(57)【要約】【課題】  できるだけ実験時の環境にかかわらず、再現性があり信頼できるデータを得ることができるプローブアレイ及びそれを用いた試料とのハイブリダイゼーションの結果から信頼できるデータを得ることができ、解析時間の短縮を実現するためのデータ処理方法を提供すること。【解決手段】  固相上に複数種類のプローブのそれぞれを固定してスポットを形成し、同一種類のプローブのスポットを複数設けるとともに、各同一種類プローブスポットのプローブ固定量を均等としたプローブアレイを用意し、これに試料を反応させて得られるプローブ・標的物質ハイブリッド体の形成をシグナルとして数値化し、各同一種類プローブスポットからの数値データをまとめ、かつ異常値を排除して集計する。【選択図】    図２
2006322741.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種類のプローブの各々を互いに区別し得るスポットとして固相上に固定配置したプローブアレイに標的物質を含む試料を反応させて得られる該固相上でのプローブ・ハイブリッド体の形成をシグナルとして取り出し、該シグナルを数値化してデータ処理するデータ処理方法であって、
（１）前記プローブアレイとして、複数種類のプローブの各々を互いに区別し得るスポットとして固相上に固定配置し、同一種類のプローブについて複数個のスポットを設け、かつこれらの同一種類のプローブは、同一か実質的に同一濃度のプローブ溶液により固相上に固定されたプローブアレイを用い、前記標的物質を含む試料を反応させる工程と、
（２）各スポットからのシグナルを取り込み、数値化し数値データとして取り込む工程と、
（３）前記各スポットから得られた数値化データを同一種類のプローブのスポットからの数値データ毎に集計する工程と、
（４）前記同一種類のプローブのスポットからの数値データから所定の基準に従って異常値を排除し、残りの数値データを処理してハイブリッド体形成を示す数値データを求める工程と
を有することを特徴とするデータ処理方法。
【請求項２】
前記同一種類のプローブのみからなるスポットは、６以上1000以下の個数で前記固相上に配置されている請求項１に記載のデータ処理方法。
【請求項３】
前記同一種類のプローブからなる複数のスポットは、互いに隣り合わない位置に配置されている請求項１または２に記載のデータ処理方法。
【請求項４】
前記同一種類のプローブのＮ個のスポットからの全数値データの平均値を計算するステップと、前記全数値データの分散を計算するステップとを含み、前記分散と前記平均値の値から異常値を排除する請求項１〜３のいずれかに記載のデータ処理方法。
【請求項５】
ハイブリダイゼーション反応のエラーに関する情報を入力するステップを更に含む請求項１〜４のいずれかに記載のデータ処理方法。
【請求項６】
前記同一種類のプローブのＮ個のスポットから得られる数値データ群に所定の割合以上の異常値が含まれる場合に、エラーメッセージを出力するステップを含む請求項１〜５のいずれかに記載のデータ処理方法。
【請求項７】
複数種類のプローブの各々を互いに区別し得るスポットとして固相上に固定配置したプローブアレイに標的物質を含む試料を反応させて得られる該固相上でのプローブ・ハイブリッド体の形成をシグナルとして取り出し、該シグナルを数値化してデータ処理するデータ処理方法であって、
（１）前記プローブアレイとして、複数種類のプローブの各々を互いに区別し得るスポットとして固相上に固定配置し、同一種類のプローブについて複数個のスポットを設け、かつこれらの同一種類のプローブは、同一か実質的に同一濃度のプローブ溶液により固相上に固定されたプローブアレイを用い、前記標的物質を含む試料を反応させる工程と、
（２）各スポットからのシグナルを取り込み、数値化し数値データとして取り込む工程と、
（３）前記各スポットから得られた数値化データを同一種類のプローブのスポットからの数値データ毎に集計する工程と、
（４）前記同一種類のプローブのスポットからの数値データの中央値を求め、
前記中央値をハイブリッド体形成を示す数値データとする工程と
を有することを特徴とするデータ処理方法。
【請求項８】
前記同一種類のプローブのみからなるスポットは、６以上1000以下の個数で前記固相上に配置されている請求項７に記載のデータ処理方法。
【請求項９】
前記同一種類のプローブからなる複数のスポットは、互いに隣り合わない位置に配置されている請求項７または８に記載のデータ処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中に含まれる複数種類の遺伝子等の標的物質の解析を正確に行うことを可能にするプローブアレイの構成、及びそのプローブアレイを用いたハイブリダイゼーション結果の正確な解析に有用なデータ処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム計画に代表されるように各種の生物の遺伝子が解明され、生命活動のメカニズム、病気、体質等と遺伝子の関連が次々と調べられている。そして、遺伝子の有無やその存在量(発現量)を知ることで、例えば病気などのより詳細な特徴やタイピング、あるいは効果的な治療方法の選択などが可能となることがわかってきた。
【０００３】
検体に含まれている特定の遺伝子の有無やその存在量を調べる方法は、昔から多くの方法が考案されている。その中でも応用範囲が広く検出対象によらず適用可能な方法として、検出対象とする遺伝子あるいは核酸（標的物質）の特徴的な部分配列を選び、その部分配列の有無や量を調べることにより、その有無あるいは存在量を調べる方法が広く用いられている。具体的には、選び出された部分配列の相補鎖に相当する核酸配列(プローブ)を用意し、検体（標的物質）とプローブがハイブリダイゼーションすることを何らかの手段で検出することにより、検体中の核酸配列の有無を調べる方法である。
【０００４】
ハイブリダイゼーションを利用した特定の核酸の検出方法は、固相、液相を問わず用いることが可能である。例えば、固相上でハイブリダイゼーションを行う場合には、プローブを固相上に固定または吸着させておき、その固相上に何らかの検出可能な標識物質により標識した検体を添加し、固相上からの標識物質のシグナルを測定することにより検出する方法が代表的である。中でもプローブをガラスや金属などの平面基板上に固定したチップ、あるいは微少粒子表面へ固定したビーズ等は代表的な固相ハイブリダイゼーションの形態である。固相上のハイブリダイゼーションが好まれる理由は、B/F分離が容易であること、検出領域を物理的に微小化でき高感度化が期待できること、複数種のプローブを物理的に隔離することにより同時多項目の検出が可能であること、固相ゆえにその取り扱いや応用が容易に出来るからである。
【０００５】
例えば、米国特許第6410229号明細書において開示されているように、平面基板上に合成されたオリゴＤＮＡに対し、標識された核酸を作用させ、そのハイブリダイゼーションを蛍光検出により測定することで、検体中に含まれる特定の核酸の有無や量を検出している。また、特開2001-128683号公報で開示されているように、あらかじめアミノ基が導入された基板を用いてDNAマイクロアレイを作製し、これを用いて標識された22merの一本鎖DNAを検出している。
【０００６】
ところで、上記のようなハイブリダイゼーションを利用した特定の核酸の検出方法では、標識物質のシグナルを測定し、信号強度を数値化して表すのが一般的である。信号強度を数値化したデータをもとにサンプルに含まれるＤＮＡ、すなわち遺伝子及び発現量を読み取ることが出来る。
【０００７】
特開2003-121441号公報で開示される蛍光シグナル処理方法では、１つのプローブに対して濃度の異なるプローブを用意したマイクロアレイを作成し、2種類の蛍光シグナルを検出してその比と分散を計算することにより、実験結果を評価している。
【特許文献１】米国特許第6410229号明細書
【特許文献２】特開2001-128683号公報
【特許文献３】特開2003-121441号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、ＤＮＡマイクロアレイにおいて、実験から得られる信号強度は実際のサンプルに含まれるＤＮＡ量に必ずしも対応していない、という点も無視できない。例えば、ＤＮＡマイクロアレイ上にスポッティングされたプローブ量が一定でない場合もあり得るし、またハイブリダイゼーションの際に、気泡や不純物の混入により、正しく実験が行なわれていないこともあり得る。
【０００９】
ＣＧＨ（comparative genomic hybridization）法のように、腫瘍ＤＮＡと正常ＤＮＡをそれぞれ違う蛍光色素で標識して同時にハイブリダイゼーションを行い、その強度比によって発現量を解析する場合には、ＤＮＡマイクロアレイのできによらず、また実験中の気泡混入等の環境による影響を緩和することができていたために、シグナルデータは１種あればよかった。しかし、検体のみを検出対象とする場合は、比をとることによって環境の影響をなくすことが出来ず、実験時の環境が結果に反映され、再現性に欠けるなど実験の信頼性が低いという問題があった。
【００１０】
そこで上記問題を鑑み、できるだけ実験時の環境にかかわらず、再現性があり信頼できるデータを得ることができるＤＮＡマイクロアレイ等のプローブアレイを提供することを本発明の第一目的とする。本発明では、詳細は後述するが、１種のプローブに対して複数個のシグナルデータを得られるようなプローブアレイを提供することにより、この課題を解決した。
【００１１】
しかし、上記のように1種のプローブに対して複数個のシグナルデータが得られることになると、その集計方法が問題になってくる。通常考えられるのは、これらのシグナルデータの平均を求めることである。本来、同一のＤＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイゼーションを行った同一種のプローブに関する複数個のシグナルデータは、ほぼ同じシグナル値を示すか、正規分布を取ると考えられる。だが、前述した通り、気泡や不純物の混入によってシグナル値がばらつくことが起こり得る。また、検出手段の１つである蛍光は環境によって変化しやすいことや、検出時において、固相観察における散乱光の影響を受けやすい等の問題があり、シグナルデータの値は正規分布からゆがみが生じたものになる。
【００１２】
そこで、データ集計の際にこれらの異常値を示すデータを、蛍光画像を見ながら手動で排除して、実験データの正確性を確保しようとしていた。しかし、プローブの種類が多くなったり、実験数が増したりするにつれて、これらの処理に時間がかかるといった問題があった。また、画像を見ながらの手動処理では、処理量が多くなると見落としの可能性が出てくるといった問題もあった。
【００１３】
そこで、上記問題を鑑み、信頼できるデータを得ることができ、解析時間の短縮を実現するためのデータ処理方法を提供することが第２の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するために本発明者らは、同一固相上に同一種類のプローブのスポットを複数箇所固定したプローブアレイを用意し、これと試料とを反応させて得られるシグナルデータを効率的に解析する方法を見出した。
【００１５】
すなわち、本発明のデータ処理方法の一態様は、複数種類のプローブの各々を互いに区別し得るスポットとして固相上に固定配置したプローブアレイに標的物質を含む試料を反応させて得られる該固相上でのプローブ・ハイブリッド体の形成をシグナルとして取り出し、該シグナルを数値化してデータ処理するデータ処理方法であって、
（１）前記プローブアレイとして、複数種類のプローブの各々を互いに区別し得るスポットとして固相上に固定配置し、同一種類のプローブについて複数個のスポットを設け、かつこれらの同一種類のプローブは、同一か実質的に同一濃度のプローブ溶液により固相上に固定されたプローブアレイを用い、前記標的物質を含む試料を反応させる工程と、
（２）各スポットからのシグナルを取り込み、数値化し数値データとして取り込む工程と、
（３）前記各スポットから得られた数値化データを同一種類のプローブのスポットからの数値データ毎に集計する工程と、
（４）前記同一種類のプローブのスポットからの数値データから所定の基準に従って異常値を排除し、残りの数値データを処理してハイブリッド体形成を示す数値データを求める工程と
を有することを特徴とするデータ処理方法である。
【００１６】
本発明のデータ処理方法の他の態様は、複数種類のプローブの各々を互いに区別し得るスポットとして固相上に固定配置したプローブアレイに標的物質を含む試料を反応させて得られる該固相上でのプローブ・ハイブリッド体の形成をシグナルとして取り出し、該シグナルを数値化してデータ処理するデータ処理方法であって、
（１）前記プローブアレイとして、複数種類のプローブの各々を互いに区別し得るスポットとして固相上に固定配置し、同一種類のプローブについて複数個のスポットを設け、かつこれらの同一種類のプローブは、同一か実質的に同一濃度のプローブ溶液により固相上に固定されたプローブアレイを用い、前記標的物質を含む試料を反応させる工程と、
（２）各スポットからのシグナルを取り込み、数値化し数値データとして取り込む工程と、
（３）前記各スポットから得られた数値化データを同一種類のプローブのスポットからの数値データ毎に集計する工程と、
（４）前記同一種類のプローブのスポットからの数値データの中央値を求め、
前記中央値をハイブリッド体形成を示す数値データとする工程と
を有することを特徴とするデータ処理方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、１種のプローブに対して複数個のシグナルデータを得られるようなＤＮＡマイクロアレイを提供することにより、実験時の環境にかかわらず、再現性があり信頼できるデータを得ることができるＤＮＡマイクロアレイを提供することができた。
【００１８】
更に、本発明のデータ処理方法によりハイブリダイゼーション時の気泡や不純物の混入による実験エラーを自動的に排除してデータを集計することが可能となり、信頼できるデータを解析の手間をかけることなく得ることができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明において用いることのできるプローブアレイは、固相上に複数種のプローブを各々のプローブごとにスポット状に固定した構成を有する。固相としては、当該分野で利用されているガラス、プラスチックなど各種の材料からなる基板などが利用できる。プローブの固定方法についても、本発明が目的とするシグナルの取り込みが達成できるものであれば特に制限されない。なかでも、プローブの固相上への固定量の制御が容易であり、スポットの高配列密度を達成できるインクジェット法によるスポット形成が特に好ましい。また、スポットの平面形状は、各スポットが互いに独立して認識できるものであれば特に制限されず、円形などの形状が利用できる。スポットの大きさやその固相上での配置密度はデータ取得目的に応じて適宜選択でき、高密度配置としてマイクロアレイとして利用することができる。
【００２０】
複数個設けられる同一種類のプローブのスポットは、各プローブを高密度に配置した場合には、互いに隣接しないように固相上に配置されることが、シグナルの読み取りエラーを防止する上で好ましい。シグナルの読み取りエラーが発生する程度に同一種類のプローブのスポットが近接するような高密度配列を採用した場合には、近接する２つの同一種類のプローブのスポットを結ぶ直線上に他のプローブのスポットが必ず存在するようにこれらを配置することが好ましい。また、逆に、このように隣接する同一種類のスポット間に他のプローブのスポットを配置するようにしておくことで、スポットを高密配置した場合にも、シグナルの読み取りエラーを防止することが可能となる。
【００２１】
本発明においては、同一種類のプローブについては複数のスポットが固相上に形成される。そして、同一種類のプローブの複数のスポットの形成には、同一プローブ溶液、あるいは実質的に同一のプローブ濃度のプローブ溶液が用いられる。その結果、同一種類のプローブのスポットにけるプローブの固定量が均等に設定される。実質的に同一な濃度のプローブ溶液のプローブ濃度のバラツキの範囲は、例えば±３０％、好ましくは±１０％とされる。
【００２２】
このプローブの固定量を均等にする方法としては、先に記載したインクジェット法が特に好ましい。インクジェット法では吐出される微小液滴量を均一にすることが可能であり、同一プローブ濃度の溶液を同量各スポット形成領域に付与することで、各スポットでのプローブ量を均等にすることが可能であり、かかるプローブの同一固定量のスポットを形成する上で特に好ましい。
【００２３】
本発明では、異なる複数種のプローブ（Ｐ１・・・Ｐｎ：ｎ≧２）のそれぞれについて、プローブ固定量の均等な複数のスポット（Ｐ１Ｓ１・・・・Ｐ１ＳＮ；・・・ＰｎＳ１・・・・ＰｎＳＮ）が形成される。ここでＮは後述するデータ処理における信頼性を得る上で、６以上１０００以下に設定することが好ましい。
【００２４】
例えば、後述する実施例では、Ｐ１〜Ｐ３の３種類のプローブの各々について１６個（Ｎ＝１６）のスポットが用意されている。
【００２５】
本発明でのデータ処理方法では、上記のようなプローブアレイとターゲット検体（標的物質）とのハイブリダイゼーション結果について、同一種類のプローブのＮ個のスポットのそれぞれからシグナルを検出して数値化し、それらの数値データを同一種類のプローブごとに集計する。
【００２６】
集計された数値データの処理としては、
（１）こうして得られた複数個の数値データから異常値を排除し、残りのデータを集計して、ハイブリダイゼーション（ハイブリッド体の形成）の結果を示すデータとする処理、及び
（２）こうして得られた複数個の数値データの中央値を求め、この中央値をハイブリダイゼーション（ハイブリッド体の形成）の結果を示す数値データとする処理
のいずれかが用いられる。
【００２７】
上記（１）の処理における異常値の排除方法としては、例えば、各プローブに関して得られた数値データの全数値データの平均値を計算するステップと、各プローブに関して全数値データの分散を計算するステップとを設け、分散と平均値の値から異常値を排除する方法を好適に利用できる。また、あらかじめエラーであることがわかっているスポットに関するデータは最初から排除するステップを設けることにより、不純物や気泡の混入のために実験を失敗とすることなく、貴重な実験データを活かし、より精度の高いデータ処理を実現することができる。
【００２８】
更に、このデータ処理を行うことにより、ハイブリダイゼーションにより得られたデータ群の数値が二極化しているなど、異常な分布を示しているかを検知することができる。その際に、エラーメッセージを出すことにより、実験者に実験上の失敗があったのではないか、もしくはプローブアレイの製造上に不備があったのではないかを示唆することが可能となる。
【００２９】
また、未知試料の試験及び評価を行なう実験者だけではなく製造側の品質評価用途にも、このデータ処理は有効である。製造したプローブアレイに対して標準試料を用いたハイブリダイゼーションを行い、得られたデータについてこのデータ処理を行えば、製造時のエラーではない評価時のエラーによる品質評価への悪影響を排除することが可能となる。
【００３０】
異常値の排除ステップは、必要に応じて条件を変更して、異常値がない状態まで必要回数を繰り返してもよい。こうして異常値を排除して得られた数値データ群に含まれる数値の平均値や分布に基づいて、データ処理対象としたスポットを形成するプローブで検出される検体の試料中での有無を信頼性よく判断できる。更に、同一種類のプローブの複数スポットからの数値データ群中に占める異常値の割合が一定以上のときに検査結果を採用しないようなアラームが作動するステップを用意しておくことで、異常値に基づく判定ミスを防止することができ、かかるステップを含めることは病気の判定やＤＮＡ比較による種の同定など正確な判定が必要とされる検査において極めて効果的である。
【００３１】
また、上記の（２）おける中央値をハイブリダイゼーション（ハイブリッド体の形成）の結果とすることでも、より正確な判定が可能となる。
【実施例】
【００３２】
本発明によるマイクロアレイの作成方法とデータ処理方法について、以下の実施例により、さらに詳しく説明する。ただし、以下に述べる実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３３】
＜実施例１＞
Ｉ．マイクロアレイの作成
（１）プローブの設計及び合成
市販のＴａｋａｒａ社製ベクター  ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ（全長３１６２ｂｐ）の塩基配列中より、後述する配列を有するプライマー２種を設計した。なお、ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰの全塩基配列情報に関しては、Ｔａｋａｒａ社より提供されており、また、公開されているデータベース等からも入手可能である。設計は、設計した部分塩基配列を特異的に認識できるよう、配列、GC%、融解温度(Tm値)に充分配慮して設計を行った。設計されたプローブの塩基配列およびTm値を表１に示す。
【００３４】
【表１】
2006322741.tif 000003
【００３５】
このプローブ設計においては、Rのプライマーから伸長したDNA鎖が、プローブとハイブリダイゼーションし、プローブとハイブリッド体を形成する。
【００３６】
（２）ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ（Ｗ×Ｌ×Ｔ）：２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリ性のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩、洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて、ガラス基板を取り出し、軽く純水で漱いだ後、超純水中で２０分超音波洗浄を行った。次に、８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間、ガラス基板を浸した。再び、純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の洗浄済石英ガラス基板を用意した。
【００３７】
（３）表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、洗浄済石英ガラス基板を、このシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、ガラス基板の両面に窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。次に、窒素ブロー乾燥したガラス基板を、１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させた。このカップリング剤処理により、ガラス基板表面に、シランカップリング剤由来のアミノ基が導入された。
【００３８】
一方、同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）；以下、ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ベーク終了後、カップリング剤処理済ガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この浸漬処理間に、カップリング剤処理済ガラス基板の表面に導入されているアミノ基と、ＥＭＣＳのスクシイミド基とが反応し、ガラス基板表面にＥＭＣＳ由来のマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のジメチルスルホキシドとエタノールの混合溶媒を用いて洗浄し、さらに、エタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００３９】
（４）プローブ用ＤＮＡの合成
上記（１）で設計したプローブを合成した。
【００４０】
プローブＤＮＡは、上記の表面にマレイミド基が導入されガラス基板に対して共有結合させるため、定法に従って、５’末端にチオール化処理を施した。その後、ＤＮＡ合成時における副反応を避けるために、保護を施している保護基を脱保護し、さらにＨＰＬＣ精製および脱塩処理を施した。
【００４１】
得られたプローブＤＮＡは、純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）１０μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
【００４２】
（５）ＢＪプリンターによるプローブＤＮＡ吐出、および基板表面への結合
グリセリン７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液を用意した。続いて、分注したプローブＤＮＡを上記の混合溶媒に規定濃度（１０μＭ）となるように溶解した。得られたプローブＤＮＡ溶液を、バブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０  キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００４３】
なお、前記バブルジェットプリンターは、平板へのインクジェット印刷が可能なように改造を施したものである。また、該改造バブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ｐｌのＤＮＡ溶液液滴を、約１２０μｍピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【００４４】
続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、ガラス基板表面に、プローブＤＮＡ溶液のスポッティング操作をおこなった。ＤＮＡマイクロアレイ１枚あたり、図１に示すような、プローブごとに１６スポットの吐出が行われるよう印字のパターンを予め作成し、インクジェット印字した。目的のパターンにＤＮＡ溶液のスポッティングが確実に行われていることを拡大鏡等により確認した後、３０分間常温で加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基とプローブＤＮＡ５’末端のスルファニル基（−ＳＨ）とを反応させた。
【００４５】
（６）洗浄
加湿チャンバー内における３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により、ガラス基板表面に残った未反応のプローブＤＮＡを洗い流した。ガラス基板表面に、各ＤＮＡチップ当たり１６スポットに所定の一本鎖プローブＤＮＡが、それぞれ固定された、ＤＡＮマイクロアレイ型ＤＮＡチップを得た。
【００４６】
＜実施例２＞
ＩＩ.ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰのＰＣＲ
（１）プライマーの設計
市販のＴａｋａｒａ社製ベクター  ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ（全長３１６２ｂｐ）の塩基配列中より、Ｉで作成したＤＮＡマイクロアレイに固定されたプローブとハイブリダイズし得る、後述する配列を有するプライマー２種を設計した。
【００４７】
プライマーの設計にあたっては、ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰの中の、所望の部分塩基配列がPCR増幅により特異的かつ効率的に増幅されるよう、配列、GC%、融解温度(Tm値)に充分配慮して設計を行った。
設計されたプライマーはフォワード側(F)、リバース側(R)それぞれ１種の計２種である。ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰをテンプレートとし、FとRの組み合わせでPCR増幅することにより、１３２４ｂｐのＰＣＲ産物が増幅されることになる。設計されたプライマーの塩基配列およびTm値を表２に示す。
【００４８】
【表２】
2006322741.tif 000004
【００４９】
またｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ全長における１種のプライマーの位置を図２に示す。なお、この図において矢印の示す方向は、各プライマー鎖において５’末端から３’末端に向かう方向を示している。
【００５０】
（２）プライマーの合成
（１）で設計した２種のプライマーを合成した。各プライマーの合成は、それぞれの塩基配列を有するＤＮＡ鎖を定法に従ってＤＮＡ合成機で合成した。精製は、カートリッジ精製により行い、２種のプライマーを得た。得られたプライマーは、ＴＥバッファーにて１０μＭの濃度に希釈した。
【００５１】
（３）ＰＣＲ増幅反応
実施例１の（２）で合成した２種のプライマー、鋳型遺伝子ＤＮＡとするＴａｋａｒａ社製ベクター  ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ、ならびに、ＱＩＡＧＥＮ社製ＰＣＲキット  ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  を用いて、ＰＣＲ増幅反応を行った。Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ中にはdATP、dCTP、dTTP、dGTPの4種のデオキシヌクレオチドが含まれているが、PCR産物を蛍光標識により標識するため、アマシャムファルマシア社製のCy3dUTPを加えて、PCR産物をCy3により標識した。
【００５２】
フォワード・プライマーとリバース・プライマーは、（１）中に記載した組み合わせでＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲの反応条件は、下記のプロトコルによって、下記表３に示す組成の反応液の調製を行った。
【００５３】
【表３】
2006322741.tif 000005
【００５４】
調製された反応液について、市販のサーマルサイクラーを用いて、下記表４の温度サイクル・プロトコルに従って、ＰＣＲ増幅反応を行った。
【００５５】
【表４】
2006322741.tif 000006
【００５６】
増幅反応終了後、ＰＣＲ増幅産物は、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて精製した。精製後、ＰＣＲ増幅産物溶液の液量は、５０μｌとなるよう調製した。得られた精製済ＰＣＲ増幅産物溶液の一部を取り、定法に従って電気泳動を行い、ＰＣＲ産物が所望の塩基長を有するバンドが出ていることを確認した。
【００５７】
III．ハイブリダイゼーション反応
実施例１で作製したＤＮＡマイクロアレイと、サンプル核酸検体として作製したＰＣＲ増幅産物を用いて、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションを行った。
【００５８】
（１）ＤＮＡマイクロアレイのブロッキング
ＢＳＡ（牛血清アルブミンＦｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ：Ｓｉｇｍａ社製）を１ｗｔ％となるように、１００ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒに溶解し、この溶液にＩＩで作製したＤＮＡマイクロアレイを室温で２時間浸し、ガラス基板面のブロッキングを行った。ブロッキング終了後、０．１ｗｔ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む０．１×ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ  １５ｍＭ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｉｈｙｄｒａｔｅ，Ｃ6Ｈ5Ｎａ3・２Ｈ2Ｏ）  １．５ｍＭ、ｐ．Ｈ．  ７．０）で洗浄を行った後、純水でリンスした。その後、スピン・ドライ装置でＤＮＡマイクロアレイの水切りを行った。
【００５９】
（２）ハイブリダイゼーション溶液の調製
最終濃度が下記の構成となるよう、各ＰＣＲ産物に対しハイブリダイゼーション溶液を調製した。
【００６０】
＜ハイブリダイゼーション溶液＞
６×ＳＳＰＥ／１０％  Ｆｏｒｍ  ａｍｉｄｅ／ＰＣＲ増幅産物溶液
（６×ＳＳＰＥ：  ＮａＣｌ  ９００ｍＭ、ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ  ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ６ｍＭ、ｐ．Ｈ．  ７．４）
（３）ハイブリダイゼーション
水切りしたＤＮＡチップを、ハイブリダイゼーション装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ）にセットし、上記組成のハイブリダイゼーション溶液を用いて、下記表５に示す手順・条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００６１】
【表５】
2006322741.tif 000007
【００６２】
（４）  蛍光測定
ハイブリダイゼーション反応終了後、スピン・ドライ乾燥したＤＮＡチップについて、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、Ｇｅｎｅｐｉｘ  ４０００Ｂ）を用いて、ハイブリッド体に由来する蛍光測定を行った。蛍光輝度を測定した結果を下記の表６に示す。
【００６３】
【表６】
2006322741.tif 000008
【００６４】
表６中の１〜１６は図２に示すようなＤＮＡチップのブロックナンバーに相当し、蛍光測定を行って各プローブに対し、１６個の測定データを得た。これらの輝度データについてそれぞれ平均値μと分散σを求め、表７に示す。
【００６５】
【表７】
2006322741.tif 000009
【００６６】
データが正規分布である場合、μ−3σ〜μ＋3σの間に全データの99.7％が含まれる。すなわち、3σ/μの値が大きいほどデータのばらつきが大きいということになる。本来、ＤＮＡチップで得られる輝度データは、同濃度、同種のプローブに関しては同じ輝度値になるのが理想的であり、若干のばらつきがあっても3σ/μ0.2が成り立っている。3σ/μが大きくなる要因は、ハイブリダイゼーション時の気泡・不純物の混入による異常データである場合が多い。そこで、図３のフローチャートに示す手順で異常データを排除する。
【００６７】
まず、ステップ１(Ｓ１)において、集計すべきデータＸi(データ数Ｎ個)、例えばプローブＰ３の測定データ１から１６を取得する。続いて、ステップ２(Ｓ２)で、Ｓ１で取得したデータについて平均値μと分散σを計算する。プローブＰ３の場合は、μ=6693.5、σ=3429.0が算出される。そして、ステップ３(Ｓ３)にて現在のデータＸiの個数を確認する。まだ、データの排除は行われていないので、ここでは最初のデータ数Ｎ（＝１６）である１６個であるので、ステップ４(Ｓ４)に進む。3σ/μは1.54であり、0.3より大きいのでステップ５(Ｓ５)に進む。ここで、3σ/μが3より大きい場合にはステップ６に進む。3σ/μが3より大きい場合には、不純物等による輝度値が異常に高いデータが含まれていることがく、これが大きく平均値と分散を歪めている原因となっている。そこで、取得データＸiと平均値μとの差の絶対値を求め、その値が最大となるデータを排除する(Ｓ６)。そして、Ｓ２に戻り、残ったデータで平均値と分散を計算し直す。
【００６８】
プローブＰ３の場合には、3σ/μは３より小さいので、ステップ７(Ｓ７)に進む。ここでは、3σ/μは1.54と１より大きいので、ステップ８の処理へと進む。0.4μ=2677.4、1.6μ=10709.6であり、これに従って不等式を満たさないデータは排除する(Ｓ８)。ここでは、８番、１２番、そして１６番のデータが削除される。
【００６９】
そしてＳ２に戻り、残ったデータ１３個で平均値と分散を計算し直す。μ=8189.8、σ=1362.2が新たに求まる。続いて、Ｓ３に進む。データ数は１３でＮ／２＝８より多いのでＳ４に進む。3σ/μは0.49であるので、Ｓ５→Ｓ７→Ｓ９に進む。0.8μ=6551.8、1.2μ=9827.8であり、これに従って不等式を満たさないデータがある場合、ステップ１０に進み、平均値と差が最も大きいデータ１つを排除する(Ｓ１０)。ここでは、4番の5949.9がμとの差2239.9で最大となり、排除される。
【００７０】
再びＳ２に戻り、また残ったデータ１２個で平均値と分散を計算し直す。これら、Ｓ２からＳ９までのステップを繰り返すことにより、データ数８の時点で、μ=7593.9、σ=367.2、3σ/μ=0.15とＳ４の不等式を満たす、ばらつきのない、信頼性あるデータを得ることができ、処理は終了となる。
【００７１】
ただし、処理を繰り返すうちに、残ったデータ数がＮ／２より小さくなった場合(Ｓ３)、データの見直しを促すエラーメッセージを出す(Ｓ１１)。
【００７２】
また、3σ/μが0.3より大きくても、残ったデータが0.8μ≦Ｘi≦1.2μを満たすときには、データ処理終了とする(S９)。
【００７３】
以上のような処理を行い、他のプローブＰ１、Ｐ２についてもデータ処理を行うと、表８に示す通りになり、ばらつきのないデータからの処理を行うことができた。
【００７４】
【表８】
2006322741.tif 000010
【００７５】
なお、以上の各ステップにおける閾値は、目的とする検出精度に応じて設定できる。例えば、Ｓ４における「３σ／μ＜０．３」の設定は、処理に採用するデータが平均値±１０％以内に収めることを目的としたもので、平均値±２０％の範囲を設定しても良い場合には、Ｓ４での閾値は「３σ／μ＜０．６」の設定となる。
【００７６】
上記の処理によって異常値が排除された数値データ（例えばμの値）と、予め設定された陰性または陽性を示す数値とを比較して、試料中に各プローブで検出し得る標的核酸が存在してたかどうかの判定をすることができる。あるいは、異常値を排除して得られた分散の範囲から、予め設定された陽性、陰性の判断基準と比較して、陽性とするデータの許容範囲を決めることもできる。
【００７７】
＜実施例３＞
実施例２に記載したようなデータ処理を行う前に、ハイブリダイゼーション情報を入力するステップを追加する。
【００７８】
例えば、実施例２の実験結果を用いて説明する。この実験のハイブリ時にはハイブリ液がＤＮＡマイクロアレイ全体に行き渡らず、右側が気泡であったことが実験時に確認されていた。そこで、集計前に図２のブロック８、１２、１６のデータはエラーであることを入力しておく。
【００７９】
続いて、図３に示すようなデータ処理に移る。Ｓ１の数値データＸiの取得の際に、エラーであることが示されているブロックからはデータを取得しない。これにより、最初のデー多数はＮ＝13個となる。あらかじめ、わかりきったエラーデータを排除しておくことにより、データ処理においてデータのばらつきのために排除され、データ数がＮ／２以下になり(Ｓ３)、エラーメッセージが出力されることが減り、効率的にデータ処理を行うことができる。また、ＤＮＡマイクロアレイが破損する等のアクシデントにより全ブロック中の半分しかデータを測定できなくても信頼できるデータ集計を行うことが可能となる。
【００８０】
＜実施例４＞
実施例２に記載したようなデータ処理を行った際に、データが全て排除されてしまう場合や、排除すべきデータがないのに3σ/μの値が大きい場合がある。その時は、異常データ群であるか判別するステップに移る。
【００８１】
取得データＮ個をシグナル値順に並べ替え、上位Ｎ／２個と下位Ｎ／２個とでそれぞれ図３に示すデータ処理を行う。得られたそれぞれの平均値と分散の値を比較し、上位の平均値と下位の平均値との差が分散以上であった場合には、これらのデータ群は二極化しており、異常データ群であったとしてエラーメッセージを出力する。
【００８２】
以上の処理のように、異常データ群の存在を判別することにより、信頼性の低いデータを出力する可能性を軽減することが可能となる。また、ＤＮＡマイクロアレイ製造上のエラーの可能性を示唆することも可能となる。
【００８３】
＜実施例５＞
表６に示した各スポットの数値データに対し、中央値を求めると、Ｐ１＝103.1、Ｐ２＝2577.5、Ｐ３＝7541.5が得られる。これらの値は、実施例2のデータ処理で得られた数値(表８)とほぼ同じであり、中央値を求めることによってもハイブリダイゼーションエラーに影響されない信頼できるデータを得られることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰにおいて、２つのプライマー、および１つのプローブを示した図である。矢印はそれぞれのプライマーにおいて５’から３’に向かう方向を示している。
【図２】本発明におけるＤＮＡマイクロアレイのデザインを示している。
【図３】本発明におけるデータ処理の方法を示すフローチャートである。
【図１】
2006322741.tif 000011
【図２】
2006322741.tif 000012
【図３】
2006322741.tif 000013
【配列表】
2006322741000001.app