(57)【要約】【課題】有用な情報を得るために十分な大きさおよび質を有するCD40Lの結晶またはCD40Lのフラグメントの結晶の調製方法【解決手段】CD40リガンドの結晶の調製方法であって、以下の工程：a)CD40リガンドのフラグメントを含む水溶液を提供する工程；b)沈澱化剤を含む貯蔵溶液を提供する工程；c)ある容量の該水溶液をある容量の該貯蔵溶液と混合し、それによって混合物を形成する工程；およびd)該混合物の少なくとも一部を結晶化する工程；を包含する、CD40リガンドの結晶の調製方法。【選択図】図１
2006188541.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD40リガンドの結晶の調製方法であって、以下の工程：
a)CD40リガンドのフラグメントを含む水溶液を提供する工程；
b)沈澱化剤を含む貯蔵溶液を提供する工程；
c)ある容量の該水溶液をある容量の該貯蔵溶液と混合し、それによって混合物を形成する工程；および
d)該混合物の少なくとも一部を結晶化する工程；
を包含する、 CD40リガンドの結晶の調製方法。
【請求項２】
前記工程a)で提供されるCD40リガンドの水溶液が約１mg/mlから約50mg/mlのCD40リガンド濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記水溶液が約５mg/mlから約15mg/mlのCD40リガンド濃度を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記水溶液が約10mg/mlのCD40リガンド濃度を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記沈澱化剤がクエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、およびポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記貯蔵溶液中の前記沈澱化剤の濃度が約1.0Ｍから約1.5Ｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記沈澱化剤の濃度が約1.2Ｍである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記貯蔵溶液のpHが約４から約10である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記pHが約7.5である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程d)が蒸発拡散結晶化、バッチ結晶化、液体架橋結晶化、または透析結晶化による、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
およそ以下の格子定数を有するCD40リガンドの細胞外ドメインの機能的フラグメントによって形成される結晶：a+b=77.17×10-10Ｍ(Å)、c=90.46×10-10Ｍ(Å)、α=β=90°、γ=120°、および空間群R3。
【請求項１２】
前記結晶が結合部位を含み、該結合部位がアミノ酸Lys143、Arg203、Arg207、およびTyr145を含む、請求項１１に記載のCD40リガンド（116-261)の結晶またはそのホモログ。
【請求項１３】
前記結晶がArg207を少なくとも２つの疎水性残基に近接して含む、請求項１１に記載の結晶またはそのホモログ。
【請求項１４】
前記結晶が、Ile127、Ser128、Glu129、Ala130、Ser131、Thr135、Ser136、Ala41、Lu142、Gly144、Tyr146、Cys178、Asn180、Ser185、Gln186、Ala187、Pro188、Ile190、Ala191、Ser192、Ser197、Pro198、Gly199、Arg200、Phe201、Glu202、Ile204、Ala209、Thr211、Pro217、Cys218、Gly219、Gln220、Glu230、Leu231、Gln232、Asn240、Val241、Thr242、Asp243、Ser245、Val247、Ser248、His249、Gly250、Thr251、Gly252、およびPhe253からなる群から選択される少なくとも30個のアミノ酸を含む、請求項１２に記載の結晶。
【請求項１５】
前記結合部位がアミノ酸Ile127、Ser128、Glu129、Ala130、Ser131、Thr135、Ser136、Ala141、Glu142、Lys143、Gly144、Tyr145、Tyr146、Cys178、Asn180、Ser185、Gln186、Ala187、Pro188、Ile190、Ala191、Ser192、Ser197、Pro198、Gly199、Arg200、Phe201、Glu202、Arg203、Ile204、Arg207、Ala209、Thr211、Pro217、Cys218、Gly219、Gln220、Glu230、Leu231、Gln232、Asn240、Val241、Thr242、Asp243、Ser245、Val247、Ser248、His249、Gly250、Thr251、Gly252、およびPhe253を含む、請求項１４に記載の結晶。
【請求項１６】
CD40リガンドの結晶化された形態の重原子誘導体。
【請求項１７】
請求項１１に記載の結晶の重原子誘導体。
【請求項１８】
化学物質とCD40リガンドとの間の結合相互作用を決定するためのCD40リガンド結晶の使用。
【請求項１９】
前記CD40リガンド結晶が請求項１１に記載の結晶である、請求項１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトCD40リガンドの細胞外ドメインの可溶性フラグメントの結晶形態、そしてより詳細には、Gly116残基からLeu261残基(「sCD40L(116-261)」)を含むCD40Lフラグメントの結晶およびそのＸ線回折によって得られた構造に関する。さらに、本発明は、CD40L、またはそのフラグメント、および特にsCD40L(116-261)の結晶構造を、CD40L活性に影響を与える化合物を設計し、スクリーニングし、そして最適化するために用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
免疫系は、身体を毒性および/または病原性の因子から保護する多くの複雑なプロセスからなる。一般的に、免疫応答は、体内の特定の細胞が毒性または病原性の因子を認識するときに開始される。次いでこの応答は、免疫応答に関する他の細胞への細胞-細胞接触または可溶性の媒介物のような任意の一連の手段によって、伝達される。
【０００３】
CD40リガンド（「CD40L」）は、免疫応答に関する機能的なＴ細胞およびＢ細胞相互作用を媒介することが示されている。用語CD40Lは、CD40、またはそのホモログに結合し得るポリぺプチドの属をいう。実際、Ｂ細胞によって発現されたCD40とのCD40Lの相互作用は、抗原特異的抗体産生へのＢ細胞の増殖および分化のＴ細胞接触依存性誘導を担う主要な分子相互作用である。Ｂリンパ球の表面で発現された相手レセプターCD40へのＴ細胞CD40Lの結合により、多面発現活性（抗体アイソタイプスウィッチング、Ｂ細胞アポトーシスの阻止、免疫記憶の確立、リンパ組織での胚中心形成、活性化されたＢ細胞でのサイトカイン産生の調節、ならびにＢ細胞増殖および分化を含む）が生じる。
【０００４】
CD40Lの可溶型は、その細胞外領域またはフラグメントから作製され得る。本明細書中で用いられる用語CD40Lには、膜貫通領域および細胞内領域を欠失する可溶性のCD40Lポリぺプチド、CD40Lのホモログおよびアナログまたはその誘導体が含まれる。初期の研究は、CD40Lがサイトカインの腫瘍壊死因子(TNF)ファミリーのメンバーであることを示した。このファミリーの他のメンバーには、TNF-α、LT-α（リンホトキシン-α、またTNF-βとしても知られる）、LT-β、Fasリガンド、CD30L、およびCD27Lが含まれる。CD40Lは、Ｃ末端に細胞外領域、膜貫通領域、およびＮ末端に細胞内領域を有する膜結合ポリぺプチドである。
【０００５】
CD40Lのいくつかの変異が、Hyper-IgM症候群(「HIGMS」)として知られるＸ染色体関連の重篤な免疫不全を生じることが知られている。HIGMSは、IgMの正常または上昇したレベル、しかし血清中のIgG、IgA、およびIgEの非存在または低いレベルによって特徴付けられる。マウスCD40L遺伝子「ノックアウト」はまた、ヒトにおけるHyper-IgM症候群に類似して、IgG、IgA、およびIgEの発現を欠失する。これらの観察は、CD40シグナル伝達がIgG、IgA、およびIgE産生に必要とされること、およびこの機能が他のシグナル伝達/接着経路と非重複であることを示唆する。研究は、CD40Lがまた、関節炎、ループス、多発性硬化症、移植片対宿主病、潰瘍性結腸炎、アレルギー、組織移植、および抗原性薬物に対する抗体の生成のような特定の疾患においてもまた役割を果たし得ることを示す。従って、CD40-CD40L相互作用を妨害することは、広範に及ぶ治療的及び診断的な適用を有することが明らかである。
【０００６】
現在、CD40-CD40L相互作用を妨害する潜在的な薬物候補を設計するか、同定するか、または得ることに関心がある。生理学的に関連のある生物学的経路において役割を果たす候補を同定するための薬物設計の最近の出現は、薬物のためのリード化合物を得、または設計するのに有用なアプローチを提供した。
【０００７】
一般的に、このアプローチは、生理学的に関連のある生物学的経路において役割を果たすタンパク質標的分子を選択することを必要とする。代表的には、一旦天然または合成のリガンドが標的分子について発見されると、それは所望の性質を有する候補を生成するために改変または最適化される。
【０００８】
リガンドをより効果的に設計または改変するためには、それが標的タンパク質分子に結合するように、既知のリガンドの生物活性なコンフォメーションの３次元構造を有することが有用である。さらに、その既知のリガンドと複合体を形成しているタンパク質標的の３次元構造を試験することによって、リガンドのその標的タンパク質との詳細な相互作用を理解することは価値がある。これによって、当業者はタンパク質との重要な相互作用を保存し、一方で候補リガンドをタンパク質とより正確に相互作用するように改変し、よりよい効力および特異性を得ることが可能になる。
【０００９】
しかし、タンパク質標的の３次元結晶構造は、構造に関する正確な情報を提供するのに十分な大きさおよび分解能を有する結晶を得るのに大変な努力を要するために、しばしば入手不可能である。例えば、タンパク質を発現、精製、および特徴付けするのには非常に時間がかかり、そしてしばしば困難である。さらに、一旦十分な純度のタンパク質が得られれば、それはある大きさに結晶化されそしてどれがＸ線回折およびその後の構造解析に有用であるかが明らかにされねばならない。従って、結晶構造は、薬物の設計および発見の分野において貴重な情報の富を提供し得るが、特定の生物学的に関連のある化合物（例えば、CD40L）の結晶は、当業者にとって容易に入手可能ではない。
【００１０】
さらに、標的タンパク質またはそのリガンド（例えば、CD40L)のアミノ酸配列が知られているが、この配列情報は、タンパク質/リガンドの結晶構造の正確な予測を可能にしないし、またこの配列情報は、CD40Lのようなリガンドとそのタンパク質標的との間の構造的、コンフォメーション的、および化学的な相互作用の理解にも十分ではない。
【００１１】
従って、CD40Lの細胞外ドメインの結晶の３次元構造の詳細な知識が、CD40L-CD40相互作用を妨害し得る化合物を効果的に設計し、スクリーニングし、または最適化するために必要である。CD40とそのリガンドとの結合が研究され、この系とTNF系との間の類似性が見出されたが、存在する差異はこれらの２つのリガンド-レセプター系が、異なる結合の分子決定基と空間的に重複するが、同一ではない接触残基の非保存部位を利用することを示唆する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
Ｘ線回折研究を行うことを可能にする大きさおよび質を有するCD40LまたはCD40Lのフラグメントの結晶は、当業者がCD40Lの結合特性、ならびにCD40Lまたはそのフラグメントと会合し得る分子または分子複合体の結合特性に関する研究を行うことを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の要旨
従って、本発明は、CD40L、およびCD40LまたはCD40と結合し得る分子または複合体の特性についての有用な情報を得るために十分な大きさおよび質を有するCD40Lの結晶またはCD40Lのフラグメントの結晶に関する。本願の発明は、未知の結晶の構造を解析するため、所望の結合特性を有する変異体を提供するため、そして究極的にはCD40とCD40Lとの間の相互作用を妨害し得る分子または化学物質を設計し、特徴付けし、または同定するため結合部位を同定するために用いられ得る、CD40LのGly116〜Leu261フラグメントの３次元結晶構造を提供する。
【００１４】
本発明のさらなる特徴および利点は、以下の説明に記載され、そして部分的にその記載から明らかであり、または本発明の実施から学ばれ得る。本発明の目的および他の利点は、記載された説明およびその請求の範囲、ならびに添付された図面において特に指摘される組成物および方法から認識されそして得られる。
【００１５】
これらおよび他の利点を達成するために、そして本発明の目的に従い、本明細書中において実施されそして広範に記載されるように、本発明は、CD40Lの結晶に関する。より詳細には、本発明は、sCD40L(116-261)の細胞外ドメインの機能的なフラグメントによって形成される結晶に関する。ここで、この結晶は格子定数(cellconstant)a=b=77.17×10-10Ｍ(Å)、c=90.46×10-10Ｍ(Å)、α=β=90°、γ=120°、および空間群R3、およびその結晶の等価物を有する。請求されるCD40Lの結晶は、表１において同定される構造座標によって実質的に記載される。特定の実施態様において請求される結晶は、Ile127、Ser128、Glu129、Ala130、Ser131、Thr135、Ser136、Ala141、Glu142、Lys143、Gly144、Tyr145、Tyr146、Cys178、Asn180、Ser185、Gln186、Ala187、Pro188、Ile190、Ala191、Ser192、Ser197、Pro198、Gly199、Arg200、Phe201、Glu202、Arg203、Ile204、Arg207、Ala209、Thr211、Pro217、Cys218、Gly219、Gln220、Glu230、Leu231、Gln232、Asn240、Val241、Thr242、Asp243、Ser245、Val247、Ser248、His249、Gly250、Thr251、Gly252、およびPhe253を含む結合部位部分によって特徴付けられる。
【００１６】
さらに、本発明は、少なくともArg207、および好ましくはアミノ酸Lys143、Arg203、Arg207、およびTyr145を含む結合部位を有する分子の結晶に関する。特定の実施態様において請求される結晶は、少なくとも２つの疎水性残基によって囲まれるArg207を含む結合部位部分を有する分子から形成される。請求される結晶の変異体、ホモログ、共複合体(co-complex)およびフラグメントはまた、本明細書中で考慮される。
【００１７】
特定の実施態様において請求される本発明は、sCD40L(116-261)の結晶化された形態の重原子誘導体、そしてより詳細には、上記のCD40Lの結晶化された形態の重原子誘導体に関する。種々の実施態様において、本願の発明は、少なくともCD40Lのフラグメントを含む水溶液を提供し、沈澱化剤を含む貯蔵溶液を提供し、ある容量のCD40L溶液をある容量のこの貯蔵溶液と混合し、そして得られる混合物を結晶化することによる、CD40L、またはそのフラグメントの結晶形態の調製方法に関する。特定の実施態様において、結晶は、sCD40L(116-261)を含む水溶液に由来する。種々の態様において、水溶液中でのCD40Lの濃度は、約１mg/mlから約50mg/ml、好ましくは、約５mg/mlから約15mg/ml、そして最も好ましくは、約10mg/mlである。本発明において用いられる沈澱化剤は、当該分野で公知の任意の沈澱化剤、好ましくはクエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、およびポリエチレングリコールからなる群から選択される沈澱化剤であり得る。沈澱化剤の任意の濃度が、貯蔵溶液中で用いられ得るが、濃度は、約1.0Ｍから約1.5Ｍ、より好ましくは約1.2Ｍであることが好ましい。同様に、貯蔵溶液のpHは、好ましくは約４から10の間で変化し得、最も好ましくは約7.5である。
【００１８】
結晶化の種々の方法が、本願の発明において用いられ得、それらには蒸発拡散(vapor diffusion)結晶化、バッチ結晶化、液体架橋(liquidbridge)結晶化、または透析結晶化が含まれるがこれらに限定されない。蒸発拡散結晶化が好ましい。
【００１９】
さらに、本願の発明は、CD40とCD40Lとの間の相互作用を妨害し得る分子または他の化学物質をスクリーニングし、設計し、または最適化する方法において請求される結晶、および構造座標を使用する方法に関する。従って、CD40Lまたはその部分の構造座標は、CD40Lの変異体、ホモログ、または共複合体またはそのフラグメントの結晶構造を解析するため、ならびにCD40Lまたはそのフラグメントに会合する他の未知の結晶を解析するために使用され得る。
【００２０】
いくつかの実施態様において、CD40Lの構造座標は、CD40Lへの化学物質の結合についての情報を得るために化学物質を評価するために使用し得る。本願の発明はまた、表１に記載される構造座標に関する。構造座標は、阻害剤またはアゴニストのようなCD40またはCD40Lとの間の関係を妨害する化学物質を特徴付けするために使用され得る。座標はまた、結合特性を最適化するために、CD40LまたはCD40の結合部位におけるリガンドの配向を決定するために用いられ得る。当業者は、薬物設計、スクリーニングおよび薬物候補の最適化の分野、ならびにさらなる未知の結晶構造の決定における請求される発明の多くの使用を理解する。
【００２１】
種々の実施態様において、本願の発明は、適切な機械で読みとられた場合に、結晶の３次元表示が可能な、機械読みとり可能データでコードされるデータ記憶材料を含む機械読みとり可能データ記憶媒体に関する。表示された結晶は、表１の座標によって記載されるようなCD40Lのフラグメントを含むか、またはアミノ酸Lys143、Arg203、Arg207、およびTyr145を含む結合部位を有する結晶を含む。
【００２２】
他の実施態様において、本願の発明は、CD40リガンドのフラグメントの結晶の構造座標からの位相を計算し、得られた位相から電子密度マップを計算し、次いで電子密度マップに基づいて未知の構造の少なくとも一部を決定することによって、化学物質または分子複合体の３次元構造の少なくとも一部を決定する方法に関する。
【００２３】
なお他の実施態様において、本発明は、化学物質のCD40またはCD40Lに会合する能力を評価する方法に関する。この方法は、計算または実験の手段を使用し、化学物質とCD40またはCD40Lとの間でフィッティング演算を行って会合に関するデータを得、そしてそのデータを分析して特性を決定する。CD40とCD40Lとの間のインビボまたはインビトロ会合を妨害し得るこれらの方法で同定された化学物質はまた、本願の発明に含まれる。請求された化学物質は、CD40Lの結合部位と実質的に類似の結合部位を含み得るか、またはCD40Lの結合部位に会合可能な結合部位を含み得る。
【００２４】
本発明はさらに、以下の項目を提供する。
（項目１）  CD40リガンドの結晶の調製方法であって、以下の工程：
a)CD40リガンドのフラグメントを含む水溶液を提供する工程；
b)沈澱化剤を含む貯蔵溶液を提供する工程；
c)ある容量の該水溶液をある容量の該貯蔵溶液と混合し、それによって混合物を形成する工程；および
d)該混合物の少なくとも一部を結晶化する工程；
を包含する、 CD40リガンドの結晶の調製方法。
（項目２）  前記工程a)で提供されるCD40リガンドの水溶液が約１mg/mlから約50mg/mlのCD40リガンド濃度を有する、項目１に記載の方法。
（項目３）  前記水溶液が約５mg/mlから約15mg/mlのCD40リガンド濃度を有する、項目２に記載の方法。
（項目４）  前記水溶液が約10mg/mlのCD40リガンド濃度を有する、項目３に記載の方法。
（項目５）  前記沈澱化剤がクエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、およびポリエチレングリコールからなる群から選択される、１に記載の方法。
（項目６）  前記貯蔵溶液中の前記沈澱化剤の濃度が約1.0Ｍから約1.5Ｍである、項目１に記載の方法。
（項目７）  前記沈澱化剤の濃度が約1.2Ｍである、項目６に記載の方法。
（項目８）  前記貯蔵溶液のpHが約４から約10である、項目１に記載の方法。
（項目９）  前記pHが約7.5である、項目８に記載の方法。
（項目１０）  工程d)が蒸発拡散結晶化、バッチ結晶化、液体架橋結晶化、または透析結晶化による、項目１に記載の方法。
（項目１１）  およそ以下の格子定数を有するCD40リガンドの細胞外ドメインの機能的フラグメントによって形成される結晶：a+b=77.17×10-10Ｍ(Å)、c=90.46×10-10Ｍ(Å)、α=β=90°、γ=120°、および空間群R3。
（項目１２）  適切な機械で読みとられた場合に、アミノ酸Lys143、Arg203、Arg207、およびTyr145を含む結合部位を有するCD40Lのフラグメントを含む分子または分子複合体の結晶の３次元表示が可能な、機械読みとり可能データでコードされるデータ記憶材料を含む機械読みとり可能データ記憶媒体。
（項目１３）前記結晶が結合部位を含み、該結合部位がアミノ酸Lys143、Arg203、Arg207、およびTyr145を含む、項目１１に記載のCD40リガンド（116-261)の結晶またはそのホモログ。
（項目１４）  前記結晶がArg207を少なくとも２つの疎水性残基に近接して含む、項目１１に記載の結晶またはそのホモログ。
（項目１５）  前記結晶が、Ile127、Ser128、Glu129、Ala130、Ser131、Thr135、Ser136、Ala41、Lu142、Gly144、Tyr146、Cys178、Asn180、Ser185、Gln186、Ala187、Pro188、Ile190、Ala191、Ser192、Ser197、Pro198、Gly199、Arg200、Phe201、Glu202、Ile204、Ala209、Thr211、Pro217、Cys218、Gly219、Gln220、Glu230、Leu231、Gln232、Asn240、Val241、Thr242、Asp243、Ser245、Val247、Ser248、His249、Gly250、Thr251、Gly252、およびPhe253からなる群から選択される少なくとも30個のアミノ酸を含む、項目１３に記載の結晶。
（項目１６）  前記結合部位がアミノ酸Ile127、Ser128、Glu129、Ala130、Ser131、Thr135、Ser136、Ala141、Glu142、Lys143、Gly144、Tyr145、Tyr146、Cys178、Asn180、Ser185、Gln186、Ala187、Pro188、Ile190、Ala191、Ser192、Ser197、Pro198、Gly199、Arg200、Phe201、Glu202、Arg203、Ile204、Arg207、Ala209、Thr211、Pro217、Cys218、Gly219、Gln220、Glu230、Leu231、Gln232、Asn240、Val241、Thr242、Asp243、Ser245、Val247、Ser248、His249、Gly250、Thr251、Gly252、およびPhe253を含む、項目１５に記載の結晶。
（項目１７）  分子複合体の３次元構造の少なくとも一部を決定するための方法であって、該複合体が少なくともCD40リガンドのフラグメントを含み、該方法が以下の工程：
a)  CD40リガンドのフラグメントの結晶の構造座標を決定する工程；
b)  該構造座標から位相を計算する工程；
c)  工程b)で得られた位相から電子密度マップを計算する工程；
d)  該電子密度マップに基づいて該複合体の少なくとも一部の構造を決定する工程、
を包含する、分子複合体の３次元構造の少なくとも一部を決定するための方法。
（項目１８）  前記工程a)で用いられる構造座標が（１）表１に記載のものと実質的に同一であるか、または（２）表１に記載の座標と実質的に同一な結晶を表現する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）  化学物質のCD40リガンドもしくはCD40、CD40もしくはCD40リガンドのフラグメント、またはCD40リガンド、CD40を含む複合体、またはそれらのホモログと結合する能力を評価する方法であって、該方法が以下の工程：
a)計算的なまたは実験的な手段を使用して該化学物質と該CD40リガンドまたはCD40、そのフラグメントまたは複合体との間でフィッティング演算を行い、それによって該結合に関するデータを得る工程；および
b)工程a)で得られた該データを分析し、該化学物質と該CD40リガンドまたはCD40、フラグメントまたは複合体との間の該結合の特徴を決定する工程、
を包含する、方法。
（項目２０）  前記化学物質が、CD40とCD40Lとの間のインビボまたはインビトロ結合を妨害し得る、項目１９に記載の方法によって同定される2000ダルトン未満の分子量を有する化学物質。
（項目２１）  前記化学物質が、CD40L上の結合部位と結合し得、該結合部位がアミノ酸Lys143、Arg203、Arg207、およびTyr145を含む、項目１９に記載の方法によって同定される2000ダルトン未満の分子量を有する化学物質。
（項目２２）  前記化学物質が、CD40と結合し得、アミノ酸Lys143、Arg203、Arg207、およびTyr145を含む結合部位を含む、項目１９に記載の方法によって同定される2000ダルトン未満の分子量を有する化学物質。
（項目２３）  前記CD40L結合部位が、Ile127、Ser128、Glu129、Ala130、Ser131、Thr135、Ser136、Ala141、Glu142、Gly144、Tyr146、Cys178、Asn180、Ser185、Gln186、Ala187、Pro188、Ile190、Ala191、Ser192、Ser197、Pro198、Gly199、Arg200、Phe201、Glu202、Ile204、Ala209、Thr211、Pro217、Cys218、Gly219、Gln220、Glu230、Leu231、Gln232、Asn240、Val241、Thr242、Asp243、Ser245、Val247、Ser248、His249、Gly250、Thr251、Gly252、およびPhe253からなる群から選択される少なくとも30個のアミノ酸を含む、項目２１または２２に記載の方法によって同定される化学物質。
（項目２４）  前記物質がCD40L上の結合部位と結合可能であり、該結合部位がアミノ酸Ile127、Ser128、Glu129、Ala130、Ser131、Thr135、Ser136、Ala141、Glu142、Lys143、Gly144、Tyr145、Tyr146、Cys178、Asn180、Ser185、Gln186、Ala187、Pro188、Ile190、Ala191、Ser192、Ser197、Pro198、Gly199、Arg200、Phe201、Glu202、Arg203、Ile204、Arg207、Ala209、Thr211、Pro217、Cys218、Gly219、Gln220、Glu230、Leu231、Gln232、Asn240、Val241、Thr242、Asp243、Ser245、Val247、Ser248、His249、Gly250、Thr251、Gly252、およびPhe253を含む、項目２２に記載の化学物質。
（項目２５）  CD40リガンドの結晶化された形態の重原子誘導体。
（項目２６）  項目１１に記載の結晶の重原子誘導体。
（項目２７）  CD40リガンドの変異体、ホモログ、または共複合体またはそのフラグメントの結晶形態を分子置換によって決定するための、前記CD40リガンドの構造座標またはその一部の使用。
（項目２８）  そのCD40リガンドの結合部位との結合についての情報を得るために、CD40リガンドの結晶またはその構造座標を用いて化学物質を計算的にまたは実験的に評価する方法。
（項目２９）  前記結晶が表１に記載の構造座標を有する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）  表１に記載の座標によって表現されるCD40リガンドの結晶と実質的に同一である結晶の構造座標の使用。
（項目３１）  前記結晶が項目１１に記載の結晶である、項目２８に記載の方法。
（項目３２）  CD40リガンドまたはそのフラグメントとの所望の結合を有する化学物質を同定し、特徴付けし、または設計するための、項目３０に記載の結晶の構造座標の使用。
（項目３３）  前記同定され、特徴付けされ、または設計された化学物質の結合の特徴を最適化する工程をさらに含む、項目３２に記載の方法。
３４．CD40リガンドの結合部位におけるリガンドの配向を決定する工程をさらに含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）  項目３２に記載の、同定され、または設計された2000ダルトン未満の分子量を有する化学物質。
（項目３６）  化学物質とCD40リガンドとの間の結合相互作用を決定するためのCD40リガンド結晶の使用。
（項目３７）  前記CD40リガンド結晶が項目１１に記載の結晶である、項目３６に記載の使用。
【００２５】
前述の一般的な記載および以下の詳細な記載は、例示的および説明的であり、請求される発明のさらなる説明を提供することが意図されることが理解されるべきである。
【００２６】
添付の図面は、本発明のさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書に組み込まれ、そしてその一部を成し、本発明のいくつかの実施態様を例示し、そして詳細な説明と共に本発明の原理を説明するために貢献する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本明細書に記載される発明がより十分に理解され得るために、以下の詳細な説明が記載される。
【００２８】
本発明は、CD40リガンドの細胞外ドメインの可溶性フラグメントの結晶に関する。詳細には、Gly116からLeu261までの配列（sCD40L(116-261)）を含むタンパク質の結晶、Ｘ線結晶学によって決定されるようなsCD40L(116-261)の構造、ならびに、CD40L活性の候補インヒビターまたはアゴニストを設計、同定、特徴付け、スクリーニング、および／または最適化するためのsCD40L(116-261)構造の使用、およびそのホモログ、変異体、および共複合体の使用に関する。
Ａ．定義
本明細書で使用される場合、用語CD40リガンド（「CD40L」）とは、CD40、またはそのホモログもしくはフラグメントに結合し得るポリペプチドの種類をいう。本明細書で使用されるこの用語には、sCD40L(116-261)、ホモログ、変異体、等価物、およびそれらのフラグメントが含まれる。
【００２９】
用語「共複合体」とは、化学物質と共有的または非共有的に会合したCD40LまたはCD40Lの変異体またはホモログをいう。
【００３０】
用語「ホモログ」とは、比較されるタンパク質と少なくとも約50％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をいう。
【００３１】
用語「変異体」とは、野生型からの少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、または挿入によって特徴づけられる、CD40Lまたはそのフラグメントをいう。このような変異体は、例えば、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発によってそのコーディング配列において予め変更されたCD40Lの発現によって、調製され得る。
【００３２】
用語「正の電荷を有するアミノ酸」には、正常な生理学的条件下で正の電荷を有する側鎖を有する天然または非天然の任意のアミノ酸が含まれる。正の電荷を有する天然に存在するアミノ酸の例は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンである。
【００３３】
用語「負の電荷を有するアミノ酸」には、正常な生理学的条件下で負の電荷を有する側鎖を有する天然または非天然の任意のアミノ酸が含まれる。負の電荷を有する天然に存在するアミノ酸の例は、アスパラギン酸およびグルタミン酸である。
【００３４】
用語「疎水性アミノ酸」とは、水に比較的不溶性である非荷電の非極性の側鎖を有する任意のアミノ酸を意味する。例は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンである。
【００３５】
用語「親水性アミノ酸」とは、水に比較的可溶性である非荷電の極性の側鎖を有する任意のアミノ酸を意味する。例は、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、およびシステインである。
【００３６】
用語「改変された表面電荷」とは、生理学的pHで、CD40リガンドと比較して、変異体ポリペプチドの１つ以上の電荷単位における変化を意味する。表面電荷の変化は、置換されたアミノ酸を含むポリペプチド分子の等電点（pI）を測定すること、およびそれを野生型分子のpIと比較することによって決定され得る。
【００３７】
用語「〜と会合する」とは、２つの化学物質、またはその一部の間、例えば、CD40リガンドまたはその部分とある化学物質との間の近接の状態をいう。会合は非共有であり得、この場合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、または静電的相互作用により、並置がエネルギー的に好ましい。あるいは、会合は共有会合であり得る。
【００３８】
用語「結合部位」とは、化学物質が他の物質と結合または会合する任意またはすべての部位をいう。
【００３９】
用語「構造座標」とは、結晶形態における分子の原子（散乱中心）によってＸ線の単色ビームの回折で得られるパターンに関する数学的等式から誘導される座標をいう。回折データは、結晶の繰り返し単位の電子密度マップを計算するために使用される。得られるデータが、使用される個別の系に依存的であるため、異なる座標が実際に同じ結晶を記載し得る（このような座標が本明細書に記載される座標と実質的に同じ関係を定義する場合）ことを、当業者は理解する。電子密度マップは、結晶の単位格子内の個々の原子の位置を確立するために使用される。
【００４０】
Ｘ線結晶学によって決定される構造座標のセットが標準誤差を含まないわけではないことを、当業者は理解する。表１はsCD40L(116-261)の原子座標である。本発明の目的のためには、表１の構造座標に---バックボーン原子を使用して---重ねた場合、等価タンパク質バックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が約２×10−１０Ｍ（Å）よりも小さい、CD40L(116-261)の構造座標の任意のセットが、同一であると考えられる。好ましくは、偏差は、約１×10−１０Ｍ（Å）よりも小さく、そしてより好ましくは約0.5×10−１０Ｍ（Å）よりも小さい。
【００４１】
用語「重原子誘導体化」とは、結晶化したCD40リガンドの化学的に修飾された形態を製造するための方法をいう。実際には、結晶は、重金属原子塩、または有機金属化合物（例えば、塩化鉛、チオリンゴ酸金、チメロサール、もしくは酢酸ウラニル）を含む溶液に浸漬され、これは、結晶を通って拡散し得、そしてタンパク質の表面に結合し得る。結合した重金属原子の位置は、浸漬された結晶のＸ線回折分析によって決定され得る。この情報は、分子の３次元構造を構築するために使用される位相情報を生成するために使用され得る。
【００４２】
用語「単位格子」とは、基本的な形状のブロックをいう。結晶の全体の容積は、このようなブロックの規則的組み立てによって構築され得る。各単位格子はパターンの単位の完全な表現を構成し、その繰り返しによって結晶が組み立てられる。
【００４３】
用語「空間群」とは、結晶の対称要素の配置をいう。
【００４４】
用語「分子置換」とは、構造座標が公知である分子（例えば、表１のCD40リガンド座標）を、未知の結晶の単位格子内で、未知の結晶の観察される回折パターンを最もよく説明するように方向付けることおよび配置することによって、構造座標が未知である結晶の予備構造モデルを生成することを包含する方法をいう。次いで、位相が、このモデルから計算され、そして観察された振幅と組み合わされて、座標が未知である構造の近似的なフーリエ合成を与え得る。これは次に、未知結晶の最終的に正確な構造を提供するためにいくつかの形態の改良に供され得る。（例えば、Lattman,E.,「回転および翻訳関数の使用（Use of the Rotation and Translation Functions）」, Methods in Enzymology, 115, 55-77頁 (1985)；Rossman編, 「分子置換法（The Molecular Replacement Method）」, Int. Sci. Rev. Ser. 第13号, Gordon and Breach, New York (1972)を参照のこと。特に、参考として本明細書に援用される。）本発明によって提供されるCD40リガンドの構造座標を使用して、分子置換を用いて、結晶性共複合体、未知リガンド、変異体、ホモログの構造座標、またはCD40リガンドの異なる結晶性形態の構造座標を決定し得る。さらに、本発明の結晶およびその座標を使用して、CD40LまたはCD40と会合する化学物質の構造座標を決定し得る。
【００４５】
用語「化学物質」とは、本明細書で使用される場合、例えば、任意の分子、分子複合体、化合物、またはそのフラグメントを意味する。
【００４６】
CD40L変異体は、当業者に公知の一般的生合成方法を使用して、天然または非天然のアミノ酸をCD40L中へ部位特異的導入することによって生成され得る。例えば、野生型CD40L中の目的のアミノ酸をコードするコドンが、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を使用して、TAGのような「ブランク」非センスコドンによって置き換えられ得る。次いで、このコドンに対するサプレッサーtRNAが、所望のアミノ酸でインビトロで化学的にアミノアシル化され得る。次いで、アミノアシル化tRNAが、部位特異的に導入されたアミノ酸を有する変異体sCD40Lを得るためにインビトロ翻訳システムに添加され得る。
【００４７】
CD40Lの可溶性フラグメントという用語および本明細書で使用される任意の等価の用語は、CD40Lの機能的フラグメントをいう。この文脈で使用される用語「機能的」とは、CD40、CD40-Ig融合タンパク質、またはそのフラグメントを含む分子複合体を包含するその任意のフラグメントもしくはホモログに、結合または会合し得る細胞外ドメインの可溶性フラグメントをいう。このような結合は、当該分野で公知の標準的プロトコルを使用して、免疫沈降実験によって証明され得る。
【００４８】
Ａ．CD40L、その結晶、およびその生物学的意味
【００４９】
本明細書および請求の範囲全体を通して、記載されるアミノ酸の位置づけは、絶対値ではなく、むしろ残基の相対関係を定義することが理解される。したがって、本発明が同一または類似の相対位置を有する配列を包含することが意図される。
【００５０】
本発明は、CD40Lの活性部位または補助結合部位に結合し得る、化学物質および化合物（阻害物質を包含する）を、全体または部分的に、設計、スクリーニング、および最適化するための、分子設計技法の使用を初めて可能にする。CD40リガンド（CD40L）は、CD40LのCD40への結合によって媒介される重要な免疫系機能に関与するので、生体医学的にかなり興味深いＴ細胞膜結合多面的サイトカインである。CD40は、Ｂ細胞および他の細胞タイプの表面で発現される分子である。CD40Lは、ヒト、マウス、ラット、ブタなどのような種々の生物で見いだされる。本発明は、任意の特定の種または生物に限定されることを意図しない。
【００５１】
CD40Lは、腫瘍壊死因子ファミリーのリガンドのメンバーである。このファミリーの他のメンバーであるリンホトキシン-α（LTα）の、そのレセプターと複合体化した結晶構造は記載されており、そしてCD40L結晶構造を理解するための枠組みとして使用されている。しかし、いくらかの類似性にもかかわらず、LT系とCD40系との間の差は、２つのリガンド−レセプター系が、空間的に重複するが同一でなくそして保存されていない、異なる分子結合決定基を有する接触残基の部位を利用することを立証する。
【００５２】
種々の免疫系プロセスの複雑性および重複を考慮すると、CD40シグナリングが非重複性のようである事実は、CD40Lシグナリングを阻害することが重要な治療適用を有し得ることを示唆する。本明細書に示されるCD40Lの結晶構造は、このような治療薬剤の設計、同定、特徴付け、および最適化に有用であると予測される。
【００５３】
以下の本発明の詳細な説明は、(a) CD40L(116-261)の結晶構造およびその座標、(b)CD40Lの結合部位、(c) CD40L結晶を製造する方法、および(d)CD40L結晶およびその構造座標を使用する方法を包含する。
【００５４】
(a.)  CD40リガンドの結晶構造
本発明は、CD40リガンドの結晶、ならびにそれから決定されるCD40リガンドの構造を提供する。詳細には、本発明は、菱面体であり、そして以下の大きさを有する単位格子を有するCD40リガンドのフラグメント(116-261)の結晶を提供する：ａ＝ｂ＝77.17×10−１０Ｍ（Å）およびｃ＝90.46×10−１０Ｍ（Å）、α＝β＝90×10−１０Ｍ（Å）およびγ＝120×10−１０Ｍ（Å）。ほとんどすべてのCD40リガンドフラグメントの残基は、Ｎ末端の残基116-119を除いて、図１に示す最終的な電子密度マップで十分定義される。残基182-186および210-220について弱い密度の領域がある。現在のモデルは、142アミノ酸残基および95水分子からなり、7.5×10−１０Ｍ（Å）と２×10−１０Ｍ（Å）との間のデータについて、21.8％の結晶学的Ｒ因子および29.1％のＲｆｒｅｅを有する。ラマチャンドランダイヤグラムは、142アミノ酸残基のうち140が許容される領域内に（φ，ψ）角を有することを示す。例外は、ジスルフィド架橋の形成に関連する残基Cys218、およびLys143である。
【００５５】
CD40リガンドは、ゼリーロールまたはGreekキー(key)トポロジーを有する２つのβシートのサンドイッチとして折り畳まれる（図３）。分子の大きさは、25×10−１０Ｍ（Å）×30×10−１０Ｍ（Å）×50×10−１０Ｍ（Å）である。全体の折り畳みは、TNF-αおよびLT-αの折り畳みと同様である。本明細書で使用される表記法は、βストランドおよび他の構造的特徴について、Eckら,「ヒトリンホトキシンの構造（The Structure of Human Lymphotoxin）」, J. Biol. Chem., 267,2119-2112に記載されているものである。一方のβシートは、ストランドA"AHCFからなり、そして他方はストランドB'BGDEからなる。TNF-αと、LT-αと、CD40リガンドとの間の構造類似性の程度を評価するために、配列を、等価のβストランド残基の重複を最大にするようにアラインした。次いで、βストランドからの等価のＣα原子を使用して、分子構造を重ね合わせた。重ね合わせたTNF-αおよびCD40L分子の86個の等価のＣα原子の座標偏差の平均二乗の平方根(rms）は、1.10×10−１０Ｍ（Å）である。LT/CD40L対の場合、100個の等価のＣα原子についてのrms偏差は、1.03×10−１０Ｍ（Å）である。残基の位置は、コアおよびβストランド領域において非常に保存されているが、ＡＡ”、ＣＤ、およびＥＦループのような特定のループでは著しく異なる。最良の構造的重ね合わせに基づくTNF-α、LT-α、およびCD40L配列のアラインメントを作成した。図５。CD40Lの疎水性コアのほとんどの残基は、TNFおよびLTの等価の残基で見いだされる特徴との同一性を維持する。LT-αのLeu33がCD40LにおいてVal36へと置換されているような側鎖変化を調節するための局部的代償的コンフォメーション的変化があり、その結果Leu161の側鎖がシフトして、空の空間を満たす。
【００５６】
３つのCD40L分子は、TNF-αおよびLT-αの結晶構造で観察されるのと同様のトリマーを形成する。トリマーは欠隅の錐の形状を有する。トリマーの三回軸は、各サブユニットのβストランドにほぼ平行である。サブユニット間の接触面は、主として、２つのチロシン、２つのヒスチジン、および１つのロイシンによって形成される。したがって、LTで観察される「芳香性タイリング(tiling)」はCD40Lにおいて一般的ではない。各モノマーからのTyr170およびHis224は、トリマーの三回軸に沿って２つの三つ組(triad)の普通でないクラスターを形成する。
【００５７】
CD40Lトリマーの結晶充填も研究した。各CD40Lモノマーは、１つの分子からのループＤＥ（残基198-201）、ＦＧ（232-233）、およびＢＣ（64-166）、ならびに隣の分子からのループＣＤ（182-186）、ＡＡ”（131-135）、およびＧＨ（245-246）を伴う１つの結晶接触(crystalcontact)を形成する。16の水分子が、この接触の形成に関与する。
【００５８】
CD40Lの分子の「上部」のＣＤおよびＥＦループは、TNF-αおよびLT-αのものよりも短い。しかし、長さがより短いにもかかわらず、ＣＤループは、LTにおける等価のループと同様にヘリックスの1.5ターンを含む。LTに類似して、乏しい電子密度の領域がこれらのループ内に生じ、これは秩序の乱れを示し得る。さらに、温度因子のプロット（図６）は、ＣＤおよびＥＦループが分子の最も可動性部分であることを示唆する。ＣおよびＦストランドはCys178とCys218との間のジスルフィド架橋によって連結され、これは分子の上部を安定化することに役割を果たし得る。ジスルフィド架橋はまた、TNF中にも存在するが、異なる位置に位置する。ＡＡ”ループはTNFとLTとの間で大きく異ならないが、CD40Lにおいては、非常に異なる構造を有する。CD40Lにおいて、ＡＡ”ループは、TNFおよびLTと比較してCD40L結合部位から離れる方向にシフトしている。ＡＡ”ループのこの普通でないコンフォメーションは、結晶接触への広範な関与に関連し得る。短い10ヘリカル構造がＧＨループ内に見いだされ、そしてβ胴構造はストランドＥの中央に生じる。ＮおよびＣ末端は、トリマーの底部で互いに近寄っている。構築物のＮ末端の残基116-119は、電子密度マップでの定義が不十分であり、したがって、最初の十分に順序づけられた残基はPro120である。残基116-119は、おそらく、球状ドメインを膜貫通セグメントに接続する茎の部分を構成する。この65残基茎は、TNFファミリーの他のメンバーにおける等価なセグメントと比較して異常に長い。
【００５９】
CD40L配列の分析から、単一のグリコシル化部位が予測される。生化学的実験は、結晶化に使用されるCD40Lタンパク質の残基Asn240がそれに結合したN-連結した炭水化物を有することを示す。2F-Fcマップは、Asn240の側鎖の付近の電子密度を示し、これはおそらく結合した炭水化物に対応する。しかし、密度が十分定義されていないので、現在のモデルはこの位置に炭水化物原子を含まない。
【００６０】
(b.)  結合部位
LT-TNFR複合体結晶構造との類推によって、CD40結合部位は、２つのモノマー間で形成される浅い溝からなる。CD40L-CD40の活性化複合体は、LT-TNFR複合体に類似すると予測される。LTのどの残基がTNFRのどの残基と相互作用するかを示す連結ダイヤグラムに基づいて、CD40Lの結合部位を構築するようであるCD40L配列の範囲を推論した。
【００６１】
出願人らは、CD40L結合部位が、少なくとも２つの疎水性残基に物理的にきわめて接近してArg207を含むことを決定した。より詳細には、結合部位は、少なくともアミノ酸Lys143、Arg203、Arg207、およびTyr145を含む。多くの他の残基が結合部位に含まれ得、以下を含むが、これらに限定されない：Ile127、Ser128、Glu129、Ala130、Ser131、Thr135、Ser136、Ala141、Glu142、Lys143、Gly144、Tyr145、Tyr146、Cys178、Asn180、Ser185、Gln186、Ala187、Pro188、Ile190、Ala191、Ser192、Ser197、Pro198、Gly199、Arg200、Phe201、Glu202、Arg203、Ile204、Arg207、Ala209、Thr211、Pro217、Cys218、Gly219、Gln220、Glu230、Leu231、Gln232、Asn240、Val241、Thr242、Asp243、Ser245、Val247、Ser248、His249、Gly250、Thr251、Gly252、およびPhe253。
【００６２】
当業者は、結合部位への改変、すなわち、置換、挿入、または欠失が行われ得、そして結合部位がその活性を維持することを理解する。したがって、上で定義されたものと少なくとも50％の相同性を含む結合部位が本発明によって包含されることが意図される。より詳細には、約60％の相同性を有することが好ましく、そして約75〜99％の相同性が最も好ましい。上で定義された結合部位に対する相同性の割合の変動は、得られる物質の結合特性を変更し得る。好ましい実施態様では、結合部位は、上で定義されたリストから少なくとも30残基を含む。
【００６３】
結合部位は、大部分はＡＡ”およびＤＥループからの残基を含むことが予測された。さらに、ＣＤおよびＧＨループおよびＢストランドからの残基、Ｃ、Ｄ、Ｇ、およびＨが、CD40結合に関連すると予測された。実質的には、配列保存は、これらの領域において、CD40LとLT-αまたはTNF-αとの間に存在しない。ＡＡ”ループのSer131は配列の整列で保存されるようであるが、構造的重ね合わせは、LTにおいて等価の位置（Ser38）から比較的離れていることを示す。CD40LのＡＡ”ループのTyr45側鎖は乱れているが、LTのArg51に等価の位置に見いだされ、そしてLT-α-TNFR複合体中のArg51のように複合体において広がりかつ十分に定義されたコンフォメーションを有し得る。ＤＥループ上で、Phe201のみが保存される（LTのPhe110に等価）。Phe201は、LT-α-TNFR複合体におけるPhe110と同様のコンフォメーションを採用するが、連結していないLTにおいて、Phe110は異なるコンフォメーションを採用する。ＤＥループ中のArg200側鎖は結晶接触に関与する。ループＤＥ、ＡＡ”、およびＧＨのコンフォメーションは、結晶接触によって影響されるようであり、したがって、これらの構造が複合体中で異なることが予測される。LTの場合における複合体形成に付随するが小さいコンフォメーション的変化は、CD40LへのCD40結合の際に生じる変化の程度を示し得る。
【００６４】
疎水性および親水性の両方の残基の混合物は、結合部位の表面を形成する。LT-TNFR結合接触面は、別々の上方および下方領域としてみなされ得る。LTと同様にして、CD40Lにおける上方領域は、下方領域よりも疎水性かつ電荷を有さない極性の残基を有する。Arg207は、上方および下方領域が連結する領域に存在する、重要な残基である。Arg207側鎖は、CD40レセプターの推定位置に向いている広がったコンフォメーションを採用し、そして少なくとも２つの表面に露出した疎水性残基および１つのセリン残基（Ser192）によって囲まれる。疎水性残基のうちの２つ（190およびPhe253）は、隣のサブユニットに属するが、Ile204は同じサブユニットからである。マウスCD40Lは、ヒトCD40LのArg207に等価な位置にリジンを有し、そしてこのリジンもまた、おそらく疎水性残基によって囲まれるようである。アルギニンの疎水性環境は、この残基とCD40の酸性残基との間の可能な静電的相互作用の強度を増幅し得る。
【００６５】
(c.)  CD40L結晶を製造する方法
種々の実施態様において、本発明は、CD40Lまたはそのフラグメントを含む水溶液を最初に提供することによって、CD40Lまたはそのフラグメントの結晶形態を調製する方法に関する。次いで、沈殿化剤を含む貯蔵溶液は、ある容量のCD40L溶液と混合され、次いで得られる混合物は結晶化される。ある実施態様では、結晶は、sCD40L(116-261)を含む水溶液に由来する。水溶液中のCD40Lの濃度は変化し得、そして好ましくは約１〜約50mg/ml、より好ましくは約５mg/ml〜約15mg/ml、そして最も好ましくは約10mg/mlである。同様に、本発明で使用される沈殿化剤は変化し得、そして当該分野で公知の任意の沈殿化剤から選択され得る。好ましくは、沈殿化剤は、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、およびポリエチレングリコールからなる群より選択される。任意の濃度の沈殿化剤が貯蔵溶液中で使用され得、しかし、この濃度が約1.0M〜約1.5Mであることが好ましく、より好ましくは約1.2Mである。貯蔵溶液のpHもまた変化し得、好ましくは約４と約10との間であり、最も好ましくは約7.5である。これらのパラメータのそれぞれを過度の実験をすることなく変化することができ、そしてなお、受容可能な結晶が得られることを、当業者は理解する。実際に、適切な沈殿化剤、緩衝化剤、または他の実験的変数が任意の所定の成長方法について決定されると、これらの方法のいずれかまたは任意の他の方法が、本発明の結晶を成長させるために使用され得る。当業者は、特定の必要に依存する変数を決定し得る。
【００６６】
結晶化の種々の方法が本発明に使用され得、蒸発拡散、バッチ、液体架橋、または透析を含むが、これらに限定されない。蒸発拡散結晶化が好ましい。例えば、McPhersonら、「Preparation and Analysis of Protein Crystals」, Glick編,82-159頁, John Wiley & Co. (1982)；Jancarikら、「希薄マトリクスサンプリング：タンパク質結晶化のスクリーニング法（Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of protein）」, J.Appl.Cryst. 24, 409-411 (1991)を参照のこと。詳細には、本明細書に参考として援用される。
【００６７】
蒸発拡散結晶化では、少容量（すなわち、数ミリリットル）のタンパク質溶液を、沈殿化剤を含む溶液と混合する。この混合物を、少量（すなわち、約１ml）の沈殿化溶液を含むウェル上で懸濁する。ウェルへの滴からの蒸発拡散により、滴中で結晶形成を生じる。
【００６８】
結晶化の透析方法は、タンパク質を保持するが小分子（すなわち、緩衝化剤および沈殿化剤）を内側および外側へ拡散させるサイズ排除半透膜を利用する。透析において、タンパク質および沈殿化剤を蒸発によって濃縮することよりもむしろ、沈殿化剤は、膜を通ってゆっくりと拡散され、そしてタンパク質濃度を一定に保ちながらタンパク質の溶解性を減少させる。
【００６９】
バッチ法は、一般的に、溶液がちょうど濁るまで、タンパク質の水溶液へ沈殿化剤をゆっくりと添加することを包含し、この時点で容器を密閉しそして結晶化が生じるまでの時間静置し得る。
【００７０】
したがって、出願人らは、本発明が結晶化の任意およびすべての方法を包含することを意図する。当業者は、このような方法のいずれかを選択し得、そして選択した方法によって所望の結晶を得るようにパラメータを変化し得る。
【００７１】
(d.)  CD40L結晶およびその座標の使用
本発明の結晶およびそれを記載する座標は、CD40LまたはCD40の結合部位に全体または部分に結合または会合し得る阻害化合物またはアゴニストを含む、化学物質および化合物を設計、選択、および合成するための分子設計技法の使用を可能にする。
【００７２】
本発明によって可能にされた１つのアプローチは、CD40Lに結合または会合し、そして種々の方法で化合物の物理学的特性を変更する化学物質を設計するための、CD40Lの構造座標の使用である。したがって、例えば、溶解性、親和性、特異性、効力、オン／オフ速度、または他の結合特徴のような特性は、すべて変更および／または最適化され得る。
【００７３】
候補化学物質とCD40Lとの間の相互作用についての最適部位を決定するために、CD40L結晶を種々の物質のライブラリーとプロービングすることによって、所望の化学物質を設計し得る。例えば、溶媒で飽和した結晶から集めた高分解能Ｘ線回折データは、溶媒分子の各タイプがはまりこむ場所を決定させる。次いで、その位置に堅く結合する小分子が設計および合成され、そして所望の活性についてテストされ得る。所望の活性が得られると、分子はさらに最適化され得る。
【００７４】
本発明はまた、小分子データベースをコンピュータでスクリーニングすること、あるいは、CD40またはCD40Lに全体でまたは部分で結合し得る化学物質または化合物をコンピュータで設計することを可能にする。それらはまた、変異体、共複合体の結晶構造、あるいはCD40Lの少なくとも一部と相同であるまたは会合し得る任意の他の分子の結晶形態の結晶構造を解明するために使用され得る。
【００７５】
この目的に用いられ得る１つの方法は、分子置換である。未知の結晶構造は、例えば、CD40Lの他の結晶形態、CD40L変異体、またはCD40との共複合体、あるいは目的のCD40Lと会合する化学物質の任意の他の未知の結晶のような任意の未知構造であり得、これは、表１に記載される本発明の構造座標を使用して決定され得る。CD40Lとの共複合体は、CD40-CD40L、CD40L-小分子、およびCD40由来のフラグメントを含み得るが、これらに限定されない。この方法は、本発明を含まないような情報を決定することを試みることよりも迅速におよび効率的に未知結晶の正確な構造形態を提供する。
【００７６】
したがって、得られた情報は、CD40LまたはCD40の潜在的インヒビターまたはアゴニストを最適化するために、そしてより重要なことには、CD40LとCD40との間の関連に影響を及ぼす化学物質の新規なクラスを設計および合成するために使用され得る。
【００７７】
本発明に従ってCD40Lを阻害または拮抗する化合物の設計は、少なくとも２つの因子の考察を包含する。第１に、化合物は、CD40LまたはCD40と物理的または構造的に会合し得なければならない。会合は、例えば、共有または非共有結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性または静電的相互作用のような、任意の物理的、構造的、または化学的会合であり得る。
【００７８】
第２に、化合物は、CD40またはCD40Lと会合させるコンフォメーションを仮定し得なければならない。化合物のすべての部分が必ずしもCD40またはCD40Lとの会合に関与するわけではないが、その非関与部分はなお、分子の全体のコンフォメーションに影響し得る。これは順に、化合物の望ましさに重要な影響を有し得る。このようなコンフォメーションの必要条件は、結合部位のすべてまたは一部に関して化学物質または化合物の全体の３次元構造および配向を含む。
【００７９】
CD40またはCD40Lにおける化学化合物の潜在的阻害または結合効果は、実際の合成およびコンピュータモデリング技法の使用によるテストの前に、分析され得る。所定の化合物の理論的構造が、化合物とCD40またはCD40Lとの間の不十分な相互作用および会合を示唆する場合、化合物の合成およびテストの必要性が除去される。しかし、コンピュータモデリングが強い相互作用を示す場合、分子は次いで合成され、CD40またはCD40Lに結合する能力についてテストされ得る。したがって、効力のない化合物の高価なおよび時間を費やす合成が避けられ得る。
【００８０】
CD40またはCD40Lの阻害または他の結合化合物は、化学物質またはフラグメントが、CD40Lの個々の結合部位と会合する能力についてスクリーニングおよび選択される一連の工程によって、コンピュータによって評価および設計され得る。
【００８１】
したがって、当業者は、CD40Lと、より特定すると、sCD40L(116-261)の個々の結合部位と会合する能力について、化学物質またはフラグメントをスクリーニングするいくつかの方法の１つを使用し得る。このプロセスは、例えば、表１のCD40L座標に基づくコンピュータスクリーニングにおける結合部位の視覚的検査によって始まり得る。次いで、選択されたフラグメントまたは化学物質は、種々の配向に配置され得、あるいはCD40Lの個々の結合ポケット内に「ドッキング」され得る。ドッキングは、QuantaおよびSybylのようなソフトウエア、次いでCHARMMおよびAMBERのような標準分子力学力場でのエネルギー最小化および分子動力学を使用して成し遂げられ得る。
【００８２】
特定化したコンピュータプログラムは、興味深いフラグメントまたは化学物質を選択するための使用であり得る。（GRID、Oxford University,Oxford, UKから入手可能；MCSSまたはCATALYST、Molecular Simulations, Burlington, MAから入手可能；AUTODOCK、Scripps Research Institute, LaJolla, CAから入手可能；DOCK、University of California, San Francisco, CAから入手可能；XSITE、University College of London, UKから入手可能）。
【００８３】
適切な化学物質またはフラグメントが選択されると、これらはインヒビターまたはアゴニストに組み立てられ得る。組み立ては、本明細書で開示される構造座標に関して、コンピュータスクリーニングで表示された３次元画像における互いのフラグメントの関連の視覚的検査によるものであり得る。
【００８４】
あるいは、いずれかの空の結合部位を使用して、または所望の活性を有する分子の一部を任意に含む、所望の化学物質を「新たに」実験的に設計し得る。したがって、例えば、CD40Lまたはそのフラグメント、あるいは評価されるべき候補化学物質のいずれかが固相に付着され、それによってさらなる研究または最適化のために潜在的バインダーを同定する、固相スクリーニング技法を使用し得る。
【００８５】
基本的には、任意の分子モデリング技法が本発明に従って用いられ得る；これらの技法は公知であるか、または当業者に容易に入手可能である。本明細書開示される方法および組成物が、CD40Lに会合または結合する物質を同定、設計、または特徴付けするだけでなく、CD40に結合しそれによってCD40L-CD40相互作用を破壊する、CD40Lのような物質を同定、設計、または特徴付けするために使用され得ることが理解される。本発明は、これらの方法および組成物を広く包含することを意図する。
【００８６】
化合物が上記の方法によって設計または選択されると、化合物がCD40Lに結合し得る効率は、コンピュータまたは実験的評価を使用してテストおよび最適化され得る。種々のパラメータは、所望の結果に依存して最適化され得る。これらには、特異性、親和性、オン／オフ速度、疎水性、溶解性、および当業者によって容易に同定可能な他の特徴が含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
したがって、必要に応じて、結合特性を改良または改変するために、化学物質の成分のいくつかに置換、欠失、または挿入を行い得る。一般的に、最初の置換は保存的であり、すなわち、置換基は、元の成分とほぼ同じサイズ、形状、疎水性、および電荷を有する。
【００８８】
本発明はまた、CD40Lの変異体の設計およびそれらの結晶構造の解明を可能にする。より特定すると、本発明は、当業者が結合部位および接触面の位置づけを決定し、それによって変異体についての所望の部位を同定することを可能にする。
【００８９】
例えば、変異体は、１つ以上のアミノ酸残基を置き換えまたは代用することによって、CD40L上の特定の部位または部位の組み合わせに向けられ得る。このような変異体は、所望であってもなくてもよい変更された結合特性を有し得る。
【００９０】
変異体は、例えば、部位特異的変異誘発、欠失、または付加のような当業者に公知の任意の方法によって調製され、次いで目的の任意の特性についてテストされ得る。例えば、変異体は、特定のpHでの変更された電荷、より堅い結合、より良い特異性などについてスクリーニングされ得る。
【００９１】
CD40L構造は、すべてではないがほとんどの天然に存在する単一部位HIGMS変異が、直接的に結合部位よりもタンパク質の折り畳みおよび安定性に影響を及ぼすことを示唆する。実際に、欠失または他の劇的変化を含むより厳しいHIGMS変異は、構造の単一よりもずっと多くの部位変異を撹乱させることが予測される。さらに、変異誘発に選択された６つの結合部位残基のうちの２つのみがCD40結合に重要であることが見いだされた。
【００９２】
ヒットの同様の低頻度が、LTαの類似の変異研究で見られた。Van Ostadeら、「Structure activity studies of human tumour necrosis factors」, Protein Engineering 7: 5-22(1994)。この観察は、個々のCD40L結合部位残基の変異が、CD40L-CD40結合を完全に破壊するために一般的に十分であるかどうかの疑問を生じる。不十分であれば、CD40が媒介する細胞性シグナリングは引き続き行われ、そして変異は臨床的に検出不可能である。この挙動は、LTα-レセプター複合体構造において、38ものLTα残基が結合接触面に関連するという事実に一致する。接触面はかなり広く（52010−１０M２（Å））、そしておそらくCD40L-CD40複合体において同様の大きさである。したがって、各残基が結合エネルギーの小部分に寄与するのみであることが予測される。しかし、ヒト成長ホルモンのそのレセプターとの相互作用はまた大きな表面領域を含むことが示されており、さらに比較的少ない重要な残基がほとんどの結合エネルギーに寄与する。
【００９３】
さらに、本発明は、潜在的小分子薬物候補の最適化に有用である。したがって、本発明の結晶構造はまた、CD40リガンドおよび小分子インヒビターの複合体の結晶構造についての情報を得るために使用され得る。例えば、小分子インヒビターがCD40リガンドと共結晶化されるならば、複合体の結晶構造は、位相の計算についてのCD40リガンドの公知の座標を使用する分子置換によって解明され得る。このような情報は、例えば、CD40リガンドと小分子インヒビターとの間の相互作用の性質を決定するために有用であり、したがって、親和性、特異性、および速度論ような結合特徴を改良する改変を示唆し得る。
【００９４】
CD40LにおけるいくつかのHIGMS変異の有害な効果は、その構造を脱安定化することによって引き起こされるようである。例えば、Trp140は、タンパク質内に埋め込まれた大きな疎水性残基であり、そしてHIGMS変異Trp140→GlyおよびTrp140→Argにおけるその側鎖の除去は、構造の脱安定化を明らかに導く。Val126→Ala変異によって影響されるバリンもまた、疎水性コアを形成することに関与する。Leu155は完全に埋め込まれていないが、βストランドＢの中央にある。Leu155→ProHIGMS変異におけるようなこの位置でのプロリンの導入は、ストランドの形成を破壊し得る。HIGMS変異Ala235→Proの作用は同様に説明され得る。HIGMS変異Gly144→GluにおけるGly144の置換は、ＡＡ”ループのコーナーを形成するための位置に必要なコンフォメーション的自由の喪失を生じ得る。結果として、結合に関連することが公知である隣接する残基、Lys143およびTyr145の配置が破壊される。興味深い観察は、上記の残基のすべてがクラスターであるようであることである：Trp140、Leu155、およびVal126は、ストランドＡ、Ａ”、Ｂ’、およびＢによって部分的に形成される疎水性コアの領域の形成に関与する。Lys143、Gly144、およびTyr145は、上記の疎水性残基に非常に近くにあるＡＡ”ループの露出した表面残基である。これは、CD40結合能力がCD40Lのこの領域における撹乱に非常に感受性であることを示唆する。
【００９５】
HIGMS変異Ala123→Glu、Gly227→Val、およびThr211→Aspは、サブユニット接触面の形成に関連する残基に影響を及ぼす。Ala123は、トリマーの下部付近にあり、そして隣接するサブユニットの３つの疎水性残基（Leu168、Val228、およびLeu261）のファンデルワールス距離内にある。Gly227は、隣接するサブユニットのTyr172に対して詰め込み、そしてThr211は、隣接するサブユニットからのArg181と相互作用するようであるサブユニット間接触面に近接するＥＦループ上にある。これらの位置により大きな側鎖を導入する変異（例えば、Thr211→Asp）は、サブユニット間パッキングを破壊し、そしておそらくトリマー化（trimeritation）を抑えることが予測される。したがって、ほとんどの単一部位HIGMS変異が、CD40結合に直接の役割を演じるよりも、CD40Lの折り畳みおよび安定性に影響を及ぼすようである。さらに、９つの標的した表面残基のうちの２つのみの変異が、CD40結合に影響を及ぼすようである。
【００９６】
CD40Lにおける変異誘発研究は、残基Tyr145およびLys143がCD40結合に直接関連することを示している。結晶構造は、両方の残基がＡＡ”ループ上にあり、そして表面に露出していることを示す。図７。LT-TNFR結晶構造における等価のループは、結合の類似性を示唆するいくつかのリガンドレセプター接触に関連する。Tyr145は、ループのコーナーにあり、そしてその側鎖は、混乱することを示唆する明らかな電子密度を有さない。Lys143の原子N1は、Glu129のOδ1との水素結合を形成する。図２。電子密度マップはまた、Lys143の側鎖がさらなるコンフォメーションを有することを示す。HIGMS変異Ser128→ArgGlu129→Glyに関連する２つの残基のSer128およびGlu129は、Lys143の近くにあり、そしてマップに十分定義される。Ser128はほとんど完全に埋まり、そしてその側鎖ヒドロキシル基はHis249の水素結合距離内である。HIGMS変異で見られるGlu129-Gly置換は、CD40への結合に関与し得る溶媒接近可能な残基に影響を及ぼすことが示されている。Bajorathら、「Identification of Residues on CD40 and its Ligand which are Critical for the Receptor-ligand interaction」, Biochemistry 34, 1833-1844 (1995)、詳細には本明細書に参考として援用される。それに対する１つの可能な候補は、露出した残基Lys143であり、そしてGlu129への水素結合の喪失は、減少したCD40結合で生じるコンフォメーションを脱安定化し得る。これらの残基のすべては、マウスCD40L配列で保存される。
【００９７】
残基Ser131、Asn180、Phe201、Glu202、およびAsn240（結合部位に位置する）がアラニンによって置換される５つのさらなる単一部位変異は、これらの残基がCD40結合に重要でないことを確立した。さらに、結合部位の外の残基位置の２つの他の変異（Thr135およびAsp243）はまた、結合に影響を及ぼさないことが示された。構造に従って、Ser131およびThr135は、ＡＡ”ループ上にあり、そしてその側鎖は露出されない。グリコシル化部位であるAsn240は、溶媒に露出される。付着した糖がCD40との相互作用に利用可能でないAsn240を作成すると予測されるので、変異誘発の結果と一致して、CD40結合におそらく関連しないと結論する。Asp243は半露出した残基であり、そしてAsn186への水素結合を作成する。Asn180は、分子の上部の露出した残基である。その側鎖は、残基183および216への水素結合を作成する。Phe201およびGlu202の両方とも、結合部位領域のＤＥループ上にあり、そして溶媒に露出される。
【実施例】
【００９８】
Ｃ. 実施例
１．sCD40L(116〜261)の結晶構造の決定
Ａ.結晶化
緩衝薬品をFisher(Boston,MA)から購入した。結晶条件のスクリーニングを、Hampton Research (Riverside, CA)からのCrystalScreenTMキットを用いて行った。アミノ酸残基Gly116〜Ｃ末端残基Leu261を含むヒトCD40リガンドの細胞外ドメインの可溶性フラグメントを、可溶性形態において産生し、そして以下のように精製した：
アミノ酸G116〜L261のsCD40L（116〜261）配列をコードする遺伝子を、Pichiapastoris発現ベクターpWS106中にクローン化し、そしてsCD40L(116〜261)タンパク質を、標準的なプロトコルを用いて発現させた。Peitschら、「CD40リガンドのB-Dモデルは、それが腫瘍壊死因子に類似する緻密なトリマーであると予測する」、Int.Immunol.5, 233-238 (1993)。pWS106は、部位指向性変異誘発によって欠失した3'-AOX1フランキング領域中の3634ntでのNcoI部位を有するベクターpPIC9(Invitorogen)の変異体である。細胞を溶解し、そして媒体を20mM Tris-HCl(pH 6.8)を用いて一晩透析し、そしてSP（Pharmacia）カラムにロードした。結合したsCD40Lを、２×PBS(pH 7.2)によって溶出し、そして緩衝液を１×PBSに交換した。
【００９９】
タンパク質ストックを、PBS(20.44g/l Na2HPO4、7.73g/l Na2HPO4-H2O、87.66g/ltNaCl)緩衝液中の８mg/ml sCD40Lの溶液として利用可能にした。結晶を蒸発拡散法によって成長させた（Jancarikらを参照のこと）。結晶化の条件を見出すために、不完全な階乗スクリーン(incomplete factorial screen)を組み立てた。代表的な実験において、タンパク質溶液を同容量の貯蔵溶液と混合し、そして混合物の一滴を貯蔵溶液上のガラスカバースリップ下に懸濁した。結晶を、1.4Mクエン酸ナトリウム、50mMナトリウム、Hepes(pH7.5)貯蔵溶液中で成長させた。立方体として成形した結晶は、再生産が容易であり、そして各側面がほぼ１mmの最大寸法に到達し得る（最大の結晶を生じるための沈澱化剤の最適濃度は、1.2Mクエン酸ナトリウムである）。７と８との間のpHの変化は、結晶の質に影響を与えない。必要ではないが、データの収集のために十分な質の結晶を得るために、マクロシーディング技術もまた好結果をもたらす。結晶組成物を、洗浄、水中への溶解、およびSDS電気泳動の後にアッセイした。ゲルは、約20,000ダルトンの強いバンドおよび17,000ダルトンのより弱いバンドを示した。より弱いバンドは、非グリコシル化タンパク質に対応するが、より強いバンドは、グリコシル化形態に対応する。
【０１００】
当業者は、上記の結晶化条件を変化し得ることを認識する。結晶化条件を変化することによって、sCD40Lの他の結晶形態が得られ得る。このような変化を、単独または組み合わせて使用し得、そして以下を包含する：最終タンパク質濃度を、５mg/mlと35mg/mlの間で変化させること；SCD40Lと沈澱化剤との比を変化させること；クエン酸塩の濃度を1.2Mと2.0nMの間で変化させること；pHを5.5と9.5の範囲で変化させること；HEPES濃度を5と395mMの間で変化させること；洗浄剤の濃度または型を変化させること；温度を-5℃と30℃の間で変化させること；およびSCD40Lを上記の条件またはその変形を用いたバッチ法、液体架橋法、または透析法によって結晶化させること。McPherson,A.(1982)を参照のこと。タンパク質結晶の調製および分析（Glick編）pp.82-159,JohnWiley & Co.,N.Y.,（これらは、本明細書中で参考として援用される）。
【０１０１】
Ｂ. データの収集および処理
結晶をキャピラリー管中にマウントし、そしてElliot GX-13 generatorのＸ線上で回折容量(diffraction capacity)を試験した。振動写真は、強い回折が高分解能であることを示した。写真の最初の視察は、はぼ立方格子を示唆した。
【０１０２】
大きな結晶（0.8×0.8×0.8mm）を、20％グリセロール、1.2Mクエン酸ナトリウム、50mM HEPESナトリウム（pH 7.5）の凍結防止溶液中で徐々に平衡化し、ループ上にマウントし、そして-150℃の液体窒素ガス流中で直ちに凍結した。凍結技術により、結晶を本質的に不滅化（immortalize）し、そしてさらにより高い質のデータセットを産生した。1.75×10-10Ｍ（Å）分解能までの天然のＸ線のデータセットを、Nicolet/Siemens multiwire area detector(Siemens, Inc.)を用いて収集した。BUDDHA(25)およびCCP4プログラムパッケージ（SERC(UK)Collaborative Computing Project No 4, Daresbury Laboratory, UK 1979）を用いてデータを集積し、そして換算した。データ収集には約５日を要した。
【０１０３】
データ処理は、近似の格子寸法a=b=c=55×10-10M(Å)およびα=β=γ=91を有する菱面体単位格子を示唆した。計算を補助するために、寸法a=b=77.17×10-10M(Å)、c=90.46×10-10M(Å)、γ=120°を有する六方単位格子を代わりに用いて規定した。データの併合は、空間群がR3であることを示唆した。空間群R3を仮定した場合、Rmergeは6.7％である。空間群R32を仮定すると、Rmergeは16.6％である。表１は、得られたデータセットについての情報を含む。
【０１０４】
Matthews体積の計算により、Z=9(単位格子における非対称単位の数)およびMW=20,000ダルトンと仮定すると、VM=533,610A3/Z*MW=2.97が得られる。Eckら、J.Biol.Chem. 267, 2119-2112(1992)（これは、本明細書中で参考として特に援用される）。従って、非対称単位中に１つまたは２つのモノマーが存在するかどうかは最初のうちは明確ではなかった。
【０１０５】
Ｃ. 分子置換
XPLORプログラムパッケージを用いて、全ての続く分子置換および精密化演算を行った。QUANTA(Molecular Simulations, Inc.)ソフトウェアを用いて、分子グラフィック操作を行った。XPLORおよびQUANTAの両方を、Silicon Graphics Indigo 2 コンピュータワークステーション上で作動させた。
【０１０６】
非結晶学的対称が存在するかどうかを調査するために、8〜4×10-10M(Å)データを用いて自己回転関数(self rotation function)を計算した。φ=90゜、ψ=90゜、κ=180゜に非常に強いピークが認められた（これらは、結晶学的３回回転軸に対応する）。これは、SCD40Lのトリマーの３回回転軸に一致する。また、あまり強くないピークが、３回回転軸に垂直な２回回転軸に対応するφ=0゜、ψ=30゜、κ=180゜、およびφ=0゜、ψ=90゜、κ=180゜、ならびにφ=0゜、ψ=150゜、κ=180゜として現れた。これらの軸は、非結晶学的対称に対応しない。
【０１０７】
ヒトsCD40Lの３次元モデルを、QUANTAタンパク質相同性モデリングソフトウェア（QUANTA protein homology modeling software）を用いて、基礎構造としてマウスCD40Lモデルを用いることにより構築した。このモデルを、分子置換計算のためのプローブとして使用した。
【０１０８】
2.5゜角度格子(angle grid)および8〜4×10-10M(Å)データを用いた交差回転関数(cross rotation function)の計算は、オイラー角（θ1=234.5゜、θ2=5.0゜、θ3=234.5゜）で平均以上の強いピーク4.5σを産生した。この解析に従うモデルの回転およびそれに続く結晶学的３回対称に対応する対称関連分子の産生は、予想どおりＺ軸に平行な３回回転軸を有するトリマーを生じる。正確な回転解析を、Patterson相関精密化（Pattersoncorrelation refinement）を用いて見出した。回転関数において有意な第２のピークは、見出されなかった。
【０１０９】
並進検索を行うために、回転検索の最初のピークに従ってモデルプローブを回転し、そして並進した結果、トリマーの質量の中心は、Ｚ軸に存在すると思われる。トリマーの３回回転軸が単位格子のＺ軸に存在するようであるので、これは、予想される位置に近いと仮定した。ｘｙ平面上の並進関数において明確なピークを見出すための最初の企ては、失敗した。調整したモデルプローブ（主として、構造がTNFファミリーの異なるメンバー間で保存されるようなコア残基を含む）は、予想される位置に近い位置でのピークの密集を有する並進関数を生じる。全ての骨格原子ならびに残基8〜12、53〜62、90〜93、110〜114、および141〜146の側鎖原子を含むそれらの調整されたモデルの１つは、x=0.053、y=0.053での平均以上の相関係数3.3σを有するピークを生じる。このピークは、ピークのリストで最も高く、そして予想の位置に近かった。
【０１１０】
対称関連分子を生成し、そしてコンピュータグラフィックを用いてそれらを示すことにより、分子が単位格子中に充分に詰め込まれ、そして第２の分子のための十分な空間が存在しないことが見出された。従って、本発明者らは、非対称単位中にほんの１分子のみが存在すると結論づけた。自己回転関数中の２回回転対称（2-foldsymmetry）の存在は、見かけ上分子内の内部対称の結果であり、おそらく高含量の平行ストランドに関連した。実際に、モデルに由来する構造因子から計算される自己回転関数は、２回回転対称に対応するピークを示す。
【０１１１】
Ｄ．モデル構築および結晶精密化
XPLORパッケージのparaml9.pro立体化学パラメータのセットを、全ての精密化計算に使用した。並進関数の解析を見出すために使用された部分モデルを、7.5〜2.5×10-10M(Å)データを用いることにより剛体精密化に供した。最初の剛体精密化後のＲおよびＲfree(29)因子は、それぞれ49.9%および51.4%であった。Ｒfreeの計算に使用された試験データのセットは、データの10%を含んでいた。部分モデルを、40回の従来の位置精密化および初温度T=2500Kでのシュミレートされたアニーリングサイクルに供した。ＲおよびＲfree因子は、それぞれ31.2%および43.1%に下がった。モデルの偏りを減らすために、部分モデルをマップ計算および精密化に使用した。使用された分解能の範囲は、7.5〜2.5×10-10M(Å)であった。各回でモデルの10％を結果として省略することによって計算されたシュミレート化アニーリング省略マップ(30)は、モデルのどの部分が位相調整(phasing)に使用され得ることを示した。ゆえに、モデルを、アニーリングされた省略マップにおいて十分に定義される残基のみを含むように修正した。最初のモデルは、完全なモデルの合計1374原子のうち815個の原子を含んだ。3FO-2FCマップを、モデル構築および精密化のサイクルに使用した。代表的に、サイクルは、モデル構築、位置精密化、およびＢ−因子精密化からなった。必要に応じて、シュミレートされたアニーリングを行った。位相が改善するにつれ、より多くの原子をモデルに加えた。最初に、グループ化されたＢ−因子を各ストランドに（主鎖原子に１つ、そして側鎖原子に１つ）割り当てた。後に、各残基について精密化するＢ−因子をグループ化し、そして最終的に個々の原子のＢ−因子をグループ化した。精密化の後に低いRfreeがもたらされるマニュアル構造修正だけを、適切であるとした。ＲおよびＲfreeが、それぞれ31.1%および36.4%に達成した場合、分解能は2.25×10-10M(Å)まで上がり、そして最終的には2×10-10M(Å)まで上がった。水分子を、QUANTA4.1のＸ-溶媒和ユーティリティー(X-solvateutility)を用いて加えた。占有および温度因子の両方を、水分子について精密化した。図８に、結晶データおよび精密化に関連する情報を要約する。表１は、sCD40L(116-261)の原子座標を列挙する。
【０１１２】
sCD40Lの結晶構造の座標を、CD40Lの小分子インヒビターの構造基礎設計、コンピューター薬物設計、および反復構造最適化に使用し得る。
【０１１３】
ａ．コンピューター薬物設計
小分子インヒビターを、コンピューターアプローチを用いて設計し得る。これらのアプローチはまた、新たな薬物設計として公知である。簡単に言えば、sCD40Lの結晶構造座標は、コンピュータープログラムの入力(例えば、DOCK)である。DOCKのようなプログラムは、CD40Lに結合すると予測される小分子構造のリストを出力する。次いで、これらの分子をCD40L結合についての生化学アッセイによりスクリーニングし得る。
【０１１４】
代表的には、分子をCD40Lに結合する能力に関してスクリーニングする生化学アッセイは、競合型アッセイである。このようなアッセイにおいて、分子をアッセイ溶液に添加し、そして従来の方法論を用いて阻害の程度を測定する。
【０１１５】
ｂ．構造最適化の反復サイクル
sCD40Lと小分子インヒビターとの間に形成された複合体の結晶構造を解明し得る。簡単に言えば、小分子インヒビターは、代表的に、上述のコンピューターアプローチまたは小分子ライブラリのスクリーニングのいずれかにより、sCD40Lの結晶構造座標を用いて見出される。次いで、小分子インヒビターをsCD40Lと共に同時結晶化し、複合体の結晶構造を分子置換により解明する。分子置換は、位相計算のためにsCD40Lの座標を必要とする。これらの実験から得られた情報を使用して、小分子がタンパク質標的とどのように相互作用するかを明らかにすることにより、小分子インヒビターの構造を最適化し得る。これは、小分子を改変して、その物理化学的性質（例えば、CD40L標的に関する親和性、特異性、および速度論）を改善する方法を示唆する。
【０１１６】
コンピューター薬物設計および構造最適化の必要性に加えて、sCD40Lの結晶座標は、CD40Lの結合部位を分析するのに有用である。このような分析により、薬物標的化に特に有効な領域がArg207付近にあることを決定した。Arg207は、３つの疎水性残基および１つの適度な疎水性残基に取り囲まれた領域に位置する。このグループ化は、２つのCD40Lモノマー間に形成される結合溝の１つの壁を画定するようである。理論に束縛されることは望まないが、CD40のAsp84、またはGlu117は、この部位においてCD40Lとおそらくは相互作用するようである。Arg207を取り囲む疎水性残基は、結果としてCD40のArg207、Asp84、およびGlu117の間の静電相互作用の強度を増加させ得る。特に、Glu117およびAsp84が重要であるように思われる。上記の観察および仮説は、この領域がCD40L/CD40相互作用の結合エネルギーに顕著に寄与し得、それによりこの領域がインヒビター設計の有効な標的であることを示唆する。部位突然変異研究は、上述のプロセスと組み合わせて使用され、さらに結合部位を規定し得る。
【０１１７】
種々の改変および変化が、本発明の思想または範囲から逸脱することなく、本発明の方法および組成物において行われ得ることが、当業者に理解されるべきである。それゆえ、本発明は、添付の請求の範囲およびその等価物の範囲内である場合、本発明の改変および変化を包含することが意図される。
【０１１８】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
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【表１−２５】
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【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、2.5σで等密度線を記された(contour)2Fo-Fc電子密度マップの代表的な領域であり、CD40結合部位の近隣における残基を示している。
【図２】図２は、CD40の三量体の中心の近隣において形成される３つのチロシンおよび３つのヒスチジン残基のネットワークの様子を示す電子密度マップである。
【図３】図３は、ヒトCD40L、特にCD40L Cαバックボーンの三次元構造の立体図である。
【図４】図４は、CD40Lのリボン表示および二次構造アサインメントである。
【図５】図５は、構造的考慮に基づくTNFα、Ltα、およびCD40LのTNF様ドメインの配列アラインメントである。
【図６】図６は、残基番号の関数としての主鎖原子の温度因子のグラフである。残基は、Pro120を残基１として番号づけられる。
【図７】図７は、Hyper-IgMおよび設計された変異に関する残基の描写である。３番目のモノマーは、簡潔のため除いてある。
【図８】図８は、sCD40L(116-261)の結晶学的および精密化データの要約である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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