(57)【要約】      （修正有）【課題】  オリゴ糖を用いて一段階で蛋白質分析用の支持体に簡便に固定化することができ、また分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な影響が低減され、蛋白質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価できる支持体を得ることができるリンカー化合物を提供する。【解決手段】  リンカー化合物は、  一般式（１０１）2006047318.tif 000039で表される構造を有する。上記リンカー化合物は、ビオチン−ストレプトアビジン結合によりリガンド中のオリゴ糖鎖を蛋白質分析用の支持体表面に一段階で固定できる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１０１）
【化１】
2006047318.tif 000037
で表されるリンカー化合物。
【請求項２】
一般式（１０２）
【化２】
2006047318.tif 000038
で表されるリガンド。
【請求項３】
オリゴ糖鎖を蛋白質分析用の支持体の表面に固定化するオリゴ糖鎖の固定化方法であって、
請求項２記載のリガンドを含む溶液を、表面にストレプトアビジンを固定化した支持体とを接触させることを特徴とするオリゴ糖鎖の固定化方法。
【請求項４】
請求項２記載のリガンドを、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介して表面に固定化させてなることを特徴とする蛋白質分析用の支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴ糖鎖を、表面プラズモン共鳴等のセンサチップやアフィニティークロマトグラフィーの担体等の蛋白質分析用の支持体に一段階で導入し、固定することが可能なリンカー化合物および該リンカー化合物を用いたリガンド並びに該リガンドを用いたオリゴ糖鎖の固定化方法および該リガンドを表面に固定化させてなる蛋白質分析用の支持体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
下記一般式（６）
【０００３】
【化１】
2006047318.tif 000002
【０００４】
で表される硫酸化多糖ヘパリンは、構造や分子量が非常に不均一なものであり、多くの生物活性を有することが知られている。そのなかでも、抗血液凝固活性は有名であり、医薬として広く用いられている。
【０００５】
しかしながら、不均一な硫酸化多糖ヘパリンは、血小板やフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）とも結合する。このため、従来、硫酸化多糖ヘパリンを医薬として用いた場合における血液中の血小板との結合に起因する副作用が指摘されている。
【０００６】
これらの結合相互作用には、硫酸化多糖ヘパリン中の、下記一般式（７）
【０００７】
【化２】
2006047318.tif 000003
【０００８】
で表される特定の部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）と、それに基づくクラスタリング効果が重要である。
【０００９】
本願発明者等は、以前に、この特定の部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）が血小板細胞や血液凝固に関わるフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）という蛋白質との結合に大きく関与することを見出した。
【００１０】
しかしながら、これらの生化学的結合実験のためには特殊な設備や多量のオリゴ糖が必要になるという問題がある。生物活性測定法としては、従来、放射標識法（ＲＩ法）とＳＰＲ法とが知られているが、ＲＩ法は、特殊な実験設備や多量のオリゴ糖を必要とする。
【００１１】
そこで、本願発明者等は、蛋白質分析用の支持体として非放射標識法である表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサチップを使用し、図１１に示すように、該センサチップの表面上に、疎水性相互作用を介して上記した部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を固定化し、ＳＰＲを用いて硫酸化多糖ヘパリン中の部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）と硫酸化多糖ヘパリン結合性の蛋白質との結合挙動を解析した。ＳＰＲ法は、少量のオリゴ糖で測定が可能であり、分子間の相互作用をリアルタイムで観測することが可能である。なお、図１１中、ＮＳ６Ｓは上記した部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）のうちＧｌｃＮＳ６Ｓを示し、Ｉ２ＳはＩｄｏＡ２Ｓを示し、Ｇはグルコース単位を示す。
【００１２】
具体的には、センサチップとしての疎水性チップ上に上記部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を固定化し、この疎水性チップ上に、硫酸化多糖ヘパリン結合性ドメインを有する合成ｖＷＦペプチド（ｖＷＦ中のヘパリン結合サイト；ＹＩＧＬＫＤＲＫＲＰＳＥＬＲＲＩＡＳＱＶＫＹＡ−ＮＨ）をアナライトとして添加した。
【００１３】
この結果、図１２の線ａに示すように、ｖＷＦペプチドの濃度変化に応じて結合量の変化、すなわち、ΔＲＵ１（オリゴ糖の結合量）／ΔＲＵ２（ｖＷＦペプチドの結合量）が観測された。
【００１４】
この線ａのカーブから求められる解離定数ＫD は、以前にSobel等が生化学的手法を用いて測定した値（ＫＤ＝370±100ｎＭ、非特許文献１参照）にオーダーとして近いものであった。
【００１５】
一方、従来、ＳＰＲ測定装置等に用いるセンサチップの表面にオリゴ糖鎖を結合（固定化）する試みとしては、例えば、チップ表面に長鎖アルキル鎖の短分子膜を作り、疎水性相互作用を利用してオリゴ糖鎖をチップに固定化する試みがなされている（非特許文献２参照）。
【非特許文献１】M.Sobel et al., J. Biol. Chem., vol.267, p8857, (1992)
【非特許文献２】G.M.Kuziemko et al., Biochemistry, Vol. 35, p6375, (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
しかしながら、この場合、図１２の線ｂに示すように末端にグルコース残基を有するリガンドを用いても、合成ｖＷＦペプチドとの結合相互作用が観察されたことから、上記した値には、疎水性親和力に起因すると思われる非特異的な相互作用、つまり、上記センサチップの疎水性場と合成ｖＷＦペプチドとの非特異的な相互作用が含まれていることが判った。
【００１７】
このため、このように蛋白質分析用の支持体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用をほぼ無視できるリンカー化合物およびリガンド並びに該リガンドをチップに固定化する方法、さらには、該リガンドを固定化した、例えばＳＰＲ用のセンサチップ等の蛋白質分析用の支持体を提供することは、上記した部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）と蛋白質との生化学的結合による結合相互作用、つまり、構造が明確な硫酸化オリゴ糖と種々の蛋白質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価する上で非常に重要である。
【００１８】
また、近年、オリゴ糖鎖が生体内で重要な働きを担っていることが明らかになっている。しかしながら、オリゴ糖鎖の分子レベルでの研究を行うには、上記したように構造が完全に判っているオリゴ糖鎖を用いなければならず、このようなオリゴ糖鎖を多量に天然から得ることは困難であり、また、合成も容易ではないという問題がある。
【００１９】
また、オリゴ糖鎖は、それ一分子では活性はそれほど高くないことが多く、蛋白質との相互作用を解析するにはオリゴ糖鎖を集合化させる必要がある。つまり、一般的に、天然のオリゴ糖とそれが相互作用する蛋白質との親和性は低いので、オリゴ糖の生物活性を評価するためには、オリゴ糖鎖を効率よく集合化することが重要である。
【００２０】
従来、ＳＰＲ測定装置等に用いるセンサチップの表面にオリゴ糖鎖を結合（固定化）する試みとしては、例えば、チップ表面に長鎖アルキル鎖の短分子膜を作り、疎水性相互作用を利用してオリゴ糖鎖をチップに固定化する試み（非特許文献２参照）がなされている。
【００２１】
しかしながら、上記非特許文献２に記載の方法は、チップ表面に固定化することができるオリゴ糖鎖の種類が限定され、ガングリオシド等の、疎水性基を有するオリゴ糖鎖はチップに固定化することはできるものの、様々なオリゴ糖鎖をチップ表面に簡便に固定化することはできない。また、上記従来の方法によりオリゴ糖鎖が固定化されたチップは、チップ表面の疎水性が高すぎ、チップを用いて分析する蛋白質との非特異的な相互作用が大きく観測されてしまい、実用性に乏しいという問題点を有している。
【００２２】
また、上記従来の方法でオリゴ糖鎖をチップ表面に固定化するためには、合成化学を駆使し、オリゴ糖鎖の水酸基に種々の保護基をまず導入し、それを化学的に縮合した上で、さらにチップに固定化する必要がある。このため、従来は、自然界から単離、精製して得られるオリゴ糖をそのまま用いてそのオリゴ糖鎖をチップ表面に固定化することは事実上、不可能であった。
【００２３】
さらに、オリゴ糖鎖と特異的に相互作用する蛋白質を分離精製するためには、構造既知のオリゴ糖鎖をアフィニティークロマトグラフィーのリガンドとして用いる必要がある。
【００２４】
このため、オリゴ糖鎖を集合化させ、上記したＳＰＲ用のセンサチップまたはアフィニティークロマトグラフィーの担体等の蛋白質分析用の支持体上に固定化させることができると共に、多種のオリゴ糖を一段階で導入することが可能なリンカー化合物および該リンカー化合物を用いたリガンド並びに該リガンドをチップに固定化する方法、さらには、該リガンドを固定化した蛋白質分析用の支持体が求められている。
【００２５】
本発明は、上記問題点を解決するためになされたものであって、その目的は、自然界から単離、精製して得られる種々のオリゴ糖をそのまま用いて一段階で蛋白質分析用の支持体表面にオリゴ糖鎖を簡便に固定化することができると共に、蛋白質分析用の支持体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用による影響が低減され、種々の蛋白質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価できる蛋白質分析用の支持体を得ることができるリンカー化合物およびリガンド並びにオリゴ糖鎖の固定化方法および蛋白質分析用の支持体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本願発明者等は、上記の目的を達成すべく鋭意検討した結果、分子内にＳ−Ｓ結合もしくはビオチンを持たせた部位をリンカー化合物に導入することで、オリゴ糖鎖を分子内に簡便に導入できる部分をリンカー化合物に組み込むと共に、オリゴ糖鎖の導入に際し、親水性部分がリンカー化合物との間に形成されるように、蛋白質分析用の支持体表面に例えばコートした金もしくは予め蛋白質分析用の支持体表面に固定化したストレプトアビジン（またはアビジン）と結合させ易く、強固に結合できるようにすることができ、自然界から単離、精製して得られる種々のオリゴ糖をそのまま用いて蛋白質分析用の支持体表面にオリゴ糖鎖を一段階で簡便に固定化することができると共に、蛋白質分析用の支持体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用による影響が低減され、種々の蛋白質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価できる蛋白質分析用の支持体を得ることができることを見出して本発明を完成させるに至った。
【００２７】
即ち、本発明にかかるリンカー化合物は、上記の課題を解決するために、
一般式（１）
【００２８】
【化３】
2006047318.tif 000004
【００２９】
で表されることを特徴としている。
【００３０】
また、本発明にかかるリンカー化合物は、上記の課題を解決するために、
一般式（１０１）
【００３１】
【化４】
2006047318.tif 000005
【００３２】
で表されることを特徴としている。
【００３３】
本発明にかかるリガンドは、上記の課題を解決するために、一般式（３）
【００３４】
【化５】
2006047318.tif 000006
【００３５】
で表されることを特徴としている。
【００３６】
本発明にかかるリガンドは、上記の課題を解決するために、一般式（４）
【００３７】
【化６】
2006047318.tif 000007
【００３８】
で表されることを特徴としている。
【００３９】
本発明にかかるリガンドは、上記の課題を解決するために、一般式（１０２）
【００４０】
【化７】
2006047318.tif 000008
【００４１】
で表されることを特徴としている。
【００４２】
本発明にかかるオリゴ糖鎖の固定化方法は、上記の課題を解決するために、オリゴ糖鎖を蛋白質分析用の支持体の表面に固定化するオリゴ糖鎖の固定化方法であって、上記一般式（３）または（４）で表されるリガンドを含む溶液と、表面に金を有する支持体とを接触させることを特徴としている。
【００４３】
本発明にかかるオリゴ糖鎖の固定化方法は、上記の課題を解決するために、オリゴ糖鎖を蛋白質分析用の支持体の表面に固定化するオリゴ糖鎖の固定化方法であって、上記一般式（１０２）で表されるリガンドを含む溶液と、表面にストレプトアビジン（またはアビジン）を固定化した支持体とを接触させることを特徴としている。
【００４４】
本発明にかかる蛋白質分析用の支持体は、上記の課題を解決するために、上記一般式（３）または（４）で表されるリガンドを、Ｓ−Ａｕ結合を介して表面に固定化させてなることを特徴としている。
【００４５】
本発明にかかる蛋白質分析用の支持体は、上記の課題を解決するために、上記一般式（１０２）で表されるリガンドを、ビオチン−ストレプトアビジン（またはアビジン）結合を介して表面に固定化させてなることを特徴としている。
【発明の効果】
【００４６】
以上のように、本発明によれば、分子内にＳ−Ｓ結合もしくはビオチンを持たせた部位をリンカー化合物に導入することで、自然界から単離、精製して得られる種々のオリゴ糖を一段階で、蛋白質分析用の支持体表面に固定化することができると共に、このような支持体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用による影響が低減された蛋白質分析用の支持体を得ることができるリンカー化合物およびリガンド並びにオリゴ糖鎖の固定化方法および蛋白質分析用の支持体を提供することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
〔実施の形態１〕
以下、本発明について詳細に説明する。
本願発明者等は、自然界から単離、精製して得られる種々のオリゴ糖をそのまま用いて一段階で蛋白質分析用の支持体表面にオリゴ糖鎖を簡便に固定化することができると共に、蛋白質分析用の支持体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用による影響が低減され、種々の蛋白質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価できる蛋白質分析用の支持体を得るべく、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いて、構造が明確な硫酸化オリゴ糖を上記ＳＰＲのセンサチップに効率よく固定化し、種々の蛋白質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価できるシステムの開発を行った。
【００４８】
以下の説明では、蛋白質分析用の支持体としてＳＰＲのセンサチップを使用して該センサチップに、構造が明確な硫酸化オリゴ糖である硫酸化多糖ヘパリン中の下記一般式（７）
【００４９】
【化８】
2006047318.tif 000009
【００５０】
で表される特定の部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を二次元的に固定し、上記部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）と種々の蛋白質との結合相互作用を評価するシステムについて主に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
【００５１】
本発明では、オリゴ糖鎖を簡便に導入できる部位をリンカー化合物に組み込み、オリゴ糖鎖をリンカー化合物に導入した際に親水性部分がリンカー化合物との間に形成されるリガンド、すなわち、蛋白質と特異的に結合する物質を得た。これにより、本発明においては、リガンドを直接、蛋白質分析用の支持体に共有結合させ、これによりオリゴ糖を蛋白質分析用の支持体表面に固定化している。
【００５２】
本発明にかかるリンカー化合物は、分子内にジスルフィド結合を有する化合物であり、一般式（１）
【００５３】
【化９】
2006047318.tif 000010
【００５４】
で表される構造を有している。
【００５５】
上記一般式（１）で表されるリンカー化合物は、例えば以下の反応式
【００５６】
【化１０】
2006047318.tif 000011
【００５７】
で示される反応により容易に得ることができる。
【００５８】
先ず、芳香族ジアミンである下記一般式（８）
【００５９】
【化１１】
2006047318.tif 000012
【００６０】
で表されるｍ−フェニレンジアミンを、上記反応式に示すように、ＣＨ3 ＯＨ（式中、ＭｅＯＨと記す）および（Ｃ2 Ｈ5 ）3 Ｎ（式中、Ｅｔ3Ｎと記す）の存在下、（（ＣＨ3)3 ＣＯＣＯ）2 Ｏ（式中、（Ｂｏｃ)2Ｏと記す）と反応させることにより、上記一般式（８）で表されるｍ−フェニレンジアミンの一方のアミノ基を、ｔ−ブトキシカルボニル基（−ＣＯＣＯ（ＣＨ3)3 基; 式中、Ｂｏｃ基と記す）で保護（Ｂｏｃ化）することにより、下記一般式（９）
【００６１】
【化１２】
2006047318.tif 000013
【００６２】
で表される化合物が得られる。
【００６３】
次に、上記一般式（９）で表される化合物を、上記反応式に示すように、ＣＨ2 Ｃｌ2 中、水溶性カルボジイミド（式中、ＥＤＣ・ＨＣｌと記す）、並びに、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（式中、ＨＯＢｔと記す）の存在下で、ジスルフィド結合を有する下記一般式（１０）
【００６４】
【化１３】
2006047318.tif 000014
【００６５】
で表されるチオクト酸と縮合反応させることにより、下記一般式（１１）
【００６６】
【化１４】
2006047318.tif 000015
【００６７】
で表される化合物が得られる。
【００６８】
次いで、上記一般式（１１）で表される化合物を、上記反応式に示すように、ジオキサンの存在下、例えば０℃にてトリフルオロ酢酸（式中、ＴＦＡと記す）によりＢｏｃ基を除去することにより、分子内にジスルフィド結合を有する前記一般式（１）で表されるリンカー化合物が得られる。
【００６９】
本実施の形態では、前記一般式（８）で表されるｍ−フェニレンジアミンの一方のアミノ基をＢｏｃ化して前記一般式（９）で表される化合物を７８％の収率で得た後、該一般式（９）で表される化合物をＥＤＣ・ＨＣｌおよびＨＯＢｔの存在下で前記一般式（１０）で表されるチオクト酸と縮合反応させることにより、前記一般式（１１）で表される化合物を収率８６％で調製した。その後、前記一般式（１１）で表される化合物をジオキサンの存在下、０℃にてＴＦＡでＢｏｃ基を除去することにより、前記一般式（１）で表される目的のリンカー化合物を収率８５％で得た。
【００７０】
続いて、このリンカー化合物の反応性を確認するために該リンカー化合物をグルコースと反応させたところ、下記一般式（３）
【００７１】
【化１５】
2006047318.tif 000016
【００７２】
で表される親水性のリガンドを合成することができた。
【００７３】
すなわち、本発明にかかる上記一般式（３）で表されるリガンドは、グルコースをリンカー化合物に導入することにより、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物に由来する構造単位、特に、ジスルフィド結合をその分子内に有すると共に、グルコースの導入、ひいてはオリゴ糖鎖の導入に際し、親水性部分がリンカー化合物との間に形成される親水性のリガンドであり、下記反応式
【００７４】
【化１６】
2006047318.tif 000017
【００７５】
で示されるように、前記一般式（１）で示されるリンカー化合物を、ＮａＢＨ3 ＣＮ、ＣＨ3 ＣＯＯＨ（式中、ＡｃＯＨと記す）およびＨ2 Ｏの存在下、ｐＨ３、反応温度３７℃にて下記一般式（１２）
【００７６】
【化１７】
2006047318.tif 000018
【００７７】
で表されるＤ−グルコースと還元アミノ化反応させることにより容易に調製することができる。
【００７８】
本実施の形態では、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物を上記条件下で一般式（１２）で表されるＤ−グルコースと還元アミノ化反応させることにより、還元末端を効率良く利用して、前記一般式（３）で表される、親水性のリガンドを９２％という高収率で得た。
【００７９】
このように分子内にジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を持たせた部位をリンカー化合物に導入することで、該リンカー化合物を例えばＳＰＲのセンサーチップ等をはじめとする蛋白質分析用の支持体表面にコートした金とイオウ−金結合（Ｓ−Ａｕ結合）させ易く、かつ、これら蛋白質分析用の支持体に、上記リンカー化合物に結合させたオリゴ糖鎖、つまり、上記したリンカー化合物を用いたリガンド中に含まれるオリゴ糖鎖を強固に結合させることができる。
【００８０】
すなわち、本発明によれば、リンカー分子内にジスルフィド結合を組み込んだ上記のリガンドを用いることで、該リガンドを例えばＳ−Ａｕ結合を介して蛋白質分析用の支持体に共有結合により直接結合させることができる。このため、上記のリガンド、すなわち、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物に由来する構造単位を含むリガンドを用いれば、オリゴ糖鎖を蛋白質分析用の支持体表面に簡便に固定化することができると共に、蛋白質分析用の支持体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用をほぼ無視することができるシステムを構築することができる。
【００８１】
次に、上記したリンカー化合物並びにリガンドに由来する構造単位を有する本発明にかかるリガンドとして、前記一般式（７）で表される特定の部分二糖構造
（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を有するリガンドについて以下に説明する。
【００８２】
本発明にかかる上記リガンドは、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物を前記一般式（７）で表される部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を含む化合物と反応させることにより上記部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を前記した本発明にかかるリンカー化合物に導入してなるリガンドであり、下記一般式（４）
【００８３】
【化１８】
2006047318.tif 000019
【００８４】
で表される構造を有している。
【００８５】
このため、上記一般式（４）で表されるリガンドもまた、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物に由来する構造単位、特に、ジスルフィド結合をその分子内に有している。
【００８６】
上記一般式（４）で表される構造を有するリガンド（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｌｉｇａｎｄ）は、下記反応式
【００８７】
【化１９】
2006047318.tif 000020
【００８８】
で示されるように、ヘパリンの部分構造である二糖、すなわち、前記一般式（７）で表される部分二糖構造（以下、ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓと記す）の還元末端にグルコース単位を挿入した、下記一般式（１３）
【００８９】
【化２０】
2006047318.tif 000021
【００９０】
で表される構造を有する三糖を公知の方法で別途合成しておき、この三糖と前記一般式（１）で表されるリンカー化合物とを、ＣＨ3 ＣＯＯＨ（式中、ＡｃＯＨと記す）／Ｈ2 Ｏ／ＣＨ3ＯＨ（式中、ＭｅＯＨと記す）の混合溶媒中にて、ＮａＢＨ3 ＣＮの存在下、最適化した還元アミノ化反応させることによって調製することができる。上記三糖は、例えば「S.Koshida et al., Tetrahedron lett. Vol. 42, p1289, 2001年」に記載の方法により合成することができる。表１に、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物と三糖との反応条件を示す。なお、ＮａＢＨ3 ＣＮは、１０当量（ｅｑ）ずつ複数回に分けて添加した。
【００９１】
【表１】
2006047318.tif 000022
【００９２】
なお、表１中、ａ）は６ｍＭ、ｂ）は１３ｍＭ、ｃ）は３７ｍＭを示す。
【００９３】
前記一般式（１）で表されるリンカー化合物は、酢酸・水・メタノール溶媒系に溶解する。表１から判るように、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物は、酢酸・水・メタノール溶媒系にてＮａＢＨ3 ＣＮの存在下で三糖と反応し、例えば反応例５に示す条件下で前記一般式（１）で表されるリンカー化合物と三糖とを反応させることにより、本発明にかかる目的のリガンド（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｌｉｇａｎｄ；ＥＳＩ−ＭＳ（negative) ｍ／ｚ＝１０７２．１５[ Ｍ−３Ｎａ＋２Ｈ] - ) を得ることができる。
【００９４】
このようにして得られた本発明にかかるリガンドは、分子内にＳ−Ｓ結合を有し、これらリガンドを含む溶液と、表面に金を有する蛋白質分析用の支持体、例えば金をコートした前記ＳＰＲのセンサーチップ等のチップとを接触させることにより、これらリガンドに含まれるオリゴ糖鎖、つまり、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物に組み込んだオリゴ糖のオリゴ糖鎖を、例えば図１に示すようにＡｕ−Ｓ結合を介して、一段階で上記蛋白質分析用の支持体表面に固定化させることができる。これにより、図１に示すように、分子内にジスルフィド基を有するリンカー化合物を還元アミノ化反応によって一段階で糖鎖に縮合させ、これをＡｕ−Ｓ結合を介してチップ上に固定化して部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）の二次元クラスターを形成させてなるセンサーチップが得られる。なお、図１中、ＮＳ６Ｓは上記した部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）のうちＧｌｃＮＳ６Ｓを示し、Ｉ２ＳはＩｄｏＡ２Ｓを示し、Ｇはグルコース単位を示す。
【００９５】
本発明にかかる上記した各リガンドを用いて蛋白質分析用の支持体表面に一段階でオリゴ糖鎖を固定化する際に用いられる上記リガンドを含む溶液としては、特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、これらリガンドのメタノール溶液等が挙げられる。
【００９６】
本実施の形態においては、前記一般式（３）または（４）で表されるリガンドのメタノール溶液（０．１ｍＭ）に、表面を金でコーティングしたガラス製のチップを２時間浸漬し、前記一般式（３）または（４）で表されるリガンド中のＳ−Ｓ結合をチップ表面の金とのＡｕ−Ｓ結合に変換させることによって、オリゴ糖をチップ表面に固定化させた。このようにして調製した２種類のチップの非特異的相互作用を、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと記す）を試料として使用し、表面プラズモン共鳴装置（日本レーザー電子社製、ＳＰＲ６７０）を用いて測定することにより検討した。
【００９７】
なお、上記測定においては、比較のために、「G.M.Kuziemko et al, Biochemistry, Vol. 35, p6375, 1996年」に報告されているような疎水性相互作用を介してチップ表面にオリゴ糖鎖を固定化した場合におけるチップの非特異的相互作用を、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを試料として使用し、表面プラズモン共鳴装置（日本レーザー電子社製、ＳＰＲ６７０）を用いて測定した。
【００９８】
図２は、下記一般式（１４）
【００９９】
【化２１】
2006047318.tif 000023
【０１００】
で表される従来のリガンドを用いて疎水性相互作用を介してオリゴ糖類（マルトース）をチップに結合させた場合（図２中、線Ａにて示す）における非特異的相互作用によるレスポンス（ＲＵ：Resonance Unit）と前記一般式（３）で表される本発明のリガンドを用いてＡｕ−Ｓ結合を介してグルコースをチップに結合させた場合（図２中、線Ｂにて示す）における非特異的相互作用によるレスポンス（ＲＵ）との比較を示している。なお、バッファにはｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用した。また、バッファの流量は５μｌ／ｍｉｎとした。
【０１０１】
ＢＳＡはマルトースやグルコースには相互作用しないことが判っているが、前記一般式（１４）で表される従来のリガンドによる疎水性相互作用を利用した測定系では、疎水性チップ上にこのようなグルコース構造をもったリガンドを固定化し、その上に疎水性蛋白質であるＢＳＡを加えたところ、線Ａに示すように大きなレスポンス（ＲＵ）が観測され、１２４０もの共鳴角度変化（ΔＲＵ）が観測され、非特異的な結合が起こっていることが判る。
【０１０２】
これは、ＢＳＡとチップ上の疎水性場との非特異的な相互作用によるものであり、このように大きな非特異的相互作用があると、特異的相互作用を観測するのは非常に困難になる。
【０１０３】
一方、同じ濃度のＢＳＡを、Ａｕ−Ｓ結合を介してグルコース単位を固定化したチップ、すなわち、ジスルフィド結合を有する本発明にかかる親水性リガンドを固定化したチップ上に加えたところ、線Ｂに示すように、レスポンス（ＲＵ）はほぼ直線となり、非特異的な結合は殆ど観測されなかった。このことから、前記一般式（３）で表される本発明のリガンドを用いてＡｕ−Ｓ結合を介してグルコースをチップに結合させた場合、疎水性相互作用に基づく非特異的相互作用は無視できることが判った。
【０１０４】
また、同様に、前記一般式（４）で示されるリガンドを用いて上述した方法によりヘパリンの部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を固定化したチップを用いて、ＢＳＡ、並びに、ヒト由来フォンビルプラント因子蛋白質中のヘパリン結合ドメインである合成ｖＷＦペプチド（ｖＷＦ中のヘパリン結合サイト：ＹＩＧＬＫＤＲＫＲＰＳＥＬＲＲＩＡＳＱＶＫＹＡ−ＮＨ）との相互作用によるレスポンス（ＲＵ）を、表面プラズモン共鳴装置（日本レーザー電子社製、ＳＰＲ６７０）を用いて測定した。
【０１０５】
図３中、線Ｃは試料として０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを使用した場合のレスポンス（ＲＵ）を示し、線Ｄは試料として２μＭの合成ｖＷＦペプチドを使用した場合のレスポンス（ＲＵ）を示す。なお、バッファにはｐＨ７．４のＰＢＳを使用した。また、バッファの流量は５μｌ／ｍｉｎとした。
【０１０６】
ＢＳＡはヘパリンと非特異的に僅かに相互作用することが知られているが、上記測定の結果、線Ｃに示すように、僅かに相互作用はみられるが、その強さはほぼ無視できる程度であることが判明した。
【０１０７】
一方、ヘパリンと結合相互作用することが確認されている、ヒト由来フォンビルプラント因子蛋白質中のヘパリン結合ドメインである、２μＭの合成ｖＷＦペプチドをＢＳＡの代わりに用いてＳＰＲを測定したところ、線Ｄに示すように明らかな結合曲線が観測され、非常に高い相互作用があることが判った。このことから、上記したチップを用いた場合には疎水性相互作用による非特異的な相互作用の影響を無視できると考え、合成ｖＷＦペプチドの解離定数ＫD を求めた。
【０１０８】
図４は、合成ｖＷＦペプチドの濃度を０．０５μＭから２．０μＭまで連続的に変化させて前記一般式（４）で表されるリガンドを固定化したチップ上に加えた場合の結合曲線を示す。なお、図４中、↑は合成ｖＷＦペプチドの注入を示し、↓はバッファに切り替わったことを示す。また、合成ｖＷＦペプチドのチップへの固定化量は、ｖＷＦペプチド注入前のベースライン（図中、点線にて示す）から、バッファに切り替わった後、合成ｖＷＦペプチドが解離して平行に達したたところまでの差をそれぞれとっている。なお、上記測定においても、バッファにはｐＨ７．４のＰＢＳを使用し、バッファの流量は５μｌ／ｍｉｎとした。また、表面プラズモン共鳴装置には、日本レーザー電子社製の表面プラズモン共鳴装置「ＳＰＲ６７０」を用いた。
【０１０９】
図５の線Ｅは、このときの固定量の変化、すなわち、前記一般式（４）で表されるリガンドを固定化したチップを用いた場合における合成ｖＷＦペプチドのチップへの固定化量の変化（レスポンス（ＲＵ））を合成ｖＷＦペプチドの濃度に対してプロットした図である。
【０１１０】
図５に示すように上記合成ｖＷＦペプチドの濃度を変化させて該合成ｖＷＦペプチドのそれぞれの濃度に対するレスポンス（ＲＵ）から結合度を測定し、該結合度から解離定数ＫD を算出したところ、線Ｅで示すように、前記一般式（４）で表されるリガンド（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−ｌｉｇａｎｄ）を用いた場合には、 Sobel等が放射標識法によって求めた値(M.Sobel et al. J. Biol. Chem. (1992), vol.267, p8857 、ＫD＝370 ±100 ｎＭ)と非常に近い値（ＫD ＝２１０ｎＭ）が導かれた。
【０１１１】
一方、前記一般式（３）で表されるリガンド（親水性リガンド）を固定化したチップ上に合成ｖＷＦペプチドを上記と同様に注入したが、この場合は、図５の線Ｆに示すように、合成ｖＷＦペプチドと該チップとの結合相互作用は殆ど観測されず、非特異的な相互作用はないことが確認された。
【０１１２】
以上のように前記一般式（３）で表されるリガンドを固定化したチップを用いてｖＷＦ中のヘパリン結合ドメインを含む合成ペプチドとの結合挙動をＳＰＲで測定した結果、特異的な相互作用のみが観測され、さらに天然ヘパリンとこの合成ペプチド（合成ｖＷＦペプチド）との解離定数ＫD にほぼ等しい値がＳＰＲ解析から得られたことから、このチップの有用性が明らかとなった。
【０１１３】
また、以上のことから、本発明にかかる上記各リガンド並びにこれらリガンドに用いられる前記一般式（１）で表されるリンカー化合物は、オリゴ糖鎖を、例えばＡｕ−Ｓ結合を介して、蛋白質分析用の支持体表面に固定化するために非常に優れた性質を有する化合物であることが明らかになった。
【０１１４】
以上のように、本発明によれば、還元アミノ化反応によって、硫酸化二糖、すなわち、ヘパリンの部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）に、分子内にジスルフィド結合を有するリンカーを導入することができた。そして、このようにして合成したリガンドを用いて、硫酸化二糖をＡｕ−Ｓ結合を介してチップへ固定化することにより、チップとの非特異的な相互作用を無視できる実験系を確立することができた。さらに、このチップを用いると、硫酸化二糖と合成ｖＷＦペプチドとの特異的な相互作用を観測することができることが判った。
【０１１５】
なお、本発明においては、ヘパリン結合性蛋白質として上記した合成ｖＷＦペプチドを使用したが、本発明はこれに限定されるものではなく、上記したチップを用いることで、他のヘパリン結合性蛋白質との結合挙動も解析することが可能である。
【０１１６】
以上のように、本発明によれば、上記のリンカー化合物を用いれば、還元末端を有しているオリゴ糖鎖をチップ表面に簡便に固定化できるようになったばかりでなく、チップを用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用をほぼ無視することができるシステムを構築することができた。
【０１１７】
さらに、本願発明者等は、オリゴ糖の生物活性を評価するために、オリゴ糖を効率良く集合化し、多糖のオリゴ糖を一段階で蛋白質分析用の支持体表面に導入すべく鋭意検討した。この結果、本願発明者等は、図６に示すように多価の芳香族アミン部分とビオチン部分とを有するリンカー化合物（ビオチンリンカー）を用いてオリゴ糖鎖を集合化させ、該オリゴ糖鎖を、ビオチン−ストレプトアビジン（またはアビジン）の結合を利用してＳＰＲのセンサチップ等のチップやアフィニティークロマトグラフィーの担体等の蛋白質分析用の支持体表面に固定化することで、多糖のオリゴ糖を一段階で蛋白質分析用の支持体表面に導入し、オリゴ糖の集合化と固定化との両方を実現することができることを見い出した。なお、図６並びに以下に示す図において、Ｓｔはストレプトアビジン（またはアビジン）を示し、Ｂｉはビオチンを示す。
【０１１８】
以下、本発明にかかる他のリンカー化合物として、分子内にＳ−Ｓ結合を持たせた部位の代わりにビオチンをリンカー化合物に導入してなるビオチンリンカーについて説明すると共に、該ビオチンリンカーを用いたリガンド並びに該リガンドを用いたオリゴ糖鎖の固定化方法および該リガンドを固定化させた、蛋白質分析用の支持体について説明する。
【０１１９】
本発明にかかる他のリンカー化合物は、ビオチンと複数個のオリゴ糖を結合させ得る反応点を併せ持った多岐用途型リンカーであり、
一般式（１０１）
【０１２０】
【化２２】
2006047318.tif 000024
【０１２１】
で表される構造を有している。
【０１２２】
上記一般式（１０１）で表されるリンカー化合物は、例えば以下の式
【０１２３】
【化２３】
2006047318.tif 000025
【０１２４】
で示される反応により容易に得ることができる。
【０１２５】
先ず、上記の反応式にしたがって下記一般式（１５）
【０１２６】
【化２４】
2006047318.tif 000026
【０１２７】
で表されるｐ−アミノ安息香酸を、ＭｅＯＨおよびトリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下、（Ｂｏｃ）2 Ｏと室温にて反応させて上記一般式（１５）で表されるｐ−アミノ安息香酸のアミノ基をＢｏｃ基で保護（Ｂｏｃ化）することにより、下記一般式（１６）
【０１２８】
【化２５】
2006047318.tif 000027
【０１２９】
で表される化合物が得られる。
【０１３０】
次に、反応温度を０℃から室温に昇温させて、上記一般式（１６）で表される化合物を、ＣＨ2 Ｃｌ2 中、ＨＯＢｔ、ＥＤＣ．ＨＣｌの存在下で、下記一般式（１７）
【０１３１】
【化２６】
2006047318.tif 000028
【０１３２】
で表されるジエチレントリアミン（０．５当量）と反応させて縮合させることにより、下記一般式（１８）
【０１３３】
【化２７】
2006047318.tif 000029
【０１３４】
で表される化合物が得られる。
【０１３５】
次に、上記一般式（１８）で表される化合物をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、ＴＥＡ（２当量）の存在下で、下記一般式（１９）
【０１３６】
【化２８】
2006047318.tif 000030
【０１３７】
で表される、ビオチンの活性エステル化合物と反応させることにより、下記一般式（２０）
【０１３８】
【化２９】
2006047318.tif 000031
【０１３９】
で表される化合物が得られる。
【０１４０】
次いで、反応温度を０℃から室温に昇温させてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で上記一般式（２０）で表される化合物のＢｏｃ基、すなわち、アミノ基の保護基を外す（脱保護する）ことにより、本発明にかかるリンカー化合物として、前記一般式（１０１）で表される、糖鎖を二単位集合化させるためのビオチンリンカーが得られる。
【０１４１】
本実施の形態では、上記一般式（１５）で表されるｐ−アミノ安息香酸のアミノ基をＢｏｃ基で保護（Ｂｏｃ化）することにより、一般式（１６）で表される化合物を収率７５％で得た後、該一般式（１６）で表される化合物を上記した条件下で一般式（１７）で表されるジエチレントリアミン（０．５当量）と反応させることにより、収率９３％で一般式（１８）で表される化合物を調製した。その後、上記一般式（１８）で表される化合物を、上記した条件下で一般式（１９）で表されるビオチンの活性エステル化合物と反応させることにより、一般式（２０）で表される化合物（ＥＳＩ−ＭＳ（positive）ｍ／ｚ＝５２４．４ [Ｍ＋Ｈ] + ) を得た。上記ビオチンの活性エステル化合物並びに反応式中、conditionsの表記にて示す反応条件（溶媒および反応温度）を変更した場合における上記一般式（２０）で表される化合物の各収率を表２に示す。
【０１４２】
【表２】
2006047318.tif 000032
【０１４３】
表２に示すように、ビオチン活性化エステルとして、ペンタフルオロフェニル基（Ｐｆｐ）を用いた系により、目的とする上記一般式（１８）で表される化合物を最も収率良く得ることができた。
【０１４４】
続いて、ＴＦＡで上記一般式（１８）で表される化合物のＢｏｃ基を脱保護することにより、上記ビオチンリンカー、すなわち、前記一般式（１０１）で表されるリンカー化合物を収率９１％で得た。
【０１４５】
続いて、このリンカー化合物を用いてオリゴ糖鎖を集合化させた。集合化させる糖鎖には、血液凝固に関わるフォンビルブラント因子ペプチド（ｖＷＦペプチド）と相互作用する、ヘパリン中の硫酸化部分二糖、すなわち、前記一般式（７）で表される部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を使用した。
【０１４６】
すなわち、上記ビオチンリンカーを用いた本発明にかかるリガンドは、下記一般式（１０２）
【０１４７】
【化３０】
2006047318.tif 000033
【０１４８】
で表される構造を有し、前記一般式（１０１）で表されるリンカー化合物にヘパリン中の硫酸化部分二糖（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）が導入された構造を有している。
【０１４９】
これにより、上記一般式（１０２）で表されるリガンドは、前記一般式（１０１）で表されるリンカー化合物に由来する構造単位を有し、ビオチンとストレプトアビジン（またはアビジン）との高い親和性を利用してオリゴ糖鎖として上記硫酸化部分二糖（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）をビオチン−ストレプトアビジン（またはアビジン）結合により蛋白質分析用の支持体に固定化させることができる。
【０１５０】
上記一般式（１０２）で表されるリガンドは、下記反応式
【０１５１】
【化３１】
2006047318.tif 000034
【０１５２】
で示されるように、最適化した還元アミノ化反応を用いて、上記硫酸化部分二糖を含む三糖体、すなわち、ヘパリン中の部分構造二糖（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）の還元末端にグルコース単位を導入した前記一般式（１３）で表される三糖を、Ｈ2 Ｏ／ＡｃＯＨ／ＭｅＯＨの混合溶媒に溶解し、ＮａＢＨ3 ＣＮの存在下で前記一般式（１０１）で表される、多岐用途型のリンカー化合物であるビオチンリンカーに導入することにより調製した。
【０１５３】
表３に、前記一般式（１０１）で表されるリンカー化合物と三糖との反応条件を示す。
【０１５４】
【表３】
2006047318.tif 000035
【０１５５】
表３から判るように、前記一般式（１０１）で表されるリンカー化合物は、酢酸・水・メタノール溶媒系にてＮａＢＨ3 ＣＮの存在下で三糖と反応し、例えば反応例３に示す条件下で前記一般式（１０１）で表されるリンカー化合物と三糖とを反応させることにより、糖鎖が２単位集合化した本発明にかかる目的のリガンド、すなわち、ヘパリン部分二糖構造を２単位含む、上記一般式（１０２）で表される多岐用途型のリガンド（オリゴ糖鎖リガンド；ＥＳＩ−ＭＳ（negative) ｍ／ｚ＝５２３．８[ Ｍ−７Ｎａ＋３Ｈ]4- ） を得ることができた。
【０１５６】
次に、上記オリゴ糖鎖リガンドを使用し、ＳＰＲにより、該オリゴ糖鎖リガンドと合成ｖＷＦペプチドとの相互作用を確認した。まず、上記一般式（１０２）で表される化合物をストレプトアビジンを固定化したＳＰＲのセンサチップ表面上にビオチン−ストレプトアビジンの高い親和性を利用して配列させ、ヘパリン結合性のモデルペプチドとの相互作用を調べ、その有用性を検討した。
【０１５７】
ここで、オリゴ糖鎖リガンドをＳＰＲのセンサチップ上に固定化する操作について、図７（ａ）〜（ｄ）を参照して以下に説明する。
【０１５８】
本発明にかかる上記オリゴ糖鎖リガンドは、該オリゴ糖鎖リガンドを含む溶液と、予めストレプトアビジンを固定化したＳＰＲのセンサチップ（ストレプトアビジン固定化チップ）とを接触させることにより、該オリゴ糖鎖リガンドに含まれるオリゴ糖鎖、つまり、上記ビオチンリンカーに組み込んだオリゴ糖のオリゴ糖鎖を一段階でＳＰＲのセンサチップ表面に固定化させることができる。
【０１５９】
ストレプトアビジン固定化チップは、図７（ａ）に示すようにガラス基盤表面に金をコーティングしたＳＰＲのセンサチップに、図７（ｂ）に示すようにＡｕ−Ｓ結合を利用して下記一般式（２１）
【０１６０】
【化３２】
2006047318.tif 000036
【０１６１】
で表される４，４−ジチオジ酪酸を固定化させ、図７（ｃ）に示すように固定化させた４，４−ジチオジ酪酸を水可溶性のカルボジイミドの存在下でＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させて活性化した後、図７（ｄ）に示すようにストレプトアビジンの末端アミノ基を縮合させることにより作成、つまり、ストレプトアビジンを固定化することができる。
【０１６２】
図８はＳＰＲのセンサチップ上にストレプトアビジンを固定化した時のＳＰＲのセンサグラムの結果の一例であり、横軸はランニングバッファのフロー時間を示し、縦軸は共鳴角度変化（ＲＵ：Resonance Unit）を示す。
【０１６３】
また、図８中、矢印Ｘはストレプトアビジン溶液の注入を示し、矢印Ｙはランニングバッファに自動的に切り替わったことを示す。なお、ランニングバッファにはｐＨ７．４のＰＢＳを使用し、その流量は５μｌ／ｍｉｎとした。また、表面プラズモン共鳴装置には、日本レーザー電子社製の表面プラズモン共鳴装置「ＳＰＲ６７０」を用いた。そして、結合に関与しなかったストレプトアビジンをランニングバッファで洗い流し、チップ上に残存する活性エステルを１Ｍアミノエタノールによりキャッピングした。最終的なストレプトアビジンの固定化量はストレプトアビジン注入前のベースラインと、アミノエタノールによるキャッピングの後の共鳴角度変化の差とした。このセンサグラムでのストレプトアビジンの固定化量は２９３０ＲＵであった。
【０１６４】
本発明にかかるオリゴ糖鎖リガンドは、このようにして作成したストレプトアビジン固定化チップに、ビオチン−ストレプトアビジンの高い親和性を利用して固定化させることが可能であり、上記オリゴ糖鎖リガンドを用いれば、前記したように該オリゴ糖鎖リガンドを含む溶液と、予めストレプトアビジンを固定化したＳＰＲのセンサチップとを接触させることにより、該センサチップ表面に集合化されたオリゴ糖鎖を一段階で固定することができる。
【０１６５】
このときに用いられる上記オリゴ糖鎖リガンドを含む溶液としては、具体的には、例えば、上記オリゴ糖鎖リガンドのＰＢＳ溶液等が挙げられる。
【０１６６】
本実施の形態によれば、上記オリゴ糖鎖リガンドを含む溶液、例えば上記オリゴ糖鎖リガンドのＰＢＳ溶液に、ストレプトアビジンを固定化した上記センサチップを浸漬するかもしくは後述するようにストレプトアビジンを固定化したセンサチップにオリゴ糖鎖リガンドを含む溶液を注入して既知のビオチン−アビジン特異的結合相互作用を用いたビオチン−ストレプトアビジン結合によって上記オリゴ糖鎖リガンドを上記センサチップに固定化させることにより、表面にヘパリン部分二糖構造を有するセンサチップを作成することができた。
【０１６７】
次に、このセンサチップを用いてｖＷＦペプチドとの結合定数ＫD を測定した。
図９（ａ）は、ストレプトアビジンを固定化したＳＰＲのセンサチップを示す。上記ｖＷＦペプチドとの結合定数の測定に際しては、図９（ａ）に示すセンサチップに、濃度を変えてオリゴ糖鎖リガンドを含むＰＢＳ溶液を注入して図９（ｂ）に示すように該オリゴ糖鎖リガンド固定化させ、次いで、図９（ｃ）に示すようにさらに濃度を変えてｖＷＦペプチドを注入した。このようにして得られたセンサグラムの一例を図１０に示す。
【０１６８】
図１０はセンサチップ上にオリゴ糖鎖リガンドを固定化させ、濃度を変えてｖＷＦペプチドを注入したときのＳＰＲのセンサグラムの結果の一例であり、横軸はランニングバッファのフロー時間を示し、縦軸は共鳴角度変化（ＲＵ）を示す。
【０１６９】
また、図１０中、↑はオリゴ糖鎖リガンドの注入を示し、↓は結合に関与しなかったオリゴ糖鎖リガンドの洗浄のためのランニングバッファの注入を示す。オリゴ糖鎖リガンドは、その濃度を１．３９μＭから２．２２μＭまで連続的に変化させて上記センサチップに加えた。なお、ランニングバッファにはｐＨ７．４のＰＢＳを使用し、その流量は１０μｌ／ｍｉｎとした。また、表面プラズモン共鳴装置には、日本レーザー電子社製の表面プラズモン共鳴装置「ＳＰＲ６７０」を用いた。オリゴ糖鎖リガンドの固定化量は、オリゴ糖鎖リガンドの注入前のベースラインと、余分なオリゴ糖鎖リガンドが洗い流され、共鳴角度変化（ＲＵ）が一定になった時の差が固定化量に相当する。上記のセンサグラムではオリゴ糖鎖リガンドの固定化量は１４０ＲＵであった。
【０１７０】
続いて、オリゴ糖鎖リガンドを固定化させたセンサーチップに、ｖＷＦペプチドを注入し、結合させた後、ランニングバッファにより解離させ、その時の共鳴角度変化（ＲＵ）を観測した。ｖＷＦペプチドは、その濃度を０．５μＭから１．０μＭまで連続的に変化させて上記センサチップに加えた。結合定数ＫD の算出には、オリゴ糖鎖リガンドとｖＷＦペプチドとの結合による正の共鳴角度変化から求めた結合速度と、解離による負の共鳴角度変化から求めた解離速度とを用いた。
【０１７１】
上記の測定から算出された結合定数ＫDは、Sobel 等が放射標識法によって求めた値(M.Sobel et al. J. Biol. Chem. (1992), vol.267, p8857 、ＫD＝370 ±100 ｎＭ）とほぼ同じ値（ＫD ＝２８０ｎＭ）であった。
【０１７２】
以上のように、本実施の形態においては、糖鎖を集合化させるための新規なビオチンリンカーを提供した。そして、このビオチンリンカーを用いることにより、糖鎖を集合化させることができた。そして、この集合化させた糖鎖と蛋白質との相互作用をＳＰＲで確認することにより、ビオチンリンカーのＳＰＲへの応用が可能であることが判った。
【０１７３】
このように、上記ビオチンリンカーは、その分子内にビオチンが導入されていることで、既知の方法で前もってストレプトアビジンを固定化したチップやアフィニティークロマトグラフィーの担体に、ビオチン−アビジンの強い特異的相互作用を利用したビオチン−ストレプトアビジン結合によりオリゴ糖鎖を固定化することができる。
【０１７４】
この結果、上記ビオチンリンカーを用いることで、還元末端を有しているオリゴ糖鎖を蛋白質分析用の支持体表面に簡便に固定化できるようになった。また、従来、不可能であった、自然界から単利精製して得られるオリゴ糖をそのまま用いて蛋白質分析用の支持体表面に固定することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】一般式（４）で表される本発明のリガンドを用いて硫酸化多糖ヘパリン中の部分二糖構造を固定化してなる蛋白質分析用の支持体を示す模式図である。
【図２】従来のリガンドを用いてマルトースをセンサチップに結合させた場合における非特異的相互作用によるレスポンスと一般式（３）で表される本発明のリガンドを用いてグルコースを蛋白質分析用の支持体に結合させた場合における非特異的相互作用によるレスポンスとを比較するグラフである。
【図３】図１に示す蛋白質分析用の支持体を用いてＢＳＡ並びに合成ｖＷＦペプチドとの非特異的相互作用によるレスポンスを測定した結果を示すグラフである。
【図４】合成ｖＷＦペプチドの濃度を連続的に変化させて図１に示す蛋白質分析用の支持体に加えた場合の結合曲線を示すグラフである。
【図５】合成ｖＷＦペプチドの濃度を連続的に変化させて図１に示す蛋白質分析用の支持体に加えた場合における合成ｖＷＦペプチドの上記蛋白質分析用の支持体への固定化量の変化を示すグラフである。
【図６】一般式（１０２）で表される本発明のリガンドを用いてオリゴ糖鎖を集合可能なうえ固定化してなる蛋白質分析用の支持体を示す模式図である。
【図７】（ａ）〜（ｄ）は、一般式（１０２）で表される本発明のリガンドを上記蛋白質分析用の支持体上に固定化する操作を示す説明図である。
【図８】ＳＰＲに用いる蛋白質分析用の支持体上にストレプトアビジンを固定化した時のＳＰＲのセンサグラムである。
【図９】（ａ）は、ストレプトアビジンを固定化したＳＰＲ用の蛋白質分析用の支持体を示す模式図であり、（ｂ）は、（ａ）に示す蛋白質分析用の支持体に一般式（１０２）で表される本発明のリガンドを固定化させた状態を示す模式図であり、（ｃ）は、（ｂ）に示す蛋白質分析用の支持体にさらに濃度を変えてｖＷＦペプチドを注入したときの上記蛋白質分析用の支持体とｖＷＦペプチドとの相互作用を示す模式図である。
【図１０】ＳＰＲに用いる蛋白質分析用の支持体上に一般式（１０２）で表されるリガンドを固定化させ、濃度を変えてｖＷＦペプチドを注入したときのＳＰＲのセンサグラムである。
【図１１】従来のリガンドを用いて疎水性相互作用により硫酸化多糖ヘパリン中の部分二糖構造を固定化してなる従来のセンサチップを示す模式図である。
【図１２】図１１に示すセンサチップを用いて硫酸化多糖ヘパリン中の部分二糖構造と硫酸化多糖ヘパリン結合性の蛋白質との結合挙動を解析した結果を示すグラフである。
【図１】
2006047318.tif 000040
【図２】
2006047318.tif 000041
【図３】
2006047318.tif 000042
【図４】
2006047318.tif 000043
【図５】
2006047318.tif 000044
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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