(57)【要約】【課題】胸腺は、感染症や癌等に対する生体防御あるいは免疫システムの中枢を担う器官であり、かかる胸腺発生因子とその遺伝子は、免疫疾患の診断、治療及び予防等の手段として多大に寄与する。しかし、胸腺発生の機構の解明は、未だ遅々として進んでいない。【解決手段】胸腺発生因子ＴＯＦ１及びＴＯＦ２並びにこれ等の遺伝子が、それぞれ提供される。また、ＰＣＲ用プライマー、ハイブリダイゼーション用プローブ等が提供される。これ等の物質は、胸腺不全に起因する多種多様な免疫疾患の治療剤、診断、臨床検査、予防等の手段として有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列、又は該塩基配列において少なくとも１塩基がコドンの縮重に基づき置換された塩基配列を有するＤＮＡ分子。
【請求項２】
配列番号２に記載の塩基配列、又は該塩基配列において少なくとも１塩基がコドンの縮重に基づき置換された塩基配列を有するＤＮＡ分子。
【請求項３】
配列番号３に記載の塩基配列、又は該塩基配列において少なくとも１塩基がコドンの縮重に基づき置換された塩基配列を有するＤＮＡ分子。
【請求項４】
配列番号４に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において少なくとも１アミノ酸残基が置換又は欠失又は挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項５】
配列番号５に記載の塩基配列、又は該塩基配列において少なくとも１塩基がコドンの縮重に基づき置換された塩基配列を有するＤＮＡ分子。
【請求項６】
配列番号６に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において少なくとも１アミノ酸残基が置換又は欠失又は挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項７】
配列番号７に記載の塩基配列、又は該塩基配列において少なくとも１塩基がコドンの縮重に基づき置換された塩基配列を有するＤＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、新規な胸腺器官発生因子ＴＯＦ１及びＴＯＦ２両遺伝子とその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
胸腺は、細胞障害性Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞等を活発に産生することにより、感染症や癌等に対する生体防御あるいは免疫システムにおいて中枢的機能を演じる器官であることが知られており、骨髄と共に第一次リンパ性器官と呼ばれている。また、胸腺発生関連遺伝子として、ＦｏｘＮ１（非特許文献１）、Ｈｏｘａ３（非特許文献２）、Ｐａｘ１（非特許文献３）等が公知である。更に、胸腺器官発生の初期に発現される因子として、新規な免疫グロブリンスーパファミリーに属するＥＶＡとその遺伝子が報告されてはいる（非特許文献４）。しかし、胸腺器官発生因子とその利用に関する特許文献は見当たらず、胸腺上皮プロゼニター細胞とその用途に係る技術が知られているに過ぎない（特許文献１及び２）。
【特許文献１】ＷＯ０２／０５１９８８．
【特許文献２】ＷＯ０３／１０５８７４．
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ，３７２（６５０１），１０３−１０７，１９９４．
【非特許文献２】Ｄｅｖｅｌｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９５（１），１９５（１），                １−１５，１９９８．
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４（１１），５７５３−５７６０，２０００．
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４１（４），１０６１−１０７１，１９９８．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上述した通り、胸腺は健康維持にとって非常に重要な器官である。従って、胸腺器官発生の分子機構に係る全体像の解明とこれより得られる知見の活用は、人類の現在及び未来における生体防御、免疫システム、ホメオスタシス等の確保に極めて有力な手段となり得る。しかしながら、この分野の解明は未だ、遅々として進んでいない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、胸腺器官発生の分子機構に係る全体像の解明の重要性と必要性とを評価かつ認識し、この発生過程を徹底的に解明するための材料と方法につき、長年にわたる試行錯誤と創意工夫を重ねた結果、マウス胸腺原基で特異的に発現される遺伝子に着目し、その網羅的解析を行った。その成果として、胸腺器官発生因子ＴＯＦ１及びＴＯＦ２とこれ等の遺伝子を発見するに至った。その概要は次の通りある：
「先ず、胎齢11.5日のマウス胸腺原基をマイクロダイセクション法により単離し、対照表皮組織との差分ＰＣＲクローニング法により胸腺原基特異的遺伝子の候補クローンを得、それらの部分配列を網羅的に決定した。複数の出発材料に共通の発現が確認された遺伝子を多数同定した中に、Ｅｎｔｒｅｚ／ＮＣＢＩ公開遺伝子データベースにて性状解析が確認されずＥＳＴ名称のみ付与されている、新規な２つの遺伝子を発見した。これ等の遺伝子は胎齢11.5日のマウスでは胸腺器官ストロマ細胞のみに発現特異性がみられ、成体マウスでも胸腺での発現に比較的特異性が高いことを確認し、胸腺器官発生因子ＴＯＦ１（ｔｈｙｍｕｓ  ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  １）及びＴＯＦ２（ｔｈｙｍｕｓ  ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ２）とそれぞれ命名した。」
【発明の効果】
【０００５】
ＴＯＦ１及びＴＯＦ２は、マウスの胸腺器官の発生過程において特異的に発現される新規な遺伝子である。従って、この事実は、これ等の遺伝子が胸腺器官発生、特に、胸腺器官および免疫系の形成に極めて重要な役割を演じ得ることを示唆する。更に、これ等のマウス遺伝子に対するホモロジー検索により得られるヒトの相同遺伝子は、胸腺発生異常、免疫不全、自己免疫疾患等の原因遺伝子あるいは責任遺伝子として、免疫病の診断、治療及び予防のための新規な手段をもたらし得る。その対象疾患として、例えば、ディジョージ症候群等の無胸腺症を含む先天性免疫不全症や、ＡＩＤＳや環境汚染等による後天的免疫不全症等々の免疫不全症を上げることができる。また、抗ガン剤使用の癌患者や造血細胞移植を含む臓器移植等に伴う免疫抑制状態の患者の治療にも適用できる。その具体的な治療方法として、例えば、ＴＯＦ１及び／又はＴＯＦ２並びこれ等の遺伝子を有効成分として用いる薬剤治療、遺伝子治療、細胞再生治療を上げることができる。また、これ等の遺伝子の定性検査や発現量の定量は、先天性及び後天性の免疫不全が疑わしい患者、更に、癌や、造血細胞移植等を含む臓器移植等に伴う免疫抑制状態の患者を対象にした免疫機能の診断あるいは臨床検査に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
この発明によれば、上記課題を解決するための手段として、ＴＯＦ１及びＴＯＦ２両遺伝子ＤＮＡ、これ等の遺伝子ＤＮＡがコードするタンパク質ないしはポリペプチドあるいはペプチド、ハイブリダイゼーション用プローブ、及びＰＣＲ用プライマー等々、具体的には、次の（１）〜（９）に記載の物質がそれぞれ提供される：
配列番号１に記載の塩基配列は、ＴＯＦ１遺伝子ＤＮＡの塩基配列である。配列番
号１に記載の塩基配列、又は該塩基配列において少なくとも１塩基がコドンの縮重に基づき置換された塩基配列を有するＤＮＡ分子。更に、これ等のＤＮＡ分子の部分からなるＤＮＡ断片。
（２）配列番号２に記載の配列は、配列番号１に記載の完全長塩基配列をＲＳＡ１消化し得られた３´側のコード配列を占める合計３８０塩基対から作製された。配列番号２に記載の塩基配列、又は該塩基配列において少なくとも１塩基がコドンの縮重に基づき置換された塩基配列を有するＤＮＡ分子。更に、これ等のＤＮＡ分子の部分からなるＤＮＡ断片。
（３）配列番号３に記載の塩基配列は、ＴＯＦ２遺伝子ＤＮＡの完全長塩基配列である。
配列番号３に記載の塩基配列、又は該塩基配列において少なくとも１塩基がコドンの縮重に基づき置換された塩基配列を有するＤＮＡ分子。更に、これ等のＤＮＡ分子の部分からなるＤＮＡ断片。尚、配列番号３と後述の配列番号５に記載の両塩基配列はいずれも、ＴＯＦ２遺伝子ＤＮＡの完全長塩基配列であり、両者は互いにスプライシングバリアント（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔ）ないしはａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ
ｆｏｒｍの関係にある。
（４）配列番号４に記載のアミノ酸配列は、ＴＯＦ２の完全長アミノ酸配列である。配列番号４に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において少なくとも１アミノ酸残基が置換又は欠失又は挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質。更に、これ等のアミノ酸配列の部分断片からなるタンパク質。尚、この明細書でいう置換とは別の種類のアミノ酸残基との置換を意味する。また、これ等のタンパク質は、胸腺器官発生に係る活性ドメインをその分子内に保有するか、胸腺器官発生活性を呈する必要がある。
（５）配列番号５に記載の塩基配列は、ＴＯＦ２遺伝子ＤＮＡの完全長塩基配列である。
配列番号５に記載の塩基配列、又は該塩基配列において少なくとも１塩基がコドンの縮重に基づき置換された塩基配列を有するＤＮＡ分子。更に、これ等のＤＮＡ分子の部分からなるＤＮＡ断片。
（６）配列番号６に記載のアミノ酸配列は、ＴＯＦ２の完全長アミノ酸配列である。配列番号６に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において少なくとも１アミノ酸残基が置換又は欠失又は挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質。更に、これ等のアミノ酸配列の部分断片からなるタンパク質。但し、これ等のタンパク質は、胸腺器官発生に係る
活性ドメインをその分子内に保有するか、胸腺器官発生活性を呈する必要がある。
（７）配列番号７に記載の配列は、配列番号３に記載の完全長塩基配列をＲＳＡ１消化し得られた５´側のコード配列を占める合計２４５塩基対から作製された。配列番号７に記載の塩基配列、又は該塩基配列において少なくとも１塩基がコドンの縮重に基づき置換された塩基配列を有するＤＮＡ分子。更に、これ等のＤＮＡ分子の部分からかるＤＮＡ断片。
（８）次に示す合計１５種のＴＯＦ１遺伝子用のＰＣＲプライマー。１種、又は２種（１対）を用いる：
ＴＯＦ１−１：５’−ＴＣＡＣＧＴＧＴＧＣＧＣＴＧＴＡＴＡＣＣ−３’
ＴＯＦ１−２：５’−ＣＣＴＴＴＧＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＴ−３’
ＴＯＦ１−３：５’−ＴＣＡＣＧＴＧＴＧＣＧＣＴＧＴＡＴＡＣＣ−３’
ＴＯＦ１−４：５’−ＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＡＣＴＡＡＧＧＡＣ−３’
ＴＯＦ１−５：５’−ＡＴＡＣＡＧＣＧＣＡＣＡＣＧＴＧＡＧＴＧ−３’
ＴＯＦ１−６：５’−ＴＴＣＣＴＡＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＣＣ−３’
ＴＯＦ１−７：５’−ＴＡＣＣＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＣＡＣＡＡＴＧ−３’
ＴＯＦ１−８：５’−ＡＣＡＴＣＴＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＴＣＣ−３’
ＴＯＦ１−９：５’−ＣＣＣＴＴＴＧＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＣＡＣ−３’
ＴＯＦ１−１０：５’−ＡＧＣＧＧＧＴＡＴＡＣＡＧＣＧＣＡＣＡＣＧＴＧＡＧ−３’
ＴＯＦ１−１１：５’−ＧＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡＴＧＣＴＣＴＣＣＧＧ−３’
ＴＯＦ１−１２：５’−ＡＧＣＣＴＧＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＧＣＣＴＡＧ−３’
ＴＯＦ１−１３：５’−ＣＴＡＧＧＣＧＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＡＣＡＧＧＣＴ−３’
ＴＯＦ１−１４：５’−ＧＡＧＧＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＣＣＣＴＧＧＧＡＴＧＧＧＣ
Ｃ−３’
ＴＯＦ１−１５：５’−ＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＴＧＧＴＣＧＣＡＣＴＧＡＧＡＧＴＴ
Ｇ−３’
（９）次に示す合計６種のＴＯＦ２遺伝子用のＰＣＲプライマー。例えば、ＴＯＦ２−１ＦとＴＯＦ２−１Ｒとの組合せ（１対）を用いる：
ＴＯＦ２−１Ｆ：５’−ＡＧＴＴＧＣＡＧＴＣＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧ−３’
ＴＯＦ２−１Ｒ：５’−ＣＴＧＴＣＴＣＣＣＡＡＡＣＴＧＧＧＴＡＴＣ−３’
ＴＯＦ２−２Ｆ：５’−ＡＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＴＧ−３’
ＴＯＦ２−２Ｒ：５’−ＴＣＡＧＴＡＡＣＴＴＴＴＡＴＣＡＧＴＧ−３’
ＴＯＦ２−３Ｆ：５’−ＧＴＧＴＧＧＡＣＴＴＣＣＣＴＴＧＣＡＧＴ−３’
ＴＯＦ２−３Ｒ：５’−ＴＧＣＴＧＣＣＡＣＡＴＡＴＡＧＧＣＴＣＡ−３
【０００７】
以下、参考例及び実施例を上げ、本発明の構成と効果を具体的に説明する。但し、この発明は、これ等の参考例や実施例だけに限定されるわけではない。
（参考例１）
【０００８】
胎齢１１．５日胚におけるマウス胸腺原基の同定：
胎齢１１．５日胚のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統マウスから胸腺原基を含む組織切片を作製した。正確に胸腺原基を構築する上皮系細胞領域を確定するために、抗マウスＣＤ４５及び汎サイトケラチン抗体（ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社［米国］製）を用いて、胸腺原基を含む選定した組織切片を二重染色し、胸腺原基とその周囲に集積するＴ前駆細胞を含む血球細胞を同定した。
（参考例２）
【０００９】
マイクロダイセクション法を利用した胸腺原基由来RNAの単離：
組織切片から正確に胸腺原器のみを単離するために、マイクロダイセクション法を利用した（ＰｉｘＣｅｌｌIIＬａｓｅｒ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎシステム；Ａｒｃｔｕｒｕｓ社［米国］製）。得られた組織からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出は、ＰｉｃｏＰｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ社［米国］製）を使用した。
（参考例３）
【００１０】
差分ＰＣＲクローニング法による胸腺器官関連遺伝子の同定：
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、６胎仔から単離された胸腺原基から抽出され、そのｃＤＮＡへの変換及び増幅は、Ｓｕｐｅｒ  ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社［米国］製）を用いて行われた。得られた胸腺原基由来のｃＤＮＡと、同様の操作により得られた同齢表皮組織ｃＤＮＡを利用してＰＣＲ−ｓｅｌｅｃｔｅｄｃＤＮＡ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社［米国］製）による差分ＰＣＲクローニングを行った。差分ｃＤＮＡ産物はｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクターにクローニングされた。１回のＰＣＲクローニングで２００−２５０クローンを得る作業を５回繰り返し、合計１３７０クローンを得、その核酸配列を決定した。それぞれのロットから得られた核酸配列をＥｎｔｒｅｚ／ＮＣＢＩゲノム・データベースにて解析し推定される遺伝子群を同定した。これらの遺伝子群の中ですべてのロットに含まれていた遺伝子群を胸腺原基に特異的に発現する候補遺伝子として選定した。
（参考例４）
【００１１】
候補遺伝子群の発現解析：
候補遺伝子群の発現解析は、定量的ＰＣＲ法が利用され、胎齢１１．５日、１４．５日及び生後８週齢マウスの各臓器別あるいは細胞系譜別にその発現量が比較された。胎齢１１．５日の各組織を単離するためにマイクロダイセクション法を利用した。これら組織から得られたＲＮＡは、ＲｉｂｏＡｍｐ  ＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ社［米国］製）でＲＮＡ増幅され、更にＳｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔII逆転写酵素（インビトロジェン社）でｃＤＮＡに変換された。定量発現解析には、リアルタイムＰＣＲ法（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ型；ＡＢＩ社［米国］製）が利用された。
（参考例５）
【００１２】
Ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： 
このｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法は、Ｍａｎｌｅｙらの方法に準じて行うことができる（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２１，１９８９−２００３，１９９５文献１）。４容量％パラホルムアルデヒドで固定した胎齢９−１２日胚をメタノールで脱水後、ジゴキシンで標識したＴＯＦ１及びＴＯＦ２のＲＮＡプローブ（塩基配列２及び７に記載）を用いてハイブリダイゼーションを行う。ＴＯＦ１のＲＮＡプローブは、ＲＳＡＩ消化により得られるＴＯＦ１の３´側のコード配列（３８０塩基対）を用いることができる。また、ＴＯＦ２のものは、５´側翻訳開始部位から２４５塩基対のコード配列を利用することができる。
【実施例１】
【００１３】
候補遺伝子群の発現解析：
候補遺伝子群の発現解析は、定量的ＰＣＲ法が利用され、胎齢１１．５日、１４．５日及び生後８週齢マウスの各臓器別あるいは細胞系譜別にその発現量が比較された。胎齢１１．５日の各組織を単離するためにマイクロダイセクション法を利用した。これら組織から得られたＲＮＡは、ＲｉｂｏＡｍｐ  ＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ社［米国］製）でＲＮＡ増幅され、更にＳｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔII逆転写酵素（インビトロジェン社）でｃＤＮＡに変換された。定量発現解析には、リアルタイムＰＣＲ法（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ型；ＡＢＩ社［米国］製）が利用された
候補遺伝子群のうち、ＴＯＦ１の結果を図１に、ＴＯＦ２のそれを図２にそれぞれ示す。これ等の両遺伝子はいずれも、胎齢11.5日のマウスでは胸腺器官ストロマ細胞のみに発現特異性がみられ、また、成体マウスでも胸腺での発現に比較的特異性の高いことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００１４】
本発明に係るＴＯＦ１及び２とこれ等の遺伝子は、胸腺不全あるいは免疫不全に起因する種々の疾患の基礎研究試薬、治療剤、治療薬の開発、診断剤、遺伝子治療、遺伝子診断、予防等に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】器官別（横軸）にＴＯＦ１遺伝子の発現量（縦軸）を示す図である。（ａ）胎齢１１．５日、（ｂ）胎齢１４．５日、及び（ｃ）生後８週齢の各マウス。
【図２】器官別（横軸）にＴＯＦ２遺伝子の発現量（縦軸）を示す図である。（ａ）胎齢１１．５日、（ｂ）胎齢１４．５日、及び（ｃ）生後８週齢の各マウス。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
2006101828000001.app