(57)【要約】【課題】I型アレルギー反応の作用機序の解明、あるいは抗アレルギー薬の開発に有用なノックアウト動物の提供。【解決手段】ホスファチジルイノシトール4-リン酸5-キナーゼ(PIPKI) α遺伝子の一部または全てを破壊又は変異させたことを特徴とする、アレルギー反応を起こす非ヒトノックアウト動物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチジルイノシトール4-リン酸5-キナーゼα遺伝子の一部または全てを破壊又は変異させたことを特徴とする、アレルギー反応を起こす非ヒトノックアウト動物。
【請求項２】
アレルギーがI型アレルギーである、請求項１記載の動物。
【請求項３】
I型アレルギーが、気管支喘息、アレルギー鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性結膜炎、消化管アレルギー、アナフィラキシー、及び薬剤によるショックからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項２記載の動物。
【請求項４】
アナフィラキシーが、受身皮膚アナフィラキシー又は全身性アナフィラキシーである、請求項３記載の動物。
【請求項５】
アレルギー反応が、肥満細胞のヒスタミン放出の抑制又はサイトカイン産生の抑制によって引き起こされるものである、請求項１記載の動物。
【請求項６】
肥満細胞のヒスタミン放出の抑制又はサイトカイン産生の抑制が、アクチン細胞骨格の制御及びチロシンリン酸化の促進によるものである、請求項５記載の動物。
【請求項７】
動物がマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ヒツジ及びヤギからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項1記載の動物。
【請求項８】
動物がマウスである、請求項1記載の動物。
【請求項９】
非ヒト動物のホスファチジルイノシトール4-リン酸5-キナーゼα遺伝子の一部または全てを破壊又は変異させることを特徴とする、アレルギー反応を起こす非ヒトノックアウト動物の作製方法。
【請求項１０】
アレルギーがI型アレルギーである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
I型アレルギーが、気管支喘息、アレルギー鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性結膜炎、消化管アレルギー、アナフィラキシー、及び薬剤によるショックからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
アナフィラキシーが、受身皮膚アナフィラキシー又は全身性アナフィラキシーである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
アレルギー反応が、肥満細胞のヒスタミン放出の抑制又はサイトカイン産生の抑制によって引き起こされるものである、請求項9記載の方法。
【請求項１４】
肥満細胞のヒスタミン放出の抑制又はサイトカイン産生の抑制が、アクチン細胞骨格の制御及びチロシンリン酸化の促進によるものである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
動物がマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ヒツジ及びヤギからなる群から選択されるいずれか一種である、請求項９記載の方法。
【請求項１６】
動物がマウスである、請求項９記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の動物に候補物質を投与することを特徴とする、抗アレルギー薬のスクリーニング方法。
【請求項１８】
アレルギーがI型アレルギーである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
I型アレルギーが、気管支喘息、アレルギー鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性結膜炎、消化管アレルギー、アナフィラキシー、及び薬剤によるショックからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
アナフィラキシーが、受身皮膚アナフィラキシー又は全身性アナフィラキシーである、請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファチジルイノシトール4-リン酸5-キナーゼ(PIPKI) α遺伝子の一部または全てを破壊又は変異させたことを特徴とする、アレルギー反応を起こす非ヒトノックアウト動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸（PI(4,5)P2)は、細胞膜の微量構成成分であるとともに、細胞内シグナル伝達において非常に重要な役割を担っている。最も古くより知られているPI(4,5)P2機能として、セカンドメッセンジャーの前駆体としての役割がある。すなわちPI(4,5)P2は、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼCによってジアシルグリセロール（DG）とイノシトール 1,4,5-三リン酸（IP3）の2つのセカンドメセッンジャーに加水分解され、産生されたDGとIP3は、それぞれプロテインキナーゼCの活性化および小胞体からのカルシウムイオンの放出を誘導することが知られている。さらに、PI(4,5)P2は、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼによりリン酸化されて細胞増殖や生存に関与するセカンドメッセンジャーであるPI(3,4,5)P3に代謝されることも知られている。
【０００３】
近年、PI(4,5)P2自身が種々のタンパク質の機能やシグナル伝達酵素の活性化を制御することも報告されている。例えば、細胞膜に局在しているPI(4,5)P2がプレクストリン相同領域と相互作用することにより、このドメインを有しているタンパク質を細胞膜へリクルートすることや、近年新規な細胞内シグナル伝達酵素として注目を集めているホスホリパーゼDと相互作用して活性化することも明らかになっている。
【０００４】
このように多彩な生理機能をもつPI(4,5)P2は、ホスファチジルイノシトール 4-リン酸のイノシトール環の5位が、タイプIのホスファチジルイノシトール 4-リン酸 5-キナーゼ（PIPKI）によりリン酸化されることにより合成される。PIPKIの存在は1960年代から知られており、1996-1998年にはヒトおよびマウスのPIPKIアイソザイムが相次いでクローニングされ、マウスPIPKIα（ヒトPIPKIβと同一）、マウスPIPKIβ（ヒトPIPKIαと同一）、およびマウスPIPKIγの三種類のアイソザイムの存在が明らかにされた。
【０００５】
PIPKIは、他のイノシトールリン脂質キナーゼやプロテインキナーゼとは一次構造上の相同性が全くなく、独自の脂質キナーゼファミリーを形成している。PIPKIα、βおよびγ間の相同性はアミノ酸レベルで約70%であり、kinase core domainとよばれる、種を越えて高度に保存された領域を有している。しかし、各PIPKIアイソザイムのN末端、C末端には各アイソザイム間で全く相同性がない固有の領域が存在している。この領域は、各PIPKIアイソザイム固有の機能発現に関与していると考えられているが、それらの機能は全く解明されていない。
【０００６】
一方、PIPKIの活性調節機構については詳細な解析が行われている。ヒト胎盤やラット脳、ラット肝臓の膜画分において、非水解性GTPアナログであるGTPγSによりPI(4,5)P2産生が増大することより、PIPKIの活性化に、低分子量GTP結合タンパク質の関与が示唆されていた。さらに、ラット線維芽細胞の無細胞系あるいは膜透過性血小板を用いて低分子量GTP結合タンパク質RhoAあるいはRac1がPI(4,5)P2の産生を増大することが報告され、PIPKIの活性化因子の本体がこれらの低分子量GTP結合タンパク質である可能性が示された。しかしながら、発明者の研究グループによりPIPKIを直接活性化する低分子量GTP結合タンパク質としてADP-リボシル化因子（ARF）が同定された。
【０００７】
また、PIPKIの生理機能については今までに以下のことが明らかにされている。PIPKIは、膜透過性ラット副腎髄質褐色細胞腫由来PC12細胞において、Ca2+により活性化されるATP依存的分泌反応に必要であることが報告されている。また、発明者の研究グループは、PIPKIが、アクチン細胞骨格に富んだ構造体であるラメリポディア形成（葉状仮足）に関与していることを明らかにした。これらの結果は、PIPKIが、その産物であるPI(4,5)P2を介して、アクチン細胞骨格を介した生理機能に関与していることを示唆している。しかしながら、PIPKIの個々のアイソザイム特異的な生理機能についての報告はほとんどない。
【非特許文献１】J.C. Hey et al., Nature 374, 173-177, 1995
【非特許文献２】A. Honda et al., Cell 99, 521-532, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、PIPKIα遺伝子の一部または全てを破壊又は変異させたことを特徴とする、アレルギー反応を起こす非ヒトノックアウト動物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、三種類存在するPIPKIのアイソザイムの一つであるPIPKIα遺伝子の一部または全てを破壊又は変異させたノックアウト動物を作製することによりその生理的機能を解析し、このアイソザイムが、アレルギー反応を起こすことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）本発明は、PIPKIα遺伝子の一部または全てを破壊又は変異させたことを特徴とする、アレルギー反応を起こす非ヒトノックアウト動物である。
【００１１】
本発明において、上記アレルギーとしては、例えば、I型アレルギーが挙げられる。I型アレルギーとしては、例えば、気管支喘息、アレルギー鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性結膜炎、消化管アレルギー、アナフィラキシー、薬剤によるショック等を例示することができる。また、アナフィラキシーは、受身皮膚アナフィラキシー又は全身性アナフィラキシーであってもよい。
【００１２】
本発明のアレルギー反応は、肥満細胞のヒスタミン放出の促進又はサイトカイン産生の促進によって引き起こされるが、これはアクチン細胞骨格の制御及びチロシンリン酸化の促進によるものである。
【００１３】
また、本発明の動物はマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ヒツジ及びヤギであり、好ましくは、マウスである。
（２）本発明は、PIPKIα遺伝子の一部または全てを破壊又は変異させることを特徴とする、アレルギー反応を起こす非ヒトノックアウト動物の作製方法である。
【００１４】
本発明において、上記アレルギーとしては、例えば、I型アレルギーが挙げられる。I型アレルギーとしては、例えば、気管支喘息、アレルギー鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性結膜炎、消化管アレルギー、アナフィラキシー、薬剤によるショック等を例示することができる。また、アナフィラキシーは、受身皮膚アナフィラキシー又は全身性アナフィラキシーであってもよい。
【００１５】
本発明のアレルギー反応は、肥満細胞のヒスタミン放出の促進又はサイトカイン産生の促進によって引き起こされるが、これはアクチン細胞骨格の制御及びチロシンリン酸化の促進によるものである。
【００１６】
また、本発明の動物はマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ヒツジ及びヤギであり、好ましくは、マウスである。
（３）本発明は、上記（１）記載の動物に候補物質を投与することを特徴とする、抗アレルギー薬のスクリーニング方法である。
【００１７】
本発明において、上記アレルギーとしては、例えば、I型アレルギーが挙げられる。I型アレルギーとしては、例えば、気管支喘息、アレルギー鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性結膜炎、消化管アレルギー、アナフィラキシー、薬剤によるショック等を例示することができる。また、アナフィラキシーは、受身皮膚アナフィラキシー又は全身性アナフィラキシーであってもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、PIPKIα遺伝子の一部または全てを破壊又は変異させたことを特徴とする、アレルギー反応を起こす非ヒトノックアウト動物が提供される。このノックアウト動物は、アレルギー反応の作用機序の解明、あるいは抗アレルギー薬のスクリーニングを行うためのモデル動物として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明は、PIPKIα遺伝子の一部または全てを破壊又は変異させたことを特徴とする、アレルギー反応を起こす非ヒトノックアウト動物である。
１．ノックアウト動物
PIPKI（ホスファチジルイノシトール4-リン酸5-キナーゼ）とは、細胞内シグナル伝達において、ホスファチジルイノシトール4-リン酸(PI(4)P)をホスファチジルイノシトール4、5-二リン酸(PI(4,5)P2)に変換する酵素であり、このようにイノシトールリン脂質（PI）の代謝回転を活性化させる酵素であるため、PIキナーゼともよばれる。
【００２１】
PIPKIには、α、β及びγの３つのアイソザイムが存在する。このうち、本発明において破壊又は変異される対象となる遺伝子は、PIPKIα遺伝子である。
【００２２】
PIPKIはPI(4,5)P2の産生を制御することにより細胞機能の発現に重要な役割を果たすと考えられるが、詳細はほとんど解明されておらず、各々のアイソザイムの生理的機能も明らかにされていない。
【００２３】
本発明のノックアウト動物において破壊されているPIPKIα遺伝子は、マウス由来の遺伝子である（H. Ishihara et al., J. Biol. Chem. 271, 23611-23614, 1996）。
【００２４】
本発明の非ヒトノックアウト動物を作製するためには、以下の標準的な方法を用いることができる。
【００２５】
まず、PIPKIα遺伝子の塩基配列の一部または全てを改変したものを分化全能性細胞に導入し、改変PIPKIα遺伝子が導入された細胞を選択する。次に、選択された遺伝子改変（欠損、破壊、変異等）が施された細胞を受精卵に導入してキメラ個体を作製し、得られたキメラ個体を交配することにより相同染色体上の一方又は双方のPIPKIα遺伝子がノックアウトされた個体を作出する。
【００２６】
本発明に用いられる動物の種類は、特に限定されるものではない。たとえば、ヒトを除くマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ヒツジ及びヤギなどが挙げられる。本発明では取り扱いが容易で繁殖しやすいマウスが好ましい。
【００２７】
本明細書において、PIPKIα遺伝子の機能を失わせるために、PIPKIα遺伝子の塩基配列の一部または全部を改変することができる。「改変」とは、PIPKIα遺伝子のDNAの一部に、欠損、置換または付加を生じさせる変異を加えることをいう。これらの変異としては、例えば、遺伝子工学的手法による塩基配列の一部又は全部の削除（欠失）、あるいは他遺伝子又は塩基配列の挿入または置換があげられる。例えば、コドンの読み取り枠をずらすか、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより、PIPKIα欠損遺伝子を作製することができる。これにより、PIPKIα遺伝子の発現産物であるPIPKIαタンパク質の機能が発現しなくなる。
【００２８】
本発明のノックアウトマウスは、例えば、公知の遺伝子組み換え法（ジーンターゲッティング法）により作製することができる。ジーンターゲッティング法は、当分野においてはよく知られた技術であり、本分野の種々の実験書に開示されている。PIPKIα遺伝子のターゲッティングベクターは、PIPKIα遺伝子を破壊することにより当該遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させる。
【００２９】
ターゲティングベクターを設計するにあたり、PIPKIα遺伝子の構造に変化をもたらす部位は、PIPKIα遺伝子の機能が欠損する限り、特に限定されるものではない。但し、PIPKIα遺伝子の機能及び構造を考慮して、PIPKIα遺伝子のエキソン３領域を欠失させるように設計することが特に好ましい。
【００３０】
また、ベクターを導入した組換え体は、ターゲティングベクターにより導入した薬剤耐性遺伝子を用いたスクリーニングと、サザンブロット法やPCR法を用いたスクリーニングとを併用して選抜することが好ましい。薬剤選択のマーカー遺伝子として、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子等を使用することができる。また、ネガティブ選択用遺伝子には、HSVチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素A遺伝子等を使用することができる。
【００３１】
上記の方法により作製したターゲッティングベクターを使用して、相同組換えを行う。本明細書において、「相同組換え」とは、改変されたPIPKIα遺伝子を、ゲノム中のPIPKIα遺伝子のDNA領域に人工的に組換えさせることをいう。
【００３２】
目的とする相同組み換え体を得るためには、多数の組換え体をスクリーニングする必要がある。しかし、受精卵では多数のスクリーニングを行うことが技術的に困難である。そこで、受精卵と同様に多分化能を有し、かつin vitroで培養することができる細胞を使用することが好ましい。分化全能性細胞としては、マウス（Nature 292:154-156, 1981）、ラット（Dev. Biol. 163(1): 288-292, 1994）、サル（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(17):7844-7848, 1995）、ウサギ（Mol. Reprod. Dev. 45(4):439-443, 1996）についてはES細胞等が確立している。また、ブタについてはEG(embryonic germ)細胞が確立している（Biol. Reprod 57(5):1089-1095, 1997）。
【００３３】
従って本発明においては、これらの動物種を対象に作製することが好ましいが、特にノックアウト動物の作製に関して技術が整っているマウスが最適である。マウスES細胞としては、現在マウス由来のES細胞株がいくつか確立されており、例えばTT2細胞株、AB-1細胞株、J1細胞株、R1細胞株等を使用することができる。これらのどのES細胞株を用いるかは、実験の目的又は方法により適宜選択することができる。
【００３４】
ES細胞を樹立する場合、一般には受精後3.5日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に8細胞期胚(受精後2.5日目頃の8細胞期胚が好ましい)を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより、効率よく多数の初期胚を取得することができる。
【００３５】
このようにして得られたES細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる再生能を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、STO繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でLIF(１〜10000U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、5%炭酸ガス、95%空気または5%酸素、5%炭酸ガス、90%空気）で約37℃で培養し、継代時には、例えば、トリプシン/EDTA溶液処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などが採用される。このような継代は、通常1〜3日毎に行なうとともに、細胞の形態的観察を行うことが好ましい。
【００３６】
ES細胞への遺伝子導入は、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などの方法を採用することができるが、簡便に多数の細胞を処理できる点でエレクトロポレーション法が好ましい。
【００３７】
得られた組換えES細胞につき、相同組み換えが起こっているかどうかのスクリーニングを行う。即ち、まずネオマイシン等を導入した薬剤耐性因子によりスクリーニングを行うことができる。この場合、薬剤耐性遺伝子としては、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(nptII)遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(hpt)遺伝子などが挙げられ、レポーター遺伝子としては、例えばβ-ガラクトシダーゼ(lacZ)遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(cat)遺伝子などが挙げられる。
【００３８】
スクリーニングを確実にするために、PIPKIα遺伝子がノックアウトされた細胞は、PIPKIα遺伝子上またはその近傍のDNA配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析を行うか、あるいは、ターゲティングベクター上のDNA配列と、ターゲティングベクターに使用したマウス由来のPIPKIα遺伝子以外の近傍領域のDNA配列とをプライマーとしたPCRを行うことができる。サザンハイブリダイゼーション解析またはPCRは併用することもできる。
【００３９】
これらのアッセイにより、染色体上に存在する野生型PIPKIα遺伝子と導入したPIPKIα遺伝子断片の間で正しく相同遺伝子組み換えが起こり、染色体上のPIPKIα遺伝子に変異が移った細胞を選択することができる。
【００４０】
導入遺伝子の組込みが確認されたES細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚内に戻すことにより、宿主胚の細胞塊に組み込まれたキメラ胚が形成される。ES細胞を胚盤胞等の胚に導入する方法としては、マイクロインジュクション法や凝集法が知られているが、いずれの方法を用いることも可能であり、当業者が適宜改変することができる。
【００４１】
マウスの場合には、ホルモン剤（例えば、FSH様作用を有するPMSGおよびLH作用を有するhCGを使用）により過排卵処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、胚盤胞を用いる場合には受精から3.5日目に、8細胞期胚を用いる場合には2.5日目に、それぞれ子宮から初期発生胚を回収する。このようにして回収した胚に対して、ターゲティングベクターを用いて相同組み換えを行ったES細胞をin vitroにおいて注入し、キメラ胚を作製する。これを仮親に移植して発生及び生育させることにより、キメラノックアウトマウスが得られる。仮親とするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上記の方法により作製したキメラ胚を子宮内移植し、妊娠・出産させることによりキメラマウスを作製することができる。キメラ胚の着床、妊娠がより確実に起こるようにするため、受精卵を採取する雌マウスと仮親となる偽妊娠マウスとを、同一の性周期にある雌マウス群から作出することが望ましい。
【００４２】
そして、仮親から生まれた子（マウスの場合は約17日で子が生まれる）のうちキメラ動物を選ぶ。ES細胞移植胚に由来するマウス個体が、このようなキメラマウスの中から得られた場合、このキメラマウスを純系のマウスと交配し、そして次世代個体にES細胞由来の被毛色が現れること等により、ES細胞がキメラマウス生殖系列へ導入されたことを確認することができる。ES細胞が生殖系列へ導入されたことを確認するには、様々な形質を指標として用いることができるが、体の一部（例えば尾部先端）からDNAを抽出し、サザンブロット解析やPCRアッセイを行うことにより、選抜を行うこともまた可能である。キメラの寄与率が高い動物は生殖系列の可能性が高いが、キメラ動物を正常な動物と交配することにより、生殖系列のキメラ動物であることの確認が可能である。その後、正常な雌と交配し、F1を得て変異動物系統を樹立する。
【００４３】
上記のようにして得られるキメラノックアウト動物は、相同染色体の一方にのみ遺伝子欠損を有するヘテロ接合体として得られる。相同染色体上の双方のPIPKIα遺伝子が破壊されたホモ接合体であるノックアウト動物を得るには、F1動物のうち相同染色体の一方にのみ遺伝子欠損を有するヘテロ接合体をC57BL/6マウスに1回または2回戻し交配すればよい。このようにして得られたPIPKIαホモ欠損動物は、生存可能であり、メンデルの法則にしたがって発生する。雄雌ともに正常な生殖能を有しており、外見的には健常であり、個体レベルでは野生型と異なる表現型は認められない。
【００４４】
ノックアウト動物が得られたか否かは、以下の方法によって確認する。すなわち、野生型動物とPIPKIα遺伝子がノックアウトされた（PIPKIα-/-）動物の受身皮膚および全身性アナフィラキシーを比較することによって、PIPKIα-/-動物に即時型アレルギー反応が亢進しているかを観察することにより確認することができる。具体的には、全身性アナフィラキシーについては、抗DNP IgE抗体を静注して24時間感作した後、DNP-HSAを静注する。体温は直腸温を測定することによって行う。受身皮膚アナフィラキシーについては、抗TNP-IgE抗体を静注して24時間感作した後、アセトンに溶かした塩化ピクリルとオキサゾロンをそれぞれ右耳と左耳に塗布して耳介肥厚反応を誘導し、耳の厚さを測定することにより行う。
【００４５】
また、以下一般的な方法によっても確認できる、すなわち、組織から染色体DNAを抽出し、サザンブロット法を行う。また、細胞の代謝活性を測定することもできるし、解剖を行った際の諸組織−臓器の異常を観察することもできる。さらに、組織からRNAを抽出し、ノザンブロット解析により遺伝子の発現パターンを解析することもできる。さらに、必要に応じて血液を採取し、血液検査や血清生化学的検査を実施することも可能である。
２．アレルギー反応
アレルギーとは、免疫反応が過度に、あるいは不適当な形で起こり、組織障害を引き起こすことをいう。本発明のノックアウト動物が引き起こすアレルギーは、好ましくはI型（即時型）アレルギーである。I型アレルギーとは、花粉、ハウスダスト（室内塵）、ダニ、動物のふけのような環境中に存在する通常無害な物質に対し、免疫グロブリンE（IgE）抗体が産生されるときに起こるアレルギーである。I型アレルギーは、抗原と接触後、即座にアレルギー反応が起こるため、即時型アレルギーともいわれる。I型アレルギーにより引き起こされる症状は、気管支喘息、アレルギー鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性結膜炎、消化管アレルギー、受身皮膚アナフィラキシー、全身性アナフィラキシー、及び薬剤によるショックなどがある。
【００４６】
I型アレルギーの作用機序は、以下の通りである。すなわち、IgEは、そのFc部で肥満（マスト）細胞上のFcεレセプターに強く結合し、その結合体に抗原（アレルゲン）がさらに結合すると、Fcレセプター同士が抗原分子による架橋によって結合する。この架橋による結合がシグナルとなり、肥満細胞の原形質顆粒中のヒスタミンなどが細胞外に放出され、ロイコトリエン等の化学伝達物質が放出される。この化学伝達物質は、血管透過性亢進、平滑筋収縮、粘液分泌亢進、白血球走化などをもたらす作用を示し、このような作用に起因する組織反応によって、喘息や、鼻炎などの症状を伴う急性炎症反応（アレルギー反応）が起こるのである。
【００４７】
以下に、I型アレルギーにより引き起こされる各々の症状について記載する。
【００４８】
気管支喘息とは、呼吸困難性の疾患をいう。この疾患は、気管支における以下のメカニズムにより生ずる。すなわち、気管支において化学伝達物質が放出されると、気管支の平滑筋が収縮を起こして、気管支が細くなる。その結果、血管透過性が亢進することにより粘膜が浮腫を起こし、気道がさらに狭くなり、さらに、粘液が増加することによって、ますます気道が塞がれることにより、呼吸が困難になるというものである。
【００４９】
アレルギー鼻炎及びアレルギー性結膜炎とは、化学伝達物質により、血管透過性亢進による粘膜の浮腫がもたらされ、神経の刺激によるくしゃみが起こり、粘液の分泌が高まる症状である。
【００５０】
アトピー性皮膚炎とは、表皮中のランゲルハンス細胞表面の高親和性及び低親和性のFcレセプターに結合しているIgEに外来性抗原が反応し、ランゲルハンス細胞からサイトカインが放出されることにより発症する皮膚の発疹をいう。
【００５１】
蕁麻疹とは、皮膚肥満細胞からの化学伝達物質がもたらす血管透過性亢進による膨疹、血管拡張による皮膚発赤、神経を刺激することにより生じる痒みをいう。
【００５２】
消化管アレルギーとは、消化管での化学伝達物質の放出により平滑筋が収縮して消化管の蠕動が高まり、粘液の分泌が亢進し、腹痛及び蹴りがもたらされることをいう。
【００５３】
アナフィラキシーとは、血液内で化学伝達物質の放出が大量に起こることにより、末梢血管の拡張が生じ、血圧が下がって激しい全身的な症状（ショック）がもたらされることをいう。特に、受身皮膚アナフィラキシーとは、抗血清を皮膚内に注射後、6〜24時間置いて特異抗原とPontamineブルーやEvansブルーのような染料を静脈内接種したときに起こる反応をいい、全身性アナフィラキシーとは、抗原の静脈内または皮内注射後に起こる感作されたヒト平滑筋及び毛細血管にわたる即時的反応をいう。この場合、特に薬剤が化学伝達物質となる場合を、薬剤によるショックといい、薬剤は抗生物質である場合がある。
【００５４】
３．PIPKIαによる肥満細胞のヒスタミン放出抑制等
興味深いことに、PIPKIα遺伝子がノックアウトされた（PIPKIα-/-）肥満細胞においては、高親和性Fcεレセプター（FcεRI）の刺激によるヒスタミン放出が非常に顕著に亢進している。このような、PIPKIα-/-肥満細胞に、PIPKIαを強制発現すると、ヒスタミン放出反応は、正常肥満細胞のヒスタミン放出レベルにまで回復する。
【００５５】
高親和性Fcεレセプター（FcεRI）とは、肥満細胞上のFc部に対する高親和性のレセプターをいう。このFcεRIα鎖に結合しているIgEに抗原が結合すると、レセプター同士が抗原分子によって架橋された形になる。β鎖には、チロシンキナーゼが会合しているが、このチロシンキナーゼが活性化されて、チロシンがリン酸化されると、ホスホリパーゼが活性化されて、Ca2+の動員とプロテインキナーゼCの活性化がもたらされ、これにより、細胞質顆粒が細胞膜に融合して、ヒスタミンが放出されるのである。
【００５６】
したがって、チロシンがリン酸化されることにより、ヒスタミンの放出が促進されるのである。
【００５７】
上記のように、PIPKIαは(PI(4)P をPI(4,5)P2に変換する酵素であるが、生成産物であるPI(4,5)P2は、その標的タンパク質の一つであるアクチン結合タンパク質の活性を調節することによりアクチン細胞骨格の再構築を制御しており、アクチン細胞骨格の再構築は顆粒放出反応に関与していると考えられている。そこで、PIPKIαはその産物PI(4,5)P2を介してアクチン細胞骨格を再構築し、その結果、肥満細胞のFcεRI刺激によるヒスタミン放出反応を負に制御していると考えられる。
【００５８】
このようなPI(4,5)P2を介したアクチン細胞骨格の再構築によるヒスタミン放出反応は、以下に記載するように、アクチン重合剤であるLatrunculinを用いて調べることができる。すなわち、PIPKIα+/+肥満細胞を0.5μM  Latrunculinと共に37℃で15分間インキュベートすることによりFcεRI刺激によるヒスタミン放出反応はPIPKIα-/-肥満細胞と同様に亢進するのである。また、PIPKIα-/-肥満細胞及びLatrunculin処理されたPIPKIα-/-肥満細胞の細胞内のF-アクチン量をフローサイトメトリーにより定量することができる。すなわち、骨髄由来肥満細胞を抗DNP IgE抗体でインキュベートした後、DNP-HASで刺激する。当該細胞をホルマリン/PBSで固定した後、Alexa Flor 488 phalloidin（Molecular Probe社）で染色し、フローサイトメトリーにより定量し、細胞のphalloidin蛍光強度の平均値で表すことができる。顕微鏡解析においては、刺激した細胞をスライドガラスに接着させ、パラホルムアルデヒド/PBSで固定した後にAlexa488標識phalloidinでラベルし、その蛍光を観察することができる。このように測定した実験結果において、PIPKIα-/-肥満細胞及びLatrunculin処理されたPIPKIα-/-肥満細胞ともに、細胞内のF-アクチン量が有意に減少した場合は、PIPKIαは、アクチン細胞骨格を再構築し、FcεRI刺激によるヒスタミン放出反応を負に制御しているといえる。
【００５９】
さらに、PIPKIα-/-肥満細胞においては、野生型のPIPKIα肥満細胞に比し、FcεRI刺激によるサイトカイン産生が顕著に亢進されていることが明らかであり、PIPKIαは、FcεRI刺激によるサイトカイン産生反応を負に制御していることが明らかである。
【００６０】
肥満細胞のヒスタミン放出や、サイトカイン産生、アクチン細胞骨格の再構築は、アレルギー反応と密接に関連していることが知られている。したがって、上記のように、ヒスタミン放出反応や、サイトカイン産生を負に制御するPIPKIαは、アレルギー反応も負に制御しているといえる。
４．抗アレルギー薬のスクリーニング方法
本発明は、非ヒトノックアウト動物に候補物質を投与することを特徴とする、抗アレルギー薬のスクリーニング方法を提供する。
【００６１】
具体的には、本発明のノックアウト動物又はその一部に候補物質を接触させ、前記候補物質を接触させた非ヒト動物又はその一部において標的とする疾患と相関関係を有する指標値を測定し、対照と比較し、この比較結果に基づきアナフィラキシーの軽減等を指標として候補物質の予防・治療・改善効果を試験することができる。
【００６２】
「ノックアウト動物又はその一部」とは、動物の生体の全身、及び限定された組織又は器官の両者を含む。限定された組織又は器官の場合は、動物から摘出されたものも含む。
【００６３】
候補物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。これら候補物質は塩を形成していてもよく、候補物質の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００６４】
試験動物を候補物質で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、塗布、皮下投与、皮内投与、腹腔投与などが用いられ、試験動物の症状、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、候補物質の投与量は、投与方法、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００６５】
例えば、抗アレルギー薬をスクリーニングする場合、本発明のノックアウト動物等に候補物質を投与し、該動物の直腸温、耳介肥厚反応による耳の厚さなどを経時的に測定することにより、有効性を示した物質をスクリーニングすることができる。
【００６６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６７】
PIPKIαノックアウトマウスの作製
12kbのゲノミックPIPKIα断片は129/Olaマウスゲノミックライブラリーから単離し、ターゲティングベクターは620塩基対の短腕と9000塩基対の長腕の間に、酵素活性に必須である68-106アミノ酸残基を、ネオマイシン耐性カセット（PGK-Neo）をPIPKIαの転写方向と逆向きに置換して作製した（図１）。このターゲッティングベクターを直鎖化し、それを1 x 107個のE14K胚性幹細胞に電気穿孔法により導入した。G418耐性コロニーを選択し、PIPKIαとネオマイシン耐性カセットに特異的なプライマーを用いて相同組み換えを起こしたことを確認した。相同組換えクローンは、Hind IIIまたはEcoRVにより断片化したゲノムDNAを、3'側隣接配列をプローブとしてサザンブロッティングによりさらに確認した。得られたESクローンをC57BL/6マウスの胚盤胞にインジェクトしてキメラマウスを作製した。
【００６８】
作製したキメラマウスの雄をC57BL/6の雌と交配してヘテロ接合体を作製した。ヘテロ接合体同士を交配したのち、産仔の遺伝子型をPCRおよびサザンブロッティングにより同定した。PIPKIα+/+またはPIPKIα-/-骨髄由来肥満細胞からRNAを調製し、ノザンブロッティングとウェスタンブロッティングでPIPKIαの発現の有無を確認した。
【００６９】
その結果、PIPKIα-/-骨髄由来肥満細胞では、PIPKIαの発現が見られないことが示された（図２）。また、PIPKIα-/-骨髄由来肥満細胞では、Hind IIIまたはEcoRVにより断片化したゲノムDNA（各々、3.2kb及び3.4kb）のバンドが見られたのに対し、野生型ではこれらのバンドは見られなかった（図３）。従って、PIPKIα-/-は、エクソン3とネオマイシン耐性カセットの相同組み換えにより得られたものであることが確認された。
【００７０】
PIPKIα+/-マウスをC57BL/6マウスに1回または2回戻し交配した。実験のコントロールには同腹仔を用いた。この結果は、独立な2つのESクローンから作製した独立なマウス系統で同様の結果が得られることを確認した。すべてのマウスは東京都臨床医学総合研究所のガイドラインに沿って飼育した。PIPKIα-/-マウスはメンデルの法則通りの個体数が生まれ、10ヶ月以上健常であった。
【００７１】
BMMCsを破砕し、その破砕液の30 μg蛋白質を用いて、抗PIPKIα、抗PIPKIβ、抗PIPKIγ、および抗アクチン抗体をプローブとしてPIPKIアイソザイムの発現を検出した。ノックアウトマウス由来のBMMCsにおいては、PIPKIαは発現されておらず、PIPKIαとPIPKIαの発現量は影響を受けていなかった。一方、PIPKIαを欠損させても他のPIPKIアイソザイムであるPIPKIβとPIPKIγの発現量は野生型のものと同等であった（図２）。
【実施例２】
【００７２】
骨髄由来肥満細胞株とレトロウィルス感染
PIPKIα+/+およびPIPKIα-/-マウスから骨髄由来肥満細胞株を樹立した（図4）。骨髄由来肥満細胞は以前の報告（Q. Liu et al., Genes Dev. 13, 786-791, 1999）に従って培養した。すなわち、PIPKIα+/+またはPIPKIα-/-マウスの大腿骨から骨髄細胞を洗い出し、これをIL-3存在下で4-8週培養した。c-Kitの発現は抗c-Kit抗体を用いて解析した。FcεRIの発現は細胞を抗DNP IgE抗体でインキュベートしたのちFITC-抗IgE抗体を用いて検出した。これらの発現量をフローサイトメーターFACScanにより解析した。
【００７３】
その結果、肥満細胞の発現マーカーであるc-Kitの発現量はPIPKIα+/+およびPIPKIα-/-で変化が見られなかった。従って、PIPKIαの欠損は、肥満細胞が骨髄細胞から分化する際には、何ら影響を及ぼさないことが示された（図４）。
【００７４】
レトロウィルス感染実験のためにMyc-PIPKIαをレトロウィルスベクターのpBabe-puroに挿入した。作製したpBabe-puro-Myc-PIPKIαまたはpBabe-puroをphoenix-Eパッケージング細胞にトランスフェクトした。PIPKIα-/-骨髄由来肥満細胞はポリブレンと共にパッケージング細胞培養上清で1日培養し、ピューロマイシンにより三週間選択をかけた。PIPKIα-/-骨髄由来肥満細胞でのMyc-PIPKIαの発現はウェスタンブロッティングにより確認した。
【実施例３】
【００７５】
脱顆粒とIP3およびカルシウム動員の測定
骨髄由来肥満細胞を、10％FCS含有OPTI-MEM中で抗DNP IgE抗体とともに15時間培養した。細胞を洗浄後、0.1％BSA含有OPTI-MEMに再懸濁してDNP-HSAを加えた。脱顆粒は細胞内から放出されたβ-hexosaminidaseを測定して定量した。IP3濃度はIP3 radioreceptor assay kit（PerkinElmer社）を用いて測定した。カルシウム動員については、感作した骨髄由来肥満細胞をTyrode's 緩衝液（10 mM HEPES, pH 7.4, 112 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.4 mM NaH2PO4, 1.6 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 2 mM glucose, 1% BSA）中で室温にて45分間2 M Fura-2-AMと共にとインキュベートした後、FcεRI刺激によるカルシウム動員を0.5秒毎に340 nmと380 nmの励起光を用いて、510 nmの発光を蛍光光度計（Shimadzu社）で検出することにより測定した。
【００７６】
その結果、細胞内のβ-hexosaminidase活性はPIPKIα+/+とPIPKIα-/-で差はなかったが、FcεRI依存的な脱顆粒はPIPKIα+/+肥満細胞と比較してPIPKIα-/-肥満細胞では顕著に増加していた（図５）。図中、＊＊印は、PIPKIα+/+細胞と比較したPIPKIα-/-細胞において、Student's t testの結果がP<0.01であることを意味している。データは、トリプリケートの平均±SDである。脱顆粒は、全細胞内β-hexosaminidaseのパーセントで表した。しかし、TPAとイオノマイシンによる脱顆粒はPIPKIα+/+とPIPKIα-/-で差が見られなかったことから、基本的な分泌機構には変化がないと考えられた（図６）。また、脱顆粒には細胞内カルシウム濃度の増加が重要であることが知られているが、この知見と一致して、PIPKIα-/-肥満細胞ではカルシウム濃度の増加量が亢進していることが明らかとなった（図７）。さらに、PIPKIα-/-肥満細胞にレトロウィルス発現系を用いてPIPKIαを発現させると、脱顆粒量および細胞内カルシウム濃度の増加量はPIPKIα+/+肥満細胞と同レベルまで回復することが分かった（図８）。図８において、Ａは、PIPKIα-/-肥満細胞においてPIPKIαを発現させた場合の脱顆粒量の経時変化を示し、ＢはPIPKIα-/-肥満細胞においてPIPKIαを発現させた場合の細胞内カルシウム濃度の経時変化を示している。
【００７７】
以上の結果からPIPKIαの欠損によりFcεRI依存的な脱顆粒が亢進されることが明らかとなった。
【００７８】
次に、肥満細胞でのPI(4,5)P2産生におけるPIPKIαの寄与について検討した。これについては、まず、BMMCsを[32P]無機リン酸で標識し、細胞内リン脂質レベルを薄層クロマトグラフィーで解析した。測定したPIPとPI(4,5)P2の放射活性は、全リン脂質の放射活性を基盤にして補正し、PIPKIα+/+細胞におけるPIPとPI(4,5)P2値を100%としてPIPKIα-/-BMMCsのそれぞれのリン脂質を相対的に表した。データは、４回の実験結果の平均値±s.d.で表した。
その結果、PIPKIα-/-肥満細胞のPI(4,5)P2量はPIPKIα+/+肥満細胞と比較してわずかに低いことが明らかとなった（図９）。図９において、左パネルは、PIPKIα+/+細胞におけるPIP値を100%としてPIPKIα-/-BMMCsのリン脂質を相対的に示す。この結果より、PIPKIαを欠損させると、PIPはPI(4,5)P2に変化することができないことが分かる。右パネルは、PIPKIα+/+細胞におけるPI(4,5)P2値を100%としてPIPKIα-/-BMMCsのリン脂質を相対的に示したグラフである。PIPKIαを欠損させると、本来であれば、上記のように、PIPはPI(4,5)P2に変化することができないため、PI(4,5)P2値はかなり減少するはずであるが、実際はPI(4,5)P2値はわずかに減少した程度に過ぎなかった。これは、PIPKIαが欠損された場合、PIPKIの機能はPIPKIβ及びPIPKIγで補われたことによるものであると考えられる。
【００７９】
さらに、FcεRI依存的なIP3の産生は細胞内カルシウム濃度の増加を誘導することが知られているが、PIPKIα-/-肥満細胞ではFcεRI依存的なIP3の産生が促進されていることが分かった。
【実施例４】
【００８０】
アクチン細胞骨格
細胞内F-アクチン量はフローサイトメトリーにより定量した。IgEで感作したBMMCsを0.5 μM Latrunculinで15分間処理した後、50 ng/mlのDNP-HASで５分間刺激し、その細胞を3.7%ホルムアルデヒドで固定した。
F-アクチンをAlexa488標識phalloidinで染色し、フローサイトメトリーを用いて定量し、細胞のphalloidin蛍光強度の平均値で表した。顕微鏡解析においては、刺激した細胞をスライドガラスに接着させ、パラホルムアルデヒド/PBSで固定した後にAlexa488標識phalloidinでラベルし、その蛍光を観察した（図１０）。蛍光値は、PIPKIα+/+BMMCsにおける蛍光強度を100として表した。
その結果、PIPKIα-/-肥満細胞ではPIPKIα+/+肥満細胞と比較してF-アクチンの総量が70-80％に減少していることが分かった（図１０A、B）。すなわち、図１０Bにおいて、PIPKIα-/-肥満細胞のグラフのピークがPIPKIα+/+肥満細胞のグラフのピークよりも左にずれていることから、PIPKIα-/-肥満細胞ではF-アクチンの総量が減少しているということが分かった。
【００８１】
またPIPKIαをPIPKIα-/-肥満細胞に過剰発現させたものは、対照(pBabe)と比して、グラフのピークが右にずれており、F-アクチンが増加していることが示された（図１１）。
【００８２】
さらに蛍光抗体法によりF-アクチンを以下のように観察する。すなわち、細胞を上記のようにLatrunculinで処理し、スライドガラス上に接着させた後に2.4%パラホルムアルデヒドで固定した。F-アクチンをAlexa488標識phalloidinで染色し、蛍光顕微鏡で観察した。
【００８３】
その結果、PIPKIα+/+肥満細胞と比較してPIPKIα-/-肥満細胞におけるF-アクチンが顕著に減少していることが分かった（図12）。PIPKIα-/-BMMCsにおける脱顆粒を測定した結果を図1３に示す。
【００８４】
図１３より、ヒスタミンの放出は、PIPKIα-/-肥満細胞において最も促進されていた。また、PIPKIα+/+肥満細胞をLatrunculinで処理した場合には、処理をしない場合に比して、ヒスタミンの放出が亢進していた。これにより、F-アクチンが減少すると、ヒスタミン放出が促進されることが確認された。
【実施例５】
【００８５】
イムノブロッティングと免疫沈降
感作した骨髄由来肥満細胞を0.1％ BSA含有OPTI-MEMに再懸濁した後、DNP-HASで刺激した。冷PBSで反応を停止させ、RIPA緩衝液を加えて細胞破砕液を調製した。免疫沈降は以前に報告されている方法（J. Irie-Sasaki et al., Nature 409, 349-354, 2001）に従った。すなわち、細胞破砕液または免疫沈降物の蛋白質をSDS-PAGEで分離した後、定法に従ってイムノブロッティングを行った。ERK、SAPK、p38、AktおよびPLCγ1のリン酸化特異的抗体を用いてそれらのリン酸化を検出した。SykとLATに関しては、それらを免疫沈降した後にSDS-PAGEで分離し、抗リン酸化抗体の4G10とPY99を用いてそれぞれのチロシンリン酸化を検出した。それぞれの蛋白質レベルは、それぞれの蛋白質特異的な抗体を用いて検出した。
【００８６】
図中の数字は、NIHイメージングで測定したそれぞれの免疫反応強度を示している。相対量の比較はNIH imageにより行った。リン酸化特異的抗体およびAkt、SAPK、p38、PLCγ1抗体はCell Signaling社より購入した。抗LAT抗体と抗リン酸化チロシン抗体4G10はUpstate Biotech社より購入した。抗リン酸化チロシン抗体PY99はSanta Cruz Biotechnology社より購入した。抗Syk抗体はInstitut PasteurのU. Blank博士より供与された。ヤギ抗マウスIgG-HRPはBD Bioscience/Becton Dickinson社より、ロバ抗ラビットIgG-HRPはSanta Cruz Biotechnology社より購入した。
【００８７】
結果は、PIPKIα-/-肥満細胞ではこれらのタンパク質のリン酸化が促進されていることが明らかとなった（図１４）。さらにFcεRIを介した細胞内シグナリングで最も初期におきる現象の一つであるSykのチロシンリン酸化やPLCγ、LATのチロシンリン酸化も促進されていた（図１４）。しかし、未刺激時のこれらのタンパク質のリン酸化は亢進していなかった。またIL-3やSCF刺激時のERKやAktのリン酸化はPIPKIα+/+とPIPKIα-/-肥満細胞で差はみられなかった。
【実施例６】
【００８８】
RT-PCR
BMMCsをIgEで感作した骨髄由来肥満細胞をDNP-HASで刺激した後、全RNAをTRIzol reagent（Gibco社）を用いて精製した。ここからfirst-strand cDNAを合成し、各サイトカインおよびGAPDHに特異的なプライマーを用いてmRNAの誘導をRT-PCRで検出した。PCRを行い、GAPDHで標準化して半定量的に評価した。GAPDHは, glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenaseを、 ILはinterleukinを、TNFはtumor necrosis factorをそれぞれ示す。
【００８９】
その結果、PIPKIα-/-肥満細胞ではFcεRI依存的なサイトカイン産生が増加していることが明らかとなった（図１５）。IL-2とIL-3の産生はもっとも影響を受けており、刺激1時間後のPIPKIα-/-肥満細胞におけるmRNA量は50倍以上であった（図１５）。
【実施例７】
【００９０】
受身皮膚および全身性アナフィラキシー
全身性アナフィラキシーについては、一匹のマウス当たり5μgの抗DNP IgE抗体を静注して24時間感作した後、1 mgのDNP-HASを静注した。その後、経時的に直腸温を測定した。受身皮膚アナフィラキシーについては、抗TNP-IgE抗体を静注して24時間感作した後、アセトンに溶かした塩化ピクリルとオキサゾロンをそれぞれ右耳と左耳に塗布して耳介肥厚反応を誘導した。耳の厚さは常法に従って測定した。マウスは10-15週令の個体を用い、コントロールには同腹仔を用いた。
【００９１】
DNP特異的IgE抗体で感作したマウスに抗原を投与したところ、PIPKIα-/-マウスでは野生型マウスと比較して、全身性アナフィラキシー反応の指標である体温の低下が顕著にみられた（図１６A）。図中、＊印は、unpaired t-testにおけるP<0.05の有意差を示している。
【００９２】
また、一匹のマウス当たり100μgの抗TNP IgEを静注し、24時間後に右耳に10μlの1%塩化ピクリルを、左耳に対照として10μlの1%オキサゾロンを塗布して、受身皮膚アナフィラキシーを誘導した。受身皮膚アナフィラキシー反応は、肥厚耳介（右耳の厚さから左耳の厚さを差し引いたもの）により表した。データは、平均±SEMで表した。＊＊印は、unpaired t-testにおけるP<0.01の有意差を示している。これにより、受身皮膚アナフィラキシー反応もPIPKIα-/-マウスで促進されることが明らかとなった（図１６B）。このアナフィラキシー反応の違いは、肥満細胞の数の差を反映しているものではないことが確認された。
【実施例８】
【００９３】
細胞内PI(4,5)P2測定
IgE感作した骨髄由来肥満細胞を、[32P]orthophosphate、0.1％BSA、10mM HEPES（pH7.5）を含むphosphate-freeのRPMI1640培地中、37℃で1時間ラベルした。細胞を２回洗浄した後、さらに10分インキュベートした。ラベル反応はクロロホルム/メタノール/4％HClO4（5：10：1）を加えて停止させた。クロロホルム/1％HClO4を加えた後に有機層を採取し、クロロホルム飽和1％HClO4で2回洗浄した後、脂質を乾燥させた。乾燥させた脂質をクロロホルム/メタノール（95：5）で溶解し、以前の報告（T. Sasaki et al., Science 287, 1040-1046, 2000）に従って分離した。すなわち、全リン脂質、PI(4,5)P2、PIPに取り込まれた放射活性は、BAS2500 bio-imaging analyzer（Fuji Film社）により定量した。
【００９４】
その結果、肥満細胞においてPIPKIαは、刺激依存的なエキソサイトーシスに重要なアクチン細胞骨格の再編成を制御していることが明らかとなった。PI(4,5)P2はアクチン細胞骨格の再編成に重要であることから、PIPKIα-/-肥満細胞でみられたアクチン細胞骨格の異常は、限定された細胞膜領域におけるPI(4,5)P2産生の減少により引き起こされたと考えられる。PIPKIαによるアクチン細胞骨格の制御は、PI(4,5)P2非依存的なメカニズムによるものである可能性も残されているが、いずれにしてもPIPKIαによる肥満細胞での脱顆粒とアクチン細胞骨格の制御は、他のPIPKsによって相補されない機能であることが明らかとなった。また今回の結果から、PIPKIαの欠損は、アクチン細胞骨格制御の異常のみならず、FcεRIを介した細胞内シグナルの増強も誘導することが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ゲノミックPIPKIα配列の部分制限マップとネオマイシン耐性（Neor）ベクターを示す。
【図２】骨髄由来肥満細胞（BMMCs）におけるPIPKIアイソザイムの発現のウェスタンブロッティングによる解析を示す。
【図３】野生型（+/+）、PIPKIα+/-（+/-）、およびPIPKIα-/-（-/-）のE12ES細胞から単離したゲノミックDNAをHind IIIまたはEcoRVで切断し、サザンブロッティングで解析した写真を示す。
【図４】成熟BMMCsの二つのマーカーc-Kit（左側）とFcεRI（右側）の細胞表面での発現レベルをフローサイトメトリーで測定したグラフを示す。
【図５Ａ】PIPKIα+/+およびPIPKIα-/-由来BMMCsにおけるβ-hexosaminidaseの放出を表したグラフである。
【図５Ｂ】PIPKIα+/+およびPIPKIα-/-由来BMMCsにおけるβ-hexosaminidaseの放出を表したグラフである。
【図６】TPA（50 nM）とイオノマイシン（2.5μM）で刺激した際の脱顆粒を示す。
【図７】Fura-2をロードしたBMMCsをIgEで感作した後、50 ng/mlの抗原で刺激した場合のカルシウム遊離を測定したグラフである。
【図８Ａ】PIPKIα-/-BMMCsにpBABEあるいはPIPKIα cDNAを導入し、脱顆粒を測定したグラフである。
【図８Ｂ】PIPKIα-/-BMMCsにpBABEあるいはPIPKIα cDNAを導入し、カルシウム遊離を測定したグラフである。
【図９】BMMCsを[32P]無機リン酸で標識し、細胞内リン脂質レベルを薄層クロマトグラフィーで解析したグラフを示す。
【図１０Ａ】細胞内F-アクチン量の解析を示す。
【図１０Ｂ】PIPKIα-/-BMMCsにおけるF-アクチン量の減少を示すグラフである。
【図１１】PIPKIα-/-BMMCsにおけるF-アクチン量の減少を示すグラフである。
【図１２】PIPKIα-/-BMMCsにおけるF-アクチン形態の変化を示す。
【図１３】PIPKIα-/-BMMCsにおける脱顆粒を測定したグラフを示す。
【図１４】FcεRI刺激後のBMMCsにおけるシグナリング分子のリン酸化を示す。
【図１５】PIPKIα+/+およびPIPKIα-/-BMMCsの抗原刺激後のサイトカインmRNAレベルのキネティックスを示す。
【図１６Ａ】全身性アナフィラキシーを誘導したグラフを示す。
【図１６Ｂ】受身皮膚アナフィラキシーを誘導したグラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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