(57)【要約】【課題】  血管再生に応用可能な化合物を提供する。【解決手段】  有効成分として、式（１）もしくは式（２）で表されるピリミジン化合物等を含有する幹細胞および／または内皮前駆細胞の分化促進剤等が提供される。【化１】2006083095.tif 000007（式（１）または式（２）において、  Ｒ1からＲ8は、各々独立に、水素、低級アルキル基、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、−ＣＯＣＨ3、−ＣＯＣ2Ｈ5、または−ＣＨ2ＯＣＯＣ2Ｈ5を表し、  Ｘは、＞ＮＨ、＞Ｎ−ＣＨ3、＞Ｎ−Ｃ2Ｈ5、＞Ｎ−ｐｈ、＞Ｎ−ＣＨ2−ｐｈ、＞Ｎ−ＣＨ−ｐｈ2、＞Ｎ−ＣＯＣＨ3、＞Ｎ−ＣＯＯＣ2Ｈ5、＞Ｎ−ＳＯ2ＣＨ3、＞ＣＨ2、＞ＣＨＣＨ3、＞ＣＨＣ2Ｈ5、−Ｏ−、または−Ｓ−を表す。  ただし、ｐｈはフェニル基を示す。）【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、式（１）もしくは式（２）で表されるピリミジン化合物またはその塩もしくはそのプロドラッグを含有する幹細胞および／または内皮前駆細胞の分化促進剤。
【化１】
2006083095.tif 000005
（式（１）または式（２）において、
Ｒ1からＲ8は、各々独立に、水素、低級アルキル基、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、−ＣＯＣＨ3、−ＣＯＣ2Ｈ5、または−ＣＨ2ＯＣＯＣ2Ｈ5を表し、
Ｘは、＞ＮＨ、＞Ｎ−ＣＨ3、＞Ｎ−Ｃ2Ｈ5、＞Ｎ−ｐｈ、＞Ｎ−ＣＨ2−ｐｈ、＞Ｎ−ＣＨ−ｐｈ2、＞Ｎ−ＣＯＣＨ3、＞Ｎ−ＣＯＯＣ2Ｈ5、＞Ｎ−ＳＯ2ＣＨ3、＞ＣＨ2、＞ＣＨＣＨ3、＞ＣＨＣ2Ｈ5、−Ｏ−、または−Ｓ−を表す。
ただし、ｐｈはフェニル基を示す。）
【請求項２】
幹細胞および／または内皮前駆細胞を血管内皮細胞へ分化させるための請求項１に記載の剤。
【請求項３】
有効成分として、実質的に請求項１に記載のピリミジン化合物またはその塩もしくはそのプロドラッグのみを含有する血管新生促進剤。
【請求項４】
有効成分として、請求項１に記載のピリミジン化合物またはその塩もしくはそのプロドラッグを含有する虚血性疾患治療剤。
【請求項５】
請求項１に記載のピリミジン化合物またはその塩もしくはそのプロドラッグの存在下で、幹細胞、内皮前駆細胞および／または血管内皮細胞を培養するステップを含む幹細胞および／または内皮前駆細胞の培養方法。
【請求項６】
移植治療用の細胞を調製するための請求項５に記載の培養方法。
【請求項７】
請求項５または６に記載の方法により得られた細胞。
【請求項８】
幹細胞および／または内皮前駆細胞を、式（１）もしくは式（２）で表されるピリミジン化合物またはその塩もしくはそのプロドラッグに暴露するステップを含む幹細胞および／または内皮前駆細胞の分化を促進する方法。
【化２】
2006083095.tif 000006
（式（１）または式（２）において、
Ｒ1からＲ8は、各々独立に、水素、低級アルキル基、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、−ＣＯＣＨ3、−ＣＯＣ2Ｈ5、または−ＣＨ2ＯＣＯＣ2Ｈ5を表し、
Ｘは、＞ＮＨ、＞Ｎ−ＣＨ3、＞Ｎ−Ｃ2Ｈ5、＞Ｎ−ｐｈ、＞Ｎ−ＣＨ2−ｐｈ、＞Ｎ−ＣＨ−ｐｈ2、＞Ｎ−ＣＯＣＨ3、＞Ｎ−ＣＯＯＣ2Ｈ5、＞Ｎ−ＳＯ2ＣＨ3、＞ＣＨ2、＞ＣＨＣＨ3、＞ＣＨＣ2Ｈ5、−Ｏ−、または−Ｓ−を表す。
ただし、ｐｈはフェニル基を示す。）
【請求項９】
幹細胞および／または内皮前駆細胞を血管内皮細胞へ分化させるための請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
血管内皮細胞を、請求項１に記載のピリミジン化合物またはその塩もしくはそのプロドラッグに暴露するステップを含む血管内皮細胞の遊走を促進する方法。
【請求項１１】
血管内皮細胞を、請求項１に記載のピリミジン化合物またはその塩もしくはそのプロドラッグに暴露するステップを含む血管内皮細胞による管腔形成を促進する方法。
【請求項１２】
内皮前駆細胞を、請求項１に記載のピリミジン化合物またはその塩もしくはそのプロドラッグに暴露するステップを含む内皮前駆細胞の血中への動員を促進する方法。
【請求項１３】
幹細胞、内皮前駆細胞および／または血管内皮細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子に暴露することなしに、請求項１に記載のピリミジン化合物またはその塩もしくはそのプロドラッグに暴露するステップを含むアンジオジェネシスを促進する方法。
【請求項１４】
幹細胞、内皮前駆細胞および／または血管内皮細胞を、請求項１に記載のピリミジン化合物またはその塩もしくはそのプロドラッグに暴露するステップを含むバスキュロジェネシスを促進する方法。
【請求項１５】
幹細胞、内皮前駆細胞および／または血管内皮細胞を、請求項１に記載のピリミジン化合物またはその塩もしくはそのプロドラッグに暴露するステップを含むアンジオジェネシスおよびバスキュロジェネシスを促進する方法。
【請求項１６】
前記暴露するステップが、インビトロまたはエクスビボで行われる請求項８〜１５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生に関する。特に、本発明は、幹細胞および／または内皮前駆細胞の分化促進剤、血管新生促進剤、虚血性疾患治療剤、幹細胞および／または内皮前駆細胞の培養方法、当該培養方法により得られた細胞、幹細胞および／または内皮前駆細胞の分化を促進する方法、血管内皮細胞の遊走を促進する方法、血管内皮細胞による管腔形成を促進する方法、内皮前駆細胞の血中への動員を促進する方法、ならびに、アンジオジェネシスおよび／またはバスキュロジェネシスを促進する方法、に関する。
【背景技術】
【０００２】
胎児の血管形成は、バスキュロジェネシス（血管発生、脈管形成）とアンジオジェネシス（狭義の血管新生）の２つの異なるプロセスからなる。バスキュロジェネシスは、胎生期、中胚葉由来の幹細胞（血管芽細胞、血球血管芽細胞）が内皮細胞(ECs: endothelial cells)へと分化し、原始血管叢を形成するプロセスである。アンジオジェネシスは原始血管叢の再構築によって新しい血管が形成されるプロセスであり、内皮細胞による細胞外基質の消化、遊走、増殖、管腔形成等からなる（非特許文献１，２）。このようにして形成された血管は周囲を壁細胞（平滑筋細胞やペリサイト）によって被覆され、成熟した血管となる（非特許文献３〜５）。生後にも血管は新生される。これまで生後に生じる血管新生はすべてアンジオジェネシスであると考えられていたが、1997年Asaharaらは、生後にもバスキュロジェネシスが生じることを初めて報告した（非特許文献６）。すなわち、血液中には内皮前駆細胞(EPCs: endothelial progenitor cells)が存在し、血管新生部位に到達し、内皮細胞へと分化して血管新生に加担するというのである。内皮前駆細胞は、末梢血（非特許文献６）、骨髄（非特許文献７，８）、臍帯血（非特許文献９，１０）、胎児肝臓（非特許文献１１）、胎児骨格筋（非特許文献１２）などに存在することが示されている。
【０００３】
また、非特許文献１３に記載のように、血管新生は既存の血管から内皮細胞が出芽して新しい血管網が形成される現象であるといわれ、胎生期の血管形成、成長に伴う心臓・血管系の発達、子宮粘膜での周期的な血管網の増生、卵巣における卵胞の発育や黄体形成に伴う血管網の発達、創傷治癒などにおいての生理的な血管新生と、固形腫瘍や糖尿病性網膜症などにおける血管の過剰増殖の如き、病的な血管新生に分けられている（非特許文献１４，１５）。この区分けは、正常状態においては血管新生は一過性であり、異常・病的状態においては持続的で、病態の進展を促進するものという規定に基づくものであると考えられる。
【０００４】
血管新生にかかわる生体物質として、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic FGF: acidic fibroblast growth factor)、塩基性線維芽細胞増殖因子(basic FGF: basic fibroblast growth factor)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF: vascular endothelial growth factor)、肝細胞増殖因子(HGF: hepatocyte growth factor)、上皮細胞増殖因子(EGF: epidermal growth factor)などの増殖因子が知られている。血管新生因子の活性はニワトリの受精卵漿尿膜を用いるＣＡＭ(chorioallantoic membrane)法や、実験動物の組織に傷害を与えて伸長する血管を検出する方法などによって、測定されている（非特許文献１４）。
【０００５】
生体の各組織における恒常的な傷害や外傷を修復するのに、古今、生体の自然治癒能におまかせのところがあるのは事実であるが、創傷の治癒を促進するための医療が、遺伝子組換え技術の進展によって、今日可能となりつつある。すなわち、上にあげた、創傷部位において、発現し、血管新生や様々な細胞の遊走や分化を促進し、細胞の増殖を担う増殖分化因子を遺伝子工学的手法で、大量に調製し臨床効果が検討されている。また、増殖因子タンパクそのものではなく、その遺伝子発現を誘導する遺伝子治療もかたや検討されている。しかしながら、タンパクや遺伝子の生体への投与法と効果発現方法には、多くの解決すべき問題点があることも周知のことであり、これら増殖因子の作用の数分の１でも効果を持つような低分子ペプチドや、生体への投与が比較的容易な合成化合物を見出す努力も加速する必要があると考えられる。
【０００６】
ここで、合成ピリミジン化合物（ピリミジン誘導体とも記す。）である２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン(2-piperadino-6-methyl-5-oxo-5,6-dihydro(7H) pyrrolo[3,4-d]pyrimidine)(以下、MS-818とも記す。)等は、神経芽腫由来の細胞株において神経突起の伸張を促進する（非特許文献１６）。さらにMS-818は神経軸索の伸張、再生（非特許文献１７〜２０）、神経膠細胞の分化（非特許文献２１）、神経細胞の生存（非特許文献２２）等を促進することが知られている。神経系以外に対する作用として、Yasuharaらは、鶏受精卵絨毛尿膜におけるｂＦＧＦの血管新生作用をMS-818が促進することを報告しているが、MS-818単独の作用については不明である（非特許文献２３）。さらに、MS-818には、胃粘膜上皮の再生（非特許文献２４）、骨折の治癒（非特許文献２５）、大脳虚血後の回復（非特許文献２６）、骨格筋の再生（非特許文献２７、２８）などの効果があることが報告されている。これらに基づき、MS-818等は、神経細胞の再生（特許文献１〜３）や、創傷治療（特許文献４、非特許文献２９、３０）への応用が期待されている。
【０００７】
具体的には、本発明者らが、かつて神経芽腫瘍細胞の神経突起伸展活性を見出した以下に示すMS-818、MS-820、MS-430などの合成ピリミジン誘導体（非特許文献２９，特許文献２，３，５）はまた、ＮＧＦ添加によってはじめて神経細胞様細胞に分化するラットＰＣ１２細胞に対して、ＮＧＦと併用すると神経突起伸長効果を増強することが示された（非特許文献１６）。この２系統の細胞系への合成ピリミジン誘導体の知見は、シグナルオン状態時の作用という意味で大変示唆的であった。ＮＧＦに限らず、神経分化誘導性(neurotrophic)な作用を持つｂＦＧＦやＩＧＦ−１などの増殖因子をマウスやラットの胎児の大脳や脊髄の神経細胞の初代培養に加える実験で、MS-818を併用すると、同様の神経突起伸展の増強効果も、予想通り見出されたのである（非特許文献２２、非特許文献３１）。MS-818、MS-430はインビトロの効果のみならず、末梢神経の圧挫や切断されたラット（非特許文献１７、３２〜３９）やマウス（非特許文献１８、１９、４０）の神経傷害モデルや、ラット筋肉切断−縫合モデル（非特許文献２７、２８）での有効性も見出されている。中枢神経系の傷害モデルにおいても、MS-818は治癒促進効果を有する（非特許文献２６、４１，４２）。
【０００８】
【化１】
2006083095.tif 000002
【０００９】
脳神経系疾患は、神経系細胞の傷害のみならず、血管傷害によってもおこるが、山口大学・脳神経外科の伊藤治英教授、柏木史郎講師、安原新子医師はモヤモヤ病に対する間接的血管吻合術の効果を補助する手段としてｂＦＧＦの投与を考えておられた。そこでｂＦＧＦのニワトリ胚の漿尿膜での血管新生作用をMS-818が促進することを期待して共同研究を行った。ｂＦＧＦの1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml単独群、MS-818の0.01mM、0.1mM、1mM単独群、そして各濃度のｂＦＧＦに各濃度のMS-818を添加した混合群の血管新生能をＣＡＭ法で測定した（非特許文献２３）。
【００１０】
この非特許文献によれば、ｂＦＧＦ単独群は対照に比べ血管新生能があり、濃度依存の傾向があったが、1、10、100ng/mlの各比較では有意差は認められなかった。MS-818単独群でも高濃度では血管新生能を認めたが、対照に比べ有意差はなかった。10ng/mlのｂＦＧＦとMS-818の混合群は、各単独群に比べ有意に高い血管新生能を示した。10ng/mlのｂＦＧＦに0.01mMという比較的低濃度のMS-818を添加しただけで、100ng/mlのｂＦＧＦを凌駕する血管新生が見られたことが特筆された。他の知見も含めてMS-818の併用実験によってｂＦＧＦの至適濃度域が10ng/ml付近にあることがわかった。
【００１１】
なお、非特許文献２３では、ｂＦＧＦとMS-818をしみこませたディスクの周囲で血管新生が起きているので、MS-818がｂＦＧＦの血管新生作用の増強効果を有することまでは明らかにされたと言える。一方で、この文献においては、ニワトリの受精卵を用いて、MS-818の効果を調べただけであり、どのようなパスウェイで血管新生作用がもたらされたのかは全く不明であった。
【００１２】
【特許文献１】米国特許出願公開公報第2003/0139410号
【特許文献２】特許第2561689号公報
【特許文献３】特許第2628707号公報
【特許文献４】特開平9-295946号公報
【特許文献５】特許第2825092号公報
【特許文献６】米国特許第4959368号
【特許文献７】米国特許第5304555号
【特許文献８】特開平1-40483号公報
【特許文献９】特開平2-221275号公報
【特許文献１０】特公平8-5887号公報
【非特許文献１】Folkman J, Shing Y. Angiogenesis. J Biol Chem. 1992; 267:10931-10934
【非特許文献２】Bussolino F, Mantovani A, Persico G. Molecular mechanisms of blood vessel formation. Trends Biochem Sci. 1997; 22:251-256.
【非特許文献３】Risau W. Differentiation of endothelium. FASEB J. 1995; 9: 926-933.
【非特許文献４】Beck L Jr, D'Amore PA. Vascular development: cellular and molecular regulation. FASEB J. 1997; 11:365-373.
【非特許文献５】Risau W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 1997: 386;671-674.
【非特許文献６】Asahara T, Murohara T, Sullivan A, Silver M, van der Zee R, Li T, Witzenbichler B, Schatteman G, Isner JM. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 1997;275;964-967.
【非特許文献７】Quirici N, Soligo D, Caneva L, Servida F, Bossolasco P, Deliliers GL. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells. Br J Haematol. 2001;115:186-194.
【非特許文献８】Reyes M, Dudek A, Jahagirdar B, Koodie L, Marker PH, Verfaillie CM. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. J Clin Invest. 2002 ;109:337-346.
【非特許文献９】Nieda M, Nicol A, Denning-Kendall P, Sweetenham J, Bradley B, Hows J. Endothelial cell precursors are normal components of human umbilical cord blood. Br J Haematol. 1997;98:775-777.
【非特許文献１０】Peichev M, Naiyer AJ, Pereira D, Zhu Z, Lane WJ, Williams M, Oz MC, Hicklin DJ, Witte L, Moore MA, Rafii S. Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34+ cells identifies a population of functional endothelial precursors. Blood. 2000; 95 952-958.
【非特許文献１１】Salven P, Mustjoki S, Alitalo R, Alitalo K, Rafii S. VEGFR-3 and CD133 identify a population of CD34+ lymphatic/vascular endothelial precursor cells. Blood. 2003; 101:168-172.
【非特許文献１２】Majka SM, Jackson KA, Kienstra KA, Majesky MW, Goodell MA, Hirschi KK. Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration. J Clin Invest. 2003; 111:71-79.
【非特許文献１３】粟屋昭:血管新生を促進する合成ピリミジン誘導体MS-818:ニューサイエンス社,細胞,1999年31巻3号(通巻396号):p40-44.[A synthesized pyrimidine compound, MS-818 promotes angiogenesis.]
【非特許文献１４】深田允子,三井洋司:血管新生とFGF:実験医学Vol.10, No.1, 48-53, 1992.
【非特許文献１５】佐藤靖史:癌と血管新生:Mebio Vol.15, No.3, 105-109, 1998.
【非特許文献１６】Awaya A, Kobayashi H, Horikomi K, Tanaka S, Kabir A, Yokoyama K, Ohno H, Kato K, Kitahara T, Tomino I, Isayama S, Nakamura S. Neurotropic pyrimidine heterocyclic compounds. I. The new synthesized pyrimidine compounds promote neurite outgrowth of GOTO and Neuro 2a neuroblastoma cell lines, and potentiate nerve growth factor (NGF)-induced neurite sprouting of PC 12 cells. Biol Pharm Bull. 1993; 16:248-253.
【非特許文献１７】Itoh S, Samejima H, Shinomiya K, Awaya A. The effect of neurotrophic pyrimidine heterocyclic compounds, MS-818 and MS-430, on the regeneration of injured peripheral nerves. Restor Neurol Neurosci. 1999;14:265-273.
【非特許文献１８】Jiang XM, Ohnishi A, Yamamoto T, Murai Y, Awaya A, Ikeda M. The effect of MS-818, a pyrimidine compound, on the regeneration of peripheral nerve fibers of mice after a crush injury. Acta Neuropathol (Berl). 1995;90:130-134.
【非特許文献１９】Torigoe K, Awaya A. A newly synthesized neurotropic pyrimidine compound, MS-818, may activate migratory schwann cells in peripheral nerve regeneration. Brain Res. 1998;787:337-340.
【非特許文献２０】Fukuyama R, Ohta M, Ohta K, Saiwaki T, Fushiki S, Awaya A. A synthesized pyrimidine compound, MS-818, promotes walking function recovery from crush injury of the sciatic nerve through its indirect stimulation of Schwann cells. Restor Neurol Neurosci. 2000;17:9-16.
【非特許文献２１】Koyama Y, Awaya A, Ishikawa N, Fujita S, Tomino I, Yokoyama K, Araki S, Takesue M, Kato K, Ishiguro M, Kitahara T, Kihara N, Baba A.  Neurotrophic pyrimidine heterocyclic compounds. II. Effect of novel neurotrophic pyrimidine derivatives on astrocytic morphological differentiation.  Biol. Pharm. Bull. 1997; 20:138-141.
【非特許文献２２】Sanjo N, Owada K, Kobayashi T, Mizusawa H, Awaya A, Michikawa M. A novel neurotrophic pyrimidine compound MS-818 enhances neurotrophic effects of basic fibroblast growth factor.  J. Neuroscience Research. 1998; 54: 604-612.
【非特許文献２３】Yasuhara S., Kashiwagi S., Ito H. Awaya A.  The neurotrophic pyrimidine heterocyclic compound MS-818 promotes the angiogenesis induced by basic FGF.  Int. J. Clin. Pharm. Res 1995; XV(5/6):167-174.
【非特許文献２４】Watanabe S, Wang XE, Hirose M, Osada T, Yoshizawa T, Tanaka H, Itatsu T, Nakajima M, Yamamoto J, Miwa H, Miyazaki A, Awaya A, Sato N.  A neurotrophic pyrimidine compound, MS-818, enhances EGF-induced restoration of gastric epithelial wounds in vitro. J. Clin. Gastroenterol. 1998; 27: S105-S109.
【非特許文献２５】Yoshikawa M, Saura R, Mizuno K, Awaya A. The effect of MS-818, newly synthesized pyrimidine compound, on fracture repair. Kobe J. Med. Sci. 2000; 46: 265-282.
【非特許文献２６】Mitsuyama T, Kawamata T, Yamane F, Awaya A, Hori T. Role of a synthetic pyrimidine compound, MS-818, in reduction of infarct size and amelioration of sensorimotor dysfunction following permanent focal cerebral ischemia in rats. J Neurosurg. 2002;96:1072-1076.
【非特許文献２７】Sugiyama N, Yoshimura A, Fujitsuka C, Iwata H, Awaya A, Mori S, Yoshizato H, Fujitsuka N. Acceleration by MS-818 of early muscle regeneration and enhanced muscle recovery after surgical transection. Muscle Nerve. 2002;25:218-229.
【非特許文献２８】杉山宜幸,吉村篤司,藤墳規明,粟屋昭ほか:ラット筋切断縫合モデルにおける神経成長因子様活性化合物(MS-818)の効果:日本整形外科学会雑誌(J. Jpn. Orthop. Assoc.)68(8), S1507,1994年.
【非特許文献２９】Akira Awaya, Hisashi Kobayashi, Kazutoshi Horikomi, Shuitsu Tanaka, Shun Nakamura et al. Neurotropic Pyrimidine Heterocyclic Compounds. I. The Newly Synthesized Pyrimidine Compounds Promote Neurite Outgrowth of GOTO and Neuro 2a Neuroblastoma Cell Lines, and Potentiate Nerve Growth Factor (NGF)-Induced Neurite Sprouting of PC 12 Cells. Biol. Pharm. Bull. 16(3) 248-253 (1993).
【非特許文献３０】粟屋昭:組織傷害の修復・再生や創傷治癒を促進する合成ピリミジン化合物MS-818:組織培養工学28(3), 2002:p20-25.[MS-818, a synthesized pyrimidine compound, promotes restoration, regeneration and wound healing of tissue injuries.]
【非特許文献３１】三條伸夫,道川誠,小林高義,粟屋昭:ラット脊髄,マウス大脳皮質ニューロンにおける向神経性合成ピリミジン誘導体MS-818の各種神経栄養因子に対する併用効果の検討:第37回日本神経学会総会プログラム/抄録,148頁,1996年.
【非特許文献３２】大西晃生,山本辰紀,村井由之,粟屋昭:末梢神経再生に対する合成ピリミジン誘導体MS-430の投与効果−形態計測学的研究−:J UOEH(産業医科大学雑誌)17(2)131-139(1995).
【非特許文献３３】Mitsuo Ochi, Masayuki Noda, Yoshikazu Ikuta, Akira Awaya et al. Promotion of Sciatic Nerve Regeneration in Rats by a New Neurotrophic Pyrimidine Derivative MS-430. Gen. Pharmac. Vol.26, No.1, pp.59-64, 1995.
【非特許文献３４】Katsumi Ohbayashi, Hiroshi K.Inoue, Akira Awaya, Chihiro Ohye et al.: Peripheral Nerve Regeneration in a Silicone Tube Effect of Collagen Sponge Prosthesis, Laminin, and Pyrimidine Compound Administration.: Neurol Med Chir (Tokyo) 36, 428-433, 1996.
【非特許文献３５】伊藤聰一郎,鮫島弘武,四宮謙一,粟屋昭:神経再生における合成pyrimidine化合物の効果について:日本手の外科学会雑誌(J. Jpn. Soc. Surg. Hand)第15巻, 第4号, 542-546, 1998.
【非特許文献３６】福山隆一,伏木信次,粟屋昭:挫滅されたラット坐骨神経の再生・修復における合成ピリミジン誘導体,MS-818の効果について:神経組織の成長・再生・移植研究会 第13回学術集会抄録, 85-86頁, 1998年.
【非特許文献３７】Masayuki Noda, Mitsuo Ochi. Yoshikazu Ikuta and Akira Awaya:Increase of Nerve Regeneration Capacity by New Neurotrophic Pyrimidine Derivative MS-430.: Gen. Pharmac. Vol.31, No.5, pp821-824. 1998.
【非特許文献３８】Soichiro Itoh, Hirotake Samejima, Kenichi Shinomiya and Akira Awaya: The effect of neurotrophic pyrimidine heterocyclic compounds, MS-818 and MS-430, on the regeneration of injured peripheral nerves.: Restorative Neurology & Neuroscience, 14,265-273 (1999).
【非特許文献３９】神経再生における合成pyrimidine化合物の効果について  伊藤聰一郎，鮫島弘武，四宮謙一，粟屋  昭：日本手の外科学会雑誌（J.Jpn.Soc.Surg.Hand）第15巻，第４号，542-546，1998．
【非特許文献４０】末梢神経再生に対する合成ピリミジン化合物MS-430の投与効果  −形態計測学的研究−  大西晃生，山本辰紀，村井由之，粟屋  昭：J UOEH（産業医科大学雑誌）17(2)131-139(1995).
【非特許文献４１】高屋豪瑩,粟屋昭:DMM投与ラットでの後根神経有髄神経線維変性への神経成長因子様合成化合物MS-818の作用:第15回日本神経治療学会総会プログラム・抄録,77頁,1997年.
【非特許文献４２】藤墳チエ,伊藤実知子,粟屋昭,藤墳規明:慢性的な片側頸動脈閉塞による海馬CA1野神経細胞の変性とMS-818投与の効果:日本神経科学学会学術大会Pl-73-07,1998.[Effects of MS-818 on the Hippocampal Neurons Exposed Chronically to Uni1ateral Cerebral Occlusion in the Rat.: Neuroscience Research, Supplement 22, S351, 1998.]
【非特許文献４３】佐田政隆,永井良三:薬物による血管新生療法:第120回日本医学会シンポジウム:p68-73
【非特許文献４４】室原豊明:造血幹細胞を利用した血管新生療法:Molecular Medicine, Vol.40, No.12, 2003:p1442-1449
【非特許文献４５】Sato Y, Rifkin DB. Autocrine activities of basic fibroblast growth factor: regulation of endothelial cell movement, plasminogen activator synthesis, and DNA synthesis. J Cell Biol. 1988;107:1199-205.
【非特許文献４６】Sato Y, Okamura K, Morimoto A, Hamanaka R, Hamaguchi K, Shimada T, Ono M, Kohno K, Sakata T, Kuwano M. Indispensable role of tissue-type plasminogen activator in growth factor-dependent tube formation of human microvascular endothelial cells in vitro. Exp Cell Res. 1993;204:223-229.
【非特許文献４７】Nakagawa T, Abe M, Yamazaki T, Miyashita H, Niwa H, Kokubun S, Sato Y. HEX acts as a negative regulator of angiogenesis by modulating the expression of angiogenesis-related gene in endothelial cells in vitro. Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol. 2003;23: 231-237.
【非特許文献４８】Iwasaka C, Tanaka K, Abe M, Sato Y. Ets-1 regulates angiogenesis by inducing the expression of urokinase-type plasminogen activator and matrix metalloproteinase-1 and the migration of vascular endothelial cells. J Cell Physiol. 1996;169:522-531.
【非特許文献４９】Takahashi T, Kalka C, Masuda H, Chen D, Silver M, Kearney M, Magner M, Isner JM, Asahara T. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 1999; 5:434-438.
【非特許文献５０】Vasa M, Fichtlscherer S, Adler K, Aicher A, Martin H, Zeiher AM, Dimmeler S. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 2001;103:2885-2890.
【非特許文献５１】Walter DH, Rittig K, Bahlmann FH, Kirchmair R, Silver M, Murayama T, Nishimura H, Losordo DW, Asahara T, Isner JM. Statin therapy accelerates reendothelialization: a novel effect involving mobilization and incorporation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells. Circulation. 2002;105:3017-3024.
【非特許文献５２】Carmeliet P. Blood vessels and nerves: common signals, pathways and diseases. Nat Rev Genet. 2003;4:710-720.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
近年、心筋虚血、脳虚血、四肢の閉塞性動脈硬化症などで血流障害が生じた場合の血管再生療法が注目されており、血管新生因子の遺伝子を用いた遺伝子療法や骨髄単核球を採取して虚血部位に注入する自家骨髄移植の臨床治験が進められている。しかしながら、薬剤による簡便な治療法が開発されれば、患者にとってメリットは大きい。本発明は薬剤による血管再生療法の開発に繋がるものである。我々は薬物を用いた血管再生療法の可能性について考慮し、血管再生に応用可能な化合物について検討した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一の側面によると、有効成分として、式（１）もしくは式（２）で表されるピリミジン化合物またはその塩もしくはそのプロドラッグ（以下、ピリミジン化合物等またはピリミジン誘導体等とも記す。）を含有する幹細胞および／または内皮前駆細胞の分化促進剤が提供される。
【００１５】
【化２】
2006083095.tif 000003
【００１６】
式（１）または式（２）において、
Ｒ1からＲ8は、各々独立に、水素、低級アルキル基、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、−ＣＯＣＨ3、−ＣＯＣ2Ｈ5、または−ＣＨ2ＯＣＯＣ2Ｈ5を表し、
Ｘは、＞ＮＨ、＞Ｎ−ＣＨ3、＞Ｎ−Ｃ2Ｈ5、＞Ｎ−ｐｈ、＞Ｎ−ＣＨ2−ｐｈ、＞Ｎ−ＣＨ−ｐｈ2、＞Ｎ−ＣＯＣＨ3、＞Ｎ−ＣＯＯＣ2Ｈ5、＞Ｎ−ＳＯ2ＣＨ3、＞ＣＨ2、＞ＣＨＣＨ3、＞ＣＨＣ2Ｈ5、−Ｏ−、または−Ｓ−を表す。
ただし、ｐｈはフェニル基を示す。
【００１７】
また、本発明の他の側面によると、有効成分として、実質的に上記ピリミジン化合物等のみを含有する血管新生促進剤が提供される。また、本発明の他の側面によると、有効成分として、上記ピリミジン化合物等を含有する虚血性疾患治療剤が提供される。
【００１８】
また、本発明の他の側面によると、上記ピリミジン化合物等の存在下で、幹細胞、内皮前駆細胞および／または血管内皮細胞を培養するステップを含む幹細胞および／または内皮前駆細胞の培養方法が提供される。また、本発明の他の側面によると、当該培養方法により得られた細胞が提供される。また、本発明の他の側面によると、幹細胞および／または内皮前駆細胞を、上記ピリミジン化合物等に暴露するステップを含む幹細胞および／または内皮前駆細胞の分化を促進する方法が提供される。また、本発明の他の側面によると、血管内皮細胞を、上記ピリミジン化合物等に暴露するステップを含む血管内皮細胞の遊走を促進する方法が提供される。また、本発明の他の側面によると、血管内皮細胞を、上記ピリミジン化合物等に暴露するステップを含む血管内皮細胞による管腔形成を促進する方法が提供される。また、本発明の他の側面によると、内皮前駆細胞を、上記ピリミジン化合物等に暴露するステップを含む内皮前駆細胞の血中への動員を促進する方法が提供される。また、本発明の他の側面によると、幹細胞、内皮前駆細胞および／または血管内皮細胞を、酸塩基性線維芽細胞増殖因子に暴露することなしに、上記ピリミジン化合物等に暴露するステップを含むアンジオジェネシスを促進する方法が提供される。また、本発明の他の側面によると、幹細胞、内皮前駆細胞および／または血管内皮細胞を、上記ピリミジン化合物等に暴露するステップを含むバスキュロジェネシスを促進する方法が提供される。また、本発明の他の側面によると、幹細胞、内皮前駆細胞および／または血管内皮細胞を、上記ピリミジン化合物等に暴露するステップを含むアンジオジェネシスおよびバスキュロジェネシスを促進する方法が提供される。また、本発明の他の側面によると、上記ピリミジン化合物等の上記の剤の製造のための使用が提供される。また、本発明の他の側面によると、上記ピリミジン化合物等を、それ必要とする哺乳動物に投与するステップを含む虚血性疾患の治療方法が提供される。
【発明の効果】
【００１９】
上記したように、合成ピリミジン化合物MS-818は組織傷害に対し、修復・再生作用のあることが知られている。また、合成ピリミジン化合物MS-818がｂＦＧＦの血管新生作用を増強することが、in vivoの実験で示されている。しかしながら、合成ピリミジン化合物MS-818自身に血管新生促進作用があるのか、有るとすればその作用は血管内皮細胞や内皮前駆細胞に対する直接作用かどうか不明であった。
【００２０】
本発明者らは、以下に詳細に説明するように、ピリミジン化合物等が、単独で血管内皮細胞に直接作用して血管新生を促進することや、血管内皮細胞の遊走を促進すること、血管内皮細胞による管腔形成を促進すること、骨髄の内皮前駆細胞の血中への動員を促進すること、幹細胞の血管内皮細胞への分化を促進すること、内皮前駆細胞の血管内皮細胞への分化を促進すること、バスキュロジェネシスとアンジオジェネシスの両面で血管新生を促進すること等を証明した。すなわち、本発明によると、ピリミジン化合物等の暴露により、血管内皮細胞や骨髄の内皮前駆細胞に直接作用して、内皮前駆細胞の動員、血管内皮細胞への分化、血管新生等の作用を介して血管再生を促進することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に、本発明の実施の形態を、添付図面を参照しながら説明する。もっとも、本発明は、以下に説明する実施の形態に限定されるものではない。
【００２２】
本発明にあっては、ピリミジン誘導体として、特許文献２、３、６〜１０などに記載のある２−置換−６−アルキル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン類化合物および２−置換−７−アルキル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン類化合物を用いることができる。より具体的には、式（１）または式（２）で表わされる化合物を用いることができる。
【００２３】
【化３】
2006083095.tif 000004
【００２４】
式（１）または式（２）において、Ｒ1からＲ8は、各々独立に、水素、低級アルキル基、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、−ＣＯＣＨ3、−ＣＯＣ2Ｈ5、または−ＣＨ2ＯＣＯＣ2Ｈ5を表し、Ｘは、＞ＮＨ、＞Ｎ−ＣＨ3、＞Ｎ−Ｃ2Ｈ5、＞Ｎ−ｐｈ、＞Ｎ−ＣＨ2−ｐｈ、＞Ｎ−ＣＨ−ｐｈ2、＞Ｎ−ＣＯＣＨ3、＞Ｎ−ＣＯＯＣ2Ｈ5、＞Ｎ−ＳＯ2ＣＨ3、＞ＣＨ2、＞ＣＨＣＨ3、＞ＣＨＣ2Ｈ5、−Ｏ−、または−Ｓ−を表す。ただし、ｐｈはフェニル基を示す。また、低級アルキル基は、炭素数が１から７の低級アルキル基が好ましい。
【００２５】
式（１）で表される化合物のうち代表的なものを以下に例挙する。２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−（４−メチルピペラジノ）−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−（４−エチルピペラジノ）−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−（４−メチルピペリジノ）−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−（４−エチルピペリジノ）−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−モルホリノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−チオモルホリノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−６−エチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−６−イソプロピル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−６−ｎ−ブチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−６−ｓｅｃ−ブチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−６−ｔ−ブチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−４，６−ジメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−６，７−ジメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−６，７，７−トリメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−４，６−ジメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−６，７，７−トリメチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−７−メチル−６−エチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−４−メチル−６−エチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン。
【００２６】
式（２）で表される化合物のうち代表的なものを以下に例挙する。２−ピペラジノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−（４−メチルピペラジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−（４−エチルピペラジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−（４−Ｎ−アセチルピペラジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−（４−メチルピペリジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−（４−エチルピペリジノ）−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−モルホリノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−チオモルホリノ−７−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−７−エチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−７−ｎ−プロピル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−７−イソプロピル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−７−ｎ−ブチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−７−ｔ−ブチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−５−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−５−メチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−４，７−ジメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−５，７−ジメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−５，５，７−トリメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−５，７−ジメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペラジノ−５，５，７−トリメチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−４メチル−７−エチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン、２−ピペリジノ−５−メチル−７−エチル−６−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン。
【００２７】
また、本発明にあっては、上記ピリミジン誘導体の塩、好ましくは薬学的に許容される塩を用いることもできる。特に限定されるものではないが、ピリミジン誘導体の薬学的に許容される塩として、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩などの薬学的に許容しうるアニオンを有する非毒性酸付加塩を形成する酸から形成される塩類およびそれらの水和物、ならびに第四級アンモニウム（またはアミン）塩類およびそれらの水和物が挙げられる。また、本発明にあっては、上記ピリミジン誘導体のプロドラッグを用いることもできる。
【００２８】
上記ピリミジン誘導体等の製造方法は、既に、本発明者らが特許出願および論文発表をしているので、それらを参照されたい（特許文献２，３，６〜１０，非特許文献１６等）。
【００２９】
以下に詳細に説明するように、本発明者等により、これらのピリミジン誘導体等が、(a)血管内皮細胞の遊走を促進する作用、(b)血管内皮細胞による管腔形成を促進する作用、(c)内皮前駆細胞の血中への動員を促進する作用、(d)内皮前駆細胞の血管内皮細胞への分化を促進する作用、(e)幹細胞の血管内皮細胞への分化を促進する作用、(f)ERK1/2の活性化を促進する作用を有することが明らかにされた。これらの知見から、上記ピリミジン誘導体等が、(g)アンジオジェネシスを促進する作用、(h)バスキュロジェネシスを促進する作用、ひいては(i)血管新生を促進する作用を有することが、当業者には理解される。ここで、上記したように、MS-818がｂＦＧＦの血管新生作用を促進することが報告されていたが、ピリミジン誘導体等の単独の作用については不明であった。このため、本発明者等により、ピリミジン誘導体等が単独でこれらの作用を発揮することが明らかにされたことを特筆すべきである。
【００３０】
これらの知見に基づくと、上記ピリミジン誘導体等が、幹細胞および／または内皮前駆細胞の分化促進剤、血管内皮細胞の遊走剤、血管内皮細胞による管腔形成剤、内皮前駆細胞の血中への動員剤、アンジオジェネシス促進剤、バスキュロジェネシス促進剤、アンジオジェネシスおよびバスキュロジェネシス促進剤、血管新生促進剤ならびに虚血性疾患治療剤として有用であることが、当業者には理解される。特に、有効成分として、上記ピリミジン誘導体等のみを含有するものを、これらの剤として利用できることが理解される。
【００３１】
ここで、バスキュロジェネシスは、幹細胞や内皮前駆細胞が内皮細胞へと分化し、原始血管叢を形成するプロセスである。アンジオジェネシスは、原始血管叢の再構築によって新しい血管が形成されるプロセスであり、内皮細胞による細胞外基質の消化、遊走、増殖、管腔形成等のステップを含む。また、幹細胞は、胚性幹細胞、血管芽細胞、および血球血管芽細胞を含む。また、内皮前駆細胞は、血管内皮前駆細胞を含む。虚血性疾患は、心筋虚血、脳虚血、四肢の閉塞性動脈硬化症等の上肢または下肢閉塞性動脈疾患、閉塞性動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞等を含む。
【００３２】
なお、これらの剤は、インビトロ、インビボまたはエクスビボのいずれでも用いることができる。ここで、インビトロは、対象とする反応を広く生体外で行わせることをいい、無細胞系、細胞培養系および組織培養系を含むものとする。また、インビボは、対象とする反応を生体内で行わせることをいい、治療の目的で、対象とする反応を、ヒトまたはその他の哺乳動物内で行わせることを含むものとする。また、エクスビボは、対象とする反応を、生体から採取した生きた細胞内で、後に元の生体に戻すことを前提として行わせることをいう。
【００３３】
また、上記剤は、例えば錠剤、カプセル、散剤、顆粒、トローチ、カシエー、エリキシル、乳濁液、乳液、シロップ、懸濁液、エアロゾル、軟膏、無菌注射液、成形パップ、軟質および硬質ゼラチンカプセル、ａｌｚｅｔ（登録商標）ｐｕｍｐカプセル、ペレット、坐薬および無菌包装粉末などの形にすることができる。特に、上記ピリミジン誘導体等を治療剤として用いる場合には、経口、皮下、筋肉内、静脈内、鼻内、皮膚透過および直腸経路といった種々の経路により投薬することができる。
【００３４】
また、上記剤は、担体または希釈剤、好ましくは薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含有することができる。このような担体または希釈剤の例として、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、とうもろこし澱粉、結晶セルロース、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸エステル、プロピルヒドロキシ安息香酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、不活性なポリマー類、水または鉱油などが挙げられる。
【００３５】
上記剤を、固形剤または液剤のいずれとして用いる場合であっても、上記のような担体等のほか、充填剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、崩壊剤、乳濁および懸濁剤、保存剤、甘味剤あるいは芳香剤などを含有し得る。特に、上記ピリミジン誘導体等を医薬組成物として用いる場合、上記剤は、また患者（動物を含む）に投薬の後、活性成分が急速に、持続的にまたは遅延的に放出されるように調製することができる。
【００３６】
経口投与の場合、上記ピリミジン誘導体等は、担体または希釈剤と混合され、錠剤、カプセル剤などの形にされることが好ましい。非経口投与の場合、活性成分は１０％ブドウ糖水溶液、等張食塩水、無菌水あるいは類似の液体に溶解され、静脈内に点滴または注射により、あるいは筋肉内注射により投与されるべくバイアルまたはアンプルに密閉されることが好ましい。好ましくは、溶解補助剤や局所麻酔剤、保存剤および緩衝剤も媒体中に含有させることができる。安定性を増すために、上記剤をバイアルまたはアンプルに注入した後に、凍結乾燥することも可能である。非経口投与の他の製剤としては、例えば軟膏剤、パップ剤などの経皮的に投与される製剤がある。この場合成型パップやテープ剤が有利である。また障害局所、組織、骨などの中に直接埋め込むペレット剤やａｌｚｅｔ（登録商標）ｐｕｍｐカプセル剤などもある。ペレット作製に用いる樹脂としては、ポリ（２−ハイドロキシエチルメタアクリレート）や、エチレンビニルアセテートコポリマーなどが挙げられる。
【００３７】
上記剤は、単位投薬量形状にあたり一般に０．１ないし２０００ｍｇ、好ましくは０．５ないし１０００ｍｇの活性成分を含有する。上記ピリミジン誘導体等は広い投薬量範囲にわたって有効である。例えば、１日あたりの投薬量は普通０．０３ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。実際に投与される化合物の量は、投与される化合物により、また個々の患者の年令、体重、反応、症状の程度、投与経路等により、医者により決定される。従って、上記の投薬量範囲は本発明の範囲を限定するものではない。１日あたりの好適な投薬回数は通常１〜６回、好ましくは１〜４回である。
【００３８】
上記ピリミジン誘導体等は、それ自体で有効な各種剤として用いることができるが、目的に応じて１種またはそれ以上の他の各種増殖・分化因子、成長ホルモンやサイトカイン類、亜鉛等の化合物と組合せて用いることもできる。そのような付加的な化合物として、ＥＧＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦその他のＦＧＦ類、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＢＭＰ、ＨＧＦ、ミッドカイン、ＴＮＦ、インスリン、ＩＧＦ−I，II、ケラチノサイト成長因子、ＥＣＧＦ、線維芽細胞由来上皮細胞増殖因子、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＡＤＦ、ＭＩＰ−α、トランスフェリン、トロンビン、トロンボモジュリン、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＨＲＦ、単球走化性活性因子、ＣＧＲＰ、ＳＯＤ、アンジオテンシン、プロスタグランジン類、セロトニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどおよびその同族体等が挙げられる。
【００３９】
また、上記したように、本発明によると、上記ピリミジン誘導体等の存在下で、幹細胞、内皮前駆細胞および／または血管内皮細胞を培養するステップを含む幹細胞および／または内皮前駆細胞の培養方法が提供される。幹細胞、内皮前駆細胞および／または血管内皮細胞は、上記ピリミジン誘導体等の各作用を発揮するために有効な量の上記剤の存在下で培養される。例えば、上記ピリミジン誘導体等の濃度を、好ましくは５０ｎＭ〜１ｍＭ、さらに好ましくは５００ｎＭ〜５００μＭ、さらに好ましくは１μＭ〜１００μＭ、さらに好ましくは５μＭ〜７５μＭ、さらに好ましくは５０μＭとすることができる。また、例えばインビトロで培養する場合にあっては、幹細胞および／または内皮前駆細胞は、上記ピリミジン誘導体等の各作用を発揮するために有効な時間、上記剤の存在下で培養される。例えば、培養する時間を、好ましくは１〜６０日、さらに好ましくは１〜３０日、さらに好ましくは１〜１５日、さらに好ましくは１〜１０日、さらに好ましくは２〜７日、さらに好ましくは５日とすることができる。また、幹細胞および／または内皮前駆細胞は、さらに上記増殖・分化因子、成長ホルモンやサイトカイン類、亜鉛等の化合物の存在下で培養されることができる。添加されるこのような増殖・分化因子等の濃度は、一般に１ｆｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬであり、一般に１〜１００ｎｇ／ｍＬで十分である。ただし、上記したように、本発明によると、増殖因子等の付加的な化合物の不存在下で、幹細胞および／または内皮前駆細胞を培養した場合であっても、血管内皮細胞への分化促進等の作用を発揮することができる。
【００４０】
また、本発明によると、上記培養方法により得られた細胞が提供される。このような細胞は、上記ピリミジン誘導体等により、血管内皮細胞への分化が促進された状態、または分化した状態である。また、このように得られた細胞は、虚血性疾患治療剤中の有効成分として用いることができる。当業者には理解されるように、このような虚血性疾患治療剤は、上記ピリミジン誘導体等を含有する虚血性疾患治療剤と同様に、担体または希釈剤等をさらに含有することができ、投与経路、投与形態等を選択することができる。なお、薬物による血管新生療法については、非特許文献４３等を、造血幹細胞を利用した血管新生療法については、非特許文献４４等をさらに参照されたい。
【００４１】
また、本発明によると、幹細胞および／または内皮前駆細胞を、上記ピリミジン誘導体等に暴露するステップを含む幹細胞および／または内皮前駆細胞の分化を促進する方法が提供される。本発明によると、血管内皮細胞を、上記ピリミジン誘導体等に暴露するステップを含む血管内皮細胞の遊走を促進する方法が提供される。また、本発明によると、血管内皮細胞を、上記ピリミジン誘導体等に暴露するステップを含む血管内皮細胞による管腔形成を促進する方法が提供される。また、本発明によると、内皮前駆細胞を、上記ピリミジン誘導体等に暴露するステップを含む内皮前駆細胞の血中への動員を促進する方法が提供される。また、本発明によると、幹細胞、内皮前駆細胞および／または血管内皮細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子に暴露することなしに、上記ピリミジン誘導体等に暴露するステップを含むアンジオジェネシスを促進する方法が提供される。また、本発明によると、幹細胞、内皮前駆細胞および／または血管内皮細胞を、上記ピリミジン誘導体等に暴露するステップを含むバスキュロジェネシスを促進する方法が提供される。また、本発明によると、幹細胞、内皮前駆細胞および／または血管内皮細胞を、上記ピリミジン誘導体等に暴露するステップを含むアンジオジェネシスおよびバスキュロジェネシスを促進する方法が提供される。
【００４２】
これらの方法において、各細胞を上記ピリミジン誘導体等に暴露する方法は、特に限定されるものではなく、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物に上記ピリミジン誘導体等を投与してもよく、また、各細胞を培養するための液体培地中に、上記ピリミジン誘導体等を添加してもよい。上記ピリミジン誘導体等の投与形態、投与経路、投与量、濃度、培養時間等は、上記と同様とすることができる。
【実施例】
【００４３】
以下に、本発明の実験例を、添付図面を参照しながら説明する。もっとも、本発明は、以下に説明する実施例に限定されるものではない。
【００４４】
［方法］
〔細胞遊走〕
ウシ微小結果内皮細胞（ＢＣＥ細胞）を３５ｍｍのプラスティック培養皿に培養し、既報に従ってその一部をカミソリの刃で剥ぎ取った（非特許文献４５）。細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS: phosphate-buffered saline)で洗浄し、０．１％ウシアルブミン（ＢＳＡ）と種々の濃度のMS-818を含むＤＭＥＭ中で培養した。２４時間後、細胞を固定Giemsa染色し、剥ぎ取った部分に這い出した細胞数をカウントした。１６〜２０視野についてカウントし、平均±標準偏差を算出した。
【００４５】
〔管腔形成〕
既報に従って、ＢＣＥ細胞を１型コラーゲンゲル上で培養し、敷石状となったところで培地を０．１％ウシアルブミン（ＢＳＡ）と種々の濃度のMS-818を含むＤＭＥＭに変えてさらに培養した(非特許文献４６)。３日後、１型コラーゲンゲル中に侵入した管腔様構造物の１視野当たりの総延長をＮＩＨイメージを用いて定量化した。８つのサンプルについて平均±標準偏差を算出した。
【００４６】
〔マウス末梢血からの単核球の分離〕
C57BL/6NマウスにMS-818(1または10mg/kg/day)あるいはビークル（生理食塩水）を２日に１回腹腔投与した。３日目に心臓から血液採取、Ficoll Paque Plusを用いて比重遠心し、単核球を分離する。混入する赤血球は、塩化アンモニウム溶液（8.99 g/LのNH3Cl2、1.0g/LのKHCO3および37mg/LのEDTA/4Na）を用いて溶血させた。残った単核球の表面マーカーをFACS Vantage SEを用いて解析した。
【００４７】
〔マウス骨髄Lin-細胞の単離とインビトロでの内皮細胞への分化〕
C57BL/6Nマウスの大腿骨を０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳ（ＢＳＡ／ＰＢＳ）でフラッシュ、３０μｍポアのナイロンメッシュを通してデブリスを除去し、細胞浮遊液を得た。細胞浮遊液を４℃で1,500rpmの回転数で１０分間遠心し、沈殿した細胞を、４０μＬのＢＳＡ／ＰＢＳに対して１０7個、ビオチン複合化抗体混合物(biotin-conjugated antibody cocktail)(CD5、CD45R、CD11b、anti-Ly-6G、7-4、およびTer-119; Miltenyi Biotech, Auburn, CA)１０μＬに対して１０7個となるように再浮遊し、４℃で１０分間静置した。さらに、抗ビオチンマイクロビーズを２０μＬに対して１０7となるように加え、４℃で１５分間静置した。細胞をＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、磁気ステンレス鋼ウールカラムに通してLin-細胞を回収した。得られたLin-細胞をフィブロネクチンでコートした培養皿上に、１皿あたり５×１０5個となるように撒き込み、１０％のＦＣＳと内皮増殖添加物(endothelial growth supplements)を含む内皮細胞基本培地２(endothelial cell basal medium 2)(10%のFCS/EBM2およびECGS)で培養した。４日目にMS-818を含む培地（10%のFCS/EBM2およびECGS）に換えて、さらに１０日後に以下のごとく免疫染色を行った。
【００４８】
細胞にＢＳＡ／ＰＢＳで２００倍希釈した抗ｖＷＦ(von Willebrand factor)抗体の溶液を加え、４℃で一晩静置した。次に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＢＳＡ／ＰＢＳで１００倍希釈したＦＩＴＣ複合化抗ウサギＩｇＧ(FITC-conjugated anti-rabbit IgG)を加え、室温で３０分静置した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、４６０〜４９０ｎｍの励起フィルターを通し蛍光顕微鏡(Olympus)で観察した。また、細胞核をＤＡＰＩ(4',6'-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)で染色した。全体の細胞（ＤＡＰＩ陽性）に対するｖＷＦ陽性細胞の割合を、内皮細胞への分化の指標とした。
【００４９】
〔マウス胚性幹(ES)細胞株MG1.19細胞の内皮細胞への分化〕
１．５×１０4個のMG1.19細胞を、ＯＰ９細胞上で、種々の濃度のMS-818を含む分化用培地(LIFを含まないDM、10%のFCS/αMEM、100μMの2-ME)を用いて培養した。３〜５日後、細胞を回収し、ＦＩＴＣ複合化抗マウスＣＤ３１モノクローナル抗体、ＰＥ複合化抗マウスＦｌｋ−１モノクローナル抗体、ＡＰＣ複合化抗マウスＶＥ−カドヘリンモノクローナル抗体とFACS Vantage SE(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いて内皮特異的な表面マーカーを解析した（非特許文献４７）。
【００５０】
〔ウェスタンブロット法〕
ＢＣＥ細胞を種々の濃度のMS-818を含む0.1%のFCS/DMEMで１５分間培養し、既報に従って細胞抽出液を得た（非特許文献４８）。細胞抽出液をSDS-PAGEで展開したのち、フィルターにトランスファーした（非特許文献４６）。１次抗体として1,000倍希釈の抗リン酸化ERK1/2抗体あるいは抗ERK1/2抗体、または1,000倍希釈の抗リン酸化Akt抗体あるいは抗Akt抗体、２次抗体として4,000希釈のHRP複合化抗マウスIgG抗体、またはHRP複合化抗家兎IgG Aを用いる。フィルターをECL Western blotting detection kit(Amersham)で処理し、LAS-1000(Fuji Film)で観察した。
【００５１】
〔統計解析〕
統計解析は、ANOVA(Analysis of variance)を用い、P値をチューキー法(Tukey's methods)によって算出し、P < 0.05を有意と判定した。
【００５２】
［結果］
〔培養血管内皮細胞に対するMS-818の作用〕
Yasuharaらによって、MS-818は鶏受精卵絨毛尿膜のｂＦＧＦによる血管新生作用を増強することが報告されているが（非特許文献２３）、MS-818が内皮細胞に対して直接的に作用して血管新生を促進するかどうかは不明であった。そこでＢＣＥ細胞の細胞遊走、管腔形成を指標にて解析したところ、MS-818はそれらをいずれも有意に促進した（図１Ａ，Ｂ）。
【００５３】
〔内皮前駆細胞動員に対するMS-818の作用〕
成熟個体の血管新生では、既存の血管から新生血管が生じるアンジオジェネシスの他に、骨髄由来の内皮前駆細胞が内皮細胞へと分化して血管を形成するバスキュロジェネシスも生じることが判明している。そこで、MS-818のバスキュロジェネシスに対する効果を検討した。マウスにMS-818を腹腔内投与すると、ＣＤ３４、Ｆｌｋ−１やＶＥ−カドヘリン陽性の内皮前駆細胞の血中への動員が用量依存的に促進された（図２Ａ，Ｂ）。
【００５４】
〔内皮前駆細胞の内皮分化に対するMS-818の作用〕
動員された内皮前駆細胞は、局所において内皮細胞へと分化して、新生血管の一部を構成すると考えられる。そこでMS-818の内皮細胞分化に対する効果を検討した。骨髄からLin-の幹細胞分画を採取し、フィブロネクチン上で培養し、ｖＷＦを指標にして内皮細胞への分化を検討したところ、MS-818は内皮細胞への分化を有意に促進した（図３Ａ，Ｂ）。
【００５５】
〔マウスES細胞の内皮分化に対するMS-818の作用〕
MS-818の内皮細胞への分化促進作用を再確認するために、マウス胚性幹(ES)細胞を用いた内皮細胞への分化における効果を検討したところ、MS-818はＥＳ細胞のＯＰ９細胞上での内皮細胞への分化を有意に促進した（図４）。
【００５６】
〔内皮細胞のシグナル伝達系に対するMS-818の作用〕
最後にMS-818の作用メカニズムを検討するために、内皮細胞の細胞内シグナル伝達における効果を検討した。血管新生や内皮の分化にはERK1/2やAktの活性化が関与していることが知られている。そこでそれらの活性化をウェスタンブロット法を用いて調べたところ、MS-818はERK1/2の活性化を僅かに促進したが、Aktの活性化には影響を与えなかった（図５Ａ，Ｂ）。
【００５７】
［結語］
以上のように、MS-818が、血管内皮細胞に直接的に作用して遊走、管腔形成といったアンジオジェネシスに必要なプロセスと、内皮細胞前駆細胞の血中への動員と、内皮分化を促進することが示された。前者に関して、鶏受精卵絨毛尿膜のｂＦＧＦによる血管新生作用を増強することは報告されているが、内皮細胞に対して単独で、直接的に作用することを証明したのは、今回が初めてである。一方、後者のバスキュロジェネシスの促進作用に関しては、今回が初めての知見である。そこで、その作用をさらに確認するために、マウスＥＳ細胞を用いた内皮分化の実験系を用いたが、この実験からMS-818には確かに内皮分化を促進する作用のあることが証明された。さらに、MS-818の作用機序を明らかにする目的で、内皮細胞の細胞内シグナル伝達系に対する作用を検討した結果、MS-818はERK1/2の活性化を促進するが、Aktについては影響を与えないことが判明した。
【００５８】
合成化合物として生後のアンジオジェネシスやバスキュロジェネシスに作用するものとして、HMG-CoA(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A)還元酵素阻害剤のスタチンがある。スタチンはAktの活性化を介して、これらの効果を発揮すると考えられているが（非特許文献４９〜５１）、MS-818はAktに作用しなかったことから、MS-818はスタチンとは異なる機序で作用すると考えられる。
【００５９】
これまでに、MS-818は神経系の再生に作用することが知られていたが、神経系と血管系の形成の調節には類似点のあることが知られている（非特許文献５２）。MS-818 は、ラットの大脳虚血モデルにおいて梗塞巣を減少させることが報告されているが（非特許文献２６）、この作用は、神経再生と血管再生の効果が複合的に現れたためかもしれない。いずれにしても、MS-818は、神経系のみならず、血管系にも作用する低分子量合成化合物として、臨床応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、BCE細胞に対するMS-818の作用を示す。図１（Ａ）は、細胞遊走を示す。数値は６回の実験の平均±平準偏差である（* P < 0.05）。図１（Ｂ）は、管腔形成を示す。数値は９つの視野における視野当りの管腔長の平均±平準偏差である（** P < 0.01）。
【図２】図２は、内皮前駆細胞動員に対するMS-818の作用を示す。図２（Ａ）は、回収できた血中単核球の個数を示す。図２（Ｂ）は、表面マーカーであるCD34、FLK-1、VE-カドヘリン陽性細胞の個数を示す。数値は４回の実験の平均±標準誤差である（* P < 0.05）。
【図３（Ａ）】図３は、骨髄Lin-細胞の内皮分化に対するMS-818の作用を示す。図３（Ａ）は、抗ｖＷＦ抗体による免疫染色像とDAPIによる核染色を示す。
【図３（Ｂ）】図３（Ｂ）は、内皮分化の程度を核の総数に対するｖＷＦ陽性細胞の％示す。数値は１０個に視野における平均±標準誤差である（* P < 0.05）。
【図４】図４は、マウスES細胞の内皮分化に対するMS-818の作用を示す。図４（Ａ）は、内皮マーカーとしてのFLK-1陽性細胞の比率（％）を示す。図４（Ｂ）は、内皮マーカーとしてVE-カドヘリン陽性細胞の比率（％）を示す。数値は３回の実験の平均±平準偏差である（* P < 0.05）。
【図５】図５は、内皮細胞のシグナル伝達系に対するMS-818の作用を示す。図５（Ａ）は、ERK1/2のリン酸化を示す。図５（Ｂ）は、Aktのリン酸化を示す。下段は、それぞれの総蛋白に対するリン酸化蛋白の比率を示しており、数値は３回の実験の平均±平準偏差である（* P < 0.05）。
【図１】
2006083095.tif 000008
【図２】
2006083095.tif 000009
【図３（Ａ）】
2006083095.tif 000010
【図３（Ｂ）】
2006083095.tif 000011
【図４】
2006083095.tif 000012
【図５】
2006083095.tif 000013