(57)【要約】【課題】微生物の持つ遺伝情報を指標として、簡単な操作により、短時間で正確に、複数の微生物によって構成される微生物群集に含まれる微生物種の別、ならびにその存在比を明らかにすることができる微生物群集解析方法を提案する。【解決手段】試料中の微生物の遺伝情報を含む核酸部位を増幅し、増幅された核酸断片をＴＲＦＬＰ法により処理してＴＲＦの鎖長に対応する存在比を求め、一方ＳＳＣＰ法により一本鎖の核酸断片を調製して電気泳動的に分画して、各核酸断片の塩基配列または微生物種を決定し、決定された塩基配列または微生物種から、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦがどの微生物に由来するかを決定する微生物群集解析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種の微生物を含む試料の微生物群集構造を解析する方法であって、
Ａ：試料中の微生物の遺伝情報を含む核酸部位を増幅する増幅工程と、
Ｂ：増幅工程で得られた核酸断片をＴＲＦＬＰ法により処理して、分画されるＴＲＦの鎖長に対応する微生物の存在比を求めるＴＲＦＬＰ工程と、
Ｃ：増幅工程で得られた二本鎖の核酸断片から一本鎖の核酸断片を調製し、得られた一本鎖核酸断片を電気泳動的に分画するＳＳＣＰ工程と、
Ｄ：ＳＳＣＰ工程で分画された各一本鎖核酸断片の塩基配列を特定し、塩基配列に基づいて各画分に対応する微生物種を決定するとともに、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦがどの微生物に由来するかを決定する群集構造決定工程と
を含む微生物群集構造解析方法。
【請求項２】
群集構造決定工程が、ＳＳＣＰ工程で分画された一本鎖核酸断片を増幅して塩基配列を特定し、その塩基配列に基づいて各画分に対応する微生物種を決定するとともに、各画分をＴＲＦＬＰ工程で用いた制限酵素で処理する場合に見込まれるＴＲＦの鎖長と、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦの鎖長とを対比して、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦがどの微生物に由来するかを決定するものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
増幅工程がＰＣＲである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
増幅工程が、一方のプライマーとして標識プライマーを用い、他方のプライマーとして化学修飾プライマーを用いるＰＣＲである請求項３記載の方法。
【請求項５】
増幅工程が、一方のプライマーとして5’末端を蛍光ラベルした標識プライマーを用い、他方のプライマーとして5’末端をリン酸化した化学修飾プライマーを用いるＰＣＲである請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＳＳＣＰ工程における一本鎖核酸の調製が、得られた増幅産物の化学修飾した核酸鎖をモノヌクレオチドに分解する酵素処理である請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の微生物によって構成される微生物群集の構造を明らかにするための微生物群集構造解析方法に関し、特に発酵生産、排水処理、スライムコントロール、医薬分野などの微生物を扱う分野において、複数の微生物によって構成される微生物群集に含まれる微生物種の別、ならびにその存在比などの微生物群集構造を明らかにするための微生物群集解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物が関与する発酵生産、排水処理、スライムコントロール等の産業分野や、医薬分野などの多くの分野において、複数の微生物によって構成される微生物群集に含まれる微生物の属、種、株等の微生物種の別、ならびにそれぞれの微生物種の存在比などを明らかにすることが要求されることがある。従来、このような目的の微生物の群集構造解析のためには、顕微鏡観察、培養による単離、同定などが行われていたが、このような解析方法では、複雑な操作と多くの時間が必要であった。
【０００３】
これに対して近年、微生物の群集構造解析には、個々の微生物の持つ遺伝情報を指標とした解析手法が広く利用されるようになっている。このような遺伝情報を指標とする解析手法では、個々の微生物毎にＤＮＡ配列には相異があることに着目し、ＤＮＡ配列の違いを指標として個々の微生物の名称を特定することができる。また特定のＤＮＡ分子の割合を調べることにより、もとの群集構造における各細菌の存在割合を推測することも可能である。こうした微生物群集構造解析手法として、非特許文献１には、ランダムクローニング法、ＦＩＳＨ(Fluorescent in-situ hybridization)法、ＴＧＧＥ(Thermal gradient gel electrophoresis)法、ＤＧＧＥ(Denaturing gradient gel electrophoresis)法、ＳＳＣＰ(Single strand conformational polymorphism)法、ＴＲＦＬＰ(Terminal restriction fragment length polymorphism)法などが示されている。
【０００４】
このうちＴＲＦＬＰ法は、微生物群集より抽出したＤＮＡを、標識したプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、得られた増幅産物を適切な制限酵素で処理することで得られるＴＲＦ（Terminal restriction fragment：末端制限断片）、すなわち５’末端側の断片の鎖長をキャピラリー電気泳動で解析する方法である。この方法は簡便で再現性もよいので、近年幅広く利用されている技術であり、例えば活性汚泥中の微生物や、土壌中の難分解性有機化合物の分解に関与する微生物、ヒト糞便中に含まれる微生物などの解析に利用されている。
【０００５】
しかしながら、このようなＴＲＦＬＰ解析では、ＴＲＦの長さと量から各ＤＮＡの存在比を明らかにすることは可能であるが、ＴＲＦないしは、その由来となったＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を特定することは困難である。すなわちＴＲＦＬＰ解析では、ポリマーを充填したキャピラリー式の電気泳動によってＤＮＡを分画しているため、このような微量の試料を扱う解析装置から、分離されたＤＮＡを回収することは困難であるとともに、ＴＲＦＬＰでは制限酵素で完全に消化されたＤＮＡ断片を解析しているので、例えば数１０〜１００塩基以内の長さのＴＲＦから微生物の名称を特定するための十分な遺伝情報を得ることはできないからである。
【０００６】
したがって、ＴＲＦＬＰ法によって分離されたＴＲＦ、およびその由来となる微生物の関係を特定するためには、通常はＴＲＦＬＰ法と平行して別の解析を実施する必要があった。たとえば、試料を寒天培地に塗布して得られたコロニーから分離したＤＮＡや、ランダムクローニング法等によってＤＮＡプールからクローン化されたＤＮＡの配列を特定して、得られた情報より期待されるＴＲＦの長さを推測して、ＴＲＦＬＰの結果と照合するなどの方法が用いられる。しかしながら、こうした操作は極めて煩雑なだけではなく、ＰＣＲによるバイアス等によって、必ずしもコロニーやクローンの遺伝情報の結果とＴＲＦＬＰの結果が一致しないケースがあり、全てのＴＲＦを特定することはできないなどの問題点がある。
【０００７】
一方、ＳＳＣＰ法による群集構造解析では、二本鎖のＤＮＡ断片から一本鎖のＤＮＡを調製し、得られた一本鎖ＤＮＡをポリアクリルアミド当のゲルを支持体として電気泳動的に分画し、シークエンシングに供することによってＤＮＡ断片の遺伝子配列を明らかにすることができる。ＤＮＡ配列は、ＲＤＢ等の既存のデータベースと照合することにより、微生物の名称を特定することが可能である。したがって、ＤＮＡ断片の量や数から群集における各ＤＮＡの存在比を調べ、さらに各ＤＮＡ断片に相当する正確な微生物名を容易に特定することができる。
【０００８】
しかしＳＳＣＰ法は、通常ＤＮＡ断片がバンドとして分画されるため、分画されたＤＮＡ断片の正確な存在比を得ることは困難である。またＳＳＣＰ法は、一本鎖ＤＮＡの分子内構造の差による物理的性質の差を利用して検出を行うため、検出時の物理条件等によって検出結果が異なり、再現性が悪く、経時的な変化の追跡には不向きである。また、ＰＣＲ反応には様々なバイアスが生じることが指摘されており、同一の微生物群集より調整したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を実施した場合においても、末端が修飾されていたり、配列や長さが異なるなど、プライマーの性状の違いによって、合成されるＤＮＡ分子の組成が異なる可能性が考えられる。したがって、それぞれ別のＰＣＲ産物よりＴＲＦＬＰ法とＳＳＣＰ法を並行して実施しても、両者によって得られる結果の相関性を明確にすることは困難であった。このように従来は、ＴＲＦＬＰを用いた解析手法によっては、微生物の種ならびにそれぞれの微生物種の存在比を明らかにすることは困難であった。
【非特許文献１】Re/Views in Environmental Science and Bio/Technology, 1 巻39-49ページ、2002年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、微生物の持つ遺伝情報を指標として、簡単な操作により、短時間で正確に、複数の微生物によって構成される微生物群集に含まれる微生物種の別、ならびにその存在比を明らかにすることができる微生物群集解析方法を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は次の微生物群集構造解析方法である。
（１）  複数種の微生物を含む試料の微生物群集構造を解析する方法であって、
Ａ：試料中の微生物の遺伝情報を含む核酸部位を増幅する増幅工程と、
Ｂ：増幅工程で得られた核酸断片をＴＲＦＬＰ法により処理して、分離されるＴＲＦの鎖長に対応する微生物の存在比を求めるＴＲＦＬＰ工程と、
Ｃ：増幅工程で得られた二本鎖の核酸断片から一本鎖の核酸断片を調製し、得られた一本鎖核酸断片を電気泳動的に分画するＳＳＣＰ工程と、
Ｄ：ＳＳＣＰ工程で分画された各一本鎖核酸断片の塩基配列を特定し、塩基配列に基づいて各画分に対応する微生物種を決定するとともに、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦがどの微生物に由来するかを決定する群集構造決定工程と
を含む微生物群集構造解析方法。
（２）  群集構造決定工程が、ＳＳＣＰ工程で分画された一本鎖核酸断片を増幅して塩基配列を特定し、その塩基配列に基づいて各画分に対応する微生物種を決定するとともに、各画分をＴＲＦＬＰ工程で用いた制限酵素で処理する場合に見込まれるＴＲＦの鎖長と、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦの鎖長とを対比して、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦがどの微生物に由来するかを決定するものである上記（１）記載の方法。
（３）  増幅工程がＰＣＲである上記（１）または（２）記載の方法。
（４）  増幅工程が、一方のプライマーとして標識プライマーを用い、他方のプライマーとして化学修飾プライマーを用いるＰＣＲである上記（３）記載の方法。
（５）  増幅工程が、一方のプライマーとして5’末端を蛍光ラベルした標識プライマーを用い、他方のプライマーとして5’末端をリン酸化した化学修飾プライマーを用いるＰＣＲである上記（４）記載の方法。
（６）  ＳＳＣＰ工程における一本鎖核酸の調製が、得られた増幅産物の化学修飾した核酸鎖をモノヌクレオチドに分解する酵素処理である上記（５）記載の方法。
【００１１】
本発明において、解析の対象とする微生物群集構造は、発酵生産、排水処理、スライムコントロール等の産業分野や、医薬分野などの微生物を扱う分野において、複数の微生物によって構成される微生物群集に含まれる微生物種の別、ならびにその存在比などの構造である。微生物種としては、微生物群集に含まれる微生物の属、種、株のほか、形態、機能等の微生物の特性などを含む。
【００１２】
本発明では、このような複数種の微生物を含む試料中の微生物の遺伝情報を含む核酸部位を増幅し、増幅された核酸断片をＴＲＦＬＰ法により処理して、分離されたＴＲＦの鎖長に対応する存在比を求める。一方ＳＳＣＰ法により、増幅された二本鎖の核酸断片から一本鎖の核酸断片を調製して電気泳動的に分画し、分画された各々の一本鎖核酸断片を回収・分析し、各核酸断片の塩基配列を決定し、塩基配列に基づいて各々の画分画に対応する微生物種を決定し、決定された塩基配列または微生物種から、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦがどの微生物に由来するかを決定し、群集構造を解析する。
【００１３】
ＴＲＦＬＰ（Terminal Restriction Fragment Ｌength Polymorphysm: 末端制限断片長多型）法は、5’末端をラベルしたプライマーを用いたＰＣＲ産物を制限酵素処理し、電気泳動によりわずかな配列の違いを有する同種遺伝子（DNA）を分画し、その構成比や種類を分析する方法である。5’末端を蛍光ラベルしたプライマーを用いてＰＣＲを行ったのち、増幅産物を制限酵素処理すると、末端に蛍光物質が付与されたＴＲＦ(制限酵素消化断片)が得られる。ＴＲＦの長さは制限酵素認識部位の位置、すなわちＤＮＡの配列特異性に依存するので、ＴＲＦをキヤピラリー電気泳動で分画し、長さと量（蛍光強度）を調べることで、ＤＮＡの種類や構成比を調べることができる。
【００１４】
ＳＳＣＰ（Single Strand Conformational Polymorphysm: 一本鎖立体構造多型）法は、ＤＮＡを一本鎖にし、電気泳動によりわずかな配列の違いを有する同種遺伝子（ＤＮＡ）を分画し、その構成比や種類を分析する方法である。ＤＮＡを一本鎖にすると、分子内で水素結合を形成する。温度や塩濃度に依存するが、分子毎に固有の立体構造を形成するので、同一分子量のＤＮＡでも配列の違いに応じて、電気泳動的に移動度が異なる。この違いを利用して、ＤＮＡの種類や構成比を調べることができる。
【００１５】
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）は、該当するＤＮＡに相補的な２種類のプライマーを用い、酵素反応を利用する特定ＤＮＡ（遺伝子）の試験管内増幅方法である。熱変性（約95°C、二本鎖を一本鎖に変性）、アニーリング（約40〜70℃、プライマーを結合）、伸張（約70°C、プライマーを起点とし耐熱性ＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡを合成し二本鎖ＤＮＡとする）、の三段階の反応を20〜40サイクル繰り返すことで、該当ＤＮＡを数万倍に増幅することができる。
【００１６】
本発明で微生物群集構造を解析する試料は、上記のような複数種の微生物を含む試料であり、発酵生産、排水処理、スライムコントロール、医薬分野等の解析対象場所において採取される試料である。このような試料中から微生物の遺伝情報を含む核酸部位を増幅するには、試料から混合状態の核酸を抽出し、この混合状態の核酸をＰＣＲ等により増幅する。微生物の遺伝情報を含む核酸部位としては、微生物に含まれる任意の核酸部位とすることができるが、５ＳｒＤＮＡや１６ＳｒＤＮＡ等のリボゾームＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列ならびにそのスペーサー配列、またはＤＮＡジャーイレースをコードする遺伝子等が適切である。核酸としては、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡが好ましい。ＲＮＡが遺伝情報を含む場合でも、これをＤＮＡに変換した状態で解析に供するのが好ましい。以下の記述は、核酸としてＤＮＡ、一本鎖の核酸としてプラス鎖の場合について説明する。
【００１７】
本発明の増幅工程における二本鎖ＤＮＡの増幅法については、既知の試験管内ＤＮＡ合成方法が利用できるが、ＰＣＲが好ましい。ＰＣＲは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて公知の方法で行うことができ、また市販されているＰＣＲ用キットを用いて行うこともできる。ＰＣＲはフォワードプライマーおよびリバースプライマーの２種類のプライマーを使用する。増幅を期待できる遺伝子長としては、１００〜１５００塩基対程度であるが、長すぎるとＳＳＣＰ解析における分離性能の悪化が予想され、短すぎるとＴＲＦＬＰ解析の信頼性が低下したり、微生物を特定する際の遺伝子情報が少なくなるので、およそ３００〜７００塩基対程度が最適である。増幅対象とされるＤＮＡは、全ての微生物が万遍なく保有するＤＮＡであり、進化の過程で、微妙な配列の違いを生じているものが望ましい。また、遺伝子情報と微生物の名称を特定するうえで、過去に調査された結果がデータベース化されており、容易に検索可能であることが望ましい。
【００１８】
こうしたＤＮＡをＰＣＲにより増幅するためには、プライマーとしてユニバーサルプライマーを用いることができるが、特定の微生物に対象を絞りたい場合は、その特定の微生物に特有な配列を有するプライマーを少なくとも一方のプライマーとして用いることができる。プライマーは以後のＴＲＦＬＰおよびＳＳＣＰに利用できるように、標識を有するものが好ましく、特にＴＲＦＬＰおよびＳＳＣＰの両方に共通して利用できる標識を有するものが好ましい。標識を付けたプライマーとしては、核酸断片を放射性元素、酵素、蛍光物質または化学物質等の標識物質を結合させて標識した核酸断片を用いることができる。標識はプラス鎖を形成するプライマーに付けるのが好ましく、特にプラス鎖を形成するプライマーの５’末端に蛍光物質を付けるのが好ましい。この場合、一方のプライマー（例えばプラス鎖）に標識を付け、他方のプライマー（マイナス鎖）の好ましくは5’末端に、二本鎖核酸の一本鎖をモノヌクレオチドに選択的に分解する酵素が認識するリン酸化等の化学修飾を施したプライマーを用いるのが好ましい。
【００１９】
ＴＲＦＬＰ工程では、微生物群集より抽出したＤＮＡを、標識したプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅し、得られた増幅産物を適切な制限酵素で処理して得られる５’末端側の核酸断片の鎖長を、キャピラリー電気泳動で分画し解析する。５’末端を標識したプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した増幅産物は、５’末端に標識を付けているため、５’末端側の断片をそのままＴＲＦＬＰで検出することができる。この場合、異なる微生物の切断部位が重なる場合は、異なる微生物ごとに異なる位置に存在する切断部位を切断できる制限酵素で切断することによって、末端に付けた標識部位からの長さの異なるＴＲＦ（切断片）を形成し、それぞれの長さおよび量を検出することができる。ここでＴＲＦの量、存在比はすべてのＴＲＦについて正確に決定することもできるが、一部例えば優勢のＴＲＦについてラフに決定することもできる。ＴＲＦの長さ（鎖長）は、末端から切断位置に至る塩基数（二本鎖核酸の場合はプラス鎖の塩基数）により検出することができる。
【００２０】
本発明のＳＳＣＰ工程では、増幅工程で得られた二本鎖の核酸断片から一本鎖の核酸断片を調製し、得られた一本鎖核酸断片を電気泳動的に分画する。この場合、調製した二本鎖ＤＮＡから酵素反応などの手法により一本鎖ＤＮＡを調製する。得られた一本鎖ＤＮＡを電気泳動的に分画し、分画されたＤＮＡを回収してその塩基配列を明らかにすることにより、個々のＴＲＦの塩基配列を特定することができ、これにより塩基配列に基づいて各々の画分に対応する微生物種を決定することができる。この場合、分画されたＤＮＡを回収し、増幅してその塩基配列を明らかにすることができる。
【００２１】
通常、ＤＮＡ分子は二本鎖の状態では、その泳動距離はおおむね分子量に依存する。したがって１６ＳｒＤＮＡのような同一の機能を有する遺伝子は、複数の微生物由来の分子であってもおおむね遺伝子長（鎖長）には大きな差はないことから、個々の分子毎に分離することは困難である。仮に１塩基の違いを区別して分離できても、長さは同じでも配列の異なる分子を区分することはできない。しかし、一本鎖のＤＮＡでは、適切な温度やｐＨないし塩濃度条件においては、分子内塩基間で水素結合が起こり、ＤＮＡ配列の違いに依存して異なる立体構造の分子が形成される。こうしたＤＮＡ混合物を電気泳動に供すると、各ＤＮＡ分子はその立体構造よって固有の移動度を示すので、容易に分離することが可能である。
【００２２】
一本鎖ＤＮＡの調製方法としては、熱変性や水酸化ナトリウム等の化学物質により鎖間の水素結合を解離する方法や、酵素反応によって一方の鎖を分解除去する方法がある。後者の方が、泳動時におけるプラス鎖とマイナス鎖の再結合を防止する意味で望ましい。この場合、一方のプライマー（例えばプラス鎖）に標識を付け、他方のプライマー（マイナス鎖）に二本鎖核酸の一本鎖をモノヌクレオチドに選択的に分解する酵素が認識するリン酸化等の化学修飾を施したＰＣＲで増幅し、ＳＳＣＰ工程においてリン酸化ＤＮＡ鎖等の化学修飾核酸鎖を認識する酵素によりモノヌクレオチドに分解して一本鎖を形成することができる。酵素反応による一本鎖ＤＮＡの調製方法としては、例えば、リン酸化された５’末端を特異的に認識するエキソヌクレアーゼを用いることができる。すなわち、試験管内ＤＮＡ増幅方法において用いる２種類のプライマーＤＮＡのうち、一方（プラス鎖を形成するプライマー）の５’末端をＴＲＦＬＰに用いるために蛍光標識し、もう一方（マイナス鎖を形成するプライマー）の５’末端をリン酸化したものを用いて、増幅産物を調製し、かかる増幅産物をλエキソヌクレアーゼで処理することにより、リン酸化５’末端側のＤＮＡ鎖はモノヌクレオチドに分解されるので、５’末端が蛍光標識された鎖のみを回収することができる。
【００２３】
調製された一本鎖ＤＮＡは電気泳動的に分画することができる。支持体としては、ポリアクリルアミド、アガロース等が挙げられるが、ポリアクリルアミドゲルが望ましい。泳動温度は高温では一本鎖ＤＮＡの分子間水素結合が失われるので、４℃〜４０℃の温度条件で実施することが望ましく、さらに望ましくは２０℃〜２５℃が適切である。泳動後のゲルは、適切な方法、例えばエチジウムブロマイド、サイバーグリーン、銀染色法等によって染色することにより、分離されたＤＮＡ分子を確認することができる。ＤＮＡ分子を内包するゲルは、適切な大きさに切り出した後、適切な緩衝液に浸潰しゲル内のＤＮＡ分子を溶出することができる。この際、電気的にＤＮＡ断片を移動させたり、物理的にゲルを破砕するなどの方法を用いて溶出を促進することも可能である。溶出されたＤＮＡ分子は、前述のＰＣＲ等の試験管内ＤＮＡ増幅反応を用いて、増幅することが可能である。さらに増幅されたＤＮＡを鋳型としてシークエンシング反応を行い、ＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列を決定することができる。得られたＤＮＡ配列を基に、起因する微生物種を明らかにすることができ、また各種制限酵素処理する場合に見込まれるＴＲＦの長さを明らかにすることができる。
【００２４】
群集構造決定工程では、ＳＳＣＰ工程で分画された各一本鎖核酸断片の塩基配列を特定し、塩基配列に基づいて各画分に対応する微生物種を決定するとともに、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦがどの微生物に由来するかを決定する。この場合、ＳＳＣＰ工程において分画された各々の一本鎖核酸断片を回収・分析し、各核酸断片の塩基配列を特定し、特定された塩基配列に基づいて各々の画分に対応する微生物種を決定することができる。また群集構造決定工程としては、ＳＳＣＰ工程で分画された一本鎖核酸断片を増幅して塩基配列を特定し、塩基配列に基づいて各画分に対応する微生物種を決定するとともに、各画分をＴＲＦＬＰ工程で用いた制限酵素で処理する場合に見込まれるＴＲＦの鎖長と、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦの鎖長とを対比して、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦがどの微生物に由来するかを決定するのが好ましい。ここで各画分をＴＲＦＬＰ工程で用いた制限酵素で処理する場合に見込まれるＴＲＦの鎖長とは、実際に制限酵素で処理しなくても、塩基配列から切断位置は決まるので、その切断位置から見込まれるＴＲＦの鎖長と、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦの鎖長とを対比することにより、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦがどの微生物に由来するかを決定することができる。分画された一本鎖核酸断片の増幅は、前記増幅工程と同じ条件のＰＣＲにより行うことができる。
【００２５】
ＳＳＣＰ工程の各画分について、上記のようにして解析された各ＤＮＡ由来の遺伝情報ならびに各ＤＮＡバンドの濃度と、ＴＲＦＬＰ解析におけるＴＲＦの位置およびピーク面積を比較検討することにより、ＴＲＦの由来となった微生物種および存在比を特定することが可能である。この場合、ＳＳＣＰ工程において塩基配列または微生物種を決定した後、ＳＳＣＰ工程で決定された塩基配列または微生物種から、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦがどの微生物に由来するかを決定する際、塩基配列または微生物種が特定されると、その塩基配列における特定の制限酵素による切断位置は決まるから、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦがどの微生物に由来するかは容易に決定することができる。この場合、ＳＳＣＰ工程で決定された塩基配列と、制限酵素によるＴＲＦの切断位置の塩基配列を対比させることにより、ＴＲＦＬＰ工程で分画したピークまたはバンドと、ＳＳＣＰ工程で分画したピークまたはバンドとの関係を特定することは容易である。両者のピークまたはバンドが重なる場合は、制限酵素を選択することにより、重なりを避けることができる。
【００２６】
上記の方法では、ＳＳＣＰ工程における一本鎖ＤＮＡによる解析も、ＴＲＦＬＰと同じ増幅産物を用いているため、ＤＮＡバンドやピークの重なりがない限り、各ＤＮＡ分子の種類や存在割合は一致して表示される。こうした方法を用いて、ＴＲＦＬＰ解析における各ＴＲＦの由来となる微生物を容易に特定することが可能であり、微生物群集構造解析の簡便化に大きく寄与することができる。
【００２７】
以上の解析により、試料中の複数の微生物によって構成される微生物群集に含まれる微生物種の別、ならびにその存在比などの微生物群集構造を明らかにすることができる。このような解析結果は正確で、再現性もよいので、微生物群を培養した状態で、経時的に解析を行うこともでき、再現性のよい結果を得ることができる。解析結果は試料採取場所における微生物群集構造の把握の他、発酵生産、排水処理、スライムコントロール等において、解析結果に基づいて薬剤の選択、薬剤の添加量の決定、反応条件の変更など、制御手段として利用される。また上記の解析操作を行う機器を組み合わせて、コンピュータ等の制御装置を含む解析装置を構成することができるとともに、このような解析装置を上記反応の制御手段として利用することができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明では、試料中の微生物の遺伝情報を含む核酸部位を増幅し、増幅された核酸断片をＴＲＦＬＰ法により処理してＴＲＦの鎖長に対応する存在比を求め、一方ＳＳＣＰ法により一本鎖の核酸断片を調製して電気泳動的に分画して、各核酸断片の塩基配列または微生物種を決定し、決定された塩基配列または微生物種から、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦがどの微生物に由来するかを決定するようにしたので、微生物の持つ遺伝情報を指標として、簡単な操作により、短時間で正確に、複数の微生物によって構成される微生物群集に含まれる微生物種の別、ならびにその存在比を明らかにすることができる。
【００２９】
ＳＳＣＰ工程で分画された一本鎖核酸断片を増殖して塩基配列を特定し、塩基配列に基づいて各画分に対応する微生物種を決定するとともに、各画分をＴＲＦＬＰ工程で用いた制限酵素で処理する場合に見込まれるＴＲＦの鎖長と、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦの鎖長とを対比して、ＴＲＦＬＰ工程で分離されたＴＲＦがどの微生物に由来するかを決定して群集構造決定することにより、正確に微生物種を決定して、群集構造解析の制度を上げることができる。
【００３０】
増幅工程としてＰＣＲを採用することにより、ＴＲＦＬＰおよびＳＳＣＰ工程で利用できる標識プライマーにより効率よく核酸断片を増殖して、解析を行うことができる。ＴＲＦＬＰおよびＳＳＣＰの両方に共通して利用できる標識を有するプライマーによりＰＣＲを行うと、ＴＲＦＬＰおよびＳＳＣＰの両方の解析結果を直接対比できる。
【００３１】
一方のプライマーとして標識プライマーを用い、他方のプライマーとして化学修飾プライマーを用いて増幅することにより、増幅産物の化学修飾を有する核酸鎖をモノヌクレオチドに分解して、標識を有する一本鎖核酸を調製でき、解析を効率化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
次に本発明の実施例について説明する。実施例の％は重量基準である。
【実施例１】
【００３３】
Pseudomonas fluorescence ATCC13525株、Escherichia coli HB101株、Ralstonia eutropha ATCC17697株を、別々にＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を用い３０℃で一晩、振盪培養した。各培養液は、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収後、０．８６％  ＮａＣｌで洗浄し、さらに遠心分離により菌体を回収した。同様の洗浄をもう一度繰り返し、得られた洗浄菌体を０．８６％  ＮａＣｌに懸濁した。あらかじめ、各菌株の濁度と菌数の関係を調べておき、上記菌体件濁液の濁度を指標として、各細菌濃度を３×１０7ＣＦＵ／ｍｌとなるように混合液を調製した。
【００３４】
混合液１ｍｌを遠心分離して菌体を回収し、ＤＮＡ抽出液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ−Ｎａ、０．１Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）に懸濁して、２ｍｌ容積のプラスチックチューブに移した。懸濁液に２gの「０．１ｍｍ径シリカ/ジルコニアビーズ(Biospec Products Inc.製)を加え、ビートビーターで２分間ホモジナイズした。次に、１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテイネースＫ溶液を加え３７℃で１５分間反応し、さらに２５０μｌの１０％  ＳＤＳを加えてよく混和後、６５℃で１時間放置した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分間）後、上澄液０．５ｍｌを採取し、新たな１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに移した。０．５ｍｌのクロロホルムを加えよく混合して、遠心分離をおこない、上澄液を新しいエッペンドルフチューブに移して、０．３ｍｌのイソプロパノールを加えよく混和した。室温に３０分間静置後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分間）を行い、水層を取り除き沈殿物を得た。０．５ｍｌの７０％エタノールでチューブ内と沈殿物をリンスしたのち、沈殿物を真空乾燥機で乾燥させた。乾燥した沈殿物は５０μlのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ８．０]，１ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ＥＤＴＡ[ｐＨ８．０]）溶液に懸濁し、−２０℃に保存した。
【００３５】
細菌混合物より抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。表１の混合物をＰＣＲ反応容器に混合し、９４℃、２０秒間の加熱処理後、９４℃  ２０秒間、５５℃  ３０秒間、７２℃  ２分間の反応を３０サイクル繰り返し、７２℃  ７分間のポスト反応によりＰＣＲ反応を行った。プライマーは、一方は５’末端を６ＦＡＭでラベルしたものを用い、もう一方は５’末端をリン酸化したものを用いた。
【００３６】
【表１】
2006094830.tif 000002
【００３７】
２５μｌのＰＣＲ産物は、Ｓ−３００ＨＲカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、余剰プライマーを除去した後、−２０℃に保存した。上記ＰＣＲ産物は以下のとおり、制限酵素ＢｓｔＵＩにより完全消化後、ＴＲＦＬＰ解析を行った。
【００３８】
【表２】
2006094830.tif 000003
【００３９】
上記表２の試薬を微少遠心管に取り、よく混合後、６０℃で１時間反応させた。さらに１２μｌのホルムアミド、および０．５μｌのSize  Standard (アプライドバイオシステムズ社)を加えてよく混合後、ＰＯＰ４ポリマーを充填したシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製、３１０ジェネティックアナライザー）に供した。得られたＴＲＦＬＰチャートを図１に示す。図１において、１９９ベース、３８２ベース、３８７ベースにＴＲＦピークが確認された。これらのピークはそれぞれの細菌のＰＣＲ産物の切断位置から、P.fluorescenceは３８２ベース、E. coli は３８７ベース、R.eutropha は１９９ベースの位置のピークに相当すると確認された。
【００４０】
次に、ＰＣＲ産物より一本鎖ＤＮＡの調製を行った。一本鎖ＤＮＡの調製の反応は、下記表３の混合物を３７℃で２時間反応した。
【００４１】
【表３】
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【００４２】
反応後、６μlの９５％ホルムアミド、１０ｍＭ  ＮａＯＨ溶液、２μｌの１０倍濃度のローディングバッファー（5 Prime→3 Prime lnc社製）を加え、その全量を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。あわせて、個々の微生物から個別に調製したＰＣＲ産物についても同様に一本鎖ＤＮＡを調製し、あわせて電気泳動した。電気泳動条件は、２６℃、２００Ｖ定電圧、１×ＴＢＳ緩衝液で７時間電気泳動した。電気泳動後のゲルはサイバーグリーン（宝酒造社製）で３０分間染色したのち、トタンスイルミネーターで紫外線照射することによりＤＮＡバンドを検出した。染色写真の写図を図２に示す。個々の細菌由来のＤＮＡはそれぞれ異なる位置に移動し、ＴＲＦＬＰに供したと同じ混合物から調製したＰＣＲ産物では、個々のＤＮＡに相当する３本のバンドが確認され、図１の各ピークに対応することが確認された。
【実施例２】
【００４３】
製紙工場の製紙機（微塗工紙製造、生産量４００ｔ／日）のポリディスクフィルター入口部の白水流路内壁面より採取したスライム（付着物）１００ｍｇを、２ｍｌ容積のプラスチックチューブに移し、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、さらに遠心分離によりＳＳ分を回収した。同様の洗浄をもう一度繰り返し、得られたＳＳをＤＮＡ抽出液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ−Ｎａ、０．１Ｍ  Ｎａ2ＨＰ０4、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）に懸濁した。懸濁液に２ｇの０．１ｍｍ径シリカ／ジルコニアビーズを加え、ビートビーターで２分間ホモジナイズした。次に、１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテイネースＫ溶液を加えて３７℃で１５分間反応し、さらに２５０μｌの１０％  ＳＤＳを加えてよく混和後、６５℃で１時間放置した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分間）後、上澄液０．５ｍｌを採取し、新たな１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに移した。０．５ｍｌのクロロホルムを加えよく混合して遠心分離し、上澄液を新しいエッペンドルフチューブに移して、０．３ｍｌのイソプロパノールを加えよく混和した。室温に３０分間静置後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分間）を行い、水層を取り除き沈殿物を得た。０．５ｍｌの７０％エタノールでチューブ内と沈殿物をリンスしたのち、沈殿物を真空乾燥機で乾燥させた。乾燥した沈殿物は５０μｌのTE溶液に懸濁し、−２０℃に保存した。
【００４４】
細菌混合物より抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応を行った。以下の表４の混合物をＰＣＲ反応容器に混合し、９４℃、２０秒間の加熱処理後、９４℃  ２０秒間、５５℃  ３０秒間、７２℃  ２分間の反応を３０サイクル繰り返し、７２℃  ７分間のポスト反応を行なうことで、ＰＣＲ反応を行った。プライマーは、一方は５’末端を６ＦＡＭでラベルしたものを用い、もう一方は５’末端をリン酸化したものを用いた。
【００４５】
【表４】
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【００４６】
２５μlのＰＣＲ産物は、Ｓ−３００ＨＲカラムに供し、余剰プライマーを除去した後、−２０℃に保存した。上記ＰＣＲ産物は、制限酵素ＢｓｔＵＩで完全消化後、ＴＲＦＬＰ解析を行った。
【００４７】
【表５】
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【００４８】
上記表５の試薬を微少遠心管に取り、よく混合後、６０℃で１時間反応させた。さらに１２μｌのホルムアミド、および０．５μｌのSize  Standard (アプライドバイオシステムズ社製)を加えてよく混合後、ＰＯＰ４ポリマーを充填した３１０ジェネテイックアナライザーに供した。得られたＴＲＦＬＰチャートを図３に示す。２１８ベースの位置と、３８４ベースの位置に高いピークが観察された。蛍光強度を指標としたピーク面積の相対値は、前者が26104であり、後者は47412であったことから、それぞれのＴＲＦが固有の微生物由来のＤＮＡに由来しているとすれば、後者の構成比は前者のおおむね1.8倍であるといえる。
【００４９】
次に、ＰＣＲ産物より一本鎖ＤＮＡの調製を行った。一本鎖ＤＮＡの調製の反応は、下記表６の混合物を３７℃で２時間反応した。
【００５０】
【表６】
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【００５１】
上記、混合物は３７℃で２時間反応した。反応後、６μｌの９５％ホルムアミド、１０ｍＭ  ＮａＯＨ溶液、２μｌの１０倍濃度のローディングバッファー（5 Prime→3Prime Inc社製）を加え、その全量を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動条件は、２６℃、２００Ｖ定電圧、１×ＴＢＳ緩衝液で７時間電気泳動した。電気泳動後のゲルはサイバーグリーンで３０分間染色したのち、トランスイルミネーターで紫外線照射することによりＤＮＡバンドを検出した。染色写真の写図を図４に示すが、２本の濃いバンドと３〜４本の薄いバンドが観察された。濃度の高い２本のバンド（図４、Ａ、Ｂ）について、各バンドを含むゲルをカッターで切りだし、２５０μｌのＴＥ緩衝液に移した。０．１ｍｍシリカジルコニアビーズを加えて、ビートビーターで１分間ホモジナイズし、ゲル内のＤＮＡを抽出した。
【００５２】
抽出物を鋳型とするＰＣＲ反応を行った。以下の表７の混合物をＰＣＲ反応容器に混合し、９４℃、０．２分間の加熱処理後、９４℃  ２０秒間、５５℃  ３０秒間、７２℃  ２分間の反応を３０サイクル繰り返し、ＰＣＲ反応を行った。
【００５３】
【表７】
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【００５４】
２５μｌのＰＣＲ産物は、Ｓ−３００ＨＲカラム（アマシャム社製）に供し、余剰プライマーを除去した後、シークエンシング反応に供した。
【００５５】
【表８】
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【００５６】
上記表８の反応物は、９６℃、１０秒間の加熱処理後、９６℃  １０秒間、５０℃  ５秒間、６０℃  ４分間を２５サイクル繰り返す反応を行なった。反応物は滅菌水を加えて２０μｌとした後、ＡｕｔｏＳｅｑＧ５０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）に供して未反応ヌクレオチドを除去したのち、専用のサンプルチューブに移して９５℃２分間の加熱後、氷水中で急冷し、シークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製、３１０ジェネティックアナライザー）に供した。バンドＡ由来の塩基配列を配列表の配列番号３に、Ｂ由来の塩基配列を配列表の配列番号４に示す。
【００５７】
得られた塩基配列をＢＬＡＳＴプログラムを用いて、NCBIデータベースと照合した結果、２本のバンドのうち、Ａは、Flexibacter-Cytophaga-Bacteroides(FCB)グループに属する未知の細菌として登録された細菌と９７％の相同性を有するＤＮＡであり、ＢはAcinetobacer baummaniと９９％の相同性を示すＤＮＡであることがわかった。それぞれのＤＮＡをＢｓｔＵＩで消化したときに生成する５’末端側のＴＲＦは、塩基配列より２２０と３８６と計算されることから、上述のＴＲＦＬＰで得られた図３に示す２１８のピークはＦＣＢに属する細菌に、３８４のピークはAcinetobacterに由来するものであることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
発酵生産、排水処理、スライムコントロール、医薬分野などの微生物を扱う分野において、複数の微生物によって構成される微生物群集に含まれる微生物種の別、ならびにその存在比などの微生物群集構造を明らかにするために利用される。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】実施例１のＴＲＦＬＰチャートである。
【図２】実施例１の染色写真の写図である。
【図３】実施例２のＴＲＦＬＰチャートである。
【図４】実施例２の染色写真の写図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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