(57)【要約】【課題】  寒天を分解しネオアガロビオースを生産する際、寒天をネオアガロビオースにまで分解する酵素の活性を保ちつつ、ネオアガロビオースを単糖に分解する酵素の活性を選択的に低下させることにより、ネオアガロビオースのみを生産することを可能とする新規微生物及び該微生物を利用したネオアガロビオースの製造方法を提供することにある。【解決手段】  寒天を唯一の炭素源とする寒天分解菌であるセルビブリオ（Cellvibrio）属に属する新規微生物（ＦＥＲＭ．ＡＰ−２０５１４号）及び該微生物を用いた寒天を基質とするネオアガロビオースを製造する方法、並びに該ネオアガロビオースの製法において、硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウム処理を施すことを特徴とするネオアガロビオースの製法とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルビブリオ（Cellvibrio）属に属する新規微生物（ＦＥＲＭ．ＡＰ−２０５１４号）。
【請求項２】
セルビブリオ（Cellvibrio）属に属する新規微生物（ＦＥＲＭ．ＡＰ−２０５１４号）から得られた抽出液に、寒天を基質として作用させることを特徴とするネオアガロビオースの製造方法。
【請求項３】
前記抽出液に硫酸アンモニウム及び／又は塩化アンモニウム処理を施すことを特徴とする請求項２記載のネオアガロビオースの製造方法。
【請求項４】
前記硫酸アンモニウムの濃度が５０〜８０％であることを特徴とする請求項３記載のネオアガロースの製造方法。
【請求項５】
前記塩化アンモニウムの濃度が５０〜８０％であることを特徴とする請求項３記載のネオアガロースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規微生物及び該微生物を利用したネオアガロビオースの製造方法に関し、より詳しくは寒天分解菌であるセルビブリオ（Cellvibrio）属に属する新規微生物及び該微生物を用いた寒天を基質とするネオアガロビオースを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然に存在するヘテロ多糖類は多く知られている。
この内、海藻由来のものとしては寒天、カラゲナン、アルギン酸などが知られており、増粘剤やゲル化剤として特に食品や化粧品の素材として広く利用されている。
近年では、寒天の主成分であるアガロースから得られる寒天オリゴ糖には、ガン抑制機能や抗酸化作用、皮膚の美白・保湿効果など優れた生理活性が報告されている。
【０００３】
寒天オリゴ糖の製造方法として、化学的な加水分解を用いることも可能であるが、該製法では単糖を含めて複数の糖の混合物（６糖、４糖、２糖等）が調製される結果となり、単一の寒天オリゴ糖を生産することは不可能であった。
その為、単一の寒天オリゴ糖を調製する為には、更に単離・精製の工程が必要とされており、煩雑なものとならざるを得なかった。
特に、寒天からのヘテロ二糖であるネオアガロビオースは、保湿性などの優れた機能を有することで知られ、他にもデンプン老化防止作用、非消化、静菌作用などの機能が認められているが、現在は研究用試薬としてのみ販売されており、他の糖類と比較した場合、かなり高価である。
しかし、このネオアガロビオースについて、安全性が高く、コストが低く、しかも選択的にネオアガロビオースのみを生産する技術が実現すれば、当該物質の新規な用途開発も期待される状況にある。
【０００４】
そこで、上記課題を解決すべく、寒天から単一の寒天オリゴ糖、特にヘテロ２糖であるネオアガロビオースを選択的に生産することができる寒天分解酵素を産生する寒天分解菌の探索研究が行われてきた。
例えば、特許文献１によると、ある種の微生物が作り出す寒天分解酵素を用いることで、寒天を選択的にネオアガロビオースに分解することができる。
該製法は、糖の単離・精製工程なしに、ネオアガロビオースを得ることができ、単一の寒天オリゴ糖を有利に大量生産することができる。
【０００５】
しかしながら、前記製法においてもネオアガロビオースを得ることができる一方で、ネオアガロビオース（二糖類）を単糖類にまで分解する酵素の存在を無視することができないものであるところ、結果的に、単糖類とネオアガロビオースの混合物が調製される結果となり、厳密な意味において、ネオアガロビオースのみを生産することが可能となった訳ではなかった。
即ち、現在に至る迄、ネオアガロビオースのみを生産する技術は確立されておらず、当該技術の開発が強く望まれていた。
【０００６】
【特許文献１】特開平８−１４９９７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は寒天を分解しネオアガロビオース（二糖）を生産する際、寒天をネオアガロビオース（二糖）にまで分解する酵素の活性を保ちつつ、ネオアガロビオース（二糖）を単糖に分解する酵素の活性を選択的に低下させることにより、ネオアガロビオース（二糖）のみを生産することを可能とする新規微生物及び該微生物を利用したネオアガロビオースの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
即ち、請求項１は、セルビブリオ（Cellvibrio）属に属する新規微生物（ＦＥＲＭ．ＡＰ−２０５１４号）に関する。
請求項２は、セルビブリオ（Cellvibrio）属に属する新規微生物（ＦＥＲＭ．ＡＰ−２０５１４号）から得られた抽出液に、寒天を基質として作用させることを特徴とするネオアガロビオースの製造方法に関する。
請求項３は、前記抽出液に硫酸アンモニウム及び／又は塩化アンモニウム処理を施すことを特徴とする請求項２記載のネオアガロビオースの製造方法に関する。
請求項４は、前記硫酸アンモニウムの濃度が５０〜８０％であることを特徴とする請求項３記載のネオアガロースの製造方法に関する。
請求項５は、前記塩化アンモニウムの濃度が５０〜８０％であることを特徴とする請求項３記載のネオアガロースの製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るセルビブリオ（Cellvibrio）属に属する新規微生物は、寒天を分解し、ネオアガロビオースとすることができる。
その為、寒天を基質とするネオアガロビオースの製造方法において、好適に用いることができる。
前記ネオアガロビオースの製造方法において、さらに硫酸アンモニウム若しくは塩化アンモニウム処理を施すことにより、セルビブリオ（Cellvibrio）属に属する新規微生物により寒天をネオアガロビオース（二糖）にまで分解させつつ、二糖を単糖に分解する酵素の活性を選択的に低下させることにより、ネオアガロビオース（二糖）のみを生産することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明者らはネオアガロビオース（二糖）のみを生産する技術を確立すべく、新規の微生物を検索し、これを分離した。
分離された微生物は寒天を唯一の炭素源として生育可能なセルビブリオ（Cellvibrio）属に属する新規微生物（ＦＥＲＭ．ＡＰ−２０５１４号）であり、寒天分解菌である。
上記微生物から（菌体の破砕等により）得られた抽出物が、寒天を分解し、選択的にネオアガロビオース（二糖）とすることを見出した。
更に、上記ネオアガロビオース（二糖）の製造方法において、上記微生物から得られた抽出物に硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウムを付加することにより、ネオアガロビオース（二糖）を単糖に分解する酵素の活性のみを低下させることを見出し、本発明を完成するに至った。
以下、本発明に係る新規微生物から詳述する。
【００１１】
本発明に係る新規微生物は、寒天を唯一の炭素源とする寒天分解菌であり、セルビブリオ（Cellvibrio）属に属する。
上記寒天分解菌は、例えば次のようにして得ることができる。
〔寒天分解菌の単離操作〕
培地としては、寒天 ２０ｇ/Ｌ、ＮａＮＯ３  １．０ｇ/Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １．５７ｇ/Ｌ、ＫＨ２ＨＰＯ４ ０．９ｇ/Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ/Ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ/Ｌを含む平面培地（寒天培地、ｐＨ６．８）を用いる。
分離源として紅藻や貝類の内臓物懸濁液、活性汚泥を培地上に塗布し、数日間25℃で培養する。
培養後、培地上にへこみや穴を形成する集落を取り上げ、再度塗布することにより純化する。
【００１２】
上記の単離操作により得られたセルビブリオ（Cellvibrio）属に属する寒天分解菌は、２０〜４０℃の温度条件下で生育する。至適温度は２５℃である。
Cellvibrio属に属する寒天分解菌はｐＨ６〜１０の条件下で生育する。至適ｐＨは８である。
【００１３】
本発明に係るセルビブリオ（Cellvibrio）属に属する寒天分解菌を培養する際に使用される培地は、通常の微生物の培養に用いられる培地であれば、特に限定されることなく使用することができる。
培地の栄養源としては、炭素源、窒素源、無機塩類などの細菌の成育に必要な栄養源であればよいが、炭素源としては、寒天のみによって生育可能である。
窒素源としては、有機窒素源、無機窒素源のいずれも用いることができ、有機窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、大豆分解物、尿素等を、無機窒素源としては、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等を例示することができる。
無機塩類としては、リン酸塩、硫酸マグネシウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、銅、マンガン、亜鉛、塩化カルシウム、硫酸第一鉄等を例示することができる。
【００１４】
本発明に係るセルビブリオ（Cellvibrio）属の新規微生物は寒天分解能に優れるので、寒天を分解し、ネオアガロビオースを生産するのに好適に利用することができる。
このような微生物の一例として、本発明者らは新規のCellvibrio sp.を分離、取得している。この微生物の形態観察及び生理学的性状の結果を以下の〔表１〕に示す。
尚、Cellvibrio sp.は、平成１７年４月２５日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。受領番号はＦＥＲＭ．ＡＰ−２０５１４号である。
【００１５】
【表１】
2006311821.tif 000002
【００１６】
次に上述した新規微生物によって、寒天を分解し、ネオアガロビオースを生産する方法について説明する。
本発明にかかるネオアガロビオースの製造方法は、セルビブリオ（Cellvibrio）属に属する新規微生物（ＦＥＲＭ．ＡＰ−２０５１４号）から得られた抽出液に、寒天を基質として作用させることを特徴とする。
即ち、セルビブリオ（Cellvibrio）属に属する新規微生物（ＦＥＲＭ．ＡＰ−２０５１４号）を寒天 １ｇ/Ｌを含む液体培地２Ｌで４８時間培養後、遠心分離（9,000g、20分、4℃）により集菌する。該微生物が産生する寒天分解酵素を、例えば超音波処理などにより菌体を破砕することで取り出し、得られた粗酵素液に寒天を基質として作用させることによりネオアガロビオース（２糖類）を生産する。
【００１７】
前記ネオアガロビオースの製造方法において、寒天を基質として作用させる前に、得られた粗酵素液に硫酸アンモニウム処理または塩化アンモニウム処理を施すことにより、ネオアガロビオース（二糖）を単糖に分解する酵素の活性を選択的に低下させ、ネオアガロビオース（二糖）のみを生産することが可能となる。
この際の硫酸アンモニウムの濃度が５０〜８０％であることが好ましい。
この理由は、５０％以下であると、ネオアガロビオース（二糖）を単糖に分解する酵素の活性を低下させることができない為、８０％以上であると、粗酵素液が粘稠になり扱いにくくなる為、いずれの場合も好ましくないからである。
塩化アンモニウムの濃度についても５０〜８０％であることが好ましい。
この理由は、５０％以下であると、ネオアガロビオース（二糖）を単糖に分解する酵素の活性を低下させることができない為、８０％以上であると、粗酵素液が粘稠になり扱いにくくなる為、いずれの場合も好ましくないからである。
尚、上記処理は、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムのそれぞれ単独で使用しても良いし、併用する形で使用しても良い。
【００１８】
以上より本発明にかかるネオアガロビオースの製造方法は、以下の（i）乃至（iv）の工程を経ることにより、寒天をネオアガロビオース（二糖）にまで分解する酵素の活性を保ちつつ、ネオアガロビオース（二糖）を単糖に分解する酵素の活性を選択的に低下させ、ネオアガロビオース（二糖）のみを生産することが可能となる。
（i）寒天を唯一の炭素源として増殖可能な前記新規微生物を培養することにより、寒天分解酵素を生産させること、
（ii）前記新規微生物を破砕することにより、寒天分解酵素を取り出すこと、
（iii）（ii）で得られた粗酵素液に、硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウムを添加することにより、二糖を単糖に分解する酵素を選択的に不活化させること、
（iv）(iii)で得られた酵素液に、寒天を基質として作用させることにより、ネオアガロビオース（２糖類）のみを生産すること。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【００２０】
培地としては、寒天 ２０ｇ/Ｌ、ＮａＮＯ３  １．０ｇ/Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １．５７ｇ/Ｌ、ＫＨ２ＨＰＯ４ ０．９ｇ/Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ/Ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ/Ｌを含む平面培地（寒天培地、ｐＨ６．８）を用いた。分離源として紅藻や貝類の内臓物懸濁液、活性汚泥を培地上に塗布し、数日間25℃で培養した。培養後、培地上にへこみや穴を形成する集落を取り上げ、再度塗布することにより純化した。
【００２１】
上述した方法により単離されたCellvibrio sp.（ＦＥＲＭ．ＡＰ−２０５１４号）（表１においては「SIID3377」と表記）を同定するために、以下の試験を行った。
（１）形態的性質及び生理・生化学的性質
検体を平板培地に植菌し、２５℃で培養した。その後、この培養検体を分析の供試菌株とした。光学顕微鏡ＢＸ５０Ｆ４（オリンパス社）によって、細胞形態、グラム染色性、胞子の有無、鞭毛による運動性の有無を観察した（撮影倍率×1500、引き伸ばし倍率×2000）。
培地平板上でコロニー形態を観察した。また、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス産生、ブドウ糖の酸化／発酵（０／Ｆ）について試験を行った。結果は上記〔表１〕の通りであった。
【００２２】
分類学的比較性状を調べるために、APIシステム（ビオメリュー社）を用いて、検体の生理・生化学的性状を調べた。操作はAPIシステムの測定方法（API50CHBの測定方法（50430））に従った。結果は以下の表２のとおりである。
【００２３】
【表２】
2006311821.tif 000003
【００２４】
〔16S rDNA塩基配列解析〕
ゲノムDNAの抽出には、InstaGene Matrix（Bio Rad、米国）を使用し、操作はBIO RAD
社のプロトコールに従った。抽出したゲノムDNAを鋳型として、PCRにより16S rRNA遺伝子（16S rDNA）の全塩基配列１５００〜１６００ｂｐの領域を増幅した。その後、増幅された16S rDNAをシーケンシングし、検体の16S rDNA塩基配列を取得した。
PCRには、AmpliTaq Gold PCR Master Mix（Applied Biosystems社、米国）と、プライマー９Ｆ及び１５１０Ｒを使用した。サイクルシーケンスには、ABI Prism BigDye Terminator v3.1 Kit（Applied Biosystems社、米国）とシーケンスプライマー８種を使用した。
サーマルサイクラーには、GeneAmp PCR System 9600（Applied Biosystems社、米国）
を使用した。DNAシーケンサーには、ABI PRISM 3100 DNA Sequencer（Applied Biosystems社、米国）を使用し、得られた塩基配列断片の結合には、AutoAssembler 2.1（Applied Biosystems社、米国）を使用した。尚、PCRからサイクルシーケンスまでの基本的操作は各キットのプロトコールに従った。
解析ソフトウェアとして、MicroSeq Microbial Identification System Software V.1.
4.1（Applied Biosystems社、米国）を使用し、塩基配列を解析した。
結果を配列番号１に記載する。
【００２５】
さらに、より多くの情報を得るため国際塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL）
に対して相同性検索を実施した。具体的には、米国NCBIが提供するオンラインサービスにより、BLASTを用いて国際塩基配列データベースに対して相同性検索を実施した。
相同性検索では相同率が上位20位までの配列についてデータを取得した。
相同性検索の結果検索された上位20位のエントリーを及び本検体の塩基配列とエントリー上位５位の塩基配列との相同性の比較を表３に示す。
また、得られた配列１を基に分子系統樹を推定した（表４）。
【００２６】
【表３】
2006311821.tif 000004
【００２７】
【表４】
2006311821.tif 000005
【００２８】
〔結果〕
形態観察及び生理・生化学性状試験の結果、本検体はグラム染色陰性、桿菌、芽胞形成、好気条件下での生育性、カタラーゼ反応陽性など、セルビブリオ（Cellvibrio）属に属する有芽胞桿菌に類似の性状を示した。
APIシステムを使用した生理・生化学性状試験の結果、本検体は、Ｌ−アラビノース、
リボース、Ｄ−キシロース、グルコース、フラクトース、マンノース、ソルボース、マンニトール、Ｎ−アセチルグルコサミン、エスクリン、セオビオース、マルトース、白糖、トレハロース、メレチトース、澱粉、Ｄ−ツラノース、Ｄ−タガトース、５−ケトグルコン酸、ゼラチナーゼの試験項目で陽性を示した。本検体の嫌気的生育性は確認されず、本検体は好気性の細菌であると考えられた。
MicroSeq Bacterial Full Gene Libraryに対する相同性検索の結果、本検体の16S rDNA
塩基配列は相同率89.18％でPseudomonas taetrolensの16S rDNAに対し最も高い相同性を示した。
国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果、本検体の16S rDNAは相同率99.4％でuncultured gamma proteobacterium Accession No.AY2222301の16S rDNAに対し最も高い相同性を示した。
【００２９】
前記寒天分解菌より寒天分解酵素を抽出すべく、前記寒天分解菌を寒天 １g/Lを含む液体培地２Ｌで４８時間培養後、遠心分離（９，０００ｇ、２０分、４℃）により集菌した。得られた単離株のアガロース分解能を調べる実験を下記の条件で行った。
（寒天分解実験）
反応混合液として、以下の基質及び酵素を混合した。
基質  ：粉末アガロース                   15mg
酵素  ：粗酵素液（15g/lタンパク量）     100μl
寒天を含む培地で培養後、リン酸緩衝液で洗浄した後、超音波破壊した。
緩衝液：20mMリン酸Na（pH6.5）         900μl
【００３０】
（加水分解反応）
加水分解反応条件として、粉末アガロース15mgを含む20mMリン酸緩衝液900μlに粗酵素液100μlを添加し、反応を行った。反応は25℃で行い、反応後未反応の粉末アガロースを遠心分離により取り除き、上清を5分間・100℃で煮沸することにより反応を停止した。測定はフェリシアナイド試薬を用いて還元糖量、ガラクトースデヒドロゲナーゼを用いた酵素法によりガラクトース量を測定した。
【００３１】
（硫酸アンモニウム処理法）
粗酵素液1mlに硫酸アンモニウムを0、0.1、0.3、0.5、0.8g添加し、氷水中において30分間静置した。静置後、処理酵素液100μlを粉末アガロース15mgを含む20mMリン酸Na緩衝液900μlに添加し反応を行った。
追試験により静置時間による変化はなかった。
（i）反応液上清の糖測定を上記の方法（フェリシアナイド試薬を用いた還元糖測定法およびガラクトースデヒドロゲナーゼを用いた酵素法）で行った。
（ii）反応様式の観察を薄層クロマトグラフィーで行った。
プレート；シリカゲル60ガラスプレート
展開溶媒；n-ブタノール：エタノール：水＝3：1：1
検出試薬；50％硫酸水溶液
（iii）分子量測定はゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した。
カラム； 22cm×1470cm（ KIRIYAMA）
溶離液； 20mMリン酸Na緩衝液（pH6.5）
流速  ； 1ml/min、3分 分画
試料  ； 500μl  （標準サンプル濃度：２g/L）
「80％（weight/volume）硫酸アンモニウム処理酵素、48時間反応加水分解産物」分画後、還元糖量およびガラクトース量が再度測定された。
【００３２】
図１、２は硫酸アンモニウム処理を施した酵素による寒天分解の経時変化を表す。
硫酸アンモニウム濃度（０％、１０％、３０％、５０％、８０％）の増加とともにガラクトースの生産が抑制されたが（図１）、還元糖は増加した（図２）。
このことは寒天オリゴ糖の中の二糖を分解する酵素の活性が硫酸アンモニウムにより失活した、または反応時に存在する硫酸アンモニウムにより阻害されたことを意味する。
【００３３】
図３、４は薄層クロマトグラムである。図３は硫酸アンモニウム処理をしていない粗酵素液で寒天を分解した反応液のクロマトグラムであり、時間とともに様々なオリゴ糖が生産されることを示している。図４では80％硫酸アンモニウムで処理した粗酵素液を用いて同じ分解実験を行った結果である。ネオアガロビオースと思われるスポットしか検出されず、そのスポットの大きさが反応時間とともに大きくなった。
【００３４】
図５にRf値測定結果を示す。図５の結果から分子量とRf値との関係を文献データとともに図６に示す。この図からネオアガロビオースと思われる分解産物の分子量が360近く二糖であると思われる。
【００３５】
図７は標準物質の混合液をSephadexを用いてゲルろ過したクロマトグラムを表している。図８はガラクトースのみを分画した場合である。
これらの図から単糖（分子量約180）がフラクションNo.50付近に溶離され、二糖（分子量約360）はフラクションNo.40付近に溶離されることが分かる。80％硫酸アンモニウムを用いて寒天を分解した分解産物のゲルろ過クロマトグラムを図９に示した。
ピークはNo.40付近にあり、分画されたものが二糖であることを示しており、薄層クロマトの結果と同様にガラクトースのピークは見られなかった。
【００３６】
以上の結果から、高濃度の硫酸アンモニウムを用いることにより、ネオアガロビオースを選択的に生産できる可能性があると結論づけた。
【００３７】
（塩化アンモニウム処理法）
粗酵素液1mlに塩化アンモニウムを0、0.1、0.3、0.5、0.8g添加し、氷水中において30分間静置した。静置後、処理酵素液100μlを粉末アガロース15mgを含む20mMリン酸Na緩衝液900μlに添加し反応を行った。
追試験により静置時間による変化はなかった。
（i）反応液上清の糖測定を上記の方法（フェリシアナイド試薬を用いた還元糖測定法およびガラクトースデヒドロゲナーゼを用いた酵素法）で行った。
（ii）反応様式の観察を薄層クロマトグラムで行った。
プレート；シリカゲル60ガラスプレート
展開溶媒；n-ブタノール：エタノール：水＝3：1：1
検出試薬；50％硫酸水溶液
（iii）分子量測定はゲルろ過クロマトグラムにより測定した。
カラム； 22cm×1470cm（KIRIYAMA）
溶離液； 20mMリン酸Na緩衝液（pH6.5）
流速  ； 1ml/min、3分 分画
試料  ； 500μl  （標準サンプル濃度：２g/L）
「80％（weight/volume）塩化アンモニウム処理酵素、48時間反応加水分解産物」分画後、還元糖量およびガラクトース量が再度測定された。
【００３８】
図１０１、１１は塩化アンモニウム処理を施した酵素による寒天分解の経時変化を表す。
塩化アンモニウム濃度（０％、１０％、３０％、５０％、８０％）の増加とともにガラクトースの生産が抑制されたが（図１０）、還元糖は増加した（図１１）。
このことは寒天オリゴ糖の中の二糖を分解する酵素の活性が塩化アンモニウムにより失活した、または反応時に存在する塩化アンモニウムにより阻害されたことを意味する。
【００３９】
図１２、１３は、無処理のもの、80％硫酸アンモニウム処理、80％塩化アンモニウム処理、80％硫酸ナトリウム処理を施したものの酵素による寒天分解の経時変化を表した図である。
80％硫酸アンモニウム処理、80％塩化アンモニウム処理を施したものはガラクトースの生産が抑制されたが（図１２）、還元糖は増加した（図１３）。
このことは寒天オリゴ糖の中の二糖を分解する酵素の活性が、80％硫酸アンモニウム及び80％塩化アンモニウムにより失活した、または反応時に存在する80％硫酸アンモニウム及び80％塩化アンモニウムにより阻害されたことを意味する。
【００４０】
無処理及び80％硫酸ナトリウム処理を施したものはガラクトースの生産は抑制されず（図１２）、還元糖については増加した（図１３）。
このことは寒天オリゴ糖の中の二糖を分解する酵素の活性が、80％硫酸ナトリウムによる処理では失活しない、若しくは反応時に存在する80％硫酸ナトリウムによる処理では阻害されないことを意味する。
【００４１】
図１４は、無処理のもの、80％硫酸アンモニウム処理、80％塩化アンモニウム処理、80％硫酸ナトリウム処理を施したもの、以上４サンプルにおいて、ガラストース量／還元糖量（％）の比率を示すグラフである。
このグラフより、80％硫酸アンモニウム処理及び80％塩化アンモニウム処理したサンプルは、無処理及び80％硫酸ナトリウム処理したサンプルと比して、格段にガラストース量／還元糖量（％）の比率が低いことが判る。
このことは、寒天オリゴ糖の中の二糖を分解する酵素の活性が80％硫酸アンモニウム又は80％塩化アンモニウムによって阻害されることを示している。
一方、80％硫酸ナトリウムには二糖を分解する酵素の活性を阻害できないことを示している。
【００４２】
図１５は薄層クロマトグラムである。80％の塩化アンモニウム（１で表記）及び80％の硫酸アンモニウム（２で表記）添加酵素によるアガロース分解産物を表したもので、共に３０時間反応させた粗酵素液を用いて同じ分解実験を行った結果である。
ネオアガロビオースと思われるスポットしか検出されなかった。
【００４３】
80％硫酸アンモニウム、80％塩化アンモニウムを用いて寒天を分解した分解産物のゲルろ過クロマトグラムを図１６に示した。
ピークはNo.40付近にあり、分画されたものが二糖であることを示しており、薄層クロマトグラフの結果と同様、ガラクトースのピークは見られなかった。
【００４４】
以上の結果から、高濃度の硫酸アンモニウム若しくは塩化アンモニウムを用いることにより、ネオアガロビオースを選択的に生産できる可能性があると結論づけた。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明にかかる新規微生物が産生する酵素による寒天分解の経時的変化を、硫酸アンモニウム濃度の影響とともに表した図である。
【図２】本発明にかかる新規微生物が産生する酵素による寒天分解の経時的変化を、硫酸アンモニウム濃度の影響とともに表した図である。
【図３】薄層クロマトグラフにより、本発明にかかる新規微生物が産生する酵素による寒天分解を経時的に表した図である（硫酸アンモニウム処理なし）。
【図４】薄層クロマトグラフにより、本発明にかかる新規微生物が産生する酵素による寒天分解を経時的に表した図である（硫酸アンモニウム処理有り）。
【図５】Rf値の測定結果を示した図である。
【図６】図５の結果から分子量とRf値との関係を文献データとともに示した図である。
【図７】標準物質の混合液をSephadexを用いてゲルろ過したクロマトグラムを表したものである。
【図８】ガラクトースのみを分画した場合のクロマトグラムを表したものである。
【図９】80％硫酸アンモニウムを用いて寒天を分解した分解産物のゲルろ過クロマトグラムを示したものである。
【図１０】本発明にかかる新規微生物が産生する酵素による寒天分解の経時的変化を、塩化アンモニウム濃度の影響とともに表した図である。
【図１１】本発明にかかる新規微生物が産生する酵素による寒天分解の経時的変化を、塩化アンモニウム濃度の影響とともに表した図である。
【図１２】本発明にかかる新規微生物が産生する酵素による寒天分解の経時的変化を、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウムの影響とともに表した図である。
【図１３】本発明にかかる新規微生物が産生する酵素による寒天分解の経時的変化を、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウムの影響とともに表した図である。
【図１４】ガラクトース量／還元糖量（％）に対する無機塩類（硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム）の影響を表した図である。
【図１５】薄層クロマトグラフにより、本発明にかかる新規微生物が産生する酵素による寒天分解を経時的に表した図である（８０％塩化アンモニウム処理：１、８０％硫酸アンモニウム処理：２）。
【図１６】80％硫酸アンモニウム及び80％塩化アンモニウムを用いて寒天を分解した分解産物のゲルろ過クロマトグラムを示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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