(57)【要約】【課題】  低分子チミジングリコール（ＴＧ）に反応せず高分子ＤＮＡポリマー中に含まれるＴＧのみを認識するＴＧのモノクローナル抗体とその製造方法及び、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマと、当該モノクローナル抗体の免疫原として有効な高分子チミジングリコールポリマーとこれを合成する方法を提案する。【解決手段】  deoxy thymidine （ｄＴ）を用いて酸化修飾ｄＴポリマーを作製し、ついで、この酸化修飾ｄＴポリマーを用い、常法にしたがって、免疫原を作製し、これを抗原として、常法に従って、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得て、次に、こうして得たハイブリドーマについて、スクリーニングを行って得たモノクローナル抗体。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子チミジングリコールに反応せず高分子ＤＮＡポリマー中に含まれるチミジングリコールのみを認識するチミジングリコールのモノクローナル抗体。
【請求項２】
低分子チミジングリコールに反応せず高分子ＤＮＡポリマー中に含まれるチミジングリコールのみを認識するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項３】
低分子チミジングリコールに反応せず高分子ＤＮＡポリマー中に含まれるチミジングリコールのみを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項４】
低分子チミジングリコールに反応せず高分子ＤＮＡポリマー中に含まれるチミジングリコールのみを認識するモノクローナル抗体の免疫原として有効な高分子チミジングリコールポリマー。
【請求項５】
低分子チミジングリコールに反応せず高分子ＤＮＡポリマー中に含まれるチミジングリコールのみを認識するモノクローナル抗体の免疫原として有効な高分子チミジングリコールポリマーを合成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体より発生するＤＮＡの酸化修飾物であるチミジングリコール（thymidine glycol）（以下、本明細書、図面において「ＴＧ」と表すことがある）を指標として、これを免疫学的に迅速・微量定量することにより、人体における酸化ストレスを評価することを可能ならしめるもので、酸化ストレスが深く関わっているとされる生活習慣病、老化などに関係する医学、薬学、衛生学、食品などの分野においてきわめて有用なＴＧのモノクローナル抗体およびその製造法ならびに当該モノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞と、生体試料の免疫学的測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チミジングリコール（thymidine glycol）は、図１に示すように、ＤＮＡ中に含まれる塩基deoxy thymidineに対し活性酸素が作用することによって生じる酸化損傷生成物であり、生体内における酸化ストレスの指標となることが知られている。
【０００３】
従来、放射線被曝、エネルギー代謝、薬物代謝などにより生じた酸化ストレスによるＤＮＡ構成塩基の酸化分解物の定量には、標準となる標品を用いて薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー質量分析計により分離定量が行われていた。
【０００４】
しかしながらこれらの方法中、生体試料の定性・定量においては共存類似物質による妨害が生じることがあり、また、目的物質がクロマトグラフィー検出限界以下の微量の場合や、カラムによる分離のために長時間を有する問題点があった。
【０００５】
また、ＴＧに特異的な抗体による測定法も試みられてきたが、抗原性が弱く生体サンプル中のＴＧ微量測定に適するものは得られていなかった。
【０００６】
ＴＧは生体内の残留時間が長く、活性酸素による生体損傷の蓄積を評価する上で有用である。ＴＧに類似したＤＮＡ酸化修飾物として8-hydroxy-2’-deoxyguanosine （本明細書において「８−ＯＨｄＧ」と表すことがある。）が知られているが、生体内に発生した８−ＯＨｄＧは修復酵素によって速やかに除去され、尿中に排泄されてしまう。
【０００７】
これまでに低分子のＴＧに対する抗体の開発が行われてきたが、活性酸素による生体の酸化損傷の蓄積をより正確に評価するためには、組織中のＴＧ、すなわち高分子状態のＴＧを高感度に検出できる抗体の開発が求められていた。
【非特許文献１】Lustig MJ, Cadet J, Boorstein RJ, Teebor GW.  Synthesis of the diastereomers of thymidine glycol, determination of concentrations and rates of interconversion of their cis-trans epimers at equilibrium and demonstration of differential alkali lability within DNA.Nucleic Acids Res. 1992 Sep 25;20(18):4839-45.
【非特許文献２】Hegi ME, Sagelsdorff P, Lutz WK. Detection by 32P-postlabeling of thymidine glycol in gamma-irradiated DNA.Carcinogenesis. 1989 Jan;10(1):43-7.
【非特許文献３】Thier R, Bruning T, Kocher K, Blaszkewicz M, Makropoulos V, Sundberg A, Bolt HM.Determination of urinary thymidine glycol using affinity chromatography, HPLC and post-column reaction detection: a biomarker of oxidative DNA damage upon kidney transplantation.Arch Toxicol. 1999 Nov;73(8-9):479-84.
【非特許文献４】Naritsin DB, Markey SP. Assessment of DNA oxidative damage by quantification of thymidine glycol residues using gas chromatography/electron capture negative ionization mass spectrometry.Anal Biochem. 1996 Oct 1;241(1):35-41.
【非特許文献５】Chen BX, Hubbard K, Ide H, Wallace SS, Erlanger BF. Characterization of a monoclonal antibody to thymidine glycol monophosphate. Radiat Res. 1990 Nov;124(2):131-6.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
生体組織中のＴＧは、高分子の遺伝子ＤＮＡポリマーの一成分として存在している。そこで、遊離のＴＧ、すなわち低分子のＴＧとは反応せず、高分子のＤＮＡポリマー中に含まれるＴＧのみを高感度かつ特異的に検出できるＴＧのモノクローナル抗体を提供することができれば、活性酸素による生体の酸化損傷の蓄積をより正確に評価することができる。
【０００９】
本発明は、低分子ＴＧに反応せず高分子のＤＮＡポリマー中に含まれるＴＧのみを認識するＴＧのモノクローナル抗体とその製造方法を提案すること及び、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマと、当該モノクローナル抗体の免疫原として有効な高分子チミジングリコールポリマーとこれを合成する方法を提案することを目的にしている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
遊離のＴＧ、すなわち低分子のＴＧとは反応せず、高分子のＤＮＡポリマー中に含まれるＴＧのみを高感度かつ特異的に検出できるＴＧのモノクローナル抗体を得るため、本発明ではポリマー状の抗原を調製し、高分子ＴＧを効率的に認識するモノクローナル抗体の作出に成功した。
【００１１】
すなわち、本発明は、低分子チミジングリコールに反応せず高分子のＤＮＡポリマー中に含まれるチミジングリコールのみを認識するチミジングリコールのモノクローナル抗体と、その製造方法を提案するものである。
【００１２】
この製造方法は、まず、高分子のチミジングリコールポリマー（以下「ｄＴポリマー」と表すことがある。）を合成し、ついで、これを酸化処理して酸化修飾ｄＴポリマーを作製し、次に、この酸化修飾ｄＴポリマーを用い、常法にしたがって、免疫原を作製し、これを抗原として、常法に従って、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得て、次に、こうして得たハイブリドーマについて、スクリーニングを行って、本発明の、低分子チミジングリコールに反応せず高分子のＤＮＡポリマー中に含まれるチミジングリコールのみを認識するチミジングリコールのモノクローナル抗体を製造するものである。
【００１３】
この製造方法では、まず、高分子のチミジングリコールポリマー（ｄＴポリマー）を合成し、ついで、これを酸化処理して酸化修飾ｄＴポリマーを作製する。例えば、市販のdeoxy thymidine （以下「ｄＴ」と表すことがある。）を用い、ＤＮＡポリマー（ｄＴポリマー）を、例えば、常法に従って合成し、このＤＮＡポリマー（ｄＴポリマー）に酸化処理を施して酸化修飾ｄＴポリマーを作製する。一例としては、例えば、市販のdeoxy thymidine （ｄＴ）５０分子のＤＮＡポリマーを常法に従って合成し、これをオスミウム酸（ＯｓＯ４）あるいは、ＨＯＣｌを使って酸化処理を施して酸化修飾ｄＴポリマーを作製する。
【００１４】
この酸化修飾ｄＴポリマーを用い、常法にしたがって、免疫原を作製する。例えば、前記の酸化修飾ｄＴポリマーと、メチル化ＢＳＡとのコンジュゲートを合成して免疫原とする。
【００１５】
そして、これを抗原として、常法に従って、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。例えば、前記のようにして得た免疫源を抗原としてマウスに免役し、常法に従ってモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。
【００１６】
次に、こうして得たハイブリドーマについて、スクリーニングを行って、本発明の、低分子チミジングリコールに反応せず高分子ＤＮＡポリマー中に含まれるチミジングリコールのみを認識するチミジングリコールのモノクローナル抗体を製造するものである。
【００１７】
なお、このスクリーニングは、前述した酸化修飾ｄＴポリマーを用いて行った。
【００１８】
また、本発明は、低分子チミジングリコールに反応せず高分子ＤＮＡポリマー中に含まれるチミジングリコールのみを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提案するものである。
【００１９】
かかるハイブリドーマは、前述したように、酸化修飾ｄＴポリマーを作製し（例えば、前述したように、deoxy thymidine （ｄＴ）を用い、ＤＮＡポリマー（ｄＴポリマー）を合成し、次いで、このＤＮＡポリマー（ｄＴポリマー）に酸化処理を施して酸化修飾ｄＴポリマーを作製し、具体的には、例えば、deoxy thymidine （ｄＴ）５０分子のＤＮＡポリマーを常法に従って合成し、これをオスミウム酸（ＯｓＯ４）あるいは、ＨＯＣｌを使って酸化処理を施こす等によって酸化修飾ｄＴポリマーを作製し）、この酸化修飾ｄＴポリマーを用い、常法にしたがって、免疫原を作製し（例えば、前記の酸化修飾ｄＴポリマーと、メチル化ＢＳＡとのコンジュゲートを合成して免疫原とし）、これを抗原として、常法に従って得た（例えば、前記のようにして得た免疫源を抗原としてマウスに免役し、常法に従って得た）、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。
【００２０】
更に、本発明は、低分子チミジングリコールに反応せず高分子ＤＮＡポリマー中に含まれるチミジングリコールのみを認識するモノクローナル抗体の免疫原として有効な高分子チミジングリコールポリマーを合成する方法と、これにより合成された、低分子チミジングリコールに反応せず高分子ＤＮＡポリマー中に含まれるチミジングリコールのみを認識するモノクローナル抗体の免疫原として有効な高分子チミジングリコールポリマーを提案するものである。
【００２１】
すなわち、前述したように、市販のdeoxy thymidine を用い、常法によって合成した高分子のチミジングリコールポリマー（ｄＴポリマー）を出発物質として、自然界に存在する高分子のＤＮＡが酸化されたものを効率的に検出できるようにしたものである。
【００２２】
このようにして合成した本発明の低分子チミジングリコールに反応せず高分子ＤＮＡポリマー中に含まれるチミジングリコールのみを認識するモノクローナル抗体の免疫原として有効な高分子チミジングリコールポリマーは、前述したように、オスミウム酸（ＯｓＯ４）あるいは、ＨＯＣｌを使って酸化処理を施こす等によって酸化修飾ｄＴポリマーとし、これとメチル化ＢＳＡとのコンジュゲートを合成して、低分子チミジングリコールに反応せず高分子ＤＮＡポリマー中に含まれるチミジングリコールのみを認識するモノクローナル抗体の免疫原とし、これを抗原としてマウスに免役し、常法に従ってモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得て、前記酸化修飾ｄＴポリマーを用いてスクリーニングを行うことによって、低分子チミジングリコールに反応せず高分子ＤＮＡポリマー中に含まれるチミジングリコールのみを認識するチミジングリコールのモノクローナル抗体の製造に供することのできるものである。
【発明の効果】
【００２３】
この発明によれば、遊離のＴＧ、すなわち低分子のＴＧとは反応せず、高分子ＤＮＡポリマー中に含まれるＴＧのみを高感度かつ特異的に検出できるＴＧのモノクローナル抗体とその製造方法及び、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマと、当該モノクローナル抗体の免疫原として有効な高分子チミジングリコールポリマー及びこれを合成する方法を提供することができる。
【００２４】
前述したように、生体組織中のＴＧは、高分子の遺伝子ＤＮＡポリマーの一成分として存在している。そこで、本発明により、前述したように、遊離のＴＧ、すなわち低分子のＴＧとは反応せず、高分子ＤＮＡポリマー中に含まれるＴＧのみを高感度かつ特異的に検出できるＴＧのモノクローナル抗体を提供することにより、活性酸素による生体の酸化損傷の蓄積をより正確に評価することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下に具体的な実施例を示す。
【実施例１】
【００２６】
（本発明の高分子チミジングリコールポリマーの合成）
原料として市販のdeoxy thymidine （ｄT）を用い、５０分子のｄＴからなるＤＮＡポリマー（ｄＴポリマー）を常法に従い合成した。
【００２７】
このｄＴポリマー（終濃度５００μg/mL水溶液）に対し、市販のＯｓＯ４（終濃度０．４％）を混合し、６０℃にて1時間反応させることにより、ｄＴポリマーを酸化処理し、さらにＣＣｌ4を添加し６０℃にて1時間反応させ余剰のＯｓＯ４を除去し、酸化修飾ｄＴポリマーを作製した。この方法で調製した酸化修飾ｄＴポリマーにおける主要生成物はＴＧである。こうして調製した酸化修飾ｄＴポリマーが抗原となる。
【００２８】
なお、ＨＯＣｌを用いてｄＴポリマーを酸化処理し、酸化修飾ｄＴポリマーを調製することもできる。
【００２９】
（本発明のハイブリドーマの作製）
この酸化修飾ｄＴポリマーをmethylated ＢＳＡに結合させ、酸化損傷ｄＴ-ＢＳＡコンジュゲートを調製し、抗原として用いた。
【００３０】
Methylated BSAは次の手順にて調製した。BSA 1.0gを100mlの(無水)メタノールに加え、ここに840μlの12N HClを添加した。室温、暗所にて3日間以上攪拌した。沈殿したタンパク質を遠心分離にて回収し、メタノール、続いてジエチルエーテルで洗浄し、真空ポンプで乾固させた後、水に溶解させて用いた。
マウスへの免疫およびモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ作製は、前記のように調製した酸化修飾ｄＴ-ＢＳＡを抗原として下記のように実施した。
【００３１】
Balb/c マウス（6週齢♀3匹）に対し、酸化修飾ｄＴ-ＢＳＡとFreund’s complete adjuvant (追加免疫用抗原とFreund’s incomplete adjuvant )を等量シリンジ内で混合し、乳化させたものを、100μl/匹腹腔内投与を行い免疫した。
酸化修飾ｄＴ-ＢＳＡに対する抗体力価の上昇が見られたマウスに対して、細胞融合を行う3日前に酸化修飾ｄＴ-ＢＳＡを眼底静脈に投与して最終免疫を実施した。
免疫したマウスをエーテル麻酔したあと頚椎脱臼により屠殺、開腹して脾臓を摘出した。脾細胞を取り出しFBS-free/DMEMにて２回洗浄し、脾細胞とミエローマ細胞(P3U1)の数が10:1となるように混合して細胞融合処理を行った。1500 rpm 5 min遠心した沈殿にPEG 1 mlを添加し90秒間振とうした後、FBS-free/DMEM 26mlをゆっくりと添加した。その後、1000 rpm で5分遠心し細胞を回収、HAT培地80ｍLを加え96穴マイクロプレートに蒔き、CO2インキュベーターに入れ培養した。
（酸化修飾ｄTポリマーを用いたスクリーニングと、本発明のモノクローナル抗体の作製）
細胞融合処理をして10日後に、抗原として調製した50分子長の酸化修飾ｄTポリマーを用いて、ハイブリドーマのELISA法による初回スクリーニングを行った。
【００３２】
具体的には酸化修飾ｄTポリマー水溶液(0.5mg/ml in PBS)をＥＬＩＳＡプレート (NUNC社製 イムノプレート)に100μL/ウェル分注、４℃一晩静置して吸着させ、0.05％Tween20-PBSにて３回洗浄する。
【００３３】
さらにブロックエース(雪印製0.04 mg/ml )を200 μl/well分注し37℃にて1時間インキュベートしてブロッキング処理を行う。
【００３４】
その後ハイブリドーマ培養上清を分注、続いて１０００倍希釈した市販ＨＲＰ標識-抗マウスＩｇＧを２次抗体として37℃にて１時間反応させる。
【００３５】
洗浄後、5 mg OPD /10 ml CPBS 10 ul H2O2を100 μl/wellずつ入れ5分ほど発色させ、その後2 N H2SO4にて反応を停止、マイクロプレートリーダーにて492 nmにおける吸光度を測定して抗体力価の測定を行った。
【００３６】
得られたハイブリドーマの二次スクリーニングはウシ由来ＤＮＡの酸化損傷物を用いて実施した。
【００３７】
具体的には精製calf thymus ＤＮＡ(５００μg/ml)に対してＨＯＣｌ（１ｍＭ）を添加し１時間、３７℃で反応させ、さらにメチオニン（Ｍｅｔ）（４ｍＭ）を添加して反応停止させて酸化損傷ＤＮＡ（ＤＮＡ／ＨＯＣｌ）を合成した。
【００３８】
このＤＮＡ／ＨＯＣｌ水溶液（５μg/ml）を市販のＥＬＩＳＡプレートに分注することでコーティングし、ハイブリドーマのスクリーニングに用いた。
【００３９】
スクリーニングの結果、酸化損傷ＤＮＡとの反応性が特に顕著なクローンについて限界希釈法によるクローニングを２回行い、高分子ＤＮＡ酸化損傷物に特異的なモノクローナル抗体細胞株（クローン２Ｅ８）を得た。
【００４０】
（本発明のモノクローナル抗体（２Ｅ８）の特異性の検証）
特異性の検証は下記の方法によって実施した。
【００４１】
具体的には固相抗原としてＤＮＡ／ＨＯＣｌ（５μg/ml）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングする。ここに、前述したようにして得た本発明のモノクローナル抗体（２Ｅ８）および検討対象となる競合阻害物質を混合、分注して抗ＴＧモノクローナル抗体（２Ｅ８）の特異性を検証した。
【００４２】
競争阻害物質としては、先述のｄＴポリマー合成と同一の方法により、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＡの四塩基を原料として５０分子長のｄＣポリマー、ｄＧポリマー、ｄＴポリマー、ｄＡポリマーを合成し（それぞれ５００μg/ml）、ＨＯＣｌ（１ｍＭ）を混合して３７℃にて１時間反応させ、さらにメチオニン（４ｍＭ）を添加することにより反応停止させることにより５０分子長の酸化損傷ｄＣポリマー、酸化損傷ｄＧポリマー、酸化損傷ｄＴポリマー、酸化損傷ｄＡポリマーを合成した。
【００４３】
これらの競争阻害物質を用いて本発明の抗ＴＧモノクローナル抗体（２Ｅ８）の特異性を検証した結果を図３に示す。
【００４４】
具体的には固相化抗原としてＤＮＡ／ＨＯＣｌ（5μg/ml PBS）をマイクロプレートに/ウェル分注し、4℃で一晩静置、0.05％Tween20-PBSにて３回洗浄する。さらにブロックエース(雪印製0.04 mg/ml )を200 μl/well分注し37℃にて1時間インキュベートしてブロッキング処理を行う。抗ＴＧモノクローナル抗体（２Ｅ８）を含むハイブリドーマ培養上清を0.05％ Tween20-ＰＢＳにて500倍希釈したものを50μＬ/ウェル、検討対象となる競合阻害物質溶液（2mM/ＰＢＳ）50μＬを混合し、サンプルとしてマイクロプレートに分注し37℃で2時間静置、洗浄後、２次抗体としてＨＲＰ標識-抗マウスＩｇＧを0.05％ Ｔｗｅｅｎ20-ＰＢＳにて5000倍希釈したものを100μＬ分注し37℃1時間静置。洗浄後市販のＴＭＢＺ基質を分注し、マイクロプレートリーダーを用いて450nmの吸光度を測定した。
【００４５】
この結果より、本発明の抗ＴＧモノクローナル抗体（２Ｅ８）が酸化損傷ｄＴポリマーを特異的に認識するものであり、酸化損傷ｄＣポリマー、酸化損傷ｄＡポリマー、酸化損傷ｄＧポリマーには反応しないことが判る（塩基特異性）。
【００４６】
次に、calf thymusＤＮＡを用いて酸化損傷に対する特異性の検討を行った。calf thymusＤＮＡ（５００μg/ml）に対してＫＭｎＯ４（１０ｍＭ）またはＯｓＯ４(０．４％)を添加し（具体的な反応条件・温度・時間など）により酸化損傷calf thymusＤＮＡを調製した。
【００４７】
calf thymusＤＮＡまたは酸化損傷calf thymusＤＮＡをＥＬＩＳＡプレートに分注固相化し、本発明の抗ＴＧモノクローナル抗体（２Ｅ８）を分注し、ＥＬＩＳＡ法による反応性の検証を行った（図４）。
【００４８】
その結果、本発明の抗ＴＧモノクローナル抗体（２Ｅ８）は、ＫＭｎＯ４またはＯｓＯ４により酸化損傷したＤＮＡに特異的に強く反応すること、酸化していないnative DNAには反応しないことが判明した（酸化損傷ＤＮＡに対する特異性）。
【実施例２】
【００４９】
本発明の抗ＴＧモノクローナル抗体（２Ｅ８）の免疫組織染色への適用検討を行った。
【００５０】
ＬＰＳ処理したマウスでは酸化ストレスが亢進することが知られており、ＬＰＳ処理したマウス組織中にはＴＧが存在すると考えられる。
【００５１】
具体的には８週齢のマウスに対してＬＰＳを３mg/kgとなるように腹腔内に投与した。投与後、２４時間にてジエチルエーテルにて麻酔をした後、頚椎脱臼にて屠殺した。肝臓をホルマリン固定した後、パラフィン切片の作製を行った。
【００５２】
前述したようにして得た本発明の抗ＴＧモノクローナル抗体（２Ｅ８）をＴＰＢＳにて１００倍希釈し、常法に従い免疫組織染色を実施した（図２）。
【００５３】
また染色像の特異性を検証するために、前述したようにして得た本発明の抗ＴＧモノクローナル抗体（２Ｅ８）に対し、事前に吸収抗原としてＤＮＡ／ＨＯＣｌ（２５０μg/ml）を混合して免疫組織染色も実施した（図２・免疫組織染色の競合阻害試験）。
【００５４】
結果、ＬＰＳ投与前のマウスでは本発明の抗ＴＧモノクローナル抗体（２Ｅ８）での染色は殆ど認められない。一方ＬＰＳ投与によって酸化ストレスの亢進したマウス組織では本発明の抗ＴＧモノクローナル抗体（２Ｅ８）により強く染色され、さらにＤＮＡ／ＨＯＣｌによる吸収試験で完全に染色が阻害されていた。そこで、本発明の抗ＴＧモノクローナル抗体（２Ｅ８）による染色像がＴＧに特異的であることを確認できた。
【実施例３】
【００５５】
本発明の抗ＴＧモノクローナル抗体（２Ｅ８）のＴＧ認識における分子長依存性の検討を行った。
【００５６】
具体的にはＤＮＡ／ＨＯＣｌ（５μg/ml）をＥＬＩＳＡプレートに分注固相化し、前述したようにして得た本発明の抗ＴＧモノクローナル抗体（２Ｅ８）および対象となる競合阻害物質を分注することにより、競争ＥＬＩＳＡ法を行った。
【００５７】
競合阻害物質にはＤＮＡ／ＨＯＣｌ、およびＤＮＡ／ＨＯＣｌをＤＮａｓｅI、ヌクレアーゼＰ１（ＮＰ１）、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）により加水分解処理して低分子化（モノマー化）したものを用いた。
【００５８】
その結果、本発明の抗ＴＧモノクローナル抗体（２Ｅ８）は、高分子のＤＮＡ／ＨＯＣｌには強く反応するが、加水分解処理によって低分子化（モノマー化）したＤＮＡ／ＨＯＣｌには殆ど反応しないことが判明した（図５）。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によれば、高分子のチミジングリコールポリマーを合成し、ついで、これを酸化処理して自然界に存在しない酸化修飾ｄＴポリマーを作製することによって、免疫原として、高分子構造をもつＴＧを強制的に作り出している。こうして、高分子のＤＮＡポリマーの成分の一つであるｄＴが酸化修飾されてＴＧに変化したものを効率よく検出できるようにしたのである。
【００６０】
前述したように、TGは正常DNAの１成分であるｄT（deoxy thymidine）が活性酸素によって損傷を受けた結果発生する酸化損傷生成物である。生体中の酸化ストレスを測定するために、体内のDNA中に生成したTGの定量が有用であることが知られている。ところがTG自体は低分子であるが、実際には生体中では高分子であるDNAの１成分であるｄTが酸化されて発生する。そのため、生体の酸化ストレス測定には、高分子であるDNA中に含まれるTGを効率的に検出することが求められる。
【００６１】
本発明のモノクローナル抗体は免疫原として、自然界には存在しない高分子の形態を持つｄＴポリマーを採用し、その結果、低分子のTGには反応せず、高分子DNA中に含まれるTGのみを特異的に認識するものとなる。
【００６２】
本発明のモノクローナル抗体を用いることにより、生体中のDNA中に生成されたTGを効率的、特異的に測定し、酸化ストレスの評価に用いることができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ＤＮＡ中に含まれる塩基deoxy thymidine に対し活性酸素が作用することによって酸化損傷生成物たるＴＧ（チミジングリコール）が生じる過程を説明する図。
【図２】本発明のＴＧ（チミジングリコール）のモノクローナル抗体によるＬＰＳ処理したマウスにおける免疫組織染色の検討を説明する図。
【図３】本発明のＴＧ（チミジングリコール）のモノクローナル抗体の特異性（塩基の種類による特異性）を表す図。
【図４】本発明のＴＧ（チミジングリコール）のモノクローナル抗体の特異性（酸化ＤＮＡとnativeＤＮＡの比較）を表す図。
【図５】本発明のＴＧ（チミジングリコール）のモノクローナル抗体の特異性（低分子抗原と高分子抗原の比較）を表す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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