(57)【要約】【課題】  本発明は、蛍光染色された生体細胞の細胞小器官に近赤外領域の超短光パルスを照射して適正な機能阻害を生じさせる生体細胞制御装置およびその方法を提供する。【解決手段】  本発明の生体細胞制御方法においては、染色された生体試料を可視光波長より短い又は同程度の波長光で集光照射し、励起された蛍光物質から放出される蛍光を抽出し、抽出された蛍光により生体細胞内の細胞小器官の位置を画像表示する可視化して蛍光観察を実行する。また、可視化された画像表示に基づいて細胞小器官の中から標的細胞小器官を選択し、標的細胞小器官に近赤外領域の超短光パルスを照射する。さらに、超短光パルスが照射された生体試料に対して再度、蛍光観測することによって超短光パルスの照射前後の生体試料の表示画像を比較し、所望する細胞小器官の機能阻害に対応する超短光パルスの適正なエネルギ条件を設定する。【選択図】    図２
2006311807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料の細胞小器官を蛍光物質で染色する染色工程と、
該染色工程により染色された生体試料を可視光波長より短い又は同程度の波長光で集光照射する第1照射工程と、
前記第1照射工程により励起された前記蛍光物質から放出される蛍光を抽出する蛍光抽出工程と、
抽出された蛍光により生体細胞内の細胞小器官の位置を画像表示する可視化工程と、
該可視化工程からの画像表示に基づいて細胞小器官の中から標的細胞小器官を選択する工程と、
選択された標的細胞小器官に近赤外領域の超短光パルスを照射する第２照射工程とを有し、
さらに、該第２照射工程により超短光パルスが照射された生体試料に対して再度、前記第１照射工程と前記蛍光抽出工程と前記可視化工程とを実行することによって超短光パルスの照射前後の生体試料の表示画像を比較し、該比較により所望する細胞小器官の機能阻害に対応する前記超短光パルスのエネルギ条件を設定する工程を有する、ことを特徴とする生体細胞制御方法。
【請求項２】
前記第２照射工程により超短光パルスが照射された生体試料の細胞小器官を再度、蛍光物質で染色して前記第１照射工程と前記蛍光抽出工程と前記可視化工程とを実行する、ことを特徴とする請求項１に記載の生体細胞制御方法。
【請求項３】
前記超短光パルスのエネルギ条件は、前記超短光パルスの照射前後の生体試料の表示画像を比較して照射後の標的細胞小器官が照射前の標的細胞小器官以外の細胞小器官が断片化しており、且つ細胞内の核の死滅又は細胞膜の損傷がなされていない超短光パルスのエネルギを設定する、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の生体細胞制御方法。
【請求項４】
可視光波長より短い又は同程度の波長光で細胞小器官を蛍光物質で染色した生体細胞を照射する集光照射する第1照射手段と、
前記第１照射手段による照射光の集光点を前記生体細胞内で走査させる走査手段と、
前記第1照射手段からの照射光により励起された細胞小器官の蛍光物質から放出された蛍光を電気信号に変換する検出器と、
近赤外領域の超短光パルスを照射する第２照射手段と、
該第２照射手段からの照射光を前記第１照射手段からの照射光の光路に重畳させる重畳手段を有する、ことを特徴とする生体細胞制御装置。  
【請求項５】
可視光波長より短い又は同程度の波長光で集光照射する第1照射手段と、
該第1照射手段からの照射光を反射させ、且つ該照射光よりも長波長側の蛍光を透過する第1スプリッタと、
前記第1スプリッタにより反射された前記第1照射手段からの照射光を反射させ、その反射角が変動する走査ミラーと、
該走査ミラーで反射された光を集光させて焦点が生体細胞内に位置するように配設された第1対物レンズと、
前記第1スプリッタにより透過された蛍光を集光させる第２対物レンズと、
前記第２対物レンズにより集光された蛍光の焦点と一致するように該蛍光の光路上に設けられた開口と、
該開口を通過した蛍光を電気信号に変換する検出器と、を備え、
さらに、近赤外領域の超短光パルスを照射する第２照射手段と、
該第２照射手段からの照射光を前記第１照射手段からの照射光の光路に重畳させる重畳手段を有する、ことを特徴とする生体細胞制御装置。
【請求項６】
前記重畳手段は、前記第1照射手段からの照射光を反射させて前記第１スプリッタまで伝送し、前記第２照射手段からの照射光を透過させて前記第1スプリッタまで伝送する、第２スプリッタから構成されることを特徴とする請求項５に記載の生体細胞制御装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可視状態でミトコンドリア等、生体細胞内の細胞小器官のうち一部の細胞小器官のみを機能阻害させながら生体細胞を生存させることが可能な生体細胞制御装置及び生体細胞制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体細胞の複雑なダイナミクスを理解するために生きた細胞の細胞小器官の機能を調査すること、代表的には細胞内で使うエネルギを生成するミトコンドリアを生かしたまま機能調査すること等、が所望されている。とりわけ細胞壊死（ネクローシス）と対照的な細胞死の様式であるアポトーシスを解明することで自己免疫疾患の病因を解明することが注目されている。ここでアポトーシスに言及する。アポトーシスに陥った細胞は収縮し、核が濃縮し断片化する。断片化した核は細胞膜に包まれたアポトーシス小体として形成され、食細胞により処理される。この過程は一連の遺伝子により制御され、エネルギを消費し能動的に遂行される。ネクローシスと異なり原則的に炎症を惹起しないという性質より、生体内の細胞環境のホメオスターシスを維持する重要なメカニズムとされている。免疫系の発達、調節にも深く関与しており、特に胸腺における自己反応性Ｔ細胞の除去など免疫学的寛容の成立には必須のものである。
【０００３】
従って、細胞の基本的活動に影響する細胞小器官が生体細胞内でどのように機能阻害していくかを検証する研究が近年の医学研究上、非常に重要なものとされており、その検証において細胞小器官を人為的に機能阻害たらしめる手段が必要とされる。ここで生きた細胞小器官の機能調査を実行するために適正な方法を考えた場合、光を用いれば細胞小器官の観察・操作・破壊が非接触で可能であることを利用して細胞小器官の破壊や切開を行う方法が注目されている。この方法として紫外や可視領域の連続光やパルス光をレンズで集光させて細胞内に照射する方法が検証されてきた。この方法では、細胞小器官の破切開をサブミクロンの空間分解能で実現できる点が有利である。
【０００４】
しかしながら、照射光として紫外や可視光を用いるとその線形効果により光を照射した細胞内のすべての部分で光強度に応じた吸収が生じる。従って、集光領域以外に損傷が生じること、吸収による細胞の損傷の可能性があることなどの問題がある。また、照射光として近赤外領域の超短光パルス（フェムト秒レーザパルス等）を用いることも提案されてきた。具体的には、超短光パルスを対物レンズを介して細胞小器官に集光させ、集光点付近において選択的に多光子イオン化とトンネルイオン化が生じ、プラズマが発生させる方法である。この方法では、プラズマの発生によりサブミクロンの空間分解能で細胞内の構造に損傷を引き起こすことが可能となり、集光領域以外の吸収がない、熱や衝撃波の周りへの影響が少ない点で有利である。すなわち、近赤外領域の超短光パルスを標的とする細胞小器官に照射することによって、該標的となる細胞小器官のみに損傷を与えることが可能と考えられる。
【０００５】
しかしながら、このような超短光パルスを用いた細胞内部の照射であっても標的となる細胞小器官の変移を検証するには問題点を残存させていた。特に、細胞小器官の可視化する際に問題が生じており、具体的には、従来の蛍光観察同様、細胞小器官を蛍光色素で染色、あるいは蛍光タンパク質で標識した場合に、超短光パルスを細胞小器官に集光すると、標的の細胞小器官からの蛍光は観測されず、その原因たる蛍光損失がブリーチングに依拠するものであるか、細胞小器官が移動したこと又は取り除かれたことに依拠するものであるかについての判断ができなかった。換言すれば、従来の技術においては超短光パルスを照射したことによる真の細胞小器官の変移の検証が不十分なものであった。
【０００６】
さらに、従来の超短光パルスを用いた細胞内照射の場合、その光学的条件に応じた細胞小器官の機能阻害を検証する手段が示されておらず、実例検証への具体性に欠けるものに過ぎなかったため、上記アポトーシスの人為的誘導を実行する基準を提供することができなかった。
【０００７】
【特許文献１】米国光学会誌第２６号第８１９（Opt.Lett.,26(2001)819）
【特許文献２】ネイチャー第４１８号２９０（Nature,418(2002)290）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上の事情に鑑みて本発明は提供されたものであり、可視状態で生体細胞の細胞小器官等のうち標的となる細胞小器官等（標的微小領域）を細胞が生きた状態のままで人為的に機能阻害をさせるように誘導制御することができ、特に標的となる細胞小器官や光学系等に応じて所望する機能阻害を実行・検証するための装置および方法、すなわち生体細胞制御装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の生体細胞制御方法は、生体試料の細胞小器官を蛍光物質で染色する染色工程と、この染色工程により染色された生体試料を可視光波長より短い又は同程度の波長光で集光照射する第1照射工程と、第1照射工程により励起された前記蛍光物質から放出される蛍光を抽出する蛍光抽出工程と、抽出された蛍光により生体細胞内の細胞小器官の位置を画像表示する可視化工程と、この可視化工程からの画像表示に基づいて細胞小器官の中から標的細胞小器官を選択する工程と、選択された標的細胞小器官に近赤外領域の超短光パルスを照射する第２照射工程とを有している。さらに、本生体細胞制御方法は、第２照射工程により超短光パルスが照射された生体試料に対して再度、第１照射工程と蛍光抽出工程と可視化工程とを実行することによって超短光パルスの照射前後の生体試料の表示画像を比較し、その比較により所望する細胞小器官の機能阻害に対応する超短光パルスのエネルギ条件を設定する工程を有している。
【００１０】
また、本生体細胞制御方法は、第２照射工程により超短光パルスが照射された生体試料の細胞小器官を再度、蛍光物質で染色して第１照射工程と蛍光抽出工程と可視化工程とを実行することができる。また、超短光パルスのエネルギ条件は、超短光パルスの照射前後の生体試料の表示画像を比較して照射後の標的細胞小器官が照射前の標的細胞小器官以外の細胞小器官が断片化しており、且つ細胞内の核の死滅又は細胞膜の損傷がなされていない超短光パルスのエネルギを設定することができる。
【００１１】
また、本発明の生体細胞制御装置は、可視光波長より短い又は同程度の波長光で細胞小器官を蛍光物質で染色した生体細胞を照射する集光照射する第1照射手段と、第１照射手段による照射光の集光点を前記生体細胞内で走査させる走査手段と、第1照射手段からの照射光により励起された細胞小器官の蛍光物質から放出された蛍光を電気信号に変換する検出器と、近赤外領域の超短光パルスを照射する第２照射手段と、第２照射手段からの照射光を第１照射手段からの照射光の光路に重畳させる重畳手段を有している。
【００１２】
具体的には、可視光波長より短い又は同程度の波長光で集光照射する第1照射手段と、第1照射手段からの照射光を反射させ、且つ照射光よりも長波長側の蛍光を透過する第1スプリッタと、第1スプリッタにより反射された第1照射手段からの照射光を反射させ、その反射角が変動する走査ミラーと、走査ミラーで反射された光を集光させて焦点が生体細胞内に位置するように配設された第1対物レンズと、第1スプリッタにより透過された蛍光を集光させる第２対物レンズと、第２対物レンズにより集光された蛍光の焦点と一致するように該蛍光の光路上に設けられた開口と、開口を通過した蛍光を電気信号に変換する検出器と、を備えている。さらに、生体細胞制御装置は、近赤外領域の超短光パルスを照射する第２照射手段と、第２照射手段からの照射光を第１照射手段からの照射光の光路に重畳させる重畳手段を有している。この重畳手段は、第1照射手段からの照射光を反射させて第１スプリッタまで伝送し、第２照射手段からの照射光を透過させて第1スプリッタまで伝送する機能を有する第２スプリッタから構成されることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ミトコンドリア等、生体細胞内の細胞小器官を蛍光観察しながら標的とする細胞小器官のみ照射することができ、また、近赤外領域の超短光パルス（例えば、フェムト秒レーザパルス）はピーク値が高く非線形光学効果を有するので焦点近傍のみで損傷を与え、他の部分での細胞損傷を与えないようにすることができる。また、本発明によれば、細胞小器官を画像による可視化をすることができ、蛍光観察に用いる走査手段を超短光パルスの標的にも兼用できるため１の標的細胞小器官を選択し機能阻害を企図し易い構成を有している。また、本発明によれば、再染色により超短光パルスが照射された細胞小器官から照射後の蛍光を取得できなくても該細胞小器官の生死を判断することができ、機能阻害の実証が可能となる。さらに、本発明によれば、標的細胞小器官にどの程度のエネルギの超短光パルスを照射すれば核を死滅させず又は細胞膜を破壊させずに細胞小器官の断片化が進行するかを検証することもでき、医療上、重要課題とされているアポトーシスの人為的誘導（細胞内物質の相互作用等の人的制御）に活用することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
まず、図２を参照しつつ本発明の生体細胞制御装置において実行される機能制御工程について言及する。本発明の生体細胞制御装置では最初に観察を所望する生体細胞内の細胞小器官に蛍光標識を行い、その蛍光画像を取得し、３次元画像として可視化する（STEP10）。この工程自体は、１光子蛍光画像の取得についての既知の技術を利用することができ、該工程単独が本発明の本質技術ではないため詳細な説明を略する。
【００１５】
次に、可視化された細胞小器官（特定細胞全体が可視化される）から近赤外領域フェムト秒レーザパルスの照射を所望する１つ以上の細胞小器官を選択する（STEP12）。これはSTEP10において生体細胞内の細胞小器官が可視化されていることによって可能とされるものであり、選択された細胞小器官が後述する標的細胞小器官となる。この細胞小器官の選択は可視化された３次元画像から所定領域（標的領域）を指定することで行われ、標的領域の指定は点で指定しても良く任意の領域で指定しても良い。
【００１６】
次に、選択された細胞小器官（実際にはSTEP１２で指定された標的領域）に近赤外領域のフェムト秒レーザパルスの集光点を位置決めし、標的領域に該パルスを照射する（STEP１４）。そして、再びSTEP１０と同様に生体細胞の蛍光画像を取得し、３次元画像として可視化する（STEP１６）。この工程を経ることによって、STEP１０で取得した３次元画像とSTEP16で取得した３次元画像との比較、すなわち近赤外領域のフェムト秒レーザパルス照射前後の蛍光画像を比較することができる。従って、標的となる細胞小器官に近赤外領域のフェムト秒レーザパルスを照射した場合に、該標的細胞小器官及びこれを包摂する生体細胞がどのように変化するかを検証することができ、所望する標的細胞小器官やこれに伴う他の細胞内小器官の操作制御を可視化状態で行うことが可能となる。
【００１７】
次に、上記図２に示す機能制御工程を実際に行うための光学系及びその好適条件について説明する。図１を参照すれば、本発明の生体細胞制御装置１００の一例を示している。前述するように本発明の生体細胞制御装置１００は、細胞小器官を超短光パルスで照射することにより人為的操作を実行する工程と、操作前後の細胞小器官を可視化する工程とをなすように構成されているため、その光学系も両工程に対応する光学系を一体に組み合わせて構成されている。具体的に説明すれば、標的細胞小器官を超短光パルスで照射する光学系と、細胞小器官を蛍光観測する光学系とを有している。まず、細胞小器官を蛍光観測する光学系から説明する。この光学系は、共焦点レーザ走査型蛍光顕微鏡として知られている光学系と同系の構成をなしており、細胞内部の細胞小器官の１光子蛍光画像を取得し、後述の超短光パルス照射光学系により標的とする細胞小器官を特定するためのものである。
【００１８】
具体的に説明すれば、まず図１に示すように本実施形態では照射光源としてAr+レーザ（波長488nm）や、He-Neレーザ（波長543nm）の中波長領域光を照射する第１レーザ１００を用いている。この第１レーザ１００から照射された光は、第２ダイクロイックミラー１０２で反射され、光路が９０°曲げられる。ここでダイクロイックミラーとは、特定波長域の波長光のみ反射し、それ以外の波長光を透過させる性質を有するものであり、一般化してビームスプリッタとも称している。第２ダイクロイックミラー１０２は、第１レーザ１００からの照射光を反射させるが後述する第２レーザからの照射光を透過させて同光路に重畳させるために配設している。また、第２ダイクロイックミラー１０２により反射された第１レーザ１００の照射光は、さらにその光路先に配設された他のダイクロイックミラー（第２ダイクロイックミラー１０４）により反射されて光路を９０°曲げられている。この第１ダイクロイックミラー１０４は、第１レーザ１００及び後述の第２レーザ１１６からの照射光を反射させて生体試料（生体細胞）に到達させるとともに生体試料から放出される蛍光を透過させて検出器１１８まで伝送するために配設されている（詳細には後述する）。
【００１９】
第１ダイクロイックミラー１０４により反射されたレーザ光は、その光路先に配設された走査ミラー（ガルバノミラー）１０６により反射されて対物レンズ１０８により集光されて生体細胞内１１０のピンスポット１１０ａに照射される。このときレーザ光は走査ミラー１０６によってＸＹ方向（図１に示すように生体細胞に平行な平面方向）に振られるためピンスポット１１０ａもＸＹ方向に移動することとなり、生体細胞内を走査することが可能となる。なお、図１では視認理解の便宜上、走査ミラー１０６を１枚のみで表示しているが、実際にＸＹ方向の走査を行うために２枚１組で構成されており、レーザ光はこれら２枚のミラーを通って対物レンズ１０８に到達することとなる。また、Ｚ方向（生体細胞の深さ方向）への走査についても図示しないが、生体細胞を載置するステージをＺ方向にスライド移動させること等によりなすことができる。
【００２０】
このようにして走査しながら集光照射された第１レーザ１００からの光によって生体細胞１１０、特に細胞小器官は励起される。このとき照射される細胞小器官は予め蛍光色素で染色、あるいは蛍光タンパク質で標識させておく必要がある。ここで蛍光物質について言及する。蛍光物質は適切な波長光で励起するとエネルギー準位が上昇し、不安定状態を形成する。そして物質は、この不安定な状態を解消し安定状態に戻ろうと作用し、その際に蛍光を放出する。この蛍光は、励起する光よりも波長が20〜50nmほど長波長側にずれる特性を有している。再び本実施形態の説明に戻れば、第1レーザ１００からの照射光のピンポイント（集光点）１１０ａが染色された細胞小器官、具体的には蛍光染色されたミトコンドリアの位置にあるときにはミトコンドリアとともに蛍光物質も励起され、レーザ光に対して長波長側に波長がずれた蛍光を放出する。
【００２１】
この蛍光は、空間的にすべての方向に放射され、対物レンズ１０８を通った光は平行光となり、走査ミラー１０６により反射されて前述のダイクロイックミラー１０４に伝送される。また、生体細胞の載置には通常、カバーガラス等が用いられるためダイクロイックミラー１０４に伝送される光は該カバーガラス等により反射されたレーザ光（励起光）も同時に伝送されている。このうちレーザ光はダイクロイックミラー１０４により反射されるが（前述するように第1レーザ１００からの光の波長は反射される）、長波長側に波長がずれた蛍光はダイクロイックミラー１０４を透過する。従って、細胞小器官１１０（及びカバーガラス等）から放射される光はダイクロイックミラー１０４を経ることによって蛍光成分のみ抽出されることとなる。そして、抽出された蛍光は、対物レンズ１１２を通って集光されてピンホール１１４まで伝送される。なお、この対物レンズ１１２は、放出された蛍光信号をできるだけ多く集めることができるように開口数が多いことが好ましい。
【００２２】
さらに、ピンホール１１４は、対物レンズ１１２による集光の焦点がピンホール位置に合致する場合にのみ蛍光が通過するように配設されており、前述のピンポイント１１０ａで励起させ放出した光のみが通過するようになっている。従って、ピンホール１１４を経た後の光は、レーザ光の焦点で励起された細胞小器官の蛍光物質からの蛍光のみ抽出されていることとなる。その後、蛍光は、光信号を電子信号に変換する検出器（フォトマルチプライヤ（ＰＭT））に伝送される。さらに図示しないが電子信号に変換された蛍光はＡ／Ｄ変換されてモニターに画像として映し出されることとなる。そして、走査ミラー１０６やステージのスライド（前述）により走査されることで生体細胞全体を画像化することができる。従って、次に説明する超短光パルスにより標的細胞小器官（標的ミトコンドリア）を照射する際に、オペレータが該標的細胞小器官の位置を視認してパルス照射する、すなわち上述及び図２のSTEP12で示す標的細胞小器官の選択をすることが可能となる。
【００２３】
次に、フェムト秒レーザパルス（超短光パルス）による特定の細胞小器官の照射光学系について説明する。本実施形態では、超短光パルス光源としての第２レーザ１１６は、フェムト秒チタンサファイアレーザ増幅器（中心波長８００nm、パルス時間幅約150fs、繰り返し周波数1kHz）を使用している。この第２レーザ１１６からの照射光は、第２ダイクロイックミラー１０２にまで伝送されて透過される。ここで第２ダイクロイックミラー１０２について言及すれば、第1レーザ１００からの照射光よりも長波長側の光であり、前述する通り第1レーザ１００からの照射光は反射されるが、第２レーザ１１６からの照射光は透過される性質を有している。これによって、第２ダイクロイックミラー１０２を経ると、第２レーザ１１６の光路は第1レーザ１００の光路と重畳する。従って、その後、第２レーザ１１６の照射光は第1レーザ１００の照射光と同様に第２ダイクロイックミラー１０４、走査ミラー１０６、対物レンズ１０８を介して生体細胞まで伝送される。このとき第２ダイクロイックミラー１０４により第２レーザ１１６の照射光の集光点も第1レーザ１００の照射光の集光点と合致することとなり、蛍光画像に基づいて標的細胞小器官を選択するために集光点を選択することが超短光パルスの照射点を選択することとなっている。
【００２４】
以上が本発明の実施形態の光学系概略であるが、実際に生体細胞内の細胞小器官の機能阻害を制御した実証例を記載しておく。まず、第1の実験例として図３を参照する。これは上記説明で例示した光学系での実験例であり、実験試料としてヒト子宮ガン細胞であるHeLa細胞を用いて細胞小器官としてミトコンドリアの機能阻害を検証している。また、上述もしている通り細胞小器官を操作する光源としてチタンサファイアレーザー再生増幅器を用い（中心波長 800nm；パルス時間幅 約150 fs；繰り返し周波数 1ｋHz）、照射光のパルス数はシャッターを用いて制御している。さらに、蛍光観察には１光子蛍光観察としてAr+レーザー（波長 488nm）もしくは，He-Neレーザー（波長 543nm）を用いている。
【００２５】
次に、その実験結果について言及すれば、図３はミトコンドリアターゲッティング配列と融合させたEYFP(Enhanced Yellow Fluorescent Protein)を用いて、生きているHeLa細胞のミトコンドリアを標識した様子を示している。開口数が1.4の対物レンズ１０８を用いてレーザーパルス１１６を125発入射し、生きたHeLa細胞内の1つのミトコンドリアに集光した。レーザパルス１１６の照射エネルギは、5.5 nJ/pulseから8 nJ/pulseまで増加され、標的のミトコンドリア、および細胞全体の動態を観察している。この観察結果として図３ (a)、(b)は5.5nJ/pulseのフェムト秒レーザーパルスを照射した前後の共焦点蛍光像である。この図から明らかなように該レーザパルスを照射した場合、１つのミトコンドリアが破壊されているが、集光点近傍の細胞小器官に影響はない。図３ (c)、(d)は、6.4 nJ/pulseのフェムト秒レーザーパルスを照射した前後の共焦点蛍光像を示している。この場合、フェムト秒レーザーパルス照射後およそ10分でミトコンドリアが分裂し、断片化する様子が観察されている。また、図３(f)のように、照射エネルギが、7.4 nJ/pulse以上を照射すると集光点付近のミトコンドリア数個が破壊され、細胞全体のミトコンドリアが楕円状から球状に形状変化し、断片化したことが判る。
【００２６】
さらに、レーザーパルス強度による生細胞への損傷を調べるために、PI（ヨウ化プロピディウム）を用いた実験を行っている。PIは、死細胞の核や細胞膜が損傷した細胞の核を強く染める性質があることから、細胞の生死判別に用いられるものであり、細胞内のミトコンドリアにレーザーパルス照射後、細胞周辺の培養液にPIを添加し，レーザーパルス照射後の細胞の生死と細胞膜の損傷を確認している。図３ (b)、(d)のように、ミトコンドリア１つが破壊されたとき，ならびに分裂して断片化したときにはPIによる核の染色は見られなかったが、ミトコンドリアが図３ (f)のように、球状になったときはPIによる核からの赤色蛍光が確認された核が死滅状態であることがわかる。さらに、PIを用いた再染色の他に、蛍光観察前に行ったミトコンドリアの染色方法、例えばMTR（MitoTrackerRed） により再染色しても良く、この場合はPIの場合と相違し、レーザパルスの照射によるミトコンドリアの機能阻害が、蛍光褪色でなく機能阻害に依拠することを実証することができる。すなわち、仮に標的となるミトコンドリアの蛍光損失が褪色による場合には、再染色すれば蛍光取得できるはずであり、蛍光取得できないことをもって機能阻害を実証することができる。
【００２７】
その他、特に蛍光観察結果を図示しないが、超短光パルス光源としてチタンサファイアレーザーオシレーター（波長800 nm，繰り返し周波数76 MHz、パルス幅約100fs）を用いた場合における、機能阻害、特に断片化が起こりながら細胞膜破壊や核の死滅が生じないエネルギ条件の実証例として、2.5×10＾ 6pulses（照射時間1/31秒）のとき( 0.26nJ/pulse(20mW)から0.39ｎJ/pulse(30mW))より照射パルス数（照射時間）が短い場合には集光領域のミトコンドリアが破壊され、これよりも長い照射時間の場合（4.8×10＾6pulses（照射時間1/16秒）のとき： 0.20ｎJ/pulse(15mW)から 0.53ｎJ/pulse(40mW)）には、細胞破壊（バースト）が生じていることなども検証されており、本生体細胞制御装置により所望する細胞小器官の機能阻害又はこれにともなって観察される原形質流動を誘導させるレーザパルスの適正なエネルギ条件を可視状態で検出することができることがわかっている。
【００２８】
以上が本発明の実施形態とこれを用いた実験例であるが、本発明はこれに限定させるものではなく、動物、植物細胞を問わず蛍光観察できる細胞内物質のすべてに適応可能でき、超短光パルス（フェムト秒レーザーパルス等）の制御を行うことで、細胞小器官同士の相互作用や細胞小器官の機能解明を発展させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の生体細胞制御装置の光学系を示す略図である。
【図２】本発明の生体細胞制御方法の主構成を示したフロー図である。
【図３】本発明の生体細胞制御装置で細胞小器官の機能阻害を企図した場合における実際の細胞蛍光画像を示したものであり、左上図、左下図、中上図、中下図、右上図、右下図と順にそれぞれ（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）を示している。
【符号の説明】
【００３０】
１００…第1レーザ（紫外又は可視光レーザ）
１０２、１０４…第1、第２スプリッタ（第1、第２ダイクロイックミラー）
１０６…走査ミラー（ガルバノミラー）
１０６…案内部材（トユ）
１１０…生体試料（生体細胞）
１１６…第２レーザ（超短光パルスレーザ）
【図１】
2006311807.tif 000003
【図２】
2006311807.tif 000004
【図３】
2006311807.tif 000005