(57)【要約】    【課題】エシェリヒア属細菌を用いてＬ−チロシンを効率よく製造する。    【解決手段】Ｌ−チロシン生産能を有し、かつ、チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼを保持するエシェリヒア属細菌を培地で培養し、培地中または菌体内にＬ−チロシンを生成蓄積せしめ、該培地中または菌体内よりＬ−チロシンを採取することによって、Ｌ−チロシンを製造する。    【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−チロシン生産能を有し、かつ、Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼを保持するエシェリヒア属細菌。
【請求項２】
Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが、野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の２５０〜２６９位のアミノ酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼである、請求項1に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項３】
Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが、野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の２５０位のアラニン、２５１位のフェニルアラニン、２５３位のグルタミン、２５４位のアラニン、２５５位のロイシン、２５７位のヒスチジン、２５８位のフェニルアラニン、２５９位のアラニン、２６０位のスレオニン、２６１位のフェニルアラニン、２６３位のチロシン、２６５位のロイシン、２６６位のヒスチジン、２６７位のロイシン及び２６９位のグルタミン酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼである、請求項２に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項４】
２５０位のアラニンを置換するアミノ酸がフェニルアラニンであり、２５１位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がセリンであり、２５３位のグルタミンを置換するアミノ酸がロイシンであり、２５４位のアラニンを置換するアミノ酸がセリン、プロリン又はグリシンであり、２５５位のロイシンを置換するアミノ酸がグルタミン又はグリシンであり、２５７位のヒスチジンを置換するアミノ酸がチロシン、スレオニン、セリン、アラニン又はロイシンであり、２５８位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がシステイン、アラニン、イソロイシン又はバリンであり、２５９位のアラニンを置換するアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンであり、２６０位のスレオニンを置換するアミノ酸がグリシン、アラニン、バリン、システイン、イソロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン又はセリンであり、２６１位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がメチオニン又はロイシンであり、２６３位のチロシンを置換するアミノ酸がシステイン、グリシン、スレオニン又はメチオニンであり、２６５位のロイシンを置換するアミノ酸がリジン、イソロイシン、チロシン又はアラニンであり、２６６位のヒスチジンを置換するアミノ酸がトリプトファン又はロイシンであり、２６７位のロイシンを置換するアミノ酸がチロシン又はヒスチジンであり、２６９位のグルタミン酸を置換するアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン又はロイシンである、請求項３に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項５】
野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが以下の（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質である、請求項２または３に記載のエシェリヒア属細菌；
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
さらに、プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の発現が低下するように改変された、請求項１〜５のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項７】
さらに、チロシンリプレッサーをコードする遺伝子の発現が低下するように改変された、請求項１〜６のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項８】
さらに、Ｌ−フェニルアラニンによる阻害が解除された３−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼを保持する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項９】
さらに、シキミ酸キナーゼIIをコードする遺伝子の発現が増強するように改変された、請求項１〜８のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌を培地で培養し、培地中または菌体内にＬ−チロシンを生成蓄積せしめ、該培地中または菌体内よりＬ−チロシンを採取する、Ｌ−チロシンの製造法。
【請求項１１】
プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子及びチロシンリプレッサーをコードする遺伝子の発現が低下し、かつプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子およびシキミ酸キナーゼIIをコードする遺伝子の発現が増強するように改変され、さらにＬ−フェニルアラニンによる阻害が解除された３−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼを保持するエシェリヒア属細菌を培地で培養し、培地中または菌体内にＬ−チロシンまたはその誘導体を生成蓄積せしめ、該培地中または菌体内よりＬ−チロシンまたはその誘導体を採取する、Ｌ−チロシンまたはその誘導体の製造法。
【請求項１２】
プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子に変異を導入し、変異が導入された遺伝子を微生物に導入する工程、及び該微生物から３−フルオロチロシン耐性を有する微生物を選択し、選択された微生物からＬ−チロシンによる阻害が解除されたプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離する工程を含む、Ｌ−チロシンによる阻害が解除されたプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の取得方法。
【請求項１３】
野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の２５０〜２６９位のアミノ酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵法によるＬ−チロシン生産菌及びＬ−チロシンの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般にＬ−チロシンは、医薬品の原料や合成中間体として有用な物質である。従来のＬ−チロシン製造法としては、調味料の原料となる大豆などの植物性タンパク質分解物を製造する際に沈殿するオリからＬ−チロシンを抽出する方法（特許文献１）、ブレビバクテリウム属細菌などを用いる直接発酵法(特許文献２)が知られている。
【０００３】
ブレビバクテリウム属細菌はアロゲン酸経路というＬ−チロシン生合成系をもっており、芳香族共通経路のプレフェン酸からプレフェン酸アミノトランスフェレラーゼによりアロゲン酸が生成し、さらにアロゲン酸デヒドロゲナーゼによってＬ−チロシンが生成する。この経路上の二つの酵素は最終産物であるＬ−チロシンに阻害されるものがないという特徴から、従来からＬ−チロシンの製造にブレビバクテリウム属細菌が利用されている。しかし、この細菌は生育が遅いゆえに生産性が低いという問題点があった。
【０００４】
一方、エシェリヒア・コリのＬ−チロシン生合成系はブレビバクテリウム属細菌と異なり、プレフェン酸がプレフェン酸デヒドロゲナーゼ（以下「PDH」と略す。）により脱水されて４−ヒドロキシフェニルピルビン酸となり、さらに芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼによってＬ−チロシンが合成される。エシェリヒア・コリによる直接発酵法でＬ−チロシンを製造するに当たり、最大の問題となるのが、このＬ−チロシン特異経路の最初の酵素であるPDHが低濃度のＬ−チロシンによって強い阻害を受けてしまうという点である。エシェリヒア・コリで効率よくＬ−チロシンを製造するためには、このPDHのＬ−チロシンによる阻害を解除することが先決となる。
【０００５】
これまでにエシェリヒア・コリのＬ−チロシンに生成に関する例としてはp−フルオロ−チロシン耐性菌がＬ−チロシンを排出したという報告（非特許文献１）、その他β−２−チエニル−アラニン耐性菌（非特許文献２）、ｐ−アミノフェニルアラニン耐性菌（非特許文献３）に関しても、Ｌ−チロシンを排出したという報告がある。しかし、これらの中には、その変異点が３−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（DS）遺伝子などにあって、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（tyrA）以外の変異点であるか、または変異点が不明であった。したがって、フィードバック阻害が解除されたPDHを保持するＬ−チロシン生産菌は報告されておらず、またPDH活性のフィードバック阻害解除の原因となる遺伝子変異の報告もなかった。
【０００６】
他の微生物ではバチルス属細菌においてD−チロシン耐性菌からPDHのフィードバックが阻害された菌株が取得されているが（非特許文献４）、この阻害解除によって実際にＬ−チロシンが生成されているのかどうか記されておらず、また遺伝子の変異点は調べられていない。さらに、エシェリヒア・コリはdadA（D-amino acid dehydrogenase A）遺伝子を有し、D-tyrosine耐性であるため（非特許文献５），この方法をエシェリヒア・コリに応用することも不可能である。
【０００７】
エシェリヒア・コリにおいて、PDHはtyrA遺伝子上にあり、Chorismate mutase(CM)と同一のポリペプチドを形成している(配列番号１)。PDHのL−チロシンによる阻害に関しては、わずか300μMの濃度で阻害されてしまうこという報告があり（非特許文献６）、また、tyrA遺伝子のPDH活性部位についても、94-373番目のアミノ酸にPDHの活性部位、活性阻害部位があることまでは記載されているが（非特許文献７）、活性阻害部位がどの部位（ア
ミノ酸残基）に存在するか知られていない。
【０００８】
３−フルオロ−チロシンはPDH活性を阻害することは知られていたが、同時にDS活性の阻害剤であり、そのDS発現抑制機能が広く知られていることから、３−フルオロ−チロシンはチロシンリプレッサー（tyrR）欠損株を単離する指標としては用いられてきた。しかし、３−フルオロ−チロシンを用いて変異型PDHを取得することはこれまでに報告されていなかった。
【特許文献１】特開平７−１０８２１号公報
【特許文献２】特開平９−１２１８７２号公報
【非特許文献１】J Bacteriol. 1958 Sep; 76(3): 328
【非特許文献２】J Bacteriol. 1958 Sep; 76(3): 326.
【非特許文献３】J Bacteriol. 1969 Mar; 97(3): 1234
【非特許文献４】J Biol Chem. 1970 Aug 10; 245(15): 3763
【非特許文献５】J Bacteriol. 1994 Mar; 176(5): 1500
【非特許文献６】Biochemistry. 1985 Feb 26; 24(5): 1116
【非特許文献７】Eur J Biochem. 2003 Feb; 270(4): 757
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、Ｌ−チロシンを生産する新規なエシェリヒア属細菌を提供すること、およびエシェリヒア属細菌を用いて効率よくＬ−チロシンを製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼを保持するエシェリヒア属細菌を用いることにより、効率よくＬ−チロシンを製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−チロシン生産能を有し、かつ、Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼを保持するエシェリヒア属細菌。
（２）Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが、野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の２５０〜２６９位のアミノ酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼである、（１）のエシェリヒア属細菌。
（３）Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが、野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の２５０位のアラニン、２５１位のフェニルアラニン、２５３位のグルタミン、２５４位のアラニン、２５５位のロイシン、２５７位のヒスチジン、２５８位のフェニルアラニン、２５９位のアラニン、２６０位のスレオニン、２６１位のフェニルアラニン、２６３位のチロシン、２６５位のロイシン、２６６位のヒスチジン、２６７位のロイシン及び２６９位のグルタミン酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼである、（２）のエシェリヒア属細菌。
（４）２５０位のアラニンを置換するアミノ酸がフェニルアラニンであり、２５１位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がセリンであり、２５３位のグルタミンを置換するアミノ酸がロイシンであり、２５４位のアラニンを置換するアミノ酸がセリン、プロリン又はグリシンであり、２５５位のロイシンを置換するアミノ酸がグルタミン又はグリシンであり、２５７位のヒスチジンを置換するアミノ酸がチロシン、スレオニン、セリン、ア
ラニン又はロイシンであり、２５８位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がシステイン、アラニン、イソロイシン又はバリンであり、２５９位のアラニンを置換するアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンであり、２６０位のスレオニンを置換するアミノ酸がグリシン、アラニン、バリン、システイン、イソロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン又はセリンであり、２６１位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がメチオニン又はロイシンであり、２６３位のチロシンを置換するアミノ酸がシステイン、グリシン、スレオニン又はメチオニンであり、２６５位のロイシンを置換するアミノ酸がリジン、イソロイシン、チロシン又はアラニンであり、２６６位のヒスチジンを置換するアミノ酸がトリプトファン又はロイシンであり、２６７位のロイシンを置換するアミノ酸がチロシン又はヒスチジンであり、２６９位のグルタミン酸を置換するアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン又はロイシンである、（３）のエシェリヒア属細菌。
（５）  野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが以下の（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質である、（２）または（３）のエシェリヒア属細菌；
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（６）  さらに、プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の発現が低下するように改変された、（１）〜（５）のいずれかのエシェリヒア属細菌。
（７）  さらに、チロシンリプレッサーをコードする遺伝子の発現が低下するように改変された、（１）〜（６）のいずれかのエシェリヒア属細菌。
（８）  さらに、Ｌ−フェニルアラニンによる阻害が解除された３−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼを保持する、（１）〜（７）のいずれかのエシェリヒア属細菌。
（９）  さらに、シキミ酸キナーゼIIをコードする遺伝子の発現が増強するように改変された、（１）〜（８）のいずれかのエシェリヒア属細菌。
（１０）  （１）〜（９）のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌を培地で培養し、培地中または菌体内にＬ−チロシンを生成蓄積せしめ、該培地中または菌体内よりＬ−チロシンを採取する、Ｌ−チロシンの製造法。
（１１）  プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子及びチロシンリプレッサーをコードする遺伝子の発現が低下し、かつプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子およびシキミ酸キナーゼIIをコードする遺伝子の発現が増強するように改変され、さらにＬ−フェニルアラニンによる阻害が解除された３−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼを保持する、エシェリヒア属細菌を培地で培養し、培地中または菌体内にＬ−チロシンを生成蓄積せしめ、該培地中または菌体内よりＬ−チロシンを採取する、Ｌ−チロシンの製造法。
（１２）  プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、変異が導入された遺伝子を微生物に導入する工程、及び該微生物から３−フルオロチロシン耐性を有する微生物を選択し、選択された微生物からＬ−チロシンによる阻害が解除されたプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離する工程を含む、Ｌ−チロシンによる阻害が解除されたプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の取得方法。
（１３）野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の２５０〜２６９位のアミノ酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼ。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の細菌を用いることにより、効率よくＬ−チロシンを製造することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する
＜１＞本発明のエシェリヒア属細菌
本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−チロシン生産能を有し、かつ、Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼを保持するエシェリヒア属細菌である。
【００１４】
エシェリヒア属細菌は、ナイトハルトらの著書（Neidhardt,F.C.et.al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C.,1208, table 1）に挙げられるもの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用できる。エシェリヒア・コリの野生株としては、例えばK12株又はその誘導体、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC No.47076）、及びW3110株（ATCC No.27325）等が挙げられる。これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所  12301 Parklawn Drive,Rockville Maryland 20852,United
States of America ）。
【００１５】
本発明において「Ｌ−チロシン生産能」とは、細菌を培地に培養したときに、培地中に有意な量のＬ−チロシンを蓄積する能力、又は菌体中のＬ−チロシン含量を野生株又は非形質転換株に比べて増加させる能力をいう。本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−チロシン生産能を本来的に有するものであってもよいが、変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼや阻害解除型３−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼなどを保持することによって、Ｌ−チロシン生産能を有するようになったものでもよい。
【００１６】
プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）とは、プレフェン酸を脱水して4-ヒドロキシフェニルピルビン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。このようなタンパク質としては、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。また、上記活性を有する限りにおいて、配列番号２のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。ここで数個とは、具体的には２から２０個、好ましくは、２から１０個、より好ましくは２から５個である。なお、上記のうちの置換は、アミノ酸配列２中の少なくとも１残基が除去され、そこに他の残基が挿入される変化である。置換は上記活性が保持される限り特に制限されないが、例えば、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからasn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が例示される。
【００１７】
さらに、プレフェン酸デヒドロゲナーゼは、上記活性を有する限り、配列番号２のアミノ酸配列と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
さらに、配列番号１の塩基配列を有するDNAによってコードされるタンパク質や、配列番号１の塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、上記活性を有するタンパク質であってもよい。ここでストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
なお、本発明においては、上記のような配列を有し、L−チロシンによってフィードバ
ック阻害を受けるプレフェン酸デヒドロゲナーゼを「野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼ」と呼ぶ。
【００１８】
一方、「L−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼ」とは、例えば、L−チロシンの存在下において、L−チロシン非存在下と同程度の活性を保持するプレフェン酸デヒドロゲナーゼをいう。具体的には、例えば、100μMのL−チロシンの存在下での活性が、Ｌ−チロシン非存在下での活性の５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であるプレフェン酸デヒドロゲナーゼをいう。このような変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼは、野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼにアミノ酸置換を導入し、該アミノ酸置換型プレフェン酸デヒドロゲナーゼの中から、L−チロシンによるフィードバック阻害を受けないものを選択することによって得ることができる。具体的には、例えば、PCRなどによる部位特異的変異法を用いてPDHをコードするDNA（例えば、配列番号１）にアミノ酸置換を生じさせるような塩基置換を導入し、該塩基置換が導入されたDNAでエシェリヒア属細菌（野生型PDH遺伝子が破壊されたものが好ましい）を形質転換し、該細菌のPDH活性を、L−チロシンの存在下及び非存在下において測定し、その値を比較することによって、L−チロシンによるフィードバック阻害が解除されたPDHを選択することができる。なお、PDH活性はBiochemistry. 1990 Nov 6; 29(44): 10245-54に記載の方法に従って測定することができる。
【００１９】
また、L−チロシンによるフィードバック阻害が解除されたPDHをコードする遺伝子の取得は、３−フルオロチロシンを用いて行うこともできる。すなわち、野生型ＰＤＨをコードする遺伝子に変異を導入し、変異が導入された遺伝子を微生物に導入し、該微生物から３−フルオロチロシン耐性を有する微生物を選択し、さらに、選択された微生物のPDH活性をL−チロシンの存在下および非存在下で測定することによってＬ−チロシンによる阻害が解除されたＰＤＨを保持する微生物を選択し、得られた微生物からＬ−チロシンによる阻害が解除されたＰＤＨをコードする遺伝子を取得するという方法を採用することもできる。
【００２０】
本発明のエシェリヒア属細菌が保持する変異型ＰＤＨとしては、Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除されたものである限り特に制限されないが、好ましくは、野生型PDHのアミノ酸配列において２５０〜２６９位のアミノ酸から選ばれる1又はそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものが挙げられる。
２５０〜２６９位のアミノ酸の中で置換されるアミノ酸としてより好ましいものは、２５０位のアラニン、２５１位のフェニルアラニン、２５３位のグルタミン、２５４位のアラニン、２５５位のロイシン、２５７位のヒスチジン、２５８位のフェニルアラニン、２５９位のアラニン、２６０位のスレオニン、２６１位のフェニルアラニン、２６３位のチロシン、２６５位のロイシン、２６６位のヒスチジン、２６７位のロイシン及び２６９位のグルタミン酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸である。
これらのアミノ酸を置換するアミノ酸の種類はＬ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型PDHを生じさせるものである限り特に制限されないが、特に好ましくは、２５０位のアラニンを置換するアミノ酸がフェニルアラニンであり、２５１位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がセリンであり、２５３位のグルタミンを置換するアミノ酸がロイシンであり、２５４位のアラニンを置換するアミノ酸がセリン、プロリン又はグリシンであり、２５５位のロイシンを置換するアミノ酸がグルタミン又はグリシンであり、２５７位のヒスチジンを置換するアミノ酸がチロシン、スレオニン、セリン、アラニン又はロイシンであり、２５８位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がシステイン、アラニン、イソロイシン又はバリンであり、２５９位のアラニンを置換するアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンであり、２６０位のスレオニンを置換するアミノ酸がグリシン、アラニン、バリン、システイン、イソロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン又はセリンであり、２６１位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がメチオニン又は
ロイシンであり、２６３位のチロシンを置換するアミノ酸がシステイン、グリシン、スレオニン又はメチオニンであり、２６５位のロイシンを置換するアミノ酸がリジン、イソロイシン、チロシン又はアラニンであり、２６６位のヒスチジンを置換するアミノ酸がトリプトファン又はロイシンであり、２６７位のロイシンを置換するアミノ酸がチロシン又はヒスチジンであり、２６９位のグルタミン酸を置換するアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン又はロイシンである。
なお、各アミノ酸の位置は配列番号２における位置を示している。ただし、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその位置は前後することがあり、例えば、「260位のスレオニン」は、Ｎ末端側に１つのアミノ酸が挿入されれば本来260位のスレオニンはN末端から261番目のアミノ酸残基となるが、そのようなスレオニンも、本発明においては260位のスレオニンと呼ぶこととする。その他のアミノ酸についても同様である。
【００２１】
Ｌ−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型PDHをエシェリヒア属細菌に保持させるためには、例えば、変異型PDHをコードするDNAを含むプラスミドでエシェリヒア属細菌を形質転換すればよい。
【００２２】
変異型PDHをコードするＤＮＡ（変異型ｔｙｒＡ遺伝子ともいう）としては、ＰＤＨ活性を有し、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されたＰＤＨをコードするものであれば特に制限されないが、例えば、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにおいて、PDHの250〜269位のアミノ酸、好ましくは２５０位のアラニン、２５１位のフェニルアラニン、２５３位のグルタミン、２５４位のアラニン、２５５位のロイシン、２５７位のヒスチジン、２５８位のフェニルアラニン、２５９位のアラニン、２６０位のスレオニン、２６１位のフェニルアラニン、２６３位のチロシン、２６５位のロイシン、２６６位のヒスチジン、２６７位のロイシン及び２６９位のグルタミン酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸に対応するコドンが、上述したような他のアミノ酸のコドンに置換された遺伝子を挙げることができる。
【００２３】
変異型ｔｙｒＡ遺伝子を導入するために使用できるベクターとしては、エシェリヒア属細菌の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができるが、具体的には、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184,（pHSG、pACYCは宝バイオ社より入手可）, RSF1010, pBR322, pMW219（pMWはニッポンジーン社より入手可）等が挙げられる。
【００２４】
変異型ｔｙｒＡ遺伝子を含むプラスミドを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970) ）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan, C.H., Wilson, G.A.and Young,
F.E., Gene, 1, 153 (1977) ）がある。
【００２５】
さらに、変異型ｔｙｒＡ遺伝子の導入は、変異型ｔｙｒＡ遺伝子をエシェリヒア属細菌の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体DNA上に変異型ｔｙｒＡ遺伝子を多コピーで導入するには、例えば、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、変異型ｔｙｒＡ遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。変異型ｔｙｒＡ遺伝子を導入する際には、強力なプロモーターの下流に該遺伝子を連結して導入してもよい。例えば、lacプロモーター、trpプロモ
ーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。
【００２６】
本発明のエシェリヒア属細菌は、上記のような変異型ＰＤＨを保持し、さらに、プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の発現が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌であることが好ましい。プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子（ｐｈｅＡ遺伝子ともいう）としては、例えば、配列番号3の塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。また、プレフェン酸デヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここでストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。プレフェン酸デヒドラターゼ活性は、Biochemica Biophysica Acta (BBA) 1965 (100)76-88に記載の方法に従って測定することができる。ｐｈｅＡ遺伝子の発現量は野生株などの非改変株に比べて１０％以下に低下していることが好ましい。なお、低下とは完全に発現量が消失した場合も含む。ｐｈｅＡ遺伝子の発現量を低下させるための改変は、遺伝子破壊や、プロモーターなどの発現調節領域の改変によって行うことができる。具体的には、以下の方法によって行うことができる。
【００２７】
相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある。エシェリヒア・コリ用の温度感受性複製起点を含むプラスミドとしては、例えばpMAN031（Yasueda, H. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 211 (1991)）、pMAN997（WO 99/03988号）、及びpEL3（K. A. Armstrong et. al., J. Mol. Biol. (1984) 175, 331-347）が挙げられる。
【００２８】
内部配列が欠失したような欠失型ｐｈｅＡ遺伝子を、宿主染色体上のｐｈｅＡ遺伝子と置換するには、例えば以下のようにすればよい。温度感受性複製起点と、欠失型ｐｈｅＡ遺伝子と、アンピシリン又はクロラムフェニコール等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子とをベクターに挿入して組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡでエシェリヒア属細菌を形質転換し、温度感受性複製起点が機能しない温度で形質転換株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養することにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換株が得られる。こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するｐｈｅＡ遺伝子配列との組換えを起こし、染色体（内因性）ｐｈｅＡ遺伝子と欠失型ｐｈｅＡ遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。
【００２９】
次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型ｐｈｅＡ遺伝子のみを残すために、２個のｐｈｅＡ遺伝子の組換えにより１コピーのｐｈｅＡ遺伝子を、ベクター部分（温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、正常なｐｈｅＡ遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、欠失型ｐｈｅＡ遺伝子が切り出される場合と、反対に欠失型ｐｈｅＡ遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、正常なｐｈｅＡ遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養すれば、切り出されたＤＮＡはプラスミド状で細胞内に保持される。次に、温度感受性複製起点が機能しない温度で培養すると、プラスミド上のｐｈｅＡ遺伝子は、プラスミドとともに細胞から脱落する。そして、PCRまたはサザンハイブリダイゼーション等により、染色体上に欠失型ｐｈｅＡ遺伝子が残った株を選択することによって、ｐｈｅＡ遺伝子が破壊された株を取得することができる。
【００３０】
ところで、チロシンリプレッサーは発現をｔｙｒＡ遺伝子などの発現を抑制する（Ｊ Biol Chem, 1986, vol 261, p403-410）。したがって、本発明の微生物はさらに、チロシ
ンリプレッサーをコードする遺伝子の発現が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌であってもよい。チロシンリプレッサーをコードする遺伝子（ｔｙｒＲ遺伝子ともいう）としては、例えば、配列番号５の塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。また、チロシンリプレッサー活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、配列番号５の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここでストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。ｔｙｒＲ遺伝子の発現量は野生株などの非改変株に比べて１０％以下に低下していることが好ましい。なお、低下とは完全に発現量が消失した場合も含む。ｔｙｒＲ遺伝子の発現量を低下させるための改変は、遺伝子破壊や、プロモーターなどの発現調節領域の改変によって行うことができる。具体的には、上述したｐｈｅＡ遺伝子の破壊と同様の方法によって行うことができる。
【００３１】
本発明の微生物は、さらにＬ−フェニルアラニンによる阻害が解除された３-デオキシ-D-アラビノヘプツロン酸-7-リン酸シンターゼ（ＤＳとも呼ぶ）を保持するものであってもよい。Ｌ−フェニルアラニンによる阻害が解除されたＤＳとしては、例えば、ａｒｏＧ遺伝子（例えば、配列番号７）にコードされるアミノ酸配列（例えば、配列番号８）の１５０位のプロリンがロイシンに置換されたタンパク質、２０２位のアラニンがスレオニンに置換されたタンパク質、１４６位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換されたタンパク質、１４７位のメチオニンがイソロイシンに置換され、かつ３３２位のグルタミン酸がリジンに置換されたタンパク質、１４７位のメチオニンがイソロイシンに置換されたタンパク質、１５７位のメチオニンがイソロイシンに置換され、かつ２１９位のアラニンがスレオニンに置換されたタンパク質などが挙げられる（特開平05-344881または特開平05-236947参照）。これらのタンパク質のいずれかをコードする遺伝子をエシェリヒア属細菌に導入することによって、Ｌ−フェニルアラニンによる阻害が解除されたＤＳを保持するエシェリヒア属細菌が得られる。なお、遺伝子導入は、上述した変異型ｔｙｒＡ遺伝子の導入と同様にして行うことができる。
【００３２】
本発明の微生物は、さらにシキミ酸キナーゼをコードする遺伝子（ａｒｏＬ）の発現量が上昇するように改変されたものであってもよい。シキミ酸キナーゼをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号９の塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。また、シキミ酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、配列番号９の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここでストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。この遺伝子をエシェリヒア属細菌に導入することによって、シキミ酸キナーゼをコードする遺伝子の発現量が上昇するように改変されたエシェリヒア属細菌が得られる。なお、遺伝子導入は、上述した変異型ｔｙｒＡ遺伝子の導入と同様にして行うことができる。
【００３３】
以上、本発明のエシェリヒア属細菌について述べたが、本発明のエシェリヒア属細菌の育種に当たっては、変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼを保持させるための改変、プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の発現を低下させるための改変などの各種改変は、どのような順序で行ってもよい。
【００３４】
＜２＞本発明のＬ−チロシンの製造法
本発明のＬ−チロシンの製造法は、本発明のエシェリヒア属細菌を培地で培養し、培地中または菌体内にＬ−チロシンを生成蓄積せしめ、該培地中または菌体内よりＬ−チロシンを採取する方法である。本発明のエシェリヒア属細菌を培養する方法は、従来のＬ−チロシン生産菌の培養方法と同様にして行うことができる。即ち、培地としては、炭素源、
窒素源、無機イオン、更に必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常のものを使用することができる。炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩その他が使用できる。培養は好気的条件下で培地のpH及び温度を適宜調節しつつ、実質的にＬ−チロシンの生産蓄積が停止するまで行うことが好ましい。培養終了後の培養液中には著量のＬ−チロシンが生成蓄積される。培養液よりＬ−チロシンを採取するには、通常の方法が適用できる。
【００３５】
本発明はまた、プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子及びチロシンリプレッサーをコードする遺伝子の発現が低下し、かつプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子およびシキミ酸キナーゼIIをコードする遺伝子の発現が増強するように改変され、さらにＬ−フェニルアラニンによる阻害が解除された３−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼを保持する、エシェリヒア属細菌を培地で培養し、培地中または菌体内にＬ−チロシンまたはその誘導体を生成蓄積せしめ、該培地中または菌体内よりＬ−チロシンまたはその誘導体を採取する、Ｌ−チロシンまたはその誘導体の製造法を提供する。この方法に用いるエシェリヒア属細菌の作製に用いる各遺伝子は、プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（tyrＡ遺伝子）を変異型ではなく、通常型（例えば、配列番号1の塩基配列を有する遺伝子）を用いる以外は、上述したものと同じものを用いることができる。なお、ここでいうＬ−チロシン誘導体とは、E.coli中において１つまたは２つ以上の遺伝子を発現増強させることによってＬ−チロシンから生成させうることが知られている化合物を指し、例えばメラニン(欧州特許第0547065B1号明細書)や、L-DOPA(特開昭62-259589号公報)などが挙げられる。
【００３６】
[実施例]
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下のものには限定されない。
【００３７】
[LB培地]
バクト・トリプトン（ディフコ社製）    10g/L
酵母エキス（ディフコ社製）             5g/L
塩化ナトリウム                        10g/L
pH7.0
[120℃、20分間蒸気滅菌を行った。]
【００３８】
［LB寒天培地］
L培地
バクトアガー            15g/L
120℃、20分間蒸気滅菌を行った。
【００３９】
［最小培地］
グルコース            0.2%
硫酸マグネシウム      1mM
リン酸2水素カリウム  4.5g/L
クエン酸ナトリウム    0.5g/L
硫酸アンモニウム      1g/L
リン酸2ナトリウム    10.5g/L
thiamine hydrochloride 5mg/L
115℃、10分間蒸気滅菌を行った。
【００４０】
［最小寒天培地］
最小培地
バクトアガー    15g/L 
115℃、10分間蒸気滅菌を行った。
【００４１】
［エシェリヒア・コリ  L-チロシン生産培地］
グルコース                      40g/L
硫酸アンモニウム                16g/L 
リン酸２水素カリウム            1.0g/L
硫酸マグネシウム・７水塩        1.0g/L
硫酸鉄４・７水塩                10mg/L
硫酸マンガン４・７水塩           8mg/L
イーストエキストラクト          2.0g/L
局方炭酸カルシウム              30g/L
水酸化カリウムでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブ
但しグルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に殺菌した。
適宜、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンを添加した。
抗生物質として、クロラムフェニコール25mg/Lやアンピシリン100mg/Lを添加した。
【実施例１】
【００４２】
＜フィードバック阻害が解除されたPDHをコードする新規遺伝子の取得〜その１＞
（１）エシェリヒア・コリのtyrA由来変異型PDH遺伝子の取得
エシェリヒア・コリK-12  W3110株から通常の方法に従って染色体DNAを抽出した。一方、公知の文献[J. Mol. Biol. 180 (4), 1023(1984)] に記載されているtyrA遺伝子の塩基配列に基づいて、配列番号11及び12に示すような合成DNAプライマー2本を通常の方法で合成した。これらは、それぞれtyrA遺伝子の上流及び下流に相同な配列を持つ。この染色体DNAとプライマーを用いて、PCRを行い、約1kbpのDNA断片を得た。以下、図1に示すようにこの断片をEcoRIとSalIで切断した後、同じくEcoRIとSalIで切断したpSTV28(タカラバイオ社製)にLigation Kit Ver.2(タカラバイオ社製)を用いて連結した。このライゲーション溶液でエシェリヒア・コリ  K-12  JM109株(タカラバイオ社製)を形質転換し、クロラムフェニコールを含むLB培地上で選択した。クロラムフェニコール耐性株にtyrA遺伝子が挿入されたかどうかをPCRで確認し、野生型tyrA遺伝子を保有する菌株からプラスミドを抽出し、プラスミドpSTVtyrA(W)を取得した。
【００４３】
次に、Gene Morph（登録商標） Random mutagenesis Kit(STRATAGENE社製)を用いて、配列番号１１,１2のプライマーによるPCRでランダムに変異が導入されたtyrA遺伝子断片を得た後、再びpSTV28に連結し、内因性のtyrR遺伝子及びtyrA遺伝子が破壊されたW3110ΔtyrR,tyrA株を形質転換し、クロラムフェニコール、0.1mM 3‐fluoro‐Tyrosineの入った最少培地で生育してきた耐性株を５株W3110ΔtyrR,tyrA/pSTV28tyrA-1,2,5,10,24を選択し、この中からPDHの活性がＬ−チロシンによる阻害を受けないものを選択した。W3110ΔtyrR,tyrAはAJ12741(FERM BP-4796)株よりプラスミドpMGAL1（脱感作型aroG4、野生型aroL及び野生型pheAを含むプラスミド）を脱落させることにより得られる。
【００４４】
（２）PDH活性の測定
JM109/pSTV28tyrA-1,2,5,10,24の菌体をLB培地を用いて37℃、15時間培養した培養液を遠心分離し、集菌した。次いで、該菌体を50mM Tris-HCl(pH7.5)にて２回洗浄し、氷冷下20%グリセロールを含む50mM Tris-HCl(pH7.5)に懸濁した後、30秒間、80回の超音波破砕することにより粗酵素液を調製した。PDH活性測定は[Biochemistry. 1990 Nov 6; 29(44): 10245-54]に従った。すなわち0.25mMプレフェン酸、1mM EDTA、1mM DTT、2mM NADを含んだ50mM Tris-HCl(pH7.5)存在下、30℃10分反応させ、生成するNADHを340nmの吸光波長にて測定した。タンパク質定量法はBradford法で行った。結果は図2に示すように、選択
した5株のうち1株が阻害解除型のPDHを保持していた。野生型PDHでは100μMのL-チロシン存在下で強く酵素反応が阻害されるのに対し、変異型PDHは800μMのＬ−チロシンでもほとんど阻害を受けなかった。以後、このフィードバック阻害解除型tyrAをtyrA(mut)と表記する。
【００４５】
（３）フィードバック阻害が解除されたPDHを導入したエシェリヒア・コリの培養評価
pSTVtyrA(W)またはpSTVtyrA(mut)でW3110ΔtyrR,tyrAを形質転換し、25mg/Lクロラムフェニコールを含むLB培地に塗り広げ、生育してきた菌体を1 cm2かきとって25 mg/Lのクロラムフェニコールを含む上述のエシェリヒア・コリ  L-チロシン生産培地5mlに植菌し、37℃、24時間振盪培養した。培養後、培養液1mlをサンプリングし、培養液中のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度は、12,000 rpmで2分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈した培養液をバイオテックアナライザー（サクラ精器）により測定した。Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニンの測定は残りの培養液に終濃度0.3 MとなるようにＫＯＨを添加し、1時間ほど37 ℃で振盪してL-チロシンを溶解し、これを適当倍率に水で希釈し、Ultrafree-MC 0.45 μm Filter Unit(ミリポア)を通し不純物を除いてからHPLC(HITACHI)で行った。HPLCカラムはChromolith(MERCK)を用い、bufferは5 %アセトニトリル/0.1
% トリフルオロ酢酸を用いた。結果を表1及び図３に示す。tyrAが脱感作されたことによって、L-チロシンの蓄積が8〜10倍に向上することが明らかとなった。
【００４６】
【表１】
2006311833.tif 000003
【００４７】
（４）フィードバック阻害が解除されたPDHの変異点の決定
フィードバックが解除されたPDHの遺伝子である、tyrA(mut)の配列を通常の方法に従って決定した。具体的なアミノ酸配列上の置換部位及びその対応塩基配列上の変異点を図４（Ａ）に示す。この株で100位のプロリンがセリンに、260位のスレオニンがイソロイシンに置換していた。このどちらが、変異型PDHの脱感作に効果を示しているのかを確認するために、以下のような実験を行った(図４（Ｂ）)。pSTVtyrA(mut)とpSTVtyrA(W)をtyrAの上流側のマルチクローニングサイトにあるEcoRIと100位の置換部位と260位の置換部位のあいだに位置するCpoIで消化した。ここで得られた、100位の置換部位のみを含む断片をpSTVtyrA(mut)とpSTVtyrA(W)の対応する断片それぞれにつなぎ変え、100位のみが置換されたpSTVtyrA(P100S)、および260位のみが置換されたpSTVtyrA(T260I)を作製した。これらプラスミドでW3110ΔtyrR,tyrAを形質転換し、得られた株をW3110ΔtyrR,tyrA / pSTVtyrA(P100S)、W3110ΔtyrR,tyrA /pSTVtyrA(T260I)と名づけた。この二つの株を培養した結果を表２及び図５に示す。結果、２６０位の置換が脱感作に効果を示しているということが明らかになった。以後の実験にはtyrA(T260I)を使用した。
【００４８】
【表２】
2006311833.tif 000004
【実施例２】
【００４９】
フィードバック阻害が解除されたPDHをコードする新規遺伝子の取得〜その２
（１）E.coliのtyrA由来変異型PDH遺伝子の取得
tyrAの250番目から270番目のアミノ酸それぞれに対して、ランダムに変異が入るプライマーを設計した(配列番号15〜35)。
これらのプライマー及び配列番号11,12のプライマーを用いて次のような変異導入PCRを行った（図８）。
1stPCR：pSTVtyrA(W)をテンプレートとし、配列番号15〜35のいずれかのプライマーとT2プライマー（配列番号１２）を用いて変異導入部位から下流の配列をpyrobestDNAポリメラーゼ（Takara）で増幅する。
2ndPCR：1stPCRと一連のサイクルで行う。1stPCRで増幅したPCR産物がプライマーとしてtyrA(W)にアニールし、1stPCRで増幅されていないtyrAの上流側に向かって伸長する。
＜1st/2nd PCR cycle＞
96℃2min.→〔94℃30s.・60℃30s.・72℃30s.〕×20→〔94℃1min.・37℃1min.・72℃30s.〕×10→4℃
3rdPCR：2ndPCR産物をすべて混合したものをテンプレートにT1（配列番号11）とT２（配列番号12）で変異点の入ったtyrA全長を増幅する。
＜3rdPCR cycle＞96℃2min.→〔94℃30s.・55℃30s.・72℃1min.〕×30→4℃
増幅された変異型tyrA のPCR断片をpSTV28のSmaIサイトにライゲーションし、pSTVtyrA(mut)を得た。このプラスミドを用いて、W3110ΔtyrR,tyrA株を形質転換した。形質転換した株はクロラムフェニコール、0.1mM 3-fluoro-Tyrosineの入った最少培地に塗布し、37℃、24時間目に生育してきた株から、50株を候補株として取得した。
【００５０】
（２）フィードバック阻害が解除されたPDHを導入したE.coliの培養評価
pSTVtyrA(W)とpSTVtyrA(mut)でW3110ΔtyrR,tyrAを形質転換し、25mg/Lクロラムフェニコールを含むLB培地に塗り広げ1 cm2かきとって25 mg/Lのクロラムフェニコールを含む上述のE.coli  L-チロシン生産培地5mlに植菌し、37℃、24時間振盪培養した。培養後、培養液1mlをサンプリングし、培養液中のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度は、1
2,000 rpmで2分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈した培養液をバイオテックアナライザー（サクラ精器）により測定した。一方、Ｌ−チロシンの蓄積は、残りの培養液に終濃度0.3 MとなるようにＫＯＨを添加し、1時間ほど37 ℃で振盪してL-チロシンを溶解し、これを適当倍率に水で希釈し、Ultrafree-MC 0.45 μm Filter Unit(ミリポア)を通し不純物を除いてからHPLC(HITACHI)で測定した。HPLCカラムはChromolith(MERCK)を用い、bufferは5 %アセトニトリル/0.1 % トリフルオロ酢酸を用いた。各置換体（変異型PDH）導入株のL-チロシンの蓄積を表３に示す。tyrAへの変異導入によって、L-チロシンの蓄積が1.5〜14倍に向上した株が取得されたことが明らかとなった。
【００５１】
（３）フィードバック阻害が解除されたPDHの変異点の決定
フィードバック阻害が解除された各置換体の塩基配列を通常の方法に従って決定した。置換部位のアミノ酸及びコドンの配列を表３に示す。
【００５２】
【表３】
2006311833.tif 000005
【００５３】
（４）PDH活性の測定
（３）で取得された株のうち、もっとも収率の高かった257/265、2番目に収率の高かった254/269(収率5.5%、2.5%)、実施例１で取得したT260I(収率3.5%)の菌体をLB培地を用いて37℃、15時間培養した培養液を遠心分離し、集菌した。次いで、該菌体を50mM Tris-HCl(pH7.5)にて２回洗浄し、氷冷下20%グリセロールを含む50mM Tris-HCl(pH7.5)に懸濁した後、30秒間、80回の超音波破砕することにより粗酵素液を調製した。PDH活性測定は[Biochemistry. 1990 Nov 6; 29(44): 10245-54]に従った。すなわち0.25mMプレフェン酸、1mM EDTA、1mM DTT、2mM NAD+を含んだ50mM Tris-HCl(pH7.5)存在下、30℃10分反応させ、生成するNADHを340nmの吸光波長にて測定した。タンパク質定量法はBradford法で行った。結果は図９に示すように、野生型PDHでは100μML-チロシン存在下で強く酵素反応が阻害されるのに対し、T260I、254/269では800μMのチロシンでもほとんど阻害を受けなかった。しかし、257/265に変異の入った株に関しては、収率が高いにもかかわらず活性は測定できなかった。
【実施例３】
【００５４】
E.coliのtyrA由来変異型PDH遺伝子の取得〜その３
実施例２とほぼ同様の方法を用いて変異型tyrA 株を取得した。異なる点は、1st/2nd PCR後、PCRプロダクトを混合せずに、各プライマーを用いて得られたPCRプロダクトに対し個別に3rd PCRを行った点である。各プライマーを用いて得られたクローンからそれぞれ3〜10個の株を候補株として取得した。これらの株を（２）と同様の方法で培養、塩基配列分析を行った結果を表４に示す。それぞれ、1種類〜8種類のアミノ酸に置換され、チロシン収率の向上した株が取得できたことが明らかとなった。
【００５５】
【表４】
2006311833.tif 000006
【実施例４】
【００５６】
＜W3110ΔtyrR,tyrAのpheA破壊株の作製＞
プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子（pheA）の欠失は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645] によって行った。この方法によれば、目的とする遺伝子を合成オリゴヌクレオチドの5'側にデザインし、抗生物質耐性遺伝子を３’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドを用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することが出来る。公知の文献[J. Mol. Biol. 180 (4), 1023(1984)] に記載されているpheA遺伝子塩基配列と [Gene. 1982 Oct; 19(3): 327-36.] に記載されているpCE1134のカナマイシン耐性遺伝子NptII遺伝子の配列に基づいて、pheA遺伝子及び鋳型プラスミドに抗生物質耐性を付与する遺伝子のそれぞれに近接する領域に、それぞれ相補的なプライマーを設計した。配列番号13および14に示すような合成DNAプライマーを2本通常の方法で合成した。このプライマーを用いてpCE1134をテンプレートに、PCRを行った。
【００５７】
増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を含むW3110ΔtyrR,tyrA(以下W3110ΔtyrR,tyrA／pKD46と表記する)をエレクトロポレーションするために用いた。プラスミドpKD46[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645] は、アラビノース誘導性ParaBプロモーターに制御されるλRedシステムの遺伝子（λ、β、exo遺伝子）を含むλファージの合計2154塩基のDNAフラグメント（GenBank/EMBL アクセッション番号 J02459, 第31088番目〜33241番目）を含む
。プラスミドpKD46はPCR産物をW3110ΔtyrR,tyrAに組み込むために必要である。
【００５８】
エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。100mg／Lのアンピシリンを含んだLB培地中で30℃、一晩培養したW3110ΔtyrR,tyrA/pKD46を、アンピシリンとL-アラビノース（1mM）を含んだ5mLのLB培地で100倍希釈した。得られた希釈物を30℃で通気しながらOD600が約0.6になるまで生育させた後、氷冷した1mM HEPES(pH7.0)で３回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。エレクトロポレーションは50μＬのコンピテントセルと約100ngのPCR産物を用いて行った。エレクトロポレーション後のセルは１ｍＬのSOC培地[モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook, J.ら、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年）]を加えて37℃で1時間培養した後、LB寒天培地上、37℃で平板培養し、カナマイシン耐性組換え体を選択した。次に、pKD46プラスミドを除去するために、カナマイシン入りのLB寒天培地上、37℃で継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性を試験し、pKD46が脱落しているアンピシリン感受性株を取得した。カナマイシン耐性遺伝子によって識別できるpheA遺伝子の欠失を含む変異体を、PCRによって確認した。pheA遺伝子欠損株W3110ΔtyrR,tyrA,pheA::NptIIの細胞のＤＮＡを鋳型にして得られたPCR産物の長さは野生株より長く、pheA遺伝子内部にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されていることが確認され、pheA遺伝子が欠損されていることを確認できた。カナマイシン耐性遺伝子が挿入されたpheA破壊株をW3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km株と名づけた。
【実施例５】
【００５９】
＜Ｌ−チロシンの発酵生産＞
（１）pMGLの作製
FERM BP-4796に搭載されているpMGAL1（脱感作型aroG4、野生型aroL及び野生型pheAを含むプラスミド）をHindIIIで消化してpheA遺伝子を切り出し、再度ライゲーションを行うことで、脱感作型aroG4と野生型aroLのみがpM119に組み込まれたプラスミドを作製しpMGLと名づけた(図６)。
【００６０】
（２）菌株の作製
実施例４で作製したW3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Kmに実施例1で作製したpSTVtyrA(T260I)、pSTVtyrA(W)、またはpSTV28を導入してW3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/ pSTVtyrA(T260I)、W3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pSTVtyrA(W)、およびこれらの比較対照用にW3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pSTV28を作製した。さらに、pMGLでこれらの株を形質転換して、W3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pMGL/pSTVtyrA(T260I)、W3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pMGL/pSTVtyrA(W)、およびこれらの比較対照用にW3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pMGLを作製した。
【００６１】
（３）Ｌ−チロシンの製造
形質転換株W3110ΔtyrR,tyrA,pheA/pMGL/pSTV28-tyrAをエシェリヒア・コリ L-チロシン生産培地を用いて37度で28時間培養した。その結果を表５及び図７に示す。
分析は、実施例１−（３）と同様の方法で行った。W3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km株では、変異型tyrAを導入することで0.8〜1.0g/Lが3.3〜3.5g/Lと約5倍になり、W3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pMGL株では、変異型tyrAを導入することで3.9g/Lが5.7〜6.0g/Lと約1.5倍の収率向上効果が見られた。さらに、変異型tyrAを導入することで副生物のL-フェニルアラニンが生成されなくなるということが明らかになった。
【００６２】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】プラスミドpSTV28tyrA(mut)の構築を示す図。
【図２】各Ｌ−チロシン濃度におけるPDH活性を示す図。
【図３】tyrA(mut)導入株および対照株を用いたときのＬ−チロシン及びＬ−フェニルアラニンの収率を示す図。なお、各番号は表1と対応している。
【図４】（Ａ）；tyrA遺伝子の変異の位置を示す図。（Ｂ）；プラスミドpSTV28tyrA(T260I)またはpSTV28tyrA(P100S)の構築を示す図。
【図５】tyrA(T260I)導入株および対照株を用いたときのＬ−チロシン及びＬ−フェニルアラニンの収率を示す図。なお、各番号は表2と対応している。
【図６】プラスミドpMGLの構築を示す図。
【図７】tyrA(T260I)導入株、pMGL導入株および対照株を用いたときのＬ−チロシン及びＬ−フェニルアラニンの収率を示す図。なお、各番号は表５と対応している。
【図８】PDHの250番目から270番目のアミノ酸にランダムに変異を導入するためのPCRの模式図。
【図９】各置換体導入株の各チロシン濃度におけるPDH活性を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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