(57)【要約】【課題】  魚類を用いて味覚受容体遺伝子などの味覚関連遺伝子の機能を、迅速、かつ的確に解析可能な実質的有効な同定方法を提供すること。【解決手段】  メダカ遺伝子由来の、魚類の味覚器官において特異的に発現可能なプロモーター機能を有する塩基配列を持つベクターの下流に、目的の味覚受容体遺伝子を挿入してメダカ胚細胞に導入し、導入した味覚受容体遺伝子を効率的に発現させたトランジェニックメダカを作成した後、該メダカを蛍光物質ならびに味覚物質を含有する飼料で飼育して魚体内の蛍光強度を測定し、発現した遺伝子産物によって変化する魚類の摂食行動の変化を追跡するシステムを用いることによる、味覚受容体遺伝子の機能を迅速、かつ的確に同定できる同定方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類の味覚器官での発現を制御する領域を含む塩基配列を有するＤＮＡを含むベクター。
【請求項２】
ポリＡ付加シグナル領域を含む塩基配列を有するＤＮＡを含む請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
マーカーとしての蛍光タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡを含んでなる請求項１および請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
魚類の味覚器官での発現を制御する領域が以下の（Ａ）又は（Ｂ）に記載のＤＮＡである請求項１乃至３のいずれか１項に記載のベクター。
（Ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号２９７７〜４５１９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｂ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号２９７７〜４５１９からなる塩基配列を含むＤＮＡの一部から作製したプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、メダカの味覚器官で特異的に発現可能なプロモーター活性を有する塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項５】
ｐ５’ｂ２１．６であることを特徴とする請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
蛍光物質、及び味覚物質を含む飼料を給餌して飼育後、魚体中の蛍光強度を測定することを特徴とする魚類摂食行動の判別方法。
【請求項７】
味覚受容体を含む味覚受容シグナルに関連するタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡを請求項１乃至５のいずれか1項に記載のベクターのプロモーター領域下流に連結し、魚類胚細胞中に導入して得られるトランスジェニック魚類。
【請求項８】
魚類がメダカであること、を特徴とする請求項７に記載のトランスジェニック魚類。
【請求項９】
請求項７又は請求項８に記載のトランスジェニック魚類を用いて、請求項６に記載の方法により魚類摂食行動を判別すること、を特徴とする味覚受容体を含む味覚受容シグナルに関連するタンパク質をコードする遺伝子の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に魚類の味覚器官をコードする遺伝子を発現させる発現系と、該遺伝子の機能を検査することができるアッセイ系とに関する。
【背景技術】
【０００２】
生命体における遺伝子は、ＤＮＡとして知られる４種類の塩基によりコードされた情報である。細胞分化が見られる高等生物においては、遺伝子は、各臓器や器官、細胞毎に、特異的にＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳されて、各臓器や器官、細胞に固有のタンパク質が発現する仕組となっている。このような遺伝情報の流れにより、生物は各臓器や器官をつくり、変化する外界に対処しながら生命活動を営んでいる。
【０００３】
近年、ＤＮＡ塩基配列や実際に発現している遺伝子の塩基配列データが大量、かつ急速に決定され、その情報をもとに、各遺伝子の機能を特定する作業が進められつつある。
【０００４】
しかし、臓器や器官をコードする遺伝子の機能を同定するための実質的に有効な方法がなく、各遺伝子の機能の同定作業は遅れているのが現状であった。
【０００５】
一方、味覚に関連する遺伝子についても解析が進められているが、現在までに同定されている味覚受容体遺伝子は極めて少なく、わずかにショウジョウバエの味覚受容体遺伝子（例えば、特許文献１参照）、哺乳動物由来のＴ１Ｒ味覚受容体遺伝子（例えば、特許文献２参照）やＴ２Ｒ味覚受容体遺伝子（例えば、特許文献３参照）などが開示されているに過ぎず、特に魚類の味覚受容体遺伝子については、機能が特定されたものは全く開示されていないのが現状であった。
【０００６】
このような、味覚受容体遺伝子の解析の遅れは、前述の如く、味覚受容体遺伝子の候補の中から、遺伝子の機能を特定する有効な方法がないことに起因しており、従って、味覚関連遺伝子の機能を、迅速、かつ的確に解析可能な実質的有効な同定方法の開発が求められていた。
【特許文献１】特表２００３−５０２０４３号公報
【特許文献２】特表２００４−５１３６０８号公報
【特許文献３】特表２００３−５３００９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上のように、味覚受容体を含む味覚受容シグナルに関連するタンパク質をコードする遺伝子を効率良く同定する方法の開発に成功した例は、未だ報告されていない。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、魚類の味覚受容体遺伝子などの味覚関連遺伝子の機能を、迅速、かつ的確に解析可能な実質的有効な同定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ね、その過程において、魚類の味覚器官において導入した遺伝子を効率的に発現させる手法を開発し、さらに、発現した遺伝子産物によって変化する魚類の摂食行動の変化を追跡するシステムを開発することによって、味覚受容体遺伝子の機能を迅速、かつ的確に同定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下に例示する態様を包含するものである。
【００１１】
（１）魚類の味覚器官での発現を制御する領域を含む塩基配列を有するＤＮＡを含むベクター。
（２）ポリＡ付加シグナル領域を含む塩基配列を有するＤＮＡを含む上記（１）記載のベクター。
（３）マーカーとしての蛍光タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡを含んでなる上記（１）および（２）記載のベクター。
（４）魚類の味覚器官での発現を制御する領域が以下の（Ａ）又は（Ｂ）に記載のＤＮＡである上記（１）〜（３）のいずれかに記載のベクター。
（Ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号２９７７〜４５１９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｂ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号２９７７〜４５１９からなる塩基配列を含むＤＮＡの一部から作製したプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、メダカの味覚器官で特異的に発現可能なプロモーター活性を有する塩基配列を含むＤＮＡ。
（５）ｐ５’ｂ２１．６であることを特徴とする上記（４）に記載のベクター。
（６）蛍光物質、及び味覚物質を含む飼料を給餌して飼育後、魚体中の蛍光強度を測定することを特徴とする魚類摂食行動の判別方法。
（７）
味覚受容体を含む味覚受容シグナルに関連するタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡを上記（１）乃至（５）のいずれか1項に記載のベクターのプロモーター領域下流に連結し、魚類胚細胞中に導入して得られるトランスジェニック魚類。
（８）魚類がメダカであること、を特徴とする上記（７）に記載のトランスジェニック魚類。
（９）
上記（７）又は（８）に記載のトランスジェニック魚類を用いて、上記（６）に記載の方法により魚類摂食行動を判別すること、を特徴とする味覚受容体を含む味覚受容シグナルに関連するタンパク質をコードする遺伝子の同定方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、特に、魚類の味覚受容体遺伝子の機能を、迅速、かつ的確に解析可能な実質的に有効な同定方法を提供することができる。例えば、味覚受容体遺伝子をメダカ等の魚類に導入して発現させ、その摂食行動により、該遺伝子の作用を確認したり、同定したりすることができる。具体的には、蛍光物質等マーカーが添加された飼料に対して、導入した味覚受容体に期待される味覚物質を添加した飼料を調整しておき、このような飼料と味覚物質を添加していない飼料とに対するトランスジェニックメダカの摂食行動の差異を確認することによって、導入された味覚受容体遺伝子の機能を確認したり、同定したりすることができる。味覚受容体遺伝子としては、魚類のみに限定されるものではなく、ヒトをはじめとする哺乳類、あるいは両生類など他の高等生物の味覚受容体も包含される。さらに、味覚受容体以外にも、味覚受容シグナルに関連するタンパク質をコードする遺伝子の機能を確認したり、同定したりすることもできる。
【００１３】
そして、本発明においては、味覚受容体を含む味覚受容シグナルに関連するタンパク質をコードする遺伝子を効率的に発現することのできるプロモーターを含む発現調節部位を開発するのにはじめて成功した点で画期的である。発現調節部位として配列表の配列番号１に示される塩基配列の内、塩基番号２９７７〜４５１９からなる塩基配列を含有するＤＮＡが機能することをはじめてつきとめたのは、本発明が最先であって、まさに画期的である。このような塩基配列を含むＤＮＡが魚類などの味覚器官において味覚受容体遺伝子を特異的に発現せしめる機能を有することは従来全く知られておらず、本発明が最先である。
【００１４】
しかも本発明においては、このような発現調節部位（味覚器官での発現を制御する領域）を含む新規ベクターも提供するものである。このベクターには、発現制御領域のほか、ポリＡ（ｐＡ）付加シグナル領域、マーカーとして蛍光タンパク質等をコードする遺伝子領域等を組み込んでもよく、したがって、このベクターにおいて、目的とする味覚受容体遺伝子を発現制御領域の下流域に連結することにより、味覚器官において効率的に発現できるという著効が奏される。そのうえ、本発明においては、発現調節部位は、その塩基配列が決定されているので、ＰＣＲ法その他既知の方法で合成できるだけでなく、メダカのＰＬＣ−β２遺伝子を利用してもよい。ＰＬＣ−β２遺伝子における上記特定された塩基配列に発現調節機能があることは、従来全く知られておらず、本発明が最先である。また、本発明においては、この発現調節部位のほか、他の各部位は、いずれも容易に入手可能であるため、本発明に係る新規ベクターの構築は、再現性を有するものであって充分可能である点でも、特徴的である。
【００１５】
したがって、本発明によれば、例えば、メダカ遺伝子由来の、魚類の味覚器官において特異的に発現可能なプロモーター機能を有する塩基配列を持つベクターの下流に、目的の味覚受容体遺伝子を挿入してメダカ胚細胞に導入し、導入した味覚受容体遺伝子を効率的に発現させたトランジェニックメダカを作成した後、該メダカを蛍光物質ならびに味覚物質を含有する飼料で飼育して魚体内の蛍光強度を測定し、発現した遺伝子産物によって変化する魚類の摂食行動の変化を追跡するシステムを用いることによる、味覚受容体遺伝子の機能を迅速、かつ的確に同定できる同定方法も提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、メダカ胚細胞に対して導入した魚類の味覚受容体遺伝子をメダカの味覚器官において効率的に発現させるシステムと、さらに、発現した遺伝子産物によって変化するメダカの摂食行動の変化を追跡するシステムから構成される。
【００１８】
メダカ胚細胞への魚類の味覚受容体遺伝子の導入に際しては、メダカ味覚器官において効率的に味覚受容体遺伝子を発現させるシステムが必須の機能として要求されるが、本発明においては、メダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ）のＰＬＣ−β２遺伝子の開始メチオニンの上流にあるプロモーターを含む発現調節部位が利用される。なお、ＰＬＣ−β２は、味覚受容体からのシグナルを伝達するタンパク質であり、魚類の味覚器官の中でも味覚を受容する味細胞で特異的に発現している（例えば、「ニューロサイエンス・レター（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ）」、３１巻、ｐ．６１−６４、２０００年参照）。
【００１９】
このようなプロモーターを含む発現調節部位を持つ塩基配列としては、配列表の配列番号１に示される塩基配列（図４〜図８）のうち、塩基番号２９７７〜４５１９からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
【００２０】
また、他の塩基配列としては、配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号２９７７〜４５１９からなる塩基配列の一部から作製したプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、メダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ）の味覚器官で特異的に発現可能なプロモーター活性を有する塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
【００２１】
これらの塩基配列を含むＤＮＡを持つベクターは、メダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ）の胚細胞に導入可能であり、該発現調節部位の下流に連結した味覚受容体遺伝子を、メダカの味覚器官において、効率的に発現させることができるので有用である。
【００２２】
なお、ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有する核酸同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
【００２３】
さらに、このようなベクターの具体的な例としては、配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号２９７７〜４５１９からなる塩基配列を大腸菌ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIのＳｐｅＩ部位に挿入したｐ５‘ｂ２１．６ｋが示される。
【００２４】
該ベクターは、メダカ胚細胞に効率良く導入可能であり、さらに胚細胞が味覚器官に分化した際に、導入された味覚受容体遺伝子を味覚器官において効率的に発現させる機能を有しており、好適なベクターである。
【００２５】
これらのベクターに連結して、メダカの胚細胞に導入される遺伝子としては、基本的にはメダカを初めとする魚類の味覚受容体遺伝子や味覚受容シグナルに関連するタンパク質をコードする遺伝子が選ばれる。
【００２６】
しかし、メダカの味覚器官において、発現し、メダカの摂食行動に変化を与える機能を有する遺伝子であれば、特に、メダカを初めとする魚類の味覚受容体遺伝子に限定されるものではなく、ヒトを初めとする哺乳類、あるいは両生類など他の高等生物の味覚受容体遺伝子や味覚受容シグナルに関連するタンパク質をコードする遺伝子であってもかまわない。
【００２７】
本発明においては、これらの外来の味覚受容体遺伝子を上記ベクターに連結した後、メダカ胚細胞中に導入する。
【００２８】
メダカ胚細胞への遺伝子の導入方法については、特に限定はなく、従来公知の方法が採用される。具体的には、マイクロインジェクターを用いたマイクロインジェクション法などが上げられ、採卵したメダカ卵中から選択された１〜２細胞期の胚に対して、細胞質にＤＮＡを注入する方法が挙げられる。
【００２９】
このようにして作製されたトランスジェニックメダカ（Ｇ０）は、野生型メダカと交配され、得られた受精卵を飼育し稚魚のスクリーニングが行われる。スクリーニングは蛍光遺伝子などのマーカー遺伝子の発現などで確認することが出きる。このようにして選択された個体（Ｆ１）を、再び野生型と交配し、再びスクリーニングを行って得られた個体（Ｆ２）を用いて、味覚受容体遺伝子の機能をアッセイする。
【００３０】
味覚受容体遺伝子のアッセイは、上記Ｆ２のメダカを、以下の要領で飼育して行われる。
【００３１】
すなわち、予め蛍光物質が入った飼料を調製しておく。この場合に用いられる蛍光物質については、特に制限がなく、例えばＤｉＩＣ12（３）（Ｄ−３８３、Molecular Probes社製）などが例示される。
【００３２】
次に、このような蛍光物質が添加された飼料に対して、導入した味覚受容体に期待される味覚物質を添加した飼料を調製しておき、このような飼料と味覚物質が添加されていない飼料とに対するトランスジェニックメダカの摂食行動の差異を確認することによって、導入された味覚受容体遺伝子の機能を確認することができる。
【００３３】
味覚物質としては、調べたい味覚受容体遺伝子の機能によって適宜選択したものを用いればよいが、例えば、メダカが嗜好する物質としてはアミノ酸や核酸などが挙げられ、さらに忌避する物質としてはキニーネやデナトニウムが挙げられる。
【００３４】
これらの飼料は、水中に散布してメダカに投与されるので、飼料が分散したり、添加した物質が容易に流出したりしないように、粒子状に固められたものとするのが好ましい。この場合の粒子のサイズは、１００〜３００μｍ程度するのが良い。
【００３５】
このような飼料を摂食した後は、メダカ体内に取り入れられた飼料中に添加された蛍光物質が、メダカ体内で蛍光を発生するので、適宜、蛍光強度を測定することによって、メダカが好んで摂食した飼料や摂食を忌避した飼料を同定することができる。
【００３６】
その結果、このような摂食行動の変化をもって、導入した味覚受容体遺伝子の機能を確認することができるのである。
【実施例】
【００３７】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００３８】
実施例１（メダカの摂餌行動アッセイ系の開発）
【００３９】
（１）アッセイに供するメダカの飼育
野生型ヒメダカＣａｂ系統を、水温２８℃、ｐＨ８．０程度、コンダクタンス７００〜８００（μs/cm）に維持した循環型水槽で、９．５時間明期及び１４．５時間暗期の条件で飼育した。
【００４０】
雌の腹部に付着している卵を、ｅｇｇ  ｗａｔｅｒ（０．０３％人工海塩、約１ｐｐｍメチレンブルー）中に採集した。その後、２８℃の恒温槽にて１０日間飼育し、孵化させた。受精後１１日目に循環型水槽に移し、一日二回粉餌（鮎スーパーゴールド０：オリエンタル酵母社製）を給餌して、飼育した。
【００４１】
（２）アッセイ用飼料の調製
デンプンと油脂を担体として、蛍光物質ＤｉＩＣ12（３）（Ｄ−３８３：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を０．１ｍ  ｍｏｌ／ｋｇ添加し、混合した後、径１００〜３００μｍの粒子状に成型したもの（プラセボ区）を調製した。さらに試験区としては、前記飼料に、メダカが嗜好する物質としてアミノ酸および核酸をＬ−セリン、Ｌ−プロリン、グリシン、グルタミン酸 各10m mol/kg、イノシン酸2m mol/kg添加したもの（アミノ酸区）、または忌避する物質としてデナトニウムを10m mol/kg添加したもの（デナトニウム区）を調製した。これらをアッセイ用の飼料とした。
【００４２】
（３）アッセイ方法
受精後２０日目のメダカを、脱塩素水を入れた径９０ｍｍのシャーレで２４時間絶食させた後、４０ｍｌの脱塩素水を入れた径９０ｍｍシャーレに１０匹ずつ入れた。上記のアッセイ用飼料をミクロスパーテルに軽く一杯づつ（約２ｍｇ）散布し、自由摂食させたのち、２分から２分３０秒の間にメダカを９６穴プレートに移し換えた。
【００４３】
その後、５２０〜５５０ｎｍの励起フィルタと５８０ｎｍの吸収フィルタを用いて、ＤｉＩ蛍光を蛍光実体顕微鏡を用いて観察した。さらに、蛍光実体顕微鏡観察における蛍光強度を、ＷｉｎＲＯＯＦ（画像解析ソフト、三谷商事社製）により１０段階で蛍光強度数値化を行って評価した。
【００４４】
（４）結果
以上の結果を図１（図面代用写真）に示した。図中、上段はアミノ酸を、中段はプラセボ区、下段はデナトニウム区を示し、各１０サンプルについて、得られたスコアをそれぞれ右上に示し、平均値を、平均６、３、２として図示した。平均値が高いほど効果が高いことを示す。
【００４５】
図１の結果から、メダカの消化管内でＤｉＩ蛍光が観察されるもの、観察されないものが存在したが、メダカの好む味物質（アミノ酸）を混入した飼料はよく摂食し、忌避する物質（デナトニウム）を混入した飼料は殆ど摂食しなかった。
【００４６】
このことから、メダカの摂食行動（嗜好性）を観察する効率的なアッセイ系が確立できたことが確認された。
【００４７】
実施例２（メダカ味細胞を標識するトランスジェニックメダカ）
【００４８】
（１）トランスジーンの構築
メダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ）のゲノム由来のＰＬＣ−β２遺伝子の開始メチオニンの上流約７ｋｂｐのＨｉｎｄIIIより、下流約１００ｂｐ付近のＢａｍＨＩまでの領域をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にサブクローニングした。
【００４９】
これを鋳型として、Ｍ１３プライマー（プライマー１：５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’、配列表の配列番号２（図９）に記載）、およびメダカＰＬＣ−β２遺伝子の開始コドンの５’側の配列にＳｐｅＩ部位を付加したプライマー（プライマー２：５’−ＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＣＡＡＧＡＧＴＴＴＧＣＴＣＣ−３’、配列表の配列番号３（図１０）に記載）を用いたＰＣＲを行い、得られた産物をＳｐｅＩで消化することにより、両端にＳｐｅＩ部位を持つ１．６ｋｂｐの断片（以下、５’ｍｆｂ２（１．６Ｋ）と称する）を得た後、この５’ｍｆｂ２（１．６Ｋ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIのＳｐｅＩ部位にサブクローニングした（このようにして得られたベクターを、以下ｐ５’ｂ２１．６ｋと称する）。なお、この断片はＳｐｅＩ部位以外の塩基配列はメダカゲノムの配列と１塩基を除いて一致していた。
【００５０】
次にカナマイシン耐性遺伝子の５’側と３’側にＩ−ＳｃｅＩカセットを外向きに持つカセットを作製した（以下、ｐ＜Ｋａｎ＞と称する）。
【００５１】
一方、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を有するプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）から、ＥＧＦＰとｐＡの領域をＳａｃＩとＡｆｌIIで切り出し、ｐ＜Ｋａｎ＞のＳｍａＩ部位に挿入した（以下、ｐＥＧＦＰ＜Ｋａｎ＞と称する）。
【００５２】
ｐＥＧＦＰ＜Ｋａｎ＞から、ＥＧＦＰ−＜Ｋａｎ＞カセットをＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで切り出し、ｐ５’ｂ２１．６ｋのＢａｍＨＩ、及びＨｉｎｄIII部位間に挿入した。
【００５３】
このようにして作製したトランスジーンの構造の概略を図２に示した。
【００５４】
また、該トランスジーンの全塩基配列を決定し、配列表の配列番号１（図４〜図８）に示した。なお、配列表の配列番号１において、主要な各配列の位置は、以下の表１（各配列の部位）のとおりである。
【００５５】
【表１】
2006204214.tif 000002
【００５６】
（２）メダカ胚への微量注入
プラスミドＤＮＡ溶液に終濃度１ｕｎｉｔ／μｌ  のＩ−ＳｃｅＩ酵素（Ｒｏｃｈｅ社製）、０．５×メガヌクレアーゼバッファー（Ｒｏｃｈｅ社製）、１．５％のｄｅｘｔｒａｎ（ＭＷ＝１０，０００）−ｒｈｏｄａｍｉｎｅＢ（Ｄ−１８２４：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を加え、注入直前に終濃度５ｍＭの塩化マグネシウムを加えた。
【００５７】
メダカの点灯直後の卵を採卵し、約１０℃に予冷した０．０３％人工海水塩と１ｐｐｍ程度のメチレンブルーｅｇｇ  ｗａｔｅｒを含む溶液に採取した。
【００５８】
１〜２細胞期の胚を選択し、氷上で発生を遅延させた。芯入硝子管（径１ｍｍ：Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ社製）より針を作製し、マイクロインジェクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用いて細胞質にＤＮＡ溶液を注入した。
【００５９】
（３）胚の観察
胚を２８℃で保温し、４６０−４９０ｎｍの励起フィルタと５１０ｎｍの吸収フィルタを用いてＧＦＰ蛍光を観察した。
【００６０】
（４）トランスジェニックメダカの維持
顕微鏡観察によるスクリーニングにより得られたトランスジェニックメダカ（Ｇ０世代）を、野生型メダカと交配し、受精卵を飼育し稚魚のスクリーニングを行った。ＧＦＰポジティブな個体（Ｆ１）を、再び野生型と交配し、稚魚をスクリーニングしてＦ２世代を得た。
【００６１】
（５）結果
トランスジェニックメダカのＧＦＰ蛍光は、内在のＰＬＣ−β２を発現する領域、口腔および鰓弓部に観察された。口唇におけるトランスジェニックメダカのＧＦＰの発現と、内在のＰＬＣ−β２の発現状況を図３（図面代用写真）に示した。図３（図中、左側は口唇におけるＧＦＰの発現、及び、右側は内在のＰＬＣ−β２の発現をそれぞれ示した写真である。）の結果から明らかなように、ＧＦＰの発現が確認された。このように、マーカーの発現が実際に確認されたことにより、その結果、発現制御領域の下流に連結した目的の味覚受容体を含む味覚受容シグナルに関連するタンパク質をコードする遺伝子を発現させることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】蛍光顕微鏡による蛍光強度を観察した結果を示した図である（図面代用写真）。
【図２】構築したトランスジーンの概略を示す図である。
【図３】トランスジェニックメダカのＧＦＰ遺伝子の発現状態を示す図である（図面代用写真）。
【図４】配列表の配列番号１で示される塩基配列を示す。
【図５】同上続きを示す。
【図６】同上続きを示す。
【図７】同上続きを示す。
【図８】同上続きを示す。
【図９】プライマー１を示す。
【図１０】プライマー２を示す。
【図１】
2006204214.tif 000003
【図２】
2006204214.tif 000004
【図３】
2006204214.tif 000005
【図４】
2006204214.tif 000006
【図５】
2006204214.tif 000007
【図６】
2006204214.tif 000008
【図７】
2006204214.tif 000009
【図８】
2006204214.tif 000010
【図９】
2006204214.tif 000011
【図１０】
2006204214.tif 000012
【配列表】
2006204214000001.xml