(57)【要約】【課題】    特別な装置を必要とすることなく簡便にプロテアーゼ活性を測定できるプロテアーゼ活性の測定方法及びそのための試薬を提供すること。【解決手段】  被検試料中のプロテアーゼ活性の測定方法は、少なくとも１個のアミノ基を有する着色色素のアミノ基のうち少なくとも１個のアミノ基に、アミノ酸又はオリゴペプチドがアミド結合した着色化合物を、被検試料中のプロテアーゼの基質として用いて酵素反応を行ない、該着色化合物の変色に基づいてプロテアーゼ活性を測定する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個のアミノ基を有する着色色素のアミノ基のうち少なくとも１個のアミノ基に、アミノ酸又はオリゴペプチドがアミド結合した着色化合物を、被検試料中のプロテアーゼの基質として用いて酵素反応を行ない、該着色化合物の変色に基づいてプロテアーゼ活性を測定する、前記被検試料中のプロテアーゼ活性の測定方法。
【請求項２】
前記基質が、少なくとも１個のアミノ基を有する着色色素のアミノ基のうち少なくとも１個のアミノ基に、アミノ酸がアミド結合した着色化合物である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記着色色素がクレジルバイオレット、サフラニンＯ又はメチレンバイオレット3RAXである請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１個のアミノ基を有する着色色素のアミノ基のうち少なくとも１個のアミノ基に、アミノ酸又はオリゴペプチドがアミド結合した着色化合物から成る、プロテアーゼ活性測定用試薬。
【請求項５】
前記基質が、少なくとも１個のアミノ基を有する着色色素のアミノ基のうち少なくとも１個のアミノ基に、アミノ酸がアミド結合した着色化合物である請求項４記載の試薬。
【請求項６】
前記着色色素がクレジルバイオレット、サフラニンＯ又はメチレンバイオレット3RAXである請求項４又は５記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検試料中のプロテアーゼ活性の測定方法及びそのための試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼ活性の測定方法としては、種々の方法が知られており、例えば、酸変性ヘモグロビンを基質とする方法、カゼインの加水分解により生ずる酸可溶性ペプチドを測定する方法、合成ペプチドN-アセチル-L-フェニルアラニル-3, 5-ジヨード-L-チロシン（APDT）を用い遊離されるジイオード-L-チロシンをニンヒドリン法等により定量する方法、合成ペプチドに酵素が作用して生じるペプチドを高速液体クロマトグラフィーによって測定する方法、４メチルクマリルー７アミド（MCA）の合成ペプチド基質を用いる方法、パラニトロフェニルエステル合成ペプチド基質、パラニトロアニリド合成ペプチド基質を用いる方法、加水分解で生じるアンモニアもしくはカルボン酸を定量する方法、コンゴレッド、アゾ、オルセインなどの色素を結合した基質を用いる方法、放射活性を用いる方法、ペプチドチオエステルを用いる方法、ゼラチンフィルム法などが知られている。
【０００３】
【特許文献１】特開平5-192192号公報
【特許文献２】特開2002-159297号公報
【特許文献３】再特WO97/008194
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記の種々の測定方法は、方法が煩雑であるか又は測定のための装置を必要とする。このため、例えば環境中のプロテアーゼ活性を測定しようとする場合等には、測定現場に測定装置を持ち込んだり、その場で煩雑な処理が必要であり、簡便性に欠ける。
【０００５】
従って、本発明の目的は、特別な装置を必要とすることなく簡便にプロテアーゼ活性を測定できるプロテアーゼ活性の測定方法及びそのための試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、少なくとも１個のアミノ基を有する着色色素のアミノ基のうち少なくとも１個のアミノ基に、アミノ酸又はオリゴペプチドがアミド結合した着色化合物にプロテアーゼが作用すると、上記アミド結合が切断され、変色することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、少なくとも１個のアミノ基を有する着色色素のアミノ基のうち少なくとも１個のアミノ基に、アミノ酸又はオリゴペプチドがアミド結合した着色化合物を、被検試料中のプロテアーゼの基質として用いて酵素反応を行ない、該着色化合物の変色に基づいてプロテアーゼ活性を測定する、前記被検試料中のプロテアーゼ活性の測定方法を提供する。また、本発明は、少なくとも１個のアミノ基を有する着色色素のアミノ基のうち少なくとも１個のアミノ基に、アミノ酸又はオリゴペプチドがアミド結合した着色化合物から成る、プロテアーゼ活性測定用試薬を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、肉眼で変色を観察することにより、簡便に、特別な装置を必要とすることなくプロテアーゼ活性を測定することができる、新規なプロテアーゼ活性の測定方法及びそのための試薬が初めて提供された。本発明の方法では、肉眼により、また、変色に基づいてプロテアーゼ活性を測定することができる。変色は、励起光を必要とする蛍光よりも簡便に観察することができ、また、着色（無色のものに色がつく）に比べて微妙な変化でも判別しやすいので有利である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
上記の通り、本発明の方法では、基質として、少なくとも１個のアミノ基を有する着色色素のアミノ基のうち少なくとも１個のアミノ基に、アミノ酸又はオリゴペプチドがアミド結合した着色化合物が用いられる。該着色化合物にプロテアーゼが作用すると、上記アミド結合が切断され、変色することを見出した。ここで、「変色」とは、酵素反応の前後の両方において肉眼で色を見ることができ、かつ、その色が肉眼で見て変化することを意味する。着色色素の好ましい例としては、クレジルバイオレット、サフラニンＯ及びメチレンバイオレット３RAX、ナイルブルーA、ダローレッド、アズレA,アズレC、ブリリアントクレジルブルー、ローダミン１２３、チオニンの様に共役系にアミノ基を有する色素を挙げることができ、特に好ましくは、下記化学構造を有するクレジルバイオレット、サフラニンＯ及びメチレンバイオレット3RAXを挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１０】
【化１】
2006166830.tif 000002
【００１１】
クレジルバイオレットのように、着色色素が複数のアミノ基を有している場合には、そのうちの少なくとも１個がアミド化されていればよい。また、アミド化に供するアミノ酸は、アミノ酸分子１個でもよいし、オリゴペプチド（好ましくはアミノ酸数２〜１０程度）でもよい。アミノ酸又はオリゴペプチドの種類は、プロテアーゼの種類に応じて適宜選択される。例えば、ダニ抗原であるDermatophagoides farinae抽出物またはDermatophagoides pteronyssinus抽出物が有するプロテアーゼ活性の測定には、ロイシン、メチオニン又はリジン分子１個をアミド結合したものが好ましく、特に、クレジルバイオレットの１個又は２個のアミノ基をロイシンとアミド結合したものが好ましい。
【００１２】
着色色素とアミノ酸のアミド結合は、例えば、着色色素分子とアミノ基をBocで保護したアミノ酸を、カルボニルジイミダゾールを縮合剤として用いて、室温で１日塩化メチレン又はDMF中で反応させ、アミド結合を形成させた後、トリフルオロ酢酸を用いて脱保護することにより達成することができ、詳細な方法は下記実施例に記載されている。オリゴペプチドも同様な方法またはF-moc法等の既存のペプチド合成方法に適宜保護基で保護した色素を加えることによりアミド結合することができる。
【００１３】
基質は、溶液の状態で用いることもできるし、基質を支持体に担持して用いることもできる。溶液の場合、溶媒としては水及び水系緩衝液を好ましく用いることができる。支持体としては、担持する基質の量を多くできる多孔性支持体を好ましく用いることができ、多孔性支持体としては、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、シリカゲル等のゲルや、ガラス繊維等から成るろ紙、合成樹脂から成る多孔性フィルム等を挙げることができる。基質溶液を用いる場合、溶液中の基質濃度は、用いる基質の種類や、予測されるプロテアーゼ活性の範囲等に応じて適宜設定されるが、通常、10μM〜50ｍＭ程度、好ましくは100μM〜10 ｍＭ程度程度である。また、基質を支持体に担持させる場合も、用いる基質の種類や、予測されるプロテアーゼ活性の範囲等に応じて適宜設定されるが、支持体表面に塗布する場合は、通常、１cm2当り1 nmol〜100 nmol程度、支持体に含浸させる場合は、通常、0.1μmol-100μmol程度である。
【００１４】
測定は、単に上記基質を被検試料と接触させるだけでよい。そうすると、着色化合物の変色に基づいてプロテアーゼ活性を測定することができる。なお、「測定」には、検出、定量及び半定量が包含される。色の変化の度合いを観察することにより半定量することも可能であり、また、必要に応じ、吸光度測定を行えば定量することも可能である。反応温度は特に限定されず、測定対象であるプロテアーゼがプロテアーゼ活性を発揮できる温度であれば限定されないが、通常、室温で測定するのが簡便で好ましい。また、測定時間も特に限定されず適宜設定できるが、通常、１分間〜２４時間程度である。
【００１５】
本発明の方法に供される試料としては何ら限定されるものではなく、例えば、環境中のアレルゲン（ダニや花粉等）が有するプロテアーゼを含む試料、食品、各種体液等の臨床検体等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１７】
酵素切断により色変わりを起こす基質を合成した。クレジルバイオレット、サフラニンO、メチレンバイオレット3RAXのアミノ基に、以下の方法により、ロイシン、またはメチオニンをアミド結合により結合させた。すなわち、色素分子（終濃度０．１M）とアミノ基をBocで保護したアミノ酸（終濃度０．１M）を、ジメチルアミノピリジン（終濃度０．２M）を触媒として、カルボニルジイミダゾール（終濃度０．１M）を縮合剤として用いて、室温で１日塩化メチレン又はDMF中で反応させ、アミド結合を形成させた。反応後トリフルオロ酢酸（５０％）/塩化メチレン（５０％））を用いて脱保護した。
【００１８】
クレジルバイオレットはアミノ基を２つ有するところ、上記合成より２つのアミノ基のうち両方がアミノ酸とのアミド結合に寄与しているもの（黄色、最大吸収波長：440 nm）またはそのうちの片方のみがアミド結合に寄与しているもの（オレンジ色、490 nm）が単離された。吸収波長はそれぞれプレートリーダー（SPECTRA Max）を用いて測定した。
【００１９】
さらに、これらのロイシンとクレジルバイオレットのアミド結合化合物にアミノペプチダーゼMを加え、アミド結合を切断する実験を行った。すなわちN末端にアミド結合により結合しているアミノ酸を切断する酵素である、アミノペプチダーゼMを適宜PBSで希釈したものを50マイクロリットルと約10 mMにエタノールに溶解した基質を5マイクロリットル加え、３０分放置し、96穴プレートでこれの吸収スペクトルを測定した。その結果一方のアミノ基のみがアミド結合に寄与していた基質は酵素消化により、オレンジ（最大吸収波長：490 nm）から紫（最大吸収波長：590 nm）に吸収スペクトルが変化し、両方のアミノ基がアミド結合に寄与していた化合物は、黄（最大吸収波長：450 nm）から緑、青を経て、紫（最大吸収波長：590 nm）を呈することが示された。質量分析の結果このうち青色を示す物質はクレジルバイオレットにロイシンがひとつ結合したものであることが確認された。また酵素消化により最終的に呈する紫色の吸光スペクトルはクレジルバイオレットそのものの吸光スペクトルと完全に一致し、薄相クロマトグラフィーの結果からも、クレジルバイオレットそのものであることが確認された。クレジルバイオレットにロイシンがひとつ結合した場合に青またはオレンジの２種類の色調を示すのはクレジルバイオレットの分子構造が対称構造ではなく、いずれのアミノ基が関与するかで吸収スペクトルが異なるためである。それぞれの吸光スペクトルを図１に示す。アミノ酸として、ロイシン以外にメチオニン、又はリジンを用いても同様の色調変化がおこることを確認した。
【００２０】
メチレンバイオレット3RAXは、アミノ基を１個有しこれがアミノ酸とのアミド結合に寄与している場合は薄い紫色（最大吸収波長：550 nm及び590 nm）を呈し、これをアミノペプチダーゼMで消化すると、鮮やかな桃色（最大吸収波長：550 nm）を呈した。消化後の吸光スペクトルはメチレンバイオレット3RAXの吸光スペクトルと完全に一致する。メチレンバイオレット3RAXとロイシンのアミド結合体がアミノペプチダーゼMによりスペクトル変化する様子を図２に示す。なお、図２及び後述する図３において、「Apase」はアミノペプチダーゼＭを意味する。
【００２１】
サフラニン-Oとロイシンのアミド結合体はアミノ基を２個有し、これらとロイシンの結合体は赤色を示した。アミノペプチダーゼMで消化することによりオレンジ色の色調を呈した。消化後の吸光スペクトルはサフラニン-Oの吸光スペクトルと完全に一致する。サフラニンＯとロイシンのアミド結合体がアミノペプチダーゼMによりスペクトル変化する様子を図３に示す。
【００２２】
実際にクレジルバイオレットとロイシンのアミド結合物(CV-Leu)がハウスダスト中のダニ抗原量に応じて色変化することを確認した。すなわち、表１に示すa-gの試料について、室内アレルゲン測定用の市販のELISAキットを用い、添付のプロトコールにしたがって、ダニ抗原量をプロテアーゼ活性に基づき定量した（表１）。これらのa-gの試料に上述のCV-Leuを加え、一晩おいたところ、a, bのサンプルについて、紫色の呈色が観察され、ダニ抗原の量が多いことが示された。この結果はELISAの結果と相互している。よって、CV-Leuを基質として用い、その変色によりダニ抗原が有するプロテアーゼ活性を測定できることが明らかになった。
【００２３】
【表１】
2006166830.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】クレジルバイオレットとロイシンのアミド結合体にアミドペプチダーゼＭを作用させた場合の、酵素反応の前後及び中途における、出発物質又は反応混合物の吸光スペクトルである。
【図２】メチレンバイオレットとロイシンのアミド結合体にアミノペプチダーゼMを作用させた場合の、酵素反応の前後における、出発物質又は反応混合物の吸光スペクトルである。
【図３】サフラニン-Oとロイシンのアミド結合体にアミノペプチダーゼMを作用させた場合の、酵素反応の前後における出発物質又は反応混合物の吸光スペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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