(57)【要約】      （修正有）【課題】  正常組織での発現レベルが極めて低く、癌特異的に発現レベルが高い遺伝子を見出し、これを用いた癌の新規診断方法を提供する。【解決手段】  ＤＫＫ４（Homo sapiens dickkopf homolog 4 (Xenopus laevis)）、ＮＯＨＭＡ（Homo sapiens HORMA domain containing protein）、ＣＹＰ２Ｗ１（Homo sapiens cytochrome P450, family 2, subfamily W, polypeptide 1 ）およびＡＰＩＮ（Homo sapiens APin protein）をコードする遺伝子は癌特異的に発現レベルが高いことを見出した。これらの発現レベルを正常レベルと比較することにより、客観的な癌の診断が可能となる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、
被検体由来の試料において、配列番号１、３、５または７に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも１つのレベルを測定するポリヌクレオチド測定工程、および
上記ポリヌクレオチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項２】
上記ポリヌクレオチド測定工程において、配列番号９ないし１６のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを少なくとも１つ使用することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、
被検体由来の試料において、配列番号２、４、６または８に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドの少なくとも１つのレベルを測定するポリペプチド測定工程、および
上記ポリペプチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項４】
上記ポリペプチド測定工程において、配列番号２、４、６または８に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドの少なくとも１つに特異的に結合する抗体を使用することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記癌が胃癌または大腸癌であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
被検体由来の試料を用いて癌を診断するための器具であって、
配列番号１、３、５または７に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも１つと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドが支持体上に固定化されていることを特徴とする器具。
【請求項７】
支持体上に固定化されているポリヌクレオチドが、配列番号９ないし１６のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも１つであることを特徴とする請求項６に記載の器具。
【請求項８】
被検体由来の試料を用いて癌を診断するための器具であって、
配列番号２、４、６および８に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドの少なくとも１つに特異的に結合する抗体が支持体上に固定化されていることを特徴とする器具。
【請求項９】
被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、
配列番号１、３、５または７に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドを備えることを特徴とするキット。
【請求項１０】
上記ポリヌクレオチドが、配列番号９ないし１６のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも１つであることを特徴とする請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
上記ポリヌクレオチドがＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲのプライマーとして用いられることを特徴とする請求項９または１０に記載のキット。
【請求項１２】
被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、
配列番号２、４、６および８に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドの少なくとも１つに特異的に結合する抗体を備えることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の新規診断方法に関するものであり、特に胃癌および大腸癌における特定遺伝子の発現レベルを正常レベルと比較して癌の診断を行う方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、癌の診断には主として病理形態学的診断が用いられてきた。病理形態学的診断による病変の質的診断、広がりの程度、脈管内侵襲および断端浸潤の有無の判定は、後治療の選択・決定に不可欠である。しかし、良性と悪性の中間的な形態を示す病変はまれではなく、また、形態の変化では悪性度や予後の類推に限界がある。このような病理形態学的診断の弱点を補うために、分子生物学的解析が用いられており、様々な癌の分子マーカーが開発されている。
【０００３】
胃癌や大腸癌などの消化管癌のマーカーとして既に実用化されているものに癌胎児性抗原（carcino embryonic antigen、以下「ＣＥＡ」と略記する。）がある。ＣＥＡは血中から検出できる分子として消化管癌をはじめとする腺癌の診断に広く使用されているが、胃癌、大腸癌においては早期の癌を検出するのに不適切であり、さらに喫煙、肝硬変等でも血中から検出され、偽陽性も多いことが問題点として指摘されている（例えば、非特許文献１および非特許文献２参照）。
【０００４】
ＣＥＡ以外に臨床現場で利用されているマーカーとしてはＣＡ１９−９を挙げることができる。しかしながら、ＣＡ１９−９もＣＥＡと同様に胃癌、大腸癌においては早期癌の検出率は低い。また、いずれのマーカーも消化管癌に特異性の高いものではない。
【０００５】
一方、本発明者らが胃癌および大腸癌において高発現していることを見出した遺伝子は、Homo sapiens dickkopf homolog 4 (Xenopus laevis)をコードする遺伝子（以下「ＤＫＫ４」と略記する。）、Homo sapiens HORMA domain containing proteinをコードする遺伝子（以下「ＮＯＨＭＡ」と略記する。）、Homo sapiens cytochrome P450, family 2, subfamily W, polypeptide 1 をコードする遺伝子（以下「ＣＹＰ２Ｗ１」と略記する。）およびHomo sapiens APin proteinをコードする遺伝子（以下「ＡＰＩＮ」と略記する。）の４種類である。
【０００６】
ＤＫＫ４（GenBank Ac No. NM_014420）はＷｎｔシグナルを負に制御する遺伝子として１９９９年にクローニングされた。２９３Ｔ細胞に発現させると、細胞外に分泌されることが明らかとなっている。その他、癌との関連については全く分かっていない（非特許文献３参照）。
【０００７】
ＮＯＨＭＡ（GenBank Ac No. NM_032132）はＨＯＲＭＡドメインを有するタンパク質であり、１９９８年に同定された。ＨＯＲＭＡドメインはＨｏｐ１ＰＣＲ、Ｒｅｖ７ｐ、ＭＡＤ２に共通する。ＨＯＲＭＡドメインを有する分子はクロマチンと直接結合し、ＤＮＡ修復や細胞周期を制御する分子であることが想定されている。ＮＯＨＭＡについてはＨＯＲＭＡドメインを有する分子であること以外、何も分かっていない（非特許文献４参照）。
【０００８】
ＣＹＰ２Ｗ１（GenBank Ac No. NM_017781）は、２００２年に１５０００種類のヒトおよびマウスのｃＤＮＡ全長が新規に同定された中の１つである。塩基配列から、シトクロムＰ４５０遺伝子群の１つと想定されているが、詳細については全くわかっていない（非特許文献５参照）。シトクロムＰ４５０は薬物代謝酵素として、多くのファミリーが知られている。
【０００９】
ＡＰＩＮ（GenBank Ac No. NM_017855）は、calcifying epithelial odontogenic tumorにおけるアミロイド沈着の構成分子として同定された。癌細胞における意義については全く不明である（非特許文献６参照）。
【非特許文献１】Horie Y, Miura K, Matsui K, Yukimasa A, Ohi S, Hamamoto T, Kawasaki H. Marked elevation of plasma carcinoembryonic antigen and stomach carcinoma. Cancer.;77(10):1991-7 (1996).
【非特許文献２】Molnar IG, Vandevoorde JP, Gitnick GL. CEA levels in fluids bathing gastrointestinal tumors. Gastroenterology.;70(4):513-5 (1976).
【非特許文献３】Krupnik VE, Sharp JD, Jiang C, Robison K, Chickering TW, Amaravadi L, Brown DE, Guyot D, Mays G, Leiby K, Chang B, Duong T, Goodearl AD, Gearing DP, Sokol SY, McCarthy SA. Functional and structural diversity of the human Dickkopf gene family. Gene 238(2), 301-13 (1999).
【非特許文献４】Aravind L, Koonin EV. The HORMA domain: a common structural denominator in mitotic checkpoints, chromosome synapsis and DNA repair. Trends Biochem Sci 23(8), 284-6 (1998).
【非特許文献５】Strausberg RL, Feingold EA, Grouse LH, Derge JG, Klausner RD, Collins FS, Wagner L, Shenmen CM, Schuler GD, Altschul SF, Zeeberg B, Buetow KH, Schaefer CF, Bhat NK, Hopkins RF, Jordan H, Moore T, Max SI, Wang J, Hsieh F, Diatchenko L, Marusina K, Farmer AA, Rubin GM, Hong L, Stapleton M, Soares MB, Bonaldo MF, Casavant TL, Scheetz TE, Brownstein MJ, Usdin TB, Toshiyuki S, Carninci P, Prange C, Raha SS, Loquellano NA, Peters GJ, Abramson RD, Mullahy SJ, Bosak SA, McEwan PJ, McKernan KJ, Malek JA, Gunaratne PH, Richards S, Worley KC, Hale S, Garcia AM, Gay LJ, Hulyk SW, Villalon DK, Muzny DM, Sodergren EJ, Lu X, Gibbs RA, Fahey J, Helton E, Ketteman M, Madan A, Rodrigues S, Sanchez A, Whiting M, Madan A, Young AC, Shevchenko Y, Bouffard GG, Blakesley RW, Touchman JW, Green ED, Dickson MC, Rodriguez AC, Grimwood J, Schmutz J, Myers RM, Butterfield YS, Krzywinski MI, Skalska U, Smailus DE, Schnerch A, Schein JE, Jones SJ, Marra MA; Mammalian Gene Collection Program Team. Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences. Proc Natl Acad Sci U S A 99(26), 16899-903 (2002).
【非特許文献６】Solomon A, Murphy CL, Weaver K, Weiss DT, Hrncic R, Eulitz M, Donnell RL, Sletten K, Westermark G, Westermark P. Calcifying epithelial odontogenic (Pindborg) tumor-associated amyloid consists of a novel human protein. J Lab Clin Med. 142(5), 348-55 (2003).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のように、実用化されている腫瘍マーカーは胃癌および大腸癌に特異性が高いものではなく、擬陽性も多いという問題がある。また、早期癌の検出には不適切であることも指摘されている。それゆえ、胃癌および大腸癌の早期検出が可能な特異性の高い腫瘍マーカーの開発が強く望まれている。
【００１１】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、正常組織での発現レベルが極めて低く、胃癌、大腸癌などの消化管癌に特異性が高い腫瘍マーカーを見出し、これを用いた癌の新規診断方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために、手術により得られた胃癌組織において発現している遺伝子をＳＡＧＥ（Serial analysis of gene expression）法を用いて網羅的に解析し、正常組織における発現レベルと比較することにより、胃癌において特異的に発現レベルが高い遺伝子を同定した。さらに、本発明者らは、これらの遺伝子が大腸癌においても特異的に高レベルで発現していることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明に係る方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号１、３、５または７に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも１つのレベルを測定するポリヌクレオチド測定工程、および上記ポリヌクレオチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程
を包含することを特徴としている。上記ポリヌクレオチドは癌組織において高レベルで発現していることが本発明者らにより明らかにされている。それゆえ、被検体由来の試料において上記ポリヌクレオチドのレベルと正常レベルを比較することにより、簡易かつ客観的に当該被検体が癌を有しているか否かを診断することができる。
【００１４】
上記ポリヌクレオチド測定工程において、配列番号９ないし１６のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを少なくとも１つ使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは発明者らが実際に上記ポリヌクレオチドレベルを測定するために用いたポリヌクレオチドであり、本発明の方法に使用できることが確認されている。
【００１５】
また、本発明に係る方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号２、４、６または８に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドの少なくとも１つのレベルを測定するポリペプチド測定工程、および上記ポリペプチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含することを特徴としている。遺伝子の発現レベルを当該遺伝子がコードするポリペプチドレベルとして測定し、これを正常レベルと比較すれば、簡易かつ客観的に当該被検体が癌を有しているか否かを診断することができる。
【００１６】
上記ポリペプチド測定工程において、配列番号２、４、６または８に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドの少なくとも１つに特異的に結合する抗体を使用することができる。
【００１７】
なお、本発明の方法は胃癌または大腸癌の診断に用いることが好ましい。
【００１８】
本発明に係る器具は、被検体由来の試料を用いて癌を診断するための器具であって、配列番号１、３、５または７に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも１つと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドが支持体上に固定化されていることを特徴としている。上記支持体上に固定化されているポリヌクレオチドは配列番号９ないし１６のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも１つであることが好ましい。また、本発明に係る器具は配列番号２、４、６および８に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドの少なくとも１つに特異的に結合する抗体が支持体上に固定化されているものであってもよい。
【００１９】
上記構成の器具を用いることにより、上記本発明の方法を簡便に実施することができる。
【００２０】
本発明に係るキットは、被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号１、３、５または７に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドを備えることを特徴としている。上記ポリヌクレオチドは配列番号９ないし１６のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも１つであることが好ましい。また、上記ポリヌクレオチドはＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲのプライマーとして用いられることが好ましい。
【００２１】
本発明に係るキットは、配列番号２、４、６および８に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドの少なくとも１つに特異的に結合する抗体を備えるものであってもよい。
【００２２】
上記構成のキットを用いることにより、上記本発明の方法を簡便に実施することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る方法を使用することにより、癌を客観的な分子学的基準に基づき診断することができるという効果を奏する。例えば、病理形態学的診断が困難な癌について分子学的基準に基づく診断ができ、癌の機序解明に貢献できる。
【００２４】
また、従来のマーカーによる診断では擬陽性が多いことが問題となっているが、本発明に係る方法は特異性が高いので、擬陽性が少ないという効果を奏する。さらに、従来のマーカーでは早期癌の検出が困難であったが、本発明に係る方法を用いれば、早期癌を感度よく検出することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２６】
（１）癌を診断する方法
本発明者らは、手術により得られた早期胃癌１例を含む４例の胃癌組織において発現している遺伝子をＳＡＧＥ（Serial analysis of gene expression）法を用いて網羅的に解析し、正常組織における発現レベルと比較することにより、胃癌特異的遺伝子候補を同定した。さらに、これらの候補遺伝子について、手術により得られた早期胃癌３例を含む９例の胃癌組織（上記４例とは異なるもの）および９例の大腸癌組織における発現レベルを詳細に解析し、正常組織における発現レベルが低く、胃癌および大腸癌において発現レベルが高い４種類の遺伝子を特定した。
【００２７】
上記４遺伝子は、ＤＫＫ４、ＮＯＨＭＡ、ＣＹＰ２Ｗ１およびＡＰＩＮである。既に述べたように、これらの遺伝子はいずれもクローニングされており、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の塩基配列がＧｅｎＢａｎｋに登録されている（ＤＫＫ４：ＮＭ＿０１４４２０、ＮＯＨＭＡ：ＮＭ＿０３２１３２、ＣＹＰ２Ｗ１：ＮＭ＿０１７７８１、ＡＰＩＮ：ＮＭ＿０１７８５５）。しかしながら、上記４種類の遺伝子については、過去に癌特異的に発現レベルが高いとの報告はなく、上記４種類の遺伝子が正常組織において発現レベルが低く、かつ癌組織において発現レベルが高いという知見は本発明者らが初めて見出したものである。すなわち、上記４遺伝子は、癌特異的に発現レベルが高い遺伝子であり、当該遺伝子の転写産物および翻訳産物は腫瘍マーカーとして利用可能であることが明らかとなった。
【００２８】
配列番号１にはＤＫＫ４のｃＤＮＡの塩基配列が示されており、配列番号２にはＤＫＫ４がコードするタンパク質のアミノ酸配列が示されている。配列番号３にはＮＯＨＭＡのｃＤＮＡの塩基配列示されており、配列番号４にはＮＯＨＭＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列が示されている。配列番号５にはＣＹＰ２Ｗ１のｃＤＮＡの塩基配列が示されており、配列番号６にはＣＹＰ２Ｗ１がコードするタンパク質のアミノ酸配列が示されている。配列番号７にはＡＰＩＮのｃＤＮＡの塩基配列が示されており、配列番号８にはＡＰＩＮがコードするタンパク質のアミノ酸配列が示されている。
【００２９】
本発明の方法は、被検体由来の試料を用いて、当該試料における上記ＤＫＫ４、ＮＯＨＭＡ、ＣＹＰ２Ｗ１またはＡＰＩＮの少なくとも１つの発現レベルを測定し、このレベルを正常レベルと比較することにより癌を診断する方法である。
【００３０】
被検体は特に限定されるものではなく広く動物一般を含むが、ヒトであることが好ましい。被検体がヒトである場合、癌患者や癌を有する疑いのある患者のみでなく、健常人も被検体となり得る。
【００３１】
非検体由来の試料としては、非検体から得られるものであれば特に限定されない。例えば、血液、尿、糞便、喀痰、腹水、腹腔洗浄液、生検組織、外科的に切除された検体などを挙げることができる。
【００３２】
遺伝子の発現レベルは、その転写産物（ｍＲＮＡ）量、またはその翻訳産物（タンパク質）量を測定することにより決定することができる。
【００３３】
正常レベルとは、正常健康個体（健常人）における同一遺伝子の発現レベルを意味する。正常レベルは、比較する非検体由来の試料と同一の正常細胞、組織、体液を試料として用いて測定されたものであることが好ましい。また、正常レベルは正常健康個体集団の平均レベルを用いることがより好ましい。
【００３４】
癌を診断するとは、被検体が癌を有しているか否かの判定を行うことを意味する。
【００３５】
また、診断の対象となる癌の種類は特に限定されるものではないが、消化管癌であることが好ましく、胃癌または大腸癌であることが特に好ましい。
【００３６】
一実施形態において、本発明の方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号１、３、５または７に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも１つのレベルを測定するポリヌクレオチド測定工程、および上記ポリヌクレオチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含するものであればよい。なお、ポリヌクレオチドにはＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。
【００３７】
本実施形態では、ポリヌクレオチド測定工程において、上記４遺伝子、すなわちＤＫＫ４、ＮＯＨＭＡ、ＣＹＰ２Ｗ１またはＡＰＩＮの少なくとも１つのｍＲＮＡレベルを測定すればよい。
【００３８】
ｍＲＮＡレベルを測定する方法としては、特定のｍＲＮＡレベルを測定できる方法であれば特に限定されず、公知の方法から適宜選択して用いることができる。例えば、上記４遺伝子のいずれかのｍＲＮＡもしくはそのｃＤＮＡの塩基配列またはそれらの相補塩基配列の一部からなるポリヌクレオチドであって、上記４遺伝子のいずれかのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに部位特異的に結合（ハイブリダイズ）するポリヌクレオチドを含むプライマーやプローブを用いた方法が挙げられる。上記プライマーやプローブは、上記４遺伝子のいずれかのｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡと部位特異的塩基対を形成するものであれば、ｍＲＮＡを測定・検出するための様々な修飾がされたものであってよい。
【００３９】
上記プライマーおよび／またはプローブとして使用するポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号９〜１６のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。これらのポリヌクレオチドは、本発明者らが実際にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した際に用いたプライマーであり、目的のｍＲＮＡを特異的に増幅させるものであることが実証されている。具体的には、配列番号９および配列番号１０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを組み合わせたプライマーセットを用いることによりＤＫＫ４を増幅することができ、配列番号１１および配列番号１２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを組み合わせたプライマーセットを用いることによりＮＯＨＭＡを増幅することができ、配列番号１３および配列番号１４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを組み合わせたプライマーセットを用いることによりＣＹＰ２Ｗ１を増幅することができ、配列番号１５および配列番号１６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを組み合わせたプライマーセットを用いることによりＡＰＩＮを増幅することができる。なお、目的のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を特異的に増幅させるプライマーとして利用可能なポリヌクレオチドは当該ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を特異的に検出するためのプローブとして使用可能であることは当業者にとって周知である。
【００４０】
上述のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに部位特異的に結合するポリヌクレオチドを含むプライマーやプローブを用いてｍＲＮＡを測定する公知の方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、コンペティティブＰＣＲ法、ｉｎ  Ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法、ｉｎ  Ｓｉｔｕ  ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法などを挙げることができる。
【００４１】
例えば、上記ＲＴ−ＰＣＲ法は、試料から調製したトータルＲＮＡやｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型に目的領域をＰＣＲで増幅する方法である。さらに、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、ｃＤＮＡを鋳型に目的領域をＰＣＲ増幅する際に、リアルタイムモニタリング用試薬を用いて増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングし、解析する方法である。リアルタイムモニタリング試薬としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）Ｇｒｅｅｎや、ＴａｑＭａｎ（登録商標：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）プローブ等が挙げられる。
【００４２】
例えば、上記ＤＮＡアレイ法は、支持体上にＤＫＫ４、ＮＯＨＭＡ、ＣＹＰ２Ｗ１またはＡＰＩＮの少なくとも１つのｃＤＮＡまたはその部分配列が固定化し、試料から調製したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとインキュベートする。この際、上記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを蛍光標識等することにより、支持体上に固定化したＤＮＡと試料から調製したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出し、試料中のｍＲＮＡレベルを測定することができる。
【００４３】
上記比較工程においては、ポリヌクレオチド測定工程において測定した試料中のｍＲＮＡレベルを正常レベルと比較すればよい。正常レベルは、上述のように、比較する非検体由来の試料と同一の正常細胞、組織、体液を試料として用いて、同一の方法で測定されたものであることが好ましい。正常レベルは正常健康個体由来の試料を同時に測定してもよく、背景データとして蓄積されているデータを用いてもよい。被検体由来の試料におけるｍＲＮＡレベルが正常レベルより高い場合に、被検体は癌を有していると判定することが可能である。正常レベルより高い場合とは、少なくとも２倍高いレベルであり、好ましくは５倍高いレベルである。
【００４４】
他の実施形態において、本発明の方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号２、４、６または８に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドの少なくとも１つのレベルを測定するポリペプチド測定工程、および上記ポリペプチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含するものであればよい。
【００４５】
すなわち、本実施形態では、ポリペプチド測定工程において、ＤＫＫ４、ＮＯＨＭＡ、ＣＹＰ２Ｗ１またはＡＰＩＮの少なくとも１つがコードするタンパク質レベルを測定すればよい。
【００４６】
タンパク質の発現レベルを測定する方法としては、特定のタンパク質レベルを測定できる方法であれば特に限定されず、公知の方法から適宜選択して用いることができる。例えば、上記４遺伝子の少なくとも１つがコードするタンパク質に特異的に結合する抗体を使用する方法を挙げることができる。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等）でもよい。
【００４７】
抗体を用いてタンパク質レベルを測定する公知の方法としては、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ法（固相酵素免疫検定法）、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫組織化学法、抗体アレイ法などを挙げることができる。これらの中でも、より感度がよく、簡便という点から、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【００４８】
上記比較工程においては、ポリペプチド測定工程において測定した試料中のタンパク質レベルを正常レベルと比較すればよい。正常レベルは、上述のように、比較する非検体由来の試料と同一の正常細胞、組織、体液を試料として用いて、同一の方法で測定されたものであることが好ましい。正常レベルは正常健康個体由来の試料を同時に測定してもよく、背景データとして蓄積されているデータを用いてもよい。被検体由来の試料におけるタンパク質レベルが正常レベルより高い場合に、被検体は癌を有していると判定することが可能である。正常レベルより高い場合とは、少なくとも２倍高いレベルであり、好ましくは５倍高いレベルである。
【００４９】
（２）癌を診断するための器具
本発明に係る器具は、被検体由来の試料を用いて癌を診断するための器具であって、配列番号１、３、５または７に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも１つと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドが支持体上に固定化されている器具であればよい。より具体的には、ＤＫＫ４、ＮＯＨＭＡ、ＣＹＰ２Ｗ１またはＡＰＩＮのいずれかのｍＲＮＡもしくはそのｃＤＮＡの塩基配列またはそれらの相補塩基配列の一部からなるポリヌクレオチドであって、上記４遺伝子のいずれかのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドが支持体上に固定化されたＤＮＡアレイ（ＤＮＡチップ）が挙げられる。
【００５０】
上記支持体上に固定化されるポリヌクレオチドは上記４遺伝子のいずれかのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されるものではない。例えば、配列番号９〜１６のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。これらのポリヌクレオチドは、本発明者らが目的のｍＲＮＡを特異的に増幅させるプライマーとして使用したポリヌクレオチドであり、当該ｍＲＮＡを特異的に検出するためのプローブとして使用可能であることは当業者にとって周知である。なお、上記４遺伝子のいずれかのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドが支持体上に固定化されているものであれば、これら以外のポリヌクレオチドが同じ支持体上に固定化されているものであってもよい。
【００５１】
支持体としては、ポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に限定されるものではなく、どのような形状や材質であってもよい。支持体の材料としては、一般的には、例えば、ガラス、シリコンウエハ等の無機系材料、紙等の天然高分子、ニトロセルロースやナイロン等の合成高分子、合成高分子や天然高分子を用いたゲル体等を挙げることができる。
【００５２】
上記本発明に係る器具は、公知のＤＮＡアレイ作製方法を用いて作製することができる。例えば、ｃＤＮＡ（全長配列または部分配列）からなるポリヌクレオチド溶液を調製し、スポッター等により支持体上にスポットして固定化すればｃＤＮＡアレイを作製することができる。固定化するポリヌクレオチドはｃＤＮＡの塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドでもよい。また、基板上でＤＮＡを合成する、いわゆるアフィメトリクス型のＤＮＡチップ技術を用いることも可能である。
【００５３】
遺伝子の発現を検出するために設計された公知の手法は、上記本発明に係る器具に好適に応用することができる。例えば、試料は細胞や組織のトータルＲＮＡやｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡやｃＲＮＡを用いることができる。より具体的には、ｃＤＮＡやｃＲＮＡを蛍光標識しておき、支持体上に固定化されたポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、そのハイブリダイゼーションの強度を蛍光を指標に測定することにより遺伝子の発現量を評価することができる。また、２種類の試料から調製したｃＤＮＡやｃＲＮＡをそれぞれ異なる色を発する蛍光物質で標識し、同一の支持体上のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせれば、その色調と蛍光強度を測定することにより、遺伝子発現の差異を評価することができる。
【００５４】
また、他の実施形態において、本発明に係る器具は、被検体由来の試料を用いて癌を診断するための器具であって、配列番号２、４、６および８に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドの少なくとも１つに特異的に結合する抗体が支持体上に固定化されている器具であればよい。より具体的には、ＤＫＫ４、ＮＯＨＭＡ、ＣＹＰ２Ｗ１またはＡＰＩＮの少なくとも１つがコードするタンパク質に特異的に結合する抗体が支持体上に固定化された抗体アレイまたはＥＬＩＳＡ用プレートが挙げられる。なお、上記４遺伝子の少なくとも１つがコードするタンパク質に特異的に結合する抗体が支持体上に固定化されているものであれば、これら以外の抗体が同じ支持体上に固定化されているものであってもよい。
【００５５】
支持体としては、抗体、すなわちタンパク質を固定化できるものであれば特に限定されるものではなく、どのような形状や材質であってもよい。支持体の材料としては、一般的には、例えば、ガラス、シリコンウエハ等の無機系材料、紙等の天然高分子、ニトロセルロース、ナイロン、ポリスチレン等の合成高分子、合成高分子や天然高分子を用いたゲル体等を挙げることができる。
【００５６】
抗体を用いてタンパク質（ポリペプチド）を検出するために設計された公知の手法は、上記本発明に係る器具に好適に応用することができる。例えば、サイファージェン・バイオシステムズ社より、プロテインチップの１種類としてバイオロジカルチップが販売されている。これは基板（支持体）の表面にカルボニルジイミダゾールまたはエポキシの活性基を持つもので、ユーザーが自由に目的のタンパク質や抗体を固定化して使用するものである。上記本発明に係る器具の作製にこれを応用することが可能である。
【００５７】
（３）キット
本発明に係るキットは、被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号１、３、５または７に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドを備えるものであればよい。配列番号１、３、５または７に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、ＤＫＫ４、ＮＯＨＭＡ、ＣＹＰ２Ｗ１またはＡＰＩＮの少なくとも１つのｍＲＮＡを測定するために使用するプライマー、プローブを挙げることができる。
【００５８】
また、本発明に係るキットは、被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号２、４、６および８に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドの少なくとも１つに特異的に結合する抗体を備えるものでもよい。
【００５９】
一実施形態として、本キットはＲＴ−ＰＣＲ用キットまたはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用キットを構成することができる。また、ユーザーの選択によりＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの何れかを選択できるキットとすることもできる。キットにはＤＫＫ４を増幅するためのプライマーセット、ＮＯＨＭＡを増幅するためのプライマーセット、ＣＹＰ２Ｗ１を増幅するためのプライマーセット、ＡＰＩＮを増幅するためのプライマーセットの少なくともいずれかが備えられていることが好ましい。４種類のプライマーセットがすべて備えられていることが特に好ましい。
【００６０】
上記プライマーセット以外のキットの構成品は特に限定されないが、例えば、組織または細胞からＲＮＡを調製するための試薬、逆転写酵素、逆転写反応に用いる緩衝液、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ用試薬、リアルタイムＰＣＲ用試薬、ＰＣＲ用チューブ、ＰＣＲ用プレートなどを備えていることが好ましい。また、上記プライマーセットに加えて、上記以外のプライマーセットが含まれていてもよい。
【００６１】
他の実施形態として、本キットはＤＮＡアレイ用キットを構成することができる。当該キットには上記本発明に係る器具（ＤＮＡアレイ）が備えられていることが好ましい。ＤＮＡアレイ以外のキットの構成品は特に限定されないが、例えば、組織または細胞からＲＮＡを調製するための試薬、逆転写酵素、逆転写反応に用いる緩衝液、ｃＤＮＡを蛍光標識するための試薬、ハイブリダイゼーション用試薬などを備えていることが好ましい。
【００６２】
さらに他の実施形態として、本キットはＥＬＩＳＡ用キットを構成することができる。キットには、ＤＫＫ４コードするタンパク質に特異的に結合する抗体、ＮＯＨＭＡコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、ＣＹＰ２Ｗ１コードするタンパク質に特異的に結合する抗体、ＡＰＩＮコードするタンパク質に特異的に結合する抗体の少なくとも１つが備えられていることが好ましい。４種類の抗体がすべて備えられていることが特に好ましい。また、上記抗体は、予めＥＬＩＳＡ用プレートに固定化（固相化）された状態でキットに含まれていることが好ましい。
【００６３】
上記ＥＬＩＳＡ用プレート以外のキットの構成品は特に限定されないが、例えば、標識された二次抗体、発色用試薬、洗浄用緩衝液などを備えていることが好ましい。また、上記抗体に加えて、他のタンパク質に対する抗体が含まれていてもよい。
【００６４】
なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、核酸の抽出、切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、等一般の遺伝子組換えに必要な方法は、特に記載のない限り、各操作に使用する市販の試薬、機器装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd Ed（Sambrookら(2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press）」）に基本的に従った。
【００６６】
（１）ＳＡＧＥ法による胃癌特異的遺伝子候補の同定
広島大学病院で外科的に切除された早期胃癌１例（Ｗ２２６Ｔ）、進行胃癌３例（Ｗ２４６Ｔ、Ｓ２１９Ｔ、Ｐ２０８Ｔ）について、ＳＡＧＥ法を用いて遺伝子発現を網羅的に解析した。
【００６７】
すなわち、各癌組織から調製したｍＲＮＡ（５μｇ）を材料として、ビオチンラベルされたオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応を行い、first strandおよびsecond strandを合成した。次に、ＣＡＴＧを認識して切断する制限酵素NlaIIIで切断し、アビジンをコートしたマグネットビーズを用いて３’側のフラグメントを回収した。ライゲースによりリンカーを結合させた後、ＣＡＴＧから３’側に１０〜１２塩基を認識して切断する制限酵素BsmFIで切断し、アビジンをコートしたマグネットビーズを用いて５’側のフラグメントを回収した。得られたフラグメントをライゲースを用いて２分子結合させ、これを鋳型としてリンカーの塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行い増幅させた。
【００６８】
増幅産物をゲルで精製した後、ライゲースによりフラグメントをいくつも直列に結合させた。電気泳動により５００ｂｐ以上のフラグメントを回収し、pZeroに組み込んで大腸菌ＤＨ１０Ｂにトランスフォームした。抗生物質ゼオシンを含むＬＢ培地で大腸菌を培養し、生育したコロニーからプラスミドを抽出して、組み込まれたフラグメントの塩基配列を決定した。塩基配列情報をＳＡＧＥ２０００ソフトウェアを用いて遺伝子発現情報に変換した。
【００６９】
上記４例の胃癌組織から得られた合計約１万クローンの解析から約１４万タグが得られ、多数の癌関連遺伝子を新規に同定した。
【００７０】
胃癌に特異的に発現している遺伝子を同定するため、ＮＣＢＩ（米国国立バイオテクノロジーインフォメーションセンター）のＳＡＧＥデータベースである「ＳＡＧＥｍａｐ」で利用可能な１２種類の全身正常組織（大脳白質、小脳、視床、腎臓、白血球、結腸、胃、心臓、肝臓、肺、脊髄、腹膜）のＳＡＧＥライブラリーと、上記４例の胃癌のＳＡＧＥライブラリーとをコンピュータ上で比較した。
【００７１】
すなわち、上記１２種類の全身正常組織のＳＡＧＥライブラリーをＳＡＧＥｍａｐからダウンロードし、ＳＡＧＥ２０００ソフトウェア上で、１２種類の全身正常組織を合わせた遺伝子発現情報と、上記４例の各胃癌の遺伝子発現情報とを順次比較した。この作業により、胃癌のみで発現しており、かつ、胃癌で３回以上発現しているタグを選択した。その結果、Ｗ２２６Ｔから２４種類、Ｗ２４６Ｔから１５種類、Ｓ２１９Ｔから２７種類、Ｐ２０８Ｔから１３種類、合計５４種類（２５種類は重複）のタグが選択され、これらを胃癌特異的遺伝子の候補として同定した。
【００７２】
（２）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法による発現量の測定
上記５４種類の候補遺伝子について、胃癌特異的遺伝子であるか否かをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を用いて詳細に検討した。
【００７３】
試料として、広島大学病院で外科的に切除された早期胃癌３例を含む９例の原発性胃癌を用いた。正常組織としては、クロンテックより購入した１４種類の正常組織Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（肝臓（カタログ番号636531）、腎臓（カタログ番号636529）、心臓（カタログ番号636532）、結腸（カタログ番号636553）、大脳（カタログ番号636530）、骨髄（カタログ番号636548）、骨格筋（カタログ番号636534）、肺（カタログ番号636524）、小腸（カタログ番号636539）、脾臓（カタログ番号636525）、脊髄（カタログ番号636554）、胃（カタログ番号636578）、膵臓（カタログ番号636577）、白血球（カタログ番号636580））を用いた。
【００７４】
上記９例の各胃癌組織から抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡおよび上記購入した各正常組織のＴｏｔａｌ  ＲＮＡから定法にしたがってｃＤＮＡを合成した。また、胃癌特異的遺伝子の候補遺伝子５４種類について、個々の遺伝子の特異的プライマーを設計した。上記ｃＤＮＡを鋳型とし、上記特異的プライマーを用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、アプライドバイオシステムズ社製のABI PRISM 7700 Sequence Detection System上で、SYBR Green PCR Core Reagents Kitを用いて行った。
【００７５】
反応液の組成は、10×SYBR(R) Green PCR Buffer:5μL、25mM MgCl2 Solution:6μL、12.5mM dNTP Mix:4μL、5U/μL Ampli Taq GoldTM:0.25μL、1U/μL AmpErase(R):0.5μL、Forward primer:0.5μL、Reverse primer:0.5μL、Sample（各組織由来のcDNA）:1μLおよび滅菌蒸留水:32.25μLとした。なお、primer、Sampleおよび滅菌蒸留水以外はすべて上記SYBR Green PCR Core Reagents Kitに付属のものである。反応条件は、50℃/2分、95℃/10分に引き続き、95℃/15秒および60℃/1分の反応を40サイクル行った。
【００７６】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果、１４種類の正常組織で最も発現の高かった組織の遺伝子発現量と、９例の胃癌組織で最も発現が高かった症例の遺伝子発現量の比率を、候補遺伝子５４種類について計算し、比率が１０以上である遺伝子を胃癌特異的遺伝子とした。これらの条件を満たす遺伝子のうち、癌特異性に関する文献がない遺伝子という条件を加え、ＤＫＫ４、ＮＯＨＭＡ、ＣＹＰ２Ｗ１およびＡＰＩＮの４遺伝子を選択した。
【００７７】
ここで、上記リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーは以下のとおりである。
(1)ＤＫＫ４増幅用プライマーセット
Forward  5' CGCGATGAGAAGCCGTTC 3'  （配列番号９）
Reverse  5' GCATCTCGCTGGCACCTC 3'  （配列番号１０）
(2)ＮＯＨＭＡ増幅用プライマーセット
Forward  5' AAATCCTGAGGGACAAAGATGTAGA 3'  （配列番号１１）
Reverse  5' TTTTTCCTGTTCTTCCATTTTAGTTTC 3'  （配列番号１２）
(3)ＣＹＰ２Ｗ１増幅用プライマーセット
Forward  5' AAATGGAAACACTGACCCGG 3'  （配列番号１３）
Reverse  5' GTGATTCGCCTGCCTCGGCC 3'  （配列番号１４）
(4)ＡＰＩＮ増幅用プライマーセット
Forward  5' TGCAGGAGTTTTCATGCCC 3'  （配列番号１５）
Reverse  5' TTGGTCTACAGCAGAAGTGAAAACA 3'  （配列番号１６）
上記ＤＫＫ４、ＮＯＨＭＡ、ＣＹＰ２Ｗ１およびＡＰＩＮの４遺伝子について、大腸癌における発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で測定した。試料として広島大学病院で外科的に切除された大腸癌９例を用いた以外は、上記胃癌における手順と同一の手順でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００７８】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した遺伝子発現量を図１〜図４に示した。図１はＤＫＫ４、図２はＮＯＨＭＡ、図３はＣＹＰ２Ｗ１、図４はＡＰＩＮの正常組織、胃癌組織および大腸癌組織における発現量を示している。発現量は正常胃における発現量を１として相対的発現量を計算して表した。
【００７９】
図１〜図４から明らかなように、ＤＫＫ４、ＮＯＨＭＡ、ＣＹＰ２Ｗ１およびＡＰＩＮの４遺伝子については、正常組織で最も発現が高かったものの発現量と比較して、胃癌組織で最も発現量が高かった症例の発現量は１０倍以上であった。また、正常組織で最も発現が高かったものの発現量と比較して、大腸癌組織で最も発現量が高かった症例の発現量も１０倍以上であり、大腸癌特異的な遺伝子であることも確認された。
【００８０】
一方、正常組織で最も発現が高かったものの発現量と比較して、胃癌組織で最も発現量が高かった症例の発現量が１０倍以上でなかったため、胃癌特異的遺伝子から除外した代表的な４遺伝子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ結果を図５〜図８に示した。図５はＩＦＲＤ１、図６はＩＬ１６、図７はＫＩＦ４Ａ、図８はＬＭＯ６の正常組織および胃癌組織における発現量を示している。
【００８１】
図５〜図８から明らかなように、これらの遺伝子についてはそれぞれ特定の正常組織において発現量が高く、胃癌特異的遺伝子から除外した。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明は癌の診断に用いるものであり、臨床検査薬産業、試薬産業、医療機器産業等において利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】正常組織、胃癌および大腸癌におけるＤＫＫ４の発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定した結果を示すグラフである。
【図２】正常組織、胃癌および大腸癌におけるＮＯＨＭＡの発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定した結果を示すグラフである。
【図３】正常組織、胃癌および大腸癌におけるＣＹＰ２Ｗ１の発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定した結果を示すグラフである。
【図４】正常組織、胃癌および大腸癌におけるＡＰＩＮの発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定した結果を示すグラフである。
【図５】正常組織および胃癌におけるＩＦＲＤ１の発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定した結果を示すグラフである。
【図６】正常組織および胃癌におけるＩＬ１６の発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定した結果を示すグラフである。
【図７】正常組織および胃癌におけるＫＩＦ４Ａの発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定した結果を示すグラフである。
【図８】正常組織および胃癌におけるＬＭＯ６の発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2006166789.tif 000009
【図８】
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【配列表】
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