ＰＣＲ誘導配列のアミノ酸位置２１１で人工的ＳからＦまでの突然変異の導入に起因もした。ＰＣＲ断片の翻訳から推定されるシグナルペプチドは、ＥＳＴ共通のものにある程度異なった。
【００５７】
全長の胎盤ビクニンｃＤＮＡを得るために、ＰＣＲ由来産物（図４Ｅ）を、ゲル精製し、そしてビクニン配列を表す非ＰＣＲ基本の全長クローンを単離するのに使用した。ＰＣＲ誘導ｃＤＮＡ配列を、ハイプライム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）によって３２Ｐ−ＣＴＰで標識し、そしてコロニーハイブリッド形成技術を使用して、胎盤ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｕｎｉｚａｐ（商標）λライブラリー）をプローブするために使用した。およそ２×１０６ファージプラークは、３回のスクリーニングおよびプラーク精製を受けた。２つのクローンは、制限酵素分析によって測定され、そしてＥＳＴ共通配列（上記参照）のサイズでの比較に基づいて、全長（−１．５キロベース）と思われた。ジデオキシ方法によるこれらのクローンのうちの１つの配列決定は、図４Ｆで描かれるオリゴヌクレオチド配列を生じた。この配列から得られる翻訳産物は、枠内開始剤メチオニン、シグナルペプチドおよび成熟胎盤ビクニン配列を伴うタンパク質を生じた。シグナルペプチド配列長および配列が異なるが、成熟骨盤ビクニン配列は、ＥＳＴ共通の翻訳によって誘導される成熟タンパク質の配列に一致した。ＰＣＲ誘導産物と異なり、コロニーハイブリッド形成によって誘導されるｃＤＮＡは、全体の外側ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメインおよび枠内終止コドンを含んだ。実際に、クローンは、ポリ−Ａ尾部に全ての方法で伸びた。開始剤メチオニンは、ＰＣＲ誘導クローンでコードされたシグナルペプチドに一致する疎水性シグナルペプチドに続いた。続いて、我々は、Ｓｆ９細胞（実施例９）およびＣＨＯ細胞（実施例１７）から得られる、胎盤ビクニン、ビクニン（１−１７０）の可溶性断片を発現および精製し、そしてそれらは、機能性プロテアーゼ阻害剤（実施例１０および１８）であることが分かった。さらに、我々は、活性プロテアーゼ阻害剤（実施例７）としても胎盤ビクニンの可溶性断片であるヒト胎盤から単離した。上の観察に基づいて、可溶性タンパク質と同様に細胞の表面に膜貫通タンパク質として存在する能力を有する。クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインを含む他の膜貫通タンパク質は、蛋白分解性プロセシングを受けて、可溶性で膜関連形態の混合物を得ることが知られている。これらは、ＡＰＰ７５１（Ｅｓｃｈ  Ｆ．ら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８、１１２２−１１２４頁）およびＡＰＰ７７０（Ｗａｎｇ  Ｒ．ら（１９９１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６６、１６９６０−１６９６４頁）と称されるアミロイド前駆体タンパク質の２つの形態を含む。
【００５８】
接触活性化は、凝固カスケードの成分に、損傷を受けた血管表面の露出によって達成されるプロセスである。脈管形成は、内皮表面でプラスミンの局所活性化に関与するプロセスである。細胞表面に固定する胎盤ビクニンの特異性およびその推定許容量は、膜貫通胎盤ビクニンの生理学的機能が、接触活性化および脈管形成の調節を含み得ることを示唆する。
【００５９】
胎盤ビクニン（７−６４）、ビクニン（１０２−１５９）、および全長胎盤ビクニン（図４Ｆ）についてのアミノ酸配列を、ＰＩＲ（バージョン４６．０）およびＰａｔｃｈＸ（バージョン４６．０）タンパク質データベース、並びにＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐプログラム  ＦａｓｔＡを用いて特許を受けたデータベースのＧｅｎｅＳｕｑ（バージョン２０．０）タンパク質データベースについて調べた。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐプログラム  ＴＦａｓｔＡ（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４−２４４８）を使用して、これらの同じタンパク質配列を、ＧｅｎＢａｎｋ（９６年１月２６日までの最新版バージョン９２．０）およびＥＭＢＬ（修正されたバージョン４５．０）ヌクレオチドデータベース、並びに特許を受けた配列のＧｅｎｅＳｕｑ（バージョン２０．０）ヌクレオチドデータベースの６つの枠の翻訳に対して調べた。ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬのＥＳＴおよびＳＴＳ副組は、この組の調査に含まれなかった。これらの調査から得られる最高のマッチは、クローンＲ７４５９３およびＲ３５４６４の我々の分析から誘導される５８のアミノ酸タンパク質配列までそれらの全長より約５０％の同一性のみがある配列を含んだ。
【００６０】
ヒトビクニンの単離
上述されたように、ビクニン（図３）について翻訳された共通配列から測定されるとおり、ビクニン（７−６４）およびビクニン（１０２−１５９）に対応する合成ペプチドは、再び畳み込んで（それぞれ、実施例２および１）、活性なカリクレイン阻害剤タンパク質（それぞれ、実施例４および３）を生じえた。我々は、精製模式図を工夫して、ヒト組織からの生来の胎盤ビクニンを単離するこの予測されない特性を利用した。
【００６１】
最初の工程として、カリクレイン−セファロース親和性クロマトグラフィを使用する精製模式図を用いて、非常に精製された生来の強力なカリクレイン阻害剤を単離した。単離した生来のヒトビクニンは、共通核酸配列（図３）アミノ酸残渣＋１から＋５０（実施例７）の翻訳によって推定される配列と同一のＮ末端を有した。これは、ヒト胎盤から単離される新規の生来のカリクレイン阻害剤の存在を最初に確認した。
【００６２】
公知であるクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインは、以下に挙げられる。標的プロテアーゼと接触させるべきであると信じられる残渣は、特別の興味のもの（太字／下線付）として目立たせる。これらの特定の残渣は、標識Ｘａａによって示されるとおり特定の文献について位置Ｘａａ１−１６と名付けられる。
【００６３】
ビクニン（７−６４）（配列番号：４）
【化７】
2006232810.tif 000004
【００６４】
ビクニン（１０２−１５９）（配列番号：６）
【化８】
2006232810.tif 000005
【００６５】
組織因子経路阻害剤前駆体１（配列番号：１８）
【化９】
2006232810.tif 000006
【００６６】
組織因子経路阻害剤前駆体１（配列番号：１９）
【化１０】
2006232810.tif 000007
【００６７】
組織因子経路阻害剤前駆体（配列番号：２０）
【化１１】
2006232810.tif 000008
【００６８】
組織因子経路阻害剤前駆体２（配列番号：２１）
【化１２】
2006232810.tif 000009
【００６９】
組織因子経路阻害剤前駆体２（配列番号：２２）
【化１３】
2006232810.tif 000010
【００７０】
アミロイド前駆体タンパク質相同体（配列番号：２３）
【化１４】
2006232810.tif 000011
【００７１】
アプロチニン（配列番号：２４）
【化１５】
2006232810.tif 000012
【００７２】
内部−α−トリプシン阻害剤前駆体（配列番号：２５）
【化１６】
2006232810.tif 000013
【００７３】
内部−α−トリプシン阻害剤前駆体（配列番号：２６）
【化１７】
2006232810.tif 000014
【００７４】
アミロイド前駆体タンパク質（配列番号：２７）
【化１８】
2006232810.tif 000015
【００７５】
コラーゲンα−３（ＶＩ）前駆体（配列番号：２８）
【化１９】
2006232810.tif 000016
【００７６】
ＨＫＩ−Ｂ９（配列番号：２９）
【化２０】
2006232810.tif 000017
【００７７】
本発明の単離ドメインまたは他の変異体である胎盤ビクニンは、Ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，２（ペプチド、分析、合成、生物学、２）における、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｒ．Ｂ．およびＢａｒａｎｙ  Ｇ、Ｇｒｏｓｓ  Ｅ．ら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８０）第１章によって記載されるとおりｔ−Ｂｏｃ化学を使用するか、またはＣａｒｐｉｎｏ  Ｌ．Ａ．およびＨａｎ  Ｇ．Ｙ．、（１９７０）Ｊ．Ａｍｅｒ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ、９２、５７４８−５７４９によって記載され、そして実施例２に例示されるＦ−ｍｏｃ化学を使用するかのいずれかで標準固相ペプチド合成によって産生され得る。代替的に、胎盤ビクニン変異体をコードするＤＮＡの発現は、組換え胎盤ビクニン変異体を産生するために使用され得る。
【００７８】
本発明は、カリクレインを特異的に阻害できる精製ヒトセリンプロテアーゼ阻害剤の使用を提供し、そしてそれは、親和性クロマトグラフィを介してヒト胎盤組織から単離された。ここで、ヒト胎盤ビクニンと称されるヒトセリンタンパク質阻害剤は、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）クラスの２つのセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインを含む。１つの特定の実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を有するタンパク質を具体化する：    
【化２１】
2006232810.tif 000018
【００７９】
（配列番号：１）。
【００８０】
特に好ましい実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を有するビクニンタンパク質（ビクニン（１−１７０））を提供する。
【化２２】
2006232810.tif 000019
【００８１】
（配列番号：５２）。
【００８２】
１つの態様では、本発明を行う上で有用なタンパク質の生物学的活性は、それが、トリプシン、ヒト血漿および組織カリクレイン、ヒトプラスミンおよびファクターＸＩＩａの生物学的活性に結合でき、そして実質的に阻害できることである。好ましい実施形態では、本発明は、グリコシル化形態で生来のヒト胎盤ビクニンタンパク質を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、それが少なくとも１つのシステイン−システインジスルフィド結合を含有するように形成された生来のヒトビクニンタンパク質を含む。好ましい実施形態では、タンパク質は、ＣＹＳ１１−ＣＹＳ６１、ＣＹＳ２０−ＣＹＳ４４、ＣＹＳ３６−ＣＹＳ５７、ＣＹＳ１０６−ＣＹＳ１５６、ＣＹＳ１１５−ＣＹＳ１３９、およびＣＹＳ１３１−ＣＹＳ１５２からなる群から選択される１対のシステインの間に形成される少なくとも１つの鎖内システイン−システインジスルフィド結合を含み、システインは、生来のヒト胎盤ビクニンのアミノ酸配列によって数字をつけられる。通常の技術を有する者は、本発明のタンパク質が、生来のヒトビクニンの生物学的活性が、維持され、生来の鎖内システイン−システインジスルフィド結合のいずれもが存在しないか、１つまたはそれ以上または全てが存在する適切な三次元コンフォメーションに折り畳まれ得ることを認識する。最も好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、適切に折り畳まれ、そして適切な生来のシステイン−システインジスルフィド結合の全てと形成される。
【００８３】
本発明に使用するための活性なタンパク質は、胎盤のようなヒト組織から、または以下の実施例によって例示されるとおり、合成タンパク質化学技術を介して精製することによって得られる。本発明に使用するためのタンパク質が、分子生物学技術を用いて得られ、自己複製ベクターが、本発明のタンパク質を、形質転換細胞から発現させる能力のあることも分かる。このようなタンパク質は、形質転換細胞から非分泌または分泌形態として作成され得る。形質転換細胞からの分泌を促進するか、翻訳タンパク質の機能的安定性を増強するか、またはビクニンタンパク質の畳込みを助けるために、特定のシグナルペプチド配列を、生来のヒトビクニンタンパク質のＮＨ２−末端部分に添加し得る。
【００８４】
１つの実施形態において、本発明は、したがって無傷の生来のシグナルペプチド配列の少なくとも一部と共に生来のヒトビクニンタンパク質を供給する。このように、本発明の１つの実施形態は、アミノ酸配列：
【化２３】
2006232810.tif 000020
【００８５】
（配列番号：２）を有するシグナルペプチドの少なくとも一部と共に生来のヒトビクニンを提供する。
【００８６】
好ましい実施形態では、本発明は、アミノ酸配列：
【化２４】
2006232810.tif 000021
【００８７】
（配列番号：５３）を有する無傷の先導セグメントと共に、配列番号：５２のアミノ酸配列を有する無傷の先導配列の一部と共に、生来のヒトビクニンの使用を提供する。
【００８８】
好ましい実施形態では、本発明は、アミノ酸配列：
【化２５】
2006232810.tif 000022
【００８９】
（配列番号：５４）を有する無傷の先導セグメントと共に、配列番号：５２のアミノ酸配列を有する無傷の先導配列の一部と共に、ビクニンタンパク質の使用を提供する。
【００９０】
ここに使用される好ましい番号付けシステムでは、＋１と番号付けされたアミノ酸は、生来のヒト胎盤ビクニンについてのアミノ酸配列のＮＨ２末端に付与される。誰もが、機能性タンパク質断片が、生来のヒト胎盤ビクニンから誘導され得ることを十分に認識し、そして生来のヒト胎盤ビクニンの少なくとも生物学的活性の一部を維持し、そしてセリンプロテアーゼ阻害剤として作用する。
【００９１】
１つの実施形態では、本発明の方法に使用するためのタンパク質は、以下「ビクニン（７−１５９）」と称される、生来のヒト胎盤ビクニンアミノ酸７−１５９のアミノ酸配列を有する、少なくとも１つの機能性クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインを含有する生来のヒト胎盤ビクニンの断片を含む。したがって、本発明は、アミノ酸配列：
【化２６】
2006232810.tif 000023
【００９２】
（配列番号：３）を有するタンパク質を使用する方法を具体化する。式中、アミノ酸番号付けは、生来のヒト胎盤ビクニンのアミノ酸配列のものに対応する。
【００９３】
この実施形態の別の機能性異性体は、生来のヒト胎盤ビクニンの断片であり得て、そしてそれは、生来のヒト胎盤ビクニンアミノ酸１１−１５６のアミノ酸配列、ビクニン（１１−１５６）
【化２７】
2006232810.tif 000024
【００９４】
（配列番号：５０）を有する少なくとも１つの機能性クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインを含む。
【００９５】
個々のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインが生来の胎盤ビクニンの断片でもあることを、誰もが認識できる。特に、本発明は、以下「ビクニン（７−６４）」と称される、生来のヒト胎盤ビクニンアミノ酸７−６４のアミノ酸配列からなる最初のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインのアミノ酸配列を有するタンパク質の使用を意図する。したがって、１つの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列：
【化２８】
2006232810.tif 000025
【００９６】
（配列番号：４）を有する少なくとも１つのクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインを含有するタンパク質を含む。式中、アミノ酸番号付けは、生来のヒト胎盤ビクニンのアミノ酸配列のものに対応する。この実施形態の別の形態のタンパク質は、生来のヒト胎盤ビクニンアミノ酸１１−６１のアミノ酸配列からなる最初のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインである、アミノ酸配列：
【化２９】
2006232810.tif 000026
【００９７】
（配列番号：５）を有する「ビクニン（１１−６１）」であり得る。
【００９８】
本発明は、以後「ビクニン（１０２−１５９）」と称される、生来のヒト胎盤ビクニンアミノ酸１０２−１５９のアミノ酸配列からなるクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインのアミノ酸配列を有するタンパク質をも提供する。したがって、１つの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列：
【化３０】
2006232810.tif 000027
【００９９】
（配列番号：６）を有する少なくとも１つのクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインを含有するタンパク質を含む。式中、アミノ酸番号付けは、生来のヒト胎盤ビクニンのアミノ酸配列のものに対応する。このドメインの別の形態は、アミノ酸配列：
【化３１】
2006232810.tif 000028
【０１００】
（配列番号：７）を有する「ビクニン（１０６−１５６）」である、生来のヒト胎盤ビクニンアミノ酸１０６−１５６のアミノ酸配列からなるクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインであり得る。
【０１０１】
したがって、通常の技術の者は、生来のヒトビクニンタンパク質の断片が、少なくともある程度の生来のタンパク質生物学的活性を保持するように作り得ることを認識する。このような断片は、異なる配向で組合せて、または複数組合せて、生来のヒトビクニンタンパク質の同じ、またはそれ以上の生物学的活性のいくらかを保持する代替のタンパク質を提供し得る。
【０１０２】
本発明の方法で使用される生物学的に活性なタンパク質が、他の源から別のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインと組合せて１つまたはそれ以上の本発明のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインを包含し得ることを、誰もが容易に認識し得る。本発明の方法の生物学的に活性なタンパク質は、多様な生物学的活性を示す他の源から別のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインと組合せて１つまたはそれ以上の本発明のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメインを包含し得る。本発明を行う上で有用な本発明の生物学的活性は、検出可能な生物学的活性を示す多機能融合タンパク質を準備するために、公知である他のタンパク質またはタンパク質類のものと組合せ得る。したがって、１つの実施形態では、本発明の方法は、配列番号：５または配列番号：７のいずれかのアミノ酸配列と同じか、または機能的に等価である少なくとも１つのアミノ酸配列セグメントを含むタンパク質の使用を含む。
【０１０３】
早期の終止コドンで終了するオープンリーディングフレームは、さらに、機能性タンパク質をコードし得る。本発明は、このような代替終止を包含し、そして１つの実施形態では、アミノ酸配列：
【化３２】
2006232810.tif 000029
【０１０４】
（配列番号：８）のタンパク質の使用のために提供する。
【０１０５】
１つの実施形態では、本発明は、先導配列の無傷のセグメント、および少なくとも無傷の生来の膜貫通領域の一部と共に、実質的に精製されるか、または組換えて産生される生来のヒトビクニンタンパク質の使用のために提供する。したがって、本発明の１つの実施形態は、
【化３３】
2006232810.tif 000030
【０１０６】
から選択されるアミノ酸配列を示す、無傷の先導配列と共に、そして膜貫通ドメインの少なくとも一部（下線付き）と共に、生来のヒトビクニンの使用のために提供する。式中、ＥＳＴは、共通の配列番号：４５から誘導されるＥＳＴであり、ＰＣＲは、ＰＣＲクローン配列番号：４７であり、そしてλｃＤＮＡは、ラムダｃＤＮＡクローン配列番号：４９である。好ましい実施形態では、本発明の方法のタンパク質は、タンパク質が、最後のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインおよび膜貫通領域（下線付き）の末端の間の領域に切断された配列番号４５、４７または４９のアミノ酸配列のうちの１つを含む。
【０１０７】
本発明は、シグナルペプチドが欠失されたタンパク質の使用を具体化もする。
【０１０８】
したがって、本発明の方法は、膜貫通アミノ酸配列：
【化３４】
2006232810.tif 000031
【０１０９】
（配列番号：６９）  膜貫通アミノ酸配列：
【化３５】
2006232810.tif 000032
【０１１０】
（配列番号：６８）または膜貫通アミノ酸配列：
【化３６】
2006232810.tif 000033
【０１１１】
（配列番号：６７）に継続する配列番号：５２のアミノ酸配列を有するタンパク質を提供する。
【０１１２】
本発明に使用するためのタンパク質アミノ酸配列は、本発明に使用するためのタンパク質を産生するための分子生物学技術に使用できる適切な核酸配列を、当業者に明確に教示する。したがって、本発明の１つの実施形態は、図３の生来のヒト胎盤ビクニン配列（配列番号：１０）についてのアミノ酸配列に翻訳する図３の共通ＤＮＡ配列（配列番号：９）を示すヒトビクニンをコードする核酸配列の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、図４Ｄのアミノ酸配列（配列番号：４５）をコードする図４Ｃの共通核酸配列（配列番号：５１）を提供する。
【０１１３】
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号：４９のタンパク質配列をコードする図４ＦのＤＮＡ配列（配列番号：４８）を有する生来のヒト胎盤ビクニンをコードする核酸配列の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号：４７のタンパク質配列をコードする図４Ｅの核酸配列（配列番号：４６）を提供する。
【０１１４】
核酸配列でなされる特定の対立遺伝子突然変異、および保存的置換が、行われ得て、そしてそれは本発明の方法によって包含されるさらにタンパク質アミノ酸配列を生じることを、誰もが容易に認識できる。当業者は、本発明のタンパク質の特定の自然の対立遺伝子の突然変異、および本発明のタンパク質中のアミノ酸の保存的置換が、そのタンパク質の生物学的活性を明らかに修正させず、そして本発明によって包含されないことを認識できる。
【０１１５】
本発明は、粘膜腺毛機能不全によって損傷を受けた患者でＭＣＣを刺激するために有用であるヒト胎盤ビクニンおよびその断片を含む医薬組成物をも提供する。
【０１１６】
本発明は、生理学的に適合するビヒクル中の本発明の有効量の開示されたヒトセリンプロテアーゼ阻害剤が、患者に投与されることを特徴とする、粘膜腺毛機能不全に罹っている患者でのＭＣＣを刺激する方法をも提供する。
【０１１７】
本発明は、プロテアーゼ特異性を修正するアミノ酸置換を含む胎盤ビクニンの変異体、および上に記載される特異的クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインを使用するＭＣＣを刺激する方法をも提供する。置換の好ましい部位は、生来の胎盤ビクニンについてのアミノ酸配列でのＸａａ１からＸａａ３２までの位置として以下に示される。
【０１１８】
Ｘａａ１からＸａａ１６まででの置換はまた、Ｘａａ１７からＸａａ３２まででの置換がビクニン（１０２−１５９）の変異体にとって好ましい一方で、ビクニン（７−６４）の変異体にとって好ましい。
【０１１９】
したがって、本発明の方法は、アミノ酸配列：
【化３７】
2006232810.tif 000034
【０１２０】
を有するタンパク質の使用を具体化する。式中、Ｘａａ１−Ｘａａ３２は、各々、独立に、Ｃｙｓ以外の自然に発生するアミノ酸残渣を表すが、ただし、アミノ酸残渣Ｘａａ１−Ｘａａ３２の少なくとも１つが、生来の配列の対応するアミノ酸残渣と異なる。    
本発明の内容で、語句「自然に発生するアミノ酸残渣」は、２０の一般的に生じるアミノ酸、すなわち、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌのうちのいずれか１つを示すことが意図される。
【０１２１】
上に示される１つまたはそれ以上の位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸を置換することによって、生来の胎盤ビクニンの阻害剤特異性プロファイル、または個々のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメイン、ビクニン（７−６４）またはビクニン（１０２−１５９）のものを変化して、その結果それに限定されないが、補体カスケードの酵素、ＴＦ／ＦＶＩＩａ、ＦＸａ、プロスタシン、トロンビン、好中球エラスターゼ、カテプシンＧまたはプロテイナーゼ−３のような他のセリンプロテアーゼを優先的に阻害することが可能であり得る。
【０１２２】
胎盤ビクニンの好ましい変異体の例は、Ｘａａ１が、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＬｙｓからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ１が、ＨｉｓまたはＰｒｏであるもの；またはＸａａ２が、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ２が、ＶａｌまたはＴｈｒであるもの；またはＸａａ３が、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ３が、ＡｒｇまたはＰｒｏであるもの；またはＸａａ４が、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＳｅｒ、Ｇｌｎからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ４が、ＡｒｇまたはＬｙｓであるもの；Ｘａａ５が、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｔｈｒからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ５が、Ａｌａであるもの；またはＸａａ６が、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｐｈｅからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ６が、ＳｅｒまたはＡｒｇであるもの；またはＸａａ７が、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ＴｈｒおよびＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ７が、ＭｅｔまたはＩｌｅであるもの；またはＸａａ８が、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、またはＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ８が、ＰｒｏまたはＩｌｅであるもの；またはＸａａ９が、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ９が、Ａｒｇであるもの；またはＸａａ１０が、Ｖｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、ＬｅｕおよびＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ１０が、Ｖａｌであるもの；またはＸａａ１１が、Ｇｌｙ、ＳｅｒおよびＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ１１が、Ｇｌｙであるもの；またはＸａａ１２が、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ１２が、ＡｓｐまたはＡｒｇであるもの；またはＸａａ１３が、ＧｌｙおよびＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの；Ｘａａ１４が、ＡｓｎまたはＬｙｓからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの；またはＸａａ１５が、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＶａｌおよびＬｙｓからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ１５が、ＬｅｕまたはＬｙｓであるもの；またはＸａａ１６が、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、およびＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ１６が、ＶａｌまたはＡｌａであるもの；またはＸａａ１７が、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、ＬｙｓまたはＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ１７が、ＧｌｕまたはＰｒｏであるもの；またはＸａａ１８が、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、ＡｌａまたはＬｙｓからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ１８が、Ｔｈｒであるもの；またはＸａａ１９が、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ１９が、Ｐｒｏであるもの；またはＸａａ２０が、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ２０が、ＡｒｇまたはＬｙｓであるもの；またはＸａａ２１が、Ａｌａ、Ａｓｐ、ＴｈｒまたはＧｌｙからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ２１が、Ａｌａであるもの；またはＸａａ２２が、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＡｒｇまたはＰｈｅからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ２２が、ＳｅｒまたはＡｒｇであるもの；またはＸａａ２３が、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ＴｈｒまたはＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ２３が、ＰｈｅまたはＩｌｅであるもの；またはＸａａ２４が、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、ＳｅｒまたはＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ２４が、ＰｒｏまたはＩｌｅであるもの；またはＸａａ２５が、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ２５が、Ａｒｇであるもの；またはＸａａ２６が、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ，Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ，ＴｒｐおよびＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ２６が、ＶａｌまたはＩｌｅであるもの；またはＸａａ２７が、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ２７が、Ｇｌｙであるもの；またはＸａａ２８が、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ２８が、Ａｒｇであるもの；またはＸａａ２９が、ＧｌｙおよびＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの；またはＸａａ３０が、ＡｓｎまたはＬｙｓからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの；またはＸａａ３１が、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＶａｌおよびＬｙｓからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ３１が、ＡｒｇまたはＬｙｓであるもの；またはＸａａ３２が、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、ＭｅｔおよびＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸残渣であるもの、特に、Ｘａａ３２が、ＧｌｎまたはＡｌａであるものが挙げられる。
【０１２３】
本発明は、本発明の胎盤ビクニンタンパク質変異体をコードするＤＮＡ構築物にも関する。これらの構築物は、Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｓ．Ｌ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ  Ｍ．Ｈ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、２２、１８５９−１８６２頁；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  Ｍ．ＤおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓＭ．Ｈ．（１９８１）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３、３１８５頁で記載されるもののような合成法によって；またはＤＮＡ配列をコードする胎盤ビクニンとハイブリッド形成するように設計されたｃＤＮＡプローブでゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得られたゲノムまたはｃＤＮＡから製造され得る。ゲノムまたはｃＤＮＡ配列は、１つまたはそれ以上の部位で修正して、この開示で記載されるアミノ酸置換または欠失のいずれかをコードするｃＤＮＡを得ることができる。
【０１２４】
本発明は、組換え胎盤ビクニン変異体の産生に使用され得る本発明の胎盤ビクニンをコードするＤＮＡ構築物、単離ドメインまたは他の変異体を含む発現ベクターにも関する。ｃＤＮＡは、選択の宿主での転写活性を示し、適切なターミネータおよびポリアデニル化シグナルを保有する適切なプロモータ配列に接触させるべきである。胎盤ビクニン変異体をコードするｃＤＮＡは、ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質を生じて、分泌を受ける５’シグナルペプチドに融合され得る。シグナルペプチドは、宿主生物によって認識されるものであり得る。哺乳類宿主の場合には、シグナルペプチドは、全長の胎盤ビクニンに存在する天然のシグナルペプチドでもあり得る。胎盤ビクニン変異体の発現のためにこのようなベクターを製造するために使用される手段は、当業界においてよく知られ、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング；実験室マニュアル）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載される。
【０１２５】
本発明は、組換え胎盤ビクニン異性体の産生のために使用できる胎盤ビクニン、単離ドメインまたは本発明の他の変異体をコードするＤＮＡ構築物を含む形質転換細胞にも関する。胎盤ビクニン異性体の産生のために使用され得た発現ベクターおよび宿主生物の多様な組合せが存在する。適切な宿主細胞としては、バキュロウイルス感染Ｓｆ９昆虫細胞、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＨｅｌａおよびＣ−１２７のような哺乳類細胞、大腸菌等の細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ等の酵母が挙げられる。胎盤ビクニンの発現を達成するために必要とされる哺乳類、昆虫および微生物発現系を使用する方法は、当業界においてよく知られ、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における最近のプロトコル）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９５）第１６章に記載される。ビクニン（７−６４）および（１０２−１５９）、酵母および大腸菌発現系等の単独のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）阻害剤ドメインを含有する胎盤ビクニンの断片については、好ましく、そして酵母系は、最も好ましい。典型的には、酵母発現は、アプロチニン変異体については米国特許第５，１６４，４８２号に、記載されるとおり行われ、そして胎盤ビクニン（１０２−１５９）について本明細書の実施例５で適合した。大腸菌発現は、米国特許第５，０３２，５７３号に記載される方法を用いて行い得る。哺乳類および酵母系の使用が、変異体ビクニン（７−１５９）等の両方の阻害剤ドメインを含む大きな胎盤ビクニン変異体の発現のために最も好ましい。
【０１２６】
天然のアミノ酸配列のアミノ酸置換を保有する胎盤ビクニンのＤＮＡコード変異体は、Ｋｕｎｋｅｌ  Ｔ．Ａ．、（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８２、４８８−４９２頁の方法を用いた組換えタンパク質の発現のために製造され得る。簡便には、突然変異誘発されるべきＤＮＡを、Ｍ１３等の一本鎖バクテリオファージベクターにクローニングする。変化されるべきその領域を貫通し、置換をコードするオリゴヌクレオチドを、一本鎖ＤＮＡにハイブリッド形成され、そして標準的な分子生物学技術によって二重鎖にする。
【０１２７】
その後、このＤＮＡは、適切な細菌性宿主に形質転換させ、そしてジデオキシヌクレオチド配列決定によって確認する。その後、正しいＤＮＡを、発現プラスミドにクローニングする。代替的に、標的ＤＮＡは、標準ＰＣＲ技術によって突然変異誘発でき、配列決定し、そして適切な発現プラスミドに挿入し得る。
【０１２８】
以下の特定の実施例は、本発明の特定の態様および好ましい実施形態を示す例示の方法によって提供され、そして限定されない。この出願に引用された全ての特許、特許出願および学術文献は、それらの全体で参照して組み込まれる。
【０１２９】
実施例１
合成胎盤ビクニン（１０２−１５９）の製造
使用した材料および方法／試薬。蛍光作用性基質Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ＡＭＣは、Ｂａｃｈｅｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ（Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）から購入した。ＰＮＧＢ、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ＡＭＣ、ウシトリプシン（ＩＩＩ型）、ヒト血漿カリクレイン、およびヒトプラスミンは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。
【０１３０】
組換えアプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ（商標））は、Ｂａｙｅｒ  ＡＧ（Ｗｕｐｐｅｒｔａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。予備負荷したＧｌｎワン樹脂は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から得た。チオアニソール、エタンジチオールおよびｔ−ブチルメチルエーテルは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から得た。
【０１３１】
機能性胎盤ビクニン（７−６４）（配列番号：４）および（１０２−１５９）の定量精製の種々の段階にある再折り畳み試料に存在するトリプシン阻害活性の量は、基質としてＧＰＫ−ＡＭＣを用いて測定した。ウシトリプシン（２００ピコモル）を、緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、０．１ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２および０．０１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００）中の種々の段階の精製からビクニン（７−６４）または（１０２−１５９）を用いて、３７％Ｃで、５分間インキュベートした。ＧＰＫ−ＡＭＣを、添加（最終２０μＭ）し、そして産生されたクマリンの量は、２分間かけて、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ−５０Ｂ蛍光測定装置で蛍光物質（ｅｘ＝３７０ｎｍ、ｅｍ＝４３２ｎｍ）を測定することによって測定される。試験されるべき試料については、各々についての阻害率（％）は、方程式１（式中、Ｒ０は、阻害剤の存在下での蛍光物質増大の速度であり、そしてＲ１は、添加した試料の不在下で測定された速度である）によって計算された。阻害剤についての活性の１単位は、記載されたとおりの条件を用いて、アッセイで５０％阻害を達成するために必要とされる量として定義される。
【０１３２】
（数１）
阻害率（％）＝１００×［１−Ｒ０／Ｒ１］    （１）
合成。胎盤ビクニン（１０２−１５９）（配列番号：６）を、ＮＭＰ−ＨＢＴＵＦｍｏｃ化学を用いたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのモデル４２０Ａペプチド合成装置で合成した。ペプチドを、各結合のために８倍過剰のアミノ酸を用いて、予備負荷Ｇｌｎ樹脂で合成した。切断および脱保護を、室温で、２時間、８４．６％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、４．４％トリアニソール、２．２％エタンジチオール、４．４％液化フェノール、および４．４％Ｈ２Ｏで行った。粗ペプチドを沈殿させ、遠心分離し、そして２回ｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄した。ペプチドを、ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を用いて、Ｄｙｎａｍａｘ  ６０Ａ  Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。最終製品（６１．０ｍｇ）は、正しいアミノ酸組成物を生じ、そして推定配列：
【化３８】
2006232810.tif 000035
【０１３３】
（配列番号：６）について分子量を、エレクトロスプレー質量分子学（ＭＨ＋＝６８３６．１；測定値＝６８３５．５）によって得た。
【０１３４】
精製。胎盤ビクニン（１０２−１５９）の再折り畳みを、Ｔａｍら、（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９１、１１３：６６５７−６２）の方法によって行った。精製ペプチドの一部（１５．２ｍｇ）を、４．０ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）および８Ｍ尿素に溶解させた。ジスルフィドの酸化は、２３％ＤＭＳＯ、および０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）を含有する溶液の滴下の添加によって達成して、２０％ＤＭＳＯ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）および１Ｍ尿素中の０．５ｍｇ／ｍｌペプチドの最終濃度を得た。それを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および０．１ＭのＮａＣｌを含む緩衝液中で１：１０に希釈した後に、溶液を、２５℃で２４時間攪拌させた。材料を、製造業者の指示によって、３．５ｍｌのＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に３０ｍｇのウシ脾臓カリクレイン（Ｂａｙｅｒ  ＡＧ）に共有結合で付着させることによって、カリクレイン親和性カラムを用いて精製した。再折り畳み材料を、１ｍｌ／分の流速で、親和性カラムに負荷し、そして洗浄の２８０ｎｍでの吸光度が、もはや検出されなくなるまで、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および０．１ＭのＮａＣｌで洗浄した。カラムは、３倍量の各々の０．２Ｍ酢酸（ｐＨ４．０および１．７）で溶出させた。活性画分を、貯蔵し（以下参照）、そして溶液のｐＨを、２．５に調節した。材料を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８逆相カラム（５ミクロン、０．４６×２５ｃｍ）に直接使用し、そして、０．１％ＴＦＡ中の２２．５％アセトニトリルで平衡にした。分離は、４０分かけて、１．０ｍｌ／分で０．１％ＴＦＡ中の２２．５から４０％のアセトニトリルの線状勾配を用いて達成した。活性画分を、貯蔵し、凍結乾燥し、０．１％ＴＦＡで再溶解し、そして必要とされるまで−２０℃で保存した。
【０１３５】
結果。合成胎盤ビクニン（１０２−１５９）を、上記のように酸化剤として２０％ＤＭＳＯを用いて、再折り畳みし、そして下に示される２段階の精製プロトコルによって精製して、活性トリプシン阻害剤を得た（下の表１）。
【表１】
2006232810.tif 000036
【０１３６】
免疫化ウシ脾臓カリクレインカラム上の粗再折り畳み材料のクロマトグラフィは、存在する６．０％のタンパク質および９７％のトリプシン阻害活性を選択的に分離した。Ｃ１８逆相を用いた連続クロマトグラフィは、７４％の全体の回収率で２倍の別の精製を生じた。ＲＰＨＰＬＣで、還元および再折り畳み胎盤ビクニン（１０２−１５９）は、それぞれ２６．３および２０．１分の溶出時間を表した。精製した材料の質量分子学分析は、６８２９．８の分子量を表した。出発材料から６質量単位の損失。これは、ペプチド配列から推定された３つのジフスルフィドの完全な形成を示す。
【０１３７】
精製され、再折り畳みされた合成胎盤ビクニン（１０２−１５９）の等電点は、プレキャストＡｍｐｈｏｌｉｎｅ（商標）ＰＡＧプレート（ｐＨ３．５から９．５）を用いて、ｐＩ標準と共に、製造業者の示唆によって起動されるＭｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（電気泳動システム）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて測定し、そして１．５時間焦点を合わせた。染色後、ゲルの陽極から異なるタンパク質バンドまでの移動距離を、測定した。各未知のｐＩを、標準対対応のｐＩの移動距離のプロットによって生じた標準曲線を用いて測定した。この技術で、胎盤ビクニン（１０２−１５９）のｐＩを、アミノ酸配列から推定される値と一致して、８．３と測定した。これは、アプロチニンのｐＩについて樹立された１０．５の値より低い（Ｔｅｎｓｔａｄら、１９９４、Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１５２：３３−５０）。
【０１３８】
実施例２
合成胎盤ビクニン（７−６４）の製造
胎盤ビクニン（７−６４）（配列番号：４）を合成し、再折り畳み、そして以下の修正を示す以外は、実施例１で胎盤ビクニン（１０２−１５９）（配列番号：６）について基本的に記載されるとおり精製した：再折り畳みの間中、合成ペプチドを、２５℃で、２０％ＤＭＳＯ中の溶液として３０時間攪拌した；Ｃ１８ＰＲ−ＨＰＬＣによる精製は、４０分間かけて０．１％ＴＦＡ中の２５から４５％までのアセトニトリルの線状勾配（１ｍｌ／分）で達成された。最初のＣ１８操作から得た活性画分は、カラムに再度入れられ、そして０．１％ＴＦＡ中の２０から４０％アセトニトリルの線状勾配（６０分、１ｍｌ／分）で分画した。結果。最終精製還元ペプチドは、配列：
【化３９】
2006232810.tif 000037
【０１３９】
（配列番号：４）に一致するＭＨ＋＝６５６３を示した。
【０１４０】
再折り畳みおよび精製は、トリプシンの阻害剤として活性である機能性クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインを生じた（以下の表２）。
【表２】
2006232810.tif 000038
【０１４１】
精製された再折り畳みタンパク質は、ＭＨ＋＝６５５８、すなわち、還元ペプチドについてより少ない５±１質量単位を示した。これは、再畳込みが、少なくとも１つの適切なジスルフィド結合の形成を引き起こすことを示す。胎盤ビクニン（７−６４）のｐＩは、胎盤ビクニン（１０２−１５９）のｐＩを測定するために使用された方法を使用して測定された。胎盤ビクニン（７−６４）は、予測値（ｐＩ＝７．９）よりいっそう高いｐＩを示した。再度折り畳んだ胎盤ビクニン（７−６４）は、ゲル（ｐＨ９．５）の陽性末端まで移動し、そして正確なｐＩは、これらの条件下で測定できなかった。
【０１４２】
合成胎盤ビクニン（７−６４）の連続製造法
合成胎盤ビクニン（７−６４）が、精製および再折り畳みの前に、完全な脱保護を受けてはいけないので、再折り畳みは、完全に脱保護されたことが確かであるタンパク質を用いて繰り返された。胎盤ビクニン（７−６４）は、合成され、再畳込みされ、そして、以下の修正を伴い以外は、胎盤ビクニン（１０２−１５９）について基本的に記載されるとおりに精製された：再折り畳みの間中、合成ペプチド（０．２７ｍｇ／ｍｌ）を、２５℃で、２０％ＤＭＳＯ中の溶液として３０時間攪拌した；Ｃ１８ＰＲ−ＨＰＬＣによる精製は、４０分間かけて０．１％ＴＦＡ中の２２．５から５０％までのアセトニトリルの線状勾配（１ｍｌ／分）で達成された。
【０１４３】
結果。最終精製還元ペプチドは、配列：
【化４０】
2006232810.tif 000039
【０１４４】
（配列番号：４）に一致するＭＨ＋＝６５６７．５を示した。
【０１４５】
再折り畳みおよび精製は、トリプシンの阻害剤として活性である機能性クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインを生じた（以下の表２Ｂ）。
【表３】
2006232810.tif 000040
【０１４６】
精製した再折り畳みタンパク質は、ＭＨ＋＝６５６１．２、すなわち、還元ペプチドについてより少ない６．３質量単位を示した。これは、再折り畳みが、予測される３つのジスルフィド結合の形成を引き起こすことを示す。
【０１４７】
再折り畳み胎盤ビクニン（７−６４）のｐＩは、胎盤ビクニン（１０２−１５９）のｐＩを測定するために使用された方法を用いて測定された。再折り畳み胎盤ビクニン（７−６４）は、検出値（ｐＩ＝７．９）よりわずかに高い８．８５のｐＩを示した。
【０１４８】
実施例３
機能的胎盤ビクニン断片（１０２−１５９）のインビトロ特異性
プロテアーゼ。ウシトリプシン、ヒトプラスミンおよびウシ膵臓カリクレイン定量を、既に記載したように（Ｃｈａｓｅ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｓｈａｗ，Ｅ．，（１９７０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９，２０−２７）、Ｐ−ニトロフェニルｐ’−グアニジノベンゾエートＨＣｌを用いて活性部位滴定によって行った。ヒトカリクレインを、標準としてウシアプロチニン、および１：１複合体形成を呈する基質としてＰＦＲ−ＡＭＣを使用して活性部位滴定によって定量した。それぞれの酵素に関して使用した条件下でのトリプシンおよびプラスミンでのＧＰＫ−ＡＭＣに対するＫｍはそれぞれ２９μＭおよび７２６μＭであり、ヒト血漿カリクレインおよびウシ脾臓カリクレインでのＰＦＲ−ＡＭＣに対するＫｍはそれぞれ４５７μＭおよび８１．５μＭであり、エラスターゼによるＡＡＰＲ−ＡＭＣに対するＫｍは１６００μＭであった。ヒト組織カリクレイン（Ｂａｙｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）定量を、既に記載したように（Ｃｈａｓｅ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｓｈａｗ，Ｅ．，（１９７０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９，２０−２７）、ｐ’ニトロフェニル  ｐ’−グアニジノベンゾエートＨＣｌを用いて活性部位滴定によって行った。
【０１４９】
阻害速度論。（実施例１で記載した）胎盤ビクニン（１０２−１５９）またはアプロチニンによるトリプシンの阻害を、総容量１．０ｍｌでの緩衝液Ａ中の胎盤ビクニン（１０２−１５９）（０−２ｎＭ）またはアプロチニン（０−３ｎＭ）との５０ｐＭトリプシンのインキュベーションで測定した。３７℃にて５分後、１５μｌの２ｍＭ  ＧＰＫ−ＡＭＣを添加し、（上記のような）蛍光の変化をモニターした。胎盤ビクニン（１０２−１５９）およびアプロチニンによるヒトプラスミンの阻害を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む緩衝液中のプラスミン（５０ｐＭ）と胎盤ビクニン（１０２−１５９）（０−１０ｎＭ）またはアプロチニン（０−４ｎＭ）で測定した。３７℃でのインキュベーションの５分後、２５μｌの２０ｍＭ  ＧＰＫ−ＡＭＣを添加し、蛍光の変化をモニターした。胎盤ビクニン（１０２−１５９）またはアプロチニンによるヒト血漿カリクレインの阻害を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中のカリクレイン（２．５ｎＭ）および胎盤ビクニン（１０２−１５９）（０−３ｎＭ）またはアプロチニン（０−４５ｎＭ）を用いて測定した。３７℃で５分後、１５μｌの２０ｍＭ  ＰＦＲ−ＡＭＣを添加し、蛍光の変化をモニターした。胎盤ビクニン（１０２−１５９）およびアプロチニンによるウシ脾臓カリクレインの阻害を、カリクレイン（９２ｐＭ）、胎盤ビクニン（１０２−１５９）（０−１．６ｎＭ）およびアプロチニン（０−１４ｐＭ）および１００μＭの最終基質濃度で、同様の様式で測定した。みかけの阻害定数Ｋｉ＊を、非線形回帰データ解析プログラムＥｎｚｆｉｔｔｅｒソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて決定した。それぞれの実験からの速度論データを、強い結合阻害剤に関する方程式によって解析した。
【０１５０】
（数２）
Ｖｉ／Ｖ０＝１−（Ｅ０＋Ｉ０＋Ｋｉ＊−［（Ｅ０＋Ｉ０＋Ｋｉ＊）２−４Ｅ０Ｉ０］１／２）／２Ｅ０                  （２）
式中Ｖｉ／Ｖ０は分数酵素活性（阻害対非阻害比）であり、Ｅ０およびＩ０はそれぞれ酵素および阻害剤の総濃度であり、Ｋｉ値は方程式
（数３）
Ｋｉ＝Ｋｉ＊／（１＋［Ｓ０］／Ｋｍ）    （３）
による基質の効果に関する補正によって得た。（Ｂｏｕｄｉｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｂｉｅｔｈ，Ｊ．Ｇ．，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．９９５：３６−４１）。
【０１５１】
胎盤ビクニン（１０２−１５９）およびアプロチニンによるヒト好中球エラスターゼの阻害に関して、エラスターゼ（１９ｎＭ）を、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および０．０５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む緩衝液中の胎盤ビクニン（１０２−１５９）（１５０ｎＭ）またはアプロチニン（０−７．５μＭ）と共にインキュベートした。３７℃での５分後、ＡＡＰＭ−ＡＭＣ（５００μＭまたは１０００μＭ）を添加し、２分間にわたって蛍光を測定した。
【０１５２】
Ｋｉ値を２つの異なる基質濃度で行った形式１／Ｖ対［Ｉ］のＤｉｘｏｎプロットより決定した（Ｄｉｘｏｎら，１９７９）。
【０１５３】
アプロチニン、胎盤ビクニン断片（７−６４）または胎盤ビクニン断片（１０２−１５９）によるヒト組織カリクレインの阻害を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ９．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１ｍｌの反応容量中で、胎盤ビクニン（７−６４）（０−４０ｎＭ）または胎盤ビクニン（１０２−１５９）（０−２．５ｎＭ）、またはアプロチニン（０−０．５ｎＭ）とともに０．３５ｎＭのヒト組織カリクレインをインキュベーションすることで測定した。３７℃にて５分後、５μｌの２ｍＭ  ＰＦＲ−ＡＭＣを最終濃度１０ｕＭになるように添加し、蛍光の変化をモニターした。使用した条件下でのヒト組織カリクレインでのＰＦＲ−ＡＭＣに対するＫｍは５．７ｕＭであった。合成胎盤ビクニン（１０２−１５９）、組換え体胎盤ビクニンおよびアプロチニンによるヒト第Ｘａ因子（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｎｏｓｔｉｃａ，Ｉｎｃ，Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）の阻害を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１％ＢＳＡを含む緩衝液中で、阻害剤の量を増加させて、０．８７ｎＭのヒト第Ｘａ因子をインキュベートすることで測定した。３７℃での５分後、３０ｕｌの２０ｍＭ  ＬＧＲ−ＡＭＣ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、蛍光の変化をモニターした。クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）阻害剤によるヒトウロキナーゼ（Ｓｉｇｍａ）の阻害を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む、総量量１ｍｌの緩衝液中でのウロキナーゼ（２．７ｎｇ）の阻害剤とのインキュベーションによって測定した。３７℃での５分後、３５μｌの２０ｍＭのＧＧＲ−ＡＭＣ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、蛍光の変化をモニターした。第ＸＩａ因子（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｓｏｕｔｈｂｅｎｄ，ＩＮから）の阻害を、ＦＸＩａ（０．１ｎＭ）を、総容量１ｍｌ中での５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１％ＢＳＡを含む緩衝液中で、０−８００ｎＭ胎盤ビクニン（７−６４）、０−１４０ｎＭ胎盤ビクニン（１０２−１５９）または０−４０ｕＭアプロチニンいずれかと共にインキュベートすることで測定した。３７℃での５分後、１０ｕｌの４０ｍＭ  Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）を添加し、蛍光の変化をモニターした。
【０１５４】
結果：胎盤ビクニン（１０２−１５９）およびアプロチニンの阻害特性の直接比較を、同一の条件下での様々なプロテアーゼによるそれらの阻害定数の測定によって行った。Ｋｉ値を以下表３に挙げる。
【表４】
2006232810.tif 000041
【０１５５】
胎盤ビクニン（１０２−１５９）およびアプロチニンは、実施した条件下で比較可能な程度までウシトリプシンおよびヒトプラスミンを阻害した。アプロチニンは、８．５μＭのＫｉでエラスターゼを阻害した。胎盤ビクニン（１０２−１５９）は３２３ｎＭのＫｉでエラスターゼを阻害した。ウシ膵臓カリクレインの胎盤ビクニン（１０２−１５９）阻害に対するＫｉ値はアプロチニン阻害のものよりも２０倍高かった。一方で胎盤ビクニン（１０２−１５９）はアプロチニンよりもより強力なヒト血漿カリクレインの阻害剤であり、５６倍高い親和性で結合する。
【０１５６】
胎盤ビクニン（１０２−１５９）は、カリクレインの阻害剤としてＴｒａｓｙｌｏｌ（商標）よりも５０倍強力であるので、ＫＩＵにおいて阻害剤の効果的患者用量を保持するためには、ヒト胎盤ビクニンまたはその断片（すなわち、胎盤ビクニン（１０２−１５９））の必要な量は、Ｔｒａｙｌｏｌ（商標）よりもより少量である。このことは、薬物の用量あたりの経費を削減し、患者への薬物への再暴露における腎毒性副作用の可能性を減少させる。さらに、このタンパク質はヒト由来であり、したがって、ウシ由来のアプロチニンよりもヒトにおいて免疫源が少ない。このことは結果として、患者への薬の再暴露における免疫学的副作用を招くリスクを減少させることになる。
【０１５７】
実施例４
機能的胎盤ビクニン断片（７−６４）のインビトロ特異性
実施例２で記載した機能的ヒト胎盤ビクニン（７−６４）のインビトロ特異性を、以上の実施例で記載したような物質および方法を用いて決定した。
【０１５８】
結果：以下の表は、インビトロでの様々なセリンプロテアーゼの阻害剤としての胎盤ビクニン（７−６４）の効力を示している。データは、胎盤ビクニン（１０２−１５９）またはアプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ（商標））どちらかを使用した阻害のスクリーニングのために得たデータに対して比較して示している。
【表５】
2006232810.tif 000042
【０１５９】
結果は、胎盤ビクニン（７−６４）をコードしているアミノ酸配列は、少なくとも４つのトリプシン様セリンプロテアーゼに対して効果的である活性セリンプロテアーゼ阻害剤を得るために再折り畳みできることを示している。
【０１６０】
以下の表４Ｂはまた、インビトロでの様々なセリンプロテアーゼの阻害剤としての再折り畳み胎盤ビクニン（７−６４）の効力を示している。再折り畳みした胎盤ビクニン（７−６４）は、精製および再折り畳みの前に完全に脱保護されることが確かなタンパク質から調製した。データは、胎盤ビクニン（１０２−１５９）またはアプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ（商標））のいずれかを用いた阻害のスクリーニングのために得たデータに対する比較を示している。
【表６】
2006232810.tif 000043
【０１６１】
驚くべきことに、胎盤ビクニン（７−６４）は、ヒト血漿カリクレインを阻害することにおいてアプロチニンよりも強力であり、プラスミン阻害剤としての効力は少なくとも同様である。これらのデータは、胎盤ビクニン（７−６４）は、インビトロアッセイで使用する、アプロチニンと同程度の効果であり、インビボではよりよいか、または同様の効力が予想されたことを示している。
【０１６２】
実施例５
酵母での胎盤ビクニン変異体（１０２−１５９）の発現
胎盤ビクニン１０２−１５９（配列番号：６）をコードしているＤＮＡを、合成オリゴヌクレオチドを用いて作製した。最終ＤＮＡ産物は、インフレーム終止コドンが続く、インフレームで胎盤ビクニン（１０２−１５９）をコードしているｃＤＮＡ配列に融合した酵母α−交配因子プロペプチドからの１５ヌクレオチドの（５’から３’）からなる。酵母発現ベクターｐＳ６０４内へのクローニングに際し、ｃＤＮＡは、胎盤ビクニン（１０２−１５９）の５８アミノ酸配列に融合したＮ−末端α−交配因子プロペプチドを含む融合タンパク質の発現を指向する。この融合タンパク質のα−交配因子とクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインの間でのＫＥＸ−２開裂部位での処理は、その天然のＮ−末端でのクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインを遊離させるように消化した。    
以下の配列であり、クローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む５’センスオリゴヌクレオチドを合成した。
【化４１】
2006232810.tif 000044
【０１６３】
（配列番号：４２）
以下の配列であり、クローニングのためのＢａｍＨＩ部位および終止コドン両方を含む３’アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。
【化４２】
2006232810.tif 000045
【０１６４】
（配列番号：４３）
オリゴヌクレオチドを１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０中に溶解し、１２ｕｇのそれぞれのオリゴを加えて混合し、０．２５Ｍ  ＮａＣｌを加えた。ハイブリッド形成するために、オリゴヌクレオチドを５分間沸騰させて変性させ、６５℃から室温まで２時間かけて冷却した。重複をＫｌｅｎｏｗ断片を用いて伸張させ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化した。得られた消化した二本鎖断片をｐＵＣ１９内にクローン化し、配列を確認した。正確な配列の断片を含むクローンをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化して、以下の＋鎖配列を持つ断片を含むビクニンを遊離させ、
【化４３】
2006232810.tif 000046
【０１６５】
（配列番号：４４）
次いでゲル精製し、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐＳ６０４内にライゲーションした。ライゲーション混合液をフェノール／クロロホルム内に抽出し、Ｓ−２００ミニスピンカラム上で精製した。ライゲーション産物を酵母株ＳＣ１０１およびＷＨＬ３４１内にトランスフォームし、ｕｒａ選別プレート上にプレートした。それぞれの株からの１２コロニーをｕｒａドロップアウトプレート上で再画線培養した。単一コロニーを２ｍｌのｕｒａＤＯ培地内に植え付け、３０℃にて一晩増殖させた。細胞を２分間、１４０００×ｇで沈殿させ、上清をその胎盤ビクニン（１０２−１５９）の含量に関して評価した。
【０１６６】
形質転換した酵母内での胎盤ビクニン（１０２−１５９）の発現の検出
まず、上清（アッセイあたり５０ｕｌ）を、実施例１で記載したようなアッセイ方法（１ｍｌアッセイ容量）を使用してトリプシンのインビトロ活性を阻害するその能力に関して評価した。未使用の培地のみの試料、およびアプロチニンの不活性変異体を発現している酵母クローンを陰性対照として使用した。天然のアプロチニンを発現している酵母クローンを陽性対照として使用し、比較を示した。
【０１６７】
胎盤ビクニン（１０２−１５９）発現の定量の第２の方法は、ウエスタンブロットを使用した組換え体ペプチドの蓄積をモニターするために、合成ペプチドに対するポリクローナル抗体（ｐＡｂｓ）を使用することで行った。これらの研究は、株ＷＨＬ３４１に由来する組換え体よりもより大きい阻害活性を産出したので、株ＳＣ１０１に由来した組み換え体でのみ行った。
【０１６８】
ｐＡｂを産出するために、２匹の６−８週齢ニュージーランドホワイト（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ）メスウサギ（Ｈａｚｅｌｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｄｅｎｖｅｒ，Ｐａ）を、フロイント完全アジュバント中の２５０ｕｇの精製した還元合成胎盤ビクニン（１０２−１５９）で第０日に免役し、続いて第１４，３５、５６および７７日に、フロイント不完全アジュバント中の１２５ｕｇの同様の抗原でブーストした。本研究で使用した抗血清は、確立された手順によって第３ブースト後に回収した。ポリクローナル抗体はプロテインＡ上で抗血清より精製した。
【０１６９】
酵母ＳＣ１０１の形質転換からのコロニー２．４および２．５（図８）およびアプロチニン対照を、３０℃にて５０ｍｌのｕｒａ  ＤＯ培地内で一晩培養した。細胞をペレット化し、上清をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ３（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）濃縮器を使用して１００倍濃縮した。それぞれの試料（３０μｌ）を、取扱手順を使用して１０−２０％トリシン緩衝ゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。二重ゲルを、銀染色キット（Ｉｎｔｅｒｇｒａｔｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎａｎｔｉｃｋ，ＭＡ）で染色するか、またはニトロセルロースに写し、合成ビクニン（１０２−１５９）を顕在化させる精製ポリクローナル抗体で染色した。アルカリホスファターゼ共役ヤギ抗ウサギ抗体を取り扱い指示にしたがって第２抗体として使用した（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。
【０１７０】
ＳＣ１０１の形質導入株からの胎盤ビクニン（１０２−１５９）の精製  ＳＣ１０１株２．４の１Ｌ培養液からの発酵液を遠心（４，０００ｇ×３０分間）にて回収し、次いで先に０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．０１％（ｖ／ｖ）ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したアンヒドロキモトリプシン−セファロース（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，ＣＡ）の１．０ｍｌカラムにのせた。カラムをＡ２８０ｎｍがゼロに下がるまで、１．０Ｍ  ＮａＣｌを含む同様の緩衝液で洗浄し、その上でカラムを０．１Ｍ  ギ酸ｐＨ２．５で溶出した。溶出した画分をため、先に０．１％ＴＦＡで平衡化したＣ１８カラム（Ｖｙｄａｃ、５ｕｍ、４．６×２５０ｍｍ）にのせ、０．１％  ＴＦＡ中の２０−８０％アセトニトリル５０分間直線勾配で溶出した。胎盤ビクニン（１０２−１５９）を含む画分をため、０．１％ＴＦＡ中の直線２２．５−５０％アセトニトリル勾配での溶出を用いてＣ１８で再クロマトグラムした。
【０１７１】
結果。図８は、ＳＣ１０１およびＷＨＬ３４１それぞれの株の形質導入に由来する１２のコロニーによって阻害されたパーセントトリプシン活性を示している。この結果は、トリプシン阻害剤胎盤ビクニン（１０２−１５９）で形質導入した酵母株ＳＣ１０１の１２のすべてのコロニーが、トリプシンを阻害する能力を示さない両方の陰性対照と比較して、統計学的量のトリプシン阻害活性を産出する能力を持っていたことを示している。したがってこの活性は、胎盤ビクニン変異体（１０２−１５９）形質導入細胞での特異的阻害剤の発現に関係する。酵母ＷＨＬ３４１試料が、最小のトリプシン阻害活性を含んだ。このことは、使用した条件下でのこの株で観察された低増殖に関連する可能性がある。
【０１７２】
図９は、酵母ＳＣ１０１上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン解析を示している。胎盤ビクニン（１０２−１５９）を発現している組換え体酵母２．４および２．５から、およびアプロチニンを発現している酵母からの上清の銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、およそ６ｋＤａのタンパク質バンドが得られ、これはそれぞれの組換え体クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）阻害剤領域に対して予想された大きさに相当する。ウエスタン解析は、株２．４および２．５によって発現した６ｋＤａバンドが、胎盤ビクニン（１０２−１５９）に結合するｐＡｂと反応したことを示した。アプロチニン対照での同様の６ｋＤａのバンドは、この抗体に反応はせず、このことは胎盤ビクニン変異体（１０２−１５９）に対する抗体の特異性を示唆している。胎盤ビクニンＣ−末端領域の最終調製品は、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、非常に純粋であった（図１０）。最終調製品での培養液由来トリプシン阻害活性の全回収は３１％であった。精製した阻害剤のＮ−末端配列は、４０％のタンパク質が正確に処理されて、正確な胎盤ビクニン（１０２−１５９）に対するＮ−末端を生成し、一方約６０％の物質は、酵母α−交配因子を含んでいたことを示唆した。精製した物質は、血漿カリクレインのインビトロ阻害に関して０．３５ｎＭの明らかなＫｉを示している活性セリンプロテアーゼ阻害剤を含んだ。
【０１７３】
結論として、発酵培地中のプロテアーゼ阻害剤活性および合成ビクニン（１０２−１５９）に免疫化学的に関連したタンパク質両方の蓄積と、形質転換した株の１つからの胎盤ビクニン（１０２−１５９）の単離により、本明細書で記載した組換え体酵母株での胎盤ビクニンの発現の証拠が得られ、このことは、胎盤ビクニン断片の産出に対する酵母の有用性をはじめて示している。
【０１７４】
さらなる構造物を、胎盤ビクニン１０２−１５９内に含まれるクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインの発現レベルを増加させ、正確なＮ−末端を持つタンパク質の産出を増加させるために調製した。本発明者らは、胎盤ビクニン１０２−１５９のＮ−末端残基（ＹＥＥＹ−−）が、酵素的に酵母ａ−因子プロ領域を取り除く酵母ＫＥＸ−２プロテアーゼによってほんのわずかしか認識される開裂部位を表している可能性があると仮定した。したがって、本発明者らは、ＫＥＸ−２開裂部位の周りのＰ’サブ部位を修正するために、胎盤ビクニン１０３−１５９（ＥＥＹ…のＮ−末端）、１０１−１５９（ＮＹＥＥＹ…のＮ−末端）および９８−１５９（ＤＭＦＮＹＥＥＹ…）の産出に対する酵母発現構造物を調製した。組換え体タンパク質発現のレベルを増加させることを試みるために、本発明者らはまた、以下で記載した構造物のいくつかを調製するときに、哺乳動物が好むコドンではなく、酵母が好むコドンを使用した。構造物は、本質的には胎盤ビクニン１０２−１５９（構造番号１として定義した）に関して以上で記載したように調製したが、以下の修正にしたがった。
【０１７５】
構造番号２  胎盤ビクニン１０３−１５９、酵母コドン使用５’センスオリゴヌクレオチド
【化４４】
2006232810.tif 000047
【０１７６】
（配列番号：５５）
および３’アンチセンスオリゴヌクレオチド
【化４５】
2006232810.tif 000048
【０１７７】
（配列番号：５６）
を、胎盤ビクニン１０２−１５９の発現のための発現構造物（上記構造番号１）の産出に関して記載したように処理した。
【０１７８】
構造番号３  胎盤ビクニン１０１−１５９、酵母コドン使用５’センスオリゴヌクレオチド
【化４６】
2006232810.tif 000049
【０１７９】
（配列番号：５７）
および構造物番号２のために使用したような３’アンチセンスオリゴヌクレオチドを、胎盤ビクニン１０２−１５９の発現のための発現構造物（上記構造番号１）の産出に関して記載したように処理した。
【０１８０】
構造物番号４  胎盤ビクニン９８−１５９、酵母コドン使用５’センスオリゴヌクレオチド
【化４７】
2006232810.tif 000050
【０１８１】
（配列番号：５８）
および構造物番号２のために使用したような３’アンチセンスオリゴヌクレオチドを、発現構造物（上記構造番号１）の産出に関して記載したように処理した。
【０１８２】
酵母株ＳＣ１０１（ＭＡＴα、ｕｒａ３−５２、ｓｕｃ２）に、以上のｃＤＮＡそれぞれを含むプラスミドを形質導入し、タンパク質を、ヒトコドン使用での胎盤ビクニン１０２−１５９の産出に関して以上で記載した方法を使用して発現させた。およそ２５０ｍｌのそれぞれの酵母培養液を回収し、遠心（１５分間×３０００ＲＰＭ）からの上清を、上記のようにカリクレイン−セファロースの１ｍｌカラムでの精製に別々にかけた。適用物のトリプシン阻害活性の相対量、再生した精製したタンパク質の量および精製したタンパク質のＮ−末端配列を決定し、表７にて以下に挙げる。
【表７】
2006232810.tif 000051
【０１８３】
結果は、Ｃ−末端クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインを含む異なる長さの胎盤ビクニン断片が、機能的な分泌したタンパク質を発現する能力において広い変動を示すことを示している。断片１０１−１５９および１０３−１５９を発現している構造物は精製前上清中に待った少しの、または小さな酵素活性を産出し、それぞれの精製した画分の０．０５ｍｌの部分のＮ−末端配列決定によっては、阻害剤の検出可能な量は産出されなかった。一方、胎盤ビクニン１０２−１５９および９８−１５９のどちらかの発現によって、精製前に明らかな量のプロテアーゼ活性が産出された。しかしながら、Ｎ−末端配列決定は、１０２−１５９の発現より回収した精製タンパク質は、ほとんど不正確に処理され、酵母α−交配因子プロ配列内の部位におけるプレタンパク質の大部分の処理と一致したＮ−末端を示していることが示された。しかしながら、胎盤ビクニン９８−１５９の発現から回収した精製タンパク質は、全体として正しい部位で処理され、正しいＮ−末端を産出した。さらに、胎盤ビクニン１０２−１５９の回収と比較してほぼ２倍のタンパク質が回収された。したがって胎盤ビクニン９８−１５９は、Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅのα−交配因子プレ−プロ配列／ＫＥＸ−２処理系による胎盤ビクニンのＣ−末端クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインの産出に関する好ましい断片長を表している。
【０１８４】
実施例６
酵母発現の他の手順
Ｒ７４５９３翻訳産物由来の５８アミノ酸ペプチドをまた、ＤＮＡ配列決定の後にＴＡ  ｖｅｃｔｏｒ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内にクローン化したＲ８７８９４−Ｒ７４５９３  ＰＣＲ産物から、またはヒト胎盤ｃＤＮＡからどちらかよりＰＣＲ増幅することができる。増幅したＤＮＡ産物は、インフレームで翻訳産物を作製しするようにＹＥＥＹ−−ＣＦＲＱ（５８残基）についてコードしているＲ７４５９３配列に相当した酵母α−交配因子リーダー配列からの１９ヌクレオチドからなる可能性があり、α−交配因子／クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメイン融合タンパク質を構築している。タンパク質配列はまた、その天然のＮ−末端においてクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインを遊離させる可能性のあるｋｅｘ２開裂も含む。
【０１８５】
クローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩを含む５’センスオリゴヌクレオチドは以下の配列を含む可能性がある。
【化４８】
2006232810.tif 000052
【０１８６】
（配列番号：３０）
３’アンチセンスオリゴヌクレオチドはクローニングのためのＢａｍＨＩおよび終止コドンを含み、以下の配列である。
【化４９】
2006232810.tif 000053
【０１８７】
（配列番号：３１）
酵母発現ベクター内にクローン化すべき全２０６ヌクレオチドｃＤＮＡ配列は以下の配列である。
【化５０】
2006232810.tif 000054
【０１８８】
（配列番号：３２）
ＰＣＲ増幅の後、このＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで消化し、これもまたＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化した酵母発現ベクターｐＭＴ１５（参照して全体に組み込まれた、米国特許第５，１６４，４８２号を参照）内にクローン化した。得られたプラスミドベクターを、米国特許第５，１６４，４８２号で記載した方法を用いて酵母株ＳＣ１０６に形質導入するのに使用した。ＵＲＡ３＋酵母形質導入体を単離し、誘導条件下で培養した。組換え体胎盤ビクニン変異体の産出を、上述したインビトロアッセイ方法を用いて時間を追って培養液上清で蓄積したトリプシン阻害活性の量にしたがって測定した。発酵液を９０００ｒｐｍにて３０分間遠心した。次いで上清を０．４、次いで０．２μｍフィルタを通して濾過し、７．５ｍｓの伝導率まで希釈し、クエン酸にてｐＨ３にあわせた。次いで試料を５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３中のＳ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅファーストフロー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）２００ｍｌ上にバッチ吸収させ、６０分間攪拌した。続いてゲルをそれぞれ２Ｌの、５０ｍＭクエン酸ナトリウム  ｐＨ３．０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ６．０で連続的に洗浄した。洗浄したゲルを好適なカラムに移し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ６．０中の０−１Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配で溶出した。次いでインビトロでトリプシン阻害活性を持っている溶出した画分をため、さらに、ａ）（基本的に実施例２で記載したような）固定化したアンヒドロトリプシンのカラム上でのクロマトグラフィ、ｂ）固定化したウシカリクレインのカラム上でのクロマトグラフィ、またはｃ）ゲル濾過および／または陰イオン交換クロマトグラフィを含む従来のカラムクロマトグラフ工程の組合せのいずれかによって精製した。
【０１８９】
実施例７
胎盤からの天然のヒト胎盤ビクニンの単離と特性化
ビクニンタンパク質を、全凍結胎盤（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）からの明白な均質性を得るまで精製した。胎盤（７４０ｍｇ）を室温まで解凍し、０．５−１．０ｃｍ断片に切断し、氷上におき、６００ｍｌのＰＢＳ緩衝液で洗浄した。
【０１９０】
洗浄物をデカントし、２４０ｍｌの胎盤断片をＷａｒｉｎｇブレンダーに入れた。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む３００ｍｌの緩衝液を添加した後に、混合液を高速度で２分間混和し、７５０．０ｍｌの遠心チューブ内にデカントし、氷上に置いた。この手順をすべての物質を処理するまで繰り返した。スラリーを混合し、４５００×ｇにて６０分間、４℃にて遠心した。上清を、チーズ状の布を通して濾過し、胎盤ビクニンを、取扱説明書にしたがって、７０ｍｇのウシ膵臓カリクレイン（Ｂａｙｅｒ  ＡＧ）を５．０ｍｌのＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に共有結合させて作製したカリクレイン親和性カラムを用いて精製した。物質を２．０ｍｌ／分の流速で親和性カラム上にのせ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ  ＮａＣｌで、洗浄液の２８０ｎｍでの吸光度がもはや検出されなくなるまで洗浄した。さらにカラムを０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄し、次いで３倍量の０．２Ｍ酢酸、ｐＨ４．０で溶出した。カリクレインおよびトリプシン阻害（以下参照）活性を含む画分をため、冷凍し、凍結乾燥した。さらに胎盤ビクニンを、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ  ＨＰＬＣ型に接続したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィによって精製した。簡便には、カラムを、流速０．５ｍｌ／分にて０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で平衡化した。凍結乾燥試料を１．０ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中で元に戻し、２００μｌ分液にてゲル濾過カラム上の注入した。画分を回収し（０．５ｍｌ）、トリプシンおよびカリクレイン阻害活性に関してアッセイした。活性画分をため、溶液のｐＨをＴＦＡの添加によって２．５に合わせた。この物質を、０．１％ＴＦＡ中の２０％アセトニトリル中で平衡化したＶｙｄａｃ  Ｃ１８  逆相カラム（５ミクロン、０．４６×２５ｃｍ）に直接のせた。分離を、０．１％ＴＦＡ中２０％のアセトニトリルでの初期２０分間洗浄の後に、５０分間かけて１．０ｍｌ／分にて０．１％ＴＦＡ中の２０−８０％アセトニトリルの直線勾配を用いて行った。画分（１ｍｌ）を回収し、トリプシンおよびカリクレイン阻害活性に関してアッセイした。阻害活性を含んでいる画分をｓｐｅｅｄ−ｖａｃ濃縮器（Ｓａｖａｎｔ）を用いて濃縮し、Ｎ−末端配列解析にかけた。
【０１９１】
胎盤ビクニンの機能的アッセイ
機能的胎盤ビクニンの同定を、ウシトリプシンおよびヒト血漿カリクレインを阻害するその能力を測定することで行った。トリプシン阻害活性は、基質としてＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−アミノメチルクマリンを使用して９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）にて、室温でアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中で行った。トリプシンによって産出されたクマリンの量を、プレートリーダーを備えたＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＬＳ−５０Ｂ蛍光計にて蛍光（ｅｘ＝３７０ｎｍ、ｅｍ＝４３２ｎｍ）を測定することで決定した。トリプシン（１００μｌ緩衝液中２３μｇ）を２０μｌの試験すべき試料と混合し、２５℃にて１０分間インキュベートした。反応をアッセイ緩衝液中の５０μｌの基質ＧＰＫ−ＡＭＣ（最終濃度３３μＭ）の添加で開始した。蛍光強度を測定し、それぞれの画分の％阻害を
（数４）
％阻害＝１００×［１−Ｆ０／Ｆ１］
により決定した。式中Ｆ０は未知の蛍光であり、Ｆ１はトリプシンのみの対照の蛍光である。この画分のカリクレイン阻害活性を、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中の７．０ｎＭ  カリクレインおよび基質としての６６．０μＭ  Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣを使用して同様に測定した。
【０１９２】
胎盤ビクニンのインビトロ特異性の決定
天然のヒト胎盤ビクニンのインビトロ特異性を、以上の実施例での処理で記載したような物質および方法を用いて決定した。胎盤ビクニンを、基質としてＧＰＫ−ＡＭＣを用いて既知濃度のトリプシンに対する活性部位滴定によって定量し非結合トリプシンの画分をモニターした。
【０１９３】
タンパク質配列決定
１ｍｌ画分（Ｃ１８−２９  Ｄｅｌａｒｉａ）を容量にして３００ｍｌまで、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ上で濃縮し、有機溶媒の量を減らした。次いで試料をＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ小型二相反応カラム上にのせ、１ｍｌの２％トリフルオロ酢酸で洗浄した。試料をＥｄｍａｎ分解を用いて、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  Ｍｏｄｅｌ  Ｇ１００５Ａタンパク質配列決定系上で配列決定した。
【０１９４】
バージョン３．０配列決定法およびすべての試薬は、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄより供給された。配列は５０サイクルで確認した。
【０１９５】
結果。胎盤ビクニンを連続的なカリクレイン親和性、ゲル濾過および逆相カラムクロマトグラフィによって明白な均質性を得るまで精製した（以下の精製表を参照）。
【表８】
2006232810.tif 000055
【０１９６】
大部分のカリクレインおよびトリプシン阻害活性は、ｐＨ４．０溶出でのカリクレイン親和性カラムより溶出した。続くゲル濾過クロマトグラフィ（図５）により、同一の条件下での分子量標準を流したことで得られた標準曲線によって判断したところ、分子量１０−４０ｋＤａの範囲でカリクレインおよびトリプシン阻害活性のピークが得られた。逆相Ｃ１８クロマトグラフィ（図６）によって、およそ３０％のアセトニトリルの時点での最も強力な溶出で、阻害活性の４ピークが得られた。Ｃ１８から溶出した第１ピーク（画分２９）に関連した活性は、胎盤ビクニン（ＡＤＲＥＲ…；配列番号：１）の予想されるアミノ酸配列のアミノ酸１より始まるアミノ酸配列を表しており、５０サイクルの配列決定に対して予想された配列と同一であった（図３の下線アミノ酸）。この配列長内のシステイン残基は、酸化したタンパク質の配列決定に関して予想されたようにサイレントであった。成熟胎盤ビクニンのアミノ酸位置１１および２０でのシステイン残基は、そこでＰＴＨ−ピリジルエチル−システインがサイクル１１および２０で回収されたＳ−ピリジルエチル化タンパク質の配列決定より後に同定された。
【０１９７】
興味深いことに、配列のアミノ酸残基番号３０でのアスパラギン（図３）はサイレントであり、この部位が糖付加される可能性があることを示している。画分２９は、残基番号１の時点で開始している（サイクル１で２７ｐｍｏｌ）胎盤ビクニンに相当する１つの主要配列＋残基６で開始している胎盤ビクニン（ＳＩＨＤ…）より由来した副次的な配列を産出した。このことは、画分２９内で配列決定した最終調製品はとても純粋であり、この画分に関連するプロテアーゼ阻害活性に最も感受性であり得ることを示している（図６）。
【０１９８】
したがって、Ｃ１８クロマトグラフィからの胎盤ビクニンの最終調製品は、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に基づいてとても純粋であり（図７）、そこでタンパク質は、以下の分子量マーカ、インスリン（２．９ｋＤａ）、ウシトリプシン阻害剤（５．８ｋＤａ）、リソザイム（１４．７ｋＤａ）、β−ラクトグロブリン（１８．４ｋＤａ）、炭酸アンヒドラーゼ（２９ｋＤａ）、オバルブミン（４３ｋＤａ）によって目盛りを定めた１０−２０％アクリルアミドトリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上で２４ｋＤａの明らかなＭｒで移動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の胎盤ビクニンの上記の大きさは、全長コード配列から予想されるものと一致した（図４Ｆ）。
【０１９９】
上述したＮ−末端配列決定結果に基づいて予想すると、精製したタンパク質は、胎盤ビクニン（７−４６）に対する抗体と反応し、銀染色にてゲル上で検出された（図７）精製した調製品で観察されたのと同一のＭｒのバンドを産出した（図１２Ａ）。しかしながら、同様の調製品を、合成胎盤ビクニン（１０２−１５９）に対する抗体と反応させた場合、全長タンパク質に相当するバンドは観察されなかった。むしろ、およそ６ｋＤａの合成ビクニン（１０２−１５９）と共に移動した断片が観察された。これらの結果の最も単純な解釈は、精製した調製品が、精製の後に分解を起こし、Ｎ−末端領域を含むＮ−末端断片とＣ−末端領域を含むＣ−末端断片を産出したと考えることである。胎盤ビクニン（７−６４）への抗血清に対する断片応答性は、全長タンパク質のＣ−末端を欠いていると仮定すると、大きさ（２４ｋＤａ）は高段階の糖付加を示唆している。
【０２００】
以下の表６は、胎盤ビクニンによる様々なセリンプロテアーゼのインビトロ阻害の効力を示している。データはアプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ（商標））で得たものと比較した。
【表９】
2006232810.tif 000056
【０２０１】
結果は、天然の供給源（ヒト胎盤）から単離した胎盤ビクニンがトリプシン−類似セリンプロテアーゼの強力な阻害剤であることを示している。
【０２０２】
実施例８
異なるヒト器官および組織間での胎盤ビクニンの発現パターン
ヒト心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓からの２μｇのｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを含む多数の組織のノザンを Ｃｌｏｎｔｅｃｈより購入した。
【０２０３】
２つの異なるｃＤＮＡプローブを使用した。１）胎盤ビクニン（１０２−１５９）をコードしているゲル精製したｃＤＮＡ、２）ＥｃｏＲＩで消化し、ゲル精製したＴＡクローンより遊離させた７８０塩基対ＰＣＲ−由来ｃＤＮＡ（図４Ｅ）である。それぞれのプローブをＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａ）からの３２Ｐ−ｄＣＴＰおよびランダムプライミング標識化キットを用いて標識化し、次いで取扱説明書にしたがって多数の組織に対してハイブリッド形成するのに使用した。オートラジオグラフィを１８時間の露光時間でＢｉｏｍａｘフィルムを用いて作製し、Ｕｍａｘ  Ｓｃａｎｎｅｒを用いて感光し、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いてスキャンした。
【０２０４】
結果。胎盤ビクニン（１０２−１５９）プローブ（図１１Ａ）または胎盤ビクニンの両方のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインを含むより大きなプローブ（図１１Ｂ）を用いて観察した組織発現のパターンは、予想したものと本質的に同一であった。胎盤ビクニンｍＲＮＡは、膵臓および胎盤で最も豊富であった。有意なレベルが肺、脳および腎臓でも観察されたが、心臓および肝臓では低いレベルであり、骨格筋ではｍＲＮＡは検出されなかった。転写物の大きさは、すべての場合で１．９５キロ塩基であり、ＥＳＴオーバーレイおよび以上の項で記載した全長ｃＤＮＡクローニング両方から予想した胎盤ビクニンの予想サイズと一致した。
【０２０５】
ｍＲＮＡの広い組織分布は、胎盤ビクニンが幅広く発現していることを示している。タンパク質がまた、リーダー配列を含んでいるので、ヒト免疫系へ広く暴露されている可能性があり、それが単独のタンパク質として認識されるようになることが必要である。胎盤ビクニンｍＲＮＡの広い組織分布に関するさらなる証拠が、胎盤ビクニンに対する相同性で登録したいくつかのＥＳＴ（図４Ｂ）が、ヒト成人および幼児脳、ヒト網膜、乳、子宮、嗅覚上皮および胎盤から由来したという事実より得られる。したがって、天然のヒトタンパク質のヒト患者への投与が、免疫応答を誘発する可能性はないと結論づけた。
【０２０６】
興味深いことに、胎盤ビクニンの発現パターンは、ウシ肺および膵臓で高いレベルで見られるウシアプロチニンに関するものを思い起こさせるものである。胎盤ビクニンの発現パターンをさらにはっきりさせるために、以下のヒト細胞からのトータルＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを行った。未刺激ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）、ＨＫ−２（腎臓近位細管由来の株）、ＴＦ−１（赤白血病株）およびホルボールエステル（ＰＭＡ）−刺激ヒト末梢血白血球である。使用したプローブ、
【化５１】
2006232810.tif 000057
【０２０７】
（センス；配列番号：５９）
【化５２】
2006232810.tif 000058
【０２０８】
（アンチセンス；配列番号：６０）
は、ｃＤＮＡ断片をコードしている６００ｂｐ胎盤ビクニンを増幅するために設計した。比較対照を、８００ｂｐアクチン断片を増幅するのにアクチンプライマーを加えることによって標準化した。エチジウムブロマイドによってアガロースゲル上で同定された８００ｂｐの断片がすべてのレーンで同等の強度であった一方で、６００ｂｐの胎盤ビクニン断片はＨＵＶＥＣｓには存在せず、しかし他の細胞株それぞれには有意な量存在した。本発明者らは、胎盤亜ビクニンは少なくともいくつかの内皮細胞には発現していないが、いくつかの白血球集団には発現していると結論づけた。
【０２０９】
実施例９
バキュロウイルス／Ｓｆ９発現系よりよく精製された胎盤ビクニン（１−１７０）の精製および特性  両方のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインを含んでいる胎盤ビクニン（ビクニン（１−１７０））（配列番号：５２）の大きな断片を以下のようにＳｆ９に発現させた。ＰＣＲ（図４Ｅ）より得、ＴＡベクター内に含まれる（以上の実施例を参照）胎盤ビクニンｃＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩでの消化によって遊離させ、５’ＸｂａＩ部位および３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位によって隣接した断片を産出した。この断片をゲル精製し、次いでＭ１３ｍｐ１９ベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）内にクローン化した。インビトロ変異導入（Ｋｕｎｋｅｌ  Ｔ．Ａ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８−４９２）を使用して、５‘末端でのＸｂａＩ部位に対してＰｓｔＩ３’部位を作製し、一方でＡＴＧ開始部位をコードしている配列、天然の胎盤ビクニンシグナルペプチドおよび成熟胎盤ビクニンコード配列に対して５‘を作製した。変異導入のために使用したオリゴヌクレオチドは配列
【化５３】
2006232810.tif 000059
【０２１０】
（配列番号：６１）
を持った。終止コドン（ＴＡＧ）およびＢｇｌＩＩ／ＸｍａＩ部位を同様にオリゴヌクレオチド：
【化５４】
2006232810.tif 000060
【０２１１】
（配列番号：６２）
を使用してｃＤＮＡの３’末端に作製した。終止コドンは胎盤ンビクニンをコードしている配列とインフレームであり、アミノ酸残基１７０のリシンの直後で終了となり、したがって短くした胎盤ビクニン断片をコードすることは、推定される膜貫通領域が欠けている。ＰｓｔＩおよびＢｇｌＩＩによる消化からの産物を単離し、両方のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインを含むが、予想される膜貫通区画に対するＮ末端後で短くなっている胎盤ビクニン断片（１−１７０）の発現のためにＢａｃＰａｃ８ベクター内にクローン化した。
【０２１２】
Ｓｆ９昆虫細胞によるビクニンの発現は、培地を感染後７２時間回収した場合、１対１の感染の多重感染において最適であった。回収後、バキュロウイルス細胞培養上清（２Ｌ）をＴｒｉｓ−ＨＣｌの添加によってｐＨ８．０に合わせた。
【０２１３】
ビクニンを、胎盤からの天然の胎盤ビクニンの精製に関して実施例７で既に記載したように、５ｍｌのウシ膵臓カリクレイン親和性カラムを使用したカラムクロマトグラフィによって精製した。溶出した物質をＴＦＡによってｐＨ２．５にあわせ、１ｍｌ／分の流速にて、０．１％ＴＦＡ中の１０％アセトニトリルで平衡化したＣ１８逆相カラム（１．０×２５ｃｍ）上のカラムクロマトグラフィにかけた。ビクニンを４０分間かけて、０．１％ＴＦＡ中の１０−８０％アセトニトリルの直線勾配で溶出した。活性画分をため、凍結乾燥し、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に再懸濁させ、必要になるまで−２０℃にて保存した。組換え体ビクニンの濃度をアミノ酸解析により決定した。
【０２１４】
結果。組換え体ビクニンを、以下に示したような２段階精製プロトコルを用いてバキュロウイルス細胞培養上清より精製し、活性トリプシン阻害剤を得た（以下の表８）。
【表１０】
2006232810.tif 000061
【０２１５】
固定化ウシ膵臓カリクレイン親和性カラム上での未精製物質のカラムクロマトグラフィは、０．０１３％のタンパク質および０．６７％の存在しているトリプシン阻害剤活性を選択的に単離した。開始上清に存在したトリプシン阻害活性の大部分は、固定化したカリクレインに結合せず、ビクニンと関連しなかった（結果は示さず）。続くＣ１８逆相を使用したクロマトグラフィにより、５倍のさらなる精製が行われ、収率は０．２％であった。最終調製品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって非常に純粋であり（図１３）、２１．３ｋＤａのＭｒを示しており、ウサギ抗胎盤ビクニン１０２−１５９への免疫ブロットで反応した（示していない）。Ｎ−末端配列決定（２６サイクル）により、残基＋１より始まる（ＡＤＲＥＲ…）成熟胎盤ビクニン（図４Ｆ）に関する予想された配列が得られ、これはシグナルペプチドがＳｆ９細胞内で正確に処理されていたことを示している。
【０２１６】
Ｓｆ９細胞からの精製した胎盤ビクニン（１００ｐｍｏｌ）をピリジルエチル−アルキル化し、ＣＮＢｒ消化し、次いで得られた断片の分解なしに配列決定した。２０サイクルの配列決定によって以下のＮ−末端が得られた。
【化５５】
2006232810.tif 000062
【０２１７】
このようにして、予想された４つの断片のそれぞれに相当しているＮ−末端を回収した。これは、Ｓｆ９発現タンパク質は、胎盤ビクニン（１−１７０）の全エクトドメイン配列を含むことを確かにした。
【０２１８】
実施例１０
Ｓｆ９細胞由来の精製した胎盤ビクニン（１−１７０）の阻害特異性
組換え体ビクニンのインビトロ特異性を、実施例３、４および７で記載したような物質および方法で決定した。さらに、ヒト組織カリクレインのビクニンによる阻害を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０１％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む緩衝液中で０．３５ｎＭのヒト組織カリクレイン組換え体ビクニンをインキュベートすることで測定した。３７℃にて５分後、５μｌの２ｍＭ  ＰＥＲ−ＡＭＣを添加し、蛍光の変化をモニターした。
【０２１９】
組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）の阻害もまた以下のように測定した。ｔＰＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯからの、ヒトメラノーマ細胞培養液からの単鎖形態）を阻害剤と共に、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．２中で室温にて２時間、前インキュベートした。反応を続けて以下の初期成分濃度を含む反応系に移して開始した。０．００４％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．００５％（ｖ／ｖ）アジ化ナトリウムを含む２８ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５中、ｔＰＡ（７．５ｎＭ）、阻害剤０−６．６μＭ、ＤＩｌｅ−Ｌｐｒｏ−Ｌａｒｇ−ｐニトロアニリン（１ｍＭ）。ｐ−ニトロアニリンの形成を、３７℃での２時間のインキュベーションの後にＡ４０５ｎｍを測定して決定した。
【０２２０】
以下の表は、インビトロでの様々なセリンプロテアーゼの阻害剤としての組換え体ビクニンの効力を示している。データは、組換え体ビクニンまたはアプロチニンどちらかを使用した阻害のスクリーニングに関して得たデータと比較して示した。
【表１１】
2006232810.tif 000063
【０２２１】
この結果は、組換え体ビクニンが、少なくとも５つの異なるセリンプロテアーゼ阻害剤として効果的な活性プロテアーゼ阻害剤を産出するために昆虫細胞に発現されることができることを示している。組換え体ビクニンは、ヒト血漿カリクレイン、トリプシンおよびプラスミンに対してアプロチニンよりも強力であった。驚くべきことに、組換え体ビクニンは、試験したすべての酵素に対して、合成的に誘導したビクニン断片（７−６４）および（１０２−１５９）より強力であった。これらのデータは、組換え体ビクニンが、インビトロアッセイで使用されているアプロチニンよりも効果的であり、インビボ効力がよりよいことが期待されることを示している。
【０２２２】
特定のプロテアーゼに対する効力の測定に加えて、活性化部分的トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を引き延ばす胎盤ビクニン（１−１７０）の能力を評価し、アプロチニンに関連した活性と比較した。阻害剤を１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含んでいる２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．２中に希釈し、ＭＬＡ  ＥｌｅｃｔｒａＲ８００  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅｒ凝固測定器（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｌｅａｓａｎｔｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．）内に含まれたキュベットに加えた（０．１ｍｌ）。この器具を、３００秒活性時間および二重モードでのＡＰＴＴモードにセットした。０．１ｍｌの血漿（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ａｓｓａｙｅｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｌａｓｍａロット１−６−５１８５，Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｅａｕｍｏｎｔ，ＴＸ）を添加した後に、ＡＰＴＴ試薬（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＡＰＴＴ−ロット１０２３４５、Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ  Ｃｏｒｐ．，Ｄｕｒｈａｎ，ＮＣより）および２５ｍＭ  ＣａＣｌ２を自動的に初期凝固に施し、凝固時間を自動的にモニターした。結果（図１４）は凝固時間を２倍にするにはおよそ２μＭの最終アプロチニンが必要であるが、Ｓｆ９誘導胎盤ビクニンは０．３μＭのみ必要であったことを示した。これらのデータは、胎盤ビクニンが効果的な抗凝固剤であり、凝固の内因性経路の病理学的活性化を含む疾患に対する薬剤として有用であることを示している。
【０２２３】
実施例１１
モルモットでの気管電位差の測定
本研究の目的は、処置後３時間のモルモット気管電位差におけるクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）セリンプロテアーゼ阻害剤ビクニン、およびナトリウムチャネルブロッカーアミロリドの効果を調査することであった。これらの薬剤は、局所滴下によって頭方向の気管内に伝送した。ＴＰＤを２時間後に６０分間モニターした。本実施例で使用した手順は、「Ｃｉｌｉａ，Ｍｕｃｕｓ  ａｎｄ  ＭｕｃｏｃｉｌｉａｒｙＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｅｄ．，Ｂａｕｍ，Ｇ．Ｌ．ら，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８；Ｎｅｗｔｏｎら，Ｐｅｄ．Ｐｕｌｍ．Ｓ１７，Ａｂｓ．３６４，１９９８においてＮｅｗｔｏｎらで記載されている。
【０２２４】
使用した物質および方法／薬剤
（以下の実施例１７で記載したような）ビクニン（１−１７０）（５および５０ｕｇ／ｍＬ（配列番号：５２））および（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡから入手した）アミロリド（１００ｕＭ）の水様処方を調製し、使用の前に無菌濾過してエンドトキシン試験を行った。これらの処方は、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）内で調製し、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２％  Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ７．１を含むように調製し、本実施例での使用のために無菌濾過し、エンドトキシン試験した。ＨＢＳＳを対照溶液として使用した。Ｈｙｐｎｏｒｍ（商標）（クエン酸フェンタニル０．３１５ｍｇ／ｍＬ）およびフルアニゾン１０ｍｇ／ｍＬ）はＪａｎｓｓｅｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈから入手し、Ｈｙｐｎｏｖｅｌ（商標）（ミダゾラム５ｍｇ／ｍＬ）はＲｏｃｈｅから入手した。オスＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（５５０−７５０ｇ）はＤａｖｉｄ  Ｈａｌｌ，ＵＫより供給された。サーミスタプローブはＫａｎｅ−Ｍａｙ  Ｌｔｄ，ＵＫより入手した。
【０２２５】
気管気道内への麻酔の導入とビクニンの投与動物をハロタンを使用して麻酔した。一旦麻酔が十分なレベル導入されたならば、小切開を下顎の下で行った。気管をさらし、１００ｕｌ容量のビヒクル、ビクニン（０．５ｕｇまたは５ｕｇ）またはアミロリド（１００ｕＭ）をニードルおよびシリンジを用いて気管表面上に一滴ずつ垂らした。一旦注入したならば、皮膚切開をＶｅｔｂｏｎｄ（商標）（シアノカクリレート組織接着剤）を用いて閉じた。次いで動物を回復させた。
【０２２６】
気管電位差の測定のためのモルモットの調製
薬剤処理の２時間後、モルモットをＨｙｐｎｏｒｍ（商標）およびＨｙｐｎｏｖｅｌ（商標）で２回目の麻酔をし、仰向けの状態で固定化した。直腸温度を、サーミスタプローブで測定し、熱ランプの手動調節によって３７℃に保った。腹部中線切開を、下顎から鎖骨までで行った。鈍解剖具を用いて、気管の全長を曝露し、カニューレを挿入した。外部頸動脈をさらし、カニューレを挿入した。次いで尾側の気管にカニューレを挿入し、動物に部屋の空気で自発的に呼吸させた。次いで動物を仰向けに置き、その体温を熱ランプを用いて保った。筋肉内麻酔の導入後２０分、気管寒天電極を頭側の気管に挿入し、気管電位差を６０分間測定した。対照電極は、気管軟骨に結合させて頭側気管の下に配置した。傷部分を乾燥を防ぐために覆った。
【０２２７】
結果
図１５に示したように、ビクニン（５ｕｇ）は、賦形剤に関する処理の３時間後、インビボで、モルモット気管の電位差を阻害した。アミロリド（１００ｕＭ）およびビクニン（０．５ｕｇ）の効果を比較として示した。
【０２２８】
実施例１２
モルモットでの気管粘液速度におけるビクニンの効果
本研究の目的は、処理の１．５時間後のモルモット気管粘液速度におけるクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ファミリーセリンプロテアーゼ阻害剤ビクニンの効果を調査することであった。この薬剤は、局所滴下によって頭側気管に伝送した。ＴＭＶを１．５時間後、６０分間モニターした。本実施例で使用した手順は、「Ｃｉｌａ，Ｍｕｃｕｓ  ａｎｄ  Ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｅｄ．，Ｂａｕｍ，Ｇ．Ｌ．ら，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８；Ｎｅｗｔｏｎら，Ｐｅｄ．Ｐｕｌｍ．Ｓ１７，Ａｂｓ．３６４，１９９８においてＮｅｗｔｏｎらで記載されている。    
使用した物質および方法／薬剤
（以下の実施例１７で記載したような）ビクニン（１−１７０）処方（５０ｕｇ／ｍＬ（配列番号：５２））を１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２％  Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ７．１を含むＨＢＢＳ中で調製した。この処方を本実施例での使用の前に無菌濾過し、エンドトキシン試験した。ＨＢＳＳを対照溶液として使用した。Ｈｙｐｎｏｒｍ（商標）（クエン酸フェンタニル０．３１５ｍｇ／ｍＬおよびフルアニゾン１０ｍｇ／ｍＬ）はＪａｎｓｓｅｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈから入手し、Ｈｙｐｎｏｖｅｌ（商標）（ミダゾラム５ｍｇ／ｍＬ）はＲｏｃｈｅから入手した。オスＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（５５０−７５０ｇ）はＤａｖｉｄ  Ｈａｌｌ，ＵＫより供給された。サーミスタプローブはＫａｎｅ−Ｍａｙ  Ｌｔｄ，ＵＫより入手した。
【０２２９】
気管気道内への麻酔の導入とビクニンの投与
動物をハロタンを使用して麻酔した。一旦麻酔が十分なレベル導入されたならば、小切開を下顎の下で行った。気管をさらし、１００ｕｌ容量のビヒクルまたはビクニン（５ｕｇ）をニードルおよびシリンジを用いて気管表面上に一滴ずつ垂らした。一旦注入したならば、皮膚切開をＶｅｔｂｏｎｄ（商標）（シアノカクリレート組織接着剤）を用いて閉じた。次いで動物を回復させた。
【０２３０】
気道粘液速度（ＴＭＶ）の測定
ＴＭＶを、実際には麻酔したモルモットの気管粘膜繊毛層上に移動させ、３２Ｐ−標識化したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの注入部分から放射された放射活性を検出するように配置した小型ベータ粒子検出検出器プローブで平行にした導線を用いてモニターした（Ｎｅｗｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ１９９８）。図１６（ａ）は、シリンジおよびベータプローブの配置を図示している。図１６（ｂ）は、３２Ｐ−標識化Ｓ．セルビシエを気管粘膜繊毛層にそって移動させたときにプローブによって検出したカウントを示している。
【０２３１】
ビクニンの滴下後７０分に、それぞれの動物にＨｙｐｏｎｏｒｍ（商標）およびＨｙｐｏｎｏｖｅｌ（商標）で２回目の麻酔をし、仰向けの状態で固定した。
【０２３２】
最初のＴＭＶ測定を２０分後に行った。続く測定を１５分ごとに行った。ＴＭＶ測定の手順は、Ｎｅｗｔｏｎら、「Ｃｉｌｉａ，Ｍｕｃｕｓ  ａｎｄ  ＭｕｃｏｃｉｌｉａｒｙＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｅｄ．，Ｂａｕｍ，Ｇ．Ｌ．，Ｐｒｅｉｌ，Ｚ．，Ｒｏｔｈ，Ｙ．，Ｌｉｒｏｎ．，Ｏｓｔｆｉｅｌｄ，Ｅ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０およびＰｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｐｕｌｍｏｎｏｌｏｇｙ  Ｓ１７，Ａｂｓ  ３６４，１９９８でのＮｅｗｔｏｎらにて詳細に記載されている。
【０２３３】
結果。図１６（ｃ）で示したように、ビクニン（５ｕｇ）は、投与後１．５−２．５時間の保持時間にわたって、食塩水と比較して、インビボでモルモットのＴＭＶを増加させた。
【０２３４】
実施例１３
ビクニンは、インビトロでの培養ヒト気管支上皮（ＨＢＥ）細胞短回路電流におけるナトリウム電流を減少させる交会まで増殖させた三次ＨＢＥ細胞単層を修正Ｕｓｓｉｎｇチャンバー上に載せ、Ｋｒｅｂｓ緩衝液（ＫＢＲ）溶液内に浸し、３７℃に暖めた９５％Ｏ２／５％ＣＯ２でバブリングした。
【０２３５】
細胞を、バックグラウンドノイズおよび流体抵抗に関する較正の前２０分間平衡のままにした。次いで経上皮電位差異をＷＰＩ  ＥＶＣ  ４０００電圧クランプを使用して０ｍＶまでクランプした。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を使用しＩｓｃをモニターした。一旦安定した基準線が得られたら（典型的には１０−２０分）、細胞をアミロリド（１０ｕＭ）で処理した。一旦アミロリドに対する応答が見られたならば、ＫＢＲ溶液で洗浄した。基準線および平衡が戻った後、（以下の実施例１７で記載したような）ビクニン（１−１７０）（ＰＢＳ中０．５−５０ｕｇ／ｍＬ）またはＰＢＳ対照を加えた。薬剤処理の９０分後、アミロリド（１０ｕＭ）を添加した。電流が一旦安定になったならば、フォルスコリン（１０ｕＭ）、次いでブメタニド（１００ｕＭ）を添加した。
【０２３６】
結果
図１７に示したように、ビクニン（７０ｎＭ）は、インビトロで９０分にわたって間、ヒト気管上皮細胞でのナトリウム電流を阻害した。ＦｏｒｓｋｏｌｉｎはｃＡＭＰ誘導塩素分泌を誘導し、単層抵抗性には影響を与えなかった。
【０２３７】
実施例１４
モルモットでのＴＭＶにおける高張食塩水（１４．４％）の効果
本比較研究の目的は、モルモット気管粘液速度における高張食塩水（１４．４％×５分間）の効果を調査することであった。この薬剤は、エアロゾルによって頭側気管内に伝送した。ＴＭＶを、直後および毎１５分ごと、３０分間モニターした。本実施例で使用した手順は、「Ｃｉｌｉａ，Ｍｕｃｕｓ  ａｎｄ  Ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｅｄ．，Ｂａｕｍ，Ｇ．Ｌ．ら，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８；Ｎｅｗｔｏｎら，Ｐｅｄ．Ｐｕｌｍ．Ｓ１７，Ａｂｓ．３６４，１９９８においてＮｅｗｔｏｎらで記載されている。
【０２３８】
使用した物質および方法／薬剤
Ｈｙｐｎｏｒｍ（商標）（クエン酸フェンタニル０．３１５ｍｇ／ｍＬおよびフルアニゾン１０ｍｇ／ｍＬ）はＪａｎｓｓｅｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈから入手し、Ｈｙｐｎｏｖｅｌ（商標）（ミダゾラム５ｍｇ／ｍＬ）はＲｏｃｈｅから入手した。オスＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（５５０−７５０ｇ）はＤａｖｉｄ  Ｈａｌｌ，ＵＫより供給された。サーミスタプローブはＫａｎｅ−Ｍａｙ  Ｌｔｄ，ＵＫより入手した。
【０２３９】
気道粘液速度の測定
動物をＨｙｐｎｏｒｍ（商標）およびＨｙｐｎｏｖｅｌ（商標）を用いて麻酔した。ＴＭＶを、実際には麻酔したモルモットの気管粘膜繊毛層上に移動させ、３２Ｐ−標識化したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの注入部分から放射された放射活性を検出するように配置した小型ベータ粒子検出検出器プローブで平行にした導線を用いてモニターした（Ｎｅｗｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ  １９９８）。
【０２４０】
最初のＴＭＶ測定（ラン１）を投与後２０分で行った。続く測定を、１５分ごとに行った。第２ランの前６分の時点で、５分間食塩水（０．９％）または高張食塩水（１４．４％）のエアロゾルを投与した。放射標識化トレーサ粒子を気管に作製した０．５ｕｍの穴を介して与えた。食塩水（０．９％）または高張食塩水（１４．４％）どちらかのエアロゾルは、Ｐａｒｉ加圧噴霧器によって作製した。エアロゾルを第２ランの前１分でスイッチを切った。ＴＭＶ測定に関する手順は、Ｎｅｗｔｏｎら，「Ｃｉｌｉａ，Ｍｕｃｕｓ  ａｎｄ  Ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｅｄ．，Ｂａｕｍ，Ｇ．Ｌ．，Ｐｒｅｉｌ，Ｚ．，Ｒｏｔｈ，Ｙ．，Ｌｉｒｏｎ．，Ｏｓｔｆｉｅｌｄ，Ｅ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０およびＰｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｐｕｌｍｏｎｏｌｏｇｙ  Ｓ１７，Ａｂｓ  ３６４，１９９８でのＮｅｗｔｏｎらにて詳細に記載されている。
【０２４１】
結果
図１８に示したように、高張食塩水（１４．４％×５分間）は、エアロゾル直後のＴＭＶの一過性の増加を引き起こした。
【０２４２】
実施例１５
モルモットでのＴＭＶにおけるアミロリドの効果
本研究の目的は、麻酔した自発的呼吸を行っているモルモットでのモルモット気管粘液におけるアミロリド（１０ｍＭ×２０分間）の効果を調査することであった。この薬剤は、実施例１４で記載したように、エアロゾル化によって頭側気管内に伝送した。本実施例で使用したＴＭＶ測定手順は、「Ｃｉｌｉａ，Ｍｕｃｕｓ  ａｎｄ  Ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｅｄ．，Ｂａｕｍ，Ｇ．Ｌ．ら，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８；Ｎｅｗｔｏｎら，Ｐｅｄ．Ｐｕｌｍ．Ｓ１７，Ａｂｓ．３６４，１９９８においてＮｅｗｔｏｎらで記載されている。
【０２４３】
使用した物質および方法／薬剤
水中のアミロイド処方（１０ｍＭ）を本実施例のために調製した。Ｈｙｐｎｏｒｍ（商標）（クエン酸フェンタニル０．３１５ｍｇ／ｍＬおよびフルアニゾン１０ｍｇ／ｍＬ）はＪａｎｓｓｅｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈから入手し、Ｈｙｐｎｏｖｅｌ（商標）（ミダゾラム５ｍｇ／ｍＬ）はＲｏｃｈｅから入手した。オスＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（５５０−７５０ｇ）はＤａｖｉｄ  Ｈａｌｌ，ＵＫより供給された。サーミスタプローブはＫａｎｅ−Ｍａｙ  Ｌｔｄ，ＵＫより入手した。
【０２４４】
気道粘液速度の測定
動物をＨｙｐｎｏｒｍ（商標）およびＨｙｐｎｏｖｅｌ（商標）を用いて麻酔した。ＴＭＶを、実際には麻酔したモルモットの気管粘膜繊毛層上に移動させ、３２Ｐ−標識化したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの注入部分から放射された放射活性を検出するように配置した小型ベータ粒子検出検出器プローブで平行にした導線を用いてモニターした。モルモットは０時点でＨｙｐｎｏｒｍ（商標）およびＨｙｐｏｎｏｖｅｌ（商標）で麻酔した。アミロリド（１０ｍＭ×２０分間）はエアロゾルによって投与した。最初のＴＭＶ測定を、その直後に行い、続く測定を１５分ごとに行った。
【０２４５】
結果
図１９に示すように、アミロリド（１０ｍＭ×２０分間）は、エアロゾルの１５分後にＴＭＶの統計学的に有意な増加を引き起こした。
【０２４６】
実施例１６  アプロチニン二重ムテインは培養ヒト気道上皮（ＨＢＥ）細胞短回路電流（Ｉｓｃ）におけるナトリウム電流を減少させる。
【０２４７】
本研究の目的は、インビトロで、Ｉｓｃにおけるクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ファミリーセリンプロテアーゼ阻害剤アプロチニン二重ムテインの効果を調査することであった。交会まで増殖させ三次ＨＢＥ細胞単層を修正Ｕｓｓｉｎｇチャンバー上に載せ、Ｋｒｅｂｓ緩衝液（ＫＢＲ）溶液内に浸し、３７℃まで暖めた９５％Ｏ２／５％ＣＯ２でバブリングした。アプロチニン二重ムテインは、参照して全体に組み込まれた、１９９８年１月２８日に発行された欧州特許第ＥＰ８２１  ００７号の実施例１で記載されたＤｅｓ  Ｐｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ａｒｇ１５−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンである。
【０２４８】
細胞をバックグラウンドノイズおよび流体抵抗に関して較正する前に２０分間平衡にさせたままにした。次いで経内皮電位差を、ＷＰＩ  ＥＶＣ４０００電圧クランプを用いて０ｍＶまでクランプした。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を使用してＩｓｃをモニターした。一旦安定した基準線が得られたならば（典型的には１０−２０分間）、細胞をアミロリド（１０ｕＭ）で処理した。一旦アミロリドへの応答が見られたならば、ＫＢＲ溶液で洗浄した。基準線および平衡に戻った後、ビクニン（５ｕｇ／ｍＬ）、アプロチニン二重ムテイン（０．５−５ｕｇ／ｍＬ）、アプロチニン（１．５−５ｕｇ／ｍＬ）またはＰＢＳを添加した。薬物処理の９０分後、アミロリド（１０ｕＭ）を添加した。
【０２４９】
結果
図２０に示したように、アプロチニン二重ムテイン（０．５−５ｕｇ／ｍＬ）は、９０分の期間にわたって、ヒト気管上皮細胞で、インビトロにおいてナトリウム電流を用量依存的に阻害した。
【０２５０】
実施例１７
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現した胎盤ビクニン（１−１７０）の発現、精製および比較プロテアーゼ阻害活性
（ａ）ビクニンを発現する安定な、高産出ＣＨＯ細胞株の発展
多量のビクニンを分泌する安定産出細胞株を、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞に実施例２７で示した発現ベクターをトランスフェクトして確立した。ベクターは標準の組換え体ＤＮＡ技術を使用して構築した。発現ベクターおよびＣＨＯ細胞発現系の構造の記載は、発明者Ｓａｍ  Ｃｈａｎによる「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  Ｂｉｋｕｎｉｎ（糖付加ビクニン産出の方法）」という題名で１９９９年１１月１２日に発行されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／４４１，６５４号で見ることができる。簡便には、発現ベクターｐＢＣ−ＢＫは、早期プロモータのサイトメガロウイルスすぐ下流、およびポリアデニル化シグナル配列の上流にビクニンｃＤＮＡをクローニングすることで構築した。発現ベクターｐＢＣ−ＢＫは、ビクニン、ジヒドロ葉酸リダクターゼおよびアンピシリン耐性の転写単位からなる。ビクニンｃＤＮＡを制限酵素によってクローニングベクターより放出させ、平滑末端化し、直線化したｐＢＣへライゲーションした。ｐＢＣの直線化は、単一制限酵素消化によって行った。ビクニンｃＤＮＡの方向を配列決定によって確認した。
【０２５１】
約１×１０６  ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞に、取扱説明書にしたがってＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ薬剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いて１０μｇのｐＢＣ−ＢＫをトランスフェクトした。次いで細胞を５０ｎＭメトトレキサートの存在下で選別し、チミジンおよびヒポキサンチン＋５％透析したウシ胎児血清欠失ＤＭＥ／Ｆ１２培地で増殖させた。細胞集団を発色アッセイでビクニン産出に関して選別した。簡単には、ビクニン標準または培養液を、連続希釈し、等容量のカリクレインと共に、発色基質Ｎ−ベンゾイル−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡを添加した後３０分間、３７℃にてインキュベートした。反応液を５０％酢酸の添加前１５分間インキュベートした。放出されたｐ−ニトロアニリドの量を４０５ｎＭにて測定した。多量産出集団をさらに、増加させたメトトレキサートの濃度（１００−４００ｎＭメトトレキサート）を含んでいる培地中で選択し、ビクニンの産出について選別した。次いで限界希釈クローニングを、高く、安定な産出性を持つクローンを得るために適用した。クローニングを、９６ウェルプレート内に１細胞／ウェルを入れることで、標準組織培養技術を用いてメトトレキサートのない状態で行った。ＦＤ３−１と命名したクローンを、バイオリアクターでの生産性評価に関して選択し、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに１９９９年１１月１２日に寄託し、Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ  ＰＴＡ−９４０を割り当てられた。
【０２５２】
（ｂ）灌流バイオリアクターでのビクニンの血清なしでの産出
ビクニンの連続的産出を、連続的な灌流発酵によって行った。１．５リッターＷｈｅａｔｏｎ発酵物に安定ＣＨＯ細胞株を２×１０６細胞／ｍｌ接種し、０．５リッター／日の培地交換速度にて灌流した。産出培地は、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）およびＦｅＳＯ４・ＥＤＴＡ（５０μＭ）を含むＤＭＥ／Ｆ−１２基礎培地であった。培養物の平均日収量は−２０ｍｇ／日であった。ビクニンの産出は２１日間安定に保たれた。
【０２５３】
（ｃ）ＣＨＯ細胞発現系から産出したビクニン（１−１７０）の精製
ＣＨＯ細胞から産出したビクニンを、実施例２９にて概略したようなイオン交換、金属キレートおよびサイズ排除クロマトグラフィを含む標準のクロマトグラフィ技術を用いて精製した。
【０２５４】
ＳＰカラム（１８×１０ｃｍ、２．５Ｌ）を、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で調製し、平衡化した。冷えた濾過したＣＨＯ細胞採取物（ＴＣＦ）を、冷滅菌水で１：２．５に希釈し、ｐＨを５．０にあわせた。クロマトグラフィを、冷緩衝液にて、室温にて行った。冷開始物質を８００ｍＬ／分（１８９ｃｍ／時間）にてカラム上にのせた。カラムに載せたビクニンの量は０．８８８−１．９３８ｇ（およそ１４ｍｇ／Ｌ）の範囲であった。ローディングの後、カラムを平衡化緩衝液にて洗浄し、ビクニンを溶出緩衝液で溶出した。溶出液を２−８℃（氷浴中）にて回収し、すぐに６Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７にあわせた。カラムを洗浄し、次いで冷（２−８℃）１Ｎ  ＮａＯＨにて殺菌し、次回に使用するまで２０％エタノール中で２−８℃にて保存した。
【０２５５】
平衡化および洗浄緩衝液は５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ５．０を含み、溶出緩衝液は３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ５．０を含み、ｐＨ調節緩衝液は１Ｍクエン酸、１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ２．４であった。
【０２５６】
陰イオン交換クロマトグラフィのための調製で行った、ダイアフィルトレーション（ＤＦ）で容量を５−７倍まで少なくする前に、解凍したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液を、超濾過（ＵＦ）にておよそ１０倍まで濃縮した。すべての作業は、水平フローフード内で、室温で行った。ＵＦ／ＤＦは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）からのＰｅｌｌｉｃｏｎ２「ミニ」フィルタ系および２つの１０ｋＤａ再生セルロースカートリッジ（Ｐ２Ｃ０１０Ｃ０１）を使用した。流速は、２−カートリッジ系に関しておよそ１３０±２０ｍＬ／分であり、流入圧および流出圧をそれぞれ２２−２６ｐｓｉおよび１２−１６ｐｓｉに調節することで維持した。循環は蠕動性ポンプで行い、再循環は、膜圧調節の前に、５００−６００ｍＬ／分まで設定した。ダイアフィルトレーションは冷１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ８．１で行った。
【０２５７】
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィを以下のように行った。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１３×９ｃｍ、１．２Ｌカラムを５倍容量（ＣＶ）の滅菌水で洗浄し、およそ１０ＣＶの平衡化緩衝液で平衡化した。ダイアフィルタ化したＳＰ溶出液をｐＨ８．１に合わせ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上に１００ｍＬ／分（４５ｃｍ／時間）で載せた。カラム上にのせたビクニンの量は１１２１−２６０７ｍｇ（およそ１５ｍｇ／ｍＬ）の範囲であった。ローディングの後、カラムをＡ２８０のＵＶ吸収が基準線に達するまで平衡化緩衝液で洗浄し、次いでビクニンを溶出した。溶出液を収集し、Ｚｎ−ＩＭＡＣ、亜鉛固定化金属イオン吸着クロマトグラフィのための種物質として使用した。カラムを１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、滅菌水ですすぎ、２０％エタノール中で保存した。すべての操作は２−８℃にて行った。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムのための平衡化および洗浄緩衝液は１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．１を含んだ。溶出緩衝液は１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．１を含んだ。
【０２５８】
およそ２００ｍＬのベット容量のＣｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含んでいるＺｎ−ＩＭＡＣカラム（５×１０ｃｍ）を、３容量のＺｎＳＯ４溶液（以下参照）で帯電させ、以下で記載したような２容量の滅菌水で洗浄し、６容量の緩衝液で平衡化した。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液をｐＨ７．４および（ＮａＣｌ固体の添加によって）３００ｍＭ  ＮａＣｌまで合わせ、３０ｍＬ／分（９２ｃｍ／時間直線速度）でＺｎ−ＩＭＡＣにのせ、次いでカラムをＵＶ吸収が基準線に達するまで平衡化緩衝液で洗浄した。カラムにのせたビクニンの量は０．０９７−１．６８１ｇ（およそ０．６３ｍｇ／ｍＬ）の範囲であった。フロースルーおよび洗浄液をＵＦのために回収した。カラムを解体し、０．５Ｍ  ＮａＯＨで殺菌した。この工程のすべての操作は２−８℃にて行った。Ｚｎ−ＩＭＣＡのための平衡化緩衝液は１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を含み、解体緩衝液は５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を含み、帯電溶液は２ｍｇ／ｍＬ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏであった。
【０２５９】
Ｚｎ−ＩＭＡＣフロー−スルーをＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００クロマトグラフィのためにＰｅｌｌｉｃｏｎ２系（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）での超濾過５倍によって濃縮した。浸透流速はおよそ６０−７０ｍＬ／分であり、上述したように維持した。再循環は４００−５００ｍＬ／分であった。
【０２６０】
４．５９ＬのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むカラム（１０×５８．５ｃｍ）を、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、２．９ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍｇ／Ｌ  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．２で平衡化した。流速は３０ｍＬ／分（２３ｃｍ／時間）であった。典型的なランでは、９５ｍＬの容量での１４７５ｍｇのビクニンをカラムにのせた。  Ｓ−２００後のプールを、潜在的な発熱物質を取り除くためにバッチ法でＥｔｏｘ樹脂で処理した。ＡｃｔｉＣｌｅａｎ  Ｅｔｏｘ，２７０５樹脂（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を１Ｍ  ＮａＯＨですすぎ、室温で攪拌しながら１Ｍ  ＮａＯＨ中で５時間インキュベートした。樹脂を洗浄し、ＰＢＳ、ｐＨ７．２で平衡化した。８０ｍＬの濾過し、平衡化した樹脂を１０６３ｍＬのビクニンＳ２００プール（５４６０．１１ｍｇ）に加え、一晩２−８℃で攪拌した。次いでＥＴＯＸ樹脂を０．２ミクロンＮａｌｇｅｎｅフラスコフィルタで濾過して取り除いた。
【０２６１】
結果、表１０は各工程によって供給された平均収率である。
【表１２】
2006232810.tif 000064
【０２６２】
ビクニンの総収率は９５％の純度で約３０％であった。質量分析データがまた、全長ビクニン（１−１７０）分子に加えて、ビクニン（１−１７０）のカルボキシ末端からの３つ（Ｇ−Ｓ−Ｋ）および４つ（Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｋ）のアミノ酸を欠く種が、純粋なタンパク質プール中に存在することを示唆した。産出された物質は、室温または３７℃、中性ｐＨでの７２時間インキュベーションにさらした時に分解に安定であることが示された。Ｎ−末端配列決定、ゲル電気泳動、免疫ブロッティングおよびアミノ酸解析により、ビクニンは本質的に純粋（他の配列が検出されない）ことが示唆された。さらなる逆相クロマトグラフィ工程は、ＣＨＯ由来精製ビクニンが、まだいくつかの種類に分画できることを明らかにした（図３０Ａ）。ＣＨＯビクニン（８．５ｍｇ）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、０．１％最終濃度）でｐＨ２．５まで合わせ、１７．５％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡで平衡化したＣ１８逆相カラム（Ｖｙｄａｃ、２．５×２５ｃｍ）上で、流速２ｍｌ／分でのクロマトグラフィにかけた。ＣＨＯビクニンを、６０分間かけて０．１％  ＴＦＡ中の１７．５−４０％アセトニトリルの直線勾配で溶出した。図３０Ｂはこれらの画分の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ図を示している（５４と５５の間のレーンは分子量マーカを示している）。
【０２６３】
予備的な糖鎖解析を、約２１ｋＤａ−約３８ｋＤａの範囲のＭＷを持つＣＨＯビクニンの糖付加アイソフォームで行った。総糖鎖含量は７．５％であるとわかった。両方のＮ−型結合部位（Ａｓｎ−３０およびＡｓｎ−６７）が、糖構造によって占有されていることがわかった。クロマトグラフィおよび質量分析解析で、高い異質性および精製ビクニンに関して観察された大きさの異質性に寄与している高分岐オリゴサッカライド構造の存在が確かめられた。約９０％のオリゴサッカライドがシアル酸付加しており、残りの構造は中性であった。Ｎ−グリコシダーゼＦで処理した場合、ＣＨＯビクニンの糖付加アイソフォーム（図３０Ｂ）は単一の１８ｋＤａアイソフォームに変換された（図３１参照）。
【０２６４】
ビクニンのシアル酸含量を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０中でシアリダーゼと一緒の、ふたをしたマイクロヒュージチューブ内での１８時間のインキュベーションによって解析した。シアル酸を、１ｍｌ／分の流速での５０分間の１００ｍＭ  ＮａＯＨ中の２０−２５０ｍＭ酢酸ナトリウムの緩衝液勾配を用いたＣａｒｂｏ  Ｐａｃ  ＰＡ１陰イオン交換カラム上で分離した。検出は、パルス電気化学検出器で行い、試料の保持時間およびピーク面積の標準シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸およびＮ−グルタリルノイラミン酸）に対する比較で定量した。結果は表１１に示している。
【表１３】
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【０２６５】
実施例１８
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に発現した胎盤ビクニン（１−１７０）の比較プロテアーゼ阻害活性
概要。組換え体ビクニンのインビトロ特異性を、実施例３、４、７および１０に記載したような物質および方法を用いて測定した。以下の表１２は、インビトロでの様々なセリンプロテアーゼの阻害剤としての組換え体ビクニンの効力を示している。データは、組換え体ビクニンまたはアプロチニンのどちらかを用いて示している。
【０２６６】
プロテアーゼ。ヒトプラスミンおよびヒト血漿カリクレイン定量を、既に記載したように（Ｃｈａｓｅ，Ｔ．，およびＳｈａｗ，Ｅ．，（１９７０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｍｏｌ．１９，２０−２７）、ｐ−ニトロフェニルｐ’−グアニジンベンゾエートＨＣｌを用いて活性部位滴定で実施した。ヒト組織カリクレイン（Ｂａｙｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、標準としてウシアプロチニン、１：１複合体形成をとる基質としてＰＦＲ−ＡＭＣを使用して活性部位滴定によって定量した。使用した条件下でのプラスミンによるＧＰＫ−ＡＭＣに対するＫｍは７２６μＭであり、ヒト血漿カリクレインでのＰＦＲ−ＡＭＣに対するＫｍは４５７ｍＭであり、ヒト組織カリクレインでのＰＦＲ−ＡＭＣに対するＫｍは５．７μＭであった。
【０２６７】
阻害速度論。ヒトププラスミンのＣＨＯ発現胎盤ビクニン（１−１７０）およびアプロチニンによる阻害を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、および０．０２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む緩衝液中のプラスミン（５０ｐＭ）およびＣＨＯ発現胎盤ビクニン（１−１７０）（０−２ｎＭ）またはアプロチニン（０−４ｎＭ）で測定した。３７℃でのインキュベーションの３０分後、２５μｌの２０ｍＭ  ＧＰＫ−ＡＭＣを添加し、蛍光の変化をモニターした。ＣＨＯ発現胎盤ビクニン（１−１７０）またはアプロチニンによるヒト血漿カリクレインの阻害を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中のカリクレイン（０．２ｎＭ）およびＣＨＯ発現胎盤ビクニン（１−１７０）（０−４ｎＭ）またはアプロチニン（０−４５ｎＭ）を用いて測定した。３７℃での３０分後、５μｌの２０ｍＭ  ＰＦＲ−ＡＭＣを添加し、蛍光の変化をモニターした。
【０２６８】
アプロチニンまたはＣＨＯ発現胎盤ビクニン（１−１７０）によるヒト組織カリクレインの阻害を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１ｍｌ反応容量中で、０．３５ｎＭヒト組織カリクレインをＣＨＯ発現胎盤ビクニン（１−１７０）（０−１０ｎＭ）またはアプロチニン（０−０．５ｎＭ）とインキュベーションすることで測定した。３７℃にて５分後、最終濃度１０ｕＭになるように５ｕｌの２ｍＭ  ＰＦＲ−ＡＭＣを添加し、蛍光の変化をモニターした。
【０２６９】
第ＸＩａ因子（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、Ｓｏｕｔｈ  Ｂｅｎｄ，ＩＮ）の阻害を、総容量１ｍｌの５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎｘ−１００および１％  ＢＡＳを含む緩衝液内で、ＦＸＩａを０−４ｕＭのＣＨＯ発現胎盤ビクニン（１−１７０）または０−４ｕＭのアプロチニンと共にインキュベーションすることで測定した。３７℃にて３０分後、１０ｕｌの４０ｍＭ  Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）を添加し、蛍光の変化をモニターした。    
明白な阻害定数Ｋｉ＊を非直線回帰データ解析プログラムＥｎｚｆｉｔｔｅｒソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃａｎｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて決定した。それぞれの実験からの速度論的データは、強い結合阻害剤に関する方程式によって解析した。
【０２７０】
（数５）
Ｖｉ／Ｖ０＝１−（Ｅ０＋Ｉ０＋Ｋｉ＊−［（Ｅ０＋Ｉ０＋Ｋｉ＊）２−４Ｅ０Ｉ０］１／２）／２Ｅ０                  （２）
式中Ｖｉ／Ｖ０は分数酵素活性（阻害対非阻害比）であり、Ｅ０およびＩ０はそれぞれ酵素および阻害剤の総濃度であり、Ｋｉ値は方程式
（数６）
Ｋｉ＝Ｋｉ＊／（１＋［Ｓ０］／Ｋｍ）    （３）
による基質の効果に関する補正によって得た。（Ｂｏｕｄｉｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｂｉｅｔｈ，Ｊ．Ｇ．，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．９９５：３６−４１）。
【０２７１】
結果：Ｋｉ値は以下の表１２に挙げる。
【表１４】
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【０２７２】
結果は、少なくとも３つの異なるセリンプロテアーゼに対して効果的な活性プロテアーゼ阻害剤を産出するために、組換え体ビクニンをＣＨＯ細胞に発現させることができることを示している。組換え体ビクニンは、ヒト血漿カリクレインおよびヒトＦＸＩａに対して、アプロチニンよりも強力であった。ヒト血漿を阻害する点は、アプロチニンと等しい効力を持った。
【０２７３】
実施例１９
アプロチニンは、インビトロで、ヒト培養嚢胞性線維症気管上皮細胞短回路電流（Ｉｓｃ）でのナトリウム電流を減少させる。
【０２７４】
ＨＢＥ細胞をＣＦ患者肺移植組織から単離し、１週間コラーゲンコートしたフラスコで培養した。次いで細胞を継代し、コラーゲンコートしたＣｏｓｔａｒ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌフィルタ（０．３３ｃｍ２）上にまき、２％  Ｕｌｔｒｏｓｅｒ  Ｇを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で増殖させた。細胞を空気液体境界にて培養させ、播種後２−４週間使用した。
【０２７５】
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌフィルタ上の細胞を、修正Ｃｏｓｔｅｒ  Ｕｓｓｉｎｇチャンバー内にのせ、Ｉｓｃ条件下で試験した。基準線Ｉｓｃ値を記録し（０−１０分間）、次いでアプロチニン（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）をアピカル側に添加した。Ｉａｃを１００分間記録し、次いでアピカル側浴流体を新鮮な培養液に交換した。トリプシン（１００ＢＡＥＥ単位／ｍＬ）をアピカル側に添加し、Ｉｓｃをさらに１０分間記録した。次いで、アミロリド（１０ｕＭ）をアピカル側に添加し、Ｉｓｃをさらに１０分間記録した。
【０２７６】
結果
図２１に示したように、アプロチニン（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）は、１００分間にわたってヒトＣＦ気管上皮細胞でインビトロにてＩｓｃを阻害した。洗浄後、Ｉｓｃはセリンプロテアーゼであるトリプシンでのアピカル表面の処理によって増加した。最終的に、アミロリド（１０ｕＭ）の添加が、Ｉｓｃの変化が、ナトリウム依存電流での変化の結果であったことを示唆していた。
【０２７７】
実施例２０
噴霧化後のビクニン（１−１７０）の活性の査定
本研究の目的は、噴霧化後の実施例１７に記載したビクニン（１−１７０）の抗プロテアーゼ活性を査定することであった。すべての研究は、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０２ｇ／Ｌ  Ｔｗｅｅｎ８０）内で処方したビクニンで行った。
【０２７８】
噴霧化の方法
Ｒａｉｎｄｒｏｐ（商標）薬剤噴霧器：ビクニンを１および３ｍｇ／ｍＬの濃度でエアロゾル化した。噴霧器のふたを２．５ｍＬのビクニン溶液で満たした。
【０２７９】
エアロゾル化を７．３５Ｌ／分または３５ｐｓｉで行った。
【０２８０】
Ｃｏｌｌｉｓｏｎ噴霧器：ビクニンを４．７ｍｇ／ｍＬの濃度でエアロゾル化した。噴霧器のふたを２．５ｍＬのビクニン溶液で満たした。エアロゾル化を３５ｐｓｉで行った。
【０２８１】
噴霧した試料の回収
エアロゾル化したビクニンを、対のインピンジャー（６０Ｌ／分で本系を通した、６．４ｕｍ平均空気力学粒子カットオフサイズ）を使用して回収した。インピンジャーは、液体衝撃の原理で働き、エアロゾルを呼吸不可能な画分（段階１で回収した＞６．４ｕｍ）および呼吸可能な画分（段階２で回収した＜６．４ｕｍ）に分けた。
【０２８２】
抗プロテアーゼ活性の測定
ビクニン活性を、ヒト血漿カリクレインのその阻害によってインビトロで測定した。
【０２８３】
結果
Ｒａｉｎｄｒｏｐ（商標）薬剤噴霧器：噴霧化前後試料に対する活性（Ｋｉ）値は以下のようであった。１ｍｇ／ｍＬビクニン：Ｋｉ値はそれぞれ０．４７（±０．０２）および０．７６（±０．０４）であり、３ｍｇ／ｍＬビクニン（１−１７０）に関して、Ｋｉ値はそれぞれ０．５２（±０．０３）および０．６２（±０．０３）であった。
【０２８４】
Ｃｏｌｌｉｓｏｎ噴霧器：噴霧化前後試料に対する活性（Ｋｉ）値はそれぞれ０．２７（±０．０３）および０．４５（±０．０３）であった。
【０２８５】
結論：  ＲａｉｎｄｒｏｐおよびＣｏｌｌｉｓｏｎ噴霧器からの噴霧化前後ビクニン試料は、同様の活性（アッセイ量内で同様のＫｉ値）を示し、このことはビクニン（１−１７０）が、エアロゾル化で安定であり、噴霧後その抗プロテアーゼ活性を残していることを示唆している。
【０２８６】
実施例２１
ヒツジでの気管粘液流速におけるビクニンの効果
本研究の目的は、処置後８時間にわたるヒツジ気管粘液流速における、実施例１７で記載したクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ファミリーセリンプロテアーゼ阻害剤ビクニン（１−１７０）の効果を調査することであった。この薬剤を噴霧化エアロゾル投与によって気道に伝送した。本実施例で使用した手順は、Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８５（３），１０８６−１０９１，１９９８に記載されている。
【０２８７】
ＴＭＶの測定
成体オスヒツジを特殊化した体装置で頭を固定化し、直立状態にしたままにした。これらに声帯の直下に配置したカフスにて鼻から気管内管で挿管した。吸気を暖め、湿らせた。膨張させたカフスによって引き起こされたＴＭＶの可能性ある障害を最小化するために、残っている気管内管カフスを、エアロゾル投与の期間を除いて、研究を通して収縮させた。
【０２８８】
ＴＭＶを測定するために５−１０放射パックＴｅｆｌｏｎ粒子（直径およそ１ｍｍ、厚さ０．８ｍｍ、重さ１．５−２ｍｇ）を気管内管内に配置したカテーテルを介して気管内に挿管した。次いでＴｅｆｌｏｎ粒子の移動を１分間隔にわたって測定した。本実施例で使用した手順は、Ｒｕｓｓｉら，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｙｓｉｏｌ．５９（５），１４１６−１４２２，１９８５に記載されている。既知の長さの放射パックマーカを含む首輪を動物の外部に適用し、ビデオスクリーン上で粒子によって横断した距離を移動した実際の距離に変換するのに標準として使用した。ＴＭＶを、５−１０のＴｅｆｌｏｎ粒子に関して分あたりに移動した頭側方向での平均距離より計算した。基準線ＴＭＶをエアロゾルの投与直前に測定した。
【０２８９】
試験基質；ＰＢＳ、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬビクニンまたはＰＢＳ中３ｍｇ／ｍＬビクニンを、３．６ｕｍの重量メディアン空気力学直径の小滴を産出する流速にて操作されたＲａｉｎｄｏｒｏｐジェット噴霧器を使用して作製されたエアロゾル（３ｍＬ）として、ヒツジ気道に伝送した。ＴＭＶを、試験基質を投与した直後（０時）に測定、次いで０．５、１、２、３、４、５、６、７および８時に測定した。
【０２９０】
結果
図２２に示したように、ヒツジ気道に伝送された９ｍｇのビクニンエアロゾル（３ｍｇ／ｍＬの３ｍＬ）は、ＰＢＳ賦形剤エアロゾルを与えた動物の群に対する同時点と比較して、０、０．５、１、２、３、４、５、６、７および８時間の時点で有意にＴＭＶを増加させた。２４時間の時点でＴＭＶは、ビクニン処理およびＰＢＳ賦形剤群両方で基準線速度まで戻った。
【０２９１】
より低用量（３ｍｇ  ビクニンエアロゾル（１ｍｇ／ｍＬの３ｍＬ）では、試験したどの時間点でも処理および賦形剤群管でＴＭＶは観察されなかった。
【０２９２】
実施例２２
ビクニン（５０ｕｇ／ｍＬ）は、培養モルモット気道上皮（ＧＰＴＥ）細胞短回路電流（Ｉｓｃ）でのナトリウム電流を減少させる
本研究の目的は、インビトロでのＧＰＴＥ細胞上のＩｓｃにおけるビクニン（１−１７０）（実施例１７を参照）の効果を調査することであった。ＧＰＴＥ細胞を１．２ｃｍ直径、０．４ｕｍポアサイズＳｎａｐｗｅｌｌ（商標）インサート（Ｃｏｓｔａｒ  ＵＫ）上にまいた。細胞を交会まで増殖させ、空気−液体境界上に置いた後に２−４日、修正Ｕｓｓｉｎｇチャンバー内にのせた。インサートをＫｒｅｂｓ緩衝（ＫＢＲ）溶液内に浸し、３７℃まで暖めた９５％  Ｏ２／５％  ＣＯ２でバブリングした。
【０２９３】
２０分の平衡期間の後、経上皮電圧差を、ＷＰＩ  ＥＶＣ４０００電圧クランプを用いて０ｍＶまでクランプした。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を、Ｉｓｃをモニターするのに使用した。一旦安定な基準線が得られたならば（一般的に２０−３０分間）、細胞をアミロリド（３０ｕＭ）で処理した。一旦アミロリドへの反応を得られたならば、ＫＢＲ溶液で洗浄した。基準線および平衡へ戻ったならば、実施例１７で記載したビクニン（１−１７０）（１０−５０ｕｇ／ｍＬ）またはＰＢＳを添加した。薬剤処理後３０分間、アミロリド（３０ｕＭ）を添加した。
【０２９４】
結果
図２３に示したように、ビクニン（１−１７０）（５０ｕｇ／ｍＬ）は、３０分間にわたってモルモット気管上皮細胞でのインビトロのナトリウム電流を阻害した。
【０２９５】
実施例２３
ビクニン（１−１７０）（１００ｕｇ／ｍＬ）は、培養ヒツジ気道上皮（ＯＴＥ）細胞短回路電流（Ｉｓｃ）でのナトリウム電流を減少させる
本研究の目的は、インビトロでのＯＴＥ細胞中のＩｓｃにおける、ビクニン（１−１７０）（実施例１７を参照）の効果を調査することであった。ＯＴＥ細胞を１．２ｃｍ直径、０．４ｕｍポアサイズＳｎａｐｗｅｌｌ（商標）インサート（Ｃｏｓｔａｒ  ＵＫ）上にまいた。細胞を交会まで増殖させ、空気−液体境界上に置いた後に３−５日、修正Ｕｓｓｉｎｇチャンバー内にのせた。インサートをＫｒｅｂｓ緩衝（ＫＢＲ）溶液内に浸し、３７℃まで暖めた９５％Ｏ２／５％ＣＯ２でバブリングした。
【０２９６】
２０分の平衡期間の後、経上皮電圧差を、ＷＰＩ  ＥＶＣ４０００電圧クランプを用いて０ｍＶまでクランプした。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を、Ｉｓｃをモニターするのに使用した。一旦安定な基準線が得られたならば（一般的に３０分間）、細胞をアミロリド（１０ｕＭ）で処理した。一旦アミロリドへの反応を得られたならば、ＫＢＲ溶液で洗浄した。基準線および平衡へ戻ったならば、実施例１７で記載したビクニン（２５、５０または１００ｕｇ／ｍＬ）またはＰＢＳを添加した。薬剤処理後９０分間、アミロリド（１０ｕＭ）を再び添加した。
【０２９７】
結果
図２４に示したように、ビクニン（１−１７０）（１００ｕｇ／ｍＬ）は、９０分間にわたってヒツジ気管上皮細胞でのインビトロのナトリウム電流を阻害した。
【０２９８】
実施例２４
ＬＰＳで前処理したモルモットでの気管電位差におけるビクニン（１−１７０）の効果  気道炎症を支配する多形核（ＰＭＮ）白血球（好中球）はしばしばＣＦ肺疾患の特徴である。モルモットにおいて、大腸菌リポポリサッカライド（ＬＰＳ）のエアロゾルへの曝露は、チャレンジの後２４時間での気管支肺胞洗浄液での明らかなＰＭＮ流入を誘導する。本研究の目的は、ＬＰＳのエアロゾルに前曝露したモルモットにおける気管電位差における、実施例１７に記載したビクニン（１−１７０）の効果を調査することであった。薬剤は局所滴下によって頭側気管内へ伝送した。ＴＰＤをＬＰへの曝露２３時間後、６０分間モニターした。
【０２９９】
物質／薬剤
ビクニン（１−１７０）を、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）内で処方した。
【０３００】
アミロリドはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓより得、ＨＢＳＳ内に処方した。
【０３０１】
ビヒクル対照はＨＢＳＳであった。Ｈｙｐｎｏｒｍ（フェンタニルクエン酸０．３１５ｍｇ／ｍＬおよびフルアニゾン１０ｍｇ／ｍＬ）はＪａｎｓｓｅｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈから入手し、Ｈｙｐｎｏｖｅｌ（商標）（ミダゾラム５ｍｇ／ｍＬ）はＲｏｃｈｅから入手した。オスＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（６００−７５０ｇ）はＤａｖｉｄ  Ｈａｌｌ，ＵＫより供給された。
【０３０２】
サーミスタプローブはＫａｎｅ−Ｍａｙ  Ｌｔｄ，ＵＫより入手した。
【０３０３】
ＰＭＮ流入の誘導
個々の動物を１０分間、０．０３ｍｇ／ｍＬのＬＰＳまたはＰＢＳのエアロゾルに曝露した。
【０３０４】
気管電位差に対する測定のためのモルモットの調製
ＬＰＳ処理の２３．４時間後、モルモットをＨｙｐｏｒｍとＨｙｐｎｏｖｅｌで麻酔し、仰向け状態で固定した。腹部中線切開を、下顎から鎖骨までで行った。鈍解剖具を用いて、気管の全長を曝露し、鎖骨の上端で二等分した。外部頸動脈をさらしてカニューレを挿入した。次いで尾側の気管にカニューレを挿入し、動物に部屋の空気で自発的に呼吸させた。次いで動物を仰向けに置き、体温を熱ランプを用いて３７℃に保った。直腸温度をサーミスタプローブでモニターした。
【０３０５】
麻酔の導入後２０分、ビクニン（５０ｕｇ／ｍＬ）またはアミロリド（１００ｕＭ）を頭側気管内に局所的に滴下した。次いで気管寒天電極を頭側の気管に挿入し、気管電位差を６０分間測定した。対照電極は、気管軟骨に結合させて頭側気管の下に配置した。傷部分を乾燥を防ぐために覆った。
【０３０６】
結果
図２５（ａ）に示すように、ＬＰＳへの曝露は、有意なＰＭＮ流入を引き起こした。ビクニンは、図２５（ｂ）で示したように、ＬＰＳに前曝露したモルモットでの電位差異を有意に阻害した。
【０３０７】
実施例２５
モルモットでの気管粘液速度におけるアプロチニン二重ムテインの効果
本研究の目的は、処理１５．時間後でのモルモット気管粘液速度における実施例１６で記載したアプロチニン二重ムテインの効果を調査することであった。この薬剤は局所滴下によって頭側気道内に伝送した。ＴＭＶを１．５時間後に６０分間モニターした。
【０３０８】
物質／薬剤
アプロチニン二重ムテイン（実施例１６を参照）は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、Ｂａｙｅｒ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ  ＵＳＡより入手し、ハンクス平衡溶液（ＨＢＳＳ）内で処方した。Ｈｙｐｎｏｒｍ（フェンタニルクエン酸０．３１５ｍｇ／ｍＬおよびフルアニゾン１０ｍｇ／ｍＬ）はＪａｎｓｓｅｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈから入手し、Ｈｙｐｎｏｖｅｌ（商標）（ミダゾラム５ｍｇ／ｍＬ）はＲｏｃｈｅから入手した。オスＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（６００−７５０ｇ）はＤａｖｉｄ  Ｈａｌｌ，ＵＫより供給された。サーミスタプローブはＫａｎｅ−Ｍａｙ  Ｌｔｄ，ＵＫより入手した。
【０３０９】
麻酔の導入
動物をハロタンを使用して麻酔した。一旦麻酔が十分なレベル導入されたならば、小切開を下顎の下で行った。気管をさらし、１００ｕｌ容量の賦形剤、アプロチニン二重ムテイン（１０ｕｇ）をニードルおよびシリンジを用いて気管表面上に一滴ずつ垂らした。一旦注入したならば、気管注入部位を覆う皮膚を修繕した。次いで動物を回復させた。
【０３１０】
気道粘液速度（ＴＭＶ）の測定
気管粘液速度（ＴＭＶ）を、実際には麻酔したモルモットの気管粘膜繊毛層上に移動させ、リン３２Ｐ−標識化したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの注入部分から放射された放射活性を検出するように配置した小型ベータ粒子検出検出器プローブで平行にした導線を用いてモニターした（ＮｅｗｔｏｎおよびＨａｌｌ  １９９８）。試験薬剤の滴下後７０分に、モルモットをＨｙｐｎｏｒｍおよびＨｙｐｎｏｖｅｌで第２麻酔し、仰向け状態に固定した。第１ＴＭＶ測定をその後２０分間行った。
【０３１１】
結果
図２６で示したように、アプロチニン二重ムテイン（１０ｕｇ）は、投与後１．５−２．５時間の保持期間にわたって、ＨＢＳＳに対して、インビボで、モルモットでのＴＭＶを増加させた。
【０３１２】
実施例２６
ビクニン（１−１７０）は、インビトロでの培養ヒト嚢胞性線維症気管上皮細胞短回路電流（Ｉｓｃ）でのナトリウム電流を減少させる
ＨＢＥ細胞をＣＦ患者肺移植組織から単離し、１週間コラーゲンコートしたフラスコで培養した。次いで細胞を継代し、コラーゲンコートしたＣｏｓｔａｒ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌフィルタ（０．３３ｃｍ２）上にまき、２％  Ｕｌｔｒｏｓｅｒ  Ｇを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で増殖させた。細胞を空気液体境界にて培養させ、播種後２−４週間使用した。
【０３１３】
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌフィルタ上の細胞を、修正Ｃｏａｓｔｅｒ  Ｕｓｓｉｎｇチャンバー内にのせ、Ｉｓｃ条件下で試験した。基準線Ｉｓｃ値を記録し（０−２０分間）、次いでビクニン（１−１７０）（実施例１７を参照のこと）（ＰＢＳ中１０ｕｇ／ｍＬ）をアピカル側に添加した。Ｉａｃを９０分間記録し、次いでアミロリド（１０ｕＭ）を添加し、Ｉｓｃをさらに１０分間記録した。次いでアピカル側浴流体を新鮮な培養液に交換し、Ｉｓｃをさらに１５分間記録した。
【０３１４】
トリプシン（１ｕＭ）をアピカル側に添加し、Ｉｓｃを１５分間記録した。次いでアミロリド（１０ｕＭ）をアピカル側に加え、Ｉｓｃをさらに１０分間記録した。
【０３１５】
結果
図２８（ａ）で示すように、ビクニン（１−１７０）（ＰＢＳ中１０ｕｇ／ｍＬ）は、９０分の期間にわたってヒトＣＦ気管上皮細胞でのインビトロでのＩｓｃを阻害した。Ｉｓｃはさらにアミロリド（１０ｕＭ）の添加によって減少した。洗浄に際し、Ｉｓｃはアミロリドの添加前の電流まで増加して戻った。さらに１５分後、アピカル側表面をトリプシン（１ｕＭ）で処理し、これによりさらにＩｓｃが基準線電流レベルまで増加した（すなわち、２０分の時点で観察された）。最後に、アミロリド（１０ｕＭ）の添加により大部分の電流が阻害され、Ｉｓｃの変化がナトリウム依存電流の変化の結果とあることが示唆された。
【０３１６】
図２８（ｂ）は、１、５および１０ｕｇ／ｍＬでのビクニン（１−１７０）および２０ｕｇ／ｍＬのアプロチニンが、インビトロでヒトＣＦ気管上皮細胞へのアピカル適用後９０分の時点でＩｓｃを阻害したことを示している。
【０３１７】
本発明の特定の実施様態を例示の目的で詳述したが、本明細書で記載した方法および処方は、本発明の意図および範囲を逸脱しない限り修正されてよいことが当業者に容易に明らかになるであろう。したがって、本発明は付随する特許請求によること以外で制限されない。
【０３１８】
配列表のフリーテキスト
＜２１０＞９
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”６２２，６７９，７０７のｎはヌクレオチドのいずれかの部位”
＜２１０＞１０
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”２０１，２２６，及び２３３のＸａａはナンセンスコドンあるは終結コドン”
＜２１０＞１１
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”８，１７，２１−２６，４０，４２，４５−４７，５２，６４，１０３，１１２，１１４，１１６−１２１，１３５，１３７，１４０−１４２，１４７，及び１５９のＸａａはアミノ酸残渣のいずれか”
＜２１０＞１２
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”３６１の残渣はヌクレオチドのいずれかの部位”
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”３６７の残渣はヌクレオチドのいずれかの部位”
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”３８４の残渣はヌクレオチドのいずれかの部位”
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”３９０の残渣はヌクレオチドのいずれかの部位”
＜２１０＞１３
＜２２３＞／ｌａｂｅｌ＝シグナルペプチド
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”１１１，１２０，１２２，１２８，及び１３０のＸａａはナンセンスコドンあるは終結コドンを表す”
＜２１０＞１４
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”４２５，４８２，及び５１０のｎはのヌクレオチドのいずれかの部位”
＜２１０＞１５
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”２，２３，１３２，１６０，及び１６７のＸａａはナンセンスコドンあるは終結コドンを表す”
＜２１０＞１６
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”３，１１，１２，１７，５１，及び４２９のｎはヌクレオチドのいずれかの部位を表す”
＜２１０＞１７
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”６，３１０，及び４０８のｎはヌクレオチドのいずれかの部位を表す”
＜２１０＞１８
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”組織因子経路阻害剤前駆対１”
＜２１０＞１９
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”組織因子経路阻害剤前駆対１”
＜２１０＞２０
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”組織因子経路阻害剤前駆対”
＜２１０＞２１
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”組織因子経路阻害剤前駆対２”
＜２１０＞２２
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”組織因子経路阻害剤前駆対２”
＜２１０＞２３
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”アミロイド前駆体タンパク質相同体”
＜２１０＞２４
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”アプロチニン”
＜２１０＞２５
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”内部−α−トリプシン阻害剤前駆体”
＜２１０＞２６
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”内部−α−トリプシン阻害剤前駆体”
＜２１０＞２７
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”アミロイド前駆体タンパク質”
＜２１０＞２８
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”コラーゲンα−３（ＶＩ）前駆体”
＜２１０＞２９
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ＨＫＩ−Ｂ９”
＜２１０＞３２
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
＜２１０＞４５
＜２２３＞／ｌａｂｅｌ＝シグナルペプチド
＜２１０＞４７
＜２２３＞／ｌａｂｅｌ＝シグナルペプチド
＜２１０＞４９
＜２２３＞／ｌａｂｅｌ＝シグナルペプチド
＜２１０＞５０
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
＜２１０＞５１
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
＜２１０＞５２
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
＜２１０＞５３
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質のシグナルペプチド”
＜２１０＞５４
＜２２３＞ヒトビクニンタンパク質断片
＜２１０＞５５
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”構造表示開始のためのオリゴマー”
＜２１０＞５６
＜２２３＞構造表示開始のためのオリゴマー
＜２１０＞５７  ＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”構造発現開始のためのオリゴマー”
＜２１０＞５８
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”構造発現開始のためのオリゴマー”
＜２１０＞６１
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ビクニン構造発現開始のためのオリゴマー”
＜２１０＞６２
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ビクニン構造開始のためのオリゴマー”
＜２１０＞６３
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
＜２１０＞６４
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
＜２１０＞６５
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
＜２１０＞６６
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
＜２１０＞６７
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
＜２１０＞６８
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
＜２１０＞６９
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
＜２１０＞７０
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
＜２１０＞７１
＜２２３＞／ｎｏｔｅ＝”ヒトビクニンタンパク質断片”
【図面の簡単な説明】
【０３１９】
【図１】図１は、ＥＳＴ  Ｒ３５４６４（配列番号：１２）のヌクレオチド配列およびこのＤＮＡ配列の翻訳（配列番号：１３）を描き、アプロチニンに対して同じ配列類似性を示すオープンリーディングフレームを生じる。翻訳産物は、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様阻害剤ドメイン（太字で示される）についての特徴である訂正空間中に６つのシステインのうちの５つを含む。残りのシステイン（コドン３８で）によって正常に占められる部分は、代わりにフェニルアラニン（＊によって示される）を含有した。
【図２】図２は、ＥＳＴ  Ｒ７４５９３（配列番号：１４）のヌクレオチド配列およびこのＤＮＡ配列の翻訳（配列番号：１５）を描き、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）クラスのセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインに類似を示すオープンリーディングフレームを生じる。翻訳産物は、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様阻害剤ドメイン（太字で示される）についての特徴である訂正空間中に６つのシステインを含む。しかし、このリーディングフレーム配列は、コドン３および２３で終止コドンを示す。
【図３−１】図３は、ヒト胎盤ビクニン（配列番号：９）標識「共通」の推定核酸配列を描き、そして翻訳タンパク質アミノ酸配列標識「翻訳物」（配列番号：１０）に適合した。さらに、比較されるとおり、ＥＳＴ  Ｈ９４５１９（配列番号：１６）、Ｎ３９７９８（配列番号：１７）、Ｒ７４５９３（配列番号：１４）およびＲ３５４６４（配列番号：１２）についての核酸配列と示された。共通配列中の下線付きヌクレオチドは、実施例で記載されるＰＣＲプライマーの部位に対応する。翻訳共通配列中の下線付きアミノ酸は、その認識が、精製された生来のヒト胎盤ビクニンのアミノ酸配列決定によって確認された残渣である。ヌクレオチドおよびアミノ酸コードは、標準単独文字コードであり、核酸コード中の「Ｎ」は、未付与核酸を示し、そして「＊」は、アミノ酸配列中の終止コドンを示す。
【図３−２】図３は、ヒト胎盤ビクニン（配列番号：９）標識「共通」の推定核酸配列を描き、そして翻訳タンパク質アミノ酸配列標識「翻訳物」（配列番号：１０）に適合した。さらに、比較されるとおり、ＥＳＴ  Ｈ９４５１９（配列番号：１６）、Ｎ３９７９８（配列番号：１７）、Ｒ７４５９３（配列番号：１４）およびＲ３５４６４（配列番号：１２）についての核酸配列と示された。共通配列中の下線付きヌクレオチドは、実施例で記載されるＰＣＲプライマーの部位に対応する。翻訳共通配列中の下線付きアミノ酸は、その認識が、精製された生来のヒト胎盤ビクニンのアミノ酸配列決定によって確認された残渣である。ヌクレオチドおよびアミノ酸コードは、標準単独文字コードであり、核酸コード中の「Ｎ」は、未付与核酸を示し、そして「＊」は、アミノ酸配列中の終止コドンを示す。
【図３−３】図３は、ヒト胎盤ビクニン（配列番号：９）標識「共通」の推定核酸配列を描き、そして翻訳タンパク質アミノ酸配列標識「翻訳物」（配列番号：１０）に適合した。さらに、比較されるとおり、ＥＳＴ  Ｈ９４５１９（配列番号：１６）、Ｎ３９７９８（配列番号：１７）、Ｒ７４５９３（配列番号：１４）およびＲ３５４６４（配列番号：１２）についての核酸配列と示された。共通配列中の下線付きヌクレオチドは、実施例で記載されるＰＣＲプライマーの部位に対応する。翻訳共通配列中の下線付きアミノ酸は、その認識が、精製された生来のヒト胎盤ビクニンのアミノ酸配列決定によって確認された残渣である。ヌクレオチドおよびアミノ酸コードは、標準単独文字コードであり、核酸コード中の「Ｎ」は、未付与核酸を示し、そして「＊」は、アミノ酸配列中の終止コドンを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ヒト胎盤ビクニンまたはその部分をコードするＥＳＴに相同なある種の核酸配列を有する一連のＥＳＴの元来の重複を描く。資料について見られるのは、ビクニン（７−６４）およびビクニン（１０２−１５９）の相対的位置、それぞれ、標識ＫＩＤ１およびＫＩＤ２である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、別のＥＳＴを組み込む連続のより複雑なＥＳＴ重複を描く。上部Ｘ軸上の数は、最も５’のＥＳＴ配列から最初の塩基で出発して塩基対での長さに該当する。各棒の長さは、個々のＥＳＴの塩基対での長さに比例している。ＥＳＴ評価数は、それらの個々のＥＳＴ棒の右に示される。
【図４Ｃ−１】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−２】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−３】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−４】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−５】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−６】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−７】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−８】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−９】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−１０】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−１１】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−１２】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−１３】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−１４】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−１５】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−１６】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−１７】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−１８】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−１９】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｃ−２０】図４Ｃは、図４Ｂで模式的に示される各々の重複ＥＳＴのオリゴヌクレオチド配列の対応配列を描く。上部配列（配列番号：５１）標識ビクニンは、各位置で重複ヌクレオチドから由来した共通オリゴヌクレオチド配列を表す。その数は、ＥＳＴ地図内の塩基対の位置に該当する。太字下線（地図位置９９４および１００５で）付されたＥＳＴ  Ｒ７４５９３中のオリゴヌクレオチドは、各々の他の重複ＥＳＴに一致して不在であるＲ７４５９３で観察される塩基挿入である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、図４Ｃ（配列番号：４５）で描かれたビクニンについての共通オリゴヌクレオチド配列のアミノ酸翻訳を描く。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ＰＣＲ基本増幅によるヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから誘導された胎盤ビクニンコード配列のヌクレオチド配列（配列番号：４６）および対応のアミノ酸翻訳（配列番号：４７）を描く。
【図４Ｆ−１】図４Ｆは、コロニーハイブリッド形成によるヒト胎盤ラムダｃＤＮＡライブラリーから単離された生来のヒト胎盤ビクニンコード化クローンのヌクレオチド配列（配列番号：４８）および対応のアミノ酸翻訳（配列番号：４９）を描く。
【図４Ｆ−２】図４Ｆは、コロニーハイブリッド形成によるヒト胎盤ラムダｃＤＮＡライブラリーから単離された生来のヒト胎盤ビクニンコード化クローンのヌクレオチド配列（配列番号：４８）および対応のアミノ酸翻訳（配列番号：４９）を描く。
【図４Ｇ】図４Ｇは、ＥＳＴ重複（配列番号：４５）により得られる胎盤ビクニンについてのアミノ酸翻訳オリゴヌクレオチド配列、ＰＣＲ基本クローニング（配列番号：４７）、および従来のラムダコロニーハイブリッド形成（配列番号：４９）の配列を比較する。
【図５】図５は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ゲル濾過後の胎盤組織から得られるヒト胎盤ビクニンの精製のグラフを示す。プロットは、ＯＤ２８０ｎｍによって測定されるとおりのタンパク質溶出プロファイル（実線）、トリプシン阻害アッセイでの溶出タンパク質の活性（円によって示される阻害率（％））およびカリクレイン阻害アッセイでの溶出タンパク質の活性（四角によって示される阻害率（％））の重複である。
【図６】図６は、Ｃ１８逆相クロマトグラフィを用いて胎盤組織から得られるヒト胎盤ビクニンをプロット取りするグラフを示す。プロットは、ＯＤ２１５ｎｍによって測定されるとおりのタンパク質溶出プロファイル（実線）、トリプシン阻害アッセイでの溶出タンパク質の活性（円によって示される阻害率（％））およびカリクレイン阻害アッセイでの溶出タンパク質の活性（四角によって示される阻害率（％））の重複である。
【図７】図７は、高度に精製された胎盤ビクニン（レーン２）、およびキロダルトンでの指標サイズの一連の分子サイズのマーカタンパク質（レーン１）の銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを描く。移動は、頂部から底部までであった。
【図８】図８は、胎盤ビクニン（１０２−１５９）の発現を指示するプラスミド（ｐＳ６０４）で安定に形質転換された酵母株ＳＣ１０１（パネル８Ａ）またはＷＨＬ３４１（パネル８Ｂ）の成長から得られる細胞不含発酵ブロスに存在するトリプシン阻害活性の量を示す。
【図９】図９は、ウシアプロチニン、または胎盤ビクニン（１０２−１５９）の発現を指示するプラスミドで安定に形質転換された酵母株ＳＣ１０１（組換え体２．４および２．５）の成長から得られる細胞不含発酵ブロスの銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図９Ａ）および抗胎盤ビクニン（１０２−１５９）ｐＡｂを用いたウエスタンブロット（図９Ｂ）の両方を示す。移動は、頂部から底部までであった。
【図１０】図１０は、キロダルトンで示されたサイズの高度に精製した胎盤ビクニン（１０２−１５９）（レーン２）および一連の分子サイズマーカタンパク質（レーン１）の銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す写真である。
【図１１】図１１は、胎盤ビクミン（１０２−１５９）（図１１Ａ）をコードするか、胎盤ビクニン（１−２１３）（図１１Ｂ）をコードするかのいずれかである３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブにハイブリッド形成された種々のヒト組織から得られるｍＲＮＡのノザンブロットの結果を示す写真である。移動は、頂部から底部までであった。各ブロットの右にある数は、隣接ＲＮＡマーカのキロベースでのサイズに該当する。ｍＲＮＡが誘導される器官は、ブロットの各レーンの下に記載される。
【図１２】図１２は、合成の還元胎盤ビクニン（７−６４）（図１２Ａ）または１０２−１５９（図１２ｂ）のいずれかに対して生じたウサギ抗血清を用いた胎盤由来の胎盤ビクニンの免疫ブロットを描く。各パネルについては、内容は、分子サイズマーカ（レーン１）であった；ヒト胎盤から単離される生来の胎盤ビクニン（レーン２）；合成胎盤ビクニン（７−６４）（レーン３）および合成胎盤ビクニン（１０２−１５９）（レーン４）であった。トリシン１０−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、ブロットし、そしてプロテインＡ精製一次ポリクローナル抗体（２０ｍｌの０．１％ＢＳＡ／Ｔｒｉｓ−緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）中に８ｕｇ  ＩｇＧ）で、続いてアルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗ウサギ二次抗体で展開させた。移動は、頂部から底部までであった。
【図１３】図１３は、バキュロウイルス／Ｓｆ９発現システム（レーン２）から誘導される高度に精製した胎盤ビクニン（１−１７０）の３マイクログラムのクマシン青染色した１０−２０％トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを描く。レーン１は、分子サイズマーカを含む。移動は、頂部から底部までであった。
【図１４】図１４は、ヒト血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間におけるＳｆ９由来のヒト胎盤ビクニン（１−１７０）（黒抜き円形）、合成胎盤ビクニン（１０２−１５９）（白抜き円形）、またはアプロチニン（白抜き四角形）のいずれかの濃度を増大する効果の比較を描く。凝固は、ＣａＣｌ２で開始された。タンパク質の濃度は、凝固時間でのブロット対支持延長である。非阻害凝固時間は、３０．８秒であった。
【図１５】図１５は、３時間処理後のモルモット気管での潜在的差異におけるアミロライド（１００ｕＭ）およびハンクス平衡塩生理食塩水（ＨＢＳＳ）ビヒクル（対照）に対応して２ｕＭおよび０．２ｕＭの投与レベルでビクニンの効果を例示する。
【図１６】図１６は、（ａ）モルモットの気管に対応する点滴シリンジおよびベータプローブの位置決め；（ｂ）３２Ｐ標識Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅを用いた気管平均速度（ＴＭＶ）の測定についての個々のグラフ；および（ｃ）気管点滴に続く１．５、１．７５、２．０、２．２５および２．５時間でのＨＢＳＳビヒクル対照に対応するビクニン（５μｇ）に対応してモルモットでのインビボでのＴＭＶでの持続的増大を例示する。
【図１７】図１７は、ビクニン（７０ｎＭ）が、アミロライド（１０ｕＭ）に対して培養したヒト気管支上皮細胞でのナトリウムの流れを減少させることを例示する。
【図１８】図１８は、モルモット気管中のＴＭＶ増大、続いてエアロゾル処理での高張性生理食塩水（１４．４％）の５分のエアロゾルの効果を例示する。
【図１９】図１９は、モルモット気管中のＴＭＶにおけるアミロイド（１０ｍＭ）の２０分のエアロゾル、続いてエアロゾル処理での効果を例示する。
【図２０】図２０は、ビクニン（５ｕｇ／ｍＬ）、アプロチニン（５ｕｇ／ｍＬ）、およびアプロチニン二重ムテイン（０．５ｕｇ／ｍＬ、１．５ｕｇ／ｍＬ、および５ｕｇ／ｍＬ）が、インビトロでの培養したヒト気管支細胞でのナトリウム短期電流を減少させることを例示する。
【図２１】図２１は、アプロチニン（１ｍｇ／ｍＬ）が、ヒトＣＦ気管支上皮細胞でのインビトロでのＩｓｃを阻害したことを例示する。
【図２２】図２２は、ビクニンエアロゾル（３ｍＬの３ｍｇ／ｍＬ）が、ＰＢＳ対照に対応するヒツジでのＴＭＶを明らかに増大したことを例示する。
【図２３】図２３は、ビクニン（５０ｕｇ／ｍＬ）が、３０分間かけてモルモットの気管上皮細胞中のインビトロでのナトリウム流を阻害したことを例示する。
【図２４】図２４は、ビクニン（１００ｕｇ／ｍＬ）が、９０分間かけてヒツジの気管上皮細胞中のインビトロでのナトリウム流を著しく阻害したことを例示する。
【図２５】図２５は、（ａ）ＬＰＳに対する露出が、明らかなＰＭＮ流入を引き起こしたこと、そして（ｂ）ビクニンが、ＬＰＳに予め露出したモルモットでの潜在的差異を明らかに阻害したことを例示する。
【図２６】図２６は、アプロチニン二重ムテイン（１０ｕｇ）が、投与に続く１．５から２．５時間の持続期間をかけてＨＢＳＳに対応してモルモットでのインビボでＴＭＶを増大したことを例示する。
【図２７】図２７は、ｐＢＣ−ＢＫのプラスミド地図を表す（ＣＭＶ−ＩＥ＝サイトメガロウイルス即時；ＤＨＦＲ＝ジヒドロホレートレダクターゼ；ＡＭＰ−ｒ＝アンピシリン耐性）。
【図２８】図２８は、（ａ）ＣＨＯ発現ビクニン（１−１７０）（１０ｕｇ／ｍＬ）が、９０分の期間をかけてヒトＣＦ気管支上皮細胞でインビトロでのナトリウムの流れを減少させたこと、および（ｂ）１、５、および１０ｕｇ／ｍＬでのＣＨＯビクニン（１−７０）、および２０ｕｇ／ｍＬでのアプロチニンが、インビトロでのヒトＣＦ気管支上皮細胞に先端使用後９０分でのナトリウムの流れを減少させることを例示する。
【図２９】図２９は、ＣＨＯ細胞発現系からビクニン（１−１７０）を精製するプロセスの工程を例示する。
【図３０Ａ】図３０Ａは、Ｃ１８逆相クロマトグラフィを用いた精製ＣＨＯビクニン（１−１７０）の異性形態の移動のグラフを示す。プロットは、２８０ｎｍでの吸光度（実線）によって測定されるときのタンパク質溶出プロファイルの重複、およびタンパク質を溶出するのに使用される０．１％トリフルオロ酢酸でのアセトニトリルの含有率（ダイヤモンド）である。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、ＣＨＯ細胞発現系から発現される精製ビクニン（１−１７０）グリコシル化異性形態（レーン４５−５５）の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびキロダルトンで例示されたサイズの一連の分子サイズマーカタンパク質（レーン５４および５５の間）を示す写真である。移動は、頂部から底部までであった。
【図３１】図３１は、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理した（レーン２および４）および未処理（レーン１および３）のＣＨＯ精製ビクニン（１−１７０）異性形態の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびキロダルトンで例示されたサイズの一連の分子サイズマーカタンパク質を示す写真である。移動は、頂部から底部までであった。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ−１】
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【図４Ｃ−２】
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【図４Ｃ−３】
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【図４Ｃ−４】
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【図４Ｃ−５】
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【図４Ｃ−６】
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【図４Ｃ−７】
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【図４Ｃ−８】
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【図４Ｃ−９】
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【図４Ｃ−１０】
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【図４Ｃ−１１】
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【図４Ｃ−１２】
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【図４Ｃ−１３】
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【図４Ｃ−１４】
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【図４Ｃ−１５】
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【図４Ｃ−１６】
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【図４Ｃ−１７】
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【図４Ｃ−１８】
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【図４Ｃ−１９】
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【図４Ｃ−２０】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ−１】
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【図４Ｆ−２】
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【図４Ｇ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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