(57)【要約】【課題】  摂食抑制作用及び学習促進作用に優れた中枢機能改善剤を提供すること。【解決手段】  Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒで示される生理活性ペプチドを含有してなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒで示される生理活性ペプチドを含有することを特徴とする中枢機能改善剤。
【請求項２】
摂食抑制剤に用いることを特徴とする請求項１記載の中枢機能改善剤。
【請求項３】
学習促進剤に用いることを特徴とする請求項１記載の中枢機能改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒで示される生理活性ペプチドを含有する中枢機能改善剤に関し、さらには摂食抑制作用及び学習促進作用を有する中枢機能改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢化社会の進展とともに生活習慣病の増大が問題となっており、これには、中高年期以降の肥満が基礎となり、高血圧、糖尿病、動脈硬化を引き起こすことが考えられている。この原因として、過剰な食物摂取によるカロリーの増大に対し、運動不足による消費エネルギーが減少しており、カロリー調節のバランスが崩れているために肥満を引き起こしていると考えられている。
【０００３】
また、一方では高齢化に伴う痴呆症も大きな社会問題となっており、これを治療、あるいは予防する物質の開発が望まれている。
【０００４】
かかる痴呆症に関しては、ほうれん草由来のペプチド（Ｔry−Ｐro−Leu−Asp−Leu−Phe）に学習促進作用があることが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【非特許文献１】Peptides，vol２４，３２５−３２８（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記の文献記載のペプチドは、学習促進作用は認められるが、摂食抑制作用についてはその作用を有しないものである。
すなわち、今後の高齢化社会を見据えた中枢機能を改善し、摂食抑制作用や学習機能促進作用を併せもつようなマルチファンクションのペプチドが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者等は、かかる課題を解決すべくペプチドに関して種々検討した結果、Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒで示される生理活性ペプチドが摂食抑制作用と学習促進作用を併せ持つ中枢改善機能を有することを見出し本発明を完成するに至った。
なお、本発明者は、なたね由来のＡｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒで示される生理活性ペプチドについて既に出願している（特開２００４−５１６３６号公報）。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の新規ペプチドは、摂食抑制作用を有し、かつ学習機能促進作用をも示すペプチドである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の中枢機能機能を有するペプチドはＡｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒの配列で示されるもので、ここでいうＡｒｇはアルギニン、Ｉｌｅはイソロイシン、Ｔｙｒはチロシンを意味しかかるアミノ酸はいずれもＬ−体である。
【０００９】
上記のペプチドは、下記のようなペプチド合成法で製造することができる。
かかるペプチドの合成は液相法または固相法で行われ、いずれの場合でもペプチド結合の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料とを２−（１Ｈ−Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ）−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＨＢＴＵ）等の活性エステルを用いた方法またはカルボジイミドを用いた方法等で縮合させる。
【００１０】
この縮合において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。カルボキシル基の保護基としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。
【００１１】
縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断し、通常の方法に従い精製される。かかる精製については例えば逆相液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法が挙げられる。
合成したペプチドの分析は、エドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取るプロティンシークエンサー、ＬＣ−ＭＳ等の方法で行われる。
【００１２】
本発明の中枢機能改善剤は、上記のペプチドを含有するもので、かかる中枢機能改善剤の投与経路としては、経口投与、血管内投与、直腸内投与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。かかる中枢機能改善剤の人に対する投与量は、投与方法、患者の症状・年令等により一概に言えないが、通常は１回０.１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇを１日当たり１〜３回とすることが好ましい。
かかる中枢機能改善剤は、通常製剤の形で投与される。製剤に用いられる担体や助剤としては、製剤分野において常用され、かつかかるペプチドと反応しない物質が用いられる。
【００１３】
具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、庶糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコール等が挙げられる。
【００１４】
剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、中枢機能改善剤を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００１５】
これらの製剤は、目的のペプチドを０．０１重量％以上、さらには０．５〜７０重量％の割合で含有することが好ましい。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【実施例】
【００１６】
次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。なお、試験群はコントロール群に対して有意水準１％で有意な場合はＰ＜０．０１、有意水準５％で有意な場合はＰ＜０．０５と表記した。
【００１７】
実施例１
【００１８】
〔ペプチドの合成〕
市販のＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）樹脂（置換率０．５ｍｅｑ／ｇ）０．６ｇをＰＳ３型ペプチド合成機（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の反応槽に分取し、以下のように新規ペプチドの合成を行った。
まず、上記の樹脂を反応容器に入れて、１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｉｌｅと、活性化剤として１ｍｍｏｌのＨＢＴＵを１０ｍｌの０．４Ｍ  Ｎ−メチルモルフォリンを含むジメチルフォルムアミドに溶解したものを反応槽に加え、室温にて２０分撹拌反応させた。一旦樹脂をジメチルフォルムアミドで洗浄した後、上記と同様にＦｍｏｃ−Ｉｌｅ及びＨＢＴＵを使用し反応した。
得られた樹脂を２０容量％ピペリジンを含むジメチルフォルムアミド２０ｍｌ中で、Ｆｍｏｃ基を除去し、ついで上記のＦｍｏｃ−Ｉｌｅをカップリングさせた方法と同様にＣ末端から順次Ｆｍｏｃ−アミノ酸をカップルさせて、Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）樹脂を得た。該樹脂を１０ｍｌの脱保護液（８２容量％トリフルオロ酢酸、５容量％チオアニソール、３容量％エタンジチオール、２容量％エチルメチルスルフィド、３容量％フェノール、５容量％水の混合液）中で室温にて４時間撹拌し、ペプチドを樹脂から遊離させた。
【００１９】
ここに４０ｍｌの冷エーテルを添加し、ペプチドを沈殿させ、さらに冷エーテルにて３回洗浄して粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲII、２０×２５０ｍｍ）による逆相クロマトグラフィーにより０．１重量％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開、精製し、Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒの配列を有するペプチドを得た。なお、本品をプロテインシーケンサー（アプライド  バイオシステムズ社製「４９２型」）により分析して、上記の配列であることを確認した。
【００２０】
上記で得られたペプチドを用いて、Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒの摂食抑制作用に関して以下に示す方法で試験した。
（試験化合物の調製および投与）
ｄｄＹマウス（雄、７週齢、日本エスエルシー株式会社）を一定の条件下（２２℃、明暗サイクル１２時間）に維持したケージ内で個別に飼育し、飼料と水を自由摂取させた。マウスは、試験２４時間前より絶食させて試験に使用した。Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒは生理食塩水に溶解して経口投与し、コントロールには生理食塩水のみを投与した。
【００２１】
（摂食量の測定）
マウスにＡｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（３０、５０ｍｇ／ｋｇ）を経口投与し、経口投与前および投与後、２０、６０、１２０および１８０分に飼料重量を測定し、摂取量を算出した。
【００２２】
（統計学的解析）
結果を平均±標準誤差で示した。ボンフェローニｔ−検定による分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて各群の間の差を調べた。（０．０５未満のＰ値を有意とした。）
【００２３】
図１に示されるように、Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ投与群では、コントロール群と比較して摂取量が抑制され、Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒの摂食抑制作用が示された。
【００２４】
（学習促進作用）
学習能に対する効果を、ステップスルー装置を用いた受動的回避実験により検討した。ｄｄｙマウス（オス、体重２４±２ｇ）を明暗２室に分かれた装置の明室に入れると、マウスは暗いところを好むことから暗室に入る。暗室に入ると床から電気ショック（２８−２９Ｖ、５ｓｅｃ  ｄｕｒａｔｉｏｎ）を与えて暗室が危険なことを教育する（訓練試行）。訓練試行直後にＡｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒを１０または３０ｎｍｏｌ／マウスの容量で側脳質内投与し、２４時間後にテスト試行を行った。即ちマウスを再び同じ装置に入れ、明暗に止まっている時間を測定することにより、ペプチドの有無におけるマウスの学習能を比較した。
【００２５】
図２に示したとおり、Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒを投与することにより、明室内滞在時間は延長され、ペプチドを投与することによりマウスの学習能が増強されていることが示された。なお、図２においてｎ＝１２であり、６００秒を本実験におけるカットオフ値とした。マン  アンド  ホイットニー（Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｎｅｙ）法によりＵ検定を行ったところ、Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒを１０ｎｍｏｌ投与した群において、コントロール群と比較して５％の危険率で有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。また、３０ｎｍｏｌ投与では有意差はないものの同様の傾向が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明の中枢機能改善剤は、摂食抑制作用及び学習促進作用に優れており、摂食抑制剤及び学習促進剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】各投与後の経時における摂食量を示すグラフ
【図２】各濃度でＡｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒを脳室内投与した際の明室内滞在時間を示す          グラフ
【図１】
2006008572.tif 000002
【図２】
2006008572.tif 000003