(57)【要約】【課題】  各種の研究において、体外で継代培養できるサル類の体細胞であり、かつ正常なサル類の遺伝情報を保持した細胞及びその培養系を開発し、それらを提供すること。【解決手段】  サル類由来の初代培養線維芽細胞、サル類胎児由来の初代培養線維芽細胞、サル類が新世界ザルであることを特徴とする前記の初代培養線維芽細胞、サル類がコモンマーモセットであることを特徴とする前記の初代培養線維芽細胞、前記の初代培養線維芽細胞の培養系であることを特徴とするサル類由来の初代培養線維芽細胞の継代培養系等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サル類由来の初代培養線維芽細胞。
【請求項２】
サル類胎児由来の初代培養線維芽細胞。
【請求項３】
サル類が新世界ザルであることを特徴とする請求項１又は２記載の初代培養線維芽細胞。
【請求項４】
サル類がコモンマーモセットであることを特徴とする請求項１又は２記載の初代培養線維芽細胞。
【請求項５】
請求項１記載の初代培養線維芽細胞の培養系であることを特徴とするサル類由来の初代培養線維芽細胞の継代培養系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サル類由来の初代培養線維芽細胞及びその培養系等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、線維芽細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラット等由来の線維芽細胞がすでに知られており、これら線維芽細胞は体外培養に供され、種々の研究に用いられている。
一方、サル類由来の初代培養細胞としては、例えば、初代培養肝細胞、初代培養リンパ細胞等の初代培養細胞がすでに知られており、これら初代培養細胞も体外培養に供され、種々の研究に用いられている。
【０００３】
【非特許文献１】R. Ian Freshney著, CULTURE OF ANIMAL CELLS, A Manual of Basic Technique, 2nd ed: 1987 1st ed: 1983, Alan R. Liss Inc., New York
【特許文献１】特表平８−５０６７３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
各種の研究において、体外で継代培養できるサル類の体細胞であり、かつ正常なサル類の遺伝情報を保持した細胞及びその培養系の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、かかる状況下において鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．サル類由来の初代培養線維芽細胞（以下、本発明細胞と記すこともある。）；
２．サル類胎児由来の初代培養線維芽細胞；
３．サル類が新世界ザルであることを特徴とする前項１又は２記載の初代培養線維芽細胞；
４．サル類がコモンマーモセットであることを特徴とする前項１又は２記載の初代培養線維芽細胞；
５．前項１記載の初代培養線維芽細胞の培養系であることを特徴とするサル類由来の初代培養線維芽細胞の継代培養系（以下、本発明培養系と記すこともある。）；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、体外で継代培養できるサル類の体細胞であり、かつ正常なサル類の遺伝情報を保持した細胞及びその培養系が提供可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において線維芽細胞とは、結合織形成細胞とも呼ばれている細胞であり、動物固体内の殆ど全ての組織中に分散して存在する中胚葉由来の細胞で、体外培養した場合紡錘形をなす特徴を有している。当該細胞は、通常、増殖力と運動性が非常に強く、組織片を体外培養系に移すと、組織片の周辺に移住して増殖する。また当該細胞は、一般に、体内の間質物質（コラーゲン、フィブロネクチン、ムコ多糖等）を多量産生する。
【０００８】
本発明において対象となるサル類としては、真猿類を好ましいものとして挙げることができる。より好ましくは新世界ザル類が挙げられる。最も好ましくはコモンマーモセットが挙げられる。尚、これら動物、例えばコモンマーモセットは、日本クレア株式会社等から商業的に入手することができる。
【０００９】
本発明細胞は、サル類由来であるが、中でも、例えば、サル類死亡胎児由来若しくは流産胎児由来等のサル類胎児由来であることが好ましいが、勿論、普通分娩による出産以前のサル類胎児由来であってもよい。通常、線維芽細胞を取得し樹立させるには、交配成立後から一定期間経過した後に、子宮内に存在している胎児から線維芽細胞を取得するために、交配作業等に伴う労力、飼育スペースの確保等が必要なうえに、サル類の場合には１個体当りのコストも膨大なものになるために、サル類死亡胎児由来若しくは流産胎児由来等のサル類胎児由来であることが有利となる。しかしながら、交配成立後から一定期間経過した後に死亡若しくは流産した胎児から取得された線維芽細胞が実際に体外で継代培養できる体細胞であり、かつ正常なサル類の遺伝情報を保持した細胞である初代培養線維芽細胞になり得るかどうかは実際に初代培養線維芽細胞を作製し確認してみなければ判らないが、本発明者は後述の実施例のように実験を行い、本発明を完成させている。
【００１０】
本発明細胞は、初代培養（primary culture）細胞であって、サル類生体（サル類死亡胎児若しくは流産胎児等のサル類胎児も含む）から直接取り出された細胞を初代培養することにより生じた細胞をいう。当該初代培養細胞の中には、通常、多数の細胞系が含まれている。
本発明細胞は、例えば、コラゲナーゼ灌流法、コラゲナーゼ振とう法等の通常の方法等、当該分野で通常用いられている分離方法等により、直接取り出せばよい。
【００１１】
本発明細胞系（cell line）は、初代培養から第１回目の継代培養によって生じた細胞の系をいい、これは初代培養の中に存在していた多数の細胞系を含んでいる。さらに当該細胞系には、第１回目以降の多回目の継代培養によって生じた細胞の継代培養系をも含むものである。因みに当該継代培養系に関して言えば下記のようになる。即ち、生体から培養に移した細胞が活発に分裂増殖する第II期の途中から、次第に分裂能が衰える第III期の初めにかけて、細胞集団の中に突然強い増殖能力をもった細胞が出現し、体外培養条件下にほとんど無限に増殖を続けることができるようになることがある。これは、元の生体から取り出した細胞が、培養条件に対して適応（adaptation）して生じたものか、あるいは突然変異（mutation）や淘汰（selection）によって生じたものか、現在のところはっきりしたことは不明であるが、こうして新しく出現した細胞は、もとの細胞とはその形態や生化学的性質、ウィルス感受性、抗原性などが変化しているほか、染色体構成も多くの場合3倍体 - 4倍体に近い異数性を示し、もとの細胞の特性を失って“体外培養型”になっている。このような細胞を株細胞と呼び、生体から取り出した細胞を長期継代培養して、このような株細胞ができることを株細胞の樹立（establishment）といい、当該株細胞の系が樹立細胞系(established cell line)と呼ばれている。
【００１２】
本発明における培養方法等で用いられる細胞外基質としては、如何なるものでもよく、その由来、形状等については特に限定されない。また、培養基盤としては、細胞外基質が使用し得るものであればよく、特に限定されないが、その材質としては、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニール、ポリエチレン、ポリクロロカーボネート等の合成高分子化合物、ガラス、多孔性ガラス、スリガラス等の無機物質等を挙げることができる。また、当該培養基盤は、プレート、フォローファイバーチューブ、シリンダー等多種多様の形態で使用し得る。尚、当該培養基盤に細胞外基質をコーティングする方法としては、通常、当該分野で行われている方法であれば特に限定されないが、例えば、文献「Cellmatrix コラーゲンを用いる細胞培養法、P.25、第三版 （1989）新田ゼラチン（株）生物化学研究所 発行」等に記載される、コラーゲン・フィルムを作製後に中和することにより行う方法、中和後にコラーゲン・フィルムを作製することにより行う方法、コラーゲン・ゲル・マトリックスの調製法等が挙げられる。
【００１３】
本発明における細胞系、細胞株等の樹立方法としては、例えば、モダンバイオロジーシリーズ 23「動物組織培養法」黒田行昭著、共立出版株式会社（1974）、P121−123（last update:June 9、1998）等を挙げることができる。
【００１４】
本発明における培養方法・継代方法は、細胞外基質として使用された培養基盤と当該分野で通常用いられている完全合成培地とを使用して、当該分野で通常行われる初代培養細胞や線維芽細胞等の培養方法に準じて実施すればよく、例えば、温度、湿度、ＣＯ２分圧、培養時間等の培養条件は、通常の初代培養細胞や線維芽細胞等の培養方法における培養条件に準じて適宜選択して設定すればよい。
【００１５】
サル類由来の初代培養線維芽細胞及びその培養系は凍結保存し保管してもよく、そして用時に当該凍結保存されたサル類由来の初代培養線維芽細胞及びその培養系を融解して各種の実験に使用してもよい。
【００１６】
本発明細胞及びその培養系の利用方法としては、特に限定されないが、ES細胞樹立の際に用いられるフィーダー細胞や、その他各種の研究の材料等を挙げることができる。
【００１７】
尚、本発明において利用することができる動物組織・動物細胞等の培養技術に係る技術として、例えば、モダンバイオロジーシリーズ 23「動物組織培養法」黒田行昭著、共立出版株式会社（1974）、R. Ian Freshney著, CULTURE OF ANIMAL CELLS, A Manual of Basic Technique, 2nd ed: 1987 1st ed: 1983, Alan R. Liss Inc., New York、J. M. Davis著, Basic Cell Culture, Second Edition, Oxford University, 29 halftones/line illus, 0-19-963853-5、特表平８−５０６７３５等を挙げることができる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明をより詳細に説明するため、実施例を挙げて説明するが本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１  （コモンマーモセット胎児の採取）
毎日の観察を実施している妊娠雌コモンマーモセットにおいて、妊娠約２ヵ月目に自然流産が認められ、胎児３例の死亡が確認された。
これらの胎児を80％エタノール水溶液で洗浄した後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS(−)）で洗浄した。このようにして３体の死亡コモンマーモセット胎児を得た。
【００２０】
実施例２  （コモンマーモセット胎児から線維芽細胞の採取）
実施例１で得られた死亡コモンマーモセット胎児の頭部、尾部、四肢を切断し、内臓及び骨を取り除いた後、胴体部の皮膚のみを少量のリン酸緩衝生理食塩水中で細切することにより細胞懸濁液を調製した。
調製された細胞懸濁液に、0.25％トリプシン及び0.53ｍＭ EDTAが添加されたリン酸緩衝生理食塩水を加え、当該操作により得られる混合物を３７℃のウォーターバス中で培養して細胞塊を個々の細胞に分離した。
分離された細胞を、10％ウシ胎児血清添加ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）で洗浄した後、トリプシン処理によって細胞分離作用を停止させた。
このようにして得られた細胞混合物を、1000rpm、5分間、室温で遠心分離することにより上清を除去して、コモンマーモセット胎児由来の線維芽細胞のペレットを調製した。
次に、調製されたペレットを、10％ウシ胎児血清添加ダルベッコ変法イーグル培地中で再懸濁した後、当該細胞懸濁液に含まれている細胞の数をトーマ式血球計算盤を用いて測定した。また、当該細胞懸濁液に含まれている細胞を細胞培養フラスコ中に封入した後、これを37℃、５％二酸化炭素−９５％空気に条件設定された恒温培養器内で培養した。このようにして、コモンマーモセット胎児由来線維芽細胞の初代培養を行った。
【００２１】
実施例３  （コモンマーモセット初代培養線維芽細胞の継代培養系）
前記細胞培養フラスコ中で、当該フラスコの底面積のうち約80％程度の面積をコモンマーモセット初代培養線維芽細胞が占めるまで増殖させた後、当該フラスコ中の培養液を除去した。
次いで、当該フラスコ中に、0.25％トリプシン及び0.53mM EDTAが添加されたリン酸緩衝生理食塩水をごく少量添加した後、これを37℃、５％二酸化炭素−９５％空気に条件設定された恒温培養器内で約３〜５分間程度培養した。
コモンマーモセット初代培養線維芽細胞がフラスコの底面から剥がれたことを確認した後、当該フラスコ中に10％ウシ胎児血清添加ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を十分量添加した後、トリプシン処理によって細胞分離作用を停止させた。
このようにして得られた細胞混合物を、1000rpm、5分間、室温で遠心分離することにより上清を除去して、コモンマーモセット胎児由来の線維芽細胞のペレットを調製した。このようにして得られた細胞は、体外で継代培養できるサル類の体細胞であり、かつ正常なサル類の遺伝情報を保持した細胞であった。
次に、調製されたペレットを、10％ウシ胎児血清添加ダルベッコ変法イーグル培地中で再懸濁した後、当該細胞懸濁液に含まれている細胞の数をトーマ式血球計算盤を用いて測定した。  また、当該細胞懸濁液に含まれている細胞を細胞培養フラスコ中に封入した後、これを37℃、５％二酸化炭素−９５％空気に条件設定された恒温培養器内で培養した。このようにして、コモンマーモセット胎児由来線維芽細胞の継代培養を行った。
【００２２】
実施例４  （コモンマーモセット胎児由来線維芽細胞における継代培養系細胞の凍結・融解）
実施例３に記載された遠心分離操作及び上清除去操作までの手順を繰り返し行った後、獲られたペレットをDMSO含有細胞凍結保存培地（セルバンカー等）地中で再懸濁した後、当該細胞懸濁液を細胞凍結用チューブに封入し、これを−80℃に設定された超低温槽に投入することにより、継代培養系細胞の凍結を行った。
一旦凍結された継代培養系細胞の融解は、超低温槽から取り出した細胞凍結用チューブを３７℃に条件設定されたウォーターバス中で約２〜5分間程度培養した後、当該細胞凍結用チューブ内の内容物が完全に溶解されたことを確認した。
次いで、当該内容物を、予め１０％ウシ胎児血清添加ダルベッコ変法イーグル培地が入れられた細胞培養フラスコに添加した後、これを37℃、５％二酸化炭素−９５％空気に条件設定された恒温培養器内で培養した。このようにして、コモンマーモセット胎児由来線維芽細胞における継代培養系細胞の融解を行った。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明により、体外で継代培養できるサル類の体細胞であり、かつ正常なサル類の遺伝情報を保持した細胞及びその培養系が提供可能となる。