(57)【要約】【課題】本発明は、簡便に、生きた細胞内でNotchシグナル伝達系活性化を検知するためのNotchシグナル伝達系活性化検知方法を提供することを目的とする。【解決手段】野生型Hes-1遺伝子プロモーターに制御される蛍光タンパク質Venus遺伝子を有するベクターを導入した遺伝子導入細胞におけるVenusの発現と、活性化Notchタンパク質によって制御を受けない変異Hes-1遺伝子プロモーターに制御される蛍光タンパク質Venus遺伝子を有するベクターを導入した遺伝子導入細胞におけるVenusの発現と、を比較し、野生型Hes-1遺伝子プロモーターを有するベクターを導入した遺伝子導入細胞においてVenusの発現によるシグナルが得られ、活性化Notchタンパク質によって制御を受けない変異Hes-1遺伝子プロモーターを有するベクターを導入した遺伝子導入細胞においてVenusの発現によるシグナルが得られないような細胞を同定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Notchシグナル伝達系が活性化された細胞を検知するNotchシグナル伝達系活性化検知方法であって、
第１の蛍光タンパク質をコードし、野生型Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第１の蛍光タンパク質（fluorescence protein；ＦＰ）遺伝子を有する遺伝子導入細胞における前記第１の蛍光タンパク質の発現と、
第２の蛍光タンパク質をコードし、活性化Notchタンパク質によって制御を受けない変異Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第２の蛍光タンパク質遺伝子を有する前記遺伝子導入細胞における前記第２の蛍光タンパク質の発現と、を比較し、
前記第１の蛍光タンパク質の発現によるシグナルが得られ、前記第２の蛍光タンパク質の発現によるシグナルが得られない細胞を同定することを特徴とするNotchシグナル伝達系活性化検知方法。
【請求項２】
前記第１の蛍光タンパク質遺伝子と、前記第２の蛍光タンパク質遺伝子のうちの少なくとも一方が、Hes-1遺伝子座に挿入され、前記Hes-1遺伝子座の内在性Hes-1遺伝子プロモーターによって制御されることを特徴とする請求項１に記載のNotchシグナル伝達系活性化検知方法。
【請求項３】
前記第１の蛍光タンパク質遺伝子と、前記第２の蛍光タンパク質遺伝子のうちの少なくとも一方が、ゲノムに挿入された外来性Hes-1遺伝子プロモーターによって制御されることを特徴とする請求項１に記載のNotchシグナル伝達系活性化検知方法。
【請求項４】
前記変異Hes-1遺伝子プロモーターが、RBP-J結合配列に変異を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のNotchシグナル伝達系活性化検知方法。
【請求項５】
前記第１の蛍光タンパク質と、前記第２の蛍光タンパク質のうち、少なくとも一方がVenusであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のNotchシグナル伝達系活性化検知方法。
【請求項６】
前記第１の蛍光タンパク質と、前記第２の蛍光タンパク質のうち、少なくとも一方の蛍光タンパク質にＰＥＳＴ配列が融合されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のNotchシグナル伝達系活性化検知方法。
【請求項７】
野生型Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第１の蛍光タンパク質（fluorescence protein；ＦＰ）遺伝子を有する第１の遺伝子導入細胞と
活性化Notchタンパク質によって制御を受けない変異Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第２の蛍光タンパク質遺伝子を有する第２の遺伝子導入細胞との細胞ペア。
【請求項８】
前記第１の蛍光タンパク質遺伝子と、前記第２の蛍光タンパク質遺伝子のうち、少なくとも一方の蛍光タンパク質遺伝子が、Hes-1遺伝子座に挿入され、前記Hes-1遺伝子座の内在性変異Hes-1遺伝子プロモーターに制御されることを特徴とする請求項７に記載の細胞ペア。
【請求項９】
前記第１の蛍光タンパク質遺伝子と、前記第２の蛍光タンパク質遺伝子のうち、少なくとも一方の蛍光タンパク質遺伝子が、ゲノムに挿入された外来性Hes-1遺伝子プロモーターに制御されることを特徴とする請求項７に記載の細胞ペア。
【請求項１０】
前記変異Hes-1遺伝子プロモーターが、RBP-J結合配列に変異を有することを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の細胞ペア。
【請求項１１】
前記第１の蛍光タンパク質遺伝子と、前記第２の蛍光タンパク質遺伝子のうち、少なくとも一方の蛍光タンパク質遺伝子のコードする蛍光タンパク質がVenusであることを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の細胞ペア。
【請求項１２】
前記第１の蛍光タンパク質遺伝子と、前記第２の蛍光タンパク質遺伝子のうち、少なくとも一方の蛍光タンパク質遺伝子のコードする蛍光タンパク質にＰＥＳＴ配列が融合されていることを特徴とする請求項７〜１１のいずれかに記載の細胞ペア。
【請求項１３】
野生型Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第１の蛍光タンパク質（fluorescence protein；ＦＰ）遺伝子と
活性化Notchタンパク質によって制御を受けない変異Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第２の蛍光タンパク質遺伝子を有する遺伝子導入細胞。
【請求項１４】
前記第１の蛍光タンパク質遺伝子と、前記第２の蛍光タンパク質遺伝子のうち、少なくとも一方の蛍光タンパク質遺伝子が、Hes-1遺伝子座に挿入され、前記Hes-1遺伝子座の内在性変異Hes-1遺伝子プロモーターに制御されることを特徴とする請求項１３に記載の遺伝子導入細胞。
【請求項１５】
前記第１の蛍光タンパク質遺伝子と、前記第２の蛍光タンパク質遺伝子のうち、少なくとも一方の蛍光タンパク質遺伝子が、ゲノムに挿入された外来性Hes-1遺伝子プロモーターに制御されることを特徴とする請求項１３または１４に記載の遺伝子導入細胞。
【請求項１６】
前記変異Hes-1遺伝子プロモーターが、RBP-J結合配列に変異を有することを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の遺伝子導入細胞。
【請求項１７】
前記第１の蛍光タンパク質遺伝子と、前記第２の蛍光タンパク質遺伝子のうち、少なくとも一方の蛍光タンパク質遺伝子が、Venusであることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれかに記載の遺伝子導入細胞。
【請求項１８】
前記第１の蛍光タンパク質遺伝子と、前記第２の蛍光タンパク質遺伝子のうち、少なくとも一方の蛍光タンパク質遺伝子のコードする蛍光タンパク質にＰＥＳＴ配列が融合されていることを特徴とする請求項１３〜１７のいずれかに記載の遺伝子導入細胞。
【請求項１９】
第１の蛍光タンパク質遺伝子の発現が、前記野生型Hes-1遺伝子プロモーターによって制御されるように構築された第１の蛍光タンパク質発現レポーターと
第２の蛍光タンパク質遺伝子の発現が、活性化Notchタンパク質によって制御を受けない変異Hes-1遺伝子プロモーターによって制御されるように構築された第２の蛍光タンパク質発現レポーターと、
から成るレポーターペア。
【請求項２０】
前記変異型Hes-1遺伝子プロモーターが、RBP-J結合配列に変異を有することを特徴とする請求項１９に記載のレポーターペア。
【請求項２１】
前記第１の蛍光タンパク質遺伝子と、前記第２の蛍光タンパク質遺伝子のうち、少なくとも一方の蛍光タンパク質遺伝子のコードする蛍光タンパク質がVenusであることを特徴とする請求項１９または２０に記載のレポーターペア。
【請求項２２】
前記第１の蛍光タンパク質遺伝子と、前記第２の蛍光タンパク質遺伝子のうち、少なくとも一方の蛍光タンパク質遺伝子のコードする蛍光タンパク質にＰＥＳＴ配列が融合されていることを特徴とする請求項１９〜２１のいずれかに記載のレポーターペア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Notchシグナル伝達系活性化検知方法、並びに、それに用いられる遺伝子導入細胞、及びレポーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
Notchシグナル伝達系は、発生過程を中心として、様々な生体機能を調節する。膜タンパクであるNotchは広範囲で発現しているが、隣接する細胞膜上に存在するDeltaからシグナルが伝えられることによりNotchシグナル伝達系が活性化するため、全ての細胞でNotchシグナル伝達系が活性化している訳ではない。
【０００３】
このNotchシグナル伝達系の活性化を検知するために、いくつかの実験が行われている。例えば、Notchシグナル伝達系が活性化すると、最終的に、核内でHes-1遺伝子の活性化が起きるため、Notchシグナルの活性化の指標としてHES-1プロモーターの活性化を利用し、Notchシグナルの活性化に従ってHES-1プロモーターの制御下でルシフェラーゼを発現させたり（例えば、非特許文献１参照）、活性化Notch特異的な抗体で、免疫組織染色を行ったり（例えば、非特許文献２参照）することによって、Notchシグナル伝達系の活性化が検知できるようになった。
【非特許文献１】Jarriault, S., Brou, C., Logeat, F., Schroeter, E. H., Kopan, R. and Israel, A. (1995). Signalling downstream of activated mammalian Notch. Nature 377, 355-8.
【非特許文献２】Tokunaga, A., Kohyama, J., Yoshida, T., Nakao, K., Sawamoto, K. and Okano, H. (2004). Mapping spatio-temporal activation of Notch signaling during neurogenesis and gliogenesis in the developing mouse brain. J Neurochem. 90, 142-154.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、HESプロモーターには、Notchシグナル伝達系以外のシグナルによって調節される領域があり、Notchシグナル伝達系活性化の指標として、野生型HESプロモーターだけを用いても、その活性化を正確に反映していない。また、活性化Notch特異的な抗体による免疫組織染色は、検出が難しい。さらに、これまで開発された方法では、細胞をホモゲナイズしたり、固定したりしなければならないので、細胞が生きたままでNotchシグナル伝達系活性化を検知することはできなかった。
【０００５】
そこで、本発明は、簡便に、生きた細胞内でNotchシグナル伝達系活性化を検知するためのNotchシグナル伝達系活性化判検知法と、それに用いられる遺伝子導入細胞、及び蛍光タンパク質発現レポーターを提供するためになされた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明にかかるNotchシグナル伝達系活性化検知方法は、Notchシグナル伝達系が活性化された細胞を検知するNotchシグナル伝達系活性化検知方法であって、第１の蛍光タンパク質をコードし、野生型Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第１の蛍光タンパク質（fluorescence protein；ＦＰ）遺伝子を有する遺伝子導入細胞における前記第１の蛍光タンパク質の発現と、第２の蛍光タンパク質をコードし、活性化Notchタンパク質によって制御を受けない変異Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第２の蛍光タンパク質遺伝子を有する前記遺伝子導入細胞における前記第２の蛍光タンパク質の発現と、を比較し、前記第１の蛍光タンパク質の発現によるシグナルが得られ、前記第２の蛍光タンパク質の発現によるシグナルが得られない細胞を同定することを特徴とする。
【０００７】
上記Notchシグナル伝達系活性化検知方法において、前記第１の蛍光タンパク質遺伝子と、前記第２の蛍光タンパク質遺伝子のうちの少なくとも一方が、Hes-1遺伝子座に挿入され、前記Hes-1遺伝子座の内在性Hes-1遺伝子プロモーターに制御されてもよい。別法として、前記第１の蛍光タンパク質遺伝子と、前記第２の蛍光タンパク質遺伝子のうちの少なくとも一方が、ゲノムに挿入された外来性Hes-1遺伝子プロモーターに制御されてもよい。
【０００８】
ここで、Hes-1遺伝子座の内在性Hes-1遺伝子プロモーターとは、生物がゲノム上に持つ本来のHes-1遺伝子プロモーターのことであるが、配列それ自体は、外来性の配列と置換されていてもよい。例えば、Hes-1遺伝子座の本来有する内在性Hes-1遺伝子プロモーターが、相同組換えによって、外来性野生型Hes-1遺伝子プロモーターまたは外来性変異Hes-1遺伝子プロモーターと置換しているような場合も含まれる。全体的な構造が同一である限り、プロモーター機能に差異はなく、本来のHes-1遺伝子の発現を再現できるからである。
【０００９】
上記いずれのNotchシグナル伝達系活性化検知方法においても、前記変異Hes-1遺伝子プロモーターが、RBP-J結合配列に変異を有しているのが好ましい。また、前記第１の蛍光タンパク質と、前記第２の蛍光タンパク質のうち、少なくとも一方がVenusであることが好ましい。また、上記いずれのNotchシグナル伝達系活性化検知方法においても、前記第１の蛍光タンパク質と、前記第２の蛍光タンパク質のうち、少なくとも一方の蛍光タンパク質にＰＥＳＴ配列が融合されていてもよい。
【００１０】
ＰＥＳＴ配列とは、プロリン−グルタミン酸−セリン−トレオニンに富むアミノ酸配列のことであり、配列自体やその長さに特異性はないが、タンパク質の細胞内での半減期を短縮する機能を持つアミノ酸配列を意味する。
【００１１】
さらに、本発明にかかる細胞ペアは、野生型Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第１の蛍光タンパク質（fluorescence protein；ＦＰ）遺伝子を有する第１の遺伝子導入細胞と、活性化Notchタンパク質によって制御を受けない変異Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第２の蛍光タンパク質遺伝子を有する第２の遺伝子導入細胞とから成る。また、本発明にかかる遺伝子導入細胞は、野生型Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第１の蛍光タンパク質遺伝子と活性化Notchタンパク質によって制御を受けない変異Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第２の蛍光タンパク質遺伝子を有する。これらの態様は、Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第１の蛍光タンパク質遺伝子と変異Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第２の蛍光タンパク質遺伝子とを、異なる細胞に導入するか、同じ細胞に導入するかの違いである。
【００１２】
ここで、遺伝子導入細胞は、培養細胞のように単独で存在していてもよく、他の細胞と共に組織、器官、個体など細胞集団を形成していてもよい。
【００１３】
上記細胞ペアあるいは遺伝子導入細胞において、第１の蛍光タンパク質遺伝子と、第２の蛍光タンパク質遺伝子のうち、少なくとも一方の蛍光タンパク質遺伝子が、Hes-1遺伝子座に挿入され、Hes-1遺伝子座の内在性変異Hes-1遺伝子プロモーターに制御されてもよい。また、第１の蛍光タンパク質遺伝子と、第２の蛍光タンパク質遺伝子のうち、少なくとも一方の蛍光タンパク質遺伝子が、ゲノムに挿入された外来性Hes-1遺伝子プロモーターに制御されてもよい。
【００１４】
上記細胞ペアあるいは遺伝子導入細胞において、変異Hes-1遺伝子プロモーターが、RBP-J結合配列に変異を有することが好ましい。また、第１の蛍光タンパク質遺伝子と、第２の蛍光タンパク質遺伝子のうち、少なくとも一方の蛍光タンパク質遺伝子のコードする蛍光タンパク質がVenusであることが好ましい。また、第１の蛍光タンパク質遺伝子と、第２の蛍光タンパク質遺伝子のうち、少なくとも一方の蛍光タンパク質遺伝子のコードする蛍光タンパク質にＰＥＳＴ配列が融合されていてもよい。
【００１５】
さらに、本発明にかかる蛍光タンパク質発現レポーターペアは、第１の蛍光タンパク質遺伝子の発現が、前記野生型Hes-1遺伝子プロモーターによって制御されるように構築された第１の蛍光タンパク質発現レポーターと第２の蛍光タンパク質遺伝子の発現が、活性化Notchタンパク質によって制御を受けない変異Hes-1遺伝子プロモーターによって制御されるように構築された第２の蛍光タンパク質発現レポーターと、から成る。
【００１６】
上記レポーターペアにおいて、前記変異型Hes-1遺伝子プロモーターが、RBP-J結合配列に変異を有しているのが好ましい。また、いずれの蛍光タンパク質発現レポーターにおいても、前記蛍光タンパク質遺伝子のコードずる蛍光タンパク質がVenusであることが好ましい。また、いずれの蛍光タンパク質遺伝子のコードずる蛍光タンパク質にもＰＥＳＴ配列が融合されていてもよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、簡便に、生きた細胞内でNotchシグナル伝達系活性化を検知するためのNotchシグナル伝達系活性化検知方法と、それに用いられる遺伝子導入細胞、及び蛍光タンパク質発現レポーターを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook & D.W.Russell (Ed.), Molecular Cloning: a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１９】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２０】
＝＝蛍光タンパク質遺伝子を有する遺伝子導入細胞の作製＝＝
野生型Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第１の蛍光タンパク質遺伝子及び／又は活性化Notchタンパク質によって制御を受けない変異Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第２の蛍光タンパク質遺伝子を有する遺伝子導入細胞を作製する。
【００２１】
蛍光タンパク質は、特定の波長で励起した時蛍光を発するものであればよく、例として、ＧＦＰ(green fluorescent protein)、ＹＦＰ(yellow fluorescent protein)、ＢＦＰ(blue fluorescent protein)などが挙げられるが、蛍光強度が強いため、改良ＹＦＰであるVenusであることが好ましい。Venusとは、ＹＦＰに点突然変異を加えることで、従来の蛍光タンパク質に比べ、蛍光強度が強く、また発光団形成時間も短くなるように設計されたタンパク質である (Nagai et al Nat. Biotechnol. 20, 87-90, 2002)。
【００２２】
第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質は同じ種類の蛍光タンパク質でも異なる種類の蛍光タンパク質でも構わないが、同一細胞内に両方の蛍光タンパク質遺伝子を導入し、そのシグナルを比較する時は、異なる種類の蛍光タンパク質を用いる。
【００２３】
遺伝子導入細胞は、培養細胞株として作製してもよく、組織、器官に属する細胞としてもよく、遺伝子導入マウス個体中の細胞としてもよい。
【００２４】
変異Hes-1遺伝子プロモーターは、Notchシグナル伝達系の活性化によって活性化されないようにする変異であれば何でもよいが、例えば、RBP-J結合配列に変異を有し、そのためRBP-Jタンパク質が結合できなくなるような変異が考えられる。この場合、Notchシグナル伝達系以外によるプロモーター調節を野生型Hes-1遺伝子プロモーターと完全に同じにするため、導入した変異以外は、野生型Hes-1遺伝子プロモーターと同じ塩基配列を有するのが好ましい。また、Notchシグナル伝達系以外によるプロモーター制御に影響を与えないようにするため、導入する変異は小さいものほど好ましく、点突然変異が最も好ましい。
【００２５】
＜内在性Hes-1遺伝子プロモーターの利用＞
Hes-1遺伝子プロモーターに制御される蛍光タンパク質遺伝子は、in vivoと同様に正確に制御されるためには、ゲノム中で、Hes-1遺伝子座に挿入され、Hes-1遺伝子座固有の内在性Hes-1遺伝子プロモーターに制御されるのが好ましい。この場合、相同組換えの手法を用いて、蛍光タンパク質遺伝子をHes-1遺伝子座に挿入したり、内在性Hes-1遺伝子と置換したりすることができる。また、同様に相同組換えの手法を用いて、内在性Hes-1遺伝子プロモーターに変異を導入することができる。
【００２６】
この場合に用いる細胞は特に限定されないが、例えば遺伝子導入マウスを作製するには、胚幹細胞を用いる。この場合、常法により、ジャームラインキメラマウス(germline chimeric mice)を作製し、相同組換えを生じたゲノムを有するマウスを単離することにより、遺伝子導入マウスが得られる。また、この遺伝子導入マウスから、組織や器官や細胞を培養に移すことによって、遺伝子を導入した組織や器官や細胞を得ることができる。
【００２７】
＜外来性Hes-1遺伝子プロモーターの利用＞
蛍光タンパク質遺伝子は、Hes-1遺伝子座の外に挿入された外来性Hes-1遺伝子プロモーターに制御されてもよい。即ち、Hes-1遺伝子プロモーターの制御下に蛍光タンパク質遺伝子を挿入した発現ベクターを作製し、細胞に導入すればよい。以下、詳細を述べる。
【００２８】
まず、野生型Hes-1遺伝子プロモーターの下流に蛍光タンパク質遺伝子を挿入し、Notchシグナル伝達系の活性化によって蛍光タンパク質が発現する第１の蛍光タンパク質発現レポーターを作製する。この野生型Hes-1遺伝子プロモーターは、RBP-J結合配列を有し、Notchシグナル伝達系の活性化によって活性化されるような領域であればよいが、内在性Hes-1遺伝子プロモーターと同じ調節を受けるものが最も好ましい。下流の遺伝子の転写に必要な最小限の領域である最小プロモーターを含んでも含まなくてもよいが、含まない時は、他の遺伝子のプロモーターの最小プロモーターを用いる。最小プロモーターの由来は、ＳＶ４０やｔｋやアクチンなどが考えられるが、これらに限定されない。
【００２９】
次に、変異Hes-1遺伝子プロモーターの下流に蛍光タンパク質遺伝子を挿入し、Notchシグナル伝達系の活性化によっては蛍光タンパク質が発現しない第２の蛍光タンパク質発現レポーターを作製する。変異型Hes-1遺伝子プロモーターは、下流の遺伝子の転写に必要な最小限の領域である最小プロモーターを含んでも含まなくてもよいが、含まない時は、他の遺伝子のプロモーターの最小プロモーターを用いる。最小プロモーターの由来は、ＳＶ４０やｔｋやアクチンなどが考えられるが、これらに限定されない。
【００３０】
第１の蛍光タンパク質発現レポーターと第２の蛍光タンパク質発現レポーターとは、Hes-1遺伝子プロモーターに導入した変異以外、全く同じ塩基配列を有することが好ましいが、前者の有するプロモーターはNotchシグナル伝達系の活性化によって活性化され、後者の有するプロモーターはNotchシグナル伝達系の活性化によっては活性化されず、その他に関しては両者のプロモーターが同様に調節を受けるのであれば、配列が異なっていても構わない。
【００３１】
これら第１の蛍光タンパク質発現レポーターと第２の蛍光タンパク質発現レポーターとは、同じ細胞に導入する場合、一つのベクター上にあっても異なるベクター上にあってもよく、異なる細胞に導入する場合、異なるベクター上になければならない。
【００３２】
以上のようにして作製した蛍光タンパク質発現レポーターを用いて、遺伝子導入細胞を作製する。例えば、培養細胞（組織培養、器官培養を含む）に、リポフェクション、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどの常法により、蛍光タンパク質発現レポーターを有するベクターを導入することができる。この場合、ベクターにはプラスミドを用いるのが好ましいが、アデノウイルスやレトロウイルスなどのウイルスベクターを用いて、ウイルス感染によって蛍光タンパク質発現レポーターを培養細胞に導入してもよい。また、遺伝子導入マウスを作製するには、蛍光タンパク質発現レポーターを用い、常法に従って、トランスジェニックマウスを作製すればよい。
【００３３】
＝＝Notchシグナル伝達系活性化の検知＝＝
同じ細胞種（cell-type）の細胞を用いて、以上のように、第１の蛍光タンパク質をコードし、野生型Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第１の蛍光タンパク質遺伝子を有する遺伝子導入細胞と、第２の蛍光タンパク質をコードし、活性化Notchタンパク質によって制御を受けない変異Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第２の蛍光タンパク質遺伝子を有する遺伝子導入細胞を作製し、第１の蛍光タンパク質の発現と第２の蛍光タンパク質の発現とを比較する。野生型Hes-1遺伝子プロモーターはNotchシグナル伝達系の活性化に反応し、変異Hes-1遺伝子プロモーターはNotchシグナル伝達系の活性化に反応しないので、第１の蛍光タンパク質の発現によるシグナルが得られ、第２の蛍光タンパク質の発現によるシグナルが得られない場合、Notchシグナル伝達系が活性化されていると判断できる。
【００３４】
具体的には、例えば、野生型Hes-1遺伝子プロモーターに制御されるVenus遺伝子を有するマウスと変異Hes-1遺伝子プロモーターに制御されるVenus遺伝子を有するマウスを作製し、各のマウスにおける蛍光発光領域を比較する。あるいは、同一のマウスに、野生型Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第１の蛍光タンパク質遺伝子（例えばＧＦＰ遺伝子）と変異Hes-1遺伝子プロモーターに制御される第２の蛍光タンパク質遺伝子（例えばＹＦＰ遺伝子）の両方を導入し、ＧＦＰの発現のみが検出できる領域を同定することにより、Notchシグナル伝達系が活性化されている領域を検知できる。
【００３５】
蛍光タンパク質の発現によるシグナルは、細胞を適当な波長の光で励起することにより得られる蛍光を検出することにより検知する。この手法を用いれば、細胞を生きたまま行うことができ、細胞を固定する必要がないので、例えば、マウス内で時間の経過と共にシグナルをモニターすることも可能である。また、細胞を固定したり、切片を作製したりした後で、蛍光タンパク質の抗体を用いて組織免疫学的にシグナルを検出することも可能である。
【００３６】
＝＝RBP-Jタンパク質による発現抑制の検知＝＝
RBP-Jタンパク質は、Notchシグナル伝達系が活性化されていない場合、野生型Hes-1プロモーターに対し、RBP-J結合配列に結合し、プロモーター活性を抑制する機能を有する。従って、RBP-J結合配列に変異を有するプロモーターを有する個体では、普段RBP-Jタンパク質によってHes-1遺伝子の発現が抑制されている細胞において、その発現の抑制が解除され、異所的な発現が見られることになる。このように、RBP-J結合配列に変異を有する変異Hes-1遺伝子プロモーターが制御するレポーターは、RBP-Jタンパク質によってHes-1遺伝子の発現が抑制されている細胞を同定するのに用いることができる。
【実施例】
【００３７】
＝＝プラスミドの作製＝＝
d4Venus cDNA（Nagai et al. Nat. Biotechnol. 20, 87-90, 2002）のAgeI-NotI断片をpEGFP（Clontech社）及びpEGFP-N1（Clontech社）のAgeI-NotI断片と置換し、それぞれpd4Venus-1及びpd4Venus-1-N1を作製した。Hes1p-luciferase (Jarriault et al. Nature 377, 355-358, 1995) の プロモーター領域を、それぞれAseI siteまたはAgeI siteをもつ下記のプライマーを用い、PCRで増幅した。  
プライマー１：  GATTAATCTCAGGCGCGCGCCA  （配列番号１）
プライマー２：  GACCGGTGGATCCGCTTACGTC  （配列番号２）
【００３８】
増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素AseI-AgeIで処理することにより作成した断片及びHes1pAmBm-luciferase (Jarriault et al. Nature 377, 355-358, 1995)の （KpnI-HindIII）断片を、それぞれpd4Venus-1-N1のAseI-AgeI部位及びpd4Venus-1のKpnI-HindIII部位に挿入し、pHes1p-d4Venus及びpHes1pAmBm-d4Venusを作製した。図１にそれらのプラスミドマップを示す。
【００３９】
pHes1p-d4Venusは、Hes-1プロモーター（図２参照）の下流に、蛍光タンパク質VenusにPEST配列の融合タンパク質をコードする遺伝子が挿入され、さらに下流に転写終止配列として、SV40polyAシグナルが挿入されている。このHes-1プロモーター断片は、in vivoでのNotchシグナルによる応答を正確に反映できることが知られている。また、PEST配列はVenusの半減期を短くするため、この配列をVenusに付加することにより、Venusの発現が無くなってからVenusが検出されるようなことがなく、発現と検出の相関性がより強くなる。また、変異Hes-1プロモーターであるHes1pAmBmプロモーター（図２）は、２カ所のRBP-J結合配列に変異が導入されており、RBP-Jが結合できない(Jarriault et al. Nature 377, 355-358, 1995)。
【００４０】
1704-2531番目のアミノ酸を持つ断片（Notch1C+3’UTR）を有するpME18S-mNotchIC  のEcoRI-XbaI断片をpEF-BOSベクターのEcoRI-XbaI部位に挿入し、pEF-Notch1A(pEF-NotchΔE)を作製した(Yamamoto et al. JBC 276(48):45031-45040, 2001)（図３）。
【００４１】
＝＝レンチウイルスを用いたレポーターシステムの構築＝＝
CS-CDF-CGF-PRE (Miyoshi et al. J Virol. 72, 8150-8157,1998)のEcoRI-XhoI断片、Hes1p-d4VenusのAseIp-NotI断片およびHes1pAmBm-d4VenusのKpnI-NotI断片をそれぞれ平滑末端にし、Hes1p-d4VenusおよびHes1pAmBm-d4Venusの断片をCS-CDF-CGF-PREに挿入し、pSIN-Hes1p-d4VenusおよびpSIN-Hes1pAmBm-d4Venusを作成した（図４）。
【００４２】
次に、このようにしてできたHes1又はHes1pAmBmの発現ベクターを用い、文献記載の方法（Miyoshi et al.,  J. Virol. vol.72, 8150-8157, 1998）により、レンチウイルスを得た。以下、簡単に記載すると、まず、HEK293T細胞を15cm dishでDMEM+10%FBSで培養した。細胞がdishの80%を占める程度まで増殖したら、リン酸カルシウム法によりdish一枚あたり、ベクターDNA 45.9ug、pMDLg/p RRE 32.4ug 、pCMV-VSV-F  20.25ug（VSV-F発現ベクター）、PRSV-Rev      13.5ug（Rev発現ベクター）を導入した。16時間後に、メディウムを交換し、新たに15.5mlのDMEM+10%FBSを加えた。48時間後に、培養上清を回収し、0.45umフィルターを通した後、超遠心し、ウイルスを濃縮した。濃縮したウイルス液を100ulの無血清培養液で希釈した。
【００４３】
＝＝Notchシグナル伝達系活性化に対する各プロモーターの反応＝＝
培養細胞におけるトランジエント・アッセイを用い、pHes1p-d4Venus及びpHes1pAmBm-d4Venusの有する各プロモーターのNotchシグナル伝達系活性化に対する反応を調べた。
【００４４】
１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２，３７℃の条件下でＨＥＫ２９３Ｔを培養した。Lipofectamine Plus（Gibco-BRL社）を用い、添付のプロトコールに従って、レポーターとしてpHes1p-d4VenusまたはpHes1pAmBm-d4Venus、及びNotchシグナル伝達系を活性化するためにpPEF-Notch1Aを導入した。ネガティブコントロールとして、PEF-Notch1Aを導入せず、レポーターのみを導入する実験も行った。lipofectionを行って２４時間後、細胞を溶解し、CytoFluor（PerSeptive Biosystem社）を用いて、蛍光強度を測った。結果を図５に示す。
【００４５】
レポーターにpHes1p-d4Venusを用いた場合、Notchシグナル伝達系を活性化すると、蛍光強度が約９倍に上昇するのに対し、レポーターにpHes1pAmBm-d4Venusを用いた場合、Notchを活性化しても、蛍光強度は変化しなかった。即ち、pHes1pプロモーターは Notchシグナル伝達系の活性化に反応するのに対し、Hes1pAmBmプロモーターは、Notchシグナル伝達系の活性化に反応しなかった。従って、Notchシグナル伝達系が活性化されている遺伝子導入細胞においては、pHes1p-d4Venusによる蛍光シグナルは得られるが、pHes1pAmBm-d4Venusによる蛍光シグナルは得られない。
【００４６】
＝＝変異Hes-1プロモーターのNotchシグナル伝達系に対する特異性＝＝
変異Hes-1プロモーターであるHes1pAmBmプロモーターのNotchシグナル伝達系に対する特異性を調べるため、Notch-1の細胞内ドメインの切り離しを抑制することによりNotchシグナル伝達系の活性化を抑制することが知られているγ―シクレターゼ阻害剤（γ-secretase inhibitor）を用い、Notchシグナル伝達系によるレポーターの活性化が阻害されるかどうか調べた。
【００４７】
まず、１４日胚のマウスから、端脳を切り出し、ピペッティングにより解離し、端脳細胞を1x106/MLになるようにEGF（最終濃度20ng/ML）とbFGF（最終濃度20ng/ML）を加えたＭＨＭ培地（Kawaguchi et al. Mol Cell Neurosci.  17, 259-73 2001）で培養した。
【００４８】
培養３時間後に、pSIN-Hes1p-d4VenusまたはpSIN-Hes1pAmBm-d4Venusを有するレンチウイルスを、MOIが50となるようにの培地に添加し、そのまま２４時間細胞を培養した。
【００４９】
塊になった大脳皮質細胞を再びピペッティングによって解離し、１μg/ml propidium idodide(PI)を含有したＭＨＭ培地に再懸濁し、４０μm孔径のナイロンメッシュで濾過した。FACSVantage SE flow cytometer(Becton-Dickinson社)またはMOFLO(DakoCytomation社)を用いて、細胞の分離と解析を行った。結果を図６に示す。
【００５０】
ネガティブコントロールである、ラット最小プロモーターのみを有するレンチウイルスを感染させても蛍光は検出されなかったが、pSIN-Hes1p-d4VenusまたはpSIN-Hes1pAmBm-d4Venusを有するレンチウイルスを感染させると、蛍光を発する細胞が検出された。
【００５１】
そこで、pSIN-Hes1p-d4VenusまたはpSIN-Hes1pAmBm-d4Venusを有するレンチウイルスを感染させた端脳細胞に、１μＭγ−シクレターゼ阻害剤を加え、１２〜２４時間後に細胞を解離し、上記と同様にflow cytometryを行って、細胞の分離と解析を行った。結果を図７に示す。
【００５２】
pSIN-Hes1p-d4Venusを有するレンチウイルスを感染させた端脳細胞は、γ−シクレターゼ阻害剤に対して感受性を有し、１ｘ１０−７Ｍの濃度で、蛍光シグナルが抑制された。しかし、pSIN-Hes1pAmBm-d4Venusを有するレンチウイルスを感染させた端脳細胞は、γ−シクレターゼ阻害剤に対して抵抗性を示し、１０ｘ−６Ｍの濃度でも、蛍光シグナルの抑制は観察されなかった。従って、この変異プロモーターであるHes1pAmBmプロモーターは、Notchシグナル伝達系の活性化には影響されないことが明らかになった。
【００５３】
＝＝マウス脳におけるNotchシグナル伝達系活性化の検知＝＝
exo uteroでマウス胚の脳に蛍光タンパク質発現レポーターを導入し、Notchシグナル伝達系活性化細胞を検知した。以下に、その詳細を述べる。なお、蛍光タンパク質発現レポーターとして、pHes1p-d4VenusまたはpHes1pAmBm-d4Venusを用い、全ての細胞で発現するpCXN2-mRFP（modified red fluorescent protein）を全体のＤＮＡの２０％になるように添加した。
【００５４】
まず、妊娠１４日目のマウス（ICR）を麻酔し、腹部を切開して子宮を露出させた。胚や胎盤を傷つけないように胎盤と反対側の子宮筋層を長軸方向に切開し、胎盤と結合している１４日胚をそのまま取り出した。ＤＮＡ溶液（濃度5 mg DNA/ml PBS）１μｌを端脳（telencephalon）の側室の左側に注入した後、胚を胚体外膜で覆い、ピンセット型電極（napa Gene Company社）で挟み、矩形パルスのエレクトロポレータ（CUY21EDIT、Napa Gene社）を用いて、９５０ミリ秒の間隔をおいて、２５Ｖの電圧を８回印加した。子宮壁を縫わずに処理胚を腹腔に戻し、腹腔を３７℃に加温したＰＢＳで満たした。その後、腹壁及び表皮を縫い合わせた。４８時間後、妊娠マウスを再度開腹し、マウス胚を取りだし、４％ホルムアルデヒド溶液で固定した。脳を取り出した後、その脳を２０％スクロース液に一晩浸した後、１２μｍの厚さになるように切片を作成した。結果を図８に示す。
【００５５】
pCXN2-mRFPからの赤色蛍光は、ほとんどがventricular zone（VZ）に観察され、そのうち、pHes1p-d4Venusからの緑色蛍光を発する細胞は、脳室側から脳軟膜側へ伸びる放射状繊維を有するという特徴をもっていた。これに対し、pHes1pAmBm-d4Venusからの緑色蛍光を発する細胞は、放射状繊維を有せず、ほとんどの細胞がsubventricular zone（SVZ）に観察され、一部intermediate zone(IZ)にも観察された。
【００５６】
このように、本発明のNotchシグナル伝達系活性化検知方法を用いて、マウス１４日〜１６日胚の脳では、Notchシグナル伝達系は主に、脳室側から脳軟膜側へ伸びる放射状繊維を有する細胞で特異的に活性化されていることが明らかになった。また、SVZ及びIZでは、RBP-J結合配列依存的にHES1の発現が抑制されている細胞の存在することが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明にかかる実施例に用いられたpHes1p-d4Venus及びpHes1pAmBm-d4Venusの構造を示す図である。
【図２】本発明にかかる実施例において用いられたHes-1プロモーター（野生型及び変異型）の塩基配列及び構造を示す図である。RBP-J結合配列を二重下線で示しており、＜＞内には変異型（Hes1pAmBm）の塩基配列を示す。pHes1p-d4Venusの作製に用いられたプライマー配列を一重下線で示す。なお（  ）内の配列は、プライマーにおいて、クローニングのために付加された本来のプロモーターに存在しない配列である。各制限酵素の認識配列を強調文字で示す。
【図３】本発明にかかる実施例において用いられたpME18S-mNotchIC、pEF-BOS、pEF-Notch1A(pEF-NotchΔE)の制限酵素地図である。
【図４】本発明にかかる実施例において用いられたCS-CDF-CGF-PRE、 pSIN-Hes1p-d4Venus、及びpSIN-Hes1pAmBm-d4Venusの制限酵素地図である。
【図５】本発明にかかる実施例において、培養細胞におけるトランジエント・アッセイを用い、pHes1p-d4Venus及びpHes1pAmBm-d4Venusの有する各プロモーターのNotchシグナル伝達系活性化に対する反応を調べた結果を示す図である。
【図６】本発明にかかる実施例において、培養した端脳細胞に、pSIN-Hes1p-d4VenusまたはpSIN-Hes1pAmBm-d4Venusを有するレンチウイルスを投与して得られた蛍光シグナルに対し、細胞の分離と解析を行った結果を示す図である。
【図７】本発明にかかる実施例において、pSIN-Hes1p-d4VenusまたはpSIN-Hes1pAmBm-d4Venusを有するレンチウイルスを感染させた端脳細胞に、γ−シクレターゼ阻害剤を加え、細胞を解離し、得られた蛍光シグナルに対し、細胞の分離と解析を行った結果を示す図である。
【図８】本発明にかかる実施例において、マウス脳におけるNotchシグナル伝達系活性化の検知を行った結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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