(57)【要約】【課題】  食品（加工食品を含む）、特に加熱及び／又は加圧処理された食品中から抽出された蛋白質含有液を、蛋白質の抗原抗体反応性を消失させることなく保存する方法及びその方法に使用される希釈液を提供する。【解決手段】  本発明は、食品から、イオン性界面活性剤と還元剤からなる液を用いて抽出した蛋白質含有液を、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非界面活性剤型スルホベタインから選ばれた少なくとも一種を含む希釈液で希釈することからなる蛋白質含有液の保存方法及びそれに使用される希釈液である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
食品から、イオン性界面活性剤と還元剤からなる液を用いて抽出した蛋白質含有液、又は
標準蛋白質をイオン性界面活性剤と還元剤からなる液で溶解した蛋白質含有標準溶液を、
非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非界面活性剤型スルホベタインから選ばれた少なくとも一種を含む希釈液で希釈することからなる蛋白質含有液の保存方法。
【請求項２】
食品が、加熱及び／又は加圧処理された食品である請求項１記載の方法。
【請求項３】
非イオン性界面活性剤が、BigCHAP, DeoxyBigCHAP, Brij35, Brij58P, Cymal-1, Cymal-2, Cymal-5, Cymal-6, Decyl-β-D-maltopyranoside, n-Dodecyl-β-D-maltoside, n-Hexadecyl-β-D-maltoside, Undecyl-β-D-maltoside, Decyl-β-D-1-thiomaltopyranoside, Octyl-β-D-glucopyranoside, Decyl-β-D-1-thioglucopyranoside, Octyl-β-D-thioglucopyranoside, Digitonin, Dimethyldecylphosphine oxide(APO-10), Dodecyldimethylphosphine oxide (APO-12), IGEPAL CA-630, N-Octanoyl-N-methylglucamine (MEGA-8), N-Nonanoyl-N-methylglucamine (MEGA-9), N-Decanoyl-N-methylglucamine (MEGA-10), Nonidet P40-substitute, Pluronic F-68, Saponin, Thesit, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN 20, TWEEN 40, TWEEN 80からなる群から選択される少なくとも一種である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
両性界面活性剤が、ASB-14(amidosulfobetaine-14), ASB-16 (amidosulfobetaine-16), C7BzO, CHAPS, CHAPSO, EMPIGEN BB, 3-(N,N-Dimethyloctylammonio)propanesulfonate inner salt (SB3-8), 3-(Decyldimethylammonio)propanesulfonate inner salt (SB3-10), 3-(Dodecyldimethylammonio)propanesulfonate inner salt (SB3-12), 3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate inner salt (SB3-14), 3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate inner salt (SB3-16), 3-(N,N-Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate inner salt (SB3-18)からなる群から選択される少なくとも一種である請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
非界面活性剤型スルホベタインが、3-(1-Pyridinio)-1-propanesulfonate (NDSB 201), 3-(Benzyldimethylammonio)-propanesulfonate (NDSB 256)から選択される少なくとも一種である請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法に使用される、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非界面活性剤型スルホベタインから選ばれた少なくとも一種を含む、蛋白質含有液の希釈液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛋白質含有液の保存方法及びそれに使用される希釈液に関する。より詳細には、加熱及び／又は加圧処理された食品（加工食品を含む）中から抽出された蛋白質含有液を、蛋白質の抗原抗体反応性を消失させることなく保存する方法及びその方法に使用される希釈液に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食物アレルギーの方は増加する傾向にあり、平成9〜11年度旧厚生省食物アレルギー対策検討委員会の調査では、幼児から成人の約6〜9％が食物アレルギーを有し、卵、牛乳、小麦、そば、落花生などによる即時型アレルギーが多く、とりわけ、そばと落花生では、血圧低下、呼吸困難、意識消失などの生死に関わる事故を起こすことが報告されている。
そこで、食物アレルギー患者の適切な食品選択を助けることを目的に、食物アレルギーの原因食品（食品衛生法では特定原材料と呼ばれている）を僅かでも含む加工食品について、平成１４年４月以降、その旨を表示することが食品衛生法により義務付けられた。省令により表示が義務付けられた特定原材料は、食物アレルギーを起こす頻度と重篤度から「卵、乳、小麦、そば、落花生」の５品目が定められている。その後、平成１４年１１月６日付けで「アレルギー物質を含む食品の検査方法について（食発第1106001号）」が厚生労働省医薬局食品保健部長通知として公表された。本通知法の中で、スクリーニング法として２種類の免疫学的測定法（エライザ法）が採用された。エライザ法は比較的簡便な操作で短時間に結果が得られる事から、様々な検査方法に応用され近年広く普及している。
しかしながら、上記の通知法では、加熱及び／又は加圧処理が施された食品（例えば缶詰、レトルトパウチ食品、焼き菓子等）からの抽出効率が極めて低く、引き続き実施するエライザ法にて検体中の蛋白質濃度を正確に測定できないことが指摘されていた。
【０００３】
一方、以前より、(1)アルキル硫酸塩（SDSなどの陰イオン性界面活性剤）、(2)尿素（変性剤）、(3)2-メルカプトエタノール（2-ME；還元剤）を共存させた抽出液により、加熱及び／又は加圧処理後の食品から蛋白質の抗原性又はアレルゲン性の分析が可能な程度に、蛋白質を変性させることなく抽出する方法が提案されていた（特許文献１）。本抽出液は免疫学的活性が高く維持されており、インビトロでの各種免疫学的測定法の試料として、そのまま（アルキル硫酸塩を除去することなく）使用できるとされた。しかし、本法では、
(1)SDS：0.09〜1.5％、好適には0.125〜0.5％；
(2)尿素：２M以上、好適には4〜8M；
(3)2-ME：0.07〜3.13％、好適には0.098〜0.78％；
であることが必要であり、上記(1)〜(3)のいずれか一つの化合物が欠けたり、指定濃度範囲を外れると、蛋白質が十分に抽出できない、又は抗原性・アレルゲン性の分析ができないとされており、制約が多い。
更に、上記文献記載の方法に基づいて食品中の蛋白質（卵、牛乳、小麦、そば、落花生の蛋白質）を抽出し、当該抽出液を保存した後、常法に準じて免疫学的測定法を実施すると、食品検体溶液中の蛋白質濃度を正確に測定できず、抗原抗体反応性を維持し得ないことが判明した。また、本法により得られた標準溶液（即ち、既知量の蛋白質を含む溶液）についても、保存安定性が悪く、その抗原抗体反応性を長期間維持することはできなかった。
【特許文献１】特開2000-65820公報
【０００４】
また、試料中に含まれる水溶性/難抽出性蛋白質又はオボムコイド等の所定の蛋白質をイオン性界面活性剤（陽イオン性界面活性剤又は陰イオン性界面活性剤）により抽出／可溶化し、その存在を検出するための免疫学的測定法が提案された。イオン性界面活性剤の濃度は0.1％〜10％（特許文献２）、又は0.3％以上、好適には１％以上とされ（特許文献３）、良好な抗原抗体反応に最適と考えられていた0.03％以下に希釈する必要はなく、またHydrophile-Lipophile Balance（HLB価）調整のために非イオン性界面活性剤を含有しても良いとされた。しかし、本法では、食品衛生法で指定されるオボアルブミンには効果がなかった。そして、これらの抽出液により抽出された蛋白質溶液は、エライザ法による免疫学的測定法において、標準溶液の場合には抗原抗体反応性を維持できても数日であり、食品検体溶液の場合には反応性を全く維持できなかった。
【特許文献２】特開2004-239885公報
【特許文献３】特許第３６００２３１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、従来の方法では、食品から抽出した蛋白質含有液又は所定量の蛋白質を含有する標準溶液を長期間保存することができないという問題があった。本発明は係る問題を解消するものであり、上記の蛋白質含有液を特定の種類の界面活性剤を含む希釈液で希釈することにより、蛋白質の抗原抗体反応性を維持したまま保存し得ることを見出したもので、本発明は係る保存方法及びそれに使用される希釈液を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題を解決するためになされた手段は、食品から、イオン性界面活性剤と還元剤からなる液を用いて抽出した蛋白質含有液、又は標準蛋白質をイオン性界面活性剤と還元剤からなる液で溶解した蛋白質含有標準溶液を、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非界面活性剤型スルホベタインから選ばれた少なくとも一種を含む希釈液で希釈することからなる蛋白質含有液の保存方法であり、また係る方法に使用される、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非界面活性剤型スルホベタインから選ばれた少なくとも一種を含む、蛋白質含有液の希釈液である。
本発明の方法は、食品として、加熱及び／又は加圧処理された食品である場合に好適に使用される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法によれば、蛋白質含有液を、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非界面活性剤型スルホベタインから選ばれた少なくとも一種を含む希釈液で希釈することにより、抽出蛋白質間の凝集が抑制され、保存中の変性が防止できるので、引き続き実施する免疫学的測定法での抗原抗体反応性を維持できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明者らは、食品、特に加熱及び／又は加圧処理された食品からの蛋白質の抽出及び抽出液中の蛋白質の免疫学的測定を研究してきたが、従来から使用されている変性剤（尿素等）は蛋白質の抗原抗体反応性に影響を及ぼすおそれがあることから、変性剤を含まない抽出液を使用することを検討した。即ち、イオン性界面活性剤及び還元剤を含む抽出液により、食品中の蛋白質を可溶化させた蛋白質溶液（抽出原液）を調製できることが分かった。しかし、この蛋白質溶液（食品検体溶液）は抗原抗体反応性を長期間維持し得なかった。また、標準曲線を作成するための標準溶液についても、蛋白質を上記の抽出液に溶解した場合にも抗原抗体反応性を長期間維持することができなかった。
この問題を解決するために、本発明者らは種々検討したところ、上記の蛋白質含有液に、さらに、緩和な界面活性剤（非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び／又は非界面活性剤型スルホベタイン）を含有する希釈液により、抽出原液を希釈することにより、引き続き実施する免疫学的測定法において抗原抗体反応性を維持する蛋白質溶液（標準溶液希釈液又は食品検体溶液）が得られることを見出して、この問題を解決した。蛋白質が変性・可溶化する抽出液組成に、さらに緩和な界面活性剤を添加することにより、抽出蛋白質間の凝集を防ぎ、引き続き実施する免疫学的測定法での抗原抗体反応性を維持できるものと考えられる。
【０００９】
上記のように、本発明では、食品からの蛋白質抽出液、又は標準溶液を調製するための溶液として、イオン性界面活性剤及び還元剤を含む溶液が使用される。
上記のイオン性界面活性剤は陰イオン性界面活性剤及び陽イオン性界面活性剤が包含される。陰イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキル硫酸塩（例えばドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸カリウム、オクチル硫酸ナトリウム等）、アルキルベンゼンスルホン酸塩（例えばドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等）、アルキルスルホン酸塩（例えば、ドデシルスルホン酸ナトリウム等）が挙げられ、特にドデシル硫酸ナトリウムを使用するのが好ましい。
陽イオン性界面活性剤としては、例えば、第四アンモニウム塩（例えば、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ドデシルピリジニウム等）などが挙げられる。
係るイオン性界面活性剤は２種以上を併用してもよい。
上記のイオン性界面活性剤は、蛋白質の変性を考慮して、低濃度で使用するのが好ましく、１％(w/v%、以下同様)以下、より好ましくは０．５％程度の濃度で使用される。
【００１０】
還元剤としては、この分野で慣用されているものであれば何れも使用でき、例えば２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、ジチオスレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンなどが挙げられる。係る還元剤の濃度としては、１〜５％、好ましくは２％程度の濃度に調整される。
【００１１】
上記のイオン性界面活性剤及び還元剤とからなる抽出液を用いて、食品からの蛋白質の抽出は常法に準じて行うことができ、例えば、当該抽出液を粉砕した食品に加え、振とう機などを使用して振とうし、次いで遠心分離などの手段を用いて分離することにより、蛋白質含有抽出液（食品検体溶液）が調製される。
また、標準溶液を調製するには、既知量の蛋白質を上記の抽出液に溶解して調製することができる。
【００１２】
本発明においては、上記で調製された食品検体溶液（蛋白質含有抽出液）又は標準溶液を、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非界面活性剤型スルホベタインから選ばれた少なくとも一種を含む希釈液で希釈する。係る希釈により、食品検体溶液又は標準溶液中の蛋白質の変性が防止され、抗原抗体反応性を維持することが可能となる。
【００１３】
上記の非イオン性界面活性剤としては、BigCHAP, DeoxyBigCHAP, Brij35, Brij58P, Cymal-1, Cymal-2, Cymal-5, Cymal-6, Decyl-β-D-maltopyranoside, n-Dodecyl-β-D-maltoside, n-Hexadecyl-β-D-maltoside, Undecyl-β-D-maltoside, Decyl-β-D-1-thiomaltopyranoside, Octyl-β-D-glucopyranoside, Decyl-β-D-1-thioglucopyranoside, Octyl-β-D-thioglucopyranoside, Digitonin, Dimethyldecylphosphine oxide(APO-10), Dodecyldimethylphosphine oxide (APO-12), IGEPAL CA-630, N-Octanoyl-N-methylglucamine (MEGA-8), N-Nonanoyl-N-methylglucamine (MEGA-9), N-Decanoyl-N-methylglucamine (MEGA-10), Nonidet P40-substitute, Pluronic F-68, Saponin, Thesit, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN 20, TWEEN 40, TWEEN 80などが例示され、係る非イオン性は２種以上を併用してもよい。
【００１４】
両性界面活性剤としては、例えば、ASB-14(amidosulfobetaine-14), ASB-16 (amidosulfobetaine-16), C7BzO, CHAPS, CHAPSO, EMPIGEN BB, 3-(N,N-Dimethyloctylammonio)propanesulfonate inner salt (SB3-8), 3-(Decyldimethylammonio)propanesulfonate inner salt (SB3-10), 3-(Dodecyldimethylammonio)propanesulfonate inner salt (SB3-12), 3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate inner salt (SB3-14), 3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate inner salt (SB3-16), 3-(N,N-Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate inner salt (SB3-18)などが挙げられる。係る両性界面活性剤は２種以上を併用してもよい。
【００１５】
非界面活性剤型スルホベタインとしては、例えば、3-(1-Pyridinio)-1-propanesulfonate (NDSB 201), 3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate (NDSB 256)などが挙げられる。係る非界面活性剤型スルホベタインは２種以上を併用してもよい。
【００１６】
なお、上記の非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非界面活性剤型スルホベタインは併用してもよい。
上記の非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び／又は非界面活性剤型スルホベタインを含む希釈液中の非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非界面活性剤型スルホベタイン濃度は0.01〜１％程度、好ましくは0.05〜0.8％程度、より好ましくは0.1〜0.2％程度に調整される。
また、本発明の希釈液には、保護蛋白質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加してもよく、ＢＳＡの濃度としては0.01〜１％程度に調整される。更に、当該希釈液には、前記のイオン性界面活性剤及び／又は還元剤を含有させてもよい。
【００１７】
本発明の希釈液で希釈された食品検体溶液又は標準溶液は、常法に準じて免疫学的測定法（例えばエライザ法）で、当該溶液中に含まれる蛋白質の測定に供される（例えば、前掲の厚生労働省医薬局食品保健部長通知に記載の方法参照）。
本発明の希釈液で希釈された食品検体溶液は、含有する蛋白質が低濃度であるにもかかわらず引き続き実施する免疫学的測定法での抗原抗体反応性を長期間（６ヶ月以上）維持できる。同様に本希釈液により希釈された標準溶液もは抗原抗体反応性を維持し得る。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例に基づいて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は係る実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
落花生からの標準溶液の調整例と免疫学的測定法の結果
落花生を凍結乾燥した標準粉末1ｇをプラスチック製遠心管に量りとり、アセトン10mlを添加した。これを激しく振とうした後、遠心分離した（10,000g×30分間）。これを3回繰り返した後、風乾した。これに抽出液（SDS; 1％、2-ME；1％）19mlを添加した後、振とう機により12時間以上振とうし抽出操作を行った。この抽出液を10,000g×30分間遠心分離し、遠心後の上清を0.8μmマイクロフィルター処理し、抽出原液とした。次にPBS（pH7.4）により1/20倍濃度に希釈し、蛋白質定量により濃度を確定し、二次希釈液とした（濃度；SDS;0.05％、2-ME；0.05％）。
二次希釈液をさらに、希釈液（濃度；SDS; 0.05％、2-ME；0.05％、TritonX-100；0.2％）により適宜希釈し50ng/ml濃度の標準溶液を作製した。標準溶液調整当日に、標準溶液中の蛋白質含量（５０ng/ml）を免疫学的測定法により測定した。
上記の標準溶液を、４℃で３日間及び６ヶ月間保存し、同様に測定を行った。
【００２０】
実施例２
実施例１において、希釈液（濃度；TritonX-100；0.2％、2-ME；0.05％）を使用した以外は同様に保存した。
【００２１】
実施例３
実施例１において、希釈液（濃度；TritonX-100；0.2％、SDS; 0.05％）を使用した以外は同様に保存した。
【００２２】
実施例４
実施例１において、希釈液（濃度；TritonX-100；0.2％）を使用した以外は同様に保存した。
【００２３】
比較例１
実施例１において、希釈液（濃度；SDS; 0.05％、2-ME；0.05％）を使用した以外は同様に保存した。
【００２４】
比較例２
実施例１において、希釈液（濃度；SDS; 0.05％）を使用した以外は同様に保存した。
【００２５】
上記の結果を表１に示した。表１に示したように、実施例１の希釈液（濃度；SDS; 0.05％、2-ME；0.05％、TritonX-100；0.2％）を使用した場合は、この標準溶液は冷蔵で6ヶ月以上安定であり50ng/mlを維持した。また、同様に、実施例２の希釈液（濃度；TritonX-100；0.2％、2-ME；0.05％）、実施例３の希釈液（濃度；TritonX-100；0.2％、SDS；0.05％）及び実施例４の希釈液（濃度；TritonX-100；0.2％）を使用した場合も、この標準溶液は冷蔵で6ヶ月以上安定であり50ng/mlを維持した。一方、比較例１の希釈液（濃度；SDS; 0.05％、2-ME；0.05％）及び比較例２の希釈液（濃度；SDS; 0.05％）を使用した場合には、３日目にそれぞれ5ng/ml、2ng/mlに低下し、極めて低い安定性しか示さなかった。
【００２６】
2006189358.tif 000002
【００２７】
実施例５
食品（クッキー）中の牛乳蛋白質抽出と免疫学的測定法の結果
市販のクッキー（原材料にバターオイルの表示あり）1ｇをプラスチック製遠心管に量りとり、これに抽出液（SDS;1％、2-ME；1％）19mlを添加した後、振とう機により12時間以上振とうし抽出操作を行った。この抽出液を3000g×20分間遠心分離し、遠心後の上清を食品検体溶液とした。次に、希釈液（濃度；BSA；0.5％、TritonX-100；0.2％）により1/20倍濃度に希釈し測定溶液を作製し（抽出と希釈を併せ最終1/400倍濃度）、４℃で３時間保存した後、免疫学的測定法により牛乳蛋白質を測定した。
【００２８】
比較例３
実施例５において、希釈液（ＰＢＳ）を使用した以外は同様に保存した。
【００２９】
その結果を表２に示す。表２に示されるように、実施例５での測定値は19.0ｐｐｍであったが、比較例３では2.4ｐｐｍに低下していた。
【００３０】
2006189358.tif 000003