(57)【要約】  【課題】アクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとによるリラックス状態からキャッチ状態を引き起こす仕組みは、明らかになっていない部分があり、簡単に再構成することは難しかった。  【解決手段】アクチン及びモータタンパク質であるミオシンと、このミオシンとともに太いフィラメントを構成するツイッチンを脱リン酸化するセリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ｂという脱リン酸化酵素を用いて、アクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが結合していないリラックス状態から、アクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが低エネルギー消費で高い張力を保って結合するキャッチ状態へ変換するようにするとともに、プロテインキナーゼＡを用いてリン酸化し、前記キャッチ状態から前記リラックス状態へ変換し、これらキャッチ状態とリラックス状態とを可逆的に変換し得るようにした。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチンとミオシンとこのミオシンとともに太いフィラメントを構成するツイッチンとを備えた筋肉を構成するタンパク質の状態変換方法であって、
前記ツイッチンを、セリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ｂを用いて脱リン酸化し、
前記アクチンと前記ミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが結合していないリラックス状態から、
前記アクチンと、前記ミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが所定の張力を保って結合するキャッチ状態へ変換するようにしている状態変換方法。
【請求項２】
アクチンとミオシンとツイッチンとを備えた筋肉を構成するタンパク質の状態変換方法であって、
前記ツイッチンを、セリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ｂを用いて脱リン酸化し、
前記アクチンと前記ミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが結合していないリラックス状態から、
アクチンと前記ミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが所定の張力を保って結合するキャッチ状態へ変換するようにするとともに、
前記ツイッチンを、プロテインキナーゼＡを用いてリン酸化し、
前記キャッチ状態から前記リラックス状態へ変換し、
これらキャッチ状態とリラックス状態とを可逆的に変換し得るようにしているタンパク質状態変換方法。
【請求項３】
前記キャッチ状態への変換を、カルシウムイオンの濃度を１０−５Ｍ程度で行うようにしている請求項１または２記載のタンパク質状態変換方法。
【請求項４】
前記セリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ｂとして、カルシニューリンを使用している請求項１乃至３何れかに記載のタンパク質状態変換方法。
【請求項５】
カルモジュリンを、所定量添加するようにしている請求項４記載のタンパク質状態変換方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクチンとミオシンとツイッチンとを含んだ筋肉を構成するタンパク質の状態を変換させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、貝類の筋肉においては、その筋肉を構成するタンパク質であるアクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとがすべり運動して筋肉の収縮を起こすアクティブ状態、及び、アクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが結合せず筋肉が弛緩した状態となるリラックス状態以外に、アクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが低エネルギー消費で高い張力を保って結合する「キャッチ」と呼ばれる状態を形成することが知られていた。そして、本発明者らは、このようなキャッチ状態を引き起こす能力を有するいわゆる「キャッチ筋」から取り出したタンパク質フィラメントまたは、キャッチ筋から精製したタンパク質を使って、上記キャッチ状態及びリラックス状態を試験管内で再構成することに成功している（非特許文献１、２参照）。
【０００３】
一方、前記キャッチ状態とリラックス状態とは可逆的に変化し、この変化にはミオシンとともに太いフィラメントを構成するツイッチンというタンパク質の、リラックス状態の形成に関してはリン酸化が、キャッチ状態の形成に関しては脱リン酸化が、関与していることが、細胞膜を取り除いた筋肉の細胞を使った研究で明らかになっていた。
【非特許文献１】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２００１年６月５日号  ｖｏｌ．９８；ｐｐ６６３５−６６４０
【非特許文献２】遺伝２００１年９月号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、リラックス状態の再構成に関しては、ツイッチンをリン酸化する酵素がすでに特定されておりその仕組みも明らかになっていたが、リラックス状態からキャッチ状態を引き起こす仕組みは、未だ明らかになっていない部分があった。
【０００５】
そこで、本発明者らは、鋭意努力の結果、筋肉のキャッチ状態を引き起こすツイッチンの脱リン酸化酵素の特定に成功し、人為的に簡単にキャッチ状態を作り出すことを実現した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明は、アクチンとミオシンとこのミオシンとともに太いフィラメントを構成するツイッチンとを備えた筋肉を構成するタンパク質の状態変換方法であって、ツイッチンを脱リン酸化するセリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ｂという脱リン酸化酵素を用いて、前記アクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが結合していないリラックス状態から、アクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが所定の張力を保って結合するキャッチ状態へ変換するようにした状態変換方法である。ここで、「ミオシン又はミオシンを含むフィラメント」とは、フィラメントを形成しているミオシンや形成していないミオシン、ミオシンがツイッチンやその他のタンパク質を含んでフィラメントを形成している状態となっているもののことを指す。
【０００７】
また、本発明の別の態様としては、アクチンとミオシンとツイッチンとを備えた筋肉を構成するタンパク質の状態変換方法であって、前記ツイッチンを脱リン酸化するセリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ｂという脱リン酸化酵素を用いて、前記アクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが結合していないリラックス状態から、アクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが低エネルギー消費で高い張力を保って結合するキャッチ状態へ変換するようにするとともに、ツイッチンをリン酸化するプロテインキナーゼＡというリン酸化酵素を用いて、前記キャッチ状態から前記リラックス状態へ変換し、これらキャッチ状態とリラックス状態とを可逆的に変換し得るようにしているタンパク質状態変換方法が挙げられる。
【０００８】
また、前記キャッチ状態への変換は、カルシウムイオン濃度を１０−５Ｍ程度とすることが望ましい。
【０００９】
そして、セリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ｂとして、カルシニューリンを使用してもよい。例えば、手に入り易い牛由来のものを利用するようにする。この場合は、このカルシニューリンを活性化させるカルモジュリンを、所定量（例えば、カルシニューリンの濃度を０．２μMとした場合は２μM）、添加するようにする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、アクチンとミオシンとツイッチンとを使って、低エネルギー消費でアクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが高い張力を維持するキャッチ状態を人為的に簡単に作り出すことができるようになる。
【００１１】
この結果、従来より明らかであったキャッチ状態からリラックス状態への再構成と、本発明により可能になったリラックス状態からキャッチ状態への再構成とによって、リラックス状態とキャッチ状態とを簡単に自由に形成することができるようになる。
【００１２】
さらに、これらアクチンとミオシンとツイッチンとで作り出されるリラックス状態及びキャッチ状態のメカニズムを利用することにより、ナノマシン等で用いることのできる新たなデバイスの開発も可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の一実施形態を、図面を参照して説明する。
【００１４】
このタンパク質状態変換方法は、アクチンとミオシンとツイッチンとを備えた筋肉を構成するタンパク質の状態変換方法であって、タンパク質脱リン酸化酵素であるセリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ｂ（以下、ＰＰ２Ｂという）を用いてツイッチンを脱リン酸化することでアクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが結合していないリラックス状態から、アクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが高い張力を保って結合するキャッチ状態へ変換するようにするとともに、タンパク質リン酸化酵素であるプロテインキナーゼＡ（以下、ＰＫＡという）を用いてツイッチンをリン酸化することで、キャッチ状態からリラックス状態へ変換し、これらキャッチ状態とリラックス状態とを可逆的に再構成するようにしたものである。その可逆的変化のモデルを図１に示している。
【００１５】
このタンパク質の可逆的状態の様子は、図２の示している代表的な画像によって観察される。図２の上段に示した暗視野顕微鏡での観察画像、及び図２の下段に示した蛍光顕微鏡での観察画像である。なお、図２においては、暗視野顕微鏡で観察されるのが、ミオシン及びツイッチンを含んだ合成の太いフィラメントであり、蛍光顕微鏡で観察されるのが、後述するように蛍光標識したアクチンフィラメントである。
【００１６】
アクチンは、ウサギの骨格筋から精製したアクチンフィラメントを蛍光標識して使用した。より具体的には、ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｓｉｇｍａ，Ｐ−１９５１）でラベルし、２μｇ／ｍｌの濃度のものを使用した。なお、ムラサキイガイの足糸牽引筋や後閉殻筋（平滑筋）、すなわちキャッチ筋を、所定の緩衝液でホモジネートさせた懸濁液から得た細いフィラメントを使用してもよいのは勿論であるが、上記ウサギ骨格筋由来のアクチンで代用できることはすでに本発明者によって証明されている。
【００１７】
上記の通り図２においては合成の太いフィラメントを使用した場合の様子を示しているが、本実施形態においては、ミオシンは、上記ムラサキイガイのキャッチ筋から、所定の方法により精製して得られたたものを使用した。その精製法としては、例えば、筋肉の高塩濃度抽出物の４０〜６０％硫酸アンモニウム画分を、ゲルろ過するという方法が挙げられる。このゲルろ過には、本実施形態においては、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ＨＲ  １０／３０  カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を使用した。
【００１８】
ツイッチンは、ミオシンと同じ筋肉から、所定の方法により精製して得られたものを使用した。その精製法としては、例えば、筋肉の高塩濃度抽出物の３０〜４０％硫酸アンモニウム画分を、０．１５Ｍ  リン酸カリウム  １ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴを含み、ｐＨ７．５に調整した緩衝液に溶解し、イオン交換クロマトグラフィーにかけることよって得る方法が挙げられる。このイオン交換クロマトグラフィーには、本実施形態においては、Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  ５／５  カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を使用し、０．１５Ｍ  ＫＣｌで溶出した。
【００１９】
ＰＰ２Ｂは、本実施形態では、キャッチ筋から得られる可溶性タンパク質画分中に含まれるＰＰ２Ｂと、ＰＰ２Ｂに分類されるボバインカルシニューリン（牛由来カルシニューリン）とを使用した。
【００２０】
ＰＫＡは、本実施形態では、キャッチ筋から得られる可溶性タンパク質画分中に含まれるＰＫＡと、ボバインＰＫＡ（牛由来ＰＫＡ）とを使用した。
【００２１】
可溶性タンパク質画分は、以下の方法によって得たものを使用した。まず、ムラサキイガイのキャッチ筋を、所定の緩衝液でホモジネートさせて懸濁液を得た。この緩衝液は、本実施形態においては、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、２０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ−ＮａＯＨを含み、ｐＨ７．０に調整したものを使用した。そして、前記懸濁液を遠心分離し（例えば、３０万Ｇで３０分）、その上清を用いた。
【００２２】
しかして、上記のアクチン、ミオシン、ツイッチン、ＰＰ２Ｂを使って、筋肉のキャッチ状態を引き起こし、さらには、ＰＫＡを使って、筋肉のキャッチ状態及びリラックス状態を可逆的に再構築する手順を、図３〜７を参照して以下に述べる。なお、図３〜７において、左図が暗視野顕微鏡での観察画像であり、右図が蛍光顕微鏡での観察画像である。
【００２３】
まず、可溶性タンパク質画分を使用してキャッチ状態とリラックス状態を再構成した場合について説明する。本実施形態において、可溶性タンパク質画分のタンパク質濃度は、０．２ｍｇ／ｍｌとした。
【００２４】
ツイッチンを、１０−５Ｍのカルシウムイオンの存在下で可溶性タンパク質画分と混合した（以下、この処理をキャッチ処理という）。室温（２４度）で、１時間放置した後、過剰のＥＧＴＡを加えて、カルシウムイオン濃度を１０−７Ｍ以下まで下げた。
【００２５】
精製したミオシンは、再び透析することでフィラメント状としておき、そのミオシンフィラメントと、前記キャッチ処理したツイッチンとを混合し、太いフィラメントを形成させた。この太いフィラメントを、ＭｇＡＴＰ及び低濃度のカルシウムイオンの存在下で、あらかじめ蛍光標識しておいたアクチンフィラメントと混合すると、アクチンフィラメントと結合した（図３参照）。
【００２６】
これに対し、ツイッチンを、１０−５Ｍ  ｃＡＭＰ、及び１〜４ｍＭ  ＡＴＰの存在下で、可溶性タンパク質画分と混合すると（以下、この処理をリラックス処理と言う）、アクチンフィラメントは、ツイッチン及びミオシンフィラメントからなる太いフィラメントとは結合しない（図４参照）。
【００２７】
この状態で、可溶性タンパク質画分によるキャッチ処理を行うと、再びアクチンフィラメントは、太いフィラメントと結合する（図５参照）。
【００２８】
また、前記可溶性タンパク質画分の変わりに、ＰＫＡとして、ボバインＰＫＡを、ＰＰ２Ｂとして、ボバインカルシニューリンを使用した場合については、以下のような結果を得た。
【００２９】
図３に示したキャッチ状態のアクチンフィラメントと太いフィラメントとに、ボバインＰＫＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−５５１１）  ２μｇ／ｍｌを、１０−５Ｍ  ｃＡＭＰ、１−４ｍＭ  ＡＴＰの存在下で加えたところ、図６に示したように、リラックス状態を形成した。
【００３０】
このリラックス状態にある太いフィラメントに、ボバインカルシニューリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−１９０７）０．２μＭ及びカルモジュリン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−２２７７）２μＭを、１０−５Ｍのカルシウムイオンの存在下において混合した。室温（２４℃）で１０分間放置した後、過剰のＥＧＴＡを加えて、カルシウムイオン濃度を１０−７Ｍ以下まで下げた。ここにアクチンフィラメントを混合すると、図７に示したように再び、アクチンフィラメントが太いフィラメントに結合した
【００３１】
以上のようなキャッチ処理後、リラックス処理後の、ツイッチン（Ｔｗ）とミオシンの重鎖（ＭＨＣ）それぞれの脱リン酸化及びリン酸化の状態を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、［γ−32Ｐ］ＡＴＰを使用したオートラジオグラフィとで調べたところ、図８に示すような結果が得られた。図中、３、４、６、５、７と付しているものは、それぞれ、可溶性タンパク質画分によるキャッチ処理（図３）、この状態から可溶性タンパク質画分によるリラックス処理（図４）、ボバインＰＫＡによるリラックス処理（図６）、リラックス状態からの可溶性タンパク質画分によるキャッチ処理（図５）、ボバインカルシニューリンによるキャッチ処理（図７）を行った場合の、ミオシン、ツイッチンを示している。
【００３２】
図８の４、６で示している結果のように、ツイッチンは、可溶性タンパク質画分によっても、ボバインＰＫＡによっても、リラックス処理をされると、リン酸化され、ミオシンは、リン酸化されていないことがわかる。ただし、可溶性タンパク質画分と混合させたものにおいては、ミオシンの若干のリン酸化が見られるが、ボバインＰＫＡでリラックス処理したものでは、このリン酸化は観察されないので、別の酵素によるものであると考えられる。
【００３３】
また、図８の５、７で示している結果のように、ツイッチンは、可溶性タンパク質画分によっても、ボバインカルシニューリンによっても、キャッチ処理をされると、脱リン酸化されていることがわかる。
【００３４】
ここで、本発明者らが、ツイッチンを脱リン酸化する酵素がＰＰ２Ｂであることを解明した実験について説明しておく。
【００３５】
まず、種々の脱リン酸化酵素に阻害効果を有する阻害剤であるオカダ酸（ｏｋａｄａｉｃ  ａｃｉｄ）とマイクロシスチンＬＲ（ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ  ＬＲ）の濃度を変化させて、キャッチ状態への変換に対する阻害効果の違いを調べた。
【００３６】
濃度の設定は、オカダ酸については、３μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、マイクロシスチンＬＲについては、０．２μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭとした。
【００３７】
それぞれの濃度での阻害効果を、暗視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡で観察した。結果は、図９及び図１０に示すようになった。これら図９及び図１０において、上段が暗視野顕微鏡による観察画像であり、下段が蛍光顕微鏡による観察画像である。そして、暗視野顕微鏡で観察されるのがミオシン及びツイッチンを含む合成の太いフィラメントであり、蛍光顕微鏡で観察されるのが蛍光標識を行ったアクチンフィラメントである。
【００３８】
各濃度において観察された阻害の状態と、阻害効果が１／２となる濃度に相当するＫｉのＰＰ２Ｂに係る値が、オカダ酸では５μMであり、マイクロシスチンＬＲは０．２μＭであるという事実から、脱リン酸化酵素がＰＰ２Ｂではないかという予想がなされた。
【００３９】
そこで、ＰＰ２Ｂの特異的な阻害剤であるサイクロスポリンＡ、ＦＫ５０６及びカルシニューリンペプチドインヒビターでの阻害効果を調べると、図１１に示すように、これら阻害剤の存在下ではキャッチ処理をしても、アクチンフィラメントは合成の太いフィラメントと全く結合しなかった。すなわち、キャッチ状態を引き起こす脱リン酸化酵素は、ＰＰ２Ｂであることが証明された。なお、図１１においても、上段が暗視野顕微鏡による観察画像であり、下段が蛍光顕微鏡による観察画像である。
【００４０】
さらに、キャッチ状態の再構成にカルシウムイオンが必要であるということは、ＰＰ２Ｂがカルシウム依存性ホスファターゼである事実とも一致しており、このことも、脱リン酸化酵素がＰＰ２Ｂであるという強力な根拠となっている。
【００４１】
また、牛由来のカルシニューリン及びカルモジュリンのみを、可溶性タンパク質画分の代わりに使用して、アクチンフィラメントが太いフィラメントに結合したという結果を得たため、キャッチ処理を行った可溶性タンパク質画分の中でキャッチ状態へ寄与する物質が、ＰＰ２Ｂとこれを活性化するカルモジュリンとだけであることを明らかにした。
【００４２】
以上のように説明した本実施形態によるタンパク質状態変換方法によれば、精製したアクチン、ミオシン及びツイッチンを使って、キャッチ筋から所定の分画方法により得た必要な酵素を含む可溶性タンパク質画分、または、ボバインカルシニューリン及びボバインＰＫＡを使って、筋肉のキャッチ状態及びリラックス状態を自由に再構成することができる。
【００４３】
これら、キャッチ状態、リラックス状態は、それぞれ、いわば自動車における「ブレーキングで停止した状態」、「ニュートラルで停止した状態」のようなものであると言えるので、これらのメカニズムを利用してナノマシンなどに適用できる新しいデバイスの開発が大いに期待できる。
【００４４】
また、現在、解明が進められている血管平滑筋などのラッチ状態を考察する上でのモデルともなり得る。
【００４５】
また、ＰＰ２Ｂとして牛由来のカルシニューリン、ＰＫＡとして牛由来のＰＫＡを使用する場合にあっては、比較的簡単に手に入る酵素によって、手軽にキャッチ状態及びリラックス状態を再構成することができる。
【００４６】
なお、本発明は、本実施形態に限られない。
【００４７】
例えば、本実施形態においては、精製したアクチン、ミオシン、ツィッチンを使用しているが、本発明の状態変換方法を適用するためには、必ずしも精製したものでなくともよい。例えば、上記阻害実験で使用した、ミオシン及びツイッチンを含む合成の太いフィラメントであってもよい。また、精製方法も上記のものに限られない。また、遺伝子工学を使って改変したタンパク質を使用することも可能である。
【００４８】
また、タンパク質の状態変換に係る濃度や温度などの実施条件も上記実施形態に限られない。
【００４９】
また、ＰＰ２Ｂ、ＰＫＡともに牛由来のものでなくとも構わない。
【００５０】
その他、各部の具体的構成についても上記実施形態に限られるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の一実施形態を示す概略説明図。
【図２】同実施形態により得られるタンパク質の状態を示す画像を示す図。
【図３】同実施形態により得られるタンパク質の状態を示す画像を示す図。
【図４】同実施形態により得られるタンパク質の状態を示す画像を示す図。
【図５】同実施形態により得られるタンパク質の状態を示す画像を示す図。
【図６】同実施形態により得られるタンパク質の状態を示す画像を示す図。
【図７】同実施形態により得られるタンパク質の状態を示す画像を示す図。
【図８】同実施形態により得られるミオシンとツイッチンとのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィの結果を示す図。
【図９】本発明の根拠となる実験画像を示す図。
【図１０】本発明の根拠となる実験画像を示す図。
【図１１】本発明の根拠となる実験画像を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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