(57)【要約】【課題】本発明は腸内球菌潜在性ファージ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ΦＦＣ１）に内在したインテグラーゼ（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）であるＭＪ１を含有する再組合せベクター及びこれを利用したインテグレーション方法を提供する。【解決手段】本発明はヒト細胞で他の要因無しに単独で部位特異的インテグレーション（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を起こすがそれとは対照的にエクシジョン（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）は起こさないＭＪ１遺伝子を含有した再組合せベクター及びこれを利用したインテグレーション方法に関する。本発明によって提供されるヒト細胞での部位特異的インテグレーション機能は哺乳動物細胞で遺伝子治療に利用できるので医療産業上非常に優れた効果がある。【選択図】    図１Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のインテグラーゼＭＪ１遺伝子を含み、下記の図１Ｃの切断地図で示される再組合せベクターｐｃＭＪ１。
2006166903.tif 000005
【請求項２】
遺伝子を動物細胞にインテグレーションする方法において、配列番号1のインテグラーゼＭＪ１遺伝子を含む再組合せベクター、ａｔｔＢ遺伝子を含む再組合せベクター及びａｔｔＰ遺伝子を含む再組合せベクターを共にトランスフェクションすることを特徴とする、部位特異的インテグレーション方法。
【請求項３】
前記ＭＪ１遺伝子を含む再組合せベクターは請求項１による再組合せベクターｐｃＭＪ１であることを特徴とする、請求項２に記載の部位特異的インテグレーション方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腸内球菌潜在性ファージ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ΦＦＣ１）に内在したインテグラーゼ（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）であるＭＪ１を含有する再組合せベクター及びこれを利用したインテグレーション方法に係わり、より詳しくは、ヒト細胞で他の要因無しに単独で部位特異的インテグレーション（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を起こすがそれとは対照的にエクシジョン（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）は起こさないＭＪ１遺伝子を含有した再組合せベクター及びこれを利用したインテグレーション方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バクテリオファージΦＦＣ１はエンテロコックスフェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＫＢＬ７０３）をＵＶインダクション（ＵＶ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）による溶原性ストレーン（ｓｔｒａｉｎ）の培養を通じて最初発見された。ファージΦＦＣ１は部位特異的な機作を通じて宿主染色体に挿入される。ファージΦＦＣ１に内在したインテグラーゼＭＪ１はファージ接合部位であるａｔｔＰの上部に位置しており、４６５−アミノ酸ポリペプチドをコーディング（ｃｏｄｉｎｇ）する。ＫＢＬ７０３の指標ストレーン（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）であるＫＢＬ７０７の染色体で発見したバクテリア接合部位であるａｔｔＢはａｔｔＰと共に実際にＭＪ１が結合する部位であってストランド（ｓｔｒａｎｄ）交換が起こる。ＭＪ１によってａｔｔＢとａｔｔＰは各部位を伴ずつ共有することによりａｔｔＬとａｔｔＲに分けられ、その間にはファージゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡがインテグレーションされる。
【０００３】
本発明者はファージの再組合せ部位であるａｔｔＰ付近で部位−特異的な再組合せ酵素をインコーディング（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）するものと推定されるＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）を発見し、これをＭＪ１と命名し、前記遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させた（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：４４８〜４５４）、しかし、ＭＪ１が高い水準に発現されることにも拘わらず、封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｉｅｓ；ＩＢｓ）形態を有する不溶性蛋白質（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の形成を招き部位特異的リコンビナーゼ（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）と推定される酵素の活性測定が不可能であった。このような理由によりＭＪ１の触媒（ｃａｔａｌｙｔｉｃ）特性、再組合せ活性について報告されたことが無く、さらにＭＪ１酵素を利用して遺伝子を再組合せさせる研究は行われたことがない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はこのような点を勘案して案出されたものであって、一般に他の種から由来したインテグラーゼはインテグレーションとエクシジョンの機能を同時に有するため治療的遺伝子の伝達（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）の効率性面で問題があったが、このような点を改善して所望の遺伝子を効率的にインテグレーションさせることができる再組合せベクター及びこれを利用したインテグレーション方法を提供しようとすることにその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の上記のような目的は腸内球菌潜在性ファージ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ΦＦＣ１）に内在したインテグラーゼ（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）であるＭＪ１がＥ．ｃｏｌｉでファージ接合部位（ｐｈａｇｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｉｔｅ）であるａｔｔＰとバクテリア接合部位（ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｉｔｅ）であるａｔｔＢに作用して単独で部位特異的インテグレーション（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を起こすということを確認し、ヒト細胞で染色体外ベクター実験（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を通じてＭＪ１が他の要因無しに単独で部位特異的インテグレーション（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を起こすがそれとは対照的にエクシジョン（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）は起こさないということを確認し、ＭＪ１遺伝子を含有した再組合せベクター及びこれを利用したインテグレーション方法を開発することによって達成した。
【０００６】
本発明ではＭＪ１インテグラーゼをヒト細胞で発現させａｔｔＰとａｔｔＢとの間のインテグレーションが実際に起こるかその活動性を見てみた。生体内実験において、ＭＪ１による部位特異的インテグレーションを証明するために、ａｔｔＰとａｔｔＢを含むベクターをＭＪ１発現ベクターと共にヒト胎児腎臓細胞であるＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、緑色蛍光蛋白質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＦＰ）をリポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）として用いた。コンフォーカルマイクロスコピー（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）とＦＡＣＳアナリシスによって見てみた結果、ＭＪ１を含むプラスミドをコトランスフェクションしたセルライン（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）でＧＦＰが発現され、これは他の補助蛋白質無しでもＭＪ１によるインテグレーションが細胞内で起こったことを示す。また、ａｔｔＲとａｔｔＬを含むベクターで同じ実験方法によってＭＪ１によるエクシジョンを見てみると、インテグレーション実験とは対照的にＧＦＰの発現が全く起こらず、これはＭＪ１によるエクシジョンは起こらなかったことを示す。
【発明の効果】
【０００７】
本発明はエンテロコックスフェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）ＫＢＬ７０３の潜在性バクテリオファージ（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）に内在したＭＪ１インテグラーゼを含有した再組合せベクター及びこれを利用したインテグレーション方法に関するものであって、本発明によるヒト細胞での部位特異的インテグレーションは他の要因無しに単独で部位特異的インテグレーションを起こすがそれとは対照的にエクシジョンは起こさないという優れた効果があるので、これは遺伝子治療及び医薬品産業上非常に有用な発明である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は腸内球菌潜在性ファージ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ΦＦＣ１）に内在したインテグラーゼ（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）であるＭＪ１を含有する再組合せベクター及びこれを利用したインテグレーション方法に関するものであって、より詳しくは、ヒト細胞で他の要因無しに単独で部位特異的インテグレーション（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を起こすがそれとは対照的にエクシジョン（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）は起こさないＭＪ１遺伝子を含有した再組合せベクター及びこれを利用したインテグレーション方法に関する。
【０００９】
本発明では腸内球菌潜在性ファージΦＦＣ１（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ΦＦＣ１）に内在したインテグラーゼ（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）であるＭＪ１がイーコライ（Ｅ．ｃｏｌｉ）でファージ接合部位（ｐｈａｇｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｉｔｅ）であるａｔｔＰとバクテリア接合部位（ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｉｔｅ）であるａｔｔＢに作用して単独で部位特異的インテグレーション（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を起こすということを確認し、ヒト細胞で染色体外ベクター実験（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を通じてＭＪ１が他の要因無しに単独で部位特異的インテグレーション（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を起こすがそれとは対照的にエクシジョン（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）は起こさないということを糾明した。ＭＪ１によるイーコライ（Ｅ．ｃｏｌｉ）だけでなくヒト細胞での部位特異的インテグレーション機能は哺乳動物細胞で遺伝子治療に利用されることができので医療産業上非常に優れた効果がある。
【００１０】
本発明において、ａｔｔＰはファージの接合部位（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｉｔｅ；７３８ｂｐ）を、ａｔｔＢはバクテリアの接合部位（２９０ｂｐ）を意味し、ａｔｔＬとａｔｔＲは前記ａｔｔＰとａｔｔＢの各ストランド交換によって部位−特異的に再組合せ（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）されたａｔｔＬ（４０４ｂｐ）、ａｔｔＲ（６２４ｂｐ）のＤＮＡを意味する（以下、‘ａｔｔＰ’、‘ａｔｔＢ’、‘ａｔｔＬ’、‘ａｔｔＲ’と略称する）。
前記ａｔｔＢをクローニングするためにファージΦＦＣの指標ストレーンであるエンテロコックスフェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｃａｌｉｓ）ＫＢＬ７０７菌株（寄託番号  ＫＦＣＣ  １２１７７）をＫＣＣＭから分譲を受けてＰＣＲの鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として使用し、ａｔｔＬ、ａｔｔＲはファージΦＦＣが染色体に挿入（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）されたエンテロコックスフェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｃａｌｉｓ）ＫＢＬ７０３菌株（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ４；１５５〜１５８）を使用してクローニングし、ａｔｔＰは７．７ｋｂのΦＦＣ１  ＤＮＡが挿入されたベクターであるｐＦＥ１（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｗ．１９９９．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＦＣ１  ｆｒｏｍ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ．Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ．Ｋｏｒｅａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｋｏｒｅａ）を鋳型として使用した。
【００１１】
本発明のＭＪ１遺伝子の塩基配列は配列番号１に示し、その発現蛋白質のアミノ酸配列は配列番号２に示す。 本発明の ａｔｔＰ 遺伝子の塩基配列は配列番号3に示し、ａｔｔＢ 遺伝子の塩基配列は配列番号4に示す。
本発明はバクテリア、バクテリオファージとプラスミドを培養する段階；動物細胞へのトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のための部位特異的挿入プラスミドを製造する段階；ヒト胎児腎臓細胞ライン２９３のトランスフェクションとフルオレセンス活動性を測定する段階；リバーストランスクリプションＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を遂行する段階；ＦＡＣＳアナリシス（ａｎａｌｙｓｉｓ）を遂行する段階；ａｔｔＰとａｔｔＢの挿入（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）とａｔｔＬとａｔｔＲのエクシジョン（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）を確認する段階で構成される。
【００１２】
以下、本発明の具体的な構成と作用、効果を実施例及び実験例を通じてさらに詳しく説明する。
【００１３】
［実施例１］バクテリア、バクテリオファージとプラスミドの培養
本発明で使用されたバクテリアストレーン（ｓｔｒａｉｎ）とプラスミドは下記表１で言及された。エンテロコックスフェーカリスＫＢＬ７０３（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＫＢＬ７０３）ストレーンとＫＢＬ７０７ストレーンはトッドヒューイットブロス（Ｔｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔ  ｂｒｏｔｈ（ＴＨＢ）：Ｄｉｆｃｏ  Ｃｏ．，Ｕ．Ｓ．Ａ）でシェイキング（ｓｈａｋｉｎｇ）せずに３７℃で育て、イーコライ（Ｅ．ｃｏｌｉ）であるＤＨ５αはＬＢでシェイキングした状態で３７℃で育てた。潜在性ファージであるΦＦＣ１はエンテロコックスフェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ＫＢＬ７０３でＵＶ−照射を通じてインダクション（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）とピュリフィケーション（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を行った。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
［実施例２］動物細胞へのトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のための部位特異的挿入プラスミドの製造
ファージΦＦＣ１のＤＮＡと、ＫＢＬ７０７のゲノムＤＮＡ及びＫＢＬ７０３のゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記表２に示したプライマーを使用して約１５００ｂｐのＭＪ１インテグラーゼ遺伝子と２９０，３４７ｂｐのａｔｔＢ、ａｔｔＬ遺伝子をＰＣＲで合成し、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）にＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩ  ｓｉｔｅを利用してクローニングしてｐｃＭＪ１（図１Ｃ参照）とｐｃＢ、ｐｃＬ（図１Ａ、１Ｄ参照）を作った。ｐＧＰ（−）とｐＧＲ（−）（図１Ｂ、１Ｅ参照）を作るためにまず、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）にＡｓｅＩとＢｇｌII  ｓｉｔｅを利用してＣＭＶ  プロモーター部分をディリーション（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）した後、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）を利用してブラントエンド（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ）を作った。そして、各末端をライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させた後、ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩ  ｓｉｔｅを利用して下記表２のプライマーで増幅された７３９と６２４ｂｐのａｔｔＰとａｔｔＲのＰＣＲ産物をクローニングした。
【００１６】
【表２】
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【００１７】
［実施例３］ヒト胎児腎臓細胞ライン２９３のトランスフェクションとフルオレセンス活動性を測定
ヒト胎児腎臓細胞ライン２９３はＤＭＥＭに１０％のＦＢＳと１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で育てた。サブコンフルエント（Ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な４０〜６０％の細胞に各々１０ｕｇのプラスミドＤＮＡをカルシウムホスフェート方法（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ）を利用して６０ｍｍ培養皿（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ）にトランスフェクションした。それぞれのトランスフェクションされた細胞はトランスフェクションしてから７２時間後、ツァイスコンフォーカルマイクロスコピー（Ｚｅｉｓｓ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を利用して１００倍率の状態でＧＦＰのフルオレセンス活動性を測定した。
【００１８】
［実施例４］リバーストランスクリプションＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の遂行
前記実施例１のｐｃＭＪ１を２９３Ｔにトランスフェクションした細胞からトータルＲＮＡを分離した後、スーパースクリプトII  ＲＮａｓｅＨ−リバーストランスクリプターゼ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  II  ＲＮａｓｅＨ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してリバーストランスクリプション（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）とＰＣＲを遂行し、プライマーシーケンス（ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は表２の通りである。ＰＣＲは９４℃で５分、２５サイクルで９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、６８℃で３０秒遂行し、ＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ）とエチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）で染色して見てみた。図２のようにＭＪ１インテグラーゼは動物細胞で発現がよく起こったことをＰＣＲ産物のバンドを通じて確認し、ＧＡＤＰＨ遺伝子の発現程度はインターナルコントロール（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として用いた。
【００１９】
［実施例５］ＦＡＣＳアナリシス（ａｎａｌｙｓｉｓ）の遂行
それぞれのセルライン（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）はトランスフェクションしてから７２時間後、ハーベスト（ｈａｒｖｅｓｔ）し、ＰＢＳで二回洗って０．１％ＢＳＡと０．０５％ＮａＮ3で固定させてＦＡＣＳアナリシスを行った。
【００２０】
以下、本発明の上記実施例の結果を確認する実験結果を開示する。
【００２１】
［実験例１］ａｔｔＰとａｔｔＢの挿入（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）とａｔｔＬとａｔｔＲのエクシジョン（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）の確認
ｐｃＢとｐＧＰ（−）、ｐｃＬとｐＧＲ（−）を各々ｐｃＭＪ１がある場合と無い場合に区分してコトランスフェクション（ｃｏｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、ｐＧＰ（−）とｐＧＰ（＋）を各々単独でトランスフェクションしてこれをネガティブ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）とポジティブ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）で行った（図３Ｅ）。ｐｃＢはａｔｔＢを含みプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を有しており、ｐＧＰ（−）はａｔｔＰを含みプロモーターを有していない。また、ｐＧＰ（−）はＧＦＰがリポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ）としてあるが、プロモーターが無いため単独では発現することができない。しかし、二つのプラスミドＤＮＡが有しているａｔｔＰとａｔｔＢがＭＪ１によってインテグレーション（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）が起こると、ｐＲＥＣ−Ｉ（図１Ｆ）のようなプラスミドが作られ、ＧＦＰがＣＭＶプロモーターによって発現する。同様に、エクシジョン（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）も、ｐＧＲ（−）単独ではプロモーターが無いためＧＦＰが発現されないが、ＭＪ１によってａｔｔＬとａｔｔＲの間でエクシジョンが起こると、ｐＲＥＣ−Ｅ（図１Ｇ）のようなプラスミドが作られ、顕微鏡でＧＦＰの発現を観察可能になる。図３ＡはｐＧＰ（−）とｐｃＢに含まれたａｔｔＰとａｔｔＢの間でＭＪ１による部位特異的インテグレーションにより再組合せプラスミドであるｐＲＥＣ−Ｉが生成され、その結果ＧＦＰが発現された。その反面、ＭＪ１を共にトランスフェクションしない細胞ではインテグレーションが起こらずＧＦＰの発現も観察されなかった。また、これは図３の（Ｃ）と（Ｄ）から分かるようにプロモーターによるものでなく、ＭＪ１によるものであることが分かる。このようなインテグレーションの程度を数値的に確認するために前記実施例のＦＡＣＳアナリシス（ａｎａｌｙｓｉｓ）を行い、その結果、図４のような結果を得ることができた。（Ａ）と（Ｂ）は図３と同様にｐｃＢとｐＧＰ（−）に含まれているａｔｔＢとａｔｔＰがＭＪ１によってインテグレーションが起こることをＧＦＰ発現で確認したものであり、（Ｂ）のように発現程度が増加したことを観察することができる。その程度は（Ｃ）のように約３倍以上差があった。同じ方法でＭＪ１によるエクシジョンを見てみた結果、図５の（Ａ）と（Ｂ）から分かるように、ＭＪ１の発現には関係無しにＧＦＰの発現が観察されなかった。（Ｃ）はポジティブコントロールである。これはＭＪ１によってａｔｔＬとａｔｔＲの間にエクシジョンが起こらないことによってｐＲＥＣ−Ｅのような再組合せプラスミドが生成されなかったことを示す。
【００２２】
前記実施例及び実験例によってエンテロコックスフェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）ＫＢＬ７０３の潜在性バクテリオファージ（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）であるΦＦＣ１に内在したＭＪ１遺伝子を含有した発現ベクターｐｃＭＪ１をヒト細胞で発現させた時、他の要因無しに単独で部位特異的インテグレーションを起こすがそれとは対照的にエクシジョンは起こさない優れた効果があることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】２９０ｂｐ  ａｔｔＢ遺伝子を含みＣＭＶプロモーターのあるｐｃＢベクターである。
【図１Ｂ】７３９ｂｐ  ａｔｔＰ遺伝子を含みＣＭＶプロモーターが無くＧＦＰをリポーターとして有するｐＧＰ（−）ベクターである。
【図１Ｃ】ＭＪ１遺伝子を含むｐｃＭＪ１ベクターである。
【図１Ｄ】６２４ｂｐ  ａｔｔＬ遺伝子を含みＣＭＶプロモーターのあるｐｃＬベクターである。
【図１Ｅ】４０４ｂｐ  ａｔｔＲ遺伝子を含みＣＭＶプロモーターが無くＧＦＰをリポーターとして有するｐＧＲ（−）ベクターである。
【図１Ｆ】ｐｃＢ、ｐＧＰ（−）及びｐｃＭＪ１を共にコトランスフェクションさせた時にインテグレーションによって生成される再組合せベクターである。
【図１Ｇ】ｐｃＬ、ｐＧＲ（−）及びｐｃＭＪ１を共にコトランスフェクションさせた時にエクシジョンによって生成される再組合せベクターである。
【図２】２９３細胞でのＭＪ１の発現を示す。
【図３】２９３細胞での挿入実験結果のコンフォーカルマイクロスコープイメージである。
【図４Ａ】Ｙ軸は細胞数、Ｘ軸はＧＦＰの発現程度であって、ＭＪ１が発現しなかった時のイメージである。
【図４Ｂ】Ｙ軸は細胞数、Ｘ軸はＧＦＰの発現程度であって、ＭＪ１が発現した時のイメージである。
【図４Ｃ】図４Ａと４Ｂの数値を定量化したグラフである。
【図５】２９３細胞でのエクシジョン実験結果のコンフォーカルマイクロスコープイメージである。
【図４Ｃ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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