(57)【要約】【課題】  ヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡを特異的に分解するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を利用して肺癌の増殖を抑制する医薬組成物を提供する。【解決手段】  神経内分泌分化を示す肺癌の増殖を抑制するための医薬組成物であって、ヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡ配列からの連続する１９〜２５ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクターを、医薬上許容可能な担体と組み合わせて含む医薬組成物。【選択図】  図１１
2006101707.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経内分泌分化を示す肺癌の増殖を抑制するための医薬組成物であって、ヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡ配列からの連続する１９〜２５ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むｓｉＲＮＡ又はその前駆体をコードするＤＮＡ配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクターを、医薬上許容可能な担体と組み合わせて含む、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記ＤＮＡ配列がヘアピン型ＲＮＡをコードする配列を含み、ここで該ヘアピン型ＲＮＡが前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列を含み、該ヘアピン型ＲＮＡが細胞内ＲＮアーゼであるダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によってプロセシングされてｓｉＲＮＡが形成される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＤＮＡ配列が、その３'末端にポリＴ配列を含む、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ポリＴ配列が１〜６個のＴからなる、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＤＮＡ配列がタンデム型配列を含み、ここで該タンデム型配列が前記センス鎖をコードするＤＮＡ配列と前記アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とを５'→３'方向に連続して含み、各鎖の５'末端にプロモーターが、また各鎖の３'末端にポリＴ配列がそれぞれ連結された配列からなり、細胞内で転写後、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとがハイブリダイズしてｓｉＲＮＡを形成する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ポリＴ配列が１〜６個のＴからなる、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡが配列番号１に示される核酸配列によってコードされる配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＤＮＡ配列が配列番号２又は配列番号３に示される配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ＤＮＡ配列が配列番号４に示される配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記発現ベクターがプラスミド又はウイルスベクターである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記プラスミドがｐＵ６-ｓｉＡＳＨ１Ｌ１−ｐｕｒｏ又はｐＵ６-ｓｉＡＳＨ１Ｌ２−ｐｕｒｏである、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ウイルスベクターがＡＳＨ１−ＲＮＡｉ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓである、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記プラスミドがリポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン及びその他の正電荷リポソームから選択されるリポソームと複合体形成される、請求項１０又は１１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである、請求項１０又は１２記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記プロモーターがＵ６又はＨ１プロモーターである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡ配列からの連続する１９〜２５ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むｓｉＲＮＡ又はその前駆体をコードするＤＮＡ。
【請求項１７】
前記ＤＮＡがヘアピン型ＲＮＡをコードする配列を含み、ここで該ヘアピン型ＲＮＡが前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列を含み、該ヘアピン型ＲＮＡが細胞内ＲＮアーゼであるダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によってプロセシングされてｓｉＲＮＡが形成されるものである、請求項１６記載のＤＮＡ。
【請求項１８】
その３'末端にポリＴ配列を含む、請求項１７記載のＤＮＡ。
【請求項１９】
前記ＤＮＡがタンデム型配列を含み、ここで該タンデム型配列が前記センス鎖をコードするＤＮＡ配列と前記アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とを５'→３'方向に連続して含み、各鎖の５'末端にプロモーターが、また各鎖の３'末端にポリＴ配列がそれぞれ連結された配列からなり、細胞内で転写後、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとがハイブリダイズしてｓｉＲＮＡを形成するものである、請求項１６記載のＤＮＡ。
【請求項２０】
前記ヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡが配列番号１に示される核酸配列によってコードされる配列を含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
【請求項２１】
配列番号２〜４に示されるいずれかの配列を含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
【請求項２２】
請求項１６〜２１のいずれか１項に記載のＤＮＡによってコードされるｓｉＲＮＡ又はその前駆体。
【請求項２３】
配列番号１に示される核酸配列によってコードされるヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡ配列からの連続する１９〜２５ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むｓｉＲＮＡ。
【請求項２４】
前記センス鎖配列が配列番号５に示される配列を含む、請求項２３記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２５】
請求項１６〜２１のいずれか１項に記載のＤＮＡをプロモーターの調節下に含むベクター。
【請求項２６】
前記プロモーターがＵ６又はＨ１プロモーターである、請求項２５記載のベクター。
【請求項２７】
ｐＵ６-ｓｉＡＳＨ１Ｌ１−ｐｕｒｏ、ｐＵ６-ｓｉＡＳＨ１Ｌ２−ｐｕｒｏ又はＡＳＨ１−ＲＮＡｉ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓから選択される、請求項２５又は２６記載のベクター。
【請求項２８】
癌の増殖抑制のために使用される、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２９】
前記癌が肺癌、甲状腺癌又は前立腺癌である、請求項２８記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経内分泌分化を制御するｂａｓｉｃ−ＨＬＨ（Ｈｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ）型の転写因子ＡＳＨ１（ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ−ｌｉｋｅ  １  （ＡＳＣＬ１とも称する））の遺伝子を、肺癌治療の分子標的とすることに関する。具体的には、本発明は、ヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡを特異的に分解するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を利用して肺癌の増殖を抑制するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は小細胞肺癌と非小細胞肺癌に分類され、肺癌の中で特に悪性度が高いと認められている小細胞肺癌は神経内分泌分化という特殊な分化傾向をもつことが知られている。小細胞肺癌は進行性が高く、通常、診断の時点で散在性を示す。この癌は最初、化学療法に反応性であるが、殆どの場合やがて耐性型に戻るため、５年生存率は５％を下回る。小細胞肺癌は進行性挙動と劣悪な治療結果のために、その全身治療に対する新しい治療方法が高く求められている。一方、非小細胞肺癌は神経内分泌分化を示すことは少ないが、非小細胞肺癌のなかでも大細胞肺癌はこの神経内分泌分化を示すことが比較的多く、そのような癌はやはり予後不良とされる。又、大細胞肺癌以外の非小細胞肺癌も神経内分泌分化傾向を示すことが少数ながら認められ、やはり予後不良とされる。したがって、この神経内分泌分化が肺癌の悪性度と関連している可能性が強く示唆される。
【０００３】
神経内分泌分化の誘導は神経細胞系の分化と相似し、特殊なＡＳＨ１の関与がショウジョウバエ、マウス等の種を用いて基礎的研究から解明されてきている。上記の神経内分泌分化を有する肺癌ではＡＳＨ１の発現が亢進していることが知られている（Ｄ．Ｗ．  Ｂａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９９３），  ９０：５６４８−５６５２  （非特許文献１）；  Ｈ．  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  （１９９７），  ８：６７７−６８６（非特許文献２））。これに対して、非小細胞肺癌やヒト成人正常組織ではヒトＡＳＨ１転写体が検出されないことが示されている（Ｂ．Ａ．  Ｗｅｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （２００２），  ８：１０８２−１０８６（非特許文献３））。
【０００４】
ＡＳＨ１の遺伝子破壊により、気道上皮の神経内分泌細胞が消失することから、ＡＳＨ１は特に気道上皮における神経内分泌分化に重要な役割を果たしている可能性が指摘されている（Ｒ．Ｉ．  Ｌｉｎｎｏｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２０００），  ６０：４００５−４００９（非特許文献４））。トランスジェニックマウスの実験では、ＡＳＨ１トランスジーンは、単独では癌を発症させないが、ＳＶ４０−ｌａｒｇｅＴ  トランスジェニックマウスと掛け合わせることで、癌遺伝子ＳＶ４０−ｌａｒｇｅＴの造腫瘍能を増強し、神経内分泌腫瘍を発生させる。また、前立腺神経内分泌癌細胞系でマウスＡＳＨ１（ｍＡＳＨ１）発現をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法によってノックダウンすることによって、ｍＡＳＨ１のＤＮＡ結合部位と、神経内分泌細胞増殖、分化及び生存を調節するシグナル伝達ネットワークの成分が提案されている（Ｙ．  Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （２００４），  １０１：５５５９−５５６４（非特許文献５））。さらに、ＡＳＨ１は甲状腺癌でも見出されている（Ｒ．Ｓ．  Ｓｉｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  （２００３），  １３４：８６６−８７１（非特許文献６））。
【０００５】
ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によってその配列特異的にｍＲＮＡが分解されて遺伝子の発現が抑制される現象をいう（多比良和誠ら、実験医学（２００４）２２巻４号４５０−５００頁（非特許文献７））。ｄｓＲＮＡが細胞内のダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によってプロセシングされた約２１塩基のｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ−ヌクレアーゼ複合体の形成を誘導し、そのｓｉＲＮＡ配列に相補的な配列をもつｍＲＮＡを選択的に分解する（Ｓ．Ｍ．  Ｈａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （２０００），  ４０４：２９３−２９６（非特許文献８））。ＲＮＡｉは線虫、ショウジョウバエ、植物など多くの真核生物で確認されており、またｓｉＲＮＡ  ｏｌｉｇｏを細胞内導入することで哺乳類細胞でもＲＮＡｉ効果が得られることが知られている。さらにまた、Ｕ６  プロモーター等の特殊なプロモーターをもつベクターにｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ｏｌｉｇｏを挿入し、ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡを発現させることでも同様にＲＮＡｉが誘導されることが報告されている。ＲＮＡｉの医療への応用のための基礎研究が急速に進行しており、そのターゲットとしてウイルス性疾患、癌、遺伝性疾患などに注目が集まっている（多比良和誠ら、実験医学（２００４）上記；米国特許出願公開第２００４／０１８０３５７号（特許文献１）；米国特許出願公開第２００４／０１８１８２１号（特許文献２））。
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０１８０３５７号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／０１８１８２１号
【非特許文献１】Ｄ．Ｗ．  Ｂａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９９３），  ９０：５６４８−５６５２
【非特許文献２】Ｈ．  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  （１９９７），  ８：６７７−６８６
【非特許文献３】Ｂ．Ａ．  Ｗｅｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （２００２），  ８：１０８２−１０８６
【非特許文献４】Ｒ．Ｉ．  Ｌｉｎｎｏｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２０００），  ６０：４００５−４００９
【非特許文献５】Ｙ．  Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （２００４），  １０１：５５５９−５５６４
【非特許文献６】Ｒ．Ｓ．  Ｓｉｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  （２００３），  １３４：８６６−８７１
【非特許文献７】多比良和誠ら、実験医学（２００４）２２巻４号４５０−５００頁
【非特許文献８】Ｓ．Ｍ．  Ｈａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （２０００），  ４０４：２９３−２９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＡＳＨ１が、マウスによる実験により神経内分泌分化を有する肺癌でＡＳＨ１の発現が亢進していることは知られていた。しかし、ＡＳＨ１の発現を抑えるとき肺癌の増殖が抑制されうるという知見は報告されていない。
【０００８】
本発明の目的は、神経内分泌分化を示す肺癌の増殖をＲＮＡｉ法を利用して抑制するための医薬組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、上記肺癌の増殖を抑制するｓｉＲＮＡ、該ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ、及び該ｓｉＲＮＡを発現するベクターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ヒトＡＳＨ１に対するＲＮＡｉで使用可能なベクターを作製し、それらがヒトＡＳＨ１の発現を非常に強く抑制することを見出した。また、この増殖抑制はｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養細胞の実験だけでなく、アデノウイルス−ＲＮＡｉベクターを用いて、ヒト肺癌を移植した担癌マウスでのｉｎ  ｖｉｖｏ治療実験という、より臨床の癌治療に近いところで実験を行い、同様に肺癌の増殖を抑制し得ることを確認し、本発明を完成させた。本発明により、ヒトＡＳＨ１がヒト肺癌治療において特異性の高い分子標的となり得ることが示された。
【００１１】
本発明は以下の特徴を有する。
即ち、本発明は、第１の態様において、神経内分泌分化を示す肺癌の増殖を抑制するための医薬組成物であって、ヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡ配列からの連続する１９〜２５ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むｓｉＲＮＡ又はその前駆体をコードするＤＮＡ配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクターを、医薬上許容可能な担体と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
前記ＤＮＡ配列の１つの例は、ヘアピン型ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むものである。ここで、前記ＤＮＡ配列はヘアピン型ＲＮＡをコードする配列を含み、該ヘアピン型ＲＮＡが前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列を含み、該ヘアピン型ＲＮＡが細胞内ＲＮアーゼであるＤｉｃｅｒによってプロセシングされてｓｉＲＮＡが形成されるものである。
【００１３】
本発明において、前記ＤＮＡ配列は、オーバーハングとして又は転写停止配列としてその３'末端にポリＴ配列を含むことが好ましい。前記ポリＴ配列は、１〜６個、好ましくは１〜５個であり、転写停止シグナル配列として４〜５個のチミジン（Ｔ）が連結されることが好ましい。
【００１４】
前記ＤＮＡ配列の別の例は、タンデム型配列を含むものであり、ここで該タンデム型配列が前記センス鎖をコードするＤＮＡ配列と前記アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とを５'→３'方向に連続して含み、各鎖の５'末端にプロモーターが、また各鎖の３'末端にポリＴ配列がそれぞれ連結された配列からなり、細胞内で転写後、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとがハイブリダイズしてｓｉＲＮＡを形成するものである。ここでポリＴ配列は上記と同義である。
【００１５】
本発明の実施形態において、前記ヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡは、配列番号１に示されるヒトＡＳＨ１核酸配列によってコードされる配列を含む。即ち、前記ＲＮＡ配列は、前記核酸配列において、すべてのＴをウラシル（Ｕ）に読み替えた配列に相当する。
【００１６】
本発明の実施形態において、前記ヘアピン型ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の例は、配列番号２又は配列番号３に示される配列を含むものである。
【００１７】
本発明の別の実施形態において、前記タンデム型ＤＮＡ配列の例は、配列番号４に示される配列を含むものである。
【００１８】
前記発現ベクターの例は、プラスミド又はウイルスベクターである。プラスミドの例は、ｐＵ６-ｓｉＡＳＨ１Ｌ１−ｐｕｒｏ又はｐＵ６-ｓｉＡＳＨ１Ｌ２−ｐｕｒｏである（図１２）。またウイルスベクターの例は、ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓである（図１３）。
【００１９】
前記プラスミドは、遺伝子導入の際に、リポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン及びその他の正電荷リポソームから選択されるリポソームと複合体形成されるのが好ましい。
【００２０】
前記ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである。
前記プロモーターの例は、哺乳類、特にマウス又はヒトＵ６又はＨ１プロモーターである。
【００２１】
本発明はまた、第２の態様において、ヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡ配列からの連続する１９〜２５ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むｓｉＲＮＡ又はその前駆体をコードするＤＮＡを提供する。
【００２２】
前記ＤＮＡの例は、ヘアピン型ＲＮＡをコードする配列を含むＤＮＡであり、ここでヘアピン型ＲＮＡは前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列からなり、該ヘアピン型ＲＮＡが細胞内ＲＮアーゼであるＤｉｃｅｒによってプロセシングされてｓｉＲＮＡが形成されるものである。好ましくは、ヘアピン型ＲＮＡはその３'末端にポリＵ配列を含む。
【００２３】
前記ＤＮＡの別の例は、タンデム型ＤＮＡ配列を含むものであり、ここで該タンデム型配列が前記センス鎖をコードするＤＮＡ配列と前記アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とを５'→３'方向に連続して含み、各鎖の５'末端にプロモーターが、また各鎖の３'末端にポリＴ配列がそれぞれ連結された配列からなり、細胞内で転写後、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとがハイブリダイズしてｓｉＲＮＡを形成するようなものである。
前記ヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡの特定の例は、配列番号１に示されるヒトＡＳＨ１  核酸配列によってコードされる配列を含むものである。
【００２４】
本発明のＤＮＡの例は、配列番号２〜４に示されるいずれかの配列を含むものである。
本発明はさらに、第３の態様において、上に定義のＤＮＡによってコードされるｓｉＲＮＡ又はその前駆体を提供する。
【００２５】
本発明の実施形態により、配列番号１に示される核酸配列によってコードされるヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡ配列からの連続する１９〜２５ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むｓｉＲＮＡを提供する。特に制限はされないが、本発明のｓｉＲＮＡの例は、配列番号５に示されるセンス鎖配列を含む下記の二本鎖ＲＮＡ配列である。
ＧＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧＵＣＡＡＧＣＧＡＣＡＧ  （センス鎖）
ＣＧＧＧＵＵＣＧＵＵＣＡＧＵＵＣＧＣＵＧＵＣ  （アンチセンス鎖）
【００２６】
本発明はさらにまた、第４の態様において、上に定義のＤＮＡをプロモーターの調節下に含むベクターを提供する。プロモーターの例は、哺乳類、特にマウス又はヒトＵ６又はＨ１プロモーターである。
【００２７】
ベクターの特定の例は、ｐＵ６-ｓｉＡＳＨ１Ｌ１−ｐｕｒｏ、ｐＵ６-ｓｉＡＳＨ１Ｌ２−ｐｕｒｏ又はＡＳＨ１−ＲＮＡｉ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ（図１２及び図１３）である。
【００２８】
本発明のベクターは、癌の増殖抑制のために使用することができる。癌の例は、肺癌、甲状腺癌又は前立腺癌である。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、神経内分泌分化を示すヒト肺癌においてヒトＡＳＨ１の発現レベルが強く抑制されること、及び肺癌の増殖がｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍特異的に抑制されることから、本発明はヒト肺癌の治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、神経内分泌分化を示す、或いは神経内分泌型の、ヒト肺癌を治療するために有効である。本発明の標的である肺癌の例は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌に分類される大細胞肺癌、などである。これらの肺癌では、ＡＳＨ１の発現が異常亢進しており、一般に悪性度が高く予後が不良であることが特徴である。
【００３１】
ＡＳＨ１は、ｂａｓｉｃ−ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ型の転写因子であり、ゲノムＤＮＡのＥボックス（５'-ＣＡＮＮＴＧ-３'）に結合することによって転写を活性化する。ヒトＡＳＨ１遺伝子はヒト12番染色体１２ｑ２２−ｑ２３に位置し、その核酸配列は配列番号１に示される１６３５ヌクレオチドからなる。４３３〜１１４９番目に転写因子活性が存在し、また７９６〜９４８番目にｂａｓｉｃ  ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘドメインが存在する。
【００３２】
本発明によれば、特にヒト肺癌細胞内のＡＳＨ１の発現を強く抑制し、その結果癌細胞の増殖を抑制する。また、肺癌に加えて、ＡＳＨ１の存在が確認される前立腺癌、甲状腺癌を含むヒト神経内分泌型癌に対しても同様の増殖抑制を示すことが期待される。
【００３３】
本発明によれば、ヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡを分解するのに有効なｓｉＲＮＡを、癌の増殖抑制のために使用することによって特徴付けられる。ｓｉＲＮＡは、ヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡの部分配列と相同の配列をもつセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列を含む二本鎖ＲＮＡである。本明細書中で使用されるｓｉＲＮＡの「前駆体」は、センス鎖とアンチセンス鎖の各配列を含み、細胞内でｓｉＲＮＡに変換される。センス及びアンチセンスの各鎖を構成するヌクレオチド数は、約１８〜２７であり、好ましくは約１９〜２５、さらに好ましくは２０〜２３である。細胞内に導入された、又は細胞内でその前駆体から形成された、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ-ヌクレアーゼ複合体（ＲＮＡ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｃｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ：  ＲＩＳＣ）の形成を誘導し、それによってヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡが選択的に分解され、ＡＳＨ１の発現が阻止又は抑制される。
【００３４】
したがって、本発明のｓｉＲＮＡは、ヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡ配列からの連続する１９〜２５ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含む。
【００３５】
本明細書中で使用する「選択的スプライス型ＲＮＡ」とは、転写によって形成されたｍＲＮＡ前駆体が成熟ｍＲＮＡにスプライシングされるときに、通常のスプライス部位と異なる部位での切断の結果生じるｍＲＮＡを意味する。本発明では、このような選択的スプライス型ＲＮＡを、通常の配列を有するヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡと区別している。
【００３６】
本発明の実施形態によれば、ヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡは、配列番号１に示される核酸配列によってコードされるＲＮＡ配列である。即ち、該ＲＮＡ配列は、該核酸配列中のすべてのＴがＵに読み替えられた配列に相当する。このＲＮＡ又は核酸配列から可能なｓｉＲＮＡ配列を決定する。該ｍＲＮＡのターゲットサイトの選択のために公知の知識を使用することができる。例えば、（ａ）ＧＣ含量が約３０〜約７０％、好ましくは約５０％である、（ｂ）すべての塩基が均等であり、またＧが連続していない、（ｃ）アンチセンス鎖の５'末端の塩基がＡ、Ｕである、などの基準が参考になろう（Ｄ．Ｍ．  Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  （２００３），  ７７：７１７４−７１８１；  Ａ．  Ｋｈｖｏｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  （２００３），  １１５：２０９−２１６）。また、標的候補のｍＲＮＡ配列部位とマイクロＲＮＡの結合程度をＲＮＡ二次構造予測プログラムであるｍｆｏｌｄを用いて候補遺伝子を推定することもできる（Ｊ．Ａ．  Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （１９８９），  １８３：２８１−３０６；Ｄ．Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９），２８８：９１１−９４０）。この二次構造予測において、ヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡ構造のなかで常に同じ構造でかつ開放されている構造部分を選択した。本発明における選択されたｓｉＲＮＡの特定のセンス鎖配列の例は、配列番号５に示される配列である。また本発明の別の可能なｓｉＲＮＡのセンス鎖配列の例（ただし、ＤＮＡで示す。）は下記のものである。これらのセンス鎖配列（Ｔ→Ｕ）とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列を含むｓｉＲＮＡのいずれも本発明に包含される。
【００３７】
ＧＧＣＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧＴＡＡＧ  （配列番号６）
ＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＧ  （配列番号７）
ＣＣＧＣＧＴＣＡＡＧＴＴＧＧＴＣＡＡＣＣＴＧ  （配列番号８）
ＧＣＴＣＧＣＣＧＧＴＣＴＣＡＴＣＣＴＡＣＴＣ  （配列番号９）
ＣＡＧＣＧＣＴＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＣＧＡＡＣ  （配列番号１０）
ＣＧＣＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣ  （配列番号１１）
ＴＧＧＴＣＡＡＣＣＴＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＡＣ  （配列番号１２）
ＣＴＣＣＡＡＣＧＡＣＴＴＧＡＡＣＴＣＣＡＴＧ  （配列番号１３）
ＧＴＣＡＧＣＧＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧ  （配列番号１４）
ＣＣＧＧＣＴＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＴＴＴ  （配列番号１５）
ＣＡＣＡＡＧＴＣＡＧＣＧＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧ  （配列番号１６）
ＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧ  （配列番号１７）
ＡＧＧＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡ  （配列番号１８）
ＣＧＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ  （配列番号１９）
ＣＧＣＣＧＧＴＣＴＣＡＴＣＣＴＡＣＴＣＧＴＣ  （配列番号２０）
ＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣ  （配列番号２１）
ＣＧＧＣＴＣＧＣＣＧＧＴＣＴＣＡＴＣＣＴＡＣ  （配列番号２２）
ＣＧＣＣＣＧＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴＣＴＴＴＧＣ  （配列番号２３）
ＣＣＧＣＣＣＧＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴＣＴＴＴＧ  （配列番号２４）
【００３８】
本発明ではさらに、選択されたｓｉＲＮＡ配列について、標的ｍＲＮＡの切断を可能にするかぎり、そのセンス鎖配列に１〜３個、好ましくは１〜２個までの変異を含むことができる。変異は、もしあれば、５'側にあるのが好ましく、中央から３'側での変異は失活の原因となりやすい。変異の例は、ヌクレオチドの置換、付加又は欠失を含む。あるいは、天然型の配列との相同率が８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上であるような変異である。変異の導入は、例えば慣用の部位特異的突然変異法を使用することができる。
【００３９】
選択されたｓｉＲＮＡは、臨床使用の際にいわゆるｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を示さないことが望ましい。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果とは、標的遺伝子以外に、使用したｓｉＲＮＡに部分的にホモロジーのある別の遺伝子の発現を抑制する作用をいう。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けるために、候補ｓｉＲＮＡについて、予めジーンチップなどを利用して交差反応がないことを確認するのがよい。
【００４０】
本発明のｓｉＲＮＡを生体内で使用するときには、ｓｉＲＮＡを直接患部に注入するか、或いはｓｉＲＮＡの発現が可能なベクターを使用することが好ましい。
ｓｉＲＮＡを直接患部に注入する場合には、それらをリポソーム、たとえばリポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン及びその他の正電荷リポソームと複合体形成して注入することもできる。
【００４１】
本発明で使用可能なヘアピン型ＲＮＡは、前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列を含むものであり、細胞内ＲＮアーゼであるＤｉｃｅｒによってプロセシングされてｓｉＲＮＡが形成されるＲＮＡである。ｓｉＲＮＡをコードするヘアピン型ＤＮＡの３'末端には、転写停止シグナル配列として、或いはオーバーハングのために、１〜６個、好ましくは１〜５個のＴからなるポリＴ配列、たとえば４個又は５個のＴからなるＴＴＴＴ又はＴＴＴＴＴが連結される。ベクターＤＮＡから転写されたｓｉＲＮＡ前駆体としてのｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、そのアンチセンス鎖の３'末端に２〜４個のＵからなるオーバーハングを有することが望ましく（図１）、オーバーハングの存在によって、センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡはヌクレアーゼによる分解に対して安定性を増すことができる。ヒトには内在性のＤｉｃｅｒが１つ存在し、これが長鎖ｄｓＲＮＡや前駆体マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をそれぞれｓｉＲＮＡと成熟ｍｉＲＮＡに変換する役割をもつ。本発明における前記ループ配列の例は、５'-ＣＵＵＣＣＵＧＵＣＡ-３'又は５'-ＵＵＣＣＡＧ-３'であるが、これらに限定されず公知のループ配列も使用できる。
【００４２】
本発明の別のＤＮＡの例は、タンデム型ＤＮＡであり、これは前記センス鎖をコードするＤＮＡ配列と前記アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とを５'→３'方向に連続して含み、各鎖の５'末端にプロモーターが、また各鎖の３'末端にポリＴ配列がそれぞれ連結された配列からなり、細胞内で転写後、同時に生成したセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとが一緒にハイブリダイズしてｓｉＲＮＡを形成するようなＤＮＡである。ポリＴ配列は、上記と同様に、転写停止シグナル配列としての１〜５個、特に４〜５個のＴからなることが好ましい。また、ヘアピン型と同様に、生成するｓｉＲＮＡは、センス及び/又はアンチセンス鎖の３'末端に２〜４個のＵからなるオーバーハングを有していてもよい。
【００４３】
本発明のＤＮＡの特定例は、配列番号２〜４に示されるような配列を含む次のようなＤＮＡである。
（ａ）５'-ＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＧＡＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＧＣＴＴＧＡＣＴＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＴＴＴＴ-３'（配列番号２）
（ｂ）５'-ＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＧＡＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＴＣＧＣＴＴＧＡＣＴＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＴＴＴＴ-３'（配列番号３）
（ｃ）５'-（マウスＵ６プロモーター配列）-ＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＧＡＣＡＧＴＴＴＴＴ-（マウスＵ６プロモーター配列）-ＣＴＧＴＣＧＣＴＴＧＡＣＴＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＴＴＴＴ-３'（配列番号４）
（下線はセンス又はアンチセンス鎖配列を示す。なお、配列番号４の配列中、１〜３１５及び３４２〜６５６は共にマウスＵ６プロモーター配列、３１６〜３３６はセンス鎖配列、６５７〜６７８はアンチセンス鎖配列、３３７〜３４１及び６７９〜６８３はともに転写停止シグナル配列であり、またベクターの合成の際には、プロモーター配列とセンス又はアンチセンス鎖配列との境界、或いは、プロモーター配列の５'末端、には制限部位を付加又は挿入することもできる。）
【００４４】
また、本発明の上記定義のＤＮＡにおいて、配列番号６〜２４の各々のセンス配列が配列番号５のセンス配列と置換されたようなＤＮＡも、本発明に包含される。
【００４５】
本発明のＤＮＡは、化学的に又は組換え的に周知の方法で合成することができる。ヌクレオチド数を考慮すると、慣用のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を使用して化学的に合成するのがよい。あるいは、ｓｉＲＮＡ関連の受託合成会社（たとえばフナコシ株式会社、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社、Ａｍｂｉｏｎ社など）に合成を依頼することも可能である。
【００４６】
本発明のＤＮＡは、実際にベクター中に組み込まれ、適当なプロモーターの調節下でＲＮＡに転写される。本発明で使用されるベクターには、プラスミド及びウイルスベクターが含まれる。
【００４７】
プロモーターとしてｐｏｌＩＩＩプロモーター、たとえばヒトもしくはマウスＵ６プロモーター及びＨ１プロモーター、及びサイトメガロウイルスプロモーターを使用することができる。
【００４８】
プラスミドベクターは、後述の実施例に記載の手法又は文献記載の方法を用いて調製してもよいし、或いは市販のベクター系、たとえばｐｉＧＥＮＥＴＭＵ６系ベクター及びｐｉＧＥＮＥＴＭＨ１系ベクター（タカラバイオ株式会社）を利用することもできる（Ｔ．Ｒ．  Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００２），  ２９６：５５０−５５３；  Ｎ．Ｓ．  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  （２００２），  ２０：５００−５０５；Ｍ．  Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｔａｉｒａ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （２００２），  ２０：４９７−５００；  Ｐ．Ｊ．  Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  （２００２），  １６：９４８−９５８；  Ｔ．  Ｔｕｓｃｈ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  （２００２），  ２０：４４６−４４８；  Ｃ．Ｐ．  Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００２），  ２０：５０５−５０８；  多比良和誠ら編、ＲＮＡｉ実験プロトコール、羊土社、２００３年）。
【００４９】
具体的には、ｐＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ２  （ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）からＩＲＥＳ領域を含む不要な部分をＨｉｎｄＩＩＩにて切断し、ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎさせて、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから直接ピューロマイシン耐性遺伝子を発現するｐＣＭＶ−ｐｕｒｏベクターを作製し、このｐＣＭＶ−ｐｕｒｏのＮｒｕＩ−ＢｇｌＩＩ  部位（ＣＭＶプロモーターの５’上流部位）に、オリゴ挿入部位として制限酵素ＡｐａＩ及びＥｃｏＲＩ切断部位を３'にもつＵ６プロモーターを挿入する。この手法によって、Ｕ６プロモーターから細胞内でｓｉＲＮＡになるｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現し、同時にピューロマイシン耐性遺伝子を発現することができるプラスミドベクター、ｐＵ６−ｓｉＡＳＨ１Ｌ１−ｐｕｒｏ又はｐＵ６−ｓｉＡＳＨ１Ｌ２−ｐｕｒｏを得ることができる。
【００５０】
プラスミドベクターは一般に、本発明のｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列及びプロモーターの他に、薬剤耐性遺伝子（たとえばピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子）、転写停止配列、ユニーク制限部位もしくはマルチプルクローニングサイト、複製開始点、シャイン−ダルガルノ配列などを含むことができる。
【００５１】
一方、ウイルスベクターは、たとえばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター（白血病ウイルスベクターなど）、ヘルペスウイルスベクターなどを使用することができる。ウイルスベクターは、ヒトに使用する際に疾病を引き起こさないように例えば自己複製能を欠損したタイプのものが好ましい。たとえばアデノウイルスベクターの場合には、Ｅ１遺伝子及びＥ３遺伝子を欠失した自己複製能欠損型アデノウイルスベクター（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＡｄｅｎｏ−Ｘ）を使用することができる。ウイルスベクターの構築方法には、後述の実施例に記載の手法及び文献記載の方法を利用することができる（米国特許第５２５２４７９号、国際公開ＷＯ９４／１３７８８など）。
【００５２】
具体的には、ＣＭＶプロモーターを含むＡｄｅｎｏ−Ｘ  発現系を使用して目的のベクターを構築することができる。ｐＳｈｕｔｔｌｅ２のＣＭＶ−ＭＣＳ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）−ｐｏｌｙＡ部位を切除し、上記例示のＡＳＨ１−ＲＮＡｉプラスミドベクターのＡＳＨ１−ｓｈＲＮＡを含むＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片を挿入し、ＲＮＡｉ用のシャトルベクターに改変した後、制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−Ｓｃｅ−Ｉで切断後、Ａｄｅｎｏ−ＸウイルスＤＮＡと結合し、ＡＳＨ１-ＲＮＡｉ-アデノウイルスベクターを得ることができる。このベクターＤＮＡを、通常のアデノウイルス産生用細胞ＨＥＫ２９３に遺伝子導入し、生じたプラークの中から、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔで十分なＡＳＨ１−ｓｉＲＮＡの発現を認めたクローンを選択する。
【００５３】
上記のようにして作製されたベクターは、神経内分泌分化を示すヒト癌、たとえば肺癌、前立腺癌及び甲状腺癌、好ましくは肺癌の治療のために使用することができる。
【００５４】
プラスミドベクターは、リポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン及びその他の正電荷リポソームから選択されるリポソームと複合体を形成しカプセル化された状態で患部に直接注入することができる（中西守ら、蛋白質  核酸  酵素（１９９９）、４４：１５９０−１５９６）。正電荷リポソームによる遺伝子導入では、ＤＮＡが細胞内にエンドサイトーシスされたのち、エンドソームと核膜との融合が起こり、ベクターが核へ移行する。
【００５５】
一方、ウイルスベクターについては患部にベクターを直接注入し細胞感染させることによって細胞内に遺伝子導入することができる（Ｌ．  Ｚｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （２００３），  １００：７７７９７−７８０２；  Ｈ．  Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  （２００２），  ２０：１００６−１０１０；  Ｘ．Ｆ．  Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （２００３），  １００：１８３−１８８；  Ｇ．Ｍ．  Ｂａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．，  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （２００２），  ９９：１４９４３−１４９４５；  Ｊ．Ｄ．  Ｈｏｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  （２００３），  ９：１５３９−１５４４）。特にアデノウイルスベクターは種々の細胞種に非常に高い効率で遺伝子導入可能であることが確認されており、また遺伝子治療のために実際に臨床応用されている。このベクターはまた、ゲノム中に組み込まれることがないため、その効果は一過的であり安全性も他のウイルスベクターと比べて高いと考えられる。
【００５６】
したがって、本発明はさらに、上記発現ベクター又は上記ｓｉＲＮＡを医薬上許容可能な担体と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。
【００５７】
本発明の医薬組成物に含まれるベクター中にコードされるｓｉＲＮＡ核酸の投与量は、特に限定されないが、０．１ｎＭ〜１０μＭ、好ましくは１〜１００ｎＭ、さらに好ましくは５〜５０ｎＭである。投与量は、治療有効量であり、また一定の時間的間隔で複数回投与することもできる。実際には、患者の状態、年齢、性別、重篤度などに応じて専門医の判断により投与量が決定されるべきである。
【００５８】
本発明のベクターは、医薬上許容可能な担体、たとえば生理食塩水、緩衝液など、と一緒に患者に投与される。医薬組成物にはさらに、安定剤、保存剤、等張化剤などを含有させることができる。本発明の医薬組成物の投与方法については、特に制限はないが、局所投与又は非局所投与のいずれでも実施しうる。局所投与の場合、気管支鏡等の内視鏡下、或いは外科手術にて患部を露出し、癌組織に注射器等の手段で直接ベクターを投与することができる。非局所投与の場合、たとえば腫瘍栄養血管（たとえば気管支動脈）内投与で行うことができる。好ましくは、局所投与である。投与形態としては、たとえばウイルスベクター、又はプラスミドとリポソームの複合体、を医薬上許容可能な担体に懸濁させた形態で投与される。
【００５９】
本発明により、肺癌のサイズが有意に、たとえば約６０％以上縮小される。また、本発明により、同様に、ＡＳＨ１の発現が知られる神経内分泌分化型の甲状腺癌及び前立腺癌に対しても本発明のベクターが有効であるはずである。
【００６０】
本発明はしたがって、上記の医薬組成物を患者に投与することを含む、神経内分泌分化型のヒト癌、特に肺癌、甲状腺癌又は前立腺癌を治療する方法、特に前記癌の増殖を抑制する方法をも提供する。投与量及び投与方法は、上と同様である。
【００６１】
下記の実施例の実験から判明した結果を以下に要約する。
１）肺癌細胞株Ａ５４９にＡＳＨ１発現ベクターとＡＳＨ１−ＲＮＡｉプラスミドとを、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて遺伝子導入し、ピューロマイシンを含む培地中で遺伝子導入された細胞だけを選択した。ピューロマイシン選択後に細胞抽出液を作製し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔにて、ＡＳＨ１蛋白の発現量を調べた。その結果、本発明のｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ｏｌｉｇｏによるＡＳＨ１  ＲＮＡｉは、強いＲＮＡｉ作用を示し、ＡＳＨ１の発現レベルを強く抑制した（図１〜５）。
【００６２】
２）ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ−ｐｌａｓｍｉｄ（ｐＵ６−ｓｉＡＳＨ１Ｌ１−ｐｕｒｏ又はｐＵ６−ｓｉＡＳＨ１Ｌ２−ｐｕｒｏ）を、肺癌細胞株（ＡＳＨ１陽性３株・陰性３株）に遺伝子導入し、ピューロマイシンにて遺伝子導入された細胞だけを選択し、コロニー形成能（細胞増殖能）解析及び一部の細胞でＦＡＣＳ解析を行った。コロニー形成能では、ＡＳＨ１  ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ｏｌｉｇｏの無い、ｅｍｐｔｙ  ＲＮＡｉ−ｐｌａｓｍｉｄも同時に遺伝子導入を行い、ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ−ｐｌａｓｍｉｄと比較検討した。その結果、ＡＳＨ１陰性肺癌細胞株３株は全例ｅｍｐｔｙ  ＲＮＡｉ  ｐｌａｓｍｉｄと比較して優位な差異を示さなかったが、一方、ＡＳＨ１陽性３株では全例で、約６０％〜約９０％の抑制率で顕著な増殖抑制が認められた。ＡＳＨ１（＋）−肺腺癌（ＶＭＲＣ−ＬＣＤ）でも増殖抑制が確認された（図６）。
【００６３】
ＦＡＣＳ解析を行ったところ、ＡＳＨ１陽性細胞ではＲＮＡｉ法によりＡＳＨ１遺伝子の発現を阻害すると、Ｇ１／Ｇ２での細胞周期停止とｓｕｂ−Ｇ１の増加（細胞死誘導）が見られた（図７）。この細胞周期停止は、ＲＮＡｉの標的部位にｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎを導入したＡＳＣＬ１を発現させることで解除され、ＲＮＡｉ部位特異的効果（即ち、ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔでなくＡＳＨ１に対する特異的ＲＮＡｉ効果）であることが確認された（図８）。
【００６４】
３）作製されたＡＳＨ１−ＲＮＡｉアデノウイルスベクター（図９）を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖抑制効果の検討では、ＡＳＨ１陽性の肺癌ＬＮＭ３５では増殖の抑制が見られ、ＡＳＨ１陰性のＡ５４９では無効であった。ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ−ｐｌａｓｍｉｄと同様に、ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ−アデノウイルスでもＡＳＨ１発現特異的に増殖抑制が認められた（図１０）。
【００６５】
４）ＡＳＨ１−ＲＮＡｉアデノウイルスベクターによる、マウス移植肺癌でのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果の検討では、ＡＳＨ１陽性ＬＮＭ３５では増殖の抑制が見られ、ＡＳＨ１陰性のＡＣＣ−ＬＣ−１７６では無効であった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの検討と同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏでもＡＳＨ１発現特異的に増殖抑制が認められた（図１１）。
【００６６】
本発明を以下の実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されないものとする。また、実施例及び図面で使用される細胞株の名称について、通称名と正式名は以下のとおりである。
（通称名）        （正式名）
ＳＫ３：    ＡＣＣ−ＬＣ−１７２
ＹＳ：      ＡＣＣ−ＬＣ−９１
ＫＳ：      ＡＣＣ−ＬＣ−１７６
【実施例１】
【００６７】
ＡＳＨ１ｍＲＮＡターゲット部位の選択とＲＮＡｉベクターの作製
（１）ＡＳＨ１  ＲＮＡｉ用のｓｈｏｒｔ−ｈａｉｒｐｉｎオリゴ
記載される方法（Ｄ．Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９），２８８：９１１−９４０）を利用して、ヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡの二次構造からＡＳＨ１  ＲＮＡｉのターゲット部位を予測、選択し（図３）、次の２つの二重鎖オリゴを外部の合成委託会社に依頼して合成した。
ｐＵ６−ｓｉＡＳＨ１Ｌ１−ｐｕｒｏに挿入されるオリゴ１：
5’-CCCAAGCAAGTCAAGCGACAGTTCCAGCTGTCGCTTGACTTGCTTGGGCTTTTTTG-3’
3’-GGGTTCGTTCAGTTCGCTGTCAAGGTCGACAGCGAACTGAACGAACCCGAAAAAACTTAA-5’
（左端はｂｌｕｎｔでＡｐａＩ  ＋  Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに対応し、右端はＥｃｏＲＩ断端に対応する）
ｐＵ６−ｓｉＡＳＨ１Ｌ２−ｐｕｒｏに挿入されるオリゴ２：
5’-CCCAAGCAAGTCAAGCGACAGCTTCCTGTCACTGTCGCTTGACTTGCTTGGGCTTTTTG-3’
3’-GGGTTCGTTCAGTTCGCTGTCGAAGGACAGTGACAGCGAACTGAACGAACCCGAAAAACTTAA-5’
（同様に左端はｂｌｕｎｔ、右端はＥｃｏＲＩ断端に対応する。）
上記配列中のセンス、アンチセンス、ループの位置は下記のとおりである。
（オリゴ１）
５'-ＧＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＧＡＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＧＣＴＴＧ
（ＡＳＨ１センス）                                    （ループ）
ＡＣＴＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＴＴＴＴＧ-３'
（ＡＳＨ１アンチセンス）
（オリゴ２）
５'-ＧＣＣＣＡＡＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＧＡＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＴＣＧ
（ＡＳＨ１センス）                                        （ループ）
ＣＴＴＧＡＣＴＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＴＴＴＴＧ-３'
（ＡＳＨ１アンチセンス）
（上記オリゴ１及びオリゴ２の配列中、ＴＴＴＴＴは転写停止シグナル配列である。）
【００６８】
（２）ベクターの作製
Ｉ．ＲＮＡｉプラスミドベクター
１）ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子発現ベクターｐＣＭＶ−ｐｕｒｏの作製
ｐＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ２  （ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）からＩＲＥＳ領域を含む不要な部分をＨｉｎｄＩＩＩにて切断し、自己連結（ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）させて、ＣＭＶプロモーターから直接ピューロマイシン耐性遺伝子を発現するｐＣＭＶ−ｐｕｒｏベクターを作製した。
【００６９】
２）マウスＵ６プロモーター
ベクターによるＲＮＡｉとして、Ｕ６遺伝子プロモーターを用いることは公知であり（Ｇｕａｎｇｃｈａｏ  Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ‘Ａ  ＤＮＡ  ｖｅｃｔｏｒ−ｂａｓｅｄ  ＲＮＡｉ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ’  ＰＮＡＳ（２００２），  ９９：５５１５−５５２０）、それに従いＲＮＡｉマウスゲノムからＵ６遺伝子プロモーターを単離しｐＢＳＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ部位に挿入した。慣用のｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発法にてＡｐａＩ切断部位を転写開始点に導入した。Ｕ６プロモーター転写開始点からＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶの制限部位構成となる（配列番号２５）。
【００７０】
３）ピューロマイシン（ｐｕｒｏ）耐性ＲＮＡｉベクター
１）のｐＣＭＶ−ｐｕｒｏのＮｒｕＩ−ＢｇｌＩＩ部位（ＣＭＶプロモーターの５’上流部位）に、２）のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片（Ｕ６プロモーター−ＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩ断片）を挿入した。これによりこの１個のベクターで、Ｕ６プロモーターから（細胞内でｓｉＲＮＡになる）ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現し、同時にピューロマイシン耐性遺伝子を発現させることができる。
【００７１】
ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ用のｓｈＲＮＡ発現のために、図１のＲＮＡｉ部位が逆方向に繰り返す二本鎖ＤＮＡオリゴをＡｐａＩ（＋Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙ処理）−ＥｃｏＲＩ切断部位に挿入した。このようにして、ｐＵ６−ｓｉＡＳＨ１−ｐｕｒｏベクターとして、ｐＵ６−ｓｉＡＳＨ１Ｌ１−ｐｕｒｏ及びｐＵ６−ｓｉＡＳＨ１Ｌ２−ｐｕｒｏベクターを作製した（図１２）。
【００７２】
ＩＩ．ＲＮＡｉ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓベクター
通常のＣＭＶプロモーターから通常遺伝子を発現するＡｄｅｎｏ−Ｘ発現系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を改変した。Ａｄｅｎｏ−Ｘ系では、発現させる遺伝子のｃＤＮＡを、ｐＳｈｕｔｔｌｅ２ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に挿入し、そのｐＳｈｕｔｔｌｅ２ベクターとＡｄｅｎｏ−ＸウイルスＤＮＡとを（ともに制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−Ｓｃｅ−Ｉで切断後に）結合し、目的遺伝子発現ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡとなる。今回はｐＳｈｕｔｔｌｅ２のＣＭＶ−ＭＣＳ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）−ｐｏｌｙＡ  ｓｉｔｅを切除し、上記ＩのＡＳＨ１−ＲＮＡｉプラスミドベクターの（ＡＳＨ１−ｓｈＲＮＡを含む）ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片を挿入し、ＲＮＡｉ用のＳｈｕｔｔｌｅベクターに改変した。その後、型の通りに制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−Ｓｃｅ−Ｉで切断後、Ａｄｅｎｏ−ＸウイルスＤＮＡと結合し、ＡＳＨ１に対するＲＮＡｉ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓベクターとした（図１３）。
【００７３】
このベクターＤＮＡ（ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、空のＵ６−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、及び  通常のＣＭＶプロモーターからＬａｃＺ遺伝子を発現するＬａｃＺ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓの３種のＤＮＡを、通常のアデノウイルス産生用細胞ＨＥＫ２９３に遺伝子導入し、アデノウイルスが産生され生じたプラークを多数単離した。この各プラークに由来しアデノウイルス粒子を含む培養上清（クローン）から、アデノウイルスを増幅した。ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓは、図９のようにノザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ）で十分なＡＳＨ１−ｓｉＲＮＡの発現を認めたクローンを１個選択し、大量のＨＥＫ２９３細胞に感染させ、通常のＣｓＣｌ超遠心法にてアデノウイルス粒子を精製した。
【００７４】
ＩＩＩ．ＡＳＨ１発現ベクター
ヒトＡＳＨ１  ｃＤＮＡ（ＯＲＦ全長）を、ヒト小細胞肺癌細胞株ＡＣＣ−ＬＣ−１７０（通称ＳＡ）のｃＤＮＡからＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲは、rTaq (Takara)を用いてＤＭＳＯ５％存在下で、アニール温度５５℃の３−ｓｔｅｐ  ＰＣＲを実施した。使用したプラーマーは以下のとおりである。
センスプライマー：５'-ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＧＡＡＡＧＣＴＣＴＧＣＣＡＡＧＡＴ-３'
アンチセンスプライマー：５'-ＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＴＣＴＧＡＣＴＣＧＡＧＣＡＧ-３'
そのＰＣＲ産物を通常の遺伝子発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入した。ＡＳＨ１蛋白に対する抗体の使用を容易にするため、ＯＲＦ  ５’にｍｙｃ−ｔａｇをつけた。
【実施例２】
【００７５】
ベクターによる肺癌細胞の増殖抑制効果
（１）ＲＮＡｉによる発現抑制（Ａ５４９）
ＡＳＨ１発現陰性の肺癌細胞株Ａ５４９、約１ｘ１０５  個に対し、ＡＳＨ１発現ベクターとＲＮＡｉ−プラスミドベクターを等量混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて遺伝子導入した。その後ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）（２μｇ／ｍｌ）を添加した牛胎児血清（ＦＢＳ）  ５％添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中で３７℃、４８時間培養した。遺伝子導入された細胞だけが残るので、通常のＳＤＳ−ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで細胞溶解液を作製した。ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）し、９Ｅ１０  ｍｙｃ  ｔａｇ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で、ＡＳＨ１蛋白の発現を検討した。Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔのバンドの濃度をデンシトメトリーで定量して、ＲＮＡｉ効果（つまり、発現抑制効果）を検討した。
【００７６】
その結果、ＡＳＨ１−ＲＮＡｉは、ＡＳＨ１  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ（ｐｃＤＮＡ３-ＡＳＨ１  ｗｔ）の発現を、Ｕ６−ｓｉＡＳＨ１Ｌ１が５％、Ｕ６−ｓｉＡＳＨ１Ｌ２が７％の発現率まで顕著に抑制した。非常に良好なＲＮＡｉ効果が得られた。ＲＮＡｉ抵抗性変異ＡＳＨ１（ｐｃＤＮＡ３−ＡＳＨ１  ｍｕｔ：後述の（３）及び図５参照）の発現はＡＳＨ１−ＲＮＡｉにより全く影響を受けなかった（図２）。
なお、抗ＡＳＨ１抗体でも同様の結果であった。
【００７７】
（２）ｓｉＲＮＡの発現／Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析
肺腺癌に由来する肺癌細胞株２９３Ｔ細胞、ＳＫ３（正式名ＡＣＣ−ＬＣ−１７２）及びＡ５４９へ、ｐＵ６−ｐｕｒｏベクター（Ｕ６−ｅｍｐｔｙ）或いはｐＵ６−ｓｉＡＳＨ１−ｐｕｒｏベクター（Ｕ６−ｓｉＡＳＨ１Ｌ１又はＵ６−ｓｉＡＳＨ１Ｌ２）を、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と混和し、（製造業者の説明書に従って）遺伝子導入した。２９３Ｔは遺伝子導入後２４時間後に、ＳＫ３及びＡ５４９に関してはピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）を含むＦＢＳ５％添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中で３７℃、４８時間選択した後に、ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）にてＲＮＡ回収した。ＲＮＡ（１５μｇ）は１５％ポリアクリルアミドゲル０．５ｘＴＢＥバッファーにて電気泳動し、泳動後にナイロン膜Ｚｅｔａ−ｐｒｏｂｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に電気転写した。得られたＺｅｔａ−ｐｒｏｂｅ膜を、ＡＳＨ１  ＲＮＡｉ部位のオリゴを３２Ｐ−ｇａｍｍａ−ＡＴＰ・Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにて放射能標識したプローブとハイブリダイズした。
【００７８】
その結果、ＡＳＨ１に対するｓｉＲＮＡの強いシグナルが見られ、作製したｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎオリゴ及びベクターがＡＳＨ１−ｓｉＲＮＡ発現ベクターとして良好に作用していることが確認された（図４）。
【００７９】
（３）ＲＮＡｉ抵抗性変異ＡＳＨ１
ＡＳＨ１発現ベクター中のＡＳＨ１の配列の中のＲＮＡｉ部位に、ＰｆｕＴＵＲＢＯ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ＰＣＲを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発法（Ｐａｐｗｏｒｔｈ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（１９９６），９（３）：３-４に記載されるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）使用）にて、アミノ酸変異を起こさないＤＮＡ変異を導入しＲＮＡｉ抵抗性ＡＳＨ１発現ｖｅｃｔｏｒを作製した（図５）。図５中、上段の配列は正常（又は天然）ＤＮＡ配列、下段は変異を導入したＤＮＡ配列をそれぞれ示す。
【００８０】
（４）ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ（ｐｌａｓｍｉｄ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖抑制作用（作用特異性）
図６（Ａ）に示される６種の肺癌細胞株に、ｐＵ６−ｐｕｒｏ（「ｅｍｐｔｙ」）或いはｐＵ６−ｓｉＡＳＨ１−ｐｕｒｏ（「ｓｉＡＳＨ１」）をｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００とともに遺伝子導入し、約１８時間後からピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）を含むＦＢＳ５％添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中で３７℃、約２週間選択培養した。その後Ｔｅｔｒａｃｏｌｏｒ  ＯＮＥ（生化学工業）を加え吸光度測定し、生細胞数の定量を行った。図６（Ａ）はｐＵ６−ｐｕｒｏの細胞数に対するｐＵ６−ｓｉＡＳＨ１−ｐｕｒｏの細胞数の比率を示す。
【００８１】
その結果、ＡＳＨ１を発現している細胞のみに、ＡＳＨ１−ＲＮＡｉで強い増殖抑制が見られた（図６（Ａ））。
【００８２】
さらに、細胞数測定に使用した培養皿をギムザ染色し、生細胞のコロニーを測定した。その結果、ＡＳＨ１を発現しているＣａｌｕ６株では、ＡＳＨ１−ＲＮＡｉにてほとんどコロニーが見られなかった（図６（Ｂ））。
【００８３】
（５）ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ（ｐｌａｓｍｉｄ）の細胞周期停止・細胞死誘導作用
ＡＳＨ１陽性肺癌細胞株ＹＳ（正式名ＡＣＣ−ＬＣ−９１）に、ｐＵ６−ｐｕｒｏ（「Ｕ６ｂｌａｎｋ」又は「Ｕ６ｂ」）或いはｐＵ６−ｓｉＡＳＨ１−ｐｕｒｏ（「ｓｉＡＳＨ１Ｌ１」又は「ｓｉＡＳＨ１Ｌ２」）をｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００とともに遺伝子導入し、約１８時間後からピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）を含むＦＢＳ５％添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中で３７℃、４８時間選択培養した。界面活性剤Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ）０．５％にて細胞融解し、抽出された核をヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ社）で染色し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）にて細胞周期解析を行った。
【００８４】
その結果、ＡＳＨ１−ＲＮＡｉによりＳ期・Ｇ１期の低下及びＧ２Ｍ期の増加が誘導され、細胞周期のＧ２Ｍでの停止が起こることが示された（図７（Ａ））。又、いわゆるｓｕｂ−Ｇ１  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎと呼ばれる細胞死が誘導された細胞群もＡＳＨ１−ＲＮＡｉで検出され、細胞死誘導も引き起こされていることが示唆された（図７（Ｂ））。したがって、肺癌細胞の細胞死の結果、図６の強い増殖抑制が起こることが示された。
【００８５】
（６）ＲＮＡｉ抵抗性変異ＡＳＨ１によるＡＳＨ１−ＲＮＡｉの作用抑制（標的特異性の検討）
（５）と同様にＡＳＨ１陽性肺癌細胞株ＹＳ（正式名ＡＣＣ−ＬＣ−９１）に、ｐＵ６−ｐｕｒｏ（「Ｕ６-ｂｌａｎｋ」）或いはｐＵ６−ｓｉＡＳＨ１−ｐｕｒｏ（「Ｕ６−ｓｉＡＳＨ１Ｌ１」又は「Ｕ６−ｓｉＡＳＨ１Ｌ２」）をｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００とともに遺伝子導入するが、この際に、空の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３）或いはＲＮＡｉ抵抗性変異ＡＳＨ１発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３−ＡＳＨ１ｍｕｔ）も同時に遺伝子導入し、約１８時間後からピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）を含むＦＢＳ５％添加ＲＰＭＩ−１６４０の培地中で３７℃、４８時間選択培養した。（５）と同様にＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて細胞周期解析を行った。
【００８６】
その結果、空の発現ベクターを同時遺伝子導入した群では、（５）と同様に、ＡＳＨ１−ＲＮＡｉによりＳ期・Ｇ１期の低下及びＧ２Ｍ期の増加が誘導され、細胞周期のＧ２Ｍでの停止が起こることが示された。しかし、ＲＮＡｉ抵抗性変異ＡＳＨ１発現ｖｅｃｔｏｒを同時導入した群では細胞周期の停止傾向が減弱した。したがって、ＡＳＨ１−ＲＮＡｉの細胞周期停止効果は、実際にＡＳＨ１が標的となって起こっていることが示唆された（図８）。
【００８７】
（７）ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓベクター
ＲＮＡｉ−ｐｌａｓｍｉｄをＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入し、約４８時間後にＲＮＡを回収して、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔで解析した。一方、アデノウイルス（「ＲＮＡｉ−Ａｄｅｎｏ」）はＨＥＫ２９３細胞に感染させて約４８時間後にＲＮＡを回収し、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔで解析した。
【００８８】
さらに、ＲＮＡｉ−ｐｌａｓｍｉｄをＨＥＫ２９３細胞にＡＳＨ１発現ベクターと同時に遺伝子導入し、４８時間後に細胞融解し蛋白サンプルを得、これをＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析で解析した。アデノウイルス（「ＲＮＡｉ−Ａｄｅｎｏ」）は、まずＡＳＨ１発現ベクターを遺伝子導入し、その約１８時間後にアデノウイルスを感染させて、４８時間後に細胞融解し蛋白サンプルを得て、同様に解析した。このとき、ＡＳＨ１発現ベクターに挿入してあるｍｙｃ−ｔａｇに対する抗体９Ｅ１０を用いて各サンプルをＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析した。
【００８９】
その結果、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ分析では、ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓを感染させると、ｐＵ６−ｓｉＡＳＨ１−ｐｕｒｏ（「ｓｉＡＳＨ１」）と同様に豊富なＡＳＨ１−ｓｉＲＮＡの発現が見られた（図９（Ａ））。またＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔでも、ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓによってＡＳＨ１の発現の抑制が見られた（図９（Ｂ））。図中、「ｅｍｐｔｙ」はｓｉＡＳＨ１を含まない対照である。
【００９０】
（８）ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓによる肺癌細胞株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  増殖抑制
ＦＢＳ５％添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中のＡＳＨ１陽性肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０−ＬＮＭ３５或いはＡＳＨ１陰性肺癌細胞株Ａ５４９の培養液中に、ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ（「Ａｄ−ｓｉＡＳＨ１」）或いはＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ＬａｃＺ（「Ａｄｅｎｏ（ｅｍｐｔｙ）」又は「Ａｄ」）を添加し感染させた。添加後図１０のグラフに示す日数ごとにＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ  Ｏｎｅ（生化学工業）にて生細胞数を定量した。
【００９１】
その結果、Ａ５４９細胞株ではＡＳＨ１−ＲＮＡｉ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓによってごく弱い非特異的と思われる増殖の抑制が見られただけであったが（図１０（Ｂ））、ＮＣＩ−Ｈ４６０−ＬＮＭ３５細胞株では非常に強い増殖抑制が見られ、細胞数はほとんど増加せず、むしろ減少傾向がみられた（図１０（Ａ））。ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓでも細胞周期停止・細胞死誘導が引き起こされていることが示唆された。
【００９２】
（９）ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓによるマウス移植肺癌腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖抑制
ＡＳＨ１陽性肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０−ＬＮＭ３５（２ｘ１０６個）或いはＡＳＨ１陰性肺癌細胞株ＡＣＣ−ＬＣ−１７６（１ｘ１０７個）をＳＣＩＤマウスの背中の皮下に注入し腫瘍を形成させた。その約１週間後に腫瘍径が約５ｍｍとなったところで、ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ-ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ（「Ａｄ−ｓｉＡＳＨ１」）或いはＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ＬａｃＺ（「Ａｄ」）を腫瘍内に注射器にて直接注入した（４ｘ１０７  ｉｆｕ、隔日２回）。最初の注入から１週間後にマウスを安楽死させ、皮下腫瘍を摘出し、重量を測定し、病理標本を作製した。
【００９３】
その結果、ＮＣＩ−Ｈ４６０−ＬＮＭ３５では強い増殖抑制が見られ、腫瘍重量に差異が認められたが（図１１（Ａ））、ＡＣＣ−ＬＣ−１７６では、腫瘍重量は殆ど差異が認められなかった（図１１（Ｂ））。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ヒトＡＳＨ１に対するｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡを示す。
【図２】ＲＮＡｉによる発現抑制（肺癌細胞株Ａ５４９）を示す。ここで、ｐｃＤＮ  Ａ3-ＡＳＨ1ｗｔは正常ＡＳＨ１発現ベクターを、ｐｃＤＮＡ3-ＡＳＨ1ｍｕｔはＲＮＡｉ抵抗性変異ＡＳＨ１発現ベクターを、Ｕ６−ｂｌａｎｋは対照ベクターをそれぞれ示す。Ｕ６−ｂｌａｎｋは、以下のように、両端がＡｐａＩ部位とＥｃｏＲＩ部位に対応し、ＥｃｏＲＶ部位（ｏｌｉｇｏが挿入されたことを確認するための部位）と停止シグナルをもつオリゴを挿入した陰性対照用のベクターである。    5’-CGATATCTTTTTTG-3’3’-CCGGGCTATAGAAAAAACTTAA-5’
【図３】ＡＳＨ１-ＲＮＡｉによるヒトＡＳＨ１  ｍＲＮＡ構造の標的部位を示す。標的部位は、図に示すような開放した構造を示す。
【図４】作製したプラスミドによるｓｉＲＮＡの発現を示す。ここで、Ｕ６−ｅｍｐｔｙはオリゴ未挿入のベクターを、ｓｈＲＮＡはｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡをそれぞれ示す。上記のＵ６−ｂｌａｎｋは停止シグナルを入れてあるので非常に短いＲＮＡが転写されるのに対して、Ｕ６−ｅｍｐｔｙは、ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ  ｏｌｉｇｏを挿入する前のものであり、停止シグナルもなく、ベクター由来のＲＮＡが発現する。
【図５】ＲＮＡｉ抵抗性変異ＡＳＨ１の配列（ｍｕｔ）を示す。
【図６】ＡＳＨ１−ＲＮＡｉプラスミド（ｐＵ６−ｓｉＡＳＨ１Ｌ２）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖抑制作用（作用特異性）を示す。ここで、Ｃａｌｕ６は大細胞肺癌由来のＡＳＨ１陽性肺癌細胞株を、（Ａｄ），（Ｓｑ），（Ｓｍ）及び（Ｌａ）はそれぞれ腺癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、大細胞肺癌を示す。
【図７】ＡＳＨ１−ＲＮＡｉプラスミドの細胞周期停止、細胞死誘導作用（ＡＣＣ−ＬＣ−９１）を示す。
【図８】ＲＮＡｉ抵抗性変異ＡＳＨ１によるＡＳＨ１−ＲＮＡｉの作用抑制（標的特異性の検討）を示す。
【図９】ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒによるｓｉＲＮＡの発現を示す。
【図１０】ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓによる肺癌細胞株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖抑制を示す。ここで、ＭＯＩは、ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ／ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ（細胞１個に対するアデノウイルス力価の比）を示す。
【図１１】ＡＳＨ１−ＲＮＡｉ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓによるマウス移植肺癌腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖抑制を示す。ここで、Ｂｕｆｆｅｒは透析液を、Ａｄはａｄｅｎｏ−ＬａｃＺを示す。（アデノウイルス精製時にＣｓＣｌ超遠心後に透析してＣｓＣｌを除去するが、最終的にアデノウイルスは透析液中に保存される。）
【図１２】ＲＮＡｉプラスミドｐｕ６−ｓｉＡＳＨ１Ｌ１−ｐｕｒｏ及びｐＵ６−ｓｉＡＳＨ１Ｌ２−ｐｕｒｏの構造を示す。
【図１３】ＡＳＨ１−ＲＮＡｉアデノウイルスベクターの構造を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００９５】
配列番号２：  ヘアピン型ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列。
配列番号３：  ヘアピン型ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列。
配列番号４：  タンデム型ＤＮＡ配列。
配列番号２５：  Ｕ６プロモーター  プラス  ＡｐａＩ-ＥｃｏＲＩ-ＥｃｏＲＶ配列。
【図１】
2006101707.tif 000003
【図２】
2006101707.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2006101707.tif 000014
【図１３】
2006101707.tif 000015
【配列表】
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