(57)【要約】【課題】  硫酸化単糖の位置異性体やジアステレオマーを容易に同時に同定が可能な硫酸化単糖の同定方法及び硫酸化単糖異性体混合物の異性体の同定が可能な硫酸化単糖異性体混合物の分析方法を提供する。【解決手段】  本発明の硫酸化単糖の同定方法は、（ｉ）被検硫酸化単糖を、ＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法によってイオン化させ、得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行うことにより、当該硫酸化単糖についての質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）に関する情報を得る工程、及び、（ｉｉ）  （ｉ）で得られた情報と、標準硫酸化単糖についての質量分析のｎ乗スペクトルに関する情報とを比較する工程、を含有する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）  被検硫酸化単糖を、ＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法によってイオン化させ、得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行うことにより、当該硫酸化単糖についての質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）に関する情報を得る工程、及び、
（ｉｉ）  （ｉ）で得られた情報と、標準硫酸化単糖についての質量分析のｎ乗スペクトルに関する情報とを比較する工程、
を含有する、硫酸化単糖の同定方法。
【請求項２】
質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）に関する情報を、ＩＴ型分析装置又はＦＴ−ＩＣＲ型分析装置を用いて得ることを特徴とする、請求項１に記載の同定方法。
【請求項３】
質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）に関する情報が、同一スペクトル中に存在する２種類の異なるフラグメントイオンのイオン強度比に関する情報を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）  被検硫酸化単糖異性体混合物を、ＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法によってイオン化させ、得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行うことにより、当該硫酸化単糖異性体混合物についての質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）に関する情報を得る工程、及び、
（ｉｉ）  （ｉ）で得られた情報と、標準硫酸化単糖異性体混合物についての質量分析のｎ乗スペクトルに関する情報とを比較する工程、
を含有し、かつ、質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）に関する情報が、同一スペクトル中に存在する２種類の異なるフラグメントイオンのイオン強度比に関する情報を含むことを特徴とする、硫酸化単糖異性体混合物の分析方法。
【請求項５】
質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）に関する情報を、ＩＴ型分析装置又はＦＴ−ＩＣＲ型分析装置を用いて得ることを特徴とする、請求項４に記載の分析方法。
【請求項６】
硫酸化単糖が、六炭糖の３位、４位又は６位の炭素原子の少なくとも１つに硫酸基を保持しているものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
硫酸化単糖が、六炭糖の２位の炭素原子にＮ−アセチル基を保持しているものであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硫酸化単糖の同定方法及び硫酸化単糖異性体混合物の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願の出願書類においては、以下の略号を使用する。
エレクトロスプレーイオン化法：ＥＳＩ法
マトリックス支援レーザー脱離イオン化法：ＭＡＬＤＩ法
イオントラップ型：ＩＴ型
フーリエ変換−イオンサイクロトロン共鳴型：ＦＴ−ＩＣＲ型
グルコース３−硫酸：Ｇｌｃ３Ｓ
グルコース６−硫酸：Ｇｌｃ６Ｓ
ガラクトース４−硫酸：Ｇａｌ４Ｓ
ガラクトース６−硫酸：Ｇａｌ６Ｓ
マンノース６−硫酸：Ｍａｎ６Ｓ
Ｎ−アセチルグルコサミン３−硫酸：ＧｌｃＮＡｃ３Ｓ
Ｎ−アセチルグルコサミン６−硫酸：ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ
Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸：ＧａｌＮＡｃ４Ｓ
Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸：ＧａｌＮＡｃ６Ｓ
Ｎ−アセチルグルコサミン３，６−二硫酸：ＧｌｃＮＡｃ３，６ｄｉＳ
【０００３】
単糖の構造解析は、従来、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）に依存するところが大きかったが、最近の質量分析（ＭＳ）装置の発展により、これを用いた糖の構造決定の研究が活発化している。例えば、グリコシド結合様式を決定するＭＳスペクトルの法則性の検索研究が注目を浴びている（非特許文献１参照）。しかしながら、硫酸化糖について、位置異性体とジアステレオマーとを同時に同定する方法は知られていない（非特許文献２参照）。
【非特許文献１】Analytical Chemistry, Joseph Zaia et al., Vol. 73, pp. 6030-3039, No. 24, December 15 (2001)
【非特許文献２】Analytical Chemistry, Joseph Zaia et al., Vol. 75, pp. 2445-2455, No. 10, May 15 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
硫酸化糖の位置異性体とジアステレオマーとを容易に同時に同定することができれば、硫酸化糖試料の化学構造に関するより多くの情報を得ることができ、また、硫酸化糖異性体混合物中に存在する異性体の同定や定量等も可能となる。
本発明の目的は、硫酸化単糖の位置異性体とジアステレオマーを容易に同時に同定できる硫酸化単糖の同定方法を提供することである。
また、本発明の別の目的は、硫酸化単糖異性体混合物における異性体の同定や定量が可能な硫酸化単糖異性体混合物の分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、硫酸化単糖をＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法によりイオン化させ、そのイオンの開裂（フラグメンテーション）を１回以上行うことによって得られるＭＳのｎ乗スペクトルに法則性があることを発見し、これに基づいて被検硫酸化単糖と標準硫酸化単糖のデータを比較することで被検硫酸化単糖を同定できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（７）に関する。
（１）  （ｉ）  被検硫酸化単糖を、ＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法によってイオン化させ、得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行うことにより、当該硫酸化単糖についての質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）に関する情報を得る工程、及び、
（ｉｉ）  （ｉ）で得られた情報と、標準硫酸化単糖についての質量分析のｎ乗スペクトルに関する情報とを比較する工程、
を含有する、硫酸化単糖の同定方法。
（２）  質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）に関する情報を、ＩＴ型分析装置又はＦＴ−ＩＣＲ型分析装置を用いて得ることを特徴とする、（１）に記載の同定方法。
（３）  質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）に関する情報が、同一スペクトル中に存在する２種類の異なるフラグメントイオンのイオン強度比に関する情報を含むことを特徴とする、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）  （ｉ）  被検硫酸化単糖異性体混合物を、ＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法によってイオン化させ、得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行うことにより、当該硫酸化単糖異性体混合物についての質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）に関する情報を得る工程、及び、
（ｉｉ）  （ｉ）で得られた情報と、標準硫酸化単糖異性体混合物についての質量分析のｎ乗スペクトルに関する情報とを比較する工程、
を含有し、かつ、質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）に関する情報が、同一スペクトル中に存在する２種類の異なるフラグメントイオンのイオン強度比に関する情報を含むことを特徴とする、硫酸化単糖異性体混合物の分析方法。
（５）  質量分析のｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）に関する情報を、ＩＴ型分析装置又はＦＴ−ＩＣＲ型分析装置を用いて得ることを特徴とする、（４）に記載の分析方法。
（６）  硫酸化単糖が、六炭糖の３位、４位又は６位の炭素原子の少なくとも１つに硫酸基を保持しているものであることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれか１つに記載の方法。
（７）  硫酸化単糖が、六単糖の２位の炭素原子にＮ−アセチル基を保持しているものであることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、硫酸化単糖についてのＭＳのｎ乗スペクトル解析における法則性が導かれ、硫酸化単糖試料の位置異性及びジアステレオマーを同時に同定することができる。また、硫酸化単糖混合物試料中に存在する異性体の同定や定量が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において「硫酸化単糖」とは、硫酸基を保持する単糖を意味する。
本発明における「硫酸化単糖」の骨格となる単糖としては、三炭糖（トリオース）、四炭糖（テトロース）、五炭糖（ペントース）、六炭糖（ヘキソース）等が挙げられ、これらは環状構造を有していてもよいし、開裂構造を有していてもよい。また、これら糖はＤ型でも、Ｌ型でもよい。具体的には、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース等が挙げられる。
硫酸化単糖中に存在する硫酸基は、当該硫酸化単糖の骨格となる単糖中の任意のＯＨ基に置換していればよく、単独でも、２以上の複数個存在していてもよい。例えば、本発明の方法によって分析可能な硫酸化単糖の一例として、３位、４位又は６位の炭素原子の少なくとも１つに硫酸基を有する六炭糖等が挙げられる。
【０００８】
硫酸化単糖は、Ｎ−アセチル基等の置換基でさらに置換されていてもよい。置換基は、ＭＳで分析可能な置換であれば特に限定されない。また、置換基は、単独でも、２以上の複数個存在していてもよい。例えば、本発明の方法によって分析可能な硫酸化単糖の一例として、２位の炭素原子にＮ−アセチル基を有する六炭糖等が挙げられる。
【０００９】
本発明に係る硫酸化単糖の同定方法では、まず、同定の対象となる硫酸化単糖（被検硫酸化単糖）をＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法によりイオン化させる。イオン化させる方法は、ＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法のいずれであってもよいが、ＥＳＩ法が好ましい。
ＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法によって被検硫酸化単糖をイオン化することにより、被検硫酸化単糖の分子量に起因する１種類又は２種類以上のイオン（以下、分子量関連イオンと呼ぶ。）が生成する。生成した分子量関連イオンを検出することにより、当該被検硫酸化単糖の分子量を確定することができる。分子量関連イオンの検出は、任意の質量分析装置を用いて行うことができるが、ＩＴ型分析装置又はＦＴ−ＩＣＲ型分析装置を用いることが好ましく、ＩＴ型分析装置を用いることが好ましい。このような質量分析装置を用いて分子量関連イオンを検出することにより、ＭＳの１乗スペクトルが得られる。
本発明では、イオン化法としてＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法を採用し、分析装置として任意の質量分析装置を採用することができるが、装置が小型で軽量且つ操作が簡便である等の点から、ＥＳＩ法によりイオン化し、ＩＴ型分析装置によって検出を行う方法（以下、ＥＳＩ−ＩＴ−ＭＳ法という。）が好ましい。ＥＳＩ−ＩＴ−ＭＳ法は、例えばＥｓｑｕｉｒｅ  ３０００  ｐｌｕｓ（ブルカー社製）等の一般的な市販の装置を使用して行うことができる。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法を用いる場合にも、各社市販の装置を使用できる。
【００１０】
前記のようにして得られたＭＳの１乗スペクトルにおける分子量関連イオンを前駆イオンとしてフラグメンテーションを行い、フラグメントイオンを生成させて検出する（これによって、「ＭＳの２乗スペクトル」が得られる）。さらに必要に応じてＭＳの２乗スペクトルにおけるフラグメントイオンについてフラグメンテーションを行いＭＳの３乗スペクトルを、以下同様にＭＳの４乗、・・・、ｎ乗スペクトルを得ることができる。ＭＳのｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数。以下同じ。）も、ＩＴ型装置もしくはＦＴ−ＩＣＲ型装置を用いることによって容易に得ることができる。
このようにして、被検硫酸化単糖についてのＭＳのｎ乗スペクトルに関する情報を得ることができる。同一ＭＳスペクトル中に複数のフラグメントイオンのシグナルが観測される場合には、通常、イオン強度が最も高いフラグメントイオンのシグナル、あるいは標準硫酸化単糖のｎ乗スペクトルのデータと比較して構造上の特徴を有すると思われるフラグメントイオンのシグナルが、同定（構造決定）の際の特に重要な情報となる。
【００１１】
また、このような「ＭＳのｎ乗スペクトルに関する情報」には、同一スペクトル中に存在する２種類の異なるフラグメントイオンのイオン強度比に関する情報を含むことが好ましい。例えば、硫酸化単糖についてのＭＳの２乗スペクトルにおいて、フラグメントイオンＸのシグナルと、フラグメントイオンＹのシグナルが存在する場合、前者のシグナルのイオン強度と後者のシグナルのイオン強度との比を算出し、これも「ＭＳのｎ乗スペクトルに関する情報」として包含させることが好ましい。これによって、被検硫酸化単糖のジアステレオマー構造も区別し同定することができる。ここで、同定可能なジアステレオマーとしては、同じ分子量、同じ硫酸基位置で、一箇所の水酸基の配向のみが異なるエピマ−等のジアステレオマーが挙げられる。例えば、本発明により、Ｇｌｃ６ＳとＭａｎ６Ｓ、Ｇｌｃ６ＳとＧａｌ６Ｓ、ＧｌｃＮＡｃ６ＳとＧａｌＮＡｃ６Ｓ等のジアステレオマー同士を判別することができる。
このようにして得られる被検硫酸化単糖についてのＭＳのｎ乗スペクトルに関する情報と、既知の標準硫酸化単糖について同様に得られるＭＳのｎ乗スペクトルに関する情報とを比較することにより、被検硫酸化単糖の硫酸基の存在位置やその構造を決定し、硫酸化単糖を同定することができる。
【００１２】
また、このような硫酸化単糖の同定方法を応用することにより、硫酸化単糖の複数の異性体の混合物（硫酸化単糖異性体混合物）を分析することもできる。例えば、分析の対象となる硫酸化単糖異性体混合物（被検硫酸化単糖異性体混合物）と、硫酸化単糖の複数の異性体を種々の濃度比で混合した標準硫酸化単糖異性体混合物についてそれぞれＭＳのｎ乗スペクトルに関する情報（同一スペクトル中に存在する２種類の異なるフラグメントイオンのイオン強度比に関する情報を含む）を得て、両者を比較することによって、被検硫酸化単糖異性体混合物中に存在する異性体の種類や存在比を分析することができる。ここで判別可能な異性体としては、硫酸基の存在位置が異なる位置異性体、水酸基の配向のみが異なるジアステレオマー等が挙げられる。具体的には、ＧｌｃＮＡｃ３ＳとＧｌｃＮＡｃ６Ｓとの混合物中における両者の存在比、ＧａｌＮＡｃ４ＳとＧａｌＮＡｃ６Ｓとの混合物中における両者の存在比、ＧｌｃＮＡｃ６ＳとＧａｌＮＡｃ６Ｓとの混合物中における両者の存在比などを分析することが可能である。
一例として、下記構造式（Ｉ）で表される硫酸化単糖の同定方法について説明する。下記構造式（Ｉ）の硫酸化単糖は、ＭＳの２乗及び３乗スペクトルにおいて、以下の0,2Ａ、2,4Ａ、0,4Ａの三つのフラグメントに分割され得る。
【００１３】
【化１】
2006047239.tif 000002
【００１４】
Ｇｌｃ３Ｓ、Ｇａｌ４Ｓ、Ｇａｌ６Ｓ、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ、ＧａｌＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＡｃ３Ｓ、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ及びＧｌｃＮＡｃ３，６ｄｉＳに関しては、ＭＳの１乗スペクトル（ＭＳ1）、ＭＳの２乗スペクトル（ＭＳ2）、ＭＳの３乗スペクトル（ＭＳ3）において、表１に示される質量数／電荷数（ｍ／ｚ）の位置に、分子量関連イオンあるいはフラグメントイオンのシグナルが現れる。なお表１中には示していないが、Ｇｌｃ６Ｓ及びＭａｎ６Ｓについては、いずれも表１におけるＧａｌ６Ｓと同じシグナルが現れる。  表１中の［Ｍ−ｎＨ］n-、［Ｍ−Ｈ2Ｏ−Ｈ］-及び［Ｍ−ＯＳＯ3Ｈ−Ｈ2Ｏ−Ｈ］-中の「Ｍ」は、それぞれの糖の基本骨格を示す。また、ｎは各イオンの価数を示す。
【００１５】
【表１】
2006047239.tif 000003
【００１６】
表１において、ＭＳ2スペクトルは、ＭＳ1スペクトルにおける［Ｍ−ｎＨ］n-フラグメントイオンをフラグメンテーションすることによって得られたものである。また、ＭＳ3スペクトルは、ＭＳ2スペクトルにおけるフラグメントイオンのなかで最もイオン強度が高いもの（0,2Ａフラグメント；１９８．８（ｍ／ｚ）の位置にシグナルが現れる）についてフラグメンテーションを行うことによって得られたものである。このような情報により、少なくとも以下の法則性が得られ、この法則性を利用することにより、被検硫酸化単糖の構造を決定することができる。
１）  ６位の炭素原子に硫酸基を保持する硫酸化単糖に限って、ＭＳ3スペクトルにおいて0,4Ａフラグメントが観測される。
２）  ４位の炭素原子に硫酸基を保持する硫酸化単糖に限って、ＭＳ3スペクトルにおいて2,4Ａフラグメントが観測される。
３）  ３位の炭素原子に硫酸基を保持する硫酸化単糖は、ＭＳ2スペクトルにおいて硫酸基（ＯＳＯ3Ｈ-）が顕著に脱離する。
４）  ３位の炭素原子に硫酸基を保持する硫酸化単糖以外については、すべて、ＭＳ2スペクトルにおいて0,2Ａフラグメントが観測される。
【００１７】
また、硫酸化単糖がＮ−アセチル化されている場合には、Ｎ−アセチル化されていない場合に比べて、ＭＳ1スペクトルにおける［Ｍ−ｎＨ］n-イオンのｍ／ｚ値が増加することを指標として同定することができる（表１参照）。
一方、Ｇａｌ６Ｓ、Ｇｌｃ６Ｓ及びＭａｎ６Ｓのデータ並びにＧａｌＮＡｃ６Ｓ及びＧｌｃＮＡｃ６Ｓのデータは、いずれも表１に示した範囲内では同一ではあるが、これらの硫酸化単糖のＭＳ3スペクトルにおける0,2Ａフラグメントイオンの強度に対するＯＳＯ3Ｈ-フラグメントイオンの強度の比の値はいずれも異なることから、このイオン強度比を算出することによって、いずれのジアステレオマーかを同定することができる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明する。
（実施例１）
硫酸化単糖として、Ｇｌｃ３Ｓ、Ｇｌｃ６Ｓ、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ及びＧｌｃＮＡｃ６Ｓ（以上はシグマ社より購入）並びにＧａｌ４Ｓ、Ｇａｌ６Ｓ、ＧａｌＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＡｃ３Ｓ及びＭａｎ６Ｓ（いずれもフナコシ社より購入）を用いた。
ＭＳスペクトルは、Ｅｓｑｕｉｒｅ  ３０００  ｐｌｕｓ（ブルカー社製）を用い、ネガティヴ・イオン・モードで測定した。被検硫酸化単糖を、酢酸の終濃度が１ｍＭかつメタノール含量が５０％の溶媒に、１０ｐｍｏｌ／μＬの濃度になるように溶解し、マイクロシリンジを用いて３６０μＬ／時間の速度で装置に注入した。その際のキャピラリー電圧は−３．８ｋＶであり、キャピラリー温度は３００(Ｃに設定した。
ＭＳ2スペクトルは、ＭＳ1スペクトルにおいて観測された分子量関連イオンを、１．００Ｖのフラグメント・エネルギーでフラグメンテーションすることによって生じたフラグメントイオンを観測することによって得た。同様にＭＳ3スペクトルは、ＭＳ2スペクトルで観測された最も強度の高いフラグメントイオンを選択し、これを同様にフラグメンテーションすることによって生じたフラグメントイオンを観測することによって得た。
【００１９】
結果を、図１及び図２に示す。図１及び図２より、Ｇｌｃ３Ｓ（図１（Ａ））及びＧｌｃＮＡｃ３Ｓ（図２（Ａ））では、ＭＳ2スペクトルにおいて顕著な硫酸基脱離が観察された。Ｇｌｃ３Ｓ及びＧｌｃＮＡｃ３Ｓ以外については、ＭＳ2スペクトルにおいて0,2Ａフラグメントの生成が観察され、Ｇａｌ４Ｓ（図１（Ｂ））及びＧａｌＮＡｃ４Ｓ（図２（Ｂ））においては、ＭＳ3スペクトルにおいて2,4Ａフラグメントが観測された。Ｇａｌ６Ｓ（図１（Ｃ））及びＧａｌＮＡｃ６Ｓ（図２（Ｃ））においては、ＭＳ3スペクトルにおいて0,4Ａフラグメントの生成が観察された。
また、図１（Ａ）〜（Ｃ）と図２（Ａ）〜（Ｃ）とをそれぞれ比較したところ、ＧｌｃＮＡｃ３Ｓ、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ及びＧａｌＮＡｃ６ＳはそれぞれＮ−アセチル化されていることから、その分、ＭＳ1スペクトルにおける分子量関連イオンのｍ／ｚ値がＧｌｃ３Ｓ、Ｇａｌ４Ｓ及びＧａｌ６Ｓに比して高値にシフトしていた。
以上のように、Ｇｌｃ３Ｓ、Ｇａｌ４Ｓ、Ｇａｌ６Ｓ、ＧｌｃＮＡｃ３Ｓ、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ及びＧａｌＮＡｃ６Ｓは、ＭＳのｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）が全て異なっていた。従って、被検硫酸化単糖のＭＳのｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）を、上記硫酸化単糖のＭＳのｎ乗スペクトル（ｎは２以上の整数）と比較することにより、被検硫酸化単糖の構造を同定できることが明らかとなった。
【００２０】
（実施例２）
実施例１で得られたＧａｌ６Ｓの0,2ＡフラグメントのＭＳ3スペクトルのイオン（0.4Ａフラグメント）強度に対するＯＳＯ3Ｈ-フラグメントのイオン強度比を算出した。また、Ｇａｌ６Ｓとジアステレオマーの関係にあるＧｌｃ６ＳとＭａｎ６Ｓについても同様にイオン強度比を算出した。
さらに、実施例１で得られたＧａｌＮＡｃ６Ｓの0,2ＡフラグメントのＭＳ3スペクトルのイオン（0.4Ａフラグメント）強度に対するＯＳＯ3Ｈ-フラグメントのイオン強度比を算出した。また、ＧａｌＮＡｃ６Ｓとジアステレオマーの関係にあるＧｌｃＮＡｃ６Ｓについても同様にイオン強度比を算出した。
結果をそれぞれ図３及び図４に示す。なお、実験は５回行い、平均値±標準偏差をバーで示した。
図３及び図４から、ジアステレオマーの種類に応じて、前記のイオン強度比が異なることが示された。従って、同一スペクトル中に存在する２種類の異なるフラグメントイオンのイオン強度比を調べることにより、被検硫酸化単糖のジアステレオマー構造を同定できることが明らかとなった。
【００２１】
（実施例３）
ＧｌｃＮＡｃ３ＳとＧｌｃＮＡｃ６Ｓとの混合物を種々の濃度比で作製して、この混合物のＭＳのｎ乗スペクトルを測定した。なお、混合物中のＧｌｃＮＡｃ３Ｓ及びＧｌｃＮＡｃ６Ｓの全濃度は１０ｐｍｏｌ／μＬとした。
この混合物のＭＳ2スペクトルにおいて、ＯＳＯ3Ｈ-に対応する約９７（ｍ／ｚ）のフラグメントイオンをＧｌｃＮＡｃ３Ｓの指標として、［Ｍ−Ｈ2Ｏ−Ｈ］-に対応する約２８２（ｍ／ｚ）のフラグメントイオンをＧｌｃＮＡｃ６Ｓの指標として選択した。［Ｍ−Ｈ2Ｏ−Ｈ］-のイオン強度に対するＯＳＯ3Ｈ-イオンの強度比と、混合物中のＧｌｃＮＡｃ６Ｓのモル比との相関関係を図５に示す。なお、実験は３回行い、平均値±標準偏差をバーで示した。
その結果、図５に示される通り、前記のイオン強度比は混合物中の異性体（ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ）の濃度に対して二次関数的に高い相関を示し、その相関係数はｒ2＝０．９９９であった。従って、図５に示される相関関係を用いることにより、ＧｌｃＮＡｃ３ＳとＧｌｃＮＡｃ６Ｓとの混合試料中におけるそれぞれの異性体の濃度比（存在比）を分析できることが明らかとなった。
【００２２】
（実施例４）
実施例３と同様に、ＧａｌＮＡｃ４ＳとＧａｌＮＡｃ６Ｓの混合物中の濃度比とＭＳスペクトルのイオン強度比との関係を調べた。両者のスペクトルの差は、図２のＭＳ2スペクトルにおける約２８２（ｍ／ｚ）のＧａｌＮＡｃ６Ｓ由来のフラグメントイオン［Ｍ−Ｈ2Ｏ−Ｈ］-に現れる。
ＧａｌＮＡｃ４ＳとＧａｌＮＡｃ６Ｓに共通して現れるＭＳ2スペクトルにおける約１９９（ｍ／ｚ）の0,2Ａフラグメントのイオン強度に対する［Ｍ−Ｈ2Ｏ−Ｈ］-フラグメントのイオン強度比と、混合物中のＧａｌＮＡｃ６Ｓのモル比との相関関係を図６に示す。両者の間には高い二次相関が観察され、その相関係数はｒ2＝０．９９７であった。
従って、図６に示される相関関係を用いることにより、ＧａｌＮＡｃ４ＳとＧａｌＮＡｃ６Ｓとの混合試料中におけるそれぞれの異性体の濃度比（存在比）を分析することができることが明らかとなった。
【００２３】
（実施例５）
実施例３と同様に、ＧｌｃＮＡｃ６ＳとＧａｌＮＡｃ６Ｓの混合物中の濃度比とＭＳスペクトルの強度比との関係を調べた。実施例２の図４で示されたように、両者のスペクトルの差は、ＭＳ3スペクトルの0,4Ａフラグメントのイオン強度に対するＯＳＯ3Ｈ-フラグメントのイオン強度比にのみ現れる。
そこで、ＧｌｃＮＡｃ６ＳとＧａｌＮＡｃ６Ｓの混合物を種々の混合比で作製し、ＭＳ3スペクトルを測定して、この混合物のＭＳ3スペクトルにおける0,4Ａフラグメントに対するＯＳＯ3Ｈ-フラグメントのイオン強度比を算出した。その結果を図７に示す。その結果、混合物中のＧａｌＮＡｃ６Ｓの割合が増加するにつれて前記強度比が増加する高い一次相関が観察され、その相関係数はｒ2＝０．９９２であった。
従って、図７に示される相関関係を用いることにより、ＧｌｃＮＡｃ６ＳとＧａｌＮＡｃ６Ｓの混合試料中のそれぞれの異性体の濃度比（存在比）を同定することができることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】（Ａ）Ｇｌｃ３Ｓ、（Ｂ）Ｇａｌ４Ｓ及び（Ｃ）Ｇａｌ６ＳについてのＭＳ1、ＭＳ2及びＭＳ3スペクトルを示した図である。
【図２】（Ａ）ＧｌｃＮＡｃ３Ｓ、（Ｂ）ＧａｌＮＡｃ４Ｓ及び（Ｃ）ＧａｌＮＡｃ６ＳについてのＭＳ1、ＭＳ2及びＭＳ3スペクトルを示した図である。
【図３】Ｇｌｃ６Ｓ、Ｍａｎ６Ｓ及びＧａｌ６ＳのそれぞれのＭＳ3スペクトルにおける0,4Ａフラグメントのイオン強度に対するＯＳＯ3Ｈ-フラグメントのイオン強度比を示した図である。
【図４】ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ及びＧａｌＮＡｃ６ＳのＭＳ3スペクトルにおける0,4Ａフラグメントのイオン強度に対するＯＳＯ3Ｈ-フラグメントのイオン強度比を示した図である。
【図５】ＧｌｃＮＡｃ３ＳとＧｌｃＮＡｃ６Ｓとの混合物中のＧｌｃＮＡｃ６Ｓのモル比と、ＭＳ2スペクトルにおける［Ｍ−Ｈ2Ｏ−Ｈ］-のイオン強度に対するＯＳＯ3Ｈ-イオンの強度比との関係を示した図である。
【図６】ＧａｌＮＡｃ４ＳとＧａｌＮＡｃ６Ｓとの混合物中のＧａｌＮＡｃ６Ｓのモル比と、ＭＳ2スペクトルにおける0,2Ａフラグメントのイオン強度に対する［Ｍ−Ｈ2Ｏ−Ｈ］-フラグメントのイオン強度比との関係を示した図である。
【図７】ＧｌｃＮＡｃ６ＳとＧａｌＮＡｃ６Ｓとの混合物中のＧａｌＮＡｃ６Ｓのモル比と、ＭＳ3スペクトルにおける0,4Ａフラグメントのイオン強度に対するＯＳＯ3Ｈ-フラグメントのイオン強度比との関係を示した図である。
【図１】
2006047239.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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