(57)【要約】【課題】  連続光を照射する場合よりも試料Ａの損傷を抑制し、かつ、明るい蛍光画像を得る。【解決手段】  パルス状の励起光Ｌを発生するパルス光源装置２と、該パルス光源装置２から発せられたパルス状の励起光Ｌを走査させる走査装置４と、該走査装置４により走査されたパルス状の励起光Ｌを試料Ａに結像させる対物レンズ７と、試料Ａにおいて発生した蛍光Ｆを検出する光検出装置１０とを備え、パルス光源装置２は、試料Ａの各位置にパルス状の励起光Ｌを複数回照射するようにパルス間隔が設定されている１光子励起型蛍光観察装置１を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルス状の励起光を発生するパルス光源装置と、
該パルス光源装置から発せられたパルス状の励起光を走査させる走査装置と、
該走査装置により走査されたパルス状の励起光を試料に結像させる対物レンズと、
試料において発生した蛍光を検出する光検出装置とを備え、
前記パルス光源装置は、試料の各位置にパルス状の励起光を複数回照射するようにパルス間隔が設定されている１光子励起型蛍光観察装置。
【請求項２】
前記対物レンズの結像位置と共役な位置に配置され、対物レンズおよび走査装置を介して戻る蛍光の一部を通過させる共焦点ピンホール部材を備える請求項１に記載の１光子励起型蛍光観察装置。
【請求項３】
前記光検出装置が、０次元の光検出素子からなる請求項１または請求項２に記載の１光子励起型蛍光観察装置。
【請求項４】
前記走査装置が、前記対物レンズの結像位置と共役な位置に光軸を遮るように配置され、複数のピンホールまたはスリットを有する共焦点ディスクと、該共焦点ディスクを光軸に略平行な軸線回りに回転させるモータとを備える請求項１に記載の１光子励起型蛍光観察装置。
【請求項５】
前記パルス光源装置が、ストロボ光源またはパルスレーザ光源を備える請求項１から請求項４のいずれかに記載の１光子励起型蛍光観察装置。
【請求項６】
前記パルス光源装置が、連続発光光源と、該連続発光光源からの光を変調してパルス状の励起光を形成する変調装置を備える請求項１から請求項４のいずれかに記載の１光子励起型蛍光観察装置。
【請求項７】
パルス状の励起光を試料に走査させて、試料から発生する蛍光を検出する１光子励起型蛍光観察方法であって、試料の各位置にパルス状の励起光を複数回照射するようにパルス間隔が設定されている１光子励起型蛍光観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、１光子励起型蛍光観察装置および方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、パルスレーザ光源を用いて短時間にわたり励起光を試料に照射し、試料において発生する蛍光を検出することで、瞬時に変化する高速現象の１瞬間を画像として捕らえる装置として、パルスレーザ蛍光顕微鏡が知られている（例えば、非特許文献１）。このパルスレーザ蛍光顕微鏡によれば、選択された一瞬に高いエネルギのパルス光を照射することで、十分な蛍光量を発生させることができ、明るい蛍光画像を得ることができる。
【０００３】
また、従来、フェムト秒単位のパルス幅を有する極短パルスレーザ光を試料に照射することにより、試料の非常に限られた領域で多光子吸収現象を発生させ、得られる蛍光を観察する多光子励起型蛍光顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この多光子励起型蛍光顕微鏡によれば、試料におけるレーザ光の結像位置のみにおいて多光子吸収現象を生じさせるので、高い空間分解能を達成することができる。また、試料内の深部にまでレーザ光を到達させ、蛍光観察を行うことができる。
【非特許文献１】宝谷紘一、他一名、「限界を超える生物顕微鏡−見えないものを見る  日本分光学会  測定法シリーズ」、株式会社学会出版センター、１９９１年６月３０日、２１巻、ｐ．１０５−１１９
【特許文献１】特許第２８４８９５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来のパルスレーザ蛍光顕微鏡による瞬間像はノイズが多く、空間分解能も低いため、試料における微妙な変化を精度よく捕らえるには適していないという問題がある。また、十分な蛍光量を得るために、高いエネルギのパルス光を一瞬に照射するため、例えば、細胞のような試料に損傷を与え、退色を生じさせてしまう不都合もある。仮に、試料に損傷を与えない程度にエネルギを下げたパルス光を照射する場合には、蛍光画像が暗くなるという不都合が考えられる。
【０００５】
一方、多光子励起型蛍光顕微鏡によればそのような不都合はない。すなわち、複数の光子により蛍光を発生させるので、各光子のエネルギが低い長波長のレーザ光を使用することができるため、試料の損傷が少なくて済む。したがって、焦点面以外の観察しない部分における試料の退色を防止し、長時間にわたる観察も可能となる。
しかしながら、多光子励起型蛍光顕微鏡は、極短パルスレーザ光を使用するため、光学素子を通過する際に発生する分散を補償するために、分散補償装置が必要不可欠であり、装置が複雑かつ大型化するという不都合がある。また、極短パルスレーザ自体も大きく、コストが高いという問題もある。
【０００６】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、連続光を照射する場合よりも試料の損傷を抑制し、かつ、明るい蛍光画像を得ることができる１光子励起型蛍光観察装置および方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、パルス状の励起光を発生するパルス光源装置と、該パルス光源装置から発せられたパルス状の励起光を走査させる走査装置と、該走査装置により走査されたパルス状の励起光を試料に結像させる対物レンズと、試料において発生した蛍光を検出する光検出装置とを備え、前記パルス光源装置は、試料の各位置にパルス状の励起光を複数回照射するようにパルス間隔が設定されている１光子励起型蛍光観察装置を提供する。
【０００８】
本発明によれば、パルス光源装置から発せられたパルス状の励起光は、走査装置の作動により走査され、対物レンズによって試料に結像される。すなわち、対物レンズにより結像された励起光の光スポットは、走査装置の作動によって、試料における結像面上を走査させられることになる。励起光が照射された試料の各位置においては、蛍光物質が励起されることによって蛍光が発せられ、発生した蛍光は対物レンズおよび走査装置を介して戻り、光検出装置により検出される。
【０００９】
本発明の発明者は、検討の結果、連続発光の励起光を照射し続けた場合に発生する蛍光よりも、パルス状の励起光を複数回照射した場合に発生する蛍光の方が、明るい蛍光像を得ることができ、また、試料の損傷も少ないという知見を得た。
本発明に係る１光子励起型蛍光観察装置は、パルス光源装置が、試料の各位置に複数回にわたりパルス状の励起光を照射するようなパルス幅に設定されたパルス状の励起光を出射する。したがって、本発明によれば、パルス状の励起光の光スポットが移動する結像面上の各位置において複数回にわたりパルス状の励起光を照射することで、連続光により走査する場合よりも明るい蛍光画像を得ることができ、かつ、試料の損傷を抑制することができる。また、多光子吸収現象を発生するような極短パルスレーザを必ずしも使用する必要がないので、分散補償が不要となり、装置の構成を簡易にして小型化を達成することができる。
なお、本発明において、「パルス状」の語句には、正弦変調等のように光の強弱の変動があるものも含まれる。
【００１０】
上記発明においては、前記対物レンズの結像位置と共役な位置に配置され、対物レンズおよび走査装置を介して戻る蛍光の一部を通過させる共焦点ピンホール部材を備えることとしてもよい。
このようにすることで、明るくかつ分解能の高い共焦点蛍光画像を得ることができる。
【００１１】
また、上記発明においては、前記光検出装置が、０次元の光検出素子からなることとしてもよい。
このようにすることで、試料の各位置において複数回にわたり発生した蛍光を、その位置毎に０次元の光検出素子によって蓄積した後に信号処理することができる。すなわち、複数回にわたる検出の度に処理された信号を電気的に加算平均処理する場合と比較して、光検出素子内で蓄積した方が、信号処理量が少なくて済み、ノイズの発生を低減して精度の高い蛍光画像を得ることができる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記走査装置が、前記対物レンズの結像位置と共役な位置に光軸を遮るように配置され、複数のピンホールまたはスリットを有する共焦点ディスクと、該共焦点ディスクを光軸に略平行な軸線回りに回転させるモータとを備えることとしてもよい。
このように構成することで、モータの作動により共焦点ディスクを回転させると、共焦点ディスクに設けられたピンホールまたはスリット等が移動する結果、ピンホールまたはスリット等を通過したパルス状の励起光が試料に結像されて形成される複数の光スポットが、試料上で走査させられる。各光スポットにおいて発生した蛍光はＣＣＤやＣＭＯＳのようなイメージング装置からなる光検出器により一度に検出されるので、より高速に明るい蛍光画像を得ることができる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記パルス光源装置が、ストロボ光源またはパルスレーザ光源を備えることとしてもよい。単一のパルス状の励起光によって十分な蛍光量を得る従来の装置と異なり、各位置における複数回の照射により連続照射より明るい蛍光画像を得るので、従来よりも十分にエネルギの低いパルス状の励起光を照射して、試料の損傷を防ぐことができる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記パルス光源装置が、連続発光光源と、該連続発光光源からの光を変調してパルス光を形成する変調装置を備えることとしてもよい。ストロボ光源は、蓄えたエネルギを瞬時に放出することでパルス状の励起光を発生するため、パルスレーザ光源と比較して高速性および安定性が低い。本発明においては、単一のパルス光を照射する場合よりも十分に小さなピークパワーで済むので、安定性の高い連続発光光源を採用し、変調装置によって高速変調することにより、安定性および高速性の高いパルス光源装置を得ることができる。これにより、走査範囲の全域にわたって均一にパルス状の励起光を照射し、精度の高い蛍光画像を得ることができる。
【００１５】
また、本発明は、パルス状の励起光を試料に走査させて、試料から発生する蛍光を検出する１光子励起型蛍光観察方法であって、試料の各位置にパルス状の励起光を複数回照射するようにパルス間隔が設定されている１光子励起型蛍光観察方法を提供する。
本発明によれば、試料の各位置に断続的に照射されるパルス状の励起光の各々によって蛍光が発生するので、連続した励起光を照射する場合と比較して、試料の損傷を低く抑えながら明るい蛍光画像を得ることができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、試料の各位置に断続的に照射されるパルス状の励起光の各々によって蛍光が発生するので、連続した励起光を照射する場合と比較して、試料の損傷を低く抑えながら明るい蛍光を得ることができる。したがって、走査範囲の全域にわたって試料の損傷を抑えつつ明るい蛍光を得ることにより、明るい蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の一実施形態に係る１光子励起型蛍光観察装置１について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る１光子励起型蛍光観察装置１は、図１に示されるように、パルス状のレーザ光を発生するパルスレーザ光源（パルス光源装置）２と、該パルスレーザ光源２から発せられたレーザ光Ｌを平行光に変換するコリメートレンズ３と、平行光に変換されたレーザ光Ｌを２次元的に走査する走査装置４と、該走査装置４により走査されたレーザ光が通過する瞳投影レンズ５と、瞳投影レンズ５を通過した光を平行光に変換する結像レンズ６と、この平行光を試料Ａに集光させる対物レンズ７と、試料Ａにおいて発生し、対物レンズ７、結像レンズ６、瞳投影レンズ５および走査装置４を介して戻る蛍光Ｆを分岐するダイクロイックミラー８と、分岐された蛍光Ｆを集光する集光レンズ９と、該集光レンズ９の焦点位置近傍に検出面が配置された光検出器（光検出装置）１０とを備えている。
【００１８】
走査装置４は、例えば、直交する２つの軸線（模式的に図示されている）回りに揺動可能な２枚のガルバノミラー４ａ，４ｂを対向配置してなる、いわゆる近接ガルバノミラーである。
光検出器１０は、例えば、０次元の光検出素子である光電子増倍管(ＰＭＴ：PhotoMultiplier-Tube)である。
【００１９】
図中、符号１１は、ダイクロイックミラー８によって分岐された蛍光Ｆに含まれるレーザ光Ｌ成分を除去するバリアフィルタである。また、符号１２は、光検出器１０において発生した電気信号を処理して画像情報を形成する信号処理装置であり、符号１３は形成された画像情報を表示するモニタである。信号処理装置１２は、各ガルバノミラー４ａ，４ｂの角度情報と、光検出器１０から受け取った蛍光の輝度情報とに基づいて画像情報を構築するように構成されている。
また、符号１４はパルスレーザ光源２から発せられたレーザ光を導く光ファイバ、負号１５は、瞳投影レンズ５からのレーザ光を偏向するミラーを示している。
【００２０】
本実施形態においては、パルスレーザ光源２が、走査装置４を構成するガルバノミラー４ａ，４ｂの揺動速度よりも十分に速い速度で断続するパルス状のレーザ光Ｌを出射するように構成されている。近接ガルバノミラーの場合、一方のガルバノミラー４ａ（または４ｂ）の揺動速度が速く、他方のガルバノミラー４ｂ（または４ａ）の揺動速度が遅いが、本実施形態においては速い方のガルバノミラー４ａ（または４ｂ）の揺動速度よりも十分に速い速度でパルス状のレーザ光Ｌが断続するようにそのパルス間隔が設定されている。
これにより、パルスレーザ光源２は、パルス状のレーザ光Ｌが試料Ａの各位置において複数回断続して照射されるようにそのパルス幅を設定されていることになる。
【００２１】
このように構成された本実施形態に係る１光子励起型蛍光観察装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る１光子励起型蛍光観察装置１により蛍光画像を取得するには、パルスレーザ光源２を作動させることにより、パルス状のレーザ光Ｌを発生させる。パルスレーザ光源２から発せられたパルス状のレーザ光Ｌは、光ファイバ１４を伝播してコリメートレンズ３によって平行光に変換され、ダイクロイックミラー８を通過して走査装置４により２次元的に走査される。その後、瞳投影レンズ５によって光をリレーし、ミラー１５によって偏向され、結像レンズ６および対物レンズ７を介して試料Ａに集光させられる。
【００２２】
試料Ａにおいて発生した蛍光Ｆは、対物レンズ７によって集められ、結像レンズ６、ミラー１５、瞳投影レンズ５および走査装置４を介して戻り、ダイクロイックミラー８によってレーザ光Ｌから分岐され、バリアフィルタ１１を通過して集光レンズ９により光検出器１０に集光させられて検出される。
この場合において、本実施形態に係る１光子励起型蛍光観察装置１によれば、試料Ａの各位置においてパルス状のレーザ光Ｌが複数回にわたって照射される。
【００２３】
ここで、蛍光分子の励起と蛍光発光機構について説明する。
一般的に、蛍光分子は安定な基底準位レベル（Ｅ０）の状態に多数存在している。この状態の分子に対して、上準位のエネルギー状態（Ｅ１）との差に相当するエネルギー（Ｅ１−Ｅ０＝ｈν１）の光を吸収すると、ある確率(Ｆ０１)にて励起が起こり、上準位のエネルギー状態に遷移する。
ここで、ｈ：プランク定数、ν１：Ｅ１−Ｅ０のエネルギー差に相当する振動数である。
【００２４】
主に光励起方法としては、レーザ光やランプ光が用いられ、ｈν１にあったエネルギーの光を選択している。
上準位のエネルギー状態は、比較的寿命が短く、また不安定であり、別の安定なエネルギー状態に移行する。例えば、下準位のエネルギー状態（Ｅ２）へある確率γ１で移行し、その準位から光（ｈν２）を放出して、基底状態（Ｅ０）へ遷移する。このとき発生する光が蛍光である。
【００２５】
また、中にはｈν２の光を放出せずに、別のエネルギー準位へ遷移したり、イオン化が起こり異なる分子状態なったり、また分子解離など発生し組成が変わることも考えられる。このような現象はある確率γ２で発生し、光を発しないため、長時間観察をしている場合、蛍光量が時間と共に減少していく。これは、基底状態に戻る分子数が減り、結果的に蛍光を発する分子が減少するためで、一般的に退色と言われる。
本説明に使ったモデルは３準位系モデルであるが、２準位または４準位であっても、基本的なメカニズムは変わらない。
【００２６】
なお、蛍光量の多さは、蛍光分子に与える励起光の単位時間あたりのエネルギーやその時間変化と、蛍光分子の励起確率や上準位のエネルギーの寿命などに依存している。例えば、エネルギーの高い励起光を連続的に与え続けても強い蛍光が得られるとは限らず、上準位レベルの分子が飽和状態になったり、また退色現象が多数発生したりしてしまい、効率のよい蛍光発生のプロセスとは言えない。
長時間観察や細胞ダメージ回避のためには、できるだけ少ない励起エネルギーで、分子を効率的に励起し、また退色現象をできるだけ低減し、効率よい蛍光を得ることが非常に重要である。
【００２７】
本実施形態に係る１光子励起型蛍光観察装置１によれば、単一のパルスにより十分な蛍光量を得る従来のパルスレーザ蛍光顕微鏡と比較して、同じ蛍光量を得るための各パルス状のレーザ光Ｌのピークパワーを十分に低減することができる。また、連続発光レーザ光を各位置における光スポットの滞在期間中にわたって連続照射する場合と比較すると、各パルス状のレーザ光Ｌのピークパワーを大きくしても、パルス間隔をあけて休止期間を設けることによって、その滞在期間中にわたる平均パワーを低減することができる。
【００２８】
その結果、ピークパワーを単一のパルスの場合よりも低減して、試料Ａの瞬間的な損傷を防止することができるとともに、連続発光レーザ光を照射する場合よりも平均パワーを低減して、試料Ａに加える総エネルギが過大となることによる試料Ａの損傷防止を図ることができる。また、発明者の知見によれば、レーザ光を連続的に照射する場合と比較して、十分に低い平均パワーでも明るい蛍光Ｆを得ることができる。したがって、レーザ光Ｌのパワーを低減しながら明るい蛍光画像を取得することができるという利点がある。
【００２９】
特に、試料Ａの各位置における光スポットの滞在期間中に複数回に分けて発生した蛍光Ｆを０次元の光検出素子である光検出器１０によって蓄積した後に、信号処理装置１２に送り、各ガルバノミラー４ａ，４ｂの角度情報とともに画像情報を構築することにより、蛍光Ｆの発生毎に信号処理装置１２に送り、信号処理装置１２において平均処理するような場合と比較して、信号の伝送や処理において重畳するノイズを低減することができる。
【００３０】
ここで、本実施形態に係る１光子励起型蛍光観察装置１の一実施例について説明する。
オリンパス株式会社製レーザ走査型蛍光顕微鏡ＦＶ３００を用いて、オリンパス株式会社製Ｐｔｋ２細胞（マウス血管内皮細胞）をＤＡＰＩにより染色した試料Ａを観察した。光源としては、４０５ｎｍ連続発光レーザ光源と、４０５ｎｍパルスレーザ光源とを用いた。パルスレーザ光源のパルス半値幅は７０ｐｓ、繰り返し周波数は１００ＭＨｚである。
これによれば、パルスレーザ光源を用いた場合に得られた蛍光画像を同等の明るさを有する蛍光画像を、連続発光レーザ光源によって得るためには、２倍以上の平均パワーを試料Ａに加える必要があることがわかった。
【００３１】
すなわち、パルスレーザ光源２を用いることにより、試料Ａに加える平均パワーを低減して明るい蛍光画像を得ることができる。したがって、試料Ａに与える損傷を低減して長期間にわたる観察が可能となる。また、超短パルスレーザ光を使用する多光子励起型蛍光観察装置とは異なり、レーザ光Ｌの分散を考慮する必要がないので、装置の構成を簡易にし、また、小型化を図ることができる。
【００３２】
なお、本実施形態においては、試料Ａから戻る蛍光Ｆを全て検出する方式の１光子励起型蛍光観察装置１を例に挙げて説明したが、これに代えて、図３に示されるように、ダイクロイックミラー８の後段に第２の中間像を形成する集光レンズ１６を配置し、試料Ａにおける対物レンズ７の結像位置と共役な位置関係となる第２の中間像位置近傍に共焦点ピンホール部材１７を配置することにしてもよい。これにより、試料Ａにおけるレーザ集光位置から発せられた蛍光Ｆのみが共焦点ピンホール１７ａの通過を許容される。したがって、高い解像度の共焦点蛍光画像を得ることができる。
【００３３】
また、上記実施形態においては、単一のパルスレーザ光源２を使用した１光子励起型蛍光観察装置１を例に挙げて説明したが、図４に示されるように、波長の異なるパルス状のレーザ光Ｌ１，Ｌ２を出射する複数のパルスレーザ光源２Ａ，２Ｂを使用してもよい。図４は２つのパルスレーザ光源２Ａ，２Ｂを用いた場合の例であり、この場合に、第１の波長のレーザ光Ｌ１を通過させ、第２の波長のレーザ光Ｌ２を反射するダイクロイックミラー１８によって、２種類のレーザ光Ｌ１．Ｌ２を試料Ａに同時に入射させることができる。
【００３４】
図中、符号１９はコリメートレンズ、符号２０は光ファイバ１４の端面にレーザ光Ｌ１，Ｌ２を集光させるカップリングレンズ、符号２１はレーザ光Ｌ２を偏向させるミラー、符号２２は、蛍光Ｆ１，Ｆ２を分岐するダイクロイックミラーを示している。
【００３５】
また、第１のパルスレーザ光源２Ａから発せられた第１の波長のレーザ光Ｌ１により試料Ａが励起された結果、試料Ａにおいて発生する第１の波長の蛍光Ｆ１を検出する第１の光検出器１０Ａと、第２のパルスレーザ光源２Ｂから発せられた第２の波長のレーザ光Ｌ２により試料Ａが励起された結果、試料Ａにおいて発生する第２の波長の蛍光Ｆ２を検出する第２の光検出器１０Ｂとをダイクロイックミラー２２によって結合し、複数の波長の蛍光Ｆ１，Ｆ２を同時に検出することができる。
【００３６】
また、上記実施形態においては、近接ガルバノミラーからなる走査装置４により単一のレーザ光束を走査させるシングルビーム走査型の１光子励起型蛍光観察装置１について説明したが、図５に示されるように、マルチビーム走査型の１光子励起型蛍光観察装置１に適用してもよい。図５に示される１光子励起型蛍光観察装置１は、集光ディスク２３とピンホールディスク２４とをドラム２５により連結し、モータ２６により回転駆動する共焦点スキャナ２７を有している。
【００３７】
集光ディスク２３は、ガラス基板の片面に形成された複数のマイクロ凸レンズ（図示略）を有するものである。マイクロ凸レンズは、半径方向に所定距離だけ順次ずれた状態で配列されている。ピンホールディスク２４は、基板に複数のピンホール（図示略）を有するものである。ピンホールは、半径方向に所定距離だけ順次ずれた状態で配置されている。集光ディスク２３とピンホールディスク２４との間には、ダイクロイックミラー８が配置されており、ピンホールディスク２４のピンホールを通過して戻る蛍光Ｆをダイクロイックミラー８によって分離して、バリアフィルタ１１、集光レンズ９を介してクールドＣＣＤまたはＣＭＯＳ等のイメージング素子からなる光検出装置１０′により撮像するようになっている。
【００３８】
共焦点スキャナ２７を用いることにより、パルスレーザ光源２から発せられたレーザ光Ｌを複数のピンホールに同時に通過させて、複数点のレーザ光Ｌの光スポットによって試料Ａを走査することができ、試料Ａの蛍光画像を迅速に取得することができる。
この場合に、各瞬間において、複数点のレーザ光Ｌの光スポットが試料Ａに照射されると、その位置において蛍光Ｆが発生し、光検出装置１０′の対応する画素に入射される。そして、共焦点スキャナ２７の回転により、各光スポットの位置が試料Ａに対して時々刻々と移動する。
【００３９】
本実施形態においては、光スポットの移動速度よりも十分に速い速度で断続するパルスレーザ光Ｌを出射することにより、光スポットが一の位置に滞在している期間中に複数回のパルスレーザ光Ｌを試料Ａに照射することができる。これにより、連続光を照射する場合と比較して、明るい蛍光画像を得ることができ、また、試料Ａの退色等の損傷を抑制することができる。
【００４０】
なお、上記実施形態において、共焦点スキャナ２７としてピンホールディスク２４を有するものを例に挙げて説明したが、これに代えて、回転により変位する複数のスリットが設けられたディスクを有するものを採用してもよい。
【００４１】
また、レーザ光Ｌを走査する近接ガルバノミラーからなる走査装置４または共焦点スキャナ２７に代えて、図６に示されるように、複数の微小なミラーを２次元的に配列してなるデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）のような走査ミラー素子２８を採用してもよい。図中、符号２９は集光レンズである。
走査ミラー素子２８を構成する各ミラーを、外部の図示しない制御装置からの動作指令により選択的にオンオフして、試料Ａに向けて反射するレーザ光Ｌの位置を２次元的に変化させることで、試料Ａに照射する光スポットを移動させることができる。
【００４２】
そして、走査ミラー素子２８を結像レンズ６の後側焦点位置に配置することで、微小なミラーを共焦点ピンホールに見立て、共焦点系を構成することができる。すなわち、微小なミラーにより反射して戻る蛍光Ｆのみを光検出装置１０によって検出することが、対物レンズ７の結像位置において発生した蛍光Ｆのみを検出することになり、高い分解能の蛍光画像を得ることができるという利点がある。また、複数の微小なミラーによって同時にレーザ光Ｌを反射させることにより、マルチビーム走査型の１光子励起型蛍光観察装置１を構成することができる。
【００４３】
また、上記実施形態においては、パルス光源装置として、パルスレーザ光源２を有するものについて説明した。これに代えて、キセノンフラッシュランプのようなストロボ光源と励起フィルタとを組み合わせたパルス光源装置を採用してもよい。
【００４４】
ここで、連続発光光源装置とキセノンフラッシュランプを用いた場合の比較実験結果について説明する。
連続発光光源装置として１００Ｗの水銀連続照明ランプを用い、パルス光源装置として６０Ｗ、繰り返し周波数６０Ｈｚのキセノンフラッシュランプを用いた。水銀連続照明ランプと比較して、キセノンフラッシュランプは、ピークパワーが約１００倍、平均パワーが約１／４５である。キセノンフラッシュランプの各パルスの半値幅は４μｓである。
試料Ａとしては、オリンパス製Ｐｔｋ２細胞（マウス血管内皮細胞）をＤＡＰＩおよびＡｌｅｘａ４８８により染色したものを用いた。これによれば、平均パワーが等しくなるように換算すると、キセノンフラッシュランプでの露光時間が水銀連続照明ランプの１／３０以下となり、試料Ａに与えるダメージを十分に低減しつつ、明るい蛍光画像を得ることができることがわかった。
【００４５】
また、これに代えて、図７に示されるように、連続発光レーザ光Ｌを発生する連続発光レーザ光源２′と、発生されたレーザ光Ｌを断続させてパルス状に整形する高速光変調素子３０とを備えるものとしてもよい。高速光変調素子３０としては、音響光学素子あるいは電気光学素子を採用することができる。このようにすることで、より安定したピークパワーとパルス幅およびパルス間隔を有するパルスレーザ光Ｌを発生させることができる。したがって、試料Ａの各位置を均一なパルスレーザ光Ｌにより照射して、精度の高い蛍光画像を得ることができる。また、安価な連続発光レーザで高い繰り返し周波数のパルス状の光を照射することができる。
【００４６】
ここで、上述した複数のレーザ光源を備える１光子励起型蛍光観察装置１の場合に、上記連続発光レーザ光源２Ａ′，２Ｂ′と高速光変調素子３０Ａ，３０Ｂとの組合せからなるパルス光源装置を用いる場合、図８に示されるように、図４に示したパルスレーザ光源２Ａ，２Ｂをそれぞれパルス光源装置に置き換えることができる。また、図９に示されるように、高速光変調素子３０を複数の連続発光レーザ光源２Ａ′，２Ｂ′に対して共用するようにしてもよい。
【００４７】
さらに、図１０に示されるように、２つの連続発光レーザ光源２Ａ′，２Ｂ′をダイクロイックミラー１８によって接続する場合に、一方の連続発光レーザ光源２Ｂ′から出射されたレーザ光Ｌ２′のみを１／２波長板３１に通過させることにより、他方の連続発光レーザ光源２Ａ′から出射されたレーザ光Ｌ１′に対して、高速光変調素子３０に入射する際のレーザ光Ｌ２′の偏光面を異ならせることとしてもよい。このようにすることで、単一の高速光変調素子３０により、２つの連続発光レーザ光源２Ａ′，２Ｂ′から出射された２種類のレーザ光Ｌ１′，Ｌ２′を交互に強弱をつけて変調することができる。
【００４８】
また、図１１に示されるように、パルス状の光を出射する光源として、ＬＥＤ３２を用いることにしてもよい。ＬＥＤ３２によれば、入力する電圧の切替により、高速に断続するパルス状の光を容易に形成することができる。
ＬＥＤ３２単体の光量は制限があるため、図１１に示されるように、複数のＬＥＤ３２を２次元的に配列して光量を確保し、フライアイレンズ３３，３４およびレンズ３５，３６を用いて、均一な光量分布を有する光束を形成した後に、励起フィルタ３７を通過させて、十分な光量および均一な光量分布を有するパルス状の励起光を形成することにしてもよい。
【００４９】
図１１に示す例では、符号３８，３９は集光レンズ（シリンドリカルレンズ）、符号４０はスリット板、符号４１は、スリットに平行な軸線回りに揺動させられるガルバノミラーである。スリット板４０により形成されたスリット光が、ガルバノミラー４１によって走査されることにより、試料上の２次元的な範囲にわたってパルス状の励起光を照射することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明の一実施形態に係る１光子励起型蛍光観察装置の全体構成を概略的に示す模式図である。
【図２】蛍光分子の励起と、蛍光発光機構を説明するための蛍光分子の３準位系モデルを示す図である。
【図３】図１の１光子励起型蛍光観察装置の第１の変形例を示す模式図である。
【図４】図１の１光子励起型蛍光観察装置の第２の変形例を示す模式図である。
【図５】図１の１光子励起型蛍光観察装置の第３の変形例を示す模式図である。
【図６】図１の１光子励起型蛍光観察装置の第４の変形例を示す模式図である。
【図７】図１の１光子励起型蛍光観察装置の第５の変形例を示す模式図である。
【図８】図１の１光子励起型蛍光観察装置の第６の変形例を示す模式図である。
【図９】図１の１光子励起型蛍光観察装置の第７の変形例を示す模式図である。
【図１０】図１の１光子励起型蛍光観察装置の第８の変形例を示す模式図である。
【図１１】図１の１光子励起型蛍光観察装置の第９の変形例を示す模式図である。
【符号の説明】
【００５１】
Ａ  試料
Ｆ，Ｆ１，Ｆ２  蛍光
Ｌ，Ｌ１，Ｌ２  レーザ光（励起光）
１  １光子励起型蛍光観察装置
２，２Ａ，２Ｂ  パルスレーザ光源（パルス光源装置）
２′，２Ａ′，２Ｂ′  連続発光レーザ光源（連続発光光源）
４  走査装置
７  対物レンズ
１０，１０′，１０Ａ，１０Ｂ  光検出装置
１７  共焦点ピンホール部材
２４  ピンホールディスク（共焦点ディスク）
２６  モータ
３０  高速光変調素子（変調装置）
３２  ＬＥＤ（パルス光源装置）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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