(57)【要約】【課題】高トリグリセリド血症の成因解明と高トリグリセリド血症のテーラーメイド予防に有用なＬＰＬ遺伝子解析をより簡便に行うために、日本人におけるＬＰＬ遺伝子変異を集積するとともに、それら変異を標的とした遺伝子診断を行うのに必要な、特異的診断キットを提供する。【解決手段】日本人高トリグリセリド血症被検者のＬＰＬ遺伝子中に新たな突然変異Ｓ２５１ＦおよびＣ２８３Ｆを見出し、この新たに発見されたエキソン６に変異を有するＬＰＬ遺伝子の塩基配列に基づいて、当該変異を検出するためプローブを提供し、また変異部分を含む塩基配列を増幅し変異を検出する簡便な原発性高トリグリセリド血症診断法、診断用キットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表わされるヒトリポタンパクリパーゼ遺伝子エキソン６の塩基配列、または５８番目の塩基を含む部分塩基配列、またはその相補配列からなる核酸。
【請求項２】
核酸が１０ヌクレオチド以上である、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
核酸が２０ヌクレオチド以上である、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
核酸が２０ヌクレオチド以上２００ヌクレオチド以下である、請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
ヒトリポタンパクリパーゼ遺伝子診断方法であって、検査対象からＤＮＡを採取し、ＤＮＡ標品を作製する工程、ＤＮＡ標品中に請求項１に記載の塩基配列の存在の有無を検出する工程、とを含むことを特徴とする、ヒトリポタンパクリパーゼ遺伝子診断方法。
【請求項６】
検出工程が、請求項１に記載の核酸をプローブとして用いることを特徴とする請求項５に記載の診断方法。
【請求項７】
検出工程が、ＤＮＡ標品から請求項１に記載の核酸に相当する領域を含む部分を増幅し、変異の有無で切断箇所の数が変化する制限酵素で消化し、制限断片のパターンから変異の有無を判定することを特徴とする、請求項５に記載の診断方法。
【請求項８】
制限酵素がＨｉｎｆＩであることを特徴とする、請求項７記載の診断方法。
【請求項９】
配列番号１の塩基配列、または５８番目の塩基を含むその部分塩基配列を増幅するためのプライマーセットおよび変異検出用試薬とを含むことを特徴とする高トリグリセリド血症の病因を特定する診断キット。
【請求項１０】
変異検出用試薬が、請求項４に記載の核酸からなるプローブであることを特徴とする、請求項９に記載の診断キット。
【請求項１１】
変異検出用試薬が制限酵素であることを特徴とする、請求項９に記載の診断キット。
【請求項１２】
制限酵素がＨｉｎｆＩであることを特徴とする、請求項１１に記載の診断キット。
【請求項１３】
プライマーセットが配列番号５および６の配列を有することを特徴とする、請求項９から１２のいずれかに記載の診断キット。
【請求項１４】
配列番号３で表わされるヒトリポタンパクリパーゼ遺伝子エキソン６の塩基配列、または１５４番目の塩基を含むその部分塩基配列、またはその相補配列からなる核酸。
【請求項１５】
核酸が１０ヌクレオチド以上である、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
核酸が２０ヌクレオチド以上である、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１７】
核酸が２０ヌクレオチド以上２００ヌクレオチド以下である、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１８】
ヒトリポタンパクリパーゼ遺伝子診断方法であって、
検査対象からＤＮＡを採取し、ＤＮＡ標品を作製する工程、
ＤＮＡ標品中に請求項１４に記載の塩基配列の存在の有無を検出する工程、とを特徴とする、ヒトリポタンパクリパーゼ遺伝子診断方法。
【請求項１９】
検出工程が、請求項１７に記載の核酸をプローブとして用いることを特徴とする請求項１８に記載の診断方法。
【請求項２０】
検出工程が、ＤＮＡ標品から請求項１４に記載の核酸に相当する領域を含む部分を増幅し、変異の有無で切断箇所の数が変化する制限酵素で消化し、制限断片のパターンから変異の有無を判定することを特徴とする、請求項１８に記載の診断方法。
【請求項２１】
制限酵素がＢｓｔＸＩであることを特徴とする、請求項２０記載の診断方法。
【請求項２２】
配列番号３の塩基配列、または１５４番目の塩基を含むその部分塩基配列を増幅するためのプライマーセットおよび変異検出用試薬とを含むことを特徴とする高トリグリセリド血症の病因を特定する診断キット。
【請求項２３】
変異検出用試薬が請求項１７に記載の核酸からなるプローブであることを特徴とする、請求項２２に記載の診断キット。
【請求項２４】
変異検出用試薬が制限酵素であることを特徴とする、請求項２２に記載の診断キット。
【請求項２５】
制限酵素がＢｓｔＸＩであることを特徴とする、請求項２４に記載の診断キット。
【請求項２６】
プライマーセットが配列番号５および６の配列を有することを特徴とする、請求項２２から２５のいずれかに記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は高トリグリセリド血症の成因の診断に有用なリポタンパクリパーゼ遺伝子変異（Ｓ２５１ＦとＣ２８３Ｓ）に関するものである。更にこれら変異を検出するための遺伝子診断試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リポタンパクリパーゼ（以下、ＬＰＬという）は、約６０キロダルトンの糖タンパク質であり、腸管で生成されるカイロミクロンや、肝臓で生成される超低比重リポタンパク中のトリグリセリドを加水分解して、遊離脂肪酸を産生する酵素である。
【０００３】
ＬＰＬ遺伝子異常のホモ接合体の患者は、高カイロミクロン血症をともなう１，０００ｍｇ／ｄｌ以上の著しい高トリグリセリド血症を呈し、急性膵炎が引き起こされ死に至る場合がある。よって、高カイロミクロン血症や膵炎を発症した場合の病因を明らかにすることは、その後の治療方針を決定するために重要である。
【０００４】
ＬＰＬ遺伝子欠損ヘテロ接合体の場合には、正常者にくらべＬＰＬ活性は約半分になるが、高インスリン血症にならず、飲酒癖のない健全な生活習慣をもっている場合には、高トリグリセリド血症（IV型高脂血症）を発症することはない。しかし、ＬＰＬ遺伝子欠損ヘテロ接合体の遺伝背景を持っていて、飲酒癖や運動不足・肥満などの悪い生活習慣を伴うと、肝臓でのトリグリセリド合成が亢進し、ＬＰＬ活性が正常者の半分のレベルでは血中のトリグリセリドを加水分解して正脂血状態を保つには不足であり、高トリグリセリド血症（IV型高脂血症）を発症する。これが続くと、低密度リポタンパク（ＬＤＬ）の小型・高密度化を引き起こし、これは動脈硬化の危険因子となり、将来的に心疾患等の危険因子となる。高トリグリセリド血症の成因にはＬＰＬ遺伝子異常以外の遺伝因子や環境因子もかかわり、その成因はすべてが解明されているわけでない。高トリグリセリド血症になったときにその病因を明らかにすることは、その後の治療方針の決定や、患者がその治療を受け入れ、生活習慣の改善もふくめて、確実に実行するためには、たいへん重要である。
【０００５】
将来的には、高トリグリセリド血症になる前に、たとえば、飲酒癖等、悪い生活習慣を身に付ける２０歳以前に自分がＬＰＬ遺伝子異常ホモあるいはヘテロ接合体であるか否かを知ることで、将来起こる可能性のある高トリグリセリド血症発症、動脈硬化、心疾患を予防できるようになるであろう。これは究極のテーラーメード医療である。いったん身についた悪しき生活習慣を改善するよりは、最初からそのような生活習慣を身につけない方が容易であると考えられる。特に、女性の場合は、妊娠すればＬＰＬ遺伝子正常者でも高トリグリセリド血症になるのが普通なので、それ以前にあらかじめ自分のＬＰＬ遺伝子の状態を知っておくことは、妊娠中の栄養管理を厳密に行うことができ、それによって、高トリグリセリド血症に起因する膵炎の併発や流産を予防できる。
【０００６】
ヒトのＬＰＬ遺伝子は第８染色体短腕（ｐ２２）に位置し、１０個のエキソンからなり、３５ｋｂの長さがある。
【０００７】
ＬＰＬ遺伝子の変異は日本人においてこれまでに２２種程度が見いだされている。このなかで日本以外で見いだされているものは少数であり、人種の違いで、見いだされる変異の種類に違いがあることをしめす。日本人の高トリグリセリド血症の成因診断を簡便かつ正確に行うには、日本人でのリポタンパクリパーゼ遺伝子変異をさらに集積することが重要である。
【非特許文献１】Wion et al. Science, 1987 第235巻, 第1638頁-第1641頁
【非特許文献２】Lo J-Y, Smith LC, Chan L, Lipoprotein lipase: role of intramolecular disulfide bonds in enzyme catalysis. Biochemical and Biophysical Research Communications, 206巻第266頁-第271頁、1995年.
【非特許文献３】A. Mori et al. Clinical Biochemistry, 第33巻 第323頁-327頁 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
高トリグリセリド血症の成因がＬＰＬ遺伝子異常によるものか否かを診断することは、高トリグリセリド血症の治療方針の決定に重要である。更に、将来的には高トリグリセリド血症のテーラーメイド予防として、本症を発症する前にＬＰＬ遺伝子診断がなされることが望ましい。しかし、遺伝子配列決定法等の通常の遺伝子解析方法は、一般的な診断に適用するには時間やコストがかかるため実用的とはいえず、より簡便な診断方法の開発が望まれている。
【０００９】
従って、本発明の目的は、高トリグリセリド血症の成因解明と高トリグリセリド血症のテーラーメイド予防に有用なＬＰＬ遺伝子解析をより簡便に行うために、日本人において集積してきたＬＰＬ遺伝子変異を用いて、それら変異を標的とした遺伝子診断を行うことにより、ＬＰＬ遺伝子診断を簡便化することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らはこれまで、日本人の高トリグリセリド血症者から１７種類のＬＰＬ遺伝子変異を集積してきた。その他、日本の他施設でのみ見いだされている５種類のＬＰＬ遺伝子変異を含め、現在日本人でのＬＰＬ遺伝子変異は２２種類が集積されている。ちなみにこれら変異があるとＬＰＬ酵素活性はゼロあるいはほぼゼロになる。
【００１１】
本発明者らは上記目的を達成するために日本人の高トリグリセリド血症者におけるＬＰＬ遺伝子異常をさらに検索した結果、エキソン６にこれまでに知られていなかった新たな変異２種、Ｓ２５１Ｆ変異とＣ２８３Ｓ変異を発見し、この事実に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の第１は、配列番号１で表わされるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド、または５８番目の塩基を含むその部分配列で、好ましくは１０ヌクレオチド以上、さらに好ましくは２０ヌクレオチド以上からなるポリヌクレオチドまたはその相補配列である。このヒトＬＰＬ遺伝子エキソン６の塩基配列において、野生型ではｃである５８番目の塩基が、ｔであり、このミスセンス変異（Ｓ２５１Ｆと命名する）の結果、ヒトＬＰＬのアミノ酸配列の２５１番目（以下本明細書中ではＬＰＬのアミノ酸残基の番号付けはWionらの論文（非特許文献１）に従う）が野生型ではセリン（Ｓｅｒ）であるのにたいし、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）となり、ＬＰＬ活性を失う。
【００１２】
本発明の第２は、配列番号３で表わされるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド、または１５４番目の塩基を含むその部分配列で、好ましくは１０ヌクレオチド以上、さらに好ましくは２０ヌクレオチド以上からなるポリヌクレオチドまたはその相補配列である。このヒトＬＰＬ遺伝子エキソン６の塩基配列において、野生型ではｇである１５４番目の塩基が、ｃであり、このミスセンス変異（Ｃ２８３Ｓと命名する）の結果ヒトＬＰＬのアミノ酸配列の２８３番目が野生型ではシステイン(Ｃｙｓ)であるのにたいし、セリン（Ｓｅｒ）となり、ＬＰＬ活性を失う。
【００１３】
本発明のＳ２５１Ｆ変異、またはＣ２８３Ｓ変異を有するポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、当該部位の変異による原発性高トリグリセリド血症の診断に有用なプローブやプライマー等を作成することが可能になる。
【００１４】
本発明の第３は、配列番号１で表わされる配列、またはその５８番目の塩基を含む部分塩基配列を増幅し検出するためのプライマーおよび変異検出試薬を含むことを特徴とする高トリグリセリド血症の病因を特定する診断キットである。
【００１５】
本発明の高トリグリセリド血症の成因を特定する診断キットの好ましい実施形態の一つは、プライマーとして、配列番号５で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含み、かつ検出試薬として制限酵素ＨｉｎｆＩを含むものである。
【００１６】
本発明の第４は、配列番号３で表わされる配列、またはその１５４番目の塩基を含む部分塩基配列を増幅し検出するためのプライマーおよび変異検出試薬を含むことを特徴とする高トリグリセリド血症の病因を特定する診断キットである。
【００１７】
このトリグリセリド血症の病因を特定するための診断キットの好ましい態様の一つは、プライマーとして、配列番号５で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含み、かつ検出試薬として制限酵素ＢｓｔＸＩを含むものである。
【発明の効果】
【００１８】
以上説明したように、本発明によれば、２種の突然変異による原発性高トリグリセリド血症の診断に有用なポリヌクレオチドを提供できる。また、これらのポリヌクレオチドの塩基配列に基いて原発性高トリグリセリド血症の診断に有用なプローブやプライマー等を容易に作成することが可能になり、上記ＬＰＬ遺伝子の変異による高トリグリセリド血症の成因診断を簡単に行なうことができる診断キットを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
すでに述べたように、配列番号１および３で表わされる塩基配列は、本発明者らにより高トリグリセリド血症者から新たに発見されたＬＰＬ遺伝子のエキソン６の塩基配列である。配列番号１で表わされる塩基配列においては、５８番目の塩基が野生型ではｃであるが、ｔとなったために、野生型ではヒトＬＰＬのアミノ酸配列２５１番目（配列番号２では１９番目）はセリン（Ｓｅｒ）であるものがフェニルアラニン（Ｐｈｅ）となったミスセンス変異（Ｓ２５１Ｆと命名する）である。
【００２０】
また、配列番号３で表わされる基配列においては、１５４番目の塩基が野生型ではｇであるが、ｃとなったために、野生型ではヒトＬＰＬのアミノ酸配列２８３番目（配列番号４では５１番目）はシステイン（Ｃｙｓ）であるものがセリン（Ｓｅｒ）となったミスセンス変異（Ｃ２８３Ｓと命名する）である。
なお非特許文献２はヒトＬＰＬの２８３位のＣｙｓと２７８位のＣｙｓをセリンに変えた場合酵素活性が失われることを記載しているが、それらの変異と日本人の高トリグリセリド血症とのかかわりについては開示も示唆もしていない。
【００２１】
従って、エキソン６の上記遺伝子変異、Ｓ２５１ＦとＣ２８３Ｓ変異の有無を調べることは、高トリグリセリド血症の診断や予防において有用である。
【００２２】
ＬＰＬ遺伝子の上記変異を調べる方法としては、DNA sequencing法（normal sequencing, ddNTP extension）、PCR(polymerase chain reaction)-RFLP(restriction fragment length polymorphism)法、SSCP法（single strand conformation polymorphisms）、ECA（electrochemical array） -chip法）、Allele Specific PCR法、TaqMan Allelic Discrimination法、Hybridization法（DNA microarray, DNA chip）、Mass Spectrometry法、Denaturing HPLC法、Invader Assay法、Nano-Invader Assay法等が挙げられるが、これらの方法に限定されるわけではなく、その他多くの方法が存在する。
【００２３】
具体的な上記変異に的をしぼった遺伝子解析法はPCR(polymerase chain reaction)-RFLP(restriction fragment length polymorphism)法、ECA（electrochemical array） -chip法）、Allele Specific PCR法、TaqMan Allelic Discrimination法、Hybridization法（DNA microarray, DNA chip）、Mass Spectrometry法、Invader Assay法、Nano-Invader Assay法等が挙げられるが、これらの方法に限定されるわけではなく、その他多くの方法が存在する。
【００２４】
本発明の高トリグリセリド血症の病因を特定する診断キット（以下、単に診断キットという）は、ＬＰＬ遺伝子のエキソン６の上記１塩基置換変異２種を判別するための診断キットであり、配列番号１で表わされる塩基配列の５８番目の塩基を含む塩基配列を検出するためのプライマーを含む。上記プライマーとしては、５８番目の塩基を含む塩基配列を挟む少なくとも１組のプライマー（センスプライマー及びアンチセンスプライマー）が好ましい。このようなプライマーとしては、配列番号５で表わされるプライマー（センスプライマー）と配列番号６で表わされるプライマー（アンチセンスプライマー）の組み合わせが挙げられる。
【００２５】
配列番号５（非特許文献３）で表わされる４６塩基からなるオリゴヌクレオチドはセンスプライマーであり、２１Ｍ１３配列１８塩基（配列番号５の１〜１８番目までの塩基配列）とＬＰＬ遺伝子のイントロン５のセンス鎖側の一部の塩基配列（配列番号５の１９〜４６番目までの塩基配列）を含む。配列番号６（非特許文献３）で表わされる４７塩基からなるオリゴヌクレオチドはアンチセンスプライマーであり、Ｍ１３ＲＰＩ配列の１８塩基（配列番号６の１〜１８番目までの塩基配列）とＬＰＬ遺伝子のイントロン６のアンチセンス鎖側の一部の塩基配列（配列番号６の１９〜４７番目までの塩基配列）を含む。このプライマーセットを用いるとヒトＬＰＬ遺伝子のエキソン６とその周辺領域が増幅できる。
【００２６】
配列番号５及び６で表わされるプライマーを用いて、高トリグリセリド血症被検者の血液などから常法により抽出したゲノムＤＮＡからＰＣＲ法でＬＰＬ遺伝子のエキソン６とその周辺部分を増幅すると、Ｓ２５１Ｆ変異をもつ場合には、配列番号１で表わされる２４３ｂｐを含む全長３５９ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。Ｃ２８３Ｓ変異をもつ場合には、配列番号３で表わされる２４３ｂｐを含む全長３５９ｂｐのＰＣＲ産物が得られる。野生型をテンプレートとした場合も同サイズのＰＣＲ産物が得られる。
【００２７】
そして、Ｓ２５１Ｆ変異のホモ接合体者のＰＣＲ産物をＨｉｎｆＩで消化すると、配列番号１で表わされる配列を含むＰＣＲ産物は変異のためＨｉｎｆＩの認識配列を１つ失っているので、２７６ｂｐ、６１ｂｐ、２２ｂｐの３つのフラグメントに切断される。一方、Ｓ２５１Ｆ変異を持たない野生型の場合には、１６４ｂｐ、１１２ｂｐ、６１ｂｐ、２２ｂｐの４つのフラグメントに切断される。よって、Ｓ２５１Ｆ変異のヘテロ接合体者のＰＣＲ産物は、２７６ｂｐ、１６４ｂｐ、１１２ｂｐ、６１ｂｐ、２２ｂｐの５つのフラグメントを持つ。
【００２８】
Ｃ２８３Ｓ変異のホモ接合体者のＰＣＲ産物をＢｓｔＸＩで消化すると、配列番号３で表わされる配列を含むＰＣＲ産物は変異した場所にＢｓｔＸＩの認識配列を持つので、２１９ｂｐ、１４０ｂｐの２つのフラグメントに切断される。一方、Ｃ２８３Ｓ変異を持たない野生型の場合には、ＢｓｔＸＩの認識配列を持たないので、切断されず、３５９ｂｐの１つのフラグメントのみである。よって、Ｃ２８３Ｓ変異のヘテロ接合体者のＰＣＲ産物は、３５９ｂｐ、２１９ｂｐ、１４０ｂｐの３つのフラグメントを持つ。これらのフラグメントサイズの差異は、アガロースゲル電気泳動等により、検出することができるので、ＬＰＬ遺伝子のエキソン６にＳ２５１Ｆ変異とＣ２８３Ｓ変異があるかどうかを簡単に判別できる。
【００２９】
本発明の診断キットは、上記プライマーと制限酵素ＨｉｎｆＩあるいはＢｓｔＸＩの他に、通常のＰＣＲに用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ用バッファーなどのＰＣＲ用試薬、制限酵素用バッファー等を含むこともできる。
【００３０】
本発明の診断法及び診断キットは変異検出試薬として上記のような制限酵素ではなく、変異部位特異的プローブを使用して、通常のハイブリダイゼーション法により変異を検出するものであってもよい。この場合、上と同様に作製した被験者ＤＮＡのＰＣＲ産物をフィルターに固定し、変異部位を含む２０塩基程度の標識オリゴヌクレオチドをプローブとして使用し、常法によりハイブリダイゼーションを行い変異の有無を検出することができる。
【００３１】
［実施例］
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。なお、以下の実施例において、ＰＣＲ用試薬（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ用バッファー）はApplied Biosystems社のものを用いた。
【実施例１】
【００３２】
高トリグリセリド血症を呈する被検者Ａ（ＴＧ：１５１０ｍｇ／ｄｌ、ＴＣ：５５７ｍｇ／ｄｌ、ＨＤＬ−Ｃ：３０ｍｇ／ｄｌ）の末梢血（ＥＤＴＡ採血の試料、以下同じ。）から、QIAamp DNA Blood Kit (QIAGEN社)によりゲノムＤＮＡを抽出した。
【００３３】
そして、GeneAmp PCR System 9700(ABI Perkin-Elmer社製)を用いたＰＣＲ法により、配列番号５及び６で表わされるプライマーを含む、A．Moriらの文献（Clinical Biochemistry, 第３３巻, 第３２３頁３２７頁、２０００）に示されたプライマーを用いて、ＬＰＬ遺伝子のエキソン１からエキソン９までを増幅した。
【００３４】
増幅したＤＮＡサンプルは、QIAquick PCR Purification (商品名、QIAGEN社)により精製後、Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (商品名、Applied Biosystems社) により直接塩基配列決定反応を行い、Genetic Analyser 310 (Applied Biosystems社)により、泳動を行い、塩基配列を決定した。
【００３５】
その結果、配列番号１で表わされるように、ヒトＬＰＬ遺伝子エキソン６の塩基配列において、５８番目の塩基が野生型ではｃであるが、ｔとなったために、野生型ではヒトＬＰＬのアミノ酸配列２５１番目はセリン（Ｓｅｒ）であるものがフェニルアラニン（Ｐｈｅ）となったミスセンス変異（Ｓ２５１Ｆと命名する）が新規に見いだされた。本被験者はこの変異に関してヘテロ接合体であった。
【実施例２】
【００３６】
実施例１で発見された、エキソン６に新たなＳ２５１Ｆ変異を有する被検者Ａ及び対照者の末梢血から実施例１と同様にしてゲノムＤＮＡを抽出して、下記の条件でＰＣＲを行った。
【００３７】
ＰＣＲ用試薬 
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ AmpliTaq GoldR（１．２５ｕｎｉｔｓ/μｌ）
０．２μｌ
ＰＣＲ用バッファー GeneAmp 10x PCR Buffer １.０μｌ 
dNTP Mixture(各２．０mM) １μｌ 
Template(Genomic DNA)   ５０ｎｇ 
プライマー（配列番号５）（１ｐｍｏｌ/μｌ）    １μｌ 
プライマー（配列番号６）（１ｐｍｏｌ/μｌ）    １μｌ
滅菌蒸留水で最終液量１０μｌ。
【００３８】
ＰＣＲ反応条件９５℃、１０．０分後以下のステップを４０回繰り返した。
９４℃、０．５分５５℃、１．０分７２℃、２．０分その後、７２℃、７．０分１回。
【００３９】
得られた各ＰＣＲ産物（１０μｌ）に、制限酵素バッファー（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＤＴ、ｐＨ７．９）を１μｌ及び制限酵素ＨｉｎｆＩ（New England Biolabs社製）を１μｌ添加して、３７℃で一晩反応させ消化した。８０℃、２０分で酵素の熱失活を行った後、この消化物を４％NuSieve GTGアガロース（CAMBREX社）ゲル（臭化エチジウム入り）で電気泳動を行い分析した。図１にその泳動パターンを示す。
【００４０】
図１に示すように、対照者（レーン３）では、１６４ｂｐと１１２ｂｐのフラグメント及び野生型とＳ２５１Ｆ変異に共通に存在する６１ｂｐのフラグメントが検出された（２２ｂｐのフラグメントは短すぎて検出できない）。一方、被検者（レーン２、ヘテロ接合体）では、更にＳ２５１Ｆ変異アレル由来の２７６ｂｐのフラグメントが検出され、この診断キットによって、被験者の高トリグリセリド血症の病因を容易に特定することが可能となった。
【実施例３】
【００４１】
高トリグリセリド血症を呈する被検者Ｂ（ＴＧ：６５７ｍｇ／ｄｌ、ＴＣ：２７７ｍｇ／ｄｌ）の末梢血から、上記と同様にしてゲノムＤＮＡを抽出した。
【００４２】
そして、上記と同様にして、ＬＰＬ遺伝子のエキソン１からエキソン９までを増幅した。
【００４３】
増幅したＤＮＡサンプルは、上記と同様にして、塩基配列を決定した。
【００４４】
その結果、配列番号３で表わされるヒトリポタンパクリパーゼ遺伝子エキソン６の塩基配列において、１５４番目の塩基が野生型ではｇであるが、ｃとなったために、野生型ではヒトＬＰＬのアミノ酸配列２８３番目はシステイン（Ｃｙｓ）であるものがセリン（Ｓｅｒ）となったミスセンス変異（Ｃ２８３Ｓと命名する）が新規に見いだされた。本被験者はＬＰＬ遺伝子上にこの変異と他のすでに報告のあるものと同じ変異をもつ複合型ヘテロ接合体であった。
【００４５】
実施例４：実施例３で発見されたエキソン６に新たなＣ２８３Ｓ変異を有する被検者Ｂ及び対照者の末梢血から実施例２と同様にしてゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲを行った。
【００４６】
得られた各ＰＣＲ産物（１０μｌ）に、制限酵素バッファー（１０００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＤＴ、ｐＨ７．９）を１μｌ及び制限酵素ＢｓｔＸＩ（New England Biolabs社製）を１μｌ添加して、５５℃で一晩反応させ消化した。６５℃、２０分で酵素の熱失活を行った後、この消化物を４％NuSieve GTGアガロース（CAMBREX社）ゲル（臭化エチジウム入り）で電気泳動を行い分析した。図２にその泳動パターンを示す。
【００４７】
図２に示すように、対照者（レーン２）では、３５９ｂｐのフラグメントが検出された。一方、被検者Ｂ（レーン３、ヘテロ接合体）では、野生型アレル由来の３５９ｂｐのフラグメントに加え、Ｃ２８３Ｓ変異アレル由来の２１９ｂｐと１４０ｂｐのフラグメントが検出され、この診断キットによって、被験者はＣ２８３Ｓ変異のヘテロ接合体であることがわかり、被験者の高トリグリセリド血症の病因を簡便に特定することが可能となった。
なお、被検者ＢはＬＰＬ遺伝子上の他のエキソンに既に報告のあるものと同じ変異があることが別の方法で明らかになったので、被検者Ｂは複合型ヘテロ接合体であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の２種類の新規ＬＰＬ遺伝子変異は、ＬＰＬ変異を簡便に検出する遺伝子診断チップ等の開発において重要なものである。日本人のＬＰＬ遺伝子変異の早期診断キットの開発においては、日本人から見いだされたすべてのＬＰＬ変異を検出できる遺伝子診断チップが必要である。我々は日本人に見いだされた２２種類の変異についてすでにインベーダー法による遺伝子診断システムを開発している。今回、新たに見いだされた変異を日本人のＬＰＬ遺伝子変異の診断キットの中に加えることで、変異検出力を高めることができる。本発明の変異は、ＬＰＬ遺伝子変異の診断キットの開発を念頭においている企業にとって有用なものであると考えられる。ＬＰＬ遺伝子変異の診断が迅速に行えるようになると、高トリグリセリド血症の成因解明と治療方針の決定のみならず、生活習慣病予防のためのテーラーメイド医療にも貢献すると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】被験者Ａと対照者のゲノムを鋳型にして、配列番号５と配列番号６で表わされるプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の制限酵素ＨｉｎｆＩ消化物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す図である。
【図２】被験者Ｂと対照者のゲノムを鋳型にして、配列番号５と配列番号６で表わされるプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の制限酵素ＢｓｔＸＩ消化物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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