(57)【要約】【課題】波長により異なる有効計測空間体積を補正する手段を設けて正しい計測結果が得られるようにすること。【解決手段】試料に照射するための励起光を発生する少なくとも一つの励起光源１，７と、励起光を試料内で極微小領域に集光する対物レンズ１３と、該励起光によって励起される蛍光を集光するレンズ２０，２６と、少なくとも二つ以上の光検出器１８，２４と、各検出器１８，２４の前方にピンホール２１，２７を配置して実効的に極微小な蛍光検出空間を生成する共焦点光学系と、を具備し、各検出器１８，２４によって検出される蛍光強度の相互相関信号を用いて分析を行なう蛍光分光分析装置であって、各検出器１８，２４によって検出される蛍光強度に対応する有効計測空間体積を補正する手段を備える。【選択図】        図１
2006017628.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に照射するための励起光を発生する少なくとも一つの励起光源と、
前記励起光を試料内で極微小領域に集光する集光光学系と、
該励起光によって励起される蛍光を集光する検出光学系と、
少なくとも二つ以上の検出器と、各検出器の前方にピンホールを配置して実効的に極微小な蛍光検出空間を生成する共焦点光学系と、を具備し、
前記各検出器によって検出される蛍光強度の相互相関信号を用いて分析を行なう蛍光分光分析装置であって、
前記各検出器によって検出される蛍光強度に対応する有効計測空間体積を補正する手段を備えたことを特徴とする蛍光分光分析装置。
【請求項２】
前記二つの検出器は、それぞれが異なる波長領域の蛍光を検出することを特徴とする請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項３】
前記励起光源は、波長の異なる二つの光源であることを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項４】
前記有効計測空間体積は、標準試料を用いて求められることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の蛍光分光分析装置。
【請求項５】
前記標準試料は、２つの蛍光色素が１００％結合し、単独の蛍光色素が存在しない標準試料であることを特徴とする請求項４に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項６】
測定した拡散時間の比を用いて補正を行なうことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の蛍光分光分析装置。
【請求項７】
励起光のビームプロファイルを考慮した補正式を用いて補正を行なうことを特徴とする請求項５または６に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項８】
試料に照射するための励起光を少なくとも一つの励起光源により発生し、
前記励起光を集光光学系により試料内で極微小領域に集光し、
該励起光によって励起される蛍光を検出光学系により集光し、
少なくとも二つ以上の検出器と、各検出器の前方にピンホールを配置してなる共焦点光学系により実効的に極微小な蛍光検出空間を生成し、
前記各検出器によって検出される蛍光強度の相互相関信号を用いて分析を行なう蛍光分光分析方法であって、
前記各検出器によって検出される蛍光強度に対応する有効計測空間体積を補正することを特徴とする蛍光分光分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光分光分析装置及び蛍光分光分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ塩基配列の解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）解析、蛋白質相互作用の解析など、ゲノム関連解析に蛍光種の統計分布解析の技術を用いた方法が用いられている。統計分布解析には、蛍光相関分光解析法、蛍光強度分布解析法などが知られている。蛍光相関分光分析法は蛍光強度の揺らぎを解析し、分子毎の拡散時間や平均分子数を求める手法で、Single molecule Detection in Solution,69p.,Ch.Zander,J.Enderleing,R.A.keller eds, (ＷＩＬＥＹＶＣＨ Verlag Berlin 2002)等に詳述されている。また、蛍光強度分布解析法は、蛍光揺らぎ
【数１】
2006017628.tif 000003
【０００３】
で表され、結合分子の数ＮABは、
【数２】
2006017628.tif 000004
【０００４】
で求められる。
【非特許文献１】Single molecule Detection in Solution,69p.,Ch.Zander,J.Enderleing,R.A.keller eds, (ＷＩＬＥＹＶＣＨ Verlag Berlin 2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
蛍光強度相互相関分光分析は顕微鏡にレーザを導入し（一台でも良い）、そのレーザ光によって励起された溶液中の蛍光分子から発生する異なる波長の蛍光の強度を測定し相互相関解析を行うことが従来行われていた（特表平１１−５０２６０８号公報）。
【０００６】
通常の光学顕微鏡の上部から蛍光色素励起用のレーザを入射する（一台でも良い）。波長が異なる二台のレーザを用いる場合はダイクロイックミラー（ビームコンバイナ）により二波長のレーザビームを重畳する。レーザ光は対物レンズによって集光され観測領域を作り出す。試料容器中に、観察する蛍光標識された溶液が入れられる。例えば、結合する二種類の分子に、それぞれ異なる波長の蛍光を発する蛍光色素をそれぞれ結合させてある。観測領域中に存在する試料の蛍光標識から蛍光が発生し再び対物レンズを通過してビームスプリッタにより検出器へと導かれる。波長の異なる二つの蛍光はダイクロイックミラーにより分離され、バリアフィルターによって励起光など不要な光を遮蔽する。それぞれの検出器の前には集光レンズとピンホールが設けられており、コンフォーカル検出を行うのが普通である。このことにより非常に小さな観測領域のみからの蛍光を検出することができる。検出器で得られた蛍光信号は解析装置で解析され所望の測定が、例えば蛋白質の相互作用の測定などが行われる。
【０００７】
蛍光色素Ａで標識された分子ＭA の数ＮA は、蛍光色素Ａの蛍光強度の自己相関から求められ、蛍光色素Ｂで標識された分子ＭB の数ＮB は、蛍光色素Ｂの蛍光強度の自己相関から求められる。両方の分子ＭA 、ＭB が結合した分子ＭABの数ＮABは、蛍光色素ＡとＢが同じ揺らぎになることから相互相関で求められる。ＭA 、ＭB それぞれ単独の（未結合の）分子数をそれぞれＮSA、ＮSBとすると、ＮSA＝ＮA −ＮAB、ＮSB＝ＮB −ＮABで求めることができる。結合率Ｄc は、全分子数に対する結合分子の割合で示される。すなわち、
Ｄc ＝ＮAB／（ＮSA＋ＮSB＋ＮAB）。しかし、実際には、レーザのアライメント誤差、ピンホールの調整誤差、光学系の色収差、波長による回折の違いなどにより、二つの波長に対する有効計測空間体積が異なり、正しい計測結果が得られないことがある。
【０００８】
本発明は、このような課題に着目してなされたものであり、その目的とするところは、波長により異なる有効計測空間体積を補正する手段を設けることにより、正しい計測結果が得られる蛍光分光分析装置及び蛍光分光分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的を達成するために、第１の発明は、試料に照射するための励起光を発生する少なくとも一つの励起光源と、前記励起光を試料内で極微小領域に集光する集光光学系と、該励起光によって励起される蛍光を集光する検出光学系と、少なくとも二つ以上の検出器と、各検出器の前方にピンホールを配置して実効的に極微小な蛍光検出空間を生成する共焦点光学系と、を具備し、前記各検出器によって検出される蛍光強度の相互相関信号を用いて分析を行なう蛍光分光分析装置であって、前記各検出器によって検出される蛍光強度に対応する有効計測空間体積を補正する手段を備える。
【００１０】
また、第２の発明は、第１の発明に係る蛍光分光分析装置において、前記二つの検出器は、それぞれが異なる波長領域の蛍光を検出する。
【００１１】
また、第３の発明は、第１または第２の発明に係る蛍光分光分析装置において、前記励起光源は、波長の異なる二つの光源である。
【００１２】
また、第４の発明は、第１〜第３のいずれか１つの発明に係る蛍光分光分析装置において、前記有効計測空間体積は、標準試料を用いて求められる。
【００１３】
また、第５の発明は、第４の発明に係る蛍光分光分析装置において、前記標準試料は、２つの蛍光色素が１００％結合し、単独の蛍光色素が存在しない標準試料である。
【００１４】
また、第６の発明は、第１〜第３のいずれか１つの発明に係る蛍光分光分析装置において、測定した拡散時間の比を用いて補正を行なう。
【００１５】
また、第７の発明は、第５または第６の発明に係る蛍光分光分析装置において、励起光のビームプロファイルを考慮した補正式を用いて補正を行なう。
【００１６】
また、第８の発明は、試料に照射するための励起光を少なくとも一つの励起光源により発生し、前記励起光を集光光学系により試料内で極微小領域に集光し、該励起光によって励起される蛍光を検出光学系により集光し、少なくとも二つ以上の検出器と、各検出器の前方にピンホールを配置してなる共焦点光学系により実効的に極微小な蛍光検出空間を生成し、前記各検出器によって検出される蛍光強度の相互相関信号を用いて分析を行なう蛍光分光分析方法であって、前記各検出器によって検出される蛍光強度に対応する有効計測空間体積を補正する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、波長により異なる有効計測空間体積を補正する手段を設けたので、正しい計測結果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。図１は、本発明の蛍光分光分析装置の全体構成を示す図である。また、図２は、本蛍光分光分析装置のブロック図である。ここでは、試料の螢光観察を行なうために共焦点光学顕微鏡１００を用いる。蛍光分光分析装置は、基本的な構成として、共焦点光学顕微鏡１００本体に加えて、レーザ光源１、レーザ光源７、ＣＣＤカメラ１０、試料ステージ８、ステッピングモータ１１、コンピュータ３２（図２）、ＴＶモニタ１２、照明光源１７等からなる。
【００１９】
レーザ光源１，７は、励起する螢光物質の種類により異なる発振波長のものを用いる。本発明では螢光物質として、ローダミン・グリーン(Rhodamine Green:RhG)、サイファイヴ(Cy5) の２種類を用いている。これに伴い、励起光としてのレーザは螢光物質ローダミン・グリーン(RhG)を励起するために、波長488nmのアルゴンレーザ、またサイファイヴ(Cy5) を励起するために、波長632.8nmのヘリウムネオン(He・Ne)レーザを用いている。
【００２０】
２種類のレーザ光源１、７から発せられたレーザ光をダイクロイックミラー４により同一の光路上を通るようにして、共焦点光学顕微鏡１００に導き、試料ステージ８上に載置された試料９に励起光として集光する。すなわち、アルゴンレーザからなるレーザ光源１から発せられたレーザ光は、レンズ２によりビーム直径を拡大されてコリメート光とされた後、ミラー３により反射されてダイクロイックミラー４を透過し、光接続端子５を介して共焦点光学顕微鏡１００に入射する。入射したレーザ光はダイクロイックミラー１５で反射された後、切り換えミラー１４を通過して対物レンズ１３により、試料ステージ８上に載置された試料９に励起光として集光される。
【００２１】
また、ヘリウムネオンレーザからなるレーザ光源７から発せられたレーザ光は、レンズ６によりビーム直径を拡大されてコリメート光とされた後、ダイクロイックミラー４により反射された後、光接続端子５を介して共焦点光学顕微鏡１００に入射する。入射したレーザ光はダイクロイックミラー１５で反射された後、切り換えミラー１４を通過して対物レンズ１３により、試料ステージ８上に載置された試料９に励起光として集光される。
【００２２】
また、ハロゲンランプ、あるいはメタルハライドランプなどにより構成される照明用の光源１７からの光線を共焦点光学顕微鏡１００本体に導き、切り替えミラー１４を介して試料９全体を照明する。試料９から発せられる螢光信号をＣＣＤカメラ１０で受光し、ＴＶモニタ１２、あるいは顕微鏡接眼部を通して、試料９の螢光顕微鏡観察を行なう。
【００２３】
ただし、試料９を測定するときには、切り替えミラー１４を測定光路の外に移動させる。共焦点光学顕微鏡１００本体の試料ステージ８には２個のステッピングモータ１１がそれぞれ９０°方向に取り付けられており、それぞれのステッピングモータ１１は、試料ステージコントローラ(図示しない)に接続されている。試料ステージコントローラはコンピュータ３２に接続されており、コンピュータ３２からの指令により、２個のステッピングモータ１１を駆動し、試料ステージ８をＸ方向及びＹ方向に移動させる。
【００２４】
以下に、蛍光相関分光測定の手順を説明する。共焦点光学顕微鏡１００本体に入射されたレーザ光源１のアルゴンレーザ光はダイクロイックミラー１５により反射されて対物レンズ１３に導かれる。同様にして、共焦点光学顕微鏡１００本体に入射されたレーザ光源７のヘリウムネオンレーザ光はダイクロイックミラー１５により反射されて対物レンズ１３に導かれる。
【００２５】
ここでの対物レンズ１３は、微小な共焦点領域の形成のためにNA(開口数)1.0程度の大きい開口数の対物レンズを用いる。これにより得られる共焦点領域は、直径0.6μm程度、長さ2μm程度の略円筒状となる。この測定領域に存在する蛍光分子をレーザ光により励起し、蛍光信号(フォトンパルス)を得る。
【００２６】
得られた螢光信号は励起光が通ったと同じ光路を通ってダイクロイックミラー１５を透過し、ミラー１６で反射され、ダイクロイックミラー２５に入射する。ダイクロイックミラー２５は、レーザ光源１からのアルゴンレーザ光で励起された試料９より発せられた蛍光を反射する。また、レーザ光源７からのヘリウムネオンレーザ光で励起された試料９より発せられた蛍光を通過する。つまり、ダイクロイックミラー２５は、螢光物質ローダミン・グリーンによる螢光を反射させ、螢光物質サイファイヴによる螢光を透過させるスペクトル特性を持っている。
【００２７】
ダイクロイックミラー２５により分離された２種類の蛍光信号は、それぞれレンズ２０，２６によりピンホール位置に集光され、ピンホール２１、２７を通過して、光検出器１８、光検出器２４に入射される。各光検出器１８、２４から発せられた電気信号はそれぞれ光ファイバ１９−１，１９−２を通って、共焦点光学顕微鏡１００本体に取り付けられた光接続端子２２に導かれ、光ファイバ２３を介して信号処理装置３０（図２）に導かれる。
【００２８】
なお、光接続端子２２としては、例えばＦＣコネクタ、ＳＣコネクタ、ＳＴコネクタなどが好適する。また光検出器１８，２４としては、アバランシェ・フォトダイオード(ＡＰＤ:Avalanche Photo Diode)や光電子増倍管が好適する。光ファイバ２３としては、例えばコア直径100μm、NA0.22のマルチモードファイバーを用いる。
各光検出器１８，２４から出力された光強度信号(フォトンパルス)に対応する電気信号は信号処理装置３０で波形整形され、on-offの２値化パルスに変換されて、相関解析装置３１に導かれる。相関解析装置３１に入力された２値化パルス信号に対して相関演算が行なわれ、自己相関関数あるいは相互相関関数が求められる。
【００２９】
相関解析装置３１での解析結果はコンピュータ３２に導かれ、得られた自己相関関数から、蛍光物質の並進拡散速度や測定領域中の蛍光分子の数の変化などが求められる。あるいは相関解析装置３１を用いず、信号処理装置３０から出力されるon-offの２値化パルス信号を直接コンピュータ３２に入力し、コンピュータ３２にて相関解析を行なって、蛍光強度ゆらぎの相互相関関数を求めても良い。
【００３０】
螢光物質として、ローダミン・グリーン(Rhodamine Green:RhG)、サイファイヴ(Cy5)以外に、例えばTMR(Tetramethylrhodamine)、5-Tamra(5-carboxytetramethylrhodamine)などを用いても良い。この場合、螢光物質TMRを励起するために、波長514.5nmのアルゴンレーザ、螢光物質5-Tamraを励起するために波長543.5nmのヘリウムネオンレーザなどを励起レーザ光源として用いればよい。その他螢光色素としてFITC(Fluorescein-isothiocyanate)、TOTO 1、Acridine-Orange、Texas-Redなどを用いても良い。
【００３１】
なお、試料として異なる蛍光波長の二つの色素を用いた場合には、二つの検出器１８，２４は、それぞれ異なる波長領域の蛍光を検出する。また、二つの色素の励起波長が異なる場合には、波長の異なる二つの光源を用いる。
【００３２】
ここで、本実施形態に係る計測方法について説明する。図３は、レーザ光源の２つの波長に対する有効計測空間体積の違いを示している。ＶA,effは、光検出器１８が測定する有効計測空間体積であり、ＶB,effは、光検出器２４が測定する有効計測空間体積である。このように、２つの波長に対する有効計測空間体積が異なっている場合には、正しい計測結果が得られない。そこで、本実施形態では、ＶA,effと、ＶB,effとの共通部分である相互相関の有効計測空間体積ＶAB,effを用いて補正を行うようにする。
【００３３】
以下に、この補正の手順を詳細に説明する。ここでは、標準試料を用いて有効計測空間体積を求め、補正を行なうこととする。例えば、蛍光分子Ａ、Ｂが両方とも一つの分子に標識されて、単独で蛍光分子に標識された分子および単独の蛍光分子が存在しない理想的な標準試料を考える。すなわち結合率１００％の試料である。その場合、蛍光分子Ａの自己相関によって得られる濃度ＣAOと蛍光分子Ｂの濃度ＣBOと相互相関による濃度ＣABO は等しいはずだから、
【数３】
2006017628.tif 000005
【００３４】
となる。従って、各有効計測空間体積の比は、
【数４】
2006017628.tif 000006
【００３５】
と考えられる。従って、ＮABを基準としたときの、ＮA 、ＮB の値をＮA’、ＮB’とすると、
【数５】
2006017628.tif 000007
【００３６】
で求められる。補正後の結合率Ｄc’は、
【数６】
2006017628.tif 000008
【００３７】
となる。
【００３８】
しかし、励起光強度にはプロファイルがある。以下その点を考慮する。
【００３９】
自己相関、或いは相互相関によって求められるのは分子数Ｎであるが、装置によって決まる有効計測空間体積をＶeff として、
【数７】
2006017628.tif 000009
【００４０】
の関係がある。励起光に分布がある場合（通常はレーザを用いるのでガウシアンビーム）、励起光のビームプロファイルをＷ（ｒ）として、有効計測空間体積Ｖeff は、
【数８】
2006017628.tif 000010
【００４１】
となる。二つの蛍光波長に関してビームプロファイルが異なる場合は、それぞれ、
【数９】
2006017628.tif 000011
【００４２】
相互相関の有効計測空間体積は、（１）式を計算すると、
【数１０】
2006017628.tif 000012
【００４３】
となる。ここで、相互相関として欲しい体積はＶABS である。すなわち、ＷA(ｒ)とＷB(ｒ)が違うために、実際にはＶAB,effで計測されている。
【数１１】
2006017628.tif 000013
【００４４】
である。従って、
【数１２】
2006017628.tif 000014
【００４５】
ここで、ＶABS の体積を基準に考える。
【数１３】
2006017628.tif 000015
【００４６】
【数１４】
2006017628.tif 000016
【００４７】
となる。従って、
【数１５】
2006017628.tif 000017
【００４８】
となる。好ましくは、この式を用いるが、（３）式と同じになる。
【００４９】
また、相互相関分光法を用いる理由に、結合後の分子量が小さい試料だからと言う理由がある。仮に試料の結合後の分子量の変化が小さいとして拡散係数を等しいとして、有効計測空間体積比を求めることが考えられる。蛍光色素Ａが標識された分子と蛍光色素Ｂが標識された分子の自己相関によって得られる拡散時間を、それぞれτA 、τB 、相互相関によって得られた結合分子の拡散時間をτABとする。計測空間体積は測定される拡散時間の３／２乗に比例するから、
【数１６】
2006017628.tif 000018
【００５０】
補正後の分子数は、
【数１７】
2006017628.tif 000019
【００５１】
結合率は、
【数１８】
2006017628.tif 000020
【００５２】
励起光の強度プロファイルを考慮しても同様Ｄc’’を得る。τの値は異なる。
【００５３】
以下に、実際の測定結果について説明する。蛍光分子Ａで標識した分子ＭA と蛍光標識Ｂで標識した分子ＭB が１００％結合し、どちらかが単独で存在していない標準試料を測定した。その結果、自己相関及び相互相関から下記の表を得た。
【表１】
2006017628.tif 000021
【００５４】
ＮA 、ＮB 、ＮABの値が違うのは、有効計測空間体積が異なるからと考えられる。このとき、結合率Ｄc は、５２．７％である。（２）式から補正計数は、ｋA ＝０．６８、ｋB ＝０．７０である。補正された結合率Ｄc’は、当然１００％である。ＮA’＝ＮB’＝ＮAB＝６．１４である。
【００５５】
励起光の強度プロファイルを考慮した場合も、結合率Ｄc’は１００％と計算され、ＮA’＝ＮB’＝ＮAB’＝１２．８８となる。
【００５６】
拡散時間による補正を行なう。（５）式より、ＲA ＝０．９４４、ＲB ＝０．７１７となり、Ｄc’＝７１％と計算される。ＮA’＝８．５３、ＮB’＝６．２７である。
【００５７】
上記した実施形態によれば、波長により異なる有効計測空間体積を補正する手段を設けたので、正しい計測結果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の蛍光分光分析装置の全体構成を示す図である。
【図２】本蛍光分光分析装置のブロック図である。
【図３】レーザ光源の２つの波長に対する有効計測空間体積の違いを示す図である。
【符号の説明】
【００５９】
１…レーザ光源、２…レンズ、３…ミラー、４…ダイクロイックミラー、５…光接続端子、６…レンズ、７…レーザ光源、８…試料ステージ、９…試料、１０…ＣＣＤカメラ、１１…ステッピングモータ、１２…ＴＶモニタ、１３…対物レンズ、１４…切り替えミラー、１５…ダイクロイックミラー、１６…ミラー、１７…照明光源、１８…光検出器、１９−１，１９−２…光ファイバ、２０…レンズ、２１…ピンホール、２２…光接続端子、２３…光ファイバ、２４…光検出器、２５…ダイクロイックミラー、２６…レンズ、２７…ピンホール、２８…光接続端子、３０…信号処理装置、３１…相関解析装置、３２…コンピュータ、１００…共焦点光学顕微鏡。
【図１】
2006017628.tif 000022
【図２】
2006017628.tif 000023
【図３】
2006017628.tif 000024