(57)【要約】【課題】安全性の向上した改変組換えウイルスを提供し、且つ、そのような組換えウイルスを製造する方法を提供する。【解決手段】改変組換えウイルスであって、該ウイルスにコードされている遺伝子機能が不活化されていることにより毒性が弱毒化され安全性が高められた組換えウイルスを産生する。その遺伝子機能は、非必須であり毒性に関連する。ウイルスとしてはポックスウイルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルスである。この改変組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域に、免疫不全性ウイルス由来の抗原もしくはエピトープおよび／またはＣＴＬエピトープ、例えば、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、ＥＬＤＫＷＡ、ＬＤＫＷエピトープ等をコードする外来ＤＮＡ配列を含み得る。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変組換体ウイルスであって、ウイルスにコードされている遺伝子機能が不活化されていることにより該ウイルスの毒性が弱毒化されているが効力は保持しており；さらに、該ウイルスの非必須領域に外来ＤＮＡを含み、該外来ＤＮＡが少なくとも１つの免疫不全症ウイルスエピトープをコードし、前記改変組換体ウィルスが、NYVAC組換体ウィルス、COPAK組換体ウィルスまたはALVAC組換体ウィルスであり、前記外来DNAが、gp120(MN)(+トランスメンブラン)およびHIV1gag(+プロ)(IIIB)、nef(BRU)CTLエピトープ、またはpol(IIIB)CTLエピトープの少なくとも１つをコードすることを特徴とする組換体ウイルス。
【請求項２】
前記外来DNAが、gp120(MN)(+トランスメンブラン)およびHIV1gag(+プロ)(IIIB)をコードすることを特徴とする請求項１記載のウィルス。
【請求項３】
前記外来DNAが、gp120(MN)(+トランスメンブラン)およびHIV1gag(+プロ)(IIIB)、２つのnef(BRU)CTLおよび３つのpol(IIIB)CTLエピトープをコードすることを特徴とする請求項１記載のウィルス。
【請求項４】
前記２つのnef(BRU)CTLおよび３つのpol(IIIB)CTLエピトープが、CTL1、CTL2、pol1、pol2およびpol3であることを特徴とする請求項３記載のウィルス。
【請求項５】
ALVAC組換体ウィルスであることを特徴とする請求項１記載のウィルス。
【請求項６】
前記外来DNAが、gp120(MN)(+トランスメンブラン)およびHIV1gag(+プロ)(IIIB)をコードすることを特徴とする請求項５記載のウィルス。
【請求項７】
前記外来DNAが、gp120(MN)(+トランスメンブラン)およびHIV1gag(+プロ)(IIIB)、２つのnef(BRU)CTLおよび３つのpol(IIIB)CTLエピトープをコードすることを特徴とする請求項５記載のウィルス。
【請求項８】
前記２つのnef(BRU)CTLおよび３つのpol(IIIB)CTLエピトープが、CTL1、CTL2、pol1、pol2およびpol3であることを特徴とする請求項７記載のウィルス。
【請求項９】
vCP205(ALVAC-MN120TMG)、vCP264(ALVAC-MN120TMGN)、またはvCP300(ALVAC-MN120TMGNP)であることを特徴とする請求項５記載のウィルス。
【請求項１０】
免疫応答を誘発するための組成物であって、請求項１、２、４、６、８または９のいずれかに記載のウイルスを適当な担体と混合して含むことを特徴とする組成物。
【請求項１１】
生体外で培養された細胞中で遺伝子産物を発現する方法であって、請求項１、２、４、６、８または９のいずれかに記載のウィルスを前記細胞中に導入する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１、２、４、６、８または９のいずれかに記載のウィルスの生体外発現から調製されることを特徴とする免疫欠損ウィルス抗原。
【請求項１３】
請求項１、２、４、６、８または９のいずれかに記載のウィルスからの抗原の生体内発現により、または、前記ウィルスの生体外発現からの免疫欠損ウィルス関連抗原の投与により誘発される抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変ポックスウイルス（modified poxvirus)およびそれを製造し使用する方法に関する。特に、本発明は、外来遺伝子を挿入し発現させて、免疫不全ウイルスに対して免疫応答を誘起するための安全な免疫化媒体として用いられる改良ベクターに関する。すなわち、本発明は、免疫不全ウイルスの遺伝子産物を発現する組換えポックスウイルス、および、接種された宿主またはインビトロ（例えば、生体外の様式）で、免疫不全ウイルスに対して免疫応答を誘起する免疫原性組成物に関し、さらには、該ポックスウイルスの発現産物であって、それ自身が免疫応答を誘起、例えば抗体を産生するのに有用な生成物に関し、ここで、該抗体は、血清反応陽性または血清反応陰性の個体において免疫不全ウイルス感染に対して有用であり、あるいは、動物またはヒトから単離されることにより、ウイルスまたは感染細胞の検出用の診断キット、試験または分析法を構築するのに有用なものである。
【０００２】
本出願においては、幾つかの刊行物を参照している。これらの参考文献は、本明細書の末尾の特許請求の範囲の前にまとめて引用しているか、あるいは、刊行物について言及している個所においてそれぞれの刊行物を引用している。
【背景技術】
【０００３】
外来遺伝子を挿入し発現させるためにはワクシニアウイルス、および最近は、その他のポックスウイルスが用いられている。生きた感染性ポックスウイルス内に外来遺伝子を挿入する基本的な手法は、ドナープラスミド内の外来遺伝子をはさむポックスＤＮＡ配列と、レスキューポックスウイルス内に存在する相同配列との間で組換えを起こすことである（Piccini他、1987）。
【０００４】
詳述すれば、組換えポックスウイルスは、当該技術分野で既知であり、また、特許文献１−５に記載されているような方法（これらの特許の開示を参考のために本明細書に引用しておく。）に類似の２つの工程で構築される。
【０００５】
第１の工程として、当該ウイルスに挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列、特に、非−ポックス源からのオープンリーディングフレームが、ポックスウイルスＤＮＡの一部に相同的なＤＮＡが予め挿入されている大腸菌プラスミド構造体に導入される。これとは別に、挿入されるべきＤＮＡ遺伝子配列をプロモータに連結しておく。プラスミド構築物におけるプロモーター−遺伝子連結体の位置は、非必須（nonessential）遺伝子座を含有するポックスＤＮＡの領域をはさむＤＮＡ配列に相同的なＤＮＡが、該プロモーター−遺伝子連結体の両端にあるようにしておく。このようにして得られたプラスミド構造体は、次いで、大腸菌内で培養、増幅され（Clewell、1972）、単離される( Clewell 他、1969；Maniatis他、1982）。
【０００６】
第２の工程として、挿入されるべきＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離後のプラスミドは、ポックスウイルスとともに、培養細胞、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞に形質導入（トランスフェクト）される。プラスミド内の相同ポックスＤＮＡと、ウイスルゲノムとの間の組換えにより、ポックスウイルスのゲノムの非必須領域に外来ＤＮＡ配列が存在する改変ポックスウイルスが得られる。「外来（foreign)」ＤＮＡ配列という語は、外因性ＤＮＡ、特に非ポックス源からのＤＮＡであって、該外因性ＤＮＡが導入されているゲノムによって通常は産生されない遺伝子産物をコードするＤＮＡを指称する。
【０００７】
遺伝子組換えは、一般に、２つのＤＮＡ鎖間の相同ＤＮＡ部分の交換である。ウイルスによっては、ＤＮＡの代わりにＲＮＡとなることもある。核酸の相同部分とは、同じ配列の核酸塩基を有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の一部分である。
【０００８】
遺伝子組換えは、本来、感染宿主細胞内で新しいウイルスゲノムが複製または産生される間に起こる。すなわち、２種またはそれ以上の異なるウイルスまたは遺伝子構造体で共感染された（co-infected)宿主細胞内で起こり得る。ウイルス複製サイクル中に、ウイルス遺伝子間の遺伝子組換えが起こる。第１のゲノム由来のＤＮＡの一部を交換させることにより、この第１のウイルスゲノムに相同的なＤＮＡを有する第２の共感染性ウイルスのゲノムの一部を構成する。
【０００９】
しかしながら、組換えは、完全に相補的でない異なるゲノムにおけるＤＮＡ部分間でも起こり得る。第１のゲノム由来のそのようなＤＮＡの一部分が別のゲノムの一部分に相同的であるが、その第１のＤＮＡ部分に、例えば、遺伝子マーカーや抗原決定基をコードする遺伝子が挿入されて存在されているような場合には、組換えが起こり得、その組換え産物はそのような遺伝子マーカーや組換えウイルスゲノム内の遺伝子により検出されるようになる。最近は、組換えワクシニアウイルスを調製するためにその他の戦略も報告されている。
【００１０】
感染性改変ウイルスにより、挿入されたＤＮＡ遺伝子配列の発現を成功させるためには２つの条件が要求される。第１に、ウイルスの非必須領域に挿入を行い、改変ウイルスの生存性が維持されるようにしなければならない。挿入ＤＮＡの発現に関する第２の条件は、該挿入ＤＮＡに対して至適な関係にあるプロモータが存在しているということである。プロモータの位置は、発現されるべきＤＮＡ配列の上流にあるようにしなければならない。
【００１１】
ワクシニアウイルスは天然痘に対する免疫処置に使用されて成功をおさめ、１９８０年には世界的に天然痘を撲滅させた。その歴史の過程でワクシニアの多くの菌株が出現した。これらの異なる菌株は、種々の免疫原性を示し、また、程度の差はあるが、いろいろな合併症に関連する可能性があるとされ、その最も深刻なものはワクチン接種後の脳炎と全身性ワクシニアである（Behbehani 、1993）。
【００１２】
天然痘の撲滅に伴い、ワクシニアの新しい役割、すなわち、外来遺伝子を発現させるための遺伝子工学用ベクターとして役割が重要となった。きわめて多くの異種抗原をコードする遺伝子がワクシニア内で発現され、その結果、対応する病原体の投与に対する防御免疫をもたらしたこともしばしばである（Tartaglia他による総説、1990a)。
【００１３】
ワクシニアウイルスの遺伝学的背景が、発現される外来免疫原の防御効能に影響を与えることが示されている。例えば、ワクシニアウイルスのWyeth ワクチン株内でエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ３４０が発現されても、ＥＢＶウイルスで引き起こされるリンパ腫に対してコットントップ（cottontop ）タマリンを防御しなかったが、ワクシニアウイルスのＷＲ研究室株内で同じ遺伝子を発現させると防御効果があった（Morgan他、1988）。
【００１４】
ワクシニアウイルスベースの組換ワクチンを得ようとする場合には効力と安全性との間に精密なバランスをとることがきわめて重要である。組換えウイルスは、ワクチン接種された動物内で防御能のある免疫応答を誘起するが、実質的に病原性が無いやり方で免疫原を与えなければならない。したがって、ベクター株を弱毒化することが、現在の技術状況では最も望ましいであろう。
【００１５】
多くのワクシニア遺伝子が、組織培養におけるウイルスの成長に非必須であることが確認されており、それらを削除し不活化することにより、いろいろな動物系における毒性が減少される。
【００１６】
ワクシニアウイルス  チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子についてはマッピングが行われ（Hruby 他、1982）、また、配列決定も行われている（Hruby 他、1993；Weir他、1993）。チミジキナーゼ遺伝子が不活化または完全に欠失しても、広範な組織培養中でワクシニアウイルスの増殖は妨げられない。また、ＴＫ- ワクシニアウイルスは各種の投与法により各種の宿主における接種部位においてインビボ複製する能力を有する。
【００１７】
単純ヘルペスウイルス２型については、ＴＫ- ウイルスをモルモットに膣内投与すると、ＴＫ+ ウイルスの投与の場合よりも脊髄中のウイルス力価がかなり低くなることが示された（Stanberry 他、1985）。インビトロでのヘルペスウイルスがコードしているＴＫ活性は、代謝の活発な細胞中ではウイルスの増殖に重要でないが、静止細胞中ではウイルス増殖に必須であることが示された( gamieson他、1974）。
【００１８】
ＴＫ- ワクシニアが弱毒化がマウスの脳内投与および腹膜内投与において示された（Buller他、1985）。神経毒性のあるＷＲ実験室株およびWyeth ワクチン株の双方について弱毒化が認められた。皮内投与されたマウスにおいては、ＴＫ- 組換えワクシニアが、親株のＴＫ+ ワクシニアウイルスと同等の抗ワクシニア中和抗体を産生したが、これは、この試験系では、ＴＫ機能の喪失がワクシニアウイルスベクターの免疫原性を有意に減少させないことを示唆している。ＴＫ- およびＴＫ+ の組換えワクシニアウイルス（ＷＲ株）をマウスに鼻内投与すると、他の部位（脳を含む）へのウイルスの伝播が有意に減少したことが見出された（Taylor他、1991a)。
【００１９】
ヌクレオチドの代謝に関連する別の酵素は、リボヌクレオチド還元酵素である。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）内でコードされているリボヌクレオチド還元酵素の活性が、そのラージサブユニットをコードしている遺伝子を欠失させることにより喪失しても、インビトロの分裂細胞中でのウイルス増殖やＤＮＡ合成は影響されないが、無血清細胞でのウイルスの増殖能力は極めて損なわれることが示された（Goldstein 他、1988）。眼部の急性ＨＳＶ感染および三叉神経ガングリオンにおける再活性性潜伏感染に関するマウスモデルを用いた場合、リボヌクレオチド還元酵素のラージサブユニットを欠失したＨＳＶについては、野生型ＨＳＶに比べて毒性が減少することが示された（Jacobson他、1989）。
【００２０】
ワクシニアウイルスにおいては、リボヌクレオチド還元酵素のスモールサブユニット（Slabaugh他、1988）およびラージサブユニット（Schmidtt他、1988）のいずれも同定されている。ワクシニアウイルスのＷＲ株にリボヌクレオチド還元酵素を挿入によって不活化すると、ウイルスの弱毒化がもたらされ、これはマウスに頭蓋内接種することによって測定される（Child他、1990）。
【００２１】
ワクシニアウイルスの血球凝集素（ＨＡ）遺伝子についてはマッピングおよび配列決定が行われている（Shida、1986）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子は、組織培養中の増殖にとって非必須なものである（Ichihashi 他、1971）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子を不活化すると、頭蓋内投与されたウサギにおいては神経毒性化が減少し、また、皮膚内投与部位におけるウサギの外傷は小さくなっていた（Shida 他、1988）。ＨＡの遺伝子座を利用して、ワクシニアウイルスのＷＲ株（Shida 他、1987）、Lister株の誘導体（Shida 他、1988）およびCopenhagen株（Guo 他、1989）に外来遺伝子を挿入している。外来遺伝子を発現する組換えＨＡ- ワクシニアウイルスは、免疫原性があり（Guo 他、1989；Itamura 他、1990；Shida 他、1988；Shida 他、1987）、また、関連する病原体による投与に対して防御効果を有する（Guo他、1989；Shida他、1987）ことが示された。
【００２２】
牛痘ウイルス（Brighton赤色株）は、鶏卵の漿尿膜上に赤色（出血性）痘瘡を生じさせる。牛痘ゲノム内で自然欠失すると白色痘瘡を生じる突然変異体となる（Pichup他、1984）。出血性機能（ｕ）は、初期遺伝子によってコードされた３８ｋＤａのタンパク質によることがマッピングされている（Pickup他、1986）。この遺伝子は、セリンプロテアーゼインヒビターと相同性を有し、牛痘ウイルスに対する宿主の炎症応答を阻害し（Palumbo 他、1989）、また、血液凝固のインヒビターである。
【００２３】
このｕ遺伝子は、ワクシニアウイルスのＷＲ株中に存在する（Kotwal他、1989b)。外来遺伝子を挿入することによりｕ領域が不活化されているＷＲワクシニアウイルス組換体を接種されたマウスは、ｕ遺伝子が手つかずのままである類似の組換えワクシニアウイルスを接種されたマウスよりも、該外来遺伝子に対して高い抗体レベルを産生する（Zhou他、1990）。このｕ領域は、ワクシニアウイルスのCopenhagen株内で欠陥性非機能形態として存在する（Goebel他による報告（1990a,b)においてＢ１３およびＢ１４と称されているオープンリーディングフレーム）。
【００２４】
感染細胞内において牛痘ウイルスは、細胞質Ａ型封入体（ＡＴＩ）として局在化している（Kato他、1959）。ＡＴＩの機能は、動物から動物への伝播に際して牛痘ウイルス粒子を防護することにあると考えられている（Bevgoin 他、1971）。牛痘ゲノムのＡＴＩ領域は１６０ｋＤａのタンパク質をコードしており、これがＡＴＩ封入体のマトリックスを形成する（Funahashi 他、1988；Patel 他、1987）。ワクシニアウイルスは、そのゲノムに相同領域を含有するが、一般にＡＴＩを産生しない。ワクシニアのＷＲ株においては、ゲノムのＡＴＩ領域は９４ｋＤａのタンパク質として翻訳される（Patel 他、1988）。ワクシニアウイルスのCopenhagen株においては、ＡＴＩ領域に相応するＤＮＡ配列の大部分は欠失されており、該領域の残存する３´末端はＡＴＩ領域の上流にある配列と融合して、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）Ａ２６Ｌを形成する（Goebel他、1990a,b)。
【００２５】
ワクシニアウイルスゲノムの左末端近傍については、各種の自然欠失（Altenburger 他、1989；Drillien他、1981；Lai他、1989；Moss他、1981；Paez他、1985；Panicali他、1981）や人為的欠失が報告されている。１０ｋｂが自然欠失したワクシニアウイルスのＷＲ株（Moss他、1981；Panicali他、1981）は、マウスに頭蓋内接種した場合に、弱毒化されることが示された（Buller他、1985）。後に、この欠失部は１７ヶのＯＲＦを含む可能性が示された（Kotwal他、1988b)。該欠失部内にある特別の遺伝子としては、ビロカインＮ１Ｌおよび３５ｋＤａタンパク質（Goebel他による1990a,b の報告でＣ３Ｌと称されたもの）が挙げられる。Ｎ１Ｌを挿入して不活化すると、通常のマウスおよびヌードマウスのいずれについても、頭蓋内接種した場合に、毒性が減少する（Kotwa他、1989a)。上記の３５ｋＤａタンパク質は、ワクシニアウイルス感染細胞の培地にＮ１Ｌと同様に分泌される。このタンパク質は、補体制御タンパク質群、特に補体４Ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）に相同的である（Kotwal他、1988a)。細胞性Ｃ４ｂｐと同様に、ワクシニアの３５ｋＤａタンパク質は補体の第４成分と結合し、古典的補体カスケードを阻害する（Kotwal他、1990）。このように、ワクシニアの３５ｋＤａタンパク質は、該ウイルスが宿主の防御機構を回避するのを助けることに関与しているものと考えられる。
【００２６】
ワクシニアゲノムの左末端は、宿主域遺伝子として同定された２つの遺伝子、Ｋ１Ｌ（Gillard他、1986）およびＣ７Ｌ（Perkus他、1990）を含む。これらの遺伝子の双方が欠失すると、各種のヒト細胞系でワクシニアウイルスの増殖能が減少する（Perkus他、1990）。
【００２７】
上記以外の２つのワクチンベクター系においては、必然的に宿主が制限されているポックスウイルスであるトリポックスウイルスを使用する。ニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ：fowlpoxvirus）およびカナリアポックスウイルス（canarypoxvirus）の両者に工夫を施して外来遺伝子産物を発現させてきた。ニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ）は、ポックスウイルス科のトリポックス(Avipox）属の基本ウイルスである。このウイルスは、家禽類に経済的に重要な疾病を引き起こすが、１９２０年代から弱毒化生ワクチンを使用することにより対策が講じられてきた。トリポックスウイルスの複製は鳥類に限られ（Matthews他、1982）、ヒトを含む非鳥類においてトリポックスウイルスの感染が起こったという文献の報告は存しない。このように宿主が制限されているので、他の種にウイルスが伝染することに対する本質的な安全性が確保され、トリポックスウイルス由来のワクチンベクターは魅力ある手段として動物やヒトへ応用される。
【００２８】
ＦＰＶは、家禽類病原体由来の抗原を発現するベクターとして使用されると有利である。毒性トリインフルエンザウイルスの血球凝集素タンパク質がＦＰＶ組換体で発現された（Taylor他、1988a)。この組換体をニワトリおよび七面鳥に接種すると、同種または異種の毒性インフルエンザウイルスのいずれの投与に対しても防御能のある免疫応答が誘起された（Taylor他、1988a)。ニューカッスル病ウイルスの表面糖タンパク質を発現するＦＰＶ組換体も開発された（Taylor他、1990；Edbauer他、1990）。
【００２９】
宿主制限によりＦＰＶおよびＣＰＶの複製は鳥類系に限られているにも拘わらず、これらのウイルスから誘導された組換体が、非鳥類起源細胞においては外来遺伝子を発現することが見出された。さらに、そのような組換ウイルスは、該外来遺伝子産物に対する免疫学的応答を引き起こし、場合によって、相応する病原体による投与に対する防御能を有することが示された（Tartaglia他、1993a,b；Taylor他、1992；1991b；1988b)。
【００３０】
１９８３年、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ１）がエイズの原因物質であることが同定された。１２年が経過し、多くの世界中の努力にも拘わらず、効果的なＨＩＶ１ワクチンは未だ入手できない。しかしながら、最近になって、効果的なＨＩＶ１ワクチンを得る可能性のあることが幾つかの報告で示唆されている。例えば、あるワクチン接種法によりサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ：Simian immunodeficiency virus)投与に対してサル科マカク属のサルが防御されており、このワクチン接種法では、ＳＩＶのｇｐ１６０糖タンパク質を発現するワクシニアウイルス組換体で１次免疫を行い、さらに、精製したＳＩＶｇｐ１６０糖タンパク質で追加免疫を行っている（Hu他、1992）。さらに、ＨＩＶ１ｇｐ１２０サブユニットワクチンを用いることによりＨＩＶ１の投与に対してチンパンジーが防御された（Berma他、1990）。また、不活化ＨＩＶ１、ｇｐ１６０および／またはＶ３ペプチドまたはｇｐ１６０、ｐ１７（Gagタンパクの１種）および／またはＶ３ペプチドを多回注射するワクチン接種によっても、ＨＩＶ１投与に対してチンパンジーが防御された（Girard他、1991）。ｇｐ１６０、ｐ１７、ｐ２４（Gagタンパクの１種）、Ｖｉｆ、Ｎｅｆおよび／またはＶ３ペプチドを多回注射する同様のプロトコールによっても、ＨＩＶ１感染細胞の投与に対してチンパンジーが防御された（Fultz他、1992）。さらに、ＨＩＶ１  Ｖ３に特異的な抗体を注入することにより、チンパンジーは受動免疫防御された（Emini他、1992）。
【００３１】
これらのワクチン接種プロトコールにおいては、ＨＩＶ１またはＳＩＶのエンベロープ（表面膜）糖タンパク、特に、エンベロープ糖タンパクのＶ３エピトープに対して免疫応答を誘起することに重点が置かれてきた。不幸なことには、ＨＩＶ１の菌株が異なると、遺伝子や抗原性、特にエンベロープ糖タンパクにおけるそれらが広範囲に変異する。したがって、効果的なＨＩＶ１ワクチンは、単一のＨＩＶ１抗原、または単一のＨＩＶ１抗原の単一のエピトープだけでなく、それらの多くに対して免疫応答を誘起させることが必要であろう。
【００３２】
Ｂ細胞エピトープにおいては配列が広く変異していることが認められるのに対して、Ｔ細胞エピトープは比較的保存されている。例えば、ＨＩＶ１ｇｐ１６０（ＬＡＩ株）を発現するワクシニアウイルスを接種し精製ＨＩＶ１  ｇｐ１６０（ＬＡＩ）を追加免疫したＨＩＶ１に血清反応陰性の個体から単離した細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）クローンは、ＨＩＶ１のＭＮまたはＲＦエンベロープ糖タンパク質を発現する標的細胞を効率的に溶菌し、ＨＩＶ１  ＬＡＩエンベロープ糖タンパク質を発現する細胞も同様に溶菌する(Hammond他、1992）。したがって、比較的保存されているＴ細胞エピトープに対して免疫応答を誘起するワクチンは、同種の感染に対して効果的であるのみならず、異種の感染に対しても効果的であるかも知れない。
【００３３】
ＳＩＶに対してサル科マカク属のサルをワクチン接種するのに採用した上述の方式に類似する１次免疫−追加免疫プロトコールに従い、ＨＩＶ１  ｇｐ１６０を発現するＡＬＶＡＣ組換体（ｖＣＰ１２５）を用いてＨＩＶ１に血清反応陰性の個体にワクチン接種した。これらのＡＬＶＡＣをベースとしたプロトコールでは、サブユニットを追加免疫すると、ｖＣＰ１２５が、ＨＩＶ１エンベロープに特異的なＣＤ８+ ＣＴＬを誘起し且つエンベロープに特異的な液性反応を増強する能力を有することが認められた（Pialoux他、1995）。これらの結果は、ＡＬＶＡＣに基づく組換えＨＩＶ１ワクチンに対する根拠となっている。
【００３４】
１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ１）に感染した個体は、当初、ＨＩＶ１に特異的な中和抗体およびＨＩＶ１に特異的なＣＴＬを含む比較的強い抗ウイルス性免疫応答を示す。しかしながら、このような応答にも拘わらず、きわめて多くのＨＩＶ１感染者は、ＨＩＶ１関連疾病により実際には死亡してしまう。多くのＨＩＶ１感染者により起こされる免疫応答が防御機能を有しないことを考えると、有効な免疫応答とは、その免疫応答が変化または修正されて、ＨＩＶ１感染者により通常または多くは認められないようなＨＩＶ１エピトープに抗するようになることが必要であるのかも知れない。
【００３５】
ＨＩＶ１に血清反応陽性の個体にありＨＩＶ１感染細胞に結合することのできるＨＩＶ１特異性抗体の約４０％は、ＨＩＶ１エンベロープ糖タンパクの第３の可変領域（Ｖ３）に特異的である（Spear他、1994）。この結果は、Ｖ３ループが1)免疫原性が高く、また、2)感染細胞の表面上に露出されていることを示唆している。Ｖ３ループのアミノ酸配列は、ＨＩＶ１単離源が異なると非常に相違する。すなわち、配列が緩やかに相違してエンベロープ糖タンパクのこの領域の構造や免疫原性を変化させているようではない。Ｖ３領域は免疫原性が高く、その構造と免疫原性は、配列変化により大きく影響されないので、エンベロープ糖タンパクのこの領域が、通常は非免疫原性のエピトープまたは異種エピトープを免疫系に提供する免疫原性プラットホームとして有用であるかもしれない。
【００３６】
ＨＩＶ１に血清反応陽性の個体由来の血清は、実験室で適応化されたＨＩＶ１菌株を中和することができる。このような血清は、また、ＨＩＶ１の初代単離物を中和することもできる（但し、力価を１００倍以上高めることが必要である）。逆に、ＨＩＶ１  ｇｐ１２０でワクチン接種された個体由来の血清は、ＨＩＶ１の実験室適応化株を中和することができる（但し、血清反応陽性のヒト由来の血清に比べて力価を１０倍以上高めることが必要である）が、初代単離物を（分析可能なレベルで）中和することはできない（Hanson、 1994）。血清反応陽性の個体およびｇｐ１２０を接種した個体由来の血清に見出される中和活性の有意部分は、Ｖ３ループに特異的なようである（Spear 他、1994；Berman他、1994）。Ｖ３は高変異性であること、また、この領域に対する抗体は、ＨＩＶ１の初代単離物や異種株を中和することができないかも知れないことを考えると、Ｖ３以外のエピトープ、すなわち、初代単離物を含む広範囲のＨＩＶ１菌株を中和することのできるエピトープに対して免疫応答を誘起するワクチンを開発することが必要であろう。
【００３７】
ＨＩＶ１初代単離物および広範囲の実験室適応化ＨＩＶ１株を中和する能力を有するモノクローナル抗体が分離された（Conley他、1994；Katinger他、1992）。このモノクローナル抗体によって認識されるエピトープは、ＨＩＶ１  ｇｐ４１の６６２〜６６７間のアミノ酸にあることがマッピングされ、アミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡを有する（Buchacher他、1994）。配列情報が誘導されたＨＩＶ１のいろいろな菌株（種々のＨＩＶ１クレード由来の菌株を含む）の約８０％は、このエピトープのコア結合性配列ＬＤＫＷを発現する（Conley他、1994）。したがって、このエピトープは、Ｖ３ループとは異なり、比較的保存性が高いものと考えられる。不幸なことに、このエピトープは、その通常の形態では、免疫原性が大きくない。ＨＩＶ１に血清反応陽性のヒトの僅か５０％が、このエピトープを含有するｇｐ４１領域に対して検知可能な抗体応答を有する（Broliden他、1992）。
【００３８】
以上のことから理解されるように、免疫不全ウイルスの組換えポックスウイルス、あるいは、宿主に接種したときに免疫不全ウイルス感染に対して免疫応答を誘起する免疫原性組成物であって、特に、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣに基づく組換体のように安全性が高く、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬエピトープ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬエピトープ；例えば、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎｅｆＣＴＬ１、ｎｅｆＣＴＬ２、ｐｏｌ１（ｐｏｌＣＴＬ１）、ｐｏｌ２（ｐｏｌＣＴＬ２），ｐｏｌ３（ｐｏｌＣＴＬ３）、ＥＬＤＫＷＡまたはＬＤＫＷエピトープのいずれかまたは全てを、特に、免疫原性を与えるような形でコードし、または、それらを任意に組み合わせて、例えば、それらの全てを組み合わせたような組成物が得られれば、現在の技術レベルを前進させるきわめて望ましいものとなるであろう。
【特許文献１】米国特許第4,769,330号明細書
【特許文献２】米国特許第4,772,848号明細書
【特許文献３】米国特許第4,603,112号明細書
【特許文献４】米国特許第5,100,587号明細書
【特許文献５】米国特許第5,179,993号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３９】
したがって、本発明の目的は、安全性の向上した改変組換えウイルスを提供し、且つ、そのような組換えウイルスを製造する方法を提供することにある。
【００４０】
本発明の別の目的は、既知の組換えポックスウイルスワクチンに比べて安全性のレベルが高められた組換えポックスウイルス抗原、ワクチンまたは免疫学的組成物を提供することにある。
【００４１】
本発明のさらに別の目的は、宿主内で遺伝子産物を発現するための改変ベクターであって、該宿主内で弱毒化された毒性を有するように改変されたベクターを提供することにある。
【００４２】
本発明の他の目的は、安全性のレベルが高められた改変組換えウイルスまたは改変ベクターを用いて、インビトロ培養細胞内で遺伝子産物を発現させる方法を提供することにある。
【００４３】
本発明のこれらの目的およびその他の目的ならびに効果は、以下の記述から一層明らかになるであろう。
【発明を解決するための手段】
【００４４】
一つの態様として、本発明は、改変組換えウイルスであって、該ウイルスにコードされている遺伝子機能が不活化されていることにより毒性が弱毒化され安全性が高められた組換えウイルスに関する。その遺伝子機能は、非必須的なものである場合もあれば、毒性に関連している場合もある。ウイルスとしてはポックスウイルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルス、例えばニワトリポックスウイルスまたはカナリアポックスウイルスである。この改変組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域に、免疫不全性ウイルス由来の抗原もしくはエピトープおよび／またはＣＴＬエピトープ、例えば、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、ＥＬＤＫＷＡ、ＬＤＫＷエピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは、それらの全ての組合せをコードする外来ＤＮＡ配列を含み得る。
【００４５】
他の態様として、本発明は、接種された宿主動物内に免疫応答を誘起する抗原性、免疫原性、ないしはワクチン組成物または治療用組成物に関し、該ワクチンは、担体と改変組換えウイルスとを含み、該組換えウイルスは、ウイルスにコードされている非必須遺伝子機能が不活化されていることにより毒性が弱毒化され安全性が向上している。本発明に従うこの組成物に用いられるウイルスはポックスウイルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルス、例えば、ニワトリポックスウイルスまたはカナリアポックスウイルスである。この改変組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域に、抗原性タンパク質、例えば、免疫不全ウイルス由来のものおよび／またはＣＴＬ、例えば、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、ＥＬＤＫＷＡ、ＬＤＫＷエピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは、それらの全ての組合せをコードする外来ＤＮＡ配列を含み得る。
【００４６】
さらに別の態様として、本発明は、改変組換えウイルスを含有する免疫原性組成物に関し、該改変組換えウイルスは、ウイルスにコードされている非必須遺伝子機能が不活化されていることにより毒性が弱毒化され安全性が高められている。この改変組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域に、抗原性タンパク質（例えば、免疫不全ウイルス由来のものおよび／またはＣＴＬ、例えば、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、ＥＬＤＫＷＡ、ＬＤＫＷエピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは、それらの全ての組合せ）をコードする外来ＤＮＡ配列を含み、該組成物は、宿主に接種されると、該抗原に特異的な免疫学的応答を誘起する能力を有する。
【００４７】
別の態様として、本発明は、毒性が弱毒化されているが安全性が高められた改変組換えウイルスを細胞［例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ節単核細胞（ＬＮＭＣ）］に導入することにより、該細胞内でインビトロに遺伝子産物を発現させる方法に関する。この改変ウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域に、免疫不全性ウイルス由来の抗原もしくはエピトープおよび／またはＣＴＬ、例えば、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、ＥＬＤＫＷＡ、ＬＤＫＷエピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは、それらの全ての組合せをコードする外来ＤＮＡ配列を含み得る。そのような細胞は、その後、個体内に直接再注入されるか、または特異的なＣＤ８+ ＣＴＬ反応活性を上昇させるのに用いられて再注入に供される（半生体外治療）。
【００４８】
別の態様として、本発明は、インビトロ培養される細胞に、毒性が弱毒化され安全性が高められた改変組換えウイルスを導入することにより該細胞内で遺伝子産物を発現させる方法に関する。この改変組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域に、抗原性タンパク質、例えば免疫不全性ウイルス由来のもの例えば、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、ＥＬＤＫＷＡ、ＬＤＫＷエピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは、それらの全ての組合せをコードする外来ＤＮＡ配列を含み得る。得られた遺伝子産物は、ヒトまた動物に接種されて免疫応答を刺激することができる。産生された抗体は、各個体内で免疫不全ウイルスの予防および治療に有用であり、また、動物由来の抗体は、診断キット、アッセイまたはテストに用いられて、血清のようなサンプル中の免疫不全ウイルスまたはＣＴＬ抗原の有無（したがって、免疫応答すなわち抗体を生じたウイルスの有無）を測定するのに用いることができる。
【００４９】
さらに別の態様として、本発明は改変組換えウイルスに関し、該組換えウイルスは、ウイルスにコードされている非必須遺伝子機能が不活化されていることにより毒性が弱毒化されており、さらに、ウイルスゲノムの非必須領域に外因性のＤＮＡを含有している。このＤＮＡは、免疫不全ウイルスおよび／またはＣＴＬ抗原、例えば、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、ＥＬＤＫＷＡ、ＬＤＫＷエピトープ、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは、それらの全ての組合せをコードすることができるものである。特に、遺伝子機能の不活化は、毒性因子をコードするオープンリーディングフレームを欠失させることにより、または、自然の宿主制限ウイルスを利用することによって行われる。本発明に従って用いるウイルスは、ポックスウイルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルス、例えばニワトリポックスウイルスまたはカナリアポックスウイルスである。オープンリーディングフレームは、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ、およびＩ４Ｌ（Goebel他による1990a,b の報告における用語による）から成る群、ならびにそれらの組合せより選択されるのが好ましい。この点に関し、オープンリーディングフレームは、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域もしくはリボヌクレオチド還元酵素のラージサブユニット、またはそれらの組合せから成る。ＮＹＶＡＣとして同定されたワクシニアウイルスの改変Copenhagen株（Tartaglia他、1992）が使用される。しかしながら、ＣＯＰＡＫ株も本発明を実施するのに用いることができる。
【００５０】
最も好ましくは、本発明の組換えウイルスにおいて、外来ＤＮＡは、ＨＩＶｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、２つのｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、および３つのｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬエピトープをコードし、または、外来ＤＮＡは、ＥＬＤＫＷＡまたはＬＤＫＷエピトープをコードするものであり、そして、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０の領域で発現されるように挿入され（すなわち、該外来ＤＮＡは、Ｖ３ループにおいてＥＬＤＫＷＡまたはＬＤＫＷ改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０、例えばＥＬＤＫＷＡもしくはＬＤＫＷまたはそれらの一方または両方の繰り返しをコードするものである）、この結果、該エピトープが免疫原性を有する形態で発現される。この最も好ましい態様においても特に好ましいのは、２つのｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬエピトープと３つのｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬエピトープが、ＣＴＬ１、ＣＴＬ２、ｐｏｌ１、ｐｏｌ２およびｐｏｌ３であることである。別の好ましい態様においては、外来ＤＮＡがＨＩＶ１ｇｐ１２０＋ＴＭをコードし、Ｖ３ループが改変されて少なくとも１つ、好ましくは２つのＥＬＤＫＷＡエピトープを含有する場合である。
【００５１】
別の態様として、本発明は、ＨＩＶ免疫原および改変ｇｐ１６０またはｇｐ１２０を包含する。すなわち、本発明は、ＨＩＶ免疫原、好ましくは、ＨＩＶｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、およびＥＬＤＫＷＡまたはＬＤＫＷエピトープから成る群より選ばれるＨＩＶ免疫原を含む。ＨＩＶ免疫源はｇｐ１６０またはｇｐ１２０の一部であってもよい。かくして、例えば、ＨＩＶ免疫原ＥＬＫＤＫＷＡまたはＬＤＫＷＡは、ｇｐ１２０の領域またはｇｐ１６０の領域の一部、例えば、ｇｐ１２０Ｖ３の一部となることができる。したがって、本発明は、ｇｐ１６０に本来は存在していないエピトープを含有するように改変されたｇｐ１２０またはｇｐ１６０を包含する。エピトープは、Ｂ細胞エピトープであってよい。特に、エピトープは、ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブレン）、ｎｅｆ（ＢＲＵ）ＣＴＬ、ｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬ、およびＥＬＤＫＷＡまたはＬＤＫＷエピトープの少なくとも１つとすることができる。Ｖ３ループ内でｇｐ１２０を改変することができる。これらの免疫原や改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０は、任意の適当なベクター、例えば本発明の組換体のようなポックスウイルス；または、Merrifield合成法のような適当な化学合成法により合成することができる。
【００５２】
本発明は、さらに別の態様として、本発明による組換えポックスウイルスの発現産物およびその使用、ならびに、本発明に従う免疫原や改変ｇｐ１２０およびｇｐ１６０の使用、例えば、治療、予防、診断または試験に用いられる抗原性組成物、免疫原性組成物ないしはワクチン組成物を調製することに関する。さらに、本発明は、本発明の組換体由来のＤＮＡを、サンプル中のＨＩＶ  ＤＮＡの有無を検知するためのプロープとして使用したり、適当な発現プラスミドを用いるＤＮＡ免疫法に利用することに関する。
【００５３】
これらの態様およびその他の態様は、以下の詳細な説明に含まれ、それから明らかであろう。
【００５４】
図面の簡単な説明
下記には、本発明を、例を挙げて詳しく説明してあるが、本発明はここで挙げた実施例に限定されるものではない。下記に示した図面を参照することで、本発明の理解が深まるであろう。
【００５５】
図１はチミジンキナーゼ遺伝子を欠失させるためのプラスミドpSD460を構築し、組み換えワクシニアウイルス・vP410を作製する方法を図式化して示したものである。
【００５６】
図２は毒性部位を欠失させるためのプラスミドpSD486を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP553を作製する方法を図式化して示したものである。
【００５７】
図３はＡＴＩ部位を欠失させるためのプラスミドpMP494△を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP618を作製する方法を図式化して示したものである。
【００５８】
図４は赤血球凝集素遺伝子を欠失させるためのプラスミドpSD467を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP723を作製する方法を図式化して示したものである。
【００５９】
図５は遺伝子クラスタ[C7L-k1L]を欠失させるためのプラスミドpMPCK1△を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP804を作製する方法を図式化して示したものである。
【００６０】
図６はリボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニットを欠失させるためのプラスミドpSD548を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP866を作製する方法を図式化して示したものである。
【００６１】
図７は狂犬病ウイルス糖タンパク質・Ｇ遺伝子をＴＫ欠失遺伝子座に挿入させるためのプラスミドpRW842を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP879を作製する方法を図式化して示したものである。
【００６２】
図８はＣ５オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むカナリアポックスウイルスPvuII断片のＤＮＡ塩基配列(配列番号66)を示したものである。
【００６３】
図９Ａ，９Ｂは組み換えカナリアポックスウイルスvCP65(ALVAC-RG)を構築する方法を図式化して示したものである。
【００６４】
図１０はＮＹＶＡＣを作製するために欠失したＯＲＦを図式化して示したものである。
【００６５】
図１１はＦ８のＯＲＦを含むＴＲＯＶＡＣ・ＤＮＡの断片のヌクレオチド塩基配列(配列番号67)を示したものである。
【００６６】
図１２はＦ７のＯＲＦを含むＴＲＯＶＡＣ・ＤＮＡの2356塩基対断片のＤＮＡ塩基配列(配列番号68)を示したものである。
【００６７】
図１３Ａ−１３Ｄは同じかまたは別のワクチン（０日目、２８日目、１８０目にワクチンを接種し、接種後０、７、２８、３５、５６、１７３、１８７、２０８日目に抗体価測定）のいずれかで事前に免疫したボランティアにおける狂犬病ウイルス中和抗体価(RFFIT, IU/ml)、ＨＤＣおよびｖＣＰ６５(10５．５ TCID５０)の追加免疫効果をグラフ化したものである。
【００６８】
図１４Ａ−１４ＤはpHIV32(配列番号78)に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶ１・ｇｐ１２０（+トランスメンブレン）遺伝子、Ｉ３ＬでプロモートされたＨＩＶＩgag(+pro)遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【００６９】
図１５Ａ−１５ＦはpVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【００７０】
図１６はp2-60-HIV.3(配列番号91)におけるＩ３Ｌでプロモートされたｎｅｆ・ＣＴＬ２エピトープおよびＨ６でプロモートされたｎｅｆ・ＣＴＬ１エピトープのヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【００７１】
図１７Ａ−１７ＣはpC6L(配列番号92)におけるＣ６遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【００７２】
図１８Ａ−１８ＢはpC5POLT5A(配列番号105)に含まれるＩ３Ｌでプロモートされたpol2エピトープ、Ｈ６でプロモートされたpol1エピトープ、４２Ｋでプロモートされたpol3エピトープのヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【００７３】
図１９Ａ−１９ＣはpNC5L-SP5(配列番号 106)におけるＣ５遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【００７４】
図２０はALVAC,vCP205,またはペプチドCLTB-36による免疫後におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク質に対するウサギ抗体反応を示したものである。
【００７５】
図２１はALVAC,vCP205,またはペプチドCLTB-36による免疫後におけるＨＩＶ・ＭＮ・Ｖ３ループに対するウサギ抗体反応を示したものである。
【００７６】
図２２はALVAC,vCP205,またはペプチドCLTB-36による免疫後におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク質に対するモルモット抗体反応を示したものである。
【００７７】
図２３はALVAC,vCP205,またはペプチドCLTB-36による免疫後におけるＨＩＶ・ＭＮ・Ｖ３ループに対するモルモット抗体反応を示したものである。
【００７８】
図２４はＨＩＶ血清反応陽性者（患者１）のＰＢＭＣ・ＨＩＶー１特異的ＣＴＬのin vitroでの刺激結果を示したものである。
【００７９】
図２５患者２における図２４の内容を示したものである。
【００８０】
図２６ａ−ｃはpHIV59およびvCP1307に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 124)および発現タンパク質(配列番号125)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【００８１】
図２７はvC1307感染細胞について、ＦＡＣＳ分析結果を示したものである（ＨＩＶ１血清反応陽性者の血清由来のALVAC, vP1286またはvCP1307に感染したＨｅＬａ細胞[上のパネル]または、ＥＬＤＫＷＡエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体、IMA41-2F5[下のパネル]についてＦＡＣＳ分析を行った）。
【００８２】
図２８ａ−ｃはpHIV60およびvP1313に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 126)および発現タンパク質(配列番号127)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【００８３】
図２９はvP1313感染細胞について、ＦＡＣＳ分析結果を示したものである（ＨＩＶ１血清反応陽性者の血清由来のNYVAC, vP1286またはvP1313に感染したＨｅＬａ細胞[上のパネル]、または、ＥＬＤＫＷＡエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体、IAM41-2F5[下のパネル]についてＦＡＣＳ分析を行った）。
【００８４】
図３０ａ−ｃはpHIV61およびvP1319に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 128)および発現タンパク質(配列番号128)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【００８５】
図３１はvP1319感染細胞について、ＦＡＣＳ分析結果を示したものである（ＨＩＶ１血清反応陽性者の血清由来のWR, vP1286またはvP1319に感染したＨｅＬａ細胞[上のパネル]または、ＥＬＤＫＷＡエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体、IMA41-2F5[中段のパネル]、Ｖ３ループ、に特異的なマウスモノクローナル抗体50.1についてＦＡＣＳ分析を行った）。
【００８６】
図３２、３３ａ，３３ｂ，３３ｃ，３４，３５，３６，３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３８ａ，３８ｂ，３８ｃはvCP205およびプラセボ（placebo ）（図３２）を接種したサルにおける体重（図・３２）、血球計算（図３３ａ−ｃ）、クレアチニン（図３４）、ＳＧＯＴ（図３５）、ＳＧＰＴ（図３６）、ＥＬＩＳＡ（Anti-gp160 Mn/BR, -V3MN,  -p24,  図３７ａ−ｃ、３８ａ−ｃ）の比較を示したものである。上部パネル＝サル  １ー４、プラセボ；下部パネル＝サル  ５ー８ vCP205；サル：１＝白四方形、２＝白ひし形、３＝白三角形、４＝白マル、５＝黒四方形、６＝黒ひし形、７＝黒三角形、８＝黒マル；縦軸は体重（ｗｔ）、横軸は週（矢印の点で接種実施）。図３３ａ：白血球：左上と底部パネル＝サル  １ー４，プラセボ；右上と底部＝サル５ー８、vCP205；上端パネル：各ＷＢＣ数、小さな黒マルが平均値（ｍ）であることを除いては、図３２と同じ；下段パネル示差細胞数、黒四方形＝顆粒球、白四方形＝リンパ球、黒ひし形＝単球。図３３ｂ：レイアウトと表示は図３３ａと同様。上部パネルが赤血球、下部パネルが平均血球数、平均は、黒マルで表示。図３３ｃ：レイアウトは図３３ｂと同じ。上部パネルがヘマトクリット、下部パネルがヘモグロビン。図３４で、上部棒グラフはサル１ー４、プラセボ；下部棒グラフ＝サル５ー８、vCP205；mg/1対日数、矢印は接種実施日を示す。サル１と５＝黒棒、サル２と６＝二点描棒（反対方向に斜線）、サル３と７＝ドット棒、サル４と８＝一点描棒（１つの方向に斜線）、平均は黒マル。図３５：図３４と表示は同じ。但し、縦軸がIU/l、横軸が日数。図３６：図３５と表示は同じ。図３７ａ−ｃと図３８ａ−ｃ：プラセボを接種したサルおよびvCP205を接種したサルでのＥＬＩＳＡ分析結果、（図３８ａ−ｃ）、縦軸が抗体価（対数）横軸が週。矢印は注射実施を示す。図３７ａと３８ａ＝anti-gp160MN/BRU。図３７ｂと３８ｂ＝anti-V3MN。図３７ｃと３８ｃ＝anti-p24；サル１と５＝白マル；サル２と６＝黒マル；サル３と７＝白逆三角形；サル４と８＝黒逆三角形。
【００８７】
図３９はvCP205接種のサルにおけるanti-HIVI(MN)中和抗体価を示したものである（表示は図３８ａ−ｃと同じ）。
【００８８】
図４０，４１ａ，４１ｂ，４１ｃ，４２，４３ａ，４３ｂ，４３ｃ，４３ｄ，４４ａ，４４ｂ，４５ａ，４５ｂ，４６ａ，４６ｂ，４７ａ，４７ｂは白血球数（図４０）、血球計算（赤血球、図４１ａ、ヘマトクリット４１ｂ、網状赤血球図４１ｃ）、プロトロンビン（図４２）、生化学結果（総コレステロール、総タンパク、グルコース、図４３ａ；ナトリウム、カリウム、図４３ｂ、クレアチニン、ビリルビン図４３ｃ；ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、アルカリ性ホスファターゼ、図４３ｄ）、gp160 MN/BRU ELISA（対照図４４ａ、試験動物図４４ｂ）、V3 MN ELISA（対照図４６ａ、試験動物図４６ｂ）、ｖＣＰ３００とプラセボを接種したサルにおけるnef ELISA（対照図４７ａ、試験動物図４７ｂ）（図４０：レイアウトは図３３aと同じ。表示は、上部パネルにおいて、平均値がドットマル（左）と白いマル（右）であり、下部パネルでは、パーセントの代わりに小数が使用され、黒四方形が好中球、白ひし形が好酸球、黒三角形が好塩基球である以外は図３３ａと同じである。図４１ａ：レイアウトは図３３ｂと同じ、表示は、平均がドットマル（左）と白マル（右）である以外は図３３ａと同じである。図４１ｂは図３３ｃと同じであり、表示は図４１ａと同じである。図４１ｃ：レイアウトも表示も図４１ｂと同様で、上部パネルが網状赤血球、下段パネルが血小板である。図４２：上段パネルがプラセボ、下段パネルがｖＣＰ３００、表示は４１ｃと同様。図４３ａ：最上段がコレステロール、中段がタンパク質、下段がグルコース、白マルがプラセボ、黒マルがｖＣＰ３００である。図４３ｂ：最上段がナトリウム、下段がカリウム、表示は４３ａである。図４３ｃ：最上段がクレアチニン、下段がビリルビン、表示は図４３ａと同様。図４３ｄ：最上段がＳＧＯＴ、中断がＳＧＰＴ、下段がアルカリ性ホスファターゼ、表示は図４３ａと同様。図４４ａ、図４４ｂ：gp160 MN/BRU ELISA、対照とｖＣＰ３００。表示は３７ａと３８ａとそれぞれ同じ。図４５ａと図４５ｂ：v3 MN ELISA、対照とｖＣＰ３００、表示は３７ｂと３８ｂとそれぞれ同じ。図４６ａと４６ｂ：p34, ELISA, 対照とｖＣＰ３００,  表示は図３７ｃと３８ｃと同様。図４７ａと４７ｂ：nef ELISA、対照とｖＣＰ３００,  表示は図４４ａー４６ｂと同様。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８９】
新しいワクシニア・ウイルス・ワクチン株ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）を開発するために、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン株を、すでに既知であるか、または、潜在的な毒性要素をコードしているゲノムの中の６個の非必須部位を欠失させることで改良を行った。ここで採用した、一連の欠失法について下記に説明する。ワクシニア制限断片のすべての、オープンリーディングフレーム、ヌクレオチドの位置の命名については、Geobelらが報告している(1990a,b )用語に準じている。
【００９０】
欠失遺伝子座を、外来の遺伝子の挿入のための受容遺伝子座となるように操作した。下記リストは、ＮＹＶＡＣから欠失させる遺伝子、部位を示したものである。また、この中には、ワクシニア組換体(vP)から欠失する遺伝子、部位を略字で示したもの、欠失部位のオープンリーディングフレーム(Goebelら、1990a,b)が含まれる。
【００９１】
（１）チミジンキナーゼ遺伝子(TK; J2R)、vP410   
（２）出血性領域（u;B13R +B14R) vP553
（３）Ａ型細胞封入体(ATI;A26L) vP618
（４）赤血球凝集素遺伝子(HA; A56R) vP723
（５）宿主域遺伝子部位(C7L-K1L) vP804
（６）リボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニット(I4L)vP866（ＮＹＶＡＣ）
ＮＹＶＡＣは、遺伝子操作技術により、１８個の毒性遺伝子をコードしているオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と宿主域領域を欠失させることで作製したワクシニアウイルスである。このＮＹＶＡＣは多くの基準によって高度に弱毒化されている。弱毒化させる場合の基準としては、（ｉ）新生マウスの大脳内に接種した後の減少された毒性、（ｉｉ）遺伝的(NU+/NU+)免疫不全マウスまたは化学的（シクロホスファミド）免疫不全マウスにも接種可能であること、（ｉｉｉ）免疫不全マウスに接種しても播種感染を引き起こさないものであること、（ｉｖ）重大なウサギの皮膚の硬化や腫瘍化を起こさないこと、（ｖ）接種部位から速やかに消失すること、（ｖｉ）ヒトを含む組織培養細胞における複製能力が減少されていることがある。このように弱毒化されたものであるにもかかわらず、ＮＹＶＡＣをベースにしたベクターは、外来性の免疫原に優れた免疫応答を示し防御免疫を提供している。
【００９２】
ＴＲＯＶＡＣは弱毒化ニワトリポックスウイルスのことで、ニワトリポックスウイルスのＦＰー１ワクチン株由来のプラーククローン化分離菌であったものであり、１日齢鶏の接種用にその使用が許可されているものである。ＡＬＶＡＣは弱毒化カナリアポックスウイルスをベースにしたベクターであり、これはすでに使用許可されているカナリアポックスウイルスであるカナポックス(Kanapox)(Tartagliaら、1992)のプラーククローン化誘導体であったものである。ＡＬＶＡＣには、カナポックスの一般特性の一部と類似した特性がある。外来性の免疫原を発現させるＡＬＶＡＣをベースにした組み換えウイルスもワクチンベクターとして有効であることはすでに認められていることである(Tartaliaら、1993 a,b)。このアビポックスベクターは、生産的な複製のためには、鳥類種に限定して使用される。ヒトの細胞培養では、カナリアポックスウイルス複製が、ウイルス複製サイクルの中の、ウイルスＤＮＡ合成の前に、早期に中止してしまう。それにもかかわらず、このウイルスを外来性免疫原が発現するように操作すると、哺乳動物細胞中でin vitroの真正発現とプロセシングが観察され、これを種々の哺乳動物種に接種した場合には、外来免疫原に対する抗体を誘導し細胞性免疫応答を示し、さらに、同種病原体に対する防御作用をするのである(Tayler ら、1992;Tayler等、1991)。カナリアポックスウイルス／狂犬病ウイルス糖タンパク質組換体（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）に関するヨーロッパとアメリカでの最近のフェーズＩ・臨床試験では、患者はこの実験ワクチンに十分な耐えて、しかも、狂犬病ウイルス中和抗体価がその予防可能レベルにまで達した(Cadozら、1992,Friesら、1992)。さらに、ＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種者由来の末梢血単核細胞(PBMC)に対して、精製した狂犬病ウイルスで刺激すると、そのリンパ球増殖も有意なレベルに達した(Friesら、1992)。
【００９３】
これらＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣは、ウイルスやベクターの病原性という観点から、それらの使用上の安全手順ガイドラインやウイルスやベクターなどの遺伝子物質の物理的封じ込めに関するガイドラインを出している米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）と米国組み換えＤＮＡ諮問委員会は、これら３つについて、その物理的封じ込めレベルをＢＳＬ２レベルからＢＳＬ１レベルに緩和したという点で、ポックスウイルスの中では独特なものとして認識されるものである。物理的封じ込めレベルがＢＳＬ１であるポックスウイルスは他にない。通常使用されているポックスウイルスであるワクシニアウイルスのコペンハーゲン株でさえ、その物理的封じ込めのレベルはＢＳＬ２なのである。従って、これらＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣは、ほかのどのポックスウイルスよりもその病原性が低いということが技術的にも認知されていることになる。
【００９４】
ＮＹＶＡＣをベースにした、およびＡＬＶＡＣをベースにした組み換えウイルスは両方とも、ヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋  ＣＴＬにin vitroで特異的に刺激反応を示すことが報告されている(Tartagliaら、1993a)。種々のＨＩＶー１・エンベロープ・糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ組換体で免疫したマウスでは、第二次接種で復活可能であった一次ＣＴＬ応答と記憶ＨＩＶ特異的ＣＴＬ応答を示している(Tartagliaら、1993a, Coxら、1993)。ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖおよびＮＹＶＡＣ−ｅｎｖの組換体（ともにＨＩＶー１エンベロープ糖タンパク質を発現）は、ＨＩＶー１に感染したヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、強いＨＩＶー特異的ＣＴＬ応答を高めた(Tartagliaら、1993a；Coxら、1993)。急性感染させた自己由来ＰＢＭＣを残余ＰＢＭＣの刺激細胞として使用した。外来性ＩＬー２の不存在下での接種後１０日目に、細胞のＣＴＬ活性を評価した。ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖおよびＮＹＶＡＣ−ｅｎｖの組換体がマウスにおける高レベルの抗−ＨＩＶ活性を刺激した。
【００９５】
本願出願人は、多数のＨＩＶ１抗原およびＨＩＶ１・Ｔー細胞エピトープを発現するＡＬＶＡＣ組換体であるｖＣＰ３００(ALVAC-MN120TMGNp)を作製した。このｖＣＰ３００はＨＩＶ１（ＩＩＩＢ）ｇａｇ（および、プロテアーゼ）タンパク質を発現する。（プロテアーゼタンパク質の発現により、ｇａｇポリタンパク質が正確にプロセッシングされる）。ｖＣＰ３００は、ある形態のＨＩＶ１（ＭＮ）エンベロープ糖タンパク質も発現し、ｇｐ１２０がｇｐ４１由来のトランスメンブレンアンカー配列に融合される。ｖＣＰ３００は、２個の（２）ＨＩＶ１（ＢＲＵ）ｎｅｆ・ＣＴＬエピトープと３個の（３）ＨＩＶＩ（ＩＩＩＢ）ｐｏｌ・ＣＴＬエピトープも発現する。しかし、ｖＣＰ３００は機能性逆転写酵素活性は示さない。さらに、ｖＣＰ３００は、ＳＩＶ・サル科マカク属のサル（アカゲザル）モデルでの病原性と関連しＨＩＶ１毒性と関連する機能性ｎｅｆ遺伝子産物は発現しない(Millerら、1994; Spinaら、1994)。したがって、ｖＣＰ３００は、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌおよびｎｅｆの免疫的に重要な抗原またはエピトープを発現するが、ｐｏｌおよびｎｅｆと関連した有害な酵素または病原性活性は示さないのである。
【００９６】
上記の通り、ｖＣＰ３００は、ある形態のＨＩＶ１（ＭＮ）エンベロープ糖タンパク質を発現し、そこでは、多数のｇｐ４１配列が欠失されている。ＨＩＶ１（ＭＮ）エンベロープ・糖タンパク質と関係がある免疫的に重要なエピトープの殆どが、ｇｐ４１上よりもむしろｇｐ１２０上で見られたので、この組換体により発現されるエンベロープ・糖タンパク質の免疫原性が悪影響を受けることはないことが予想される。事実、比較研究では、ＨＩＶ１・ｇｐ１２０サブユニットワクチンが、チンパンジーをＨＩＶ１感染から防御したが、他方、ＨＩＶ１・ｇｐ１６０サブユニットワクチンではその防御ができなかった(Bermanら、1990)。これら２つのワクチンの効果がなぜ異なるのかについてはまだ分かっていない。しかし、エピトープ・ｇｐ４１に対する抗体がin vitroでＨＩＶ１感染を増進させることが分かっている(Robinsonら、1990)。ＨＩＶ１の血清反応陽性者において、ｇｐ４１の推定免疫抑制部位に対する抗体が、ＡＩＤＳの無発症と関連していることから、この部位が病原性に関してなんらかの役割を果たしていることは知られたことである(Klasseら、1988)。さらに、ｇｐ４１のＣ末端部位に対する抗体はＨＬＡクラスＩＩ抗原との交差反応し、(Goldingら、1988)、抗原特異的リンパ増殖性反応を阻害することも知られたことである(Goldingら、1989)。
【００９７】
ｖＣＰ３００により発現されたエンベロープ・糖タンパク質の場合には、トランスメンブレン部位と関連した２８アミノ酸を除いて、いかなるｇｐ４１配列も含んでいないので、これらのｇｐ４１と関連した有害な影響は避けられる。さらに、ｖＣＰ３００により発現したエンベロープ・糖タンパク質の場合、ｇｐ４１上の抗血清により認識される免疫優性エピトープが、ＨＩＶ１血清陽性者の感染のどの段階においても含まれてない(Shaffermanら、1989)。従って、このエピトープに対する反応を基礎にした診断試験が、ワクチン接種者とＨＩＶ１感染者を区別するために使用できる。ｇｐ４１抗体アッセイにより、ｖＣＰ３００接種者とＨＩＶ１感染者を区別できることは重要である。その理由は、ｖＣＰ３００接種者は高レベルのｐ２４抗体を保持していることが予想されるので、大抵の診断キット（ＨＩＶ１ｐ２４抗体の存在をアッセイする）は役にたたなくなるからである。他には、ＨＩＶー１感染者では抗ーｇｐ４１抗体が産生されることが予想されるが、ｖＣＰ２０５またはｖＣＰ３００の接種者にはそれは考えられない。その理由は、ｖＣＰ２０５またはｖＣＰ３００にはｇｐ４１が欠失しているからである。
【００９８】
ウサギとモルモットにＡＬＶＡＣ組換体（vCP205;ALVAC-MN120TMG)を接種すると、ｖＣＰ３００が発現させたと同様の、細胞表面関連型ＨＩＶ１・ｇｐ１２０（１２０ＴＭ）およびＧａｇ／ｐｒｏを発現した。ウサギとモルモットにｖＣＰ２０５を接種して、さらに、ＨＩＶ１・Ｔ−Ｂ・ペプチドで二次免疫させた。ＡＬＶＡＣをベースにしたプロトコールによる接種で、ＨＩＶ１・ｇｐ１６０ー抗体およびＶ３ループ特異的抗体の産生が誘発されたが、このことは、ＨＩＶ１・ｇｐ１２０細胞表面型を発現するＡＬＶＡＣ組換体が、ＨＩＶ１−特異的免疫応答を誘発することを示している。
【００９９】
ｖＣＰ３００は、ＨＩＶ１・ｇｐ１２０・エンベロープ・糖タンパク質、細胞表面関連型ＨＩＶ１・Ｇａｇ・タンパク質、ＣＴＬエピトープを含むＨＩＶ１・ｎｅｆからの２つの部位、ＣＴＬエピトープを含むＨＩＶ１・ｐｏｌからの３つの部位を発現する。ｇｐ４１を含まないＨＩＶ１・エンベロープ・糖タンパク質が発現されることにより、ｇｐ４１抗体の検査を使用することで、ｖＣＰ３００の被接種者をＨＩＶ１−感染者から区別でき、種々のｇｐ４１エピトープと関係する有害な反応を減らすことができる。ＨＩＶ１・ｇｐ１６０を発現する従来のＡＬＶＡＣ組換体が、ヒトにおけるＨＩＶ１特異的液性免疫反応および細胞性免疫反応を誘発することが報告されているが(Pialouxら、1995)、さらに、Ｇａｇ、Ｐｏｌ，Ｎｅｆ、エピトープを追加することにより（および、有害なｇｐ４１エピトープを除去することにより）、ｖＣＰ３００により誘発された免疫応答をｖＣＰ１２５と比較してさらに高め範囲を広げる効果があり、これにより、有効なＨＩＶ１ワクチンまたは有効な免疫原、抗原物質を提供できることになる。
【０１００】
ｖＣＰ２０５またはｖＣＰ３００で免疫したMacaca Fascicularis（サル科マカク属のサル）において、抗体反応（抗ＨＩＶ）が観察されており、このことは、これらの組換体が、さらに利用度の高い有効なものであることを示している。
【０１０１】
従来のＥＬＤＫＷＡやＬＤＫＷは、その本来の形状では免疫原性が高くはないために、その免疫原性を高めたものが本発明の組換体であり、ｇｐ１２０のＶ３ループの中やｇｐ１２０の別の部位の中、あるいは、ｇｐ１６０エンベロープの一部分の形で、免疫系に効果的に免疫原性を与えることができる。
【０１０２】
ＡＬＶＡＣ組換体（ｖＣＰ１３０７）、ＮＹＶＡＣ組換体（ｖＰ１３１３）、ＣＯＰＡＫ組換体（ｖＰ１３１９）は、ＨＩＶ１・ｇｐ１２０＋ＴＭ・遺伝子産物を発現し、そこで、Ｖ３ループが、ＥＬＤＫＷＡ・エピトープの二つのコピを含むように改変される。このｇｐ１２０＋ＴＭ・遺伝子産物（ＥＬＤＫＷＡ・エピトープとともに）は、ｖＣＰ１３０７、ｖＰ１３１３，ｖＰ１３１９に感染した細胞の表面に発現する。
【０１０３】
このＨＩＶ１・ｇｐ１２０＋ＴＭ（またはｇｐ１６０）のＶ３ループは、単に線状ＨＩＶ１エピトープではない線状エピトープの免疫プラットフォームとして使用できるのである。これらの組換体により産生されたｇｐ１２０＋ＴＭ・タンパク質を、ポックスウイルスに感染した細胞から分離することができ、それをサブユニットワクチンの形で（何かの構成成分として、あるいは、抗原物質、免疫物質として）ヒトに接種可能である。この組換体から産生したタンパク質およびそれを抗原にして誘発された抗体をＨＩＶの有無の診断に使用できる。従って、本発明は、ＨＩＶ免疫原および改変したｇｐ１２０およびｇｐ１６０を含む。そのようなエンベロープをベースにした免疫原（ＨＩＶ免疫原または改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０）は、真核または原核発現ベクターからも誘導でき、サブユニット剤として使用できるし、適当な発現プラスミドを使用することで、ＤＮＡ免疫により接種が可能である。ＤＮＡ免疫の技術はすでに公知となっている技術である。このＤＮＡ免疫に関する文献には次のようなものがあり、添付してある。「免疫療法および免疫法のための遺伝子直接移転」(Nabel and Felgner, Tibteck, May 1993, 11; 211-215)、「ＤＮＡワクチンによるインフルエンザからのイタチ（ferret ）の防御」(Webster et al., Vaccine, 1994 12(16), 1495-1498)。組換体である ｖＣＰ１３０７、ｖＰ１３１３、ｖＰ１３１９由来のＤＮＡを、すでに既知であるハイブリダイゼーション法を使用してある特定のサンプルにおけるＨＩＶ・ＤＮＡの検出プローブとして活用できるし、すでに既知の技術でＰＣＲプライマーを作製することにも利用できる。
【０１０４】
外来性免疫原に対して液性免疫と細胞性免疫の両方を誘導する(Tartagliaら,1993a,b; Taylorら、1992; Konishiら、1992)ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ・ベクターの弱毒化されたプロフィールにより、これらの組換体には、すでに述べたワクシニアをベースにした組み換えウイルスよりも明らかに優れた長所がある。
【０１０５】
本発明にかかる組み換えウイルス、免疫原、改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０、ＤＮＡまたは発現物質を、抗原、ワクチン、治療剤として使用する場合に、非経口（皮内、筋肉内、皮下）の投与が可能である。このような投与法が可能であるので、全身的な免疫応答が期待できる。
【０１０６】
より一般的に、本発明の抗原物質、免疫ワクチン物質、免疫治療剤（本発明にかかるポックスウイルス組換体、それからの発現物質、本発明の免疫原、ＤＮＡ、改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０を含む）は、製薬業の当業者にはすでに知られた技術により調剤が可能である。本発明の物質を含む、そのような製剤の投与量は、年齢、性、体重、患者の状況、投与経路などを考慮に入れて、医学の当業者にはすでに既知の方法で決定できる。これらの製剤は、単独で投与してもよいし、別の薬剤と併用してもよいし、順番に投与してもよい。また、別の免疫原や抗原やワクチンと一緒に、または一定の順序で投与してもよく、血清反応陽性者に治療薬として投与してもかまわない。さらに、これらの製剤は、単独で投与してもよいし、別の製剤と併用してもよいし、順番に投与してもよい。また、別の免疫原や抗原やワクチンと一緒にまたは一定の順序で投与してもよく、血清反応陰性者に抗原、免疫原、治療薬として投与してもかまわない。その他の製剤には、免疫不全ウイルスから得た精製抗原や、組み換えポックスウイルスやその他のベクター系の抗原による発現物質から精製した抗原も含み、さらに、其の他の免疫不全抗原や生物学的応答改変物質（例：サイトキニン；共働刺激分子）を発現する組み換えポックスウイルスを含むものである。年齢、性、体重、患者状況、投与経路などのすでに知られている要素を考慮に入れて、本発明の物質と他の製剤を併用投与してもかまわない。投与のために、本発明の物質を、例えば口、鼻、肛門、膣等の開口部から投与できるように液体状の製剤にしてもよいし、懸濁液、シロップ、エリキシル剤の形にしてもよい。皮下、皮内、筋肉内、静脈内などの非経口投与用に懸濁液やエマルジョン、注射液の形にしてもよい。さらに、本発明の組み換えポックスウイルス、それからの発現物質、本発明の免疫原、ＤＮＡ、改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０を、適当なキャリア、希釈剤、蒸留水、生理食塩水、グルコースなどの添加剤に混ぜて使用してもかまわない。
【０１０７】
さらに、本発明の組み換えポックスウイルスが発現する物質は、血清反応陽性または陰性のヒト、または、動物において、免疫応答で促進された用として直接に使用可能である。この発現物質を本発明の物質の代わりに使用してもよいし、本発明の物質に追加して使用してもよい。同様に、本発明の物質を免疫原として使用もできる。
【０１０８】
さらに、本発明の組み換えポックスウイルス、それからの発現物質、本発明の免疫原、改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０は、ヒトおよび動物において、免疫応答、抗体反応を高める。既知の技術を使用して、この抗体からモノクローナル抗体を調製でき、このモノクローナル抗体を、特別な免疫不全ウイルス抗原の有無、従って、そのウイルスの有無、またはウイルスや抗原に対する免疫応答が単に高められたかどうかを決定するための抗体結合アッセイまたは診断キットに利用可能である。これらのモノクローナル抗体は、免疫不全ウイルスまたは本発明の組み換えポックスウイルスの発現物質を発見するための免疫吸着クロマトグラフィーにも適用可能である。
【０１０９】
モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞が産生したイムノグロブリンである。モノクローナル抗体は、単一の抗原決定基と反応し、従来の血清由来の抗体よりもより高い特異性を有する。多数のモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより所望する特異性、結合活性、アイソタイプを有する個別の抗体を選択することができる。ハイブリドーマ細胞系が一定で安価な化学的に同一の抗体ソースを提供し、そのような抗体製剤の標準化を容易に行える。モノクローナル抗体の生産法は当業者にはよく知られた技術であり、例えば、米国特許第４,１９６,２６５(Koprowski)（１９８９年４月）に示されており、参考文献として、ここにも添付してある。
【０１１０】
モノクローナル抗体の使用法も知られた技術である。診断法での応用がその一つであり、例えば、米国特許第４,３７６,１１０(David,  G. およびGreene, H. )（１９８３年３月８日に成立）があり、参考文献として添付してある。モノクローナル抗体は、免疫吸着クロマトグラフィーによる物質の検出にも使用されており、例えば、Scientific American 243:66,70でのMilsten, C. 1980 の論文があり、これも参考文献として添付してある。
【０１１１】
さらに、本発明の組み換えポックスウイルス、それからの発現物質、本発明の免疫原、改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０は、患者への後の再注入ために、in vitroまたはex vivo（体外）で、リンパ球またはＣＴＬのような細胞における反応を高めるのに使用できる。患者が血清反応陰性者の場合には、再注入は、能動免疫のような免疫応答、抗原応答の免疫応答を高めるためのものである。血清反応陽性者の場合には、再注入は免疫不全ウイルスに対する免疫系を刺激して増進させるのが目的である。
【０１１２】
本発明の組換体によるＤＮＡは、サンプル内のＨＩＶ・ＤＮＡの有無を検出するプローブとして使用できるし、ＰＣＲプライマーの作製に応用でき、すでに既知の技術で適当な発現プラズマを使用してＤＮＡ免疫用に使用可能である。（NabelおよびFelgerおよびWebster et al., 前出、を参照されたい）
従って、本発明の組み換えポックスウイルスには、種々の使用法がある。例えば血清陰性者に対して投与する抗原、免疫原、ワクチン組成物として使える。血清陽性者には、治療剤として、免疫不全ウイルスに対する免疫系の強化のために使える。本発明によれば、in vitroで、発明の抗原、免疫原、改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０を作製可能であり、その場合でも、これらの作製したものは、抗原、免疫原、ワクチン組成物または治療剤として使用可能である。本発明の組み換えポックスウイルスを直接に投与するか、このウイルスの発現物質を投与して得られた抗体は、例えば血清等のサンプル中に抗原があるかないか、例えば、血清中の免疫不全ウイルスまたはＣＴＬの有無、ウイルスや特定の抗原に免疫応答を示したかどうかを探知するための診断キット、試験キットに使用され、さらに、免疫吸着クロマトグラフィに使用される。（本発明にかかる免疫原および改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０は、利用価値のある抗体を産生させるために使用可能である。）ハイブリダイゼーション・プローブとして使うＤＮＡやＰＣＲプライマーの作製、ＤＮＡ免疫にも使用（再注入）できる。本発明の組み換えポックスウイルス、それからの発現物質、本発明の免疫原、改変ｇｐ１２０またはｇｐ１６０は、刺激細胞を作製するのに使用でき、その刺激細胞は免疫応答（抗原反応、免疫反応、能動免疫）を刺激し、あるいは、免疫系を高めて強化（例えば、免疫不全患者あるいは血清反応陽性者の免疫系を強化）するのに使用可能である。本発明の実施例としてまだ他の使用法はある。
【０１１３】
本発明について、図面を参照して、下記の例を検討することで、さらに理解が深まり多くの長所を理解できるであろう。
【実施例】
【０１１４】
ＤＮＡクローニングと合成  プラスミドを構築し、スクリーニングし、定法に従って増殖させた（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２；Ｐｅｒｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｐｉｃｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。制限エンドヌクレアーゼは、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡおよびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮより入手した。Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより入手した。ＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼおよびファージＴ４ＤＮＡリガーゼはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓより入手した。試薬は供給者によって特定された方法で用いられた。
【０１１５】
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはＢｉｏｓｅａｒｃｈ８７５０またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ３８０ＢＤＮＡ合成装置により前述のように調製された（Ｐｅｒｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。ＤＮＡシークエンスはジデオキシ法により（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）を用いて前述のとおり行った（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。配列確認のためのＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅（Ｅｎｇｅｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）を、カスタム合成オリゴヌクレオチドプライマーとＧｅｎｅＡｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を用いて自動化Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ＤＮＡサーマルサイクラー中で行った。過剰のＤＮＡ配列を、制限エンドヌクレアーゼ消化とそれに続くＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼによる限定切断および合成ヌクレオチドを用いた突然変異（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，１９８６）によりプラスミド中から除去した。
【０１１６】
細胞、ウイルス、および形質導入  ワクシニアウイルスコペンハーゲン株の起源と培養条件は以前に記述されている（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。組換えによる組換ウイルスの開発、ニトロセルロースフィルターのin situ ハイブリダイゼーションおよびベータガラクトシダーゼ活性によるスクリーニングは以前に記述された（Ｐｉｃｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。
【０１１７】
ワクシニアウイルスコペンハーゲン株およびＮＹＶＡＣの起源と培養条件は以前に記述されている（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｔａｒｔａｇｌｉａ    ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。組換えによる組換ウイルスの開発、ニトロセルロースフィルターのin situ ハイブリダイゼーションおよびベータガラクトシダーゼ活性によるスクリーニングは以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２；Ｐｅｒｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。
【０１１８】
親カナリアポックスウイルス（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ株）はカナリアのためのワクチン株である。このワクチン株は野生株単離体から得られ、ニワトリ胚繊維芽細胞において２００回以上の連続継代を通して弱毒化された。マスターウイルスシードは寒天の下で４回の連続的プラーク精製にかけられ、１つのプラークは５回のさらなる継代により増幅され、そのあとそのストックウイルスが生体外組換えテストにおいて親株として用いられた。プラーク精製されたカナリアポックス単離体はＡＬＶＡＣと命名された。
【０１１９】
ＦＰ−１と命名されたニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ）株は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８ａ）。それは生後一日のニワトリのワクチン接種に有用な弱毒化されたワクチン株である。親ウイルス株Ｄｕｖｅｔｔｅはフランスでニワトリからのニワトリポックスかさぶたとして得られた。このウイルスはニワトリ受精卵中で約５０回連続継代され続いてニワトリ胚繊維芽細胞において２５回継代された。このウイルスは４回の連続的プラーク精製にかけられた。１つのプラーク単離体がさらに初代ＣＥＦ細胞中で増幅され、ＴＲＯＶＡＣと命名され、ストックウイルスとされた。
【０１２０】
ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣウイルスベクターおよびその派生体は以前に記述されたように増殖された（Ｐｉｃｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）。ＶＥＲＯ細胞およびニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）は以前に記述されたように増殖された（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）。
【０１２１】
実施例１    チミジンキナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）の欠失のための
プラスミドｐＳＤ４６０の構築                  
今、図１を参照しているが、プラスミドｐＳＤ４０６は、ｐＵＣ８中にクローン化されたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊ（位置８３３５９−８８３７７）を含んでいる。ｐＳＤ４０６はＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｖｕＩＩで切断され、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊの左側からの１．７ｋｂ断片が、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで消化されたｐＵＣ８中にクローン化され、ｐＳＤ４４７となった。ｐＳＤ４４７はＪ２Ｒ（位置８３８５５−８４３８５）全体の遺伝子を有している。開始コドンはＮｌａＩＩＩ部位内部に含まれ、終止コドンはＳｓｐＩ部位内部に含まれている。転写方向は図１中に矢印で示されている。
【０１２２】
左側の隣接アーム（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ａｒｍ）を得るため、０．８ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＳＤ４４７から単離し、続いてＮｌａＩＩＩで消化し、０．５ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片を単離した。アニーリングさせた合成ヌクレオチドＭＰＳＹＮ４３／ＭＰＳＹＮ４４（配列番号１／配列番号２）
2006141407.tif 000002
を０．５ｋｐＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片とともにＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ１８中へ連結し、プラスミドｐＳＤ４４９を生成した。
【０１２３】
ワクシニア右隣接アームおよびｐＵＣベクター配列を含む制限酵素断片を得るために、ｐＳＤ４４７をワクシニア配列内部においてＳｓｐＩで（部分的に）、そしてＨｉｎｄＩＩＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分において消化し、２．９ｋｂｐのベクター断片を単離した。このベクター断片を、アニーリングさせた合成ヌクレオチドＭＰＳＹＮ４５／ＭＰＳＹＮ４６（配列番号３／配列番号４）
2006141407.tif 000003
と連結し、ｐＳＤ４５９を創出した。
【０１２４】
隣接アームの左側と右側とをひとつのプラスミド中で結合するために、０．５ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ断片をｐＳＤ４４９から単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで消化したｐＳＤ４５９と連結し、プラスミドｐＳＤ４６０を創出した。ｐＳＤ４６０を、野生型親ワクシニアウイルスコペンハーゲン株ＶＣ−２との組換えのドナープラスミドとして用いた。ＭＰＳＹＮ４５（配列番号３）をテンプレートとして、および相補的な２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４７（配列番号５）（５’  ＴＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣ  ３’）をプライマーとして用いたプライマーエクステンション法により、３２Ｐ標識されたプローブを合成した。組換えウイルスｖＰ４１０がプラークハイブリダイゼーションにより同定された。
【０１２５】
実施例２    出血性領域（Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）の欠失のための
プラスミドｐＳＤ４８６の構築                  
今、図２を参照しているが、プラスミドｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８中にクローン化されたワクシニアＳａｌＩ  Ｇ（位置１６０７４４−１７３３５１）を有している。ｐＳＤ４２２は、右側に近接したワクシニアＳａｌＩ断片、ｐＵＣ８中にクローン化されたＳａｌＩ  Ｊ（位置１７３３５１−１８２７４６）を有している。出血性領域、ｕ、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ（位置１７２５４９−１７３５５２）を欠失させたプラスミドを構築するために、ｐＳＤ４１９を左側隣接アームの源として、そしてｐＳＤ４２２を右側の隣接アームの源として用いた。領域ｕの転写方向は図２において矢印で示されている。
【０１２６】
所望でない配列をｐＳＤ４１９から取り除くため、ＮｃｏＩ部位（位置１７２２５３）の左側の配列は、ｐＳＤ４１９をＮｃｏＩ／ＳｍａＩで消化し続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片により平滑末端化したのちライゲーションし、プラスミドｐＳＤ４７６を生成した。ワクシニア右隣接アームは、ｐＳＤ４２２を、Ｂ１４Ｒの終止コドンでＨｐａＩで消化し、そして０．３ｋｂｐ右側をＮｒｕＩで消化して得た。この０．３ｋｂｐ断片を単離し、ｐＳＤ４７６から単離した３．４ｋｂｐのＨｉｎｃＩＩベクター断片と連結し、プラスミドｐＳＤ４７７とした。ワクシニアｕ領域のｐＳＤ４７７の部分的欠失の位置は三角形で示した。残りのプラスミドｐＳＤ４７７中のＢ１３Ｒをコードしている領域配列を、ＣｌａＩ／ＨｐａＩでの消化により取り除き、その結果生じた断片を、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチドＳＤ２２ｍｅｒ／ＳＤ２０ｍｅｒ（配列番号６／配列番号７）
2006141407.tif 000004
と連結させ、ｐＳＤ４７９とした。ｐＳＤ４７９は、ＢａｍＨＩ部位が続いている開始コドン（下線）を有している。Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼをＢ１３−Ｂ１４（ｕ）欠失座中に、ｕプロモーターのコントロール下で配置するため、３．２ｋｂｐのベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）を含むＢａｍＨＩ断片を、ｐＳＤ４７９のＢａｍＨＩに挿入し、ｐＳＤ４７９ＢＧとした。ｐＳＤ４７９ＢＧは、ワクシニアウイルスｖＰ４１０との組換えのドナープラスミドとして用いた。組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３は、色素基質Ｘ−ｇａｌ存在下でプループラークとして単離された。ｖＰ５３３において、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ領域は欠失されベータガラクトシダーゼで置換されていた。
【０１２７】
ベータガラクトシダーゼ配列をｖＰ５３３から取り除くため、ｐＳＤ４７７からの派生体でポリリンカー領域は含むが、ｕ欠失結合部分の開始コドンは有さないｐＳＤ４８６を用いた。第１に、前述のｐＳＤ４７７由来ＣｌａＩ／ＨｐａＩベクター断片を、アニーリングさせた合成ヌクレオチドＳＤ４２ｍｅｒ／ＳＤ４０ｍｅｒ（配列番号８／配列番号９）
2006141407.tif 000005
と連結させ、プラスミドｐＳＤ４７８とした。次にｐＵＣ／ワクシニア結合部分のＥｃｏＲＩ部位を、ｐＳＤ４７８をＥｃｏＲＩで消化し続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片により平滑化し、ライゲーションすることにより破壊して、プラスミドｐＳＤ４７８Ｅ−  とした。ｐＳＤ４７８Ｅ−  をＢａｍＨＩおよびＨｐａＩで消化したのち、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５／ＨＥＭ６（配列番号１０／配列番号１１）
2006141407.tif 000006
と連結し、プラスミドｐＳＤ４８６とした。ｐＳＤ４８６は、組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３との組換えにドナープラスミドとして用いて、Ｘ−ｇａｌ存在下で透明プラークとして単離されたｖＰ５３３を創出した。
【０１２８】
実施例３  ＡＴＩ領域（Ａ２６Ｌ）欠失のための
プラスミドｐＭＰ４９４Δの構築    
今、図３を参照しているが、ｐＳＤ４１４はｐＵＣ８中にクローン化されたＳａｌＩ  Ｂを含んでいる。Ａ２６Ｌ領域の左側の所望でないＤＮＡ配列を取り除くため、ｐＳＤ４１４を、ＸｂａＩでワクシニア配列の内部（位置１３７０７９）で、ＨｉｎｄＩＩＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分で切断し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化しライゲーションし、プラスミドｐＳＤ４８３とした。Ａ２６Ｌ領域の右側の所望でないワクシニア配列を取り除くため、ｐＳＤ４８３をＥｃｏＲＩで切断し（位置１４０６６５およびｐＵＣ／ワクシニア結合部分）、ライゲーションし、プラスミドｐＳＤ４８４とした。Ａ２６Ｌコード領域を除去するため、ｐＳＤ４８４はＮｄｅＩで（部分的に）Ａ２６ＬＯＲＦの僅かに上流を（位置１３９００４）、ＨｐａＩでＡ２６ＬＯＲＦの僅かに下流を（位置１３７８８９）切断した。５．２ｋｂｐのベクター断片を単離し、アニーリングさせた人工合成オリゴヌクレオチドＡＴＩ３／ＡＴＩ４（配列番号１２／配列番号１３）
2006141407.tif 000007
と連結し、Ａ２６Ｌ上流領域を再構築し、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩ制限酵素部位を有する短いポリリンカー領域で、Ａ２６ＬＯＲＦを上記のように置換した。構築されたプラスミドをｐＳＤ４８５と命名した。ｐＳＤ４８５のポリリンカー領域のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位は固有ではないので、所望でないＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位をｐＳＤ４８３（前述）から、ＢｇｌＩＩ（位置１４０１３６）、およびＥｃｏＲＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分を消化し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化することにより取り除いた。生成されたプラスミドをｐＳＤ４８９と命名した。ｐＳＤ４８９由来のＡ２６ＬＯＲＦを含む１．８ｋｂｐのＣｌａＩ（位置１３７１９８）／ＥｃｏＲＶ（位置１３９０４８）断片を、対応するｐＳＤ４８５由来の０．７ｋｂｐポリリンカーを含むＣｌａＩ／ＥｃｏＲＶ断片で置換し、ｐＳＤ４９２を生成した。ｐＳＤ４９２のポリリンカー領域中のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位は固有である。
【０１２９】
Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｐｅｒｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）の支配下で含む３．３ｋｂｐのカセットをｐＳＤ４９２のＢｇｌＩＩ部位に挿入し、ｐＳＤ４９３ＫＢＧとした。プラスミドｐＳＤ４９３ＫＢＧはレスキューウイルスｖＰ５５３の組換えにおいて用いられた。組換えワクシニアウイルスｖｐ５８１は、ベータガラクトシダーゼをＡ２６Ｌ欠失領域内に有し、Ｘ−ｇａｌ存在化でブループラークとして単離された。
【０１３０】
ベータガラクトシダーゼ遺伝子配列を組換えワクシニアウイルスｖＰ５８１から除去するためのプラスミドを開発するために、プラスミドｐＳＤ４９２のポリリンカー領域を、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ１７７（配列番号１４）
（5’ AAAATGGGCGTGGATTGTTAACTTTATATAACTTATTTTTTGAATATAC 3’）
を用いた突然変異により欠失させた（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，１９８６）。生成されたプラスミド、ｐＭＰ４９４Δにおいては、Ａ２６Ｌ  ＯＲＦの全体を含む位置［１３７８８９−１３８９３７］を取り巻くワクシニアウイルスＤＮＡが欠失していた。ｐＭＰ４９４Δと、ベータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体ｖＰ５８１との間での組換えにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ６１８が、Ｘ−ｇａｌ存在下での透明プラークとして単離され、得られた。
【０１３１】
実施例４    血球凝集素遺伝子（Ａ５６Ｒ）の欠失のための
プラスミドｐＳＤ４６７の構築              
今、図４を参照しているが、ワクシニアＳａｌＩ  Ｇ制限酵素断片（位置１６０７４４−１７３３５１）はＨｉｎｄＩＩＩ  Ａ／Ｂ結合部分（位置１６２５３９）で交差している。ｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８中にクローン化されたワクシニアＳａｌＩ  Ｇ断片を有している。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写方向は図１３中に矢印で示されている。ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｂから派生したワクシニア配列は、ｐＳＤ４１９をＨｉｎｄＩＩＩでワクシニア配列内部とｐＵＣ／ワクシニア結合部分を消化し続いてライゲーションすることにより取り除いた。生成されたプラスミド、ｐＳＤ４５６は、ＨＡ遺伝子Ａ５６Ｒを、左に０．４ｋｂｐのワクシニア配列、右に０．４ｋｂｐのワクシニア配列と隣接した状態で有している。Ａ５６Ｒコード配列を、ｐＳＤ４５６をＲｓａＩで（部分的；位置１６１０９０）Ａ５６Ｒコード配列の上流を、またＥａｑＩで（位置１６２０５４）遺伝子の末端ちかくを切断することにより除去した。３．６ｋｂｐＲｓａＩ／ＥａｑＩベクター断片を単離し、アニーリングさせた合成ヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９（配列番号１５）、ＭＰＳＹＮ６２（配列番号１６）、ＭＰＳＹＮ６０（配列番号１７）およびＭＰＳＹＮ６１（配列番号１８）
2006141407.tif 000008
とライゲーションし、Ａ５６Ｒ  ＯＲＦの上流域を再構築し、Ａ５６Ｒ  ＯＲＦを上記のポリリンカー領域で置換した。その結果生成されたプラスミドはｐＳＤ４６６である。プラスミドｐＳＤ４６６中のワクシニア欠失は位置［１６１１８５−１６２０５３］を含んでいる。ｐＳＤ４６６中の欠失部位は図４に三角形で示されている。
【０１３２】
Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）の支配下で含む３．３ｋｂｐのカセットをｐＳＤ４６６のＢｇｌＩＩ部位に挿入し、ｐＳＤ４６６ＫＢＧとした。プラスミドｐＳＤ４６６ＫＢＧはレスキューウイルスｖＰ６１８の組換えにおいて用いられた。組換えワクシニアウイルスｖｐ７０８は、ベータガラクトシダーゼをＡ２６Ｌ欠失部内に有し、Ｘ−ｇａｌ存在化でブループラークとして単離された。
【０１３３】
ベータガラクトシダーゼ配列を、ｖＰ７０８からドナープラスミドｐＳＤ４６７を用いて除去した。ｐＳＤ４６７は、ｐＳＤ４６６をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化した後にＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化しライゲーションして、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ部位がｐＵＣ／ワクシニア結合部分から取り除いてある以外はｐＳＤ４６６と同一である。ｖＰ７０８とｐＳＤ４６７との組換えの結果、組換えワクシニアウイルス欠失変異体、ｖＰ７２３が生成し、Ｘ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離された。
【０１３４】
実施例５    オープンリーディングフレーム［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］の
欠失のためのプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構築    
今は、図５を参照しているが、以下のワクシニアクローンがｐＭＣＳＫ１Δの構築のために利用された。ｐＳＤ４２０はｐＵＣ８中にクローン化されたＳａｌＩ  Ｈである。ｐＳＤ４３５は、ｐＵＣ１８中にクローン化されたＫｐｎＩ  Ｆである。ｐＳＤ４３５はＳｐｈＩで切断され、再び連結され、ｐＳＤ４５１となった。ｐＳＤ４５１中では、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ中のＳｐｈＩ部位（位置２７４１６）の左側のＤＮＡ配列は取り除かれている（Ｐｅｒｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。ｐＳＤ４０９はｐＵＣ８中にクローン化されたＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍである。
【０１３５】
ワクシニア由来の［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］遺伝子クラスターの欠失のための基質を供与するために、Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼが最初にワクシニアＭ２Ｌ欠失座に以下のように挿入された（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。ｐＳＤ４０９中のＢｇｌＩＩ部位を除去するために、プラスミドをワクシニア配列中（位置２８２１２）でＢｇｌＩＩで、そしてＢａｍＨＩでｐＵＣワクシニア結合部分で切断し、続いて連結しｐＭＰ４０９Ｂとした。ｐＭＰ４０９Ｂを固有のＳｐｈＩ部位（位置２７４１６）で切断した。続いてＭ２Ｌコード配列を合成ヌクレオチドを用いた突然変異で除去した（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，１９８６）。
【０１３６】
ＭＰＳＹＮ８２（配列番号１９）
2006141407.tif 000009
その結果生成されたプラスミドｐＭＰ４０９Ｄは、Ｍ２Ｌ欠失座に上記のように挿入された固有のＢｇｌＩＩ部位を含んでいる。Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）の支配下で含む３．２ｋｂｐのＢａｍＨＩ（部分）／ＢｇｌＩＩカセットをｐＭＰ４０９ＤのＢｇｌＩＩ部位に挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＭＰ４０９ＤＢＧはレスキューワクシニアウイルスｖＰ７２３の組換えにおいてドナープラスミドとして用いられた。組換えワクシニアウイルスｖｐ７８４は、Ｍ２Ｌ欠失座に挿入されたベータガラクトシダーゼを有し、Ｘ−ｇａｌ存在下でブループラークとして単離された。
【０１３７】
ワクシニア遺伝子［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠失のためのプラスミドが、ＳｍａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、で切断されＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化されたｐＵＣ８中に集められた。ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｃ配列からなる左隣接アームはｐＳＤ４２０をＸｂａＩで消化し（位置１８６２８）続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化した後ＢｇｌＩＩで消化して（位置１９７０６）得た。ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ配列からなる右隣接アームはｐＳＤ４５１をＢｇｌＩＩ（位置２９０６２）およびＥｃｏＲＶ（位置２９７７８）で消化して得た。その結果生成されたプラスミド、ｐＭＰ５８１ＣＫは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｃ中のＢｇｌＩＩ部位（位置１９７０６）とＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ中のＢｇｌＩＩ部位（位置２９０６２）との間のワクシニア配列を欠失された。プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫ中のワクシニア配列の欠失部位は図５において三角形で示されている。
【０１３８】
ワクシニア欠失結合部位の過剰のＤＮＡを取り除くため、プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫをワクシニア配列内のＮｃｏＩ部位（位置１８８１１；１９６５５）で切断し、Ｂａｌ−３１エキソヌクレアーゼ処理し、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２３３（配列番号２０）
5’-TGTCATTTAACACTATACTCATATTAATAAAAATAATATTTATT-3’
を用いた突然変異にかけた。その結果生成したプラスミド、ｐＭＣＳＫ１Δは、１２のワクシニアオープンリーディングフレーム［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を含む位置１８８０５−２９１０８のワクシニア配列を欠失していた。ｐＭＣＳＫ１Δと、ベータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体ｖＰ７８４との組換えにより、ワクシニア欠失変異体、ｖＰ８０４が生成し、Ｘ−ｇａｌ存在下で透明プラークとして単離された。
【０１３９】
実施例６    リボヌクレアーゼ還元酵素ラージサブユニット（Ｉ４Ｌ）の
欠失のためのプラスミドｐＳＤ５４８の構築              
今、図６を参照しているが、プラスミドｐＳＤ４０５は、ｐＵＣ８中にクローン化されたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｉ（位置６３８７５−７０３６７）を有している。ｐＳＤ４０５をＥｃｏＲＶでワクシニア配列内部（位置６７９３３）を、およびＳｍａＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分を消化し、連結させ、プラスミドｐＳＤ５１８とした。ｐＳＤ５１８はｐＳＤ５４８の構築において用いられた、全てのワクシニア制限断片の供給源として用いられた。
【０１４０】
ワクシニアＩ４Ｌ遺伝子は位置６７３７１−６５０５９にわたっている。Ｉ４Ｌの転写方向は図６中で矢印によって示されている。Ｉ４Ｌコード配列部分を欠失させたベクタープラスミド断片を得るため、ｐＳＤ５１８をＢａｍＨＩ（位置６５３８１）、およびＨｐａＩ（位置６７００１）で消化し、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化した。この４．８ｋｂｐのベクター断片は、Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｐｅｒｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）の支配下で含む３．２ｋｂｐのＳｍａＩカセットと連結され、プラスミドｐＳＤ５２４ＫＢＧとなった。ｐＳＤ５２４ＫＢＧを、ワクシニアウイルスｖＰ８０４との組換えでドナープラスミドとして用いた。組換えワクシニアウイルス、ｖｐ８５５は、ベータガラクトシダーゼをＩ４Ｌ遺伝子部分欠失部位中に含み、Ｘ−ｇａｌ存在下でブループラークとして得られた。
【０１４１】
ベータガラクトシダーゼとＩ４Ｌ  ＯＲＦの残りの部分をｖＰ８５５から欠失させるために、欠失プラスミドｐＳＤ５４８を構築した。左および右ワクシニア隣接アームは別々に、以下に詳細に、および図６中に模式的に示されているようにｐＵＣ８中に集められた。
【０１４２】
左ワクシニア隣接アームを受け入れるベクタープラスミドを構築するために、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチド５１８Ａ１／５１８Ａ２（配列番号２１／配列番号２２）
2006141407.tif 000010
と連結し、プラスミドｐＳＤ５３１とした。ｐＳＤ５３１をＲｓａＩ（部分）およびＢａｍＨＩで切断し、２．７ｋｂｐの断片を単離した。ｐＳＤ５１８をＢｇｌＩＩ（位置６４４５９）／ＲｓａＩ（位置６４９９４）で切断し、０．５ｋｂｐの断片を単離した。２つの断片を連結し、Ｉ４Ｌコード配列の左の完全ワクシニア隣接アームを有するプラスミドｐＳＤ５３７とした。
【０１４３】
右ワクシニア隣接アームを受け入れるためのベクターを構築するため、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチド５１８Ｂ１／５１８Ｂ２（配列番号２３／配列番号２４）
2006141407.tif 000011
と連結させ、ｐＳＤ５３２とした。ｐＳＤ５３２をＲｓａＩ（部分的）／ＥｃｏＲＩで切断し、２．７ｋｂｐのベクター断片を単離した。ｐＳＤ５１８を、ＲｓａＩでワクシニア内部（位置６７４３６）を、ＥｃｏＲＩでワクシニア／ｐＵＣ結合を切断し、０．６ｋｂｐの断片を単離した。この２つの断片を連結し、Ｉ４Ｌコード領域の右の完全ワクシニア隣接アームを含むｐＳＤ５３８とした。
【０１４４】
右ワクシニア隣接アームは、ｐＳＤ５３８由来の０．６ｋｂｐＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片として単離され、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで切断されたｐＳＤ５３７中へ連結された。その結果生成したプラスミドｐＳＤ５３９においては、Ｉ４Ｌ  ＯＲＦ（６５０４７−６７３８６）はポリリンカー領域で置換され、ポリリンカー領域は左で０．６ｋｂｐのワクシニア配列、右で０．６ｋｂｐのワクシニア配列と、すべてｐＵＣのバックグラウンド内部で隣接している。ワクシニア配列内部での欠失部位は、図６で三角形で示されている。組換えワクシニアウイルスｖＰ８５５中のベータガラクトシダーゼ配列と、ｐＳＤ５３９のｐＵＣ派生部分のベータガラクトシダーゼとの、起こりうる組換えを避けるために、ワクシニアＩ４Ｌ欠失カセットがｐＳＤ５３９からｐＲＣ１１へ移動され、ｐＵＣ派生体からすべてのベータガラクトシダーゼを除去し、ポリリンカー領域で置換した（Ｃｏｌｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。ｐＳＤ５３９をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断し、１．２ｋｂｐ断片を単離した。この断片をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断したｐＲＣ１１（２．３５ｋｂｐ）中へ挿入し、ｐＳＤ５４８とした。ｐＳＤ５４８とベータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体ｖＰ８５５との組換えの結果、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８６６が生成し、Ｘ−ｇａｌ存在下で透明プラークとして単離された。
【０１４５】
組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６由来のＤＮＡを、制限酵素消化とそれに続くアガロースゲル上での電気泳動により分析した。制限パターンは期待通りのものであった。ｖＰ８６６をテンプレートとして、上に詳述された６欠失座に隣接するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｅｎｇｅｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）により、期待されたサイズのＤＮＡ断片が生産された。ＰＣＲにより生産された断片の、欠失結合部位の範囲の周りの配列分析により、結合部位は期待された通りであることが確認された。組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６は、上記の６つの操作された欠失を有し、ワクシニアワクチン株「ＮＹＶＡＣ」と命名された。
【０１４６】
実施例７ 狂犬病糖タンパク質  Ｇ遺伝子のＮＹＶＡＣへの挿入
ワクシニアＨ６プロモーター（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）の支配下で狂犬病糖タンパク質  Ｇをコードしている遺伝子を、ＴＫ欠失プラスミドｐＳＤ５１３中に挿入した。ｐＳＤ５１３は、ポリリンカー領域の存在を除いてプラスミドｐＳＤ４６０（図１）と同一である。
【０１４７】
今、図７を参照しているが、ポリリンカー領域はｐＳＤ４６０をＳｍａＩで切断し、プラスミドベクターをアニーリングさせた合成ヌクレオチドＶＱ１Ａ／ＶＱ１Ｂ（配列番号２５／配列番号２６）
2006141407.tif 000012
と連結することにより挿入され、ベクターｐＳＤ５１３を生成した。ｐＳＤ５１３をＳｍａＩで切断し、ワクシニアＨ６プロモーター（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）支配下の狂犬病糖タンパク質  Ｇを含むＳｍａＩ末端化１．８ｋｂｐのカセットと連結した。生成したプラスミドはｐＲＷ８４２と命名された。ｐＲＷ８４２はＮＹＶＡＣレスキューウイルス（ｖＰ８６６）との組換えのドナープラスミドとして用いられた。組換えワクシニアウイルスｖＰ８７９を、狂犬病糖タンパク質  Ｇに対する３２Ｐ−標識ＤＮＡプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションにより同定した。
【０１４８】
本発明の改変組換えウイルスは、組換えワクチンベクターとしての利点を供与する。弱毒化されたベクターの毒性は、ワクチン接種によるワクチン接種された個体内でのランナウェイ感染（ｒｕｎａｗａｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を有利に減少させ、ワクチン接種された個体からされていない個体への伝播もしくは環境への汚染を減少もさせる。
【０１４９】
改変組換えウイルスはまた、遺伝子産物をコードし細胞内で発現する外来遺伝子を有する改変組換えウイルスを、細胞内に導入することにより、生体外で培養された細胞中での遺伝子発現の方法にもまた有利に用いることができる。
【０１５０】
実施例８    ニューカッスル病ウイルスの
融合および血球凝集素ノイラミニダーゼ糖タンパク質を発現する
ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶの構築                                
本実施例では、ニワトリポックスウイルスベクターＴＲＯＶＡＣ、およびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶと命名されたニワトリポックスニューカッスル病ウイルス組換体の開発、およびその安全性並びに効率を記述する。毒性ＮＤＶ株テキサスのＦおよびＨＮ遺伝子を両方発現するニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ）ベクターを構築した。創出された組換体はＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶと命名された。ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶは実際にプロセシングされたＮＤＶ糖タンパク質を、組換えウイルスを感染させた鳥類細胞中で発現し、生後１日のニワトリへの接種により、それに続く毒性ＮＤＶ投与に対して防御する。
【０１５１】
細胞とウイルス  ＮＤＶテキサス株は短期潜伏性の株である。ＦおよびＨＮ遺伝子のｃＤＮＡの調製は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｅｄｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。ＦＰＶウイルスのＦＰ−１と命名された株は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８ａ）。それは生後１日のニワトリのワクチン接種に有用なワクチン株である。親ウイルス株Ｄｕｖｅｔｔｅはフランスでニワトリからのニワトリポックスのかさぶたとして得られた。ウイルスはふ化鶏卵における約５０回の連続継代とそれに続くニワトリ胚繊維芽細胞で２５回の継代により弱毒化された。ウイルスは４回の連続プラーク精製にかけられた。１つのプラーク単離体を初代ＣＥＦ細胞中で増幅し、ＴＲＯＶＡＣと命名されたストックウイルスとした。この生体外組換えテストでＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶを生成するために用いられたストックウイルスは、プラーク単離体から初代ＣＥＦ中で１２回の継代にかけられた。
【０１５２】
ＮＤＶ−Ｆのカセットの構築  ５’末端からの２２ヌクレオチドを除く全てのＦタンパク質をコードしている配列を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ断片を、ｐＮＤＶ８１（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）から切り出し、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＣＥ１３とした。以前に記述されたワクシニアウイルスＨ６プロモーター（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８ａ，ｂ；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｐｅｒｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）は、ｐＣＥ１３をＳａｌＩで消化し、粘着末端をＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で充填し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより、ｐＣＥ１３中に挿入した。Ｈ６プロモーター配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、続いてｐＣＥ１３中に挿入し、ｐＣＥ３８とした。完全５’末端は、ｐＣＥ３８をＫｐｎＩおよびＮｒｕＩで消化し、アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドＣＥ７５（配列番号２７）およびＣＥ７６（配列番号２８）を挿入して生成し、ｐＣＥ４７を生成した。
【０１５３】
（配列番号）
CE75:
CGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGCTCCAGATCTTCTACCAGGATCCCGGTAC
CE76:
CGGGATCCTGGTAGAAGATCTGGAGCCCATTACGATACAAACTTAACGGATATCG
ＮＤＶ−Ｆの３’末端非コード領域を取り除くため、ｐＣＥ１３由来のＳｍａＩからＰｓｔＩ断片をｐＵＣ１８のＳｍａＩおよびＰｓｔＩ部位に挿入し、ｐＣＥ２３とした。非コード領域をｐＣＥ２３のＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＳＩヌクレアーゼおよびＥｃｏＲＩによる連続的消化により除去した。アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドＣＥ４２（配列番号２９）およびＣＥ４３（配列番号３０）を続いて挿入しｐＣＥ２９とした。
【０１５４】
CE42:AATTCGAGCTCCCCGGG
CE43:CCCGGGGAGCTCG
ＮＤＶ−Ｆ配列の３’末端を続いて、既にｐＣＥ２９からのＰｓｔＩ−ＳａｃＩ断片をｐＣＥ２０のＰｓｔＩ−ＳａｃＩ部位に挿入することによりＮＤＶ−Ｆの５’末端を有しているプラスミドｐＣＥ２０に挿入しｐＣＥ３２とした。ｐＣＥ２０の開発は以前にＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０中で記述された。
【０１５５】
Ｈ６プロモーターおよびｐＣＥ４７に含まれているＮＤＶ−Ｆ５’配列を、ｐＣＥ３２に含まれている３’ＮＤＶ−Ｆ配列とを整列させるために、ｐＣＥ４７のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＣＥ３２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位へ挿入し、ｐＣＥ４９とした。Ｈ６プロモートされたＮＤＶ−Ｆは続いてＯＲＦを除いたＦ８座（以下に記述）へ、ｐＣＥ４９由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｒｕＩ断片をｐＪＣＡ００２（以下に記述）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩ部位へ挿入することにより移し、ｐＣＥ５４とした。ｐＣＥ５４をＳａｃＩで、部分的にＢａｍＨＩで消化し、アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドＣＥ１６６（配列番号３１）およびＣＥ１６７（配列番号３２）を挿入することにより、ｐＣＥ５４へ転写終結シグナルを挿入し、ｐＣＥ５８とした。
【０１５６】
（配列番号）
CE166:CTTTTTATAAAAAGTTAACTACGTAG
CE167:GATCCTACGTAGTTAACTTTTTATAAAAAGAGCT
ＮＤＶ−Ｆ完全３’末端を、ｐＣＥ５４をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＣＥ１８２（配列番号３３）およびＣＥ１８３（配列番号３４）をプライマーとしたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得た。
【０１５７】
（配列番号）
CE182:CTTAACTCAGCTGACTATCC
CE183:TACGTAGTTAACTTTTTATAAAAATCATATTTTTGTAGTGGTC
ＰＣＲ断片はＰｖｕＩＩおよびＨｐａＩにより消化させ、ＨｐａＩおよび部分的にＰｖｕＩＩにより消化したｐＣＥ５８中へクローン化した。その結果生成されたプラスミドはｐＣＥ６４と命名された。ｐＣＥ６４由来の完全Ｈ６プロモーターおよびＦコード配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片を、ｐＲＷ８４６のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ部位にクローン化することにより、翻訳終結シグナルを挿入し、最終ＮＤＶ−ＦカセットであるｐＣＥ７１を生成した。プラスミドｐＲＷ８４６は実質的にｐＪＣＡ００２（以下に記述）と同一ではあるが、Ｈ６プロモーターおよび転写並びに翻訳終結シグナルを有している。ｐＲＷ８４６をＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｐａＩで消化することによって、Ｈ６プロモーターは除かれるが停止シグナルは手つかずで残る。
【０１５８】
ＮＤＶ−ＨＮカセットの構築  プラスミドｐＲＷ８０２の構築は以前にＥｄｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０中で記述された。このプラスミドはワクシニアウイルスＨ６プロモーターの３’末端に連結したＮＤＶ−ＨＮ配列をｐＵＣ９ベクター中に有している。ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの５’末端を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＲＷ８０２のＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶ部位に挿入しｐＲＷ８３０とした。アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドＣＥ１６２（配列番号３５）およびＣＥ１６３（配列番号３６）をｐＲＷ８３０に挿入することにより、ＮＤＶ−ＨＮの完全３’末端を得て、最終ＮＤＶ−ＨＮカセットであるｐＣＥ５９を生成した。
【０１５９】
（配列番号）
CE162:
AATTCAGGATCGTTCCTTTACTAGTTGAGATTCTCAAGGATGATGGGATTTAATTTTTATAAGCTTG
CE163:
AATTCAAGCTTATAAAAATTAAATCCCATCATCCTTGAGAATCTCAACTAGTAAAGGAACGATCCTG
ＦＰＶ挿入ベクターの構築  プラスミドｐＲＷ７３１−１５は、ゲノムＤＮＡからクローン化された１０ｋｂｐのＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片をコードしている。３６６０ｂｐのＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片の両方の鎖に関してヌクレオチド配列が決定され図１１に示されている（配列番号６７）。ここでＦ８と名付けられたオープンリーディングフレームの限定が決定された。プラスミドｐＲＷ７６１は２４３０ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶ断片を含むｐＲＷ７３１−１５のサブクローンである。Ｆ８オープンリーディングフレームの全体は、ｐＲＷ７６１中のＸｂａＩ部位およびＳｓｐＩ部位の間に含まれている。ＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡとの組換えにおいてＦ８ＯＲＦを取り除く挿入プラスミドを創出するために、以下の工程が行われた。プラスミドｐＲＷ７６１を完全にＸｂａＩで、部分的にＳｓｐＩで消化した。ゲルから単離された３７００ｂｐのＸｂａＩ−ＳｓｐＩバンドをアニーリングさせた２本鎖オリゴヌクレオチドＪＣＡ０１７（配列番号３７）およびＪＣＡ０１８（配列番号３８）と連結した。
【０１６０】
（配列番号）
JCA017:5’
CTAGACACTTTATGTTTTTTAATATCCGGTCTTAAAAGCTTCCCGGGGATCCTTATACGGGGAATAAT
JCA018:5’
ATTATTCCCCGTATAAGGATCCCCCGGGAAGCTTTTAAGACCGGATATTAAAAAACATAAAGTGT
このライゲーションの結果生成されたプラスミドはｐＪＣＡ００２と命名された。
【０１６１】
ＮＤＦ  ＦおよびＨＮの二重挿入ベクターの構築  Ｈ６プロモートされたＮＤＶ−ＨＮ配列を、Ｈ６プロモートされたＮＤＶ−Ｆカセット中に、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で充填したｐＣＥ５９由来のＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＣＥ７１のＨｐａＩ部位へクローン化することにより挿入し、ｐＣＥ８０とした。プラスミドｐＣＥ８０は完全にＮｄｅＩで、部分的にＢｇｌＩＩで部分的に消化し、Ｆ８隣接アームに連結し、ともにＨ６プロモーターによって駆動されているＮＤＶ  ＦおよびＨＮ遺伝子を含む４７６０ｂｐ断片を生成した。プラスミドｐＪＣＡ０２１は、ｐＲＷ７３１−１５由来の４９００ｂｐのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄＩＩ断片をｐＢＳＳＫ＋  のＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩに挿入することにより得られた。プラスミドｐＪＣＡ０２１を続いてＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ｐＣＥ８０の４７６０ｂｐのＮｄｅＩ−ＢｇｌＩＩ断片と連結し、ｐＪＣＡ０２４とした。プラスミドｐＪＣＡ０２４は、それ故、ＦＰＶ隣接アームの間に３’末端が隣接した逆向きの方向で挿入されたＮＤＶ−ＦおよびＨＮ遺伝子を有している。両方の遺伝子はワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結されている。ＮＤＶ−Ｆ配列に近い右隣接アームは２３５０ｂｐのＦＰＶ配列からなる。ＮＤＶ−ＨＮ配列に近い左隣接アームは１７００ｂｐＦＰＶ配列からなる。
【０１６２】
ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶの開発  プラスミドｐＪＣＡ０２４を、ＴＲＯＶＡＣを感染させた初代ＣＥＦ細胞中に、以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２；Ｐｉｃｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）リン酸カルシウム沈殿法を用いて形質導入した。陽性プラークを、ＮＤＶ−ＦおよびＨＮ特異的放射性標識プローブとのハイブリダイゼーションに基づいて選択し、続いて純粋な集団が達成されるまでプラーク精製の連続的過程にかけた。続いて１つの代表プラークを増幅し、その結果得られたＴＲＯＶＡＣ組換体はＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ（ｖＦＰ９６）と命名された。
【０１６３】
免疫蛍光  直接的ではない免疫蛍光を、記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、ポリクローナル抗ＮＤＶ血清、およびモノ特異的試薬として、ＮＤＦ−ＶまたはＮＤＶ−ＨＮを発現するワクシニアウイルス組換体に対するウサギ体内で作られた血清を用いて行った。
【０１６４】
免疫沈降  免疫沈降反応を、記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）ＳＰＡＦＡＳ  Ｉｎｃ．Ｓｔｏｒｒｓ，ＣＴより得たポリクローナル抗ＮＤＶ血清を用いて行った。
【０１６５】
ストックウイルスを、Ｆ８ＯＲＦのが欠失されていることを確認するためにin situ プラークハイブリダイゼーションにより選別した。ＴＲＯＶＡＣゲノムへのＮＤＶ遺伝子の正確な挿入およびＦ８ＯＲＦの欠失は、サザンブロットハイブリダイゼーションによってもまた確認された。
【０１６６】
ＮＤＶ感染細胞中では、Ｆ  糖タンパク質は、カルボキシル末端付近の疎水性膜貫通領域によって膜に固定され、プレカーサーＦ０  の、２つのジスルフィド結合したポリペプチドＦ１  およびＦ２  への翻訳後の切断を必要とする。Ｆ０  の切断は、与えられたＮＤＶ株の病原性の決定において重要であり（Ｈｏｍｍａ  ａｎｄ  Ｏｃｈｉａｉ，１９７３；Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６；Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０）、切断部位のアミノ酸配列は、それ故にウイルスの毒性の決定に重要である。ＦＰＶ中に挿入され、組換体ｖＦＰ２９を生成したＮＤＶ−Ｆ配列中の切断部位のアミノ酸は、配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号３９）（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）を有し、これは毒性ＮＤＶ株で要求されると判明している配列（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｅｓｐｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；ＭｃＧｉｎｎｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８６；Ｔｏｙｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）と一致していた。ＮＤＶ毒性株に感染した細胞中で合成されるＨＮ糖タンパク質は切断されていない７４ｋＤａの糖タンパク質である。例えばＵｌｓｔｅｒおよびＱｕｅｅｎｓｌａｎｄのような極端に無毒性の株は、活性化には切断を要求するＨＮ（ＨＮ０  ）をコードしている（Ｇａｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０）。ＦおよびＨＮ遺伝子のＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ中での発現を、遺伝子産物が正確にプロセシングされ、提供されているかどうかを確認するために分析した。ポリクローナル抗ＮＤＶニワトリ血清を用いた、直接的ではない免疫蛍光により、免疫活性なタンパク質が感染細胞の表面に提供されていることが確認された。両方のタンパク質が原形質膜上に提供されていることを決定するために、ＦもしくはＨＮ糖タンパク質のいずれかを発現するワクシニア組換体に対するモノ特異的ウサギ血清が生成された。これらの血清を用いた直接的でない免疫蛍光により、両方のタンパク質の表面での提供が確認された。
【０１６７】
免疫沈降実験を、親および組換えウイルスに感染させたＣＥＦ細胞の（３５Ｓ）メチオニン標識破砕物を用いて行った。Ｆ１  およびＦ２  のグリコシル化された状態での見かけの分子量の期待値は、それぞれ５４．７および１０．３ｋＤａである（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）。ポリクローナル抗ＮＤＶ血清を用いた免疫沈降実験において、適当なサイズの融合特異的産物がＮＤＶ−Ｆ単独組換体ｖＦＰ２９（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）およびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ二重組換体ｖＦＰ９６から検出された。適切なサイズのＨＮ糖タンパク質もまたＮＤＶ−ＮＨ単独組換体ｖＦＰ４７（Ｅｄｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）およびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶから検出された。感染させなかった細胞、および親ＴＲＯＶＡＣを感染させたＣＥＦ細胞からはＮＤＶ特異的産物は検出されなかった。
【０１６８】
ＣＥＦ細胞においてＦおよびＨＮ糖タンパク質は、適切に細胞表面上に提供され、そこにおいてそれらはＮＤＶ免疫血清によって認識された。免疫沈降分析により、毒性株で要求されるようにＦ０  タンパク質は正確にＦ１  およびＦ２  成分へと切断されることが示された。同じようにＨＮ糖タンパク質は組換体ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶに感染させたＣＥＦ細胞中で正確にプロセシングされた。
【０１６９】
以前の報告（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｅｄｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０ａ，ｂ，ｃ；Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）では、ＨＮもしくはＦのいずれかのみの発現で、ＮＤＶ投与に対する防御免疫の誘導には十分であると示唆されていた。しかしながら、他のパラミクソウイルスについての研究により、十分な防御免疫には両方のタンパク質に対する抗体要求され得ることが示唆されている。ＳＶ５ウイルスはＨＮ糖タンパク質に対する抗体の存在下で組織培養中に拡散できるが、Ｆ糖タンパク質に対する抗体の場合はできない。（Ｍｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０）。加えて、殺された麻疹ウイルスワクチンでのワクチン失敗は融合成分の不活性化によるものであると提案されている（Ｎｏｒｒｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５）。両方のＮＤＶ糖タンパク質はウイルス中和抗体の誘導に反応性である（Ａｖｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９）、および両方の糖タンパク質は、独立してニワトリポックスベクターで発現された場合にも防御的免疫反応を誘導できることが示されているが、最も効果的なＮＤＶワクチンには両方の糖タンパク質を発現しなくてはならないことが理解されている。
【０１７０】
実施例９    狂犬病ウイルス糖タンパク質  Ｇを発現する
ＡＬＶＡＣ組換体の構築                  
本実施例では、カナリアポックスウイルスベクター、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）と命名されたカナリアポックス−狂犬病組換体の開発およびその安全性と効率を記述する。
【０１７１】
細胞とウイルス  親カナリアポックス（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ株）はカナリアのためのワクチン株である。ワクチン株は野生株単離体から得られ、ニワトリ胚繊維芽細胞上で２００回以上の継代を通して弱毒化された。マスターウイルスシードは４回の連続した寒天下プラークハイブリダイゼーションにかけられ、１つのプラーククローンがさらに５回の付加的な継代により増幅され、その後ストックウイルスが親株として生体外組換え試験において用いられた。プラーク精製されたカナリアポックス単離体はＡＬＶＡＣと命名された。
【０１７２】
カナリアポックス挿入ベクターの構築  ８８０ｂｐのカナリアポックスＰｖｕＩＩ断片を、ｐＵＣ９中のＰｖｕＩＩ部位の間にクローン化し、ｐＲＷ７６４．５とした。この断片の配列を図８（配列番号６６）中の位置１３７２および２２５１の間に示す。Ｃ５と命名されたオープンリーディングフレームの限定が決定された。オープンリーディングフレームは断片中の位置１６６から開始され、位置４８７で終了することが決定された。オープンリーディングフレームに干渉することなくＣ５の欠失がなされた。位置１６７から位置４５５までの塩基は配列（配列番号３９）
ＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴ
により置換された。この置換用配列はＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、およびＥｃｏＲＩ挿入部位および、それに続くワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼによって認識される翻訳停止および転写終結シグナル（Ｙｕｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）を有している。Ｃ５  ＯＲＦ欠失は以下に記述されるように行った。プラスミドｐＲＷ７６４．５を部分的にＲｓａＩで切断し、線状産物を単離した。ＲｓａＩ線状断片を再びＢｇｌＩＩで切断し、今、位置１５６から位置４６２へのＲｓａＩからＢｇｌＩＩへの欠失のあるｐＲＷ７６４．５断片を単離し、以下の合成ヌクレオチドのためのベクターとして用いた：
（配列番号４０および４１）
2006141407.tif 000013
オリゴヌクレオチドＲＷ１４５およびＲＷ１４６をアニーリングさせ、ｐＲＷ７６４．５ＲｓａＩおよびＢｇｌＩＩベクターに上記のように挿入した。その結果生成されたプラスミドはｐＲＷ８３１と命名された。
【０１７３】
狂犬病Ｇ遺伝子を含む挿入ベクターの構築  ｐＲＷ８３８の構築を以下に記述する。オリゴヌクレオチドＡからＥは、Ｈ６プロモーターの翻訳開始コドンおよび狂犬病ＧのＡＴＧとオーバーラップしているが、これらをｐＵＣ９中にｐＲＷ７３７としてクローン化した。オリゴヌクレオチドＡからＥはＨ６プロモーター、ＮｒｕＩでの開始、狂犬病ＧのＨｉｎｄＩＩＩを通ってそれに続くＢｇｌＩＩを含んでいる。
【０１７４】
オリゴヌクレオチドＡからＥ（(配列番号４２)−(配列番号４６)）の配列は：
2006141407.tif 000014
アニーリングさせたオリゴヌクレオチドＡからＥの配置は以下の通りである：
2006141407.tif 000015
オリゴヌクレオチドＡからＥをキナーゼ処理し、アニーリングさせ（９５℃、５分間、続いて室温まで冷却）、ｐＵＣ９のＰｖｕＩＩ部位に挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ７３７を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、ｐｔｇ１５５ＰＲＯ（Ｋｉｅｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）の１．６ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片のためのベクターとして用い、ｐＲＷ７３９を生成した。ｐｔｇ１５５ＰＲＯのＨｉｎｄＩＩＩ部位は狂犬病Ｇ遺伝子の翻訳開始コドンから８６ｂｐ下流にある。ＢｇｌＩＩはｐｔｇ１５５ＰＲＯ中の狂犬病Ｇ遺伝子翻訳終了コドンの下流にある。ｐＲＷ７３９を部分的にＮｒｕＩで切断し、完全にＢｇｌＩＩで切断し、以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８ａ，ｂ；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｐｅｒｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）Ｈ６プロモーターの３’末端を狂犬病Ｇ遺伝子全体を通して含んでいる１．７ｋｂｐのＮｒｕＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ｐＲＷ８２４のＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩ部位の間に挿入した。その結果生成されたプラスミドはｐＲＷ８３２と命名された。ｐＲＷ８２４への挿入によりＮｒｕＩのＨ６プロモーター５’を付加した。ｐＲＷ８２４の、ＳｍａＩが続いているＢａｍＨＩの配列は（配列番号４７）：ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧである。ｐＲＷ８２４は、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターに正確に連結した非関連遺伝子を有している。ＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩでの消化によりこの非関連遺伝子を完全に切り出した。１．８ｋｂｐｐＲＷ８３２のＳｍａＩ断片は、Ｈ６プロモートされた狂犬病Ｇを有しており、ｐＲＷ８３１のＳｍａＩ部位中に挿入され、プラスミドｐＲＷ８３８を生成した。
【０１７５】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧの開発  プラスミドｐＲＷ８３８を、ＡＬＶＡＣを感染させた初代ＣＥＦ細胞に、以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２；Ｐｉｃｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）リン酸カルシウム沈殿法により形質導入した。狂犬病Ｇ遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な集団が達成させるまで６回の連続したプラーク精製過程にかけた。１つの代表プラークが続いて増幅され、その結果生成されたＡＬＶＡＣ組換体はＡＬＶＡＣ−ＲＧと命名された（ｖＣＰ６５）（図９Ａおよび９Ｂもまた参照されたい）。狂犬病Ｇ遺伝子のＡＬＶＡＣゲノムへの、続いて起こる変異なしでの正確な挿入を、配列分析により確認した。
【０１７６】
免疫蛍光  成熟狂犬病ウイルス粒子の集合の最後の段階で、糖タンパク質成分はゴルジ体から、細胞質へ伸長しているカルボキシ末端および細胞膜の外側表面上のタンパク質のバルクとともにそれが蓄積する原形質膜へと輸送される。ＡＬＶＡＣ−ＲＧで発現された狂犬病糖タンパク質が正確に提供されていることを確認するために、ＡＬＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させた初代ＣＥＦ細胞について免疫蛍光を行った。免疫蛍光は以前に記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、狂犬病Ｇモノクローナル抗体を用いて行った。ＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させたＣＥＦ細胞では強力な表面蛍光が検出されたが、親ＡＬＶＡＣに感染させたものは検出されなかった。
【０１７７】
免疫沈降  予め形成された初代ＣＥＦ単層、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓細胞の系統、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１）およびＭＲＣ−５細胞（ノーマルヒト胎児肺組織から派生した繊維芽様細胞系統、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１）を、１０ｐｆｕの親ウイルスＡＬＶＡＣおよび組換えウイルスＡＬＶＡＣ−ＲＧで放射性標識３５Ｓ−メチオニンの存在下で接種し、以前に記述されたように処理した（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。免疫沈降を、狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いて行った。約６７ｋＤａの分子量の狂犬病特異的糖タンパク質の効果的な発現が組換体ＡＬＶＡＣ−ＲＧに関して検出された。感染させていない細胞もしくは親ＡＬＶＡＣウイルスに感染させた細胞においては、狂犬病特異的産物は検出されなかった。
【０１７８】
連続継代実験  非鳥類種の範囲でのＡＬＶＡＣウイルスの研究においては、拡散的感染も明白な病気も観察されなかった（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１ｂ）。しかしながら、親も組換体もどちらも非鳥類種細胞中で増殖可能に適応しないようにするために、連続継代実験を行った。
【０１７９】
２つのウイルス、ＡＬＶＡＣとＡＬＶＡＣ−ＲＧを３種類の細胞系統で１０連続盲継代（ｂｌｉｎｄ  ｐａｓｓａｇｅ）を行った：
（１）１１日経過白レグホン胚から調製された初代ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞；
（２）Ｖｅｒｏ細胞−アフリカミドリザル腎臓細胞の連続系統（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１）；
（３）ＭＲＣ−５細胞−ヒト胎児肺組織から派生した二倍体細胞系統（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１）。
【０１８０】
最初の接種は０．１ｐｆｕ／細胞のｍ．ｏ．ｉで、一皿あたり２×１０６  の細胞を含む３枚の６０ｍｍのディッシュを用いて行った。ひとつのディッシュは、４０μｇ／ｍｌのＤＮＡ複製阻害剤シトシンアラビノシド（Ａｒａ  Ｃ）の存在下で接種した。１時間、３７℃での吸収期間の後、接種物を取り除き、単層を吸収されなかったウイルスを除去するために洗浄した。このとき、培地を、２つのディッシュ（試料ｔ０からｔ７）では５ｍｌのＥＭＥＭ＋２％  ＮＢＣＳで、第３のディッシュでは４０μｇ／ｍｌのＡｒａ  Ｃを含む５ｍｌのＥＭＥＭ＋２％  ＮＢＣＳで（試料ｔ７Ａ）置換した。残存投入ウイルスの指標を提供するため、試料ｔ０は−７０℃で凍結した。試料ｔ７およびｔ７Ａを３７℃で７日間保温し、その後で内容物を回収し細胞を非直接的超音波破砕により破砕した。
【０１８１】
それぞれの細胞系統のｔ７試料の１ｍｌを希釈せずに、同じ細胞系統の３枚のディッシュ（試料ｔ０、ｔ７およびｔ７Ａを提供するため）に、そして１枚の初代ＣＥＦ細胞のディッシュに接種した。試料ｔ０、ｔ７およびｔ７Ａを継代１として扱った。付加的なＣＥＦ細胞への接種は、非鳥類種の細胞中に存在するかも知れないウイルスの、より高感度の検出のための増幅工程である。
【０１８２】
この工程を１０回（ＣＥＦおよびＭＲＣ−５）または８回（Ｖｅｒｏ）の連続盲継代について繰り返した。試料は続いて３回凍結、融解させ、初代ＣＥＦ単層上での滴定によりアッセイした。
【０１８３】
それぞれの試料中のウイルス収量を、寒天下のＣＥＦ単層上のプラーク滴定により決定した。まとめた実験の結果を表１および２に示す。
【０１８４】
結果より、親ＡＬＶＡＣおよび組換体ＡＬＶＡＣ−ＲＧは両方ともＣＥＦ単層上で力価の損失なしに持続した複製が可能であることが示唆された。Ｖｅｒｏ細胞においては、ＡＬＶＡＣは２回の継代で、そしてＡＬＶＡＣ−ＲＧは１回の継代で、ウイルスレベルは検出レベル以下に低下した。ＭＲＣ−５細胞においては、同様の結果が明白となり、１継代の後はウイルスは検出されなかった。表５および６には４継代の結果のみを示したが、この一連の工程はＶｅｒｏについては８継代、ＭＲＣ−５については１０継代続けたが、いずれのウイルスも非鳥類種細胞中で増殖可能であるような検出可能な適応は無かった。
【０１８５】
継代１においては、比較的高いレベルのウイルスが、ＭＲＣ−５およびＶｅｒｏ細胞のｔ７試料中に存在していた。しかしながら、このウイルスのレベルはｔ０試料、およびウイルス複製が起こり得ないシトシンアラビノシドの存在下で保温されたｔ７Ａ試料においてみられたものと同等であった。このことは、非鳥類種細胞で７日に見られたウイルスレベルは、新たに複製されたウイルスではなく残存ウイルスを示していることを表している。
【０１８６】
アッセイをより敏感にするため、それぞれの細胞系統からの７日の回収物を許容的ＣＥＦ単層に接種し、細胞改変効果（ＣＰＥ）が得られた時点、またＣＰＥが見られなかった場合は７日で回収した。この実験の結果を表３に示す。許容的細胞系統を通した増幅の後ですらも、ＭＲＣ−５およびＶｅｒｏ細胞は付加的な２継代においてのみ検出された。これらの結果は、用いられた条件においては、いずれのウイルスもＶｅｒｏもしくはＭＲＣ−５細胞中での増殖への適応は無かったことを示している。
【０１８７】
サル科マカク属のサル（Ｍａｃａｑｕｅ）への接種  ４匹のＨＩＶ血清陽性サル科マカク属のサルに、最初にＡＬＶＡＣ−ＲＧで表８に記述したように接種した。１００日後、これらの動物の追加免疫効果を決定するために再接種し、さらに付加的に７匹の動物をある投与量範囲で接種した。血液を適当な間隔で取り出し、５６℃、３０分間熱失活させた後、抗狂犬病抗体の存在について、高速蛍光焦点阻害アッセイ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３）を用いて血清を分析した。
【０１８８】
チンパンジーへの接種  ２匹の雄成チンパンジー（５０−６５ｋｇの体重範囲）を、１×１０７  ｐｆｕのｖＣＰ６５で筋肉内または皮下で接種した。動物は反応を観察し、ＲＦＦＩ試験（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３）による抗狂犬病抗体の存在分析のために定期的に採血した。動物を、最初の接種から１３週間後に同じ投与量で再接種した。
【０１８９】
マウスへの接種  マウスの群を５０−１００μｌの範囲の異なったバッチのｖＣＰ６５の希釈液で接種した。マウスは足部で接種された。１４日目に、１５−４３マウスＬＤ５０の狂犬病ウイルス毒性ＣＶＳ株を頭蓋内投与で投与した。マウスの生存を観察し、５０％防御率（ＰＤ５０）を、投与後２８日に計算した。
【０１９０】
イヌおよびネコへの接種  生後５ヶ月の１０匹のビーグル犬および生後４ヶ月の１０匹のネコに、６．７もしくは７．７ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０のＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下で接種した。４匹のイヌおよびネコには接種しなかった。接種の１４および２８日後に動物から採血し、抗狂犬病抗体をＲＦＦＩ試験で評価した。６．７ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０のＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した動物には接種の２９日後に、３．７ｌｏｇ１０マウスＬＤ５０（イヌ）もしくは４．３ｌｏｇ１０マウスＬＤ５０（ネコ）のＮＹＧＳ狂犬病ウイルス投与株を投与した。
【０１９１】
リスザルへの接種  ４匹のリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）の３つの群に、３つのウイルス、（ａ）ＡＬＶＡＣ、親カナリアポックスウイルス、（ｂ）ＡＬＶＡＣ−ＲＧ、狂犬病Ｇ遺伝子を発現する組換体、または（ｃ）ｖＣＰ３７、ネコ白血病ウイルスエンベローブ糖タンパク質を発現するカナリアポックス組換体、の１つを接種した。接種は、ケタミン麻酔（ｋｅｔａｍｉｎｅ  ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ）のもとで行った。各々の動物は同時：（１）２０μｌを右目の表面に傷付処理なしに点眼；（２）１００μｌを口内へいくつかの水滴として；（３）１００μｌを、右腕の外側表面の剃った皮膚上の２つの皮内接種部位それぞれに；（４）１００μｌを右大腿部前方筋肉内に接種された。
【０１９２】
４匹のサルに各々のウイルスを、２匹はトータルで５．０ｌｏｇ１０ｐｆｕ、２匹はトータルで７．０ｌｏｇ１０ｐｆｕ接種した。動物から規則的な間隔で採血し、血清をＲＦＦＩ試験（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３）を用いて抗狂犬病抗体の存在に関して分析した。動物のワクチン接種に対する反応を毎日観察した。最初の接種の６ヶ月後、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種された４匹のサル、最初にｖＣＰ３７を接種された２匹のサル、最初にＡＬＶＡＣを接種された２匹のサルに加えて接種されていないサルに、６．５ｌｏｇ１０ｐｆｕのＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下接種した。ＲＦＦＩ試験（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３）により狂犬病中和抗体の存在について血清を観察した。
【０１９３】
ヒト細胞系統へのＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種  ウイルスが生産的に複製されない非鳥類種細胞中で、外来遺伝子の効率的な発現が得られるか否かを決定するため、５つの細胞型、１つは鳥類種で４つは非鳥類種を、ウイルス収量、外来狂犬病Ｇ遺伝子の発現およびウイルス特異的ＤＮＡ蓄積に関して分析した。接種された細胞は：
（ａ）Ｖｅｒｏ、アフリカミドリザル腎臓細胞、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１；
（ｂ）ＭＲＣ−５、ヒト胚肺、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１；
（ｃ）ＷＩＳＨ、ヒト羊膜、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２５；
（ｄ）デトロイト−５３２、ヒト包皮、ダウン症、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ５４；および
（ｅ）初代ＣＥＦ細胞。
【０１９４】
１１日経過白レグホン胚から調製されたニワトリ胚繊維芽細胞を陽性コントロールとして含んだ。全ての接種は、予め形成された２×１０６  の細胞の単層について以下に記述するように行った。
【０１９５】
Ａ  ＤＮＡ分析の方法
３枚のそれぞれの細胞系統のディッシュを５ｐｆｕ／細胞のウイルスで試験のもとで接種し、別の１つのそれぞれの細胞系統のディッシュを接種しないでおいた。１つのディッシュは４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（Ａｒａ  Ｃ）の存在下で保温した。３７℃、６０分間の吸収期間の後、接種物を取り除き、単層を吸収されなかったウイルスを除去するために２回洗浄した。培地（Ａｒａ  Ｃが存在もしくは不在）は続いて置換された。１つのディッシュ（Ａｒａ  Ｃ無し）からの細胞を、時間０の試料として回収した。残りのディッシュは、３７℃で７２時間保温し、そのとき細胞を回収しＤＮＡ蓄積分析に用いた。２×１０６  の細胞それぞれは、０．５ｍｌの４０ｍＭＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、３７℃で５分間保温した。等量の、４２℃で予め保温された１２０ｍＭのＥＤＴＡを含む１．５％アガロースを細胞懸濁液に加え、穏やかに混合した。懸濁液はアガロースプラグ型へ移され少なくとも１５分固定化された。アガロースプラグを続いて取り除き、プラグを完全にカバーする量の溶解バッファー（１％サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）、１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５、２００ｍＭＥＤＴＡ）中で１２−１６分間５０℃で保温した。溶解バッファーを、続いて５．０ｍｌの滅菌０．５ｘＴＢＥ（４４．５ｍＭトリス−ホウ酸、４４．５ｍＭホウ酸、０．５ｍＭＥＤＴＡ）で置換し、４℃で６時間にわたり３回ＴＢＥバッファーを交換して平衡化した。プラグ内のウイルスＤＮＡをパルスフィールド電気泳動により細胞ＲＮＡおよびＤＮＡと分画した。電気泳動は２０時間にわたり１８０Ｖで５０−９０秒のランプで、１５℃、０．５ｘＴＢＥ中で行った。ＤＮＡはラムダＤＮＡ分子量スタンダードとともに泳動した。電気泳動後、ウイルスＤＮＡバンドはエチジウムブロミド染色により可視化した。ＤＮＡは続いてニトロセルロース膜に移され、精製ＡＬＶＡＣゲノムＤＮＡから調製された放射性標識プローブで探索した。
【０１９６】
Ｂ．ウイルス収量の評価
投入多重度を０．１ｐｆｕ／細胞にしたこと以外は、正確に上記のようにディッシュに接種した。感染後７２時間で、３回連続の凍結融解サイクルにより破砕した。ウイルス収量はＣＥＦ単層上のプラーク滴定により評価した。
【０１９７】
Ｃ．狂犬病Ｇ遺伝子の発現の分析
多重度１０ｐｆｕ／細胞で、組換体もしくは親ウイルスをディッシュに接種し、さらに付加的は１つのディッシュをウイルス感染させていない対照とした。１時間の吸収期間の後、培地を取り除きメチオニンフリーの培地で置換した。３０分の期間の後に、この培地を２５μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンを含むメチオニンフリー培地で置換した。感染させた細胞を一晩標識し、続いてバッファーＡ溶解バッファーを添加して溶解させた。免疫沈降を、狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いて、以前に記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）行った。
【０１９８】
結果：ウイルス収量の評価  ０．１ｐｆｕ／細胞での接種後７２時間後の収量の滴定の結果を表５に示す。この結果は、鳥類細胞においては生産的感染がなされうる一方で、４つの非鳥類種細胞システムでは、ウイルス収量の増加はこの方法では検出されなかったことを示唆している。
【０１９９】
ウイルスＤＮＡの蓄積の分析  生産的ウイルス複製の防御が、ＤＮＡ複製の前で行われているかもしくは後でかを決定するために、細胞破砕物由来のＤＮＡを電気泳動により分画し、ニトロセルロース膜に移し、ウイルス特異的ＤＮＡの存在を探索した。感染させなかった細胞、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させた時間０のＣＥＦ細胞、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させた感染後７２時間のＣＥＦ細胞、および４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシドの存在下でＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させた感染後７２時間のＣＥＦ細胞由来のＤＮＡは全て、いくらかの、恐らくは放射性標識ＡＬＶＡＣ  ＤＮＡプローブの調製におけるＣＥＦ細胞ＤＮＡの混入によるバックグラウンド活性を示した。しかしながら、感染後７２時間のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞は、ＡＬＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ蓄積を示す約３５０ｋｂｐの領域にある強いバンドを示した。このようなバンドは、培地をＤＮＡ合成阻害剤シトシンアラビノシドの存在下で保温した場合には検出されなかった。Ｖｅｒｏ細胞中で生成された相当する試料では、ＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させた時間０のＶｅｒｏ細胞において、約３５０ｋｂｐのかすかなバンドが示された。このレベルは残存ウイルスを示す。バンドの強度は、感染後７２時間には増幅されており、ウイルスの繁殖の増加とはならないＶｅｒｏ細胞において、いくらかのレベルのウイルス特異的ＤＮＡの複製が起こっていることが示唆された。ＭＲＣ−５細胞で生成された相当する試料は、この細胞系統では、これらの条件下ではウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は検出されないことを示唆していた。この実験を続いて付加的なヒト細胞系統、特にＷＩＳＨおよびデトロイト５３２細胞を含むように拡張した。ＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞を陽性コントロールとして用意した。ＡＬＶＡＣ−ＲＧで接種した、ＷＩＳＨ、デトロイト５３２細胞のいずれにおいても、ウイルス特異的ＤＮＡ蓄積は検出されなかった。この方法の検出限界はまだ十分に確認されておらず、この方法の感度より低いレベルで、ウイルスＤＮＡ蓄積は起こっているかも知れないことは注意されるべきである。ウイルスＤＮＡ複製を  ３Ｈチミジンの取り込みによって測定した別の実験は、ＶｅｒｏおよびＭＲＣ−５について得られた結果を支持していた。
【０２００】
狂犬病Ｇ遺伝子の発現の分析  いずれかの遺伝子、特に挿入した外来遺伝子の発現が、ウイルスＤＮＡ複製のないヒト細胞系列中で起こるか否かを決定するため、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させた、３５Ｓ−メチオニン標識された鳥類および非鳥類細胞破砕物について免疫沈降実験を行った。狂犬病Ｇ遺伝子特異的モノクローナル抗体を用いた免疫沈降の結果は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させたＣＥＦ、ＶｅｒｏおよびＭＲＣ−５、ＷＩＳＨおよびデトロイト細胞中で６７ｋＤａの糖タンパク質の免疫沈降を示した。このような特異的狂犬病遺伝子産物は、感染させていないか又は親に感染させた細胞破砕物からは検出されなかった。
【０２０１】
この実験の結果は、分析されたヒト細胞系統中では、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ組換体は感染を開始しＨ６ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターの転写制御のもとで外来遺伝子を発現することは可能であるが、ＤＮＡ複製を通した複製は進行せず、いかなる検出可能なウイルス繁殖の生成も見られなかった。Ｖｅｒｏ細胞中においては、いくらかのレベルでのＡＬＶＡＣ−ＲＧ特異的ＤＮＡ蓄積は見られたが、これらの方法によってはウイルス繁殖は検出されなかった。これらの結果は、分析されたヒト細胞系統中ではウイルス複製の防御はＤＮＡ複製の開始に先だって起こるが、その一方Ｖｅｒｏ細胞中では防御はウイルスＤＮＡ複製の開始に続いて起こることを示唆しているであろう。
【０２０２】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧにおいて発現された狂犬病糖タンパク質が免疫原性か否かを決定するため、多くの動物種をこの組換体の接種により試験した。現在の狂犬病ワクチンの効率はマウスモデルシステムで評価されている。それ故、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを用いた同様の試験を行った。９つの異なったウイルス調製物（シードウイルスを１０連続の組織培養継代後に生成されたワクチンバッチ（Ｊ）を含む）を、６．７から８．４のｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌの感染力価の範囲で連続的に希釈し、５０から１００μｌの希釈液を４匹の生後６週間のマウスの足部に接種した。マウスに１４日後に頭蓋内経路で、対照マウスグループ中の致死滴定により決定された１５から４３マウスＬＤ５０を含む３００μｌの狂犬病ウイルスＣＶＳ株を接種した。ＰＤ５０（５０％防御量）として表された能力を、接種後１４日に計算した。この実験の結果を表６に示す。この結果から、ＡＬＶＡＣ−ＲＧは一貫して、３．３３から４．５６、平均３．７３（標準偏差０．４８）のＰＤ５０値の範囲で狂犬病ウイルス投与に対してマウスを防御可能であることが示された。この研究の拡散として、雄マウスを、６．０ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０のＡＬＶＡＣを含む５０μｌのウイルス、または等量の感染させていない細胞懸濁液で頭蓋内に接種した。マウスを接種後１日、３および６日に犠牲にし、脳を取り除き、固定し、分画した。組織病理学的試験により、マウス中でのＡＬＶＡＣ−ＲＧの神経毒性の証拠は無いことが示された。
【０２０３】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧのイヌおよびネコに対する安全性と効率を評価するため、１４の生後５ヶ月のビーグル犬の群および１４の生後４ヶ月のネコの群を試験した。それぞれの種の４匹の動物はワクチン接種されなかった。５匹の動物は６．７ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０を皮下で接種され、５匹の動物は７．７ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０を同じ経路で接種された。動物は抗狂犬病抗体の分析のために採血された。接種されなかったまたは６．７ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０を接種された動物に、接種後２９日目に３．７ｌｏｇ１０マウスＬＤ５０（イヌ、側頭中）または４．３ｌｏｇ１０マウスＬＤ５０（ネコ、首中）のＮＹＧＳ狂犬病ウイルス投与株を投与した。この実験の結果を表７に示した。
【０２０４】
いずれの投与量についても、イヌ、ネコいずれにおいても接種に対する不利な反応は見られなかった。６．７ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０で免疫化された５匹のイヌのうちの４匹は、ワクチン接種後１４日で抗体力価を有し、２９日には全てのイヌが有していた。全てのイヌは、対照の４匹中３匹を殺した投与に対して保護された。ネコにおいては、６．７ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０を投与された５匹のうち３匹が、１４日に特異的抗体力価を有し、２９日には全てのネコが陽性であったが平均抗体力価は２．９ＩＵと低かった。全ての対照を殺した投与に対して５匹中３匹が生き残った。７．７ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０で免疫化された全てのネコは１４日に抗体力価を有し、２９日には、相乗平均力価は８．１国際単位と計算された。
【０２０５】
リスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ−ＲＧおよび関係のないカナリアポックスウイルス組換体の接種に対する免疫反応を調べた。サルのグループを上記のように接種し、狂犬病特異的抗体の存在について血清分析した。皮内経路の接種に対する軽度の典型的な皮膚反応は別にして、不利な反応はいずれのサルにおいても見られなかった。少量の残存ウイルスが皮膚外傷から、皮下接種の後、接種後２日および４日のみに単離された。全ての検体７日およびそれ以降は陰性だった。筋内接種に対する局部反応は無かった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧで接種された４匹の全てのサルが、ＲＦＦＩ試験で測定された抗狂犬病血清中和抗体を生産した。最初の接種から約６ヶ月後、全てのサルおよび１匹の付加的な接種されていないサルに、６．５ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０のＡＬＶＡＣ−ＲＧを、皮下経路で左大腿部の外側表面上に再び接種した。抗狂犬病抗体の存在について血清を分析した。結果を表８に示す。
【０２０６】
狂犬病にかかったことのない５匹のサルのうち４匹が、ＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種後７日までに血清学的反応を生成した。接種後１１日までには、５匹のサル全てが検出可能な抗体を有していた。前に狂犬病糖タンパク質にさらした４匹のサルの、全てがワクチン接種後の３日と７日との間に顕著な血清中和力価の上昇を示した。この結果はリスザルのＡＬＶＡＣ−ＲＧでのワクチン接種は、不利な副作用を引き起こさず、初期中和抗体反応が誘導されうることを示している。既往反応もまた再ワクチン接種で誘導される。ＡＬＶＡＣもしくは無関係の外来遺伝子を発現するカナリアポックス組換体への事前の接種は、再ワクチン接種時の抗狂犬病免疫反応の誘導に影響しなかった。
【０２０７】
ＨＩＶ−２血清陽性のサル科マカク属のサルのＡＬＶＡＣ−ＲＧ接種に対する免疫的反応を評価した。動物は上記のように接種され、抗狂犬病血清中和抗体の存在をＲＦＦＩ試験によって評価した。その結果は、表９に示されているが、皮下経路で接種されたＨＩＶ−２陽性動物は、抗狂犬病抗体を１回の接種の１１日後までに生成した。既往反応が、最初の接種の約３ヶ月後に与えられた追加接種の後で検出された。経口経路で組換体を接種された動物においては反応は検出されなかった。加えて、一連の６匹の動物を、減少させた量のＡＬＶＡＣ−ＲＧで筋内または皮下経路のいずれかで接種した。接種された６匹の内の５匹が、接種後１４日までに、抗体力価に顕著な差もなく反応した。
【０２０８】
ＨＩＶに事前にさらされたチンパンジーを、７．０ｌｏｇ１０ｐｆｕのＡＬＶＡＣ−ＲＧで皮下もしくは筋内経路で接種した。接種後３ヶ月に、両方の動物を同じ方法で再接種した。結果を表１０に示す。
【０２０９】
筋内もしくは皮下のいずれの経路でも、不利な反応は見られなかった。両方のチンパンジーは最初の接種後１４日までに反応し、再接種に続いて強力な上昇反応が検出された。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【０２１０】
実施例１０  狂犬病糖タンパク質を発現する
カナリアポックスウイルス（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ；ｖＣＰ６５）
を用いたヒトの免疫化                                    
ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）は実施例９および図９Ａおよび９Ｂで記述されたように開発された。ワクチン製造をスケールアップするために、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を特定の病原体のない卵から派生した初代ＣＥＦ細胞中で増殖させた。細胞を多重度０．０１で感染させ、３７℃で３日間保温した。
【０２１１】
ワクチンウイルス懸濁液を、血清フリーの培地中の感染させた細胞の超音波破砕により得た；細胞破片を遠心分離と濾過により取り除いた。その結果得られた清澄化された懸濁液にリンパ形成安定剤（アミノ酸混合物）を加え、１回分の量ごとにバイアルに小分けし、凍結乾燥した。血清フリー培地およびリンパ形成安定剤中のウイルス懸濁液を１０倍ごとに連続して希釈することにより、力価が減少してゆく３つのバッチをリンパ形成に先だって調製した。
【０２１２】
細胞基質、培地および種ウイルスおよび最終産物の品質制御テストを、実験室齧歯類中での無害性および偶発的な作用物に注意しながら行った。望ましくない特徴は何も発見されなかった。
【０２１３】
臨床前データ  生体外での研究により、ＶｅｒｏまたはＭＲＣ−５細胞はＡＬＶＡＣ−ＲＧの増殖を支持しないことが示された；一連の８（Ｖｅｒｏ）および１０（ＭＲＣ−５）盲連続継代により、ウイルスのこれらの非鳥類細胞系統中での増殖への検出可能な適応は引き起こされなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を感染もしくは接種したヒト細胞系統（ＭＲＣ−５、ＷＩＳＨ、デトロイト５３２、ＨＥＬ、ＨＮＫもしくはＥＢＶを形質転換したリンパ芽球細胞）の分析で、ウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は見られず、これらの細胞内においてはＤＮＡ合成に先だって複製のブロックが起きていることが示唆された。しかしながら、重要なことには、狂犬病ウイルス糖タンパク質遺伝子の発現は、試験された全ての細胞系統において、カナリアポックス複製サイクルの中止段階はウイルスＤＮＡ複製に先だって行われることを示している。
【０２１４】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の安全性および効率は、動物における一連の実験で立証された。カナリア、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、実験室齧歯類（乳児および成マウス）、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコおよびイヌ、リスザル、アカゲザル、およびチンパンジーに、１０５  から１０８  ｐｆｕの範囲にある量を接種した。多様な経路が用いられ、もっとも一般的には皮下、筋内および皮内であったが、経口（サルおよびマウス）および頭蓋（マウス）内も用いられた。
【０２１５】
カナリアにおいては、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）は乱切部位において「受け入れ」外傷を、病気の兆候または死を伴わずに引き起こした。ウサギへの皮内接種は、拡散せずに７−１０日で治る典型的なポックス接種反応を引き起こした。これらの動物実験のいずれにおいても、カナリアポックスによる望ましくない副作用は見られなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の接種に続いて、齧歯類、イヌ、ネコ、および霊長類において、高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）で測定された抗狂犬病抗体が生産されたことにより、免疫原性が立証された。ＡＬＶＡＣ−ＲＧで免疫化されたマウス、イヌ、およびネコにおける狂犬病ウイルス投与実験により、防御が立証された。
【０２１６】
ボランティア  ２５人の健康な、２０−４５歳の年齢で、以前に狂犬病免疫の経歴のない成人を登録した。彼らの健康状態を完全な医学的経歴、生理的試験、血液学および血液化学分析により評価した。除外基準には、妊娠、アレルギー、あらゆる種類の免疫抑制、慢性衰弱病、ガン、過去３ヶ月以内の免疫グロブリンの注入、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＢ型肝炎表面抗原に対する血清陽性が含まれていた。
【０２１７】
研究計画  参加者に無作為に標準ヒト二倍体細胞狂犬病ワクチン（ＨＤＣ）バッチ番号Ｅ０７５１（Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｍｅｒｉｅｕｘ  Ｓｅｒｕｍｓ  ＆  Ｖａｃｃｉｎｅ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）または研究用ワクチンＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を割り当てた。
【０２１８】
この試みは量増加研究と命名された。実験用ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ワクチンの３つのバッチは、３つのグループのボランティア（グループＡ、ＢおよびＣ）に順番に、各々の段階の間に２週間の間隔を置いて用いられた。３つのバッチの濃度はそれぞれ、１０３．５  、１０４．５  、１０５．５  組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）／投与量であった。
【０２１９】
それぞれのボランティアは、同じワクチンを４週間の間隔をおいて三角筋領域に皮下で２投与量を接種された。注入されたワクチンの本質は、最初の接種時には参加者には知られていなかったが、調査者には知られていた。
【０２２０】
２回目の注入時の、即時ヘルペス感受性の危険を最小化するため、実験ワクチンの中程度の量を割り当てられたグループＢのボランティアは、少ない量を１時間前に接種され、大量を割り当てられたグループＣは、少量および中程度の量を１時間の間隔をおいて連続的に接種された。
【０２２１】
６ヶ月後、最も多い投与量のＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）（グループＣ）およびＨＤＣワクチンの被験者に、３回目の量のワクチンを要請した；彼らは無作為に、前回と同じワクチンを接種されるかまたは別のワクチンを接種されるように設定された。その結果、以下の免疫化の手順に相当する４種類のグループが形成された。１．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＨＤＣ；２．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）；３．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＨＤＣ；４．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）。
【０２２２】
副作用の観察  全ての被験者を注入後１時間観察し、次の５日間毎日再検査した。彼らは局所的および全体的反応を次の３週間記録するよう要請され、１週間に２回問診された。
【０２２３】
実験室調査者  登録前およびそれぞれの接種後２、４および６日後の血液見本を得た。分析は、完全血液細胞計数、肝臓酵素およびクレアチンキナーゼアッセイを含んでいた。
【０２２４】
抗体アッセイ  最初の注入の７日前および、研究の７、２８、３５、５６、１７３、１８７および２０８日に抗体アッセイを行った。
【０２２５】
狂犬病に対する中和抗体のレベルは、高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｙａｅｇｅｒ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｎ  Ｒａｂｉｓ中）を用いて決定した。カナリアポックス抗体は直接ＥＬＩＳＡにより測定した。抗原である、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００で破壊した精製カナリアポックスウイルスの懸濁液をマイクロプレートにコートした。固定化された血清の希釈液を室温で２時間反応させ、反応している抗体はペルオキシダーゼで標識化された抗ヒトＩｇＧヤギ血清で明らかとされた。この結果は４９０ｎｍの光学密度により表されている。
【０２２６】
分析  ２５人の被験者が登録され、研究を実行された。１０人の男性と１５人の女性で平均年齢は３１．９歳であった（２１から４８まで）。３人を除く全ての被験者が以前に天然痘ワクチンの証拠を有していた；残りの被験者の３人は典型的な傷跡もワクチン接種経歴も有してはいなかった。３人の被験者は少量の実験用ワクチン（１０３．５  、１０４．５  ＴＣＩＤ５０）の投与量で接種され、９人の被験者は１０５．５  ＴＣＩＤ５０の投与量で接種され、１０人はＨＤＣワクチンを接種された。
【０２２７】
安全性（表１１）  最初のシリーズの免疫化の間、接種後２４時間以内に３７．７℃を超える熱が、１人のＨＤＣ被験者（３７．８℃）および１人のｖＣＰ６５  １０５．５  ＴＣＩＤ５０の被験者（３８℃）において見られた。ワクチン接種に帰属される他の全体的反応はいずれの被験者においても観察されなかった。
【０２２８】
局所的反応は皮下でＨＤＣワクチンを接種された被験者１０人中９人で見られ、ｖＣＰ６５の１０３．５  、１０４．５  、１０５．５  ＴＣＩＤ５０での被験者ではそれぞれ３人中０人、３人中１人および９人中９人であった。
【０２２９】
圧痛はもっとも一般的な兆候であったが、つねに穏やかであった。他の局所的兆候には、穏やかで一過性の赤化と硬化が含まれていた。全ての兆候は通常２４時間以内に沈静化し、７２時間以上は続かなかった。
【０２３０】
血液細胞計数、肝臓酵素あるいはクレアチンキナーゼの値に顕著な変化は無かった。
【０２３１】
免疫反応；狂犬病に対する中和抗体（表１２）  最初の注入から２８日後に全てのＨＤＣ被験者は防御的力価（０．５ＩＵ／ｍｌ以上）を有していた。これとは対照的に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の被験者は、グループＡおよびＢ（１０３．５  、１０４．５  ＴＣＩＤ５０）では０人が、グループＣ（１０５．５  ＴＣＩＤ５０）では９人中２人のみがこの防御的力価に達していた。
【０２３２】
５６日目（即ち第２の接種から２８日後）には、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の被験者のうち、グループＡでは３人中０人、グループＢでは３人中２人、およびグループＣでは９人中９人においてこの防御的力価が達成され、１０人のＨＤＣ被験者の全てにおいても保持されていた。
【０２３３】
５６日の相乗平均力価は、グループＡ、Ｂ、ＣおよびＨＤＣそれぞれにおいて０．０５、０．４７、４．４および１１．５ＩＵ／ｍｌであった。
【０２３４】
１８０日には、全ての被験者において狂犬病抗体力価は実質的に減少していたが、ＨＤＣ被験者１０人中５人、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）被験者９人中５人において最小防御力価である０．５ＩＵ／ｍｌより大きく残存していた；相乗平均力価はグループＨＤＣおよびグループＣで、それぞれ０．５１および０．４５ＩＵ／ｍｌであった。
【０２３５】
カナリアポックスウイルスに対する抗体（表１３）  観察された免疫化前力価は、高い力価を示した被験者が事前のカナリヤに接触していなかったにも拘わらず、力価０．２２から１．２３Ｏ．Ｄ．単位で広く変化していた。免疫化前と２回目の免疫化後との間で力価が２倍を越えて上昇した場合を血清変換と定義した場合、グループＢでは被験者３人中１人、グループＣでは被験者９人中９人で血清変換が得られたが、ＨＤＣまたはグループＡでは被験者は１人も血清変換されなかった。
【０２３６】
追加接種  ワクチンは同様に６ヶ月後の追加接種時にも十分耐性があった：ＨＤＣ追加免疫を受けた９人中２人で、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加免疫を受けた１０人中１人で熱がみられた。局所的反応はＨＤＣ追加免疫を受けた９人中６人で、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加免疫を受けた９人中５人でみられた。
【０２３７】
観察  図１３Ａ−１３Ｄは、狂犬病中和抗体力価（高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）ＩＵ／ｍｌ）を示している：同じまたは別のワクチンで予め免疫化されたボランティア体内におけるＨＤＣおよびｖＣＰ６５（１０５．５  ＴＣＩＤ５０）の追加免疫効果。ワクチンは０、２８および１８７日および２０８日に与えられた。０、７、２８、３５、５６、１７３および１８０日に抗体力価を測定した。
【０２３８】
図１３Ａ−１３Ｄに示されるとおり、与えられた追加免疫量は免疫化の方式に拘わらず全ての被験者中で、狂犬病抗体力価のさらなる上昇をもたらした。しかしながら、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加免疫は全体的に、ＨＤＣ追加免疫より低い免疫反応を誘導し、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）グループは他の３つのグループより顕著に低い力価を有していた。同様に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加注入は、ＨＤＣワクチンを以前に接種された被験者５人中３人、および以前にＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）で免疫化された被験者５人すべてにおいて、カナリアポックス抗体力価の上昇をもたらした。
【０２３９】
全体として、ｖＣＰ６５の接種による局所的副作用は、ウイルスの局所的増殖を示すものではなかった。特に、ワクチンの注入後にみられる等の皮膚の外傷は無かった。見かけ上のウイルスの複製が無かったにも拘わらず、注入はボランティアにおいて大量のカナリアポックスベクターおよび発現された狂犬病糖タンパク質の両方に対する抗体の生産をもたらした。
【０２４０】
狂犬病中和抗体は、マウス中の血清中和試験と相関することが知られている高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）によりアッセイした。１０５．５  ＴＣＩＤ５０の被験者９人のうち、５人は最初の量の後より少ないレベルの反応を示した。狂犬病抗体の防御的力価が、２回目の接種の後で、試験された多量の被験者の全て、および、中程度の量の被験者においてすら３人中２人において得られた。この研究において、両方のワクチンは、生ワクチンで推奨されているが不活性化ＨＤＣにはされていない、皮下経路で接種された。この接種経路は、接種部位を注意深く観察するのに最適であるために選択されたが、これによりＨＤＣ被験者における抗体の遅い出現が説明できる：事実、ＨＤＣ被験者は７日には１人も抗体上昇を有していなかったが、ＨＤＣワクチンを筋肉内に接種した殆どの研究においては、かなりの割合の被験者が有している（Ｋｌｉｅｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ  Ｇｒｅｅｎ  Ｃｒｏｓｓ−Ｇｅｎｅｖａ，１９８１；Ｋｕｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ  Ｇｒｅｅｎ  Ｃｒｏｓｓ−Ｇｅｎｅｖａ，１９８１）。しかしながら、本発明は必ずしも皮下経路の接種に限定されない。
【０２４１】
狂犬病中和抗体のＧＭＴ（相乗平均）は、試験しているワクチンはＨＤＣ対照よりも低かったが、しかし防御に要求される最小値よりも十分に上だった。本研究で用いられた３種類の投与量について得られた明白な投与量効果反応は、より多量の投与量はより強力な反応を誘導するかもしれないことを示唆している。この開示から確かに、当業者は、委された患者に対する適切な量を選択できる。
【０２４２】
抗体反応を上昇させる能力は、もう一つのこの実施例の重要な結果である；事実、狂犬病抗体力価は、どの免疫化の方法でも、６ヶ月後に全ての被験者において得られ、カナリアポックスベクターまたは狂犬病糖タンパク質によって以前に誘導された免疫性は組換えワクチン候補株または従来のＨＤＣ狂犬病ワクチンによる追加免疫にブロック効果を有さないことが示された。このことは、他のワクシニアウイルス組換体に関する、以前から存在する免疫によってヒトにおいて免疫反応はブロックされるという発見と対照をなす（Ｃｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  １９９１，３３７：５６７−７２；Ｅｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ９：４７０−７２，１９９１）。
【０２４３】
このように、この実施例は、非複製的ポックスウイルスが動物もしくは人間において免疫化ベクターとして、複製作用物は免疫反応を与えるという利点があるが、十分に伝播性であるウイルスによって引き起こされる安全性の問題をともなわずに利用可能であることが明白に示された。
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【０２４４】
実施例１１  ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣのＬＤ５０の
様々なワクシニアウイルス株との比較  
マウス  雄の異系交配されたスイスウェブスターマウス（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ  ｍｉｃｅ）を、タコニック  ファーム（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）より購入し、マウス用食事および水  ａｄ  ｌｉｂｉｔｕｍで生後３週間で使用するまで育てた（「通常」マウス）。両方の性の新生異系交配スイスウェブスターマウスを、タコニックファームで行われた続いての定期の妊娠により得た。用いられた全ての新生マウスは２日間の期間内に配達された。
【０２４５】
ウイルス  ＡＬＶＡＣはカナリアポックスウイルス集団のプラーク精製により派生し、初代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）中で調製された。ショ糖密度勾配遠心分離による精製に続いて、ＣＥＦ細胞中でプラーク形成単位を数え上げた。ワクシニアウイルスＷＲ（Ｌ）変異体は、ＷＲの大プラーク表現型の選択により派生された（Ｐａｎｉｃａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）。ニューヨーク州保健委員会ワクシニアウイルスワクチン株であるＷｙｅｔｈは、Ｐａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃａｌｆ  Ｌｙｍｐｈ  ＴｙｐｅワクチンＤｒｙｖａｘ、制御番号３０２００１Ｂより得た。コペンハーゲン株ワクシニアウイルスＶＣ−２をＩｎｓｔｉｔｕｔ  Ｍｅｒｉｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅより得た。ワクシニアウイルス株ＮＹＶＡＣはコペンハーゲンＶＣ−２から派生された。Ｗｙｅｔｈ株を除く全てのワクシニアウイルス株をＶｅｒｏアフリカミドリザル腎臓細胞中で培養し、ショ糖密度勾配遠心分離により精製しそしてＶｅｒｏ細胞上でのプラーク形成単位を数え上げた。Ｗｙｅｔｈ株はＣＥＦ細胞中で増殖させ、ＣＥＦ細胞中で数え上げた。
【０２４６】
接種  １０匹の通常マウスに、ストック調製物を滅菌リン酸緩衝生理食塩水で１０倍づつ連続的に希釈したいくつかの希釈液の１つを、０．０５ｍｌ頭蓋内経路（ｉｃ）で接種した。いくつかの場合には、希釈しないストックウイルス調製物を接種に用いた。
【０２４７】
１０匹の、生後１日または２日の新生マウスのグループに、通常マウスと注入量が０．０３ｍｌで用いられたこと以外は同じようにｉｃで接種した。
【０２４８】
全てのマウスについて、接種後１４日（新生マウス）または２１日（通常マウス）の期間にわたり、毎日死亡率を観察した。接種の次の朝に死んでいるのが見つかったマウスは、トラウマによる死の可能性があるので除外した。
【０２４９】
実験集団の死亡率５０％を達成するために要求される致死量（ＬＤ５０）をＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの比例法により測定した。
【０２５０】
ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣの、通常マウスおよび、若異系交配マウスに対するｉｃ経路でのＬＤ５０と、様々なワクシニアウイルス株との比較  若マウス、通常マウスにおけるＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの毒性は、他の試験されたワクシニアウイルスよりも数桁のオーダーで低かった（表１５）。ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣは、Ｗｙｅｔｈ株より通常マウス中で３０００倍以上も毒性が低いこと；１２５０００倍以上も親ＶＣ−２より毒性が低いこと；および６３００００００倍もＷＲ（Ｌ）派生体よりも毒性が低いことが判明した。これらの結果は、ＮＹＶＡＣは他のワクシニア株と比較して高度に弱毒化されていること、および、両方とも極端に大量（３．８５×１０８  ｐｆｕ；ＡＬＶＡＣ  および３×１０８  ｐｆｕ；ＮＹＶＡＣ）に頭蓋内経路で接種すると、まだ同定されていない機構によってマウスにおいて死を引き起こすが、ＡＬＶＡＣは一般的に頭蓋内経路で投与された場合には若マウスにおいて非毒性であること、を示唆しているであろう。
【０２５１】
ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣの、新生異系交配マウスに対するｉｃ経路でのＬＤ５０と、様々なワクシニアウイルス株との比較  ５つのポックスウイルス株の相対毒性を、通常、新生マウスに対して頭蓋内（ｉｃ）投与モデルシステムにおいて滴定により試験した（表１５）。終了点としての死亡率に関し、ＬＤ５０値は、ＡＬＶＡＣは１０００００倍以上もワクシニアウイルスＷｙｅｔｈ株よりも非毒性であること；ワクシニアウイルスコペンハーゲンＶＣ−２株より２０００００倍以上も非毒性であること；およびワクシニアウイルスＷＲ−Ｌ株より２５００００００倍以上も非毒性であることが示された。にもかかわらず、試験された最も多量の投与量６．３×１０７  ｐｆｕでは、死亡率１００％という結果であった。６．３×１０６  ｐｆｕでは、３３．３％という死亡率であった。死の原因は、実際に決定されてはいないが、最も多量の投与量（約６．３ＬＤ５０）のグループの平均生存時間（ＭＳＴ）は６．７プラスマイナス１．５日だったので、毒物学的またはトラウマ的本質ではないようであった。５ＬＤ５０の投与量ではＭＳＴが４．８プラスマイナス０．６日であるＷＲ（Ｌ）と比較した場合、ＡＬＶＡＣのＭＳＴは顕著に長かった（Ｐ＝０．００１）。
【０２５２】
ＮＹＶＡＣと比較して、Ｗｙｅｔｈは１５０００倍以上も毒性であり；ＶＣー２は３５０００倍以上も毒性であり；ＷＲ（Ｌ）は３００００００倍以上も毒性であった。ＡＬＶＡＣと同様に、最も多量の２つのＮＹＶＡＣ投与量６×１０８  ｐｆｕおよび６×１０７  ｐｆｕは、１００％の死亡率を引き起こした。しかしながら、３８０ＬＤ５０に相当する、最も多量に投与されたマウスのＭＳＴはたったの２日であった（９匹が２日に死に、１匹が４日に死んだ）。これと対照的に、最も多量の５００ＬＤ５０に相当するＷＲ−Ｌを投与された全てのマウスは、４日まで生存した。
【表１４】
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【表１５】
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【０２５３】
実施例１２  ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）および
ＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）の評価
免疫沈降  事前に形成された鳥類もしくは非鳥類細胞の単層に１０ｐｆｕ／細胞の親ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）もしくはＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）ウイルスを接種した。接種をメチオニンフリーで２％の透析牛胎児血清を添加したＥＭＥＭ中で接種を行った。１時間の保温の後で、接種物を除去し、培地を２０μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンを含むＥＭＥＭ（メチオニンフリー）で置換した。一晩、約１６時間の保温の後、細胞をバッファーＡ（１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１０ｍＭトリスｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％アジ化ナトリウム、５００単位／ｍｌのアプロチニンおよび０．０２％フェニルメチルスルフォニルフロリド）の添加により溶解させた。免疫沈降を、Ｃ．Ｔｒｉｍａｒｃｈｉ博士、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ研究所、ニューヨーク州保健部、Ａｌｂａｎｙ、ニューヨークによって供給された２４−３Ｆ１０と命名された、狂犬病糖タンパク質特異的モノクローナル抗体、およびベーリンガーマンハイム社より得られたラット抗マウス接合体（型番＃６０５−５００）を用いて行った。ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージーより得られたプロテインＡセファロースＣＬ−４８を支持マトリクスとして用いた。免疫沈降沈殿物は、Ｄｒｅｙｆｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）の方法に従って１０％ポリアクリルアミドゲルにより分画した。ゲルを固定化し、間接撮影用に１Ｍサリチル酸ナトリウムで１時間処理し、免疫沈降されたタンパク質種を視覚化するためにコダックＸＡＲ−２フイルムに曝露した。
【０２５４】
動物の起源  ニュージーランド白ウサギはＨａｒｅ−Ｍａｒｌａｎｄ（Ｈｅｗｉｔｔ、ニュージャージー）より得た。生後３週間の雄のスイスウェブスター異系交配マウス、定期妊娠雌スイスウェブスター異系交配マウス、および生後４週間のスイスウェブスターヌード（ｎｕ＋  ｎｕ＋  ）マウスはタコニックファーム社（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ニューヨーク）より得た。全ての動物はＮＩＨガイドラインに従って維持された。全ての動物プロトコルはＩＡＣＵＣ協会で承認されている。必要と思われるときは、明らかに末期的病状のマウスは安楽死させた。
【０２５５】
ウサギにおける外傷  ２匹のウサギの各々に、皮下で複数の部位に、それぞれ１０４  、１０５  、１０６  、１０７  または１０８  ｐｆｕの試験用ウイルスを含むＰＢＳまたはＰＢＳのみを０．１ｍｌ接種した。ウサギを４日から外傷が治るまで毎日観察した。硬化および潰瘍化を測定し記録した。
【０２５６】
接種部位からのウイルスの回収  １匹のウサギに、皮下で複数の部位に、１０６  、１０７  、１０８  ｐｆｕの試験用ウイルスを含むＰＢＳまたはＰＢＳのみを０／１ｍｌ接種した。１１日後、ウサギを安楽死させ、接種部位それぞれから採取された皮膚生検試料を、機械的破壊および直接的ではない超音波によって無菌的に、ウイルス回収のために調製した。感染可能なウイルスはＣＥＦ単層上でのプラーク滴定によりアッセイした。
【０２５７】
マウス中での毒性  マウス１０匹、またはヌードマウス実験では５匹のグループを、いくつかの０．５ｍｌの滅菌ＰＢＳ中のウイルス希釈液のうちの１つで、ｉｐ接種した。実施例１１を参照した。
【０２５８】
シクロホスファミド（ＣＹ）処理  マウスをｉｐ経路で４ｍｇ（０．０２ｍｌ）のＣＹ（ＳＩＧＭＡ）で−２日に接種し、続いて０日にウイルスを接種した。感染後に続く日々には、マウスにＣＹをｉｐ接種：１日には４ｍｇ；４、７および１１日には２ｍｇ；１４、１８、２１、２５および２８日には３ｍｇ。免疫抑制を間接的にクールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）により１１日に白血球を計数することにより観察した。平均白血球数は処理されていないマウス（ｎ＝４）で１μｌあたり１３５００細胞、ＣＹ処理対照マウス（ｎ＝５）で１μｌあたり４２２０細胞であった。
【０２５９】
ＬＤ５０の計算  死亡率５０％をなすために必要な致死量（ＬＤ５０）を、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの比例法（Ｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ，１９３８）により決定した。
【０２６０】
ＮＹＶＡＣ−ＲＧのマウス中での能力試験  生後４−６週間のマウスに、５０から１００μｌのＶＶ−ＲＧ（Ｋｉｅｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１ｂ）、またはＮＹＶＡＣ−ＲＧのいずれかの、２．０−８．０  ｌｏｇ１０  組織培養感染量５０％（ＴＣＩＤ５０）を含む希釈液を足部に接種した。各々のグループは８匹のグループからなっていた。接種後１４日に、マウスに脳内接種で１５ＬＤ５０の狂犬病ウイルスＣＶＳ株を投与した（０．０３ｍｌ）。２８日には、生存したマウスを数え、防御量５０％（ＰＤ５０）を計算した。
【０２６１】
ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）の誘導  ワクシニアウイルスＮＹＶＡＣは、コペンハーゲンワクチン株のプラーククローン単離体であるＶＣ−２から開発された。ＶＣ−２からＮＹＶＡＣを開発するために、多くの毒性に関与するウイルス機能を含む１８のワクシニアＯＲＦを、一連の連続的操作によりこの開示の前の部分で記述したように精密に欠失させた。これらの欠失は、新しい所望でないＯＲＦが現れることを防ぐために計画された方式で構築した。図１０はＮＹＶＡＣを開発するために欠失されたＯＲＦを模式的に示している。図１０の上部は、ワクシニアウイルスゲノム（ＶＣ−２プラーク単離体、コペンハーゲン株）のＨｉｎｄＩＩＩ制限地図を示している。拡大部分は、ＮＹＶＡＣの開発において連続的に欠失されたＶＣ−２の６つの領域である。この欠失はこの開示の前の部分で記述されている（実施例１から６）。以下に、座からＯＲＦが欠失された欠失座を、機能もしくはホモロジーおよびそれらの遺伝子産物の分子量とともに列記する。
【０２６２】
ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣのヒト組織細胞系統上での複製の研究  ヒト起源の細胞中でのワクシニアウイルスＮＹＶＡＣ株（ｖＰ８６６）の複製のレベルを決定するために、６種類の細胞系統に、細胞あたり０．１ｐｆｕの投入多重度で液体培地に接種し、７２時間保温した。平行して、コペンハーゲン親クローン（ＶＣ−２）も接種した。初代ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞（１０−１１日経過したＳＰＦ起源の受精卵から得た、Ｓｐａｆａｓ、Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｒｒｓ、ＣＴ）を、全てのウイルスに対する許容的細胞基質を代表するものとして含めた。培養を２つの基準：生産的ウイルス複製の発生および外因性抗原の発現、に基づいて分析した。
【０２６３】
多数のヒト派生細胞中でのＮＹＶＡＣの複製能力を図１６に示した。ＶＣ−２およびＮＹＶＡＣは両方ともＣＥＦ細胞中で生産的に複製可能であったが、ＮＹＶＡＣは僅かに収量が減少した。ＶＣ−２は、試験された６種類のヒト派生細胞系統のうち、ＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞系統ＪＴ−１（エプスタイン−バーウイルスで形質転換されたヒトリンパ芽球細胞系統、Ｒｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４を参照）を除いて、匹敵する収量で生産的に複製可能であった。これに反し、ＮＹＶＡＣは、いずれの試験されたヒト派生細胞系統においてもその生産的複製能力において高度に減衰されていた。残存ウイルスレベル以上の感染可能なウイルスの少量の増加が、ＮＹＶＡＣに感染させたＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１、ヒト胚肺起源）、デトロイト５３２（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ５４、ヒト包皮、ダウン症）、ＨＥＬ２９９（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１３７、ヒト胚肺細胞）およびＨＮＫ（ヒト新生児腎臓細胞、Ｗｈｉｔｔｉｋｅｒ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、型番＃７０−１５１）細胞より得られた。これらの細胞系統における複製は、ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞から得られた収量、または親ＶＣ−２（表１６）と比較して、顕著に減少していた。ＮＹＶＡＣおよびＶＣ−２のＣＥＦ細胞中の２４時間での収量は７２時間での収量と同等であったことは注目すべきである。ヒト細胞系統培養をさらに４８時間（さらに２回のウイルス増殖サイクル）保温することは、従って、得られる相対ウイルス収量を増幅させるかもしれない。
【０２６４】
ヒト派生細胞系統ＭＲＣ−５およびデトロイト５３２において得られる低レベルのウイルス収量と一致して、検出可能であるが減少したレベルでのＮＹＶＡＣ特異的ＤＮＡ蓄積がみられた。ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞でみられたものと関連して、ＭＲＣ−５およびデトロイト５３２ＮＹＶＡＣ感染細胞系統ＤＮＡ蓄積レベルの相対ウイルス収量を比較した。ＮＹＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ蓄積はいずれの他のヒト派生細胞においても観察されなかった。
【０２６５】
同等の実験をアビポックスウイルスＡＬＶＡＣを用いて行った。ウイルス複製の結果は表１６に示す。カナリアポックスウイルスの鳥類種への宿主制限と一致して、子ウイルスはいずれのヒト細胞系統においても検出されなかった。ＡＬＶＡＣがこれらのヒト派生細胞内での生産的複製の欠失は、ＡＬＶＡＣ特異的ＤＮＡ蓄積がいずれのヒト派生細胞系統においても検出されなかったという観察とも一致している。
【０２６６】
ヒト細胞中でのＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）による狂犬病糖タンパク質の発現  効率的な外来遺伝子の発現が、顕著なレベルの生産的ウイルス複製の存在無しに得られるか否かを決定するために、同じ細胞系統を、狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣ組換ウイルス（ｖＰ８７９、実施例７）３５Ｓメチオニン存在下で接種した。放射性標識された培養破砕物から、狂犬病糖タンパク質特異的モノクローナル抗体を用いて狂犬病糖タンパク質の免疫沈降を行った。６７ｋＤａのタンパク質の免疫沈降が検出され、狂犬病糖タンパク質の完全グリコシル化型と一致していた。血清学的に交叉反応する生産物は、非感染もしくは親ＮＹＶＡＣ感染細胞破砕物においては検出されなかった。分析された他の全てのヒト細胞においても同様の結果が得られた。
【０２６７】
ウサギ皮膚への接種  皮内（ｉｄ）接種に続くウサギの外傷の誘導および本質が、ワクシニアウイルスの病原性の尺度として、以前から用いられている（Ｂｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｆｅｎｎｅｒ，１９５８；Ｆｌｅｘｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｇｈｅｎｄｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｎｏｓ，１９６４）。故に、ワクシニア株ＷＲ（ＡＴＣＣ＃ＶＲ１１９、ＣＶ−１細胞ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ７０上でプラーク精製、およびＬ変異体と命名されたプラーク単離体、ＡＴＣＣ＃ＶＲ２０３５  Ｐａｎｉｃａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１に記載の通りに選択）、Ｗｙｅｔｈ（ＡＴＣＣ＃ＶＲ３２５、ＤＲＹＶＡＣとして流通、Ｗｙｅｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍａｒｉｅｔｔａ、ＰＡ）、コペンハーゲン（ＶＣ−２）、およびＮＹＶＡＣでのｉｄ接種と関連した外傷の本質を、２匹のウサギ（Ａ０６９およびＡ１２８）への接種により評価した。２匹のウサギは、ウイルスに対して異なった全体的感受性を示し、ウサギＡ１２８はウサギＡ０６９よりも深刻ではない反応を示した。ウサギ１２８Ａにおいては、外傷は比較的小さく接種後２７日までに治癒した。ウサギＡ０６９においては、外傷は強烈で、特にＷＲ接種部位に対してひどく、４９日後にようやく治癒した。外傷の強度は、リンパ排出経路に関連して接種部位にもまた依存していた。特に、背脊椎上に位置した部位ではより強烈な外傷を示し、側腹部に位置した外傷を治癒するためにはより長い時間を要した。全ての外傷を、４日から最後の外傷が消失するまで毎日測定し、最大の外傷の大きさと治癒に要した日数の平均を計算した（表１７）。対照ＰＢＳを接種した部位からは局所反応は観察されなかった。潰瘍化外傷がワクシニアウイルス株ＷＲ、ＶＣ−２およびＷｙｅｔｈを接種した部位で観察された。重要なことには、ＮＹＶＡＣを接種した部位では潰瘍化または硬化した外傷は観察されなかった。
【０２６８】
感染可能なウイルスの接種部位での持続性  これらのウイルスの接種部位での相対持続性を評価するため、ウサギに対して、皮内経路で複数の部位に、１０６  、１０７  または１０８  ｐｆｕのＶＣ−２、ＷＲ、ＷｙｅｔｈまたはＮＹＶＡＣを含む０．１ｍｌのＰＢＳを接種した。各々のウイルスは、１０７  ｐｆｕ量を背脊椎上に、１０６  および１０８  量を隣接させて位置させた。接種部位を１１日間毎日観察した。ＷＲは最も強烈な反応を誘導し、ＶＣ−２およびＷｙｅｔｈが続いた（表１８）。潰瘍化は最初に９日目にＷＲおよびＷｙｅｔｈで、１０日目にＶＣ−２で観察された。ＮＹＶＡＣまたは対照ＰＢＳを接種した部位は潰瘍化も硬化も示さなかった。接種後１１日目に、接種部位から皮膚試料を切り出し、機械的に破壊し、ウイルスをＣＥＦ細胞で滴定した。この時点で、投与された以上のウイルスが回収された例は無かった。ワクシニア株ＷＲの回収は、投与ウイルス量に関係なく約１０６  ｐｆｕであった。ワクシニア株ＷｙｅｔｈおよびＶＣ−２の回収は投与量に関係なく１０３  から１０４  ｐｆｕであった。感染可能なウイルスはＮＹＶＡＣ接種部位から回収されなかった。
【０２６９】
遺伝的もしくは化学的免疫欠損マウスの接種  大量のＮＹＶＡＣ（５×１０８  ｐｆｕ）またはＡＬＶＡＣ（１０９  ｐｆｕ）を腹腔経路でヌードマウスに接種したが、１００日間の観察期間にわたって死亡、外傷および明白な病気もみられなかった。これと対照的に、ＷＲ（１０３  から１０４  ｐｆｕ）、Ｗｙｅｔｈ（５×１０７  または５×１０８  ｐｆｕ）もしくはＶＣ−２（１０４  から１０９  ｐｆｕ）を接種したマウスは、伝播した典型的なポックスウイルス外傷を、最初はつま先、次に尾に示し、続いていくつかの動物においては深刻な睾丸炎を示した。ＷＲまたはＷｙｅｔｈを感染させたマウスにおいては、伝播した外傷の現れは総じて最後には死へとつながっていたが、ＶＣ−２に感染させたマウスは殆どは最後には回復した。計算されたＬＤ５０値は表１９に示されている。
【０２７０】
特に、ＶＣ−２を接種されたマウスは、つま先に、１から２日後には尾に外傷（赤い丘疹）を示した。これらの外傷は接種後（ｐｉ）１１から１３日の間に最も高い投与量のマウスにおいて（１０３  、１０８  か、１０７  かおよび１０６  ｐｆｕ）、ｐｉ１６日には１０５  ｐｆｕ投与されたマウス、およびｐｉ２１日には１０４  ｐｆｕ投与されたマウスにおいて起こった。１０３  および１０２  ｐｆｕを接種したマウスにおいては、１００日の観察期間の間は外傷はみられなかった。ｐｉ２３日には、１０９  および１０８  ｐｆｕを接種したマウスにおいて、７日後には他のグループ（１０７  から１０４  ｐｆｕ）において睾丸炎がみられた。睾丸炎は特に１０９  および１０８  ｐｆｕグループにおいて強烈で、減少してはいたものの、１００日間の観察の終わりまで観察された。いくつかの、ｐｉ３０−３５日頃に起じてきた痘様外傷が、２、３のマウスの皮膚上にみられた。殆どの痘外傷は通常はｐｉ６０−９０日の間に治癒した。１０９  ｐｆｕを接種したグループのマウスが１匹だけ死に（ｐｉ３４日）、１０８  ｐｆｕを接種したグループのマウスが１匹だけ死んだ（ｐｉ９４日）。ＶＣ−２を接種されたマウスにおいて他に死亡は観察されなかった。
【０２７１】
１０４  ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種したマウスはｐｉ１７日で痘外傷を示し始めた。これらの外傷はＶＣ−２を注入されたマウスによって示された（つま先、尾と拡がる）外傷と同様に現れた。１０３  ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種したマウスはｐｉ３４日まで外傷を示さなかった。睾丸炎は最も多量のＷＲ（１０４  ｐｆｕ）を接種したマウスにおいてのみみられた。観察期間の後半の間、外傷は口の周りに現れ、マウスは摂食を停止した。１０４  ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種したマウスは全て、ｐｉ２１日から３１日の間に死ぬか必要と思われたときは安楽死させた。１０３  ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種したマウス５匹のうち４匹はｐｉ３５日から５７日の間に死ぬか必要と思われるときには安楽死させた。低いＷＲの投与量（１から１００ｐｆｕ）を接種されたマウスにおいて死亡は観察されなかった。
【０２７２】
ワクシニアウイルスＷｙｅｔｈ株を多量に（５×１０７  ｐｆｕおよび５×１０８  ｐｆｕ）接種されたマウスはつま先と尾に外傷を示し、睾丸炎を起こし、死んだ。５×１０６  ｐｆｕもしくはこれ以下のＷｙｅｔｈを注入されたマウスは病気もしくは外傷の兆候を示さなかった。
【０２７３】
表１９に示されるとおり、ＣＹ処理マウスは、ヌードマウスよりも高感度なポックスウイルス毒性アッセイモデルを提供した。ワクシニアウイルス株ＷＲ、ＷｙｅｔｈおよびＶＣ−２に対するＬＤ５０値は、このモデルシステムにおいては、ヌードマウスモデルにおけるよりも顕著に低かった。さらに、以下に示すように、Ｗｙｅｔｈ、ＷＲおよびＶＣ−２ワクシニアウイルスを、それぞれ多量に注入されたマウスで生じた外傷は、より早い外傷の形成という結果となった。ヌードマウスでみられたように、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを注入されたＣＹ処理マウスは、外傷を引き起こさなかった。しかしながら、ヌードマウスとは異なり、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを投与されたＣＹ処理マウスにおいて、投与量に関係なく、いくつかの死亡が観察された。これらのランダムな出来事が死の原因と考えられる。
【０２７４】
全てのＷｙｅｔｈ投与量（９．５×１０４  から９．５×１０８  ｐｆｕ）で注入されたマウスは、ｐｉ７日と１５日の間にそれらの尾および／またはつま先に痘外傷を示した。加えて、尾とつま先は膨張した。尾の外傷の発展は、ポックス外傷に典型的な丘疹、潰瘍化および最終的なかさぶたの形成であった。全てのＶＣ−２投与量（１．６５×１０５  から１．６５×１０９  ｐｆｕ）で注入されたマウスもまた、Ｗｙｅｔｈで接種されたマウスのそれと同様に、それらの尾および／またはつま先に痘外傷を示した。これらの外傷は、接種後７−１２日の間に観察された。少量のＷＲウイルスを注入されたマウスでは外傷は観察されなかったが、これらのグループにおいて死亡は引き起こされた。
【０２７５】
ＮＹＶＡＣ−ＲＧの能力試験  ワクシニアウイルスコペンハーゲン株の弱毒化が、その結果生じたＮＹＶＡＣ株の有用なベクターとしての能力を顕著に変化させることなく効果を示していることを調べるため、比較能力試験を行った。ウイルスを弱毒化するために行われた連続的遺伝子操作の間のベクターの免疫原的能力を観察するために、狂犬病ウイルス糖タンパク質をレポーター外因性遺伝子として用いた。狂犬病糖タンパク質遺伝子を発現するベクターの防御効果を、狂犬病に対する標準ＮＩＨマウス能力試験（ｓｅｌｉｇｍａｎｎ，１９７３）により評価した。表２０は高度弱毒化ＮＹＶＡＣベクターから得られたＰＤ５０値が、ｔｋ座に狂犬病糖タンパク質遺伝子を有するコペンハーゲンをベースとした組換体（Ｋｉｅｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）を用いて得られた値と同一であり、鳥類種に複製が限定されているカナリアポックスベースのベクターであるＡＬＶＡＣ−ＲＧについて得られたＰＤ５０値に近かったことを示している。
【０２７６】
観察  公知の毒性遺伝子を欠失され制限された生体外増殖特性を有するＮＹＶＡＣを、その弱毒化特性を評価するため動物モデルシステム中で分析した。これらの研究は、神経毒性ワクシニアウイルス実験室株、ＷＲ、２つのワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈ（ニューヨーク市保健局）およびコペンハーゲン（ＶＣ−２）、さらにカナリアポックスウイルス株、ＡＬＶＡＣ（実施例１１を参照）と比較して行った。これとともに、これらのウイルスは、マウス投与モデルおよびウサギ皮膚モデルにおける、最も毒性株であるＷＲ、立証された特性とともに以前に用いられていた弱毒化ワクチン株を提供しているコペンハーゲン（ＶＣ−２）およびＷｙｅｔｈ、複製が鳥類種に限られているポックスウイルスの例を提供しているＡＬＶＡＣに関し、相対的病原性ポテンシャルのスペクトルを提供した。これらの生体内分析の結果は、ワクシニアウイルス株、ＷＲ、Ｗｙｅｔｈおよびコペンハーゲン（ＶＣ−２）と比較して高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣの性質を明白に示している（表１４−２０）。重要なことには、ＮＹＶＡＣのＬＤ５０値は、鳥類宿主制限アビポックスウイルス、ＡＬＶＡＣについて見られた値と匹敵するものであった。ＮＹＶＡＣによる死亡は、ＡＬＶＡＣと同様に、極端に大量のウイルスが頭蓋内経路で投与された場合にのみ観察された（実施例１１、表１４、１５、１９）。これらの死が、多量のタンパク質の接種の非特異性は必然的結果であるか否かはまだ確定はしていない。免疫不全マウスモデル（ヌードマウスおよびＣＹ処理）における分析はまた、ＷＲ、Ｗｙｅｔｈおよびコペンハーゲン株と比較して、ＮＹＶＡＣの相対的に高い弱毒化特性を示している（表１７および１８）。重要なことには、伝播したワクシニア感染あるいはワクシニア性病気の証拠が、ＮＹＶＡＣを接種された動物またはＡＬＶＡＣを接種させた動物においては、観察期間にわたって観察されなかったことである。ＮＹＶＡＣ中の複数の毒性関連遺伝子の欠失は、病原性に関して相乗効果を示した。他のＮＹＶＡＣの無毒性の尺度が、ウサギ皮膚への皮内投与によって提供された（表１７および１８）。非鳥類種では複製できないウイルスであるＡＬＶＡＣについての結果を考えると、ＡＬＶＡＣの皮内接種は、投与量に応じたかたちで硬化の範囲を引き起こしたので、接種部位における複製能力は、単に反応性と相関しているのではない。従って、ウイルスの複製能力以外の要素が外傷の形成に寄与していることはあり得る。ＮＹＶＡＣの遺伝子の欠失は外傷の現れを防止する。
【０２７７】
同じく、実施例１１を含む先の実施例およびこの実施例の結果は、ＷＲ、および以前にワクシニアウイルスワクチン株として用いられていた、Ｗｙｅｔｈおよびコペンハーゲンと比較して、高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣの性質を示している。事実、試験された動物モデルシステムにおける、ＮＹＶＡＣの病原性プロフィールは、鳥類種でのみ生産的に複製することが知られているポックスウイルス、ＡＬＶＡＣのそれに近かった。ヒト（表１６）およびマウス、ブタ、イヌおよびウマを含む他の種から派生した細胞上での、明らかに制限されたＮＹＶＡＣの生産的複製能力は、ワクチン接種されていない接触体もしくは一般的環境への潜在的伝播を限定もしくは防止するとともに、ワクチン接種された個体内での伝播の、低い可能性をベクターに提供する。
【０２７８】
重要なことには、ＮＹＶＡＣベースのワクチン候補株は効率的であることが示されている。数多くの病原体由来の外来遺伝子産物を発現するＮＹＶＡＣ組換体は、霊長類を含むいくつかの動物種において外来遺伝子産物に対する免疫反応を誘導する。特に、狂犬病糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣベース組換体は、致死量の狂犬病投与に対してマウスを防御可能であった。ＮＹＶＡＣベースの狂犬病糖タンパク質組換体の能力は、ｔｋ遺伝子座中に狂犬病糖タンパク質を含むコペンハーゲンベースに対するＰＤ５０値に匹敵していた（表２０）。ＮＹＶＡＣベースの組換体は麻疹ウイルス中和抗体をウサギにおいて誘導し、ブタにおいて仮性狂犬病ウイルスおよび日本脳炎ウイルス投与に対する防御を誘導することが示された。高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣ株は、ヒトおよび獣医学の用途に安全性の利点を付与している（Ｔａｒｔａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。さらには、ＮＹＶＡＣの総合的研究室用発現ベクターシステムとしての利用は、ワクシニアウイルス利用に関する生物的危険を大きく減少させる。
【０２７９】
以下の基準によって、この実施例の結果および、実施例１１を含む文書中の実施例は、ＮＹＶＡＣが高度に弱毒化されていることを示している：ａ）接種部位での検出可能な硬化あるいは潰瘍化がない（ウサギ皮膚）；ｂ）皮内接種部位からの感染可能はウイルスの速やかな消失（ウサギ皮膚）；ｃ）睾丸炎がない（ヌードマウス）；ｄ）大きく減少された毒性（頭蓋内投与、生後３週間および新生マウス）；ｅ）大きく減少された病原性および免疫不全対象物（ヌードおよびシクロホスファミド処理マウス）において拡散性がない；およびｆ）劇的に減少された、多様なヒト組織培養細胞上での複製能力。しかしながら、高度に弱毒化されているにも拘わらず、ＮＹＶＡＣは、ベクターとして、外因性抗原に対して強力な免疫反応を誘導する能力を保持している。
【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【０２８０】
実施例１３  トリインフルエンザウイルス
血球凝集素糖タンパク質を発現する
ＴＲＯＶＡＣ組換体の構築        
この実施例はトリインフルエンザウイルスの３つの血清型の血球凝集素遺伝子を発現するニワトリポックスウイルス組換体の開発を記述する。
【０２８１】
細胞およびウイルス  Ｈ４、Ｈ５およびＨ７血球凝集素遺伝子のｃＤＮＡクローンを含むプラスミドを、Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ  Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｍｅｍｐｈｉｓ、Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅより入手した。ＦＰ−１と命名されたＦＰＶ株は以前に記述されている（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）。これは、生後１日のニワトリのワクチン接種に有用なワクチン株である。親株Ｄｕｖｅｔｔｅはフランスでニワトリからニワトリポックスのかさぶたとして得られた。親株はふ化鶏卵における約５０回の連続継代とそれに続くニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞で２５回の継代により弱毒化された。このウイルスは１９８０年にＲｈｏｎｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅで得られ、マスターウイルスシードを作り出した。このウイルスは１９８９年にＶｉｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓに受領され、ウイルスは４回の連続プラーク精製にかけられた。１つのプラーク単離体を初代ＣＥＦ細胞中で増幅し、ＴＲＯＶＡＣと命名されたストックウイルスとした。この生体外組換えテストでＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）およびＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）を生成するために用いられたストックウイルスは、初代ＣＥＦ中で８回の継代にかけられさらに増幅された。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７（ｖＦＰ１００）を生成するために用いられたストックウイルスは、初代ＣＥＦ中で１２回の継代にかけられさらに増幅された。
【０２８２】
Ｆ８座へのニワトリポックス挿入プラスミドの構築  プラスミドｐＲＷ７３１．１５は、ＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡからクローン化された１０ｋｂｐのＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片を有している。３６５９ｂｐＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片のヌクレオチド配列が両方の鎖について決定された。この配列を図１１に示す（配列番号６７）。本研究室でＦ８と命名されたオープンリーディングフレームの限定が、この配列の内部で決定された。オープンリーディングフレームは、位置４９５から開始され位置１８８７で終了する。以下に記述するように、位置７７９から位置１９２６までを欠失させた。
【０２８３】
プラスミドｐＲＷ７６１は２４３０ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶ断片を含むｐＲＷ７３１．１５のサブクローンである。プラスミドｐＲＷ７６１をＸｂａＩで完全消化、ＳｓｐＩで部分消化した。３７００ｂｐのＸｂａＩ−ＳｓｐＩバンドを単離し、アニーリングさせたオリゴヌクレオチドＪＣＡ０１７（配列番号３７）およびＪＣＡ０１８（配列番号３８）と連結した。
【０２８４】
2006141407.tif 000036
【０２８５】
この連結により生じたプラスミドをｐＪＣＡ００２と命名した。プラスミドｐＪＣＡ００４はワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結した非関連遺伝子をプラスミドｐＪＣＡ００２中に有している。ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの配列は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８ａ，ｂ；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｐｅｒｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。プラスミドｐＪＣＡ００４をＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化し、非関連遺伝子とＨ６プロモーター３７末端の一部を欠失させた。アニーリングさせたオリゴヌクレオチドＲＷ１７８（配列番号４８）およびＲＷ１７９（配列番号４９）をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、ＪＣＡ００４のＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩ部位の間に入れ、ｐＲＷ８４６を生成した。
【０２８６】
（配列番号）
2006141407.tif 000037
【０２８７】
それ故、プラスミドｐＲＷ８４６はＨ６プロモーターの５’ＥｃｏＲＶを、ＯＲＦ欠失されたＦ８座に有している。プラスミドｐＲＷ８４６中のＨ６プロモーターの３’ＨｉｎｃＩＩ部位に、翻訳終了コドン、ワクシニアウイルス初期プロモーター（Ｙｕｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）により認識される転写終結コドンおよびＳｍａＩ部位が続いている。
【０２８８】
Ｆ７座へのニワトリポックス挿入プラスミドの構築  元々のＦ７ＯＲＦが欠失されていない挿入プラスミド、ｐＲＷ７３１．１３は、５．５ｋｂｐのＦＰゲノムのＰｖｕＩＩ断片をｐＵＣ９のＰｖｕＩＩ部位中に有している。挿入部位はこれらの配列内部の固有のＨｉｎｃＩＩである。図１２に示されているヌクレオチド配列（配列番号６８）は、固有のＨｉｎｃＩＩ部位を含む２３５６ｂｐの領域について決定された。この配列の解析により、固有のＨｉｎｃＩＩ部位（図１２、下線）は９０アミノ酸のポリペプチドをコードしているＯＲＦの内部に位置していることが明らかとなった。ＯＲＦは位置１５３１のＡＴＧにより始まり、位置８９８で終わる（図１２中で矢印で示された位置）。
【０２８９】
ＯＲＦ欠失させた挿入プラスミドのためのアームはｐＲＷ７３１．１３をテンプレートとして用いたＰＣＲにより派生した。ＯＲＦの上流領域に相当する５９６ｂｐのアーム（ＨＢと命名）は、オリゴヌクレオチドＦ７３ＰＨ２（配列番号５０）およびＦ７３ＰＢ（配列番号５１）により増幅された。
【０２９０】
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【０２９１】
ＯＲＦの下流領域に相当する２７０ｂｐのアーム（ＥＨと命名）は、オリゴヌクレオチドＦ７５ＰＨＥ（配列番号５２）およびＦ７３ＰＨ１（配列番号５３）により増幅された。
【０２９２】
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【０２９３】
断片ＥＨをＥｃｏＲＶで消化し、１２６ｂｐの断片を生成した。ＥｃｏＲＶ部位は３’末端にあり、５’末端はＨｉｎｃＩＩの３’末端を含むようＰＣＲにより形成した。この断片を、ＨｉｎｃＩＩで消化したｐＢＳ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中に挿入し、プラスミドｐＦ７Ｄ１とした。この配列をジデオキシヌクレオチド配列分析により確認した。プラスミドｐＦ７Ｄ１をＡｐａＩで直線化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、５９６ｂｐのＨＢ断片へ連結した。生成されたプラスミドをｐＦ７Ｄ２と命名した。全体の配列と方向をヌクレオチド配列分析により確認した。
【０２９４】
プラスミドｐＦ７Ｄ２をＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩで消化し、６００ｂｐの断片を生成させた。この断片をＡｐａＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、続いてＢａｍＨＩで消化したｐＢＳ−ＳＫに挿入した。その結果生成されたプラスミドをｐＦ７Ｄ３と命名した。このプラスミドは４０４ｂｐのＨＢアームと１２ｂｐのＥＨアームを含んでいる。
【０２９５】
プラスミドｐＦ７Ｄ３を、ＸｈｏＩで直線化し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼクレノー断片で２ｍＭのｄＮＴＰの存在下で平滑化した。この直線化されたプラスミドはアニーリングさせたオリゴヌクレオチドＦ７ＭＣＳＢ（配列番号５４）およびＦ７ＭＣＳＡ（配列番号５５）と連結させた。
【０２９６】
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【０２９７】
これは、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩ制限部位を含むマルチプルクローニング領域をＥＨアームとＨＢアームとの間に挿入するために行った。生成されたプラスミドをｐＦ７ＤＯと命名した。
【０２９８】
Ｆ８座へのＨ４血球凝集素挿入プラスミドの構築  Ａ／Ｔｙ／Ｍｉｎ／８３３／８０から派生したトリインフルエンザＨ４をコードしているｃＤＮＡは、プラスミドｐＴＭ４Ｈ８３３中に、Ｄｒ．Ｒ．Ｗｅｂｓｔｅｒより入手した。プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｒｕＩで消化し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼクレノー断片でｄＮＴＰの存在下で平滑化した。Ｈ４コード領域を含む平滑化２．５ｋｂｐＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｒｕＩ断片を、ｐＩＢＩ２５（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ８２８を部分的にＢａｎＩＩで切断し、線状産物を単離しＨｉｎｄＩＩＩで再び切断した。今、１００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｎＩＩを欠失されたプラスミドｐＲＷ８２８は、合成オリゴヌクレオチドＲＷ１５２（配列番号５６）およびＲＷ１５３（配列番号５７）のベクターとして用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、ＥｃｏＲＶ部位からのＨ６プロモーターの３’部分を表し、Ｈ４ｃＤＮＡのＡＴＧをプロモーターのＡＴＧと並列させている。
【０２９９】
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【０３００】
これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、ＢａｎＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上記のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｎＩＩ欠失ｐＲＷ８２８ベクター中に挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ８４４をＥｃｏＲＶおよびＤｒａＩで切断し、３’Ｈ６プロモートされたＨ４コード配列を含む１．７ｋｂｐ断片を、ｐＲＷ８４６（以前に記述）のＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｃＩＩ部位に挿入し、ｐＲＷ８４８とした。プラスミドｐＲＷ８４８は、それ故、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結したＨ４コード領域を、ニワトリポックスウイルスＦ８座ＯＲＦ欠失領域中に有している。
【０３０１】
Ｆ８座へのＨ５血球凝集素挿入プラスミドの構築  Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｒｅｌａｎｄ／１３７８／８３から派生したトリインフルエンザＨ５をコードしているｃＤＮＡは、プラスミドｐＴＨ２９中に、Ｄｒ．Ｒ．Ｗｅｂｓｔｅｒより入手した。合成ヌクレオチドＲＷ１０（配列番号５８）からＲＷ１３（配列番号６１）までは、以前に記述されたワクシニアウイルスＨ６プロモーターの翻訳開始コドンをＨ５遺伝子のＡＴＧとオーバーラップさせるために設計された。配列は、Ｈ５遺伝子の５’ＳａｌＩ部位を通して連続しており、Ｈ５停止コドンを含む３’Ｈ５ＤｒａＩ部位で再び開始する。
【０３０２】
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【０３０３】
オリゴヌクレオチドを、９５℃で３分間、続いてゆっくりと室温で冷却しアニーリングさせた。これは以下の、示された末端での二本鎖構造という結果となる。
【０３０４】
2006141407.tif 000043
【０３０５】
ｐＲＷ７４２のＥｃｏＲＶとＰｓｔＩ部位との間へのオリゴヌクレオチドのクローン化によりｐＲＷ７４４を生成した。ｐＲＷ７３１．１５のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入されたワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結した非関連遺伝子を有するプラスミドｐＲＷ７４２Ｂは以前に記述された。ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＶによる消化で、非関連遺伝子およびＨ６プロモーターの３’末端を除去した。今、プラスミドｐＲＷ７４４はトリインフルエンザＨ５のＡＴＧとオーバーラップしたＨ６プロモーターの３’部分を有している。このプラスミドはまた、５’ＳａｌＩ部位を通ったＨ５配列およびＨ５停止コドン（ＤｒａＩ部位を含む）からの３’配列を含む。ＤｒａＩ部位の利用によりＨ５  ３’非コード末端を除去する。オリゴヌクレオチドは、初期ワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼにより認識される転写終結シグナル（Ｙｕｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）を付与する。Ｈ６プロモートされたＨ５の構築を完成させるため、Ｈ５コード領域を１．６ｋｂｐのＳａｌＩ−ＤｒａＩ断片としてｐＴＨ２９から単離した。プラスミドｐＲＷ７４４をＤｒａＩで部分切断し、線状断片を単離し、ＳａｌＩで再び消化した、ＳａｌＩとＤｒａＩとの間の８ベースを欠失させたプラスミドを、１．６ｋｂｐのｐＴＨ２９ＳａｌＩ−ＤｒａＩ断片のベクターとして用いた。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ７５９をＥｃｏＲＶおよびＤｒａＩで切断した。３’Ｈ６プロモーターおよびＨ５遺伝子を含む１．７ｋｂｐのｐＲＷ７５９ＥｃｏＲＶ−ＤｒａＩ断片を、ｐＲＷ８４６（以前に記述）のＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ８４９は、ＯＲＦ欠失Ｆ８座内にＨ６プロモートされたトリインフルエンザウイルスＨ５遺伝子を含んでいた。
【０３０６】
Ｆ７座へのＨ７血球凝集素挿入ベクターの構築  Ａ／ＣＫ／ＶＩＣ／１／８５由来のＨ７血球凝集素を含むプラスミドｐＣＶＨ７１は、Ｄｒ．Ｒ．Ｗｅｂｓｔｅｒより入手した。Ｈ７遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼクレノー断片により平滑末端化し、ｐＩＢＩ２５のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入し、ｐＲＷ８２７とした。合成オリゴヌクレオチドＲＷ１６５（配列番号６２）およびＲＷ１６６（配列番号６３）とをアニーリングさせ、ＨｉｎｃＩＩおよびＳｔｙＩで消化し、ｐＲＷ８２７のＥｃｏＲＶおよびＳｔｙＩ部位に挿入し、ｐＲＷ８４５とした。
【０３０７】
2006141407.tif 000044
【０３０８】
オリゴヌクレオチドＲＷ１６５（配列番号６２）およびＲＷ１６６（配列番号６３）はＨ６プロモーターの３’部分をＨ７遺伝子に連結している。Ｈ７遺伝子の３’非コード末端は、ｐＲＷ８４５のＡｐａＬＩ消化の線状産物を単離し、ＥｃｏＲＩで再び切断し、最も大きな断片を単離し、合成ヌクレオチドＲＷ２２７（配列番号６４）およびＲＷ２２８（配列番号６５）とアニーリングさせることにより除去した。その結果生成されたプラスミドはｐＲＷ８５４である。
【０３０９】
2006141407.tif 000045
【０３１０】
ｐＲＷ８５４のＨ７の停止コドンにはＨｐａＩ部位が続いている。ＯＲＦ欠失されたＦ７座中のＨ６プロモートされたＨ７構築物中間体を、ｐＲＷ８５４のＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩ断片を、ＥｃｏＲＶで切断し、ＰｓｔＩ部位を平滑化させたｐＲＷ８５８中に移動させることにより生成した。プラスミドｐＲＷ８５８（以下に記述）は、Ｈ６プロモーターをＦ７ＯＲＦ欠失中に含む挿入プラスミドである。
【０３１１】
プラスミドｐＲＷ８５８は、非関連遺伝子に連結したＨ６プロモーターを有する８５０ｂｐのＳｍａＩ／ＨｐａＩ断片を、以前に記述されたｐＦＤＯのＳｍａＩ部位に挿入することによって構築された。この非関連配列は、ｐＲＷ８５８のＥｃｏＲＶ（Ｈ６プロモーターの３’末端の２４ｂｐ上流の部位）およびＰｓｔＩでの消化により取り除いた。３．５ｋｂｐのその結果生じた断片を単離しＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼクレノー断片を用いて２ｍＭのｄＮＴＰ存在下で平滑末端化した。この平滑化された断片を、ｐＲＷ８５４（以前に記述）から派出した１７００ｂｐのＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ断片に連結された。このＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ断片は、ＶＶ  Ｈ６プロモーターの３’部分の２４ｂｐの３’側に並列された完全ＡＩＶ  ＨＡ（Ｈ７）遺伝子を有している。その結果生成されたプラスミドはｐＲＷ８６１と命名された。
【０３１２】
１２６ｂｐＥＨアーム（以前に定義）は、ｐＲＷ８６１中で、ＴＲＯＶＡＣ  ＤＮＡとの組換え頻度を高めるために伸長された。これを実行するため、５７５ｂｐのＡｃｃＩ／ＳｎａＢＩ断片をｐＲＷ７３１．１３（以前に定義）から派生させた。この断片を単離し、ｐＲＷ８６１のＡｃｃＩ部位とＮａｅＩ部位との間に挿入した。その結果生成されたプラスミドは、ＡＩＶ  Ｈ７遺伝子に隣接している７２５ｂｐのＥＨアームおよび４０４ｂｐのＨＢアームを有し、ｐＲＷ８６９と命名された。プラスミドｐＲＷ８６９は、それ故、５’末端でワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結されたＨ７コード配列を有している。左隣接アームは４０４ｂｐのＴＲＯＶＡＣ配列からなり右隣接アームは欠失ＯＲＦＦ７座への挿入を目的とした７２５ｂｐのＴＲＯＶＡＣ配列からなる。
【０３１３】
ＴＲＯＶＡＣ−トリインフルエンザウイルス組換体の開発  トリインフルエンザウイルスＨＡコード配列を有する挿入プラスミドを、個別に、ＴＲＯＶＡＣを感染させた初代ＣＥＦ細胞に、以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２；Ｐｉｃｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）リン酸カルシウム沈殿法により形質導入した。ＨＡ特異的放射性標識プローブとのハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な集団が達成させるまで連続したプラーク精製過程にかけた。１つの代表プラークが続いて増幅されてストックウイルスとされた。プラスミドｐＲＷ８４９は、生体外組換えテストにおいて用いられ、その結果、Ｈ５血球凝集素を発現するＡＬＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）を生成した。プラスミドｐＲＷ８４８が用いられ、その結果、Ｈ４血球凝集素を発現するＡＬＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）を生成した。プラスミドｐＲＷ８６９が用いられ、その結果、Ｈ７血球凝集素を発現するＡＬＶＡＣ−ＡＩＨ７（ｖＦＰ１００）を生成した。
【０３１４】
免疫蛍光  インフルエンザウイルスに感染した細胞においては、ＨＡ分子は合成され、プレカーサー分子として粗面小胞体においてグリコシル化される。原形質膜への輸送の間に、最終的にジスルフィド結合したＨＡ１  および  ＨＡ２  サブユニットとなるようなタンパク質切断である翻訳後の拡張的修飾、および成熟ウイルスエンベローブへ取り込まれる場所である宿主細胞膜への挿入を受ける。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ組換体に感染させた細胞中でＨＡ分子が細胞表面で発現されているかどうかを決定するため、免疫蛍光を行った。直接的でない免疫蛍光は以前に記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）行った。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４ではＨ４血球凝集素が、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５ではＨ５血球凝集素が、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７ではＨ７血球凝集素が表面で発現していることが、表面蛍光により確認された。Ｈ５血球凝集素の発現は、Ｈ５ＨＡ特異的モノクローナル抗体のプールを用いて検出された。Ｈ４ＨＡの発現はヤギ単独特異的抗Ｈ４血清を用いて分析した。Ｈ７ＨＡの発現はＨ７特異的モノクローナル抗体調製物を用いて分析した。
【０３１５】
免疫沈降  ウイルス粒子が感染可能であるためには、血球凝集素のポリペプチドの切断が必要であるため、血球凝集素分子の切断部位およびそのの周辺の配列は、ウイルス毒性の決定において重要な役割を果たすことが同定されている。毒性Ｈ５およびＨ７ウイルスは、ＨＡ１  にカルボキシ末端において１以上の塩基性アミノ酸を有している。これにより、一連の塩基性アミノ酸を認識する細胞内プロテアーゼが血球凝集素を切断することを可能にし、感染可能なウイルスが生体外でも生体内でも拡散することを可能にしていると考えられている。無毒性株のＨ４血球凝集素分子は組織培養中では、外因性トリプシンが添加されないかぎり切断されない。
【０３１６】
ＴＲＯＶＡＣ組換体によって発現された血球凝集素分子が実際にプロセシングされているか否かを決定するため、免疫沈降実験を記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、上記の特異的試薬を用いて行った。
【０３１７】
ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）によって発現されたＨ５血球凝集素の免疫沈降分析により、糖タンパク質は、それぞれ約４４および２３ｋＤａの分子量の切断産物ＨＡ１  およびＨＡ２  として明瞭であることを示した。感染させていない細胞もしくは親ＴＲＯＶＡＣウイルスに感染させた細胞においては、このようなタンパク質は沈殿されなかった。同様に、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ１００）によって発現されたＨ５血球凝集素の免疫沈降分析により、切断産物ＨＡ２  特異的沈殿を示した。ＨＡ１  切断産物は認識されなかった。感染させていないＣＥＦ細胞もしくは親ＴＲＯＶＡＣウイルスに感染させたＣＥＦ細胞においては、このようなタンパク質は沈殿されなかった。これと対照的に、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）によって発現されたＨ４血球凝集素の免疫沈降分析においては、プレカーサータンパク質ＨＡ０  のみの発現を示した。無毒性亜型の血球凝集素の、組織培養中での発現の欠如と一致している。感染させていないもしくは親ＴＲＯＶＡＣウイルスに感染させたＣＥＦ細胞においては、Ｈ４特異的タンパク質は検出されなかった。組換えによる組換えウイルスの開発、ニトロセルロース膜フィルターによるin situ ハイブリダイゼーション、およびベータガラクトシダーゼ活性によるスクリーニングは以前に記述された通りである（Ｐａｎｉｃａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２；Ｐｅｒｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。
【０３１８】
実施例１４−ＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ）
(＋トランスメンブレン）エピトープを発現するＡＬＶＡＣ組
換え体の構築                                            
ＨＩＶ１（ＩＩＩＢ）ｃＤＮＡ配列（Ratner他、1985）を含有するプラスミドｐＨＸＢ２ＤをRobert Gallo氏（米国ＮＩＨ、ＮＣＩ）から入手した。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋ隣接アームの間にクローニングした。これを行うために、ｐＨＸＢ２Ｄの１，６２５ｂｐのＢｇｌＩＩ断片（ｇａｇ遺伝子の５′末端を含有する）をｐＳＤ５４２ＶＣＶＱの４，０７５ｂｐのＢｇｌＩＩ断片内にクローニングした。この操作によって得られたプラスミドをｐＨＩＶＧ２と呼ぶ。
【０３１９】
次いで、ｇａｇ遺伝子の３′末端をｐＧＩＶＧ２にクローニングした。これを行うために、２８０ｂｐのＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ  ＰＣＲ断片（ｇａｇ遺伝子の３′末端を含有する）を、ｐＨＩＶＧ２の５，６２０ｂｐのＡｐａＩ−ＢａｍＨ断片内にクローニングした。（該ＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチドプライマーＨＩＶＰ５（配列番号６９）
2006141407.tif 000046
【０３２０】
およびＨＩＶＰ６（配列番号７０）
2006141407.tif 000047
【０３２１】
を用いてプラスミドｐＨＸＢ２Ｄから調製した。）この操作によって得られたプラスミドをｐＨＩＶＧ３と呼ぶ。
【０３２２】
次いで、ｇａｇ遺伝子の上流にＩ３Ｌプロモーターをクローニングした。これを行うために、ワクシニアウイルスのＩ３Ｌプロモーターおよびｇａｇ遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌクレオチドＨＩＶＬ１７（配列番号７１）
2006141407.tif 000048
【０３２３】
およびＨＩＶＬ１８（配列番号７２）
2006141407.tif 000049
【０３２４】
を、ｐＧＩＶＧ３の５，５４０ｂｐの部分的ＢａｌＩＩ−ＣｌａＩ断片内にクローニングした。この操作によって得られたプラスミドをｐＨＩＶＧ４と呼ぶ。
【０３２５】
次に、ｇａｇ遺伝子のうち、ｐ２４、ｐ２、ｐ７およびｐ６をコードする部分を除去した。これを行うためにオリゴヌクレオチドＨＩＶＬ１９（配列番号７３）
2006141407.tif 000050
【０３２６】
およびＨＩＶＬ２０（配列番号７４）
2006141407.tif 000051
【０３２７】
を、ｐＨＩＶＧ４の４，４５０ｂｐの部分的ＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ断片内にクローニングした。この操作によって得られたプラスミドをｐＨＩＶＧ５と呼ぶ。
【０３２８】
次いで、ｇａｇ遺伝子の残り、ならびにｐｏｌ遺伝子をｐ１７「遺伝子」の下流にクローニングした。これを行うために、ｐＨＸＢ２Ｄの４，９５５ｂｐのＣｌａＩ−ＳａｌＩ断片（ｇａｇ遺伝子の大部分、およびｐｏｌ遺伝子の全部を含有する）を、ｐＨＩＶＧ５の４，１５０ｂｐのＣｌａＩ−ＳａｌＩ断片内にクローニングした。この操作によって得られたプラスミドをｐＨＩＶＧ６と呼ぶ。
【０３２９】
次いで、非関連３′−非コード配列を除去した。これを行うために、３６０ｂｐのＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩ  ＰＣＲ断片（ｐｏｌ遺伝子の３′末端を含有する）を、ｐＨＩＶＧ６の８，０３０ｂｐのＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片内にクローニングした。（該ＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチドプライマーＨＩＶＰ７（配列番号７５）
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【０３３０】
およびＨＩＶＰ８（配列番号７６）
2006141407.tif 000053
【０３３１】
を用いてプラスミドｐＨＸＢ２Ｄから調製されたものである。）このようにして得られたプラスミドをｐＨＩＶＧ７と呼ぶ。
【０３３２】
次いで、Ｉ３Ｌをプロモーターとするｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子を、カナリアポックスＣ３の隣接アームの間にクローニングした。これを行うために、ｐＨＩＶＧ７の４，３６０ｂｐの部分的ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（Ｉ３Ｌをプロモーターとするｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子を含有する）を、ｐＶＱＨ６ＣＰ３ＬのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１４と呼ぶ。
【０３３３】
次に、Ｈ６をプロモーターとするＨＩＶ１ｇｐ１２０（ＭＮ）（＋トランスメンブブレン）「遺伝子」（Gurgo他、1988）をｐＨＩＶＧＥ１４内にクローニングした。これを行うために、ｐＣ５ＨＩＶＭＮ１２０Ｔの１，７００ｂｐのＮｒｕＩ−ＳｍａＩ断片（ｇｐ１２０（＋トランスメンブレン）「遺伝子」を含有する）を、ｐＨＩＶＧＥ１４の１１，４００ｂｐのＮｒｕＩ−ＳｍａＩ断片内にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１４Ｔと呼ぶ。
【０３３４】
次いで、ｐｏｌ遺伝子の大部分を除去した。これを実施するために、５４０ｂｐのＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ  ＰＣＲ断片（ＨＩＶ１プロテアーゼ「遺伝子」を含有するの３’末端）を、ｐＨＩＶＧＥ１４Ｔの１０，０００ｂｐのＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングした。（なお、このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチドプライマーＨＩＶＰ５およびＨＩＶＰ３７（配列番号７７）
2006141407.tif 000054
【０３３５】
を用いてプラスミドｐＨＩＶＧ７から調製されたものである。この操作により、ｐｏｌ遺伝子の大部分が除去されるが、そのプロテアーゼ「遺伝子」はインタクトのままで残っている。この操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶ３２という。ｐＨＩＶ３２（配列番号７８）のＤＮＡ配列は図１４Ａ〜１４Ｃに示されており、この図は、ｐＨＩＶ３２に含まれＨ６をプロモーターとするＨＩＶ１ｇｐ１２０（＋トランスメンブレン）遺伝子およびＩ１３ＬをプロモーターとするＨＩＶ１ｇａｇ（＋プロ）遺伝子のヌクレオチド配列を示す。ｇａｇ（＋プロ）およびｇｐ１２０（＋トランスメンブレン）
特徴        開始点    全長          内容
frag             1      56        Ｃ３隣接アーム
frag           162      76        (c) HIV1 (IIIB) env  トランスメンフ゛レン 領域
frag          1728     163        (c) HIV1 (MN) gp120遺伝子
frag          1853    1729        (c) ワクシニアH6フ゜ロモーター 
frag          1925    1983         ワクシニアI3Lフ゜ロモーター 
frag          1984    3746         HIV1 (IIB) gag/フ゜ロ遺伝子
frag          1753    3808         C3 隣接アーム
ＡＬＶＡＣ  Ｃ３隣接アームのＤＮＡ配列（配列番号７９）は、図１５Ａ〜Ｆに示されている。この図１５Ａ〜１５Ｆは、ｐＶＱＨ６ＣＰ３ＬにおけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド配列を示している。
【０３３６】
Ｃ３遺伝子座、ｐＶＱＨ６ＣＰ３Ｌ中
特徴        開始点    全長          内容
frag             1    1460         C3 隣接アーム
frag          1461    1501         クローニンク゛ 部位
frag          1630    1502         H6フ゜ロモーター 
frag          1717    4291         C3 隣接アーム
ｐＨＩＶ３２を用いてＡＬＶＡＣをレスキューウイルスとするインビトロ組換えを行いｖＣＰ２０５を得た。
【０３３７】
実施例１５−ＨＩＶ１のｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ
）（＋トランスメンブレン）および２つのｎｅｆ（ＢＲＵ）エ
ピトープを発現するＡＬＶＡＣ組換体の構築                
次に、２つのｎｅｆ  ＣＴＬエピトープ、ＣＴＬ１（アミノ酸６６〜１４７）およびＣＴＬ２（アミノ酸１８２〜２０６）（Wain-Hobson他、1985；NixonおよびMcMichael、1991）をコードする発現カセットをｖＣＰ２０５に挿入した。ｎｅｆ  ＣＴＬエピトープを含有する挿入プラスミドｐ２−６０−ＨＩＶ．３の構築は次のように行った。Ｉ１３ＬをプロモーターとするＣＴＬエピトープをｐＢＳＨ６にクローニングした。これを実施するため、２５５ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ  ＰＣＲ断片（Ｉ３ＬをプロモーターとするＣＴＬ２エピトープを含有する）を、ｐＢＳＨ６の３，１００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングした。（この２５５ｂｐのＰＣＲは次にように調製した。すなわち、オリゴヌクレオチドフライマーＶＱＰＣＲＩ３（配列番号８０）
：５′−ATCATCAAGCTTAATTAATTAGTTATTAGACAAGGTGAAAACGAAACTATTTGTAGCTTAATTATTAGACATCATGCAGTGGTTAAAC−３′）
およびＩ３ＰＣＲＣＴＬ（配列番号８１）
：５′−CTAGCTACGTGATGAAATGCTAATCTAGAATCAAATCTCCACTCCATGATTAAACCTAAATAATTGTAC −３′）
を用いてプラスミドｐＭＰＩ３Ｈから、Ｉ３ＬプロモーターおよびＣＴＬ２エピトープの５′末端を有する２１６ｂｐのＰＣＲ断片を調製した。次に、この２１６ｂｐのＰＣＲ断片を鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーＶＱＰＣＲＩ３およびＣＴＬＰＣＲ（配列番号８２）
：５′−GAATTCCTCGAGGATCCTCTAGATTAACAATTTTTAAAATATTCAGGATGTAATTCTCTAGCTACGTGATGAAATGC−３′）
を用いて第２のＰＣＲ反応を行い、Ｉ３ＬをプロモーターとするＣＴＬ２エピトープを含有するＰＣＲ断片を調製し、これをＨｉｎｄＩＩＩＸｈｏＩで酵素分解して、ｐＢＳＨ６にクローニングした。）この操作により得られたプラスミドをｐ２−６０−ＨＩＶ．１と呼ぶ。
【０３３８】
次いで、このｐ２−６０−ＨＩＶ．１に、Ｈ６をプロモーターとするＣＴＬ１エピトープをクローニングした。これを行うために、２９０ｂｐＮｒｕＩ−ＥｃｏＲＩ断片（Ｈ６をプロモーターとするＣＴＬエピトープを含有）を、ｐ２−６０−ＨＩＶ．１の３，３００ｂｐのＮｒｕＩ−ＥｃｏＲＩ断片にクローニングした。（なお、２９０ｂｐのＮｒｕＩ−ＥｃｏＲＩ断片の調製は、次のように行った。オリゴヌクレオチドＨ６ＰＣＲ１（配列番号８３）
：５′−ACTACTAAGCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG−３′）
およびＮＣＣＰＣＲ１（配列番号８４）
：５′−CAGCTGCTTTGTAAGTCATTGGTCTTAAAGGTACTTGAGGTGTTACTGGAAAACCTACCATTACGATACAAACTTAACGGATATCGCG−３′）
を用いて、プラスミドｐＨ６Ｔ２から、Ｈ６プロモーターおよびＣＴＬ１エピトープの５′末端を含有する１９５ｂｐのＰＣＲ断片を得た。次に、この１９５ｂｐのＰＣＲ断片およびオリゴヌクレオチドＮＣＣ１７４Ａ（配列番号８５）
：５′−ACTTACAAAGCAGCTGTAGATCTTTCTCACTTTTTAAAAGAAAAAGGAGGTTTAGAAGGGCTAATTCATTCTCAACGAAGACAAGATATTCTTGATTTGTGG−３′）
およびＮＣＣ１７Ｂ（配列番号８６）
：５′−CCACAAATCAAGAATATCTTGTCTTCGTTGAGAATGAATTAGCCCTTCTAAACCTCCTTTTTCTTTTAAAAAGTGAGAAAGATCTACAGCTGCTTTGTAAGT−３′）
を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーＨ６ＰＣＲおよびＮＣＣＰＣＲ２（配列番号８７）
：５′−CTGCCAATCAGGAAAATATCCTTGTGTATGATAAATCCACAAATCAAGAATATC−３′
を用いて第２のＰＣＲ反応を行った。得られた３１７ｂｐのＰＣＲ断片（Ｈ６プロモーターおよび大部分のＣＴＬ１エピトープを含有する）ならびにオリゴヌクレオチドＮＣＣ２９１Ａ（配列番号８８）
：５′−GGATATTTTCCTGATTGGCAGAATTACACACCAGGACCAGGAGTCAGATACCCATTAACCTTTGGTTGGTGCTACAAGC−３′）
およびＮＣＣ２９１Ｂ（配列番号８９）
：５′−GCTTGTAGCACCAACCAAAGGTTAATGGGTATCTGACTCCTGGTCCTGGTGTGTAATTCTGCCAATCAGGAAAATATCC−３′）
を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーＨ６ＰＣＲ１およびＮＣＣＰＣＲ３（配列番号９０）
：５′−ACTACTGAATTCTCGAGAAAAATTATGGTACTAGCTTGTAGCACCAACC−３′）
を用いて第３のＰＣＲ反応を行い、Ｈ６をプロモーターとするＣＴＬ１エピトープを含有するＰＣＲ断片を得て、これをＮｒｕＩおよびＥｃｏＲＩで酵素分解し、ｐ２−６−ＨＩＶ．１にクローニングした。）この操作により得られたプラスミドをｐ２−６０−ＨＩＶ．２と呼ぶ。
【０３３９】
次に、Ｉ３ＬをプロモーターとするＣＴＬ２およびＨ６をプロモーターとするエピトープをカナリアポックスＣ６隣接アーム間にクローニングした。これを行うために、ｐ２−６０−ＨＩＶ．２の６４０ｂｐのＸｈｏＩ断片（２つのｎｅｆ  ＣＴＬエピトープを含有する）をｐＣ６ＬのＸｈｏＩ部位にクローニングした。この操作で得られたプラスミドをｐ２−６０−ＨＩＶ．３と呼ぶ。ｐ２−６０−ＨＩＶ．３のＤＮＡ配列（配列番号９１）は図１６に示されている。この図１６は、ｐ２−６０−ＨＩＶ．３に含有されているＩ３Ｌをプロモーターとするｎｅｆ  ＣＴＬ２エピトープおよびＨ６をプロモーターとするｎｅｆＣＴＬ１エピトープのヌクレオチド配列を示す。
【０３４０】
ｎｅｆ  ＣＴＬエピトープ
特徴      開始点      全長              内容
frag          1         51       C6左側アーム
pept        175         98    (C)nef CTL2
frag        275        176    (C)I3Lフ゜ロモーター
frag        337        460       H6フ゜ロモーター
pept        461        709       1 nef CTL1
frag        751        801       C6右側アーム
ＡＬＶＡＣ  Ｃ６隣接アームのＤＮＡ配列（配列番号９２）は、図１７Ａ〜Ｃに示されている。この図１７Ａ〜１７Ｃは、ｐＣ６ＬにおけるＣ６遺伝子座のヌクレオチド配列を示す。
【０３４１】
Ｃ６遺伝子座、ｐＣ６Ｌ中
特徴      開始点      全長              内容
frag          1        381       C6隣接アーム
frag        382        467       クローニンク゛部位
frag        448       1615       C6隣接アーム
ｐ２−６０ＨＩＶ．３を用いてｖＣＰ２０５をレスキューウイルスとするインビトロ組換えを行いｖＣＰ２６４を得た。
【０３４２】
実施例１６−ＨＩＶ１のｇａｇ（＋プロ）（ＩＩＩＢ）、ｇｐ１２０（ＭＮ
）（＋トランスメンブレン）および２つのｎｅｆ（ＢＲＵ）お
よび３つのｐｏｌ（ＩＩＩＢ）ＣＴＬエピトープを含有する領
域を発現するＡＬＶＡＣ組換体の構築                      
次に、このｖＣＰ２６４に、３つのｐｏｌＣＴＬエピトープ、ｐｏｌ１（アミノ酸１７２〜２１９）、ｐｏｌ２（アミノ酸３２５〜３８３）およびｐｏｌ３（アミノ酸４６１〜５１９）（Ratner他、1985；NixonおよびMcMichael、1991）をコードする発現カセットを挿入した。３つのｐｏｌＣＴＬエピトープを含有する挿入プラスミドｐＣ５ＰＯＬＴ５Ａの調製は、９４８ｂｐのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片（Ｈ６をプロモーターとするｐｏｌ１エピトープ、Ｉ３Ｌをプロモーターとするｐｏｌ２，４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３を含有）を、ｐＢＳＫ+の２，９４０ｂｐのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行った。（なお、９４８ｂｐのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片は次のように調製した。プラスミドｐＨＸＢ２Ｄから、オリゴヌクレオチドプライマーＰｌＡ（配列番号９３）
；５′−TTTGTATCGTAATGATTGAGACTGTACCAGTAAAATTAAAGCC−３′）
およびＰ１Ｂ（配列番号９４）
；５′−GGGCTGCAGGAATTCTAATCAATTAAGGCCCAATTTTTGAAATTTTCCCTTCCTTTTCCATCTCTG−３′）
を用いて、１８３ｂｐのＰＣＲ断片（ｐｏｌ１エピトープを含有）を調製した。プラスミドｐＨＸＢ２Ｄから、オリゴヌクレオチドプライマーＰ２Ａ（配列番号９５）
；５′−ACAAAGTACAATTATTTAGGTTTAATCATGGCAATATTCCAAAGTAGCATGAC−３′）
およびＰ２Ｂ（配列番号９６）
；５′−ATCATCCTCGAGAAAAATTAGGTAAGTCCCCACCTCAACAGATG−３′）
を用いて、２２４ｂｐのＰＣＲ断片（ｐｏｌ２エピトープを含有）を調製した。プラスミドｐＨＸＢ２Ｄから、オリゴヌクレオチドプライマーＰ３Ａ（配列番号９７）
；５′−AAAATATATAATTACAATATAAAATGCCACTAACAGAAGAAGCAGAGCTAGAACTGGC−３′）
およびＰ３Ｂ（配列番号９８）
；５′−ATCATCTCTAGACTCGAGGATCCATAAAAATTATCCTGTTTTCAGATTTTTAAATGGCTC−３′）
を用いて、２３６ｂｐのＰＣＲ断片（ｐｏｌ３エピトープを含有）を調製した。プラスミドｐ２−６０−ＨＩＶ．２からオリゴヌクレオチドプライマーＰ２ＩＶＨ（配列番号９９）
；５′−GTCATGCTACTTTTGAATATTGCCATGATTAAACCTAAATAATTGTACTTTG−３′）
およびＩＶＨＰ１（配列番号１００）
；５′−TTTAATTTTACTGGTACAGTCTCAATCATTACGATACAAACTTAACGGATATCGCG−３′）
を用いて、３４０ｂｐのＰＣＲ断片（Ｉ１３ＬプロモーターとＨ６プロモーターを頭部対頭部の関係で含有）を調製した。プラスミドｐＶＱ４２ＫＴｈ４．１から、オリゴヌクレオチドプライマーＥＰＳ４２Ｋ（配列番号１０１）
；５′−AATTGATTAGAATTCCTGCAGCCCGGGTCAAAAAAATATAAATG−３′）
および４２ＫＰ３Ｂ（配列番号１０２）
５′−CCAGTTCTAGCTCTGCTTCTTCTGTTAGTGGCATTTTATATTGTAATTATATATTTTC−３′）
を用いて、１６８ｂｐのＰＣＲ断片（４２Ｋプロモーターを含有）を調製した。２２４ｂｐのＰＣＲ断片（ｐｏｌ２エピトープを含有）、および３４０ｂｐのＰＣＲ断片（Ｉ３ＬプロモーターおよびＨ６プロモーターを含有）を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーＰ２ＢおよびＩＶＨＰ１を用いてＰＣＲ反応を行い、Ｈ６プロモーターおよびＩ３Ｌをプロモーターとするｐｏｌ２エピトープを含有する５１１ｂｐのＰＣＲ断片を調製した。１６８ｂｐのＰＣＲ断片（４２Ｋプロモーターを含有）および２３６ｂｐのＰＣＲ断片（ｐｏｌ３エピトープを含有）を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーＩＰＳ４２ＫおよびＰ３Ｂを用いて、ＰＣＲ反応を行い、４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３エピトープを含有する３４７ｂｐのＰＣＲ断片を調製した。１８３ｂｐのＰＣＲ断片（ｐｏｌ１エピトープを含有）および３４７ｂｐのＰＣＲ断片（４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３エピトープを含有）を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーＰＩＡおよびＰ３Ｂを用いてＰＣＲ反応を行い、ｐｏｌ１エピトープおよび４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３エピトープを含有する５０６ｂｐのＰＣＲ断片を調製した。５１１ｂｐのＰＣＲ断片（Ｈ６プロモーターおよびＩ３Ｌをプロモーターとするｐｏｌ２エピトープを含有）および５０６ｂｐのＰＣＲ断片（ｐｏｌ１エピトープおよび４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３を含有）を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーＰ２ＢおよびＰ３Ｂを用いてＰＣＲ反応を行い、Ｈ６をプロモーターとするｐｏｌ１エピトープ、Ｉ３Ｌをプロモーターとするｐｏｌ２および４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３エピトープを含有する９７７ｂｐのＰＣＲ断片を調製した。次いで、この９７７ｂｐのＰＣＲ断片をＸｈｏＩとＢａｍＨＩで酵素分解し、ｐＢＳＫ+の２，９４０ｂｐのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングした。）この操作により得られたプラスミドをｐＢＳＰＯＬＴ５と称する。
【０３４３】
このｐＢＳＰＯＬＴ５のヌクレオチド配列分析を行ったところｐｏｌ２エピトープに誤りがあることが示された。この誤りを訂正するために、Ｈ６をプロモーターとするｐｏｌ１エピトープ、Ｉ３Ｌをプロモーターとするｐｏｌ２エピトープおよび４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３エピトープを含有する９４８ｂｐのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーＩ３ＰＣＲ１（配列番号１０３）
５′−ATCATCGGATCCAAGCTTACATCATGCAGTGG−３′）
およびＦＩＸＰＯＬ２（配列番号１０４）
；５′−ATCATCCTCGAGCTATTCAATTAGGTTGTAAGTCCCCACCTCAAC−３′）
を用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ断片（Ｉ３Ｌをプロモーターとする訂正ｐｏｌ２エピトープを含有）をＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで酵素分解し、ｐＢＳＰＯＬＴ５の３，６５０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをｐＢＳＰＯＬＴ５Ａと呼ぶ。
【０３４４】
次に、Ｈ６をプロモーターとするｐｏｌ１エピトープ、Ｉ３Ｌをプロモーターとするｐｏｌ２エピトープおよび４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３エピトープをカナリアポックスＣ５隣接アーム間にクローニングした。これを行うために、Ｈ６をプロモーターとするｐｏｌ１エピトープ、Ｉ３Ｌをプロモーターとするｐｏｌ２エピトープおよび４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３エピトープを含有するｐＢＳＰＯＬＴ５Ａの８９７ｂｐのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片内にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをｐＣ５ＰＯＬＴ５Ａと呼ぶ。ｐＣ５ＰＯＬＴ５ＡのＤＮＡ配列（配列番号１０５）のＤＮＡ配列は、図１８Ａ〜Ｂに示されている。この図１８Ａ〜図１８Ｂは、ｐＣ５ＰＯＬＴ５Ａ内のＩ３Ｌをプロモーターとするｐｏｌ２エピトープ、Ｈ６をプロモーターとするｐｏｌ１エピトープおよび４２Ｋをプロモーターとするｐｏｌ３のヌクレオチド配列を示すものである。
【０３４５】
ＰＯＬ  ＣＴＬエピトープ
特徴      開始点      全長              内容
frag           1         50          C5左側アーム
pept         272         92       (C)POL 2
frag         372        273       (C)I3Lフ゜ロモーター
frag         377        500          H6フ゜ロモーター
pept         501        647          POL 1
frag         676        782          42kフ゜ロモーター
pept         783        962          POL 3
frag         986       1035          C5右側アーム
ＡＬＶＡＣ  Ｃ５隣接アームのＤＮＡ配列（配列番号１０６）は図１９Ａ〜Ｃに示されている。この図１９Ａ〜１９ＣはｐＮＣ５Ｌ−ＳＰ５におけるＣ５遺伝子座のヌクレオチド配列を示すものである。
【０３４６】
Ｃ５遺伝子座（ｐＮＣ５Ｌ−ＳＰ５中）
特徴      開始点      全長              内容
frag           1       1849          C5隣接アーム
frag        1550       1637          クローニンク゛部位
frag        1638       2049          C5隣接アーム
ｐＣ５ＰＯＬＴ５Ａを用いてｖＣＰ２６４をレスキューウイルスとするインビトロ組換えを行いｖＣＰ３００を得た。
【０３４７】
実施例１７−制限酵素分析および免疫沈降分析
ｖＣＰ３００内でＨＩＶ１配列が正しい遺伝子座に存在していることを確認するために、制限酵素分析を行った。ＡＬＶＡＣ、ｖＣＰ２０５、ｖＣＰ２６４およびｖＣＰ３００のＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩまたはＸｈｏＩで分解し、得られた断片をアガロースゲル上で分画化した。得られた断片の大きさを比較したところ、予期されたように、ｇａｇ（＋プロ）遺伝子およびｇｐ１２０（＋トランスメンブレン）遺伝子はＣ３遺伝子座に挿入され、ｎｅｆエピトープはＣ６遺伝子座に挿入され、また、ｐｏｌエピトープはＣ５遺伝子座に挿入されていたことが確認された。
【０３４８】
ｖＣＰ３００が真正のＨＩＶ１ｇａｇおよびｇｐ１２０（＋トランスメンブレン）遺伝子産物を発現しているか否かを確認するため免疫沈降分析を行った。ＨｅＬａ細胞の単層を、１０ｐｆｕ／細胞のm.o.i.でＡＬＶＡＣまたはｖＣＰ３００で疑似感染または感染させた。１時間の吸着期間の後、接種物を吸引して取り出し、細胞の上に２％のウシ胎児血清および［３５Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する改変イーグル液（メチオニン無し）２ｍｌをかぶせた。感染後１８時間経過した、１ｍｌの３×バッファーＡ（３％ＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のアジ化ナトリウムおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）および５０μｌのアプロチニンを添加した後、細胞の単層をかきとることにより、細胞を回収した。感染細胞由来の破砕物を分析して、ＨＩＶ１に血清反応陽性個体由来の血清を用いＨＩＶ１ｇａｇおよびｇｐ１２０（＋トランスメンブレン）遺伝子の発現をＨＩＶ１血清陽性者由来の血清（ニューヨーク州保健部より入手）を用いて調べた。４℃で一晩保存して該血清を保存してプロテインＡ−セファロースに結合させた。この定温保存後、材料をバッファーＡで４回洗浄した。平常なヒト血清およびプロテインＡ−セファローズで予め調べられた破砕物を、次に、プロテインＡ−セファロースに結合されたＨＩＶ１に血清反応陽性のヒト血清とともに４℃において一晩培養した。一晩の培養の後、サンプルをバッファーＡで４回およびＬｉＣＬ2／尿素バッファーで２回洗浄した。２×Laemmliバッファー（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間沸騰させることにより、免疫複合体から沈着タンパク質を解離させた。このタンパク質を１０％のDreyfussゲル（Dreyfuss他、1984）上で分画化し、固定化し、且つ、１Ｍのサリチル酸ナトリウムで処理して間接撮影に供した。この分析により、ＨＩＶ１ｇａｇおよびｇｐ１２０（＋トランスメンブレン）遺伝子産物はｖＣＰ３００で感染された細胞からは沈降したが、疑似感染細胞またはＡＬＶＡＣ感染細胞からは沈降されないことが示された。
【０３４９】
ｖＣＰ３００で感染された細胞内でのｎｅｆおよびｐｏｌエピトープの発現は確認されていないが、これは、該エピトープに特異的な血清試薬が未だ入手できないためである。しかしながら、ヌクレオチド配列分析により、ｖＣＰ３００にクローニングされたｎｅｆおよびｐｏｌは正しいものであることが確認された。ｎｅｆおよびｐｏｌの発現カセットを含有するＰＣＲ断片をｖＣＰ３００ＤＮＡから調製した。これらの断片のヌクレオチド配列の分析により、ｎｅｆおよびｐｏｌの配列が正しいことが示された。
【０３５０】
ｖＣＰ２０５は、ｖＣＰ３００の場合と同様に細胞表面に結合した形態のＨＩＶ１ｇｐ１２０を発現させる。ｖＣＰ２０５により発現されたようなこの遺伝子産物の免疫原性を実験用小動物で分析した。
【０３５１】
実施例１８−免疫原性の検討
２匹のウサギまたはモルモットから成る各グループに、１０8ｐｆｕのＡＬＶＡＣ、ＶＣＰ２０５、または０．１ｍｇのペプチドＣＬＴＢ−３６（GPKEPFRDYVDRFYKNKRKRIHIGPGRAFYTTKN）（配列番号１０７）（０．０５ｍｇのＱＳ−２１をアジュバントとする）を次の表（表２１）に示すスケジュールに従って筋肉内接種した。
【表２１】
2006141407.tif 000055
【０３５２】
各ウサギおよびモルモットは、最初の接種の前、また、最初の接種後は２週間毎に１４週間にわたり採血した。各血液サンプルから血清を調製し、使用するまで−７０℃で保存した。各血清について、動力学的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＫＥＬＩＳＡ）により、組換えＨＩＶ  ＭＮ／ＢＲＵハイブリッドｇｐ１６０または２５−ｍｅｒの合成ＨＩＶ  ＭＮｇｐ１２０  Ｖ３ループ（米国マサチューセッツ州CambridgeのAmerican Bio-technologies社製、製品番号６８６０１０）に対する抗体応答を調べた。
【０３５３】
ｖＣＰ２０５で免疫されたウサギ（グループ２）が最も高いレベルの抗ｇｐ１６０抗体を産生した（図２０参照）。ウサギは表２１のスケジュールに従って免疫され（図２０の矢印）、２週間おきに採血された。各血清を稀釈バッファーで１００倍に稀釈し、動力学的ＥＬＩＳＡ法を用いて精製組換えＨＩＶ  ＭＮ／ＢＲＵ  ｇｐ１６０に対する反応性を調べた。このグループの２匹のウサギはいずれも、単一の接種後にｇｐ１６０に反応性の抗体を産生し始めた。後の接種により追加しても抗体レベルの上昇は僅かであった。ｖＣＰ２０５を２回接種し、その後、ＱＳ−２１アジュバント中のペプチドＣＬＴＢ−３６で追加免疫したウサギ（グループ３）は、コントロール用ウサギ（グループ１）と比較すると抗ｇＰ１６０抗体を産生していないようであった。ＱＳ−２１に溶かしたペプチドＣＬＴＢ−３６で３回免疫したウサギのうち、１匹だけが、ｇｐ１６０に特異的な抗体を産生して応答した。その応答のあったウサギ（Ａ３５３）は、第３回目の免疫後になってようやくｇｐ１６０抗体を産生し始めた。
【０３５４】
ペプチドＣＬＴＢ−３６のみを免疫したウサギは、該ペプチドはエンベロープ（膜）糖タンパク質（Ｖ３ループ）の一部のみしか含んでいないので、広範に反応性のあるｇｐ１６０特異的抗体を産生するとは期待されなかった。したがって、血清を試験して、ＨＩＶ  ＭＮ  Ｖ３ループの２５ヶのアミノ酸を含有するペプチドに対する反応性を検討した（図２１）。表２１のスケジュールに従ってウサギを免疫し（図２２の矢印）、２週間毎に採血した。各血清を稀釈バッファーで１００倍に稀釈して、ＨＩＶ  ＭＮ  ｇｐ１２０  Ｖ３ループを表す２５−ｍｅｒから成る合成ペプチド（CNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIGTIC：（配列番号１０８）米国マサチューセッツ州CambridgeのAmerican Bio-technologies社製、製品番号686010）に対する反応性を動力学的ＥＬＩＳＡ法を用いて試験した。前と同様に、ｖＣＰ２０５を３回接種したウサギの血清中に最も高いＶ３抗体応答が見出された。ｖＣＰ２０５を２回接種した後、ＱＳ−２１に溶かしたペプチドＣＬＴＢ−３６を接種すると抗Ｖ３抗体の応答はあったが、グループ２のように高くはなかった。ここでも前と同様に、ＱＳ−２１に溶かしたペプチドＣＬＴＢ−３６を３回接種したうち１匹のウサギだけが応答を示した。
【０３５５】
全てのグループのモルモット（グループ１の１匹を含む）ＨＩＶｇｐ１６０に反応する抗体を産生した（図２２）。表２１のスケジュールに従いモルモットを免疫し（図２２の矢印）、２週間の間隔をおいて採血した。各血清を稀釈緩衝液で２００倍に稀釈し、動力学的ＥＬＩＳＡ法を用いて精製された組換えＨＩＶ  ＭＮ／ＢＲＵｇｐ１６０に対する反応性を試験した。グループ１においては１匹のみが、ＱＳ−２１アジュバンド中のペプチドＣＬＴＢ−３６を接種した後で応答を示した。グループ２、３および４における全てのモルモットの血清中の抗体レベルは同程度であった。殆どのモルモットは単一回の接種後にｇｐ１６０抗体を産生することにより応答した。
【０３５６】
ＫＥＬＩＳＡ抗原としてＨＩＶ  ＭＮ  Ｖ３  ２５−ｍｅｒペプチドを用いた場合にも同様の結果が認められた（図２３）。表２１のスケジュールに従いモルモットを免疫し（図２３の矢印）、２週間毎に採血した。各血清を稀釈バッファーで２００倍に稀釈し、ＨＩＶ  ＭＮ  ｇｐ１２０  Ｖ３ループを表す２５−ｍｅｒから成る合成ペプチド（CNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIGTIC（配列番号１０９）米国マサチューセッツ州CambridgeのAmerican Bio-Technologies社製、製品番号686010）に対する反応性を動力学的ＥＬＩＳＡ法を用いて試験した。ＱＳ−２１中のペプチドＣＬＴＢ−３６を単一回接種するとＶ３抗体応答が誘起され、第２回および第３回目の接種により追加免疫効果が認められた。Ｖ３抗体応答を誘起するにはｖＣＰ２０５の２回接種が必要であったが、ｖＣＰ２０５またはＱＳ−２１中のＣＬＴＢ−３２を３回目に接種すると追加免疫効果があり、さらに高レベルとなった。
【０３５７】
ｖＣＰ３００により発現されたＮｅｆおよびｐｏｌ  ＣＴＬエピトープの発現性および免疫原性を明らかにするため以下のインビトロアッセイを行った。ＨＩＶに血清反応陽性の個体から新鮮なＰＢＭＣを入手した。これらの細胞の２０％に１０m.o.iでｖＣＰ３００を接種した。接種から２時間後、細胞を洗浄し、自己由来の非接種ＰＢＭＣと、非接種／接種の比率を１０：１として混合した。（接種密度は１．５×１０６  細胞／ｍｌとした。）０日目に、外来源としてＩＬ−７を最終濃度が１０００Ｕ／ｍｌとなるように添加した。３日目に、外来源として、ＩＬ−７およびＩＬ−２を、最終濃度がそれぞれ１０００Ｕ／ｍｌおよび２２０Ｕ／ｍｌとなるように添加した。培養から１２日経過後、ターゲットとしてＨＩＶ−１タンパク質を発現するワクシニアウイルス（ＷＲ）組換体を感染させた自己由来のエピスタイン−バーウイルス形質転換Ｂ細胞を標的として用いる標準的な51Ｃｒ遊離アッセイに、上記のインビトロ刺激された細胞群を用いた。エフェクター／ターゲット（Ｅ／Ｔ）細胞比を２０：１とした場合のアッセイの結果を図２４および図２５に示し、特異的溶解のパーセントとして表している。これらの結果を総合すると、ｖＣＰ３００を感染させたＰＢＭＣが、ＨＩＶ−１、Ｅｎｖ−、Ｇａｇ−、Ｐｏｌ−、およびＮｅｆ−特異的細胞溶解活性を刺激することが明らかである。さらに、抗ＣＤ８モノクローナル抗体により細胞溶解活性が排除されることにより、細胞溶解活性を媒介する細胞の特性は古典的なＣＤ８+ＣＴＬであることが明らかである。
【０３５８】
以上のことをまとめると、ＨＩＶ  ＡＬＶＡＣ組換体カナリアポックスウイルスであるｖＣＰ２０５を接種されたウサギおよびモルモットは、ＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質、ＨＩＶ中和に関連するＨＩＶエンベロープ糖タンパク質の１領域（ｇｐ１２０  Ｖ３領域）に対する抗体を誘起した。また、ｖＣＰ３００により発現されたＥｎｖ、Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＮｅｆをコードする発現産物の発現性と免疫原性は、血清反応陽性の個体由来のＣＤ８+ＣＴＬのインビトロ刺激により明らかにされる。かくして、ｖＣＰ２０５およびｖＣＰ３００、ならびに、これらの組換体の前駆体、発現産物およびこれらの組換体由来のＤＮＡは、上記のようにきわめて有用である。
【０３５９】
実施例１９−ｖＣＰ１３０７（ｇｐ１２０  Ｖ３ループに挿入された２つの
ＥＬＤＫＷＡエピトープを含むＨＩＶ１  ｇｐ１２０＋ＴＭを
発現するＡＬＶＡＣ組換体）の構築                        
ｇｐ１２０  Ｖ３ループ領域に挿入されたＨＩＶ１のｇｐ４１由来の２つのＥＬＤＫＷＡエピトープとともにＨＩＶ１  ｇｐ１２０＋ＴＭを発現するＡＬＶＡＣ組換体であるｖＣＰ１３０７を以下のように作成した。ＥＬＤＫＷＡ要素およびＶ３ループの一部をコードする配列をｐＢＳＫ＋（米国カリフォルニア州La JollaのStratagene社製）にクローニングした。これを行うために、ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩで酵素分解した２２５ｂｐのＰＣＲ断片（ＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列の一部を含有）を、ｐＢＳＫ＋の２，９００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片にクローニングした。（なお、該ＰＣＲ断片は、プラスミドｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔから、プライマーＨＩＶＰ７２（配列番号１１０）
；５′−TTATTACCATTCCAAGTACTATT−３´
およびＨＩＶＰ７４（配列番号１１１）
；５′−TCTGTACAAATTAATTGTACAAGACCCAACTACGAGCTCGACAAATGGGCCCATATAGGACCAGGGAGAGAATTGGATAAGTGGGCGAATATAATAGGAACTATAAGAC−３′）
から調製した。）この操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶ５５と呼ぶ。
【０３６０】
また、Ｈ６をプロモーターとするＨＩＶ１  ｇｐ１２０＋ＴＭ遺伝子を含有するプラスミドであるｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔは、次のように調製されたものである。ＨＩＶ（ＭＮ）ｅｎｖ遺伝子のｃＤＮＡコピーを含有するプラスミドＰＭＮ１．８−９をMarvin Reitz氏（米国ＮＣＩ、ＮＩＨ）から入手した。ｅｎｖ遺伝子の初期転写終結シグナルＴ5ＮＴを改変させた。これを行うために、ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ消化された１，１００ｂｐのＰｃＲ断片（ｅｎｖ遺伝子のＴ5ＮＴ改変５′末端を含有する）を、ｐＢＳＫ＋の２，９００ｂｐのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片中にクローニングした。（なお、該ＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ６（配列番号１１２）
；５′−GGGTTATTAATGATCTGTAG−３′）
およびＨＩＶ３Ｂ２（配列番号１１３）
；５′−GAATTACAGTAGAAGAATTCCCCTCCACAATTAAAAC−３′）
を用いて、プラスミドｐＭＮ１．８−９から調製した。この操作により得られたプラスミドｐＢＳＭＩＤＭＮと呼ぶ。
【０３６１】
次に、ｅｎｖ遺伝子のＴ5ＮＴ改変５′末端をｅｎｖ遺伝子の残りｅｎｖ遺伝子の上流にクローニングした。これを行うため、ｐＢＳＭＩＤＭＮの１，０２５ｂｐのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片（ｅｎｖ遺伝子のＴ5ＮＴ改変５′末端を含有）を、ｐＢＳ３ＭＮの４，３００ｂｐのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片にクローニングした。（ｐＢＳ３ＭＮは、ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ酵素分解した４３０ｂｐのＰＣＲ断片（ｅｎｖ遺伝子の中央部分を含有）およびＳａｃＩ−ＸｂａＩ酵素分解した１，０５０ｂｐのＰＣＲ断片（ｅｎｖ遺伝子の３′末端を含有）を、ｐＢＳＫ＋の２，９００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片中にクローニングすることにより調製した。ここで、４３０ｂｐのＰＣＲ断片は、プラスミドｐＭＮ１．８−９から、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１１４）
；５′−GTTTTAATTGTGGAGGGGAATTCTTCTACTGTAATTC−３′）
およびＨＩＶＭＮ４（配列番号１１５）
；５′−ATCATCGAGCTCCTATCGCTGCTC−３′）
を用いて調製した。また、１，０５０ｂｐのＰＣＲ断片は、プラスミドｐＭＮ１．８−９から、オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ５（配列番号１１６）
；５′−ATCATCGAGCTCTGTTCCTTGGGTTCTTAG−３′）
およびＨＩＶＭＮ３Ｐ（配列番号１１７）
；５′−ATCATCTCTAGAATAAAAATTATAGCAAAGCCCTTTCCAAGCC−３´）
を用いて調製した。このような操作により得られたプラスミドをｐＢＳＭＩＤ３ＭＮと呼ぶ。
【０３６２】
次に、ｅｎｖ遺伝子の上流にＨ６プロモーター（Perkus他、1989）をクローニングした。これを行うために、ｐＨ６ＩＩＩＢＥの３２０ｂｐのＫｐｎＩ断片（ＨＩＶ１（ＩＩＩＢ）ｅｎｖ遺伝子の５′末端に結合されたＨ６プロモーターを含有）およびｐＢＳＭＩＤ３ＭＮの２，４５０ｂｐのＫｐｎＩ−ＸｂａＩ断片（ＨＩＶ（ＭＮ）ｅｎｖ遺伝子の本体を含有）を、ｐＢＳＫ＋の２，９００ｂｐのＫｐｎＩ−ＸｂａＩ断片中にクローニングした。このような操作により得られたプラスミドをｐＨ６ＨＭＮＥと呼ぶ。
【０３６３】
次に、ｇｐ４１をコードする配列を、ＨＩＶ１のｅｎｖトランスメンブレン（ＴＭ）領域をコードする配列と置き換えた。これを実施するため、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩで酵素分解した４８０ｂｐのＰＣＲ断片（ｇｐ１２０遺伝子の３′末端およびＨＩＶ１のｅｎｖトランスメンブレン領域を含有）を、ｐＧ６ＨＭＮＥの４，２００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片にクローニングした。（なお、このＰＣＲ断片は、ＰＣＲ断片（ＰＣＲ−ＭＮ１１）ならびにオリゴヌクレオチドＨＩＶＴＭ１（配列番号１１８）
；５′−TTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTCTCTGTAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATAA−３′）
およびＨＩＶＴＭ２（配列番号１１９）
；５′−TTATCCCTGCCTAACTCTATTCACTACAGAGAGTACAGCAAAAACTATTCTTAAACCTACCAAGCCTCCTACTATCATTATGAATAA−３′
から、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１１４）およびＨＩＶＴＭ３（配列番号１２０）
；５′−ATCATCTCTAGAATAAAAATTATCCCTGCCTAACTCTATTCAC−３′）
を用いて調製した。ＰＣＲ−ＭＮ１１は、プラスミドｐＨ６ＨＭＮＥから、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１１４）およびＨＩＶＭＮ１８（配列番号１２１）
；５′−GCCTCCTACTATCATTATGAATAATCTTTTTTCTCTCTG−３′）
から調製した。）この操作により得られたプラスミドをｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔと呼ぶ。
【０３６４】
ＥＬＤＫＷＡエピトープおよびＶ３ループをコードしている配列の別の部分を、続いてｐＢＳＫｔ中にクローン化した。これは、ＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列の一部を含む３００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ消化したＰＣＲ断片を、２９００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ消化したｐＢＳＫｔ断片中にクローン化することにより行った。（このＰＣＲ断片は、プラスミドｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔを、プライマーＨＩＶＰ６９（配列番号１２２；）およびＨＩＶＰ７５（配列番号１２３）とともに用いて作成した。）
2006141407.tif 000056
【０３６５】
この操作により作成されたプラスミドをｐＨＩＶ５６と称した。
【０３６６】
次に、ｐＨＩＶ５５およびｐＨＩＶ５６からのＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列を、Ｈ６をプロモーターとするｇＰ１２０＋ＴＭ遺伝子にクローニングした。これを行うため、ｐＨＩＶ５５の２２５ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片およびｐＨＩＶ５６の３００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片（ＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループを含有）を、ｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔの４，３００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶ５７と呼ぶ。
【０３６７】
次に、ＥＬＤＫＷＡエピトープを含有しているＨ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭ構築物を、Ｃ５隣接アームの間にクローニングした。これを実施するため、ｐＨＩＶ５７の１，７００ｂｐのＮｒｕＩ−ＸｂａＩ断片（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含有し、Ｈ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭを含有する）を、ｐＳＩＶＧＣ１５の４，７００ｂｐのＮｒｕＩ−ＸｂａＩ断片にクローニングした。（ｐＳＩＶＧＣ１５は、Ｃ５隣接アーム間にクローニングされたＨ６をプロモーターとするＳＩＶのｅｎｖ遺伝子を含有する。）この操作により得られたプラスミドをｐＧＩＶ５９と呼ぶ。Ｈ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭ（ＥＬＤＫＷＡエピトープも有する）のＤＮＡ配列は図２６に示されている。
【０３６８】
ｐＨＩＶ５９を用いて、ＡＬＶＡＣをレスキューウイルスとする組換え実験を行いｖＣＰ１３０７を得た。
【０３６９】
ｖＣＰ１３０７を感染させた細胞上でＨＩＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭ（ＥＬＤＫＷＡエピトープも含む）が発現された否かを確認するためＦＡＣＳ分析を行った。Ｓ−ＭＥＭ（Sigma製M-8026Joklik懸濁媒体）に懸濁させた５×１０６  のＨｅＬａ−Ｓ３細胞に、５ｐｆｕ／細胞のm.o.i.で、ＡＬＶＡＣ、ｖＰ１２８６（ＨＩＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭを発現するＷＲ組換体）、またはｖＣＰ１３０７を感染させた。３７℃で６０分間の吸着期間の後、該細胞を１０ｍｌのＳ−ＭＥＭで洗浄し、１，０００ＲＰＭで５分間遠心した。次に、それらのサンプルを１ｍｌのＳ−ＭＥＭに再懸濁させ、５ｍｌのSarstadt管に移して３７℃の温度下に回転させた。１８時間後、２００μｌのアリコート（細胞数１×１０６  ）をポリプロピレンチューブに入れ、３ｍｌのＰＢＳ−ＣＭＦ（０．２％ＮａＮ３  ＋０．２％ＢＳＡを含む）で洗浄した。次いで、上澄液をデカンテーションで除去し、ＨＩＶ１に血清反応陽性のヒト由来の血清（米国the New York State Dept. of Healthから入手）を１００倍稀釈したもの、または、ＥＬＤＫＷＡエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体ＩＡＭ４１−２Ｆ５（米国テキサスHoustonのViral Testing Systems社製）を１００倍稀釈したもの１００μｌにペレットを再懸濁させた。それらのサンプルを６０分間４℃で定温保存し、ＰＢＳ−ＣＭＦ（０．２％ＮａＮ３  ＋０．２％ＢＳＡを含む）で２回洗浄し、１，０００ＲＰＭで５分間遠心した。上澄液をデカンテーション除去し、ヤギの抗ヒトＦＩＴＣ（Boehringer Mannheimから入手）の１００倍稀釈液にペレットを再懸濁させた。サンプルを３０分間、４℃で定温保存し、ＰＢＳ−ＣＭＦ（０．２％ＮａＮ３  ＋０．２％ＢＳＡを含む）で２回洗浄し、Fascan flow 細胞計測計（サイトメーター）で分析した。ｖＣＰ１３０７感染細胞の表面にはＥＬＤＫＷＡエピトープを含有する遺伝子産物が低レベルで発現されていたが、ＡＬＶＡＣ感染細胞またはｖＰ１２８６感染細胞の表面には発現されていなかった（図２７の下欄参照）。ｖＰ１２８６感染細胞およびｖＣＰ１３０７感染細胞の表面には、ＨＩＶ１血清反応陽性の血清に反応性を有する遺伝子産物が発現されていたが、ＡＬＶＡＣ感染細胞の表面には発現されていなかった（図２７の上欄参照）。このように、ｖＣＰ１３０７感染細胞の表面にはＨＩＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭ（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含む）遺伝子産物であるＥＬＤＫＷＡエピトープが発現され、該遺伝子産物のＶ３ループの一部がＥＬＤＫＷＡエピトープで置換された事実を裏付けている。
【０３７０】
ｖＣＰ１３０７が、免疫原性のあるＥＬＤＫＷＡエピトープを含むｇｐ１２０＋ＴＭの一形態を発現するか否かを確認するため、免疫沈降分析を行った。ＨｅＬａ細胞の単層に、１０ｐｆｕ／細胞のm.o.i.で、ＡＬＶＡＣ（親ウイルス）、ｖＰ１２８６（ＨＩＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭを発現するＷＲ組換体）、またはｖＣＰ１３０７を感染させた。１時間の吸着期間の後、接種物を除去し、２％の透析ウシ胎児血清および［３５Ｓ］−ＴＲＡＮＳラベル（３０μＣｉ／ｍｌ）を含有する改変Ｅａｇｌｅ液（システインおよびメチオニン欠除）で細胞を覆った。１ｍｌの３×バッファーＡ（４５０ｍＭのＮａＣｌ、３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のアジ化ナトリウムおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）を添加することにより溶解物を回収し、次のものの発現を分析した。１）ＥＬＤＫＷＡエピトープ：ＥＬＤＫＷＡエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体ＩＡＭ４１−２Ｆ５（米国テキサス州HoustonのViral Testing System社製）を１００倍稀釈したものを用いた。２）ＨＩＶ１の遺伝子産物：ＨＩＶ１に血清反応陽性のヒト由来の血清（米国のthe New York State Dept. of Healthから入手）を１００倍稀釈したものを用いた。平常なヒト血清およびプロテインＡ−セファローズＡで予め清浄化した溶解物をＩＡＭ４１−２Ｆ５／プロテインＡ−セファローズ複合体またはＨＩＶ１血清反応陽性血清／プロテインＡ−セファローズ複合体とともに、４℃で一晩定温保存した。それらのサンプルをバッファーＡで４回、ＬｉＣｌ2／尿素バッファーで２回洗浄した。２倍稀釈のLaenmliバッファー（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ＝６．８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間沸騰させることにより沈降したタンパク質を免疫複合体から解離させた。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分画化し、固定化し、次に１Ｍのサリチル酸ナトリウムで処理し、間接撮影に供した。ＥＬＤＫＷＡに対するモノクローナル抗体を用いると、ｖＣＰ１３０７感染細胞からは適当な大きさのタンパク質が沈降したが、ＡＬＶＡＣ感染細胞またはｖＰ１２８６感染細胞からは沈降しなかった。さらに、ＨＩＶ１血清反応陽性のヒト血清を用いると、ｖＰ１２８６感染細胞およびｖＣＰ１３０７感染細胞からは適当な大きさのタンパク質が沈殿したが、ＡＬＶＡＣ感染細胞からは沈殿しなかった。これらの結果が示すように、ｖＣＰ１３０７は、抗原性のあるＥＬＤＫＷＡエピトープを含有するｇｐ１２０＋ＴＭの一形態を発現させる。
【０３７１】
実施例２０−ｖＰ１３１３（ｇｐ１２０  Ｖ３ループに挿入された２つのＥ
ＬＤＫＷＡエピトープを含むｇｐ１２０＋ＴＭを発現させるＮ
ＹＶＡＣ組換体）の構築                                  
ｇｐ１２０  Ｖ３ループに挿入したＨＩＶ１  ｇｐ４１からの２つのＥＬＤＫＷＡエピトープを含むＨＩＶ１  ｇｐ１２０＋ＴＭを発現させるＮＹＶＡＣ組換体であるｖＰ１３１３を次の方法により作成した。ＥＬＤＫＷＡエピトープおよびＶ３ループの一部をコードする配列をｐＢＳＫ+ にクローニングした。これを行うため、ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩで酵素分解した２２５ｂｐのＰＣＲ断片（ＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列の一部を含有する）を、ｐＢＳＫ+ の２，９００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片にクローニングした。（なお、このＰＣＲ断片は、プラスミドｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔから、プライマーＨＩＶＰ７２（配列番号１３０）
；５′−TTATTACCATTCCAAGTACTATT−３′）
およびＨＩＶＰ７４（配列番号１３１）
；５′−TCTGTACAAATTAATTGTACAAGACCCAACTACGAGCTCGACAAATGGGCCCATATAGGACCAGGGAGAGAATTGGATAAGTGGGCGAATATAATAGGAACTATAAGAC−３′）
を用いて調製した。）この操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶ５５と呼ぶ。
【０３７２】
Ｈ６をプロモーターとするＨＩＶ１  ｇｐ１２０＋ＴＭ遺伝子を含有するプラスミドであるｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔは次のように調製した。Marvin Reitz氏（米国ＮＣＩ、ＮＩＨ）から、ＨＩＶ１（ＭＮ）ｅｎｖ遺伝子のｃＤＮＡコピーを含有するプラスミドｐＭＮ１．８−９を入手した。該ｅｎｖ遺伝子の初期転写終結シグナルＴ5ＮＴを改変させた。これを行うため、ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ酵素分解された１，１００ｂｐのＰＣＲ断片(ｅｎｖ遺伝子のＴ5ＮＴ改変５′末端を含有）をｐＢＳＫ+ の２，９００ｂｐのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片にクローニングした。（該ＰＣＲ断片は、プラスミドｐＭＮ１．８−９から、オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ６（配列番号１３２）
；５′−GGGTTATTAATGATCTGTAG−３′）
およびＨＩＶ３Ｂ２（配列番号１１３）
；５′−GAATTACAGTAGAAGAATTCCCCTCCACAATTAAAAC−３′）
を用いて調製した。）この操作により得られたプラスミドをｐＢＳＭＩＤＭＮと呼ぶ。
【０３７３】
次に、このｅｎｖ遺伝子のＴ5ＮＴ改変５′末端をｅｎｖ遺伝子の残りの上流にクローニングした。これを行うため、ｐＢＳＭＩＤＭＮの１，０２５ｂｐのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片（ｅｎｖ遺伝子のＴ5ＮＴ改変５′末端を含有する）を、ｐＢＳ３ＭＮの４，３００ｂｐのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片にクローニングした。（ｐＢＳ３ＭＮは、ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ酵素分解した４３０ｂｐのＰＣＲ断片（ｅｎｖ遺伝子の中央部分を含有する）およびＳａｃＩ−ＸｂａＩ酵素分解された１，０５０ｂｐのＰＣＲ断片（ｅｎｖ遺伝子の３′末端を含有する）を、ｐＢＳＫ+ の２，９００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片にクローニングした。４３０ｂｐのＰＣＲ断片は、プラスミドｐＭＮ１．８−９から、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１１４）
；５′−GTTTTAATTGTGGAGGGGAATTCTTCTACTGTAATTC−３′）
およびＨＩＶＭＮ４（配列番号１１５）
；５′−ATCATCGAGCTCCTATCGCTGCTC−３′）
を用いて調製した。また、１，０５０ｂｐのＰＣＲ断片は、プラスミドｐＭＮ１．８−９からオリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ５（配列番号１１６）
；５′−ATCATCGAGCTCTGTTCCTTGGGTTCTTAG−３′）
およびＨＩＶＭＮ３Ｐ（配列番号１１７）
；５′−ATCATCTCTAGAATAAAAATTATAGCAAAGCCCTTTCCAAGCC−３´）
を用いて調製した。）この操作により得られたプラスミドをｐＢＳＭＩＤ３ＭＮと呼ぶ。
【０３７４】
次いで、ｅｎｖ遺伝子の上流にＨ６プロモーターをクローニングした。このために、ｐＨ６ＩＩＩＢＥの３２０ｂｐのＫｐｎＩ断片（ＨＩＶ１（III Ｂ）ｅｎｖ遺伝子の５′末端に結合したＨ６プロモーターを含有する）、およびｐＢＳＭＩＤ３ＭＮの２，４５０ｂｐのＸｐｎＩ−ＸｂａＩ断片（ＨＩＶ１（ＭＮ）ｅｎｖ遺伝子の本体を含有する）をｐＢＳＫ+の２，９００ｂｐのＸｐｎＩ−ＸｂａＩ断片にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをｐＨ６ＨＭＮＥと呼ぶ。
【０３７５】
次に、ｇｐ４１をコードする配列を、ＨＩＶ１  ｅｎｖトランスメンブレン（ＴＭ）領域をコードする配列と置き換えた。これを行うため、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ酵素分解した４８０ｂｐのＰＣＲ断片（ｇｐ１２０の３′末端およびＨＩＶ１  ｅｎｖトランメンブレン領域を含有する）を、ｐＨ６ＨＭＮＥの４，２００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片にクローニングした。（該ＰＣＲ断片は、ＰＣＲ断片ＰＣＲ−ＭＮ１１ならびにオリゴヌクレオチドＨＩＶＴＭ１（配列番号１１８）
；５′−TTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTCTCTGTAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATAA−３′）
およびＨＩＶＴＭ２（配列番号１１４）
；５′−TTATCCCTGCCTAACTCTATTCACTACAGAGAGTACAGCAAAAACTATTCTTAAACCTACCAAGCCTCCTACTATCATTATGAATAA−３′）
から、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１２０）およびＨＩＶＴＭ３（配列番号１１４）
；５′−ATCATCTCTAGAATAAAAATTATCCCTGCCTAACTCTATTCAC−３′）
を用いて調製した。ＰＣＲＭＮ−１１は、プラスミドｐＨ６ＨＭＮＥから、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１１４）およびＨＩＶＭＮ１８（配列番号１２１）
；５′−GCCTCCTACTATCATTATGAATAATCTTTTTTCTCTCTG−３′）
を用いて調製した。）このようにして得られたプラスミドをｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔと呼ぶ。
【０３７６】
次に、ＥＬＤＫＷＡエピトープとＶ３ループをコードする他方の部分をｐＢＳＫ+にクローニングした。これは、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ酵素分解した３００ｂｐのＰＣＲ断片（ＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列の一部を含有する）を、ｐＢＳＫ+の２，９００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片にクローニングすることにより行った。（なお、該ＰＣＲ断片は、プラスミドｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔから、プライマーＨＩＶＰ６９（配列番号１２２）
；５′−TGATAGTACCAGCTATAGGTTGAT−３′）
およびＨＩＶＰ７５（配列番号１２３）
；５′−TTTGTCGAGCTCGTAGTTGGGTCTTGTACAATT−３′）
を用いて調製した。）この操作によって得られたプラスミドをｐＨＩＶ５６と呼ぶ。
【０３７７】
次に、ｐＨＩＶ５５およびｐＨＩＶ５６由来のＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列を、Ｈ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭ遺伝子にクローニングした。これを行うために、ｐＨＩＶ５５の２２５ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片およびｐＨＩＶ５６の３００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片（ＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列を含有）を、ｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔの４，３００ｂｐのＥｃｏ−ＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片中にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶ５７と呼ぶ。
【０３７８】
次いで、ＥＬＤＫＷＡエピトープを含有しＨ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭ構築物を、Ｃ５隣接アーム間にクローニングした。これを行うために、ｐＨＩＶ５７の１，７００ｂｐのＮｒｕＩ−ＸｂａＩ断片（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含みＨ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭを含有する）を、ｐＳＩＶＧＣ１５の４，７００ｂｐのＮｒｕＩ−ＸｂａＩにクローニングした。（ｐＳＩＶＧＣ１５は、Ｃ５隣接アーム間にクローニングされたＨ６をプロモーターとするＳＩＶのｅｎｖ遺伝子を含有する。）このような操作によって得られたプラスミドをｐＨＩＶ５９と呼ぶ。
【０３７９】
次に、ＥＬＤＫＷＡを含みＨ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭをＩ４Ｌ隣接アーム間にクローニングした。これは、ｐＨＩＶ５９の１，８５０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含みＨ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭ遺伝子を含有する）を、ｐＳＤ５５０ＶＣの３，６００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片にクローニングすることにより行った。このような操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶ６０と呼ぶ。ｐＨＩＶ６０内のＨ６をプロモーターとするＴＭ（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含む）遺伝子の配列は図２８に示されている。
【０３８０】
ｐＨＩＶ６０を用いてＮＹＶＡＣをレスキューウイルスとするインビトロ組換えを行いｖＰ１３１３を得た。
【０３８１】
ｖＰ１３１３を感染させた細胞の表面に、ＨＩＶ１  ｇｐ１２０＋ＴＭ（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含む）が発現されているか否かを確認するためＦＡＣＳ分析を行った。Ｓ−ＭＥＭ（Sigma Ｍ−８０２８Joklik懸濁媒体）に懸濁させた５×１０６  個のＨｅＬａ−Ｓ３細胞に、５ｐｆｕ／細胞のm.o.i.でＮＹＶＡＣ、ｖＰ１２８６（ＨＩＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭを発現するＷＲ組換体）またはｖＰ１３１３を感染させた。３７℃において１時間の吸着期間の後、１０ｍｌのＳ−ＭＥＭで細胞を洗浄し、１，０００ＲＰＭで５分間遠心した。次いで、それらのサンプルを１ｍｌのＳ−ＭＥＭに再懸濁させ、５ｍｌのSarstadt管に移し、３７℃の回転装置の上に置いた。１８時間後、２００μｌのアリコート（細胞数１×１０６  ）をポリプロピレンチューブに移し、３ｍｌのＰＢＳ−ＣＭＦ（０．２％ＮａＮ３  ＋０．２％ＢＳＡを含む）で洗浄した。次いで、上澄液をデカンテーション除去し、ＨＩＶ１に血清反応陽性のヒト由来の血清（米国のthe New York State Dept. of Healthから入手）を１００倍稀釈したもの、またはＥＬＤＫＷＡエピトープに特異的ヒトモノクローナル抗体ＩＡＭ４１−２Ｆ５（米国テキサス州HoustonのViral Testing Systems社製）を１００倍稀釈したものの１００μｌにペレットを再懸濁させた。それらのサンプルを４℃で６０分間定温保存し、ＰＢＳ−ＣＭＦ（０．２％ＮａＮ３  ＋０．２％ＢＳＡを含む）で２回洗浄し、１，０００ＲＰＭで５分間遠心した。上澄液をデカンテーション除去し、ヤギ抗ヒトＦＩＴＣ（Boehringer Mannheimから入手）の１００倍稀釈液に再懸濁させた。それらのサンプルを４℃で３０分間低温保存した後、ＰＢＳ−ＣＭＦ（０．２％ＮａＮ３  ＋０．２％ＢＳＡを含む）で２回洗浄し、Facscan flow 流通式細胞計測計（サイトメーター）で分析した。ｖＰ１３１３感染細胞の表面にはＥＬＤＫＷＡエピトープを含む遺伝子産物が発現されていたが、ＮＹＶＡＣ感染細胞またはｖＰ１２８６感染細胞の表面には発現が認められなかった（図２９の下欄参照）。また、ｖＰ１２８６感染細胞およびｖＰ１３１３感染細胞の表面には、ＨＩＶ１血清反応陽性の血清に反応性の遺伝子産物が発現されたが、ＮＹＶＡＣ感染細胞の表面には発現されなかった（図２９の上欄参照）。このように、ｖＰ１３１３感染細胞の表面には、ＨＩＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭ（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含む）遺伝子によるＥＬＤＫＷＡエピトープが発現されており、この遺伝子産物のＶ３ループがＥＬＤＫＷＡエピトープによって置き換えられたという事実を裏付けている。
【０３８２】
ｖＰ１３１３が、免疫原性のあるＥＬＤＫＷＡエピトープを含有するｇｐ１２０＋ＴＭの一形態を発現するか否かを確認するため、免疫沈降分析を行った。ＨｅＬａ細胞の単層に１０ｐｆｕ／細胞のm.o.i.で、ＮＹＶＡＣ（親ウイルス）、ｖＰ１２８６（ＨＩＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭを発現するＷＲ組換体）またはｖＰ１３１３を感染させた。１時間の吸着期間の後、接種物を取り出し、細胞の上に、２％の透析したウシ胎児血清および［３５Ｓ］−ＴＲＡＮＳラベル（３０μＣｉ／ｍｌ）を含有する改変Ｅａｇｌｅ液（システインおよびメチオニンが欠除）の２ｍｌをまいた。感染から１８時間後、３ＸバッファーＡ（４５０ｍＭのＮａＣｌ、３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ＝７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のアジ化ナトリウムおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）を添加することにより溶解物（リゼイト）を回収し、次のものの発現を分析した：１）ＥＬＤＫＷＡエピトープ［ＥＬＤＫＷＡエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体ＩＡＭ４１−２Ｆ５（米国テキサス州HoustonのViral Testing Systems社より入手の１００倍稀釈液を使用］、および２）ＨＩＶ１の遺伝子産物［ＨＩＶ１に血清反応陽性ヒト由来の血清（米国のthe New York State Dept. of Healthから入手）の１００倍稀釈液を使用。正常なヒト血清およびプロテインＡ−セファロース複合体で予め清浄化した溶菌物を、ＩＡＭ４１−２Ｆ５／プロテインＡ−セファロース複合体またはＨＩＶ１血清反応陽性血液／プロテインＡ−セファロース複合体とともに、４℃で一晩定温保存した。それらのサンプルを、バッファーＡで４回、ＬｉＣｌ2／尿素バッファーで２回洗浄した。２ＸのLaemmliバッファー（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ＝６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間沸騰させることにより、免疫複合体から沈降タンパク質を解離させた。ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分画し、固定化し、且つ１Ｍのサリチル酸ナトリウムで処理し間接撮影（フルオログラフィー）に供した。ＥＬＤＫＷＡエピトープに対するモノクローナル抗体を使用すると、ｖＰ１３１３感染細胞から適当な大きさのタンパク質が沈降したが、ＮＹＶＡＣ感染細胞またはｖＰ１２８６感染細胞からは沈降しなかった。さらに、ＨＩＶ１に血清反応陽性のヒト血清を使用すると、ｖＰ１２８６感染細胞およびｖＰ１３１３感染細胞からは適当な大きさのタンパク質が沈降したが、ＮＹＶＡＣ感染細胞からは沈降しなかった。これらの結果が示すように、ｖＰ１３１３は、免疫原性のあるＥＬＤＫＷＡエピトープを含有するｇｐ１２０＋ＴＭの一形態を発現するものである。
【０３８３】
実施例２１−ｖＰ１３１９（ｇｐ１２０  Ｖ３ループに挿入され２つのＥＬＤ
ＫＷＡエピトープを含むＨＩＶ１  ｇｐ１２０＋ＴＭを発現す
るＣＯＰＡＫ組換体）の構築                                
ｇｐ１２０  Ｖ３ループに挿入されたＨＩＶ１のｇＰ４１由来の２つのＥＬＤＫＷＡを含むＨＩＶ１  ｇｐ１２０＋ＴＭを発現するＣＯＰＡＫ組換体であるｖＰ１３１９を次のように作成した。ＥＬＤＫＷＡエピトープとＶ３ループの一部をコードする配列をｐＢＳＫ＋にクローニングした。これは、ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ酵素分解した２２５ｂｐのＰＣＲ断片（ＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列の一部を含有する）を、ｐＢＳＫ+ の２，９００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片にクローニングすることにより行った。（なお、該ＰＣＲ断片は、プラスミドｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔから、プライマーＨＩＶＰ７２（配列番号１１０）
；５′−TTATTACCATTCCAAGTACTATT−３′）
およびＨＩＶＰ７４（配列番号１１１）
；５′−TCTGTACAAATTAATTGTACAAGACCCAACTACGAGCTCGACAAATGGGCCCATATAGGACCAGGGAGAGAATTGGATAAGTGGGCGAATATAATAGGAACTATAAGAC −３′）
を用いて調製した。）このような操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶ５５と呼ぶ。
【０３８４】
［Ｈ６をプロモーターとするＨＩＶ１  ｇｐ１２０＋ＴＭ遺伝子を含有するプラスミドであるｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔは以下のように調製した。ＨＩＶ１［ＭＮ］ｅｎｖ遺伝子のｃＤＮＡコピーを含有するプラスミドであるｐＭＮ１．８−９をMarvin Reitz氏（米国ＮＣＩ、ＮＩＨ）から入手した。該ｅｎｖ遺伝子の初期転写終結シグナル配列Ｔ5ＮＴを改変した。これを行うために、ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩで酵素分解した１，１００ｂＰのＰＣＲ断片（ｅｎｖ遺伝子のＴ5ＮＴ改変５′末端を含有する）を、ｐＢＳＫ+ の２，９００ｂｐのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片にクローニングした。（なお、該ＰＣＲ断片は、プラスミドｐＭＮ１．８−９から、オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ６（配列番号１１２）
；５′−GGGTTATTAATGATCTGTAG−３′）
およびＨＩＶ３Ｂ２（配列番号１１３）
；５′−GAATTACAGTAGAAGAATTCCCCTCCACAATTAAAAC −３′）
を用いて調製した。）この操作により得られたプラスミドをｐＢＳＭＩＤＭＮと呼ぶ。
【０３８５】
次に、このｅｎｖ遺伝子のＴ5ＮＴ改変５′末端を、ｅｎｖ遺伝子の残りの上流にクローニングした。これを行うために、ｐＢＳＭＩＤＭＮの１，０２５ｂｐのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片（ｅｎｖ遺伝子のＴ5ＮＴ改変５′末端を含有する）を、ｐＢＳ３ＭＮの４，３００ｂｐのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片にクローニングした。（ｐＢＳ３ＭＮの調製は、ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ酵素分解した４３０ｂｐのＰＣＲ断片（ｅｎｖ遺伝子の中央部分を含有する）およびＳａｃＩ−ＸｂａＩ酵素分解した１，０５０ｂｐのＰＣＲ断片（ｅｎｖ遺伝子の３′末端を含有する）を、ｐＢＳＫ＋の２，９００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片にクローニングすることにより行った。（ここで、４３０ｂｐのＰＣＲ断片は、プラスミドｐＭＮ１．８−９から、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１１４）
；５′−GTTTTAATTGTGGAGGGGAATTCTTCTACTGTAATTC −３′）
およびＨＩＶＭＮ４（配列番号１１５）
；５′−ATCATCGAGCTCCTATCGCTGCTC−３′
を用いて調製した。また、１，０５０ｂｐのＰＣＲ断片は、プラスミドｐＭＮ１．８−９から、オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ５（配列番号１１６）
；５′−ATCATCGAGCTCTGTTCCTTGGGTTCTTAG−３′）
およびＨＩＶＭＮ３Ｐ（配列番号１１７）
；５′−ATCATCTCTAGAATAAAAATTATAGCAAAGCCCTTTCCAAGCC −３′）
を用いて調製した。）このような操作により得られたプラスミドをｐＢＳＭＩＤ３ＭＮと呼ぶ。
【０３８６】
次に、ｅｎｖ遺伝子の上流にＨ６プロモーターをクローニングした。これを行うため、ｐＨ６ＩＩＩＢＥの３２０ｂｐのＫｐｎＩ断片（ＨＩＶ１（ＩＩＩＢ）ｅｎｖ遺伝子の５′末端に結合されたＨ６プロモーターを含有する）およびｐＢＳＭＩＤ３ＭＮの２，４５０ｂｐのＸｐｎＩ−ＸｂａＩ断片（ＨＩＶ１（ＭＮ）ｅｎｖ遺伝子の本体を含有する）を、ｐＢＳＫ＋の２，９００ｂｐのＫｐｎＩ−ＸｂａＩ断片にクローニングした。この操作により得られたプラスミドをｐＨ６ＨＭＮＥと呼ぶ。
【０３８７】
次いで、ｇｐ４１をコードする配列を、ＨＩＶ１のｅｎｖトランスメンブレン（ＴＭ）領域をコードする配列と置き換えた。これを行うために、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ酵素分解した４８０ｂｐのＰＣＲ断片（ｇｐ１２０遺伝子の３′末端およびＨＩＶ１のｅｎｖトランスメンブレン領域を含有する）を、ｐＨ６ＨＭＮＥの４，２００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片にクローニングした。（該ＰＣＲ断片は、ＰＣＲ断片であるＰＣＲ−ＭＮ１１並びにオリゴヌクレオチドＨＩＶＴＭ１（配列番号１１８）
；５′−TTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTCTCTGTAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATAA −３′）
およびＨＩＶＴＭ２（配列番号１１９）
；５′−TTATCCCTGCCTAACTCTATTCACTACAGAGAGTACAGCAAAAACTATTCTTAAACCTACCAAGCCTCCTACTATCATTATGAATAA −３′）
から、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１１４）およびＨＩＶＴＭ３（配列番号１２０）
；５′−ATCATCTCTAGAATAAAAATTATCCCTGCCTAACTCTATTCAC −３′）
を用いて調製した。また、ＰＣＲＭＮ１１は、プラスミドｐＨ６ＨＭＮＥから、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列番号１１４）およびＨＩＶＭＮ１８（配列番号１２１）
；５′−GCCTCCTACTATCATTATGAATAATCTTTTTTCTCTCTG −３′）
を用いて調製した。）このような操作によって得られるプラスミドをｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔと呼ぶ。］
次にＥＬＤＫＷＡおよびＶ３ループをコードする他方の部分をｐＢＳＫ+ にクローニングした。これを行うために、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ酵素分解した３００ｂｐのＰＣＲ断片（ＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列の一部を含有する）を、ｐＢＳＫ+ の２，９００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片にクローニングした。（なお、該ＰＣＲ断片は、プラスミドｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０ＴからプライマーＨＩＶＰ６９（配列番号１２２）
；５′−TGATAGTACCAGCTATAGGTTGAT−３′）
およびＨＩＶＰ７５（配列番号１２３）
；５′−TTTGTCGAGCTCGTAGTTGGGTCTTGTACAATT −３′）
を用いて調製した。）この操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶ５６と呼ぶ。
【０３８８】
次に、ｐＨＩＶ５５およびｐＨＩＶ５６由来のＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列を、Ｈ６プロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭ遺伝子内にクローニングした。これは、ｐＨＩＶ５５の２２５ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩおよびｐＨＩＶ５６の３００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片（ＥＬＤＫＷＡ−Ｖ３ループ配列を含有）を、ｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔの４，３００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片にクローニングにすることにより行った。この操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶ５７と呼ぶ。
【０３８９】
次いで、ＥＬＤＫＷＡエピトープを含有し、Ｈ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭ構築物を、Ｃ５隣接アーム間にクローニングした。これを行うために、ｐＨＩＶ５７の１，７００ｂｐのＮｒｕＩ−ＸｂａＩ断片（Ｈ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭ（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含む）遺伝子を含有する）を、ｐＳＩＶＧＣ１５の４，７００ｂｐのＮｒｕＩ−ＸｂａＩ断片にクローニングした。（ｐＳＩＶＧＣ１５は、Ｃ５隣接アーム間にクローニングされたＨ６をプロモーターとするＳＩＶのｅｎｖ遺伝子を含有する。）この操作により得られたプラスミドをｐＨＩＶ５９と呼ぶ。
【０３９０】
次に、Ｈ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋ＴＭ（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含む）を、ＣＯＰＡＫ隣接アーム間にクローニングした。これを行うため、ｐＨＩＶ５９の１，８５０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片（Ｈ６をプロモーターとするｇｐ１２０＋（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含む）遺伝子を含有する）を、ｐＳＤ５５３ＶＣの４，６００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片にクローニングした。この操作によって得られたプラスミドをｐＨＩＶ６１と呼ぶ。このｐＨＩＶ６１における（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含む）ｇｐ１２０＋ＴＭ遺伝子のＤＮＡ配列は図３０に示されている。
【０３９１】
ｐＨＩＶ６１を用いＣＯＰＡＫをレスキューウイルスとするインビドロ組換えを行いｖＰ１３１９を得た。
【０３９２】
ｖＰ１３１９が感染された細胞の表面でＨＩＶ１ｇｐ１２０＋ＴＭ（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含む）が発現されたか否かを確認するためＦＡＣＳ分析を行った。Ｓ−ＭＥＭ（Sigma製Ｍ−８０２８Joklik 懸濁媒体）に懸濁させた５×１０６  個のＨｅＬａ−Ｓ３細胞に、５ｐｆｕ／細胞のm.o.i.でＷＲ、ｖＰ１２８６（Ｈ  ＩＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭを発現するＷＲ組換体）またはｖＰ１３１９を感染させた。３７℃において６０分間の吸着期間の後、１０ｍｌのＳ−ＭＥＭで細胞を洗浄し、１，０００ＲＰＭで５分間遠心した。次いで、サンプルを１ｍｌのＳ−ＭＥＭに再懸濁させ、５ｍｌのSarstadt管に移し、３７℃の温度下に回転装置上に配置した。１８時間後、２００μｌのアリコート（細胞数１×１０６)をポリプロピレンチューブにいれ、３ｍｌのＰＢＳ−ＣＭＦ（０．２％ＮａＮ３  ＋０．２％ＢＳＡを含む）で洗浄した。次いで、上澄液をデカンテーションで除去し、ＨＩＶ１に血清反応陽性のヒト由来の血清（米国the New York State Dept. of Healthから入手）を１００倍稀釈したもの、ＨＩＶ１（ＭＮ）Ｖ３ループに特異的なマウスモノクローナル抗体５０．１（米国ＮＣＩ、ＮＩＨのM. Robert Guroff氏から入手）を５００倍稀釈したもの、または、ＥＬＤＫＷＡエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体ＩＡＭ４１−２Ｆ５（米国テキサスHouston のViral Testing Systems 社製）を１００倍稀釈したもの１００μｌにペレットを再懸濁させた。それらのサンプルを６０分間４℃で定温保存し、ＰＢＳ−ＣＭＦ（０．２％ＮａＮ３ ＋０．２％ＢＳＡを含む）で２回洗浄し、１，０００ＲＰＭで５分間遠心した。上澄液をデカンテーション除去し、ヤギの抗ヒトＦＩＴＣまたはヤギの抗マウスＦＩＴＣ（Boehringer Mannheim から入手）の１００倍稀釈ペレットを再懸濁させた。サンプルを３０分間、４℃で定温保存し、ＰＢＳ−ＣＭＦ（０．２％ＮａＮ３  ＋０．２％ＢＳＡを含む）で２回洗浄し、Facscanflow細胞計測計（サイトメーター）で分析した。ｖＰ１３１９感染細胞の表面にはＥＬＤＫＷＡを含有する遺伝子産物が発現されていたが、ＷＲ感染細胞またはｖＰ１２８６感染細胞の表面には発現されていなかった（図３１の中欄参照）。ｖＰ１２８６感染細胞の表面にはＶ３ループを含有する遺伝子産物が発現されていたが、ＷＲ感染細胞またはｖＰ１３１９感染細胞の表面には発現されなかった（図３１の下欄参照）。ｖＰ１２８６感染細胞およびｖＰ１３１９感染細胞の表面には、ＨＩＶ１に血清反応陽性の血清に反応性の遺伝子産物が発現されていたが、ＷＲ感染細胞の表面には発現されていなかった（図３１の上欄参照）。この分析が示すように、１）ｖＰ１３１９感染細胞の表面にはＨＩＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭ（ＥＬＤＫＷＡエピトープを含む）遺伝子産物であるＥＬＤＫＷＡエピトープが発現され、且つ、２）ｖＰ１３１９感染細胞の表面に発現された遺伝子産物は野生型のＶ３ループを含有せず、該遺伝子産物のＶ３ループがＥＬＤＫＷＡエピトープで置換された事実を裏付けている。
【０３９３】
ｖＰ１３１９が、免疫原性のあるＥＬＤＫＷＡエピトープを含むｇｐ１２０＋ＴＭの一形態を発現するか否かを確認するため、免疫沈降分析を行った。ＨｅＬａ細胞の単層に、１０ｐｆｕ／細胞のm.o.i.で、ＮＹＶＡＣ（親ウイルス）、ｖＰ１２８６（ＨＩＶ１のｇｐ１２０＋ＴＭを発現するＷＲ組換体）、またはｖＰ１３１９を感染させた。１時間の吸着期間の後、接種物を除去し、２％の透析ウシ胎児血清および［３５Ｓ］−ＴＲＡＮＳラベル（３０μＣｉ／ｍｌ）を含有する改変Ｅａｇｌｅ液（システインおよびメチオニン欠除）で細胞を覆った。感染から１８時間後、１ｍｌの３×バッファーＡ（４５０ｍＭのＮａＣｌ、３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のアジ化ナトリウムおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）を添加することにより溶解物を回収し、次のものの発現を分析した。１）ＥＬＤＫＷＡエピトープ：ＥＬＤＫＷＡエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体ＩＡＭ４１−２Ｆ５（米国テキサスHouston のViral Testing Systems 社製）を１００倍稀釈したものを用いた。２）ＨＩＶ１の遺伝子産物：ＨＩＶ１に血清反応陽性のヒト由来の血清（米国the New York State Dept. of Healthから入手）を１００倍稀釈したものを用いた。
【０３９４】
平常なヒト血清およびプロテインＡ−セファロースＡで予め清浄化した溶解物をＩＡＭ４１−２Ｆ５／プロテインＡ−セファロース複合体またはＨＩＶ１血清反応陽性血清／プロテインＡ−セファロース複合体とともに、４℃で一晩定温保存した。それらのサンプルをバッファーＡで４回、ＬｉＣｌ2 ／尿素バッファーで２回洗浄した。２ＸのLaenmli バッファー（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ＝６．８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間沸騰させることにより沈降したタンパク質を免疫複合体から解離させた。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分画化し、固定化し、次に１Ｍのサリチル酸ナトリウムで処理し、間接撮影（フルオログラフィー）に供した。ＥＬＤＫＷＡに対するモノクローナル抗体を用いると、ｖＰ１３１９感染細胞からは適当な大きさのタンパク質が沈降したが、ＮＹＶＡＣ感染細胞またはｖＰ１２８６感染細胞からは沈降しなかった。さらに、ＨＩＶ１血清反応陽性のヒト血清を用いると、ｖＰ１２８６感染細胞およびｖＰ１３１９感染細胞からは適当な大きさのタンパク質が沈殿したが、ＮＹＶＡＣ感染細胞からは沈殿しなかった。これらの結果が示すように、ｖＰ１３１９は、抗原性のあるＥＬＤＫＷＡエピトープを含有するｇｐ１２０＋ＴＭの一形態を発現させる。
【０３９５】
ｖＣＰ１３０７、ｖＰ１３１３およびｖＰ１３１９は、それぞれ、免疫原性のある形態でＥＬＤＫＷＡエピトープを発現させるので、前述したように、これらの組換体は、それらの発現産物、それから誘起される抗体、さらには、それらの組換体由来のＤＮＡなどと同様に広範な利用性を有する。
【０３９６】
実施例２２−ｖＣＰ２０５をサル科マカク属のサルに筋肉内投与した場合の接種効果と免疫原性                                                    
実験動物：Macaca fascicularis （カニクイザル）（成体、野生捕獲）
数：８匹
性別：オス
捕獲源：モーリシャス島。Ｂ型肝炎、フィロウイルスおよび結核症が存在しないと考えられる。
【０３９７】
前歴：ポリオの実験に供された。
【０３９８】
食事および飲料水：市販のエサと果物；随意に水道水
４匹のオスのカニクイザル（Cynomolgus macaque）に、１ヶ月間隔で５回、ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ２０５）（１回投与当たり１０５．６ ＴＣＩＤ５０を含有）を筋肉内投与した。この注入（注射）によって、何らの症状も外傷も引き起こされなかった。注入によるサルの体重変化はなかった。４匹のコントロール（対照）用サルには、プラセボ（placebo ）（ＤＭＥＭ−Ｆ１２（２５％）、ラクトグルタメート（２５％）および凍結乾燥用基質（５０％）) を注入した。一般的な状態を毎日監視し、各接種後、１、２、３、４および７日目に注射部位の観察を行った。体重を週に１回測定した。
【０３９９】
血液サンプルを採取して、血液学的分析用にＥＤＴＡ血液採取用VacutainerＲ  チューブ（フランスMeyland のBecton-Dickinson製）、生化学的分析用にリチウム−ヘパリン  マイクロベット  ＣＢ１００  チューブ（ドイツNumbrecht のSarstedt）、および血清学的分析用に血清分離器SST VacutainerＲ  チューブ付きの管に入れた。サンプリングは、０、３、７、１４、２８、３１、３５、４２、５６、５９、６３、７０、８４、８７、９１、９８、１１２、１１５、１１９、１２６および１４０日目に行った。臨床検査および血液採取に際しては麻酔（ケタミン２０ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与）を行った。
【０４００】
血液学的および生化学的分析は、ＶＥＴ  ＴＥＳＴ  ８００８装置を用いて実施した。抗ＨＩＶ  ｇｐ１６０、ｐ２４タンパク質およびＶ３ペプチド抗体の力価をＥＬＩＳＡ法によって測定した。このため、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｆ９６  ＮＵＮＣプレートを、０．１Ｍの炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）に稀釈した次のいずれかの抗原で３７℃において１時間被覆した。
【０４０１】
・１ウエル当たり１３０ｎｇの精製ｇｐ１６０  ＭＮ／ＢＲＵ（組換えワクシニア由来であり、３０％の切断ｇｐ１６０を含有するがα2 マクログロブリンは含有しない）、
・２００ｎｇのＶ３ＭＮペプチド
・１３０ｎｇの精製「ｐ２４」ＨＩＶ（大腸菌Ｐ２５  ＬＡＩから単離、バッチ６７２Ｃｌ、Transgene)
インキュベートは、全て、最終体積が１００μｌになるように行い、その後、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．１）／０．１％Tween ２０を用いて３回洗浄した。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．１）／０．０５％Tween ２０／５％(ｗ／ｖ）粉状スキムミルク（Gloria）の１５０μｌを用いて３７℃で１時間、プレートのブロッキングを行った。
【０４０２】
血清をリン酸緩衝生理食塩水０．０５％Tween ２０／５％（ｗ／ｖ）粉状スキムミルクに溶かし、逐次的に３倍ずつ稀釈（１／５０から１／１２１５０の範囲）してウエルに添加し、３７℃で９０分間保温した。
【０４０３】
洗浄後、抗サルＩｇＧ／ペルオキシダーゼ複合体（Cappel、ヤギのＩｇＧ画分）をリン酸緩衝生理食塩水／０．５％Tween ２０／５％（ｗ／ｖ）粉状スキムミルク中に１／３０００稀釈したものを添加して、該プレートを３７℃において更に９０分間保温した。プレートを４回洗浄し、基質であるＯ−フェニレンジアミン  ジハイドロクロリド（Sigma タブレット）とともに暗中で室温下に３０分間保温した。基質は、０．０３％の過ホウ酸ナトリウム（Sigma カプセル）を含有する０．０５Ｍのリン酸塩・クエン酸塩系緩衝液（ｐＨ５．０）に溶かし１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で用いた。
【０４０４】
４ＮのＨ2 ＳＯ4 の５０μｌを用いて反応を停止させた。自動プレートリーダー（Vmax, Molecular Devices)を用い４９０−６５０ｎｍにおける光学密度を測定した。抗体力価は次の式に従って計算した。
【０４０５】
力価＝ｌｏｇ（ＯＤ４９０−６５０ ×１０）／（１／稀釈倍数）
ＯＤ値の範囲は０．２から１である。
【０４０６】
中和抗体の分析により、１０  ＴＣＩＤ５０のＨＩＶ  ＭＮで感染された血清のマイクロウエルにおけるシンシチウムの発生を防止する稀釈倍数が決定される。ＭＮ株は、F. Barre-Sinoussi から入手し、ＣＥＭクローン１６６細胞中で増殖させた。
【０４０７】
血清は補体除去され、ＲＰＭＩ中で血清の逐次的な２倍稀釈液（最初は１／１０）を調製した。等体積の血清稀釈液とＨＩＶ懸濁液（各５００μｌ）を混合し、３７℃において２時間保温した。ＨＩＶ懸濁液は、１ｍｌ当たり１０２  〜１０２．５ のＴＣＩＤ５０を含有するように調製しておいたものである。
【０４０８】
使用の前に、ポリ−Ｌ−リジンがコーティングされたマイクロウエルに指示剤となるＣＥＭｓｓ細胞をまき、３７℃で１時間保温した。培地を取り除き、ウイルス／血清混合物（１００μｌ／ウエル、各稀釈当たり６ウエル）と置き換えた。３７℃で１時間の保温の後、各ウエルに培地を添加し、３７℃でプレートを保温した。保温は全て、ＣＯ２ ５％のインキュベーター内で行った。
【０４０９】
７日後および１４日後に、培養物を顕微鏡で調べ、シンシチウムを示すウエルを記録した。中和５０％力価をＳＰＥＡＲＭＡＮおよびＫÅＲＢＥＲに従って計算し、終点のｌｏｇ１０として表した。確認のために、７日目に培養物を上澄液を採取し、各稀釈液毎にまとめて、ＲＴ活性を分析した。各分析は、ウイルス懸濁液の伝染性滴定、参照用血清および陰性コントロールとしての１組の非感染マイクロウエルの抗体滴定を含む。
【０４１０】
結果
血液学的および生化学的状態を監視するためのパラメーター（赤血球数、平均血球体積、ヘマトクリット、クレアチニンおよびアラニンアミノトランスフェラーゼなど）の大部分は平常な範囲内で変化した。
【０４１１】
ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ２０５）による繰り返し免疫に帰することができない幾つかの変化が認められた：ｉ）試験グループおよびコントルールグループの両方における８週および９週目の説明できないリンパ球増加、ii) 両グループにおける１７および２０週目、並びにコントロールグループにおける９週目のヘモグロビンレベルの減少、iii)２匹のコントロール用サルにおけるアスパルテートアミノトランスフェラーゼの異常な高い値、最後に、iv) 何匹かについてマイクロ凝集によって引き起こされる異常な血小板値。
【０４１２】
ｖＣＰ２０５によって誘起される抗ＨＩＶ免疫応答は、精製ｇｐ１６０ＭＮ／ＢＲＵ（組換体ワクシニア由来）、Ｖ３ＭＮ合成ペプチドおよびｐ２４（大腸菌由来、ＬＡＩ単離物）を用いるＥＬＩＳＡ試験により評価した。すべてのサルがｇｐ１６０およびＶ３に対する抗体を、また、４匹のうち２匹がｐ２４に対する抗体を産生した。明確な抗ＨＩＶ免疫応答は、通常、２回の注射後、あるいは最大限、３回の注射後に現れた。後にｖＣＰ２０５を接種すると、主として抗体レベルが維持され（時には、僅かに上昇）、サル間の応答の均質性が向上した。最大の抗体力価は、通常、各接種の２週間後に認められ、その後、次のブースター（追加免疫）まで減少した。ＨＩＶ／ＭＮに対する中和抗体は、免疫された全てのサルについて検出可能であった。
【０４１３】
臨床観察：接種部位には紅斑も浮腫も認められなかった。コントロール用サルおよびＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ２０５）感染サルとも体重は安定していた（図３２）。
【０４１４】
血液学分析：白血球数は、８週および９週目にformula inversion とともにコントロール用サルおよび試験用サルのいずれにおいても大きく向上した（図３３ａ）。この事実は、いずれのグループにおいて認められており、ウイルス注射との相関関係はない。
【０４１５】
赤血球数、血球平均体積およびヘマトクリットは平常な範囲内で変化したが、ヘモグロビンは、コントロール用サルでは、９、１７および２０週目に、また、ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ２０５）が接種されたサルでは１７および２０週目に不一致が認められた（図３３ｂおよび３３ｃ参照）。血小板値は、サンプリングの質に応じて変化した（ミクロ凝固）（図３３ｃ参照）。
【０４１６】
生化学的分析：クレアチニンおよびＡＬＡＴ（ＳＧＰＴトランスアミナーゼ）は、反復接種後も有意に変化しなかった（図３４および図３６参照）。ＡＳＴ（ＳＧＯＴトランスアミナーゼ）は、コントロール用サルの＃３および２において、それぞれ、５週目および８〜９週目に特に重要な変化を示した（図３５）。
【０４１７】
血清学的分析：サル血清の陰性コントロールグループのＥＬＩＳＡ力価を考慮すると、血清学的応答の陰性検出限界は、ｇｐ１６０、Ｖ３およびｐ２４について、ｌｏｇ１０で表して、それぞれ、１．５６±０．２４、１．９２±０．１２および２．１８±０．３４と考えられた。ｇｐ１６０およびＶ３に特異的応答は図３７ａ〜３７ｂ、図３８ａ〜３８ｂに示す。ｇｐ１６０に対する抗体の動力学的挙動は、Ｖ３に対するそれと類似している。後者の方が僅かに弱い（２０週目における平均力価は４．３７対８．８４である）。
【０４１８】
検出可能な免疫応答を誘起するには２回の投与が必要であった。３匹のサルは２回目の投与後に最大の応答を示した；４匹目のサルは、最大の応答を示すのに、３回の投与（ｇｐ１６０について）または４回の投与（Ｖ３について）が必要であった。各投与間の４週間の期間中、抗体力価は上昇した後低下し、次の接種によって増強されることになる。当初の投与に対する応答には個体間に有意の相違があるが、実験が進行するに従い応答は平均化した。
【０４１９】
ｐ２４に特異的な応答（図３７ｃおよび３８ｃ）：４匹のうちの２匹のサル科マカク属のサル（サル５および７）については、それぞれ、ｖＣＰ２０５の２回目の投与後および３回目の投与後に、応答が認められた。これは、モルモットの場合には接種されたどのグループにおいても抗ｐ２４抗体が検出されなかったことと対照的である。抗ｇｐ１６０抗体および抗Ｖ３抗体の場合と同様に、力価は各投与間に上下動し、個体間の相違は、次第になくなった。ｇｐ１６０およびＶ３の場合とは異なり、抗ｐ２４抗体のプロフィルは一定水準（プラトー）に達することはなかった。
【０４２０】
中和抗体：図３９に示すように、ｖＣＰ２０５が投与された４匹のサルはいずれも、検出可能なレベルの抗ＨＩＶ（ＭＮ）中和抗体を産生した。そのうちの１匹は１回の投与後に陽性となり、２匹は第２回の投与後に、また最後の１匹は５回の投与を必要とした。注目すべきことは、最後の１匹がＥＬＩＳＡ抗体の動力学挙動が最も遅かったということである。中和抗体のレベルは比較的穏当であり（数学的表現で１／１０から１／３０）、ＥＬＩＳＡ測定値と同様に、各投与の間では上下動した。
【０４２１】
ｇｐ１６０およびｐ２４による追加免疫効果：４匹のサルに、ｖＣＰ２０５の最後の投与から７週間後、２００μｇのｇｐ１６０および２００μｇのｐ２４タンパク質をフロインド（freund's）不完全アジュバント（Montanide ＩＳＡ５１）に溶かしたものを追加投与して超免疫標準血清を産生させた。この結果、抗体力価に著しい上昇（少なくとも１０倍）が生じ、ＥＬＩＳＡ分析において見られたプラトー値が応答限界ではなかったことを示唆していた。
【０４２２】
この免疫試験により、ｇｐ１６０  ＭＮ／ＢＲＵおよびＶ３  ＭＮペプチドに対する高レベルの結合抗体が誘起され、そして、低いが明確な中和抗体が誘起された。血清学的結果ではＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ１２５）が接種されたサル科マカク属のサルにおいて観測されたものより高い抗体レベルが示され、また、１回の追加免疫（２回ではない）が良好な既往的応答を得るのに充分であった。この実施例は、ｖＣＰ２０５およびその発現産物、それから得られる抗体、ならびにｖＣＰ２０５由来のＤＮＡが前述のように有用であることを示すものである。
【０４２３】
実施例２３−ｖＣＰ３００をサル科マカク属のサルに投与した場合の接種効果と免疫原性
実験動物：
種：Macaca fascicularis（カニクイザル）
数：８匹
性別：オス
捕獲源：モーリシャス島。Ｂ型肝炎、フィロウイルスおよび結核症が存在しないと考えられる。
【０４２４】
４匹のカニクイザル（Cynomolgus macaque）に、１ヶ月間隔で５回、ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ３００）（１回投与当たり１０6.16ＴＣＩＤ50を含有）を筋肉内投与した。４匹のコントロール（対照）用サルにはプラセボを注射した。６回目の注射として、すべてのサルにＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ３００）を静脈投与した。プログラムは以下のとおりである。
【０４２５】
グループ＃１
投与薬剤：プラセボ
投与方法：左または右の三角筋に交互に筋肉内投与。
【０４２６】
量：１ｍｌ
注射回数：５回（０、４、８、１２および１６週）
グループ＃２
投与薬剤：ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ
投与方法：右または右の三角筋に交互に筋肉内投与。
【０４２７】
量：１ｍｌ
投与量：１０６．１６ＴＣＩＤ５０
注射回数：５回（０、４、８、１２および１６週）
グループ＃１および＃２
２０週目。
【０４２８】
投与薬剤：ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ３００
投与方法：静脈内投与
量：１ｍｌ
投与量：１０６．１６ＴＣＩＤ５０
注射回数：１回
臨床観察：各接種の後、１、２、３、４および７日目に注射部位の観察を行った。１週間に１度、サルの体重測定を行った。
【０４２９】
サンプリング：ケタミン麻酔して、大腿部静脈から血液サンプルを採取した。血液は以下の順にVacutainerチューブ（フランスMeylanのBecton Dickinson）：
１）０．１２９Ｍクエン酸ナトリウム緩衝チューブ内に１．８ｍｌ（プロトロンビン分析用）。
【０４３０】
２）５ｍｇのフッ化ナトリウムとシュウ酸カリウムチューブに２ｍｌ（グルコース分析用）
３）０．１７ＭのＥＤＴＡ  Ｋ3チューブに２ｍｌ（血液学的分析用）。
【０４３１】
４）不活性保護剤とクロット活性剤を含む血清分離用チューブに２〜３ｍｌ（生化学的および血清学的分析用）。
【０４３２】
サンプリングは、０、３、７、１４、２８、３１、３５、４２、５６、５９、６３、７０、８４、８７、９１、９８、１１２、１１９、１２６、１４０および１４３日目に行った。
【０４３３】
用量
血液学的分析として、血球数および分化白血球数（differential leucocyte counts ）、ヘモグロビン、血小板、プロトロンビン、網状赤血球および沈降率等を測定した。
【０４３４】
生化学的分析として、ナトリウム、カリウム、グルコース、アルカリホスファターゼ、コレステロール、全タンパク質および電気泳動、トランスアミナーゼＳＧＯＴおよびＳＧＰＴ等を測定した。
【０４３５】
血清学的分析として、抗ＨＩＶ  ｇｐ１６０糖タンパク質、ｐ２４タンパク質、Ｖ３ペプチドおよびｎｅｆタンパク質各抗体を、次のように、ＥＬＩＳＡ法を改良して滴下した：
Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｆ９６  ＮＵＮＣプレートに、０．１Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）で稀釈した以下の抗原の１つを３７℃で１時間、次いで４℃で一晩被覆した。
【０４３６】
・１ウエル当たり１３０ｎｇの精製ｇｐ１６０  ＭＮ／ＢＲＵ（組換えワクシニアＶＶＴＧ５１５６由来）、
・２００ｎｇのＶ３ＭＮペプチド、
・１３０ｎｇの精製ｐ２４  ＨＩＶ（大腸菌ｐ２５  ＬＡＩ単離物、バッチ６７２Ｃ１、Transgene製）。
【０４３７】
保温は全て、最終体積を１００μｌとして行い、その後、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．１）／０．１％のTween ２０で３回洗浄した。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．１）／０．１％のTween ２０／５％（ｗ／ｖ）の粉状スキムミルク（Gloria）の１５０μｌを用いて３７℃で１時間、プレートのブロッキングを行った。リン酸緩衝生理食塩水／０．０５％Tween ２０／５％（ｗ／ｖ）の粉状スキムミルクに溶かした血清を逐次的に３倍ずつ稀釈した溶液（範囲は１／５０から１／１２１５０または１／５００から１／１２１５００）をウエルに添加し、３７℃で９０分間保温した。
【０４３８】
洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水／０．０５％Tween ２０／５％（ｗ／ｖ）の粉状スキムミルク中で３０００倍に稀釈した抗サルＩｇＧ／ペルオキシダーゼ複合体（Cappel、ヤギのＩｇＧ画分）を添加し、３７℃においてさらに９０分間プレートを保温した。プレートを４回洗浄した後、基質としてＯ−フェニレンジアミンジハイドロクロリド（Sigma タブレット）を用いて暗中で３０分間、室温下で保温した。基質は、０．０３％の過ホウ酸ナトリウム(Sigmaカプセル）を含有する０．０５％Ｍのリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶かした１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。５０μｌの４Ｎ  Ｈ２ ＳＯ４  を用いて反応を停止させた。
【０４３９】
自動式プレードリーダー（Vmax, Molecular Devies製）を用いて４９０−６５０ｎｍにおける光学密度を測定した。ブランクの値を差し引き、２回の値を平均した。ＥＬＩＳＡプレート上に存在させたモルモットの抗ｇｐ１６０および抗ｐ２４超免疫標準血清の回帰曲線から、０．２〜１．２の範囲のＯＤ値について抗体力価を計算した。該標準血清の力価は、次式によって予め定められたものである：
力価＝ｌｏｇ（ＯＤ４９０−６５０ ×１０）／（１／稀釈倍数）
ＯＤ値の範囲は０．２〜１．２である。
【０４４０】
サルの抗ｎｅｆ標準血清が入手できなかったので、抗ｎｅｆ抗体の測定は、内部的な陽性コントロールとして、マウスのモノクローナル参照用抗体（抗ｎｅｆ  ＨＩＶ１  ＡＬ１、ＭＡＴＧ００２０、Transgene 製）を試験に利用することによって行った。次に、５０００倍稀釈した抗マウスＩｇＧ／ペルオキシダーゼ複合体（Amersham製）を用い、上述の式に従って血清の力価を計算した。
【０４４１】
結果
注入によって何等の症状も外傷も引き起こさなかった。注入によりサルの体重変化はなかった。血液学的パラメーターは有意に変化しておらず、また、生化学的分析によれば、腎臓機能や肝臓機能に変化は認められなかった。
【０４４２】
血液学的結果：変化が認められた場合でも、プラセボグループとワクチン化グループにおいてそのパターンや範囲は類似していた。
【０４４３】
個々のＷＢＣ数は、平常範囲内で変化していた。ＷＢＣ数較差は、血液サンプリングの３日後にしばしばリンパ球の減少を示した（図４０参照）。赤血球数、ヘマトクリットおよびヘモグロビンは、各サンプリング後に一時的に減少したが、これとは対照的に、網状赤血球数は穿刺後、常に増加していた（図４１ａ、４１ｂ、４１ｃ参照）。平均血球体積は、１４０日目における増加を除いては、全てのサルにおいて安定していた。血小板数は、幾分変化したが（図４１）、プロトロンビンレベルは安定していた（図４２）。いずれのグループにも貧血症の徴候は認められなかった。血沈速度は、すべてのサンプルにおいて１時間後１ｍｍであった。
【０４４４】
生化学的結果：観測された変化を解釈しやすくするために、標準血清（１８のサル血清をプールしたもの）を用い、一連のサンプル測定の開始時（Std ａ）および終了時（Std ｐ）に分析した。
【０４４５】
コレステロール値は、コントロールグループおよび試験グループとも同じように変化した（図４３ａおよび４３ｂ）。
【０４４６】
ナトリウムおよびカリウムは全ての注射後で安定していたが、全タンパク質とグルコースに関しては、１４０日目に大きな上昇が認められた。その日には、静脈内注射に先立ち血液サンプルを麻酔をかけずに抜き出した（その結果、干渉を起こさずに臨床反応を監視することができた）；幾つかの生物学的パラメーターに認められた変化は、無麻酔の処置とサンプリングに関連するストレスに因ったものであろう（図４３ａおよび４３ｂ）。電気泳動プロフィール（データを示していない）はすべてのサンプルにおいて酷似していた。クレアチニン、ビリルビン、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼおよびアルカリホスファターゼは平常な範囲内で変化し、常に、コントロールグループおよび試験グループの両方において同じ傾向を示した（図４３ｃおよび４３ｄ）。したがって、ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ３００）の接種により腎臓機能および肝臓機能が影響されることはなかった。
【０４４７】
血清学的結果：検出可能な抗ｇｐ１６０および抗Ｖ３応答を誘起するには、２回の注射（サル＃６、７、８）または３回の注射（サル＃５）が必要であった（図４４ａ、４４ｂ、４５ａ、４５ｂ）。２回目の注射の２週間後に、これらの応答はサル間で変化していた（抗ｇｐ１６０力価はｌｏｇで２から４．６の間で変動した）。このような応答の不一致は３回目の注射で平滑化された。後続して筋肉内投与を行うと、力価は主として維持されるか上昇し、４回から５回目の注射後には、抗ｇｐ１６０抗体および抗Ｖ３抗体に関して、それぞれ、約４．３および３．６に達した。ｖＣＰ３００の筋肉内注射を３回（サル＃６、８）から４回（サル＃６）、または５回（サル＃７）を行った後に、検出可能な抗体が認められた。最も高い抗ｇｐ１６０／Ｖ３力価を示したサルが、最も高い抗ｐ２４値（１次免疫から１８週目において約４．３）を示した。抗ｎｅｆ抗体を産生したサルはなかった（図４７ａ、４７ｂ）。
【０４４８】
ＥＬＩＳＡで抗ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０、Ｖ３、ｐ２４、ｎｅｆ血清抗体を分析することにより、ｖＣＰ３００により誘起された免疫応答の検討を行った。
【０４４９】
全てのサルがｇｐ１６０、Ｖ３およびｐ２４に対する抗体を産生した。２回または多くても３回の筋肉内投与により有意の抗ｇｐ１６０または抗Ｖ３応答が得られた。後続の接種はその抗体レベルを維持または上昇させた。抗ｐ２４応答は３〜５回の投与後に検出され、ｖＣＰ３００の各接種はそのレベルを上昇させた。いずれのサルにおいても抗ｎｅｆ抗体は検出することができなかった。
【０４５０】
抗体力価は、一般に、それぞれの筋肉内注射の２週後に最大となり、次に追加投与が行われるまで減少した。
【０４５１】
これらの血清学的結果は、同じタンパク質類を発現させるがＣＴＬエピトープを発現させないＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ２０５）を用いて得られた結果と非常に似ている。ｖＣＰ３００を用いた本実施例において２つの僅かな違いを指摘することができる。すなわち、抗ｇｐ１６０／Ｖ３抗体力価が少し低く（約０．２〜０．５ｌｏｇ）、且つ、抗ｐ２４応答が高い（すべてのサルにおいて陽性であり、血清力価が高い）ことである。サル間に個体差があるので、これらの相違は有意なものとは考えられない。静脈内接種後に過敏症の徴候は認められなかった。副作用も記録されていない。本プログラムは、ｇｐ１６０、Ｖ３およびｐ２４に対する高レベルの結合性抗体を産生させた（ｇｐ１６０についてはｖＣＰ２０５を用いる場合よりも低いが）。本実施例が示すように、ｖＣＰ３００およびその遺伝子産物、それから得られる抗体、ならびにｖＣＰ３００由来のＤＮＡは、上述したような有用性を有するものである。
【０４５２】
以上のように本発明の好ましい態様を詳述したが、添付の請求の範囲により定義された本発明は上述の特定の態様に限定されるものではなく、その精神と意図から逸脱しない多くの変形が可能である。
【参考文献１】
【０４５３】
2006141407.tif 000057
【参考文献２】
【０４５４】
2006141407.tif 000058
【参考文献３】
【０４５５】
2006141407.tif 000059
【参考文献４】
【０４５６】
2006141407.tif 000060
【参考文献５】
【０４５７】
2006141407.tif 000061
【参考文献６】
【０４５８】
2006141407.tif 000062
【参考文献７】
【０４５９】
2006141407.tif 000063
【参考文献８】
【０４６０】
2006141407.tif 000064
【参考文献９】
【０４６１】
2006141407.tif 000065
【図面の簡単な説明】
【０４６２】
【図１】チミジンキナーゼ遺伝子を欠失させるためのプラスミドpSD460を構築し、組み換えワクシニアウイルス・vP410を作製する方法を図式化して示したものである。
【図２】毒性部位を欠失させるためのプラスミドpSD486を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP553を作製する方法を図式化して示したものである。
【図３】ＡＴＩ部位を欠失させるためのプラスミドpMP494△を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP618を作製する方法を図式化して示したものである。
【図４】赤血球凝集素遺伝子を欠失させるためのプラスミドpSD467を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP723を作製する方法を図式化して示したものである。
【図５】遺伝子クラスタ[C7L-k1L]を欠失させるためのプラスミドpMPCK1△を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP804を作製する方法を図式化して示したものである。
【図６】リボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニットを欠失させるためのプラスミドpSD548を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP866を作製する方法を図式化して示したものである。
【図７】狂犬病ウイルス糖タンパク質・Ｇ遺伝子をＴＫ欠失遺伝子座に挿入させるためのプラスミドpRW842を構築し、組み換えワクシニアウイルスvP879を作製する方法を図式化して示したものである。
【図８Ａ】Ｃ５オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むカナリアポックスウイルスPvuII断片のＤＮＡ塩基配列(配列番号66)を示したものである。
【図８Ｂ】Ｃ５オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むカナリアポックスウイルスPvuII断片のＤＮＡ塩基配列(配列番号66)を示したものである。
【図８Ｃ】Ｃ５オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むカナリアポックスウイルスPvuII断片のＤＮＡ塩基配列(配列番号66)を示したものである。
【図９Ａ】組み換えカナリアポックスウイルスvCP65(ALVAC-RG)を構築する方法を図式化して示したものである。
【図９Ｂ】組み換えカナリアポックスウイルスvCP65(ALVAC-RG)を構築する方法を図式化して示したものである。
【図１０】ＮＹＶＡＣを作製するために欠失したＯＲＦを図式化して示したものである。
【図１１Ａ】Ｆ８のＯＲＦを含むＴＲＯＶＡＣ・ＤＮＡの断片のヌクレオチド塩基配列(配列番号67)を示したものである。
【図１１Ｂ】Ｆ８のＯＲＦを含むＴＲＯＶＡＣ・ＤＮＡの断片のヌクレオチド塩基配列(配列番号67)を示したものである。
【図１１Ｃ】Ｆ８のＯＲＦを含むＴＲＯＶＡＣ・ＤＮＡの断片のヌクレオチド塩基配列(配列番号67)を示したものである。
【図１２Ａ】Ｆ７のＯＲＦを含むＴＲＯＶＡＣ・ＤＮＡの2356塩基対断片のＤＮＡ塩基配列(配列番号68)を示したものである。
【図１２Ｂ】Ｆ７のＯＲＦを含むＴＲＯＶＡＣ・ＤＮＡの2356塩基対断片のＤＮＡ塩基配列(配列番号68)を示したものである。
【図１３−１】は同じかまたは別のワクチン（０日目、２８日目、１８０目にワクチンを接種し、接種後０、７、２８、３５、５６、１７３、１８７、２０８日目に抗体価測定）のいずれかで事前に免疫したボランティアにおける狂犬病ウイルス中和抗体価(RFFIT, IU/ml)、ＨＤＣおよびｖＣＰ６５(10５．５ TCID５０)の追加免疫効果をグラフ化したものである。
【図１３−２】は同じかまたは別のワクチン（０日目、２８日目、１８０目にワクチンを接種し、接種後０、７、２８、３５、５６、１７３、１８７、２０８日目に抗体価測定）のいずれかで事前に免疫したボランティアにおける狂犬病ウイルス中和抗体価(RFFIT, IU/ml)、ＨＤＣおよびｖＣＰ６５(10５．５ TCID５０)の追加免疫効果をグラフ化したものである。
【図１４Ａ−１】はpHIV32(配列番号78)に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶ１・ｇｐ１２０（+トランスメンブレン）遺伝子、Ｉ３ＬでプロモートされたＨＩＶＩgag(+pro)遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１４Ａ−２】はpHIV32(配列番号78)に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶ１・ｇｐ１２０（+トランスメンブレン）遺伝子、Ｉ３ＬでプロモートされたＨＩＶＩgag(+pro)遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１４Ａ−３】はpHIV32(配列番号78)に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶ１・ｇｐ１２０（+トランスメンブレン）遺伝子、Ｉ３ＬでプロモートされたＨＩＶＩgag(+pro)遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１４Ａ−４】はpHIV32(配列番号78)に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶ１・ｇｐ１２０（+トランスメンブレン）遺伝子、Ｉ３ＬでプロモートされたＨＩＶＩgag(+pro)遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１４Ｂ−１】はpHIV32(配列番号78)に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶ１・ｇｐ１２０（+トランスメンブレン）遺伝子、Ｉ３ＬでプロモートされたＨＩＶＩgag(+pro)遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１４Ｂ−２】はpHIV32(配列番号78)に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶ１・ｇｐ１２０（+トランスメンブレン）遺伝子、Ｉ３ＬでプロモートされたＨＩＶＩgag(+pro)遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１４Ｂ−３】はpHIV32(配列番号78)に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶ１・ｇｐ１２０（+トランスメンブレン）遺伝子、Ｉ３ＬでプロモートされたＨＩＶＩgag(+pro)遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１４Ｂ−４】はpHIV32(配列番号78)に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶ１・ｇｐ１２０（+トランスメンブレン）遺伝子、Ｉ３ＬでプロモートされたＨＩＶＩgag(+pro)遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１４Ｂ−５】はpHIV32(配列番号78)に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶ１・ｇｐ１２０（+トランスメンブレン）遺伝子、Ｉ３ＬでプロモートされたＨＩＶＩgag(+pro)遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１４Ｃ−１】はpHIV32(配列番号78)に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶ１・ｇｐ１２０（+トランスメンブレン）遺伝子、Ｉ３ＬでプロモートされたＨＩＶＩgag(+pro)遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１４Ｃ−２】はpHIV32(配列番号78)に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶ１・ｇｐ１２０（+トランスメンブレン）遺伝子、Ｉ３ＬでプロモートされたＨＩＶＩgag(+pro)遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１４Ｃ−３】はpHIV32(配列番号78)に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶ１・ｇｐ１２０（+トランスメンブレン）遺伝子、Ｉ３ＬでプロモートされたＨＩＶＩgag(+pro)遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１４Ｃ−４】はpHIV32(配列番号78)に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶ１・ｇｐ１２０（+トランスメンブレン）遺伝子、Ｉ３ＬでプロモートされたＨＩＶＩgag(+pro)遺伝子のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１５Ａ−１】pVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１５Ａ−２】pVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１５Ｂ−１】pVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１５Ｂ−２】pVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１５Ｂ−３】pVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１５Ｃ−１】pVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１５Ｃ−２】pVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１５Ｃ−３】pVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１５Ｄ−１】pVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１５Ｄ−２】pVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１５Ｄ−３】pVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１５Ｅ−１】pVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１５Ｅ−２】pVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１５Ｅ−３】pVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１５Ｆ−１】pVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１５Ｆ−２】pVQH6CP3L(配列番号79)におけるＣ３遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１６Ａ】p2-60-HIV.3(配列番号91)におけるＩ３Ｌでプロモートされたｎｅｆ・ＣＴＬ２エピトープおよびＨ６でプロモートされたｎｅｆ・ＣＴＬ１エピトープのヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１６Ｂ】p2-60-HIV.3(配列番号91)におけるＩ３Ｌでプロモートされたｎｅｆ・ＣＴＬ２エピトープおよびＨ６でプロモートされたｎｅｆ・ＣＴＬ１エピトープのヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１６Ｃ】p2-60-HIV.3(配列番号91)におけるＩ３Ｌでプロモートされたｎｅｆ・ＣＴＬ２エピトープおよびＨ６でプロモートされたｎｅｆ・ＣＴＬ１エピトープのヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１７Ａ−１】pC6L(配列番号92)におけるＣ６遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１７Ａ−２】pC6L(配列番号92)におけるＣ６遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１７Ｂ−１】pC6L(配列番号92)におけるＣ６遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１７Ｂ−２】pC6L(配列番号92)におけるＣ６遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１７Ｂ−３】pC6L(配列番号92)におけるＣ６遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１７Ｃ】pC6L(配列番号92)におけるＣ６遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１８Ａ−１】pC5POLT5A(配列番号105)に含まれるＩ３Ｌでプロモートされたpol2エピトープ、Ｈ６でプロモートされたpol1エピトープ、４２Ｋでプロモートされたpol3エピトープのヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１８Ａ−２】pC5POLT5A(配列番号105)に含まれるＩ３Ｌでプロモートされたpol2エピトープ、Ｈ６でプロモートされたpol1エピトープ、４２Ｋでプロモートされたpol3エピトープのヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１８Ａ−３】pC5POLT5A(配列番号105)に含まれるＩ３Ｌでプロモートされたpol2エピトープ、Ｈ６でプロモートされたpol1エピトープ、４２Ｋでプロモートされたpol3エピトープのヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１８Ｂ】pC5POLT5A(配列番号105)に含まれるＩ３Ｌでプロモートされたpol2エピトープ、Ｈ６でプロモートされたpol1エピトープ、４２Ｋでプロモートされたpol3エピトープのヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１９Ａ−１】pNC5L-SP5(配列番号 106)におけるＣ５遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１９Ａ−２】pNC5L-SP5(配列番号 106)におけるＣ５遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１９Ａ−３】pNC5L-SP5(配列番号 106)におけるＣ５遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１９Ｂ−１】pNC5L-SP5(配列番号 106)におけるＣ５遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１９Ｂ−２】pNC5L-SP5(配列番号 106)におけるＣ５遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１９Ｂ−３】pNC5L-SP5(配列番号 106)におけるＣ５遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１９Ｃ−１】pNC5L-SP5(配列番号 106)におけるＣ５遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図１９Ｃ−２】pNC5L-SP5(配列番号 106)におけるＣ５遺伝子座のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２０】ALVAC,vCP205,またはペプチドCLTB-36による免疫後におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク質に対するウサギ抗体反応を示したものである。
【図２１】ALVAC,vCP205,またはペプチドCLTB-36による免疫後におけるＨＩＶ・ＭＮ・Ｖ３ループに対するウサギ抗体反応を示したものである。
【図２２】ALVAC,vCP205,またはペプチドCLTB-36による免疫後におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク質に対するモルモット抗体反応を示したものである。
【図２３】ALVAC,vCP205,またはペプチドCLTB-36による免疫後におけるＨＩＶ・ＭＮ・Ｖ３ループに対するモルモット抗体反応を示したものである。
【図２４】ＨＩＶ血清反応陽性者（患者１）のＰＢＭＣ・ＨＩＶー１特異的ＣＴＬのin vitroでの刺激結果を示したものである。
【図２５】患者２における図２４の内容を示したものである。
【図２６Ａ−１】pHIV59およびvCP1307に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 124)および発現タンパク質(配列番号125)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２６Ａ−２】pHIV59およびvCP1307に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 124)および発現タンパク質(配列番号125)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２６Ａ−３】pHIV59およびvCP1307に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 124)および発現タンパク質(配列番号125)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２６Ｂ−１】pHIV59およびvCP1307に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 124)および発現タンパク質(配列番号125)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２６Ｂ−２】pHIV59およびvCP1307に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 124)および発現タンパク質(配列番号125)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２６Ｂ−３】pHIV59およびvCP1307に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 124)および発現タンパク質(配列番号125)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２６Ｃ−１】pHIV59およびvCP1307に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 124)および発現タンパク質(配列番号125)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２６Ｃ−２】pHIV59およびvCP1307に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 124)および発現タンパク質(配列番号125)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２６Ｃ−３】pHIV59およびvCP1307に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 124)および発現タンパク質(配列番号125)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２７】vC1307感染細胞について、ＦＡＣＳ分析結果を示したものである（ＨＩＶ１血清反応陽性者の血清由来のALVAC, vP1286またはvCP1307に感染したＨｅＬａ細胞[上のパネル]または、ＥＬＤＫＷＡエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体、IMA41-2F5[下のパネル]についてＦＡＣＳ分析を行った）。
【図２８Ａ−１】pHIV60およびvP1313に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 126)および発現タンパク質(配列番号127)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２８Ａ−２】pHIV60およびvP1313に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 126)および発現タンパク質(配列番号127)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２８Ａ−３】pHIV60およびvP1313に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 126)および発現タンパク質(配列番号127)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２８Ｂ−１】pHIV60およびvP1313に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 126)および発現タンパク質(配列番号127)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２８Ｂ−２】pHIV60およびvP1313に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 126)および発現タンパク質(配列番号127)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２８Ｂ−３】pHIV60およびvP1313に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 126)および発現タンパク質(配列番号127)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２８Ｃ−１】pHIV60およびvP1313に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 126)および発現タンパク質(配列番号127)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２８Ｃ−２】pHIV60およびvP1313に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 126)および発現タンパク質(配列番号127)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２８Ｃ−３】pHIV60およびvP1313に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 126)および発現タンパク質(配列番号127)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図２９】vP1313感染細胞について、ＦＡＣＳ分析結果を示したものである（ＨＩＶ１血清反応陽性者の血清由来のNYVAC, vP1286またはvP1313に感染したＨｅＬａ細胞[上のパネル]、または、ＥＬＤＫＷＡエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体、IAM41-2F5[下のパネル]についてＦＡＣＳ分析を行った）。
【図３０Ａ−１】pHIV61およびvP1319に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 128)および発現タンパク質(配列番号128)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図３０Ａ−２】pHIV61およびvP1319に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 128)および発現タンパク質(配列番号128)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図３０Ａ−３】pHIV61およびvP1319に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 128)および発現タンパク質(配列番号128)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図３０Ｂ−１】pHIV61およびvP1319に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 128)および発現タンパク質(配列番号128)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図３０Ｂ−２】pHIV61およびvP1319に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 128)および発現タンパク質(配列番号128)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図３０Ｂ−３】pHIV61およびvP1319に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 128)および発現タンパク質(配列番号128)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図３０Ｃ−１】pHIV61およびvP1319に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 128)および発現タンパク質(配列番号128)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図３０Ｃ−２】pHIV61およびvP1319に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 128)および発現タンパク質(配列番号128)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図３０Ｃ−３】pHIV61およびvP1319に含まれるＨ６でプロモートされたＨＩＶＩ・ｇｐ１２０+TM(ＥＬＤＫＷＡエピトープとともに）遺伝子(配列番号 128)および発現タンパク質(配列番号128)のヌクレオチド塩基配列を示したものである。
【図３１】vP1319感染細胞について、ＦＡＣＳ分析結果を示したものである（ＨＩＶ１血清反応陽性者の血清由来のWR, vP1286またはvP1319に感染したＨｅＬａ細胞[上のパネル]または、ＥＬＤＫＷＡエピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体、IMA41-2F5[中段のパネル]、Ｖ３ループ、に特異的なマウスモノクローナル抗体50.1についてＦＡＣＳ分析を行った）。
【図３２】vCP205およびプラセボ（placebo ）を接種したサルにおける体重
【図３３−１】vCP205およびプラセボ（placebo ）を接種したサルにおける血球計算
【図３３−２】vCP205およびプラセボ（placebo ）を接種したサルにおける血球計算
【図３３−３】vCP205およびプラセボ（placebo ）を接種したサルにおける血球計算
【図３４】vCP205およびプラセボ（placebo ）を接種したサルにおけるクレアチニン
【図３５】vCP205およびプラセボ（placebo ）を接種したサルにおけるＳＧＯＴ
【図３６】vCP205およびプラセボ（placebo ）を接種したサルにおけるＳＧＰＴ
【図３７】vCP205およびプラセボ（placebo ）を接種したサルにおけるＥＬＩＳＡ
【図３８】vCP205およびプラセボ（placebo ）を接種したサルにおけるＥＬＩＳＡ
【図３９】vCP205接種のサルにおけるanti-HIVI(MN)中和抗体価を示したものである
【図４０】白血球数
【図４１−１】血球計算
【図４１−２】血球計算
【図４１−３】血球計算
【図４２】プロトロンビン
【図４３−１】生化学結果；総コレステロール、総タンパク、グルコース
【図４３−２】生化学結果；ナトリウム、カリウム
【図４３−３】生化学結果；クレアチニン、ビリルビン
【図４３−４】生化学結果；ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、アルカリ性ホスファターゼ
【図４４】gp160 MN/BRU ELISA
【図４５】v3 MN ELISA、対照とｖＣＰ３００
【図４６】p34, ELISA, 対照とｖＣＰ３００
【図４７】nef ELISA、対照とｖＣＰ３００
【図１】
2006141407.tif 000066
【図２】
2006141407.tif 000067
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2006141407.tif 000072
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2006141407.tif 000077
【図１０】
2006141407.tif 000078
【図１１Ａ】
2006141407.tif 000079
【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３−１】
2006141407.tif 000084
【図１３−２】
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【図１４Ａ−１】
2006141407.tif 000086
【図１４Ａ−２】
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【図１４Ａ−３】
2006141407.tif 000088
【図１４Ａ−４】
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【図１４Ｂ−１】
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【図１４Ｂ−２】
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【図１４Ｂ−３】
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【図１４Ｂ−４】
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【図１４Ｂ−５】
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【図１４Ｃ−１】
2006141407.tif 000095
【図１４Ｃ−２】
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【図１４Ｃ−３】
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【図１４Ｃ−４】
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【図１５Ａ−１】
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【図１５Ａ−２】
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【図１５Ｂ−１】
2006141407.tif 000101
【図１５Ｂ−２】
2006141407.tif 000102
【図１５Ｂ−３】
2006141407.tif 000103
【図１５Ｃ−１】
2006141407.tif 000104
【図１５Ｃ−２】
2006141407.tif 000105
【図１５Ｃ−３】
2006141407.tif 000106
【図１５Ｄ−１】
2006141407.tif 000107
【図１５Ｄ−２】
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【図１５Ｄ−３】
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【図１５Ｅ−１】
2006141407.tif 000110
【図１５Ｅ−２】
2006141407.tif 000111
【図１５Ｅ−３】
2006141407.tif 000112
【図１５Ｆ−１】
2006141407.tif 000113
【図１５Ｆ−２】
2006141407.tif 000114
【図１６Ａ】
2006141407.tif 000115
【図１６Ｂ】
2006141407.tif 000116
【図１６Ｃ】
2006141407.tif 000117
【図１７Ａ−１】
2006141407.tif 000118
【図１７Ａ−２】
2006141407.tif 000119
【図１７Ｂ−１】
2006141407.tif 000120
【図１７Ｂ−２】
2006141407.tif 000121
【図１７Ｂ−３】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ−１】
2006141407.tif 000124
【図１８Ａ−２】
2006141407.tif 000125
【図１８Ａ−３】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ−１】
2006141407.tif 000128
【図１９Ａ−２】
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【図１９Ａ−３】
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【図１９Ｂ−１】
2006141407.tif 000131
【図１９Ｂ−２】
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【図１９Ｂ−３】
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【図１９Ｃ−１】
2006141407.tif 000134
【図１９Ｃ−２】
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【図２０】
2006141407.tif 000136
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ−１】
2006141407.tif 000142
【図２６Ａ−２】
2006141407.tif 000143
【図２６Ａ−３】
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【図２６Ｂ−１】
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【図２６Ｂ−２】
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【図２６Ｂ−３】
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【図２６Ｃ−１】
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【図２６Ｃ−２】
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【図２６Ｃ−３】
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【図２７】
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【図２８Ａ−１】
2006141407.tif 000152
【図２８Ａ−２】
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【図２８Ａ−３】
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【図２８Ｂ−１】
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【図２８Ｂ−２】
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【図２８Ｂ−３】
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【図２８Ｃ−１】
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【図２８Ｃ−２】
2006141407.tif 000159
【図２８Ｃ−３】
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【図２９】
2006141407.tif 000161
【図３０Ａ−１】
2006141407.tif 000162
【図３０Ａ−２】
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【図３０Ａ−３】
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【図３０Ｂ−１】
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【図３０Ｂ−２】
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【図３０Ｂ−３】
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【図３０Ｃ−１】
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【図３０Ｃ−２】
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【図３０Ｃ−３】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３３−３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４１−３】
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【図４２】
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【図４３−１】
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【図４３−２】
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【図４３−３】
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【図４３−４】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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