(57)【要約】      （修正有）【課題】芳香性の高いイネの品種の作出と、その選択のためのマーカーを提供する。【解決手段】あらゆる香米の主要な強い香気成分である芳香族化合物２−アセチル−１−ピロリン（２ＡＰ）が、天然に存在する非芳香性種で合成されるレベルよりも高いレベルで合成される非天然植物であり、２ＡＰの分解に関与する遺伝子の発現が抑制されたトランスジェニックイネ。さらに、より高いレベルの２ＡＰを合成する植物および真菌を選択するための、分子マーカーとして使用することができる核酸。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照非トランスジェニックイネ植物におけるレベルよりも高いレベルの化合物２−アセチル−１−ピロリンを含んでなるトランスジェニックイネ植物であって、該化合物のレベルが、該トランスジェニック植物において、該トランスジェニックイネ植物における２−アセチル−１−ピロリン遺伝子によりコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを、該対照非トランスジェニックイネ植物における２−アセチル−１−ピロリン遺伝子によりコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質レベルよりも低減することによって高められる、トランスジェニックイネ植物。
【請求項２】
該２−アセチル−１−ピロリン遺伝子のｍＲＮＡレベルが、該トランスジェニック植物において、２−アセチル−１−ピロリン遺伝子もしくはその一部のアンチセンス方向での発現により、またはＲＮＡ干渉により低減されている、請求項１に記載のトランスジェニックイネ植物。
【請求項３】
該２−アセチル−１−ピロリン遺伝子が配列番号５で示される配列を含んでなる、請求項１に記載のトランスジェニックイネ植物。
【請求項４】
請求項１に記載のトランスジェニック植物由来の種子。
【請求項５】
植物２−アセチル−１−ピロリンタンパク質をコードする単離された核酸であって、
該核酸が、少なくとも１回の０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳでの６０〜６５℃にて３０分間の洗浄を含むハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２で示される核酸配列またはその相補配列とハイブリダイズする、単離された核酸。
【請求項６】
配列番号２で示される核酸配列と７０％より高い割合、８０％より高い割合、９０％より高い割合または９５％より高い割合で同一である、請求項５に記載の単離された核酸。
【請求項７】
配列番号２で示される配列と実質的に同一である、請求項５に記載の単離された核酸。
【請求項８】
配列番号３で示されるアミノ酸配列と実質的に同一であるポリペプチドをコードする、請求項５に記載の単離された核酸。
【請求項９】
配列番号３で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％を超える割合で同一であるポリペプチドをコードする、請求項５に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
プロモーターに作動可能なように連結されている、請求項５に記載の単離された核酸。
【請求項１１】
プロモーターが構成的プロモーター、発達的プロモーターまたは誘導プロモーターである、請求項１０に記載の単離された核酸。
【請求項１２】
プロモーターが、ツユクサ黄色斑紋ウイルスプロモーター、サトウキビバドナウイルスプロモーター、イネツングロ桿菌状ウイルスプロモーター、トウモロコシ条斑ウイルスエレメント、コムギ萎縮ウイルスプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーター、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター、オクトピンシンターゼプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）プロモーターおよびイネアクチンプロモーターから選択される、請求項１０に記載の単離された核酸。
【請求項１３】
請求項５に記載の単離された核酸を含んでなる、細胞。
【請求項１４】
対照天然植物におけるレベルよりも高いレベルの化合物２−アセチル−１−ピロリンを含んでなる非天然植物であって、
化合物２−アセチル−１−ピロリンのレベルが、対照植物よりも、１以上の２−アセチル−１−ピロリン遺伝子の発現を低減し、該１以上の２−アセチル−１−ピロリン遺伝子によってもたらされるｍＲＮＡレベルを低減し、および／または１以上の２−アセチル−１−ピロリンタンパク質の活性もしくは量を低減することによって高められる、非天然植物。
【請求項１５】
２−アセチル−１−ピロリン遺伝子の発現が、２−アセチル−１−ピロリン遺伝子もしくはその一部のアンチセンス方向での発現により、またはＲＮＡ干渉により低減される、請求項１４に記載の非天然植物。
【請求項１６】
２−アセチル−１−ピロリン遺伝子の発現が、突然変異誘発により低減される、請求項１４に記載の非天然植物。
【請求項１７】
植物がイネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ココナッツ、ソルガムおよびオートムギからなる群から選択される、請求項１４に記載の非天然植物。
【請求項１８】
請求項１４に記載の非天然植物から生じた、種子。
【請求項１９】
植物または植物の一部における２−アセチル−１−ピロリン遺伝子の芳香性対立遺伝子の存在を検出する方法であって、２−アセチル−１−ピロリン遺伝子が２−アセチル−１−ピロリンタンパク質の量、機能または活性を低減する突然変異を有しているかどうかを検出することを含む、方法。
【請求項２０】
突然変異がＯｓ２ＡＰの芳香性対立遺伝子に見られる８塩基対の欠失である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
突然変異を検出する方法がＰＣＲおよび／またはマイクロアレイの使用を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
突然変異を検出する方法がハイブリダイゼーションまたは配列決定を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
突然変異を検出する方法が２−アセチル−１−ピロリンタンパク質レベル、構造または活性を検出することを含む、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、植物分子遺伝学に関する。とりわけ、本発明は、高いレベルの２−アセチル−１−ピロリンを有する非天然植物および真菌、かかる植物および真菌を作製する方法、ならびに２−アセチル−１−ピロリン合成に関与する核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
穀物の芳香は、高品質の米の最も魅力的な特徴であり、アジア市場で需要が増加しているだけでなく、欧州、そして世界中で広く認識されている。調理した米の芳香は、炭水化物、アルコール、アルデヒド、ケトン、酸、エステル、フェノール、ピリジン、ピラジンおよびそれ以外の化合物のような百を超える揮発性化合物からなっている(Yajima et al., 1978; Maga, 1984; Takashi et al., 1980; Paule and Power, 1989)。あらゆる香米、小麦パンおよびライ麦パンの皮の主要な強い香気成分として「ポップコーン様」の芳香族化合物、２−アセチル−１−ピロリン（２ＡＰ）が発見された(Buttery et al., 1982, 1983)。２−アセチル−１−ピロリンは、主として、数多くの香米品種に特有の芳香に関与している(Tanchotikul and Hsieh, 1991)。驚くべきことに、この米の芳香は、タコノキの葉(Buttery et al., 1983)、グルテン麦粉(Vallaris Glabra Ktze.)(Wongpornchai et al., 2003)、含水雑穀(wet millet)(Seitz et al., 1993)、ポップコーン(Schieberle, 1991)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)(Romanczyk et al., 1995)および真菌(Nagsuk et al., 2004)からも単離され、同定された。２−アセチル−１−ピロリンは、芳香性種のイネの、根を除く各部位（茎、葉、穀粒）に存在している(Lorieux et al., 1996)。芳香性種の穀粒にはこの芳香があるが、総ての穀粒にあるとは限らない。
【０００３】
芳香族化合物、２−アセチル−１−ピロリンは、アミノ酸プロリンに類似したピロリン環を有している（図１）。アミノ酸プロリンを、２−アセチル−１−ピロリンを合成する前駆体として関連付ける最初の証拠が、細胞とカルス培養での試験によって見つけられた（Suprasanna et al., 1998; Suprasanna et al., 2002）。同位元素標識を用いた試験によって、タイ・ホーム・マリ(Thai Hom Mali)（ＴＨＭ）米において(Yoshihashi et al., 2002)、そしておそらく他の香米においても、穀粒２−アセチル−１−ピロリンの前駆体がアミノ酸プロリンである可能性が最も高いことが示され、その結果の裏付けが得られた。しかしながら、２−アセチル−１−ピロリンの正確な生合成経路はまだ解明されていない。従って、２−アセチル−１−ピロリン合成に関与する遺伝子を同定し、植物および真菌において２−アセチル−１−ピロリンレベルを高めて芳香を増強するための方法を提供する必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、化合物２−アセチル−１−ピロリンが、対照植物および真菌で産生されるレベルよりも高いレベルで産生される非天然植物および真菌を提供することによりこれらの必要性に満たすものである。対照植物および真菌とは、化合物２−アセチル−１−ピロリンレベルが低い類似遺伝子型または関連遺伝子型の植物および真菌をさす。このような対照植物が非天然植物であってもよい。本発明はさらに、このような非天然植物および真菌、ならびに該植物から生じた種子についてスクリーニングし、作出する方法を提供する。
【０００５】
化合物２−アセチル−１−ピロリンの正確な生合成経路は分かっていないが、その化合物はプロリンの誘導体である。プロリンは２−アセチル−１−ピロリンまたはグルタミン酸のいずれかに変換され得るため、グルタミン酸合成経路を阻害することによってプロリン（または中間体）の２−アセチル−１−ピロリン合成への利用可能性が高まる（図４Ａ）という仮定が立てられる。Ｏｓ２ＡＰ（オリザ・サティバ(oryza sativa)２−アセチル−１−ピロリン）と呼ばれる、米の芳香を制御するタンパク質をコードする遺伝子が、プロリンのグルタミン酸への変換において重要な役割を果たすと考えられているアルデヒトデヒドロゲナーゼファミリーのメンバーとして同定された。試験した総ての香米種では、この遺伝子に８個のヌクレオチドの欠失が存在する。この欠失は、ナンセンス変異を介したそのｍＲＮＡの分解を引き起こす早期停止コドンを与え、その結果、機能喪失表現型をもたらす。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）研究では、Ｏｓ２ＡＰ遺伝子の転写破壊により、植物において高いレベルの２−アセチル−１−ピロリンが生じ、それとともに芳香が強まることが示された。
【０００６】
本発明は、２−アセチル−１−ピロリン（２ＡＰ）遺伝子の発現を抑制し、２ＡＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルを低減し、および／または２ＡＰタンパク質の活性を低下させることによって、高いレベルの２−アセチル−１−ピロリンが産生される非天然植物および真菌を提供する。２ＡＰタンパク質のレベルは、対照植物に対して、２５パーセント、５０パーセントまたは１００パーセント低減する可能性がある。２ＡＰ遺伝子の発現の抑制または２ＡＰ遺伝子のｍＲＮＡの低減は、ａ）２ＡＰ遺伝子もしくはその断片をアンチセンス方向で発現させ、ｂ）その遺伝子の一部をＲＮＡ干渉構築物にクローニングし、トランスジェニック植物においてこの構築物を発現させ、またはｃ）種々の方法（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes（ＴＩＬＬＩＮＧ）法およびｔＤＮＡ挿入突然変異誘発法を含む）によって突然変異誘発した後、ＰＣＲまたは他の方法により芳香性変異体についてスクリーニングすることにより、実現し得る。
【０００７】
本発明はさらに、対照非トランスジェニックイネ植物が有するレベルよりも高いレベルの化合物２−アセチル−１−ピロリンを有するトランスジェニックイネ植物であって、該トランスジェニック植物における２ＡＰ遺伝子によりコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを、該対照非トランスジェニック植物における２ＡＰ遺伝子によりコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質レベルよりも、低減することによって、該トランスジェニック植物において該化合物のレベルが高められる、トランスジェニックイネ植物を提供する。一形式においては、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルがＲＮＡ干渉によりまたはアンチセンスにより低減されている。本発明はさらに、本発明のイネから生じたトランスジェニックイネの種子に向けられる。
【０００８】
後記の実施例は、イネにて実施した試験について記載しているが、本発明は、限定されるものではないが、コムギ、オオムギ、ライムギ、ココナッツ、ソルガムおよびオートムギを含む他の植物および真菌に関する。
【０００９】
本発明はさらに、２ＡＰ遺伝子をコードする単離された核酸であって、少なくとも１回の０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳでの６０〜６５℃にて３０分間の洗浄を含むハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５で示される核酸配列またはその相補配列とハイブリダイズする核酸、配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５で示される配列と少なくとも７０％同一、８０％同一、９０％同一、９５％以上同一である核酸、および配列番号３または配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、または９５％を超える割合で同一であるポリペプチドをコードする核酸を含む、単離された核酸を提供する。
【００１０】
米中の２−アセチル−１−ピロリン量は、作況や土壌型によって変わり得る。非芳香性品種であるニホンバレ(Nipponbare)では、２−アセチル−１−ピロリンレベルが０〜０．１ｐｐｍ（１００万分の１）の範囲である。これに対して、香米品種であるタイ・ホーム・マリでは、２−アセチル−１−ピロリン量が１〜２．５ｐｐｍの範囲である。実施例２では、米ニホンバレ中の２−アセチル−１−ピロリンレベルを２．５ｐｐｍまで高めた、イネＯｓ２ＡＰ遺伝子に対するＲＮＡ干渉試験について詳述している。よって、本発明は、非芳香性植物の芳香レベルを芳香族化合物レベルまで増強するための方法を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、プロモーターに作動可能なように連結され得る本発明の核酸を含有している組換え構築物および発現ベクターを提供する。１つの有用なプロモーターがカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーターであり、このプロモーターは、ほとんどの植物組織において高レベルの発現を与える。
【００１２】
本発明はさらに、本発明の核酸、構築物および発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。
【００１３】
本発明はまた、植物および核酸を、２ＡＰタンパク質の発現または活性の低減を引き起こし、２ＡＰ化合物の産生が増加した結果として必然的に生じる芳香の増強をもたらす２ＡＰ遺伝子における突然変異についてスクリーニングするための方法も提供する。１つの特異的突然変異が、イネ２ＡＰ遺伝子の芳香性表現型と関連する８個のヌクレオチドの欠失である。この突然変異および他の突然変異についてのスクリーニングは、ＰＣＲ、配列決定、ハイブリダイゼーションまたはマイクロアレイ試験のような種々の方法によって行うことができる。別の方法としては、２ＡＰタンパク質レベルの低減または２ＡＰタンパク質の構造もしくは活性の変化を探る方法がある。これについては、例えば、活性２ＡＰタンパク質と結合する抗体を使用することによって行えるし、２ＡＰタンパク質活性についてのアッセイによっても行える。
【００１４】
本明細書に記載の配列は、核酸ハイブリダイゼーション試験におけるプローブまたはプライマーとして使用され得る。配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５で示されるヌクレオチド配列の１４ヌクレオチド長の連続したＤＮＡセグメントと同じ配列を有するか、または配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５で示されるヌクレオチド配列の１４ヌクレオチド長の連続したＤＮＡセグメントと相補的である少なくとも１４ヌクレオチド長の連続した配列を含む核酸セグメントを使用することができる。
【００１５】
より長い連続した同一または相補配列、例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００ヌクレオチドのもの他(中間にあるあらゆる長さから全長配列を含むその長さまでを含む)もまた、特定の実施形態において有用である。
【００１６】
このような核酸プローブの、２ＡＰ遺伝子配列と特異的にハイブリダイズする能力によって、それらが特定サンプルにおいて相補配列の存在を検出するのに有用であり得る。
【００１７】
しかしながら、突然変異種プライマー、すなわち、他の遺伝的構造の調製用のプライマーの作製に用いる配列情報の使用をはじめとする他の使用が想定される。
【図面の説明】
【００１８】
図１は、カオ・ド・マリ(Khao Dawk Mali)（ＫＤＭＬ１０５）、タイジャスミン米（芳香性）およびコシヒカリ(Koshihikari)、非香米から、ＧＣ−ＭＳにより得られた２−アセチル−１−ピロリンの化学構造を示す。
【００１９】
図２は、穀物の芳香について分離する、単一Ｆ６植物由来の１８６のＦ９植物を用いたイネにおける芳香遺伝子の詳細なマッピングと穀物の芳香に関する遺伝子を含む物理的地図の構築を示す。
【００２０】
図２の第１の部分は、単一Ｆ６植物由来の８のＦ１１植物の図式遺伝子型を示す。第２の部分は、単一ＢＡＣにおいて重要な領域を２７ｋｂに絞るための、単一Ｆ６植物由来の１１１６のＦ１２植物を用いたウルトラスケールマッピングを示す。第３の部分は、３つのオープンリーディングフレームを示すＫＤＭＬ１０５のゲノム配列の注釈を示す。第４の部分は、ＫＤＭＬ１０５とＪＨＮの異種交配による１７７のＦ６植物を用いて、穀物の芳香および２−アセチル−１−ピロリン含量に大きな影響を及ぼす未知タンパク質遺伝子のエクソン７内に３つの二重組換え体が確認されることを示す。この未知タンパク質遺伝子は、Ｏｓ２ＡＰ、オリザ・サティバ２−アセチル−１−ピロリンと名づけられた。「アロマーカー」は、穀物の芳香に特有の８塩基対の欠失と３つのＳＮＰ（一塩基変異多型）を定義するＰＣＲベースのマーカーである。
【００２１】
図３Ａは、芳香性および非芳香性同質遺伝子系統の受粉の１０、１５および２０日後に単離された全ＲＮＡからの、ＲＴ−ＰＣＲを用いた７つの候補遺伝子の発現を示す。この図において、Ｏｓ２ＡＰは、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼと見なされる。
【００２２】
図３Ｂは、芳香性および非芳香性同質遺伝子系統の受粉の１５日後に単離された全ＲＮＡからのＯｓ２ＡＰ転写産物の葉、茎および根における示差的発現を示している。
【００２３】
図３Ｃは、ＴＨＭ（ＫＤＭＬ１０５）、芳香性同質遺伝子系統１１７、非芳香性同質遺伝子系統１０およびそれらのＦ２（ＩＳＬ１１７×ＩＳＬ１０）の穀粒における２−アセチル−１−ピロリンレベルの解析を示す。Ｆ１では、２−アセチル−１−ピロリンレベルの解析を葉で実施した。
【００２４】
図３Ｄは、上のパネルは、Ｏｓ２ＡＰ  ＲＮＡｉ構築物を含有するトランスジェニックニホンバレにおける染色体４のＯｓ２ＡＰホモログとアクチンの発現を示す。下のパネルは、芳香性および非芳香性同質遺伝子系統のイネにおいて示差的発現を示す、染色体４ではなく染色体８のＯｓ２ＡＰ遺伝子（本明細書ではＢＡＤＨと呼ぶ）を示す。
【００２５】
図４Ａは、プロリンおよびグルタミン酸間の代謝経路を示す。Ｌ−プロリンは、酵素Ｐ５ＣシンターゼおよびＰ５Ｃレダクターゼを用いてグルタミン酸から合成され、グルタミン酸は、プロリンデヒドロゲナーゼ（ＰｒｏＤＨ）およびＰ５Ｃデヒドロゲナーゼ（Ｐ５ＣＤＨ）を用いてプロリンから合成される。提示された代謝シフトは、Ｏｓ２ＡＰのナンセンス突然変異が介在するものであった。
【００２６】
図４Ｂは、Microbiology Department of the University of Massachusetts, Amherst, USAのウェブサイトを通して利用されるプログラム、ＲＡＳＭＯＬ（新しいバージョンがProtein Explorerである）を利用して作製されたＯｓ２ＡＰ酵素の推定タンパク質構造を示す。
【００２７】
図５Ａ−１は、ＫＤＭＬ１０５（芳香性）およびニホンバレ（非芳香性）由来のＯｓ２ＡＰ遺伝子のゲノム配列比較を示す。図５Ａ−２は、図５Ａ−１の続きを示す。
【００２８】
図５Ｂは、ニホンバレ、非芳香性系統と比べて、芳香性系統、タイ・ホーム・マリ（ＴＨＭ）における８塩基対の欠失を示すＤＮＡアラインメントおよび２系統間のアミノ酸配列比較を示す。アラインメントしているヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド７０１〜７６５と配列番号２のヌクレオチド７０１〜７５７である。
【００２９】
図６は、単一Ｆ６植物由来の８のＦ１１植物の図式遺伝子型と米粒子の２−アセチル−１−ピロリンレベルの解析を示す。
【００３０】
図７Ａは、ＲＮＡ干渉構築物と形質転換用ベクターを示す。下のパネルは、構築物の発現確認を示す。本図面においてＢＡＤＨとは、Ｏｓ２ＡＰをさす。
【００３１】
図７Ｂは、ＲＮＡｉ構築物、ＧＦＰおよび内在性Ｏｓ２ＡＰの発現を示す。下のパネルは、２−アセチル−１−ピロリンレベルと芳香を示す。ＢＡＤＨ−ＲＮＡｉ２は、Ｏｓ２ＡＰ遺伝子に対するＲＮＡｉ構築物である。
【００３２】
図８Ａは、「アロマーカー」プライマーセットを用いた、芳香の増強と関係しているＯｓ２ＡＰ変異体についてのＦ６後代のスクリーニング結果を示す。
【００３３】
図８Ｂは、芳香性Ｏｓ２ＡＰ対立遺伝子についての種々の米品種のスクリーニング結果を示す。
【００３４】
図９Ａは、種々の系統のイネ由来のＯｓ２ＡＰオーソログのＤＮＡ配列を示す。アラインメントしているヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド７０１〜７６５と配列番号２のヌクレオチド７０１〜７５７である。
【００３５】
図９Ｂは、２２のＢＡＤＨ（Ｏｓ２ＡＰ）オーソログの近隣結合樹を用いて構築した系統樹を示す。
【配列表の一部の配列の簡単な説明】
【００３６】
配列番号１は、香米系統、タイ・ホーム・マリ由来のＯｓ２ＡＰ遺伝子のゲノムヌクレオチド配列である。
配列番号１
【化１−１】
2006311854.tif 000002
【化１−２】
2006311854.tif 000003
【化１−３】
2006311854.tif 000004
【００３７】
配列番号２は、タイ・ホーム・マリＯｓ２ＡＰのタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号２
【化２】
2006311854.tif 000005
【００３８】
配列番号３は、タイ・ホーム・マリＯｓ２ＡＰタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号３
【化３】
2006311854.tif 000006
【００３９】
配列番号４は、非香米系統、ニホンバレ由来のＯｓ２ＡＰ遺伝子のゲノムヌクレオチド配列である。
配列番号４
【化４−１】
2006311854.tif 000007
【化４−２】
2006311854.tif 000008
【００４０】
配列番号５は、ニホンバレＯｓ２ＡＰのタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号５
【化５】
2006311854.tif 000009
【００４１】
配列番号６は、ニホンバレＯｓ２ＡＰタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号６
【化６】
2006311854.tif 000010
【００４２】
配列番号７〜８８は、Ｏｓ２ＡＰヌクレオチド配列の一部、ＧＦＰまたはアクチンを増幅するのに使用できるプライマーである（表１）。
【００４３】
【化７】
2006311854.tif 000011
【００４４】
配列番号９６は、一般アルデヒドデヒドロゲナーゼに高度に保存されているデカペプチドである。
Val-Thr-Leu-Glu-Leu-Gly-Gly-Lys-Ser-Pro
【発明の詳細な説明】
【００４５】
本発明は、２−アセチル−１−ピロリン（２ＡＰ）遺伝子に関する。イネ、コムギ、トウモロコシ、オートムギ、タコノキの葉、芳香ココナッツおよび一部の細菌および真菌に見られる主要な芳香族化合物である、２−アセチル−１−ピロリンのレベルを高めるために、２ＡＰ遺伝子の核酸配列が用いられる。
【００４６】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明がその適用において、以下の説明において記載されている構造の詳細および要素の配列に限定されないことを理解すべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、または種々の方法での実践もしくは実施が可能である。さらに、本明細書において使用する表現および専門用語は、説明するためのものであって、限定を意図したものではないことも理解すべきである。
【００４７】
この開示内容を通じて、種々の刊行物、特許および公開特許明細書が引用されるている。これらの刊行物、特許および公開特許明細書の開示内容は、本発明が関連する技術の状況をさらに十分説明するために、引用することにより本明細書の開示内容の一部とされる。本発明の実施では、特に断りのない限り、当技術分野の技術の範囲内である植物育種学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来の技術を使用する。例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al eds., (1987); Plant Breeding: Principles and Prospects (Plant Breeding, Vol 1) M. D. Hayward, N. O. Bosemark, I. Romagosa; Chapman & Hall, (1993.); Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher and Wingfeld, eds. (1995) CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE (John Wiley & Sons, Inc.); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE R. I. Freshney, ed. (1987)参照。
【００４８】
特に断りのない限り、慣例的用法に従って専門用語を使用する。分子生物学において共通する用語の定義は、Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (SBN 0-19-854287-9)発行; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (SBN 0-632-02182-9)発行;およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology, a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)発行; Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New Yorkで見られる。植物生物学において共通する用語の定義は、Esau, Plant Anatomy, John Wiley & Sons (1977) (ISBN 0-471-24520-8)発行;およびSolomon et al, Biology, Saunders College Publishing (1993)発行、で見られる。
定義
【００４９】
本発明の種々の実施形態の検討を容易にするため、以下の定義を提供する：
【００５０】
２−アセチル−１−ピロリン（２ＡＰ）ポリヌクレオチド配列：本発明の遺伝子としては、本明細書において開示される全長配列だけでなく、本明細書において具体的に示される配列の特有の活性を保持するこのような配列の断片も挙げられる。
【００５１】
イネ２ＡＰ遺伝子配列は、本明細書において開示されている。このイネ２ＡＰ遺伝子配列を用いたいくつかの手段を通じて、別の植物由来の２ＡＰポリヌクレオチド配列を容易に同定し、得ることができることは当業者には明らかである。特定の遺伝子またはその一部は、培養物寄託機関から得られ得、または合成により、例えば、遺伝子マシンを用いて構築され得る。
【００５２】
このような遺伝子の変化は、点突然変異を作製するための標準的な技術を用いて容易に構築し得る。また、これらの遺伝子の断片も、標準的な手順に従って市販のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いて作製することができる。例えば、Ｂａｌ３１のような酵素または部位特異的突然変異誘発を利用して、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを意図的に切り出すことができる。また、種々の他の制限酵素を用いて、活性断片についてコードする遺伝子を得ることができる。種々の酵素を利用して、これらの２ＡＰポリヌクレオチド配列の活性断片を直接得てもよい。
【００５３】
等価な２ＡＰポリヌクレオチド配列および／またはこれらの等価な２ＡＰポリヌクレオチド配列をコードする遺伝子も、本明細書において記載される教示を用いて、系統および／またはＤＮＡライブラリーから単離され得る。例えば、本明細書において開示される２ＡＰタンパク質に対する抗体を使用して、タンパク質混合物から他の２ＡＰタンパク質を同定し、単離することができる。具体的に言えば、最も不変で、かつ、他のタンパク質と最も異なっている２ＡＰタンパク質の一部に対して抗体を作製してもよい。こうして作製した抗体を使用して、特に、特有の活性を有する等価な２ＡＰタンパク質を免疫沈降、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）またはウエスタンブロッティングにより同定することができる。
【００５４】
本発明の遺伝子を同定するためのさらなる方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用による方法である。これらのプローブは、検出可能な標識を有するヌクレオチド配列である。当技術分野では周知であるように、プローブ分子と核酸サンプルが２分子間で強い結合を形成することによってハイブリダイズするならば、プローブとサンプルが本質的に同じであると当然判断することができる。プローブの検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションが起こったかどうかを既知の方法で判断するための手段を提供する。このようなプローブ解析は、本発明の遺伝子の迅速な同定法を提供する。典型的なプローブを表１に示している。
【００５５】
本発明のプローブとして使用するヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡ合成装置を使用し、標準的な手順を用いて合成することができる。ヌクレオチドセグメントのプローブとしての使用においては、特定のプローブを、放射性および非放射性標識をはじめとする当業者には公知のあらゆる好適な標識で標識する。一般的な放射性標識としては、３２Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓなどが挙げられる。ＤＮアーゼとＤＮＡポリメラーゼを用いて、一般的なニックトランスレーション反応により、ＤＮＡサンプルと相補的であるヌクレオチド配列から放射性同位元素で標識したプローブを構築することができる。次いで、プローブおよびサンプルをハイブリダイゼーションバッファー溶液に入れて合わせ、アニーリングが起こるまで好適な温度に保つ。その後、メンブレンを洗浄し、異物を除いてサンプルを残し、結合したプローブ分子を、通常、オートラジオグラフィーおよび／または液体シンチレーション計測により検出し、定量する。
【００５６】
非放射性標識としては、例えば、ビオチンもしくはチロキシンのようなリガンド、さらに、ヒドロラーゼもしくはペルオキシダーゼのような酵素、あるいはルシフェリンのような種々の化学発光体またはフルオレセインおよびその誘導体のような蛍光化合物も挙げられる。また、分離を容易にするために、プローブを、両末端において異なるタイプの標識で標識してもよく、例えば、一末端で、以上で記載した同位元素標識を、そして、もう一方の末端でビオチン標識を使用することによって標識してもよい。
【００５７】
二重形成と安定性は、ハイブリッドの２鎖間の実質的な相補性に依存しており、以上で記載したように、ある程度のミスマッチは許容される。それゆえ、本発明のプローブは、上記配列の突然変異（単一突然変異と多重突然変異の両方）、欠失、挿入およびそれらの組合せ（前記突然変異、挿入および欠失によって目的の標的ポリヌクレオチドとの安定したハイブリッドが形成される）を含む。突然変異、挿入および欠失は、数多くの方法により、現在当業者に公知の方法により、そして、将来、広まるであろう他の方法により特定のポリヌクレオチド配列において作製することができる。
【００５８】
表に記載したプローブの可能性ある変化は、ある程度、遺伝子コードの冗長性による。遺伝子コードの冗長性から、すなわち、タンパク質の作製に使用されるほとんどのアミノ酸に２つ以上のコーディングヌクレオチドトリプレット（コドン）が使用される。そのため、異なるヌクレオチド配列が特定のアミノ酸をコードする可能性がある。従って、２ＡＰタンパク質およびペプチドのアミノ酸配列を、タンパク質またはペプチドの同じアミノ酸配列をコードする等価なヌクレオチド配列により調製することができる。よって、本発明は、このような等価なヌクレオチド配列を含む。また、逆または相補配列も本発明の１つの態様であり、当業者ならば容易に使用することができる。さらに、構造および機能が同定されたタンパク質群が、アミノ酸配列を変えることにより、このような変化がタンパク質二次構造を改変しないという条件において、構築され得ることが示されている(Kaiser and Kezdy, 1984)。よって、本発明は、本明細書で示されるアミノ酸配列の、タンパク質二次構造が変化していないか、または構造が変化を受けているならば、生物活性が実質的に保持されている突然変異型を含む。さらに、本発明はまた、本発明の遺伝子をコードする２ＡＰポリヌクレオチド配列の総てまたは一部を受け入れる生物の突然変異体を含む。このような突然変異体は、当業者には周知の技術によって作製され得る。例えば、紫外線照射を利用して、宿主生物の突然変異体を作製することができるし、ｔＤＮＡ挿入突然変異誘発法を利用してもよいし、またはＴＩＬＬＩＮＧ(Targeted Induced Local Lesion of Genome)法を利用してもよい。同様に、このような突然変異体としては、当技術分野で周知の手順によって作製することができる胞子無形成宿主細胞も含んでよい。
【００５９】
イネ由来のものを含む２ＡＰポリヌクレオチド配列を、本発明のＰＣＲプライマーを用いて得てもよい。これらのプライマーを表１に示しており、これらのプライマーは配列番号７〜配列番号７９で示される配列と対応している。これらのプライマーの組合せを使用して、Ｏｓ２ＡＰ遺伝子の異なる領域を増幅することができる。この増幅に有効なＰＣＲ条件は、以下のとおりである：１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５Ｍの各プライマー、０．５単位のＴａｑポリメラーゼ、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１×好熱性ポリメラーゼバッファー(Promega)を含有する１０μＬ反応混合物。この混合物により、以下の時間および温度：９４℃３０秒間（変性）、６０℃３０秒間（アニーリング）および７２℃２分間（伸長）を用いて３０サイクルのＰＣＲを行う必要がある。
【表１−１】
2006311854.tif 000012
【表１−２】
2006311854.tif 000013
【表１−３】
2006311854.tif 000014
【００６０】
オリザ・サティバ２−アセチル−１−ピロリン（Ｏｓ２ＡＰ）ホモログ：本願にて記載したものと類似性を示す配列を、パブリックドメイン配列アラインメントアルゴリズムと配列データベースを検索するための配列類似性検索ツールを使用するコンピューターを利用した方法により同定することができる（パブリックドメインデータベースとしては、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＰＩＲなどが挙げられる）。
【００６１】
類似性検索を読み出し、解析しようとする標的配列（すなわち、質問配列）と比較する配列をアラインする。比較する配列の局所領域間の最適なアラインメントは、ローカルアラインメントとして知られている。配列比較アルゴリズムは、各アラインメントに総合スコアを与えるスコアリングマトリックスを使用している。
【００６２】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列をアラインし、他のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列と比較した、指定領域における同一残基率を公的に入手可能なコンピューターアルゴリズムを利用して決定する。同一性パーセントスコアは、比較している配列のオーバーラップ領域の長さに依存する。
【００６３】
２核酸配列間または２アミノ酸配列間の類似性は、配列同一性で表される（または、タンパク質の場合、配列類似性でも表される）。配列同一性は、同一性パーセントとして測定されることが多い；割合が高いほど、２配列の類似性が高いということである。本明細書において記載するように、２ＡＰタンパク質をコードする核酸分子のホモログおよび変異体を、本発明に使用してもよい。これらの核酸分子のホモログおよび変異体は、標準的な方法を使用してアラインした場合に、比較的高い配列同一性を有しているものである。このようなホモログおよび変異体は、高ストリンジェンシー条件下で互いにハイブリダイズする。
【００６４】
比較用配列のアラインメント方法は、当技術分野ではよく知られている。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムについては、配列アラインメント方法と相同性計算の詳細にわたる検討を示しているSmith and Waterman (1981); Needleman and Wunsch (1970); Pearson and Lipman (1988); Higgins and Sharp (1988); Higgins and Sharp (1989); Corpet et al. (1988); Huang et al. (1992);およびPearson et al. (1994). Altschul et al.(1994)で記載されている。
【００６５】
ＮＣＢＩベーシックローカルアラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）(Altschul et al., 1990)は、National Center for Biotechnology Information(NCBI, Bethesda, MD)を含むいくつかの供給元からインターネット上で入手可能であり、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘとともに用いられる。このツールはＮＣＢＩウェブサイトでアクセス可能である。このプログラムを利用した配列同一性決定方法についての解説は、ＮＣＢＩウェブサイトで入手可能である。
【００６６】
開示されたタンパク質配列のホモログは、一般に、開示された配列のアミノ酸配列との全長アラインメントにおいて、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ２．０を使用し、ギャップ入りｂｌａｓｔｐをデフォルトパラメーターに設定して計算した場合に少なくとも４０％配列同一性を有するという特徴を有するものである。調整パラメーターは、好ましくは、以下の値に設定する：オーバーラップスパン１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ  ＳおよびＨＳＰ  Ｓ２パラメーターは動的値であり、それぞれの配列の構成と目的の配列が検索されるデータベースの構成に応じて、そのプログラム自体によって確立される。しかしながら、それらの値は、感度を高めるように調整される可能性がある。この方法を用いて評価した場合、参照配列との類似性がさらに高いタンパク質は、同一性パーセントの増加、例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％配列の同一性を示す。
【００６７】
開示された核酸配列のホモログは、一般に、開示された配列のアミノ酸配列との全長アラインメントにおいて、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ２．０を使用し、ギャップ入りｂｌａｓｔｎをデフォルトパラメーターに設定して計算した場合に少なくとも４０％配列同一性を有するという特徴を有するものである。さらに、このような配列は、高ストリンジェンシー条件下で相同配列とハイブリダイズする。好ましい方法は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを使用し(Altschul et al., 1996)、デフォルトパラメーターに設定し、オーバーラップスパンおよびオーバーラップフラクションをそれぞれ１および０．１２５に設定する。この方法を用いて評価した場合、参照配列との類似性がさらに高い核酸配列は、同一性パーセントの増加、例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％配列の同一性を示す。
【００６８】
アラインメントは、アラインする配列へのギャップの挿入を含み得る。さらに、配列番号３もしくは配列番号６で示されるタンパク質より含有するアミノ酸が多い配列または配列番号３もしくは配列番号６で示されるタンパク質より含有するアミノ酸が少ない配列では、１つの実施形態において、配列同一性パーセントがアミノ酸総数に対する同一アミノ酸の数に基づいて決定されると理解される。よって、例えば、以下で述べる図面で示されたものより短い配列の配列同一性は、１つの実施形態において、長い方の配列のアミノ酸数を用いて決定される。同一性パーセントの計算において、相対重量は、挿入、欠失、置換他のような配列変化の多様な現れには関係していない。
【００６９】
１つの実施形態においては、同一である場合だけにプラスの評点をつけ（＋１）、ギャップを含むあらゆる形態の配列変化には「０」の値をつける。この場合、配列類似性計算に関して本明細書において記載する加重尺度またはパラメーターの必要性が除去される。配列同一性パーセントは、例えば、マッチしている同一残基数をアラインした領域の「短い方の」配列の残基総数で除し、１００を乗じることにより計算することができる。「長い方の」配列は、アラインした領域に最も多くの現実の残基を有するものである。
【００７０】
同じゲノム（パラログ）または異なるゲノム（オーソログ）において、タンパク質をそれらの配列関連性に従って他のタンパク質と区別することができる。オーソログ遺伝子は、共通の先祖遺伝子からの種形成によって生じた遺伝子である。これらの遺伝子は、通常、それらが導くものと同じ機能を保持している。パラログ遺伝子は、ゲノム内で複製される遺伝子である。これらの遺伝子は、初代のものに関係しているが、新しい特異性または改変された機能を獲得している。系統発生解析方法は、バイオインフォマティクスにおける通常の技量を有する人であれば周知である。
【００７１】
当業者には明らかなように、本発明の配列は、配列決定エラーを含み得る。すなわち、不正確なアミノ酸配列、ヌクレオチド、フレームシフト、未知ヌクレオチドまたは他のタイプの配列決定エラーが配列中に存在する可能性がある。しかしながら、正確な配列が、核酸に関する本明細書における相同性およびストリンジェンシーの定義、ならびにタンパク質またはポリペプチドに関して記載されているタンパク質相同性の範囲に入る。
【００７２】
２−アセチル−１−ピロリン（２ＡＰ）ポリペプチド：本明細書において「２ＡＰポリペプチド」とは、２ＡＰオーソログのアミノ酸配列を実質的に有する遺伝子産物を意味する用語である。２ＡＰポリペプチドは、１つには、その発現を低減し、そのｍＲＮＡレベルを低減し、またはタンパク質量もしくは活性を低減することによって、植物における化合物２−アセチル−１−ピロリンのレベルが高められるということを特徴とする。２ＡＰポリペプチドはまた、１つには、配列番号３または配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有していることも特徴とする。
【００７３】
実質的に同一：「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、配列番号３もしくは配列番号６で示されるアミノ酸配列）または核酸配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５で示される核酸配列）と少なくとも３０％、好ましくは、５０％、より好ましくは、８０％、最も好ましくは、９０％、あるいは９５％相同性を示すポリペプチドまたは核酸を意味する。ポリペプチドの場合、比較配列の長さは、一般に、少なくとも１６アミノ酸、好ましくは、少なくとも２０アミノ酸、より好ましくは、少なくとも２５アミノ酸、最も好ましくは、３５アミノ酸以上である。核酸の場合、比較配列の長さは、一般に、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも６０ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも７５ヌクレオチド、最も好ましくは、１１０ヌクレオチド以上である。
【００７４】
配列同一性は、一般に、配列解析ソフトウェア（例えば、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705の配列解析ソフトウェアパッケージ、ＢＬＡＳＴまたはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を用いて測定する。例えば、このようなソフトウェアは、標準的なパラメーターに設定すると、種々の置換、欠失および／または他の改変に相同性度を与えることによって、同一または類似配列をマッチさせる。保存的置換としては、一般に、以下の群：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン内での置換が挙げられる。
【００７５】
高いレベル：高いレベルとは、本明細書において、対応する天然植物における化合物２−アセチル−１−ピロリンの平均レベルと比べた際の非天然植物における化合物２−アセチル−１−ピロリンの平均レベルの上昇を意味する。当業者ならば、植物における化合物２−アセチル−１−ピロリンのレベルが数多くの変数に応じて植物によって異なるならば、非天然植物と対応する天然植物における化合物２−アセチル−１−ピロリンの平均レベルの比較においては、同様に制御された条件下で成長させた各タイプの植物の合理的な大きさのサンプル集団を比較するべきであることが分かるであろう。好ましくは、各集団からのいくつかの植物において化合物２−アセチル−１−ピロリンのレベルを測定し、それらを平均して、非天然植物が高いレベルのものを含有しているかどうかを判定する。本発明の非天然植物においての高いレベルとは、対応する天然植物におけるそのレベルよりも平均して、少なくとも約２０％高い、４０％高い、６０％高い、８０％高い、１００％高い、１５０％高い、２００％高い、２５０％高い、３００％高い、４００％高いまたは５００％高いレベルである。
【００７６】
プロモーター：構造遺伝子に発現制御エレメントを提供し、かつ、ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合し、それによりその遺伝子のＲＮＡ合成（転写）を開始するＤＮＡ配列またはＤＮＡ配列群にある認識部位。
【００７７】
これらのプロモーターを用いた植物発現構築物の例が、Fraley et al., 米国特許第５，３５２，６０５号で見られる。トランスジェニック植物のほとんど組織では、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターは強いプロモーターである（例えば、Odell et al., Nature 313: 810, 1985参照）。ＣａＭＶプロモーターは、単子葉植物においても極めて活性が高い（例えば、Dekeyser et al., Plant Cell 2: 591, 1990; Terada and Shimamoto, Mol. Gen. Genet. 220: 389, 1990参照）。さらに、このプロモーターの活性は、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの重複によってさらに高めることができる（すなわち、２〜１０倍の間）（例えば、Kay et al., Science 236: 1299, 1987; Ow et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A. 84: 4870, 1987;およびFang et al., Plant Cell 1: 141, 1989, and McPherson and Kay, 米国特許第５，３７８，１４２号参照）。
【００７８】
他の有用な植物プロモーターとしては、限定されるものではないが、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター(An et al., Plant Physiol. 88: 547, 1988およびRodgers and Fraley, 米国特許第５，０３４，３２２号)、オクトピンシンターゼプロモーター(Fromm et al., Plant Cell 1: 977, 1989)、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）プロモーター(Rogers, 米国特許第５，３７８，６１９号)およびイネアクチンプロモーター(Wu and McElroy, ＷＯ９１／０９９４８)が挙げられる。
【００７９】
典型的な単子葉植物プロモーターとしては、限定されるものではないが、ツユクサ黄色斑紋ウイルスプロモーター、サトウキビバドナウイルスプロモーター、イネツングロ桿菌状ウイルスプロモーター、トウモロコシ条斑ウイルスエレメントおよびコムギ萎縮ウイルスプロモーターが挙げられる。
【００８０】
構築物：特に断りのない限り、「構築物」とは、本発明の１以上の単離ポリヌクレオチド配列を含んでなる組換え遺伝子分子をさす用語である。
【００８１】
宿主生物における導入遺伝子の発現に使用される遺伝子構築物は、オープンリーディングフレームに作動可能なように連結された遺伝子プロモーター配列と、所望により、オープンリーディングフレームの３’下流に遺伝子終止配列を含む。オープンリーディングフレームは、遺伝子配列の使用目的に応じてセンス方向またはアンチセンス方向のいずれかに置かれている。構築物は、選択マーカー遺伝子と遺伝子発現用の他の調節エレメントも含んでいてもよい。
【００８２】
ベクター：宿主細胞において複製可能であり、かつ／または付着したセグメントの複製が起こるように別のＤＮＡセグメントが作動可能なように連結され得るＤＮＡ分子。プラスミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣおよびＢＡＣは総て典型的なベクターである。
【００８３】
「ベクター」とは、ポリヌクレオチド配列を宿主細胞へと導入して、形質転換された宿主細胞を作製するために使用される核酸分子をさす用語である。「ベクター」は、上述の遺伝子構築物の他に、遺伝物質、例えば、１種以上の宿主細胞においてその複製を可能にする、複製起点のような１以上の核酸配列、選択マーカー遺伝子および当技術分野で公知の他の遺伝要素（例えば、遺伝物質を宿主細胞のゲノムに組み込むための配列など）を含んでいてよい。
【００８４】
形質転換された：形質転換された細胞は、分子生物学技術によって核酸分子が導入されている細胞である。本明細書において、形質転換とは、核酸分子がこのような細胞、植物または動物細胞に導入され得る、ウイルスベクターによるトランスフェクション、アグロバクテリウム(Agrobacterium)による形質転換、プラスミドベクターの使用、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクションおよび粒子銃加速による裸のＤＮＡの導入をはじめとする総ての技術を包含する用語であり、一過性だけでなく安定な形質転換体も含む。
【００８５】
植物細胞のＤＮＡ形質転換方法としては、アグロバクテリウムを介した植物形質転換、プロトプラスト形質転換、花粉への遺伝子導入、生殖器官への注入、未熟胚への注入および粒子衝撃が挙げられる。これらの方法は、それぞれ、異なる長所と短所を有している。そのため、特定の植物系統に遺伝子を導入する特定の一方法は、必ずしも別の植物系統に対して最も効果的な方法ではないが、それぞれの方法がどの植物系統に対して有効であるかは十分に分かっている。
【００８６】
形質転換ＤＮＡセグメントを細胞に導入するための方法は数多くあるが、総てのものがＤＮＡの植物細胞への送達に適しているわけではない。好適な方法としては、事実上、ＤＮＡが細胞に導入され得る、アグロバクテリウム感染、ＤＮＡの直接送達（例えば、プロトプラストのＰＥＧを介した形質転換(Omirulleh et al., 1993)による、乾燥／阻害を介したＤＮＡ取り込みによる、エレクトロポレーションによる、カーボランダム繊維での攪拌による、ＤＮＡコーティング粒子の加速によるなど）によるなどの総ての方法が挙げられるであろう。特定の実施形態においては、加速法が好ましく、その方法としては、例えば、マイクロプロジェクタイル衝撃などが挙げられる。
【００８７】
細胞へのＤＮＡ導入技術は、当業者には周知の技術である。遺伝子を細胞へと送達するための一般的な４通りの方法が記載されている：（１）化学的方法(Graham and van der Eb, 1973; Zatloukal et al., 1992)；（２）マイクロインジェクション(Capecchi, 1 980)、エレクトロポレーション(Wong and Neumann, 1982; Fromm et al., 1985)および遺伝子銃(Johnston and Tang, 1994; Fynan et al., 1993)のような物理的方法；（３）ウイルスベクター法(Clapp, 1993; Lu et al., 1993; Eglitis and Anderson, 1988a; 1988b)；ならびに（４）受容体を介する機構(Curiel et al., 1991; 1992; Wagner et al., 1992)。
【００８８】
エレクトロポレーション：短時間の高電圧電気パルスの適用により種々の動物および植物細胞の原形質膜にナノメートルの大きさの穴を開ける。これらの穴を通じてか、またはその穴の閉鎖に伴って起こる膜成分の再分布の結果として、ＤＮＡが直接細胞質に取り入れられる。エレクトロポレーションは極めて効率が良く、クローニングした遺伝子の一過性発現にも、目的の遺伝子のコピーが組み込まれた細胞系統の確立にも使用することができる。エレクトロポレーションでは、リン酸カルシウムを介したトランスフェクションやプロトプラスト融合とは対照的に、外来ＤＮＡの１コピーまたは多くても数コピーが組み込まれた細胞系統が生じることが多い。
【００８９】
エレクトロポレーションを用いたＤＮＡ導入は、当業者には周知のことである。この方法では、ペクチン分解酵素のような特定の細胞壁分解酵素を使用して、目的の受容細胞のエレクトロポレーションによる形質転換を未処理の細胞よりも起こりやすくする。あるいは、受容細胞の機械的損傷による形質転換を起こりやすくする。エレクトロポレーションによる形質転換を起こすために、細胞の懸濁培養物のようなもろい組織または胚発生カルスのいずれかを使用してもよいし、あるいは、未熟胚または他の組織化組織を直接形質転換してもよい。制御された方法で、選択した細胞の細胞壁をペクチン分解酵素（ペクトリアーゼ）または機械的損傷に曝すことによってそれらを部分的に分解する。このような分解を受けた細胞はこの段階で実施し得るエレクトロポレーションによるＤＮＡ移入を受け入れる。新たに組み込まれたＤＮＡの性質に応じた好適な選択またはスクリーニングプロトコールによって、その後、形質転換された細胞を同定することができる。
【００９０】
マイクロプロジェクタイル衝撃：形質転換用ＤＮＡセグメントを植物細胞へと送達するのにさらに有利な方法がマイクロプロジェクタイル衝撃である。この方法では、粒子を核酸でコーティングし、それを推進力によって細胞へと送達する。典型的な粒子としては、タングステン、金、白金などで構成されているものが挙げられる。
【００９１】
マイクロプロジェクタイル衝撃（Bombardment）の利点は、安定形質転換単子葉植物を再生可能な方法で得る有効な手段であることの他、プロトプラストの単離(Cristou et al., 1988)もアグロバクテリウム感染に対する感受性も必要としないことである。加速法によりＤＮＡをトウモロコシ細胞へと送達するための方法の実施形態がBiolistics Particle Delivery Systemである。このシステムを使用して、ＤＮＡまたは細胞でコーティングした粒子を、ステンレス鋼またはNytex社製スクリーンのようなスクリーンを通して、懸濁培養したトウモロコシ細胞で被覆したフィルター表面に推進することができる。粒子が大きな凝集体として受容細胞に送達されないようにこのスクリーンによって粒子を分散するものと考えられる。発射装置と衝撃しようとする細胞との間にあるスクリーンが発射物の凝集体の大きさを小さくし、大きすぎる発射物による受容細胞へのダメージを減少させることにより、形質転換の頻度を高めることへとつながる。
【００９２】
衝撃では、懸濁細胞をフィルターまたは固体培養培地に集中させることが好ましい。あるいは、未熟胚または他の標的細胞を固体培養培地に配置してもよい。衝撃しようとする細胞をマクロプロジェクタイル停止プレートの下方、好適な距離に置く。要すれば、１以上のスクリーンも加速装置と衝撃しようとする細胞との間に配置する。本明細書で示される技術の使用を通じて、マーカー遺伝子を一過性発現している細胞の最大１０００またはそれ以上の増殖巣を得ることができる。衝撃の４８時間後に外来遺伝子産物を発現する増殖巣中の細胞数は、ほとんどの場合、１〜１０および平均１〜３の範囲である。
【００９３】
衝撃形質転換では、最大数の安定した形質転換体を得るために、衝撃前培養の条件および衝撃パラメーターを最適化することができる。衝撃に関する物理的パラメーターおよび生物学的パラメーターはいずれも、この技術において重要である。物理的因子としては、ＤＮＡ／マイクロプロジェクタイル沈降の操作に関与するものまたはマクロプロジェクタイルもしくはマイクロプロジェクタイルのいずれかの飛行および速度に影響を及ぼすものがある。生物学的因子としては、衝撃前および衝撃直後の細胞の操作に関わる総ての工程、衝撃に伴う損傷の軽減のために役立つ標的細胞の浸透圧調整、さらに線状化ＤＮＡまたは完全なスーパーコイル状プラスミドのような形質転換用ＤＮＡの性質が挙げられる。未熟胚の形質転換を成功させるためには、衝撃前操作が特に重要であると考えられる。
【００９４】
よって、条件を十分に最適化するためには小規模研究において衝撃パラメーターの一部を調整することが望ましいと考えられる。特に、ギャップ距離、飛行距離、組織距離およびヘリウム圧のような物理的パラメーターを調整することが望ましい。受容細胞の生理的状態に影響を及ぼし、その結果として、形質転換および組込み効率に影響を及ぼし得る条件を改変することにより、損傷低減係数（ＴＲＦ）を最小限に抑えることもできる。例えば、最適な形質転換を行うために、受容細胞の浸透圧状態、組織の水和および継代培養段階または細胞周期を調整することができる。他の通常の調整の実施については、本開示内容に照らして、当業者には分かるであろう。
【００９５】
アグロバクテリウムを介した導入：アグロバクテリウムを介した導入は、ＤＮＡをあらゆる植物組織に導入することができ、プロトプラストからの完全な植物を再分化させる必要性がなくなることから、応用の範囲が広い、遺伝子を植物細胞へと導入するためのシステムである。ＤＮＡを植物細胞に導入するためにアグロバクテリウムを介して植物に組み込むベクターを使用することは、当技術分野では周知のことである。例えば、記載されている方法参照(Fraley et al., 1985; Rogers et al., 1987)。さらに、Ｔｉ−ＤＮＡの組込みは、比較的正確なプロセスであり、再配列はほとんど起こらない。導入しようとするＤＮＡの領域は、境界配列によって規定され、記載されている(Spielmann et al., 1986; Jorgensen et al., 1987)ように、介在するＤＮＡが、通常、植物ゲノムに挿入される。
【００９６】
最新のアグロバクテリウム形質転換ベクターは、大腸菌(E. coll)ならびにアグロバクテリウムでの複製が可能であり、記載されている(Klee et al., 1985)ように便宜的な操作が可能である。さらに、アグロバクテリウムを介した遺伝子導入用ベクターにおける最近の技術的進歩により、ベクターにおける遺伝子および制限部位の配列が改善され、種々のポリペプチドコード遺伝子を発現し得るベクターの構築が容易になった。記載されているベクター(Rogers et al., 1987)は、挿入されたポリペプチドコードグ遺伝子を直接発現させるために、プロモーターにフランキングする便宜的なマルチリンカー領域とポリアデニル化部位を有しており、このベクターは本目的に適している。さらに、形質転換には武装Ｔｉ遺伝子および非武装Ｔｉ遺伝子を含有するアグロバクテリウムを使用することができる。アグロバクテリウムを介した形質転換が有効である植物系統では、遺伝子導入が容易で明確なことからこの方法が一般的に好まれて用いられる。
【００９７】
葉のディスクおよび子葉や胚軸のような他の組織のアグロバクテリウムを介した形質転換は、アグロバクテリウムが自然に感染する植物に限定されるようである。アグロバクテリウムを介した形質転換は、双子葉植物において最も効果的である。記載されている(Bytebier et al., 1987)ように、アグロバクテリウムベクターを用いてアスパラガスにおいてトランスジェニック植物が作製されているが、ほとんどの単子葉植物は、アグロバクテリウムの自然宿主ではないように思われる。そのため、イネ、トウモロコシおよびコムギのような商業的に重要な穀物は、通常、別の方法を用いて形質転換しなければならない。
【００９８】
アグロバクテリウム形質転換法を用いて作製されたトランスジェニック植物は、一般に、一染色体上に単一遺伝子を有する。このようなトランスジェニック植物は、追加した遺伝子のヘテロ接合体であるといえる。しかしながら、「ヘテロ接合体」という言葉の使用には、通常、染色体対の第２の染色体の同じ遺伝子座に補足遺伝子が存在することが包含され、さらに、１個の追加された遺伝子を含有する植物にはこのような遺伝子がないため、追加された外来遺伝子が有糸分裂および減数分裂中に独立に分離することからも、このような植物に対するより正確な名前は、独立した分離体であると考えられる。
【００９９】
追加された構造遺伝子のホモ接合体であるトランスジェニック植物；すなわち、２個の追加された遺伝子、染色体対の各染色体の同じ遺伝子座に１個の遺伝子を含有するトランスジェニック植物がより好ましい。ホモ接合体トランスジェニック植物は、単一追加遺伝子を有する独立した分離体であるトランスジェニック植物を雌雄交配（自殖）させ、生じた種子の一部を発芽させ、結果として得られた植物を、対照（天然非トランスジェニック）または独立した分離体であるトランスジェニック植物と比べて高い２−アセチル−１−ピロリンレベルについて解析することにより得ることができる。
【０１００】
これらシステムの異なる植物系統への適用は、プロトプラストからその特定の植物系統を再分化させる能力に応じる。プロトプラストから穀物を再分化させる方法の例は記載されている(Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Yamada et al., 1986; Abdullah et al., 1986)。
【０１０１】
プロトプラストからの再分化がうまくいかなかった植物系統を形質転換するために、ＤＮＡを完全な細胞または組織に導入する他の方法を利用してもよい。例えば、未熟胚または外植片からの穀物の再分化は、記載されている(Vasil, 1988)ように行われる。さらに、「粒子銃」または高速マイクロプロジェクタイル技術を利用してもよい(Vasil, 1992)。
【０１０２】
後者の技術を用いて、記載されているように、金属小粒子の表面に付けたＤＮＡを細胞壁を通過して細胞質に運び込む(Klein et al., 1987; Klein et al., 1988; McCabe et al., 1988)。金属粒子は数層の細胞を貫通するため、組織外植片内での細胞の形質転換が可能となる。
【０１０３】
単離された：「単離された」生物学的成分（核酸もしくはタンパク質または細胞小器官など）は、その成分が自然に存在する細胞または生物体における他の生物学的成分、すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびに細胞小器官から実質的に分離されているか、または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質としては、標準的な精製方法により精製された核酸およびタンパク質が挙げられる。この用語は化学合成された核酸を含む核酸を包含し、また、in vitroでの組換え発現または宿主細胞での組換え発現により調製されたタンパク質および以下に定義する組換え核酸も包含する。一例として、コンティグのような大きなゲノムＤＮＡ断片の遺伝子は、平均コンティグに見られる余分のＤＮＡが比較的多量にあるため、他の生物学的成分から、単離されたと考えられるほど十分には精製されない。以下に概説するように、「組換え核酸」および「組換えタンパク質」もまた上記のように「単離される」。
【０１０４】
組換え：「組換え核酸」とは、本明細書において、天然には存在していない配列を有する核酸、または配列の２つの別の分離セグメントを人為的に組み合わせることによって作製された配列を有する核酸を意味する。この人為的な組合せは、化学合成により、または、一般的には、核酸の人為的操作により、例えば、制限酵素、リガーゼ、リコンビナーゼおよび／またはポリメラーゼによる少なくとも１つの核酸の操作によるような遺伝子工学技術により行われることが多い。宿主細胞に導入されると、組換え核酸が宿主細胞によって複製される；しかしながら、細胞で一度複製された組換え核酸は、依然として本発明の目的での組換え核酸である。「組換えタンパク質」とは、本明細書において、組換え核酸を使用する方法によって作製されたタンパク質を意味する。以上で概説したように、「組換え核酸」および「組換えタンパク質」もまた上記のように「単離される」。コンティグのような大きな断片の遺伝子は、このような人為的な組合せがその遺伝子と関係ない場合には、「組換え核酸」ではないだろう。しかしながら、コンティグのある遺伝子の周囲または内部の配列がその遺伝子に関連する目的で（すなわち、その遺伝子がコンティグの末端近くにあるという理由だけでなく）操作されている場合には、核酸の組換え部分と問題の遺伝子とが相対的に近いことから、コンティグのそのような遺伝子は「組換え核酸」の構成要素となるであろう。
【０１０５】
非天然植物：本明細書において、植物に関して使用する「非天然」とは、植物における化合物２−アセチル−１−ピロリンのレベルを改変するために人間の介入による遺伝子操作を受けた植物を意味する語である。遺伝子操作を受けた天然植物とは、「対照」植物をさす。本発明において、対照植物がトランスジェニック植物であってもよい。例えば、対照植物が除草剤耐性トランスジェニック植物であってもよい。この例においては、非天然植物が除草剤耐性であり、対照除草剤耐性植物よりも高いレベルの化合物２−アセチル−１−ピロリンを有するであろう。本発明のトランスジェニック植物は、例えば、２ＡＰ遺伝子またはその断片をコードする外来核酸分子を含有する非天然植物であり、それゆえ、人間の介入による遺伝子操作を受けたものである。さらに、例えば、突然変異誘発物質、例えば、化学的突然変異誘発物質またはトランスポゾンまたはＴ−ＤＮＡのような「挿入突然変異誘発物質」に計画的に曝露させた結果として２ＡＰ遺伝子調節エレメントまたはコーディング配列に突然変異を有する植物も、人間の介入による遺伝子操作を受けたということから非天然植物と考えられる。これに対し、偶発または自然発生突然変異しか有していない植物は、本明細書にて定義する「非天然植物」ではない。非天然植物は、一般に、天然植物と比べて変化した核酸配列を有しているが、同時に、非天然植物に、その核酸配列を変えることなく、例えば、そのメチル化パターンを改変することにより、人間の介入による遺伝子操作を行い得ることは当業者には明白である。
【０１０６】
トランスジェニック植物：形質転換された植物細胞またはプロトプラストから得られた、その植物ＤＮＡが同じ系統のネイティブな非トランスジェニック植物にはもともと存在していない導入された外来ＤＮＡ分子を有している植物またはその後代。用語「トランスジェニック植物」および「形質転換された植物」とは、当技術分野において、その植物のＤＮＡが外来ＤＮＡ分子を有している場合の植物を定義するための同義語として使用されることがある。しかしながら、形質転換された植物細胞またはプロトプラストから得られた再分化植物またはカルスをトランスジェニック植物と呼ぶことがより科学的に正しいと考えられ、その使用法は、本明細書に従うものとする。
Ｉ．２−アセチル−１−ピロリン（２ＡＰ）遺伝子
【０１０７】
Ａ．オーソログ／ホモログの単離：イネにおけるＯｓ２ＡＰ遺伝子の単離および特性決定を記載している以下の実施例節は、２ＡＰ遺伝子を単離するための典型的な一般アプローチである。このような２ＡＰ遺伝子は２ＡＰタンパク質をコードする。単離された遺伝子は、その後、植物における２ＡＰ遺伝子発現を低減するための組換えベクターの構築に使用することができる。
【０１０８】
一般に、以下に記載する組換えＤＮＡ技術における用語および実験室手順は十分に知られているものであり、当技術分野では一般に使用されている。クローニング、ＤＮＡおよびＲＮＡ単離、増幅ならびに精製には標準的な技術を用いる。一般に、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを必要とする酵素反応は、製造業者の仕様書に従って実施する。これらの技術および種々の他の技術は、一般に、Sambrook et al., Molecular Colning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989)に従って実施する。
【０１０９】
２ＡＰ遺伝子の単離は、数多くの技術によって行うことができる。例えば、本明細書において開示された配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー内の所望の遺伝子を同定することができる。ゲノムライブラリーを構築するため、ゲノムＤＮＡの大きなセグメントを、例えば、制限エンドヌクレアーゼを使用したランダム断片化により作製し、それをベクターＤＮＡと連結して、好適なベクターにパッケージングし得るコンカテマーを作出する。ｃＤＮＡライブラリーを作成するため、ｍＲＮＡを葉のような所望の器官から単離し、ｍＲＮＡから２ＡＰ遺伝子転写物を含むｃＤＮＡライブラリーを作成する。あるいは、２ＡＰ遺伝子またはホモログが発現される他の組織から抽出されたｍＲＮＡよりｃＤＮＡを調製してもよい。
【０１１０】
本明細書において開示されたイネＯｓ２ＡＰ遺伝子のようなクローニングされる２ＡＰ遺伝子の配列に基づくプローブを使用して、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを、その後、スクリーニングすることができる。同じまたは異なる植物種の相同遺伝子を単離するために、プローブを使用してゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列とハイブリダイズさせてもよい。
【０１１１】
１０〜１４、１５〜２０、３０、５０ヌクレオチド、場合によっては、およそ１００〜２００ヌクレオチドの、配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５で示されるＤＮＡ配列と同じか、または配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５で示されるＤＮＡ配列と相補的である、連続したヌクレオチドストレッチで構成されている配列領域を有する核酸分子が、例えば、サザンおよびノーザンブロット法で用いるハイブリダイゼーションプローブとして、特に意図される。連続した相補的領域の長さが約１０〜１４から約１００または２００ヌクレオチドまでのように可変であるより小さな断片は、一般に、ハイブリダイゼーション実施形態において有用であるが、検出が望まれる相補配列の長さに応じて、より大きな連続した相補的ストレッチを使用してもよい。
【０１１２】
約１４ヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブを使用することで安定した選択できる二本鎖分子が形成される。しかしながら、ハイブリッドの安定性と選択性を高めることによって、得られる特異的なハイブリッド分子の品質と程度を向上させるためには、１４塩基長を上回るストレッチに対する連続した相補配列を有する分子が一般に好ましい。一般的には、１５〜２０個の連続したヌクレオチド、要すれば、より長いヌクレオチドの遺伝子相補的なストレッチを有する核酸分子を設計することが好ましい。
【０１１３】
当然のことながら、例えば、機械的剪断または制限酵素消化によるなどの他の技術によっても断片を得ることができる。小さな核酸セグメントまたは断片は、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用して一般に実施されているように、化学的手段によって断片を直接合成することによって、容易に調製され得る。また、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号（それぞれ引用することにより本明細書の一部とされる）のＰＣＲ．ＴＭ．法のような核酸複製技術を適用することにより断片を得てもよいし、選択した配列を組換え生産用組換えベクターに導入することにより断片を得てもよいし、分子生物学分野における通常の技術を有する人には一般に知られている他の組換えＤＮＡ技術により断片を得てもよい。
【０１１４】
よって、ＤＮＡ断片の相補的ストレッチと選択的に二本鎖分子を形成させるために本発明の核酸配列を使用することができる。想定される用途に応じて、ハイブリダイゼーション条件を変え、標的配列に向けるプローブの選択性の程度を変えることが望ましい。高い選択性を必要とする用途では、一般に、比較的ストリンジェントな条件を使用して、ハイブリッドを形成させることが望ましい。例えば、約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、約５０℃〜約７０℃の温度にて提供されるような比較的低塩および／または高温条件を選択する。このような選択条件は、プローブと鋳型または標的鎖間のミスマッチがもしあるとしてもほとんど許容しないため、２ＡＰポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントまたはタンパク質をコードするＤＮＡセグメントの単離に特に好適であろう。ハイブリダイゼーションを介したＤＮＡセグメントの検出は、当業者には周知のことであるが、米国特許第４，９６５，１８８号および第５，１７６，９９５号（それぞれ引用することにより本明細書の一部とされる）の教示がハイブリダイゼーション解析の典型的な方法である。Maloy et al., 1994; Segal 1976; Prokop, 1991;およびKuby, 1994の本文中に記載されている内容のような教示が特に適切である。
【０１１５】
当然のことながら、例えば、対象鋳型とハイブリダイズする突然変異型プライマー鎖を使用して、突然変異体を調製することが望ましく、また、関連種、機能的同等物などから２ＡＰタンパク質をコードする配列を単離しようとする一部の用途では、ヘテロ二本鎖を形成させるために、一般に、より低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が必要である。これらの状況においては、約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍ塩、約２０℃〜約５５℃の範囲の温度のような条件を使用することが望まれる。制御ハイブリダイゼーションでは、クロスハイブリダイズしている種をハイブリダイズししているシグナルとして容易に確認することができる。どんな場合でも、温度上昇と同様に、ハイブリッド二本鎖を不安定にする働きをする漸増量のホルムアミドの添加によってより高いストリンジェントな条件にすることができることは一般に知られている。このように、ハイブリダイゼーション条件は容易に操作し得るものであることから、一般には、所望する結果に応じて方法が選択できる。
【０１１６】
特定の実施形態においては、本発明の核酸配列をハイブリダイゼーションを判定するための標識のような好適な手段と組み合わせて使用することが有利である。多種多様な好適な表示手段が当技術分野で公知であり、これらの手段としては、検出可能なシグナルを与え得る、アビジン／ビオチンのような、蛍光、放射性、酵素リガンドまたは他のリガンドが挙げられる。好ましい実施形態において、放射性試薬または他の環境的に望ましくない試薬の代わりに蛍光標識またはウレアーゼ、アルカリ性ホスファターゼもしくはペルオキシダーゼのような酵素タグを使用することが望ましいと思われる。酵素タグの場合、熱量表示基質が知られており、それを使用して、人間の眼でまたは分光光度法で確認できる手段を提供し、相補的核酸を含有するサンプルとの特異的ハイブリダイゼーションを確認することができる。
【０１１７】
一般に、本明細書において記載するハイブリダイゼーションプローブは、溶液ハイブリダイゼーションにおける試薬としても、固相を使用する実施形態においても有用であると想定される。固相に関連する実施形態では、試験ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を、選択したマトリックスまたは表面に吸着させるか、そうでなければ付着させる。この固定された一本鎖核酸を、続いて、所望の条件下で、選択したプローブとの特異的ハイブリダイゼーションに付す。選択する条件は、必要な特定の判定基準に基づいた特定の状況によって変わる（例えば、Ｇ＋Ｃ含量、標的核酸のタイプ、核酸の起源、ハイブリダイゼーションプローブの大きさ他に応じる）。非特異的に結合しているプローブ分子を除去するためにハイブリダイズした表面を洗浄した後、特異的ハイブリダイゼーションを検出する。場合によっては、標識を用いて定量する。
【０１１８】
また、増幅技術を用いて、核酸サンプルから目的の核酸を増幅することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、２ＡＰ遺伝子の配列を、ｍＲＮＡから、ｃＤＮＡから、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから直接増幅することができる。ＰＣＲおよび他のin vitro増幅法は、例えば、発現させようとするタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするのに、サンプル中の所望のｍＲＮＡの存在を検出する目的で、核酸配列を決定する目的で、または他の目的でプローブとして使用する核酸を作製するのにも有用であり得る。
【０１１９】
植物組織由来の２ＡＰ遺伝子配列を同定するのに好適なプライマーおよびプローブは、本明細書において提供する配列の比較により得られる。ＰＣＲの一般概要に関しては、引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＲプロトコール：A Guide to Methods and Applications. (Innis, M, Gelfand, D., Sninsky, J. and White, T., eds.), Academic Press, San Diego (1990)参照。
【０１２０】
技術文献に記載されている周知の技術によりポリヌクレオチドも合成し得る。例えば、Carruthers et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411-418 (1982)およびAdams et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 661 (1983)参照。さらに、相補鎖を合成し、好適な条件下でそれらの鎖を一緒にアニーリングすることによるか、または好適なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を合成することにより二本鎖ＤＮＡ断片が得られる。
【０１２１】
Ｂ．２ＡＰ遺伝子オーソログを単離する生物：トウモロコシ属(Zea)、カラスムギ属(Avena)、オオムギ属(Hordeum)、ライムギ属(Secale)、コムギ属(Triticum)およびモロコシ属(Sorghum)の種を含むいろいろな種類の植物および真菌を使用することができる。２−アセチル−１−ピロリンは、あらゆる香米、小麦およびライ麦パン(Buttery et al., 1982, 1983)、含水雑穀(Seitz et al., 1993)、ポップコーン(Schieberle et al., 1991)、バチルス・セレウス(Romanczyk et al., 1995)ならびにアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)およびスポロボルス・ビルギニカス(Sporobolus virginicus)のような一部の真菌種(Nagsuk et al., 2004)の主要な強い香気化合物であることが分かっている。ゲノムレベルでの穀物間でのシンテニー、さらに、植物および微生物においてよく保存されたプロリンおよびポリアミン代謝経路を示すいくつかの報告がある（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Kyoto University, Bioinformatics Center, Institute for Chemical Researchのホームページにてオンラインで見つけられる）。そのため、２ＡＰ遺伝子のオーソログは、穀物用植物間で同様に作用するかもしれず、本発明にて示す教示によって、イネと同様に他の植物においても化合物２−アセチル−１−ピロリンの蓄積が増強する可能性がある。
II．植物における２−アセチル−１−ピロリンレベルを上昇させるための２ＡＰ遺伝子発現または２ＡＰタンパク質レベルもしくは活性の低減
【０１２２】
Ａ．突然変異誘発：ＥＭＳ（メタンスルホン酸、エチルエステル）のような化学的突然変異誘発物質ならびにγ線および高速中性子照射によってＤＮＡに突然変異が生じる可能性がある。突然変異のいくつかの例が、欠失、挿入およびミスセンス突然変異である。突然変異後、スクリーニングを行って、早期停止コドンを与えるか、そうでなければ機能しない２ＡＰ遺伝子を生じる欠失を確認することができる。配列決定によるか、または本発明によって提供される、２ＡＰ遺伝子またはタンパク質に特異的なプローブもしくはプライマーを使用することにより突然変異体のスクリーニングを行うことができる。２ＡＰ遺伝子における特異的突然変異は、ＴＩＬＬＩＮＧ(Targeted Induced Local Lesion of Genome)(Till et al., 2003)およびｔＤＮＡ挿入によっても起こし得る。このような突然変異の結果として、２ＡＰ遺伝子発現の低下、２ＡＰ  ｍＲＮＡの安定性の低下または２ＡＰタンパク質の活性および／もしくは安定性の低下が起こり得る。本明細書において定義するような植物は、天然に存在するものではない。
【０１２３】
Ｂ．アンチセンス技術：アンチセンス技術は、２ＡＰ  ｍＲＮＡのような標的ｍＲＮＡの翻訳を妨げる。そのようなものとして、アンチセンス技術は、一般に、標的タンパク質、本明細書では２ＡＰタンパク質のレベルを低減する。２ＡＰ遺伝子またはその断片は、植物にアンチセンス方向で導入することができる。断片は、１８ヌクレオチドといった小さなものであってもよいし、３，０００ヌクレオチドといった大きなものであってもよいし、あるいはそれより大きくてもよい。２ＡＰ遺伝子のｃＤＮＡ断片は、ベクター（例えば、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２）に天然遺伝子とは逆方向にクローニングすることができる。逆転写物は、天然の２ＡＰ遺伝子転写物を含むヘテロ二本鎖構造を形成しているが、その後、その遺伝子転写物は翻訳前に分解される。センスおよびアンチセンス配列は同一である必要はなく、標的遺伝子発現の抑制を実現するには部分的な相同性で十分である。従って、イネＯｓ２ＡＰ由来の配列（配列番号１、配列番号２、配列番号４および配列番号５）を使用して、他の植物由来の２ＡＰ遺伝子オーソログの配列が分からなくとも、その植物における２ＡＰ遺伝子発現を抑制することができる。
【０１２４】
Ｃ．ＲＮＡ干渉：ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的ｍＲＮＡの排除に関連するもう１つの技術である。ＲＮＡｉ用のベクターの構築は様々であるが、基本的にはＲＮＡにおいてヘアピンループ構造の形成が起こる(Horiguchi 2004)。実施例２では、そのｃＤＮＡとは逆方向にエクソン６、７および８を含むＯｓ２ＡＰ核酸配列の断片をベクターにクローニングして、ｍＲＮＡにおいて逆ヘアピン構造をもたらした。これらのヘアピン構造はＤｉｃｅｒと呼ばれるエンドヌクレアーゼによって小断片に切断される。このＤｉｃｅｒの機能は、間違った転写産物が翻訳されないようにすることである(Hamilton and Baulcombe, 1999, Matzke et al., 2001)。ｍＲＮＡの小断片は、一般に、約２０〜２１ヌクレオチドの大きさであり、ｓｉＲＮＡまたは小干渉ＲＮＡと呼ばれている。より大きな断片もより小さな断片も使用することができる。これらのｓｉＲＮＡは、相同遺伝子の発現をダウンレギュレートし得る。この場合もまた、相同性が完全である必要はないため、本発明において詳述するイネ由来の配列を使用して、他の植物のＲＮＡｉ構築物を作製することができる。実施例２は、非香米系統におけるＯｓ２ＡＰ遺伝子を標的としたＲＮＡｉ試験によって、いかにして、香米に見られるレベルまでに高められた２−アセチル−１−ピロリンレベルおよび芳香が得られるのかを示している。
III．トランスジェニック植物の作製
【０１２５】
これまでの技術において単離された２ＡＰ遺伝子配列を使用するために、植物細胞の形質転換に好適な組換えＤＮＡベクターを調製することができる。多種多様な高等植物種を形質転換する技術はよく知られたものであり、技術文献および科学文献に記載されている。例えば、Weising et al. Ann. Rev. Genet. 22: 421-477 (1988)参照。
【０１２６】
このようなＤＮＡ構築物を、種々の従来の技術により所望の植物宿主のゲノムに導入し得る。例えば、ＤＮＡ構築物を、植物細胞プロトプラストまたは胚発生カルスのエレクトロポレーション、ＰＥＧポレーション、粒子衝撃およびマイクロインジェクションのような技術を用いて植物細胞のゲノムＤＮＡに直接導入してもよいし、またはＤＮＡ構築物を、ＤＮＡ粒子衝撃のような弾道学的方法を用いて植物組織に直接導入することもできる。あるいは、ＤＮＡ構築物を好適なＴＤＮＡフランキング領域と組み合わせ、一般的なアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)宿主ベクターに導入してもよい。アグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主の毒性機能が、細胞が細菌類に感染したときに、構築物と隣接するマーカーの植物細胞ＤＮＡへの挿入を導く。
【０１２７】
マイクロインジェクション技術は、当技術分野では公知のものであり、科学文献および特許文献で詳しく記載されている。ポリエチレングリコール沈降を用いたＤＮＡ構築物の導入は、Paszkowski et al. Embo J. 3: 2717-2722 (1984)で記載されている。エレクトロポレーション技術は、Fromm et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824 (1985)で記載されている。弾道学的形質転換技術は、Klein et al. Nature 327: 70-73 (1987)で記載されている。数多くのアプローチを用いて、ライムギ(de la Pena et al., Nature 325: 274-276 (1987))、トウモロコシ(Rhodes et al., Science 240: 204-207 (1988))およびイネ(エレクトロポレーションによるShimamoto et al., Nature 338: 274-276 (1989); 弾道学的技術によるLi et al. Plant Cell Rep. 12: 250-255 (1993))のような穀物種を形質転換することができる。
【０１２８】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介した形質転換技術は、科学文献で詳しく記載されている。例えば、Horsch et al. Science 233: 496-498 (1984)およびFraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803 (1983)参照。アグロバクテリウムは、主として、双子葉植物において有用であるが、アグロバクテリウムによって形質転換することができる単子葉植物もある。例えば、イネのアグロバクテリウム形質転換は、Hiei et al., Plant J. 6: 271-282 (1994)により記載されている。
【０１２９】
上記形質転換技術のいずれかによって誘導された形質転換植物細胞を培養して、形質転換された遺伝子型を有し、その結果としてより高いレベルの２−アセチル−１−ピロリンと増強された芳香を有する完全な植物体を再分化させることができる。このような再分化技術は、一般に、２ＡＰヌクレオチド配列とともに導入された殺生物剤および／または除草剤マーカーに依存して、組織培養増殖培地における特定の植物ホルモンの操作によって行うものである。培養プロトプラストからの植物再分化は、Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983;およびBinding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985で記載されている。植物カルス、外植片、器官またはその一部からも再分化が可能である。このような再分化技術は、一般に、Klee et al. Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486 (1987)で記載されている。
【０１３０】
熟練者ならば、発現カセットがトランスジェニック植物に安定して組み込まれ、機能しうることが確認された後、それが雌雄交配により他の植物に導入することができることが分かるであろう。交配しようとする種に応じ、数多くの標準的な繁殖方法のいずれを使用してもよい。
IV．２−アセチル−１−ピロリンレベルについての試験
【０１３１】
Ａ．官能試験：乾燥種子、調理した米またはすりつぶした葉の揮発性芳香は、感覚によって識別することができる。(Dhulappanavar, 1976, Ghose et al., 1952, Kadam et al., 1938).このような感覚識別法としては、味覚試験が挙げられる。米育種家の間で一般に実施されているもう１つのものが、水中で葉組織を加熱した後、希釈ＫＯＨ溶液を添加する方法である(Sood and Siddiq, 1978)。これらの試験は必ずしも一貫性と信頼性があるとが限らず、人的エラーが起こりやすく、偏りがちである。
【０１３２】
Ｂ．クロマトグラフィー：調理した米１００グラムから揮発性化合物を定量するためのガスクロマトグラフィーを使用したより信頼性のある方法を開発した(Petrov et al., 1995)。最近、たった１グラムの米から１ｐｐｂ（１０億分の１）といった低い２−アセチル−１−ピロリンレベルを分析するために、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣＭＳ）法が開発された(Mahatheeranont et al., 1995)。そのようなものとして、ＧＣＭＳを使用して、天然および非天然植物における２−アセチル−１−ピロリンのレベルを調べることができる。図１参照。
【実施例】
【０１３３】
好ましい実施形態の説明
実施例１：米の芳香を制御する遺伝子のポジショナルクローニング
米の芳香特性は、これまでに、定性的芳香測定法と定量的芳香測定法の両方に基づいて染色体８にマッピングされている(Lorieux et al. 1996)。芳香遺伝子は、ＲＧ２８から４．５ｃＭ離れた位置にマッピングされ(Ahn et al. 1992)、ＲＧ２８とＲＧ１の間、１２ｃＭ内にマッピングされている(Lorieux et al. 1996)。最近、公開イネゲノム配列から得られた一塩基変異多型（ＳＮＰ）マーカーＲＳＰ０４が芳香遺伝子から２ｃＭ離れた位置にマッピングされた(Jin et al. 2003)。
【０１３４】
単一ＱＴＬは、染色体８のＲＦＬＰマーカーＲＧ１およびＲＧ２８によってフランキングされる４．５ｃＭ領域に位置していた(Lorieux et al., 1996; Lanceras et al. 2000)。ＫＤＭＬ１０５由来のＥｃｏＲＩ  ＢＡＧライブラリーは、１７の一倍体ゲノムを示す７５，２６４クローンで構成されたものであった。２５ＢＡＧクローンからなる開始ＢＡＧコンティグを、領域内のマッピングされている６個のマーカーを用いることにより選択し(Wanchana et al., 2005)、ＨｉｎｄIIIフィンガープリンティングによりさらに絞り込んだ。２−アセチル−１−ピロリンの蓄積に関与する遺伝子を同定するため、重要な領域を以下の戦略により狭めた。
【０１３５】
最初に、重要な領域内に新規組換え体を生み出すための起源として単一のＦ６植物を選択した（そのＦ７において穀物の芳香について分離した）。Ｆ７〜Ｆ１から、各世代に対して、穀物の芳香とマーカー遺伝子型に基づいてヘテロ接合体植物を選択した。Ｆ１０世代では、３７４個体のＦ１０植物をＫＤＭＬ１０５ＢＡＧ末端配列から得られた１８個の多型マーカーを用いてスクリーニングすることにより重要な領域が３８０ｋｂに狭められた。２７４個体のＦ１１植物をスクリーニングすることによりその領域を１２０ｋｂにさらに絞った（図２）。図式遺伝子型決定および２−アセチル−１−ピロリン量に基づいて、８のＦ１１植物を選択して、芳香性、非芳香性およびヘテロ接合体同質遺伝子系統を作製した（図２）。この段階で、３つのＫＤＭＬ  ＢＡＧクローン、１５５Ｌ１１、６８Ｌ１３および１６７Ｍ２３をショットガン配列決定用に選択した。ＫＤＭＬ由来の配列と対応するニホンバレゲノムコンティグのアラインメントにより、Ｆ１２世代におけるさらなるスクリーニングに用いられる２１個の挿入／欠失（「ｉｎｄｅｌ」）マーカーが同定された。１，１１６個体のＦ１２植物を使用することにより、標的領域を５８ｋｂ  ＢＡＧ，１６７Ｍ２３内の２７ｋｂに狭めた（図２）。この交配では、これ以上の組換えは確認されなかった。米粒子において２−アセチル−１−ピロリン蓄積に違いがはっきりと示される数系統の同質遺伝子系統が作出された（図６）。
【０１３６】
配列解析では、ＢＡＣ  １６７Ｍ２３が１９個の遺伝子を含有していることが分かった。しかしながら、１０個の遺伝子だけが既知タンパク質またはコーディング配列との類似性を有するものであった。２７ｋｂ領域内では、３個の候補遺伝子が同定された：３−メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＭＣＣアーゼ）、仮定的遺伝子および未知タンパク質。ＫＤＭＬ１０５とＪａｏＨｏｍ  Ｎｉｎ（ＪＨＮ）、非芳香性黒色米の交配による１７７のＦ６植物を用いて、穀物の芳香および２−アセチル−１−ピロリンレベルに影響を及ぼす未知タンパク質のエクソン７内に組換え部位が確認された。ＢＡＧ  １６７Ｍ２３とＢＡＧ  ６８Ｌ１３両方のこれらの７個の候補遺伝子の発現を調べるため、２−アセチル−１−ピロリンが米粒子に蓄積する登熟期間中にＲＴ−ＰＣＲを行った。芳香性および非芳香性同質遺伝子系統の受粉の１０、１５および２０日後にイネの穂から全ＲＮＡを採取した。ＮＢＳ／ＬＲＲ遺伝子の発現は検出されなかった。ほとんどの候補遺伝子については、芳香性および非芳香性同質遺伝子系統間での発現差は示されなかった。Ｏｓ２ＡＰの場合においてのみ、芳香性同質遺伝子系統で受粉の１５日後に遺伝子発現が急激に低下した（図３Ａ）。Ｏｓ２ＡＰ遺伝子発現の低下は、葉、茎および根においても顕著であった（図３Ｂ）。そのため、発現研究とポジショナルクローニングの両方により、穀物の芳香の蓄積および２−アセチル−１−ピロリンのin vivo合成に関与するレギュレーターとしてＯｓ２ＡＰを確認する。
【０１３７】
これまでに、研究者によって穀物の芳香を制御する１つの劣性核内遺伝子が報告されている(Berner and Hoff, 1986; Yanjuan et al., 1992; Ali et al., 1993)。このことは、本明細書において報告する研究結果と一致する。２−アセチル−１−ピロリンの蓄積を、芳香性および非芳香性同質遺伝子系統とＦ１植物で比較した。これらの結果からは、Ｆ１葉では２−アセチル−１−ピロリンが検出されなかったことが示された。Ｆ２世代で分離が起こったことから、２−アセチル−１−ピロリンレベルは、その供与体である親に見られるレベルの４分の１であった（図３Ｃ）。その結果、古典的遺伝学および分子遺伝学の両方から、エクソン７における突然変異が植物における２−アセチル−１−ピロリン蓄積を調節する分子機構であることが裏付けられた。
【０１３８】
Ｏｓ２ＡＰ遺伝子の構造を、ＫＤＭＬ１０５、芳香性同質遺伝子系統、非芳香性同質遺伝子系統およびニホンバレ間で比較した。５．８ｋｂのＯｓ２ＡＰ遺伝子は、１５エクソンで構成されており、いくつかの同義的な突然変異がエクソン２に見られた（図５Ａ）。ＫＤＭＬ１０５および芳香性同質遺伝子系統では、２つの重要な突然変異事象がエクソン７で確認された。まず、２つの過渡的な突然変異が７３０位（ＡからＴへ）と７３２位（ＴからＡへ）に見られ、続いて、８塩基対の欠失，ＧＡＴＴＡＧＧＣ，が７３４位から開始していた。８同質遺伝子系統間での２−アセチル−１−ピロリンレベルの解析により、８塩基対の欠失がコメ粒子における２−アセチル−１−ピロリンの蓄積と関係していることが示された（図６Ａ）。この突然変異は、７２９位からフレームシフト翻訳開始させ、７５３位から開始する早期停止コドンを与えた（図５Ｂ）。ニホンバレでは、Ｏｓ２ＡＰ全長ｃＤＮＡは５０３個のアミノ酸に翻訳される。欠失により２５２個のアミノ酸の末端切断型ペプチドが作出された（図５Ｂ）。ＫＤＭＬ１０５とＪＨＮから誘導された１７７のＦ６植物では、８塩基対の欠失にフランキングする二重組換えによって、米粒子において２−アセチル−１−ピロリンを生産できないことが説明される。
【０１３９】
この早期停止コドンは、Ｏｓ２ＡＰの発現に大きな影響を与え得る。早期翻訳停止コドンを含む大部分のｍＲＮＡは、ほとんどの場合翻訳されない。その結果として、それらは、遺伝子発現におけるエラーを減少させるという働きをする監視システムとしてナンセンス変異を介したｍＲＮＡの分解（ＮＭＤ）を引き起こすことが多い(Pulak and Anderson, 1993)。この現象によって、香米においてＯｓ２ＡＰ遺伝子発現のレベルが低いことが説明される。
【０１４０】
２ＡＰの直接の前駆体は、まだ確認されていない。しかしながら、Ｏｓ２ＡＰのピロリン環の前駆体は、同位体希釈により決定されたようにアミノ酸プロリンである(Yoshihashi et al., 2002)。また、１−ピロリンおよびピロリン−２−カルボン酸（Ｐ２Ｃ）のようなピロリン含有代謝産物が直接の前駆体としても供給される可能性もあるかもしれない。穀物の芳香の強さを増強するための１つの方法が、より多くの前駆体または中間体が蓄積され、粒子成長期間に２ＡＰへの特異的な変換により多く利用できるようになるように、関連生合成経路に関与する酵素の発現を操作することである。例としては、酵素Ｐ５Ｃシンターゼ、Ｐ５Ｃレダクターゼの発現を増強すると同時にプロリンおよびＰ５Ｃデヒドロゲナーゼを抑制することがある。ポリアミン生合成経路におけるいくつかの酵素を増強して、米粒の成長時により多くの１−ピロリンを生じさせることも可能である。代謝工学アプローチに加え、米において利用できる胚乳特異的なプロモーターを用いることにより、米胚乳における酵素発現を増強してもよい。これらの技術によって、精米においてより芳香性の高い米系統を生み出すことができる。
【０１４１】
実施例２：Ｏｓ２ＡＰ遺伝子を用いた植物形質転換：
Ｏｓ２ＡＰ遺伝子をＲＮＡｉ構築物に組み込み、それを用いてＯｓ２ＡＰ遺伝子発現をダウンレギュレートし、イネにおける２−アセチル−１−ピロリンレベルを高めた。
【０１４２】
Ｏｓ２ＡＰ−ｉｈｐＲＮＡ含有ベクターの構築
Ｏｓ２ＡＰ遺伝子のセンス−アンチセンス断片の発現用にｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ベクターを使用した。ＫＤＭＬ１０５由来のゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡそれぞれを鋳型として用い、ＰＣＲによりセンスおよびアンチセンス断片を作製した。エクソン６〜９に対応するゲノムＤＮＡ配列を含有するセンス断片を、ＮｃｏＩおよびＳｐｅＩ制限部位（下線）を有するプライマー（順方向：AATTCCATGGGGTTGGTCTTCCTTCAGGTG（配列番号８０）；逆方向：AATTACTAGTTTCCACCAAGTTCCAGTGAA（配列番号８１））を用いて増幅した。エクソン６〜８に対応するｃＤＮＡ配列を含有するアンチセンス断片を、ＮｃｏＩおよびＮｈｅＩ制限部位を有するプライマー（順方向：AATTCCATGGGGTTGGTCTTCCTTCAGGTG（配列番号８０）；逆方向：AATTGCTAGCGGTCCAAAAGCAACCAAAGA（配列番号８２）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物をまず、ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩで消化し、その後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。次いで、連結した断片をＮｃｏＩで消化した。精製した連結断片をｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ベクターにＮｃｏＩクローニング部位にてクローニングした（図７Ａ）。
【０１４３】
イネ形質転換
非香米品種（オリザ・サティバ  Ｌ．日本型品種ニホンバレ）の胚発生カルスを粒子衝撃形質転換の標的組織として使用した(Nimlek, 1999)。ハイグロマイシン耐性カルスを、プライマーＯｓ２ＡＰ−エクソン７．１−欠失＿ＦおよびＲ（U:5'-TGCTCCTTTGTCATCACACC-3'（配列番号５４）およびL:5'-TTTCCACCAAGTTCCAGTGA-3'（配列番号５５））とＧＦＰのプライマー（U:5'-CTTGTTGAATTAGATGGTGATGTT-3'（配列番号８３）およびL:5'GTTGTGGGAGTTGTAGTTGTATTC-3'（配列番号８４））を用いてＰＣＲによりスクリーニングした。
【０１４４】
サザンブロット解析
トランスジェニック植物（Ｒ０）および対照（ニホンバレ）植物の葉から全ＤＮＡを単離した。Ｏｓ２ＡＰ−ｉｈｐＲＮＡ断片の検出用にゲノムＤＮＡ（１０ｍｇ）をＮｃｏＩで消化した。陽性対照として、プラスミドＯｓ２ＡＰ−ＲＮＡｉから単離されたＤＮＡをＮｃｏＩで消化した。０．８％アガロースゲルでの電気泳動後、ＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレン(Southern 1975)に移した。プローブとのハイブリダイゼーションを製造業者(Amersham)の使用説明書に従って実施した。（α−３２Ｐ）−ｄＣＴＰを用いてランダムプライマー法により放射性プローブを調製した。プローブは、Ｏｓ２ＡＰ遺伝子のコード領域で構成されていた（ｐＯｓ２ＡＰ−ＲＮＡｉ，２１０ヌクレオチドのＳｐｅＩ−ＮｃｏＩ断片）。
【０１４５】
ＲＴ−ＰＣＲ
異なる成長段階における転写レベルと異なる組織における転写レベルを調べるため、ニホンバレおよびトランスジェニック植物の若い植物（１０日）、成葉（３０日）および根（１４日）および開花期の穂から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ解析に使用した。染色体８のＯｓ２ＡＰ遺伝子の芳香遺伝子座を、Ｏｓ２ＡＰ−エクソン７．１プライマー（U:5'-TGCTCCTTTGTCATCACACC-3'（配列番号５４）およびL:5'-TTTCCACCAAGTTCCAGTGA-3'（配列番号５５））を用いてＰＣＲにより増幅した。ＢＡＤＨ（Ｏｓ２ＡＰ−ｃｈｒ４；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ００１３４８）とも呼ばれる染色体４のＯｓ２ＡＰ遺伝子のホモログを、Ｏｓ２ＡＰｃｈ４プライマー（U:5'-TAGCTTCACATCCCCATGTG-3'（配列番号８５）およびL:5'-GCACCTTCACATCTTGCTGT-3'（配列番号８６）を用いてＰＣＲにより増幅した。対照として、イネアクチン遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｘ１６２８０）を、アクチンU:5'-ACATCGCCCTGGACTATGAC-3'（配列番号８７）およびアクチンL:5'-TGCTGAGAGATGCCAAGA TG-3'（配列番号８８）を用いて増幅した。
【０１４６】
リアルタイム定量的ＰＣＲ
Ｔａｑｍａｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙおよびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出システム(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を利用することにより、製造業者の使用説明書に従ってリアルタイム定量的ＰＣＲを実施した。Ｏｓ２ＡＰのコピー数とイネアクチンのものの比として相対量を算出した。Ｏｓ２ＡＰ遺伝子の芳香性対立遺伝子と非芳香性対立遺伝子を区別するようにTaqmanプローブを設計した。
【０１４７】
結果
４つのハイグロマイシン−ＧＦＰ陽性小植物が再分化された。トランスジェニックイネにおけるＧＦＰの発現は様々であった。Ｔ０ＲＮＡｉ２（１０）、ＧＦＰの最高の発現が示される系統、の内在性Ｏｓ２ＡＰの発現は最も低い（図７Ｂ）。２−アセチル−１−ピロリン含量の解析とＫＯＨ法を用いた官能試験には、十分な相関関係があった。Ｔ０ＲＮＡｉ２（１０）は、最大量の２−アセチル−１−ピロリンを含有しており、芳香性葉が最も多かった。干渉配列の発現量が少ないＴ０ＲＮＡｉ５（２０）とＴ０ＲＮＡｉ３（３０）は、２−アセチル−１−ピロリンの蓄積が少なく、芳香性葉スコアが低かった（図７Ｂ）。Ｔ１ＲＮＡｉ２（１０）の穀物の芳香の分離比分析によりこの結果を確認した。その結果、ＲＮＡ干渉によるＯｓ２ＡＰ遺伝子発現の抑制により、イネにおける２−アセチル−１−ピロリンの蓄積が増加する。このことにより、８塩基対の欠失によって起こる香米におけるＮＭＤによるＯｓ２ＡＰ遺伝子発現の自然抑制が香米の芳香の直接原因であることが示唆される。
【０１４８】
実施例３：イネのＯｓ２ＡＰ／ＢＡＤＨ遺伝子座の特性決定
Ｏｓ２ＡＰは、これまでに染色体４で見つけられたＢＡＤＨ（ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ）のホモログである(Nagamura et al., 1997)。本発明者らは、Ｇｅｎｂａｎｋ配列受託番号ＡＢ００１３４８とＡＰ００４４６３の、それぞれ、染色体４のＢＡＤＨ遺伝子と染色体８のＯｓ２ＡＰ遺伝子のゲノム配列を特徴付けた。イネＧＡＡＳの遺伝子注釈結果に従って（イネゲノム自動注釈システム, Sakata et al., 2002）、ＢＡＤＨおよびＯｓ２ＡＰ両方の構造遺伝子は、１４イントロンによって分断された１５エクソンを含んでなる。ＢＡＤＨおよびＯｓ２ＡＰそれぞれのＯＲＦは、５０５および５０３アミノ酸残基のタンパク質をコードする。両タンパク質は、アミノ酸レベルでは７７％同一であり、他の植物ＢＡＤＨタンパク質と８８％〜９９％同一性を共有している。さらに、これらの２つのタンパク質は、一般アルデヒドデヒドロゲナーゼに高度に保存されているデカペプチドVal-Thr-Leu-Glu-Leu-Gly-Gly-Lys-Ser-Pro（配列番号９６）をコードするヌクレオチド配列を含有している(Weretilnyk et al. 1990)。タンパク質配列のＰｆａｍ解析によれば、ＢＡＤＨもＯｓ２ＡＰもアルデヒドデヒドロゲナーゼファミリーに属する。このファミリーに属するタンパク質は、特定植物種におけるグリシンベタインの合成に関して推定機能を有する。しかしながら、イネ、トウモロコシおよびコムギのようなグリシンベタインを蓄積しない穀物でのこれらのタンパク質の機能は分かっていない。本発明者らは、プロリンが２−アセチル−１−ピロリンの前駆体として報告されていることから、プロリン異化において機能するピロリン−５−カルボン酸デヒドロゲナーゼ（Ｐ５ＣＤＨ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ３００３８）もこのファミリーに含まれることに驚いた。Ｏｓ２ＡＰの機能がベタインアルデヒド以外のアルデヒドの脱水素化を触媒することである可能性がある。
【０１４９】
Ｏｓ２ＡＰ遺伝子発現および米の芳香：両Ｏｓ２ＡＰ遺伝子が芳香生合成に関連しているかどうかを確認するため、芳香性および非芳香性同質遺伝子系統（それらのゲノム背景は芳香遺伝子領域を除いて同一であった）の発現レベルを解析した。結果として、本発明者らは、ＢＡＤＨは両同質遺伝子系統間での発現差は示さないが、一方、Ｏｓ２ＡＰは芳香性同質遺伝子系統の総ての組織において遺伝子抑制を一貫して示すことが分かった（図３Ｄ）。本発明者らはさらに、同質遺伝子系統ならびにニホンバレおよびＫ１０５（芳香性系統）における両タンパク質の発現についても研究した。Ｏｓ２ＡＰ遺伝子発現は、芳香性同質遺伝子系統およびＫＤＭＬＬ１０５においてのみダウンレギュレートされた。これに対し、非芳香性同質遺伝子系統およびニホンバレ米（非芳香性系統）においては、Ｏｓ２ＡＰ遺伝子発現のダウンレギュレーションは検出されなかった。
【０１５０】
実施例４：マーカーを利用した選択
通常の異種交配により新規香米を開発するために、香米供与体とより生産性の高い受容体米品種と交配してもよい。その交配による後代は、数ある形質の中で特に穀物の芳香について分離する。この状況は育種家を混乱させ、より優れた香米についての通常の育種が成功しにくくなる。芳香遺伝子の発見は、従来の育種植物の新しいパラダイムとなる。何千もの植物を最高の精度でスクリーニングし得るように、特異的な分子マーカーを芳香遺伝子を検出するために開発することができる。育種家は、ＤＮＡマーカー法によって、Ｏｓ２ＡＰ遺伝子の芳香性対立遺伝子を早い段階で高感度にて検出し得る。このことにより、育種家が後の段階で芳香性植物に好ましい形質を与えるためのより多くの機会が残される。イネにおいて確認される芳香の分子基盤は、おそらく他の穀物でも見つけられるため、他の穀物のＤＮＡマーカーを開発する方法も開かれる。
【０１５１】
実施例５：Ｏｓ２ＡＰ遺伝子の系統発生解析
プロリンおよびポリアミン生合成は、植物界において高度に保存された経路である。本明細書において提示する２−アセチル−１−ピロリンの生合成は、他の２−アセチル−１−ピロリン産生植物が利用する共通のテーマである。この点について例証するために、マルチプル配列アラインメントを利用して２ＡＰ遺伝子のアミノ酸配列を比較した。結果として得られた系統樹により、イネ、コムギおよびオオムギ由来の２ＡＰ遺伝子が共通の祖先を有し得ることが分かる（図９Ｂ）。それゆえ、穀物における２−アセチル−１−ピロリンの生合成が共通のテーマを有している可能性がある。この点について例証するためには、将来、他の穀物において２ＡＰ遺伝子オーソログを用いた試験を行う必要がある。
【０１５２】
Ｏｓ２ＡＰ遺伝子がどこから来たのかを遡るのは興味深い。「アロマーカー」ＰＣＲプライマーを用いて９５の在来品種を細かく調べることにより、本発明者らは８塩基対の欠失を有する対立遺伝子が芳香の増強と厳密に相関していることが分かった。また、本発明者らは、オリザ・ニバラ(Oryza nivara)およびＯ．ルフィポゴン(O. rufipogon)をはじめとする野生種間で８塩基対の欠失に関連するエクソン７を配列決定した（図９Ａ）。本発明者らは、タイジャスミン(Thai Jasmine)、バスマティ(Basmati)およびアズセナ(Azucena)をはじめとする最も芳香性の高い品種がその欠失を有しており、それゆえ、古代にまで遡り得る共通の祖先を有することが分かった。本発明者らは、芳香性野生米においても芳香性対立遺伝子を確認した。よって、本発明者らが今日知っている香米は、人間が栽培するようになるずっと以前に、単一突然変異が起こって生み出されたのである。
【参照文献】
【０１５３】
以下の参照文献は、それらの全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる。
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【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】カオ・ド・マリ（ＫＤＭＬ１０５）、タイジャスミン米（芳香性）およびコシヒカリ、非香米から、ＧＣ−ＭＳにより得られた２−アセチル−１−ピロリンの化学構造。
【図２】穀物の芳香について分離する、単一Ｆ６植物由来の１８６のＦ９植物を用いたイネにおける芳香遺伝子の詳細なマッピングと穀物の芳香に関する遺伝子を含む物理的地図の構築。第１の部分は、単一Ｆ６植物由来の８のＦ１１植物の図式遺伝子型を示す。第２の部分は、単一ＢＡＣにおいて重要な領域を２７ｋｂに絞るための、単一Ｆ６植物由来の１１１６のＦ１２植物を用いたウルトラスケールマッピングを示す。第３の部分は、３つのオープンリーディングフレームを示すＫＤＭＬ１０５のゲノム配列の注釈を示す。第４の部分は、ＫＤＭＬ１０５とＪＨＮの交配による１７７のＦ６植物を用いて、穀物の芳香および２−アセチル−１−ピロリン含量に大きな影響を及ぼす未知タンパク質遺伝子のエクソン７内に３つの二重組換え体が確認されることを示す。この未知タンパク質遺伝子は、Ｏｓ２ＡＰと名づけられた。「アロマーカー」は、穀物の芳香に特有の８塩基対の欠失と３つのＳＮＰ（一塩基変異多型）を定義するＰＣＲベースのマーカーである。
【図３Ａ】芳香性および非芳香性同質遺伝子系統の受粉の１０、１５および２０日後に単離された全ＲＮＡからの、ＲＴ−ＰＣＲを用いた７つの候補遺伝子の発現。この図において、Ｏｓ２ＡＰは、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼと見なされる。
【図３Ｂ】芳香性および非芳香性同質遺伝子系統の受粉の１５日後に単離された全ＲＮＡからのＯｓ２ＡＰ転写産物の葉、茎および根における示差的発現。
【図３Ｃ】ＴＨＭ（ＫＤＭＬ１０５）、芳香性同質遺伝子系統１１７、非芳香性同質遺伝子系統１０およびそれらのＦ２（ＩＳＬ１１７×ＩＳＬ１０）の穀粒における２−アセチル−１−ピロリンレベルの解析。Ｆ１では、２−アセチル−１−ピロリンレベルの解析を葉で実施した。
【図３Ｄ】上のパネル：Ｏｓ２ＡＰ  ＲＮＡｉ構築物を含有するトランスジェニックニホンバレにおける染色体４のＯｓ２ＡＰホモログとアクチンの発現。下のパネル：染色体４ではなく染色体８のＯｓ２ＡＰ遺伝子（本明細書ではＢＡＤＨと呼ぶ）が、芳香性および非芳香性同質遺伝子系統のイネにおいて示差的発現を示している。
【図４Ａ】プロリンおよびグルタミン酸間の代謝経路。Ｌ−プロリンは、酵素Ｐ５ＣシンターゼおよびＰ５Ｃレダクターゼを用いてグルタミン酸から合成され、グルタミン酸は、プロリンデヒドロゲナーゼ（ＰｒｏＤＨ）およびＰ５Ｃデヒドロゲナーゼ（Ｐ５ＣＤＨ）を用いてプロリンから合成される。提示された代謝シフトは、Ｏｓ２ＡＰのナンセンス突然変異が介在するものであった。
【図４Ｂ】Ｏｓ２ＡＰ酵素の推定タンパク質構造を示す。
【図５Ａ−１】ＫＤＭＬ１０５（芳香性）およびニホンバレ（非芳香性）由来のＯｓ２ＡＰ遺伝子のゲノム配列比較。
【図５Ａ−２】図５Ａの続き。
【図５Ｂ】ニホンバレ、非芳香性系統と比べて、芳香性系統、タイ・ホーム・マリ（ＴＨＭ）における８塩基対の欠失を示すＤＮＡアラインメントおよび２系統間のアミノ酸配列比較。
【図６】単一Ｆ６植物由来の８のＦ１１植物の図式遺伝子型と米粒子の２−アセチル−１−ピロリンレベルの解析。
【図７Ａ】ＲＮＡ干渉構築物と形質転換用ベクター。下のパネルは、構築物の発現確認を示す。本図面においてＢＡＤＨとは、Ｏｓ２ＡＰをさす。
【図７Ｂ】ＲＮＡｉ構築物、ＧＦＰおよび内在性Ｏｓ２ＡＰの発現。下のパネルは、２−アセチル−１−ピロリンレベルと芳香を示す。ＢＡＤＨ−ＲＮＡｉ２は、Ｏｓ２ＡＰ遺伝子に対するＲＮＡｉ構築物である。
【図８Ａ】「アロマーカー」プライマーセットを用いた、芳香の増強と関係しているＯｓ２ＡＰ変異体についてのＦ６後代のスクリーニング。
【図８Ｂ】芳香性Ｏｓ２ＡＰ対立遺伝子についての種々の米品種のスクリーニング。
【図９Ａ】種々の系統のイネ由来のＯｓ２ＡＰオーソログのＤＮＡ配列を示す。
【図９Ｂ】２２のＢＡＤＨ（Ｏｓ２ＡＰ）オーソログの近隣結合樹を用いて構築した系統樹。
【図１】
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【図２】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図５Ａ−１】
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【図５Ａ−２】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ｂ】
2006311854.tif 000036
【図７Ａ】
2006311854.tif 000037
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2006311854000001.pdf