(57)【要約】【課題】加工食品中に含まれる本わさび、西洋わさびの辛味原料をＰＣＲを用いて比較的簡単な操作のもと、高精度に検出する。【解決手段】本わさびのＤＮＡのみを特異的に増幅させる葉緑体由来配列のプライマー、西洋わさびのＤＮＡのみを特異的に増幅させる葉緑体由来のプライマー、あるいはこれらを組み合わせて用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動像よりそれぞれの辛味原料に特異的なＤＮＡ断片を定性的に検出することから構成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ増幅産物の電気泳動像より加工食品中の本わさびまたは西洋わさびからなる辛味原料の検出方法。
【請求項２】
本わさびのＤＮＡのみを特異的に増幅させる葉緑体由来配列のプライマー（５´−ＴＣＴＡＣＧＡＡＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＴＴＴＣＡＡＴ−３´、５´−ＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴＡＧＡＡＣＧＧＴＣＧＡＴＴＣＴ−３´）を用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動像より、本わさびに特異的なＤＮＡを検出することを特徴とする辛味原料の検出方法。
【請求項３】
西洋わさびのＤＮＡのみを特異的に増幅させる葉緑体由来配列のプライマー（５´−ＡＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＴＴＧＴＣ−３´、５´−ＣＧＡＧＡＴＴＣＡＧＧＴＣＧＴＣＡＴＴＴＴＴＧ−３´）を用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動像より、西洋わさびに特異的なＤＮＡを検出することを特徴とする辛味原料の検出方法。
【請求項４】
次の（ａ）〜（ｂ）に記載されるプライマーの一種または二種を組み合わせて用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動像よりそれぞれの辛味原料に特異的なＤＮＡ断片を検出することを特徴とする辛味原料の検出方法。
（ａ）植物葉緑体由来配列のプライマー（５´−ＴＣＴＡＣＧＡＡＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＴＴＴＣＡＡＴ−３´、５´−ＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴＡＧＡＡＣＧＧＴＣＧＡＴＴＣＴ−３´）
（ｂ）植物葉緑体由来配列のプライマー（５´−ＡＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＴＴＧＴＣ−３´、５´−ＣＧＡＧＡＴＴＣＡＧＧＴＣＧＴＣＡＴＴＴＴＴＧ−３´）
【請求項５】
請求項２〜４に使用されるプライマーの塩基配列をその特異性やアニ−リング適性に影響を与えない程度に改変した請求項２〜４に記載の辛味原料の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は加工食品中に含まれる本わさび（Eutrema wasabi、異名Wasabia japonica）、西洋わさび（Armoracia rusticana）をＰＣＲを用いて比較的簡単な操作のもと、高精度に検出する方法に係り、詳細には、それぞれの辛味原料のＤＮＡのみを特異的に増幅するプライマーを設計し、これらプライマーを用いてそれぞれの辛味原料を定性的に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、わさびに関係する加工食品には主原料として本わさび、西洋わさび等の辛味原料が使用されている。この種の加工食品中の辛味原料を判別する方法として、従来、ガスクロマトグラフイーによる分析や官能分析等が採用されていた。
【０００３】
しかし、ガスクロマトグラフイーによる分析では、辛味原料の香気成分が熱に弱く、また、経時変化を起こしやすく、このため、十分な分析精度が得られなかった。さらに、官能分析では、分析者の熟練度や健康状態によって分析結果が左右され、あるいは分析結果の数値化が難しく、このため、客観的な判定基準になり得ない等の問題があった。
【０００４】
また、加工食品に原材料として用いられる本わさび、西洋わさびはいずれもアブラナ科植物に属し、含有成分が類似しているため、機器分析や官能分析を一層困難なものにしていた。これらの理由により現在では加工食品の辛味原料を判別する有効な手段は乏しいということができる。さらに現在では、加工食品の原材料に関する消費者の関心や、適正表示に対する要求が高まっており、高精度な新規分析方法の開発が望まれている。
【非特許文献１】Plant Mol．Biol．，１４  １１０５〜１１０９（１９９１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明が解決しようとする課題は加工食品から本わさび、西洋わさび等の辛味原料を定性的に検出する技術の開発を行うことに存する。本発明者等は鋭意研究の結果、辛味原料のＤＮＡ配列の違いを利用したＰＣＲ法を開発して上述課題を解決した。特に、発明者等は植物の葉緑体のＤＮＡ配列を利用した分析系が所期の課題解決に有効であるとの知見を得て、本発明を完成するに至った。
【０００６】
葉緑体ＤＮＡの塩基配列を解析することにより、本わさびのＤＮＡのみを特異的に増幅するプライマーおよび西洋わさびのＤＮＡのみを特異的に増幅するプライマーを設計した。これらセンスストランドプライマーと、アンチセンスストランドプライマーに挟まれた領域における本わさび、西洋わさびのＤＮＡ配列情報は本発明の開発過程で新たに解明されたものである。
【０００７】
本発明はこれらの領域のＤＮＡの種による違いから、加工食品中の辛味原料を判別ないしは検出する技術を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述の課題を解決するために、本発明によれば、ＰＣＲ増幅産物の電気泳動像より加工食品中の本わさび、西洋わさびからなる辛味原料を検出することを特徴とし、具体的には次の（１）〜（３）を特徴とする。
【０００９】
（１）本わさびのＤＮＡのみを特異的に増幅させる葉緑体由来配列のプライマー（５´−ＴＣＴＡＣＧＡＡＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＴＴＴＣＡＡＴ−３´、５´−ＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴＡＧＡＡＣＧＧＴＣＧＡＴＴＣＴ−３´）を用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動像より、本わさびに特異的なＤＮＡを検出する。
【００１０】
（２）西洋わさびのＤＮＡのみを特異的に増幅させる葉緑体由来配列のプライマー（５´−ＡＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＴＴＧＴＣ−３´、５´−ＣＧＡＧＡＴＴＣＡＧＧＴＣＧＴＣＡＴＴＴＴＴＧ−３´）を用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動像より、西洋わさびに特異的なＤＮＡを検出する。
【００１１】
（３）次の（ａ）〜（ｂ）に記載されるプライマーの一種または二種を組み合わせて用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動像よりそれぞれの辛味原料に特異的なＤＮＡ断片を検出する。
（ａ）植物葉緑体由来配列のプライマー（５´−ＴＣＴＡＣＧＡＡＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＴＴＴＣＡＡＴ−３´、５´−ＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴＡＧＡＡＣＧＧＴＣＧＡＴＴＣＴ−３´）
（ｂ）植物葉緑体由来配列のプライマー（５´−ＡＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＴＴＧＴＣ−３´、５´−ＣＧＡＧＡＴＴＣＡＧＧＴＣＧＴＣＡＴＴＴＴＴＧ−３´）
【発明の効果】
【００１２】
本発明は加工食品中に含有される本わさび、西洋わさびからなる辛味原料を比較的簡単な操作のもとに高精度で検出するという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を具体的に詳述する。
本発明は加工食品中に含有される本わさび、西洋わさびをＰＣＲ法を用いて定性的に検出する方法に係り、具体的には以下のとおりである。
【００１４】
（Ａ）プライマーとして次に記載のものを用いる。
本わさびプライマー    
５´−ＴＣＴＡＣＧＡＡＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＴＴＴＣＡＡＴ−３´
５´−ＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴＡＧＡＡＣＧＧＴＣＧＡＴＴＣＴ−３´
【００１５】
（Ｂ）プライマーとして次に記載のものを用いる。
西洋わさびプライマー
５´−ＡＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＴＴＧＴＣ−３´
５´−ＣＧＡＧＡＴＴＣＡＧＧＴＣＧＴＣＡＴＴＴＴＴＧ−３´
【００１６】
上述に記載されるプライマーの一種または二種を組み合わせて用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動像より辛味原料のそれぞれに特異的なＤＮＡ断片を検出する。
【００１７】
なお、本発明では、上述のプライマーの塩基配列をその特異性やアニーリング適性に影響を与えない程度に改変することもできる。
【００１８】
さらに、本発明を具体的に詳述すると以下のとおりになる。
【００１９】
本発明検出方法の適用される対象は本わさび、西洋わさびが使用される加工食品であり、おろしわさび、粉わさび、練りわさび、わさび漬、レホール、ドレッシング、スナック菓子等も含む。なお、チューブ、小袋、ボトル、缶、瓶等、食品の包装形態には限定されない。
【００２０】
さらに、本発明では、葉緑体のＤＮＡ配列情報を解析して、本わさび、西洋わさびのそれぞれに対して特異的な配列の領域を検索し、それらに対応する以下に示すようなプライマーを開発した。
【００２１】
（１）本わさびプライマー    
５´−ＴＣＴＡＣＧＡＡＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＴＴＴＣＡＡＴ−３´
５´−ＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴＡＧＡＡＣＧＧＴＣＧＡＴＴＣＴ−３´
（２）西洋わさびプライマー
５´−ＡＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＴＴＧＴＣ−３´
５´−ＣＧＡＧＡＴＴＣＡＧＧＴＣＧＴＣＡＴＴＴＴＴＧ−３´
【００２２】
上記（１）のプライマーは本わさびのＤＮＡを増幅するが、西洋わさびのＤＮＡは増幅しない。（２）のプライマーは西洋わさびのＤＮＡを増幅するが、本わさびのＤＮＡは増幅しない。上記（１）、（２）のいずれかのプライマーを用いて加工食品の分析を行った場合、プライマーの種類に則した辛味原料を使用している場合にのみバンドが検出される。例えば、加工わさび食品を本わさびプライマーを用いて分析した場合、本わさびを原料として使用した食品からのみバンドが検出される。
【実施例１】
【００２３】
試作品からの本わさびの検出
（１）プライマー
本わさびに特異的な領域に対応するプライマーを使用した。
【００２４】
本わさびプライマー    
５´−ＴＣＴＡＣＧＡＡＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＴＴＴＣＡＡＴ−３´
５´−ＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴＡＧＡＡＣＧＧＴＣＧＡＴＴＣＴ−３´
【００２５】
（２）分析に供した加工わさび食品
市販の加工わさび食品を模した試作品を８品目調製した。各試料の内容は以下のとおりである。
試料１  本わさび根茎９５％、ショ糖５％
試料２  本わさび根茎１５％、本わさび葉柄６０％、本わさび根１５％、ショ糖７％、植物油脂２．９％、香料０．１％
試料３  本わさび根茎９％、本わさび葉柄３５％、本わさび根１％、西洋わさび４５％、ショ糖５％、植物油脂５％
試料４  本わさび葉柄４０％、西洋わさび４０％、ショ糖５％、植物油脂５％、水１０％
試料５  本わさび葉柄１０％、西洋わさび６０％、ショ糖１０％、植物油脂５％、水１５％
試料６  本わさび葉柄５％、西洋わさび３０％、コーンスターチ１５％、ショ糖５％、植物油脂５％、酸味料０．２％、着色料０．１％、香料０．１％、水３９．６％
試料７  本わさび葉柄２％、西洋わさび４０％、コーンスターチ１０％、ショ糖５％、食塩３％、植物油脂３％、酸味料０．２％、着色料０．１％、香料０．１％、水３６．６％
試料８  西洋わさび９８％、植物油脂１．９％、着色料０．１％
【００２６】
（３）ＤＮＡの抽出・精製
試料は液体窒素で凍結し、粉砕したものを供試試料とした。ＤＮＡの抽出は、QUIAGEN社製DNeasy Plant Mini Kitを用い、同キットに添付のマニュアルに従って行った。すなわち、試料３０ｍｇを１．５ｍｌ容量のマイクロチューブに量り取り、０．４ｍｌのBuffer AP1と４μｌのRNaseAを加え、ピペッティング後に６５℃で１０分間保温した。その後、１３０μｌのBuffer AP2を加え、氷中で５分間冷却した。遠心分離後、上澄をLilac spin column に移し、再び遠心分離した。カラムのパス液に１．５倍量のAP3／E Bufferを加えた後に、DNeasy spin columnに移して遠心分離し、カラム部にＤＮＡを吸着させた。パス液を除去した後、５００μｌのAWを加えて遠心分離し、カラム内のＤＮＡを洗浄した。この操作をもう１回行った後、空の状態のカラムを遠心分離し、カラムに残存するAWを完全に除去した。同カラム部を新しい１．５μｌマイクロチューブに移し、６５℃に予熱した５０μｌのBuffer AE を加え室温で５分間静置した。遠心分離後、さらに５０μｌのBuffer AE を加えて遠心分離し、約１００μｌのＤＮＡ抽出液を得た。
【００２７】
抽出したＤＮＡはBIO 101 System 社製 GENECLEAN SPIN Kitを用い、同キットに添付のマニュアルに従って精製した。すなわち、よく振って懸濁させた４００μｌの  GENECLEAN SPIN GLASS MILKを spin column に加え、さらにそこへＤＮＡ抽出液を加え、時々転倒混和しながら室温にて５分間静置した。遠心分離後、パス液を除去し、５００μｌの GENECLEAN SPIN NEW WASHを加えピペッティングした。遠心分離後、パス液を除去し、次いで、さらに空の状態のカラムを遠心分離し、カラムに残存するGENECLEAN SPIN NEW WASHを完全に除去した。同カラムをキット附属の新しいマイクロチューブに移し、２０μｌの Elution Solution を加えピペッティングした。５分間静置後、遠心分離を行い、さらに２０μｌの Elution Solution を加え遠心分離し、約４０μｌの精製ＤＮＡ抽出液を得た。
【００２８】
（４）ＰＣＲ
ＰＣＲは、Applied Biosystems社製 GeneAmp PCR System 9700を用い、１μｌの精製ＤＮＡ抽出液、１．２５unitのKOD Dash（TOYOBO）、０．２mMの dNTP、５μｌの１０× Buffer（KOD Dash添付のもの）、２μＭのプライマーを含む５０μｌの反応液で行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で１分間熱変性後、熱変性９４℃３０秒間、アニーリング５５℃２秒間、伸長反応７４℃、３０秒間を１サイクルとして３０サイクル行い、最後に、７４℃、８分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、反応液５μｌをエチジウムブロマイド含有の２．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、０．５時間、TBE）に供し、蛍光下でＰＣＲ産物の検出を行った。その結果を図１に示す。
【００２９】
（５）結果
図１に本手法により加工わさび食品を模した試作品の分析を行った結果を示した。試料９は本わさびのＤＮＡ抽出物である。試料１〜７は本わさびを使用した試作品であり、本わさびのバンドが検出された。試料８は本わさびを使用していない試作品であるため、本わさびのバンドは検出されなかった。以上の結果から本発明は、本わさびの部位が異なる場合や、添加物等の影響を受けることなく、本わさびの検出が可能であることが分かった。
【実施例２】
【００３０】
試作品からの西洋わさびの検出
（１）プライマー
西洋わさびに特異的な領域に対応するプライマーを使用した。
【００３１】
西洋わさびプライマー    
５´−ＡＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＴＴＧＴＣ−３´
５´−ＣＧＡＧＡＴＴＣＡＧＧＴＣＧＴＣＡＴＴＴＴＴＧ−３´
【００３２】
（２）分析に供した加工わさび食品
実施例１に同じ。
【００３３】
（３）ＤＮＡの抽出・精製
実施例１に同じ。
【００３４】
（４）ＰＣＲ
実施例１に同じ。その結果を図２に示す。
【００３５】
（５）結果
図２に本手法により加工わさび食品を模した試作品の分析を行った結果を示した。試料９は西洋わさびのＤＮＡ抽出物である。試料３〜８は西洋わさびを使用した試作品であり、西洋わさびのバンドは検出された。試料１、２は西洋わさびを使用していない試作品であるため、西洋わさびのバンドは検出されなかった。以上の結果から本発明は、本わさびの有無および添加物の有無に影響されることなく、西洋わさびの検出が可能であることが分かった。
【実施例３】
【００３６】
加工わさび食品からの本わさび、および西洋わさびの検出
（１）プライマー
本わさびプライマー
５´−ＴＣＴＡＣＧＡＡＧＴＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＴＴＴＣＡＡＴ−３´
５´−ＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴＡＧＡＡＣＧＧＴＣＧＡＴＴＣＴ−３´
西洋わさびプライマー
５´−ＡＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＴＴＧＴＣ−３´
５´−ＣＧＡＧＡＴＴＣＡＧＧＴＣＧＴＣＡＴＴＴＴＴＧ−３´
【００３７】
（２）分析に供した加工わさび食品
配合が既知である市販の加工わさび食品３品目。
試料１  辛味原料として本わさびのみを配合した加工わさび食品
試料２  辛味原料として本わさびと西洋わさびを配合した加工わさび食品
試料３  辛味原料として西洋わさびのみを配合した加工わさび食品
【００３８】
（３）ＤＮＡの抽出・精製
実施例１に同じ。
【００３９】
（４）ＰＣＲ
実施例１に同じ。その結果を表１に示す。
【００４０】
（５）結果
本手法により加工わさび食品の分析を行った結果を表１に示した。試料１は本わさびのみを使用した製品であり、本わさびのみが検出された。試料２は本わさびと西洋わさびを使用した製品であり、本わさびと西洋わさびが検出された。試料３は西洋わさびのみを使用した製品であり、西洋わさびのみが検出された。以上の結果から、本発明は市販の加工わさび食品の辛味原料の検出に有効であることが分かった。
【００４１】
（表１）
実施例３の分析結果（○：検出    ×：非検出）
試料      本わさび      西洋わさび
１            ○            ×  
２            ○            ○
３            ×            ○  
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明方法によれば、加工食品に含有されている本わさび、西洋わさびを比較的簡単な操作で高精度に検出し得る。近年、加工食品の原材料に関する消費者の関心、とりわけ加工食品に含まれる辛味原料に関する消費者の関心、さらには適正表示に対する消費者の要求が高まっており、高精度な分析ないしは検出技術が必要とされている。このような現状に鑑み、本発明の検出技術の産業上の利用可能性は極めて高いものということができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】実施例１による、加工わさび食品を模した試作品由来ＤＮＡのＰＣＲ産物の電気泳動像図である。
【図２】実施例２による、加工わさび食品を模した試作品由来ＤＮＡのＰＣＲ産物の電気泳動像図である。
【図１】
2006101722.tif 000002
【図２】
2006101722.tif 000003