(57)【要約】【課題】本発明の課題は、コスト的にも有利で、ハイスループットに蛋白質の結合ＤＮＡサイトをチップ上でスクリーニングする相互作用測定方法を提供することにある。【解決手段】蛋白質との相互作用できる核酸配列を測定する方法であって、蛋白質が相互作用できる配列を含む標的核酸配列から、遺伝子増幅法を用いて長さの異なる増幅産物を複数、別々に取得し、該増幅産物を同一の固体基板上に混じり合うことなくそれぞれ異なる位置に固定化し、該蛋白質との相互作用を観察することを特徴とする相互作用測定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって得られた核酸を固体基板上に固定化し、蛋白質との相互作用を観察することを特徴とする相互作用測定方法
【請求項２】
ＰＣＲに使われるプライマー二つのうち、一方のプライマーの末端が、表面固定化のための官能基を有していることを特徴とする請求項１記載の相互作用測定方法
【請求項３】
ＰＣＲに使われるプライマー二つのうち、一方の場所を変えて、長さの異なる複数のＰＣＲ産物を準備し、同一固体基板上に混じり合うことなくそれぞれ異なる位置に固定化し、蛋白質との相互作用を観察することを特徴とする請求項１、２記載の相互作用測定方法
【請求項４】
複数のＰＣＲ産物を同一固体基板上に混じり合うことなくそれぞれ異なる位置に固定化し、蛋白質との相互作用を観察することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の相互作用測定方法
【請求項５】
蛋白質との相互作用できる核酸配列を測定する方法であって、蛋白質が相互作用できる配列を含む標的核酸配列から、遺伝子増幅法を用いて長さの異なる増幅産物を複数、別々に取得し、該増幅産物を同一の固体基板上に混じり合うことなくそれぞれ異なる位置に固定化し、該蛋白質との相互作用を観察することを特徴とする相互作用測定方法
【請求項６】
遺伝子増幅法がＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）であることを特徴とする請求項５記載の相互作用測定方法
【請求項７】
固体基板が金属であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の相互作用測定方法
【請求項８】
固体基板が金であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の相互作用測定方法
【請求項９】
固体基板が金薄層に覆われたガラス基板であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の相互作用測定方法
【請求項１０】
相互作用を観察する方法が表面プラズモン共鳴法であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の相互作用測定方法
【請求項１１】
相互作用の測定対象となる蛋白質が転写因子であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の相互作用測定方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ産物を固定化し、蛋白質との相互作用を観察する方法に関しており、蛋白質が認識する核酸配列をスクリーニングする方法に適している。
【背景技術】
【０００２】
転写因子による遺伝子発現の制御は、生体内の恒常性維持のために欠かせないメカニズムである。これまでにも、多くの転写因子が発見され、機能や構造などの研究が行われている。転写因子がそれぞれ特異的なＤＮＡ配列に結合することから、その認識配列の同定が、転写因子研究の核となっている。
【０００３】
蛋白質が結合するＤＮＡ配列を探索する方法として、ゲルシフト法やフットプリント法が挙げられる。これらの方法は、ゲル電気泳動の泳動像により結合する範囲を決定する方法である。主に、転写因子の結合塩基配列を解析する方法であり、手順が比較的簡便で、転写因子研究には欠かせない手法である。
【０００４】
ゲルシフト法は、ＤＮＡに蛋白質が結合すると分子サイズがフリーのＤＮＡより大きくなり、電気泳動においてＤＮＡの移動度が低下することを利用した方法である。３２Ｐで標識したＤＮＡ断片と蛋白質を相互作用させた複合体を、非変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけると、フリーのＤＮＡ断片のバンドよりも移動度が小さいバンドとして検出される。ＤＮＡ断片は、短いほうが良く、２００ｂｐくらいまでが最適である。長すぎると、蛋白質の大きさによっては移動度に差が出ないことがある。塩基レベルでの配列決定を行うためには、多数のＤＮＡプローブが必要であり、多検体を同時に検討することが困難である。
【０００５】
フットプリント法は、ＤＮＡに一ヶ所ニックを入れるが、蛋白質が結合しているＤＮＡには作用しないというＤＮａｓｅＩの機能を用いた方法である。ゲルシフト法と同様に、あらかじめＤＮＡ鎖の一端に３２Ｐで末端標識したＤＮＡ断片と蛋白質を反応させておく。ＤＮａｓｅＩで軽く消化させて、電気泳動を行うと、ＤＮＡは末端標識から１塩基毎のラダ−状のバンドに泳動され、蛋白質の保護を受けた配列部分の泳動像が見えない。この泳動像の見えない部分が相互作用するＤＮＡ配列である。実際には、ＤＮａｓｅＩの立体特性により、認識配列より広い範囲の配列が保護されているようにみえる場合があり、完全な配列決定は困難である。
【０００６】
また、ｉｎ  ｖｉｖｏで、転写因子が相互作用している認識配列を決定する方法がある。クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩｐ）とよばれるこの方法は、まず、核内のＤＮＡ−蛋白質複合体を架橋させておいた後、ＤＮＡを断片化する。抗体を用いて、この複合体を沈降させる。ここから、ＤＮＡを回収し、分析する方法である。この方法は、実際、生体内で結合しているＤＮＡを抽出するため、正確な配列情報を得ることができる。しかし、その反面、手順が非常に煩雑であることが欠点である。
【０００７】
いずれの従来技術は、一度に検討できる検体数が限られているため、スループット性が低く、単一の方法では塩基レベルでの配列決定は困難である。
【０００８】
近年、スループットの高い解析方法として、「チップ技術」に注目が集まっており、技術の進展には目をみはるものがある。例えば、ＤＮＡアレイは、多検体の相互作用を網羅的に同時に測定することができるため、広く用いられている。一般に、ＤＮＡアレイは、特定のＤＮＡ配列をスクリーニングする目的で使用される。そのため、ＤＮＡアレイには、多種類の配列の一本鎖ＤＮＡがプローブとして固定化されている。このアレイに、一本鎖ＤＮＡなどの核酸を反応させて、スクリーニングを行い、配列決定を行う。
【０００９】
このＤＮＡアレイの技術を応用して、ＤＮＡ結合性蛋白質が結合するＤＮＡ配列を非常に効果的に探索することができると推測される。ただし、ＤＮＡ結合性蛋白質は、転写因子をはじめ、二本鎖ＤＮＡと相互作用するものが多いため、ＤＮＡアレイを蛋白質の結合配列の探索に応用するには、ＤＮＡアレイのプローブが二本鎖である必要がある。
【００１０】
そこで、合成オリゴＤＮＡをアニールし、二本鎖ＤＮＡにしておいてから、基板に固定化し、転写因子との相互作用を観察する技術が開発されている（非特許文献１）。ここでは、一方のオリゴＤＮＡの末端をチオール基とし、ＤＮＡを基板に共有結合で固定化している。もう一方のＤＮＡは、表面に固定化されたＤＮＡと相補的に水素結合で結合している。この方法では、合成オリゴの長さに限界（最大１００ｍｅｒ、通常は５０ｍｅｒ）があるため、仮に1ｋｂの範囲をスクリーニングするには、オーバーラップを考慮して、４０種類の二本鎖オリゴＤＮＡが必要となる。すなわち、８０種類のオリゴＤＮＡを合成する必要が生じる。末端が修飾されたオリゴは非常に高価であるため、スクリーニングに応用する場合、非常にコストのかかる研究となる。この方法は非常に、簡便であることから、ある程度認識配列が絞り込めている場合は、適当な方法であるが、コスト的にも最良の方法とはいえない。
【００１１】
理想的には、長いＤＮＡ鎖を固定化したアレイを用い、徐々に認識配列を絞り込んでいく方法がコスト的に有利である。長いＤＮＡ鎖を基板上に準備する方法として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって、特定の範囲のＤＮＡを複製して、基板に固定化する方法が考えられるが、未だこのような発明は全くなされていなかった。
【００１２】
固定化するＤＮＡにＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）技術を応用したものとして、一本鎖ＤＮＡチップ表面にプライマー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ溶液を接触させることにより、一本鎖ＤＮＡアレイから二本鎖ＤＮＡアレイを作成する方法が報告されている（特許文献１）。
【００１３】
また、アレイ上で二本鎖ＤＮＡを作成する別の方法も報告されている。まず、３´側を共通配列、５´側はそれぞれ異なる配列の一本鎖ＤＮＡをアレイ状に固定化する。このアレイに共通のプライマーをハイブリダイゼーションさせて、二本鎖ＤＮＡを合成していき、最終的に二本鎖ＤＮＡアレイを作成する方法が提案されている（特許文献２）。
【００１４】
いずれの方法も、一本鎖ＤＮＡを固定化し、アレイ上で、二本鎖ＤＮＡを形成させるものである。相補鎖を容易に準備できる点では、非常に優れた方法である。ここで、使われる一本鎖ＤＮＡは基本的に合成オリゴであるため、固定化される二本鎖ＤＮＡの長さはせいぜい１００ｍｅｒであり、スクリーニングに適しているとは言いがたい。結局、スクリーニングに応用するには、プローブ数を多く設定する必要があるため、固定化する一本鎖ＤＮＡを全て異なる配列にしなければならない。この場合、非常に多くのオリゴＤＮＡが必要となり、多額の費用がかかってしまい、実用的ではない。また、固定化溶液中でのＰＣＲとは異なり、一本鎖ＤＮＡを固定化しているため、自由度が下がり、産物量が少ない可能性もある。
【００１５】
このように、ハイスループットに蛋白質の結合ＤＮＡサイトをチップ上でスクリーニングする方法は、開発されていないのが現状である。
【００１６】
【特許文献１】特開２００１−１０８６７６
【特許文献２】米国特許６３２６４８９
【非特許文献１】Ｋｙｏら  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ、９（２００４）１５３−１６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の課題は、コスト的にも有利で、ハイスループットに蛋白質の結合ＤＮＡサイトをチップ上でスクリーニングする相互作用測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
１．ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって得られた核酸を固体基板上に固定化し、蛋白質との相互作用を観察することを特徴とする相互作用測定方法
２．ＰＣＲに使われるプライマー二つのうち、一方のプライマーの末端が、表面固定化のための官能基を有していることを特徴とする１の相互作用測定方法
３．ＰＣＲに使われるプライマー二つのうち、一方の場所を変えて、長さの異なる複数のＰＣＲ産物を準備し、同一固体基板上に混じり合うことなくそれぞれ異なる位置に固定化し、蛋白質との相互作用を観察することを特徴とする１、２の相互作用測定方法
４．複数のＰＣＲ産物を同一固体基板上に混じり合うことなくそれぞれ異なる位置に固定化し、蛋白質との相互作用を観察することを特徴とする１〜３のいずれかの相互作用測定方法
５．蛋白質との相互作用できる核酸配列を測定する方法であって、蛋白質が相互作用できる配列を含む標的核酸配列から、遺伝子増幅法を用いて長さの異なる増幅産物を複数、別々に取得し、該増幅産物を同一の固体基板上に混じり合うことなくそれぞれ異なる位置に固定化し、該蛋白質との相互作用を観察することを特徴とする相互作用測定方法
６．遺伝子増幅法がＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）であることを特徴とする５の相互作用測定方法
７．固体基板が金属であることを特徴とする１〜６のいずれかの相互作用測定方法
８．固体基板が金であることを特徴とする１〜７のいずれかの相互作用測定方法
９．固体基板が金薄層に覆われたガラス基板であることを特徴とする１〜８のいずれかの相互作用測定方法
１０．相互作用を観察する方法が表面プラズモン共鳴法であることを特徴とする１〜９のいずれかの相互作用測定方法
１１．相互作用の測定対象となる蛋白質が転写因子であることを特徴とする１〜１０のいずれかの相互作用測定方法
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、ＰＣＲで増幅した核酸分子を用いて、蛋白質が結合する塩基配列を探索することが可能となる。特に、転写因子の核酸結合部位を、チップを用いてハイスループットに同定できる、安価な方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、ＰＣＲで増幅して得られた核酸分子を固体基板上に固定化し、蛋白質との相互作用を観察する方法であり、蛋白質が結合する塩基配列を探索するのに適している。
【００２１】
本発明において、固体基板上に固定化される核酸分子は、ＰＣＲ法によって増幅して得られた核酸であることが好ましい。さらに、ＰＣＲ産物は二本鎖の核酸分子であることが好ましい。二本鎖であると、転写因子などのＤＮＡ結合性蛋白質との相互作用の解析が可能となるからである。二本鎖の核酸分子を形成する一方の核酸分子のみが、固体基板上に固定化されているのが好ましい。もう一方の核酸分子は、基板上に固定化した核酸分子と相補的にワトソン−クリック対を形成し、基板上に二本鎖の核酸分子が固定化されているのが好ましい。二本鎖を形成する核酸分子の両方が固体基板に固定化されていると、安定した二本鎖を形成できない可能性が生じるためである。固定化される核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡだけでなく、ＰＮＡ（ペプチド核酸）やＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）などの人工核酸、さらには、それらの誘導体を含む。
【００２２】
ＰＣＲ法でＤＮＡを増幅する場合、使用するＤＮＡポリメラーゼは、特に限定されるものではなく、ＴａｑやＫＯＤなどのＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。なかでも、ＫＯＤは、他のＤＮＡポリメラーゼより、高い正確性を有していると言われており、本発明に使用することができる。プライマー濃度、ポリメラーゼ濃度、テンプレートＤＮＡ濃度、ＰＣＲにおけるサイクル数、伸張温度、ＰＣＲ溶液の組成などは特に限定されるものではなく、一般的に推奨されている条件の範囲で選ぶことができる。
【００２３】
ＰＣＲで増幅する核酸分子の長さは、１００〜１２ｋｂｐであることが好ましい。１００ｂｐ以下の場合、ＰＣＲ法を用いるより、合成オリゴで二本鎖の核酸分子を作成したほうが簡便である。また、前述のＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、約１２ｋｂｐまでの増幅が確認されているため、その他のＤＮＡポリメラーゼを使用した場合も、ほぼ同程度の大きさを目安にして、ＰＣＲを実施することが好ましい。また、より詳細な塩基配列に絞り込むために、１００〜１ｋｂｐであればさらに好ましく、１００〜３００ｂｐであれば特に好ましい。
【００２４】
ＰＣＲに使われる一方のプライマー（センスプライマー）は、表面固定化のために官能基や結合グループが修飾されていることが好ましい。官能基や結合グループとしてはアミノ基、チオール基、ビオチンが挙げられるが、なかでもチオール基は共有結合が可能であり、反応が特異的に進むため最も好ましい。チオール基は表面に形成したマレイミド基、エポキシ基、チオール基、ジスルフィド基と反応することができる。また、チオール基は金の（１１１）面に直接結合することもできる。
【００２５】
チオール基を用いる場合、チオール基が酸化される問題を有する。そこで、ＰＣＲ反応を行う際には、チオール基が保護されているのが好ましい。保護基は特に限定されるものではないが、容易に脱保護されるのが好ましい。ＰＣＲ反応を行った後に、脱保護された上で、精製及び濃縮されるのが好ましい。チオール基の酸化を防ぐために精製・濃縮されたＰＣＲ産物は抗酸化剤を入れて保存されることが好ましい。ただし、抗酸化剤として、チオール基を含むジチオスレイトール（ＤＴＴ）などは、固定化反応に支障を与える危険性があるため、不適当である。
【００２６】
もう一方のＰＣＲに使われるプライマー（アンチセンスプライマー）は長さの異なるＰＣＲ産物ができるように、一つのセンスプライマーに対して、複数のアンチセンスプライマーを設計するのが好ましい。センスプライマーは末端に官能基が導入されていることが好ましいため、プライマーは高価である。それに対し、アンチセンスプライマーは安価に入手できる。従って、一つのセンスプライマーに対して複数のセンスプライマーを設計し、ＰＣＲを行うことで、異なる配列を含むＰＣＲ産物を得ることができる。このＰＣＲ産物を基板に固定化し、蛋白質との結合を観察することで安価にかつ詳細に蛋白質結合サイトをスクリーニングすることができる。
【００２７】
いずれのプライマーの長さは１５〜４０ｍｅｒが好ましく、特に１６〜３０ｍｅｒがより好ましい。１５ｍｅｒ未満であると、所望の範囲におけるＰＣＲ反応が進みにくくなる場合があるため好ましくない。また、４０ｍｅｒ以上であると、プライマーが高価になることと、不純物が混ざる危険性が高まるため好ましくない。いずれのプライマーも、ターゲットのゲノムＤＮＡに対して、全ての配列で相補的であってもよく、一部の配列で相補的でない部分を含んでもよい。
【００２８】
得られたＰＣＲ産物は、非常に希薄であるため精製された上で、濃縮されることが好ましい。精製の方法は特に限定されるものではないが。ゲルろ過を使った方法、ゲルからの切り出しを行う方法、磁気ビーズを使った方法などが挙げられる。濃縮する方法は特に限定されるものではないが、溶媒を蒸発させて濃縮する方法、絶乾して水または緩衝液を与える方法、メンブレンフィルターを使って濃縮する方法などが挙げられる。
【００２９】
得られたＰＣＲ産物は、アレイ状に固定化することが好ましい。複数のプローブをアレイ状にすることで、より詳細な結合範囲の特定が容易となる。アレイの形態としては、ＰＣＲ産物がアレイ状にスポットとして固定化されていることが好ましい。スポットとは不連続であり、互いに分け隔てる領域が存在していることを言う。スポットの形状は特に限定されるものではない。また、スポットの作製方法も特に限定されるものではないが、自動スポッターを使うと非常に容易にアレイを作製することができる。
【００３０】
本発明における固相は金属であることが好ましい。金属基板は表面加工が容易であり、さまざまな光学的測定法や水晶発振子の方法に使用することができるからである。また、熱安定性にも優れ、薬剤耐性も高いことも有利な点である。形態は、平面基板、ナノ粒子を含むビーズなどが挙げられるが、アレイへの応用ができる有利さから、平面基板が好ましい。
【００３１】
固定化する金属基板としては透明基板上に形成された金薄層が好ましい。金表面には金−硫黄結合を利用し、直接的あるいは間接的に表面へＰＣＲ産物を固定化することができる。直接的にはチオール末端のＰＣＲ産物を金表面に固定化することが挙げられる。間接的には、金表面に官能基を導入した後に、第一のＤＮＡ鎖末端の官能基あるいは結合グループと直接的あるいは間接的に結合させることが可能である。金表面に官能基を導入する方法としては二官能基型アルカンを金表面に密に充填する方法が好ましい。二官能基型アルカンとしては限定されるものではないが、例えば末端にアミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、スクシンイミド基、ビニル基などを有し、反対側の末端にチオール基を有するアルカンチオール、またはそれらの二量体であるジスルフィドなどが挙げられる。
【００３２】
二官能基型アルカンを使って表面に官能基を導入したのち、ＰＣＲ産物は直接あるいは間接的に表面に固定化される。間接的に、スペーサーを介してＰＣＲ産物が固定化されると、固定化された核酸分子にモビリティが与えられるため特に好ましい。スペーサーとしては、ポリエチレングリコールなどの合成親水性高分子、デキストランなどの天然親水性高分子、チミンやアデニンのＤＮＡ繰り返し配列などが挙げられる。
【００３３】
相互作用観察の手段としては、ラベルによって検出する方法とラベルフリーで検出する方法が挙げられる。ラベルする方法としては、蛋白質にラベルし検出する方法、蛋白質をラベル化抗体で検出する方法、または二次抗体で検出する方法などが挙げられる。ラベルの方法は特に限定されるものではないが、ＧＦＰなどの蛍光蛋白質との融合蛋白質を形成する方法、放射線同位体とコンジュゲートを形成させる方法などが挙げられる。ラベルフリーな方法としては、ラベルフリーな検出手段としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、局在プラズモン共鳴（ＬＰＲ）、水晶発振子（ＱＣＭ）、エリプソメトリ、二面偏波式干渉、和周波発生（ＳＦＧ）、第２高調波発生（ＳＨＧ）などの方法が挙げられる。そのなかでＳＰＲは、光学系の操作によって、複数の点を同時に測定できることができるため好ましい。ＳＰＲイメージング法はチップの広い範囲にｐ偏光光束を照射し、その反射像をＣＣＤカメラで撮影する方法であり、アレイフォーマットでの解析が可能であるため、さらに好ましい。複数の配列を固定化した核酸分子と蛋白質の相互作用を測定することが可能となる。
【００３４】
相互作用の解析の対称となる蛋白質は、核酸結合性蛋白質であると好ましく、転写因子であるとさらに好ましい。相互作用解析の際の蛋白濃度は特に限定されるものではないが、一般的には蛋白濃度５０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌから選ばれる。相互作用解析の際の使用される緩衝液の種類なども特に限定されるものではなく、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、トリス緩衝液などが使用される。また、塩濃度も特に限定されるものではないが、通常は１００〜３００ｍＭのＮａＣｌが緩衝液に加えられる。緩衝液には、Ｔｗｅｅｎなどの界面活性剤や牛血清アルブミンなどブロッキング剤などの物質が加えられてもよい。相互作用解析において、サンプル液を常時流してもよく、止めてもよい。流す場合、流速に特に限定されるものではないが、一般的に５〜５００μｌ／ｍｉｎの範囲で選択される。
【００３５】
本発明は転写因子結合部位の探索では、有効かつ安価な手段である。
【実施例】
【００３６】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３７】
転写因子Ｎｒｆ２ＣＴ／ＭａｆＧがゲノムＤＮＡ内に存在する認識部位ｎｑｏ１ＡＲＥ（図１、２）をスクリーニングする方法を検討する。
【００３８】
（ＰＣＲによるＤＮＡプローブの調整)
認識部位ｎｑｏ１ＡＲＥを含むと予想されるゲノムＤＮＡ領域（約３００ｂｐ）内の配列４種類と非認識部位ｌｄｈを含む配列１種類、計５種類をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲで用いたプライマーを表１に示す。なお、センスプライマーの５´末端にはチオール基が修飾してある。（チオール基に対する保護基はＰＣＲ終了後に除去する。）
【００３９】
【表１】
2006166785.tif 000002
【００４０】
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、２００ｎｇゲノムＤＮＡ、１０ｐｍｏｌプライマーを含むＰＣＲ溶液（５０μｌ×２）を用いて、９０℃（１５秒）−５５℃（３０秒）−６８℃（３０秒）のサイクルを３５回行った。ＰＣＲ反応後、２％アガロース電気泳動により、長さの異なるＰＣＲ産物を得たことを確認した。  ｎｑｏ１ＡＲＥにおいては、共通のセンスプライマーと４種類の異なったアンチセンスプライマーを用いたため、長さが異なる４種類のＰＣＲ産物を得た。
【００４１】
（チオール基の保護基の除去）
それぞれのセンス側プライマーの５’末端はチオール基修飾されているが、酸化されやすいため、ＰＣＲ終了時までチオール保護基を結合させたままにしておき、ＰＣＲ終了後、保護基を除去した。
【００４２】
ＰＣＲ産物に、終濃度４０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を１６時間室温で反応させることにより、保護基を除去し後、磁気ビーズ（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ：東洋紡績社製）により精製、乾燥した。５×ＳＳＣ（７５ｍＭクエン酸ナトリウム、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）／１ｍＭＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）３μＬで溶解した。
【００４３】
（対照プローブの調整）
ポジティブコントロールとして、転写因子Ｎｒｆ２ＣＴ／ＭａｆＧの認識配列２種類（ＭＡＲＥ２５、ｎｑｏ１−ＳＨ）、ネガティブコントロールとして、非認識配列（ｔｈｉｏｌ）の合成オリゴを設計した。片方のＤＮＡ鎖は、５’チオール末端からチミン１５塩基をスペーサーとして介した後、それぞれの配列が入るように設計されている。それぞれの配列は表２に示した。
【００４４】
【表２】
2006166785.tif 000003
【００４５】
５×ＳＳＣ／１ｍＭＴＣＥＰに５’チオール末端ＤＮＡが５０μＭ、その相補的ＤＮＡを１００μＭになるように溶液を調製し、ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。さらに、この反応溶液を５×ＳＳＣ／１ｍＭＴＣＥＰで希釈し、５μＭの二本鎖ＤＮＡ溶液を調整した。あらかじめ、チオール基の保護基は除去してあるが、ＴＣＥＰにより、チオール基の酸化が防止されている。
【００４６】
（ＳＰＲ測定チップ表面の処理）
ＤＮＡチップ作成には、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ  ＮＨ２チップ（東洋紡績社製）を使用した。このチップは、ＮＨ２基が導入された５００μｍ四方のスポット領域が８×１２＝９６個形成されている。スポット領域でない領域（バックグラウンド領域）には、非特異吸着を抑制するポリエチレングリコールが固定化されている。
スポット領域に、ＰＥＧの両端にそれぞれマレイミド基とＮＨＳ基を有する架橋剤ＭＡＬ−ｄＰＥＧ１２−ＮＨＳ（Ｑｕａｎｔａ  ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ社製）５ｍｇ／ｍｌを２時間反応させ、表面にマレイミド基を導入した。
【００４７】
（プローブの固定化）
マレイミド基表面のチップに、ＰＣＲ産物、ハイブリダイゼーション溶液をそれぞれ自動スポッター（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ：東洋紡績社製）を用いてスポットし、室温で１６時間反応し、プローブを表面に固定化した。
【００４８】
（チップ表面の洗浄、ＳＰＲ機器への設置）
ＰＣＲ産物を固定化した表面を５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１５分間、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１５分間、０．２×ＳＳＣ１５分間で洗浄した後、１ｍＭチオール末端ＰＥＧ１時間反応させて、未反応のマレイミド基をブロッキングした。
【００４９】
ＳＰＲイメージング機器（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ：東洋紡績社製）のフローセルにセットし、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭＴＣＥＰ、ｐＨ７．９の転写因子測定用緩衝液をフローセル内に流した。
【００５０】
（ヘテロダイマーの調整）
Ｎｒｆ２ＣＴとＭａｆＧ１−１２３が、それぞれ終濃度５００ｎＭ、５０ｎＭになるように上記転写因子測定用緩衝液を用いて調整した。
Ｎｒｆ２ＣＴは、ＭａｆＧ及びＤＮＡとの結合部位を有するＮｒｆ２蛋白質であり、ＭａｆＧ１−１２３は、ｂ−Ｚｉｐ構造、ＤＮＡ結合部位などを有している。二種類を混合することにより、相互作用して、ヘテロダイマーが形成される。
【００５１】
（相互作用測定）
ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、転写因子ヘテロダイマーＮｒｆ２ＣＴ／ＭａｆＧを上記転写因子測定用緩衝液に溶解し、セル内に１０分間１００μｌ／ｍｉｎの速度で注入し、さらに転写因子を含まない緩衝液を流した。相互作用の有無は、シグナル上昇の有無で判断した。認識部位ｎｑｏ１ＡＲＥ配列を完全に含む配列（ｎｑｏ１ＡＲＥ−Ａ、ｎｑｏ１ＡＲＥ−Ｂ）はシグナルが上昇し、相互作用が確認された。ｎｑｏ１ＡＲＥ配列を完全には含まない配列（ｎｑｏ１ＡＲＥ−Ｃ）、全く含まない配列（ｎｑｏ１ＡＲＥ−Ｄ）、ｌｄｈは相互作用しなかった（図３）。対照プローブと比較しても、ヘテロダイマーが、ＰＣＲ法により増幅したプローブ（ｎｑｏ１ＡＲＥ−Ａ）を認識し、相互作用したことがわかった（図４）。この方法により、ＳＰＲイメージング法により、転写因子の結合部位のスクリーニングが可能であることがわかった。
【００５２】
［比較例］
合成オリゴによるＤＮＡプローブの調整
認識部位ｎｑｏ１ＡＲＥを含むと予想されるゲノムＤＮＡ領域（約３００ｂｐ）を、網羅するように約３０ｂｐの配列を含むオリゴＤＮＡを設計する。５´末端にはチオール基、スペーサーのチミン１５塩基を結合させておく。相補鎖をハイブリダイゼーションによりｄｓＤＮＡにし、実施例と同様の方法で固定化、ＳＰＲ測定を行う。この比較例を用いる場合、設計した配列の中に、認識部位が完全に存在する必要があり、そのためには膨大な数のオリゴＤＮＡが必要である。合成オリゴのチオール基の修飾は非常に高価であり、解析に多額の費用が必要である。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明により、ＰＣＲで増幅した核酸分子を用いて、蛋白質が結合する塩基配列を探索することが可能となる。特に、転写因子の機能を知るために本発明は大いに有用であることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ｍｏｕｓｅ  ｎｑｏ１ＡＲ付近の配列（抜粋）
【図２】転写因子のスクリーニングの模式図
【図３】転写因子とＰＣＲ増幅プローブとの相互作用
【図４】合成オリゴプローブとＰＣＲ増幅プローブの比較
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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