(57)【要約】      （修正有）【課題】  遺伝子工学的に製造されるＦｌｔ３リガンド、その製造方法の提供。【解決手段】  イヌのｃＤＮＡからＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインをコードする遺伝子をクローニングし、Ｆｌｔ３リガンドの細胞外ドメインをコードするＤＮＡを含む組み替えバキュロウイルスを作成し、これを昆虫細胞に感染させることによってイヌＦｌｔ３リガンドの大量生産に成功した。これにより、ヒトをはじめ、動物の抗腫瘍薬、抗アレルギー薬、抗ウイルス薬などへのＦｌｔ３の用途が開かれることが期待される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｌｔ３受容体に結合し、イヌ樹状細胞の増殖促進活性を有することを特徴とする化合物。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその変異体であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質またはその変異体である請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｆｌｔ３受容体に結合し、イヌ樹状細胞の増殖促進活性を有する物質を含むことを特徴とする動物用疾患治療剤。
【請求項５】
該物質がタンパク質であることを特徴とする請求項４に記載の動物用疾患治療剤。
【請求項６】
該物質が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその変異体である請求項４に記載の動物用疾患治療剤。
【請求項７】
該物質がイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質またはその変異体である請求項４に記載の動物用疾患治療剤。
【請求項８】
該疾患が腫瘍または感染症である請求項４〜７のいずれか１項に記載の動物用疾患治療剤。
【請求項９】
対象となる動物がイヌである請求項４〜８のいずれか１項に記載の動物用疾患治療剤。
【請求項１０】
インターロイキン１２および／またはインターロイキン１８を含んでなる請求項４〜９のいずれか１項に記載の動物用疾患治療剤。
【請求項１１】
注射剤であることを特徴とする請求項４〜１０のいずれか１項に記載の動物用疾患治療剤。
【請求項１２】
請求項４〜１１のいずれか１項に記載の動物用疾患治療剤を動物へ注射投与することを特徴とする動物の疾患治療方法。
【請求項１３】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載された動物用疾患治療剤を末梢血から分離したリンパ球に作用させた後、再び体内に戻すことを特徴とする動物の疾患治療方法。
【請求項１４】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載された動物用疾患治療剤を投与した動物から分離した末梢血単核球を生体外で培養後、再び体内に戻すことを特徴とする動物の疾患治療方法。
【請求項１５】
配列番号２のＤＮＡ配列を含む組換えベクター。
【請求項１６】
イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質またはその変異体をコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクター。
【請求項１７】
配列番号２のＤＮＡ配列を含む組換えバキュロウイルス。
【請求項１８】
イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質またはその変異体をコードするＤＮＡ配列を含む組換えバキュロウイルス。
【請求項１９】
請求項１５または請求項１６に記載の組換えベクターにより宿主細胞を形質転換してなる形質転換体。
【請求項２０】
宿主細胞が真核細胞あるいは原核生物である請求項１９に記載の形質転換体。
【請求項２１】
請求項１９または請求項２０に記載の形質転換体を培養することを特徴とするイヌＦｌｔ３リガンドの製造方法。
【請求項２２】
請求項１７または請求項１８に記載の組換えバキュロウイルスを昆虫樹立細胞中で増殖させることを特徴とするイヌＦｌｔ３リガンドの製造方法。
【請求項２３】
請求項１７または請求項１８に記載の組換えバキュロウイルスをカイコ生体中で増殖させることを特徴とするイヌＦｌｔ３リガンドの製造方法。
【請求項２４】
請求項１５または請求項１６に記載の組換えベクターを用いた哺乳細胞発現系によるイヌＦｌｔ３リガンドの製造方法。
【請求項２５】
請求項１５または請求項１６に記載の組換えベクターを用いた大腸菌発現系によるイヌＦｌｔ３リガンドの製造方法。
【請求項２６】
請求項１５または請求項１６に記載の組換えベクターを用いた無細胞発現系によるイヌＦｌｔ３リガンドの製造方法。
【請求項２７】
イヌＦｌｔ３リガンドを特異的に認識する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆｌｔ３受容体に結合し、イヌ樹状細胞の増殖促進活性を有するタンパク質、該タンパク質を含む動物用疾患治療剤、該動物用疾患治療剤を用いる動物の疾患治療方法、
動物用医薬品（抗腫瘍・抗ウイルス・ワクチンアジュバント）とすることを目的とした組換えベクター、組換えウイルス及び形質転換体、並びに該タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞は骨髄由来抗原提示細胞であり、免疫系、抗原の取り込み、抗原提示に関与している。ナイーブＴ細胞は樹状細胞によって提示された抗原により活性化され増殖する。このため樹状細胞の重要な役割として、リンパ球が介する免疫システムを誘導し、制御することが挙げられる。近年、癌の免疫療法においてワクチンのアジュバントとして樹状細胞を利用することが注目されている。マウスの腫瘍モデルの実験で、生体外で誘導・活性化した樹状細胞を用いた抗腫瘍効果の報告が多数あり、ヒト腫瘍に対する臨床試験も多くの施設で実施されている。このような樹状細胞を用いた治療は現在のところ、最も有望な腫瘍の免疫治療方法と考えられている。
【０００３】
Fms-like tyrosine kinase receptor 3 ligand（特許文献１、以下Ｆｌｔ３リガンドと略記する）は、Ｆｌｔ３レセプターを介したシグナル伝達により造血系の前駆細胞や幹細胞の増殖、分化を制御することが知られている。さらに、Ｆｌｔ３リガンドは樹状細胞の増殖活性を有することが知られており、Ｆｌｔ３リガンドを用いて生体内あるいは生体外で樹状細胞を増幅させることにより、極めて効率的に抗腫瘍免疫を誘導し腫瘍を退縮できることができ、新規癌ワクチン療法としてのヒト臨床応用への可能性が示されている。また、脊髄形成異常症、再生不良性貧血、HIV感染等の感染症を対象にしたＦｌｔ３リガンドを用いた治療も期待されている。
【０００４】
遺伝子操作技術によりマウスのＦｌｔ３リガンド（特許文献１）に続き、ヒトのＦｌｔ３リガンドのｃＤＮＡもクローニングされ（特許文献１）、その遺伝子組換え手法を用いた量産化が検討されている。ヒトおよびマウスＦｌｔ３リガンドと相同性の高い遺伝子がイヌから同定されているが、そのタンパクの発現およびその機能は明らかにされていない（非特許文献１）。
【特許文献１】米国特許第５５５４５１２号明細書
【非特許文献１】ヤング（Yang）、外１名、「ディーエヌエー・シークエンス（DNA Sequence）」、２０００年、第11巻、p163-166
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｆｌｔ３リガンドは膜貫通型と膜貫通型Ｆｌｔ３リガンドの細胞外ドメインが切断されることで形成される可溶性型の２種類が存在し、その両方が生理活性を持つ（ハナン（Hannum）、「ネイチャー（Nature）」、１９９４年、第３６８巻、ｐ．６４３-６４８）。そのため、遺伝子操作により可溶化Ｆｌｔ３リガンドを作製することで、細胞内から活性型で分泌させることが可能になる。ヒトおよびマウスのFlt3リガンドの細胞外ドメインは、従来の方法、例えば大腸菌、酵母、哺乳動物細胞、を用いて活性型タンパクの製造が可能である（特許文献１）が、イヌＦｌｔ３リガンドに関しては活性型の製造ができなかった。
【０００６】
イヌ由来遺伝子からＦｌｔ３リガンドの活性を有したタンパク質を遺伝子組換え手法を用いて細胞で容易に量産することが可能になれば、ヒトをはじめ、動物の抗腫瘍薬、抗アレルギー薬、抗ウイルス薬など、Ｆｌｔ３リガンドとしての用途が開かれることが期待される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、かかる状況に鑑み、イヌＦｌｔ３リガンド遺伝子の大量発現を目的とし、創意工夫を成し、イヌのｃＤＮＡからＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインをコードする遺伝子をクローニングし、Ｆｌｔ３リガンドの細胞外ドメインをコードするＤＮＡを含む組換えバキュロウイルスを作製し、これを昆虫細胞に感染させることによってイヌＦｌｔ３リガンドの大量生産にも成功し、以って簡単に大量にＦｌｔ３リガンドを製造する方法を確立し、かくして本発明を完成させるに至った。
【０００８】
具体的には、本発明は以下の構成からなる。
【０００９】
（１）Ｆｌｔ３受容体に結合し、イヌ樹状細胞の増殖促進活性を有することを特徴とする化合物。
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその変異体であることを特徴とする（１）に記載の化合物。
（３）イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質またはその変異体である（１）に記載の化合物。
（４）Ｆｌｔ３受容体に結合し、イヌ樹状細胞の増殖促進活性を有する物質を含むことを特徴とする動物用疾患治療剤。
（５）該物質がタンパク質であることを特徴とする（４）に記載の動物用疾患治療剤。
（６）該物質が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその変異体である（４）に記載の動物用疾患治療剤。
（７）該物質がイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質またはその変異体である（４）に記載の動物用疾患治療剤。
（８）該疾患が腫瘍または感染症である（４）〜（７）のいずれか１項に記載の動物用疾患治療剤。
（９）対象となる動物がイヌである（４）〜（８）のいずれか１項に記載の動物用疾患治療剤。
（１０）インターロイキン１２および／またはインターロイキン１８を含んでなる（４）〜（９）のいずれか１項に記載の動物用疾患治療剤。
（１１）注射剤であることを特徴とする（４）〜（１０）のいずれか１項に記載の動物用疾患治療剤。
（１２）（４）〜（１１）のいずれか１項に記載の動物用疾患治療剤を動物に注射投与することを特徴とする動物の疾患治療方法。
（１３）（４）〜（１０）のいずれか１項に記載された動物用疾患治療剤を末梢血から分離したリンパ球に作用させた後、再び体内に戻すことを特徴とする動物の疾患治療方法。
（１４）（４）〜（１０）のいずれか１項に記載された動物用疾患治療剤を投与した動物から分離した末梢血単核球を生体外で培養後、再び体内に戻すことを特徴とする動物の疾患治療方法。
（１５）配列番号２のＤＮＡ配列を含む組換えベクター。
（１６）イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質またはその変異体をコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクター。
（１７）配列番号２のＤＮＡ配列を含む組換えバキュロウイルス。
（１８）イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質またはその変異体をコードするＤＮＡ配列を含む組換えバキュロウイルス。
（１９）（１５）または（１６）に記載の組換えベクターにより宿主細胞を形質転換してなる形質転換体。
（２０）宿主細胞が真核細胞あるいは原核生物である（１９）に記載の形質転換体。
（２１）（１９）または（２０）に記載の形質転換体を培養することを特徴とするイヌＦｌｔ３リガンドの製造方法。
（２２）（１７）または（１８）に記載の組換えバキュロウイルスを昆虫樹立細胞中で増殖させることを特徴とするイヌＦｌｔ３リガンドの製造方法。
（２３）（１７）または（１８）に記載の組換えバキュロウイルスをカイコ生体中で増殖させることを特徴とするイヌＦｌｔ３リガンドの製造方法。
（２４）（１５）または（１６）に記載の組換えベクターを用いた哺乳細胞発現系によるイヌＦｌｔ３リガンドの製造方法。
（２５）（１５）または（１６）に記載の組換えベクターを用いた大腸菌発現系によるイヌＦｌｔ３リガンドの製造方法。
（２６）（１５）または（１６）に記載の組換えベクターを用いた無細胞発現系によるイヌＦｌｔ３リガンドの製造方法。
（２７）イヌＦｌｔ３リガンドを特異的に認識する抗体。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、バキュロウイルスを用いた昆虫細胞発現系、カイコ発現系および無細胞発現系によるイヌＦｌｔ３リガンドとその製造方法を開示する。イヌＦｌｔ３リガンドは、Ｆｌｔ３受容体に結合し、イヌＣＤ１１ｃ陽性細胞の増殖促進活性を有することを特徴とする。製造したイヌＦｌｔ３リガンドは、腫瘍、アレルギー、感染症を対象にした動物用疾病治療剤になりうる。
【００１１】
また、本発明はイヌＦｌｔ３リガンドを特異的に認識する抗体も開示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の一態様は、Ｆｌｔ３受容体に結合し、イヌＣＤ１１ｃ陽性細胞の増殖促進活性を有する化合物に関する。本明細書中でいう化合物は、イヌＦｌｔ３リガンド遺伝子がコードするタンパク質であり、配列番号１に示すアミノ酸からなるタンパク質もしくはその変異体あるいはイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインからなるタンパク質もしくはその変異体でもよい。
【００１３】
本明細書中に「イヌＦｌｔ３リガンド」と単独で表記されている場合は、上記に標す化合物のことを指す。
【００１４】
ここでいうＦｌｔ３受容体とは、哺乳動物におけるＦｌｔ３受容体をいい、特にヒトまたはイヌのものが好ましい。Ｆｌｔ３受容体は細胞外ドメインと細胞内ドメインからなる膜貫通タンパク質である。２量体のＦｌｔ３リガンドがＦｌｔ３受容体の細胞外ドメインに結合すると、Ｆｌｔ３受容体が２量体を形成し、Ｆｌｔ３受容体の細胞内ドメインがリン酸化されることで細胞増殖等に必要なシグナルが伝達される。ここでいうＦｌｔ３リガンドのＦｌｔ３受容体への結合は、Ｆｌｔ３リガンドのＦｌｔ３受容体細胞外ドメインへの結合のことを指す。また、ここでいう樹状細胞とは、樹状細胞の分子マーカーであるＣＤ１１ｃまたはCD123を細胞表面に発現している細胞のことである。また、ＣＤ１１ｃまたはCD123陽性細胞の中で、単球の分子マーカーＣＤ１４が発現していない細胞によって、樹状細胞を特徴づけることができる。これら以外の樹状細胞の分子マーカーには、CD1a, CD40, CD48, CD54, CD58, CD80, CD86, VAL-4, MHCクラスII, Eカドヘリン等があり、これらのマーカーが発現していることを指標にして樹状細胞を特徴づけることも可能である。
【００１５】
Ｆｌｔ３リガンドのＦｌｔ３受容体への結合は、例えば以下の方法で測定することができる。Ｆｌｔ３受容体のタンパク質を吸着させたカラム担体を作成し、このカラム担体にＦｌｔ３リガンドのタンパク質を含む溶液を接触させる。担体カラムを洗浄後、緩衝液の条件変更（pH、塩濃度、極性）、変性緩衝液の使用（pHの極端な変化、カオトロピック塩の添加）、Ｆｌｔ３リガンドの競合などにより担体からＦｌｔ３リガンドが溶出される場合に、Ｆｌｔ３リガンドがＦｌｔ３受容体へ結合すると認めるのがよい。また、Ｆｌｔ３リガンドのタンパク質を吸着させたカラム担体とＦｌｔ３受容体のタンパク質を含む溶液を使用してもよい。
【００１６】
さらに、ここでいう増殖促進活性とは、イヌ由来の細胞にイヌＦｌｔ３リガンドを作用させた場合、ＣＤ１１ｃ陽性細胞の数の増加、全細胞中のＣＤ１１ｃ陽性細胞の割合の増加、ＣＤ１１ｃ陽性細胞のDNA合成の活性化のいずれかの活性を有することをいう。本発明において、好ましい細胞の増殖促進活性の測定方法は、例えばイヌＦｌｔ３リガンド存在下と非存在下でイヌ末梢血リンパ球（以下ＰＢＭＣと略記する）を培養し、トリチウムチミジンの取り込み量を液体シンチレーションカウンターを用いて測定し、さらに培養前後におけるＣＤ１１ｃ陽性細胞の割合を測定する。イヌＦｌｔ３リガンド存在下の場合におけるイヌＰＢＭＣのトリチウムチミジンの取り込み量が、イヌＦｌｔ３リガンド非存在下の場合におけるイヌＰＢＭＣのトリチウムチミジンの取り込み量を上回り、さらに培養後にＣＤ１１ｃ陽性細胞の割合の増加が見られた場合にイヌＣＤ１１ｃ陽性細胞の増殖促進活性を有すると認めるのがよい。
【００１７】
本発明でいう変異体とは、配列番号１またはイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質のアミノ酸配列の１から４０個のいずれか、好ましくは１から２０個のいずれか、さらに好ましくは１から数個のいずれかのアミノ酸付加、置換または欠失を含む。イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインは、その代表例としては配列番号１のアミノ酸番号１から１８６番目を指す。また、配列番号１のアミノ酸番号１から２４はシグナル配列と推測されることから、本発明の細胞外ドメインは配列番号１のアミノ酸番号２５番目から１８６番目を好ましく用いることができ、さらにこれらタンパク質を構成するアミノ酸数が１または数個異なるものも含む。
【００１８】
変異体はタンパクに対する修飾も含み、タンパクをコードする核酸に対してなされることができ、その例としては、欠失、点突然変異、切頭化、アミノ酸置換およびアミノ酸の付加が挙げられる。
【００１９】
あるいは、修飾は、例えば開裂、リンカー分子の付加、検出可能部分（例えばビオチン）の付加、脂肪酸の付加、あるアミノ酸の別のアミノ酸による置換等により、タンパクに対して直接なされ得る。イヌＦｌｔ３リガンドのアミノ酸配列は、天然または非天然起源であり得る。即ち、それらは、天然イヌＦｌｔ３リガンドを含み得るか、あるいはアミノ酸配列が、Ｆｌｔ３受容体に結合し、細胞にシグナルを伝達し細胞を活性化、例えば細胞増殖促進、する能力を保持する限り、非天然型起源の配列を含み得る。非天然型起源のアミノ酸は人工合成アミノ酸を含むがこれに限定されない。
【００２０】
さらに、ここでいう変異体には、イヌＦｌｔ３リガンドをコードする核酸分子（本明細書中ではDNAと表記することもある）とハイブリダイズする他の核酸分子が有する核酸配列よりコードされる相同体タンパク質のうちイヌＣＤ１１ｃ陽性細胞の増殖促進活性を有するタンパク質を含む。核酸ハイブリダイゼーションパラメーターは、このような方法を編集する参考文献、例えばサムブルック（Sambrook）著、「モレキュラー・クローニング  ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning:： A Laboratory Manual）」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年、第１−３巻に見出され得る。
【００２１】
ここでいうハイブリダイズする他の核酸分子は、例えば前述のMolecular Cloningに記載の方法によって得ることができる。例えば、６×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０.１×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイズのシグナルが観察されることを表す。用いられ得る条件、試薬等があるが、当業者はこのような条件に通じており、従ってこの条件に限定されない。
【００２２】
イヌＦｌｔ３リガンドをコードする核酸に関するスクリーニングでは、３２Ｐプローブと一緒に上記の条件を用いて、核酸ハイブリダイゼーション、例えばサザンブロットまたはノーザンブロットが実施され得る。イヌＦｌｔ３リガンドをコードするＤＮＡが最後に移された膜を洗浄後、放射能シグナルを検出するために、その膜はＸ線フィルムに対して配置される。
【００２３】
しかしながら、本発明のイヌＦｌｔ３リガンドをコードする核酸分子とハイブリダイズする他の核酸分子が有する核酸配列よりコードされる相同体タンパク質の明瞭な同定を可能にする方法で当業者は条件を操作し得ることを理解されたい。当業者は、その後ルーチンに単離されるこのような分子の発現に関する細胞およびライブラリーのスクリーニングとその後の関連核酸分子の単離およびシーケンシングのための方法にも周知している。
【００２４】
概して、ここでいう相同体タンパク質とは、前記の変異体の一態様であり、典型的には配列番号１に示すイヌＦｌｔ３リガンドのアミノ酸配列あるいはイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメイン、またはこのようなアミノ酸配列をコードする核酸分子（例えば、配列番号２）と少なくとも９０％のアミノ酸同一性および／または少なくとも７５％の核酸分子の同一性を共有する。いくつかの場合には、相同体タンパク質は、少なくとも９０％のアミノ酸同一性および／または９５％の核酸分子の同一性を共有し、そしてさらにその他の場合には、少なくとも９５％のアミノ酸同一性および／または９０％の核酸分子の同一性を共有する。
【００２５】
本発明のまた別の一様態は、Ｆｌｔ３受容体に結合し、イヌＣＤ１１ｃ陽性細胞の増殖促進活性を有する物質を含むことを特徴とする動物用疾患治療剤に関する。ここでいう動物用疾患治療剤とは、イヌＦｌｔ３リガンドを含む組成物を動物に投与することで疾患動物の症状を改善することができる治療剤を指す。例えば、癌を発症しているイヌに本発明の治療剤を投与し、癌が生体より消失する、癌の大きさが減少する、癌の増殖を抑制するか、あるいは白血球の増加、呼吸様式の安定、元気・食欲・活動性の回復などのクオリティー・オブ・ライフ（QOL）の改善等、いずれかの効果が期待される。疾患動物の症状の改善を判断する方法はこれらに限定されない。なお、ここでいう動物はイヌが好ましく、ヒトは含まれない。
【００２６】
イヌＦｌｔ３リガンドは、イヌ白血球からの樹状細胞マーカーＣＤ１１ｃ陽性細胞とMHCクラスII陽性細胞の増殖促進能、イヌ白血球の増殖促進能、上記に示したイヌ生体に発生した腫瘍を縮小させる能力などのいずれかの活性を有することにより特性化される。ＣＤ１１ｃ分子とＭＨＣクラスII分子の発現解析は、例えば、蛍光を標識したそれら分子に対する抗体を細胞に反応させ、フローサイトメーターなどの蛍光強度を測定できる装置によって蛍光の強度を測定し、測定細胞中の各分子の陽性率を測定することで可能である。イヌ白血球の増殖は、例えばイヌＦｌｔ３リガンド存在下で細胞を培養し、トリチウムチミジンの取り込み量を液体シンチレーションカウンターを用いて測定する、イヌ白血球の数をヘモサイトメーターで数える、ことで調べることができる。また、ＭＴＴにより細胞増殖を測定することもできる。ＭＴＴは細胞内ミトコンドリアの脱水素酵素の基質であり、生存能の高い細胞ほど還元されるＭＴＴ量が多く、その結果生じるホルマザン量が生存細胞数とよく対応し生細胞のみを測定することができる。イヌＦｌｔ３リガンドの特性を調べる方法はこれらに限定されない。
【００２７】
Ｆｌｔ３リガンドは、好ましくは以下に示す方法にてその活性を測定することが可能である。例えば、Ｆｌｔ３リガンド存在下と非存在下でヒト白血病株化細胞であるOCI-AML5（AML5）を培養し、トリチウムチミジンの取り込み量を液体シンチレーションカウンターを用いて測定する。Ｆｌｔ３リガンド存在下の場合におけるAML5のトリチウムチミジンの取り込み量が、Ｆｌｔ３リガンド非存在下の場合におけるAML5のトリチウムチミジンの取り込み量を上回れば、Ｆｌｔ３リガンドの活性を有すると認めるのがよい。また、別の好ましい方法は、末梢血単核球あるいは骨髄由来単核球を用いる方法である。例えば、Ｆｌｔ３リガンド存在下と非存在下でこれら細胞を培養し、トリチウムチミジンの取り込み量を液体シンチレーションカウンターを用いて測定する。Ｆｌｔ３リガンド存在下の場合におけるこれら細胞のトリチウムチミジンの取り込み量が、Ｆｌｔ３リガンド非存在下の場合におけるこれら細胞のトリチウムチミジンの取り込み量を上回れば、Ｆｌｔ３リガンドの活性を有すると認めるのがよい。少なくとも上記の細胞を２種類使って、精製Ｆｌｔ３リガンドの活性を確認することがよい。
【００２８】
本発明の動物用疾患治療剤の対象となる疾患は、例えば腫瘍、アレルギー疾病、皮膚炎、感染症であるが、好ましい疾患は腫瘍および感染症である。対象となる腫瘍には、例えば乳腺腫瘍、肝臓癌、肺癌、白血病などがある。また、対象となる感染症には、例えばイヌジステンバー、イヌ伝染性肝炎、イヌパルボウイルス感染症、狂犬病などがあげられる。
【００２９】
本発明の動物用疾患治療剤に関する免疫感作プロトコールの一部として、免疫応答を増強する物質が、イヌＦｌｔ３リガンドとともに投与され得る。このような免疫応答増強化合物は、アジュバントまたはサイトカインとして分類され得る。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外またはマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得る。多数の種類のアジュバントが、当業界で周知である。特定の例としては、ＭＰＬ（SmithKline Beecham）、サルモネラ属のSalmonella minnesota Re 595リポ多糖類の精製および酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（SmithKline Beecham）、Quillja saponaria抽出物から精製される純ＱＡ−２１サポニン；ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３３７３９（SmithKline Beecham）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８およびＱＳ−Ｌ１（ソ（So）、外１０名、「モレキュルズ・アンド・セル（Molecules and cells）」、１９９７年、第７巻、ｐ．１７８−１８６）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、クレイグ（Kreig）、外７名、「ネイチャー（Nature）」、第３７４巻、ｐ．５４６−５４９）を参照）；ならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。好ましくは、イヌＦｌｔ３リガンドは、ＤＱＳ２１／ＭＰＬの組合せと混合されて投与される。ＤＱＳ２１対ＭＰＬの比は、典型的には約１：１０〜１０：１，好ましくは約１：５〜５：１、さらに好ましくは約１：１である。典型的には、イヌ投与に関しては、ＤＱＳ２１およびＭＰＬは、約１μｇ〜約１００μｇの範囲で動物用疾患治療剤に存在する。その他のアジュバントが当業界で既知であり、本発明に用いられ得る（例えば、ゴッディング（Goding）著,「モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプル・アンド・プラクティス（Monoclonal Antibodies:Principles and Practice）」、第２版、１９８６年を参照）。イヌＦｌｔ３リガンドおよびアジュバントの混合物またはエマルションの調製方法は、当業者には周知である。
【００３０】
対象疾患に対する免疫応答を刺激するその他の因子も、本発明の動物用疾患治療剤に含まれる。例えばサイトカインも、リンパ球刺激特性の結果として、免疫感作プロトコールに有用である。このような目的のために有用な多数のサイトカインは当業者に既知であり、その例としてはインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびＩＬ−１８などが挙げられる。また、バクテリア由来の非メチル化DNA配列を含むCpGも、免疫応答を刺激する因子として用いられる。免疫を刺激する因子はこれらに限定されない。
【００３１】
対象の動物に投与される場合、本発明の動物用疾患治療剤は、製薬上許容可能な調製物中で投与される。このような調製物は、製薬上許容可能な濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性担体、補助免疫増強剤、例えばアジュバントおよびサイトカイン、ならびに任意にその他の療法的作用物質をルーチンに含有し得る。
【００３２】
本発明はさらに、イヌＦｌｔ３リガンドと腫瘍、アレルゲン、ウイルスに関連した抗原タンパク質あるいは抗原ペプチドとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。また、剤型としては、リポソーム製剤、直径数μmのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッド（脂質）を結合させた製剤などが用いられる。
【００３３】
本発明のイヌＦｌｔ３リガンドの考え得る治療効果を誘導するには、イヌＦｌｔ３リガンドを直接体内に導入するin vivo方法、イヌからある種の細胞を採取し体外でイヌＦｌｔ３リガンド存在下で培養し、その細胞を体内に戻すex vivo方法がある（日経サイエンス，１９９４年４月，ｐ２０−４５、月刊薬事，１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３−４８、実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号、およびこれらの引用文献等）が、in vivo方法がより好ましい。
【００３４】
in vivo方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することが出来る。また、腫瘍を対象にした場合、本発明の動物用疾患治療剤を動物の腫瘍に直接注射投与することもできる。in vivo方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には本発明のイヌＦｌｔ３リガンドを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明のイヌＦｌｔ３リガンドを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【００３５】
製剤中の本発明のイヌＦｌｔ３リガンドの含量は、治療目的の疾患、患畜の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常本発明のイヌＦｌｔ３リガンドとして、１μg〜1000μg/kg、好ましくは１0μg〜100μg/kgであり、これを１週間から４週間連続的に投与するのが好ましい。
【００３６】
イヌＦｌｔ３リガンドの投与により生体内でＣＤ１１ｃ陽性細胞が増殖した状態で、抗原タンパク質あるいは抗原ペプチドおよびCpG等の免疫を刺激する因子を投与することで、抗原に対する強い免疫反応を誘導し、疾病を治療することが可能である。例えば、表皮に腫瘤を持つ患犬に対してイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を腫瘍部分付近の皮下に１週間から４週間連続で注射投与し、その後、１μg〜1000μg/kgの癌関連抗原タンパク質または腫瘍組織とCpG等の免疫活性化剤を所属リンパ節付近の皮下および皮内に注射投与した後、投与した抗原タンパク質および腫瘍組織に対する強い免疫反応が誘導され、腫瘍の退縮、縮小および転移抑制が観察される。また本治療方法により、QOLの大幅な改善効果が得られる。
【００３７】
さらに、上記のプロトコールに加えイヌＩＬ１２および/またはイヌＩＬ１８を１から１０回注射投与することで、上記治療法の治療効果およびQOLの改善効果を増強することが期待できる。
【００３８】
また、本発明のイヌＦｌｔ３リガンドにより、in vitroで誘導した樹状細胞を体内に戻すことも効果的であろう。
【００３９】
すなわち、骨髄あるいは末梢血から、GM-CSFとIL-3（あるいはIL-4）により樹状細胞を誘導し、その培養系にイヌＦｌｔ３リガンドと好ましくは腫瘍、アレルゲン、ウイルスに関連した抗原タンパク質あるいは抗原ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。この樹状細胞を有効量投与することで、症状の治療に望ましい免疫応答を誘導できる。さらに好ましくは、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導後、T細胞を樹状細胞と相互作用させて腫瘍特異的に反応するＴ細胞を増殖させ、投与することもある。
【００４０】
用いる末梢血または骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やCD4陽性細胞等が含まれている。
【００４１】
用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で10〜1000ng/mL程度が好ましく、さらに好ましくは20〜500ng/mL程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、37℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、5％CO2を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常3日〜8週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。上記の方法によりin vitroで培養された樹状細胞およびＴ細胞はの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常1〜1000000000個、好ましくは1000000〜1000000000個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００４２】
また別の方法では、明細書に記載のイヌＦｌｔ３リガンドを含む動物用疾患治療剤を動物に投与し、その後に骨髄あるいは末梢血からリンパ球を分離し、その培養系に腫瘍、アレルゲン、ウイルスに関連した抗原タンパク質あるいは抗原ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的なリンパ球を誘導することができる。
【００４３】
上記に示した腫瘍に対する治療法の効果の検証は、治療後の腫瘍の大きさの測定、腫瘍の内臓への転移を観察する、あるいはイヌのQOLの改善等により判定可能である。
【００４４】
本発明に係る動物用疾患治療剤は、腫瘍あるいは感染症など免疫能が低下した疾病、あるいは特に細胞性免疫反応に比べ、液性免疫反応が中心となったような片寄った免疫反応を示す疾病などさまざまな動物の免疫疾病に対して、従来のこれらイヌの疾病に対する治療薬・予防薬や治療方法・治療方法に比べ、顕著な治療効果および予防効果を示す。
【００４５】
また、この動物用疾患治療剤は、イヌＦｌｔ３リガンドに加えて任意に他の成分を含むことができる。本発明の動物用疾患治療剤に添加される成分は、主として、動物用疾患治療剤が投与される方式に依存して決定される。動物用疾患治療剤が個体として用いられる場合は、例えばラクトース等の充填剤、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン等の結合剤、着色剤、コーティング剤等を用いることができ、このような剤は経口投与に好適である。また、担体または賦活剤として例えば、白色ワセリン、セルロース誘導体、界面活性剤、ポリエチレングリコール、シリコーン、オリーブ油等を加えてクリーム、乳液、ローション等の形態として外用薬として患部に塗布して用いることもできる。また、本薬が液体として投与される場合は、通常行われている生理学的に許容される溶媒、および乳化剤、安定剤を含むことができる。溶媒としては水、ＰＢＳ、等張性生理食塩水等が挙げられ、乳化剤としては、ポリオキシエチレン系界面活性剤、脂肪酸系界面活性剤、シリコーン等が例示でき、安定剤としては、イヌ血清アルブミン、ゼラチン等のポリオール、またはソルビトール、トレハロースなどの糖類等が挙げられる。
【００４６】
本発明の動物用疾患治療剤は、例えば下記の精製過程を経て、対象となる動物へ投与される。Flt3リガンドを含む溶液をハイドロキシアパタイト担体および／または色素担体および／またはイオン交換担体および／またはゲル濾過担体に接触させ、Ｆｌｔ３リガンドを回収する。これらカラム担体を用いた精製操作はそれぞれ単独で行ってもイヌＦｌｔ３リガンドの高純度化が可能であるが、好ましくはそれぞれを組合わせて、さらに好ましくはすべてを組み合わせて行った方がより効果が高い。
【００４７】
本発明のイヌＦｌｔ３リガンドをコードするＤＮＡを組込んだ組換えベクターは、例えば次のようにして製造することができる。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、マウスやヒトのＦｌｔ３リガンドに相同性の高いイヌ由来タンパクをコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことにより、イヌＦｌｔ３リガンドｃＤＮＡの全長あるいは細胞外ドメインをコードする核酸分子をクローニングすることができる。
【００４８】
イヌの臟器などよりＲＮＡを得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられる。上記イヌ臟器やイヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（チルグウィン（Chirgwin）、外３名、「バイオケミストリー（Biochemistry）」、１９７９年、第１８巻，ｐ．５２９４-５２９９）バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法（バーガー（Berger）、外１名、「バイオケミストリー（Biochemistry）、１９７９年、第１８巻，ｐ．５１４３-５１４９」，グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。
【００４９】
イヌ臟器やマイトージェンなどで刺激されたイヌ単核球やイヌリンパ球より通常の方法、例えば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロースカラム法等によりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（グブラー（Gubler）、外１名、「ジーン（Gene）」、１９８３年，第２５巻，ｐ．２６３−２６９），Ｏｋａｙａｍａらの方法（オカヤマ（Okayama）、外１名、「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and cellular biology）」,１９８２年、第２巻，p.１６１-１７０；オカヤマ（Okayama）、外１名、「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and cellular biology）」,１９８３年、第３巻，p.２８０-２８９）等によりｃＤＮＡを合成する。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。
【００５０】
本発明中の配列番号２のDNA配列またはイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNA配列を含む組換えベクターは、本発明の化合物の相同体タンパク質をコードするDNA配列を含む組換えベクターも包含する。
【００５１】
また、本発明の組み換えベクターは、イヌＦｌｔ３リガンドの同一アミノ酸残基をコードする代替的コドンを含む核酸配列の使用も包含する。例えば、ロイシン残基（配列番号１の第４番目のアミノ酸）は、コドンＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＵ，ＣＵＣ，ＣＵＡおよびＣＵＧによりコードされ得る。６つのコドンは各々、ロイシン残基をコードするという目的に関して等価である。したがって、ロイシンコードヌクレオチドトリプレットのいずれかを用いて、in vitroまたはin vivoでタンパク質合成装置を指図して、ロイシン残基を組み入れ得る、ということは当業者には明らかであろう。同様に、配列番号１のイヌＦｌｔ３リガンドを含む他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列トリプレットとしては、以下のものが挙げられる：ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡおよびＡＧＧ（アルギニンコドン）；ＡＡＡおよびＡＡＧ（リシンコドン）；ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧおよびＧＵＵ（バリンコドン）；ＧＡＡおよびＧＡＧ（グルタミンコドン）；ＵＵＣおよびＵＵＵ（フェニルアラニンコドン）ならびにＵＡＣおよびＵＡＵ（チロシンコドン）。その他のアミノ酸残基は、ポリヌクレオチド配列により同様にコードされ得る。したがって本発明は、遺伝子コードの縮重のためにコドン配列中の天然型イヌＦｌｔ３リガンドをコードする核酸とは異なる縮重核酸よりコードされるタンパク質を包含する。
【００５２】
例えば、単一アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする修飾核酸分子が調製され得る。これらの核酸分子は各々、本明細書中に記載したような遺伝子コードの縮重に対応するヌクレオチド変化と相容れない１、２または３つのヌクレオチド置換を有し得る。同様に、２つのアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする修飾核酸分子が調製され得るが、これらは例えば２〜６のヌクレオチド変化を有する。例えばアミノ酸２および３、２および４、２および５、２および６等をコードするコドンのヌクレオチドの置換を含めたこれらと同様の多数の修飾核酸分子が当業者により容易に意図される。上記の例では、２つのアミノ酸の各組合せは、修飾核酸分子の組に、ならびにアミノ酸置換をコードするすべてのヌクレオチド置換に含まれる。当業者に容易に意図されるように、さらなる置換（即ち、３またはそれ以上）、付加または欠失（例えば、停止コドンまたはスプライス部位（単数または複数）の導入による）を有するポリペプチドをコードする付加的核酸分子も調製され得るし、本発明に包含される。上記の核酸またはポリペプチドはいずれも、本明細書中に開示された核酸および／またはポリペプチドに対する構造的関連または活性の保持に関して、ルーチン実験により試験され得る。
【００５３】
本発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換させることで形質転換体を作製することができる。ここでいう組換えベクターを用いて宿主を形質転換させるとは、エレクトロポレーション法、リポフェクチン法、リン酸カルシウム法などを用いて組換えベクターを宿主へ導入し、組換えベクターのもつ形質を宿主へ供与することをいう。この場合の形質とは、例えば薬剤耐性遺伝子を持つ組換えベクターを宿主に導入すると、その宿主は薬剤に抵抗性の特性をもつことをいう。
【００５４】
宿主としては原核生物又は真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌（Escherichia coli），バチルス属（Bacillus）細菌、例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等を用いることができる。真核生物としては酵母、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces serevisiae）等の真核性微生物、昆虫細胞、例えば、ヨガ（夜盗蛾）細胞（Spodoptera frugiperda），キャベツルーパー細胞（Trichoplusiani），カイコ細胞（Bombyx mori），動物細胞、例えばヒト細胞、サル細胞、マウス細胞等を使用することができる。本発明においてはさらに、生物体それ自体、例えば昆虫、例えばカイコ、キャベツルーパー等を用いることもできる。
【００５５】
ある特定のタンパク質をコードするDNAが含まれる組換えベクターの場合、その組換えベクターを用いて宿主を形質転換させると、宿主は特定のタンパク質を発現し生産する形質を獲得する。このような場合の組換えベクターは、発現ベクターをいうこともできる。
【００５６】
発現ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウイルス（バキュロ（昆虫）、ワクチニア（動物細胞））等が使用できる。発現ベクター中のプロモーターは宿主に依存して選択され、例えば細菌用プロモーターとしてはｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えばａｄｈ１プロモーター、ｐｑｋプロモーター等が使用される。また、昆虫用プロモーターとしてはバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等、動物細胞としてはＳｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ４０のｅａｒｌｙまたはｌａｔｅプロモーター等があげられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本発明の組換えベクターに用いる好ましいプロモーターはバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等が挙げられるが、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターがより好ましい。
【００５８】
イヌＦｌｔ３リガンドを哺乳動物細胞あるいは昆虫細胞を用いて生産する場合、配列番号１のアミノ酸からなるイヌＦｌｔ３リガンドには膜貫通ドメインが存在するため、この場合のイヌＦｌｔ３リガンドは細胞外に分泌されない。ヒトあるいはマウスのＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質は樹状細胞の増殖活性を有することが知られており、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターを用いることによって活性型イヌＦｌｔ３リガンドを細胞で生産し、かつ培養液から回収することができると期待される。
【００５９】
また、配列番号１のアミノ酸より構成されるイヌＦｌｔ３リガンドを哺乳動物細胞あるいは昆虫細胞を用いて生産する場合、配列番号１をコードするDNAを含む発現ベクターを用いることによって配列番号１に示すイヌＦｌｔ３リガンドを細胞膜上に発現させることができる。この細胞膜を界面活性剤等で処理することで、配列番号１に示すイヌＦｌｔ３リガンドを回収することができる。
【００６０】
イヌＦｌｔ３リガンドは、例えば、夜盗蛾由来の昆虫細胞、例えばSf-9、Sf-21あるいはHigh Fiveに感染する夜盗蛾科由来のバキュロウイルスよりイヌＦｌｔ３リガンドをコードするDNAを含む発現ベクターを用いて組換えウイルスを作製することによって、昆虫細胞発現系にてイヌＦｌｔ３リガンドを生産することができる。組換えバキュロウイルスは、イヌＦｌｔ３リガンドをコ−ドするＤＮＡをバキュロウイルス用の発現ベクターに連結して作製した組換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡとを、昆虫細胞にコトランスフェクションして作製することができる。従って、組換えウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ的な方法で作製することができる。
【００６１】
すなわち、イヌＦｌｔ３リガンドをコードするＤＮＡ部分を、例えばpAcAB3（Pharmingen社製）などのクローニングベクターの発現調節部分の下流に連結するという一般的な遺伝子操作に従って組換えベクターを作製することができる。この組換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡとを、文献（藤井著、「蛋白質  核酸  酵素」、１９９２年、第３７巻、p.２７０１−２７０６）のような方法で昆虫細胞、例えばSf-9にコトランスフェクションした後、培養を続け、培養液中に出現した非組換え体（野性型）と組換え体のウイルスの中から限界希釈法、もしくはプラーク法などの一般的な方法によって組換え体ウイルスをクローニングすることができる。組換え体ウイルスはイヌＦｌｔ３リガンドを発現していることから、組換えウイルスのクローンから産生されるイヌＦｌｔ３リガンドを抗イヌＦｌｔ３リガンド抗体を用いて検出することで、野性型ウイルスと容易に区別できる。イヌＦｌｔ３リガンドの生産は、前記の組換えバキュロウイルスを昆虫細胞中で増殖させることにより行なう。
【００６２】
昆虫細胞を用いる場合は、前記組換え体ウイルスを含む培養液により、細胞を感染させ、平面培養または浮遊培養により培養する。昆虫細胞を培養する培地としては、例えば牛血清を添加したTC-100培地を使用することができる。培養温度は２５〜２８℃が適当である。培養後、培溶液を遠心分離しその上清からイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を回収、あるいは組換えウイルスが感染した昆虫細胞を界面活性剤等で処理することで配列番号１よりなるイヌＦｌｔ３リガンドのタンパク質を回収する。
【００６３】
さらに、イヌＦｌｔ３リガンドは、例えば、カイコに感染する組換えカイコ核多角体病ウイルスを作製することによって、カイコ発現系を用いて生産することができる。組換えカイコ核多角体病ウイルスは、イヌＦｌｔ３リガンドをコ−ドするＤＮＡをカイコの組換えベクターに連結して作製した発現ベクターとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡとを、カイコ樹立細胞にコトランスフェクションして作製することができる。従って、組換えウイルスは、in vivo的な方法で作製することができる。
【００６４】
すなわち、イヌＦｌｔ３リガンドをコードするＤＮＡ部分を、例えばｐＢＫ２８３などのカイコの組換えベクターの発現調節部分の下流に連結するという一般的な遺伝子操作に従って発現ベクターを作製することができる。この発現ベクターとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡとを、文献（ホリウチ（Horiuchi）、「アグリカルチュアル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry）」, １９８７年、第５１巻，p.１５７３−１５８０）のような方法でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ−Ｎ株にコトランスフェクションした後、培養を続け、培養液中に出現した非組換え体（野性型）と組換え体のウイルスの中から限界希釈法、もしくはプラーク法などの一般的な方法によって組換え体ウイルスをクローニングすることができる。組換え体ウイルスは多角体の形成能がないことから、野性型ウイルスと容易に区別できる。イヌＦｌｔ３リガンドの生産は、前記の組換えカイコ核多角体病ウイルスをカイコ樹立細胞中、またはカイコ生体中で増殖させることにより行なう。
【００６５】
カイコ樹立細胞を用いる場合は、前記組換え体ウイルスを含む培養液により、ＢＭ−Ｎ細胞を感染させ、平面培養または浮遊培養により培養する。ＢＭ−Ｎ細胞を培養する培地としては、例えば牛血清を添加したＴＣ−１００培地を使用することができる。培養温度は２５〜２８℃が適当である。培養後、培溶液を遠心分離しその上清からイヌＦｌｔ３リガンドを回収、あるいは組換えウイルスが感染した細胞を界面活性剤等で処理することで配列番号１よりなるイヌＦｌｔ３リガンドのタンパク質を回収する。
【００６６】
カイコ生体を用いる場合は、前記の組換え体ウイルスを含む培養液をカイコ幼虫に注射して、合成飼料を与えて飼育する。飼育後、体液を採取しその上清からイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を回収、あるいは組換えウイルスが感染した細胞を界面活性剤等で処理することで配列番号１よりなるイヌＦｌｔ３リガンドのタンパク質を回収する。
【００６７】
また、哺乳動物発現系を用いることでイヌＦｌｔ３リガンドを製造することも可能である。イヌＦｌｔ３リガンドをコードするDNAを有する哺乳動物細胞用の発現ベクターを構築し、例えば、サルの株化細胞COS1あるいはCOS7、チャイニーズハムスターの株化細胞CHO等にトランスフェクトすることで、イヌＦｌｔ３リガンドの産生が可能となる。哺乳類細胞中でのイヌＦｌｔ３リガンドの発現に好ましい系は、Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子（安定トランスフェクト化細胞株の選択を促す）、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター配列のような選択可能マーカーを含有するｐＲｃ／ＣＭＶ（Invitrogen, Carlsbad, CAから入手可能）のような系である。さらに、霊長類またはイヌ細胞株中での発現に適しているのは、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）複製起点を含有し、多コピー染色体外素子としてのベクターの保持を促すｐＣＥＰ４ベクター（Invitrogen）である。別の発現ベクターは、in vitroでの転写を効率的に刺激するポリペプチド延長因子１αのプロモーターを含有するｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドである。この発現ベクターは、ミジズマ（Mishizuma）ら（「ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic acids research）」、１９９０年、第１８巻、ｐ．５３２２）により記載されており、トランスフェクション実験におけるその使用は、例えばデモウリン（Demoulin）ら（「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and cellular biology）、１９９６年、第１６巻、ｐ．４７１０−４７１６」により開示されている。さらに別の好ましい発現ベクターは、スタンフォード-ペリカウデット（Stratford-Perricaudet）らにより記載されたアデノウイルスであり、これはＥ１およびＥ３タンパク質を欠いている（「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インバスティゲーション（The Journal of clinical investigation）」、１９９２年、第９０巻、ｐ．６２６−６３０）。Adeno.Ｐ１Ａ組換え体としてのアデノウイルスの使用は、Ｐ１Ａに対する免疫感作のためのマウスにおける皮内注射において、ワーニアー（Warnier）らにより開示されている（「インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（International journal of cancer）」、１９９６年、第６７巻、ｐ．３０３−３１０）。
【００６８】
また、原核生物、例えば大腸菌発現系を用いることでイヌＦｌｔ３リガンドを製造することも可能である。イヌＦｌｔ３リガンドをコードするDNAを有する大腸菌用の発現ベクターを構築し、宿主細胞の大腸菌、例えばＢＬ２１にトランスフェクトすることで、イヌＦｌｔ３リガンドの産生が可能となる。細胞増殖を促進する等の生理活性を有したイヌＦｌｔ３リガンドを製造するには、可溶性タンパクとしてイヌＦｌｔ３リガンドを回収することが必要である。大腸菌の発現系においてイヌＦｌｔ３リガンドが不溶性タンパクとして発現した場合、変成剤、例えば尿素あるいはグアニジン塩酸で不溶性タンパクを可溶化させ、その後、穏やかに変成剤を除去することで生理活性を有したイヌＦｌｔ３リガンドを製造することが可能であろう。変成剤を除去する方法は当業者には周知である。また、上記の方法以外にイヌＦｌｔ３リガンドの生産あるいは生理活性を向上させるには、プロテアーゼを欠損した大腸菌を使用する、チオレドキシンを発現した大腸菌を使用する、分子シャペロン、例えばgroELおよびgroESを発現している大腸菌を使用する方法があるが、これらの方法に限定されない。
【００６９】
また、無細胞発現系を用いて、イヌＦｌｔ３リガンドを製造ことも可能である。無細胞発現系としては、遺伝子の転写、アミノ酸の翻訳に必要な構成成分であるトランスファーRNA、リボソーム、RNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、アミノ酸、ピロリン酸、リン酸、ヌクレオチド一リン酸、ヌクレオチド二リン酸等を含んだ大腸菌、コムギ胚芽の細胞溶解物（ライセート）を用いることが知られている。これらライセートとイヌＦｌｔ３リガンドの遺伝子を含むベクターを加えて反応させることで、in vitroでイヌＦｌｔ３リガンドの製造が可能である。また、分子シャペロン、例えばgroEL、groES、DnaK、DnaJ等を単独あるいは組み合わせて上記の反応を行うことで、イヌＦｌｔ３リガンドの生理活性を向上させることができるであろう。ここでいう無細胞発現系は、上記に限定されるものではない。
【００７０】
本発明の別の一態様は、イヌＦｌｔ３リガンドを特異的に認識する抗体に関する。ここでいう特異的とは、本発明の抗体がイヌＦｌｔ３リガンドのみを検出し、別の種、例えばヒトＦｌｔ３リガンドには反応しないことをいう。また、ここでいう抗体とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、血清、血漿を包含する。
【００７１】
本発明のイヌＦｌｔ３リガンドに対する抗体は、イヌＦｌｔ３リガンドの変異体に対する抗体も包含し、例えば、レイル（Lane）ら著、「アンティボディーズ；ア・ラボラトリー・マニュアル（Antibodies; A Laboratory Manual）、第１版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harber Laboratory Press）、１９８９年」などに記載の方法により、本発明の化合物およびその変異体、あるいは配列番号１に含まれる１から４０個のアミノ酸、好ましくは１０から３０個のアミノ酸配列よりなるペプチド、例えば配列番号１に示すアミノ酸番号19から39番目からなるペプチドを用いて適切な方法で適切な動物、例えばウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット等を免疫することにより、イヌＦｌｔ３リガンドを認識する抗体、あるいはその活性を中和する抗体を容易に作製できる。抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、cDNAライブラリーのスクリーニング、免疫学的診断法等が挙げられる。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
【００７３】
参考例１：イヌおよびヒトＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAのクローニング
イヌおよびヒト末梢血よりHistopaque-1077（Sigma社製）を用いた密度勾配遠心によりヒトおよびイヌ末梢血単核球（以下PBMCと略記する）を分離した。PBMC分離後、イヌＰＢＭＣは10%牛胎児血清（以下FBSと略記する）を含むERDF培地（極東製薬（株）製）で培養し、ヒトＰＢＭＣはＡＩＭ−Ｖ培地（Gibco社製）にで培養した。イヌおよびヒトＦｌｔ３リガンドの発現を誘導するために、10μg/mlのコンカナバリンA（Sigma社製）で１日刺激した。刺激したイヌおよびヒトPBMCから、TRIZOL（Gibco社製）を用いて総RNAを調整した。得られたRNAの５μgから、SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen社製) を用いて、添付のプロトコールに従いcDNA（総量２０μl）を調整した。
【００７４】
PCRは１μlの刺激イヌおよびヒトリンパ球由来cDNA、それぞれ２種類のプライマー（イヌＦｌｔ３リガンドは配列番号３と配列番号４、ヒトＦｌｔ３リガンドは配列番号５と配列番号６）を各１μM, 0.2mM各dNTP, １mM MgSO4, 1UのKODポリメラーゼ（Toyobo社製）となるように各試薬と添付のバッファーを加え全量を５０μlとし、Bio Rad社製のThermal Cyclerを用いて行った。なお、配列番号３と配列番号４のプライマーには制限酵素部位のEcoRIが挿入してあり、さらに配列番号４には終止コドンが付加されている。ＰＣＲ後、増幅されたDNAを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約５７０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。TAクローニングキット（Invitrogen社）を用いて調整したDNAをベクターへ挿入し、蛍光ＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystems社製ABI PRISM 3100）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、調整したＤＮＡの塩基配列を決定した。
【００７５】
実施例１：イヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを挿入した組換えバキュロウイルスの作製
参考例１により得られたベクターを制限酵素EcoRIで切断後、Klenow Fragment（Takara社製）で平滑末端化を行った。バキュロウイルス発現ベクターとしてpAcAB3（Pharmingen社製）を用いた。ポリヘドリンプロモーター下流のXbaIサイトを制限酵素XbaI（Takara社製）で切断後、Klenow Fragmentで平滑末端化を行い、Calf intestine Alkaline Phosphatase（Takara社製）で脱リン酸化処理をした。調整したベクターとイヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインのDNA断片を連結し、組換えベクターを作製した。添付マニュアルに従い、作製した組換えベクターと昆虫細胞Ｓｆ９（Spondoptera frugeruda由来、Gibco社製）を用いて組換えウイルスrAcCaFLを作製した。
【００７６】
７５ｃｍ2のフラスコでコンフルエントまで平面培養したＳｆ９細胞を血清非含有の培地Sf-900 II（Gibco社製）で置き換え、組換えバキュロウイルスrAcCaFLを感染させ、４日間培養した後、培養上清を回収した。
【００７７】
イヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインタンパク質の産生はウェスタンブロットにより以下の方法で確認した。回収した培養上清に等量の可溶化バッファーを添加し、９５℃で５分間熱処理を行った。その後、サンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写した。タンパクが転写されたPVDF膜を３％スキムミルク含有リン酸緩衝液（以下SM-PBSと略記する）で４℃、一晩、ブロッキングし、その後、実施例４で作製した２種類の抗イヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体を室温で１時間反応させた。0.1% Tween-20を含むPBS（以下PBSTと略記する）で３回洗浄し、HRP標識抗ウサギIgG抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄後、ECL（Amersham社製）に反応させ、X線フィルムに感光することで、図１に示すようにイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現を確認した。
【００７８】
参考例２：ヒトＦｌｔ３受容体の細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAのクローニング
ヒト白血病株化細胞であるOCI-AML5（DSMZ製、以下AML5と略記する）は、Ｆｌｔ３リガンド依存的に増殖する細胞株でありＦｌｔ３受容体が発現している。AML5は、20% FBSと10 ng/mlのGM-CSFを含むalpha-MEM培地（Gibco社製）で培養し、培養開始後１ヶ月以内の細胞を解析に用いた。AML5から、TRIZOLを用いて総RNAを調整した。得られたRNAの５μgから、SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCRを用いて、添付のプロトコールに従いcDNA（総量２０μl）を調整した。
【００７９】
PCRは１μlのAML5由来cDNA、配列番号７と配列番号８に示す２種類のプライマを各１μM, 0.2mM各dNTP, １mM MgSO4, 1UのKODポリメラーゼとなるように各試薬と添付のバッファーを加え全量を５０μlとし、Thermal Cyclerを用いて行った。なお、配列番号７のプライマーには制限酵素部位のBamHIが挿入してあり、配列番号８のプライマーには制限酵素部位のHindIII、６個のヒスチジンタグをコードする配列および停止コドンが挿入されている。ＰＣＲ後、増幅されたDNAを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約１，６００ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。TAクローニングキット（Invitrogen社）を用いて調整したDNAをベクターへ挿入し、蛍光ＤＮＡシーケンサを用い、その添付プロトコールに従って、ダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、挿入したＤＮＡの塩基配列を決定した。ベクターへクローニングされたDNAは、Flt3受容体の細胞外ドメイン（アミノ末端から５４１アミノ酸まで）とそのカルボキシル末端へ６個のヒスチジンを融合したタンパク質（Hisタグ）をコードしている。
【００８０】
参考例３：Ｆｌｔ３受容体の細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを挿入した組換えバキュロウイルスの作製
PCRにより得られたDNA断片を制限酵素BamHIとHindIIIで切断後、Klenow Fragment（Takara社製）で平滑末端化を行った。バキュロウイルス発現ベクターとしてpAcAB3を用いた。ポリヘドリンプロモーター下流のXbaIサイトを制限酵素XbaI（Takara社製）で切断後、Klenow Fragmentで平滑末端化を行い、Calf intestine Alkaline Phosphatase（Takara社製）で脱リン酸化処理をした。調整したベクターとイヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインのDNA断片を連結し、組換えベクターを作製した。添付マニュアルに従い、作製した組換えベクターと昆虫細胞Sf9を用いて組換えウイルスrAcFlt3-Hisを作製した。
【００８１】
７５ｃｍ2のフラスコでコンフルエントまで平面培養したＳｆ９細胞を血清非含有の培地Sf-900 IIで置き換え、組換えバキュロウイルスrAcFlt3-Hisを感染させ、４日間培養した後、培養上清を回収した。
【００８２】
Flt3受容体の産生はウェスタンブロットにより以下の方法で確認した。回収した培養上清に等量の可溶化バッファーを添加し、９５℃で５分間熱処理を行った。その後、サンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写した。タンパクが転写されたPVDF膜をSM-PBSで４℃、一晩、ブロッキングし、その後、抗Ｆｌｔ３受容体ウサギ抗体（Upstate biotechnology社製）または抗HRP標識抗His抗体（Quiagen社製）を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄し、抗Ｆｌｔ３レセプター抗体の反応後にHRP標識抗ウサギIgG抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄後、ECLに反応させ、X線フィルムに感光することで、Flt3レセプターの発現を確認した。
【００８３】
実施例２：イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質のＦｌｔ３受容体の細胞外ドメインタンパク質への結合実験
７５ｃｍ2のフラスコでコンフルエントまで平面培養したＳｆ９細胞を血清非含有の培地Sf-900 IIで置き換え、実施例１で作製したrAcCaFLと参考例３で作製したrAcFlt3-Hisを同時あるいはおのおの単独で感染させ、４日間培養した後、培養上清を回収した。各培養上清を、ハイドロキシアパタイト担体（バイオラッド社製）を充填したカラムにアプライした後、十分量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：６）でカラムを洗浄した。０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ：６）をカラムに展開し、溶出画分を回収した。
【００８４】
溶出画分中のイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質およびFlt3受容体の細胞外ドメインタンパク質はウェスタンブロットにより以下の方法で確認した。回収した培養上清に等量の可溶化バッファーを添加し、９５℃で５分間熱処理を行った。その後、サンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写した。タンパクが転写されたPVDF膜をSM-PBSで４℃、一晩、ブロッキングし、その後、実施例８で作製したイヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体（配列番号１に示すイヌＦｌｔ３リガンドのアミノ酸配列中のアミノ酸番号１５３から１７５番目よりなるペプチドより作製した抗体）あるいは抗HRP標識抗His抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄し、HRP標識抗ウサギIgG抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄後、ECLに反応させ、X線フィルムに感光することで、溶出画分中のイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質およびFlt3受容体の細胞外ドメインタンパク質の存在を確認した。結果を図２に示す。ｒAcCaFLあるいはrAcFlt3-Hisを単独で感染させた場合の実験結果より、イヌＦｌｔ３リガンド単独ではハイドロキシアパタイト担体に結合しないが、Flt3受容体はハイドロキシアパタイト担体に結合することが判明した。次に、ｒAcCaFLあるいはrAcFlt3-Hisを単独で感染させて回収した培養上清を等容量で１時間、室温にて混合した場合とrAcCaFLとrAcFlt3-Hisを同時に感染させた後に回収した培養上清の場合は、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質が溶出画分で検出された。この結果は、Flt3受容体の細胞外ドメインタンパク質に対しイヌFlt3リガンドの細胞外ドメインが結合していることを示している。
【００８５】
参考例４：イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインの精製方法
実施例１で得られた細胞培養上清を用いてハイドロキシアパタイト担体によるイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の分画を検討した。精製はｐＨ：６で行った。培養上清を、ハイドロキシアパタイト担体を充填したカラムにアプライした後、十分量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：６）でカラムを洗浄した。溶出はリン酸緩衝液（ｐＨ：６）の濃度を０．１Ｍから０．５Ｍまで０．１Ｍ刻みで行った。その結果、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質は、ハイドロキシアパタイト担体に結合することなく素通りの画分で検出された。なお、昆虫細胞およびバキュロウイルス由来の夾雑物の大部分はハイドロキシアパタイト担体に結合した。
【００８６】
イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を含む画分をさらにブルーセファロース担体を充填したカラムにアプライし、十分量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ：８）でカラムを洗浄後、ＮａＣｌの濃度を０．１Ｍから１Ｍまで０．１Ｍ刻みで溶出を行った。その結果、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ：８）により溶出された。
【００８７】
イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を含む画分をさらにアニオン交換担体を充填したカラムにアプライし、十分量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ：８）でカラムを洗浄後、ＮａＣｌの濃度を０．１Ｍから１Ｍまで０．１Ｍ刻みで溶出を行った。その結果、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質は０．１ＭのＮａＣｌ濃度でにより溶出された。
【００８８】
イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を含む画分をさらにゲル濾過担体を充填したカラムにアプライし、０．０１％のPluronic F-68を含むPBSを十分量カラムに展開した。スーパーデックス２００を用いた場合、流速２００μl/minの条件では７０分から８０分の間にイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質が回収できた。イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で９８％以上、逆相カラムを用いたＨＰＬＣによる分析で、９０％以上であった。
【００８９】
実施例３：イヌＣＤ１１ｃ陽性およびイヌMHCクラスII陽性細胞の増殖能の測定
イヌ末梢血よりHistopaque-1077を用いた密度勾配遠心によりイヌＰＢＭＣを分離した。洗浄したイヌＰＢＭＣをAIM-V培地で懸濁し、細胞が5 x 104 / 100 μl / wellとなるように96穴プレートに移した。イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を含む培養上清、ヒトGM-CSF（Genzyme社製）とヒトIL-4（Genzyme社製）を添加し、5% CO2, 37℃の条件で７日間培養した。なお、培養開始から６日目にそれぞれの培養液に１μＣｉづつのトリチウムチミジンを添加した。培養後、細胞ハーベスターにて細胞をガラス濾紙上に回収し、トリチウムチミジンの取り込み量を液体シンチレーションカウンターにて測定した。図３に示すように、1000U/mlのヒトGM-CSFと1000U/mlのヒトIL-4をを加えることで、イヌPBMC由来の細胞の増殖が促進することが確認された。次に、1000U/mlのヒトGM-CSFと1000U/mlのヒトIL-4の存在下でイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を含む培養上清を加えたところ、図４に示すように、イヌPBMC由来の細胞の増殖をさらに促進することが確認された。
【００９０】
上記の方法でイヌPBMCを分離後、AIM-V培地で懸濁し、細胞数が6 x 106/ 5 ml/ 25 cm2フラスコ2 x 106 / 2 ml/ 24ウェルプレートとなるように、5% CO2, 37℃の条件で培養した。９０分後に培養上清を除き、5 mlのAIM-V培地にイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を含む昆虫細胞の培養上清（1:150希釈）存在下あるいは非存在下で1000 U/mlのヒトGM-CSF と1000 U/ml のヒトIL-4を加え、5% CO2, 37℃の条件で６日間培養した。培養細胞におけるCD11c, CD3, MHC class IIの発現はFACS Calibur（Becton, Dickinson and Company社製）を使い測定した。使用した抗体の抗イヌCD3-FITC、抗イヌCD11c、抗イヌMHC class II-FITCはSerotec社より購入した。
【００９１】
イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の存在下でを含む昆虫細胞の培養上清存在下において、培養４日目から細胞に樹状突起物を有し、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質非存在下の細胞に比べて細胞の大きさが大きい細胞群が観察されたことから、樹状細胞様の細胞が誘導されていることが示唆された。イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の添加により樹状細胞の増殖が促進されるかを確認するため、培養開始後６日目の細胞を回収し、フローサイトメトリーで樹状細胞のマーカーであるCD11c陽性細胞と抗原提示細胞のマーカーであるMHC class II の割合を比較した。樹状細胞はＴ細胞マーカーであるＣＤ３の発現は見られないことから、CD3陰性細胞とMHC class II陽性細胞の割合を算出した。表１で示すように、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を添加しない場合に比べて、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を添加することでＣＤ３陰性細胞中のCD11c陽性およびMHC class II陽性細胞が約２倍に増加することが確認された。この結果は、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質がイヌ樹状細胞を増殖させる活性をもつことを示唆している。
【００９２】
【表１】
2006166908.tif 000002
【００９３】
次に精製イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を用いた解析を行った。
【００９４】
イヌ末梢血よりHistopaque-1077を用いた密度勾配遠心によりイヌＰＢＭＣを分離した。洗浄したイヌＰＢＭＣを２％FCSを含むRPMI培地で懸濁し、細胞が1 x 105 / 100 μl / wellとなるように96穴プレートに移した。各濃度のイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を添加し、5% CO2, 37℃の条件で７日間培養した。なお、培養開始から６日目にそれぞれの培養液に１μＣｉづつのトリチウムチミジンを添加した。培養後、細胞ハーベスターにて細胞をガラス濾紙上に回収し、トリチウムチミジンの取り込み量を液体シンチレーションカウンターにて測定した。図５に示すように、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を加えることで、濃度依存的にイヌPBMC由来の細胞の増殖が促進することが確認された。
【００９５】
上記の方法でイヌPBMCを分離後、AIM-V培地あるいは１０％ＦＢＳを含むRPMI培地で懸濁し、細胞数が2 x 106 / 2 ml/ 24ウェルプレートとなるように、5% CO2, 37℃の条件で培養した。２時間後に培養上清を除き、2 mlのAIM-V培地あるいは１０％ＦＢＳを含むRPMI培地に10ng/mlあるいは25ng/mlイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の存在下あるいは非存在下で1000 U/mlのヒトGM-CSF と1000 U/ml のヒトIL-4を加え、5% CO2, 37℃の条件で６日間培養した。培養細胞におけるCD11c, CD14の発現はFACS Calibur（Becton, Dickinson and Company社製）を使い測定した。使用した抗体の抗イヌCD14はPharmingen社より購入した。
【００９６】
図６に示すように、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の存在下で、培養６日目から細胞に樹状突起物を有し、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質非存在下の細胞に比べて細胞の大きさが大きい細胞群が観察されたことから、樹状細胞様の細胞が誘導されていることが示唆された。イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の添加により樹状細胞の増殖が促進されるかを確認するため、培養開始後６日目の細胞を回収し、フローサイトメトリーで樹状細胞のマーカーであるCD11c陽性細胞と単球マーカーであるCD14の割合を比較した。樹状細胞は単球マーカーであるCD14の発現は見られないことから、培養細胞中のCD11c陽性CD14陰性細胞割合を算出した。表２で示すように、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を添加しない場合に比べて、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を添加することでCD11c陽性CD14陰性細胞が増加することが確認された。イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の有無によるイヌ樹状細胞誘導能の差は、AIM-V培地で培養した時に顕著に現れた。この結果は、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質がイヌ樹状細胞を増殖させる活性をもつことを示唆している。
【００９７】
【表２】
2006166908.tif 000003
【００９８】
実施例４：イヌＦｌｔ３リガンドを検出するウサギポリクローナル抗体の作製
配列番号１に示すイヌＦｌｔ３リガンドのアミノ酸配列中のアミノ酸番号19から39番目及び153から175番目までのペプチドを合成後、ウサギに免疫することにより抗血清を得た。この抗血清には抗イヌＦｌｔ３リガンドウサギポリクローナル抗体が含まれている。
【００９９】
作製した抗イヌＦｌｔ３リガンドウサギポリクローナル抗体におけるイヌＦｌｔ３リガンドに対する反応性の確認は、ウェスタンブロットにより以下の方法で実施した。実施例１より回収した培養上清に等量の可溶化バッファーを添加し、９５℃で５分間熱処理を行った。その後、サンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写した。タンパクが転写されたPVDF膜を３％スキムミルク含有リン酸緩衝液（以下SM-PBSと略記する）で４℃、一晩、ブロッキングし、その後、作製した２種類のイヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体を室温で１時間反応させた。PBSＴで３回洗浄し、HRP標識抗ウサギIgG抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄後、ECLに反応させ、X線フィルムに感光することで、図１に示すように２種類の抗体は共にイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現を確認した。
【０１００】
実施例５：カイコによるイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現
カイコ核多角体病ウイルス発現ベクターのp283（日本農産工業（株）製）をEcoRIで切断後、Calf intestine Alkaline Phosphatase（Takara社製）で脱リン酸化処理をし、参考例１により得られたベクターを制限酵素EcoRIで切断後に得られるイヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインのDNA断片と連結し、組換えベクターを作製した。添付マニュアルに従い、作製した組換えベクターとBmN4細胞（フナコシ（株）製）を用いて組換えウイルスrBmCaFLを作製した。
【０１０１】
作製したrBmCaFLを５齢のカイコに皮下接種し、３日後に体液を回収した。
【０１０２】
イヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインタンパク質の産生はウェスタンブロットにより以下の方法で確認した。回収した体液に等量の可溶化バッファーを添加し、９５℃で５分間熱処理を行った。その後、サンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写した。タンパクが転写されたPVDF膜をSM-PBSで４℃、一晩、ブロッキングし、その後、実施例４で作製したイヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体（配列番号１に示すイヌＦｌｔ３リガンドのアミノ酸配列中のアミノ酸番号１５３から１７５番目よりなるペプチドより作製した抗体）を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄し、HRP標識抗ウサギIgG抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄後、ECL（Amersham社製）に反応させ、X線フィルムに感光することで、図７に示すようにイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現を確認した。
【０１０３】
実施例６：哺乳動物細胞によるイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現
哺乳動物発現ベクターのpcDNA3.1（Invitrogen社製）をEcoRIで切断後、Calf intestine Alkaline Phosphatase（Takara社製）で脱リン酸化処理をし、参考例１により得られたベクターを制限酵素EcoRIで切断後に得られるイヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインのDNA断片と連結し、組換えベクターを作製した。作製した組換えベクターをCOS1細胞へトランスフェクトし、その４日後に培養上清を回収した。
【０１０４】
イヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインタンパク質の産生はウェスタンブロットにより以下の方法で確認した。回収した培養上清に等量の可溶化バッファーを添加し、９５℃で５分間熱処理を行った。その後、サンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写した。タンパクが転写されたPVDF膜をSM-PBSで４℃、一晩、ブロッキングし、その後、実施例４で作製したイヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体（配列番号１に示すイヌＦｌｔ３リガンドのアミノ酸配列中のアミノ酸番号１５３から１７５番目よりなるペプチドより作製した抗体）を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄し、HRP標識抗ウサギIgG抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄後、ECL（Amersham社製）に反応させ、X線フィルムに感光することで、図８に示すようにイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現を確認した。
【０１０５】
参考例５：哺乳動物細胞で製造したイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の精製
実施例６で得られたＦｌｔ３リガンドタンパク質を含む溶液を用いてアニオン交換担体よるイヌＦｌｔ３リガンドの分画を検討した。培養上清を、アニオン交換担体を充填したカラムにアプライした後、十分量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ：８）でカラムを洗浄した。溶出はＮａＣｌの濃度を０Ｍから１．０Ｍまで０．１Ｍ刻みで行った。その結果、イヌＦｌｔ３リガンドは、アニオン交換担体に結合することなく素通りの画分で検出された。
【０１０６】
イヌＦｌｔ３リガンドを含む画分をさらにブルーセファロース担体を充填したカラムにアプライし、十分量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：６．８）でカラムを洗浄後、溶出はＮａＣｌの濃度を０Ｍから１．０Ｍまで０．１Ｍ刻みで行った。その結果、イヌＦｌｔ３リガンドは１．０Ｍ  ＮａＣｌにより溶出された。
【０１０７】
イヌＦｌｔ３リガンドを含む画分をさらにハイドロキシアパタイト担体を充填したカラムにアプライし、十分量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：６．８）でカラムを洗浄後、リン酸緩衝液（ｐＨ：６．８）の濃度を０Ｍから０．５Ｍまで０．１Ｍ刻みで溶出を行った。その結果、イヌＦｌｔ３リガンドは０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ：６．８）の濃度でにより溶出された。
【０１０８】
イヌＦｌｔ３リガンドを含む画分をさらにゲル濾過担体を充填したカラムにアプライし、０．０１％のPluronic F-68（Gibco社製）を含むPBSを十分量カラムに展開した。スーパーデックス２００を用いた場合、流速２００μl/minの条件では７０分から８０分の間にイヌＦｌｔ３リガンドが回収できた。イヌＦｌｔ３リガンドの純度は、逆相カラムを用いたＨＰＬＣによる分析で、９０％以上であった。
【０１０９】
実施例７：哺乳動物細胞で製造したイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の活性測定
AML-5細胞を２％FCSを含むα-MEM培地で懸濁し、細胞が1 x 104 / 100 μl / wellとなるように96穴プレートに移した。各濃度のイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を添加し、5% CO2, 37℃の条件で2日間培養した。なお、測定前６時間でそれぞれの培養液に１μＣｉづつのトリチウムチミジンを添加した。培養後、細胞ハーベスターにて細胞をガラス濾紙上に回収し、トリチウムチミジンの取り込み量を液体シンチレーションカウンターにて測定した。図９に示すように、イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を加えることで、濃度依存的にAML-5細胞の増殖が促進することが確認された。また、実施例３に示す方法により、哺乳動物細胞で生産したイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質がイヌ樹状細胞を増殖させる活性をもつことを確認した。
【０１１０】
実施例８：大腸菌によるHisタグ融合イヌおよびヒトＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現
大腸菌にてイヌおよびヒトＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインタンパク質を発現させるための発現ベクターの構築は以下の方法により実施した。PCRは、参考例１でTAクローニングキットを用いて作製したベクターを１μl、それぞれ２種類のプライマー（イヌＦｌｔ３リガンドは配列番号９と配列番号１０、ヒトＦｌｔ３リガンドは配列番号１１と配列番号１２）を各１μM, 0.2mM各dNTP, １mM MgSO4, 1UのKODポリメラーゼとなるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Thermal Cyclerを用いて行った。なお、プライマーには制限酵素部位のNdeIが挿入してあり、配列番号１０と配列番号１２には終止コドンが挿入してある。ＰＣＲ後、増幅されたDNAを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約５７０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。
【０１１１】
PCRにより得られたDNA断片を制限酵素NdeI（Takara社製）で切断後、あらかじめ制限酵素NdeIで切断後、Calf intestine Alkaline Phosphatase（Takara社製）で脱リン酸化処理したpET-16b（Novagen社製）へ組み込み、大腸菌用発ベクターを作製した。宿主として大腸菌BL21（DE3）（Takara社製）を使用した。トランスフォームしたBL21のシングルコロニーをアンピシリン（終濃度50μg/ml）含有LB培地でOD600が約0.5になるまで培養後、終濃度で1mMになるようにIPTGを添加してさらに４時間培養した。培養後、大腸菌を5,000xgで4℃、30分間遠心し、沈殿物を0.5% Triton X-100とプロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma社製）の存在下で超音波にて破砕した。破砕物を数回洗浄し、沈殿物を終濃度8M尿素で4℃、一晩可溶化させた。その後、15,000xgで4℃、20分間、２回遠心し、得られた上清をフィルター濾過し、可溶性画分を得た。発現産物は、イヌおよびヒトＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインのＮ末端にHisタグが融合したものである。
【０１１２】
イヌおよびヒトＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインタンパク質の産生はウェスタンブロットにより以下の方法で確認した。回収した培養上清に等量の可溶化バッファーを添加し、９５℃で５分間熱処理を行った。その後、サンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写した。タンパクが転写されたPVDF膜をSM-PBSで４℃、一晩、ブロッキングし、その後、実施例４で作製したイヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体またはヒトＦｌｔ３リガンドに対するヤギポリクローナル抗体（Santa Cruz社製）を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄し、HRP標識抗ウサギIgG抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄後、ECL（Amersham社製）に反応させ、X線フィルムに感光することで、図１１に示すようにイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現を確認した。また、実施例３に示す方法により、本大腸菌発現系で生産したイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質がイヌ樹状細胞を増殖させる活性をもつことを確認した。
【０１１３】
実施例９：大腸菌によるイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現
大腸菌にてイヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインタンパク質を発現させるための発現ベクターの構築は以下の方法により実施した。PCRは、参考例１でTAクローニングキットを用いて作製したベクターを１μl、それぞれ２種類のプライマー（配列番号９と配列番号１０）を各１μM, 0.2mM各dNTP, １mM MgSO4, 1UのKODポリメラーゼとなるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Thermal Cyclerを用いて行った。なお、プライマーには制限酵素部位のNdeIが挿入してあり、配列番号１０には終止コドンが挿入してある。ＰＣＲ後、増幅されたDNAを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約５７０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。
【０１１４】
PCRにより得られたDNA断片を制限酵素NdeI（Takara社製）で切断後、あらかじめ制限酵素NdeIで切断後、Calf intestine Alkaline Phosphatase（Takara社製）で脱リン酸化処理したpET-30a（Novagen社製）へ組み込み、大腸菌用発ベクターを作製した。宿主として大腸菌BL21（DE3）（Takara社製）を使用した。トランスフォームしたBL21のシングルコロニーをカナマイシン（終濃度15μg/ml）含有LB培地でOD600が約0.5になるまで３７℃で培養後、終濃度で1mMになるようにIPTGを添加してさらに２５℃で２０時間培養した。培養後、大腸菌を5,000xgで4℃、30分間遠心し、沈殿物を0.5% Triton X-100とプロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma社製）の存在下で超音波にて破砕した。その後、16,000xgで4℃、30分間、遠心し、得られた上清を可溶性画分、沈殿物を不溶性画分とした。
【０１１５】
イヌＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインタンパク質の産生はウェスタンブロットにより以下の方法で確認した。回収した培養上清に等量の可溶化バッファーを添加し、９５℃で５分間熱処理を行った。その後、サンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写した。タンパクが転写されたPVDF膜をSM-PBSで４℃、一晩、ブロッキングし、その後、実施例４で作製したイヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄し、HRP標識抗ウサギIgG抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄後、ECL（Amersham社製）に反応させ、X線フィルムに感光することで、図１０に示すようにイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現を確認した。また、実施例３に示す方法により、本大腸菌発現系で生産したイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質がイヌ樹状細胞を増殖させる活性をもつことを確認した。
【０１１６】
実施例１０：イヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体の特異性の検証
イヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体の特異性の検証はウェスタンブロット法により確認した。実施例８より調整した可溶性画分および大腸菌破砕液に等量の可溶化バッファーを添加し、９５℃で５分間熱処理を行った。その後、サンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写した。タンパクが転写されたPVDF膜をSM-PBSで４℃、一晩、ブロッキングし、その後、実施例９４で作製したイヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体（配列番号１に示すイヌＦｌｔ３リガンドのアミノ酸配列中のアミノ酸番号19から39番目よりなるペプチドより作製した抗体）あるいは抗ヒトＦｌｔ３リガンド抗体（Santa Cruz社製）を室温で１時間反応させた。PBSＴで３回洗浄し、HRP標識抗ウサギIgG抗体を室温で１時間反応させた。PBSTで３回洗浄後、ECLに反応させ、X線フィルムに感光することで、イヌおよびＦｌｔ３リガンド細胞外ドメインタンパク質の発現を確認した。結果を図１１に示す。大腸菌において、イヌおよびヒトＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の発現が確認された。作製したイヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体は、ヒトＦｌｔ３リガンドには反応せず、イヌＦｌｔ３リガンド特異的に反応することが判明した。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞から産生されるイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をイヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットにより検出したことを示す図である。
【図２】昆虫細胞から産生されるイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質がＦｌｔ３受容体の細胞外ドメインタンパク質に結合する能力を有することを示す図である。
【図３】ヒトGM-CSFとヒトIL-4の存在下でイヌ末梢血単核球由来細胞の増殖が促進することを示す図である。
【図４】ヒトGM-CSFとヒトIL-4の存在下でイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を含む昆虫細胞由来培養上清を添加することによりイヌ末梢血単核球由来細胞の増殖が促進することを示す図である。
【図５】イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の存在下でイヌ末梢血単核球由来細胞の増殖が促進することを示す図である。
【図６】ヒトGM-CSFとヒトIL-4の存在下でイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を添加することにより、培養開始後４日目で細胞に樹状突起物を有している細胞群が観察されることを示す図である。
【図７】イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を発現する組換えカイコ核多角体病ウイルスを５齢カイコへ接種し、３日目に回収した体液からイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を検出できることを示す図である。
【図８】イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを挿入した哺乳動物発現ベクターをCOS1細胞へトランスフェクトし、４日目の培養上清からイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を検出できることを示す図である。
【図９】哺乳動物細胞で製造したイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質の存在下でAML-5細胞の増殖が促進することを示す図である。
【図１０】Hisタグを付加していないイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質が大腸菌発現系にて発現可能なことを示す図である。
【図１１】作製したイヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体（配列番号１に示すイヌＦｌｔ３リガンドのアミノ酸配列中のアミノ酸番号19から39番目よりなるペプチドより作製した抗体）がイヌＦｌｔ３リガンドを特異的に検出することを示す図である。
【符号の説明】
【０１１８】
１  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスを昆虫細胞Ｓｆ９へ４日間感染後に回収した培養上清を抗原とし、配列番号１に示すアミノ酸番号１９から３９に対するウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１１９】
２  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスを昆虫細胞Ｓｆ９へ４日間感染後に回収した培養上清を抗原とし、配列番号１に示すアミノ酸番号１５３から１７５に対するウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１２０】
３  ウェスタンブロットにより検出されたイヌＦｌｔ３リガンドのタンパクのバンドを示す。
【０１２１】
４  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスとヒトＦｌｔ３受容体の細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスを同時に昆虫細胞Ｓｆ９へ４日間感染後に回収した培養上清をハイドロキシアパタイトカラムへアプライし、カラムを洗浄後、０．５Ｍリン酸緩衝液でタンパクを溶出したものを抗原としたウエスタンブロットの結果である。
【０１２２】
５  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスあるいはヒトＦｌｔ３受容体の細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスを昆虫細胞Ｓｆ９へ４日間感染後に別々に回収し、その後混合した培養上清をハイドロキシアパタイトカラムへアプライし、カラムを洗浄後、０．５Ｍリン酸緩衝液でタンパクを溶出したものを抗原としたウエスタンブロットの結果である。
【０１２３】
６  ヒトＦｌｔ３受容体の細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスを昆虫細胞Ｓｆ９へ４日間感染後に回収した培養上清をハイドロキシアパタイトカラムへアプライし、カラムを洗浄後、０．５Ｍリン酸緩衝液でタンパクを溶出したものを抗原としたウエスタンブロットの結果である。
【０１２４】
７  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスを昆虫細胞Ｓｆ９へ４日間感染後に回収した培養上清をハイドロキシアパタイトカラムへアプライし、カラムを洗浄後、０．５Ｍリン酸緩衝液でタンパクを溶出したものを抗原としたウエスタンブロットの結果である。
【０１２５】
８  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスを昆虫細胞Ｓｆ９へ４日間感染後に回収した培養上清を抗原としたウエスタンブロットの結果である。
【０１２６】
９  Ｆｌｔ３受容体に対する抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１２７】
１０  イヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１２８】
１１  AIM-V培地で７日間培養後のイヌ末梢血単核球におけるトリチウムチミジンの取り込み量を示す結果である。
【０１２９】
１２  1000U/mlのヒトGM-CSF を含むAIM-V培地で７日間培養後のイヌ末梢血単核球におけるトリチウムチミジンの取り込み量を示す結果である。
【０１３０】
１３  1000U/mlのヒトIL-4を含むAIM-V培地で７日間培養後のイヌ末梢血単核球におけるトリチウムチミジンの取り込み量を示す結果である。
【０１３１】
１４  1000U/mlのヒトGM-CSFと1000U/mlのヒトIL-4を含むAIM-V培地で７日間培養後のイヌ末梢血単核球におけるトリチウムチミジンの取り込み量を示す結果である。
【０１３２】
１５  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだバキュロウイルスを昆虫細胞Ｓｆ９へ４日間感染後に回収した培養上清、1000U/mlのヒトGM-CSF、1000U/mlのヒトIL-4を含むAIM-V培地で７日間培養後のイヌ末梢血単核球におけるトリチウムチミジンの取り込み量を示す結果である。
【０１３３】
１６  コントロールのバキュロウイルスを昆虫細胞Ｓｆ９へ４日間感染後に回収した培養上清、1000U/mlのヒトGM-CSF、1000U/mlのヒトIL-4を含むAIM-V培地で７日間培養後のイヌ末梢血単核球におけるトリチウムチミジンの取り込み量を示す結果である。
【０１３４】
１７  25 ng/mlのイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク、1000U/mlのヒトGM-CSF、1000U/mlのヒトIL-4を含むAIM-V培地で６日間培養後のイヌ末梢血単核球の顕微鏡写真である。
【０１３５】
１８  AIM-Ｖ培地のみで６日間培養後のイヌ末梢血単核球の顕微鏡写真である。
【０１３６】
１９  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を発現する組換えカイコ核多角体病ウイルスのクローン１を５齢カイコへ接種し、３日目に回収した体液からイヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体（配列番号１に示すイヌＦｌｔ３リガンドのアミノ酸配列中のアミノ酸番号１５３から１７５番目よりなるペプチドより作製した抗体）を用いてイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を検出できることを示す結果である。
【０１３７】
２０  イヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を発現する組換えカイコ核多角体病ウイルスのクローン２を５齢カイコへ接種し、３日目に回収した体液からイヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体（配列番号１に示すイヌＦｌｔ３リガンドのアミノ酸配列中のアミノ酸番号１５３から１７５番目よりなるペプチドより作製した抗体）を用いてイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を検出できることを示す結果である。
【０１３８】
２１  ５齢カイコの体液からは、イヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体（配列番号１に示すイヌＦｌｔ３リガンドのアミノ酸配列中のアミノ酸番号１５３から１７５番目よりなるペプチドより作製した抗体）を用いてもイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を検出することができないことを示す結果である。
【０１３９】
２２  イヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体（配列番号１に示すイヌＦｌｔ３リガンドのアミノ酸配列中のアミノ酸番号１５３から１７５番目よりなるペプチドより作製した抗体）を用いて、昆虫細胞で製造したイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質を検出することができることを示す結果である。
【０１４０】
２３  カイコの体液からウェスタンブロットにより検出されたイヌＦｌｔ３リガンドのタンパクのバンドを示す。
【０１４１】
２４ウェスタンブロットにより検出された昆虫細胞発現系由来イヌＦｌｔ３リガンドのタンパクのバンドを示す。
【０１４２】
２５  ウェスタンブロットにより検出された哺乳細胞発現系由来イヌＦｌｔ３リガンドのタンパクのバンドを示す。
【０１４３】
２６  IPTG添加後のイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液を抗原とし、イヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１４４】
２７  IPTG添加前のイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液を抗原とし、イヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１４５】
２８  IPTG添加後のイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液の可溶性画分を抗原とし、イヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１４６】
２９  IPTG添加前のイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液の可溶性画分を抗原とし、イヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１４７】
３０  IPTG添加後のイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液の不溶性画分を抗原とし、イヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１４８】
３１  IPTG添加前のイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液の不溶性画分を抗原とし、イヌＦｌｔ３リガンドに対するウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１４９】
３２  ウェスタンブロットにより検出された大腸菌発現系由来イヌＦｌｔ３リガンドのタンパクのバンドを示す。
【０１５０】
３３  IPTG添加前のイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液を抗原とし、抗イヌＦｌｔ３リガンド抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１５１】
３４  IPTG添加後のイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液を抗原とし、抗イヌＦｌｔ３リガンド抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１５２】
３５  IPTG添加後のイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液の可溶性画分を抗原とし、抗イヌＦｌｔ３リガンド抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１５３】
３６  IPTG添加後のイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液を尿素で可溶化後の可溶性画分を抗原とし、抗イヌＦｌｔ３リガンド抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１５４】
３７  IPTG添加前のヒトＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液を抗原とし、抗イヌＦｌｔ３リガンド抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１５５】
３８  IPTG添加後のヒトＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液を抗原とし、抗イヌＦｌｔ３リガンド抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１５６】
３９  IPTG添加後のヒトＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液の可溶性画分を抗原とし、抗イヌＦｌｔガンド抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１５７】
４０  IPTG添加後のイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液を尿素で可溶化後の可溶性画分を抗原とし、抗イヌＦｌｔ３リガンド抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１５８】
４１  IPTG添加前のヒトＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液を抗原とし、抗ヒトＦｌｔ３リガンド抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１５９】
４２  IPTG添加後のヒトＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液を抗原とし、抗ヒトＦｌｔ３リガンド抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１６０】
４３  IPTG添加後のヒトＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液の可溶性画分を抗原とし、抗ヒトＦｌｔ３リガンド抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【０１６１】
４４  IPTG添加後のイヌＦｌｔ３リガンドの細胞外ドメインタンパク質をコードするDNAを組み込んだ大腸菌用の発現ベクターを導入した大腸菌破砕液を尿素で可溶化後の可溶性画分を抗原とし、抗ヒトＦｌｔ３リガンド抗体を用いたウエスタンブロットの結果である。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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