(57)【要約】【課題】  生体組織補填体の出荷時における簡易な測定により、十分に活性を備えた生体組織補填体を出荷することを可能にする。【解決手段】  生体組織補填材に細胞を付着させて培養された生体組織補填体内における細胞数、アルカリフォスファターゼの活性およびオステオカルシンの産生量をそれぞれ測定するステップＳ２１，Ｓ３１，Ｓ４１と、測定された細胞数、アルカリフォスファターゼの活性およびオステオカルシンの産生量が所定値以上または陽性であるか否かを判断するステップＳ２２，Ｓ３２，Ｓ４２と、細胞数が所定値以上であり、アルカリフォスファターゼの活性が所定値以上または陽性であり、かつ、オステオカルシンの産生量が陽性である場合に培養終了を判断するステップＳ５とを備える生体組織補填体の検査方法を提供する。【選択図】    図１
2006204173.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織補填材に細胞を付着させて培養された生体組織補填体内における細胞数、アルカリフォスファターゼの活性およびオステオカルシンの産生量をそれぞれ測定するステップと、
測定された細胞数、アルカリフォスファターゼの活性およびオステオカルシンの産生量が所定値以上または陽性であるか否かを判断するステップと、
細胞数が所定値以上であり、アルカリフォスファターゼの活性が所定値以上または陽性であり、かつ、オステオカルシンの産生量が陽性である場合に培養終了を判断するステップとを備える生体組織補填体の検査方法。
【請求項２】
前記細胞数の測定を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロマイド（ＭＴＴ）法、ＷＳＴ−１法あるいはＷＳＴ−８法によるホルマザンの検出により行う請求項１に記載の生体組織補填体の検査方法。
【請求項３】
アルカリフォスファターゼの活性の測定を、生体組織補填体中のアルカリフォスファターゼをｐ−ニトロフェニルリン酸基質法によるｐ−ニトロフェノールの検出により行う請求項１または請求項２に記載の生体組織補填体の検査方法。
【請求項４】
アルカリフォスファターゼの活性の測定が、ＥＩＡ法による培地上清中のアルカリフォスファターゼに対して行われる請求項１または請求項２に記載の生体組織補填体の検査方法。
【請求項５】
オステオカルシンの産生量の測定がＥＩＡ法により行われる請求項１から請求項４のいずれかに記載の生体組織補填体の検査方法。
【請求項６】
Hoechst３３２５８を利用した測定法によりＤＮＡ量を測定し、測定されたアルカリフォスファターゼの活性およびオステオカルシンの産生量をＤＮＡ量で補正する請求項１から請求項５のいずれかに記載の生体組織補填体の検査方法。
【請求項７】
細胞数、アルカリフォスファターゼの活性、オステオカルシンの産生量およびＤＮＡ量の測定に際し、検量用のサンプルに、細胞の付着していない生体組織補填材を導入する請求項１から請求項６のいずれかに記載の生体組織補填体の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、生体組織補填体の検査方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
培養されている生体組織、例えば、間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化しているか否かを示す指標として、従来、骨芽細胞が分泌するアルカリフォスファターゼおよびオステオカルシンが用いられている（例えば、非特許文献１参照。）。
アルカリフォスファターゼの活性は、間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化する過程において経時的に上昇していくが、ある時点でピークを迎え、その後減少していくことが知られている。一方、オステオカルシンは、骨芽細胞が産生すると考えられており、その産生量は、アルカリフォスファターゼに遅れて増加する。
【非特許文献１】吉川隆章、生体材料、vol.19、27-33、2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
その発生の時期の相違から、アルカリフォスファターゼの量が減少しても、オステオカルシンの量が増加していることがあり、一概にアルカリフォスファターゼの量のみによって骨芽細胞への十分な分化を判断することは困難である。また、オステオカルシンの量が十分に多い場合においても、細胞のいくつかが大量のオステオカルシンを産生しているに過ぎない場合もあり、生体組織補填体として十分な活性を備えているか否かを判断することが困難であった。
【０００４】
アルカリフォスファターゼの量およびオステオカルシンの量の変化を長時間にわたり経時的に測定していき、その変化の推移から、十分に活性を備えた生体組織補填体として最適な状態となる時点を推定して出荷することも考えられる。しかし、検査に要する時間、サンプル作製などの検査に要する費用を考慮すると現実的な手段ではない。
【０００５】
この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体組織補填体の出荷時における簡易な測定により、十分に活性を備えた生体組織補填体を出荷することを可能にする生体組織補填体の検査方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、生体組織補填材に細胞を付着させて培養された生体組織補填体内における細胞数、アルカリフォスファターゼの活性およびオステオカルシンの産生量をそれぞれ測定するステップと、測定された細胞数、アルカリフォスファターゼの活性およびオステオカルシンの産生量が所定値以上または陽性であるか否かを判断するステップと、細胞数が所定値以上であり、アルカリフォスファターゼの活性が所定値以上または陽性であり、かつ、オステオカルシンの産生量が陽性である場合に培養終了を判断するステップとを備える生体組織補填体の検査方法を提供する。
【０００７】
本発明によれば、アルカリフォスファターゼの活性に加えて細胞数が測定され、さらにオステオカルシンの産生量が測定され、それらがそれぞれ所定値を超えたこと、あるいは活性あるいは産生量が陽性であることを条件として培養を終了することが判断される。その結果、少ない数の細胞が大量のアルカリフォスファターゼを分泌しているような場合や、アルカリフォスファターゼの活性は低いが、オステオカルシンの産生量が十分に多い場合には、細胞の活性が十分であると判断することができ、しかも、十分な数の細胞が存在しているために、補填後に十分な生体組織形成作用を生じ得る生体組織補填体を出荷することが可能となる。
【０００８】
アルカリフォスファターゼの活性あるいはオステオカルシンの産生量が陽性であるとは、２回の検査を行い、活性あるいは産生量が増加していることを示す。アルカリフォスファターゼの活性やオステオカルシンの産生量は個人差が大きく、規定値を設けることが困難な場合があるが、そのような場合においても、活性あるいは産生量の増加傾向を見ることにより、出荷判断を行うことが可能となる。
また、アルカリフォスファターゼの活性あるいはオステオカルシンの産生量を長時間にわたり経時的な測定を行うことなく、出荷時等に短時間に判断することができるので、検査のコストや手間を省くことが可能となる。
【０００９】
上記発明においては、前記細胞数の測定を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロマイド（ＭＴＴ）法、ＷＳＴ−１法あるいはＷＳＴ−８法によるホルマザンの検出により行うこととしてもよい。
また、上記発明においては、アルカリフォスファターゼの活性の測定を、生体組織補填体中のアルカリフォスファターゼをｐ−ニトロフェニルリン酸基質法によるｐ−ニトロフェノールの検出により行うこととしてもよい。
また、アルカリフォスファターゼの活性の測定が、ＥＩＡ法による培地上清中のアルカリフォスファターゼに対して行われることとしてもよい。
さらに、オステオカルシンの産生量の測定がＥＩＡ法により行われることとしてもよい。
【００１０】
また、上記発明においては、Hoechst３３２５８を利用した測定法によりＤＮＡ量を測定し、測定されたアルカリフォスファターゼの活性およびオステオカルシンの産生量をＤＮＡ量で補正することが好ましい。
このようにすることで、単位ＤＮＡ量当たりのアルカリフォスファターゼの活性またはオステオカルシンの産生量を用いて評価することが可能となり、例えば、生体組織補填体の形状に基づくアルカリフォスファターゼの活性およびオステオカルシンの産生量のバラツキが評価に与える影響を抑制することができる。
【００１１】
また、上記発明においては、細胞数、アルカリフォスファターゼの活性、オステオカルシンの産生量およびＤＮＡ量の測定に際し、検量用のサンプルに、細胞の付着していない生体組織補填材を導入することが好ましい。
生体組織補填体における細胞数、アルカリフォスファターゼの活性、オステオカルシンの産生量およびＤＮＡ量の測定条件と、検量用のサンプルにおける細胞数、アルカリフォスファターゼの活性、オステオカルシンの産生量およびＤＮＡ量の測定条件とを一致させることで、生体組織補填材の存在の有無による測定値と検量線との誤差を低減することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、生体組織補填体の出荷時における簡易な測定により、十分に活性を備えた生体組織補填体を出荷することできるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の検査方法について、図１の参照して説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の検査方法は、例えば、骨髄間葉系幹細胞をリン酸カルシウム多孔体のような生体組織補填材に付着させて所定期間培養した培養骨の検査方法である。
【００１４】
この検査方法は、図１に示されるように、生体組織補填体のＤＮＡ量を測定するステップＳ１と、生細胞数を判定するステップＳ２と、アルカリフォスファターゼ（以下、ＡＬＰと言う。）の活性を判定するステップＳ３と、オステオカルシン（以下、ＯＣと言う。）の産生量を判定するステップＳ４と、上記ステップＳ２〜Ｓ４が所定の条件を満たしている場合に移植可能であると判定するステップＳ５とを直列に備えている。
【００１５】
ＤＮＡ量の測定ステップＳ１は、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８を利用して行われる。
生細胞数を判定するステップＳ２は、生細胞数を測定するステップＳ２１と、生細胞数が所定数（例えば、１０７個）以上であるか否かを判断するステップＳ２２と、所定数より少ない場合に、測定が１回目の場合には培養を継続させ（ステップＳ２３）、測定が２回目である場合には、移植できないと判定するステップＳ２４，Ｓ２５とを備えている。
生細胞数の測定ステップＳ２１は、例えば、ＭＴＴ法、ＷＳＴ−１法またはＷＳＴ−８法を用いて行われる。
【００１６】
ＡＬＰ活性を判定するステップＳ３は、ＡＬＰ活性を測定するステップＳ３１と、ＤＮＡ量で補正したＡＬＰ活性が所定値（例えば、０．６ｕｎｉｔｓ／μｇＤＮＡ）以上であるか否かを判断するステップＳ３２と、所定値より小さい場合に、測定が１回目の場合には培養を継続させ（ステップＳ３３）、測定が２回目である場合には、移植できないと判定するステップＳ３４，Ｓ３５とを備えている。
ＡＬＰ活性の測定ステップＳ３１は、例えば、ニトロフェニルリン酸基質法またはサンドイッチ酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）により行われる。
【００１７】
ＯＣ産生量を判定するステップＳ４は、ＯＣ産生量を測定するステップＳ４１と、ＯＣ産生量が陽性であるか否かを判断するステップＳ４２と、所定値より小さい場合に、測定が１回目の場合には培養を継続させ（ステップＳ４３）、測定が２回目である場合には、移植できないと判定するステップＳ４４，Ｓ４５とを備えている。
ＯＣ産生量の測定ステップＳ４１は、例えば、サンドイッチ酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）により行われる。
【００１８】
また、本実施形態においては、これらのＤＮＡ量、細胞数、ＡＬＰ活性およびＯＣ産生量の測定において検量線法を用いる際に、検量用サンプルに、細胞を導入していない上記と同一の生体組織補填材を加えて測定する。
【００１９】
このように構成される本実施形態に係る生体組織補填体の検査方法によれば、ＡＬＰ活性のみならずＯＣ産生量および細胞数に基づいて生体組織補填材が移植可能であるか否かが判断される。したがって、生体組織補填体の出荷時における簡易な測定により、十分に活性を備えた生体組織補填体を出荷することが可能となる。
【００２０】
また、本実施形態に係る生体組織補填体の検査方法によれば、検量用サンプルに細胞を導入していない生体組織補填材を加えて測定するので、各検査法において生じた物質が生体組織補填材に吸収されるために検量線と実際の生体組織補填体に対する測定結果との間に生ずる誤差を低減することができる。その結果、正確な測定値を得ることができるという利点がある。
【００２１】
また、オステオカルシンについては生体組織補填材に吸着してしまうために、その産生量の測定値を正確に出すことができない不都合がある。本実施形態に係る検査方法によれば、コントロールとして、例えば、骨分化前の細胞を用意し、分化前の細胞とＯＣ産生量を比較し、分化前の細胞よりも多ければ陽性とすることで、絶対量ではなく相対量として判断することができる。その結果、ＯＣ産生量を出荷判定の基準とすることができる。
【００２２】
さらに、本実施形態に係る生体組織補填体の検査方法によれば、ＡＬＰ活性の判定ステップＳ３２において、ＡＬＰ活性をＤＮＡ量によって補正した値を用いて判定しているので、単位ＤＮＡ量当たりのＡＬＰ活性を判断することができ、例えば、生体組織補填体の形状のバラツキによる影響を抑制することができるという利点がある。
【００２３】
なお、本実施形態においては、ＡＬＰ活性の判定ステップＳ３２において、ＡＬＰ活性が所定値、例えば、０．６ｕｎｉｔｓ／μｇＤＮＡ以上の場合に十分なＡＬＰ活性があると判定しているが、これに代えて、ＯＣ産生量の判定ステップＳ４２と同様に、ＡＬＰ活性が、コントロールに対して陽性であるか否かにより判定することにしてもよい。
【００２４】
以下に、本実施形態に係る生細胞数、ＡＬＰ活性、ＯＣ産生量およびＤＮＡ量の測定方法の具体的な手順について説明する。
＜ＷＳＴ−８法による生体組織補填材内の生細胞数測定方法＞
Ａ  材料
材料として、以下のものを用意する。
１．培養骨調製時（βリン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）多孔体への播種時）に使用する間葉系幹細胞（未分化または分化後）
２．間葉系幹細胞培養培地［Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) +10%Fetal Bovine Serum(FBS) + 50μg／ml gentamicin + 250ng/ml amphotercin B +
10ng/ml
basic Fibroblast Growth Factor(bFGF) + 50μg/ml L-ascorbic acid phosphate
magnesium salt n-hydrate(Asc-P)］、骨分化培地［DMEM + 10%FBS + 50μg／ml gentamicin + 250ng/ml amphotercin B +
50μg/ml
Asc-P + 10mmol/l
β-glycerophosphate(GP) + 10-7mol/l dexamethasone(DEX)］、0.05% trypsin-0.53mmol/l Ethylene
Diamine Tetraacetic Acid solution（トリプシン溶液）、Dulbecco's Phosphate-Buffered
Saline(PBS)，0.4% trypan blue
solution（トリパンブルー溶液）
３．各種ピペット、６，１２，９６ウェル組織培養用マイクロプレート、１５ml遠心チューブ、ＴＡＴＡＩ式血球計数盤、ピンセット
４．同仁化学研究所製のCell Counting Kit-8(CCK-8)
５．β−ＴＣＰ多孔体ブロック5mm×5mm×５mm
６．プレートミキサー［OPM-103、アズワン株式会社製］、遠心分離機（５２００，株式会社久保田製作所製）、マイクロプレートリーダ（Synergy HT, Bio-Tek社製）
【００２５】
Ｂ  方法
（１）検量線作成
１．培養骨調製時に使用する間葉系幹細胞を培地に懸濁し、細胞密度が2.0×10５cell/mlになるように細胞懸濁液を調製する。
２．培地２mlずつを10mlピペットで６枚の６ウェルマイクロプレートの全てのウェルに分注する（プレートにそれぞれＮｏ．１−１，１−２，２−１，２−２，３，４と記す。）
３．プレートＮｏ．１−１，２−１，３の３つのウェルに１．で調製した細胞懸濁液をそれぞれ２mlずつ５mlピペットで分注する。
４．３．で細胞懸濁液を分注されたウェルを１０００μlマイクロピペットでピペッティングした後、細胞懸濁液2mlずつを同じプレートの他のウェルに5mlピペットで分注する。
５．４．でプレートＮｏ．１−１，２−１で細胞懸濁液を分注されたウェルを１０００μlマイクロピペットでピペッティングした後、細胞懸濁液2mlずつをプレートＮｏ．１−２，２−２の３つのウェルに５mlピペットで分注する。
６．５．で細胞懸濁液を分注されたウェルを１０００μlマイクロピペットでピペッティングした後、細胞懸濁液2mlずつを同じプレートの他のウェルに5mlピペットで分注する。
７．全てのプレートをＣＯ２インキュベータに入れ、２４時間培養する。
８．プレートＮｏ．１−１，１−２，２−１，２−２，４を取り出し、ＣＣＫ−８  200μlずつを１０００μlマイクロピペットで分注する。
９．プレートＮｏ．２−１，２−２の全てのウェルとＮＯ．４の３つのウェルにβ−ＴＣＰ多孔体ブロックを１個ずつピンセットで入れる。
１０．プレートＮｏ．１−１，１−２，２−１，２−２，４をＣＯ２インキュベータに入れ、２時間培養する。
１１．プレートＮｏ．３を取り出し、全てのウェルから培地をパスツールピペットで吸引する。
１２．ＰＢＳ2mlずつを10mlピペットでプレートＮｏ．３の全てのウェルに分注し、洗浄する。
１３．全てのウェルからＰＢＳをパスツールピペットで吸引する。
１４．トリプシン溶液500μlずつを１０００μlマイクロピペットで全てのウェルに分注する。
１５．プレートＮｏ．３をＣＯ２インキュベータに入れ、３分間培養する。
１６．プレートＮｏ．３を取り出し、培地500μlずつを１００μlマイクロピペットで９６ウェルマイクロプレートに分注する。
１７．全てのウェルを１０００μlマイクロピペットでピペッティングして接着していた細胞を剥がした後、細胞懸濁液50μlずつを１００μlマイクロピペットで９６ウェルマイクロプレートに分注する。
１８．９６ウェルマイクロプレートの細胞懸濁液を入れた全てのウェルにトリパンブルー液50μlずつを100μlマイクロピペットで分注する。
１９．細胞懸濁液とトリパンブルー液を入れたウェルを100μlマイクロピペットでピペッティングした後、ＴＡＴＡＩ式血球計数盤を使用して細胞懸濁液中の細胞数を計数する。
２０．プレートＮｏ．１−１，１−２，２−１，２−２，４を取り出し、冷蔵庫に１０分間入れ、反応を停止させる。
２１．ウェルに入っている全てのβ−ＴＣＰ多孔体ブロックをスパーテルで粉々にする。
２２．全てのプレートをプレートミキサーに載せ、プレートミキサーを１０分間使用して形成されたホルマザンを溶解させる。
２３．β−ＴＣＰ多孔体ブロックの入っていない全てのウェルから上清100μlずつを100μlマイクロピペットで９６ウェルマイクロプレートに分注する。
２４．β−ＴＣＰ多孔体ブロックの入った全てのウェルから上清を１０００μlマイクロピペットで15ml遠心チューブに全て分注する。
２５．遠心分離機に全ての遠心チューブを入れ、遠心分離を行う(2500rpm、３分間)。
２６．全ての遠心チューブから上清100μlずつを100μlマイクロピペットで２３．の９６ウェルマイクロプレートに分注する。
２７．マイクロプレートリーダに２６．の９６ウェルマイクロプレートを置き、吸光度(450nm)を測定する。
２８．２７．で得られた吸光度と、１９．で得られた生細胞数とから、β−ＴＣＰ多孔体ブロックを入れた場合と入れない場合の両方について検量線を作成する。
【００２６】
（２）β−ＴＣＰ多孔体ブロックに播種した細胞の生細胞数測定
１．調製した培養骨を１２ウェルマイクロプレートのウェルにピンセットで入れる。
２．１．培養骨の入ったウェルに培地2mlずつを5mlピペットで分注する。
３．２．の培養骨と培地を入れたウェルにＣＣＫ−８  200μlずつを1000μlマイクロピペットで分注する。
４．プレートをＣＯ２インキュベータに入れ、２時間培養する。
５．プレートを取り出し、冷蔵庫に１０分間入れ、反応を停止させる。
６．ウェルに入っている培養骨をスパーテルで粉々にする。
７．プレートをプレーミキサーに載せ、プレートミキサーを１０分間使用して形成されたホルマザンを溶解させる。
８．ウェルから上清を1000μlマイクロピペットで遠心チューブに全て分注する。
９．遠心分離機に全ての遠心チューブを入れ、遠心分離を行う(2500rpm，３分間)。
１０．遠心チューブから上清100μlずつ1000μlマイクロピペットで（１）−２３．の９６ウェルマイクロプレートに分注する。
１１．マイクロプレートリーダに１０．の９６ウェルマイクロプレートを置き、吸光度（450nm）を測定する。
１２．得られた吸光度を検量線に照らし合わせ、β−ＴＣＰ多孔体ブロック内に存在した生細胞数を算定する。
【００２７】
＜ＭＴＴ法による生体組織補填材内の生細胞数測定方法＞
Ａ  材料
材料として、以下のものを用意する。
１．培養骨調製時（β−ＴＣＰ多孔体ブロックへの播種時）に使用する間葉系幹細胞（未分化または分化後）
２．間葉系幹細胞培養培地［DMEM +10%FBS + 50μg／ml gentamicin + 250ng/ml amphotercin B +
10ng/ml
bFGF + 50μg/ml
Asc-P］、骨分化培地［DMEM + 10%FBS + 50μg／ml gentamicin + 250ng/ml amphotercin B +
50μg/ml
Asc-P + 10mmol/l
GP + 10-7mol/l DEX］、トリプシン溶液、PBS，トリパンブルー溶液
３．各種ピペット、６，１２，９６ウェル組織培養用マイクロプレート、１５ml遠心チューブ、ＴＡＴＡＩ式血球計数盤、ピンセット
４．ＭＴＴ溶液（ＭＴＴ100mgを20mlPBS中に溶かして5mg/mlに調製し、ろ過滅菌したもの）、ＭＴＴ抽出液（dimethyl sulfoxide）
５．β−ＴＣＰ多孔体ブロック5mm×5mm×５mm
６．プレートミキサー［OPM-103、アズワン株式会社製］、遠心分離機（５２００，株式会社久保田製作所製）、マイクロプレートリーダ（Synergy HT, Bio-Tek社製）
【００２８】
Ｂ  方法
（１）検量線作成
１．培養骨調製時に使用する間葉系幹細胞を培地に懸濁し、細胞密度が2.0×１０５cell/mlになるように細胞懸濁液を調製する。
２．培地２mlずつを10mlピペットで６枚の６ウェルマイクロプレートの全てのウェルに分注する（プレートにそれぞれＮｏ．１−１，１−２，２−１，２−２，３，４と記す。）
３．プレートＮｏ．１−１，２−１，３の３つのウェルに１．で調製した細胞懸濁液をそれぞれ２mlずつ５mlピペットで分注する。
４．３．で細胞懸濁液を分注されたウェルを１０００μlマイクロピペットでピペッティングした後、細胞懸濁液2mlずつを同じプレートの他のウェルに5mlピペットで分注する。
５．４．でプレートＮｏ．１−１，２−１で細胞懸濁液を分注されたウェルを１０００μlマイクロピペットでピペッティングした後、細胞懸濁液2mlずつをプレートＮｏ．１−２，２−２の３つのウェルに５mlピペットで分注する。
６．５．で細胞懸濁液を分注されたウェルを１０００μlマイクロピペットでピペッティングした後、細胞懸濁液2mlずつを同じプレートの他のウェルに5mlピペットで分注する。
７．全てのプレートをＣＯ２インキュベータに入れ、２４時間培養する。
８．プレートＮｏ．１−１，１−２，２−１，２−２，４を取り出し、ＭＴＴ溶液200μlずつを１０００μlマイクロピペットで分注する。
９．プレートＮｏ．２−１，２−２の全てのウェルとＮＯ．４の３つのウェルにβ−ＴＣＰ多孔体ブロックを１個ずつピンセットで入れる。
１０．プレートＮｏ．１−１，１−２，２−１，２−２，４をＣＯ２インキュベータに入れ、４時間培養する。
１１．プレートＮｏ．３を取り出し、全てのウェルから培地をパスツールピペットで吸引する。
１２．ＰＢＳ2mlずつを10mlピペットでプレートＮｏ．３の全てのウェルに分注し、洗浄する。
１３．全てのウェルからＰＢＳをパスツールピペットで吸引する。
１４．トリプシン溶液500μlずつを１０００μlマイクロピペットで全てのウェルに分注する。
１５．プレートＮｏ．３をＣＯ２インキュベータに入れ、３分間培養する。
１６．プレートＮｏ．３を取り出し、培地500μlずつを１００μlマイクロピペットで９６ウェルマイクロプレートに分注する。
１７．全てのウェルを１０００μlマイクロピペットでピペッティングして接着していた細胞を剥がした後、細胞懸濁液50μlずつを１００μlマイクロピペットで９６ウェルマイクロプレートに分注する。
１８．９６ウェルマイクロプレートの細胞懸濁液を入れた全てのウェルにトリパンブルー液50μlずつを100μlマイクロピペットで分注する。
１９．細胞懸濁液とトリパンブルー液を入れたウェルを100μlマイクロピペットでピペッティングした後、ＴＡＴＡＩ式血球計数盤を使用して細胞懸濁液中の細胞数を計数する。
２０．プレートＮｏ．１−１，１−２，２−１，２−２，４を取り出し、全てのウェルから培地をパスツールピペットで吸引する。
２１．全てのウェルにＭＴＴ抽出液2mlずつを1000μlマイクロピペットで分注する。
２２．ウェルに入っている全てのβ−ＴＣＰ多孔体ブロックをスパーテルで粉々にする。
２３．全てのプレートをプレートミキサーに載せ、プレートミキサーを１０分間使用して形成されたホルマザンを溶解させる。
２４．β−ＴＣＰ多孔体ブロックの入っていない全てのウェルから上清100μlずつを100μlマイクロピペットで９６ウェルマイクロプレートに分注する。
２５．β−ＴＣＰ多孔体ブロックの入った全てのウェルから上清を１０００μlマイクロピペットで15ml遠心チューブに全て分注する。
２６．遠心分離機に全ての遠心チューブを入れ、遠心分離を行う(2500rpm、３分間)。
２７．全ての遠心チューブから上清100μlずつを100μlマイクロピペットで２４．の９６ウェルマイクロプレートに分注する。
２８．マイクロプレートリーダに２７．の９６ウェルマイクロプレートを置き、吸光度(540nm)を測定する。
２９．２８．で得られた吸光度と、１９．で得られた生細胞数とから、β−ＴＣＰ多孔体ブロックを入れた場合と入れない場合の両方について検量線を作成する。
【００２９】
（２）β−ＴＣＰ多孔体ブロックに播種した細胞の生細胞数測定
１．調製した培養骨を１２ウェルマイクロプレートのウェルにピンセットで入れる。
２．１．培養骨の入ったウェルに培地2mlずつを5mlピペットで分注する。
３．２．の培養骨と培地を入れたウェルにＭＴＴ溶液200μlずつを1000μlマイクロピペットで分注する。
４．プレートをＣＯ２インキュベータに入れ、４時間培養する。
５．プレートを取り出し、全てのウェルから培地をパスツールピペットで吸引する。
６．ウェルにＭＴＴ抽出液2mlずつを1000μlマイクロピペットで分注する。
７．ウェルに入っている培養骨をスパーテルで粉々にする。
８．プレートをプレーミキサーに載せ、プレートミキサーを１０分間使用して形成されたホルマザンを溶解させる。
９．ウェルから上清を1000μlマイクロピペットで遠心チューブに全て分注する。
１０．遠心分離機に全ての遠心チューブを入れ、遠心分離を行う(2500rpm，３分間)。
１１．遠心チューブから上清100μlずつ1000μlマイクロピペットで（１）−２４．の９６ウェルマイクロプレートに分注する。
１１．マイクロプレートリーダに１１．の９６ウェルマイクロプレートを置き、吸光度（540nm）を測定する。
１２．得られた吸光度を検量線に照らし合わせ、β−ＴＣＰ多孔体ブロック内に存在した生細胞数を算定する。
【００３０】
＜ニトロフェニルリン酸基質法による生体組織補填材内のＡＬＰ活性測定方法＞
Ａ  材料
材料として、以下のものを用意する。
１．培養骨調製時（β−ＴＣＰ多孔体ブロックへの播種時）に使用する間葉系幹細胞（未分化または分化後）
２．間葉系幹細胞培養培地［DMEM +10%FBS + 50μg／ml gentamicin + 250ng/ml amphotercin B +
10ng/ml
bFGF + 50μg/ml
Asc-P］、骨分化培地［DMEM + 10%FBS + 50μg／ml gentamicin + 250ng/ml amphotercin B +
50μg/ml
Asc-P + 10mmol/l
GP + 10-7mol/l DEX］、トリプシン溶液、PBS，トリパンブルー溶液
３．各種ピペット、８連マイクロピペット、６，１２，９６ウェル組織培養用マイクロプレート、１５ml遠心チューブ、ＴＡＴＡＩ式血球計数盤、ピンセット、セルスクレイパー、1.5ml遠心チューブ、ホモジナイザー
４．和光純薬工業社製のラボアッセイALP、ALP
Lysis Buffer（2mmol/l塩化マグネシウム-０．０５％Triton X-100溶液）
５．β−ＴＣＰ多孔体ブロック5mm×5mm×５mm
６．プレートミキサー［OPM-103、アズワン株式会社製］、遠心分離機（５２００，株式会社久保田製作所製）、冷却遠心分離機、マイクロプレートリーダ（Synergy HT, Bio-Tek社製）
【００３１】
Ｂ  方法
（１）検量線作成
１．ラボアッセイALPのキットに含まれる標準液（0.5mMｐ-ニトロフェノール溶液）をPBSで希釈し、検量線用の標準液希釈系（×１，２，４，８）を作成する。
２．ラボアッセイALPのキットに含まれる基質錠（ｐ-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム）を基質溶解液（２mM塩化マグネシウム含有0.1M炭酸塩緩衝液、pH9.8）に溶解し、基質緩衝液(6.7mMｐ-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム)を作成する。
３．基質緩衝液100μlずつを８連マイクロピペットで９６ウェルマイクロプレートに分注する。
４．各標準液20μlずつを100μlマイクロピペットで９６ウェルマイクロプレートに分注した基質緩衝液中に分注する。
５．９６ウェルマイクロプレートをＣＯ２インキュベータに入れ、１５分間放置する。
６．９６ウェルマイクロプレートを取り出し、反応停止液（0.2mmol/l水酸化ナトリウム）80μlずつを８連マイクロピペットでマイクロプレートに添加する。
７．プレートミキサーを用いて９６ウェルマイクロプレートを１分間攪拌する。
８．マイクロプレートリーダに７．の９６ウェルマイクロプレートを置き、吸光度（405nm）を測定する。
【００３２】
（２）β−ＴＣＰ多孔体ブロックに播種した細胞のＡＬＰ活性測定
１．ラボアッセイALPのキットに含まれる基質錠（ｐ-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム）を基質溶解液（２mM塩化マグネシウム含有0.1M炭酸塩緩衝液、pH9.8）に溶解し、基質緩衝液(6.7mMｐ-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム)を作成する。
２．基質緩衝液100μlずつを８連マイクロピペットで９６ウェルマイクロプレートに分注する。
３．調製した培養骨およびβ−ＴＣＰ多孔体ブロック単体を１２ウェルマイクロプレートのウェルにピンセットで入れる。
４．３．の培養骨およびβ−ＴＣＰ多孔体ブロックの入ったウェルにＰＢＳ2mlずつを5mlピペットで分注し、培養骨を洗浄する。
５．ＰＢＳをパスツールピペットで吸引する。
６．培養骨およびβ−ＴＣＰ多孔体ブロックを1.5ml遠心チューブにピンセットで移し、ALP Lysis Buffer 500μlを1000μlマイクロピペットで分注する。
７．培養骨およびβ−ＴＣＰ多孔体ブロックをホモジナイザーで粉々にする。
８．得られたサンプルを３回凍結融解する。
９．サンプルを1000μlマイクロピペットでピペッティングした後、冷却遠心分離機に1.5ml遠心チューブを入れ、遠心分離を行う（10000rpm，２分間）。
１０．1.5ml遠心チューブから上清全てを1000μlマイクロピペットで1.5ml遠心チューブに分注する。
１１．1.5ml遠心チューブを冷却遠心分離機に入れ、遠心分離を行う（10000rpm，２分間）。
１２．1.5ml遠心チューブから上清20μlを1000μlマイクロピペットで９６ウェルマイクロプレートに分注した基質緩衝液中に分注する。
１３．９６ウェルマイクロプレートをＣＯ２インキュベータに入れ、１５分間放置する。
１４．９６ウェルマイクロプレートを取り出し、反応停止液（0.2mmol/l水酸化ナトリウム）80μlずつを８連マイクロピペットでマイクロプレートに添加する。
１５．プレートミキサーを用いて９６ウェルマイクロプレートを１分間攪拌する。
１６．マイクロプレートリーダに１５．の９６ウェルマイクロプレートを置き、吸光度（405nm）を測定する。
【００３３】
＜サンドイッチ酵素免疫測定法による生体組織補填材内のＯＣ産生量測定方法＞
Ａ  材料
材料として、以下のものを用意する。
１．培養骨調製時（β−ＴＣＰ多孔体ブロックへの播種時）に使用する間葉系幹細胞（未分化または分化後）
２．間葉系幹細胞培養培地［DMEM +10%FBS + 50μg／ml gentamicin + 250ng/ml amphotercin B +
10ng/ml
bFGF + 50μg/ml
Asc-P］、骨分化培地［DMEM + 10%FBS + 50μg／ml gentamicin + 250ng/ml amphotercin B +
50μg/ml
Asc-P + 10mmol/l
GP + 10-7mol/l DEX］、トリプシン溶液、PBS，トリパンブルー溶液
３．各種ピペット、８連マイクロピペット、６，１２，９６ウェル組織培養用マイクロプレート、１５ml遠心チューブ、ＴＡＴＡＩ式血球計数盤、ピンセット、セルスクレイパー、1.5ml遠心チューブ、ホモジナイザー
４．タカラバイオ社製のGla-Type Osteocalcin(Gla-OC)EIA Kit(Precoated), ALP Lysis Buffer（2mmol/l塩化マグネシウム-０．０５％Triton X-100溶液）
５．β−ＴＣＰ多孔体ブロック5mm×5mm×５mm
６．プレートミキサー［OPM-103、アズワン株式会社製］、遠心分離機（５２００，株式会社久保田製作所製）、冷却遠心分離機、マイクロプレートリーダ（Synergy HT, Bio-Tek社製）
【００３４】
Ｂ  方法
（１）検量線作成
１．Gla-OC
EIA Kitに含まれる標準液（Gla型オステオカルシン）を検体希釈液で希釈し、検量線用の標準液希釈系（×１，２，４，８）を作成する。
２．１．の標準液100μlずつを８連マイクロピペットでGla-OC EIA Kitに含まれる抗ＯＣモノクローナル抗体プレートに２連で、５分以内に分注する。
３．２．のプレートを室温で２時間放置する。
４．プレートのウェル内の溶液を廃棄する。
５．プレートのウェルにＰＢＳ100μlずつを８連マイクロピペットで分注する。
６．プレートのウェル内のＰＢＳを廃棄する。以下、５．６．の操作を合計３回行い、ウェル内を洗浄する。
７．プレートのウェルにペルオキシダーゼ標識抗ＯＣモノクローナル抗体100μlずつを８連マイクロピペットで分注する。
８．７．のプレートを室温で１時間放置する。
９．プレートのウェル内の溶液を廃棄する。
１０．５．６．の操作を合計３回行い、ウェル内を洗浄する。
１１．プレートのウェルに基質液（３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン：ＴＭＢＺ）100μlずつを８連マイクロピペットで分注する。
１２．１１．のプレートを室温で１５分間放置する。
１３．プレートのウェルに反応停止液（１Ｎ硫酸）100μlずつを８連マイクロピペットで分注する。
１４．マイクロプレートリーダにプレートを置き、吸光度(450nm)を測定する。
【００３５】
（２）β−ＴＣＰ多孔体ブロックに播種した細胞のＯＣ産生量の測定
１．調製した培養骨およびβ−ＴＣＰ多孔体ブロック単体を１２ウェルマイクロプレートのウェルにピンセットで入れる。
２．１．の培養骨およびβ−ＴＣＰ多孔体ブロックの入ったウェルにＰＢＳ2mlずつを5mlピペットで分注し、培養骨を洗浄する。
３．ＰＢＳをパスツールピペットで吸引する。
４．培養骨およびβ−ＴＣＰ多孔体ブロックを1.5ml遠心チューブにピンセットで移し、ALP Lysis Buffer 500μlを1000μlマイクロピペットで分注する。
５．培養骨およびβ−ＴＣＰ多孔体ブロックをホモジナイザーで粉々にする。
６．得られたサンプルを３回凍結融解する。
７．サンプルを1000μlマイクロピペットでピペッティングした後、冷却遠心分離機に1.5ml遠心チューブを入れ、遠心分離を行う（10000rpm，２分間）。
８．1.5ml遠心チューブから上清全てを1000μlマイクロピペットで1.5ml遠心チューブに分注する。
９．1.5ml遠心チューブを冷却遠心分離機に入れ、遠心分離を行う（10000rpm，２分間）。
１０．1.5ml遠心チューブから上清250μlを９６ウェルマイクロプレートに分注し、８連マイクロピペットで100μlずつGla-OC EIA Kitに含まれる抗ＯＣモノクローナル抗体プレートに２連で、５分以内に分注する。
１１．１０．のプレートを室温で２時間放置する。
１２．プレートのウェル内の溶液を廃棄する。
１３．プレートのウェルにPBS100μlずつを８連マイクロピペットで分注する。
１４．プレートのウェル内のＰＢＳを廃棄する。以下、１３．１４．の操作を合計３回行い、ウェル内を洗浄する。
１５．プレートのウェルにペルオキシダーゼ標識抗ＯＣモノクローナル抗体100μlずつを８連マイクロピペットで分注する。
１６．１５．のプレートを室温で１時間放置する。
１７．プレートのウェル内の溶液を廃棄する。
１８．１３．１４．の操作を合計３回行い、ウェル内を洗浄する。
１９．プレートのウェルに基質液（３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン：ＴＭＢＺ）100μlずつを８連マイクロピペットで分注する。
２０．１９．のプレートを室温で１５分間放置する。
２１．プレートのウェルに反応停止液（１Ｎ硫酸）100μlずつを８連マイクロピペットで分注する。
２２．マイクロプレートリーダにプレートを置き、吸光度(450nm)を測定する。
【００３６】
＜Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８を利用した生体組織補填材内のＤＮＡ量測定方法＞
Ａ  材料
材料として、以下のものを用意する。
１．培養骨調製時（β−ＴＣＰ多孔体ブロックへの播種時）に使用する間葉系幹細胞（未分化または分化後）
２．間葉系幹細胞培養培地［DMEM +10%FBS + 50μg／ml gentamicin + 250ng/ml amphotercin B +
10ng/ml
bFGF + 50μg/ml
Asc-P］、骨分化培地［DMEM + 10%FBS + 50μg／ml gentamicin + 250ng/ml amphotercin B +
50μg/ml
Asc-P + 10mmol/l
GP + 10-7mol/l DEX］、トリプシン溶液、PBS，トリパンブルー溶液
３．各種ピペット、８連マイクロピペット、６，１２，９６ウェル組織培養用マイクロプレート、１５ml遠心チューブ、ＴＡＴＡＩ式血球計数盤、ピンセット、セルスクレイパー、1.5ml遠心チューブ
４．バイオラッド社製のFluorescent DNA Quantitation Kit
５．β−ＴＣＰ多孔体ブロック5mm×5mm×５mm
６．プレートミキサー［OPM-103、アズワン株式会社製］、遠心分離機（５２００，株式会社久保田製作所製）、マイクロプレートリーダ（Synergy HT, Bio-Tek社製）
【００３７】
Ｂ  方法
（１）検量線作成
１．Fluorescent
DNA Quantitation Kitに含まれる標準液をPBSで希釈し、検量線用の標準液希釈系（100，10μg/μl）を作成する。
２．９６ウェルマイクロプレートにHoechst33258(2μg/ml)200μlずつを８連マイクロピペットで添加する。
３．１．の標準液を10μl、100μlマイクロピペットで、２．のプレートに1000,500,200,100,560,20ngになるように３連で分注する。
４．プレートミキサーで１分間攪拌する。
５．４．より５分以上経過後、マイクロプレートリーダにプレートを置き、excitation filter 360nm/emission filter 460nmの蛍光を測定する。
【００３８】
（２）β−ＴＣＰ多孔体ブロックに播種した細胞のＤＮＡ量測定
１．９６ウェルマイクロプレートにHoechst33258(2μg/ml)200μlずつを８連マイクロピペットで添加する。
２．ＡＬＰ活性測定、ＯＣ産生量測定で用いた試料5μlを10μlマイクロピペットで３連で分注する。
３．プレートミキサーで１分間攪拌する。
４．３．より５分以上経過後、マイクロプレートリーダにプレートを置き、excitation filter 360nm/emission filter 460nmの蛍光を測定する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の検査方法を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００４０】
Ｓ１  ＤＮＡ量測定ステップ
Ｓ２２，Ｓ３２，Ｓ４２  判断ステップ
Ｓ２１  細胞数測定ステップ
Ｓ３１  ＡＬＰ活性測定ステップ
Ｓ４１  ＯＣ産生量測定ステップ
Ｓ５  培養終了判断ステップ
【図１】
2006204173.tif 000003