(57)【要約】      （修正有）【課題】  抗ガン作用を有し、その製造法が簡便で効率的に製造し得るタモキシフェン類縁体を提供する。【解決手段】  以下の式（Ｉ）で表わされる化合物を有効成分として含有することを特徴とする、抗ガン剤。2006117648.tif 000035（式中Ｒ１とＲ２はＨ又はアルキル基を表わし、一緒になって環を形成してもよい。ｎは０を含む整数を表わす。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）で表わされる化合物を有効成分として含有することを特徴とする、抗ガン剤。
【化１】
2006117648.tif 000023
（但し、式中Ｒ１及びＲ２は、水素又はそれぞれ同一あるいは異なるアルキル基を表わし、Ｒ１とＲ２は一緒になって環を形成してもよい。また、ｎは０を含む整数を表わす。）
【請求項２】
有効成分が以下の式（II）で表わされる化合物である、請求項１に記載の抗ガン剤。
【化２】
2006117648.tif 000024
【請求項３】
有効成分が以下の式（III）で表わされる化合物である、請求項１に記載の抗ガン剤。
【化３】
2006117648.tif 000025
【請求項４】
有効成分が以下の式（IＶ）で表される化合物である、請求項１に記載の抗ガン剤。
【化４】
2006117648.tif 000026
【請求項５】
上記式（Ｉ）〜（IＶ）のいずれかで表される化合物を有効成分として含有することを特徴とする、血管新生抑制剤。
【請求項６】
以下の式（III）で表わされる、化合物。
【化５】
2006117648.tif 000027
【請求項７】
以下の式（IＶ）で表される、化合物。
【化６】
2006117648.tif 000028
【請求項８】
式（７）で表わされる化合物と、式（８）で表わされる化合物とを塩基の存在下で反応させることを特徴とする、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の製造方法。
【化７】
2006117648.tif 000029
【化８】
2006117648.tif 000030
（但し、式中Ｒ１及びＲ２は、水素又はそれぞれ同一あるいは異なるアルキル基を表わし、Ｒ１とＲ２は一緒になって環を形成してもよい。また、Ｒ３はハロゲン原子、アルキル硫酸エステル残基又はトリフルオロメタン硫酸エステル残基を表わし、ｎは０を含む整数を表わす。）
【請求項９】
式（７）の化合物が、下記の式（１）、（２）及び（３）で表わされる化合物を酸触媒の存在下で反応させて、下記の式（４）の化合物を生成させ、以下順に、加水分解反応、２重結合のマイグレーション化反応及びアルコキシ基の脱アルキル反応を行なうことにより製造されたものである、請求項８に記載の製造方法。
【化９】
2006117648.tif 000031
（但し、式中Ｒ４はアルカノイル基を表わす。）
【化１０】
2006117648.tif 000032
【化１１】
2006117648.tif 000033
（但し、式中Ｒ５はアルキル基を表わす。）
【化１２】
2006117648.tif 000034
（但し、式中Ｒ４及びＲ５は上記と同様の置換基を表わす。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タモキシフェン類縁体を有効成分として含有する抗ガン剤、タモキシフェン類縁体の製造方法、及び新規タモキシフェン類縁体に関する。
【背景技術】
【０００２】
タモキシフェンは、以下の構造を有する化合物であり、ホルモン依存性乳ガンの治療薬として用いられてきた。
【０００３】
【化１】
2006117648.tif 000002
タモキシフェンは、組織特異的にエストロゲン性、あるいは抗エストロゲン性作用を有し、乳房細胞においては、抗エストロゲン作用を有することが知られている。
エストロゲンは、特に乳ガン細胞のエストロゲン受容体に結合し、ガン細胞の増殖を促進するが、タモキシフェンは、エストロゲンと競合的にエストロゲン受容体と結合することにより、エストロゲンとエストロゲン受容体の結合を阻止し、ガン細胞の増殖を抑制する。
このような作用を有するタモキシフェンにおいては、現在まで様々な類縁体が合成されており、これら類縁体を例示すると、４−ヒドロキシタモキシフェン、４−ブロモタモキシフェン、３−ヨードタモキシフェン、イドキシフェン等が挙げられる。
【０００４】
また、これらタモキシフェン類縁体を合成するための製法についても、様々なものが提案され、本発明者等も、オレフィン部位を有するタモキシフェン類縁体の前駆体を、異性化触媒として酸性物質あるいはアルカリ性物質を使用して転移させることにより、安価かつ効率的にタモキシフェン類縁体を合成する方法を開発している（特許文献１）。
しかし、これら従来のタモキシフェン類縁体においては、幾何異性体としてＺ体、Ｅ体が存在し、Ｚ体のみが抗ガン作用を有するので、Ｚ体を分離する等の手段が必要であり、また、これらタモキシフェン誘導体は、もっぱらホルモン依存性乳ガンの治療剤として用いられており、他のガンについても有効であるとの実証はまったくなされていない。
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２６６６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、従来のタモキシフェン類縁体よりも、より立体構造的にエストロゲンと近似するとともに、さらに、効率的に製造し得るタモキシフェン類縁体を見いだし、その薬理作用を明らかにして、新たな抗ガン剤を提供するとともに、該類縁体の製造手段として、極めて効率的な手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、以下の（１）に示されるタモキシフェン類縁体が、エストロゲンと立体構造的に近似することを見いだし、さらに、該タモキシフェン類縁体が、特に白血病細胞に対し優れた細胞障害性を有するという全く予想できない作用を有し、該タモキシフェン誘導体が抗ガン剤としてきわめて有用であるという知見を得るとともに、該タモキシフェン類縁体が、その構造上の特徴によって、Ｚ体の分離等の手段が不要であり、きわめて効率的に製造可能であることを確認した。また、上記タモキシフェン類縁体の作用メカニズムの解明を進めた結果、これらタモキシフェン類縁体が、血管新生を抑制するという驚くべき知見を得て、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（９）のとおりである。
【０００８】
（１）：以下の式（Ｉ）で表わされる化合物を有効成分として含有することを特徴とする、抗ガン剤。
【０００９】
【化２】
2006117648.tif 000003
（但し、式中Ｒ１及びＲ２は、水素又はそれぞれ同一あるいは異なるアルキル基を表わし、Ｒ１とＲ２は一緒になって環を形成してもよい。また、ｎは０を含む整数を表わす。）
（２）：有効成分が以下の式（II）で表わされる化合物である、前記第（１）項に記載の抗ガン剤。
【００１０】
【化３】
2006117648.tif 000004
（３）：有効成分が以下の式（III）で表わされる化合物である、前記第（１）項に記載の抗ガン剤。
【００１１】
【化４】
2006117648.tif 000005
（４）：有効成分が以下の式（IＶ）で表される化合物である、前記第（１）項に記載の抗ガン剤。
【００１２】
【化５】
2006117648.tif 000006
（５）：上記式（Ｉ）〜（IＶ）のいずれかで表される化合物を有効成分として含有することを特徴とする、血管新生抑制剤。
（６）：以下の式（III）で表わされる、化合物。
【００１３】
【化６】
2006117648.tif 000007
（７）：以下の式（IＶ）で表される、化合物。
【００１４】
【化７】
2006117648.tif 000008
（８）：式（７）で表わされる化合物と、式（８）で表わされる化合物とを塩基の存在下で反応させることを特徴とする、前記第（１）項に記載の式（Ｉ）の化合物の製造方法。
【００１５】
【化８】
2006117648.tif 000009
【００１６】
【化９】
2006117648.tif 000010
（但し、式中Ｒ１及びＲ２は、水素又はそれぞれ同一あるいは異なるアルキル基を表わし、Ｒ１とＲ２は一緒になって環を形成してもよい。また、Ｒ３はハロゲン原子、アルキル硫酸エステル残基又はトリフルオロメタン硫酸エステル残基を表わし、ｎは０を含む整数を表わす。）
（９）：式（７）の化合物が、下記の式（１）、（２）及び（３）で表わされる化合物を酸触媒の存在下で反応させて、下記の式（４）の化合物を生成させ、以下順に、加水分解反応、２重結合のマイグレーション化反応及びアルコキシ基の脱アルキル反応を行なうことにより製造されたものである、前記第（８）項に記載の製造方法。
【００１７】
【化１０】
2006117648.tif 000011
（但し、式中Ｒ４はアルカノイル基を表わす。）
【００１８】
【化１１】
2006117648.tif 000012
【００１９】
【化１２】
2006117648.tif 000013
（但し、式中Ｒ５はアルキル基を表わす。）
【００２０】
【化１３】
2006117648.tif 000014
（但し、式中Ｒ４及びＲ５は上記と同様の置換基を表わす。）
なお、上記式（II）の化合物を、以下リダイフェンＡといい、式（III）、（IＶ）の化合物をそれぞれリダイフェンＢ、リダイフェンＣという。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のタモキシフェン類縁体は、より立体構造的にエストロゲンと近似し、特に白血病細胞に対して、その増殖を極めて効果的に抑制する。このことは、ホルモン依存性乳ガン治療剤として知られていた、タモキシフェン類縁体の作用効果としては、全く予想外のものである。また、これらタモキシフェン類縁体は、血管新生抑制作用を有する。血管新生は、ガン、糖尿病性網膜症、あるいは慢性関節リュウマチ等数多くの疾患の発生あるいは悪化に必要不可欠であることが明らかにされており、特にガンによる血管新生は、ガン細胞の増殖、湿潤、転位の原因でもある。したがって、この点で、本発明のタモキシフェン類縁体は、これら疾患、特にガンの新規な治療法の開発等において大いに寄与するものである。
一方、本発明のタモキシフェン類縁体は対称型の置換アミノエチルオキシフェニル基を有し、したがって幾何異性体が存在しないため、幾何異性体の分割あるいは立体特異的な合成工程が不要で、１，１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−１−ブテン（式（７）の化合物）から１工程で、極めて効率的に製造できるという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明のタモキシフェン誘導体は、以下の式（Ｉ）で表わされ、
【００２３】
【化１４】
2006117648.tif 000015
（但し、式中Ｒ１及びＲ２は、水素又はそれぞれ同一あるいは異なるアルキル基を表わし、Ｒ１とＲ２は一緒になって環を形成してもよい。また、ｎは０を含む整数を表わす。）
その化学構造上の特徴は、ブテンの末端２重結合の炭素原子に２つの同一置換基を有するフェニル基が置換されている点にあり、これにより幾何異性体が存在しない。
これに対して、上記式（ａ）で表わされるタモキシフェンは、ブテンの末端２重結合の炭素原子に、互いに置換基の異なるフェニル基が置換しているため、幾何異性体が存在する。タモキシフェンの活性はそのうちのＺ体にあるので、このＺ体を得るための工程を必要としていた。この点は、以下に示される従来のタモキシフェン類縁体も幾何異性体が存在する点で同様である。
上記式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２が形成する環としては、例えばピロリジン環、ピリミジン環、モルフォリン環等が挙げられる。また、ｎは、例えば１〜３０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５である。
【００２４】
【化１５】
2006117648.tif 000016
【００２５】
本発明のタモキシフェン類縁体の構造は、上記製法上の利点に加えて、立体構造的に他の類縁体よりもよりエストロゲンに類似しているため、エストロゲン受容体に対して、高い親和性を有し、エストロゲンの受容体との結合を効果的に阻止するものと思われるが、特に白血病細胞に対して優れた細胞障害性を有することは全く予想外のことである。
図１は、本発明のタモキシフェン類縁体の一種である１，１−ビス（ジメチルアミノエトキシフェニル）２−フェニル−１−ブテンの立体構造を模式的に示したものである。本発明のタモキシフェン類縁体であるリダイフェンＡ（１，１−ビス（ジメチルアミノエトキシフェニル）２−フェニル−１−ブテン）と、タモキシフェン、イドキシフェンとにおいて、ブテン部分の２重結合面に対する各置換、非置換フェニル基が形成するａ，ｂ，ｃの２面角を、表１に示す。
また、エストラジオールにおける図１に示す２面角ａ、ｂ、ｃを表１に併せて示す。
【００２６】
【表１】
2006117648.tif 000017
表１に示したように、本発明のタモキシフェン類縁体は、ａの２面角がエストラジオールのそれと一致し、また、他の類縁体に比べｃの２面角が最も小さいので平面性が高く、エストラジオールの構造に近い。
【００２７】
本発明のタモキシフェン誘導体のうち式（II）で示される化合物は公知物質であるが、該化合物の抗ガン作用は実証されていない。一方、式（III）、（IＶ）で表わされる化合物は、新規化合物である。
これら本発明のタモキシフェン化合物の製法について、図２を参照して以下に説明する。本発明の式Ｉで表わされる化合物は、直接的には、式（７）の化合物（１，１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−１−ブテンと、一般式（８）の化合物をそれぞれＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の極性溶媒からなる反応溶媒中において、触媒として、例えば、水素化ナトリウム等の塩基性化合物の存在下反応せしめることにより得られる（図２中、工程５）。
この工程の触媒としては、上記水素化ナトリウムに限らず、例えば、アルカリ金属、アルカリ金属塩等の塩基性化合物、遷移金属塩等の遷移金属触媒などが挙げられる。
これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
反応溶媒としてはＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）、ＤＭＥ（１，２−ジメトキシエタン）等の極性溶媒の他、さらにヘキサン、ベンゼン、石油エーテル等の非極性溶媒等も使用でき、これら溶媒は１種単独で使用してもよく、２種以上を併用しても良い。
【００２８】
この製法によれば、例えば、リダイフェンＡ（式（II）の化合物）及びリダイフェンＣ（式（IＶ）の化合物）の収率は８０％以上であり、リダイフェンＢ（式（III）の化合物）の収率は１００％に近い。また、他の本発明のタモキシフェン類縁体もこの反応方式を利用することにより、高収率で得られる。
したがって、式（７）の化合物（１，１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−１−ブテンを原料化合物として用いることにより、きわめて高収率で、効率よく本発明のタモキシフェン化合物を製造することができる。
この式（７）の化合物は、例えば、図２に示される方法（工程１〜４）で合成可能である、この図２の方法について以下に説明する。ただし、本発明においては、この図２の方法のみに限定されない。
【００２９】
〔工程１〕
４−ピバロイルオキシベンズアルデヒド等の４位の水酸基がアルカノイル基等で保護された式（１）の化合物、アニソール等の式（３）の化合物、及び１−フェニル−３−トリメチルシリル−１−プロペン（式（２）の化合物）を、例えば、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルフォネート（ＴＭＳＯＴｆ）等を触媒としてＨｆＣｌ４等のルイス酸あるいはプロトン酸等の存在下、反応させ、式（４）の化合物を生成させる。この工程においては、触媒として上記ＴＭＳＯＴｆの他トリメチルシリルクロリド等も使用でき、ルイス酸としては上記の他、Ｈｆ（ＯＴｆ）４，ＴｉＣｌ４，ＴｉＣｌ２（ＯＴｆ）２等の第４属金属塩、ＡｌＣｌ３，ＢＣｌ３，Ｓｃ（ＯＴｆ）３等の第３属金属塩、ＳｎＣｌ２，Ｓｎ（ＯＴｆ）２等の第２属金属塩等が使用できる。またプロトン酸としては塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸等も使用可能である。これらは一種単独で使用してもよく、また２種以上併用してもよい。
【００３０】
〔工程２〕
ついで、式（４）の化合物を、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の溶媒の存在下、触媒として、例えば、カリウム第３級ブトキシド等の塩基性化合物を使用して加水分解し、一般式（５）の化合物を得る。
この加水分解工程において使用する触媒としては、塩基性化合物に限らず、酸性化合物及び遷移金属触媒も使用できる。
触媒として使用する塩基性化合物としては、例えば、アルカリ金属あるいはアルカリ金属塩等が挙げられ、酸性化合物としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、あるいは上記の各種ルイス酸が挙げられる。また、遷移金属触媒としては各種遷移金属塩等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用しても良い。
また、使用する溶媒としては、上記ＤＭＳＯの他、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１，２−ジメトキシエタン等の極性溶媒であってもよく、また、ヘキサン、ベンゼン、ジクロロメタン等の非極性溶媒も用いることができる。これらは一種単独で使用してもよく、また２種以上併用してもよい。
【００３１】
〔工程３〕
式（５）の化合物に対して、溶媒として、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下、触媒としてより多量のカリウム第３級ブトキシド等を使用して、２重結合の転移反応（マイグレーション）を行ない、一般式（６）の化合物を得る。
この工程の触媒としては、上記カリウム第３級ブトキシドの他、例えば、アルカリ金属あるいはアルカリ金属塩等の塩基性化合物、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、あるいは上記の各種ルイス酸等の酸性化合物、および各種遷移金属塩等の遷移金属触媒が用いられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用しても良い。
また、使用する溶媒としては、上記ＤＭＳＯの他、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１，２−ジメトキシエタン等の極性溶媒であってもよく、また、ヘキサン、ベンゼン、ジクロロメタン等の非極性溶媒も用いることができる。これらは一種単独で使用してもよくまた２種以上併用してもよい。
この工程３の反応系は触媒の使用量及び反応温度をのぞいて、工程２の反応系と同様であり、工程２において、あらかじめ触媒量を多くし、反応温度を高めに設定（例えば５０℃）すれば、工程２と工程３を同時に行なうことができる。
なお、式（６）の化合物においては、幾何異性体として、Ｚ体、Ｅ体が存在するが、本発明においてはこれらを分離することなく、次工程の原料化合物としてそのまま使用できる。
【００３２】
〔工程４〕
図２中、一般式（６）の化合物を例えば、ジクロロメタン等からなる溶媒中で、触媒として臭素化硼素等のルイス酸の存在下、アルコキシ基のアルキル基を脱離させ、式（７）の化合物を得る。
工程４における、触媒としては、上記臭素化硼素の他、上記各種ルイス酸等が使用できるが、さらに、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸等の酸性化合物、あるいはアルカリ金属、アルカリ金属塩等の塩基性化合物、遷移金属塩等の遷移金属触媒も用いることができる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
また、反応溶媒としては、上記ジクロロメタンの他の非極性溶媒の他、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）、ＤＭＥ（１，２−ジメトキシエタン）等の極性溶媒が用いられる。また、他の非極性溶媒としては、ヘキサン、ベンゼン等が挙げられる。これら溶媒は１種単独で使用してもよく、２種以上を併用しても良い。
一方、本発明のタモキシフェン類縁体は、ガン細胞、特に白血病細胞の細胞傷害剤として有用であり、そのＩＣ５０値は、タモキシフェンあるいは従来のタモキシフェン類縁体に比較して半分以下であり、極めて有効である。さらに、本発明のタモキシフェン類縁体は低濃度で血管新生抑制作用を有する。これに対して従来のタモキシフェンあるいはその類縁体は、このような血管新生抑制作用はないかあるいはあっても極めて低い。この点で本発明のタモキシフェン類縁体は特異的である。
特に、ガンについていえば、腫瘍は血管と結ばれていない状態では、１〜２ｍｍ３以上に成長することができないが、腫瘍は自ら血管新生促進因子を産生して血管新生を誘導し、ガン細胞の増殖、湿潤に必要な、酸素、栄養素を補給するための新生血管網を構築する。そして、ガン細胞は、この新生血管網を通じて転位する。したがって、血管新生を抑制する本発明のタモキシフェンフェン類縁体は、このようなガンの増殖、湿潤、転位を抑制する新しいガン治療法の確立に大いに貢献する。
【実施例】
【００３３】
以下に本発明の実施例を、図３を参照しつつ示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
〔実施例１〕
＜中間体１，１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−１−ブテン（図３中、式（７）の化合物）の製造＞
（１）：反応容器に、酸触媒としてＨｆＣｌ４を８０．１ｍｇ（１当量）を加えて０℃に維持しながら、アニソール０．５ｍｌ、アニソール１ｍｌにトリメチルシリルトリフルオロメタンスルフォネート（ＴＭＳＯＴｆ）２７．８ｍｇ（０．５当量）を溶解した溶液、４−ピバロイルオキシベンズアルデヒド（図３中、式（１）の化合物）５１．６ｍｇ（０．２５ｍＭ）、及びアニソール１ｍｌに１−フェニル−３−トリメチルシリル−１−プロペン（図２、中式（２）の化合物）５７．１ｍｇ（１．２当量）を溶解した溶液を順次加えた。なお、アニソールの合計使用量は２．５ｍｌである。ついで、室温で反応を行い２時間経過後、反応生成物の一部に対し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（展開溶媒；ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１）を行って原料化合物が検出されなくなったことを確認した後、反応系を０℃に冷却するとともに、ＮａＨＣＯ３水溶液を加えて反応を終了させた。
この後、反応生成物をエーテルで抽出した後、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を濃縮後、分取薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１）による精製を行ない、４−（４−ピバロイルオキシフェニル）−４−（４−メトキシフェニル）−３−フェニル−１−ブテン（図３中、式（４）の化合物）を６４．７ｍｇ得た。収率は６２％であった。
【００３４】
（２）：反応容器に上記工程（１）において得られた、４−（４−ピバロイルオキシフェニル）−４−（４−メトキシフェニル）−３−フェニル−１−ブテン（図３中、式（４）の化合物）５７．２ｍｇ（０．１３８ｍＭ）、カリウム第３級ブトキシド（ｔＢｕＯＫ）１５．５ｍｇ、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．６９ｍｌ（０．２Ｍ）を加えて、室温で１５分反応させ、ピバロイル基を加水分解した。次いで、反応系を０℃に冷却するとともに塩化アンモニウム水溶液を加え反応を終了させた。
反応生成物を酢酸エチルで抽出した後、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を濃縮後、分取薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）による精製を行ない、４−（４−ヒドロキシフェニル）−４−（４−メトキシフェニル）−３−フェニル−１−ブテン（図３中、式（５）の化合物）を４６．７ｍｇ得た。収率は定量的であった。
【００３５】
（３）：反応容器に上記工程（２）において得られた、４−（４−ヒドロキシフェニル）−４−（４−メトキシフェニル）−３−フェニル−１−ブテン（図３中、式（５）の化合物）４５．７ｍｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１ｍｌ（０．１３８Ｍ）を加え反応系の温度を５０℃に加温し、さらに、カリウム第３級ブトキシド２８３．９ｍｇ（１８当量）を加えて、２重結合転移反応を行った。５０℃で３０分維持した後、反応生成物の一部に対し薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）を行って、上記式（３）の化合物に対応するスポットが検出されなくなったことを確認した後、反応系を０℃に冷却するとともに塩化アンモニウム水溶液を加え反応を終了させた。
ついで、反応生成物を酢酸エチルで抽出した後、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を濃縮後、分取薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）による精製を行ない、１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−（４−メトキシフェニル）−２−フェニル−１−ブテン（図３中、式（６）の化合物）、を３７．２ｍｇ得た。収率は８１％であった。
【００３６】
（４）：反応容器に上記工程（３）で得られた、１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−（４−メトキシフェニル）−２−フェニル−１−ブテン（図３中、式６の化合物）１４５．２ｍｇ（０．４３９ｍＭ）とジクロロメタン２．２ｍｌを加え、反応系を−７８℃に冷却した。次いで臭素化硼素（ＢＢｒ３）１０当量を含むヘプタン１Ｍ溶液４．３９ｍｌを加え、１時間維持した。次いで反応温度を０℃に上昇させた。さらに３時間経過後、反応生成物の一部に対し、薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）を行って、上記式（６）の化合物に対応するスポットが検出されなくなったことを確認した後、ＮａＨＣＯ３水溶液を加え、反応を終了させた。
反応生成物をジクロロメタンで抽出した後、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を濃縮後、生じた固体を塩化メチレンに溶解し、再結晶させ、１，１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−１−ブテン（図３中、式（７）の化合物）中の結晶６１．４ｍｇを得た。一方、液相を濃縮後、分取薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）による精製を行ない、中間体１，１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−１−ブテンを５８．４ｍｇ得た。前者の結晶との合計は１１９．６ｍｇであり、収率は８６％であった。
【００３７】
上記各工程で得られた化合物のＮＭＲ測定結果を以下に示す。
式（４）の化合物
1H NMR(CDCl3)σ= 7.32-6.75(m, 11H, Ph), 6.57(d, J=8.6Hz, 2H, Ph), 5.94-5.84(m, 1H, 3-H), 4.90-4.80(m, 1H, 4-H), 4.25(d, J=11.6 HZ, 1H, 1-H), 4.06(dd, J=7.1, 9.6 Hz, 1H, 2-H), 3.66(s, 3H, MeO), 1.31(s, 9H, PivO)
【００３８】
式（６）の化合物（Ｚ体とＥ体の等量混合物）
1H NMR(CDCl3) σ=7.27-6.45(m, 13H, Ph),3.82 and 3.67(s, 3H, MeO), 2.48(q, J=7.3Hz, 2H, 3-H), 0.93 and 0.92(t, J=7.3Hz, 3H, 4-H)
【００３９】
式（７）の化合物（１，１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−１−ブテン）
1H NMR(CDCl3)σ=7.29-6.45(m, 13H, Ph), 2.48(q, J=7.6Hz, 2H, 3-H), 0.92(t, J=7.6 Hz, 3H, 4-H)
【００４０】
〔実施例２〕
＜リダイフェンＡの製造＞
反応容器に、６０重量％水素化ナトリウム（ＮａＨ）含有オイル６３．２ｍｇ（水素化ナトリウム２０当量）を加え、これを石油エーテルで洗浄した後乾燥させた。次に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）０．８ｍｌ（０．１Ｍ）を投入し、０℃に保った。次いで、実施例１で得られた、１，１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−１−ブテン（図３中、式（７）の化合物）２５ｍｇ（０．０７９ｍＭ）を反応容器に加え、室温で１５分維持した後、０℃に冷却し、１−ジメチルアミノ−２−クロロエタン塩酸塩（図３中式（８）の化合物）１１３．８ｍｇ（１０当量）を加え、５０℃で６時間反応させた後、反応系を０℃に冷却するとともに、塩化アンモニウム水溶液を加え、反応を終了させた。反応生成物をジクロロメタンで抽出し、有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を濃縮後、分取薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；ベンゼン／トリエチルアミン＝９／１）を行ない、リダイフェンＡ（１，１−ビス〔４−（２−ジメチルアミノエトキシ）フェニル〕−２−フェニル−１−ブテン；図３中、式（II）の化合物）３０．０ｍｇを得た。収率は８３％であった。
得られた化合物のＮＭＲ測定結果は以下のとおりである。
1H NMR(CDCl3)σ=7.19-6.45(m, 13H, PH), 4.01 and 3.85(t, J=5.9 Hz, 4H, OCH2), 2.67 and 2.57(t, J=5.9Hz, 4H, NCH2), 2.40(q, J=7.3Hz, 2H, 3-H), 2.28 and 2.21(s, 12H, NMe2), 0.85(t, J=7.3Hz, 3H, 4-H)
【００４１】
〔実施例３〕
＜リダイフェンＢの製造＞
反応容器に、６０重量％水素化ナトリウム（ＮａＨ）含有オイル１２６．４ｍｇ（水素化ナトリウム２０当量）を加え、これを石油エーテルで洗浄した後乾燥した。次にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を１．５８ｍｌ（０．１Ｍ）を投入し、０℃に保った。次いで、実施例１で得られた、１，１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−１−ブテン（図３中、式（７）の化合物）５０ｍｇ（０．１５８ｍＭ）を反応容器に加え、室温で１５分維持した後、０℃に冷却し、１−（２−クロロエチル）−ピロリジン塩酸塩（図３中、式（９）の化合物）５０ｍｇ（１０当量）を加えて５０℃で１２時間反応を行った。反応生成物の一部に対し、薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；メタノール／ジクロロエタン＝１／１９を行なって、上記式７の化合物に対応するスポットが検出されなくなったことを確認した後、反応系を０℃に冷却するとともに、塩化アンモニウム水溶液を加えて終了させた。
次いで、反応生成物をジクロロメタンで抽出した後、有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を濃縮後、分取薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；ベンゼン／トリエチルアミン＝１９／１）による精製を行い、リダイフェンＢ（１，１−ビス［４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）フェニル］−２−フェニル−１−ブテン；図３中式（III）の化合物）７９．７ｍｇを得た。収率は９９％であった。
得られた化合物のＮＭＲ測定結果は以下のとおりである。
1H NMR(CDCl3)σ=7.18-6.45(m, 13H, Ph),  4.09 and 3.89 (t, J= 5.9 Hz, 4H, OCH2), 2.84 and 2.73 (t, J= 5.9 Hz, 4H, NCH2), 2.58-2.47 (m, 8H, N(CH2CH2)2), 2.40 (q, J = 7.3 Hz, 2H, 3-H), 1.76-1.18 (m, 8H, N(CH2CH2)2), 0.85 (t, J= 7.3 Hz, 3H, 4-H)
【００４２】
＜リダイフェンＣの製造＞
反応容器に、６０重量％水素化ナトリウム（ＮａＨ）含有オイル５０．４ｍｇ（水素化ナトリウム２０当量）を加え、これを石油エーテルで洗浄した後乾燥させた。次に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）０．６ｍｌ（０．１Ｍ）を投入し、０℃に保った。実施例１で得られた、１，１−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−１−ブテン（図３中、式（７）の化合物）２０ｍｇ（０．０６３２ｍＭ）を反応容器に加え、室温で１５分維持した後、０℃に冷却し、１−（２−クロロエチル）−ピペリジン塩酸塩１１６．４ｍｇ（１０当量）を加え、５０℃で６時間反応させた後、反応系を０℃に冷却するとともに、塩化アンモニウム水溶液を加え、反応を終了させた。反応生成物をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を濃縮後、薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；クロロホルム／メタノール＝９／１）を行ないリダイフェンＣ（１，１−ビス［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）フェニル］−２−フェニル−１−ブテン；図３中式（IＶ）の化合物）３０ｍｇを得た。収率は８８％であった。
得られた化合物のＮＭＲ測定結果は以下の通りである。
1HNMR(CDCl3)σ＝7.19-6.52(m, 13H, Ph), 4.13 and 3.97(t, J＝6.2 Hz, 4H, OCH2), 2.80 and 2.70(t, J＝6.2 Hz, 4H, NCH2), 2.57-2.43(m, 8H, N(CH2CH2)2), 2.49(q, J＝7.3Hz, 2H, 3-H), 1.67-1.54(m, 4H, N(CH2CH2)2), 1.50-1.42(m, 4H, N(CH2CH2)2CH2), 0.92(t, J＝7.3 Hz, 3H, 4-H)
【００４３】
〔実施例４〕
前骨髄性白血病ＨＬ−６０細胞を（２×１０５ｃ／ｍｌ）を９６穴プレートにまき、タモキシフェン、４−ブロモタモキシフェン、３−ヨードタモキシフェン、イドタモキシフェン、リダイフェンＡ及びリダイフェンＢを、各々、finalで、０，１，５，１０，２０μｇ／ｍＬになるように添加し５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃培養した。測定１時間前にfinal０．５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ（３−（４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム  ブロマイド）を添加し、さらに１時間培養した。
上記前骨髄性白血病ＨＬ−６０細胞に対する上記各薬剤の細胞障害性は、該細胞のミトコンドリア中のコハク酸デヒドロゲナーゼ活性を測定することにより行ない、該酵素活性の測定は、コハク酸デヒドロゲナーゼによるＭＴＴのテトラゾリウム環の開裂に伴う不溶性の暗青色ホルマザン色素の生成量を、上記培養後、遠心して上澄みを除き、沈殿として残った上記色素をＤＭＳＯで溶解し、マイクロプレートリーダーでＯＤ５７０を測定することにより行った。なお、ＭＴＴアッセイは、多検体にわたる細胞死を判定するための分析法としてよく知られているものである。
【００４４】
結果を図４に示す。また、該コハク酸デヒドロゲナーゼ活性が５０％に低下する各薬剤量を図４から求め、細胞障害性のＩＣ５０値とした。使用した上記各薬剤のＩＣ５０値を以下の表２に示す。
【００４５】
【表２】
2006117648.tif 000018
【００４６】
以上の結果から明らかなようにリダイフェンＡ及びリダイフェンＢの細胞障害性は、顕著に高く、本発明のタモキシフェン類縁体誘導体は極めて効果的にガン細胞を死滅又は増殖抑制させることが明らかである。
【００４７】
以上の結果から明らかなようにリダイフェンＡ及びリダイフェンＢの細胞障害性は、顕著に高く、本発明のタモキシフェン類縁体誘導体は極めて効果的にガン細胞を死滅又は増殖抑制させることが明らかである。
【００４８】
〔実施例５〕
＜白血病Ｔ細胞であるJurkat細胞に対するリダイフェンＡ、Ｂのアポトーシス誘導＞
（１）細胞傷害性の計測
Jurkat細胞を、１０％ＦＣＳ（牛胎児血清）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養し、２×１０５cells/ml濃度になるように調製した。
この２×１０５cells/ml濃度に調製したJurkat細胞試料溶液を９６穴プレートの各ウエルに９０μｌずつ分注し、さらに、該細胞試料を含有する各ウエルに、リダイフェンＡ、リダイフェンＢ、タモキシフェン、４−ブロモタモキシフェン、３−ヨードタモキシフェン、イドキシフェンをそれぞれ１０μＭ、２０μＭ及び３０μＭ添加した。
これら全てを入れ終わった後２時間インキュベレトした、２時間後インキュベーターから取り出し、各ウエルに、Cell Counting Kit-8（和光純薬工業社製）の反応試薬（ＷＳＴ−８）を１０μｌづつ加え、再び２ｈインキュベートした。その後マイクロプレートリーダー４５０ｎｍで吸光度を測定した。結果を図５に示す。
Cell Counting Kit-8使用による解析法は、細胞試料のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ活性を測ることにより、試料内の生細胞数を割り出すものであり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ活性は試料中の生細胞数とほぼ比例関係にある。図５の結果によれば、リダイフェンＡ及びＢの極めて低い濃度で細胞傷害を引き起こしており、その細胞傷害性は、タモキシフェン及びその他のタモキシフェン類縁体に比べ遙かに高いことが分かる。また、タモキシフェンあるいはその類縁体は、乳ガン細胞膜上のエストロゲンレセプター（ER)に結合することにより、アポトーシスを誘導するとされているが、この実験で使用した白血病Ｔ細胞であるJurkat細胞は、エストロゲンレセプターを有していないものである（ER-negative)。それにもかかわらず、該細胞に対して本発明のリダイフェンＡ、リダイフェンＢが高い細胞傷害性を示したことは、特筆すべきことである。
また、上記図５の結果に基づき、リダイフェンＡ、リダイフェンＢ、タモキシフェン及びその他の類縁体のＩＣ５０を算出した。これら薬剤のＩＣ５０を表３に示す。ＴＡＭ３（３−ヨードタモキシフェン）は４０μＭまで添加しても障害性を有さなかった。
【００４９】
【表３】
2006117648.tif 000019
【００５０】
（２）アポトーシスに伴うＤＮＡ断片化の確認
上記（１）と同様に培養して得たJurkat細胞を２×１０６cellsづつ、２×１０５cells/ml濃度で９ｃｍシャーレに培地とともに分注し、リダイフェンＡ、リダイフェンＢ、タモキシフェン、４−ブロモタモキシフェン、３−ヨードタモキシフェン、及びイドキシフェンをそれぞれ以下の濃度で加え、４時間反応させた。
リダイフェンＡ；０．５μＭ、１μＭ、２μＭ
リダイフェンＢ；０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ
タモキシフェン；５μＭ、1０μＭ、２０μＭ、３０μＭ
４−ブロモタモキシフェン；５μＭ、1０μＭ、１５μＭ、２０μＭ
３−ヨードタモキシフェン；１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ
イドキシフェン；０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ
なお、これら薬剤の濃度は、上記（１）で算出された各薬剤のＩＣ５０に合わせて設定したものである（３−ヨードタモキシフェンは上限を４０μＭに設定）。
次いで、該反応液をプロテナーゼＫ（ProteinaseK）、RNaseAで処理し、ＤＮＡを抽出した。次いで、抽出されたＤＮＡについて０．９％アガロースゲル電気泳動を行ない。ＵＶトランスイルミネータで観察し、写真撮影した。
この電気泳動写真を図６に示す。なお、電気泳動写真における数字は、上記薬剤の濃度を示し、Ｃは上記薬剤無添加の場合を示す。
この電気泳動の結果によれば、リダイフェンＡ、リダイフェンＢを加えた場合においては、無添加、タモキシフェン及びその他の類縁体を加えた場合に比べ、より低濃度でJurkat細胞において、アポトーシス特有のＤＮＡ断片化が起こっていることが分かる。
【００５１】
（３）ギムザ染色
上記（２）と同様の操作でリダイフェンＡ、リダイフェンＢ、タモキシフェン、４−ブロモタモキシフェン、３−ヨードタモキシフェン、及びイドキシフェンをそれぞれ上記（１）で算出されたＩＣ５０の濃度（表３）で加え（３−ヨードタモキシフェンは４０μＭ）、４時間反応させた後、ギムザ染色を行い、Jurkat細胞の形態変化を顕微鏡で観察した。その結果を図７に示す。
これによれば、リダイフェンＡ、リダイフェンＢを加えた場合においては、無添加、タモキシフェン及びその他の類縁体を加えた場合に比べ、より低濃度で顕著な核の凝縮が起こっており、Jurkat細胞に対して顕著な細胞傷害性を有することが分かる。
【００５２】
（４）キャスパーゼ−３（Caspase-3)の活性測定
上記（１）と同様に培養して得たJurkat細胞を２×１０６cellsづつ、２×１０５cells/ml濃度で９ｃｍシャーレに入れ、リダイフェンＡ、リダイフェンＢ、タモキシフェン、４−ブロモタモキシフェン、３−ヨードタモキシフェン、及びイドキシフェンをそれぞれ上記（１）のＩＣ５０濃度（表３）で加え、反応させた（３−ヨードタモキシフェンは４０μＭ）。この反応において、それぞれ０時間、１時間、２時間、３時間及び４時間反応させた場合の各細胞を回収し、RIPAbufferに懸濁し、該懸濁液にキャスパーゼ-３の人工基質であるAc−DEVD−pNAを加え、Ac−DEVD−pNAの切断により生じるpNAの吸光度を405nmの波長で測定した。また、その際のタンパク質量をBCA protein Assayで測定して、キャスパーゼ-３の比活性（Unit/mg）を算出し、上記反応０時間のときの比活性を１とした場合の各時間における比活性を求めた。結果を図８のグラフに示す。
キャスパーゼ−３はアポトーシスに特異的なプロテアーゼであり、本発明のリダイフェンＡ及びＢ、並びにタモキシフェン、４−ブロモタモキシフェン、及びイドキシフェンは、いずれも反応時間を長くすると、キャスパーゼ-３の比活性が増大するという同様の傾向を示しているが、本発明のリダイフェンＡ及びＢは極めて低濃度でキャスパーゼ−３の比活性を増大せしめている。
【００５３】
これらの実験結果をまとめると、タモキシフェン及び３−ヨードタモキシフェンを除くその類縁体は、ER-nagative細胞にもアポトーシスを誘導するが、特にこの中でリダイフェンＡおよびＢは、極めて顕著なアポトーシス誘導能を有し、乳ガン以外の抗ガン剤としても極めて有用であるといえる。
【００５４】
〔実施例６〕
＜リダイフェンＡ、Ｂ、Ｃによる血管新生抑制＞
１．ＣＡＭ（鶏胚漿尿膜法）による血管新生抑制活性の検定
（１）リダイフェンＡの活性検定
ａ．サンプルの調製
５％ＥＶ(ethylene-vinyl acetate copolymer 40)にリダイフェンＡを溶かし、10μｌをガラスシャーレに滴下し、風乾させ、次に、スパーテルを用いて、風乾したフィルム状のEVを球形のペレットにして、一晩以上、冷凍庫保存した。
ｂ．実験
鶏卵を３７℃で培養し、培養４日後に、気室上部及び鶏卵側部の卵殻の２ヶ所に錐で穴を開け、側部の穴より約４ｍｌの卵白を注射器で吸引除去した。また、上部の穴より駒込ピペット用シリコンスポイトをあてて吸引し、気室上部に仮気室を作り、仮気室上の卵殻膜を除去し、窓を作り、これらの穴をオートクレーブしたアルミ箔でキャップした。
培養５日後に、上記ａで作成したＥＶペレットを漿尿膜上にのせ、再びアルミ箔でキャップした。
培養７日後に、観察しやすいように卵殻を取り除き、窓を広げ、さらに、血管網を見やすくするために漿尿膜内に脂肪乳剤を適当量注入し、漿尿膜上の血管網を実体顕微鏡下で観察した。この観察において３ｍｍ以上の無血管領域がある場合を血管新生を抑制するものと判定した。
結果を以下の表４、及び図９及び図１０に示す。なお、上記ａ．のサンプルの調製においてリダイフェンＡを使用しない他は上記と同様に実験を行なった結果もコントロールとして併せて示す。これらの結果により、リダイフェンＡは、血管新生抑制作用を示すことが明らかとなった。
【００５５】
【表４】
2006117648.tif 000020
（２）リダイフェンＢ，Ｃの活性検定
ａ．サンプルの調製
２％メチルセルロース溶液にエタノールに溶かしたリダイフェンＢ、Ｃをそれぞれを混合し（エタノールの終濃度５％）、テフロンロッドの上に２０μｌずつ滴下したあと、風乾してディスク状にする。
これをピンセットでテフロンロッドからはがし、シャーレに入れて、一晩以上冷凍庫保存した。
ｂ．実験
このようにして得られた、サンプルディスクをそれぞれ用いて、上記（１）ｂ．と同様の実験を行った。結果を表５、表６、及び図１１、図１２に示す。
【００５６】
【表５】
2006117648.tif 000021
【００５７】
【表６】
2006117648.tif 000022
これらの結果から明らかなように、リダイフェンＢ，ＣもリダイフェンＡと同様に、血管新生抑制作用を示した。
【００５８】
〔実施例７〕
ＭＴＴアッセイによる血管内皮細胞生存率の測定
ａ．リダイフェンＡについての測定
ＢＡＥＣ（ウシ冠動脈血管内皮細胞）を１×１０５cell/mlになるように調製し、９６穴プレートに１００μｌ/wellづつ播き、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した後、培養上清を除去し、リダイフェンＡ、タモキシフェン、４−ブロモタモキシフェン及びイドキシフェンを、それぞれ各濃度で含有するＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した後、ＭＴＴ保存液（ＭＴＴ  ５mg/mlin PBS(-) ）を１．１μｌ／ｗｅｌｌづつ添加した。１時間後、上澄みを除去しＤＭＳＯを１００μｌ／Ｗｅｌｌづつ加え、マイクロプレートリーダー（５７５ｎｍ）で吸光度を測定した。結果を図１３に示す。
ｂ．リダイフェンＢ、Ｃについての測定
ＢＡＥＣ（ウシ冠動脈血管内皮細胞）を１×１０４cell/mlになるように調製した他は、上記Ａと同様にして吸光度を測定した。結果を図１４に示す。
ＭＴＴアッセイは、実施例４に示したように細胞数の測定を、ミトコンドリアの脱水素酵素活性を測定することにより行うものであり、図１３、図１４に示されるように、タモキシフェンＡ，Ｂ、Ｃはいずれも低濃度で（５μＭ以下）でウシ冠動脈血管内皮細胞の生残数を０にしているのに対し、タモキシフェン、４−ブロモタモキシフェン、イドキシフェンは、１０μＭでもかなりのウシ冠動脈血管内皮細胞の生残していることが分かる。すなわち、本発明のタモキシフェン類縁体は、タモキシフェンあるいはその類縁体の中で特異的に血管内皮細胞の細胞死を誘導する。
血管新生においては、血管内皮細胞の増殖を伴う。したがって、この結果は本発明のタモキシフェン類縁体の血管新生抑制作用を裏付けるものである。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明のタモキシフェン類縁体の立体構造を模式的に示した図である。
【図２】本発明のタモキシフェン類縁体の製造法の各工程を示す模式図である。
【図３】実施例で行った各工程の工程図である。
【図４】本発明のタモキシフェン類縁体と他の類縁体の、ＭＴＴアッセイによる細胞障害性を測定した結果を示すグラフである。
【図５】Jurat細胞に対する、本発明のタモキシフェン類縁体、タモキシフェン及びその他の類縁体の細胞傷害性を示すグラフである。
【図６】本発明のタモキシフェン類縁体、タモキシフェン及びその他の類縁体による、Jurat細胞のＤＮＡ断片化を確認した電気泳動写真である。
【図７】本発明のタモキシフェン類縁体、タモキシフェン及びその他の類縁体をJurat細胞に作用させた後ギムザ染色を行い、細胞の状態を観察した顕微鏡写真である。
【図８】本発明のタモキシフェン類縁体、タモキシフェン及びその他の類縁体をJurat細胞に作用させ、作用時間毎に該細胞のキャスパ−ゼ−３の活性変化を測定した結果を示すグラフである。
【図９】本発明のリダイフェンＡを使用した場合と使用しない場合とにおける漿尿膜上の血管網形成の様子を実体顕微鏡下で観察した結果を示す写真である。
【図１０】本発明のリダイフェンＡを各濃度で使用した場合における漿尿膜上の血管網形成を実体顕微鏡下で観察した結果に基き作成された、血管新生抑制割合を示すグラフである。
【図１１】本発明の本発明のリダイフェンＢを各濃度で使用した場合における漿尿膜上の血管網形成を実体顕微鏡下で観察した結果に基き作成された血管新生抑制割合を示すグラフである。
【図１２】本発明の本発明のリダイフェンＣを各濃度で使用した場合における漿尿膜上の血管網形成を実体顕微鏡下で観察した結果に基き作成された血管新生抑制割合を示すグラフである
【図１３】リダイフェンＡ、タモキシフェン、４−ブロモタモキシフェン進歩性の点で安全ですンの各濃度に対するウシ冠動脈血管内皮細胞の生残率を、ＭＴＴアッセイで測定した結果を示すグラフである。
【図１４】リダイフェンＢ，Ｃの各濃度に対するウシ冠動脈血管内皮細胞の生残率を、ＭＴＴアッセイで測定した結果を示すグラフである。
【図１】
2006117648.tif 000036
【図２】
2006117648.tif 000037
【図３】
2006117648.tif 000038
【図４】
2006117648.tif 000039
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2006117648.tif 000043
【図９】
2006117648.tif 000044
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2006117648.tif 000048
【図１４】
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