(57)【要約】      （修正有）【課題】  タンパク質工学的手法により分子シャペロン活性が増強されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを提供する。【解決手段】  特定のアミノ酸配列からなるモチーフを含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子に対して、特定の５箇所のうちの少なくとも１箇所のコドン置換を行い、別のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子を作製する。また、特定のアミノ酸配列からなるモチーフを含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子に対して、特定の１箇所のコドン置換を行い、別のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子を作製する。当該別のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、元のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅに比べて分子シャペロン活性が高い。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１乃至３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるモチーフを含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子に対して、下記工程、
（１）前記モチーフのＮ末端のアミノ酸がＰｈｅ以外である場合に、該アミノ酸に対応するコドンをＰｈｅに対応するコドンに置換する工程、
（２）前記モチーフのＮ末端から９番目のアミノ酸がＧｌｕ以外である場合に、該アミノ酸に対応するコドンをＧｌｕに対応するコドンに置換する工程、
（３）前記モチーフのＮ末端から１０番目のアミノ酸がＶａｌ以外である場合に、該アミノ酸に対応するコドンをＶａｌに対応するコドンに置換する工程、
（４）前記モチーフのＮ末端から１４番目のアミノ酸がＴｒｐ以外である場合に、該アミノ酸に対応するコドンをＴｒｐに対応するコドンに置換する工程、
（５）前記モチーフのＣ末端から２番目のアミノ酸がＩｌｅ以外である場合に、該アミノ酸に対応するコドンをＩｌｅに対応するコドンに置換する工程、
の少なくとも１つを行うことにより、前記遺伝子に変異を導入し、別のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子を作製することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法。
【請求項２】
前記モチーフは、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法。
【請求項３】
前記モチーフを含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項２に記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法。
【請求項４】
配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるモチーフを含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子に対して、前記モチーフのＣ末端のアミノ酸がＰｈｅ以外である場合に、該アミノ酸に対応するコドンをＰｈｅに対応するコドンに置換することにより、前記遺伝子に変異を導入し、別のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子を作製することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法。
【請求項５】
前記モチーフは、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項４に記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法。
【請求項６】
前記モチーフを含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項５に記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法によって製造されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を転写及び翻訳させることにより、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを合成することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの製造方法。
【請求項８】
配列番号９で表されるアミノ酸配列（５６番目のアミノ酸がＬｅｕ、６４番目のアミノ酸がＧｌｎ、６５番目のアミノ酸がＭｅｔ、６９番目のアミノ酸がＰｈｅ、かつ１０３番目のアミノ酸がＬｅｕである場合を除く）からなる単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ。
【請求項９】
配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５又は２７で表されるアミノ酸配列からなる単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ。
【請求項１０】
配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなる単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ。
【請求項１１】
請求項８乃至１０のいずれかに記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする単離された
ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を含有する発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子からなる第１コード領域と、少なくとも１つの制限酵素サイトを有し、前記制限酵素サイトに目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することによりＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１４】
前記制限酵素サイトは、前記第１コード領域の下流に位置することを特徴とする請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
前記第１コード領域と前記制限酵素サイトの間に、ペプチドリンカーをコードする塩基配列を有することを特徴とする請求項１３又は１４に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
前記ペプチドリンカーは、プロテアーゼ消化アミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１３乃至１６のいずれかに記載の発現ベクターの制限酵素サイトに、目的タンパク質をコードする第２コード領域が組み込まれていることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１８】
前記第２コード領域は、抗体又は抗体の部分断片をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１７に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
前記第２コード領域は、膜タンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１７に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１２乃至１９のいずれかに記載の発現ベクターを含有する形質転換体。
【請求項２１】
宿主が大腸菌であることを特徴とする請求項２０に記載の形質転換体。
【請求項２２】
請求項８乃至１０のいずれかに記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質。
【請求項２３】
前記ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと前記目的タンパク質との間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
請求項１７に記載の発現ベクターに組み込まれた第１コード領域及び第２コード領域を転写及び翻訳させ、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を合成することを特徴とする融合タンパク質の製造方法。
【請求項２５】
請求項１７に記載の発現ベクターに組み込まれた第１コード領域及び第２コード領域を転写及び翻訳させ、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質の融合タンパク質を合成し、次いで、該融合タンパク質から目的タンパク質を切り出すことを特徴とする目的タンパク質の製造方法。
【請求項２６】
前記発現ベクターは第１コード領域と第２コード領域の間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、第１コード領域と、プロテアーゼ消化アミノ酸配列をコードする塩基配列と、第２コード領域とを転写及び翻訳させ、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列を有する融合タンパク質を合成
し、該融合タンパク質に該プロテアーゼを作用させることにより目的タンパク質を切り出すことを特徴とする請求項２５に記載の目的タンパク質の製造方法。
【請求項２７】
請求項８乃至１０のいずれかに記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子を同一宿主内で共発現させることにより、宿主内で目的タンパク質にＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを作用させ、目的タンパク質を可溶化し、宿主の可溶画分から目的タンパク質を採取することを特徴とする目的タンパク質の製造方法。
【請求項２８】
請求項８乃至１０のいずれかに記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを変性した目的タンパク質に作用させることにより、変性した目的タンパク質を正しく折り畳み、変性した目的タンパク質を再生することを特徴とする目的タンパク質の再生方法。
【請求項２９】
請求項８乃至１０のいずれかに記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを目的タンパク質に作用させることにより、目的タンパク質が変性することを抑制し、目的タンパク質を安定化させることを特徴とする目的タンパク質の安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子及びＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの製造方法、単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ及びその遺伝子、発現ベクター、形質転換体、融合タンパク質及びその製造方法、目的タンパク質の製造方法、目的タンパク質の再生方法、並びに、目的タンパク質の安定化方法に関し、さらに詳細には、タンパク質工学的手法により分子シャペロン活性が増強された変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子の製造方法、タンパク質工学的手法により分子シャペロン活性が増強された変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの製造方法、高い分子シャペロン活性を有する単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する発現ベクター、該発現ベクターを含有する形質転換体、該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質及びその製造方法、該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを利用した目的タンパク質の製造方法、該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを利用した目的タンパク質の再生方法、並びに、該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを利用した目的タンパク質の安定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、種々の生物のゲノム解析が終了しつつあり、今後の研究は、遺伝子の発現産物であるタンパク質の網羅的な機能解析へと進むものと考えられている。即ち、個々のタンパク質の性質を明らかにするとともに、タンパク質同士の相互作用を網羅的に解析することで、生命現象解明の一助としようとする研究が急速に増加しつつある。なかでも、各種の生理活性物質と特異的に結合し、その作用を伝達する細胞内受容体タンパク質は、その受容体タンパク質と結合する活性物質が新規医薬品の候補物質となり得ることから、その３次元構造決定に重大な関心が持たれている。
【０００３】
タンパク質の性質を決定しようとする場合は、そのタンパク質を組換えＤＮＡ技術によって大量に合成し、解析試料とすることが多い。すなわち、目的タンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み、該発現ベクターをバクテリア、酵母、昆虫細胞等の宿主に導入し、宿主内で目的タンパク質の遺伝子を発現させ、得られた組換えタンパク質の性質を調べる方法が一般的である。
【０００４】
しかし、タンパク質の性質を正確に評価するためには、一次構造のみならず三次元的な立体構造が極めて重要であるところ、上記のようにして得られた組換えタンパク質においては、宿主内で折り畳み反応が正しく行われず、正しい立体構造を有しない異常型タンパク質としてしか得られないケースにしばしば遭遇する。さらに、このような異常型タンパク質は可溶性ではなく封入体と呼ばれる不溶性の凝集体として得られることが多い。例えば、目的タンパク質が抗体の場合、大腸菌を宿主とすると、合成された組換えタンパク質のほとんどが不溶性の封入体となることが知られている（非特許文献１）。また、細胞内受容体タンパク質のように、元々は生体膜の表面上または内部に埋もれて存在しているタンパク質が目的タンパク質である場合も、組換えタンパク質として発現させると封入体になりやすい。そして、いったん封入体となった異常型タンパク質を折り畳み直して正しい立体構造に戻すことは予想以上に困難であり、成功しないことが多い。
【０００５】
そこで、封入体の形成を回避するために、折り畳み因子と呼ばれるタンパク質を利用する方法が提案されている。折り畳み因子は、非酵素的に働く「分子シャペロン」と酵素的に働く「フォルダーゼ」に分類されている。このうち、フォルダーゼの一種であるペプチ
ジル−プロリル  シス−トランス  イソメラーゼ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ。以下、「ＰＰＩａｓｅ」と称する。）は、細胞内で折り畳み途上のタンパク質中のアミノ酸のうち、プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシス−トランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）を有するものである。そして、古細菌に由来するＦＫＢＰ（ＦＫ５０６  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）型ＰＰＩａｓｅは、ＰＰＩａｓｅ活性のみならず、分子シャペロン活性をも有することが知られている。ここで、「分子シャペロン活性」とは、タンパク質の不可逆的凝集を抑制すると同時に、変性タンパク質の再折り畳みを促進させる活性と定義される。そして、この分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを用いて、正常型のタンパク質を得る方法が提案されている（特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。この古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅが有する分子シャペロン活性は、分子シャペロンの一種であるシャペロニンが有する分子シャペロン活性と異なり、その活性発現にＡＴＰ等の高エネルギー物質を必要としない点で優れている。
【０００６】
一方、アミノ酸置換等のタンパク質工学的手法によって既知のタンパク質を改変し、新たな活性や性質をもつタンパク質を作製する技術が開発されている。例えば、特許文献２には、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのＥＸＯＩ領域のヒスチジンを他のアミノ酸に置換することにより、よりフィデリティの高い新規の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを作製した旨が記載されている。
【特許文献１】国際公開２００４／００１０４１号パンフレット
【特許文献２】特開２００２−２５３２６５号公報
【非特許文献１】プルックサン（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ）、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第９巻、第５４５頁〜、１９９１年
【非特許文献２】古谷（Ｆｕｒｕｔａｎｉ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３９巻、第４５３頁〜、２０００年
【非特許文献３】井手野（Ｉｄｅｎｏ）、ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第２６７巻、第３１３９頁〜、２０００年
【非特許文献４】井手野（Ｉｄｅｎｏ）、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．）、第３５７巻、第４６５頁〜、２００１年
【非特許文献５】井手野（Ｉｄｅｎｏ）、アプライド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、第６８巻、第４６４頁−、２００２年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのように分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅによって目的タンパク質を折り畳む場合は、当該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの分子シャペロン活性が高いほど、より高効率で折り畳み反応が行なわれる。そのためにも、より高い分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅが求められている。この際、タンパク質工学的手法を既知のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅに施すことによって、より高い分子シャペロン活性を有する新規のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを作製することが考えられる。例えば、アミノ酸置換によって、分子シャペロン活性が増強された新規のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを作製することができれば、タンパク質の折り畳みをより高効率で行なうことができると考えられる。
【０００８】
しかし、タンパク質の立体構造予測や立体構造と機能の相関解析が容易でない現在の技術では、所望の性質をもつタンパク質を自在に設計することは不可能である。例えば、アミノ酸置換によってタンパク質を改変する場合、所望の活性や性質をもつものを得るために、どのアミノ酸を何のアミノ酸に置換すればよいかは試行錯誤によるしかない。しかも
、アミノ酸置換によって所望の活性や性質をもつタンパク質が必ず得られるという保証はない。むしろ、不用意にアミノ酸置換を行なうと、本来有していた活性が消失することもある。したがって、アミノ酸置換によってより高い分子シャペロン活性を有する新規のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを作製する場合も、どのアミノ酸を置換すればよいかは全く不明であり、所望のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅが作製できる保証もない。
【０００９】
本発明の目的は、タンパク質工学的手法により分子シャペロン活性が増強されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを提供し、より高効率で目的タンパク質を正しく折り畳むことができる技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、特定のモチーフを含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅについてアミノ酸置換による改変を試みた結果、分子シャペロン活性に関連する６箇所のアミノ酸を見出した。そして、当該６箇所の少なくとも１箇所を特定のアミノ酸に置換することにより、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの分子シャペロン活性を高められることを見出し、本発明を完成した。すなわち、上記した課題を解決するための本発明の要旨は以下の通りである。
【００１１】
請求項１に記載の発明は、配列番号１乃至３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるモチーフを含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子に対して、下記工程、
（１）前記モチーフのＮ末端のアミノ酸がＰｈｅ以外である場合に、該アミノ酸に対応するコドンをＰｈｅに対応するコドンに置換する工程、
（２）前記モチーフのＮ末端から９番目のアミノ酸がＧｌｕ以外である場合に、該アミノ酸に対応するコドンをＧｌｕに対応するコドンに置換する工程、
（３）前記モチーフのＮ末端から１０番目のアミノ酸がＶａｌ以外である場合に、該アミノ酸に対応するコドンをＶａｌに対応するコドンに置換する工程、
（４）前記モチーフのＮ末端から１４番目のアミノ酸がＴｒｐ以外である場合に、該アミノ酸に対応するコドンをＴｒｐに対応するコドンに置換する工程、
（５）前記モチーフのＣ末端から２番目のアミノ酸がＩｌｅ以外である場合に、該アミノ酸に対応するコドンをＩｌｅに対応するコドンに置換する工程、
の少なくとも１つを行うことにより、前記遺伝子に変異を導入し、別のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子を作製することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法である。
【００１２】
本発明はＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法に係り、配列番号１乃至３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるモチーフを含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子の５箇所のコドンのうちの少なくとも１個を、別のアミノ酸に対応するコドンに置換し、別のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を製造する。本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法によれば、当該モチーフを含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅにアミノ酸置換を施すことにより、分子シャペロン活性が高められた変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを作製する際に有用な、当該変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子を製造することができる。そして、製造された当該遺伝子を発現させることにより、元のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅよりも分子シャペロン活性が高い変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを製造することができる。
【００１３】
また請求項２に記載の発明は、前記モチーフは、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法である。
【００１４】
本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法においては、前記モチーフが配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子の、５
箇所のコドンのうちの少なくとも１個を、別のアミノ酸に対応するコドンに置換し、別のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を製造する。配列番号４で表される当該モチーフは、古細菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅによくみられるものである。かかる構成により、古細菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子から、元のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅよりも分子シャペロン活性が高い変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子を得ることができる。
【００１５】
また請求項３に記載の発明は、前記モチーフを含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項２に記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法である。
【００１６】
本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法においては、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子の５箇所のコドンのうちの少なくとも１個を、別のアミノ酸に対応するコドンに置換し、別のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を製造する。配列番号５で表されるアミノ酸配列は、例えば、ある種の常温性古細菌が有している。かかる構成により、常温性古細菌等由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子から、元のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅよりも分子シャペロン活性が高い変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子を得ることができる。
【００１７】
また請求項４に記載の発明は、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるモチーフを含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子に対して、前記モチーフのＣ末端のアミノ酸がＰｈｅ以外である場合に、該アミノ酸に対応するコドンをＰｈｅに対応するコドンに置換することにより、前記遺伝子に変異を導入し、別のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子を作製することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法である。
【００１８】
本発明はＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法に係り、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるモチーフを含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子の１個のコドンを、別のアミノ酸に対応するコドンに置換し、別のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を製造する。本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法によれば、当該モチーフを含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅにアミノ酸置換を施すことにより、分子シャペロン活性が高められた変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを作製する際に有用な、当該変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子を製造することができる。そして、製造された当該遺伝子を発現させることにより、元のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅよりも分子シャペロン活性が高い変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを製造することができる。
【００１９】
また請求項５に記載の発明は、前記モチーフは、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項４に記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法である。
【００２０】
本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法においては、前記モチーフが配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子の１個のコドンを、別のアミノ酸に対応するコドンに置換し、別のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を製造する。配列番号７で表される当該モチーフは、古細菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅによくみられるものである。かかる構成により、古細菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子から、元のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅよりも分子シャペロン活性が高い変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子を得ることができる。
【００２１】
また請求項６に記載の発明は、前記モチーフを含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項５に記載のＦＫＢＰ型ＰＰ
Ｉａｓｅ遺伝子の製造方法である。
【００２２】
本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法においては、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子の１個コドンを、別のアミノ酸に対応するコドンに置換し、別のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を製造する。配列番号８で表されるアミノ酸配列は、例えば、ある種の超好熱性古細菌が有している。かかる構成により、超好熱性古細菌等由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子から、元のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅよりも分子シャペロン活性が高い変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子を得ることができる。
【００２３】
また請求項７に記載の発明は、請求項１乃至６のいずれかに記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法によって製造されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を転写及び翻訳させることにより、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを合成することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの製造方法である。
【００２４】
本発明はＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの製造方法に係り、コドンが置換された変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を転写及び翻訳させ、アミノ酸置換された変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを合成する。かかる構成により、元のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅよりも分子シャペロン活性が高い変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを製造することができる。
【００２５】
また請求項８に記載の発明は、配列番号９で表されるアミノ酸配列（５６番目のアミノ酸がＬｅｕ、６４番目のアミノ酸がＧｌｎ、６５番目のアミノ酸がＭｅｔ、６９番目のアミノ酸がＰｈｅ、かつ１０３番目のアミノ酸がＬｅｕである場合を除く）からなる単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅである。
【００２６】
本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、特定のアミノ酸配列からなるものであり、３１種のアミノ酸配列のいずれかを有する。本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは高い分子シャペロン活性を有するので、目的タンパク質をより高効率で折り畳むことができる。
【００２７】
また請求項９に記載の発明は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５又は２７で表されるアミノ酸配列からなる単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅである。
【００２８】
本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、特定のアミノ酸配列からなるものであり、９種のアミノ酸配列のいずれかを有する。本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは高い分子シャペロン活性を有するので、目的タンパク質をより高効率で折り畳むことができる
【００２９】
さらに請求項１０に記載の発明は、配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなる単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅである。
【００３０】
本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、特定のアミノ酸配列からなるものである。本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは高い分子シャペロン活性を有するので、目的タンパク質をより高効率で折り畳むことができる
【００３１】
また請求項１１に記載の発明は、請求項８乃至１０のいずれかに記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子である。
【００３２】
本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子は、高い分子シャペロン活性を有す
るＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする。本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を転写及び翻訳させることにより、高い分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを製造することができる。
【００３３】
また請求項１２に記載の発明は、請求項１１に記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を含有する発現ベクターである。
【００３４】
本発明の発現ベクターは、高い分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子を含有する。本発明の発現ベクターによれば、発現ベクター上のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を転写及び翻訳させることにより、高い分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを製造することができる。
【００３５】
また請求項１３に記載の発明は、請求項１１に記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子からなる第１コード領域と、少なくとも１つの制限酵素サイトを有し、前記制限酵素サイトに目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することによりＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができることを特徴とする発現ベクターである。
【００３６】
さらに請求項１４に記載の発明は、前記制限酵素サイトは、前記第１コード領域の下流に位置することを特徴とする請求項１３に記載の発現ベクターである。
【００３７】
本発明の発現ベクターは、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子からなる第１コード領域と少なくとも１つの制限酵素サイトを有する。そして、制限酵素サイトに目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することにより、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる。本発明の発現ベクターにおいては、第１コード領域がコードするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅが高い分子シャペロン活性を有するので、発現された融合タンパク質に含まれる目的タンパク質はより高効率で正しく折り畳まれる。
【００３８】
また請求項１５に記載の発明は、前記第１コード領域と前記制限酵素サイトの間に、ペプチドリンカーをコードする塩基配列を有することを特徴とする請求項１３又は１４に記載の発現ベクターである。
【００３９】
本発明の発現ベクターにおいては、前記第１コード領域と前記制限酵素サイトの間に、ペプチドリンカーをコードする塩基配列を有する。そして、当該リンカーペプチドに所望の機能を有するものを選択することにより、発現される融合タンパク質に新しい機能を付加することができる。
【００４０】
また請求項１６に記載の発明は、前記ペプチドリンカーは、プロテアーゼ消化アミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１５に記載の発現ベクターである。
【００４１】
本発明の発現ベクターにおいては、前記第１コード領域と前記制限酵素サイトの間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列が含まれている。かかる構成により、発現される融合タンパク質にプロテアーゼを作用させることにより、正しく折り畳まれた目的タンパク質を切り出すことができる。
【００４２】
また請求項１７に記載の発明は、請求項１３乃至１６のいずれかに記載の発現ベクターの制限酵素サイトに、目的タンパク質をコードする第２コード領域が組み込まれていることを特徴とする発現ベクターである。
【００４３】
かかる構成により、高い分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を製造することができる。
【００４４】
また請求項１８に記載の発明は、前記第２コード領域は、抗体又は抗体の部分断片をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１７に記載の発現ベクターである。
【００４５】
かかる構成により、高い分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと抗体又は抗体の部分断片との融合タンパク質を製造することができる。その結果、該融合タンパク質から正常に折り畳まれた抗体又は抗体の部分断片を切り出すことができる。
【００４６】
また請求項１９に記載の発明は、前記第２コード領域は、膜タンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１７に記載の発現ベクターである。
【００４７】
かかる構成により、高い分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと抗体又は抗体の部分断片との融合タンパク質を製造することができる。その結果、該融合タンパク質から正常に折り畳まれた膜タンパク質を切り出すことができる。
【００４８】
また請求項２０に記載の発明は、請求項１２乃至１９のいずれかに記載の発現ベクターを含有する形質転換体である。
【００４９】
本発明の形質転換体を培養することにより、該培養物からより高い分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、又は該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を採取することができる。
【００５０】
また請求項２１に記載の発明は、宿主が大腸菌であることを特徴とする請求項２０に記載の形質転換体である。
【００５１】
本発明の形質転換体においては宿主が大腸菌であるので、培養が容易である。その結果、高い分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、又は該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を大量に生産することができる。
【００５２】
また請求項２２に記載の発明は、請求項８乃至１０のいずれかに記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質である。
【００５３】
本発明の融合タンパク質は、高い分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質とからなる。かかる構成により、高効率で目的タンパク質は正しく折り畳まれる。
【００５４】
また請求項２３に記載の発明は、前記ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと前記目的タンパク質との間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２２に記載の融合タンパク質である。
【００５５】
かかる構成により、融合タンパク質にプロテアーゼを作用させることにより、正しく折り畳まれた目的タンパク質を切り出すことができる。
【００５６】
また請求項２４に記載の発明は、請求項１７に記載の発現ベクターに組み込まれた第１コード領域及び第２コード領域を転写及び翻訳させ、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を合成することを特徴とする融合タンパク質の製造方法である。
【００５７】
本発明の融合タンパク質の製造方法によれば、高い分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を製造することができる。
【００５８】
また請求項２５に記載の発明は、請求項１７に記載の発現ベクターに組み込まれた第１コード領域及び第２コード領域を転写及び翻訳させ、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質の融合タンパク質を合成し、次いで、該融合タンパク質から目的タンパク質を切り出すことを特徴とする目的タンパク質の製造方法である。
【００５９】
本発明の目的タンパク質の製造方法においては、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質の融合タンパク質から目的タンパク質を切り出す。本発明の目的タンパク質の製造方法においては、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅが高い分子シャペロン活性を有するものであるので、より確実に正常に折り畳まれた目的タンパク質を製造することができる。
【００６０】
また請求項２６に記載の発明は、前記発現ベクターは第１コード領域と第２コード領域の間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、第１コード領域と、プロテアーゼ消化アミノ酸配列をコードする塩基配列と、第２コード領域とを転写及び翻訳させ、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列を有する融合タンパク質を合成し、該融合タンパク質に該プロテアーゼを作用させることにより目的タンパク質を切り出すことを特徴とする請求項２５に記載の目的タンパク質の製造方法である。
【００６１】
本発明の目的タンパク質の製造方法においては、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列を有する融合タンパク質を用いる。かかる構成により、正しく折り畳まれた目的タンパク質を容易に切り出すことができる。
【００６２】
また請求項２７に記載の発明は、請求項８乃至１０のいずれかに記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子を同一宿主内で共発現させることにより、宿主内で目的タンパク質にＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを作用させ、目的タンパク質を可溶化し、宿主の可溶画分から目的タンパク質を採取することを特徴とする目的タンパク質の製造方法である。
【００６３】
本発明の目的タンパク質の製造方法は、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子を同一宿主内で共発現させるものである。本発明の目的タンパク質の製造方法によれば、目的タンパク質を切り出す必要がなく、目的タンパク質の製造が容易である。
【００６４】
また請求項２８に記載の発明は、請求項８乃至１０のいずれかに記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを変性した目的タンパク質に作用させることにより、変性した目的タンパク質を正しく折り畳み、変性した目的タンパク質を再生することを特徴とする目的タンパク質の再生方法である。
【００６５】
本発明は目的タンパク質の再生方法に係り、変性した目的タンパク質に高い分子シャペロン活性のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを作用させ、目的タンパク質を正しく折り畳み直すことにより再生する。本発明の目的タンパク質の再生方法では、高い分子シャペロン活性のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを用いるので、再生効率が高い。
【００６６】
また請求項２９に記載の発明は、請求項８乃至１０のいずれかに記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを目的タンパク質に作用させることにより、目的タンパク質が変性することを抑制し、目的タンパク質を安定化させることを特徴とする目的タンパク質の安定化方法である。
【００６７】
本発明は目的タンパク質の安定化方法に係り、目的タンパク質に高い分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを作用させ、目的タンパク質が変性することを抑制し、目的タンパク質を安定化する。本発明の目的タンパク質の安定化方法では、高い分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを用いるので、安定化の効率が高い。
【発明の効果】
【００６８】
本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法によれば、上記したモチーフを含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅにアミノ酸置換を施すことにより、分子シャペロン活性が高められた変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを作製する際に有用な、当該変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子を製造することができる。
【００６９】
本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの製造方法によれば、アミノ酸置換により分子シャペロン活性が高められた変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを製造することができる。
【００７０】
本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅによれば、より高効率で目的タンパク質を正しく折り畳むことができる。
【００７１】
本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子によれば、高い分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを製造することができる。
【００７２】
本発明の発現ベクターによれば、発現ベクター上の遺伝子を発現させることにより、高い分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、又は該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を製造することができる。
【００７３】
本発明の形質転換体によれば、その培養物から高い分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を採取することができる。
【００７４】
本発明の融合タンパク質によれば、目的タンパク質を高効率で正しく折り畳むことができる。
【００７５】
本発明の融合タンパク質の製造方法によれば、目的タンパク質を高効率で正しく折り畳むことができる融合タンパク質を容易に製造することができる。
【００７６】
本発明の目的タンパク質の製造方法によれば、正しく折り畳まれた目的タンパク質を高効率で製造することができる。
【００７７】
本発明の目的タンパク質の再生方法によれば、変性した目的タンパク質を高効率で正しく折り畳み直すことができる。
【００７８】
本発明の目的タンパク質の安定化方法によれば、目的タンパク質が変性することを高効率で抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７９】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、詳しく説明する。
【００８０】
本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法は、アミノ酸置換によりＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを改変する際に必要な、改変されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を製造するものである。本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法の一つの様相は、配列
番号１乃至３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるモチーフ（以下、「モチーフＡ」と称する。）を含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の５箇所のコドンのうちの少なくとも１個を、別のアミノ酸に対応するコドンに置換し、別のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を製造するものである。配列番号１、２、３で表されるアミノ酸番号、置換前のコドンに対応するアミノ酸、後述の一般式（Ｉ）における記号、及び置換後のコドンに対応するアミノ酸をまとめた表を表１に示す。
【表１】
2006166845.tif 000002
【００８１】
表１に示すように、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるモチーフＡ（モチーフＡ−１）、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるモチーフＡ（モチーフＡ−２）、
配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるモチーフＡ（モチーフＡ−３）はそのアミノ酸配列の大部分が共通している。すなわち、これら３種のモチーフＡは、Ｎ末端から３３番目までのアミノ酸配列が同じである。さらに、Ｃ末端から１４番目までのアミノ酸配列（モチーフＡ−１の場合はＮ末端から３４〜４７番目、モチーフＡ−２の場合はＮ末端から３５〜４８番目、モチーフＡ−３の場合はＮ末端から３６〜４９番目）が同じである。そして、Ｎ末端から３４番目以降の２〜４個のアミノ酸の数が異なり、モチーフＡ−１はアミノ酸の数が２個、モチーフＡ−２はアミノ酸の数が３個、モチーフＡ−３はアミノ酸の数が４個、である。
【００８２】
本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法では、モチーフＡの中の５箇所のアミノ酸に対応するコドンのうちの少なくとも１箇所を、別のアミノ酸に対応するコドンに置換する。その５箇所を表１の「一般式（Ｉ）」の欄のＸ１〜Ｘ５に示す。まず、第１の箇所は、モチーフＡのＮ末端のアミノ酸であり、表１のＸ１である。そして、Ｘ１のアミノ酸がＰｈｅ以外である場合に、Ｘ１に対応するコドンをＰｈｅに対応するコドンに置換する。また、第２の箇所は、モチーフＡのＮ末端から９番目のアミノ酸であり、表１のＸ２である。そして、Ｘ２のアミノ酸がＧｌｕ以外である場合に、Ｘ２に対応するコドンをＧｌｕに対応するコドンに置換する。また、第３の箇所は、モチーフＡのＮ末端から１０番目のアミノ酸であり、表１のＸ３である。そして、Ｘ３のアミノ酸がＶａｌ以外である場合に、Ｘ３に対応するコドンをＶａｌに対応するコドンに置換する。また、第４の箇所は、モチーフＡのＮ末端から１４番目のアミノ酸であり、表１のＸ４である。そして、Ｘ４のアミノ酸がＴｒｐ以外である場合に、Ｘ４に対応するコドンをＴｒｐに対応するコドンに置換する。また、第５の箇所は、モチーフＡのＣ末端から２番目のアミノ酸であり、表１のＸ５である。そして、Ｘ５のアミノ酸がＩｌｅ以外である場合に、Ｘ５に対応するコドンをＩｌｅに対応するコドンに置換する。このようにコドンを置換することにより、置換後の遺伝子がコードするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのアミノ酸が置換される。そして、アミノ酸置換された変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、元のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅよりも高い分子シャペロン活性を有する。なお、コドンを置換する箇所は１以上であれば特に制限はなく、１箇所でもよいし複数箇所でもよい。
【００８３】
また、モチーフＡは下記の一般式（Ｉ）で表すこともできる。
【化１】
2006166845.tif 000003
【００８４】
本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法の好ましい実施形態の１つは、モチーフＡのアミノ酸配列が配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる実施形態である。配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるモチーフＡは、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭａＦＫＢＰ１７．８、配列番号５）が有している。すなわち、配列番号５で表されるアミノ酸配列の５６番目（Ｌｅｕ）〜１０４番目（Ｐｒｏ）の部分がモチーフＡに相当する。したがって、本実施形態においては、Ｍ．  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子そのものの他、Ｍ．  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのモチーフＡ以外の部分にアミノ酸の置換、欠失、挿入等がされているＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子が使用可能である。なお、配列番号５で表されるアミノ酸配列は、１３８番目（Ｖａｌ）〜１５２番目（Ｌｙｓ）の部分に後述のモチーフＢも含む。
【００８５】
本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法の他の様相は、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるモチーフ（以下、「モチーフＢ」と称する。）を含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の１箇所のコドンを、別のアミノ酸に対応するコドンに置換し、別のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を製造する方法も含む。配列番号６で表されるアミノ酸番号、置換前のコドンに対応するアミノ酸、後述の一般式（ＩＩ）における記号、及び置換後のコドンに対応するアミノ酸をまとめた表を表２に示す。
【表２】
2006166845.tif 000004
【００８６】
本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法では、モチーフＢの中の１箇所のアミノ酸に対応するコドンを、別のアミノ酸に対応するコドンに置換する。そのコドンの箇所を表２の「一般式（ＩＩ）」の欄のＹ１で示した。すなわち、本発明におけるコドン置換箇所はモチーフＢのＣ末端のアミノ酸である。そして、Ｙ１のアミノ酸がＰｈｅ以外である場合に、Ｙ１に対応するコドンをＰｈｅに対応するコドンに置換する。このようにコドンを置換することにより、置換後の遺伝子がコードするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのアミノ酸が置換される。そして、アミノ酸置換された変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、元のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅよりも高い分子シャペロン活性を有する。
【００８７】
また、モチーフＢは下記の一般式（ＩＩ）で表すこともできる。
【化２】
2006166845.tif 000005
【００８８】
本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法の好ましい実施形態の１つは、モチーフＢのアミノ酸配列が配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる実施形態である。配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるモチーフＢは、例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＰｈＦＫＢＰ２９、配列番号８）が有している。すなわち、配列番号８で表されるアミノ酸配列の１３６番目（Ｖａｌ）〜１４９番目（Ｔｙｒ）の部分がモチーフＢに相当する。したがって、本実施形態においては、Ｐ．  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子そのものの他、Ｐ．  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのモチーフＢ以外の部分にアミノ酸の置換、欠失、挿入等がされているＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子が使用可能である。なお、配列番号８で表されるアミノ酸配列は、４７番目（Ｖａｌ）〜９５番目（Ｔｈｒ）の部分に前述のモチーフＡも含む。
【００８９】
モチーフＡ及び／又はモチーフＢを含むＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの他の例を以下に挙げる。まず、配列番号３０はＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｉｎａｒｕｍ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＨｂｓＦＫＢＰ３３）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の６４番（Ａｒｇ）〜１１０番（Ｓｅｒ）の部分がモチーフＡに、１４４番（Ｖａｌ）〜１５９番（Ｔｙｒ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号３１はＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＡｆＦＫＢＰ２９）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の４５番（Ｉｌｅ）〜９３番（Ｓｅｒ）の部分がモチーフＡに、１２６番（Ｖａｌ）〜１３９番（Ｐｈｅ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号３２はＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭｓｂＦＫＢＰ２８．１）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の４６番（Ａｓｐ）〜９４番（Ｓｅｒ）の部分がモチーフＡに、１２８番（Ｖａｌ）〜１４１番（Ｔｙｒ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号３３はＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  ｓｔｒ.  Ｃ２Ａ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭａＦＫＢＰ２８）の
アミノ酸配列である。該アミノ酸配列の４６番（Ａｓｐ）〜９４番（Ｓｅｒ）の部分がモチーフＡに、１２８番（Ｖａｌ）〜１４１番（Ｔｙｒ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号３４はＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ  Ｇｏｅ１由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭｍＦＫＢＰ２８）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の４９番（Ａｓｐ）〜９７番（Ｓｅｒ）の部分がモチーフＡに、１３１番（Ｉｌｅ）〜１４４番（Ｔｙｒ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号３５はＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＡｐＦＫＢＰ３０）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の５０番（Ｐｈｅ）〜９８番（Ｐｒｏ）の部分がモチーフＡに、１３４番（Ｉｌｅ）〜１４７番（Ｉｌｅ）の部分がモチーフＢに相当する。
【００９０】
また、配列番号３６はＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＰｂａＦＫＢＰ２６）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の４７番
（Ａｒｇ）〜９５番（Ｓｅｒ）の部分がモチーフＡに、１３１番（Ｌｅｕ）〜１４４番（Ｖａｌ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号３７はＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＳｓＦＫＢＰ２７）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の４６番（Ａｒｇ）〜９４番（Ｐｒｏ）の部分がモチーフＡに、１３１番（Ｌｅｕ）〜１４４番（Ｔｙｒ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号３８はＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＳｔＦＫＢＰ２７）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の４６番（Ｌｙｓ）〜９４番（Ｓｅｒ）の部分がモチーフＡに、１３１番（Ｌｅｕ）〜１４４番（Ｔｙｒ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号３９はＦｅｒｒｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄａｒｍａｎｕｓ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＦａＦＫＢＰ）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の４５番（Ａｒａ）〜９３番（Ｐｒｏ）の部分がモチーフＡに、１２９番（Ｉｌｅ）〜１４２番（Ｔｙｒ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号４０はＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＴａＦＫＢＰ３０）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の４８番（Ｉｌｅ）〜９６番（Ｔｈｒ）の部分がモチーフＡに、１３２番（Ｖａｌ）〜１４５番（Ｔｙｒ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号４１はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭｊＦＫＢＰ２６）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の４４番（Ｖａｌ）〜９２番（Ｐｒｏ）の部分がモチーフＡに、１２８番（Ｖａｌ）〜１４１番（Ｔｙｒ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号４２はＭｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ  ＡＶ１９由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭｋＦＫＢＰ２４）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の４４番（Ｖａｌ）〜９２番（Ａｒｇ）の部分がモチーフＡに、１２６番（Ｖａｌ）〜１３９番（Ｔｙｒ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号４３はＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ  ｓｔｒ.  Ｄ
ｅｌｔａ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭｂｔＦＫＢＰ２８）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の４６番（Ｉｌｅ）〜９４番（Ｐｒｏ）の部分がモチーフＡに、１３０番（Ｖａｌ）〜１４４番（Ｔｙｒ）の部分がモチーフＢに相当する。
【００９１】
配列番号４４はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＰａＦＫＢＰ３０）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の４７番（Ｖａｌ）〜９５番（Ｔｈｒ）の部分がモチーフＡに、１３６番（Ｖａｌ）〜１４９番（Ｔｙｒ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号４５はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.  ＫＳ１由来の
ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の４６番（Ｍｅｔ）〜９４番（Ｐｒｏ）の部分がモチーフＡに、１３０番（Ｌｅｕ）〜１４４番（Ｐｈｅ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号４６はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭｔＦＫＢＰ１７）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の４８番（Ｌｅｕ）〜９６番（Ｐｒｏ）の部分がモチーフＡに、１３２番（Ｌｅｕ）〜１４５番（Ｐｈｅ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号４７はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭｊＦＫＢＰ１８）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の４７番（Ｉｌｅ）〜９５番（Ｐｒｏ）の部分がモチーフＡに、１３１番（Ｌｅｕ）〜１４４番（Ｐｈｅ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号４８はＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  ｓｔｒ.  Ｃ２Ａ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ
（ＭａＦＫＢＰ１９）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の７７番（Ｌｅｕ）〜１２５番（Ｐｒｏ）の部分がモチーフＡに、１６０番（Ｌｅｕ）〜１７３番（Ｐｈｅ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号４９はＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭｓｂＦＫＢＰ２１）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の８４番（Ｌｅｕ）〜１３２番（Ｐｒｏ）の部分がモチーフＡに、１７１番（Ｌｅｕ）〜１８４番（Ｐｈｅ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号５０はＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ  Ｇｏｅ１由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭｍＦＫＢＰ１７．９６）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の６１番（Ｌｅｕ）〜１０９番（
Ｐｒｏ）の部分がモチーフＡに、１４５番（Ｐｈｅ）〜１５８番（Ｐｈｅ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号５１はＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭｓｂＦＫＢＰ１８）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の５０番（Ｐｈｅ）〜９８番（Ｐｒｏ）の部分がモチーフＡに、１３４番（Ｌｅｕ）〜１４７番（Ｌｅｕ）の部分がモチーフＢに相当する。
【００９２】
また、配列番号５２はＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  ｓｔｒ.  Ｃ２Ａ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭａＦＫＢＰ１８．２）のアミノ酸配列で
ある。該アミノ酸配列の５０番（Ｐｈｅ）〜９８番（Ｐｒｏ）の部分がモチーフＡに、１３４番（Ｌｅｕ）〜１４７番（Ｌｅｕ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号５３はＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ  Ｇｏｅ１由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭｍＦＫＢＰ１８．２）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の５０番（Ｐｈｅ）〜９８番（Ｐｒｏ）の部分がモチーフＡに、１３４番（Ｌｅｕ）〜１４７番（Ｌｅｕ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号５４はＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭｓｂＦＫＢＰ１９）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の６５番（Ｌｅｕ）〜１１３番（Ｐｒｏ）の部分がモチーフＡに、１４７番（Ｖａｌ）〜１６０番（Ｐｈｅ）の部分がモチーフＢに相当する。配列番号５５はＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ  Ｇｏｅ１由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭｍＦＫＢＰ１８．０３）のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列の５９番（Ｌｅｕ）〜１０７番（Ｐｒｏ）の部分がモチーフＡに、１４１番（Ｉｌｅ）〜１５４番（Ｐｈｅ）の部分がモチーフＢに相当する。
【００９３】
例えば、これらのＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子に対して、モチーフＡの上記５箇所のうちの少なくとも１箇所のコドンを置換することにより、別のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を製造することができる。また、これらのＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子に対して、モチーフＢのＣ末端のアミノ酸に対応するコドンを置換することにより、別のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を製造することができる。このようにして得られたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子がコードするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、元のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅに比べて分子シャペロン活性が高く、目的タンパク質をより高効率に正しく折り畳むことができる。なお、コドンの置換は、モチーフＡとモチーフＢのどちらか一方に対して行ってもよく、両方に対して行ってもよい。また、モチーフＡにおけるコドンの置換は、１箇所でもよいし複数箇所でもよい。
【００９４】
上記のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを含めて、本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法に用いることができる分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子は、例えば、以下の分類、すなわち、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ属、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｓｔｙｇｉｏｌｏｂｕｓ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、Ｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｕｌｆｕｒｉｓｐｈａｅｒａ属、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｅｔｔｅｒｉａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｄｉｓｃｕｓ属、Ｉｇｎｅｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｓｕｌｆｏｐｈｏｂｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ属、Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ属、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ属、Ｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ属、Ｆｅｒｒｏｇｌｏｂｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｉｇｎｉｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ属などに属する古細菌から得ることができる。さらに、本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法に用
いることができる分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子は、例えば、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ属、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｈａｌｏｂａｃｕｌｕｍ属、Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ属、Ｈａｌｏｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｍ属、Ｈａｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｈａｌｏｒｈａｂｄｕｓ属、Ｈａｌｏｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ属、Ｈａｌｏｔｅｒｒｉｇｅｎａ属などに属する好塩性古細菌からも得ることができる。
【００９５】
本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法において、遺伝子のコドンを置換する方法としては、例えば、各種の部位特異的変異導入法を用いることができる。例えば、目的の変異を導入できるようにオリゴヌクレオチドを設計・合成し、１本鎖にした標的のＤＮＡにアニーリングさせる。その後、ＤＮＡポリメラーゼによって２本鎖ＤＮＡを合成し、変異が導入された鎖のみを選抜すればよい。標的のＤＮＡは、例えば、Ｍ１３やＭｕ等のファージを用いることで１本鎖とすることができる。
【００９６】
本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの製造方法は、上記したＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の製造方法で製造された遺伝子を用い、該遺伝子を転写及び翻訳させてＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを合成するものである。遺伝子の転写及び翻訳は、インビボ、インビトロのいずれの系によって行ってもよい。すなわち、インビボの系であれば、該遺伝子を含有する形質転換体を作製して培養し、該培養物からＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを採取することができる。また、インビトロの系であれば、無細胞翻訳系（Ｓｐｉｒｉｎ，  Ａ．  Ｓ．，  １９９１，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １１，  ２６５６−２６６４：Ｆａｌｃｏｎｅ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １１，  ２６５６−２６６４）によってＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを製造することができる。
【００９７】
本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの1つの様相は、基本的に、配列番号９で
表されるアミノ酸配列からなる。配列番号９のアミノ酸配列においては、５６番目のアミノ酸はＬｅｕ又はＰｈｅであり、６４番目のアミノ酸がＧｌｎ又はＧｌｕであり、６５番目のアミノ酸がＭｅｔ又はＶａｌであり、６９番目のアミノ酸がＰｈｅ又はＴｒｐであり、かつ１０３番目のアミノ酸がＬｅｕ又はＩｌｅである。ただし、５６番目のアミノ酸がＬｅｕ、６４番目のアミノ酸がＧｌｎ、６５番目のアミノ酸がＭｅｔ、６９番目のアミノ酸がＰｈｅ、かつ１０３番目のアミノ酸がＬｅｕである場合は、配列番号５で表されるアミノ酸配列と同一であり、これは公知であるので除外される。すなわち、本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、配列番号５で表されるＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの上記５箇所のアミノ酸のうちの少なくとも１つが別のアミノ酸に置換されたものである。本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる公知のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅに比べて分子シャペロン活性が高く、目的タンパク質をより高効率で正しく折り畳むことができる。
【００９８】
また、本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの好ましい実施形態は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５又は２７で表されるアミノ酸配列からなるＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅである。すなわち、配列番号１１で表されるアミノ酸配列は、配列番号５で表されるアミノ酸配列の５６番目のアミノ酸をＰｈｅに置換したものである。また、配列番号１３で表されるアミノ酸配列は、配列番号５で表されるアミノ酸配列の６４番目のアミノ酸をＧｌｕに置換したものである。また、配列番号１５で表されるアミノ酸配列は、配列番号５で表されるアミノ酸配列の６５番目のアミノ酸をＶａｌに置換したものである。また、配列番号１７で表されるアミノ酸配列は、配列番号５で表されるアミノ酸配列の６９番目のアミノ酸をＴｒｐに置換したものである。また、配列番号１９で表されるアミノ酸配列は、配列番号５で表されるアミノ酸配列の１０３番目のアミノ酸をＩｌｅに置換したものである。また、配列番号２１で表されるアミノ酸配列は、配列番号５で表されるアミノ酸配列の６４番目のアミノ酸をＧｌｕに、１０３番目のアミノ酸をＩ
ｌｅに置換したものである。また、配列番号２３で表されるアミノ酸配列は、配列番号５で表されるアミノ酸配列の６４番目のアミノ酸をＧｌｕに、及び６５番目のアミノ酸をＶａｌに、及び１０３番目のアミノ酸をＩｌｅに置換したものである。また、配列番号２５で表されるアミノ酸配列は、配列番号５で表されるアミノ酸配列の５６番目のアミノ酸をＰｈｅに、６４番目のアミノ酸をＧｌｕに、６５番目のアミノ酸をＶａｌに、及び１０３番目のアミノ酸をＩｌｅに置換したものである。また、配列番号２７で表されるアミノ酸配列は、５６番目のアミノ酸をＰｈｅに、６４番目のアミノ酸をＧｌｕに、６５番目のアミノ酸をＶａｌに、６９番目のアミノ酸をＴｒｐに、及び１０３番目のアミノ酸をＩｌｅに置換したものである。
【００９９】
また、本発明の単離したＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの他の様相は、配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなるものである。配列番号２９のアミノ酸配列は、配列番号８で表されるアミノ酸配列の１４４番目のアミノ酸をＰｈｅに置換したものである。本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅに比べて分子シャペロン活性が高く、目的タンパク質をより高効率で正しく折り畳むことができる。
【０１００】
本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子は、請求項８乃至１０のいずれかに記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードするものである。換言すれば、配列番号９（ただし、５６番目のアミノ酸がＬｅｕ、６４番目のアミノ酸がＧｌｎ、６５番目のアミノ酸がＭｅｔ、６９番目のアミノ酸がＰｈｅ、かつ１０３番目のアミノ酸がＬｅｕである場合を除く）、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５又は２７で表されるアミノ酸配列をコードするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子である。本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の塩基配列は、これらのアミノ酸配列をコードする物であれば何でもよい。配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５又は２７で表されるアミノ酸配列をコードするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子の塩基配列の一例を、それぞれ、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６に示す。
【０１０１】
本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を含有する発現ベクターを構築し、該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を発現させることにより、活性が高いＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを製造することができる。遺伝子の発現は、該発現ベクターを含有する形質転換体を作製し、該形質転換体を培養することにより行なうことができる。
【０１０２】
本発明の発現ベクターは３つの様相からなる。１つは、上記した本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子を含む発現ベクターである。もう１つは、本発明の単離されたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子と制限酵素サイトを含む発現ベクターであり、該制限酵素サイトに目的タンパク質の遺伝子を挿入することにより、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を発現できるようになる。さらに１つは、すでに前記制限酵素サイトに目的タンパク質の遺伝子が組み込まれている、前記融合タンパク質を発現することができる発現ベクターである。
【０１０３】
本発明の発現ベクターのうち、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子と制限酵素サイトを含む発現ベクターは、上記した本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を発現できるものである。すなわち、本発明の発現ベクターは、本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする第１コード領域と、少なくとも１つの制限酵素サイトを有するものであり、この制限酵素サイトに目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することによりＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質の融合タンパク質を発現することができる。ここで、融合タンパク質が発現できるということは、換言すれば、制限酵素サイトは、第１コード領域と同じ解読枠内に位置しているということである。さらに換言すれば、該制限酵素サイトに第２コード領域を挿入したときに、第１コード領域と第２
コード領域の解読枠が一致しており、かつ第１コード領域と第２コード領域の間に終止コドンが存在しないということである。なお、制限酵素サイトの位置は第１コード領域の上流でもよいし下流でもよい。制限酵素サイトが第１コード領域の下流にあるときは、第１コード領域はプロモーターに有効に連結していることが必要である。そのような発現ベクターによれば、該プロモーターによって第１コード領域から転写が開始され、Ｎ末端側がＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅでＣ末端側が目的タンパク質である融合タンパク質を発現することができる。
【０１０４】
上記プロモーターとしては、用いる発現系に応じて適宜選択すればよく、宿主内で発現させる場合は、その宿主に適合したものを用いればよい。宿主が大腸菌であれば、例えば、Ｐｌａｃプロモーター、Ｐｔａｃプロモーター、ｘｙｌＡプロモーター、ＡｒａＢプロモーター、ｌａｍｂｄａプロモーター、Ｔ７プロモーター等を用いることができる。ほ乳細胞系によって発現させる場合は、ほ乳類細胞のゲノムから単離された、例えばマウスメタロチオネインプロモーター等のプロモーターや、これらの細胞で成長するウイルスから単離された、例えばバキュロウイルスプロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター等のプロモーターを用いることができる。
【０１０５】
本発明の発現ベクターにおいては、さらに、第１コード領域と前記制限酵素サイトの間にペプチドリンカーとなる塩基配列を有してもよい。そのようなペプチドリンカーの代表例はプロテアーゼ消化アミノ酸配列である。すなわち、本発明の発現ベクターにおいては、第１コード領域と前記制限酵素サイトとの間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列をコードする塩基配列を有することが好ましい。該プロテアーゼ消化アミノ酸配列をコードする塩基配列は、第１コード領域及び第２コード領域と同じ解読枠内で転写・翻訳され、プロテアーゼ消化アミノ酸配列となる。すなわち、本実施形態の発現ベクターによれば、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質とがプロテアーゼ消化アミノ酸配列を介して連結された融合タンパク質を発現することができる。そして、該融合タンパク質に対応のプロテアーゼを作用させることにより、目的タンパク質を切り出すことができる。
【０１０６】
上記プロテアーゼとしては特に限定されず、例えば、トロンビン、ファクターＸａ、プレシジョンプロテアーゼ、エンテロキナーゼ等が挙げられる。これらのプロテアーゼとしては、例えば、市販されているものを用いることができる。また、プロテアーゼ認識アミノ酸配列以外のペプチドリンカーとしては、例えば、インテインの自己切断アミノ酸配列が挙げられる。すなわち、インテインの自己タンパク質スプライシング機能を利用して融合タンパク質から目的タンパク質を切り出すことができる。なお、ペプチドリンカーをコードする塩基配列の長さは特に限定されないが、１５〜９０塩基程度であることが好ましく、翻訳されてグリシンやセリン等の中性アミノ酸となる塩基配列を多く含むことが好ましい。
【０１０７】
本発明の発現ベクターは、さらに、他の従来公知の塩基配列を含んでいてもよい。上記他の従来公知の塩基配列としては特に限定されず、例えば、発現産物の安定性を付与する安定性リーダー配列、発現産物の分泌を付与するシグナル配列、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の形質転換された宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等が挙げられる。
【０１０８】
上記した発現ベクターの制限酵素サイトに、目的タンパク質をコードする第２コード領域がすでに組み込まれている発現ベクターも、本発明の１つである。このような発現ベクターによれば、第２コード領域を組み込む操作が不要であり、そのまま転写・翻訳させることによりＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を製造することができる。第２コード領域にコードされる目的タンパク質としては、例えば、抗体又は抗
体の部分断片が挙げられる。抗体の部分断片としては、Ｆａｂ、Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｃ、抗体の各ドメインの２個以上の断片がペプチド結合で連結したポリペプチド等が挙げられる。また、上記抗体の由来動物やサブクラスは何でもよい。このように、抗体又は抗体の部分断片をコードする第２コード領域を含むベクターを使用すると、大腸菌等の宿主内で発現させても封入体とならず、正しく折り畳まれた抗体を得ることができる。その結果、従来のように動物を用いて抗体を作らせる必要がなく、より簡便かつ大量に抗体を得ることができる。なお、抗体をコードする遺伝子は、例えば、ハイブリドーマから調製することができる。そして、単一のハイブリドーマから得られる抗体をコードする遺伝子は単一であるので、得られる抗体はモノクローナルな抗体である。一方、ポリクローナルな抗体を取得する場合は、例えば、複数種のハイブリドーマからそれぞれ抗体をコードする遺伝子を取得し、それらの遺伝子を別々のベクターに組み込み、別々の形質転換体を作製し、それらの形質転換体を混合培養すればよい。
【０１０９】
第２コード領域にコードされる目的タンパク質の他の例としては、膜貫通型タンパク質、膜結合型タンパク質等が挙げられる。より具体的には、ヒトエンドセリンＡ受容体等のＧタンパク質共役型受容体（７回膜貫通型受容体）の他、イオンチャンネル型受容体、チロシンカイネース型受容体等が挙げられる。
【０１１０】
本発明の形質転換体は、上記した本発明の発現ベクターを含有するものである。すなわち、目的タンパク質の遺伝子が組み込まれていない発現ベクターを含有する形質転換体であれば、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを単独で生産することができ、目的タンパク質の遺伝子が組み込まれている発現ベクターであれば、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を生産することができる。本発明の形質転換体の元となる宿主は、本発明の発現ベクターの特性と適合するものであれば特に制限はなく、例えば、細菌等の原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫細胞、ほ乳類細胞等が挙げられる。ここで、宿主が発現ベクターの特性と適合するとは、宿主内においてその発現ベクターが複製可能であり、かつ第１コード領域と第２コード領域を転写・翻訳できるということである。特に、転写が正常に行われるためには、発現ベクター上のプロモーターが正常に働く宿主を選択することが必要である。
【０１１１】
上記宿主のうち、大腸菌はその取り扱いが容易であり、かつ宿主ベクター系も充実しているので特に好適である。大腸菌を宿主として用いる場合、発現ベクターから転写・翻訳されるＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質は、細胞質に発現させてもよいし、ペリプラズム領域に発現させてもよい。ペリプラズム領域に融合タンパク質を発現させる場合は、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質の５’末端にシグナル配列が付加されるように発現ベクターを構築し、大腸菌に導入すればよい。
【０１１２】
本発明の形質転換体を作成する際の、発現ベクターを宿主に導入する方法は、公知の種々の方法を用いることができ、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気穿孔、リポソーム融合、核注入、ウイルス又はファージ感染等が挙げられる。
【０１１３】
なお、本発明の発現ベクターは、宿主に導入する以外に、バクテリア又は真核生物抽出液等を用いた無細胞翻訳系にて発現させることも可能である。無細胞翻訳系は、目的タンパク質が宿主に毒性を示すものである場合等に有効である。
【０１１４】
本発明の融合タンパク質の主な実施形態は、活性が高いＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質である。本発明の融合タンパク質によれば、目的タンパク質が単独で発現すると正しく折り畳まれずに異常型タンパク質となってしまう場合でも、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質として発現させることで、目的タンパク質を正しく折り畳まれた正常型タンパク質として発現することができる。その結果、正常型の
目的タンパク質の生産性を飛躍的に向上させることができる。なお、目的タンパク質は適宜の方法で融合タンパク質から切り出すことができる。例えば、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質の間にプロテアーゼ認識アミノ酸配列を挿入しておけば、融合タンパク質に該プロテアーゼを作用させることにより、目的タンパク質を切り出し、単離することができる。なお、本発明の融合タンパク質は、例えば、上記した発現ベクター上の第１コード領域と第２コード領域を転写・翻訳することにより製造することができる。さらに、第１コード領域と第２コード領域の間にプロテアーゼ認識アミノ酸配列をコードする塩基配列を挿入しておけば、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質の間にプロテアーゼ認識アミノ酸配列を有する融合タンパク質を製造することができる。
【０１１５】
本発明の目的タンパク質の製造方法は、活性が高いＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの作用を利用して、正しく折り畳まれた正常型の目的タンパク質を製造するものである。この際、該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを目的タンパク質に作用させる態様は主に２つある。１つの態様は、上記したように、目的タンパク質をＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質として発現させる、融合発現法である。融合発現法の場合は、目的タンパク質を切り出す工程が必要である。もう１つの態様は、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質をそれぞれ単独に同時に発現させる、共発現法である。共発現法によれば、目的タンパク質を切り出す必要がなく、製造工程を減らすことができる。なお、宿主を用いた共発現法の場合は、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの遺伝子と目的タンパク質の遺伝子は、同じ発現ベクター上に存在してもよく、別々の発現ベクターに組み込まれていてもよい。同じ発現ベクター上に存在する場合は、例えば、それぞれの遺伝子が別々のプロモーター下流に組み込めばよい。さらに、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの遺伝子を宿主のゲノム上に、目的タンパク質の遺伝子を発現ベクター上に組み込む構成も可能である。
【０１１６】
本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ及び融合タンパク質は、タンパク質の精製に一般的に用いられている手法、すなわち、塩析、膜分離、各種クロマトグラフィー等を組み合わせることにより精製することができる。精製に供するためのＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ及び融合タンパク質を含む試料は、例えば、それらの遺伝子を含有する形質転換体の培養物から調製することができる。
【０１１７】
また、本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ及び融合タンパク質は、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとＦＫ５０６との親和性を利用して精製することもできる。すなわち、ＦＫ５０６やラパマイシン、その類縁化合物を担持させた担体を調製して、該担体にＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質を含む試料を接触させ、担体上にＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質を捕捉することができる。その後、適宜の方法で担体からＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質を回収すればよい。
【０１１８】
また、ヒスチジン６残基程度からなるヒスチジンタグをあらかじめ、本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質の末端に導入しておくことにより、それらの精製を容易にすることができる。すなわち、ヒスチジンタグを末端に有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質は、ニッケル等の金属をキレートした担体上に、ヒスチジンタグを介して結合する。具体的には、ニッケル等の金属をキレートした担体にＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質を含む試料を接触させ、該担体上にヒスチジンタグを介してＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質を捕捉することができる。その後、イミダゾール等で溶出して担体からＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質を回収すればよい。このようなタグを用いる方法としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ又はその一部分をタグとし、グルタチオン樹脂によるアフィニティークロマトグラフィーにより精製する方法や、マルトース結合タンパク質又はその一部をタグとし、アミロース樹脂により精製する方法等がある。なお、これらのタグは、ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質のＮ末端側及びＣ末端側のいずれに導入してもよく、双方に導入してもよい。
【０１１９】
本発明の目的タンパク質の再生方法は、本発明の単離したＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの高い分子シャペロン活性を利用して、変性した目的タンパク質を正しく折り畳みなおし、再生するものである。ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを目的タンパク質に作用させる方法としては、例えば、緩衝液中でＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質を共存させればよい。目的タンパク質が不溶化している場合は、尿素や塩酸グアニジンで可溶化した後にＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを作用させることができる。具体的には、不溶化した目的タンパク質を８Ｍ尿素や６Ｍ塩酸グアニジンで可溶化し、本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを含む緩衝液で３０〜２００倍に希釈すればよい。ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを目的タンパク質に作用させる際のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質とのモル比は、目的タンパク質１に対してＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅが０．０１〜５０が好適で、０．１〜１５が特に好ましい。
【０１２０】
本発明の目的タンパク質の安定化方法は、本発明の単離したＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの高い分子シャペロン活性を利用して、目的タンパク質を変性することを抑制し、目的タンパク質を安定化するものである。ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを目的タンパク質に作用させる方法としては、例えば、緩衝液中でＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質を共存させればよい。共存させる系はインビボ、インビトロの両方の系が可能である。すなわち、インビボの系であれば、例えば、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質を共発現させることにより目的タンパク質を安定化させることができる。インビトロの系であれば、適宜の緩衝液中にＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質を溶解させればよい。ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを目的タンパク質に作用させる際のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質とのモル比は、目的タンパク質１に対してＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅが０．１〜５００が好適である。
【０１２１】
なお、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの分子シャペロン活性の評価方法としては、例えば、ロダネーゼ、クエン酸合成酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等をモデル酵素とし（河田、バイオサイエンスとインダストリー  ５６, ５９３−、１９９８年）、これらを６Ｍ塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤で変性処理後、検定対象物質を含む緩衝液で変性剤を希釈した際に開始する変性タンパク質の再生率や、変性タンパク質の凝集の抑制率でその検定対象物の分子シャペロン活性を評価することができる。なお、変性タンパク質の再生率を評価する方法としては、例えばロダネーゼの場合、ホロビッチらの方法（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ４０、３６１−、１９９５年）が挙げられ、変性タンパク質の凝集抑制を評価する方法としては田口らの方法（Ｔａｇｕｃｈｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６９、８５２９−、１９９４年）等が挙げられる。
【０１２２】
以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【０１２３】
本実施例では、常温性古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭａＦＫＢＰ１７．８）の１アミノ酸置換体（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ）をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含有する発現ベクターを構築した。
【０１２４】
Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  Ｃ２Ａ  （ＤＳＭ２８３４）の菌懸濁液から菌ペレットを回収し、フェノール／クロロホルム処理、及びエタノール沈殿法により、ゲノムＤＮＡを回収した。配列番号５６に示される公知のＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子の塩基配列を参考にして、ＰＣＲ用のプライマーとして配列番号５９に示されるＭａ１７−ＦＷプライマー及び配列番号６０に示されるＭａ１７−ＲＷプライマーを
合成した。次に、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｍａ１７−ＦＷプライマー及びＭａ１７−ＲＷプライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を確認したところ、公知のＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子の塩基配列と一致した。なお、増幅されたＤＮＡ断片の両端には、Ｍａ１７−ＦＷの５’末端に由来するＮｃｏＩサイト及びＭａ１７−ＲＷの３’末端に由来するＳｐｅＩサイトが導入された。
【０１２５】
一方、配列番号５８に示されるリンカーＴｈｒｏｍ−Ｆ２及びその相補鎖であるリンカーＴｈｒｏｍ−Ｒ２を合成した。なお、リンカーＴｈｒｏｍ−Ｆ２は、５’側にＳｐｅＩサイトを、３’側にＥｃｏＲＩサイトを有し、内部には目的タンパク質の遺伝子を導入するためのＢａｍＨＩサイト及びＮｄｅＩサイトを有している。さらに、融合タンパク質から目的タンパク質をトロンビンにより切り出せるように、ＢａｍＨＩサイトの上流に、翻訳されてトロンビン認識アミノ酸配列となる塩基配列を有している（図１）。次に、リンカーＴｈｒｏｍ−Ｆ２とリンカーＴｈｒｏｍ−Ｒ２をアニーリングさせ、２本鎖リンカーＴｈｒｏｍを調製した。
【０１２６】
ＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩで、２本鎖リンカーＴｈｒｏｍをＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＩでそれぞれ処理し、あらかじめＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩにて処理したｐＥＴ２１ｄプラスミドＤＮＡ（ノバジェン社製）に、ＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子−２本鎖リンカーの順になるよう挿入して、発現ベクターｐＭａ１７Ｆ２を構築した。
【０１２７】
天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子に部位特異的変異を導入するためのプライマーとして、配列番号６１に示されるＭａ１７−Ｆ１プライマーと配列番号６２に示されるＭａ１７−Ｒ１プライマーを合成した。これらのプライマーは、天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子にハイブリダイズするものであり、当該遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行うことにより、１０３番目のアミノ酸に対応するコドンをＣＴＣ（Ｌｅｕに対応）からＡＴＣ（Ｉｌｅに対応）に置換することができる。上記で構築した発現ベクターｐＭａｌ１７Ｆ２を鋳型とし、Ｍａ１７−Ｆ１プライマーとＭａ１７−Ｒ１プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８の１０３番目のＬｅｕがＩｌｅに置換された変異型ＭａＦＫＢＰ１７．８（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ）を発現する発現ベクターｐＭａ１７Ｌ１０３Ｉを構築した。なお、上記ＰＣＲはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ   Ｓ
ｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｒａｇｅｎｅ社）を用いて、添付のプロトコールにしたがって行なった。発現ベクターｐＭａ１７Ｌ１０３Ｉの構成を図１に示す。すなわち、発現ベクターｐＭａ１７Ｌ１０３Ｉは、Ｔ７プロモーターの下流に、順に、第１コード領域となるＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ遺伝子、トロンビン認識アミノ酸配列をコードする塩基配列、ＢａｍＨＩサイト、及びＮｄｅＩサイトを有する。そして、ＢａｍＨＩサイト又はＮｄｅＩサイトに第２コード領域となる目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入することにより、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる。また、発現される該融合タンパク質は、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉと目的タンパク質の間にトロンビン消化アミノ酸配列を有する。また、発現ベクターｐＭａ１７Ｌ１０３Ｉは、第２コード領域を挿入しない状態では、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉを単独で発現することができる。
【実施例２】
【０１２８】
本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８の１アミノ酸置換体（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ５６Ｆ）をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含有する発現ベクターを構築した。
【０１２９】
天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子に部位特異的変異を導入するためのプライマーとし
て、配列番号６３に示されるＭａ１７−Ｆ２プライマーと配列番号６４に示されるＭａ１７−Ｒ２プライマーを合成した。これらのプライマーは、天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子にハイブリダイズするものであり、当該遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行うことにより、５６番目のアミノ酸に対応するコドンをＣＴＧ（Ｌｅｕに対応）からＴＴＣ（Ｐｈｅに対応）に置換することができる。実施例１と同様にして、発現ベクターｐＭａｌ１７Ｆ２を鋳型とし、Ｍａ１７−Ｆ２プライマーとＭａ１７−Ｒ２プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８の５６番目のＬｅｕがＰｈｅに置換された変異型ＭａＦＫＢＰ１７．８（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ５６Ｆ）を発現する発現ベクターｐＭａ１７Ｌ５６Ｆを構築した。すなわち、発現ベクターｐＭａ１７Ｌ５６Ｆは、実施例１で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｌ１０３ＩのＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ遺伝子の代わりにＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ５６Ｆ遺伝子が導入された構成を有する。したがって、発現ベクターｐＭａ１７Ｌ５６Ｆは、目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することによりＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ５６Ｆと目的タンパク質との融合タンパク質を発現でき、第２コード領域を挿入しない状態では、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ５６Ｆを単独で発現することができる。
【実施例３】
【０１３０】
本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８の１アミノ酸置換体（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｑ６４Ｅ）をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含有する発現ベクターを構築した。
【０１３１】
天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子に部位特異的変異を導入するためのプライマーとして、配列番号６５に示されるＭａ１７−Ｆ３プライマーと配列番号６６に示されるＭａ１７−Ｒ３プライマーを合成した。これらのプライマーは、天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子にハイブリダイズするものであり、当該遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行うことにより、６４番目のアミノ酸に対応するコドンをＣＡＧ（Ｇｌｎに対応）からＧＡＡ（Ｇｌｕに対応）に置換することができる。実施例１と同様にして、発現ベクターｐＭａｌ１７Ｆ２を鋳型とし、Ｍａ１７−Ｆ３プライマーとＭａ１７−Ｒ３プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８の６４番目のＧｌｎがＧｌｕに置換された変異型ＭａＦＫＢＰ１７．８（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｑ６４Ｅ）を発現する発現ベクターｐＭａ１７Ｑ６４Ｅを構築した。すなわち、発現ベクターｐＭａ１７Ｑ６４Ｅは、実施例１で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｌ１０３ＩのＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ遺伝子の代わりにＭａＦＫＢＰ１７．８Ｑ６４Ｅ遺伝子が導入された構成を有する。したがって、発現ベクターｐＭａ１７Ｑ６４Ｅは、目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することによりＭａＦＫＢＰ１７．８Ｑ６４Ｅと目的タンパク質との融合タンパク質を発現でき、第２コード領域を挿入しない状態では、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｑ６４Ｅを単独で発現することができる。
【実施例４】
【０１３２】
本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８の１アミノ酸置換体（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５Ｖ）をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含有する発現ベクターを構築した。
【０１３３】
天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子に部位特異的変異を導入するためのプライマーとして、配列番号６７に示されるＭａ１７−Ｆ４プライマーと配列番号６８に示されるＭａ１７−Ｒ４プライマーを合成した。これらのプライマーは、天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子にハイブリダイズするものであり、当該遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行うことにより、６５番目のアミノ酸に対応するコドンをＡＴＧ（Ｍｅｔに対応）からＧＴＴ（Ｖａｌに対応）に置換することができる。実施例１と同様にして、発現ベクターｐＭａｌ１７Ｆ２を鋳型とし、Ｍａ１７−Ｆ４プライマーとＭａ１７−Ｒ４プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８の６５番目のＭｅｔがＶａｌに置換された変異型ＭａＦＫＢＰ１７．８（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５Ｖ）を発現する発現ベクター
ｐＭａ１７Ｍ６５Ｖを構築した。すなわち、発現ベクターｐＭａ１７Ｍ６５Ｖは、実施例１で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｌ１０３ＩのＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ遺伝子の代わりにＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５Ｖ遺伝子が導入された構成を有する。したがって、発現ベクターｐＭａ１７Ｍ６５Ｖは、目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することによりＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５Ｖと目的タンパク質との融合タンパク質を発現でき、第２コード領域を挿入しない状態では、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５Ｖを単独で発現することができる。
【実施例５】
【０１３４】
本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８の１アミノ酸置換体（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｆ６９Ｗ）をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含有する発現ベクターを構築した。
【０１３５】
天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子に部位特異的変異を導入するためのプライマーとして、配列番号６９に示されるＭａ１７−Ｆ５プライマーと配列番号７０に示されるＭａ１７−Ｒ５プライマーを合成した。これらのプライマーは、天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子にハイブリダイズするものであり、当該遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行うことにより、６９番目のアミノ酸に対応するコドンをＴＴＴ（Ｐｈｅに対応）からＴＧＧ（Ｔｒｐに対応）に置換することができる。実施例１と同様にして、発現ベクターｐＭａｌ１７Ｆ２を鋳型とし、Ｍａ１７−Ｆ５プライマーとＭａ１７−Ｒ５プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８の６９番目のＰｈｅがＴｒｐに置換された変異型ＭａＦＫＢＰ１７．８（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｆ６９Ｗ）を発現する発現ベクターｐＭａ１７Ｆ６９Ｗを構築した。すなわち、発現ベクターｐＭａ１７Ｆ６９Ｗは、実施例１で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｌ１０３ＩのＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ遺伝子の代わりにＭａＦＫＢＰ１７．８Ｆ６９Ｗ遺伝子が導入された構成を有する。したがって、発現ベクターｐＭａ１７Ｆ６９Ｗは、目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することによりＭａＦＫＢＰ１７．８Ｆ６９Ｗと目的タンパク質との融合タンパク質を発現でき、第２コード領域を挿入しない状態では、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｆ６９Ｗを単独で発現することができる。
【実施例６】
【０１３６】
本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８の２アミノ酸置換体（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ）をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含有する発現ベクターを構築した。
【０１３７】
実施例１で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｌ１０３Ｉを鋳型とし、実施例３で合成したＭａ１７−Ｆ３プライマーとＭａ１７−Ｒ３プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８の１０３番目のＬｅｕがＩｌｅに、６４番目のＧｌｎがＧｌｕに置換された変異型ＭａＦＫＢＰ１７．８（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ）を発現する発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅを構築した。すなわち、発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅは、実施例１で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｌ１０３ＩのＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ遺伝子の代わりにＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ遺伝子が導入された構成を有する。したがって、発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅは、目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することによりＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅと目的タンパク質との融合タンパク質を発現でき、第２コード領域を挿入しない状態では、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅを単独で発現することができる。
【実施例７】
【０１３８】
本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８の３アミノ酸置換体（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ）をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含有する発現ベ
クターを構築した。
【０１３９】
実施例６で構築した発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅを鋳型とし、実施例４で合成したＭａ１７−Ｆ４プライマーとＭａ１７−Ｒ４プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８の１０３番目のＬｅｕがＩｌｅに、６４番目のＧｌｎがＧｌｕに、６５番目のＭｅｔがＶａｌに置換された変異型ＭａＦＫＢＰ１７．８（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ）を発現する発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖを構築した。すなわち、発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖは、実施例１で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｌ１０３ＩのＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ遺伝子の代わりにＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ遺伝子が導入された構成を有する。したがって、発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖは、目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することによりＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖと目的タンパク質との融合タンパク質を発現でき、第２コード領域を挿入しない状態では、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖを単独で発現することができる。
【実施例８】
【０１４０】
本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８の４アミノ酸置換体（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆ）をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含有する発現ベクターを構築した。
【０１４１】
実施例７で構築した発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖを鋳型とし、実施例２で合成したＭａ１７−Ｆ２プライマーとＭａ１７−Ｒ２プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８の１０３番目のＬｅｕがＩｌｅに、６４番目のＧｌｎがＧｌｕに、６５番目のＭｅｔがＶａｌに、５６番目のＬｅｕがＰｈｅに置換された変異型ＭａＦＫＢＰ１７．８（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆ）を発現する発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆを構築した。すなわち、発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆは、実施例１で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｌ１０３ＩのＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ遺伝子の代わりにＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆ遺伝子が導入された構成を有する。したがって、発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆは、目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することによりＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆと目的タンパク質との融合タンパク質を発現でき、第２コード領域を挿入しない状態では、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆを単独で発現することができる。
【実施例９】
【０１４２】
本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８の５アミノ酸置換体（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆ／Ｆ６９Ｗ）をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含有する発現ベクターを構築した。
【０１４３】
実施例８で構築した発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆを鋳型とし、実施例５で合成したＭａ１７−Ｆ５プライマーとＭａ１７−Ｒ５プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８の１０３番目のＬｅｕがＩｌｅに、６４番目のＧｌｎがＧｌｕに、６５番目のＭｅｔがＶａｌに、５６番目のＬｅｕがＰｈｅに、６９番目のＰｈｅがＴｒｐに置換された変異型ＭａＦＫＢＰ１７．８（ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆ／Ｆ６９Ｗ）を発現する発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆ／Ｆ６９Ｗ
を構築した。すなわち、発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆ／Ｆ６９Ｗは、実施例１で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｌ１０３ＩのＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ遺伝子の代わりにＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆ／Ｆ６９Ｗ遺伝子が導入された構成を有する。したがって、発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆ／Ｆ６９Ｗは、目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することによりＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆ／Ｆ６９Ｗと目的タンパク質との融合タンパク質を発現でき、第２コード領域を挿入しない状態では、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆ／Ｆ６９Ｗを単独で発現することができる。
【実施例１０】
【０１４４】
本実施例では、超好熱性古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＰｈＦＫＢＰ２９）の１アミノ酸置換体（ＰｈＦＫＢＰ２９Ｙ１４９Ｆ）をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含有する発現ベクターを構築した。
【０１４５】
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（ＤＳＭ１２４２８）の菌懸濁液から菌ペレットを回収し、フェノール／クロロホルム処理、及びエタノール沈殿法により、ゲノムＤＮＡを回収した。配列番号５７に示される公知のＰｈＦＫＢＰ２９遺伝子の塩基配列を参考にして、ＰＣＲ用のプライマーとして配列番号７１に示されるＰｈＦＫ−ＦＷプライマー及び配列番号７２に示されるＰｈＦＫ−ＲＶプライマーを合成した。次に、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰｈＦＫ−ＦＷプライマー及びＰｈＦＫ−ＲＶプライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ＰｈＦＫＢＰ２９遺伝子を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を確認したところ、公知のＰｈＦＫＢＰ２９遺伝子の塩基配列と一致した。なお、増幅されたＤＮＡ断片の両端には、ＰｈＦＫ−ＦＷの５’末端に由来するＮｃｏＩサイト及びＰｈＦＫ−ＲＶの３’末端に由来するＳｐｅＩサイトが導入された。次に、実施例１と同様の方法で、ｐＥＴ２１ｄプラスミドＤＮＡに、ＰｈＦＫＢＰ２９遺伝子−２本鎖リンカーの順になるよう挿入して、発現ベクターｐＰｈ２９Ｆ２を構築した。
【０１４６】
天然型ＰｈＦＫＢＰ２９遺伝子に部位特異的変異を導入するためのプライマーとして、配列番号７３に示されるＰｈＦＫ−Ｆ１プライマーと配列番号７４に示されるＰｈＦＫ−Ｒ１プライマーを合成した。これらのプライマーは、天然型ＰｈＦＫＢＰ２９遺伝子にハイブリダイズするものであり、当該遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行うことにより、１４９番目のアミノ酸に対応するコドンをＴＡＴ（Ｔｙｒに対応）からＴＴＴ（Ｐｈｅに対応）に置換することができる。実施例１と同様にして、上記で構築した発現ベクターｐＰｈ２９Ｆ２を鋳型とし、ＰｈＦＫ−Ｆ１プライマーとＰｈＦＫ−Ｒ１プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、天然型ＰｈＦＫＢＰ２９の１４９番目のＴｙｒがＰｈｅに置換された変異型ＰｈＦＫＢＰ２９（ＰｈＦＫＢＰ２９Ｙ１４９Ｆ）を発現する発現ベクターｐＰｈ２９Ｆ２Ｙ１４９Ｆを構築した。すなわち、発現ベクターｐＰｈ２９Ｆ２Ｙ１４９Ｆは、実施例１で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｌ１０３ＩのＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ遺伝子の代わりにＰｈＦＫＢＰ２９Ｙ１４９Ｆ遺伝子が導入された構成を有する。したがって、発現ベクターｐＰｈ２９Ｆ２Ｙ１４９Ｆは、目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することによりＰｈＦＫＢＰ２９Ｙ１４９Ｆと目的タンパク質との融合タンパク質を発現でき、第２コード領域を挿入しない状態では、ＰｈＦＫＢＰ２９Ｙ１４９Ｆを単独で発現することができる。
【実施例１１】
【０１４７】
本実施例では、実施例１〜１０で作製した各発現ベクターを含有する形質転換体を作製した。また、該形質転換体を培養することにより、各種の変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを製造した。
【０１４８】
実施例１〜１０で作製した各発現ベクター、ｐＭａ１７Ｌ１０３Ｉ、ｐＭａ１７Ｌ５６Ｆ、ｐＭａ１７Ｑ６４Ｅ、ｐＭａ１７ＬＭ６５Ｖ、ｐＭａ１７Ｆ６９Ｗ、ｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ、ｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ、ｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆ、ｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆ／Ｆ６９Ｗ、及びｐＰｈ２９Ｆ２Ｙ１４９Ｆを、それぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に導入し、各形質転換体を得た。２Ｌ容の三角フラスコに、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンを含む２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ  酵母エキス、２０ｇ／Ｌ  バクトトリプトン、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）７００ｍＬを仕込み、得られた各形質転換体を白金耳で２〜３回接種し、３５℃で２４時間回転培養（１１０ｒｐｍ）した。培養終了後、培養液を遠心分離（１００００ｒｐｍ×１０分）し、菌体を回収した。得られた菌体を１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＬに懸濁し、−２０℃にて凍結保存した。
【０１４９】
凍結保存した各菌体懸濁液を融解し、超音波処理をして菌体を破砕した。各菌体破砕液を遠心分離し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分）に分離した。得られた各可溶性画分を下記条件の陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びゲル濾過の順でカラム精製を繰り返すことにより、各変異型ＭａＦＫＢＰ１７．８、すなわちＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ５６Ｆ、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｑ６４Ｅ、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５Ｖ、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｆ６９Ｗ、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆ、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ／Ｍ６５Ｖ／Ｌ５６Ｆ／Ｆ６９Ｗ、及びＰｈＦＫＢＰ２９Ｙ１４９Ｆをほぼ単一にまで精製した。なお、対照として、実施例１で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｆ２、及び実施例１０で構築した発現ベクターｐＰｈ２９Ｆ２についても同様の操作を行い、天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８及び天然型ＰｈＦＫＢＰ２９を製造した。
【０１５０】
（ａ）陰イオン交換クロマトグラフィーの条件
使用カラム：ＤＥＡＥ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ｃｏｌｕｍｎ
（１６ｍｍ×６０ｃｍ；東ソー社）
溶離液
Ａ液：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ衝液（ｐＨ６．８）
Ｂ液：０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ６．８）溶出条件：０−３００分：Ｂ液０−１００％の直線グラジエント溶出
３００−４２０分：Ｂ液１００％のイソクラティック溶出
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：室温
（ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィーの条件
使用カラム：ＨｉｇｈＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＦＦ
（容量５ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社製）
溶離液
Ａ液：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）／１．５Ｍ硫酸アンモニウム含有
Ｂ液：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
溶出条件：０−５０分：Ｂ液０−１００％の直線グラジェント溶出
５０−７０分：Ｂ液１００％のイソクラティック溶出
流速：３ｍＬ／分
カラム温度：室温
（ｃ）ゲル濾過条件
使用カラム：ＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ  ｃｏｌｕｍｎ
（２６  ｍｍ×６０ｃｍ、アマシャムバイオサイエンス社製）
溶離液：１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ含有）溶出条件：イソクラティック溶出
流速：３ｍＬ／分
カラム温度：室温
【実施例１２】
【０１５１】
本実施例では、実施例１１で製造した各変異型ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを用いて、変性したタンパク質を再生した。
【０１５２】
１６．９ｍｇ/ｍＬ（３９３μＭ）のＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ由来のクエン酸合成酵
素（シグマ社。以下、「ＣＳ」と称する。）に、２０倍量の６Ｍグアニジン塩酸（５ｍＭ
ＤＴＴを含有する２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８)に溶解）を加えてＣ
Ｓを変性させ、変性したＣＳを含む試料を調製した。一方、実施例１１で製造した５種の１変異型ＭａＦＫＢＰ１７．８、すなわち、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ５６Ｆ、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｑ６４Ｅ、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５Ｖ、又はＭａＦＫＢＰ１７．８Ｆ６９Ｗを、１０μＭの濃度になるようにそれぞれ５ｍＭ  ＤＴＴ含有/２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解した。変性したＣＳ
を含む試料に各１変異型ＭａＦＫＢＰ１７．８溶液を加えて６０倍希釈し、３０℃で３０分間インキュベートした。その後、５０℃における各反応液中のＣＳ活性をＳｒｅｒｅらの方法（Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ.  Ｓｃａｎｄ.  １７，Ｓ１２９−Ｓ１３４，１９６３）に従って測定した。天然型ＣＳの活性の値に対する得られたＣＳ活性の値の割合（再生率）を算出し、各１変異型ＭａＦＫＢＰ１７．８の分子シャペロン活性を評価した。結果を図２に示す。すなわち、天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８と各１変異型ＭａＦＫＢＰ１７．８のいずれにおいても、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを添加しなかった試料（自発的反応）に比べて分子シャペロン活性が高かったが、各１変異型ＭａＦＫＢＰ１７．８の方が天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８に比べて再生率が高く、より分子シャペロン活性が高かった。以上より、変異型ＭａＦＫＢＰ１７．８によってより高効率で変性タンパク質を再生できることが分かった。
【実施例１３】
【０１５３】
本実施例では、実施例１１で製造したＰｈＦＫＢＰ２９Ｙ１４９Ｆを用いて、タンパク質を安定化させた。
【０１５４】
１μＭのＰｈＦＫＢＰ２９Ｙ１４９Ｆ又はＰｈＦＫＢＰ２９（対照）を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７．８)２．５ｍＬ中に、牛肝臓由来のロダネーゼ（シグマ社）を０．８μＭとなるように加え、４５℃で１０分間インキュベートした。その後、反液の３２０ｎｍにおける光散乱強度を測定し、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを含まない反応液における光散乱強度を１００としたときの相対値を算出し、ロダネーゼの熱変性による凝集強度を評価した。結果を図３に示す。すなわち、反応液中にＰｈＦＫＢＰ２９が存在するときは凝集強度が約５０％であったのに対し、ＰｈＦＫＢＰ２９Ｙ１４９Ｆが存在するときは凝集強度が約３０％であった。これにより、ＰｈＦＫＢＰ２９Ｙ１４９ＦはＰｈＦＫＢＰ２９に比べてロダネーゼの熱変性を抑制する効果が高いことがわかった。
【実施例１４】
【０１５５】
本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５ＶとｓｃＦｖ抗体断片を宿主細胞内で共発現させて、ｓｃＦｖ抗体断片を製造した。
【０１５６】
ＰＣＲ用のプライマーとして配列番号７５に示されるＳＣＦ−Ｆ３プライマー及び配列番号７６に示されるＳＣＦ−Ｒ３プライマーを合成した。次に、プラスミドｐＡＡＬＳＣ
（伊庭ら  １９９７、Ｇｅｎｅ  １９４、３５−）を鋳型とし、ＳＣＦ−Ｆ３プライマー及びＳＣＦ−Ｒ３プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、マウス由来ａｎｔｉ−ニワトリリゾチーム（ＨＥＬ）  ｓｃＦｖ抗体断片（Ｄ１．３）遺伝子を増幅した。増幅された遺伝子をＴＡクローニングにより、ｐＴ７ブルーベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入し、ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理後、あらかじめＮｄｅＩ／ＮｏｔＩにより処理しておいたｐＥＴ２１ａプラスミドＤＮＡに挿入し、上記ｓｃＦｖの発現ベクターｐＥＴｓｃＦｖを構築した。次に、ｐＥＴｓｃＦｖを鋳型とし、配列番号７７に示されるＴ７−Ｆ１プライマーと配列番号７８に示されるＴ７−Ｒ１プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、上記ｓｃＦｖ遺伝子及びＴ７プロモーター部を含むｓｃＦｖの発現ユニットＤＮＡ断片を増幅した。なお、増幅されたＤＮＡ断片の両端には、Ｔ７−Ｆ１プライマーの５’末端に由来するＳｐｈＩサイト及びＴ７−Ｒ１プライマーの３’末端に由来するＢａｍＨＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片をＴＡクローニングによりｐＴ７ ブルーＴベ
クターに挿入した後、制限酵素ＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩで処理後、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド（和光純薬社）のＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩサイトに挿入し、共発現用ベクターｐＡＣｓｃＦｖを構築した。
【０１５７】
２種類のベクター、すなわち、共発現用ベクターｐＡＣｓｃＦｖと実施例４で調製した発現ベクターｐＭａ１７Ｍ６５Ｖを、コンピテントセル大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に導入し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び１００μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地にて培養した。得られたコロニーを、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び１００μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含む２×ＹＴ培地７００ ｍＬに接種した。３
５℃で回転培養（１１０ ｒｐｍ）した後、ＯＤ６００が０．７となった時点で１００ｍ
Ｍ  ＩＰＴＧを７ｍＬ添加し、培養温度を２０℃に下げてさらに約１６時間培養し、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５及びマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ  ｓｃＦｖ抗体断片の発現を誘導した。培養終了後、遠心分離（１００００ ｒｐｍ×１０ 分）にて菌体を回収した。回収した菌体を１ ｍＭ   ＥＤＴＡを含む２５ ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２
０ ｍＬに懸濁し、−２０℃にて一晩凍結保存した。菌体を融解し、超音波破砕を行って
上清（可溶画分）及び沈澱画分に分離し、それぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにて染色した。一方、比較例として、ｐＡＣｓｃＦｖのみを導入した組換え大腸菌についても同様の操作を行った。その結果、ｐＡＣｓｃＦｖのみを導入した組換え大腸菌ではｓｃＦｖ抗体断片は全て沈殿画分に検出されたが、ｐＡＣｓｃＦｖとｐＭａ１７Ｍ６５Ｖの両方を導入した組換え大腸菌では、ｓｃＦｖ抗体断片は上清画分に検出された。以上より、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５Ｖと共発現させることにより、ｓｃＦｖは可溶性画分に発現させることが可能となった。
【実施例１５】
【０１５８】
本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５ＶとｓｃＦｖ抗体断片からなる融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。さらに、該発現ベクター含有する形質転換体を作製した。さらに、該形質転換体を培養することにより、該融合タンパク質を製造した。さらに、該培養物より該融合タンパク質を精製した。さらに、精製された該融合タンパク質からｓｃＦｖを切り出し、ｓｃＦｖを正常型タンパク質として取得した。
【０１５９】
１．発現ベクターの構築
実施例１４で調製したｓｃＦｖ抗体断片遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片をＮｄｅＩ／ＮｏｔＩにて処理し、実施例４で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｍ６５ＶのＮｄｅＩ／ＮｏｔＩサイトに挿入し、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５ＶとｓｃＦｖ抗体断片との融合タンパク質を発現することができる発現ベクターｐＭａ１７Ｍ６５Ｖ−ｓｃＦｖを構築した。すなわち、発現ベクターｐＭａ１７Ｍ６５Ｖ−ｓｃＦｖは、Ｔ７プロモーターの下流に、順に、第１コード領域となるＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５Ｖ遺伝子、トロンビン認識アミノ酸配列をコードするアミノ酸配列、及び第２コード領域となるｓｃＦｖ抗体断片をコード
する遺伝子を有する。よって、該発現ベクターによれば、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５ＶとｓｃＦｖ抗体断片との融合タンパク質を発現することができる。また、発現される該融合タンパク質は、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５ＶとｓｃＦｖ抗体断片の間にトロンビン消化アミノ酸配列を有する。次に、構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｍ６５Ｖ−ｓｃＦｖを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を作製した。
【０１６０】
２．融合タンパク質の製造
作製した形質転換体を、実施例１４と同様の方法により培養、回収した後、菌体破砕液の可溶性画分及び封入体画分を得た。実施例１４と同様にして可溶性画分と封入体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにてゲルを染色した。その結果、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５ＶとｓｃＦｖ抗体断片からなる融合タンパク質に相当するバンドが、可溶性画分に認められた。ＣＢＢ染色した可溶性画分の電気泳動像から、該融合タンパク質のバンド密度をデンシトメーターで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約２０％が該融合タンパク質であり、大量に発現していた。可溶性画分に発現した該融合蛋白質の可溶化率は全発現産物の約８０％であった。以上より、ｓｃＦｖ抗体断片はＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５Ｖとの融合タンパク質とすることにより、封入体とはならず、可溶状態で合成された。実施例１１と同様の３種のクロマトグラフィーにより、可溶性画分から融合タンパク質をほぼ単一にまで精製した。
【０１６１】
３．ｓｃＦｖ抗体断片の製造
精製した融合タンパク質１ｍｇ当たりに１０Ｕのトロンビンを加え、２２℃にて１６時間処理した。反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにてゲルを染色した。その結果、トロンビン添加前の試料ではＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５ＶとｓｃＦｖ抗体断片との融合タンパク質のみが検出されたが、トロンビン添加・処理後の試料では当該融合タンパク質以外に、ｓｃＦｖ抗体断片に相当するバンドとＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５Ｖに相当するバンドが検出された。以上より、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５ＶとｓｃＦｖ抗体断片との融合タンパク質のトロンビン認識サイトが切断され、ｓｃＦｖ抗体断片が切り出されていることが確認された。以上より、ｓｃＦｖ抗体断片は大腸菌内で単独で発現させると沈殿画分に発現される（実施例１４）が、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５Ｖとの融合タンパク質にすると、可溶性画分に合成されることが分かった。
【実施例１６】
【０１６２】
本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４ＥとｓｃＦｖ抗体断片からなる融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。さらに、該発現ベクター含有する形質転換体を作製した。さらに、該形質転換体を培養することにより、該融合タンパク質を製造した。
【０１６３】
実施例１４で調製したｓｃＦｖ抗体断片遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片をＮｄｅＩ／ＮｏｔＩにて処理し、実施例６で構築した発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４ＥのＮｄｅＩ／ＮｏｔＩサイトに挿入し、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４ＥとｓｃＦｖ抗体断片との融合タンパク質を発現することができる発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ−ｓｃＦｖを構築した。すなわち、発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ−ｓｃＦｖは、実施例６で構築したｐＭａ１７Ｍ６５Ｖ−ｓｃＦｖで、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５Ｖ遺伝子の代わりにＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ遺伝子とした構成を有する。次に、構築した発現ベクターｐＭａ１７／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅ−ｓｃＦｖを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を作製した。対照として、実施例１で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｆ２に上記したｓｃＦｖ抗体断片遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片を導入し、ＭａＦＫＢＰ１７．８とｓｃＦｖ抗体断片との融合タンパク質を発現することができる発現ベクターｐＭａ１７Ｗ−ｓｃＦｖを構築した。さらに、発現ベクターｐＭａ１７Ｗ−ｓｃＦｖを含有する形質転換体を作製した。
【０１６４】
２．融合タンパク質の製造
作製した形質転換体を、実施例１５と同様にして培養し、菌体破砕液の可溶性画分及び封入体画分を得た。実施例１５と同様にして可溶性画分と封入体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにてゲルを染色した。その結果、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４ＥとｓｃＦｖ抗体断片からなる融合タンパク質に相当するバンドが、可溶性画分に認められた。ＣＢＢ染色した可溶性画分の電気泳動像から、該融合タンパク質のバンド密度をデンシトメーターで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約２４％が該融合タンパク質であり、大量に発現していた。可溶性画分に発現した該融合蛋白質の可溶化率は全発現産物の約８０％であった。以上より、ｓｃＦｖ抗体断片はＭａＦＫＢＰ１７．８Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４Ｅとの融合タンパク質とすることにより、封入体とはならず、可溶状態で合成された。
【０１６５】
３．融合タンパク質の精製
実施例１５と同様にして形質転換体を培養し、菌体破砕液を調製し、上清を得た。あらかじめ上清に１Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加え、溶離液Ａに「１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）／１Ｍ  硫酸アンモニウム含有」を用いる以外は実施例１１と同じ条件の疎水性相互作用クロマトグラフィーを行なった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢによる分析結果を図４に示す。すなわち、天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８とｓｃＦｖとの融合タンパク質は、その７０％程度がカラム素通り画分に検出された（図４（ａ））。それに対し、２アミノ酸置換体であるＭａＦＫＢＰ１７．８／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４ＥとｓｃＦｖとの融合タンパク質は、その３０％程度がカラム素通り画分に検出された（図４（ｂ））。以上より、本条件の疎水性相互作用クロマトグラフィーにおいてはＭａＦＫＢＰ１７．８／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４ＥとｓｃＦｖとの融合タンパク質はカラムに対する吸着性が高く、高純度の融合タンパク質が高収率で得られた。
【実施例１７】
【０１６６】
本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５Ｖとヒト由来セロトニン（ＨＴ１ａ）レセプターからなる融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。さらに、該発現ベクター含有する形質転換体を作製した。さらに、該形質転換体を培養することにより、該融合タンパク質を製造した。さらに、該培養物より該融合タンパク質を精製した。
【０１６７】
１．発現ベクターの構築
公知のＨＴ１ａレセプター遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩコード：ＨＳＳＥＲＲ５１）をもとに、ＰＣＲ用のプライマーとして配列番号７９に示されるＨＴ１ａ−Ｆ１プライマー及び配列番号８０に示されるＨＴ１ａ−Ｒ１プライマーを合成した。次に、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社）を鋳型とし、ＨＴ１ａ−Ｆ１プライマー及びＨＴ１ａ−Ｒ１プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ＨＴ１ａレセプター遺伝子を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、その塩基配列を確認したところ、データベースの登録情報と一致した。なお、増幅されたＤＮＡ断片の両端には、ＨＴ１ａ−Ｆ１の５’末端に由来するＮｄｅＩサイト及びＨＴ１ａ−Ｒ１の３’末端に由来するＮｏｔＩサイトが導入された。次に、ＨＴ１ａレセプター遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片をＮｄｅＩ／ＮｏｔＩにて処理し、実施例４で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｍ６５ＶのＮｄｅＩ／ＮｏｔＩサイトに挿入し、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５ＶとＨＴ１ａレセプターとの融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。すなわち、該発現ベクターは、Ｔ７プロモーターの下流に、順に、第１コード領域となるＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５Ｖ遺伝子、トロンビン認識アミノ酸配列をコードするアミノ酸配列、及び第２コード領域となるＨＴ１ａレセプターをコードする遺伝子を有する。よって、該発現ベクターによれば、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５ＶとＨＴ１ａレセプターと
の融合タンパク質を発現することができる。また、発現される該融合タンパク質はＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５ＶとＨＴ１ａレセプターの間にトロンビン消化アミノ酸配列を有する。次に、構築した発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を作製した。
【０１６８】
２．融合タンパク質の製造
作製した形質転換体を、実施例１４と同様の方法により培養、回収した後、菌体破砕液の可溶性画分及び封入体画分を得た。実施例１４と同様にして可溶性画分と封入体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにてゲルを染色した。その結果、ＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５ＶとＨＴ１ａレセプターからなる融合タンパク質に相当するバンドが、可溶性画分に認められた。ＣＢＢ染色した可溶性画分の電気泳動像から、該融合タンパク質のバンド密度をデンシトメーターで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約８％が該融合タンパク質であり、大量に発現していた。以上より、ＨＴ１ａレセプターはＭａＦＫＢＰ１７．８Ｍ６５Ｖとの融合タンパク質とすることにより、封入体とはならず、可溶状態で合成された。
【０１６９】
以下の表３に、上記した実施例で用いたＰＣＲ用のプライマーの塩基配列、制限酵素サイト又は変異導入部位、及び配列番号をまとめて記載した。塩基配列中の下線は制限酵素サイト又は変異導入部位を表す。
【表３】
2006166845.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】実施例１で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｌ１０３Ｉの構成を表す模式図である。
【図２】実施例１２において、各１変異型ＭａＦＫＢＰ１７．８の作用によって変性したクエン酸合成酵素を再生した結果を表すグラフである。
【図３】実施例１３において、ＰｈＦＫＢＰ２９Ｙ１４９Ｆの作用によってロダネーゼを安定化した結果を表すグラフである。
【図４】実施例１６において、融合タンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィーで精製したときの各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢの結果を表し、図４（ａ）は対照の天然型ＭａＦＫＢＰ１７．８とｓｃＦｖとの融合タンパク質の例を表し、図４（ｂ）はＭａＦＫＢＰ１７．８／Ｌ１０３Ｉ／Ｑ６４ＥとｓｃＦｖとの融合タンパク質の例を表す。
【図１】
2006166845.tif 000007
【図２】
2006166845.tif 000008
【図３】
2006166845.tif 000009
【図４】
2006166845.tif 000010
【配列表】
2006166845000001.app