(57)【要約】【課題】  ポリヒドロキシアルカノエートの分解、再生産に有用なポリヒドロキシアルカノエート分解酵素およびその遺伝子を提供することである。【解決手段】  特徴的な基質特異性を有するポリヒドロキシアルカノエート生産菌の有するポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を単離し、その遺伝子をクローニングして、ＤＮＡ配列を決定し、組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の製造を可能とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質(YN21_PhaZ)；
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列。
【請求項２】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかのＤＮＡを有し、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子(YN21_phaZ)：
（ｉ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｉｖ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質(H45_PhaZ)；
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が付加、欠失、置換されたアミノ酸配列。
【請求項４】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかのＤＮＡを有し、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子(H45_phaZ)：
（ｉ）配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｉｖ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質(P161_PhaZ)；
（ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が付加、欠失、置換されたアミノ酸配列。
【請求項６】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかのＤＮＡを有し、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子(P161_phaZ)：
（ｉ）配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｉｖ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質(P91_PhaZ)；
（ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が付加、欠失、置換されたアミノ酸配列。
【請求項８】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかＤＮＡを有し、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子(P91_phaZ)：
（ｉ）配列番号８に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号８に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号７で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｉｖ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項２、４、６または８に記載の遺伝子を含有している組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１１】
大腸菌である請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の形質転換体を培養し、培養液からポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を回収することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の製造方法。
【請求項１３】
請求項１２記載のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を用いた、ポリヒドロキシアルカノエートの分解方法。
【請求項１４】
ポリヒドロキシアルカノエートが式[１]から式[16]に示す群から選ばれた少なくとも１種類のポリマーユニットをポリマー分子中に含むことを特徴とする請求項１３記載の分解方法；
【化１】
2006204253.tif 000031
（ただし式中R1およびａの組合せが下記のいずれかであるポリマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。
（１）R1が水素原子（H）であり、aが1から10の整数のいずれかであるポリマーユニット、
（２）R1がハロゲン原子であり、aが1から10の整数のいずれかであるポリマーユニット、
（３）R1が、
【化２】
2006204253.tif 000032
であり、ａが1から8の整数のいずれかであるポリマーユニット)
【化３】
2006204253.tif 000033
(式中R2は芳香環への置換基を示し、R2は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、およびKのいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH=CH2基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中bは0から7の整数のいずれかを表す。)
【化４】
2006204253.tif 000034
(式中R3は芳香環への置換基を示し、R3は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、SCH3基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中cは0から7の整数のいずれかを表す。)
【化５】
2006204253.tif 000035
(式中R4は芳香環への置換基を示し、R4は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中dは0から7の整数のいずれかを表す。)
【化６】
2006204253.tif 000036
(式中R5は芳香環への置換基を示し、R5は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す）基、SO2R"（R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中eは1から8の整数のいずれかを表す。)
【化７】
2006204253.tif 000037
(式中R6は芳香環への置換基を示し、R6は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す）基、SO2R"（R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中fは1から8の整数のいずれかを表す。)
【化８】
2006204253.tif 000038
(式中gは1から8の整数のいずれかを表す。)
【化９】
2006204253.tif 000039
(式中hは1から8の整数のいずれかを表す。)
【化１０】
2006204253.tif 000040
(式中iは1から8の整数のいずれかを表す。)
【化１１】
2006204253.tif 000041
(式中ｊは1から8の整数のいずれかを表す。)
【化１２】
2006204253.tif 000042
(式中R7はシクロヘキシル基への置換基を示し、R7は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中kは0から8の整数のいずれかを表す。)
【化１３】
2006204253.tif 000043
(式中R8はシクロヘキシルオキシ基への置換基を示し、R8は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中mは1から8の整数のいずれかを表す。)
【化１４】
2006204253.tif 000044
(式中nは1から8の整数のいずれかを表す。)
【化１５】
2006204253.tif 000045
(式中pは3または5のいずれかの整数を表す。)
【化１６】
2006204253.tif 000046
(式中q1は1から8の整数のいずれかを表し、q2は0から8の整数のいずれかを表す。)
【化１７】
2006204253.tif 000047
(式中R9は水素原子(Ｈ)、Na原子またはK原子であり、式中rは1から8の整数のいずれかを表す。)
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ組換え技術によるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素に関し、より詳しくは、シュードモナス属（Pseudomonads）由来のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素および該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を有する発現ベクター、該発現ベクターにより形質転換された微生物、該形質転換体を培養することによる組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の製造方法、そのようにして得られる組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素、該組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を用いるポリヒドロキシアルカノエートの分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、多くの微生物がポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)あるいはその他のポリ-３-ヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)を生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,Ｐ178-197(1995))。これらのポリマーは従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。さらに、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全分解されるという利を有しており、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。特に最近、微生物産生ＰＨＡのより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮して、アルキル基以外の置換基を側鎖に導入したＰＨＡ「unusual ＰＨＡ」が極めて有用であることが期待されている。このような置換基の例としては、芳香環を含むもの(フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基等)や、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシド、チオエーテルなどが挙げられる。微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、このようなPHAを産生する微生物については様々な研究が成され、PHAの生合成経路は比較的よく調べられてきた。これまでのところポリヒドロキシアルカノエート合成酵素はその基質特異性とサブユニット構成により、3つのクラスに分類されている。
【０００３】
「第1のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素はRalstonia eutrophaやAeromonas punctataなどに見出されるもので、炭素数３から５の短い鎖長の３−ヒドロキシアルカン酸と、補酵素CoAとのチオエステル体を基質として利用する。
【０００４】
「第2のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素はPseudomonas oleovolansやPseudomonas aeruginosaなどに見出されるもので、炭素数６から１４の中鎖長３−ヒドロキシアルカン酸のほか様々な「unusual」な３−ヒドロキシアルカン酸と補酵素CoAとのチオエステル体を基質として利用する。
第1、第2のクラスともに、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素は分子量６１から７３ｋDaの単一のサブユニットから構成されている。
【０００５】
「第3のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素はAllochromatium vinosumやEctothiorhodospira shaposhnikoviiなどに見出され、約４０ｋDaの相異なる2種類のサブユニットから構成される。基質特異性は、第1のクラスのポリヒドロキシアルカノエート合成酵素に似て、炭素数３から５の短い鎖長の３−ヒドロキシアルカン酸と補酵素CoAとのチオエステル体を利用する。
【０００６】
一方、PHAの分解経路については不明な点が多い。The Journal of Biological Chemistry 266, 2191(1991)には上記「第2のクラス」に属する基質特異性を有するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するPseudomonas oleovolansに対する化学変異原処理によって細胞内ＰＨＡを分解できない変異株を取得し、これを利用してPHA分解活性を相補する遺伝子をクローニングしたことが開示されている。これによれば、PHA合成酵素遺伝子(phaC1, phaC2)とPHA分解酵素遺伝子(phaZ)はクラスターを形成し、phaC1-phaZ-phaC2という構成をとっている。その後、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas sp.61-3、Pseudomonas resinovolans、Pseudomonas putida U、Pseudomonas mendocinaなど、Pseudomonas oleovolansと同じ「第2のクラス」に属する基質特異性を有するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有する他の細菌においても、同じphaC1-phaZ-phaC2という遺伝子構成をとっていることが明らかになっている。
【０００７】
ところでこれらの研究の過程でPHA分解酵素遺伝子の機能しない変異株が単離されたものの、PHA分解酵素活性と細胞内PHAの蓄積量との関係についてはわかっていない。
【０００８】
一方、特開平11−113574号公報には「第1のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するアルカリゲネス・ユートロファスから単離されたポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)の分解酵素が提示されている。また特開平9−191887号公報には「第1のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するアルカリゲネス・フェリカスから単離されたポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)の分解酵素が提示されている。さらに、特開平6−086681号公報には「第1のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するズーグロエア・ラミゲラから単離されたポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)の分解酵素が提示されている。
【特許文献１】特開平11−113574号公報
【特許文献２】特開平9−191887号公報
【特許文献３】特開平6−086681号公報
【非特許文献１】「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,Ｐ178-197(1995)
【非特許文献２】The Journal of Biological Chemistry 266, 2191(1991)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
機能性ポリマーとして期待されているPHAを、安価にかつ大量に安定的に得るためにはその生産性を向上させることが必要である。このためには、単にPHAを産生する微生物の生合成効率を高めるのみでなく、その分解を抑えることが重要であると考えられる。従来知られていた前記第1のクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有する微生物から単離されたポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)の分解酵素は、炭素数３から５の短い鎖長の３−ヒドロキシアルカン酸を構成単位とするＰＨＡの分解に関与するものであるので、機能性ポリマーとして期待されているPHA(特にunusual PHA)を、安価にかつ大量に安定的に得るためには、利用できない。本発明の解決しようとする課題は、前記第２のクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有する微生物のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素およびその遺伝子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意研究を行ない、unusualなPHA産生微生物の一種であるシュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株(Pseudomonas sp. YN21)、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（Pseudomonas cichoriiH45）、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Pseudomonas jessenii P161）、及びシュードモナス・プチダ・Ｐ９１株（Pseudomonas putida P91）由来のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードするＤＮＡのクローニングを行った。つづいて、該ＤＮＡを含有する発現ベクターを構築し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養することにより、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有する組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を製造することに成功した。本発明によりポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードするＤＮＡがクローニングされたので、該ＤＮＡを含有する適当な発現ベクターを構築し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換させ、効率よくポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を得ることが可能になった。
また、通常の遺伝子組換え技術を用いて、アミノ酸の付加、欠失、挿入、置換等により、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を保持している誘導体を得ることも当業者にとって容易に行えるようになった。
また、本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素は従来基質にならなかった様々な置換基を側鎖に有するunusualなPHAを基質として利用しうることを見出したことによって本発明を完成した。
【００１１】
即ち、本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質の第１の態様は、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質(YN21_PhaZ)である。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列。
【００１２】
本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質の第２の態様は、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質(H45_PhaZ)である。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が付加、欠失、置換されたアミノ酸配列。
【００１３】
本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質の第３の態様は、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質(P161_PhaZ)である。
（ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が付加、欠失、置換されたアミノ酸配列。
【００１４】
本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質の第４の態様は、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質(P91_PhaZ)である。
（ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が付加、欠失、置換されたアミノ酸配列。
【００１５】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の第１の態様は、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかのＤＮＡを有し、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子(YN21_phaZ)である。
（ｉ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｉｖ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【００１６】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の第２の態様は、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかのＤＮＡを有し、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子(H45_phaZ)である。
（ｉ）配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｉｖ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【００１７】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の第３の態様は、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかのＤＮＡを有し、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子(P161_phaZ)である。
（ｉ）配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｉｖ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【００１８】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の第４の態様は、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかＤＮＡを有し、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子(P91_phaZ)である。
（ｉ）配列番号８に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号８に示す塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号７で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｉｖ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【００１９】
本発明にかかる組換えベクターは、上記の各態様にかかる遺伝子を含有している組換えベクターである。また、本発明にかかある形質転換体は、宿主細胞がこの組換えベクターにより形質転換されているものである。
【００２０】
本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の製造方法は、上記の形質転換体を培養し、培養液からポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を回収することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の製造方法である。
【００２１】
本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエート分解方法は、上記のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を用いた、ポリヒドロキシアルカノエートの分解方法である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、シュードモナス属（Pseudomonads）由来のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素および該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を有する発現ベクターが提供され、該発現ベクターにより形質転換された微生物、該形質転換体を培養することによる組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の製造が可能になる。またそのようにして得られる組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を用いれば、様々な置換基を有するunusual PHAの分解が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明者らはフェニル吉草酸を基質として用いて、３−ヒドロキシフェニル吉草酸モノマーユニットを含むＰＨＡを生産する能力を有する微生物の探索を行った。その結果、土壌より所望の能力を有する微生物株を分離することに成功し、ＹＮ２１株とした。
【００２４】
以下に述べる菌学的性質から、バージェーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー・第１巻（Ｂｅｒｇｅｙ‘ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ１）（１９８４年）、及び、バージェーズ・マニュアル・オブ・ディタミネーティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ‘ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第９版（１９９４年）に基づいて検索したところ、ＹＮ２１株はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属すると判明した。従って、この菌株をシュードモナス・スピーシーズ・ＹＮ２１株と命名した。
【００２５】
unusualな置換基を有するポリヒドロキシアルカノエート生産菌として本発明者らが土壌より分離した微生物である、シュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株（Pseudomonas sp. YN21）は寄託番号FERM ＢＰ−０８５６９として、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（Pseudomonas cichorii H45）は寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７４として、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Pseudomonas jessenii P161）は寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７６として、シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株（Pseudomonas putida P91）は寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７３として、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。
【００２６】
なお、ＹＮ２１株、Ｈ４５株、Ｐ１６１株、およびＰ９１株の菌学的性質を列挙すれば以下の通りである。
＜YN21株の菌学的性質＞
１）形態学的性質
細胞の形と大きさ：桿菌、0.8μｍ×1.5〜2.0μｍ
細胞の多形性：なし
運動性：あり
胞子形成：なし
グラム染色性：−
コロニー形状：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、半透明
２）生理学的性質
カタラーゼ活性：＋
オキシダーゼ活性：＋
O/F試験：酸化型
硝酸還元：＋
インドール産生：−
アルギニンジヒドロラーゼ：＋
エスクリン加水分解：−
ゼラチン加水分解：−
King's B寒天での蛍光色素産生：＋
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積：−
Tween 80 の加水分解：＋
41℃生育：−
グルコン酸還元：−
レバン産生：−
ジャガイモ腐敗：−
タバコ過敏感反応：−
スクロース：−
カゼイン：−
チロシナーゼ：＋
硫化水素：−
ペクチン：−
レシチナーゼ：−
リトマスミルク：B
デンプン：−
３）基質資化能
ブドウ糖：＋
Ｌ-アラビノース：＋
Ｄ-マンノース：＋
Ｄ-マンニトール：−
マルトース：−
グルコン酸：＋
D-キシロース：(＋)
ラフィノース：−
サリシン：−
グリセリン：＋
D-セロビオース：−
D-メレチトース：−
ラクトース：−
ガラクトース：＋
D-ソルビトール：−
α-メチル-D-グルコシド：−
D-リボース：(＋)
スクロース：−
イノシトール：−
D-フルクトース：＋
L-ラムノース：−
D-アラビノース：−
ズルシトール：−
メリビオース：−
アドニトール：−
デンプン：−
エリスリトール：−
トレハロース：−
ベタイン：＋
DL-乳酸：＋
D-酒石酸：−
L-酒石酸：(＋)
メソ酒石酸：＋
n-カプリン酸：＋
L-リンゴ酸：(＋)
クエン酸：＋
D-サッカラート：＋
レブリン酸：＋
メサコン酸：−
マロン酸：＋
コハク酸：＋
酢酸：＋
プロピオン酸：＋
n-酪酸：＋
ギ酸：−
グルタル酸：＋
D-キナ酸：＋
セバシン酸：＋
p-ヒドロキシ安息香酸：＋
アントラニル酸：−
ペラルゴン酸：＋
グリセリン酸：＋
γ-アミノ酪酸：＋
L-ロイシン：＋
L-セリン：＋
ヒスチジン：＋
L-イソロイシン：＋
L-アルギニン：＋
β-アラニン：＋
L-チロシン：＋
L-バリン：＋
ホモセリン：−
サルコシン：＋
トリアセチン：＋
トリゴネリン：＋
5-フェニル吉草酸：＋
3-ヒドロキシ酪酸：＋
L-アスパラギン：＋。
【００２７】
YN21株は従来菌株であるPseudomonas cichorii YN2株（FERM BP-7375）と硝酸塩還元性、インドール生成、ブドウ糖酸性化、アルギニンジヒドロラーゼ活性、Ｄ-マンノース資化能などの生理学的性質及び基質資化能の違いを示すことができる。また同様に従来菌株であるH45 株（FERM BP-7374）とは硝酸塩の還元性、アルギニンジヒドロラーゼ活性、Ｌ-アラビノース資化能、Ｄ-マンニトール資化能において、P161 株（FERM BP-7376）とはＤ-マンニトール資化能において、P91 株（FERM BP-7373）とは硝酸塩還元性、Ｌ-アラビノース資化能、Ｄ−マンノース資化能においてそれぞれ特性を異にする。
【００２８】
＜シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株の菌学的性質＞
（１）形態学的性質
細胞の形と大きさ：桿菌、０．８μｍ×１．０〜１．２μｍ
細胞の多形性：なし
運動性：あり
胞子形成：なし
グラム染色性：陰性
コロニー形状：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、クリーム色
（２）生理学的性質
カタラーゼ：陽性
オキシダーゼ：陽性
Ｏ／Ｆ試験：酸化型
硝酸塩の還元：陰性
インドールの生成：陰性
ブドウ糖酸性化：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ：陰性
ウレアーゼ：陰性
エスクリン加水分解：陰性
ゼラチン加水分解：陰性
β−ガラクトシダーゼ：陰性
Ｋｉｎｇ’ｓＢ寒天での蛍光色素産生  ：陽性
４％ＮａＣｌでの生育  ：陰性
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積：陰性
（３）基質資化能
ブドウ糖：陽性
Ｌ−アラビノース  ：陰性
Ｄ−マンノース  ：陽性
Ｄ−マンニトール  ：陽性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陽性
マルトース：陰性
グルコン酸カリウム：陽性
ｎ−カプリン酸  ：陽性
アジピン酸：陰性
ｄｌ−リンゴ酸：陽性
クエン酸ナトリウム：陽性
酢酸フェニル：陽性。
【００２９】
＜シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株の菌学的性質＞
（１）形態学的性質
細胞の形と大きさ：球状  φ０．６μｍ、桿状  ０．６μｍ×１．５〜２．０μｍ
細胞の多形性：あり（伸長型）
運動性：あり
胞子形成：なし
グラム染色性：陰性
コロニー形状：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、淡黄色
（２）生理学的性質
カタラーゼ：陽性
オキシダーゼ：陽性
Ｏ／Ｆ試験：酸化型
硝酸塩の還元：陽性
インドールの生成：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ：陽性
ウレアーゼ：陰性
エスクリン加水分解：陰性
ゼラチン加水分解：陰性
β−ガラクトシダーゼ：陰性
Ｋｉｎｇ’ｓＢ寒天での蛍光色素産生  ：陽性
（３）基質資化能
ブドウ糖：陽性
Ｌ−アラビノース  ：陽性
Ｄ−マンノース  ：陽性
Ｄ−マンニトール  ：陽性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陽性
マルトース：陰性
グルコン酸カリウム：陽性
ｎ−カプリン酸  ：陽性
アジピン酸：陰性
ｄｌ−リンゴ酸：陽性
クエン酸ナトリウム：陽性
酢酸フェニル：陽性。
【００３０】
＜シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株の菌学的性質＞
（１）形態学的性質
細胞の形と大きさ：桿菌、０．６μｍ×１．５μｍ
細胞の多形性：なし
運動性：あり
胞子形成：なし
グラム染色性：陰性
コロニー形状：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、クリーム色
（２）生理学的性質
カタラーゼ：陽性
オキシダーゼ：陽性
Ｏ／Ｆ試験：酸化型
硝酸塩の還元：陰性
インドールの生成：陰性
ブドウ糖酸性化：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ：陽性
ウレアーゼ：陰性
エスクリン加水分解：陰性
ゼラチン加水分解：陰性
β−ガラクトシダーゼ：陰性
Ｋｉｎｇ’ｓ  Ｂ寒天での蛍光色素産生：陽性
（３）基質資化能
ブドウ糖：陽性
Ｌ−アラビノース  ：陰性
Ｄ−マンノース  ：陰性
Ｄ−マンニトール  ：陰性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陰性
マルトース：陰性
グルコン酸カリウム：陽性
ｎ−カプリン酸  ：陽性
アジピン酸：陰性
ｄｌ−リンゴ酸：陽性
クエン酸ナトリウム：陽性
酢酸フェニル：陽性
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードするＤＮＡのクローニングは、当該技術分野で既知の方法に従って行うことができる。まず、シュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株、およびシュードモナス・プチダ・Ｐ９１株それぞれの培養物からポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を精製し、各精製酵素のＮ末端アミノ酸配列を決定する。次いで精製ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を限定分解することにより得られたペプチド断片より、部分アミノ酸配列を決定し、該アミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ゲノムＤＮＡを鋳型とし、これらのプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）を行い、各菌株のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の一部（または全部）を含むＰＣＲ断片を得る。次に、該断片をプローブにサザンハイブリダイゼーションを行って、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の全配列を含むＤＮＡ断片を得る。さらに、この断片をサブクローニングして、コロニーハイブリダイゼーションを行い、陽性コロニーを取得する。これらのコロニーからプラスミドを抽出し塩基配列を決定する。
【００３１】
このようにして取得されたポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子をコードする塩基配列を、配列番号２、４、６および８に、また塩基配列から推定されたポリヒドロキシアルカノエート分解酵素のアミノ酸配列を、配列番号１、３、５および７にそれぞれ示す。配列番号１、３、５または７に開示された内容に基づいて、通常の遺伝子組換え技術を用いて、アミノ酸の付加、欠失、挿入、置換等によりポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を保持している誘導体を得ることは当業者にとって容易である。ゆえにそのような常套手段で得られるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の活性な誘導体も本発明の範囲に包含されるものである。
【００３２】
また、配列番号２、４、６および８に示す塩基配列を含むＤＮＡのみならず、配列番号２、４、６または８に示す塩基配列を含むＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１、３、５または７のアミノ酸配列あるいは、その変異配列をコードするＤＮＡも本発明の範囲に包含されるものである。
【００３３】
ここで、上記の「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズ」するＤＮＡとは、以下に示すＤＮＡをいう。すなわち、（１）高イオン濃度下[例えば、6xSSC(900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム)等が挙げられる。]  に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより配列番号１で示される塩基配列を含むＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下[例えば、0.1xSSC(15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム)等が挙げられる。]  に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも該ハイブリッドが維持されるＤＮＡをいう。具体的には、例えば、配列番号2で示される塩基配列において、その一部が、その遺伝子産物が所望とする酵素活性を維持し得る範囲内で、欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡなどが挙げられる。かかるＤＮＡは自然界からクローニングされたＤＮＡであってもよいし、自然界からクローニングされたＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加が人為的に導入されたＤＮＡであってもよく、また、人為的に合成されたＤＮＡであってもよい。
【００３４】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードするＤＮＡを、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、様々なＰＨＡ分解酵素非生産性の宿主内で発現可能なポリヒドロキシアルカノエート分解酵素発現ベクターを構築することができる。よって、以下の実施例で示す発現ベクター及び宿主細胞は、本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードするＤＮＡの発現に適した多くのベクター及び宿主細胞の１例にすぎず、当業者ならば、当該技術分野での常法に従い、任意の宿主細胞内で機能的なポリヒドロキシアルカノエート分解酵素発現ベクターを構築することができる。プロモーターは既知のものから適宜選択するか、あるいは各種の遺伝子から利用可能なものを選択して、新たに調製、あるいは合成したものでもよい。このように、本発明の発現ベクターは本明細書記載の例示のプラスミドに限定されず、通常の技術を用いて修飾(例えば、プロモーターを交換する)することによって、異なる種類の微生物、また他の細胞内で機能的であり、及び／又はポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を高レベルに産生させることができる発現ベクターを構築することができる。
【００３５】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードするＤＮＡを担持する発現ベクターで形質転換するために用いられる宿主細胞は、大腸菌等の原核細胞、酵母等の真核細胞のいずれでもよく、さらには一般的に利用されている高等生物の細胞でもよい。宿主細胞としては、微生物［原核生物（細菌、例えば大腸菌や枯草菌等）、真核生物（例えば酵母）］、動物細胞又は培養植物細胞が挙げられる。微生物の好ましい例は、原核生物、特にEscherichia属に属する菌株(例えば、E.coli等)、酵母、特にSaccharomyces属に属する株（例えば、S.cerevisiae）やCandida属に属する株（例えば、C.boidinii）である。好ましい動物細胞株は例えば、マウスＬ９２９細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞などである。
【００３６】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を使用するのに適した、発現ベクターは既知であり、例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーター等の慣用のプロモーターを有するものを挙げることができる。酵母でのポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の発現のための発現ベクターとしては、ＧＡＬプロモーターやＡＯＤプロモーター等のプロモーターを含有するものが好ましい。又、哺乳動物細胞でのポリヒドロキシアルカノエート分解酵素発現のための発現ベクターとしては、ＳＶ４０プロモーター等のプロモーターを有するものが挙げられる。しかしながら、操作及び入手の容易さを考慮して、宿主細胞としては原核性宿主が好ましく、特に大腸菌が好ましい。原核性宿主−ベクター系については、多くの成書（例えばＭolecular Ｃloning：A LABOLATORY MANUAL, Ｃold ＳpringＨarbor Ｌaboratory Ｐress）があり、当該技術分野で既知であるが、以下に簡単に説明する。
例えば、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードするＤＮＡを大腸菌で発現させるには、大腸菌を用いた形質転換に適するプラスミドのプロモーターの下流に該ＤＮＡを挿入する。
【００３７】
後述する実施例では、大腸菌での１つの態様の発現が記載されているが、他の態様での発現は、例えば、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードするＤＮＡを適当な酵素（例えば制限酵素、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼなど）で処理することによりポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の酵素活性をコードするＤＮＡ断片を得、これを適当なベクターに組み込むことにより様々な宿主でポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するペプチドを発現させることができ、これらのポリヒドロキシアルカノエート分解酵素も本発明の範囲に含まれる。
【００３８】
発現ベクターによる宿主細胞の形質転換方法は既知であり、Ｍolecular Ｃloning：A LABOLATORY MANUAL, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐressに記載の方法で行うことができる。例えば、原核性宿主の場合は、コンピテントセル作製法、真核性宿主の場合は、コンピテントセル作製法、哺乳動物細胞の場合はトランスフェクション法、エレクトロポレーション法により行うことができる。次いで、得られた形質転換体を適当な培地に培養する。培地は、炭素源（例えばグルコース、メタノール、ガラクトース、フルクトース等）及び無機また有機窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸等）を含有していてよい。所望により、培地に他の栄養源（例えば無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム）、ビタミン類（例えばビタミンＢ1）、抗生物質（例えばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン等)）を加えてもよい。哺乳動物細胞の培養には、イーグル培地が適当である。
【００３９】
形質転換体の培養は、通常、pＨ６.０〜８.０、好ましくはpＨ７.０、２５〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で８〜４８時間行えばよい。生産されたポリヒドロキシアルカノエート分解酵素が培養液中に存在しているときは、培養物を濾過又は遠心分離する。精製は、回収した培養液上清から、天然又は合成のタンパク質の精製、単離に用いられる常法（例えば透析、ゲル濾過、対応する抗ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素モノクロナール抗体を用いてのアフィニティカラムクロマトグラフィー、適当な吸着剤を用いてのカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等）を用いて行うことができる。生産されたポリヒドロキシアルカノエート分解酵素が培養形質転換体のペリプラズム及び細胞質中に存在するときは、濾過や遠心分離によって細胞を集め、それらの細胞壁及び／又は細胞膜を、たとえば超音波及び／又はリゾチーム処理によって破壊して細胞破砕物を得る。この細胞破砕物に適当な水溶液（例えば緩衝液）を混合し、常法によって、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を精製することができる。
【００４０】
大腸菌中で生産されたポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を再生（リフォールディング）する必要があるときは、これを常法によって行うことができる。
【００４１】
尚、用途に応じてポリヒドロキシアルカノエート分解酵素は完全に精製されていなくとも良く、次の（１）〜（７）のいずれかであっても良い。
（１）生細胞：ろ過又は遠心分離等の通常の方法で培養物から分離された細胞。
（２）乾燥細胞：(１)の生細胞を凍結乾燥又は真空乾燥したもの。
（３）細胞抽出物：(１)又は(２)の細胞を通常の方法（例えば有機溶媒中での自己溶菌、アルミナや海砂と混合しての摩砕、又は超音波処理）して得られる。
（４）酵素溶液：細胞抽出物を常法通り精製するか部分精製することにより得られる。
（５）精製酵素：（４）に記載の酵素溶液をさらに精製し、不純物を含まないもの。
（６）酵素活性を有するフラグメント；精製酵素等を適当な方法で断片化処理することにより得られるペプチドフラグメント。
（７）固定化細胞又は酵素：細胞又は酵素を通常の方法で固定化（例えばポリアクリルアミド、ガラスビーズ、イオン交換樹脂等に固定化）したもの。
【００４２】
培地に分泌される場合（適当な分泌用シグナルをコードする領域をアセチル−CoAアシルトランスフェラーゼをコードする領域に配置して、アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼを培養液中に分泌する場合も含む）は、培養物そのもの及びそれから精製される酵素（溶液、凍結乾燥品、断片化したフラグメント等）及び固定化酵素が培養物又は処理物の例として挙げられる。また、「酵素活性を有するフラグメント」は、（６）に記載のごとく、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有し、本発明の目的に有用なペプチドフラグメントを指す。そのようなフラグメントは、例えば、上記（５）の精製酵素を、適当な方法で断片化処理することにより得ることができる。
【００４３】
上記の培養物、その処理物（精製酵素標品及び酵素活性を有するフラグメントを含む）は、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素酵素活性を有し、例えば下記の構造式[1]から[16]で示されるポリヒドロキシアルカノエートの分解活性を有する。
【００４４】
【化１】
2006204253.tif 000002
【００４５】
（ただし式中R1およびａの組合せが下記のいずれかであるポリマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。
（１）R1が水素原子（H）であり、aが1から10の整数のいずれかであるポリマーユニット、
（２）R1がハロゲン原子であり、aが1から10の整数のいずれかであるポリマーユニット、
（３）R1が、
【００４６】
【化２】
2006204253.tif 000003
【００４７】
であり、ａが1から8の整数のいずれかであるポリマーユニット)
【００４８】
【化３】
2006204253.tif 000004
【００４９】
(式中R2は芳香環への置換基を示し、R2は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、およびKのいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH=CH2基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中bは0から7の整数のいずれかを表す。)
【００５０】
【化４】
2006204253.tif 000005
【００５１】
(式中R3は芳香環への置換基を示し、R3は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、SCH3基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中cは0から7の整数のいずれかを表す。)
【００５２】
【化５】
2006204253.tif 000006
【００５３】
(式中R4は芳香環への置換基を示し、R4は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中dは0から7の整数のいずれかを表す。)
【００５４】
【化６】
2006204253.tif 000007
【００５５】
(式中R5は芳香環への置換基を示し、R5は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す）基、SO2R"（R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中eは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００５６】
【化７】
2006204253.tif 000008
【００５７】
(式中R6は芳香環への置換基を示し、R6は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す）基、SO2R"（R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中fは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００５８】
【化８】
2006204253.tif 000009
【００５９】
(式中gは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００６０】
【化９】
2006204253.tif 000010
【００６１】
(式中hは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００６２】
【化１０】
2006204253.tif 000011
【００６３】
(式中iは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００６４】
【化１１】
2006204253.tif 000012
【００６５】
(式中ｊは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００６６】
【化１２】
2006204253.tif 000013
【００６７】
(式中R7はシクロヘキシル基への置換基を示し、R7は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中kは0から8の整数のいずれかを表す。)
【００６８】
【化１３】
2006204253.tif 000014
【００６９】
(式中R8はシクロヘキシルオキシ基への置換基を示し、R8は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中mは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００７０】
【化１４】
2006204253.tif 000015
【００７１】
(式中nは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００７２】
【化１５】
2006204253.tif 000016
【００７３】
(式中pは3または5のいずれかの整数を表す。)
【００７４】
【化１６】
2006204253.tif 000017
【００７５】
(式中q1は1から8の整数のいずれかを表し、q2は0から8の整数のいずれかを表す。)
【００７６】
【化１７】
2006204253.tif 000018
【００７７】
(式中R9は水素原子(Ｈ)、Na原子またはK原子であり、式中rは1から8の整数のいずれかを表す。)
本発明方法に従ってポリヒドロキシアルカノエートの分解反応を行うには、本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の基質であるポリヒドロキシアルカノエートを含有する試料と、本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を発現する形質転換体の培養物又はその処理物を、適当な反応用の媒体を必要に応じて用いて接触させる。
【００７８】
培養物又はその処理物は水又は緩衝液中懸濁液(溶液)として用いる。pＨ、温度及び反応時間等の反応条件は特に限定されるものでなく、同様の酵素反応に通常用いられる条件から適宜選択するとよい。しかしながら、好ましくはpＨ６.０〜９.０、より好ましくはpＨ約７．０から８．０であり、反応温度は２５〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃、より好ましくは約３５℃である。
【００７９】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素は、適当な固体支持体に固定化することができる。酵素の固定化は当該技術分野で既知の方法により行うことができる。例えば、担体結合法、架橋化法、包括法、複合法等によって行う。担体としては、高分子ゲル、マイクロカプセル、アガロース、アルギン酸、カラゲーナン、などがある。結合は共有結合、イオン結合、物理吸着法、生化学的親和力を利用し、当業者既知の方法で行う。このようにして得られた固定化酵素は、例えばポリヒドロキシアルカノエートの分解再利用プラントに有用である。
【実施例】
【００８０】
次下、に実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、これらは本発明を制限するものではない。以下の実施例において用いたプラスミド類、様々な制限酵素やＴ４ＤＮＡリガーゼ、その他の酵素類は、市販品から入手し、供給者の指示に従って使用した。また、ＤＮＡのクローニング、各プラスミドの構築、宿主の形質転換、形質転換体の培養及び培養物からの酵素の回収は、当業者既知の方法、あるいは文献記載の方法に準じて行った。
【００８１】
（実施例１）
[シュードモナス スピーシーズ YN21株(Pseudomonas sp. YN21)由来のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子のクローニング]
１）培養及び粗酵素液の調製
0.１％(v/v)ノナン酸、0.5％(w/v)ポリペプトンおよび0.5％(w/v)グルコースを加えたＭ９培地を用いて、Pseudomonas sp. YN21株を３０℃で３６時間前培養を行った。本培養には０．１％(v/v)ノナン酸 、0.5％(w/v)ポリペプトンおよび0.5％(w/v)グルコースを加えたＭ９培地を用い、前培養液を添加して３０℃で２４時間振とう培養した。
Ｍ９培地の組成は以下の通りである。
【００８２】
Ｎa2ＨＰＯ4:    6.2g
ＫＨ2ＰＯ4 :    3.0g
ＮaＣl    ：    0.5g
ＮＨ4Ｃl  ：    1.0g
微量成分溶液  ：    0.3％(v/v)
(培地１リットル中、pＨ 7.0)
上記の微量成分溶液の組成は以下の通りである。
【００８３】
ニトリロ三酢酸:     1.5g
ＭgＳＯ4      :     3.0g
ＭnＳＯ4      :     0.5g
ＮaＣl        :     1.0g
ＦeＳＯ4      :     0.1g
ＣaＣl2       :     0.1g
ＣoＣl2       :     0.1g
ＺnＳＯ4      :     0.1g
ＣuＳＯ4      :     0.1g
ＡlＫ(ＳＯ4)2  :    0.1g
Ｈ3ＢＯ3       :    0.1g
Ｎa2ＭoＯ4     :    0.1g
ＮｉＣｌ2        :    0.1g
(１リットル中)
その後、遠心分離(４℃，９５００rpm，４０分)して菌体を回収し、１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ7.5)で菌体を懸濁し再度遠心分離して回収することによって菌体を洗浄した。ついで１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ7.5)で菌体を懸濁し、フレンチプレス処理によって菌体を破砕した。破砕液を遠心分離して、未破砕の細胞を沈殿として除き、上清を粗酵素液として調整した。
【００８４】
ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性は以下の力価の測定法に従って測定した。
ポリヒドロキシノナン酸をソルベントキャスト法にてＱＣＭ（水晶発振子マイクロバランス）上にフィルム化し、これを５０mM Ｔris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ７.５）２ｍｌ、３５℃中に静置し、ＱＣＭ信号が安定するまでプレインキュベートした。ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素150μgの添加で反応を開始し、ＱＣＭの共振周波数を経時的に測定した。周波数変化量からポリヒドロキシアルカノエートの質量減少量を求め、これを酵素活性とした。なお、ＩＵは３５℃で１分間に１μｇのポリヒドロキシアルカノエートを分解する酵素量と定義した。
【００８５】
２）酵素の精製
調製した粗酵素液に、体積比で１／２０量の５０mM Tris-HCl（pH7.5）緩衝液で十分に平衡化したDEAE-cellulose樹脂を加え、１５分間撹拌、１０分間静置を２回繰り返し、バッチ法による吸着をおこなった。２０分間静置してデカンテーションで上清を取り除き、５０mM Tris-HCl（pH7.5）緩衝液で洗浄してからカラムにつめた。溶出はＮaＣl（０〜１Ｍ）のリニアグラジエントで行った。集めた活性画分は、１０ｍＭのＮaＣｌを含む５０mM Tris-HCl緩衝液(pＨ7.5)で平衝化したPhenyl-Sepharose CL-4Bにアプライした。同緩衝液で洗浄後、塩濃度とエチレングリコールの直線濃度勾配により溶出させた。活性画分はエチレングリコールを除去するため、回収後、５０mMTris-HCl緩衝液(pＨ7.5)で一晩透析した。最後にDEAE−Toyopearlカラムクロマトグラフィーをおこなった。予め５０mM Tris-HCl緩衝液(pＨ7.5)で平衝化したカラムに、透析した活性画分をアプライした。同緩衝液で洗浄後、ＮaＣlによる塩濃度勾配により目的タンパクを溶出させた。これらのステップでポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を粗酵素液から回収率１５％で、２２倍に精製した。得られた酵素標品を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動)を行い分子量の決定をした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは７.５重量％ゲルを用いてデービスの方法に従った。２０mAの一定電流で２時間泳動後、染色はクマシーブリリアントブルーで行った。分子量既知の数種のタンパク（ミオシン、β−ガラクトシダーゼ、ホスホリラーゼＢ、牛血清アルブミン、オボアルブミン）を同様に泳動し、分子量マーカーを作成した。この結果より、精製酵素は分子量約３１ｋＤａのタンパク質であることがわかった。また等電点電気泳動の結果、本酵素の等電点は９．６であった。
【００８６】
３）部分アミノ酸配列の決定
上記の方法で精製した酵素標品を用いて、該酵素の部分アミノ酸配列を決定した。Ｎ末端アミノ酸の配列決定には、微量透析やゲル濾過により精製酵素標品を完全に脱塩したものをサンプルとし、プロテインシークエンサーに用いた。また、内部アミノ酸配列を解析する際には、精製タンパクを還元カルボキシメチル化して変性した後、Staphylococcal peptidase Iを作用させて断片化を行った。それぞれのペプチド断片はＣ１８を用いた逆相カラムクロマトグラフィーにより分取し、プロテインシークエンサーで解析した。その結果、Ｎ末端からの２7残基（配列番号９）と２つの内部領域（配列番号１０、１１）のアミノ酸配列が決定された。
【００８７】
４）オリゴヌクレオチドプライマーの設計
上記３）で得たアミノ酸配列から推定される塩基配列を基に、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）に用いるためのプライマーを設計した（図１）。Ｎ末端領域及び配列番号１１の内部領域の配列に基づいて、それぞれプライマーphaZ21-1F-1（配列番号１２）及びphaZ21-1R-1（配列番号１３）を合成した。なお、プライマーphaZ21-1R-1は、配列番号１１のアミノ酸配列から推定される塩基配列のＤＮＡに対する相補鎖として合成された。
【００８８】
５）ゲノムＤＮＡの調製
上記１）に記載したように、0.5％（w/v）ポリペプトンおよび0.5％(w/v)グルコースを加えたＭ９培地でPseudomonas sp. YN21株を３０℃で36時間培養し、遠心分離（４℃、１２,０００rpm、２０min）して生菌体を調製した。つぎにWizard Genomic DNA Purification System(プロメガ(株)製)を用いて、YN21株のゲノムDNAを調製した。
【００８９】
６）ＰＣＲによる部分配列の増幅
上記５）で調製したゲノムＤＮＡをテンプレートに、４）で設計したプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）を行った。すなわち以下の反応混合液を調製した。
【００９０】
【表１】
2006204253.tif 000019
【００９１】
ＰＣＲは、変性［９４℃で１分（１サイクル目だけ１０分間)］、アニーリング（５５℃で２分間）、伸長反応（７２℃で３分間）からなる一連の処理を３５サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロース電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、プライマーphaZ21-1F-1（配列番号１２）とphaZ21-1R-1（配列番号１３）により約380bの断片が増幅された。
【００９２】
７）ＰＣＲ増幅断片のサブクローニング
上記６）で得た約380bのＰＣＲ産物をアガロース電気泳動（ゲル濃度１重量％）して精製した。目的物を含むゲルを切り出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてＤＮＡ断片を回収した。次に回収したDNA断片を用いてpGEM-T Easy Vector Systems[プロメガ(株)製]によりTAクローニングを行った。
以下にライゲーション反応液の組成を示す。
【００９３】
【表２】
2006204253.tif 000020
【００９４】
上記の混合物を２５℃で1時間インキュベートし、Ｅ．coli JM109コンピテントセルに形質転換した。アンピシリン５０μg/ml、X-gal ５０μg/ml、ＩＰＴＧ ０.１mＭを含むＬＢアガロースプレートでホワイトコロニーを形質転換体として選択した。形質転換体より単離したプラスミドpGEM-phaZ21を各種制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動で消化断片の解析を行ったところ、約400ｂのＰＣＲ断片がpGEM-T Easy VectorのEroRI、SpeIサイトに挿入されていることが判明した。pGEM-phaZ21の制限酵素切断地図を図２に示す。
得られたプラスミドpGEM-phaZ21中の挿入部分（図２、PCR Product）の塩基配列をジデオキシ法により決定したところ、配列番号１０の内部領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ塩基配列が見出され、約380ｂのＰＣＲ増幅断片がポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードするＤＮＡの一部であることが確認できた。
【００９５】
８）サザンハイブリダイゼーション
上記５）で得たゲノムＤＮＡを各種制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動で分離し、これをナイロン膜に転写した。次いで、上記６）で増幅したＰＣＲ断片をジゴキシゲニンで標識してプローブとして用い、サザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、PstIにより切断された約３．２kbの断片に陽性シグナルを得た。この約３．２kbのＤＮＡ断片をアガロースから切り出し、ＤＮＡ回収用フィルター付遠心チューブ（孔径０.２２μｍ、宝酒造（株）製）を用いて、１００００rpm、４℃、１０分の遠心の後、エタノール沈澱を行うことで精製した。
【００９６】
９）コロニーハイブリダイゼーション
上記８）で精製された得られた約３．２kbのＤＮＡ断片を、同じくPstIで消化したpＵＣ１8(宝酒造社製：lacプロモーターを有する大腸菌用発現ベクター)にライゲーション(１６℃、１６時間)し、得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌JM109株を形質転換した。次いで、上記６）で増幅したＰＣＲ断片をジゴキシゲニンで標識してプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーションを行った。ライゲーション、形質転換及びコロニーハイブリダイゼーションは、Maniatisらの方法(Molecular Cloning, a laboratory manual(2nd ed.),pp.1.62-1.104(1989) Sambrook,J.,Fritch,E.and Maniatis,T.(eds)Cold Spring Harbor Laboratory)に従った。その結果、８００個のコロニーから１０個の陽性コロニーを得た。得られた陽性コロニーからプラスミドを抽出し、塩基配列を決定した。その結果、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の全長に相当する塩基配列を含有するプラスミドpUC-pZ21を保有するクローンを１株得た（大腸菌形質転換体(Ｅ．coli JM109/pUC-pZ21)）。このプラスミドpUC-pZ21の制限酵素切断地図を図３に示す。このプラスミドのポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子をコードする部分の塩基配列を決定し、推定のアミノ酸配列を決定した。結果を配列番号１４、１５及び図４及び５に示す。図４及び５における下線は、プロテインシーケンサーにより決定したＮ末端および内部アミノ酸配列を表す。
【００９７】
（実施例２）
[組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子発現ベクターの構築、組換えタンパク質の発現、精製および活性測定]
実施例１で決定されたPseudomonas sp. YN21株のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の塩基配列（配列番号２）に基づいて、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子をＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターpGEX-6P-1（アマシャムバイオサイエンス社製）にリクローニングするため、ＰＣＲプライマーphaZ21-for(配列番号１６)およびphaZ21-rev（配列番号１７）を設計・合成した。
【００９８】
実施例１で調製したプラスミドpUC-pZ21をテンプレートに、設計したプライマーphaZ21-for(配列番号１６)およびphaZ21-rev（配列番号１７）を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）を行った。以下の反応混合液を調製した。
【００９９】
【表３】
2006204253.tif 000021
【０１００】
ＰＣＲは、変性［９４℃で１分（１サイクル目だけ１０分間)］、アニーリング（５５℃で２分間）、伸長反応（７２℃で３分間）からなる一連の処理を３５サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロース電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、プライマーphaZ21-for（配列番号１６）とphaZ21-rev（配列番号１７）により約８５０bの断片が増幅された。上記PCRに用いたプライマー；phaZ21-for（配列番号１６）およびphaZ21-rev（配列番号１７）中には予めそれぞれ制限酵素XhoIの認識部位が含まれている。そこで約８５０bのＰＣＲ増幅産物を制限酵素XhoIで消化した。消化断片をＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターpGEX-6P-1（アマシャムバイオサイエンス社製）の対応する制限酵素XhoIの認識部位に挿入した。得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリンを添加したＬＢ寒天プレート上で生育可能なコロニーを選択した。
【０１０１】
プライマーpGEX-５'（配列番号１８）およびphaZ21-rev（配列番号１７）を用いてPCRを行い、約９７０ｂの増幅断片が得られることを確認することによって、上記８５０ｂのPCR増幅産物がグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子と同じ方向で挿入されたクローンを選択した。このクローンから抽出したプラスミド(pGEX-phaZ21)を用いて大腸菌（ＢＬ２１）を形質転換し、発現用菌株を得た。得られた菌株をLB-Amp培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その1mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、37℃、170rpmで3時間振とう培養した。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続けた。IPTG 誘導した大腸菌を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ（Glutathion Sepharose 4B beads: アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製した。使用したグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄(8000×g、１分、４℃) した後、４重量％ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、1/2量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオンセファロース 40μLを、無細胞抽出液１mL に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質GST-PhaZ21をグルタチオンセファロースに吸着させた。吸着後、遠心 (8000×g、 1分、4℃)してグルタチオンセファロースを回収し、400μLのＰＢＳで３回洗浄した。その後、10 mMグルタチオン40μLを添加し、4℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心 (8000×g、2分、4℃)して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、GST融合タンパク質を精製した。SDS-PAGEにより、シングルバンドを示すことを確認した。精製されたGST融合タンパク質の分子量は約５９ｋＤａであった。
【０１０２】
次に、GST融合タンパク質５００μｇをPreScissionプロテアーゼ（アマシャムバイオサイエンス、５Ｕ）で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴを除去した。フロースルー分画をさらに、PBSで平衡化したセファデックスG200カラムにかけ、発現タンパク質PhaZ21の最終精製物を得た。発現精製タンパク質PhaZ21のタンパク質濃度は、マイクロBCAタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。精製タンパク質のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性の測定は前述の方法にて行った。
その結果、精製された組換え酵素の比活性は野生型酵素と同等であることがわかった。また、SDS-PAGEにより精製タンパク質は分子量約３１ｋＤａであることがわかった。さらに等電点電気泳動の結果、精製タンパク質の等電点は９．６であった。
【０１０３】
（実施例３）
[unusual PHAの分解]
PHAとして、
（１）３-ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタン酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約３２％、約６８％含むコポリマー、
（２）３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約９２％、約８％含むコポリマー、
（３）３−ヒドロキシ−４−フェノキシ−ｎ−酪酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８６％、約１４％含むコポリマー、
（４）３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロベンゾイル）吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８６％、約１４％含むコポリマー、
（５）３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（６）３-ヒドロキシ−４−(フェニルスルファニル)酪酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（７）３−ヒドロキシ−５−フェニルメチルオキシ吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（８）３−ヒドロキシ−５−（２−チエニル）吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約９７％、約３％含むコポリマー、
をそれぞれ個々に用い、実施例２で調製した組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素による分解を次の様にして確認した。各々のPHAのクロロホルム溶液をＱＣＭ上にキャスト法にてフィルム化した。これを５０mM Ｔris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ７.５）２ｍｌ、３５℃中に静置し、ＱＣＭ信号が安定するまでプレインキュベートした。ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素150μgの添加で反応を開始し、ＱＣＭの共振周波数を経時的に測定した。経時的な共振周波数の増加が観察され、QCM上のポリヒドロキシアルカノエートの分解に伴う質量減少が確認された。
【０１０４】
（実施例４）
[unusual PHAの分解]
PHAとして、
（１）３−ヒドロキシ−５−(２−チエニルスルファニル)吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８２％、約１８％含むコポリマー、
（２）３−ヒドロキシ−５−(２−チエノイル)吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８６％、約１４％含むコポリマー、
（３）３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（４）３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシルオキシ酪酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（５）３-ヒドロキシ−10−ウンデセン酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約２５％、約７５％含むコポリマー、
（６）３−ヒドロキシドデカ−５−エン酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約９０％、約１０％含むコポリマー、
（７）３-ヒドロキシ-５-(メチルチオ)吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約９０％、約１０％含むコポリマー、
（８）３-ヒドロキシ-７-カルボキシヘプタン酸ユニットと３−ヒドロキシノナン酸ユニットをそれぞれモル比で約１３％、約８７％含むコポリマー、
をそれぞれ個々に用い、実施例２で調製した組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素による分解を次の様にして確認した。各々のPHAのクロロホルム溶液をＱＣＭ上にキャスト法にてフィルム化した。これを５０mM Ｔris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ７.５）２ｍｌ、３５℃中に静置し、ＱＣＭ信号が安定するまでプレインキュベートした。ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素150μgの添加で反応を開始し、ＱＣＭの共振周波数を経時的に測定した。経時的な共振周波数の増加が観察され、QCM上のポリヒドロキシアルカノエートの分解に伴う質量減少が確認された。
【０１０５】
（実施例５）
[変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の作製]
配列番号１のアミノ酸配列において、１４番目のグリシンをアラニンに、７５番目のチロシンをヒスチジンに、また２０１番目のスレオニンをバリンにそれぞれ置換した変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を作製した。それぞれのアミノ酸の置換は、遺伝子ＤＮＡのそれぞれ対応するコドンを、１４番目のグリシンであればＧＧＣをＧＣＣに、７５番目のチロシンであればＴＡＴをＣＡＴに、２０１番目のスレオニンであればＡＣＣをＧＴＣにそれぞれ塩基を置換することによって行った。それぞれの変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素は、実施例２で作製した組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子発現ベクター(pGEX-phaZ21)をテンプレートプラスミドとして、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて行った。
【０１０６】
ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の野生型（PhaZ21[wt]）に対して、１４番目のグリシンをアラニンに置換したもの（PhaZ21[G14A]）、７５番目のチロシンをヒスチジンに置換したもの（PhaZ21[Y75H]）、２０１番目のスレオニンをバリンに置換したもの（PhaZ21[T201V]）、さらにこれらの組合せとして、PhaZ21[G14A, Y75H]、PhaZ21[G14A, T201V]、PhaZ21[Y75H, T201V]、PhaZ21[G14A, Y75H, T201V] の計７種類の変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を発現する遺伝子発現ベクターを構築し、実施例２に述べた方法によって、各種ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を精製した。精製した各種ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の酵素活性を実施例１に述べた方法によって測定した。
【０１０７】
その結果、精製された変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の比活性は野生型酵素と同等であることがわかった。また、各変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードするＤＮＡは、（１）高イオン濃度下[6xSSC(900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム)  に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより配列番号２で示される塩基配列を含むＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下[0.1xSSC(15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム)]  に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも該ハイブリッドが維持され、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡであることが確認された。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの検出はAlkPhos Direct Labelling and Detection System（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて行った。
【０１０８】
（実施例６）
[シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株(Pseudomonas cichorii H45)由来のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子のクローニング]
１）培養及び粗酵素液の調製
0.１％(v/v)ノナン酸、0.5％(w/v)ポリペプトンおよび0.5％(w/v)グルコースを加えたＭ９培地を用いて、Pseudomonas cichorii H45株を３０℃で３６時間前培養を行った。本培養には０．１％(v/v)ノナン酸 、0.5％(w/v)ポリペプトンおよび0.5％(w/v)グルコースを加えたＭ９培地を用い、前培養液を添加して３０℃で２４時間振とう培養した。
Ｍ９培地の組成は以下の通りである。
【０１０９】
Ｎa2ＨＰＯ4:    6.2g
ＫＨ2ＰＯ4 :    3.0g
ＮaＣl    ：    0.5g
ＮＨ4Ｃl  ：    1.0g
微量成分溶液  ：    0.3％(v/v)
(培地１リットル中、pＨ 7.0)
上記の微量成分溶液の組成は以下の通りである。
【０１１０】
ニトリロ三酢酸:     1.5g
ＭgＳＯ4      :     3.0g
ＭnＳＯ4      :     0.5g
ＮaＣl        :     1.0g
ＦeＳＯ4      :     0.1g
ＣaＣl2       :     0.1g
ＣoＣl2       :     0.1g
ＺnＳＯ4      :     0.1g
ＣuＳＯ4      :     0.1g
ＡlＫ(ＳＯ4)2  :    0.1g
Ｈ3ＢＯ3       :    0.1g
Ｎa2ＭoＯ4     :    0.1g
ＮｉＣｌ2        :    0.1g
(１リットル中)
その後、遠心分離(４℃，９５００rpm，４０分)して菌体を回収し、１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ7.5)で菌体を懸濁し再度遠心分離して回収することによって菌体を洗浄した。ついで１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ7.5)で菌体を懸濁し、フレンチプレス処理によって菌体を破砕した。破砕液を遠心分離して、未破砕の細胞を沈殿として除き、上清を粗酵素液として調整した。
【０１１１】
ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性は以下の力価の測定法に従って測定した。
ポリヒドロキシノナン酸をソルベントキャスト法にてＱＣＭ（水晶発振子マイクロバランス）上にフィルム化し、これを５０mM Ｔris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ７.５）２ｍｌ、３５℃中に静置し、ＱＣＭ信号が安定するまでプレインキュベートした。ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素150μgの添加で反応を開始し、ＱＣＭの共振周波数を経時的に測定した。周波数変化量からポリヒドロキシアルカノエートの質量減少量を求め、これを酵素活性とした。なお、ＩＵは３５℃で１分間に１μｇのポリヒドロキシアルカノエートを分解する酵素量と定義した。
【０１１２】
２）酵素の精製
調製した粗酵素液に、体積比で１／２０量の５０mM Tris-HCl（pH7.5）緩衝液で十分に平衡化したDEAE-cellulose樹脂を加え、１５分間撹拌、１０分間静置を２回繰り返し、バッチ法による吸着をおこなった。２０分間静置してデカンテーションで上清を取り除き、５０mM Tris-HCl（pH7.5）緩衝液で洗浄してからカラムにつめた。溶出はＮaＣl（０〜１Ｍ）のリニアグラジエントで行った。集めた活性画分は、１０ｍＭのＮaＣｌを含む５０mM Tris-HCl緩衝液(pＨ7.5)で平衝化したPhenyl-Sepharose CL-4Bにアプライした。同緩衝液で洗浄後、塩濃度とエチレングリコールの直線濃度勾配により溶出させた。活性画分はエチレングリコールを除去するため、回収後、５０mMTris-HCl緩衝液(pＨ7.5)で一晩透析した。最後にDEAE−Toyopearlカラムクロマトグラフィーをおこなった。予め５０mM Tris-HCl緩衝液(pＨ7.5)で平衝化したカラムに、透析した活性画分をアプライした。同緩衝液で洗浄後、ＮaＣlによる塩濃度勾配により目的タンパクを溶出させた。これらのステップでポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を粗酵素液から回収率１５％で、２２倍に精製した。得られた酵素標品を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動)を行い分子量の決定をした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは７.５重量％ゲルを用いてデービスの方法に従った。２０mAの一定電流で２時間泳動後、染色はクマシーブリリアントブルーで行った。分子量既知の数種のタンパク（ミオシン、β−ガラクトシダーゼ、ホスホリラーゼＢ、牛血清アルブミン、オボアルブミン）を同様に泳動し、分子量マーカーを作成した。この結果より、精製酵素は分子量約31.5ｋＤａのタンパク質であることがわかった。また、等電点電気泳動の結果、本酵素の等電点は９．５であった。
【０１１３】
３）部分アミノ酸配列の決定
上記の方法で精製した酵素標品を用いて、該酵素の部分アミノ酸配列を決定した。Ｎ末端アミノ酸の配列決定には、微量透析やゲル濾過により精製酵素標品を完全に脱塩したものをサンプルとし、プロテインシークエンサーに用いた。また、内部アミノ酸配列を解析する際には、精製タンパクを還元カルボキシメチル化して変性した後、Staphylococcal peptidase Iを作用させて断片化を行った。それぞれのペプチド断片はＣ１８を用いた逆相カラムクロマトグラフィーにより分取し、プロテインシークエンサーで解析した。その結果、Ｎ末端からの２7残基（配列番号１９）と２つの内部領域（配列番号２０、２１）のアミノ酸配列が決定された。
【０１１４】
４）オリゴヌクレオチドプライマーの設計
上記３）で得たアミノ酸配列から推定される塩基配列を基に、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）に用いるためのプライマーを設計した（図６）。Ｎ末端領域及び配列番号２１の内部領域の配列に基づいて、それぞれプライマーphaZ45-1F-1（配列番号２２）及びphaZ45-1R-1（配列番号２３）を合成した。なお、プライマーphaZ45-1R-1は、配列番号２１のアミノ酸配列から推定される塩基配列のＤＮＡに対する相補鎖として合成された。
【０１１５】
５）ゲノムＤＮＡの調製
上記１）に記載したように、0.5％(w/v)ポリペプトンおよび0.5％(w/v)グルコースを加えたＭ９培地でPseudomonas cichorii H45株を３０℃で36時間培養し、遠心分離（４℃、１２,０００rpm、２０min）して生菌体を調製した。つぎにWizard Genomic DNA Purification System(プロメガ(株)製)を用いて、H45株のゲノムDNAを調製した。
【０１１６】
６）ＰＣＲによる部分配列の増幅
上記５）で調製したゲノムＤＮＡをテンプレートに、４）で設計したプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）を行った。すなわち以下の反応混合液を調製した。
【０１１７】
【表４】
2006204253.tif 000022
【０１１８】
ＰＣＲは、変性［９４℃で１分（１サイクル目だけ１０分間)］、アニーリング（５５℃で２分間）、伸長反応（７２℃で３分間）からなる一連の処理を３５サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロース電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、プライマーphaZ45-1F-1（配列番号２２）とphaZ45-1R-1（配列番号２３）により約390bの断片が増幅された。
【０１１９】
７）ＰＣＲ増幅断片のサブクローニング
上記６）で得た約390bのＰＣＲ産物をアガロース電気泳動（ゲル濃度１重量％）して精製した。目的物を含むゲルを切り出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてＤＮＡ断片を回収した。次に回収したDNA断片を用いてpGEM-T Easy Vector Systems[プロメガ(株)製]によりTAクローニングを行った。
以下にライゲーション反応液の組成を示す。
【０１２０】
【表５】
2006204253.tif 000023
【０１２１】
上記の混合物を２５℃で1時間インキュベートし、Ｅ．coli JM109コンピテントセルに形質転換した。アンピシリン５０μg/ml、X-gal ５０μg/ml、ＩＰＴＧ ０.１mＭを含むＬＢアガロースプレートでホワイトコロニーを形質転換体として選択した。形質転換体より単離したプラスミドpGEM-phaZ45を各種制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動で消化断片の解析を行ったところ、約400ｂのＰＣＲ断片がpGEM-T Easy VectorのEroRI、SpeIサイトに挿入されていることが判明した。pGEM-phaZ45の制限酵素切断地図を図７に示す。
得られたプラスミドpGEM-phaZ45中の挿入部分（図７、PCR Product）の塩基配列をジデオキシ法により決定したところ、配列番号２０の内部領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ塩基配列が見出され、約390ｂのＰＣＲ増幅断片がポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードするＤＮＡの一部であることが確認できた。
【０１２２】
８）サザンハイブリダイゼーション
上記５）で得たゲノムＤＮＡを各種制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動で分離し、これをナイロン膜に転写した。次いで、上記６）で増幅したＰＣＲ断片をジゴキシゲニンで標識してプローブとして用い、サザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、ＢａｍＨＩにより切断された約４．４kbの断片に陽性シグナルを得た。この約４．４kbのＤＮＡ断片をアガロースから切り出し、ＤＮＡ回収用フィルター付遠心チューブ（孔径０.２２μｍ、宝酒造（株）製）を用いて、１００００rpm、４℃、１０分の遠心の後、エタノール沈澱を行うことで精製した。
【０１２３】
９）コロニーハイブリダイゼーション
上記８）で精製された得られた約４．４kbのＤＮＡ断片を、同じくＢａｍＨＩで消化したpＵＣ１8(宝酒造社製：lacプロモーターを有する大腸菌用発現ベクター)にライゲーション(１６℃、１６時間)し、得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌JM109株を形質転換した。次いで、上記６）で増幅したＰＣＲ断片をジゴキシゲニンで標識してプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーションを行った。ライゲーション、形質転換及びコロニーハイブリダイゼーションは、Maniatisらの方法(Molecular Cloning, a laboratory manual(2nd ed.),pp.1.62-1.104(1989) Sambrook,J.,Fritch,E.and Maniatis,T.(eds)Cold Spring Harbor Laboratory)に従った。その結果、８００個のコロニーから１０個の陽性コロニーを得た。得られた陽性コロニーからプラスミドを抽出し、塩基配列を決定した。その結果、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の全長に相当する塩基配列を含有するプラスミドpUC-pZ45を保有するクローンを１株得た（大腸菌形質転換体(Ｅ．coli JM109/pUC-pZ45)）。このプラスミドpUC-pZ45の制限酵素切断地図を図８に示す。このプラスミドのポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子をコードする部分の塩基配列を決定し、推定のアミノ酸配列を決定した。結果を配列番号２４、２５及び図９及び１０に示す。図９及び１０における下線は、プロテインシーケンサーにより決定したＮ末端および内部アミノ酸配列を表す。
【０１２４】
（実施例７）
[組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子発現ベクターの構築、組換えタンパク質の発現、精製および活性測定]
実施例６で決定されたPseudomonas cichorii H45株のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の塩基配列（配列番号４）に基づいて、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子をＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターpGEX-6P-1（アマシャムバイオサイエンス社製）にリクローニングするため、ＰＣＲプライマーphaZ45-for(配列番号２６)およびphaZ45-rev（配列番号２７）を設計・合成した。
実施例６で調製したプラスミドpUC-pZ45をテンプレートに、設計したプライマーphaZ45-for(配列番号２６)およびphaZ45-rev（配列番号２７）を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）を行った。以下の反応混合液を調製した。
【０１２５】
【表６】
2006204253.tif 000024
【０１２６】
ＰＣＲは、変性［９４℃で１分（１サイクル目だけ１０分間)］、アニーリング（５５℃で２分間）、伸長反応（７２℃で３分間）からなる一連の処理を３５サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロース電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、プライマーphaZ45-for（配列番号２６）とphaZ45-rev（配列番号２７）により約８６０bの断片が増幅された。上記PCRに用いたプライマー；phaZ45-for（配列番号２６）およびphaZ45-rev（配列番号２７）中には予めそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの認識部位が含まれている。そこで前記約８６０bのＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。消化断片をＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターpGEX-6P-1（アマシャムバイオサイエンス社製）の対応する制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの認識部位に挿入した。得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリンを添加したＬＢ寒天プレート上で生育可能なコロニーを選択した。プライマーpGEX-５'（配列番号１８）およびphaZ45-rev（配列番号２７）を用いてPCRを行い、約９５０ｂの増幅断片が得られることによって、上記８６０ｂのPCR増幅産物がグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子と同じ方向で挿入されたクローンであることを確認した。
【０１２７】
このクローンから抽出したプラスミド(pGEX-phaZ45)を用いて大腸菌（ＢＬ２１）を形質転換し、発現用菌株を得た。得られた菌株をLB-Amp培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その1mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、37℃、170rpmで3時間振とう培養した。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続けた。IPTG 誘導した大腸菌を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ（Glutathion Sepharose 4B beads: アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製した。使用したグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄(8000×g、１分、４℃) した後、４重量％ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、1/2量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオンセファロース 40μLを、無細胞抽出液１mL に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質GST-PhaZ45をグルタチオンセファロースに吸着させた。吸着後、遠心 (8000×g、 1分、4℃)してグルタチオンセファロースを回収し、400μLのＰＢＳで３回洗浄した。その後、10 mMグルタチオン40μLを添加し、4℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心 (8000×g、2分、4℃)して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、GST融合タンパク質を精製した。SDS-PAGEにより、シングルバンドを示すことを確認した。精製されたGST融合タンパク質の分子量は約５８ｋＤａであった。
【０１２８】
次に、GST融合タンパク質５００μｇをPreScissionプロテアーゼ（アマシャムバイオサイエンス、５Ｕ）で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴを除去した。フロースルー分画をさらに、PBSで平衡化したセファデックスG200カラムにかけ、発現タンパク質PhaZ45の最終精製物を得た。発現精製タンパク質PhaZ45のタンパク質濃度は、マイクロBCAタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。精製タンパク質のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性の測定は前述の方法にて行った。その結果、精製された組換え酵素の比活性は野生型酵素と同等であることがわかった。また、SDS-PAGEにより精製タンパク質は分子量約31.5ｋＤａであることがわかった。さらに等電点電気泳動の結果、精製タンパク質の等電点は9.5であった。
【０１２９】
（実施例８）
[unusual PHAの分解]
PHAとして、
（１）３-ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタン酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約３２％、約６８％含むコポリマー、
（２）３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約９２％、約８％含むコポリマー、
（３）３−ヒドロキシ−４−フェノキシ−ｎ−酪酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８６％、約１４％含むコポリマー、
（４）３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロベンゾイル）吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８６％、約１４％含むコポリマー、
（５）３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（６）３-ヒドロキシ−４−(フェニルスルファニル)酪酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（７）３−ヒドロキシ−５−フェニルメチルオキシ吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（８）３−ヒドロキシ−５−（２−チエニル）吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約９７％、約３％含むコポリマー、
をそれぞれ個々に用い、実施例７で調製した組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素による分解を次の様にして確認した。各々のPHAのクロロホルム溶液をＱＣＭ上にキャスト法にてフィルム化した。これを５０mM Ｔris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ７.５）２ｍｌ、３５℃中に静置し、ＱＣＭ信号が安定するまでプレインキュベートした。ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素150μgの添加で反応を開始し、ＱＣＭの共振周波数を経時的に測定した。経時的な共振周波数の増加が観察され、QCM上のポリヒドロキシアルカノエートの分解に伴う質量減少が確認された。
【０１３０】
（実施例９）
[unusual PHAの分解]
PHAとして、
（１）３−ヒドロキシ−５−(２−チエニルスルファニル)吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８２％、約１８％含むコポリマー、
（２）３−ヒドロキシ−５−(２−チエノイル)吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８６％、約１４％含むコポリマー、
（３）３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（４）３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシルオキシ酪酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（５）３-ヒドロキシ−10−ウンデセン酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約２５％、約７５％含むコポリマー、
（６）３−ヒドロキシドデカ−５−エン酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約９０％、約１０％含むコポリマー、
（７）３-ヒドロキシ-５-(メチルチオ)吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約９０％、約１０％含むコポリマー、
（８）３-ヒドロキシ-７-カルボキシヘプタン酸ユニットと３−ヒドロキシノナン酸ユニットをそれぞれモル比で約１３％、約８７％含むコポリマー、
をそれぞれ個々に用い、実施例７で調製した組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素による分解を次の様にして確認した。各々のPHAのクロロホルム溶液をＱＣＭ上にキャスト法にてフィルム化した。これを５０mM Ｔris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ７.５）２ｍｌ、３５℃中に静置し、ＱＣＭ信号が安定するまでプレインキュベートした。ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素150μgの添加で反応を開始し、ＱＣＭの共振周波数を経時的に測定した。経時的な共振周波数の増加が観察され、QCM上のポリヒドロキシアルカノエートの分解に伴う質量減少が確認された。
【０１３１】
（実施例１０）
[変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の作製]
配列番号３のアミノ酸配列において、１４番目のグリシンをアラニンに、７５番目のチロシンをヒスチジンに、また２０１番目のスレオニンをバリンにそれぞれ置換した変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を作製した。それぞれのアミノ酸の置換は、遺伝子ＤＮＡのそれぞれ対応するコドンを、１４番目のグリシンであればＧＧＣをＧＣＣに、７５番目のチロシンであればＴＡＴをＣＡＴに、２０１番目のスレオニンであればＡＣＣをＧＴＣにそれぞれ塩基を置換することによって行った。それぞれの変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素は、実施例２で作製した組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子発現ベクター(pGEX-phaZ45)をテンプレートプラスミドとして、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて行った。ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の野生型（PhaZ45[wt]）に対して、１４番目のグリシンをアラニンに置換したもの（PhaZ45[G14A]）、７５番目のチロシンをヒスチジンに置換したもの（PhaZ45[Y75H]）、２０１番目のスレオニンをバリンに置換したもの（PhaZ45[T201V]）、
さらにこれらの組合せとして、PhaZ45[G14A, Y75H]、PhaZ45[G14A, T201V]、PhaZ45[Y75H, T201V]、PhaZ45[G14A, Y75H, T201V] の計７種類の変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を発現する遺伝子発現ベクターを構築し、実施例７に述べた方法によって、各種ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を精製した。精製した各種ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の酵素活性を実施例６に述べた方法によって測定した。その結果、精製された変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の比活性は野生型酵素と同等であることがわかった。また、各変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードするＤＮＡは、（１）高イオン濃度下[6xSSC(900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム)  に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより配列番号４で示される塩基配列を含むＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下[0.1xSSC(15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム)]  に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも該ハイブリッドが維持され、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡであることが確認された。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの検出はAlkPhos Direct Labelling and Detection System（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて行った。
【０１３２】
（実施例１１）
[シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Pseudomonas jessenii P161）由来のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子のクローニング]
１）培養及び粗酵素液の調製
0.１％(v/v)ノナン酸、0.5％(w/v)ポリペプトンおよび0.5％(w/v)グルコースを加えたＭ９培地を用いて、Pseudomonas jessenii P161株を３０℃で３６時間前培養を行った。本培養には０．１％(v/v)ノナン酸 、0.5％(w/v)ポリペプトンおよび0.5％(w/v)グルコースを加えたＭ９培地を用い、前培養液を添加して３０℃で２４時間振とう培養した。
Ｍ９培地の組成は以下の通りである。
【０１３３】
Ｎa2ＨＰＯ4:    6.2g
ＫＨ2ＰＯ4 :    3.0g
ＮaＣl    ：    0.5g
ＮＨ4Ｃl  ：    1.0g
微量成分溶液  ：    0.3％(v/v)
(培地１リットル中、pＨ 7.0)
上記の微量成分溶液の組成は以下の通りである。
【０１３４】
ニトリロ三酢酸:     1.5g
ＭgＳＯ4      :     3.0g
ＭnＳＯ4      :     0.5g
ＮaＣl        :     1.0g
ＦeＳＯ4      :     0.1g
ＣaＣl2       :     0.1g
ＣoＣl2       :     0.1g
ＺnＳＯ4      :     0.1g
ＣuＳＯ4      :     0.1g
ＡlＫ(ＳＯ4)2  :    0.1g
Ｈ3ＢＯ3       :    0.1g
Ｎa2ＭoＯ4     :    0.1g
ＮｉＣｌ2        :    0.1g
(１リットル中)
その後、遠心分離(４℃，９５００rpm，４０分)して菌体を回収し、１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ7.5)で菌体を懸濁し再度遠心分離して回収することによって菌体を洗浄した。ついで１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ7.5)で菌体を懸濁し、フレンチプレス処理によって菌体を破砕した。破砕液を遠心分離して、未破砕の細胞を沈殿として除き、上清を粗酵素液として調整した。ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性は以下の力価の測定法に従って測定した。ポリヒドロキシノナン酸をソルベントキャスト法にてＱＣＭ（水晶発振子マイクロバランス）上にフィルム化し、これを５０mM Ｔris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ７.５）２ｍｌ、３５℃中に静置し、ＱＣＭ信号が安定するまでプレインキュベートした。ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素150μgの添加で反応を開始し、ＱＣＭの共振周波数を経時的に測定した。周波数変化量からポリヒドロキシアルカノエートの質量減少量を求め、これを酵素活性とした。なお、ＩＵは３５℃で１分間に１μｇのポリヒドロキシアルカノエートを分解する酵素量と定義した。
【０１３５】
２）酵素の精製
調製した粗酵素液に、体積比で１／２０量の５０mM Tris-HCl（pH7.5）緩衝液で十分に平衡化したDEAE-cellulose樹脂を加え、１５分間撹拌、１０分間静置を２回繰り返し、バッチ法による吸着をおこなった。２０分間静置してデカンテーションで上清を取り除き、５０mM Tris-HCl（pH7.5）緩衝液で洗浄してからカラムにつめた。溶出はＮaＣl（０〜１Ｍ）のリニアグラジエントで行った。集めた活性画分は、１０ｍＭのＮaＣｌを含む５０mM Tris-HCl緩衝液(pＨ7.5)で平衝化したPhenyl-Sepharose CL-4Bにアプライした。同緩衝液で洗浄後、塩濃度とエチレングリコールの直線濃度勾配により溶出させた。活性画分はエチレングリコールを除去するため、回収後、５０mMTris-HCl緩衝液(pＨ7.5)で一晩透析した。最後にDEAE−Toyopearlカラムクロマトグラフィーをおこなった。予め５０mM Tris-HCl緩衝液(pＨ7.5)で平衝化したカラムに、透析した活性画分をアプライした。同緩衝液で洗浄後、ＮaＣlによる塩濃度勾配により目的タンパクを溶出させた。これらのステップでポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を粗酵素液から回収率１５％で、２２倍に精製した。得られた酵素標品を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動)を行い分子量の決定をした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは７.５重量％ゲルを用いてデービスの方法に従った。２０mAの一定電流で２時間泳動後、染色はクマシーブリリアントブルーで行った。分子量既知の数種のタンパク（ミオシン、β−ガラクトシダーゼ、ホスホリラーゼＢ、牛血清アルブミン、オボアルブミン）を同様に泳動し、分子量マーカーを作成した。この結果より、精製酵素は分子量約31.5ｋＤａのタンパク質であることがわかった。また等電点電気泳動の結果、本酵素の等電点は９．５であった。
【０１３６】
３）部分アミノ酸配列の決定
上記の方法で精製した酵素標品を用いて、該酵素の部分アミノ酸配列を決定した。Ｎ末端アミノ酸の配列決定には、微量透析やゲル濾過により精製酵素標品を完全に脱塩したものをサンプルとし、プロテインシークエンサーに用いた。また、内部アミノ酸配列を解析する際には、精製タンパクを還元カルボキシメチル化して変性した後、Staphylococcal peptidase Iを作用させて断片化を行った。それぞれのペプチド断片はＣ１８を用いた逆相カラムクロマトグラフィーにより分取し、プロテインシークエンサーで解析した。その結果、Ｎ末端からの２7残基（配列番号２８）と２つの内部領域（配列番号２９、３０）のアミノ酸配列が決定された。
【０１３７】
４）オリゴヌクレオチドプライマーの設計
上記３）で得たアミノ酸配列から推定される塩基配列を基に、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）に用いるためのプライマーを設計した（図１１）。Ｎ末端領域及び配列番号２８の内部領域の配列に基づいて、それぞれプライマーphaZ161-1F-1（配列番号３１）及びphaZ161-1R-1（配列番号３２）を合成した。なお、プライマーphaZ161-1R-1は、配列番号３０のアミノ酸配列から推定される塩基配列のＤＮＡに対する相補鎖として合成された。
【０１３８】
５）ゲノムＤＮＡの調製
上記１）に記載したように、0.5％(w/v)ポリペプトンおよび0.5％(w/v)グルコースを加えたＭ９培地でPseudomonas jessenii P161株を３０℃で36時間培養し、遠心分離（４℃、１２,０００rpm、２０min）して生菌体を調製した。つぎにWizard Genomic DNA Purification System(プロメガ(株)製)を用いて、Ｐ１６１株のゲノムDNAを調製した。
【０１３９】
６）ＰＣＲによる部分配列の増幅
上記５）で調製したゲノムＤＮＡをテンプレートに、４）で設計したプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）を行った。すなわち以下の反応混合液を調製した。
【０１４０】
【表７】
2006204253.tif 000025
【０１４１】
ＰＣＲは、変性［９４℃で１分（１サイクル目だけ１０分間)］、アニーリング（５５℃で２分間）、伸長反応（７２℃で３分間）からなる一連の処理を３５サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロース電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、プライマーphaZ161-1F-1（配列番号３１）とphaZ161-1R-1（配列番号３２）により約390bの断片が増幅された。
【０１４２】
７）ＰＣＲ増幅断片のサブクローニング
上記６）で得た約390bのＰＣＲ産物をアガロース電気泳動（ゲル濃度１重量％）して精製した。目的物を含むゲルを切り出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてＤＮＡ断片を回収した。次に回収したDNA断片を用いてpGEM-T Easy Vector Systems[プロメガ(株)製]によりTAクローニングを行った。以下にライゲーション反応液の組成を示す。
【０１４３】
【表８】
2006204253.tif 000026
【０１４４】
上記の混合物を２５℃で1時間インキュベートし、Ｅ．coli JM109コンピテントセルに形質転換した。アンピシリン５０μg/ml、X-gal ５０μg/ml、ＩＰＴＧ ０.１mＭを含むＬＢアガロースプレートでホワイトコロニーを形質転換体として選択した。
形質転換体より単離したプラスミドpGEM-phaZ161を各種制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動で消化断片の解析を行ったところ、約400ｂのＰＣＲ断片がpGEM-T Easy VectorのEroRI、SpeIサイトに挿入されていることが判明した。pGEM-phaZ161の制限酵素切断地図を図１２に示す。得られたプラスミドpGEM-phaZ161中の挿入部分（図１２、PCR Product）の塩基配列をジデオキシ法により決定したところ、配列番号２９の内部領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ塩基配列が見出され、約390ｂのＰＣＲ増幅断片がポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードするＤＮＡの一部であることが確認できた。
【０１４５】
８）サザンハイブリダイゼーション
上記５）で得たゲノムＤＮＡを各種制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動で分離し、これをナイロン膜に転写した。次いで、上記６）で増幅したＰＣＲ断片をジゴキシゲニンで標識してプローブとして用い、サザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、ＫｐｎＩにより切断された約３．８kbの断片に陽性シグナルを得た。この約３．８kbのＤＮＡ断片をアガロースから切り出し、ＤＮＡ回収用フィルター付遠心チューブ（孔径０.２２μｍ、宝酒造（株）製）を用いて、１００００rpm、４℃、１０分の遠心の後、エタノール沈澱を行うことで精製した。
【０１４６】
９）コロニーハイブリダイゼーション
上記８）で精製された得られた約３．８kbのＤＮＡ断片を、同じくＫｐｎＩで消化したpＵＣ１8(宝酒造社製：lacプロモーターを有する大腸菌用発現ベクター)にライゲーション(１６℃、１６時間)し、得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌JM109株を形質転換した。次いで、上記６）で増幅したＰＣＲ断片をジゴキシゲニンで標識してプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーションを行った。ライゲーション、形質転換及びコロニーハイブリダイゼーションは、Maniatisらの方法(Molecular Cloning, a laboratory manual(2nd ed.),pp.1.62-1.104(1989) Sambrook,J.,Fritch,E.and Maniatis,T.(eds)Cold Spring Harbor Laboratory)に従った。その結果、８００個のコロニーから１０個の陽性コロニーを得た。得られた陽性コロニーからプラスミドを抽出し、塩基配列を決定した。その結果、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の全長に相当する塩基配列を含有するプラスミドpUC-pZ161を保有するクローンを１株得た（大腸菌形質転換体(Ｅ．coli JM109/pUC-pZ161)）。このプラスミドpUC-pZ161の制限酵素切断地図を図１３に示す。このプラスミドのポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子をコードする部分の塩基配列を決定し、推定のアミノ酸配列を決定した。結果を配列番号３３、３４及び図１４及び１５に示す。図１４及び１５における下線は、プロテインシーケンサーにより決定したＮ末端および内部アミノ酸配列を表す。
【０１４７】
（実施例１２）
[組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子発現ベクターの構築、組換えタンパク質の発現、精製および活性測定]
実施例１１で決定されたPseudomonas jessenii P161株のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の塩基配列（配列番号６）に基づいて、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子をＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターpGEX-6P-1（アマシャムバイオサイエンス社製）にリクローニングするため、ＰＣＲプライマーphaZ161-for(配列番号３５)およびphaZ161-rev（配列番号３６）を設計・合成した。実施例１１で調製したプラスミドpUC-pZ161をテンプレートに、設計したプライマーphaZ161-for(配列番号３５)およびphaZ161-rev（配列番号３６）を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）を行った。以下の反応混合液を調製した。
【０１４８】
【表９】
2006204253.tif 000027
【０１４９】
ＰＣＲは、変性［９４℃で１分（１サイクル目だけ１０分間)］、アニーリング（５５℃で２分間）、伸長反応（７２℃で３分間）からなる一連の処理を３５サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロース電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、プライマーphaZ161-for（配列番号３５）とphaZ161-rev（配列番号３６）により約８６０bの断片が増幅された。上記PCRに用いたプライマー；phaZ161-for（配列番号３５）およびphaZ161-rev（配列番号３６）中には予めそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの認識部位が含まれている。そこで前記約８６０bのＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。消化断片をＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターpGEX-6P-1（アマシャムバイオサイエンス社製）の対応する制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの認識部位に挿入した。得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリンを添加したＬＢ寒天プレート上で生育可能なコロニーを選択した。プライマーpGEX-５'（配列番号１８）およびphaZ161-rev（配列番号３６）を用いてPCRを行い、約９５０ｂの増幅断片が得られることによって、上記８６０ｂのPCR増幅産物がグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子と同じ方向で挿入されたクローンであることを確認した。このクローンから抽出したプラスミド(pGEX-phaZ161)を用いて大腸菌（ＢＬ２１）を形質転換し、発現用菌株を得た。得られた菌株をLB-Amp培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その1mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、37℃、170rpmで3時間振とう培養した。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続けた。IPTG 誘導した大腸菌を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ（Glutathion Sepharose 4B beads: アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製した。
【０１５０】
使用したグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄(8000×g、１分、４℃) した後、４重量％ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、1/2量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオンセファロース 40μLを、無細胞抽出液１mL に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質GST-PhaZ161をグルタチオンセファロースに吸着させた。吸着後、遠心 (8000×g、 1分、4℃)してグルタチオンセファロースを回収し、400μLのＰＢＳで３回洗浄した。その後、10 mMグルタチオン40μLを添加し、4℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心 (8000×g、2分、4℃)して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、GST融合タンパク質を精製した。SDS-PAGEにより、シングルバンドを示すことを確認した。精製されたGST融合タンパク質の分子量は約５８．５ｋＤａであった。
【０１５１】
次に、GST融合タンパク質５００μｇをPreScissionプロテアーゼ（アマシャムバイオサイエンス、５Ｕ）で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴを除去した。フロースルー分画をさらに、PBSで平衡化したセファデックスG200カラムにかけ、発現タンパク質PhaZ161の最終精製物を得た。発現精製タンパク質PhaZ161のタンパク質濃度は、マイクロBCAタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。精製タンパク質のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性の測定は前述の方法にて行った。その結果、精製された組換え酵素の比活性は野生型酵素と同等であることがわかった。また、SDS-PAGEにより精製タンパク質は分子量約31.5ｋＤａであることがわかった。さらに等電点電気泳動の結果、精製タンパク質の等電点は9.5であった。
【０１５２】
（実施例１３）
[unusual PHAの分解]
PHAとして、
（１）３-ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタン酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約３２％、約６８％含むコポリマー、
（２）３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約９２％、約８％含むコポリマー、
（３）３−ヒドロキシ−４−フェノキシ−ｎ−酪酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８６％、約１４％含むコポリマー、
（４）３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロベンゾイル）吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８６％、約１４％含むコポリマー、
（５）３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（６）３-ヒドロキシ−４−(フェニルスルファニル)酪酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（７）３−ヒドロキシ−５−フェニルメチルオキシ吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（８）３−ヒドロキシ−５−（２−チエニル）吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約９７％、約３％含むコポリマー、
をそれぞれ個々に用い、実施例１２で調製した組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素による分解を次の様にして確認した。各々のPHAのクロロホルム溶液をＱＣＭ上にキャスト法にてフィルム化した。これを５０mM Ｔris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ７.５）２ｍｌ、３５℃中に静置し、ＱＣＭ信号が安定するまでプレインキュベートした。ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素150μgの添加で反応を開始し、ＱＣＭの共振周波数を経時的に測定した。経時的な共振周波数の増加が観察され、QCM上のポリヒドロキシアルカノエートの分解に伴う質量減少が確認された。
【０１５３】
（実施例１４）
[unusual PHAの分解]
PHAとして、
（１）３−ヒドロキシ−５−(２−チエニルスルファニル)吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８２％、約１８％含むコポリマー、
（２）３−ヒドロキシ−５−(２−チエノイル)吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８６％、約１４％含むコポリマー、
（３）３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（４）３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシルオキシ酪酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（５）３-ヒドロキシ−10−ウンデセン酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約２５％、約７５％含むコポリマー、
（６）３−ヒドロキシドデカ−５−エン酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約９０％、約１０％含むコポリマー、
（７）３-ヒドロキシ-５-(メチルチオ)吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約９０％、約１０％含むコポリマー、
（８）３-ヒドロキシ-７-カルボキシヘプタン酸ユニットと３−ヒドロキシノナン酸ユニットをそれぞれモル比で約１３％、約８７％含むコポリマー、
をそれぞれ個々に用い、実施例１２で調製した組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素による分解を次の様にして確認した。各々のPHAのクロロホルム溶液をＱＣＭ上にキャスト法にてフィルム化した。これを５０mM Ｔris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ７.５）２ｍｌ、３５℃中に静置し、ＱＣＭ信号が安定するまでプレインキュベートした。ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素150μgの添加で反応を開始し、ＱＣＭの共振周波数を経時的に測定した。経時的な共振周波数の増加が観察され、QCM上のポリヒドロキシアルカノエートの分解に伴う質量減少が確認された。
【０１５４】
（実施例１５）
[変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の作製]
配列番号５のアミノ酸配列において、１４番目のグリシンをアラニンに、７５番目のチロシンをヒスチジンに、また２０１番目のスレオニンをバリンにそれぞれ置換した変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を作製した。それぞれのアミノ酸の置換は、遺伝子ＤＮＡのそれぞれ対応するコドンを、１４番目のグリシンであればＧＧＣをＧＣＣに、７５番目のチロシンであればＴＡＴをＣＡＴに、２０１番目のスレオニンであればＡＣＣをＧＴＣにそれぞれ塩基を置換することによって行った。それぞれの変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素は、実施例２で作製した組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子発現ベクター(pGEX-phaZ161)をテンプレートプラスミドとして、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて行った。ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の野生型（PhaZ161[wt]）に対して、１４番目のグリシンをアラニンに置換したもの（PhaZ161[G14A]）、７５番目のチロシンをヒスチジンに置換したもの（PhaZ161[Y75H]）、２０１番目のスレオニンをバリンに置換したもの（PhaZ161[T201V]）、さらにこれらの組合せとして、PhaZ161[G14A, Y75H]、PhaZ161[G14A, T201V]、PhaZ161[Y75H, T201V]、PhaZ161[G14A, Y75H, T201V] の計７種類の変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を発現する遺伝子発現ベクターを構築し、実施例１２に述べた方法によって、各種ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を精製した。精製した各種ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の酵素活性を実施例１１に述べた方法によって測定した。
その結果、精製された変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の比活性は野生型酵素と同等であることがわかった。また、各変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードするＤＮＡは、（１）高イオン濃度下[6xSSC(900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム)  に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより配列番号６で示される塩基配列を含むＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下[0.1xSSC(15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム)]  に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも該ハイブリッドが維持され、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡであることが確認された。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの検出はAlkPhos Direct Labelling and Detection System（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて行った。
【０１５５】
（実施例１６）
[シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株（Pseudomonas putida P91）由来のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子のクローニング]
１）培養及び粗酵素液の調製
0.１％(v/v)ノナン酸、0.5％(w/v)ポリペプトンおよび0.5％(w/v)グルコースを加えたＭ９培地を用いて、Pseudomonas putida P91株を３０℃で３６時間前培養を行った。本培養には０．１％(v/v)ノナン酸 、0.5％(w/v)ポリペプトンおよび0.5％(w/v)グルコースを加えたＭ９培地を用い、前培養液を添加して３０℃で２４時間振とう培養した。
Ｍ９培地の組成は以下の通りである。
【０１５６】
Ｎa2ＨＰＯ4:    6.2g
ＫＨ2ＰＯ4 :    3.0g
ＮaＣl    ：    0.5g
ＮＨ4Ｃl  ：    1.0g
微量成分溶液  ：    0.3％(v/v)
(培地１リットル中、pＨ 7.0)
上記の微量成分溶液の組成は以下の通りである。
【０１５７】
ニトリロ三酢酸:     1.5g
ＭgＳＯ4      :     3.0g
ＭnＳＯ4      :     0.5g
ＮaＣl        :     1.0g
ＦeＳＯ4      :     0.1g
ＣaＣl2       :     0.1g
ＣoＣl2       :     0.1g
ＺnＳＯ4      :     0.1g
ＣuＳＯ4      :     0.1g
ＡlＫ(ＳＯ4)2  :    0.1g
Ｈ3ＢＯ3       :    0.1g
Ｎa2ＭoＯ4     :    0.1g
ＮｉＣｌ2        :    0.1g
(１リットル中)
その後、遠心分離(４℃，９５００rpm，４０分)して菌体を回収し、１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ7.5)で菌体を懸濁し再度遠心分離して回収することによって菌体を洗浄した。ついで１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ7.5)で菌体を懸濁し、フレンチプレス処理によって菌体を破砕した。破砕液を遠心分離して、未破砕の細胞を沈殿として除き、上清を粗酵素液として調整した。
【０１５８】
ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性は以下の力価の測定法に従って測定した。
ポリヒドロキシノナン酸をソルベントキャスト法にてＱＣＭ（水晶発振子マイクロバランス）上にフィルム化し、これを５０mM Ｔris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ７.５）２ｍｌ、３５℃中に静置し、ＱＣＭ信号が安定するまでプレインキュベートした。ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素150μgの添加で反応を開始し、ＱＣＭの共振周波数を経時的に測定した。周波数変化量からポリヒドロキシアルカノエートの質量減少量を求め、これを酵素活性とした。なお、ＩＵは３５℃で１分間に１μｇのポリヒドロキシアルカノエートを分解する酵素量と定義した。
【０１５９】
２）酵素の精製
調製した粗酵素液に、体積比で１／２０量の５０mM Tris-HCl（pH7.5）緩衝液で十分に平衡化したDEAE-cellulose樹脂を加え、１５分間撹拌、１０分間静置を２回繰り返し、バッチ法による吸着をおこなった。２０分間静置してデカンテーションで上清を取り除き、５０mM Tris-HCl（pH7.5）緩衝液で洗浄してからカラムにつめた。溶出はＮaＣl（０〜１Ｍ）のリニアグラジエントで行った。
集めた活性画分は、１０ｍＭのＮaＣｌを含む５０mM Tris-HCl緩衝液(pＨ7.5)で平衝化したPhenyl-Sepharose CL-4Bにアプライした。同緩衝液で洗浄後、塩濃度とエチレングリコールの直線濃度勾配により溶出させた。活性画分はエチレングリコールを除去するため、回収後、５０mMTris-HCl緩衝液(pＨ7.5)で一晩透析した。最後にDEAE−Toyopearlカラムクロマトグラフィーをおこなった。予め５０mM Tris-HCl緩衝液(pＨ7.5)で平衝化したカラムに、透析した活性画分をアプライした。同緩衝液で洗浄後、ＮaＣlによる塩濃度勾配により目的タンパクを溶出させた。これらのステップでポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を粗酵素液から回収率１５％で、２２倍に精製した。得られた酵素標品を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動)を行い分子量の決定をした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは７.５重量％ゲルを用いてデービスの方法に従った。２０mAの一定電流で２時間泳動後、染色はクマシーブリリアントブルーで行った。分子量既知の数種のタンパク（ミオシン、β−ガラクトシダーゼ、ホスホリラーゼＢ、牛血清アルブミン、オボアルブミン）を同様に泳動し、分子量マーカーを作成した。この結果より、精製酵素は分子量約31.5ｋＤａのタンパク質であることがわかった。また等電点電気泳動の結果、本酵素の等電点は９．５であった。
【０１６０】
３）部分アミノ酸配列の決定
上記の方法で精製した酵素標品を用いて、該酵素の部分アミノ酸配列を決定した。Ｎ末端アミノ酸の配列決定には、微量透析やゲル濾過により精製酵素標品を完全に脱塩したものをサンプルとし、プロテインシークエンサーに用いた。また、内部アミノ酸配列を解析する際には、精製タンパクを還元カルボキシメチル化して変性した後、Staphylococcal peptidase Iを作用させて断片化を行った。それぞれのペプチド断片はＣ１８を用いた逆相カラムクロマトグラフィーにより分取し、プロテインシークエンサーで解析した。その結果、Ｎ末端からの２7残基（配列番号３７）と２つの内部領域（配列番号３８、３９）のアミノ酸配列が決定された。
【０１６１】
４）オリゴヌクレオチドプライマーの設計
上記３）で得たアミノ酸配列から推定される塩基配列を基に、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）に用いるためのプライマーを設計した（図１６）。Ｎ末端領域及び配列番号３９の内部領域の配列に基づいて、それぞれプライマーphaZ91-1F-1（配列番号４０）及びphaZ91-1R-1（配列番号４１）を合成した。なお、プライマーphaZ91-1R-1は、配列番号３９のアミノ酸配列から推定される塩基配列のＤＮＡに対する相補鎖として合成された。
【０１６２】
５）ゲノムＤＮＡの調製
上記１）に記載したように、0.5％（w/v)ポリペプトンおよび0.5％(w/v)グルコースを加えたＭ９培地でPseudomonas putida P91株を３０℃で36時間培養し、遠心分離（４℃、１２,０００rpm、２０min）して生菌体を調製した。つぎにWizard Genomic DNA Purification System(プロメガ(株)製)を用いて、P91株のゲノムDNAを調製した。
【０１６３】
６）ＰＣＲによる部分配列の増幅
上記５）で調製したゲノムＤＮＡをテンプレートに、４）で設計したプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）を行った。すなわち以下の反応混合液を調製した。
【０１６４】
【表１０】
2006204253.tif 000028
【０１６５】
ＰＣＲは、変性［９４℃で１分（１サイクル目だけ１０分間)］、アニーリング（５５℃で２分間）、伸長反応（７２℃で３分間）からなる一連の処理を３５サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロース電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、プライマーphaZ91-1F-1（配列番号４０）とphaZ91-1R-1（配列番号４１）により約520bの断片が増幅された。
【０１６６】
７）ＰＣＲ増幅断片のサブクローニング
上記６）で得た約520bのＰＣＲ産物をアガロース電気泳動（ゲル濃度１重量％）して精製した。目的物を含むゲルを切り出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてＤＮＡ断片を回収した。次に回収したDNA断片を用いてpGEM-T Easy Vector Systems[プロメガ(株)製]によりTAクローニングを行った。
以下にライゲーション反応液の組成を示す。
【０１６７】
【表１１】
2006204253.tif 000029
【０１６８】
上記の混合物を２５℃で1時間インキュベートし、Ｅ．coli JM109コンピテントセルに形質転換した。アンピシリン５０μg/ml、X-gal ５０μg/ml、ＩＰＴＧ ０.１mＭを含むＬＢアガロースプレートでホワイトコロニーを形質転換体として選択した。形質転換体より単離したプラスミドpGEM-phaZ91を各種制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動で消化断片の解析を行ったところ、約540ｂのＰＣＲ断片がpGEM-T Easy VectorのEroRI、SpeIサイトに挿入されていることが判明した。pGEM-phaZ91の制限酵素切断地図を図１７に示す。得られたプラスミドpGEM-phaZ91中の挿入部分（図１７、PCR Product）の塩基配列をジデオキシ法により決定したところ、配列番号３８の内部領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ塩基配列が見出され、約520ｂのＰＣＲ増幅断片がポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードするＤＮＡの一部であることが確認できた。
【０１６９】
８）サザンハイブリダイゼーション
上記５）で得たゲノムＤＮＡを各種制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動で分離し、これをナイロン膜に転写した。次いで、上記６）で増幅したＰＣＲ断片をジゴキシゲニンで標識してプローブとして用い、サザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、ＫｐｎＩにより切断された約２．１kbの断片に陽性シグナルを得た。この約２．１kbのＤＮＡ断片をアガロースから切り出し、ＤＮＡ回収用フィルター付遠心チューブ（孔径０.２２μｍ、宝酒造（株）製）を用いて、１００００rpm、４℃、１０分の遠心の後、エタノール沈澱を行うことで精製した。
【０１７０】
９）コロニーハイブリダイゼーション
上記８）で精製された得られた約２．１kbのＤＮＡ断片を、同じくＫｐｎＩで消化したpＵＣ１8(宝酒造社製：lacプロモーターを有する大腸菌用発現ベクター)にライゲーション(１６℃、１６時間)し、得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌JM109株を形質転換した。次いで、上記６）で増幅したＰＣＲ断片をジゴキシゲニンで標識してプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーションを行った。ライゲーション、形質転換及びコロニーハイブリダイゼーションは、Maniatisらの方法(Molecular Cloning, a laboratory manual(2nd ed.),pp.1.62-1.104(1989) Sambrook,J.,Fritch,E.and Maniatis,T.(eds)Cold Spring Harbor Laboratory)に従った。その結果、８００個のコロニーから１０個の陽性コロニーを得た。得られた陽性コロニーからプラスミドを抽出し、塩基配列を決定した。その結果、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の全長に相当する塩基配列を含有するプラスミドpUC-pZ91を保有するクローンを１株得た（大腸菌形質転換体(Ｅ．coli JM109/pUC-pZ91)）。このプラスミドpUC-pZ91の制限酵素切断地図を図１８に示す。このプラスミドのポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子をコードする部分の塩基配列を決定し、推定のアミノ酸配列を決定した。結果を配列番号４２、４５及び図１９及び２０に示す。図１９における下線は、プロテインシーケンサーにより決定したＮ末端および内部アミノ酸配列を表す。
【０１７１】
（実施例１７）
[組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子発現ベクターの構築、組換えタンパク質の発現、精製および活性測定]
実施例１６で決定されたPseudomonas putida P91株のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の塩基配列（配列番号８）に基づいて、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子をＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターpGEX-6P-1（アマシャムバイオサイエンス社製）にリクローニングするため、ＰＣＲプライマーphaZ91-for(配列番号４３)およびphaZ91-rev（配列番号４４）を設計・合成した。実施例１６で調製したプラスミドpUC-pZ91をテンプレートに、設計したプライマーphaZ91-for(配列番号４３)およびphaZ91-rev（配列番号４４）を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）を行った。以下の反応混合液を調製した。
【０１７２】
【表１２】
2006204253.tif 000030
【０１７３】
ＰＣＲは、変性［９４℃で１分（１サイクル目だけ１０分間)］、アニーリング（５５℃で２分間）、伸長反応（７２℃で３分間）からなる一連の処理を３５サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロース電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、プライマーphaZ91-for（配列番号４３）とphaZ91-rev（配列番号４４）により約８６０bの断片が増幅された。上記PCRに用いたプライマー；phaZ91-for（配列番号４３）およびphaZ91-rev（配列番号４４）中には予めそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩの認識部位が含まれている。そこで前記約８６０bのＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化した。消化断片をＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターpGEX-6P-1（アマシャムバイオサイエンス社製）の対応する制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩの認識部位に挿入した。得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリンを添加したＬＢ寒天プレート上で生育可能なコロニーを選択した。
プライマーpGEX-５'（配列番号１８）およびphaZ91-rev（配列番号４４）を用いてPCRを行い、約９５０ｂの増幅断片が得られることによって、上記８６０ｂのPCR増幅産物がグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子と同じ方向で挿入されたクローンであることを確認した。このクローンから抽出したプラスミド(pGEX-phaZ91)を用いて大腸菌（ＢＬ２１）を形質転換し、発現用菌株を得た。得られた菌株をLB-Amp培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その1mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、37℃、170rpmで3時間振とう培養した。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続けた。IPTG 誘導した大腸菌を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ（Glutathion Sepharose 4B beads: アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製した。使用したグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄(8000×g、１分、４℃) した後、４重量％ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、1/2量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオンセファロース 40μLを、無細胞抽出液１mL に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質GST-PhaZ91をグルタチオンセファロースに吸着させた。吸着後、遠心 (8000×g、 1分、4℃)してグルタチオンセファロースを回収し、400μLのＰＢＳで３回洗浄した。その後、10 mMグルタチオン40μLを添加し、4℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心 (8000×g、2分、4℃)して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、GST融合タンパク質を精製した。SDS-PAGEにより、シングルバンドを示すことを確認した。精製されたGST融合タンパク質の分子量は約５８．２ｋＤａであった。
次に、GST融合タンパク質５００μｇをPreScissionプロテアーゼ（アマシャムバイオサイエンス、５Ｕ）で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴを除去した。フロースルー分画をさらに、PBSで平衡化したセファデックスG200カラムにかけ、発現タンパク質PhaZ91の最終精製物を得た。発現精製タンパク質PhaZ91のタンパク質濃度は、マイクロBCAタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。精製タンパク質のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性の測定は前述の方法にて行った。その結果、精製された組換え酵素の比活性は野生型酵素と同等であることがわかった。また、SDS-PAGEにより精製タンパク質は分子量約31.5ｋＤａであることがわかった。さらに等電点電気泳動の結果、精製タンパク質の等電点は9.5であった。
【０１７４】
（実施例１８）
[unusual PHAの分解]
PHAとして、
（１）３-ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタン酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約３２％、約６８％含むコポリマー、
（２）３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約９２％、約８％含むコポリマー、
（３）３−ヒドロキシ−４−フェノキシ−ｎ−酪酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８６％、約１４％含むコポリマー、
（４）３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロベンゾイル）吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８６％、約１４％含むコポリマー、
（５）３−ヒドロキシ−５−｛［（４−フルオロフェニル）メチル］スルファニル｝吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（６）３-ヒドロキシ−４−(フェニルスルファニル)酪酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（７）３−ヒドロキシ−５−フェニルメチルオキシ吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（８）３−ヒドロキシ−５−（２−チエニル）吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約９７％、約３％含むコポリマー、
をそれぞれ個々に用い、実施例１７で調製した組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素による分解を次の様にして確認した。各々のPHAのクロロホルム溶液をＱＣＭ上にキャスト法にてフィルム化した。これを５０mM Ｔris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ７.５）２ｍｌ、３５℃中に静置し、ＱＣＭ信号が安定するまでプレインキュベートした。ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素150μgの添加で反応を開始し、ＱＣＭの共振周波数を経時的に測定した。経時的な共振周波数の増加が観察され、QCM上のポリヒドロキシアルカノエートの分解に伴う質量減少が確認された。
【０１７５】
（実施例１９）
[unusual PHAの分解]
PHAとして、
（１）３−ヒドロキシ−５−(２−チエニルスルファニル)吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８２％、約１８％含むコポリマー、
（２）３−ヒドロキシ−５−(２−チエノイル)吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８６％、約１４％含むコポリマー、
（３）３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（４）３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシルオキシ酪酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約８８％、約１２％含むコポリマー、
（５）３-ヒドロキシ−10−ウンデセン酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約２５％、約７５％含むコポリマー、
（６）３−ヒドロキシドデカ−５−エン酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約９０％、約１０％含むコポリマー、
（７）３-ヒドロキシ-５-(メチルチオ)吉草酸ユニットと３−ヒドロキシデカン酸ユニットをそれぞれモル比で約９０％、約１０％含むコポリマー、
（８）３-ヒドロキシ-７-カルボキシヘプタン酸ユニットと３−ヒドロキシノナン酸ユニットをそれぞれモル比で約１３％、約８７％含むコポリマー、
をそれぞれ個々に用い、実施例１７で調製した組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素による分解を次の様にして確認した。各々のPHAのクロロホルム溶液をＱＣＭ上にキャスト法にてフィルム化した。これを５０mM Ｔris-ＨＣl緩衝液（ｐＨ７.５）２ｍｌ、３５℃中に静置し、ＱＣＭ信号が安定するまでプレインキュベートした。ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素150μgの添加で反応を開始し、ＱＣＭの共振周波数を経時的に測定した。経時的な共振周波数の増加が観察され、QCM上のポリヒドロキシアルカノエートの分解に伴う質量減少が確認された。
【０１７６】
（実施例２０）
[変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の作製]
配列番号７のアミノ酸配列において、１４番目のグリシンをアラニンに、７５番目のチロシンをヒスチジンに、また２０１番目のスレオニンをバリンにそれぞれ置換した変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を作製した。それぞれのアミノ酸の置換は、遺伝子ＤＮＡのそれぞれ対応するコドンを、１４番目のグリシンであればＧＧＣをＧＣＣに、７５番目のチロシンであればＴＡＴをＣＡＴに、２０１番目のスレオニンであればＡＣＣをＧＴＣにそれぞれ塩基を置換することによって行った。それぞれの変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素は、実施例２で作製した組換えポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子発現ベクター(pGEX-phaZ91)をテンプレートプラスミドとして、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて行った。ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の野生型（PhaZ91[wt]）に対して、１４番目のグリシンをアラニンに置換したもの（PhaZ91[G14A]）、７５番目のチロシンをヒスチジンに置換したもの（PhaZ91[Y75H]）、２０１番目のスレオニンをバリンに置換したもの（PhaZ91[T201V]）、
さらにこれらの組合せとして、PhaZ91[G14A, Y75H]、PhaZ91[G14A, T201V]、PhaZ91[Y75H, T201V]、PhaZ91[G14A, Y75H, T201V] の計７種類の変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を発現する遺伝子発現ベクターを構築し、実施例１７に述べた方法によって、各種ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を精製した。精製した各種ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の酵素活性を実施例１５に述べた方法によって測定した。
その結果、精製された変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素の比活性は野生型酵素と同等であることがわかった。また、各変異型ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードするＤＮＡは、（１）高イオン濃度下[6xSSC(900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム)  に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより配列番号８で示される塩基配列を含むＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下[0.1xSSC(15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム)]  に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも該ハイブリッドが維持され、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡであることが確認された。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの検出はAlkPhos Direct Labelling and Detection System（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて行った。
【０１７７】
（実施例２１）
［YN21株の取得］
ポリペプトン0．5％、フェニル吉草酸0．1％、ミネラル溶液0．3％、粉末寒天1.2%を含むＭ９培地をオートクレーブ滅菌し、50℃に冷却後、ナイルレッドを0.05%含有するDMSO溶液を0．1％添加し、滅菌シャーレに15mlずつ分注し、寒天を固化させて寒天培地を作製した。
【０１７８】
なお、M9培地及びミネラル溶液の組成は以下に示す。
[M9培地]
Ｎa2ＨＰＯ4：６.２g、ＫＨ2ＰＯ4：３.０ｇ、ＮaＣl：０.５g、ＮＨ4Ｃl：１.０g（培地１リットル中、pＨ７.０）
[ミネラル溶液]
ニトリロ三酢酸：1.5 g、ＭgＳＯ4：3.0 g、ＭnＳＯ4：0.5 g、ＮaＣl：1.0 g、ＦeＳＯ4：0.1 g、ＣaＣl2：0.1 g、ＣoＣl2：0.1 g、ＺnＳＯ4：0.1 g、ＣuＳＯ4：0.1 g、ＡlＫ(ＳＯ4)2：0.1 g、Ｈ3ＢＯ3：0.1 g、Ｎa2ＭoＯ4：0.1 g、ＮiＣl2：0.1 g（１リットル中、pH7.0）
次に、野外から採取した土壌試料5gを10mlの滅菌蒸留水に添加し、1分間攪拌した。この土壌懸濁液0．5mlを4．5mlの滅菌水に添加・攪拌し、10倍希釈液を作製した。同様の操作を繰り返し、100倍希釈液、1000倍希釈液、10000倍希釈液を作製した。10倍〜10000倍希釈液を先に作製した寒天培地に各0．1mlずつ分注し、寒天表面に均一になるように広げた。これを培養器に移し、30℃で5日間培養した。培養後、PHAを合成したと思われる赤色のコロニーのうち、形態の異なる株を分離した。こうして野生株を十数株取得した。次に、ポリペプトン0．5％、グルコース0．5％、フェニル吉草酸0．1％、ミネラル溶液0．3％を含むＭ９培地（pH7.0）50mlに上記野生株を保存寒天培地のコロニーから植菌し、500ml容坂口フラスコにて30℃、125ストローク／分で振盪培養した。また上記培地をpH5.0、pH8.5にそれぞれ調整した培地に関しても同様に培養を行った。72時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて洗浄した後、真空乾燥した。この乾燥菌体ペレットを酢酸エチル１０ｍｌに懸濁し、３５℃で１５時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させ、沈澱物のみを回収して真空乾燥し、得られたＰＨＡを秤量してポリマー乾燥重量（PDW）を求めた。得られたＰＨＡのモノマーユニット比を、１Ｈ−ＮＭＲ（ＦＴ−ＮＭＲ：ＢｒｕｋｅｒＤＰＸ４００；共鳴周波数：４００ＭＨｚ；測定核種：１Ｈ；使用溶媒：ＣＤＣｌ３；ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ３；測定温度：室温）によって求めた。以上により得られたポリマー乾燥重量（PDW）及びモノマーユニット比を各野生株及び従来菌株に関して比較することで、PHA生産性を有するYN21株を取得した。
【産業上の利用可能性】
【０１７９】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素を利用すれば、ポリヒドロキシアルカノエートの分解促進による廃棄物処理や、分解物のポリヒドロキシアルカノエート生産の基質としての再利用が可能となり、これらの処理を行うプラントの効率的な稼動を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】Pseudomonas sp. YN21株から精製したポリヒドロキシアルカノエート分解酵素のＮ末端領域および内部領域のアミノ酸配列、およびそれらとプライマーphaZ21-1F-1およびphaZ21-1R-1との関係を示す模式図である。
【図２】プラスミドpGEM-phaZ21の制限酵素地図である。
【図３】コロニーハイブリダイゼーションで得られたプラスミドpUC-pZ21の制限酵素地図である。
【図４】プラスミドpUC-pZ21のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする領域の塩基配列及び推定のアミノ酸配列を示す模式図である。
【図５】プラスミドpUC-pZ21のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする領域の塩基配列及び推定のアミノ酸配列を示す模式図である。
【図６】Pseudomonas cichorii H45株から精製したポリヒドロキシアルカノエート分解酵素のＮ末端領域および内部領域のアミノ酸配列、およびそれらとプライマーphaZ45-1F-1およびphaZ45-1R-1との関係を示す模式図である。
【図７】プラスミドpGEM-phaZ45の制限酵素地図である。
【図８】コロニーハイブリダイゼーションで得られたプラスミドpUC-pZ45の制限酵素地図である。
【図９】プラスミドpUC-pZ45のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする領域の塩基配列及び推定のアミノ酸配列を示す模式図である。
【図１０】プラスミドpUC-pZ45のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする領域の塩基配列及び推定のアミノ酸配列を示す模式図である。
【図１１】Pseudomonas jessenii P161株から精製したポリヒドロキシアルカノエート分解酵素のＮ末端領域および内部領域のアミノ酸配列、およびそれらとプライマーphaZ161-1F-1およびphaZ161-1R-1との関係を示す模式図である。
【図１２】プラスミドpGEM-phaZ161の制限酵素地図である。
【図１３】コロニーハイブリダイゼーションで得られたプラスミドpUC-pZ161の制限酵素地図である。
【図１４】プラスミドpUC-pZ161のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする領域の塩基配列及び推定のアミノ酸配列を示す模式図である。
【図１５】プラスミドpUC-pZ161のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする領域の塩基配列及び推定のアミノ酸配列を示す模式図である。
【図１６】Pseudomonas putida P91株から精製したポリヒドロキシアルカノエート分解酵素のＮ末端領域および内部領域のアミノ酸配列、およびそれらとプライマーphaZ91-1F-1およびphaZ91-1R-1との関係を示す模式図である。
【図１７】プラスミドpGEM-phaZ91の制限酵素地図
【図１８】コロニーハイブリダイゼーションで得られたプラスミドpUC-pZ91の制限酵素地図である。
【図１９】プラスミドpUC-pZ91のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする領域の塩基配列及び推定のアミノ酸配列を示す模式図である。
【図２０】プラスミドpUC-pZ91のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする領域の塩基配列及び推定のアミノ酸配列を示す模式図である。
【図１】
2006204253.tif 000048
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2006204253.tif 000054
【図８】
2006204253.tif 000055
【図９】
2006204253.tif 000056
【図１０】
2006204253.tif 000057
【図１１】
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【図１２】
2006204253.tif 000059
【図１３】
2006204253.tif 000060
【図１４】
2006204253.tif 000061
【図１５】
2006204253.tif 000062
【図１６】
2006204253.tif 000063
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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