(57)【要約】      （修正有）【課題】リジンおよびグルタミンの合成アナログは、検出可能な部分で標識化した場合でさえ、フィブリンを安定化する酵素 第XIIIa因子に対する基質としての機能を与える。適当な保護基の使用は、とりわけペプチダーゼによるインビボでの代謝に対して減少した感受性を有する化合物を与え、従って、血栓症、塞栓症、アテローム性動脈硬化症、炎症、または癌の診断に有用な薬剤である。血栓症、塞栓症、アテローム性動脈硬化症、炎症、または癌の診断に有用な薬剤を提供する。【解決手段】適当な保護基の使用は、とりわけペプチダーゼによるインビボでの代謝に対して減少した感受性を有するリジンおよびグルタミンの合成アナログ化合物を与え、上記の診断目的を達成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
Ｙ−（ＣＲ２）ｎ−Ｘ−ＮＨＪ
｛式中、
Ｘは、Ｃ＝ＯまたはＣＲ２であり；
ｎは、数値１〜６の整数であり；
Ｙは、Ｒ１Ｒ２ＣＲ−であり；
［ここで、Ｒ１およびＲ２のうちの一方は、−ＮＨ（Ｂ）ｐＺ１であって、他方は、
−ＣＯ（Ｂ）ｑＺ２であり；
（ここで、ｐおよびｑは、数値０〜４５の整数であって、Ｒ１およびＲ２におけるアミノ酸残基の総数は２〜３０の範囲であり；
各々のＢは、Ｑ（ここで、Ｑは、環状ペプチドである。）またはアミノ酸残基から独立して選択され；そして
Ｚ１およびＺ２は、ペプチドの生体内代謝を阻害または抑制する生体適合可な金属錯化基またはその他の保護基である。）］
Ｊおよび各々のＲ基は、Ｈ、Ｃ１−４ アルキル、Ｃ１−４ アルケニル、Ｃ１−４ アルキニル、Ｃ１−４ アルコキシアルキル、またはＣ１−４ ヒドロキシアルキルから独立して選択される。｝
［ただし、
（ｉ）ＸがＣＲ２であるならば、Ｚ２は金属錯化基であり；
（ｉｉ）Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、非金属放射性同位体または放射性金属から選ばれた放射性医薬品イメージングのための少なくとも１つの検出可能な部分を有し；
（ｉｉｉ）Ｒ１またはＲ２は、少なくとも３個のアミノ酸残基を含む、α２−抗プラスミン、フィブロネクチン、β−カゼイン、テタヌス、アミロイド、トラッピン、およびポリグルタミン残基のうちの１つ以上のペプチドフラグメントを含む、
ものとする。］
の化合物。
【請求項２】
ただし書き（ｉｉｉ）のペプチドフラグメントがα２−抗プラスミン由来のものである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ペプチドＮ末端からの２位におけるアミノ酸がグルタミンである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
ＪがＨである、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
式：
Ｙ−（ＣＲ２）ｘ−（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２またはＹ−（ＣＲ２）ｙ−（ＣＨ２）４ＮＨ２
［式中、ｘは、数値０〜４の整数であり；そして
ｙは、数値０〜３の整数である。］
である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｚ１およびＺ２のうちの少なくとも一方が金属錯化基である、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
Ｚ２が金属錯化基であって、Ｚ１は金属錯化基ではない、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
請求項６または請求項７に記載の化合物の金属錯体。
【請求項９】
金属が放射性金属である、請求項８に記載の金属錯体。
【請求項１０】
放射性金属が９９ｍＴcである、請求項９に記載の放射性金属錯体。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれかに記載の化合物または請求項８〜１０のいずれかに記載の金属錯体を含んでなる、ヒトへの投与のための調製物。
【請求項１２】
請求項８〜１０のいずれかに記載の金属錯体の調製において有用である、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物を含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、静脈および動脈の血栓症、塞栓症、または感染症部位の診断に有用な一群の化合物、それらを含む医薬品製剤、疾患の診断におけるそれらの使用、並びにそれらの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血栓を画像診断する放射性医薬品の先行技術には、放射能標識化フィブリノーゲンまたはプラスミノーゲン；ヒトフィブリンの放射能標識化フラグメントＥ１；組織プラスミノーゲン活性化因子（t−ＰＡ）のような放射能標識化プラスミノーゲン活性化因子；および標識化抗フィブリン抗体が含まれる。放射能標識化血小板（例えば、１１１Ｉｎオキシンを使用する）または放射能標識化抗血小板抗体の投与といったような、血小板蓄積部位の検出に基づいた方法もまた記載されている。より最近の努力は、細胞接着モチーフ ＲＧＤ（ここで、Ｒ、Ｇ、およびＤは、各々、アミノ酸アルギニン、グリシン、およびアスパラギン酸の標準的な略語である。）；血小板因子４もしくはそのフラグメント；またはディスインテグリン（disintegrin）のような抗凝血性ペプチドといったような、放射能標識化ペプチドまたはポリペプチドに焦点を絞っている。
【０００３】
第XIII因子は、触媒作用的に不活性な（またはチモーゲンの）形で血液およびある組織中に存在する血漿糖タンパク質である。第XIII因子は、カルシウムイオンの存在下、トロンビンにより、その活性型第XIIIa因子に変換される。第XIIIa因子はまた、血漿トランスグルタミナーゼ、フィブリノリガーゼ、またはフィブリン安定化因子としても知られている。血液クロットの形成における最終段階は、トロンビンによるフィブリノーゲンのタンパク質分解性切断により形成される、フィブリンの共有結合性架橋である。フィブリン分子を整列させて、酵素 第XIIIa因子は、各々、リジルおよびグルタミニル残基のＮＨ２およびＣＯＮＨ２基の共有結合性架橋を触媒して、血液クロットに構造剛性を与える。架橋は、フィブリンクロット構造を安定化させて、フィブリン溶解に対する抵抗性を授ける。架橋形成は、正常な血液凝固および創傷治癒、さらにはまた、血栓症のような病的状態の重要な一面である。アテローム血栓性脳梗塞は、一般的なサブタイプの卒中であることから、第XIIIa因子の基質は、卒中の診断を可能とし得る。それはまた、アテローム性動脈硬化症、炎症過程、腫瘍増殖および転移にも関与し得る。ＷＯ ９１／１６９３１は、第XIII因子（ここでは、活性部位がアミノ酸置換により不活性化されている）の放射能標識化アナログが血栓を画像診断する放射性医薬品として有用であることを開示している。
【０００４】
第XIIIa因子はまた、タンパク質のγ−グルタミン部位への低分子量アミンの取込みを触媒することも知られている。同様に、第XIIIa因子はまた、リジル残基への低分子量グルタミンアナログの取込みも触媒する。このように、そのような低分子量アミン（またはグルタミンアナログ）は、第XIIIa因子が誘発するタンパク質のリジル／グルタミニル架橋の競合的阻害剤として機能する。合成アミンの範囲は、ブタ肝臓トランスグルタミナーゼにより触媒されるＮ,Ｎ'−ジメチルカゼインへの標識化プトレシン（１,４−ブタンジアミン）の取込みの競合的阻害剤であると記載されている［Ｌ. Ｌorandら，Ｂiochem., １８,１７５６（１９７９）］。
【０００５】
ＷＯ ８９／０００５１（Ｃytrx Ｂiopool Ｌtd.）は、第XIIIa因子によりフィブリンに共有結合する標識化化合物を使用して、フィブリン沈析物を標的化する方法を特許請求している。フィブリンを結合する化合物は、「第XIIIa因子として一般的に知られている血液酵素に対する基質である全てのペプチド」であると述べられている。好ましいペプチドは、テトラペプチド配列 -Asn-Gln-Glu-Gln-（または標準的なアミノ酸の略語表記ではＮＱＥＱ）が含まれると言われている。α−２ 抗プラスミン酵素のＮＨ２末端由来の１２−merのペプチド配列：
NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-OH
もまた、合成アナログ：
NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Tyr-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-OH
（各々、ＮＱＥＱＶＳＰＬＴＬＴＬＬＫおよびＮＱＥＱＶＳＰＹＴＬＴＬＬＫと表示される）と一緒に開示されている。後者を１２５Ｉで放射能標識化して、インビトロでトロンビンクロットに取入れられることを示した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、静脈および動脈の血栓症、塞栓症、または感染症部位の診断に有用な一群の化合物、それらを含む医薬品製剤を提供し、これらの疾患の診断を容易に、かつより正確に行なおうとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記の課題を解決するために、静脈および動脈の血栓症、塞栓症、または感染症部位の診断に有用な化合物およびそれらを含む医薬品製剤を提供する。
【０００８】
本発明は、以下の化合物：
Ｙ−（ＣＲ２）ｎ−Ｘ−ＮＨＪ
｛式中、
Ｘは、Ｃ＝ＯまたはＣＲ２であり；
ｎは、数値１〜６の整数であり；
Ｙは、Ｌ（Ａ）ｍ−またはＲ１Ｒ２ＣＲ−であり；
［ここで、
Ｌは、金属錯化剤であり；
Ａは、−ＣＲ２−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＮＲＣＯ−、
−ＣＯＮＲ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、−ＣＲ２ＯＣＲ２−、
−ＣＲ２ＳＣＲ２−、−ＣＲ２ＮＲＣＲ２−、
Ｃ４−８ シクロヘテロアルキレン基、Ｃ４−８ シクロアルキレン基、
Ｃ５−１２ アリーレン基、Ｃ３−１２ ヘテロアリーレン基、または
ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸部分
であり；
ｍは、数値０〜１０の整数であり；
Ｒ１およびＲ２のうちの一方は、−ＮＨ（Ｂ）ｐＺ１であって、
他方は、−ＣＯ（Ｂ）ｑＺ２である。
（ここで、
ｐおよびｑは、数値０〜４５の整数であり；
各々のＢは、Ｑ（ここで、Ｑは、環状ペプチドである。）
またはアミノ酸残基から独立して選択され；および
Ｚ１およびＺ２は、保護基である。）］
Ｊおよび各々のＲ基は、Ｈ、Ｃ１−４ アルキル、Ｃ１−４ アルケニル、Ｃ１−４ アルキニル、Ｃ１−４ アルコキシアルキル、またはＣ１−４ ヒドロキシアルキルから独立して選択される。｝
［ただし、
（ｉ）Ｒ１およびＲ２基におけるアミノ酸残基の総数は、４５個を超えず；
（ii）ＸがＣＲ２であるならば、Ｙは−ＣＲＲ１Ｒ２であって、Ｚ２は金属錯化
剤であり；
（iii）Ｙが−ＣＲＲ１Ｒ２であるならば、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも一方は少なくとも１つの検出可能な部分を有する。］
を提供する。
【０００９】
本発明にはまた、検出可能な部分で標識化した上記化合物の調製のためのキット、並びに血栓症、塞栓症、アテローム性動脈硬化症、炎症、または癌の診断または治療におけるこれらの化合物および関連化合物の使用も含まれる。
【００１０】
「環状ペプチド」という用語は、ペプチドもしくはジスルフィド結合、またはチオエーテル、ホスホジエステル、ジシロキサン、もしくはウレタン結合といったような合成非ペプチド結合となり得る共有結合により、２個の末端アミノ酸が一緒に結合する、５〜１５個のアミノ酸配列を意味する。
【００１１】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在し得る、または純粋に合成起源のものであり得る、そして光学的に純粋、すなわち、単一エナンチオマー、従って、キラル、またはエナンチオマーの混合物であり得る、Ｌ−もしくはＤ−アミノ酸、アミノ酸アナログ、またはアミノ酸模倣物を意味する。好ましくは、本発明のアミノ酸は、光学的に純粋である。「アミノ酸模倣物」という用語は、等配電子体（isosteres）である、すなわち、天然化合物の立体および電子構造を模倣するよう設計されている、天然に存在するアミノ酸の合成アナログを意味する。そのような等配電子体は、当業者に十分知られており、限定されるものではないが、デプシペプチド、レトロ−インベルソペプチド、チオアミド、シクロアルカン、または１,５−二置換テトラゾールが含まれる［Ｍ. Ｇoodman，Ｂiopolymers，２４,１３７（１９８５）を参照］。
【００１２】
「保護基」という用語は、アミノまたはカルボキシル末端にあるペプチドまたはアミノ酸のインビボでの代謝を阻害または抑制する、生体適合可能な基を意味する。そのような基は、当業者に十分知られており、アミン末端（Ｚ１）に関しては：アセチル、Ｂoc（ここで、Ｂocは、tert−ブチルオキシカルボニルである。）、Ｆmoc（ここで、Ｆmocは、フルオレニルメトキシカルボニルである。）、ベンジルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Ｄde〔すなわち、１−（４,４−ジメチル−２,６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル〕、Ｎpys（すなわち、３−ニトロ−２−ピリジン スルフェニル）、または金属錯化基；およびカルボキシル末端（Ｚ２）に関しては：カルボキサミド、tert−ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、アミノアルコール、または金属錯化基から適当に選択される。好ましくは、保護基は金属錯化基であり、最も好ましくは、それは金属に結合した金属錯化基、すなわち、金属錯体である。ペプチドのカルボキシル末端は、カルボキシペプチダーゼ酵素によるインビボでの切断に特に影響されやすい。その結果、金属錯化基または金属錯体は、カルボキシル末端に結合するのが好ましい。Ｒ１が−ＮＨ（Ｂ）ｐ−１ＱＺ１であるか、またはＲ２が−ＣＯ（Ｂ）ｑ−１ＱＺ２であるならば、保護基は、環状ペプチド（Ｑ）環を閉環する共有結合となり得る。
【００１３】
「検出可能な部分」とは、シグナルを発する部分であり、またはヒト身体の診断用イメージングに適当であって、放射性医薬品イメージングもしくは治療のための放射性同位体、ＭＲＩコントラストイメージングのための常磁性金属もしくは種、Ｘ線コントラストイメージングのための放射線不透過性基もしくは金属、ガスマイクロバブル超音波コントラスト剤、または外部光イメージングによる検出に適当な色素であり得る。好ましくは、イメージング部分は金属イオンであり、最も好ましくは、それは放射性金属である。
【００１４】
Ｙが−ＣＲＲ１Ｒ２であるならば、好ましくは、Ｒ１およびＲ２のうちの一方または両方は、α２−抗プラスミン、フィブロネクチン、もしくはβ−カゼイン、フィブリノーゲン、またはトロンボスポンジンの１つ以上のペプチドフラグメントを含んでなる。そのようなペプチドフラグメントは、少なくとも３個、好ましくは４−２０個のアミノ酸残基を含んでなる。Ｙが−ＣＲＲ１Ｒ２であって、−（ＣＲ２）−Ｘ−ＮＨＪが−（ＣＨ２）４ＮＨ２（すなわち、リジンのアミノ酸側鎖）であるならば、好ましくは、Ｒ１およびＲ２のうちの一方または両方は、α２−抗プラスミン、フィブロネクチン、またはβ−カゼインの１つ以上のそのようなペプチドフラグメントを含んでなる。α２−抗プラスミン、フィブロネクチン、β−カゼイン、フィブリノーゲン、およびトロンボスポンジンのアミノ酸配列は、以下の参考文献において見出すことができる：α２−抗プラスミン前駆体［Ｍ. Ｔoneら, Ｊ. Ｂiochem，１０２,１０３３（１９８７）］；β−カゼイン［Ｌ. Ｈanssonら，Ｇene, １３９,１９３（１９９４）］；フィブロネクチン［Ａ. Ｇutmanら, ＦＥＢＳ Ｌett., ２０７,１４５（１９９６）］；トロンボスポンジン−１前駆体［Ｖ. Ｄixitら, Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci., ＵＳＡ, ８３,５４４９（１９８６）］；Ｒ. Ｆ. Ｄoolittle, Ａnn. Ｒev. Ｂiochem., ５３,１９５（１９８４）。
【００１５】
好ましくは、アミノ酸配列は、
（ｉ）α２−抗プラスミン、
すなわち、
NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-OH
または
NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-OH
NH2-Asn-Gln-Glu-Ala-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-OH
NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Gly-OH
といったような、１個以上のアミノ酸が交換され、付加され、または除去されている、この変異体；または
（ii）カゼイン
すなわち、
Ac-Leu-Gly-Pro-Gly-Gln-Ser-Lys-Val-Ile-Gly
のＮ末端から取る。
【００１６】
本発明の化合物がペプチドである、すなわち、ＹがＲ１Ｒ２ＣＲ−である場合、アミノ酸残基の数は、好ましくは２〜３０個、最も好ましくは３〜２０個、とりわけ３〜１５個である。
【００１７】
好ましい化合物は、ＪがＨである、すなわち、ＮＨ２基を末端とする。Ｘは、Ｃ＝Ｏであるのが好ましい、すなわち、式 Ｙ−（ＣＲ２）ｎ−ＣＯＮＨ２の化合物が好ましい。最も好ましい化合物は、式 Ｙ−（ＣＲ２）ｘ−（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２またはＹ−（ＣＲ２）ｙ−（ＣＨ２）４ＮＨ２（ここで、ｘは、数値０〜４の整数であり、およびｙは、数値０〜３の整数である。）のものである。グルタミンと同じ側鎖を有する化合物、すなわち、式 Ｙ−（ＣＲ２）ｘ−（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２のグルタミンアナログがとりわけ好ましい。
【００１８】
本発明での使用に適当な非金属放射性同位体には、限定されるものではないが、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉといったような放射性ヨウ素、好ましくは１２３Ｉ；１８Ｆ、１１Ｃ、または７５Ｂrといったような陽電子放射体；および治療のための同位体、例えば、２１１Ａtが含まれる。
【００１９】
金属錯化剤を含んでなる本発明の化合物は、すなわち、−（ＣＲ２）ｎ−Ｘ−ＮＨＪ置換基が結合した単一型の標的化分子のみを有するのが好ましい。錯化剤上には他の置換基も存在し得るが、−（ＣＲ２）ｎ−Ｘ−ＮＨＪ置換基は、生体局在化特性の主たる原因であると予想される置換基である。本発明の金属錯体は、同じであっても異なっていてもよい、１つ以上の金属イオンを含み得る。このように、幾つかの状況において、多核錯体は、超常磁性特性を有し、従って、ＭＲＩコントラスト剤として特に有用である、ある金属クラスターのような、有利な特性を有し得る。本発明の好ましい金属錯体は、単一金属イオンのみを含む。金属錯体の金属が放射性金属である場合、それは、（６８Ｇaもしくは６４Ｃuといったような）陽電子放射体、または９９ｍＴc、１１１Ｉn、１１３ｍＩn、もしくは６７Ｇaといったようなγ−放射体であり得る。ＭＲＩでの使用に適当な金属イオンは、ガドリニウム（III）またはマンガン（II）といったような常磁性金属イオンである。診断用イメージングに最も好ましい放射性金属は、γ−放射体、とりわけ９９ｍＴcである。ある放射性核種の金属錯体は、癌のような様々な疾患の放射線治療、または血栓症もしくは再狭窄の処置のための放射性医薬品として有用であり得る。そのような放射線治療適用に有用な放射性同位体には、９０Ｙ、８９Ｓr、６７Ｃu、１８６Ｒe、１８８Ｒe、１６９Ｅr、１５３Ｓm、および１９８Ａuが含まれる。いずれの金属錯体を選択しても、それが血液中で容易な代謝を受けないような方法で第XIIIa因子の基質に結合し、その結果、金属錯体が第XIIIa因子の基質から切断された後、標識化第XIIIa因子の基質が画像診断すべき所望のインビボでの部位に達することは是非とも好ましい。従って、第XIIIa因子の基質は、本発明の金属錯体に共有結合するのが好ましい。
【００２０】
金属錯化剤、またはより好ましくはキレート化剤を使用して、これらの金属イオンを錯体形成させる。キレート化剤は、非配位骨格鎖により一緒に共有結合した２−１０個の金属供与体原子を含んでなる。好ましいキレート化剤は、４−８個の金属供与体原子を有して、金属供与体原子を鎖状もしくは大環状配置またはそれらの組み合わせで有する。最も好ましいキレート化剤は、４−６個の金属供与体原子を有して、金属中心に配位された場合、５員または６員のキレート環を形成する。そのような多配座および／または大環状キレート化剤は、トランスフェリンまたは血漿タンパク質といったような、インビボでの金属に対する内因性競合リガンドによる攻撃に耐え得る、安定な金属錯体を形成する。あるいはまた、たとえ、それらが金属配位でキレート環を形成しなくても、所望の金属イオンと共に安定な錯体を形成する一座配位錯化剤を使用することが可能である。９９ｍＴcとの使用に特に適当である、この種類の既知の錯化剤の例は、ヒドラジン、ホスフィン、アルシン、またはイソニトリルである。
【００２１】
適当なキレート化剤の例は、ジアミンもしくはジホスフィンといったような二座配位、モノアミンジチオールのような三座配位、もしくはジアミンジオキシム（ＵＳ ４６１５８７６）のような四座配位、またはアミド供与体を取込むようなリガンド（ＷＯ ９４／０８９４９）；ＷＯ ９４／２２８１６の四座配位リガンド；Ｎ２Ｓ２ ジアミンジチオール、ジアミドジチオール、またはアミドアミンジチオール；Ｎ３Ｓ チオールトリアミド；テトラアミンのようなＮ４ リガンド、大環状アミン、またはシクラム、オキソシクラム（中性テクネチウム錯体を形成する）、もしくはジオキソシクラムといったようなアミドリガンド；またはジチオセミカルバゾンである。上記リガンドは、テクネチウムに特に適当であるが、他の金属にもまた有用である。他の適当なリガンドは、ＳandozのＷＯ ９１／０１１４４に記載されており、インジウム、イットリウム、およびガドリニウムに特に適当なリガンド、とりわけ大環状アミノカルボキシレートおよびアミノホスホン酸リガンドが含まれる。ガドリニウムの非イオン性（すなわち、中性）金属錯体を形成するリガンドが知られており、ＵＳ ４８８５３６３に記載されている。そのリガンドはまた、ＷＯ ９２／１３５７２のＣys／アミノ酸／Ｃys トリペプチドのような短い配列のアミノ酸、またはＥＰ ０７１９７９０ Ａ２に記載されているペプチドリガンドも含んでなる。
【００２２】
好ましいキレート化剤は、式：
ＲＮ〔（ＣＲ２）ａＮ（ＣＲ２）ｂＣＲ＝ＮＯＨ〕２
［式中、
各々のａは、２または３であり；
各々のｂは、１または２であり；
１つのＲは、キレート化剤を残りの分子に結合させるアミノアルキレンであり；
Ｒは互いに独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０ ヒドロカルビル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミン、アミド、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、もしくはカルボキシレートであるか、または２つのＲ基が、それらが結合する原子で一緒になって、カルボキシル性ヘテロ環式の飽和もしくは不飽和環を形成する。］
を有する。
【００２３】
非ペプチドに基づいた金属キレート化剤は、金属イオンの結合および解離に対して改良された制御を与え、好ましい。
【００２４】
本発明にはまた、３−４５個のアミノ酸残基を含んで、末端金属錯化剤を有する、α２−抗プラスミン、フィブロネクチン、β−カゼイン、テタヌス、アミロイド、トラッピン、またはポリグルタミンのペプチドフラグメントが含まれる。
【００２５】
それに官能基が結合しているキレート化剤（「二官能性キレート」）を調製することは十分知られている。キレート化剤に結合している官能基には、アミン、カルボン酸、シアネート、チオシアネート、マレイミド、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような活性エステルが含まれる。ジアミンジオキシムリガンドに対するキレート−アミン抱合体の例は、ＷＯ ９５／１９１８７に記されている。所望の第XIIIa因子の基質の官能性がアミンである場合、（好ましくは、当業者に知られている適当な保護基の使用により保護した）両方のアミン基を含む二官能性化合物と、塩化スルホニル、酸塩化物、活性エステル、またはアルキル／ベンジルハロゲン化物といったような反応性基との反応により、本発明のリガンドを調製することができる。次いで、その反応性基を、二官能性キレートのいずれかのアミン側基に結合させるか、またはＮ含有リガンドの１個以上のアミン供与体原子を誘導体化するために使用することができる。あるいはまた、１つを保護したジアミンを、活性エステルまたはカルボキシル側基をもつ二官能性キレートと反応させて、アミド結合によってリガンドシステムに結合した保護アミン基を与えることができる。上に概略を述べた両方の合成経路において、次いで、その結果得られたリガンド保護アミン共役体を適当な条件下に脱保護して、所望のアミン官能基化リガンドを与える。所望の第XIIIa因子の基質の官能性がカルボキサミド基である場合、例えば、適当な鎖長のω−ハロアルキルカルボキサミドと、アミン側基をもつ二官能性キレートとの反応により、所望のリガンドを調製して、所望のカルボキサミド結合リガンドを得ることができる。
【００２６】
適当な酸化状態にある金属の溶液をリガンドと適当なpＨで反応させることにより、本発明の金属錯体を調製することができる。その溶液は、（クロリド、グルコネート、またはシトレートといったような）金属に弱く錯体形成するリガンドを含み得るのが好ましく、すなわち、金属錯体をリガンド交換またはトランスキレート化により調製する。そのような条件は、金属イオンの加水分解のような、望ましくない副反応を抑制するのに有用である。金属イオンが９９ｍＴcである場合、通常の出発物質は、９９Ｍo ジェネレーター由来の過テクネチウム酸ナトリウムである。テクネチウムは、比較的不反応性である、Ｔc（VII） 酸化状態にある９９ｍＴc−過テクネチウム酸塩で存在する。従って、より低い酸化状態 Ｔc（Ｉ）〜Ｔc（Ｖ）のテクネチウム錯体の調製は、通常、錯体形成を促進するために、スズイオンのような適当な還元剤の添加を必要とする。さらに適当な還元体を以下に記載する。
【００２７】
金属錯体はまた、低い非特異的な血液バックグラウンドを示すのが好ましくもある。
【００２８】
このように、本発明は、主として、酵素 第XIII因子を活性化して、フィブリンまたはコラーゲンといったような血液タンパク質を沈析させる、哺乳類の身体における部位を画像診断するための診断薬に関する。本発明の薬剤は、ヒト身体の診断用イメージングに特に有用である。その薬剤は、（シンチグラフィーのための）放射性金属または（ＭＲＩのための）常磁性金属イオンといったような、外部イメージングに適当な金属錯体で標識化する、酵素 第XIIIa因子に対する基質を含んでなる。本発明の金属錯体は、各々、酵素 第XIIIa因子によるタンパク質 グルタミル カルボキサミドまたはリジル アミン基への共有結合に利用できる、アミノまたはカルボキサミド官能側基を有する。フィブリンと第XIIIa因子との密接な関係は、フィブリン沈析または蓄積および第XIII因子の活性化の両方がある疾患状態の診断のための、本発明の薬剤の可能性のある使用を強調する。増大したフィブリン沈析は、血栓症、アテローム性動脈硬化症、線維症肝臓、および散在性血管内凝固といったような疾患の特徴であることが知られている。フィブリンはまた、感染症、自己免疫疾患、または癌といったような、多くの疾患過程と関連のある組織炎症部位でも沈析する。第XIII因子および組織トランスグルタミナーゼは、既知の生理的条件の間に活性化される。アポトーシスおよび新たな基質タンパク質構造の発生の間に、高められた酵素レベルが見られる。このように、本発明の薬剤はまた、増大した基質タンパク質沈析が起こる、アポトーシス、および関節炎のような疾患状態の検出に使用することもできる。第XIII因子は、インビボでの重要な部位（すなわち、血栓、塞栓等）で活性化されることから、これは、本発明の金属錯体に局在化機構を与える。次いで、放射性核種シンチグラフィーまたは磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）により、共有結合した金属錯体を外部から画像診断し、従って、疾患部位を診断する非観血的方法を与えることができる。
【００２９】
本発明の治療態様に関する限り、発明者達は、（以下の実施例１７により）本明の標識化ペプチドの存在下に作り出されたクロットが標識化ペプチドの不存在下に作り出されたクロットより小さいことを示す、（本明細書中では詳細に報告していない）予備的なインビボでのデータを有する。これに基づいて、典型的には、４−３０個、例えば、約１０個のアミノ酸残基を含む、本明細書中に定義するペプチドが、クロットにおけるフィブリン架橋の強力な阻害剤として作用することにより、クロット溶解速度を増大させるための薬物として有効であることを提唱する。このように、開示する化合物は、治療のための血栓溶解または抗凝固薬物としての可能な医薬品使用を有する。
【００３０】
本発明はまた、第XIIIa因子の基質に結合した金属錯体の調製のためのキットにも関する。そのキットは、例えば、血流への注射によって、ヒトへの投与に適当な無菌生成物を与えるよう設計されている。可能な態様を以下に開示する。検出可能な部分が９９ｍＴcである場合、そのキットは、亜ジチオン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、ホルマミジン スルフィン酸、スズイオン、Ｆe（II）、またはＣu（Ｉ）といったような、薬学的に許容され得る還元剤、好ましくは塩化スズまたは酒石酸スズといったようなスズ塩と一緒に、金属に対する遊離リガンドまたはキレート化剤を含むバイアルを含んでなる。あるいはまた、そのキットは、金属錯体を含み得、これは、放射性金属または常磁性金属の添加で、金属交換反応（すなわち、リガンド交換）を受けて、所望の生成物を与える。９９ｍＴcに関しては、そのキットを凍結乾燥させ、９９ｍＴc 放射性同位体ジェネレーターから無菌９９ｍＴc−過テクネチウム酸塩（ＴcＯ４−）で再構築するよう設計して、ヒトへの投与に適当な溶液をさらなる操作なく与えるのが好ましい。
【００３１】
本発明の薬剤はまた、ヒトへの注射に使える単位用量形態で与えることもでき、例えば、予め充填しておいた無菌注射器で供給することができる。検出可能な部分が９９ｍＴcのような放射性同位体である場合、単位用量を含む注射器はまた、（操作する人を可能性のある放射能用量から保護するために）注射器シールド内で供給することもできる。
【００３２】
上記キットまたは予め充填しておいた注射器は、場合により、緩衝液；薬学的に許容され得る可溶化剤（例えば、シクロデキストリン、またはＰluronic、Ｔween、もしくはリン脂質といったような界面活性剤）；（アスコルビン酸、ゲンチジン酸、またはパラ−アミノ安息香酸といったような）薬学的に許容され得る安定化剤もしくは抗酸化剤、または（塩化ナトリウムもしくはマンニトールといったような）凍結乾燥のための充填剤といったような、さらなる成分を含み得る。
【００３３】
以下の実施例は、本発明の化合物の調製、およびイメージングにおけるそれらの使用を説明する。本発明の個々の化合物の合成を実施例１−９に記し、１２３Ｉまたは９９ｍＴcでのそれらの放射能標識化を実施例１０−１２に記す。化合物１（先行技術）は、比較実施例として含まれる。インビトロでの増大した血漿安定性に関する証拠を実施例１３に記す。実施例１６に報告する放射能標識化化合物の正常なラットの体内分布と共に、インビトロおよびインビボでの血液クロットにおける取込みに関する証拠を、各々、実施例１５および１７に記す。
【００３４】
１２３Ｉ−化合物１のインビトロでの血漿安定性は、恐らく、プロテアーゼ活性により、乏しい（実施例１３を参照）。放射能標識化化合物２−５および７−４９に関する限り、カルボキシおよびアミノ末端の両方での保護基の導入は、血漿安定性の実質的な増大を授ける。
【００３５】
試験した化合物の大部分は、インビトロでのクロットの高い取込みを示し、従って、クロットに対する結合活性を示す。他の化合物は、化合物１４、１６、１８、３１、３４、３６、４６、および４８が取込みの有意な減少を示すことから、より低い効力のものである。化合物１４におけるような、α２−抗プラスミンに由来する配列の２位からのＧln残基の除去は、このトレーサーの取込みの大きな下落を引き起こし、そういうわけで、Ｇln−２がこの配列型における必須アミノ酸であることを強く提唱する。
【００３６】
正常なラット、並びに新しいクロットモデルおよび古いクロットモデルにおける体内分布の詳細を実施例１６および１７に記す。これらの化合物の血中クリアランス速度は、生物学的半減期が１−２時間であることから、比較的速い。９９ｍＴc−化合物３の体内分布を代表的な実施例として記し、この場合において、ｔ１／２は２時間であると予想される。血液、肺、心臓、および筋肉といったようなバックグラウンド組織からの迅速なクリアランスは、本発明の薬剤がイメージングに有利な薬物動態を有することを示し、放射能診断法としてのそれらの可能性を示す。これらの化合物に関して、幾つかの肝胆道排泄が見られるが、主要な排泄経路は、尿路によってである。
【００３７】
多くの放射能標識化化合物に関して、ラットモデルにおける新しいクロットおよび古いクロットへの取込みは、クロット対バックグラウンド組織の比率がイメージングに非常に有利である（＞５）ことから、非常に良好である（相対濃度またはＲＣ＝５−１５）。実施例１８は、９９ｍＴc−化合物５がラットモデルにおけるクロットを画像診断するのに適当であることを示す。
【００３８】
９９ｍＴc−化合物２−４９は、１２３Ｉ−化合物１（ＲＣ＝１.５）と比較して、血漿安定性を改良しており、これは、これらの化合物で見られる改良されたインビボでのクロットの取込みの原因であり得る。
【００３９】
新しいクロットおよび古いクロットに関する、実施例１７のクロットの取込みの結果比較は、本発明の薬剤が一定でクロットの年齢とは無関係な取込みを示すことを示す。このように、そのような薬剤は、肺塞栓症で見られるクロットのような、既存のクロットに対するイメージング能力を改良する。
【００４０】
実験
以下の表において、
Ｚは、ベンジルオキシカルボニルであり；
Ｆmocは、フルオレニルメトキシカルボニルであり；
Ａcは、アセチルであり；
Ｐn４４は、
【化１】
2006137751.tif 000002
であり；
Ｐn２１６は、
【化２】
2006137751.tif 000003
であり；
Ｈynicは、
【化３】
2006137751.tif 000004
である。
【００４１】
【表１】
2006137751.tif 000005
【００４２】
【表２】
2006137751.tif 000006
【００４３】
ＥＳ＋ 質量分析法を使用して、表示した化合物を除く全ての化合物を分析した。ａで表示した化合物は、ＦＡＢにより分析し、ｂで表示した化合物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析法により分析した。
【００４４】
実施例１：化合物１および２の合成
Ｆmoc−Ｌys（Ｂoc）を樹脂にしっかりと固定することにより、保護ペプチド Ａc−Ａsn（Ｔrt）−Ｇln（Ｔrt）−Ｇlu（ＯtＢu）−Ｇln（Ｔrt）−Ｖal−Ｓer（tＢu）−Ｐro−Ｔyr（tＢu）−Ｔhr（tＢu）−Ｌeu−Ｌeu−Ｌys（Ｂoc）−Ｇly−ＯＨを２−クロロトリチル樹脂上に結合させた後、（Ｐ. Ｌloyd−Ｗilliams, Ｆ. ＡlbericioおよびＥ. Ｇirald：Ｃhemical Ａpproaches to the Ｓynthesis of Ｐeptides and Ｐroteins, ＣＲＣ Ｐress, １９９７に記載されているように）連続的な脱保護／適当な保護アミノ酸との結合サイクルにかけた。ジクロロメタン中の０.１％ＴＦＡを使用しての切断、脱保護、およびＲＰ−ＨＰＬＣ（システムＡ）による精製により、標記化合物を得た。
【００４５】
実施例２：化合物３−９、１２−２１、２８−３３、３５、３７、４２、
および４５−４９の合成
適当な保護ペプチドを実施例１のように適当な保護アミノ酸と結合させた。保護フラグメントを樹脂から切断した後、結合剤としてＢＯＰを使用して、溶液中の（ＷＯ ９５／１９１８７に記載されているように製造した）６−アミノメチル−３,３,６,９,９−ペンタメチル−４,８−ジアザウンデカン−２,１０−ジオン ジオキシム、（ＷＯ ９８／３１３９９に記載されているように製造した）３,３,１１,１１−テトラメチル−７−アミノエチル−４,７,１０−トリアザトリデカン−２,１２−ジオンジオキシム、または（米国特許第５,２０６,３７０号に記載されているように製造した）６−Ｂoc−ヒドラジノピリジン−３−カルボン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステルと結合させた。標記化合物をＴＦＡ／水／トリエチルシラン（９０／５／５）中での脱保護により得て、ＲＰ−ＨＰＬＣ（システムＡ）により精製した。
【００４６】
実施例３：化合物２２−２７の合成
Ｅppendorfバイアル中、化合物５、８、または９（１mg）、酢酸アンモニウム緩衝液（４００μl、０.２Ｍ、pＨ ４）、ヨウ化ナトリウム（０.５当量、０.１Ｍ ＮaＯＨ中、１５mg／１０ml）、および過酢酸（１.５当量、０.１Ｍ 溶液）を加えた。その反応混合物を１分間徹底的に混合し、モノヨードおよびジヨード生成物を分離して、分取ＨＰＬＣにより集めた。その手順を繰り返して、十分な量の単離生成物を得た。
【００４７】
実施例４：化合物１０および１１の合成
Ｆmoc−Ａsn（Ｔrt）−Ｇln（Ｔrt）−Ｇlu（tＢu）−Ｇln（Ｔrt）−Ｖal−Ｓer（tＢu）−Ｐro−Ｔyr（tＢu）−Ｔhr（tＢu）−Ｌeu−Ｌeu−Ｌys（Ｂoc）−Ｇly（２００mg、０.７３mmol）、Ｐn２１６（３０mg、０.８７mmol）、およびＨＢＴＵ（３３mg、０.８７mmol）を無水ＤＭＦ（２.５ml）に溶解した。その溶液にジイソプロピルエチルアミン（２０ml、１.１５mmol）を加えて、その反応混合物を室温で１.７５時間撹拌した。次いで、その反応混合物をピペリジン（０.５ml）で処理して、その混合物を室温で２時間撹拌した。生成物を半分取ＨＰＬＣにより精製して、白色の固体（１７１mg、８２％）を得た；ＥＳ＋−ＭＳ：ｍ／ｚ ９５２.４０（Ｍ＋３Ｈ＋）。
【００４８】
１−アダマンタンカルボン酸または３,５−ビス（トリフルオロメチル）安息香酸（１.５モル当量）、保護ペプチド Ａsn（Ｔrt）−Ｇln（Ｔrt）−Ｇlu（tＢu）−Ｇln（Ｔrt）−Ｖal−Ｓer（tＢu）−Ｐro−Ｔyr（tＢu）−Ｔhr（tＢu）−Ｌeu−Ｌeu−Ｌys（Ｂoc）−Ｇly−Ｐn２１６（１モル当量）、およびＨＢＴＵ（１.２−１.５モル当量）を無水ＤＭＦ（１ml）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（１１モル当量）を加えて、反応がＨＰＬＣにより完了したと判断されるまで、その反応混合物を室温で撹拌した。次いで、保護ペプチドフラグメントをＣＨ２Ｃl２中の９５％トリフルオロ酢酸で処理した。その反応混合物を室温で２〜４時間撹拌した。その反応混合物から生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製した。
【００４９】
実施例５：化合物３４の合成
例として、Ｆmoc−Ａsn（Ｔrt）−Ψ（ＣＨ２ＮＨ）−Ｇln（Ｔrt）−ＯＨを古典的な還元ペプチド結合の合成方法により得たことを除き、保護ペプチドをＦmoc−Ａsn（Ｔrt）に由来するアルデヒドでのＧln（Ｔrt）の還元的アミノ化（Ｇ. Ｇuichardら, Ｐeptide Ｒes., ６（３）, １２１（１９９３）およびその中での参考文献を参照）により合成した。
【００５０】
その結果得られた化合物を調製して、実施例２のように精製した。
【００５１】
実施例６：化合物３６、３８、および３９の合成
保護ペプチドをＲink樹脂上ではあるが実施例１のように合成した。グリシン Ｎ−保護を除去した後、まだ樹脂上にある間に、ペプチドを無水グルタル酸と反応させた。樹脂上でのＢＯＰ／ＨＯＢtでのグルタレート カルボン酸の活性化および６−アミノメチル−３,３,６,９,９−ペンタメチル−４,８−ジアザウンデカン−２,１０−ジオン ジオキシムまたは３,３,１１,１１−テトラメチル−７−アミノエチル−４,７,１０−トリアザトリデカン−２,１２−ジオンジオキシムとの結合により、保護生成物を得た。ＴＦＡ／水（９５／５）での切断により、粗製物質を得、ＲＰ−ＨＰＬＣ（システムＡ）を使用して、これを精製した。
【００５２】
実施例７：化合物４０および４１の合成
無水テトラヒドロフラン（５ml）中、必要とされる分子量のα−Ｎ−（tert−ブトキシカルボニル）−ポリ（エチレングリコール）アミノ−ω−スクシンイミジル カーボネート、および１モル当量の６−アミノメチル−３,３,６,９,９−ペンタメチル−４,８−ジアザウンデカン−２,１０−ジオン ジオキシムまたは３,３,１１,１１−テトラメチル−７−アミノエチル−４,７,１０−トリアザトリデカン−２,１２−ジオンジオキシムを窒素下に５時間還流した。その反応混合物を減圧下に還元して、白色の固体をもたらし、これを、イソプロパノール／アンモニア／水 １０：１：１を使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標記化合物を白色の固体として得た。３７％ ＨＣlを使用し、メタノール中の氷冷溶液に滴加して、Ｂoc保護基を除去した。次いで、その溶液を室温で４時間撹拌した。その反応混合物を４Ｍ ＮaＯＨ（４.１８ml）の添加によりpＨ〜１０まで塩基性とした。生成物を半分取ＨＰＬＣ（システムＤ）により単離した。
【００５３】
上から得た固体をＤＭＦに溶解して、それに保護ペプチドフラグメントを加えた。ジイソプロピルエチルアミンおよびＨＢＴＵを加えて、反応が完了するまで、その反応混合物を室温で撹拌した。生成物をＨＰＬＣ（システムＥ）により精製して、無色のガムを得た。
【００５４】
このガムをジクロロメタン（２ml）に溶解して、その溶液をＴＦＡ（０.２ml）で５時間処理した。その反応物を１Ｍ ＮaＯＨ（２ml）で塩基性として、揮発性物質を減圧下に除去した。残留物にＭeＯＨ（２.５ml）を加え、Ａcrodiscフィルター（ＬＣ１３ ＰＶＤＦ ０.４５ｍ）を使用して、その混合物を濾過した。生成物をメタノール性溶液からＨＰＬＣ（システムＥ）により単離した。
【００５５】
実施例８：化合物４３の合成
１２−Ｎ−Ｆmoc−アミノドデカン酸を先に記載したように３,３,１１,１１−テトラメチル−７−アミノエチル−４,７,１０−トリアザトリデカン−２,１２−ジオンジオキシムに結合させた。Ｆmoc保護基をＤＭＦ中の２０％ ピペリジンにより除去して、生成物をＨＰＬＣ（システムＦ）により精製した。
【００５６】
上記生成物を保護ペプチドフラグメントと結合させて、その後、上記のように脱保護した。生成物をＨＰＬＣ（システムＧ）により精製した。
【００５７】
実施例９：化合物４４の合成
Ｆmocに基づいた方法により、部分的に脱保護されたペプチド Ｈ−Ａsn（Ｔrt）−Ｇln（Ｔrt）−Ｇlu（ＯtＢu）−Ｇln（Ｔrt）−Ｖal−Ｓer（tＢu）−Ｐro−Ｔyr（tＢu）−Ｌeu−Ｌeu−Ｌys（Ｂoc）−Ｇly−ＯＨをＢＯＰ／ＨＯＢtでの逐次延長により２−クロロトリチル クロリド樹脂上に結合させた。Ｎ末端保護をピペリジン処理により除去して、部分的に保護されたペプチドをジクロロメタン溶液中の０.５％ ＴＦＡにより保持体から切断した。
【００５８】
既知の方法により、縮合剤としてＢＯＰを含むＤＭＦ中の１０mＭの濃度での溶液中、環化を固体重炭酸ナトリウムの存在下に行った（例えば、Ｍ. Ｒodriguezら, Ｉnt. Ｊ. Ｐept. Ｐrotein Ｒes., ３５,４４１,１９９０を参照）。
【００５９】
ＴＦＡ／水／エタン ジチオール（９０／５／５）の混合物における最終脱保護により、粗製の標記化合物を得、これをＲＰ−ＨＰＬＣ（システムＡ）により精製した。
【００６０】
実施例１０：化合物１−２および化合物４４のＩ−１２３標識化
Ｅppendorfチューブ中、酢酸アンモニウム緩衝液（２００μl、０.２Ｍ、ｐＨ４.０）およびＮa１２７Ｉ（１０μl、１.５μg）をリガンド溶液（２０μl、２０μg）に加えた。その溶液を徹底的に混合した後、Ｎa１２３Ｉ（５−５０μl、１１１ＭＢq）を加えた。その溶液を徹底的に混合した後、ＰＡＡ溶液（１０μl、０.０１Ｍ）を加えて、さらに混合を続けた。調製物の活性を測定した。全ての場合において、必要とされる生成物を反応副生成物および未標識化基質からＨＰＬＣにより分離した。
【００６１】
実施例１１：化合物３、５−４３、４５−４９のＴc−９９ｍ標識化
Ｈ２Ｏに溶解した化合物（１mg／ml）の０.１mlのアリコートを、脱酸素化生理食塩水（０.９％ ｗ／ｖ、１ml）および水性ＮaＯＨ（０.１Ｍ）０.０３５mlと一緒に、窒素を充填した１０mlのガラスバイアルに移した。この溶液に、テクネチウムジェネレーター溶出液（１ml、約０.４ＧＢq）、次いで、水性塩化スズ溶液（０.１ml、約１０μg）を加えた。標識化pＨは、９.０−１０.０であった。バイアルを周囲実験室温度（１５−２５℃）で３０分間インキュベートして、標識化を成し遂げた。その結果得られた調製物を所望の放射能濃度まで希釈するか、またはＨＰＬＣ（システムＢ）精製を行い、未標識化出発物質および放射性不純物を除去して、試験した。精製した後、有機溶媒を減圧下に除去し、試料を０.１Ｍ リン酸緩衝液（pＨ ７.４）約５mlに再溶解して、６−９ＭＢq／mlの作業濃度を与えた。放射化学的純度を評価した後、以下に記載する薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）システムにより使用した：
ｉ）０.９％ ｗ／ｖ 生理食塩水で溶出するＩＴＬＣ ＳＧ ２cm×２０cm；
ii）５０：５０ ｖ／ｖのアセトニトリル：Ｈ２Ｏで溶出するＷhatman Ｎo.１  ２cm×２０cm。
【００６２】
標識化基質は、ＴＬＣシステム（ｉ）における起点またはその付近に残留して、システム（ii）における溶媒先端付近まで移動する。適当な検出装置により分析する場合、放射化学的純度は、典型的には、８５％以上の標識化化合物である。
【００６３】
実施例１２：化合物４のＴc−９９ｍ標識化
水に溶解した化合物（１mg／ml）の０.１mlのアリコートを、水に溶解したトリシン（０.５ml、３７.５mg）および水に溶解したホスフィンダイントリス（ベンゼンスルホン酸）トリス ナトリウム塩（０.１ml、１０mg）と一緒に、窒素を充填した１０mlのガラスバイアルに移した。この溶液に、テクネチウムジェネレーター溶出液（１ml、約０.４ＧＢq）、次いで、０.１Ｍ ＨＣl中の塩化スズの溶液（０.０２ml、約２μg）を加えた。標識化pＨは、４.５−５.５であった。バイアルを６０℃で３０分間インキュベートして、標識化を成し遂げた。精製および放射化学的純度の評価を実施例１０のように行った。
【００６４】
実施例１３：インビトロでの血漿安定性
一部の化合物（５０μl、１０ＭＢq／ml）に、等量の血漿（ラットもしくはヒト）または生理食塩水を加えた。その混合物を３７℃でインキュベートして、安定性をＨＰＬＣ（システムＣ）により０、３０、および１２０分の時点で測定した。生理食塩水希釈は、対照として作用した。
【００６５】
【表３】
2006137751.tif 000007
【００６６】
実施例１４：ＨＰＬＣシステム
流速：全てのシステムにおいて、１ml／分。
【００６７】
システムＡ
カラム：      Ｗaters Ｃ１８ ２５０×４.５mm。粒径 ４ミクロン。
グラジエント：溶離プロフィール ２５分で１０−６０％ Ｂ。
溶離液Ａ：    ０.１％ 水性ＴＦＡ。
溶離液Ｂ：    アセトニトリル中の０.１％ ＴＦＡ。
【００６８】
システムＢ
カラム：      Ｗaters Ｃ１８ １５０×３.９mm。粒径 ４ミクロン。
グラジエント：溶離プロフィール ２２分で０−１００％ Ｂ。
溶離液Ａ：    ０.１％ 水性ＴＦＡ。
溶離液Ｂ：    アセトニトリル中の０.１％ ＴＦＡ。
【００６９】
システムＣ
カラム：      Ｗaters Ｃ１８ １５０×３.９mm。粒径 ４ミクロン。
グラジエント：溶離プロフィール ２０分で０−１００％ Ｂ。
溶離液Ａ：    ５０mＭ ＮＨ４ＯＡc緩衝液（pＨ ５.６）。
溶離液Ｂ：    アセトニトリル。
【００７０】
システムＤ
カラム：      Ｈamilton ＰＲＰ−１、３０５mm×７.０mm。
グラジエント：溶離プロフィール １０分で０−６５％ Ｂ。
溶離液Ａ：    ５％ 水性アンモニア。
溶離液Ｂ：    アセトニトリル。
【００７１】
システムＥ
カラム：      Ｈamilton ＰＲＰ−１、１５０mm×４.１mm。
グラジエント：溶離プロフィール １５分で０−１００％ Ｂ。
溶離液Ａ：    ５％ 水性アンモニア。
溶離液Ｂ：    アセトニトリル。
【００７２】
システムＦ
カラム：      Ｐolymer Ｌaboratories ＰＬＲＰ−Ｓ、１５０mm×２.５mm。
グラジエント：溶離プロフィール １５分で０−１００％ Ｂ。
溶離液Ａ：    ５％ 水性アンモニア。
溶離液Ｂ：    アセトニトリル。
【００７３】
システムＧ
カラム：      Ｈamilton ＰＲＰ−１、１５０mm×４.１mm。
グラジエント：溶離プロフィール １５分で０−１００％ Ｂ。
溶離液Ａ：    ０.１％ 水性ＴＦＡ。
溶離液Ｂ：    アセトニトリル中の０.１％ ＴＦＡ。
【００７４】
実施例１５：ヒト血漿クロットへの取込み
フィブリンへの放射能標識化基質の取込みをインビトロでのヒト血漿クロットの導入により以下の方法で研究した。５mlのシリコン化ガラスバイアルに、（ａ）塩化カルシウム（５０mＭ トリス、１５０mＭ 塩化ナトリウム、４mＭ 塩化カルシウム）を含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝化生理食塩水（pＨ ７.５）８００μl、（ｂ）１mlあたり１００単位のトロンビンを含む生理的塩類溶液約４０μl、（ｃ）典型的には、１０kＢq／mlの濃度で放射能標識化基質を含むヒト血漿約４００μlを加えた。クロットの導入を補助するために、粗いガラスロッドを反応バイアルに加えた。トロンビンおよび塩化カルシウムを省略するが、対照バイアルを同様に調製した。
【００７５】
試験溶液を周囲実験室温度（約２０℃）で６０分間インキュベーションした後、反応を３３.５mＭ エチレンジアミン四酢酸 二ナトリウム塩の冷溶液約４００μlの添加で停止させた。（０.１％ Ｔween ２０を含む１.５％ ＢＳＡ／トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン緩衝化生理食塩水（pＨ ７.５）に予め浸漬しておいた）０.４５μＭ ニトロセルロースフィルター上への減圧濾過により、クロットを血清から分離し、Ｔween ２０を含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝化生理食塩水（pＨ ７.５）約２×１０mlで洗浄して、最終濃度を０.１％ ｖ／ｖとした。適当な検出装置において計数することにより、全放射能の割合を計算した。
【００７６】
フィルター上に保持された放射能の画分は、非特異的な結合の控除を対照から測定した後、濾過したクロットへの取込みの測定となる。
【００７７】
【表４】
2006137751.tif 000008
＊ 血漿クロットアッセイにおいて保持された％（トロンビン有り）−血漿クロットアッセイにおいて保持された％（トロンビン無し）。
【００７８】
【表５】
2006137751.tif 000009
＊ 血漿クロットアッセイにおいて保持された％（トロンビン有り）−血漿クロットアッセイにおいて保持された％（トロンビン無し）。
【００７９】
実施例１６：正常なラットの体内分布
クロットイメージの解析は、放射性医薬品の取込み速度とその血中／組織クリアランス速度との組み合わせに依存する。この理由から、幾つかの化合物の体内分布がラットにおいて測定されている。雄のＷistar（１００−１５０ｇ）ラットに放射能標識化トレーサー溶液（８ＭＢq／ml）０.１−０.２mlを静脈内注射して、注射した後の様々な時点で解剖した。選択された各々の組織における％ＩＤを測定した。尿および糞便中に排泄された％ＩＤを測定することができるよう、何匹かの動物を代謝ケージに閉じ込めた。薬剤に関して使用した解剖時間は、１５、３０、６０、２４０分であった。データを％ＩＤの平均（ｎ＝３）として示す。
【００８０】
９９ｍＴc−化合物３
【００８１】
【表６】
2006137751.tif 000010
【００８２】
実施例１７：ラットモデルにおいて誘発したクロットへの取込み
ラット下大静脈（ＩＶＣ）モデル
ラット（雄のＷistar、２５０−３５０ｇ）を１５％ウレタンで麻酔にかけた。開腹した後、大静脈を単離して、周囲の脂肪組織を取り除いた。白金ワイヤー（１.５cm×０.５mm）を下大静脈に挿入して、手術してから５分後、前もってカニューレを挿入しておいた大腿静脈を通して、エラグ酸（１.２×１０−４Ｍ）０.４mlを静脈内注射して、クロットを形成させた。このモデルにおいて形成されたクロットの平均重量は、約２７mg、ｎ＝３２（５−５０mgの範囲）であった。導入後５分（新しいクロット）および６０分（古いクロット）で、化合物を注射した。６０分後、動物を犠牲として、クロットを取り除き、重量を測って、計算した。他の組織、例えば、血液、肺、心臓もまた解剖して、計算した。クロットへのトレーサーの取込みを相対濃度（用量／ｇ 動物によるクロットのcpm／ｇ）およびクロット対バックグラウンド組織として測定した。
【００８３】
結果：
新しいクロット
【００８４】
【表７】
2006137751.tif 000011
【００８５】
【表８】
2006137751.tif 000012
【００８６】
【数１】
2006137751.tif 000013
【００８７】
古いクロット
【００８８】
【表９】
2006137751.tif 000014
【００８９】
【表１０】
2006137751.tif 000015
【００９０】
実施例１８：ラットモデルにおいて誘発したクロットのイメージング
これらの実験に関しては、白金ワイヤーを頚静脈に配置したことを除き、クロットを雄のＷistarラット（２５０−３５０ｇ）において実施例１７に記載したように誘発した。注射してから６０分後に化合物を注射して、注射してから１５−１８０分後の間に二次元イメージを得た。これらの実験に関しては、Ｐark 医用 Ｉsocam Ｉ γカメラを使用し、ＬＥＵＨＲまたはＬＥＰＨ コリメーターを使用して、胸郭の３００Ｋまたは１５０Ｋの計数を集めた。注射してから１５分後より、クロットを視覚化した。化合物の迅速なクリアランスにより、注射してから１８０分後の時点で、最も高いクロット対バックグラウンドの比率に達した。
【００９１】
略語
Ａc                 アセチル。
Ｂoc                tert−ブチルオキシカルボニル。
Ｃmpd               化合物。
ＤＭＦ              ジメチルホルムアミド。
ＥＳ                エレクトロスプレー。
ＦＡＢ              高速原子衝撃。
Ｆmoc               フルオレニルメトキシカルボニル。
ＨＰＬＣ            高性能液体クロマトグラフィー。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  基質補助レーザー脱離イオン化 − 飛行時間。
Ｎal                ナフチルアラニン。
ＲＣＰ              放射化学的純度。
ＲＰ−ＨＰＬＣ      逆相高性能液体クロマトグラフィー。
ＴＦＡ              トリフルオロ酢酸。
ＴＬＣ              薄層クロマトグラフィー。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】ラット頚静脈クロットモデルにおいて、注射してから１５分後、３０分後、６０分後、および１８０分後にＬＥＵＨＲ コリメーターで得られた９９ｍＴc−化合物５でのイメージング。
【図２】ラット頚静脈クロットモデルにおいて、注射してから１８０分後にＬＥＰＨ コリメーターで得られた９９ｍＴc−化合物５でのイメージング。
【図１】
2006137751.tif 000016
【図２】
2006137751.tif 000017