(57)【要約】【課題】  結晶性セルロースの高い加水分解活性を有する新規な微生物、かかる微生物の製造方法及びかかる微生物を用いた結晶性セルロースの高い加水分解活性を有するセルラーゼの製造方法の提供。【解決手段】  結晶性セルロースの高加水分解活性を有するトリコデルマ・リーゼイ；セルロース分解能を有する糸状菌から乾燥緑色成熟分生子を調製し、次いでこれから膨潤分生子を調製し、次いでこれから高次同質倍数核を有する膨潤分生子を調製し、次いでこれから遺伝的組換核を複数有する膨潤分生子を調製し、次いでこれから選択基質を用いて結晶性セルロース高加水分解活性を有する微生物を選択することを特徴とする上記トリコデルマ・リーゼイの製造方法；並びに上記トリコデルマ・リーゼイを培養し、培養後培養液をろ過し、ろ過液からセルラーゼを採取することを特徴とする結晶性セルロースの高加水分解活性セルラーゼの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶性セルロースの高加水分解活性を有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）。
【請求項２】
アビセル加水分解活性が、在来菌株の２．５倍以上である請求項１に記載のトリコデルマ・リーゼイ。
【請求項３】
β−グルコシダーゼ活性が、在来菌株の８倍以上である請求項１又は２に記載のトリコデルマ・リーゼイ。
【請求項４】
カルボキシメチルセルロース分解活性が、在来菌株の１．１倍以上である請求項１〜３のいずれか１項にトリコデルマ・リーゼイ。
【請求項５】
前記トリコデルマ・リーゼイの菌株が、８Ｈ（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１７４）である請求項１〜４のいずれか１項に記載のトリコデルマ・リーゼイ。
【請求項６】
セルロース分解能を有する糸状菌から乾燥緑色成熟分生子を調製し、次いでこれから膨潤分生子を調製し、次いでこれから高次同質倍数核を有する膨潤分生子を調製し、次いでこれから遺伝的組換核を複数有する膨潤分生子を調製し、次いでこれから選択基質を用いて結晶性セルロース高加水分解活性を有する微生物を選択することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のトリコデルマ・リーゼイの製造方法。
【請求項７】
次の１）乃至５）の工程を有することを特徴とする請求項６記載のトリコデルマ・リーゼイの製造方法。
１）トリコデルマ・リーゼイ  ＲｕｔＣ−３０（ＡＴＣＣ５６７６５）をポテトデキストロース寒天斜面培地に載置して培養し、緑色成熟分生子を着生させ、着生した分生子を滅菌蒸留水に懸濁し、撹拌してろ過し、菌糸片を除去し、ろ液を遠心分離して分生子を分離し、乾燥し、乾燥緑色成熟分生子を調製する工程、
２）前記第１工程で調製した該乾燥緑色成熟分生子をマンデルス培地に添加して培養し、培養液をろ過して菌糸片を除去し、ろ液中に膨潤分生子を調製する工程、
３）前記第２工程のろ液を遠心分離して膨潤分生子をろ液から分離し、マンデルス培地に添加して培養し、培養後培地をろ過して伸長した菌糸を除去し、高次同質倍数核を有する膨潤分生子を調製する工程、
４）前記第３工程で調製した高次同質倍数核を有する膨潤分生子をマンデルス培地に添加して培養し、培養後培地をろ過して伸長した菌糸を除去し、同質遺伝的組換核を複数有する膨潤分生子を調製するベノミル処理工程、及び
５）前記第４工程で調製したベノミル処理された同質遺伝的組換核を複数を有する膨潤分生子を、選択基質を含有する重層培地に接種して培養し、結晶性セルロース高加水分解活性微生物を選択する工程。
【請求項８】
選択基質が、アビセル、木粉又は脱脂綿である請求項６又は７に記載のトリコデルマ・リーゼイの製造方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のトリコデルマ・リーゼイを培養し、培養後培養液をろ過し、ろ過液からセルラーゼを採取することを特徴とする結晶性セルロースの高加水分解活性セルラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、その製造方法及び結晶性セルロースの高加水分解活性セルラーゼの製造方法に関する。
【０００２】
本明細書において膨潤分生子とは、元の楕円形分生子の膨潤により内容積が増大し、球形となった状態の分生子を意味し、膨潤分生子の核数は元の分生子と同数の１であり、核サイズも元の分生子と同一である。
【背景技術】
【０００３】
リグノセルロース系バイオマスからのエタノール製造方法において、リグノセルロース系バイオマスを酵素により加水分解する方法（以下、酵素法と記載する。）は、糖の収率が高いこと、発酵阻害物質の生成が少ないこと、温和な条件により実施できるので、設備費を抑制し得ること等の利点があり、現在実用化が促進されている酸による加水分解の代替方法として期待されている。
【０００４】
しかしながら、酵素法においては、効果的な前処理を実施すること及び高い加水分解活性を有する酵素を安価に製造することが課題になっている。何故ならば、酵素法においては、加水分解する物品に適切な前処理を実施した後、セルラーゼにより加水分解を実施するが、結晶性セルロースがグルコースに分解されるまでには、数種類のセルラーゼが作用するからである。
【０００５】
この酵素法に使用される代表的な酵素として、結晶性セルロースをランダムに分解するエンドグルカナーゼ、結晶性セルロースを二糖類であるセロビオースの単位で分解するエクソグルカナーゼ、セロビオースをグルコースに加水分解するβ−グルコシダーゼ等を例示することができる。
【０００６】
一方、セルラーゼを産生する微生物として、トリコデルマ属（例えば、特許文献１参照。）、ラミコラ属（Ｒａｍｉｃｏｌａ）（例えば、特許文献２参照。）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）（例えば、特許文献３参照。）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌ）（例えば、特許文献４参照。）等に属する多くの微生物が発見又は開発されている。
【０００７】
特に、トリコデルマ・リーゼイについては、この菌株が生産するセルラーゼによるセルロースの加水分解物は、セロビオース：グルコースの比が１：１から１：３であることが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。このセロビオースをグルコースに加水分解するために、セロビオースに対する加水分解に優れた菌株、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のβ−グルコシダーゼを併用することが行われており、何の処理も行わないトリコデルマ・リーゼイ単独での加水分解は、従来実施されていなかった。
【０００８】
前記微生物の加水分解活性を向上させる方法として突然変異又は遺伝子組換が知られているが、複数成分の加水分解活性を同時に向上させるために突然変異又は遺伝子組換を行わず、安全、簡便、安価、かつ有効な微生物の取得方法は従来知られていなかった。
【０００９】
本発明者らは、前記従来技術に鑑みて、糸状菌類の微小核化した同質多倍数体の製造法を開発し、既に特許出願した（特許文献５、特許文献６及び特許文献７）。
【特許文献１】特開平９−１６３９８０号公報
【特許文献２】特開昭５７−１５９４８８号公報
【特許文献３】特開２００３−１３５０５２号公報
【特許文献４】特公平３−５７７４８号公報
【特許文献５】特開平６−２５３８２１号公報
【特許文献６】特開平６−２５３８２２号公報
【特許文献７】特開平８−２７５７７０号公報
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・テクノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第５４巻、第２６７ページ、１９７６年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の第一の目的は、結晶性セルロースの高い加水分解活性を有する新規な微生物を提供することであり、本発明の第二の目的は、結晶性セルロースの高い加水分解活性を有する新規な微生物を製造する方法を提供することであり、本発明の第三の目的は、結晶性セルロースの高加水分解活性セルラーゼの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記従来技術が存在しない複数成分の加水分解活性を同時に向上させるための、突然変異又は遺伝子組換を行わない安全、簡便、安価、かつ有効な方法について鋭意研究を行った結果、前記特許出願した糸状菌類の微小核化した同質多倍数体の製造法により製造した菌株を更に改良することにより、結晶性セルロースの高い加水分解活性を有する新規な微生物を製造できることを見出だし、本発明を完成した。
【００１２】
請求項１の発明は、結晶性セルロースの高加水分解活性を有するトリコデルマ・リーゼイである。
請求項２の発明は、アビセル加水分解活性が、在来菌株の２．５倍以上である請求項１に記載のトリコデルマ・リーゼイである。
請求項３の発明は、β−グルコシダーゼ活性が、在来菌株の８倍以上である請求項１又は２に記載のトリコデルマ・リーゼイである。
請求項４の発明は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）分解活性が、在来菌株の１．１倍以上である請求項１〜３のいずれか１項にトリコデルマ・リーゼイである。
請求項５の発明は、前記トリコデルマ・リーゼイの菌株が、８Ｈ（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１７４）である請求項１〜４のいずれか１項に記載のトリコデルマ・リーゼイである（以上、第１の発明）。
請求項６の発明は、セルロース分解能を有する糸状菌から乾燥緑色成熟分生子を調製し、次いでこれから膨潤分生子を調製し、次いでこれから高次同質倍数核を有する膨潤分生子を調製し、次いでこれから遺伝的組換核を複数有する膨潤分生子を調製し、次いでこれから選択基質を用いて結晶性セルロース高加水分解活性を有する微生物を選択することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のトリコデルマ・リーゼイの製造方法である。
請求項７の発明は、次の１）乃至５）の工程を有することを特徴とする請求項６記載のトリコデルマ・リーゼイの製造方法である。
１）トリコデルマ・リーゼイ  ＲｕｔＣ−３０（ＡＴＣＣ５６７６５）をポテトデキストロース寒天斜面培地に載置して培養し、緑色成熟分生子を着生させ、着生した分生子を滅菌蒸留水に懸濁し、撹拌してろ過し、菌糸片を除去し、ろ液を遠心分離して分生子を分離し、乾燥し、乾燥緑色成熟分生子を調製する工程、
２）前記第１工程で調製した該乾燥緑色成熟分生子をマンデルス培地に添加して培養し、培養液をろ過して菌糸片を除去し、ろ液中に膨潤分生子を調製する工程、
３）前記第２工程のろ液を遠心分離して膨潤分生子をろ液から分離し、マンデルス培地に添加して培養し、培養後培地をろ過して伸長した菌糸を除去し、高次同質倍数核を有する膨潤分生子を調製する工程、
４）前記第３工程で調製した高次同質倍数核を有する膨潤分生子をマンデルス培地に添加して培養し、培養後培地をろ過して伸長した菌糸を除去し、同質遺伝的組換核を複数有する膨潤分生子を調製するベノミル処理工程、及び
５）前記第４工程で調製したベノミル処理された同質遺伝的組換核を複数を有する膨潤分生子を、選択基質を含有する重層培地に接種して培養し、結晶性セルロース高加水分解活性微生物を選択する工程。
請求項８の発明は、選択基質が、アビセル、木粉又は脱脂綿である請求項６又は７に記載のトリコデルマ・リーゼイの製造方法である（以上、第２の発明）。
請求項９の発明は、請求項１〜５のいずれか１項に記載のトリコデルマ・リーゼイを培養し、培養後培養液をろ過し、ろ過液からセルラーゼを採取することを特徴とする結晶性セルロースの高加水分解活性セルラーゼの製造方法である（以上、第３の発明）。
【発明の効果】
【００１３】
１）第１の発明の微生物は、分生子は元の菌株と同一の単核性なので、遺伝的に安定である。
２）第２の発明により、結晶性セルロースを加水分解するのに必要なアビセル分解酵素活性及びβ−グルコシダーゼ活性がともに向上した菌株を迅速に選択できる。
３）第２の発明では、外来遺伝子を使用した遺伝子組換菌株ではないので、安全性が高く、    食品加工にも利用し得る。
４）第２の発明において、選択基質を変更することにより、例えば古紙、バガス等のセルロース原料に対する加水分解活性の高いセルラーゼ生産菌株を作製することも可能であ    る。従って、第２の発明は、極めて有用である。
５）第２の発明により得た菌株を、第２の発明により再処理し、酵素生産性を更に向上させることも可能である。
６）第３の発明により、結晶性セルロースの高い加水分解活性を有するセルラーゼを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の第１の発明について説明する。本発明のトリコデルマ・リーゼイは、結晶性セルロースの高加水分解活性を有するものであり、特に次のいずれかの少なくとも１つの特性を有するものである。
１）    アビセル加水分解活性が、在来菌株の２．５倍以上である。
２）    β−グルコシダーゼ活性が、在来菌株の８倍以上である。
３）    ＣＭＣ活性が、在来菌株の１．１倍以上である。
特に、トリコデルマ・リーゼイ  ８Ｈは、以下の菌学的性質を有する。
（ア）ポテトデキストロース寒天培地（ポテト抽出物  ４.0ｇ、グルコース  20.0ｇ、寒天  15.0ｇ、蒸留水1000ml）上及びペプトンとグルコースを加えたマンデルス寒天培地（ペプトン  5.0g、グルコース 10.0g、寒天  15.0g、マンデルス液体培地  1000ml）上での生育は良好であり、菌糸伸張も良好である。
（イ）寒天培地上での培養初期では気生菌糸は白色で少量であるが、次第に羽毛上の気生菌糸を生じる。
（ウ）形態的性質
・分生子柄は気生菌糸より生じ、不規則に分岐し、各分岐は下方のものほど伸びて分岐を繰り返し、全体としては円錐形を呈する。各分岐はほぼ直角に分かれ先端はフィアライドとなる。
・フィアライドは分生子柄先端に２-４個が規則的に形成され、フィアライド先端は細くなる。
・分生子はフィアライド頂端に形成され、球形〜亜球形〜楕円系であり表面は平滑である。
・分生子の大きさは短軸長が ２μｍ前後であり、長軸長は４μｍ前後である。
（エ）ろ紙崩壊性、
トリコデルマ・リーゼイRut  C-30株を２８℃、６日間振盪培養して得た酵素液では１センチ四方のろ紙を崩壊させるのにおよそ２５分かかるがトリコデルマ・リーゼイ８H株の同様の酵素液は１０分でろ紙を崩壊させる。またろ紙を崩壊させたときの液中の還元糖量も８H株の方が多く明確な相違となっている。
（オ）分解活性
トリコデルマ・リーゼイRut  C-30株もトリコデルマ・リーゼイ８H株も共にアビセル分解活性、CMC分解活性、サリシン分解活性を保持するが、８Ｈはアビセル加水分解活性がＲｕｔＣ−３０の約３．７倍、β−グルコシダーゼ活性が約１０倍高く、明確な相違がある。また、ＣＭＣ加水分解活性についても、８ＨはＲｕｔＣ−３０より高い。
【００１５】
以下に示す本発明の微生物の製造方法から明らかなように、本菌株は、トリコデルマ・リーゼイであるが、上記菌学的性質に基づき、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティク・バクテリオロジー（Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology）第  版を参照し、比較検討した結果、本菌株は、新規な菌株であると判断された。そこで、本菌株を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１７４）。
【００１６】
本菌株は、後記する試験例から明らかなように、特に結晶性セルロースを加水分解する高い活性を有しており、多方面に利用することが可能である。
【００１７】
次に本発明の第２の発明について説明する。
本発明の第２の発明は、セルロース分解能を有する糸状菌から乾燥緑色成熟分生子を調製し、次いでこれから膨潤分生子を調製し、次いでこれから高次同質倍数核を有する膨潤分生子を調製し、次いでこれから遺伝的組換核を複数有する膨潤分生子を調製し、次いでこれから選択基質を用いて結晶性セルロース高加水分解活性を有する微生物を選択することを特徴とする本発明のトリコデルマ・リーゼイの製造方法である。これをさらに詳述する。
【００１８】
第１工程は、成熟緑色分生子を調製する工程である。トリコデルマ・リーゼイ  ＲｕｔＣ−３０（ＡＴＣＣ５６７６５）（以下、ＲｕｔＣ−３０と記載する。）を、常法により２５〜３０℃で５〜１０日間、望ましくは２８℃で７日間、滅菌冷却した寒天培地で培養する。得られた培養物から、例えば寒天を含めて約２ｍｍ四方に切除し、該培養物を滅菌冷却したポテトデキストロース寒天斜面培地に載置し、望ましくは２８℃で７日間培養し、緑色成熟分生子を着生させ、得られた着生緑色成熟分生子を採取し、滅菌蒸留水約１００ｍｌに懸濁し、十分撹拌し、例えばガラスフィルター３Ｇ−２等でろ過して菌糸片を除去し、得られたろ液を遠心分離し、沈殿した緑色成熟分生子を、例えばデシケーター中で乾燥させ、乾燥成熟緑色分生子を調製する。この工程において使用する菌株は、ＲｕｔＣ−３０が最も望ましいが、その他の菌株も使用可能である。尚、この工程で使用する寒天培地及びポテトデキストロース寒天斜面培地は、ポテトエキストラクト  ４．０ｇ／Ｌ，グルコース  ２０．０ｇ／Ｌ，寒天  １５．０ｇ／Ｌの組成を有するものである。
【００１９】
第２工程は、膨潤分生子を調製する工程である。第一工程で調製した乾燥成熟緑色分生子を、以下に示す滅菌冷却したマンデルス培地［ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・テクノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第５４巻、第４号、第２６〜２８ページ、１９７６年］に添加し、回転振盪培養機（例えば、タイテック社製ダブルシェーカーＮＲ３０等）により、２５〜３０℃、１００〜２００ｒｐｍで４〜８時間、望ましくは２８℃、１６０ｒｐｍで６時間培養する。得られた培養物を、例えばガラスフィルター３Ｇ−１等でろ過し、菌糸片を除去し、ろ液を分離し、ろ液に膨潤分生子集め、膨潤分生子を調製する。
【００２０】
◎マンデルス培地
(NH4)2SO4: １．４ｇ, KH2PO4:２．０ｇ, urea:０．３ｇ, CaCl2:０．３ｇ, MgSO4・7H2O: ０．３ｇ, FeSO4・7H2O:０．００５ｇ, MnSO4・H2O:０．００１６ｇ, ZnSO4・H2O:０．００１４ｇ, CoCl2:０．００２０ｇ, 蒸留水:１０００ｍｌ)(pH６．０).
◎マンデルス培地の貯蔵と使用法：
なお、通常、マンデルス培地は、(NH4)2SO4: １４ｇ, KH2PO4:２０ｇ, urea:３ｇ, CaCl2:３ｇ， MgSO4・7H2O:３ｇを蒸留水に溶解して１０００ｍｌとしたもの（Ａ液）、FeSO4・7H2O:０．５ｇ, MnSO4・H2O:０．１６ｇ, ZnSO4・H2O:０．１４ｇ, CoCl2:０．２０ｇを蒸留水に溶解して１０００ｍｌとしたもの（Ｂ液）を、それぞれ１０倍、１００倍に希釈し、混合して使用する。
【００２１】
第３工程は、高次同質倍数核を調製する工程である。第２工程で得られた膨潤分生子を遠心分離して収集し、これをコルヒチンを含有するマンデルス培地に加え、例えば２８℃で７日間静置培養する。培養後、培地を例えばガラスフィルター３Ｇ−１等でろ過し、伸長した菌糸を除去する。ろ液中に、高次同質倍数核を保持する膨潤分生子が残るので、これを第４工程に使用する。中の核は直径が増大するが、核数は1のままである。なお、コルヒチンは、菌糸の伸長を抑制する作用を有する。コルヒチンの効果が不十分で菌糸が伸張する膨潤分生子もあるが、コルヒチンにより菌糸伸張が抑えられる膨潤分生子もある。そのタイプの膨潤分生子は、外形は球状のままであるが、内部の核は倍数化し倍数核が形成されているので、これを用いる。
【００２２】
第４工程は、高次同質倍数核を含む膨潤分生子をベノミル処理する工程である。高次同質倍数核を含む膨潤分生子をベノミルを含むマンデルス培地に加え、例えば２８℃で７日間静置培養する。培養後、培地を例えばガラスフィルター３Ｇ−１等でろ過し、伸長した菌糸を除去する。ろ液中に、同質遺伝的組換核を複数保持する膨潤分生子が残る。これを第５工程に使用する。この段階で膨潤分生子中に元株サイズの複数の核が形成されている。これらの核は、一個の大型の高次同質倍数核からベノミルの作用により生じた核である。なお、ベノミルには、倍数核から染色体を欠落させ、そのとき遺伝的組換を起こすことが知られている。
【００２３】
第５工程は、重層選択培地を用いて、セルロース高分解性株を選択する工程である。マンデルス培地と寒天を含む下層培地を加熱した後冷却し、約３０℃になった時点で、上記ベノミル処理された分生子を加え、固化させる。次いで、マンデルス培地、寒天と選択基質（例えばアビセル等）を含む上層培地をオートクレーブ後、手で持てる程度の熱さ（例えば４０℃）に冷却し、下層培地上に重層し固化させる。これを、例えば２８℃で６日間培養し、培地表面に出現したコロニーが、本発明の微生物である。さらに、このコロニーから、後記するろ紙崩壊試験でさらに優良株を選択することができる。なお、トリコデルマ・リーゼイ  ８Ｈは、アビセルを選択基質として選択した株であるが、選択基質として他に木粉や脱脂綿を用いてもよい。木粉の場合、リグニン分解力のある菌株を得ることができる。
【００２４】
結晶性セルロースの高加水分解性セルラーゼは、上記コロニーから調製することができる。すなわち、上記コロニーをマンデルス液体培地に加え、例えば回転振盪培養器で２８℃、１６０ｒｐｍ、６日間振盪培養し、次いでろ過して、ろ液を酵素液とする。ここで、早期に出現したコロニーが高性能を示す傾向がある。
【実施例１】
【００２５】
（トリコデルマ・リーゼイ  ８Ｈの採取）
第１工程
トリコデルマ・リーゼイ  ＲｕｔＣ−３０を、常法により寒天培地で培養し、２ｍｍ四方の寒天培地を切除し、滅菌冷却したポテト・デキストロース寒天斜面培地に載置し、２８℃の温度で７日間培養し、緑色成熟分生子を着生させた。着生した分生子を収集し、滅菌蒸留水１ｌに懸濁し、十分撹拌した後ガラスフィルター（（株）三商社製。３Ｇ−２）でろ過して菌糸片を除去し、ろ液を遠心分離して沈殿した分生子を採取し、デシケーターで乾燥し、乾燥した緑色成熟分生子を得た。
【００２６】
第２工程
１００ｍｌの三角フラスコに、上記マンデルス培地とグルコース０．５ｇ、ペプトン０．２５ｇを追加した培地５０ｍｌを加え、滅菌冷却後に第１工程で得られた乾燥緑色成熟分生子を添加し、回転振盪培養機（タイテック社製。ダブルシェーカーＮＲ３０）により２８℃、１６０ｒｐｍで６時間培養し、培養液をガラスフィルター（（株）三商社製。３Ｇ−１）でろ過して菌糸片を除去し、膨潤分生子を含有するろ過液を得た。
【００２７】
第３工程
５０ｍｌの三角フラスコに、上記マンデルス培地とグルコース０．２５ｇ、ペプトン０．１２５ｇ、コルヒチン０．０２５ｇを追加した培地２５ｍｌを加えて滅菌冷却した。これに、前記膨潤分生子を含有するろ過液を遠心分離して収集した膨潤分生子を加えて、２８℃で７日間培養した。培養液をガラスフィルター（（株）三商製。３Ｇ−１）でろ過して伸長した菌糸を除去し、高次同質倍数核を有する膨潤分生子を含有するろ過液を得た。
【００２８】
第４工程
５０ｍｌの三角フラスコに、マンデルス培地とグルコース０．２５ｇ、ペプトン０．１２５ｇ、ベルミノ０．１μｇ／ｍｌを追加した培地２５ｍｌを加え、滅菌冷却した。次いで、これに、前記高次同質倍数核を有する膨潤分生子を含有するろ過液を遠心分離して収集した高次同質倍数核を有する膨潤分生子を添加し、２８℃で７日間培養し、培養液をガラスフィルター（（株）三商製。３Ｇ−１）でろ過して伸長した菌糸を除去し、同質遺伝的組換核を複数有する膨潤分生子を含有するろ過液を得た。
【００２９】
第５工程
マンデルス培地１００ｍｌに、グルコース１．０ｇ、ペプトン０．５ｇ、ポリオキシエチレン・（１０）オクチルフェニルエーテル０．３ｍｌ及び寒天３．０ｇを添加して滅菌冷却した。これを、大型深型ガラスプレート（東京ペトリシャーレ社製。深さ６ｃｍ、直径１５ｃｍ）に注入し、４℃の温度で放冷し、約３０℃に冷却したとき同質遺伝的組換核を複数有する膨潤分生子を含有するろ過液０．２ｍｌを添加して固化させ、下層培地を調製した。
次いでマンデルス培地１００ｍｌに、アビセル１．０ｇ、ペプトン０．５ｇ、ポリオキシエチレン・オクチルフェニルイーテル０．３ｍｌ及び寒天３．０ｇの割合で添加し、滅菌放冷して、約４０℃に冷却したとき前記下層培地上に注入し、４℃で放冷して上層培地を調製した。
この調製した重層培地を２８℃で６日間培養し、培地表面にコロニーを形成させた。このコロニーが新規なトリコデルマ・リーゼイ  ８Ｈ菌株である。
【実施例２】
【００３０】
（結晶性セルロースの高加水分解性セルラーゼの生産）
マンデルス液体培地１００ｍｌに、アビセル０．５ｇ及びペプトン０．２５ｇの割合で添加し、滅菌冷却後、前記実施例１により得たトリコデルマ・リーゼイ  ８Ｈのコロニーの３ｍｍ四方の小片を培地に添加し、回転振盪培養機（タイテック社製。ダブルシェーカーＮＲ３０）により２８℃、１６０ｒｐｍで６日間振盪培養し、培養液をろ紙（ワットマン社製。Ｎｏ．２）でろ過し、結晶性セルロースの高い加水分解活性を有するセルラーゼ含有液を得た。
【００３１】
（比較例１）
実施例２において、トリコデルマ・リーゼイ  ８Ｈの代わりに、トリコデルマ・リーゼイ  ＲｕｔＣ−３０を用いた以外は、実施例２と同様にして、セルラーゼ含有液を得た。
【００３２】
（試験例１）
実施例２、比較例１で得られたセルラーゼの特性を試験した。
（試験方法）
１）ろ紙崩壊試験
セルラーゼ含有液５ｍｌをＬ字型試験管（タイテック社製。横１２０ｍｍ、高さ６８ｍｍ）に採取し、１ｃｍ四方のろ紙（ワットマン社製。Ｎｏ．２）を添加し、モノー振盪機（タイテック社製。モノー・シェイカー・パーソナル−１１）により５０℃、７５ストローク／分で保持し、ろ紙が完全に崩壊するまでの時間を測定した。
２）還元糖の定量
ろ紙が完全に崩壊した後、Ｌ字型試験管内に生成した還元糖の量を次のＤＮＳ法により定量した。
３）セルラーゼ活性試験
前記セルラーゼ含有液２ｍｌを、１８．５ｍｍ×１８５ｍｍの試験管に採取し、以下に示す基質４ｍｌを添加し、往復振盪機（トーマス科学機器社製。Ｔ−２２Ｓ型）により５０℃、１２５ストローク／分で１時間往復振盪させた。開始３０分後に試験管を振って沈殿したアビセルを再懸濁させた。反応終了後、ろ紙（ワットマン社製。Ｎｏ．２）でろ過し、ろ液中の還元糖をＤＮＳ法により定量し、セルラーゼ活性を試験した。
【００３３】
（基質）
アビセル加水分解活性用：０．１Ｎ酢酸緩衝液（ｐＨ５）１００ｍｌ＋アビセル１ｇ
ＣＭＣ加水分解活性用：０．１Ｎ酢酸緩衝液（ｐＨ５）１００ｍｌ＋ＣＭＣ−Ｎａ（ＤＳ０．７−０．８）１ｇ
βーグルコシダーゼ活性測定用：0.1Ｎ酢酸緩衝液（ｐＨ5）１００ｍｌ＋サリシン１ｇ
【００３４】
（結果）
ろ紙崩壊時間、ろ紙崩壊後に生じた還元糖量を表１に、加水分解活性を表２に示す。なお、各表とも３回の測定値の平均値を算出した結果である
【００３５】
【表１】
2006166848.tif 000002
【００３６】
【表２】
2006166848.tif 000003
【００３７】
表１から明らかなとおり、ろ紙崩壊に要する時間は、ＲｕｔＣ−３０が２５分であるのに対して８Ｈは１５分と１０分も短く、対象菌株の約０．６倍であり、生成する還元糖の量も８ＨはＲｕｔＣ−３０の約１．８倍と多い。これらの結果は、８Ｈの作用が、従来公知の菌株よりも格段に優れていることを示している。
【００３８】
また、表２から明らかなとおり、８Ｈはアビセル加水分解活性がＲｕｔＣ−３０の約３．７倍、β−グルコシダーゼ活性が約１０倍と格段に優れていることを示している。また、ＣＭＣ加水分解活性についても、８ＨはＲｕｔＣ−３０より高かった。
【００３９】
以上の試験結果から、８Ｈは結晶性セルロースの加水分解活性が優れている新規な菌株であり、突然変異又は遺伝子組換を行わない８Ｈを作製する方法も新規かつ安全な方法であり、更に新規な方法により得た菌株からのセルラーゼの製造法も優れた、かつ新規な方法であることが明白である。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の微生物及び本発明のセルラーゼの製造方法を用いて得られたセルラーゼは、リグノセルロース系バイオマスを加水分解するのに有用である。