(57)【要約】【課題】免疫不全症候群を惹起する新規レトロウイルス及びその変異体を抑制・阻害するワクチンを提供する。【解決手段】 ＭＶＰ−２９０１／９４なる名称を有し、欧州動物細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に第Ｖ９５０１２６０１号として寄託されている新規免疫不全レトロウイルスまたはＲＮＡの相同性が少なくとも７５％である該ウイルスの変異体を抑制・阻害するワクチンであって、抗原として前記免疫不全ウイルスの外被糖タンパク質ｇｐ４１をコードする表1のＤＮＡ配列又はこの配列との相同性が少なくとも７５％であるＤＮＡ配列から演繹されるペプチドを特異的抗原として調製されることを特徴とする、前記ワクチン。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＶＰ−２９０１／９４なる名称を有し、欧州動物細胞培養収集機関（ヨ−ロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャ−ズ；ＥＣＡＣＣ）において第Ｖ９５０１２６０１号として寄託されているレトロウイルスに相当する形態学的および免疫学的性質を有する、ＨＩＶグル−プに属する免疫不全ウイルスまたはＲＮＡの相同性が少なくとも７５％である該ウイルスの変異体を抑制・阻害するワクチンであって、抗原として前記免疫不全ウイルスの外被糖タンパク質ｇｐ４１をコードする表1のＤＮＡ配列又はこの配列との相同性が少なくとも７５％であるＤＮＡ配列から演繹されるペプチドを特異的抗原として調製されることを特徴とする、前記ワクチン。
【請求項２】
表１のアミノ酸配列またはそのうちの少なくとも１０個のアミノ酸からなるペプチドを特異的抗原として調製されることを特徴とする、請求項１において記載されたワクチン。
【請求項３】
表１のアミノ酸配列のうちの少なくとも２０個のアミノ酸からなるペプチドを特異的抗原として調製されることを特徴とする、請求項１において記載されたワクチン。
【請求項４】
ＮＱＱＬＬＮＬＷＧＣＫＧＫＬＩＣＹＴＳＶＫＷＮなるアミノ酸配列またはそのうちの少なくとも１０個のアミノ酸からなるペプチドを特異的抗原として調製されることを特徴とする、請求項１において記載されたワクチン。
【請求項５】
表１のＤＮＡ配列またはこの配列と相同性が少なくとも７５％であるＤＮＡを含んで成る発現ベクターを含有するコンピーテントセルを培養することによって得られる組換え型ペプチドを特異的抗原として調製されることを特徴とする、請求項１において記載されたワクチン。
【請求項６】
合成により調製されたペプチドを特異的抗原として調製されることを特徴とする、請求項１において記載されたワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＶＰ−２９０１／９４なる名称を有し、欧州動物細胞培養収集機関（ヨ−ロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャ−ズ；ＥＣＡＣＣ）において第Ｖ９５０１２６０１号として寄託されているレトロウイルスに相当する形態学的および免疫学的性質を有する、ＨＩＶグル−プに属する免疫不全ウイルスまたはＲＮＡの相同性が少なくとも７５％である該ウイルスの変異体を抑制・阻害するワクチンであって、抗原として前記免疫不全ウイルスの外被糖タンパク質ｇｐ４１をコードする表1のＤＮＡ配列又はこの配列との相同性が少なくとも７５％であるＤＮＡ配列から演繹されるペプチドを特異的抗原として調製されることを特徴とする、前記ワクチンに係わる。
【背景技術】
【０００２】
いわゆるＨＩＶグル−プに属するレトロウイルスは、ヒトに感染した場合、免疫不全即ちエイズ（ＡＩＤＳ；後天性免疫不全症候群）なる総称で概括される疾患症状の原因となる。
【０００３】
疫学的研究の結果、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）がエイズ（後天性免疫不全症候群）症例の圧倒的大部分の発病因子であることが証明されている。１９８３年に一人の患者から単離され次いで特性化されたレトロウイルスは、ＨＩＶ−１と命名された（Barre-Sinoussi、F. et al., Science 220, 868-871 1983) 。ＨＩＶ−１の一変異株については、ＷＯ８６／０２３８３に記載されている。
【０００４】
ヒト免疫不全ウイルスの第二のグル−プが１９８５年に西アフリカで確認され（Clavel, F. et al., Science 233, 343-346 1986）、ヒト免疫不全ウイルスタイプ２（ＨＩＶ−２）と命名された（ＥＰ−Ａ−Ｏ２３９４２５）。ＨＩＶ−２レトロウイルスはＨＩＶ−１とは明らかに相違するが、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ−２）に関連性がある。ＨＩＶ−１と同様、ＨＩＶ−２もエイズの症候を惹起する。
【０００５】
最近、ＡＮＴ７０（J. Vir., 1994, Vol. 68, No. 3, pp. 1586-1596) およびＭＶＰ−５１８０／９１（J. Vir., 1994, Vol. 68, No. 3, pp. 1581-1585) で表示される新らしいウイルスが報告されているが、これらはＨＩＶ−１サブタイプＡ−Ｆに分類できないものである。これらの単離株は、既知のＨＩＶ−１株とは構造上明瞭に相違するため暫定的に共にサブタイプＯに分類されている(G. Meyers, Los Alamos Data Base) ものの、ゲノムヌクレオチド配列は相互に明らかに異なっている。
【０００６】
高度の変異性を示しそのために異なる分離株の比較可能性が著しく錯綜することになるのが、ヒト免疫不全ウイルスの一つの特徴である。異なるＨＩＶ−１分離株を比較する場合、たとえば、ゲノムのいくつかの領域において高度の変異性が見られるのに対して他のゲノム領域は比較的によく保存されている場合がある（Benn, S. et. al., Science, 230, 949-951 1985) 。ＨＩＶ−２が極めて高い多型性を示すことも報告されている（Clavel, et. al., Nature 324, 691- 6951986)。構造的にも酵素的にも必須であるタンパク質をコ−ドするｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子中の諸領域が、遺伝的安定性が最も大きいのであるが、これとは対照的にｅｎｖ遺伝子中のいくつかの領域及び調節タンパク質をコ−ドする遺伝子（vif,vpr,tat,rev,nef）は変異性が極めて高い。
【０００７】
さらに、ＨＩＶ−１に対する抗血清は、仮に配列相同性が低くても、ＨＩＶ−２のｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子産物とも交差反応することが証明されている。これら２種のウイルスの間でのハイブリダイゼ−ションも、厳密性の極めて低い条件を用いない限り、大きな意義を持つものとはならなかったという（Clavel, et. al., Nature 324, 691-695 1986) 。
【０００８】
ＨＩＶグル- プに属するレトロウイルスが広く分布しかつ感染時点と病的変化の明確な症状が認められる時点との間に数年から数十年（２〜２０年）の期間が経過するため、ＨＩＶグループのレトロウイルスによる感染をできるだけ早期の段階でしかも特に信頼性の高い方法で確認することは、疫学的にきわめて重要である。これのことは、免疫不全の幾つかの徴候を示している患者の診断において重要であるばかりでなく、給血者のスクリ−ニングにおいても殊更に重要である。ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２型のレトロウイルスまたはこれらの成分を検出システムに使用する場合、血清によっては、血清を採取した患者に免疫不全の徴候が現われているにも関わらず、抗体も検出できないかまたは感度が極めて低い状態でしか検出できないことが今までに起きている。本発明のＨＩＶグル−プのレトロウイルスを用いると、場合によってはかかる検出が可能である。
【０００９】
ＨＩＶウイルスの遺伝子型の多様性は、特に診断上大きな問題となっている。ＨＩＶ−１ウイルスの場合、各々の複製サイクル毎にゲノム当り１個のヌクレオチドが変化すると推定されている。このような遺伝的変異性があるため、ＨＩＶウイルスは、生体内選択圧力に対して異常なほど柔軟に対応することが可能でありまた生理活性物質に抵抗性を有するかまたはある程度の免疫学的防御を構築している個体を攻撃することが出来る突然変異体を生み出す能力を有するのである（Sharp et al., "Origins and diversity of human immunodeficiency viruses", AIDS 1994, vol. 8, Suppl. 1; pp. 27-42)。
【００１０】
特に輸血に関連するばかりでなく臓器提供に関連した感染の蔓延を阻止するために、ＨＩＶウイルス感染を可能ならば１００％の確実性で確認できなければならない。この理由によって、現在のところは幾つかの地域に分布しているだけであるが、適切な予防措置を講じなければ欧州およびアメリカ合衆国に容易に蔓延する可能性があるウイルスに起因する感染症を検出することが診断学上からも必要とされている。
【００１１】
免疫不全の徴候を呈していたカメル−ン出身の２４歳の女性患者の末梢リンパ球から１９９４年に単離された、以下ＭＶＰ−２９０１／９４と称する新規のヒト免疫不全ウイルスの単離および特性について以下に記述する。地理的観点からすれば、このレトロウイルスは、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ウイルスによる感染が風土病となっている西アフリカと伝播しているのはほとんどすべてＨＩＶ−１である東アフリカとの間に位置するアフリカのある地域を起源としている。従って、本発明は、ＭＶＰ−２９０１／９４と呼ばれるＨＩＶサブタイプＯグル−プの新種レトロウイルス及びその変種・変異体を抑制・阻害するワクチンに関する。
【００１２】
ＭＶＰ−２９０１／９４は、ＭＴ２細胞系およびジャ−カット(Jurkat)細胞系内で増殖することが出来る。ウイルス類の単離および増殖については、成書「ＨＩＶ感染におけるウイルス数量化(Viral Quantitation in HIV Infection）、ジャン＝マリ−  アンドリュ−（Jean-Marie Andrieu）編、ジョン・リビ−・ユウロテクスト（John Libbey Eurotext）、１９９１年」に記載されている。該書に記載されている操作法を、引用して本出願の開示に加えることにする。
【００１３】
本発明のＭＶＰ−２９０１／９４とＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２レトロウイルスとの差をよりよく理解出来るようにするため、免疫不全を惹起するレトロウイルスの構造を先ず簡単に説明する。ウイルスの中心には、ＲＮＡが円錐形のコア部の中に位置しており、該コアはｐ２４（ｐはタンパク質の意）と称されるタンパク質サブユニットから組立られている。この内側コアは、タンパク質ｐ１７から構築されたタンパク質外被（外側コア）ならびに糖タンパク質外被によって囲竇されており、該糖タンパク質外被は、宿主細胞由来の脂質に加えて、膜透過タンパク質ｇｐ４１および外被タンパク質１２０（ｇｐ１２０）を含んでいる。このｇｐ１２０が、次に宿主細胞のＣＤ−４受容体に結合する。
【００１４】
公知の範囲では、ＨＩＶウイルス類のＲＮＡは単純化して記述すると、下記する遺伝子領域を有している：各端末に存在するいわゆる長い末端反復（ＬＴＲ）及び次の遺伝子領域：ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよびｎｅｆ。ｇａｇ遺伝子は、とりわけ、コア蛋白質ｐ２４およびｐ１７をコ−ドしており、ｐｏｌ遺伝子は逆転写酵素、プロテア−ゼ、ＲＮＡ分解酵素Ｈおよびインテグラ−ゼをコ−ドしておりまたｅｎｖ遺伝子はウイルス外被の糖タンパク質ｇｐ４１およびｇｐ１２０をコ−ドしている。ｎｅｆ遺伝子は、調節機能を有するタンパク質をコ−ドしている。ＨＩＶタイプのレトロウイルスのゲノムの構成を第１図に概略図として示す。
【００１５】
いわゆるＰＣＲ（ポリメラ−ゼ連鎖反応）が、多様な利用可能性を持つ遺伝子操作法の一つとなっており、この方法を実施するのに必要な構成成分は購入可能である。この方法を用いれば、増幅するべき配列を有するのいくつかのＤＮＡ領域が公知であれば、ＤＮＡ配列を増幅することが可能である。そこで次には簡単に言えば、増幅するべき核酸のある短い領域にアニ−ルする相補的ＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド＝プライマ−）を合成しなければならない。試験を実施するには、それらプライマ−とともに、ＨＩＶ核酸ならびにポリメラ−ゼおよびヌクレオシド三燐酸類を含有する反応混合物中に導入する。重合（ＤＮＡ合成）を所定時間実施し、つぎに、核酸鎖を加熱により解離させる。冷却後は、重合が再度進行する。それゆえ本発明のレトロウイルスがＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ウイルスである場合は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ウイルスの既知の配列の中に保存されているプライマ−を用いて核酸を増幅できるはずである。この種のいくつかのプライマ−が既に記載されている（ｐｏｌ３およびｐｏｌ４については、Laure et al., Lancet ii, (1988) 538-54  及びsk38/39、sk68/69については Ou C. Y. et al., Science 239 (1988) 295-297）。
【００１６】
しかしながら、これらのプライマ−は、ＨＩＶ分離株ＭＶＰ−５１８０／９１からＤＮＡを増幅させる能力はない（J. Vir., 1994, vol. 68, no. 3, pp.
【００１７】
1581-1585)。同様に、これらのプライマ−を使用しても、ＭＶＰ−２９０１／９４分離株からＤＮＡを増幅させることはできなかったため、この分離株はＨＩＶ−１の共通配列から大幅に異なっているという見解を支持するものである。従って、既知の配列から誘導されかつ保存度を可能な限り高くした極めて多様な新規プライマ−を構築すること並びに反応条件を変えながらこのようなプライマ−を出来るだけ多くの組み合わせで使用することが必要であった。驚くべきことに、実施例４に記載した反応条件において、ＭＶＰ−５１８０／９１分離株の配列から誘導したプライマ−２１２および４１２の組合せを用いて、ＭＶＰ−２９０１／９４のＤＮＡを増幅することが可能であり、かくして該分離株の配列についての最初の手掛かりを得ることができることが見出されたのである。
【００１８】
（配列識別番号１）
５’                                                    ３’
２１２    ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＡＴＧ
（配列識別番号２）
５’                                                    ３’
４１２    ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＴＴＴ  ＴＡＣ  ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＧＴＡ
【００１９】
この場合におけるように、一旦ＨＩＶウイルスの配列の一構成成分領域が解読されると、公知の標準的な分子生物学的方法を用いて、そのウイルスのゲノム全体をクロ−ン化し、配列決定することができる。
【００２０】
１）このような配列決定は例えば、下記する方法でＤＮＡをクロ−ン化することにより達成できる：適当な量（およそ１リットル）の培養液からウイルスを沈降させ、燐酸緩衝食塩水に再懸濁させる。次いでこれを、（２０％）スクロ−スクッションを通してペレット化する。このウイルスペレットは、３０ｍＭジチオスレイト−ルと０．５％ノニデットＰ４０中に溶かした６Ｍの塩化グアニジニウム溶液に懸濁させればよい。ＣｓＣｌを２モルの濃度まで加え、破砕されたウイルスを含有する溶液を塩化セシウムクッションに載置する。次いでこのウイルスＲＮＡを遠心分離によってペレット化し、溶解させ、フェノ−ルで抽出し、エタノ−ルおよび塩化リチウムで沈澱させる。第一のｃＤＮＡ鎖の合成は、オリゴ（ｄＴ）プライマ−を用いてかかるウイルスＲＮＡまたはその部分上で行なう。逆転写酵素を加える目的で行う合成は市販のキットを用いて実施出来る。第二鎖の合成を行うためには、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖をＲＮＡ分解酵素Ｈで消化し、大腸菌由来ＤＮＡポリメラ−ゼＩを用いて第二鎖を合成する。次に、Ｔ４ＤＮＡポリメラ−ゼを用いて平滑末端を生成させ、これらの末端を適当なリンカ−に結合させて、制限切断部位を生じさせればよい。適当な制限エンドヌクレア−ゼを用いて制限消化を行った後、アガロ−スゲルからｃＤＮＡ断片を単離し、予め適当に切断しておいたベクタ−に連結させる。次いで、ｃＤＮＡ挿入片を含むベクタ−を用いて、受容能のある大腸菌を形質転換することができる。得られたコロニ−を次に膜に転写し、細胞溶解し、変性させ、最後にジゴキシゲニンまたはビオチンで標識した核酸とハイブリダイズさせることにより検出する。相当するｃＤＮＡを遺伝子操作によって一旦調製すると、レトロウイルスに由来する所望のＤＮＡ断片を単離することが可能である。次にこれらの断片を適当な発現ベクタ−に組み込めば、所望のタンパク質またはタンパク質断片を発現させ、診断試験に使用することが可能となる。また同様にして免疫原として例えばｇｐ４１に由来する由来タンパク質またはタンパク質断片を選択して発現させると、感染予防・防御または発症防止・治療目的とする抗体を誘導出来るワクチンとしても有効に使用できることは当然である。
【００２１】
２）上記方法の代替法として、免疫不全ウイルスの核酸をＰＣＲ技術を用いてクロ−ン化すればよい。このようなクロ−ン化を行うには夫々の場合に、当該配列の内の未知の領域からプライマ−を幾つか決定する必要があるのであって、かかるプライマ−は、当該配列の内の既知部分から導かれたプライマ−と組み合わせて分離株のＤＮＡの増幅を行うこと可能ならしめるものである。なおこの際、免疫原として例えばｇｐ４１に由来するタンパク質またはタンパク質断片をコードするＤＮＡまたはＤＮＡ断片をベクターに組み込み、大腸菌、酵母などに導入して相当するタンパク質を産生させることによって、同様の目的のワクチンとして使用することが出来る。
【００２２】
３）既知配列のセグメントから出発してウイルスをクロ−ン化するもう一つの可能性は、ウイルスのプロウイルスゲノムＤＮＡをクロ−ン化する方法である。このためには、感染細胞系からのゲノムＤＮＡをまず標準的方法によって精製する。次いで宿主のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡは、ゲノムライブラリ−を構築してスクリ−ンした後クロ−ン化すればよい。このようなクロ−ン化を行うには、ゲノムＤＮＡを部分的に断片化し、長さ約１０−２５ｋｂの断片を含有する画分を単離し、この長さの断片を収容できるベクタ−系、たとえばコスミドまたはラムダファ−ジ中にクロ−ン化する。選択したベクタ−系を用いて、ゲノム断片の混合物を大腸菌株に導入し、形質転換させる。次いでウイルスゲノムを含有するベクタ−は、探索したウイルスのクロ−ン化ＤＮＡ断片とハイブリダイゼ−ションさせて同定し、その後に単離すればよいのであるが（プラ−クスクリ−ニングまたはコロニ−スクリ−ニング）、前記ＤＮＡ断片は放射能又は他の何らかの方法で標識しておくのである。かくして、かかるウイルスゲノムは、配列分析を行ない、次いで当該タンパク質を発現させるのに利用可能となるわけである。  なお前記と同様に、免疫原として例えばｇｐ４１に由来するタンパク質をコードするＤＮＡまたはＤＮＡ断片を単離し、ベクターに組み込むことによって相当するタンパク質またはタンパク質断片を発現させて、ワクチンとすることが出来る。
【００２３】
異なるウイルス分離株の間の類似性は、核酸またはタンパク質の配列の間の相同性の度合によって表わすことができる。例えば、相同性５０％とは、配列中の１００個のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置のうちの５０個が相互に一致することを意味するのである。このようなタンパク質の相同性は、配列分析により求める。相同性のＤＮＡ配列も、ハイブリダイゼ−ション手法により同定することが出来る。
【非特許文献１】Barre-Sinoussi、F. et al., Science 220, 868-871 1983
【非特許文献２】Clavel, F. et al., Science 233, 343-346 1986
【非特許文献３】J. Vir., 1994, Vol. 68, No. 3, pp. 1586-1596
【非特許文献４】J. Vir., 1994, Vol. 68, No. 3, pp. 1581-1585
【非特許文献５】Benn, S. et. al., Science, 230, 949-951 1985
【非特許文献６】Clavel, et. al., Nature 324, 691- 6951986
【非特許文献７】Clavel, et. al., Nature 324, 691-695 1986
【非特許文献８】Sharp et al., "Origins and diversity of human immunodeficiency viruses", AIDS 1994, vol. 8, Suppl. 1; pp. 27-42
【非特許文献９】Laure et al., Lancet ii, (1988) 538-54
【非特許文献１０】Ou C. Y. et al., Science 239 (1988) 295-297
【非特許文献１１】J. Vir., 1994, vol. 68, no. 3, pp.
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
従って本発明は、欧州動物細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）に第Ｖ９５０１２６０１号として寄託され、ＭＶＰ−２９０１／９４なる名称を有するレトロウイルスに相当する形態学的および免疫学的性質を有するＨＩＶグル−プの免疫不全ウイルスまたはこのウイルスの変異株を抑制・阻害するワクチンに関する。なお、当該レトロウイルスの寄託日は１９９５年１月２６日であった。
【００２５】
免疫不全ウイルスの本質的な形態学的および免疫学的性質とは、該ウイルスの免疫学的特性化を行う上で決定的に重要である構造を意味するものと解される。かかる意味で、感染者において抗体産生を増幅させかつウイルスを異なるサブクラスおよびサブタイプに分類するのに適しているエピト−プが特に重要である。従って、この意味において重要性を持つエピト−プはとりわけ、ＨＩＶ−１グル−プおよび／またはＨＩＶ−２グル−プのウイルスにも存在するエピト−プではなくむしろ本発明に係わる寄託ウイルス及びＭＶＰ−２９０１／９４ウイルスという狭いグル−プに属するその変異株にのみ存在するエピト−プである。ウイルスの形態学的および免疫学的性質は、外被タンパク質の内の診断上該当する領域にも反映されている。
【００２６】
本発明は、寄託されている該ウイルスのＲＮＡとの相同性がゲノム全体を基準として少なくとも７５％であるＲＮＡ配列を有する免疫不全ウイルスを抑制・阻害するワクチンも包含する。
【発明の効果】
【００２７】
免疫不全ウイルスに対するワクチンを調製することは、極めて困難であることが証明されつつあるとはいえ、このウイルスまたはその部分、すなわち免疫優性エピト−プおよび細胞性免疫誘導物質、または組換え技術により調製した抗原を特異的抗原として用いることによって、感染予防用及び発症抑制・治療用のワクチンの開発、調製をすることも出来るのである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
好ましい免疫不全ウイルスは、寄託されている該ウイルスのＲＮＡとの相同性がゲノム全体を基準として少なくとも８５％、特に好ましくは少なくとも９０％であるＲＮＡ配列を有する免疫不全ウイルスである。ことのほか特に好ましい免疫不全ウイルスは、寄託されている該ウイルスのＲＮＡとの相同性がゲノム全体を基準として９２％又は９５％であるＤＮＡ配列を有する免疫不全ウイルスである。
【００２９】
本発明に係わる免疫不全ウイルスは、表１に記載したＤＮＡ配列に相補的でありかつ表１のかかる配列と相同性が少なくとも７５％であるＲＮＡ配列を有する。好ましい一態様においては、本発明に係わる免疫不全ウイルスは、表１のＤＮＡ配列に対して相補的でありかつ表１のかかる配列との相同性が少なくとも８５％であるＲＮＡ配列を有するのである。これに関して言えば、当該配列の相同部分は長さがヌクレオチドで少なくとも５０個であり、好ましい実施態様においては、長さがヌクレオチドで少なくとも１００個である。
【００３０】
本発明に関わる免疫不全ウイルスは、表１に記載した配列に相補的であるか又はこの配列と相同性がある配列または構成成分配列を有し、表１に示した配列との配列差が、診断上該当する領域を基準としてヌクレオチドレベルで高々２０％でありかつタンパク質レベルで２５％である。
【００３１】
好ましい一つの実施態様において、表１に記載した配列との配列差が、診断上該当する領域を基準としてヌクレオチドレベルで高々１０％でありかつタンパク質レベルで１５％である。
【００３２】
本発明はまた、欧州動物細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）において第Ｖ９５０１２６０１号として寄託されている免疫不全ウイルスＭＶＰ−２９０１／９４、即ち本発明に関わるウイルスのＲＮＡまたはその部分に相補的であるＤＮＡから発現される免疫原性タンパク質から成るワクチンに関する。
【００３３】
かかる好ましい実施態様においては、かかるＤＮＡは、組換えＤＮＡの形状である。
【００３４】
本発明はまた、本発明に係わるｃＤＮＡまたは組換えＤＮＡを用いて又はそのｃＤＮＡから演繹されるアミノ酸構造を用いて調製される、ワクチンをも包含する。これに関連して言えば、ワクチンとはタンパク質またはペプチドである。
【００３５】
好ましい一つの実施態様においては、本発明に係わるワクチンは、表１に記載したアミノ酸配列またはその構成成分配列に相当するアミノ酸配列を有するペプチドを特異的抗原として調製される。
【００３６】
該ワクチンは好ましくは、表１に記載したアミノ酸配列から選択された少なくとも１０個、特に好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸から成る構成成分配列を有するペプチドを特異的抗原として調製される。
【００３７】
特に好ましい一実施態様においては、本発明に係わるワクチンは、アミノ酸配列ＮＱＱＬＬＮＬＷＧＣＫＧＫＬＩＣＹＴＳＶＫＷＮまたは連続した少なくとも１０個のアミノ酸から成るその構成成分配列を有するペプチドを特異的抗原として調製される。
【００３８】
本発明の範囲内において、診断のために特に関連し、該当する外皮タンパク質の一部の配列が決定されたのである。かかる部分は、いわゆるＶ３ル−プの区域を包含するエンベロ−プ領域である；本発明の範囲内において配列決定された領域は、いわゆるｇｐ４１領域にまで及んでいる。
【００３９】
本発明の範囲内において、外被タンパク質の一部が初めて配列決定され、その結果この配列がＨＩＶタイプの諸ウイルスの対応する配列とは比較的低度の相同性しか示さないことが確立された。デ−タベ−スを用いて行なった各ＨＩＶ配列との比較により、とくにｇｐ４１領域は、ヌクレオチドレベルで、高々７９．１％しか相同でないことが示された。
【００４０】
本発明に関わるウイルスの配列は、既知ウイルスのそれとは異なっている。従って本発明は、かかるウイルス及びこれに対応するＤＮＡとアミノ酸配列に関するものであって、該アミノ酸配列は本発明のウイルスの配列と実質的に一致するものであるが、その偏差の程度は相同性の度合によって決まる。従って例えば、８５％以上の相同性とは、１００個のヌクレオチドまたはアミノ酸のうち少なくとも８５個が同じヌクレオチドまたはアミノ酸であって残余は異なっていてよいとされるような配列が包含されることを意味する。相同性を確定するに際しては、二つの配列を相互に対応するヌクレオチドまたはアミノ酸が可能な限り多数相互に一致するように並列させ、比較するのである。
【００４１】
単離された配列に基づいて、免疫優性エピト−プ（ペプチド）を構造作成して、合成すればよい。ウイルスの核酸配列が既知であるので、当業者は、かかる配列からアミノ酸配列は演繹可能である。このようなアミノ酸配列の一構成成分領域を表１に示す。従って、本発明はまた、表１に記載した情報を用いて調製できる抗原、即ちタンパク質、オリゴペプチドまたはポリペプチドを特異的抗原として調製されるワクチンに関する。これらの抗原、即ちタンパク質、ポリペプチドおよびオリゴペプチドは、表１に示したアミノ酸配列を有する。かかる抗原またはペプチドは、表１に図示してあるアミノ酸配列の内の比較的短い構成成分配列を有するものであればよい。このようなアミノ酸配列は、長さが少なくとも１０個のアミノ酸であり、好ましくは少なくとも２０個、特に好ましくは２５個のアミノ酸である。これらのペプチドは、組換え技術を利用することに加えて合成法によっても調製すること出来る。適合した調製ル−トはメリフィ−ルドタイプの固相合成である。本方法及び現行の技術水準から公知である他の方法については、詳細な記述は、文献、例えばボダンスキ−ら（M. Bodansky et al.）、Peptide  Synthesis，John Wiley & Sons, 2nd Ed., 1976においてなされている。
【実施例１】
【００４２】
実施例１（ウイルスの培養）
本発明の免疫不全ウイルスＭＶＰ−２９０１／９４を、免疫不全の徴候を示す女性患者の血液から単離した。このような単離するために、末梢単核細胞（末梢血リンパ球、ＰＢＬ）およびＨＩＶに感染していないドナ−の血液の末梢リンパ球（ＰＢＬ）を、植物凝集素で刺激し、培養させた。このためにウシ胎児血清を１０％含有する慣用のＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。培養条件は、Ａ．ランデイら（Landay A., et al. ）、J. Inf. Dis., 161 (1990) pp. 706 - 710に記載されている。巨細胞の形成は一切認められなかった。ＨＩウイルスの産生は、アボット社から市販されている試験キットを用いてｐ２４抗原を測定することにより決定した。ウイルスの増殖を決定するために用いた他の試験は、粒子結合逆転写酵素を用いる試験（Everle J., Seibl R., J. Virol. Methods 40, 1992, pp.347 - 356)であった。その結果, ウイルス産生をモニタ−するために、週に１回または２回培養上澄み中の酵素活性に基づいて、ウイルスの増殖を測定した。週に１回、新しいドナ−リンパ球を加えた。
【００４３】
ＨＩウイルスの増殖が一旦確立すると、ＨＩＶに感染していない健康なドナ−の血液から得た新鮮な末梢リンパ球（ＰＢＬ）を、最初の培養液の上澄み液で感染させる。この工程を繰り返し、次いでＭＴ２またはジャ−カット（Jurkat）細胞を前記上澄み液で感染させた。このようにして、免疫不全ウイルスを永続的に生産することが可能であった。
【００４４】
実施例２
【００４５】
ＨＩＶ分離株ＭＶＰ−２９０１／９４のゲノムの区画（ｇｐ４１をコ−ドする）のＤＮＡ単離と増幅及び構造特性化
【００４６】
ゲノムＤＮＡをＭＶＰ−２９０１／９４感染血液リンパ球から標準的方法（Current Protocols in Molecular Biology、Wiley International, 1994)を用いて単離した。
【００４７】
ＭＶＰ−２９０１／９４単離株のゲノムの種々の領域の特性を知るために、ｇｐ４１外被タンパク質領域からのプライマ−対を幾つ用いてＰＣＲ（ポリメラ−ゼ連鎖反応）実験を実施した。ＰＣＲ（Saik et al., Science 239: 487-491,  1988) は、下記する修正を加えて実施した：
【００４８】
ＨＩＶに特異的なＤＮＡ領域を増幅するために、ＭＶＰ−２９０１／９４感染血液リンパ球から得たゲノムＤＮＡ５μl （２００μｇ／ｍｌ）をピペットを用いて、１００μl の反応混合物（０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μＭの各プライマ−、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、０．００１％ゼラチン、２．５単位のＴａｑポリメラ−ゼ（パ−キン・エルマ−社））に加え、次の温度プログラムに従って増幅させた：１．初期変性：９５℃で３分間、２．増幅：９４℃で９０秒間、５６℃で６０秒間、７２℃で９０秒間（３０サイクル）。
【００４９】
このようなＰＣＲおよびヌクレオチド配列決定に用いたプライマ−は、バイオサ−チ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）８７５０オリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成したもので、かかる次の配列を有するものであった：
【００５０】
（配列識別番号３〜９）
５’                                                        ３’
２１２    ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＡＴＧ
２１４    ＴＴＴ  ＡＧＴ  ＴＡＴ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  Ｃ
４１２    ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＴＴＴ  ＴＡＣ  ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＧＴＡ
４２５    ＴＣＧ  ＧＴＡ  ＣＧＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＴＣＡ  Ｔ
４３１    ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＧＡ
４３８    ＡＡＣ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＴＡ
４４７    ＡＧＴ  ＡＧＴ  ＴＡＣ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＡＣＡ  ＴＧＧ
文献に記載されているプライマ−を用いても（ｐｏｌ３およびｐｏｌ４についの  Laure et al., Lancet ii, (1988) 538-541 及びｓｋ３８／３９、ｓｋ６８／６９についての Ou C. Y. et al., Science 239 (1988) 295-297）前記単離株を増幅することが可能でなかったので、既知配列から導かれかつ可能な限り強度に保存されている広範な種類の新規プライマ−を構築し、反応条件を変化させながら考え得る全ての組み合わせで使用した。驚くべきことに、単離株ＭＶＰ−５１８０／９１の配列から導いたプライマ−２１２と４１２との組合せにより、ＭＶＰ−２９０１／９４のＤＮＡを増幅させることが可能となり、かくしてこの分離株の配列について最初の手掛かりが得られることが明かとなったのである。
【００５１】
最初に増幅した試料の配列を決定した結果、ＭＶＰ−２９０１／９４に特異的であるプライマ−４２５および４３１を設計することが可能となった。かくして既知となった領域をさらに拡大するために、新規プライマ−を上記した基準に従って設計し、プライマ−４２５またはプライマ−４３１と組合せて使用した。次いでＭＶＰ−５１８０／９１から誘導したプライマ−２１４を４２５と組合せて使用することにより、３’方向の拡張が達成されまた５’方向の拡張は、４３１／４３８および４３１／４４７の組合せを用いて達成したが、プライマ−４３８および４４７は、殆どのＨＩＶ−１サブタイプにおいて保存されている領域から導いたものである。
【００５２】
増幅したＤＮＡを、３％”Nusieve”アガロ−スゲル（Biozyme社製）を用いて分画し、増幅された断片を切り出し、等量の緩衝液（１ｘＴＢＥ（０．０９Ｍｔｒｉｓ／瑙酸塩、０．００２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０) ）で処理した。このＤＮＡ／アガロ−ス混合物を７０℃で１０分間インキュベ−トし、その後フェノ−ルで抽出したのち、１／１０容量の３Ｍ  ＮａＡｃ、ｐＨ５．５および２容量のエタノ−ルを加えて、ＤＮＡを水相から−２０℃にて１５分間沈澱させ、エッペンドルフ遠心分離器でペレット化した（１３０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）。ペレット化したＤＮＡを乾燥し、水にとり、次いでベックマン分光光度計により２６０ｎｍで測光してＤＮＡ濃度を定量した後、サンガ−法(F. Sanger, Proc. Natl. Acad., 74:5436, 1977) により配列を決定した。クレノウＤＮＡポリメラ−ゼを用いて配列決定する代わりに、アプライド・バイオシステムズ社製のキット（"Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing" 、注文番号４０１１５０）を用いて、配列決定反応を行った。このＰＣＲに用いたプライマ−の一つを夫々の場合に個々の配列分析反応におけるプライマ−として使用した（各場合とも１μＭ）。この配列決定反応は、アプライド・バイオシステムズ社の３７３ＡＤＮＡシ−クエンサ−を用いてメ−カ−の指示に従って解析した。
【００５３】
増幅されたＤＮＡ領域のヌクレオチド配列及びそれから演竏されるアミノ酸配列を表１に示す（配列識別番号１０）。
（表１）
【００５４】
TABLE 1
TCAGGTAATATCTTAGTGACCCTAAATTCTACTATAAACATGACCTGCGTGAGGCCAGGA
1---------+---------+---------+---------+---------+---------+60
AGTCCATTATAGAATCACTGGGATTTAAGATGATATTTGTACTGGACGCACTCCGGTCCT
SGNILVTLNSTINMTCVRPG
AATAATCCAGTACAGGAGATAAGGATAGGTCCAATGGCTTGGTACAGTATGGGACTTGAG
61---------+---------+---------+---------+---------+---------+
TTATTAGGTCATGTCCTCTATTCCTATCCAGGTTACCGAACCATGTCATACCCTGAACTC
NNPVQEIRIGPMAWYSMGLE
AGAGGGTATACAAATAAATCAAGAATAGCTTATTGTGCCTATAATGTCACAAAATGGAAA
121---------+---------+---------+---------+---------+---------+
TCTCCCATATGTTTATTTAGTTCTTATCGAATAACACGGATATTACAGTGTTTTACCTTT
RGYTNKSRIAYCAYNVTKWK
GAAACCTTGCSSGGGATAGCTGAAAGGTATTTAGAACTTGTAAATTATTCAAGAAACATG
181---------+---------+---------+---------+---------+---------+
CTTTGGAACGTTCCCTATCGACTTTCCATAAATCTTGAACATTTAATAAGTTCTTTGTAC
ETLQGIAERYLELVNYSRNM
ACCATAACATTCAATAGCAGCATTGGTGGAGGAGATATAGAAGTAACCCGTTTGCATTTT
241---------+---------+---------+---------+---------+---------+
TGGTATTGTAAGTTATCGTCGTAACCACCTCCTCTATATCTTCATTGGGCAAACGTAAAA
TITFNSSIGGGDIEVTRLHF
AACTGTCATGGAGAATTCTTTTATTGTAACACAAGTCAAATGTTTAATTATACATTCAAA
301---------+---------+---------+---------+---------+---------+
TTGACAGTACCTCTTAAGAAAATAACATTGTGTTCAGTTTACAAATTAATATGTAAGTTT
NCHGEFFYCNTSQMFNYTFK
TGTAATAACTCCAAATGTAATACTCATAATGACAATAATACTTATGAGAACAGTACAAGA
361---------+---------+---------+---------+---------+---------+
ACATTATTGAGGTTTACATTATGAGTATTACTGTTATTATGAATACTCTTGTCATGTTCT
CNNSKCNTHNDNNTYENSTR
ATAATATATTGCCAGTTGAGACAGGTAGTAAGGTCATGGATGAGGGGAGGGTCAGGGCTC
421---------+---------+---------+---------+---------+---------+
TATTATATAACGGTCAACTCTGTCCATCATTCCAGTACCTACTCCCCTCCCAGTCCCGAG
IIYCOLRQVVRSWMRGGSGL
TATGCACCTCCTATCAGAGGTAATCTAACCTGCAATTCAAACATAACTGGATTGATTCTA
481---------+---------+---------+---------+---------+---------+
ATACGTGGAGGATAGTCTCCATTAGATTGGACGTTAAGTTTGTATTGACCTAACTAAGAT
YAPPIRGNLTCNSNITGLIL
CAAATGGATACACCATATAATAAAAGCTCCAACATCACATTTAGACCAATAGGAGGAGAT
541---------+---------+---------+---------+---------+---------+
GTTTACCTATGTGGTATATTATTTTCGAGGTTGTAGTGTAAATCTGGTTATCTCTCTCTA
CMDTPYNKAANITFRPIGGD
ATGAAGGATATATGGAGAACCCAAATGTAQCAATTACAAAGTAGTAAGGGTAAAATCTTTT
601---------+---------+---------+---------+---------+---------+
TACTTCCTATATACCTCTTGGGTTTACATGTTAATGTTTCATCATTCCCATTTTAGAAAA
MKDIWRTQMYNYKVVRVKSF
AGTGTAGCACCTACTAAGATTAGTAGACCAGTTATAGGCACTAACCATCAAAGAGAAAAA
661---------+---------+---------+---------+---------+---------+
TCACATCGTGGATGATTCTAATCATCTGGTCAATATCCGTGATTGGTAGTTTCTCTTTTT
SVAPTKISRPVIGTNHQREK
AGGGCAGTAGGATTGGGAATGCTATTCTTGGGGGTTCTAAGTGCAGGTAGCAGCACTATG
721---------+---------+---------+---------+---------+---------+
TCCCGTCATCCTAACCCTTACGATAAGAACCCCCAAGATTCACGTCGTCCATCGTGATAC
RAVGLGMLFLGVLSAAGSTM
GGCGCAGCGGGAGTAACGCTGTCGGTACGAACCCACTCATTAATGAGGGGTATAGTGCAA
781---------+---------+---------+---------+---------+---------+
CCGCGTCGCCCTCATTGCGACAGCCATGCTTGGGTGAGTAATTACTCCCCATATCACGTT
GAAGVTLSVRTHSLMRGIVQ
CAGCAGGACAACCTGCTGAGAGCAATACAGGCCCAGCAACATCTGCTGAGGTTATCTGTA
841---------+---------+---------+---------+---------+---------+
GTCGTCCTGTTGGACGACTCTCGTTATGTCCGGGTCGTTGTAGACGACTCCAATAGACAT
QQDNLLRAIQAQQHLLRLSV
TGGGGTATTAGACAACTCCGAGCTCGCCTGCAAGCCTTAGAAACCCTTATGCAGAATCAG
901---------+---------+---------+---------+---------+---------+
ACCCCATAATCTGTTGAGGCTCGAGCGGACGTTCGGAATCTTTGGGAATACGTCTTAGTC
WGIRQLRARLQALETLMQNQ
CAACTCCTAAACCTGTGGGGCTGTAAAGGAAAATTAATCTGCTACACATCAGTAAAATGG
961---------+---------+---------+---------+---------+---------+
GTTGAGGATTTGGACACCCCGACATTTCCTTTTAATTAGACGATGTGTAGTCATTTTACC
QLLNLWGCKGKLICYTSVKW
AACGAAACATGGGGAGGAAATCTCTCAATTTGGGACAGCTTAACATGGCA
1021---------+---------+---------+---------+---------+1070
TTGCTTTGTACCCCTCCTTTAGAGAGTTAAACCCTGTCGAATTGTACCGT
NETWGGNLSIWDSLTW
実施例３
【００５５】
単離株ＭＶＰ−２９０１／９４を他のＨＩＶ単離株から識別する方法
【００５６】
表１に示した、今回発見されたヌクレオチド配列につき、ＧＥＮＥＢＡＮＫデ−タベ−ス（Release 83, June 1994)及びＥＭＢＬデ−タベ−ス（Release 38March, 1994)において相同配列があるか否かを検索し、又同時にこのヌクレオチドから演竏されるタンパク質配列について、ＧＣＧコンピュ−タプログラム（Genetic Computer Group, Inc. Wisconsin USA, version 7.1, March 1992)を用いてＳＷＩＳＳＰＲＯＴタンパク質デ−タベ−ス（Release 28, February 1994)で検索した。これらのデ−タベ−スには、ヒト起源の免疫不全ウイルスおよび霊長類からの分離株について１９９４年７月にて既知となっているヌクレオチド配列の大半が包含されている。
【００５７】
表１のヌクレオチド配列は最善の場合で、ＨＩＶ−１サブタイプＯの一つの分離株と７９．６％の相同性を有しているのであるが、他のＨＩＶ−１サブタイプとの最善の相同性は５９．６％である。表１のＤＮＡは、ＨＩＶ−２分離株との相同性がせいぜい５１．６％である。
【００５８】
表１のアミノ酸配列は最善の場合で、ＨＩＶ−１サブタイプＯの代表的な株の相応する外被タンパク質区画との相同性が２．７％であり、またＨＩＶ−１分離株ＨＩＶ−１−Ｍａｌとの相同性は最善の場合でも５２．１％である。表１のアミノ酸配列は、ＨＩＶ−２外被タンパク質（ＨＩＶ−２ＲＯＤ分離株）とは相同性がせいぜい３７．０％である。
【００５９】
【表２】
2006008653.tif 000002
【００６０】
相同性比較の結果に基づくと、ＭＶＰ−２９０１／９４は、これまで暫定的にＨＩＶ−１サブタイプＯと称されてきた２つの分離株ＭＶＰ−５１８０／９１およびＡＮＴ７０に極めて類似している。しかしながら、これら２つの分離株に関しては、ヌクレオチドレベルで少なくとも２０．９％またタンパク質レベルで少なくとも２７．３％という比較的大きい配列異常が存在している。
【００６１】
本発明は従って、組換え技術によりまたは合成により調製可能でありかつ表１に記載した配列またはその構成成分配列を有するペプチドに関する。なお前記構成成分配列は、少なくとも１０個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも２０個また特に好ましくは少なくとも２５個の連続したアミノ酸を有するものであるとする。
【００６２】
本発明は従って、ウイルス、ＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびそれらの構成成分配列であって、表１に記載された配列との相同性が、診断上該当する遺伝子座を基準として少なくとも表３において％数値で表した割合だけ相違するような前記ウイルス、ＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびそれらの構成成分配列に関する。
【００６３】
（表３）
遺伝子座を基準とした相同性、タンパク質配列における最大の差として表示。
遺伝子座    差     好ましい差    特に好ましい差
ＥＮＶ             ２５％ １５％        １０％
【００６４】
ＥＮＶ領域は、表１にヌクレオチド配列としてまたアミノ酸配列として示した診断上該当する外被タンパク質領域である。
【００６５】
表３において％値で示した相同性数値は、表１のタンパク質配列を他のウイルス由来の配列と比較した場合、多くとも上記した百分率に相当する配列割合のみが相違していることが許容されることを意味している。
【００６６】
実施例４
【００６７】
ＭＶＰ−２９０１／９４に関する血清学的デ−タ
【００６８】
本ウイルスが持つ血清学的診断法上の重要性を評価するために、２９０１に感染した患者に由来する血清試料を市販の種々の抗ＨＩＶ−１／２スクリ−ニング試験器で検査した。
【００６９】
これらの検討の結果を表４に示す。
【表４】
2006008653.tif 000003
【００７０】
表４から明らかなように、市販試験キットのいずれもこの試料を検出するこよはない。これとは逆に一つのアミノ酸を除いて（ＮＱＱＬＬの代わりにＮＱＱＲＬ）２９０１の配列に相当するペプチド（ＮＱＱＲＬＮＬＷＧＣＫＧＫＬＩＣＹＴＳＶＫＷＮ）を固相抗原として使用しまたEnzygnost抗ＨＩＶ−１／２試薬を液体試薬として使用する新らしいＥＬＩＳＡを用いると、かかる試料は容易に検出される。例えばPasteur製などの市販のウェスタンブロット材は、このようなＭＶＰ−２９０１／９４試料（図示していない）を検出することはない。従って、このようなウエスタンブロット材は、ＭＶＰ−２９０１／９４感染症に由来する資料については間違って陰性の結果を与えることは極めて可能性が高いであろう。
【００７１】
表１に記載したアミノ酸配列の内で特に好ましい領域は、アミノ酸配列ＮＱＱＬＬ・・・から開始する領域である（この領域は、表１において用いた名数法に従えば、ヌクレオチド１０１０のところから概略始まる）。
【００７２】
実施例４の結果から、本発明に係わるかかる開示を診断法に利用するために、アミノ酸配列に僅かな変更を幾つか加えても、相応する試験が有する診断上の関連性に有害な影響を及ぼすことはないことが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ＨＩＶタイプレトロウイルスのゲノムの構成を示す。
【図１】
2006008653.tif 000004
【配列表】
2006008653000001.app