(57)【要約】【課題】  高いクロロフィル及びカロテノイド含量を有し、色調及び生理活性の優れたクロレラの製造法の提供。【解決手段】  （１）有機炭素源を含有する培地で、クロレラを従属栄養的に培養する工程、及び（２）該従属栄養的に培養したクロレラを、有機炭素源を含有しない培地で培養する工程、を含む同調培養方法による、高クロロフィル及び高カロテノイド含有性のクロレラの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）有機炭素源を含有する培地で、クロレラを従属栄養的に培養する工程、及び（２）該従属栄養的に培養したクロレラを、有機炭素源を含まない培地で培養する工程、を含む同調培養方法による、高クロロフィル及び高カロテノイド含有性のクロレラの製造方法。
【請求項２】
クロレラがクロレラ・レギュラリス（Chlorella regularis）又はクロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
（１）有機炭素源を含有する培地で、クロレラを従属栄養的に培養する工程の培地中の酸素濃度が、３．０mmol Ｏ2ｇ-1ｈ-1以上であり、（２）該従属栄養的に培養したクロレラを、有機炭素源を含まない培地で培養する工程の培地中の酸素濃度が、２．０mmol Ｏ2ｇ-1ｈ-1以上である、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
（１）有機炭素源を含有する培地で、クロレラを従属栄養的に培養する工程、及び（２）該従属栄養的に培養したクロレラを、有機炭素源を含有しない培地で培養する工程、を含む同調培養方法により得られる、乾燥藻体当りクロロフィル含量が２０mg／ｇ以上かつ総カロテノイド含量が３mg／ｇ以上である高クロロフィル及び高カロテノイド含有性のクロレラ。
【請求項５】
クロレラがクロレラ・レギュラリス（Chlorella regularis）又はクロレラ・ソロキニアナ（chlorella sorokiniana）である請求項４記載の高クロロフィル及び高カロテノイド含有性のクロレラ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
高いクロロフィル及びカロテノイド含量を有し、色調、生理活性等の優れたクロレラ、及びその効率的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロレラは、クロロコックム目、オオシステス科、クロレラ属に分類される直径５〜１０μmの球状の淡水性単細胞緑藻である。その藻体中には必須アミノ酸を多く含む良質のタンパク質、ビタミン類及びミネラル類が含有されており、健康食品、食品素材、養殖魚の餌料等の素材として広く利用されている。クロレラは光合成により独立栄養的に増殖するのみならず、有機炭素源を利用し従属栄養的にも増殖することができる。通常、独立栄養的培養方法は屋外の開放培養池において行われているので、天候や気温等の要因がクロレラの増殖に直接影響する。
【０００３】
そのため、独立栄養的培養方法はクロレラの培養に好ましい条件を維持するのが困難であり、その収穫量や品質が不安定である。また、解放系で培養されることから、雑菌汚染があり健康食品や食品素材等に利用することは好ましくない。一方、従属栄養的培養は密閉されたタンク内で行われるため培養条件をコントロールし易く、収穫量、品質等も安定で雑菌等による汚染がない。この培養方法は光照射を必要とせず、高密度で衛生的なクロレラを製造できる優れた方法である。このため、クロレラの製造方法は従属栄養的培養が増えてきている。
【０００４】
しかしながら、この方法では太陽光による誘導がないため、色素類（クロロフィルやカロテノイド等）の含量が独立栄養的培養のクロレラに比べて低いという欠点を有している。実際、開放池で光合成により増殖したクロレラのクロロフィル含量は環境条件が良いと３０mg／ｇを超えるものがあるのに対して、密閉されたタンク内で従属栄養的に培養されたものでは、含量が高いものでも２５mg／ｇ程度である。また、総カロテノイド含量も４．０mg／ｇ程度である。
【０００５】
このような従属栄養的培養の欠点を克服するために、培養液の溶存酸素濃度、pH等を所定の範囲内にとどめ、グルコース及びアミノ酸類を添加することでクロレラ中のクロロフィル含量を高める技術が開示されている（特許文献１）。しかしながら、この発明においては、アミノ酸等の添加も行われるためコストがかかるという問題があった。
【０００６】
また、紫外線照射や突然変異剤投与等を行うことにより、β−カロチンを高濃度に含有し抗酸化活性を有するクロレラ変異株が開示され（特許文献２）、従属栄養的培養において増殖能を有するクロレラに紫外線照射を行うことにより、高いクロロフィル含量を有するに至ったクロレラ変異株が開示されている（特許文献３）。しかしながら、これらの変異株においてもそのクロロフィル及びカロテノイド含量の両方は高められていなかった。
【特許文献１】特公昭５８−４０４６２号公報
【特許文献２】特開平６−１５３９８６号公報
【特許文献３】特開平７−２５５４６３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
通常、クロレラは色素含量、タンパク質含量、ＣＧＦ（Chlorella Growth Factor）含量が高い程、高品質であるとされている。特に、クロレラは緑黄色野菜の代替となる健康食品として主に利用されるためクロロフィルやカロテノイド含量が高いことは最も重要である。クロロフィルやカロテノイドには抗酸化活性、変異原吸着活性、プロビタミン活性等が報告されている。従って、本発明の課題は、従属栄養的培養方法で得られたクロレラにおいても、高いクロロフィル及びカロテノイド含量を有し、色調、生理活性等の優れたクロレラ、及びその効率的な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意研究の結果、従属栄養的培養方法においても、（１）有機炭素源を含有する培地で、クロレラを従属栄養的に培養する工程、及び（２）該従属栄養的に培養したクロレラを、有機炭素源を含まない培地で培養する工程を組み合わせた同調培養方法により、独立栄養的培養方法にて得られるクロレラと同等あるいはそれ以上のクロロフィル含量及びカロテノイド含量を有するクロレラが効率良く得られることを見出し本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、（１）有機炭素源を含有する培地で、クロレラを従属栄養的に培養する工程、及び（２）該従属栄養的に培養したクロレラを、有機炭素源を含まない培地で培養する工程を組み合わせて、同調的に培養することにより、高クロロフィル及び高カロテノイド含有性のクロレラの製造方法を提供するものである。
【００１０】
また本発明は、（１）有機炭素源を含有する培地で、クロレラを従属栄養的に培養する工程、及び（２）該従属栄養的に培養したクロレラを、有機炭素源を含まない培地で培養する工程を組み合わせた同調培養方法により得られる、乾燥藻体当りクロロフィル含量が３０mg／ｇ以上かつ総カロテノイド含量が６．０mg／ｇ以上である高クロロフィル及び高カロテノイド含有性のクロレラを提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
高いクロロフィル及びカロテノイド含量を有し、色調、生理活性等の優れたクロレラを、安定して効率良く提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のクロレラの製造方法は、（１）有機炭素源を含有する培地で、クロレラを従属栄養的に培養する工程（以下、これを「工程１」と略称することがある。）、及び（２）該従属栄養的に培養したクロレラを、有機炭素源を含まない培地で培養する工程（以下、これを「工程２」と略称することがある。）を含む一連の操作からなる。本操作により、培養物は本質的に同調培養、すなわち、培養物中の細胞の相当部分が同時に細胞周期に入り、同様の時間と速度で増殖する状態になる。工程１において細胞分裂を伴うことなく同調的に生長した細胞（母細胞）は、工程２において、同調的に細胞分裂し、娘細胞を与えるが、該娘細胞は、その母細胞に比して、細胞中のクロロフィル及びカロテノイド含量が高いことから、同調培養により得られる娘細胞を収穫することにより、生産性よく高クロロフィル及び高カロテノイド含有性のクロレラを製造することができる。なお、工程１及び工程２を含む同調培養の操作は、繰り返し行ってもよい。
【００１３】
以下、有機炭素源を含有する培地で、クロレラを従属栄養的に培養する工程（工程１）について説明する。
【００１４】
本発明の製造方法に使用する、クロレラとしては、クロレラ属に属するものであれば特に問題はなく、例えばクロレラ・レギュラリス（Chlorella regularis）、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsidea）、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）及びこれらの変異株等が挙げられる。これらの中でも工業的に生産されており、安全性が確認されているクロレラ・レギュラリス、クロレラ・ソロキニアナが好ましく、これらを変異処理して得られる株を用いても良い。また、本発明の製造方法に使用する前記クロレラは、予め工程（１）と工程（２）を繰り返し行うことにより得られる細胞周期が同調したものを用いるのが好ましい。
【００１５】
工程１の従属栄養的培養方法としては、公知の方法を採用することができ、例えば、リン、カリウム、マグネシウム等の多種類の元素を含む無機塩培地に、有機炭素源と、硝酸塩、アンモニア、アンモニウム塩、尿素等の窒素等を添加し、暗所、pH５．５〜７．５、２８〜３８℃の条件下で、振とう又は撹拌することにより好気的に行うことができる。
【００１６】
有機炭素源としては、例えばグルコース、果糖、ガラクトース等の糖類；酢酸、ピルビン酸、アミノ酸、ペプチド、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸等の有機酸；エタノール等のアルコール等が挙げられる。これらの中でも、グルコースが特に好ましい。
【００１７】
工程１において、有機炭素源として、グルコース等の糖類を使用する場合、培地中のグルコース濃度は、０．２〜３０ｇＬ-1の範囲であるのが好ましく、０．５〜１０ｇＬ-1の範囲であるのがより好ましい。グルコース濃度が、０．２ｇＬ-1未満、又は３０ｇＬ-1を超える場合は、クロレラの比増殖速度が低下し好ましくない。培地中のグルコース濃度の制御は、培地中に必要量のグルコース等の糖類を添加することにより行うが、例えばグルコース分析器を使用して、培地中のグルコース濃度を経時的に分析し、コンピュータ制御により、培地中のグルコース濃度の減少に応答して培地中に必要量のグルコースを添加する方法等を用いるのが好ましい。
【００１８】
また、酢酸等の有機酸の濃度は０．１〜２ｇＬ-1が好ましく、エタノール等のアルコールの濃度は０．１〜２ｇＬ-1が好ましい。なお、酢酸やエタノールは２ｇＬ-1を超えると細胞の成長が阻害されるため好ましくない。
【００１９】
工程１の培養における酸素供給量は、高い比増殖速度を維持するためにクロレラの呼吸活性を考慮し、３．０mmol Ｏ2ｇ-1ｈ-1以上を維持するのが好ましい。培養時間は、培養するクロレラの種類によって異なるため適宜好ましい時間を設定することが望ましいが、クロレラ・レギュラリスの場合には、およそ６時間である。ここで呼吸活性とは、１ｇのクロレラが一時間に消費する酸素量（mmol）である。
【００２０】
以下、工程１で得られたクロレラを、有機炭素源を含まない培地で培養する工程（工程２）について説明する。
【００２１】
工程２の培養方法としては、例えば、リン、カリウム、マグネシウム等の多種類の無機塩に、硝酸塩、アンモニア、アンモニウム塩、尿素等の窒素源を含む培地を用い、暗所、pH５．５〜７．５、２８〜３８℃の条件下で、振とう又は通気撹拌することにより行うことができるが、簡便性の観点から、グルコースを消費した後の工程１の培養液をそのまま工程２に付すのが好ましい。
また、尿素を添加する場合には、その添加量が５ｇＬ-1以下であることが好ましい。尿素の添加量が、５ｇＬ-1以上となるとクロレラの成長阻害が生じる。そのため、高濃度の培養を行う場合には、尿素を少しずつ分割して添加することが好ましい。
【００２２】
工程２の培養における酸素供給量は、細胞分裂や色素類の合成を高めるためにクロレラの呼吸活性を考慮し、２．０mmol Ｏ2ｇ-1ｈ-1以上を維持するのが好ましい。培養時間は、２〜５時間、特に３時間であるのが好ましい。
【００２３】
工程１及び工程２を１回又は繰り返し行った後の工程２終了後の培養液中にはクロレラの娘細胞が選択的に増殖している。従って、工程２で得られたクロレラは、クロロフィル及びカロテノイド含量が高い。すなわち、本発明方法により得られるクロレラのクロロフィル含量は乾燥藻体当り３０mg／ｇ以上であり、総カロテノイド含量は乾燥藻体当り６．０mg／ｇ以上である。
【００２４】
培養液からクロレラを採取するには、例えば、遠心分離機を使用して、遠心分離を行うことにより、簡便に収集することができる。
【００２５】
本発明のクロレラは、生細胞を餌料等として使用してもよく、また、乾燥粉末としたものを錠剤等の形状で使用することもできる。さらには、クロレラ中の色素や栄養成分等を抽出し使用することもできる。その用途としては、健康食品、餌料、色素としての利用の他、食品素材、医薬品原料等が好適に例示される。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００２７】
本実施例中、カロテノイド類は、Ann. Report Yakult Inst. Microbiol. Res., 4, 91-99(1973)に記載の方法に従い、ＴＬＣにて定量した。トコフェロールは、Ann. Report Yakult Inst. Microbiol. Res., 5, 91-98(1974)に記載の方法に従い、ＴＬＣにて定量した。ユビキノンは、Ann. Report Yakult Inst. Microbiol. Res., 6, 1-8(1975)に記載の方法に従い、ＴＬＣにて定量した。タンパク質、アミノ酸、脂質、クロロフィル、ビタミン及び一般的な化学成分等の細胞質の主要成分は、“Official Method of Analysis of the A.O.A.C.” 10th, ed by W. Horwitz, A.O.A.C., Washington, D.C, p95, p752(1965)に記載の方法に従い、定量した。
【００２８】
［参考例］  クロレラ・レギュラリスＳ−５０−１７
淡水より単離されたクロレラ・レギュラリスＳ−５０を、メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソ・グアニジンを用いて常法により変異処理し、クロレラ・レギュラリスＳ−５０−１７株を得た。この株を通常の方法で培養した場合に得られるクロレラの組成は、表１に示すとおりであり、カロテノイド含量が４８０mg／乾燥藻体１００ｇ、クロロフィル含量２５００mg／乾燥藻体１００ｇであった。また、このようにして得られるクロレラの細胞は、容積の大きな細胞が不均一に混在し、同調化はされていなかった。
【００２９】
実施例１
グルコース；７ｇ、KH2PO4；１．０ｇ、MgSO4・７H2O；１．０ｇ、クエン酸；０．０６ｇ、FeSO4・７H2O；０．００９ｇ、Arons'sA５；１．０mL、CaCl・２H2O；０．０１６ｇ及び尿素；２．５ｇを、７００mLの水に溶解させることにより基本培地を調製した。また、工程１の培養中に添加する添加培地は、グルコース；１７１ｇ、KH2PO4；５．９ｇ、MgSO4・７H2O；３．５ｇ、クエン酸；１．４ｇ、FeSO4・７H2O；０．２２ｇ、Arons'sA５；３．０mL、CaCl・２H2O；０．３８ｇ及び尿素；１２．７ｇを、３００mLの水に溶解させることにより調製した。なお、これらの培地は、１１５℃で２０分間滅菌処理した尿素溶液を、別途１２１℃、３０分間の条件で殺菌処理した尿素を含まない培地に無菌的に添加して調製した。
一方、クロレラ・レギュラリスＳ−５０−１７株は、本発明の工程１と工程２により反復培養して同調化した細胞をシードとして用いた。
【００３０】
（工程１）１０m3の培養タンクを用い、クロレラ・レギュラリスＳ−５０−１７を細胞濃度が１．２５ｇ／Ｌとなるように上記基本培地５．５m3に接種し、１vvmの流速で、無菌空気を通気しながら、２００rpmの撹拌下、３６℃、pH６．５〜７．０の条件で６時間、無菌状態で培養した。本培養中、培養液中のグルコース濃度をグルコース分析器（商品名「ＢＦ４００Ｃ」、エイブル株式会社製）を用いオフライン測定法により６０分ごとに分析し、培地中のグルコース濃度が０．５〜１０ｇ／Ｌの範囲を維持するように上記添加培地を継続的に添加した。
【００３１】
（工程２）工程１を６時間継続した後、添加培地の供給を停止し、３時間、無菌状態で培養を継続した。
【００３２】
前記工程１と工程２を１セットとする操作を３回繰り返し行い、３０時間、無菌状態で培養した。なお、最後の工程２は、６時間行った。この方法により得られた細胞は、同調的に生長しており、その細胞密度は、１．２５ｇ／Ｌから８０ｇ／Ｌに増加した（図１）。
得られた細胞は、遠心分離により洗浄・濃縮し、さらに細胞質の酵素を不活性化するために加熱処理し、スプレードライヤーで乾燥することにより、乾燥粉末を得た。なお、乾燥粉末は、使用した全グルコース１４００kgに対し、６３０kg（乾燥質量）得られ、対糖収率は０．４５であった。
【００３３】
得られた乾燥粉体１００ｇには、必須アミノ酸、脂質、ビタミン及びミネラルに加え、カロテノイド類が７２３mg、ルテインが３６８mg、α−カロテンが５０mg、β−カロテンが６２mg、トコフェノールが２３mg、クロロフィルが３．６ｇ、及びその他の緑黄色野菜に特有の植物成分が多く含まれていた。その組成の詳細は表２に示すとおりである。
また、クロロフィルやカロテノイドの含有量は、通常の培養により得られるクロレラ（表１参照）よりも明らかに高い数値を示した。
本発明の方法による細胞の生産性は、６７．２ｇ／Ｌ・dayであり、カロテノイド、ルテイン、トコフェノール、及びクロロフィルの生産性は、それぞれ４８４mg／Ｌ・day、２３５mg／Ｌ・day、１５mg／Ｌ・day及び２．４mg／Ｌ・dayであった。
【００３４】
【表１】
2006101795.tif 000002
【００３５】
【表２】
2006101795.tif 000003
【００３６】
実施例１において、工程１と工程２の１セットを３回繰り返した場合の細胞数と平均細胞容積を測定した。その結果、図１に示すとおり、グルコースを含有する培地で培養する工程１（０〜６時間、９〜１５時間、１８〜２４時間）においては、細胞の大きさは増大したが、細胞数は増加しなかった。一方、グルコースを含まない培地で培養する工程２（６〜９時間、１５〜１８時間、２４〜２７時間）では、細胞数が急速に増加した。
この結果、工程１では、細胞が大きくなり（細胞容積の増大）、工程２で細胞の分裂（娘細胞の生成）が同調しておきていることが分かる。
【００３７】
実施例１の工程１及び工程２におけるクロレラ細胞の呼吸活性をBeckman Fieldlab oxygen analyzer Model 1008及びType777を用いて測定した。
その結果、工程１では３．０〜４．５mmol Ｏ2／ｇｈ、工程２では２．０〜２．５mmol Ｏ2／ｇｈであった。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】培養時間と細胞数及び細胞容積との関係を示す図である。
【図１】
2006101795.tif 000004