(57)【要約】【課題】  製造された膜の長手方向のどの場所を用いるかにより、核酸精製時間に差がでたり、著しく時間を要したり、目詰まりが生じ精製不能となったりといった、孔径等の膜物性が長手方向に僅かなローカリティーを持つために起こる諸問題を解決すること。【解決手段】  親溶剤、貧溶剤、非溶剤の混合溶剤に溶解したポリマー溶液を支持体上に流延、乾燥、相分離させる工程を含む微細多孔性膜の製造法において、ポリマー溶液の温度よりも流延面の温度を低く設定し、かつ製造中のポリマー溶液の温度変化、および製造中の流延面の温度変化を、それぞれ±３．０℃以内で製造する。【選択図】    図１
2006083292.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親溶剤、貧溶剤、非溶剤の混合溶剤に溶解したポリマー溶液を支持体上に流延、乾燥、相分離させる工程を含む多孔性膜の製造方法において、ポリマー溶液の温度よりも流延面の温度を低く設定し、かつポリマー溶液の温度変化、および流延面の温度変化がそれぞれ±３．０℃以内で製造することを特徴とする多孔性膜の製造方法。
【請求項２】
上記ポリマー溶液が、セルロースのエステル誘導体のポリマー溶液であることを特徴とする請求項１に記載の多孔性膜の製造方法。
【請求項３】
上記セルロースのエステル誘導体が、セルロースのカルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルから選ばれるいずれか一つ以上のエステル誘導体であることを特徴とする請求項２に記載の多孔性膜の製造方法。
【請求項４】
上記セルロースのエステル誘導体が、アセチルセルロースであることを特徴とする請求項２に記載の多孔性膜の製造方法。
【請求項５】
上記アセチルセルロースが、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物であることを特徴とする請求項４に記載の多孔性膜の製造方法。
【請求項６】
上記親溶剤がメチレンクロライド、上記貧溶剤がメタノール、上記非溶剤が水であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【請求項７】
請求項２〜６に記載の方法で製造した多孔性膜を鹸化処理することを特徴とする多孔性膜の製造方法。
【請求項８】
上記多孔性膜の最小孔径が０．１μｍ以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【請求項９】
上記多孔性膜が表裏非対称の多孔性膜であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【請求項１０】
上記多孔性膜の最大孔径と最小孔径の比が２以上であることを特徴とする請求項１〜９いずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【請求項１１】
上記多孔性膜の厚さが１０〜５００μｍであることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【請求項１２】
上記多孔性膜の空隙率が５０〜９５％であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【請求項１３】
上記多孔性膜のバブルポイントが０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ2であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【請求項１４】
上記多孔性膜の圧力損失が０．１〜１００ｋＰａであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【請求項１５】
上記多孔性膜の２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2当たり１分間で１〜５０００ｍＬであることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【請求項１６】
上記多孔性膜１ｍｇ当たりの核酸吸着量が０．１μｇ以上であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法により製造された多孔性膜の、下記の各工程を含む核酸の分離精製方法における使用。
(1) 核酸を含む試料溶液を該多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
(2) 洗浄液を該多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び
(3) 回収液を該多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細多孔性膜の安定製造方法に関する。より詳細には、本発明は、核酸を含む試料溶液から核酸を分離精製する方法に用いる核酸吸着性微細多孔性膜の安定製造方法、およびその微細多孔性膜の核酸分離精製方法における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースアセテート微細多孔性膜は、古くから製品化されており、分離膜、濾過用フィルタとして広く利用されている。その製造方法として、様々な提案がなされている（例えば、特許文献１〜２）。また、セルロースアセテート微細多孔性膜を鹸化処理することによりセルロース微細多孔性膜を製造する製造方法も提案されており（例えば、特許文献３）、製品化されて耐溶剤性のフィルタとして利用されている。
【０００３】
ところで、周知のように、核酸は様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の領域においては、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核酸の形状で用いることが要求されている。
【０００４】
核酸は、診断分野においても種々の方法で用いられており、例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出および診断に日常的に用いられている。また、核酸は遺伝障害の検出や食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は、遺伝地図の作製やクローニング、遺伝子組換えによる形質発現におよぶ種々の目的のために、所定の核酸に関する位置確認や同定、単離において日常的に用いられている。
【０００５】
しかし、多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、そしてその単離と精製との操作が、煩雑であり多くの時間を要する。この時間を要する煩雑な工程は、核酸の損失に結びつきやすいという問題がある。また、例えば、血清、尿およびバクテリアのカルチャーから得られた試料における核酸の精製においては、コンタミネーションが発生したり、疑陽性の結果を招くという問題も加わる。
【０００６】
上記問題を解決し、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、セルロースのような、表面に水酸基を有する有機高分子により構成される多孔質膜に核酸を吸着ならびに脱着させる方法が、例えば特許文献４に開示されている。
【０００７】
【特許文献１】特公昭４３−１５６９８号公報
【特許文献２】特公昭５５−６４０６号公報
【特許文献３】特公昭４５−４６３３号公報
【特許文献４】特開２００３−１２８６９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、核酸を分離精製するために核酸吸着性微細多孔性膜を用いると、従来の製造方法で作製した膜では、孔径等の膜物性が多孔性膜の長手方向に僅かなローカリティーを持つため、比較的懸濁物を多く含む核酸試料を用いた場合、製造した膜の長手方向のどの場所を用いるかにより、核酸精製時間に差がでたり、目詰まりが生じ精製不能となったり、また完全に目詰まりが生じなくても核酸の分離精製時間に著しく時間を要するといった問題が生じていた。この問題を解決するためには、核酸吸着性微細多孔性膜の製造方法を改善し、製造された多孔性膜の長手方向について孔径等の膜物性がローカリティーを持たないような、従来以上に品質の安定した核酸吸着性微細多孔性膜を供給することが望まれていた。
【０００９】
従って、本発明の目的は、孔径等の膜物性について多孔性膜の長手方向におけるローカリティーが改善され、従来以上に品質の安定した核酸吸着性微細多孔性膜ならびにその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために各種要因を鋭意検討した結果、親溶剤、貧溶剤、非溶剤の混合溶液に溶解したポリマー溶液を支持体上に流延、乾燥、相分離させる工程を含む多孔性膜の製造方法において、ポリマー溶液の温度よりも流延面の温度を低く設定し、かつ製造中のポリマー溶液の温度変化、および製造中の流延面の温度変化がそれぞれ±３．０℃以内で製造した膜を使用した場合に膜物性の長手方向のローカリティーが改善され、比較的懸濁物を多く含む試料からの核酸精製時に生じる目詰まり、精製時間のばらつき等の上記問題を解決できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。即ち、本発明は、下記の構成よりなるものである。
【００１１】
１．  親溶剤、貧溶剤、非溶剤の混合溶剤に溶解したポリマー溶液を支持体上に流延、乾燥、相分離させる工程を含む多孔性膜の製造法において、ポリマー溶液の温度よりも流延面の温度を低く設定し、かつポリマー溶液の温度変化、および流延面の温度変化がそれぞれ±３．０℃以内で製造することを特徴とする多孔性膜の製造方法。
【００１２】
２．  上記ポリマー溶液が、セルロースのエステル誘導体のポリマー溶液であることを特徴とする１．に記載の多孔性膜の製造方法。
【００１３】
３．  上記セルロースのエステル誘導体が、セルロースのカルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルから選ばれるいずれか一つ以上のエステル誘導体であることを特徴とする２．に記載の多孔性膜の製造方法。
【００１４】
４．上記セルロースのエステル誘導体が、アセチルセルロースであることを特徴とする２．に記載の多孔性膜の製造方法。
【００１５】
５．  上記アセチルセルロースが、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物であることを特徴とする４．に記載の多孔性膜の製造方法。
【００１６】
６．  上記親溶剤がメチレンクロライド、上記貧溶剤がメタノール、上記非溶剤が水であることを特徴とする請求項１．〜５．のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【００１７】
７．  ２．〜６．に記載の方法で製造した多孔性膜を鹸化処理することを特徴とする多孔性膜の製造方法。
【００１８】
８．  上記多孔性膜の最小孔径が０．１μｍ以上であることを特徴とする１．〜７．のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【００１９】
９．  上記多孔性膜が表裏非対称の多孔性膜であることを特徴とする１．〜８．のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【００２０】
１０．  上記多孔性膜の最大孔径と最小孔径の比が２以上であることを特徴とする１．〜９．いずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【００２１】
１１．  上記多孔性膜の厚さが１０〜５００μｍであることを特徴とする１．〜１０．のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【００２２】
１２．  上記多孔性膜の空隙率が５０〜９５％であることを特徴とする１．〜１１．のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【００２３】
１３．  上記多孔性膜のバブルポイントが０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ2であることを特徴とする１．〜１２．のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【００２４】
１４．  上記多孔性膜の圧力損失が０．１〜１００ｋＰａであることを特徴とする１．〜１３．のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【００２５】
１５．  上記多孔性膜の２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2当たり１分間で１〜５０００ｍＬであることを特徴とする１．〜１４．のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【００２６】
１６．  上記多孔性膜１ｍｇ当たりの核酸吸着量が０．１μｇ以上であることを特徴とする１．〜１５．のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法。
【００２７】
１７．  １．〜１６．のいずれかに記載の多孔性膜の製造方法により製造された多孔性膜の、下記の各工程を含む核酸の分離精製方法における使用。
(1) 核酸を含む試料溶液を該多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
(2) 洗浄液を該多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び
(3) 回収液を該多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、製造した膜の長手方向のどの場所を用いるかによらず多孔性品質の安定した膜を得ることができる。
そして、特に核酸を含む試料溶液から核酸を分離精製する方法に用いる核酸吸着性の微細多孔性膜として、従来以上に品質の安定した膜の製造方法を提供することができる。
その結果、本発明による微細多孔性膜を核酸を分離精製するために用いると、比較的懸濁物を多く含む核酸試料を用いた場合でも、従来長手方向の膜性能の僅かなローカリティーにより生じていた、核酸分離精製時間のばらつき、目詰まりによる精製不能となる事態、完全に目詰まりが生じないまでも核酸の分離精製時間に著しく時間を要するといった事態などの問題が解消でき、製造した微細多孔性膜の長手方向のどの部分を用いても、核酸分離精製システムとして安定した性能が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の微細多孔性膜の製造方法は、例えば下記のように行うことができる。
先ず、ポリマーを親溶剤と貧溶剤と非溶剤を混合した溶剤に溶解したポリマー溶液（ドープ）を調製する。本発明の製造法で使用する原料ポリマーとしては、水酸基を有する高分子がエステル化されたものを使用することができる。特に多糖構造を有するポリマーのエステル誘導体、ポリビニルアルコールのエステル誘導体などが好ましい。
【００３０】
〔ポリマー〕
本発明で使用可能な多糖構造を有する有機材料としては、具体的にはセルロース、ヘミセルロース、デキストラン、アガロース、デキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン、グリコーゲン、プルラン、マンナン、グルコマンナン、リケナン、イソリケナン、ラミナラン、カラギーナン、キシラン、フルクタン、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キチン、キトサン等を挙げることができ、さらに前記いずれかの多糖構造の誘導体についても挙げることができ、特にエステル誘導体が好ましく用いることができる。多糖構造およびその誘導体であれば前記に挙げた材料に限定されることはない。
【００３１】
前記多糖構造のエステル誘導体のエステルとしては、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。
【００３２】
前記いずれかの多糖構造のカルボン酸エステルとしては、アルキルカルボニルエステル、アルケニルカルボニルエステル、芳香族カルボニルエステル、芳香族アルキルカルボニルエステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。
【００３３】
前記いずれかの多糖構造のアルキルカルボニルエステルのエステル基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基のいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。
【００３４】
前記いずれかの多糖構造のアルケニルカルボニルエステルのエステル基がアクリル基、メタクリル基のいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。
【００３５】
前記いずれかの多糖構造の芳香族カルボニルエステルのエステル基がベンゾイル基、ナフタロイル基の少なくとも一つ以上から選ばれることが好ましい。
【００３６】
前記いずれかの多糖構造の硝酸エステルとしては、ニトロセルロース、ニトロヘミセルロース、ニトロデキストラン、ニトロアガロース、ニトロデキストリン、ニトロアミロース、ニトロアミロペクチン、ニトログリコーゲン、ニトロプルラン、ニトロマンナン、ニトログルコマンナン、ニトロリケナン、ニトロイソリケナン、ニトロラミナラン、ニトロカラギーナン、ニトロキシラン、ニトロフルクタン、ニトロアルギン酸、ニトロヒアルロン酸、ニトロコンドロイチン、ニトロキチン、ニトロキトサンなどを好ましく用いることができる。
【００３７】
前記いずれかの多糖構造の硫酸エステルとしては、セルロース硫酸、ヘミセルロース硫酸、デキストラン硫酸、アガロース硫酸、デキストリン硫酸、アミロース硫酸、アミロペクチン硫酸、グリコーゲン硫酸、プルラン硫酸、マンナン硫酸、グルコマンナン硫酸、リケナン硫酸、イソリケナン硫酸、ラミナラン硫酸、カラギーナン硫酸、キシラン硫酸、フルクタン硫酸、アルギン酸硫酸、ヒアルロン酸硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸などを好ましく用いることができる。
【００３８】
前記いずれかの多糖構造のスルホン酸エステルとしては、アルキルスルホン酸エステル、アルケニルスルホン酸エステル、芳香族スルホン酸エステル、芳香族アルキルスルホン酸エステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。
【００３９】
前記いずれかの多糖構造のリン酸エステルとしては、セルロースリン酸、ヘミセルロースリン酸、デキストランリン酸、アガロースリン酸、デキストリンリン酸、アミロースリン酸、アミロペクチンリン酸、グリコーゲンリン酸、プルランリン酸、マンナンリン酸、グルコマンナンリン酸、リケナンリン酸、イソリケナンリン酸、ラミナランリン酸、カラギーナンリン酸、キシランリン酸、フルクタンリン酸、アルギン酸リン酸、ヒアルロン酸リン酸、コンドロイチンリン酸、キチンリン酸、キトサンリン酸などを好ましく用いることができる。
【００４０】
前記いずれかの多糖構造のホスホン酸エステルとしては、セルロースホスホン酸、ヘミセルロースホスホン酸、デキストランホスホン酸、アガロースホスホン酸、デキストリンホスホン酸、アミロースホスホン酸、アミロペクチンホスホン酸、グリコーゲンホスホン酸、プルランホスホン酸、マンナンホスホン酸、グルコマンナンホスホン酸、リケナンホスホン酸、イソリケナンホスホン酸、ラミナランホスホン酸、カラギーナンホスホン酸、キシランホスホン酸、フルクタンホスホン酸、アルギン酸ホスホン酸、ヒアルロン酸ホスホン酸、コンドロイチンホスホン酸、キチンホスホン酸、キトサンホスホン酸などを好ましく用いることができる。
【００４１】
前記いずれかの多糖構造のピロリン酸エステルとしては、セルロースピロリン酸、ヘミセルロースピロリン酸、デキストランピロリン酸、アガロースピロリン酸、デキストリンピロリン酸、アミロースピロリン酸、アミロペクチンピロリン酸、グリコーゲンピロリン酸、プルランピロリン酸、マンナンピロリン酸、グルコマンナンピロリン酸、リケナンピロリン酸、イソリケナンピロリン酸、ラミナランピロリン酸、カラギーナンピロリン酸、キシランピロリン酸、フルクタンピロリン酸、アルギン酸ピロリン酸、ヒアルロン酸ピロリン酸、コンドロイチンピロリン酸、キチンピロリン酸、キトサンピロリン酸などを好ましく用いることができる。
【００４２】
前記いずれかの多糖構造の水酸基が、任意の置換度でエーテル化したものについても好ましく用いることができる。多糖類としてセルロースを用いた場合、エーテル誘導体としては、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチル−カルバモイルエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、シアノエチルセルロース、カルバモイルエチルセルロース等を用いることができ、好ましくは、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースを用いることができるが、多糖の種類、エーテルの種類を含めてこれらに限定されることはない。
【００４３】
前記いずれかの多糖構造の水酸基が、任意の置換度でハロゲン化したものについても好ましく用いることができる。
【００４４】
上記多糖構造を有するポリマーのエステル誘導体としては、セルロースエステル誘導体、とりわけトリアセチルセルロース、ジアセチルセルロース、モノアセチルセルロースのようなアセチルセルロースが好ましく、特にトリアセチルセルロースが好ましい。より好ましくはトリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとの混合物が用いられる。
【００４５】
〔溶剤〕
セルロースエステル誘導体を例にとると、上記親溶剤とはセルロースエステル誘導体を溶解することができる溶剤で、メチレンクロライド（＝ジメチルクロライド）やクロロホルムのようなハロゲン化炭化水素、酢酸メチル、酢酸エチル、蟻酸メチルやメチルグリコールアセテートのようなエステル類、アセトンやメチルエチルケトンのようなケトン類などを用いることができるが、メチレンクロライドを好ましく用いることができる。
上記貧溶剤とは、セルロースエステル誘導体を膨潤させるのみで実質的に溶解せず、上記親溶剤と相溶性があり、さらに親溶剤よりも高い沸点を持つ溶剤を言う。貧溶剤の具体例としてはメタノール、エタノールやブタノールのようなアルコール類、イソプロピルエーテルのようなエーテル類、テトラヒドロフランなどがあるが、メタノールを好ましく用いることができる。
上記非溶剤とは、セルロースエステル誘導体に対して溶解もしくは膨潤することなく、上記親溶剤あるいは貧溶剤と相溶性があり、さらに親溶剤よりも高い沸点を持つ溶剤を言う。非溶剤の具体例としてはヘプタンやデカンやトルエンのような炭化水素、エチレングリコールやエチレングリコールモノエチルエーテルのような多価アルコールおよび多価アルコールのエーテル類および水などがあるが、水を好ましく用いることができる。
ここで親溶剤と貧溶剤との比は５：５〜８：２の範囲で設定することでき、好ましくは６：４〜７：３である。非溶剤は１〜８質量％、好ましくは４〜６質量％加えられる。この混合溶剤に対して１〜３０％、好ましくは５〜１０％の濃度にセルロースエステル誘導体が溶解される。
【００４６】
溶剤の使用方法、特に親溶剤、貧溶剤の使用方法に関しては特公昭５５−３１４１８号公報、特開昭５０−１２２５６号公報、特開昭５１−７６３６０号公報等に記載の手法を応用できる。
【００４７】
上記ドープには用途に応じた種々の添加剤（例えば、可塑剤、静電防止剤、劣化防止剤、紫外線防止剤、界面活性剤、剥離剤、着色剤、補強剤、架橋剤など）を加えることができる。またその添加する時期はドープ作製工程において何れでも添加しても良いが、ドープ調製工程の最後の調製工程に添加剤を添加し調製する工程を加えて行ってもよい。また、製膜後に膜に含浸することにより添加することもできる。
【００４８】
上記ドープは調製後に濾紙で濾過、脱気を行うことが好ましい。
【００４９】
〔微細多孔性膜の製造〕
以下、図を参照しながら、本発明の多孔性膜の製造方法を実施するための一実施形態について説明する。
図１は、本発明の多孔性膜の製造方法を実施するための製造設備の概略図である。
この製造設備は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）ベースフィルム（４）をＰＥＴベース送り出しロール（Ａ）から流延装置へと送り出すとともに、一方でドープタンク（１）から送液ポンプ（２）により送液されてくるドープを、エンドレスバンド（５）上に搬送されてくるＰＥＴフィルム（４）上に流延ダイ（３）から流延し、以後、乾燥後、流延膜をエンドレスバンド（５）からＰＥＴとともに剥ぎ取り、さらに乾燥（８）してＰＥＴベース＋微細多孔性膜巻き取りロール（Ｂ）で巻き取るものである。
【００５０】
本製造設備では、まず、温度調整装置のついたドープタンク（１）内でドープを一定温度±３．０℃以内に制御する。次に、ほぼ一定の温度に制御されたドープはドープタンク（１）から送液ポンプ（２）により送液され、流延ベルト上に搬送されるＰＥＴベースフィルム（４）上に、流延ダイ（３）から流延されるが、この際流延面はドープ温度より低い一定温度±３．０℃以内に制御される。
【００５１】
ドープ温度は、好ましくは５〜５０℃の温度範囲内の一定温度、より好ましくは１５〜４０℃の温度範囲内の一定温度の、±３．０℃以内、例えば３５．０±３．０℃以内に制御される。
ドープタンク内のドープ温度を一定温度±３．０℃以内に精密に温度制御するには、ドープタンクを温度調節装置付きのタンクとすることにより達成することができる。
そのために具体的には、ドープタンクには外側に一定温度の液体媒体を流すことができるジャケット付のステンレス製の容器を用い、温度精度±２．０℃以内、循環ポンプ能力１０Ｌ／ｍｉｎ以上の恒温循環装置（例えば東京理科器械株式会社製ＮＣＣ−２１００）を接続し一定温度の液体媒体を循環させる構成、または、温度精度±２．０℃以内に制御された浴槽に循環ポンプ能力１０Ｌ／ｍｉｎ以上のポンプを接続し一定温度の液体媒体を循環させる構成が採用されるが、ドープタンク内のドープ温度を一定温度±３．０℃以内に制御することができれば、この構成に限定されることはない。
【００５２】
また、流延面温度は、好ましくはドープ温度より３〜６０℃低い−１０〜４７℃の温度範囲内の一定温度、より好ましくはドープ温度より５〜５０℃低い０〜４５℃の温度範囲内の一定温度、さらに好ましくはドープ温度より５〜１５℃低い１５〜２５℃の温度範囲内の一定温度の、±３．０℃以内、例えば１０．０±３．０℃以内に制御される。
流延面温度を±３．０℃以内に精密に制御するには、ドープが流延ダイからＰＥＴベースフィルム（４）上に流延される位置に用いられている搬送ドラムのドラム表面を±３．０℃以内に精密に温度制御できる温度調節装置付きのものとすることにより達成することができる。
そのためには具体的には、搬送ドラムには、２重の中空のドラムで外側の中空ドラムと内側の中空ドラムの間に隙間があり、内側のドラムの端面には液体を通す穴が開いた構造のものを用い、温度精度±２．０℃以内、循環ポンプ能力１０Ｌ／ｍｉｎ以上の恒温循環装置（例えば東京理科器械株式会社製ＮＣＣ−２１００）を接続し、外側のドラムと内側のドラムとの隙間に軸受け側から一定温度の液体媒体を流し、端面で内側のドラムに入り、軸受け側に排出することで一定温度の液体媒体を循環させる構成、または、温度精度±２．０℃以内に制御された浴槽に循環ポンプ能力１０Ｌ／ｍｉｎ以上のポンプを接続し、外側のドラムと内側のドラムとの隙間に軸受け側から一定温度の液体媒体を流し、端面で内側のドラムに入り、軸受け側に排出することで一定温度の液体媒体を循環させる構成が採用されるが、搬送ドラム温度を一定温度±３．０℃以内に制御することができれば、この構成に限定されることはない。
【００５３】
このように、ドープ温度、流延面温度を、ともに±３．０℃以内に精密に制御することによって、製造された微細多孔性膜について孔径等の膜物性の長手方向におけるローカリティーが改善され、従来以上に品質の安定した核酸吸着性微細多孔性膜を得ることができる。
【００５４】
流延された微細多孔性膜は、乾燥工程を経る。乾燥条件としては、３０〜１１０℃で１５〜５０分が好ましく、４０〜１００℃で２０〜４０分がより好ましい。
【００５５】
乾燥された微細多孔性膜は、その後巻き取りロール（Ｂ）に巻き取られる。
【００５６】
〔微細多孔性膜の鹸化処理〕
本発明に関する微細多孔性膜は、セルロースエステル誘導体の微細多孔性膜をさらに鹸化処理したものであることが好ましい。
【００５７】
セルロースエステル誘導体の微細多孔性膜をさらに鹸化処理した微細多孔性膜としては、アセチルセルロース微細多孔性膜の表面鹸化物が好ましい。アセチルセルロースとしては、先にも記載したように、モノアセチルセルロース、ジアセチルセルロース、トリアセチルセルロースの何れでもよいが、特にはトリアセチルセルロースが好ましい。より好ましくはトリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとの混合物が用いられる。
【００５８】
鹸化処理した微細多孔性膜の場合、膜の構造体はアセチルセルロースのままで、アルカリ性の鹸化処理液（例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、等）が接触する構造体の表面だけを鹸化することが好ましい。表面鹸化処理の程度（表面鹸化率）と微細多孔性膜構造とにより、空間的な水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。また、膜の構造体はアセチルセルロースから構成されているため、堅固な固相を得ることができる。ここで、アセチルセルロースを表面鹸化して表面にのみ水酸基を導入するということは、構造体はアセチルセルロースのままで、表面をセルロース化するということを意味する。なお、セルロースを原材料として用いると、液体にできないため、工業的に多孔膜や平膜を製造することはできない。
【００５９】
例えば、トリアセチルセルロースの微細多孔性膜として、ミクロフィルターＦＭ５００（富士写真フイルム（株）製）が市販されている。
【００６０】
微細多孔性膜を表面鹸化するには、アルカリ性の水溶液中に、微細多孔性膜を浸漬する。表面鹸化率を変えるには、アルカリ性水溶液の濃度ないし浸漬時間を変えればよい。例えば、０．１〜１．０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液に、微細多孔性膜を１０〜１２０分間浸漬する。
鹸化率は、周知の方法によって容易に測定することできる。滴定による酢化度測定方法や、ＮＭＲ、ＩＲ、ＸＰＳ等の測定機器による構造解析により、例えば残存アセチル基を定量して定められる。
【００６１】
鹸化処理した微細多孔性膜を核酸の分離に使用する場合、核酸の分離効率を挙げるためには、水酸基の数が多い方が好ましい。例えば、トリアセチルセルロースなどのアセチルセルロースの場合には、表面鹸化率が約５％以上１００％以下であることが好ましく、１０％以上であることが更に好ましい。そのような鹸化率であると、核酸の分離精製のための吸着物として用いたときに、充分な吸着能を有するようになる。この鹸化率を達成するためには、例えば、０．４ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液への浸漬時間は１０分以上とすることが好ましい。
【００６２】
〔鹸化処理装置〕
以下、図を参照しながら、微細多孔性膜の鹸化処理を実施するための一実施形態について説明する。
【００６３】
図２は、セルロースエステル微細多孔性膜の鹸化処理装置の概略図である。この鹸化処理装置１０は、セルロースエステル微細多孔性膜（以下、単に「セルロースエステル膜」ともいう。）１１を、シート状で順次、あるいは、長尺のままで連続的に搬送させながら、所定の処理により鹸化膜１２とする処理装置となっている。鹸化処理装置１０は、鹸化装置１５と、中和装置１６と、水洗装置１７と、乾燥装置１８とを有している。
【００６４】
鹸化装置１５内には、鹸化槽（図示せず）が備えられており、この鹸化槽には、セルロースエステル膜１１を鹸化して鹸化膜１２とするためのアルカリ性水溶液が備えられる。
【００６５】
中和装置１６には、中和処理層（図示せず）が備えられており、鹸化によって生成した鹸化膜１２の表面あるいは内部に残留するアルカリ性水溶液を中和するための酸性水溶液が、この中和処理槽内に備えられる。
【００６６】
水洗装置１７には、攪拌機を有する水洗機（図示せず）が備えられている。水洗機には、吸水口と排水口が備えられ、吸水口からは適宜洗浄用の水が水供給２０から供給され、また排水口からは適宜使用済みの水が外部へ排水される。
【００６７】
そして、乾燥装置１８は、鹸化膜１２を加熱する加熱手段としてのドラム２５を有する。また、乾燥装置１８はベルト２６を有しており、このベルト２６は、鹸化膜１２を搬送し、かつドラム２５との間に鹸化膜１２を挟み込むことにより鹸化膜１２の加熱効率を高める。乾燥装置１８は、さらに、ベルト２６を搬送するための搬送ローラ２７を備える。ドラム２５には、これを回転駆動するためのモータ２５ａと、ドラム２５の表面温度を検知してこの検知結果に基づいて表面温度を制御するための温度コントローラ２５ｂとが備えられている。また、乾燥装置１８には、チャンバ３１が備えられており、このチャンバ３１には内部の空気を排出するための排気口３１ａが備えられている。このチャンバ３１への空気の取り込みは鹸化膜１２の入口でなされている。
【００６８】
鹸化装置１５では、アルカリ性水溶液によりセルロースエステル膜１１の鹸化がなされる。例えば、常温（１５〜３５℃）下で、０．１〜１．０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液を攪拌しながら、セルロースエステル膜１１を１０〜１２０分間浸漬する。
【００６９】
鹸化された後の鹸化膜１２は、鹸化後できるだけすぐに、中和されることが好ましい。中和工程において使用する酸の濃度や種類、中和時間については、鹸化工程により鹸化膜１２に付着したアルカリ性水溶液を中和するために充分であればよい。例えば、０．１〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩酸水溶液に、１０〜６０分浸漬することで、中和がなされる。中和方法としては、他にも、鹸化膜１２に対して酸性水溶液を塗布したり吹付けたりする等、公知の種種の方法を用いることができる。
【００７０】
次に、水洗装置１７において、鹸化膜１２を充分に水洗する。水は連続的に供給と排出とがなされ、流水での洗浄が実施されるようにすることができる。このような流水方式とすることにより、洗浄効率ならびに洗浄効果が向上する。また、水洗時間については、流水の場合には６０分以上であることが好ましく、滞留式の水洗では適宜水を交換しながら６０分よりも長くすることが好ましい。
【００７１】
洗浄において用いる水は濾過水であり、この濾過水はヌクリアーゼフリーであり、粒子直径が０．５μｍ以上の粒子が除去されたものである。ヌクリアーゼはＤＮＡ及びＲＮＡの分解酵素であるので、ヌクリアーゼフリー水を洗浄水とすることにより、核酸の分離精製における得率低下を防ぐことができる。
【００７２】
本実施形態においては、水洗工程に限らず、鹸化工程のアルカリ水溶液、中和工程の酸性水溶液等、用いる水すべてについてヌクリアーゼフリー水とすることにより、核酸の分離精製における得率低下をより確実に防いでいる。
【００７３】
また、洗浄水に対して、水溶性有機溶媒を混合してもよい。水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールとその異性体の中から選ばれることが好ましく、また選ばれるものは複数であってもよい。
【００７４】
次に乾燥装置１８による乾燥工程について説明する。本実施形態において用いた加熱手段は上記のとおり接触式のドラム２５とされている。ドラム２５には搬送ローラ２７により循環して連続搬送されるベルト２６が巻きかけられており、水洗装置１７を経た鹸化膜１２は搬送ローラ２１等によりベルト２６にまで至る。そして、鹸化膜１２はベルト２６によりドラム２５まで案内されて、表面が加熱されたドラム２５により加熱される。加熱時においては、鹸化膜はドラム２５とベルト３６との間に挟まれながら搬送されている。そして加熱された鹸化膜はドラム２５から離れてからもベルト２６上でもその昇温により乾燥が進み、チャンバ３１の外部に出る頃までには充分に乾燥される。そしてこの乾燥工程を経てセルロース微細多孔性膜が得られる。
【００７５】
この挟み込み加熱により鹸化膜１２の加熱効率が向上するとともに、膜の破断等を防止することができる。これは、鹸化膜１２の水分蒸発に伴って発生する鹸化膜１２の収縮が抑制され、破断がこのような収縮に起因するものだからである。したがって、本実施形態によると、従来、側端部を保持する等の枠保持方式により保持搬送しながら鹸化膜を乾燥する等により発生していた破断を防止することができる。
【００７６】
ドラム２５の温度は、鹸化膜１２の厚みと、この鹸化膜１２に含まれる水の量、搬送速度等に応じて決定され、また搬送速度は、鹸化膜１２の強度等を考慮して決定されるが、ドラム２５の表面温度は概ね１００〜２００℃とし、搬送速度は、０．０５〜５．０ｍ／ｍｉｎとすることが好ましい。表面温度を１００℃未満とすると、加熱不十分のために乾燥が充分になされないことがあり、２００℃を超えると、鹸化膜１２を劣化させることがある。また、搬送速度を０．０５ｍ／分未満とすると、生産性の点で問題があり、また５．０ｍ／分とすると、乾燥不良が生じるという問題がある。
【００７７】
また、上記のように挟み込みにより加熱して乾燥させる方法によると、高い平面性を有する鹸化膜１２を得ることができる。この平面性により、得られた鹸化膜１２を所定のサイズに切断して核酸分離精製用のカートリッジに良好に収容することができる。
【００７８】
〔微細多孔性膜の諸特性〕
本発明に関する微細多孔性膜の最小孔径は、一般に約０．０１〜８μｍ程度であるが、核酸分離精製用の微細多孔性膜としては、好ましくは０．１μｍ以上、より好ましくは０．５〜５μｍであることが核酸抽出効率の点で好ましい。
微細多孔性膜の最小孔径は、バブルポイント法により測定することができる。
本発明に関する微細多孔性膜の孔の形状は、表裏対称、表裏非対称等種々のものがあり得るが、核酸分離精製用の微細多孔性膜としては、表裏非対称の多孔性膜であることが、目詰まりの点で好ましい。
本発明に関する微細多孔性膜は、核酸分離精製用の微細多孔性膜としては、その最大孔径と最小孔径の比が、好ましくは２以上、より好ましくは５以上であることが、核酸の膜への吸着量及び目詰まりの点で好ましい。
微細多孔性膜の最大孔径は、電子顕微鏡により測定することができる。
【００７９】
また、本発明に関する微細多孔性膜は、核酸分離精製用の微細多孔性膜としては、その厚さが、好ましくは１０〜５００μｍ、より好ましくは５０〜２５０μｍであることが、膜洗浄の点で好ましい。
微細多孔性膜の厚さは、デジマティックインディケーターなどの膜厚測定器により測定することができる。
【００８０】
また、本発明に関する微細多孔性膜は、核酸分離精製用の微細多孔性膜としては、その空隙率が、好ましくは５０〜９５％、より好ましくは６５〜８０％であることが、目詰まり、核酸回収量の点で好ましい。
空隙率は、膜密度から算出により測定することができる。
【００８１】
また、本発明に関する微細多孔性膜は、核酸分離精製用の微細多孔性膜としては、そのバブルポイントが、好ましくは０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ2、より好ましくは０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ2であることが、目詰まり、核酸回収量の点で好ましい。
バブルポイントは、バブルポイント法により測定することができる。
【００８２】
また、本発明に関する微細多孔性膜は、核酸分離精製用の微細多孔性膜としては、その圧力損失が、好ましくは０．１〜１００ｋＰａ、より好ましくは０．５〜５０ｋＰａであることが、加圧系を用いる自動化の点で好ましい。
圧力損失は、差圧計により測定することができる。
【００８３】
また、本発明に関する微細多孔性膜は、核酸分離精製用の微細多孔性膜としては、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、好ましくは膜１ｃｍ2当たり１分間で１〜５０００ｍＬ、より好ましくは膜１ｃｍ2当たり１分間で５〜１０００ｍＬであることが、加圧系を用いる自動化の点で好ましい。
【００８４】
上記の好ましい範囲とすることにより、核酸分離精製方法における微細多孔性膜としてより好適に用いることができる。
【００８５】
本発明に関する微細多孔性膜は、核酸分離精製方法に使用する際の多孔性膜１ｍｇ当たりの核酸吸着量が好ましくは０．１μｇ以上、より好ましくは０．９μｇ以上であることが好ましい。
【００８６】
〔核酸の分離精製方法〕
本発明に関する微細多孔性膜は、下記の各工程を含む核酸の分離精製方法において使用される。
(1) 核酸を含む試料溶液を該多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
(2) 洗浄液を該多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び
(3) 回収液を該多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程。
「核酸」は一本鎖、二本鎖のいずれでもよく、また、分子量の制限も無い。
【００８７】
核酸の分離精製方法では、好ましくは、少なくとも２個の開口を有する容器内に微細多孔性膜から成る固相を収容した核酸分離精製ユニットを用いて核酸の吸着及び脱着を行うことができる。
【００８８】
さらに好ましくは、(ａ)微細多孔性膜から成る固相、(ｂ)前記固相を収容する、少なくとも２個の開口を有する容器、及び(ｃ)前記容器の一の開口に結合された圧力差発生装置を含む核酸分離精製ユニットを用いて核酸の吸着及び脱着を行うことができる。
【００８９】
この場合の核酸の分離精製方法の第一の実施態様は、以下の工程を含むことができる。
(ａ)核酸分離精製ユニットの一の開口を核酸を含む試料溶液中に挿入する工程、
(ｂ)核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして核酸を含む試料溶液を吸引し、微細多孔性膜から成る固相に接触させる工程、
(ｃ)核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、吸引された核酸を含む試料溶液を容器外に排出する工程、
(ｄ)核酸分離精製ユニットの一の開口を核酸洗浄バッファ溶液中に挿入する工程、
(ｅ)核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして核酸洗浄バッファ溶液を吸引し、微細多孔性膜から成る固相に接触させる工程、
(ｆ)核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、吸引された核酸洗浄バッファ溶液を容器外に排出する工程、
(ｇ)核酸分離精製ユニットの一の開口を、微細多孔性膜から成る固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液中に挿入する工程、
(ｈ)核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして、微細多孔性膜から成る固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液を吸引し、固相に接触させる工程、及び
(ｉ)核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、微細多孔性膜から成る固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液を容器外に排出する工程。
【００９０】
核酸の分離精製方法の第二の実施態様は、以下の工程を含むことができる。
(ａ)検体を用いて核酸を含む試料溶液を調製し、核酸分離精製ユニットの一の開口に上記の核酸を含む試料溶液を注入する工程、
(ｂ)核酸分離精製ユニットの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、他の開口より排出することによって、微細多孔性膜から成る固相に接触させる工程、
(ｃ)核酸分離精製ユニットの上記一の開口に核酸洗浄バッファを注入する工程、
(ｄ)核酸分離精製ユニットの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸洗浄バッファを上記他の開口より排出することによって、微細多孔性膜から成る固相に接触させる工程、
(ｅ)核酸分離精製ユニットの上記一の開口に微細多孔性膜から成る固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液を注入する工程、
(ｆ)核酸分離精製ユニットの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸を脱着せしめうる液を上記他の開口より排出させることによって、微細多孔性膜から成る固相に吸着された核酸を脱着させ、容器外に排出する工程。
【００９１】
微細多孔性膜を用いた核酸の分離精製方法についてさらに具体的に説明する。好ましくは、核酸を含む試料溶液を微細多孔性膜から成る固相に接触させることにより試料溶液中の核酸を固相に吸着させ、次いで、固相に吸着させた核酸を、以下に説明する好適な溶液を用いて固相から脱着させる。さらに好ましくは、核酸を含む試料溶液は、細胞又はウイルスを含む検体を細胞膜及び核膜を溶解する溶液で処理することにより核酸を液中に分散させた溶液に水溶性有機溶媒を添加した溶液である。
【００９２】
使用できる核酸を含む試料溶液に制限はないが、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）など、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料から調製された溶液が対象となる。
【００９３】
最初にこれらの検体を、細胞膜を溶解して核酸を可溶化する試薬を含む水溶液で処理する。これにより細胞膜および核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に分散する。細胞膜の溶解および核酸の可溶化のためには、例えば、対象となる試料が全血の場合、(1) 赤血球の除去、(2) 各種タンパク質の除去、及び(3) 白血球の溶解及び核膜の溶解が必要となる。(1) 赤血球の除去および(2) 各種タンパク質の除去は、固相への非特異吸着および多孔膜の目目詰まりを防ぐために、(3) 白血球の溶解及び核膜の溶解は、抽出の対象である核酸を可溶化させるためにそれぞれ必要となる。特に、(3) 白血球の溶解及び核膜の溶解は重要な工程であり、この工程で核酸を可溶化することが必要である。本明細書中以下に記載の実施例では、塩酸グアニジン、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、プロテアーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加した状態で６０℃で１０分インキュベートすることによって上記の(1)、(2)及び(3)を同時に達成している。
【００９４】
核酸可溶化試薬としては、グアニジン塩、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を含む溶液が挙げられる。グアニジン塩としては、塩酸グアニジンが好ましいが、他のグアニジン塩（イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン）を使用することもできる。グアニジン塩の溶液中の濃度は、０.５Ｍ以上６Ｍ以下、好ましくは１Ｍ以上５Ｍ以下である。
【００９５】
界面活性剤としてはＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用することができるが、この他にも、ＳＤＳ、コール酸ナトリウム又はサルコシンナトリウム等の陰イオン性界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ２０又はメガファック等のノニオン性界面活性剤、その他各種両性界面活性剤を使用することもできる。ポリオキシエチレンオキチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）等のノニオン性界面活性剤を使用することが好ましい。界面活性剤の溶液中の濃度は、通常０．０５重量％〜１０重量％、特に好ましくは０．１重量％〜５重量％である。
【００９６】
タンパク質分解酵素としては、プロテアーゼＫを使用することはできるが、他のプロテアーゼでも同様の効果を得ることができる。プロテアーゼは酵素であるため加温するのが好ましく、３７℃〜７０℃で使用することが好ましく、特に５０℃〜６５℃で使用することが好ましい。
【００９７】
このように核酸が分散した水溶液中に、水溶性有機溶媒を添加して、微細多孔性膜と接触させる。この操作により、試料溶液中の核酸が微細多孔性膜に吸着される。本明細書中上記した操作で可溶化された核酸を、微細多孔性膜から成る固相に吸着させるためには、可溶化した核酸混合液に水溶性有機溶媒を混合することと、得られた核酸混合液中に塩が存在することが必要である。
【００９８】
即ち、核酸の周りに存在する水分子の水和構造を破壊することにより、核酸は不安定な状態で可溶化することになる。この状態の核酸を、微細多孔性膜から成る固相と接触させると、核酸表面上の極性基と固相表面の極性基間で相互作用し、核酸は固相表面上に吸着するものと考えられる。可溶化した核酸混合液に水溶性有機溶媒を混合することと、得られた核酸混合液中に塩が存在することによって、核酸を不安定な状態にさせることができる。
【００９９】
ここで用いる水溶性有機溶媒としては、エタノール、イソプロパノール又はプロパノールなどが挙げられ、中でもエタノールが好ましい。水溶性有機溶媒の濃度は、好ましくは５重量％〜９０重量％であり、さらに好ましくは２０重量％〜６０重量％である。エタノールの添加濃度は、擬集物を生じない程度でできるだけ高くすることが特に好ましい。
【０１００】
得られた核酸混合液中に存在する塩としては、各種カオトロピック物質（グアニジウム塩、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム）や塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム等が好ましい。特にグアニジウム塩は、細胞膜の溶解および核酸の可溶化の効果を併有するので特に好ましい。
【０１０１】
次いで、この核酸が吸着した微細多孔性膜を核酸洗浄バッファ溶液に接触させる。この溶液は核酸と一緒に微細多孔性膜に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する。従って、微細多孔性膜から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成を有する必要がある。核酸洗浄バッファ溶液は主剤と緩衝剤、及び必要に応じて界面活性剤を含む水溶液からなる。主剤としてはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノール、アセトン等の約１０〜１００重量％（好ましくは約２０〜１００重量％、さらに好ましくは約４０〜８０重量％）の水溶液が、緩衝剤及び界面活性剤としては、既述の緩衝剤及び界面活性剤が挙げられる。これらの内では、エタノール、Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む溶液が好ましい。Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００の好ましい濃度は、それぞれ１０〜１００ｍＭ、及び０．１〜１０重量％である。
【０１０２】
次に、微細多孔性膜に吸着した核酸を脱着せしめうる溶液に、上記洗浄後の微細多孔性膜を接触させる。この溶液には目的とする核酸が含まれているので、これを回収し、後に続く操作、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による核酸の増幅に提供する。核酸を脱着せしめうる溶液としては、塩濃度が低いことが好ましく、特に好ましくは０．５Ｍ以下の塩濃度の溶液を使用する。この溶液としては、精製蒸留水、ＴＥバッファ等が使用できる。
【０１０３】
〔核酸分離精製ユニット〕
核酸分離精製ユニットは、少なくとも２個の開口を有する容器内に微細多孔性膜から成る固相を収容した核酸分離精製ユニットである。容器の材料に特別な限定はなく、微細多孔性膜が収容でき、かつ少なくとも２個の開口を設けることができればよいが、製造の容易性からプラスチックが好ましい。例えば、ポリスチレン、ポリメタアクリル酸エステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン、ポリカーボネート等の透明あるいは不透明の樹脂を用いるのが好ましい。
【０１０４】
容器の概念図を図３に示す。基本的には、固相の収容部を持ち、収容部に固相を収容でき、固相が試料液等の吸引及び排出時に収容部の外へは出ることがなく、開口に圧力差発生装置、例えば注射器を接合できればよい。このためには、容器が当初は二つの部分に分かれており、固相を収容した後で一体化できることが好ましい。また、固相が収容部から外へでることをさける為には、固相の上下にＤＮＡを汚染しない材料で作成されたメッシュを置くことができる。
【０１０５】
上記容器に収容される微細多孔性膜の形状にも特別な限定は無く、円形、正方形、長方形、楕円、筒状、巻物状等、任意の形状で良いが、製造適性の点からは、円、正方形、円筒状、巻物状等の対称性の高い形状が好ましい。
【０１０６】
上記容器の一の開口を核酸を含む試料溶液中に挿入し、他の一の開口から吸引して微細多孔性膜に試料溶液を接触させ、これを排出し、次いで核酸洗浄バッファ溶液を吸引・排出し、次いで、微細多孔性膜に吸着した核酸を脱着せしめうる溶液を吸引・排出して、この排出液を回収することにより、目的とする核酸を得ることができる。
【０１０７】
微細多孔性膜を、核酸を含む試料溶液、核酸洗浄バッファ溶液、及び微細多孔性膜に吸着した核酸を脱着せしめうる溶液中に順次浸漬しても目的とする核酸を得ることができる。
【０１０８】
核酸分離精製ユニットは、(ａ)微細多孔性膜から成る固相、(ｂ)前記固相を収容する、少なくとも２個の開口を有する容器、及び(ｃ)前記容器の一の開口に結合された圧力差発生装置、を含むものであることが好ましい。以下、この核酸分離精製ユニットについて説明する。
【０１０９】
容器は、通常、微細多孔性膜から成る固相を収容する本体と、蓋体に分けた態様で作製され、いずれにも少なくとも１個の開口が設けられている。一方は核酸を含有する試料溶液、核酸洗浄バッファ溶液及び固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液（以下、「試料溶液等」と記す。）の入口及び出口として使用され、他方は容器内を減圧又は加圧状態にせしめうる圧力差発生装置に接続される。本体の形状に特に限定はないが、製造が容易で、試料溶液等が固相の全面に拡散し易くするには、断面を円形にすることが好ましい。断面を四角形にすることも、固相の裁断屑を発生させないために好ましい。
【０１１０】
上記蓋は、圧力差発生装置によって容器内部を減圧及び加圧状態にできるように本体に接合されている必要があるが、この状態が達成できれば、接合方法は任意に選択できる。例えば、接着剤の使用、ねじ込み、はめ込み、ネジ止め、超音波加熱による融着等が挙げられる。
【０１１１】
容器の内容積は処理すべき試料溶液の量のみによって決められるが、通常、収容される固相の体積で表す。即ち、厚さが約１ｍｍ以下（例えば、５０〜５００μｍ程度）で、直径が約２ｍｍ〜２０ｍｍの固相を１枚〜６枚程度収容する大きさとすることが好ましい。
【０１１２】
固相の端面は、試料溶液等が通過しない程度に、容器の内壁面に密着させることが好ましい。
【０１１３】
試料溶液等の入り口に使用される開口に対向する固相の下は、容器の内壁に密着させずに空間を設け、試料溶液等が固相の全面にできるだけ均等に拡散する構造にする。
【０１１４】
他の一の開口、即ち圧力差発生装置に結合される開口に対向する固相の上には、ほぼ中央に穴を穿った部材を設けることが好ましい。この部材は、固相を押さえると共に、試料溶液等を効率よく排出する効果を有するものであり、液が中央の穴に集まる様に、漏斗状あるいはお椀状等の斜面を有する形状にすることが好ましい。この穴の大きさ、斜面の角度、部材の厚さは、処理する試料溶液等の量や固相を収容する容器の大きさ等を考慮して、当業者が適宜定めることができる。この部材と当該開口の間には、オーバーフローした試料溶液等を溜めて、圧力差発生装置内に吸引されることを防ぐための空間を設けることが好ましい。この空間の大きさも当業者が適宜選択することができる。なお、核酸を効率良く集めるためには、固相の全体が浸る以上の量の核酸を含む試料溶液を吸引することが好ましい。
【０１１５】
また、吸引している開口の真下の部分にのみ試料溶液等が集中することを防いで、試料溶液等が固相内を比較的均一に通過できるようにするため、固相とこの部材の間にも空間を設けることが好ましい。このためには、当該部材から固相に向けて複数の突起物を設けることが好ましい。突起物の大きさや数は当業者が適宜選択することができるが、空間を保持しながら固相の開口面積をできる限り大きく保つことが好ましい。
【０１１６】
なお、容器に３以上の開口を設けた場合には、減圧及び加圧操作に伴う液の吸引及び排出を可能にすべく、余分の開口を一時的に封鎖する必要があることはいうまでもない。
【０１１７】
圧力差発生装置は、まず固相を収容した容器内を減圧にして核酸を含む試料溶液を吸引する。圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、あるいはペリスタポンプのような吸引及び加圧が可能なポンプ等が挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力差発生装置は、前記容器の一の開口に着脱可能に結合されている。
【０１１８】
次に、上記した核酸分離精製ユニットを使用した、核酸の精製方法について説明する。先ず、核酸を含む試料溶液中に、上記の核酸分離精製ユニットの一の開口を挿入する。次いで他の一の開口に接続された圧力差発生装置を用いて精製ユニットの内部を減圧にして試料溶液を容器内に吸入する。この操作により、試料溶液が固相と接触して試料溶液中にある核酸が固相に吸着する。この際に、固相のほぼ全体と接触する量の試料溶液を吸引することが好ましいが、圧力差発生装置内に吸引すると装置を汚染するので、適量に調整する。
【０１１９】
適量の試料溶液を吸引後、圧力差発生装置を用いてユニットの容器内を加圧して、吸引した液を排出する。この操作までに間隔を開ける必要はなく、吸引後直ちに排出してもよい。
【０１２０】
次に、上記と同様の減圧−加圧操作で核酸洗浄バッファ溶液を容器内に吸引し、これから排出して容器内部を洗浄する。この溶液は容器内に残留する試料溶液を洗い流すと共に、核酸と一緒に固相に吸着した試料溶液中の不純物も洗い流す機能を有する。従って、固相から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成を有する必要がある。核酸洗浄バッファ溶液は主剤と緩衝剤、及び必要に応じて界面活性剤を含む水溶液からなり、主剤としてはメチルアルコール、エチルアルコール、ブチルアルコール、アセトン等の約１０〜９０％（好ましくは約５０〜９０％）の水溶液が、緩衝剤及び界面活性剤としては、既述の緩衝剤及び界面活性剤が挙げられる。これらの内では、エチルアルコール、Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む溶液が好ましい。Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００の好ましい濃度は、それぞれ１０〜１００ｍＭ、及び０．１〜１０％である。
【０１２１】
次に、固相に吸着した核酸を脱着せしめうる溶液を、上記と同様の減圧−加圧操作によって容器内部に導入し、容器から排出する。この排出液には目的とする核酸が含まれているので、これを回収し、後に続く操作、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による核酸の増幅に提供することができる。
【０１２２】
図４は、核酸分離精製ユニットの一例の断面図である。但し圧力差発生装置は図示していない。固相を収容する容器５００は、本体１００と蓋２００から成り、透明なポリスチレンで形成されている。本体１００は固相３００として表面鹸化したトリアセチルセルロースの多孔性膜を収容している。また、試料溶液等を吸引する開口１０１を有する。開口から続いている底面１０２は漏斗状に形成され、固相３００との間に空間１２１が設けられている。固相３００を支えて空間１２１を保つために、底面１０２と一体となった枠１０３が設けられている。
【０１２３】
本体は、内径が２０．１ｍｍ、深さが５．９ｍｍ、底面１０２から開口１０１までの長さは約７０ｍｍである。また、内蔵されている固相３００の直径は２０．０ｍｍ、一枚の厚さは約５０〜５００μｍであり、厚さの一例としては１００μｍである。
【０１２４】
図４において、固相の上部には漏斗状の押さえ部材１３０が設けられている。押さえ部材１３０の中央には穴１３１があり、かつ下方に一群の突起１３２が設けられ、固相３００との間に空間１２２が設けられている。固相３００と本体１００の壁１０４の間から試料溶液等が漏れにくい様に、壁１０４の上部の直径は固相の直径より大きく作成され、段差１０５の上に押さえ部材１３０の端が乗っている。
【０１２５】
蓋２００は本体１００と超音波加熱により接合されている。蓋２００のほぼ中央部には、圧力差発生装置を結合する開口２１が設けられている。蓋２００と押さえ部材１３０の間には、穴１３１から流出する試料溶液等を保持する空間１２３が設けられている。空間１２３の容積は約０．１ｍｌである。
【実施例】
【０１２６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１２７】
[実施例１]
（１）核酸吸着性微細多孔性膜の作製
セルロースエステルのドープを調製した。ドープ調製における溶解方法では、先ず、ポリマー成分を最初にジメチルクロライドに溶解し、さらに、この溶液にメタノールを少量ずつ添加した。そして、この溶液にさらにグリセリンと純水とを少量ずつ添加して、未溶解物がほとんどない状態のドープを得た。そして、ドープを濾紙で濾過する。なお、ドープ調製における各成分の配合は以下の通りである。
【０１２８】
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ジアセチルセルロース（酢化度５４．５％）          ２．４２％
トリアセチルセルロース（酢化度６０．８％）        ３．４３％
グリセリン                                        ０．１８％
ジメチルクロライド                              ５５．５０％
メタノール                                      ３３．２２％
純水                                              ５．０５％
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【０１２９】
上記ドープを温調装置付きドープタンク（図１：１）に仕込み、ドープタンク（１）を３５．０±３．０℃以内に制御する。次に、ギヤーポンプ（２）で３５．０±３．０℃のドープを送液し、さらに濾過を行ってから、エンドレスバンド（５）上に載せて搬送されるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（４）上にダイ（３）から流延した。この際、ドラム（６）温度を１０．０±３．０℃以内に制御し、流延面が±３．０℃以内となるように制御した。この流延膜を２０〜４０℃の乾燥風により２０分間乾燥した（７）。
【０１３０】
エンドレスバンド（５）から、流延膜をＰＥＴとともに剥ぎ取り、これを１５分間、８０〜１２０℃で熱風乾燥（８）して巻き取り機（Ｂ）で巻き取った。ＰＥＴ上には、セルロースアセテート微細多孔性膜が形成されている。
【０１３１】
得られた巻き取りロール（Ｂ）を、スリッター付きの巻き替え機（Ｃ）により４３ｃｍの幅にスリットした。この４３ｃｍ幅のＰＥＴ付きセルロースアセテート膜を、剥離バー（Ｄ）を用いて、ＰＥＴ部（Ｅ）とセルロースアセテート微細多孔性膜（Ｆ）とに分けた。得られたセルロースアセテート多孔性膜は、平均孔径が１．２μｍ、平均膜厚７０μｍのものであった。
【０１３２】
このように作製されたセルロースアセテート微細多孔性膜に、メタノール１．５リットルとヌクレアーゼフリー水１３．５リットルとの混合溶液を吸収させてから、鹸化装置１５を用い、０．４ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨ水溶液で２０〜３０℃、６０分の条件で鹸化を行った。
中和は、中和装置１６で２０〜３０℃の０．１ｍｏｌ／ｌ塩酸に浸漬することにより実施した。
洗浄は、オートウォッシャを水洗装置１７として用い、洗浄水はヌクレアーゼフリー水で行った。
そして、接触式ドラム乾燥機１８を用いて乾燥し、目的の核酸吸着性微細多孔性膜を得た。
【０１３３】
（２）核酸分離精製カートリッジの作成
内径７ｍｍ、核酸吸着性微細多孔性膜を収容する部分を持つ核酸分離精製カートリッジ用容器をハイインパクトポリスチレンで作成する。（１）の微細多孔性膜の長手方向部位における、１ｍ部、５０ｍ部、１００ｍ部、１５０ｍ部、２００ｍ部から採取した微細多孔性膜をそれぞれの核酸分離精製カートリッジ用容器の核酸吸着性多孔性膜を収容する部分に収容し、核酸分離精製カートリッジに加工する。
【０１３４】
（３）核酸可溶化試薬及び洗浄液の調製
以下に示す処方の核酸可溶化試薬溶液、及び洗浄液を調製する。
【０１３５】
（核酸可溶化試薬溶液）
―――――――――――――――――――――――――――――
塩酸グアニジン（ライフテクノロジー社製）      ３８２ｇ
Ｔｒｉｓ（ライフテクノロジー社製）          １２．１ｇ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＩＣＮ製）              １０ｇ
蒸留水                                    １０００ｍｌ
―――――――――――――――――――――――――――――
（洗浄液）
――――――――――――――――
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
１０ｍＭ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
６５％  エタノール
――――――――――――――――
【０１３６】
（４）ＤＮＡ分離精製操作
人全血検体２００μｌに、実施例１で作製した核酸可溶化試薬２００μlと、プロテアーゼ（ＳＩＧＭＡ社製、“Ｐｒｏｔｅａｓｅ”  Ｔｙｐｅ  ＸＸIV  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ）溶液２０μlを添加して、６０℃で１０分間インキュベートする。インキュベート後、エタノール２００μｌを加え攪拌することで、核酸を含む試料溶液を作製する。該核酸を含む試料溶液を、上記（２）で作製した長手方向部位の異なる核酸吸着性微細多孔性膜を備えた、それぞれの核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した該核酸を含む試料溶液を、上記核酸吸着性微細多孔性膜に通過させることで、上記核酸吸着性微細多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出する。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、（３）で作製した洗浄液を注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、上記核酸吸着性微細多孔性膜に通過させ、他の開口より排出する。この操作を３回繰り返す。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合して、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、上記核酸吸着性微細多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収する。このとき、核酸を含む試料溶液が核酸吸着性微細多孔性膜を通過するのにかかる時間をそれぞれの核酸分離精製カートリッジについて記録した。（表１）
【０１３７】
［比較例１］
流延面の温度を１０．０±５．０℃でコントロールする条件で行ったこと以外は、実施例１と同じ条件で、同じ操作を行う。
［比較例２］
ポリマー溶液の温度を３５．０±５．０℃でコントロールする条件で行ったこと以外は、実施例１と同じ条件で、同じ操作を行う。
【０１３８】
【表１】
2006083292.tif 000003
【０１３９】
上記の実施例１と比較例１、比較例２との比較の結果、比較例１の製造条件（ポリマー溶液の温度：３５．０±３．０℃、流延面温度：１０．０±５．０℃）や比較例２の製造条件（ポリマー溶液の温度：３５．０±５．０℃、流延面温度：１０．０±３．０℃）で得られた微細多孔性膜では、核酸分離精製にかかる時間が微細多孔性膜の長手方向部位による違いで大きくバラついたが、実施例１の製造条件（ポリマー溶液の温度：３５．０±３．０℃、流延面温度：１０．０±３．０℃）で得られた微細多孔性膜では、核酸分離精製にかかる時間は微細多孔性膜の長手方向部位による違いによらずほぼ一定であり、一定の性能が得られた。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】本発明の多孔性膜の製造方法を実施するための製造設備の概略図である。
【図２】セルロースエステル微細多孔性膜の鹸化処理装置の概略図である。
【図３】核酸分離精製ユニットの容器の概念図である。
【図４】核酸分離精製ユニットの容器の一例の断面図である。
【符号の説明】
【０１４１】
１：  温調装置付きドープタンク
２：  送液ポンプ
３：  流延ダイ
４：  ＰＥＴベースフィルム
５：  エンドレスバンド
６：  温調ドラム
７：  乾燥装置
８：  乾燥装置
Ａ    ＰＥＴベース送り出しロール
Ｂ    ＰＥＴベース＋微細多孔性膜巻き取りロール
Ｃ    スリッター付き巻き替え機
Ｄ    剥離バー
Ｅ    ＰＥＴベース巻き取りロール
Ｆ    微細多孔性膜巻き取りロール
１０：  鹸化処理装置
１１：  セルロースエステル微細多孔性膜
１２：  鹸化膜
１５：  鹸化装置
１６：  中和装置
１７：  水洗装置
１８：  乾燥装置
２５：  ドラム
２６：  ベルト
５００：  核酸分離精製ユニットの容器
１００：  本体
２００：  蓋
３００：  固相（表面鹸化したトリアセチルセルロースの多孔性膜）
【図１】
2006083292.tif 000004
【図２】
2006083292.tif 000005
【図３】
2006083292.tif 000006
【図４】
2006083292.tif 000007