(57)【要約】【課題】  細胞の付着性を損なうことなく、生体組織欠損部等に任意に充填されたときに、周囲の隙間を均一に形成することができる球状セラミックス粒子を効率よく製造する。【解決手段】  略水平に配置された円筒状容器５内に所定量の顆粒状のセラミックス粒子４を収容し、該円筒状容器５をその軸線６回りに回転させる球状セラミックス粒子の製造方法を提供する。【選択図】    図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
略水平に配置された円筒状容器内に所定量の顆粒状のセラミックス粒子を収容し、該円筒状容器をその軸線回りに回転させる球状セラミックス粒子の製造方法。
【請求項２】
略水平に配置された円筒状容器内に球状セラミックス粒子を収容し、
円筒状容器内に播種すべき細胞を浮遊させた細胞懸濁液を封入し、
円筒状容器をその軸線回りに回転させる細胞の播種方法。
【請求項３】
前記球状セラミックス粒子の量が、前記円筒状容器の円筒内面に球状セラミックス粒子を１層に並べたときに、該円筒内面全体をほぼ覆う量である請求項２に記載の細胞の播種方法。
【請求項４】
略水平に配置された円筒状容器内に顆粒状のセラミックス粒子を収容して該円筒状容器をその軸線回りに回転させる球状セラミックス粒子の製造ステップと、
製造された球状セラミックス粒子とともに付着すべき細胞を浮遊させた細胞懸濁液を円筒状容器内に封入して該円筒状容器をその軸線回りに回転させる播種ステップとを備える生体組織補填体の製造方法。
【請求項５】
前記製造ステップと前記播種ステップとの間に、球状セラミックス粒子に付着した切削粉を洗い流す洗浄ステップを備える請求項４に記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項６】
前記製造ステップにおける円筒状容器の回転数が２０〜１００ｒｐｍであり、
前記播種ステップにおける円筒状容器の回転数が０．２５〜１０ｒｐｍである請求項４または請求項５に記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項７】
前記球状セラミックス粒子の量が、前記円筒状容器の円筒内面に球状セラミックス粒子を１層に並べたときに、該円筒内面全体をほぼ覆う量である請求項４から請求項６のいずれかに記載の生体組織補填体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、球状セラミックス粒子の製造方法、細胞の播種方法および生体組織補填体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨細胞に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを吸収し、骨芽細胞が新しい骨を形成する、いわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
骨補填材の形態としては、一般に、立方体ブロック状、顆粒状等の形態が知られており、骨欠損部の形態に合わせて、適宜選択されるようになっている。比較的広範囲にわたる骨欠損部の場合には、大きめの立方体ブロック状の骨補填材によって大部分の容積を埋めるとともに、それよりも小さい立方体ブロック状の骨補填材によって隙間を埋め、さらに小さな隙間には顆粒状の骨補填材を充填することが行われる。
【非特許文献１】植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
骨補填材が粉体である場合には、種々の骨欠損部に固有の複雑な形態に合わせるようにして内容積全体を隙間なく高い密度で充填することができる。しかしながら、粉体では、完全に隙間が塞がれるため、細胞が成長する際の経路や、細胞への栄養分の補給、細胞からの老廃物の排出用の経路を確保することができない。このため、立方体ブロック状または顆粒状のリン酸カルシウム多孔体が使用されるが、立方体ブロック状の骨補填体は角部を有しているために、整然と補填されない限り、その周囲に不均一な隙間が形成されてしまう不都合がある。また、顆粒状の骨補填材は、立方体ブロック状の骨補填体ほどではないが、各顆粒体は不規則な形態を有しているために、やはり顆粒体相互間の隙間は、不均一なものとなり易い。立方体ブロック状の骨補填体どうしの隙間を顆粒状の骨補填材で埋める方法によっても同様に、大きな隙間と小さな隙間が生ずることになる。
【０００５】
このように、骨補填材を始めとする生体組織補填材の周囲に不均一な隙間が形成されてしまう場合には、以下の不都合が考えられる。
第１に、上記のように生体組織補填材の周囲に不均一な隙間が形成されてしまう場合、生体組織の欠損部に補填された状態においては、周囲に流れる体液の流れが不均一となる。その結果、生体組織補填材を足場として成長する細胞の密度が不均一となり、生体組織が均一に再生されないという不都合がある。
第２に、人工肝臓等のバイオリアクタの内部空間に充填された生体組織補填材の周囲に不均一な隙間が形成されてしまう場合には、内部空間全体にわたってバイオリアクタとしての機能を実現することができず、高い性能を得ることができないという不都合がある。
【０００６】
第３に、このように不均一な隙間が形成された状態で生体組織補填材が細胞とともに培地内に投入されて培養される場合には、細胞の分布が不均一になり、出荷検査等において正確な判定ができないという不都合がある。すなわち、出荷検査において採取したサンプルに比較的多くの細胞が存在していたため出荷許可判定を行ったら、実際には、他の部位には全く細胞が存在していなかったり、その逆に、サンプルに全く細胞が存在していないために培養を続行したら、実際には他の場所では十分に細胞の増殖が行われていたりする事態も考えられる。これを回避するためには、２カ所以上からサンプルを採取して検査を行う必要があり、作業工数が増えてしまう不都合がある。
【０００７】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞の付着性を損なうことなく、生体組織欠損部等に任意に充填されたときに、周囲の隙間を均一に形成することができる球状セラミックス粒子の製造方法、細胞を効率的に播種する細胞の播種方法および生体組織補填体を効率よく製造する生体組織補填体の製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、略水平に配置された円筒状容器内に所定量の顆粒状のセラミックス粒子を収容し、該円筒状容器をその軸線回りに回転させる球状セラミックス粒子の製造方法を提供する。
本発明によれば、円筒状容器内に顆粒状のセラミックス粒子を収容して円筒状容器を水平軸線回りに回転させることにより、円筒状容器内においては、セラミックス粒子が円筒状容器の回転に伴って所定の高さまで持ち上げられた後に、重力により落下させられる動作を繰り返される。その結果、各セラミックス粒子は。他のセラミックス粒子、または、円筒状容器の内面との間で衝突や摩擦を生じて削られ、時間の経過とともに球状に形成されていくことになる。これにより、細胞の付着性を損なうことなく、生体組織欠損部等に任意に充填されたときに、周囲の隙間を均一に形成することができる球状セラミックス粒子を簡易に製造することができる。
【０００９】
また、本発明は、略水平に配置された円筒状容器内に球状セラミックス粒子を収容し、円筒状容器内に播種すべき細胞を浮遊させた細胞懸濁液を封入し、円筒状容器をその軸線回りに回転させる細胞の播種方法を提供する。
本発明によれば、円筒状容器内に球状セラミックス粒子と細胞懸濁液とを封入して、水平軸線回りに回転させることにより、球状セラミックス粒子は細胞懸濁液に接触させられてその表面張力により円筒状容器の内面に付着させられる。そして、円筒状容器の内面に付着した球状セラミックス粒子は、円筒状容器が回転させられるにつれて、その下側に溜まった細胞懸濁液内を通過させられる。細胞懸濁液内には播種すべき細胞が浮遊しているので、細胞は細胞懸濁液内を通過させられる球状セラミックス粒子に捕らえられて播種されることになる。これにより、球状セラミックス粒子に細胞を効率的に播種することが可能となる。
【００１０】
上記発明においては、前記球状セラミックス粒子の量が、前記円筒状容器の円筒内面に球状セラミックス粒子を１層に並べたときに、該円筒内面全体をほぼ覆う量であることが好ましい。
このように構成することで、円筒状容器の円筒内面に球状セラミックス粒子が１層に付着すると、円筒内面全体がほぼ覆われた状態となり、細胞懸濁液には、連続的に球状セラミックス粒子が浸漬されることになる。この場合に、球状セラミックス粒子は、円筒状容器の下側に溜まる細胞懸濁液の底面近傍を通過させられることになるので、細胞懸濁液内において沈降する傾向にある細胞が効率よく球状セラミックス粒子に播種されることになる。
【００１１】
また、本発明は、略水平に配置された円筒状容器内に顆粒状のセラミックス粒子を収容して該円筒状容器をその軸線回りに回転させる球状セラミックス粒子の製造ステップと、製造された球状セラミックス粒子とともに付着すべき細胞を浮遊させた細胞懸濁液を円筒状容器内に封入して該円筒状容器をその軸線回りに回転させる播種ステップとを備える生体組織補填体の製造方法を提供する。
本発明によれば、顆粒状のセラミックス粒子を収容した円筒状容器をその軸線回りに回転させることにより、セラミックス粒子が削られて、細胞の付着性を損なうことなく、生体組織欠損部等に任意に充填されたときに、周囲の隙間を均一に形成することができる球状セラミックス粒子が簡易に製造される。そして、その円筒状容器内に細胞懸濁液を封入して再度軸線回りに回転させることにより、細胞懸濁液内の細胞を球状セラミックス粒子に捕らえさせ、効率よく細胞を播種して、生体組織補填体を製造することが可能となる。
【００１２】
上記発明においては、前記製造ステップと前記播種ステップとの間に、球状セラミックス粒子に付着した切削粉を洗い流す洗浄ステップを備えることが好ましい。
このようにすることで、顆粒状のセラミックス粒子が削れて球状セラミックス粒子に付着した切削粉が洗浄ステップによって洗い流されるので、細胞の付着性が向上し、さらに効率的に、生体組織補填体を製造することができる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記製造ステップにおける円筒状容器の回転数が２０〜１００ｒｐｍであり、前記播種ステップにおける円筒状容器の回転数が０．２５〜１０ｒｐｍであることが好ましい。
このようにすることで、回転数を変えるだけで同一の円筒状容器または同様の円筒状容器により球状セラミックス粒子の製造と該球状セラミックス粒子への細胞の播種とを行って、生体組織補填体を製造することができる。製造ステップにおける回転数を２０〜１０００ｒｐｍとすることにより、円筒状容器の内面に対して顆粒状のセラミックス粒子を転がすように移動させ、効率的に球状セラミックス粒子を製造することができる。また、播種ステップにおける回転数を０．２５〜１０ｒｐｍとすることにより、細胞懸濁液によって円筒状容器の内面に付着した球状セラミックス粒子を付着状態に維持して細胞懸濁液内に通過させ、効率的に細胞を播種することができる。
【００１４】
さらに、上記発明においては、前記球状セラミックス粒子の量が、前記円筒状容器の円筒内面に球状セラミックス粒子を１層に並べたときに、該円筒内面全体をほぼ覆う量であることが好ましい。
このようにすることで、球状セラミックス粒子が円筒状容器の円筒内面全体をほぼ覆った状態で、細胞懸濁液に連続的に浸漬させることができ、細胞懸濁液内において沈降する傾向にある細胞が効率よく球状セラミックス粒子に播種して、生体組織補填体を効率よく製造することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、顆粒状のセラミックス粒子の角部を削って簡易に球状セラミックス粒子を製造することができ、また、製造された球状セラミックス粒子に細胞を効率的に播種し、内部まで細胞が浸透した生体組織補填体を効率的に製造することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の一実施形態に係る生体組織補填体１の製造方法について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体１の製造方法は、図１に示されるように、球状セラミックス粒子２の製造ステップＳ１と、洗浄ステップＳ２と、前記製造ステップＳ１において製造された球状セラミックス粒子２への細胞の播種ステップＳ３とを備えている。
【００１７】
球状セラミックス粒子２の製造ステップＳ１は、図２および図３に示されるように、平行間隔をあけて配置された２つの略水平なローラ３上に顆粒状のセラミックス粒子４を収容した円筒状容器５を載置し、２つのローラ３を同一方向に回転させることで円筒状容器５を水平な中心軸線６回りに回転させるようになっている。ローラ３の回転数は、約２０〜１００ｒｐｍである。例えば、５０ｍｌの円筒状容器５の場合には、直径が２７ｍｍであるため、その周速が、約２８ｍｍ／ｓ〜１４０ｍｍ／ｓとなるように設定されている。
【００１８】
上記の回転数範囲において円筒状容器５を回転させることにより、図３（ｂ）に示されるように、円筒状容器５内部の顆粒状のセラミックス粒子４を、円筒状容器５の内面に対して転がるように移動させるようになっている。これにより、顆粒どうしまたは円筒状容器５の内面との間での摩擦や衝突によって削られ、図３（ｃ）に示されるように、効率的に球状セラミックス粒子２を得ることができるようになっている。
【００１９】
洗浄ステップＳ２は、上記製造ステップＳ１において形成されたセラミックス粒子２の切削粉を洗い流すステップであって、例えば、純水や生理食塩水等の任意の洗浄液を円筒状容器５内に導入して攪拌した後に円筒状容器５内から流し出すようになっている。これにより、円筒状容器５内に溜まった切削粉や、球状セラミックス粒子２の表面に付着した切削粉を洗い流すことができるようになっている。
【００２０】
播種ステップＳ３は、洗浄ステップＳ２によって洗浄された球状セラミックス粒子２を収容した円筒状容器５内に播種すべき細胞を浮遊させた細胞懸濁液７を導入し、上記ローラ３上において水平な中心軸線６回りに回転させるようになっている。ローラ３の回転数は、約０．２５〜１０ｒｐｍである。例えば、５０ｍｌの円筒状容器５の場合には、その周速が、０．３５ｍｍ／ｓ〜１４ｍｍ／ｓの範囲となるように設定されている。
【００２１】
播種ステップＳ３においては、円筒状容器５内に導入する細胞懸濁液７は、水平状態に配した円筒状容器５内の下側に球状セラミックス粒子２の直径よりも深い最大深さで溜まる程度の量を導入する。例えば、５０ｍｌの円筒状容器５の場合には、約５〜１５ｍｌである。
また、円筒状容器５内の球状セラミックス粒子２の量は、円筒状容器５の内面に球状セラミックス粒子２を並べたときに、１層で内面全体を埋め尽くす程度の量であることが好ましい。例えば、５０ｍｌの円筒状容器５の場合には、３ｇ程度である。
【００２２】
このようにして球状セラミックス粒子２と細胞懸濁液７とを封入した円筒状容器５を略水平状態として中心軸線６回りに回転させると、各球状セラミックス粒子２が細胞懸濁液７の表面張力によって円筒状容器５の内面に付着し、図４の（ｂ）に示されるように、円筒状容器５の回転に伴って移動させられる。円筒状容器５の下部に集まっていた球状セラミックス粒子２は、図４（ｃ）に示されるように、円筒状容器５の回転とともに、順次円筒状容器５の内面に付着していき、最終的に、図４（ｄ）に示されるように、円筒状容器５の内面を全て埋め尽くすように、１層に敷き詰められることになる。
【００２３】
この状態で、さらに円筒状容器５を回転させることにより、円筒状容器５の内面に付着している球状セラミックス粒子２は、回転に伴って順次、円筒状容器５内に貯留している細胞懸濁液７に浸漬されるようになる。円筒状容器５内の細胞懸濁液７は、球形セラミックス粒子２の直径よりも深い最大深さとなる程度に貯留されているので、球形セラミックス粒子２は細胞懸濁液７内に完全に没するように浸漬される。
【００２４】
また、球状セラミックス粒子２は、円筒状容器５の内面に付着した状態で移動するので、細胞懸濁液７の下部を通過させられる。細胞懸濁液７内の細胞は重力の作用によって沈降する傾向にあるので、細胞懸濁液７の下部に多く存在している。したがって、球状セラミックス粒子２が細胞懸濁液７の下部を通過させられることにより、球状セラミックス粒子２は細胞が多く存在する領域を通過して、より多くの細胞を捕らえることができる。
そして、このようにして円筒状容器５を約２４時間にわたって回転させ続けることにより、細胞が球状セラミックス粒子２に効率的に播種されることになる。
【００２５】
このように、本実施形態に係る生体組織補填体１の製造方法によれば、生体組織欠損部等に任意に充填されたときに、周囲の隙間を均一に形成することができる球状セラミックス粒子２に細胞を付着させた生体組織補填体１を簡易に製造することができる。
また、このように構成された生体組織補填体１の製造方法によれば、シャーレ内に細胞懸濁液と生体組織補填材を投入して静置する場合と比較すると、高い播種効率を得ることができた。
【００２６】
なお、本実施形態に係る生体組織補填体１の製造方法においては、製造ステップＳ１と播種ステップＳ３との間に洗浄ステップＳ２を配置したが、洗浄ステップＳ２は必ずしも必要ではない。特に、製造ステップＳ１と播種ステップＳ３とで円筒状容器５を入れ替えることとすれば、洗浄ステップＳ２はなくてもよい。球状セラミックス粒子２の製造時に最適な顆粒状のセラミックス粒子４と、播種を最大効率で行うことができる球状セラミックス粒子２の量とは異なると考えられるので、両ステップＳ１，Ｓ２間で取り扱うセラミックス粒子２，４の量を異ならせることとしてもよい。
【００２７】
また、円筒状容器５としては、球状セラミックス粒子２の製造ステップＳ１においてより効率的に球状セラミックス粒子２を製造することができるように、顆粒状のセラミックス粒子２が転がり回転して球状化するような内面構造を有する円筒状容器を採用してもよい。例えば、内面に突起を有する円筒状容器を採用してもよい。突起としては、例えば、１００μｍ程度の高さを有する突起が好ましい。
また、球状セラミックス粒子２の原料としては、βリン酸三カルシウムの他、ハイドロキシアパタイト等の他の任意のセラミックス粒子を採用してもよい。
また、播種する細胞としては、間葉系幹細胞の他、他の任意の付着性の細胞を採用することにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の生体組織補填体の製造方法における製造ステップを示す斜視図である。
【図３】図２の製造ステップにおけるセラミックス粒子の状態を示す工程図である。
【図４】図１の生体組織補填体の製造方法における播種ステップを示す工程図である。
【符号の説明】
【００２９】
１  生体組織補填体
２  球状セラミックス粒子
４  顆粒状のセラミックス粒子
５  円筒状容器
６  軸線
７  細胞懸濁液
Ｓ１  製造ステップ
Ｓ３  播種ステップ
Ｓ２  洗浄ステップ
【図１】
2006101986.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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