(57)【要約】      （修正有）【課題】抗原特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導方法、がんの治療に有用なＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドの提供。【解決手段】目的とする抗原をコードするＲＮＡを導入した自家Ｔリンパ球を抗原提示細胞として使用することにより、前記抗原に特異的な細胞傷害性リンパ球を誘導する。前記の自家Ｔリンパ球は免疫誘導剤として使用することができる。また、ＭＡＧＥ−４、ＳＡＧＥ由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドとして、それぞれ特定のアミノ酸配列が示されるペプチドが提供される。これらのぺプチドは前記抗原に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導することができ、前記抗原を発現しているがんの治療に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とする抗原をコードするＲＮＡを導入した、前記抗原を認識するＴリンパ球を誘導する活性を有するＴリンパ球。
【請求項２】
Ｔリンパ球がフィトヘムアグルチニンで活性化されたＣＤ４陽性細胞である請求項１記載のＴリンパ球。
【請求項３】
請求項１または２記載のＴリンパ球を含有する免疫誘導剤。
【請求項４】
目的とする抗原をコードするＲＮＡを導入したＴリンパ球を抗原提示細胞として使用することを特徴とする、前記抗原を認識するＴリンパ球の誘導方法。
【請求項５】
Ｔリンパ球がフィトヘムアグルチニンで活性化されたＣＤ４陽性細胞である請求項４記載の誘導方法。
【請求項６】
抗原を認識するＴリンパ球がＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球であることを特徴とする請求項４記載の誘導方法。
【請求項７】
抗原が腫瘍関連抗原または感染性微生物抗原である請求項４〜６いずれか記載の誘導方法。
【請求項８】
癌組織から調製したＲＮＡを使用することを特徴とする請求項７記載の誘導方法。
【請求項９】
ＥＢＮＡ３Ａ、ＣＭＶｐｐ６５の少なくとも一つのウイルス抗原を発現するＲＮＡを使用することを特徴とする請求項７記載の誘導方法。
【請求項１０】
請求項４〜９いずれか記載の方法によって誘導されたＴリンパ球を有効成分として含有してなるがんまたは感染症の治療剤。
【請求項１１】
配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を認識するＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球。
【請求項１２】
請求項１１記載の細胞傷害性Ｔリンパ球を有効成分として含有してなる制がん剤。
【請求項１３】
配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分として含有してなる、請求項１１記載の細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤。
【請求項１４】
配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分として含有してなる制がん剤。
【請求項１５】
配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体を含有する、請求項１１記載の細胞傷害性Ｔリンパ球の有するＴ細胞レセプター検出用のテトラマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡを導入したＴリンパ球を抗原提示細胞として利用した抗原特異的なＴリンパ球の誘導方法、および誘導されたＴリンパ球のがんまたは感染症の治療剤としての利用に関する。また、腫瘍関連抗原であるＭＡＧＥ−Ａ４またはＳＡＧＥに特異的なＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびその認識する抗原ペプチド、並びにそれらのＣＴＬ誘導剤および制がん剤としての利用に関する。さらに、該ＣＴＬを検出するために有用なＭＨＣ−抗原ペプチド複合体を４量体化したテトラマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）には、抗原ペプチドと主要組織適合性抗原遺伝子複合体（major histo-compatibility gene complex；以下、ＭＨＣと略す）にコードされる主要組織適合性抗原ＭＨＣ（ヒトの場合 human leukocyte antigenと呼ばれ、以下、ＨＬＡと略す）分子との結合物である複合体を特異的なＴ細胞レセプター（T cell receptor；以下、ＴＣＲと略す）によって認識し、その複合体を細胞表面に提示している細胞を傷害することのできるものがある。このようなＣＴＬは自身と同じＨＬＡ分子を有する標的細胞のみを認識し傷害することから、ＨＬＡ拘束性ＣＴＬと呼ばれる。したがって該細胞傷害反応が成立するためには、１）特異的ＴＣＲを持ったＣＴＬが存在すること、２）ＨＬＡに提示されＣＴＬに認識される抗原ペプチドとなるために、ＨＬＡ分子との結合だけでなく、ＴＣＲによる認識を受ける複合体を形成できる抗原ペプチドが存在すること、が必要である。
【０００３】
このような抗原ペプチドは、例えば哺乳類細胞の細胞内で合成された抗原等が小胞体でプロセスされ、小さいエピトープペプチドに分解されることにより生じ、更にＨＬＡ分子と会合し、細胞表面に提示される。すなわち、多くのサブユニットよりなるプロテオソーム複合体の中で、タンパク質は８〜１５アミノ酸よりなるペプチドに分解され、そのうちのいくつかがＴＡＰトランスポーターにより細胞質から小胞体に運ばれる。これらのペプチドは小胞体でクラスＩ／β２ミクログロブリン（microglobulin）のヘテロダイマーに結合できれば、３分子複合体として安定化され、ゴルジ装置を通って、細胞表面に輸送される。腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原タンパク質を発現している腫瘍細胞は、腫瘍細胞表面にＴリンパ球に認識される、ＨＬＡ拘束性抗原ペプチドを提示できるはずである。
さらに、ウイルス、細菌や原虫、真菌による感染においても、これらの微生物の有する抗原に対するＣＴＬが感染防御に重要な役割を果していることが明らかにされている。
【０００４】
ＨＬＡクラスＩ分子は主としてＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃがあり、これらに結合して提示される抗原ペプチドは、８〜１０個のアミノ酸よりなり、更に各々のＨＬＡ分子によって異なる一定の構造上の特徴があることが知られている。例えば、世界的に最も頻度の高いＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合するペプチドとしてはＮ末端より２番目にＬｅｕ、且つＣ末端にＬｅｕ又はＶａｌを有する９〜１０個のアミノ酸よりなるペプチドが最も良く知られているものである。また、日本人を始めとするアジアの人種に多いＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプチドはＮ末端より２番目にＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐのいずれか、且つＣ末端にＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅのいずれかを有する９〜１０個のアミノ酸よりなるものであるペプチドが最もよく知られている〔非特許文献１〕。
【０００５】
現在までに抗原ペプチドが同定されている腫瘍抗原としては、ＨＬＡ−Ａ１に対するＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＨＬＡ−Ａ２．１に対するＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＥＡ等、ＨＬＡ−Ｃｗ１に対するＭＡＧＥ−３、ＨＬＡ−Ｂ４４に対するＭＡＧＥ−３、ＨＬＡ−Ｂ３７に対するＭＡＧＥ−Ａ４、ＨＬＡ−Ａ２４に対してはＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＣＥＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、チロシナーゼ、β−カテニン（catenin）等がある。これらの中の多くは、まず腫瘍細胞を認識するクラスＩ拘束性のＣＴＬを株化し、このＣＴＬの認識する腫瘍抗原を同定し、続いて遺伝子工学的方法により腫瘍抗原タンパク質中最小単位を見出し、更にＨＬＡクラスＩ分子への結合モチーフに関する情報を基に最小単位中のペプチドが見出されている〔非特許文献２〕。また、まず前記のＨＬＡクラスＩ分子結合ペプチドに共通したモチーフ構造を基に、腫瘍抗原タンパク質中のＨＬＡクラスＩ分子結合ペプチドを見出し、続いて抗原提示細胞を利用してＣＴＬを誘導可能なものを選択した後、最終的に腫瘍細胞に対して傷害性を有するＣＴＬが誘導できているかどうかにより抗原ペプチドが決定されている〔非特許文献３、４〕。
【０００６】
一方、ＨＬＡクラスＩ分子はいくつかのサブタイプに分類されるが、その保有サブタイプの種類は人種間で大きく異なり、世界的にはＨＬＡ−Ａ２が最も多く、白色人種の４５％を占めている。そして、このＨＬＡ−Ａ２拘束性の抗原ペプチドの同定が最も進んでいる。日本人ではＨＬＡ−Ａ２は４０％を占めるが、そのサブタイプを見ると白色人種と同じＨＬＡ−Ａ＊０２０１は２０％で、残りの多くはＡ＊０２０６である。これらのサブタイプへの結合ペプチドは異なり、主として研究されているＨＬＡ−Ａ２はＨＬＡ−Ａ＊０２０１である。一方、日本人ではＨＬＡ−Ａ２４が６０％以上を占めており、このＨＬＡ−Ａ２４はアジア人種では他の人種に比べて比率が高い。従って、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原ペプチドの発見はアジア人種、特に日本人において腫瘍細胞特異的に作用するＣＴＬを誘導する事による、腫瘍治療に有用なＣＴＬの提供に重要な役割を示す。
【０００７】
同じ抗原でも、ＨＬＡの違いに基づいて抗原ペプチドが異なるため、抗原ペプチドを利用したＣＴＬの誘導は煩雑である。この問題を解決するために色々な工夫がなされているが、まだ満足できる成果は得られていない。工夫されていることの一つは、患者自身（自家）由来の抗原提示細胞に抗原遺伝子を形質導入し、これを利用したＴリンパ球誘導方法である。抗原提示細胞として、プロフェッショナル抗原提示細胞として知られている、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞が検討され、樹状細胞を中心として、ワクチンのアジュバント等として使用する臨床試験が実施されている〔非特許文献５〕。しかし、これらの抗原提示細胞は、免疫誘導に必要な量を準備するのに労力を要することが課題である。Ｂ細胞はＥＢウイルスによる不死化による大量調製が可能であるが、ウイルスを使用している点から安全性上問題がある。また、遺伝子導入法に関しても、ウイルスベクターやプラスミドＤＮＡを用いる遺伝子導入は、遺伝子が染色体上に挿入され、新たな変異体を生じる可能性が否定できない。
【０００８】
【非特許文献１】ジャーナル  オブ  イムノロジー（J. Immunol.）、第１５５巻、第４３０７〜４３１２頁（１９９５）
【非特許文献２】プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  ザ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. U S A）、第９１巻、第３５１５〜３５１９頁（１９９４）
【非特許文献３】プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ、第９１巻、第２１０５〜２１０９頁（１９９４）
【非特許文献４】ジャーナル  オブ  イクスペリメンタル  オブ  メディシン（J. Exp. Med.）、第１７９巻、第９２１〜９３０頁（１９９４）
【非特許文献５】ジャーナル  オブ  イムノセラピー（J. Immunotherapy ）、第２１巻、第４１〜４７頁（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドは、腫瘍関連抗原の場合、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＣＥＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、チロシナーゼ、βカテニン等があるがＨＬＡ−Ａ２．１に比べると未だにその解析は遅れており、種々の腫瘍抗原に対する新たな抗原ペプチドの発見が望まれる。したがってアジア人種、特に日本人において腫瘍細胞特異的に作用するＣＴＬの解析も遅れており、腫瘍治療に有用なＣＴＬの提供が不可能であった。
【００１０】
また、プロフェッショナル抗原提示細胞として知られている、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞を使用してＣＴＬ誘導を行う試みは、これらの細胞の取り扱い、例えば採取や拡大に問題を有している。なお、従来、Ｔリンパ球の抗原提示能については知られていない。
【００１１】
ＣＴＬは、その細胞表面のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）とＣＤ３分子の複合体により、抗原提示細胞または標的細胞表面のＭＨＣ分子に結合している抗原ペプチドをＭＨＣ分子と共に認識して、活性化され、さまざまな免疫反応を起こすため、ＣＴＬの動態や機能に関する解析は、細胞自身を使用する必要があり、各種細胞株、抗原遺伝子形質転換株などを用いて、種々の工夫をしながら行われてきた。しかし、最近使用されているＭＨＣテトラマーはＭＨＣ−抗原ペプチド複合体をビオチン−ストレプトアビジン法で４量体化したものであり、抗原提示細胞や標的細胞の代わりに、また目的のＴＣＲを有するＣＴＬの特異的測定法として有用性が高いことが明らかになっている。しかし、ＴＣＲに応じて、すなわち、ＨＬＡおよび抗原ペプチドの違いに応じて、それぞれに必要なテトラマーが異なるため、多種類のテロラマーが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、腫瘍抗原に対する有用なＣＴＬの誘導方法を検討した結果、自家リンパ球をフィトヘムアグルチニン等のＴ細胞活性化剤で刺激し、これに抗原をコードするＲＮＡを電気穿孔法で導入したものを抗原提示細胞として使用したところ、抗原特異的なＣＴＬを誘導できることを明らかにした。さらに、腫瘍抗原であるＭＡＧＥ−Ａ４、ＳＡＧＥに対するＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬを誘導し、このＣＴＬの認識するＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドが、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを同定した。そしてこの抗原ペプチドがヒト末梢血リンパ球よりＣＴＬを誘導するために有用であることを明らかにした。同時に、配列番号１または２の抗原ペプチドを使用して調製されるＭＨＣ−抗原ペプチド複合体をビオチン−ストレプトアビジンで４量体化したテトラマーを調製し、これがＣＴＬの検出に有用であることを明らかにし、本発明を完成させた。
【００１３】
本発明の第１の態様は、目的とする抗原をコードするＲＮＡを導入した、前記抗原を認識するＴリンパ球を誘導する活性を有するＴリンパ球に関する。
【００１４】
本発明の第２の態様は、第１の態様のＴリンパ球を含有する免疫誘導剤に関する。
【００１５】
本発明の第３の態様は、第１の態様のＴリンパ球を抗原提示細胞として使用することを特徴とする、前記抗原を認識するＴリンパ球の誘導方法に関する。
【００１６】
本発明の第４の態様は、第２の態様のＴリンパ球の誘導方法によって誘導されたＴリンパ球を有効成分として含有してなるがんまたは感染症の治療剤に関する。
【００１７】
本発明の第５の態様は、配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を認識するＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球に関する。
【００１８】
本発明の第６の態様は、第５の態様の細胞傷害性Ｔリンパ球を有効成分として含有してなる制がん剤に関する。
【００１９】
本発明の第７の態様は、配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分として含有してなる、第５の態様の細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導剤に関する。
【００２０】
本発明の第８の態様は、配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分として含有してなる制がん剤に関する。
【００２１】
本発明の第９の態様は、配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体を含有する、第５の態様の細胞傷害性Ｔリンパ球の有するＴ細胞レセプター検出用のテトラマーに関する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、取得の容易なＴリンパ球を抗原提示細胞として使用するＣＴＬの誘導方法が提供される。また、（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性の新規な抗原ペプチドが提供される。前記の抗原提示細胞、抗原ペプチドを使用して誘導されるＣＴＬは、例えばがんの治療において有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の第１の態様は、目的とする抗原をコードするＲＮＡを導入した自家Ｔリンパ球を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用することを特徴とする、該抗原認識性のＴリンパ球を誘導する方法に関する。
【００２４】
本発明には、当該抗原を特異的に認識する細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導が望まれる抗原（目的とする抗原）をコードするＲＮＡが使用される。前記抗原には特に限定はないが、例えば、腫瘍関連抗原、感染性微生物抗原が例示される。
【００２５】
腫瘍関連抗原としては、ＭＡＧＥファミリーのほか、ＳＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１、ｈＴＥＲＴ等があげられる。感染性微生物抗原としては、ＥＢＮＡ−３Ａ等のＥＢウイルス抗原、ＣＭＶｐｐ６５等のサイトメガロウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ＨＩＶウイルス抗原、Salmonella抗原、Shigella抗原、Enterobacter抗原、原虫や真菌由来の抗原などが挙げられる。
【００２６】
抗原をコードするＲＮＡは通常の遺伝子工学的手法により調製することが可能である。また、細胞から調製したＲＮＡも使用可能である。例えば、抗原をコードするＲＮＡを細胞より抽出してｃＤＮＡに逆転写し、このｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅しておけば、この増幅ＤＮＡをテンプレートにして転写したＲＮＡを本発明に使用することができる。ｃＤＮＡがクローニングされたプラスミドが得られている場合は、これをＲＮＡ合成のテンプレートとして使用可能である。このような手法により、少量の細胞からでも本発明に使用可能な十分量のＲＮＡを調製することが可能である。
【００２７】
抗原提示細胞として使用されるＴリンパ球に抗原をコードするＲＮＡを人為的に導入する方法には特に限定はなく、エレクトロポレーション（電気穿孔法）、パーティクルガン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、リポソーム法などの物理的方法で導入することができる。また、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いた遺伝子導入を行い、細胞内でＲＮＡを発現させることができる。
【００２８】
抗原提示細胞として使用されるＴリンパ球は患者自身のＣＤ３陽性細胞（自家Ｔリンパ球）、もしくは患者とＨＬＡのタイプが一致するドナー由来のＣＤ３陽性細胞であれば、ＣＤ４、ＣＤ８陽性いずれでも良いが、好ましくはＣＤ４陽性Ｔリンパ球である。なお、同種造血幹細胞移植等の移植を受けた患者では、移植片のドナーのＴリンパ球を使用することも可能である。Ｔリンパ球はフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）等のレクチンや抗ＣＤ３抗体を用いて、ＩＬ−２、ＩＬ−７などを添加した培地で活性化することが必要である。活性化に使用される条件は通常使用される条件であれば特に特定されない。抗原提示細胞として使用するために、ガンマ線照射やマイトマイシンなどの処理をされる。
【００２９】
上記の第１の態様のＴリンパ球を抗原提示細胞として使用し、抗原認識製Ｔリンパ球を誘導することができる（本発明の第３の態様）。誘導される抗原認識性Ｔリンパ球は、ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはＣＤ４陽性のヘルパーＴリンパ球のいずれかであるが、使用される出発材料によって異なり、例えば、血液から採取した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）や、ＰＢＭＣより抗ＣＤ８抗体と磁気ビーズを使用した方法で分離したＣＤ８陽性リンパ球が使用可能であり、ＰＢＭＣを使用すれば、抗原認識性ＣＴＬ及びヘルパーＴリンパ球の通常両者が混在したリンパ球が得られるが、ＣＤ８陽性細胞を使用すれば、ＣＴＬを含有するリンパ球が得られる。
【００３０】
イン  ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で該ＣＴＬを誘導する場合、例えば上記のＴリンパ球とＨＬＡのタイプが一致する生体よりの体外摘出試料を用い誘導することができる。本明細書における体外摘出試料とは、血液のほか、手術などにより摘出したリンパ節、脾臓、その他各種臓器が包含され、これらの試料に存在するリンパ球や浸潤リンパ球細胞が好適に使用される。
【００３１】
例えば血液を用いる場合、ＨＬＡタイプが一致するヒトの血液より調製した末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cells；以下、ＰＢＭＣと略す）より得られるリンパ球に、上記の抗原ＲＮＡを導入したＴリンパ球による抗原刺激を繰り返し与えることによりＣＴＬを誘導することができる。誘導されたＣＴＬは、クローン化することにより安定した細胞傷害性を有するリンパ球として維持することもできる。例えば、誘導されたＣＴＬにフィーダー細胞、抗原、各種サイトカイン、抗ＣＤ３抗体刺激を与えることにより増殖させることができる。
【００３２】
誘導された抗原特異的ＣＴＬの活性は、ＣＴＬを誘導した抗原由来のペプチドをパルスした後、放射性物質等で標識した標的細胞に対する傷害性（放射性物質の遊離）によって測定できる。また、抗原ペプチドをパルスした抗原提示細胞に対するＣＴＬの増殖反応を放射能の取り込みによって測定することも可能である。抗原ＤＮＡで形質導入、または抗原ＲＮＡを導入した標的細胞または抗原提示細胞として使用可能である。またはＣＴＬや標的細胞より抗原特異的に遊離される抗原特異的なＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ等サイトカイン量を測定することにより検出することができる。その他蛍光色素等によって標識された抗原ペプチド−ＨＬＡ複合体の使用によって直接確認することもできる。この場合、例えばＣＴＬをＣＴＬ特異的抗体とカップリングさせた第１蛍光マーカーと接触させてから第２蛍光マーカーとカップリングさせた抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体を接触させ、そして二重標識細胞の存在をＦＡＣＳ（fluorescence−activated cell sorting）分析によって行ことができる。
【００３３】
こうして、第１の態様のＴリンパ球を使用して誘導されたＣＴＬは、がんまたは感染症の治療剤として使用することができる（本発明の第４の態様）。当該治療剤は、後述の第６の態様の制がん剤に準じて製剤化し、治療に供することができる。
【００３４】
本発明の第２の態様は第１の態様のＴリンパ球を有効成分として含有してなる免疫誘導剤に関する。該免疫誘導剤は、該Ｔリンパ球を医薬的に許容される希釈剤に懸濁した形で提供される。なお、ここで言う希釈剤とは例えば該Ｔリンパ球の保存に適した培地、生理食塩水、又はリン酸緩衝生理食塩水である。培地としては、特に限定するものではないが、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ１０などの培地が一般的に挙げられる。また該免疫誘導剤には医薬的に許容される担体が安定化の目的で添加されていてもよい。なおここで言う担体とはヒト血清アルブミン等である。該免疫誘導剤には第１の態様のＴリンパ球を、Ｔリンパ球１種類当り１０４〜１０８個／ｍｌ、好ましくは５×１０５〜５×１０７個／ｍｌ含有させる。
【００３５】
前記の免疫誘導剤は前記Ｔリンパ球のドナーに対して（autologous）投与できるほか、ＨＬＡのタイプが一致する別の個体に（allogenic）投与することができる。上記免疫誘導剤をヒトに投与する場合、例えば皮下、皮内、静脈内へ注射器で投与することができ、成人１人当りの投与量としては通常Ｔリンパ球数が、Ｔリンパ球１種類当り１０６〜１０１０個となるようにする。なお上記範囲は目安でありこれに限定されるものではない。さらに、当該製剤の投与は所望の効果が得られるまで反復することができる。また有効成分であるＴリンパ球１種類当り１０６〜１０１０個となるようにする。なお上記範囲は目安でありこれに限定されるものではない。また、含有される細胞は、投与するヒト由来のもの、もしくはＨＬＡのタイプが同一であるため、該免疫誘導剤の毒性は特に認められない。
【００３６】
前記の免疫誘導剤が投与された個体においては、該免疫誘導剤に含有されるＴリンパ球に導入されたＲＮＡにコードされた抗原を認識するＣＴＬが誘導される。
【００３７】
本発明の第５の態様は、配列番号１または２で表されるＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドまたはその機能的誘導体とＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を認識するＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。配列番号１、２に示されるアミノ酸配列のペプチドはそれぞれＭＡＧＥ−Ａ４、ＳＡＧＥ由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドである。従って、前記ＣＴＬは標的細胞または抗原提示細胞に対して特異的に細胞溶解又はサイトカイン遊離反応等を起こす。
【００３８】
本明細書において、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチドの機能的誘導体とは、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体形成能を有すると共に、形成された複合体が配列番号１又は２で表される抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を認識するＣＴＬに認識されるものを意味する。例えば、配列番号１又は２で表されるペプチドのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が、欠失、他のアミノ酸若しくはアミノ酸アナログに置換、及び／又は１又は数個のアミノ酸若しくはアミノ酸アナログの付加、又はそれらの組み合わせによってアミノ酸配列は異なるが、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体形成能を有すると共に、形成された複合体が本発明のＣＴＬに認識されるペプチドである。機能的誘導体のアミノ酸配列長は、９〜１０残基が好ましいが、これに特に限定されない。なお、本明細書におけるアミノ酸アナログとは、種々のアミノ酸のＮ−アシル化物、Ｏ−アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等を意味する。
【００３９】
また、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体がＣＴＬに認識されれば、抗原ペプチドのＮ末端や遊離のアミノ基は、ホルミル基、アセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）基等が結合していてもよい。また、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体がＣＴＬに認識されれば、抗原ペプチドのＣ末端や遊離のカルボキシル基は、メチル基、エチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基等が結合していてもよい。
【００４０】
機能的誘導体は、配列番号１又は２で表される抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を認識するＣＴＬを用いることにより同定することが出来、例えば、下記方法が挙げられる。
【００４１】
第１の方法は、機能的誘導体としての候補物質とＨＬＡ−Ａ２４発現細胞を混合し、ＨＬＡ−Ａ２４分子に未結合の候補物質を洗浄後、ＣＴＬと反応させる。候補物質特異的な、細胞傷害性、サイトカイン遊離、又は増殖反応が認められれば機能的誘導体であると判断出来る。
【００４２】
第２の方法としては、候補物質を抗原提示能を有する細胞に添加し、適当な時間、例えば、抗原が細胞内に取り込まれプロセッシングを受け、抗原ペプチドとＨＬＡ分子複合体が細胞表面に提示されるために要する時間、反応させた後、ＣＴＬと反応させる。候補物質特異的なサイトカイン遊離又は増殖反応が認められれば、該物質は機能的誘導体であると判断出来る。
【００４３】
第３の方法としては、後述の抗原提示能を有する細胞上のＨＬＡ−Ａ２４分子上にペプチドを提示させることが可能な発現ベクターに候補物質のアミノ酸配列をコードする核酸を結合させ、該組換えベクターにより形質転換された抗原提示能を有する細胞とＣＴＬを反応させる。候補物質特異的なサイトカイン遊離又は増殖反応が認められれば、該物質は機能的誘導体であると判断出来る。
【００４４】
上記機能的誘導体としては、例えば、配列番号１又は２で表されるペプチドのアミノ酸配列において、ＨＬＡ−Ａ２４分子への結合を強めるために、Ｎ末端より２番目のアミノ酸がＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプチドに特徴的なＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐより選択されるアミノ酸に置換、及び／又はＣ末端のアミノ酸がＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプチドに特徴的なＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅより選択されるアミノ酸に置換されたペプチドのうち、ＨＬＡ−Ａ２４分子との結合能を有し、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体が配列番号１又は２記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体をＣＴＬに認識されるペプチドが挙げられる。例えば、配列番号２記載のアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸であるＰｈｅをＬｅｕに置換したペプチドが挙げられる。
【００４５】
また、配列番号１又は２記載のアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列で表されるペプチドにおいて、置換されるそれぞれのアミノ酸と側鎖の類似したアミノ酸若しくはアミノ酸アナログに置換したペプチドのうち、ＨＬＡ−Ａ２４分子と結合能を有し、ＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体が本発明のＣＴＬに認識されるペプチドも挙げられる。側鎖の類似したアミノ酸としては、例えば、グリシン（Ｇｌｙ）とアラニン（Ａｌａ）；バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とメチオニン（Ｍｅｔ）；アスパラギン（Ａｓｎ）とグルタミン（Ｇｌｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）とグルタミン酸（Ｇｌｕ）；セリン（Ｓｅｒ）とスレオニン（Ｔｈｒ）；リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）とチロシン（Ｔｙｒ）が挙げられる。
【００４６】
本発明の第６の態様は、第５の態様のＣＴＬを有効成分として含有する制がん剤に関する。
【００４７】
該制がん剤は、特に第５の態様のＣＴＬが認識する抗原、すなわちＭＡＧＥ−４またはＳＡＧＥの発現が認められるがんの治療に有用である。
【００４８】
該制がん剤は、前記のＣＴＬを医薬的に許容される希釈剤に懸濁した形で提供される。なお、ここで言う希釈剤とは例えば該ＣＴＬの保存に適した培地、生理食塩水、又はリン酸緩衝生理食塩水である。培地としては、特に限定するものではないが、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ１０などの培地が一般的に挙げられる。また該制がん剤には医薬的に許容される担体が安定化の目的で添加されていてもよい。なおここで言う担体とはヒト血清アルブミン等である。該制がん剤には第５の態様のＣＴＬを、ＣＴＬ１種類当り１０４〜１０８個／ｍｌ、好ましくは５×１０５〜５×１０７個／ｍｌ含有させる。
【００４９】
上記制がん剤をヒトに投与する場合注射器で投与することができ、成人１人当りの投与量としては通常ＣＴＬ数が、ＣＴＬ１種類当り１０６〜１０１０個となるようにする。なお、上記範囲は目安でありこれに限定されるものではない。また、有効成分であるＣＴＬは投与するヒト由来のもの、もしくはＨＬＡのタイプが同一であるため、該免疫誘導剤の毒性は特に認められない。
【００５０】
本発明の第７の態様は、配列番号１または２の抗原ペプチドまたはその機能的誘導体を有効成分として含有する第５の態様のＣＴＬの誘導剤に関する。ＣＴＬ誘導剤は、抗原ペプチドを単独、又は他の分子（ヘルパーＴ細胞抗原ペプチド及び／又はアジュバント）との混合物として生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水に懸濁した形で供給される。該抗原ペプチドは、高級脂肪酸やヘルパーＴ細胞抗原ペプチドとの共有結合体あるいはＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体としてもよい。該誘導剤には抗原ペプチドを、抗原ペプチド１種類当り０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜９５重量％含有させる。
【００５１】
該ＣＴＬ誘導剤は、イン  ビトロで本発明のＣＴＬを増殖させるための培地への添加物、Ｔリンパ球増殖活性、遅延型皮膚反応を指標とした免疫感作状態の診断などに利用することができる。例えば培地への添加物として使用する場合、使用量は培地中のペプチド濃度として、抗原ペプチド１種類当り１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌである。培地としては血清を含有するＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖなどの培地が一般的に挙げられる。
【００５２】
本発明の第８の態様は、配列番号１または２の抗原ペプチドまたはその機能的誘導体を有効成分から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを含有する制がん剤に関する。該制がん剤は、１）抗原ペプチドを単独、２）抗原ペプチドと医薬的に許容される担体及び／又は希釈剤との混合物、又は３）更に必要ならば上記１）若しくは２）に補助剤を加えた形で提供される。なおここで言う担体とは例えば、ヒト血清アルブミンであり、また希釈剤とは例えばリン酸緩衝液、蒸留水、生理食塩水等である。また補助剤とは薬学的に許容されるアジュバント等が挙げられる。アジュバントとしては、（ａ）フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュバント、（ｂ）フロイント不完全アジュバント、（ｃ）水酸化アルミニウム、みょうばん等の無機物ゲル、（ｄ）リゾレシチン、ジメチルオクタデシルアンモニウムブロミド等の界面活性剤、（ｅ）硫酸デキストラン、ポリＩＣ等のポリアニオン、（ｆ）ムラミルペプチド、タフトシン等のペプチド、（ｇ）リビ（Ｒｉｂｉ）社製のモノホスホリルリピド（monophosphoryl lipid；ＭＰＬ）Ａ等があるが、特に限定されない。該制がん剤をヒトに投与する場合、例えば皮下、皮内、静脈内へ注射器で投与することもできるし、噴霧等の方法で粘膜からの経皮吸収等で投与してもよい。該制がん剤には抗原ペプチドを、抗原ペプチド１種類当り０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜９５重量％含有させる。成人１人当りの投与量はペプチド濃度として、抗原ペプチド１種類当り０．１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、更に好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇである。なおヒトに投与した場合、該ペプチドの毒性は特に認められない。
【００５３】
本発明の第９の態様は、配列番号１又は２で表されるヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）−Ａ２４拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体を含有する、第５の態様の細胞傷害性Ｔリンパ球の有するＴＣＲに結合するテトラマーに関する。該テトラマーはβ２ミクログロブリン存在下で作製したＨＬＡ−Ａ２４分子と抗原ペプチドの複合体をビオチン−ストレプトアビジン法で４量体化したものであり、ＣＴＬの細胞傷害性測定の代わりに短時間で測定できる簡便な活性測定法として有用である。特に、ＰＢＭＣ等のＣＴＬが微量しか含有されない検体中のＣＴＬの検出やＣＴＬの分離に有用である。
【００５４】
患者の体内におけるＴリンパ球のモニタリングのために使用されるELISPOT（Enzyme-linked Immunospot）や細胞傷害性試験の標的細胞に使用可能である。
テトラマーは細胞傷害性Ｔリンパ球のモニタリングに有用である。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５６】
実施例１  ＨＬＡ−Ａ２４０２トランスジェニックマウスを使用したＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）の同定
（１）材料と方法
ＨＨＤＡ２４０２＋／−  β２ｍ−／−  ｍｉｃｅ
ＨＬＡ−Ａ２４０２のリーダー配列、ヒトβ２  ミクログロブリン、ＨＬＡ−Ａ２４０２  α１およびα２ドメイン、Ｈ−２Ｄｂ  α３のトランスメンブレンドメイン、および細胞質ドメインからなるＤＮＡコンストラクト（ＨＨＤＡ２４０２）を構築し、これを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビロジェン社製）にクローニングした。ＨＨＤＡ２４０２の４−ｋｂのＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片を妊娠Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の卵子に注入した。ＨＨＤＡ２４０２発現マウスをβ２ｍ−／−  ｍｉｃｅ（Jackson Laboratory, Bar Harbor、ME）と交配させ、得られるＨＨＤＡ２４０２  ＋／−β２ｍ  ＋／−をβ２ｍ−／−マウスと交配させ、ＨＨＤＡ２４０２＋／−  β２ｍ−／−マウス（以下、ＨＨＤＡ２４０２マウス）を作製した。
【００５７】
（２）細胞株
ＴＡＰトランスポーター欠損株Ｔ２にＨＬＡ−Ａ２４０２ｃＤＮＡをトランスフェクトしてＴ２Ａ２４株を作製した。その他以下の細胞株を使用した。乳癌細胞株Ｒ２７（Ａ２４０２陰性）、食道癌株ＫＥ−４（Ａ２４０２陽性）、同ＴＥ−１０（Ａ２４０２陽性）、慢性骨髄性白血病株Ｋ５６２（Ａ２４０２陰性）、肺癌株１１−１８（Ａ２４０２陽性）、胎児性腎細胞２９３（Ａ２４０２陰性）。Ｒ２７Ａ２４４、Ｋ５６２Ａ２４、２９３Ａ２４はＨＬＡ−Ａ２４０２ｃＤＮＡをトランスフェクトして作製した。ヒトＢ−リンパ芽球（ＬＣＬ）はＨＬＡ−Ａ２４０２陽性または陰性のボランティア由来の細胞よりＥＢＶウイルスを用いて常法により作製した。
【００５８】
（３）プラスミド
全長のＭＡＧＥ−Ａ４、ＳＡＧＥ、ＥＢＮＡ−３ＡのｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。
【００５９】
（４）遺伝子銃による免疫
ＨＨＤＡ２４０２マウス（６〜８週齢、雌）の腹壁内にプラスミドＤＮＡをコートした金粒子をHelios Gene Gun System（Bio-Rad）を用いてヘリウム加圧３５０〜４００ｐｓｉで投与した。なお、金粒子は製造元のマニュアルに従って調製した。２週後にブースターの投与を行い、その１週後に脾細胞を採取した。
【００６０】
（５）マウスＣＤ８陽性Ｔ細胞の調製
最終免疫後１週目に、ＣＤ８  ａｌｐｈａ（Ｌｙｔ２）マイクロビーズを用いたMACS system（Miltenyi Biotec, Germany）により、ＣＤ８陽性細胞をポジティブセレクションした。得られたＴ細胞画分はフローサイトメトリー分析で９５％以上の純度であった。
【００６１】
（６）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（マウス）
９６ウェルのニトロセルロースELISPOTプレート（MAHA S4510; Millipore, Bedford, MA）を２μｇ／ｍｌのanti-mouse IFN-gamma mAb（clone R4-6A2, PharMingen）で４℃にて一夜コートした。各ウェルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、ＦＣＳ入り培地でブロッキングした（３７℃、２時間）。免疫マウス由来の分離した新鮮ＣＤ８陽性細胞（１×１０５／ｗｅｌｌ）および各種ペプチドパルスしたＣＤ８陰性細胞（１×１０６／ｗｅｌｌ）を各ウェルに撒き、最終液量が２００μｌになるようにした。３７℃で２２時間培養後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０入りＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で十分に洗浄し、１．２５μｇ／ｍｌ  biotinylated anti-mouse IFN-gamma mAb（PharMingen）を加え、４℃で一夜培養した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、１μｇ／ｍｌ  streptavidin-alkaline phosphatase conjugate（Mabtech）を１００μｌ加え、室温で９０分反応、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、alkaline phosphatase conjugate substrate kit（BioRad, Hercules, CA）で染色した。そして、蒸留水で洗浄し反応を停止、その後プレートを乾燥、スポットをカウントした。
【００６２】
（７）エピトープペプチドの推定
ＨＬＡ−Ａ２４０２結合能を持つ可能性のある９残基ペプチドを、BioInformatics & Molecular Analysis Section（BIMAS） HLA Peptide Binding Predictionウェブサイト（ＵＲＬ；http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla-bind/）で検索した。下記表１記載のＳＡＧＥ由来の５個のペプチド、ＭＡＧＥ−Ａ４由来の１０ペプチドを選び、ペプチド合成機により化学合成した。その他、ＥＢウイルス由来のEBNA3A246-254（RYSIFFDYM）およびHER2由来のHER263-71（TYLPTNASL）を合成した。使用したペプチドの純度は９０％以上である。
【００６３】
【表１】
2006101735.tif 000002
【００６４】
ＥＢウイルス由来のＥＢＮＡ３Ａ遺伝子をコードする発現プラスミドを遺伝子銃でＨＨＤＡ２４０２マウスに免疫した。２回免疫後、脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を調製し、上記EBNA3A246-254ペプチドでパルスしたＣＤ８陰性細胞を標的細胞として使用してＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。その結果、EBNA3A246-254ペプチド特異的ＣＴＬが検出された（図１ａ）。次に、腫瘍・精巣抗原であるＭＡＧＥ−Ａ４、ＳＡＧＥ由来の候補ペプチド（上記表１）について同様にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。その結果、ＭＧＥ−Ａ４では２つのペプチド（MAGE-A4239-247 and MAGE-A4143-151）が陽性であった（図１ｂ）。同様にＳＡＧＥでも２つのペプチド（SAGE776-784 and SAGE715-723）が陽性であった（図１ｃ）。次に、野生型のＣ５７ＢＬ６マウスを上記と同様の実験を行ったところ、MAGE-A4239-247とSAGE776-784のみが陽性であった。従って、MAGE-A4143-151とSAGE715-723が、ＨＬＡ−Ａ２４０２に提示される抗原ペプチドであると同定された。
【００６５】
実施例２  ｍＲＮＡを導入したＣＤ４陽性ＰＨＡ幼芽細胞を使用したＨＬＡ−２４０２抗原ペプチド特異的ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の調製
（１）ｍＲＮＡの調製
ＭＡＧＥ−Ａ４及びＳＡＧＥプラスミドを直鎖にした。インビトロ転写はＴ７ポリメラ−ゼ（mMESSAGE mMACHINE T7 Kit; Ambion, Austin, TX）を使用して製造元のマニュアルに従って行った。その後、ポリＡポリメラーゼ（Poly(A) Tailing Kit; Ambion, Austin, TX）を使用して製造元のマニュアルに従ってポリアデニル化した。得られたＲＮＡを水に懸濁し、−８０℃で使用前まで保存した。
【００６６】
（２）ＣＤ４陽性フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）幼芽細胞の調製
ＭＡＣＳ  ＣＤ４マイクロビーズ（Miltenyi Biotec, Germany）を用いたポジティブ選択によって分離して得られた新鮮なＣＤ４陽性細胞を、２４ウェルプレート（Corning, NY）に１ウェル当り１〜２×１０６個／ｍｌ  ＲＰＭＩ−１６４０培地（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１０％非働化ヒトＡＢ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン）の細胞濃度で植えた。Day 0に１０μｇ／ｍｌのＰＨＡ（HA15, Murex, UK）を培地に添加した。Day 3に培地の半量をＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）及びＩＬ−７（４０ｎｇ／ｍｌ）を含む完全培地に交換した。同じ操作を３日ごとに繰り返した。得られた活性化ＣＤ４陽性細胞を培養後１４〜２８日目にエレクトロポレーションを行い、抗原提示細胞として使用した。
【００６７】
（３）ｍＲＮＡ導入ＣＤ４陽性幼芽細胞を用いたIn vitroでのヒトＣＴＬ誘導
ＰＢＭＣよりMACS CD8 Microbeads（Miltenyi Biotec）を用いて分離したＣＤ８＋Ｔ細胞５×１０５個を、１×１０５個の放射線（３０Ｇｙ）照射したｍＲＮＡ導入ＣＤ４＋ＰＨＡ幼芽細胞で、９６ウェル丸底プレート（Nunc）中で刺激した。7日後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を１×１０５個の放射線（３０Ｇｙ）照射したｍＲＮＡ導入ＣＤ４＋ＰＨＡ幼芽細胞で再刺激し、さらにＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍ）入り培地で７日間培養した。
【００６８】
（４）ＣＴＬのインビトロ増幅
抗原特異的ＣＴＬを含有する、感作ＣＤ８＋Ｔ細胞を増幅するために、標的抗原ｍＲＮＡをエレクトロポレーションで導入した自己ＬＣＬ（５×１０６個）、自己ＰＢＭＣ（２．５×１０７個）とＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）を加え、抗ＣＤ３抗体なしで２５ｍｌフラスコ（Corning）で培養した。
【００６９】
（５）限界希釈
９６ウェル丸底プレート（Nunc）に０．３個／ウェルとなるように希釈し、自家ＰＢＭＣ（５×１０４個／ウェル）、放射線照射ＬＣＬ（１×１０４個／ウェル）、ＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）、および抗ＣＤ３ｍＡｂ（３０ｎｇ／ｍｌ）を加えて培養した。標的である抗原提示細胞を溶解するＣＤ８＋Ｔ細胞はさらに放射線照射ＰＢＭＣ、放射線照射ＬＣＬおよび抗ＣＤ３ｍＡｂ存在下で増幅した。
【００７０】
（６）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ヒト）
９６ウェルのニトロセルロースELISPOTプレート（MAHA S4510; Millipore, Bedford, MA）を２μｇ／ｍｌ  antihuman IFN-γ mAb（1-D1K）で４℃にて一夜コートした。各ウェルをＰＢＳで洗浄後、１０％ヒトＡＢ血清入り培地でブロッキングした（３７℃、２時間）。エフェクター細胞（２×１０４／ｗｅｌｌ）およびペプチドパルスしたＴ２Ａ２４細胞（５×１０４／ｗｅｌｌ）を各ウェルに撒いた。３７℃で１８時間培養後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄し、１．２５μｇ／ｍｌ  biotinylated anti-mouse IFN-gamma mAb（PharMingen）を加え、４℃で一夜培養した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、１μｇ／ｍｌ  streptavidin-alkaline phosphatase conjugate（Mabtech）を１００μｌ加え、室温で６０分反応、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、alkaline phosphatase conjugate substrate kit（BioRad, Hercules, CA）で染色した。そして、蒸留水で洗浄し反応を停止、その後プレートを乾燥、スポット数をカウントした。
【００７１】
（７）５１Ｃｒ遊離細胞傷害性アッセイ
細胞傷害性は常法に従って行った。標的細胞は１００μＣｉ（３．７×１０６Ｂｑ）  ５１Ｃｒで標識し、１×１０４個を９６ウェルのＶ底プレート（Nunc）で細胞数を変えたエフェクター細胞と３７℃で反応させた。５時間後、１００μｌの上清を集め、測定した。アッセイは３連で行い、３ウェルの特異的溶解％の平均を計算した。
特異的細胞傷害活性（％）＝〔（各ウェルの測定値−最小放出値）／（最大放出値−最小放出値）〕×１００
上式において、最小放出値は標的細胞及びＫ５６２細胞のみ入っているウェルの５１Ｃｒ量であり、標的細胞からの５１Ｃｒの自然遊離量を示す。また、最大放出値は、標的細胞に界面活性剤トリトンＸ−１００を加えて細胞を破壊した際の５１Ｃｒ遊離量を示している。
【００７２】
健常人より調製したＣＤ８＋細胞をインビトロでｍＲＮＡ導入した自家ＣＤ４＋ＰＨＡ幼芽細胞で感作した。ＭＡＧＥ−Ａ４  ｍＲＮＡを導入した自家ＣＤ４＋ＰＨＡ幼芽細胞で２回刺激後に、ＭＡＧＥ−Ａ４特異的バルクＣＴＬが得られた（図２ａ）。このバルク細胞をｍＲＮＡ導入自家ＬＣＬ、自家ＰＢＭＣ及びＩＬ−２で増幅して得られた細胞は、MAGE-A4143-151ペプチドをパルスしたＴ２Ａ２４細胞に特異的な反応を示した（図２ｂ）。限界希釈法に得られた＃２−２８細胞は、MAGE-A4143-151テトラマーによって陽性に染色されたが、対象として使用したテトラマーでは染色されなかった（図３ａ）。そして、この＃２−２８細胞は、MAGE-A4143-151ペプチドをパルスした標的細胞にＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性に細胞傷害性を示した（図３ｂ左）。さらに、この２−２８細胞はＭＡＧＥ−Ａ４およびＨＬＡ−Ａ２４０２の両者を発現する腫瘍細胞株に対して細胞傷害性を示した（図３ｂ右）。このことからMAGE-A4143-151ペプチドは、ｍＲＮＡ導入ＣＤ４＋ＰＨＡ幼芽細胞だけでなくＨＬＡ−２４０２陽性の腫瘍細胞でもＭＡＧＥ−Ａ４抗原が細胞内でプロセスされ抗原提示されることを示している。
【００７３】
次に、SAGE715-723特異的バルクＣＴＬがｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ＳＡＧＥ  ｍＲＮＡを導入したＣＤ４＋幼芽細胞で２回刺激により誘導された（図４ａ）。フローサイトメトリー分析により、このバルクＣＴＬがSAGE715-723 ＨＬＡ−Ａ２４テトラマー陽性のＣＤ８＋細胞を含有していることが明らかとなった（図４ｂ）。SAGE715-723特異的ＨＬＡ−Ａ２４  ＣＴＬ細胞＃２２を限界希釈法により作製した。この＃２２細胞はSAGE715-723 HLA-A24テトラマー陽性であった（図５ａ）。この細胞はＳＡＧＥ遺伝子全長をコードするプラスミドで遺伝子導入した２９３−Ａ２４０２と共培養するとＩＦＮ−γを分泌した（図５ｂ）。この細胞は、Ｋ５６２Ａ２４及びＲ２７Ａ２４（両者ともＨＬＡ−Ａ２４０２とＳＡＧＥを発現する）いずれにも細胞傷害性を示した（図５ｃ左及び中）。さらにＳＡＧＥ遺伝子のｍＲＮＡを導入したA2402+LCL細胞に対して特異的な細胞傷害性を示した(図５ｃ右)。
【００７４】
実施例３  SAGE715-723特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞はＡ２４０２陽性健常人から高い確率で誘導される。
in vitroでのペプチドをパルスしたＣＤ８−のＰＢＭＣを用いたヒトＣＴＬの誘導
１×１０７個のＣＤ８陰性ＰＢＭＣに１０μＭのペプチドで室温で１時間、３７℃で５％ＣＯ２で１時間パルスした後、抗原提示細胞として使用した。次に、分離した５×１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞に対して、ペプチドをパルスした１×１０６個のＣＤ８−ＰＢＭＣで１０〜１２日間刺激した。１、４、７日目に、培地を半量交換し、ヒトＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−７（５０ｎｇ／ｍｌ）を追加した。誘導は２４ウェル（Nunc）プレートで２００μｌのＲＰＭＩ培地（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１０％非働化ヒトＡＢ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン）で行った。
【００７５】
ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性SAGE715-723特異的ＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２４０２陽性の健常人ボランティアにおいて、SAGE715-723ペプチドをパルスしたＣＤ８陰性のＰＢＭＣでin vitroで一回ＣＤ８＋細胞を刺激することによって誘導されるかを検討した。６人のＨＬＡ−Ａ２４０２＋健常人のうち３人において、in vitroでの混合リンパ球反応１０日後にSAGE715-723ＨＬＡ−Ａ２４テトラマー陽性Ｔ細胞が検出された。図６にその一例の解析結果を示す。
【００７６】
実施例４ テトラマー作製及びフローサイトメトリー分析 
ＭＨＣ−ペプチドテトラマーの作製は、ＨＬＡ−Ａ２４０２重鎖とβ２−ミクログロブリンは不溶性重合体として大腸菌で発現させた。重鎖のＣ末端は、ビオチン化酵素BirAの基質となる配列を付加した。モノマーのＨＬＡ／β２−ミクログロブリン／ペプチド複合体は、in vitroでMAGE-A4143-151ペプチドまたはSAGE715-723の存在下にフォールディングさせた。ＭＨＣはBirA酵素組換え体（Avidity, Denver, CO, USA）でビオチン化され、phycoerythrin-labelled streptavidin（Molecular Probes, Eugene, OR, USA）を使用して４量体化された。
【００７７】
染色においては、感作ＣＤ８＋Ｔ細胞をテトラマー２０μｇ／ｍｌで３７℃で３０分反応させ、その後、Tricolor anti-CD8 monoclonal antibody（Caltag, Burlingame, CA, USA）と氷上で１５分間反応させた。洗浄後、染色した細胞はフローサイトメトリー（FACSCalibur; Becton Dickinson）で分析した。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ＨＨＤＡ２４０２＋／−β２ｍ−／−  マウスにおけるペプチドの免疫原性を示す図である。  （ａ）ＥＢＮＡ３ＡｃＤＮＡ、（ｂ）ＭＡＧＥ−Ａ４ｃＤＮＡおよび（ｃ）ＳＡＧＥｃＤＮＡのプラスミドを用いて遺伝子銃で免疫したマウスから調製した脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す図である。
【００７９】
【図２】ＭＡＧＥ−Ａ４由来ペプチドのヒトにおける免疫原性を示す図である。  （ａ）ＭＡＧＥ−Ａ４またはＳＡＧＥのｍＲＮＡを導入した自家ＣＤ４＋ＰＨＡ幼芽細胞で２回感作したヒトのバルクＣＴＬのＩＦＮ−γ  ELISPOTアッセイの結果を示す図である。ＭＡＧＥ−Ａ４またはＳＡＧＥのｍＲＮＡを導入した自家ＬＣＬをＡＰＣとして使用した。  （ｂ）ウェル＃２をＭＡＧＥ−Ａ４またはＳＡＧＥのｍＲＮＡを導入した自家ＬＣＬ、自家ＰＢＭＣとＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）で増幅した結果を示す図である。得られた細胞を候補ペプチドをパルスしたＴ２Ａ２４をＡＰＣとして使用してELISPOTアッセイを行った。
【００８０】
【図３】MAGE-A4143-151ペプチドの細胞内でプロセス後にＨＬＡ−Ａ２４０２と共に細胞表面へ提示した結果を示す図である。  （aの左）MAGE-A4143-151特異的ＣＴＬ＃２−２８細胞はMAGE-A4143-151A24テトラマー染色で陽性であり、（aの右）対照テトラマーでは陰性であった。（ｂの左）この＃２−２８細胞はＨＬＡ−Ａ２４０２依存性にMAGE-A4143-151特異的な細胞傷害性を示し、また、（ｂの右）ＨＬＡ−Ａ２４０２とＭＡＧＥ−Ａ４を発現する腫瘍細胞株で細胞内でプロセスされたMAGE-A4143-151ペプチドを認識した。
【００８１】
【図４】SAGE715-723ペプチドのヒトにおける免疫原性を示す図である。  （ａ）ＳＡＧＥ  ｍＲＮＡ導入自家ＣＤ４＋ＰＨＡ幼芽細胞で２回感作して得られたヒトバルクＣＴＬ細胞を用いたＩＦＮ−γ ELISPOTアッセイの結果を示す図である。標的細胞としては、SAGE715-723ペプチドをパルスした、または対照ペプチドをパルスしたＴ２Ａ２４細胞を使用した。  （ｂ）ウェル＃２のバルクＣＴＬを拡大培養した結果を示す図である。得られたＣＴＬはSAGE715-723A24テトラマー染色で陽性であった。  （ｃ）SAGE715-723ペプチドをパルスしたＴ２Ａ２４を標的細胞として使用した場合だけにＩＦＮ−γを遊離した。
【００８２】
【図５】SAGE715-723ペプチドの細胞内プロセス後のＨＬＡ−Ａ２４０２と共に細胞表面へ提示した結果を示す図である。  （ａ）SAGE715-723特異的バルクＣＴＬから得られたSAGE715-723特異的ＣＴＬ＃２２細胞は、SAGE715-723A24テトラマー染色で陽性であった。  （ｂ）この＃２２細胞（１×１０４個）と、ＳＡＧＥ  ｃＤＮＡ形質転換２９３Ａ２４細胞（１×１０４個）を９６ウェル丸底プレートで１８時間培養したところ、ＩＦＮ−γが遊離された。  （ｃ）この＃２２細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４０２およびＳＡＧＥを発現するＫ５６２Ａ２４とＲ２７Ａ２４に細胞傷害性を示した（ｃの左と中）。また、ＳＡＧＥ  ｍＲＮＡを導入したＡ２４０２陽性のＬＣＬに対しても特異的細胞傷害性を示した（ｃの右）。
【００８３】
【図６】健常人ＰＢＭＣの中のSAGE715-723特異的プレカーサーを検出した結果を示す図である。  各ウェルに５×１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞を入れ、これをSAGE715-723ペプチドをパルスしたＣＤ８−ＰＢＭＣで感作した。１０日目に、テトラマーアッセイを行ったところ、試験した６人中３人でSAGE715-723A24テトラマー陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞が検出された。図６はその一例の解析結果である。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の抗原認識Ｔリンパ球の誘導方法は、ＨＬＡに関係なく、抗腫瘍性または抗感染性微生物抗原に対する特異的Ｔリンパ球を誘導できることから、誘導した特異的Ｔリンパ球は、がんまたは感染症に対する免疫療法における治療剤として有用である。また、腫瘍関連抗原であるＭＡＧＥ−Ａ４またはＳＡＧＥに特異的なＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびその認識する抗原ペプチドは免疫療法における制がん剤として有用である。さらに、該抗原ペプチドを使用したＭＨＣ−抗原ペプチド複合体テトラマーは、調製したＣＴＬの機能測定やＣＴＬ投与後のモニタリングに有用である。
【図１】
2006101735.tif 000003
【図２】
2006101735.tif 000004
【図３】
2006101735.tif 000005
【図４】
2006101735.tif 000006
【図５】
2006101735.tif 000007
【図６】
2006101735.tif 000008
【配列表】
2006101735000001.app