(57)【要約】  【課題】  本発明の目的は、光線力学的療法に使用される新たな光感受性薬剤及びその製造方法を提供することである。  【解決手段】  ポリカルボン酸化合物で表面処理された蛍光性半導体量子ドットが、標的細胞に選択的に結合可能な物質に結合されてなる光感受性薬剤。並びに、蛍光性半導体量子ドットと２以上のＣＯＯＨ基及びチオール基を有するポリカルボン酸化合物を混合し、硫黄原子を介して該化合物を蛍光性半導体量子ドットに結合し、次いで、該ＣＯＯＨ基を介して標的細胞に選択的に結合可能な物質を結合することを特徴とする、光感受性薬剤の製造方法。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリカルボン酸化合物で表面処理された蛍光性半導体量子ドットが、標的細胞に選択的に結合可能な物質に結合されてなることを特徴とする、光感受性薬剤。
【請求項２】
前記ポリカルボン酸化合物が、硫黄原子を介して蛍光性半導体量子ドットの表面に結合されてなる、請求項１に記載の光感受性薬剤。
【請求項３】
標的細胞に選択的に結合可能な物質が、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を介して結合してなる、請求項１又は２に記載の光感受性薬剤。
【請求項４】
標的細胞に選択的に結合可能な物質が抗体である、請求項１乃至３のいずれかに記載の光感受性薬剤。
【請求項５】
量子ドットの平均粒子径が、5nm以下である、請求項１乃至４のいずれかに記載の光感受性薬剤。
【請求項６】
ポリカルボン酸化合物がメルカプトコハク酸である、請求項１乃至５のいずれかに記載の光感受性薬剤。
【請求項７】
標的細胞が、白血病細胞、腫瘍細胞、及びウイルス感染細胞よりなる群から選択される  少なくとも１種である、請求項１乃至６のいずれかに記載の光感受性薬剤。
【請求項８】
(a)請求項１乃至６のいずれかに記載の光感受性薬剤、及び(b)トリフルオペラジン及びスルホン化アルミニウムフタロシアニンよりなる群から選択される少なくとも1種を含有する、医薬組成物。
【請求項９】
蛍光性半導体量子ドットと２以上のＣＯＯＨ基及びチオール基を有するポリカルボン酸化合物を混合し、硫黄原子を介して該化合物を蛍光性半導体量子ドットに結合し、次いで、該ＣＯＯＨ基を介して標的細胞に選択的に結合可能な物質を結合することを特徴とする、光感受性薬剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞に結合し、光の照射を受けることにより該標的細胞を選択的に死滅させることができる光感受性薬剤に関する。更に、本発明は、該光感受性薬剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光線力学的療法（以下、PDT（Photo Dynamic Therapy）と表記する）は、光感受性薬剤PS（フォトセンシタイザ）と、レーザー光又は所定波長の紫外線の照射によって引き起こされる光化学反応を利用した治療法で、標的組織中に活性酸素を生成させ、該活性酸素の作用によって標的組織を壊死させるものであり、癌の治療に応用されている（例えば、非特許文献１参照）。PDTによる実際の癌の治療では、あらかじめ患者に光感受性薬剤を静注し、該薬剤を腫瘍組織に取り込ませた後に、該薬剤の励起波長と一致する波長のレーザー（エキシマレーザー）光の照射が行われている。このレーザー照射によって腫瘍組織に取り込まれた薬剤が励起され、一部の励起分子は三重項状態になる。次いで、この励起三重項分子が腫瘍組織内に溶存している分子状の酸素と接触するとエネルギーが分子状酸素に伝達され、分子状酸素は活性化されて一重項酸素になる。一重項酸素は非常に反応性に富むため、腫瘍細胞内の生理活性分子を酸化・変性させ、その結果、アポトーシス等を誘発し、腫瘍細胞を壊死させる。PDTで使用するレーザーは、出力がレーザーメスの約1／100と低い上、薬剤は、腫瘍組織に多く集積するため正常組織への障害を最小限に抑制でき、がん病巣のみを選択的に治療することが可能になる。
【０００３】
今日、PDT用に市販・使用されている光感受性薬剤は、ポリフィマーナトリウム(商品名フォトフリン)のみであるが、トリフルオペラジン(Trifluoperazine：以下、TFPZと表記する)やスルホン化アルミニウムフタロシアニン（Sulfonated Aluminum Phtalocyanine：以下、SALPCと表記する)等も光感受性薬剤として知られている。しかしながら、上記以外の化合物では、光感受性薬剤として使用し得るものについては一切分かっていない。
【非特許文献１】Roder, B., Nather, D., Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng., 1991, 1525, 377-384.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、光線力学的療法に使用される新たな光感受性薬剤及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、ポリカルボン酸化合物で表面処理された蛍光性半導体量子ドットは、所定の波長の紫外線又はレーザー照射により励起されることにより細胞を壊死（死滅）させる作用を発揮すること、及び該蛍光性半導体量子ドットを標的細胞に選択的に結合可能な物質に結合することにより、PDTにおいて光感受性薬剤として使用できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。
【０００６】
即ち、本発明は、下記に掲げる光感受性薬剤及びその製造方法を提供する：
項１．  ポリカルボン酸化合物で表面処理された蛍光性半導体量子ドットが、標的細胞に選択的に結合可能な物質に結合されてなることを特徴とする、光感受性薬剤。
項２．  前記ポリカルボン酸化合物が、硫黄原子を介して蛍光性半導体量子ドットの表面に結合されてなる、項１に記載の光感受性薬剤。
項３．  標的細胞に選択的に結合可能な物質が、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を介して結合してなる、項１又は２に記載の光感受性薬剤。
項４．  標的細胞に選択的に結合可能な物質が抗体である、項１乃至３のいずれかに記載の光感受性薬剤。
項５．  量子ドットの平均粒子径が、5nm以下である、項１乃至４のいずれかに記載の光感受性薬剤。
項６．  ポリカルボン酸化合物がメルカプトコハク酸である、項１乃至５のいずれかに記載の光感受性薬剤。
項７．  標的細胞が、白血病細胞、腫瘍細胞、及びウイルス感染細胞よりなる群から選択される少なくとも１種である、項１乃至６のいずれかに記載の光感受性薬剤。
項８．  (a)項１乃至６のいずれかに記載の光感受性薬剤、及び(b)トリフルオペラジン及びスルホン化アルミニウムフタロシアニンよりなる群から選択される少なくとも1種を含有する、医薬組成物。
項９．  蛍光性半導体量子ドットと２以上のＣＯＯＨ基及びチオール基を有するポリカルボン酸化合物を混合し、硫黄原子を介して該化合物を蛍光性半導体量子ドットに結合し、次いで、該ＣＯＯＨ基を介して標的細胞に選択的に結合可能な物質を結合することを特徴とする、光感受性薬剤の製造方法。
【０００７】
以下、本発明について詳細に説明する。
【０００８】
本発明の光感受性薬剤は、ポリカルボン酸化合物で表面処理された蛍光性の（蛍光を発する）半導体量子ドットが、標的細胞に選択的に結合可能な物質に結合されてなることを特徴とするものである。
【０００９】
本発明の光感受性薬剤に使用される蛍光性半導体量子ドットは、その励起子のボーア半径以下であればよく、その平均粒子径の一例として５ｎｍ以下、好ましくは１〜５ｎｍ程度が例示される。代表的な蛍光性半導体量子ドットであるCdS、CdSe、及びCdTeのボーア半径は、それぞれ30 nm、11.2 nm、及び7.8 nmである。
【００１０】
蛍光性半導体量子ドットとしては、例えば、II-VI族の半導体として、CdS、CdSe、CdTe、ZnS、ZnSe、ZnTe等が挙げられ、III-V族としてInPやGaP等が挙げられる。更に、(In、Ga)Pのように複数の金属種を含むもの、或いは、Cd（Se、Te）やGa(As、P)のように複数の６B族原子もしくは５B族原子を含むものを用いることもできる。また、CdSe/ZnS  コア／シェル  ナノ結晶のように、ある種のナノ結晶をコアとして他種の半導体物質を被覆した構造の蛍光性半導体量子ドットも利用することができる。これらの蛍光性半導体量子ドットの中で、CdSeが、簡便に応用でき、紫外線照射によって標的細胞を死滅させる作用を効果的に発揮できるため特に好ましい。CdSeは、高い発光効率を示し、サイズを2.3nmから5.5nmまで制御することによって、470nmから620nmまでの蛍光色を得ることができる。
【００１１】
ポリカルボン酸化合物により表面処理された蛍光性半導体量子ドットは、２以上のカルボキシル基と蛍光性半導体量子ドットの結合可能な官能基（例えばＳＨ基）を有する化合物（即ちポリカルボン酸化合物）と、蛍光性半導体量子ドットとを水溶液中で反応させることにより該量子ドット表面に該化合物を結合させ、ＣＯＯＨ基により水溶性になった量子ドットを回収することによって得ることができる。上記のポリカルボン酸化合物としては、メルカプトコハク酸、２，３−ジメルカプトコハク酸などのカルボキシル基（ＣＯＯＨ）を２以上有する化合物が挙げられる。
【００１２】
ポリカルボン酸化合物に関し、水溶性向上の観点からはチオール基（ＳＨ）が１つで、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を２以上有する化合物が好ましい。
【００１３】
一方、２，３−ジメルカプトコハク酸のようなチオール基を複数有する化合物は、量子ドットとの結合性が強まる可能性があり、利点も期待される。
【００１４】
これらの化合物は、チオール基（−SH）を介して蛍光性半導体量子ドットを構成する金属と結合することができ、チオール基以外の２以上のカルボキシル基を有する水溶性量子ドットを得ることができる。ＨＳ−ＣＨ2ＣＯＯＨのようなモノカルボン酸を用いて量子ドットを処理すると、水溶液中での十分な安定性が得られず、蛍光性半導体量子ドットが凝集等により沈殿し、標的細胞に結合可能な物質との結合（連結）が十分に行えない。一方、本発明のポリカルボン酸化合物を用いた場合には、蛍光性半導体量子ドットの凝集が起こらず、２４〜４８時間、或いはそれ以上の長時間に渡って水溶液中で溶解状態となり、凝集による沈殿は実質的に起こらない。
【００１５】
蛍光性半導体量子ドットに水溶性を付与するための該処理は、例えば蛍光性半導体量子ドット１ｇに対し、ポリカルボン酸化合物を通常０．００５〜０．１モル程度、好ましくは０．０２〜０．０３モル程度使用し、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素、メタノール、エタノールなどのアルコール、酢酸エチルなどのエステル、ＴＨＦ、ジオキサンなどのエーテル、ＤＭＦ，ＤＭＳＯ、ホルムアミド、アセトニトリル、酢酸などの有機溶媒の存在下に、０℃から溶媒の沸点程度の温度下に１０分から２４時間程度反応させることにより、有利に行うことができる。反応終了後は、溶媒を留去することで、これらの化合物で表面処理された水溶性の蛍光性半導体量子ドットを得ることができる。
【００１６】
例えば、ポリカルボン酸化合物としてメルカプトコハク酸を使用する場合、CdSe コアナノ結晶10 mgあたりメルカプトコハク酸を10〜150 mg、好ましくは30〜40 mg使用するのがよい。
【００１７】
過剰量のポリカルボン酸化合物が存在すると、溶液／懸濁液が濁る原因になるので、Vivaspin 限外濾過等により過剰量のポリカルボン酸化合物を除去するのが好ましい。多量のポリカルボン酸化合物を使用すると、限外濾過等により過剰量のメルカプトコハク酸を除去するのが困難であり、溶液／懸濁液は曇る(cloudy)傾向にある。適正な量のポリカルボン酸化合物を使用すると、除去が容易であるので、透明な溶液を得ることができる。
【００１８】
本発明の光感受性薬剤に使用される「標的細胞に選択的に結合可能な物質」としては、標的細胞に選択的に結合可能であって、薬学的に許容される限り、特に制限されない。上記蛍光性半導体量子ドットとの結合（連結）を容易に行うためには、アミノ基を有していることが望ましい。
【００１９】
ここで、標的細胞とは、本発明の光感受性薬剤により死滅させるべき細胞であり、例えば、白血病細胞、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞等の疾病の原因遺伝子の発現あるいは外来遺伝子の発現が原因となっている細胞が例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
標的細胞に選択的に結合可能な物質の具体例としては、標的細胞に選択的に結合する抗体又はそのフラグメント、標的細胞の細胞表面に特異的に存在している糖鎖に結合するレクチン等のタンパク質やペプチドが挙げられる。
【００２１】
上記抗体としては、例えば、IgG、IgA、IgM、IgE等が挙げられる。これらの中で好ましくは、IgGである。標的細胞に選択的に結合する抗体は、従来公知の方法に従って製造される。
【００２２】
また、上記の抗体のフラグメントとしては、上記抗体をペプシン等のプロテアーゼで処理することにより得られるＦ（ab'）2、更にＦ（ab'）2をメルカプタンで還元することにより得られるＦab'、抗体をパパイン、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン等の蛋白質分解酵素で分解することにより得られるＦab等が例示される。
【００２３】
また、上記レクチンとしてはドリコスマメレクチン（DBA）、ダイズマメレクチン（SBA）、小麦胚芽凝集素（WGA）、トウアズキ種子レクチン（abrin-a）等が挙げられる。これらの中で好ましくはDBA、SBA、abrin-aである。標的細胞に選択的に結合するレクチンは、従来公知の方法によって製造される。
【００２４】
例えば、標的細胞が白血病細胞の場合であれば、標的細胞に選択的に結合可能な物質の具体例として、抗ＣＤ９０抗体又はそのフラグメントが例示される。また、標的細胞が悪性黒色腫(メラノーマ)細胞であれば、標的細胞に選択的に結合可能な物質の具体例として、抗ＧＤ３抗体又はそのフラグメントが例示される。
【００２５】
本発明の光感受性薬剤は、上記蛍光性半導体量子ドットと標的細胞に選択的に結合可能な物質とが結合されている限り、その結合形態については特に制限されないが、好適には、蛍光性半導体量子ドットの表面上のＣＯＯＨ基を介して標的細胞に選択的に結合可能な物質を結合されてなるものが例示される。このように、蛍光性半導体量子ドットの表面上のＣＯＯＨ基を介して標的細胞に選択的に結合可能な物質を結合させるには、1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, hydrochloride（以下、EDCと表記する）等のペプチド合成における縮合剤を用いて、蛍光性半導体量子ドットの表面上のＣＯＯＨ基を活性化した後に、該基を標的細胞に選択的に結合可能な物質のアミノ基との間で脱水縮合させればよい。具体例として、蛍光性半導体量子ドットを抗ＣＤ９０抗体に結合させるスキームを図１に示す。
【００２６】
本発明の光感受性薬剤は、静脈、皮下、筋肉、腹膜内等の注射により投与され、光線力学的療法のフォトセンシタイザとして使用される。具体的な使用態様として、当該光感受性薬剤を投与して、当該光感受性薬剤を標的細胞に結合させた後に、標的細胞に対して、蛍光性半導体量子ドットを励起させる波長の光を照射する方法が挙げられる。このように、光照射により蛍光性半導体量子ドットを励起させることにより、標的細胞を死滅させることができる。
【００２７】
本発明の光感受性薬剤を用いた光線力学的療法において、照射される光は、該光感受性薬剤の蛍光性半導体量子ドットを励起できる波長を含むものであれば、特に制限されないが、非標的細胞や人体に吸収されないもの（悪影響を及ぼさないもの）であることが望ましい。好適な照射光としては、紫外線が挙げられる。
【００２８】
本発明の光感受性薬剤を用いて光線力学的療法を行うにあたり、患者に投与する光感受性薬剤の量、光感受性薬剤の投与から光照射を開始するまでの時間、照射する光の強度、照射時間等については、治療対象疾患（標的細胞の種類）、使用する光感受性薬剤の種類等に応じて、適宜設定される。
【００２９】
また、本発明の光感受性薬剤は、TFPZ又はSALPCと組み合わせて、光線力学的療法に使用されることにより、標的細胞を死滅させる作用を一層増強することができる。故に、光線力学的療法のフォトセンシタイザの一態様として、(a)本発明の光感受性薬剤と(b)TFPZ及びSALPCよりなる群から選択される少なくとも1種を含有する医薬組成物が、好適に使用される。当該医薬組成物において、(a)本発明の光感受性薬剤と(b)の化合物の比率については特に制限されないが、例えば、(b)の化合物１重量部に対して、(a)本発明の光感受性薬剤が１０〜１０００重量部となる比率が例示される。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の光感受性薬剤は、光線力学的療法においてフォトセンシタイザとして使用され、腫瘍細胞や白血病細胞等の標的細胞を選択的に死滅させることができる。本発明の光感受性薬剤は、直径数使用nmの粒子状の極めて微小な量子ドットが光感受性物質として結合されているため、細胞との親和性に優れていたり、細胞外ではなく細胞内でも効果を発揮させる場合に、細胞内にトランスフェクション(導入)し易いという特徴を備えている。
【００３１】
本発明者等による種々の実験を行った結果、本発明の光感受性薬剤の作用メカニズムは下記のように推定された。本発明の光感受性薬剤は、「標的細胞に選択的に結合可能な物質」が標的細胞表面に結合することで、標的細胞表面にのみ「蛍光性半導体量子ドット」を存在させる。そこに、励起光が照射されると量子ドットは該光のエネルギーを吸収して蛍光を発する。しかし、吸収されたエネルギーの一部は、量子ドット付近に存在する酸素と反応して、活性酸素や１重項酸素などの生体にとって有毒な酸素種を発生させる。これらが、標的細胞、多くの場合アポトーシスと呼ばれるあらかじめプログラムされた自発的な細胞死が起こらない細胞、にアポトーシスを誘導し、殺してしまうこと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
１．量子ドットの水溶性化と抗体とのコンジュゲート化
遮光下で保存していたCdSeナノ結晶をクロロホルム溶液に分散させ、その濃度を25mg/mlに調整した。濃度調整の目安として、吸収端付近の最大となる吸光度の値（以下、OD at MAXと表記する）が、0.5となるようにした。12.75mlの当該CdSeナノ結晶溶液に対してメタノールに溶解した2.5mlのメルカプトコハク酸（HOOC-CH2-CH(SH)-COOH）溶液（30mg/ml、アルドリッチ社）を添加し、室温、遮光下で、溶液が白濁するまで約2時間インキュベートした。用いたクロロホルムとメタノールは吸引エヴァポレートにより除去し、CdSeナノ結晶の表面にメルカプトコハク酸がメルカプト基に由来する硫黄原子（-S-）を介して結合した表面処理量子ドットの乾燥粉末を得た。当該乾燥粉末に5.5mlのPBS(-)溶液（pH7.3）を添加し、緩やかに混合することにより、溶解させた。当該溶解液は4℃で20分間遠心（12,000×g）し、凝集していない水溶性CdSeナノ結晶を含む中間水層画分を注意深く回収した。さらに回収した当該画分は4℃で一晩保持した後、4℃で20分間遠心（1,200×g）し、不溶物を除去した。水溶性CdSeナノ結晶を含む上清はVivaspin-20（分画分子量：3,000MW、ザルトリウス社製）を用いた遠心ろ過濃縮により、分子量3,000以下のものを除いた後、さらにVivaspin-20（分画分子量：30,000MW、ザルトリウス社製）を用いた遠心ろ過濃縮により分子量30,000以上のものを除き、精製、濃縮した。最終的にはVivaspin-20により水溶性のCdSeナノ結晶を濃縮し、PBS(-)溶液（pH7.3）中で目的の濃度（OD at MAX =0.5）に調整した。
【００３３】
かくして調製した水溶性CdSeナノ結晶（以下、Qdotと表記する）と、抗CD90抗体（以下、CD-90と表記する）のコンジュゲートは、図１に示す方法に従って調製した。具体的な方法は、次の通りである。150mMのPBS溶液（pH7.3）に溶解した1.3mlのQdot溶液に対して、PBS溶液（pH7.3）で調製した150μlのCD-90溶液（5mg）を添加、混合した。さらに当該混合溶液に水で7.2mg/mlの濃度に調製した1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, hydrochloride溶液を添加、混合し、2時間、室温で反応させた。未反応のQdot及び反応副産物のイソウレアはVivaspin-6（限界分子量：3,000MW、ザルトリウス社製）を用いて遠心ろ過濃縮により除去した。かくして精製された「CD-90が結合されてなるQdot」（以下、QD-CD90と表記する）は、同様に遠心ろ過濃縮法で1mg/mlの濃度にPBS溶液（pH7.3）で調整した。
【００３４】
２．白血病細胞とQD-CD90の反応
QD-CD90（0.1mgのQdotに相当）を、PBS(-)溶液（pH7.3）で1.0 X 106 cells/mlに調整したJurkat細胞（急性リンパ性白血病細胞；急性リンパ性罹患者由来のもので、株化されたものを東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより分譲）1.2mlに添加し、30分間室温で反応させた。未反応のQD-CD90は遠心（1000Xg/10min）沈殿を3回繰り返すことにより除去した。
【００３５】
３．QD-CD90結合Jurkat細胞の紫外線照射
上記で得られたQD-CD90結合Jurkat細胞（1.0 X 106 cells/ml）を、健常人の末梢血から分離した正常白血球細胞（1.0 X 106 cells/ml）と容量比１：１で混合した後、混合細胞溶液に10分間紫外線照射（1.4 mW；UV lamp type UV-B 300 nm, UTF-34U Sigma Koki filter）、10分間消光、の操作を3回繰り返した。
【００３６】
また、上記混合細胞溶液に、TFPZ（最終濃度1μM、480x10-6 mg/ml）又はSALPC（最終濃度1μM、560x10-6 mg/ml）を含有させたものについても、上記と同様の条件で紫外線の照射を行った。
【００３７】
４．細胞の分離とフローサイトメトリーによる確認
紫外線照射後、ダイズレクチン：SBAを固定化したSepharose 6MBカラム（親和性カラムクロマト）に両細胞を供与した。同カラムに吸着することなく素通りした画分を正常リンパ球細胞、また、同カラムに吸着し、N-アセチルガラクトサミンによって溶出される画分をQD-CD90結合Jurkat細胞、として実験に用いた。なお、溶出画分の細胞の確認は、抗CD44PE抗体（正常リンパ球細胞と特異的に反応）と抗CD90FITC抗体（Jurkat細胞と特異的に反応）を用いてフローサイトメトリーにより行った。
【００３８】
５．紫外線照射による細胞の生存率に及ぼす影響
細胞の生存率はCellTiter Glo（プロメガ社）を用いて細胞のATP量を測定することにより行った。その結果、紫外線処理した正常リンパ球細胞の生存率が未処理のものと比較して９３％の生存率を保持していたのに対して、紫外線処理したQD-CD90結合Jurkat細胞の生存率は未処理のものと比較して80％まで低下した。また、TFPZ、及びSALPCの共存在下で同様に処理した場合は、QD-CD90結合Jurkat細胞の生存率は未処理のものと比較して、それぞれ64.5％、及び57％まで低下し、光感受性効果が顕著に増加することが判明した（表１参照）。
【００３９】
【表１】
2006137682.tif 000002
以上の結果から、QD-CD90は、白血病細胞に対して結合し、紫外線の照射を受けることにより該細胞を選択的に死滅させることが確認され、光線力学療法におけるフォトセンシタイザとして有用であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】蛍光性半導体量子ドット(CdSe)を抗ＣＤ９０抗体に結合させるスキーム示す図である。
【図１】
2006137682.tif 000003