(57)【要約】【課題】本発明の課題は発癌性物質の代謝能を予測することによる、肺癌易罹患性の診断のための検査方法を提供することである。ＵＧＴ１A７の核酸配列のエキソン１領域の遺伝子変異を検査することにより、発癌性物質の代謝能を予測する検査を行うとともに、肺癌発症の危険因子の検査予測方法を提供することである。 【解決手段】ＵＧＴ１A７の核酸配列のエキソン１領域の変異と肺癌の関係を検索したところ、エキソン１の特定の変異が肺癌発症の危険因子になりうることを見出し、本発明を完成させた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ１A７）の核酸配列の検査方法であって、配列番号１で表した配列の、３８７番目のｔからｇへの変異（Ｎ１２９Ｋ）、３９１番目のcからa及び３９２番目のｇからaへの変異（Ｒ１３１Ｋ）及び６２２番目のｔからｃへの変異（W２０８Ｒ）のうち、少なくとも１つの変異を検査することを特徴とする肺癌易罹患性の検査方法。
【請求項２】
請求項１に記載のＵＧＴ１A７の核酸配列の検査によるUGT1A７酵素分子の機能、酵素活性を検査又は予測することによる肺癌易罹患性の検査方法。
【請求項３】
配列番号１で表した配列の、３８７番目のｔからｇへの変異（Ｎ１２９Ｋ）、３９１番目のcからa及び３９２番目のｇからaへの変異（Ｒ１３１Ｋ）及び６２２番目のｔからｃへの変異（W２０８Ｒ）の３つの変異を組合わせて検査することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１に記載の方法が肺癌易罹患性の診断をする検査方法である。
【請求項５】
配列番号２、３、４及び５に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのいずれか１または少なくとも２つを用いる請求項１〜４のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１に記載の検査方法に用いる検査装置、試薬又はキット。
【請求項７】
請求項５に記載の検査方法に用いるオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1種を組み込んでなる検査装置、試薬又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は臨床検査の分野で用いられ、とりわけグルクロン酸抱合に関与する酵素の核酸配列検査の方法を提供し、さらに本発明は肺癌易罹患性の診断のための検査方法を提供するものである。またこれらの検査方法を実施するための試薬又はキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
UDP-グルクロン酸転移酵素（UGT）により触媒されるグルクロン酸抱合はビリルビンをはじめ種々の薬剤や毒物の代謝、解毒に重要な役割をしている。ヒトUGT１遺伝子群は少なくとも１３個の異なるエキソン１と共通エキソン２〜５からなり、1つのエキソン１が共通エキソン２〜５に対してスプライシングする（非特許文献１）。それぞれのUGTは広い基質特異性と独自の生体組織内分布を有している。
【０００３】
UGT1A７は肺、口腔、咽頭、食道、胃、小腸等で発現しており、ヒドロキシルベンゾ[アルファ]ピレンや、２−ヒドロキシアミノ−１−メチル−６−フェニル[４，５−ベータ]ピリジン等の発癌性物質をグルクロン酸抱合し、解毒することが知られている（非特許文献２など）。最近、UGT1A７の機能上の多型が存在し、これらの多型により酵素活性が低下すること及び口腔咽頭癌、肝細胞癌、膵癌や大腸癌と多型が関連することが報告されている（非特許文献３など）。しかしながら、UGT1A7の多型と肺癌の関係は調べられていない。
【非特許文献１】J.Biol.Chem.(1992) 267, 1043-1047
【非特許文献２】Mol.Pharmacol. (1997) 52, 212-220
【非特許文献３】Gastroenterogy (2001) 121, 1136-1144
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は発癌性物質の代謝能を予測することによる、肺癌易罹患性の診断のための検査方法を提供することである。ＵＧＴ１A７の核酸配列のエキソン１領域の遺伝子変異を検査することにより、発癌性物質の代謝能を予測する検査を行うとともに、肺癌の危険因子の検査予測方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らはＵＧＴ１A７の核酸配列のエキソン１領域の変異と肺癌の関係を検索したところ、エキソン１の特定の変異が肺癌の独立した危険因子になりうることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
本発明は、以下の構成からなる。
１、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ１A７）の核酸配列の検査方法であって、配列番号１で表した配列の、３８７番目のｔからｇへの変異（Ｎ１２９Ｋ）、３９１番目のcからa及び３９２番目のｇからaへの変異（Ｒ１３１Ｋ）及び６２２番目のｔからｃへの変異（W２０８Ｒ）のうち、少なくとも１つの変異を検査することを特徴とする肺癌易罹患性の検査方法。
２、前記１に記載のＵＧＴ１A７の核酸配列の検査によるUGT1A７酵素分子の機能、酵素活性を検査又は予測することによる肺癌易罹患性の検査方法。
３、配列番号１で表した配列の、３８７番目のｔからｇへの変異（Ｎ１２９Ｋ）、３９１番目のcからa及び３９２番目のｇからaへの変異（Ｒ１３１Ｋ）及び６２２番目のｔからｃへの変異（W２０８Ｒ）の３つの変異を組合わせて検査することを特徴とする前記１又は２に記載の方法
４、前記１〜３のいずれか１に記載の方法が肺癌易罹患性の診断をする検査方法である。
５、配列番号２、３、４及び５に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのいずれか１または少なくとも２つを用いる前記１〜４のいずれか１に記載の検査方法。
６、前記１〜５のいずれか１に記載の検査方法に用いる検査装置、試薬又はキット。
７、前記５に記載の検査方法に用いるオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1種を組み込んでなる検査装置、試薬又はキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、UGT1A７のエキソン１領域の変異を検査することにより、肺癌発症の危険因子の診断を可能になるといった格段の効果をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明をさらに詳細に説明するため、実施態様を例示して説明する。
（検査対象）
本発明による検査対象は肺癌の危険因子の検査である。
UGT1A7のエキソン１領域には３種類の変異、Ｎ１２９Ｋ、Ｒ１３１Ｋ及びW208Ｒが存在する。ここで、全く変異を持たない正常型をUGT1A7*1と表し、N129KとR131Kの２箇所に変異を有するものをUGT1A7*2、N129K,R131K及びW208Rの３箇所に変異を有するのをUGT1A７*3、W２０８Rのみに変異を有するものをUGT1A7*4とそれぞれ表す。これらの変異体では、発癌性物質の一種であるベンゾ（アルファ）ピレン代謝物に対する酵素活性が正常型に比べて、UGT1A7*２では２．６分の１倍、UGT1A7*４では２．８分の１倍の低下が認められ、さらにUGT1A7*３においては５．８分の１倍にも低下する。従って、このような発癌性物質に暴露される機会と発癌の関係から、本発明は、癌とりわけ肺癌との関連を検査する方法として有用であり、肺癌の発症と喫煙の関連を理解、予測する上においても有用な検査方法である。
【０００９】
（検査試料）
検査しようとするＵＧＴ１A７核酸配列のゲノムDNAは肝臓、腎臓、白血球、毛髪等の臓器、組織等特に限定されることなく得ること可能である。白血球からゲノムDNAを得る方法の一つに市販のキット、例えばキアゲン社のQuiagen Blood DNAキットを用いることができる。得られたゲノムDNAを用いて、配列番号１に記載の領域を含むゲノムDNAを、例えば、配列番号２に記載の５´CGTCAAGGCCAAAAGCAT−３´と配列番号３に記載の５´−GTACAAAAGAATTCCTTAAACCAGAAA−３´のプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅させる。ゲノムDNAを増幅する手段はPCRに限られたものではなく、ＬＡＭＰ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ等の公知の増幅工程により増幅させることも可能である。
【００１０】
（変異検出）
得られた増幅産物の変異を検出する方法は直接シーケンス法を初め、種々の公知の方法が適用され特に限定されるものではない。直接シーケンス法のためのプライマーの例として、配列番号４及び５のプライマーが挙げられる。制限酵素による断片化試料の電気泳動分析やＤＮＡ試料を溶液内ハイブリザイズさせるＦＩＳＨ法等により、検査することも可能である。その他サザンハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（J. Mol. Biol., 98: 503-517, 1975等参照）、ジデオキシ塩基配列決定法、ＤＮＡの増幅手法を組合せた各種の検出法［例えばＰＣＲ−制限酵素断片長多型分析法（RFLP: Restriction fragment length polymorphism），ＰＣＲ−単鎖高次構造多型分析法（Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86:
2766-2770, 1989等参照），ＰＣＲ−特異的配列オリゴヌクレオチド法（SSO: Specific sequence oligonucleotide），ＰＣＲ−ＳＳＯとドットハイブリダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法（Nature, 324: 163-166, 1986等参照）］等を例示することができる。さらにオリゴヌクレオチドプローブを用いる核酸チップ又は核酸アレイによって簡便に検出することも可能である。
【００１１】
本発明で用いるプライマー類のオリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機、例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社）等を用いて容易に合成することができ、得られるオリゴヌクレオチドは更に必要に応じて、市販の精製用カートリッジ等を用いて精製することもできる。
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。
【実施例１】
【００１２】
（検査対象及び試料の調製）
健常日本人１４０人及び肺癌患者９２人を検査対象とした。キアゲン社のQuiagen Blood DNAキットを用いてゲノムDNAを分離し精製した。それぞれについてUGT1A７のエキソン１の領域を配列番号２及び３に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅させた。PCRの条件は９４℃で２分間の変性、９４℃で１分間の放置、６０℃で１分間、７２℃で２分間のサイクルを３０サイクル行った。その後、７２℃で8分間最終の伸長反応を行った。増幅した試料をジクロロローダミン使用ダイターミネーター法シーケンシングキット（dRhodamine
Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit）を用いて直接シーケンス法にて配列を確認した。配列解析用プライマーとして、配列番号４及び５のプライマーを用いた。
【実施例２】
【００１３】
（対立遺伝子頻度の解析）
実施例１に記載の検査対象について、対立遺伝子（アレル）の発現頻度の解析を行った。その結果を表１に示した。健常人群において全２８０アレルのうち正常型、UGT1A7*1は１８６アレル（６６％）であった。８２アレル（２９％）で、Ｎ１２９ＫとＲ１３１Ｋの重複変異（UGT1A7*２又はUGT1A7*３）が観察された。その中で、５７アレル（２０％）においてW２０８Ｒの変異がさらに重複していた（UGT1A7*３）。  一方肺癌患者群では全１８４アレルのうち正常型（UGT1A7*1）は１０６アレル（５８％）であった。７４アレル（４１％）で、Ｎ１２９ＫとＲ１３１Ｋの重複変異（UGT1A7*２又はUGT1A7*３）が観察された。その中で、５８アレル（３２％）においてW２０８Ｒの変異がさらに重複していた（UGT1A7*３）。W２０８Ｒのみの変異であるUGT1A7*4は健常人群で１２アレル（４％）と肺癌患者群で４アレル（２％）が認められた。これらの結果、肺癌患者群において明らかにＮ１２９Ｋ、Ｒ１３１Ｋ及びW208Ｒの３種類の重複変異が、健常人群よりも高頻度に起きていることがわかった。
【００１４】
【表１】
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【実施例３】
【００１５】
実施例１で示した全対立遺伝子解析について、そのゲノタイプを調べた。その結果を表２に示した。両対立遺伝子共に変異を持たない正常型（UGT1A7*１/１）は健常人群で１４０例中６６例（４７．１％）、肺癌患者群で９２例中３１例（３３．７％）であった。一方、UGT1A7*３のホモ変異型であるUGT1A7*３/３は健常人群で１４０例７例（５．０％）に対して肺癌患者群では９２例中１４例（１５．２％）と３倍も高頻度に認められた。またこの変異による肺癌の罹患率を多変量解析により計算すると、そのオッズ比は変異を持たないヒトに比べて約５倍となった。このことから明らかに本発明の方法により、肺癌易罹患性を予測、検査できることが判った。
【００１６】
【表２】
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【実施例４】
【００１７】
実施例１に記載の検査対象について、ＵＧＴ１Ａ７*３の出現頻度と肺癌の関連を喫煙群と非喫煙群に分けて解析した。その結果、喫煙群でＵＧＴ１Ａ７*３を持つ人は５８例中３５例（６０．３％）に肺癌であり、一方持たない人では８０例中３６例（４５％）が肺癌であった。一方、非喫煙群では、ＵＧＴ１Ａ７*３をもつ人は３６例中９例（２５％）が肺癌、持たない人は５８例中１２例（２０．６％）で肺癌であった。以上の結果、喫煙群では非喫煙群に比べて、肺癌の罹患率が高く、さらに、喫煙者でＵＧＴ１Ａ７*３を持つ人は、同じ喫煙者でも持たない人に比べて肺癌の罹患率が高くなる傾向が認められた。したがって、本発明は肺癌易罹患性を予測、検査に有用であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明は、発癌性物質の代謝予測に利用されるほか、癌とりわけ肺癌易罹患性を予測、検査のために必要な臨床検査の分野で用いられる診断薬キットとして製造される。
【配列表】
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