(57)【要約】  【課題】チオレドキシンの発現を誘導し、例えば、酸化ストレスによる影響を緩和することができる、安全な飲食品を提供することを主な目的とする。  【解決手段】アブラナ科植物の抽出物であるスルフォラファンを含む飲食品を提供する。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルフォラファン含有エキスを含むことを特徴とする飲食品。
【請求項２】
該エキスが０．０１〜５０ｍｇ／ｇのスルフォラファンを含む請求項１に記載の飲食品。
【請求項３】
スルフォラファンを内容組成物の１０〜２０００μｇ／１００ｇ添加することを特徴とする、請求項１に記載の飲食品。
【請求項４】
該スルフォラファンがアブラナ科植物由来である請求項１に記載の飲食品。
【請求項５】
該アブラナ科の植物が、ブロッコリースプラウト、カイワレダイコン及びムラサキキャベツの新芽からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の飲食品。
【請求項６】
チオレドキシン発現誘導用である請求項１〜５に記載の飲食品。
【請求項７】
酸化ストレス緩和用である請求項１〜５に記載の飲食品。
【請求項８】
飲食品中にスルフォラファンを内容組成物の１０〜２０００μｇ／１００ｇ添加することを特徴とする、スルフォラファン含有エキスを含む飲食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アブラナ科植物からの抽出物又はエキスを含むチオレドキシンの発現を誘導する食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
チオレドキシンは、その活性部位にある２つのシステイン残基によって、ＮＡＤＰＨ依存性酵素であるチオレドキシンリダクターゼを触媒として可逆的な酸化還元反応（レドックス制御）を行う分子である（例えば非特許文献１）。また、チオレドキシンは、細胞内還元環境を維持し、酸化ストレス（フリーラジカル）や腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）が引き起こす障害から細胞を保護する役割を持つことが知られている（例えば非特許文献２及び３）。
【０００３】
さらに、チオレドキシントランスジェニックマウスは、寿命の延長や虚血障害、急性肺不全、糖尿病等に対して抵抗性を示す(例えば、非特許文献４〜８)。これらの病態は酸化ストレスに密接な関係があることから、チオレドキシンは酸化ストレスに対して重要な保護作用を示すと考えられている。
【０００４】
この様なチオレドキシンの特徴を利用し、チオレドキシンの発現を誘導することで、酸化ストレスの影響を緩和できると考えられる。
【非特許文献１】Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９９５；  ２５２：１９９−２０８．
【非特許文献２】Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９４；  ４２：７５−８０．
【非特許文献３】Ｍａｔｓｕｄａ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９１；  １４７：３８３７−３８４１．
【非特許文献４】Ｍｉｔｓｕｉ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｏｘｉｄ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ  ２００２；  ４：６９３−６９６．
【非特許文献５】Ｔａｋａｇｉ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９９；  ９６：４１３１−４１３６．
【非特許文献６】Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２００３；  １６８：１０７５−１０８３．
【非特許文献７】Ｈｏｔｔａ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９８；  １８８：１４４５−１４５１．
【非特許文献８】Ｙｏｏｎ  ＢＩ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｃｏｎｔａｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２００１；  ４１：２３２−２３６．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、チオレドキシンの発現を誘導し、例えば、酸化ストレス（フリーラジカル）による影響を緩和することができる、安全な飲食品を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、スルフォラファンがチオレドキシン発現を誘導することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、以下のスルフォラファンを含む飲食品を提供する。
項１.スルフォラファン含有エキスを含むことを特徴とする飲食品。
項２.該エキスが０．０１〜５０ｍｇ／ｇのスルフォラファンを含む項１に記載の飲食品
。
項３.スルフォラファンを内容組成物の１０〜２０００μｇ／１００ｇ添加することを特
徴とする、項１に記載の飲食品。
項４. 該スルフォラファンがアブラナ科植物由来である項１に記載の飲食品。
項５.該アブラナ科の植物が、ブロッコリースプラウト、カイワレダイコン及びムラサキ
キャベツの新芽からなる群より選ばれる少なくとも１種である項１に記載の飲食品。
項６.チオレドキシン発現誘導用である項１〜５に記載の飲食品。
項７．酸化ストレス緩和用である項１〜５に記載の飲食品。
項８．飲食品中にスルフォラファンを内容組成物の１０〜２０００μｇ／１００ｇ添加することを特徴とする、スルフォラファン含有エキスを含む飲食品の製造方法。
【０００８】
スルフォラファンは、例えば、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）植物のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、キバナスズシロ属（Ｅｒｕｃａ）イベリス属（Ｉｂｅｒｉｓ）、大根属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）等の植物に含まれ、抗癌作用、抗酸化作用等の多様な生理活性を有する物質であることが知られているが、チオレドキシン発現誘導作用は知られていなかった。スルフォラファンのチオレドキシン発現誘導作用に基づき、肝機能障害の改善、酸化ストレス障害の改善、抗炎症作用等の種々の有用な作用が期待できる。
【０００９】
本発明においてスルフォラファンを抽出するために使用される植物種としては、特に限定されず、例えば、キャベツ、ムラサキキャベツ、ブロッコリー、ケール、ロケット菜、カリフラワー、ダイコン、ハクサイ、カブ、コマツナ、チンゲンサイ等があげられ、これらの植物の新芽であることが好ましい。なかでも、ブロッコリーの新芽（ブロッコリースプラウト）、ダイコンの新芽（カイワレダイコン）、ムラサキキャベツの新芽であることが特に好ましい。
【００１０】
これらの植物においてスルフォラファンを抽出する部位としては、スルフォラファンとしての効果が得られれば特に限定されず、例えば、前記植物の種子、ダイコン、カブ等の根、キャベツ、ケール、ハクサイ等の葉、ブロッコリー、カリフラワー等の花蕾等があげられる。
【００１１】
上記した植物の新芽からスルフォラファンを得る場合、新芽のスルフォラファン含有量は、発芽後の日数によって大幅に変化するため、例えば、ブロッコリースプラウトであれば発芽後１〜５日程度、好ましくは発芽後１〜３日程度の新芽から抽出することが望ましい。
【００１２】
本発明で使用するスルフォラファンは、上記の植物から当業者によって通常用いられる方法によって得ることができる。抽出方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、ブロッコリー等のスルフォラファンを含む原料を粉砕し、必要であれば凍結乾燥を行い、水又は含水溶媒で含浸又は抽出した後、ろ過し、濃縮する等の方法があげられる。
【００１３】
抽出に使用する溶媒としては、特に限定されないが、例えば、水、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、ｉｓｏ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等の１級アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステル、ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素、アセトン、塩化メチレン等の従来公知の溶媒、またはそれらの混合溶液が例示される。中でも好ましい溶媒としては、水、エタノール又はエタノール及び水の混合溶液があげられる。また、超臨界ＣＯ2等の超臨界溶媒で抽出してもよ
い。
【００１４】
これらの方法を用いて抽出を行う場合、抽出回数は単回でもよく、収率を上げるために
複数回行ってもよい。
【００１５】
抽出を行う際、植物内に含まれる酵素によってグルコシノレートを加水分解してスルフォラファンを効率的に得るため、原料を粉砕した後に自己消化を行ってもよい。自己消化は、当業者によって通常用いられる条件にて行えばよいが、例えば、約１０〜５０℃にて１５〜６０分程度行うことが望ましい。
【００１６】
この様にして得られた抽出物は、スルフォラファンエキスとしてそのまま用いることもでき、また、本発明の効果を失わない範囲内で脱臭、脱色等の精製操作を加えることもできる。
【００１７】
他の方法として、例えば、合成吸着剤を用いた分離・精製操作を行ってもよい。合成吸着材を用いた場合の分離・精製操作方法は特に限定されず、従来公知の方法でよいが、例えば、スルフォラファンを含有する原料を粉砕して残渣を除去した後、合成吸着剤を充填したカラム等に通し、水、エタノール（又はその混合溶液）等で溶出する方法があげられる。合成吸着剤としては、例えば、芳香族系（架橋スチレン系）合成吸着剤、置換芳香族系合成吸着剤、アクリル系合成吸着剤等があげられる。
【００１８】
また、粉砕した植物をエタノール等の好適な溶媒で抽出した後、ろ過し、濃縮する方法を用いても良い。さらに簡易な方法としては、原料の植物をジュース状にした後、植物の残渣を除去し、濃縮する方法があげられる。
【００１９】
濃縮工程にかえて、必要に応じて、ろ液にペクチン、デキストリン等の水溶性食物繊維を賦形剤として加え、スプレードライ法等の公知の方法により乾燥させ、粉末状にして用いてもよい。また、この粉末状にした抽出物を水、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等の溶媒に再溶解して用いることもできる。
【００２０】
本発明においては、エキス又はエキスを乾燥させて用いることで、スルフォラファンの安定性を高めることが期待される。
【００２１】
以上の方法によって得られたスルフォラファン含有エキスは、スルフォラファンを０．００１〜２００ｍｇ／ｇ程度、好ましくは０．００５〜８０ｍｇ／ｇ程度、より好ましくは０．０１〜５０ｍｇ／ｇ程度含むことが望ましい。
【００２２】
スルフォラファンによって発現が誘導されるチオレドキシンの量は、例えば、スルフォラファン１０〜５００μｇ／１００ｇであれば、細胞内に含まれるチオレドキシンタンパクとして、恒常時の１．３〜２倍量程度、好ましくは１．５〜３倍量程度、より好ましくは２〜６倍量程度である。
【００２３】
本発明の飲食品としては、例えば、健康食品、栄養補助食品（バランス栄養食、サプリメント等）、栄養機能食品、特定保健用食品等があげられる。これらの食品の製造方法は、スルフォラファンの所期の効果が得られるものであれば特に限定されず、各用途で当業者によって使用されている方法に従えばよい。
【００２４】
飲食品としては、例えば、ガム、キャンディー、グミ、錠菓、クッキー、ケーキ、チョコレート、アイスクリーム、ゼリー、ムース、プリン、ビスケット、コーンフレーク、チュアブルタブレット、ウエハース、煎餅等の菓子類；炭酸飲料、清涼飲料、乳飲料、コーヒー飲料、紅茶飲料、果汁飲料、栄養飲料、アルコール飲料、ミネラルウォーター等の飲料類；粉末ジュース，粉末スープ等の粉末飲料；バランス栄養食；粉末、カプセル、錠剤等の形態を有するサプリメント；ドレッシング、ソース等の調味料；パン類；麺類；かま
ぼこ等の練り製品；ふりかけ等があげられる。
【００２５】
本発明の飲食品に含まれるスルフォラファンの量は、チオレドキシン発現が誘導されるのに必要な量であれば特に限定されないが、通常は、１〜５０００μｇ／１００ｇ程度、好ましくは５〜３０００μｇ／１００ｇ程度、より好ましくは１０〜２０００μｇ／１００ｇ程度であり、配合する飲食品の風味を損なわない程度が望ましい。
【００２６】
本発明の食品がクッキー、ビスケット等のクッキー状食品である場合、スルフォラファンを１０〜２０００μｇ／１００ｇ程度含むことが好ましい。
【００２７】
例えば、飲料類である場合は、スルフォラファンを１０〜２０００μｇ／１００ｇ程度含むことが好ましい。
【００２８】
スルフォラファンを含む植物から抽出されたエキスを造粒した後、打錠したタブレットである場合は、スルフォラファンを２〜１４０μｇ／ｇ程度含むことが好ましい。
【００２９】
ゼリー、ムース、プリン等のムース状食品の場合は、スルフォラファンを１０〜５００μｇ／１００ｇ程度含むことが好ましい。
【００３０】
ドレッシングである場合は、スルフォラファンを１０〜２０００μｇ／１００ｇ程度含むことが好ましい。
【００３１】
これらの食品を製造する過程において、スルフォラファン含有エキスの他に、さらにブロッコリー（ブロッコリースプラウト）、ダイコン（カイワレダイコン）、ムラサキキャベツ（ムラサキキャベツの新芽）等のスルフォラファンを含有する原料を加えて食品とすることもできる。
【００３２】
本発明における飲食品は、原料又は添加剤等を含む担体に本発明の有効成分を混合し、当該飲食品形態における常法に従って調製することができる。添加剤としては、例えば、甘味剤、着色剤、抗酸化剤、ビタミン類、香料等があげられる。
【００３３】
上記飲食品の摂取量は、その用法、摂取する人の年齢、性別、体重、健康状態、その他の条件、症状の程度等により適宜選択されるが、通常、有効成分であるスルフォラファンの量が成人１人当り１日当り０．００１〜１０００μｇ／ｋｇ程度、好ましくは０．００５〜２００μｇ／ｋｇ程度、より好ましくは０．０１〜６０μｇ／ｋｇ程度となるようにすることが好ましい。他の成分は、上記スルフォラファンの量を基準にして適宜選択することができる。また、所期の効果が得られるのであれば、スルフォラファンを含む原料のペーストを用いても良い。
【００３４】
本発明の飲食品を、動物用の飼料として製造することもできる。すなわち、ペットフード又は家畜の飼料として使用することも可能である。
【００３５】
これらは、上記食品と同様に、ペットフード又は飼料に用いられている形態であればいずれの形態であってもよく、通常ペットフード又は飼料に含有される添加剤又は食品素材と組み合わせて、常法に従って種々の形態に調製することができる。投与量は、上記食品を参考にして適宜選択することができる。
【００３６】
本発明の飲食品に含まれるスルフォラファンがチオレドキシンの発現を誘導することから、酸化ストレス緩和（フリーラジカルの消去）を目的として用いることができる。
【００３７】
チオレドキシンの発現によって、例えば、二日酔い等を含む肝障害の改善、更年期障害の改善、血中コレステロールの低下、血中中性脂質の低下、血糖値の低下、血圧の低下、動脈硬化の予防、老化の予防等が期待される。
【００３８】
例えば、動脈硬化は、フリーラジカルの一種である過酸化脂質の蓄積が原因とされている。本発明の飲食品を摂取することにより、ＴＲＸの発現が誘導され、ＴＲＸ自体あるいはＴＲＸ依存性のペルオキシダーゼのフリーラジカル消去作用によって動脈硬化が改善されることが期待される。
【００３９】
また、血糖値の過度の上昇は、膵臓ラ氏島のインシュリン産生細胞の酸化ストレスによる傷害の関与がその発症の一因として考えられている。本発明の飲食品を摂取することにより、ＴＲＸの発現が誘導され、ＴＲＸ自体、あるいはＴＲＸ依存性のペルオキシダーゼのフリーラジカル消去作用によってインシュリン産生細胞の傷害が抑制されることで血糖値の低下が期待される。
【００４０】
また、本発明の飲食品を滋養強壮、疲労回復等を目的として用いることもできる。
【発明の効果】
【００４１】
本発明によれば、チオレドキシンの発現を誘導することによって、例えば、二日酔い等を含む肝障害の改善、更年期障害の改善、滋養強壮等に有効な、スルフォラファンを含有する飲食品を提供することが可能である。また、本発明に使用されるスルフォラファンは、食用植物由来であるため、安全性の高い飲食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、実施例及び試験例をあげて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、これらの実施例及び試験例によって限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００４３】
エキス
（１）洗浄したブロッコリーの新芽をコミトロール（アーシェルジャパン株式会社製）により粉砕、等量の水を加え２０℃で１時間自己消化させた後、珪藻土によりろ過し残渣を除去、減圧下にて蒸発濃縮した。この様にして得られたエキスに含まれるスルフォラファン量は、０．１〜１ｍｇであった。
（２）洗浄したブロッコリーの新芽をコミトロールにより粉砕、珪藻土によりろ過し残渣を除去、架橋スチレン系合成吸着剤（ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０：三菱化学株式会社製）を使用してエタノール・水の混合物（エタノール：水＝７０：３０）で分離した。この様にして得られたエキスに含まれるスルフォラファン量は、１．０〜１２ｍｇ／ｇであった。
（３）洗浄したブロッコリーの新芽をコミトロールにより粉砕、珪藻土によりろ過し残渣を除去、架橋スチレン系合成吸着剤（ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０：三菱化学株式会社製）を使用してエタノール・水の混合物（エタノール：水＝５０：５０）で分離した後、さらに真空乾燥した。この様にして得られたエキスに含まれるスルフォラファン量は、０．５〜１０ｍｇ／ｇであった。
【実施例２】
【００４４】
清涼飲料水
（１）(i)ブロッコリー、人参をコミトロールで破砕した。
【００４５】
(ii)りんごをハンマークラッシャーで破砕し後、搾汁機で搾汁した。
【００４６】
(iii)(i)(ii)をストレーナーに通し皮等の残渣を除去した。
【００４７】
(iv)ブロッコリー汁１００ｋｇ、人参汁５０ｋｇ、リンゴ１００ｋｇ、水３００ｋ
ｇ、レモン果汁１０ｋｇ及び果糖ブドウ糖液２０ｋｇを混合後、実施例１の（２
）で調製したエキスを１０ｋｇ加え均一混合した。
【００４８】
(v)プレート式殺菌殺菌で９５℃、６０秒殺菌、冷却後、１８０ｍｌを容器に充填
した。
（２）実施例１の（１）で調製したエキス１００ｋｇ、水５００ｋｇ、クエン酸５ｋｇ、オリゴ糖５０ｋｇ、ビタミンＣ、Ｂ１，Ｂ２、香料各適量を混合、ストレーナーを通した後、プレート式殺菌で９８℃、３０秒殺菌、冷却後、１００ｍｌを容器に充填した。
【実施例３】
【００４９】
ドレッシング
（i）セロリ２０ｋｇ、タマネギ５０ｋｇ、ニンニク５ｋｇを粗砕後、酢１００ｋｇ、レ
モン果汁１０ｋｇ、食塩１０ｋｇ、ハーブ及び香辛料適量に、実施例１の（１）で調製したエキスを２０ｋｇ加えて混合した。
（ii）（i）５５ｍｌを植物油５０ｍｌと共に容器に充填した。
【実施例４】
【００５０】
タブレット
実施例１の（１）で調製したエキスを、スプレー式造粒乾燥装置にて造粒後、粒状エキス３５ｋｇにマルトデキストリン１５ｋｇ加えロータリー式打錠機にて成型した。
【実施例５】
【００５１】
ムース
(i)牛乳５０ｋｇ、生クリーム２５ｋｇを攪拌機で泡立てた。
(ii)予備混合した砂糖１０ｋｇ、寒天２．５ｋｇに水２５ｋｇを加え加熱溶解した後、ブロッコリーペースト２５ｋｇ、香料適量を加え混合した。
(iii)(i)(ii)を混合した後、８０ｇを容器に充填した。
【試験例１】
【００５２】
ヒト赤芽球様白血病細胞株であるＫ５６２細胞において、チオレドキシン遺伝子発現の活性化が、様々な野菜からの抽出物によって変化するかどうかについて検討するため、チオレドキシン遺伝子の発現調節領域全体を含むベクターを用いてルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。
【００５３】
［培養細胞と培養系］
Ｋ５６２細胞を、１０％ＦＣＳを含み、抗生物質（１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を添加したＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で、５％ＣＯ2を含む湿潤な条
件下において３７℃で培養した。ヒト培養肝癌細胞株であるＨｅｐＧ２細胞については、ＤＭＥＭにて培養し、ヒト網膜色素上皮細胞由来であるＲＰＥ細胞については、Ｆ−２（Ｓｉｇｍａ）にて培養した。
【００５４】
本試験例を通して使用した細胞を、上記の培養条件下で維持した。
【００５５】
［野菜抽出物の調製］
野菜抽出物は文献（Ｚｈａｎｇ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９２；  ８９：  ２３９９−２４０３）を参考に調製した。
【００５６】
生鮮野菜に２倍量の水を加え、粉砕（７０００回転５分間の後、９０００回転３分間）した後、３７℃で３時間自己消化させ、凍結乾燥した。凍結乾燥物４ｇを１４０ｍｌのアセトニトリルで溶解し、４℃で６時間振盪、抽出した。抽出液をメンブレンフィルターでろ過し、エバポレーターを用いて、３０℃で乾固させた。乾燥物をエタノール１ｍｌに溶解し、後の分析に用いた。
【００５７】
［プラスミド］
ｐＴｒｘＣＡＴプラスミドを、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９６；  ２４：２７４６−２７５２．に記載の通り作製した。すなわち、ｐＴｒｘＣＡＴベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩインサートを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）へサブクローニングした（ｐＴＲＸｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ）。
【００５８】
ｐＴＲＸ−Ｌｕｃベクターは、Ｋｉｍ  Ｙ−Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１；  ２７６，１８３９９−１８４０６．及びＫｉｍ  ＹＣ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００３；２２，  １８６０−１８６５．に記載されるように作製した。すなわち、ｐＧＬ３  ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）のＫｐｎＩ／ＢｇｌＩＩサイトへｐＴＲＸｂｌｕｅベクターのＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを結合することにより、ｐＴＲＸ（−１１４８）−Ｌｕｃベクターを作製した。
【００５９】
全てのコンストラクトについて、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＩＩ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて直接塩基配列決定法により塩基配列を確認した。
【００６０】
［トランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイ］
Ｋ５６２細胞に、ルシフェラーゼレポーター発現ベクター（ｐＴＲＸ（−１１４８）−Ｌｕｃ）又はｐＧＬ３  ｂａｓｉｃベクターをＤＭＲＩＥ−Ｃ（ＧＩＢＣＯ）試薬を用いて製品説明に従って遺伝子導入した。遺伝子導入効率の標準化のため、ｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をコトランスフェクションして、Ｒｅｎｉｌｌａ（ウミシイタケ）ルシフェラーゼ遺伝子発現を測定した。
【００６１】
この細胞を４時間培養の後、野菜抽出物（最終濃度１％）又はエタノール（最終濃度１％）を加え、１６時間反応させた。遺伝子導入から２４時間後、ルシフェラーゼ遺伝子発現をアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて解析した。解析は、それぞれの誘導物質について、２つの別々のウェルを用いて独立した遺伝子導入を行い、それぞれのウェルから別々に細胞を回収し、別々にルシフェラーゼ活性を測定することによって行った。
【００６２】
図１Ａに示した通り、異なる２つの品種のブロッコリースプラウト抽出液（Ｂｒｏｃｃｏｌｉ  Ｓｐｒｏｕｔ  Ａ又はＢｒｏｃｃｏｌｉ  Ｓｐｒｏｕｔ  Ｂ）がチオレドキシンレポーター遺伝子をそれぞれ１３．５倍、４．１倍活性化した。一方、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクターについても同様の試験を行ったが、活性化には変化がなかった。対照的に、ケール（Ｋａｌｅ）、キャベツ（Ｃａｂｂａｇｅ）及びブロッコリー（Ｂｒｏｃｃｏｌｉ）の花蕾の抽出液は、コントロール（Ｅｔｈａｎｏｌ）に比べてチオレドキシンレポーター遺伝子を活性化したものの有意差はなかった（図１Ｂ）。
【試験例２】
【００６３】
ブロッコリーには、スルフォラファンが重要な構成成分として含まれることが知られていることから（Ｆａｈｅｙ  ＪＷ．  eｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓ
ｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９７；  ９４：１０３６７−１０３７２．）、チオレドキシン遺
伝子発現の活性化が、スルフォラファンによって変化するかどうかを検討した。
【００６４】
［トランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイ］
ｐＴＲＸ（−１１４８）−Ｌｕｃ又はｐＧＬ３  ｂａｓｉｃベクターを、Ｋ５６２細胞にトランスフェクションし、４時間培養した後、ＤＭＳＯ（最終濃度１％）、又はスルフォラファン１μＭ（ＳＦ１）もしくは１０μＭ（ＳＦ１０）をそれぞれの細胞に加え、１６時間反応させた。トランスフェクションから２４時間経過後、試験例１と同様の条件でルシフェラーゼアッセイを行った。トランスフェクション効率の標準化のために、ｐＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）をコトランスフェクションし、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子発現を測定した。
【００６５】
ＨｅｐＧ２細胞についても、ｐＴＲＸ（−１１４８）−Ｌｕｃ又はｐＧＬ３  ｂａｓｉｃベクターをトランスフェクションし、４時間培養を行った。その後、ＤＭＳＯ最終濃度１％、スルフォラファン１０μＭ（ＳＦ）をそれぞれ加え、１６時間反応させた。トランスフェクションから２４時間経過後、試験例１と同様にルシフェラーゼアッセイを行った。
【００６６】
ＨｅｐＧ２細胞へのルシフェラーゼレポーター発現ベクター（ｐＴＲＸ（−１１４８）−Ｌｕｃ）の導入は、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた。
【００６７】
図２Ａ及び２Ｂに示すとおり、スルフォラファンはチオレドキシンプロモーター領域全体を含むレポーター遺伝子ｐＴＲＸ（−１１４８）−Ｌｕｃの活性化をＫ５６２細胞（図２Ａ）およびＨｅｐＧ２細胞（図２Ｂ）で誘導したが、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクターの活性化には効果が認められなかった。また、Ｋ５６２細胞において、スルフォラファン１０μＭ（ＳＦ１０）では、チオレドキシン発現に有意な増強が見られた。
【００６８】
［定量的ＲＴ−ＰＣＲ］
チオレドキシンのｍＲＮＡ発現への影響を解析するために定量的Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００６９】
Ｋ５６２細胞を０．１％ＤＭＳＯ、スルフォラファン（ＳＦ）１μＭ又は１０μＭで処理した。その後、２４時間もしくは４８時間経過した後、細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄した。ＴｏｔａｌＲＮＡはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により、製品説明に従って分離した。ヒトチオレドキシンのフォワードおよびリバースプライマーとタックマンプローブは製品説明に従ってデザインした。
【００７０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲは、９６穴プレートでＴａｑＭａｎ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００にて行った。試験した反応液には、最終液量５０μｌ中に５０ｎｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡが含まれる。
【００７１】
ＲＴ−ＰＣＲの条件は次の通りである。ＲＴステップを４８℃、３０分、ＰＣＲステップを９５℃、１５秒及び６０℃、１分を４５サイクル行った。内部標準として１８Ｓ  ｒＲＮＡの増幅をＴａｑＭａｎ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行い、チオレドキシン遺伝子の定量を標準化した。
【００７２】
Ｋ５６２細胞において、スルフォラファン（ＳＦ）１０μＭの処理により、２４時間と４８時間でチオレドキシンのｍＲＮＡレベルでの有意な誘導が認められた（図３）。
【００７３】
［ウェスタンブロット解析］
チオレドキシンタンパク質発現量におけるスルフォラファンの効果を検討した。
【００７４】
Ｋ５６２細胞を、1％ＤＭＳＯ、スルフォラファン（Ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎ）５μＭ
又はスルフォラファン１０μＭで４８時間処理し、細胞を回収した。回収した細胞を、冷やしたＰＢＳで２度洗浄し、その後氷上で３０分間可溶化液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＮＰ−４０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ，８μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，２μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）中で溶解した。抽出物は遠心により清澄化した。
【００７５】
Ｋ５６２細胞溶解液（１３．５μｇ）を９５℃、５分間加熱処理後、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離した。分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜（ポリビニルデン  ジフロライド）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．，Ｂｅｄｆｏｒｅ，ＭＡ）に転写した。ＰＶＤＦ膜は、Ｔ−ＰＢＳ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）にて溶解した１０％スキムミルク中で一晩処理し、抗ヒトチオレドキシンモノクローナル抗体（Ｒｅｄｏｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）にて１時間インキュベートし、その後ペルオキシダーゼを抱合させた抗マウスＩｇＧ（１：５０００希釈）（Ａｍｅｒｓｈａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にて１時間反応させた。発色はＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた（図４Ａ）。
【００７６】
ＲＰＥ細胞におけるチオレドキシンタンパク質発現量についても、同様の方法を用いて観察した。ＲＰＥ細胞を、１％ＤＭＳＯ、０．１μＭスルフォラファン、１μＭスルフォラファン又は１０μＭスルフォラファンで４８時間処理し、細胞を回収し、上記と同様の方法でＲＰＥ細胞溶解液を作製した。次に、得られたＲＰＥ細胞溶解液５μｇを用いて、上記と同様の方法でウェスタンブロット解析を行った（図４Ｂ）。
【００７７】
Ｋ５６２細胞とＲＰＥ細胞において、１０μＭのスルフォラファンで４８時間処理したもので、チオレドキシン発現が顕著に亢進することが確認できた（図４Ａ及び４Ｂ）。
【試験例３】
【００７８】
実施例1でチオレドキシン遺伝子を強く誘導した品種（Ｂｒｏｃｃｏｌｉ  sｐｒｏｕｔ
Ａ）を用い、ブロッコリー抽出物の濃度が、チオレドキシン遺伝子誘導の活性化に及ぼす影響を検討した。
［ブロッコリースプラウト抽出物の調製］
ブロッコリースプラウト抽出物を試験例１と同様に調製した。
［トランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイ］
ｐＴＲＸ（−１１４８）−Ｌｕｃ又はｐＧＬ３  ｂａｓｉｃベクターを、Ｋ５６２細胞にトランスフェクションし、４時間培養した後、最終濃度が１％、０．７５％、０．５％及び０．２５％になるようにエタノール（コントロール）、又はブロッコリースプラウト抽出物（Ｂｒｏｃｃｏｌｉ  sｐｒｏｕｔ）、もしくはスルフォラファン（Ｓｕｌｆｏｒ
ａｐｈａｎ）１０μＭをそれぞれの細胞に加え、１６時間反応させた。本試験例において、ブロッコリースプラウト抽出物を用いた場合、含有スルフォラファン量としては、それぞれ２．８μＭ、２．１μＭ、０．１４μＭ及び０．７１μＭであった。
【００７９】
トランスフェクションから２４時間経過後、試験例１と同様に条件でルシフェラーゼアッセイを行った。トランスフェクション効率の標準化のために、ｐＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）をコトランスフェクションし、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子発現を測定した。
【００８０】
図５に示す通り、ｐＴＲＸ（−１１４８）−ＬｕｃをトランスフェクションしたＫ５６２細胞において、ブロッコリースプラウト抽出物の濃度が１〜０．２５％の範囲で、濃度依存的にチオレドキシン遺伝子の活性化が認められた。一方、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクターにおける活性化に変化はなかった。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１Ａ】品種の異なる２種のブロッコリースプラウト抽出物（Ｂｒｏｃｃｏｌｉ  Ｓｐｒｏｕｔ  Ａ又はＢｒｏｃｃｏｌｉ  Ｓｐｒｏｕｔ  Ｂ）によるチオレドキシン遺伝子の活性化を示す。
【図１Ｂ】ケール（Ｋａｌｅ）、ブロッコリー（Ｂｒｏｃｃｏｌｉ）、キャベツ（Ｃａｂｂaｇｅ）抽出物によるチオレドキシン遺伝子の活性化を示す。
【図２Ａ】Ｋ５６２細胞におけるスルフォラファンによるチオレドキシン遺伝子の活性化を示す。
【図２Ｂ】ＨｅｐＧ２におけるスルフォラファンによるチオレドキシン遺伝子の活性化を示す。
【図３】スルフォラファンによるチオレドキシンｍＲＮＡ発現誘導を示す。
【図４Ａ】スルフォラファンによるチオレドキシン蛋白発現の誘導を示す。        ｌａｎｅ  １：ＤＭＳＯで処理したＫ５６２細胞のチオレドキシン蛋白の発現を示す。ｌａｎｅ  ２：５μＭのスルフォラファンで４８時間処理したＫ５６２細胞のチオレドキシン蛋白の発現を示す。                                                 ｌａｎｅ  ３：１０μＭのスルフォラファンで４８時間処理したＫ５６２細胞のチオレドキシン蛋白の発現を示す。
【図４Ｂ】スルフォラファンによるチオレドキシン蛋白発現の誘導を示す。        ｌａｎｅ  １：ＤＭＳＯで処理したＲＰＥ細胞のチオレドキシン蛋白の発現を示す。ｌａｎｅ  ２：０．１μＭのスルフォラファンで４８時間処理したＲＰＥ細胞のチオレドキシン蛋白発現を示す。                                                  ｌａｎｅ  ３：１μＭのスルフォラファンで４８時間処理したＲＰＥ細胞のチオレドキシン蛋白の発現を示す。                                                    ｌａｎｅ  ４：１０μＭのスルフォラファンで４８時間処理したＲＰＥ細胞のチオレドキシン蛋白の発現を示す。
【図５】スルフォラファン１０μＭもしくはスルフォラファン１％、０．７５％、０．５％又は０．２５％と共にインキュベートしたＫ５６２細胞における、チオレドキシンの発現誘導を示す。図中白いバーは、コントロール（エタノール）を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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