(57)【要約】【課題】電気生理計測装置において、孔と細胞との間のシール性能を良くして高精度に計測すること、チップのコストを低くすること、および細胞や薬液を操作性良く供給することにある。【解決手段】陰圧２０２をかけた時に、パッチ孔１０１の径が元の径よりも小さくなる部材１０２、例えばPDMSを用いる。さらに細胞１０４をパッチ孔１０１上に供給し、バッファー液供給流路６０２とパッチ孔１０１の流路の途中に、薬液供給流路６０３を設置し、バッファー液が薬液のシースフロー７０２になるマイクロ流路チップ６０１を構成する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の大きさよりも小さい孔を有する部材と、この部材を挟むように配置した電極と、前記細胞を前記孔に吸引する手段とを備え、前記孔上に前記細胞を吸引した状態で計測する細胞の電気生理計測装置において、前記細胞を前記孔に吸引する手段を駆動したときに、前記部材の前記細胞側に面した孔の径が元の径よりも小さくなる部材を用いたことを特徴とする細胞の電気生理計測装置。
【請求項２】
前記請求項１に記載した細胞の電気生理計測装置において、前記部材としてポリジメチルシロキサン（PDMS）を用いたことを特徴とする細胞の電気生理計測装置。
【請求項３】
前記請求項２に記載した細胞の電気生理計測装置において、前記部材の前記細胞を吸引する面としてプラズマ照射された面を用いることを特徴とする細胞の電気生理計測装置。
【請求項４】
前記請求項１〜３に記載した細胞の電気生理計測装置において、前記孔は前記細胞側に面した孔の径がその裏面側の孔の径よりも大きく、すり鉢形状にしたことを特徴とする細胞の電気生理計測装置。
【請求項５】
前記請求項１〜４に記載した細胞の電気生理計測装置において、前記部材の孔の上流部に細胞供給部を、下流部に廃液部を設置した流路を有し、前記細胞供給部と前記孔までの流路の途中に縮流部を有し、前記孔の下流側に、前記孔の中心から前記細胞の半径に相当する位置に、細胞の直径よりも狭い間隔に複数のせきを設置したことを特徴とする細胞の電気生理計測装置。
【請求項６】
前記請求項５に記載した細胞の電気生理計測装置において、前記部材の孔の上流部にバッファー液の供給部を設置し、前記バッファー液の供給部と前記孔までの流路の途中に、薬液の供給部を設置し、バッファー液が薬液のシースフローになるような流路形状にしたことを特徴とする細胞の電気生理計測装置。
【請求項７】
前記請求項６に記載した細胞の電気生理計測装置において、  前記薬液の供給部からの薬液量を調節する手段を有することを特徴とする細胞の電気生理計測装置。
【請求項８】
細胞の大きさよりも小さい孔を有する部材と、前記部材を挟むように配置した電極と、前記細胞を前記孔に吸引する手段とを備え、前記孔上に前記細胞を吸引した状態で計測する細胞の電気生理計測装置の使用方法において、細胞を前記部材の孔に吸引させた後、前記部材を前記電気生理計測装置から取り外して培養容器で一定時間培養させてから、前記部材を装置に設置して、計測を行うことを特徴とする細胞の電気生理計測装置の使用方法。
【請求項９】
前記請求項８に記載した細胞の電気生理計測装置の使用方法において、複数の細胞を前記部材の複数の孔に吸引させた後、電気生理計測装置から前記部材を取り外して培養容器に移し、前記培養容器で一定時間培養させてから、前記部材を装置に設置して、複数の細胞の計測を行うことを特徴とする細胞の電気生理計測装置の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単離細胞および培養細胞の電気生理的な信号を計測するための装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年の急激な新薬候補化合物の増加により、細胞の電気生理的活動を指標にして薬品をスクリーニングするための装置開発が強く望まれている。生きている細胞の細胞膜内外には、数１０ｍＶの電位差（静止膜電位）が存在する。予め任意の受容体を細胞表面に発現させた細胞では、添加された化合物が受容体に結合すると、膜中に存在するイオンチャネルが開く。その結果、膜内外のイオン濃度が変化し、膜を通して電流が流れることにより膜電位が変化する。細胞の電気生理的な信号を計測する装置では、固定膜電位に対する電流変化から、タンパク質の定量化を容易に行うことができる。そのため、イオンチャネルやトランスポータなどの電気生理学的情報が、直接高精度で得られる。これらの分析の結果は、臨床試験の方法の設計に貢献するだけでなく、ヒトへのリスクを回避する化合物の早期選別に有効な手段である。
【０００３】
細胞の電気生理的な信号を計測するための従来の装置としては、例えば、非特許文献１に記載されているパッチクランプ法がある。パッチクランプ法は、ガラスピペットで細胞を吸引することにより、ガラスピペットの先端に細胞を密着させ、さらなる吸引圧によってガラスピペットに密着している範囲内の細胞の細胞膜を破り、ピペット内と細胞内を同電位とする。その後、アンプ等の検出手段を用いて、ピペット内の電極の電位を参照電極の電位との差として検出することにより、細胞内の電位変化を検出する方法である。
【０００４】
一方、高速の薬品スクリーニングの用途、特にファーストスクリーニング（第一候補の絞り込み）の用途には、測定の迅速性、簡便性がより重視されるため、例えば特許文献１に開示されている微細孔を有する平板チップを使った電気生理的な信号を計測する装置がある。微細孔を有する平板チップを使った電気生理的な信号を計測する装置では、生体内塩濃度組成に近い溶液中で細胞、組織片等の生体試料を平板電極上に配置し、その電極の電位変化を測定することによりイオンチャンネルを通過するイオン流を検出する。この方法では、細胞をガラスピペットに密着させる操作等を必要としないので、簡便かつ迅速に生体内での状態に近い細胞の電気生理的活動を測定することができる。
【０００５】
【特許文献１】特開2004−12215号公報
【０００６】
【非特許文献１】Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ細胞生物学、第５版、南江堂、２００２、日本語版、中村桂子ら監訳、３８８〜３８９頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来の微細孔を有する平板チップを使った電気生理的な信号を計測する装置では、微細孔と細胞との間のシール性能が必ずしも良いとは限らなかった。微細孔と細胞との間のシール性能は、微細孔の径が小さいほど良くなる。一方、微細孔の径が小さくなると流体抵抗が大きくなり、吸引ポンプ等で細胞を微細孔上に吸引する力が弱くなる。このように、微細孔の径が小さくすると、微細孔と細胞との間のシール性能と、細胞を微細孔上に吸引する力とはトレードオフの関係になる。シール性能は電気生理的な信号の精度に直接影響を及ぼす因子である。高精度計測のためには、シール性能の向上という課題があった。
【０００８】
また、平板チップは通常使い捨てであるが、従来の平板チップの材質としては、シリコンあるいはガラスが用いられていた。このような平板チップの製造では、半導体製造等で用いられるフォトリソプロセスやイオンビームによる孔あけを利用しており、プロセス数もかなり多く、材料費も高く、非常に大量に生産しないとトータルのコストが高くなるという課題があった。
【０００９】
さらに、従来の微細孔を有する平板チップを使った電気生理的な信号を計測する装置では、細胞や薬液の供給方法が、必ずしも操作性の良いものではなかった。特に、細胞に投与する薬液は濃度の影響を調べるために、薬液濃度を数通り用意して溶液を投与する必要があり、細胞や薬液の供給システムが充分に整っていないという課題があった。
本発明は微細孔を有する平板チップを使った電気生理的な信号を計測する装置において、微細孔と細胞との間のシール性能を良くすること、チップのコストを低くすること、および細胞や薬液の供給システムを操作性の良いものにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで、上記目的のひとつを解決するために本発明は、細胞の大きさよりも小さい孔を有する部材と、前記部材を挟むように配置した電極と、細胞を前記孔に吸引する手段とを備え、細胞を前記孔に吸引する手段を駆動したときに、前記部材の細胞側に面した孔の径が元の径よりも小さくなる部材を用いたことを特徴とする細胞の電気生理計測装置を構成する。
【００１１】
また、上記目的のひとつを解決するために本発明は、前記部材としてポリジメチルシロキサン（PDMS）を用いた。
【００１２】
さらに、上記目的のひとつを達成するために本発明は、前記バッファー液の供給部と前記孔までの流路の途中に、薬液の供給部を設置し、バッファー液が薬液のシースフローになるような流路形状にし、前記薬液の供給部からの薬液量を調節する手段を設けた。
【発明の効果】
【００１３】
以上述べたように、本発明によれば、微細孔と細胞との間のシール性能が良くなり高精度に計測すること、チップのコストを低くすること、および細胞や薬液の供給を操作の良いシステムにすることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明について図１〜１２を参照しながら説明する。図１は、本発明の細胞の電気生理計測装置全体の模式図である。細胞１０４の直径よりも小さいパッチ孔１０１を有するたわみ部材１０２とそれを補強する補強部材１０３から構成されている計測チップ２０１（図２参照）を、計測ブロック１０５に設置する。計測チップ２０１上に、バッファー液１０６を満たし、参照電極１０７をバッファー液１０６中に、電極１０８をパッチ孔１０１の下方に設置し、アンプユニット１０９に接続して微弱な電流や電圧を計測する構成になっている。吸引ポンプ１１０は、バッファー液１０６中にある複数の細胞１０４のうちの１つをパッチ孔１０１に吸引するため際に使用する。そして細胞１０４をパッチ孔１０１に吸引したのちに、さらに陰圧２０２ （図２参照）をかければ細胞１０４の細胞膜も破壊することが可能になっている。本発明の細胞の電気生理計測装置にはこの他に、バッファー液供給部１１１、細胞供給部１１２、薬液供給部１１３、および廃液部１１４が設置されている。
【００１５】
図２は図１の計測チップの孔径の変化の様子を示した模式図である。計測チップ２０１は、直径が細胞１０４よりも小さい数μｍのパッチ孔１０１を有するたわみ部材１０２とそれを補強する補強部材１０３から構成されている。本実施例では、たわみ部材１０１にはシリコンゴムの一種であるポリジメチルシロキサン：PDMS（横1.5mm×縦1.5mm×高さ0.5mm、ヤング率 E=7.5×105 Pa、ポアソン比ν=0.49）を、補強部材１０３にはアクリル（横1.5mm×縦1.5mm×高さ0.5mm、孔径φ 1.0mm、ヤング率 E=3.0×109 Pa、ポアソン比ν=0.23）を用いている。図２（A）は、吸引ポンプ１１０で陰圧をかける前の状態のものであり、細胞１０４に面する側のパッチ孔１０１の直径φD０は５μｍである。一方、図２（B）は、吸引ポンプ１１０で陰圧をかけた状態をしたものであり、０．２×１０５Paで吸引した場合パッチ孔１０１はたわみ、細胞１０４に面する側のパッチ孔１０１の直径φD１は約４μｍになる。すなわち、部材１０１は、陰圧２０２をかけたときに、細胞側に面したパッチ孔１０１の径（φD１）が元の径（φD０）よりも小さくなる材料で構成されている。パッチ孔１０１と細胞１０４との間のシール性能は、パッチ孔１０１の径が小さいほど良くなる。一方、パッチ孔１０１の径が小さくなるとそこを流れる流体の抵抗が大きくなり、吸引ポンプ等で細胞１０４をパッチ孔１０１上に吸引する力が弱くなるというトレードオフの関係となっていた。しかし、上述のように、陰圧をかけたときに、細胞１０４側に面したパッチ孔１０１の径が、陰圧の大きさに応じて元の径よりも徐々に小さくなるポリジメチルシロキサン（PDMS）等の部材を用いることで、パッチ孔１０１と細胞１０４との間のシール性能を向上することができる。さらに、パッチ孔１０１を流れる流体の抵抗をあまり大きくせずに、細胞１０４をパッチ孔１０１上に吸引することも可能である。
【００１６】
また、パッチ孔１０１を有するポリジメチルシロキサン（PDMS）の計測チップ２０１の表面に、プラズマを照射して表面の濡れ性を良くする処理をすると、パッチ孔１０１と細胞１０４との間の付着性が良くなる。その結果、シール性能も向上し、電気生理信号の高精度な計測が可能になる。
【００１７】
なお、図２の計測チップ２０１の孔形状は、図３の計測チップ３０１に示すような細胞側に面した孔の径がその裏面側の孔の径よりも大きいすり鉢形状にしても良い。この形状の場合、細胞１０４がパッチ孔１０１に安定して吸着できるようになる。
【００１８】
次に、図４にパッチ孔１０１を有するポリジメチルシロキサン（PDMS）の計測チップ２０１の製造方法の一例を示す。まず図４（Ａ）に示すように、ガラス管４０１をマイクロマニピュレータ４０２に固定して、ガラス管４０１の先端が容器４０３の表面に接触するように配置する。その後、図４（Ｂ）に示すように、硬化剤を入れた液状のポリジメチルシロキサン（PDMS）４０４を流し込み、硬化するのを待つ。そして硬化後、図４（Ｃ）に示すように、ガラス管４０１を取り除くと、パッチ孔４０５が形成できる。
【００１９】
このように、パッチ孔４０５を有するポリジメチルシロキサン（PDMS）の計測チップ２０１を用いることで、従来のシリコンあるいはガラス製のチップと比較して、製造プロセス数もかなり少なく、かつ材料費も安いため、トータルのコストを低く抑えることが可能になる。
【００２０】
図５は、図１の計測チップにおいて細胞をパッチ孔上に供給するマイクロ流路構造を示した図である。細胞供給部１１２からパッチ孔１０１の上を通って廃液部１１４までの間に流路が形成されている。細胞供給部１１２はパッチ孔１０１の上流部にあり、途中には流路幅が３００μｍ程度の細胞供給流路５０３がある。また、廃液部１１４は、パッチ孔１０１の下流部にあり、途中には流路幅が６００μｍ程度の廃液流路５０４がある。なお、本実施例では細胞供給部１１２とパッチ孔１０１までの流路の途中に縮流部５０２を有し、パッチ孔１０１の下流側に、パッチ孔１０１の中心から細胞１０４の半径に相当する位置に、細胞１０４の直径よりも狭い間隔に複数のせき５０１が設置されている。このようなマイクロ流路構造を設置することにより、細胞１０４を効率良くパッチ孔１０１に供給することが可能になる。
【００２１】
図６のマイクロ流路用計測チップ６０１は、図５のマイクロ流路（細胞供給流路５０３と廃液流路５０４）にバッファー液供給流路６０２と薬液供給流路６０３を設置し、バッファー液と薬液を混合させるマイクロ流路を連結した計測チップの模式図である。
【００２２】
図７は、図６の計測チップ６０１においてバッファー液と薬液の混合の様子を示した模式図である。流路幅が６００μｍ程度のバッファー液供給流路６０２とパッチ孔１０１の流路の途中に、流路幅が３００μｍ程度の薬液供給流路６０３を設置し、バッファー液が薬液のシースフロー７０２になるような形状にしたことが特徴である。バッファー液と薬液は、マイクロオーダの流路を流れるので、分子拡散が速く、混合領域７０１でお互いに完全に混ざり合う。薬液の濃度は、薬液供給部１１３から、薬液供給流路６０３に流す流量をコントロールすることにより、適宜変えることができる。
【００２３】
以上、上述のようなマイクロ流路構造を設置することにより、ピペッタを使わずに、細胞や薬液の供給システムを操作性の良いものにすることが可能になる。
【００２４】
図８は、図６の計測チップ６０１を計測ブロック８０１に設置したシステムの模式図である。複数の継ぎ手８０２を用いて、バッファー液供給部１１１とバッファー液供給流路６０２、細胞供給部１１２と細胞供給流路５０３、薬液供給部１１３と薬液供給流路６０３、および廃液部１１４よ廃液流路５０４を連結し、図１に示した細胞の電気生理計測装置を構成して、計測を行うことができるようになっている。
【００２５】
図９は、図８の計測チップを計測ブロックに設置したシステム６０１を８個円周状に並べた場合の模式図である。中央部には、細胞供給部９０１、薬液供給図（図示せず）およびバッファー液供給部 （図示せず）を配置し、半径方向に８個にチップに並列に、細胞、薬液、およびバッファー液を供給できる構造にしたものである。
【００２６】
ここまでは、細胞１０４がパッチ孔１０１上に配置された後、時間をおかずに計測を行う場合の実施例について述べてきた。以下では、 細胞１０４を前記部材のパッチ孔１０１に吸引させた後、培養容器で一定時間培養させてから、前記部材を装置に設置して、計測を行う方法について述べる。
【００２７】
図１０は図１の計測チップにあらかじめ細胞をパッチ孔上に付着させてから計測する方法の模式図である。図１に記載された計測チップは取り外し可能となっている。図１０（Ａ）は、バッファー液中にある複数の細胞１０４のうちの１つの細胞１００１をパッチ孔１０１に吸引する工程である。次の図１０（Ｂ）は、細胞の電気生理計測装置から計測チップを取り外した後、細胞１００１がパッチ孔１０１上にある状態の計測チップ２０１を細胞培養容器１００２に一定時間（数時間程度）入れて、細胞１００１をパッチ孔１０１上に充分付着させる工程である。 そして図１０（Ｃ）は、細胞１００１がパッチ孔１０１上に充分付着した状態の計測チップ２０１を計測ブロック１０５に設置して、陰圧２０２をかけた後、微弱な電流や電圧を計測する工程である。このような方法を用いることにより、パッチ孔１０１と細胞が充分付着しているため、パッチ孔１０１と細胞との間のシール性能がさらに向上し、高精度な計測結果を得ることが可能になる。
【００２８】
図１１は、図１０の計測チップをマルチチャンネル化してあらかじめ細胞をパッチ孔上に付着させた場合の模式図である。また、図１２は、図１１のＡ−Ａ断面の模式図である。シリンジ１２０２を用いて、マルチチャンネル用計測チップ１１０１の各孔（図示せず）に、１６個の細胞１１０２を同時に吸引し、その後、上述の方法と同様に培養容器に一定時間入れてから計測を行う。なお、各孔に配置する細胞は、すべて同一の細胞１１０２でも良いが、別のイオンチャネルを発現させた細胞１１０３を入れても構わない。
培養容器から取り出したマルチチャンネル用計測チップ１１０１をマルチチャンネル用計測ブロック１２０１に設置して計測を行えるようになっている。吸引ポンプ１２０２で、複数の細胞１１０２に陰圧をかけ、その後、薬液供給部１２０３から、各々計測部に薬液を供給する。各々計測部には、参照電極１２０４と電極１２０５があり、切り替え器１２０６を介してアンプユニット１２０７に接続してある。切り替え器１２０６を適宜切り替えることにより、マルチチャンネルの計測が可能になる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明は、細胞の電気生理的活動を指標にして薬品をスクリーニングするための装置に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の細胞の電気生理計測装置全体の模式図。
【図２】図１の計測チップの孔径の変化の様子を示した模式図。
【図３】図１の計測チップの孔形状をすり鉢状にした場合の模式図。
【図４】図１のポリジメチルシロキサン（PDMS）製の計測チップの製造方法の一例。
【図５】図１の計測チップにおいて細胞をパッチ孔上に供給するマイクロ流路構造。
【図６】図５のマイクロ流路にバッファー液と薬液を混合するマイクロ流路を連結した計測チップの模式図。
【図７】図６の計測チップにおいてバッファー液と薬液の混合の様子を示した模式図。
【図８】図６の計測チップを計測ブロックに設置したシステムの模式図。
【図９】図８の計測チップを計測ブロックに設置したシステムを８個円周状に並べた場合の模式図。
【図１０】図１の計測チップにあらかじめ細胞をパッチ孔上に付着させてから計測する方法の模式図。
【図１１】図１０の計測チップをマルチチャンネル化してあらかじめ細胞をパッチ孔上に付着させた場合の模式図。
【図１２】図１１のＡ−Ａ断面の模式図。
【符号の説明】
【００３１】
１０１：パッチ孔                          １０２：たわみ部材
１０３：補強部材                          １０４：細胞
１０５：計測ブロック                    １０６：バッファー液
１０７：参照電極                       １０８：電極
１０９：アンプユニット                  １１０：吸引ポンプ
１１１：バッファー液供給部              １１２：細胞供給部
１１３：薬液供給部                      １１４：廃液部
２０１：計測チップ                      ２０２：陰圧
３０１：すり鉢状の孔を有するたわみ部材
４０１：ガラス管                        ４０２：マイクロマニピュレータ
４０３：容器
４０４：ポリジメチルシロキサン（PDMS）     
４０５：パッチ孔
５０１：せき                            ５０２：縮流部
５０３：細胞供給流路                        ５０４：廃液流路
６０１：マイクロ流路用計測チップ          ６０２：バッファー液供給流路
６０３：薬液供給流路
７０１：バッファー液と薬液の混合領域       ７０２：シースフロー
８０１：マイクロ流路用計測ブロック         ８０２：継ぎ手
９０１：細胞供給部
１００１：細胞                                １００２：細胞培養容器
１１０１：マルチチャンネル用計測チップ        １１０２：細胞
１１０３：細胞
１２０１：マルチチャンネル用計測ブロック      １２０２：吸引ポンプ
１２０３：薬液供給部                           １２０４：参照電極 
１２０５：電極                             １２０６：切り替え器
１２０７：アンプユニット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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