(57)【要約】【課題】  金属イオンなどの補因子が結合しているタンパク質から、効率的にアポタンパク質の生成と濃縮とを行うことができるアポタンパク質の製造方法を提供する。【解決手段】  酸性条件下で解離する補因子が結合しているタンパク質を含有する液を限外濾過膜で濃縮するに際して、該タンパク質含有液に酸を添加し、解離した補因子を酸と共に膜透過させ分離除去することにより、アポタンパク質の生成と濃縮とを同時に行う。【選択図】  図１。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性条件下で解離する補因子が結合しているタンパク質を含有する液を限外濾過膜で濃縮するに際して、該タンパク質含有液に酸を添加し、解離した補因子を酸と共に膜透過させ分離除去することにより、アポタンパク質の生成と濃縮とを同時に行うことを特徴とするアポタンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記タンパク質がラクトフェリンであり、補因子が金属イオンである請求項１記載のアポタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸性条件下で解離する補因子が結合しているタンパク質からアポタンパク質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトフェリンは、分子量約８０，０００の鉄結合性の糖タンパク質であり、１分子中に２個の鉄が結合している。ラクトフェリンは、多くの哺乳動物の体液中、例えば、乳汁中に存在する。特に、母乳の初乳には、５〜１０ｇ／Ｌ含まれ、含有されている全タンパク質の３０％〜７０％を占めることが知られている。ラクトフェリンは、乳児の健康維持および発育に重要なタンパク質であると共に、近年、抗菌作用および抗バクテリア作用を有するラクトフェリンは、一般に、初乳、常乳、チーズホエイ（チーズ製造時に生じる残漆）などから抽出される（例えば、非特許文献１および２）。
【０００３】
例えば、非特許文献１には、ラクトフェリンがカチオン性である性質を利用して、ホエーをカチオン交換樹脂と接触させてカチオン交換樹脂にラクトフェリンを吸着させ、この樹脂を高濃度塩類溶液で洗浄してラクトフェリンを脱離させ、次いでこのラクトフェリンを含む脱離液を限外濾過により脱塩して、ラクトフェリン濃縮物を得る方法が記載されている。その他、ラクトフェリン濃縮物を得る方法として、陽イオン交換性セルロース膜を用いた単純拡散法（非特許文献３）や電気泳動による分離法（非特許文献３）、アフィニティークロマトグラフによる分離方法（非特許文献４）、キャピラリー電気泳動による分離方法（非特許文献６）などが知られている。
【０００４】
抽出されたラクトフェリンには、一般的に２０〜４０％の鉄が結合している。この鉄を除去したアポラクトフェリンは、静菌作用が向上することが知られている。これは、微生物が生育に必要とする鉄分がアポラクトフェリンのキレート作用で奪われる為に、その増殖が制限され、従ってその生育に際して鉄分を必要とする微生物に対して静菌作用が有効に発現するものと考えられる。
【非特許文献１】富田守、眼CNews21、1998年、247頁
【非特許文献２】富田守、Foods  Food  Ingredients  J.  Jpn,  181巻、1999年、33q41頁
【非特許文献３】Clovis  X.  ChiuおよびMark  R.  Etzel,  Journal  of  Food  Science、62巻、5号、1997年、996−1001頁
【非特許文献４】Hurly  WLら、J  Dairy  Sci、76巻、1993年、377頁
【非特許文献５】M.  K.  WalshおよびS.H.  Nam、Prep.  Biochem.  Biotechnol.  31巻、3号、2001年、229−240頁
【非特許文献６】Peter  Riechelら、Journal  of  Chromatography  A、817巻、1998年、187−193頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アポラクトフェリンは、一般にバッチ法で製造され、例えば、ホエーなどから抽出されたラクトフェリン含有液に、塩酸やクエン酸などの酸を添加してＰＨを２程度に調整し、鉄分を解離させることによりアポラクトフェリンが製造されている。しかし、解離した鉄とアポラクトフェリンが共存しているかぎり、ラクトフェリンの抽出段階で再結合する為、効率的にアポラクトフェリンを得ることが難しかった。また、添加した酸を構成するアニオンが不純物となりアポラクトフェリンの精製に障害となりうる。他の方法として、クエン酸溶液に対してラクトフェリンの透析を行う方法やエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤と接触させる方法などあるが、いずれも効率的なアポラクトフェリンの製造方法とはいえない。
【０００６】
従って、本発明の目的は、金属イオンなどの補因子が結合しているタンパク質から、効率的にアポタンパク質の生成と濃縮とを行うことができるアポタンパク質の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の技術課題を解決するべく鋭意研究した結果、酸性条件下で解離する補因子が結合しているタンパク質を限外濾過膜で濃縮する工程で酸を添加することにより、上記目的を達成できること見出し、本発明を提供するに到った。
【０００８】
本発明によれば、酸性条件下で解離する補因子が結合しているタンパク質を含有する液を限外濾過膜で濃縮するに際して、該タンパク質含有液に酸を添加し、解離した補因子を酸と共に膜透過させ分離除去することにより、アポタンパク質の生成と濃縮とを同時に行うことを特徴とするアポタンパク質の製造方法が提供される。
【０００９】
本発明の製造方法においては、前記タンパク質がラクトフェリンであり、補因子が金属イオンであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、酸を添加することによりタンパク質から補因子が分離されてアポタンパク質が生成するが、分離した補因子は、酸と共に、限外濾過膜を透過して連続的に分離除去されるため、生成したアポタンパク質と補因子との再結合が有効に抑制され、効率よく、アポタンパク質を製造することができる。また、同時に生成したアポラクトフェリンを濃縮することができ、アポラクトフェリンの製造プロセスを簡素化できる。
【００１１】
本発明において、限外濾過膜による濃縮工程中に酸添加することが重要であり、酸添加工程と限外濾過膜による濃縮工程が完全に分離独立していると期待される効果は得られない。例えば、予め酸添加して補因子が解離しアポタンパク質と共存する溶液を限外濾過膜で濃縮する場合、濃縮過程においてアポタンパク質と補因子が再結合する為、効率的にアポタンパク質を得ることができず、補因子を有するタンパク質との混合物となってしまう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（補因子を有するタンパク質）
本発明において、アポタンパク質の製造原料として用いる補因子を有するタンパク質とは、酸性条件下で補因子を解離する性質を有するタンパク質（酵素を含む）であり、例えば、ヘム類、アミラーゼ類、ヘキソキナーゼ類、金属プロテアーゼ類等を例示することができる。更に具体的には、ラクトフェリン、トランスフェリン、フェリチン、卵由来タンパク鉄、ヘモグロビン、ミオグロビン、シトクロームなどが挙げられる。また、補因子としては、補欠分子族、補酵素、金属イオンが挙げられ、補欠分子族としては、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ヘム、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）など、補酵素としては、チアミン２リン酸、ピリドキサルリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンアイヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、補酵素Ａ  （ＣｏＡ）など、金属イオンとしては、鉄、銅、マンガン、亜鉛、コバルト、バナジウム、カルシウムなどが挙げられる。
尚、ラクトフェリンの場合、鉄が一般的である。
【００１３】
（分離対象液）
本発明の出発原料である限外濾過に供される分離対象液は、前記酸性条件下で解離する補因子を有するタンパク質を含有する溶液であれば、特に制限されないが、該タンパク質より分子量の大きな物質を含まないほうが好ましい。無機塩や該タンパク質より分子量の低い物質は、該分離対象液に含まれていても、限外濾過膜で除去可能である。また、該分離対象液の取得方法は、特に限定されない。取得方法として、例えば、ラクトフェリン場合、ホエーからカチオン交換樹脂で吸着させ高濃度塩類溶液で脱離させる方法、電気泳動による分離法、アフィニティークロマトグラフによる分離法などによる方法が挙げられる。
【００１４】
（酸）
本発明において用いられる酸は、補因子を解離し、限外濾過で補因子と共に膜透過して除去されるものであれば特に制限されないが、好適には、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、炭酸などの無機酸や酢酸、安息香酸、クエン酸などの有機酸が挙げられる。分離対象液に添加する酸の濃度も特に制限されないが、高濃度の酸水溶液を添加するとタンパク質の変性が生じ、また、低濃度の酸水溶液を添加すると、効率的に所望の酸性条件下にすることが困難となるおそれがあるため、酸濃度は、０．００１〜１０ｍｏｌ／Ｌ、特に０．０１〜５ｍｏｌ／Ｌの範囲であることが好ましい。また、酸の添加量は、対象となるタンパク質に依存し、該タンパク質が補因子を解離するＰＨ領域まで添加すればよい。
【００１５】
（限外濾過装置）
本発明において、限外濾過に用いる装置は、特に制限されず、一般に市販されている装置が用いられる。例えば、図１に示すように、分離対象液用のタンク１１、液供給用のポンプ１２、限外濾過膜を備えた限外濾過モジュール１３を備え、さらに、図示されていないが、透過液１４用のタンクを備えた構造のものが一般的に使用され、これらの各部材は、所定の配管で接続され、さらにバルブ、流量計や圧力計などの計測器、架台および配電盤などが設けられ、必要に応じて、膜洗浄などに要する付帯要素が付加される。
【００１６】
限外濾過モジュールに使用される限外濾過膜は、特に制限されず、分離対象となるタンパク質の分子量、構造により、適宜選択できる。分画分子量としては、限外濾過膜として一般的な３０００〜１０００００のものが使用できるが、分画分子量が小さいものは濾過に時間がかかり、分画分子量の大きなものはタンパク質のロスがあり適さない。例えば、分子量約８００００のラクトフェリンからアポラクトフェリンの濃縮液を得るためには、分画分子量５０００〜８００００のものが選択される。
【００１７】
限外濾過膜の素材としては、例えば、酢酸セルロース、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリルアミド、ポリイミド、芳香族ポリアミド、ポリアクリロニトリル、親水性ポリオレフィンなどの天然もしくは合成ポリマーの有機膜やアルミナ、ジルコニア、チタンなどセラミックの無機膜などが挙げられる。
【００１８】
膜の形式としては、中空糸モジュール型、平板型モジュール型、平膜型のものが挙げられるが、濾過速度の点から中空糸モジュール型が、好適に選択される。
【００１９】
（限外濾過運転方法）
本発明における限外濾過の運転方法は、限外濾過工程において酸を添加して対象タンパク質を濃縮しうる方法であればよいが、好適には、バッチ式による循環処理方式が選択される。酸の添加方法には、バッチ式と連続式が挙げられるが、分離目的、処理量、分離対象液性状等によって適宜決めればよい。
【００２０】
例えば、バッチ式で酸を添加する場合には、タンク１１に供給された分離対象液に酸２１を添加し、限外濾過膜（限外濾過モジュール１３）に供給し、透過液１４は系外に取り出し、分離対象液が所定の目標とする液量、アポタンパク質濃度になるまで循環する。このようにして限外濾過で減容し、生成したアポタンパク質の濃縮液に再び酸２１を添加して、更に限外濾過を行い、目標とするアポタンパク質濃度、分離率になるまで該操作を繰返し行う。
【００２１】
また、連続的に酸を添加する場合には、分離対象液を限外濾過膜（限外濾過モジュール）に供給し、タンパク質を含む非透過液をタンクに戻して循環させながら、酸２１を定量的に例えばタンク１１などの循環ラインに添加する。酸添加量は、濃縮という観点からも透過液量よりも少なくすべきである。
【００２２】
前記方法によれば、何れの方法においても酸２１を添加することにより補因子が解離し、酸と共に限外濾過膜を透過し系外へ分離除去されるため、限外濾過膜を透過しないアポタンパク質が効率的に濃縮される。
【００２３】
限外濾過の温度は、通常、５〜７０℃、好ましくは、２０〜５０℃の範囲が好適である。それより高い温度では、タンパク質が変性しやすく好ましくない。また、温度が低すぎると、膜透過量が減少し濃縮効率が低下する為好ましくない。
【００２４】
得られた濃縮液中には、アポタンパク質と酸が共存する為、水などの適当な溶媒を添加して限外濾過を行い、更に酸を除去することもできる。
こうして得られたアポタンパク質溶液から必要に応じてエバポレータ等の濃縮機や冷凍真空乾燥機、噴霧乾燥機などを用いて溶媒を除去することにより、アポタンパク質が得られる。
【実施例】
【００２５】
本発明を更に具体的に説明するために下記に実施例を掲げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
（実施例１）
限外濾過装置は、旭化成ケミカルズ（株）社製のペンシル型モジュール用小型実験装置（ＰＳ−２４００１型）に、同社製のＵＦモジュールであるＡＣＰ−００１３（中空糸モジュール：膜内径０．８ｍｍ、有効膜面積１７０ｃｍ２、膜素材：ポリアクリロニトリル、公称分画分子量：１３，０００）を組み込み、実験に供した。
【００２７】
１００ｍｇ／ｍＬのホロラクトフェリン（１００％鉄結合）水溶液１０００ｍＬを室温中、操作開始圧力をモジュール出口圧で５０ＫＰａに設定し限外濾過して、溶液量が５００ｍＬまで濃縮・減容した。次いで、０．０５ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液を溶液体積が１０００ｍＬになるまで添加した後、限外濾過を行い、溶液量を５００ｍＬまで濃縮・減容した。更に同操作を行った後、０．０５ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液を容積体積が１０００ｍＬになるまで添加して、限外濾過を行い、溶液量を２５０ｍＬまで濃縮・減容した。また、ラクトフェリンの鉄脱離度は、濃縮液を採取し、ラクトフェリンに結合した鉄量を４７０ｎｍの吸光度で測定した。得られた溶液は、濃縮倍率約４倍、ラクトフェリンの鉄脱離度は、７４％であった。
【００２８】
（実施例２）
１００ｍｇ／ｍＬのホロラクトフェリン（１００％鉄結合）水溶液１０００ｍＬを室温中、操作開始圧力をモジュール出口圧で５０ＫＰａに設定し、供給液タンクに０．０５ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液を６ｍＬ／ｍｉｎで連続して添加しながら、限外濾過を３時間、行った。その結果、溶液体積は、２８０ｍＬとなった。また、ラクトフェリンの鉄脱離度は、濃縮液を採取し、ラクトフェリンに結合した鉄量を４７０ｎｍの吸光度で測定した。得られた溶液は、濃縮倍率約３．６倍、ラクトフェリンの鉄脱離度は、６８％であった。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明に用いられる限外濾過装置の概略構造を示す図。
【符号の説明】
【００３０】
１１：分離対象液タンク
１２：液供給ポンプ
１３：限外濾過膜モジュール
１４：透過液
１５：非透過液（濃縮液）
２１：酸
【図１】
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