(57)【要約】      （修正有）【課題】 カスタステロン（ステロイドC-6位ケトン）からブラシノライド（ステロイドB環ラクトン）への反応（バイヤー・ビリガー反応）を触媒する新規なブラシノライド合成酵素及びその遺伝子を提供すること。【解決手段】  下記の何れかのアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子。（１）特定のアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；（２）上記のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；又は（３）上記のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の何れかのアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；
【請求項２】
下記の何れかの塩基配列から成る、請求項１に記載の遺伝子。
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列から成り、ブラシノライド合成酵素をコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列から成り、ブラシノライド合成酵素をコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列から成り、ブラシノライド合成酵素をコードする塩基配列；
【請求項３】
植物に由来する遺伝子である、請求項１又は２に記載の遺伝子。
【請求項４】
植物がトマトである、請求項３に記載の遺伝子。
【請求項５】
下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；
【請求項６】
請求項１から４の何れかに記載の遺伝子を含む組み換えベクター。
【請求項７】
請求項１から４の何れかに記載の遺伝子又は請求項６に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養し、培養物から請求項５に記載のタンパク質を採取することを含む、請求項５に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項９】
請求項５に記載のタンパク質あるいは請求項７に記載の形質転換体又はその培養物を用いて、ブラシノライドを合成する方法。
【請求項１０】
基質として6-デオキソカスタステロン及び／又はカスタステロンを使用する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
下記の何れかのアミノ酸配列から成るタンパク質あるいは上記タンパク質を発現する形質転換体又はその培養物を用いて、ブラシノライドを合成する方法。
（１）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；
【請求項１２】
基質として6-デオキソカスタステロン及び／又はカスタステロンを使用する、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トマトなどから得ることのできるブラシノライド合成酵素及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
シトクロムP450酸化酵素（P450）はブラシノステロイド生合成の多くのステップに関与する。ブラシノステロイドのC-6位の酸化はその生理活性に重要であり、P450の一つであるC-6位酸化酵素により触媒される。ブラシノライドの直接の前駆体であるカスタステロンは、C-6位酸化酵素により6-デオキソカスタステロンからそのC-6水酸化を経て合成される。現在までに、カスタステロンの合成酵素であるシトクロームP450酵素CYP85Aは、トマトCYP85A1 (非特許文献１)、シロイヌナズナCYP85A1(非特許文献２)、シロイヌナズナCYP85A2(非特許文献３)、及びイネCYP85A1(非特許文献４)が知られている。いずれも酵母で機能的にタンパク質を発現させることにより6-デオキソカスタステロンからカスタステロンへの触媒能力が確認されているが、ブラシノライドへの変換は報告されていない。
【０００３】
カスタステロンからブラシノライドへの変換はC-6位のさらなる酸化（バイヤー・ビリガー反応）により行なわれ、この反応にはP450の関与が推定されている。しかしながら、このブラシノライド生合成の最終段階を触媒する酵素は同定されていなかった。
【０００４】
【非特許文献１】Bishop, G.J., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1761-1766
【非特許文献２】Shimada, Y., et al. (2001) Plant Physiol. 126, 770-779
【非特許文献３】Shimada, Y., et al. (2003) Plant Physiol. 131, 287-297
【非特許文献４】Hong, Z., et al. (2002) Plant J. 32, 495-508
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ブラシノライドの生合成の最終段階であるカスタステロン（ステロイドC-6位ケトン）からブラシノライド（ステロイドB環ラクトン）への反応（バイヤー・ビリガー反応）は、シトクロームP450酵素により触媒されることが植物培養細胞を用いた代謝実験により確かめられていた（Kim, T.-W. et al. (2004) Phytochemistry 65, 679-689.; Bishop, G.J., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1761-1766.）。しかしながら、現在までその酵素遺伝子の同定には至っていなかった。本発明は、カスタステロン（ステロイドC-6位ケトン）からブラシノライド（ステロイドB環ラクトン）への反応（バイヤー・ビリガー反応）を触媒する新規なブラシノライド合成酵素及びその遺伝子を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
トマトの<I>dwarf</I>突然変異体は、ブラシノステロイド生合成に欠陥を有する矮性種であり、その原因遺伝子<I>Dwarf</I>はブラシノステロイドC-6位酸化酵素（CYP85A1）をコードしている。もっとも表現型の厳しい<I>extreme dwarf</I> (<I>d<SUP>x</SUP></I>)は<I>CYP85A1</I>遺伝子を完全に欠いており、茎葉においてはカスタステロンおよびブラシノライドは検出されず、6-デオキソカスタステロンの異常な蓄積が観察される。そのBR欠損により<I>d<SUP>x</SUP></I>突然変異体は茎葉の伸長抑制、葉の形態異常、および稔性の減少を引き起こすが、低頻度ではあるが比較的正常な果実を着ける。この<I>d<SUP>x</SUP></I>の果実における内生ブラシノステロイド含量をGC-MSを用いて分析したところ、ブラシノライドが野生型と比較して非常に高濃度で蓄積していることを見出した。一方、<I>d<SUP>x</SUP></I>突然変異体の果実におけるカスタステロンは野生型よりも低濃度であり、その前駆体である6-デオキソカスタステロンは野生型とほぼ同じレベルであった。これらの結果は、トマトの果実において6-デオキソカスタステロンからブラシノライドへの変換を触媒する酵素の存在を示唆するものである。
【０００７】
本発明者らは、<I>d<SUP>x</SUP></I>突然変異体の果実において発現するP450遺伝子を探索し、6-デオキソカスタステロンからブラシノライドへの変換を触媒する新規C-6位酸化酵素を同定した。このP450の転写産物はトマトの茎葉と根では検出されず、<I>d<SUP>x</SUP></I>突然変異体の果実に比較的高いレベルで蓄積していた。トマト新規C-6位酸化酵素を生産する形質転換酵母と重水素標識6-デオキソカスタステロンをインキュベートしたところ、重水素標識ブラシノライドへの変換がGC-MS分析により確認された。
【０００８】
上記の通り、本発明者らは、植物のステロイド成長ホルモンであるブラシノステロイドに関して、最も活性型であるブラシノライドの合成酵素の同定に成功した。また、本発明者らは、新たにシロイヌナズナCYP85A2もブラシノライド合成能をもつことを発見した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、下記の何れかのアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子が提供される。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；
【００１０】
好ましくは、 下記の何れかの塩基配列から成る遺伝子が提供される。
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列から成り、ブラシノライド合成酵素をコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列から成り、ブラシノライド合成酵素をコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列から成り、ブラシノライド合成酵素をコードする塩基配列；
【００１１】
好ましくは、本発明の遺伝子は、植物に由来する遺伝子であり、さらに好ましくは植物はトマトである。
【００１２】
本発明の別の側面によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質が提供される。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の遺伝子を含む組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の遺伝子又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の形質転換体を培養し、培養物から本発明のタンパク質を採取することを含む、本発明のタンパク質の製造方法が提供される。
【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のタンパク質あるいは形質転換体又はその培養物を用いて、ブラシノライドを合成する方法が提供される。
好ましくは、基質として6-デオキソカスタステロン及び／又はカスタステロンを使用する。
【００１５】
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのアミノ酸配列から成るタンパク質あるいは上記タンパク質を発現する形質転換体又はその培養物を用いて、ブラシノライドを合成する方法が提供される。
（１）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；
好ましくは、基質として6-デオキソカスタステロン及び／又はカスタステロンを使用する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のブラシノライド合成酵素は、カスタステロン合成酵素と同じシトクロームP450酵素のCYP85Aファミリーであり、ブラシノステロイドC-6位の三段階の酸化を触媒する。これは、ステロイドのラクトン体を生成する初めての酵素の発見である。この酵素の利用により容易にブラシノライドを合成できるようになり大規模な農業利用を可能とする。また、この酵素の利用はその特異的なバイヤー・ビリガー反応により新たな薬剤を生成する道具となりうる可能性を秘めている。トマトでは、ブラシノライド合成酵素は果実特異的に発現しており、内生ブラシノライドも果実特異的に存在している。さらに、シロイヌナズナのブラシノライド合成酵素（CYP85A2）に欠陥のある突然変異体では、茎葉サイズは野生型とほぼ同等であるが、明らかな稔性の低下が観察される。これらは、ブラシノライドの生殖成長への関与を示すものである。本発明のブラシノライド合成酵素は植物の果実形成などの制御に有効利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の遺伝子
ブラシノライドの前駆体のカスタステロンは、シトクロームP450酵素CYP85Aに触媒され6-デオキソカスタステロンから二段階の酸化を経て合成される（Bishop et al., 1999）。本発明者らは今回、その酵素が欠損したトマト矮性種dxの果実から新たにトマトCYP85A1と85%の相同性をもつタンパク質をコードする遺伝子を単離した。この遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示し、アミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。この遺伝子は断片ですら「国際塩基配列データベース」に登録されていない新規の遺伝子であった。酵母にて機能的に発現させることにより、そのタンパク質は6-デオキソカスタステロンからカスタステロン経てブラシノライドを合成する新規のシトクロームP450酵素であることが確認された。
【００１８】
即ち、本発明の遺伝子は、下記の何れかのアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子である。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；
【００１９】
本発明の遺伝子の具体例としては、下記の何れかの塩基配列から成る遺伝子が挙げられる。
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列から成り、ブラシノライド合成酵素をコードする塩基配列；
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列から成り、ブラシノライド合成酵素をコードする塩基配列；又は
（３）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列から成り、ブラシノライド合成酵素をコードする塩基配列；
【００２０】
本発明において、「ブラシノライド合成酵素」とは、ブラシノステロイドC-6位の三段階の酸化を触媒する活性を有する酵素であり、例えば、基質としての6-デオキソカスタステロン又はカスタステロンに作用することによってブラシノライドを合成することができる酵素である。
本発明の遺伝子は、例えば、トマトなどの植物から単離することができる。
【００２１】
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００２２】
本明細書で言う「配列表の配列番号２（又は４）に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」における相同性は、７０％以上であれば特に限定されないが、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％、特に好ましくは９５％以上である。
【００２３】
本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００２４】
上記した「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０MのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２５】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２６】
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１又は２に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いてトマト由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、本発明の遺伝子を発現している細胞から常法により作製することができる。
【００２７】
ＰＣＲ法により本発明の遺伝子を取得することもできる。トマト由来の染色体ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００２８】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２９】
また、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；並びに配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列から成り、ブラシノライド合成酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を変異遺伝子と称する）については、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００３０】
例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００３１】
（２）本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、下記の何れかのアミノ酸配列を有する。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、ブラシノライド合成酵素活性を有するアミノ酸配列；
【００３２】
本発明のタンパク質はブラシノライド合成酵素活性を有するタンパク質である。本発明のタンパク質あるいはそれを発現する微生物（形質転換体など）又はその培養物の存在下において基質（例えば、6-デオキソカスタステロン、又はカスタステロン）を反応させることにより、ブラシノライドを合成することができる。上記したブラシノライドの合成方法も本発明の範囲内に含まれる。
【００３３】
本発明のタンパク質の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質でもよい。
組み換えタンパク質を作製する場合には、先ず、本明細書の上記（１）に記載した当該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質を産生することができる。発現系でのタンパク質の発現については本明細書中後記する。
【００３４】
（３）本発明の組み換えベクター
本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
【００３５】
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００３６】
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰLプロモータ、大腸菌の lac、trp若しくはtacプロモータなどが挙げられる。
【００３７】
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
【００３８】
また、本発明の遺伝子は必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。
【００３９】
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
【００４０】
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の遺伝子、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００４１】
（４）本発明の形質転換体及びそれを用いた組み換えタンパク質の製造
本発明の遺伝子又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明の遺伝子または組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
【００４２】
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００４３】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００４４】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００４５】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）。
【００４６】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
【００４７】
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
【００４８】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００４９】
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
【００５０】
例えば、本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
（１）植物材料：
トマト(Lycopersicon esculentum、品種 Ailsa Craig)の野生型とシトクロームP450酵素CYP85A1欠損突然変異体 extreme dwarf (dx)は自然光下のグラスハウスで成育させた。
【００５２】
（２）ブラシノライド合成酵素の単離：
PCRプライマー D-F1（TGCCTAARRTTGATSAGTTTATGAG）（配列番号５）と D-R1（TATACRTATATTCTCCAWCCTTTAGG）（配列番号６）は、トマトCYP85A1、シロイヌナズナCYP85A1及び CYP85A2の間で保存性の高い配列をもとに設計された。PCR機器は GeneAmp PCR System 9700 (PE Applied Biosystems)を 、酵素は Expand High Fidelity PCR System (Roche)を使用して、 dxの葉から抽出したゲノムDNAから2426bp 遺伝子断片をPCR増幅させた。ABI PRISM 3100 sequencer (Amersham Biosciences) を用いて塩基配列を決定したところ、その産物は新規のCYP85A遺伝子断片を含んでいた。その配列から遺伝子特異的なプライマー、D-R3 for 5' end（CCATCATAGAAGTAGTGGAGACAG）（配列番号７）、D-R7 for 5' end（ CTTGAGCTATTGATGAGCTTGTTG）（配列番号８）、D-R5 for 5' end（CATTGCAATTATCCCAACCAC）（配列番号９）、D-F2 for 3' end（GTGGTTGGGATAATTGCAATG）（配列番号１０）及びD-F6 for 3' end（GTGTTCTTAGGAAAACCACACAAG）（配列番号１１）を設計した。dxの未熟果実（直径約2cm）の総RNAから合成した一本鎖cDNA群を鋳型にして、5' 及び 3' RACE (rapid amplification of cDNA ends) 法を行うことにより、下記の完全長cDNA配列（1404 bp）を決定した。また、単離した遺伝子は、トマトの茎葉や根では発現しておらず、果実特異的に発現していることをRT-PCR法で確認した。
【００５３】
単離したブラシノライド合成酵素の遺伝子（トマト由来）の塩基配列を配列表の配列番号１に記載し、アミノ酸配列を配列表の配列番号２に記載する。
【００５４】
（３）ブラシノライド合成酵素の機能実験１：
トマトのブラシノライド合成酵素遺伝子は、PCRプライマーToD2-F1（GAAGATCTATGGCCATTTTCTTGATAATTTTTG：スタートコドン直前にBgl II 制限酵素部位を配置） （配列番号１２）とToD2-R1（GGGGTACCTTAGTAAGCTGAAACCTTAATCCATAG：ストップコドン直後にKpn I制限酵素部位を配置）（配列番号１３）を用いて、dx未熟果実の一本鎖cDNA群からPCR増幅した。その産物をBgl II及びKpn I制限酵素で消化した後、制限酵素BamH I及び Kpn Iで消化したpYeDP60ベクターに結合した。pYeDP60ベクターはガラクトース存在下でシトクロームP450タンパク質を誘導する既知ベクターである(Pompon,D. et al. (1996) Methods Enzymol. 272, 51-64)。そのプラスミドは、ガラクトース存在下でアラビドプシスのシトクロームP450還元酵素１を共発現させる既知のWAT11 酵母に形質転換させた(Pompon,D. et al. (1996) Methods Enzymol. 272, 51-64)。
【００５５】
形質転換体は10 ml のSGI 液体培地（Glucose 20g, Yeast Nitrogen Base without Amino Acids 6.7g, Bacto Casamino Acid 1g, DL-Tryptophan 40mg, dist H2O 1L）に植え付け、30℃で24時間振とう(200rpm)培養した。その培養液1 ml を10 mlの SLI液体培地（Galactose 20g, Yeast Nitrogen Base without Amino Acids 6.7g, Bacto Casamino acid 1g, DL-Tryptophan 40mg, dist H2O 1L, pH 5.4） に植え付け、28℃で4 x 107 cells per ml濃度に増殖するまで振とう培養した。増殖した形質転換酵母は500 x g 遠心で沈殿させ、新しいSLI液体培地で8x 106 cells per ml濃度になるように懸濁した。その形質転換培地5mlに1 μg (2μlのエタノールに溶解) の基質ブラシノステロイドを加え、28℃で6 x 107 cells per ml濃度に増殖するまで振とう培養した。
【００５６】
培養後の形質転換体培地は酢酸エチルで抽出され、その抽出物は酢酸エチルと0.5 M リン酸水素二カリウムバッファー(pH 9)間で溶媒分配された。酢酸エチル区は溶媒を乾燥除去した後、80%メタノールとヘキサン間で溶媒分配された。80%メタノール区は溶媒を乾燥除去した後、GC-MS分析のため、メタンホウ素酸ピリジン溶液（2mg mL-1）を加え、70℃で30分間加温してビスメタンボロネート体に誘導体化した。GC-MS はAutomass (JEOL) - 6890N (Agilent technologies) を、カラムは DB-1 column (J & W Scientific; 0.25 mm x 15 m; 0.25 μm film thickness) を用いて代謝物を分析した。
【００５７】
結果を図１に示す。その結果、6-デオキソカスタステロンの代謝物として、カスタステロンとブラシノライドが検出された。また、カスタステロンを代謝させると、ブラシノライドが検出された。これによりブラシノライド合成酵素が初めて同定された。この酵素は、6-デオキソカスタステロンから二段階の酸化によりカスタステロンを生成し、さらにバイヤー・ビリガー反応によるブラシノライド合成を触媒する新規のシトクロームP450酵素である（下図）。
【００５８】
【化１】
2006109728.tif 000002
【００５９】
（４）ブラシノライド合成酵素の機能実験２：
シロイヌナズナのカスタステロン合成酵素遺伝子として知られていたCYP85A2遺伝子（塩基配列を配列表の配列番号３に記載、アミノ酸配列を配列表の配列番号４に記載する）に、PCRプライマー85A2-F1(CGGGATCCATGGGCATAATGATGATGATTTTG：スタートコドン直前にBamH I制限酵素部位を配置)（配列番号１４） と 85A2-R1（GGGGTACCTCAGTAAGGTGAACACTTAAGATGG：ストップコドン直後にKpn I制限酵素部位を配置）（配列番号１５）を用いて制限酵素部位を挿入し、pYeDP60ベクターへ結合させた。機能実験１のトマトのブラシノライド合成酵素と同様の実験を行った。結果を図２に示す。その結果、6-デオキソカスタステロンの代謝物として、カスタステロンとブラシノライドが検出された。また、カスタステロンを代謝させると、ブラシノライドが検出された。したがって、この酵素も、6-デオキソカスタステロンからカスタステロンを経てブラシノライドの合成を触媒するブラシノライド合成酵素であることが新たに明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、本発明のトマト由来のブラシノライド合成酵素の機能実験の結果を示す。
【図２】図２は、シロイヌナズナ由来のカスタステロン合成酵素遺伝子の機能実験の結果を示す。
【００６１】
(配列表)
<110> RIKEN
<120> brassinolide synthase
<130> A41829A
<160> 15
<210> 1
<211> 1404
<212> DNA
<213> Tomato
<400> 1
atg gcc att ttc ttg ata att ttt gtt gtg ttt ttt gga ttt tgc att 48
Met Ala Ile Phe Leu Ile Ile Phe Val Val Phe Phe Gly Phe Cys Ile
1               5                  10                  15
ttg agt act cct cta ttt aga tgg att gac att gtg tac aac aag aaa 96
Leu Ser Thr Pro Leu Phe Arg Trp Ile Asp Ile Val Tyr Asn Lys Lys
20                  25                  30
aat ttg cct cct gga act atg ggt tgg cca att ttt ggt gag act agg 144
Asn Leu Pro Pro Gly Thr Met Gly Trp Pro Ile Phe Gly Glu Thr Arg
35                  40                  45
gaa ttt cta aat caa ggt cca aat ttc atg aaa aat caa aga gca agg 192
Glu Phe Leu Asn Gln Gly Pro Asn Phe Met Lys Asn Gln Arg Ala Arg
50                  55                  60
tat ggg aat ttc ttc aaa tcc cac ata ctt ggt tgc cct act gtt gtt 240
Tyr Gly Asn Phe Phe Lys Ser His Ile Leu Gly Cys Pro Thr Val Val
65                  70                  75                  80
tca atg gat gca ggg ttg aat gta tat att ctg aat aat gaa gca aag 288
Ser Met Asp Ala Gly Leu Asn Val Tyr Ile Leu Asn Asn Glu Ala Lys
85                  90                  95
gga ctt atc cca ggc tac cca cag tcc atg tta gac att tta ggg aaa 336
Gly Leu Ile Pro Gly Tyr Pro Gln Ser Met Leu Asp Ile Leu Gly Lys
100                 105                 110
tgc aat att gct gct gtg cat ggt gct act cac aag tac att aga gga 384
Cys Asn Ile Ala Ala Val His Gly Ala Thr His Lys Tyr Ile Arg Gly
115                 120                 125
gca ctt tta tct cta ata aat ccc aca atg atc aaa gac cat att ttg 432
Ala Leu Leu Ser Leu Ile Asn Pro Thr Met Ile Lys Asp His Ile Leu
130                 135                 140
ccc aaa att gat aaa ttc atg aga tca cat ttg agt ggt tgg gat aat 480
Pro Lys Ile Asp Lys Phe Met Arg Ser His Leu Ser Gly Trp Asp Asn
145                 150                 155                 160
tgc aat gtc att gat att caa caa atg acc aaa gag atg gca ttt ttc 528
Cys Asn Val Ile Asp Ile Gln Gln Met Thr Lys Glu Met Ala Phe Phe
165                 170                 175
tca tca ttg gac caa att ggt ggg ttt gca aca agc tca tca ata gct 576
Ser Ser Leu Asp Gln Ile Gly Gly Phe Ala Thr Ser Ser Ser Ile Ala
180                 185                 190
caa gaa ttc agg gct gga ttc ttg aat att gca ctt gga act att tca 624
Gln Glu Phe Arg Ala Gly Phe Leu Asn Ile Ala Leu Gly Thr Ile Ser
195                 200                 205
ttg cct atc aac ttt ccc acc aca aac tat tat cgc gga tta cag ggg 672
Leu Pro Ile Asn Phe Pro Thr Thr Asn Tyr Tyr Arg Gly Leu Gln Gly
210                 215                 220
cgg aaa acc att gtc aaa cta ttg agg aaa ata ata gaa gat aga aga 720
Arg Lys Thr Ile Val Lys Leu Leu Arg Lys Ile Ile Glu Asp Arg Arg
225                 230                 235                 240
ggt agc aag aaa att caa caa gac atg ctt ggt ttg atg atg aat gaa 768
Gly Ser Lys Lys Ile Gln Gln Asp Met Leu Gly Leu Met Met Asn Glu
245                 250                 255
gaa gca aaa aat aga tac aca tta agt gat gaa gag cta att gat caa 816
Glu Ala Lys Asn Arg Tyr Thr Leu Ser Asp Glu Glu Leu Ile Asp Gln
260                 265                 270
att ata aca ata atg tat tct gga ttt gaa act gtc tcc act act tct 864
Ile Ile Thr Ile Met Tyr Ser Gly Phe Glu Thr Val Ser Thr Thr Ser
275                 280                 285
atg atg gct gtc aag tat ctt cat gat cat cca aaa gca ctt gaa gaa 912
Met Met Ala Val Lys Tyr Leu His Asp His Pro Lys Ala Leu Glu Glu
290                 295                 300
att aga aaa gaa cat ttt gca atc aga gaa aag aag agt ctg gag gat 960
Ile Arg Lys Glu His Phe Ala Ile Arg Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp
305                 310                 315                 320
cca att gat tac aat gat ttt aag gct atg aga ttt aca agg gct gtg 1008
Pro Ile Asp Tyr Asn Asp Phe Lys Ala Met Arg Phe Thr Arg Ala Val
325                 330                 335
ata tat gag aca tta agg ttg gca aca att gta aat ggt gtt ctt agg 1056
Ile Tyr Glu Thr Leu Arg Leu Ala Thr Ile Val Asn Gly Val Leu Arg
340                 345                 350
aaa acc aca caa gat atg gaa tta aat gga tac atg att ccc aaa gga 1104
Lys Thr Thr Gln Asp Met Glu Leu Asn Gly Tyr Met Ile Pro Lys Gly
355                 360                 365
tgg agg ata tat gtg tac aca aga gag ctt aac tat gat cca ttg att 1152
Trp Arg Ile Tyr Val Tyr Thr Arg Glu Leu Asn Tyr Asp Pro Leu Ile
370                 375                 380
tat cct gac ccg tat acc ttt aac cca tgg aga tgg ctg gaa aat aac 1200
Tyr Pro Asp Pro Tyr Thr Phe Asn Pro Trp Arg Trp Leu Glu Asn Asn
385                 390                 395                 400
ttg gac cac caa agc tct ttc ttg atg ttt gga gga ggt aca agg ctt 1248
Leu Asp His Gln Ser Ser Phe Leu Met Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu
405                 410                 415
tgt cct gga aag gaa cta ggt gtg gct gaa att tca aca ttt ctt cat 1296
Cys Pro Gly Lys Glu Leu Gly Val Ala Glu Ile Ser Thr Phe Leu His
420                 425                 430
tac ttc gtt aca aga tac agg tgg gaa gag gtt gga gga aat aag ctg 1344
Tyr Phe Val Thr Arg Tyr Arg Trp Glu Glu Val Gly Gly Asn Lys Leu
435                 440                 445
atg aaa ttt cct aga gtt gaa gca cta aat ggc cta tgg att aag gtt 1392
Met Lys Phe Pro Arg Val Glu Ala Leu Asn Gly Leu Trp Ile Lys Val
450                 455                 460
tca gct tac taa                                                 1404
Ser Ala Tyr
465
<210> 2
<211> 467
<212> PRT
<213> Tomato
<400> 2
Met Ala Ile Phe Leu Ile Ile Phe Val Val Phe Phe Gly Phe Cys Ile
1               5                  10                  15
Leu Ser Thr Pro Leu Phe Arg Trp Ile Asp Ile Val Tyr Asn Lys Lys
20                  25                  30
Asn Leu Pro Pro Gly Thr Met Gly Trp Pro Ile Phe Gly Glu Thr Arg
35                  40                  45
Glu Phe Leu Asn Gln Gly Pro Asn Phe Met Lys Asn Gln Arg Ala Arg
50                  55                  60
Tyr Gly Asn Phe Phe Lys Ser His Ile Leu Gly Cys Pro Thr Val Val
65                  70                  75                  80
Ser Met Asp Ala Gly Leu Asn Val Tyr Ile Leu Asn Asn Glu Ala Lys
85                  90                  95
Gly Leu Ile Pro Gly Tyr Pro Gln Ser Met Leu Asp Ile Leu Gly Lys
100                 105                 110
Cys Asn Ile Ala Ala Val His Gly Ala Thr His Lys Tyr Ile Arg Gly
115                 120                 125
Ala Leu Leu Ser Leu Ile Asn Pro Thr Met Ile Lys Asp His Ile Leu
130                 135                 140
Pro Lys Ile Asp Lys Phe Met Arg Ser His Leu Ser Gly Trp Asp Asn
145                 150                 155                 160
Cys Asn Val Ile Asp Ile Gln Gln Met Thr Lys Glu Met Ala Phe Phe
165                 170                 175
Ser Ser Leu Asp Gln Ile Gly Gly Phe Ala Thr Ser Ser Ser Ile Ala
180                 185                 190
Gln Glu Phe Arg Ala Gly Phe Leu Asn Ile Ala Leu Gly Thr Ile Ser
195                 200                 205
Leu Pro Ile Asn Phe Pro Thr Thr Asn Tyr Tyr Arg Gly Leu Gln Gly
210                 215                 220
Arg Lys Thr Ile Val Lys Leu Leu Arg Lys Ile Ile Glu Asp Arg Arg
225                 230                 235                 240
Gly Ser Lys Lys Ile Gln Gln Asp Met Leu Gly Leu Met Met Asn Glu
245                 250                 255
Glu Ala Lys Asn Arg Tyr Thr Leu Ser Asp Glu Glu Leu Ile Asp Gln
260                 265                 270
Ile Ile Thr Ile Met Tyr Ser Gly Phe Glu Thr Val Ser Thr Thr Ser
275                 280                 285
Met Met Ala Val Lys Tyr Leu His Asp His Pro Lys Ala Leu Glu Glu
290                 295                 300
Ile Arg Lys Glu His Phe Ala Ile Arg Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp
305                 310                 315                 320
Pro Ile Asp Tyr Asn Asp Phe Lys Ala Met Arg Phe Thr Arg Ala Val
325                 330                 335
Ile Tyr Glu Thr Leu Arg Leu Ala Thr Ile Val Asn Gly Val Leu Arg
340                 345                 350
Lys Thr Thr Gln Asp Met Glu Leu Asn Gly Tyr Met Ile Pro Lys Gly
355                 360                 365
Trp Arg Ile Tyr Val Tyr Thr Arg Glu Leu Asn Tyr Asp Pro Leu Ile
370                 375                 380
Tyr Pro Asp Pro Tyr Thr Phe Asn Pro Trp Arg Trp Leu Glu Asn Asn
385                 390                 395                 400
Leu Asp His Gln Ser Ser Phe Leu Met Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu
405                 410                 415
Cys Pro Gly Lys Glu Leu Gly Val Ala Glu Ile Ser Thr Phe Leu His
420                 425                 430
Tyr Phe Val Thr Arg Tyr Arg Trp Glu Glu Val Gly Gly Asn Lys Leu
435                 440                 445
Met Lys Phe Pro Arg Val Glu Ala Leu Asn Gly Leu Trp Ile Lys Val
450                 455                 460
Ser Ala Tyr
465
<210> 3
<211> 1398
<212> DNA
<213> Arabidopsis
<400> 3
atg ggc ata atg atg atg att ttg ggt ctt ctt gtg atc att gtt tgt 48
Met Gly Ile Met Met Met Ile Leu Gly Leu Leu Val Ile Ile Val Cys
1               5                  10                  15
tta tgt act gct ctt ctc cga tgg aac cag atg cga tat tct aag aaa 96
Leu Cys Thr Ala Leu Leu Arg Trp Asn Gln Met Arg Tyr Ser Lys Lys
20                  25                  30
ggt ctt cct cct gga acc atg ggc tgg cca ata ttt ggt gaa acg act 144
Gly Leu Pro Pro Gly Thr Met Gly Trp Pro Ile Phe Gly Glu Thr Thr
35                  40                  45
gag ttt ctt aaa caa gga cca gat ttc atg aaa aac caa aga cta aga 192
Glu Phe Leu Lys Gln Gly Pro Asp Phe Met Lys Asn Gln Arg Leu Arg
50                  55                  60
tat ggg agt ttc ttc aag tct cac att ctt ggt tgc cca aca ata gtc 240
Tyr Gly Ser Phe Phe Lys Ser His Ile Leu Gly Cys Pro Thr Ile Val
65                  70                  75                  80
tca atg gac gca gag tta aac aga tac att cta atg aat gaa tcg aaa 288
Ser Met Asp Ala Glu Leu Asn Arg Tyr Ile Leu Met Asn Glu Ser Lys
85                  90                  95
gga ctt gtt gcc ggt tac ccg caa tct atg ctt gat att cta ggg aca 336
Gly Leu Val Ala Gly Tyr Pro Gln Ser Met Leu Asp Ile Leu Gly Thr
100                 105                 110
tgc aac ata gct gcg gtt cat ggc ccg agc cac cgg cta atg aga ggc 384
Cys Asn Ile Ala Ala Val His Gly Pro Ser His Arg Leu Met Arg Gly
115                 120                 125
tcg ttg ctt tct tta ata agc cca acc atg atg aaa gac cat ctc ttg 432
Ser Leu Leu Ser Leu Ile Ser Pro Thr Met Met Lys Asp His Leu Leu
130                 135                 140
cct aag att gat gat ttc atg aga aac tat ctt tgt ggt tgg gat gat 480
Pro Lys Ile Asp Asp Phe Met Arg Asn Tyr Leu Cys Gly Trp Asp Asp
145                 150                 155                 160
ctt gag aca gtt gat atc caa gaa aag acc aaa cat atg gca ttt tta 528
Leu Glu Thr Val Asp Ile Gln Glu Lys Thr Lys His Met Ala Phe Leu
165                 170                 175
tca tcg ttg tta caa ata gct gag act ttg aaa aaa cca gag gtt gaa 576
Ser Ser Leu Leu Gln Ile Ala Glu Thr Leu Lys Lys Pro Glu Val Glu
180                 185                 190
gaa tat aga aca gag ttt ttc aag ctt gtt gtg gga act cta tcg gtc 624
Glu Tyr Arg Thr Glu Phe Phe Lys Leu Val Val Gly Thr Leu Ser Val
195                 200                 205
ccg atc gat atc ccg gga acg aat tac cgc agt gga gtc caa gca aga 672
Pro Ile Asp Ile Pro Gly Thr Asn Tyr Arg Ser Gly Val Gln Ala Arg
210                 215                 220
aac aac atc gat agg tta ttg aca gaa ctg atg caa gaa aga aaa gag 720
Asn Asn Ile Asp Arg Leu Leu Thr Glu Leu Met Gln Glu Arg Lys Glu
225                 230                 235                 240
tct gga gaa act ttc aca gac atg ttg ggt tac ttg atg aag aag gaa 768
Ser Gly Glu Thr Phe Thr Asp Met Leu Gly Tyr Leu Met Lys Lys Glu
245                 250                 255
gat aac cga tac ttg tta acc gat aaa gag ata aga gat caa gtg gta 816
Asp Asn Arg Tyr Leu Leu Thr Asp Lys Glu Ile Arg Asp Gln Val Val
260                 265                 270
acg atc ttg tat tcc ggt tat gag act gtc tct aca acc tcc atg atg 864
Thr Ile Leu Tyr Ser Gly Tyr Glu Thr Val Ser Thr Thr Ser Met Met
275                 280                 285
gct ctt aag tat ctc cat gat cat cca aaa gct ctt gaa gaa ctc aga 912
Ala Leu Lys Tyr Leu His Asp His Pro Lys Ala Leu Glu Glu Leu Arg
290                 295                 300
aga gaa cat ttg gct ata agg gag aga aaa cga cct gac gaa ccg ctc 960
Arg Glu His Leu Ala Ile Arg Glu Arg Lys Arg Pro Asp Glu Pro Leu
305                 310                 315                 320
act ctc gac gat att aaa tcg atg aaa ttc act cga gct gtg atc ttt 1008
Thr Leu Asp Asp Ile Lys Ser Met Lys Phe Thr Arg Ala Val Ile Phe
325                 330                 335
gag aca tca aga ttg gca acg att gtt aat ggt gtc ctt agg aaa act 1056
Glu Thr Ser Arg Leu Ala Thr Ile Val Asn Gly Val Leu Arg Lys Thr
340                 345                 350
act cac gac tta gaa ctc aac ggt tat tta atc cca aaa ggt tgg aga 1104
Thr His Asp Leu Glu Leu Asn Gly Tyr Leu Ile Pro Lys Gly Trp Arg
355                 360                 365
att tac gta tac aca aga gag att aac tat gat aca tct ctt tat gaa 1152
Ile Tyr Val Tyr Thr Arg Glu Ile Asn Tyr Asp Thr Ser Leu Tyr Glu
370                 375                 380
gat cca atg atc ttt aac cca tgg aga tgg atg gaa aag agc tta gaa 1200
Asp Pro Met Ile Phe Asn Pro Trp Arg Trp Met Glu Lys Ser Leu Glu
385                 390                 395                 400
tca aag agc tat ttc tta ctc ttt gga ggt gga gtt agg ctt tgc cct 1248
Ser Lys Ser Tyr Phe Leu Leu Phe Gly Gly Gly Val Arg Leu Cys Pro
405                 410                 415
gga aag gaa cta gga atc tcg gaa gtc tca agc ttc ctt cac tac ttt 1296
Gly Lys Glu Leu Gly Ile Ser Glu Val Ser Ser Phe Leu His Tyr Phe
420                 425                 430
gtt aca aaa tat aga tgg gaa gag aat gga gaa gac aaa tta atg gtc 1344
Val Thr Lys Tyr Arg Trp Glu Glu Asn Gly Glu Asp Lys Leu Met Val
435                 440                 445
ttt cca aga gtt tct gca cca aaa gga tac cat ctt aag tgt tca cct 1392
Phe Pro Arg Val Ser Ala Pro Lys Gly Tyr His Leu Lys Cys Ser Pro
450                 455                 460
tac tga                                                         1398
Tyr
465
<210> 4
<211> 465
<212> PRT
<213> Arabidopsis
<400> 4
Met Gly Ile Met Met Met Ile Leu Gly Leu Leu Val Ile Ile Val Cys
1               5                  10                  15
Leu Cys Thr Ala Leu Leu Arg Trp Asn Gln Met Arg Tyr Ser Lys Lys
20                  25                  30
Gly Leu Pro Pro Gly Thr Met Gly Trp Pro Ile Phe Gly Glu Thr Thr
35                  40                  45
Glu Phe Leu Lys Gln Gly Pro Asp Phe Met Lys Asn Gln Arg Leu Arg
50                  55                  60
Tyr Gly Ser Phe Phe Lys Ser His Ile Leu Gly Cys Pro Thr Ile Val
65                  70                  75                  80
Ser Met Asp Ala Glu Leu Asn Arg Tyr Ile Leu Met Asn Glu Ser Lys
85                  90                  95
Gly Leu Val Ala Gly Tyr Pro Gln Ser Met Leu Asp Ile Leu Gly Thr
100                 105                 110
Cys Asn Ile Ala Ala Val His Gly Pro Ser His Arg Leu Met Arg Gly
115                 120                 125
Ser Leu Leu Ser Leu Ile Ser Pro Thr Met Met Lys Asp His Leu Leu
130                 135                 140
Pro Lys Ile Asp Asp Phe Met Arg Asn Tyr Leu Cys Gly Trp Asp Asp
145                 150                 155                 160
Leu Glu Thr Val Asp Ile Gln Glu Lys Thr Lys His Met Ala Phe Leu
165                 170                 175
Ser Ser Leu Leu Gln Ile Ala Glu Thr Leu Lys Lys Pro Glu Val Glu
180                 185                 190
Glu Tyr Arg Thr Glu Phe Phe Lys Leu Val Val Gly Thr Leu Ser Val
195                 200                 205
Pro Ile Asp Ile Pro Gly Thr Asn Tyr Arg Ser Gly Val Gln Ala Arg
210                 215                 220
Asn Asn Ile Asp Arg Leu Leu Thr Glu Leu Met Gln Glu Arg Lys Glu
225                 230                 235                 240
Ser Gly Glu Thr Phe Thr Asp Met Leu Gly Tyr Leu Met Lys Lys Glu
245                 250                 255
Asp Asn Arg Tyr Leu Leu Thr Asp Lys Glu Ile Arg Asp Gln Val Val
260                 265                 270
Thr Ile Leu Tyr Ser Gly Tyr Glu Thr Val Ser Thr Thr Ser Met Met
275                 280                 285
Ala Leu Lys Tyr Leu His Asp His Pro Lys Ala Leu Glu Glu Leu Arg
290                 295                 300
Arg Glu His Leu Ala Ile Arg Glu Arg Lys Arg Pro Asp Glu Pro Leu
305                 310                 315                 320
Thr Leu Asp Asp Ile Lys Ser Met Lys Phe Thr Arg Ala Val Ile Phe
325                 330                 335
Glu Thr Ser Arg Leu Ala Thr Ile Val Asn Gly Val Leu Arg Lys Thr
340                 345                 350
Thr His Asp Leu Glu Leu Asn Gly Tyr Leu Ile Pro Lys Gly Trp Arg
355                 360                 365
Ile Tyr Val Tyr Thr Arg Glu Ile Asn Tyr Asp Thr Ser Leu Tyr Glu
370                 375                 380
Asp Pro Met Ile Phe Asn Pro Trp Arg Trp Met Glu Lys Ser Leu Glu
385                 390                 395                 400
Ser Lys Ser Tyr Phe Leu Leu Phe Gly Gly Gly Val Arg Leu Cys Pro
405                 410                 415
Gly Lys Glu Leu Gly Ile Ser Glu Val Ser Ser Phe Leu His Tyr Phe
420                 425                 430
Val Thr Lys Tyr Arg Trp Glu Glu Asn Gly Glu Asp Lys Leu Met Val
435                 440                 445
Phe Pro Arg Val Ser Ala Pro Lys Gly Tyr His Leu Lys Cys Ser Pro
450                 455                 460
Tyr
465
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 5
tgcctaarrt tgatsagttt atgag                     25
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 6
tatacrtata ttctccawcc tttagg                    26
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 7
ccatcataga agtagtggag acag                      24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 8
cttgagctat tgatgagctt gttg                      24
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 9
cattgcaatt atcccaacca c                         21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 10
gtggttggga taattgcaat g                         21
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 11
gtgttcttag gaaaaccaca caag                      24
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 12
gaagatctat ggccattttc ttgataattt ttg            33
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 13
ggggtacctt agtaagctga aaccttaatc catag          35
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 14
cgggatccat gggcataatg atgatgattt tg             32
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 15
ggggtacctc agtaaggtga acacttaaga tgg            33
【図１】
2006109728.tif 000003
【図２】
2006109728.tif 000004