(57)【要約】【課題】  安全性に優れた高血圧症の予防若しくは治療のための医薬となり得る物質を提供すること目的とする。【解決手段】  前記目的を達成するために、本発明は、脂肪組織若しくは脂肪細胞におけるヘキサミン生合成経路（ＨＢＰ）活性抑制剤であって、チアミン、チアミン誘導体、およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一種を含む抑制剤を提供する。細胞内における解糖とグルコース酸化の代謝ミスマッチによるＨＢＰ活性化は、転写因子を含むタンパク質のＯ-ＧｌｃＮＡｃ化を促進し、その結果、例えば、レニン・アンギオテンシン系が活性化され、高血圧症等の疾患の発症を引き起こす。本発明によれば、大量のチアミンを供給することで、細胞内のグルコース代謝ミスマッチを改善でき、例えば、高血圧症、高インスリン血症、線維症、その他の生活習慣病、糖尿病合併症等の予防や治療が可能となる。【選択図】図２ 
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘキサミン生合成経路（ＨＢＰ）の活性抑制剤であって、チアミン、チアミン誘導体、およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一種を含み、脂肪組織若しくは脂肪細胞におけるヘキサミン生合成経路（ＨＢＰ）の活性を抑制することを特徴とする抑制剤。
【請求項２】
前記チアミン誘導体が、ジセチアミン、オクトチアミン、シコチアミン、ビスイブチアミン、ビスベンチアミン、フルスルチアミン、プロスルチアミン、および、ベンフォチアミンからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１記載の抑制剤。
【請求項３】
前記抑制剤が含有するチアミン、チアミン誘導体、およびそれらの塩の一回投与量が、前記一回投与量に一日あたりの投与回数を乗じた一日あたりの投与量が、投与する生体の体重（ｋｇ）あたり５〜２００ｍｇとなる量である請求項１または２記載の抑制剤。
【請求項４】
脂肪組織若しくは脂肪細胞において、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質の生成を抑制する請求項１〜３のいずれかに記載の抑制剤。
【請求項５】
生体におけるｐ５３の活性化を抑制する請求項４記載の抑制剤。
【請求項６】
脂肪組織若しくは脂肪細胞において、ｐ５３の活性化を抑制する請求項５記載の抑制剤。
【請求項７】
生体におけるレニン・アンギオテンシン系の活性抑制剤であって、請求項５または６に記載の抑制剤を含むことを特徴とする抑制剤。
【請求項８】
高血圧症の予防若しくは治療のための医薬であって、請求項７記載の抑制剤を含むことを特徴とする予防若しくは治療のための医薬。
【請求項９】
高インスリン血症の予防若しくは治療のための医薬であって、請求項７記載の抑制剤を含むことを特徴とする予防若しくは治療のための医薬。
【請求項１０】
脂肪組織若しくは脂肪細胞におけるＳｐ１のグリコシル化の抑制剤であって、請求項４記載の抑制剤を含むことを特徴とする抑制剤。
【請求項１１】
生体におけるトランスフォーミング成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）の発現抑制剤であって、請求項１０記載の抑制剤を含むことを特徴とする抑制剤。
【請求項１２】
生体におけるプラスミノーゲン・アクチベータ・インヒビター−１（ＰＡＩ−１）の発現抑制剤であって、請求項１０記載の抑制剤を含むことを特徴とする抑制剤。
【請求項１３】
線維症の予防若しくは治療のための医薬であって、請求項１１または１２記載の抑制剤を含むことを特徴とする予防若しくは治療のための医薬。
【請求項１４】
請求項７記載の抑制剤を含む、高血圧症および高インスリン血症の少なくとも一方の症状改善用または予防用の食品添加剤。
【請求項１５】
請求項１０から１２のいずれかに記載の抑制剤を含む、線維症の症状改善用または予防用の食品添加剤。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の食品添加剤を含む食品。          
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高血圧症および高インスリン血症等の予防若しくは治療に有効なヘキサミン生合成経路活性化抑制に関する。
【背景技術】
【０００２】
生活習慣の欧米化等に伴い、高血圧症等の生活習慣病が増大しており、社会問題となっている。高血圧症が発症するメカニズムとしては、レニン−アンギオテンシン系が知られており、高血圧症の医薬品としては、このレニン−アンギオテンシン系の活性化を抑制する物が開発され、一部は高血圧症の予防若しくは治療に供されている。例えば、アンギオテンシンＩＩの拮抗剤としては、２−ブチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−３−［［２’−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−１，３−ジアザスピロ［４．４］ノナン−４−オンが知られている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、これらの合成医薬品は、血圧がコントロールできるという優れた効果を奏するが、対症療法であって根本的な治療にいたらず、場合によっては一生これらの薬剤に頼らざるを得ないことや、副作用の問題がある。
【特許文献１】特開平８−２４５３８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、安全性に優れた高血圧症の予防若しくは治療のための医薬となり得る物質を提供することを、その目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記目的を達成するために、本発明は、ヘキサミン生合成経路（ＨＢＰ）活性抑制剤であって、チアミン、チアミン誘導体、およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一種を含み、脂肪組織若しくは脂肪細胞におけるヘキサミン生合成経路（ＨＢＰ）の活性を抑制することを特徴とする抑制剤である。
【発明の効果】
【０００５】
本発明者は、上記の目的の達成のために、高血圧のメカニズムを中心に一連の研究を重ねた。その結果、高血圧症の原因となるレニン-アンギオテンシン系の活性化は、ヘキサミン生合成経路で生じるグリコシル化タンパク質（Ｏ−ＣｌｃＮＡｃ化タンパク質）が原因であり、そもそもヘキサミン生合成経路が活性化するのは、グルコースの主要代謝経路である解糖系およびＴＣＡ回路での代謝が不完全であるため、という仮説を立てた。そして、この仮説に基づき、解糖系およびＴＣＡ回路を活性化してグルコースを完全に代謝するために、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに変換する際に必要となるチアミンに着目した。チアミンの通称は、ビタミンＢ１であり、食物に含まれて長年にわたって人類が利用してきているから安全性に問題がなく、また水溶性であるので、この点からも、大量摂取しても安全性に問題がない。そして、ラットを使用した実験により、チアミンを大量に摂取すれば、脂肪組織若しくは脂肪細胞においてヘキサミン生合成経路の活性化が抑制され、それに伴い、高血圧症の予防若しくは治療が可能であることを見出し、本発明をするに至った。本発明のヘキサミン生合成経路活性化抑制剤は、高血圧症以外にも、タンパク質のグリコシル化に伴う疾病、例えば、生活習慣病や、糖尿病に伴う合併症等の予防若しくは治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明のヘキサミン生合成経路活性化抑制剤において、前記チアミン誘導体は、ジセチアミン、オクトチアミン、シコチアミン、ビスイブチアミン、ビスベンチアミン、フルスルチアミン、プロスルチアミン、および、ベンフォチアミンからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【０００７】
前記抑制剤が含有するチアミン、チアミン誘導体、およびそれらの塩の一回投与量は、前記一回投与量に一日あたりの投与回数を乗じた一日あたりの投与量が、投与する生体の体重（ｋｇ）あたり５〜２００ｍｇとなる量であることが好ましい。
【０００８】
本発明の脂肪組織若しくは脂肪細胞におけるＯ−ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質の生成抑制剤は、前記本発明のヘキサミン生合成経路活性抑制剤を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明の生体におけるｐ５３の活性化抑制剤は、前記本発明のＯ−ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質の生成抑制剤を含むことを特徴とする。本発明のｐ５３の活性化抑制剤は、脂肪組織若しくは脂肪細胞において、前記抑制作用を奏することが好ましい。
【００１０】
本発明の生体におけるレニン・アンギオテンシン系の活性抑制剤は、前記本発明のｐ５３の活性化抑制剤を含むことを特徴とする。本発明の生体におけるレニン・アンギオテンシン系の活性抑制剤は、脂肪組織若しくは脂肪細胞において、前記抑制作用を奏すことが好ましい。
【００１１】
本発明の高血圧症の予防若しくは治療のための医薬は、前記本発明のレニン・アンギオテンシン系の活性抑制剤を含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の高インスリン血症の予防若しくは治療のための医薬は、前記本発明のレニン・アンギオテンシン系の活性抑制剤を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明のＳｐ１のグリコシル化の抑制剤は、前記本発明のＯ−ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質の生成抑制剤を含むことを特徴とする。本発明のＳｐ１のグリコシル化の抑制剤は、脂肪組織若しくは脂肪細胞において前記抑制作用を奏することが好ましい。
【００１４】
本発明のトランスフォーミング成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）の発現抑制剤は、前記本発明のＳｐ１のグリコシル化の抑制剤を含むことを特徴とする。本発明のＴＧＦ−β１の発現抑制剤は、脂肪組織若しくは脂肪細胞において前記抑制作用を奏することが好ましい。
【００１５】
本発明のプラスミノーゲン・アクチベータ・インヒビター−１（ＰＡＩ−１）の発現抑制剤は、前記本発明のＳｐ１のグリコシル化の抑制剤を含むことを特徴とする。本発明のＰＡＩ−１発明抑制剤は、脂肪組織若しくは脂肪細胞において、前記抑制作用を奏することが好ましい。
【００１６】
本発明の線維症の予防若しくは治療のための医薬は、前記本発明のＳｐ１のグリコシル化の抑制剤を含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明の高血圧症および高インスリン血症の少なくとも一方の症状改善用または予防用の食品添加剤は、前記本発明のレニン・アンギオテンシン系の活性抑制剤を含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明の線維症の症状改善用または予防用の食品添加剤は、前記本発明のＳｐ１のグリコシル化の抑制剤を含むことを特徴とする。
【００１９】
本発明の食品は、前記本発明の食品添加剤を含むことを特徴とする。
【００２０】
本発明において、チアミン誘導体としては、例えば、ジセチアミン、オクトチアミン、シコチアミン、ビスイブチアミン、ビスベンチアミン、フルスルチアミン、プロスルチアミンもしくはベンフォチアミンがあげられる。また、本発明において、チアミンおよびチアミン誘導体の塩としては、薬理学上許容される塩をあげることができる。これらのチアミン類は、例えば、第１４改正日本薬局方及び日本薬局方外医薬品規格等に収載されており容易に入手できる。これらの中でも、本発明に使用する前記チアミン誘導体、および、前記塩としては、少なくとも、チアミンと同様な生理活性を有し、脂肪組織若しくは脂肪細胞においてヘキサミン生合成経路（ＨＢＰ）の活性抑制効果を有するものが好ましい。
【００２１】
本発明の抑制剤、予防若しくは治療のための医薬の具体的な剤形としては、例えば、錠剤、細粒剤（散剤を含む）、カプセル、液剤（シロップ剤を含む）等をあげることができる。本発明の抑制剤は、各剤形に適した添加剤や基材を適宜使用し、日本薬局方等に記載された通常の方法に従い、製造することができる。前記各剤形において、その剤形に応じ、通常使用される各種添加剤を使用することもできる。前記添加剤としては、例えば、錠剤の場合、乳糖または結晶セルロース等を賦形剤として、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムまたは酸化マグネシウム等を安定化剤として、ヒドロキシプロピルセルロース等をコーテイング剤として、ステアリン酸マグネシウム等を滑沢剤として使用することができる。また、前記剤形が細粒剤及びカプセル剤の場合、乳糖または精製白糖等を賦形剤として、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムまたは酸化マグネシウム等を安定化剤として、トウモロコシデンプン等を吸着剤として、ヒドロキシプロピルセルロース等を結合剤として、使用することができる。前記各剤形において、必要に応じて、クロスポビドン等の崩壊剤、ポリソルベート等の界面活性剤、ケイ酸カルシウム等の吸着剤、三二酸化鉄、カラメル等の着色剤、安息香酸ナトリウム等の安定剤、ｐＨ調節剤、香料等を添加してもよい。
【００２２】
本発明の抑制剤、予防若しくは治療のための医薬において、チアミン類（チアミン、前記チアミン誘導体およびそれらの塩）の投与量は、前記チアミン類の種類、剤形等により異なるが、体重１kgあたりの１日量として、例えば、５ｍｇ〜２００ｍｇである。つまり、例えば、体重６０ｋｇのヒトであれば、１日あたり３００ｍｇ〜１２００ｍｇである。前記体重１kgあたりの１日量としては、好ましくは、１０ｍｇ〜１００ｍｇであって、より好ましくは、１５ｍｇ〜５０ｍｇである。１日の投与回数は、特に制限されず、その投与回数に応じて、本発明の抑制剤、予防若しくは治療のための医薬における前記チアミン類の含有量を設定できる。また、１日あたりの投与量は、前記上限値を越える場合であってもよい。
【００２３】
本発明の食品添加剤は、本発明の抑制剤を含み、食品に添加できるものであれば、特に制限されない。本発明の食品添加剤の形状は、特に限定されないが、例えば、液状、ペースト状、粉末状、フレーク状、顆粒状等いずれの形状でも良い。取り扱いやすさや、他の添加物と混合して使用することも考えれば、乾燥して粉末状、フレーク状、顆粒状にすることが好ましい。乾燥方法としては、通常の乾燥方法、例えばスプレー乾燥、ドラム乾燥、棚式乾燥、真空乾燥、凍結乾燥などで行うことができる。
【００２４】
本発明の食品添加剤が添加される本発明の食品は、特に限定はないが、例えば穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆等）、食肉加工品（ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等）、水産製品（冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等）、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等）、野菜・果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等）、菓子類（チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等）、アルコール飲料 （日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料（緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料 等）、調味料（しょうゆ、ソース、酢、みりん等）、缶詰・瓶詰め・袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥又は濃縮食品（レバーペースト、その他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麺類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲 、調理済みスープ等）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シュウマイ、鮫子、各種スティック、フルーツカクテル等）、固形食品、液体食品（スープ等）、香辛料類等の農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品等があげられる。本発明の食品の製造法は、特に限定されず、例えば、調理、加工及び一般に用いられている食品の製造法をあげることができる。本発明の食品における前記チアミン類の含有量は、前記チアミン類およびそれぞれの食品に応じて異なるが、例えば、０．０００５ｗ／ｗ％から９０ｗ／ｗ％である。
【００２５】
つぎに、本発明について詳しく説明する。
【００２６】
図２に、グルコースの代謝の概略を示す。図示のように、生体内に接収されたグルコースは、リン酸化されて、主要代謝経路である解糖系およびこれにつづくＴＣＡ回路で水と二酸化炭素に分解され、その際に生体エネルギー体であるＡＴＰが生成される。この他に、グルコースの代謝経路としては、ヘキサミン生合成経路、ポリオール経路、ジアシルグリセロール経路などがあり、これらの経路によってグルコースが種々の物質に変換されていく。これらの代謝経路において疾病と大きく関係するのが、ヘキサミン生合成経路である。ヘキサミン生合成経路では、グルコースが代謝されて生じたフルクトース６リン酸からグルタミン６リン酸が生じ、これからＮ−アセチルグルコサミン１リン酸が生じ、これからＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃが生じる。そして、図９に示すように、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃが基質となり、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼにより、ｐ５３やＳｐ１等の転写活性因子タンパク質がグリコシル化されて活性化若しくは修飾される。ｐ５３が活性化されると、アンギオテンシノゲン（ＡＴＧ）およびアンギオテンシン１型受容体の発現が活性化され、この結果として、レニン・アンギオテンシン系が活性化されることになる。レニン・アンギオテンシン系が活性化されると、高血圧症等が発症することになる。一方、Ｓｐ１がグリコシル化されると、プラスミノーゲン・アクチベータ・インヒビター-１（ＰＡＩ−１）やトランスフォーミング成長因子-β１（ＴＧＦ−β１）が活性化され、この結果、腎臓等の血管を含む様々な臓器や組織において、線維症が発生することになる。ここで、解糖系およびＴＣＡ回路において、グルコースから生じたフルクトース６リン酸が、その後の代謝ステップに移行しないために、別の代謝経路であるヘキサミン生合成経路が活性化される。この事実は、本発明者等が初めて見出したことである。そして、解糖系の最終段階からＴＣＡ回路の最初の段階に移行するステップであるピルビン酸からアセチルＣｏＡへの変換は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体が関与しており、チアミンが重要な役割を果たしている。ここで、チアミンを大量に摂取すると、このピルビン酸からアセチルＣｏＡへの移行ステップがスムーズになり、フルクトース６リン酸がフルクトース１，６ビスリン酸に速やかに代謝されるため、フルクトース６リン酸の蓄積が起こり難くなり、その結果、ヘキサミン生合成経路の活性化が抑制され、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの合成およびそれに伴うｐ５３やＳｐ１の活性が抑制され、最終的には、レニン・アンギオテンシン系の活性化の抑制、ＴＧＦ−β１およびＰＡＩ−１の活性化の抑制につながり、これらに関連する疾病（例えば、高血圧症や高インスリン血症など）の予防もしくは治療につながる。具体的には、脂肪細胞若しくは脂肪組織において、ＨＢＰの構成要素であるグルタミン−フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ; EC 2.6.1.16）およびＯ-ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、レニン・アンギオテンシン系（ＲＡＳ）の構成要素であるアンギオテンシノゲン（ＡＧＴ）、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）およびアンギオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ）、ならびに、アジポカイン（adipokine）であるＰＡＩ-１、ＴＧＦ-β���、およびアジポネクチンの各発現が、チアミンの大量摂取若しくは大量投与によって抑制される。このように、チアミンの大量摂取若しくは投与によって、高血圧症や高インスリン血症、繊維症等の予防若しくは治療が可能であることを見出したのも本発明者が初めてである。なお、従来から、チアミンは、必要微量栄養素として、食品以外のサプリメントや医薬品に使用されてきたが、それはチアミン欠乏症の予防若しくは治療のためであって、例えば、正常成人の一日当たりの摂取量は０．５ｍｇ／１０００ｋｃａｌと、極めて微量である。しかし、本発明では、チアミン欠乏症の予防若しくは治療のためにチアミンを使用するのではなく、前述のように、チアミンを大量に摂取（若しくは投与）することにより、解糖系からＴＣＡ回路への移行ステップであるピルビン酸からアセチルＣｏＡの生成をスムーズに行うことにより、フルクトース６リン酸の蓄積を防止し、これによりヘキサミン生合成経路の活性化を抑制し、これに伴う疾病の予防若しくは治療を図るものである。これが、本発明のポイントである。
【００２７】
［実施例］
次に、本発明の実施例を説明する。用いた試薬、方法等は、以下のとおりである。
【００２８】
抗体および試薬
抗Ｏ結合型グリコシル化抗体ＲＬ−２（アフィニティー・バイオリージェント、ゴールデン社製）、ビオチン化抗マウス免疫グロブリンウサギ抗体Ｆ(ａｂ’)２フラグメントおよび過酸化物結合ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ社製）、２-デオキシ-Ｄ-[3Ｈ(Ｇ)]グルコース（６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）およびＤ-[14Ｈ(Ｕ)]グルコース（３０３ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）（パーキンエルマー・ライフサイエンス社製）、イソフルレン（アボット社製）、並びに、チアミン塩酸塩（シグマ・ケミカル社製）は、それぞれ、市販のものを使用した。すべての試薬は、利用可能な最高品質のものを使用した。
【００２９】
使用実験動物
自然発生高血圧ラット（ＳＨＲ／ＮＣｒ）、ウィスター京都ラット（ＷＫＹ／ＮＣｒ）およびスパレーグ・ドーリー（ＳＤ）ラットは、チャールズリバー社から購入した。
【００３０】
下記実施例１では、チアミン大量投与の効果を、ＳＨＲ／ＮＣｒラットで確認した。ＳＨＲ／ＮＣｒラット（４週齢のオス）を、２つのグループのいずれかにランダムに分け、１０週間、標準的な飼料（ＭＭ−３、ケアリ社製）を与えた。ラットは、自由に水（未処理グループ）またはチアミンを含む水（０．２ｗ/ｖ％、チアミングループ）を飲めるようにした。
【００３１】
下記実施例２では、チアミン大量投与の効果を、フルクトース誘導高血圧ＳＤラットで確認した。ＳＤラット（１０週齢オス）を、下記の３つのグループに分けた（１グループあたり８ラット）。前記高フルクトース摂取ラット（ＨＦＦＲ）には、６０％フルクトースを含む粉末状の半合成飼料（オリエント酵母社製）を与えた。コントロールグループには、粉末状の標準的な飼料（５０％コーンスターチおよび１０％スクロース、オリエント酵母社製）を与えた。チアミングループのＨＦＦＲには、６週間、０．２％チアミンを含む水を自由に飲ませた。
【００３２】
動物は、ケージごとに４匹ずつ飼育し、標準の状態に制御した湿度および温度で、１２時間の明暗サイクルを保持した。体重、血圧および心拍数は、１週間ごとに測定し、飼料および水の摂取量は、１日おきに記録した（飼料および水の摂取量は、各ケージの動物の平均とした）。心収縮期の血圧および心拍数は、テール・カフ・フォトプレチスモグラフィー（tail-cuff photoplethysmography、商品名Softron BP-98A、ソフトロン社製）により測定した。各ラットの血圧と心拍数の測定値は、少なくとも３回の血圧および心拍数の記録の平均値をとった。グループの平均値は、同一グループの各ラットの前記測定の結果を平均して得た。すべての手順は、米国生理学会（American Physiological Society）のガイドラインにしたがって行い、大阪医科大学の動物調査委員会（Animal Research Committee）により承認を受けた（承認番号第２６２号）。
【００３３】
放射能の測定
組織中の２-デオキシ-Ｄ-[3Ｈ(Ｇ)]グルコースからの放射能は、組織のグルコース摂取量を示す。デオキシグルコースは、リン酸化された形態となった後では代謝されないからである。他方、Ｄ-[14Ｃ(Ｕ)]グルコースからの放射能は、グルコースの組織内での代謝量を示す。組織中の細胞内に取り込まれたグルコースは、主にＣＯ2に酸化され細胞から漏出するからである。すなわち、心筋グルコースの最終結果（fate）は、[14Ｃ]放射能と、[3Ｈ]放射能との比率（[14Ｃ]/[3Ｈ]カウント比）として算出できる。
【００３４】
２-デオキシ-Ｄ-[3Ｈ(Ｇ)]グルコースおよびＤ-[14Ｃ(Ｕ)]グルコースの混合物を、尾部静脈注射により投与した。２時間後、過剰量のペントバルビタールによりラットを絶命させた。そのラットの心臓を取り出し、大動脈およびそのほかの血管を取り除き、７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２５Ｍスクロースおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を含む氷冷した媒質中で、比率１：１０（重量／体積）で、０℃、ポリトロン（Polytron）を用いてホモジナイズした。前記ホモジネートを、４８０×ｇで５分間、冷媒遠心分離機を用いて遠心した。その上清を取り除いた後、ペレットを、前記ホモジナイズ用原媒質に懸濁して、再び４８０×ｇで５分間遠心した。その上清を、最初の遠心で得られた上清と合わせて、さらに、７７００×ｇで５分間遠心した。ミクロソームとサイトソルとを分画するために、前記７７００×ｇで遠心した上清を、１０５０００×ｇで、６０分間遠心した。各フラクション（１００μＬ）を、トルエンを主成分としたシンチレーション液が１０ｍｌ入ったシンチレーションバイアル瓶に移し、その放射能を計測した。
【００３５】
免疫組織学およびウエスタンブロッティング
心臓を、４％リン酸緩衝化ホルマリン中で、２〜３日間固定し、パラフィンに包埋した。免疫組織化学的な評価のために、パラフィンで包埋した組織切片を、脱パラフィン処理した。ストレプトアビジン−ビオチン複合体ペルオキシダーゼ染色のために、抗ＵＤＰ-ＧｌｃＮＡｃマウスモノクロナール抗体（ＲＬ−２）を、一次抗体（１：１００；３７℃で一晩）として使用し、続いてビオチン化ヤギ抗マウス抗体（１：２００）を二次抗体として使用した。３，３'-ジアミノベンジジンを色原体として使用した。ネガティブコントロールでは、一次抗体を除いて行った。ウエスタンブロッティングでは、心臓の一部を、前記“放射能の測定”の項目に記載したようにホモジネートし、総ホモジネートを、Laemmliのサンプルバッファーで希釈し、２０μｇのタンパク質を、７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、ＲＬ−２抗体（１：１０００）で一晩インキュベートし、ＥＣＬの手順により現像させた。
【００３６】
心エコー検査解析
心エコー検査は、気管内挿管することなく、自発呼吸によって軽く麻酔したラット（１〜２％イソフルレン）に行った。２次元ガイドＭ-モード心エコー検査は、１０−ＭＨｚトランスデューサーを装備したエコーカルジオグラムを用いて行った（商品名ＶｉＶｉｄ５、ジェネラルエレクトリック社製）。詳細な血流力学パラメーターを得るために、前述のようにして、ドップラーレコーディングを、近位上行大動脈切断面に対して行った。
【００３７】
血液の回収および生化学的測定
介入の終わりに、動物を、一晩（１６時間）絶食させた後、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔した。血液を心穿刺により回収した。その血漿を、遠心分離により直ちに分離し、その後に行う生化学的測定のために、−４０℃で凍結した。グルコース、総コレステロール、トリグリセリドおよびＮＥＦＡの血漿中のレベルは、日立社製自動分析装置（商品名７４７）で測定した。ノルエピネフリンの血漿濃度は、カテコールアミン分析装置（トウショウ社製、商品名HLC-8030）で測定した。インシュリン、アンギオテンシンIIおよびアジポネクチンの血漿中のレベルは、市販のキットを用いて測定した。前記キットは、それぞれ、商品名インシュリンRIAキット（リンコ・リサーチ社製）、アンギオテンシンII（ケイマン・ケミカル社製）およびアジポネクチン（大塚製薬社製）であった。
【００３８】
ＲＮＡの調製
ＲＮＡは、グアニジンイソチオシアン酸塩とフェノール−クロロホルムとを用いて精巣上体の脂肪細胞から抽出した。そのＲＮＡペレットを、ＲＮaseフリー水に溶解し、商品名ＲＮｅａｓｙミニキット（キアジェン社製））を用い、メーカーからの推奨事項にしたがって単離した。ＲＮＡ濃度および純度は、使用する前に、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの光学濃度を測定することにより判断した。それらの吸光度の比率（Ａ２６０／Ａ２８０）は、１．７５〜１．９５の範囲であった。単離したＲＮＡの品質は、１．０％アガロースゲルを用いて調べた。各試料から、総ＲＮＡ２μｇを、逆転写に用いた。第１ストランドｃＤＮＡは、ランダムプライマーと、モロニーマウス白血病ウィルス逆転写酵素（プロメガ社製）とで合成した。
【００３９】
逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によるｍＲＮＡレベルの相対的な定量
反応条件（ＲＮＡ鋳型の量および増幅のためのサイクル数）を予備実験により最適化し、反応の対数期内で、再現性および信頼性の高い増幅を得た。ネガティブコントロールとして、逆転写を行うことなくｍＲＮＡから増幅を行った。ＧＦＡＴ：グルタミン−フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｏ-ＧｌｃＮＡｃＴ：ＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミン−ペプチドグリコシルトランスフェラーゼ、ＡＧＴ：アンギオテンシノゲン、ＡＣＥ：アンギオテンシン変換酵素、ＡＴ１Ｒ：アンギオテンシン１型受容体、ＰＡＩ-１、ＴＧＦ-β１、および、アジポネクチンのＲＴ−ＰＣＲに使用したフォワード（Ｆ）およびリバースプライマー（Ｒ）（配列番号１〜１６）、ＰＣＲのサイクル数、および、１８Ｓ比（プライマーと、コンペティターである１８ＳｒＲＮＡの比）を下記表１に示す。ＰＣＲは、９４℃１分、５５℃１分、７２℃１分のサイクルを下記表のサイクル数だけ行った。
【００４０】
（表１）
遺伝子      プライマー                     (SEQ ID NO) サイクル ｂｐ 18S比  
GFAT       Ｆ: AGC TGT GCA AAC ACT CCA GA           1     32    501  0.4:9.6
Ｒ: CCA ATC TCA GGA CCA GCA TT           2
O-GlcNAc T Ｆ: GGT GAC CCA GAA GAA ATC CA           3     30    417  0.5:9.5
Ｒ: CAG GTC CTT CAT GCA GTT GA           4
AGT        Ｆ: AGA AGA CCC TGC GAG ATA AGC          5     26         0.9:9.1
Ｒ: TTT TCT GGG CAG CAA GAA CT           6
ACE        Ｆ: TTG ACG TGA GCA ACT TCC AG           7     30    421  1.2:8.8
Ｒ: GGC TGC AGC TCC TGG TAT AG           8
AT1R       Ｆ: CAC CTA TGT AAG ATC GCT TC           9     35    445  0.4:9.6
Ｒ: GCA CAA TCG CCA TAA TTA TCC         10
TGF-β1    Ｆ: CGA GGT GAC CTG GGC ATC CAT GAC     11     28    405  0.6:9.4
Ｒ: CTG CTC CAC CTT GGG CTT GCG ACC CAC 12
PAI-1      Ｆ: TTT GGG AAA GGG TTC GCT TC          13     29    493  0.7:9.3
Ｒ: AGT CGT TGA TGA TGA ATC TGG         14
アジポネク Ｆ: TAA GGG TGA CCC AGG AGA TG          15     29    433  0.8:9.2
チン       Ｒ: GTC CCC TTC CCC ATA CAC TT          16                        
インターナルコントロールとして、市販の１８Ｓ ｒＲＮＡ（商品名クアンタムＲＮＡ  １８Ｓインターナルスタンダード、アンビオン社製）を用い、ＲＴ−ＰＣＲの対象となったＲＮＡの量を標準化するために、同時に増幅させた。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル上でエチジウムブロマイドにより検出した。個別のバンドの強度は、コダック社製のカメラにより測定し、ＩＭＡＧＥソフトを用いて定量した。使用したＲＮＡ量は、１８Ｓ ｒＲＮＡにより標準化した。各データは、３回の測定を行い算出した。
【００４１】
統計分析
各パラメーターの結果は、平均化し、平均値±標準偏差（ＳＤ）で表した。グループ間の比較は、対応のないｔ検定により行い、ｐ値＜０．０５の場合、統計的に有意とみなした。
【実施例１】
【００４２】
ＳＨＲ／ＮＣｒラットおよびＷＫＹ／ＮＣｒラットの心臓における[3Ｈ]デオキシグルコースおよび[14Ｃ]グルコースの放射能の蓄積
[3Ｈ]デオキシグルコース（以下、[3Ｈ]ＤＧと表すことがある。）と、[14Ｃ]グルコー
ス（以下、[14Ｃ]Ｇと表すことがある。）との混合物を、ＳＨＲ／ＮＣｒラットおよびＷ
ＫＹ／ＮＣｒラット（それぞれ、ｎ＝３）尾部静脈から注入した。投与２時間後に、それ
ぞれの心臓を摘出し、前記心臓における[3Ｈ]および[14Ｃ]の放射能の蓄積(カウント/分
;ｃｐｍ)を解析した。前記放射能は、もっぱらサイトゾル分画においてのみで検出した。
【００４３】
各[3Ｈ]および[14Ｃ]放射能レベル(ｃｐｍ/１００μLホモジネート)の測定結果を図１ＡおよびＢに、それぞれ示す。同図ＡおよびＢにおいて、オープンカラム（白色棒グラフ）がＷＫＹ／ＮＣｒラットの結果を示し、ハッチカラム（灰色棒グラフ）がＳＨＲ／ＮＣｒラットの結果を示す。同図ＡおよびＢに示すとおり、ＳＨＲ／ＮＣｒラットの[3Ｈ]および[14Ｃ]放射能は、ＷＫＹ／ＮＣｒラットのそれよりも大きかった。[3Ｈ]-放射能は、ぞれぞれ、２５３２.４±２９３.４（ＳＨＲ／ＮＣｒ）、１５４０.３±２２５.１（ＷＫＹ／ＮＣｒ）であり、[14Ｃ]-放射能は、それぞれ、３５８２.３±４４６.７（ＳＨＲ／ＮＣｒ）、１８３８.２±２４８.７（ＷＫＹ／ＮＣｒ）であった。この結果は、ＳＨＲ（自然発生高血圧ラット）の心臓において、グルコースの取り込みが増加するという知見と一致する。
【００４４】
[14Ｃ]-放射能と[3Ｈ]-放射能の比率（以下、[14Ｃ]/[3Ｈ]比と表す。）の結果を図１Ｃに示す。同図Ｃにおいて、オープンカラム（白色棒グラフ）がＷＫＹ／ＮＣｒラットの結果を示し、ハッチカラム（灰色棒グラフ）がＳＨＲ／ＮＣｒラットの結果を示す。[14Ｃ]/[3Ｈ]比は、ＳＨＲ／ＮＣｒラットの心臓とＷＫＹ／ＮＣｒラットの心臓において異なっていた。同図Ｃに示すとおり、ＳＨＲ／ＮＣｒラットの心臓の[14Ｃ]/[3Ｈ]比は、ＷＫＹ／ＮＣｒラットのそれよりも大きく、それぞれ、１.４１±０.０４（ＳＨＲ／ＮＣｒ）、１.１９±０.０２（ＷＫＹ／ＮＣｒ）であった。なお、注入に用いた混合物の[14Ｃ]/[3Ｈ]比は、１.５９±０.０６であり、図１Ｃにおいて、点線で示した。
【００４５】
ＳＨＲ／ＮＣｒラットの心臓の[14Ｃ]/[3Ｈ]比がより大きいことは、細胞内において、例えば、グリコゲン等の[14Ｃ]Ｇ代謝産物の蓄積がより大きいこと、および/または、細胞から、例えば、ＣＯ2等の[14Ｃ]Ｇ代謝産物の漏出がより少ないことを示す。[14Ｃ]Ｇから生成される14ＣＯ2を測定することはできなかったが、ＣＤ３６欠損心臓に豊富に流入するグルコースは、二酸化炭素にまで代謝されないと推察される。グルコースの取込みが向上することが示されているＣＤ３６-/-マウスの筋肉中のグリコゲン容量が、同腹子のコントロールと比較しても著しい変化がない事実は、部分的に前記推察を支持する。
【００４６】
ＴＣＡサイクルによる酸化およびグリコゲンとしての貯蔵に加え、細胞内に取り込まれたグルコースは、前述のように、少なくとも４つの経路に流れ込む。前記経路としては、例えば、ヘキソサミン生合成経路（ＨＢＰ）、ポリオール経路、ジアシルグリセロール経路およびメチルグリセロール経路等があげられ、その様子を図２に示す。同図に示すように、細胞に入ったグルコースは、リン酸化され、グルコース-６-リン酸（Glucose-6-P）となり、その後、主要な経路であるグリコゲン合成および解糖へ使用される。前記ＨＢＰにおいて、グルタミン−フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）は、この経路の流れを制御する重要な酵素である。同図において、ＲＯＳは、反応性酸素種を表し、ＤＡＧは、ジアシルグリセロールを表し、ＡＧＥは、糖化最終産物を表す。また、前記４つの経路はすべて高血糖症損傷と密接に関連することを示す。これらの中でも、前記ヘキソサミン生合成経路（ＨＢＰ）は、特に、インスリン抵抗性の病態生理学に関連するとされている。インスリン抵抗性には、前記ＨＢＰを通した炭水化物の代謝経路の増加が介在する。
【００４７】
正常状態において、細胞内に入ったグルコースの１−３％は、前記ＨＢＰに分岐する。前記ＨＢＰの生成物であるＮ-アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）は、転写因子を含む細胞内タンパク質のＯ結合型グリコシル化（Ｏ-ＧｌｃＮＡｃ化）の基質として機能を果たす。放射能標識グルコースを用いた前記検出において、ミトコンドリア、ミクロソーム、および、トリクロロ酢酸不溶タンパク質の各分画では、ほとんど放射能は検出できなかった。それにもかかわらず、ＳＨＲ／ＮＣｒラットの心臓におけるグルコース代謝産物の少なくともその一部分は、タンパク質のＯ結合型ＧｌｃＮＡｃ化に関与すると推察される。そこで、タンパク質のＯ結合型ＧｌｃＮＡｃ化が、ＳＨＲ／ＮＣｒラットの心臓で増加するか否かを確認するために、ＳＨＲ／ＮＣｒラットおよびＷＫＹ／ＮＣｒラットの心臓の、ＲＬ−２抗体に対する免疫反応性を調べた。ここで、前記ＲＬ−２は、数多くのタンパク質のＯ結合型ＧｌｃＮＡｃ修飾を認識する抗体である。
【００４８】
ＳＨＲ／ＮＣｒラットおよびＷＫＹ／ＮＣｒラットの心臓におけるＲＬ-２抗体に対する免疫反応
ホルムアルデヒド固定され、パラフィン包埋された６週齢のＳＨＲ／ＮＣｒおよびＷＫＹ／ＮＣｒラットの心臓から得た切片を、ＲＬ-２抗体で免疫染色した。その結果の一例を図３に示す。図３ＡおよびＢは、それぞれ、ＳＨＲ／ＮＣｒラットおよびＷＫＹ／ＮＣｒラットの心臓の免疫染色の結果を示す。図３Ｃは、ネガティブコントロールであって、最初の抗体を省いて行った結果の一例である。ＲＬ−２抗体の免疫反応シグナルは、細胞質ゾルおよび核で観察された。これは、核および細胞質ゾルのタンパク質が、細胞質ゾルＵＤＰ-Ｎ-アセチルグルコサミン−ペプチドグリコシルトランスフェラーゼ（Ｏ-ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ；ＥＣ ２.４.１）によりグリコシル化されるという報告と一致した。
【００４９】
ＲＬ−２抗体の免疫反応シグナルは、ＷＫＹ／ＮＣｒラットの心臓と比べて、ＳＨＲ／ＮＣｒラットの心臓において、いっそう強かった（図３ＡおよびＢ参照）。心筋のホモジネートを用いた前記抗体に対する免疫ブロットシグナルの検出結果を図３Ｄに示す。同図は、ＳＨＲ／ＮＣｒラット（SHR）およびＷＫＹ／ＮＣｒラット（WKY）の、それぞれ、４個体についての結果を示しており、Mr は、分子量マーカーを表している。同図に示すとおり、免疫ブロットシグナルにおいても同様に、ＷＫＹ／ＮＣｒラットの心臓と比較して、ＳＨＲ／ＮＣｒラットの心臓における免疫反応シグナルがより高いことが示された。
【００５０】
グルコース酸化の前駆ステップは、炭水化物利用の主要な制御部位である、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＨＣ）によるピルビン酸からアセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）への変換である（図２参照）。飢餓や糖尿病の状態下では、前記ＰＤＨＣの活性は低下する。前記ＰＤＨＣの活性化は、グルコース酸化の増大と、それに付随しておきる、細胞内グルコースの過負荷環境におけるＨＢＰへのグルコースの流れの減少とをもたらすことが期待される。ＰＤＨＣの活性は、リン酸化−脱リン酸化サイクルにより、劇的に制御される。ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＨＫｓ）の阻害は、筋肉におけるグルコース酸化を増大させる。ＰＤＨＫｓの阻害剤であるジクロロアセテート（ＤＣＡ）は、ＰＤＨＣの活性化によるグルコース酸化を増大させ、解糖とグルコース酸化のミスマッチを減少させる。ＤＣＡは、糖尿病や心不全の治療に効果がある。しかしながら、ＤＣＡには、例えば、神経毒性効果、白内障形成、および、精巣変性等の毒性があり、治療剤としての使用の妨げとなっている。
【００５１】
チアミン（ビタミンＢ1）およびα-リポ酸は、ＰＤＨＣの補酵素である。α-リポ酸の投与は、インスリン抵抗性ザッカー（Zucker）肥満ラットにおける、インスリン刺激全身および骨格筋のグルコース酸化を改善する。それゆえ、ＰＤＨＣの補酵素を大量投与にすることで、ＰＤＨＣの活性化を達成するその他のアプローチを開発できる可能性がある。
【００５２】
チアミンは、直接グルコース代謝に関与し、解糖系からのグリセロール３リン酸をペントースリン酸経路にシフトさせるトランスケトラーゼ、ＴＣＡサイクルにおけるケトグルタル酸のスクシニルＣｏＡへの酸化を触媒するα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、および、ピルビン酸をアセチルＣｏＡへ変換するＰＤＨＣの補酵素である。このように、チアミンは、グルコース代謝に必須であり、チアミンの大量投与により、細胞内グルコースの過負荷環境におけるＨＢＰへのグルコースの流れを減少させることができる。
【００５３】
ＣＤ３６の欠損は、心臓および骨格筋において脂肪酸の取り込み不足をもたらし、燃料としてグルコースへの依存が増大する。この細胞内グルコース負荷の増大は、正常状態と比較して、かなり大量のチアミンを要求する。しかし、細胞内グルコース負荷に応じたチアミンの摂取増大は自然には起こらない。なぜなら、哺乳類細胞は、チアミンを合成できず、絶対的に外来栄養源に依存しているからである。さらに、チアミンは、グルコース代謝が増大する環境において過剰に発生する反応性酸素種により、生物学的に非機能的な産物へと不活性化されてしまう。この酸化による不活性化が、さらに、チアミンの相対的欠乏をまねく。そこで、次に、オスのＳＨＲ／ＮＣｒラットに対して、離乳期（４週齢）から１４週齢まで期間、０.２％チアミンを含む水を摂取させた。
【００５４】
ＳＨＲ／ＮＣｒラットにおけるチアミン大量投与の影響
チアミン大量投与グループのラットにおける水の摂取量の平均値は、３５.２±２.３ｍｌ/日/ラットであった。これは、チアミンの摂取量の平均値が、７０.４±４.３ｍｇ/日/ラットであることに相当する。食料の摂取量の平均値は、チアミン大量投与グループ（チアミングループ）と未処理のコントロールグループ（未処理グループ）とで差異はなく、それぞれ、２２.４±１.０ｇ/日/ラット（チアミングループ）および２３.０±１.０ｇ/日/ラット（未処理グループ）であった。１０週間のチアミン大量投与は、ラットの活動を減衰させることも、肉眼で見て取れる外観の変化を生じさせることもなかった。
【００５５】
１）  ＳＨＲ／ＮＣｒラットにおける[3Ｈ]および[14Ｃ]放射能レベル、ならびにＲＬ-２免疫反応
[3Ｈ]ＤＧおよび[14Ｃ]Ｇの混合物を静脈注射した後の[3Ｈ]および[14Ｃ]放射能の蓄積に対する、チアミン大量投与の影響を解析した。[3Ｈ]ＤＧおよび[14Ｃ]Ｇの混合物を、チアミン大量投与ＳＨＲ／ＮＣｒラットおよび未処理ＳＨＲ／ＮＣｒラット（それぞれ、ｎ＝３）の尾部静脈から注入した。投与２時間後に、それぞれの心臓を摘出し、前記心臓における[3Ｈ]および[14Ｃ]の放射能の蓄積(カウント/分;ｃｐｍ)を解析した。各[3Ｈ]および[14Ｃ]放射能レベル(ｃｐｍ/１００μLホモジネート)の測定結果を図４およびＢに、それぞれ示す。同図ＡおよびＢにおいて、オープンカラム（白色棒グラフ）が未処理グループを、ハッチカラム（灰色棒グラフ）がチアミングループを示す。同図ＡおよびＢに示すとおり、未処理グループの心臓の[3Ｈ]および[14Ｃ]放射能は、ともに、チアミングループのそれよりも大きかった。[3Ｈ]-放射能は、ぞれぞれ、３２４５.５±３６１.５（未処理グループ）および２７５２.９±３５３.３（チアミングループ）であり、[14Ｃ]-放射能は、それぞれ、４８８１.３±５３９.１（未処理グループ）および３３６１.７±２７７．０（チアミングループ）であった。[14Ｃ]/[3Ｈ]比の結果を図４Ｃに示す。同図Ｃにおいて、オープンカラム（白色棒グラフ）が未処理グループを、ハッチカラム（灰色棒グラフ）がチアミングループを示す。同図Ｃに示すとおり、未処理グループの心臓の[14Ｃ]/[3Ｈ]比は、チアミングループのそれよりも大きく、それぞれ、１.５０±０.１０（未処理グループ）および１.２３±０.０５（チアミングループ）であった。なお、注入に用いた混合物の[14Ｃ]/[3Ｈ]比は、１.５９±０.０６であり、図４Ｃにおいて、点線で示した。
【００５６】
ＲＬ-２抗体に対する免疫反応性の結果の一例を図５に示す。ホルムアルデヒド固定され、パラフィン包埋された１４週齢の未処理グループのＳＨＲ／ＮＣｒラット（図５Ａ）および１４週齢のチアミングループのＳＨＲ／ＮＣｒラット（図５Ｂ）の心臓から得た切片を、ＲＬ-２抗体で免疫染色した。図５Cは、ネガティブコントロールである。同図に示すとおり、チアミングループの免疫反応シグナルは、未処理グループのそれよりも弱かった。
【００５７】
２）  体重、心収縮期の血圧および心拍
チアミングループおよび未処理グループのＳＨＲ／ＮＣｒラットの体重、心収縮期の血圧および心拍をテイルカフ法により測定した。図６に、１０週にわたり週ごとに測定した平均体重（図６Ａ）、平均収縮期血圧（図６Ｂ）、および、平均心拍（図６Ｃ）の結果を示す。同図において、クローズドサークル（黒円）はチアミングループを、オープンサークル（白円）は未処理グループの値を示し、値は、それぞれのグループにつき８個体の平均値±ＳＤである（*；ｐ＜０．０５、**；ｐ＜０．００５、***；ｐ＜０．０００５）。
【００５８】
同図に示すように、チアミングループの体重の増加は、未処理グループのそれよりも有意に低くかった。未処理グループの心収縮期の血圧は、継続的に約１９０ｍｍＨｇまで増加した。他方、チアミングループのそれは、７週齢までに１４０から１５０ｍｍＨｇまで増加し、その後、１４０から１５０ｍｍＨｇのプラトー状態を維持した。測定期間を通して、チアミングループの心収縮期の血圧および心拍は、未処理グループのそれらよりも、有意に低かった。
【００５９】
チアミングループにおける任意の試料消費は、未処理グループのそれと同等であった。それゆえ、カロリー制限により高血圧症の発生が予防されたのでないといえる。チアミンが毒性を欠いていることは周知であり、悪影響は何ら観察されなかった。実際、後述する表２に示すとおり、チアミングループの脛骨の長さと、未処理グループのそれとは、差異がなく、このことから、チアミングループにおける実質的な成長遅延がないといえる。
【００６０】
３）  心エコー検査のパラメーター
心エコー検査のパラメーターにおけるチアミン大量投与の影響を下記表２に示す。同表に示すとおり、拡張期心室中隔壁厚（ＩＶＳｄ）および拡張期左室後壁厚（ＬＶＰＷｄ）は、チアミングループにおいて有意に減少し、ＩＶＳｄは、それぞれ、１.３３±０.１３ｍｍ（チアミングループ）および１.５９±０.１５ｍｍ（未処理グループ）であって（ｐ＜０.００５）、ＬＶＰＷｄは、それぞれ、１.３３±０.１１ｍｍ（チアミングループ）および１.５８±０.１９ｍｍ（未処理グループ）であった（ｐ＜０.００５）。なお、同表の値は、平均値±ＳＤである（ｎ＝８）。
【００６１】
（表２）
未処理グループ   チアミングループ
（ｎ＝８）      （ｎ＝８）            ｐ  
心拍（beats/min）      393.3±36.3      345.4±36.3        0.0296
心収縮期圧（mmHg）     188.6±14.4      156.0±8.2         0.0002
心拡張期圧（mmHg）     141.6±27.6      101.5±19.1        0.0081
平均圧（mmHg）         157.1±23.2      119.6±13.9        0.0032
ＩＶＳｄ（mm）          1.59±0.15       1.33±0.13        0.0021
ＬＶＰＷｄ（mm）        1.58±0.19       1.33±0.11        0.0046
Ａｏ（mm）              3.93±0.08       3.88±0.07        0.1582
ＴＶＩ（cm）           5.524±0.304     4.739±0.739       0.0148
拍出量（mL/min）       261.5±21.9      220.9±40.0        0.0243
一回拍出量（mL）       0.672±0.054     0.562±0.102       0.0176
ＳＶＲ                  51.1±7.1        43.7±6.4         0.0443
（ダイン×秒×cm-5）（×104）                                        
チアミングループにおける時間速度積分（ＴＶＩ）、心拍出量（ＣＯ）、一回拍出（ＳＶ）、および、体血管抵抗（ＳＶＲ）は、明確に有意な減少を示した。ＴＶＩは、それぞれ、４.７３９±０.７３９ｍｍ（チアミングループ）および５.５２４±０.３０４ｍｍ（未処理グループ）であって（ｐ＜０.０５）、ＣＯは、それぞれ、２２０.９±４０.０ｍＬ/ｍｉｎ（チアミングループ）および２６１.５±２１.９ｍＬ/ｍｉｎ（未処理グループ）であって（ｐ＜０.０５）、ＳＶは、それぞれ、０.５６２±０.１０２ｍＬ（チアミングループ）および０.６７２±０.０５４ｍＬ（未処理グループ）であって（ｐ＜０.０２）、ＳＶＲは、それぞれ、４３.７±６.４ダイン×秒×ｃｍ-5(×104)（チアミングループ）および５１.１±７.１ダイン×秒×ｃｍ-5(×104)（未処理グループ）であった（ｐ＜０.０５）。
【００６２】
４）  臓器形態計測および血清の生化学的パラメーター
臓器形態計測におけるチアミン大量投与の影響を下記表３に示す。同表に示すとおり、心臓および腎臓の重さは、チアミングループのＳＨＲ/ＮＣｒラットにおいて有意に低く、心臓重量は、それぞれ、０.９５６±０.００７ｇ（チアミングループ）および１.０９３±０.０４９ｇ（未処理グループ）であって（ｐ＜０.００５）、腎臓重量は、それぞれ、１.８８４±０.１５０ｇ（チアミングループ）および２.１２７±０.０５３ｇ（未処理グループ）であった（ｐ＜０.００５）。前記心エコー検査におけるチアミングループのＩＶＳｄおよびＰＷｄの減少は、チアミングループの心臓重量の低さを支持した。
【００６３】
（表３）
未処理グループ    チアミングループ
（ｎ＝６）      （ｎ＝６）        ｐ    
体重（g）
開始時           45.3±1.0         46.7±3.8        0.3276
終了時          297.7±14.9       270.7±16.2       0.0133
摂取量（g／日）      23.0±1.0         23.4±1.0        0.2078
脛骨長（mm）       36.990±0.451     36.627±0.510      0.2204
心臓重量（g）       1.093±0.049      0.956±0.073      0.0032
心／体重量比        3.927±0.130      3.708±0.113      0.0111
心／脛骨長比       29.574±1.664     26.080±1.778      0.0056
腎臓重量（g）       2.127±0.053      1.884±0.150      0.0039
腎／体重量比      7.642±0.202      7.318±0.449      0.1380
腎／脛骨長比     57.518±2.008     51.430±3.776      0.0059
右腎臓（g）         1.064±0.037      0.922±0.072      0.0016
腎／体重量比      3.820±0.093      3.584±0.241      0.0490
腎／脛骨長比     28.765±1.287     25.176±1.774      0.0025
左腎臓（g）         1.063±0.022      0.962±0.082      0.0153
腎／体重量比      3.882±0.133      3.734±0.226      0.4312
腎／脛骨長比     28.753±0.827     26.254±2.101      0.0219   
なお、上記表３における値は、平均値±ＳＤである。
【００６４】
血清の生化学的パラメーターにおけるチアミン大量投与の影響を下記表４に示す。同図に示すとおり、循環するチアミン濃度は、チアミングループにおいて有意に高く、それぞれ、６７８.２±４７.０ｎｇ／ｍＬ（チアミングループ）および２８３.６±３１.１ｎｇ／ｍＬ（未処理グループ）であった（ｐ＜０.０００１）。チアミングループにおける循環する非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）、インスリンおよびノルエピネフリンの濃度は、未処理グループと比較して低く、ＮＥＦＡは、それぞれ、０.４３５±０.０６５ｍＥｑ／Ｌ（チアミングループ）および０.５７３±０.０５７ｍＥｑ／Ｌ（未処理グループ）であって（ｐ＜０.００５）、インスリンは、それぞれ、１.５±０.４ｎｇ／ｍＬ（チアミングループ）および２.４±０.７１ｎｇ／ｍＬ（未処理グループ）であって（ｐ＜０.０１）、ノルエピネフリンは、それぞれ、４４２.７±９６.２ｐｇ／ｍＬ（チアミングループ）および９１５.０±３３８.０ｐｇ／ｍＬ（未処理グループ）であった（ｐ＜０.０１）。
【００６５】
（表４）
未処理グループ    チアミングループ
（ｎ＝８）      （ｎ＝８）         ｐ  
チアミン（ng/mL）            283.6±31.1      678.2±47.0     <0.0001
絶食血糖量（mg/dL）           47.4±3.1        49.0±3.1       0.2436
NEFA（mEq/L）                0.573±0.057     0.435±0.065     0.0029
トリアシルグリセロール(mg/dL) 20.6±4.9        23.1±6.5       0.4001
総コレステロール（mg/dL）     50.6±4.2        54.6±5.9       0.1389
インスリン（ng/mL）            2.4±0.71        1.5±0.4       0.0096
ノルエピネフリン（pg/mL）    915.0±338.0     442.7±96.2      0.0072
アンギオテンシンII（pg/mL）   61.0±11.0       84.3±25.0      0.0631
アジポネクチン（ng/mL）     5152.7±371.0    5151.8±770.1     0.9981
なお、上記表４における値は、平均値±ＳＤである。
【００６６】
他方、チアミン大量投与は、血清グルコース、トリアシルグリセロール、総コレステロール、アンギオテンシンII、および、アジポネクチン（adiponectin）の循環レベルには影響を与えなかった。チアミン大量投与がアンギオテンシンＩＩの循環レベルに影響を与えないことは、高血圧症の病因論からレニン・アンギオテンシン系（ＲＡＳ）の役割を排除するものである。しかしながら、ＳＨＲは、高レニン高血圧症のモデルではない。腎臓の組織のアンギオテンシンＩＩ濃度は、ＳＨＲにおいて上昇し、マフリーフローマイクロパンクチャーにより測定したラットの近位細管管腔のアンギオテンシンＩＩ濃度は、循環濃度と比べて、二桁高く、近位細管管腔では、１０-8Ｍのレベルであって、循環血液では、１０-10Ｍのレベルであるとの報告がある。これらの知見は、循環アンギオテンシンＩＩではなく、局所的なＲＡＳが、高血圧症の発生に寄与していることを示唆する。引き続いて、精巣上体の脂肪組織において、ＲＡＳに関与するｍＲＮＡの発現レベルについて解析した。
【００６７】
脂肪組織は、単なるエネルギー貯蔵器官ではなく、内分泌器官としても機能する。脂肪細胞は、ＲＡＳの全ての構成要素を含み、さまざまなペプチドを分泌する。前記ペプチドには、例えば、トランスフォーミング成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）、プラスミノゲン・アクチベータ・インヒビター−１（ＰＡＩ−１）、および、アジポネクチン（adiponectin）等が含まれる。脂肪細胞は、ＣＤ３６を発現することが知られているが、ＣＤ３６欠損ＳＨＲ脂肪細胞の細胞膜では、ＣＤ３６タンパク質を検出できない。脂肪細胞は、少なくとも部分的には、ＣＤ３６欠損の病態生理学を示すと考えられるため、脂肪細胞におけるチアミン大量投与によるｍＲＮＡ発現の変化を解析した。
【００６８】
５）  脂肪組織におけるｍＲＮＡの発現レベル
ＨＢＰの構成要素であるグルタミン−フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ; EC 2.6.1.16）およびＯ-ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＲＡＳの構成要素であるアンギオテンシノゲン（ＡＧＴ）、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）およびアンギオテンシン１型受容体（ＡＴ１Ｒ）、ならびに、アジポカイン（adipokine）であるＰＡＩ-１、ＴＧＦ-β１、およびアジポネクチンをコードするｍＲＮＡについて、相対的な発現レベルを解析した。ＷＫＹ／ＮＣｒラット、未処理グループＳＨＲ／ＮＣｒラット、および、チアミングループＳＨＲ／ＮＣｒラットの精巣上体脂肪パッドからトータルＲＮＡを精製した。その結果を図７に示す。同図において、前記各ｍＲＮＡのｃＤＮＡは、１８ＳｒＲＮＡの発現レベルを基準に標準化し、ＷＫＹ／ＮＣｒラットにおける前記各ｍＲＮＡの平均発現レベルを１として他の数値を相対化して示した。同図の値は、別個の３個体からそれぞれ単離した脂肪パッドを用いて、それぞれのアッセイについて２度繰返し行って得た平均値±ＳＤである。ラットの組織は、１６時間の断食後、採取した。同図において、オープンカラムはＷＫＹ／ＮＣｒラット、クローズドカラムは未処理グループＳＨＲ／ＮＣｒラット、および、ハッチカラムは、チアミングループＳＨＲ／ＮＣｒラットをそれぞれ表す。
【００６９】
同図に示すとおり、未処理グループＳＨＲ／ＮＣｒラットの脂肪組織における各ｍＲＮＡの発現レベルは、ＷＫＹ／ＮＣｒラットのそれらよりも高く、それぞれ、の発現レベルと比較して、ＧＦＡＴは４.１倍、Ｏ-ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼは４.５倍、ＡＧＴは４.４倍、ＡＣＥは１.６倍、ＡＴ１Ｒは４.３倍、ＴＧＦ-β１は２.５倍、ＰＡＩ-１は６.２倍、およびアジポネクチンは１.５倍であった。チアミン大量投与は、前記ｍＲＮＡの発現レベルをほぼＷＫＹ／ＮＣｒラットの発現レベルと同程度まで下方制御した。チアミングループの発現レベルは、未処理グループの発現レベルと比較して、それぞれ、ＧＦＡＴは−３０％、Ｏ-ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼは−６５％、ＡＧＴは−８０％、ＡＣＥは−７７％、ＡＴ１Ｒは−７２％、ＴＧＦ-β１は−９０％、ＰＡＩ-１は−７４％、およびアジポネクチンは−３４％となった。
【００７０】
過剰な脂肪組織は、代謝異常や心疾患の発生と強い関連性がある。チアミン大量投与のＳＨＲ／ＮＣｒラットは、体重増加が減少するため、内臓脂肪質量をコンピュータ化した断層撮影法により測定した。しかしながら、チアミングループと未処理グループとの間で、有意な差異は何ら見出されなかった。これらの結果は、ＳＨＲ／ＮＣｒラットの脂肪細胞は、チアミン大量投与によりその性質は変化するものの、量的には変化しないことを示す。
【実施例２】
【００７１】
高フルクトース摂取ラット（ＨＦＦＲ）におけるチアミン大量投与の影響
ラットのフルクトース誘導高血圧症は、フルクトースが豊富な餌を食べさせることで誘導される血圧の上昇を伴う高インスリン血症であり、高血圧症の後天性モデルである。そこで、このモデルにおいても、チアミン大量投与により高血圧症の発生を防止することができることを、下記に示すように確認した。
【００７２】
図８に、ＨＦＦＲにおける平均心収縮期血圧（図８Ａ）、平均心拍（図８Ｂ）および平均体重（図８Ｃ）を、６週にわたり週ごとに測定した結果を示す。同図において、オープンサークル（白円）がチアミン大量投与ＨＦＦＲを、クロースドサークル（黒円）が未処理ＨＦＦＲを、クローズドスクウェア（黒四角）がコントロールの正常餌ラットを、それぞれ表す。同図に示すとおり、チアミン未処理のＨＦＦＲにおいて、心収縮期血圧は継続的に上昇し、約１６０ｍｍＨｇに達した。他方、チアミン大量投与ＨＦＦＲの心収縮期血圧は、正常な餌のグループと同じレベルである１２０から１３０ｍｍＨｇを保った。心拍および体重については、前記３つのグループ間で、有意な差異は観察されなかった。
【００７３】
心エコー検査のパラメーターにおけるチアミン大量投与の影響をを下記表５に示す。同表に示すとおり、拡張期心室中隔壁厚（ＩＶＳｄ）および拡張期左室後壁厚（ＰＷｄ）は、チアミン大量投与ＨＦＦＲグループにおいて有意に減少した。ＩＶＳｄは、それぞれ、１.５５±０.１０ｍｍ（チアミングループ）および１.８１±０.１１ｍｍ（未処理グループ）であって（ｐ＜０.０００５）、コントロール正常餌グループでは、１.５１±０.０９ｍｍであった。ＰＷｄは、それぞれ、１.４８±０.０６ｍｍ（チアミングループ）および１.７３±０.１２ｍｍ（未処理グループ）であって（ｐ＜０.０００１）、コントロール正常餌グループでは、１.５２±０.１６ｍｍであった。なお、同表の値は、平均値±ＳＤである（ｎ＝８）。
【００７４】
（表５）
ｐ            
正常餌       未処理      チアミン    正常餌   未処理   正常餌
グループ     グループ     グループ      vs       vs      vs 
（ｎ＝８）   （ｎ＝８）   （ｎ＝８）   未処理  チアミン チアミン
心拍（beats／min）
開始時       426.3±23.1  421.4±22.2  432.8±5.8    0.6792  0.2586  0.5183
終了時       407.0±46.3  391.2±32.9  376.8±33.9   0.4471  0.3901  0.1439
心収縮期圧(mmHg)
開始時       123.7±6.8   124.3±3.9   122.6±5.8    0.8356  0.4932  0.7164
終了時       126.7±9.9   159.8±5.6   126.3±6.7   <0.0001 <0.0001  0.9260
平均圧 (mmHg)   93.1±7.6   106.0±3.9    90.5±10.7   0.0007  0.0017  0.5895
IVSd (mm)       1.51±0.09   1.81±0.11   1.55±0.10  <0.0001  0.0003  0.4397
LVPWd (mm)      1.52±0.16   1.73±0.12   1.48±0.06   0.0076 <0.0001  0.5320
Ao (mm)         3.76±0.36   3.83±0.11   3.80±0.20   0.6243  0.8220  0.6837
TVI (cm)        5.51±0.51   5.26±0.25   5.27±0.57   0.2336  0.9690  0.3863
拍出量 (mL/min)  229±26      222±24      218±26     0.5693  0.7624  0.4032
ＳＶＲ          3.30±0.54   3.86±0.41   3.33±0.28   0.0360  0.0097  0.8805
（ダイン×秒×cm-5）（×104）                                                    
チアミン大量投与ＨＦＦＲにおいて、体血管抵抗（ＳＶＲ）は明らかな減少を示した。ＳＶＲは、それぞれ、３.３３±０.２８ダイン×秒×ｃｍ（チアミングループ）および３.８６±０.４１ダイン×秒×ｃｍ（未処理グループ）であり（ｐ＜０.０５）、コントロール正常餌グループでは、３.３０±０.５４ダイン×秒×ｃｍであった。
【００７５】
チアミン大量投与がＨＦＦＲに与える生化学的な影響について測定した結果を下記表６に示す。同図に示すとおり、血清グルコース、トリアシルグリセロール(トリアシル)、総コレステロール（総コレステ)、およびＮＥＦＡについては、グループ間の有意な差異はなかった。しかしながら、チアミン大量投与は、血清インスリンおよびノルエピネフリン(ノルエピネ)の減少を引き起こした。
【００７６】
（表６）
ｐ          
正常餌      未処理       チアミン    正常餌  未処理 正常餌
グループ    グループ      グループ      vs      vs     vs 
（ｎ＝８）  （ｎ＝８）    （ｎ＝８）   未処理  チアミ チアミ
絶食血糖値(mg/dL) 67.5±13.0    74.5±21.1   57.0±5.3   0.4378 0.0293 0.0413
インスリン(ng/mL) 1.67±0.78    3.03±1.02   1.81±0.54  0.0161 0.0165 0.6963
ノルエピネ(pg/mL)560.6±276.1 1143.6±590.3 682.6±175.6 0.0356 0.0710 0.3434
トリアシル(mg/dL) 45.3±39.9    56.9±30.7   46.0±26.9  0.5544 0.4952 0.9693
総コレステ(mg/dL) 67.9±21.6    60.6±13.1   60.7±13.0  0.4599 0.9840 0.4673
NEFA （mEq/L）   0.397±0.175  0.421±0.058 0.416±0.052 0.7342 0.8495 0.7927
インスリンの循環レベルは、未処理のＨＦＦＲと比較してチアミン大量投与ＨＦＦＲで低く、それぞれ、１.８１±０.５４ｎｇ／ｍＬ（チアミングループ）および３.０３±１.０２ｎｇ／ｍＬ（未処理グループ）であって（ｐ＜０.０５）、コントロール正常餌グループでは、１.６７±０.７８ｎｇ／ｍＬであった。ノルエピネフリンの循環レベルは、未処理のＨＦＦＲと比較してチアミン大量投与ＨＦＦＲで低かったが、統計学的に有意とはならなかった。ノルエピネフリンは、それぞれ、６８２.６±１７５.６ｐｇ／ｍＬ（チアミングループ）および１１４３.６±５９０.３ｐｇ／ｍＬ（未処理グループ）であって（ｐ＜０.０７１０）、コントロール正常餌グループでは、５６０.６±２７６.１ｐｇ／ｍＬであった。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
以上、説明したとおり、本発明の抑制剤を用いれば、脂肪組織若しくは脂肪細胞においてヘキサミン生合成経路を抑制し、細胞内における解糖とグルコース酸化の代謝ミスマッチを改善できるから、本発明は、例えば、高血圧症等の代謝異常に伴う疾患や生活習慣病の予防や治療の分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１ＡおよびＢは、それぞれ、本発明の一例における、[3Ｈ]および[14Ｃ]放射能レベルの測定結果のグラフを示す図であり、図１Ｃは、[14Ｃ]-放射能と[3Ｈ]-放射能の比率のグラフを示す図である。
【図２】図２は、グルコース代謝の概略を説明する図である。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、本発明のその他の例における、ラットの心臓の免疫染色の結果を示す図であり、図３Ｄは、ウェスタンブロットの結果の一例を示す図である。
【図４】図４ＡおよびＢは、それぞれ、本発明のさらにその他の例における、[3Ｈ]および[14Ｃ]放射能レベルの測定結果のグラフを示す図であり、図４１Ｃは、[14Ｃ]-放射能と[3Ｈ]-放射能の比率のグラフを示す図である。
【図５】図５Ａ〜Ｃは、本発明のその他の例における、ラットの心臓の免疫染色の結果を示す図である。
【図６】図６Ａ〜Ｃは、それぞれ、本発明のさらにその他の例における、ラットの平均体重、平均心収縮期血圧、および、平均心拍の測定結果のグラフを示す図である。
【図７】図７は、本発明のその他の例における、ｍＲＮＡの半定量ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す電位泳動の写真およびグラフを示す図である。
【図８】図８Ａ〜Ｃは、それぞれ、本発明のさらにその他の例における、ラットの平均心収縮期血圧、平均心拍および平均体重の測定結果のグラフを示す図である。
【図９】図９は、レニン・アンギオテンシン系の活性化と疾患との関連性を説明する図である。
【配列表フリーテキスト】
【００７９】
配列番号１：ＧＦＡＴ遺伝子フォワードプライマー
配列番号２：ＧＦＡＴ遺伝子リバースプライマー
配列番号３：Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ遺伝子フォワードプライマー
配列番号４：Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ遺伝子リバースプライマー
配列番号５：ＡＧＴ遺伝子フォワードプライマー
配列番号６：ＡＧＴ遺伝子リバースプライマー
配列番号７：ＡＣＥ遺伝子フォワードプライマー
配列番号８：ＡＣＥ遺伝子リバースプライマー
配列番号９：ＡＴ１Ｒ遺伝子フォワードプライマー
配列番号１０：ＡＴ１Ｒ遺伝子リバースプライマー
配列番号１１：ＴＧＦ−β１遺伝子フォワードプライマー
配列番号１２：ＴＧＦ−β１遺伝子リバースプライマー
配列番号１３：ＰＡＩ−１遺伝子フォワードプライマー
配列番号１４：ＰＡＩ−１遺伝子リバースプライマー
配列番号１５：アジポネクチン遺伝子フォワードプライマー
配列番号１６：アジポネクチン遺伝子リバースプライマー
【図１】
2006008576.tif 000003
【図２】
2006008576.tif 000004
【図３】
2006008576.tif 000005
【図４】
2006008576.tif 000006
【図５】
2006008576.tif 000007
【図６】
2006008576.tif 000008
【図７】
2006008576.tif 000009
【図８】
2006008576.tif 000010
【図９】
2006008576.tif 000011
【配列表】
2006008576000001.app