(57)【要約】【課題】ピログルタミン酸エステルの酵素的合成法を提供する。【解決手段】本発明は、一般式（Ｉ）2006101877.tif 000008（式中、Ｒは、アルコールの炭化水素ラジカルである）の化合物の調製方法であって、著しい量の溶媒を使用せずに、好ましくは溶媒を使用せずに、好ましくは減圧下、１００℃未満の温度で、ヒドロラーゼの種類からの酵素の存在下で、１以上の一般式（ＩＩ）    Ｒ−ＯＨ          （ＩＩ）（式中、Ｒは上記で定義された通りである）のアルコールを、一般式（ＩＩＩ）2006101877.tif 000009（式中、Ｒ１は、水素、あるいは１〜３個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキルもしくはアルケニル基のいずれかである）の化合物とエステル化および／またはエステル交換反応させる方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2006101877.tif 000006
（式中、Ｒは、≧４の炭素原子を有するアルコールの炭化水素ラジカルである）の化合物の調製方法であって、著しい量の溶媒を使用せずに、好ましくは溶媒を使用せずに、好ましくは減圧下、１００℃未満の温度で、酵素の存在下で、１以上の一般式（ＩＩ）
Ｒ−ＯＨ          （ＩＩ）
（式中、Ｒは上記で定義された通りである）のアルコールを、一般式（ＩＩＩ）
【化２】
2006101877.tif 000007
（式中、Ｒ１は、水素、あるいは１〜３個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキルもしくはアルケニル基のいずれかである）の化合物とエステル化および／またはエステル交換反応させる方法。
【請求項２】
一般式（ＩＩ）のアルコールにおいて、Ｒが、多重結合を任意に含有する、４〜２２個の炭素原子を有する任意に分枝形成された炭化水素ラジカルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一般式（ＩＩ）の化合物と一般式（ＩＩＩ）の化合物との比率が、都合よく２：１未満、好ましくは１．５：１未満、特に約１：１である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
０重量％〜１００重量％の量で、好ましくは０重量％〜５０重量％の量で、特に１０重量％〜４０重量％の量でＲ１が水素原子である比率で、Ｒ１＝ＨおよびＲ１＝Ｃ１〜Ｃ３アルキルである一般式（ＩＩＩ）の化合物の混合物が使用される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
使用される一般式（ＩＩＩ）の化合物が、Ｒ１が水素原子である化合物と、Ｒ１が、１〜３個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキルもしくはアルケニル基、好ましくはメチルまたはエチルである化合物との混合物であって、超臨界条件下でのグルタミン酸と、対応する短鎖アルコール、好ましくはメタノールまたはエタノールとの反応から生じる混合物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
固定化酵素、例えば、カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、サーモマイセス  ランゴシオサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｇｏｓｉｏｓｕｓ）、ブタすい臓、ムコール  ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、アルカリジンズ属（Ａｌｃａｌｉｇｉｎｅｓ  ｓｐ．）からのリパーゼ、カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）からのコレステロールエステラーゼ、またはブタ肝臓からのエステラーゼ、好ましくはカンジダ  アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）からのリパーゼＢを使用する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピログルタミン酸エステルの酵素的調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピログルタミン酸（２−ピロリドン−５−カルボン酸）は、低い大気湿度においてさえも皮膚の角質層の含水量を増加させるという点から、水分調節機能を有することが知られている。そのナトリウム塩は、水溶性の吸湿性物質であり、そして天然保湿因子（ＮＭＦ；（非特許文献１））の成分である。これは、パーソナルケア用途に関して最も知られている保湿剤の１つである。
【０００３】
ピログルタミン酸またはそれらの塩は、両方とも、親水性のため局所的適用時における皮膚および毛髪中へ浸透する能力を限定的にのみ有し、水によって迅速に洗い流され、その結果として、連続的な水分注入のような長期的な効果は妨げられる。
【０００４】
この理由のため、皮膚を保湿するために、さらには毛髪成長速度を増加させるために、ピログルタミン酸のアルキルエステルを化粧品配合物中に使用する（（特許文献１）、（特許文献２）、（特許文献３））。この特性は、皮膚を通して角質層中へ浸透するこれらの化合物の能力に基づいている。ここで、これらの化合物は、そこに存在するピログルタミン酸ペプチダーゼ（ＥＣ  ３．４．１９．３；（非特許文献２））によって切断されて、遊離ピログルタミン酸を放出する。
【０００５】
これまでは、単純でコスト効率の良い調製方法がなかったため、化粧品用途における頻繁な使用は妨げられていた。現在の従来技術は、例えば、硫酸、塩化チオニルおよび塩化水素のような従来のエステル化触媒を使用して、極めて激しい条件下で所望の生成物を得ており、そして溶媒を使用している（例えば、（特許文献４）および（特許文献５）を参照のこと）。さらに最近では、電子レンジを使用する代替となる合成についても記載されている（（特許文献６））。
【０００６】
最近、酵素的エステル交換反応によるピログルタミン酸エステルの生体触媒による合成も記載されている（（非特許文献３）、（非特許文献４））。しかしながら、この方法も、工業的応用を可能にするために必要とされる要求条件を満足させるものではない。
【０００７】
まず第一に、この方法は有機溶媒の使用をベースとしており、これは第一に、化粧品製剤における使用に関して絶対的に望ましくなく、そして第二に、追加的な製造コストをもたらす。
【０００８】
さらに、記載された転換（通常、６５％〜７３％）を達成するためにも、大過剰量のアルコール（通常、５当量）および多量の酵素（１０重量％まで）を使用する必要がある。
【０００９】
次いで、この様式で得られた反応混合物を、広範なワークアップ工程に続いて化粧品用途のために使用することができる。
【００１０】
例えば、最初に有機溶媒および過剰量のアルコールを蒸留によって除去しなければならない。より長鎖の脂肪族アルコールの場合、低圧にもかかわらず、依然として高温がしばしば必要とされ、その結果として、酵素的方法の一利点、すなわち穏和な条件下での反応が再び取り消される。
【００１１】
最終的に、この方法は、出発化合物として純粋なピログルタミン酸エチルまたはメチルを使用することに限定され、すなわち、これらのエステルは、純粋な形態で最初に合成されなければならず、これは複雑である。
【００１２】
ピログルタミン酸エステルの可能性の大きさ、および現在利用可能な製造方法の不都合の著しさを考慮すると、工業グレードの低分子量ピログルタミン酸誘導体から出発して、実質的に定量収率で、迅速かつコスト効率が良く、これらの生成物を調製することができる方法に関する活動的な要求が続いている。
【００１３】
【特許文献１】ＥＰ−Ｂ−０  ３４２  ０５４号明細書
【特許文献２】ＥＰ−Ｂ−０  ３４２  ０５５号明細書
【特許文献３】ＥＰ−Ｂ−０  ３４２  ０５６号明細書
【特許文献４】ＤＥ−２１０２１７２号明細書
【特許文献５】ＤＥ−２１０２１７号明細書
【特許文献６】ＦＲ−Ａ−２  ８３３  ２６０号明細書
【特許文献７】ＤＥ  １０  ２００４  ００８  ０４２．９号明細書
【非特許文献１】ゲスライン（Ｇｅｓｓｌｅｉｎ）：コンディショニング  エージェンツ  フォー  ヘア  アンド  スキン（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｈａｉｒ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎ），第９５〜１１０頁；編集者：Ｒ．シェラー（Ｒ．Ｓｃｈｕｅｌｌｅｒ），Ｐ．ロマノスキー（Ｐ．Ｒｏｍａｎｏｗｓｋｉ）；マーセル  デッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）；ニューヨーク／バーセル（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／Ｂａｓｅｌ）１９９９
【非特許文献２】ジャーナル  オブ  インベスティゲーティブ  デマトロジー（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．）１９８３，８１，１２２−１２７
【非特許文献３】エンザイム  マイクロバイアル  テクノロジー（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．）２００３，３３，７９−８３
【非特許文献４】バイオテクノロジー  レター（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）２００４，２６，１９３−１９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、本発明の対象は、これらの要求条件を正確に満足させる方法を開発することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
驚くべきことに、工業的に単純な方法で、ピログルタミン酸およびその短鎖アルコールのエステルを、アルコールと、酵素的にエステル化またはエステル交換反応させることができることが見出された（スキーム１を参照のこと）。
【化１】
2006101877.tif 000002
スキーム１
【００１６】
従って、本発明は、一般式（Ｉ）
【化２】
2006101877.tif 000003
（式中、Ｒは、≧４の炭素原子を有するアルコールの炭化水素ラジカル（遊離基）である）の化合物の調製方法であって、著しい量の溶媒を使用せずに、好ましくは溶媒を使用せずに、好ましくは減圧下、１００℃未満の温度で、酵素、好ましくは加水分解酵素の種類からの酵素の存在下で、１以上の一般式（ＩＩ）
Ｒ−ＯＨ          （ＩＩ）
（式中、Ｒは上記で定義された通りである）のアルコールを、一般式（ＩＩＩ）
【化３】
2006101877.tif 000004
（式中、Ｒ１は、水素、あるいは１〜３個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキルもしくはアルケニル基のいずれかである）の化合物とエステル化および／またはエステル交換反応させる方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明に従って使用される一般式（ＩＩＩ）の化合物は、ピログルタミン酸（Ｒ１＝Ｈ）、短鎖アルコールとのエステル（式中、Ｒ１＝メチル、エチル、ビニルまたはイソプロピルラジカルである）の両方であるか、あるいは例えば、ピログルタミン酸とエタノールまたはメタノールとの不完全なエステル化の間に生じるような、それらの工業グレード混合物である。
【００１８】
これらは、例えば、０重量％〜１００重量％の量で、好ましくは０重量％〜５０重量％の量で、特に１０重量％〜４０重量％の量でＲ１が水素原子である比率で、Ｒ１が水素原子である化合物と、Ｒ１が、１〜３個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキルもしくはアルケニル基である化合物との混合物であってよい。例えば、未公開特許出願（特許文献７）に記載の通り、超臨界条件下でグルタミン酸を、対応する短鎖アルコール、好ましくはメタノールまたはエタノールと反応させた場合に、かかる混合物を好ましく得ることができる。
【００１９】
本発明に従って化合物を調製するために使用されるアルコールは、例えば、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、オクタノール、およびイソプロパノール、イソブタノール、２−エチルヘキサノール、イソノニルアルコールのようなそれらの異性体のような、４〜２２個の炭素原子を有する標準的な市販製品である。
【００２０】
加えて、既知の方法によって調製されるアルコールは、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、イソステアリン酸、ステアリン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、ジヒドロキシステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、ペトロセリン（ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｃ）酸、エライジン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、エルカ酸、ガドレイン酸、ナタネ油脂肪酸、ダイズ油脂肪酸、ヒマワリ油脂肪酸、獣脂油脂肪酸、パーム油脂肪酸、パーム核油脂肪酸、ヤシ脂肪酸のような、６〜２２個の炭素原子、特に１４〜１８個の炭素原子を有する天然植物油または動物油をベースとする一塩基脂肪酸を形成し、これらを単独で、または混合物中で使用することができる。
【００２１】
一般式（ＩＩ）の化合物と一般式（ＩＩＩ）の化合物との比率は、広範囲で変更可能である。この比率は、都合よく２：１未満、好ましくは１．５：１未満、特に約１：１であるべきである。
【００２２】
本発明に従って使用することができる酵素は、加水分解酵素の群からの酵素、例えば、リパーゼ、エステラーゼまたはプロテアーゼであり、例えば、カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、サーモマイセス  ランゴシオサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｇｏｓｉｏｓｕｓ）、ブタすい臓、ムコール  ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、アルカリジンズ属（Ａｌｃａｌｉｇｉｎｅｓ  ｓｐ．）からのリパーゼ、カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）からのコレステロールエステラーゼ、またはブタ肝臓からのエステラーゼであり、好ましくはカンジダ  アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）からのリパーゼＢを使用する。
【００２３】
遊離型、または適切な担体に固定化された状態で、本発明に従って酵素を使用することができる。
【００２４】
本発明に従って、酵素として、（全反応物質の初期重量を基準として）５重量％未満、好ましくは２重量％未満のカンジダ  アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）からの固定化リパーゼＢを使用することが好ましい。
【００２５】
本発明の方法において、対応する反応物質を、上記された比率で適切な反応器（例えば、撹拌機を備えた丸底フラスコ、または固定床式反応器）中で混合し、そして使用される生体触媒の最適作用温度まで加熱する。使用される生体触媒次第で、この温度は２０℃〜１００℃、好ましくは３５℃〜７０℃である。固定床式反応器を使用する場合、選択された酵素によって固定床を充填し、そして反応温度に到達した後、ポンプで反応混合物を固定床に通す。固定床式反応器を使用しない場合、酵素を直接的に反応混合物に添加して、そして反応完了時に、適切なデバイスを通して濾去する。
【００２６】
本発明の方法において、全種類の追加的溶媒を使用しないことが可能である。最も完全な転換の可能性を達成するために、反応を減圧下で実行し、得られる反応水（ピログルタミン酸を使用する場合）または遊離の短鎖アルコール（対応するエステルを使用する場合）を蒸留によって除去する。確定されるべき大気圧より低い圧力は、反応温度、除去されるべきいずれのアルコールＲ１−ＯＨの沸点、および除去されるべき反応凝縮物の沸点次第である。この圧力は、反応間に出発材料として使用される一般式（ＩＩ）のアルコールを可能な限り多量に反応容器に残しながら、除去されるべき成分が留去されることを確実にするべきである。
【００２７】
本発明の方法によって、方法パラメーター（出発化合物としてのピログルタミン酸の割合、使用される酵素の種類および量）次第で、８時間〜２４時間以内に定量的転換（１Ｈ  ＮＭＲによって決定され、この方法の検出限度は、約９８％の転換度である）が達成される。
〔実施例〕
【実施例１】
【００２８】
ピログルタミン酸オレイルの調製
多頚丸底フラスコにおいて、初期充填として、ピログルタミン酸エチルおよびピログルタミン酸の混合物（モル比７１：２９）１９．２ｇ（１２９ミリモル）と、オレイルアルコール３４．７ｇ（１２９ミリモル）とを６０℃まで加熱する。２．６ｇのノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）４３５（Ｃ．アンタルクチカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）からの固定化リパーゼＢ）を添加後、真空を適用し（２０ｍｂａｒ）、そして低沸点反応生成物を留去する。ＮＭＲ分光法の手段によって、または適切なクロマトグラフ法の手段によって反応をモニターする。８時間後の転換：９８％、２４時間後の転換：＞９８％である。反応完了時に固定化酵素を濾去する。この濾液から、さらなるワークアップをせずに淡黄色液体として４９．０ｇの生成物（理論収率の１００％）が得られる。
【００２９】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ＝８．０（ｂｒ，ｓ，１Ｈ），５．３（ｍ，２Ｈ），４．１（ｄｄ，３Ｊ＝８．６Ｈｚ，３．９Ｈｚ，１Ｈ），４．０（ｔｄ，３Ｊ＝６．６Ｈｚ，２．１Ｈｚ，２Ｈ），２．３（ｍ，１Ｈ），２．１（ｍ，２Ｈ），２．０（ｍ，５Ｈ），１．６（ｍ，２Ｈ），１．３（ｍ，２２Ｈ），０．８（ｔ，３Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）．
【実施例２】
【００３０】
ピログルタミン酸オレイルの調製
実施例１と同様に、ピログルタミン酸エチルおよびピログルタミン酸の混合物（モル比に関しては表１を参照のこと）２０ｇを、１当量のオレイルアルコールおよび５重量％のノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）４３５と反応させる。８時間後および２４時間後、反応転換をＮＭＲ分光法（ＤＭＳＯ−ｄ６中１Ｈ  ＮＭＲ）の手段によって決定する。
【００３１】
【表１】
2006101877.tif 000005
【実施例３】
【００３２】
ピログルタミン酸オレイルの調製
多頚丸底フラスコにおいて、初期充填として、ピログルタミン酸エチルおよびピログルタミン酸の混合物（モル比７１：２９）１９．２ｇ（１２９ミリモル）と、オレイルアルコール３４．７ｇ（１２９ミリモル）とを６０℃まで加熱する。１．０７ｇのノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）４３５（Ｃ．アンタルクチカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）からの固定化リパーゼＢ）を添加後、真空を適用し（２０ｍｂａｒ）、そして低沸点反応生成物を留去する。ＮＭＲ分光法の手段によって、または適切なクロマトグラフ法の手段によって反応をモニターする。８時間後の転換：９５％、２４時間後の転換：＞９８％である。反応完了時に固定化酵素を濾去する。この濾液から、さらなるワークアップをせずに淡黄色液体として４９．０ｇの生成物（理論収率の１００％）が得られる。
【００３３】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ＝８．０（ｂｒ，ｓ，１Ｈ），５．３（ｍ，２Ｈ），４．１（ｄｄ，３Ｊ＝８．６Ｈｚ，３．９Ｈｚ，１Ｈ），４．０（ｔｄ，３Ｊ＝６．６Ｈｚ，２．１Ｈｚ，２Ｈ），２．３（ｍ，１Ｈ），２．１（ｍ，２Ｈ），２．０（ｍ，５Ｈ），１．６（ｍ，２Ｈ），１．３（ｍ，２２Ｈ），０．８（ｔ，３Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）．
【実施例４】
【００３４】
ピログルタミン酸オクチルの調製
多頚丸底フラスコにおいて、初期充填として、ピログルタミン酸エチルおよびピログルタミン酸の混合物（モル比７１：２９）５０．０ｇ（３３６ミリモル）と、オクタノール４３．７ｇ（３３６ミリモル）とを６０℃まで加熱する。４．６ｇのノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）４３５（Ｃ．アンタルクチカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）からの固定化リパーゼＢ）を添加後、真空を適用し（２０ｍｂａｒ）、そして低沸点反応生成物を留去する。ＮＭＲ分光法の手段によって、または適切なクロマトグラフ法の手段によって反応をモニターする。８時間後の転換：９５％、２４時間後の転換：＞９８％である。反応完了時に固定化酵素を濾去する。この濾液から、さらなるワークアップをせずに淡黄色液体として８１ｇの生成物（理論収率の１００％）が得られる。
【００３５】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ＝８．０（ｂｒ，ｓ，１Ｈ），４．２（ｄｄ，３Ｊ＝８．６Ｈｚ，４．３Ｈｚ，１Ｈ），４．１（ｔ，３Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．３（ｍ，１Ｈ），２．１（ｍ，２Ｈ），２．０（ｍ，１Ｈ），１．６（ｍ，２Ｈ），１．３（ｍ，１０Ｈ），０．８（ｔ，３Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）．
【実施例５】
【００３６】
ピログルタミン酸ラウリルの調製
多頚丸底フラスコにおいて、初期充填として、ピログルタミン酸エチルおよびピログルタミン酸の混合物（モル比７７：２３）５１．０ｇ（３３９ミリモル）と、ラウリルアルコール６３．１ｇ（３３９ミリモル）とを６０℃まで加熱する。５．７ｇのノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）４３５（Ｃ．アンタルクチカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）からの固定化リパーゼＢ）を添加後、真空を適用し（２０ｍｂａｒ）、そして低沸点反応生成物を留去する。ＮＭＲ分光法の手段によって、または適切なクロマトグラフ法の手段によって反応をモニターする。８時間後の転換：９７％、２４時間後の転換：＞９８％である。反応完了時に固定化酵素を濾去する。この濾液から、さらなるワークアップをせずに淡黄色固体として１００．７ｇの生成物（理論収率の１００％）が得られる。
【００３７】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ＝８．０（ｂｒ，ｓ，１Ｈ），４．２（ｄｄ，３Ｊ＝８．６Ｈｚ，３．５Ｈｚ，１Ｈ），４．１（ｔ，３Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．３（ｍ，１Ｈ），２．１（ｍ，２Ｈ），２．０（ｍ，１Ｈ），１．６（ｍ，２Ｈ），１．３（ｍ，１８Ｈ），０．８（ｔ，３Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）．
【実施例６】
【００３８】
ピログルタミン酸２−ヘキシルデシルの調製
多頚丸底フラスコにおいて、初期充填として、ピログルタミン酸エチルおよびピログルタミン酸の混合物（モル比９０：１０）２７．３ｇ（１７７ミリモル）と、２−ヘキシルデシルアルコール（イソフォール（Ｉｓｏｆｏｌ）−１６）４２．９ｇ（１７７ミリモル）とを６０℃まで加熱する。３．４ｇのノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）４３５（Ｃ．アンタルクチカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）からの固定化リパーゼＢ）を添加後、真空を適用し（２０ｍｂａｒ）、そして低沸点反応生成物を留去する。ＮＭＲ分光法の手段によって、または適切なクロマトグラフ法の手段によって反応をモニターする。８時間後の転換：９７％、２４時間後の転換：＞９８％である。反応完了時に固定化酵素を濾去する。この濾液から、さらなるワークアップをせずに淡黄色固体として６２．５ｇの生成物（理論収率の１００％）が得られる。
【００３９】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ＝８．０（ｂｒ，ｓ，１Ｈ），４．２（ｍ，１Ｈ），４．１（ｍ，２Ｈ），２．３（ｍ，１Ｈ），２．１（ｍ，２Ｈ），１．９（ｍ，１Ｈ），１．６（ｍ，２Ｈ），１．３（ｍ，２４Ｈ），０．８（ｔ，３Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ）．