(57)【要約】【課題】 ドナー魚類由来の分離始原生殖細胞を異種のレシピエント魚類の初期胚に移植する分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法において、レシピエント由来の卵子及び／又は精子を形成させることなく、ドナー由来の卵子及び／又は精子を特異的に形成させる魚類の増殖或いは育種を効率よく行う方法を提供すること。【解決手段】 ドナー魚類由来の分離始原生殖細胞を異種のレシピエント魚類の初期胚に移植する分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法において、ドナーと異なるレシピエント魚類として３倍体魚類を用いることにより、レシピエント由来の卵子及び／又は精子を殆ど形成させることなく、ドナー由来の卵子及び／又は精子、特に雌においては殆どドナー由来の卵子を特異的に形成させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナー魚類由来の分離始原生殖細胞を、異種のレシピエント魚類（３倍体）の初期胚に移植することを特徴とする分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
【請求項２】
分離始原生殖細胞が、孵化前後の胚から分離した始原生殖細胞であることを特徴とする請求項１記載の分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
【請求項３】
異種のレシピエント魚類（３倍体）の初期胚への移植が、孵化前後の発生段階にある宿主の腹腔内腸管膜裏側への移植であることを特徴とする請求項１又は２記載の分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載の分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法により、ドナー魚類由来の卵子及び／又は精子を形成せしめることを特徴とする魚類の増殖方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドナー魚類由来の分離始原生殖細胞（２ｎ）を、異種のレシピエント魚類（３倍体）の初期胚に移植して、生殖細胞系列への分化誘導方法や、かかる分化誘導方法を利用したドナー魚類由来の卵子及び／又は精子を特異的に形成せしめるドナー魚類の増殖方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、魚類において、遺伝的に改変した或いは分離した細胞を、宿主個体に移植し、これを生殖細胞系列へ分化誘導する方法について、（１）ＥＳ細胞が生殖細胞系列に分化することが知られているマウスでは、未分化な状態を維持している細胞集団が、周辺細胞からの刺激により生殖細胞へと分化していくと考えられているのに対して、魚類においては、親の卵巣内で成熟途上の卵内に蓄積されたＲＮＡやタンパク質等の母性因子が、生殖細胞系列の決定に重要な役割を果たしており、そして、これらの母性因子が受精卵中に不均一に存在するため、細胞分裂により一部の割球のみがこの因子を受け取ることとなり、その結果、母性因子を受け取った一部の細胞のみが、将来生殖細胞系列へと分化していくと考えられること、（２）このような生殖細胞系列の決定機構を考慮すると、マウスにおいては生殖細胞系列に分化可能な細胞株に求められる条件は“未分化であること”であるが、魚類の場合は“生殖細胞への分化を決定する母性因子を含むこと”であること、（３）魚類において、遺伝的に改変した或いは分離した細胞を、宿主個体に移植し、これを生殖細胞系列へ分化誘導する際に用いるべき細胞（すなわち、宿主個体に移植後、卵子又は精子に分化し、次世代個体に改変可能な細胞）は、未分化な胚細胞ではなく、将来生殖細胞に分化することが決定付けられている生殖細胞の幹細胞、すなわち始原生殖細胞であること、（４）該始原生殖細胞を、魚類の初期胚に移植することにより、始原生殖細胞を、生殖細胞系列へ分化誘導することができること、（５）魚類由来の分離始原生殖細胞を、宿主魚類の初期胚への移植、特には、初期発生段階の宿主の腹腔内腸管膜裏側への移植により、該始原生殖細胞を生殖細胞系列への分化誘導を行うことが可能であること、を報告している（例えば、特許文献１参照）。そして、このような生殖細胞への分化誘導に関する研究を応用すれば、ヒラメを宿主とし、他のヒラメやカレイの仲間を借り腹で作ることも可能である。
【０００３】
他方、優良品質の魚の育種に３倍体を作製する技術が知られている。具体的には、染色体操作によって誘導した完全同型接合体の選抜によって、好ましくは通常魚をも対照群として該優良形質の個体を選び出すことによって、優良形質を遺伝的に固定し、これと、他の完全同型接合体もしくは通常魚と交配し、優良形質の品種を作出することを特徴とするヒラメ類の育種方法が知られている（例えば、特許文献２及び特許文献３参照）。また、三倍体のフナの胎盤部分を取り出し、金魚の胚に移植し、キメラを作ることにより、両者の卵を生産することも知られている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２３５５５８号公報
【特許文献２】特開平１０−３２７７０６号公報
【特許文献３】特開２０００−１３５０３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記特許文献１記載の分化誘導方法は極めて優れた方法であるが、ドナー魚類由来の分離始原生殖細胞を、異種のレシピエント魚類の初期胚に移植した場合、レシピエント魚類は、ドナー由来の卵子及び／又は精子を作ると共に、レシピエント由来の卵子及び／又は精子を作る。しかし、ドナー魚類の方が異種のレシピエント魚類よりも付加価値が高い場合など、ドナー由来の卵子及び／又は精子を特異的に形成させることが必要とされる場合がある。本発明の課題は、ドナー魚類由来の分離始原生殖細胞を異種のレシピエント魚類の初期胚に移植する分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法において、レシピエント由来の卵子及び／又は精子を形成させることなく、ドナー由来の卵子及び／又は精子を特異的に形成させる魚類の増殖或いは育種を効率よく行う方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究し、ドナー魚類由来の分離始原生殖細胞を異種のレシピエント魚類の初期胚に移植する分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法において、ドナーと異なるレシピエント魚類として３倍体魚類を用いることにより、レシピエント由来の卵子及び／又は精子が殆ど形成されることなく、ドナー由来の卵子及び／又は精子、特に雌においては殆どドナー由来の卵子が特異的に形成されることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、(１)ドナー魚類由来の分離始原生殖細胞を、異種のレシピエント魚類（３倍体）の初期胚に移植することを特徴とする分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法や、(２)分離始原生殖細胞が、孵化前後の胚から分離した始原生殖細胞であることを特徴とする請求項１記載の分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法や、(３)異種のレシピエント魚類（３倍体）の初期胚への移植が、孵化前後の発生段階にある宿主の腹腔内腸管膜裏側への移植であることを特徴とする上記(１)又は(２)記載の分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法や、(４)上記(１)〜(３)のいずれか記載の分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法により、ドナー魚類由来の卵子及び／又は精子を形成せしめることを特徴とする魚類の増殖方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、ドナー魚類由来の始原生殖細胞を用いて、これを異種のレシピエント魚類（３倍体）の初期胚に移植することにより、レシピエント由来の卵子及び／又は精子が殆ど形成されることなく、ドナー由来の卵子及び／又は精子、特に雌においては殆どドナー由来の卵子が特異的に形成されることから、例えば、分離した始原生殖細胞を、異種系統や異種の宿主個体（３倍体）に移植して、魚類等の借り腹としての利用が可能となり、この方法により、マグロのような巨大な種の始原生殖細胞を小型の近縁種に移植することで、異種系統や異種の宿主個体由来の稚魚が殆ど混じっていないのでこれらを分離する手間が省け、マグロ特異的な稚魚生産が可能となる。また、希少種、絶滅危惧種の始原生殖細胞を凍結保存し、必要な時に飼育が容易な近縁種に移植することにより、近縁種由来の卵子や精子が混じっていない希少種、絶滅危惧種特異的な遺伝子資源の保存への利用が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法としては、ドナー魚類由来の分離始原生殖細胞を、異種のレシピエント魚類（３倍体）の初期胚に移植する方法であれば特に制限されるものではなく、本発明の魚類の増殖方法としては、上記本発明の分化誘導方法により、ドナー魚類由来の卵子及び／又は精子を形成せしめる方法であれば特に制限されるものではなく、魚類としては海水魚、淡水魚等特に制限されず、異種の魚類としては同属異種や異属の魚類を挙げることができ、例えば、ドナーがニジマスの場合、同属異種としてヤマメ、異属としてブラウントラウト、イワナを具体的に例示することができる。
【００１０】
また、ドナー分離始原生殖細胞のレシピエントの初期胚への移植は、初期発生段階の宿主レシピエントの腹腔内腸管膜裏側への移植によって行うことができる。ドナー分離始原生殖細胞を、レシピエント（３倍体）の孵化胚の腹腔内に、マイクロインジェクション法のような方法で移植すると、移植した始原生殖細胞は、自発的に宿主生殖腺内へと移動し、そこで増殖、分化を誘導することができる。魚類においては、移植に用いる始原生殖細胞は、孵化前後の胚から分離した始原生殖細胞を用いることができ、又、宿主の初期胚への移植は、孵化前後の発生段階にある宿主レシピエント（３倍体）を用いることができる。
【００１１】
上記ドナーの始原生殖細胞を移植に用いるに際しては、該細胞の分離、精製を行い、取得することが好ましい。魚類の始原生殖細胞は、初期発生の限られた段階、例えば孵化前後の限られた初期発生の段階でのみ出現する細胞集団であることから、その取得のためには、その可視化を行い、分離、精製を可能として、取得を行うことが好ましい。始原生殖細胞の可視化には、本発明者らが報告した方法（Int. J. Dev. Biol.44: 323-326, 2000）を用いることができる。即ち、例えば、魚類の始原生殖細胞の可視化には、まず、魚類の生殖細胞で特異的に発現している遺伝子を取得し（Mol. Reprod. Develop. 55: 364-371, 2000）、その調節領域を利用する。魚類においては、ｖａｓａ遺伝子を利用することができる。ｖａｓａとは、ショウジョウバエでＦ１世代が不妊になる（Ｆ２世代が取れない）突然変異の原因遺伝子として単離され、生殖細胞におけるｍＲＮＡの翻訳に関与するＲＮＡヘリカーゼ活性を有するといわれている遺伝子で（蛋白質核酸酵素，43，356-363，1998）、ニジマスのような魚類においても、始原生殖細胞において特異的に発現しており、この遺伝子の発現を、始原生殖細胞の可視化に利用することができる。
【００１２】
始原生殖細胞の可視化に際して、始原生殖細胞において特異的に発現している遺伝子の発現を用いて、生体中で始原生殖細胞を標識して分離するためには、ｖａｓａ遺伝子のように生殖細胞で特異的に発現している遺伝子の調節領域に、例えば、生体中で始原生殖細胞を可視化しうるタンパク質等をコードするマーカー遺伝子を組込んだプラスミドを、魚類の受精卵の細胞質内に導入することによって行うことができる。該マーカー遺伝子としては、蛍光タンパク質ＦＰをコードする遺伝子、例えばオンワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（green fluorescent protein）やＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorecent Protein）のようなマーカー遺伝子を用いることができる。
【００１３】
可視化した始原生殖細胞を、生殖細胞組織から分離するには、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、孵化胚から始原生殖細胞を含む生殖隆起を回収し、これをタンパク質分解酵素でバラバラになるまで解離し、更にこれをセルソーターに掛けて、分取することができる。始原生殖細胞は、マーカー遺伝子の発現により、蛍光陽性に標識されているから、蛍光を発している生殖細胞と蛍光を発していない他の体細胞とを、セルソーターにより、容易に分離することができる。
【００１４】
取得した始原生殖細胞は、例えば、マイクロインジェクション等の適宜の方法により、初期発生段階のレシピエント（３倍体）の腹腔内腸管膜裏側への移植を行うことによって、始原生殖細胞は、自発的に宿主生殖腺内へと移動し、卵母細胞或いは精原細胞への分化誘導、更には卵子或いは精子への分化誘導を行うことができる。本発明の分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法は、これを、新規個体の作製に用いることができ、ドナー魚類の増殖方法に用いることができる。
【００１５】
ドナー魚類由来の分離始原生殖細胞を移植する３倍体のレシピエント魚類の作製方法としては特に制限されないが、実施例に記載されているように、通常２倍体魚類の雌親からの卵と、通常２倍体魚類の雄親からの精子を用いて、通常の方法で人工授精を施した後、１０℃の流水下で発生を開始させ、受精後１５分経過した後に２８℃の温水に浸漬し、その後１０℃の流水で通常卵となると同様に発生させる方法の他、通常２倍体魚類の雌親からの卵と、通常２倍体魚類の雄親からの精子を用いて、通常の方法で人工授精を施した後、圧力処理によって第二極体の放出を阻止することにより卵の染色体を三倍体化した受精卵を経て、３倍体稚魚を作出する方法や、紫外線やγ線によって不活性化した精子を卵にかけ、発生させることで雌性発生を行わせ、第二極体放出阻止法（発生の過程で、圧力刺激や温度刺激によって第二極体の放出を阻止して２倍体にする方法）又は第一卵割阻止法（発生の段階で第二極体を放出して雌性前核のみで発生を開始したところに、物理化学的な刺激を与え、第１回の卵割を阻止して２倍体とする方法）により染色体を倍加する方法や、雌魚を雄性ホルモン（テストステロン）で処理して、性転換を起こさせ雄化させ、この偽雄と普通の雌を交配する方法等を挙げることができる。３倍体のレシピエントとしては、殆どドナー由来の卵子が特異的に形成される雌が好ましい。
【００１６】
本発明の分離始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法の魚類の増殖方法への利用としては、該分化誘導方法を魚類の異種個体の卵子及び／又は精子の形成に用い、これを用いて魚類等の大量の増殖に利用することができる。本発明の増殖方法の特徴として、レシピエントとして３倍体宿主を用いるため殆ど始原生殖細胞を保持していない。ここにドナー由来の始原生殖細胞を移植することで、レシピエント（３倍体）宿主生殖腺内で、ドナー始原生殖細胞に由来する卵・精子、が殆どを占めることになる。
【００１７】
また、ドナー始原生殖細胞は孵化前後の極めて若い胚に由来するため、元来その増殖能力が極めて高く、移植後の異種の３倍体宿主個体内であっても、その増殖が極めて早いことが確認されている。さらに精原細胞の移植では精子しか作れないが、始原生殖細胞は性が分化する以前の細胞であるため、卵・精子の両者の形成が可能である。ちなみに魚類では卵の凍結保存技術が完成していないため、本始原生殖細胞を凍結保存後、移植により卵・精子を作れば遺伝子始原の保存と技術となる。
【００１８】
（実施例）
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。本発明の実施例として、ニジマスを用いた例を示し、本発明を説明する。
【００１９】
（実施例１）
［ヤマメ（３倍体）の調製］
宿主となるヤマメ（３倍体）の調製は、通常２倍体ヤマメの雌親からの卵と、通常２倍体ヤマメの雄親からの精子を用いて、通常の方法で人工授精を施した後、１０℃の流水下で発生を開始させ、受精後１５分経過した後に２８℃の温水に浸漬し、その後１０℃の流水で通常卵となると同様に発生させ、受精後３５日に達した個体を宿主ヤマメ（３倍体）として実験に供した。なお、受精後３５日に達した段階の幼魚の３倍体化率を、ＤＮＡ量の顕微測光法で調べたところ、９９．８％であり、殆どの幼魚が３倍体となっていた。
【００２０】
（実施例２）
［分離した始原生殖細胞のヤマメ（３倍体）初期胚での分化誘導］
（分離始原生殖細胞のヤマメ（３倍体）初期胚への導入）
特開２００３−２３５５５８号公報記載の方法により、ニジマスのｖａｓａ遺伝子の発現調節領域にオワンクラゲ由来のＧＦＰ遺伝子を接続し、可視化したニジマスの始原生殖細胞（２倍体）を、異種個体である宿主ヤマメ（３倍体）の初期胚に導入した。このＧＦＰ遺伝子を導入した始原生殖細胞は特異的に緑色蛍光を発するため、生きたヤマメ（３倍体）個体内で可視化することができる。ヤマメ（３倍体）の初期胚への始原生殖細胞の導入は、ニジマスの孵化前後の胚（水温１０℃で飼育した場合、受精後３０−４０日の胚、孵化は受精後３２日）から、前記の方法で単離した始原生殖細胞１０個程度を、マイクロインジェクターに装着したガラス製のマイクロピペットで吸引し、同じ初期発生段階のヤマメ（３倍体）個体の腹腔内腸管膜裏側に移植した。
【００２１】
（移植した始原生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導）
初期発生段階のヤマメ（３倍体）個体の腹腔内腸管膜裏側に移植した始原生殖細胞は、自発的に未熟生殖腺に向かって移動を開始し、そこで生殖腺内に取り込まれる。導入効率の確認は、移植後に経時的に宿主生殖線を蛍光観察し、ドナー由来の生殖細胞の割合を調査した。移植後、６０日目において、移植した始原生殖細胞が生殖腺中の生殖隆起へ移動し、生殖隆起内に取り込まれて、更に増殖しているのが観察された。その後、移植した始原生殖細胞は、宿主レシピエント生殖腺内で効率よく増殖し、精巣において精原細胞に、卵巣において卵原細胞・卵母細胞に分化誘導しているのが観察された。これらの卵母細胞や精原細胞は、ヤマメ（３倍体）個体内で、卵子又は精子に分化するので、これらの生殖細胞を用いることにより、新しいニジマス個体を作製することができる。
【００２２】
（実施例３）
［精子・卵子の形成］
ニジマスの始原生殖細胞（２倍体）を移植したヤマメ（３倍体）レシピエント（recipient）を、移植１８ヶ月後に精巣と卵巣の蛍光顕微鏡による解剖観察を行った。対照としては、移植したヤマメ（３倍体）レシピエント（recipient）と同ステージの移植をしなかった３倍体ヤマメ（3n control）、及びニジマスの始原生殖細胞（２倍体）を移植した移植１８ヶ月後ヤマメ（２倍体）レシピエント（2n control）を用いた。精巣における解剖結果を図１（参考写真１）に、卵巣における解剖結果を図２（参考写真２）に示す。図１からわかるように、ヤマメ（３倍体）レシピエント（recipient）精巣内に大きなコロナイズが認められた。また、図２からわかるように、ヤマメ（２倍体）レシピエント（2n control）と同程度に発達したドナー由来の卵がヤマメ（３倍体）レシピエント（3n recipient）の卵巣を満たしていた。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ニジマスの始原生殖細胞（２倍体）を移植したヤマメ（３倍体）レシピエント（recipient）の精巣の移植１８ヶ月後における解剖観察の結果を示す図である。
【図２】ニジマスの始原生殖細胞（２倍体）を移植したヤマメ（３倍体）レシピエント（3n recipient）の卵巣の移植１８ヶ月後における解剖観察の結果を示す図である。
【図１】
2006101845.tif 000002
【図２】
2006101845.tif 000003