(57)【要約】【課題】  高倍率で、回収率が高く、でんぷんやタンパク質等水溶性の夾雑物や水に親和性が高い夾雑物は濃縮しないという特異性を有する微生物濃縮方法を用いて、微生物を計測する方法を提供する。【解決手段】  微生物を含む溶液に、界面活性剤と親水性有機溶媒とを加え均一溶液を形成し、次いで、上記溶液のｐＨを低下させ、上記溶液を、微生物と界面活性剤と親水性有機溶媒と水とが混合している析出相と、上澄み相との二相に分離し、上記析出相中に濃縮した微生物を、培養法、顕微鏡、標識、遺伝子増幅方法を用いて計測することとした。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を含む溶液に、界面活性剤と親水性有機溶媒とを加え均一溶液を形成し、
次いで、上記溶液のｐＨを低下させ、
上記溶液を、微生物と界面活性剤と親水性有機溶媒と水とが混合している析出相と、上澄み相との二相に分離し、
上記析出相中に濃縮した微生物を計測することを特徴とする微生物計測方法。
【請求項２】
微生物を培養法を用いて計測することを特徴とする請求項１に記載の微生物計測方法。
【請求項３】
微生物を顕微鏡を用いて計測することを特徴とする請求項１に記載の微生物計測方法。
【請求項４】
微生物を標識を用いて計測することを特徴とする請求項１又は３に記載の微生物計測方法。
【請求項５】
微生物を遺伝子増幅方法を用いて計測することを特徴とする請求項１又は４に記載の微生物計測方法。
【請求項６】
上記遺伝子増幅方法がＰＣＲ法であって、
上記析出相を、ろ過してフィルタ上に微生物のみを補足し、界面活性剤と親水性有機溶媒とを洗い流すことを特徴とする請求項５に記載の微生物計測方法。
【請求項７】
上記遺伝子増幅技術がＰＣＲ法であって、
フィルタ上に微生物のみを補足し、上記フィルタを水と共に容器に移し、凍結融解することで遺伝子を抽出することを特徴とする請求項５又は６に記載の微生物計測方法。
【請求項８】
上記界面活性剤がフルオロカルボン酸であることを特徴とする請求項１から7のいずれかに記載の微生物計測方法。
【請求項９】
上記親水性有機溶媒がアルコール、エーテル、ケトン、アミド、ニトリル、スルホキシドのうち少なくとも１種を含むことを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の微生物計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品、医療、製薬、環境等の分野で、細菌、酵母、かび、ウイルス等の微生物を計測する方法に関し、特に、培養法、顕微鏡、蛍光標識等の標識、遺伝子増幅技術を用いて、高倍率で濃縮した微生物を計測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品、医療、製薬、環境等の分野では、細菌、酵母、かび、ウイルス等の微生物検査は重要である。例えば、食品分野では、食品の安全保障や品質管理に、医療の分野では、患者の診断や治療に重要である。さらに、微生物検査は、迅速、正確であることが望まれている。
【０００３】
一方、従来、食品分野や環境分野等の微生物検査では、試料中の微生物の存在を確認するために、培養法、マイクロコロニー法、染色法、及び遺伝子増殖技術等を用いている。培養法は、目的とする種の微生物を選択的に増殖させ、検出することが可能であり、１００年以上にわたり用いられてきた。マイクロコロニー法は、培養法を発展させた技術であり、微生物の成長を微視的な段階で検知することによって、培養法より短時間で検出することができる。次に、染色法は微生物を試薬で染色し検出する方法であり、近年では、遺伝子や抗原抗体反応を利用した染色法が行われている。また、遺伝子増殖技術を用いた微生物検査では、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が用いられている。
【０００４】
これらのうち、例えば、ＰＣＲ法を用いた微生物検査では、食品中の特定菌を検出するために、食品をストマックした液を特定菌に適した培地、温度で培養する。次に、菌を増殖させた培養液から数十μＬサンプリングし、ＰＣＲの試薬と共に遺伝子を増幅する。
【０００５】
ＰＣＲ法を用いた微生物検査では、菌種により遺伝子の特異性があるため、特定菌を検出することができる。しかしながら、サンプリングは数十μＬであるため、上記検査では、食品の一部分だけを検査しているにすぎず、食品の全体を検査していない。
【０００６】
このように、上記した従来の微生物検査では、試料の一部分中の菌を抽出して培養したり、試料の部分的特徴を増幅・検出しているに過ぎない。すなわち、試料の部分的特徴を検査しているのに過ぎず、試料全体の性状を全体として把握することは必ずしもできていない。したがって、より高倍率でかつ回収率の高い濃縮方法を用いた検査が望まれている。
【０００７】
試料の全体を検査するために、微生物検査では試料中の微生物の濃縮が行われてきた。微生物を濃縮する方法としては、古くから遠心分離や、セルロース、ナイロン、ポリエステル等の有機高分子繊維のフィルターを用いたろ過等が行われてきた。しかし、これらの古典的な微生物濃縮方法では、高い濃縮倍率を得ることができない。さらに、遠心分離機や高分子繊維のフィルター等高価な器具を必要とし、コストがかかる。
【０００８】
このような問題を解決するものとして、特許文献１に示す菌体濃縮方法及び菌体濃縮試薬が提案された。この方法では、まず、微生物が含まれる水性溶媒に対して、陰イオンと陽イオンとを存在させて、水難溶性物質を生成させる。次に、この水難溶性物質に微生物を吸着させて微生物を回収する。さらに、微生物が吸着した水難溶性物質を溶解剤により溶解することで微生物を回収している。
【特許文献１】特開２０００−１４３８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記従来の方法には以下の問題があり、効率的な微生物の計測を行うことができなかった。
（１）微生物が吸着した水難溶性物質を溶解剤で溶解することにより、微生物を含む相の体積が増え、数十倍程度しか濃縮することができない。
（２）微生物の回収率が約９０％であるため、残りの約１０％の回収できなかった微生物は検査することができない。したがって、微生物の陰陽性を検査する手段には使うことができない。
（３）吸着に特異性がないため、微生物以外の夾雑物も濃縮してしまい、計測の誤差要因になる。
本発明は、このような問題を解決し、高倍率で、回収率が高く、でんぷんやタンパク質等水溶性の夾雑物や水に親和性が高い夾雑物は濃縮しないという特異性を有する微生物濃縮方法を用いて、高倍率で濃縮した微生物を計測する方法を提供するものである。本発明は、特に、生きているが通常の方法では培養が困難な状態な細菌（ＶＢＮＣ、ｖｉａｂｌｅ  ｂｕｔ  ｎｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ）に適している。このような状態の細菌は、培地上にコロニーを形成せず、従来の培養法では検出できなかった。したがって、これまでは、「存在しない」ものとして取り扱われ、衛生管理の対象から外されていた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明は、微生物計測方法であって、微生物を含む溶液に、界面活性剤と親水性有機溶媒とを加え均一溶液を形成し、次いで、上記溶液のｐＨを低下させ、上記溶液を、微生物と界面活性剤と親水性有機溶媒と水とが混合している析出相と、上澄み相との二相に分離し、上記析出相中に濃縮した微生物を計測することを特徴とする。
【００１１】
本発明に係る微生物計測方法は、その一の実施の形態で、微生物を培養法を用いて計測することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係る微生物濃縮方法は、別の実施の形態で、微生物を顕微鏡を用いて計測することを特徴とする。
【００１３】
さらに、本発明に係る微生物濃縮方法は、別の実施の形態で、微生物を標識を用いて計測することを特徴とする。
【００１４】
またさらに、本発明に係る微生物濃縮方法は、別の実施の形態で、微生物を遺伝子増幅方法を用いて計測することを特徴とする。
【００１５】
本発明に係る微生物濃縮方法で、遺伝子増幅方法として、ＰＣＲ法を用いるとき、上記析出相を、ろ過してフィルタ上に微生物のみを補足し、水で洗浄して、上記界面活性剤と上記親水性有機溶媒とを洗い流すことが好ましい。また、このとき、フィルタ上に微生物のみを補足して、上記フィルタを水と共に容器に移して、凍結融解することで遺伝子を抽出することが好適である。
【００１６】
上記界面活性剤としては、例えば、フルオロカルボン酸が好適である。また、上記親水性有機溶媒としては、アルコール、エーテル、ケトン、アミド、ニトリル、スルホキシドのうち少なくとも１種が好適である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、高倍率で、回収率が高く、でんぷんやタンパク質等水溶性の夾雑物や水に親和性が高い夾雑物は濃縮しないという特異性を有する微生物濃縮方法を用いて、高倍率で濃縮した微生物を計測する方法が提供される。後述するように、本発明に係る微生物計測方法によれば、以下のような効果を期待することができる。
１．微生物を数万倍という高い倍率で濃縮することができるため、大容量の試料を微量の体積に濃縮することができ、高倍率に濃縮した微生物を、培養法、顕微鏡、標識、又は遺伝子増幅方法を用いて、効率的に計測することができる。
２．試料中の微生物を約１００％の回収率で濃縮することができ、正確な結果を得ることができ、微生物の陰陽判定が可能になる。
３．でんぷんやタンパク質等水溶性の夾雑物や水に親和性が高い夾雑物は、濃縮されないので、これらを微生物と分離することができ、正確な微生物計測を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に、本発明に係る微生物計測方法について、その実施の形態を参照しながらさらに詳細に説明する。
【００１９】
本発明に係る微生物計測方法は、界面活性剤と、親水性有機溶媒と、ｐＨを低下させる試薬とを用いて微生物の濃縮を行い、高倍率で濃縮した微生物を、培養法、顕微鏡、標識、又は遺伝子増殖方法を用いて計測する方法であり、少なくとも以下のステップを含んでいる。
１．微生物を含む溶液に、界面活性剤と親水性有機溶媒とを加え均一溶液を形成するステップ（ステップ１）。
２．上記溶液のｐＨを低下させ、上記溶液を、微生物と界面活性剤と親水性有機溶媒と水とが混合している析出相と、上澄み相との二相に分離するステップ（ステップ２）。
３．上記析出相中に濃縮した微生物を計測するステップ（ステップ３）。
本発明に係る微生物計測方法は、細菌、酵母、かび、ウイルス等を対象としており、以上のステップを実行し、微生物を計測することとしている。各ステップについて、以下にさらに説明を加える。
【００２０】
ステップ１
このステップ１では、微生物を含む溶液に、界面活性剤と親水性有機溶媒とを加え、均一溶液を形成する。このような「均一溶液」は、完全な溶液の他、ミセルが形成されたような擬均一溶液も含む概念である。界面活性剤と親水性有機溶媒とは、相溶性を有することが好ましく、ステップ１では、微生物を含む溶液、界面活性剤、親水性有機溶媒が全体として単一の液相を形成させる。界面活性剤としては、フルオロカルボン酸が好適であり、各炭素原子に結合している水素原子の少なくとも１個がフッ素原子で置換されているカルボン酸を用いることが好適である。
【００２１】
フルオロカルボン酸は対応するカルボン酸よりもプロトンが解離しやすく、また疎水性である。したがって、フルオロカルボン酸は、著しく低いｐＨでない限り、対応するカルボン酸よりも容易にプロトンを解離して水に溶解し、かつ一部の低級なものを除き、これに鉱酸を添加してｐＨを低下させると、容易に非解離状態となって水相から分離する。このような傾向はフッ素化の程度が大きいほど著しい。したがって、本発明では、ペルフルオロデカン酸、ペルフルオロオクタン酸等完全にフッ素化されたカルボン酸を用いるのが好ましい。
【００２２】
以上の界面活性剤のうち、例えば、ペルフルオロオクタン酸は、常温で固体である。したがって、ペルフルオロオクタン酸を含む水溶液のｐＨを低下させるとペルフルオロオクタン酸は固体として析出する。しかし、ペルフルオロオクタン酸を含む水溶液にアセトン又はテトラヒドロフラン等のこれと相溶性のある親水性有機溶媒を共存させておくと、ペルフルオロオクタン酸は、親水性有機溶媒と水と共に析出相を形成して水溶液から分離する。本発明に係る微生物計測方法は、このような現象を利用することを一つの特徴としている。
【００２３】
本発明で用いる界面活性剤が、特に、下記の一般式（１）で示されるフルオロカルボン酸の場合、鉱酸や有機酸を添加してｐＨを６以下の酸性にすれば、微生物と界面活性剤と親水性有機溶媒と水とが混合する析出相として微生物を濃縮することができる。すなわち、フルオロカルボン酸を界面活性剤として用いれば、ｐＨを６以下程度として、あまり下げずに済む。したがって、微生物を生きたまま濃縮したり、遺伝子を損傷せずに濃縮するのに好適である。
【００２４】
【化１】
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【００２５】
ここでＲはフルオロアルキル基であり、各炭素原子に結合している水素原子の少なくとも１個がフッ素原子で置換されているものである。また、通常Ｘはフッ素を含有しない二価の有機基である。具体的には炭素数１〜４個程度のアルキレン基、オキシアルキレン基あるいは炭素鎖中に酸素、窒素、硫黄などのヘテロ原子を有するアルキレン基である。例えば、−ＣＨ2ＣＨ2ＳＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−などが挙げられる。
【００２６】
親水性有機溶媒としては、アルコール、エーテル、ケトン、アミド、ニトリル、スルホキシドの中の１種類以上が好適である。例えば、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド等が好適である。
【００２７】
親水性有機溶媒がエーテル、アミド、アルコール、ケトンの中から選択される場合、微生物をその形態を保ったまま析出相に濃縮することが可能である。エーテルとしては、特にテトラヒドロフランが、アミドとしては、特にジメチルホルムアミドが、アルコールとしては、特にエタノールが、ケトンとしては、特にアセトンが好適である。
【００２８】
ステップ２
このステップでは、ステップ１で得られる溶液のｐＨを低下させ、この溶液を、微生物と界面活性剤と親水性有機溶媒と水とが混合している析出相と、上澄み相との二相に分離する。
【００２９】
ｐＨを低下させる試薬としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸を用いることが好ましい。本発明の微生物濃縮方法によれば、微生物と共に水溶性物質や親水性物質が共存する場合、微生物は析出相へ、水溶性物質や親水性物質は上澄み相へ分離することができる。これによって、微生物を濃縮することができる。
【００３０】
界面活性剤と親水性有機溶媒と微生物と水とからなる溶液に、ｐＨを低下させるための試薬を添加する時、一般的には、添加後そのまま放置するのではなく、軽く攪拌してから放置する方が好ましい。すなわち、攪拌により混合しないと、酸が均一に拡散するまでに時間がかかり、その分反応が遅れることで、相分離が遅くなることが起こるため、攪拌プロセスを設けることが好ましい。
【００３１】
攪拌は、手で振るか、又はスターラ、ボルテックスミキサー等を用いることが好ましい。ステップ２で、析出相を形成させる際、反応液全体の温度を低下させると析出速度が速くなる。これは、温度が低下することで水中に溶ける親水性有機溶媒の溶解度が低下するためと考えられる。
【００３２】
なお、界面活性剤と親水性有機溶媒と微生物と水とからなる溶液のｐＨを低下させた後、遠心分離を行うと、放置して析出相を形成させる時間に比べて短い時間で析出相を形成させることができる。
【００３３】
ステップ３
このステップ３では、ステップ１及び２より、析出相中に濃縮させた微生物を、様々な検査方法を用いて計測することができる。検査方法としては、培養法、顕微鏡観察、標識を用いる方法、又は遺伝子増幅を用いる方法等がある。
【００３４】
培養法
微生物の培養法では、一般的に、寒天培地上で微生物を増殖させ検出する。この場合、培地に塗抹される試料の容量は、培養容器底板の面積により限定される。このため、本発明で示すように、微生物の培養法では、試料が希薄な場合、試料を十分に濃縮することが好ましい。また、微生物は耐酸性かつ耐有機溶媒性であることが好ましい。さらに、微生物の培養法では、適した培地、温度、及び時間で培養することが好ましい。例えば、大腸菌では、寒天培地に塗抹後、３７℃で約２０時間、黄色ブドウ球菌では、寒天培地に塗抹後、３５℃で１日から２日間培養する。
【００３５】
顕微鏡観察
微生物の計測に顕微鏡を用いる方法では、個々の微生物を識別すると同時に、特定の微生物を識別することが重要である。そのため、親水性有機溶媒にはエーテル、アミド、アルコール、ケトンの少なくともいずれか一つを用いることが好ましい。例えばテトラヒドロフランやジメチルホルムアミド、エタノール、アセトン等を用いた場合、微生物は形態を保ったまま析出され、顕微鏡を用いて形態を観察することができる。
【００３６】
また、使用できる顕微鏡としては、実態顕微鏡、位相差顕微鏡、又は微分干渉顕微鏡、蛍光顕微鏡を挙げることができる。
実態顕微鏡では、反射光による照明により、カバーガラスをかけずに立体的に観察することができる。
位相差顕微鏡では、コントラストの弱い試料を透過してきた光を位相が異なる直接光と回折光に分離し、それを互いに干渉させ、明暗の像として観察する。
微分干渉顕微鏡では、偏光を利用し、わずかにずれた２つの光線を干渉させ、透明な試料にコントラストをつけて観察する。位相差顕微鏡に比べて焦点深度が深く、微生物表面や内部等が立体的に観察できる。
【００３７】
また、微生物の計測に顕微鏡を用いる方法では、観察者が直接微生物を観察する以外に、コンピューターを用いて、画像を取得し解析を行う場合がある。本発明に係る微生物計測方法によれば、希薄な試料を濃縮し、単位面積あたりの微生物濃度を高くすることができ、格段に有利である。
【００３８】
標識を用いる方法
標識の方法としては、一般的染色法、ハイブリダイゼーション法、抗原抗体反応を利用した方法等がある。標識としては、蛍光標識が好適である。
【００３９】
染色法に用いられる、染色剤にはＤＡＰＩ、ＣＦＤＡ、ＰＩ、ラクトフェノール液、メチレンブルー、グラム染色液、ギムザ染色液、グロコット染色液、ビクトリアブルー染色液、オルセイン染色液、チールネルゼン染色液等を用いることが好ましい。
【００４０】
微生物をＤＡＰＩで染色する場合、微生物を含む有機相は疎水性のため、エタノールなどの有機溶媒にＤＡＰＩを溶解してから有機相と接触させて染色する方法が好適である。
【００４１】
微生物の大きさは、原虫、真菌、細菌等では数μｍから数十μｍであり、ウィルスでは数十ｎｍから数百ｎｍである。従って、回折限界により光学顕微鏡の分解能が０．４〜０．８μｍであるために、ウィルス等は顕微鏡を用いて観察することができない。蛍光顕微鏡では、上記問題点を解決することができる。また、蛍光顕微鏡法では、蛍光標識を用いて、微生物の様々な状態を観察することができる。例えば、微生物の生死は、蛍光顕微鏡法を用いて観察することができる。
【００４２】
また、遺伝子を用いるハイブリダイゼーション法や抗原抗体反応を利用した免疫染色法を用いてもよい。標識したものは蛍光顕微鏡やフローサイトメーター、パーティクルカウンター、分光光度計などで計測することができる。また、本発明では、でんぷんやタンパク質等水溶性の夾雑物や水に親和性が高い夾雑物は濃縮しないという特異性を有し、蛍光顕微鏡や上記測定機器において、不純物による不要な蛍光シグナルが生じない。
【００４３】
ハイブリダイゼーションとは、ＤＮＡやＲＮＡの間で、お互いに相補的な塩基配列が、２本鎖の核酸分子を形成させることをいう。放射性同位体（33Ｐ、35Ｓ等）、蛍光色素等で標識したＤＮＡやＲＮＡと、試料とをハイブリダイゼーションさせ、オートラジオグラフィーや蛍光顕微鏡等を用いてシグナルを検出することができる。
【００４４】
また、微生物を標識する方法として、抗原抗体反応を利用して、免疫染色法を行なうこともできる。免疫染色法とは、蛍光色素等を結合させた抗体を、特異的に標識したい抗原に結合させ、観察する方法である。免疫染色法では、直説法と間接法とがあり、本発明では、特異性があり、高い蛍光シグナルが得られる間接法を用いることが好ましい。
【００４５】
蛍光色素は、ＦＩＴＣ、ＬＣＲｅｄ６４０、ＬＣＲｅｄ７０５、ＡＭＣＡ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、ＰＥ／ＲＤ１、ＥＣＤ、ＰＣ５／ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＣ７／ＰＥ−Ｃｙ７、ＴＲＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃｙ５、ＡＰＣ、ボディピ（Ｂｏｄｉｐｙ）、または量子ドット等を用いることが好ましい。
【００４６】
微生物の計測に蛍光標識技術を用いる場合では、微生物を固定して染色する方法（微生物は死んでいる）と、生きたまま微生物を染色する方法とがある。例えば、蛍光標識をしたＤＮＡ断片を、微生物内に微小針を用いて、微量注入する。固定処理が無く、微生物が生きているので、迅速で、詳細な検査が行える。
【００４７】
遺伝子増殖を用いる方法
このステップでは、微生物を遺伝子増幅を用いて計測する。このとき、遺伝子増幅方法は、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）等を用いることが好ましい。
【００４８】
ＰＣＲ法とは、ＤＮＡをテンプレートとして、増幅したい領域の両端に相補的なプライマーと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてサイクル反応（第１段階はテンプレートＤＮＡとプライマーとのアニーリング、第２段階は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応、第３段階は二本鎖ＤＮＡの解離）を行うことにより、目的とするＤＮＡ領域を増幅する方法である。一般的な検査手順としては、例えば、菌を陰イオン界面活性剤により破壊し、塩析によりタンパク質を除去して、イソプロパノールを用いてＤＮＡを沈殿させる。続いて、ＰＣＲ法を用いて、抽出したＤＮＡの特定領域を増幅させ、ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により、ＤＮＡの特定領域が増幅しているかを確認する。以上により、食品中の特定菌の有無を確認する。
【００４９】
ＬＡＭＰ法とは、遺伝子にある化学的条件を与え、遺伝子を増やすことで、遺伝子の有無を判定する方法である。具体的には、標的遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の６箇所の領域に対して設定した４種類のプライマー及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用する。このＤＮＡポリメラーゼがもつ鎖置換活性を利用し、一定温度で増幅反応を行い、蛍光強度又はピロリン酸マグネシウムの白色沈殿の検出を１ステップで行うことができる。
ＩＣＡＮ法とは、約４キロベースまでの遺伝子の任意の領域を、一定温度（５０℃から６５℃）で増幅することができる。反応を一定温度で行えるため、逆転写酵素の活性を下げることなく、遺伝子の増幅が短時間で行える。
【００５０】
本発明の微生物測定方法では、一つの実施の形態として、ＰＣＲ法を用いるとき、微生物と界面活性剤と親水性有機溶媒と水とが混合している析出相から、ろ過してフィルタ上に微生物のみを補足し、水で洗浄して、界面活性剤と親水性有機溶媒とを洗い流す。これは、析出相は疎水性であるためプローブやプライマーなどの試薬がＤＮＡに接触できないことから、ろ過などで微生物以外の有機相を取り除いてから測定することが好ましいからである。
【００５１】
さらに、親水性有機溶媒としてテトラヒドロフランやジメチルホルムアミド、エタノール、アセトンなどを用いた場合、微生物は形態を保ったまま析出するため、ＰＣＲ法を行う前に、微生物内からＤＮＡまたはＲＮＡを取り出す必要がある。この方法としては凍結融解法やボイル法、アルカリ法などを用いることが好ましい。本発明では、例えば、フィルタ上に微生物のみを補足して、上記フィルタを水と共に容器に移して、凍結融解することで遺伝子を抽出する。
【００５２】
また、本発明の微生物の濃縮方法では、ｐＨが６以下程度とすることができ、遺伝子を損傷させない。このため、遺伝子増幅方法を用いるのに適している。
【実施例】
【００５３】
以下に、本発明に係る微生物計測方法を実施例を挙げて説明する。
実施例１
供試菌株として大腸菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２を用いた。大腸菌の分離工程では、３７℃のＬＢ培地中で、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２を１８時間振蕩培養し、得られた菌液１０μｌ（大腸菌数は約１０7個）を純水７６９ｍｌに添加した。次に、図１（ａ）のように、０．１Ｍペルフルオロオクタン酸（２）２．５ｍｌ、テトラヒドロフラン（３）３８ｍｌ、６．０Ｍ塩酸（４）１９２ｍｌを順次に添加し、溶液が均一になるように、容器の蓋を閉めて上下に３０回振った。続いて、図１（ｂ）で示すように、室温で３時間放置し、容器底面に析出相（５）を析出させた。
【００５４】
次に、大腸菌の抽出工程では、エタノールで溶解した０．１ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ溶液３３ｍｌを、析出相と水相が入った前記容器に加え、析出相中の大腸菌を蛍光染色した。次に、ピペットを用いて析出相の体積を計量した後、析出した析出相（５）と上澄み相（６）を５μｌずつとり、各々をスライドグラス上に乗せ、さらに、カバーガラスを被せて蛍光顕微鏡を用いて菌数を測定した。
【００５５】
図２は、大腸菌の顕微鏡像である。図２（ａ）は、大腸菌の透過光像、図２（ｂ）は、ＤＡＰＩにより染色した蛍光画像である。解析の結果、上澄み相中の大腸菌数は、０個／５μｌであり、析出相中の大腸菌数は、５．８×１０6個／５μｌであった。析出した析出相の体積は、約２０μｌであったため、析出相中の大腸菌数は以下の計算式で求めた。
【００５６】
【数１】
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【００５７】
そして、大腸菌の分離工程では、析出相中の大腸菌数は始めに添加した大腸菌数とほぼ同じであり、さらに上澄み相に大腸菌は見られなかったことから、大腸菌の回収率はほぼ１００％であることが分かった。
【００５８】
また、以下の式を用いて、濃縮方法の濃縮倍率を求めた。
【数２】
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【００５９】
実施例２
実施例２では、図３のフローチャートに従って実施した。実施例１と同様の方法で、容器底面に大腸菌を含む析出相を析出させた。析出させた析出相をピペットで吸出し、口径０．２μｍのメンブレンフィルタ上へろ過した。さらに、メンブレンフィルタ上に滅菌水を約１０ｍｌ加え、ろ過して析出相を洗い流した。この洗浄操作は３回行った。次に、このメンブレンフィルタを軽くピンセットでまるめ、１．５ｍｌのマイクロチューブに入れ、０．５ｍｌの滅菌水を加え、さらに内部標準としてルシフェラーゼのプラスミドＤＮＡを加えた。マイクロチューブの蓋を閉めた後、パラフィルムを巻き、液体窒素の中に３分間浸け、その後に６５℃の湯浴で３分間解凍した。この凍結融解操作を３回繰り返して大腸菌の細胞膜を破砕した。その後、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離にかけて上澄みに大腸菌のＤＮＡを抽出した。
【００６０】
次に、本実施例２では、ＰＣＲを用いて、抽出したＤＮＡを検出した。ＰＣＲでは、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ製）用のキャピラリーに、以下の試薬とテンプレートを加え、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ専用の遠心分離機にかけてから、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒにセットして反応を行った。試薬は、１０ＬＣ  ＤＮＡ  ｍａｓｔｅｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ社製  ＰＣＲ試薬）を２μＬ、１ｐｍｏｌ／μＬ  プローブ（３’ＦＩＴＣ）を２μＬ、１ｐｍｏｌ／μＬ（５’ＬＣＲｅｄ６４０）を２μＬ、１０ｐｍｏｌ／μＬ  ＰＣＲプライマーＥＣＡ７５Ｆ（塩基配列が、５’−ｇｇａ  ａｇａａｇｃ  ｔｔｇ  ｃｔｔ  ｃｔｔ  ｔｇｃ  ｔｇａ  ｃ−３’）を１μＬ、１０ｐｍｏｌ／μＬ  ＰＣＲプライマーＥＣＲ６１９Ｒ（塩基配列が、５’−ａｇｃ  ｃｃｇ  ｇｇｇ  ａｔｔ  ｔｃａ  ｃａｔ  ｃｔｇ  ａｃｔ  ｔａ−３’）を１μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を３．２μＬ用いる。上記反応試薬液に、大腸菌から抽出したＤＮＡテンプレートを１μＬ、滅菌水を７．８μＬ加えた。その結果、ペルフルオロオクタン酸とテトラヒドロフランと塩酸を用いて濃縮を行った大腸菌のＤＮＡをＰＣＲ法によって検出することができた。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明に係る微生物計測方法で、微生物の濃縮と抽出工程を説明する概念図である。
【図２】本発明に係る微生物計測方法により、顕微鏡を用いて析出層中の大腸菌を観察した透過光像、蛍光像を示すイメージ図である。  （ａ）は透過光像を示す。  （ｂ）は蛍光像（ＤＡＰＩ染色）を示す。
【図３】本発明に係る微生物計測方法を説明するフローチャート図である。
【符号の説明】
【００６２】
１  大腸菌と純水の混合溶液
２  ペルフルオロオクタン酸
３  テトラヒドロフラン
４  塩酸
５  大腸菌を含む析出相
６  上澄み相
【図１】
2006141352.tif 000006
【図２】
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【図３】
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