(57)【要約】      （修正有）【課題】新規ヒト４−１ＢＢ受容体タンパク質を提供すること。【解決手段】ヒト４−１ＢＢ受容体タンパク質をコードする、特定のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡおよび特定のアミノ酸配列を有するヒト４−１ＢＢ受容体タンパク質を提供する。また、ヒト４−１ＢＢ受容体タンパク質を有する細胞外部分とアルカリホスファターゼからなる融合タンパク質を提供する。さらに、Ｔ細胞活性化を促進するために、４−１ＢＢ受容体タンパク質を有するＴ細胞をヒト４−１ＢＢ受容体タンパク質を認識するモノクローナル抗体で処理する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト４−１ＢＢポリペプチドの少なくとも一部をコードする単離されたＤＮＡであって、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ：
ａ）配列番号１のヌクレオチド４１〜８０５；
ｂ）配列番号１のヌクレオチド１１０〜８０５；
ｃ）  配列番号２のアミノ酸１〜１８６を有する可溶性ヒト４−１ＢＢポリペプチドまたはヒト４−１ＢＢに対する細胞膜リガンドに結合可能なそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列；
ｄ）配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト４−１ＢＢをコードするヌクレオチド配列；および
ｅ）前記可溶性ヒト４−１ＢＢポリペプチドのＣ−末端に融合するポリペプチドをさらにコードする、ｃ）記載のヌクレオチド配列。
【請求項２】
米国アグリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクションに受託番号ＮＲＲＬ Ｂ２１１３１として寄託された、ｐＨ４−１ＢＢとして特定される、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
ａ）適当なトランスフェクション宿主と、配列番号２を有するヒト４−１ＢＢまたはヒト４−１ＢＢに対する細胞膜リガンドに結合可能なそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクターとを接触させて、そのＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質を発現するトラスフェクトされた宿主細胞を得；
ｂ）ヒト４−１ＢＢタンパク質を精製する
ことによって製造されるタンパク質。
【請求項４】
前記ＤＮＡ配列が配列番号２のアミノ酸残基１〜１８６をコードする、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記ＤＮＡ配列がヒト４−１ＢＢと第２のポリペプチドからなる融合タンパク質をコードする請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記第２のポリペプチドが検出タンパク質である、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
検出タンパク質がアルカリホスファターゼである、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記ＤＮＡ配列が配列番号２をコードする、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項９】
配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト４−１ＢＢを特異的に認識する  モノクローナル抗体。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト４−１ＢＢを特異的に認識する  モノクローナル抗体を産生することが可能なハイブリドーマ。
【請求項１１】
Ｔ細胞増殖を促進するために請求項９に記載のモノクローナル抗体を使用する方法であって、発現したヒト４−１ＢＢを有するＴ細胞を該モノクローナル抗体によりインビトロで処理する工程を含む方法。
【請求項１２】
前記処理をタンパク質チロシンキナーゼの存在下で行う工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｔ細胞活性化を促進するために請求項９に記載のモノクローナル抗体を使用する方法であって、発現したヒト４−１ＢＢを有するＴ細胞を該モノクローナル抗体によりインビトロで処理する工程を含んでなる方法。
【請求項１４】
前記処理をタンパク質チロシンキナーゼの存在下で行う工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ａ）ヒト４−１ＢＢに対する細胞膜リガンドに結合する、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト４−１ＢＢの細胞外ドメインに対応する、ヒト４−１ＢＢの少なくとも一部；および
ｂ）前記ヒト４−１ＢＢの該一部に結合した検出タンパク質であって、リガンド結合が、該検出タンパク質の比活性アッセイによって検出できるような検出タンパク質
を含む融合タンパク質。
【請求項１６】
前記検出タンパク質がアルカリホスファターゼである、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
ヒト４−１ＢＢに対する細胞膜リガンドをインビトロで検出するための方法であって、
ａ）ヒト４−１ＢＢに対する細胞膜リガンドを発現していると思われる細胞と、以下のものを含む融合タンパク質：
１）ヒト４−１ＢＢの、前記細胞膜リガンドに結合する細胞外ドメインに対応する、配列番号２のアミノ酸配列を有する前記ヒト４−１ＢＢの少なくとも一部分；および
２）ヒト４−１ＢＢの該一部分に結合した検出タンパク質であって、該検出タンパク質の比活性アッセイによってリガンド結合が検出できるような検出タンパク質
とを接触させ；
ｂ）前記細胞膜リガンドに結合しなかった融合タンパク質を前記細胞から洗い流し；そして
ｃ）前記洗浄した細胞と、前記検出タンパク質に対する基質とを接触させて、前記検出タンパク質の比活性を測定する
ことを含む方法。
【請求項１８】
前記検出タンパク質がアルカリホスファターゼである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト４−１ＢＢまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクターであって、宿主細胞中での該ＤＮＡ配列の発現に適当な制御配列に作動可能なように結合し、該ＤＮＡ配列が、
ａ）配列番号１のヌクレオチド４１〜８０５；
ｂ）配列番号１のヌクレオチド１１０〜８０５；
ｃ）配列番号２のアミノ酸１〜１８６を有する可溶性ヒト４−１ＢＢポリペプチドまたはヒト４−１ＢＢに対する細胞膜リガンドに結合可能なそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列；
ｄ）配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト４−１ＢＢをコードするヌクレオチド配列；および
ｅ）前記可溶性ヒト４−１ＢＢポリペプチドのＣ−末端に融合するポリペプチドをさらにコードする、ｃ）記載のヌクレオチド配列
からなる群から選択される組換え発現ベクター。
【請求項２０】
ｅ）におけるＣ−末端に融合するポリペプチドが検出タンパク質である、請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項２１】
検出タンパク質がアルカリホスファターゼである、請求項２０に記載のＤＮＡ。
【請求項２２】
前記ｅ）におけるＣ−末端に融合するポリペプチドが検出タンパク質である、請求項１９記載のベクター。
【請求項２３】
検出タンパク質がアルカリホスファターゼである、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
ａ）配列番号２のアミノ酸配列またはヒト４−１ＢＢに対する細胞膜リガンドを結合することが可能なそのフラグメント；
ｂ）配列番号２のアミノ酸残基２４〜２５５またはヒト４−１ＢＢに対する細胞膜リガンドを結合することが可能なそのフラグメント；
ｃ）配列番号２のアミノ酸残基２４〜１８６またはヒト４−１ＢＢに対する細胞膜リガンドを結合することが可能なそのフラグメント；および
ｄ）Ｎ−末端アミノ酸配列が、Ｌeu−Ｇln−Ａsp−Ｐro−Ｃys−Ｓer−Ａsn−Ｃys−Ｐro−Ａla−Ｇly−Ｔhrである配列番号２のアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するヒト４−１ＢＢポリペプチド。
【請求項２５】
ヒト４−１ＢＢポリペプチドのＣ末端に融合した第２のポリペプチドをさらに含む、請求項２４に記載のヒト４−１ＢＢポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本発明者によるＴ細胞遺伝子の特異的発現によって分離および同定された類似のネズミ（マウス）受容体（レセプター）蛋白質４−１ＢＢを用いた研究に基づいて分離および同定された以前に知られていないヒト受容体蛋白質Ｈ４−１ＢＢに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトおよび他の種の免疫系は骨髄で作られる白血球を必要とし、その白血球には食細胞、リンパ球およびＢ細胞が含まれる。現在知られているように、食細胞にはこの系からウイルス蛋白質のような望ましくない物質を取り除くマクロファージ細胞が含まれる。リンパ球にはヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞およびＢ細胞ならびにサプレッサーＴ細胞に分類されるリンパ球を含む他の細胞が含まれる。キラーＴ細胞は細胞に物理的に突入し、またヘルパーＴ細胞は全過程を促進する。どのような事象においても、免疫過程はリンパ球によって促進される。
【０００３】
リンホカインは免疫細胞が互いに連絡を取り合うための蛋白質である。科学者は免疫学的疾患に対して治療的に使用するためにそれらの蛋白質の充分量を製造する。多くのリンホカイン蛋白質が知られており、それらにはインターフェロン、インターロイキン１、２、３、４、５、６および７、コロニー刺激因子、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、エリスロポイエチン、その他が含まれる。
【０００４】
マクロファージから分泌されるインターロイキン１はヘルパーＴ細胞を活性化し、体温を上昇させて熱を生じさせ、これにより免疫細胞の活性を増強する。活性化ヘルパーＴ細胞はインターロイキン２を産生し、インターロイキン２はヘルパーおよびキラーＴ細胞を刺激して成長および分化させる。ヘルパーＴ細胞は、もうひとつのリンホカインである、Ｂ細胞の増殖をもたらすＢ細胞成長因子（ＢＣＧＦ）をも産生する。Ｂ細胞数の増加にしたがって、ヘルパーＴ細胞は、いくつかのＢ細胞に複製を停止し抗体産生を開始する指示を与える、Ｂ細胞分化因子（ＢＣＤＦ）として知られるもうひとつのリンホカインを産生する。Ｔ細胞はインターロイキン２様の増殖効果を有するリンホカインであるガンマインターフェロン（ＩＦ）も産生する。インターフェロンはキラーＴ細胞の活性化を助け、それらが侵入した微生物を攻撃することを可能にする。ＢＣＧＦ同様に、インターフェロンはＢ細胞の抗体産生能力を増大させる。インターフェロンはマクロファージにも影響を及ぼし、感染部位にマクロファージを保持し、マクロファージが包み込んだ細胞を消化するのを助ける。マクロファージとＴ細胞間の各種のリンホカイン信号によるはずみが次第に増加することによって、リンホカインは免疫系反応を増幅し、感染細胞のウイルス蛋白質や他の外来物質の上に覆いかぶさる。おそらく数１００もしくはそれ以上の他の多くのリンホカインが存在し、免疫過程に関与している。多くのリンホカインが知られており、また知られていないものが多く存在する。
【０００５】
リンホカインは時として細胞間ペプチドシグナルと呼ばれる。科学者の間で、リンホカイン産生者としてクローン化細胞株が広く使用されており、リンホカインｍＲＮＡの分離は一般的な技術になってきている。マウス受容体蛋白質４ー１ＢＢは、刊行物（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84,2896-2900, 1987年5月, Immunology）において本発明者が示した技術を用いるＴ細胞遺伝子の特異的発現に基づいて分離および同定された（非特許文献１）。この刊行物に報告されたプロトコールを用いて、科学者は実質的にすべてのリンホカインを検出する事ができる。この方法は特異に発現した実質的にすべてのｍＲＮＡを検出するために計画され、また免疫細胞のｍＲＮＡ配列は、発現レベルが低く、分泌されたリンホカイン蛋白質の量が少ない場合でも（それらがＴ細胞およびキラーＴ細胞に関連しているため）特異に発現する。生物学的に重要であるかまたは活性な分子は最も少ないメッセージによってコードされていることを多くの指摘があることから、本発明者は上記刊行物に記載の分析法によってリンホカインのような生物学的に重要な分子を明らかにすることができるものと考える。その一例は形質転換成長因子（ＴＧＦ）であり、これは１００万クローンにわずか１個しか発現しない。
【０００６】
ほとんどのＴ細胞因子は、従来、アッセイにおいて生物活性を認識し、蛋白質情報を精製することによって同定されて来た。別のアプローチは、特異的発現に基づいて推定されたＴ細胞遺伝子を分離した後、その未知分子の機能を証明する事である。前記の改良分別スクリーニング法を用いて、本発明者はクローン化ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）Ｌ２およびクローン化細胞溶解性Ｔ細胞リンパ球（ＣＴＬ）Ｌ３から一連のＴ細胞サブセット特異的ｃＤＮＡをクローンした。
【０００７】
一連のＴ細胞サブセット特異的ｃＤＮＡは、改良分別スクリーニング法を用いてクローン化ネズミＴ細胞から分離した。ｃＤＮＡ群のいくつかのヌクレオチド配列および発現特性は報告されている。以前に特徴付けがなされていない、マウス受容体蛋白質４−１ＢＢをコードしている遺伝子のひとつがさらに研究された。これらの研究はヒトにおける４−１ＢＢ類似体であるＨ４−１ＢＢの分離をもたらした。
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 2896-2900, 1987年5月, Immunology
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はヒトの受容体蛋白質であるＨ４−１ＢＢおよび該ヒト受容体蛋白質Ｈ４−１ＢＢをコードするｃＤＮＡを提供する。
【０００９】
本発明の主な目的は、本明細書中にその配列が示された、新規のヒト受容体であるＨ４−１ＢＢを同定することである。
【００１０】
別の本発明の目的は、Ｈ４−１ＢＢの細胞外部分と検出蛋白質からなる融合蛋白質を提供することである。
【００１１】
さらなる本発明の目的は、Ｈ４−１ＢＢをコードするｃＤＮＡ、受容体蛋白質Ｈ４−１ＢＢ、Ｈ４−１ＢＢに対するモノクローナル抗体およびリガンドを用いる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
分離したｃＤＮＡのヌクレオチド配列は論理的に推理したアミノ酸配列と共に本明細書中に開示されている。ｐＨ４−１ＢＢとして示されたｃＤＮＡ遺伝子はAgricultural Research Service Culture Collectionに寄託された（受託番号：ＮＲＲＬ  Ｂ２１１３１）。
【００１３】
ｃＤＮＡおよびそのフラグメントならびに誘導体は、そのｃＤＮＡによってコードされた受容体蛋白質と同様な蛋白質をコードするＤＮＡ配列を分離するためのプローブとして用いることができる。ヒト受容体Ｈ４−１ＢＢのｃＤＮＡはマウス４−１ＢＢのｃＤＮＡと約６５％相同であり、ｃＤＮＡ４−１ＢＢ由来のプローブを用いて分離された。ｐ４−１ＢＢで示されたｃＤＮＡ遺伝子は、American Type Culture Collection(12301 Parlawn Drive,Rockville,Maryland 20852)に寄託された（ＡＣＴＴ  Ｎｏ．６７８２５）。
【００１４】
ヒト受容体蛋白質Ｈ４−１ＢＢは、
（１）Ｈ４−１ＢＢのｃＤＮＡを適切な発現ベクターに挿入し、
（２）この発現ベクターを適切なトランスフェクション宿主中にトランスフェクトし、
（ｃ）トランスフェクトさせた宿主を適切な培地中で増殖させ、
（ｄ）培地から受容体蛋白質を精製する
ことによって製造することができる。
【００１５】
本発明の蛋白質およびフラグメントならびに誘導体は、
１）ヒト受容体蛋白質Ｈ４−１ＢＢに対するリガンドを分離するためのプローブとしてか、
２）Ｈ４−１ＢＢリガンドを発現するＢ細胞の増殖を刺激するために、または
３）Ｈ４−１ＢＢの結合をブロックするために用いることができる。
【００１６】
Ｂ細胞の増殖は、受容体蛋白質Ｈ４−１ＢＢに対するリガンドを発現しているＢ細胞を受容体蛋白質Ｈ４−１ＢＢを発現している細胞で処理することによって誘導することができる。この種の出願のために、同様の共刺激免疫系経路が解析されつつある。「Mounting a Targeted Strike on Unwanted Immune Responses」(Jon Cohen,Science,257巻, 8-7-92)；「Long Term Survival of Xenogeneic Pancreatic Islet Grafts Induced by CTLA4Ig」(Lenschowら, science,257巻, 7-8-92);および「Immunosuppresion in Vivo by a Soluble Form of the CTLA-4 T Cell Activation Molecule」(Linsleyら, Scienc, 257巻, 7-8-92）を参照。
【００１７】
Ｈ４−１ＢＢに対するモノクローナル抗体は、受容体蛋白質Ｈ４−１ＢＢを発現しているＴ細胞を抗Ｈ４−１ＢＢモノクローナル抗体で処理することによってＴ細胞の増殖を増強するために使用することができる。いくつかの腫瘍は、潜在的に免疫原性であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効な抗免疫反応を刺激しない。腫瘍は抗原特異的なシグナルをＴ細胞に供給できるかも知れないが、Ｔ細胞を完全に活性化するのに必要な共刺激シグナルを供給しないかも知れない。メラノーマ細胞における共刺激リガンドＢ７の発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるネズミのメラノーマの拒絶を誘導しないことが明らかになった（「Tumor Rejection After Direact Co-Stimulation of CD8+T cells by B7-Transfected Melanoma Cells」(Sarah, E. TownsendおよびJames P. Allison, Science, 259巻, 1-5-93）。Ｈ４−１ＢＢに対するモノクローナル抗体は、Ｔ細胞の増殖と活性化を誘導することが現在知られているのと同様の効果をもたらすことができるかも知れない。
【００１８】
ヒト受容体蛋白質Ｈ４−１ＢＢに対する細胞膜リガンドを検出するための融合蛋白質が開発された。この蛋白質は受容体蛋白質Ｈ４−１ＢＢの細胞外部分と受容体蛋白質Ｈ４−１ＢＢの一部分に結合した検出蛋白質（アルカリホスファターゼ）からなる。受容体蛋白質Ｈ４−１ＢＢの一部分が細胞膜リガンドに結合し、結合は検出蛋白質に対する比活性アッセイによって検出することができる。融合蛋白質は受容体蛋白質Ｂ４−１ＢＢを発現すると思われる細胞の存在下に置かれる。次に、この細胞を、いかなる融合蛋白質もその細胞膜リガンドに結合していないように洗浄する。一旦、洗浄した細胞を検出蛋白質の基質の存在下に置き、検出蛋白質の比活性を測定することができる。
【００１９】
以下の詳細な説明では出願人の公開された研究と同様、既知の方法及び研究を引用する。これらの出版物は明確にするために引用して本願に組み込まれており、詳細な説明の最後に列挙されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
マウスレセプター４−１ＢＢの単離及び特性化
マウスレセプター４−１ＢＢのヌクレオチド配列及び推定のアミノ酸配列は図１に示されている。メッセージ鎖のヌクレオチドは５’から３’側方向に番号付されており、番号は配列の両側に記載されている。ヌクレオチド残基１はＡＴＧ開始コドンのＡであり、残基１の５’側にあるヌクレオチドには負の番号が付されている。推定のアミノ酸配列はヌクレオチド配列の下方に記載されている。推定のシグナルペプチドには下線が引かれている。停止コドンは（−−−）で示されている。システイン残基は、点々で明示されている。４−１ＢＢ配列の通常でない特徴は、ヌクレオチド１１５８−１１６３にＡＡＴＡＡＡで示される潜在的なポリアデニル化シグナルがあることである（図１、四角で囲んだ箇所)。遺伝子産物が少なくとも２つの異なる大きさのｍＲＮＡを産生することから、このシグナルは機能的であると信じられた。
【００２１】
マウス脾細胞、Ｔ細胞クローン、及びハイブリドーマ内での４−１ＢＢの転写はコンカナバリンＡによって誘導可能であった。４−１ＢＢ転写物の発現はシクロスポリンＡによって阻害された。４−１ＢＢｍＲＮＡは抗原受容体刺激によって誘導可能であったが、クローン化Ｔ−細胞内でのＩｌ−２刺激では誘導されなかった（１)。４−１ＢＢｃＤＮＡは推定のリーダー配列、潜在的な膜アンカーセグメント、及び既知の受容体タンパク質の他の特徴を含む、２５６アミノ酸ペプチドをコードしている。従って、４−１ＢＢの配列は受容体タンパク質のそれに一致しているように見えるが、発現パターンはリンホカインのそれに類似している。
【００２２】
細胞表面における４−１ＢＢの主な種は５５ーｋＤａの２量体のようである。４−１ＢＢはまた、３０−ｋＤａの単量体、そして恐らく１１０−ｋＤａの４量体としても存在するようである。これらの４−１ＢＢ種は均質な細胞集団（Ｔ−細胞クローンＦ１）から免疫沈降されたので、いずれも各細胞上に共存している可能性がある。４−１ＢＢが細胞表面でホモダイマーとして存在するか否かを決定するには、４−１ＢＢ単量体と２量体からのペプチド消化物を比較する必要があるだろう。インシュリン受容体（２)、Ｂ−細胞表面免疫グロブリン受容体（３)、Ｔ−細胞Ａｇ受容体（４)、ＣＤ２８共刺激（costimulatory)受容体（５)、及びＣＤ２７Ｔ細胞抗原（６）等の様々な細胞表面受容体はジスルフィド結合したサブユニットからなる。リガンドの結合及びその後の生化学的シグナル伝達（signaling)には、受容体の２量体化が必要かもしれない。
【００２３】
４−１ＢＢは休止期のＴ細胞には発現しないが、Ｔ細胞に対して完全な増殖刺激を与える活性化剤によって誘導可能である。ＰＭＡとイオノマイシンとの組み合わせは、Ｔ細胞の増殖に必要なこれらのシグナルをまねることができる。ＰＭＡ又はイオノマイシン単独で４−１ＢＢｍＲＮＡを誘導することができるが、ＰＭＡとイオノマイシンの併用により４−１ＢＢの至適発現が得られた。しかも、４−１ＢＢの発現は一過性でなかった。精製脾Ｔ細胞を固定化抗−ＣＤ３で刺激すると、４−１ＢＢｍＲＮＡが発現され、この発現は刺激後９６時間まで維持された。４−１ＢＢが細胞周期の進行期間を通して発現されることを確認するためには、細胞周期の解析が必要であろう。
【００２４】
４−１ＢＢは構造的に神経成長因子受容体スーパーファミリーのメンバーに関連している。これらの受容体は構造上類似のリガンド−結合特性（システイン−豊富領域）を有するか、これらタンパク質の細胞質ドメインは非保存的であり、それがトランスメンブランシグナル伝達に多様性を与えているかもしれない。このファミリーには、Ｔ又はＢ細胞の活性化工程に関与しているメンバーもある。ＯＸ−４０、ＣＤ４０及びＣＤ２７抗原に関するインビトロ機能性データがある。ＯＸ−４０に対する抗体は混合リンパ球反応におけるＴ細胞の応答性を増大し（７)、ＣＤ４０に対する抗体はＰＭＡ又はＣＤ２０抗体のような共活性化剤（coactivator)の存在下でＢ−細胞の増殖を促進し、インビトロでＩＬ−４と相乗的に作用してＢ−細胞の分化を誘導し長期正常Ｂ−細胞株を生成させる（８)。ＣＤ２７分子上のエピトープを認識する１つのイノノクローナル(inonoclonal）抗体（抗−１Ａ４）は、カルシウム動態化、ＩＬ−２分泌、ヘルパーＴ細胞機能、及びＴ細胞増殖を阻害した。一方、もう１つの抗ＣＤ２７ｍＡｂであるＣＬＢ−ＣＤ２７／１はＰＨＡ又は抗ＣＤ３ｍＡｂによって刺激されたヒトＴ細胞の増殖を促進した（６)。これらの結果はＣＤ２７分子がＴ細胞の活性化に重要な役割を果たしていることを示している。ＴＮＦＲ類、ＮＣＦＲ、及びＣＤ４０を除いて、スーパーファミリーのメンバーが結合するリガンド又は細胞表面分子はまだ同定されていない。受容体が結合するリガンドの同定及び特性化は４−１ＢＢの生理学的な役割のより良い定義のために役立つであろう。
【００２５】
細胞表面４−１ＢＢがＴ細胞活性化に貢献しうるか否かを確かめるために、抗４−１ＢＢ５３Ａ２を４−１ＢＢのアンタゴニストとして用いた。これらのデータは実際、４−１ＢＢが、Ｔ細胞の活性化及び増殖の間、副シグナル分子として機能する能力を有することを示唆していた。固定化抗ＣＤ３で刺激した、精製脾由来Ｔ細胞に可溶性５３Ａ２を加えると、抗ＣＤ３単独で刺激した場合に比較して、3Ｈチミジンの取り込みが増大した。３回の独立実験における、この増大パターンの範囲は２〜１０倍であった。
【００２６】
Bretcher及びCohnの元々の２つのシグナルモデルで、彼らはシグナル１、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の占有、では補助細胞から供給されるシグナル２の不在下でＴ細胞が不活化されると提案した。これは以後様々な研究で確認された（９)。Ｔ細胞上の潜在的な共刺激受容体としての補助細胞ＣＤ２８の同定は、Ｔ細胞の最適な増殖に必要な補助シグナル（群）の特性化を開始するのに重大な寄与であった（１０)。他の細胞表面分子がこれらの共刺激活性化要求に寄与している可能性がある（１１)。
【００２７】
４−１ＢＢを介して伝達される生化学的シグナルは、完全には分かっていない。考慮されている１つの可能性は、４−１ＢＢが推定のｐ５６kkチロシンキナーゼ結合ドメインをその細胞質尾部に含有しているとの観察であった。後に、ｐ５６kkチロシナーゼキナーゼは４−１ＢＢに結合することが決定された。４−１ＢＢを介するシグナル伝達が、その発現がＴ細胞の活性化及びその後の増殖に必要である、ＩＬ−２及びＩＬ−２受容体のような遺伝子を調節できるかどうかを決定することも価値ある。
【００２８】
神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）ファミリーのメンバーの正確な機能は多様であるように思われるが、これらの分子が様々な方法で、それらが発現される特定の細胞型の応答性又は生存可能性の維持に貢献しているかもしれない、というテーマが出現する。例えば、ＮＧＦはインビトロ及びインビボでのニューロンの生存に絶対的に必要である（１２)。可溶性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体によるＣＤ４０のクロスリンキングは、胚中心中心細胞がインビトロでアポプトーシスを受けることを妨げる（１３)。ＣＤ４０を介して伝達されるシグナルもまた、分化因子に対する応答性の維持を補助しうる。ＣＤ４０と抗−ＣＤ４０Ｆ（ａｂ’）2フラグメントのＩＬ−４の存在下での結合（ライゲーション）はＩｇＥ合成の非常な増大を誘導した（１４)。また、ＩＬ−１０及びトランスフォーミング成長因子ーβで処理した、抗ＣＤ４０活性化天然（固有）Ｂ細胞はＩｇＡ分泌を行うようになった（１５)。
【００２９】
４−１ＢＢは、ＮＧＦＲスーパーファミリーと共通する分子の特徴を有することに加えて、酵母ｅ１Ｆ−２βタンパクの推定の亜鉛フィンガー構造を有することが分かった（１６)。４−１ＢＢはまたショウジョウバエのアプサンス（absentia）のsina sevenと、保存領域を共有しており、それは適正な光受容体細胞の発展に必要である（１７)。その特定の領域はまた、その発現がｃＡＭＰによる凝集の期間に特異的に誘導される、DictyosteliumのＤＧ１７遺伝子のタンパク質生成物と類似している（１８)。
【００３０】
この領域はＣ−Ｘ2−Ｃ−Ｘ9−Ｃ−Ｘ3−Ｈ−Ｘ3−Ｃ−Ｘ−Ｃパターンを形成しており；システイン及びヒスチジンは４−１ＢＢ、sina及びＤＧ１７タンパク質内の、同様のスペースに保存されている。４−１ＢＢタンパク質とsinaタンパク質との間で２４アミノ酸の内、１０アミノ酸が同一であり、２４個の内３個は保存的置換である。保存のパターンはこれらのアミノ酸が機能的に重要であることを示している。sinaタンパク質は核に局在しており、これは、細胞内で調節機能を果たしていることを示唆している。４−１ＢＢのアミノ酸配列が、亜鉛フィンガーモチーフ、核タンパク質、及び受容体ドメインの様な特徴を含有しているという事実は、４−１ＢＢが細胞増殖及び分化の間に多様な役割を果たしていることを示している。
【００３１】
４−１ＢＢはＴ−細胞−ＡＰＣ相互作用に関連する他の細胞表面分子を表しているかもしれない。４−１ＢＢ−ＡＰ融合タンパク質は、成熟Ｂ−細胞株、抗μ−活性化初代Ｂ細胞、及び成熟マクロファージ細胞株と特異的に結合する。４−１ＢＢ−ＡＰは、未成熟な、Ｂ細胞株及びマクロファージ細胞株、Ｔ細胞クローン、Ｔ細胞株、Ｔ細胞の初代培養、及び種々の非リンパ様細胞株とは低レベル又は僅かなレベルで結合する。４−１ＢＢ−ＡＰは成熟Ｂ細胞及びマクロファージと結合するので、４−１ＢＢの結合に際して伝達されるシグナルは何等かの方法でＡＰＣ機能を調節する可能性がある。この可能性は探索の余地がある。
【００３２】
Chalupnyら（１９）は４−１ＢＢＲｇ、４−１ＢＢの細胞外領域とヒトＩｇＧのＦｃ領域からなる融合タンパク質、が細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に結合すると提案した。４−１ＢＢＲｇ結合はヒトビトロネクチンとの間で最高レベルであった。データは示されていないが、４−１ＢＢ−ＡＰ及びマイクロタイター上、１ウエル当たり０.００７μg−１０μgで固定化されたヒトビトロネクチンを用いてＥＬＩＳＡが行われた［Yelios Pharmaceuticals/GIBCO-BRL, Grand Island, NY.)。ＡＰ活性に基づいて、４−１ＢＢ−ＡＰの結合は観察されなかった。細胞表面に外因的に結合しているタンパク質（細胞外マトリックス構成成分の可能性あり）に４−１ＢＢ−ＡＰが結合する可能性を排除するために、結合アッセイの前にＢ細胞リンパ腫を酸性条件で洗浄した。４−１ＢＢ−ＡＰは依然として成熟Ｂ−細胞に特異的に結合した。Ｂ細胞及びマクロファージ上で特異的に発現される４−１ＢＢ−リガンドが存在するか否か、及び４−１ＢＢ−ＡＰが特定の結合条件下でＥＣＭと結合するか否かはなお決定されるべきことである。ＥＣＭは４−１ＢＢの特定の細胞表面リガンドへの結合を容易にしている可能性がある。
【００３３】
Ｂ細胞とヘルパーＴ細胞とは、Ｔ細胞上の特異的な対応受容体に結合するＢ細胞上の受容体によって互いに相互作用する。この相互作用の結果、これら２つの細胞種間での生化学的シグナル伝達リレーのカスケードが起こると考えられている（２０)。この相互作用が進行するにつれ、これら細胞は細胞周期のＳ期に入るようになる。ＴＣＲとＴ細胞上のＣＤ４、およびＢ細胞上のプロセスされた抗原−ＭＨＣＩＩとの間の初期相互作用は、Ｂ細胞が細胞周期に入るという結果にはならない（２１)。しかしながら、インビトロ系での研究は、Ｔ細胞が一旦刺激されると、Ｂ細胞を細胞周期に入らせうる新たに合成されたまたは修飾された細胞表面分子を発現することを示唆している（２２、２３)。このＴ細胞機能は抗原特異的でもＭＨＣに限定されたものでもない（２４)。加えて、Ｂ細胞活性化の活性化Ｔｈ誘導には可溶性因子を必要としない（２５)。Ｂ細胞が細胞周期に入ったら、ＩＬ−４がＢ細胞をＧ1期からＳ期への進行を誘導する。活性化Ｔ細胞またはＴ細胞膜がＢ細胞を細胞周期に入るのを促進する能力は、シクロヘキシミドかまたはシクロスポリンＡ処理により阻止することができる（２６、２７)。これらの新たに発現される膜タンパク質は、その誘導特性において「リンホカイン様」であると思われる。
【００３４】
４−１ＢＢは、Ｂ細胞のコスティミュレーターとしての要求を満たす発現特性を有する。４−１ＢＢは抗ＣＤ３またはＴＣＲ媒体Ｔ細胞刺激によって誘導することができ、その発現はシクロスポリンＡ並びにシクロヘキシミド処理に感受性である（２８)。興味深いことに、パラホルムアルデヒド固定したＳＦ２１−４−１ＢＢ細胞は、Ｂ細胞増殖の誘導において抗μと共同作用する（synergized)。ＳＦ２１−４−１ＢＢによる脾臓Ｂ細胞のコスティミュレーションは、抗μの最適用量（１０μｇ／ｍｌ）および最適下限用量（１.０〜０.１μｇ／ｍｌ）で起こる。休止Ｂ細胞にＳＦ２１−４−１ＢＢ細胞を加えても有意のＢ細胞増殖とはならなかった。ＳＦ２１−４−１ＢＢは、Ｂ細胞増殖の誘導においてＴＰＡまたはイオノマイシン、または最適下限濃度のＬＰＳとは共同作用しなかった。
【００３５】
大量の組換え可溶性タンパク質を発現させるためにバクロウイルス系が用いられてきているが、この系は組換え細胞表面タンパク質の発現のために用いることができる。バクロウイルス感染は、細胞当たりベースで均一な高レベルの組換えタンパク質を発現させるための都合の良い手段をもたらす。ＳＦ２１細胞を単独で加えても有意レベルのコスティミュレーションとならなかったことは注目に値する。このことは、それ自身で強力なコスティミュレーター活性を示しうるｃｏｓ−またはＬ−細胞株を用いるに際して潜在的な問題となりうる。
【００３６】
ＮＧＦＲスーパーファミリーの他の成員であるＣＤ４０はＢ細胞表面で発現され、活性化Ｔ細胞上で発現される分子であるｇｐ３９と相互作用する。マウスｇｐ３９タンパク質（２９）およびヒトｇｐ３９タンパク質（３０）をコードするｃＤＮＡはクローニングされている；この細胞表面分子は、腫瘍壊死因子と相同性を有するタイプＩＩの膜タンパク質である。ノエル（Noelle）ら（３１）は、ＣＤ４０−免疫グロブリン融合タンパク質がＴ細胞により誘導されたＢ細胞増殖および分化を用量に依存した仕方で阻止しうることを見いだした。アーミテージ（Armitage）らは、マウスｇｐ３９のｃＤＮＡを単離し、ｇｐ３９がコスティミュレーター（co-stimuli）の不在下でＢ細胞増殖を誘導することができ、ＩＬ−４−の存在下でＩｇＥ産生という結果になることを示した。ホレンバウ（Ｈollenbaugh）ら（３２）は、ヒトｇｐ３９でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞がヒトＢ細胞増殖を誘導するうえでＴＰＡかまたは抗ＣＯ２０と共同作用しうること、およびコスティミュレーターなしでは低レベルでしかＢ細胞を刺激できないことを示している。これらデータは、ＣＤ４０がＴ細胞との物理的接触の間にシグナルを伝達するＢ細胞表面分子の一つであることを示している。
【００３７】
細胞表面受容体は、可溶性因子かまたは隣接細胞上に発現された他の細胞表面分子のいずれかと相互作用することによって外部環境と連絡している。細胞表面受容体と相互作用する可溶性因子によって送達される生化学的シグナルに対して細胞−細胞接触によって送達される生化学的シグナルの役割は明らかでない。ＮＧＦＲが２以上のリガンドと結合するのと同様に、ＮＧＦＲスーパーファミリーはＴＮＦＲＩおよびＩＩに対して普通でない。ＴＮＦＲＩおよびＩＩはともにＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−Ｒの両者に結合する（３３)。ＮＧＦＲは、ＮＧＦ、脳由来神経栄養因子、およびニューロトロフィン−３に結合する（３４)。
【００３８】
加えて、一つのリガンドが細胞表面リガンドとしても可溶性リガンドとしても機能する。ＣＤ４−０リガンドであるｇｐ３９に関する最近の証拠は、このリガンドが膜結合したリガンドとしても可溶性リガンドとしても存在しうることを示唆している（３５)。４−１ＢＢが分泌され、Ｂ細胞と可溶性形態並びに膜結合形態で相互作用する可能性がある。ＮＧＦＲ受容体ファミリーの成員であるＣＤ２７は、Ｔ細胞上で発現され、分泌されるとともに細胞表面上に発現される（３６)。１を越えるリガンド（可溶性および細胞表面）が４−１ＢＢに結合する可能性もある。
【実施例】
【００３９】
ヒト同族体、Ｈ４−１ＢＢの単離
マウス４−１ＢＢのヒト同族体（Ｈ４−１ＢＢ）を単離するため、２セットの複製連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを設計した。ＰＣＲプライマーを設計するため、神経増殖因子受容体（ＮＧＦＲ）スーパーファミリーの成員間でアミノ酸配列を比較した。なぜなら４−１ＢＢは該スーパーファミリーの成員であるからである（３７)。使用したアミノ酸配列は、マウス４−１ＢＢ（３８)、ヒトＮＧＦＲ（３９)、ヒト腫瘍壊死因子受容体（３３)、ヒトＣＤ４０（４０)、およびヒトＣＤ２７（６）であった。ＮＧＦＲスーパーファミリー間での保存配列の領域を選択した。
【００４０】
前（forward）プライマーＩ（Ｈ４−１ＢＢＦＩ）は、マウス４−１ＢＢのアミノ酸３６〜４１の範囲、前プライマーＩＩ（ＨＲ−１ＢＢＦＩＩ）はアミノ酸５２〜５８の範囲にある。逆（reverse）プライマーＩ（Ｈ４−１ＢＢＲＩ）はマウス４−１ＢＢのアミノ酸１１６〜１２１の範囲、逆プライマーＩＩ（Ｈ４−１ＢＢＲＩＩ）はアミノ酸１２２〜１２８の範囲にある。マウス４−１ＢＢにおいてＰＣＲプライマーとして用いた領域は図１に示してある。
【００４１】
各プライマーのオリゴヌクレオチド配列は以下の通りである。
【表１】
2006149389.tif 000002
【００４２】
正常な健常者から末梢血リンパ球を単離し、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μＭ）で活性化した。これらリンパ球からｍＲＮＡを単離した。逆転写酵素を用い、ヒトリンパ球ｍＲＮＡを一本鎖ｃＤＮＡに変換させた。ついで、一本鎖ｃＤＮＡをＴａｑポリメラーゼと上記プライマーとの組わせにより増幅させた。プライマーの組わせは以下の通りであった：Ｈ４−１ＢＢＦＩとＨ４−１ＢＢＲＩ；Ｈ４−１ＢＢＦＩとＨ４−１ＢＢＲＩＩ；Ｈ４−１ＢＢＦＩＩとＨ４−１ＢＢＲＩ；およびＨ４−１ＢＢＦＩＩとＨ４−１ＢＢＲＩＩ。
【００４３】
Ｈ４−１ＢＢＦＩＩとＨ４−１ＢＢＲＩＩとのプライマーセットは〜２４０ｂｐの特異的バンドを生成した。この２４０ｂｐは、ヒト同族体タンパク質がマウス４−１ＢＢとサイズが同様であるとした場合にヒト４−１ＢＢの予期されるサイズである。このＰＣＲ生成物（２４０ｂｐ）をＰＧＥＭ３ベクター中にクローニングし、配列決定した。一つのオープンリーディングフレームはマウスの４−１ＢＢと〜６５％同一であった。それゆえ、この２４０ｂｐ ＰＣＲ生成物はマウス４−１ＢＢのヒト同族体であると結論した。この２４０ｂｐ ＰＣＲ生成物を用いて活性化ヒトＴリンパ球のλｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。〜０.８５ｋｂ ｃＤＮＡが単離させた。このｃＤＮＡの配列を図２に示してあり、予測されるアミノ酸配列を図２ｂに示してある。同情報は本明細書中の配列表の配列１に示してある。
【００４４】
Ｈ４−１ＢＢ−ＡＰ融合タンパク質を発現する発現プラスミドを構築した。シグナル配列および全細胞外ドメインをコードする配列を含むＨ４−１ＢＢ ｃＤＮＡの５'部分をＰＣＲにより増幅させた。正しい方向にクローニングするため、前プライマーの５'末端上にＨｉｎｄＩＩＩ部位を、および逆プライマーの５'末端上にＢｇｌＩＩ部位をそれぞれ生成させた。
【００４５】
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ Ｈ４−１ＢＢフラグメントを哺乳動物発現ベクターＡＰｔａｑ−１中、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＡＰ）をコードする配列の上流に挿入した。Ｈ４−１ＢＢの５'部分の増幅に用いたオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーは以下の通りである。
【表２】
2006149389.tif 000003
【００４６】
Ｈ４−１ＢＢ−ＡＰは、ヒト４−１ＢＢのリガンド（すなわち、Ｈ４−１ＢＢＬ）を発現する細胞および組織を同定するのに用いるであろう。マウス４−１ＢＢを用いた研究は、４−１ＢＢのリガンドが細胞表面上に存在することを示した。Ｂ細胞およびマクロファージが４−１ＢＢを発現する主要な細胞である。Ｈ４−１ＢＢＬもまたヒトのＢ細胞およびマクロファージ上で発現されることが予想される。
【００４７】
哺乳動物発現ｃＤＮＡライブラリーは、Ｈ４−１ＢＢＬを発現するヒト細胞株から生成されるであろう。このライブラリーは［125］Ｉ−標識したＨ４−１ＢＢ−ＡＰによりスクリーニングされるであろう。ついで、Ｈ４−１ＢＢＬのｃＤＮＡが単離され、特徴付けられるであろう。ついで、可溶性組換えＨ４−１ＢＢＬが生成されるであろう。Ｈ４−１ＢＢ−ＡＰおよびＨ４−１ＢＢＬの両者とも、下記のように免疫応答を抑制または促進するために用いられるであろう。Ｈ４−１ＢＢおよびＨ４−１ＢＢＬに対するモノクローナル抗体が産生されるであろう。  マウス４−１ＢＢでの研究によれば、４−１ＢＢはコスティミュラトリーシグナルとして働く。Ｈ４−１ＢＢはＴ細胞活性化のコスティミュラトリーシグナルとして働くことが予想される。マウス４−１ＢＢは、Ｂ細胞の増殖および分化を助ける。Ｈ４−１ＢＢも同様であろうことが予想される。Ｈ４−１ＢＢ−ＡＰ、Ｈ４−１ＢＢＬおよびモノクローナル抗体は、ヒトの免疫応答を抑制または促進するために用いることができる。
【００４８】
図３ａおよび３ｂはＴ細胞活性化に関与する分子を示す。初期のＴ細胞活性化の間（認識（cognitive）期)、休止Ｔ細胞はＴＣＲ／ＣＤ３複合体および他の「アクセサリー（accessory）」分子を発現する。これら構成的に発現される分子のうち、ＣＤ４（またはＣＤ３)、ＬＦＡ−１およびＣＤ２８がおそらくコスティミュラトリーシグナルを受け取る分子である。これら「アクセサリー」コスティミュラトリーシグナルとともにＴＣＲ／ＣＤ３複合体と相互作用することにより、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、および４−１ＢＢなどの他の受容体が引き続き発現される。これら新たに発現された分子は、おそらく、Ｔ細胞活性化の後期の段階で別の重要なコスティミュラトリーシグナルを受け取るであろう（クローン増殖)。
【００４９】
免疫応答の抑制
図４ａ−ｃは正常なＴ−細胞活性経路を示す。図５ａ−ｃは４−１ＢＢの可溶性キメラによる免疫応答阻害を示す。もし４−１ＢＢがＴ細胞活性化になんらかの役割を果たすなら、抗原−提示細胞上のそのリガンドに対する相互作用の阻害がＴ−細胞依存免疫応答の抑制をもたらす筈である。カウンター−受容体Ｂ７に対するＣＤ２８の相互作用の阻害が、種々の程度でインビボの抗体産生および細胞−媒介免疫応答の両者を抑制することは十分に立証されている。両者の相互作用の阻害はより効果的な免疫抑制をもたらす。そのリガンドに対する４−１ＢＢの相互作用の阻害はＣＤ２８／Ｂ７相互作用がもはや関連性がなくなった場合の活性化プロセスの後期の段階で重要になり得る。
【００５０】
マウス受容体４−１ＢＢおよびマウスリガンド４−１ＢＢＬについて、上記に詳述したように、Ｈ４−１ＢＢ−ＡＰの添加はＨ４−１ＢＢＬ発現細胞を覆い、Ｈ４−１ＢＢとＨ４−１ＢＢＬ間の正常な相互作用を阻害する。これは免疫応答を抑制することになる。この種の免疫応答は抗原−特異的である。従って、antiＣＤ３またはシクロスポリンＡ処置によって生じる一般化された免疫応答は回避される。Ｈ４−１ＢＢ−ＡＰ処置はある種の自己免疫疾患の処置に用いることができ、臓器移植を容易にする。
【００５１】
免疫増強
Ｈ４−１ＢＢはＴ−細胞活性化の後期の段階で機能し、Ｔ−細胞活性化の完成のための重要な細胞になり得る。多くの腫瘍は腫瘍−特異抗原を示す。しかしながら、なぜ免疫原性腫瘍が宿主免疫を免れ得るかの理由の1つは腫瘍−反応性Ｔ−細胞が不十分な共刺激（costimulation）を受けているからである。従って、Ｈ４−１ＢＢなどの共刺激分子の腫瘍への導入は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の抗腫瘍免疫を増強し得た。Ｈ４−１ＢＢＬは細胞−特異様式で発現され得る。例えば、Ｈ４−１ＢＢＬは、例えば、チロシナーゼプロモーターなどのメラノサイト−特異プロモーターを用いる黒色腫中に発現され得る。Ｈ４−１ＢＢＬ−発現黒色腫はＨ４−１ＢＢを介して細胞傷害性Ｔ細胞を刺激し、黒色腫−特異ＣＴＬを活性化する。活性化された黒色腫−特異ＣＴＬは黒色腫を撲滅させ得る。
【００５２】
引用により明細書の記載とされる文献の付録
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【００５３】
上記の記載は、詳細な説明および解説の目的のために特許法の要件に従って、本発明の具体的な実施態様を述べたものである。しかしながら、本発明の範囲および要旨をはずれることなく、多くの修正および変更が可能であることは当業者にとって自明である。下記の特許請求の範囲はそのようなすべての修正を包含するものと理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１ａ】マウスレセプター（受容体）タンパク質４−１ＢＢのｃＤＮＡ配列及びヒト同族体Ｈ４−１ＢＢを得るためのＰＣＲプライマーとして用いた領域を示す。
【図１ｂ】図１ａの続き。マウスレセプター（受容体）タンパク質４−１ＢＢのｃＤＮＡ配列及びヒト同族体Ｈ４−１ＢＢを得るためのＰＣＲプライマーとして用いた領域を示す。
【図２ａ】ヒトレセプター（受容体）Ｈ４−１ＢＢのヌクレオチド配列を示す。
【図２ｂ】ヒトレセプター（受容体）Ｈ４−１ＢＢの推定アミノ酸配列を示す。
【図３】Ｔ−細胞の活性化に関与する分子を示す。
【図４】正常なＴ−細胞活性化経路を示す。
【図５】Ｔ−細胞活性化経路における遮断工程における、（ａ）ＣＴＬＡ４−１ｇ単独使用、（ｂ）４−１ＢＢ／ＡＰ及びＣＴＬＡ４−１ｇ併用、および（ｃ）４−１ＢＢ／ＡＰ単独使用を示す。
【図１ａ】
2006149389.tif 000004
【図１ｂ】
2006149389.tif 000005
【図２ａ】
2006149389.tif 000006
【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
2006149389.tif 000009
【図５】
2006149389.tif 000010
【配列表】
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