(57)【要約】      （修正有）【課題】新規の遺伝情報を発現調節する因子、遺伝情報を発現調節する方法を提供する。【解決手段】リボソーム塩基配列の保存領域に相補的な１本鎖オリゴヌクレオチドを合成して、細胞に添加し発現システムを構築する。１本鎖オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡとｒＲＮＡによって遺伝情報を翻訳しタンパクを合成し、そのタンパクが機能発現する過程を調節することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の遺伝情報を発現調節する因子としてのリボソームＲＮＡ塩基配列に相補的な１本鎖オリゴヌクレオチド
【請求項２】
細胞の遺伝情報発現調節因子としてのリボソームＲＮＡ塩基配列に相補的な１本鎖オリゴヌクレオチドを用いた細胞の遺伝情報発現調節方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞の遺伝情報を発現調節する因子と遺伝情報を発現調節する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本出願に関連して２００４−１２０５３号及び２００４−１８０９９６号がある。前記２つの出願は細胞の増減殖に着目し実験もコロニー数を計測した。本出願は細胞内の遺伝情報の発現に関するものである。
【０００３】
リボソームｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ には多様な生物種に広く認められる共通の塩基配列（保存領域）があって、１本鎖のＲＮＡとして存在している。その中でも、ＲＲＵ１ （ＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣ） （Ｅ. ｃｏｌｉのリボソーム配列番号で５１９-５３６番目）（５３０ループとよばれる）、保存領域ＲＲＵ５ （ＧＣＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴ）（Ｅ. ｃｏｌｉのリボソーム配列番号で１３９２-１４０６番目）はヒト、ラット、Ｅ. ｃｏｌｉ のリボソーム(ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ） 間の一致率は９３％以上である。保存領域ＲＲＵ１はリボソームｓｕｂｕｎｉｔのＡ ｓｉｔｅ部位そのものである。ｍＲＮＡの先導配列を識別する部位である。保存領域ＲＲＵ５ （ＧＣＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴ）（Ｅ. ｃｏｌｉのリボソーム配列番号で１３９２-１４０６番目）はＰ-ｔ ＲＮＡが結合する部位そのものである。保存領域ＲＲＵ８（ＡＣＧＡＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣ）（Ｅ. ｃｏｌｉのリボソーム配列番号で１０６０-１０７８番目）の下流部分の配列１０７５〜１０７８はＥＦ-Ｇ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ-Ｇ）結合部位であり、リボソームｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ中のタンパク合成を行う場として重要な機能を有する。特にＥＦ-Ｇは細胞内のリン酸転移酵素によるシグナル伝達系の影響を強く受けることが予想される。
【０００４】
タンパク翻訳の開始には、まずｍＲＮＡがリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のｓｍａｌｌ  ｓｕｂｎｉｔに結合する部位（Ａ ｓｉｔｅ）（ＲＲＵ１）を認識することから始まる。続いて、反応の第１段階として、Ｐ  ｓｉｔｅ部位（ＲＲＵ５）にホルミル化されたメチオニン-ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ-ｔＲＮＡi ｆＭｅｔ：ＵＡＣ）とｍＲＮＡの転写開始コドン（ＡＵＧ）が相補的に結合したものが定着する。つぎにリボソームのｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ（２３ＳｒＲＮＡ、２８ＳｒＲＮＡとリボソームタンパクの複合体）がかぶさっていわゆるリボソーム粒子が形成される。そして、ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔとｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔが結合した段階でペプチド鎖伸長反応が始まる（ＲＲＵ８）。即ち、リボソーム、ｔＲＮＡ複合体のｍＲＮＡに対する１コドンの移動（トランスロケーション）が引き続いて起こる。リボソーム上でのタンパク翻訳の第１段階で、Ｐ  ｓｉｔｅ （ＲＲＵ５）にｆＭｅｔ-ｔＲＮＡi ｆＭｅｔが結合する反応が起こる時、ｆＭｅｔ-ｔＲＮＡi ｆＭｅｔがＡ  ｓｉｔｅ （ＲＲＵ１） に誤って結合しなく、引き続きｍＲＮＡの開始コドンＡＵＧがｆＭｅｔ-ｔＲＮＡiｆＭｅｔのアンチコドンと結合する （ＲＲＵ５）。この時、ｆＭｅｔ-ｔＲＮＡiｆＭｅｔとＰ  ｓｉｔｅ （ＲＲＵ５）の結合の後に、つぎのｔ ＲＮＡが会合してこない阻害がみられる。さらにｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔが最後まで会合してこないことなど一連の阻害反応がみられ、この現象を担う因子が存在する。その後、ｆＭｅｔ-ｔＲＮＡiｆＭｅｔは伸長因子（ＥＦ-Ｇ: ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｇ）が結合する部位（ＲＲＵ８）にきて、オリゴペプチドが形成される。これらリボソームのｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ中にある５３０ループ（ＲＲＵ１）、１４０１倍位（ＲＲＵ５）は立体構造でその位置を決めると７０〜１００Åの間に入る。１０７７倍位（ＲＲＵ８）はやや外側に位置している。
【０００５】
非特許文献１では細胞増殖因子ないし細胞増殖調節方法についてタンパクや細胞増殖因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）が細胞内遺伝情報を発現調節していることが報告されているがＤＮＡは報告されていない。
【特許文献１】特許第３１３５９０９号公報
【非特許文献１】Sadayori Hoshina, Marius Ueffing, and I. Bernard Weinstein．Growth factor-induced DNA synthesis in cells that overproduce protein kinase C．Journal of Cellular Physiology,145: 262-268,1990.
【非特許文献２】Mitsuro Chiba,Tetsuo Nakamura,Sadayori Hoshina and Yoshichika Kitazawa. Optimal cases and sites to seach for Primary Microbial Agents in Crohn's Deasease. Gastroenterology(2001)120:1066-1067.クローン病患者腸上皮リンパろ胞細胞中に細菌のリボソームＲＮＡ  ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔが見出される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
新規の遺伝情報発現調節因子、新規の遺伝情報発現調節方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
リボソームＲＮＡに存在する保存的配列を合成した１本鎖オリゴヌクレオチドを無細胞タンパク合成系に取込ませるとホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現が調節されることが見出だされた。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば色々なオリゴヌクレオチドを組み合わせることにより細胞内の遺伝情報の発現を調節することができ、例えばがん細胞内の所定の遺伝情報を調節することでがん細胞の増殖を抑制でき抗がん剤としての効果がある。また、遺伝情報を簡単にかつ約２倍に増加させて発現することができ、例えば白血球のＧＣＳＦ（顆粒球増殖因子）などのタンパクについて簡単かつ大規模に人工生産を行うことができる。本発明によれば、例えば、細胞を用いて有用たんぱく質を多量に生産できる。再生医療で組織細胞を増殖させる場合に上皮細胞増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）と本発明であるオリゴヌクレオチドを加えると、必要な臓器再生技術を早期に得られる。あるいは免疫細胞に本発明であるオリゴヌクレオチドを与えれば、免疫細胞のたんばく質合成能力を制御でき、免疫機能をコントロールでき、免疫能を賦活できる。あるいは、がん細胞に本発明であるオリゴヌクレオチドを与えると、がん細胞のたんばく質合成能力を制御でき、がん細胞を殺せる可能性がある。細菌に本発明であるオリゴヌクレオチドを与えれば抗生物質のように使える可能性がある。細菌の１６ＳリボソームＲＮＡだけに存在し、ヒトや植物の１８ＳリボソームＲＮＡに無いオリゴマー配列が認められているので、識別して使うことができる。本発明であるオリゴヌクレオチドを遺伝情報の発現調節因子として細胞に添加することで例えば実験において細胞の増殖を調節することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
ＲＲＵ１（５３０ループ）は特にｍＲＮＡを最初に識別するリボソームｓｕｂｕｎｉｔ部位（Ａ ｓｉｔｅ）として重要であることから、無細胞タンパク翻訳系に添加するオリゴヌクレオチドとしてＲＲＵ１を基本として全てに添加し、ＲＲＵ１とＲＲＵ ５とＲＲＵ１とＲＲＵ８の組み合わせを用意した。ＲＲＵ１によるリボソームｓｕｂｕｎｉｔのＡ ｓｉｔｅ部位への作用に対して、ＲＲＵ５、ＲＲＵ８が協調作用を示すのか、中和（阻害）作用を示すのかをタンパク翻訳機能の定量で評価する方法をとった。
【００１０】
リボソーム塩基配列の保存領域はタンパク合成機能を行う場の領域とされ、リボソーム立体構造では１本鎖で存在することが徐々に明らかになってきた。ｒＲＮＡ塩基配列に相補的なＤＮＡ塩基配列を３つ合成した。オリゴヌクレオチドは、ＲＲＵ１（５’ＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣ３’（配列番号１））、ＲＲＵ５（ＧＣＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴ（配列番号２））、ＲＲＵ８（ＡＣＧＡＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣ（配列番号３））である。
【００１１】
無細胞タンパク合成系を用いて試験管内タンパク翻訳反応を起こさせ、溶媒中のオリゴヌクレオチドが翻訳反応に及ぼす影響を調べた。生細胞を用いた発現系では細胞内の複雑な反応系があるが、タンパク合成反応に必要な各種因子（リボソーム、イニシエーションファクター、伸長因子など）を含んだ細胞の抽出液を用いて試験管内でタンパクを合成させる無細胞タンパク合成系がある。無細胞タンパク合成系では、タンパクを発現するという本来の目的のみに系を特化できるため、生細胞内の複雑な反応系の働きを受けにくく、系を人為的に改変することが容易であるなどの利点をもっている。無細胞タンパク合成系の原理は、翻訳反応を一つのチューブ内で共役させてタンパクを合成するものである。エッペンドルフチューブなどで細胞抽出液、タンパク合成に必要な基質類（ヌクレオチドやアミノ酸）、緩衝液や塩類、鋳型ＲＮＡを混合し、適切な温度に加温すると、翻訳反応が起こり、鋳型遺伝子配列をコードしたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からタンパクが合成される。
【００１２】
オリゴヌクレオチドＲＲＵ１とオリゴヌクレオチドＲＲＵ５およびオリゴヌクレオチドＲＲＵ８を用意した。鋳型ＲＮＡとしてホタルルシフェラーゼの遺伝子塩基配列をコードする mＲＮＡを用いた。ウサギ網赤血球細胞溶解液（ＲＲＬ: ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ）とアミノ酸混合液、ＲＮＡ加水分解酵素阻害剤のＲＮＡｓｉｎをそれらに加えＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅを除いた水に溶解した。無細胞タンパク合成を３０℃６０分試験管内で行わせた。リン脂質２重層とリン酸転移酵素群を含みそれらの影響を調べるためにイヌの膵臓細胞マイクロソーム膜分画（ＣＭＭ: ｃａｎｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用い、組換えヒト上皮細胞増殖因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ: ｒｈＥＧＦ)による細胞内リン酸化シグナル伝達経路の活性化によるタンパク翻訳への活性化を行った。オリゴヌクレオチドは、それぞれ２５０ｎｇ／μＬを反応系５０μＬに加えた。ｒｈＥＧＦは、２５０ｎｇ／μＬを反応系５０μＬに加えた。ＣＭＭは、１μLを反応系５０μＬに加えた。ホタルルシフェラーゼを用いた発光検出系は、基質反応液１００μＬに１００倍希釈した無細胞タンパク合成溶液を加え、化学発光検出装置で測定しＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）単位で表現した。実験結果に関し、表１に無細胞タンパク合成系におけるリボソームｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔに相補的なオリゴヌクレオチドの添加量とホタルルシフェラーゼ合成量を、表２に無細胞タンパク合成系におけるリボソームｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔに相補的なオリゴヌクレオチド添加量と細胞内シグナル伝達経路因子によるホタルルシフェラーゼ合成量を、表３に無細胞タンパク合成系におけるリボソームｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔに相補的なオリゴヌクレオチド添加量（増量）と組換えヒト上皮細胞増殖因子（ｒｈＥＧＦ）によるホタルルシフェラーゼ合成量を示す。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【００１３】
表１に合成オリゴヌクレオチドの影響をみる実験を示す。合成したオリゴヌクレオチドを０．０２５ｎｇ〜２．５μｇの範囲で１０倍ごとの希釈列を作成したＲＲＵ１（５３０ループ）とＲＲＵ８（ＥＦ-Ｇ: ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ-Ｇ結合部位）の組合せをＲＲＬ翻訳反応溶液に添加し、合成されたホタルルシフェラーゼ酵素活性を発光量として計測した。得られた発光量は直線性を示す成績が得られた。オリゴヌクレオチドの濃度が濃くなるにともない、ホタルルシフェラーゼの合成が阻害されていることが示された。一方、ＲＲＵ１とＲＲＵ５の組合せでは、合成されたルシフェラーゼ発光量はオリゴヌクレオチドの濃度依存性と相関は認められなかった。ＲＲＵ８はＥＦ-Ｇ結合部位であることから高濃度のＲＲＵ８オリゴヌクレオチドを添加したことで、ＥＦ-Ｇの結合を阻害しタンパク翻訳を抑制したと考えられる。ＲＲＵ５はＰ-ｔＲＮＡが結合する部位ｐｅｐｔｙｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｅｎｔｅｒそのものであるが、リボソームｓｕｂｕｎｉｔの内側に存在することから立体障害などによりオリゴヌクレオチドがリボソームｓｕｂｕｎｉｔ内に侵入できなかったと考えられる。
【００１４】
表２に合成オリゴヌクレオチドの細胞内シグナル伝達系への影響を検討する場合の追加実験を示す。１つ目はＲＲＵ１とＲＲＵ５の組み合せのオリゴヌクレオチド （２５０ｎｇ/μＬ, ２．５μｇ/Ｌ）をＲＲＬの翻訳反応系に添加し、ｒｈＥＧＦとＣＭＭをさらに添加して細胞内リン酸化シグナル伝達が活性化された状態でオリゴヌクレオチドがタンパク翻訳に影響を与えるかを検討した。ＲＲＵ１とＲＲＵ５の組合せのオリゴヌクレオチド （２５０ｎｇ/μＬ, ２．５μｇ/Ｌ）をＲＲＬ翻訳反応系に添加しても変化は見られなかった。ＣＭＭを添加するとタンパク合成に影響を与える成績は見られなかった。また、ｒｈＥＧＦとＲＲＵ１とＲＲＵ５の組合せのオリゴヌクレオチドを加えても、タンパクの翻訳が阻害または促進されるデータはみられなかった。また、ＣＭＭとｒｈＥＧＦを同時に加えると、タンパクの翻訳が促進させることがわかった（数値が４３３から９８３になっている、表２）。２つ目は、ＲＲＵ１とＲＲＵ８の組み合せのオリゴヌクレオチドをRRLに添加し、rhEGFとCMMをさらに添加して細胞内リン酸化シグナル伝達が活性化された状態でオリゴヌクレオチドがタンパク翻訳に影響を与えるかを検討した。ＲＲＵ１とＲＲＵ８の組合せのオリゴヌクレオチド （２５０ｎｇ/μＬ, ２．５μｇ/Ｌ）をＲＲＬ翻訳反応系に添加してもタンパク合成に変化は見られなかった。ＣＭＭを添加するとタンパク合成を促進させることがわかった（数値が５５５から７２２になっている、表２）。一方、ｒｈＥＧＦを単独で加えた場合、ＲＲＵ１とＲＲＵ８の組合せのオリゴヌクレオチド（２５０ｎｇ/μＬ, ２．５μｇ/μＬ）はタンパクの翻訳を阻害することがわかった（数値が表２で２１６２から１８３６に、表３で３１３３から２１１９になっている）。また、ＣＭＭとｒｈＥＧＦを同時に加えると、ＲＲＵ１とＲＲＵ８の組合せのオリゴヌクレオチド（２５０ｎｇ/μＬ） によるタンパクの翻訳に変化はみられなかった。オリゴヌクレオチドは細胞調節因子としての働きをもち本発明において細胞の遺伝情報を発現調節する因子とオリゴヌクレオチドを用いた細胞の増殖を調節する方法を提供する。
【００１５】
オリゴヌクレオチドの組合せのうちＲＲＵ１はＡ ｓｉｔｅであり、ＲＲＵ１（５３０ループ）はｍＲＮＡを最初に識別するリボソームｓｕｂｕｎｉｔ部位として特に重要である。ＲＲＵ５はＰ-ｔＲＮＡが結合する部位である。ＲＲＵ８の下流部分の配列１０７５〜１０７８はＥＦ-Ｇの結合部位であり、保存領域であるリボソームｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔのタンパク合成を行う場として重要な機能を有する。特にＰ-ｔＲＮＡが結合する部位（ＲＲＵ５）とＥＦ-Ｇが結合する部位（ＲＲＵ８）は細胞内リン酸化転移酵素によるシグナル伝達の影響を強く受けることが予想される。タンパクの翻訳を促進させる結果が得られたのはＲＲＵ１とＲＲＵ５、ＲＲＵ１とＲＲＵ８の組合せのものであった（表2）。このうち、ＣＭＭとｒｈＥＧＦを同時に加えた場合に、ＲＲＵ１とＲＲＵ５の組合せのオリゴヌクレオチド（２５０ｎｇ/μＬ）は、タンパクの翻訳を促進させることが分かった（数値が４３３から９８３になっている、表２）。また、ＣＭＭを加えた場合、ＲＲＵ１とＲＲＵ８の組合せオリゴヌクレオチド（２５０ｎｇ/μＬ）は、タンパクの翻訳を促進させることがわかった（数値が５５５から７２２になっている、表２）。一方、ｒｈＥＧＦを単独で加えたときに、ＲＲＵ１とＲＲＵ８の組合せのオリゴヌクレオチド（２５０ｎｇ/μＬ, ２．５μｇ/μＬ） はタンパクの翻訳を阻害することがわかった（数値が表２で２１２６から１８３６に、表３で３１３３から２１１９になっている）。このようにリボソームｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔの保存領域であり機能を有する配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、タンパク翻訳系のリボソーム部位の配列に作用し、さらにそれぞれ細胞内のシグナル伝達への影響を与えながらタンパクの翻訳を促進していると考えられる。
【００１６】
反応溶液量当たりRRLの細胞数とリボソーム数を推計したときに１ｍＬのウサギ血液から２００μＬのＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅを回収しているといわれる。また、１ｍＬのウサギ血液には１ｘ１０９個の網状赤血球が含まれている。１個の細胞には３〜６×１０６個のリボソーム粒子が存在する。１μＬのＲＲＬには１．５〜３．０×１０１３個のリボソームが存在することになる。逆に、１個の細胞には３〜６×１０６個のリボソーム粒子が存在するので、１μＬ当たり１ｘ１０１０個分の細胞が存在していることになる。ラット繊維芽細胞にオリゴヌクレオチドを添加した実験では細胞数が１０７個にオリゴヌクレオチドを１０ｎｇ添加した場合で細胞増殖が認められたことから、今回のＲＲＬの１μＬ当たりの添加するオリゴヌクレオチド量は１０μｇ量が適量だと思われる。結果的に１個の細胞当たり少なくとも０．１ｆｇのオリゴヌクレオチドを添加する必要があった。今回のRRLを用いた無細胞タンパク合成系におけるオリゴヌクレオチドの添加量は、細胞培養系で認められた細胞増殖性を示すときのオリゴヌクレオチド量添加量の４０分の１の量〜４分の１量で行われたことになる。本研究では細胞培養系のオリゴヌクレオチドを添加した実験に比べ、少ないオリゴヌクレオチドを使用したにも関わらず、無細胞タンパク翻訳反応系においてオリゴヌクレオチドのタンパク翻訳の促進反応または阻害反応を確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００１７】
実験系で所定の細胞内の遺伝情報を簡単に多量に発現させ、タンパク生産させることができ、細胞内の遺伝情報を多量発現、制限させることで、がん細胞の遺伝情報の発現を制御できる可能性があるなど新規の抗がん剤などの医薬品の開発に繋がる。
【配列表】
2006311830000001.app