(57)【要約】【課題】            マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）法による測定において、試料中に存在する無機塩、界面活性剤などの夾雑物によるイオンサプレッションを抑止し、簡便かつ効率的なサンプル調製方法を提供する。【解決手段】        分析対象物と、マトリックス分子とを、多孔性微粒子の存在下で共結晶化する。前記共結晶化は、ターゲットプレート上にて、分析対象物と、マトリックス分子と、多孔性微粒子とを接触させ、次いで該混合物を乾燥して行うことが好ましい。前記多孔性微粒子は、大きくとも５０μｍの平均粒子径を有するイオン交換体であり、好ましくは、強塩基性陰イオン交換体である。【選択図】            なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物と、マトリックス分子とを、多孔性微粒子の存在下で共結晶化することを特徴とするマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）用のサンプル調製方法。
【請求項２】
前記共結晶化は、ターゲットプレート上にて、分析対象物と、マトリックス分子と、多孔性微粒子とを接触させ、次いで該混合物を乾燥することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多孔性微粒子が、大きくとも５０μｍの平均粒子径を有するイオン交換体である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記イオン交換体が、強塩基性陰イオン交換体である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記強塩基性陰イオン交換体が、４級アンモニウム基で修飾された破砕状のシリカゲル又は４級アンモニウム基で修飾されたビニルポリマーからなる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが、分析対象物、マトリックス材料、１以上の塩又は界面活性剤を含んでなる請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記塩又は界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウム、ＣＨＡＰＳ、オクチル−β―Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧ）、及び分子量１０００以下のポリオキシエチレン界面活性剤を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記分析対象物が生体高分子物質を含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記生体高分子物質が、タンパク質及び分子量１０００以上のペプチドから選択されるものである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
マトリックス分子と、多孔性微粒子とを含むことを特徴とするマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）法による測定のためのサンプル調製用試薬組成物。
【請求項１１】
前記多孔性微粒子が、大きくとも５０μｍの平均粒子径を有するイオン交換体である請求項１０に記載の試薬組成物。
【請求項１２】
前記イオン交換体が、強塩基性陰イオン交換体である請求項１１に記載の試薬組成物。
【請求項１３】
前記強塩基性陰イオン交換体が、４級アンモニウム基で修飾された破砕状のシリカゲル又は４級アンモニウム基で修飾されたビニルポリマーからなる請求項１２に記載の試薬組成物。
【請求項１４】
前記多孔性微粒子が、マトリックス溶液に懸濁した状態にある請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の試薬組成物。
【請求項１５】
前記マトリックス分子と、前記多孔性微粒子とが、それぞれ別の容器に分注されている請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の試薬組成物。
【請求項１６】
界面活性剤を含む生体高分子物質を分析対象物とする質量分析方法において、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法によりサンプルを調製し、該サンプルを用いてマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を行うことを特徴とする質量分析方法。
【請求項１７】
前記界面活性剤がＳＤＳを含む請求項１６に記載の質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析法、特に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）法におけるサンプルの調製方法、及びこのサンプル調製を行うための試薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム時代においてタンパク質の網羅的解析の意義はますます大きくなり、迅速かつ正確なタンパク質の同定技術の向上が求められている。多くの研究者により使用されている１つの方法として、多種類のタンパク質の中から二次元電気泳動により目的のタンパク質を単離し、これを質量分析法により解析する技術がある。質量分析法については、エレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法の開発によって生体高分子のソフトイオン化技術が確立され、プロテオミクス研究が革新的に進展した。
【０００３】
ＭＡＬＤＩ質量分析法は、タンパク質等の高分子試料をマトリックス（例えば、シナピン酸）と一緒に混ぜて、共結晶化させる。マトリックスはレーザー光を吸収し、そのエネルギーを共結晶化した高分子試料に移行させる役割をもつ。高分子試料はイオン化し、典型的には（Ｍ＋Ｈ）＋タイプのイオン化学種を生ずる。このソフトレーザー脱着過程を通して、高分子試料は気相に移行する。検出器が飛行時間（ＴＯＦ）型の場合、高分子試料がイオン化すると、そのイオンは電場の中で加速されて検出器に到達し、イオン化から検出までの時間が高精度に測定、計算される。イオンの飛行時間は運動量、質量対電荷比（ｍ／ｚ）の平方根に依存するので、質量を正確に算出することができる。
【０００４】
ＥＳＩ法は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のカラムあるいはシリンジポンプから微小量／時間で溶出する高分子試料を含んだ液体を霧状にして、エレクトロスプレー・イオン源に注入してイオン化させる。ＥＳＩ法はサンプル調製の自動化がＭＡＬＤＩ法よりも先行しているため、プロテオミクス解析の主流を占めつつある。
【０００５】
一方、ＭＡＬＤＩ法に用いるサンプル調製方法としては、逆相系粒子を用いた簡単なクロマトグラフィーでサンプルを精製した後に、ターゲットプレート上でマトリックス共結晶をつくらせる方法が主に用いられているが、技術的な熟練も必要であり、自動化するためには問題点が多い。あるいは、ターゲットプレート表面を自己組織化膜で修飾し、ターゲットプレート上で夾雑物の除去を行うという報告もある（例えば、非特許文献１及び２参照）。これらいずれの方法もマトリックス共結晶を作成する前に夾雑物を取り除くという概念に基づいている。この他、ターゲットプレート上で主に塩類の除去を目的としてクロマトグラフィー媒体を添加する方法（例えば、非特許文献３参照）や、ＳＤＳとイオンペアを作る試薬を用いて作成した下層マトリックスの上に、ＳＤＳを含むサンプルを用いて上層マトリックスを作成する２層法(Ion-pair assisted recovery、例えば、非特許文献４参照）なども報告されているが、いずれも操作が煩雑で自動化に適さなかったり、必ずしも十分な効果が得られない場合もあり、さらなる簡便かつ効果的なサンプル調製方法が求められている。
【０００６】
【非特許文献１】Adam H. Brockman, Brian S. Dodd and Ron Orlando, Anal. Chem., 69, 4716-4720 (1997)
【非特許文献２】Maria E. Warren, Adam H. Brockman and Ron Orlando, Anal. Chem., 70, 3757-3761 (1998)
【非特許文献３】Jason C. Rouse and James E. Vath, Analytical Biochemistry 238, 82-92 (1996)
【非特許文献４】Rajendram V. Rajnarayanan and Kuan Wang, J. Mass Spectrom. 39, 79-85 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
質量分析法における最大の課題は、試料中に存在する無機塩、界面活性剤などの夾雑物によるイオンサプレッションである。質量分析用サンプルを調製する前に夾雑物を除去して分析対象物を高度に精製する方法は、手間と時間がかかるだけでなく、例えば、シリカゲルに吸着させた後に洗浄工程を必要とすることから、この洗浄過程で夾雑物と共に分析対象物までが取り除かれ、試料の目減りが生じ、感度が低下し、結果として分析精度の低下を招くという問題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、かかる問題点を解決するためになされたものであって、ＳＤＳなどの界面活性剤を含む質量分析用サンプルの調製方法において、洗浄操作を行うことなく、ターゲットプレート上での簡便な操作によって、良質な質量スペクトルが得られる方法を提供することにある。
【０００９】
すなわち、本発明のマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）用のサンプル調製方法は、分析対象物と、マトリックス分子とを、多孔性微粒子の存在下で共結晶化することを特徴とする。前記共結晶化は、ターゲットプレート上にて、分析対象物と、マトリックス分子と、多孔性微粒子とを接触させ、次いで該混合物を乾燥して行うことが好ましい。
【００１０】
本発明の１つの実施形態において、前記多孔性微粒子は、大きくとも５０μｍの平均粒子径を有するイオン交換体であり、好ましくは、強塩基性陰イオン交換体である。前記強塩基性陰イオン交換体の好ましい実施形態として、４級アンモニウム基で修飾された破砕状のシリカゲル又は４級アンモニウム基で修飾されたビニルポリマーが挙げられる。
【００１１】
本発明の１つの実施形態において、前記サンプルは、分析対象物、マトリックス材料、１以上の塩又は界面活性剤を含む。
【００１２】
本発明の異なる観点において、マトリックス分子と、多孔性微粒子とを含むことを特徴とするマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）法による測定のためのサンプル調製用試薬組成物が提供される。かかる試薬組成物の１つの実施形態としては、前記多孔性微粒子が、マトリックス溶液に懸濁した状態にあるものが挙げられる。あるいは、前記マトリックス分子と、前記多孔性微粒子とが、それぞれ別の容器に分注されて提供され、使用直前に混ぜ合わせて用いてもよい。
【００１３】
本発明のさらに異なる観点において、ＳＤＳ等の界面活性剤を含む生体高分子物質を、上記サンプル調製方法、又は上記試薬組成物を用いて調製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）法により分析する方法が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によれば、分析対象物を予め高度に精製する必要がないため試料の損失がなく、かつ簡便な操作でＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定することができる。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法はレーザー照射でサンプルをイオン化できるので多検体、高速測定に適した測定方法であるが、従来は分析対象物とマトリックスとの共結晶化の段階に種々の問題点があり自動化測定を困難にしていた。特に、電気泳動ゲルから切り出した試料タンパク質のイオン化については、プロテオーム解析の分野では必要不可欠な工程であり、本発明の方法により効率的な操作が可能となる。
【００１５】
また、本発明の試薬組成物は多孔性の微粒子が含まれているため分析対象物と混合した際にサンプルが均一に分散し、ターゲットプレート上で均一な共結晶を調製することができる。分析対象物とマトリックス分子とが均一に分散された共結晶はレーザー照射によってイオン化されやすく、簡便な操作により良質の質量スペクトルを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（定義）
本明細書における用語「ターゲットプレート」は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析用にサンプルを配置する部位（スポット）を備えた器具であり、単に「プレート」や「サンプルプレート」と称する場合もある。ターゲットプレートは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法による質量分析測定に用いることができるものであれば特に限定されず、市販されている金属製やプラスチック製のものを使用することができる。１つの実施形態として、本発明のターゲットプレートは高度に洗浄可能な金属製、例えばステンレス鋼からなることが好ましく、また白金や金メッキによって表面が保護されたプレートを用いてもよい。
【００１７】
本明細書における用語「多孔性微粒子」は、十分に大きな表面積を持った粒子であって、選択された分子、例えば、塩、溶媒、及び界面活性剤等を粒子の内部に浸透または吸着する一方、他の選択された分子、例えば分析対象物及びマトリックス分子は粒子の表面に保持することができるような材料をいう。具体的にはシリカゲルやゼオライト等を含む。これにより、粒子の表面に分析対象物が濃縮されると共に塩や界面活性剤などの低分子量の不純物は粒子の孔内に取り込まれる。
【００１８】
また、用語「イオン交換体」とは、上記「多孔性微粒子」の１つの態様であって、イオン交換現象を示す物質の総称である。代表的なものには、イオン交換樹脂、イオン交換膜、イオン交換セルロース等がある。その他、陽イオン交換を行うものに沸石類、酸性白土、泥炭、亜炭などの天然物や、合成ゼオライト、パームチット、タングステン酸ジルコニウムなどがあり、陰イオン交換を行うものに塩基性のドロマイト、水和酸化鉄や水和酸化ジルコニウムなどのゲルがある。用語「イオン交換樹脂」は、交換能のあるイオンを持つ、不溶性で多孔質の合成樹脂の総称である。
【００１９】
（質量分析用サンプルの調製方法）
第一の観点において、本発明は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ用のサンプル調製方法に関する。このサンプル調製方法は、分析対象物と、マトリックス分子とを混合して共結晶化させる際に分析対象物を高度に精製して夾雑物を除くのではなく、多孔性微粒子を添加して、サンプル中に共存させることによって夾雑物による悪影響を防止し、積極的に分析対象物のイオン化を促進するものである。分析対象物としては、タンパク質、ペプチド、核酸等の生体高分子物質が含まれるが、好ましくはタンパク質、又は分子量が１０００以上のペプチドである。
【００２０】
一方、正イオンモードにおけるマトリックス分子としては、シナピン酸(Sinapinic acid)、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid）、フェルラ酸(ferulic acid)、ゲンチシン酸(gentisic acid)、３−ヒドロキシピコリン酸(3-hydroxypicolinic acid)、２，５−ジヒドロキシ安息香酸(2,5-dihydroxybenzoic acid)などが含まれるがこれらに限定されない。なお、マトリックスに用いられるこれらの化合物は全て酸性物質である。もしマトリックス共結晶の表面積を広くとることによってより多くの照射エネルギーを効率良くイオン化に結びつけることができればよりＳ／Ｎ比の良いスペクトルを得ることができるかもしれない。本発明者らはマトリックスが酸性であることに着目し、陰イオン交換体のような多孔性微粒子と共結晶をつくればその塩基性表面に共結晶の被膜を形成させることができるのではないかと考えた。通常のマトリックス共結晶はターゲットプレート上に二次元的に展開した状態であるが陰イオン交換体表面に結晶被膜を形成させればそれを三次元的に展開でき、共結晶被膜の表面積は飛躍的に増大させることが期待できる。すなわちより多くの分子がイオン化エネルギーを受け取ることができるはずである。また、負イオンモードにおいては、ハルミンなどの塩基性マトリックスと陽イオン交換体との組み合わせに相当する。マトリックス溶液中に分散した多孔性微粒子は、ターゲットプレート上で分析対象物と混合したときに均一に分散するため、これらの混合物から溶媒が蒸発して結晶化したサンプルは分析対象物とマトリックス分子との均一な共結晶として調製することができる。
【００２１】
本発明の方法は、夾雑物として、１以上の塩又は界面活性剤を含むサンプルについて好適に用いることができる。これらの塩や界面活性剤は、通常の条件下において、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによるイオン化を著しく抑制することが知られている。その典型的な例としてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。ＳＤＳは、タンパク質や脂質、及び他の生体分子の強力な可溶化剤であり、生命科学の領域での幅広い技術に使用されている。例えば、電気泳動やクロマトグラフィーによるタンパク質混合物を分離する際に用いられる。その他の塩又は界面活性剤としては、デオキシコール酸ナトリウム、ＣＨＡＰＳ(3[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)、オクチル−β―Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧ）、及び分子量１０００以下のポリオキシエチレン界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００、Ｂｒｉｊ３０等）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２２】
（試薬組成物）
他の観点において、本発明は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法による測定のためのサンプル調製用試薬組成物に関する。この試薬組成物は、マトリックス分子と、多孔性微粒子とを含むものであるが、夾雑物の吸着除去に用いる多孔性微粒子としては、通常タンパク質の精製を目的として使用されるクロマトグラフィー担体であればいずれも使用可能であり、例えば、シリカゲル、陰イオン交換体、陽イオン交換体などが挙げられる。夾雑物として含まれる塩や界面活性剤の種類に応じて適宜選択して用いることができ、また１種類の多孔性微粒子を単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２３】
最も一般的なクロマトグラフィー担体であるシリカゲルは、細孔を表面に多数有する多孔性シリカゲルである。粒子の形状には球状と破砕状（不定形）があり、球状の方がカラムへの充填効率が高く、吸着クロマトグラフィー用には主流となっている。シリカゲル表面のシラノール基に種々の官能基を化学結合させたものでもよく、最も一般的なものは、シリカ表面に炭素数１８（Ｃ１８）のアルキル鎖を付けたＯＤＳ(Octadecyl Silica)ゲルである。結合させるアルキル基の炭素数をオクチル基、ブチル基、メチル基などのように減らしたものもある。また、官能基としてフェニル基、ジオール基、ニトリル基、アミノ基などが付加されていてもよい。
【００２４】
一方、シリカゲルにイオン交換基を結合させた場合には、例えば、強酸性（−ＳＯ３Ｈ）、強塩基性（−Ｎ＋（ＣＨ３）３）、弱酸性（−ＣＯＯＨ）、弱塩基性（−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２）などのイオン交換体となる。また、シリカゲルの代わりに有機系ポリマーゲルを用いたイオン交換樹脂でもよい。ポリマーゲルとしては、ポリメタクリレート、ポリヒドロキシメタクリレート、ポリビニルアルコールゲル及びデキストランなどが好ましい。
【００２５】
これらの多孔性微粒子は、大きな表面積を得るために大きくとも５０μｍの平均粒子径の微粒子であることが好ましく、より好ましくは２０μｍ以下、さらに好ましくは１０μｍ以下の平均粒子径である。粒子の形状や均一性は特に限定されるものではなく、球状、柱状、破砕状等、種々の形態が含まれるが、好ましくは破砕状（不定形）であり、より好ましくは、４級アンモニウム基で修飾された破砕状のシリカゲルである。この理由は明らかではないが、おそらく、粒子の表面の不定形の窪みや粒子間の適度なサイズの窪みに界面活性剤が吸着される分子ふるい効果が影響するものと考えられる。
【００２６】
また、本発明の試薬組成物に含まれるマトリックス分子は、高度に精製した化合物を用いることが好ましい。例えば、アセトニトリル等の溶媒を用いて少なくとも２回再結晶したシナピン酸は５０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液中で長期間、少なくとも６ヶ月間は使用可能である。したがって、１つの実施形態における本発明の試薬組成物は、前記多孔性微粒子が、高度に精製されたマトリックス溶液中における懸濁液として提供される。あるいは、前記多孔性微粒子とマトリックス溶液とが別々の容器に分注されて提供されていてもよい。さらに、種々のマトリックス溶液及び多孔性微粒子がキットとして含まれていてもよく、例えば、分析対象物の性質に合わせて選択されるマトリックス溶液を種々の陰イオン交換体や陽イオン交換体から適宜選択される多孔性微粒子に使用前に加えて懸濁液とした後、所定の分析対象物と混合してサンプルを調製することができる。これらの試薬組成物あるいはキットには、最適な質量分析結果を得るためのサンプル調製方法を記載した使用説明書を含めることができる。
【００２７】
（質量分析方法）
本発明は、また異なる観点において、ＳＤＳ等の界面活性剤を含むタンパク質等を分析対象物とする質量分析方法において、上記本発明の方法によりサンプルを調製し、該サンプルを用いてマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を行うことを特徴とする質量分析方法に関する。これにより、分析対象物を精製するための洗浄操作なしでも、良質な質量スペクトルが得られる。すなわち、本発明は、ＳＤＳ等の界面活性剤を含む分析対象物を、本発明の試薬組成物を用いて共結晶化した後、そのままＭＡＬＤＩに付すものであり、分析対象物を水等で洗浄する必要も、また、多孔性微粒子を除去する必要もなく、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定ができる方法を提供するものである。
【実施例】
【００２８】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲は、かかる実施例により何ら限定されるものではない。
【００２９】
［実施例１］
（１）試薬
シナピン酸は東京化成（ＴＣＩ、東京）製を用い、アセトニトリルで二回再結晶し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で５０％アセトニトリル０．１％ＴＦＡ溶液とした。ミオグロビン(Myoglobin)とチトクロームＣ(Cytochrome C)はシグマ社から購入し、精製せずに実験に用いた。固相担体はワコーゲル（Wakogel、登録商標）LC-SAX-10H（１０μｍ破砕状４級アンモニウム基修飾シリカゲル、和光純薬、大阪）、ヌクレオシル（Nucleosil、登録商標）100-SB10（１０μｍ球状４級アンモニウム基修飾シリカゲル、GL-Science、東京）、Partisil（登録商標）10 SCX（１０μｍ破砕状スルホン基修飾シリカゲル、GL-Science、東京）、Partisil（登録商標）10（１０μｍ破砕状シリカゲル、GL-Science、東京）、ヌクレオシル（Nucleosil、登録商標）100-SB5（５μｍ球状４級アンモニウム基修飾シリカゲル、GL-Science、東京）、トヨパール(TOYOPEARL) SuperQ-650S（２０〜５０μｍ球状４級アンモニウム基修飾ビニルポリマー、東ソー、東京）、トヨパール(TOYOPEARL) DEAE-650S（２０〜５０μｍ球状ジエチルアミノ基修飾ビニルポリマー、東ソー、東京）、を用い、タンパク試料と固相担体は購入した状態でそのまま使用した。測定試料はミオグロビン４００μＭとチトクロームＣ４０μＭ（１００ｍＭのＮａＣｌ，５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ）に２０、５０、１００、２００ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＤＳを１対１混ぜたものを用いた。最終的な濃度はミオグロビン２００μＭ、チトクロームＣ２０μＭ（５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１、２．５、５、１０％ＳＤＳ）である。
【００３０】
（２）測定
ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ型質量分析計にはアプライド・バイオシステムズ社(Applied Biosystems)のVoyager DE-STRを用い、ターゲットプレートを挿入し、レーザーを照射した（laser power 1900、100shots）。同一実験を４回以上行なって再現性についての確認をした。
【００３１】
（３）実験手順
ターゲットプレートは純水中で最低１０分以上の超音波洗浄を行い、乾燥後タンパク質試料（サンプル）を０．１μＬ加えた。１０ｍｇ／ｍＬシナピン酸溶液に固相担体を混合したもの（５０ｍｇ／ｍＬ）を０．５μＬ添加し、室温にて自然乾燥（２５±２℃、４０〜６０％）させた。
【００３２】
（４）結果と考察
上記実験方法に従って、２．５％ＳＤＳ存在下で調製した種々のサンプルについて測定した結果を図１に示した。図１Ａは、ミオグロビン及びチトクロームＣを直接シナピン酸溶液で共結晶化したものであり、これらの分析対象物のイオンは観測されなかった。図１Ｂは、サンプルにシリカゲルを添加して共結晶化したところ、チトクロームＣがわずかに観測された。図１Ｃはサンプルに陽イオン交換体Partisil（登録商標）10 SCXを添加して共結晶化したものであるが、チトクロームＣのイオン強度が増加していることが分かる。さらに、図１Ｄでは、陰イオン交換体ワコーゲル（Wakogel、登録商標）LC-SAX-10Hを加えて共結晶化したところ、チトクロームＣのイオンがさらに強度を上げ、かつ今まで全く観測できなかったミオグロビンもＳ／Ｎ比良く観測できた。
【００３３】
次に、ＳＤＳ濃度について調べるために、５％ＳＤＳ存在下、陰イオン交換体ワコーゲル（Wakogel、登録商標）LC-SAX-10Hを加えて共結晶化したサンプルを測定したところ、図２Ａに示したように目的タンパク質のイオンを観測できなかった。そこで、サンプルを水で二倍希釈した後に実験を行ったところ図２Ｂに示したようにきれいなイオンが観測できた。
【００３４】
これらの結果は、ＳＤＳのような不純物が混じっていても、クロマトグラフ媒体（多孔性微粒子）の存在下で、良好なタンパク質のイオン化が得られることを示しており、これまでＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定においてはできるだけ不純物（無機塩、界面活性剤、その他のゴミ）を除き、きれいなマトリックス共結晶をつくらなければならないという考え方とは異なったアプローチが可能であることを示している。特に、１０μｍの破砕状シリカゲルを用いても表面が４級アンモニウム基で修飾（官能基化）されたものだけが高濃度のＳＤＳ存在下でも目的タンパク質のイオンをＳ／Ｎ比良く観測できたことに着目し、塩基性官能基の種類について、４級アンモニウム基と弱陰イオン交換基であるジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をそれぞれトヨパール(TOYOPEARL) SuperQ-650Sと、トヨパール(TOYOPEARL) DEAE-650Sとを用いて比較した。
【００３５】
その結果を図３に示した。図３Ａは、１％ＳＤＳ存在下に、イオン交換基として４級アンモニウム（Ｑ）基を用いた場合であり、チトクロームＣとミオグロビンの一価のイオンがはっきりと検出できる。これに対し、同じく１％ＳＤＳ存在下、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を用いた場合には図３Ｂのような結果であった。この結果、４級アンモニウム基の方が、より高濃度のＳＤＳ存在下でも目的タンパク質のイオン化が達成できることが分かった。このことは、用いたイオン交換体の表面に、より多くのマトリックス分子や不純物であるＳＤＳを吸着した方が目的タンパク質のイオン化を促進することを意味している。また実際にRouseらの研究グループの方法にそってイオン交換体をスパーテルで除去するとイオンが全く観測されなかった。すなわちイオン交換体表面にはマトリックス共結晶被膜が形成されていることを強く支持するものである。
【００３６】
次に陰イオン交換体表面にマトリックス共結晶の被膜が形成されているとするならばより小さい粒子を用いれば表面積が大きくなり、その効果が上がるのではないかと考え５μｍ（Nucleosil（登録商標）100-SB5）及び１０μｍの球状粒子（Nucleosil（登録商標）100-SB10）を用いた実験を行なった（５μｍの破砕状粒子は市販されていない）。
【００３７】
その結果を図４に示した。双方ともに１０μｍ破砕状粒子であるワコーゲル（Wakogel、登録商標）LC-SAX-10Hより劣る結果となった。これより粒子径が小さくなって表面積が増えてもそれほど効果がなく、むしろ破砕状のような凹凸の激しい形状が有効という結論になる。すなわち塩基性表面のみならず、粒子の形状も大きくイオン化に寄与することがわかった。凹凸の多い表面においては分子ふるい効果により、低分子量の無機塩や界面活性剤は結晶化の過程で粒子内部の方に取り込まれる。これによって表面の結晶被膜内のＳＤＳ濃度が相対的に下がり、この結果照射エネルギーがより目的物質のイオン化を促進する方向に利用されたと考察した。このことはＳＤＳのみをイオン化した際に破砕状陰イオン交換体を入れたほうに明らかなＳＤＳのクラスターイオンの減少が認められたことにより支持された。
【００３８】
以上まとめると強陰イオン交換基がもたらす塩基性環境と破砕状粒子の表面積の増大および分子ふるい効果が二大要因となってＳＤＳによるイオンサプレッションが大きく抑止されたと考えられる。言い換えれば塩基性表面積が大きくなることは酸性物質であるシナピン酸マトリックスとの親和性が高いということであり、目的物質との共結晶が広くシリカゲル粒子に分布することを意味し、照射レーザーのエネルギー吸収が高効率で進むことである。そして破砕状粒子に由来する分子ふるい効果で界面活性剤などの低分子夾雑物は粒子内部に収容されることで目的物質のイオン化を促進できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】２．５％ＳＤＳ存在下におけるＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルへの１０μｍ破砕状シリカゲルの添加効果を示す。Ａはシリカゲル無添加、Ｂはシリカゲル添加、Ｃは陽イオン交換基の結合したシリカゲル添加、及びＤは陰イオン交換基の結合したシリカゲルを添加した結果である。なお、記号☆はチトクロームＣを、記号●はミオグロビンを示す。
【図２】５％ＳＤＳ存在下におけるＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトル（Ａ）への水希釈効果（Ｂ）を示したものである。なお、記号☆はチトクロームＣを、記号●はミオグロビンを示す。
【図３】１％ＳＤＳ存在下におけるＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルへのイオン交換基Ｑ（Ａ）とＤＥＡＥ（Ｂ）の効果の差を示す。なお、記号☆はチトクロームＣを、記号●はミオグロビンを示す。
【図４】２．５％ＳＤＳ存在下における球状粒子（Ａは平均粒子径５μｍ、Ｂは平均粒子径１０μｍ）の添加効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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