(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞増殖促進作用及び器官再生促進作用を有す５７キロダルトンタンパク質をコードする遺伝子を組換えDNA技術により大量に取得する。【解決手段】遺伝子組換えにより製造されるローヤルゼリー由来の５７キロダルトンタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子を提供する。【効果】５７キロダルトンタンパク質又は５７キロダルトンタンパク質を含む融合蛋白は、肝再生促進剤、肝機能改善剤、肝炎治療剤又は肝硬変抑制剤等肝疾患の治療薬となる可能性がある。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる、細胞増殖促進作用を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１に示される塩基配列を含む遺伝子。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列を含む遺伝子とハイブリダイズする遺伝子であって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項４】
蜜蜂由来である請求項１から３の何れか１項に記載の遺伝子。
【請求項５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる、細胞増殖促進作用を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項１から３の何れか１項に記載の遺伝子よりコードされるポリペプチド。
【請求項８】
請求項１から３の何れか１項に記載の遺伝子が挿入されたベクター。
【請求項９】
請求項５から７の何れか１項に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする細胞増殖促進剤。
【請求項１０】
細胞が肝細胞であることを特徴とする、請求項９に記載の細胞増殖促進剤。
【請求項１１】
請求項５から７の何れか１項に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする器官再生促進剤。
【請求項１２】
器官が肝臓であることを特徴とする、請求項１１に記載の器官再生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖促進作用及び器官再生促進作用を有すポリペプチドをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、身体の多くの活動範囲において中心的な役割をし、様々なホルモンで制御され、主に各種栄養素（糖質、タンパク質、脂質、ビタミン、ホルモン等）の処理（代謝）、貯蔵、解毒、分解、排せつ等の多様性に富んだ機能を維持していることで知られている。これらの機能を担っている肝実質細胞は生体内において各種のホルモンによる制御下に置かれ、ある場合にはきわめて旺盛な増殖を示す。例えば、ラットの肝臓のほぼ  2/3を切除しても、約10日後には元の大きさに戻ることが知られており、ヒトでも肝癌患者等において、部分肝切除とその後の再生による治療法が行われている。一方、肝実質細胞の増殖と機能の精巧な制御は、in  vitro初代培養肝細胞を用いて研究されている。これらの研究は、in  vivoの肝機能や様々なホルモン応答性を反映している。低細胞密度の培養条件では、ラット肝細胞は、上皮増殖因子（EGF：epidermal  growth  factor）や肝細胞増殖因子（HGF：hepatocyte  growth  factor）の様な成長因子の添加で増殖し、それらの分化機能は抑制される。成長因子は、細胞増殖だけでなくプログラムされた細胞死をモデゥレイトすることにより肝再生も制御している。肝実質細胞の増殖による肝再生の機構については従来より数多くの研究が行われ、EGFやHGFの存在が報告されてきた。一方、これまでにEGFやHGF様の作用を示すものがローヤルゼリーから単離されており、分子量５７キロダルトンの糖たんぱく質であることが報告されている。その生物活性作用として、DNA合成促進作用、肝臓保護作用、抗アポトーシス作用が報告されており（Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.  282,  865-874  （2001）及びJ.  Biochem.  132,  911-919  （2002））、５７キロダルトンタンパク質の肝疾患治癒効果や肝再生促進作用が期待されている。
【０００３】
ローヤルゼリー由来５７キロダルトンの糖たんぱく質は分子量５７キロダルトンの単量体タンパク質であることが報告されている（Biosci.  Biotechnol.  Biochem.  65,  277-284  （2001））。しかし、これまでに５７キロダルトンローヤルゼリータンパク質の一次構造及び該当するcＤＮＡの塩基配列については、何の報告もされていない。
【０００４】
また、５７キロダルトンローヤルゼリータンパク質を肝障害治療薬や肝再生促進剤として利用するためには、多量のタンパク質を必要とするが、ローヤルゼリーから多量の５７キロダルトンタンパク質を安定して精製することは容易ではない。かかる理由から５７キロダルトンタンパク質の安定且つ大量の精製は行われていなかった。
【非特許文献１】Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.  282,  865-874  （2001）
【非特許文献２】J.  Biochem.  132,  911-919  （2002）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、その様な状況の下為されたものであり、５７キロダルトンタンパク質を大量に取得する手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者らは、５７キロダルトンタンパク質を組換え  DNA技術により大量に取得するべく種々検討した結果、かかる目的に有用な５７キロダルトンタンパク質をコードする遺伝子を初めてクローニングすることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、配列番号２に示すアミノ酸配列で表される５７キロダルトンタンパク質をコードする遺伝子に存する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係わる５７キロダルトンタンパク質をコードする遺伝子は常法により発現ベクターに導入することによって、これを鋳型とする発現により５７キロダルトンタンパク質または５７キロダルトンタンパク質様物質あるいはこれを含む融合蛋白を得ることができる。得られる組換え５７キロダルトンタンパク質、５７キロダルトンタンパク質様物質あるいは５７キロダルトンタンパク質を含む融合蛋白は肝再生促進剤、肝機能改善剤、肝炎治療剤あるいは肝硬変抑制剤等肝疾患の治療薬となる可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に本発明を説明するに、本発明の５７キロダルトンタンパク質をコードする遺伝子  （cDNA）  は例えば配列番号１に示すような塩基配列を有する。なお、塩基配列は他の相補的な塩基配列を省略し１本鎖のみを記載した。この遺伝子  より組換え  DNA技術により例えば配列番号２に示すアミノ酸配列を有する５７キロダルトンタンパク質を発現させることができる。この時、５７キロダルトンタンパク質をコードする  mRNA  から翻訳される蛋白はシグナル配列を含んでいるが、細胞から分泌される場合にはシグナル配列が切断され、２０番目のアスパラギン残基（Asn）以後のアミノ酸配列を有する５７キロダルトンタンパク質が産生される。シグナル配列として、他の蛋白のシグナル配列を利用する事もできる。また、宿主細胞内にシグナル配列のない成熟５７キロダルトンタンパク質を発現させる場合は、５７キロダルトンタンパク質をコードする遺伝子として配列番号１に示す塩基配列のうち５８番目のアデニン（A）から以後の塩基配列を有する遺伝子を、ベクターの  ATGコドンにつなげて使用すればよい。さらに、本発明においては、肝実質細胞増殖促進活性を損なわない範囲内で、そのタンパク質に含まれるアミノ酸配列又はその遺伝子の塩基配列の少なくとも１個（好ましくは１個又は数個）に欠失、置換、付加等の変異が生じたものであっても、本発明の技術的範囲に属する。また、本発明のタンパク質に含まれるアミノ酸をコードする塩基配列のほか、縮重コドンにおいてのみ異なる同一のポリペプチドをコードする縮重異性体も本発明の遺伝子に含まれる。以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
ローヤルゼリー中の５７キロダルトンタンパク質の精製は以下のように行うことができる。凍結乾燥したローヤルゼリーを０．７重量％で１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、ＵＦ１０万（Ｍｉｎｉｐｌａｔｅ１００；限外濾過）で６倍濃縮、７回脱塩を行い、その濾液をさらにＵＦ３万（Ｍｉｎｉｐｌａｔｅ３０；限外濾過）で８倍濃縮、１回脱塩を行い、分子量１０万〜３万の分画を得た。上記の分子量１０万〜３万のサンプルは、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーによって分画することで、分子量５７キロダルトン蛋白質を分離できる。陰イオン交換クロマトグラフィーとしては、通常に知られている方法に従って行えば良く、例えば東ソー株式会社製ＤＥＡＥーＴｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍをカラムとして用いて、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を展開液Ａ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）と１ＭＮａＣｌを展開液Ｂとしてグラジェントにより、流速を５ｍｌ／ｍｉｎ、２８０ｎｍの吸光度で検出し、２．５ｍｌ／チューブで分画したフラクションＮｏ．１１９〜１２７に分子量５７キロダルトンの蛋白質画分を検出することができる。さらにこの画分をゲル濾過クロマトグラフィーにより、これは通常に知られている方法に従って行えば良く、この様な好ましい例としては、例えば、ファルマシア株式会社製ＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ６００をカラムとして用いて、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．０を展開液とし、流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３５℃に設定し、２８０ｎｍの吸光度で検出し、２．０ｍｌ／チューブで分画したフラクションＮｏ．３５〜４３に分子量５７キロダルトンの蛋白質を検出することが出来る。
【００１１】
５７キロダルトンタンパク質のＮ末端アミノ酸配列は、Asn-Ile-Leu-Arg-Gly-Glu−Ser-Leuであり（Biosci.  Biotechnol.  Biochem.  65,  277-284  （2001））、この配列は、これまでにクローニングされていた蜜蜂の加齢に伴い発現が変化する遺伝子である56  kDa  bee-milk  protein  （p56kP-4）遺伝子（Eur.J.Biochem.49,797-802（1997））の遺伝子産物のシグナル配列を除くＮ末端アミノ酸配列と同一である。これは、p56kP-4遺伝子産物が５７キロダルトンタンパク質である可能性が高いことを示している。この両タンパク質の同一性を調べるためには、５７キロダルトンタンパク質の内部アミノ酸配列の分析と５７キロダルトンタンパク質抗体を用いたp56kP-4遺伝子産物のウエスタンブロット分析を行うことにより確認できる。内部アミノ酸配列の分析は、公知方法により決定することができる。精製５７キロダルトンタンパク質を適切なタンパク質分解酵素例えばリジルエンドペプチダーゼで分解し、生成するペプチド断片を例えば逆相高速液体クロマトグラフィーで分離したのち、各ペプチドを例えばアプライドーバイオシステムズ社世気相プロテインシーケンサーで分析し、アミノ酸配列を決定することができる。また、５７キロダルトンタンパク質抗体とp56kP-4遺伝子産物との交差性は、次のような方法で分析することができる。p56kP-4遺伝子産物を５−２０％濃度勾配をつけたポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、さらにＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）膜へ移す。その膜は、５７キロダルトンタンパク質を認識する抗体でインキュベートされ、次に二次抗体としてペルオキシダーゼ結合抗ラビットＩｇＧポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と作用させる。検出は、ＥＬＣ  ウェスタンブロッティングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）による増強化学蛍光検出法を用いて行うことができる。この方法により、５７キロダルトンタンパク質遺伝子がp56kP-4遺伝子と同一遺伝子であることを証明することができる。なお、５７キロダルトンタンパク質遺伝子の塩基配列は、公知の方法（例えばジデオキシ法）により決定することができる。また、例えば、ABI社、Pharmacia社、島津社等の自動塩基配列決定装置等を用いることができる。また、遺伝子情報の解析には、例えばDNAsis配列解析ソフトウェア（日立）を使用することができる。
【００１２】
５７キロダルトンタンパク質遺伝子を含んだベクターおよびそのベクターを導入した形質転換細胞の作製形質転換細胞の作製は、本発明の組み換えベクターを、その組み換えベクターを作製する際に用いた発現ベクターに適合する宿主中に導入することにより得られる。宿主としては、目的とする遺伝子  を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、大腸菌（Escherichia  coli）  、バチルス・ズブチリス（Bacillus  subtilis）  等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces  cerevisiae）等の酵母、COS細胞、CHO細胞等の哺乳類細胞などが挙げられる。大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、本発明の組換えDNAが宿主中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、本発明のDNA、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。発現ベクターとしては、例えばファルマシア社のpGEX、pUC18  等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、trpプロモーター、lac  プロモーター、ＰL  プロモーター、ＰR  プロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組み換え体DNAの導入方法としては、例えばエレクトロポーレーション法や塩化カルシウム法を用いることができる。
【００１３】
また、酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばYEp13  、YCp50等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばgal1  プロモーター、gal10プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。哺乳類細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばpcDNA3（INVITROGEN  CORPORATION）等が挙げられる。発現ベクタープラスミドを、例えばLipofectamine（GIBCO  BRL社）  を用いたリポソーム法にて細胞株に導入する。その後、ネオマイシンを含む選択培地にて約１ヶ月程度培養を行い、薬剤耐性を示す細胞コロニーを得ることができる。
【００１４】
５７キロダルトンタンパク質遺伝子とグルタチオンＳトランスフェラーゼ（以下、GSTという。）とをコードする遺伝子を連結させて、融合タンパク質を発現させるプラスミドベクター（例えば  pGEX（Pharmacia社））に組み込んだ後、そのプラスミドを大腸菌に導入し、その大腸菌にて目的とする融合タンパク質を発現させた後、グルタチオンセファロース４B（Pharmacia社）を用いたカラムクロマトグラフィーとＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ６００（Pharmacia社）をカラムとして用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより精製することができる。
【００１５】
５７キロダルトンタンパク質遺伝子の発現タンパク質の肝実質細胞の増殖促進作用は、次のようなＤＮＡ合成促進活性を測定することで評価できる。ウィスター系雄ラット７週齢（体重：約１５０ｇ）の肝臓をハンクスバッファーにて灌流後、コラゲナーゼ溶液で灌流し肝細胞を得る。これをペニシリンとストレプトマイシンをそれぞれ１００ｍｇ／ｌ含有し、５％ＦＢＳを添加したＬ１５培地で２回洗浄し、その後、ペニシリンとストレプトマイシンをそれぞれ１００ｍｇ／ｍｌ、デキサメタゾン１０−６Ｍ、アプロチニン０．７マイクロｇ／ｍｌ、を含有する５％ＦＢＳ添加のＬ１５培地にて３７℃、３時間、ＣＯ２インキュウベーターで培養し、その後、ＤＮＡ合成促進剤を含む無血清培地で同条件にて２２時間培養する。更に、同培地に５−bromo-2'-deoxyuridine  （BrdU）（１０マイクロmol／L）を加え、３７℃、２時間培養後、培地を除去して、DNA合成活性を測定する。測定は、Cell  Proliferation  ELISA  kit  （ロシュ・ダイアノスティクス社）を用いることができる。細胞を固定したのち、抗-BrdU-Peroxidaseを加え、30分間室温で放置する。ＰＢＳで３回洗浄したのち、反応基質であるtetramethylbenzidineを添加し、室温で10分反応させた後、１M硫酸で反応を止める。試料の吸光度を450nmにて測定する。
【００１６】
本発明の肝再生促進剤は、５７キロダルトンタンパク質遺伝子産物を含有することを特徴とする。上記５７キロダルトンタンパク質遺伝子産物は、肝疾患の治療に有効であり、これを人に投与することにより、四塩化炭素等による急性肝障害、アルコール摂取による肝障害、ウィルス感染による慢性肝障害等の肝疾患に対する改善効果が得られる。本発明の肝疾患治療薬の適応症としては、急性肝炎、慢性肝炎、アルコール性肝炎、ウィルス性肝炎、アルコール性脂肪肝、アルコール性肝硬変等が挙げられる。本発明の５７キロダルトンタンパク質遺伝子産物は、そのまま、あるいは慣用の製剤担体と共に動物及び人に投与することが出来る。１日の好ましい有効投与量は、５７キロダルトンタンパク質遺伝子産物の重量として、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、更に好ましい投与量は０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。投与形態としては、特に限定はなく、必要に応じて適宜選択して使用され、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、座剤等の非経口剤が挙げられる。以上の製剤は、常法によって製造される。通常知られた任意成分を本発明の分子量５７キロダルトンのタンパク質の生理活性が損なわれない程度に配合することが出来る。かかる任意成分として、白糖、乳糖等の賦形剤、デンプン、ゼラチン等の結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル等の界面活性剤、タルク、ロウ類等の滑沢剤、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル等の流動促進剤、生理食塩水、ブドウ糖水溶液等の希釈剤、矯味矯臭剤、着色剤、殺菌剤、防腐剤、香料等が挙げられる。
【実施例】
【００１７】
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細な説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ限定されないことは言うまでもない。
＜実施例１＞
上記のごとくローヤルゼリーから５７キロダルトンタンパク質を精製した。この精製５７キロダルトンタンパク質１nmolをカルボキシメチル化したのち、凍結乾燥した。乾燥したサンプルに５０μLの８M尿素を加え室温2時間放置し、完全に溶解する。これに、  ５７キロダルトンタンパク質に対しモル比で  1/1000に相当するリジルエンドペプチダーゼを加えて37℃で８時間反応させた。生成したペプチド混合物は和光純薬工業株式会社製Wakopack  Navi  C-22-5  Column  （2.0×250mm）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離して、各ペプチドを分取した。
【００１８】
５つのペプチドについて気相プロテインシーケンサー（Hewlett-Packard社G1005A  Protein  sequencing  System）を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、表1に示すような配列が見出された。これらのアミノ酸配列は、p56kP-4遺伝子産物の内部アミノ酸配列と一致していた。
【００１９】
【表１】
2006094727.tif 000002
【００２０】
次に、p56kP-4をコードする遺伝子（Eur.J.Biochem.49,797-802（1997））がpBluescriptに連結されたプラスミドベクター（東京大学久保健雄博士より供与）を大腸菌JM109に導入した。得られた形質転換体の菌体破砕物（タンパク質濃度１mg/ml）１０μlを５−２０％濃度勾配をつけたポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、さらにＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）膜へ移した。その膜は、５７キロダルトンタンパク質を認識する抗体でインキュベートされ、次に二次抗体としてペルオキシダーゼ結合抗ラビットＩｇＧポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と作用させた。さらに、ＥＬＣ  ウェスタンブロッティングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）による増強化学蛍光検出法を用いて検出を行った。その結果、p56kP-4遺伝子産物は抗５７キロダルトンタンパク質抗体と交差した。これらの結果から、p56kP-4遺伝子は５７キロダルトンタンパク質遺伝子と同一であることが確認された。５７キロダルトンタンパク質遺伝子の塩基配列は、ABI社製自動塩基配列決定装置等を用いて、公知の方法（例えばジデオキシ法）により決定した。このようにして決定された５７キロダルトンタンパク質遺伝子のｃDNAの塩基配列を配列番号１に、また、５７キロダルトンタンパク質遺伝子によりコードされる５７キロダルトンタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示した。
【００２１】
５７キロダルトンタンパク質のN末端アミノ酸配列の結果から、配列番号２に示すアミノ酸配列においてシグナル配列を除く１９番目のアスパラギン残基（Asn）以後のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、５７キロダルトンタンパク質に相当する。このタンパク質に対応する配列番号１に示す塩基配列のうち、５８番目のアデニン（A）以後の塩基配列で示されるDNA断片をpolymerase  chain  reaction  （PCR）で増幅させた。PCRにおいては、Ex  Taq  PCR、またはLA  Taq  PCR  kit  （Takara）を使用した。増幅されたDNA断片を6種類の発現用ベクターpET19b、pET41a、pET32a、pTrc99A、pKK223-3、pGEX6P-3にそれぞれ連結させ、大腸菌に形質転換したのち、５７キロダルトンタンパク質遺伝子産物の発現を確認した。その結果、pGEX6P-3発現ベクターを用い、形質転換体を18℃で培養した場合にのみ可溶化した５７キロダルトンタンパク質遺伝子産物を得ることができた。５７キロダルトンタンパク質遺伝子産物は、グルタチオンセファロース４B（Pharmacia社）を用いたカラムクロマトグラフィーとＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ６００（Pharmacia社）によるゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した（図１）。
【００２２】
＜実施例２＞
上記のごとく精製して得た５７キロダルトンタンパク質遺伝子産物の肝実質細胞に対する増殖促進作用を測定した。即ち、ウィスター系ラット７週齢（体重：約１５０ｇ）の肝臓をハンクスバッファーにて灌流後、コラゲナーゼ溶液で灌流し肝細胞を得た。これをペニシリンとストレプトマイシンをそれぞれ１００ｍｇ／ｌ含有する、５％ＦＢＳ添加Ｌ１５培地で２回洗浄し、その後、ペニシリンとストレプトマイシンをそれぞれ１００ｍｇ／ｌ含有し、インスリン１０−６Ｍ、デキサメタゾン１０−５Ｍを含有する５％ＦＢＳ添加Ｌ１５培地にて３７℃、３時間、ＣＯ２インキュベーターで培養し、その後、無血清培地で、同条件で２２時間培養した。その後、ＤＮＡ合成促進剤を含む無血清培地で同条件にて２２時間培養した。更に、同培地に５−bromo-2'-deoxyuridine  （BrdU）（１０マイクロmol／L）を加え、３７℃、２時間培養後、培地を除去して、DNA合成活性を測定した。測定は、Cell  Proliferation  ELISA  kit  （ロシュ・ダイアノスティクス社）を用いた。細胞を固定したのち、抗-BrdU-Peroxidaseを加え、30分間室温で放置した。ＰＢＳで３回洗浄したのち、反応基質であるtetramethylbenzidineを添加し、室温で10分反応させた後、１M硫酸で反応を止めた。試料の吸光度を450nmにて測定した。無血清培地に添加したサンプルは、５７キロダルトンタンパク質遺伝子産物（０．０２５ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ）、HGF（５０nｇ／ｍｌ）、精製５７キロダルトンタンパク質（０．１ｍｇ／ｍｌ）、GST（０．１ｍｇ／ｍｌ）で、無添加を対象群とした。結果を表２に示す。この結果から、５７キロダルトンタンパク質遺伝子産物に肝実質細胞に対する増殖促進作用があることがわかる。
【００２３】
【表２】
2006094727.tif 000003
【００２４】
＜実施例３＞
１０週齢のウィスター系のラット（雄性、２１０〜２４０ｇ）１群１０匹を開腹し、肝臓の半葉を結索、切除し、ペニシリンで処置した後、縫合した。１群には、固形餌を粉砕しこの中に５重量％５７キロダルトンタンパク質遺伝子産物を混ぜ込み、加圧成形して、餌とし、このものを１週間投与した。もう１群は固形餌を１週間投与した。８日後開腹し、肝臓を取り出し重量を計測したところ、５７キロダルトンのタンパク質投与群は肝臓重量が、５．８８±０．７７ｇであったのに対し、通常餌群では３．８５±１．３１ｇであり、投与群において明らかなリカバリーの促進が認められた。即ち、本発明の細胞増殖促進剤（５７キロダルトンタンパク質遺伝子産物）により、肝再生が促進されていることがわかる。
【配列表１】
【００２５】
配列表１.txt
【配列表２】
【００２６】
配列表２.txt
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】大腸菌によって  GST-５７キロダルトンタンパク質遺伝子融合タンパク質を発現させたときの様子を示すSDS-PAGEパターンの写真。
【図１】
2006094727.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成17年9月16日(2005.9.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
2006094727.tif 000005
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
2006094727.tif 000006