(57)【要約】  【課題】    酸化体をほとんど生じないインターロイキン−２（ＩＬ−２）組成物を製造する。  【解決手段】      メチオニン、エデト酸ナトリウムおよびチオグリコール酸ナトリウムからなる群から選択  される１または２以上の安定化剤、糖および／または糖アルコールおよびアミノ酸を含有する  ことによって、経時保存しても酸化体がほとんど生じず、しかもＩＬ−２の含量がほとんど低  下しないＩＬ−２組成物を製造することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチオニン、エデト酸ナトリウムおよびチオグリコール酸ナトリウムからなる群から選択される１または２以上の安定化剤を含有することを特徴とする、インターロイキン−２、糖および／または糖アルコールおよびアミノ酸を含有する医薬組成物。
【請求項２】
温血動物由来の血清アルブミンを含有しない請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
更に酸および／または塩基を含有する請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
更に界面活性剤を含有する請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
糖および／または糖アルコールがマルトースおよび／またはスクロースである請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
糖および／または糖アルコールがスクロースである請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
アミノ酸がアルギニンである請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
安定化剤がメチオニンおよび／またはチオグリコール酸ナトリウムである請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
組成物中のＩＬ−２に対するメチオニンの配合割合が重量比で２．５〜２５倍である請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
組成物中のＩＬ−２に対するチオグリコール酸ナトリウムの配合割合が重量比で１０〜２３０倍である請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１１】
凍結乾燥品である請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
メチオニン、エデト酸ナトリウムおよびチオグリコール酸ナトリウムからなる群から選択される１または２以上の安定化剤と、インターロイキン−２、糖および／または糖アルコール、およびアミノ酸を混合することを特徴とする、医薬組成物の製造方法。
【請求項１３】
安定化剤がメチオニンおよび／またはチオグリコール酸ナトリウムである、請求項１２記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項１４】
メチオニン、エデト酸ナトリウムおよびチオグリコール酸ナトリウムからなる群から選択される１または２以上の安定化剤を含有させることを特徴とする、インターロイキン−２、糖および／または糖アルコール、およびアミノ酸を含有する医薬組成物中のインターロイキン−２を安定化する方法。
【請求項１５】
安定化剤がメチオニンおよび／またはチオグリコール酸ナトリウムである、請求項１４記載のインターロイキン−２を安定化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定なインターロイキン−２組成物、詳しくはインターロイキン−２の酸化を防止するためのインターロイキン−２組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−２（以下、「ＩＬ−２」と略す）は、Ｔ細胞やナチュラルキラー細胞を増殖させる生理活性を有するタンパク質であり、種々の癌、特に血管肉腫や腎癌、また免疫不全の治療薬として、また、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療薬として大きな期待が寄せられている。
ＩＬ−２は、通常の保存状態では不安定な物質であるために、種々の安定化方法が試みられている。例えば、安定化剤としてヒト血清アルブミン（以下、「ＨＳＡ」と略す）を配合したＩＬ−２を含む溶液に、塩基および酸を加え、中性とすることによりＩＬ−２の組成物を得ているもの（例えば、特許文献１参照）や還元物質さらにはＨＳＡを配合することによってＩＬ−２組成物を得ているものがある（例えば、特許文献２参照）。しかしながら、上記特許文献１および特許文献２に安定化剤として開示されているＨＳＡ等の温熱動物由来の血清アルブミンは、最近、ウイルス感染や狂牛病などの危険性が指摘されており、このような特定生物由来製品は製剤処方に含まれないことが望まれている。そこで、ＨＳＡを含まない処方が種々検討されており、その一つとして、ＨＳＡを配合せず、アミノ酸としてアルギニン、糖または糖アルコールとしてマルトースまたはスクロースを配合することによって、ＩＬ−２を安定化した組成物が知られている（例えば、特許文献３参照）。
【０００３】
【特許文献１】特開昭６２−１６４６３１号公報
【特許文献２】特開昭６０−２１５６３１号公報
【特許文献３】国際公開第２００４／０２８５５７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献３のＩＬ−２組成物の場合、ＨＳＡを配合しなくても、ＩＬ−２の含量は、経時安定性試験においてほとんど低下しなかったにも関わらず、ＩＬ−２の酸化体（Met105酸化体［以下、「酸化体」と略す］）が発生し、その後試験期間が長くなるにつれ、酸化体の量が増大した。ＩＬ−２の酸化体は、未酸化体と同様の生物学的活性を有するが、蛋白鎖中のアミノ酸残基の酸化に伴う立体構造の微細な変化が、物性、毒性等に影響をおよぼす可能性も考えられる。このように、ＩＬ−２組成物として、長期保存してもＩＬ−２の含量はほとんど低下せず、しかも酸化体がほとんど生じないＩＬ−２組成物が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記事情に鑑み、本発明者らは、ある種の安定化剤、すなわちメチオニン、エデト酸ナトリウムおよびチオグリコール酸ナトリウムから選択される１または２以上の安定化剤を含有することを特徴とする、ＩＬ−２、糖および／または糖アルコールおよびアミノ酸を含有する組成物であれば、長期保存してもＩＬ−２の酸化体がほとんど生じず、しかもＩＬ−２の含量がほとんど低下しないＩＬ−２組成物を見出し、以下に示す本発明を完成した。
（１）メチオニン、エデト酸ナトリウムおよびチオグリコール酸ナトリウムからなる群から選択される１または２以上の安定化剤を含有することを特徴とする、インターロイキン−２、糖および／または糖アルコール、およびアミノ酸を含有する医薬組成物。
（２）温血動物由来の血清アルブミンを含有しない上記（１）記載の医薬組成物。
（３）更に酸および／または塩基を含有する上記（１）または（２）記載の医薬組成物。
（４）更に界面活性剤を含有する上記（１）から（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）糖および／または糖アルコールがマルトースおよび／またはスクロースである上記（１）から（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）糖および／または糖アルコールがスクロースである上記（１）から（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（７）アミノ酸がアルギニンである上記（１）から（６）のいずれかに記載の医薬組成物。
（８）安定化剤がメチオニンおよび／またはチオグリコール酸ナトリウムである上記（１）から（７）のいずれかに記載の医薬組成物。
（９）組成物中のＩＬ−２に対するメチオニンの配合割合が重量比で２．５〜２５倍である上記（８）記載の医薬組成物。
（１０）組成物中のＩＬ−２に対するチオグリコール酸ナトリウムの配合割合が重量比で１０〜２３０倍である上記（８）記載の医薬組成物。
（１１）凍結乾燥品である上記（１）から（１０）のいずれかに記載の組成物。
（１２）メチオニン、エデト酸ナトリウムおよびチオグリコール酸ナトリウムからなる群から選択される１または２以上の安定化剤と、インターロイキン−２、糖および／または糖アルコール、およびアミノ酸を混合することを特徴とする、医薬組成物の製造方法。
（１３）安定化剤がメチオニンおよび／またはチオグリコール酸ナトリウムである、上記（１２）記載の医薬組成物の製造方法。
（１４）メチオニン、エデト酸ナトリウムおよびチオグリコール酸ナトリウムからなる群から選択される１または２以上の安定化剤を含有させることを特徴とする、インターロイキン−２、糖および／または糖アルコール、およびアミノ酸を含有する医薬組成物中のインターロイキン−２を安定化する方法。
（１５）安定化剤がメチオニンおよび／またはチオグリコール酸ナトリウムである、上記（１４）記載のインターロイキン−２を安定化する方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のＩＬ−２組成物は、ＩＬ−２および下記の添加物を溶解した溶液（例：注射剤）として用いることができるが、該溶液の液媒体を乾燥し、固形剤（例：凍結乾燥製剤）とする場合もある。本発明の組成物を長期保存しても、ＩＬ−２の含量がほとんど低下せず、しかもＩＬ−２酸化体の量はほとんど増加しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において、安定化剤としては、メチオニン、エデト酸ナトリウムおよびチオグリコール酸ナトリウムからなる群から選択される１または２以上の安定化剤を添加すればよく、好ましくはメチオニン、チオグリコール酸ナトリウムである。
【０００８】
本発明の組成物の溶液１ｍＬ中に安定化剤は、メチオニンの場合、固形成分全量に対し０．００１〜５重量％、好ましくは０．００５〜２．５重量％、より好ましくは０．０１〜１重量％、ＩＬ−２に対するメチオニンの配合割合は重量比で０．１〜１００倍、好ましくは１〜５０倍、より好ましくは２．５〜２５倍である。また他の安定化剤の場合、
固形成分全量に対し０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜７．５重量％、より好ましくは１．０〜５．０重量％、ＩＬ−２に対する安定化剤の配合割合は重量比で１〜２５０倍、好ましくは５〜２４０倍、より好ましくは１０〜２３０倍である。安定化剤の含量は、前記配合量よりも少なければ、ＩＬ−２の酸化体の量を十分に低減できない可能性がある。前記配合量よりも多ければ、溶液中に安定化剤が完全に溶解しない恐れや使用時に添加剤の過剰な投与による副作用の懸念がある。
【０００９】
本発明では、天然由来または遺伝子組換えＩＬ−２の全てを用いることができるが、特に遺伝子組換えヒトＩＬ−２が好ましい。
本発明の組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中にＩＬ−２は、０．１〜５００μｇ、好ましくは０．５〜２５０μｇ、より好ましくは１〜１００μｇ配合すればよい。また、本発明の組成物を固形剤として使用する場合、固形剤全量に対しＩＬ−２は、０．００１〜５重量％、好ましくは０．００５〜２．５重量％、より好ましくは０．０１〜１重量％配合すればよい。ＩＬ−２含量が前記配合量よりも少なければ、投与液量が増え患者に負担をかける、あるいは投与方法に制限を受ける可能性があり、多量のＩＬ−２組成物を投与しなければ、薬効が生じない可能性がある。前記配合量よりも多ければ、溶液中にＩＬ−２が完全に溶解しない恐れがある。
【００１０】
本発明において、糖および／または糖アルコールは、単糖類、二糖類、多糖類あるいは水溶性グルカン類を意味し、生理的に許容されるものであれば使用できる。糖および／または糖アルコールは、ＩＬ−２の安定化のために添加されるが、溶解補助剤、賦形剤あるいは等張化剤としても添加されうる。糖として、具体的にはグルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、フルクトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、カルボキシメチルセルロース−Ｎａ等が挙げられる。また、糖アルコールとしてはＣ４〜Ｃ８の糖アルコールが好ましく、具体的には、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ズルシトール、キシリトール、アラビトール、ラフィノース、エリスリトール、マルチトール、ラクチトール、パラチニット、トレハロース等が挙げられる。前記糖および／または糖アルコールの中で、好ましくはマルトース、マンニトール、ラクトース、スクロースおよびソルビトール等であり、さらに好ましくはマルトース、マンニトール、ラクトースおよびスクロース等であり、特に好ましくはマルトース、スクロース等である。
【００１１】
前記の糖および／または糖アルコールは、単独または混合物で用いることができる。配合量は特に限定されるものではなく、組成物の溶液に溶解可能でＩＬ−２の安定性を高める量であればよい。ＩＬ−２に対する糖および／または糖アルコールの配合割合は重量比で１〜１００００倍、好ましくは５〜５０００倍、より好ましくは２０〜４０００倍であればよい。また、本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に糖および／または糖アルコールを５〜５００ｍｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇ、より好ましくは２０〜２００ｍｇ添加すればよい。前記配合量よりも少なければ、ＩＬ−２を安定化することができない恐れがあり、多ければ、組成物全量に対するＩＬ−２含量が相対的に低下し、多量のＩＬ−２組成物を投与しなければ、薬効が生じない可能性がある。
【００１２】
本発明において、アミノ酸は、ＩＬ−２の安定化のために添加されうるが、賦形剤としても添加されうる。アミノ酸とは、分子内にアミノ基とカルボキシル基とをもつ化合物を意味するが、プロリンおよびヒドロキシプロリンのようなイミノ酸も含まれ、生理的に許容されるものであれば使用できる。アミノ酸としては、中性アミノ酸、酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸が挙げられる。具体的には中性アミノ酸として、グリシン、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、ジヨードチロシン、スルナミン、トレオニン、セリン、プロリン、ヒドロキシプロリン、トリプトファン、チロキシン、メチオニン、シスチン、システイン、α―アミノ酪酸等が挙げられる。酸性アミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン等が挙げられる。塩基性アミノ酸としては、リジン、塩酸リジン、アルギニン、ヒスチジン、ヒドロキシリジン等が挙げられる。前記アミノ酸のうち、好ましくはアラニン、塩酸リジン、アルギニンであり、特に好ましくはアルギニンである。
【００１３】
前記のアミノ酸は、単独または混合物で用いることができる。添加量は特に限定されるものではなく、組成物の溶液に溶解可能でＩＬ−２の安定性を高める量であればよい。ＩＬ−２に対するアミノ酸の配合割合は重量比で１〜５０００倍、好ましくは１０〜２５００倍、より好ましくは２０〜２０００倍であればよい。また、本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中にアミノ酸を０．１〜２５０ｍｇ、好ましくは０．５〜１２５ｍｇ、より好ましくは１〜１００ｍｇ添加すればよい。前記添加量よりも少なければ、ＩＬ−２を安定化できない恐れがあり、多ければ、組成物全量に対するＩＬ−２含量が相対的に低下し、多量のＩＬ−２組成物を投与しなければ、薬効が生じない可能性がある。
【００１４】
本発明組成物は、前記したように、糖および／または糖アルコール、ならびにアミノ酸を配合しているために、固体状態でも液体状態でもメイラード反応を生じる場合がある。メイラード反応とは、アミノ酸、ペプチド、タンパク質のアミノ基とケトン、アルデヒド、特に還元糖が反応して褐色色素を生成するものである。しかし、本発明の組成物においては、特に糖および／または糖アルコールがマルトース、マンニトール、ラクトース、スクロース、好ましくはマルトース、スクロースであり、アミノ酸がアラニン、塩酸リジン、アルギニン、好ましくはアルギニンとの組合せの場合には、例えば４０℃で３０日間程度、該組成物を保存してもメイラード反応は生じる恐れが少なく、ＩＬ−２の含量が低減する可能性も少ない。
【００１５】
上記、糖および／または糖アルコールとアミノ酸の含量の比率は、糖および／または糖アルコールに対し、重量比でアミノ酸が０．０１〜４倍、好ましくは０．０２５〜３倍、より好ましくは０．０５〜２倍である。なお、タンパク質製剤の場合、添加物が同じでも主薬であるタンパク質が異なれば、メイラード反応の有無も異なるので、メイラード反応を生じないようにするためには、主薬であるタンパク質の種類によって、製剤中の添加物の種類、量等を検討する必要がある。
【００１６】
本発明において、酸としては、生理的に許容される酸を用いることができる。例えば、酢酸、乳酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン等の有機酸や、塩酸、リン酸等の無機酸が挙げられ、単独でも、２種以上の混合物で用いてもよく、好ましくはクエン酸、酒石酸である。また、これらの薬理学的に許容される塩であってもよい。酸の添加量は用いる酸の種類によっても異なるが、所望のｐＨに調整できる必要量を添加すればよい。一般的には、ＩＬ−２に対する酸の配合割合は重量比で５〜２０００倍、好ましくは１０〜１０００倍、より好ましくは２５〜５００倍であればよい。本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に酸を０．２５〜５０ｍｇ、好ましくは０．５〜２０ｍｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ添加すればよい。また、前記量よりも少なければｐＨは塩基性となり、また多ければｐＨが酸性となり、いずれの状態でもＩＬ−２を安定化できない恐れがある。
なお、有機酸のうち、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンは、構成成分中の酸であると同時にアミノ酸でもありうる。
【００１７】
本発明において、塩基としては、生理的に許容される塩基を全て用いることができる。例えば、Ｎ−メチルグルカミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミン等のアルコールアミン、モノ、ジまたはトリエチルアミン等のアルキルアミン、アルギニン、リジン、塩酸リジン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸、ならびに炭酸ナトリウム等の無機塩基等が用いられ、これらは単独でも、２種以上の混合物で用いてもよい。炭酸ナトリウム等の無機塩基を用いる際には、上記アミン等との併用が好ましい。好ましい塩基としては、Ｎ−メチルグルカミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、アルギニンであり、より好ましくは、ジエタノールアミン、アルギニンである。前記塩基は、単独でも、２種以上の混合物で用いてもよい。塩基の添加量は用いる塩基の種類によっても異なるが、所望のｐＨに調整できる必要量を添加すればよい。一般的には、ＩＬ−２に対する塩基の配合割合は重量比で１０〜５０００倍、好ましくは２５〜２５００倍、より好ましくは５０〜２０００倍であればよい。本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に酸を０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．２５〜１００ｍｇ、より好ましくは１〜５０ｍｇ添加すればよい。また、本発明組成物を固形剤として使用する場合、前記量よりも少なければ、溶液のｐＨが酸性となり、また多ければ、溶液のｐＨが塩基性となり、いずれの状態でもＩＬ−２を安定化できない恐れがある。
なお、塩基性アミノ酸であるアルギニン、リジン、塩酸リジン、ヒスチジン等は、構成成分の塩基であると同時にアミノ酸でもありうる。
【００１８】
本発明において、更に界面活性剤を添加することも可能である。界面活性剤としては、生理的に許容される界面活性剤であればよく、該界面活性剤の添加により、固形剤調製における乾燥前の組成物溶液調製時または固形剤を蒸留水に再溶解する時のＩＬ−２の溶解性改善ならびに、組成物溶液の液媒体を乾燥した時におけるＩＬ−２の安定性を向上（特に乾燥時におけるＩＬ−２の容器壁面の吸着を防止して、組成物中のＩＬ−２含量の低下を抑制する）するなどの効果が得られる。界面活性剤として、組成物の溶液に溶解または懸濁でき、ＩＬ−２の安定性を高めるものであればよいが、好ましくは非イオン性界面活性剤であり、具体的にはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等が挙げられる。ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油として具体的には、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油２０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０等がある。ポリエチレングリコールとして具体的には、マクロゴール２００、マクロゴール３００、マクロゴール４００、マクロゴール６００、マクロゴール１０００、マクロゴール１５００、マクロゴール１５４０、マクロゴール２０００、マクロゴール４０００、マクロゴール６０００、マクロゴール２００００等がある。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールとして具体的には、ポリオキシエチレン（１０５）ポリオキシプロピレン（５）グリコール、ポリオキシエチレン（１２０）ポリオキシプロピレン（４０）グリコール［プルロニックＦ８７］、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール［プルロニックＦ６８］、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール［プルロニックＰ１２３］、ポリオキシエチレン（５４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール［プルロニックＦ８５］、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール［プルロニックＦ１２７］、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（２０）グリコール［プルロニックＬ４４］等がある。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとして具体的には、ポリソルベート２０［Ｔｗｅｅｎ２０］、ポリソルベート４０［Ｔｗｅｅｎ４０］、ポリソルベート６０［Ｔｗｅｅｎ６０］、ポリソルベート６５［Ｔｗｅｅｎ６５］、ポリソルベート８０［Ｔｗｅｅｎ８０］等がある。より好ましくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、特に好ましくはポリソルベート８０［Ｔｗｅｅｎ８０］である。
【００１９】
界面活性剤の配合量は用いる界面活性剤の種類によっても異なるが、ＩＬ−２に対する界面活性剤の配合割合は重量比で１〜３００倍、好ましくは２．５〜２５０倍、より好ましくは５〜２００倍であればよい。本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ〜１５ｍｇ、好ましくは０．０７５ｍｇ〜７．５ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜４ｍｇを添加すればよい。また、本発明組成物を固形剤として使用する場合、前記添加量よりも少なければ、ＩＬ−２の溶解性が改善せず、またＩＬ−２の安定性低下やバイアル、調製時の器具等への吸着によるＩＬ−２含量低下の恐れがあり、逆に多ければ、調製の際、泡立ちにより組成物溶液の調製が困難となり、凍結乾燥物が調製できない（ポリソルベート80〔室温下で液体〕）、あるいは、酸化体の生成が促進される可能性がある。
【００２０】
本発明では、固形剤調製における乾燥前の組成物溶液製造時または固形剤を蒸留水に再溶解する時のｐＨ変動を最小限にするために緩衝剤を用いることが好ましい。緩衝剤としては、生理的に許容される緩衝剤であればよく、例えば、リン酸系またはクエン酸系の緩衝剤が挙げられる。
【００２１】
緩衝剤の添加量は用いる緩衝剤の種類によっても異なるが、所望のｐＨ、すなわち、組成物の溶液のｐＨを６．１〜９に保持するのに必要な量を用いればよい。具体的には、ＩＬ−２に対する緩衝剤の配合割合は重量比で２０〜２０００倍、好ましくは５０〜１５００倍、より好ましくは１００〜１０００倍であればよい。本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に緩衝剤を１〜１００ｍｇ、好ましくは２．５〜７５ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇ添加すればよい。前記量よりも少なければ、組成物溶液製造時または固形剤を蒸留水に再溶解する時のｐＨ変動が大きくなり、多ければ、組成物全量に対するＩＬ−２含量が相対的に低下し、多量のＩＬ−２組成物を投与しなければ、薬効が生じない可能性がある。
【００２２】
本発明の製剤は、製剤の形態に応じ、製剤学上許容される添加物を含有しうる。例えば、注射剤の場合、フェノール、クレゾール等の保存剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール等の無痛化剤、塩化ナトリウム、グリセリン等の等張化剤を添加してもよい。
温血動物由来の血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ブタ血清アルブミン等を配合した場合、ウイルス感染や狂牛病などの危険性を生じる可能性があるが、アルブミンであっても遺伝子組換えアルブミンであれば、上記副作用を生じる可能性が低く、組成物の添加剤として配合する場合もありうる。遺伝子組換えアルブミンの添加は、ＩＬ−２の安定性低下の防止に有用である。ＩＬ−２に対する遺伝子組換えアルブミンの配合割合は、重量比で１〜１０００倍、好ましくは２．５〜５００倍、より好ましくは５〜２５０倍であればよい。本発明組成物を溶液として使用する場合、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．２５ｍｇ〜５０ｍｇ、より好ましくは０．５ｍｇ〜２５ｍｇを添加すればよい。
【００２３】
本発明の組成物は、少なくともＩＬ−２、安定化剤、糖および／または糖アルコール、アミノ酸、酸ならびに塩基、要すれば界面活性剤、またｐＨの調節のために緩衝剤等の配合成分を含む。
【００２４】
安定化剤としてメチオニンを使用する場合、これら組成物の配合成分の好ましい組合せとして、１）ＩＬ−２、メチオニン、マルトース、アルギニン、クエン酸、要すればポリソルベート８０およびリン酸緩衝液、２）ＩＬ−２、メチオニン、スクロース、アルギニン、クエン酸、要すればポリソルベート８０およびリン酸緩衝液の組合せの組成物である。特に、糖または糖アルコールとして、スクロースを用いた場合、ＩＬ−２の酸化体量を低減することができる。これら好ましい組合せの配合成分の配合量について、メチオニンは、固形成分全量に対し０．００１〜５重量％、好ましくは０．００５〜２．５重量％、より好ましくは０．０１〜１重量％、ＩＬ−２に対するメチオニンの配合割合は重量比で０．１〜１００倍、好ましくは１〜５０倍、より好ましくは２．５〜２５倍である。安定化剤の含量は、前記配合量よりも少なければ、ＩＬ−２の酸化体の量を十分に低減できない可能性がある。前記配合量よりも多ければ、溶液中に安定化剤が完全に溶解しない恐れ、あるいは使用時に安定化剤の過剰投与による副作用の懸念がある。ＩＬ−２に対するマルトースまたはスクロースの配合割合は重量比で１〜１００００倍、好ましくは５〜５０００倍、より好ましくは２０〜４０００倍、ＩＬ−２に対するアルギニンの配合割合は重量比で１〜５０００倍、好ましくは１０〜２５００倍、より好ましくは２０〜２０００倍、ＩＬ−２に対するクエン酸の配合割合は重量比で５〜２０００倍、好ましくは１０〜１０００倍、より好ましくは２５〜５００倍、ＩＬ−２に対するポリソルベート８０の配合割合は、重量比で１〜３００倍、好ましくは２．５〜２５０倍、より好ましくは５〜２００倍、リン酸緩衝剤を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的にはＩＬ−２に対する緩衝剤の配合割合は、重量比で２０〜２０００倍、好ましくは５０〜１５００倍、より好ましくは１００〜１０００倍であればよい。本発明の組成物を溶液として使用する場合、ＩＬ−２は、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜５００μｇ、好ましくは０．５〜２５０μｇ、より好ましくは１〜１００μｇ、マルトースまたはスクロースは、組成物の溶液１ｍＬ中に５〜５００ｍｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇ、より好ましくは２０〜２００ｍｇ、アルギニンは、組成物の溶液１ｍＬ中に０．１〜２５０ｍｇ、好ましくは０．５〜１２５ｍｇ、より好ましくは１〜１００ｍｇ、クエン酸は、組成物の溶液１ｍＬ中に０．２５〜５０ｍｇ、好ましくは、０．５〜２０ｍｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ、ポリソルベート８０を添加するならば、組成物の溶液１ｍＬ中に０．０５ｍｇ〜１５ｍｇ、好ましくは０．０７５ｍｇ〜７．５ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜４ｍｇ、リン酸緩衝剤を添加するならば、ｐＨ６．１〜９に保持するのに必要な配合割合で添加すればよいが、具体的には組成物の溶液１ｍＬ中に１〜１００ｍｇ、好ましくは２．５〜７５ｍｇ、より好ましくは５〜５０ｍｇ添加すればよい。本発明の組成物を固形剤として使用する場合、また、マルトースとアルギニン、およびスクロースとアルギニンとの含量の比率は、マルトースまたはスクロースに対し、重量比でアルギニンが０．０１〜４倍、好ましくは０．０５〜３倍、より好ましくは０．１〜２倍である。
【００２５】
安定化剤としてエデト酸ナトリウムを使用する場合、これら組成物の配合成分の好ましい組合せとして、１）ＩＬ−２、エデト酸ナトリウム、マルトース、アルギニン、クエン酸、要すればポリソルベート８０およびリン酸緩衝液、２）ＩＬ−２、エデト酸ナトリウム、スクロース、アルギニン、クエン酸、要すればポリソルベート８０およびリン酸緩衝液の組合せの組成物である。特に、糖または糖アルコールとして、スクロースを用いた場合、ＩＬ−２の酸化体量を低減することができる。これら好ましい組合せの配合成分の配合量について、エデト酸ナトリウムは、固形成分全量に対し０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜７．５重量％、より好ましくは１．０〜５．０重量％、ＩＬ−２に対するエデト酸ナトリウムの配合割合は重量比で１〜２５０倍、好ましくは５〜２４０倍、より好ましくは１０〜２３０倍である。他の添加物のＩＬ−２に対する配合割合は、上記と同様である。安定化剤の含量は、前記配合量よりも少なければ、ＩＬ−２の酸化体の量を十分に低減できない可能性がある。前記配合量よりも多ければ、溶液中に安定化剤が完全に溶解しない恐れ、あるいは使用時に安定化剤の過剰投与による副作用の懸念がある。
【００２６】
安定化剤としてチオグリコール酸ナトリウムを使用する場合、これら組成物の配合成分の好ましい組合せとして、１）ＩＬ−２、チオグリコール酸ナトリウム、マルトース、アルギニン、クエン酸、要すればポリソルベート８０およびリン酸緩衝液、２）ＩＬ−２、チオグリコール酸ナトリウム、スクロース、アルギニン、クエン酸、要すればポリソルベート８０およびリン酸緩衝液の組合せの組成物である。これら好ましい組合せの配合成分の配合量について、チオグリコール酸ナトリウムは、固形成分全量に対し０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜７．５重量％、より好ましくは１．０〜５．０重量％、ＩＬ−２に対するチオグリコール酸ナトリウムの配合割合は重量比で１〜２５０倍、好ましくは５〜２４０倍、より好ましくは１０〜２３０倍である。他の添加物のＩＬ−２に対する配合割合は、上記と同様である。安定化剤の含量は、前記配合量よりも少なければ、ＩＬ−２の酸化体の量を十分に低減できない可能性がある。前記配合量よりも多ければ、溶液中に安定化剤が完全に溶解しない恐れ、あるいは使用時に安定化剤の過剰投与による副作用の懸念がある。
【００２７】
本発明溶液から固形剤を製造する際の溶液の乾燥法としては、組成物溶液の液媒体を乾燥しさえすればよいが、好ましくは凍結乾燥法、噴霧乾燥法、より好ましくは凍結乾燥法がある。凍結乾燥法によって固形状にした凍結乾燥品は、ＩＬ−２のようなタンパク質を含む製剤の場合、熱等のストレスがかからず、安定なタンパク質製剤を製造することができる。
【００２８】
組成物溶液のｐＨを約６以上に調節すれば、ＩＬ−２は安定に保たれ、かつ液媒体の乾燥操作中及び固形状製剤の再溶解時における液性も透明に保たれうる。従って、本発明目的のためには、特にｐＨの上限はないが、好ましくは最終的なｐＨ調節は溶液状態でｐＨ６．１〜９である。本発明組成物を注射剤として用いる場合には、該組成物を生理的なｐＨ領域付近に調整することが好ましく、この場合には最終的なｐＨ領域をｐＨ６．１〜８、さらに好ましくはｐＨ６．５〜７．５にすればよい。前記下限のｐＨよりも酸性側では、再溶解時の液状を透明に保つことが困難である恐れがあり、上限のｐＨよりも塩基性側では、組成物の安定性および溶液の透明性は満足されても、皮膚や血管等への刺激性が増す可能性があり、必ずしも好ましいものではない。
【００２９】
本発明において、長期保存してＩＬ−２の酸化体が増大した理由は必ずしも明らかではないが、ＩＬ−２のメチオニン残基が酸化された可能性が高い。本発明組成物において、安定化剤としてメチオニン、エデト酸ナトリウム、チオグリコール酸ナトリウムを配合すれば、ＩＬ−２の酸化体の増加を抑制でき、しかもＩＬ−２の含量もほとんど低下しない。その他の安定化剤であれば、酸化体の増加は抑制できない可能性が高く、または二量体の生成等により、ＩＬ−２の含量が低下する恐れがある。
【００３０】
本発明組成物の製法は、特に限定されないが、好ましくは以下のような方法で製造する。糖および／または糖アルコールならびに安定化剤であるアミノ酸の必要量を蒸留水に溶解した溶液に、ＩＬ−２原液および要すれば更に界面活性剤の適当量を加える。次いで塩基の適当量（アミノ酸として、塩基性アミノ酸を添加した場合、塩基を添加しない場合がある）を添加してｐＨ約８〜１１、好ましくはｐＨ約９〜１１、さらに好ましくはｐＨ約９．５〜１０．５とし、緩衝液を加えた後、速やかに酸を加えてｐＨ約７〜７．７とする。残りの蒸留水を加えて液量を調節し、組成物の溶液を製造後、無菌濾過、容器へ分注、次いで凍結乾燥させる。また、別法として、糖および／または糖アルコールならびに安定化剤あるアミノ酸の必要量を蒸留水に溶解した溶液に、ＩＬ−２および要すれば更に界面活性剤の適当量を加える。次いで酸の適当量（アミノ酸として、酸性アミノ酸を添加した場合、酸を添加しない場合がある）を添加して、一旦ｐＨ約２〜６、好ましくはｐＨ約２〜４、さらに好ましくはｐＨ約２〜３とし、緩衝液を加えた後、速やかに塩基を加えてｐＨ約７〜７．７とし、以下上記と同様の方法で組成物を製造する。該製造法のうち、ＩＬ−２の安定性の面から、前者の製造方法が好ましい。凍結乾燥は、上記調製した組成物の溶液を約−６０℃〜約−１０℃、好ましくは約−５０℃〜約−４０℃で急速凍結した後、要すれば、昇華熱を供給しながら、好ましくは４８〜７２時間、−５℃で１〜１００Paに保って所定含水量になるまで水分を昇華、除去し、要すれば窒素など不活性気体または乾燥空気を充填して、密栓する。
上記製造法中、塩基または酸を添加して所要のｐＨとした後、「速やかに」酸または塩基を添加しｐＨを約７〜７．７とするが、この「速やかに」酸または塩基を添加しはじめ、ｐＨを約７〜７．７とするまでの時間は、組成物の製造量によっても異なるが、約６０分間、好ましくは約４５分間、より好ましくは約３０分間以内であればよい。
【００３１】
本発明組成物は、ＩＬ−２、上記安定化剤、糖および／または糖アルコール、アミノ酸ならびに酸および塩基の成分を配合し、さらに要すれば界面活性剤や緩衝剤等を配合することによって、ＩＬ−２を長期間、例えば４０℃約２ヶ月間程度にわたって保存しても、ＩＬ−２の酸化体の増加を抑制することができた。
【００３２】
本発明組成物の使用方法は特に限定されるものではないが、非経口的に用いることが好ましい。注射剤として用いる際には、凍結乾燥された該組成物を注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖液、適当な点滴用輸液等に用時溶解して静脈内、筋肉内、皮下または皮内に投与する。また、本組成物に適当な担体、賦形剤等を加えて口、鼻、耳腔内投与等の局所投与製剤としてもよい。投与量としては、例えば血管肉腫の場合は成人に対してＩＬ−２として一日あたり、７０万〜１４０万JRU（国内標準単位）、腎癌を適用症とした場合は、成人に対してＩＬ−２として一日あたり、７０万〜２１０万ＪRＵ（国内標準単位）が一般的である。
【実施例１】
【００３３】
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、これは単に例示であって、本発明を制限するものではない。以下に示す製造方法に準じて、組成物を製造した。
（実施例１製剤の製造方法）
安定化剤としては、エデト酸ナトリウム、糖または糖アルコールとしては、マルトース、アミノ酸としては、アルギニンを用いた。界面活性剤としてはポリソルベート８０、酸としてはクエン酸、緩衝液としてはリン酸緩衝液を用いた。
試製を行う処方を表１に示す。また、表１中の各溶液の上からの順番は試製の際に添加混合する順番である。最終の溶液のｐＨを７．４に調整することを考慮して、酸性の抗酸化剤はクエン酸添加前に添加することとした。
参考例１
【００３４】
安定化剤を配合しないこと以外は、実施例１と同様である。
参考例２
【００３５】
安定化剤としてエデト酸ナトリウムのかわりに塩酸システインを配合すること以外は、実施例１と同様である。
参考例３
【００３６】
安定化剤としてエデト酸ナトリウムのかわりにアスコルビン酸を配合すること以外は、実施例１と同様である。
【００３７】
【表１】
2006137678.tif 000002
【００３８】
（試験方法）
調製した溶液を調製直後に、下記の条件でＨＰＬＣ分析をおこない、酸化体の量を測定した。
含量測定（ＨＰＬＣ）条件
装置        ： Waters 2690  Alliance
カラム      ： コスモジル 5C18-300 ４．６f×１５０ｍｍ
カラム温度  ： ３０°C
移動相      ： A液 ０．１%ＴＦＡ（トリフロロ酢酸）−水／アセトニトリル                        (９５／５)、B液０．０７%ＴＦＡ−アセトニトリルを用いて、表                      ２に示すグラジェント法を実施。
流速        ： １．０ｍＬ／分
注入量      ： １００  μL
サンプル温度： ５°C 
検出波長     ： ２２０ｎｍ
測定時間     ： ６０分
【００３９】
【表２】
2006137678.tif 000003
解析          ： Waters ミレニアム
測定対象       ： ＩＬ−２および酸化体
酸化体の含量は、以下の式で算出した。
【数１】
2006137678.tif 000004
また、無添加製剤と安定化剤を添加した製剤との酸化体の量比は、以下の式で算出した。
【数２】
2006137678.tif 000005
（試験結果）
表３に酸化体の量、無添加の酸化体に対する安定化剤を添加した場合の酸化体の量比および溶液外観の変化を示した。その結果、安定化剤として、塩酸システインおよびアスコルビン酸を使用した場合、酸化体の量比は１を超え、安定化剤無添加時よりも酸化体量が増加した。また、塩酸システインおよびアスコルビン酸を配合した溶液は、沈殿が生じたり、溶液が着色した。一方、エデト酸ナトリウムを添加した場合、酸化体の量比は１以下であり、安定化剤無添加時よりも酸化体量が低下し、かつ沈殿や着色等の外観変化は生じなかった。
【００４０】
【表３】
2006137678.tif 000006
【実施例２】
【００４１】
（実施例２製剤の製造方法）
安定化剤としては、メチオニンを、糖または糖アルコールとしては、マルトースを、アミノ酸としては、アルギニンを、界面活性剤としてはポリソルベート８０を、酸としてはクエン酸、緩衝液としてはリン酸緩衝液を用いた。
０．８３ｍｇ／ｍＬのＩＬ−２の水溶液０．９ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬのメチオニンの水溶液０．３ｍＬ、２８９．５ｍｇ／ｍＬのマルトース一水和物水溶液９ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０水溶液１．５ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬのアルギニン水溶液４．５ｍＬを混合溶解し、ｐＨ約１０とした。次いでリン酸緩衝液１４５．８ｍｇ／ｍLを３ｍLおよびクエン酸を適量添加して、該溶液のｐＨを約７．４に調整し、注射用水で全量３０ｍＬとなるように調整した。その後、上記製造した組成物の溶液１ｍＬを３ｍＬ容のガラスバイアルに分注し、凍結乾燥を行った。製剤の処方は、表４に、凍結乾燥の条件は、表５に示す。
【実施例３】
【００４２】
安定化剤として、メチオニンのかわりにチオグリコール酸ナトリウムを用い、１００ｍｇ／ｍＬのチオグリコール酸ナトリウムの水溶液１．２ｍＬを添加した以外は、実施例２と同様である。
参考例４
【００４３】
安定化剤を配合しないこと以外は、実施例２と同様である。
参考例５
【００４４】
安定化剤として、メチオニンのかわりにアルファチオグリセリンを用い、１００ｍｇ／ｍＬのアルファチオグリセリンの水溶液１．２ｍＬを添加した以外は、実施例２と同様である。
【実施例４】
【００４５】
糖または糖アルコールとして、マルトースのかわりにスクロース（３００ｍｇ／ｍLを９ｍL  以下スクロース水溶液はこの濃度）を用いた以外は、実施例２と同様である。
【実施例５】
【００４６】
安定化剤として、メチオニンのかわりにチオグリコール酸ナトリウムを用い、１００ｍｇ／ｍＬのチオグリコール酸ナトリウム水溶液１．２ｍＬを添加し、糖または糖アルコールとして、マルトースのかわりにスクロースを用いた以外は、実施例２と同様である。
参考例６
【００４７】
安定化剤を配合せず、糖および／または糖アルコールとして、マルトースのかわりにスクロースを用いた以外は、実施例２と同様である。
参考例７
【００４８】
安定化剤として、メチオニンのかわりにアルファチオグリセリンを用い、１００ｍｇ／ｍＬのアルファチオグリセリンの水溶液１．２ｍＬを添加し、糖および／または糖アルコールとして、マルトースのかわりにスクロースを用いた以外は、実施例２と同様である。
【００４９】
【表４】
2006137678.tif 000007
【００５０】
【表５】
2006137678.tif 000008
【００５１】
（試験方法）
調製した凍結乾燥品を２５℃、６０％RH下で２ヶ月間および４０℃、７５％RH下で２ヶ月間保存した。その後、１ｍＬの蒸留水に溶解し、その溶液を実施例１と同様、
ＨＰＬＣ分析をおこない、酸化体の量比およびＩＬ−２の含量を測定した。
酸化体量の算出方法、酸化体の量比の算出方法は、実施例１と同様である。また、ＩＬ−２の含量％は以下の式で算出した。
【数３】
2006137678.tif 000009
（試験結果）
表６に糖および／または糖アルコールをマルトースとした場合の酸化体の量比、表７に糖および／または糖アルコールをスクロースとした場合の酸化体の量比をそれぞれ示した。その結果、メチオニン、チオグリコール酸ナトリウムおよびアルファチオグリセリンを配合した凍結乾燥品は、安定化剤を配合していない凍結乾燥品に比べ、酸化体の量が低減でき、特に保存後の酸化体量の低減に高い効果がみられた。さらに、糖をスクロースにした場合、マルトースに比べ、酸化体の量比は低い傾向にあった。
表８に糖および／または糖アルコールをマルトースとした場合のＩＬ−２含量、表９に糖および／または糖アルコールをスクロースとした場合のＩＬ−２含量をそれぞれ示した。なお、イニシャル時の含量が１００％に達していないのは、主に標準品と実施例の検体とのＩＬ−２仕込み量の若干の差による。その結果、安定化剤を配合しない場合に比べ、メチオニンおよびチオグリコール酸ナトリウムを配合した凍結乾燥品のＩＬ−２の含量は２ヶ月保存後もイニシャルと同様、ほぼ保持された。一方、アルファチオグリセリンを配合した凍結乾燥品において、凍結乾燥品のＩＬ−２の含量は、安定化剤を配合しない場合に比べ低く、保存後はＩＬ−２の二量体形成の影響により含量が低下した。さらに、メチオニンおよびチオグリコール酸ナトリウムを配合した凍結乾燥品は、酸化体の量の結果と同様、糖をスクロースにした場合、マルトースの場合に比べＩＬ−２の含量はイニシャルと同様、高く保持された。
【００５２】
【表６】
2006137678.tif 000010
【００５３】
【表７】
2006137678.tif 000011
【００５４】
【表８】
2006137678.tif 000012
【００５５】
【表９】
2006137678.tif 000013
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の組成物は、酸化体をほとんど生じず、しかもインターロイキン−２（ＩＬ−２）の含量がほとんど低下しない組成物として、利用できる。