(57)【要約】【課題】本発明は遺伝子を導入された実験動物個体の識別等を簡易且つ迅速に行うことを可能とする可搬性に優れた生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具及び生体内蛍光蛋白質観察セットを提供する。【解決手段】生体内に蛍光蛋白質をコードする遺伝子が導入された実験動物に励起光を照射し、前記蛍光蛋白質の蛍光を観察する生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具であって、一端有底状の円筒形の本体部と、前記本体部の他端に配されるとともに、励起光を照射する発光ダイオードと、前記発光ダイオードが照射する励起光の波長を所望する波長帯域内に帯域制限するフィルタからなることを特徴とする。【選択図】  図２
2006189309.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内に蛍光蛋白質をコードする遺伝子が導入された実験動物に励起光を照射し、前記蛍光蛋白質の蛍光を観察する生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具であって、一端有底状の円筒形の本体部と、前記本体部の他端に配されるとともに、励起光を照射する発光ダイオードと、前記発光ダイオードが照射する励起光の波長を所望する波長帯域内に帯域制限するフィルタからなることを特徴とする生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具。
【請求項２】
生体内に蛍光蛋白質をコードする遺伝子が導入された実験動物に励起光を照射し、前記蛍光蛋白質の蛍光を観察する生体内蛍光蛋白質観察セットであって、請求項１記載の生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具と、前記蛍光蛋白質の蛍光から所定波長域の蛍光を抽出する蛍光フィルタとからなることを特徴とする生体内蛍光蛋白質観察セット。
【請求項３】
前記生体内蛍光蛋白質観察セットが、更に、前記生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具を保持する保持具を有し、前記保持具は、前記保持具自体を支持する土台部と、前記生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具の前記本体部を挟持する挟持部と、前記土台部と前記挟持部を接続する所定長を有する可撓性の接続部からなることを特徴とする請求項２記載の生体内蛍光蛋白質観察セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具及び生体内蛍光蛋白質観察セットに関し、より詳しくは、実験動物等の生体内に導入される蛍光蛋白質に対して励起光を照射し、効果的に蛍光観察を行うことを可能とする生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具及び生体内蛍光蛋白質観察セットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現検出方法として、ＧＦＰ遺伝子（ＧＦＰ:Green Fluoresce-nt Protein）に代表される生細胞に由来する蛍光性蛋白質の遺伝子を生細胞に導入し、観察対象である導入細胞に励起光を照射し、その蛍光発光を観察する方法がある。
【０００３】
蛍光性蛋白質の検出に励起光として使用される光源として、ハロゲンランプ、キセノンランプ、水銀ランプ等が例示されるが、これらの励起用光源では光源が放射する光の波長帯域が赤外光から紫外光に至るまで広範に広がっている為、蛍光性蛋白質への励起光の照射を目的として励起に必要な波長のみを透過するフィルタで波長帯域を制限した場合、非常に弱い励起光しか得ることができず、蛍光発光としてフィルタを通して観察する程度の光量しか得られなかった。
【０００４】
そこで前記課題を解決すべく特許文献１に開示されるような発光ダイオードを光源とする励起光照射装置の発明が創出された。
特許文献１に開示される発明は励起光を照射する光源に発光ダイオードを利用することによる励起光照射装置でフィルタにより波長帯域を制限した場合でも蛍光性蛋白質への励起光として充分な光量を提供するものであった。
【０００５】
しかしながら、特許文献１に開示される励起光照射装置は植物細胞を対象とした励起光照射装置である為、励起光照射範囲については顕微鏡レベルの視野に照射することができる程度で広範囲な励起光の照射は困難であった。
更に特許文献１に開示される励起光照射装置を備えていない実験区域内における実験動物中の蛍光蛋白質の観察は困難であるといった問題もあった。
【０００６】
その為、特許文献１に開示される励起光照射装置は今後のバイオテクノロジーの発展にとって重要な対象となる遺伝子を導入された実験動物を対象とし、実験動物個体の識別、遺伝子を導入された実験動物個体における導入遺伝子発現特性の検証等を簡易且つ迅速に行うことには適さなかった。
【０００７】
以上より、遺伝子を導入された実験動物個体の識別、遺伝子を導入された実験動物個体における導入遺伝子発現特性の検証等を簡易且つ迅速に行うことを可能とする励起光照射器具、即ち、広い励起光照射範囲を有しつつ、フィルタにより波長帯域を制限した場合でも蛍光性蛋白質への励起光として充分な光量を提供し、且つ可搬性にも優れた励起光照射器具の創出が強く望まれていた。
【０００８】
【特許文献１】特許第３４８２４４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は遺伝子を導入された実験動物個体の識別等を簡易且つ迅速に行うことを可能とする可搬性に優れた生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具及び生体内蛍光蛋白質観察セットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
即ち、請求項１は、生体内に蛍光蛋白質をコードする遺伝子が導入された実験動物に励起光を照射し、前記蛍光蛋白質の蛍光を観察する生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具であって、一端有底状の円筒形の本体部と、前記本体部の他端に配されるとともに、励起光を照射する発光ダイオードと、前記発光ダイオードが照射する励起光の波長を所望する波長帯域内に帯域制限するフィルタからなることを特徴とする生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具に関する。
請求項２は、生体内に蛍光蛋白質をコードする遺伝子が導入された実験動物に励起光を照射し、前記蛍光蛋白質の蛍光を観察する生体内蛍光蛋白質観察セットであって、請求項１記載の生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具と、前記蛍光蛋白質の蛍光から所定波長域の蛍光を抽出する蛍光フィルタとからなることを特徴とする生体内蛍光蛋白質観察セットに関する。
請求項３は、前記生体内蛍光蛋白質観察セットが、更に、前記生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具を保持する保持具を有し、前記保持具は、前記保持具自体を支持する土台部と、前記生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具の前記本体部を挟持する挟持部と、前記土台部と前記挟持部を接続する所定長を有する可撓性の接続部からなることを特徴とする請求項２記載の生体内蛍光蛋白質観察セットに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明による生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具及び生体内蛍光蛋白質観察セットにより、遺伝子を導入された実験動物個体の識別、該実験動物個体における導入遺伝子発現特性の検証等を簡易且つ迅速に行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は励起光の照射により蛍光を発する蛋白質、例えばオワンクラゲの蛍光蛋白ＧＦＰ（green fluorescent protein）、ＥＧＦＰ（Enhanced GFP）等をコードする遺伝子を導入した実験動物（Ａ）に対して、励起用光源（Ｂ）から励起光を照射し、実験動物（Ａ）からの蛍光を観察する生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具及び生体内蛍光蛋白質観察セットに関するものである。
【００１３】
本発明が対象とする蛍光蛋白質は上記するＧＦＰ、ＥＧＦＰに限られず、イソギンチャク近縁種Discosona striata由来の蛍光蛋白（ＲＦＰ:Red Fluorescent Protein）の改変型ＤｓＲｅｄや造礁サンゴ由来のＨｃＲｅｄ等にも適用可能である。
【００１４】
本発明が対象とする実験動物は通常の実験動物であれば得に限定されるものではないが、例えば実験動物がマウスである場合、励起光を妨げる原因となる体毛などが比較的少ない若齢マウスであることが望ましく、体毛を欠くヌードマウスであればさらに望ましい。
実験動物はマウス、ラット、ウサギ等の哺乳動物に限られるものではなく、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、蚕、ショウジョウバエ等にも使用可能である。
本発明を使用して観察が行われる場合には、励起光を妨げる原因となる物質の少ない目などの臓器や比較的体毛の少ない箇所を観察する部位とすることで効果的に観察を行うことができる。
【００１５】
本発明に係る生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具（１）は図２で示される如く本体部（１１）、発光ダイオード（１２）とフィルタ（１３）とからなる。
本体部（１１）は一端有底状の円筒形の形状を有している。
この本体部（１１）は開口部側に後述する発光ダイオード（１２）が配されてなる。
【００１６】
この本体部（１１）は第１本体部（１１１）と第２本体部（１１２）の２つの筒形状の部材から構成されてなる。
この第１本体部（１１１）は一端有底状であり、発光ダイオード（１２）の電源となる電池を収容する。
この第１本体部（１１１）が収容する電池は、特に限定されないが、単３型又は単４型電池を直列接続して収容することができる形状を有していることが好ましい。
このように単３型又は単４型電池を直列接続して収容することができることによって小型化を図るととともに、実験者がこの器具（１）を挟持し易くするためである。
この第１本体部（１１１）は上記の如く単３型又は単４型電池を直列接続して収容することができる内径を有しており、この第１本体部（１１１）の外径（ｄ１）は１５ｍｍ〜４０ｍｍであることによって上記効果を奏することができる。
尚、この第１本体部（１１１）の長軸方向長さは、特に限定されないが、単３型又は単４型電池が３乃至５個収容することができる長さが好ましい。
また、この第１本体部（１１１）の底部（１１３）は、この第１本体部（１１１）に着脱自在に設けられ、第１本体部（１１１）内部に収容される電池を交換する際には開放されることができる。
【００１７】
第２本体部（１１２）は第１本体部（１１１）に連通連結して配されるとともに、発光ダイオード（１２）とフィルタ（１３）を収容する。
この第２本体部（１１２）は発光ダイオード（１２）とフィルタ（１３）を収容する為、第１本体部（１１）の外径よりも僅かに長い外径を有している（図２参照）が特に限定されるものではない。
この第２本体部（１１２）の外径（ｄ２）はこの器具（１）を使用する簡便さからも３０ｍｍ〜５０ｍｍであることが好ましい。
尚、フィルタ（１３）は、発光ダイオード（１３）よりも外側に設けられている。
本体部（１１）の全長（ｄ３）は特に限定されないが１５０ｍｍ〜２００ｍｍになるように調整されている。
【００１８】
発光ダイオード（１２）は本体部（１１）の他端に配されるとともに励起光を照射する。
この発光ダイオード（１２）は観察対象となる蛍光蛋白質に応じて最適波長の励起光を照射するものに適宜変更して設定される。
本器具（１）の発光ダイオード（１２）は観察に使用する蛍光蛋白質に必要とされる励起光波長に近い波長に極大をもつ発光ダイオード素子であり、この発光ダイオード素子の選択により上述した様々な蛍光蛋白質を励起する波長に対応することができる。
例えば、ＥＧＦＰでは、前記発光ダイオードが４６５ｎｍから４７５ｎｍの波長範囲の光を照射する発光ダイオード素子である青色発光ダイオードを選択することが望ましい。
使用される発光ダイオード素子は一般市場で入手可能な青色発光ダイオードを採用することができ、例えばＬＸＨＬ−ＭＢ1Ｃ（米国Lumileds Lighting社）やＮＳＰＢ５００Ｓ−ＬＥＤ（日亜化学社製）などが例示できる。
【００１９】
この発光ダイオード（１２）は、図３で示される如く、複数の発光ダイオードを円形に配列して光量を増幅させることもできるし、１つの発光ダイオードを利用することもできる。
図３は本器具の正面図であり、（ａ）では、６つの発光ダイオードが使用（例えばＮＳＰＢ５００Ｓ−ＬＥＤの場合）され、（ｂ）では１つの発光ダイオードが使用（例えばＬＸＨＬ−ＭＢ1Ｃの場合）されている。
どちらの発光ダイオードを用いた場合でも、本発明の効果、即ち、遺伝子を導入された実験動物個体の識別、該実験動物個体における導入遺伝子発現特性の検証等を簡易且つ迅速に行うに充分な光量を提供することができる。
又、実体顕微鏡下で本装置を支持台に固定し実験動物に照射することで実体蛍光顕微鏡の蛍光装置としても使用できる。
特に（ｂ）の場合、低倍域ではそのままでも光量は充分であるが、高倍率では本器具に集光レンズを付加することにより、散光角度を狭め集光する事が出来、充分な光量を得られる。
【００２０】
発光ダイオード（１２）の指向角としては、８０°〜１２０°であることが、遺伝子を導入された実験動物個体の識別等を簡易且つ迅速に行うのに極めて好適である。
その理由は、発光ダイオード（１２）の指向角８０°以下であれば観察範囲が狭すぎる為、指向角１２０°以上であれば対象動物に好適な光量の励起光を照射できず、いずれの場合も好ましくないからである。
【００２１】
フィルタ（１３）は発光ダイオード（１２）が照射する励起光の波長を所望する波長帯域内に帯域制限する。
このフィルタ（１３）が行う波長の帯域制限は対象となる蛍光蛋白質によって適宜変更される。
このフィルタ（１３）はバンドパスフィルタを採用することができる。
このフィルタは、特に限定されるものではないが、ＥＧＦＰが対象である場合には、ＢＰＢ−４５（富士写真フィルム社）を利用することができる。
【００２２】
生体内蛍光蛋白質観察セットについて説明する。
【００２３】
本発明に係る生体内蛍光蛋白質観察セット（２）は上記する生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具（１）、蛍光フィルタ（１４）と保持具（１５）からなる。
この生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具（１）は上記で示す器具である。
蛍光フィルタ（１４）は、図１で示す如く、本器具（１）からの光の照射により生じる蛍光蛋白質の蛍光から所定波長域の蛍光を抽出する。
この蛍光フィルタ（１４）を設けることによって、蛍光像をより鮮明にすることができる。
この蛍光フィルタ（１４）は、シャープカットフィルタを採用することができ、例えば、ＳＣ‐５０（富士フィルム社製）を採用することができる。
この蛍光フィルタ（１４）は、どのような形態で使用しても構わないが、シャープカットフィルタとして簡易顕微鏡に配備することの他、遺伝子導入実験動物個体の識別等を簡易且つ迅速に行う解決課題に鑑みて、眼鏡様形態として利用することが例示される。
【００２４】
保持具（１５）は生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具（１）を保持する。
この保持具（１５）は図４で示される如く、土台部（１５１）、挟持部（１５２）と接続部（１５３）からなる。
土台部（１５１）はこの保持具（１５）自体を支持する土台であり、この形状は特に限定されるものではないが円盤形状のようなより安定性の高い形状を有していることが好ましい。
【００２５】
挟持部（１５２）は生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具（１）の本体部（１１）を挟持する。
この挟持部（１５２）は本体部（１１）の第１本体部（１１１）を挟持することができれば特に限定されるものではないが、一対の板状部材（１５４）を支点（１５５）を軸として回動するように設け、絶えずこの一対の板状部材（１５４）が当接するようにバネ等による付勢力を配しておくことが好ましい。
尚、この一対の板状部材（１５４）は、略く字状に湾曲して形成されており、この略く字状の中心空間部に本体部（１１１）が配されることになる。
【００２６】
図４はこの保持具の実施例を示す。
図４（ａ）は板状部材（１５４）が緩やかに湾曲する略く字状に形成され、図４（ｂ）は板状部材（１５４）が弧を描くように湾曲するように形成された様子を示している。
尚、これらの湾曲により形成される空間に本発明に係る生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具（１）の本体部（１１）が配置され、この板状部材（１５４）により挟持されることになる。
【００２７】
接続部（１５３）は、土台部（１５１）と挟持部（１５２）を接続する所定長を有している。この接続部（１５３）は、可撓性の形状を有しており、例えば、蛇腹に形成されている。
このように接続部（１５３）が可撓性に形成されることによって実験者が所望する角度で生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具（１）を固定できるからである。
【００２８】
以上より、本発明に係る生体内蛍光蛋白質観察セット（２）は、光源として生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具（１）を使用し、観察用光路に蛍光フィルタ（１４）を配備するとともに、前記保持具（１５）で生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具（１）を固定することにより、蛍光顕微鏡にも代替する簡易な生体内蛍光蛋白質観察器具として使用することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【００３０】
〔実施例１〕ＬＸＨＬ−ＭＢ1Ｃの場合
前記生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具は発光ダイオード素子の選択により、各種の蛍光蛋白質の検出に使用可能であるが、好ましい使用例としてはオワンクラゲより単離された蛍光蛋白ＧＦＰに由来する改変型ＧＦＰの励起波長である４８８ｎｍに近い発光特性を有する発光ダイオードを使用した。
【００３１】
使用した発光ダイオードはＬＸＨＬ−ＭＢ１Ｃ（米国Lumileds Lighting社）であり、市場で容易に入手可能である。
前記発光ダイオード素子は指向角１１０°、波長４７０ｎｍの発光特性を示す青色発光ダイオードである。
【００３２】
励起光の波長帯域を限定するバンドパスフィルタとしては、ＢＰＢ-４５（富士写真フィルム）を使用した。
実験動物からの蛍光をより鮮明に捕らえる為のシャープカットフィルタとしては、ＳＣ-５０（富士写真フィルム）を使用した。
【００３３】
使用した生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具は遺伝子を導入された実験動物個体の識別等を簡易且つ迅速に行うことを目的とする為、片手で握持できる簡便な構造であることを特徴とする。
仕様の詳細を以下に説明する。
【００３４】
前記器具の仕様として、全長１８５ｍｍ、最大径４０ｍｍ、グリップ径３０ｍｍ、材質はアルミ削り出しであり、使用する単４乾電池４本を含めた本器具の重量は約２５０ｇである。
【００３５】
蛍光蛋白質観察方法としては蛍光蛋白質ＥＧＦＰをコードする遺伝子を導入した実験動物を暗所に置き、前記器具を使用して実験動物に対し、励起光を照射した。
図５は、蛍光蛋白質ＥＧＦＰをコードする遺伝子が導入された実験動物（ラット）の脚先部（図中上部）と該遺伝子が導入されていない通常ラットの脚先部（図中下部）を比較した図である。
本発明に係る生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具を使用することにより、生体内に該蛍光蛋白質をコードする遺伝子が導入された実験動物からＥＧＦＰの蛍光発光を観察できた（図５）。
【００３６】
〔実施例２〕ＮＳＰＢ５００Ｓ
使用した発光ダイオードはＮＳＰＢ５００Ｓ−ＬＥＤであり、日亜化学より入手可能である。
前記発光ダイオード素子は、波長４６５〜４７５ｎｍの発光特性を示し、直径５ｍｍ、電圧３．６Ｖ、電流２０ｍＡ、指向特性１５度、レンズ色 無色透明である。
励起光の波長帯域を限定するバンドパスフィルタとしてＢＰＢ-４５（富士写真フィルム）、実験動物からの蛍光をより鮮明に捕らえる為のシャープカットフィルタとしてＳＣ-５０（富士写真フィルム）を使用した。
【００３７】
生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具の仕様として、全長１８８ｍｍ、最大径２８．６ｍｍ、グリップ径１８ｍｍ、材質はアルミ削り出しであり、使用する単３乾電池（ＬＲ‐６）３本を含めた本器具の重量は約１７０gであった。
【００３８】
蛍光蛋白質観察方法としては蛍光蛋白質ＥＧＦＰをコードする遺伝子を導入した実験動物を暗所に置き、前記器具を使用して実験動物に対し、励起光を照射した。
図６は、蛍光蛋白質ＥＧＦＰをコードする遺伝子が導入された実験動物（ラット）（図中下方写真）と該遺伝子が導入されていない通常ラット（図中上方写真）の眼球部を比較した図である。
本発明に係る生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具を使用することにより、生体内に該蛍光蛋白質をコードする遺伝子が導入された実験動物からＥＧＦＰの蛍光発光を観察できた（図６）。
【００３９】
以上より、本発明による生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具及び生体内蛍光蛋白質観察セットは、遺伝子を導入された実験動物個体の識別、該実験動物個体における導入遺伝子発現特性の検証等を行うのに極めて有効であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】実験実験動物等の生体内に導入される蛍光蛋白質に対して励起光を照射し、蛍光観察を行う方法を示す概念図である。
【図２】本発明に係る生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具の側面図である。
【図３】本発明に係る生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具の正面図である。
【図４】本発明に係る本発明に係る生体内蛍光蛋白質観察セットの保持具の実施例を示す。
【図５】本発明に係る生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具による蛍光照射画像である。
【図６】本発明に係る生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具による蛍光照射画像である。
【符号の説明】
【００４１】
１・・・・生体内蛍光蛋白質観察用励起光照射器具
１１・・・本体部
１２・・・発光ダイオード
１３・・・フィルタ
１４・・・蛍光フィルタ
１５・・・保持具
Ａ・・・・実験動物
Ｂ・・・・光源
【図１】
2006189309.tif 000003
【図２】
2006189309.tif 000004
【図３】
2006189309.tif 000005
【図４】
2006189309.tif 000006
【図５】
2006189309.tif 000007
【図６】
2006189309.tif 000008