(57)【要約】【課題】検出精度を上げ且つ検出に要する時間を短縮することが可能な標的核酸を検出および／または定量するためのプローブの提供。【解決手段】制限酵素付着補助配列H、制限酵素認識配列R1〜Rn、フラグ配列FL1〜FLn、第一のプライマー配列ED、および前記第一の部分配列F1〜Fnに相補的な配列rF1〜rFn、を具備するアッパープローブU1〜Unと；リン酸基、前記第二の部分配列S1〜Snに相補的な配列rS1〜rSn、第二のプライマー配列rSD、タグ配列TG1〜TGn、制限酵素認識配列rR1〜rRn、およびエクステンションプライマーの配列と相補的な配列prEP、を具備するダウンプローブD1〜Dnとを具備するプローブを提供する。また、該プローブをもちいた方法を提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の部分配列F1〜Fnおよび第二の部分配列S1〜Snを含む標的核酸N1〜Nnを検出および／または定量するためのプローブであって、
5’末端側から順に、制限酵素付着補助配列H、制限酵素認識配列R1〜Rn、フラグ配列FL1〜FLn、第一のプライマー配列ED、および前記第一の部分配列F1〜Fnに相補的な配列rF1〜rFn、を具備するアッパープローブU1〜Unと；
5’末端側から順に、リン酸基、前記第二の部分配列S1〜Snに相補的な配列rS1〜rSn、第二のプライマー配列rSD、タグ配列TG1〜TGn、制限酵素認識配列rR1〜rRn、およびエクステンションプライマーの配列と相補的な配列prEP、を具備するダウンプローブD1〜Dnと；
を具備するプローブ（上記ｎは１以上の整数を表す）。
【請求項２】
請求項１に記載のプローブであって、前記標的核酸がＲＮＡであるプローブ。
【請求項３】
請求項１に記載のプローブであって、前記標的核酸がＤＮＡであるプローブ。
【請求項４】
請求項１に記載のプローブであって、前記制限酵素認識配列が制限酵素BglI, BstXI, SfiI, Tth111I,XmnI, BbvI, MboII, BsmI, MnlI, FokI, SfaN I, HgaI, Tth111II, HphI, およびGsuIからなる群から選択されるランダムな配列を産出せしめる制限酵素により切断される配列であるプローブ。
【請求項５】
第一の部分配列F1〜Fnおよび第二の部分配列S1〜Snを含む標的核酸N1〜Nnを検出および／または定量するための方法であって、以下の工程：  
前記標的核酸N1〜Nnと、アッパープローブU1〜UnおよびダウンプローブD1〜Dnとをハイブリダイズさせる工程と；  
ハイブリダイズさせた前記アッパープローブU1〜Unと前記ダウンプローブD1〜Dnとをライゲートして連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)を作出する工程と；  
前記連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)にハイブリダイズしている前記標的核酸N1〜Nnを反応系から排除する工程と；  
前記連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)をプライマーエクステンション法により2本鎖化して2重鎖化連結プローブ((U1＋D1) /r(U1＋D1))〜((Un＋Dn)/r(Un＋Dn))を作出する工程と；  
前記2重鎖化連結プローブ((U1＋D1) /r(U1＋D1))〜((Un＋Dn)/r(Un＋Dn))を制限酵素により切断して末端配列AT1〜ATnおよびrAT1〜rATnを作出する工程と；  
前記末端配列を有する分子同士を連結する工程と；  
一定の既知なる配列をPCR反応で増幅する工程と；  
を具備する方法（上記ｎは１以上の整数を表す）。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、間隙を充填する工程を前記ハイブリダイズさせる工程の後に更に具備する方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、前記排除する工程が除去処理により達成される方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法であって、前記排除する工程が分解処理により達成される方法。
【請求項９】
請求項５〜８の何れか１項に記載の方法であって、前記標的核酸がＲＮＡである方法。
【請求項１０】
請求項５〜８の何れか１項に記載の方法であって、前記標的核酸がＤＮＡである方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記標的核酸であるＤＮＡをdUTPでラベルする工程を前記ハイブリダイズさせる工程の前に更に具備する方法。
【請求項１２】
請求項５〜１１の何れか１項に記載の方法であって、前記制限酵素認識配列が制限酵素BglI, BstXI, SfiI, Tth111I,XmnI, BbvI, MboII, BsmI, MnlI, FokI, SfaN I, HgaI, Tth111II, HphI, およびGsuIからなる群から選択されるランダムな配列を産出せしめる制限酵素により切断される配列である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解析対象となる標的核酸を検出および／または定量するためのプローブに関し、より詳細には解析対象となる標的核酸が具備する核酸配列を操作しやすい核酸配列へと変換して検出および／または定量するためのプローブに関する。また、本発明は、前記プローブを使用して前記標的核酸を検出および／または定量するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAチップを用いた解析技術は、操作が非常に簡便であるなどの多くの有用性を備え、核酸解析の迅速性を極めて向上させ得る優れた技術である。しかし、従来のDNAチップでは、単に、検出すべき標的核酸の塩基配列と相補的な配列を有するプローブが固相されているにすぎない。このため各プローブの至適ハイブリダイゼーション条件が一定ではなく、結果として偽陽性ハイブリダイゼーションが起こりやすいという欠点を有している。このような偽陽性ハイブリダイゼーションを避けるためには、各プローブ毎に最適化されたハイブリダイゼーション条件を付与すればよい。しかしながら、極めて密に固相化された各プローブ毎に最適な条件を与えることは不可能である。このような理由から従来のDNAチップは、特異性が十全でないというハイブリダイゼーションに存する根本的な問題を解決するには至っていない。加えて、従来のDNAチップでは、検出すべき標的核酸の種類が変われば、新たにそれら核酸の相補配列を固相化し直さなければならないので、極めて多種類の核酸が検出対象とされる臨床検査に適用するには汎用性が十分ではないという欠点をも有している。
【０００３】
陶山らは従来技術の欠点を解決すべく、検出すべき標的核酸の配列を操作しやすい配列群（この配列群とは即ち、ほぼ一定の長さをもちかつほぼ一定の解離温度を有しさらに互いに相補性を具備しない配列群）に変換してから検出する方法を開発した（特許文献１）。特許文献１の配列変換方法および検出方法は、操作しやすい配列群を具備しているプローブDNAおよび標識タグを具備するプローブDNAを準備し、次に標的核酸とハイブリダイズし、続いてライゲーション反応を行うことにより、操作しやすい配列群を具備しているプローブDNAと標識タグを具備するプローブDNAとを特異的に連結する。そして、前記操作しやすい配列群と基質に固定化してある前記操作しやすい配列群の相補鎖とをハイブリダイズさせ、基質を洗浄した後に連結したプローブの標識タグ由来の標識を検出する方法である。
【０００４】
特許文献１では、変換した配列を増幅していないので標的核酸の存在量によっては感度が劣る可能性がある。そこで連結したプローブをPCRで増幅する方法も考えられるが、標的核酸もPCRの鋳型として働いて検出の際のバックグラウンドノイズとなることが大いに推定される。
【０００５】
また、同様の技術を開示している特許文献２のように、連結したプローブを固相化した担体を用いた標的核酸をＢ／Ｆ分離する工程を設けて、その後に連結したプローブをPCRで増幅する方法が考えられる。しかしながら、この場合は固相担体への標的核酸の非特異的吸着が懸念され、このように非特異的に吸着した標的核酸がPCRの鋳型となり分析に干渉する可能性がある。
【０００６】
【特許文献１】特許第３１０３８０６号公報
【特許文献２】特開２００２−３１８９９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は解析対象である標的核酸を操作しやすい配列へと変換・増幅した後に検出および／または定量するためのプローブ及び方法を提供することを課題とする。より具体的には、検出精度を上げ且つ検出に要する時間を短縮することが可能な前記プローブ及び方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の手段を提供することによって本発明の課題を解決するものである、即ち、  
第一の部分配列F1〜Fnおよび第二の部分配列S1〜Snを含む標的核酸N1〜Nnを検出および／または定量するためのプローブであって、
5’末端側から順に、制限酵素付着補助配列H、制限酵素認識配列R1〜Rn、フラグ配列FL1〜FLn、第一のプライマー配列ED、および前記第一の部分配列F1〜Fnに相補的な配列rF1〜rFn、を具備するアッパープローブU1〜Unと；
5’末端側から順に、リン酸基、前記第二の部分配列S1〜Snに相補的な配列rS1〜rSn、第二のプライマー配列rSD、タグ配列TG1〜TGn、制限酵素認識配列rR1〜rRn、およびエクステンションプライマーの配列と相補的な配列prEP、を具備するダウンプローブD1〜Dnと；
を具備するプローブ（上記ｎは１以上の整数を表す）を提供する。
【０００９】
また、第一の部分配列F1〜Fnおよび第二の部分配列S1〜Snを含む標的核酸N1〜Nnを検出および／または定量するための方法であって、以下の工程：  
前記標的核酸N1〜Nnと、アッパープローブU1〜UnおよびダウンプローブD1〜Dnとをハイブリダイズさせる工程と；  
ハイブリダイズさせた前記アッパープローブU1〜Unと前記ダウンプローブD1〜Dnとをライゲートして連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)を作出する工程と；  
前記連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)にハイブリダイズしている前記標的核酸N1〜Nnを反応系から排除する工程と；  
前記連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)をプライマーエクステンション法により2本鎖化して2重鎖化連結プローブ((U1＋D1) /r(U1＋D1))〜((Un＋Dn)/r(Un＋Dn))を作出する工程と；  
前記2重鎖化連結プローブ((U1＋D1) /r(U1＋D1))〜((Un＋Dn)/r(Un＋Dn))を制限酵素により切断して末端配列AT1〜ATnおよびrAT1〜rATnを作出する工程と；  
前記末端配列を有する分子同士を連結する工程と；  
一定の既知なる配列をPCR反応で増幅する工程と；  
を具備する方法（上記ｎは１以上の整数を表す）を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
解析対象である標的核酸を操作しやすい配列へと変換して解析する場合において、高感度で且つ検出の際のバックグラウンドノイズが低いため検出精度が上がる。また、Ｂ／Ｆ分離する工程を必要としないなどの特徴を具備していることから、検出に要する時間を短縮できる。  
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
[緒  言]
生体試料中に存在する特定の核酸分子を検出する技術は、特定臓器で発現・機能するタンパク質の核酸分子レベルでの解析、或いは神経、脳または免疫系での情報伝達におけるタンパク質の発現制御の研究等において重要であるのみならず、遺伝的疾患の変異遺伝子の検出、癌の診断、ウイルス関連遺伝子の検出等遺伝子診断においても極めて重要である。しかしながら、従来の技術は、煩雑で且つ多くの工程を含み、熟練を要するために、操作によってはかなりの時間が必要とされることが多い。また、遺伝子診断などは確定診断として用いられるため誤りが許されず、さらに迅速性も要求される。そのため、迅速性を保ちながら高い精度有していなければならないが、従来の技術は、かかる要請を十分に満足するものとはいえない。
【００１２】
試料中に存在する特定の核酸分子を検出する代表的な技術としては、ハイブリダイゼーション法がある。核酸のハイブリダイゼーション分析は、多種類の核酸の中から非常に少数の標的核酸(DNAやRNA)をプローブで検出する技術である。しかしながら、ハイブリダイゼーション法では、高感度なレポーター（酵素、蛍光色素、ラジオアイソトープ等）を用いても、低コピー数（1〜1000個）の標的核酸分子を検出するのは困難である。さらに、ハイブリダイゼーション法には、非特異反応という大きな問題点が存するため、類似した複数の核酸分子から特定の核酸分子のみを検出することが難しい。このように、核酸ハイブリダイゼーション法は感度及び特異性が十分ではないため、高感度な検出を要する臨床的診断に適用することは困難である。
【００１３】
このような古典的なハイブリダイゼーション法とは全く異なるDNA検出法として、フォードール（Fodor）ら、サイエンス（Science）第251巻、767−773頁、1991年は、写真平板技術を用いてマトリックス上にオリゴヌクレオチドを合成する方法を開示している。また、ピルング（Pirrung）ら、米国特許第5,143,8、核酸検出法特開２００１−９５５７０- 2 -54号、1992年9月1日は、シリコン基板上のアレイ様式にてのポリペプチドの大規模写真平板固相合成法を教示している。さらに、ビーティエ（Beattie）、「1992年サンジエゴ会議：遺伝子認識（The 1992 San Diego Conference：Genetic Recognition）」1992年11月では、超微細ロボットエ学システムを用いて、特異的DNA配列を含む微小液滴をガラス基体上の個々の超微細加工試料ウェルに滴下させて基体上にDNA配列を合成する方法を開示している。この方法において、各試料ウェル上でのハイブリダイゼーションは、交流電場で各個別超微小ウェルを取り囲んだ、ミニチュア電極試験固定体を応答指令信号を送ることによって検出する。このような方法によって固相上に多種類のDNAが合成されたDNAチップは、ハイブリダイゼーション法に比べて操作が非常に簡便であるため、診断の迅速性を極めて向上させ得る。しかし、従来のDNAチップを用いた技術には、上記の背景技術に記載したような課題がある。  
本発明は、核酸の分析、特にDNAチップを用いた分析に有用なプローブ及び方法を提供することによって上記課題を解決するものである。
【００１４】
[本発明の分析対象]  
本発明の分析対象は核酸であり、特に本発明を用いて検出および／または定量を意図する核酸を標的核酸と称する。また、本発明において、「核酸」の用語は、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、mRNA、全RNA、hnRNA、合成RNAを含む全てのDNA及びRNAを意味する。  
標的核酸は、任意の配列を有する任意の核酸であり得る。特に、遺伝病の原因遺伝子、癌関連遺伝子、又はウイルス由来の核酸など疾病のマーカーとなり得る核酸は、本発明の好ましい標的核酸である。標的核酸を含有する試料には、血液、尿、唾液等の体液が含まれるが、標的核酸を含有する体液以外の任意の試料をも使用し得る。試料が固体であれば、酵素処理、界面活性剤又は有機溶媒の添加等の適切な方法で液体に溶解せしめればよい。
【００１５】
《標的核酸》  
標的核酸がDNAの場合は特にdUTPでラベルすることが望ましい。DNAをdUTPでラベルする方法は合成過程でdTTPの代わりにdUTPを取り込ませる方法が一般に使われる。
また、本発明において標的核酸は、  
標的核酸１（第一の部分配列F1および第二の部分配列S1を同一鎖内に具備する）、  
標的核酸２（第一の部分配列F2および第二の部分配列S2を同一鎖内に具備する）、  
・・・、並びに、  
標的核酸ｎ（第一の部分配列Fnおよび第二の部分配列Snを同一鎖内に具備する）、  
のように表記される１〜ｎまでの種類の核酸である。このように標的核酸１、標的核酸２、…、および標的核酸ｎと表される複数の核酸の集合を以下「標的核酸N1〜Nn」と略記する。
【００１６】
前記ｎは１以上の整数である。即ち、前記ｎが１の場合は前記標的核酸が前記標的核酸を１種類のみを含むことを意味し、前記ｎが２以上の場合は前記標的核酸が複数種類の標的核酸を含むこととなる。このように本発明において「１〜ｎ」は、核酸配列などの本発明のプローブの構成要件が複数存在することを意味する場合に使用される。
【００１７】
以下、同様に第一の部分配列F1、第一の部分配列F2、…、および第一の部分配列Fnと表される複数の核酸の集合を以下「第一の部分配列F1〜Fn」と略記する。更に、同様に第二の部分配列F1、第二の部分配列F2、…、および第二の部分配列Fnと表される複数の核酸の集合を以下「第二の部分配列S1〜Sn」と略記する。
【００１８】
第一の部分配列F1〜Fnおよび第二の部分配列S1〜Snの塩基配列は、該部分配列に相補的な配列を具備するプローブが、それぞれ対応する該部分配列と同じ反応系において各標的核酸N1〜Nn中から特異的なハイブリダイゼーションを達成し得るように融解温度（ＴＭ）などのハイブリダイゼーションに影響する要素を考慮して選択して設定される。また、第一の部分配列F1〜Fnおよび第二の部分配列S1〜Snは、各々対応する標的核酸N1〜Nn中の同一分子内で隣接し且つ異なる塩基配列を有する配列から選択することが好ましい。しかしながら、例えば、ある部分配列に含まれる配列が他の部分配列に重複して含まれていてもよく、全体としての配列の相違が大きく実質的に前記特異的なハイブリダイゼーションが達成されればよい。第一の部分配列F1〜Fnおよび第二の部分配列S1〜Snの塩基数は、安定なハイブリダイゼーションを達成するために15塩基以上であることが好ましい。
【００１９】
[本発明のプローブ]  
本発明のプローブは、標的核酸N1〜Nnを検出および／または定量するためのプローブであって、  
以下の特徴を具備する第一および第二のプローブを具備するプローブである。
【００２０】
＜第一のプローブ＞  
本発明の第一のプローブは、5’末端側から順に：  
制限酵素付着補助配列Hと；  
制限酵素認識配列R1〜Rnと；  
フラグ配列FL1〜FLnと；  
第一のプライマー配列EDと；  
上記標的核酸N1〜Nnの第一の部分配列F1〜Fnに相補的な配列rF1〜rFnと；  
を具備するアッパープローブU1〜Unである。  
《第一のプローブに固有な要素》  
制限酵素付着補助配列Hは、前記制限酵素認識配列R1〜Rnの制限酵素による切断が正常に行われる配列が選択される。例えば、3個以上、好ましくは３から１０塩基程度の鎖長を有する任意の配列であればよい。  
配列rF1〜rFnは、上記標的核酸N1〜Nnの第一の部分配列F1〜Fnに相補的な配列である。従って、適切な条件下で標的核酸N1〜Nnと反応させた場合に第一の部分配列F1〜Fnに特異的にハイブリダイズする。
【００２１】
＜第二のプローブ＞  
本発明の第二のプローブは、5’末端側から順に：  
リン酸基と；  
上記標的核酸N1〜Nnの第一の部分配列F1〜Fnとは異なる第二の部分配列S1〜Snに相補的な配列rS1〜rSnと；  
第二のプライマー配列rSDと；  
タグ配列TG1〜TGnと；  
制限酵素認識配列rR1〜rRnと；  
エクステンションプライマーの3’末端側一部または全てと相補的な配列prEPと；  
を有するダウンプローブD1〜Dnである。  
《第二のプローブに固有な要素》  
リン酸基は、アッパープローブ3'末端とダウンプローブの5'末端との間にホスホジエステル結合を達成するために必要である。  
配列rSnは、上記標的核酸N1〜Nnの第二の部分配列S1〜Snに相補的な配列である。従って、適切な条件下で標的核酸N1〜Nnと反応させた場合に第二の部分配列S1〜Snに特異的にハイブリダイズする。  
配列prEPは、配列pEPを具備するエクステンションプライマーがハイブリダイズし、適切な条件下で該プライマーが3'方向に伸長して相補鎖を形成し得る配列である。配列pEPは、配列prEPの一部又は全体と相補的な配列である。また、配列pEPは、エクステンションプライマーの3’末端側一部または該プライマー全体を構成する配列である。prEP配列の塩基数は特異的なハイブリダイゼーションを達成し得る鎖長であればよいが、安定なプライマーエクステンション反応を達成するために、15塩基以上であることが好ましい。当業者は、適切なエクステンションプライマーを配列prEPに基づいて設計できる。
【００２２】
＜第一および第二のプローブの共通要素＞  
《プライマー配列》  
前記プライマー配列は、ＰＣＲ反応を行う際に用いられるプライマーが反応する配列である。第一のプライマー配列EDならびに第二のプライマー配列rSDの塩基数は特異的なハイブリダイゼーションを達成し得る鎖長であればよいが、安定なPCR反応を達成するために、15塩基以上であることが好ましい。
【００２３】
《タグ配列およびフラッグ配列》  
タグ配列TG1〜TGn及びフラッグ配列FL1〜FLnは、それぞれが由来するアッパープローブU1〜Un及びダウンプローブD1〜Dnが連結された配列を特定の配列に変換した際の識別情報として使用される。タグ配列およびフラッグ配列の塩基数及び塩基配列は任意のものであり得るが、同様の至適ハイブリダイゼーション条件を有する組み合わせとなるように選択することが好ましい。  
また、タグ配列とフラッグ配列とは、以下に説明する本発明の方法の工程６で制限酵素配列Rを挟んで並ぶ。この場合、並んだタグ配列とフラッグ配列とは同一の配列であってもよいが、好ましくは一部、より好ましくは全てが異なるものであるようにタグ配列およびフラッグ配列を設定される。これらの配列の設定は、それぞれのタグ配列及びフラッグ配列が由来するアッパープローブおよびダウンプローブの情報を分析する際に解読することができ、所望の情報が得られるように実施者の目的に応じて適宜設定すればよい。従って、タグ配列およびフラッグ配列は、目的、標的核酸の数などによって様々に設定することが可能である。
【００２４】
《制限酵素認識配列》  
各アッパープローブU1〜Un中の制限酵素認識配列R1〜Rn及び各ダウンプローブD1〜Dn中の制限酵素認識配列rR1〜rRnは、特定の制限酵素で切断すると任意の相補的末端配列AT1〜ATnおよびrAT1〜rATnを産出する配列である。この任意の相補的末端配列AT1〜ATnおよびrAT1〜rATnは、同一の標的核酸に結合するアッパープローブ及びダウンプローブ（即ち、本発明において同一の番号で表現されるアッパープローブ及びダウンプローブ）では相補的な該末端配列（いわゆる粘着末端配列）を産出するように設計される。従って、本発明の方法の工程５において制限酵素で処理した結果、同一番号で表現されるアッパープローブ及びダウンプローブを含む分子同士が、特異的に結合することになる。このように、同一の標的核酸に結合するアッパープローブ及びダウンプローブを含む分子において、同一の相補的末端配列を生じさせるためには、次ぎのような制限酵素を使用することが好ましい。即ち、切断する対象配列において酵素の認識配列が該対象配列の両側もしくは片側にあり且つ該対象配列の中央部もしくはその近傍の配列が任意の配列であっても酵素活性に影響せず且つ該対象配列の中央部もしくはその近傍で粘着末端を形成するように切断する制限酵素を用いればよい。このような制限酵素には、例えば、制限酵素BglI, BstXI, SfiI, Tth111I,XmnI, BbvI, MboII, BsmI, MnlI, FokI, SfaN I, HgaI, Tth111II, HphI, およびGsuIなどが含まれる。このような制限酵素で切断されるような配列を制限酵素認識配列として用いた場合、一種類の制限酵素で多様な任意の相補的末端配列AT1〜ATnおよびrAT1〜rATnを産出するので特に好ましい。
【００２５】
[本発明の方法]  
以下、図１を参照しながら、本発明の方法の一態様を説明する。  
＜工  程１＞  
本方法の第一工程は、  
存在を検出又は定量すべき試料標的核酸１、標的核酸２、…、標的核酸ｎ（以下標的核酸N1〜Nnと略記する）と；  
5’末端側から順に制限酵素付着補助配列H、制限酵素認識配列R1、一定の既知なるフラグ配列FL1、第一のプライマー配列EDならびに上記標的核酸１の第一の部分配列F1に相補的な配列rF1を有するアッパープローブ１と、  
5’末端側から順に制限酵素付着補助配列H、制限酵素認識配列R2、一定の既知なるフラグ配列FL2、第一のプライマー配列EDならびに上記標的核酸2の第一の部分配列F2に相補的な配列rF2を有するアッパープローブ２と…、  
5’末端側から順に制限酵素付着補助配列H、制限酵素認識配列Rn、一定の既知なるフラグ配列FLn、第一のプライマー配列EDならびに上記標的核酸nの第一の部分配列Fnに相補的な配列rFnを有するアッパープローブnを含む（以下アッパープローブU1〜Unと略記する）第一のプローブ群と；  
5’末端側から順にリン酸基p、前記標的核酸１の第一の部分配列F1とは異なる第二の部分配列S1に相補的な配列rS1、第二のプライマー配列rSD、一定の既知なるタグ配列TG1、制限酵素認識配列rR1、エクステンションプライマーの3’末端側一部または全てと相補的な配列prEPを有するダウンプローブ１と、  
5’末端側から順にリン酸基、前記標的核酸２の第一の部分配列F2とは異なる第二の部分配列S2に相補的な配列rS2、第二のプライマー配列rSD、一定の既知なるタグ配列TG2、制限酵素認識配列rR2、エクステンションプライマーの3’末端側一部または全てと相補的な配列prEPを有するダウンプローブ２と…、  
5’末端側から順にリン酸基、前記標的核酸nの第一の部分配列Fnとは異なる第二の部分配列Snに相補的な配列rSn、第二のプライマー配列rSD、一定の既知なるタグ配列TGn、制限酵素認識配列rRn、エクステンションプライマーの3’末端側一部または全てと相補的な配列prEPを有するダウンプローブnを含む（以下ダウンプローブD1〜Dnと略記する）第二のプローブ群と；  
を適切に反応させることにより前記標的核酸N1〜Nnに前記アッパープローブU1〜Unおよび前記ダウンプローブD1〜Dnをハイブリダイズさせる工程である。
【００２６】
各プローブを対応する標的核酸にハイブリダイズさせるには、標的核酸が一本鎖ならば、別段の変性処理を行わずに、標的核酸を含む試料と両プローブ群を混合してハイブリダイズすればよい。標的核酸N1〜Nnが二本鎖である場合には、例えば90℃程度の高温で数分間静置して、相補的結合を解離せしめた後に、両プローブ群を添加し、例えば50℃程度の温度で2〜3時間静置することにより、ハイブリダイズを行えばよい。
【００２７】
ハイブリダイゼーションの条件（すなわち使用する緩衝液の種類、温度条件、時間等）を標的核酸の種類に応じて適宜選択し得ることは、当業者には自明である。ハイブリダイゼーションを行うと、アッパープローブU1〜UnおよびダウンプローブD1〜Dnは対応する標的核酸N1〜Nnに結合する。
【００２８】
＜工  程２＞  
本方法の第二工程は、  
前工程で前記標的核酸N1〜Nnにハイブリダイズした前記アッパープローブU1〜Unと前記ダウンプローブD1〜Dnとをライゲートする工程である（図1(2)を参照）。
【００２９】
前工程で前記標的核酸N1〜Nnにハイブリダイズした前記アッパープローブU1〜Unおよび前記ダウンプローブD1〜Dnにリガーゼ等を作用させ、アッパープローブU1〜Unの３'末端部とダウンプローブD1〜Dnの５'末端部とを連結して、プローブU1＋D1、プローブU2＋D2、…プローブUn＋Dn（以下、連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)と略記する）を作出する。両プローブ群を連結するために使用し得る好適なリガーゼには、サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)のTaqDNAリガーゼ、Ｔ4リガーゼなどが含まれるが、これに限定されず、標的核酸の種類に応じて任意のDNAリガーゼ又はRNAリガーゼを使用し得る。また、酵素的な手法に変えて、化学的な手法で両プローブ群を連結してもよい。
【００３０】
アッパープローブU1〜Unの３'末端部とダウンプローブD1〜Dnの５'末端部との間に間隙が生じて隣接せず結果として互いが連結されないときには、本工程前に間隙を充填する工程を適用して該間隙に適切な核酸を導入してもよい。間隙を充填する工程は、例えば、DNAポリメラーゼ又はRNAポリメラーゼを適切な条件下で適用することにより達成できる。また、該工程は、例えば、Taqポリメラーゼ等の耐熱性DNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ反応を適切な条件下で適用することにより達成できる。
【００３１】
＜工  程３＞  
本方法の第三の工程は、  
連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)にハイブリダイズしている対応する標的核酸を反応系から排除する工程である。
【００３２】
本工程は、残存する標的核酸が後続する工程において不都合な干渉反応を生じないように、標的核酸を反応液中で分解したり反応液から選択的に除去するものであって、後続する工程において標的核酸による有意な干渉反応が起こらない場合には必須な工程ではない。また、残存する標的核酸による干渉反応が問題となる工程の前であれば、後続する別の工程の後に実施してもよい。中が後続する別の工程中又はその工程後に実施してもよい。通常、分解処理の方が除去処理に比べて洗浄の手間が減るので好ましい。かかる分解処理又は除去処理は、何れか一方もしくは双方を組み合わせて実施される（図1(3)を参照）。以下にそれぞれの処理について説明する。
【００３３】
《分解処理》  
分解処理は、標的核酸N1〜Nnの核酸の種類によって処理方法が異なる。  
dUTPが取り込まれているDNAの場合は、ウラシルDNAグリコシラーゼで該DNAのウラシル部分が切断され、更に熱分解に供すれば標的核酸N1〜Nnは連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)から解離し分解する。  
RNAの場合は除去する場合と同様に、標的核酸から連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)を解離させ、RNaseAなどのRNA分解酵素にてRNAを分解する。アルカリ変性により標的核酸から連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)を解離させ、分解も同時に達成してもよいが、pHがアルカリ側に傾くので中性付近まで中和する必要がある。
【００３４】
《除去処理》  
除去処理では、まず対応する標的核酸から連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)を解離させる。連結プローブの解離は、熱的変性及び化学的変性を含む変性処理によって達成される。熱的変性によりプローブを解離させる場合には、生理的条件下では、85℃以上、好ましくは90℃以上の温度にすればよいが、当業者であれば、プローブ中のGC含量に応じて、適切な温度を選択し得ることは自明であろう。  
本工程で除去処理を実施する場合は、本工程より前の工程において標的核酸を前記リガンドなどによりラベルしておく。該リガンドを担体に固相化したアクセプターにて吸着すれば標的核酸を除去することができる。前記アクセプターには一般的にビオチンに対してアビジン、Dig（ジゴキシゲニン）に対して抗Dig抗体が用いられる。また前記担体にはシリコン、ガラス等の基板、粒子、試験管やバイアル瓶等の容器、繊維、キャピラリー等の毛管を含む管、アフィニティーカラム、フィルター、電極等が含まれるが、これらに限定されない。好ましい固相担体は、シリコン基板、粒子、及びキャピラリーである。  
以上のようにして、標的核酸を反応系から排除する。
【００３５】
＜工  程４＞  
本方法の第四の工程は、  
連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)をプライマーエクステンション法により2本鎖化する工程である（図1(4)を参照）。
【００３６】
まず、上記で説明した条件を具備するエクステンションプライマーを準備する。  
次にエクステンションプライマー、連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)、適切な各種ヌクレオチド、DNAポリメラーゼ又はRNAポリメラーゼを適切な条件下で混合する。この操作によって、エクステンションプライマーがハイブリダイズし、DNAポリメラーゼ又はRNAポリメラーゼによって、連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)の相補鎖が合成され連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)は2重鎖化される（以下2重鎖化された連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)は2重鎖化連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)/r(U1＋D1)〜r(Un＋Dn)と表記する）。連結プローブ(U1＋D1)〜(Un＋Dn)中の配列prEPの3'末端が正常にエクステンションプライマーと相補鎖形成しており且つエクステンションプライマー5'末端の一部が該3'末端よりも長いために相補鎖形成せずに１本鎖の状態にある場合、１本鎖の状態にある該エクステンションプライマー5'末端の一部の相補鎖も合成され２本鎖の状態となる。反応中には第一および第二の工程で反応に関与しなかったダウンプローブD1〜Dnも混在しているが、このダウンプローブD1〜Dnも同様にプライマーエクテンションされ相補鎖が合成され2重鎖化される（以下2重鎖化されたダウンプローブD1〜Dn を2重鎖化ダウンプローブD1〜Dn/ rD1〜rDnと表記する）。
【００３７】
続いて、ポリメラーゼ活性を失活させる。非耐熱性ポリメラーゼを使用した場合は、該ポリメラーゼが失活する温度条件および時間条件でインキュベートする。耐熱性ポリメラーゼを使用した場合は、該ポリメラーゼ活性を中和する中和抗体などを使用して酵素活性を阻害する。フェノールを始めとする除タンパク質剤または除タンパク質フィルターを用いて蛋白質を除去してもよい。
【００３８】
＜工  程５＞  
本方法の第五の工程は、  
2重鎖化連結プローブ((U1＋D1) /r(U1＋D1))〜((Un＋Dn)/r(Un＋Dn))をその末端部で制限酵素により切断する工程である（図1(5)を参照）。
【００３９】
まず、2重鎖化連結プローブ((U1＋D1) /r(U1＋D1))〜((Un＋Dn)/r(Un＋Dn))に前記制限酵素を混合し至適温度で至適時間インキュベートする。反応後は前記制限酵素が失活する温度および時間条件でインキュベートする。第四の工程で耐熱性ポリメラーゼを使用してその中和抗体でポリメラーゼ活性を抑えている場合は前記制限酵素の失活温度が中和抗体の失活温度を越えないようにすべきである。前記制限酵素として耐熱性制限酵素を使用した場合は、第四の工程で耐熱性ポリメラーゼを使用した場合と同様に失活させるか又は除去する。使用する制限酵素は上記定義した制限酵素が既に記した理由により望ましい。
【００４０】
2重鎖化連結プローブ((U1＋D1) /r(U1＋D1))〜((Un＋Dn)/r(Un＋Dn))は両末端近傍に制限酵素認識部位と制限酵素付着補助部位を有しているので本工程で両端が制限酵素により切り取られ、結果として両端に互いに相補な塩基配列を任意の末端配列AT1〜ATnおよびrAT1〜rATnを有することとなる。2重鎖化ダウンプローブD1〜Dn/ rD1〜rDnも同様に制限酵素によってprEP側の末端のみが切断され、任意の末端配列rAT1〜rATnを有することとなる。
【００４１】
＜工  程６＞  
本方法の第六の工程は、  
第五の工程で産出せしめた両末端に互いに相補な塩基配列を有する2重鎖化連結プローブ((U1＋D1) /r(U1＋D1))〜((Un＋Dn)/r(Un＋Dn))同士を連結する工程である（図1(6)を参照）。
【００４２】
第五の工程で産出せしめた両末端に互いに相補な塩基配列を有する2重鎖化連結プローブ((U1＋D1) /r(U1＋D1))〜((Un＋Dn)/r(Un＋Dn))にライゲース、ヌクレオチドなどを混入し至適条件下でインキュベートする。  
第五の工程で生じた2重鎖化連結プローブ((U1＋D1) /r(U1＋D1))〜((Un＋Dn)/r(Un＋Dn))は同じ当該任意の末端配列AT1〜ATnおよびrAT1〜rATnを有しているので同番号の連結分子同士が本工程で連結する。
【００４３】
2重鎖化ダウンプローブ(D1 /rD1 〜Dn /rDn)もprEP側に末端配列rAT1〜rATnを有している。従って、2重鎖化ダウンプローブ(D1 /rD1 〜Dn /rDn)は、この末端配列rAT1〜rATnを介して、2重鎖化ダウンプローブ(D1 /rD1 〜Dn /r Dn) 同士および2重鎖化連結プローブ((U1＋D1) /r(U1＋D1))〜((Un＋Dn)/r(Un＋Dn))の両端の片方もしくは両方に連結する。また、２重鎖化ダウンプローブ同士は平滑末端同士も介してランダムに数珠上に連結する。本工程で産出せしめる分子の内第七の工程のPCR反応で各変換する配列(rSD- TG1-AT1- FL1-ED〜rSD- TGn-ATn- FLn-ED)を産出せしめる鋳型となる構造は図1(6)に代表される分子内連結2重鎖化連結プローブ(self(U1＋D1) /r(U1＋D1)〜self(Un＋Dn)/r(Un＋Dn))および分子間連結2重鎖化連結プローブ((U1＋D1) /r(U1＋D1)-D1/rD1〜(Un＋Dn) /r(Un＋Dn)-Dn/rDn)である。
【００４４】
＜工  程７＞  
本方法の第七の工程は、  
第六の工程で連結した図1(6)に代表される分子内連結2重鎖化連結プローブ(self(U1＋D1) /r(U1＋D1)〜self(Un＋Dn)/r(Un＋Dn))および分子間連結2重鎖化連結プローブ((U1＋D1) /r(U1＋D1)-D1/rD1〜(Un＋Dn) /r(Un＋Dn)-Dn/rDn)から一定の既知なる配列をPCR反応にて増幅する工程である（図1(7)を参照）。
【００４５】
図1(6)に代表される分子内連結2重鎖化連結プローブ(self(U1＋D1) /r(U1＋D1)〜self(Un＋Dn)/r(Un＋Dn))および分子間連結2重鎖化連結プローブ((U1＋D1) /r(U1＋D1)-D1/rD1〜(Un＋Dn) /r(Un＋Dn)-Dn/rDn)には、図1(7)に示すように第二のプライマー配列rSD、タグ配列TG1〜TGn、任意の塩基配列AT1〜ATn、フラグ配列FL1〜FLn、第一のプライマー配列EDが順に並ぶ（以下変換する配列(rSD-TG1- AT1-FL1-ED〜rSD-TGn- ATn-FLn-ED)の片側の鎖で代表して表記する）ので、PCRで増幅される鋳型となり得る。よって、プローブSDプライマー、rEDプライマー、ポリメラーゼ、ヌクレオチドを反応に混入し、至適温度至適時間で至適サイクルでPCR反応を行うと各変換する配列(rSD-TG1- AT1-FL1-ED〜rSD-TGn- ATn-FLn-ED)が大幅に増幅される〔図1(8)を参照〕。以後、各変換する配列(rSD-TG1- AT1-FL1-ED〜rSD-TGn- ATn-FLn-ED)に、蛍光色素、ラジオアイソトープ等の標識を行い検出に供試する。本工程で増幅する際に蛍光色素、ラジオアイソトープ等の標識ヌクレオチドおよび標識プライマーを用いて標識してもよい。なお、検出の具体的工程については、上述した特許文献１または特許文献２に記載される方法に準じてよく、それ以外にも特開２００４―２５７９９１に記載されるような他の検出技術であってもよい。特に、特開２００４―２５７９９１に記載される種々の検出技術のうち、アレイ基板表面で検出せずに個別にアドレス化された多数の微粒子上で検出する技術を用いれば、フロー系で適当な間隔を置きながら連続的に多数の測定結果を短時間で得られるし、シース液により反応液中の余分な成分による影響が抑制されてＳ／Ｎ比が向上する可能性もある。また、平面上で検出せずに円柱状の棒又は螺旋状に巻かれた糸（ストランド）の表面で検出するようにすれば検出時の処理能力が向上する。
【実施例】
【００４６】
本実施例では標的核酸が2種類と非常に少ない。従って、標的核酸がPCR増幅に影響を及ぼさないため、本実施例では標的核酸を排除する工程を省略した。
【００４７】
[材  料]  
＜標的核酸＞  
標的核酸１: λpre  
λファージDNAの部分配列で5’末端側から以下の配列を有する。  
アッパー付加配列：λファージDNAの14783-14792塩基配列  
部分配列S1：λファージDNAの14793-14807塩基配列  
部分配列F1：λファージDNAの14808-14822塩基配列  
ダウン付加配列：λファージDNAの14822-14831塩基配列  
標的核酸２: λpst  
λファージDNAの部分配列で5’末端側から以下の配列を有する。  
アッパー付加配列：λファージDNAの44197-44206塩基配列  
部分配列S2：λファージDNAの44207-44221塩基配列  
部分配列F2：λファージDNAの44222-44236塩基配列  
ダウン付加配列：λファージDNAの44237-44246塩基配列  
【００４８】
＜プローブ類＞  
《第一のプローブ》  
アッパープローブU1：5’末端側から以下の配列を有する。  
制限酵素付着補助配列H: TTTTTT  
制限酵素認識配列R1: CCAG(GTAC)CTGG, 括弧内はAT1配列  
フラグ配列FL1: TGGAATCCTAGTTGGCAGTATGG  
第一のプライマー配列ED: AGGTTTTTCTAGAGTGGACACGG  
部分配列F1に相補的な配列rF1: ATGCGCGCCATGCCC  
【００４９】
アッパープローブU2：5’末端側から以下の配列を有する。  
制限酵素付着補助配列H: TTTTTT  
制限酵素認識配列R2: CCAC(TGCA)GTGG, 括弧内はAT2配列  
フラグ配列FL2: TGGAATCCTAGTTGGCAGTATGG(本実施例ではFL1と共通)  
第一のプライマー配列ED: AGGTTTTTCTAGAGTGGACACGG  
部分配列F2に相補的な配列rF2: TCTTGCCCCCGGCGT  
【００５０】
《第二のプローブ》  
ダウンプローブD1：5’末端側にリン酸基を具備し5’末端側から以下の配列を有する。  
第二の部分配列S1に相補的な配列rS1: GGTGACGCCAGAGGG  
第二のプライマー配列rSD: CGCGTACGTTACTAACTTCACAG  
タグ配列TG1: TGGAACTGGGAACGCTTTAGATG  
制限酵素認識配列rR1: CCAG(GTAC)CTGG, 括弧内はrAT1配列  
エクステンションプライマーの3’末端側一部相補的な配列prEP: CCGATACATTGCTCTCCG  
【００５１】
ダウンプローブD2：5’末端側にリン酸基を具備し5’末端側から以下の配列を有する。  
第二の部分配列S2に相補的な配列rS2: CGCGGCACTACGGCA  
第二のプライマー配列rSD: CGCGTACGTTACTAACTTCACAG  
タグ配列TG2: GAAGCCATGATACTGTTCAGGGT  
制限酵素認識配列rR2: CCAC(TGCA)GTGG, 括弧内はAT2配列  
エクステンションプライマーの3’末端側一部相補的な配列prEP: CGGAGAGCAATGTATCGG
【００５２】
《エクステンションプライマー》  
エクステンションプライマー：5’末端側から以下の配列を有する。  
pEP: CCGATACATTGCTCTCCG
【００５３】
[標的核酸およびプローブDNAの混合並びにライゲーション]  
以下のDNAと試薬を以下に示すように混合し70℃で5分、引き続き25℃で30分間インキュベートした。
【００５４】
【表１】
2006109759.tif 000002
次に各反応に  
【表２】
2006109759.tif 000003
をそれぞれ混入し、37℃で30分間インキュベートした。
【００５５】
[連結プローブ核酸のプライマーエクステンションによる2重鎖化]  
各反応に  
【表３】
2006109759.tif 000004
をそれぞれ混入し、以下の条件でインキュベートした。
95℃    10sec  
60℃    10sec  
5サイクル  
95℃    10sec  
72℃    10sec  
4℃    keeping  
次に各反応に5U/μl 抗Taq抗体 (TAKARA社)を0.6μl混入し25℃で10分間インキュベートした。
【００５６】
[制限酵素による2重鎖化連結プローブ核酸の切断]  
各反応に
【表４】
2006109759.tif 000005
を混入し37℃で30分間インキュベートした。
続いて、45℃で30分間インキュベートしBstX1活性を失活させた。
【００５７】
[2重鎖化連結プローブ核酸の連結]  
各反応に
【表５】
2006109759.tif 000006
をそれぞれ混入し、16℃で1時間インキュベートした。
【００５８】
[PCRによる変換核酸の増幅]  
以下の溶液を混合し、
【表６】
2006109759.tif 000007
（ここではAdvantage2 PCR kit（Clontech社）を用いた。また、後に変換する配列のハイブリダイゼーションによる確認のためにCy5-dUTPを取り込ませた。また、後述する[変換DNAの精製]における過剰なCy5-dUTPを除去する操作と検出に供する変換する配列の相補鎖を作出する操作のためビオチン化SDプライマーを用いた。）
以下の条件でPCR反応を行った。  
95℃    10sec  
69℃    10sec  
40cycles
【００５９】
ここで、増幅された変換する配列の核酸の増幅の様子を8%ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動法により確認した。DNA分子量マーカーはMBI Fermentas社の100bpラダーマーカーを5μlを用いた。ゲルの染色はMolecularProbes社のサイバーグリーンIIを5000倍希釈し、ゲルを30分浸漬することで染色した。ゲルの撮影はATTO社のLightCaptureにて撮影した。図2に示すように標的DNAの量に応じて変換する配列のDNAが増幅した。図2では複数のDNAバンドが見えているが、これは標識に用いたCy5がDNA分子同士を結合したためである。また、Cy5で標識されているため実際のDNA分子量（92bp）として電気泳動されていない。
【００６０】
[変換DNAの精製]  
各PCR反応にアビジン固定マグネットビーズM280（ダイナビーズ社）を16μl混入し15分25℃で適時攪拌しながらインキュベートし、次いで、マグネットでビーズを補足しマグネットを160μl TPBS（PBSに0.2%Tween20を混合したもの）で2回洗浄し、さらに160μlの水で洗浄した。そして、20μlの水にビーズを懸濁し、95℃2分インキュベートし、ビーズをマグネットで分けて、上清を分取した。上清にはCy5標識された1本鎖DNA（rSD-TG1- AT1-FL1-EDまたはrSD-TG2- AT2-FL2-EDの相補鎖）が存在している。
【００６１】
[変換DNAのハイブリダイゼーション]  
以下の溶液を混合し、
【表７】
2006109759.tif 000008
TG1ならびにTG2配列を含む12種類のTG配列に相補的なオリゴDNAを固定したマイクロアレイに37℃1時間、各反応ごとにハイブリダイズさせた。（ハイブリダイゼーションにはオリンパス株式会社で開発したキャピラリーアレイカバーを具備するキャピラリーアレイ（特開２００３―１２１３１１参照）を用いた。キャピラリーアレイカバーはガラスと張り合わせることで液漏れの無いハイブリダイゼーション空間を発生させることができるシリコンゴム製カバーであり、内部に複数のハイブリダイゼーション空間を生み出す溝が施されている。このキャピラリーアレイカバーにより一枚のマイクロアレイ上で複数の資料が一度に観察することが可能となっている。）この後0.2%SSC、0.2%SDSに浸漬し15分間2回45℃にて振盪した。最後に純水でリンスしエアーで乾燥し、GENEPIX4000（Axon社）にて、Cy5蛍光強度をレーザーパワー100%、フォトマルゲイン800の条件で測定した。
【００６２】
[配列変換の確認]  
本実験の蛍光強度画像を図3と各スポットの蛍光強度値から得られたスポット周辺のバックグラウンド蛍光強度値を減じた正味の蛍光強度値のグラフを図4に示す。
図3および図4から明らかなようにTG1およびTG2に相補的なオリゴDNAのスポットで蛍光が観察され、しかも低濃度標的核酸での反応（反応番号3,4,5）ではTG1の蛍光強度はTG2の蛍光強度よりも強く、さらに各反応間でもそれぞれのスポットの蛍光強度は標的核酸の量が少なければ少なくなっている。この結果は、定量的ではないが、PCRの増幅サイクルを増減することにより定量性を持たせることは可能である。  
以上の結果より、本発明による核酸配列変換法が標的核酸を低濃度でも確実に一定の既知なる配列に変換することができるということが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１−１】本発明の方法の工程を説明する図である。
【図１−２】本発明の方法の工程を説明する図である。
【図１−３】本発明の方法の工程を説明する図である。
【図１−４】本発明の方法の工程を説明する図である。
【図１−５】本発明の方法の工程を説明する図である。
【図１−６】本発明の方法の工程を説明する図である。
【図１−７】本発明の方法の工程を説明する図である。
【図１−８】本発明の方法の工程を説明する図である。
【図２】本発明により変換された核酸の電気泳動写真である。
【図３】本発明により変換された核酸をキャピラリアレイで検出した結果を示す写真である。
【図４】本発明により変換された核酸をキャピラリアレイで検出した結果を定量したグラフである。
【図１−１】
2006109759.tif 000009
【図１−２】
2006109759.tif 000010
【図１−３】
2006109759.tif 000011
【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
2006109759.tif 000014
【図１−７】
2006109759.tif 000015
【図１−８】
2006109759.tif 000016
【図２】
2006109759.tif 000017
【図３】
2006109759.tif 000018
【図４】
2006109759.tif 000019
【配列表】
2006109759000001.app