(57)【要約】【課題】白血球増加剤および造血障害治療剤として有用なタンパク質の製造に使用できるＤＮＡのクローニングを提供する。【解決手段】ヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをクローニングする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをクローニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、造血促進因子をコードするＤＮＡをクローニングする方法に関する。詳しくは、造血促進因子は、哺乳動物の多分化能性コロニー刺激因子、特にヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子（ｈｐＧ‐ＣＳＦ）、活性をもつポリペプチドである。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血液生成（造血）系は、様々な白血球（好中球、マクロファージ及び好塩基球／肥満細胞を含む）、赤血球（エリスロサイト）及び凝血形成細胞（巨核球／血小板）を補充する。平均的ヒト男性の造血系は毎年 4.5×1011のオーダーの顆粒球及び赤血球を産生すると推測されていたが、これは１年間で全体重に相当する。デキスターら、バイオエッセイズ、第 2巻、第 154〜158 頁、1985年〔Ｄexter et al., ＢioＥssays, 2, 154-158 (1985)〕。
【０００３】
少量の特定の造血促進因子は、少数の前駆体“幹細胞”の各種血液細胞系への分化、これらの系の著しい増殖及びこれらの系からの成熟血液細胞の最終的分化の原因をなすと考えられている。造血促進因子は極端に少量で存在しているため、これら因子の検出及び同定は分析の仕方にかかっていたが、今までは人為的条件下での培養細胞に対する刺激効果に基づき様々な因子の中から区別できるにすぎなかった。その結果、多数の名称が極めて少数の因子を表示するために考え出されてきた。かかる混同が生じた例として、ＩＬ‐３，ＢＰＡ、マルチ‐ＣＳＦ、ＨＣＧＦ，ＭＣＧＦ及びＰＳＦという語は、すべて現在では同一のマウス造血促進因子に該当すると考えられている頭字語である。メトカーフ、サイエンス、第 2 29巻、第16〜22頁、1985年〔Ｍetcalf, Ｓcience, 229，16-22 (1985)〕。更に、各種マウスの成長調節糖タンパク質に関する、バージェスら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第 252巻、第1988頁、1977年〔Ｂurgess, et al., Ｊ. Ｂiol. Ｃhem., 252, 1988 (1977）〕、ダスら、ブラッド、第58巻、第 600頁；1980年（Ｄas, et al., Ｂlood, 58, 600 (1980)〕；イーレら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、第 129巻、第2431頁、1982年〔Ｉhle,et al., Ｊ. Ｉmmunol., 129，2431 (1982）〕、ニコラら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第 258巻、第9017頁、1983年〔Ｎicola, et al., Ｊ. Ｂiol.Ｃhem., 258, 9017 (1983）〕、メトカーフら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、第30巻、第 773頁、1982年〔Ｍetcalf, et al., Ｉnt. Ｊ. Ｃance r, 30, 773 (1982)〕；及び、バージェスら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、第26巻、第 647頁、1980年〔Ｂurgess, et al., Ｉnt. Ｊ. Ｃancer, 26, 647 (1980)〕参照。
【０００４】
組換え遺伝子技術の利用はこの混乱の中から一定の秩序をもたらした。例えば、赤血球産生を促進するヒトエリスロポエチンのアミノ酸及びＤＮＡ配列が得られた〔1985年 6月20日に公開されたリン（Ｌin）のＰＣＴ出願公開第85/02610号明細書参照。〕。組換え方法は、ヒト顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子のｃＤＮＡの単離に関しても利用された。リーら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）第82巻、第4360〜4364頁、1985年〔Ｌee et al., Ｐroc. Ｎatl.Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）, 82, 4360-4364 （1985）〕及びウオンら、サイエンス、第 228巻、第 810〜814 頁、1985年〔Ｗong et al., Ｓcience, 228，810-814 (1985)〕。更に、マウス遺伝子のクローニングに関する、ヨコタら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第81巻、第1070頁、1984年〔Ｙokota,et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）, 81, 1070 (1984) 〕、ファングら、ネーチャー、第 307巻、第 233頁、1984年〔Ｆung, et al., 307, 233 (1984)〕及び、ゴーフら、ネーチャー、第 309巻、第 763頁、1984年〔Ｇough, et a l., Ｎature, 309 , 763(1984)〕、並びにヒトＭ‐ＣＳＦに関するカワサキら、サイエンス、第 230巻、第 291頁、1985年〔Kawasakiet al., Ｓcience, 230 ，291 (1985)〕参照。
【０００５】
ヒト多分化能性コロニー刺激因子（ｈｐＣＳＦ）又はプルリポエチンと称されるヒト造血促進因子は、ヒト膀胱癌細胞系の培養液中に存在していることが示された。この細胞系は5637と呼ばれて、米国菌寄託機関（Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection)、ロックビル、メリーランドにおいて制限条件付でＡＴＣＣ寄託番号第ＨＴＢ‐９号として寄託されている。この細胞系から精製されたｈｐＣＳＦは、ヒト骨髄前駆体細胞を用いた分析において、すべての主な血液細胞系の産生につながるような多分化能性前駆細胞の増殖及び分化を促進することが報告された。ウェルトら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第82巻、第1526〜1530頁、1985年〔Ｗelte et al.,Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）, 82, 1526‐1530 (1985）〕。ｈｐＣＳＦの精製には、（ＮＨ4）2 ＳＯ4 沈降、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥセルロース、ＤＥ52）、ゲル濾過（ＡｃＡ54カラム）、及びＣ18逆相高性能液体クロマトグラフィーを利用していた。Ｃ18逆相ＨＰＬＣ画分において 2つの活性ピークの 2番目に溶出するｈｐＣＳＦとして確認されたタンパク質は、銀染色を用いるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）での測定によれば、分子量（ＭＷ）18,000を有すると報告された。ｈｐＣＳＦは、等電点5.5 を有し〔ウェルトら、ジャーナル・オブ・セル・バイオケミストリー、増刊第9A号、第116 頁、1985年（Ｗelte, et al., Ｊ. Ｃell Ｂiochem., Ｓupp 9Ａ, 116 (1985)）〕、マウス骨髄単球性白血病細胞系ＷＥＨＩ‐３Ｂ Ｄ+ に対して高分化能を有する〔ウェルトら、分子及び細胞生物学のＵＣＬＡ討論会、ゲールら編集、ニューシリーズ、第28巻、1985年〔Ｗelte, et al., ＵＣＬＡ Ｓymposia on Ｍolecular and Ｃellular Ｂiology, Ｇale, et al., eds.,ＮewＳeries, 28 (1985))〕ことが早期に報告された。予備研究では、ｈｐＣＳＦと確認された因子はヒトＣＦＵ‐ＧＭ分析において最初の 7日間に顕著な顆粒球コロニー刺激活性を有することを示している。
【０００６】
ヒトＣＳＦ‐βと称されるもう1つの因子も、ヒト膀胱癌細胞系5637から単離されたが、未標識マウスＧ‐ＣＳＦの場合と同一の用量応答関係においてＷＥＨＩ‐３Ｂ Ｄ+ 細胞との結合性に関しマウス 125Ｉ‐標識顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）の競合体として記載されていた〔ニコラら、ネーチャー、第 314巻、第 625〜628 頁、1985年（Ｎicola, et al.,Ｎature, 314，625-628 （1985））〕。この用量応答関係は、以前、未標識マウスＧ‐ＣＳＦに独特であって、Ｍ‐ＣＳＦ、ＧＭ‐ＣＳＦ又はマルチ‐ＣＳＦのような因子には見られないと報告されていた〔ニコラら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第81巻、第3765〜3769頁、1984年（Ｎicola,et al.,Ｐroc.Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）, 81, 3765‐3769 (1984))〕。ＣＳＦ‐β及びＧ‐ＣＳＦはともに、それらがＷＥＨＩ‐３Ｂ Ｄ+ 細胞の分化を誘導する高い能力を有している点において、ＣＳＦ類の中では独特である（ニコラら、イムノロジー・トゥデー、第５巻、第76〜80頁、1984年〔Ｎicola, et al., Ｉmmunology Ｔoday， 5，76-80 (1984)〕）。高濃度でＧ‐ＣＳＦは混合顆粒球／マクロファージコロニー形成細胞を刺激するが（ニコラら、1984年、同上）、このことは、ヒト骨髄培養物及びｈｐＣＳＦの14日間のインキュベート後に顆粒球性、単球性、混合顆粒球／単球性及び好酸球性のコロニー（ＣＦＵ‐ＧＥＭＭ）の出現を示す予備実験結果と一致する。ＣＳＦ‐βもマウス骨髄細胞使用分析において好中球性、顆粒球性のコロニー形成を促進すると記載されていたが、この性質は因子をＧ‐ＣＳＦとして同定するための基準とされた。これらの類似性から、ヒトＣＳＦ‐βはＧ‐ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）と同一視された（ニコラら、ネーチャー、第 314巻、第 625〜 628頁、1985年〔Ｎicola, et al., Ｎature, 314 , 625-628 (1985)〕）。
【０００７】
これらの共通の性質に基づけば、ニコラら、同上のヒトＣＳＦ‐β及びウェルトら、同上のｈｐＣＳＦは、適切にはヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子（ｈｐＧ‐ＣＳＦ）と称される同一の因子であると思われる。ｈｐＧ‐ＣＳＦの特徴づけ及び組換え産生は、イン・ビトロ ＷＥＨＩ‐３Ｂ Ｄ+ 白血病細胞数を“全く正常な濃度”で完全に抑制するマウスＧ‐ＣＳＦの報告されている能力、並びに、マウスで確立された移植骨髄白血病を抑制する粗製マウスＧ‐ＣＳＦ注射製剤の報告されている能力からみて、特に望ましいであろう。メトカーフ、サイエンス、第229 巻、第 16〜22頁、1985年〔Ｍetcalf, Ｓcience, 229, 16-22(1985）〕参照。更に、サックス、サイエンティフィック・アメリカン、第284 巻、第１号、第40〜47頁、1986年〔Ｓachs, Ｓcientific Ａmerican, 2848 (1), 40-47 (1986)〕参照。
【０００８】
ｈｐＧ‐ＣＳＦが治療上重要であるとわかり、したがって市販規模量の入手が必要となる限り、細胞培養物からの単離では、十分な物質源を提供することは困難である。たとえば、ウェルトら（1985年、同上）により天然ｈｐＣＳＦ単離物源として報告されたヒト膀胱癌細胞系5637（ＡＴＣＣ ＨＴＢ９）等のヒト腫瘍バンク細胞の商業的使用に対して制約が存在していることは、注目される。
【非特許文献１】Ｗelte et al.,Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）, 82, 1526‐1530 (1985)
【非特許文献２】Ｗelte, et al., Ｊ. Ｃell Ｂiochem., Ｓupp 9Ａ, 116 (1985)
【非特許文献３】Ｇale, et al., eds.,ＮewＳeries, 28(1985)
【非特許文献４】Ｎicola, et al., Ｎature, 314 , 625-628 (1985)
【非特許文献５】Ｎicola,et al.,Ｐroc.Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）, 81, 3765‐3769 (1984)
【非特許文献６】Ｎicola, et al., Ｉmmunology Ｔoday，5，76-80 (1984)
【非特許文献７】Ｍetcalf, Ｓcience, 229,16-22(1985)
【非特許文献８】Ｓachs, Ｓcientific Ａmerican, 2848 (1), 40-47 (1986)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、造血促進因子をコードするＤＮＡ、詳しくは哺乳動物の多分化能性コロニー刺激因子、特にヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子（ｈｐＧ‐ＣＳＦ）、活性をもつポリペプチドをコードするＤＮＡをクローニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ｈｐＧ−ＣＳＦ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをクローニングする方法に関する。
【００１１】
具体的には、本発明の蛋白質は、下記のアミノ酸配列(配列番号１参照)：
2006101889.tif 000002
(但し、nは０または１である。)
または該アミノ酸配列において第1位から第174位までのアミノ酸配列のうち１つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子活性を有する蛋白質は造血障害等の治療に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明によれば、ｈｐＧ‐ＣＳＦの全部又は一部をコードするＤＮＡ配列が提供される。このような配列は、選択された非哺乳動物宿主による発現に“好ましい”コドンの組込み、制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断部位の供与、及び、簡易的発現ベクターの組立てを容易にする前端、後端又は中間部へのＤＮＡ配列の付加的供与を含むことができる。本発明は更に、１以上のアミノ酸残基の同一性又は位置に関して天然型と異なり、しかも天然型の性質の一部又は全部を保有している、ｈｐＧ‐ＣＳＦのポリペプチド類縁体又は誘導体（即ち、ｈｐＧ‐ＣＳＦに特異的な残基のすべてまでは含有していない削除類縁体、１以上の特異的残基が他の残基で置換されている〔Ｓer17〕ｈｐＧ‐ＣＳＦのような置換類縁体、及び、１以上のアミノ酸残基がポリペプチドの末端又は中間部分に付加している付加類縁体）の微生物発現をコードするＤＮＡ配列を提供する。
【００１４】
本発明の新規ＤＮＡ配列は、天然多分化能性顆粒球コロニー刺激因子における一次構造配列の少なくとも一部及び生物学的性質の１以上を有するポリペプチド産物の原核もしくは真核宿主細胞での発現を確実化するために使用される配列を含有している。本発明のＤＮＡ配列は、特に、 (a)表VII 及び表VIIIに示されたＤＮＡ配列又はそれらの相補鎖、 (b)表VII のＤＮＡ配列又はその断片と（本明細書記載のようなハイブリッド形成条件下又はより厳格な条件下で）ハイブリッド形成するＤＮＡ配列、又は (c)遺伝コードの縮重がなければ表VII のＤＮＡ配列とハイブリッド形成し得るＤＮＡ配列をも含むものである。特に (b)に包含されるものとしては、ｈｐＧ‐ＣＳＦの対立変異型及び／又は他の哺乳動物種の多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコードするゲノムＤＮＡ配列がある。特に (c)に包含されるものとしては、ｈｐＧ‐ＣＳＦ、ｈｐＧ‐ＣＳＦの断片及びｈｐＧ‐ＣＳＦ類縁体をコードする人工ＤＮＡ配列があるが、このＤＮＡ配列には微生物宿主でのメッセンジャーＲＮＡの翻訳を促進するコドンを組込むことができる。このような人工配列は、アルトン（Ａlton）らのＰＣＴ出願公開第WO83/04053号の方法により容易に組立てることができる。
【００１５】
本発明は、下記のアミノ酸配列(配列番号１参照)：
2006101889.tif 000003
【００１６】
において１つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、且つヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子活性を有するタンパク質の製造方法であって、該タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞を培養し、該タンパク質を分離精製することを特徴とする、前記製造方法を提供する。
【００１７】
ここで、アミノ酸残基の欠失、置換、付加及び／又は挿入は、例えば、D.F. Mark等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.81, p.5662-5666, 1984、S. Inouye等, Proc. Na tl. Acad. Sci. USA, Vol.79, p.3438-3441, 1982 、ＰＣＴ WO85/00817, 1985 年2 月28日公開、R.P. Wharton 等, Nature, Vol.316, p.601-605, Aug.15,1985に記載されている本願優先権主張日前の周知技術である部位特定突然変異誘発法等により実施することができる。
【００１８】
アミノ酸残基の欠失、置換、付加及び／又は挿入に関し、１つ以上のアミノ酸残基とは、該部位特定突然変異誘発法等により欠失、置換、付加及び／又は挿入できる程度の数のアミノ酸残基を意味する。
【００１９】
更に本発明に包含されるものとしては、本明細書の表VII 又は表VIIIの上部鎖ヒトｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡの一部によりコードされたポリペプチド類、即ちトラモンタノら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第12巻、第5049〜5059頁、1984年〔Ｔramontano, et al., Ｎucleic Ａcids Ｒes., 12, 5049-5059(1984)〕に記載された“相補的転化タンパク質”がある。
【００２０】
本発明は、対立変異体を含む天然ｈｐＧ‐ＣＳＦにおける一次構造配列（即ち、アミノ酸残基の連続配列）の一部もしくは全部、生物学的性質（例えば、免疫学的性質及びイン・ビトロ生物学的活性）の１以上、及び物性（例えば、分子量）を有する精製単離ポリペプチド産物を提供する。これらのポリペプチドは、化学合成操作又はゲノムもしくはｃＤＮＡのクローニングもしくは遺伝子合成により得られる外来性ＤＮＡ配列の原核もしくは真核宿主発現（例えば、細菌、酵母菌、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞の培養による）の産物である、ということによっても特徴づけられる。典型的な酵母菌〔例えばサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓaccharomyces cerevisiae)〕又は原核生物〔例えば、エシェリキア・コリ（Ｅscherichia coli)〕宿主細胞の産物は、いずれの哺乳動物タンパク質とも会合していない。脊椎動物（例えば、非ヒト哺乳動物及び鳥類）細胞における微生物発現産物は、いずれのヒトタンパク質とも会合していない。用いられた宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、哺乳動物その他の真核生物の炭水化物でグリコシル化していてもよいし、非グリコシル化のままでもよい。本発明のポリペプチドは、（-1位に）最初のメチオニンアミノ酸残基を有することもできる。
【００２１】
更に本発明に包含されるものとしては、有効量の本発明のポリペプチド産物と一緒に適切な希釈剤、アジュバント及び／又は担体を含有する、ｈｐＧ‐ＣＳＦ療法に使用される医薬組成物がある。
【００２２】
本発明のポリペプチド産物は、固体組織及び血液もしくは尿等の液体試料中におけるヒトｈｐＧ‐ＣＳＦの検出及び定量に使用される試薬を提供するために、検出可能なマーカー物質と結合させることにより“標識”する（例えば、 125Ｉで放射線標識する）ことができる。
【００２３】
本発明のＤＮＡ産物は、検出可能なマーカー（例えば、放射線標識及びビオチンのような非アイソトープ標識）で標識することもでき、しかも染色体地図上のヒトｈｐＧ‐ＣＳＦ遺伝子の位置及び／又はその関連遺伝子群の位置をつきとめるためのＤＮＡハイブリッド形成操作に用いることができる。それらはＤＮＡレベルでのヒトｈｐＧ‐ＣＳＦ遺伝子の異常を確認するためにも使用され、隣接遺伝子及びそれらの異常を確認するための遺伝子マーカーとして使用することもできる。
【００２４】
本発明のポリペプチド産物は、再生不良性貧血のような造血障害の治療のために、単独で又は他の造血因子もしくは薬物と一緒に使用される。それらは化学療法又は放射線療法による造血障害の治療にも使用される。骨髄移植の成功率は、例えばｈｐＧ‐ＣＳＦの使用により高められるであろう。創傷治癒熱傷治療及び細菌性炎症治療にもｈｐＧ‐ＣＳＦが有効である。更に、ｈｐＧ‐ＣＳＦは、白血病細胞を分化させると報告されている能力に基づき、白血病の治療にも使用される。ウェルトら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第82巻、第1526〜1530頁、1985年〔Ｗelte, et al.,Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci.(ＵＳＡ），82, 1526-1530 (1985)〕及びサックス（Ｓachs）、同上参照。
【００２５】
本発明の多数の側面及び長所は、現在の好ましい態様たる本発明の実例について説明した以下の詳細な説明を斟酌することにより、当業者であれば明らかになるであろう。
【００２６】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
【００２７】
本発明によって、ｈｐＧ‐ＣＳＦのポリペプチド配列の一部又は全部をコードするＤＮＡ配列が単離されかつ特徴づけられた。
【００２８】
下記の諸例は本発明の説明のために示されたものであって、特に、ｈｐＧ‐ＣＳＦ ｃＤＮＡ及びゲノムクローンの同定に先立ち行なわれる操作、かかる同定方法、並びに、配列決定、ｃＤＮＡ、ゲノム及び人工遺伝子に基づく発現系の開発、及びかかる系での発現ｈｐＧ‐ＣＳＦ及び類縁体産物の同定に関する。
【００２９】
更に詳しくは、例１はｈｐＧ‐ＣＳＦのアミノ酸配列決定に関する。例２はコロニーハイブリッド形成スクリーニング用ｃＤＮＡライブラリーの製造に関する。例３はハイブリッド形成プローブの組立てに関する。例４は、ハイブリッド形成スクリーニング、陽性クローンの同定、陽性ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列決定及びポリペプチド一次構造配列（アミノ酸配列）情報の作成に関する。例５はｈｐＧ‐ＣＳＦをコードするゲノムクローンの同定及び配列決定に関する。例６は、大腸菌優先（preference）コドンが用いられたｈｐＧ‐ＣＳＦをコードする人工遺伝子の組立てに関する。
【００３０】
例７は、ｈｐＧ‐ＣＳＦをコードするＤＮＡを組込んだ大腸菌形質転換ベクターの組立て方法、ｈｐＧ‐ＣＳＦの原核生物発現におけるベクターの使用、及び本発明の組換え産物の特性分析に関する。例８は、システイン残基がｈｐＧ‐ＣＳＦをコードするＤＮＡでの変異誘発により別の適切なアミノ酸残基で置換されたｈｐＧ‐ＣＳＦ類縁体の産生方法に関する。例９は、陽性ｃＤＮＡクローンから得たｈｐＧ‐ＣＳＦ類縁体をコードするＤＮＡを組込んだベクターの組立て方法、ＣＯＳ‐１細胞形質転換のためのベクターの使用、及び形質転換細胞の培養増殖に関する。例10は、本発明の組換えポリペプチド産物の物理的及び生物学的性質に関する。
【実施例】
【００３１】
例 １
(A) 文献記載方法により得られた物質の配列決定
ｈｐＧ‐ＣＳＦ試料(3〜4 μｇ、ＳＤＳ銀染色‐ＰＡＧＥ純度85〜90％)は、ウェルトら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第82巻、第1526〜1530頁、1985年〔Ｗelte, et al., Ｐroc.Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）, 82, 1526‐1530 (1985)〕に従い単離精製したものと同様であって、スローン・ケタリング・インスティテュート（Ｓloan Ｋettering Ｉnstitute）、ニューヨーク、ニューヨーク州から入手した。
【００３２】
このｈｐＧ‐ＣＳＦ試料のＮ末端アミノ酸配列を、ＡＢ 407Ａ気相分析装置〔アプライド・バイオシステムズ（Ａpplied Ｂiosystems)、フォスター市、カリフォルニア〕を用いたミクロ配列分析により１号操作（Ｒun #1)で決定し、下記表Ｉに掲示された配列情報を得た。表Ｉ‐IVでは、単一文字コードが用いられており、“Ｘ”は明確に決定されなかった残基を示し、括弧内の残基は単に択一的又は推定的に示されたものである。
【００３３】
【表１】
2006101889.tif 000004
【００３４】
高いバックグランドが操作サイクル毎に存在したが、その結果は表Ｉに報告されており、このことは試料がおそらく精製時の化学的残留物たる多くの汚染成分を有することを示していた。配列を単に参照用として保存した。
【００３５】
2号操作（Ｒun #2)では、第２試料(5〜6 μｇ、純度95％以下）は 1号操作と同様にスローン・ケタリングから入手し、配列決定操作は 1号操作と同様にして実施した。この試料は、ウェルトら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第82巻、第1526〜1530頁、1985年の図４を作成するために用いられた物質の同一ロットから得たものである。結果は、表IIに示されている。
【００３６】
【表２】
2006101889.tif 000005
【００３７】
更に多くの残基が同定されたが、 2号操作では、適当数のプローブをｈｐＧ‐ＣＳＦ ＤＮＡ調査用に組立て得るほど十分に長い明確な配列は得られなかった。表IIの配列に基づきｃＤＮＡの単離を行なうためには、少なくとも1536種類のプローブが必要であろうと計算された。再度、試料の汚染が問題視された。
【００３８】
このため、第３試料（ 3〜5 μｇ、純度40％以下）を上記のようにスローン・ケタリングから入手した。この調製物は、更に精製するために、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによる分離後、電気ブロット（electroblot)に付した。この試料の配列分析ではデータが得られなかった。
【００３９】
(B) 修正方法により得られた物質の配列決定
十分量の純粋物質を得て適切な最終的アミノ酸配列分析を実施するため、スローン・ケタリングで産生されるものと同様の膀胱癌細胞系5637の細胞（サブクローンＩＡ６）をイー・プラッツァー博士（Ｄr.Ｅ. Ｐlatzer）から入手した。細胞を最初にフラスコ中のアイコブ（Iscove′s)培地〔ギブコ（ＧＩＢＣＯ）、グランドアイランド、ニューヨーク〕で培養し、集密化させた。集密化時、培養物をトリプシン処理し、ローラーボトル中に播種したが(1.5フラスコ／ボトル）、各ボトルは 5％ＣＯ2 下で予め条件が整えられたアイコブ培地25mlを含有していた。細胞を37℃，0.3rpmで一夜増殖させた。
【００４０】
サイトデックス‐１（Ｃytodex‐1)ビーズ〔ファルマシア（Ｐharmacia）、ウプサラ、スウェーデン〕を洗浄し、下記操作により滅菌した。ビーズ 8ｇをボトルに加え、ＰＢＳ 400mlを加えた。ビーズを３時間静かに攪拌して懸濁させた。ビーズを静置させた後、ＰＢＳを排出し、ビーズをＰＢＳで洗浄し、新鮮ＰＢＳを加えた。ビーズを15分間オートクレーブで処理した。使用前に、ビーズを、新鮮培地＋10％牛胎児血清（ＦＣＳ）添加前にアイコブ培地＋10％ＦＣＳ中で洗浄し、処理ビーズを得た。
【００４１】
各ローラーボトルから30mlを除くすべての培地を除去した後、新鮮培地＋10％ＦＣＳ30ml及び処理ビーズ40mlをボトルに加えた。ボトルを 5％ＣＯ2 処理し、すべての泡を吸引除去した。ボトルを、速度0.3rpmに低下させる前、ローラー台に3rpmで 0.5時間載置した。３時間後、別のフラスコ内容物をトリプシン処理し、ビーズ含有の各ローラーボトルに加えた。
【００４２】
集密度40〜50％の時点でローラーボトル培養物をＰＢＳ50mlで洗浄し、ＰＢＳ除去前10分間回転させた。細胞を培地Ａ〔 0.2％ＦＣＳ、10-8Ｍヒドロコルチゾン、 2mMグルタミン、 100単位／mlペニシリン及び 100μｇ／mlストレプトマイシン含有アイコブ培地〕中で48時間培養した。次いで、培養上澄を3000rpm で15分間遠心分離して集め、−70℃で貯蔵した。培養物に10％ＦＣＳ含有培地Ａを再度加え、48時間培養した。培地を捨てた後、細胞を上記のようにＰＢＳで洗浄し、培地Ａ中で48時間培養した。上澄を再度集め、上記のように処理した。
【００４３】
ＩＡ６細胞の培養培地約30リットルを、10,000Ｍ. Ｗ. 遮断装置をもつ２個のカセットを備えたミリポア・ペリコン（Ｍillipore Ｐellicon)ユニットにより、濾過速度約 200ml／min 及び保持速度約1000ml/minで約 2リットルまで濃縮した。濃縮物を同一装置及び同一流速により50mMトリス(pH7.8）約10リットルで透析濾過した。透析濾過濃縮物を50mMトリス（pH7.8)で平衡化された１リットルＤＥセルロースカラムに40ml/minで添加した。添加後、カラムを50mMトリス(pH7.8)1リットル、次いで50mM ＮａＣｌ含有50mMトリス(pH7.8）２リットルにより同一速度で洗浄した。カラムを次いでＮａＣｌ濃度が75mM，100mM, 125mM， 150mM， 200mM及び300mM の６種の50mMトリス(pH7.5）１リットルで連続的に溶出させた。画分（50ml）を集め、活性画分をプールし、ＹＭ５膜装備アミコン（Ａmicon)限外濾過攪拌セルユニットで65mlに濃縮した。この濃縮物をＰＢＳで平衡化された２リットルのＡｃＡ54ゲル濾過カラムに添加した。カラムを80ml／hrで操作し、10ml画分を集めた。活性画分をプールし、Ｃ４高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに直接添加した。
【００４４】
容量125〜850mlで、タンパク質1〜8mgを含有し、その約10％がｈｐＧ‐ＣＳＦである試料を、流速1〜4ml／minでカラムに添加した。添加後、流速1ml／minで80％２‐プロパノール中の0.1Ｍ酢酸アンモニウム（pH 6.0〜7.0)により洗浄した。１ml画分を集め、タンパク質について220nm、260nm 及び280nmでモニターした。
【００４５】
精製した結果、ｈｐＧ‐ＣＳＦ含有画分を他のタンパク質含有画分から（80の画分中72及び73番目の画分として）明確に分離した。ｈｐＧ‐ＣＳＦは純度約80± 5％及び収率約50％で単離された(150〜300 μｇ）。この精製物質 9μｇを 4号操作（Ｒun #4)アミノ酸配列分析に使用し、タンパク質試料を非ポリブレンＴＦＡ活性ガラス繊維板に付着させた。配列分析は、ヘウィックら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第 256巻、第7990〜7997頁、1981年〔Hewick，et al., Ｊ. Ｂiol. Ｃhem., 256, 7990-7997 (1981)〕及びライ、アナリティカ・キミカ・アクタ、第 163巻、第 243〜 248頁、1984年〔Ｌai，Ａnal.
Ｃhim. Ａcta, 163 , 243-248 (1984)〕の方法に従い、ＡＢ 470Ａ分析装置で実施した。４号操作の結果は表III に示されている。
【００４６】
【表３】
2006101889.tif 000006
【００４７】
４号操作では、（表III の残基31に相当する）第31サイクルより先において、更に重要な配列情報は得られなかった。長い明確な配列を得るために、５号操作（Ｒun #5)においては、条件調整培地から精製されたｈｐＧ‐ＣＳＦ14μｇを45℃で１時間β‐メルカプトエタノール10mlで還元し、次いで減圧下で完全に乾燥した。タンパク質残基を次いで、ポリブレン化ガラス繊維板に付着させる前に 5％ギ酸に再溶解した。配列分析は上記 4号操作と同様にして実施した。 5号操作の結果は表IVに示されている。
【００４８】
【表４】
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【００４９】
表IVのアミノ酸配列は、下記ｈｐＧ‐ＣＳＦ ｃＤＮＡを得るためのプローブを組立てる上で、十分に長く（44残基）かつ明確であった。
例 ２
目的のｃＤＮＡ配列を単離するための標準的操作の中には、標的遺伝子の発現に基づき選択されたドナー細胞中に豊富に存在するｍＲＮＡの逆転写から得られるプラスミド担持ｃＤＮＡ“ライブラリー”の調製が含まれる。ポリペプチドのアミノ酸配列の実質的部分が公知である場合には、“標的”ｃＤＮＡ中での存在が推定される配列を複製した標識一重鎖ＤＮＡプローブ配列が、一重鎖型に変性されたｃＤＮＡのクローンコピーに対して実施されるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成操作において使用され得る。ワイスマン（Ｗeissman)ら、米国特許第 4,394,443号明細書、ウォレスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第６巻、第3543〜3557頁、1979年〔Ｗallace，et al., Ｎucleic Ａcids Ｒes., 6， 3543‐3557 (1979）〕、レイスら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第79巻、第3270〜3274頁、1982年〔Ｒeyes, et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）, 79, 3270-3274 (1982)〕、及びジェイ（Ｊaye)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーサ、第11巻、第2325〜2335、1983年参照。更に、診断実施時におけるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成操作に関するファルコー（Ｆalkow)らの米国特許第 4,358,535号明細書、及びコロニー及びプラークハイブリッド形成技術に関するデービスら、“遺伝子工学、高等細菌遺伝学のマニュアル”、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー〔Ｄavis, et al., “Ａ Ｍanual for Ｇenetic Ｅngineering, Ａdvanced ＢacterialＧenetics ”，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory 〕・コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1980年、第55〜58頁及び第 174〜176 頁参照。
【００５０】
完全ＲＮＡの定量的単離のためのグアニジニウムチオシアネート操作〔チャーグウィンら、バイオケミストリー、第18巻、第5294〜5299頁、1979年（Ｃhirgwin, et al., Ｂiochemistry , 18，5294-5299 (1979)）〕により、全ＲＮＡを膀胱癌細胞系5637（ＩＡ６）細胞約１ｇから抽出した。 無菌ＲＮＡ水溶液はＩＡ６細胞由来の全ＲＮＡを含有していた。全ＲＮＡ溶液からメッセンジャーＲＮＡのみを得るため、溶液をオリゴデオキシチミジレート〔オリゴ（ｄＴ）〕〔コラボレーティブ・リサーチ社（Ｃollaborative Ｒesearch, Ｉnc.)、ウォルサム、マサチューセッツ〕含有カラムに通した。メッセンジャーＲＮＡに特有のポリアデニル化（ポリＡ+ ）尾部はカラムに付着するが、リボソームＲＮＡは溶出する。かかる操作の結果、ポリアデニル化メッセンジャーＲＮＡ（ポリＡ+ｍＲＮＡ）約90μｇを単離した。単離されたポリＡ+ メッセンジャーＲＮＡを、ｃＤＮＡ反応で使用する前に、最終濃度４mMで 5分間室温で水酸化メチル水銀〔アルファ・ベントロン（Ａlpha Ｖentron）、デンバーズ、マサチューセッツ〕により前処理した。水酸化メチル水銀処理は、翻訳を阻害するメッセンジャーＲＮＡ自体の相互反応及びそれと汚染分子との相互反応を抑制させた。ペイバーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第 258巻、第7636〜7642頁、1979年〔Ｐayvar, et al., Ｊ. Ｂiol.Ｃhem., 258, 7636-7642 (1979)〕参照。
【００５１】
オカヤマ操作法〔オカヤマら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、第２巻、第161〜170 頁、1982年（Ｏkayama, et al., Ｍolcular & Ｃellular Ｂiology, 2, 161-170 （1982))〕に従い、ｃＤＮＡバンクをＩＡ６細胞から得たｍＲＮＡにより調製した。ｃＤＮＡを次いでインキュベートして増幅用宿主微生物大腸菌Ｋ‐12株ＨＢ 101に組込んだ。
例 ３
表IVのｈｐＧ‐ＣＳＦアミノ末端配列に基づき考え出されたハイブリッド形成プローブは、各々が長さ23塩基で 3個のイノシン残基を有する24組のオリゴヌクレオチドから構成されていた。プローブオリゴヌクレオチドをカルザースら、ジェネティック・エンジニアリング、第 4巻、第 1〜18頁、1982年〔（Ｃaruthers, et al., Ｇenetic Ｅngineering, 4, 1-18(1982)〕の操作に従い製造し、ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化（Ｋinasing)することによりγ‐32Ｐ ＡＴＰで標識した。表IVの配列中残基23〜30のメッセンジャーＲＮＡに対応するプローブオリゴヌクレオチドは、表Ｖに示されている。
【００５２】
【表５】
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【００５３】
中立性をＩに付与したのは、タカハシら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第82巻、第1931〜1935頁、1985年〔Ｔakahashi, et al., Ｐroc.Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）, 82, 1931‐1935 (1985）〕及びオーツカら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第 260巻、第2605〜2608頁、1985年〔Ｏhtsuka, et al.,Ｊ. Ｂiol. Ｃhem., 260, 2605-2608 (1985)〕の研究公表に基づいていた。しかしながら、イノシンはＧ又はＴと塩基対形成した場合には脱安定化効果を有する。タカハシらの場合では、イノシンは、それらが一群として平均化してほぼ中立化するに到ることから、中立効果を有するようである（例えば、 3個はＣと好ましく対形成したが、２個はＴと対形成し好ましくなかった）。
【００５４】
ＧとのＩ塩基対形成効果を試験するため、コントロール実験をＮ‐myc 遺伝子配列及びクローンを用いて計画した。Ｎ‐myc 遺伝子から得た配列は、ｈｐＧ‐ＣＳＦプローブで規定されたものと同一の全体的Ｇ及びＣ含有率を、各コドンの最初の２つの位置で有していた。したがって、Ｎ‐myc 試験プローブは、ｈｐＧ‐ＣＳＦプローブと比較し、同一の長さであり、同一の相対的位置にＩを含有し、しかも潜在的に同一の平均Ｔｍ（62〜66℃、 3又は 4個のイノシン残基を含有しているためではない）を有していた。
【００５５】
２組のＮ‐myc 試験プローブを前記カルザースらの操作に従い組立てた。表VIに示された第１組は、以下のものを含んでいた； 1. 完全対合体の23量体； 2. ３個の３位Ｃが、Ｉを加えた場合に最悪のケースを生じるようにＩで置換されている； 3. ４個の３位がＩで置換されている。第２組の試験プローブは、全体的な中立的塩基対形成効果を与え得るイノシン塩基対のよりランダムな配置を表わすために考え出された。表VIに示された第２組は以下のものを含んでいた； 4. Ｃと塩基対形成する２個のＩ及びＧ塩基対形成する１個のＩを有する； 5. Ｉ：Ｇ塩基対たるもう１個のＩを有する 4と同一である。
【００５６】
【表６】
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【００５７】
Ｎ‐myc ＤＮＡ配列及びニワトリ成長ホルモンＤＮＡ配列（陰性コントロール）を含有する５個のレプリカフィルターを、ハイブリッド形成前に、減圧オーブン中80℃で２時間焼いた。すべてのフィルターは、ハイブリッド形成時間が６時間のみであること以外、ｈｐＧ‐ＣＳＦプローブに関して例４で記載されたように、ハイブリッド形成した。フィルターを室温で３回しかる後45℃で１回各々10分間洗浄した。フィルターをガイガーカウンターでモニターした。
【００５８】
Ｎ‐myc プローブ３のフィルターは他の４個のプローブフィルターと比較して非常に弱いシグナルを発したため、それ以上洗浄しなかった。50℃で10分間洗浄後、ガイガーカウンターは、プローブ 1を 100％標準として、下記％シグナルを表示した：プローブ 2、20％；プロープ 3（45℃）、2 ％；プローブ4、92％；及びプローブ5 、75％。55℃での洗浄後は、％が：プローブ 2、16％；プローブ4、 100％；及びプローブ 5、80％であった。60℃での最終洗浄では下記％を表示した：プローブ 2、1.6 ％；プローブ 4、90％；及びプローブ 5、70％。
【００５９】
このように、プローブ 2及び 4のように３個のＩが存在する場合では、シグナルにおいて60倍までの差違が、理論的Ｔｍ（Ｉは計算に含まれていない）は〔最悪のＩ塩基対形成例（プローブ2)及び比較的中立なＩ塩基対形成例（プローブ4)に関して〕近いにもかかわらず観察される。
【００６０】
Ｎ‐myc 試験ハイブリッド形成により得られた標準化情報は、より厳格でない洗浄による結果が許容され得る信頼度を測定するために、下記のように洗浄及びｈｐＧ‐ＣＳＦハイブリッド形成のモニターに際して利用された。
例 ４
ハナハンら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第 166巻、第557〜580 頁、1983年〔Ｈanahan, et al., Ｊ. Ｍol. Ｂiol.，166 , 557-580 (1983)〕の操作に従い、例２で産生されたｃＤＮＡインサート（insert）との組換え体を含む細菌を、寒天プレート上に載置された24個のニトロセルロースフィルター〔ミリポア（Ｍillipore）、ベッドフォード、マサチューセッツ〕に拡散した。プレートを次いでインキュベートして約 150,000個のコロニーを得たが、これを24個の他のニトロセルロースフィルターに移してレプリカ培養した。レプリカを明瞭なコロニーが出現するまでインキュベートした。フィルター上の細菌を、10分間水酸化ナトリウム(0.5Ｍ）でわずかに飽和され、しかる後２分間トリス(1Ｍ）でブロットされ、次いで10分間ＮａＣｌ(1.5Ｍ）含有トリス(0.5Ｍ）でブロットされたワットマン3MM 紙上で溶菌させた。フィルターがほぼ乾燥した後、それらを核酸ハイブリッド形成前に減圧オーブン中80℃で２時間焼いた。ウァールら、プロシーディングス・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第76巻、第3683〜3687頁、1979年〔Ｗahl, et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）, 76, 3683‐3687(1979)〕、及びマニアティスら、セル、第81巻、第 163〜182 頁、1976年〔Ｍaniatis, et al.,Ｃell, 81, 163-182 (1976)〕。
【００６１】
フィルターを10×デンハード (Ｄenhardt) 0.2％ＳＤＳ及び６×ＳＳＣ 750ml中65℃で２時間、前ハイブリッド形成させた。フィルターを６×ＳＳＣで洗浄し、次いで４つをバッグに入れ、６×ＳＳＣ及び10×デンハード中で14時間ハイブリッド形成させた。50×106cpm の32Ｐ‐標識プローブ（オリゴヌクレオチド）を有するバッグ当たり、溶液約15mlが入っていた。
【００６２】
ハイブリッド形成後、フィルターを６×ＳＳＣ（１リットル／洗浄）中で３回室温で各々10分間洗浄した。フィルターを次いで６×ＳＳＣ１リットルにより、45℃15分間で１回洗浄した。フィルターを増強スクリーン及びコダックＸＡＲ‐２フィルムにより−70℃で２時間オートラジオグラフィーに付した。このオートラジオグラフでは、５個の非常に強いシグナルを含む40〜50個の陽性シグナルが検出された。
【００６３】
最強の５個のシグナル及び別の５個の陽性シグナルを含む領域をマスタープレートからこすり落とし、同一条件下同一プローブ混合物を用いて二次スクリーニングに移した。洗浄操作は、高温洗浄が55℃15分間で各々２回、及びしかる後の60℃15分間で１回からなる点で異なっていた。例３のＮ‐myc プローブ研究に基づき、二次スクリーニングでの最終洗浄温度を上げたが、24個の23量体に関する凝集融解温度がＮ‐myc プローブの温度に近似した60〜68℃であったためである。２回目の55℃での洗浄後、フィルターを湿潤させたままにし、オートラジオグラフィーに付した。このオートラジオグラフィーと、60℃での最終洗浄後同じ時間をかけた２回目のオートラジオグラフィーとの比較では、10個の被試クローンのうち２個だけが55℃〜60℃以上に昇温させた場合にシグナルの実質的損失をうけないことが明らかになった。これら２個のクローンは、ほぼ同一の長さ及び制限エンドヌクレアーゼパターンであることが後に示された。Ｐpo２と称される１個のクローンを配列決定のため選択した。
【００６４】
上記操作で得られた組換えｈｐＧ‐ＣＳＦ ｃＤＮＡクローンのＰpo２の配列決定は、サンガーら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第74巻、第5463〜5467頁、1977年〔Ｓanger, et al.,Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）, 74，5463-5467 (1977)〕のジデオキシ法により達成された。一重鎖ＤＮＡファージＭ‐13は、二重鎖ｃＤＮＡクローンの一重鎖ＤＮＡ鋳型を供給するためのクローニングベクターとして使用した。サンガーらの方法により、表VII に示されているようなアミノ酸翻訳を伴う配列及びポリペプチドコード領域の相補鎖が明らかとなった(配列番号2参照)。
【００６５】
【表７】
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【００６６】
【表８】
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【００６７】
【表９】
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【００６８】
表VII の下記特徴は顕著である。配列の５′末端には、ポリＧｃＤＮＡリンカー配列に相当する塩基が示されている。次いで約５個の塩基（“Ｎ”と表示されている）が存在するが、その配列は前にある多数のＧのためにサンガーらの方法によっては容易に明確に決定することができなかった。その後の配列は、ポリペプチドのリーダー配列と推定される部分をコードする12個のコドンを表わす。例１に記載されたｈｐＧ‐ＣＳＦ天然単離物のアミノ末端配列との対応により、ｈｐＧ‐ＣＳＦの推定的“成熟”型における最初のスレオニン残基は＋１で示されている。成熟ｈｐＧ‐ＣＳＦは、示された如く 174個の残基を有することがその後示された。“停止”コドン（ＯＰコドン、ＴＧＡ）の後に、約 856塩基の非翻訳３′配列及びポリＡ“尾部”の多数のＡが続く。唯一のＨgiＡＩ及びＡpaＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位、並びに２つのＳtuＩ部位（原核及び真核細胞発現系の組立てに関して以下で説明されている）も表VII に示されている。ポリペプチド中におけるアスパラギン残基の欠損のため、Ｎ‐グリコシル化のための明確な部位は存在しない。３′非翻訳配列末端近くで下線が引かれた６個の塩基は、潜在的ポリアデニル化部位を表わす。
【００６９】
合計 450,000個のクローンの中から上記ハイブリッド形成操作により同定された２つの他のｃＤＮＡクローンの各々が、転写開始部位以降の全リーダー配列をコードするＤＮＡを含有していなかったことは、注目に値する。なるほど、３つすべてのｈｐＧ‐ＣＳＦクローンは正確に同一部位の５′領域で集結しており、このことは転写されたｍＲＮＡの二次構造がこの部位より先のｃＤＮＡ形成を著しく阻害することを示唆している。実際には、したがって、オカヤマら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、第３巻、第 280〜289 頁、1983年〔Ｏkayama,et al.,Ｍol. and Ｃell. Ｂiol., 3, 280-289 (1983)〕に記載され、しかもウォンら、サイエンス、第228 巻、第 810〜814 頁、1985年〔Ｗong, et al., Ｓcience, 228, 810-814 (1985)〕においてＧＭ‐ＣＳＦを単離するために現実に利用されたｃＤＮＡ発現スクリーニングは、ｈｐＧ‐ＣＳＦ ＤＮＡの単離に簡単に利用することができなかったが、その理由は、かかる単離系が通常被験クローン中における全長のｃＤＮＡ転写体の存否に依存しているからである。
【００７０】
上記配列は、微生物宿主におけるｈｐＧ‐ＣＳＦの直接的発現を確実化するには、困難である。かかる発現を確実にするためｈｐＧ‐ＣＳＦコード領域には開始ＡＴＧコドンを加えるべきであり、しかもその配列は適切なプロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列の制御下にある部位で形質転換ベクター中に挿入されるべきである。
例 ５
この例では、前記例で単離されるようなｈｐＧ‐ＣＳＦコードｃＤＮＡを用いてゲノムクローンをスクリーニングした。λファージヒト胎児肝ゲノムライブラリー〔ローンら、セル、第15巻、第1157〜1174頁、1978年（Ｌawn , et al., Ｃell,15, 1157-1174 (1978)）の操作に従い製造され、ティー・マニアティス（Ｔ. Ｍaniatis)から入手した〕を、ＨgiＡＩ及びＳtuＩで切断単離された２つのｈｐＧ‐ＣＳＦ ｃＤＮＡ断片（ＨgiＡＩ〜ＳtuＩ、 649塩基対；ＳtuＩ〜ＳtuＩ、 639塩基対）からなるニック(nick)翻訳プローブを用いてスクリーニングした。合計約 500,000個のファージを12個のペトリ皿（15cm）で培養し、プラークを取出し、ベントン／デビソン（Ｂenton ／Ｄavi son）操作法〔ベントンら、サイエンス、第196 巻、第 180頁、1977年（Ｂenton, et al.,Ｓcience, 196, 180 (1977)）〕によりプローブとハイブリッド形成させた。合計12個の陽性クローンが観察された。二次スクリーニングにおけるオートラジオグラフィーで最強シグナルを生じた３個のクローン(1〜3)を、 1リットル培地中で増殖させ、放射線標識24量体オリゴヌクレオチド（γ‐32Ｐ ＡＴＰでキナーゼ処理されている）５′ＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧ３′を用いて制限酵素切断及びサザーンブロット法（Ｓouthern blotting）により遺伝子地図を作成した。地図作成結果は、単離体1 及び3 が同一であって、単離体2 がｈｐＧ‐ＣＳＦ遺伝子の５′に付加した2000個の塩基を含有することを示していた。したがって、クローン2 を更に特徴づけるために使用した。クローン2 のＤＮＡをＥcoＲＩで切断して8500塩基対のｈｐＧ‐ＣＳＦ含有断片を得、これを次いでｐＢＲ322 に組込んでサブクローニングし、更に制限エンドヌクレアーゼ切断、サザーンブロット法、Ｍ13サブクローニング及び配列決定により遺伝子地図を作成した。得られた配列は表VIIIに示されたとおりである(配列番号３参照)。
【００７１】
【表１０】
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【００７２】
【表１１】
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【００７３】
【表１２】
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【００７４】
【表１３】
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【００７５】
【表１４】
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【００７６】
ｈｐＧ‐ＣＳＦ遺伝子を含有するゲノムＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ地図（約 3.4キロ塩基対）は図１で詳細に記されている。図１で示された制限エンドヌクレアーゼは、ＮcoＩ，Ｎ；ＰstＩ，Ｐ；ＢamＨＩ，Ｂ；ＡpaＩ，Ａ；ＸhoＩ，Ｘ；及びＫpnＩ，Ｋである。図の下方の矢印は、ゲノム配列を得るために利用される配列決定方法を示す。ボックス領域はｃＤＮＡクローン中の領域であり、点線の端部ボックスはｃＤＮＡクローン中に存在しないもののｍＲＮＡブロット法により同定された配列を表わす。エキソン配列たるコード配列の同定をノーザン（Ｎorthern)ブロット法により実施した。エキソン1 及び2 における推定的スプライス部位にまたがる24量体オリゴヌクレオチドプローブ、５′ＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧＣＴＴ３′を、ノーザンブロット法でｈｐＧ‐ＣＳＦ ｍＲＮＡとハイブリッド形成させた。得たブロットは、エキソン2 のオリゴヌクレオチドプローブの場合と同様のサイズ（1650塩基対以下）のｍＲＮＡを示す。このデータは、表VIIIで示されるＭet開始コドンを用いたｐＳＶ／ghＧ−ＣＳＦベクター（例９）によるｈｐＧ‐ＣＳＦの直接的発現能と一緒に考え合わされた場合に、エキソン1 に含有されるコード配列を規定する。エキソン 2〜5 は、ｈｐＧ‐ＣＳＦ遺伝子（表VII ）のｃＤＮＡクローン（Ｐpo２）において得られるコード配列により規定される。
例 ６
この例は、ｈｐＧ‐ＣＳＦをコードしかつ大腸菌優先コドンを含有する人工遺伝子の製造に関する。
【００７７】
簡潔に述べると、用いられたプロトコールは、全般的に、参考のため本明細書に包含される共有権者アルトン（Ａlton）らのＰＣＴ公開第ＷＯ83／04053 号明細書の開示に示されているとおりであった。遺伝子は、成分オリゴヌクレオチドが多数の二重鎖にまず集合するように考えられ、二重鎖は次いで３つの別個のセクションにまとめられた。これらセクションは簡易な増幅用として考えられ、増幅系から除去された後に、適切な発現ベクター中に連続的に又は多数の断片結合を介してまとめることができた。
【００７８】
セクションＩ，II及びIII の構造は表IX〜XIV に示されている。表IX及びＸに示されたセクションＩの構造において、オリゴヌクレオチド 1〜14は７本の二重鎖(1及び8 ； 2及び9 ； 3及び10； 4及び11；5及び12； 6及び13； 7及び14）にまとめられた。７本の二重鎖を次いで結合し、表Ｘに示されるセクションＩを形成した。表Ｘにおいて、セクションＩは増幅・発現ベクターとの結合及びセクションIIとの結合のために用いられる上流ＸbaＩ付着端及び下流ＢamＨＩ付着端を含有することにも着目されるであろう。
【００７９】
【表１５】
2006101889.tif 000018
【００８０】
【表１６】
2006101889.tif 000019
【００８１】
表XI及びXII に示されるセクションIIの構造において、オリゴヌクレオチド15〜30は８本の二重鎖（15及び23；16及び24；17及び25；18及び26；19及び27；20及び28；21及び29；22及び30）にまとめられた。これら８本の二重鎖を次いで結合し、表XII に示されるセクションIIを形成した。表XII で更に示されるように、セクションIIは増幅ベクターとの結合及びセクションＩとの結合のために用いられる上流ＢamＨＩ付着端及び下流ＥcoＲＩ付着端を有する。その下流端部近くでは、セクションIIは最後の結合セクションII及びIII に用いられる下流ＳstＩ部位も有している。
【００８２】
【表１７】
2006101889.tif 000020
【００８３】
【表１８】
2006101889.tif 000021
【００８４】
最後に、セクションIII は表XIII及びXIV に示されているように組立てられた。この組立てのために、オリゴヌクレオチド31〜42は６本の二重鎖（31及び37；32及び38；33及び39；34及び40；35及び41；36及び42）にまとめられた。６本の二重鎖を次いで結合し、表XIV に示されるセクションIII を形成した。表XIV でも示されているように、セクションIII は、増幅ベクター、及び少なくともＥcoＲＩ末端の場合には発現ベクターとの結合のために用いられる上流ＢamＨＩ付着端及び下流ＥcoＲＩ付着端を含有する。しかもセクションIII は、セクションII及びIII の最終的結合に用いられる上流ＳstＩ部位を有している。
【００８５】
【表１９】
2006101889.tif 000022
【００８６】
【表２０】
2006101889.tif 000023
【００８７】
セクションＩで形成されたＸbaＩ〜ＢamＨＩ断片を、ＸbaＩ及びＢamＨＩで開環されたＭ13mp11ファージベクターに結合する。ベクターを次いでＢamＨＩ及びＥcoＲＩで切断することにより再開環し、次いでセクションIIで形成されたＢamＨＩ〜ＥcoＲＩ断片と結合する。この段階で、セクションＩ及びIIは適切な方向で結合された。次いで別のＭ13mp11ベクターをＢamＨＩ〜ＥcoＲＩ切断で開環し、しかる後セクションIII で形成されたＢamＨＩ〜ＥcoＲＩ断片と結合した。
【００８８】
セクションＩ及びII含有ベクターをＸbaＩ及びＳstＩで切断する。同様に、セクションIII 含有ベクターをＳstＩ及びＥcoＲＩで切断する。各々の切断で得る2つの断片のうち小断片の両方を、事前にＸbaＩ及びＥcoＲＩで開環されたプラスミドｐＣＦＭ1156に結合する。この反応の生成物は表XVに示される連続ＤＮＡ配列含有の発現プラスミドであって、そのＤＮＡ配列は大腸菌翻訳開始用のアミノ末端メチオニンコドン（ＡＴＧ）をもつ完全ｈｐＧ‐ＣＳＦポリペプチドをコードしている(配列番号１参照)。
【００８９】
【表２１】
2006101889.tif 000024
【００９０】
【表２２】
2006101889.tif 000025
【００９１】
いずれの適切なベクターもこのＤＮＡ発現のために使用することができるが、発現プラスミドｐＣＦＭ1156はプラスミドｐＣＦＭ836 から容易に組立てることができ、その構造は公開欧州特許出願第 136,490号明細書に記載されているｐＣＦＭ836 をまずＮdeＩで切断し、次いで両方に存在するＮdeＩ部位が破壊されるようにＰolＩでブラント末端化する。次いで、ベクターをＣlaＩ及びＳacIIで切断して、存在するポリリンカーを除去し、しかる後表XVI に示される代替ポリリンカーに結合する。この代替ポリリンカーは、前記アルトンらの操作に従い組立てることができる。なお、プラスミドｐＣＦＭ836 は、ｐＣＦＭ736 （後述）をＢamＨＩで切断し、下記の断片を挿入することによって得られる。
【００９２】
【表２３】
2006101889.tif 000026
【００９３】
発現ｐＣＦＭ1156プラスミドにおける発現制御はλＰL プロモーターによるが、これ自体が（大腸菌株Ｋ12ΔＨtrp から得られるような）ＣI857リプレッサー遺伝子の制御下にある。
【００９４】
【表２４】
2006101889.tif 000027
【００９５】
例 ７
この例は、〔Ｍet-1〕ｈｐＧ‐ＣＳＦコードＤＮＡ配列によるｈｐＧ‐ＣＳＦポリペプチドの大腸菌発現に関する。使用された配列は、部分的に合成で、部分的にｃＤＮＡ由来であった。使用された合成配列は大腸菌優先コドンであった。
【００９６】
表VII に示されたｈｐＧ‐ＣＳＦ遺伝子含有プラスミドＰpo２をＨgiＡＩ及びＳtuＩで切断して、約 645塩基対の断片を得たが、この断片は５′末端の７個のリーダー配列残基コドン及び３′非コード領域の約 100塩基対をもつ（表VII に示されるような）成熟ｈｐＧ‐ＣＳＦ遺伝子を含有していた。ＨgiＡＩ切断ではＰstＩ切断の場合と同一の５′の 4塩基付着端を残し、ＳtuＩではブラント末端を残す。これにより、ＰstＩ及びブラント末端形成制限酵素ＨinｃIIで切断されたＭ13mp8 （Ｒf)に断片を容易に挿入することができる。Ｍ13中で増幅させた後、ｈｐＧ‐ＣＳＦ ＤＮＡをＡpaＩ及びＢamＨＩで切断することにより摘出したが、これはそれぞれｈｐＧ‐ＣＳＦにおける+3〜+5残基コドン間にまたがるＡpaＩ部位、及びＭ13mp8 制限ポリリンカーにおけるＨinｃII部位の“下流”のＢamＨＩ部位において切断されたものである。ｈｐＧ‐ＣＳＦポリペプチドの大腸菌発現を可能にするため、合成断片を下記表XVIIに示されるように製造した。
【００９７】
【表２５】
2006101889.tif 000028
【００９８】
表XVIIの分析から調べ得るように、リンカーは、ＡpaＩ付着端、ｈｐＧ‐ＣＳＦアミノ末端の最初の 3個の残基を特定するコドン（上記Ｍ13ＤＮＡのＡpaＩ消化で削除されたＴhr1 ，Ｐro2 ，Ｌeu3指定コドンを回復させ、かつ大腸菌中で優先的に発現するコドンを採用）、翻訳開始ＡＴＧ、リボソーム結合部位を付与する24塩基対配列、及びＸbaＩ付着端を有している。
【００９９】
大腸菌発現用に使用される発現ベクターは、1985年 4月10日に公開されたモリス（Ｍorris ）の欧州特許出願第136,490 号明細書においてｐＣＦＭ536 として記載されたベクターである（更に、ｐＣＦＭ536 含有の大腸菌ＪＭ 103，ブタペスト条約に基づく寄託における受託番号、ＡＴＣＣ39934 参照）。簡単にいえば、まずプラスミドｐＣＦＭ536 をＸbaＩ及びＢamＨＩで切断した。上記ｈｐＧ‐ＣＳＦ断片（ＡpaＩ／ＢamＨＩ）及びリンカー（ＸbaＩ／ＡpaＩ）を次いでそれに結合し、プラスミドｐ536 Ｐpo２を形成した。 プラスミドｐ536 Ｐpo２を、ＣI857遺伝子含有プラスミドｐＭＷ１（ブタペスト条約に基づく寄託における受託番号、ＡＴＣＣ No.39933)で予め形質転換された大腸菌ＡＭ 7株のファージ耐性変異体に組込んだ。形質転換は、ｐＣＦＭ536 前駆体プラスミドに担持された抗生物質（ａｍｐ）耐性マーカー遺伝子に基づき確認した。ＬＢブロス（アンピシリン50μｇ／ml）中での細胞培養物を28℃に維持し、Ａ600＝0.5 の培養細胞増殖時において培養物を温度42℃に３時間上げて、ｈｐＧ‐ＣＳＦ発現を誘導した。培養物の最終ＯＤはＡ600 ＝1.2 であった。
【０１００】
形質転換細胞によるｈｐＧ‐ＣＳＦ発現レベルは、クマシーブル一色素で染色されたＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより、総細胞タンパク質 3〜5 ％と評価された。
【０１０１】
細胞をＪＳ‐4.2 ローター中3500×ｇで10分間遠心分離して回収した。水中25％(w/v) の細胞をフレンチ・プレッシャー・セル（Ｆrench Ｐressure Ｃell)に10,000psi (700kg／cm2 ）で３回通して破壊した。破壊細胞懸濁液をＪＡ‐20ローター中10,000×ｇで15分間遠心分離した。ペレットを水に再懸濁し、pH8.7 の1％ラウリン酸50mMトリス中に総タンパク質濃度約 5mg／mlで溶解させた。溶解ペレット物質を15,000×ｇで10分間遠心分離し、上澄にＣｕＳＯ4を20mMまで加えた。１時間後、この試料を、例１(B) の操作に従い精製するため、容量及び濃度を調整して、Ｃ４ＨＰＬＣカラムに充填した。
【０１０２】
非有機物含有緩衝液中で調製された更に多量のｈｐＧ‐ＣＳＦを得るために第二の精製法が開発された。この物質はイン・ビボ研究に適する。細胞ペースト 150ｇを 1mM ＤＴＴ約 600mlに再懸濁し、約7000psi (490kg／cm2 ）でマントン・グアリン（Ｍanton Ｇualin)ホモジナイザーに 4回通した。破壊細胞懸濁液を10,000×ｇで30分間遠心分離し、ペレットを 1％デオキシコール酸、 5mMＥＤＴＡ、5mM ＤＴＴ及び 50mM トリスのpH 9の400 mlに再懸濁した。この懸濁液を室温で30分間混合し、10,000×ｇで30分間遠心分離した。ペレットを水約 400mlに再懸濁し、10,000×ｇで30分間遠心分離した。ペレットを 2％ザルコシル及び50mMトリスpH8 の 100mlに溶解した。ＣｕＳＯ4 を20μM まで加え、混合物を室温で16時間撹拌し、しかる後、20,000×ｇで30分間遠心分離した。上澄にアセトン300mlを加えた。この混合物を氷上に20分間おき、しかる後5000×ｇで30分間遠心分離した。ペレットをpH4 の 6Ｍグアニジン及び40mM酢酸ナトリウムの 250mlに溶解し、平衡化された1200mlのＧ‐25カラムに充填し、pH5.4 の20mM酢酸ナトリウムで操作した。ｈｐＧ‐ＣＳＦピーク（約 400ml）をプールし、pH5.4 の20mM酢酸ナトリウムで平衡化された15mlのＣＭセルロースカラムに加えた。充填後、カラムを60mlのpH5.4 の20mM酢酸ナトリウム及び25mM塩化ナトリウムで洗浄し、しかる後カラムを 200mlのpH5.4 の20mM酢酸ナトリウム及び37mM塩化ナトリウムで溶出させた。この溶出液 150mlを10mlに濃縮し、平衡化された 300mlのＧ‐75カラムに充填し、pH5.4 の20mM酢酸ナトリウム及び 100mM塩化ナトリウムで操作した。ピーク画分35mlをプールし、フィルター滅菌した。ｈｐＧ‐ＣＳＦの最終濃度は 1.5mg／mlであったが、ゲル分析で測定した場合純度95％以上であり、ｈｐＧ‐ＣＳＦ 0.5mgにつき発熱性物質を 0.5ng以下で含有していた。発熱性物質レベルは、カブトガニ遊走細胞溶離物（ＬＡＬ）試験キット〔エム・エー・バイオプロダクツ（Ｍ．Ａ. Ｂioproducts）、ウォーカースビル、メリーランド〕により測定した。
例 ８
この例は、17，36，42，64及び74位に存在するシステイン残基が各々適切なアミノ酸残基で置換されたｈｐＧ‐ＣＳＦ類縁体を産生する組換え方法の利用に関する。
【０１０３】
1985年 2月28日に公開されたスーザ（Ｓouza）らの公開ＰＣＴ出願第ＷＯ85/00817号明細書の特定部位突然変異誘発は、下記表XVIII に示された大きさが20〜23塩基の合成オリゴヌクレオチドを用いて、下記プラスミドｐ536 Ｐpo２の〔Ｍet-1〕コードＤＮＡ上で行なわれた。オリゴヌクレオチド1 は〔Ｓer17〕ｈｐＧ‐ＣＳＦコード遺伝子の形成が可能で、オリゴヌクレオチド２は〔Ｓer36〕ｈｐＧ‐ＣＳＦの形成が可能であった。
【０１０４】
【表２６】
2006101889.tif 000029
【０１０５】
ＣysからＳerへの限定的突然変異誘発は、鋳型としてｐ536 Ｐpo２から単離されたＸbaＩ‐ＢamＨＩ ｈｐＧ‐ＣＳＦ断片含有のＭ13mp10を用いて実施した。Ｃys‐Ｓer置換体含有の各Ｍ13mp10由来のＤＮＡをＸbaＩ及びＢamＨＩで処理した。得た断片を発現ベクターｐＣＦＭ746 に組込んでクローニングし、発現産物を例７のように単離した。
【０１０６】
プラスミドｐＣＦＭ746 は、1985年 2月28日に公開されたモリス（Ｍorris)の公開ＰＣＴ出願第ＷＯ85/00829号明細書に記載されているように、ＣlaＩ及びＢamＨＩでプラスミドｐＣＦＭ736 を切断し、存在するポリリンカーを除去し、下記ポリリンカーで置換することにより組立てることができる。
【０１０７】
【表２７】
2006101889.tif 000030
【０１０８】
なお、ｐＣＦＭ736 は、ｐＣＦＭ536(ＡＴＣＣ39934)から、次の手順によりｐＣＦＭ636 を経由し、組立てることができる。まず、ｐＣＦＭ536 をＥcoＲＩ部分的切断及びＳstＩ切断することにより、アンピシリン耐性遺伝子配列及び安定化配列（par)を欠失させた後、ＥcoＲＩ部位は、リンカーによってＡatII部位に変換する。一方、プラスミドＴｎ5 （Beck等のGene, 19, p 327-336 （1982）あるいはAuerswald 等の Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.,45 p107-113 （1981）に全塩基配列が示されている。）から、カナマイシン耐性遺伝子配列を含むＳmaＩ／ＨinｄIII 断片領域を、ＳstＩリンカーをＳmaＩ粘着末端に、且つＮdeＩリンカーをＨinｄIII 粘着末端に付加することにより、ＳstＩ／ＮdeＩ断片として得る。また、ｐＳＣ101 （受託番号、ATCC 37032）から、par 遺伝子を含むＨinｃII／ＡvaＩ断片領域を、ＨinｃII部位は最初にＳalＩリンカーで次いでＡatIIリンカーで処理し、また、ＡvaＩ部位は最初にＢamＨＩリンカーで次いでＮdeＩリンカーで処理し、ＡatII／ＮdeＩ断片として得る。
【０１０９】
ｐＣＦＭ536 の大きな断片（ＡatII／ＳstＩ）、カナマイシン耐性遺伝子の断片（ＳstＩ／ＮdeＩ）およびpar 遺伝子断片（ＡatII／ＮdeＩ）を混ぜ合わせて結合し、ｐＣＦＭ636 が得られる。
【０１１０】
ｐＣＦＭ636 をＡatII及びＸbaＩにより切断後、下記のＡatIIからＸbaＩまでの断片を挿入し、ｐＣＦＭ736 を得る。
【０１１１】
【表２８】
2006101889.tif 000031
【０１１２】
本発明のＣys‐Ｓer（ＣysからＳerへの）類縁体の精製操作において、細胞ペースト約10〜15ｇを１mMＤＴＴ40mlに再懸濁し、フレンチ・プレッシャー・セルに10,000psi (700kg／cm2 ）で３回通した。破壊細胞懸濁液を1000×ｇで30分間遠心分離した。ペレットをpH9 の 1％ＤＯＣ， 5mMＥＤＴＡ， 5mM ＤＴＴ，50mMトリスに再懸濁し、室温で30分間混合した。混合物を10,000×ｇで30分間遠心分離し、Ｈ2 Ｏ 40mlに再懸濁し、10,000×ｇで30分間再遠心分離した。ペレットをpH8 の 2％ザルコシル、50mM ＤＴＴ，50mMトリスの10mlに溶解した。１時間混合後、混合物を20,000×ｇで30分間遠心分離して清澄化し、しかる後平衡化された 300mlのＧ‐75カラムに充填し、pH8 の 1％ザルコシル、50mMトリスで操作した。類縁体含有画分をプールし、少なくとも１日間空気にさらして空気酸化させた。最終濃度は 0.5〜５mg／mlの範囲であった。
例 ９
この例において、哺乳動物細胞発現系は、ｈｐＧ‐ＣＳＦ ＤＮＡの活性ポリペプチド産物が哺乳動物細胞（ＣＯＳ‐１，ＡＴＣＣ ＣＲＬ‐1650）中で発現されかつそこから分泌されるか否かを確認するために、工夫された。この系は、ウォンら、サイエンス、第228 巻、第 810〜815 頁、1985年〔Ｗong,et al., Ｓcience, 228, 810-8 15 (1985)〕及びリーら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第82巻、第4360〜4364頁、1985年〔Ｌee, et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci．（ＵＳＡ），82, 4360‐4364(1985)〕におけるヒトＧＭ‐ＣＳＦに属する残基配列を有したリーダーポリペプチドの後に位置して〔Ａla1〕ｈｐＧ‐ＣＳＦをコードする、部分的合成部分的ｃＤＮＡ由来構造体の発現分泌プロセッシングを介して、ｈｐＧ‐ＣＳＦポリペプチド類縁体を分泌させるように考え出された。
【０１１３】
本発明のポリペプチド産物の予備的発現研究のために使用される発現ベクターは、ウィルス性プロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列の制御下で挿入外来性ＤＮＡを哺乳動物細胞発現すると共に哺乳動物細胞及び大腸菌の双方において自律複製するように考え出されたｐＢＲ322 及びＳＶ40ＤＮＡの双方を組込んでいる“シャトル（shuttle)”ベクターであった。大腸菌ＨＢ101 に担持されたこのベクターｐＳＶＤＭ‐19は1985年 8月23日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、123 01 パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランドにブタペスト条約に基づいて寄託され、受託番号ＡＴＣＣ第53241 号が付された。
【０１１４】
発現ベクター組立てに必要な具体的操作は下記のとおりであった。リーダーコードＤＮＡ配列を下記表XXに示したように合成した。
【０１１５】
【表２９】
2006101889.tif 000032
【０１１６】
表XXに示されているように、配列は、ＨinｄIII 及びＡpaＩ付着端、及びヒトＧＭ‐ＣＳＦの“リーダー”に属する17個のアミノ酸残基のコドンを有している。アラニン残基、プロリン残基及びロイシン残基を特定するコドンが続いている。プロリン及びロイシン残基はｈｐＧ‐ＣＳＦの+2及び+3位に存在するアミノ酸の複製で、一方アラニン残基はｈｐＧ‐ＣＳＦ以外のＧＭ‐ＣＳＦの開始アミノ末端（+1）残基の複製である。スレオニンのアラニンによる置換は、ＧＭ‐ＣＳＦ分泌プロセッシングに通常伴う細胞メカニズムによるＧＭ‐ＣＳＦリーダーの適切な宿主細胞“プロセッシング・オフ（processing off）”を促進させるために考え出された。
【０１１７】
プラスミドｐＳＶＤＭ‐19をＫpnＩで切断し、その部位をクレノウ酵素でブラント末端化した。次いでＤＮＡをＨinｄIII で切断した。得られる大断片を表VII に示されるＨinｄIII ／ＰvuII断片（ＨinｄIII 断片及びＰvuIIでの部分的切断から得るhpＧ−ＣＳＦコード領域を完全に含む２番目に大きな断片としてプラスミドＰpo２から単離された）と混合して結合し、プラスミドｐＳＶ‐Ｐpo１を形成した。表XXの人工ＧＭ‐ＣＳＦリーダー配列断片を次いで（ＨinｄIII 及びＡpaＩで切断後の）ｐＳＶ‐Ｐpo１に結合し、プラスミドｐＳＶＧＭ‐Ｐpo１を得た。
【０１１８】
プラスミドｐＳＶＧＭ‐Ｐpo１ＤＮＡのリン酸カルシウム沈降物（ 1〜5 μｇ）を、ウィグラーら、セル、第14巻、第 725〜731 頁、1978年〔Ｗigler, et al.,Ｃell, 14, 725-731 (1978)〕に実質的に記載されているようなＣＯＳ‐１細胞の２個の60mmプレートに組込んだ。コントロールとして、プラスミドｐＳＶＤＭ‐19もＣＯＳ‐１細胞に組込んだ。組織培養上澄を形質転換後５日目に回収し、ｈｐＧ‐ＣＳＦ活性について試験した。培養上澄からの〔Ａla1〕ｈｐＧ‐ＣＳＦ収量は、１〜2.5 μｇ／mlであった。
【０１１９】
ＣＯＳ‐１細胞における〔Ａla1〕ｈｐＧ‐ＣＳＦ産物コードプラスミドｐＳＶＧＭ‐Ｐpo１の上首尾な発現の後、ヒトＧＭ‐ＣＳＦリーダー配列を含む一方で、スレオニン残基（ｈｐＧ‐ＣＳＦの１位に元来存在する）のコドンをその位置のアラニンのコドンに代わって有する他のベクターを組立てた。簡単に言えば、オリゴヌクレオチドが特定部位の突然変異誘発（ＳＤＭ）用に合成された（５′ＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧ）。ｐＳＶＧＭ‐Ｐpo１におけるＨinｄIII ‐ＢamＨＩ ｈｐＧ‐ＣＳＦ断片をＳＤＭ用にＭ13mp10と結合した。１位にＴhrコドンを有する新規合成ｈｐＧ‐ＣＳＦ遺伝子をＨinｄIII 及びＥcoＲＩで切断して単離した。断片を次いで、同一の２つの制限エンドヌクレアーゼによる切断から得られたｐＳＶＤＭ‐19に組込んで複製した。得られるベクターｐＳＶＧＭ‐Ｐpo（Ｔhr）をＣＯＳ細胞に組込んで形質転換したが、培養上澄中で測定されるｈｐＧ‐ＣＳＦの収量は 1〜5 μｇ／mlの範囲であった。
【０１２０】
最後に、単離法が例５に記載されているゲノム配列を用いて、ｈｐＧ‐ＣＳＦの哺乳動物細胞発現用の発現ベクターを形成した。更に詳しくは、ｐＳＶＤＭ‐1 9をＫpnＩ及びＨinｄIII で切断し、大断片を表XXI に示されるＨinｃIII 及びＮcoＩ粘着端含有合成リンカーとの四者結合に使用した。エキソン1含有ＮcoＩ‐ＢamＨＩ断片はｐＢＲ322(8500ｈｐＧ‐ＣＳＦゲノムサブクローン）から単離し、エキソン 2〜5 含有ＢamＨＩ‐ＫpnＩ断片はプラスミドｐＢＲ322(8500ｈｐＧ‐ＣＳＦゲノムサブクローン）から単離した。得られる哺乳動物発現ベクターｐＳＶ／ｇｈＧ‐ＣＳＦは形質転換ＣＯＳ細胞から 1〜2.5 μｇ／mlのｈｐＧ‐ＣＳＦを産生した。
【０１２１】
【表３０】
2006101889.tif 000033
【０１２２】
例 １０
この例は、本発明の組換えポリペプチド産物の物理的及び生物学的性質に関する。
１．分子量
例７における大腸菌発現の組換えｈｐＧ‐ＣＳＦ産物は（表VII の演繹的アミノ酸分析から予測されるように）還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで測定した場合の見掛分子量が18.8キロダルトンであったが、一方例１で記載したようにして精製された天然単離体は見掛の分子量が19.6キロダルトンであった。天然単離体と会合したＮ‐グリカン類の存在は、表VII のｈｐＧ‐ＣＳＦ一次配列中にアスパラギン残基が欠損していることから、実際上無視することができ、したがって、操作はＯ‐グリカン類が天然単離体及び非グリコシド組換え産物間の分子量差の原因であるか否かを調べられるように工夫した。天然単離物質約5μｇをノイラミニダーゼ〔カルビオケム（Ｃalbiochem ）、ラホラ、カリフォルニア〕で処理し、試料0.5 μｇを取出し、残留物質をＯ‐グリカナーゼ〔エンド‐ｘ‐ｎ‐アセチルガラクトースアミニダーゼ、ジェンザイム（Ｇenzyme）、ボストン、マサチューセッツ〕4mU と37℃でインキュベートした。一部をインキュベートの 0.5，２及び４時間後に取出した。これら試料を大腸菌由来組換え物質と並べてＳＤＳ‐ＰＡＧＥに付した。ノイラミニダーゼ処理後、単離体の見掛分子量は19.6キロダルトンから19.2キロダルトンに変わったが、このことはシアル酸残基の離脱を示唆する。Ｏ‐グリカナーゼ処理の２時間後、分子量は18.8キロダルトンに変わったが、これは大腸菌由来物質の見掛分子量と一致する。ノイラミニダーゼ及びＯ‐グリカナーゼに対する炭水化物構造体の感受性から判断すると炭水化物成分として下記構造体が示唆される：Ｎ‐アセチルノイラミン酸‐α(2-6) ガラクトースβ(1-3) Ｎ‐アセチルガラクトサミン‐Ｒ（Ｒはセリン又はスレオニンである）。
２． 3Ｈ‐チミジン取込み
ヒト骨髄細胞の増殖誘導を3Ｈ‐チミジンの取込み増加に基づき分析した。健康ドナー者のヒト骨髄をフィコール‐ハイパック（Ｆicoll ‐Ｈypaque）(1.077ｇ／ml、ファルマシア）による密度分離に付し、低密度細胞を10％牛胎児血清及びグルタミンペニシリン・ストレプトマイシン含有のイスコブ培地〔Ｇibco（ギブコ）〕に懸濁した。次いで、ヒト骨髄細胞 2×104 個を96個の平底ウェルプレート中コントロール培地又は例７の組換え大腸菌物質と一緒に37℃空気中 5％ＣＯ2で２日間インキュベートした。試料を重複して分析したが、濃度は10,000倍以上異なっていた。培養物に次いで 3Ｈ‐チミジン〔ニュー・イングランド・ヌクレア（Ｎew Ｅngland Ｎuclear）、ボスマン、マサチューセッツ〕 0.5μＣi ／ウェルを加えた。 3Ｈ‐チミジン取込み量をベンチュアら、ブラッド、第61巻、第 781頁、1983年〔Ｖentua, et al., Ｂlood, 61, 7 81 (1983)〕に記載されているように測定した。この分析において、ヒトｈｐＧ‐ＣＳＦ単離体は、コントロール上澄よりも約 4〜10倍高いレベルで、ヒト骨髄細胞中に3Ｈ‐チミジンを取込ませることができる。例７の大腸菌由来のｈｐＧ‐ＣＳＦ物質も同様の性質を有していた。
【０１２３】
２回目のヒト骨髄細胞増殖研究は、例９で製造された形質転換ＣＯＳ‐１細胞の培養培地を用いて実施され、同様の結果を与えたが、このことはコードされたポリペプチド産物が活性物質として培地中に実際に分泌されることを意味する。
３．ＷＥＨＩ‐３Ｂ Ｄ+ 分化誘導
マウス骨髄単球性白血病細胞ＷＥＨＩ‐３ＢＤ+ の分化を誘導する組換え大腸菌由来物質の能力を、メトカーフ、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、第25巻、第 225巻、1980年〔Ｍetcalf, Ｉnt. Ｊ．Ｃancer, 25，225 (1980)〕に記載されているように、半固体寒天培地中で分析した。組換えｈｐＧ‐ＣＳＦ産物及び培地コントロールを30℃空気中 5％ＣＯ2 で７日間60個以下のＷＥＨＩ‐３Ｂ Ｄ+ 細胞／ウェルと一緒にインキュベートした。試料を24個の平底ウェルプレート中でインキュベートしたが、濃度は2000倍以上異なっていた。コロニーを未分化、部分的分化又は全部分化のコロニーに分類し、コロニー数を顕微鏡で計測した。大腸菌組換え物質は分化を誘導することが判明した。
４．ＣＦＵ‐ＧＭ，ＢＦＵ‐Ｅ及びＣＦＵ‐ＧＥＭＭ分析
多分化能性ヒトＧ‐ＣＳＦ（ｈｐＧ‐ＣＳＦ）の天然単離体及び組換え多分化能性ヒトＧ‐ＣＳＦ（ｈｐＧ‐ＣＳＦ）は、ヒト骨髄細胞を増殖かつ分化させることが判明した。これらの活性は、ＣＦＵ‐ＧＭ〔ブロックスマイヤーら、エクスペリメンタル・ヘマトロジー、第 5巻、第87頁、1971年（Ｂroxmeyer, et al., Ｅxp. Ｈematol., 5, 87 (1971））〕、ＢＦＵ‐Ｅ及びＣＦＵ‐ＧＥＭＭ試験法〔ルーら、ブラッド、第61巻、第250 頁、1983年（Ｌu, et al., Ｂlood, 61, 250 (1983)）〕により、健康ヒトボランティアの低密度非付着性骨髄細胞を用いて測定した。各々500 単位のｈｐＧ‐ＣＳＦ又はｒｈｐＧ‐ＣＳＦを用いたＣＦＵ‐ＧＭ，ＢＦＵ‐Ｅ及びＣＦＵ‐ＧＥＭＭ生物学的活性の比較は、下記表XXIIに示されている。
【０１２４】
すべてのコロニー分析は、低密度非付着性骨髄細胞を用いて実施した。ヒト骨髄細胞をフィコールハイパック（密度 1.077ｇ／cm3 、ファルマシア）による密度分離に付した。低密度細胞を次いで牛胎児血清含有のイスコブ修正ダルベッコ（Ｄulbecco)培地に再懸濁し、ファルコン組織培養皿〔No.3003 、ベクトン・ディケンソン（Ｂecton Ｄikenson)コッキーズビル、メリーランド〕上に付着させるために37℃で 1.5時間入れておいた。
【０１２５】
【表３１】
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【０１２６】
培地コントロールは、10％ＦＣＳ、 0.2mMヘミン及び組換えエリスロポエチン1単位含有イスコブ修正ダルベッコ培地であった。
【０１２７】
ＣＦＵ‐ＧＭ分析の場合では、標的細胞は、補充マッコイ（ＭｃＣoy） 5Ａ培地及び10％熱不活化牛胎児血清を含有する 0.3％寒天培地 1ml中 1×105 個で培養した。培養７日目、培養物のコロニー（凝集物当たり細胞数40以上）について計数し、形態を観察した。コロニー数は、４個の同一プレートから測定される平均±ＳＥＭとして示されている。
【０１２８】
ＢＦＵ‐Ｅ及びＣＦＵ‐ＧＥＭＭ分析の場合では、細胞(1×105）をイスコブ修正ダルベッコ培地〔ギブコ（Ｇibco）〕、 0.8％メチルセルロース、30％牛胎児血清、0.05nM２‐メルカプトエタノール、 0.2mMヘミン及び組換えエリスロポエチン 1単位の混合物 1mlに加えた。皿を 5％ＣＯ2 及び 5％Ｏ2 湿気雰囲気中でインキュベートした。レミング・バイオインスツルメンツ（Ｒeming Ｂioinstruments)〔シラキュース（Ｓyraccuse）、ニューヨーク〕の酸素減少器により低酸素圧にした。コロニーをインキュベート14日後に計測した。コロニー数は、２個の同一プレートから測定される平均±ＳＥＭとして示されている。
【０１２９】
ＣＦＵ‐ＧＭ分析で形成されたコロニーは、すべて、クロロアセテートエステラーゼ陽性でかつ非特異的エステラーゼ（α‐ナフチルアセテートエステラーゼ）陰性であることが判明し、顆粒球型のコロニーと一致した。天然ｈｐＧ‐ＣＳＦ及びｒｈｐＧ‐ＣＳＦは双方とも、ＣＦＵ‐ＧＭ分析における連続希釈により分析した場合、約１×108 Ｕ／mg純粋タンパク質の特異的活性を有することが判明した。表XXIIのＢＦＵ‐Ｅ及びＣＦＵ‐ＧＥＭＭデータは、３つの別個の実験を表示しており、天然ｈｐＧ‐ＣＳＦに関し過去に報告されたデータと類似する。ｒｈｐＧ‐ＣＳＦが大腸菌中で産生されていることから、極めて純粋でありかつ他の潜在的哺乳動物成長因子を含有しないことに注目することは重要である。このように、ｒｈｐＧ‐ＣＳＦは、組換えエリスロポエチンの存在下で加えられた場合に、混合コロニー形成（ＣＦＵ‐ＧＥＭＭ）及びＢＦＵ‐Ｅを補助することができる。
５．細胞結合試験
ＷＥＨＩ‐３Ｂ（Ｄ+ ）細胞及び新たに診断された白血病患者のヒト白血球は
125Ｉ‐標識マウスＧ‐ＣＳＦに結合するが、この結合は未標識Ｇ‐ＣＳＦ又はヒトＣＳＦ‐βの添加により競合させることができる、と過去に報告された。ヒト及びマウスの白血球に対して 125Ｉ‐ｈｐＧ‐ＣＳＦの結合に競合する天然ｈｐＧ‐ＣＳＦ及びｒｈｐＧ‐ＣＳＦの能力に関し試験した。高度に精製された天然ｈｐＧ‐ＣＳＦ（純度95％以上、１μｇ）がヨウ素化〔デジェドーら、アナリティカル・バイオケミストリー、第 127巻、第 143頁、1982年（Ｔejedor, et al., Ａnal. Ｂiochem., 127, 143 (1982))〕され、ゲル濾過及びイオン交換クロマトグラフィーにより反応物から分離された。天然 125Ｉ‐ｈｐＧ‐ＣＳＦの比活性は約 100μＣi ／μｇタンパク質であった。マウスＷＥＨＩ‐３Ｂ（Ｄ+ ）及び２種のヒト未梢血骨髄白血病細胞（ＡＮＬＬ、１つはＭ４、他はＭ５Ｂとして分類される）を125Ｉ‐ｈｐＧ‐ＣＳＦとの結合能について試験した。
【０１３０】
マウス及び新しく得たヒトの未梢血骨髄白血病細胞をＰＢＳ／ 1％ＢＳＡで３回洗浄した。ＷＥＨＩ‐３Ｂ（Ｄ+ ）細胞(5×106 個）又は新鮮白血病細胞(3×106 個）を、各種濃度（容量：10μl ）の未標識ｈｐＧ‐ＣＳＦ，ｒｈｐＧ‐ＣＳＦ又はＧＭ‐ＣＳＦの存在又は非存在下、及び 125Ｉ‐ｈｐＧ‐ＣＳＦ（約100,000cpm又は１ng）の存在下、ＰＢＳ／ 1％ＢＳＡ(100μl ）中0 ℃90分間 2連でインキュベートした（総容量：120 μl ）。細胞を次いで 350μl プラスチック製遠心管中の氷冷ＦＣＳ 200μl に再懸濁して積層し、遠心分離（1000×ｇ；１分間）した。ペレットを管端部切断により集め、ペレット及び上澄を別々にガンマカウンター〔パッカード（Ｐackard）〕で計測した。
【０１３１】
特異的結合量（cpm)は、競合物の非存在下における総結合量（２連の平均）‐100 倍過剰の未標識ｈｐＧ‐ＣＳＦの存在下における結合量（非特異結合量）（cpm)として計算した。非特異的結合量は、最大で、ＷＥＨＩ‐３Ｂ（Ｄ+）細胞の場合が2503cpm ，ＡＮＬＬ（Ｍ４）の細胞の場合が1072cpm ，ＡＮＬＬ（Ｍ５Ｂ）細胞の場合が1125cpm であった。実験１及び２は同一の 125Ｉ‐ｈｐＧ‐ＣＳＦ調製物を用いて異なる日に実施したが、ｈｐＧ‐ＣＳＦ2000単位の場合の阻害率においては内部的一貫性を示す。得られたデータは下記表XXIII に示されている。
【０１３２】
【表３２】
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【０１３３】
表XXIII で示されているように、 125Ｉ‐ｈｐＧ‐ＣＳＦはＷＥＨＩ‐３Ｂ（Ｄ+）白血病細胞との結合性を示した。結合は、ＧＭ‐ＣＳＦではなく未標識天然ｈｐＧ‐ＣＳＦ又はｒｈｐＧ‐ＣＳＦにより用量依存的に阻害された。しかも、ヒト骨髄単球性白血病細胞（ＡＮＬＬ，Ｍ４）に対する天然ｈｐＧ‐ＣＳＦの結合も観察された。これら細胞への結合性は、液体培養物中の天然ｈｐＧ‐ＣＳＦに応じて、形態学的に判断されるマクロファージへの分化と比較される。別の患者の単球性白血病細胞（ＡＮＬＬ，Ｍ５Ｂ）との天然 125Ｉ‐ｈｐＧ‐ＣＳＦの結合性の欠如は、特定の白血病が特異的に発現したか、又はｈｐＧ‐ＣＳＦに対するレセプターを欠くことを示唆する。天然ｈｐＧ‐ＣＳＦと同様に天然 125Ｉ‐標識‐ｈｐＧ‐ＣＳＦの結合に対して競合するｒｈｐＧ‐ＣＳＦの能力は、レセプターが十分等しく両型を認識することを示唆する。
【０１３４】
白血病細胞との天然 125Ｉ‐標識ｈｐＧ‐ＣＳＦの結合性を証明するこれらの研究は、培養物中で急性前骨髄性白血病（Ｍ３）の第１患者及び急性骨髄芽球性白血病（Ｍ２）の第２患者から得た低密度骨髄球の顆粒球及び単球への分化を誘導する天然ｈｐＧ‐ＣＳＦの能力と対比される。各患者からの細胞を、培地単独で又はｒｈｐＧ‐ＣＳＦ 1×105 単位存在下で、４日間培養した。培地単独でインキュベートされたＭ３コントロール培養物からの細胞は前骨髄球のままであったが、一方ｒｈｐＧ‐ＣＳＦの存在下で培養された細胞は、後骨髄球、巨大杆状核型‐分葉核型好中球及び単球からなる骨髄型成熟細胞を示した。この患者での現実の分化は、 100個の細胞について、コントロールの場合が 100％前骨髄球であり、ｒｈｐＧ‐ＣＳＦ処理細胞の場合が22％芽球＋前骨髄球、 7％骨髄球、35％後骨髄球、20％杆状核型＋分葉核型好中球、14％単球及び 2％マクロファージであった。注目されるのは、多形核顆粒球の１つが顕著なアウエル小体をまだ有していたという事実であるが、このことは少なくともこの細胞が白血病系のクローンに属する分化細胞であることを示唆する。骨髄芽球性白血病（Ｍ２）の第２患者からの細胞もｒｈｐＧ‐ＣＳＦの存在又は非存在下で４日間培養した。培地単独で培養されたＭ２細胞の視覚分析では、大きな“芽球様”細胞を示したが、そのうちのいくつかは核小体を有していた。Ｍ２細胞のいくつかは、ｒｈｐＧ‐ＣＳＦで処理した場合に、好中球の中心にアウエル小体が残った成熟分葉核型好中球に分化したが、このことは白血病系のクローンに属する細胞で生じる分化を示唆した。形態学的に評価された細胞100 個の実際の分化では、コントロール細胞は100 ％芽球からなることが示された。ｒｈｐＧ‐ＣＳＦ処理細胞は、43％芽球、 1％骨髄球、15％後骨髄球、28％杆状核型＋分葉核型好中球、 2％前単球及び11％単球からなっていた。白血病細胞が、また 4つの異なる濃度(5×103 ， 1×104 、 2.5×104 及び 5×104 Ｕ／ml、データ示さず）のｒｈｐＧ‐ＣＳＦ存在下で分化に関して試験された。試験されたｒｈｐＧ‐ＣＳＦの最低濃度(5×103Ｕ／ml）の場合であっても、Ｍ３（50％）及びＭ２（37％）白血病細胞の著しい分化が生じた（細胞は骨髄球以上に分化した）。
６．免疫試験
免疫試験用のポリクローナル抗体を産生するために使用された抗原は、例１(B) で調製されたようにしてヒト膀胱癌細胞系5637（ＩＡ6)から精製された多分化能性Ｇ‐ＣＳＦであった。この物質は、ポリアクリルアミドゲルの硝酸銀染色に基づき、純度85％と判定された。 6週令Ｂalb ／Ｃマウスを抗原の多部位注射により免疫した。抗原をＰＢＳに再懸濁し、等量のフロイント（Ｆreund)完全アジュバントで乳化させた。投与量は抗原 5〜7 μｇ／マウス／注射であった。追加免疫注射は、等量のフロイント不完全アジュバントで乳化された同量の抗原で18日後に投与した。 4日後、マウス血清を採取し、ヒト多分化能性Ｇ‐ＣＳＦに特異的な抗体について試験した。
【０１３５】
ホルダー中のダイナテック・イムロンII・リムーバウェル（Ｄynatech ＩmmulonII Removawell）ストリップ〔ダイナテック・ラボラトリー社（Ｄynateck Ｌab., Ｉnc.)、アレクサンドリア、バージニア〕をpH9.2 の50mM炭酸‐重炭酸緩衝液中のｈｐＧ‐ＣＳＦ 5μｇ／mlで被覆した。ウェルを容量50μl 中の0.25μｇで被覆した。抗原被覆プレートを室温で２時間及び 4℃で一夜インキュベートした。溶液を捨て、プレートを 5％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で30分間インキュベートして、反応表面を保護した。この溶液を捨て、希釈された免疫前血清又は試験血清をウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。血清は 1％ＢＳＡ含有のpH7.0 のＰＢＳで希釈した。血清溶液を捨て、プレートをワッシュ・ソルーション（Ｗash Solution）（ＫＰＬ、ゲイザースブルグ、メリーランド）で３回洗浄した。pH7.0 の 1％ＢＳＡ含有ＰＢＳ50μl 中の放射性ヨウ素化ウサギ抗マウスＩｇＧ（ＮＥＮ、ボストン、マサチューセッツ）約200,000 cpm を各々のウェルに加えた。室温で 1.5時間インキュベートした後、溶液を捨て、プレートをワッシュ・ソルーションで５回洗浄した。ウェルをホルダーから取外し、ベックマン5500ガンマカウンターで計測した。高力価マウス血清は、 1：100 希釈時において、相当する免疫前血清よりも12倍以上高い反応性を示した。
【０１３６】
大腸菌由来ｈｐＧ‐ＣＳＦの免疫学的性質は、哺乳動物細胞由来ｈｐＧ‐ＣＳＦに特異的な高力価マウス血清に対する反応性により測定した。純度90％の大腸菌由来タンパク質0.25μｇを容量50μl のイムロンIIリムーバウェルに被覆し、マウス血清を上記のように分析した。
【０１３７】
高力価マウス血清は、 1：100 希釈時において、相当する免疫前血清よりも24倍高い反応性を大腸菌由来物質に対して示した。
７．セリン類縁体生物学的試験
例８で製造された〔Ｓer17〕ｈｐＧ‐ＣＳＦ，〔Ｓer36〕ｈｐＧ‐ＣＳＦ，〔Ｓer42〕ｈｐＧ‐ＣＳＦ，〔Ｓer64〕ｈｐＧ‐ＣＳＦ及び〔Ｓer74〕ｈｐＧ‐ＣＳＦ産物を、 3Ｈ‐チミジン取込み、ＣＦＵ‐ＧＭ及びＷＥＨＩ‐３Ｂ Ｄ+ 分析によりｈｐＧ‐ＣＳＦ活性に関し分析した。各分析において、〔Ｓer17〕類縁体は天然構造組換え分子の活性に匹敵する活性を有していた。他の類縁体は、 3Ｈ‐チミジン取込み分析では 1／100 の活性、ＣＦＵ‐ＧＭ分析では 1／250 の活性、及びＷＥＨＩ‐３Ｂ Ｄ+分析では 1／500 の活性を有していた。このデータは、36，42，64及び74位のシステインが十分な生物学的活性のために必要であるという考え方を支持する。
８．イン・ビボ生物学的試験
アルゼット（ＡlzetR ）浸透圧ポンプ〔アルゼット社（Ａlzet Ｃorp.) パロ・アルト（Ｐalo Ａlto)、カリフォルニア；モデル2001〕を内在型右頚静脈血管カテーテルに連結し、７匹の雄性シリアンゴールデンハムスターの皮下に植込んだ。４つのポンプは緩衝液〔20mM酢酸ナトリウム（pH5.4 ）及び37mM塩化ナトリウム〕及び大腸菌由来ｈｐＧ‐ＣＳＦ 1.5mg／mlを含有し、３つは緩衝液のみを含有していた。浸透圧ポンプに必要な排出速度は、７日目まで 1μl ／hrであった。ポンプ植込み後３日目において、４匹の処理ハムスターの平均顆粒球数は３匹の（緩衝液）コントロールの場合より６倍高く、顆粒球数増加は総白血球が４倍増加したことに反映されていた。赤血球数は処理により変化しなかった。これらの結果は、組換え物質が哺乳動物において顆粒球の産生及び／又は放出を特異的に高めることを示している。
【０１３８】
ｈｐＧ‐ＣＳＦの天然対立型に加え、本発明ではｈｐＧ‐ＣＳＦのポリペプチド類縁体及びｈｐＧ‐ＣＳＦ断片のような他のｈｐＧ‐ＣＳＦ産物も包含する。上記アルトンらの出願公開（ＷＯ／83／04053）の操作に従い、１以上の残基の同一性又は位置に関し本明細書で記載されたものとは異なる（例えば、置換、端部及び中間部付加、並びに削除）一次構造をもつポリペプチドの微生物での発現をコードする遺伝子を容易に考えかつ製造することができる。一方、ｃＤＮＡ及びゲノム遺伝子の修正は、周知の特定部位突然変異誘発法によって容易に実施することができ、しかもそれらの類縁体及び誘導体を産生するために利用することができる。このような産物はｈｐＧ‐ＣＳＦの生物学的性質のうち少なくとも１つを有するが、他の点では異なる可能性がある。例えば、考えられる本発明の産物としては、例えば削除により短縮された産物、加水分解に対しより安定な産物（したがって、天然体よりも顕著な又は持続性の効果を有する可能性がある）、１以上の潜在的Ｏ‐グリコシル化部位を削除して修正された産物（酵母菌産生産物に関しより高い活性を有するようになる）、１以上のシステイン残基が削除され又はアラニンもしくはセリン残基等で置換され、しかも微生物系から活性型でより容易に単離され得る産物、又は、１以上のチロシン残基がフェニルアラニンで置換され、しかも標的細胞上のｈｐＧ‐ＣＳＦレセプターにいくぶん容易に結合し得る産物がある。更には、ｈｐＧ‐ＣＳＦの連続アミノ酸配列又は二次構造の一部のみを複製したポリペプチド断片も包含されるが、この断片は１つの活性（例えば、レセプター結合性）を有するが、他の活性（例えば、コロニー増殖刺激活性）を有しない可能性がある。本発明のいずれの１以上の産物が、治療的効用〔ウァイラントら、ブルート、第44巻、第 173〜175 頁、1982年（Ｗeiland, et al., Ｂlut, 44, 173-175 (1982)）参照〕又はｈｐＧ‐ＣＳＦ拮抗作用分析のような他の関連における効用をもつために、活性が必ずしも必要とされないことは注目に値する。競合的拮抗剤は、例えばｈｐＧ‐ＣＳＦの過剰産生時に非常に有用である可能性がある。
【０１３９】
本発明の他の側面によれば、ｈｐＧ‐ＣＳＦポリペプチドをコードする本明細書に記載されたＤＮＡ配列は、天然産物単離体の分析的プロセッシングにもかかわらず今まで得られていなかったこの哺乳動物タンパク質のアミノ酸配列に関して、それが情報を提供することから、価値がある。ＤＮＡ配列は、様々な組換え技術によるｈｐＧ‐ＣＳＦの大規模な微生物での合成を実施するために使用される産物としても著しい価値がある。その他に、本発明により提供されるＤＮＡ配列は、新規かつ有用なウイルス性または環状プラスミドＤＮＡベクター、新規かつ有用な形質転換された及びトランスフェクトされた(transfected) 微生物原核及び真核及び真核宿主細胞（細菌、酵母菌細胞及び哺乳動物の培養細胞を含む）、ｈｐＧ‐ＣＳＦ及びその関連産物の発現が可能なかかる微生物宿主細胞の新規かつ有用な培養増殖方法を開発するために使用される。本発明のＤＮＡ配列は、ｈｐＧ‐ＣＳＦ及び関連タンパク質をコードするヒトゲノムＤＮＡ並びに他の哺乳動物種のｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ配列を単離するための標識プローブとして使用される、極めて適切な物質でもある。ＤＮＡ配列は、（例えば、昆虫細胞中での）タンパク質合成の様々な代替的方法又はヒト及び他の哺乳動物における遺伝子療法にも使用することができる。本発明のＤＮＡ配列は、ｈｐＧ‐ＣＳＦ及びｈｐＧ‐ＣＳＦ産物の大規模産生用の真核細胞“宿主”として機能し得る遺伝子転換哺乳動物種を開発するためにも使用し得る、と期待されている。一般的には、パルミターら、サイエンス、第 222巻、第4625号、第 809〜814 頁、1983年〔Ｐalmiter, et al., Ｓcience, 222(4625), 809-814 (1983)〕参照。
【０１４０】
本発明のｈｐＧ‐ＣＳＦ断片及びポリペプチド類縁体の応用例の中には、天然タンパク質、糖タンパク質及び核タンパク質中に存在するアミノ酸配列を実質的に複製した合成ペプチドの免疫学的活性に関する報告がある。更に詳しくは、比較的低分子量のポリペプチドは、ウィルス抗原、ポリペプチドホルモンその他のような生理学的に重要なタンパク質の免疫反応と時間及び程度が類似した免疫反応に関係することが示された。このようなポリペプチドの免疫反応の中には、免疫学的に活性な動物における特異的抗体産生の賦活化が含まれる。例えば、レーナーら、セル、第23巻、第 309〜310 頁、1981年〔Ｌerner, et al., Ｃel l,23, 309-310 （1981）〕、ロスら、ネーチャー、第 294巻、第 654〜656 頁、1981年〔Ｒoss, et al.,Ｎature, 294, 654‐656 （1981）〕、ワルターら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第77巻、第5197〜5200頁、1980年〔Ｗalter, et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ), 77 , 5197-5200 (1980) 〕、ラーナーら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第78巻、第3403〜3407頁、1981年、ワルターら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第78巻、第4882〜4886頁、1981年；ウォン（Ｗong)ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第78巻、第7412〜7416頁、1981年；グリーン（Ｇreen）ら、セル、第28巻、第 477〜487 頁、1982年；ニッグ（Ｎigg)ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ＵＳＡ）、第79巻、第5322〜5326頁、1982年；バロン（Ｂaron) ら、セル、第28巻、第395〜404 頁、1982年；ドリーズマン（Ｄreesman)ら、ネーチャー、第 295巻、第 185〜160 頁、1982年；及びラーナー、サイエンティフィック・アメリカン、第248 巻、第 2号、第66〜74頁、1983年〔Ｌerner, Ｓcintific Ａmerican, 248, No.2, 66-74(1983) 〕参照。更に、ペプチドホルモンの二次構造をほぼ有するもののそれらの一次構造配列を有していない合成ペプチドの生物学的及び免疫学的活性に関する、カイザーら、サイエンス、第 223巻、第 249〜255 頁、1984年〔Ｋaiser, et al., Ｓcience,223, 249-255 (1984)〕参照。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】ｈｐＧ‐ＣＳＦ遺伝子の部分的な制限エンドヌクレアーゼ地図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１４２】
配列番号１：Ｘａａは非存在またはＭｅｔを表す。
【図１】
2006101889.tif 000036
【配列表】
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