(57)【要約】      （修正有）【課題】  マイクロアレイの管状体に保持されているゲル状物に凹凸を生じない、生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法の提供。【解決手段】  以下の工程を順次行うことを含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法である。（１） 複数の管状体をそれら管状体の長手方向が同一方向となるように３次元に配列すし、管状体配列ブロックを得る工程。（２） 管状体配列ブロックの各管状体の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を充填し、次いで管状体内でゲル化反応を実施し、管状体にキャプチャープローブが固定されたゲル状物を保持する工程。（３） 管状体配列ブロックをクランプで固定し、管状体の長手方向と交叉する方向で切断を繰り返す工程。ここで、切断を繰り返すことによりブロック長の全長が短くなるにつれ、クランプ圧を減圧し切断を繰り返す。【選択図】  図１
2006047043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を順次行うことを含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法。
（１） 複数の管状体をそれら管状体の長手方向が同一方向となるように３次元に配列すし、管状体配列ブロックを得る工程。
（２） 管状体配列ブロックの各管状体の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を充填し、次いで管状体内でゲル化反応を実施し、管状体にキャプチャープローブが固定されたゲル状物を保持する工程。
（３） 管状体配列ブロックをクランプで固定し、管状体の長手方向と交叉する方向で切断を繰り返す工程。ここで、切断を繰り返すことによりブロック長の全長が短くなるにつれ、クランプ圧を減圧し切断を繰り返す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸等の生体関連物質を光学的に検出するために用いられる生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法において、キャプチャープローブを固定化したゲルが保持された、管状体配列ブロックを、連続的に切断する薄片化方法関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多数遺伝子の一括発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる分析法が数多く開発され注目を集めている。これらの方法は、いずれも核酸間のハイブリダイゼーション反応に基づく核酸の検出・定量法である。ＤＮＡマイクロアレイとしては、従来、シート状物の表面上にキャプチャープローブを配置したものが知られている。最近では、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）等の透明樹脂製板状物上に設けられた多数の凹部にキャプチャープローブを配置したもの、多数の貫通孔を有するシート物の貫通孔部にキャプチャープローブを配置したものが提案されている（特許文献１及び２参照）。また、中空繊維等の管状体の中空部にキャプチャープローブを配置したものを束ねて薄片化したものが提案されている（特許文献３〜５参照）。これらのＤＮＡマイクロアレイにおいて、キャプチャープローブは中空繊維の中空部の内表面に直接、またはポリアクリルアミド架橋体等と水を含むゲル状物を介して中空部内に保持されている。これらの従来技術のうち、中空繊維等の管状体を用い薄片化する方法は同じ形態のＤＮＡマイクロアレイを大量生産できることから、生産コストの低減が期待されている。薄片化の方法としては一般的なミクロトームを使用した方法が開示されている。
【特許文献１】特開2000-60554
【特許文献２】特開2000-78998
【特許文献３】国際公開第99/13311
【特許文献４】国際公開第99/19711
【特許文献５】国際公開第00/40942
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
薄片化方法の一例として、ミクロトームによる薄片化では、均一な厚みの薄片を得るために管状体配列ブロックをしっかりと固定する必要がある。しかし、固定する力（以下、クランプ圧）が強すぎるとゲル状物にかかる応力が大きくなり、スライス後のマイクロアレイのゲル状物が大きな凹凸を持つことが分かった。またゲル状物に凹凸を生じない程度で切断を行っていても、薄片が切り出されるブロックの切断部位によって、スライス後のゲル状物に凹凸の程度に差を生じることが分かった。
【０００４】
このように凹凸が生じると、マイクロアレイの使用時にゲル状物が剥がれ落ちたり、非特異的な検体の結合を促したりする場合がある。本発明は、上記問題点を解決したマイクロアレイの製造方法（薄片化方法）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、複数の管状体が、長手方向が同一方向となるように３次元に配列され、さらに該管状体の管内にはキャプチャープローブを固定化したゲルが保持された、管状体配列ブロックを、連続的に切断する薄片化方法に関して、管状体配列ブロックを掴むクランプ圧をある圧力以下にし、更に長手方向で変化させることでゲルの凹凸変化を改善できることを見出し、本発明に至った。
【０００６】
すなわち本発明は、以下の工程を順次行うことを含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法である。
【０００７】
（１） 複数の管状体をそれら管状体の長手方向が同一方向となるように３次元に配列すし、管状体配列ブロックを得る工程。
【０００８】
（２） 管状体配列ブロックの各管状体の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を充填し、次いで管状体内でゲル化反応を実施し、管状体にキャプチャープローブが固定されたゲル状物を保持する工程。
【０００９】
（３） 管状体配列ブロックをクランプで固定し、管状体の長手方向と交叉する方向で切断を繰り返す工程。ここで、切断を繰り返すことによりブロック長の全長が短くなるにつれ、クランプ圧を減圧し切断を繰り返す。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、薄片のゲル状物の凹凸変化を抑制することができ、安定した品質のマイクロアレイを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、以下の工程を順次行うことを含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法である。
【００１２】
（１） 複数の管状体をそれら管状体の長手方向が同一方向となるように３次元に配列すし、管状体配列ブロックを得る工程。
【００１３】
（２） 管状体配列ブロックの各管状体の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を充填し、次いで管状体内でゲル化反応を実施し、管状体にキャプチャープローブが固定されたゲル状物を保持する工程。
【００１４】
（３） 管状体配列ブロックをクランプで固定し、管状体の長手方向と交叉する方向で切断を繰り返す工程。ここで、切断を繰り返すことによりブロック長の全長が短くなるにつれ、クランプ圧を減圧し切断を繰り返す。
【００１５】
第１の工程では、複数の管状体をそれら管状体の長手方向が同一方向となるように３次元に配列すし、管状体配列ブロックを得る。
【００１６】
管状体としては、例えばチューブ、中空繊維、パイプなどが挙げられる。好ましくは中空繊維が利用される。その材質としては、例えば、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系材料、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカーボネート等のポリエステル系材料、ポリアクリロニトリル等のアクリル系材料、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系材料、ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリレート系材料、ポリビニルアルコール系材料、ポリ塩化ビニリデン系材料、ポリ塩化ビニル系材料、ポリウレタン系材料、フェノール系材料、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系材料、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系材料等が挙げられる。またエチレン-ビニルアルコール共重合体などの共重合ポリマーも挙げられる。
【００１７】
管状体の内径は任意に設定できる。好ましくは、10〜2000μmである。また管状体
にカーボンブラック等の黒色顔料を適量含有させたものを用いることもできる。
【００１８】
上記管状体の複数本を、管状体の長手方向が同一方向となるように３次元に配列し、配列体ブロックを作成する。配列体ブロックの作成方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の管状体を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法が挙げられる（特開平11-108928号公報参照）。また、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ねあわせ、それらの孔部に、管状体を通過させ、２枚の多孔板の間隔を開き、２枚の多孔板間の、中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させ硬化させる方法が挙げられる。接着剤としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂等を用いることができる（特開2001-133453号公報参照）。接着剤にはカーボンブラック等の黒色顔料を適量含有させたものを用いることもできる。また、隣接する管状体の外表面を相互に融着することによって管状体配列ブロックを製造することもできる。
【００１９】
さらに、接着剤として、有機高分子、例えば、シリコン樹脂や、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカーボネート等のポリエステル系樹脂、ポリアクリロニトリル等のアクリル系樹脂、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系樹脂、ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリレート系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、ポリ塩化ビニリデン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、フェノール系樹脂、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系樹脂、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系樹脂等を用いて管状体配列ブロックを作製しても良い。配列の固定は、配列した管状体の全長又は所定部分に対して行う。所定部分を固定することで、配列した管状体の少なくとも一方の端部から適当な長さの部分は固定しない状態とすることもできる。
【００２０】
第２の工程では、管状体配列ブロックの各管状体の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を充填し、次いで管状体内でゲル化反応を実施し、管状体にキャプチャープローブが固定されたゲル状物を保持する
キャプチャープローブとは、核酸、アミノ酸、ペプチド、糖、脂質、抗体、さらに
は化学結合、物理結合などの相互作用により生体関連物質を検出しうる有機化合物、無機
化合物等をいう。それらは、生細胞からの抽出、化学合成等により調製される。例えば、生細胞からのDNAの調製は、Blinらの方法(Nucleic Acids Res.3.2303(1976))等により行うことができる。また、RNAの調製は、Favaloroらの方法(Methods.Enzymol.65.718(1980))等により行うことができる。
【００２１】
「ゲル前駆体溶液」とは、架橋構造を形成してゲル化をもたらす化学物質を含む溶液を
いう。例えば、単量体、多官能性単量体、重合開始剤、及び水等を含む溶液である。また
、アガロース、アルギン酸ナトリウムなどの多糖類、ゼラチン等のタンパク質等である。
【００２２】
単量体としては、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピ
ルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミ
ノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエ
チルメタクリレート、（メタ）アクリル酸及びアリルデキストリン等が挙げられる。多官
能性単量体としては、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ
（メタ）アクリレート等が挙げられる。単量体成分の濃度は単量体の種類にもよるが、例えばアクリルアミド系単量体の場合は２〜２０質量％程度である。
【００２３】
上記ゲル前駆体溶液は、例えば、微細な針を有するシリンジに前記溶液を吸引し、各中
空繊維の中空部に針を差し込むことにより導入する。また、管状体配列ブロックの一方の端部が固定されていない場合は、以下の方法によりゲル前駆体溶液を管状体内へ導入することもできる。
【００２４】
即ち、まず管状体配列ブロックとゲル前駆体溶液をデシゲーター内に設置する。次いで、管状体配列ブロックの管状体が固定されていない端部を、この溶液中に浸し、デシゲーター内を減圧状態し、管状体の中空部にこの溶液を導入する。
【００２５】
ゲル前駆体溶液の導入後、所定の条件でゲル化を実施することにより管状体内にゲル状物が保持される。ゲル化の条件は使用したゲル前駆体の種類により適宜選択される。
【００２６】
キャプチャープローブは目的に応じて必要な種類（数）が準備される。例えば、中空繊
維の数と同一の数のキャプチャープローブを準備し、各管状体に互いに異なる１種類の
キャプチャープローブを導入することができる。また、複数の管状体に同じキャプチャ
ープローブを導入することもできる。
【００２７】
第３の工程では、管状体配列ブロックをクランプで固定し、管状体の長手方向と交叉する方向で切断を繰り返す工程。ここで、切断を繰り返すことによりブロック長の全長が短くなるにつれ、クランプ圧を減圧し切断を繰り返す。
【００２８】
ブロックの切断手段としては、好ましくは平刃を用いたミクロトームである。切断後に得られる薄片の厚みは、5mm以下であり、好ましくは0.1mm〜1mmである。切断の際、管状体配列ブロックはスライス中に動かないように固定する必要がある。
【００２９】
以下、図１を参照して本発明を説明する。図１は管状体配列ブロックの切断方法を表した模式図である。図１の１は管状体配列ブロックであり、図１の２に示すクランプによりしっかりと固定する。管状体配列ブロックはスライス方向に対して垂直にした状態で固定する。管状体配列ブロックはその両端をクランプによりしっかりと固定されている。その後、図１の３に示すスライス刃によって目的の厚さにスライスされる。スライスは刃を移動させスライスさせても良く、また固定された管状体配列ブロックを移動させスライスしても良い。
【００３０】
固定方法は特に限定されないが、エアーなどの圧力でクランプすることが好ましい。またスライス中に管状体配列ブロックがスライス応力により変形することを防止するため、管状体配列ブロックはスライス面の近傍でクランプされることが好ましい。好ましい距離としてはスライス面から０．５〜３ｍｍである。
【００３１】
管状体配列ブロックは図１に示すように管状体、その内部のゲル状物、管状体の周りの樹脂接着剤により構成されている。ゲル状物は接着剤硬度に比較して柔らかい。こうした物をスライスする際、クランプ力が大きすぎるとゲル状物に応力が集中し、切断後に得られたマイクロアレイのゲル部に大きな凹凸が生じてしまう。また、接着剤の硬度が小さすぎると、管状体配列ブロックにひずみが生じ、均一な厚みのマイクロアレイを得ることが困難になる。また、管状体中で保持されたゲル状物はスライスにより両端が開放されると膨潤にする。その為、ゲル部分はマイクロアレイ表面に対し若干凹凸が生じる。この凹凸、特に凸部分が大きいとマイクロアレイの取り扱い中に剥がれる恐れがあり、その結果、ハイブリダイゼーション後の検出結果に影響を与える。このマイクロアレイ表面に対する凹凸は-３０μｍ〜５０μｍの間であることが好ましく、この範囲内であれば上記不具合は生じる可能性は小さい。このような理由より、スライス時のクランプ力は０．４ＭＰａ以下が好ましい。また接着剤の硬度はＪＩＳ  ＴｙｐｅＡで測定した場合、９５以上１００未満の範囲であることが好ましい。なお、本明細書中記載の硬度とは管状体配列ブロックの周りの接着剤部分を測定した硬度のことを示す。
【００３２】
スライス時、クランプ力は同じであっても実際にゲル状物にかかる応力が異なると上記に説明したようなスライス後マイクロアレイのゲル凹凸が生じてしまう。実際、管状体配列ブロックを薄片化していく際、スライス中の温度変化やその他外部環境要因などによる応力伝達変化により同じクランプ力でスライスを続けると、途中からゲルの凹凸が生じてしまう。この変化は外部応力を調整することにより改善が可能である。具体的にはクランプ圧を初期クランプ圧に対し、７５％以下にすることで改善可能になる。このようなクランプ圧の調整は、管状体配列ブロックの全長が初期長の、６０％以降の管状体配列ブロックのスライスに対しておこなうことが好ましい。このようなクランプ圧の調整は、徐々にクランプ圧を調整しても、急激に調整してもよい。このようなクランプ圧の調製により、全てのマイクロアレイに関してゲルの凹凸が少ない安定したマイクロアレイの供給が可能となる。
【実施例】
【００３３】
＜実施例１＞
（１）管状体配列ブロックの製造
以下の方法にて管状体配列ブロックを製造した。まず、直径０．３２ｍｍの孔が、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦横各１６列で合計２５６個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板２枚を準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維（三菱エンジニアリングプラスチック社製  カーボンブラック1質量%添加、長さ２００mm）を１本づつ、通過させた。
【００３４】
Ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。
【００３５】
次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。
【００３６】
次に、この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン4276、コロネート4403）の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、８ｍｍ（縦）Ｘ８ｍｍ（横）Ｘ１２０ｍｍ（長さ方向）の管状体配列ブロックを得た。管状体配列ブロックの硬度はＪＩＳ  ＴｙｐｅＡで測定したところ９９であった。
【００３７】
（２）中空部へ重合溶液の充填及び重合反応
上記（１）で作製した管状体配列ブロックの自由端部をウレタン樹脂で密閉にし、重合装置内に窒素を満たした状態で16時間放置し、中空繊維の自由端から予め調整した反応液（下記、水溶液A）を中空繊維内に吸引して樹脂で固めた部分まで充填した。水溶液充填後、窒素雰囲気下で、55℃定値運転モードに設定した乾燥機（ヤマト科学製  DP-43）で３時間重合した。
【００３８】
＜水溶液A＞
・Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド                  4.5  質量部
・Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド            0.5  質量部
・２,２′−アゾビス（２−メチルプロピオン
アミジン）ジヒドロクロライド                    0.1  質量部
・水                                              95   質量部
（３）管状体配列ブロックの薄片化
重合後、管状体配列ブロックは上記（１）で使用した多孔版を取り外し、下部を治具にて固定し、電磁石でスライス中に動かないよう固定した。管状体配列ブロックの上部はエアー圧でクランプ固定し薄片化を行なった。
【００３９】
本実施例ではエアー圧（以下クランプ圧）０．４ＭＰａ、スライス厚さ５００μｍで、スライス速度１００ｍｍ／ｍｉｎ．で管状体配列ブロックの長さ方向に対し、薄片化が出来なくなるまで行なった。
【００４０】
スライスしたマイクロアレイは、キーエンス社製超深度レーザー顕微鏡を用いて表面のゲル部分の凹凸を測定した。
【００４１】
その結果、スライスＮｏ．１〜６０程度（ロッド全長の３分の２）までは、マイクロアレイおもて面、裏面とも凸が５０μｍ以下であったが、残りの３分の１はゲルの凸が５０μｍ以上となった。
【００４２】
（４）検査過程によるゲルの形態異常
上記（３）で得られたゲルの凸が５０μｍ以下のマイクロアレイ３０枚と５０μｍ以上のマイクロアレイ３０枚をそれぞれハイブリ、洗浄工程を行ない、その後実体顕微鏡を用いてゲルの状態を確認した。その結果５０μｍ以下のマイクロアレイに関しては全てにおいてゲルの剥がれなどの異常は認められなかった。一方ゲルの凸が５０μｍ以上のマイクロアレイに関しては３０枚中３枚に関してゲルが剥がれた様子が確認された。
【００４３】
＜実施例２＞
実施例１で作製したゲルが保持された管状体配列ブロック（全長１２０ｍｍ）をスライス厚さ５００μｍ、スライス速度１００ｍｍ／ｍｉｎ．で、ブロック全長の約６０％（上端から７０ｍｍ）まではクランプ圧０．４ＭＰａ、その後は０．２ＭＰａでスライスを行なった。
【００４４】
スライスしたマイクロアレイは、キーエンス社製超深度レーザー顕微鏡を用いて表面のゲル部分の凹凸を測定した。
【００４５】
その結果、管状体配列ブロック全長の６０％（上端から７０ｍｍ）までは、実施例４同様マイクロアレイおもて面、裏面とも凸が５０μｍ以下であった。さらに０．２ＭＰａのクランプ圧でスライスした残りの３分の１のマイクロアレイに関してもゲルの凹凸が凸部分が５０μｍ以下であった。
【００４６】
スライスＮｏ．１〜３０のマイクロアレイ３０枚と７１〜１００のマイクロアレイ３０枚をそれぞれハイブリ、洗浄工程を行ない、その後実体顕微鏡を用いてゲルの状態を確認した。その結果全てのマイクロアレイにおいてゲルの剥がれなどの異常は認められなかった。
【００４７】
＜比較例１＞
実施例１で作製した管状体配列ブロックをクランプ圧０．６ＭＰａでスライスを行なった。スライスしたマイクロアレイを、キーエンス社製超深度レーザー顕微鏡を用いて表面のゲル部分の凹凸を測定したところ、ゲル状物の凸部分が６０〜７０μｍであった。このマイクロアレイを実施例４と同様にしてゲルの剥離を確認したところ３０枚中５枚でゲルの剥離が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明により製造される生体関連物質検出用マイクロアレイは、多数遺伝子の一括発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】管状体配列ブロックの切断方法を示した模式図である。
【符号の説明】
【００５０】
１      管状体配列ブロック
２      クランプ
３      スライス刃
【図１】
2006047043.tif 000003