(57)【要約】【課題】生体内リガンドとＧＰＲ８３との相互作用を変化させる化合物をスクリーニングする方法の提供。【解決手段】長鎖脂肪酸および／または被検物質を、ＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分と接触させる工程を含んでなる、長鎖脂肪酸とＧＰＲ８３との相互作用を変化させる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
長鎖脂肪酸および／または被検物質を、ＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分と接触させる工程を含んでなる、長鎖脂肪酸とＧＰＲ８３との相互作用を変化させる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
【請求項２】
被検物質存在下および被検物質非存在下において、ＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を長鎖脂肪酸と接触させ、次いで、ＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分への長鎖脂肪酸の結合量を測定する工程を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被検物質非存在下における、ＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分への長鎖脂肪酸の結合量に対して、被検物質存在下における前記結合量が低下する場合に、その化合物をＧＰＲ８３アゴニストあるいはＧＰＲ８３アンタゴニストと決定する工程を更に含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
被検物質存在下および被検物質非存在下において、ＧＰＲ８３またはＧＲＰ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を長鎖脂肪酸と接触させ、次いで、細胞刺激活性を測定する工程を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
被検化合物が細胞刺激活性を有する場合にその化合物をＧＰＲ８３アゴニストと決定する工程を更に含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
被検化合物が細胞刺激活性を有さない場合にその化合物をＧＰＲ８３アンタゴニストと決定する工程を更に含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
被検物質存在下および被検物質非存在下において、ＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を長鎖脂肪酸と接触させ、次いで、ＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分への長鎖脂肪酸の結合量を測定し、長鎖脂肪酸のＧＰＲ８３への結合性を変化させる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を決定する工程と、
前記工程において決定された化合物の存在下および非存在下において、ＧＰＲ８３またはＧＲＰ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を長鎖脂肪酸と接触させ、次いで、細胞刺激活性を測定し、ＧＰＲ８３の活性化に影響を与える化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を決定する工程
とを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
被検化合物が細胞刺激活性を有する場合にその化合物をＧＰＲ８３アゴニストと決定する工程を更に含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
被検化合物が細胞刺激活性を有さない場合にその化合物をＧＰＲ８３アンタゴニストと決定する工程を更に含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
長鎖脂肪酸が標識されている、請求項２、３、７、８、または９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞刺激活性が、細胞内アデニル酸シクラーゼ活性またはＣａ２＋濃度の上昇活性である、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
長鎖脂肪酸がアラキドン酸またはγ−リノレン酸である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＧＰＲ８３が、（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、または（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ポリペプチドからなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
改変ポリペプチドが、配列番号４または６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその部分ポリペプチドである、請求項１３に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
長鎖脂肪酸と、ＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分とを少なくとも含んでなる、スクリーニング用キット。
【請求項１６】
長鎖脂肪酸が標識されている、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
長鎖脂肪酸がアラキドン酸またはγ−リノレン酸である、請求項１５または１６に記載のキット。
【請求項１８】
ＧＰＲ８３が、（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、または（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ポリペプチドからなる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
改変ポリペプチドが、配列番号４または６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその部分ポリペプチドである、請求項１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長鎖脂肪酸とＧＰＲ８３との相互作用を変化させる化合物をスクリーニングするための方法、およびそれらのスクリーニング用キットなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＰＲ８３はマウスのＷＥＨＩ−７ＴＧ細胞株にグルココルチコイドを作用させ、誘導される遺伝子として同定されたＧＰＣＲである（非特許文献１、非特許文献２）。引き続きヒトおよびラットでもオーソログ遺伝子がクローニングされ（特許文献１〜７、非特許文献３、非特許文献４）、３種類あるタキキニン（Ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ）レセプター（ＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３）に最も高い相同性を示すものの、それらのリガンドとは反応せず、リガンド未知のオーファンＧＰＣＲであると分類されている。しかし、近年、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−ＰＯ４）がＧＰＲ８３を活性化することが報告された（特許文献８）。
【０００３】
ＧＰＲ８３は、ヒト、マウスおよびラットに共通して脳および脊髄に高い発現を示す(非特許文献３、非特許文献５、非特許文献６)。脳では、海馬や扁桃体を含む大脳辺縁系、線条体、視床下部、脊髄に発現しており、このレセプターが、記憶、認知、ストレス、不安、報酬、情緒調節および神経内分泌調節に関わる可能性を示す。脳におけるＧＰＲ８３は、精神刺激薬のアンフェタミンで発現が上昇することからも、うつ、不安に関連する可能性が示唆されている (非特許文献６)。また、ＧＰＲ８３の脳内での発現部位が、グルココルチコイド  ｔｙｐｅＩＩレセプターの発現部位と非常に重なっていることから、グルココルチコイドの中枢作用である睡眠および情緒調節に関与している可能性が考えられる。そこで、ＧＰＲ８３の生体内リガンドを用いたより詳細な機能解明が課題となっている。
【０００４】
脂肪酸は、鎖式炭化水素から水素が１個とれた鎖式炭化水素基に、１個のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）が結合したものである。脂肪酸は、グリセリドや複合脂質を含むほとんどすべての脂質の疎水性残基として広く存在し、天然の脂肪酸は大部分が直鎖で、偶数の炭素数をもつ１塩基酸であるが、炭素数が奇数のもの、分岐鎖をもつものもある。天然の脂肪酸は、直鎖の飽和あるいは不飽和脂肪酸に分けられ、不飽和脂肪酸は二重結合の数によってモノ、ジ、トリ、テトラエン酸などに分けられる。長鎖脂肪酸は、生体膜の構成成分としての役割、エネルギー源としての役割、および生理活性シグナル分子としての役割と生命現象に重要な３つの役割を果たしている。
【０００５】
γ−リノレン酸およびアラキドン酸は、生体内で生産されない必須脂肪酸のうち、メチル基から数えて６番目の炭素から不飽和結合が始まるオメガ−６系の多価不飽和脂肪酸に所属する脂肪酸である。オメガ−６系の多価不飽和脂肪酸は、主としてリノール酸として摂取され、生体内では、リノール酸、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸の順に代謝される。さらにアラキドン酸からはエイコサノイドと総称され、産生カスケードによってプロスタグランジン類、ロイコトリエン類、トロンボキサン類と分類される様々な脂質メディエーターが合成される。これらの生理活性は、細胞の分化・増殖、代謝制御、および神経系の活動など多岐にわたっているが、その作用メカニズムには不明な部分が多く残されている。
【０００６】
ＧＰＲ４０のリガンドが飽和・不飽和の中鎖・長鎖脂肪酸であること (非特許文献７〜９)、ＧＰＲ４１とＧＰＲ４３のリガンドがギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸およびペンタン酸のような短鎖脂肪酸であることが同定された (非特許文献１０、非特許文献１１)。ＧＰＲ４０、ＧＰＲ４１およびＧＰＲ４３は遺伝子として染色体上でクラスターを形成しており、約３０％の配列同一性を持つファミリーのオーファンＧＰＣＲである（非特許文献１２）。ある特定の脂肪酸が一部のＧＰＣＲのリガンドであることは前述のとおり報告されているが、ＧＰＲ８３は上記脂肪酸に反応するいずれのレセプターにも相同性を示さないレセプターとして分類されおり（非特許文献４）、特定の脂肪酸がＧＰＲ８３を活性化することは知られていなかった。
【０００７】
【特許文献１】日本国特開平９−２７８７９８号公報
【特許文献２】国際公開第９７／３７０１８号パンフレット
【特許文献３】日本国特開２０００−０８３６８２号公報
【特許文献４】国際公開第０３／４７０６号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０３／６５０４４号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０３／７３９８３号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０４／４００００号パンフレット
【特許文献８】国際公開第０１／４４４３９号パンフレット
【非特許文献１】Harrigan et al., Mol Cell Biol 9(8) 3438-3446, 1989
【非特許文献２】Harrigan et al Mol. Endocrinol. 5(9), 1331-1338, 1991
【非特許文献３】Pesini et al., Molecular Brain Res 57, 281-300, 1998
【非特許文献４】Moerlooze et al., Cytogenet Cell Genet 90;146-150, 2000
【非特許文献５】Brezillon et al., Brain Res 921, 21-30, 2001
【非特許文献６】Wang et al., J Neurosci 21 (22) 9207-9035, 2001
【非特許文献７】Briscoe et al., J Biol Chem 278(13), 11303-11311, 2003
【非特許文献８】Itoh et al., Nature 422(6928), 173-176, 2003
【非特許文献９】Kotarsky et al., Biochem Biophys Res Commun 301(2), 406-410, 2003
【非特許文献１０】Brown et al., J Biol Chem 278(13), 11312-11319, 2003
【非特許文献１１】Nilsson et al., Biochem Biophys Res Commun 303(4), 1047-1052, 2003
【非特許文献１２】Sawzdargo et al., Biochem Biophys Res Commun 239, 543-547, 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、生体内リガンドとＧＰＲ８３との相互作用を変化させる化合物をスクリーニングする方法、およびそれらのスクリーニング用キットなどを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、長鎖脂肪酸の一種であるアラキドン酸およびγ−リノレン酸がＧＰＲ８３のリガンドであることを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明によれば、長鎖脂肪酸および／または被検物質を、ＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分と接触させる工程を含んでなる、長鎖脂肪酸とＧＰＲ８３との相互作用を変化させる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法が提供される。
本発明によればまた、長鎖脂肪酸と、ＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分とを少なくとも含んでなる、スクリーニング用キットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
長鎖脂肪酸
本発明のスクリーニング方法に使用するＧＰＲ８３のリガンドとしては、長鎖脂肪酸を使用できる。「長鎖脂肪酸」とは炭素数１１以上の飽和または不飽和の脂肪酸を意味する。長鎖脂肪酸としては、後述の実施例でＧＰＲ８３を活性化することが明らかとなったアラキドン酸およびγ−リノレン酸を使用するとよい。アラキドン酸およびγ−リノレン酸は、公知の長鎖脂肪酸であるため、当業者であれば容易に入手することができる。例えば、アラキドン酸またはγ−リノレン酸を含む生物から、常法に従って、抽出または精製の工程を経て調製することができる。また、アラキドン酸またはγ−リノレン酸は、その市販品を購入して、使用することができ、例えばＳＩＧＭＡ社製を用いるとよい。アラキドン酸やγ−リノレン酸以外の長鎖脂肪酸も同様にして入手することができる。
【００１２】
ＧＰＲ８３
本発明のスクリーニング方法に使用するＧＰＲ８３は、アラキドン酸またはγ−リノレン酸による活性化作用、あるいはアラキドン酸またはγ−リノレン酸と結合活性を有し、ＧＰＲ８３発現細胞の細胞刺激活性（例えば細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）を有するものであれば、その起源は特に限定されず、例えばＧＰＲ８３を発現する臓器、組織、細胞などの天然由来のもの、公知の遺伝子工学的手法、合成法などにより人為的に調製したものも包含される。また、ＧＰＲ８３の部分ポリペプチドとして後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されず、例えばアラキドン酸またはγ−リノレン酸による活性化作用、あるいはアラキドン酸またはγ−リノレン酸に対する結合能を有する部分ポリペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチドなども使用することもできる。
【００１３】
具体的には、本発明のスクリーニング方法に使用するＧＰＲ８３は、ＧＰＲ８３［ＧＰＲ８３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７６２４（ヒト型）、ＮＰ＿０３４４１７．１（マウス型）、ＮＰ＿５３６３３６．１（ラット型））、ＧＰＲ７２、ＲＰ−２３とも称されている］と称されているポリペプチドである。具体的には、ＧＰＲ８３は、（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ポリペプチド、（ｉｖ）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記のＧＰＲ８３と実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；および（ｖ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、しかも、前記のＧＰＲ８３と実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが含まれる。本発明に使用するＧＰＲ８３としては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」が好ましい。なお、前記ポリペプチドには、ポリペプチドの塩が含まれ、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。
【００１４】
ここで、機能的に等価な改変ポリペプチド（以下、「改変ポリペプチド」と称する）とは、そのアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であって、しかもＧＰＲ８３と実質的に同じ活性［例えばアラキドン酸やγ−リノレン酸などの長鎖脂肪酸による活性化作用、あるいはアラキドン酸やγ−リノレン酸などの長鎖脂肪酸との結合能、およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性（例えば細胞内のＣａ２＋の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離など）］を有するポリペプチドを意味する。改変ポリペプチドは、好ましくは、そのアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて１または複数個（好ましくは１または数個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であって、しかもＧＰＲ８３と実質的に同じ活性を有するポリペプチドであることができる。
【００１５】
本願明細書において「保存的置換」とは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。なお、前記改変ポリペプチドには、改変ポリペプチドの塩が含まれ、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。従って、これらの条件を満たす限り、前記改変ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。
改変ポリペプチドの例としては、ヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］由来のＧＰＲ８３もしくはその変異体が挙げられる。具体的には配列番号４で表されるアミノ酸配列（マウス由来）や、配列番号６で表されるアミノ酸配列（ラット由来）からなるポリペプチドが挙げられる。
【００１６】
上述の相同ポリペプチドとは、ＧＰＲ８３のアミノ酸配列に関して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる限り、特に限定されるものではないが、ＧＰＲ８３に関して、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、しかもＧＰＲ８３と実質的に同じ活性（例えばアラキドン酸またはγ−リノレン酸による活性化作用、あるいはアラキドン酸またはγ−リノレン酸との結合能、およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性）を有するポリペプチドを意味する。
【００１７】
本願明細書において、「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。なお、前記相同ポリペプチドには、相同ポリペプチドの塩が含まれ、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。従って、これらの条件を満たす限り、前記相同ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。例えばヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］由来のＧＰＲ８３もしくはその変異体が含まれる。具体的には配列番号４、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００１８】
なお、変異体とは、「ｖａｒｉａｔｉｏｎ」、すなわち、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
【００１９】
さらに、本発明に使用するＧＰＲ８３（すなわち、ＧＰＲ８３、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）の部分ポリペプチドも、ＧＰＲ８３と実質的に同じ活性（例えばアラキドン酸またはγ−リノレン酸による活性化作用、あるいはアラキドン酸またはγ−リノレン酸との結合能、およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチド）を有する限り使用することができる。この場合、部分ポリヌクレオチドを構成するアミノ酸数は、ＧＰＲ８３のアミノ酸数の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％である。
【００２０】
本発明に使用するＧＰＲ８３をコードするポリペプチドとしては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」が好ましい。また、配列番号４、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００２１】
ＧＰＲ８３の調製方法
これら本発明に使用するＧＰＲ８３（すなわち、ＧＰＲ８３、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）およびその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法、例えば遺伝子工学的手法、合成法などによって得ることができる。具体的には、遺伝子工学的手法の場合、ＧＰＲ８３またはその部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することによって調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。また、適当なタンパク質分解酵素で切断することによって所望の部分ポリペプチドを調製することができる。
【００２２】
以下、本発明に使用するＧＰＲ８３の調製方法のうち、遺伝子工学的手法について詳述するが、その部分ポリペプチドについても、後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されない。
【００２３】
ＧＰＲ８３をコードするポリヌクレオチド
本発明に使用するＧＰＲ８３（すなわち、ＧＰＲ８３、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、前記ＧＰＲ８３、前記改変ポリペプチド、前記相同ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
なお、本願明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。本発明に使用するＧＰＲ８３をコードするポリヌクレオチドには、具体的には下記の（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択されるものが挙げられる。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
（ｂ）「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｃ）「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記のＧＰＲ８３と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）「配列番号２で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記のＧＰＲ８３と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド； 
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記のＧＰＲ８３と実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；および
（ｆ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、しかも、前記のＧＰＲ８３と実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド
に関する。
【００２４】
本発明の一つの態様によれば、本発明に使用するＧＰＲ８３をコードするポリヌクレオチドは、「配列番号２で表されるアミノ酸配列の１または複数個（好ましくは１または数個）の箇所において、１または複数個（好ましくは１または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記のＧＰＲ８３と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個である。
【００２５】
本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するＧＰＲ８３をコードするポリヌクレオチドは、「配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記のＧＰＲ８３と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。具体的には配列番号３、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２６】
本願明細書において、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、具体的には、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ〔Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍ．，  １６４，  ７６５  （１９８８）〕などの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェントな条件下」とは、当業者が通常使用し得るハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０℃〜７０℃、好ましくは６０℃〜６５℃などで反応を行い、塩濃度が１５〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１５〜６０ｍｍｏｌ／Ｌなどの洗浄液中で洗浄する方法に従って行なうことができる。温度、塩濃度は使用するプローブの長さに応じて適宜調整することが可能である。
【００２７】
本発明に使用するＧＰＲ８３をコードするポリヌクレオチドは、例えば天然由来のものであることもできるし、または全合成したものであることもできる。さらには、天然由来のものの一部を利用して合成を行なったものであることもできる。本発明に使用するＧＰＲ８３をコードするポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、例えば市販のライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分アミノ酸配列（例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列）の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行なう方法などを挙げることができる。
【００２８】
本発明に使用するＧＰＲ８３をコードするポリヌクレオチドとしては、「配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド」が好ましい。配列番号１で表される塩基配列は、１番目〜３番目のＡＴＧで始まり、１２７０番目〜１２７２番目のＴＡＧで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、配列番号３、配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２９】
プラスミド
前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のようなＧＰＲ８３をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。
【００３０】
形質転換体
また、前記形質転換体も、上記のようなＧＰＲ８３をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、ＧＰＲ８３を発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
【００３１】
前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株）または酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、またはＣＯＳ細胞）または昆虫細胞（例えばＢｍＮ４細胞）を挙げることができる。
【００３２】
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥＸ、ｐＫＫ、またはｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、ｐＥＭＢＬＹまたはｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＯＳ細胞に対しては、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＡＭｎｅｏまたはｐＢａｂｅ  Ｐｕｒｏを；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えばｐＢＫ２８３）を挙げることができる。
【００３３】
ＧＰＲ８３を含有する細胞は、ＧＰＲ８３を細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではなく、例えば前記形質転換体（すなわち、ＧＰＲ８３をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞）を、ＧＰＲ８３の発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、ＧＰＲ８３をコードするＲＮＡを注入し、ＧＰＲ８３の発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。
【００３４】
細胞膜画分
また、ＧＰＲ８３を含有する本発明に使用する細胞膜画分は、例えば前記のＧＰＲ８３を発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザー（例えばＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｉｅｍ型ホモジナイザー）で細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーまたはポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社）による破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどで加圧しながら細いノズルから細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば遠心力による分画法、例えば分画遠心分離法または密度勾配遠心分離法を挙げることができる。
【００３５】
スクリーニング方法
本発明によるスクリーニング方法の第一の態様によれば、被検物質存在下および被検物質非存在下において、ＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を長鎖脂肪酸と接触させ、次いで、ＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分への長鎖脂肪酸の結合量を測定する工程を含んでなるスクリーニング方法が提供される。
このスクリーニング方法では、ＧＰＲ８３の機能を促進もしくは阻害する能力を区別せずに被検化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、第一の態様のスクリーニング方法では、長鎖脂肪酸とＧＰＲ８３との相互作用を変化させる化合物をスクリーニングすることができ、具体的には、長鎖脂肪酸のＧＰＲ８３への結合性を変化させる化合物を、より具体的には、ＧＰＲ８３の機能を促進もしくは阻害する能力を有する化合物を、スクリーニングすることができる。
【００３６】
具体的には、被検物質非存在下および被検物質存在下の各条件下において、ＧＰＲ８３または前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、標識したリガンド（すなわち、アラキドン酸またはγ−リノレン酸のような長鎖脂肪酸）とを接触させ、前記条件下におけるＧＰＲ８３または前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する前記リガンドの特異的結合量を比較することにより、ＧＰＲ８３の機能を促進もしくは阻害する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、被検物質非存在下におけるＧＰＲ８３または前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する前記リガンドの特異的結合量に対して、被検物質存在下における前記特異的結合量が低下する場合には、その被検物質は、長鎖脂肪酸とＧＰＲ８３との相互作用を変化させる化合物であると、具体的には、ＧＰＲ８３の機能を促進もしくは阻害する能力を有する化合物であると、より具体的には、ＧＰＲ８３アゴニストあるいはＧＰＲ８３アンタゴニストであると、決定することができる。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法において、ＧＰＲ８３または前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する前記リガンドの特異的結合量を比較する場合には、前記リガンドとして、標識した前記リガンドを用いることができる。前記標識としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、［3Ｈ］、［14Ｃ］、［125Ｉ］、［35Ｓ］などを用いることができる。前記酵素としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼなどを用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルオレセイソチオシアネート、ＢＯＤＩＰＹなどを用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。場合によっては、前記リガンドと標識物質を結合させるためにビオチン−アビジンの系を用いることもできる。
【００３８】
このように、本発明のスクリーニング方法において、ＧＰＲ８３または前記細胞もしくは前記細胞膜画分に結合して、これらと前記リガンドとの結合を阻害する化合物を、ＧＰＲ８３の機能を促進もしくは阻害する能力を区別せずにスクリーニングすることができる。
【００３９】
本発明によるスクリーニング方法の第二の態様によれば、被検物質存在下および被検物質非存在下において、ＧＰＲ８３またはＧＲＰ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を長鎖脂肪酸と接触させ、次いで、細胞刺激活性を測定する工程を含んでなるスクリーニング方法が提供される。
このスクリーニング法では、ＧＰＲ８３の機能を促進もしくは阻害する能力を区別して被検化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、第二の態様のスクリーニング方法では、長鎖脂肪酸とＧＰＲ８３との相互作用を変化させる化合物をスクリーニングすることができ、具体的には、ＧＰＲ８３の活性化に影響を与える化合物を、より具体的には、ＧＰＲ８３の機能を促進する化合物（アゴニスト）あるいはＧＰＲ８３の機能を阻害する化合物（アンタゴニスト）を、スクリーニングすることができる。
【００４０】
具体的には、被検物質非存在下および被検物質存在下の各条件下において、ＧＰＲ８３またはＧＲＰ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を長鎖脂肪酸と接触させ、次いで、前記条件下における細胞刺激活性を比較することにより、ＧＰＲ８３の機能を促進もしくは阻害する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、被検物質非存在下における細胞刺激活性に対して、被検物質存在下における細胞刺激活性が上昇する場合には、その被検物質は、ＧＰＲ８３の機能を促進する化合物（ＧＰＲアゴニスト）と決定することができる。被検物質非存在下における細胞刺激活性に対して、被検物質存在下における細胞刺激活性が低下する場合には、その被検物質は、ＧＰＲ８３の機能を阻害する化合物（ＧＰＲ８３アンタゴニスト）と決定することができる。
【００４１】
本発明によるスクリーニング方法の第三の態様によれば、
被検物質存在下および被検物質非存在下において、ＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を長鎖脂肪酸と接触させ、次いで、ＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分への長鎖脂肪酸の結合量を測定し、長鎖脂肪酸のＧＰＲ８３への結合性を変化させる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を決定する工程と、
前記工程において決定された化合物の存在下および非存在下において、ＧＰＲ８３またはＧＲＰ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を長鎖脂肪酸と接触させ、次いで、細胞刺激活性を測定し、ＧＰＲ８３の活性化に影響を与える化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を決定する工程
とを含んでなる、スクリーニング方法が提供される。
このスクリーニング法では、長鎖脂肪酸のＧＰＲ８３への結合性を変化させる化合物を絞り込んだ上で、細胞刺激活性の測定を行い、ＧＰＲ８３の機能を促進もしくは阻害する能力を区別して被検化合物をスクリーニングできる点で有利である。すなわち、第三の態様のスクリーニング方法では、長鎖脂肪酸とＧＰＲ８３との相互作用を変化させる化合物をスクリーニングすることができ、具体的には、ＧＰＲ８３の活性化に影響を与える化合物を、より具体的には、ＧＰＲ８３の機能を促進する化合物（アゴニスト）あるいはＧＰＲ８３の機能を阻害する化合物（アンタゴニスト）を、スクリーニングすることができる。
【００４２】
具体的には、まず、被検物質非存在下および被検物質存在下の各条件下において、ＧＰＲ８３または前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、標識したリガンドとを接触させ、前記条件下におけるＧＰＲ８３または前記細胞もしくは前記細胞膜画分を介する前記リガンドの特異的結合量を比較することにより、ＧＰＲ８３の機能を促進もしくは阻害する能力を区別せずに化合物をスクリーニングする。次いで、前記スクリーニングにおいて特定された被検物質の非存在下および存在下の各条件下において、ＧＰＲ８３またはＧＲＰ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を長鎖脂肪酸と接触させ、次いで、前記条件下における細胞刺激活性を比較することにより、ＧＰＲ８３の機能を促進もしくは阻害する能力を区別して化合物をスクリーニングする。すなわち、被検物質非存在下における細胞刺激活性に対して、被検物質存在下における細胞刺激活性が上昇する場合には、その被検物質は、ＧＰＲ８３の機能を促進する化合物（ＧＰＲ８３アゴニスト）と決定することができる。被検物質非存在下における細胞刺激活性に対して、被検物質存在下における細胞刺激活性が低下する場合には、その被検物質は、ＧＰＲ８３の機能を阻害する化合物（ＧＰＲ８３アンタゴニスト）と決定することができる。
【００４３】
第二の態様および第三の態様のスクリーニング方法では、細胞刺激活性として、例えば、細胞内のカルシウムの遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍ｐＨ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの誘導活性、アラキドン酸遊離などを測定することができ、好ましくは、アデニル酸シクラーゼの活性化や細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇を測定することができる。
【００４４】
これらの態様のスクリーニング方法においては、例えばアデニル酸シクラーゼの活性化によって細胞内に生成するｃＡＭＰ、あるいはホスホリパーゼＣの活性化によって上昇する細胞内カルシウム濃度を公知の手法で測定すればよく、ＧＰＲ８３の機能を促進もしくは阻害する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、ＧＰＲ８３に前記リガンドが結合することにより生じる細胞内シグナル伝達、すなわち、ＧＰＲ８３の細胞刺激活性の一つであるアデニル酸シクラーゼの活性促進および細胞内カルシウム濃度の上昇作用を利用するものである。具体的には、ＧＰＲ８３に前記リガンドが結合すると、ＧＰＲ８３に共役しているＧタンパク質ファミリーの一つであるＧsファミリーが、アデニル酸シクラーゼを活性化し、細胞内に生成されるサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ：アデニル酸シクラーゼによりＡＴＰから生成される）量を増加させることによる。およびＧｑファミリーが、細胞内Ｃａ２＋濃度を上昇させることによる。
【００４５】
例えばＧＰＲ８３を細胞膜上に発現（好ましくは、ＧＰＲ８３を含む発現ベクターを導入し過剰に発現）した哺乳動物由来細胞（例えばＨＥＫ−２９３細胞もしくはＣＨＯ細胞）にＧＰＲ８３の前記リガンドを添加すると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇、および細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇する。
【００４６】
ＧＰＲ８３の機能を促進する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系でＧＰＲ８３を介する前記リガンドに代わり、被検物質を単独で接触させて細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇する、および細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇する（すなわち前記リガンドと同様の作用を有する）化合物を選択すると良い。
【００４７】
ＧＰＲ８３の機能を阻害する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＧＰＲ８３の前記リガンド、および被検物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、前記リガンドの作用でｃＡＭＰの生成量が増加するが、被検物質が前記リガンドの作用に拮抗する場合には、ｃＡＭＰ生成量を抑制する。このときには、前記被検物質はＧＰＲ８３の機能を阻害する化合物として選択できる。
【００４８】
細胞内ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、例えばイムノアッセイなどが挙げられるが、市販のｃＡＭＰ定量キットを使用することもできる。
【００４９】
第二の態様および第三の態様のスクリーニング方法においては、また、ＧＰＲ８３を細胞膜上に発現（好ましくは、ＧＰＲ８３を含む発現ベクターを導入し過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子など、またはＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛍光タンパク質遺伝子など）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、ＧＰＲ８３の機能を促進もしくは阻害する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この場合は、前述のｃＡＭＰの生成が増加するとその結果、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が促進されることを利用している。
【００５０】
以下、前記態様による、ＧＰＲ８３の機能を促進もしくは阻害する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。
すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されているＣＲＥは、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群（ｃＡＭＰ誘導性遺伝子）の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデニル酸シクラーゼの活性化剤（例えばＦＳＫ）をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇し、その結果、ＣＲＥの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。さらにこのレポーター遺伝子は、細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇によるシグナル伝達系によっても発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。
【００５１】
また、ＧＰＲ８３の前記リガンドを加えると、アデニル酸シクラーゼ活性促進に加え、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇し、結果として、レポーター遺伝子産物の発現量が増加する。従って、ＧＰＲ８３の機能を促進する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で、ＧＰＲ８３を介する前記リガンドに代わり被検物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を上昇させる（すなわち前記リガンドと同様の作用を有する）化合物を選択すると良い。
【００５２】
ＧＰＲ８３の機能を阻害する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＧＰＲ８３の前記リガンド、および被検物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、前記リガンドの作用でレポーター遺伝子産物の発現量は上昇するが、被検物質が前記リガンドの作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現を抑制する。このときには、前記被検物質はＧＰＲ８３の機能を阻害する化合物として選択できる。
【００５３】
被検物質による作用が、ＧＰＲ８３に対する結合を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞（すなわち、ＧＰＲ８３を細胞膜上に発現し、しかも、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用いた前記試験と並行して、コントロール用細胞（例えばＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、ＧＰＲ８３を細胞膜上に発現していない細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被検物質による作用が、ＧＰＲ８３に対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被検物質による作用が、ＧＰＲ８３に対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。
【００５４】
また、別の態様として、ＧＰＲ８３は、精神刺激薬のアンフェタミンで発現が上昇することからも、うつ、不安に関連する可能性が示唆されていることから、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物（すなわち、アラキドン酸またはγ−リノレン酸によるＧＰＲ８３の活性化に影響を与える化合物、あるいはアラキドン酸またはγ−リノレン酸とＧＰＲ８３との相互作用を変化させる化合物）をヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に投与し、投与後の自発運動などの指標を解析することにより中枢神経系疾患、例えば注意欠陥多動性傷害、統合失調症、うつ病または不安などに影響を与える化合物であるか否かを確認および決定することができる。上記哺乳動物としては、正常の動物に限らず、遺伝性の病態モデル動物や遺伝子改変動物でもよい。被検物質の投与形態としては経口的または非経口的に投与する。非経口的な投与経路の様態としては、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、気道内、直腸内、脳内、好ましくは視床下部近傍の脳室内投与が挙げられる。スクリーニングなどの指標としては、例えばオープンフィールド試験、明暗試験、高架式十字迷路試験、Ｈｏｌｏ−ｂｏａｒｄ試験、Ｍａｒｂｌｅ  ｂｕｒｙｉｎｇ試験、Ｄｅｆｅｎｓｉｖｅ  ｂｕｒｙｉｎｇ試験、強制水泳試験、ｔａｉｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ試験、恐怖条件付けストレス試験、Ｙ迷路試験などを行うことも有効である。被検物質の投与回数は１日あたり一回でも数回に分けても良く、被検物質を投与する期間や観察する期間は１日から数週間にわたってもよい。
【００５５】
本発明に使用する被検物質はどのような化合物であってもよいが、例えば遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、核酸（オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ）、合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）抽出液、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを挙げることができる。
【００５６】
ＧＰＲ８３は、精神刺激薬のアンフェタミンで発現が上昇することからも、うつ、不安に関連する可能性が示唆されていることから、本発明のスクリーニング方法により得られるアラキドン酸またはγ−リノレン酸とＧＰＲ８３との相互作用を変化させる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物は、中枢神経系疾患、例えば注意欠陥多動性障害、統合失調症、うつ病、不安などの治療用の医薬として用いることができる(Wang et al., J Neurosci 21 (22) 9207-9035, 2001)。
【００５７】
スクリーニング用キット
本発明のスクリーニング用キットは、リガンド（すなわち、アラキドン酸またはγ−リノレン酸などの長鎖脂肪酸）、およびＧＰＲ８３または前記細胞（すなわち、ＧＰＲ８３を含有する細胞）もしくは前記細胞膜画分（すなわち、ＧＰＲ８３を含有する細胞膜画分）とを少なくとも含んでなる。前記リガンドは、標識した前記リガンドであってもよい。前記スクリーニング用キットは、所望により、本発明によるスクリーニング方法を実施するための種々の試薬、例えば結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および／または器具などをさらに含むことができる。
【００５８】
本発明の別の態様のスクリーニング用キットは、リガンド（すなわち、アラキドン酸またはγ−リノレン酸などの長鎖脂肪酸）、およびＧＰＲ８３を細胞膜上に発現（好ましくは、ＧＰＲ８３を含む発現ベクターを導入して過剰に発現）し、しかも、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）が５’上流に位置するレポーター遺伝子（例えば、アルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子など）を含有する細胞とを少なくとも含有する。前記リガンドは、標識した前記リガンドであってもよい。前記スクリーニング用キットは、所望により、種々の試薬、例えばレポーター遺伝子産物（例えば、アルカリフォスファターゼもしくはルシフェラーゼなど）の基質、アデニル酸シクラーゼ活性化剤（例えばＦＳＫ）、結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および／または器具などをさらに含むことができる。また、前記スクリーニング用キットは、ＣＲＥが５’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、ＧＰＲ８３を細胞膜上に発現していない細胞を含んでいてもよい。
【００５９】
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物を含有する医薬
ＧＰＲ８３は、ヒト、マウスおよびラットに共通して脳および脊髄に高い発現を示す(Pesini et al., Molecular Brain Res 57, 281-300, 1998、Brezillon et al., Brain Res 921, 21-30, 2001、Wang et al., J Neurosci 21 (22) 9207-9035, 2001)。脳では、海馬や扁桃体を含む大脳辺縁系、線条体、視床下部、脊髄に発現しており、このレセプターが、記憶、認知、ストレス、不安、報酬、情緒調節および神経内分泌調節に関わる可能性を示す。脳におけるＧＰＲ８３は、精神刺激薬のアンフェタミンで発現が上昇することからも、うつ、不安に関連する可能性が示唆されている (Wang et al., J Neurosci 21 (22) 9207-9035, 2001)。また、ＧＰＲ８３の脳内での発現部位が、グルココルチコイド  ｔｙｐｅＩＩレセプターの発現部位と非常に重なっていることから、グルココルチコイドの中枢作用である睡眠および情緒調節に関与している可能性が考えられる。
従って、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物は、中枢神経系疾患の治療の医薬として用いることができる。前記の中枢神経系疾患は、例えば注意欠陥多動性障害、統合失調症、うつ病、不安などが挙げられる。
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物は、中枢神経系疾患の治療に有効な化合物である。当該化合物は塩を形成してもよく、さらに当該化合物およびその塩は溶媒和物（例えば、水和物、アルコール和物、エーテル和物）を形成していてもよい。
本願明細書において「塩」とは、薬学的に許容される塩を示し、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物と薬学的に許容される塩を形成するものであれば特に限定されない。具体的には、例えば好ましくはハロゲン化水素酸塩（例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩（例えば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩など）などが挙げられる。
【００６０】
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物［例えば非ヒト哺乳動物（例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など］に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤などによる経口剤、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤などによる非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クエン酸、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００６１】
それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１ｋｇあたり例えば約１．０〜１，５００μｇ、好ましくは約１０〜５００μｇ程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
【００６２】
本明細書において「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病および／または症状を完全にまたは部分的に防止する点では予防的であり、疾病および/または疾病に起因する悪影響の部分的または完全な治癒という点では治療的である。本明細書において「治療」とは、哺乳動物、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、例えば以下の（a）〜(c)の治療を含む： 
（a）疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者において、疾病または症状が起こることを予防すること；
（b）疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止または遅延すること；
（c）疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退、または症状の進行の逆転を引き起こすこと。
【００６３】
本発明は、
（１）アラキドン酸またはγ−リノレン酸、および被検物質を、ＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させることを特徴とするアラキドン酸またはγ−リノレン酸とＧＰＲ８３との相互作用を変化させる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法、
（２）ＧＰＲ８３を介した細胞刺激活性を測定することを特徴とする前記（１）記載のスクリーニング方法、
（３）ＧＰＲ８３が、配列番号２、４もしくは６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（１）記載のスクリーニング方法。
（４）アラキドン酸またはγ−リノレン酸、およびＧＰＲ８３またはＧＰＲ８３を含有する細胞もしくはその細胞膜画分とを少なくとも含有することを特徴とするスクリーニング用キット、
（５）ＧＰＲ８３が、配列番号２、４もしくは６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（４）記載のスクリーニング用キット、
などにも関する。
【００６４】
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例により本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。
【００６６】
［実施例１］ＧＰＲ８３をコードするポリヌクレオチドの調製
ＧＰＲ８３をコードするポリヌクレオチドの単離は、配列番号１で表される核酸配列を基にして、以下のように行った。配列番号１では１２７２塩基対が示されており、ＧＰＲ８３をコードする領域は、１番目から１２６９番目（１２６９塩基対，４２３アミノ酸残基）とされている（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＮＭ＿０１６５６８）。ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により遺伝子を単離するために、配列番号７および配列番号８で表されるＰＣＲプライマーを常法に従い作製した。
【００６７】
ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ  （ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型として、配列番号７および配列番号８の組合せからなるＰＣＲプライマーと、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用い、添付の操作方法に従い、９８℃１分、５７℃１分、７２℃３分のサイクルを３５回繰り返すことによりＰＣＲを行った。その結果、約１，３００塩基対のＤＮＡ断片を得た。
【００６８】
このＤＮＡ断片を、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入し、ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により配列を確認した。その結果、配列番号７および８からなるプライマーの組合せによって得られたｐＣＲ２．１−ＧＰＲ８３に挿入された１２７２塩基対の配列は、配列番号１における１番目から１２７２番目と長さは同一であり、配列中には２塩基の変異が見られたが、これらの変異は、該当部位の核酸配列から翻訳されるアミノ酸には影響を与えないことが明らかであったので、ＧＰＲ８３をコードするポリヌクレオチドを得ることができた。
【００６９】
［実施例２］レトロウイルスベクタープラスミドの調製
ｐＢａｂｅ  Ｐｕｒｏ（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，  Ｊ．Ｐ．  ａｎｄ  Ｌａｎｄ，  Ｈ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ｖｏｌ．１８  ３５８７−３５９６（１９９０））（配列番号９）からＳａｌＩおよびＣｌａＩで切断することによりＳＶ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐｕｒｏ（ｒ）領域を除き、末端をクレノー断片により平滑化した。ここへｐＩＲＥＳｈｙｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）からＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｙｇ（ｒ）領域を切り出し、Ｔ４ポリメラーゼにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＸＩＨを得た。
【００７０】
ｐＢａｂｅＸＩＨからＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより５’−ＬＴＲ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌを除いた。ここへｐＣＬＸＳＮ（ＩＭＧＥＮＥＸ社）からＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより切り出した５’ＬＴＲ−ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌを挿入しｐＢａｂｅＣＬＸＩＨを得た。
【００７１】
［実施例３］ＧＰＲ８３遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドの調製
前記実施例２に記載のレトロウイルス発現用プラスミドｐＢａｂｅＣＬＸＩＨを制限酵素ＨｐａＩで切断した。ここへ前記実施例１で得たｐＣＲ２．１−ＧＰＲ８３からＥｃｏＲＩで切断することによりＧＰＲ８３をコードするポリヌクレオチドを切り出し、Ｔ４ポリメラーゼにより末端を平滑化したものを挿入しｐＢａｂｅＣＬ（ＧＰＲ８３）ＩＨを得た（図１）。
【００７２】
［実施例４］ＧＰＲ８３遺伝子導入用レトロウイルスベクターの調製
２×１０6個の２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１０ｃｍコラーゲンコートディッシュ（ＩＷＡＫＩ社）でＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社）−１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）−ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）  ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、１００μｇ／ｍｌ）（ＰＳ）（以下、「ＥＢＮＡ培養液」と称する）１０ｍｌを用いて培養した。翌日、ｐＶ−ｇｐ（ｐＶＰａｃｋ−ＧＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）からＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断することによりＩＲＥＳ−ｈｉｓＤを除きＴ４ポリメラーゼによる平滑化後、自己環化したもの）、ｐＶＰａｃｋ−ＶＳＶ−Ｇ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、および実施例３で得たＧＰＲ８３遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミド（ｐＢａｂｅＣＬ（ＧＰＲ８３）ＩＨ）それぞれ３．３μｇをリポフェクション試薬であるＴｒａｎｓＩＴ（Ｐａｎｖｅｒａ社）を用いて、前記２９３−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションした。その６〜１２時間後にＥＢＮＡ培養液を交換し、３７℃で培養を続けた。
【００７３】
トランスフェクション２日後に培養液を回収し、１，２００×ｇで１０分間遠心した。
その上清を０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過したものを非濃縮レトロウイルスベクターとして、さらにウイルスベクターの濃縮を以下のように行った。
超遠心用チューブ５０  Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ  Ｔｕｂｅｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ社）を７０％エタノールで消毒後に蒸留水ですすぎ、ここへ非濃縮ウイルスベクター約３５ｍｌを入れた。これを超遠心ローターＳＷ２８（Ｂｅｃｋｍａｎ社）に入れ、超遠心装置ＸＬ−９０（Ｂｅｃｋｍａｎ社）を使って１９，５００ｒｐｍ  １００分間の遠心操作を行った。遠心後、上清を捨てたチューブを氷に入れて放置した。１時間後、チューブ壁面に残った培養液約１００μｌ程度の濃縮ウイルスベクター溶液が得られた。
【００７４】
［実施例５］サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーター系導入細胞ＳＥ３０２の構築（１）サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーターＤＮＡの作成
Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０００  ２８４（２）：３１６−２６  の記載に従って、ｃＡＭＰに応じた転写がみられるユニットを以下のように構築した。
ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＲＥ）を含むユニットの作成のために、ＣＲＥｘ２ｈｂ用として配列番号１０および配列番号１１、ＣＲＥｘ２ｂｐ用として配列番号１２および配列番号１３で表されるオリゴＤＮＡを常法に従い作成した。
それぞれの組合せからなるオリゴＤＮＡを９５℃に熱処理後、徐々に温度を室温まで下げることにより二本鎖ＤＮＡ（ＣＲＥｘ２ｈｂ、ＣＲＥｘ２ｂｐ）を形成させた。ＣＲＥｘ２ｈｂをＨｉｎｄＩＩＩ，ＢａｍＨＩ、ＣＲＥｘ２ｂｐをＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩで消化するとともに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩで消化した。消化したＤＮＡを電気泳動して両端に制限酵素消化部位をもつＤＮＡを精製した後、これら３つのＤＮＡ（ＣＲＥｘ２ｈｂ、ＣＲＥｘ２ｂｐ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋））を一度に連結し（ｌｉｇａｔｉｏｎ）、得られたプラスミドの配列を解析して、ＣＲＥ４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫを作成した。
【００７５】
次にＶＩＰ（ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）プロモーターを含むＤＮＡを得るために配列番号１４および配列番号１５で表されるＰＣＲプライマーを常法に従い作成した。
ヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｏｓｔｉｃｓ社）を鋳型とし、配列番号１４および配列番号１５の組合せからなるＰＣＲプライマーと、組換えＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分のサイクルを３５回繰り返すことによりＰＣＲしたところ、２６４塩基対のＤＮＡ（配列番号１６）が得られた。この２６４塩基対のＤＮＡをＰｓｔＩで消化するとともにＣＲＥ４／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＰｓｔＩサイトに挿入し、得られたプラスミドの配列を確認してＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）を作成した（図２）。得られたＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）からＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩで消化した後、得られたＣＲＥ４ＶＩＰプロモーター断片の末端平滑化を行った。
【００７６】
前述の発現用ウイルスベクタープラスミドｐＢａｂｅＣＬＸＩＨよりＩＲＥＳ〜ｈｙｇｒｏ（ｒ）領域を除去したｐＢａｂｅＣＬＸを作成した（図３）。ｐＢａｂｅＣＬＸよりレトロウイルス本来のエンハンサー活性（ＬＴＲ）中のＮｈｅＩ〜ＮａｒＩ領域を除去することによって得られた外来性プロモーター導入用レトロウイルスベクタープラスミドに、ＣＲＥとＶＩＰプロモーターを含む配列と、レポーター遺伝子である胎盤由来アルカリフォスファターゼ（ＰＬＡＰ）（Ｇｏｔｏら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ４９，  ｐ．８６０−８７３，  １９９６）を導入し、ｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＮを得た（図４）。
【００７７】
（２）サイクリックＡＭＰ応答配列を含むレポーター系導入細胞ＳＥ３０２の樹立
サイクリックＡＭＰ応答配列によりレポーター遺伝子ＰＬＡＰが誘導されるレトロウイルスベクタープラスミドｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＮを用い、実施例４に記載の方法に準じてレトロウイルスベクターを調製した。調製したレトロウイルスベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入し、限界希釈法により細胞をクローン化して、ＰＬＡＰ誘導の反応性が最も良かったクローン（以下、「ＳＥ３０２細胞」と称する）を以下の実験に供した。
【００７８】
［実施例６］ＧＰＲ８３遺伝子導入用レトロウイルスベクターによるＧＰＲ８３発現細胞の調製
前記の実施例４で調製したレトロウイルスベクターによる細胞へのＧＰＲ８３遺伝子導入を以下のように行った。
前記実施例５で構築した３×１０3個のＳＥ３０２細胞を９６穴プレート（旭テクノガラス社）にＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社）−１０％ＦＣＳ−ＰＳ（以下、「培養液」と称する）１００μｌを用いて培養した。翌日、実施例４で調製したレトロウイルスベクターを適宜希釈し、その１００μｌを培養液で調製したｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（別名  ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ  ｂｒｏｍｉｄｅ）（最終濃度８μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ社）とともにＳＥ３０２細胞に加えた。その翌日、培養液を５００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）含有の培養液２００μｌと交換し培養した。この条件で増殖してきたＧＰＲ８３遺伝子導入ＳＥ３０２細胞（以下、「ＧＰＲ８３−ＳＥ３０２細胞」と称する）を適時継代して実験に供した。
【００７９】
［実施例７］ＧＰＲ８３−ＳＥ３０２細胞における転写活性のアラキドン酸またはγ−リノレン酸による促進
前記実施例６で構築したＧＰＲ８３−ＳＥ３０２細胞を、転写活性測定用培地（ＡＳＦ１０４（ＳＩＧＭＡ社）を加えたもの）にて縣濁した後、９６穴プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社）に１穴あたり１×１０４細胞となるように播種した。翌日、フォルスコリン（Ｃａｒｂｉｏ  Ｃｈｅｍ社）を最終濃度１μｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、その後エタノールで希釈した各濃度のアラキドン酸（ＳＩＧＭＡ社）またはγ−リノレン酸（ＳＩＧＭＡ社）を添加した。さらに一日培養後、細胞上清を５μｌ回収して化学発光測定用の９６穴プレート（住友ベークライト社）に移し、アッセイ用緩衝液（２８０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３、８ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ１０）を２０μｌ、Ｌｕｍｉｐｈｏｓ５３０（Ｌｕｍｉｇｅｎ社）２５μｌを添加して、室温にて２時間反応させた後、各穴の化学発光をＦｕｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）にて測定し転写活性量とした。フォルスコリン１μｍｏｌ／Ｌを添加した細胞上清の転写活性を１００％ととし、フォルスコリンを添加していない細胞の上清の活性を０％として各被検サンプルを加えた細胞上清中の活性を％で表示した（図５、図６）。
【００８０】
その結果、アラキドン酸およびγ−リノレン酸はＧＰＲ８３の活性化を促進することが分かった。この転写活性の上昇はネガティブコントロールとしてもちいたガラニン（Ｇａｌａｎｉｎ、ペプチド研究所社）に特異的にレスポンスをするＧａｌＲ２遺伝子発現細胞（Ｆａｔｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｒａｉｎ．  Ｒｅｓ．，  ５８（１−２），  １５６−１６９，  １９９８）では反応が観察されなかったため、ＧＰＲ８３特異的な反応であることが分かった。すなわち、この実験系を用いることで、アラキドン酸またはγ−リノレン酸によるＧＰＲ８３の活性化に影響を与える化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を判別できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明は、アラキドン酸またはγ−リノレン酸などの長鎖脂肪酸とＧＰＲ８３との相互作用を変化させる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物をスクリーニングするための方法、およびそれらのスクリーニング用キットなどに関する。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ｐＢａｂｅＣＬ（ＧＰＲ８３）ＩＨの構築図を示す。
【図２】ＣＲＥ４ＶＩＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）の構築図を示す。
【図３】ｐＢａｂｅＣＬＸの構築図を示す。
【図４】ｐＢａｂｅＣＬｃｒｅ４ｖＰｄＮＮの構築図を示す。
【図５】ＧＰＲ８３を発現させたＳＥ３０２細胞における転写活性のアラキドン酸による特異的な用量依存的促進を示す。白丸はＧＰＲ８３の反応を示す。黒丸はＧａｌＲ２の反応を示す。横軸の数字は添加した各リガンドの最終濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を示す。縦軸はフォルスコリン１μｍｏｌ／Ｌを添加した細胞上清のアルカリフォスファターゼの活性を１００、フォルスコリンを添加していない細胞上清の活性を０として算出した各活性の割合を示す。各点は平均値（Ｎ＝２）を示す。
【図６】ＧＰＲ８３を発現させたＳＥ３０２細胞における転写活性のγ−リノレン酸による特異的な用量依存的促進を示す。白丸はＧＰＲ８３の反応を示す。黒丸はＧａｌＲ２の反応を示す。横軸の数字は添加した各リガンドの最終濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を示す。縦軸はフォルスコリン１μｍｏｌ／Ｌを添加した細胞上清のアルカリフォスファターゼの活性を１００、フォルスコリンを添加していない細胞上清の活性を０として算出した各活性の割合を示す。各点は平均値（Ｎ＝２）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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