(57)【要約】【課題】  中温中性の環境条件でなくとも、特に高温・高アルカリの環境条件下であっても、脱窒能を十分に発揮でき、効率よく硝酸を除去できる、新しい脱窒菌株およびこれを用いた硝酸の除去方法を提供する。【解決手段】  アノキシバチルス属（Anoxybacillus属）に属し、硝酸を亜硝酸に還元し、かつ、窒素分子に還元する能力を有すること。【選択図】    図１
2006166875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アノキシバチルス属（Anoxybacillus属）に属し、硝酸を亜硝酸に還元し、かつ、窒素分子に還元する能力を有することを特徴とする脱窒菌株。
【請求項２】
菌株が、アノキシバチルス  パシュキノエンシス（Anoxybacillus pushchinoensis）AT-1（NITE  P-33）または、アノキシバチルス  パシュキノエンシス（Anoxybacillus pushchinoensis）AT-2（NITE  P-34）である請求項１記載の脱窒菌株。
【請求項３】
請求項１または２記載の脱窒菌株を用いた硝酸の除去方法であって、脱窒菌株を硝酸汚染物に添加し、温度35℃〜65℃の温度条件範囲およびpH 6.5〜10.5のpH条件範囲で、硝酸を亜硝酸に還元させ、かつ、窒素分子に還元させて硝酸の脱窒処理を行うことを特徴とする硝酸の除去方法。
【請求項４】
窒素分子の還元過程は、好気条件下で行う請求項３記載の硝酸の除去方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱窒菌株およびこれを用いた硝酸の除去方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
「脱窒」は一般に、微生物が嫌気的条件下で硝酸態窒素あるいは亜硝酸態窒素を、N2あるいはN20を生成する過程のことをいう。この脱窒は、水中や土壌中においてN03等の窒素酸化物が、N2等のガス態の窒素に還元されるので、生物圏から大気圏へ放出される窒素の主要な経路として地球上の窒素循環に大きな役割を果たしている。この脱窒を行う微生物（細菌）のことを脱窒菌という。
【０００３】
そして、現在、このような微生物（脱窒菌）の脱窒の原理を利用した上水用の硝酸の除去方法が開発されつつある。この方法では、亜硝酸還元酵素、硝酸還元酵素、一酸化窒素還元酵素、亜酸化窒素還元酵素等の一連の脱窒系酵素を産生する各種の微生物が用いられ、これらの酵素の働きにより処理水中の硝酸態・亜硝酸態窒素は全て分子状窒素として大気中に還元される。
【０００４】
近年では、上記のような脱窒能を有する微生物（脱窒菌）およびこれを用いた硝酸の除去方法を改良した方法が開発されている。たとえば、亜硝酸の硝酸への酸化と、亜硝酸から亜酸化窒素への還元を短時間で同時に行うことのできる脱窒能を有する微生物（脱窒菌）およびこれを用いた硝酸の除去方法が提案されている（特許文献１）。
【特許文献１】特開2002-78479号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、多くの微生物の至適増殖環境は中温中性条件（一般に、中温は30℃〜40℃程度、中性はpH 7前後である）であることを考慮すると、上記特許文献１のような脱窒能を有する微生物（脱窒菌）およびこれを用いた硝酸の除去方法は、その至適温度が30℃および至適pHが7.8（つまり、中温中性）の環境条件下で行われるため、自然環境下では他の雑菌も増殖してしまい、脱窒菌の脱窒能を十分に発揮できず、持続性が低いという問題があった。また、硝酸性窒素が多く含まれる低栄養の廃水を微生物で処理する場合においても、その微生物は中温中性菌であるため、上記と同様の問題があった。
【０００６】
さらに、たとえば、農畜産廃棄物の堆肥化過程における環境条件等のように、高温・高アルカリ（高pH）の環境条件下において、脱窒能を十分に発揮し得る脱窒菌およびこれを用いた効率のよい硝酸の除去方法は知られていない。
【０００７】
そこで、本発明は、以上の背景から、従来の問題を解消し、中温中性の環境条件でなくとも、特に高温・高アルカリの環境条件下であっても、脱窒能を十分に発揮でき、効率よく硝酸を除去できる、新しい脱窒菌株およびこれを用いた硝酸の除去方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するものとして、第１にはアノキシバチルス属（Anoxybacillus属）に属し、硝酸を亜硝酸に還元し、かつ、窒素分子に還元する能力を有することを特徴とし、第２には、菌株が、アノキシバチルス  パシュキノエンシス（Anoxybacillus pushchinoensis）AT-1（NITE  P-33）または、アノキシバチルス  パシュキノエンシス（Anoxybacillus pushchinoensis）AT-2（NITE  P-34）であることを特徴とする。
【０００９】
第３には、上記第１の発明または第２の発明の脱窒菌株を用いた硝酸の除去方法であって、脱窒菌株を硝酸汚染物に添加し、温度35℃〜65℃の温度条件範囲およびpH 6.5〜10.5のpH条件範囲で、硝酸を亜硝酸に還元させ、かつ、窒素分子に還元させて硝酸の脱窒処理を行うことを特徴とし、そして、第４には、窒素分子の還元過程は、好気条件下で行うことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
第１の発明によれば、中温中性の環境条件でなくとも、特に高温・高アルカリの環境条件下であっても、脱窒能を十分に発揮でき、効率よく硝酸を除去できる。
【００１１】
第２の発明によれば、上記第１の発明の効果に加えて、脱窒能がさらに向上するとともに、さらに効率よく硝酸を除去できる。
【００１２】
第３の発明によれば、中温中性の環境条件でなくとも、特に高温・高アルカリの環境条件下であっても、脱窒能を十分に発揮でき、効率よく硝酸を除去できる。
【００１３】
第４の発明によれば、上記第３の発明の効果に加えて、脱窒能がさらに向上するとともに、さらに効率よく硝酸を除去できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について詳しく説明する。
【００１５】
本発明の脱窒菌株は、アノキシバチルス属（Anoxybacillus属）に属し、硝酸を亜硝酸に還元し、かつ、窒素分子に還元する能力を有することを特徴とした微生物である。このとき、本発明の脱窒菌においては、窒素分子に還元する過程における雰囲気の条件は、好気的条件（たとえば、溶存酸素濃度6ppm以上）であることが、効率よく窒素分子を還元するために好ましい。もちろん、本発明の脱窒菌株は、従来のように嫌気条件下でもその機能を十分に発揮することができる。
【００１６】
このような特徴を有する脱窒菌によって、中温中性の環境条件でなくとも、特に高温・高アルカリの環境条件下であっても、脱窒能を十分に発揮でき、効率よく硝酸を除去することができる。
【００１７】
また、このような本発明の脱窒菌は、土壌等の自然界（たとえば、田畑の土、温泉の土、下水処理施設近辺の土、牧場の土等）から単離することができる。特に、田畑の土から得られた、アノキシバチルス  パシュキノエンシス（Anoxybacillus pushchinoensis）AT-1（NITE  P-33）およびアノキシバチルス  パシュキノエンシス（Anoxybacillus pushchinoensis）AT-2（NITE  P-34）は、本発明の脱窒菌株として好ましい。
【００１８】
このAT-1株およびAT-2株の単離（単菌分離）は、具体的には：
＜１＞試料として各土壌を採取し、ペプトン硝酸培地（1Ｌ当たりの組成：0.3％ペプトンS（日本製薬）、0.02％酵母エキス（ディフコ）、0.1％硝酸カリウムを、水に溶解してオートクレーブ滅菌し、10％炭酸ナトリウム溶液でpHを10.0に調整した）に投入し、3日間60℃で培養した。
＜２＞培養3日後、ダ-ラム管で気泡が認められた試料を、脱窒反応陽性試料として、培養上清1％を新しいペプトン硝酸培地に植菌した。そして、上記と同様の培養を繰り返し、3回の培養で陽性が認められた1試料を、ペプトン硝酸寒天培地（1Ｌ当たりの組成：0.3％ペプトンS（日本製薬）、0.02％酵母エキス（ディフコ）、0.1％硝酸カリウム、2.0％寒天末を、水に溶解してオートクレーブ滅菌し、10％炭酸ナトリウム溶液でpHを10.0に調整した）に植菌し、単菌分離した。
＜３＞pH 10.0、50℃で単菌分離した結果、AT-1株およびAT-2株を取得できた。
＜４＞このAT-1株およびAT-2株をペプトン硝酸培地で培養し、生成されたガス成分をガスクロマトグラフィーで分析したところ、99％が窒素であることから、AT-1株およびAT-2株は脱窒菌であると確認できた。なお、生成ガスの分析条件の条件は、以下のとおりである。すなわち：
＜１＞ガスクロマトグラフィー装置：島津製作所、GC-14AT
＜２＞カラム：モレキュラーシーブ-5A、60〜80メッシュ、2m
＜３＞カラム温度：50℃、試料気化室温度：100℃、検出温度：100℃
＜４＞検出器：TCD、キャリーガス：He
＜５＞試料注入量：0.25ml
である。
【００１９】
また、このAT-1株およびAT-2株は、両者ともに、2004年11月9日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに特許微生物として寄託されている（AT-1株の受託番号：NITE  P-33；AT-2株の受託番号：NITE  P-34）。
【００２０】
このAT-1株の菌学的性質は、以下のとおりである。
１．表現形質
（１）細胞形態
桿菌（大きさ:0.7〜0.8× 2.0〜3.0 μm）
運動性                        −
グラム染色                    ＋
内生胞子                      ＋
ＧＣ含量  42％
（２）生理的性質
ゼラチン液化                  −
リトマスミルク                −
インドールの生成              −
硝酸塩の還元                  ＋
アセトインの産生              −
硫化水素の生成                −
デンプンの加水分解            ＋
クエン酸の利用                −
ウレアーゼ                    −
オキシダーゼ                  ＋
カタラーゼ                    ＋
酸素に対する態度  通性嫌気性
OFテスト（グルコース）      陰性
糖の分解                    発酵
・Ｌ−アラビノース            −
・Ｄ−キシロース              −
・Ｄ−グルコース              ＋
・Ｄ−マンノース              −
・Ｄ−フラクトース            ＋
・Ｄ−ガラクトース            −
・マルトース                  ＋
・スクロース                  ＋
・ラクトース                  −
・トレハロース                ＋
・Ｄ−ソルビトール            −
・Ｄ−マンニトール            ＋
・イノシトール                −
・グリセリン                  −
・デンプン                    ＋
・ズルシトール                −
・イヌリン                    ＋
２．生育温度とpH
（１）生育温度（ペプトン硝酸培地、pH 10）
30℃    −
37℃    ＋
60℃    ＋
70℃    −
（２）生育pH（ペプトン硝酸培地、60℃）
pH 6      −
pH 7      ＋
pH 10    ＋
pH 11    −
次に、AT-2株の菌学的性質は、以下のとおりである。
１．表現形質
（１）細胞形態
桿菌（大きさ:0.70〜0.8× 1.5〜2.0 μm）
運動性                        ＋
グラム染色                    ＋
内生胞子                      ＋
ＧＣ含量  42％
（２）生理的性質
ゼラチン液化                  −
リトマスミルク                −
インドールの生成              −
硝酸塩の還元                  ＋
アセトインの産生              −
硫化水素の生成                −
デンプンの加水分解            ＋
クエン酸の利用                −
ウレアーゼ                    −
オキシダーゼ                  −
カタラーゼ                    ＋
酸素に対する態度      通性嫌気性
生育温度  40℃〜60℃で良好な生育
生育pH    pH 7〜10で良好な生育
OFテスト（グルコース）      陰性
糖の分解                    発酵
・Ｌ−アラビノース            −
・Ｄ−キシロース              −
・Ｄ−グルコース              ＋
・Ｄ−マンノース              −
・Ｄ−フラクトース            ＋
・Ｄ−ガラクトース            −
・マルトース                  ＋
・スクロース                  ＋
・ラクトース                  −
・トレハロース                ＋
・Ｄ−ソルビトール            −
・Ｄ−マンニトール            ＋
・イノシトール                −
・グリセリン                  −
・デンプン                    ＋
・ズルシトール                −
・イヌリン                    ＋
２．生育温度とpH
（１）生育温度（ペプトン硝酸培地、pH 10）
30℃    −
37℃    ＋
60℃    ＋
70℃    −
（２）生育pH（ペプトン硝酸培地、60℃）
pH 6      −
pH 7      ＋
pH 10    ＋
pH 11    −
上記のような菌学的性質を有する微生物（脱窒菌）は、通常の細菌用の培地で培養増殖させることができる。たとえば、ペプトン硝酸培地等であることが好ましい。そして、本発明の脱窒菌の培養に要する時間は、脱窒活性を十分に発揮できる程度まで培養し、通常は一晩培養する。そして、培養終了後、周知技術で培地から本発明の脱窒菌を採取し、硝酸汚染物（たとえば、堆肥化中の農畜産廃棄物や硝酸性窒素を含む低栄養性の廃水等）に添加して、硝酸の除去反応に用いることができる。
【００２１】
すなわち、本発明は、上記の脱窒菌株を用いた硝酸の除去方法も提供する。具体的には、上記のとおりの脱窒菌株を硝酸汚染物に添加し、硝酸を亜硝酸に還元させ、かつ、窒素分子に還元させて硝酸の脱窒処理を行う。その際の環境条件は、温度35℃〜65℃の温度条件範囲およびpH 6.5〜10.5のpH条件範囲であることが好ましい。特に、温度条件については、40℃〜60℃の範囲であることが好ましく、またpH条件については、pH 7〜10の範囲であることが好ましい。これによって、従来のように中温中性の環境条件でなくとも、特に高温・高アルカリの環境条件下であっても、脱窒能を十分に発揮させて、効率よく硝酸を除去することができ、硝酸性窒素による汚染物や汚染水の浄化に貢献することができる。
【００２２】
そして、このとき、窒素分子の還元過程における雰囲気の条件は、脱窒能をさらに向上するとともに、さらに効率よく硝酸を除去することを考慮すると、好気条件（たとえば、溶存酸素濃度6ppm以上）の下で行うことが好ましい。
【００２３】
なお、本発明の脱窒菌株は、公知の凍結法（たとえば、-80℃のディープフリーザーや液体窒素にて凍結。保護剤として30％グリセリン液や市販の保護剤を使用）により保管することができる。凍結した脱窒菌株は、常温に戻して、培養または硝酸の除去反応に用いることができる。
【００２４】
以下に実施例を示して、本発明の脱窒菌についてさらに具体的に説明するが、本発明はこの例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
実施例では、本発明の脱窒菌であるAT-１株およびAT-2株を用い、それぞれの作用効果を解析した。
【００２６】
AT-1株およびAT-2株を培養するにあたって、共通事項として、まず培地は、ペプトン硝酸培地を用いた。その組成は（1Ｌ当たり）：
0.3％  ペプトンS、
0.02％  酵母エキス、および
0.1％  硝酸カリウム、
を蒸留水に溶解して混合し、オートクレーブ滅菌後、10％炭酸ナトリウム溶液を用いてpHを10.0に調製した。
【００２７】
次に、培養方法は、11ml容量の試験管に上記のペプトン硝酸培地8mlを入れ、同培地で一晩培養した全培養液を終濃度1％になるように添加し、60℃で静置培養した。
【００２８】
そして、測定方法については、本発明の脱窒菌株の生育度合いは、分光光度計を用いて波長A660の吸光度を測定した。硝酸性窒素の濃度は、塩化バナジウム-ジアゾ化カップリング法（たとえば、Doane T A., and Horwath W R., Analytical Letters, Vol. 36, No. 12, pp. 2713-2722, 2003）で測定した。
実施例１：AT-1株
（１）16S rDNAの塩基配列に基づく分子系統解析
本発明のAT-1株の16S rDNAの塩基配列を定法に従って決定し、DNAデータベース（DDBJ）にアクセスし、FASTAプログラムを用いて、16S rDNA の塩基配列の相同性検索を行った。その結果、公知の菌株Anoxybacillus pushchinoensis K-1と本発明のAT-1株の16S rDNAの相同性が99.1%であることが確認できた。また、DDBJより入手したAnoxybacillus 属および代表的な細菌種の塩基配列を多重整列後、NJ法により分子系統解析を行った結果、本菌株の分子系統樹の位置はAnoxybacillus pushchinoensisと一致した。
（２）分類および同定の結果
本発明のAT-1株の表現形質による分類学的性質に基づき、公知技術（たとえば、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、Bergey's Manual of Determinative  Bacteriology  （9th ed.）等）に従って分類および同定を行った。その結果、AT-1株はAnoxybacillus pushchinoensisと同定することができた。また、AT-1株の16S rDNAの塩基配列に基づく分子系統解析の結果においても、Anoxybacillus pushchinoensisであることが示された。
（３）硝酸性窒素の除去
AT-1株を60℃の温度条件およびpH 10のpH条件の下で、上記のとおりのペプトン硝酸培地で培養した（培養時間：0時間、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間）。結果は、表１および図１に示したとおりであった。
【００２９】
【表１】
2006166875.tif 000003
【００３０】
AT-1株を培養する時間が長いほど、AT-1株は、吸光度の増加のとおり当然に増殖し、これに比例して、硝酸性窒素(mg/ml)は減少することが確認できた。つまり、本発明のAT-1株によって、効率よく硝酸を除去することができた。
実施例２：AT-2株
（１）16S rDNAの塩基配列に基づく分子系統解析
実施例１のAT-1株と同様に、AT-2株の16S rDNAの塩基配列を決定し、DDBJにアクセスして、FASTAプログラムを用いて、16S rDNA の塩基配列の相同性検索を行った。その結果、AT-2株においても、Anoxybacillus pushchinoensis K-1との塩基配列の相同性は99.1%であった。また、DDBJより入手したAnoxybacillus 属および代表的な細菌種の塩基配列を多重整列後、NJ法により分子系統解析を行った結果、AT-2株の分子系統樹の位置についても、AT-1株と同様にAnoxybacillus pushchinoensisと一致した。
（２）分類および同定の結果
本発明のAT-2株の表現形質による分類学的性質に基づき、公知技術（たとえば、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、Bergey's Manual of Determinative  Bacteriology  （9th ed.）等）に従って分類および同定を、実施例１のAT-1と同様に行った。その結果、AT-2株は、AT-1と同様にAnoxybacillus pushchinoensisと同定することができた。また、AT-2株の16S rDNAの塩基配列に基づく分子系統解析の結果においても、Anoxybacillus pushchinoensisであることが示された。
（３）硝酸性窒素の除去
AT-2株を60℃の温度条件およびpH 10のpH条件の下で、上記のとおりのペプトン硝酸培地で培養した（培養時間：0時間、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間）。結果は、表２および図２に示したとおりであった。
【００３１】
【表２】
2006166875.tif 000004
【００３２】
表２および図２に示したとおり、AT-2株を培養する時間が長いほど、AT-1株と同様にAT-2株は、吸光度の増加のとおり当然に増殖し、これに比例して、硝酸性窒素(mg/ml)は減少することが確認できた。つまり、本発明のAT-2株によっても、効率よく硝酸を除去することができた。
【００３３】
もちろん、本発明は以上の例によって限定されるものではなく、その細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の脱窒菌であるAT-1株における硝酸性窒素（硝酸）の除去能力を示した図である。
【図２】本発明の脱窒菌であるAT-2株における硝酸性窒素（硝酸）の除去能力を示した図である。
【図１】
2006166875.tif 000005
【図２】
2006166875.tif 000006