(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、安全、且つ簡便な操作により、核酸含有試料からＲＮＡを精製することに関する。【解決手段】  本願発明者らが鋭意検討した結果、ＤＮＡとＲＮＡを含む試料と、カオトロピック剤との混合液に、有機溶媒を添加すると、ＤＮＡが不溶化し、ＲＮＡは可溶状態を維持することを見出した。本発明は、核酸含有試料，カオトロピック剤、及び有機溶媒を混合し、ＤＮＡを不溶化させ、不溶化物を混合液から分離し、その残液からＲＮＡを精製することに関する。尚、残液に試薬等を加えなくとも、シリカ含有固相を接触させることで、シリカ含有固相にＲＮＡを結合させることができる。また、不溶化物からＤＮＡを精製することもできる。  本発明により、ＤＮＡとＲＮＡを含む試料から高純度のＲＮＡを安全、且つ簡便な操作により精製できる。また、単一の試料からＲＮＡとＤＮＡを同時に精製することも可能である。【選択図】図１
2006311803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸精製方法であって、
核酸含有試料，カオトロピック剤、及び有機溶媒を混合し、ＤＮＡの不溶化物を形成し、
不溶化物を混合液から除去し、
不溶化物を分離した混合液をシリカ含有固相に接触させ、シリカ含有固相にＲＮＡを結合させ、
シリカ含有固相を混合液から分離し、
シリカ含有固相を洗浄し、
シリカ含有固相からＲＮＡを溶出する方法。
【請求項２】
請求項１記載の核酸精製方法であって、
有機溶媒が、脂肪族アルコール，脂肪族エーテル，脂肪族エステル、若しくは脂肪族ケトンの化合物、又は、その組み合わせである方法。
【請求項３】
請求項１記載の核酸精製方法であって、
有機溶媒が、エタノール，２−プロパノール，２−ブタノール，ポリエチレングリコール，ジエチレングリコールジメチルエーテル，乳酸エチルである方法。
【請求項４】
核酸精製方法であって、
核酸含有試料，カオトロピック剤、及び有機溶媒を混合し、ＤＮＡの不溶化物を形成し、
不溶化物を混合液から分離し、不溶化物からＤＮＡを精製し、
不溶化物を分離した混合液とシリカ含有固相を接触させ、シリカ含有固相にＲＮＡを結合させ、
シリカ含有固相を混合液から分離し、
シリカ含有固相を洗浄し、
シリカ含有固相からＲＮＡを溶出する方法。
【請求項５】
請求項４記載の核酸精製方法であって、
有機溶媒が、脂肪族アルコール，脂肪族エーテル，脂肪族エステル、若しくは脂肪族ケトンの化合物、又は、その組み合わせである方法。
【請求項６】
請求項４記載の核酸精製方法であって、
有機溶媒が、エタノール，２−プロパノール，２−ブタノール、ポリエチレングリコール，ジエチレングリコールジメチルエーテル，乳酸エチルである方法。
【請求項７】
以下の構成を含む核酸精製器具；
核酸含有試料，カオトロピック剤、及び有機溶媒の混合液が投入される混合液投入口と、ＤＮＡの不溶化物を混合液から分離できるフィルタと、フィルタを通過した混合液が排出される混合液排出口とを備える分離部材；
分離部材の混合液排出口と接続できる溶液投入口と、溶液投入口に投入された溶液と接触可能に配置されたシリカ含有固相を備える核酸捕捉部材。
【請求項８】
請求項７記載の核酸精製器具であって、
遠心力により、混合液をフィルタに通過させ、シリカ含有固相と接触させる核酸精製器具。
【請求項９】
請求項７記載の核酸精製器具であって、
圧力差により、混合液をフィルタに通過させ、シリカ含有固相と接触させる核酸精製器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸含有試料から核酸を精製する技術に関する。例えば、ＤＮＡとＲＮＡを含有する生物材料から、ＲＮＡを精製する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の遺伝子情報を担う物質としては、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）とＲＮＡ（リボ核酸）がある。一般的にＤＮＡは生物の全遺伝子情報を担う物質であり、一方、ＲＮＡは
ＤＮＡの遺伝子情報を基に生体内のタンパク質合成を担う物質である。ＤＮＡの分析からは、主に遺伝子配列情報が得られ、また、ＲＮＡの分析からは、主に遺伝子発現情報が得られる。これらは、分子生物学的に極めて重要な情報である。ＤＮＡ分析とＲＮＡ分析を行う場合は、一般的に、ＤＮＡとＲＮＡを含有する生物材料等の試料からＤＮＡとＲＮＡを単離，精製する前処理操作が不可欠である。ＤＮＡ、及びＲＮＡの単離，精製においては、ＰＣＲ、或いはＲＴ−ＰＣＲ等の分析に対する阻害物質の混入を排除する必要がある。特に、ＲＮＡの単離，精製においては、ＲＮＡ分析の阻害物質となり得るＤＮＡの混入を排除することが重要であり、高純度なＲＮＡを単離，精製することが要求される。また、ＤＮＡとＲＮＡの分析を効率的に行う場合においては、単一の試料からＤＮＡとＲＮＡを同時に単離，精製することが望まれる。
【０００３】
生物材料からＲＮＡを単離，精製する方法として、Analitycal Biochemistry 162,156-159(1989) に記載される方法がある。本方法は、（１）生物材料をチオシアン酸グアニジン溶液により溶解し、酸性緩衝溶液，フェノール溶液，クロロホルム溶液を順次添加，混合し、（２）遠心分離によりＲＮＡを含む水相と、変性タンパク質と不溶化ＤＮＡを含む有機溶媒相と水相の中間層に分離し、（３）ＲＮＡを含む水相にエタノールあるいはイソプロパノールを添加して（４）不溶化したＲＮＡを遠心分離により選択的に沈殿させる。本方法は従来の超遠心分離方法と比較すると、効率的にＲＮＡを単離，精製できるという長所があるが、有害性の強いフェノール，クロロホルムを使用しなければならない。また、単一の試料からＤＮＡとＲＮＡを同時に単離，精製することはできない。  
【０００４】
フェノール，クロロホルム等を使用せず、且つ、エタノール沈殿，イソプロパノール沈殿等の操作を必要としない核酸の単離，精製方法として、カオトロピック剤の存在下における核酸とシリカ含有固相の結合特性を利用するB. Vogelstein and D. Gillespie, 
Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 76(2), 615-619(1979)、また、R. Boom et al, J.Clin.
Microbiol.28(3),495-503(1990) に記載される方法があるが、本方法により単離，精製されるＲＮＡはＤＮＡを含有する。また、ＤＮＡとＲＮＡを同時に単離，精製することはできない。  
【０００５】
生物材料をカオトロピック剤により溶解し、溶解液に塩と緩衝剤等を含む水溶液を添加し、ＤＮＡを含む夾雑物を不溶化させ、不溶化物を除去した溶液からＲＮＡを抽出する方法として、特表２００２−５０７１２１号公報に記載される方法があるが、本方法は、不溶化物を除去した後に、アルコール等の溶液を添加してシリカ含有固相に対するＲＮＡの結合条件を再構築する必要があり、単離，精製操作が煩雑化する。また、単一の試料からＤＮＡとＲＮＡを同時に単離，精製することはできない。
【０００６】
カオトロピック剤の存在下における核酸とシリカ含有固相の結合特性を応用し、ＲＮＡとＤＮＡを単離，精製する方法として、特開２００２−１８７８９７号公報に記載される方法があるが、本方法のＲＮＡの単離，精製においてもＲＮＡの選択性は不十分であり、ＤＮＡを含有する。また、単一の試料から、ＲＮＡとＤＮＡを同時に単離，精製する為には、シリカ含有固相に対するＤＮＡの結合条件、及び、シリカ含有固相に対するＲＮＡの結合条件を、各々に構築する必要があり、単離，精製操作が煩雑化する。
【０００７】
単一の生物試料からＤＮＡとＲＮＡを同時に単離，精製する方法として、Molecular 
Cloning Third edition 7.9にA Single-step Method for the Simultaneous Preparationof DNA,RNA,Protein from Cell and Tissue として記載される方法がある。本方法は、
（１）フェノールとチオシアン酸グアニジン等を含む溶解液により生物試料を溶解し、
（２）クロロホルムを混合し、（３）遠心分離によりＲＮＡを含む水相とＤＮＡとタンパク質を含む有機相に分離し、（４）水相からイソプロパノール沈殿によりＲＮＡを精製し、（５）有機相からエタノール沈殿によりＤＮＡを精製する方法である。本方法は単一の試料からＤＮＡとＲＮＡを同時に単離，精製することができるが、有害性の強いフェノール、及びクロロホルムを使用し、且つ、水相と有機相の分取操作や複数回の遠心分離操作などの煩雑な操作を要する。
【０００８】
【特許文献１】特表２００２−５０７１２１号公報
【特許文献２】特開２００２−１８７８９７号公報
【非特許文献１】Analitycal Biochemistry 162,156-159(1989)
【非特許文献２】B. Vogelstein and D. Gillespie, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 76  (2), 615−619(1979)
【非特許文献３】R. Boom et al, J.Clin.Microbiol.28(3),495-503(1990)
【非特許文献４】Molecular Cloning Third edition 7.9, A Single-step Method   for the Simultaneous Preparation of DNA,RNA,Protein from Cell and Tissue
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、安全、且つ簡便な操作により、核酸含有試料からＲＮＡを精製することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らが鋭意検討した結果、ＤＮＡとＲＮＡを含む試料と、カオトロピック剤との混合液に、有機溶媒を添加すると、ＤＮＡが不溶化し、ＲＮＡは可溶状態を維持することを見出した。本発明は、核酸含有試料，カオトロピック剤、及び有機溶媒を混合し、
ＤＮＡを不溶化させ、不溶化物を混合液から分離し、その残液からＲＮＡを精製することに関する。尚、残液に試薬等を加えなくとも、シリカ含有固相を接触させることで、シリカ含有固相にＲＮＡを結合させることができる。また、不溶化物からＤＮＡを精製することもできる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、ＤＮＡとＲＮＡを含む試料から高純度のＲＮＡを安全、且つ簡便な操作により精製できる。また、単一の試料からＲＮＡとＤＮＡを同時に精製することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参照して説明する。
【実施例】
【００１３】
本実施例では、核酸含有試料，カオトロピック剤、及び有機溶媒を混合し、主にＤＮＡを不溶化させ、不溶化物を混合液から分離する。そして、不溶化物が分離された混合液をシリカ含有固相と接触させて、シリカ含有固相にＲＮＡを結合し、シリカ含有固相を混合液から分離して、洗浄液によりシリカ含有固相に結合した不純物を除去し、溶出液によりシリカ含有固相に結合したＲＮＡを溶出する。また、混合液から分離した不溶化物から
ＤＮＡを精製することもできる。
【００１４】
ＤＮＡを不溶化させる為には、核酸含有試料にカオトロピック剤、及び有機溶媒を添加した後の混合液における有機溶媒の濃度を最適化する必要がある。有機溶媒の濃度が最適濃度域よりも低い場合はＤＮＡが不溶化せず、一方、有機溶媒の濃度が最適濃度域よりも高い場合はＤＮＡのみならずＲＮＡも不溶化する。有機溶媒の最適濃度は主に有機溶媒の種類に依存して異なる。不溶化物の形成は、有機溶媒添加後の、ピペッティング、または攪拌機器等による混合により促進される。
【００１５】
ＲＮＡやＤＮＡを抽出し、精製する出発材料である核酸含有試料としては、ＤＮＡと
ＲＮＡを含有する溶液や生物材料がある。ＤＮＡとＲＮＡを含有する溶液としては、DNAとＲＮＡを含む生物材料からＤＮＡとＲＮＡが混在する状態で核酸を粗精製したもの等が使用できる。また、ＤＮＡとＲＮＡを含む生物材料としては、血液，生体組織，培養細胞，細菌等が使用できる。
【００１６】
核酸含有試料に添加され、シリカ含有固相と核酸の結合を促すカオトロピック剤としては、チオシアン酸グアニジン，チオシアン酸ナトリウム，塩酸グアニジン，ヨウ化ナトリウム，ヨウ化カリウム等が使用できる。カオトロピック剤の濃度としては、有機溶媒を添加した後の混合液における濃度において、１.０〜４.０mol／ｌ の範囲が使用できる。但し、生物材料を対象とする場合は、カオトロピック剤に加えて、界面活性剤，タンパク質変性剤，タンパク質分解酵素等を添加し、さらに、混合液に対して攪拌機器、或いはホモジナイザー等による物理的処理等を施して、生物材料の溶解、及びＤＮＡとＲＮＡの遊離化を促進することが好ましい。
【００１７】
有機溶媒としては、脂肪族アルコール，脂肪族エーテル，脂肪族エステル，脂肪族ケトンの中から選ばれた化合物の１種または２種以上を組み合わせたものを使用できる。脂肪族アルコールとしては、メタノール，エタノール，２−プロパノール，２−ブタノール，ポリエチレングリコール等を使用できる。脂肪族エーテルとしては、ジエチレングリコールジメチルエーテル，ジエチレングリコールジエチルエーテル，エチレングリコールジメチルエーテル，エチレングリコールジエチルエーテル，プロピオングリコールジメチルエーテル，プロピオングリコールジエチルエーテル，テトラヒドロフラン等を使用できる。脂肪族エステルとしては、乳酸エチル，プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート等を使用できる。脂肪族ケトンとしては、アセトン，ヒドロキシアセトン，メチルケトン等を使用できる。
【００１８】
混合液からの不溶化物の分離は、混合液を濾過する方法、または混合液を遠心分離する方法により行う。混合液から不溶化物を分離する為には、核酸含有試料，カオトロピック剤、及び有機溶媒の混合液が投入される混合液投入口と、ＤＮＡの不溶化物を混合液から分離できるフィルタと、フィルタを通過した混合液が排出される混合液排出口とを備える部材を用いる。例えば、不溶化物を捕捉する為の粒子保持径を有し、且つ、混合液のRNAを結合しない非シリカ含有の材質で構成されるフィルタを内蔵したカラム，チップ、若しくはシリンジを通過させて混合液の濾過を実施することができる。不溶化物を捕捉する為の粒子保持径としては、０.１μｍ 〜５００μｍの範囲が使用できる。また、混合液の
ＲＮＡを結合しない非シリカ含有の材質としては、ポリプロピレン，ナイロン，ポリエステル，ポリフッ化ビニリデン等が使用できる。
【００１９】
混合液から不溶化物が分離された混合液とシリカ含有固相の接触は、シリカ含有固相と混合液を容器内で攪拌，混合する方法、または、混合液が投入される溶液投入口と、溶液投入口に投入された溶液と接触可能に配置されたシリカ含有固相を備える部材に混合液を通過させる方法により行う。シリカ含有固相を備える部材としては、シリカ含有固相を固定化したカラム，チップ、若しくはシリンジなどが使用できる。シリカ含有固相と混合液を接触させた後、シリカ含有固相と混合液を分離する。シリカ含有固相としては、ガラス粒子，シリカ粒子，ガラス繊維，シリカ繊維，ケイソウ土、または、それら破砕物等、酸化ケイ素を含有する物質を使用できる。
【００２０】
洗浄液とシリカ含有固相の接触は、シリカ含有固相と洗浄液を容器内で攪拌，混合する方法、または、シリカ含有固相を固定化したカラム，チップ、若しくはシリンジなどに洗浄液を通過させる方法により行う。シリカ含有固相に洗浄液を接触させた後、シリカ含有固相から洗浄液を分離する。洗浄液としては、シリカ含有固相に対するＲＮＡの結合を維持し、且つ、シリカ含有固相に結合した不純物を除去できるものであり、エタノール８０％（ｖ／ｖ）以上を含む水溶液、またはＥｔＯＨ８０％（ｖ／ｖ）以上を含む低塩濃度の緩衝液を使用できる。
【００２１】
溶出液とシリカ含有固相の接触は、シリカ含有固相と溶出液を容器内で攪拌，混合する方法、または、シリカ含有固相を固定化したカラム，チップ、若しくはシリンジなどに洗浄液を通過させる方法により行う。シリカ含有固相に溶出液を接触させた後、シリカ含有固相から溶出液を分離し、回収する。溶出液としては、シリカ含有固相に吸着したＲＮＡを溶出できるものであり、ヌクレアーゼフリーの水、またはヌクレアーゼフリーの低塩濃度の緩衝液を使用できる。
【００２２】
不溶化物からのＤＮＡ精製は、混合液の濾過により不溶化物を分離した場合は、不溶化物を捕捉したフィルタに洗浄液を接触させて不純物を除去した後、溶出液をフィルタに接触させて、ＤＮＡを溶出する方法により行う。また、混合液の遠心分離により不溶化物を分離した場合は、上清を除去し、沈殿させた不溶化物に洗浄液を添加し、不溶化物に含まれる不純物を可溶化し、再度、遠心分離により不溶化物を沈殿させて、上清を除去し、沈殿させた不溶化物にＤＮＡ溶出液を添加して、ＤＮＡを溶出する方法により行う。洗浄液としては、ＤＮＡを可溶化せず、且つ、不溶化物に含まれる不純物を可溶化するものであり、ＥｔＯＨ７０％（ｖ／ｖ）以上を含む水溶液、またはＥｔＯＨ７０％（ｖ／ｖ）以上を含む低塩濃度の緩衝液等を使用できる。溶出液としては、ＤＮＡを可溶化できるものであり、ヌクレアーゼフリーの水、またはヌクレアーゼフリーの低塩濃度の緩衝液を使用できる。尚、不溶化物から精製するＤＮＡの純度と収量をさらに向上させるために、不溶化物をヌクレアーゼフリーの水、またはヌクレアーゼフリーの低塩濃度の緩衝液に溶解した後に、エタノール沈殿等の方法により再精製できる。
【００２３】
以上に説明されるように、本実施例においては、ＤＮＡを不溶化する為の混合液の組成と、シリカ含有固相とＲＮＡを結合する為の混合液の組成が同一であり、ＤＮＡの不溶化条件とシリカ含有固相に対するＲＮＡの結合条件、または、シリカ含有固相に対するDNAの結合条件とＲＮＡの結合条件を各々に構築する必要がない。従って、ＤＮＡの不溶化物を分離した混合液を、直ちに、シリカ含有固相に接触させて、ＲＮＡを単離，精製することができる。具体的な例としては、ＤＮＡを不溶化した混合液を、ＤＮＡの不溶化物を捕捉可能なフィルタから、ＲＮＡを結合可能なシリカ含有のフィルタに連続的に通過させることで、ＤＮＡとＲＮＡを単離，精製することができる。これにより、ＤＮＡとＲＮＡの単離，精製操作の簡便性が大きく向上する。
【００２４】
（実験）
以下、本実施例の検証実験について説明する。
【００２５】
Ａ）以下、本実験にて使用する材料，試薬，器具について説明する。
【００２６】
１．ＤＮＡとＲＮＡを含む生物材料
１．１白血球
ＥＤＴＡ・２Ｎａを抗凝固剤とする真空採血管に採取したヒト全血から単離した白血球を使用した。
１．２培養細胞
Mouse Myeloma（Ｓｐ２／０−Ａｇ１４）（大日本製薬製）の培養細胞を使用した。
１．３生体組織
Mouse Liver（フナコシ製）を使用した。
【００２７】
２．試薬
２．１赤血球溶解液
１５５ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ
１０ｍＭ  ＫＨＣＯ3
０.１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ
２．２溶解液
４Ｍ  ＧｕＳＣＮ
２５ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ  ７.５）
１％  βメルカプトエタノール
２．３有機溶媒溶液
（１）４０％（ｖ／ｖ）ジエチレングリコールジメチルエーテル水溶液
（２）４２.５％（ｖ／ｖ）ジエチレングリコールジメチルエーテル水溶液
（３）４５％（ｖ／ｖ）ジエチレングリコールジメチルエーテル水溶液
（４）４７.５％（ｖ／ｖ）ジエチレングリコールジメチルエーテル水溶液
（５）５０％（ｖ／ｖ）ジエチレングリコールジメチルエーテル水溶液
（６）６５％（ｖ／ｖ）２−プロパノール水溶液
（７）６７.５％（ｖ／ｖ）２−プロパノール水溶液
（８）７０％（ｖ／ｖ）２−プロパノール水溶液
（９）７２.５％（ｖ／ｖ）２−プロパノール水溶液
（10）７５％（ｖ／ｖ）２−プロパノール水溶液
（11）７７.５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液
（12）７０％（ｖ／ｖ）２−ブタノール水溶液
（13）５０％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール（平均分子量３００）水溶液
（14）７０％（ｖ／ｖ）乳酸エチル水溶液
２．４洗浄液
（１）ＤＮＡ洗浄液
８０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液
（２）ＲＮＡ洗浄液
８０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液
２．５溶出液
（１）ＤＮＡ溶出液
ＴＥ（ｐＨ  ８.０）（和光純薬製）
（２）ＲＮＡ溶出液
Ｈ2Ｏ（ヌクレアーゼフリー）（和光純薬製）
【００２８】
３．ＤＮＡ精製器具
（１）不溶化物分離フィルタ
粒子保持径１００μｍのポリプロピレン粒子焼結板（厚さ２mm）を使用した。
（２）チップタイプＤＮＡ精製器具
図１に、チップタイプＤＮＡ精製器具の構成例を示す。チップタイプＲＮＡ精製器具
１０は、分注用チップのような外形であり、液体を投入できる開口部１１と、液体を排出できる先端部１２を備え、その内部に不溶化物分離フィルタ１３を保有する。本器具は、開口部を圧力制御装置に装着し、先端部から液体を吸引吐出することも可能である。本実験では直径４.２mm の円柱状に切り抜いた不溶化物分離フィルタを内径４mmのチップ内部に圧入したものを使用した。
（３）スピンカラムタイプＤＮＡ精製器具
図２に、スピンカラムタイプＤＮＡ精製器具の構成例示す。スピンカラムタイプＤＮＡ精製器具２０は、スピンカラムのような外形であり、溶液を投入する為の第１開口部２１と、溶液を排出する第２開口部２２を備え、その内部に不溶化物分離フィルタ２３を保有する。本器具は、遠心分離器に設置し、遠心分離により、投入した溶液を不溶化物分離フィルタに通過させ、排出することができる。本実験では、直径７.６mm の円状に切り抜いた不溶化物分離フィルタを内径７.５mmのスピンカラム内部に圧入したものを使用した。
【００２９】
４．ＲＮＡ精製器具
（１）シリカ含有固相
ガラス繊維濾紙（ＧＦ／Ｄ）（Whatman社製）を用いた。
（２）シリカ含有固相保持部材
粒子保持径１００μｍのポリプロピレン粒子焼結板（厚さ１.５mm）を使用した。
（３）チップタイプＲＮＡ精製器具
図３に、チップタイプＲＮＡ精製器具の構成例を示す。チップタイプＲＮＡ精製器具
３０は、分注用チップのような外形であり、圧力制御装置に装着できる開口部３１と、液体を吸引，排出できる先端部３２を備え、その内部にシリカ含有固相３３を保有する。シリカ含有固相の両側には、円板状のシリカ含有固相保持部材３４が配置されている。これらのシリカ含有固相保持部材も液体及び気体の流通が自由な多数の小孔が形成されている。本器具は、開口部を圧力制御装置に装着し、先端部から液体を吸引，排出することも可能である。本実験では直径４.２mmの円状に切り抜いたシリカ含有固相１枚を、直径４.１mmの円状に切り抜いたシリカ含有固相保持部材２枚で挟んだ状態で、内径４mmの中空チップ内部に圧入したものを使用した。
（４）スピンカラムタイプＲＮＡ精製器具
図４に、スピンカラムタイプＲＮＡ精製器具の構成例を示す。スピンカラムタイプRNA精製器具４０は、スピンカラムのような外形であり、溶液を投入する為の第１開口部４１と、溶液を排出する第２開口部４２を備え、その内部にシリカ含有固相保持部材４４を両端に配置したシリカ含有固相４３を保有する。この器具は、遠心分離器に設置し、遠心分離により、投入した溶液をシリカ含有固相を通過させ、排出することができる。本実験では、直径７.７mmの円状に切り抜いたシリカ含有固相２枚を、直径７.６mmの円状に切り抜いたシリカ含有固相保持部材２枚で挟んだ状態で、内径７.５mm のスピンカラム内部に圧入したものを使用した。
【００３０】
５．ＤＮＡ，ＲＮＡ精製器具
図５に、ＤＮＡ，ＲＮＡ精製器具の構成例を示す。ＤＮＡ，ＲＮＡ精製器具１００は、スピンカラムタイプＤＮＡ精製器具と、スピンカラムタイプＲＮＡ精製器具とを組み合わせたものであり、ＤＮＡ精製器具となる上段スピンカラム１１０とＲＮＡ精製器具となる下段スピンカラム１２０から構成される。上段スピンカラム１１０は、溶液を投入する為の第１開口部１１１と、溶液を排出する第２開口部１１２を備え、その内部に不溶化物分離フィルタ１１３を保有する。下段スピンカラム１２０は、上段スピンカラムと接続し、上段スピンカラムから排出された溶液を投入する為の第３開口部１２１と、溶液を排出する第４開口部１２２を備え、その内部にシリカ含有固相保持部材１２３を両端に配置したシリカ含有固相１２４を保有する。この器具は、遠心分離器に設置し、遠心分離により、投入した溶液を不溶化物分離フィルタとシリカ含有固相を連続して通過させ、排出することができる。本実験では、直径６.８mm の円状に切り抜いた不溶化物分離フィルタを内径６.７mmのスピンカラム内部に圧入した上部スピンカラムと、直径７.７mmの円柱状に切り抜いたガラス繊維濾紙２枚を、直径７.６mmの円状に切り抜いたシリカ含有固相保持部材２枚で挟んだ状態で、内径７.５mmのスピンカラム内部に圧入した下部スピンカラムを、２段に重ねたものを使用した。
【００３１】
Ｂ）以下に本実験に用いる各方法を示す。ＤＮＡとＲＮＡを含む生物材料からＤＮＡと
ＲＮＡを単離，精製する方法は以下の各方法を適宜、組み合わせて行う。
【００３２】
１．全血からの白血球単離方法
（１）全血容量に対して５倍容量の赤血球溶解液を全血に添加し混合する。
（２）氷上で５分間インキュベートする。
（３）４００×ｇで１０分間の遠心分離を行う。
（４）上清を除去する。
（５）全血添加量に対して２倍容量の赤血球溶解液をペレットに添加し混合する。
（６）４℃環境下において４００×ｇで１０分間の遠心分離を行う。
（７）上清を除去して白血球のペレットを得る。
【００３３】
２．生物材料の溶解方法
２．１白血球の溶解方法
（１）白血球を単離した全血量に対して半分容量の溶解液を白血球ペレットに添加し混合する。
（２）ホモジナイザー（QIA shredder homogenizer）（ＱＡＩＧＥＮ製）により混合液を均一化する。
２．２培養細胞の溶解方法
（１）細胞数５×１０5の細胞ペレットに対して、溶解液１ｍｌを添加し混合する。
（２）ホモジナイザー（T 8 ULTRA−TURRAX）（ＩＫＡ製）により混合液を均一化する。
２．３生体組織の溶解方法
（１）生体組織１ｍｇに対して、溶解液１ｍｌを添加し混合する。
（２）ホモジナイザー（T 8 ULTRA−TURRAX）（ＩＫＡ製）により混合液を均一化する。
【００３４】
３．不溶化物の形成方法
生物材料に添加した溶解液と等量の有機溶媒を添加して十分に混合する。
【００３５】
４．ＤＮＡ精製方法
４．１チップタイプＤＮＡ精製器具によるＤＮＡ単離，精製方法
（１）不溶化物を形成した混合液をチップ上部からチップ内部に添加する。
（２）チップにシリンジを装着して、チップ内部の溶液をチップ下部より排出する。
（３）シリンジを外して、混合液と等量のＤＮＡ洗浄液をチップ上部からチップ内部に添加する。
（４）シリンジを装着して、チップ内部のＤＮＡ洗浄液をチップ下部より排出する。
（５）（３），（４）を２回繰り返す。
（６）精製品容器に混合液の１／５容量のＤＮＡ溶出液を添加する。
（７）ＤＮＡ溶出液をチップ下部より不溶化物分離フィルタを通過するまで吸引し、室温で３分間、インキュベートする。
（８）ＤＮＡ溶出液をチップ下部より精製品容器に排出する。
（９）ＤＮＡ溶出液をチップ下部より不溶化物分離フィルタを通過するまで吸引し、精製品容器に排出する。
（10）（９）を９回繰り返し、精製品容器にＤＮＡ精製溶液を得る。
４．２スピンカラムタイプＤＮＡ精製器具によるＤＮＡ単離，精製方法
（１）不溶化物を形成した混合液をスピンカラム内部に添加する。
（２）スピンカラムに液受け容器を設置して、２０００×ｇで１０秒間の遠心分離を行い、スピンカラム内部の溶液を液受け容器に排出する。
（３）混合液と等量のＤＮＡ洗浄液をスピンカラム内部に添加する。
（４）スピンカラムに液受け容器を設置して、２０００×ｇで１０秒間の遠心分離を行い、スピンカラム内部の溶液を液受け容器に排出する。
（５）（３），（４）を２回繰り返す。
（６）混合液の１／５容量のＤＮＡ溶出液をスピンカラム内部に添加する。
（７）６０℃で３分間、インキュベートする。
（８）スピンカラムに液受け精製品容器を設置して、２０００×ｇで１分間の遠心分離を行い、スピンカラム内部の溶液を液受け精製品容器に排出し、ＤＮＡ精製溶液を得る。
４．３遠心分離によるＤＮＡ単離，精製方法
（１）不溶化物を形成した混合液を、６０００×ｇで３分間の遠心分離を行う。
（２）上清を別の容器に移す。
（３）混合液と等量のＤＮＡ洗浄液を沈殿物に添加し混合する。
（４）１００００×ｇで５分間の遠心分離を行う。
（５）上清を廃棄し、混合液と等量のＤＮＡ洗浄液を沈殿物に添加し混合する。
（６）１００００×ｇで５分間の遠心分離を行う。
（７）上清を廃棄し、混合液の１／５容量のＤＮＡ溶出液を沈殿物に添加，混合し、DNA精製溶液を得る。
【００３６】
５．ＲＮＡ精製方法
５．１．チップタイプＲＮＡ精製器具によるＲＮＡ単離，精製方法
（１）チップにシリンジを装着する。
（２）不溶化物分離フィルタを通過した混合液を、チップ下部よりシリカ含有固相を通過するまで吸引し、容器に排出する。
（３）（２）を５回繰り返す。
（４）シリンジを外して、混合液と等量のＲＮＡ洗浄液をチップ上部からチップ内部に添加する。
（５）シリンジを装着して、チップ内部のＲＮＡ洗浄液をチップ下部より排出する。
（６）（４），（５）を２回繰り返す。
（７）精製品容器に混合液の１／２０容量のＲＮＡ溶出液を添加する。
（８）ＲＮＡ溶出液をチップ下部よりシリカ含有固相を通過するまで吸引し、精製品容器に排出する。
（９）（８）を１０回繰り返し、精製品容器にＲＮＡ精製溶液を得る。
５．２スピンカラムタイプＲＮＡ精製器具によるＲＮＡ単離，精製方法
（１）不溶化物分離フィルタを通過した混合液をスピンカラム内部に添加する。
（２）スピンカラムに液受け容器を設置して、４０００×ｇで１分間の遠心分離を行い、スピンカラム内部の溶液を液受け容器に排出する。
（３）混合液と等量のＲＮＡ洗浄液をスピンカラム内部に添加する。
（４）スピンカラムに液受け容器を設置して、４０００×ｇで１分間の遠心分離を行い、スピンカラム内部の溶液を液受け容器に排出する。
（５）（３），（４）を２回繰り返す。
（６）混合液の１／２０容量のＲＮＡ溶出液をスピンカラム内部に添加する。
（７）スピンカラムに液受け精製品容器を設置して、４０００×ｇで１分間の遠心分離を行い、スピンカラム内部の溶液を液受け精製品容器に排出し、ＲＮＡ精製溶液を得る。
【００３７】
６．ＤＮＡ，ＲＮＡ精製器具によるＤＮＡとＲＮＡの単離，精製方法
（１）不溶化物を形成した混合液をＤＮＡ，ＲＮＡ精製器具の上段スピンカラム内部に添加する。
（２）スピンカラムに液受け容器を設置して、４０００×ｇで１分間の遠心分離を行い、スピンカラム内部の溶液を液受け容器に排出する。
（３）ＤＮＡ，ＲＮＡ連続精製器具の上段スピンカラムと下段スピンカラムを分離する。
（４）混合液と等量のＤＮＡ洗浄液を上段スピンカラム内部に添加する。
（５）混合液と等量のＲＮＡ洗浄液を下段スピンカラム内部に添加する。
（６）各々のスピンカラムに液受け容器を設置して、４０００×ｇで１分間の遠心分離を行い、スピンカラム内部の溶液を液受け容器に排出する。
（７）（３），（４）を２回繰り返す。
（８）混合液の１／５容量のＤＮＡ溶出液をス上段ピンカラム内部に添加し、６５℃で３分間、インキュベートする。
（９）混合液の１／２０容量のＲＮＡ溶出液を下段スピンカラム内部に添加する。
（10）各々のスピンカラムに液受け精製品容器を設置して、４０００×ｇで１分間の遠心分離を行い、スピンカラム内部の溶液を各々の液受け精製品容器に排出し、ＤＮＡ精製溶液とＲＮＡ精製溶液を得る。
【００３８】
Ｃ）以下に本実験において精製したＤＮＡとＲＮＡの評価方法を説明する。
【００３９】
１．電気泳動によるＤＮＡとＲＮＡの含有比率算出
ホルムアミドによる変性処理を行ったＤＮＡ精製溶液とＲＮＡ精製溶液を１．２５％アガロースゲル（Reliant RNA Gel System）（ＦＭＣ製）により電気泳動（１０Ｖ／cm，
４０分間）を行った。電気泳動後のアガロースゲルはエチジウムブロマイドにより染色し、ＵＶ照射下においてデンシトグラフ（ＡＴＴＯ製）によりｍＲＮＡとｒＲＮＡを含む
ＲＮＡ群の蛍光強度とgenomicDNAの蛍光強度を測定し、ＲＮＡとＤＮＡの蛍光強度比に基づいて、ＲＮＡとＤＮＡの含有比率を算出した。
【００４０】
２．ＤＮＡとＲＮＡの濃度定量
ＤＮＡ精製溶液とＲＮＡ精製溶液を適量に希釈して、分光光度計（GeneSpecI）(日立那珂インスツルメンツ製) により２６０ｎｍの吸光度を測定し、デンシトグラフ解析から算出したＤＮＡとＲＮＡの含有比率を基に、ＲＮＡとＤＮＡの濃度ファクタを４０μｇ／
ｍｌ，５０μｇ／ｍｌとしてＲＮＡ量とＤＮＡ量を算出した。
【００４１】
Ｄ）検証実験１
ＤＮＡとＲＮＡを含む生物材料と、カオトロピック剤との混合液に、有機溶媒を添加し、ＤＮＡを不溶化させ、ＤＮＡとＲＮＡを単離，精製する為には、有機溶媒の濃度を最適化することが必要である。本実験では、ＤＮＡとＲＮＡの単離，精製効果と有機溶媒濃度の関係を評価する為に、有機溶媒としてジエチレングリコールジメチルエーテル、及び２−プロパノールを用いて、有機溶媒濃度を変化させ、ＤＮＡとＲＮＡを単離，精製し、有機溶媒濃度の最適化について検討した。
生物材料：白血球（全血６００μｌ相当）
有機溶媒：ジエチレングリコールジメチルエーテル水溶液，２−プロパノール水溶液
ＤＮＡ精製方法：チップタイプＤＮＡ精製器具によるＤＮＡ精製方法
ＲＮＡ精製方法：スピンカラムタイプＲＮＡ精製器具によるＲＮＡ精製方法
以下の表１に、ＤＮＡ精製溶液のＤＮＡ量とＲＮＡ含有量、及び、ＲＮＡ精製溶液の
ＲＮＡ量とＤＮＡ含有量を示す。
【００４２】
ジエチレングリコールジメチルエーテルを用いた場合は、濃度４５％前後において、
ＤＮＡ精製溶液はＲＮＡを殆ど含まず、また、ＲＮＡ精製溶液はＤＮＡを殆ど含まず、高純度のＤＮＡとＲＮＡが単離，精製された。一方、濃度４０％においては、ＤＮＡ精製溶液のＤＮＡ量が低下し、ＲＮＡ精製溶液のＤＮＡ含有量が増加する傾向が認められた。また、濃度５０％においては、ＤＮＡ精製溶液のＲＮＡ含有量が増加し、ＲＮＡ精製溶液のＲＮＡ量が低下する傾向が認められた。
【００４３】
２−プロパノールを用いた場合は、濃度７０％前後において、ＤＮＡ精製溶液はＲＮＡを殆ど含まず、また、ＲＮＡ精製溶液はＤＮＡを殆ど含まず、高純度のＤＮＡとＲＮＡが単離，精製された。一方、濃度６５％においては、ＤＮＡ精製溶液のＤＮＡ量が低下し、ＲＮＡ精製溶液のＤＮＡ含有量が増加する傾向が認められた。また、濃度７５％においては、ＤＮＡ精製溶液のＲＮＡ含有量が増加し、ＲＮＡ精製溶液のＲＮＡ量が低下する傾向が認められた。
【００４４】
有機溶媒濃度に依存してＲＮＡ、またはＤＮＡの含有比率が変動するのは、有機溶媒濃度が最適濃度域より低い場合はＤＮＡの不溶化が不十分となり、可溶状態のＤＮＡがRNAと共にシリカ含有固相に結合し、一方、有機溶媒濃度が最適濃度域よりも高い場合はDNAのみならずＲＮＡが不溶化し、不溶化したＲＮＡはＤＮＡと共に不溶化物分離フィルタに捕捉されるためと考えられる。
【００４５】
【表１】
2006311803.tif 000003
【００４６】
Ｅ）検証実験２
ＤＮＡとＲＮＡを含む生物材料と、カオトロピック剤との混合液に、有機溶媒を添加し、ＤＮＡをのみを不溶化させ、ＤＮＡとＲＮＡを単離，精製する方法は、様々な有機溶媒を用いて実施することができる。本実験では、ＤＮＡとＲＮＡの単離，精製効果と有機溶媒種類の関係を評価する為に、有機溶媒としてエタノール，２−プロパノール，２−ブタノール，ポリエチレングリコール，乳酸エチル、ジエチレングリコールジメチルエーテルを用いて、（検証実験１）の方法に基づいて決定した最適濃度において、ＤＮＡとＲＮＡを単離，精製した。
生物材料：白血球（全血６００μｌ相当）
ＤＮＡ精製方法：チップタイプＤＮＡ精製器具によるＤＮＡ精製方法
ＲＮＡ精製方法：スピンカラムタイプＲＮＡ精製器具によるＲＮＡ精製方法
以下の表２に、ＤＮＡ精製溶液のＤＮＡ量とＲＮＡ含有量、及び、ＲＮＡ精製溶液の
ＲＮＡ量とＤＮＡ含有量を示す。各種有機溶媒の所定濃度において、ＤＮＡ精製溶液は
ＲＮＡを殆ど含まず、また、ＲＮＡ精製溶液はＤＮＡを殆ど含まず、高純度なＤＮＡと
ＲＮＡが単離，精製された。
【００４７】
【表２】
2006311803.tif 000004
【００４８】
Ｆ）検証実験３
ＤＮＡとＲＮＡを含む生物材料と、カオトロピック剤との混合液に、有機溶媒を添加し、ＤＮＡのみを不溶化させ、ＤＮＡとＲＮＡを単離，精製する方法は、様々な精製器具を用いることにより実施できる。本実験では、ＤＮＡとＲＮＡの単離，精製効果と各種精製器具の関係を評価する為に、スピンカラムタイプ、或いはチップタイプのＤＮＡ精製器具とＲＮＡ精製器具を用いた方法で、以下の条件により、ＤＮＡとＲＮＡを単離，精製した。
生物材料：白血球（全血６００μｌ相当）
有機溶媒：７０％（ｖ／ｖ）  ２−プロパノール水溶液
以下の表３に、ＤＮＡ精製溶液のＤＮＡ量とＲＮＡ含有率、及び、ＲＮＡ精製溶液の
ＲＮＡ量とＤＮＡ含有率を示す。各方法において、ＤＮＡ精製溶液はＲＮＡを殆ど含まず、また、ＲＮＡ精製溶液はＤＮＡを殆ど含まず、高純度なＤＮＡとＲＮＡが単離，精製された。
【００４９】
ＤＮＡ精製溶液のＤＮＡ量は遠心分離による方法で最も多く、次いで、チップタイプ精製器具による方法、スピンカラムタイプ精製器具による方法の順であった。これは、各方法で不溶化したＤＮＡの捕捉効率がほぼ等しいものの、不溶化したＤＮＡからのＤＮＡ溶出効率が異なる為と考えられる。また、ＲＮＡ精製溶液のＲＮＡ量は、チップタイプ精製器具による方法が、スピンカラムタイプ精製器具による方法よりも多い。これは、各方法でシリカ含有固相に対するＲＮＡ結合効率とＲＮＡ溶出効率が異なる為と考えられる。
【００５０】
一方、ＤＮＡとＲＮＡの単離，精製操作に要する時間は、ＤＮＡ，ＲＮＡ精製器具による方法が最も短く、次いで、スピンカラムタイプ精製器具による方法，チップタイプ精製器具による方法の順であった。これは、カラムタイプ精製器具による方法が、チップタイプ精製器具による方法よりも操作数が簡便な為である。
【００５１】
尚、ＤＮＡとＲＮＡの単離，精製操作において最も簡便性の高い、ＤＮＡ，ＲＮＡ精製器具を用いる方法は、ＤＮＡの不溶化物を形成する為の混合溶液の組成と、シリカ含有固相とＲＮＡを結合する為の混合溶液の組成が同一である為に、実施可能な方法である。
【００５２】
【表３】
2006311803.tif 000005
【００５３】
Ｇ）検証実験４
ＤＮＡとＲＮＡを含む生物材料と、カオトロピック剤との混合液に、有機溶媒を添加し、ＤＮＡのみを不溶化させ、ＤＮＡとＲＮＡを単離，精製する方法は、各種の核酸含有試料に適用することが可能である。本実験では、ＤＮＡとＲＮＡの単離，精製効果と核酸含有試料の関係を評価する為に、各種の生物材料を用いて、以下の条件によりＤＮＡとRNAを単離，精製した。
生物材料：
（１）白血球（全血６００μｌ相当）
（２）培養細胞（細胞数５×１０5）
（３）生体組織（１ｍｇ）
有機溶媒：７０％（ｖ／ｖ）乳酸エチル水溶液
ＤＮＡ精製方法：チップタイプＤＮＡ精製器具によるＤＮＡ精製方法
ＲＮＡ精製方法：チップタイプＲＮＡ精製器具によるＲＮＡ精製方法
以下の表４に、ＤＮＡ精製溶液のＤＮＡ量とＲＮＡ含有率、及び、ＲＮＡ精製溶液の
ＲＮＡ量とＤＮＡ含有率を示す。各種の生物材料において、ＤＮＡ精製溶液はＲＮＡを殆ど含まず、また、ＲＮＡ精製溶液はＤＮＡを殆ど含まず、高純度のＤＮＡとＲＮＡが単離，精製された。
【００５４】
【表４】
2006311803.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】チップタイプＤＮＡ精製器具の概略図。
【図２】カラムタイプＤＮＡ精製器具の概略図。
【図３】チップタイプＲＮＡ精製器具の概略図。
【図４】カラムタイプＲＮＡ精製器具の概略図。
【図５】ＤＮＡ，ＲＮＡ精製器具の概略図。
【符号の説明】
【００５６】
１０…チップタイプＤＮＡ精製器具、１１，３１…開口部、１２，３２…先端部、１３，２３，１１３…不溶化物濾過フィルタ、２０…スピンカラムタイプＤＮＡ精製器具、
２１，４１，１１１…第１開口部、２２，４２，１１２…第２開口部、３０…チップタイプＲＮＡ精製器具、３３，４３，１２４…シリカ含有固相、３４，４４，１２３…シリカ含有固相保持部材、４０…スピンカラムタイプＲＮＡ精製器具、１００…ＤＮＡ，ＲＮＡ精製器具、１１０…上段スピンカラム、１２０…下段スピンカラム、１２１…第３開口部、１２２…第４開口部。
【図１】
2006311803.tif 000007
【図２】
2006311803.tif 000008
【図３】
2006311803.tif 000009
【図４】
2006311803.tif 000010
【図５】
2006311803.tif 000011