(57)【要約】【課題】本発明の課題はＵＧＴ１A４の核酸配列のエキソン１領域の遺伝子変異の検査方法を提供するとともに、本検査方法を用いて薬剤代謝の判定、予測又は検査方法、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症の検査方法を提供することである。【解決手段】ＵＧＴ１A４の核酸配列のエキソン１領域の変異を検索したところ、UGT1A4酵素分子にアミノ酸置換を引き起こす新たな変異を見出し、それらを調べることにより、ＵＧＴ１A４活性の予測が可能であること、さらに薬剤代謝、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症に深く関与していることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ１A４）の核酸配列の検査方法であって、配列番号１で表した配列の、１４２番目のｔからｇ（L４８V）の変異を検査することを特徴とするＵＧＴ１A４の核酸配列の検査方法。
【請求項２】
請求項１に記載のＵＧＴ１A４の核酸配列の検査によるUGT1A４酵素分子の機能、酵素活性を検査又は予測する方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法による薬物代謝能、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症の検査方法。
【請求項４】
配列番号２、３、４、５、6、７、８及び９に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのいずれか１または少なくとも２つを用いる請求項１〜３のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項５】
請求項１〜５のいずれか１に記載の検査方法に用いる検査装置、試薬又はキット。
【請求項６】
請求項４又は５のいずれか１に記載の検査方法に用いるオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1種を組み込んでなる検査装置、試薬又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は臨床検査の分野で用いられ、とりわけグルクロン酸抱合に関与する酵素の核酸配列検査の方法及びそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
UDP-グルクロン酸転移酵素（UGT）により触媒されるグルクロン酸抱合はビリルビンをはじめ種々の薬剤や毒物の代謝、解毒に重要な役割をしている。ヒトUGT１遺伝子群は少なくとも１３個の異なるエキソン１と共通エキソン２〜５からなり、1つのエキソン１が共通エキソン２〜５に対してスプライシングする（非特許文献１）。それぞれのUGTは広い基質特異性と独自の生体組織内分布を有している。
【０００３】
UGT1A４は肝臓や胃で発現しており、１級アミン、３級アミン、ベータナフチルアミン、４−アミノビフェニル、ベンジジン、アンドロゲン、プロゲスチン、及びサポゲニンなどの植物ステロイド類等をグルクロン酸抱合することが知られている（非特許文献２など）。最近、肝細胞癌の患者において、UGT1A4の機能上の多型が存在することが報告されている（非特許文献３）。
【非特許文献１】J.Biol.Chem.(1992) 267, 1043-1047
【非特許文献２】Drug Metab. Dispos. （1998）26、507−512
【非特許文献３】Hepatorogy（2004）39, 970-977
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題はＵＧＴ１A４の核酸配列のエキソン１領域及びその下流域のイントロンの遺伝子変異の検査方法を提供するとともに、本検査方法を用いて薬剤代謝の判定、予測又は検査方法、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症の検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らはＵＧＴ１A４の核酸配列のエキソン１領域及びその下流域のイントロン領域の変異を検索したところ、UGT1A４酵素分子にアミノ酸置換を引き起こす新たな変異を見出し、それらを調べることにより、ＵＧＴ１A４活性の予測が可能であること、さらに薬剤代謝、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症に深く関与していることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
本発明は、以下の構成からなる。
１、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ１A４）の核酸配列の検査方法であって、配列番号１で表した配列の、１４２番目のｔからｇ（L４８V）の変異を検査することを特徴とするＵＧＴ１A４の核酸配列の検査方法。
２、前記１に記載のＵＧＴ１A４の核酸配列の検査によるUGT1A４酵素分子の機能、酵素活性を検査又は予測する方法。
３、前記２に記載の方法による薬物代謝能、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症の検査方法。
４、配列番号２、３、４、５、6、７、８及び９に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのいずれか１または少なくとも２つを用いる前記１〜３のいずれか１に記載の検査方法。
５、前記１〜４のいずれか１に記載の検査方法に用いる検査装置、試薬又はキット。
６、前記４又は５のいずれか１に記載の検査方法に用いるオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1種を組み込んでなる検査装置、試薬又はキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、これまで知られていなかったUGT1A４の新しい変異を検査する方法を提供し、この検査方法を用いることにより、薬剤代謝能、癌、黄疸、冠動脈疾患、骨粗鬆症 の検査、予測が可能になるといった格段の効果をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（検査対象）
本発明により検査対象は薬物代謝能、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症があげられる。
薬物代謝はチトクロームP450による代謝経路に加えて、ＵＧＴ１によるグルクロン酸抱合による代謝経路も重要であり、本発明の検査方法を用いることによりグルクロン酸抱合されて代謝される薬物の薬効と副作用の予測が可能になる。本発明の方法によって検査されうる対象となる薬剤の例として、１級アミン、３級アミン、ベータナフチルアミン、４−アミノビフェニル、ベンジジン、アンドロゲン、プロゲスチン、クロザピン等が挙げられる。
【０００９】
ビリルビンの肝臓からの排出には、ＵＧＴ１が必須であり、黄疸の原因を検査するために本発明は有効である。本発明は、さらに乳がん、大腸がんをはじめとする種々の癌との関連を検査する方法としても有用であり、冠動脈疾患や骨粗鬆症の発症を理解、予測する上においても有用な検査方法である。
【００１０】
（検査試料）
検査しようとするＵＧＴ１A４核酸配列のゲノムDNAは肝臓、腎臓、白血球、毛髪等の臓器、組織等特に限定されることなく得ること可能である。白血球からゲノムDNAを得る方法の一つに市販のキット、例えばキアゲン社のQuiagen Blood DNAキットを用いることができる。得られたゲノムDNAを用いて、配列番号１に記載の領域を含むゲノムDNAを、例えば、配列番号２に記載の５´−TTTGTCTTCCAATTACATGC−３´と配列番号３に記載の５´−AGATATGGAAGCACTTGTAAG−３´のプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅させる。ゲノムDNAを増幅する手段はPCRに限られたものではなく、ＬＡＭＰ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ等の公知の増幅工程により増幅させることも可能である。
【００１１】
（変異検出）
得られた増幅産物の変異を検出する方法は直接シーケンス法を初め、種々の公知の方法が適用され特に限定されるものではない。直接シーケンス法のためのプライマーの例として、配列番号４、５、６、７及び８のプライマーが挙げられる。制限酵素による断片化試料の電気泳動分析やＤＮＡ試料を溶液内ハイブリザイズさせるＦＩＳＨ法等により、検査することも可能である。その他サザンハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（J. Mol. Biol., 98: 503-517, 1975等参照）、ジデオキシ塩基配列決定法、ＤＮＡの増幅手法を組合せた各種の検出法［例えばＰＣＲ−制限酵素断片長多型分析法（RFLP: Restriction fragment length polymorphism），ＰＣＲ−単鎖高次構造多型分析法（Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86:
2766-2770, 1989等参照），ＰＣＲ−特異的配列オリゴヌクレオチド法（SSO: Specific sequence oligonucleotide），ＰＣＲ−ＳＳＯとドットハイブリダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法（Nature, 324: 163-166, 1986等参照）］等を例示することができる。さらにオリゴヌクレオチドプローブを用いる核酸チップ又は核酸アレイによって簡便に検出することも可能である。
【００１２】
本発明で用いるプライマー類のオリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機、例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社）等を用いて容易に合成することができ、得られるオリゴヌクレオチドは更に必要に応じて、市販の精製用カートリッジ等を用いて精製することもできる。
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。
【実施例１】
【００１３】
（検査対象及び試料の調製）
健常日本人１００人を検査対象とした。キアゲン社のQuiagen Blood DNAキットを用いてゲノムDNAを分離し精製した。それぞれについてUGT1A４のエキソン１の領域と一部のイントロン領域を配列番号２及び３に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅させた。PCRの条件は９４℃で５分間の変性、９４℃で１分間の放置、６２℃で１分間、７２℃で２分間のサイクルを３０サイクル行った。その後、７２℃で8分間最終の伸長反応を行った。増幅した試料をジクロロローダミン使用ダイターミネーター法シーケンシングキット（dRhodamine Terminator Cycle
Sequencing FS Ready Reaction Kit）を用いて直接シーケンス法にて配列を確認した。配列解析用プライマーとして、配列番号４,５,６、７及び８のプライマーを用いた。
【実施例２】
【００１４】
（対立遺伝子解析）
実施例１に記載の検査対象について、対立遺伝子の解析を行った。その結果を図１に示した。全１００例のうち正常型は６８例（６８％）であった。３２例（３２％）で、１４２T→G（L48V）の変異が観察され、そのうち１４２T→G（L48V）単独の変異は２例のみであり、それらは何れもヘテロ型変異であった。残り３０例のうち、１４２T→G（L48V）に加えて、４４８T→C（L１５０L）と８０４G→A（P２６８P）の何れもサイレントな変異及びイントロン領域の８６７＋４３C→Tの変異が重複して見出された（４重変異）。それらのなかで、１例はその重複変異がホモ型であった。残り２９例は何れもヘテロ型であったが、さらに、その中で２例は８０４G→A（P２６８P）の単独変異アレルと上記の４重変異アレルの複合型変異であった。これらの変異は、全て今までに報告されていないものであった。
【実施例３】
【００１５】
ヒトｃDNAライブラリーよりUGT1A４のｃDNAを配列番号２及び３に示したプライマー対を用いてPCRにより増幅し、有核細胞TAクローニングキット（Invitrogen）を用いてｐCR３．１発現ベクターに組み込んだ。変異導入操作はMutan Km キット（Takara）を用いて行った。すなわち、ｐCR３．１発現ベクターに組み込んだｃDNAをPst1とBamH1 Iの２つの制限酵素で切断し、ｐｋF18ベクター（Takara）に組み込んだ。配列番号９に示したプライマーを用いて変異を導入した。変異を導入したｃDNAをｐKF18ベクターから切り出し、再度ｐCR３．１発現ベクターに繋いだ。
各３μｇのプラスミドDNAをCOS-7細胞にGene  PORTERトランスフェクション試薬（Gene  Therapy  System）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を48時間培養した後、細胞を集めて超音波処理にて破壊し、細胞ホモジネートを調製した。クロザピン及びUDP-グルクロン酸を基質として細胞ホモジネートのUDP-グルクロン酸転移酵素活性を測定した。１４CでラベルしたUDP−グルクロン酸を用い、３７℃で１０分間反応後の生成物をTLCプラスチックシート５７４８（メルク）で分析することにより酵素活性を求めた。その結果を表１に示した。
【００１６】
【表１】
2006101808.tif 000002
以上の結果、UGT1A４の酵素活性が１４２T→G（L48V）変異型では正常型の２０７．７％となり、本発明により、酵素活性の増大が予測できることが判った。
【産業上の利用可能性】
【００１７】
本発明は、新薬開発における、薬効や副作用の予測に利用されるほか、診断・治療のために必要な臨床検査の分野で用いられる診断薬キットとして製造される。
【配列表】
2006101808000001.app