(57)【要約】      （修正有）【課題】  ＣＬＬ株、ＣＬＬ−ＡＡＴならびにこれらの細胞を使用する抗体の調製および特徴づけること。【解決手段】  ＡＴＣＣ受託番号ＸＸＸＸＸの下で寄託された、細胞株ＣＬＬ−ＡＡＴ。抗体を調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：（ｉ）請求項１に記載のＣＬＬ細胞株の表面上に提示される少なくとも１つの抗原に対する抗体を作製する工程；および（ｉｉ）該抗体が、ＣＬＬ細胞関連抗原に結合することを決定する工程、を包含する、方法。【選択図】  図１
2006006334.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＣＣ受託番号ＸＸＸＸＸの下で寄託された、細胞株ＣＬＬ−ＡＡＴ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２０００年１２月８日に出願された、米国仮出願番号６０／２５４，１１３（この開示は本明細書中に参考として援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
（技術分野）
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞由来の細胞株、ならびにＣＬＬ疾患の研究および処置におけるこれらの細胞の使用が、開示される。具体的には、本開示は、「ＣＬＬ−ＡＡＴ」と称され、ブダペスト条約の規約に従って、ＡＴＣＣ受託番号ＸＸＸＸＸで、２００１年１１月２８日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）に寄託された、ＣＬＬ細胞株に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、白血球の疾患であり、そして西半球における最も通常の形態の白血病である。ＣＬＬは、ゆっくりと増殖するが延長した寿命を有する、悪性リンパ球の増殖に関する疾患の種々の群を代表する。ＣＬＬは、種々のカテゴリーに分類され、このカテゴリーとしては、例えば、古典的および混合型のＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、Ｂ細胞およびＴ細胞の前リンパ性白血病（ｐｒｏｌｙｍｐｈｏｃｙｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ヘアリーセル白血病、ならびに大顆粒リンパ性白血病（ｌａｒｇｅ  ｇｒａｎｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）が挙げられる。
【０００４】
全ての異なる型のＣＬＬのうちでも、Ｂ−ＣＬＬは、全ての白血病の約３０％を占める。Ｂ−ＣＬＬは、５０歳を超えた個体においてより頻繁に起こるが、より若い人々においても次第に増加して見られる。Ｂ−ＣＬＬは、形態学的には正常であるが生物学的には未熟なＢリンパ球の蓄積（これは、機能の損失を導く）によって特徴付けられる。リンパ球は、通常、感染と戦うように機能する。しかし、Ｂ−ＣＬＬにおいて、リンパ球は、血液および骨髄に蓄積し、そしてリンパ節の膨潤を引き起こす。正常な骨髄細胞および血液細胞の生成が低下し、そして患者はしばしば、重篤な貧血および低い血小板計数を経験する。このことは、減少した数の白血球に起因して、生命を脅かす出血の危険性および重大な感染の発生を生じ得る。
【０００５】
白血病のような疾患をさらに理解するためには、これらの疾患の病因、病原論、および生物学に関する研究のための道具として使用され得る、適切な細胞株を有することが重要である。悪性ヒトＢリンパ球細胞株の例としては、前Ｂ急性リンパ芽球性白血病（Ｒｅｈ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２）、およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＳＵ−ＷＭ）が挙げられる。不運なことに、既存の細胞株の多くは、臨床的に最も通常の型の白血病およびリンパ腫を代表しない。
【０００６】
インビトロでのエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）感染の使用は、悪性細胞の代表であるいくらかのＣＬＬ由来細胞株（特に、Ｂ−ＣＬＬ細胞株）を生じた。これらの細胞株の表現型は、インビトロの腫瘍の表現型とは異なり、そのかわりに、Ｂ−ＣＬＬ株の特徴は、リンパ芽球細胞株の特徴に類似する傾向がある。ＥＢＶ感染の補助によってＢ−ＣＬＬ細胞を不死化する試みは、ほとんど成功していない。このことの理由は不明であるが、ＥＢＶレセプターの発現、結合または取り込みの欠如に起因するのではないことは、公知である。Ｗｅｌｌｓらは、Ｂ−ＣＬＬ細胞が、細胞周期のＧ１／Ｓ期で止められること、および形質転換関連ＥＢＶ  ＤＮＡが発現されないことを見出した。このことは、Ｂ−ＣＬＬでのＥＢＶの感染が、正常なＢ細胞での感染とは異なることを示唆する。ＥＢＶで形質転換されたＣＬＬ細胞株は、さらに、分化し、ＥＢＶによって不死化されたリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）とより類似した形態を有するようである。
【０００７】
ＥＢＶネガティブなＣＬＬ細胞株である、ＷＳＵ−ＣＬＬが、以前に樹立された（Ｍｏｈａｍｍａｄら（１９９６）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １０（１）：１３０−７）。しかし、他のこのような細胞株は、公知ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、当該分野において、ＥＢＶで形質転換することによって樹立されたのではなく、かつ初代ＣＬＬ細胞に特徴的な表面マーカーを発現する、ＣＬＬ細胞株に対する必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）  ＡＴＣＣ受託番号ＸＸＸＸＸの下で寄託された、細胞株ＣＬＬ−ＡＡＴ。
（項目２）  抗体を調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）項目１に記載のＣＬＬ細胞株の表面上に提示される少なくとも１つの抗原に対する抗体を作製する工程；および
（ｉｉ）該抗体が、ＣＬＬ細胞関連抗原に結合することを決定する工程、
を包含する、方法。
（項目３）  前記決定する工程が、前記抗体がＣＬＬ細胞上でアップレギュレートされる抗原に結合することを決定することを含む、項目２に記載の方法。
（項目４）  前記決定する工程が、前記抗体がＣＬＬ細胞に特異的な抗原と結合することを決定することを含む、項目２に記載の方法。
（項目５）  前記抗体が、項目１に記載のＣＬＬ細胞株またはその一部での生物の免疫によって作製される、項目２に記載の方法。
（項目６）  前記抗体が、項目１に記載のＣＬＬ細胞株を用いて、合成抗体ライブラリーをパニングすることによって作製される、項目５に記載の方法。
（項目７）  前記ライブラリーを、ファージディスプレイによってスクリーニングして、前記抗体を単離する、項目６に記載の方法。
（項目８）  ＣＬＬ細胞に結合する抗体を特徴付けるための方法であって、該方法は、項目１に記載の細胞株に対する抗体の結合を評価する工程を包含する、方法。
（項目９）  前記抗体が、ＣＬＬに罹患している１人以上の患者から単離された初代ＣＬＬ細胞を用いて、抗体ライブラリーをパニングすることによって単離される、項目８に記載の方法。
（項目１０）  項目２に記載の方法によって産生される、抗体。
（項目１１）  項目１に記載の細胞株によってアップレギュレートされる抗原に結合する、抗体。
（項目１２）  以下：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５、
からなる群より選択される配列を有する、抗体。
【００１０】
（要旨）
１つの実施形態において、ＥＢＶでの不死化によって樹立されたのではない、悪性起源のＣＬＬ細胞株が提供される。この細胞株は、初代ＣＬＬ細胞由来であり、そしてＡＴＣＣ受託番号ＸＸＸＸＸで寄託されている。好ましい実施形態において、この細胞株は、ＣＬＬ−ＡＡＴである。ＣＬＬ−ＡＡＴは、Ｂ−ＣＬＬ初代細胞由来のＢ−ＣＬＬ細胞株である。
【００１１】
さらなる局面において、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株は、ＣＬＬの診断および／または処置において有用なモノクローナル抗体を生成するために使用される。抗体は、免疫原として本明細書中に開示されるような細胞を使用することによって生成され得、従って、動物（この動物から、モノクローナル抗体が単離され得る）における免疫応答を上昇させる。このような抗体の配列が決定され得、そしてこの抗体またはその改変体は、組換え技術によって産生され得る。この局面において、「改変体」とは、そのモノクローナル抗体の配列に基づく、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体が挙げられる。
【００１２】
さらに、組換えライブラリー由来の抗体（「ファージ抗体」）が、本明細書中に記載される細胞、またはこの細胞由来のポリペプチドを、これらの抗体を標的特異性に基づいて単離するためのベイトとして使用して、選択され得る。
【００１３】
なおさらなる局面において、抗体は、抗体ライブラリーを、初代ＣＬＬ細胞またはこの細胞由来の抗原を使用してパニングすることによって生成され得、そしてさらに、本発明の細胞株を使用して、スクリーニングおよび／または特徴付けされ得る。従って、ＣＬＬに特異的な抗体を特徴付けるための方法が提供され、この方法は、ＣＬＬ細胞株に対する抗体の結合を評価する工程を包含する。
【００１４】
さらなる局面において、当業者に周知の方法によって（例えば、免疫沈降、および引き続く質量分析によって）、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株を使用して、ＣＬＬ細胞において独特に発現されるタンパク質を同定するための方法が提供される。このようなタンパク質は、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株、またはＣＬＬ患者由来の初代細胞において、独特に発現され得る。
【００１５】
低分子ライブラリー（多くは市販のもの）が、細胞に基づくアッセイにおいて、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株を使用してスクリーニングされて、これらの細胞に特徴的な増殖を調節し得る因子を同定し得る。例えば、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株におけるアポトーシスを調節する因子、またはＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株の成長および／もしくは増殖を阻害する因子が、同定され得る。このような因子は、治療化合物の開発のための候補である。
【００１６】
ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株から単離された核酸は、ＣＣＬ特異的遺伝子を同定するための差引きハイブリダイゼーション実験において、またはマイクロアレイ分析（例えば、遺伝子チップ実験）において、使用され得る。ＣＬＬ細胞において転写が調節される遺伝子が、同定され得る。この様式で同定されたポリペプチドまたは核酸遺伝子産物は、ＣＬＬに対する抗体または低分子治療剤の開発のための手掛かりとして、有用である。
【００１７】
好ましい局面において、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株は、細胞によって内在化される細胞表面成分に結合する内在化抗体を同定するために使用され得る。このような抗体は、治療用途のための候補である。特に、細胞質において安定なままであり、そして細胞内結合活性を維持する単鎖抗体は、この様式でスクリーニングされ得る。
【００１８】
（詳細な説明）
（定義）
本明細書中で使用される場合、「ＣＬＬ」とは、任意のリンパ球（Ｂ細胞およびＴ細胞の種々の発生段階を含むが、これらに限定されない）に関与する、慢性リンパ性白血病をいい、ＣＬＬとしては、Ｂ細胞ＣＬＬが挙げられるが、これに限定されない。本明細書中で使用される場合、Ｂ−ＣＬＬとは、ＣＤ５＋、ＣＤ２３＋、ＣＤ２０ｄｉｍ＋、ｓＩｇｄｉｍ＋、および細胞周期のＧ０／Ｇ１で阻止されている成熟Ｂ細胞表現型を有する白血病をいう。
【００１９】
「悪性起源」とは、形質転換されている（例えば、ＥＢＶによって）非増殖細胞とは対照的に、悪性ＣＬＬ初代細胞由来の細胞株の誘導をいう。本開示に従う細胞株は、それ自体で、悪性の表現型であってもなくてもよい。「悪性」表現型を有するＣＬＬ細胞は、繰り返しの細胞増殖周期によって特徴付けられる、基質培地から離れた細胞増殖を含み、そしてアポトーシスに対する耐性を示す。
【００２０】
（細胞株の調製）
細胞株は、当業者に公知の確立された方法に従って産生され得る。一般に、細胞株は、不死化細胞が培養物中で自発的に生成されるまで、患者由来の初代細胞を培養することによって産生される。次いで、これらの細胞を、単離し、そしてさらに培養して、アポトーシスに耐性を示すクローン細胞集団または細胞を産生する。
【００２１】
例えば、ＣＬＬ細胞は、ＣＬＬに罹患している患者から採取された末梢血から単離され得る。これらの細胞を、洗浄し得、そして必要に応じて、存在する細胞の型を決定するために免疫型決定（ｉｍｍｕｎｏｔｙｐｅ）し得る。その後、細胞を、培地（例えば、ＩＬ−４を含有する培地）中で培養し得る。有利には、培地の全てまたは一部を、培養プロセス中に１回以上交換する。それによって、細胞株が、単離され得、そして培養物中での増加された増殖によって同定される。
【００２２】
（モノクローナル抗体の調製）
本明細書中で使用される場合、抗体とは、選択された標的に結合し得る、完全な抗体または抗体フラグメントをいう。これらには、以下が含まれる：Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、操作された抗体（キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体およびヒト化抗体、完全ヒト抗体、および人工的に選択された抗体を含む）、ならびにファージディスプレイまたは代替技術を使用して産生される合成抗体または半合成抗体。小さいフラグメント（例えば、ＦｖおよびＳｃＦｖ）は、それらの小さいサイズおよび結果としての優れた組織分布に起因して、診断適用および治療適用のための有利な特性を有する。
【００２３】
これらの抗体は、特に、診断適用および治療適用に意図される。従って、これらは、毒素または標識のようなエフェクタータンパク質を含む、改変された抗体であり得る。インビボでの抗体分布の画像化を可能にする標識が特に好ましい。このような標識は、放射活性標識または放射線不透過性標識（例えば、金属粒子）であり得、これらは、患者の体内で容易に可視化され得る。さらに、標識は、蛍光標識、または患者から取り出した組織サンプル上で可視化され得る他の標識であり得る。
【００２４】
組換えＤＮＡ技術を使用して、本開示に従って産生された抗体を改良し得る。このようにして、キメラ抗体は、診断適用または治療適用においてその免疫原性を減少するために構築され得る。さらに、免疫原性は、ＣＤＲグラフティング、および必要に応じて、フレーム改変により、抗体をヒト化することによって最小化され得る。米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと（この内容は、参考として本明細書中で援用される）。
【００２５】
抗体は、動物の血清から得られ得るか、またはモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントの場合には、細胞培養物中で産生され得る。組換えＤＮＡ技術を使用して、確立された手順に従って、細菌細胞培養物、または好ましくは、哺乳動物細胞培養物において抗体を産生し得る。選択された細胞培養系は、好ましくは、抗体産物を分泌する。
【００２６】
別の実施形態において、本明細書中に開示される抗体の産生のためのプロセスは、ハイブリッドベクターで形質転換された宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは哺乳動物細胞）を培養する工程を包含する。ベクターは、１以上の発現カセットを含み、その発現カセットは、プロモーター、そのプロモーターを作動可能に連結させた、シグナルペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列、および、その第１のＤＮＡ配列を適切な読み枠で連結させた、抗体タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列、を含む。次いで、抗体タンパク質を、収集しそして単離する。必要に応じて、発現カセットは、抗体タンパク質をコードするポリシストロニック（例えば、ジシストロニック）のＤＮＡ配列に作動可能に連結したプロモーターを含み得、このＤＮＡ配列は、各々個々に、シグナルペプチドに対して、適切な読み枠で作動可能に連結される。
【００２７】
インビトロでのハイブリドーマ細胞または哺乳動物宿主細胞の増殖は、適切な培養培地で行われ、適切な培養培地としては、従来の標準培養培地（例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ  １６４０培地など）が挙げられ、これらには、必要に応じて、哺乳動物血清（例えば、ウシ胎仔血清）、または微量元素および増殖維持補助剤（例えば、フィーダー細胞（例えば、正常マウス腹膜滲出細胞、脾細胞、骨髄マクロファージ）、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸など）が補充される。細菌細胞または酵母細胞である宿主細胞の増殖は、当該分野で公知の適切な培養培地中で同様に行われる。例えば、細菌について、適切な培養培地としては、培地ＬＥ，ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２×ＹＴ、またはＭ９ミネラル培地が挙げられる。酵母について、適切な培養培地としては、ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最少培地、または完全最少ドロップアウト（Ｄｒｏｐｏｕｔ）培地が挙げられる。
【００２８】
インビトロ産生は、比較的純粋な抗体調製物を提供し、そして大量の所望の抗体を与えるためにスケールアップを可能にする。細菌細胞、酵母、植物または哺乳動物細胞の培養のための技術は、当該分野で公知であり、そしてこれらには、均質懸濁物培養（例えば、エアリフトリアクタまたは連続攪拌リアクタにおける）および固定化または捕捉化細胞培養（例えば、中空繊維内、マイクロカプセル内、あるいはアガロースマイクロビーズ上またはセラミックカートリッジ上での）が挙げられる。
【００２９】
大量の所望の抗体はまた、インビボで哺乳動物細胞を増殖させることによって得られ得る。この目的のために、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、組織適合性の哺乳動物に注入し、抗体産生腫瘍の増殖を引き起こす。必要に応じて、動物を、注入前に、炭化水素（特に、プリスタン（テトラメチルペンタデカン）のような鉱油）でプライムする。１〜３週間後、抗体を、これらの哺乳動物の体液から単離する。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の抗体産生脾細胞との適切な骨髄腫細胞の融合によって得られたハイブリドーマ細胞、または所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株Ｓｐ２／０由来のトランスフェクトされた細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウス（必要に応じて、プリスチン（ｐｒｉｓｔｉｎｅ）で予め処理した）に腹腔内注入する。１〜２週間後、腹水を動物から採取する。
【００３０】
前述および他の技術は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；米国特許第４，３７６，１１０号；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（この開示は、その全てが参考として本明細書中で援用される）において議論される。組換え抗体分子の調製のための技術は、上記の参考文献において、そしてまた、例えば、ＷＯ９７／０８３２０；米国特許第５，４２７，９０８号；米国特許第５，５０８，７１７号；Ｓｍｉｔｈ、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２２５巻、１３１５−１３１７頁；ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ  １９８８、Ｇｅｎｅ  ７３、３０５−３１８頁；Ｄｅ  Ｌａ  Ｃｒｕｚら、１９８８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６３、４３１８−４３２２頁；米国特許第５，４０３，４８４号；米国特許第５，２２３，４０９号；ＷＯ８８／０６６３０；ＷＯ９２／１５６７９；米国特許第５，７８０，２７９号；米国特許第５，５７１，６９８号；米国特許第６，０４０，１３６号；Ｄａｖｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．、１９９９；１８（４）：４２１−５；Ｔａｙｌｏｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０  （１９９２）：６２８７−６２９５；Ｔｏｍｉｚｕｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ９７（２）（２０００）：７２２−７２７に記載される。これら全ての参考文献の内容は、参考として本明細書中に援用される。
【００３１】
細胞培養物上清を、優先的には、ＣＬＬ細胞の免疫蛍光染色によって、免疫ブロッティングによって、酵素免疫アッセイ（例えば、サンドイッチアッセイまたはドットアッセイ）または放射免疫アッセイによって、所望の抗体についてスクリーニングする。
【００３２】
抗体の単離のために、培養上清中または腹水中の免疫グロブリンを、例えば、硫酸アンモニウムでの沈殿、吸湿性材料（例えば、ポリエチレングリコール）に対する透析、選択的な膜を通す濾過などによって、濃縮し得る。必要な場合および／または所望の場合、抗体を、従来のクロマトグラフィー方法（例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロースによるクロマトグラフィーおよび／または（免疫）アフィニティークロマトグラフィー（例えば、本開示に従うＣＬＬ細胞株由来の１以上の表面ポリペプチドでの、あるいはプロテインＡまたはプロテインＧでの、アフィニティークロマトグラフィー））によって精製する。
【００３３】
別の実施形態は、適切な哺乳動物（例えば、ウサギ）を、プールされたＣＬＬ患者サンプルで免疫するという点で特徴付けられる、細胞株に対する抗体を分泌する細菌細胞株の調製のためのプロセスを提供する。免疫されたウサギから産生されるファージディスプレイライブラリーを、当該分野で周知の方法（例えば、本明細書中に参考として援用される種々の参考文献に開示される方法のような）に従って、構築し、そして所望の抗体でパニングする。
【００３４】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞もまた、企図される。好ましいハイブリドーマ細胞は、遺伝的に安定であり、所望の特異性の本明細書中に記載のモノクローナル抗体を分泌し、そして深冷凍培養物から融解および再クローニングによって活性化され得る。
【００３５】
別の実施形態において、本明細書中に記載のＣＬＬ細胞株に対するモノクローナル抗体を分泌する、ハイブリドーマ細胞株の調製のためのプロセスを提供する。このプロセスにおいて、適切な哺乳動物（例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス）を、本開示に記載される細胞由来の１以上のポリペプチドまたはその抗原性フラグメント、その細胞株自体、または記載されるような精製ポリペプチドを含む抗原性キャリアで免疫する。免疫された哺乳動物の抗体産生細胞を、培養物中で手短に増殖させるか、または適切な骨髄腫細胞株の細胞と融合させる。その融合物に含まれるハイブリッド細胞をクローン化し、そして所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択する。例えば、本発明の細胞株で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスの脾細胞を、骨髄腫細胞株ＰＡＩまたは骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ  １４の細胞と融合させ、得られたハイブリッド細胞を、所望の抗体の分泌についてスクリーニングし、そして陽性のハイブリドーマ細胞をクローン化する。
【００３６】
本開示に従う１０６細胞〜１０７細胞の細胞株を、数ヶ月（例えば、２〜４ヶ月）にわたって数回（例えば、４〜６回）、皮下および／または腹腔内に注入することによって、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫するという点で特徴付けられる、ハイブリドーマ細胞株を調製するためのプロセスが、好ましい。免疫されたマウス由来の脾細胞を、最後の注入後、２〜４日目に採取し、そして融合プロモーター（好ましくは、ポリエチレングリコール）の存在下で、骨髄腫細胞株ＰＡＩの細胞と融合させる。好ましくは、骨髄腫細胞を、分子量約４０００の約３０％〜約５０％のポリエチレングリコールを含有する溶液中の、免疫したマウス由来の３〜２０倍過剰の脾細胞と融合する。融合後、細胞を、正常骨髄腫細胞が所望のハイブリドーマ細胞を過剰増殖させるのを妨げるために規則的な間隔で、選択培地（例えば、ＨＡＴ培地）を補充した、本明細書中上記のような適切な培養培地中で拡大する。
【００３７】
さらなる実施形態において、本明細書中上記の細胞株に対する抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む、組換えＤＮＡを生成する。用語ＤＮＡは、コード一本鎖ＤＮＡ、このコードＤＮＡおよびその相補的ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ、またはこれらの相補的（一本鎖）ＤＮＡ自体を含む。
【００３８】
さらに、本明細書中に開示される細胞株に対する抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡは、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする真正のＤＮＡ配列、あるいはそれらの変異体を有する、酵素的または化学的に合成されたＤＮＡであり得る。真正のＤＮＡの変異体は、１以上のアミノ酸が、欠失されているかまたは１以上の他のアミノ酸と交換されている上記の抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡである。好ましくは、この改変は、ヒト化適用および発現最適化適用において、抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲの外側である。用語、変異体ＤＮＡはまた、１以上のヌクレオチドが、他のヌクレオチドで置換され、その新しいコドンが、同じアミノ酸をコードする、サイレント変異体を包含する。用語、変異体配列はまた、縮重配列を含む。縮重配列は、無数のヌクレオチドが、元々コードされるアミノ酸配列の変化を生じることなく、他のヌクレオチドで置換されるという点で、遺伝コードの意味において縮重されている。このような縮重配列は、それらの異なる制限部位、および／または、特定の宿主（特に、Ｅ．ｃｏｌｉ）によって好まれる特定のコドンの頻度に起因して、重鎖マウス可変ドメインおよび／または軽鎖マウス可変ドメインの最適な発現を得るために有用であり得る。
【００３９】
用語、変異体は、当該分野で公知の方法に従う真正のＤＮＡのインビトロ変異誘発によって得られたＤＮＡ変異体を含むことが、意図される。
【００４０】
完全なテトラマー免疫グロブリン分子のアセンブリおよびキメラ抗体の発現のために、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードする組換えＤＮＡインサートを、重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインをコードする対応するＤＮＡと融合し、次いで、例えば、ハイブリッドベクターへの組み込み後に、適切な宿主細胞に移入する。
【００４１】
ヒト定常ドメインｇ（例えば、γ１、γ２、γ３またはγ４（好ましくは、γ１またはγ４））に融合された、本明細書中に開示される細胞株に対する抗体の重鎖マウス可変ドメインをコードするインサートを含む、組換えＤＮＡもまた提供される。ヒト定常ドメインκまたはλ（好ましくは、κ）に融合された、本明細書中に開示される細胞株に対する抗体の軽鎖マウス可変ドメインをコードするインサートを含む、組換えＤＮＡもまた提供される。
【００４２】
別の実施形態は、組換えポリペプチドをコードする組換えＤＮＡに関し、ここで、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが、スペーサー基によって連結され、このスペーサー基は、必要に応じて、宿主細胞における抗体のプロセシングを容易にするためのシグナル配列、および／または、抗体の精製を容易にするためのペプチドをコードするＤＮＡ、および／または、切断部位、および／または、ペプチドスペーサー、および／または、エフェクター分子を含む。
【００４３】
エフェクター分子をコードするＤＮＡは、診断適用または治療適用に有用なエフェクター分子をコードするＤＮＡであることが、意図される。従って、毒素または酵素（特に、プロドラッグの活性化を触媒し得る酵素）であるエフェクター分子が、特に指摘される。このようなエフェクター分子をコードするＤＮＡは、天然に存在する酵素または毒素をコードするＤＮＡあるいはその変異体の配列を有し、そして当該分野で周知の方法によって調製され得る。
【００４４】
本明細書中に開示される抗体および抗体フラグメントは、診断および治療に有用である。従って、本明細書中に開示される抗体を含む治療または診断のための組成物が、提供される。
【００４５】
診断組成物の場合、抗体は、好ましくは、抗体を検出するための手段と一緒に提供され、この手段は、酵素、蛍光、放射性同位体または他の手段であり得る。抗体およびその検出手段は、診断に意図される診断キットにおいて、同時の、別々の、または連続的な使用のために提供され得る。
【００４６】
（本発明の細胞株の使用）
ＣＬＬ細胞株の発生に対する、多くの利点が存在する。なぜなら、これは、ＣＬＬについての診断剤および処置の開発のための重要なツールを提供するからである。
【００４７】
本開示に従う細胞株は、ＣＬＬの病因、病理および生物学についてのインビトロ研究に使用され得る。これは、ＣＬＬ疾患の治療に有用である適切な薬剤の同定を補助する。
【００４８】
細胞株はまた、上記のような、ＣＬＬのインビトロ診断およびインビボ診断のため、ならびに、他の方法によって（例えば、ＣＬＬ患者由来の初代細胞および／または抗原での抗体ライブラリーのパニングによって）産生された抗体のスクリーニングおよび／または特徴付けのための、モノクローナル抗体を産生するために使用され得る。
【００４９】
細胞株はまた、それ自体で使用され得るか、または抗原が、その細胞株から誘導され得る。有利には、このような抗原は、ＣＬＬに特異的な細胞表面抗原である。これらは、本開示に従う細胞株から直接単離され得る。あるいは、本明細書中に記載の細胞株から作製されるｃＤＮＡ発現ライブラリーは、ＣＬＬ特異的抗原を発現させるために使用され得、この抗原は、抗ＣＬＬ抗体の選択および特徴付け、ならびに新規ＣＬＬ特異的抗原の同定に有用である。
【００５０】
モノクローナル抗体治療を使用するＣＬＬの処置は、当該分野で提唱されている。最近、Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ（Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ５（５）（２０００）３７６−３８４）は、モノクローナル抗体由来の現在の治療を記載した。特に、リンパ性白血病は、リンパ球腫瘍上の複数のリンパ球特異的抗原の存在に起因して、この治療アプローチの良い候補であると考えられる。
【００５１】
既存の抗体治療（例えば、Ｂリンパ球の表面上に発現される、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ＴＭ（ＣＤ２０抗原に対する））は、特定のリンパ性疾患に対して首尾よく使用されている。しかし、より低い密度のＣＤ２０抗原が、ＣＬＬ中のＢリンパ球の表面上で発現される（Ａｌｍａｓｒｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，４０（４）（１９９２）２５９−２６３）。
【００５２】
従って、本明細書中に記載のＣＬＬ細胞株は、本発明の細胞株の１以上の抗原決定基に対する特異性を有する、新規抗ＣＬＬ抗体の開発、ならびにＣＬＬの治療および診断におけるそれらの使用を可能にする。
【００５３】
当業者が、本明細書中に記載の組成物および方法をより良く実施し得るために、以下の実施例を、例示目的で与える。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
（細胞株ＣＬＬ−ＡＡＴの単離）
（細胞株の確立）
ＣＬＬと診断された患者の末梢血を得た。ＷＢＣ数は、１．６×１０８／ｍｌであった。単核細胞を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７密度勾配遠心（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって単離した。細胞を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充した、Ｉｓｏｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）で２回洗浄し、そして５ｍｌの氷冷ＩＭＤＭ／１０％  ＦＢＳ中に再懸濁した。生存細胞を、トリパンブルーでの染色によってカウントした。細胞を、等量の８５％  ＦＢＳ／１５％  ＤＭＳＯと混合し、そして１ｍｌアリコートで、液体窒素中で保存のために凍結させた。
【００５５】
免疫表現型決定は、９０％を超えるＣＤ４５＋リンパ球集団が、ＩｇＤ、κ軽鎖、ＣＤ５、ＣＤ１９およびＣＤ２３を発現することを示した。この集団はまた、低レベルのＩｇＭおよびＣＤ２０を発現した。約５０％の細胞が、高レベルのＣＤ３８を発現した。これらの細胞は、λ軽鎖、ＣＤ１０およびＣＤ１３８について陰性であった。
【００５６】
細胞のアリコートを、解凍し、洗浄し、そして２０％の熱不活化ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプトエタノール、および５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−４（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を補充したＩＭＤＭ中、１０７／ｍＬの密度で再懸濁した。これらの細胞を、加湿５％  ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。定常増殖が観察されるまで、培地を、４日毎に、部分的に交換した。５週間後、培養物中の細胞数が、約４日毎に倍増し始めた。この細胞株を、ＣＬＬ−ＡＡＴと名付けた。
【００５７】
（細胞株の特徴付け）
フローサイトメトリーによる細胞株の免疫表現型分類は、ＩｇＭ、κ軽鎖、ＣＤ２３、ＣＤ３８およびＣＤ１３８の高い発現、ＣＤ１９およびＣＤ２０の中程度の発現、ならびにＩｇＤおよびＣＤ５の弱い発現を示した。この細胞株は、λ軽鎖、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１０については、ネガティブであった。
【００５８】
この細胞株の免疫表現型分類をまた、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞に対する特異的結合について選択されたウサギｓｃＦｖ抗体のパネルを使用する全細胞ＥＬＩＳＡによっても行った。これら全てのＣＬＬ特異的ｓｃＦｖ抗体はまた、ＡＡＴ−ＣＬＬ細胞株を認識した。対照的に、ほとんどのｓｃＦｖは、Ｂ細胞リンパ腫由来の２つの細胞株（Ｒａｍｏｓ（バーキットリンパ腫細胞株）およびＲＬ（非ホジキンリンパ腫細胞株））に結合しなかった。
【００５９】
（実施例２）
（抗体ファージディスプレイおよび細胞表面パニングを使用する、Ｂ−ＣＬＬ特異的細胞表面抗原に対するｓｃＦｖ抗体の選択）
（免疫およびｓｃＦｖ抗体ライブラリーの構築）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｃｌｉｎｉｃ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）にてＣＬＬ患者から得た血液から単離した。２匹のウサギを、ＣＬＬを有する異なる１０人のドナーからプールされた２×１０７のＰＢＭＣで免疫した。３回の免疫（２回の皮下注射、その後の１回の静脈内注射）を、３週間間隔で行った。血清力価を、フローサイトメトリーを使用して、初代ＣＬＬ細胞に対する血清ＩｇＧの結合を測定することによってチェックした。最後の免疫の５日後、脾臓、骨髄およびＰＢＭＣを動物から回収した。総ＲＮＡを、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ）を使用してこれらの組織から単離した。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体ファージディスプレイライブラリーを、以前に記載のように構築した（Ｂａｒｂａｓら、（２００１）Ｐｈａｒｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。細胞表面パニングについて、再増幅ライブラリー由来のファージミド粒子を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて沈殿させ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し、そしてＰＢＳに対して一晩透析した。
【００６０】
（細胞表面パニングによる抗体選択）
これらのライブラリーを、Ｓｉｅｇｅｌら（１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０６：７３−８５）に記載されるように、磁気活性化細胞識別（ＭＡＣＳ）を用いるポジティブ−ネガティブ選択によって、ＣＬＬ細胞表面特異的抗体について富化した。簡潔には、ｓｃＦｖ抗体ライブラリー由来のファージミド粒子を、ＭＰＢＳ（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中２％脱脂粉乳、０．０２％アジ化ナトリウム）中で２５℃にて１時間プレインキュベートして、非特異的結合部位をブロッキングした。約１０７の初代ＣＬＬ細胞を、常磁性ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）に結合体化したマウス抗ＣＤ５  ＩｇＧおよびマウス抗ＣＤ１９  ＩｇＧで標識した。未結合のミクロビーズを、洗浄によって除去した。標識されたＣＬＬ細胞（「標的細胞」）を、過剰の「抗原ネガティブ吸収細胞」と混合し、ペレット化し、そして５０μｌのファージ粒子（１０１０〜１０１１ｃｆｕ）中に再懸濁した。この吸収細胞は、細胞表面に非特異的に固着するファージ、ならびに標的および吸収細胞の両方の上に存在する「共通」抗原に特異的なファージを吸収するように働く。使用される吸収細胞は、ＴＦ−１細胞（ヒト赤白血病細胞株）または免疫磁気ネガティブ選択（ＳｔｅｍＳｅｐ  ｓｙｓｔｅｍ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）によって末梢血から単離された正常ヒトＢ細胞のいずれかであった。標的細胞に対する吸収細胞の比は、容量にして約１０倍であった。２５℃での３０分のインキュベーション後、細胞／ファージ混合物を、ＭｉｎｉＭＡＣＳ  ＭＳ＋分離カラムに移した。このカラムを０．５ｍｌのＭＰＢＳで２回洗浄し、そして０．５ｍｌのＰＢＳで１回洗浄して、未結合のファージおよび吸収細胞を除去した。標的細胞を、１ｍｌのＰＢＳでカラムから溶出させ、そして最大速度で１５秒間微小遠心分離してペレット化した。捕捉されたファージ粒子を、標的細胞を２００μｌの酸溶出緩衝液（０．１Ｎ  ＨＣｌ、グリシンでｐＨを２．２に調節、および１μｇ／ｍｌのＢＳＡ）中に再懸濁することによって溶出した。２５℃で１０分のインキュベーション後、この緩衝液を、１２μＬの２Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ１０．５）で中和し、そして溶出したファージを、次の回のパニングのために、Ｅ．ｃｏｌｉ中で増幅した。各回のパニングについて、投入ファージおよび産出ファージの力価を決定した。投入力価は、標的細胞／吸収細胞混合物に添加される再増幅ファージ粒子の数であり、そして産出力価は、標的細胞から溶出された捕捉ファージの数である。富化係数（Ｅ）は、式Ｅ＝（Ｒｎ産出／Ｒｎ投入）／（Ｒ１産出／Ｒ１投入）を使用して算定される。ほとんどの場合、１０２〜１０３倍の富化係数は、３回または４回で達成されるはずである。
【００６１】
（パニング後の富化抗体プールの分析）
３〜５回のパニング後、捕捉されたファージのプールを、フローサイトメトリーおよび／または全細胞ＥＬＩＳＡによって、ＣＬＬ細胞に対する結合についてアッセイした：
１．ＨＡタグ化可溶性抗体の形態で完全プールを生成するために、２ｍｌの非サプレッサーＥ．ｃｏｌｉ株（例えば、ＴＯＰ１０Ｆ’）に、１μｌ（１０９〜１０１０ｃｆｕ）のファージミド粒子を感染させた。元々のパニングしていないライブラリーを、ネガティブコントロールとして使用した。カルベニシリンを２０μＭの最終濃度まで添加し、そしてこの培養物を、３７℃にて２５０ｒｐｍで１時間振とうした。８ｍｌのＳＢ培地（５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む）を添加し、そしてこの培養物を約０．８のＯＤ６００まで増殖させた。ＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度まで添加して、ＬａｃプロモーターからのｓｃＦｖの発現を誘導し、そして３７℃での振とうを、４時間続けた。この培養物を３０００×ｇで１５分間遠心分離した。可溶性抗体を含む上清を濾過し、１ｍｌのアリコートで−２０℃で保存した。
【００６２】
２．標的細胞に対するｓｃＦｖ抗体プールの結合  対  吸収細胞に対するｓｃＦｖ抗体プールの結合を、高親和性ラット抗ＨＡ（クローン３Ｆ１０、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を二次抗体として使用し、ＰＥ結合体化ロバ抗ラットを三次抗体として使用するフローサイトメトリーによって決定した。
【００６３】
３．標的細胞に対する抗体プールの結合  対  吸収細胞に対する抗体プールの結合をまた、上記のように全細胞ＥＬＩＳＡによって決定した。
【００６４】
（パニング後の個々のｓｃＦｖクローンのスクリーニング）
パニング後の個々のｓｃＦｖクローンをスクリーニングするために、ＴＯＰ１０Ｆ’細胞に、上記のようにファージプールに感染させて、カルベニシリンおよびテトラサイクリンを含むＬＢプレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。個々のクローンを、１ウェル当たり０．６〜１．０ｍｌのＳＢ−カルベニシリン培地を含む深型９６ウェルプレート中でインキュベートした。この培養物を、ＨｉＧｒｏ振とうインキュベーター（ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）において、３７℃にて５２０ｒｐｍで、６〜８時間増殖させた。この時点で、各ウェル由来の９０μｌのアリコートを、１０μｌのＤＭＳＯを含む深型９６ウェルプレートに移した。この複製プレートを、−８０℃で保存した。ＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度まで元のプレートに添加し、そして振とうを３時間続けた。このプレートを３０００×ｇで１５分間遠心分離した。可溶性ｓｃＦｖ抗体を含む上清を、別の深型９６ウェルプレートに移し、−２０℃で保存した。
【００６５】
ＨＡタグ化ｓｃＦｖ抗体をスクリーニングするための、高感度全細胞ＥＬＩＳＡが開発された：
１．ＥＬＩＳＡプレートを、コンカナバリンＡ（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ８．６、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２）でコーティングする。
【００６６】
２．このプレートをＰＢＳで洗浄した後、５０μｌのＰＢＳ中０．５〜１×１０５の標的細胞または吸収細胞を各ウェルに添加し、そしてこのプレートを２５０×ｇで１０分間遠心分離する。
【００６７】
３．ＰＢＳ中０．０２％のグルタルアルデヒド５０μｌを添加し、細胞を４℃で一晩固定する。
【００６８】
４．ＰＢＳでの洗浄後、非特異的結合部位を、４％の脱脂粉乳を含むＰＢＳを用いて室温で３時間ブロッキングする。
【００６９】
５．これらの細胞を、５０μｌの可溶性ＨＡタグ化ｓｃＦｖ抗体またはＦａｂ抗体（ＴＯＰ１０Ｆ’上清）と共に、室温で２時間インキュベートし、次いでＰＢＳで６回洗浄する。
【００７０】
６．結合した抗体を、マウス抗ＨＡ二次抗体（クローン１２ＣＡ５）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合体化抗マウスＩｇＧ三次抗体を使用して検出する。色を、アルカリホスファターゼ基質ＰＮＰＰで発色させて、マイクロプレートリーダーを使用して４０５ｎｍで測定する。
【００７１】
ｓｃＦｖクローンの一次スクリーニングを、初代ＣＬＬ細胞  対  正常ヒトＰＢＭＣに対するＥＬＩＳＡによって行った。ＣＬＬ細胞に対して陽性かつ正常ＰＢＭＣに対して陰性であったクローンを、正常ヒトＢ細胞、ヒトＢ細胞株、ＴＦ−１細胞およびＣＬＬ−ＡＴＴ細胞株に対するＥＬＩＳＡによって再スクリーニングした。これらのクローンをまた、３つの異なる患者から単離されたＣＬＬ細胞に対するＥＬＩＳＡによって再スクリーニングして、患者特異的または血液型特異的な抗原を認識するクローンを排除した。代表的なＥＬＩＳＡの結果を、図２〜６に示し、そして表１に要約する。
【００７２】
得られた独自のｓｃＦｖ抗体クローンの数を、ＤＮＡフィンガープリントおよび配列決定によって決定した。ｓｃＦｖ  ＤＮＡ挿入物を、ＰＣＲによってこのプラスミドから増幅し、そして制限酵素ＢｓｔＮＩで消化した。得られたフラグメントを４％アガロースゲルで分離し、そしてエチジウムブロマイドで染色した。異なる制限フラグメントパターンを有するクローンは、異なるアミノ酸配列を有するはずである。同一のパターンを有するクローンは、おそらく、類似または同一の配列を有する。独自のＢｓｔＮＩフィンガープリントを有するクローンを、ＤＮＡ配列決定によってさらに分析した。２５個の異なる配列が見出され、これらは、密接に関連する相補性決定領域を有する１６群の抗体にクラスター化され得た（表１）。
【００７３】
（フローサイトメトリーによる、ｓｃＦｖ抗体の特徴づけ）
いくつかのｓｃＦｖ抗体の結合特異性を、３色フローサイトメトリーによって分析した。正常なドナーから単離されたＰＢＭＣを、ＦＩＴＣ結合体化抗ＣＤ５およびＰｅｒＣＰ結合体化抗ＣＤ１９で染色した。ｓｃＦｖ抗体を用いる染色を、ビオチン結合体化抗ＨＡを二次抗体として、およびＰＥ結合体化ストレプトアビジンを使用して行った。３つの抗体（ｓｃＦｖ−２、ｓｃＦｖ−３およびｓｃＦｖ−６）は、ＣＤ１９＋Ｂリンパ球集団を特異的に認識することが見出された（データは示さず）。第四の抗体（ｓｃＦｖ−９）は、２つの異なる細胞集団（ＣＤ１９＋Ｂリンパ球およびＣＤ５＋Ｔリンパ球のサブセット）を認識した（図７を参照のこと）。Ｔ細胞サブセットのさらなる特徴付けによって、これが、ＣＤ４＋ＣＤ８−ＴＨ細胞のサブ集団であることが示された。
【００７４】
ｓｃＦｖ抗体によって認識される抗原が初代ＣＬＬ細胞上で過剰発現されるか否かを決定するために、５人の異なるＣＬＬ患者および５人の正常なドナー由来のＰＢＭＣを、ｓｃＦｖを用いて染色し、フローサイトメトリーによって比較した（図８および表２）。ポジティブ細胞集団の平均蛍光強度を比較することによって、ＣＬＬ細胞上の抗原の相対的発現レベル  対  正常細胞上の抗原の相対的発現レベルを決定し得た。１つの抗体（ｓｃＦｖ−２）は、正常ＰＢＭＣよりも低い強度で一貫してＣＬＬ細胞を染色し、一方、ｓｃＦｖ−３およびｓｃＦｖ−６は両方とも、一貫して正常ＰＢＭＣよりもより明るくＣＬＬ細胞を染色した。第四の抗体（ｓｃＦｖ−９）は、５つのＣＬＬサンプルのうちの２つを、正常ＰＢＭＣより強い強度で染色したが、他の３つのＣＬＬサンプルについては、中程度にのみより明るい染色を与えた（図８および表２）。図８において見られるように、ｓｃＦｖ−３およびｓｃＦＶ−９によって認識される抗原は、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株が誘導される初代ＣＬＬ腫瘍上で過剰発現される。ＣＣＬ−ＡＡＴ細胞株を確立するために使用される、ＣＬＬ患者由来の初代ＰＢＭＣ、または正常ドナー由来のＰＢＭＣを、ｓｃＦｖ抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ｓｃＦｖ−３およびｓｃＦｖ−９は、平均蛍光強度によって測定されるように、正常ＰＢＭＣよりもより明るくＣＬＬ細胞を染色する。
【００７５】
このことは、ｓｃＦｖ−３およびｓｃＦｖ−６に対する抗原が、全てではないにしろほとんどのＣＬＬ腫瘍上で約２倍過剰発現され、一方、ｓｃＦｖ−９は、ＣＬＬ腫瘍のサブセット上で３〜６倍過剰発現されることを示す。
【００７６】
（免疫沈降（ＩＰ）および質量分析（ＭＳ）による、ｓｃＦｖ抗体によって認識される抗原の同定）
これらの抗体に対する抗原を同定するために、ｓｃＦｖを使用して、全細胞溶解物または細胞のミクロソーム画分から調製された溶解物由来の抗原を免疫沈降させた。免疫沈降した抗原をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製し、そしてＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析によって同定した（データは示さず）。ｓｃＦｖ−２は、ＲＬ細胞およびＣＬＬ−ＡＡＴ細胞の両方から、１００ｋｄの抗原を免疫沈降した。これは、Ｂ細胞特異的マーカーのＣＤ１９として同定された。ｓｃＦｖ−３およびｓｃＦｖ−６は両方とも、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞から４５ｋｄの抗原を免疫沈降した。これは、ＣＬＬ細胞および活性化Ｂ細胞についての公知のマーカーであるＣＤ２３として同定された。ｓｃＦｖ−９は、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞由来の５０ｋｄの抗原を免疫沈降した。しかし、本発明者らは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析に十分な量でこの抗原を単離していない。なぜなら、その発現は、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株上でダウンレギュレートされたようだからである。
【００７７】
（参考文献）
以下の参考文献は、本発明が関連する分野の状態をより完全に記載するために、参考として本明細書に援用される。以下のこれらの刊行物または上記の参考文献に援用される刊行物と本開示との間の任意の不一致は、本開示の利益となるように説明されるべきである。
【００７８】
【表１】
2006006334.tif 000003
【００７９】
種々の改変が、本明細書中に開示される実施形態に対してなされ得ることが理解される。当業者は、本明細書に添付される特許請求の範囲内の他の改変を想定する。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）による、抗体ライブラリーの細胞表面パニングに関与する代表的な工程を、概略的に示す。
【図２】図２は、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞への選択されたｓｃＦｖクローンの結合、および正常ヒトＰＢＭＣへの結合の非存在を実証する、全細胞ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。この図および他の図における２°＋３°との表示は、マウス抗ＨＡで染色され、そして抗マウス抗体単独を検出する、ネガティブコントロールウェルを表す。この図および他の図におけるＲＳＣ−Ｓライブラリーとの表示は、もとのウサギｓｃＦｖのパニングされていないライブラリーから調製された可溶性抗体を表す。この図および他の図におけるＲ３／ＲＳＣ−Ｓプールとの表示は、３回目のパニングからのｓｃＦｖ抗体のプール全体から調製された、可溶性抗体を表す。抗ＣＤ５抗体を、ポジティブコントロールとして使用して、等数のＢ−ＣＬＬ細胞およびＰＢＭＣ細胞が各ウェルにプレートされたことを確認した。
【図３】図３は、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞および正常初代ヒトＢ細胞への、選択されたｓｃＦｖ抗体の結合を比較する、全細胞ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。抗ＣＤ１９抗体を、ポジティブコントロールとして使用して、等数のＢ−ＣＬＬ細胞および正常Ｂ細胞が各ウェルにプレートされたことを確認した。他のコントロールは、図２の説明文において記載される通りであった。
【図４】図４は、ｓｃＦｖクローンが患者特異的（すなわち、イディオタイプ）抗原に結合するか、血液型特異的（すなわち、ＨＬＡ）抗原に結合するかを決定するために使用された、全細胞ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。各クローンを、３つの異なるＢ−ＣＬＬ患者から単離されたＰＢＭＣに対する結合について試験した。１つの患者サンプルに結合するクローンを、患者または血液型に特異的であるとみなした。
【図５】図５は、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞および３種のヒト白血病細胞株への、ｓｃＦｖクローンの結合を比較する、全細胞ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。Ｒａｍｏｓは、バーキットリンパ腫由来の成熟Ｂ細胞株である。ＲＬとは、非ホジキンリンパ腫由来の成熟Ｂ細胞株である。ＴＦ−１とは、赤白血病由来の赤芽球細胞株である。
【図６】図６は、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞およびＣＬＬ−ＡＡＴ（Ｂ−ＣＬＬ患者由来の細胞株）への、ｓｃＦｖクローンの結合を比較する、全細胞ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。ＴＦ−１細胞を、ネガティブコントロールとして含めた。
【図７】図７は、３色フローサイトメトリーによって分析した場合の、本開示に従うｓｃＦｖ抗体の結合特異性を示す。正常な末梢血単核細胞において、ｓｃＦｖ−９によって認識される抗原は、Ｂリンパ球上に中程度に発現され、そしてＴリンパ球の部分集団上で弱く発現される。正常ドナー由来のＰＢＭＣを、３色フローサイトメトリーによって、抗ＣＤ５−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ１９−ＰｅｒＣＰ、およびｓｃＦｖ−９／抗ＨＡ−ビオチン／ストレプトアビジン−ＰＥを使用して分析した。
【図８】図８は、本開示に従うｓｃＦｖ抗体によって認識される抗原の発現レベルを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ＣＤＲ配列および選択されたｓｃＦｖ抗体の結合特異性の要約を提供する、表１である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＣＤＲ配列および選択されたｓｃＦｖ抗体の結合特異性の要約を提供する、表１である。
【図１０】図１０は、図８に記載したような、正常ＰＢＭＣに対して、初代ＣＬＬ細胞上でのｓｃＦｖ抗原の発現レベルを比較する、フローサイトメトリーの結果の要約を示す、表２である。
【図１】
2006006334.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
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