(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なプラスモジウム属原虫の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）およびそれをコードする核酸を提供する。また、プラスモジウム属原虫ＰＤＥに対する阻害薬の特徴付け、同定、選択を行う方法を提供する等。【解決手段】原虫由来の特定なアミノ酸配列からなるポリペプチド、その保存的置換変異体又は自然発生対立変異体など。前記ポリペプチドをコードする核酸もしくはその相補物。前記核酸を含有する組換えベクター、前記組換えベクターが導入された宿主細胞、ならびに前記宿主細胞を培養してポリペプチドを製造する方法。前記ポリペプチドを用いて、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害薬の特徴付け、同定又は選択を行う方法。プラスモジウム属原虫の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼに対する阻害活性を有する化合物を有効成分とするマラリア治療のための医薬組成物及び治療方法など。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）から選択されるポリペプチドであって、かつ環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチド。
（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの保存的置換変異体又は自然発生対立変異体であるポリペプチド。
（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列の全長と比較して７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｉｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｉｖ）配列番号１で示される核酸配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸又はその相補物にコードされるポリペプチド。
【請求項３】
環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性が、ｃＧＭＰを加水分解する活性である請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
プラスモジウム属原虫のポリペプチドである請求項２又は３記載のポリペプチド。
【請求項５】
組換えポリペプチドである請求項１、２又は３記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸。
【請求項７】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）から選択されるポリペプチドであってかつ環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの保存的置換変異体又は自然発生対立変異体であるポリペプチド。
（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列の全長と比較して７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｉｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｉｖ）配列番号１で示される核酸配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸又はその相補物にコードされるポリペプチド。
【請求項８】
環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性がｃＧＭＰを加水分解する活性である請求項７記載のポリペプチド。
【請求項９】
コードされるポリペプチドが、プラスモジウム属原虫のポリペプチドである請求項７又は８記載の核酸。
【請求項１０】
配列番号１で示される核酸配列からなる核酸。
【請求項１１】
以下の（１）〜（２）から選択される核酸であってかつ環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
（１）配列番号１で示される核酸配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸又はその相補物。
（２）配列番号１で示される核酸配列と７０％以上の配列同一性を有する核酸配列からなる核酸。
【請求項１２】
環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性がｃＧＭＰを加水分解する活性である請求項１１記載の核酸。
【請求項１３】
プラスモジウム属原虫の核酸である請求項１１又は１２記載の核酸。
【請求項１４】
以下の（１）〜（２）から選択される核酸であって、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のために使用される核酸。
（１）配列番号１で示される核酸配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸又はその相補物。
（２）配列番号１で示される核酸配列と７０％以上のホモロジーを有する核酸配列からなる核酸。
（Ａ）プラスモジウム属原虫のホスホジエステラーゼ遺伝子の発現又は存在の検出
（Ｂ）プラスモジウム属原虫のホスホジエステラーゼ遺伝子の発現の変調
【請求項１５】
単離された核酸である請求項６〜１４のいずれか１項記載の核酸。
【請求項１６】
請求項６〜１４のいずれか１項記載の核酸を含有する組換えベクター。
【請求項１７】
請求項１６記載の組換えベクターが導入された宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１６記載の組換えベクターが導入された宿主細胞を培養する工程、該細胞の培養物から該組換えベクター上にコードされた環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼのポリペプチドを回収する工程からなる、組換えポリペプチドの製造方法。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチドを認識する抗体。
【請求項２０】
以下の（ｉ）〜（ｖ）から選択される環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼを試験化合物と接触せしめる工程；および、該環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼに対する試験化合物の作用を決定する工程；からなる、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害薬の特徴付け、同定又は選択のための方法。
（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの保存的置換変異体又は自然発生対立変異体であるポリペプチド。
（ｉｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列の全長と比較して７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｉｖ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｖ）配列番号１で示される核酸配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸又はその相補物にコードされるポリペプチド。
【請求項２１】
試験化合物の作用を決定する工程が、
該環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ、試験化合物および基質環状ヌクレオチドを含む系内で酵素反応を行い、該環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの酵素活性に対する試験化合物の阻害活性を決定する工程からなる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
基質環状ヌクレオチドがｃＧＭＰであり、酵素活性がｃＧＭＰの加水分解活性である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
試験化合物の作用を決定する工程が、該環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼおよび試験化合物を含む系内で結合反応を行い該環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼと試験化合物との結合能を決定する工程からなる、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
医薬の特徴付け、同定又は選択のために使用される、請求項２０〜２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
医薬がマラリア治療薬である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
請求項２０〜２３のいずれか１項記載の方法を用いて特徴付け、同定又は選択された環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害薬を準備し、これをプラスモジウム属原虫の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼに対する阻害薬として販売する方法。
【請求項２７】
プラスモジウム属原虫の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼに対する阻害活性を有する化合物を用いて、マラリアを治療する方法。
【請求項２８】
プラスモジウム属原虫の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼに対する阻害活性を有する化合物を有効成分とするマラリアの治療のための医薬組成物。
【請求項２９】
プラスモジウム属原虫が、プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）である請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３０】
マラリアが、ヒトの熱帯熱マラリアである請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３１】
プラスモジウム属原虫の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼが、請求項１記載のポリペプチドである請求項２８〜３０のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項３２】
プラスモジウム属原虫の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼに対する阻害活性を有する化合物が、ザプリナストである請求項２８〜３０のいずれか１項記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なホスホジエステラーゼおよびそれをコードする核酸に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マラリアは年間２７０万人にのぼる死亡者が生じる深刻な感染症である。
マラリアは、ハマダラ蚊によって媒介され、プラスモジウム属に属するマラリア原虫がヒトの赤血球に寄生することによって起こることが知られている。
【０００３】
ヒトに対する寄生性を有するマラリア原虫としては、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（P.vivax）、四日熱マラリア原虫（P.malariae）、卵形マラリア原虫（P.ovale）の４種が知られている。熱帯熱マラリアは、患者数、重篤性、薬剤耐性の広がりなどが大きく、これらのことから、前記４種のうち特に熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）は最も重要なものとして注目される。
【０００４】
マラリアの治療薬としては、クロロキン、スルファドキシン・ピリメサミン合剤、硫酸キニーネ等が知られており、重症熱帯熱マラリアの治療においては注射用キニーネ（二塩酸塩キニーネ）が第1選択薬剤となる。しかし、これら薬剤についても、耐性の出現が見られ、新しい治療薬の研究開発が強く望まれている。
【０００５】
一方、ホスホジエステラーゼについては以下のことが知られている。
【０００６】
環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（以下、ＰＤＥとも略称する）は、基質であるｃＡＭＰ（adenosine 3',5'-cyclic monophosphate）又はｃＧＭＰ（guanosine 3',5'-cyclic monophosphate）等の環状ヌクレオチドのホスホジエステル結合を加水分解して、ＡＭＰ（adenosine 5'-monophosphate）又はＧＭＰ（guanosine 5'-monophosphate）等のヌクレオチドを生じしめる酵素である。
【０００７】
ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰなどの環状ヌクレオチドは、細胞内情報伝達のセカンドメッセンジャーとして、生体内の多くの機能調節に関与している。ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの細胞内濃度は、細胞外からのシグナルに応答して変動し、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの合成に関与する酵素（アデニル酸シクラーゼ及びグアニル酸シクラーゼ）と、それらの分解に関与するＰＤＥのバランスによって調節されている。
【０００８】
哺乳動物のＰＤＥについては、これまで、多くの種類が単離・同定されており、アミノ酸配列の相同性、生化学的性質、阻害薬による特徴付けなどから、１１の型に分類されている（非特許文献１および２：  Beavo、Physiol.Rev.、75巻、725−748頁、1995年；およびYuasaら、J.Biol.Chem.、275巻、31469−31479頁、2000年）。また、既知医薬の中にこれら哺乳動物ＰＤＥに対する阻害活性を有するものが見出されてきたこと等から、阻害薬に関する研究も精力的に進められている。
【０００９】
酵母、ショウジョウバエのＰＤＥについてもいくつかの型が同定されている。また、トリパノソーマ属原虫のＰＤＥについて単離同定の報告がなされている。（非特許文献３および４：  Zoraghiら、J.Biol.Chem.、276巻、11559−11566頁、2001年；および  Zoraghiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、99巻、4343-4348頁、2002年）
プラスモジウム属に属する原虫（以下、プラスモジウム属原虫と称する）のゲノムに関しては、ドラフト配列が種々報告されており、また、最近、熱帯熱マラリア原虫であるプラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）の染色体全塩基配列について報告があった。（非特許文献５および６：  Hallら、Nature、419巻、527-531頁、2002年；および  Gardnerら、Nature、419巻、531-534頁、2002年）
しかしながら、プラスモジウム属原虫のＰＤＥについては、いまだ単離・同定が行われておらず、阻害薬に関する研究も進んでいない。
【００１０】
また、カワモトらは、ｃＧＭＰ及び哺乳類ＰＤＥの非選択的阻害薬として知られるＩＢＭＸ（3-isobutyl-1-methylxanthine）等が、プラスモジウム属原虫の鞭毛放出（exflagellation）を促進することを報告している。（非特許文献７：  Kawamotoら、Molecular and Biochemical Parasitology、42巻、101-108頁、1990年）
また、コーシャルらは、ｃＡＭＰによりプラスモジウム・ファルシパルムにおける生殖母体形成（gametocyte formation）が誘導されることを報告している。その一方で、インセルバーグは、ｃＡＭＰによりプラスモジウム・ファルシパルムの生活サイクル中の特定ステージにおいて無性的成熟（asexual maturation）と生殖母体形成（gametocyte formation）が阻害されることを報告している。（非特許文献８および９：  Kaushalら、Nature、286巻、490-492頁、1980年；  及び  Inselburg、J.Parasitol.、69巻、592-597頁、1983年）
しかし、ＰＤＥ阻害に基づくプラスモジウム属原虫の生育阻害については、知られていない。
【００１１】
【非特許文献１】  Beavo、Physiol.Rev.、75巻、725−748頁、1995年
【非特許文献２】  Yuasaら、J.Biol.Chem.、275巻、31469−31479頁、2000年
【非特許文献３】  Zoraghiら、J.Biol.Chem.、276巻、11559−11566頁、2001年
【非特許文献４】  Zoraghiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、99巻、4343-4348頁、2002年
【非特許文献５】  Hallら、Nature、419巻、527-531頁、2002年
【非特許文献６】  Gardnerら、Nature、419巻、531-534頁、2002年
【非特許文献７】  Kawamotoら、Molecular and Biochemical Parasitology、42巻、101-108頁、1990年
【非特許文献８】  Kaushalら、Nature、286巻、490-492頁、1980年
【非特許文献９】  Inselburg、J.Parasitol.、69巻、592-597頁、1983年
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、新規なプラスモジウム属原虫の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）およびそれをコードする核酸を提供することにある。また、プラスモジウム属原虫のＰＤＥに対する阻害薬の特徴付け、同定および選択を行う方法を提供することにある。さらに、マラリアの治療のための新規な医薬組成物ならびに治療方法を提供することにある。また、上記以外の目的については以下の記載より明らかである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、プラスモジウム属原虫のＰＤＥの翻訳領域全長を含むｃＤＮＡを単離し、このｃＤＮＡを大腸菌宿主細胞中で発現させて、プラスモジウム属原虫のＰＤＥを単離・取得することに成功した。また、これを用いて、ＰＤＥ活性をアッセイすることに成功した。さらに、プラスモジウム属原虫のＰＤＥを阻害する活性を有する化合物は、そのＰＤＥ阻害作用に基づいて抗マラリア活性を示すことを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１３】
すなわち、本発明は、プラスモジウム属原虫のＰＤＥである。より詳細には、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
また、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）から選択されるポリペプチドであって、かつ環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドである。
（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの保存的置換変異体又は自然発生対立変異体であるポリペプチド。
（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列の全長と比較して７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｉｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｉｖ）配列番号１で示される核酸配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸又はその相補物にコードされるポリペプチド。
【００１４】
また本発明は、前記ポリペプチドをコードする核酸もしくはその相補物である。前記ポリペプチドをコードする核酸もしくはその相補物としては、例えば、配列番号１で示される核酸配列からなる核酸が挙げられる。
【００１５】
また、例えば、以下の（１）〜（２）から選択される核酸であってかつ環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
（１）配列番号１で示される核酸配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸又はその相補物。
（２）配列番号１で示される核酸配列と７０％以上の配列同一性を有する核酸配列からなる核酸。
【００１６】
また、例えば、前記（１）〜（２）から選択される核酸であって、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のために使用される核酸が挙げられる。
（Ａ）プラスモジウム属原虫のホスホジエステラーゼ遺伝子の発現又は存在の検出（Ｂ）プラスモジウム属原虫のホスホジエステラーゼ遺伝子の発現の変調。
【００１７】
また本発明は、前記核酸を含有する組換えベクター、前記組換えベクターが導入された宿主細胞、前記組換えベクターが導入された宿主細胞を培養して前記ポリペプチドを製造する方法、ならびに、前記ポリペプチドを認識する抗体である。
【００１８】
また、本発明は、前記ポリペプチド又は核酸を用いて、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害薬の特徴付け、同定又は選択を行う方法である。また、該方法により特徴付け、同定、又は選択された環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害薬をプラスモジウム属原虫の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害薬として販売する方法である。
【００１９】
さらに、本発明は、プラスモジウム属原虫の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼを阻害する活性を有する化合物を有効成分とするマラリア治療薬、ならびにこれを用いるマラリアの治療方法である。
【００２０】
後記配列表の配列番号１は、プラスモジウム属原虫（Plasmodium falciparum）のＰＤＥ（ＰｆＰＤＥ１とも称する。）の翻訳領域全長を含むｃＤＮＡの核酸配列を表す。また、配列番号２は前記ｃＤＮＡにコードされるＰＤＥ（ＰｆＰＤＥ１）のアミノ酸配列を表す。
【００２１】
ＰｆＰＤＥ１は、その生物学的活性（biological activity）として、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性（ＰＤＥ活性）（より詳細には、ｃＧＭＰを加水分解する活性）を有する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明において、ポリペプチドとしては、組換え型のもの又は単離されたものが挙げられる。また、本発明において、核酸としては、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子が挙げられ、組換え型のもの又は単離されたものが挙げられる。また、これら核酸としては、一本鎖のもの及び二本鎖のものが含まれる。例えば、配列番号１で示される核酸配列を有する核酸としては、該核酸配列を有する一本鎖ＤＮＡ、該塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡとその相補物（complement）からなる二本鎖ＤＮＡ、それらに対応するＲＮＡ分子などが含まれる。
【００２３】
本発明のポリペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。本発明には、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの自然発生的な変異体、人為的に改変した変異体、異種生物に由来するホモログ及びオルソログ等が含まれる。
【００２４】
すなわち、本発明のポリペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの他、これの保存的置換変異体（conservative substitution variants）および自然発生対立変異体（naturally occuring allelic variants）等が挙げられる。
【００２５】
このようなポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同様の生物学的活性〔すなわち、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性（より詳細にはｃＧＭＰを加水分解する活性）〕を有するものであればよく、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列の全長と比較して、通常約７５％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらに一層好ましくは約９５％以上のアミノ酸レベルのホモロジーを有するものである。あるいはまた、配列番号１で示される核酸配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸又はその相補物にコードされるポリペプチドである。
【００２６】
また、本発明のポリペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して１もしくはそれ以上の保存的アミノ酸置換（conservative amino acid substitutions）を有するポリペプチドが挙げられる。
【００２７】
このようなポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有する。
アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、生物学的活性〔すなわち、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性（より詳細にはｃＧＭＰを加水分解する活性）〕が失われない程度であればよく、通常１〜約２２０個、好ましくは１〜約１８０個、より好ましくは１〜約１３０個、さらに好ましくは１〜約９０個、さらに一層好ましくは１〜約４５個である。
【００２８】
環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性が失われないためには、当該活性を司る触媒領域において、他の領域よりも、アミノ酸配列がより高度に保存されていることが望ましい。従って、触媒領域におけるアミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、通常１〜約２０個、好ましくは１〜約１０個、より好ましくは１〜約５個である。触媒領域としては、例えば、後記配列表の配列番号２に示したアミノ酸配列における第６０７〜７７６番目のアミノ酸残基に相当する領域もしくはそれに対応する領域が挙げられる。
【００２９】
本発明の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）としては、例えば、配列番号１で示される塩基配列からなる核酸を含むものが挙げられるが、これに限定されない。本発明には、配列番号１で示される塩基配列からなる核酸の、自然発生的な変異体、人為的に改変した変異体、異種生物に由来するホモログ及びオルソログ等が含まれる。
【００３０】
すなわち、本発明の核酸としては、配列番号１で示される塩基配列からなる核酸のほか、配列番号１で示される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下（より好ましくはハイストリンジェントな条件下）でハイブリダイズし得る核酸またはその相補物（相補的配列を有する核酸）が挙げられる。
【００３１】
このような核酸は、配列番号１で示される塩基配列と、通常約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上のホモロジーを有するものである。
【００３２】
また、このような核酸は、それにコードされたポリペプチドが、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性（より詳細にはｃＧＭＰを加水分解する活性）〕を有するものであることが好ましい。
【００３３】
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０〜６０℃の温度条件下、約１６時間ハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。また、より高いストリンジェンシーを有する条件（ハイストリンジェントな条件）では、前記において、洗浄を０．１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で行うことにより実施できる。
【００３４】
プラスモジウム属に属する原虫としては、例えば、ヒトの熱帯熱マラリアの病原原虫であるプラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリアの病原原虫であるプラスモジウム・ヴィヴァックス（Plasmodium vivax）、四日熱マラリアの病原原虫であるプラスモジウム・マラリエ（Plasmodium malariae）、卵形マラリアの病原原虫であるプラスモジウム・オバーレ（Plasmodium ovale）、等が挙げられる。また、ネズミマラリアの病原原虫であるプラスモジウム・ベルゲイ（Plasmodium belghei）などが挙げられる。
【００３５】
より具体的には、プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）ATCC 30074、同ATCC 30074、同ATCC 30145 、同ATCC 30193、同ATCC 30194、同ATCC 30930、同ATCC 30932、同ATCC 30950、同ATCC 30993、同ATCC 50005 、同ATCC 50028、同ATCC 50037、同ATCC 50038、同ATCC 50041、同ATCC 50072、同ATCC 50110、同ATCC 50113、プラスモジウム・ファルシパルム Honduras-1株（Mitamuraら、Parasitology International、49巻、219-229頁、2000年）、プラスモジウム・ファルシパルム ３D7株（Chenら、Mol. Pharmacol.、31巻、430-437頁、1987年）、プラスモジウム・ヴィヴァクス（Plasmodium vivax）ATCC 30061、同ATCC 30073、同ATCC 30138、プラスモジウム・ベルゲイ（Plasmodium berghei）ATCC 30090、同ATCC 50173、同ATCC 50175、同ATCC 50176、同ATCC 50181、同ATCC 50182などが挙げられる。
【００３６】
これらのうち、熱帯熱マラリアの治療薬の研究開発に利用する上では、熱帯熱マラリアの病原原虫であるプラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）のものを用いることが望ましい。
【００３７】
プラスモジウム属原虫の培養は、既知の方法（Trager ら、Science、193巻、673-675頁、1976年：  Kimら、J.Med.Chem.、42巻、2604-2609頁、1999年 等）により実施できる。
【００３８】
本発明のポリペプチドおよび核酸は、プラスモジウム属に属する原虫の細胞を源（source）として用い単離取得できる。
【００３９】
本発明の核酸は、本明細書中に開示された配列情報（後記配列表の配列番号１）を利用して取得することができる。例えば、開示された塩基配列の情報をもとにプライマーやプローブを設計し、これらを用いるＰＣＲ（polymerase chain reaction）法、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法を適宜組み合わせて、ＤＮＡライブラリーから選択・取得できる。
【００４０】
例えば、プラスモジウム属に属する原虫の細胞から調製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として、ＰＣＲ法によりｃＤＮＡ断片を得る。得られたｃＤＮＡをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション法又はプラークハイブリダイゼーション法によりｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、全長ｃＤＮＡを取得できる。また、ゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノム遺伝子を単離することができる。また、プラスモジウム属に属する原虫のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異種由来のホモログ又はオルソローグを単離することができる。
【００４１】
ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Sambrook, J., Fritsch, E.F.およびManiatis, T.著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより１９８９年に発刊）に記載の方法により調製することができる。
【００４２】
得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、遺伝子産物のポリペプチドをコードする翻訳領域を決定でき、このポリペプチドのアミノ酸配列を得ることができる。
【００４３】
本発明のポリペプチドは、プラスモジウム属原虫の細胞抽出液から単離精製し得ることができる。あるいはまた、通常の遺伝子組換え技術により、組換えポリペプチドとして、過剰発現（overexpression）させ生産することができる。また、他のポリペプチドとの融合ポリペプチド（fusion polypeptide）の形で発現させ製造することもできる。
【００４４】
組換えポリペプチドは、例えば組換え発現ベクターを導入した宿主細胞を培養し、その細胞の培養物（培養液の上清、培養細胞の細胞抽出液等）から、目的の組換えポリペプチドを回収しすることにより製造できる。
【００４５】
組換えポリペプチドを過剰発現（overexpression）させるための組換え発現ベクター及び組換え細胞は、例えば、以下のようにして得ることができる。まず、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡを、適当なプロモーターの下流に連結される形でベクターに挿入し、発現ベクターを構築する。ついで得られた発現ベクターを宿主細胞に導入する。
【００４６】
発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳動物細胞の発現系などが挙げられる。
【００４７】
ベクターとしては、細菌の系の場合、ｐＵＣ系ベクター、ｐＥＴ系ベクター等；  酵母の系の場合、２μ系ベクター、ＣＥＮ４系ベクター等；  昆虫細胞系の場合、バキュロウイルスベクター等；  哺乳動物細胞系の場合、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等、を用いることができる。
【００４８】
本発明のポリペプチドを発現させるためのプロモーターとしては、細菌の系の場合、Ｌａｃプロモーター、Ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター等；  酵母の系の場合、ＧＡＬ１０プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター等；  昆虫細胞系の場合、ポリヘドリンプロモーター等；  哺乳動物細胞系の場合、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター等、を用いることができる。
【００４９】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、自然界に存在するｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ（例えば、配列番号１に示される塩基配列からなるもの）を用いることができるが、これに限定されない。目的とする蛋白質のアミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計して用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用したＰＣＲ法や部位特異的変異導入法（site specific mutagenesis）（Markら、Proceedings of National Academy of Sciences、第81巻、第5662〜5666頁、1984年）等によって実施できる。
【００５０】
本発明のポリペプチドの単離精製は、公知の精製方法（無機塩類による塩析、有機溶媒による分画沈殿、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過法など）を適宜組合せることによって実施できる。
【００５１】
本発明の核酸と高いホモロジーを有する核酸、および、本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド）またはその相補物は、（Ａ）プラスモジウム属原虫のホスホジエステラーゼ遺伝子の発現又は存在の検出のために、本技術分野における通常の技術を適用してプローブまたはプライマーとして使用できる。あるいは、（Ｂ）プラスモジウム属原虫のホスホジエステラーゼ遺伝子の発現の変調（抑制又は増強）のために、本技術分野における通常の技術を適用して例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、デコイ等として使用することもできる。
【００５２】
このような核酸としては、例えば、配列番号１示される塩基配列からなる核酸（センス鎖またはアンチセンス鎖）の、連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を有するヌクレオチド等が挙げられる。
【００５３】
また、本発明のポリペプチドを過剰発現（overexpression）させることにより、細胞における該蛋白質またはポリペプチドの機能又は活性を高める（増強させる）ことができる。
【００５４】
また、本発明のポリペプチド、またはこれと免疫学的同等性を有するペプチド（ポリペプチドの断片または部分配列を有する合成ペプチド等）を抗原として用いて、本発明のポリペプチドを認識する抗体を取得することができる。免役学的同等性を有するとは、例えば本発明のポリペプチドに対する抗体と交差反応を生じるということを意味する。
【００５５】
ポリクローナル抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に抗原を接種し、免疫血清を回収する通常の方法により製造することができる。モノクローナル抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。また、モノクローナル抗体の遺伝子を改変してヒト化モノクローナル抗体等を作製できる。
【００５６】
上記抗体を用いて、通常の免疫化学的方法（immunochemical assay法など）により、本発明のポリペプチドの細胞中又は組織中などにおける発現を検出することができる。あるいは、抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィーにより本発明のポリペプチドの精製を実施することができる。また、中和抗体を用いて、本発明のポリペプチドの機能または活性を変調させる（例えば抑制する）ことができる。
【００５７】
本発明のポリペプチドが、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性（ＰＤＥ活性）を有することは、一般的に知られた通常のＰＤＥ活性測定の方法（Thompsonら、Adv.Cyclic Nucleotide Res.、第10巻、第69−92頁、1979年；Yanakaら、Eur.J.Biochem.、第255巻、第391−399頁、1998年等）により確認することができる。酵素反応の基質環状ヌクレオチドとしては、ｃＧＭＰ及びその誘導体を好適に用いることができる。
【００５８】
本発明のポリペプチドは、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害薬（ＰＤＥ阻害薬）の特徴付け、同定又は選択のために使用することができる。
【００５９】
ＰＤＥ阻害薬の特徴付け、同定又は選択は、例えば、本発明のポリペプチド（環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ）を試験化合物と接触せしめる工程；および、該環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼに対する試験化合物の作用を決定する工程；からなる方法により実施できる。
【００６０】
試験化合物の作用を決定する工程は、例えば、該環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ、試験化合物および基質環状ヌクレオチド（ｃＧＭＰ等）を含む系内で酵素反応を行い、該環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの酵素活性に対する試験化合物の阻害活性を決定することにより実施できる。
【００６１】
あるいはまた、試験化合物の作用を決定する工程は、該環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼおよび試験化合物を含む系内で結合反応を行い、該環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼと試験化合物との結合能を決定することによって実施することもできる。結合能力を有する試験化合物（リガンド）は、阻害薬となる可能性が高い。
【００６２】
さらに、試験化合物について、本発明のポリペプチド（環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ）に対する阻害活性（又は結合能）を調べ、他の型のＰＤＥに対する阻害活性（又は結合能）と比較することにより選択性を判定できる。これにより、特定の型のＰＤＥに対して相対的に高い作用を有する、選択的な阻害薬を選択することができる。また、阻害薬を同定し、特徴付けることができる。
【００６３】
マラリアの原因原虫であるプラスモジウム属原虫（例えばプラスモジウム・ファルシパルム等）のＰＤＥ（例えば本発明のポリペプチド等）を阻害する活性を有する化合物は、その阻害活性に基づいて抗マラリア活性を有する。従って、マラリアの治療ための医薬の有効成分として用いることができる。
【００６４】
また、例えば、プラスモジウム属原虫のＰＤＥに対して高い阻害活性を有する一方、寄生主となる哺乳類動物のＰＤＥに対しては低い阻害活性を示す化合物は、副作用の少ない安全な医薬として期待される。マラリア治療薬の有効成分としては、かかる選択性の高い化合物を選択して用いることがより好ましい。
【００６５】
プラスモジウム属原虫（例えばプラスモジウム・ファルシパルム）のＰＤＥを阻害する活性を有する化合物としては、例えば、以下のものが挙げられる。
・ジピリダモール（dipyridamole）（化学名：2,2',2'',2'''-(4,8-dipiperidinopyrimido[5,4-d]pyrimidine-2,6-diyldinitrilo)tetraethanol）
・Ｅ４０２１（化学名： sodium 1-[6-chloro-4-(3,4-methylenedioxybenzyl)aminoquinazolin-2-yl]piperidine-4-carboxylate）（文献名：WO93/07124）
・シルデナフィル（sildenafil）（化学名：5-(2-ethoxy-5-(4-methyl-1-piperazinylsulphonyl)phenyl)-1-methyl-3-n-propyl-1,6-dihydro-7H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-7-one）（文献：WO94/28902）
・ザプリナスト（zaprinast）（化学名：1,4-dihydro-5-[2-propoxyphenyl]-7H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pyrimidine-7-one）（文献：WO96/05835 ）
阻害化合物の抗マラリア活性は、既知の抗マラリア活性のアッセイ方法もしくはそれらと同等の方法により評価確認できる。
In vitro抗マラリア活性のアッセイ方法としては、例えば、赤血球を含む培地でプラスモジウム属原虫（P.falciparum）を培養し、寄生虫感染赤血球数の増加（感染率）を指標として、試験化合物の抗マラリア作用をアッセイし評価する方法が挙げられる。（Kimら、J.Med.Chem.、42巻、2604-2609頁、1999年:  Kimら、Parasitol.Int.、47巻、59-67頁、1998年）
また、In vivo 抗マラリア活性のアッセイ方法としては、例えば、プラスモジウム属原虫（P.berghei）に感染させたマウスを用いて、試験化合物の抗マラリア作用をアッセイし評価することができる。
（Kimら、J.Med.Chem.、42巻、2604-2609頁、1999年:  Kimら、Parasitol.Int.、47巻、59-67頁、1998年:  "Antimalarial drugs I. In current antimalarials and new drug developments" pp229-230, Peters,W., Richards,W.H.G., Eds., Springer-Verlag, Berlin, 1984）
プラスモジウム属原虫（プラスモジウム・ファルシパルム等）のＰＤＥを阻害する活性を有する化合物を、医薬として用いる際、投与方法は特に限定されず、一般的な経口もしくは非経口的な方法（経口、静脈内、筋肉内、皮下など）を適用すればよい。また、必要に応じては、投与方法に応じた不活性な担体と共に、慣用の医薬製剤（錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、注射剤、吸入剤等）として製剤化して用いればよい。例えば、一般的な医薬において許容される結合剤、崩壊剤、増量剤、充填剤、滑沢剤などの賦活剤あるいは希釈剤とともに化合物を用い、通常の方法により、製剤化して用いることができる。
【００６６】
投与量は、投与方法、患者の年令、体重、状態によっても異なるが、一般的な投与量、例えば１日当たり、経口投与の場合は、１〜３００ｍｇ／ｋｇ、非経口投与の場合には、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で設定される。
【００６７】
プラスモジウム属原虫のＰＤＥを阻害する活性を有する化合物を有効成分とする本発明のマラリア治療薬は、プラスモジウム属原虫（プラスモジウム・ファルシパルム等）のＰＤＥに対する阻害作用に基づいて薬効（抗マラリア作用）を発現するものである。従って、かかるＰＤＥ阻害以外の他の主作用に基づいて薬効を発現する医薬は本発明には含まれない。
【００６８】
本発明の新規ＰＤＥ及びこれをコードする核酸等は、プラスモジウム属における細胞内情報伝達のメカニズム等の研究のために有用である。
【００６９】
また、本発明の新規ＰＤＥ及びその遺伝子を利用した阻害薬の特徴付け、同定、及び選択方法は、選択性の高い阻害薬や、治療効果が高く副作用の少ない優れた医薬（例えば、マラリア治療薬）を研究・開発するために有用である。また、本発明の医薬組成物もしくは治療方法は、マラリアの治療のための新規で優れた医薬組成物もしくは治療方法を提供する。
【００７０】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【００７１】
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Molecular Cloning）」（Sambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００７２】
【実施例】
実施例１  プラスモジウム属原虫および感染赤血球中のＰＤＥ活性
（１）プラスモジウム属原虫（プラスモジウム・ファルシパルム）の培養
文献（Tragerら、Science、193巻、673-675頁、1976年；  Kimら、J.Med.Chem.、42巻、2604-2609頁）に記載の方法に従い、以下のようにして、プラスモジウム・ファルシパルムHonduras-1株（Plasmodium falciparum   Honduras-1 strain）（Mitamuraら、Parasitology International、49巻、219-229頁、2000年）を培養した。
【００７３】
すなわち、10％(v/v)の不活性化A型ヒト血漿を添加したRPMI培地（Gibco社製）中、３％(v/v)ヘマトクリットのA型ヒト赤血球にプラスモジウム・ファルシパルムHonduras-1株を感染させ、CO2インキュベータ（5％ CO2, 5％O2, 90％N2下）にて３７℃で培養した。
〔ヘマトクリット：血液中の赤血球容積比（volume percent of red cell）〕
（２）プラシモジウム属原虫の細胞抽出液のＰＤＥ活性
前記（１）と同様にして、  プラスモジウム属原虫（プラスモジウム・ファルシパルムHonduras-1株）を培養した。培養後は、感染させた血球（RBC）を回収し、0.075％(w/v)サポニンを含む緩衝液〔120mM KCl, 20mM NaCl, 10mM PIPES, 1mM MgCl2, 5mM グルコース（pH6.7）〕で処理した。
【００７４】
ついで、これを遠心分離に供し、得られた沈殿（プラスモジウム原虫を含む）を氷冷した溶解用緩衝液〔40mM Tris-HCl, pH7.5, 15mM ベンズアミジン, 5μg/ml ペプスタチンＡ, 5μg/mlロイペプチン〕中に再懸濁した。これを一回凍結融解させた後、超遠心分離（100,000ｘｇ、30分、４℃）し、上清（超遠心上清）と沈殿（超遠心沈殿）とに分けた。
【００７５】
また、別途、非感染赤血球から、前記と同様にして、上清（超遠心上清）と沈殿（超遠心沈殿）を得た。
【００７６】
前記で得た感染赤血球及び非感染赤血球の超遠心上清及び超遠心沈殿についてＰＤＥ活性を測定した。ＰＤＥ活性の測定は、文献（Thompsonら、Adv.Cyclic Nucleotide Res.、10巻、69-92頁、1979年）及び後記実施例４記載の方法と同様にして、ラジオラベル核酸法により行った。
その結果を表１に示した。
【００７７】
【表１】
2006166706.tif 000002
【００７８】
表１に示したとおり、非感染赤血球については、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰのいずれを基質とした場合もＰＤＥ活性は検出されなかったが、感染赤血球の超遠心沈殿では、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰのいずれを基質とした場合も明らかなＰＤＥ活性が検出された。
【００７９】
このように、プラスモジウム属原虫の膜画分を含むと考えられる感染赤血球の超遠心沈殿には、非感染のものでは見られないＰＤＥ活性が認められたことから、このＰＤＥ活性が、プラシモジウム属原虫のＰＤＥに起因すると考えられた。
【００８０】
（３）プラシモジウム属原虫の細胞抽出液のＰＤＥ活性に対する各種化合物の作用
前記（１）と同様にしてプラスモジウム属原虫（プラスモジウム・ファルシパルムHonduras-1株）を培養した。培養後、感染させた血球を回収し、0.075％(w/v)サポニンを含む緩衝液〔120mM KCl, 20mM NaCl, 10mM PIPES, 1mM MgCl2, 5mM グルコース（pH6.7）〕で処理した後、細胞抽出液を調製した。
【００８１】
この細胞抽出液〔プラスモジウム・ファルシパルムの細胞抽出液〕を酵素液として用いて、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに対するＰＤＥ活性（環状ヌクレオチド加水分解活性）を測定したところｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに対するＰＤＥ活性が認められた。さらに、この細胞抽出液のＰＤＥ活性に対する各種試験化合物の阻害活性を調べた。
【００８２】
試験化合物としては、ＩＢＭＸ（3-isobutyl-1-methylxanthine）（Wako社製）、テオフィリン（theophylline）（Nacalai Tesque社製）及びザプリナスト（zaprinast）（Sigma社製）を用いた。その結果を表２に示した。
【００８３】
【表２】
2006166706.tif 000003
【００８４】
表２に示したとおり、このプラスモジウム属原虫（プラスモジウム・ファルシパルム）の細胞抽出液中に認められるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに対するＰＤＥ活性は、ザプリナスト（zaprinast）によって阻害されることがわかった。一方、哺乳類ＰＤＥの非特異的阻害薬として知られるＩＢＭＸ（3-isobutyl-1-methylxanthine）及びテオフィリン（theophylline）には阻害活性は認められなかった。
【００８５】
実施例２  プラスモジウム属原虫ＰＤＥ（ＰｆＰＤＥ１）のｃＤＮＡ単離
（１）プラスモジウム原虫の一本鎖ｃＤＮＡの調製
プラスモジウム・ファルシパルム３D7株（Plasmodium falciparum 3D7 strain）（Chenら、Mol. Pharmacol.、31巻、430-437頁、1987年）を、前記実施例１（１）と同様にして、ヒト赤血球に感染させ培養した。培養後、感染させた赤血球を回収し、0.075％サポニンを含むリン酸緩衝食塩水（Phosphate buffered saline: PBS）で処理した。ついで、これを遠心分離に供し、沈殿物（プラスモジウム原虫）を得た。
【００８６】
この沈殿物（プラスモジウム原虫）から、常法により、トータルＲＮＡを調製し、これを用いて一本鎖ｃＤＮＡ（complementary DNA）を調製した。
〔トータルＲＮＡの調製には、ニッポンジーン社製のキット（商品名：ISOGEN溶液）を用いた。また、一本鎖ｃＤＮＡの調製にはApplied Biosystems社製のキット（商品名：GeneAmpRNA PCRKit）を用いた。〕
（２）プラスモジウム原虫ＰＤＥのｃＤＮＡの単離
クエリー配列として哺乳類ＰＤＥ（ＰＤＥ１〜１１）のアミノ酸配列を用い、
検索ツールとしてＢＬＡＳＴ（basic local alignment search tool）を用いて、
ＥＳＴ（expressed sequence tag）及びゲノムデータベースを検索した。
その結果、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）の「プラスモジウム・ファルシパルム  ゲノムデータベース」中に相同性の高い配列を見出した。その中の一つは、第１２染色体上に存在していた。
【００８７】
このゲノム配列を元にＰＣＲ（Polymerase chain reaction）のためのプライマーをデザインし、合成した。Ｎ末端側領域の増幅のためのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとしては、各々、後記配列表の配列番号３（Pf1-F1）及び配列番号４（Pf1-R3）に示した核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを合成して用いた。また、Ｃ末端側領域の増幅のためのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとしては、各々、後記配列表の配列番号５（Pf1-F3）及び配列番号６（Pf1-R1）に示した核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを合成して用いた。
【００８８】
前記（１）で調製した一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、これらプライマーを用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲの反応は、95℃30秒、55℃30秒および72℃3分の条件で３０サイクル行った。ＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクター（ｐＧＥＭ−Ｔ Easy、Promega社製）にクローニングした。
【００８９】
Ｎ末端側領域及びＣ末端側領域の各々について、独立した５個ずつのＰＣＲクローンを取得し、各々の核酸配列を決定した。核酸配列の決定はダイデオキシ法にて、自動シークエンサー（商品名：ABI PRISM 310、Applied Biosystems社製）及びシークエンス反応用キット（商品名：BigDye terminator cycle sequencing reaction kit、Applied Biosystems社製）を用いて実施した。
【００９０】
得られた配列の各々を比較することによってＰＣＲによるエラーおよびシークエンスの読取エラーを排除した。かくして、ＰＤＥの翻訳領域全長を含む全長ｃＤＮＡの塩基配列を確定した。全長ｃＤＮＡの塩基配列を解析し、既知のＰＤＥのアミノ酸配列と比較検討して、オープンリーディングフレームを同定した。
【００９１】
プラスモジウム・ファルシパルムのＰＤＥ（ＰｆＰＤＥ１）の翻訳領域全長のｃＤＮＡ核酸配列（２６５５ｂｐ）を後記配列表の配列番号１に示した。また、これにコードされたプラスモジウム・ファルシパルムのＰＤＥ（ＰｆＰＤＥ１）のポリペプチドのアミノ酸配列（８８４アミノ酸残基）を配列番号２に示した。
【００９２】
アミノ酸配列から推定されるＰｆＰＤＥ１の分子量は約１０７ｋＤａであった。
また、ＰｆＰＤＥ１のＮ末端領域には６回膜貫通領域が存在すると推定された（図１  に模式図を示した）。
【００９３】
また、既知ＰＤＥとのアミノ酸配列上の類似性を解析したところ、ＰｆＰＤＥ１の触媒領域は、配列番号２の第６０７〜７７６番目のアミノ酸残基に相当する領域であると推定された。ＰｆＰＤＥ１の触媒領域のアミノ酸配列は、既知哺乳類ＰＤＥのうちＰＤＥ９Ａのものと最もホモロジーが高く、約３６％の同一性が見られた。
【００９４】
実施例３  プラスモジウム原虫ＰＤＥ（ＰｆＰＤＥ１）の大腸菌での発現と単離
（１）プラスモジウム原虫ＰＤＥの発現用ベクター構築
前記実施例２（２）で得たクローンのうち、正確な配列を有し、かつＰｆＰＤＥ１の触媒領域を含むと考えられた一つのＣ末端側領域クローンのｃＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ−ＳａｌＩで切断し、得られたＤＮＡ断片（約１ｋＢ）を哺乳類での発現用ベクターｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ（Invitrogen社製）のＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ切断部位に挿入した。
【００９５】
得られたプラスミドをさらに、ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩで消化し、得られたＤＮＡ断片（約１ｋＢ）を、細菌での発現用ベクターｐＱＥ−３２（Qiagen社製）のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ切断部位に挿入することにより、発現ベクターｐＱＥ−ＰｆＰＤＥ１△１を得た。
【００９６】
この発現ベクターｐＱＥ−ＰｆＰＤＥ１△１は、Ｔ５プロモーター／lacオペレーター下流に、ヒスチジンタグペプチドをコードするＤＮＡと、ＰｆＰＤＥ１の部分ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ断片が連結されている。
【００９７】
この発現ベクターにより、発現されるポリペプチドは、ＰｆＰＤＥ１のＮ末側の一部（６回膜貫通領域を含む領域）を欠く部分ポリペプチド（配列番号２における第５４０番目〜第８８４番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチド）
のＮ末端にヒスチジンタグペプチド（ヘキサヒスチジン）が付加されたポリペプチド（推定分子量  約４１ｋＤａ）である。
【００９８】
（２）大腸菌での発現
前記（１）で得た発現ベクターｐＱＥ−ＰｆＰＤＥ１△１を、大腸菌宿主ＪＭ１０９株（東洋紡社製）に導入し、形質転換株を得た。この形質転換株を、ＬＢ培地中で３７℃で一夜培養した後、新たな培地（２％グルコース含有ＬＢ培地）に１／１００容接種した。これを、３７℃で２時間、振とう培養した後、ＩＰＴＧ（isopropyl-1-thio-β-Ｄ-galactopyranoside）（最終濃度１ｍＭ）を添加し、２７℃、４時間、培養した。
【００９９】
（３）組換えポリペプチドの単離・精製
前記（２）で得た培養液から菌体を回収し、これを氷冷したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、氷冷した溶解用緩衝液（lysis buffer）（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５ｍＭベンズアミジン、５μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、５μｇ／ｍｌロイペプチン）中に再懸濁した。これを一回凍結解凍させた後、超音波破砕処理〔ソニケータにて、１５秒間ｘ５回（インターバル１分間）〕して破砕した。得られたホモジネートを遠心分離（16000ｘｇ、15分、４℃）し、上清を分取した。
【０１００】
ついで、以下のようにニッケルアフィニティーカラムを用いて精製を行った。すなわち、溶解用緩衝液で平衡化したニッケル−ニトリロトリアセテート樹脂（Qiagen製）に、前記で得た上清を供し、４℃で３時間振とうしインキュベートした。この樹脂をプラスチックカラム（０．８ｘ５ｃｍ）に充填した後、カラム中の樹脂を洗浄用緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５ｍＭベンズアミジン、２００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭイミダゾール、５μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、５μｇ／ｍｌロイペプチン）で洗浄し、さらに、溶出緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５ｍＭベンズアミジン、２００ｍＭ塩化ナトリウム、２００ｍＭイミダゾール、５μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、５μｇ／ｍｌロイペプチン）で溶出し、目的とするポリペプチドを含む画分を分取した。
これを溶解用緩衝液で透析した後、得られた精製組換えＰｆＰＤＥ１部分ポリペプチド溶液を−８０℃で保存し、用時解凍して用いた。
【０１０１】
（４）イムノブロッティング
前記（３）で得たポリペプチド溶液を12.5％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した後、ポリビニリデンジフロライドメンブレン（ミリポア製）にトランスファーした。このメンブレンを、ブロッキング処理した後、一次抗体として抗ペンタヒスチジンモノクローナル抗体（Qiagen社）で処理（室温、２時間）、ついで二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson Immuno Research Laboratories社製）で処理した後、ウエスタンブロッテイング用検出試薬（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出を行った。その結果、目的とするＰｆＰＤＥ１部分ポリペプチドの推定分子量約４１ｋＤａに相当する位置にシングルバンドが検出された。
実施例４  プラスモジウム原虫ＰＤＥ（ＰｆＰＤＥ１）のＰＤＥ活性および酵素的性質の解析
（１）ＰＤＥ活性の測定
ＰＤＥ活性の測定は、文献（Thompsonら、Adv.Cyclic Nucleotide Res.、10巻、69-92頁、1979年）記載の方法と同様にしてラジオラベル核酸法により行った。すなわち、非標識ｃＧＭＰ（又はｃＡＭＰ）及び１３ｎＭの［３Ｈ］−ｃＧＭＰ（又は５ｎＭの［３Ｈ］−ｃＡＭＰ）（Amersham Pharmacia Biotech製）を含むアッセイ用緩衝液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（又は１ｍＭ  ＭｎＣｌ２）、４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．３３ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン（Sigma製）〕５００μｌ中に８〜１０μｌの酵素溶液を添加して反応を開始した。
【０１０２】
３７℃で３０分間保温して反応を行った後、２分間煮沸して反応を停止させ、さらに１００μｌのヘビ毒（Crotalus atrox snake venom  １ｍｇ／ｍｌ）を添加して３７℃で３０分間保温した。ついで、５００μｌのメタノールを添加し、反応液をＤｏｗｅｘカラム（１ｘ８−４００）で処理した後、各溶出液に液体シンチレーションカクテルを加え、シンチレーションカウンターにてラジオ活性を測定した。
【０１０３】
前記実施例３の（３）で得た精製組換えＰｆＰＤＥ１部分ポリペプチドの溶液を酵素溶液として用いてＰＤＥ活性のアッセイを行った。その結果、このポリペプチドは、ｃＧＭＰを基質とするＰＤＥ活性（ｃＧＭＰを加水分解する活性）（約１ｐｍｏｌ／分／ｍｇ蛋白質）を有することがわかった。一方、ｃＡＭＰを基質とするＰＤＥ活性（ｃＡＭＰを加水分解する活性）は同ポリペプチドには認められなかった。
【０１０４】
（２）ＰＤＥ酵素反応における二価陽イオンの影響
精製組換えＰｆＰＤＥ１部分ポリペプチドを用い、酵素反応における二価陽イオン（Ｍｎイオン、ＭｇイオンおよびＣａイオン）の影響を調べた。その結果、ＰｆＰＤＥ１部分ポリペプチドは、二価陽イオンの存在によりそのＰＤＥ活性が高まることがわかった。また、Ｍｇイオンと比較してＭｎイオンの方がより強い活性化効果が認められ、終濃度１ｍＭのＭｎＣｌ２の添加により最大のＰＤＥ活性が得られた。
【０１０５】
（３）酵素反応の速度論的解析
精製組換えＰｆＰＤＥ１部分ポリペプチドを用い、種々の濃度の基質（ｃＧＭＰ）を用いて酵素反応を行い、ＰＤＥ活性（反応初速度）を測定した。酵素反応とＰＤＥ活性測定は、前記実施例４と同様にして行った。但し、反応液中、非標識ｃＧＭＰの濃度は０．０３１２５〜４μＭとした。
【０１０６】
その結果（Lineweaver-Burk plot）を、図２に示した。解析の結果から、ＰｆＰＤＥ１部分ポリペプチドのｃＧＭＰに対するＫｍ値は０．６５±０．０３３μＭであり、Ｖｍａｘは９１±４．１ｐｍｏｌ／分／ｍｇ蛋白質であった。
【０１０７】
実施例５  プラスモジウム原虫ＰＤＥ（ＰｆＰＤＥ１）に対する阻害活性のアッセイ
プラスモジウム原虫（プラスモジウム・ファルシパルム）から単離したＰＤＥ（ＰｆＰＤＥ１）の酵素活性に対する各種試験化合物の阻害活性を以下のようにして調べた。
【０１０８】
すなわち、前記実施例２の（３）で得た精製組換えＰｆＰＤＥ１部分ポリペプチドの溶液を酵素液として用い、前記実施例４と同様にＰＤＥ活性の測定を行った。但、反応液中には各種濃度（０〜１００μＭ）の試験化合物を添加し、試験化合物の存在下及び非存在下でのＰＤＥ活性を測定した。
【０１０９】
試験化合物としては、哺乳類ＰＤＥに対する阻害活性が知られている以下の化合物を用いた。
・ＩＢＭＸ（3-isobutyl-1-methylxanthine）
・パパベリン（papaverine）（化学名：1-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-6,7-dimethoxyisoquinoline）（文献：Brochmann-Hanssen etal., J.Pharm.Sci.,60巻:1672, 1971）
・テオフィリン（theophylline）
・ビンポセチン（vinpocetine）
・ＥＨＮＡ（erythro-9-(2-hydro-3-nonyl)-adenine）
・ミルリノン（milrinone）
・ロリプラム（rolipram）
・ジピリダモール（dipyridamole）（化学名：2,2',2'',2'''-(4,8-dipiperidinopyrimido[5,4-d]pyrimidine-2,6-diyldinitrilo)tetraethanol）
・Ｅ４０２１（化学名： sodium 1-[6-chloro-4-(3,4-methylenedioxybenzyl)aminoquinazolin-2-yl]piperidine-4-carboxylate）（文献名：WO93/07124）
・シルデナフィル（sildenafil）（化学名：5-(2-ethoxy-5-(4-methyl-1-piperazinylsulphonyl)phenyl)-1-methyl-3-n-propyl-1,6-dihydro-7H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-7-one）（文献：WO94/28902）
・ザプリナスト（zaprinast）（化学名：1,4-dihydro-5-[2-propoxyphenyl]-7H-1,2,3-triazolo[4,5-d]pyrimidine-7-one）（文献：WO96/05835 ）
〔パパベリン、Ｅ４０２１及びシルデナフィルは、文献記載の方法により合成したものを用い、他の試験化合物は市販のものを用いた。〕
結果を、表３に示した。
【０１１０】
【表３】
2006166706.tif 000004
【０１１１】
表３の通り、哺乳類ＰＤＥに対する非特異的阻害薬として知られているＩＢＭＸ、パパベリン、テオフィリンは、１００μＭ添加しても阻害活性は認められなかった。また、哺乳類ＰＤＥの各々１型、２型、３型及び４型に対して阻害活性を有することが知られているビンポセチン、ＥＨＮＡ、ミルリノン及びロリプラムにも、阻害活性は認められなかった。
【０１１２】
しかし、哺乳類ＰＤＥの５型に対する阻害活性を有することが知られているジピリダモール、Ｅ４０２１、シルデナフィルおよびザプリナストには、ＰｆＰＤＥ１部分ポリペプチドに対するＰＤＥ活性阻害活性が認められた。このうち、ザプリナストは、最も強い阻害活性を有することがわかった。
実施例６    抗マラリア活性の測定（in vitro）
文献（Kim ら、J.Med.Chem.、42巻、2604-2609頁、1999年）に記載の方法に従って、以下のように抗マラリア活性（in vitro）の測定を行った。
【０１１３】
プラスモジウム属原虫（プラスモジウム・ファルシパルムHonduras-1株）を前記実施例１の（１）と同様にヒト赤血球を用いて培養し、培養液を２４穴プレートに分注した（９９０μｌ／ウエル）。この培養液は、非同調的に行ったもの（asynchronously cultivated culture）であり、最終ヘマトクリットレベルが３％、赤血球感染率(parasitaemia)（原虫の寄生が見られる赤血球の割合）が ０．３％のものを用いた。ついで、この２４穴プレートに各種濃度の試験化合物（１０μｌ／ウエル）を添加した。ネガティブコントロールとしては、試験化合物不含の溶媒のみを添加した。
【０１１４】
試験化合物を添加したプレートを培養と同様の条件下で７２時間インキュベートした後、赤血球をギムザ染色し、顕微鏡下で観察した。各ウエル当１０００以上の赤血球について観察し原虫寄生の有無を判定して、感染率を調べた。この値から、培養前と比較した７２時間培養後の感染率増加を求めた。
【０１１５】
試験化合物としては、以下のものを用いた。
・ザプリナスト（zaprinast）（Sigma社製）
・ＩＢＭＸ（3-isobutyl-1-methylxanthine）（Sigma社製）
・8-Br-cAMP（8-bromoadenosine 3',5'-cyclicmonophosphate）（Sigma社製）
・8-Br-cGMP（8-bromoguanosine 3',5'-cyclicmonophosphate）（Sigma社製）
〔ザプリナストとＩＢＭＸは、ジメチルスフフォキシドに溶解して用いた。8-Br-cAMP及び 8-Br-cGMPは、蒸留水に溶解して用いた。〕
抗マラリア活性の測定（in vitro）結果を表４に示した。
【０１１６】
【表４】
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【０１１７】
表４に示した通り、ＩＢＭＸは、100μM添加した場合でも感染率の増加を抑制しなかったが、ザプリナストは、感染率の増加を抑制しそのＥＤ５０は約25-50μMであった。
【０１１８】
前記実施例１（３）及び実施例５で示したとおり、ＩＢＭＸは、哺乳類ＰＤＥの非選択的阻害薬として知られるが、プラスモジウム属原虫のＰＤＥに対しては阻害活性が認められなかった化合物である。一方、ザプリナストは、プラスモジウム属原虫の細胞抽出液中のＰＤＥ活性及び単離したＰｆＰＤＥ１の両者において、阻害活性が認めれた化合物である。このことから、ザプリナストの示した抗マラリア活性は、プラスモジウム属原虫のＰＤＥに対する阻害作用に基づくと考えられた。
【０１１９】
また、表４に示したように、抗マラリア活性の測定において、環状ヌクレオチド（cGMP及びcAMP）の誘導体である8-Br-cGMP及び8-Br-cAMPもまた感染率の増加を抑制したことから、ザプリナストの抗マラリア活性がＰＤＥ阻害に基づくものであることが裏付けられた。
【０１２０】
前記の通り、ザプリナストは抗マラリア活性を有することがわかった。また、プラスモジウム属原虫ＰＤＥ（及び単離したＰｆＰＤＥ１）に対する阻害活性を有する化合物は、抗マラリア活性を有すると考えられた。
【０１２１】
「配列表フリーテキスト」
配列番号３〜６のフリーテキスト
<223> 人工的に合成されたプライマーの配列（Artificially Synthesized Primer Sequence）
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  プラスモジウム属原虫のＰＤＥ（ＰｆＰＤＥ１）の模式図。
図中「Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ」は触媒領域を表し、図中の数字はＰｆＰＤＥ１ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸残基番号を示す。
【図２】  プラスモジウム属原虫のＰＤＥ（ＰｆＰＤＥ１）の部分ポリペプチドによるｃＧＭＰ加水分解反応の速度論的解析結果（Lineweaver-Burk plot）を示した図。図中「cGMP hydrolytic activity」は「ｃＧＭＰ加水分解活性」を表す。
【図１】
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【図２】
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