(57)【要約】【課題】本発明の目的は、プロテオーム解析において、より発現量の少ないタンパク質を効率よく同定することにある。より詳細には、ゲル中のタンパク質を消化し、抽出する過程において添加される、効率のよい界面活性剤を見出し、従来の方法では検出することができなかった発現量の少ないタンパク質を同定することにある。【解決手段】ゲル中のタンパク質を消化する際に、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideを添加したところ、ゲル中のタンパク質を消化し、抽出する効率が向上することを見出した。そして、質量分析計で測定し、タンパク質を同定したところ、従来の方法では、検出することができなかったタンパク質を同定することができることを見出した。【選択図】図１
2006003337.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（１）：
【化１】
2006003337.tif 000010
[式中、nは1から7の整数を表す。]
で示される化合物の存在下にゲル中のタンパク質を消化することを特徴とする、ゲル中のタンパク質の消化方法。
【請求項２】
ゲル中のタンパク質を消化する方法であって、
タンパク質をゲル電気泳動により分離する工程と、
当該分離されたタンパク質を含むゲルを切り出す工程と、
次式（１）：
【化２】
2006003337.tif 000011
[式中、nは1から7の整数を表す。]
で示される化合物の存在下に、前記切り出されたゲル中のタンパク質をタンパク質分解酵素で処理する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項３】
タンパク質の分析方法であって、
タンパク質をゲル電気泳動により分離する工程と、
当該分離されたタンパク質を含むゲルを切り出す工程と、
次式（１）：
【化３】
2006003337.tif 000012
[式中、nは1から7の整数を表す。]
で示される化合物の存在下に、前記切り出されたゲル中のタンパク質をタンパク質分解酵素で処理する工程と、
前記酵素処理により消化されたタンパク質の質量を測定する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項４】
タンパク質の分析方法であって、
タンパク質をゲル電気泳動により分離する工程と、
当該分離されたタンパク質を含むゲルを切り出す工程と、
次式（１）：
【化４】
2006003337.tif 000013
[式中、nは1から7の整数を表す。]
で示される化合物の存在下に、前記切り出されたゲル中のタンパク質をタンパク質分解酵素で処理する工程と、
前記酵素処理により消化されたタンパク質を抽出する工程と、
前記抽出されたタンパク質の質量を測定する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項５】
式（１）中nが5である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
式（１）中nが5である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質分解酵素が、トリプシンである、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ゲルが、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
次式（１）：
【化５】
2006003337.tif 000014
[式中、nは1から7の整数を表す。]
で示される化合物を含有する、タンパク質のゲル内消化添加剤。
【請求項１０】
式（１）中nが5である、請求項９に記載の添加剤。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法に用いられることを特徴とする、請求項９または１０に記載の添加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltoside等の存在下で消化することを特徴とする、ゲル中のタンパク質を消化する方法に関する。さらに、本発明は、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltoside等を有効成分とする、タンパク質のゲル内消化添加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム時代をむかえて、生体内のタンパク質を分離同定し、さらに定量することが、ますます重要になってきている。特に、病気の診断・治療技術の研究開発には、多数のタンパク質の機能を解明することが必要である。
【０００３】
近年、重要なプロテオーム解析の技術として、質量分析法が汎用されている。ここで、用語「プロテオーム解析」とは、遺伝子情報と細胞内で複雑に相互作用している多様なタンパク質との関係を明らかにする解析のことをいう（たとえば、非特許文献１参照）。つまり、プロテオーム解析は、細胞を構成するすべてのタンパク質を網羅的に解析する手法をいう。
【０００４】
本プロテオーム解析方法は、質量分析装置を用いたタンパク質やペプチドの正確な質量を分析する方法である。この質量分析装置は、一般には、タンパク質及びペプチドをイオン化する装置と、その質量に応じて分離する質量分離部を備え、該質量を分析する質量分析計とから構成されている。そして、質量分析計とタンパク質のデータベース、及びそれらを結ぶ検索システムによって、今日ではタンパク質の同定は飛躍的に容易になったといえる。そのため、特定のタンパク質群（たとえば、ある複合体を形成するタンパク質群）を網羅的に同定することが可能である。
【０００５】
しかしながら、実際には、プロテオーム解析において、タンパク質が同定されるか否かは、タンパク質量に依存するため、発現量の多いタンパク質が容易に同定され、発現量の少ないタンパク質は、同定されにくいことが知られている。
【０００６】
そこで、プロテオーム解析において、少しでも発現量の低いタンパク質を同定するために、ゲル内消化法の効率向上を目指すことが行われている。中性界面活性剤であるn-オクチルグルコシドをトリプシン消化時に添加することによって、より発現量の少ないタンパク質を同定することが可能となると報告されている（非特許文献２、３）。n-オクチルグルコシドは、トリプシンの活性を阻害しない上に、ゲル中のタンパク質の可溶化を促進し、かつ、消化後生じたペプチドの容器への吸着を妨げる効果を発揮するため、消化および抽出効率が向上したと考えられている。
【０００７】
しかし、難溶性の膜タンパク質の場合には、トリプシン消化液の可溶化力が、消化されたタンパク質の回収率に大きく影響し、n-オクチルグルコシドを加えても、まだ回収率が十分とはいえず、さらなる手法の改善が求められていた。
【非特許文献１】Karn, P. Science 270: 369-370. 1995.
【非特許文献２】Katayama H, Nagasu T, Oda Y. RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY. 15:1416-1421. 2001.
【非特許文献３】Katayama H, Satoh K, Takeuchi M, Deguchi-Tawarada M, Oda Y, Nagasu T. RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY. 17:1071-1078. 2003.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、プロテオーム解析において、より発現量の少ないタンパク質を効率よく同定することにある。より詳細には、ゲル中のタンパク質を消化する過程において、効率のよい界面活性剤を見出し、従来の方法では検出することができなかった発現量の少ないタンパク質を同定することにある。
【０００９】
また、プロテオーム解析において、疎水性アミノ酸を多く含むタンパク質、例えば、膜タンパク質を効率よく同定することにある。より詳細には、従来知られている界面活性剤に比べ、逆相クロマトグラフィーにおいて保持時間が長い界面活性剤を見出し、従来の方法では検出することができなかった疎水性アミノ酸を多く含むタンパク質、例えば、膜タンパク質を効率よく同定することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、ゲル中のタンパク質を消化する際に、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideを添加したところ、ゲル中のタンパク質を消化する効率が向上することを見出した。そして、質量分析計で測定し、タンパク質を同定したところ、従来の方法では、検出することができなかったタンパク質を同定することができることを見出した。
【００１１】
また、従来知られている界面活性剤に比べ、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideは、タンパク質分解酵素によりゲル中のタンパク質を消化させる効率が良いこと、及びLC-MS解析においてペプチドピークとオーバーラップしないとことにより、従来の方法では、検出することができなかった疎水性アミノ酸を多く含むタンパク質、例えば、膜タンパク質を効率よく同定することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、以下に関する。
（１）次式（１）：
【化６】
2006003337.tif 000003
[式中、nは1から7の整数を表す。]
で示される化合物の存在下にゲル中のタンパク質を消化することを特徴とする、ゲル中のタンパク質の消化方法。
【００１３】
（２）ゲル中のタンパク質を消化する方法であって、
タンパク質をゲル電気泳動により分離する工程と、
当該分離されたタンパク質を含むゲルを切り出す工程と、
次式（１）：
【化７】
2006003337.tif 000004
[式中、nは1から7の整数を表す。]
で示される化合物の存在下に、前記切り出されたゲル中のタンパク質をタンパク質分解酵素で処理する工程と、
を含む、前記方法。
【００１４】
（３）タンパク質の分析方法であって、
タンパク質をゲル電気泳動により分離する工程と、
当該分離されたタンパク質を含むゲルを切り出す工程と、
次式（１）：
【化８】
2006003337.tif 000005
[式中、nは1から7の整数を表す。]
で示される化合物の存在下に、前記切り出されたゲル中のタンパク質をタンパク質分解酵素で処理する工程と、
前記酵素処理により消化されたタンパク質の質量を測定する工程と、
を含む、前記方法。
【００１５】
（４）タンパク質の分析方法であって、
タンパク質をゲル電気泳動により分離する工程と、
当該分離されたタンパク質を含むゲルを切り出す工程と、
次式（１）：
【化９】
2006003337.tif 000006
[式中、nは1から7の整数を表す。]
で示される化合物の存在下に、前記切り出されたゲル中のタンパク質をタンパク質分解酵素で処理する工程と、
前記酵素処理により消化されたタンパク質を抽出する工程と、
前記抽出されたタンパク質の質量を測定する工程と、
を含む、前記方法。
【００１６】
（５）式（１）中nが5である、（１）または（２）に記載の方法。
【００１７】
（６）式（１）中nが5である、（３）または（４）に記載の方法。
【００１８】
（７）タンパク質分解酵素が、トリプシンである、（２）〜（６）のいずれか１項に記載の方法。
【００１９】
（８）ゲルが、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルである、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の方法。
【００２０】
（９）  次式（１）：
【化１０】
2006003337.tif 000007
[式中、nは1から7の整数を表す。]
で示される化合物を含有する、タンパク質のゲル内消化添加剤。
【００２１】
（１０）式（１）中nが5である、（９）に記載の添加剤。
【００２２】
（１１）（１）〜（８）のいずれか１項に記載の方法に用いられることを特徴とする、（９）または（１０）に記載の添加剤。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、プロテオーム解析において、より発現量の少ないタンパク質を効率よく同定することが可能となった。より詳細には、ゲル中のタンパク質を消化する過程において、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideを添加することで、ゲル中のタンパク質を消化する効率が向上することが可能となった。そして、従来の方法では、検出することができなかったタンパク質を同定することが可能となった。
【００２４】
また、本発明により、プロテオーム解析において、疎水性アミノ酸を多く含むタンパク質、例えば、膜タンパク質を効率よく同定することが可能となった。より詳細には、従来知られている界面活性剤に比べ、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideは、その存在下において、トリプシンなどのタンパク質分解酵素によりゲル中のタンパク質を消化させる効率が良いこと、及びLC-MS解析において疎水性ペプチドピークとオーバーラップしないとことにより、従来の方法では、検出することができなかったタンパク質を同定することが可能となった。
【００２５】
従来の方法では検出することができなかった発現量の少ないタンパク質の中には、生体、組織、細胞などにおける機能発現に重要なタンパク質も多く含まれると考えられ、生体、組織、細胞などにおけるタンパク質の機能解析に非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
【００２７】
本発明は、ゲル内のタンパク質をタンパク質分解酵素により消化し、抽出する過程において、界面活性剤である5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideを添加することで、ゲル中のタンパク質を消化、抽出する効率が向上することに基づくタンパク質消化方法及びタンパク質分析方法である。5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideは、タンパク質分解酵素の活性を阻害することなく、ゲル中のタンパク質の可溶化を促進することで、タンパク質の消化、抽出の効率を向上させることができる。
【００２８】
本発明において「タンパク質」とは、２以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したペプチドを含む。
本発明において「サンプル」とは、タンパク質を含む測定対象物を示し、好ましくは、組織、生体液、細胞、細胞器官又はタンパク質複合体を指す。組織としては、例えば、脳、脳の各部位（例えば、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、十二指腸、小腸、大腸、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、耳下腺、舌下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などがあげられる。生体液としては、例えば、血液（血漿、血清を含む）、尿、糞、唾液、涙液、浸潤液（腹水、組織液を含む）などがあげられる。細胞としては、例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例えば、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好酸球、好塩基球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、間質細胞もしくはこれらの前駆細胞、幹細胞、癌細胞などがあげられる。細胞器官としては、例えば、核、細胞小器官（核小体、核膜、細胞膜、ミトコンドリア、リソソーム、リボソーム、ペルオキシソーム、小胞体（粗面小胞体、滑面小胞体、筋小胞体など）、ゴルジ体、微小管、中心体、アクチンフィラメントなど）、サイトゾル、シナプス、基底膜、細胞間接着装置などがあげられる。タンパク質複合体とは、二以上のタンパク質が物理的に結合している状態のものをいう。また、サンプルは、植物であってもよい。ここにあげたものは具体例であって、これらに限定されるものではない。
【００２９】
１．タンパク質の消化方法
本発明は、下記式（１）で表される化合物の存在下にゲル中のタンパク質を消化することを特徴とする、ゲル中のタンパク質を消化する方法を提供する。
【００３０】
【化１１】
2006003337.tif 000008
[式中、nは1から7の整数を表す。]
【００３１】
式（１）で表される化合物は、nが５から７であることが好ましく、nが５であることが特に好ましい。
【００３２】
本発明において用いる式（１）で表される化合物は、公知の方法で製造することができ、代表的な例として、アメリカ特許公報US5674987およびUS5763586に開示される方法によれば容易に製造することができる。
また、本発明において用いる式（１）で表される化合物は、アナトレース社（Anatrace Inc., Maumee, OH, USA）から購入することができる。
【００３３】
式（１）で表される化合物は、最も好ましい化合物として、nが5である5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideがあげられる。
5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideとは、分子量494.5、分子式C23H42O11からなり、その構造式を以下に示す。
【００３４】
【化１２】
2006003337.tif 000009
【００３５】
本発明において用いる5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideは、公知の方法で製造することができ、代表的な例として、アメリカ特許公報US5674987およびUS5763586に開示される方法によれば容易に製造することができる。
また、本発明において用いる5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideは、アナトレース社（Anatrace Inc., Maumee, OH, USA）から購入することができる。
【００３６】
一般的な界面活性剤であるn-オクチルグルコシドの臨界ミセル濃度 (CMC) は、約20 mM程度であるのに対して、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideのCMCは、約2 mMである。ゲル中のタンパク質を消化する場合において、消化時に加える液量（タンパク質消化酵素、界面活性剤、緩衝液などからなる液の量）は、切り出したゲルの体積に依存するため、大きいゲル片中で消化する場合には、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideは、実質的にn-オクチルグルコシドの10倍量液を加えることができ、タンパク質を消化する効率の点で有利となる。大きいゲル片中で消化する場合の典型例には、GeLCMS法がある。これは、SDS-PAGEのバンドのパターンを無視して、泳動ゲルを均等に分けた後ゲル中でタンパク質を消化し、LC-MSで解析する方法である。
【００３７】
ゲルは、ゲル中に測定対象となるタンパク質を含むものであれば、特に限定されないが、電気泳動に用いるゲルが好ましい。電気泳動に用いるゲルとしては、例えば、アガロースゲル、ネイティブポリアクリルアミドゲル、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルなどがあげられ、好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルである。
【００３８】
測定対象となるタンパク質を含むゲルを、式（１）で表される化合物の存在下にタンパク質分解酵素で消化することで、効率よくタンパク質を消化することができる。
【００３９】
式（１）で表される化合物は、０．０１％（Ｗ／Ｖ）から０．３％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０２％（Ｗ／Ｖ）から０．２％（Ｗ／Ｖ）、特に好ましくは０．０３％（Ｗ／Ｖ）から０．１％（Ｗ／Ｖ）、例えば、０．１％（Ｗ／Ｖ）加えることができる。
タンパク質分解酵素は、例えば、トリプシン、キモトリプシン、Lys-C、Asp-N、Glu-Cなどがあげられ、好ましくはトリプシンである。
【００４０】
本発明は、ゲル中のタンパク質を消化する方法であって、タンパク質をゲル電気泳動により分離する工程と、当該分離されたタンパク質を含むゲルを切り出す工程と、式（１）で表される化合物の存在下に、前記切り出されたゲル中のタンパク質をタンパク質分解酵素で処理する工程と、を含む、ゲル中のタンパク質を消化する方法を提供する。
以下により本発明の方法を詳細に記載する。
【００４１】
（１）タンパク質の調製
本発明に用いるタンパク質は、特に限定されないが、プロテオーム解析においては、サンプル（例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官又はタンパク質複合体等）中の複数のタンパク質が好ましい。サンプル中のタンパク質は、以下のように調製することができる。
【００４２】
サンプルを破砕し、タンパク質を抽出後、分画することができる。これを分画したサンプルとする。破砕および抽出する方法は、ダウンス型テフロンTM・ホモジナイザーTM、ポリトロン、ワーリング・ブレンダー、ポッター型ガラス・ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液（例えばピアス社のM-PER: cat no. 78501, T-PER: cat no. 78510など）を用いる方法又は凍結融解法があげられ、好ましくはダウンス型テフロンTM・ホモジナイザー、ポッター型ガラス・ホモジナイザーを用いる方法である。分画する方法は、分画遠心法やショ糖密度勾配遠心法などがあげられ、好ましくはショ糖密度勾配遠心法である。
【００４３】
次に、必要に応じて、分画したサンプルを精製することができる。これを精製したサンプルとする。精製する方法は、群特異的アフィニティーカラム精製、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを利用する方法、免疫沈降法、硫安沈殿法、有機溶媒による沈殿法、限外ろ過法、ゲルろ過法、透析法などがあげられ、好ましくは群特異的アフィニティーカラム精製である。破砕・抽出、分画、精製の各操作は、これらに限定されるものではなく、当業者における技術常識により、適当なものを選択し、また、組み合わせればよい。なお、群特異的アフィニティーカラムとは、目的とするタンパク質群を特異的に精製可能なアフィニティーカラムを意味する。
【００４４】
（２）タンパク質をゲル電気泳動により分離する工程
本発明において採用されるゲル電気泳動は、電気泳動によりタンパク質が分子量や等電点の違いにより分離できる限り特に限定されないが、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、等電点電気泳動、2次元電気泳動などがあげられ、好ましくはドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）である。
【００４５】
（３）分離されたタンパク質を電気泳動に用いたゲルごと切り出す工程
上記電気泳動後、タンパク質を含むゲルを切り出す。すなわち、泳動されたタンパク質部分をゲルごと切り出すことにより、タンパク質を含むゲルを得る。
分離されたタンパク質を電気泳動に用いたゲルごと切り出す工程は、特に限定されないが、例えば、電気泳動終了後、亜鉛-イミダゾール法によるネガティブ染色、クマシーブリリアントブルー染色、銀染色等、好ましくは、亜鉛-イミダゾール法によるネガティブ染色により、タンパク質の検出を行い、タンパク質の存在するバンド部分を切り出すことができる。また、網羅的にタンパク質を解析する場合には、ゲルを電気泳動レーンごと又はバンドごとに細かく切り出すこともできる。
【００４６】
（４）タンパク質分解酵素及び式（１）で表される化合物の存在下にゲル中でタンパク質を消化する工程
上記切り出されたゲル中には、所定のタンパク質が含まれている。このタンパク質を消化するために、例えばエッペンドルフチューブ内においてタンパク質分解酵素をゲルに添加する。本発明は、タンパク質分解酵素処理の際に、式（１）で表される化合物の存在下に、ゲル中でタンパク質を消化することを特徴とする。この消化工程は、切り出されたゲルに、タンパク質分解酵素及び式（１）で表される化合物を添加して、緩衝液中でインキュベートすることにより行うことができる。前述のとおり、式（１）で表される化合物は、０．０１〜０．３％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０２〜０．２％（Ｗ／Ｖ）、特に好ましくは０．０３〜０．１％（Ｗ／Ｖ）、例えば０．１％（Ｗ／Ｖ）加えることができる。
【００４７】
タンパク質分解酵素は、例えば、トリプシン、キモトリプシン、Lys-C、Asp-N、Glu-Cなどがあげられ、好ましくはトリプシンである。
【００４８】
インキュベーションに用いる緩衝液は、特に限定されないが、タンパク質分解酵素の特性に合わせて選択することができる。例えば、トリプシンの場合には、弱アルカリ緩衝液（例えば、炭酸水素アンモニウム溶液など）が好ましい。また、タンパク質分解酵素の濃度は、タンパク質を分解し得る濃度であれば、特に限定されない。
【００４９】
インキュベーションの温度条件は、15℃から90℃の条件、好ましくは20℃から50℃の条件、例えば、37℃の条件であり、また、インキュベーションの時間は、30分以上、好ましくは2時間以上、例えば4時間である。
【００５０】
また、本工程において、ゲルは、必要に応じて、脱染色することができる。また、このとき、適当な溶液、例えば、水/メタノール/酢酸溶液（水：メタノール：酢酸を４：５：１の比率で混合した溶液）を加えて振とうすることにより洗浄することができる。
さらに、脱染色後は、ただちに脱色液を捨て、還元液、例えば、10-15 mM DTT-100 mM炭酸水素アンモニウム溶液（アンモニア水でpHを8.3-8.9に上げる）を加えて15分間程度振とうし、還元処理後、液を捨てて0.7 Mアクリルアミド-100 mM 炭酸水素アンモニウム溶液（アンモニア水でpHを8.3-8.9に上げる）を加えて15分間程度振とうすることが好ましい。
【００５１】
さらに、本工程において、必要に応じて、ゲルを溶液で平衡化した後、スピードバックなどで乾固することができる。続いて、乾固したゲルに対して、式（１）で表される化合物およびトリプシンを加えることができる。
以上の工程を行うことで、ゲル中のタンパク質を消化することができる。
【００５２】
２．タンパク質の分析方法
本発明は、タンパク質の分析方法であって、タンパク質をゲル電気泳動により分離する工程と、当該分離されたタンパク質を含むゲルを切り出す工程と、式（１）で表される化合物の存在下に、前記切り出されたゲル中のタンパク質をタンパク質分解酵素で処理する工程と、前記酵素処理により消化されたタンパク質の質量を測定する工程と、
を含む、タンパク質の分析方法を提供する。
【００５３】
当該タンパク質の分析方法は、上記ゲル中のタンパク質を消化する方法（上記１．（１）〜（４））によって得られたタンパク質を質量分析計にて測定することにより行うことができる。
消化されたタンパク質は、抽出することが望ましい。抽出方法は、特に限定されず、例えば、アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸（TFA）溶液、アセトニトリル/0.1%ギ酸溶液、好ましくは、アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸（TFA）溶液を用いて抽出することができる。
【００５４】
抽出したタンパク質溶液は、脱塩を行うことが好ましい。脱塩は、当業者において質量分析に通常使用されるものを適宜選択すればよく、例えば、ステージチップ（Rappsilber J., Ishihama Y., Mann M., Anal. Chem, 75: 663-670. 2003.）により行うことができる。
【００５５】
質量分析計は、特に限定されないが、ガスクロマトグラフと結合された質量分析装置であるガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー（GC/MS）や液体クロマトグラフと結合された質量分析装置である液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー（LC/MS）等の汎用の装置、好ましくは、LC/MSを用いて行うことができる。質量分析計におけるイオン化方法は、各装置に応じて適宜選択できる。例えば、MALDI（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）、ESI（エレクトロスプレーイオン化法）、EI（電子イオン化法）、CI（化学イオン化法）、APCI（大気圧化学イオン化法）、FAB（高速原子衝撃法）、LD、FD、SIMS、TSP等があげられ、好ましくはMALDI又はESIである。アナライザーは、各装置に応じて適宜選択できる。例えば、TOF（飛行時間型）、イオントラップ、二重収束型、四重極型、フーリエ変換型等の汎用の装置を用いて行うことができる。質量分析の装置及び方法は、ここにあげたものに限定されるものではなく、当業者において質量分析に通常使用されるものを適宜選択すればよい。
【００５６】
LC/MSのカラムは、当業者において質量分析に通常使用されるものを適宜選択すればよく、例えば、C18修飾したシリカ粒子を詰めたもの、イオン交換カラムおよびC18修飾したシリカ粒子を詰めたものを組み合わせたものを用いることができる。
【００５７】
LC/MSの移動相は、当業者において質量分析に通常使用されるものを適宜選択すればよく、例えば、酢酸/アセトニトリル、ギ酸/アセトニトリルなどを用いることができる。また、トリフルオロ酢酸（TFA）を加えることができる。
【００５８】
LC/MSのモードは、当業者において質量分析に通常使用されるものを適宜選択すればよく、例えば、逆相クロマトグラフィーモード、イオン交換-逆相クロマトグラフィーモード、ゲルろ過-逆相クロマトグラフィーモードなどで行うことができる。
【００５９】
質量分析計による測定の結果得られたデータを用いて、タンパク質を同定することができる。すなわち、得られたデータをソフトフェア（例えば、SonarMSMS（Genomic solution社製））およびデータベース（例えば、NCBInr（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、IPI、Sport等のデータベース）を使用することにより解析し、サンプル中のタンパク質を同定することが可能である。質量分析計による測定データを用いて、タンパク質を同定することは当業者にとって容易である（Nat Genet. 1998: 20, 46-50; J Cell Biol. 1998: 141, 967-977; J Cell Biol. 2000: 148, 635-651; Nature. 2002: 415, 141-147; Nature. 2002: 415, 180-183; Curr Opin Cell Biol. 2003: 15, 199-205; Curr Opin Cell Biol. 2003: 7, 21-27）。同定されたタンパク質の情報から、アミノ酸配列情報を得ることは、当業者にとって容易である。
【００６０】
３．ゲル内消化添加剤
本発明は、式（１）で表される化合物を含有する、タンパク質のゲル内消化添加剤を提供する。
タンパク質のゲル内消化添加剤としては、式（１）中nが5である5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideが好ましい。
当該ゲル内消化添加剤は、式（１）で表される化合物を含有するものであればその濃度は特に限定されない。その使用量は、ゲル中のタンパク質をタンパク質分解酵素で処理する反応液中濃度が、０．０１％（Ｗ／Ｖ）から０．３％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０２％（Ｗ／Ｖ）から０．２％（Ｗ／Ｖ）、特に好ましくは０．０３％（Ｗ／Ｖ）から０．１％（Ｗ／Ｖ）、例えば、０．１％（Ｗ／Ｖ）である。当該ゲル内消化添加剤は、本発明のタンパク質の消化方法またはタンパク質の分析方法に用いられる。
【００６１】
以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。
【実施例１】
【００６２】
１．タンパク質の調製
常法にしたがって培養したヒト大腸癌細胞株HCT116（ATCC社）及びヒト肺癌細胞株PC9（免疫生物研究所）を回収した後、ホモジナイザーで破砕した。次に、当該破砕した細胞を10,000 gで遠心した。そして、上清を除去し、沈殿した画分に対して1％ドデシル硫酸ナトリウム（以下、SDSと称する場合がある）溶液を加えてタンパク質を抽出し、これを膜画分とした。
【００６３】
２．タンパク質の電気泳動
SDSで抽出した膜画分を泳動距離が5または10 cmの5-20％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（DRC株式会社製）にそれぞれ添加し、電圧150Ｖにて5 cmのゲルは30分間、10 cmのゲルは2 時間、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、SDS-PAGEと称する場合がある）を行った。
【００６４】
３．分離されたタンパク質を電気泳動に用いたゲルごと切り出す工程
電気泳動終了後、亜鉛-イミダゾール法によるネガティブ染色（WAKO社製）を行い、タンパク質の検出を行った。その後、展開したサンプルレーンを泳動方向にそれぞれ8等分し、以下に示す方法によって、ゲル内消化を行った。
【００６５】
４．タンパク質分解酵素及び5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideを添加してゲル中でタンパク質を消化する工程
切り出したゲル片は、ネガティブ染色キットの脱染色液で脱染色した後に水/メタノール/酢酸溶液（水：メタノール：酢酸を４：５：１の比率で混合した溶液）を加えてエッペンドルフチューブを振とうすることにより洗浄した。この操作を30分間、4セット行った。
【００６６】
脱色後ただちに脱色液を捨て、還元液10-15 mM DTT-100 mM炭酸水素アンモニウム溶液(アンモニア水でpHを8.3-8.9に上げる)を加えて15分間振とうした。次に、還元処理後、液を捨てて0.7 Mアクリルアミド-100 mM 炭酸水素アンモニウム溶液(アンモニア水でpHを8.3-8.9に上げる)を加えて15分間振とうした。
【００６７】
次に、炭酸水素アンモニウム溶液でゲルを平衡化し、スピードバックで乾固した。続いて、乾固したゲルに対して、0.1% 5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltoside（アナトレース社製）または0.1% n-オクチルグルコシド（Dojindo社製）を含み、トリプシン濃度が200 ng/100 μlである炭酸水素アンモニウム緩衝液を加え、37℃で4時間インキュベートした。消化後、アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸（TFA）溶液（アセトニトリル：0.1%トリフルオロ酢酸（TFA）を75:25の比率で混合した溶液）で消化されたタンパク質の抽出を行った。
【００６８】
５．質量分析計にて測定する工程
抽出したタンパク質溶液は、ステージチップ（Rappsilber J., Ishihama Y., Mann M., Anal. Chem, 75 (2003) 663-670）により脱塩を行い、LC/MS/MS法で測定を行った。LC-MSのカラムには内径100μmにC18修飾したシリカ粒子を詰めたものを用い、酢酸/アセトニトリル系の移動相を利用した逆相クロマトグラフィーモードで測定した。
【００６９】
６．解析結果
HCT116およびPC9由来のペプチドについて、各々重複を省いたペプチド数を算出してその値を合計した。
その結果、長さ10 cmのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルで分離した場合において（図１「long」）、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideを添加した場合には（図１「Pep-Cymal5」）、1588個のペプチドを同定し、一方、n-オクチルグルコシドを添加した場合には（図１「Pep-OG」）、1427個のペプチドを同定した。また、長さ5 cmのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルで分離した場合において（図１「short」）、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideを添加した場合には（図１「Pep-Cymal5」）、2461個のペプチドを同定し、一方、n-オクチルグルコシドを添加した場合には（図１「Pep-OG」）、2178個のペプチドを同定した。よって、長いゲル、短いゲルいずれの場合においても、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideは、n-オクチルグルコシドよりも良好な結果を示した（図１）。
【００７０】
以上の結果から、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideを添加することで、ゲル中のタンパク質を消化する効率を向上させることが可能となり、より発現量の少ないタンパク質を効率よく同定することが可能となった。
【実施例２】
【００７１】
膜タンパク質由来のペプチドは、疎水性アミノ酸を多く含むため、逆相クロマトグラフィーにおいては保持が強い。よって、界面活性剤の溶出時間が疎水性ペプチドピークの溶出時間と重なると疎水性ペプチドのシグナルが抑制され、膜タンパク質の解析が困難となる。そこで、n-オクチルグルコシドと5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideとの溶出時間における効果を比較するため、下記手順に従い、HCT116の膜画分より抽出したタンパク質をゲル中で消化し、LC-MSで測定を行った。
【００７２】
１．タンパク質の調製
常法にしたがって培養したヒト大腸癌細胞株HCT116（ATCC社）及びヒト肺癌細胞株PC9（免疫生物研究所）を回収した後、ホモジナイザーで破砕した。次に、当該破砕した細胞を10,000 gで遠心した。そして、上清を除去し、沈殿した画分に対して1％ドデシル硫酸ナトリウム（以下、SDSと称する場合がある）溶液を加えてタンパク質を抽出し、これを膜画分とした。
【００７３】
２．タンパク質の電気泳動
SDSで抽出した膜画分を泳動距離が5または10 cmの5-20％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（DRC株式会社製）にそれぞれ添加し、電圧150Ｖにて5 cmのゲルは30分間、10 cmのゲルは2 時間、SDS-PAGEを行った。
【００７４】
３．分離されたタンパク質を電気泳動に用いたゲルごと切り出す工程
電気泳動終了後、亜鉛-イミダゾール法によるネガティブ染色（WAKO社製）を行い、タンパク質の検出を行った。その後、展開したサンプルレーンを泳動方向にそれぞれ8等分し、以下に示す方法によって、ゲル内消化を行った。
【００７５】
４．タンパク質分解酵素及び5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideを添加してゲル中でタンパク質を消化する工程
切り出したゲル片は、ネガティブ染色キットの脱染色液で脱染色した後に水/メタノール/酢酸溶液（水：メタノール：酢酸を４：５：１の比率で混合した溶液）を加えてエッペンドルフチューブを振とうすることにより洗浄した。この操作を30分間、4セット行った。
【００７６】
脱色後ただちに脱色液を捨て、還元液10-15 mM DTT-100 mM炭酸水素アンモニウム溶液(アンモニア水でpHを8.3-8.9に上げる)を加えて15分間振とうした。次に、還元処理後、液を捨てて0.7 Mアクリルアミド-100 mM 炭酸水素アンモニウム溶液(アンモニア水でpHを8.3-8.9に上げる)を加えて15分間振とうした。
【００７７】
次に、炭酸水素アンモニウム溶液でゲルを平衡化し、スピードバックで乾固した。続いて、乾固したゲルに対して、0.1% 5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltoside（アナトレース社製）または0.1% n-オクチルグルコシド（Dojindo社製）を含む200 ng/100 μlトリプシン溶液（炭酸水素アンモニウム溶液）を加え、37℃で4時間インキュベートした。消化後、アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸（TFA）溶液（アセトニトリル：0.1%トリフルオロ酢酸（TFA）を75:25の比率で混合した溶液）で消化されたタンパク質の抽出を行った。
【００７８】
５．質量分析計にて測定する工程
抽出したタンパク質溶液は、ステージチップ（Rappsilber J., Ishihama Y., Mann M., Anal. Chem, 75 (2003) 663-670）により脱塩を行い、LC/MS/MS法で測定を行った。LC-MSのカラムには内径100 μmにC18修飾したシリカ粒子を詰めたものを用い、酢酸/アセトニトリル系の移動相を利用した逆相クロマトグラフィーモードで測定した。
【００７９】
６．解析結果
LC-MS において、n-オクチルグルコシドは、約84.5分に溶出しているのに対して（図２（Ａ））、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideは、約88.4分に溶出した（図２（Ｂ））。これは、逆相クロマトグラフィーにおいて、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideの方が、n-オクチルグルコシドに比べ、さらに保持が強いことによる。図２（Ａ）および（Ｂ）において、各上段は、n-オクチルグルコシドまたは5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideのピークを示している（矢印）。
次に、ペプチドピークと界面活性剤のピークの重なりを確認するために、LC-MSの時間軸に対して同定されたペプチド数をプロットした（図３）。その結果、82分以降の拡大図（図３の右グラフ）を見ると、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideのピークは、すべてのペプチドが溶出された後に検出されているのに対して、n-オクチルグルコシドのピークは、まだペプチドが溶出している時間帯に溶出してしまっている。また、80分以前の保持が弱い時間帯においても5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideの方が、同定されているペプチド数が多い。
よって、n-オクチルグルコシドに比べ、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideの方が、ゲル中のタンパク質を消化させる効率が良いこと、及び、ペプチドピークとオーバーラップしないことにより、タンパク質の分析において良い結果を得ていると考えられる。
次に、同定されたタンパク質をGene Ontology (http://www.geneontology.org/) データベースで再検索し、膜タンパク質の数を抽出した（図４）。その結果、n-オクチルグルコシドを用いたときは、同定された膜タンパク質数は455個であったのに対して、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideを用いたときは、同定された膜タンパク質数は505個となった。
【００８０】
以上の結果から、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideは、膜タンパク質の解析に有用であることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明により、プロテオーム解析において、より発現量の少ないタンパク質を効率よく同定することが可能となった。より詳細には、ゲル中のタンパク質を消化し、抽出する過程において、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideを添加することで、ゲル中のタンパク質を消化する効率が向上することが可能となった。そして、従来の方法では、検出することができなかったタンパク質を同定することが可能となった。
【００８２】
また、本発明により、プロテオーム解析において、疎水性アミノ酸を多く含むタンパク質、例えば、膜タンパク質を効率よく同定することが可能となった。より詳細には、従来知られている界面活性剤に比べ、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideは、ゲル中のタンパク質を消化させる効率が良いこと、及びLC-MS解析においてペプチドピークとオーバーラップしないとことにより、従来の方法では、検出することができなかったタンパク質を同定することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、n-オクチルグルコシドまたは5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideを添加した場合において、質量分析により同定できたペプチドの数を比較したものである。縦軸は、同定できたペプチドの数を表す。横軸中、shortは、長さ5 cmのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル、longは、長さ10 cmのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルを表す。白カラム（Pep-OG）は、n-オクチルグルコシドを添加した場合、黒カラム（Pep-Cymal-5）は、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideを添加した場合をそれぞれ表す。
【図２】図２は、n-オクチルグルコシド（A）または5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltoside（B）を添加した場合において、タンパク質を質量分析（LC-MS）により測定したトータルイオンクロマトグラム（TIC）を示す。各図上段は、n-オクチルグルコシドまたは5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideのピークを示している（矢印）。また、各図上段は、各図下段の円におけるマススペクトルを示す。
【図３】図３は、ペプチドピークと界面活性剤のピークの重なりを確認するために、LC-MSの時間軸に対して同定されたペプチド数をプロットしたものである。右図は、82分以降を拡大したものである。当該拡大図を見ると、5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosideのピークは、すべてのペプチドが溶出された後に検出されているのに対して、n-オクチルグルコシドのピークは、まだペプチドが溶出している時間帯に溶出していることがわかる。
【図４】図４は、同定されたタンパク質をGene Ontology (http://www.geneontology.org/) データベースで再検索し、膜タンパク質の数を抽出した結果を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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