(57)【要約】【課題】試料からの正確、簡便、且つ迅速な目的遺伝子多型の検出方法を提供する。【解決手段】試料中の目的遺伝子の遺伝子多型検出方法は、目的遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＤＮＡを増幅する工程、増幅したＤＮＡを目的遺伝子の一塩基多型を認識配列に含む制限酵素を用いて切断する工程、切断されたＤＮＡ断片を分離する工程、  分離されたＤＮＡ断片を検出する工程、を有し、前記増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を行う第１、第２の増幅段階を備え、前記第２の増幅段階は、前記第１の段階の増幅産物を含む反応溶液を試料として前記第１の増幅段階と同一のプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う構成とされる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の目的遺伝子の遺伝子多型検出方法において、
目的遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＤＮＡを増幅する工程、
増幅されたＤＮＡを目的遺伝子の一塩基多型を認識配列に含む制限酵素を用いて切断する工程、
切断されたＤＮＡ断片を分離する工程、
分離されたＤＮＡ断片を検出する工程、
を有し、
前記増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を行う第１、第２の増幅段階を備え、前記第２の増幅段階は、前記第１の段階の増幅産物を含む反応溶液を試料として、前記第１の増幅段階と同一のプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことを特徴とする遺伝子多型検出方法。
【請求項２】
ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡの変性、プライマーアニーリング、ＤＮＡの伸長から成るサイクルの数は、前記第２の増幅段階としての前記増幅工程における２回目の増幅段階よりも、前記第１の増幅段階としての前記増幅工程における１回目の増幅段階の方が少ないことを特徴とする請求項１の遺伝子多型検出方法。
【請求項３】
前記１回目の増幅段階の前記サイクル数は１５サイクル以下であることを特徴とする請求項２の遺伝子多型検出方法。
【請求項４】
前記第２の増幅段階における試料としての前記第１の増幅段階の反応溶液は、前記第２の増幅段階の反応溶液の総量の１／５以下であることを特徴とする請求項１、２又は３の遺伝子多型検出方法。
【請求項５】
前記増幅工程における１回目の増幅段階の試料は、動物細胞；植物細胞；又は細菌、真菌、ウイルスを含む微生物である請求項１〜４のいずれかの項に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項６】
前記増幅工程における１回目の増幅段階の試料は、体液、粘膜、生体排泄物、体毛の毛根、又はこれらに含まれる細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかの項に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項７】
前記増幅工程における１回目の増幅段階の試料は、全血、血液中の細胞、又はリンパ球であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
目的とする遺伝子がアポリポタンパクＥ遺伝子であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかの項に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項９】
前記切断工程において、増幅されたＤＮＡを、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を認識配列に含む第１の制限酵素と、アポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基多型部位を認識配列に含む第２の制限酵素と、を用いて、前記コドン１１２の一塩基多型部位を認識配列での第１の切断部位で切断し、且つ、前記プライマー対及び前記第１、第２の制限酵素は、それぞれのアポリポタンパクＥ遺伝子多型に特異的なそれぞれ略１００ｂｐ以上のＤＮＡ断片を生成し得るように選択されことを特徴とする請求項８の遺伝子多型検出方法。
【請求項１０】
前記第１、第２の制限酵素はいずれも、前記コドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列と、前記コドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列との間に切断部位を持たないことを特徴とする請求項９の遺伝子多型検出方法。
【請求項１１】
前記第１の制限酵素は前記増幅したＤＮＡにおいてアポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列より上流に切断位置を持たず、前記第２の制限酵素の前記増幅したＤＮＡにおいてアポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列より上流に切断位置を持たないことを特徴とする請求項９又は１０の遺伝子多型検出方法。
【請求項１２】
前記第１の制限酵素は塩基配列ＡＣＲＹＧＴ（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ）を認識して切断し、前記第２の制限酵素は塩基配列ＲＧＣＧＣＹ（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ）を認識して切断することを特徴とする請求項９、１０又は１１の遺伝子多型検出方法。
【請求項１３】
前記第１の制限酵素はＡｆｌＩＩＩ、前記第２の制限酵素はＨａｅＩＩであることを特徴とする請求項１２の遺伝子多型検出方法。
【請求項１４】
前記切断工程において、増幅されたたＤＮＡを２種類の制限酵素を用いてアポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を含む認識配列での第１の切断部位及びアポリポタンパクＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基多型部位を含む認識配列での第２の切断部位で切断することを特徴とする請求項８の遺伝子多型検出方法。
【請求項１５】
前記２種類の制限酵素のうち一方は塩基配列ＡＣＲＹＧＴ（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ）を認識して切断し、他方は塩基配列ＲＧＣＧＣＹ（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ）を認識して切断することを特徴とする請求項１４の遺伝子多型検出方法。
【請求項１６】
前記２種類の制限酵素は、ＡｆｌＩＩＩ及びＨａｅＩＩであることを特徴とする請求項１５の遺伝子多型検出方法。
【請求項１７】
それぞれのアポリポタンパクＥ遺伝子多型に特異的なそれぞれ略１００ｂｐ以上のＤＮＡ断片が生成されることを特徴とする請求項１４、１５又は１６の遺伝子多型検出方法。
【請求項１８】
前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第１の切断位置より、６０ｂｐ以上、１３６ｂｐ以下の上流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項９〜１７のいずれかの項に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項１９】
前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第１の切断位置より９０ｂｐ以上の上流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項１８の遺伝子多型検出方法。
【請求項２０】
前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第１の切断位置より１００ｂｐ以上の上流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項１９の遺伝子多型検出方法。
【請求項２１】
前記プライマー対のうち上流側プライマーは、前記第１の切断位置より１２０ｂｐ以下の上流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項１８、１９又は２０の遺伝子多型検出方法。
【請求項２２】
前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より、３０ｂｐ以上、２０２ｂｐ以下の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項９〜２１のいずれかの項に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項２３】
前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より７０ｂｐ以上の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項２２のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
【請求項２４】
前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より１００ｂｐ以上の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項２２又は２３の遺伝子多型検出方法。
【請求項２５】
前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より１８５ｂｐ以下の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項２２、２３又は２４の遺伝子多型検出方法。
【請求項２６】
前記プライマー対のうち下流側プライマーは、前記第２の切断位置より１５６ｂｐ以下の下流の位置に５’末端が設定されることを特徴とする請求項２２〜２５のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
【請求項２７】
前記プライマー対の各プライマーは、それぞれ下記の塩基配列、
ＡＡＴＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＡＣＴＧ（配列番号１）
ＧＣＣＣＧＣＡＣＧＣＧＧＣＣＣＴＧＴＴＣ（配列番号２）
を有するオリゴンヌクレオチドであることを特徴とする請求項８〜２６のいずれかの項に記載のアポリポタンパクＥ遺伝子多型検出方法。
【請求項２８】
前記増幅工程における１回目の増幅段階の試料は全血であることを特徴とする請求項８〜２７のいずれかの項に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項２９】
切断したＤＮＡ断片を電気泳動で分離することを特徴とする請求項１〜２８のいずれかの項に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項３０】
試料中の目的遺伝子のゲノタイピングのための遺伝子増幅方法において、目的遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＤＮＡを増幅する工程を有し、前記増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を行う第１、第２の増幅段階を備え、前記第２の増幅段階は、前記第１の段階の増幅産物を含む反応溶液を試料として、前記第１の増幅段階と同一のプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことを特徴とする遺伝子増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の目的遺伝子の遺伝子多型検出方法に関するものであり、より詳細には、生体由来試料等からＤＮＡ抽出操作を行うことなく、同一プライマー対を用いて直接多段階でＤＮＡ増幅を行った後、目的遺伝子多型のゲノタイプを判定（ゲノタイピング）するのに有用な遺伝子多型検出方法、及びゲノタイピングのための遺伝子増幅方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子多型検出法としては一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（Single Strand Comformation Polymorphism：ＳＳＣＰ）法、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length polymorphism：ＲＦＬＰ）法などがある。このうち、ＳＳＣＰ法は一本鎖ＤＮＡでの高次構造の違いにより多型の有無を検出する方法である。一方、ＲＦＬＰ法は、増幅されたＤＮＡを多型部位を認識配列に含む制限酵素で切断し、切断の有無をＤＮＡ断片の長さの違いとして電気泳動で判定する方法である。前者は変異部位を同定するためには塩基配列決定作業が必要であるが、後者は多型部位が既知である場合に適用される簡便な方法とされる。いずれの場合においても、通常はヒト・染色体ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）を血液より抽出した後、多型部位の検出方法に供される。
【０００３】
従来、目的遺伝子の多型を判別する実験的方法がいくつか報告されている。例えば、下記のものが挙げられる。非特許文献１には、アポリポタンパクＥ（以下「ＡｐｏＥ」という。）遺伝子のＲＦＬＰ法によるタイピング法が記載されている。この方法の基本的な手法は、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction：ＰＣＲ）によって、ゲノタイピングを行う目的の遺伝子領域であるＡｐｏＥ特定の領域を増幅し、そのＲＦＬＰをポリアクリルアミドゲル電気泳動（Polyacrylamide Electrophoresis）による泳動パターンでゲノタイピングする方法である。
【０００４】
この方法でも、先ず、ヒト・染色体ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）を血液より抽出した後、ＡｐｏＥ遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＰＣＲで増幅し、増幅したＤＮＡを制限酵素ＨｈａＩによって断片化する。
【０００５】
ヒト血液からの一般的なＤＮＡの抽出操作は、血球分解、ゲノムＤＮＡ塊採取、ＤＮＡ検体の均一化からなる。すなわち、末梢血液に対して赤血球分解させた後、白血球を遠心分離して採取し、更に白血球核を破壊してゲノムＤＮＡ液を採取し、有機溶媒中にてＤＮＡ塊として取り出した後に緩衝液中で静かに振とうさせて均質化させる工程からなり、通常は操作時間として３〜４時間、ＤＮＡ液の均質化には更に数時間を要す。
【０００６】
近年開発された市販のＤＮＡ簡易抽出キットにおいては、末梢血液へ血球分解液を加えた後、遊離ＤＮＡをマイクロチューブに設けられたメンブレンに吸着させ、数回の洗浄後に溶出させてゲノムＤＮＡを抽出することができる。この目的に使用されるＤＮＡ抽出キットが、DNA Mini KitとしてQiagen社から市販されている。このキットでは標準的な方法での末梢血液必要量は２００μＬで、ＤＮＡ抽出の操作には遠心分離機、恒温浸透槽等の設備を要し、操作時間も３０分ほどかかる。
【０００７】
このようにして得られた抽出ＤＮＡがＲＦＬＰ法での遺伝子多型検出の検査対象となり、ＰＣＲ増幅、制限酵素による切断、切断断片の分離検出が順次行われる。非特許文献２によれば、遺伝子の発現調節の解析やゲノム構造の解析には、対象とする生物のゲノムＤＮＡの調製が必要不可欠であると記載されている。
【０００８】
一般に全血検体をそのままＰＣＲ増幅を行った後、制限酵素で断片化した場合、増幅検体中に全血由来の蛋白が残存し、制限酵素による切断が不完全になることが報告されている。例えば非特許文献３に示すように、ＤＮＡに結合したタンパク質がＤＮＡから離れていないため、制限酵素がＤＮＡに結合できずに切断反応が正常に進まず、ＤＮＡ抽出操作の必要性があると記載されている。
【０００９】
既知の多段階ＰＣＲ方法としてネステッドＰＣＲがある。ネステッドＰＣＲは非特異的な増幅を避けるために考案され、主に１種類のアミノ酸に対して複数のコドンが対応していて特異性の高いプライマーの設計が困難な場合に適用される多段階のＰＣＲである。ネステッドＰＣＲでは第１のプライマー対で増幅される標的配列の内側に第２のプライマー対を設計し、第１のプライマーで増幅されたＤＮＡ産物を希釈して新たな鋳型とした第２のＰＣＲを行うもので、プライマーの類似配列によるミスプライミングを避け、標的配列のみを拾い出す方法である。この方法は２種のプライマー対を必要とし、多段階ＰＣＲにより標的配列を特異的に増幅する方法であって、制限酵素の反応阻害の抑制を期待した方法ではない。
【非特許文献１】James E. H. and Daniel T. V. Restriction of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with HhaＩ. J. Lipid. Res .1990; 31: 545-548
【非特許文献２】「細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド（２）遺伝子解析の基礎」、秀潤社、ｐ．１１７
【非特許文献３】「バイオ実験トラブル解決超基本Ｑ＆Ａ」ｐ．９６−９７、羊土社
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、操作が煩雑であり、更に時間も要すＤＮＡ抽出操作を行うことなく、目的遺伝子を増幅し、遺伝子多型を検出することのできる遺伝子多型検出方法を提供することである。
【００１１】
本発明のより詳細な目的の一つは、操作が煩雑であり、更に時間も要すＤＮＡ抽出操作を行うことなく、目的遺伝子を増幅し、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法により遺伝子多型を検出することのできる遺伝子多型検出方法を提供することである。
【００１２】
又、抽出ＤＮＡを試料とすることなく、目的遺伝子の遺伝子多型のゲノタイピングに供することのできる増幅ＤＮＡを提供し得るゲノタイピングのための遺伝子増幅方法を提供することも本発明の目的の一つである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的は本発明に係る遺伝子多型検出方法及び遺伝子増幅方法にて達成される。要約すれば、本発明は、試料中の目的遺伝子の遺伝子多型検出方法において、目的遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＤＮＡを増幅する工程、増幅されたＤＮＡを目的遺伝子の一塩基多型を認識配列に含む制限酵素を用いて切断する工程、切断されたＤＮＡ断片を分離する工程、分離されたＤＮＡ断片を検出する工程、を有し、前記増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を行う第１、第２の増幅段階を備え、前記第２の増幅段階は、前記第１の段階の増幅産物を含む反応溶液を試料として、前記第１の増幅段階と同一のプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことを特徴とする遺伝子多型検出方法である。
【００１４】
又、本発明は、ＤＮＡが抽出されていない試料中の目的遺伝子の遺伝子多型のゲノタイピングのための遺伝子増幅方法において、目的遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＤＮＡを増幅する工程を有し、前記増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を行う第１、第２の増幅段階を備え、前記第２の増幅段階は、前記第１の段階の増幅産物を含む反応溶液を試料として、前記第１の増幅段階と同一のプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことを特徴とする遺伝子増幅方法を包含する。その他、増幅工程における特徴は、本発明の遺伝子多型検出方法における増幅工程の特徴に準じる。
【００１５】
尚、本明細書において、遺伝子配列における位置は、５’末端から３’末端方向に一本鎖でみていうものであり、その上流とは該一本鎖でみたときの５’末端側、下流とは３’末端側をいう。
【００１６】
又、ＡｐｏＥ遺伝子について、いずれかの遺伝子多型において制限酵素による切断位置（或いは認識配列）がある場合、その位置に相当する他の遺伝子多型における配列上の位置については、切断されない（或いは認識されない）場合についても切断位置（或いは認識配列）の語を用いて説明する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、操作が煩雑であり、更に時間も要すＤＮＡ抽出操作を行うことなく、目的遺伝子を増幅し、遺伝子多型を検出する。より詳細には、本発明によれば、ゲノタイピング方法として制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法を用いる場合に、操作が煩雑であり、更に時間も要すＤＮＡ抽出操作を行うことなく、目的遺伝子を増幅し、遺伝子多型を検出することができる。更に、本発明によれば、抽出ＤＮＡを試料とすることなく、目的遺伝子の遺伝子多型のゲノタイピングに供することのできる増幅ＤＮＡを提供し得る、目的遺伝子のゲノタイピングのための、遺伝子増幅方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明に係る遺伝子多型検出方法を図面に則して更に詳しく説明する。
【００１９】
本発明の一態様では、目的遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＤＮＡを増幅する工程と、増幅したＤＮＡを目的遺伝子の一塩基多型を認識配列に含む制限酵素を用いて切断する工程と、切断されたＤＮＡ断片を分離する工程と、分離されたＤＮＡ断片を検出する工程と、を有する。  増幅工程は、基本的には、一般的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いる。ＰＣＲ法自体は斯界にて周知の方法に従えばよいが、その概略を説明すると、目的領域は、一般的にサーマルサイクラーと呼ばれるＤＮＡ増幅装置を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって増幅する。ＰＣＲ法では、試料からのゲノムＤＮＡ２本鎖を加熱して変性し、１本鎖にする（変性：通常、９２℃〜９８℃で１０秒〜２分）。次に、増幅したい特定部位のＤＮＡ鎖の両端に相補的な２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー対）を反応系に過剰に加えた状態で温度を下げると、プライマーがＤＮＡ鎖の相補的な部位と２本鎖を形成する（プライマーアニーリング：通常、４０℃〜６５℃で１０秒〜３分）。この状態でＤＮＡ合成基質のデオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）とＤＮＡポリメラーゼを作用させると、ポリメラーゼはプライマー部位からＤＮＡ相補鎖を合成していく（伸長反応：通常、６５℃〜８０℃で１５秒〜３分）。通常、この変性、プライマーアニーリング、伸長反応から成るサイクルを、この順番で２０〜４０回繰り返して二種のプライマーＤＮＡに挟まれたＤＮＡ配列を増幅する。尚、プライマーのアニーリングをより確実にするため、このサイクルを開始する直前に、９２℃〜９８℃で３０秒〜１０分処理することにより、試料中のＤＮＡを十分変性しておくこともできる。又、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡが確実に２本鎖になるよう、反応終了後、６５℃〜８０℃で１分〜１０分保温することもできる（最終伸長反応）。
【００２０】
ＰＣＲ反応溶液は、緩衝液（例えば、最終濃度で２０〜５０ｍＭの塩化カリウムを含む５〜５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液pH８．０〜９．０）に、それぞれ最終濃度で２０〜４００μＭのｄＮＴＰ、０．５〜５ｍＭの塩化マグネシウム、０．１〜１．０μＭの二種のプライマー、０．５〜５Ｕ／１００μｌの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及び試料を加えて成る。反応液の総量は１０〜１００μｌが好ましい。反応中の蒸発を防ぐため、ミネラルオイル等を重層することもできる。この他、ＰＣＲ反応溶液には、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、ベタイン、ゼラチンなどの添加成分が含まれてよい。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ等の耐熱性ポリメラーゼが挙げられる。
【００２１】
そして、本発明によれば、増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を行う第１、第２の増幅段階を備え、第２の増幅段階は、第１の段階の増幅産物を含む反応溶液を試料として、第１の増幅段階と同一のプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う。つまり、本発明によれば、増幅段階は、同一のプライマー対を用いて少なくとも２回以上行う。
【００２２】
これにより、例えば、ヒトより採取された血液等からＤＮＡ抽出操作を行うことなく、目的とする遺伝子に特異的なプライマー対で少サイクルでの予備的ＰＣＲを実施し、その増幅産物の一部を同一のプライマー対で更に本ＰＣＲを実施して、血液等に由来する夾雑タンパクを失活または分離された充分量のＤＮＡ増幅した後、ＲＦＬＰ法により目的遺伝子の遺伝子多型を検出することができる。
【００２３】
以下、本発明を全血からの目的遺伝子の遺伝子多型検出に適用した場合を例にして更に詳述する。
【００２４】
図１はヒトより採取した全血から目的遺伝子の遺伝子多型を検出するまでのフロー図である。
【００２５】
この場合、遺伝子多型検出方法は、図１に示すように、ヒト血液１〜数μＬを採取する段階、採取された全血をＰＣＲにより予備的な増幅を行う段階、次いで予備的増幅の産物の一部をＰＣＲにより制限酵素切断に用いるＰＣＲ増幅産物を得る段階、引き続き制限酵素にてＰＣＲ産物を切断して、遺伝子型判定に使用する制限酵素断片を得る段階、最後に制限酵素断片を分離して各遺伝子型特有の断片長を検出・判定する段階を含む。
【００２６】
ヒト血液の採取に際しては、注射針、採血管、キャピラリ管などにより、必要の全血を採取する。この時、抗凝固剤を含む容器または管へ採取することが望ましい。抗凝固剤としては、全血をＰＣＲの試料に用いることから、特に、ポリメラーゼの活性に影響しないヘパリンが好ましい。
【００２７】
１回目のＤＮＡ増幅は、全血に含まれる制限酵素を阻害するタンパクを変性除去するとともに、検体中に含まれるＤＮＡをテンプレート（鋳型）として目的遺伝子を含むＤＮＡの予備的増幅を行うことができる。この１回目のＤＮＡ増幅は、一般的なＰＣＲの２０〜４０サイクルは行わず、１０サイクル程度に留めることにより短時間化をはかることができる。好ましくは、１回目の増幅におけるＰＣＲのサイクル数は、１５サイクル以下とすることにより、短時間化効果は顕著となる。又、制限酵素を阻害するタンパクを効果的に変性除去し、又ＤＮＡの予備的増幅効果が良好であるように、好ましくは５サイクル以上とする。より好ましくは１０サイクルである。
【００２８】
２回目のＤＮＡ増幅は、前記１回目のＤＮＡ増幅で得られた産物を、同一プライマー対を使用して、制限酵素切断での断片検出が可能な量まで増幅するものである。２回目のＤＮＡ増幅におけるＰＣＲのサイクル数は、適宜選択すればよいが、通常、２０〜４０サイクル、好ましくは２０〜３０サイクルである。
【００２９】
好ましくは、１回目のＤＮＡ増幅の増幅産物を含む反応溶液の一部を２回目のＤＮＡ増幅の試料として、新たに１回目のＤＮＡ増幅と同一のプライマー対、ポリメラーゼ、緩衝液等の試薬を加え、上述の如きＰＣＲ反応溶液を調整し、２回目のＤＮＡ増幅を行う。つまり、２回目のＰＣＲでは、１回目のＰＣＲにおいて、１回目のＤＮＡ増幅の試料、即ち、検体（ここではヒト全血）に含まれるＤＮＡが予備的に増幅された増幅産物であるＤＮＡをテンプレートとして、目的遺伝子を含むＤＮＡを増幅する。ここで、１回目のＤＮＡ増幅における反応容器（マイクロチューブ）の底に変性タンパク質が沈殿することがあるが、この場合、上清を２回目のＤＮＡ増幅の試料として分取することが好ましいがこれに限定されるものではなく、均質状態の反応溶液を分取してもよい。所望により、１回目のＤＮＡ増幅の反応溶液の全部を２回目のＤＮＡ増幅の試料として、新たに１回目のＤＮＡ増幅と同一のプライマー対、ポリメラーゼ、緩衝液等の試薬を加え、上述の如きＰＣＲ反応溶液を調整し、２回目のＤＮＡ増幅を行ってもよい。
【００３０】
こうして１回目のＤＮＡ増幅の増幅産物を含む反応溶液を２回目のＤＮＡ増幅の試料として新たにＰＣＲ反応溶液を調整することで、１回目のＤＮＡ増幅により予備的に増幅されたＤＮＡは２回目のＤＮＡ増幅の反応溶液では希釈されることなる。２回目のＤＮＡ増幅の試料としての１回目の増幅の反応溶液は、２回目のＤＮＡ増幅の反応溶液の総量の１／５以下であることが好ましい。１／５を超えると上記希釈効果が十分に得られず、後述するようなＲＦＬＰ法における制限酵素による切断を妨害するおそれがある。又、２回目のＤＮＡ増幅により、目的遺伝子を含むＤＮＡを良好に増幅するためには、２回目のＤＮＡ増幅の試料としての１回目の増幅の反応溶液は、２回目のＤＮＡ増幅の反応溶液の総量の１／１００以上であることが好ましい。１／１００未満であると、２回目のＤＮＡ増幅により良好なＤＮＡ増幅が得られなくなる傾向がある。より好ましくは、１／２０〜１／１０である。
【００３１】
図１に示す例では、増幅工程は、２段階のＰＣＲ増幅段階を有するが、より多段階のＰＣＲ増幅段階を有していてもよい。この場合、上記同様、後の増幅段階（第２の増幅段階）は、前の増幅段階（第１の増幅段階）の増幅産物を含む反応溶液の一部又は全部を試料として、前の増幅段階と同一のプライマー対を用いてＰＣＲを行う。この場合も、前の増幅段階の反応溶液の、後の増幅段階の反応溶液の総量に対する割合は上記と同様にすることができる。
【００３２】
上述のようにして増幅されたＤＮＡは、ＲＦＬＰ法のために制限酵素により切断する。
【００３３】
ここで、ＰＣＲに使用する目的遺伝子に特異的なプライマー対は、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、目的遺伝子の変異場所を含むオリゴヌクレオチド対（プライマー対）である。プライマーの設計に際しては後述の制限酵素による切断で、典型的にはアガロースゲル電気泳動によって充分な解像度にて分離可能な充分な長さのＤＮＡ制限断片が得られるように設計される。好ましい一実施態様では、プライマー対を用いて増幅されたＤＮＡに関し、制限酵素による切断によって、いずれかの目的遺伝子多型に帰属させ得る１００ｂｐ以上のＤＮＡ断片が生成する制限酵素を用いる。
【００３４】
増幅したＤＮＡ産物を切断する制限酵素は、目的とする遺伝子多型間の遺伝子変異で、認識部位が出現又は消失するもの、即ち、いずれかの目的遺伝子多型の一塩基多型部位が認識配列内に存在するものであって、切断後のＤＮＡ制限断片が典型的にはアガロースゲル電気泳動によって充分な解像度にて分離可能な充分な長さのＤＮＡ制限断片が得られるように設計される。好ましい一実施態様では、上記プライマー対を用いて増幅されたＤＮＡに関し、制限酵素による切断によって、いずれかの目的遺伝子多型に帰属させ得る１００ｂｐ以上のＤＮＡ断片が生成する制限酵素を用いる。
【００３５】
得られたＤＮＡ制限断片は、好ましい一実施態様では、電気泳動で分離する。そして、分離されたＤＮＡ制限断片は、使用する電気泳動法に応じた方法により検出する。
【００３６】
ＤＮＡ分離方法としては、典型的には斯界にて通常用いられ、且つ、安価なＤＮＡ分離方法であるアガロース電気泳動を用いることができる。アガロース電気泳動では、種々の染色法のうち例えば、染色剤としてエチジウムブロマイドで染色し、紫外線を照射することにより、分離されたＤＮＡ制限断片を検出することができる。又、日立マイクロチップ電気泳動解析システムＳＶ１２１０  コスモアイ（以下「日立ＳＶ１２１０」という。）等のＤＮＡ分離方法を用い、高解像度にてＤＮＡ制限断片を分離、検出することができる。
【００３７】
日立ＳＶ１２１０は、樹脂チップ上にサンプル等の装填用穴と微細な溝とが設けられたマイクロチップ［ｉ−チップ］及び所定の試薬キット（ゲル、染色試薬、内部標準等）と共に用い、所定の手順に従って所定の試薬及びサンプルをマイクロチップに装填して装置本体にセットすることで、マイクロチップ上の分離部へのゲルの充填、複数のサンプルの電気泳動、バンドの検出、データ出力を自動で行うことができる。分離されたＤＮＡ制限断片は、染色剤の蛍光により検出され、約５分で分析できる。
【００３８】
特に、制限酵素による切断でいずれかの目的遺伝子多型に帰属させ得る１００ｂｐ以上のＤＮＡ断片が生成する場合、アガロース電気絵移動においても、高解像度にてＤＮＡ制限断片を分離し、ゲノタイピングを良好に行うことができる。
【００３９】
検出されたＤＮＡ制限断片の分離パターンから目的遺伝子多型のタイピングを行う。ＤＮＡ制限断片の分離パターンから目的遺伝子のゲノタイピングを行う段階をコンピュータ処理により自動化してもよい。この場合、目的遺伝子多型の各ゲノタイプについて既知のＤＮＡ制限断片の分離パターンと、サンプルについて得られたＤＮＡ制限断片の分離パターンとを比較し、サンプルをいずれかの目的遺伝子多型のゲノタイプに関係付ける出力を行うようにすればよいことは当業者にとって自明である。
【００４０】
本発明の一実施態様によれば、本発明の遺伝子多型検出方法は、ＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判定のためにヒト全血からＡｐｏＥ遺伝子多型を検出する場合に適用される。
【００４１】
ＡｐｏＥは、血中コレステロールの運搬に重要な役割を果たす血漿タンパクであり、主要なアイソフォームとして、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４がある。これらＡｐｏＥ遺伝子多型は臨床検査にも応用されており、アルツハイマー型痴呆或いは心血管疾患の危険因子として、個々の患者の診断、治療を行う上で重要な臨床的情報となっている。
【００４２】
ＡｐｏＥ遺伝子多型は、それぞれ１つのアミノ酸の置換により生じる。即ち、１１２番目、１５８番目のアミノ酸が、それぞれＥ２ではシステイン、システイン、Ｅ３ではシステイン、アルギニン、Ｅ４ではアルギニン、アルギニンである。ＲＦＬＰ法において、それぞれのＡｐｏＥ遺伝子多型に特異的な長さのＤＮＡ制限酵素切断断片（ＤＮＡ制限断片）が得られることからで、各ＡｐｏＥ遺伝子多型の判別が可能となる。ヒトはアリルを２つ持つため、いずれかのＡｐｏＥ遺伝子多型の２つの組合せを持つことになる。即ち、ＡｐｏＥ遺伝子多型のアリルの組合せのパターン（遺伝子型：ゲノタイプ）には、Ｅ２／Ｅ２、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４がある。
【００４３】
ＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法は、ＡｐｏＥ遺伝子に特異的なプライマー対を用いてＰＣＲにより目的のＤＮＡ領域を増幅し、増幅されたＤＮＡを所定の制限酵素を用いて切断し、切断したＤＮＡ制限断片を分離し、分離されたＤＮＡ断片を検出する各段階を含む。特に、本発明に従い、増幅工程は少なくとも２段階のＰＣＲ増幅段階とする。
【００４４】
ＡｐｏＥ遺伝子に特異的なプライマー対は、試料からのゲノムＤＮＡをテンプレート（鋳型）として、ＡｐｏＥ遺伝子の２箇所の一塩基多型部位、即ち、ＡｐｏＥの１１２番目のアミノ酸をコードするＡｐｏＥ遺伝子領域（以下「コドン１１２」という。）、ＡｐｏＥの１５８番目のアミノ酸をコードするＡｐｏＥ遺伝子領域（以下「コドン１５８」という。）を挟んだ所定領域（以下「多型領域」という。）のＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するように設計されたオリゴヌクレオチド対（プライマー対）である。プライマー対の一方は、５’末端から３’末端方向に一本鎖でみて、上記ＡｐｏＥ遺伝子の多型領域の上流側にハイブリダイズ可能な適当な長さのオリゴヌクレオチドで、他方は同多型領域の下流側の相補鎖にハイブリダイズ可能な適当な長さのオリゴヌクレオチドである。これらプライマーは、通常通り、当業者には周知のプライマーとしての好適条件、例えば、標的遺伝子に対する特異性が良好であること、２つのプライマーのＴｍが同程度となること、又増幅効率が良好であることなどを考慮して設計される。
【００４５】
増幅したＤＮＡ産物を切断する所定の制限酵素は、ＡｐｏＥ遺伝子多型間の遺伝子変異で認識部位が出現又は消失するもの、即ち、いずれかのＡｐｏＥ遺伝子多型の一塩基多型部位が認識配列内に存在するものである。特に、この制限酵素は、切断後のＤＮＡ制限断片が典型的にはアガロースゲル電気泳動法によって十分な解像度にて分離可能な長さを有し得るものである。ＡｐｏＥ遺伝子のコドン１１２の一塩基多型部位を認識配列に含む第１の酵素と、これと同種又は異種のＡｐｏＥ遺伝子のコドン１５８の一塩基多型部位を認識配列に含む第２の制限酵素とを用いる。
【００４６】
本発明の好ましい一実施態様では、増幅したＤＮＡ産物を切断する第１、第２の制限酵素としての２種類の制限酵素として、ＡｆｌＩＩＩとＨａｅＩＩとの組み合わせを用いる。これら制限酵素の組み合わせを用いることにより、増幅されたＤＮＡに関し、２種類の制限酵素のいずれか一方の制限酵素のみによる切断、及び両方の制限酵素による切断によって、いずれかのアポリポタンパクＥ遺伝子多型に帰属させ得る１００ｂｐ以上のＤＮＡ断片が生成する。
【００４７】
図１０に示すように、制限酵素ＡｆｌＩＩＩは、塩基配列ＡＣＲＹＧＴ（ＲはＡ又はＧ，ＹはＣ又はＴ）を認識する。又、制限酵素ＨａｅＩＩは、塩基配列ＲＧＣＧＣＹ（ＲはＡ又はＧ，ＹはＣ又はＴ）を認識する。即ち、制限酵素ＡｆｌＩＩＩは、１１２番目のシステイン（Ｅ２、Ｅ３）をコードするコドンの領域にわたるＡＣＧＴＧＴを認識して切断するが、１１２番目のアルギニン（Ｅ４）をコードするコドンの領域にわたるＡＣＧＴＧＣは切断しない。又、制限酵素ＨａｅＩＩは、１５８番目のアルギニン（Ｅ３、Ｅ４）をコードするコドンの領域にわたるＡＧＣＧＣＣを認識して切断するが、１５８番目のシステイン（Ｅ２）をコードするコドンの領域にわたるＡＧＴＧＣＣは認識せず、切断しない（図中、四角で囲んだＴ又はＣはそれぞれのコドンのはじめの塩基を示す。）。つまり、Ｅ２では、コドン１５８の一塩基多型部位を含むＨａｅＩＩの認識配列が消失し、Ｅ４では、コドン１１２の一塩基多型部位を含むＡｆｌＩＩＩの認識配列が消失する。
【００４８】
これにより、これらの制限酵素ＡｆｌＩＩＩ、ＨａｅＩＩを用いて増幅されたＤＮＡを断片化すると、Ｅ３では、コドン１１２の一塩基多型部位を含む切断位置（以下「第１切断位置」という。）とコドン１５８の一塩基多型部位を含む切断位置（以下「第２切断位置」という。）との間の配列（図中Ｂ）のみを含む特異的なＤＮＡ断片Ｂ（＝１４５ｂｐ）が生成する。Ｅ２では、第１切断位置から第２切断位置より下流に位置する端部までの配列（図中Ｄ）を含む特異的なＤＮＡ断片Ｄが生成する。又、Ｅ４では、第２の切断位置から第１の切断位置より上流に位置する端部までの配列（図中Ｃ）を含む特異的なＤＮＡ断片Ｃを生成する。適切なプライマーを設計することにより、ＤＮＡ断片Ｂ、Ｃ、Ｄは、いずれかの目的遺伝子多型に帰属させ得る１００ｂｐ以上のＤＮＡ断片となる。従って、図１０中に示すように、Ｅ２／Ｅ２、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４の６種類のゲノタイプを明瞭に判定することができる。
【００４９】
ここで、第１の制限酵素としてＡｆｌＩＩＩ、第２の制限酵素としてＨａｅＩＩを用いる場合に即して好適なプライマーの設定について説明する。
【００５０】
１．上流側プライマー
上流側プライマーの５’末端の位置は、ＤＮＡ断片ＡとＤＮＡ断片Ｂ（＝１４５ｂｐ）との良好な分離が可能なように設定する（９ｂｐ以上、好ましくは２０ｂｐ以上、更に好ましくは３０ｂｐ以上の鎖長差を有する）。このことから、上流側プライマーの５’末端位置は、第１切断位置より１３６ｂｐ以下の上流の位置に設定するのが好ましい。この観点からは、より良好な分離が可能であるように、上流側プライマーの５’末端の位置は、第１切断位置よりも、より好ましくは１３０ｂｐ以下、更に好ましくは１２０ｂｐ以下の上流の位置とすることがより好ましい。
【００５１】
又、上流側プライマーの５’末端の位置は、ＤＮＡ断片Ｃ（即ち、配列Ａ及び配列Ｂを含むＤＮＡ断片Ｃ）が、ＤＮＡ断片Ｂ（＝１４５ｂｐ）と良好に分離可能であると共に、上記ＤＮＡ断片Ｄとも良好に分離可能であるように設定する。このことから、上流側プライマーの５’末端の位置は、好ましくは第１切断位置よりも６０ｂｐ以上の上流の位置に設定する。この観点からは、より良好に分離可能となるように、第１切断位置よりも７０ｂｐ以上、８０ｂｐ以上、９０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上の上流の位置と、より上流とされるのが好ましい。
【００５２】
尚、下流側プライマーの選択範囲によって生成されるＤＮＡ制限断片長が異なるが、第２切断位置より下流の配列（図中Ｒ）のみを含むＤＮＡ断片Ｒと、上記ＤＮＡ断片Ａとが良好に分離可能である場合、ＤＮＡ断片Ａの長さは他のＤＮＡ断片の長さと重なることがなく、このＤＮＡ断片ＡはＡｐｏＥ遺伝子多型判別の根拠の一つとして利用することができる。
【００５３】
２．下流側プライマー
ＤＮＡ断片ＢとＤＮＡ断片Ｄとを良好に分離することができるように、好ましくは、下流側プライマーの５’末端の位置は、第２の切断位置より３０ｂｐ以上の下流の位置に設定する。又、下流側プライマーの５’末端の位置の選択範囲によって、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成する、第２の切断位置より下流の配列（図中Ｒ）のみを含むＤＮＡ断片Ｒを、例えば制限酵素による切断反応（消化反応）の存否の確認等のために用いることができる。
【００５４】
更に説明すると、図１０に示すように、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について、第２切断位置よりも３５ｂｐ、５３ｂｐ（３５ｂｐ＋１８ｂｐ）、６６ｂｐ（３５ｂｐ＋１８ｂｐ＋１３ｂｐ）下流に、それぞれ第２の制限酵素（ＨａｅＩＩ）の切断位置がある。下流側プライマーの５’末端の位置の設定により、第２の制限酵素（ＨａｅＩＩ）による切断で生成される、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全てについて生成する第２の切断位置より下流の配列（図中Ｒ）のみを含むＤＮＡ断片Ｒが異なってくる。
【００５５】
下流側プライマーの５’末端を第２切断位置より３５ｂｐ以上、５３ｂｐ以下の下流の位置に設定（即ち、図中配列Ｒ３内に設定）することで、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について、ＤＮＡ断片Ｒ３（最長でも１８ｂｐ）が生成する。Ｅ３、Ｅ４では、ＤＮＡ断片Ｒ４（＝３５ｂｐ）も生成する。
【００５６】
又、下流側プライマーの５’末端位置を第２切断位置より５３ｂｐ以上、６６ｂｐ以下の下流の位置に設定（即ち、図中配列Ｒ２内に設定）することで、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について、ＤＮＡ断片Ｒ３（＝１８ｂｐ）、ＤＮＡ断片Ｒ２（最長でも１３ｂｐ）が生成する。Ｅ３、Ｅ４ではＤＮＡ断片Ｒ４（＝３５ｂｐ）も生成する。
【００５７】
更に、下流側プライマーの５’末端の位置を少なくとも第２切断位置より６６ｂｐ以上の下流の位置、好ましくは７０ｂｐ以上の下流の位置と、より第２切断位置より下流の位置に設定（即ち、図中配列Ｒ１内に設定）することにより、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について、所望の鎖長のＤＮＡ断片Ｒ１が生成する。又、このとき、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について、ＤＮＡ断片Ｒ３（＝１８ｂｐ）、ＤＮＡ断片Ｒ２（＝１３ｂｐ）が生成する。Ｅ３、Ｅ４ではＤＮＡ断片Ｒ４（＝３５ｂｐ）も生成する。このように、下流側プライマーの５’末端の位置を第２の切断位置より好ましくは７０ｂｐ以上の下流の位置とすることで、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の全ての多型について生成するＤＮＡ断片Ｒ１、或いは１８ｂｐ（断片Ｒ３）、１３ｂｐ（Ｒ２）のＤＮＡ断片を、例えば上記のように消化反応の良否判断等の目的で利用することができる。ここで、例えば、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４のすべてについて生成するＤＮＡ断片Ｒを利用することを考えると、良好な分離が可能であるように、下流側プライマーの５’末端の位置は、より好ましくは８０ｂｐ以上、９０ｂｐ以上、と第２の切断位置より更に下流に設定することが好ましく、より好ましくは１００ｂｐ以上の下流の位置に設定する。
【００５８】
一方、ＤＮＡ断片Ｒ１と、特にＤＮＡ断片Ｂ（更にはＤＮＡ断片Ｃ、Ｄ）とを良好に分離するためには、下流側プライマーの５’末端の位置は、第２切断位置より２０２ｂｐ以下の下流の位置に設定するのが好ましい。この観点からは、下流側プライマーの５’末端の位置は、第２切断位置より１８５ｂｐ以下の下流の位置に設定するのが好ましい。更に、ＡｐｏＥ遺伝子多型の判定の根拠の一つとして利用可能なＤＮＡ断片ＡとＤＮＡ断片Ｒ１との分離を良好とすることをも考慮すると、下流側プライマーの５’末端の位置は、好ましくは第２切断位置より１６６ｂｐ以下の下流の位置、より好ましくは１５６ｂｐ以下の下流の位置に５’末端を設定する。
【００５９】
好ましい一実施態様では、下記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから成るプライマーの対を用いる。
【００６０】
ＡＥ−Ｆ１プライマー（配列番号１）：
５’−ＡＡＴＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＡＣＴＧ−３’
ＡＥ−Ｒ１プライマー（配列番号２）：
５’−ＧＣＣＣＧＣＡＣＧＣＧＧＣＣＣＴＧＴＴＣ−３’
上記オリゴヌクレオチド配列のプライマー対によれば、ＡｐｏＥ遺伝子多型の２箇所の一塩基多型部位、即ち、ＡｐｏＥのコドン１１２、ＡｐｏＥのコドン１５８の一塩基多型部位を含み、７５番目〜１９１番目のアミノ酸をコードするコドン領域にわたる３５２ｂｐのオリゴヌクレオチド配列をＰＣＲ法によって増幅することができる。又、上記上流側プライマーの５’末端は、第１切断位置より１０６ｂｐ上流に位置し、下流側プライマーの５’末端の位置は、第２切断位置より１０１ｂｐ下流に位置する。斯かるオリゴヌクレオチド配列の各プライマーは、斯界にて周知のＤＮＡ合成方法、装置を用いて得ることができる。
【００６１】
図１０に示すように、この場合、ホモ接合体について、Ｅ２／Ｅ２では１０６ｂｐ及び１８０ｂｐ、Ｅ３／Ｅ３では１０６ｂｐ及び１４５ｂｐ、Ｅ４／Ｅ４では２５１ｂｐのＤＮＡ制限断片が得られる。又、ヘテロ接合体であるＥ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４についても、図１０に示すようにそれぞれ異なったＤＮＡ制限断片の組合せが得られる。図示の通り、この場合、ＡｆｌＩＩＩは、コドン１１２の一塩基多型部位を含む切断位置より上流及び下流に他の切断位置を持たず、又ＨａｅＩＩは、コドン１５８の一塩基多型部位を含む切断位置より上流に他の切断位置を持たない。
【００６２】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明する。
【００６３】
（実施例）
まず、ヒト検体の血液を試料として、下記の条件にてＰＣＲ法によりＡｐｏＥ遺伝子の多型領域の１回目の増幅を行った。使用するプライマー対は、ＤＮＡ合成装置により合成して得た。又、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社）を用いた。
【００６４】
ａ）プライマー対
ＡＥ−Ｆ１（５’−ＡＡＴＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＡＣＴＧ−３’）
・・・・・（配列番号１）
ＡＥ−Ｒ１（５’−ＧＣＣＣＧＣＡＣＧＣＧＧＣＣＣＴＧＴＴＣ−３’）
・・・・・（配列番号２）
【００６５】
ｂ）１回目ＰＣＲ反応混合物
血液：                                      １μＬ
プライマー対：                          ０．３μＭ
ｄＮＴＰ：                              ２００μＭ
緩衝液（１０倍濃縮標準ＰＣＲ緩衝液）：      ２μＬ
ＭｇＳＯ４：                                １ｍＭ
Ｂｅｔａｉｎｅ（ベタイン）：                  ２Ｍ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ：        ０．０２ｕｎｉｔｓ
総反応量：                                  ２０μＬ
【００６６】
ｃ）１回目ＰＣＲサイクルの条件
９４℃，２分間（変性）
次いで、下記のサイクルを１０回繰り返す。
【００６７】
９４℃，２０秒（変性）
６０℃，３０秒（プライマーアニーリング）
６８℃，３０秒（伸長反応）
次いで、次の条件で２本鎖を形成する
６８℃，５分間（最終伸長反応）
【００６８】
上記１回目ＰＣＲで得られた増幅産物溶液の一部を採取し、下記の方法により２回目ＰＣＲを行った。使用するプライマー対は上記と同一のものを使用した。
【００６９】
ｄ）２回目ＰＣＲ反応混合物
１回目ＰＣＲ増幅産物溶液：                  １μＬ
プライマー対：                          ０．３μＭ
ｄＮＴＰ：                              ２００μＭ
緩衝液（１０倍濃縮標準ＰＣＲ緩衝液）：      １μＬ
ＭｇＳＯ４：                                １ｍＭ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ：        ０．０２ｕｎｉｔｓ
総反応量：                                  １０μＬ。
【００７０】
ｃ）２回目ＰＣＲサイクルの条件
９４℃，１分間（変性）
次いで、下記のサイクルを３０回繰り返す。
９４℃，２０秒（変性）
６０℃，３０秒（プライマーアニーリング）
６８℃，３０秒（伸長反応）
次いで、次の条件で２本鎖を形成する。
６８℃，５分間（最終伸長反応）。
【００７１】
上記で得られた上記で得られたＡｐｏＥ遺伝子多型領域のＰＣＲ増幅産物の１μＬを、測定用のマイクロチップとしてｉ−チップＤＮＡ  ＩＣ−１１００、試薬キットとしてＩＣ−９１０１を用いた日立ＳＶ１２１０によるＰＣＲ増幅産物の確認に供した。測定手順は、装置供給元の指示に従った。ＤＮＡ制限断片の分離結果は、当該装置に接続されたコンピュータのディスプレイ上に表示される。代表的なＰＣＲ増幅産物の確認結果を図２（中段）〜図５（中段）に示す。
【００７２】
［ＲＦＬＰ及び制限酵素切断断片の分離とゲノタイピング］
上記で充分な増幅が確認されたＡｐｏＥ遺伝子多型領域のＰＣＲ増幅産物、制限酵素ＡｆｌＩＩＩ（New England biolabs社）（４ｕｎｉｔｓ）及びＨａｅＩＩ（New England biolabs社）（２ｕｎｉｔｓ）、１×ＮＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒ３、１×ＢＳＡを含む反応溶液を、全量が５μＬになるように調製し、３７℃で３０分以上反応させた。その後、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを２．５μＬ加え、制限酵素を失活させた。各サンプルについて、上記ＰＣＲ増幅産物の確認と同様の方法によりＤＮＡ制限酵素の分離、検出に供した。代表的なＤＮＡ切断断片の分離結果を図６（中段）〜図９（中段）に示す。
【００７３】
（比較例１）
まず、ヒト検体の血液を試料として下記の条件にてＰＣＲ法によりＡｐｏＥ遺伝子の多型領域の単回増幅を行った。使用するプライマー対は、上記実施例と同一のものを使用した。
【００７４】
ｂ）ＰＣＲ反応混合物
抽出したゲノムＤＮＡ：                    ５０ｎｇ
プライマー対：                          ０．３μＭ
ｄＮＴＰ：                              ２００μＭ
緩衝液（１０倍濃縮標準ＰＣＲ緩衝液）：    ２．５μＬ
ＭｇＳＯ４：                                １ｍＭ
Ｂｅｔａｉｎｅ：                              ２Ｍ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ：        ０．０２ｕｎｉｔｓ
総反応量：                                  ２５μＬ。
【００７５】
ｃ）ＰＣＲサイクルの条件
９４℃，２分間（変性）
次いで、下記のサイクルを４０回繰り返す。
９４℃，２０秒（変性）
６０℃，３０秒（プライマーアニーリング）
６８℃，３０秒（伸長反応）
次いで、次の条件で２本鎖を形成する。
６８℃，５分間（最終伸長反応）。
【００７６】
上記で得られた上記で得られたＡｐｏＥ遺伝子多型領域のＰＣＲ増幅産物の１μＬを、実施例と同様の方法によりＰＣＲ増幅産物の確認に供した。代表的なＰＣＲ増幅産物の確認結果を図２（上段）〜図５（上段）に示す。
【００７７】
［ＲＦＬＰ及び制限酵素切断断片の分離とゲノタイピング］
上記で充分な増幅が確認されたＡｐｏＥ遺伝子多型領域のＰＣＲ増幅産物を実施例と同様な方法によりＲＦＬＰおよび制限酵素切断断片の分離とゲノタイピングを行った。代表的なＤＮＡ切断断片の分離結果を図６（上段）〜図９（上段）に示す。
【００７８】
（比較例２）
まず、ヒト検体の血液を試料として、ＤＮＡ抽出操作を行い、精製ＤＮＡ試料を得た。ここでは、ＤＮＡの抽出は、DNA Mini Kit（Qiagen社）を用いて行った。下記の条件にてＰＣＲ法によりＡｐｏＥ遺伝子の多型領域の単回増幅を行った。使用するプライマー対は、上記実施例と同一のものを使用した。
【００７９】
ｂ）ＰＣＲ反応混合物
抽出したゲノムＤＮＡ：                    ５０ｎｇ
プライマー対：                          ０．３μＭ
ｄＮＴＰ：                              ２００μＭ
緩衝液（１０倍濃縮標準ＰＣＲ緩衝液）：      ２μＬ
ＭｇＳＯ４：                                １ｍＭ
Ｂｅｔａｉｎｅ：                              ２Ｍ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ：        ０．０２ｕｎｉｔｓ
総反応量：                                  ２０μＬ。
【００８０】
ｃ）ＰＣＲサイクルの条件
９４℃，２分間（変性）
次いで、下記のサイクルを４０回繰り返す。
９４℃，２０秒（変性）
６０℃，３０秒（プライマーアニーリング）
６８℃，３０秒（伸長反応）
次いで、次の条件で２本鎖を形成する。
６８℃，５分間（最終伸長反応）。
【００８１】
上記で得られた上記で得られたＡｐｏＥ遺伝子多型領域のＰＣＲ増幅産物の１μＬを、実施例と同様の方法によりＰＣＲ増幅産物の確認に供した。代表的なＰＣＲ増幅産物の確認結果を図２（下段）〜図５（下段）に示す。
【００８２】
［ＲＦＬＰ及び制限酵素切断断片の分離とゲノタイピング］
上記で充分な増幅が確認されたＡｐｏＥ遺伝子多型領域のＰＣＲ増幅産物を実施例と同様な方法によりＲＦＬＰおよび制限酵素切断断片の分離とゲノタイピングを行った。代表的なＤＮＡ切断断片の分離結果を図６（下段）〜図９（下段）に示す。
【００８３】
［本実施例と比較例との対比］
上記の実施例、比較例１および比較例２はそれぞれ全血の２回ＰＣＲ法によるＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピング、全血の単回ＰＣＲ法による同ゲノタイピングおよびゲノム抽出ＤＮＡの単回ＰＣＲ法による同ゲノタイピングである。
【００８４】
ａ）正確性
通常のＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイピングは比較例２で示すゲノムＤＮＡを抽出した後、ＰＣＲ増幅、ＲＦＬＰおよびゲノタイピングによる方法が行われ、得られる結果の信頼性は高い。従って、比較例２で得られた結果を正診として、以下、実施例および比較例１と対比を行う。
【００８５】
図２〜図５に示すようにＥ３／３、Ｅ２／３、Ｅ３／４およびＥ４／４の各検体とも、実施例、比較例１および比較例２の全てにおいて図中３３０ｂｐ付近に良好なＰＣＲ増幅が確認されている。
【００８６】
しかし、比較例１で得られたＥ３／３およびＥ２／３のＲＦＬＰの制限酵素切断断片パターンは実施例および比較例２と異なり、Ｅ３／３ではＥ３／４様のパターンを示し、Ｅ２／３では図中２３６ｂｐおよび２７０ｂｐに非特異的な切断片が確認されている。特にＥ３／３での結果は重大であり、本来ならばＥ３／３と判定すべきゲノタイプが誤った結果が得られることになり、臨床診断を行う上で問題となる。本発明は理論により束縛されるものではないが、試料中の夾雑タンパク質の影響により制限酵素による切断が阻害されているもの考えられる。一方、実施例においてはＥ３／３およびＥ２／３とも抽出ＤＮＡを検体とした比較例と同パターンとなり、正確なゲノタイピングが実施できている。
【００８７】
ｂ）簡便性、迅速性
本発明によれば、全血から直接ＤＮＡ増幅を行うため、ＤＮＡ抽出操作及び抽出時間は不要となり、検体採取からＡｐｏＥ遺伝子多型の検出結果を得るまでの操作および時間を大幅に低減または短縮することができる。比較例２ではＤＮＡ抽出操作を行った後にＡｐｏＥ遺伝子多型を検出しているため、正確なゲノタイピングが可能であるが、通常のＤＮＡ抽出操作では約１日、簡易抽出法でも３０分程の時間を要する。これらの抽出法は数段階の操作で実施されるため、操作中に他試料など目的外物質の混入の危険性もあり、遺伝子多型検出結果へ影響を否定できない。引き続き実施されるＰＣＲにおいては実施例、比較例２ともＰＣＲサイクル所要時間は同等であり、双方とも良好なＤＮＡ増幅が確認されている。従って、実施例は比較例２より簡便かつ迅速なゲノタイピング法といえる。
【００８８】
ｃ）検体必要量
本発明に従えば、遺伝子多型検出に際して必要とする全血は微少量であり、検体採取時の肉体的及び精神的負担を軽減できる。一般に全血よりＤＮＡ抽出操作を行う際には数ｍＬ、比較例２で示した簡易抽出法においても数百μＬの血液が必要となる。実施例における、検体量は１μＬであり検体採取時の負担を大幅に低減できる。
【００８９】
以上説明したように、本実施例によれば、ヒト全血を検体として正確且つ迅速にアポリポタンパクＥ遺伝子多型を検出することができる。又、本実施例によれば、操作が煩雑で長時間を要するＤＮＡ分離抽出操作は不要であり、検体測定時間の大幅な短縮が可能となる。更に、全血からの直接測定であるため、必要とする検体量は微少であり、検体採取時の肉体的・精神的な負担を大幅に低減することができる。
【００９０】
上述ではＤＮＡ抽出を行うことなく、例えば全血等の試料を用いて目的遺伝子を増幅し、ゲノタイピング法としてＲＦＬＰを用いて遺伝子多型のゲノタイピングを行う場合に即して本発明を詳しく説明したが、ゲノタイピング法として、ＲＦＬＰの他、例えば直接塩基配列決定法、スナップショット法、タックマン法、質量分析法が公知である。これらその他のゲノタイピング法においても、抽出されたＤＮＡを試料として用いない場合は、試料中の夾雑タンパク質によってゲノタイピングを誤ることが考えられる。本発明は、ＲＦＬＰ及びその他のゲノタイピング法に供する目的遺伝子を増幅するための遺伝子増幅方法をも提供する。本発明によれば、遺伝子増幅方法は、少なくとも抽出ＤＮＡではない試料と目的遺伝子に特異的なプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う１回目の増幅段階と、前記１回目の増幅段階の増幅産物を含む反応溶液を試料として前記１回目の増幅段階と同一のプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う２回目の増幅段階と、を有する。本発明の遺伝子増幅方法によれば、同一プライマーを用いた少なくとも２回のＰＣＲ増幅段階によって、簡便、迅速に夾雑タンパク質を除去することができる。特に、１回目のＰＣＲ増幅段階を１０サイクル程度の低サイクルとすることで、時間短縮の効果は顕著となる。又、第１の増幅段階におけるＰＣＲの増幅産物を含む反応溶液を試料として第２の増幅段階にてＰＣＲを行うことで希釈効果を得ることができ、夾雑タンパク失の影響を大幅に抑止絵することができる。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
上記実施例では、試料として末梢血液（全血）を用い、血液中の細胞、即ち、被験者本人のゲノムＤＮＡから、アルツハイマー型痴呆症など、ＡｐｏＥ遺伝子多型が関連する疾患の診断、治療にとって有用な情報となるＡｐｏＥ遺伝子多型のゲノタイプ判別を正確、且つ、迅速に行うことのできるＡｐｏＥ遺伝子多型検出方法を提供し得ることを説明した。
【００９２】
本発明は、上記実施例に限定されるものではなく、ＤＮＡの増幅工程における１回目の増幅段階の試料は、動物細胞；植物細胞；細菌、真菌、ウイルスを含む微生物のいずれであってもよい。本発明は、上記動物として、特に、哺乳動物、中でもヒトにおいて有用性が高い。より詳細には、ＤＮＡの増幅工程における１回目の増幅段階の試料は、動物の体液、粘膜、生体排泄物（尿、糞）、体毛の毛根、又はこれらに含まれる細胞であってよく、好ましくは、全血、血液中の細胞、又はリンパ球である。体液とは、血液、リンパ液、唾液、涙腺分泌液、瞼脂腺、鼻汁、汗腺分泌物、液化腺分泌液、膣等泌尿生殖器分泌液など、種々の器官よりの分泌液を含む。
【００９３】
試料として体液を用い、その中の体細胞、異種細胞、菌体、微生物、真菌、ウイルス等を標的とする場合も、体液を直接試料として目的遺伝子を増幅するという本法の有用性は非常に高いと考えられる。有用性の例を示せば、ＲＦＬＰ、その他のゲノタイピングを利用することによって、
１）人の血液中にある微生物（細菌等）の特定を行うことによって、菌血症、敗血症の起炎菌の同定が簡便にかつ正確に行うことができる。
２）器官移植および異種細胞移植の場合において、血液等の体液中にそれらが存在することを本法において、正確に知りうることができる。そのことによって、移植後の状態を評価することが可能である。
３）血液および体液中の肝炎ウイルス、ＨＩＶ、ＨＩＴＬＶ、ＨＳＶ等のウイルス、あるいはカンジダ感染症などのウイルスおよび真菌症の存在の有無、またそのタイプを同定することが可能である。これらは、臨床診断や治療に有用な情報であり、それによって最大の治療効果を得ることができる。
４）白血病等の血液疾患において、減少あるいは、増加している特定の細胞の同定が可能となり、診断治療に有用である。
５）体毛の毛根、微量の体液からDNAの増幅が可能なため、法医学的な情報、人物同定等に有用な情報が本法によって簡便、正確かつ迅速に得られる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ヒトより採取した全血から遺伝子多型を検出するまでのフロー図である。
【図２】ＡｐｏＥ３／３型検体の実施例および比較例でのＤＮＡ増幅結果を示す図である。
【図３】ＡｐｏＥ２／３型検体の実施例および比較例でのＤＮＡ増幅結果を示す図である。
【図４】ＡｐｏＥ３／４型検体の実施例および比較例でのＤＮＡ増幅結果を示す図である。
【図５】ＡｐｏＥ４／４型検体の実施例および比較例でのＤＮＡ増幅結果を示す図である。
【図６】ＡｐｏＥ３／３型検体の実施例および比較例でのＡｐｏＥ遺伝子の制限断片を分離した結果を示す図である。
【図７】ＡｐｏＥ２／３型検体の実施例および比較例でのＡｐｏＥ遺伝子の制限断片を分離した結果を示す図である。
【図８】ＡｐｏＥ３／４型検体の実施例および比較例でのＡｐｏＥ遺伝子の制限断片を分離した結果を示す図である。
【図９】ＡｐｏＥ４／４型検体の実施例および比較例でのＡｐｏＥ遺伝子の制限断片を分離した結果を示す図である。
【図１０】本発明を適用し得るＡｐｏＥ遺伝子多型の検出方法の一例の概念図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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