(57)【要約】【課題】  ポリグルタミン病に対する新規な薬剤（医薬）を提供する。【解決手段】  ゲルダナマイシン又はゲルダナマイシン誘導体を有効成分として抗ポリグルタミン病剤を構成する。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲルダナマイシン又はゲルダナマイシン誘導体を有効成分として含有する抗ポリグルタミン病剤。
【請求項２】
前記ゲルダナマイシン誘導体が、ゲルダナマイシンのＣ−１７位置のメトキシ基をアルキルアミノ基で置換して得られる化合物である、請求項１に記載の抗ポリグルタミン病剤。
【請求項３】
前記ゲルダナマイシン誘導体が、以下の群から選択される化合物である、請求項１に記載の抗ポリグルタミン病剤：
１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−（２−ジメチルアミノエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−（４−（ジメチルアミノ）ブチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−（２−（カルボキシ）エチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−（２−（Ｎ−メチルエチルアミノ）エチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−（２−（ピロリジン−１−イル）エチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−（２−（ピペラジン−１−イル）エチル）アミノ−デメトキシゲルダナマイシン、及び１７−（４−（ジメチルアミノ）ブチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンからなる群。
【請求項４】
１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン又は１７−（２−ジメチルアミノエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンが有効成分である、請求項１に記載の抗ポリグルタミン病剤。
【請求項５】
１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンが有効成分である、請求項１に記載の抗ポリグルタミン病剤。
【請求項６】
ポリグルタミン病が球脊髄性筋萎縮症である、請求項１〜５のいずれかに記載の抗ポリグルタミン病剤。
【請求項７】
抗ポリグルタミン病剤を製造するための、請求項１〜５のいずれかに記載の有効成分の使用。
【請求項８】
ゲルダナマイシン又はゲルダナマイシン誘導体を対象に投与するステップを含む、ポリグルタミン病の予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリグルタミン病に対する薬剤（抗ポリグルタミン病剤）及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
球脊髄性筋萎縮症（spinal and bulbar muscular atrophy: SBMA）は遺伝性の神経変性疾患であり、ポリグルタミン病として初めて同定された（非特許文献１）。ポリグルタミン病は、CAG繰り返し配列の異常延長を原因とする遺伝性の神経変性疾患であり、SBMAの他、ハンチントン病および脊髄小脳変性症などを含む。SBMAでは、アンドロゲン受容体（androgen receptor: AR）内のポリグルタミン鎖が異常伸長しており、この変異AR（病的AR）が神経細胞内で不溶性の封入体を形成したり、或いは蓄積する過程で神経毒性を有すると考えられている（非特許文献２）。AR内のCAGリピート数は健常者では5〜33であるのに対してSBMA患者では40〜62と異常伸長している（非特許文献３）。また、CAGリピート数が疾患の発症年齢や重症度に比例するという現象が確認されている（非特許文献４）。同様の現象が他のポリグルタミン病にも認められており、ポリグルタミン病の治療には、ポリグルタミン鎖が異常伸長した原因タンパク質を特異的に失活もしくは減少させることが有効と考えられている。
本発明者らは既に、SBMAのモデル動物であるトランスジェニックマウスを用い、病因蛋白である変異ARのテストステロン依存性核内集積がその病態の根幹をなしていることを見いだし（非特許文献５）、黄体形成ホルモン刺激ホルモン（LHRH）アナログによるテストステロン分泌の抑制が劇的な治療効果につながることを発表してきた（非特許文献６、特許文献１）。同治療薬については現在臨床試験を実施中である。
【０００３】
一方、変異タンパク質の凝集を阻害する分子として熱ショックタンパク質（heat shock protein：HSP）が知られている。熱ショックタンパク質は熱などのストレスによって発現が誘導される分子シャペロンであり、構造変化を来した異常タンパク質の形状を元に戻し（refolding）、その凝集を阻害するのみならず、プロテアゾームにおける変異タンパク質の分解を促進すると考えられている。本発明者らは、熱ショックタンパク質の一つであるHsp70の発現を増強することで変異ARの核内凝集を抑制することを球脊髄性筋萎縮症の培養細胞モデルにおいて確認し（非特許文献７）、神経症状を改善することを球脊髄性筋萎縮症のモデルマウスとHsp70高発現マウスとを交配することにより見いだした（非特許文献８）。同様の効果は球脊髄性筋萎縮症のショウジョウバエモデルや（非特許文献９）、脊髄小脳変性症のショウジョウバエやマウスモデルにおいても確認されており（非特許文献１０及び１１）、有望な治療戦略と考えられる。
【０００４】
また、転写機能を改善する作用を有するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤についても、このマウスでの治療効果を確認しており（非特許文献１２）、同様の結果がハンチントン病のモデルマウスにおいても報告されている（非特許文献１３及び１４）。この他、ハンチントン病のモデルマウスにおいては、変異蛋白の凝集抑制効果を有するcongo redやtrehalose、変異蛋白の分解を促進する効果のあるrapamycinなどの治療効果も報告されているが、いずれも臨床応用には至っていない。
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００４／０１６０８３号パンフレット
【非特許文献１】La Spada AR et al. Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbar muscular atrophy. Nature. 352, 77-79 (1991).
【非特許文献２】Poletti A et al. The polyglutamine tract of androgen receptor: from functions to dysfunctions in motor neurons. Front Neuroendocrinol. 25, 1-26 (2004).
【非特許文献３】Tanaka F, Doyu M, Ito Y, Matsumoto M, Mitsuma T, Abe K, Aoki M, Itoyama Y, Fischbeck KH, Sobue G et al. Founder effect in spinal and bulbar muscular atrophy (SBMA). Hum Mol Genet. 5, 1253-1257 (1996).
【非特許文献４】Doyu M, Sobue G, Mukai E, Kachi T, Yasuda T, Mitsuma T, Takahashi A et al. Severity of X-linked recessive bulbospinal neuronopathy correlates with size of the tandem CAG repeat in androgen receptor gene. Ann Neurol. 32, 707-710 (1992).
【非特許文献５】Katsuno M, Adachi H, Kume A, Li M, Nakagomi Y, Niwa H, Sang C, Kobayashi Y, Doyu M, Sobue G. Testosterone reduction prevents phenotypic expression in a transgenic mouse model of spinal and bulbar muscular atrophy. Neuron.35, 843-854(2002).
【非特許文献６】Katsuno M, Adachi H, Doyu M, Minamiyama M, Sang C, Kobayashi Y, Inukai A, Sobue G. Leuprorelin rescues polyglutamine-dependent phenotypes in a transgenic mouse model of spinal and bulbar muscular atrophy. Nat Med. 9, 768-773 (2003).
【非特許文献７】Kobayashi Y, Kume A, Li M, Doyu M, Hata M, Ohtsuka K, Sobue G. Chaperones Hsp70 and Hsp40 suppress aggregate formation and apoptosis in cultured neuronal cells expressing truncated androgen receptor protein with expanded polyglutamine tract. J Biol Chem. 275, 8772-8778(2000).
【非特許文献８】Adachi H, Katsuno M, Minamiyama M, Sang C, Pagoulatos G, Angelidis C, Kusakabe M, Yoshiki A, Kobayashi Y, Doyu M, Sobue G. Heat shock protein 70 chaperone overexpression ameliorates phenotypes of the spinal and bulbar muscular atrophy transgenic mouse model by reducing nuclear-localized mutant androgen receptor protein. J Neurosci.23, 2203-2211(2003).
【非特許文献９】Chan HY, Warrick JM, Andriola I, Merry D, Bonini NM Genetic modulation of polyglutamine toxicity by protein conjugation pathways in Drosophila. Hum Mol Genet.11, 2895-2904 (2002).
【非特許文献１０】Cummings CJ, Mancini MA, Antalffy B, DeFranco DB, Orr HT, Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1. Nat Genet.19, 148-154 (1998).
【非特許文献１１】Cummings CJ, Sun Y, Opal P, Antalffy B, Mestril R, Orr HT, Dillmann WH, Zoghbi HY. Over-expression of inducible HSP70 chaperone suppresses neuropathology and improves motor function in SCA1 mice. Hum Mol Genet.10, 1511-1518 (2001).
【非特許文献１２】Minamiyama M, Katsuno M, Adachi H, Waza M, Sang C, Kobayashi Y, Tanaka F, Doyu M, Inukai A, Sobue G. Sodium butyrate ameliorates phenotypic expression in a transgenic mouse model of spinal and bulbar muscular atrophy. Hum Mol Genet.13,1183-1192 (2004).
【非特許文献１３】Hockly E, Richon VM, Woodman B, Smith DL, Zhou X, Rosa E, Sathasivam K, Ghazi-Noori S, Mahal A, Lowden PA, Steffan JS, Marsh JL, Thompson LM, Lewis CM, Marks PA, Bates GP. Suberoylanilide hydroxamic acid, a histone deacetylase inhibitor, ameliorates motor deficits in a mouse model of Huntington's disease. Proc Natl Acad Sci U S A.100, 2041-2046 (2003).
【非特許文献１４】Ferrante RJ, Kubilus JK, Lee J, Ryu H, Beesen A, Zucker B, Smith K, Kowall NW, Ratan RR, Luthi-Carter R, Hersch SM. Histone deacetylase inhibition by sodium butyrate chemotherapy ameliorates the neurodegenerative phenotype in Huntington's disease mice. J Neurosci.23, 9418-9427 (2004).
【非特許文献１５】DeBoer  C et al. Geldanamycin, a new antibiotic. J Antibiot (Tokyo). 23, 442-447 (1970).
【非特許文献１６】Whitesell L et al. Benzoquinonoid ansamycins possess selective tumoricidal activity unrelated to src kinase inhibition. Cancer Res. 52, 1721-1728 (1992).
【非特許文献１７】Supko JG et al. Preclinical pharmacologic evaluation of geldanamycin as an antitumor agent. Cancer Chemother Pharmacol. 36, 305-315 (1995).
【非特許文献１８】Schnur RC et al. Inhibition of the oncogene product p185erbB-2 in vitro and in vivo by geldanamycin and dihydrogeldanamycin derivatives. J Med Chem. 38, 3806-3812 (1995).
【非特許文献１９】Goetz MP et al. The Hsp90 chaperone complex as a novel target for cancer therapy. Ann Oncol. 14, 1169-1176 (2003).
【非特許文献２０】Vanaja DK et al. Effect of geldanamycin on androgen receptor function and stability. Cell Stress Chaperones.7, 55-64 (2002).
【非特許文献２１】Banerji U et al. A pharmacokinetically (PK) - pharmacodynamically (PD) driven phase I trial of the HSP90 molecular chaperone inhibitor 17-allyamino 17-demethoxygeldanamycin (17AAG). Proc Am Assoc Cancer Res. 43, 1352 (2002).
【非特許文献２２】Munster PN et al. Phase I trial of 17-(allylamino)-17- demethoxygeldanamycin (17-AAG) in patients with advanced solid malignancies. Proc Am Soc Clin Oncol.20, 324 (2001).
【非特許文献２３】Agnew EB et al. Clinical pharmacokinetics of 17-(allylamino)-17-  demethoxygeldanamycin and the active metabolite 17-(amino)-17-  demethoxygeldanamycin given as a one-hour infusion daily for 5 days. Proc Am Assoc Cancer Res. 43, 1349 (2001).
【非特許文献２４】Page J et al. Comparison of geldanamycin (NSC-122750) and 17-allylaminogeldanamycin(NSC-330507D)toxicity in rats. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 38, 308 (1997).
【非特許文献２５】Schulte TW & Neckers LM. The benzoquinone ansamycin 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin binds to HSP90 and shares important biologic activities with geldanamycin. Cancer Chemother Pharmacol.42,273-279 (1998).
【非特許文献２６】Egorin MJ, Zuhowski EG & Eiseman JL. Plasma pharmacokinetics and tissue distribution of   17-(allylamino)- 17-demethoxygeldanamycin(NSC 330507) in CD2F1 mice1. Cancer Chemother Pharmacol. 47, 291-302 (2001).
【非特許文献２７】Egorin MJ, Lagattuta TF & Eiseman JL. Pharmacokinetics, tissue distribution, and metabolism of 17-(dimethylaminoethylamino)-17-demethoxy geldanamycin(NSC 707545) in CD2F1 mice and Fischer 344 rats. Cancer Chemother Pharmacol. 47, 291-302 (2002).
【非特許文献２８】Pratt WB & Toft DO. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp Biol Med (Maywood). 228, 111-133 (2003).
【非特許文献２９】Neckers L et al. Geldanamycin as a potential anti-cancer agent: its molecular target and biochemical activity. Invest New Drugs. 17, 361-73 (1999).
【非特許文献３０】Bonvini PU et al. Ubiquitination and proteasomal degradation of nucleophosmin-anaplastic lymphoma kinase induced by 17-allylamino-demethoxygeldanamycin: role of the co-chaperone carboxyl heat shock protein 70-interacting protein. Cancer Res. 64, 3256-3264 (2004).
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【非特許文献３４】Solit DB et al. 17-Allylamino-17-demethoxygeldanamycin induces the degradation of androgen receptor and HER-2/neu and inhibits the growth of prostate cancer xenografts. Clin Cancer Res. 8, 986-993 (2002).
【非特許文献３５】Bagatell R et al. Destabilization of steroid receptors by heat shock protein 90-binding drugs: a ligand-independent approach to hormonal therapy of breast cancer. Clin Cancer Res.7, 2076-2084 (2001).
【非特許文献３６】Blagosklonny MV et al. Toretsky J & Neckers L. Geldanamycin selectively destabilizes and conformationally alters mutated p53. Oncogene. 11, 933-939 (1995).
【非特許文献３７】Blagosklonny MV et al. Mutant conformation of p53 translated in vitro or in vivo requires functional HSP90. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 8379-8383 (1996).
【非特許文献３８】Nagata Y et al. The stabilization mechanism of mutant-type p53 by impaired ubiquitination: the loss of wild-type p53 function and the hsp90 association. Oncogene. 18, 6037-49 (1999).
【非特許文献３９】Zou J et al. Repression of heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90 complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1. Cell. 94, 471-480 (1998).
【非特許文献４０】Winklhofer KF et al. Geldanamycin restores a defective heat shock response in vivo. J Biol Chem. 276, 45160-45167 (2001).
【非特許文献４１】Sittler A, Lurz R, & Wanker EE. Geldanamycin activates a heat shock response and inhibits huntingtin aggregation in a cell culture model of Huntington's disease. Hum Mol Genet. 14, 1307-1315 (2001).
【非特許文献４２】Hay DG, Sathasivam K & Bates GP. Progressive decrease in chaperone protein levels in a mouse model of Huntington's disease and induction of stress proteins as a therapeutic approach. Hum Mol Genet. 13. 1389-1405 (2004).
【非特許文献４３】Tian ZQ, et al. Synthesis and biological activities of novel 17-aminogeldanamycin derivatives. Bioorg. Med. Chem. 12, 5317-5329 (2004).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
球脊髄性筋萎縮症に対するLHRHアナログ治療は動物モデルを用いた研究が臨床応用に向かいつつあるが、この治療法は球脊髄性筋萎縮症以外のポリグルタミン病には効果が期待しづらい。一方、ハンチントン病のモデルマウスで治療効果が報告されているヒストン脱アセチル化酵素阻害剤などの薬剤については、人体への安全性が確立されておらず、臨床で患者に使用するにはその毒性を評価し克服することが必要であると考えられる。こうしたことから、臨床応用可能な、低毒性化合物の探索が急務とされている。そこで本発明は、このような要求に応えることができる、ポリグルタミン病に対する新規な薬剤（医薬）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以上の目的の下、本発明者らは、ポリグルタミン病に対する薬剤の候補としてゲルダナマイシン（geldanamycin: GA）及びその誘導体に注目した。GAは最も古典的なHsp90阻害剤であり、1970年に抗真菌薬として見出され（非特許文献１５）、優れた抗腫瘍効果を持つことが知られていた（非特許文献１６）。しかし、その後GAには生体内で容認できない肝臓毒性があることが判明し（非特許文献１７）、より毒性の低い誘導体の検索が行われた。その結果としてGAの側鎖の一部が置換された１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin: 17-AAG）が見出された（非特許文献１８）。17-AAGは現在、新規抗癌剤として臨床応用が間近となっている（非特許文献１９）。Phase Iの治験がほぼ完了し（非特許文献２１〜２３）、既にPhase IIが始まっている。17-AAGは、GAにみられるような副作用が抑えられながら（非特許文献２４）、GAとほぼ同等の薬理活性を持つ優れた誘導体である（非特許文献２５）。動物モデルにて、17-AAGは静脈内投与、腹腔内投与であれば、良好な組織移行性を有することが確認されているが、一方で、その高い脂溶性のため経口投与が困難であることが指摘されている（非特許文献２６）。近年、経口投与も可能な17-AAGのさらなる誘導体１７−（２−ジメチルアミノエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（17-(2-dimethylaminoethyl)amino-17-demethoxygeldanamycin: 17-DMAG）が開発されており（非特許文献２７）、17-AAGに次いで臨床応用が試みられようとしている。
【０００８】
Hsp90は他の分子シャペロン（Hsp70、Hop、p23、p50など）とともにHsp90依存性のクライアントタンパク質と複合体を形成し、そのタンパク質の安定化と機能発現に重要な役割を果たしている（非特許文献２８）。GA誘導体投与により、こうしたHsp90複合体形成が阻害され、タンパク質の機能が失活し、さらにはユビキチン・プロテアゾーム系で分解されることが明らかにされている（非特許文献２９及び３０）。これまでに既知タンパク質の多くがHsp90のクライアントタンパク質であることが明らかにされているが、その中には多くの腫瘍関連タンパク質が含まれる（非特許文献２８）。GA誘導体はこうしたクライアントタンパク質のHsp90との複合体形成を阻害することで薬理効果を発揮するが（非特許文献３１）、腫瘍細胞内のタンパク質は、正常細胞内のものに比べて多量にHsp90-タンパク質複合体を形成しているため、GA誘導体に対する感受性が非常に高い（非特許文献３２）。このことから、17-AAGをはじめとするGA誘導体は、Hsp90という恒常的に発現しているタンパク質の機能を障害するという作用機序によるものの、選択的な抗腫瘍効果を有するとされている。
【０００９】
今回、本発明者らはターゲットタンパク質の発現量を減少させるというGA誘導体の薬剤効果に注目した。上記のようにSBMAはAR内のポリグルタミン鎖が延長した病的タンパク質が神経細胞内に異常蓄積する疾患である。既に本発明者らは、ARをターゲットとしたホルモン療法がSBMAの有効な治療法になることを実証している。即ち、ARのリガンドであるテストステロンを減少させることでARの核内移行を阻害し、核内封入体の形成も顕著に抑制されることを示した（非特許文献５及び６）。ARも代表的なHsp90のクライアントタンパク質であり、その機能発現にはHsp90が必須である（非特許文献３３）。図２に示すように、GA誘導体はHsp90-タンパク質複合体形成に変化をもたらし、その結果クライアントタンパク質の機能が失活し、ユビキチン・プロテアゾーム系で分解される（非特許文献２０）。このようにクライアントタンパク質であるARをはじめとするステロイド受容体が、GA誘導体によりその機能が障害され、さらには分解が促進されるという現象は、培養細胞モデルやマウスモデルにおいても既に確認されている（非特許文献２０、３４、３５）。
Hsp90依存性のクライアントタンパク質の体表的なものに変異型p53がある。全悪性腫瘍の約50％にこの変異型p53の発現が認められるが、興味深いことに正常型p53より、変異型は著しくGAに対する感受性が高くなっているという（非特許文献３６〜３８）。変異型の病的タンパク質は構造的に不安定であり、その安定化のためにはより多くのHsp90を必要としていると思われる。これと同様に、ARもポリグルタミンが伸張した変異型になることにより、GA誘導体に対する感受性が亢進していれば、GA誘導体の使用によってより効果的かつ選択的に、病的タンパク質の発現量を量的に減少させることができ、即ち優れた治療法が提供できると考えられる。
【００１０】
ポリグルタミン鎖が異常延長したARもHsp90への依存性があると考えられることに鑑み、本発明者らは、腫瘍細胞内タンパク質の場合と同様の機序で、Hsp90阻害剤投与により変異ARを量的に減少させることが可能と考えた。変異AR（病的AR）の発現量を抑制できれば、SBMAに対する優れた治療効果を期待できる。
また一方で、Hsp90阻害剤が、熱ショックタンパク質の転写因子であるHeat shock transcription factor(HSF-1)を活性化し、Hsp70やHsp40といった抗ストレス分子シャペロンを非特異的に増加させる薬理作用を有すること（非特許文献３９及び４０)にも注目した。即ち、Hsp90阻害剤は分子シャペロン誘導剤としての一面を持つため、この作用によってもSBMAに対する治療効果が得られると考えた。
GA及びその誘導体（特に17-AAG）のポリグルタミン病への適用の可能性に関しては、ポリグルタミン病培養細胞モデルにおいてGAが病因タンパク質の封入体形成を抑制することが報告されたに留まり（非特許文献４１及び４２）、マウス等の個体動物レベルでGA等の薬剤効果を検討したという報告はない。
そこで本発明者らは、GA誘導体の中でも最も薬理作用・動態が調べられ、臨床応用が間近となっている17-AAGを選択し、そのSBMAに対する治療効果を培養細胞モデル、及び病的遺伝子（AR内のCAGリピート数が97のもの）を導入したモデルマウスにて評価した。その結果驚くべきことに、培養細胞モデルにおいて、17-AAGの投与によって病的ARの発現量が著しく減少することが判明した。さらにモデルマウスにおいて、投与量依存性の有意な治療効果を17-AAGが発揮することが確認された。これらの結果から、17-AAGが実際にSBMAの治療において有効であることが明らかとなった。また、GAの基本骨格を有する化合物（GAの誘導体及びGA自体）も17-AAGと同様の機序で作用し得ることから、これらの化合物もSBMAの治療剤の候補として有力であると考えられた。
【００１１】
一方、SBMAをはじめとするポリグルタミン病では、特定の遺伝子におけるCAGリピートの異常延長が原因であること、CAGリピート長が長いほど発症年齢が若年化し重症化すること、表現促進現象（世代を経るごとに発症年齢が若年化する現象）が認められること、神経組織が選択的に障害を受けること、及び神経細胞内に変異タンパク質の凝集が認められるとともに核内封入体が観察されることなど、多くの共通点が認められる。尚、核内に集積した変異タンパク質はCBP（c-AMP response element binding protein-binding protein）などの転写調節因子の機能を障害し、これがポリグルタミン病における神経細胞障害の主因と考えられている（Steffan JS, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97: 6763-6768.；Nucifora FC Jr, et al. Science 2001; 291: 2423-2428.）。以上のような、疾患原因をはじめとした多くの共通点から、ポリグルタミン病の一つであるSBMAのモデル動物を用いた実験で得られた上記知見は他のポリグルタミン病についても適用できる可能性が極めて高い。即ち、SBMAのみならず他のポリグルタミン病に対しても17-AAG等が有効な薬理作用を奏することが当然として予測される。特に、他のポリグルタミン病においても、原因タンパク質の封入体形成抑制にHsp70やHsp40が関与していることが判明しており、さらには原因タンパク質がHsp90のクライアントタンパク質であることが予想されることを考え合わせれば、17-AAG及び同様の機序で作用する化合物はポリグルタミン病に対して広く治療効果を有することが期待される。
【００１２】
本発明は以上の知見及び考察に基づき完成されたものであり、ゲルダナマイシン（GA）及びその誘導体のポリグルタミン病に関する医用用途を提供するものである。具体的には本発明は以下の構成を提供する。
即ち本発明の一形態は、ゲルダナマイシン又はゲルダナマイシン誘導体を有効成分として含有する抗ポリグルタミン病剤である。ゲルダナマイシン誘導体は、ゲルダナマイシンのＣ−１７位置のメトキシ基をアルキルアミノ基で置換して得られる化合物であることが好ましい。ゲルダナマイシンの毒性の原因の一つがＣ−１７位置のメトキシ基にあると考えられている。従って、このメトキシ基を有しない上記化合物では一般に毒性が低減する。
本発明の一態様では、ゲルダナマイシン誘導体が、以下の化合物群、即ち１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−（２−ジメチルアミノエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−（４−（ジメチルアミノ）ブチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−（２−（カルボキシ）エチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−（２−（Ｎ−メチルエチルアミノ）エチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−（２−（ピロリジン−１−イル）エチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、１７−（２−（ピペラジン−１−イル）エチル）アミノ−デメトキシゲルダナマイシン、及び１７−（４−（ジメチルアミノ）ブチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンからなる群より選択される。
また、本発明の好ましい一態様では、１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン又は１７−（２−ジメチルアミノエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンを有効成分として抗ポリグルタミン病剤が構成される。
更に、本発明の好ましい他の一態様では、１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンを有効成分として抗ポリグルタミン病剤が構成される
一方、本発明の好ましい態様ではポリグルタミン病が球脊髄性筋萎縮症であり、従って球脊髄性筋萎縮症に対する薬剤（医薬）が提供されることとなる。
本発明の他の形態は、抗ポリグルタミン病剤を製造するために、上記化合物（即ち、ゲルダナマイシン又はゲルダナマイシン誘導体など）を使用すること、及びゲルダナマイシン又はゲルダナマイシン誘導体を用いたポリグルタミン病の医療的処置（ポリグルタミン病の予防及び治療）に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の抗ポリグルタミン病剤はゲルダナマイシン（geldanamycin、本明細書において「GA」ともいう）又はゲルダナマイシン誘導体（geldanamycin derivative）を有効成分として含有することを特徴とする。ここで「ゲルダナマイシン(GA)」は以下の構造式で表される。
【化１】
2006232705.tif 000003
但し、式中のRはCH3Oである。
【００１４】
様々なゲルダナマイシン誘導体が見出されている。例えば、Tian ZQ et al., Bioorg. Med. Chem. 12 (2004) 5317-5329、米国特許第5,387,584号、米国特許第4,261,989号、米国特許第3,987,035号、WO00/03737、WO02/079167、WO99/21552、WO99/22761に具体的な化合物が記載されている。これら文献の全内容は援用によって引用される。
本発明において好ましいゲルダナマイシン誘導体として、ゲルダナマイシンのＣ−１７位置のメトキシ基をアルキルアミノ基に置換して得られる化合物（１７−アルキルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）を挙げることができる。このような化合物は、ゲルダナマイシンの毒性の原因の一つと考えられているＣ−１７位置のメトキシ基を有しないことから毒性の面で有利である。具体的には、１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin: 17-AAG）、１７−（２−ジメチルアミノエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（17-(2-dimethylaminoethyl)amino-17-demethoxygeldanamycin: 17-DMAG）、１７−（４−（ジメチルアミノ）ブチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（17-[4-(Dimethylamino)butyl]amino-17-demethoxygeldanamycin）、１７−（２−（カルボキシ）エチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン(17-[2-(Carboxy)ethyl]amino-17-demethoxygeldanamycin)、１７−（２−（Ｎ−メチルエチルアミノ）エチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン(17-[2-(N-Methylethylamino)ethyl]amino-17-demethoxygeldanamycin)、１７−（２−（ピロリジン−１−イル）エチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン(17-[2-(Pyrrolidin-1-yl)ethyl]amino-17-demethoxygeldanamycin)、１７−（２−（ピペラジン−１−イル）エチル）アミノ−デメトキシゲルダナマイシン(17-[2-(Piperazin-1-yl)ethyl]amino-17-demethoxygeldanamycin)、及び１７−（４−（ジメチルアミノ）ブチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン(17-[4-(Dimethylamino)butyl]amino-17-demethoxygeldanamycin)からなる群より選択される化合物を用いることができる。本発明の好ましい一態様では、これらの化合物の中でも１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（本明細書において「17-AAG」ともいう）又は１７−（２−ジメチルアミノエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（本明細書において「17-DMAG」ともいう）が有効成分として用いられる。
また、１７−（２−（Ｎ−メチルエチルアミノ）エチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、及び１７−（２−（ピロリジン−１−イル）エチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンは17-DMAGと同等の薬理力価を有し、且つ水溶性が高いことから、経口可能な薬剤を構成し得る点で好ましい。
一方、Hsp90の阻害作用を保ちながら、細胞毒性の低いという点（IC50が高い）において、１７−（２−（カルボキシ）エチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン及び１７−（４−（ジメチルアミノ）ブチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンは好適な化合物である。尚、本発明が対象とする疾患（神経変性疾患）においては、腫瘍性疾患を対象とする場合と異なり、有効成分の細胞毒性は低い方が好ましい。
【００１５】
尚、１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン又は１７−（２−ジメチルアミノエチル）アミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンの誘導体を用いて、本発明の抗ポリグルタミン病剤を構成してもよい。
ここで、17-AAGは以下の構造式で表される。
【化２】
2006232705.tif 000004
但し、式中のRはCH2=CH-CH2-NHである。
【００１６】
同様に、17-DMAGは以下の構造式で表される。
【化３】
2006232705.tif 000005
但し、式中のRは(CH3)2NH-CH-CH2-NHである。
【００１７】
ゲルダナマイシンは広く市販されており、容易に入手可能である（例えば、シグマ（SIGMA）社、インビトロジェン（InvitroGen）社）。一方、ゲルダナマイシン誘導体は、公知の合成法に従って調製することができる。具体的には、ゲルダナマイシン誘導体の一種である１７−アルキルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンは例えば以下の手順で合成することができる。まず、ゲルダナマイシン溶液にアミン（合成目的の化合物に対応するアルキルアミン）を添加し所定時間攪拌する。その後、酢酸エチルなどで希釈し、続いて重炭酸塩水などで洗浄する。得られた有機層を乾燥させ、最後にクロマトグラフィー等で精製する。合成法の詳細については、Tian ZQ et al., Bioorg. Med. Chem. 12 (2004) 5317-5329を参照することができる。尚、当該文献は別法にも言及する。
【００１８】
一方、17-DMAGは以下の手順で合成することができる（Tian ZQ et al., Bioorg. Med. Chem. 12 (2004) 5317-5329を参照）。まず、ゲルダナマイシンの１，２−ジクロロエタン溶液にＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミンを添加し、所定時間攪拌する。その後、エチルアセテートで希釈し、続いて重炭酸水などで洗浄する。得られた有機層を乾燥させ、最後にクロマトグラフィー等で精製する。
【００１９】
本発明の有効成分として使用される化合物は塩の形態であってもよい。塩の例としてはハロゲン化水素酸塩（具体的にはフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等）、無機酸塩（具体的には硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩等）、有機カルボン酸塩（具体的には酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等）、有機スルホン酸塩（具体的にはメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩等）、アミノ酸塩（具体的にはアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（具体的にはナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（具体的にはマグネシウム塩、カルシウム塩等）を挙げることができる。
【００２０】
本発明において「抗ポリグルタミン病剤」とは、ポリグルタミン病の発症を抑制するために使用される薬剤（医薬）、又はポリグルタミン病の症状を改善（部分的又は完全な治癒を含む）するために使用される薬剤（医薬）のことをいう。したがって本発明の抗ポリグルタミン病剤には、ポリグルタミン病の予防的処置に使用可能な薬剤、及びポリグルタミン病の治療に使用可能な薬剤が含まれる。
「ポリグルタミン病」とは神経変性疾患の一種であって、遺伝子のコード領域においてCAGリピートの伸長（異常伸長）が認められることを特徴とする。これまでにポリグルタミン病として球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、脊髄小脳変性症１型(SCA1)、脊髄小脳変性症２型(SCA2)、Machado-Joseph病(MJD、SCA3)、脊髄小脳変性症６型(SCA6)、脊髄小脳変性症７型(SCA7)、脊髄小脳変性症１７型（SCA17）、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)が見出されている。ポリグルタミン病の患者には表現促進現象（anticipation）やCAGリピート数のばらつき（体細胞モザイク）、主に神経組織が選択的に障害されるという共通の病態が観察される。本発明の薬剤はこれらのポリグルタミン病の予防薬又は治療薬として用いられ得るが、特に球脊髄性筋萎縮症に対して好適に適用される。
【００２１】
本発明の有効成分の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、溶解補助剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、酸化防止剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、生理食塩水など）を含有させることができる。
賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。結合剤としてはポリビニルピロリドン、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アラビアゴム等を用いることができる。溶解補助剤としては生理食塩水、乳酸化リンゲル溶液、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ニコチン酸アミド等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。酸化防止剤としてはアスコルビン酸、αトコフェノール等を用いることができる。滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム等を用いることができる。
【００２２】
製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、点眼剤、点鼻剤、吸入剤、及び座剤などとして調製できる。
このように製剤化した本発明の薬剤はその形態に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射など）によって対象に適用され得る。ここでの「対象」は特に限定されず、ヒト、及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウズラ等である）を含む。好適には、本発明の薬剤はヒトに対して適用される。
本発明の薬剤中における有効成分（GA又はその誘導体）の含量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように例えば約0.01重量％〜約90重量％とする。
【００２３】
本発明の他の局面では上記薬剤を使用したポリグルタミン病の予防方法又は治療方法（以下、これら二つの方法をまとめて「治療方法等」という）が提供される。本発明の治療方法等は、GA又はその誘導体を有効成分として含む薬剤を対象に投与するステップを含む。投与経路は特に限定されず例えば経口、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜などを挙げることができる。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる（例えば、経口投与と同時に又は所定時間経過後に静脈注射等を行う等）。尚、投与が容易である点から経口投与によることが好ましい。
【００２４】
薬剤の投与量は症状、患者の年齢、性別、及び体重などによって異なるが、当業者であれば適宜適当な投与量を設定することが可能である。例えば、成人（体重約60kg）を対象として一日当たりの有効成分量が約100mg〜約10g、好ましくは約150mg〜約5gとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの設定においては、患者の病状や薬剤の効果持続時間などを考慮することができる。
【００２５】
以下の実施例における材料・試薬及び実験方法は特に記載しない限り次の通りとした。
（アンドロゲン受容体発現ベクター）
24ないし97CAGの全長アンドロゲン受容体(AR)コンストラクトをpPCR3.1ベクター（インビトロジェン社、カリフォルニア、アメリカ）にクローニングした。
【００２６】
（球脊髄性筋萎縮症(SBMA)培養細胞モデル）
ヒト神経培養細胞(SHSY-5Y)を、レチノイン酸10μMを含むメディウムで分化誘導後、24ないし97CAGを有する全長ARを含む発現ベクターをリポフェクション法にて感染させた。このようにして培養細胞モデルを調製した。
【００２７】
（SBMAモデルマウス（トランスジェニックマウス））
CMVエンハンサー及びチキンβアクチンプロモーターの制御下に97CAGを有する完全長ARを発現するコンストラクトを導入したトランスジェニックマウス(AR-97Q)をモデルマウスとして用いた。当該トランスジェニックマウスの作製方法の概要は次の通りである。まず、pCAGGSベクター(Niwa, H., Yamamura, K., and Miyazaki, J. (1991). Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108, 193-199.)内にNheI部位を作製した後(pCAGGS-NheI)、97CAGを有する全長ヒトAR遺伝子 (Kobayashi, Y., Miwa, S., Merry, D.E., Kume, A., Mei, L., Doyu, M., and Sobue, G. (1998). Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 145-150.)をこのpCAGGS-NheIにサブクローニングする。次に、SalI-NheI で処理し、AR断片を切り出す。この断片をBDF1受精卵（日本エスエルシー、静岡、日本）にマイクロインジェクションする。注入操作を終了した受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植し、所定期間飼育することで仔マウス（F0、AR-97Qマウス）を得る。これらF0マウスをC57BL/6J（日本エスエルシー、静岡、日本）に交配することで維持を行った。尚、AR-97Qの作製方法の詳細についてはWO2004/016083を参照されたい。
【００２８】
（薬剤投与）
モデルマウスへの17-AAGの投与は次のように行った。DMSOに溶解した17-AAGを腹腔内投与した。生後6週から投与を開始し、生後25週齢まで週３回の投与を行った。投与量の異なる２群（１回投与量2.5mg/kgの群、及び１回投与量25mg/kgの群）を用意した。また、対照群(Tg-0)には溶剤であるDMSOそのものを投与した。
【００２９】
（表現型解析）
１．ロータロッド法（Rotarod task）を薬剤投与開始から毎週行い、運動機能を解析した。Rotarod taskにはEconomex Rotarod (Colombus Instruments、アメリカ)を用い、毎週12時間ごとの明暗サイクルの明時に、以前の報告と同様に行った (Adachi, H., Kume, A., Li, M., Nakagomi, Y., Niwa, H., Do, J., Sang, C., Kobayashi, Y., Doyu, M., and Sobue, G. (2001). Hum. Mol. Genet. 10, 1039-1048.)。試行は3回行い、各々のマウスが回転バーにもっとも長く乗ることのできた時間を記録した。マウスがバーから落下した時ないし180秒に達した時にタイマーを停止し、その時間を記録した。
マウスの1日の行動量であるケージアクティビティ（cage activity）は、マウスを透明なケージ(16 x 30 x 14 cm)に入れ、AB system (ニューロサイエンス、日本)を用い、赤外線センサーを使って測定した。測定は10分間隔で24時間行った。
【００３０】
２．正常長（AR24Q）又は異常延長したポリグルタミン鎖（AR97Q）を含有するヒトアンドロゲン受容体（AR）遺伝子発現ベクターをヒト神経培養細胞（SHSY5Y）で一過性強制発現させて、培養細胞モデルを作成した。この培養細胞モデルを用いてGAと17-AAGの薬理効果を評価した。薬剤（GA,17-AAG）の投与は、強制発現後にメディウムに加えることによって行い、24時間後に一度薬剤（GA,17-AAG）を含んだメディウムを交換した。GAと17-AAGはDimethyl Sulfoxide(DMSO)に溶解し、それぞれGA 0.9，1.8，3.6，7.2nM，17-AAG 18，90，180，360nMの濃度で投与した。コントロールとして、何も投与しないもの(C)とDMSOのみを投与したもの(DM)を用いた。発現48時間後に細胞を回収してタンパク質を抽出し、ウエスタンブロットにてそれぞれのタンパク質の発現量を評価した。用いた抗体は以下の通りである。
抗AR抗体：N-20（Santa Cruzu Biotechnology, Inc.）
抗Hsp70抗体：SPA-810（Stressgen Biotechnologies corp.）
抗Hsp40抗体：SPA-400（Stressgen Biotechnologies corp.）
抗Hsp90抗体：SPA-835（Stressgen Biotechnologies corp.）
抗Hop抗体：SRA-1500（Stressgen Biotechnologies corp.）
抗p23抗体：MA3-414（Affinity BioReagents Inc.）
抗Hsp60抗体：MS-263（Neo Markers）
【００３１】
３．Hsp70遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用意した。これと、正常長(AR24Q)又は異常延長したポリグルタミン鎖(AR97Q)を含有するヒトAR遺伝子発現ベクターとをヒト神経培養細胞(SHSY-5Y)で共発現させ、それぞれのARの発現量をウエスタンブロットにより評価した。また、Hsp90αサブセット又はβサブセットを組み込んだ発現ベクターを用いて、ヒト神経培養細胞(SHSY-5Y)内でHsp90α又はβを高発現させ、同様にARの発現量をウエスタンブロットで評価した。
４．薬剤投与後のマウスの脊髄および筋組織のウエスタンブロットは、各組織のtotal homogenateを用いた。また、抗AR抗体はH-280（Santa Cruzu Biotechnology, Inc.）、抗Hsp70抗体はSPA-810（Stressgen Biotechnologies corp.）抗Hsp40抗体はSPA-400（Stressgen Biotechnologies corp.）、抗Hsp90抗体はSPA-835（Stressgen Biotechnologies corp.）を利用し、コントロールタンパクとしてα-tubulinを用いた。また、脊髄と骨格筋における免疫染色においては、ポリグルタミンが異常伸張したタンパクを特異的に認識する抗体として1C2（CHEMICON International）を使用した。
【実施例１】
【００３２】
17-AAGの薬剤効果は培養細胞モデル、および病的遺伝子(AR内のCAGリピート数が97のもの)を導入したモデルマウスにて評価した。今回使用したモデルマウスは、表現形に性差があり、進行性の運動障害を呈することが確認されている(非特許文献５)。薬効の評価は体重変化、生存率、Rotarod法(一定の速度で回転する棒の上に、落下せずにつかまっていられる時間測定)、Cage activity測定法(24時間のマウスの動作の回数の測定)をパラメーターとした。薬剤の１回投与量はこれまでの報告において、短期投与では毒性が問題にならないことが確認されている量とし(2.5mg/kg、25mg/kg)、薬剤吸収が確実な腹腔内注射法にて週に３回施行した。17-AAGのマウスでの薬剤動態は既に詳細に検討されている(非特許文献４３)。対照群には溶剤であるDimethyl Sulfoxide(DMSO)を投与した。
【００３３】
＜培養細胞におけるGAと17-AAGの薬理効果＞
培養細胞モデルにおいて、GAと17-AAGの薬理効果を評価した。図３Ａ及び３Ｂに示されるように、GAと17-AAG投与により薬剤濃度依存性に双方のリピート数のARの減少効果を認めた。人体では正常リピート数とされる24リピートのAR(AR24Q)でも同様の効果を認めたが、AR減少効果はリピート数が異常伸長したAR97Qで強くみられた。また、GAと17-AAGの投与でHsp70とHsp40の発現増加がみられたが、Hsp90の発現量には変化がみられなかった。その他のシャペロン群(Hsp60、Hop、p23)の発現量も変化は認めなかった。
図４Ａ及び４Ｂは、17-AAG投与実験を５回試行し、AR24QとAR97Qの減少効果の平均値を棒グラフで示したものである。これらの減少効果をDMのみ加えたコントロール群と、17-AAG（360nM）投与群で比較すると、それぞれの減少率はAR24Qが41.1%（p=0.0132）、AR97Qは11.0%（p=0.0062）であった。さらに、AR24QとAR97Qの減少率を比較すると、有意にAR97Qの減少率が大きく（p=0.0063）、ポリグルタミンが異常伸長した病的なARの方が17-AAGに対する感受性が高いことが明らかになった。統計学的解析はτ検定を使用した。
こうしたARの減少効果は、Hsp70を遺伝子操作で強制発現させることでも得ることができた。しかし、薬剤投与とほぼ同等のHsp70高発現が得られているにも拘わらず、そのAR減少効果は薬剤投与に比し劣っていた（図５Ａ）。一方、Hsp90のαとβの二つのサブセットをそれぞれ高発現させると、双方でAR24Q、AR97Qの発現量の増加がみられ、その傾向はAR97Qにより強く認められた（図５Ｂ）。
【００３４】
＜マウスモデルにおけるGAと17-AAGの薬理効果＞
以上の培養細胞モデルの結果より、ポリグルタミンが伸張した病的なARは、17-AAGにより生体内でもその発現量を減少させることが可能と予想された。GA誘導体として、個体動物レベルで既に安全性が確認されている17-AAGを選択し、マウスモデルに薬剤投与を行った。マウスの症状の変化は、体重、生存率、運動機能解析(Rotarod, cage activity)にて評価した(図６、図７)。対照群はTg-0(DMSOのみ)、治療群（投与群）はTg-2.5(17-AAG:2.5mg/kg)、Tg-25(17-AAG:25mg/kg)で示す。図８Ａは生後16週齢のマウスの写真であるが、治療群で著明な筋萎縮を呈しているのに対し、治療群ではほぼ健常マウスに近い体格をしている。図８Ｂはマウスの歩幅の比較であるが、治療群では有意に歩幅は広く、規則的である。このように、17-AAG治療群（投与群）は非治療群に比べて、すべての解析において投与量依存性に有意な治療効果を認めた。
個体数は、体重、生存率、Rotarod法においてはTg-0(n=27)、Tg-2.5(n=22)、Tg-25(n=23)とし、Cage Activity法においてはTg-0(n=18)、Tg-2.5(n=17)、Tg-25(n=18)とした。
【００３５】
ポリグルタミン鎖が異常延長した変異AR（AR97Q）の発現量の評価は、ウエスタンブロット法によりSBMAマウスモデルの脊髄と骨格筋にて施行した。AR97Qの発現量は、モノマー及びスタッキングゲル内のタンパク複合体の双方で有意に減少した（図９Ａ）。スタッキングゲルに蓄積する高分子量のARは、凝集した変異ARを示すと考えられる。培養細胞モデルと同様にHsp70とHsp40は発現が増加していたが、Hsp90の発現量には変化がみられなかった（図９Ａ）。治療群（Tg-0）、非治療群（Tg-25）の各５匹のマウスで変異ARの発現量を比較すると、変異ARは双方の臓器でモノマー及びスタッキングゲル内のタンパク複合体ともに有意に減少した（図９Ｂ）。統計学的解析はT検定を用いた。
異常延長したポリグルタミンを特異的に認識する1C2抗体を用いた免疫染色においては、17-AAG治療群で1C2陽性細胞数が減少していた(図１０)。
ウエスタンブロット法、免役染色に使用した抗体を以下に示す。
抗AR抗体：H-280（Santa Cruzu Biotechnology, Inc.）
抗Hsp70抗体：SPA-810（Stressgen Biotechnologies corp.）
抗Hsp40抗体：SPA-400（Stressgen Biotechnologies corp.）
抗Hsp90抗体：SPA-835（Stressgen Biotechnologies corp.）
抗ポリグルタミン抗体：1C2（CHEMICON International）
【００３６】
＜まとめ＞
以上のように、SBMAの培養細胞モデルとモデルマウスへの17-AAGの投与は、有意な治療効果を示した。ポリグルタミン鎖が伸張した病的なARタンパク質の方が、Hsp90に対する依存性が高くなっていると考えられる。モデルマウスへの長期連続投与に、明らかな副作用は確認されなかった。今回、SBMAの病的タンパク質である変異型ARが17-AAGの治療ターゲットとなることが明らかになった。一方、その他のポリグルタミン病の病因タンパク質にもHsp90依存性が認められ、かつポリグルタミンが異常延長することでその依存性が高くなるようであれば、同様に治療ターゲットになると予測される。17-AAGをはじめとするGA誘導体は悪性腫瘍の治療法として臨床応用されつつあるが、神経変性疾患であるポリグルタミン病全般にも応用できる有望な薬剤である。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明はポリグルタミン病の予防ないし治療に有用である。ポリグルタミン病の中でも特に球脊髄性筋萎縮症の予防ないし治療に対して本発明を好適に利用することができる。
【００３８】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１はゲルダナマイシン（GA）とその誘導体を示す。1970年に抗真菌剤としてGAが見いだされが、その後は優れた抗腫瘍効果を有することが判明した。臨床応用のためいくつかのゲルダナマイシン誘導体が開発されてきた。17-AAGはGAの側鎖の一部のみが置換された誘導体である。同じ薬理作用を保ちながら、生体内の毒性を減少させることに成功した優れた誘導体である。17-DMAGは17-AAGをさらに改良した誘導体で、水溶性を高めることにより経口投与が可能となった。
【図２】図２はHsp90およびコシャペロンの作用を模式的に示す。Hsp90は複数のコシャペロンと共同して、その機能を発現することが明らかにされている。p50とp23が結合したHsp90-クライアントタンパク複合体は、機能発現するための最も安定した形であり、逆にHopとHsp70が結合した複合体は不安定でプロテアゾームのターゲットとなる。GAをはじめとするHsp90阻害剤は、こうしたHsp90複合体の形成を特異的に阻害することで薬理作用を発揮する。
【図３】図３は、培養細胞モデルにおけるGAと17-AAGの効果を示す。A,B.培養細胞モデルは、正常長(AR24Q)又は異常延長したポリグルタミン鎖(AR97Q)を含有するヒトアンドロゲン受容体(AR)遺伝子を発現ベクターに組み込み、ヒト神経培養細胞(SHSY5Y)に発現させたものである。GAと17-AAGの薬理効果を評価した。発現48時間後に細胞を回収してタンパク質を抽出し、ウエスタンブロットを行った結果である。GAと17-AAGはDimethyl Sulfoxide(DMSO)に溶解し、それぞれGA 0.9，1.8，3.6，7.2nM，17-AAG 18，90，180，360nMの濃度で投与した。コントロールとして、何も投与しないもの(C)とDMSOのみを投与したもの(DM)を用いた。コントロールタンパク質としてp85を用いた。
【図４】図４は、17-AAG投与によるAR発現量への効果を示す。A.  17-AAGによるAR24QとAR97Qの減少効果を表す棒グラフである。B．  ARの減少率を比較した棒グラフである。
【図５】図５は、培養細胞モデルにおいて、分子シャペロン（Hsp70及びHsp90）の高発現によってもたらされる、AR発現量への効果を示す。A. Hsp70遺伝子を発現ベクターに組み込み、正常長(AR24Q)又は異常延長したポリグルタミン鎖(AR97Q)を含有するヒトアンドロゲン受容体(AR)遺伝子発現ベクターと共発現させ、それぞれのARの発現量をウエスタンブロットにより評価した。B. Hsp90のαとβの２つのサブセットをそれぞれ発現ベクターに組み込み高発現させ、同様にARの発現量を評価した。
【図６】図６は、SBMAモデルマウスの症状に対する17-AAGの効果を示す。17-AAGの投与量は2.5mg/kg(Tg-2.5)、25mg/kg(Tg-25)の2群、対照群(Tg-0)には溶剤であるDMSOそのものを投与した。薬剤は腹腔内に投与した。生後6週から投与を開始し、生後25週齢まで週３回の投与を行った。A.体重の25週齢までのグラフを示す。B. 累積生存曲線の25週齢までのグラフを示す。Tg-0は◆、Tg-2.5は▲、Tg-25は●で示した。
【図７】図７は、SBMAモデルマウスの症状に対する17-AAGの効果を示す。A. rotarod taskの25週齢までのグラフを示す。B. cage activityの25週齢までのグラフを示す。
【図８】図８は、SBMAモデルマウスの症状に対する17-AAGの効果を示す。A. 16週齢の対照群のマウス(Tg-0)と治療群のマウス(Tg-25)のマウスの写真を示す。対照群では体幹・四肢の著名な筋萎縮を呈するが、治療群のマウスは正常マウスに近い体格をしている。B. 16週齢のそれぞれの群の足跡を示す。前脚は赤、後脚は青で着色してある。
【図９】図９は、SBMAモデルマウスのタンパク発現および病理所見に対する17-AAGの効果を示す。A. 対照群(Tg-0)と治療群マウス(Tg-25)の脊髄および筋組織のtotal homogenateを用いたウエスタンブロット法である。抗AR抗体はH-280、抗Hsp70抗体はSPA-810を利用し、コントロールタンパクとしてα-tubulinを用いた。B. 対照群(Tg-0)と治療群マウス(Tg-25)の脊髄および筋組織における変異ARの発現量を比較したグラフである。
【図１０】図１０は、SBMAモデルマウスにおける17-AAGの効果を示す。対照群(Tg-0)と治療群マウス(Tg-25)の脊髄と骨格筋にて免疫染色を行った。ポリグルタミンが異常延長したタンパクを特異的に認識する抗体は1C2を利用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図８】
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【図１０】
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