(57)【要約】【課題】Streptomyces thermonitrificans CS5-9株由来D-アミノアシラーゼ遺伝子の単離および該遺伝子を用いたD-アミノアシラーゼの製造方法を構築すること。【解決手段】既知D-アミノアシラーゼ遺伝子の比較から合成したプライマーを構築し、PCR法により増幅断片を取得した。該増幅断片の一部をプローブとして、ゲノムサザンハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズした6.5 kbpのSacI断片を有するプラスミドをコロニーハイブリダイゼーションによりクローン化し、遂に、目的とするStreptomyces thermonitrificans CS5-9株由来D-アミノアシラーゼ遺伝子の単離に成功した。本遺伝子は1665 bp、554個のアミノ酸をコードしていた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（a）から（d）のいずれかに記載の単離されたDNA。
（a）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（b）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
（c）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、D-アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
（d）配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、D-アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項２】
請求項１に記載のDNAが挿入されたベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のDNAまたは請求項２に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
【請求項４】
請求項３に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、耐熱性D−アミノアシラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なD-アミノアシラーゼ遺伝子、および該遺伝子を利用したD-アミノアシラーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は触媒活性を持つタンパク質であり、アミノ酸がタンパク質のおもな構成成分である。タンパク質がその機能を発揮するためには、複雑かつ厳密な立体構造を保持する必要がある。
【０００３】
光学活性なアミノ酸は調味料、食品添加物、飼料添加物、または医薬、農薬の合成原料として様々な用途に用いられている。特にL-アミノ酸は調味料、医薬用輸送などに用いられ、その利用価値は高い。L-アミノ酸の生産はタンパク質の加水分解法、発酵法、そして酵素法など多様である。L-アミノ酸の大部分が微生物を用いた発酵法によって生産されているが、いくつかのアミノ酸については化学合成された基質から酵素法を用いて生産が行われている。
【０００４】
一方、D-アミノ酸は細菌細胞壁のペプチドグリカンやペプチド性抗生物質にその存在が知られていたが、非タンパク性アミノ酸であるがゆえに、ほとんど注目されていなかった。しかし、1981年に南米産の両性類カエルの皮膚に、D-アラニンを含むモルヒネ様鎮痛活性を示すペプチドdermorphinの存在することが報告された。最近では、ヒトの歯のエナメル質、目の水晶体、脳のタンパク質中のL-アミノ酸が老化とともにラセミ化を受けD-型に変化すること、また、血液や小脳、脳下垂体、副腎、睾丸、脾臓にD-アミノ酸が遊離型として存在すること、さらには、アルツハイマー病では脳内に蓄積するβ-アミロイドタンパク質中のアスパラギン酸およびセリン残基がD-型に変化することも明らかにされている。D-アミノ酸に関して数々の知見が得られていることから、今後、医薬品や農薬等の合成原料としてD-アミノ酸の需要が高まることが考えられ、効率的なD-アミノ酸生産方法が求められている。
【０００５】
酵素法によるD-アミノ酸生産方法としては、D-ヒダントイナーゼを用いたD-p-ヒドロキシグリシンを生産する方法が知られている。他には、N-アシル-DL-アミノ酸にD-アミノアシラーゼあるいはL-アミノアシラーゼを作用させる方法が挙げられる。この方法は煩雑な操作を必要とするため、さらにより効率的なD-アミノ酸生産方法が開発されている。この改良された方法では、N-アシルアミノ酸ラセマーゼとD-アミノアシラーゼを併用し、D-アミノアシラーゼによるN-アシル-D-アミノ酸の加水分解と同時に、反応系に残存する光学異性体をN-アシルアミノ酸ラセマーゼによりラセミ化することにより、一段階でD-アミノ酸に変換する（非特許文献1-5）。このように、D-アミノ酸の生産において、D-アミノアシラーゼは重要な役割を果たす。
【０００６】
D-アミノアシラーゼはN-アシル-D-アミノ酸を加水分解し、D-アミノ酸生成を触媒する酵素である。D-アミノアシラーゼについて、現在までに放線菌ではStreptomyces 属（Streptomyces olivaceus 62-3、Streptomyces tuirus IFO13418）、細菌では、Pseudomonas属（Pseudomonas sp. KT83、Pseudomonas sp. AAA6029、Pseudomonas sp. 1158）とAlcaligenes 属（Alcaligenes denitrificans DA181、Alcaligenes faecalis DA1、Alcaligenes xylosoxydans A-6、Alcaligenes xylosoxydans MI-4）で報告がされている。これらの酵素は、Pseudomonas sp. KT83、Pseudomonas sp. AAA6029、そしてStreptomyces属を除いて精製され、その性質が調べられている。その結果、この酵素が誘導酵素であり、Alcaligenes xylosoxydans A-6においては誘導物質を変えることによって基質特異性の異なった3種類のD-アミノアシラーゼ類が報告されている。Alcaligenes xylosoxydans A-6由来のこれら3種の酵素は全て遺伝子がクローニングされ、D-アミノアシラーゼについては大腸菌内での発現にも成功している。また、Alcaligenes denitrificans DA181では、同時に生産されているL-アミノアシラーゼについても精製され、その性質が調べられている。さらにAlcaligenes xylosoxydans A-6由来のD-アミノアシラーゼについては活性、金属結合部位に関与するアミノ酸残基が推測されている。そして、最近、TsaiらのグループがAlcaligenes faecalis DA1由来のD-アミノアシラーゼの結晶化に成功し、2003年にはX線結晶解析の詳細を報告している。その報告により、D-アミノアシラーゼの金属結合と触媒に関するアミノ酸が同定された。これらの詳細な解析により、D-アミノアシラーゼがウレアーゼ、シトシンデアミナーゼなどが属する、金属依存性のドメインを持つヒドロラーゼのス−パーファミリーに属していると考えられている。
【０００７】
しかし、上記D-アミノアシラーゼは、すべて、温度安定性は50℃以下、至適温度は50℃以下であり、耐熱性に優れているとはいえない。耐熱性D-アミノアシラーゼが存在すれば、耐熱性に応じて酵素の耐久性が向上して、経済的に有利である。また、耐熱性D-アミノアシラーゼをD-アミノ酸製造に応用する場合、反応温度を高く設定出来るので、溶解度から原料等の濃度を高くすることが可能になり、同様に経済的なメリットがある。
【０００８】
このような耐熱性D-アミノアシラーゼとして、Streptomyces thermonitrificans CS5-9株D-アミノアシラーゼが報告されている。この酵素は、以前に本発明者らによって発見された。本発明者らは、実用的なD-アミノアシラーゼの獲得を目的としてスクリーニングを行い、50℃で生育可能なStreptomyces thermonitrificans CS5-9株にD-アミノアシラーゼ活性を見出し、Streptomyces thermonitrificans CS5-9株由来D-アミノアシラーゼを精製し、該酵素が耐熱性酵素であることを確認した（特許文献１）。耐熱性酵素の多くは、タンパク質の立体配座が高温でも崩れず、触媒活性を示すが、なかには高温下では変性して活性がないが、常温に戻すと再生して触媒活性を示すものもある。この耐熱性という性質は、一般的な酵素が持つ、安定性に乏しく細胞抽出や長期保存により失活しやすいという欠点を改善している。上記酵素の工業的使用には大量の酵素が必要となる。上記酵素の遺伝子を単離できれば、有用な耐熱性D-アミノアシラーゼの大量生産が可能となる。しかしながらこれまでにStreptomyces thermonitrificans CS5-9株由来D-アミノアシラーゼ遺伝子の単離の報告はない。
【特許文献１】特開2002-45179
【非特許文献１】S.Tokuyama,K.Hatano,and T.Takahashi :Discovery of a novel enzyme, N-Acylamino acid racemase in an Actinomycete :screening, isolation, and identification.,Biosci. Biotech. Biochem.,58,24(1994)
【非特許文献２】S.Tokuyama , K.Hatano :Purification and properties of a novel enzyme, N-acylamino acid racemase, from Streptomyces atrarus Y-53., Appl. Microbiol. Biotechnol.,40,835(1994)
【非特許文献３】S.Tokuyama , K.Hatano :Purification and properties of thermostable N-acylamino acid racemase from Amycolatopsis sp. TS1-60., Appl. Microbiol. Biotechnol.,42,853(1995)
【非特許文献４】S.Tokuyama , K.Hatano :Cloning, DNA sequencing and heterologous expression of the gene for thermostable N-acylamino acid racemase from Amycolatopsis sp. TS-1-60 in Escherichia coli., Appl. Microbiol. Biotechnol.,42,884(1995)
【非特許文献５】S.Tokuyama , K.Hatano : Overexpression of the gene for N-acylamino acid racemase from Amycolatopsis sp. TS-1-60 in Escherichia coli and continuous production of optically active methionine by a bioreactor., Appl. Microbiol. Biotechnol.,44,774(1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、Streptomyces thermonitrificans CS5-9株由来D-アミノアシラーゼ遺伝子の単離および該遺伝子を用いたD-アミノアシラーゼの製造方法を構築することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決すべく、本発明者らは、Streptomyces thermonitrificans CS5-9株由来D-アミノアシラーゼ遺伝子の単離を目的として鋭意研究を行った。当初、Streptomyces thermonitrificans CS5-9株由来D-アミノアシラーゼは既に単離されていることから、該D-アミノアシラーゼのアミノ酸配列を決定して、PCR法によるクローニングを行うことを考えた。しかし上記アミノ酸配列決定を行うには、Streptomyces thermonitrificans CS5-9株のD-アミノアシラーゼの生産量が少ないために精製酵素を大量に得ることが難しく、また、酵素タンパク質のN-末端がブロックされているという難点があり、これを断念した。次に、既にクローニングされているAlcaligenes 属細菌由来D-アミノアシラーゼ遺伝子の配列からPCR用プライマーを合成することを考えた。しかし、放線菌遺伝子のGC含量は一般的な細菌の遺伝子のGC含量に比べてきわめて高いため、上記遺伝子の配列に基づいたPCR用プライマーの設計も困難であった。
【００１１】
このように目的遺伝子のクローニングに困難を来たす中、本発明者らはStreptomyces coelicolor の遺伝子：SCO4986（データベース上の名称）に着目した。Streptomyces coelicolorは既にゲノム解析が完了している放線菌の一つであり、SCO4986のDNA配列は公知である。しかし、SCO4986の機能は未知であり、D-アミノアシラーゼ活性を持つことは全く知られていなかった。さらに、SCO4986と既知Alcaligenes xylosoxydans由来D-アミノアシラーゼ遺伝子との類似性はアミノ酸配列でたった34％と低い。このような状況にもかかわらず、本発明者らはStreptomyces coelicolor のSCO4986遺伝子をD-アミノアシラーゼ類似遺伝子（Scdaa）と推測してクローニングし、Scdaaが実際にD-アミノアシラーゼ活性を有することを確認した。続いて、該Scdaa、Alcaligenes xylosoxydans D-アミノアシラーゼ遺伝子、さらにStreptomyces avermitilisの間で部分的に類似性の高い箇所を探し出し、該類似性の高い配列に基づきプライマーを設計した。この合成したプライマーを用い、Streptomyces thermonitrificans CS5-9株のtotalDNAを鋳型としてPCR法を実施し、本発明者らは、ついにStreptomyces thermonitrificansのD-アミノアシラーゼ遺伝子の増幅に初めて成功した。さらに本発明者らは、増幅断片の一部を用いてサザンハイブリダイゼーションを実施し、該遺伝子の完全な遺伝子の取得に成功し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は新規D-アミノアシラーゼ遺伝子およびその利用に関し、具体的には下記の発明を提供するものである。
（１）下記（a）から（d）のいずれかに記載の単離されたDNA、
（a）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（b）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
（c）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、D-アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
（d）配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、D-アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
（２）上記（１）に記載のDNAが挿入されたベクター、
（３）上記（１）に記載のDNAまたは上記（２）に記載のベクターを保持する形質転換細胞、
（４）上記（３）に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、耐熱性Ｄ−アミノアシラーゼの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の遺伝子は、耐熱性D-アミノアシラーゼをコードしている。本発明の遺伝子により発現するD-アミノアシラーゼは、従来よりも高温度域で種々のN-アシル-D-アミノ酸に作用して、D-アミノ酸を生じる性質を有する。すなわち、本発明の遺伝子を用いて耐熱性D-アミノアシラーゼを製造し、該D-アミノアシラーゼによりD-アミノ酸を製造すれば、原料、基質の溶解性が上がり、仕込み濃度を高く設定出来ることから、工業的に有利な製造が可能である。例えば、本発明の遺伝子を用いて製造した耐熱性D-アミノアシラーゼを、D体とL体の混合物であるN-アセチル-DL-アミノ酸に作用させて、D-アミノ酸を特異的に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、新規D-アミノアシラーゼ遺伝子に関する。新規D-アミノアシラーゼ遺伝子として、Streptomyces thermonitrificans(以下、S. thermonitrificansと略する場合もある) CS5-9株由来D-アミノアシラーゼのDNA配列を配列番号１に示す。また、S. thermonitrificans CS5-9株由来D-アミノアシラーゼの推定アミノ酸配列を配列番号２に示す。上述のとおり、本発明者らは、複雑な過程を経て、S. thermonitrificansのD-アミノアシラーゼ遺伝子の単離に成功した。本明細書において「単離」とは、本来存在する状態とは異なる状態で存在するように人為的に処理することをいう。
【００１５】
本発明のD-アミノアシラーゼ遺伝子は、当業者に周知の方法で調製することができる。例えば、S. thermonitrificansからtoal DNAを抽出し、プラスミド、ファージ、コスミド、YAC等のベクターを用いてゲノムライブラリーを作製し、S. thermonitrificans D-アミノアシラーゼをコードする塩基配列の一部、例えば配列番号１のDNAの一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、調製できる。または市販DNA合成機により、配列番号１に記載の配列の１本鎖DNAおよび相補的配列の１本鎖DNAを合成し、それらをアニーリングさせて調製してもよい。
【００１６】
また本発明は、S. thermonitrificans D-アミノアシラーゼと類似し、D-アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（以下、時に「S. thermonitrificans D-アミノアシラーゼ類似遺伝子」と省略する。）を含有する。このような遺伝子として、天然に存在する、若しくは人工的に作られたS. thermonitrificans D-アミノアシラーゼ類似遺伝子変異体、他の生物由来D-アミノアシラーゼ遺伝子、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、D-アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA、配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、D-アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。上記DNAにおいて、「１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加」するアミノ酸の数や場所は、上記DNAがコードするタンパク質がD-アミノアシラーゼ活性を有する限り、制限はない。あえて変異数を挙げるとすれば、典型的には全アミノ酸の10％以内、好ましくは全アミノ酸の5％、さらに好ましくは全アミノ酸の1％以内である。
【００１７】
上記S. thermonitrificans D-アミノアシラーゼ類似遺伝子を単離するためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１８】
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるDNAがコードするポリペプチドは、通常、本発明者らにより同定されたポリペプチドとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも40％以上、好ましくは60％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは少なくとも95％以上、さらに好ましくは少なくとも97％以上（例えば、98から99％）の配列の相同性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、Karlin and Altschul によるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993) によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990) 。BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえば score = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
【００１９】
上記S. thermonitrificans D-アミノアシラーゼ類似遺伝子の調製は、当業者にとって周知の方法で行うことができる。S. thermonitrificans D-アミノアシラーゼをコードした塩基配列、例えば、配列番号１に記載のDNA配列の一部をプローブとし、ハイブリダイゼーションによって天然に存在する変異体やホモログを調製することが可能である。例えば55℃以上の温度でも増殖し得る微生物、高温菌、好熱菌等からの調製が考えられる。高温菌（好熱菌）としては、バシルス（Bacillus）属の細菌（B. thermophilus, B. megaterium, B. coagulans, B.stearothermophilus等）、クロストリジウム（Clostridium）属の細菌（C. kluyveri等）、デサルフォトマキュラム（Desulfotomaculum）属の細菌などの他、サーマス（Thermus）属の細菌（T. flavus, T. thermophilus, T. aguaticus, T.celer等）、メタン細菌（Methanobacterium属、Methanococcus属、Methanosarcina属等）、乳酸菌（Lactobacillus lactis, L. acidphilus, L. bulgaricus, L.delbrueckii等）、水素細菌、光合成細菌等が挙げられる。また、超好熱菌であるパイロコッカス・フリサス（Pyrococcus furisus）、パイロコッカス エス ピー（Pyrococcus sp.）、およびエアロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）等も挙げられる。または、S. thermonitrificans D-アミノアシラーゼ遺伝子配列、例えば配列番号１に記載のDNA配列に対し、オリゴヌクレオチドを用いた変異法、PCRによる変異法、カセット変異法等の、当業者に周知のタンパク質変異法によって人為的に調製することも可能である。さらには、市販のDNA合成機によって合成することも可能である。
【００２０】
上記のようにして調製した遺伝子が、D-アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードしているかは、公知方法によって確認することができる。例えば、後述する実施例に記載するように、調製した遺伝子を発現させ、得られたタンパク質をN-アセチルD-メチオニンと接触させたときのD-メチオニン産生を指標にすれば、D-アミノアシラーゼ活性の有無を知ることができる。
【００２１】
本発明のS. thermonitrificans D-アミノアシラーゼ遺伝子またはS. thermonitrificans D-アミノアシラーゼ類似遺伝子は、耐熱性D-アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質の生産に利用することができる。上述したとおり、Streptomyces thermonitrificans CS5-9株のD-アミノアシラーゼの生産量は少ないが、上記遺伝子をD-アミノアシラーゼ製造に用いれば、耐熱性D-アミノアシラーゼの大量生産が可能になる。遺伝子を発現させる際には、適当な発現ベクターを用いることができる。使用する発現ベクターは、発現系によって適宜選択することが望ましい。発現系は、細胞系でも無細胞系でもよい。形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories、1989年)。微生物中などにおいて、本発明のD-アミノアシラーゼをコードするDNAを発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターをD-アミノアシラーゼをコードするDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。このようなプロモーター、ターミネーターの一例として、実施例で使用したPLDプロモーターやPLDターミネーターを挙げることができる。また、tipAp, glyCABp, mcrABp, ermEpなどのプロモーターおよびそのターミネーターも好適に使用できる例である。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102(1990)、Yeast 8, 423-488 (1992) などに詳細に記述されている。
【００２２】
例えば、放線菌発現系であれば、後述する実施例で用いたpUC19等のpUC系プラスミドの他、pIJ8600, pIJ459, pIJ4090, pMT3206, pANT850, pIJ6021などを用いることができる。その他、ストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gene 103,97-99 (1991))、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1995) )が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 (1997) )。
【００２３】
大腸菌発現系であれば、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac(β-ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、trc (lac、trpの融合)、λファージ PL、PRなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーターなどを用いることができる。
【００２４】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてapr(アルカリプロテアーゼ)、 npr(中性プロテアーゼ)、amy(α-アミラーゼ)などが利用できる。
【００２５】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子などが利用できる。
【００２６】
ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００２７】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacteriumglutamicum)においては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196,175 (1984)などのプラスミドベクターが利用可能である。
【００２８】
ストレプトコッカス(Streptococcus)属においては、pHV1301(FEMS Microbiol.Lett. 26, 239 (1985)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００２９】
ラクトバチルス(Lactobacillus)属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００３０】
ロドコッカス(Rhodococcus)属においては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能である(J. Gen. Microbiol. 138,1003 (1992) )
【００３１】
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae) においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノラーゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００３２】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyceslactis)においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００３３】
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS (自律複製に関与する遺伝子)及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００３４】
チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zygosaccharomyces rouxii)由来の pSB3（Nucleic Acids Res. 13,4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol.Chem. 54, 2521 (1990)）などが利用可能である。
【００３５】
ハンゼヌラ(Hansenula)属においては、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenulapolymorpha)において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ハンゼヌラ・ポリモルファ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、 HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991)）。また、メタノールなどで誘導される AOX（アルコールオキシダーゼ)、 FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモーターなどが利用可能である。
【００３６】
ピキア(Pichia)属においては、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 (PARS1、 PARS2)などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能な AOX など強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859(1987)）。
【００３７】
キャンディダ(Candida)属においては、キャンディダ・マルトーサ(Candidamaltosa)、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・ウチルス (Candida utilis) などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51,1587 (1987)）、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平 08-173170）。
【００３８】
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) 、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。
【００３９】
トリコデルマ(Trichoderma)属においては、トリコデルマ・リーゼイ(Trichodermareesei)を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603 (1989)）。
【００４０】
また、昆虫細胞や哺乳動物細胞を用いてタンパク質を生産させる場合には、バキュロウイルスを用いることができる。哺乳動物細胞内のバキュロウイルスベクターとしては、例えば、pAcCAGMCS1が挙げられる（村松正実 編、ラボマニュアル遺伝子工学第３版、丸善株式会社、1996年発行、pp.242-246）。
【００４１】
本発明のD-アミノアシラーゼ遺伝子または該遺伝子が挿入されたベクターを宿主細胞に導入することにより、D-アミノアシラーゼを産生する形質転換細胞を得ることができる。本発明の遺伝子またはベクターを導入する宿主細胞の種類に特別の制限はなく、目的に応じて選択することができる。上記ベクターの宿主細胞への導入は、当業者に公知の方法で行うことができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクタミン法、マイクロインジェクション法などの方法で行うことが可能である。
【００４２】
宿主細胞において発現させたD-アミノアシラーゼは、当業者に周知の方法により回収することができる。D-アミノアシラーゼが微生物体内に蓄積される場合には、培養終了後、微生物をろ過、遠心分離等の方法で集め、緩衝液、生理食塩水等で菌体を洗浄後、例えば、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理などの物理手段、もしくはリゾチームなどの細胞壁溶解酵素処理のような生化学的処理もしくは界面活性剤との接触処理などの化学的処理を単独または組み合わせて行うことにより微生物を破砕し、D-アミノアシラーゼを抽出することができる。こうして得られた粗D-アミノアシラーゼは、塩析、有機溶媒などによる分別沈殿、塩析クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、色素クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーをオープンカラム、中圧クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって行う分離および等電点電気泳動、native-電気泳動などの電気泳動法による分離等の手段を単独もしくは組み合わせて用いることにより精製することができる。
【００４３】
具体的には、例えば231液体培地（0.1%酵母エキス、0.1%肉エキス、1.0%マルトース、0.2%N.Z.アミンtypeA、pH7.0）などの培地を用いて振とう培養を行い、遠心分離により集菌する。得られた菌体を、ソニケーターで超音波破砕し、遠心分離を行い上清を回収してD-アミノアシラーゼの粗酵素液を得る。その後、硫安を用いた塩析処理、ゲルろ過による脱塩、Butyl-Toyopearl 650M疎水的クロマトグラフィー、DEAE-Toyopearl 650Mイオン交換クロマトグラフィー、Sephacryl S200ゲルろ過クロマトグラフィー、Mono Q イオン交換クロマトグラフィーを行い、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に単一のバンドに精製することができる。
【００４４】
本発明の遺伝子を利用して得られたD-アミノアシラーゼは、D-アミノ酸の製造のために利用することができる。また、培養物は、そのまま、あるいは菌体を破砕した粗精製物としてD-アミノ酸の製造のために利用することができる。すなわち、液体培地または平板培地上にて培養した菌体を採取し、必要に応じて、固定化菌体、粗酵素、固定化酵素等の菌体処理物を調製する。これを、原料であるN-アシル-DL-アミノ酸に接触させることによりD-アミノ酸の生成反応系を構成することができる。
【実施例】
【００４５】
以下に、実施例をあげて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００４６】
［実施例1］D-アミノアシラーゼ遺伝子クローニング用プライマーの設計  
S. thermonitrificansのD-アミノアシラーゼ遺伝子をPCR法により単離するため、プライマー設計を検討した。耐熱性放線菌S. thermonitrificans CS5-9株のD-アミノアシラーゼは既に単離されている（特許文献1）。しかし、Streptomyces thermonitrificans CS5-9株のD-アミノアシラーゼの生産量が少ないために精製酵素を大量に得ることが難しく、また、酵素タンパク質のN-末端がブロックされているため、N末端アミノ酸配列解析が困難であった。そのため、S. thermonitrificans CS5-9株D-アミノアシラーゼアミノ酸配列からのPCR用プライマー設計は断念した。
【００４７】
次に、他の微生物のD-アミノアシラーゼ遺伝子の配列を基に、S. thermonitrificansのD-アミノアシラーゼ遺伝子単離用プライマーの設計を試みた。クローニングに成功しているAlcaligenes 属細菌由来D-アミノアシラーゼ遺伝子の配列からPCR用プライマーの合成を検討した。しかし、放線菌遺伝子のGC含量は一般的な細菌の遺伝子のGC含量に比べてきわめて高く70%にもなるため、上記遺伝子の配列に基づいたPCR用プライマーの設計が困難であった。
【００４８】
そこで本発明者らは、既にゲノム解析が完了している放線菌配列からプライマーを設計することを検討した。放線菌Streptomyces属では、2002年にHopwoodらによりS. coelicolor A3(2)、2003年には池田らによりS. avermitilisの全ゲノム解析の完了が報告されている。S. coelicolor にはD-アミノアシラーゼ遺伝子と推定される遺伝子（Scdaa）が存在する。上記S. coelicolorから見出されたD-アミノアシラーゼ類似遺伝子とS. avermitilisから見出されたD-アミノアシラーゼ類似遺伝子の配列を比較検討したところ、両遺伝子はアミノ酸配列で78％の類似性を有することがわかった（表1）。
【００４９】
【表１】
2006166781.tif 000002
また、S. coelicolor、S. avermitilisの推定D-アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列および周辺領域遺伝子の解析、比較を行った。両放線菌において、D-アミノアシラーゼ類似遺伝子だけでなく、その周辺領域が高度に保存されていた(図1)。また、D-アミノアシラーゼ類似遺伝子周辺にはD-アミノ酸に関係すると考えられるD-アミノデアミナーゼやアミノトランスフェラーゼといった遺伝子が存在し、その遺伝子の塩基配列や方向も高度に保存されている。
【００５０】
S. thermonitrificansCS5-9株は上記2株と同じStreptomyces属である。そこで、S. thermonitrificansのD-アミノアシラーゼ遺伝子はS. coelicolor、S. avermitilisのD-アミノアシラーゼ類似遺伝子と高い類似性があると推測できる。D-アミノアシラーゼ類似遺伝子間で保存領域の探索を試みた。S. coelicolorとS. avermitilisの遺伝子ではアミノ酸配列の類似性が高いため、Alcaligenes xylosoxydans A-6由来のD-アミノアシラーゼも加え、アミノ酸配列を比較したところ（図2）、保存性の高い領域が数ヶ所認められた。
【００５１】
しかし、このScdaaとAlcaligenes 属細菌由来D-アミノアシラーゼ遺伝子との類似性はアミノ酸配列で34％と低いものであった。そこで、Scdaa発現タンパク質のD-アミノアシラーゼ活性の確認を行うことにした。プライマー：SCDAA-F1、SCDAA-R1を用い、S. coelicolor totalDNAを鋳型としてPCRを行った。SCDAA-F1、SCDAA-R1の配列を示す。
SCDAA-F1(SphIサイト作成用) ：d(TCAGGCATGCAAGAGCTGGTCATCAGGG)   （配列番号３）
SCDAA-R1(HindIIIサイト作成用)：d(CCGCAAGCTTCGCCCTCGACAACAAGCT)   （配列番号４）
約1.7 kbpの増幅断片をゲル抽出により回収後、SphI、HindIIIで処理し、開始コドン部位のSphIサイト、終止コドン下流のHindIIIサイトを作成した。この断片をpUC702のKpnI-SphIサイトにPLDプロモーターを連結したプラスミドpUC702ProのSphI、HindIIIサイトに挿入し、構築したプラスミドを放線菌発現用プラスミドCD1とした(図3)。CD1をS. lividans TK21に導入して発現させてD-アミノアシラーゼ活性を測定した。Scdaa について23KU/I cultureのD-アミノアシラーゼ活性が確認された（表2）。
【００５２】
【表２】
2006166781.tif 000003
【００５３】
ゲノム解析の結果、S. coelicolor、S. avermitilisのD-アミノアシラーゼ遺伝子周辺の遺伝子や遺伝子の方向が高度に保存されており、周辺遺伝子のアミノ酸配列も80％近い類似性を有している。そこで、上述したS. coelicolor、S. avermitilis 、Alcaligenes xylosoxydans A-6のD-アミノアシラーゼ類似遺伝子周辺の保存性が高い領域から2ヶ所を選択し、プライマーSTDAA-F1、STDAA-R1を作製した。作製したプライマーの配列を以下に示す。
STDAA-F1：d(CCCGGCTTCATCGACATGCAC)  （配列番号５）
STDAA-R1：d(GTCGAASAGSACCAGGTCGGC)  （配列番号６）
S = G or C
【００５４】
［実施例２］PCR法によるD-アミノアシラーゼ遺伝子の増幅  
上記プライマーSTDAA-F1、STDAA-R1を使用し、S. thermonitrificansのtotalDNAを鋳型としてPCRを行い、得られた増幅断片についてアガロースゲル電気泳動を行った。
【００５５】
鋳型となるtotal DNAの調製は、以下のとおり行った。スプリングを入れた試験管にTSB培地5 mlをとり、TSBスラント培地で培養した放線菌S. thermonitrificansCS5-9を1白金耳接種し、50℃で1日間振とう培養した。この培養液2 mlをスプリング数個入れた500 ml容坂口フラスコに取った100 mlのTSB培地に植菌し、対数増殖中期（50℃、112 spm、5時間）になるまで振とう培養した。培養液を50 ml容コニカルチューブにとり、遠心分離（3,000 rpm、1,500×g、15分、4℃：himac SCR20B、ローターRPRS4、日立製）し、集菌した。20 mlのTE 緩衝液（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 8.0）に懸濁し、遠心分離（5,000 rpm、4,000×g、20分、4℃）し、洗浄を行った。デカンテーションにより上清を除き、湿菌体を得た。湿菌体約2 gを5 mlのTE 緩衝液に懸濁し、ペレットをつぶしながら10 mgのリゾチームと2 mgのプロナーゼを加え、さらにペレットをつぶしながら5分毎に穏やかに攪拌し、溶液がやや粘性を帯び始めるまで最長1時間、30℃でインキュベートし、溶菌させた。0.5 M EDTAを1.2 mlを加えて穏やかに攪拌した後、10 mg/mlプロナーゼを0.13 ml加えて攪拌し、30℃で5分インキュベートした。0.7 mlの10% SDSを加え、37℃でインキュベートし、5分毎に穏やかに攪拌して、菌体が完全に溶菌して溶液が透明になるまで、最長2時間インキュベートした。その後6 mlのフェノールを加え、穏やかに10分間攪拌後、6 mlのクロロホルムを加え、5分間攪拌した。遠心分離（3,000 rpm、1,500×g、20分間、室温：himac SCR20B、ローターRPRS4、日立製）し、水層を新しいチューブに移した。残ったクロロホルム層に5 mlのTNE 緩衝液（10 mM Tris-HCl(pH 8.0)、1 mM EDTA(pH 8.0)、100 mM NaCl）を加えて5分間攪拌した。遠心分離（3,000 rpm、1,500×g、10分間、室温：himac SCR20B、ローターRPRS4、日立製）し、水層を回収して先に回収した水層に合わせた。集めた水層に6mlのクロロホルムを加え、5分間攪拌した。遠心分離（3,000 rpm、1500×g、10分間、室温：himac SCR20B、ローターRPRS4、日立製）し、水層を新しいチューブに回収した。この操作をもう一度繰り返した。溶液の重量に対してRNaseを40 μg/gになるように加え、37℃で1時間インキュベートした。その後、溶液の1/4量の5 M NaClを加え穏やかに攪拌し、終濃度が10%となるように30% PEG6,000を加え、完全に溶液が混ざるまで穏やかに攪拌した。PEGがついてこないようにパスツールピペットでDNAを巻き取り、5 mlのTE緩衝液で洗浄した。5 mlのTE緩衝液中に溶解後、4℃で一晩穏やかに攪拌した。0.6 mlの3 M 酢酸ナトリウムと12mlのエタノールを加え、糸くず状のDNA沈殿が確認できるまでよく攪拌した。パスツールピペットでDNAを巻き取り、2 mlの70%エタノールで洗浄した後、風乾し、1 mlのTEに溶解した。
【００５６】
PCR法は、Hot Star Taq DNA polymerase（QIAGEN）を用いて実施した。放線菌のDNAを用いてPCRを行う場合、DNAのGC含量及びDNA polymeraseのfidelityが問題となってくる。放線菌は一般的にGC含量が70％であり、PCR反応時における変異の導入などが危惧される。しかし、現在ではfidelityの高いDNA polymeraseが開発され、各試薬メーカーから発売されている。今回用いたHot Star Taq DNA polymerase（QIAGEN）もfidelityが高いとされ、GC含量が高い放線菌の遺伝子の増幅に適していると考えられる。なお、PCRはHot Star Taq DNA polymeraseで標準とされるサイクルをもとに放線菌のPCR条件を検討し、以下のように行った。
反応液組成
Hot Star Taq DNA polymerase（5 unit/μl）               0 μl（2.5 unit）
10×buffer                                             10 μl
dNTP Mixture（2 mM each）                              10 μl（0.2 mM）
Templete（10 ng/μl                                  ）10 μl
Primer-F（25 pmol/μl）                                 2 μl（50 pmol/μl）
Primer-R（25 pmol/μl）                                 2 μl（50 pmol/μl）
滅菌蒸留水                                           65.5 μl   
合計                                                100 μl
PCRサイクル
1, 96℃ 5分間  1サイクル
2, 97℃ 45秒間 → 55℃ 30秒間 →  74℃ 1分間  5サイクル
3, 96℃ 45秒間 → 55℃ 30秒間 →  74℃ 1分間  25サイクル
【００５７】
上記PCRで得られた増幅断片について、1×TAEバッファー（40 mM Tris base、0.4 mM 酢酸、1mM EDTA）を用い、アガロースゲル電気泳動を実施した。アガロースゲルは、1×TAEバッファーに分離したいDNA断片の長さにあわせたゲル濃度（100〜2,000bp→2％、200〜3,000bp→1.5％、500〜7,000bp→1％、800〜10,000bp→0.7％）になるようにアガロースS（ニッポンジーン）を加え、電子レンジでゲルを完全に融解させた。50℃まで冷却後、エチジウムブロマイドを終濃度50μg/μlとなるように加えて均一にし、ゲルフォーマーに流し込んで作製した。泳動はサブマリン型電気泳動槽のMupid-2（アドバンス社製）を用い、定電圧を50 V、あるいは100 Vで泳動した。DNA分子量マーカーはλDNAをHindIIIで消化したものを用いた。泳動したDNAはUVランプ(302 nm)上で確認した。
【００５８】
結果を図4に示す。アガロースゲル電気泳動から求めた増幅断片の鎖長は、それぞれ約1.5 kbp、1.8 kbpであった。
【００５９】
続いて、得られたPCR増幅産物についてシーケンス解析を行った。シーケンス解析の結果、上記PCR産物はS. coelicolorのD-アミノアシラーゼ類似遺伝子と80％の相同性を示した。
【００６０】
［実施例３］ゲノムサザンハイブリダイゼーション  
PCR法により、推定D-アミノアシラ−ゼ遺伝子を増幅できたが、PCRの反応段階で別の塩基などを取り込み、正しい遺伝子配列が増幅されていない可能性が考えられる。そこで、S. thermonitrificansのゲノムDNAからD-アミノアシラーゼ遺伝子をクローニングするため、サザンハイブリダイゼーションを試みた。
【００６１】
STDAA-F2、R2の組み合わせのプライマーで増幅した断片を、pUC19から作製したTベクターにサブクローニングし、得られたプラスミドをpUC(T)STDAAとした(図5)。pUC(T)STDAAプラスミドをBamHI、SmaI処理して得られた約400 bpのDNA断片を、DIGシステムを用いたランダムプライム法により標識し、プローブN1とした（図6A）。プローブN1の配列を下記および配列番号７に示す。
プローブN1：
cccgggatgtacgccagtgacgccgaactgaccgagctgtgccgggtggtggccgcccacggcggctactggtgcccgcaccaccgcagttacggggccggggcgctgaaggcgtacgaggaggtggtgaccctcgcgcgcgaggcgggctgcccgctgcacctggcgcacgccaccttgaacttcgcccccaacaagggccgcgcgcccgagctgctggcgctgctggacgacgcgctcgccgccggcgccgacatcaccttcgacacctatccctacacccccggctgcaccaccctggccgcgttgctgccgagctgggcgggcgagggcggcccggacgcccttctcgcccggctcgccgacgagaccgtcgccgagcggatcc  （配列番号７）。
【００６２】
S. thermonitrificansのtotal DNAを調製し、total DNA10 μgに対して3種類の制限酵素KpnI、PstI、SacIでそれぞれで分解後、アガロース電気泳動（Mupid-2、50V、30分間）し、プローブN1によりサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションは、非放射性システムであるDIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて行った。
【００６３】
結果を図6に示す。サザンハイブリダイゼーションの結果、KpnI断片中11 kbp付近、PstI断片中10 kbp付近、そしてSacI断片中7 kbp付近にバンドが検出された(図6C)。
【００６４】
［実施例４］SacI断片（6.5 kbp〜8 kbp）のクローニング  
プローブN1がハイブリダイズしたS. thermonitrificans CS5-9のSacI断片を回収するために、ゲノムDNA10 μgに対して制限酵素SacI40 Uを加え、200 μlの反応系で1時間反応させた。反応液をアガロース電気泳動（Mupid-2、50V、2時間）に供し、λ/HindIIIマーカーの6.5 kbpのバンドと9.4 kbpのバンドに対応している部分を3分割して切り出し、このゲルからDNAを抽出した。
【００６５】
一部を再びアガロース電気泳動に供し、サザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、3分割した中で6.4〜7 kbpのバンドが最もプロ−ブN1と強くハイブリダイズした（図7B）。
【００６６】
最もプロ−ブと強くハイブリダイズした部分に対応するゲル抽出液を、制限酵素SacI処理した後、BAPにより5´末端の脱リン酸化処理したpUC19ベクターとライゲーション反応させた。ライゲーションには、250 ngのSacI断片に対して、100 ngのpUC19ベクターを用いた。この反応液をE. coli JM109に形質転換した。
【００６７】
［実施例５］コロニーハイブリダイゼーション  
実施例４で得られた形質転換体1000個をコロニーハイブリダイゼーションに供した。コロニーハイブリダイゼーションは、DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit IIを用いて実施した。プローブは上述のプローブN1を用いた。
【００６８】
コロニーハイブリダイゼーションの結果、陽性クローンが１個得られた（図8）。得られたプラスミドにはSacI断片（6.5 kbp）が認められた。このDNA断片に対してサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、プローブN1と強くハイブリダイズした（図9）。
【００６９】
既存のD-アミノアシラーゼ遺伝子の長さは1.0〜1.5 kbpであり、プローブN1がハイブリダイズしたDNA断片がS. thermonitrificans由来のD-アミノアシラーゼ遺伝子ならば、このDNA断片中にD-アミノアシラーゼ遺伝子の一部、または全てが含まれていると考えられた。このDNA断片を含むプラスミドをpSAC4として今後の実験に用いた（図10）。
【００７０】
用いたDIGシステムは、検出操作が煩雑である。しかし、ハイブリダイズさせる時の温度、洗いの条件がRIシステムを用いる場合と同様に様々に変化させることができる。このため、放線菌由来の遺伝子のように、GC含量が高い場合や、ファミリー遺伝子をプローブにする場合など、様々な条件を設定する場合には適していると考えられる。
【００７１】
［実施例６］SacI断片（6.5 kbp）の制限酵素地図の作成  
S. thermonitrificans CS5-9株由来の6.5 kbp SacI断片の制限酵素地図の作成を試みた。プラスミドpSAC4を各制限酵素で切断した後、サザンハイブリダイゼーションを行った。この結果より、6.5 kbpの挿入断片中にPstI認識部位が1ヶ所、BamHI認識部位が2ヶ所、SmaI認識部位が3ヶ所存在することが推定された。次に、6.5 kbpの挿入断片を制限酵素PstI、BamHI及びSmaIを組み合わせて処理し、断片長をアガロースゲル電気泳動結果から推定した。これらについてサザンハイブリダイゼーションを行い、6.5 kbp SacI処理断片の制限酵素地図と、プローブN1がハイブリダイズした場所を推定した(図11)。
【００７２】
［実施例７］D-アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列決定と解析  
遺伝子が含まれていると考えられる推定領域をSacI-BamHI、BamHI-SmaI、SmaI-BamHI、BamHI-PstI、PstI-SacIの5つの領域に分割し、それぞれの断片をpUC19ベクターにサブクローニングした後、S. thermonitrificans CS5-9株由来D-アミノアシラーゼ遺伝子の全塩基配列を決定した（図12、配列番号１）。シーケンス解析の結果、得られた遺伝子の配列は推定の開始コドン（ATG）、終止コドン（TGA）、そして推定の開始コドンの上流にSD配列と考えられる配列（GGAGA）が認められた(図12)。推定の開始コドンから終止コドンまでの配列はS. coelicolorの推定D-アミノアシラーゼ遺伝子と約81％の類似性、推定のアミノ酸配列で79％の類似性を示した(図13)。本遺伝子は1665 bpからなり、アミノ酸554個をコードしていると推測された。
【００７３】
D-アミノアシラーゼはウレアーゼ、シトシンデアミナーゼなどが属する金属依存性のドメインを持つヒドロラーゼのス−パーファミリーに属している。そして、D-アミノアシラーゼの反応機構もウレアーゼの反応機構を参考に推測することができる。Tsaiらのグループが2003年にAlcaligenes faecalis DA1由来D-アミノアシラーゼ のX線結晶解析の詳細を報告しているがそれによると、D-アミノアシラーゼは活性中心で2つの亜鉛イオンと結合しており、220、250番目のヒスチジン、96番目のシステインが1つの亜鉛イオンを、67、69番目のヒスチジンと96番目のシステインがもう1つの亜鉛イオンの結合に関係しているとされている。さらに直接的な触媒反応は366番目のアスパラギン酸が関係していると推測されている。一方、本遺伝子では75、77、238、268番目のヒスチジンが67、69、220、250番目に対応し、432番目のアスパラギン酸が366番目のアスパラギン酸に対応していると推測された（図13）。アミノ酸配列のアライメントの結果、96番目のシステインに対応するアミノ酸については本遺伝子および、S. coelicolor、S. avermitilisのD-アミノアシラーゼ遺伝子ではアスパラギン酸であることが推測された。これがStreptomycesのD-アミノアシラーゼで特徴的なものであるかは明らかではない。さらに、S. benihanaのD-アミノアシラーゼでは、96番目のシステインにはアルギニンが対応していると推測された。S. benihanaのD-アミノアシラーゼは、クローニングされている中で唯一金属要求性を示さないという特徴をもっている。金属結合に関係しているとされるアミノ酸が存在しないと金属要求性がないという関係は非常に興味深い。今後、部位特異的変異や放線菌のD-アミノアシラーゼの結晶解析を行い、AlcaligenesのD-アミノアシラーゼと比較することで、より詳細な機能が解明されていくと期待できる。
【００７４】
［実施例８］既知D-アミノアシラーゼ遺伝子とのアミノ酸配列の比較  
得られた塩基配列を現在までに報告されているD-アミノアシラーゼ（Alcaligenes xylosoxydans A-6、Alcaligenes xylosoxydans DA1）とアミノ酸配列の比較を行った（表1）。また推定のD-アミノアシラーゼ類似遺伝子Streptomyces coelicolor A3(2)、Streptomyces avermitilis MA-4680）および、本発明者らによりクローン化されたSebekia benihana IFO14309のD-アミノアシラーゼ遺伝子と比較した。その結果、本遺伝子は同じStreptomyces属であるStreptomyces coelicolor、Streptomyces avermitilis由来の遺伝子とは、それぞれ79％、75％という高い類似性を示したが、Alcaligenes属由来の遺伝子とは34％という低い類似性であった。同じ放線菌であるSebekia benihana由来の遺伝子とは比較した中で最も低い27％という類似性を示した。
【００７５】
［実施例９］D-アミノアシラーゼ遺伝子の放線菌での発現  
本遺伝子がD-アミノアシラーゼ遺伝子であることを確認するために、遺伝子を放線菌Streptomyces lividans TK21で発現させ、D-アミノアシラーゼの生産性を検討した。
【００７６】
本遺伝子発現のため、発現プラスミドTD2を下記のとおり構築した。放線菌Phospholipase D遺伝子はプロモーター領域に加えターミネーター領域も有している。PLDプロモーターを用いて異種遺伝子を発現させる場合、ターミネーターを付加するとより発現量が増加する事が知られている。そこで、PLDターミネーターを本遺伝子下流に連結させることを試みた。まず、pUC19ベクターのKpnI-SphIサイトにPLDプロモーターを連結し、続いてPCRにより増幅した本遺伝子をSphI-HindIIIサイトでプロモーター下流に連結した。続いて、ターミネーター増幅用のプライマーを作製した。ターミネーター増幅用プライマーはForward、Reverseともに制限酵素HindIIIサイトを含んでいる。また、ReverseプライマーにはKpnIサイトも含んでいるためにKpnIでも処理することができる。ターミネーター増幅用プライマーPTF-H、PTF-Rの配列は下に示した。
PTF-H（HindIIIサイト作成用）：d(AGACAAGCTTCGCTCTGAGACGACTGAGCG)（配列番号８）
PTR-H（HindIII、KpnI作成用）：d(AAAGAAGCTTGGTACCCCCTTGGCCGCGA)（配列番号９）
このプライマーを用いて増幅した約300 bpのターミネーター領域を上記の本遺伝子下流にHindIIIサイトで連結し、この構築したプラスミドをpUCTD2とした。次にpUCTD2をKpnIで処理し、約3.4 kbpのプロモーターからターミネーター部分までを切り出し、KpnI処理したpUC702ベクターに挿入し、構築したプラスミドをTD2とした（図14）。発現ベクターTD2またはコントロールベクターpUC702を、Hopwoodらの方法（D.A.Hopwood, M.J.Bibb, K.F.Chater : Genetic manupulation of Streptomyces.,The John Innes Foundation.）に従って放線菌Streptomyces lividans TK21に形質転換した。
【００７７】
放線菌形質転換体の培養液1.5 mlを遠心分離（8,000 rpm、1分間、4℃）し、得られた菌体を0.5 mlの50 mM Tris-HCl（pH 7.5）に懸濁した。再び遠心分離（8,000×g、1分間、4℃）後、得られた菌体を0.5 mlの50 mM Tris-HCl（pH7.5）に懸濁し、ハンドソニケーター（トミー精工製）で超音波破砕（3分間）を行った。この超音波破砕液を遠心分離（16,000×g、10分間、4℃）し、上清を粗酵素液とした。N-アセチル-D-メチオニンを含む反応液に酵素液を加え、生成したメチオニンをTNBS法で定量した。酵素活性はN-アセチルD-メチオニンからD-メチオニンが1分間に1μmol生成する酵素量を1unit（U）と定義した。
【００７８】
結果を表２に示す。酵素を培地あたりのD-アミノアシラーゼ生産量は、TD2を有する形質転換体は55.9 U/Lであり、親株であるS. thermonitrificans CS5-9のD-アミノアシラーゼ生産量2.9 U/Lに比べ、約19倍の値を示した(表2)。この結果より、本遺伝子がD-アミノアシラーゼ遺伝子であることが確認できた。pUC702を含むものではD-アミノアシラーゼ活性は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】S. coelicolorおよびS.avermitilis由来D-アミノアシラーゼ遺伝子近辺に存在する遺伝子の位置および図を比較した図である。
【図２】各種D-アミノアシラーゼ（Alcaligens xylosoxydans A-6、Streptomyces coelicolor、Streptomyces avermitilis）の遺伝子配列およびアミノ酸配列を比較する図である。矢印は、PCR法プライマー位置を示す。
【図３】発現プラスミドCD1の構築を示す図である。
【図４】PCR法増幅産物のアガロース電気泳動写真である。
【図５】プラスミドpUC（T）STDAA の構築方法を示す図である。
【図６】Streptomyces thermonitrificansのトータルDNAのサザンハイブリダイゼーションに関する図である。（A）プローブとして用いたDNA断片部分を両側矢印で示す図である。（B）DNA調製物（10μg）を制限酵素で切断した後、1％アガロースゲルで電気泳動した写真である。レーン１：KpnIで切断、レーン２：PstIで切断、レーン３：SacIで切断、レーンM:HindIIIで切断したラムダDNA(サイズマーカー)。（C）さらに、D-アミノアシラーゼをコードするSma I - BamH Iフラグメント(0.4kbp)を標識したプローブを用いてハイブリダイズした写真である。
【図７】ゲノムライブラリをSacIフラグメントでサザンハイブリダイゼーションした写真である。（A）はアガロース電気泳動、（B）はサザンハイブリダイゼーション。レーン1：7.8-8.8kbp、レーン2：7.0-8.2kbp、レーン3：6.4-7.0kbp、レーンM:HindIIIで切断したラムダDNA(サイズマーカー)。
【図８】Streptomyces thermonitrificans CS5-9株のD-アミノアシラーゼを保持する形質転換体のコロニーハイブリダイゼーションを示す写真である。
【図９】プラスミドpSAC4のSAC I断片のサザンハイブリダイゼーションの写真である。（A）：アガロース電気泳動、（B）：サザンハイブリダイゼーション。レーン１：SacIで切断、レーンM:HindIIIで切断したラムダDNA(サイズマーカー)。
【図１０】プラスミドpSAC4の構築を示す図である。
【図１１】プラスミドpSAC4の制限酵素地図である。
【図１２】Streptomyces thermonitrificans CS5-9株由来D-アミノアシラーゼの塩基配列および推定アミノ酸配列を示す図である。
【図１３】D-アミノアシラーゼのアミノ酸配列を比較する図である。S. coelicolor A3(2)（上段）、S. thermonitrificans CS5-9（下段）。
【図１４】発現プラスミドTD2の構築を示す図である。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１３】
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【配列表】
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