(57)【要約】 【課題】  微量な特定の生化学物質を保持するため容器を提供する。とくに微量の生化学物質を基板上の複数箇所に高密度に保持することができ、その量のばらつきが小さく、また繰り返し再現性が良好な生化学物質保持容器を提供する。【解決手段】  ガラス基板１０の表面に所定の規則で配列された凹部２０を形成する。この凹部内表面２０ａ、２０ｂにのみアミノ基を導入した層３０を形成する。アミノ基の導入にはアミノシランカップリング剤を用いるのが好ましい。【選択図】      図３
2006189355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面に複数の凹部を備えた生化学物質保持容器において、前記凹部内表面の少なくとも一部にアミノ基が導入されていることを特徴とする生化学物質保持容器。
【請求項２】
前記基板はガラスであることを特徴とする請求項１に記載の生化学物質保持容器。
【請求項３】
Ｎ−（２−アミノエチル）アミノプロピル基または（アミノエチルアミノメチル）フェネチル基または（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミンが、シロキサン結合を介してガラス基板表面に固定されていることを特徴とする請求項２に記載の生化学物質保持容器。
【請求項４】
基板表面に形成された複数の凹部の内表面の少なくとも一部にアミノ基が導入された生化学物質保持容器の製造方法において、基板表面の所定位置に予め凹部を形成し、該凹部にアミノシランカップリング剤の有機溶媒溶液を注入し凹部内表面と反応させることを特徴とする生化学物質保持容器の製造方法。
【請求項５】
前記アミノシランカップリング剤は、Ｎ−（２−アミノエチル）アミノプロピル基または（アミノエチルアミノメチル）フェネチル基を有するもの、または（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミンであることを特徴とする請求項４に記載の生化学物質保持容器の製造方法。
【請求項６】
請求項１、２または３に記載の生化学物質保持容器を用いたことを特徴とするマイクロ化学反応器。
【請求項７】
請求項１、２または３に記載の生化学物質保持容器を用いたことを特徴とするＤＮＡ検出用マイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体関連分野で使用される所定領域に選択的に特定物質を付着または保持する機能を備えた生化学物質保持容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命科学の分野では、マイクロ化学反応器、ゲノム解析用チップ、プロテイン解析用チップなどの開発により、微少量の化学反応や高感度分析を行う技術が進展している。これらの技術においては微少量の生体関連物質を分析や反応に供することが要求されるため、生体関連物質溶液等の液体試料を選択的に所定箇所に保持する機能を備えた容器が必要となる。
【０００３】
このような機能は基板表面に特定の物質の分子を固定する機能を有する箇所（機能性結合サイト）を形成することによって実現できる。分子を固定するためには大別して化学的な結合による場合と物理的な吸着による場合とがある。例えば、ＤＮＡの固定はＤＮＡの断片が負電荷を有していることを利用し、電気的吸着によって行うことができる。基板表面に正電荷を付与し、電気的引力によりＤＮＡ断片を吸着し固定するものである。このような正電荷を付与する方法として、アミノシランを基板と反応させ、アミノ基を基板表面に導入する方法がある。
【０００４】
特許文献１にはアミノシランカップリング剤により樹脂基板やガラス基板表面にアミノ基を導入し、ＤＮＡマイクロアレイを形成する技術が開示されている。このときアミノ基とＤＮＡを架橋するグルタルアルデヒドを使用すること、また、ＤＮＡの非特異吸着を防ぐため、アミノシランカップリング剤とともにアミノシランカップリング剤よりも短いアルキルシランカップリング剤を使用することも開示されている。
【特許文献１】特開２００３−２７９５７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記特許文献１などに開示されている従来の方法は、平坦な基板の表面にアミノ基を導入するものであり、保持部が平坦面上にあるため、微量の液体試料を、基板表面の複数箇所に保持する際に、保持量のばらつきが大きく、また繰り返し再現性が悪いという問題があった。また保持部同士が接近すると試料が混入するという問題もあった。
【０００６】
また樹脂基板の場合は、有機溶媒耐性が低いため溶媒として水しか使えず、また耐熱性が低いため常温付近で使用しなければならないという問題があった。また樹脂は一般に自家蛍光が強いため高感度に蛍光を検出できないという問題点もある。
【０００７】
さらに従来、多くのアミノ修飾の場合、３−アミノプロピル基が用いられているが、この３−アミノプロピル基は短すぎるため、蛋白質の生体分子の固定化効率が悪いという問題点もあった。
【０００８】
本発明はこのような課題を解決するためになされたもので、微量の特定物質を微小容器内に再現性よく付着、保持できる生化学物質保持容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するため、本発明の生化学物質保持容器は、予め基板表面の所定位置に形成した凹部内表面の少なくとも一部にアミノ基を導入する。
基板に設けた凹部に液体試料を保持する際に、一定の保持量を再現性良く保持できる。また基板表面の複数箇所に高密度に保持できるため、単位面積あたりの試料数が多くなり、評価、測定を効率的に行うことができる。さらに生化学反応の多くを占める溶液反応を凹部内で行うことができる。
【００１０】
基板はガラスであることが好ましい。ガラス表面は容易にアミノ修飾が行え、有機溶媒を用いることもできる。また耐熱性が高いため、加熱して使用することもできる。さらにガラスは自家蛍光が少ないため、高感度な蛍光測定は可能となる。
【００１１】
上記生化学物質保持容器においては、Ｎ−（２−アミノエチル）アミノプロピル基または（アミノエチルアミノメチル）フェネチル基または（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミンが、シロキサン結合を介してガラス基板表面に固定されていることが好ましい。
【００１２】
ガラス基板に上記の基をシロキサン（Ｏ−Ｓｉ−Ｏ）結合を用いて固定化することにより、高い効率で生体分子を吸着または固定化できる生化学物質保持容器を提供することができる。
【００１３】
本発明のアミノ基を導入した生化学物質保持容器の製造方法においては、基板表面の所定位置に予め凹部を形成し、この凹部にアミノシランカップリング剤の有機溶媒溶液を注入して反応させる。
これにより、凹部表面にのみアミノ基を導入した生化学物質保持容器を製造する方法を提供することができる。
【００１４】
上記のアミノシランカップリング剤は、Ｎ−（２−アミノエチル）アミノプロピル基または（アミノエチルアミノメチル）フェネチル基を有するもの、または（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミンであることが好ましい。
これらを用いることにより、より高効率に生体分子を吸着または固定化できる生化学物質保持容器を製造する方法を提供することができる。
【００１５】
上記の生化学物質保持容器を用いてマイクロ化学反応器を構成することが望ましい。より高密度に生体分子を基板上に固定し反応に供することができる。
また上記の生化学物質保持容器を用いてＤＮＡ検出用マイクロアレイを構成することが望ましい。より高密度に生体分子を基板上に固定できるので、高感度でそれらを検出することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の生化学物質保持容器は、基板に設けた凹部に液体試料を保持するため、一定の保持量を再現性良く保持できる。また基板表面の複数箇所に高密度に保持できるため、単位面積あたりの試料数が多くなり、評価、測定を効率的に行うことができる。さらに生化学反応の多くを占める溶液反応を凹部内で行うことができる。
【００１７】
またガラス製の基板は有機溶媒を用いることができ、また耐熱性が高いため、加熱して使用することもできる。さらにガラスは自家蛍光が弱いため、高感度な蛍光測定は可能となる。
さらにアミノ基の導入に用いるシランカップリング剤を選択することにより、より高効率に生体分子を固定化できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明に用いる保持容器の一例を図１に示す。平板状のガラス基板１０の表面に複数の凹部２０を規則的に配列して形成したものである。図の例では９６個の凹部を１２行×８列に配列してある。図２は上記容器の一部の断面図である。凹部は図２（ａ）に示すような円筒状凹部２２、あるいは図２（ｂ）に示すような上面側から底面側にかけて次第に窄まる逆円錐台状凹部２４などの形状がある。逆円錐台状であれば、簡易に洗浄でき、好適に繰り返し使用することができるとともに、成型しやすく好ましい。
【００１９】
この保持容器は、紫外線透過性ガラスを用い、成型によって凹部を形成したものである。この凹部に例えば複数のＤＮＡを互いに混ざることなく収容して、それぞれの各種分析や培養を行うことができる。
【００２０】
紫外線透過性ガラス（例えば、天然石英ガラス、合成石英ガラス、ホウケイ酸ガラスなど）を溶融状態や軟化した状態とし、各種型成形により、多数の凹部を一度に形成する。なお、凹部底面２２ａ、２４ａは、研磨処理でより平滑な扁平面にしてあると、その底面に対し垂直方向から分光測定に用いる可視光や紫外光やＸ線を入射させたときに、精度よく分光測定を行うことができる。
【００２１】
上記の容器は成形したガラスの一体構造であるが、例えば特開２００４−１０９１０７号公報に開示されているように、貫通孔を設けたガラス板と底板を貼り合わせた構造や、複数の一定長さに切断したガラス管を底板状に配列固定した構造等であってもよい。
【００２２】
本発明においては、図３に示すように、この凹部２０の内部表面（内部底面２０ａと内部側面２０ｂ）にアミノ基を導入した層３０を形成する。アミノ基を導入した層３０は必ずしも図示するように内部表面全体に形成する必要はなく、例えば基板表面１０ａに近い内部側面２０ｂの一部には形成されていなくてもよい。
【００２３】
アミノ基を有する化合物としては、リシン、ポリアミン、アミノシランなどを例示できる。アミノシラン化合物としては、アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、（アミノエチルアミノメチル）フェネチルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−１１−アミノウンデシルトリメトキシシラン、アミノフェニルトリメトキシシラン、Ｎ−３−［（アミノ（ポリプロピレノキシ）アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルシラントリオール、（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミンなどを例示できる。これらのアミノシラン化合物は、加水分解した縮合体であってもよい。
【００２４】
以下に具体的な実施例について説明する。
【実施例１】
【００２５】
本実施例ではアミノ基を導入する対象として、図１に示す外観形状を有するガラス製の生化学物質保持容器を用いた。９６個の凹部は直径５ｍｍ、深さ１０ｍｍの円筒状で約２００μｌの内容積をもつ。また比較のために同様な形状の樹脂（ポリスチレン）製容器も使用した。
【００２６】
これらの容器の凹部内表面にアミノ基を導入するために上述のアミノシラン化合物のなかから次の６種類をアミノシランカップリング剤として用いた。
（１）３−アミノプロピルトリエトキシシラン
（２）Ｎ−（２−アミノエチル）アミノプロピルトリメトキシシラン
（３）Ｎ−（２−アミノエチル）−１１−アミノウンデシルトリメトキシシラン
（４）（アミノエチルアミノメチル）フェネチルトリメトキシシラン
（５）Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノプロピルトリメトキシシラン
（６）（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン
【００２７】
アミノ基の導入は図４に示すような手順によって行った。
凹部２０を設けた基板１０（図４（ａ））のそれぞれの凹部に酸溶液（濃硫酸：３０％過酸化水素水＝７：３）を分注し１２時間静置する。次いでイオン交換水で１０回洗浄し、超純水で１回洗浄する。つぎに９５％エタノールに対して３％アミノシランカップリング剤を溶解し、この溶液３２を２００μｌずつ各凹部へ分注する（図４（ｂ））。室温で１時間、反応させた後、エタノールで５回洗浄する。その後１１５℃で1時間焼成する。最後に９５％エタノールで洗浄し、乾燥させる。以上により、図４（ｃ）に示すような凹部２０の内表面にアミノ基がシロキサン（Ｏ−Ｓｉ−Ｏ）結合を介して導入された層３０が形成される。すなわち凹部２０のみがアミノ基で修飾された生化学物質保持容器が得られる（以下、この容器を容器Ａという）。
【００２８】
（接触角測定）
液体の保持機能は固体基板表面における液体の接触角で評価できる。接触角θは図５に示すように固体基板１２表面に滴下した液滴１００が基板表面と接触する角度で定義される。一般的にアミノ基が導入された表面の接触角は増大する。これはアミノ基を支持するアルキル鎖の疎水性のためである。容器Ａの凹部同様に処理したガラス基板の接触角の測定結果を、アミノシラン（１）〜（６）について表１に示す。接触角は８０°前後と未処理のガラス基板表面に比べて大きくなっており、アミノ基が導入された効果であることがわかる。
【００２９】
（表１）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
アミノシラン    （１）  （２）  （３）  （４）  （５）  （６）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
接触角（度）     ８２    ８２    ８６    ８３    ７２    ７４
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【００３０】
（表面元素分析）
アミノ基を導入した基板表面に存在する元素をＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）により検出した。表２にアミノシラン（２）と（６）で処理した基板上の元素の濃度を示す。アミノシランの成分である炭素（Ｃ１ｓ）、窒素（Ｎ１ｓ）、酸素（Ｏ１ｓ）、珪素（Ｓｉ２ｐ）が観測された。このことは、基板表面にアミノ基が存在することを示している。
【００３１】
（表２）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
アミノシラン      Ｃ１ｓ      Ｎ１ｓ      Ｏ１ｓ      Ｓｉ２ｐ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
（２）        ２７．０      ６．２    ４４．７      ２２．１
（６）        ３２．９      ４．９    ４２．２      ２０．０
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【００３２】
（タンパク質の吸着）
ガラス表面にアミノ基を導入することにより、タンパク質の吸着量を増加させることができる。以下に６種類のアミノシランカップリング剤によりコートした表面に対するタンパク質の吸着について説明する。吸着タンパク質としてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用いた。吸着量の指標として、反応生成物の発色による吸光度（波長：４５０ｎｍ）の増加を用いた。
【００３３】
ＰＯＤの吸着は以下の手順によって行った。
まず容器Ａの各凹部に、０．０５μｇ／ｍｌのＰＯＤをｐＨ７．４のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した溶液１００μｌを分注し、１０分間静置する。つぎにＰＯＤ溶液を取り除き、ｐＨ７．４のＰＢＳ１５０μｌで３回洗浄する。その後、ＰＯＤの基質溶液（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジダイン（ＴＭＢＺ）、住友ベークライト製）１００μｌを各凹部に分注する。１０分後、各凹部に反応停止液（住友ベークライト製）１００μｌを各凹部に分注する。
【００３４】
この処理後、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の測定は、フルオロスターオプティマ（マイクロプレートリーダ）により行った。表３に未処理の場合とアミノシラン（１）〜（６）による処理後の測定結果を示す。またこの吸光度から見積もったＰＯＤの吸着量の未処理表面に対する比を表４に示す。
【００３５】
以上の結果から、ガラス製容器では、未処理の場合に比べて（１）の３−アミノプロピルトリエトキシシランによる処理ではあまり効果が見られないが、（２）〜（６）のシランカップリング剤による処理により吸着量が増加することがわかる。一方、比較のために同様な処理を施した樹脂製容器の場合は、（１）、（４）および（５）のシランカップリング剤の処理により効果が見られるが、ガラス製容器に比べると全体に吸着量は少ない。
【００３６】
（表３）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
アミノシラン      未処理  （１）  （２）  （３）  （４）  （５）  （６）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ガラス製容器       0.42    0.39    0.58    0.58    1.02    0.53    1.41
樹脂製容器         0.30    0.67    0.09    0.10    0.60    0.40    0.25
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【００３７】
（表４）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
アミノシラン      （１）  （２）  （３）  （４）  （５）  （６）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ガラス製容器       0.94    1.38    1.39    2.46    1.26    3.38
樹脂製容器         2,27    0.32    0.33    2.02    1.33    0.85
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【００３８】
マイクロ化学反応器など、より多くのタンパク質を基板に吸着させなければならない場合、本発明により多くのタンパク質を吸着させることができる。この吸着量の増加は、アミノ基の導入により表面に正電荷が付与され、タンパク質の負電荷と引き合うことによる。
【００３９】
上記の処理方法は、ペルオキシダーゼだけでなく他のタンパク質においても用いることができる。特に、表面に負電荷を多く持つ酸性タンパク質を用いたときに吸着量が増大すると考えられる。また、タンパク質だけでなくＤＮＡを吸着することもできる。ＤＮＡは負電荷を帯びているため、正電荷を帯びたアミノ基と強く結合することができる。このＤＮＡの結合によって、より高感度なＤＮＡの検出キットへの応用が可能である。
【００４０】
（タンパク質の固定）
ガラス表面にアミノ基を導入することによりタンパク質を共有結合により固定化することができる。以下に６種類のアミノシランカップリング剤によりコートした表面に対するタンパク質の結合による固定について説明する。結合量の指標として、反応生成物の発色による吸光度（波長：４５０ｎｍ）の増加を用いた。
【００４１】
上記同様、ＰＯＤを例にその結合方法を以下に説明する。アミノ基を導入した容器Ａの各凹部に、ｐＨ７．４のＰＢＳに対するグルタルアルデヒドの２％溶液を１００μｌ分注し、その後３７℃で２時間静置する。この凹部を超純水１５０μｌで３回凹部を洗浄する。
【００４２】
つぎに各凹部にｐＨ７．４のＰＢＳに対して０．１ｍｇ／ｍｌのビオチンヒドラジド溶液を１００μｌ分注し、３７℃で２時間静置する。この凹部を超純水１５０μｌで３回洗浄する。
【００４３】
次いで各凹部にｐＨ７．４のＰＢＳに対する３％スキムミルク溶液を１５０μｌ分注し、この凹部を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ２００μｌで３回洗浄する。この後、各凹部にＰＯＤが架橋結合しているストレプトアビジン（０．０５ｍｇ／ｍｌ）１００ｍｌを分注し、この凹部を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ２００μｌで３回洗浄する。さらにＰＯＤの基質溶液（ＴＭＢＺ）１００μｌを各凹部に分注する。１０分後、各凹部に反応停止液１００μｌを分注する。
この後、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、未処理の場合に対するＰＯＤの固定化量の割合を求めた。吸光度の測定結果を表５に、ＰＯＤ固定化量の割合を表６に示す。
【００４４】
（表５）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
アミノシラン      未処理  （１）  （２）  （３）  （４）  （５）  （６）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ガラス製容器      0.69     0.75    0.93    0.36    1.28    0.46    1.13
樹脂製容器        0.43     0.05    0.13    0.13    0.27    0.18    0.71
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【００４５】
（表６）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
アミノシラン      （１）  （２）  （３）  （４）  （５）  （６）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ガラス製容器       1.09    1.35    0.53    1.86    0.67    1.64
樹脂製容器         0.11    0.31    0.31    0.62    0.40    1.64
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【００４６】
以上の結果から、ガラス製容器では、未処理の場合に比べて（１）の３−アミノプロピルトリエトキシシランによる処理ではあまり大きな効果が見られないが、（２）、（４）および（６）のシランカップリング剤による処理によりＰＯＤ固定量が増加することがわかる。一方、樹脂製容器の場合は、処理により効果がほとんど見られない。
【００４７】
本発明の方法により、ガラス製容器では樹脂製容器より多くのタンパク質を共有結合により固定化することができる。この固定化量の増加は、より効率的に容器凹部表面にアミノ基が導入されたことによる。
【００４８】
上記の例ではビオチン−アビジン結合反応を用いてペルオキシダーゼを固定化したが、抗原または抗体を酵素で標識化するＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）
法等への応用が可能である。上記の結果より、より高感度なＥＬＩＳＡを開発できる。また、高効率ＤＮＡマイクロアレイへの応用が期待できる。
【実施例２】
【００４９】
実施例１の最後に共有結合によりアミノ基にタンパク質を固定する例を示したが、本実施例では、より高効率なタンパク質を固定化のための手順を示す。
アミノシランカップリング剤としては、（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミンを用いた。
【００５０】
基板凹部に酸溶液（濃硫酸：３０％過酸化水素水＝７：３）を分注し３時間静置する。次いでイオン交換水で１０回洗浄し、超純水で１回洗浄する。つぎに９５％エタノールに対して３％アミノシランカップリング剤を溶解し、この溶液２００μｌを各凹部へ分注する。室温で１時間、反応させた後、エタノールで５回洗浄する。その後１１５℃で１時間焼成する。最後に超純水で洗浄し、乾燥させる（容器Ｂ）。
【００５１】
タンパク質としてはＰＯＤを用い、固定化およびその評価は、実施例１と同様の方法で行った。容器Ｂの吸光度と固定化量の評価結果を表７に示す。本実施例の場合、実施例１の場合に比べて３倍を超えるタンパク質を固定化できることがわかる。
固定化量の増加により、マイクロ化学反応器ではより大量に目的生成物が得られ、ＥＬＩＳＡなどの検査キットではより高感度に検出することができる。
【００５２】
（表７）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
未処理        処理後
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
吸光度            ０．５８      １．４０
固定化量の比        −          ５．４９
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は本発明に用いた保持容器の一例を示す斜視図である。
【図２】図２は保持容器の一例の断面模式図である。
【図３】図３は本発明のアミノ修飾を施した生化学物質保持容器の断面図である。
【図４】図４は本発明の生化学物質保持基板を製造する方法を示す図である。
【図５】図５は固体表面へ接した液体の接触角の説明図である。
【符号の説明】
【００５４】
１０  基板
２０、２２、２４  凹部
３０  アミノ基を導入した層
３２  溶液
１００  液滴
【図１】
2006189355.tif 000003
【図２】
2006189355.tif 000004
【図３】
2006189355.tif 000005
【図４】
2006189355.tif 000006
【図５】
2006189355.tif 000007