(57)【要約】【課題】標的細胞レセプターに対する、ＨＣＶタンパク質のようなＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レセプター結合リガンドの結合を測定するためのアッセイを提供する。本アッセイを用いて、研究目的および臨床応用のためのワクチン候補を評価し、ＨＣＶ中和抗体を同定および測定し得る。ここで、臨床応用では、中和抗体の存在の診断は、臨床的管理において予測値を有し得る。また、ＨＣＶに対するレセプターの同定および特徴付けを提供し、このレセプターは、レセプターの相互作用を妨害する抗ウイルス剤の同定およびスクリーニングを容易にする。【解決手段】標的細胞へのＨＣＶレセプター結合リガンドの結合を測定するアッセイであって、  ＨＣＶレセプター標的細胞へのＨＣＶレセプター結合リガンドまたはその競合的結合アナログの結合を測定する工程を包含する、アッセイ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞へのＨＣＶレセプター結合リガンドの結合を測定するアッセイであって、  ＨＣＶレセプター標的細胞へのＨＣＶレセプター結合リガンドまたはその競合的結合アナログの結合を測定する工程を包含する、アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞レセプターに対する、ＨＣＶタンパク質のようなＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レセプター結合リガンドの結合を測定するためのアッセイに関する。本アッセイを用いて、研究目的および臨床応用のためのワクチン候補を評価し、ＨＣＶ中和抗体を同定および測定し得る。ここで、臨床応用では、中和抗体の存在の診断は、臨床的管理において予測値を有し得る。
【０００２】
本発明はまた、ＨＣＶに対するレセプターの同定および特徴付けに関し、このレセプターは、レセプターの相互作用を妨害する抗ウイルス剤の同定およびスクリーニングを容易にする。
【背景技術】
【０００３】
人口の１〜２％がＨＣＶに慢性感染しているので、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ−非Ａ非Ｂ肝炎−ＮＡＮＢＶとして既に知られている）は、世界中で健康上の主要な問題となっている（１）。感染はほとんどの場合無症状であり、そして小数の症例では回復する。なぜなら、感染者の８０〜１００％は、生涯キャリアであり（２）そしてこれらの多くの症例では、慢性肝炎が発症する（３）からである。
【０００４】
ＨＣＶは、約３０００個のアミノ酸からなるポリタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレームを含む約１００００のヌクレオチドからなるポジティブセンスＲＮＡウイルスである。組換えＤＮＡ技術によって、ウイルスの構造が解明されている（１７、１８）が、ウイルス自体は単離されておらず、そしてポリタンパク質のタンパク質分解によって生じる種々のウイルスタンパク質の機能は、同様のゲノム組成（ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ）の他の同様のウイルスとの類似性によって推定されているのみである。
【０００５】
このウイルスタンパク質は、全て組換え体として入手可能であり、酵母、細菌、昆虫、および哺乳動物細胞を含む種々の細胞および細胞タイプ中で発現される（５、１０）。
【０００６】
Ｅ１およびＥ２と呼ばれる２種のタンパク質（それぞれアミノ酸１９２〜３８３位および３８４〜７５０位に対応する）は、ウイルスエンベロープの外部タンパク質であることが示唆されており（５）、この外部タンパク質は、ウイルスの標的細胞への結合の原因となっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、推定ＨＣＶレセプターを保持する細胞を同定する方法ならびにＨＣＶレセプター結合リガンドのレセプターへの結合を検出および定量するアッセイ技術を考案した。本技術は広範囲の適用性および利用性を有する。
【０００８】
ＨＣＶワクチンを設計する最初の工程は、防御免疫に関する成分の同定である。現在、ＨＣＶ感染の過程において働く免疫応答の役割についてはほとんど知られていない。
【０００９】
ＨＣＶレセプター標的細胞を同定することにより、ＨＣＶレセプター自体の特徴付けが容易になり、そしてＨＣＶレセプター標的細胞へのＨＣＶレセプター結合リガンドの結合に対するアッセイの開発において重要な成分が提供される。このようなアッセイは、各個人の中和抗体の診断、レセプター結合を妨害する抗ウイルス化合物の迅速なスクリーニング、およびワクチンの開発に使用され得る。
【００１０】
チンパンジーの受動免疫の研究において、慢性感染患者の血漿によるインビトロでの中和後に、ＨＣＶ感染が妨げられる（６）。しかし、ＨＣＶに対する防御抗体応答の評価は、インビトロでの中和アッセイがないことにより妨げられている。ＨＣＶは細胞培養物中では十分に増殖しないので、標的細胞に対するＨＣＶ結合を推定する中和試験を設定するための試みがなされている（７、８）。しかし、この入手可能な試験は、ＰＣＲによる結合ウイルスの検出に基づいており、中和抗体の定量の困難さおよびＲＴ−ＰＣＲ試験の正確な再現性を得る場合の問題点のような明らかな欠点を伴う。
【００１１】
本発明はまた、ＨＣＶ中和抗体を推定するための定量試験（結合の中和（Ｎｅｕｔｒａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ）すなわちＮ．Ｏ．Ｂ．と呼ばれる）に関し、これは、ＨＣＶエンベロープタンパク質のヒト細胞への結合を中和する血清のサイトフルオリメトリーでの評価に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の局面によれば、  ＨＣＶレセプター標的細胞に対するＨＣＶレセプター結合リガンドの結合を測定するためのアッセイが提供され、本アッセイは、ＨＣＶレセプター標的細胞に対するＨＣＶレセプター結合リガンドまたはその競合結合アナログの結合を測定する工程を包含する。
【００１３】
好ましくは、ＨＣＶレセプター結合リガンドまたはＨＣＶレセプター結合リガンドアナログの結合は、結合種を標識化し、そして遊離のＨＣＶレセプター標的細胞と結合ＨＣＶレセプター標的細胞とを識別することが可能な検出系を用いることによって、検出される。
【００１４】
好ましくは、検出系はフローサイトメトリーであり、より好ましくは、フローサイトフルオリメトリーである。この場合、結合種は蛍光標識物質を保持し、そして標識化細胞と非標識化細胞との間で物理的な細胞分別が生じる。
【００１５】
本発明の第１の局面は、可能性のあるＨＣＶレセプター結合リガンドがＨＣＶレセプター標的細胞に結合する能力に対する感度のよい迅速なアッセイを提供し、そして可能性のあるＨＣＶレセプター結合リガンドの簡単なスクリーニングを容易にする。このような可能性のあるＨＣＶレセプター結合リガンドは、抗ウイルス剤としてまたは可能性のあるワクチンまたはアッセイ用試薬の候補物として、有用性を有し得る。
【００１６】
本アッセイは、ＨＣＶレセプター標的細胞に対するＨＣＶレセプター結合リガンドの結合を直接測定する直接結合アッセイであってもよいし、または競合アッセイ（サンプル中の測定しようとするＨＣＶレセプター結合リガンドがＨＣＶレセプター結合リガンドアナログとの結合に対して競合し、そしてＨＣＶレセプター結合リガンドアナログの量が測定される）であってもよい。
【００１７】
直接結合アッセイにおいて、本アッセイは以下の工程を包含する：
ｉ）  ＨＣＶレセプター標的細胞と、ＨＣＶレセプター結合リガンドの存在について試験しようとするサンプルとを混合して、任意のＨＣＶレセプター結合リガンドとＨＣＶレセプター標的細胞とを結合させる工程、
ｉｉ）  非結合ＨＣＶレセプター結合リガンドを除去する工程、
ｉｉｉ）  ＨＣＶレセプター結合リガンドに結合し得る検出可能な抗体と混合して、結合したＨＣＶレセプター結合リガンドを有する上記ＨＣＶレセプター標的細胞を標識化する工程、および
ｉｖ）  標識化ＨＣＶレセプター標的細胞の量を検出する工程。
【００１８】
検出可能な抗体は、直接標識化され得、または抗体（適切には、検出可能な抗体の一定領域に対して特異的な抗体）のような標識化リガンドを添加することによって、検出可能であり得る。
【００１９】
標識物は、直接的または間接的に標識物の存在を表示し得るいかなる標識物であってもよい。しかし、好ましくは、標識物は、フローサイトメトリーでの使用に適した蛍光色素である。このような標識物に適したものとしては、フルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリフリン（ｐｈｙｃｏｅｒｉｐｈｒｉｎｅ）（ＰＥ）、およびテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）が挙げられる。
【００２０】
標識化リガンドは、検出可能な抗体に特異的に結合可能な他のいかなるリガンドであってもよい。例えば、検出可能な抗体は、それ自体、共有結合したビオチンを有し、そして標識化リガンドは、ストレプトアビジンであり得る。
【００２１】
検出可能な抗体は、例えば、ＩｇＧのようなヒト、ウサギ、またはマウスの免疫グロブリンであり得、そして標識化抗体は、標識化された、抗ヒト抗体、抗ウサギ抗体、または抗マウス抗体であり得る。
【００２２】
検出可能な抗体または二次標識抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。いずれの場合においても、抗体は、Ｆ（ａｂ’）フラグメントのような抗体の結合フラグメントであり得る。モノクローナル抗体は、細胞融合技術により、あるいはヒト化またはＣＤＲ移植のような組換えＤＮＡ技術により産生され得る。
【００２３】
記載の実施例において、検出可能な抗体は、免疫された動物宿主中でＨＣＶレセプター結合リガンドに対して惹起されたポリクロナール抗体（例えば、ウサギ血清）であり、そして二次標識抗体は、ＦＩＴＣで標識化された抗動物宿主（例えば、抗ウサギＩｇＧ）抗体である。しかし、好ましくは、検出可能な抗体はモノクローナル抗体である。
【００２４】
検出可能な抗体と同タイプの抗体のコントロール量は、コントロールとしての平行実験に添加され得る。コントロール量は、例えば、前免疫（ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ）血清であり得る。
【００２５】
間接結合アッセイにおいて、アッセイ工程は以下の工程を包含する：
ｉ）  ＨＣＶレセプター標的細胞と、ＨＣＶレセプター結合リガンドの存在について試験しようとするサンプルと、限定量のＨＣＶレセプター結合リガンドアナログとを混合して、ＨＣＶレセプター標的細胞への結合に対して競合させる工程、
ｉｉ）  非結合のＨＣＶレセプター結合リガンドを除去する工程、
ｉｉｉ）  ＨＣＶレセプター結合リガンドに結合し得る検出可能な抗体と混合して、結合したＨＣＶレセプター結合リガンドを有する上記ＨＣＶレセプター標的細胞を標識化する工程、および
ｉｖ）  ＨＣＶレセプター結合リガンドアナログに結合したＨＣＶレセプター標的細胞の量を検出する工程。
【００２６】
いずれの場合においても、標識化されたＨＣＶレセプター標的細胞の量は、蛍光標識を提供することによって、およびフローサイトメトリーを用いる細胞分別を実施することによって、検出され得る。
【００２７】
本発明の第２の局面によれば、ＨＣＶレセプター結合リガンドに対する中和抗体の結合から惹起されるＨＣＶレセプター結合リガンドの中和を測定するためのアッセイ（上記の
通りＮＯＢアッセイと呼ばれる）が提供され、このアッセイは、以下の工程を包含する：ｉ）  ＨＣＶレセプター標的細胞と、ＨＣＶレセプター結合リガンドと、ＨＣＶ中和抗体の存在について試験しようとするサンプルとを混合する工程、
ｉｉ）  非結合のＨＣＶレセプター結合リガンドを除去する工程、
ｉｉｉ）  ＨＣＶレセプター結合リガンドと結合し得る検出可能な抗体と混合して、結合したＨＣＶレセプター結合リガンドを有する上記ＨＣＶレセプター標的細胞を標識化する工程、および
ｉｖ）  ＨＣＶレセプター結合リガンドに結合したＨＣＶレセプター標的細胞の量を検出する工程。
【００２８】
本アッセイにおいて、ＨＣＶレセプター標的細胞およびＨＣＶ中和抗体は、ＨＣＶレセプター結合リガンドへの結合に対して競合する。
【００２９】
本発明の第２の局面は、ＨＣＶレセプターへのＨＣＶの結合を損傷し得る抗体を同定するための感度のよい迅速なアッセイを提供する。このような抗体は、ウイルスを中和し、そして連続的な免疫化から惹起される免疫系の効果的な応答の１つであるようである。従って、中和抗体のレベルは、免疫化プロトコルの成功の程度を表示し、そして中和抗体は、それ自体、受動免疫化のための薬学的調製物中の活性成分として有用であり得る。
【００３０】
本発明の第２の局面のアッセイはまた、現時点のまたは過去のＨＣＶ感染の診断方法として、サンプル中のＨＣＶ抗体を検出するための感度のよいアッセイを提供し得る。従って、好ましくは、サンプルは、患者由来のサンプルであり、そして本発明は、ＨＣＶによる現時点のまたは過去の感染を診断する方法を提供し、この方法は、患者から取り出したサンプルに関して、本発明の第２の局面のアッセイを実施する工程を包含する。
【００３１】
本発明者らは、ＨｅＬａ細胞中で産生されるＥ１／Ｅ２で免疫したチンパンジーにおいて、中和抗体の存在とその後の同種のＨＣＶによる攻撃からの防御との間に完全な相関があることを発見した。最大力価を有する動物は、完全にウイルスがいない状態のままであるので、本発明者らは、抗体はワクチン接種により誘導される中和抗体であると推測している。有効な中和力価は、３回目の追加免疫（ｔｈｉｒｄ  ｂｏｏｓｔ）の１年間後にまだ存在している。低力価は、軽度の感染を引き起こし、この感染はコントロールとは違ってワクチン接種によって回復（ｒｅｓｏｌｖｅ）する。
【００３２】
従って、中和抗体の測定能は、過去または現在のＨＣＶ感染の診断を可能にし、そして感染患者の治療において予測値を有する。
【００３３】
本アッセイは、中和抗体の特徴付けを可能にし、そして患者サンプルのアッセイとして直接用いられ得、または一般の臨床環境における使用に適した感度のよいアッセイの開発のための試薬を確認および試験するために使用され得る。このようなアッセイとしては、例えば、酵素標識化アッセイ、特にＥＬＩＳＡが挙げられる。
【００３４】
本発明の第２の局面のアッセイはまた、ＨＣＶレセプター標的細胞上のレセプターのマッピングを可能にするＨＣＶレセプターに結合し得る抗体のパネルを同定するのに有用であり得る。
【００３５】
最後に、本発明の第２の局面のアッセイは、異なるＨＣＶ遺伝子型由来のＨＣＶ外部タンパク質に対する抗体間の交差反応性を測定するのに有用であり得る。
【００３６】
本発明の第２の局面において用いられる試薬は、本発明の第１の局面および必要に応じて変更を加えたプロトコルに記載のものと同様であり得る。
【００３７】
本発明の第３の局面によれば、細胞のサンプル中のＨＣＶレセプター標的細胞を同定する方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：
ｉ）  細胞のサンプルとＨＣＶレセプター結合リガンドとを混合して、任意のＨＣＶレセプター結合リガンドとサンプル中の任意のＨＣＶレセプター標的細胞とを結合させる工程、
ｉｉ）  非結合のＨＣＶレセプター結合リガンドを除去する工程、
ｉｉｉ）    ＨＣＶレセプター結合リガンドに結合し得る検出可能な抗体と混合して、結合したＨＣＶレセプター結合リガンドを有する上記ＨＣＶレセプター標的細胞を標識化する工程、および
ｉｖ）  標識化されたＨＣＶレセプター標的細胞の量を検出する工程。
【００３８】
使用される試薬は、本発明の第１の局面および必要に応じて変更を加えたプロトコルに記載のものと同様であり得る。
【００３９】
本発明の第３の局面の方法は、ＨＣＶレセプターを保持する細胞に対する迅速なスクリーニング技術を提供する。従って、この方法を用いて、本発明の第１の局面および第２の局面のＨＣＶレセプター標的細胞を産生し得、あるいはその後の分析および、特に、入手可能なＨＣＶレセプター結合リガンドをさらに精製および改良する目的で、ＨＣＶレセプターの性質および形態の特徴付けのために、ＨＣＶレセプター標的細胞集団を産生し得る。
【００４０】
本発明はまた、本発明のアッセイおよび方法を用いて産生され、または同定された生成物を包含し、本発明のアッセイを用いて同定されたＨＣＶレセプター結合リガンドおよびその同一物を含むワクチン組成物を包含する。本発明のアッセイまたは方法に関わる開発プログラムは、本出願により得られる防御の範囲内に入る。
【００４１】
本明細書中で用いられるように、用語「ＨＣＶレセプター標的細胞」は、少なくとも１つのＨＣＶタンパク質と結合可能な細胞または細胞集団を意味する。適切には、ＨＣＶレセプター標的細胞は、少なくとも１つのＨＣＶタンパク質レセプターを含む。
【００４２】
本明細書中で用いられるように、用語「ＨＣＶレセプター結合リガンド」は、ＨＣＶレセプターに結合し得る任意のリガンドを意味する。ＨＣＶレセプター結合リガンドは、好ましくは、ＨＣＶレセプターに結合し得る、１つまたはそれ以上のＨＣＶポリペプチドおよび／またはＨＣＶポリペプチドの１つまたはそれ以上のフラグメントを含む。ＨＣＶレセプター結合リガンドは、ＨＣＶには関連しないがＨＣＶレセプターに結合し得るポリペプチドであり得る。適切には、ＨＣＶレセプター結合リガンドは、組換えＨＣＶタンパク質またはそのフラグメントである。このようなＨＣＶレセプター結合リガンドは、ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０３１８２１６および同ＥＰ−Ａ−０３８８２３２に開示されている。最も好ましいのは、ＨＣＶ外部タンパク質のＥ１およびＥ２または機能的等価物ならびにそれらのフラグメントであり、これらは、ＨＣＶレセプター標的細胞への結合能を保持している。
【００４３】
あるいは、ＨＣＶレセプター結合リガンドは、ＨＣＶレセプターと結合し得る非ポリペプチド化学化合物であり得る。非ポリペプチド化学化合物は、レセプター結合ポリペプチドの化学アナログであり得、レセプター結合エピトープを保持している。
【００４４】
本明細書中で用いられるように、用語「ＨＣＶレセプター結合リガンドアナログ」は、ＨＣＶレセプター結合リガンドのアナログを意味し、このアナログは、ＨＣＶレセプター標的細胞に結合するためのＨＣＶレセプター結合リガンドと交差反応し得るが、アッセイ
検出系を用いてＨＣＶレセプター結合リガンドと区別し得る。従って、適切には、ＨＣＶレセプター結合リガンドアナログは、好ましくは、蛍光標識物を用いて、直接に、または抗体のような標識化リガンドのさらなる結合によるかのいずれかにより、標識化される。
【００４５】
本明細書中で用いられるように、用語「ポリペプチド」は、２つまたはそれ以上のアミノ酸の配列を意味し、少なくとも１つのペプチド結合を含む。この配列中のアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であり得、あるいは合成アナログまたは任意の混合または割合の全合成アミノ酸であり得る。用語「ポリペプチド」は、一般に、糖タンパク質を含む、天然のまたは化学的に改変されたポリペプチドのようなタンパク質および改変されたポリペプチドを含む。
【００４６】
本明細書中で用いられるように、用語「ＨＣＶ中和抗体」は、ＨＣＶレセプター結合リガンドとＨＣＶレセプター標的細胞との間の相互作用を低下させ得る抗体を意味する。好ましくは、ＨＣＶレセプター結合リガンドは、ネイティブなＨＣＶタンパク質である。好ましくは、ＨＣＶ中和抗体は、ＨＣＶレセプター標的細胞へのネイティブなＨＣＶタンパク質の結合を完全に妨げる。ＨＣＶ中和抗体は、モノクローナル抗体（例えば、細胞融合のＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ技術により、またはヒト化およびＣＤＲ移植のような組換えＤＮＡ技術により産生される）であり得るが、好ましくは、ポリクローナル抗体、最も好ましくは、免疫された宿主の免疫系によって産生される抗体である。
【発明の効果】
【００４７】
本発明により、以下が提供される：
１．標的細胞へのＨＣＶレセプター結合リガンドの結合を測定するアッセイであって、
ＨＣＶレセプター標的細胞へのＨＣＶレセプター結合リガンドまたはその競合的結合アナログの結合を測定する工程を包含する、アッセイ。
【００４８】
２．以下のアッセイ工程を包含する、項１に記載のアッセイ：
ｉ）  ＨＣＶレセプター標的細胞と、ＨＣＶレセプター結合リガンドの存在について試験しようとするサンプルとを混合して、任意のＨＣＶレセプター結合リガンドと該ＨＣＶレセプター標的細胞とを結合させる工程、
ｉｉ）  非結合のＨＣＶレセプター結合リガンドを除去する工程
ｉｉｉ）  該ＨＣＶレセプター結合リガンドに結合し得る検出可能な抗体と混合して、結合したＨＣＶレセプター結合リガンドを有する該ＨＣＶレセプター標的細胞を標識化する工程、および
ｉｖ）  該標識化されたＨＣＶレセプター標的細胞の量を検出する工程。
【００４９】
３．以下のアッセイ工程を包含する、項１に記載のアッセイ：
ｉ）  ＨＣＶレセプター標的細胞と、ＨＣＶレセプター結合リガンドの存在について試験しようとするサンプルと、限定量のＨＣＶレセプター結合リガンドアナログとを混合して、該ＨＣＶレセプター標的細胞への結合に対して競合させる工程、
ｉｉ）  非結合のＨＣＶレセプター結合リガンドを除去する工程、
ｉｉｉ）  該ＨＣＶレセプター結合リガンドに結合し得る検出可能な抗体と混合して、結合したＨＣＶレセプター結合リガンドを有する該ＨＣＶレセプター標的細胞を標識化する工程、および
ｉｖ）  該ＨＣＶレセプター結合リガンドアナログに結合した該ＨＣＶレセプター標的細胞の量を検出する工程。
【００５０】
４．ＨＣＶレセプター結合リガンドへの中和抗体の結合から惹起する、ＨＣＶレセプター結合リガンドの中和を測定するアッセイであって、以下の工程を包含する、アッセイ：
ｉ）  ＨＣＶレセプター標的細胞と、ＨＣＶレセプター結合リガンドと、ＨＣＶ中和抗
体の存在について試験しようとするサンプルとを混合する工程、
ｉｉ）  非結合のＨＣＶレセプター結合リガンドを除去する工程、
ｉｉｉ）  該ＨＣＶレセプター結合リガンドに結合し得る検出可能な抗体と混合して、結合したＨＣＶレセプター結合リガンドを有する該ＨＣＶレセプター標的細胞を標識化する工程、および
ｉｖ）  該ＨＣＶレセプター結合リガンドに結合した該ＨＣＶレセプター標的細胞の量を検出する工程。
【００５１】
５．細胞サンプル中のＨＣＶレセプター標的細胞を同定する方法であって、以下の工程を包含する、方法：
ｉ）  該細胞サンプルとＨＣＶレセプター結合リガンドとを混合して、任意のＨＣＶレセプター結合リガンドと該サンプル中の任意のＨＣＶレセプター標的細胞とを結合させる工程、
ｉｉ）  非結合のＨＣＶレセプター結合リガンドを除去する工程、
ｉｉｉ）  該ＨＣＶレセプター結合リガンドに結合し得る検出可能な抗体と混合して、結合したＨＣＶレセプター結合リガンドを有する該ＨＣＶレセプター標的細胞を標識化する工程、および
ｉｖ）  該標識化されたＨＣＶレセプター標的細胞の量を検出する工程。
【００５２】
６．前記ＨＣＶレセプター結合リガンドに結合した前記ＨＣＶレセプター標的細胞の量が、フローサイトメトリーにより検出される、上記項のいずれか１つに記載のアッセイまたは方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
本発明の実施は、他に指示がなければ、当該分野の技術の範囲内にある免疫学、サイトフルオリメトリーおよび分子生物学の従来技術を用いる。このような技術は、文献中に十分に説明される（１９）。
【００５４】
当業者は、アッセイの設計および実施の一般的な方法および技術を理解し、かつ精通している。本発明は、当業者が開示の実験を理解し、かつ繰り返すために十分詳細に本明細書中に記載されている。
【００５５】
条件の変更は、特定のＨＣＶレセプター結合リガンド、  ＨＣＶレセプター標的細胞、および抗体に対するアッセイを最適化するのに必要であり得ることが、当業者に理解される。
【００５６】
ウイルスおよびタンパク質の標準の略号は、本明細書中で用いられる。本明細書中に引用される刊行物、特許、および特許出願のすべては、参考として援用される。ＨＣＶのエンベロープ１（Ｅ１）およびエンベロープ２（Ｅ２）は、公表されたタンパク質、およびそのフラグメント、ヌクレオチド配列を示す（１７、１８）。Ｅ１およびＥ２遺伝子のヌクレオチドならびにコードされたタンパク質のヌクレオチドは、異なるＨＣＶ単離株において様々である。従って、あらゆるＨＣＶ単離株のＥ１およびＥ２が、それぞれアミノ酸配列１９２〜３８３位および３８４〜７５０位に含まれるので、同定された。
【００５７】
Ｅ１およびＥ２は、異なった発現システムを用いて、組換えＤＮＡ技術により産生された（５、１０）。
【００５８】
（一般的材料および方法）
細胞。ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株、すなわちＭｏｌｔ−４を、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から得た。細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１
ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、および１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ，  Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）培地で拡張培養した。
【００５９】
組換えエンベロープタンパク質。糖タンパク質Ｅ１／Ｅ２１９９−７４５を、（５、９）に記載のように、ＨｅＬａ細胞またはＣＨＯ細胞中で発現し、抽出し、そして精製した。Ｅ２３８４−７１５を、切形型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ｅ２６６１（５）に対して記載されるように、組換えＣＨＯ細胞から発現および分泌させた。ＣＨＯ／Ｅ２の精製に対して、ＣＨＯ細胞調整培地を、限外濾過により１５倍に濃縮し、続いて７５％飽和の硫安沈澱によりさらに１０倍容量を減少させ、そして２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中に再溶解させた；モノクローナル抗体５Ｅ５／Ｈ７（ＣＨＯ／Ｅ２に特異的）を、精製し、そしてＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上で結合させた。抗体カラムを、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）中で平衡化した。硫安沈澱したＥ２を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中に溶解し、そしてカラム上に載せた。カラムを、ＰＢＳ＋１−Ｍ  ＮａＣｌで洗浄し、次いでＡｃｔｉｓｅｐ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．，  Ａｒｃａｄｉａ，  ＣＡ）の３〜４カラム容量で溶出させた。黄色化したＡｃｔｉｓｅｐを含むフラクションのすべてをプールし、セル限外フィルター内で撹拌しながら濃縮し、そしてＰＢＳ緩衝液中でダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）した。Ｅ２３８４−７１５を、（１０）に記載のように、組換えＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ（ＢＶ）感染細胞から発現および分泌させた。ＢＶ／Ｅ２の精製に対して、昆虫細胞由来の調整培地をＧＮＡレクチンアガロース（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）のカラムに載せた。次に、カラムをＰＢＳ＋０．９Ｍ  ＮａＣｌで洗浄し、そして１ＭメチルＤ−マンノシドを含むＰＢＳ＋０．９Ｍ  ＮａＣｌの溶液で溶出させた。溶出物を２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６）に対して４℃で透析した。沈澱物（ほとんど混入物を含む）を遠心分離により除去し、そして上清を、２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６）で平衡化したＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）のカラムに載せた。Ｅ２タンパク質を、２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６）で０．２５Ｍ  ＮａＣｌまでの勾配をかけて溶出させた。Ｅ２  ３８４〜７１５位の酵母からの発現および分泌に対して、本発明者らは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳ１５０−２Ｂ株および分泌ベクターＹＥｐｓｅｃ１を用いた（１１）。Ｅ２は、５５ＫＤａのコアグリコシル化ペプチドとして分泌される。酵母／Ｅ２を、レクチンカラムおよびＢＶ／Ｅ２の精製に用いた同様の手順を用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した（１０）。精製後、ＨＣＶエンベロープタンパク質は全て、８０％を超える純度であった。公表された手順に従って、全ての抗原に対するＥＬＩＳＡを実施した（１０）。
【００６０】
血清およびモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）。全ての上記のエンベロープタンパク質に対して特異的なウサギポリクローナル抗血清、および、ＨｅＬａ  Ｅ１／Ｅ２で、または酵母／Ｅ１１９９−３３０とＢＶ／Ｅ２４０４−６６１（９）との複合物で免疫したチンパンジー由来の血清を得た。モノクローナル抗体２９１  （ＩｇＧ１）を、ＣＨＯ／Ｅ２で免疫したマウスから得、そして標的細胞に結合したＥ２を認識する能力についてスクリーニングした。ＨＣＶ−１のアミノ酸３８４〜４１４位（Ｅ２超可変領域１、ＨＶＲ１）からなる合成ペプチドを、Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａトキソイドにアミノ末端残基を介して結合させ、そしてマウスの免疫に使用した。この融合から得られるｍＡｂｓを、ストレプトアビジンでコートしたプレート上で、アミノ酸２８８〜４８７位由来の一部重複したビオチン化８マー（８ｍｅｒ）のペプチドを用いて、Ｅｌｉｓａによりスクリーニングした。ＩｇＧ１  ｍＡｂ  （１Ｇ２Ａ７）を単離し、これは、ＥＬＩＳＡにおいてエピトープ３８４〜４１４位を認識した。
【実施例１】
【００６１】
＜結合アッセイ＞
結合実験の概略図を図１に示す。これはフローサイトメトリー解析で達成された分別を示す。
【００６２】
ＨＣＶレセプターと推定されるレセプターを持つ様々な細胞タイプにＨＣＶタンパク質が結合する能力を測定する目的で実験を行った。
【００６３】
（実験プロトコル）
ＨＣＶエンベロープタンパク質がＭｏｌｔ−４細胞（インビトロでＨＣＶ複製のレベルが低いと報告されているヒトＴ−細胞リンパ腫（１３）である）に結合する能力を評価するために免疫蛍光間接実験を行った。
【００６４】
Ｍｏｌｔ−４細胞（１０５／ウェル）を、４℃、５分間、２００×ｇで遠心分離し、９６  Ｕ底マイクロプレートに沈澱させた。種々の濃度（１０μｇ／ｍｌから０．００１μｇ／ｍｌ）でＰＢＳに希釈したＨＣＶタンパク質２０μｌを、Ｍｏｌｔ−４細胞のペレットと混和し、そして４℃で１時間インキュベートした。非結合ＨＣＶタンパク質を、ＰＢＳ中４℃、５分間、２００×ｇで２回の遠心分離により除去した。続いて、ＨＣＶ感染またはＨＣＶ組換えタンパク質による免疫のいずれかを施したヒト、チンパンジーまたはウサギの血清の種々の希釈溶液で、細胞を４℃、３０分間インキュベートした。可能であれば、対応する前免疫の血清をコントロールとして使用した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして、適切に希釈したフルオレセイン−イソチオシアネート結合抗血清（ヒトＩｇＧまたはウサギＩｇＧのいずれかに対する）と共に３０分間インキュベートした。
【００６５】
次に、細胞を４℃のＰＢＳで洗浄し、１００μｌ  ＰＢＳに再懸濁し、そして、細胞に結合した蛍光をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）で解析した。ドットプロット表示の前方および側方の光散乱を用いることにより、生存単一細胞を取り込み、そして細胞破砕物および細胞凝集塊を除外するように機械をゲート制御した。合計で５０００の結果を収集し、そしてＢｅｃｔｏｎ  ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＬｙｓｉｓ  ＩＩソフトウェアープログラムを使用してデータの解析を行った。このプログラムは、それぞれの細胞サンプルのヒストグラムを作成し、そして、細胞集団の平均チャンネル蛍光（これは細胞に結合した蛍光標識ＨＣＶタンパク質の表面密度と直接関与している）を算出する。平均蛍光値（平均チャンネル数）を、ＨＣＶタンパク質を伴う場合または伴わない場合とで、ならびに免疫血清の場合または前免疫血清の場合とで比較した。ポジティビティ（ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ）の閾値は、それぞれの実験について、ＨＣＶタンパク質に対する抗血清およびＦＩＴＣ標識第２抗体と共にインキュベートし、ＨＣＶタンパク質を結合していない細胞のフローサイトメトリー解析によって設定した。
【００６６】
上記の実験は、Ｅ２の標的細胞への結合が測定可能であり、そして高い親和性を持つことを示す。
【００６７】
ＨＣＶレセプターを有する種々の細胞タイプに対する、種々の系で発現する異なるＨＣＶタンパク質の結合能力を比較するために実験を行った。
【００６８】
細胞を、酵母、昆虫細胞あるいは哺乳動物細胞（ＨｅＬａあるいはＣＨＯ）のいずれかで発現する、ＨＣＶ組換えエンベロープ（Ｅ１／Ｅ２またはＥ２）と共にインキュベートし、続いて、対応する組換えタンパク質で免疫したウサギから得たポリクローナル血清と共にインキュベートした。ウサギＩｇＧに対するＦＩＴＣ結合抗血清と共にインキュベー
ト後、ＨＣＶタンパク質の結合を、フローサイトメトリーによって細胞に結合した蛍光として間接的に検出した。
【００６９】
図２の代表的な実験は、哺乳動物細胞では発現するが、しかし酵母では発現しない組換え体Ｅ１／Ｅ２またはＥ２はヒト細胞に結合し得るが昆虫細胞で発現するＥ２は低いものの検出可能な結合を有することを示す。肝細胞ガン細胞株あるいは新鮮な精製ヒトＢ細胞を標的細胞として用いた場合も、同じデータを得た。
【００７０】
標的Ｍ０ＬＴ−４細胞を、Ｅ１／Ｅ２またはＥ２の濃度を増加させてインキュベーションした後、哺乳動物細胞で発現するＥ２の結合は、１０μｇ／ｍｌの濃度でプラトーに達することが見い出された。
【００７１】
この結合は飽和可能であることから、推定レセプターへの組換えＥ２の親和性は、ハプテン−抗体相互作用の親和性を計算するための前記の二重逆数プロット法（ｄｏｕｂｌｅ
ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｐｌｏｔ  ｍｅｔｈｏｄ）（１４）を用いて、算出され得る。図３Ｂでは、予測された親和性をＫｄとして表しており、そしてこれは、Ｅ２濃度の半分がその推定レセプターに結合している時の、遊離Ｅ２濃度の逆数に等しい。ｙ軸では、Ｅ２非存在下でウサギ抗Ｅ２血清およびＦＩＴＣヤギ抗ウサギで得られた平均蛍光をＥ２存在下で得た平均蛍光から引いて、それぞれのＥ２濃度における純（ｎｅａｔ）平均蛍光強度値を算出した。純平均蛍光強度（ｙ軸）およびＥ２濃度（ｘ軸）を逆数でプロットした。
【００７２】
標的細胞に対するＥ２のＫｄは、約１０−８Ｍであることから、Ｅ２はおそらく、標的細胞に対するＥ１／Ｅ２複合体の特異的結合の原因となるタンパク質であるという結論が導き出される。
【実施例２】
【００７３】
＜中和アッセイ＞
本発明による中和アッセイの概略図を図４に示す。
【００７４】
（実験プロトコル）
細胞（１０５／ウェル）を、４℃、５分間、２００×ｇで遠心分離し、９６  Ｕ底マイクロプレートに沈澱させる。２０μｌのＣＨＯ／Ｅ２７１５（０．５μｇ／ｍｌ  ＰＢＳ）を、ＨＣＶ感染またはＨＣＶ組換えタンパク質による免疫のいずれかを施したヒト、チンパンジーまたはウサギの血清の様々な希釈溶液と混合した。４℃で１時間インキュベートした後、Ｍｏｌｔ−４細胞を加え、そして４℃で１時間インキュベートした。非結合ＨＣＶタンパク質および抗体を、４℃、５分間、２００×ｇ、  ＰＢＳ中で２回遠心分離することにより除去した。続いて、同種の中和血清由来の血清、ＨＣＶエンベロープ組換えタンパク質で免疫された動物由来の血清、またはコントロールとして対応する前免疫血清の１／１００希釈と共に細胞を４℃で３０分間インキュベートした。同種の中和血清由来の抗体との結合を示すことは重要である。なぜなら、非中和抗Ｅ２抗体は標的細胞に結合した後のＥ２を遮蔽し得、それゆえ、この結合が異種由来の抗Ｅ２血清によって示されるならば、非中和抗Ｅ２抗体は中和の評価を妨げ得るからである。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして適切な希釈のＩｇＧに対するＦＩＴＣ結合抗血清と共に３０分間インキュベートした。上記の結合アッセイについての記載のように、細胞に結合した蛍光を解析する。
【００７５】
この技術は、種々のＨＣＶ遺伝子型由来のＨＣＶエンベロープタンパク質に対する抗体の交差中和測定に大変、有用である。例えば、ＨＣＶ遺伝子型１Ａ由来のエンベロープタンパク質に対して惹起される抗体は、ＨＣＶ遺伝子型１ｂ、２、３などの由来のエンベロープタンパク質の結合を中和する抗体の能力によって評価され得る。
【００７６】
（Ｅ２超可変領域に対する抗体は結合を中和する）
実施例１に従って測定される結合は、Ｅ２に対する抗体で中和可能であるかどうかを試験するために実験を行った。ＣＨＯ細胞で発現する組換えＥ２に対して特異的なウサギポリクローナル抗血清を、Ｅ２の結合を中和する能力について評価した。
【００７７】
Ｅ２（０．５μｇ／ｍｌの濃度、すなわちＫｄ）をウサギ抗血清の一連の希釈液と混合した。次いでＥ２抗体混合液を標的細胞と共にインキュベートし、続いてＥ２の結合を検出した。哺乳動物の細胞で発現したＥ２で免疫したウサギの血清は、標的細胞へのＥ２の結合を中和し得ることを示された。
【００７８】
他のウイルスについては、中和抗体を誘導し得るエピトープが高度の可変性を示す領域に位置したので、さらなる実験では、ＨＣＶ−Ｅ２の超可変領域１（アミノ酸３８４−４１４位）に対するｍＡｂがＥ２の結合を中和するかどうかについて調べた。
【００７９】
ＣＨＯ／Ｅ２を、ＨＣＶ−Ｅ２の超可変領域１（ＨＶＲ１）に特異的な表示濃度の精製ｍＡｂ（１Ｇ２Ａ７）と共にプレインキュベートした。次いで、抗体−Ｅ２混合物をＭｏｌｔ−４細胞と共にインキュベートし、そして標的細胞に結合したＥ２を認識するモノクローナル抗体２９１を用いて結合を明らかにした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を、中和ｍＡｂ非存在下（ポジティブコントロール）、Ｅ２非存在下（ネガティブコントロール）および、Ｅ２抗体複合体存在下（実験値）で測定し、そして以下の式に従って特異的中和を決定した：特異的中和＝×１００［（ポジティブコントロールＭＦＩ−実験ＭＦＩ）／（ポジティブコントロールＭＦＩ−ネガティブコントロールＭＦＩ）］。結果を図５に示す。
【００８０】
図５は、ＨＶＲ１特異的ｍＡｂは完全ではないがＥ２の結合を中和し得ることを示し、Ｅ２の結合は少なくとも一部は超可変領域によって中介されることを表す。
【００８１】
（ＨＣＶエンベロープの結合を中和する抗体は、感染防御と相関する）
酵母や昆虫の細胞ではなく、哺乳動物細胞（ＨｅＬａ）で発現する組換えエンベロープタンパク質を用いるワクチン接種は、同系のＨＣＶ単離物からの一次感染からチンパンジーを防御し得る（９）。
【００８２】
標的細胞へのＨＣＶの結合に、Ｅ２の結合およびその次の中和のどちらが関係しているのかを調べるために、ワクチン接種して次の攻撃から防御されたチンパンジーの血清に存在する中和力価を、免疫したがＨＣＶの攻撃を受け易いチンパンジーの血清の中和力価と比較した。
【００８３】
結果を図６Ａおよび図６Ｂに示す。それぞれのチンパンジーの結果は以下の通りである：
【００８４】
【表１Ａ】
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【００８５】
【表１Ｂ】
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【００８６】
【表１Ｃ】
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図６Ａおよび図６Ｂおよび上記の結果は、少なくとも１／６００のＮＯＢ中和力価を有するチンパンジーは全て感染から防御され、約１／３００のＮＯＢ力価を有するチンパンジーは軽度の感染症を発症し、そして回復したが、ＮＯＢ抗体を有さないチンパンジーは防御されなかったことを示す（９）。
【００８７】
Ｅ２の結合を中和する能力について、組換えエンベロープタンパク質（９）をワクチン
接種したチンパンジーの血清の系列希釈液を試験した。各区画は、ワクチンとして使用したエンベロープタンパク質、ＨＣＶ−１を含む血漿による攻撃結果、ＨｅＬａ  Ｅ１／Ｅ２に対するＥＬＩＳＡ力価ならびにＥ２−ＨＶＲ１に対応するペプチド、および図５に従って算出した５０％中和力価を示す。
【００８８】
図６Ａおよび図６Ｂはまた、防御されたチンパンジー対防御されなかったチンパンジーにおいて、Ｅ２超可変領域１へのＥＬＩＳＡ力価が、同等であったことから、Ｅ２結合中和抗体は感染からの防御と相関し、そしてワクチン接種により誘導された中和はＨＶＲ１に対する抗体に依存しないことを表す。
【００８９】
同時に、特定のＨＣＶ遺伝子型に感染したヒトの血清を、感染遺伝子型とは異なるＨＣＶ遺伝子型のエンベロープタンパク質の結合を中和する能力について試験し得る。
【００９０】
本発明は、本発明の範囲内における実施例および改変により、上記のように記載され、そして本発明の主旨は、過度の実験または発明の才を要することなく成され得ることが理解される。
【００９１】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、本発明の第１の局面を示す概略図であり、ここで、ＨＣＶレセプター結合リガンドは、ＨＣＶレセプター標的細胞上のレセプターに結合し、そしてまずウサギ抗ＨＣＶ抗体を結合し、次いでＦＡＣＳｃａｎ解析による細胞分別の前に標識化抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ  Ｆ（ａｂ’）フラグメントを結合することによって、測定される（英文明細書第１４頁（上記の実施例１中の図１の説明）を参照のこと）。
【図２】図２は、種々のシステムにおいて発現されるＨＣＶ組換えエンベロープのヒト細胞への結合の差を説明するフローサイトメトリー実験の結果を表す。培地単独でインキュベートされたＭｏｌｔ−４細胞は、線影曲線として示され、そして白抜き曲線は、示されるＨＣＶ組換えエンベロープ  ５μｇ／ｍｌとインキュベートされた細胞を表す（英文明細書第１６頁  （上記の実施例１中の図２の説明）を参照のこと）。
【図３Ａ】図３Ａおよび図３Ｂは、ＣＨＯ細胞中で発現されるＥ２のヒト細胞への結合を示す（英文明細書第１６頁（上記の実施例１中の図３Ａおよび図３Ｂの説明）を参照のこと）。
【図３Ｂ】図３Ａおよび図３Ｂは、ＣＨＯ細胞中で発現されるＥ２のヒト細胞への結合を示す（英文明細書第１６頁（上記の実施例１中の図３Ａおよび図３Ｂの説明）を参照のこと）。
【図４】図４は、本発明の第２の局面を示す概略図であり、ここで、中和抗体は、  ＨＣＶレセプター標的細胞上のレセプターに結合するＨＣＶレセプター結合リガンドの結合を妨げる（英文明細書第１７頁（上記の実施例２中の図４の説明）を参照のこと）。
【図５】図５は、ＨＣＶ  Ｅ２の超可変領域１に対する抗体による、Ｅ２の標的細胞への結合の中和を示す（英文明細書第１９頁（上記の実施例２中の図５の説明）を参照のこと）。
【図６Ａ】図６Ａおよび図６Ｂは、ワクチン接種されたチンパンジーの血清による、ＨＣＶ標的細胞によるＥ２結合の中和を示し、これは、防御と中和抗体の存在との間の相関性を示す（英文明細書第１９頁（上記の実施例２中の図６の説明）を参照のこと）。
【図６Ｂ】図６Ａおよび図６Ｂは、ワクチン接種されたチンパンジーの血清による、ＨＣＶ標的細胞によるＥ２結合の中和を示し、これは、防御と中和抗体の存在との間の相関性を示す（英文明細書第１９頁（上記の実施例２中の図６の説明）を参照のこと）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
2006133233.tif 000011
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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