(57)【要約】      （修正有）【課題】抗酸菌属細菌の同定のためのキットの提供。【解決手段】結核菌群の他、多種類の好酸菌属の菌種のゲノム上に存在する遺伝子多型を、インベーダー法により検出するための、同定キットを作製した。各キットは、フラップと呼ぶ特定の共通配列を５’側に持つシグナルプローブと、インベーダーオリゴを組み合わせた、ヌクレオチドの組み合わせからなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記塩基配列の組：
配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１１と１２、配列番号１３と１５、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、配列番号１８と１９、配列番号２０と２１、配列番号２２と２３、配列番号２４と２５、配列番号２６と２９、配列番号２６と３０、配列番号２７と２９、配列番号２８と３０、配列番号３１と３２、配列番号３３と３５、配列番号３４と３５、配列番号３６と３７、配列番号３８と３９、配列番号４０と３７、配列番号４１と４２、配列番号４３と４２、配列番号４４と４５、配列番号４６と４７、配列番号４８と５０、配列番号４９と５０、配列番号５１と５２、配列番号５３と５４、配列番号５５と５６、配列番号５７と５８、配列番号５９と６０、配列番号６１と６２、配列番号６３と６４、配列番号６５と６６、配列番号６７と６８、配列番号６９と７０、配列番号７１と７２、配列番号７３と７４、配列番号７５と７６、配列番号７７と７８及び配列番号７９と８０
で示されるオリゴヌクレオチドを含む、抗酸菌属細菌同定キット、
ただし、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、３１、３３、３４、３６、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４８、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７及び７９で示されるオリゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号８１又は８２で示されるオリゴヌクレオチドをその５’側に有している。
【請求項２】
下記塩基配列の組：
配列番号５と６、配列番号７と８および１１と１２、配列番号１３〜１７、配列番号２４〜３０、配列番号３１〜３５、配列番号３６と３７および４０、配列番号４１〜４３、配列番号４４と４５および４８〜５０、配列番号５１と５２および５５と５６、配列番号５７と５８および６１と６２、配列番号６５〜６８及び配列番号７１と７２および７９と８０
で示されるオリゴヌクレオチドを含む、抗酸菌属細菌同定キット、
ただし、配列番号５、７、１１、１３、１４、１６、２４、２６、２７、２８、３１、３３、３４、３６、４０、４１、４３、４４、４８、４９、５１、５５、５７、６１、６５、６７、７１及び７９で示されるオリゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号８１又は８２で示されるオリゴヌクレオチドをその５’側に有している。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のキットを用いる抗酸菌属細菌を同定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸菌属細菌同定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗酸菌感染症には、結核、非結核性（非定型）抗酸菌感染症やハンセン病があり、現在も、多くの患者が発生している。全世界では総人口の約３分の１（２０億人）が結核に感染しており、毎年８００万人が新たに発病し、２００万人が死亡している。その多くは、アジア地域をはじめとする開発途上国で発生している。日本でも近年、毎年約３．２万人が結核を発病し、２０００人以上が死亡している。抗酸菌感染症、特に、結核感染症は、近年増加傾向にあり、代表的な再興感染症である。また、細胞性免疫能の低下しているＡＩＤ患者の約３分の１が結核を発症しており、ＡＩＤ患者の増加が結核の発症を加速している。さらに、これらの患者では結核のみならず、全身播種型のM.avium complex 感染症や時にはM.kansasii感染症などの抗酸菌症が致命的な合併症となることが知られている。
【０００３】
結核菌は、細菌検査の上で、１）細胞壁に多量の脂質を含有するためグラム染色で染まりにくい、２）増殖が遅く培養同定に時間がかかる、という点が他の細菌とは大きく異なっている。そのため、特殊な染色法および培地が必要となる。この結核の病原診断をできるだけ早く行うために、いろいろな検査法が使われ、その組み合わせも複雑になっている。
【０００４】
迅速細菌検査の第一のものは鏡検であるが、結核菌はグラム染色では染まりにくいため、チーネルゼン染色法あるいは蛍光染色法が使われている。チーネルゼン染色法では、脱色に酸とエタノールを使用するが、脱色しないで赤く染まる抗酸性のある菌を抗酸菌（マイコバクテリウム[Mycobacterium]）と呼ぶ。結核菌は抗酸菌の代表的なものであるが、結核菌以外の抗酸菌は多種類あり、非結核性抗酸菌と呼ばれている。非結核性抗酸菌には現在約１００種類以上の菌種が知られている。その多くは環境に広く分布し、ヒトに対する病原性を持たないが、一部ヒトへの病原性が知られる菌種が存在する。鏡検では、結核菌と非結核性抗酸菌とを区別することはできない。
【０００５】
結核症の起因となる結核菌群（M. tuberculosis complex）には、M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microtiなどの遺伝学的に近縁な菌種が知られているが、実際にヒトから分離される菌はほとんどM. tuberculosisと考えられている。一方、マイコバクテリウム・アビウム（M. avium）とマイコバクテリウム・イントラセルラー（M. intracellulare）はヒトの日和見感染症の起因菌で非結核性抗酸菌症の７０％を占める。遺伝学的に近縁で従来の生化学的性状試験では分類できなかった為、M. avium complex（ＭＡＣ）と総称された。また、M. kansasiiも非結核性抗酸菌症の起因菌で、ＭＡＣの次に頻度が高く２０％を占める。分離頻度が低くなるが、それ以外の起因菌も多数存在する。なお、complexとは前述のように、分類学的近縁関係の菌を区別せず一括して呼ぶときに用いる用語である。
【０００６】
近年、分子生物学的手法を利用した迅速検査法が開発されており、結核菌をはじめとする抗酸菌の検出及び同定に、これらの技術が応用されている。ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）や転写酵素＋逆転写酵素を用いる方法Transcription-mediated amplification（ＴＭＡ）を利用した、「アンプリコア（登録商標）マイコバクテリウム」（ロシュ・ダイアグノスティクス社）や「ＤＮＡプローブ『中外』−ＭＴＤ」（中外製薬）などが知られている。これらの培養操作の不要なキットを使用すれば、喀痰などの臨床検体から１〜２日で結核菌を検出同定することができる。これらのキットは、細菌分類学で最もよく利用されている１６Ｓ  リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子をターゲットとし、菌種特異的プローブを用いたハイブリダイゼーション法により検出する。同定可能な菌種は、結核菌群の他、非結核性抗酸菌のM. avium及びM. intracellulareの２菌種に限られている。これらの方法で、多種類の非結核性抗酸菌を同定するためには、高費用かつ低効率であるという欠点がある。
【０００７】
結核菌をはじめ抗酸菌属細菌の確定診断には、菌の培養が必須である。特に、非結核性抗酸菌に関しては、２００３年に日本結核病学会から出された「肺非結核性抗酸菌症の診断基準」（結核，第７８巻、５６９−５７２ページ、２００３年）に詳しく記述されている。現在、分離培養には固形培地と液体培地が使われている。固形培地は、卵から作製した小川培地が古くから使用されており、抗酸菌の培地上の集落（コロニー）を肉眼で観察することが可能である。液体培地は、小川培地に比べ培養陽性になるまでの時間を短縮できるように近年開発された培地で、主にＭＧＩＴ（Mycobacterium Growth Indicator Tube）法（ベクトン・ディッキンソン社）が使われている。この方法では、菌増殖に伴う液体培地中の溶存酸素の減少を蛍光でモニターしている。いずれの培地でも、抗酸菌の増殖は遅いため、検体中に他の細菌がいると、それが先に増殖してしまう場合がある。それを防ぐために、検体を培養前にアルカリ処理し、抗酸菌以外の菌を殺す操作が必要である。
【０００８】
分離培養で陽性となった場合、その抗酸菌が結核菌なのか非結核性抗酸菌なのか、また、どの菌種なのかを同定する必要がある。従来から、培地上の性状（増殖速度、温度、コロニーの形状や色素産生など）、ナイアシンテスト、硝酸還元試験、耐熱性カタラーゼ試験、ツイーン８０水解試験、蛍光試験などの生化学的性状で菌種の同定が行われており、ナイアシン試験はその中で最も利用されている検査法である。この方法は、結核菌が合成したナイアシンを化学的に検出する試験であるが、小川培地による培養が必須であり、結果がでるまでに２０〜３０日必要である。
【０００９】
喀痰などの生検体からの迅速検査同様、培養後の確定診断用の同定検査法も、最近、分子生物学的手法を用いた細菌同定法が開発されており、前述の２つの検査キット以外にいくつかキットが開発されている。
【００１０】
例えば、その１つに「アキュプローブ」（極東製薬工業）がある。このキットは、培養菌株中に発現している１６Ｓ  ｒＲＮＡをターゲットとし、ＲＮＡ−ＤＮＡのハイブリダイゼーション法を利用し検出を行う。この方法では、細胞内に多数発現している１６Ｓ  ｒＲＮＡを検出していることから、ＭＧＩＴ培養陽性時の菌体を用いて菌種の同定が可能である。このキットで同定できる菌種は、結核菌群（M. tuberculosis complex）とＭＡＣのみであり、M. aviumとM. intracellulareを識別することはできない。
【００１１】
さらに、全染色体ＤＮＡをターゲットとしたＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション法に基づくキット「ＤＤＨマイコバクテリウム極東」（極東製薬工業）が開発されている。この方法は、マイクロプレートに固定された基準株ＤＮＡと被検菌ＤＮＡの全塩基配列の類似度を測定することにより菌種を同定できる。このキットでは、結核菌群（M. tuberculosis complex）、M. avium、M. intracellulareのほか、M. kansasii、M. gordonae、M. chelonae、M. abscessus、M. fortuitum、M. scrofulaceum、M. marinum、M. simiae、M. szulgai、M. gastri、M. xenopi、M. nonchromogenicum、M. terrae、M. triviale、M. peregrinumの計１８菌種の同定が可能である。しかし、この方法は、比較的多くの被検菌ＤＮＡを必要とするため、分離培養でＭＧＩＴ培地を利用した場合でも、小川培地等の固形培地での増菌培養が必要である。したがって、結果がでるまで４週間かかることもあり、迅速性に欠ける。また、純粋培養された新鮮分離株を必要とし、複数菌種混ざった状態では正確な結果が得られない。
【００１２】
株式会社ビーエムエルの過去２年半のＤＤＨ法依頼検体（２００１年７月〜２００４年１月、８７０８検体）を用いて、１８菌種の出現頻度を解析した。その結果、出現頻度の高い順に、結核菌群３０００株（３４．５％）、M. avium  ２６６１株（３０．６％）、M. intracellulare  １３３０株（１５．３％）のほか、M. gordonae  ５２１株（６．０％）、M. kansasii  ４２０株（４．８％）、M. fortuitum  ２４１株（２．８％）、M. abscessus  １９０株（２．２％）、M. chelonae  １５３株（１．８％）、M. peregrinum  ４２株（０．５％）、M. xenopi  ４１株（０．５％）、M. terrae  ３４株（０．４％）、M. scrofulaceum  ２９株（０．３％）、M. szulgai  ２４株（０．３％）、M. nonchromogenicum  １２株（０．１％）、M. marinum  １０株（０．１％）が同定されており、M. simiae、M. gastri及びM. trivialeは一株も検出されていない。
【００１３】
感染症の原因菌を確定することは治療方針を決める上で重要であることから、迅速かつ正確に多種類の抗酸菌を同時に同定することができる検出系の開発が望まれている。特に、喀痰などの生検体から直接菌種を同定する迅速診断検査法と、確定診断のための培養菌株を用いた菌種同定法の両方に適応可能な検出法の開発が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、抗酸菌属細菌の同定のためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、抗酸菌属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列と１６Ｓ−２３Ｓ  ｒＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｐａｃｅｒ  １（ＩＴＳ１）領域を解析したところ、従来の方法で検出可能であった結核菌群（M. tuberculosis complex）、M. aviumおよびM. intracellulareだけでなく、他の臨床的に重要な非結核性抗酸菌を同定することができるという知見を得、この知見に基づき、本発明を完成したものである。したがって、本発明は、下記に関する。
【００１６】
１．下記塩基配列の組：
配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１１と１２、配列番号１３と１５、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、配列番号１８と１９、配列番号２０と２１、配列番号２２と２３、配列番号２４と２５、配列番号２６と２９、配列番号２６と３０、配列番号２７と２９、配列番号２８と３０、配列番号３１と３２、配列番号３３と３５、配列番号３４と３５、配列番号３６と３７、配列番号３８と３９、配列番号４０と３７、配列番号４１と４２、配列番号４３と４２、配列番号４４と４５、配列番号４６と４７、配列番号４８と５０、配列番号４９と５０、配列番号５１と５２、配列番号５３と５４、配列番号５５と５６、配列番号５７と５８、配列番号５９と６０、配列番号６１と６２、配列番号６３と６４、配列番号６５と６６、配列番号６７と６８、配列番号６９と７０、配列番号７１と７２、配列番号７３と７４、配列番号７５と７６、配列番号７７と７８及び配列番号７９と８０
で示されるオリゴヌクレオチドを含む、抗酸菌属細菌同定キット、
ただし、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、３１、３３、３４、３６、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４８、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７及び７９で示されるオリゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号８１又は８２で示されるオリゴヌクレオチドをその５’側に有している。
２．下記塩基配列の組：
配列番号５と６、配列番号７と８および１１と１２、配列番号１３〜１７、配列番号２４〜３０、配列番号３１〜３５、配列番号３６と３７および４０、配列番号４１〜４３、配列番号４４と４５および４８〜５０、配列番号５１と５２および５５と５６、配列番号５７と５８および６１と６２、配列番号６５〜６８及び配列番号７１と７２および７９と８０
で示されるオリゴヌクレオチドを含む、抗酸菌属細菌同定キット、
ただし、配列番号５、７、１１、１３、１４、１６、２４、２６、２７、２８、３１、３３、３４、３６、４０、４１、４３、４４、４８、４９、５１、５５、５７、６１、６５、６７、７１及び７９で示されるオリゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号８１又は８２で示されるオリゴヌクレオチドをその５’側に有している。
上記１．又は２．に記載のキットを用いる抗酸菌属細菌を同定するための方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明のキットは、インベーダー法を用いる抗酸菌属細菌の同定のために設計されたものである。
【００１８】
インベーダー法は、ゲノム上に存在する１塩基多型（Single nucleotide polymorphism: ＳＮＰ）や遺伝子変異などの特定の配列を同定することができる方法である（Ｆｏｒｓら、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ、第１巻、２１９−２２９ページ、２０００年）。この方法は、他のＳＮＰタイピング法に必須なＰＣＲ等のＤＮＡ増幅を必ずしも必要としないことから注目されている。インベーダー法は、インベーダーオリゴがターゲットＤＮＡとシグナルプローブとの間の２本鎖に少なくとも１塩基の浸入（インベージョン）を起こして部分的な３塩基の重複構造を形成すると、構造特異的な５’−エンドヌクレアーゼがシグナルプローブの５’側を切断することを利用している。
【００１９】
本発明のキットは、配列番号１〜８０で示した３８対のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とし、上記オリゴヌクレオチドの前者がフラップと呼ぶ配列を５’側に有するシグナルプローブに、後者がインベーダーオリゴに該当し、インベーダー法による抗酸菌同定に用いることができる。
【００２０】
本キットに採用したプローブ配列（００１６−２）の各オリゴヌクレオチド対（シグナルプローブ及びインベーダーオリゴ）及びその同定可能菌種名を詳細に説明する。なお、シグナルプローブ配列中の小文字で示した塩基配列は、フラップ配列を表す。フラップ配列は、インベーダー法に用いることができる任意の配列を用いることができる。好ましいフラップ配列は、配列番号８１又は８２である。また、下記に示したフラップ配列は、例示であり、これに限定されるものではない。また、インベーダーオリゴ配列中の小文字で示した塩基配列は、３塩基の重複構造を形成させるための塩基を表す。オリゴヌクレオチド名の後のかっこ書きは、フラップに対応するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）プローブの蛍光標識を表す。
【００２１】
ＭＴＣ  （ＦＡＭ）
シグナルプローブ      cgcgccgaggTAAAGCGCTTTCCACC
インベーダーオリゴ    GCGGGCTCATCCCACACCGCc
同定可能菌種名        M. tuberculosis 、M. bovis、M. africanum、M. microti
【００２２】
ＭＡＶ  （ＦＡＭ）
シグナルプローブ      cgcgccgaggAGGTCCTATCCGGTATTAG
インベーダーオリゴ    GCAAAAGCTTTCCACCAGAAGACATGCGTCTTGc
同定可能菌種名        M. avium、M. avium subsp. paratuberculosis、M. avium subsp. silvaticum
【００２３】
ＭＫＮ／ＭＧＡ  （Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤ）
シグナルプローブ      acggacgcggagCCGGGATAAGCCTGG
インベーダーオリゴ    ACGTGGGCAATCTGCCCTGCACAa
同定可能菌種名        M. kansasii、M. gastri
【００２４】
ＭＩＮ  （ＦＡＭ）
シグナルプローブ１    cgcgccgaggTAAAGACATGCGCCTAAA
シグナルプローブ２    cgcgccgaggAAAAGACATGCGTCTAAAG
インベーダーオリゴ    CCATCCCACACCGCAAAAGCTTTCCACCc
同定可能菌種名        M. intracellulare
【００２５】
ＭＣＨ（ＩＴＳ）  （Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤ）
シグナルプローブ      acggacgcggagGCTGGGAAATGGTGC
インベーダーオリゴ    CACTACAGAAACTCGCTTTATGTTCCCAAGCTCATTCGt
同定可能菌種名        M. chelonae
【００２６】
ＭＣＨ／ＭＡＢ  （ＦＡＭ）
シグナルプローブ      cgcgccgaggACTTCATGGTGAGTGGT
インベーダーオリゴ    GGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCACACt
同定可能菌種名        M. chelonae、M. abscessus
【００２７】
Ｇｅｎｕｓ  （Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤ）
シグナルプローブ１    acggacgcggagACACCGCAAAAGCTTT
シグナルプローブ２    acggacgcggagACACCGCTAAAGCGC
シグナルプローブ３    acggacgcggagACACCGCTACCAAACA
インベーダーオリゴ１  CTGATAGGCCGCGGGCTCATCCCc
インベーダーオリゴ２  GGCCGCGGGCCCATCCCc
同定可能菌種名        ほとんどすべての結核菌群細菌
【００２８】
ＭＳＣ  （ＦＡＭ）
シグナルプローブ      cgcgccgaggGCCTTCGTCGATGG
インベーダーオリゴ    TCTTCTCCACCTACCGTCAACCCACAAAGTGAt
同定可能菌種名        M. scrofulaceum
【００２９】
ＭＧＯ  （Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤ）
シグナルプローブ１    acggacgcggagTGTGTCCTGTGGTCC
シグナルプローブ２    acggacgcggagTGTGTTCTGTGGTCCT
インベーダーオリゴ    CACCGCAAAAGCTTTCCACCACAGGACAt
同定可能菌種名        M. gordonae
【００３０】
ＭＦＯ  （ＦＡＭ）
シグナルプローブ      cgcgccgaggATATTCGGTATTAGACCCAG
インベーダーオリゴ    ACCACACACCATGAAGCGCGTGGTCt
同定可能菌種名        M. fortuitum
【００３１】
ＭＦＣ  （Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤ）
シグナルプローブ      acggacgcggagCTATCCGGTATTAGACCCA
インベーダーオリゴ    ACCACACACCATGAAGCGCGTGGTCt
同定可能菌種名        M. farcinogenes、M. senegalense、M. houstonense
【００３２】
ＭＰＥ／ＭＳＥ  （ＦＡＭ）
シグナルプローブ      cgcgccgaggGCACTTCCTGGTGTG
インベーダーオリゴ    CCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGAATATGACCGCt
同定可能菌種名        M. peregrinum、M. septicum
【００３３】
ＭＰＣ  （Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤ）
シグナルプローブ      acggacgcggagGCTCTTCATGGGGTG
インベーダーオリゴ    CCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGAATATGACCGCt
同定可能菌種名        M. porcinum、M. boenickei、M. neworleansense
【００３４】
ＭＴＥ  （ＦＡＭ）
シグナルプローブ      cgcgccgaggTGGGATGCATGTTCTG
インベーダーオリゴ    CTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCAa
同定可能菌種名        M. terrae
【００３５】
ＭＮＯ／ＭＴＥ  （Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤ）
シグナルプローブ      acggacgcggagTCGGCGAAGCTCC
シグナルプローブ      acggacgcggagTCGGCGAAGCTTG
インベーダーオリゴ    TGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAc
同定可能菌種名        M. nonchromogenicum、M. terrae
【００３６】
ＭＸＥ  （ＦＡＭ）
シグナルプローブ      cgcgccgaggAGAATGGTCCTATCCGG
インベーダーオリゴ    ACACTTTCCACCACCCCACATGCGCt
同定可能菌種名        M. xenopi
【００３７】
ＭＩＭ  （Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤ）
シグナルプローブ      acggacgcggagCTCGGCGCATGCC
インベーダーオリゴ    CTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTt
同定可能菌種名        M. intermedium
【００３８】
ＭＳＩ（ＩＴＳ）  （ＦＡＭ）
シグナルプローブ      cgcgccgaggAACCGAAGTCGGCC
インベーダーオリゴ    CCACCACCAAGATGGAGGGACACCACTTCt
同定可能菌種名        M. simiae
【００３９】
ＭＬＥ  （Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤ）
シグナルプローブ      acggacgcggagAAAGGCATGCGCCA
インベーダーオリゴ    CCATCCCACACCGCAAAAGCTTTCCACCAc
同定可能菌種名        M. lentiflavum
【００４０】
ＭＴＲ  （ＦＡＭ）
シグナルプローブ      cgcgccgaggTATGGCCTACCAAGGC
インベーダーオリゴ    CGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTc
同定可能菌種名        M. triviale
【００４１】
ＭＳＺ  （Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤ）
シグナルプローブ      acggacgcggagGGGTCCTATCCGGTATT
インベーダーオリゴ    CACCCCAAGGCATGCGCCTCGt
同定可能菌種名        M. szulgai
【００４２】
ＭＧＡ（ＩＴＳ）  （ＦＡＭ）
シグナルプローブ      cgcgccgaggTGCTTGCTGTTGCG
インベーダーオリゴ    GCCTCAGGACCCAATAGTGTGTCTGGCTa
同定可能菌種名        M. gastri
【００４３】
ＭＭＡ／ＭＵＬ  （Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤ）
シグナルプローブ      acggacgcggagTCATGTCCTGTGGTGG
インベーダーオリゴ    CTGGGTCTAATACCGGATAGGACCACGGGATc
同定可能菌種名        M. marinum、M. ulcerance
【００４４】
また、本発明の一態様においては、本発明のオリゴヌクレオチド対を下記：
ＦＡＭ              Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤ（フラップに対応する蛍光色素）
ＭＴＣ              −
ＭＡＶ              ＭＫＮ／ＭＧＡ
ＭＩＮ              ＭＣＨ（ＩＴＳ）
ＭＣＨ／ＭＡＢ      Ｇｅｎｕｓ
ＭＳＣ              ＭＧＯ
ＭＦＯ              ＭＦＣ
ＭＰＥ／ＭＳＥ      ＭＰＣ
ＭＴＥ              ＭＮＯ／ＭＴＥ
ＭＸＥ              ＭＩＭ
ＭＳＩ（ＩＴＳ）    ＭＬＥ
ＭＴＲ              ＭＳＺ
ＭＧＡ（ＩＴＳ）    ＭＭＡ／ＭＵＬ
の組合わせで用いることができる。
【００４５】
上記の蛍光色素ＦＡＭおよびＲｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤの組み合わせを用いることにより、例えば、マイクロプレートにおいては、使用するウェル数を半分にすることができ、アッセイの効率化及び試薬コストの削減を図ることができる。さらには、本発明をＤＮＡチップ上で行えるようにした基板（特願２００１―３１０１１９）とＳｐｒｅｅｄ法（特願２００３-１８１０６８）によるＮａｎｏ−Ｉｎｖａｄｅｒ法を使用すれば、大幅なアッセイの効率化と試薬コストの削減が可能である。
【００４６】
試料は、抗酸菌を一種以上含むか又は含む可能性があるものであれば特に限定されないが、例としては、培養菌株および喀痰等の生検体を挙げることができる。これらの試料から、公知の調製方法によりＤＮＡを得ることができる。場合により、試料から得られるＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ等の公知の方法に従って１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子およびＩＴＳ１領域を増幅することができる。
【実施例１】
【００４７】
プローブの設計
抗酸菌属細菌の基準株と代表的な変異株（ｓｑｖ：sequence variant）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子とＩＴＳ１領域の塩基配列は、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ：ＲＩＤＯＭ（Ｔｕｒｎｎｅら、ＪＣＭ、第３９巻、３６３７−３６４８ページ、２００１年）から入手した。また、臨床分離株での配列の多様性を確認するために、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースから１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１１３３配列とＩＴＳ１領域の１８９配列を入手した。ＲＩＤＯＭから得た配列をアライメントすることにより、それぞれの菌種につき１箇所以上の菌種特異的な塩基配列を選定した（図１〜１１）。なお、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子解析による菌種同定法が一般的であるため、可能な限り１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を使用して菌種の同定ができるよう試みた。しかし、進化速度が遅いために、遺伝学的に近縁な菌種で１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に明確な違いがない場合は、進化速度が早くより配列に多様性のあるＩＴＳ１領域を利用した。
【００４８】
選定した菌種特異的な塩基配列を検出するプローブを、Third Wave Technologies社（ＴＷＴ社）のプローブデザインソフト（Invader Creator）を用いて設計した。
【００４９】
ＳＮＰ検出の場合、インベーダー反応における特異性は、Cleavase酵素が認識する３塩基の重複構造が形成されるかどうかが大きなポイントとなる。つまり、ＳＮＰ部位でシグナルプローブとターゲットＤＮＡがマッチする構造のみをCleavase酵素が認識し、フラップが切り出されることになる。しかし、ＳＮＰ部位でシグナルプローブとターゲットＤＮＡがマッチしない（ミスマッチ）場合でも、マッチする場合と比較し反応性は低下するもののフラップが切り出されるケースがある。この特異性の低下の原因は不明であるが、おそらくはＳＮＰ部位およびその前後の配列とそれらの立体構造を認識するCleavase酵素との関係に起因することが予想される。
【００５０】
一方、本発明のインベーダー法を用いた抗酸菌同定法では、検出の特異性を高めるためにプローブのデザインに工夫を凝らした。前述したように、インベーダー法に用いるプローブは、シグナルプローブ（ターゲットにハイブリダイズする領域）のＴｍ値は反応温度と同じ６３℃付近に、一方、インベーダーオリゴのＴｍ値は７７℃付近になるようにデザインする。したがって、シグナルプローブのハイブリダイズする領域にターゲットＤＮＡと１塩基でもミスマッチとなる塩基置換が存在すると、プローブのＴｍ値が６３℃より低くなるため、プローブとターゲットＤＮＡのハイブリダイズ効率が低下すると考えられる。一方、インベーダーオリゴとターゲットＤＮＡがミスマッチとなる塩基置換が数塩基ぐらい存在しても、Ｔｍ値が７０℃以下になることはほとんどなく、Cleavase酵素によるフラップの切断反応には影響ないと考えられていた。すなわち、Cleavase酵素によるフラップの切断反応に代表されるインベーダー反応の特異性は、主に３塩基の重複構造を形成する塩基（ＳＮＰと見立てる）を含むシグナルプローブから得られるものと考えられていた。
【００５１】
しかし、後述するように、幾つかの抗酸菌属細菌を同定するために、ＳＮＰと見立てた塩基（３塩基の重複構造を形成する塩基）は同じであるが、そのすぐ近傍の塩基の違いを見分けるプローブが必要であった。この場合、前述のような理由から、異なる塩基をシグナルプローブで認識させるほうがプローブの特異性が得られやすいと考えていた。しかし、以下の例のように、ＳＮＰと見立てた塩基のすぐ近傍の塩基の違いを検出する場合、むしろ、インベーダーオリゴにミスマッチを入れたほうが特異性を得やすいという結果を得た。
【００５２】
１３９〜１４１番塩基（図１参照）の違いを利用して、M. gordonaeを同定した実際の例を挙げる（このプローブはM. heidelbergenseという菌種を検出することが判明したため、キットには採用していない）。１３９〜１４１番塩基の３２菌種のコンセンサス配列（多数決）はＴＴＣであるが、M. fortuitum, M. peregrinumおよびM. nonchromogenicumなどの菌種はＴＴＴを、また、M. abcessus, M. chelonaeおよびM. terraeはＴＣＴを有していた。M. gordonae はＡＴＣを、一方、M. kansasii/M.gastri はＡＣＣを有していることを利用して、両者の同定を試みた。まず、M. gordonaeの検出は、コンセンサス配列と唯一異なる、１３９番塩基のＡをＳＮＰと見立ててプローブのデザインを行った。しかし、M. kansasii/M. gastriも１３９番塩基はＡを有してることから、その１塩基後の１４０番塩基の違いを利用して、M. gordonaeとM. kansasii/M. gastriの識別を行う必要性があった。今までの考えでは、シグナルプローブにミスマッチが入るアンチセンス鎖のプローブにより、M. gordonaeのみ特異的に検出できると考えられた。しかし、実際にアンチセンス鎖をターゲットとしたプローブは、反応効率は若干低下するものの、M. kansasiiおよびM. gastriの基準株ＤＮＡも検出してしまった。逆に、センス鎖をターゲットとしたプローブは、M. kansasii/M. gastriを検出しなかった。つまり、シグナルプローブにミスマッチがある場合に比べ、インベーダープローブの３’末端から２つ目の塩基にミスマッチが導入されたほうが、より特異性の高いプローブとなったのである。これは、インベーダーオリゴのＴｍ値の低下に起因するとは考えられず、インベーダーオリゴの３’末端近くに生じたミスマッチをもった３塩基の重複構造が、Cleavase酵素により認識されにくくなったことが原因だと考えられる。
【００５３】
上記のような現象の発見から、どのようにプローブをデザインしたらより特異性が得られやすいプローブとなるかということが判明した。
【００５４】
M. aviumあるいはM. intracellulareをはじめ、多くの菌種検出用プローブは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の超可変領域（Ｖ２）のおよそ１８０〜２００番塩基に設定している。この場合、この領域内のどの塩基をＳＮＰと見立ててプローブをデザイン・合成しても高い特異性が得られると考えられるが、ＳＮＰと見立てる塩基が同じ場合も多く、より特異性が得やすいよう上述の現象等を利用しデザインを慎重に行なった。
【００５５】
次に、デザインしたプローブの特異性を、ＢＬＡＳＴ検索とＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ   Ｐｒｏｊｅｃｔ−IIの「Probe Match」機能等で確認した。
【００５６】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を使用した場合、M. avium検出用プローブは３セットとも、M. aviumの亜種で遺伝学的に近縁のM. avium subsp. paratuberculosisとM. avium subsp. silvaticumを同時に同定することが判明した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとした同定法で、M. aviumあるいはＭＡＣを同定するキットは、原理的にはすべて、M. avium の亜種であるM. avium subsp. paratuberculosisとM. avium subsp. silvaticumを検出すると考えられるが、これらの菌種は臨床分離株からはほとんど検出されることはないことから、キットの添付書類にはこれらの菌種名は記載されていない。
【００５７】
さらに、M. nonchromogenicumも単独での検出は不可能と考えられたため、M. nonchromogenicumと遺伝学的に非常に近縁であるM. terraeを同時に検出するプローブを作製することにした。また、M. marinumとM. ulceransおよびM. peregrinumとM. septicumは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に明らかな違いが認められず、また、それらを分けて同定する意義に乏しいため、それらを同時に検出するプローブを作製することにした。
【００５８】
一方、M. simiaeを１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子で同定しようとすると、M. simiaeと遺伝学的に近縁である、M. genavense, M. triplex, M. lentiflavum, M. heidelbergense, M. interjectum, M.kubicae, M. intermediumを含む計８菌種を同時に検出してしまうことが判明した。そこで、M. simiaeはＩＴＳ１領域を利用して同定することにした（図９）。さらに、M. kansasiiとM. gastriおよびM. chelonaeとM. abscessusは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に明らかな違いが認められなかったことから、ともに両菌種を１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子で同定するプローブと、さらに、ＩＴＳ１領域を利用してM. gastri（図１０）とM. chelonae（図１１）を同定するプローブを作製することにした。
【００５９】
各菌種につき２〜４セットのプローブを作製し、以下の検討に使用した。合成したプローブの特異性は、まず合成オリゴヌクレオチドを用いて確認した後、抗酸菌の基準株５３株（M. tuberculosis H37Rv, M. tuberculosis H37Ra, M. bovis, M. microti, M. africaum, M. asiaticum, M. marinum, M. ulceranse, M. kansasii sqv.I, M. gastri, M. malmoense, M. avium subsp. avium sqv.I, M. avium subsp. silvaticum, M. intracellulare sqv.I, M. intracellulare sqv.II, M. szulgai, M. genavense, M. triplex, M. lentiflavum, M. simiae, M. heidelbergense, M. interjectum, M. kubicae, M. intermedium, M. gordonae sqv.I, M. gordonae sqv.II, M. scrofulaceum, M. xenopi, M. shimoidei, M. branderi, M. celatum, M. cookii, M. triviale, M. nonchromogenicum, M. terrae sqv.I, M. abscessus, M. chelonae, M. smegmatis, M. flavescens, M. vaccae, M. peregrinum, M. septicum, M. mucogenicum, M. fortuitum, M. alvei, M. hustonense, M. farcinogenes, M. senegalense, M. neworleansense, M. porcinum, M. chitae, M. aichiense, M. ashagni）と、ＭＧＩＴ培地に混入することが知られているStaphylococcus aureusなどの細菌２９株を用いて検討した。さらに、臨床分離株６６８例を用いて、全染色体ＤＮＡ塩基配列の類似性を利用したＤＤＨ法（極東製薬工業）と比較検討した。
【００６０】
測定は、３８４ウェルプレートを用いて、それぞれのインベーダーオリゴ、シグナルプローブ、ＦＲＥＴプローブおよびCleavase酵素と、熱変性した０．６ngのサンプルＤＮＡ（１．８×１０５コピー相当）を同時に混和し、６６℃で１〜４時間反応させた後、蛍光プレートリーダー（CYTOFLUOR4000／Applied Biosystems）で計測した。判定基準はＦＯＺ法を用いた（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１２巻、２２９−２４０ページ、２００３年）。なお、従来のインベーダー法では、反応温度は６３℃であるが、本発明においては、反応温度を６６℃とすることにより菌種同定の特異性をさらに高めることができた。
【００６１】
本発明の方法とＤＤＨ法との結果が整合しない場合には、シークエンス解析により、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列あるいはＩＴＳ１領域の配列を確認した。ＰＣＲプライマーは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子増幅用にForward: ５’- GGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGT -３’とReverse: ５’- CTACCTTGTTACGACTTCGTCCCAATC -３’を、また、ＩＴＳ１領域増幅用にForward: ５’- GTCGTAACAAGGTAGCCGT -３’とReverse: ５’- TGCCAAGGCATCCACC -３’使用し、公知の方法によりＰＣＲ増幅した後に、ダイレクトシークエンスあるいはクローニングシークエンス法により、それぞれの配列を解析した。得られた配列を元に、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく菌種名をＲＩＤＯＭを用いて決定した。
【００６２】
シークエンス解析の結果、ＤＤＨ法でM. intracellulareと判定された臨床分離株には、基準株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列とは異なる配列を有する菌株（sqv.II＆III＆IV）が存在することが判明した（図１２）。基準株検出用のプローブに、これら基準株とは異なる配列を有する臨床分離株検出用のシグナルプローブを加えミックスプローブ化することにより、M. intracellulareの同定率を高めることが可能となった。なお、「アンプリコア（登録商標）マイコバクテリウム」（ロシュ・ダイアグノスティクス社）では、これら基準株と異なる配列を有するM. intracellulareは検出不可能であった。
【００６３】
また、シークエンス解析の結果、M. gordonaeの臨床分離株には、基準株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列とは異なる配列を有する菌株（sqv.II＆III＆IV＆Ｖ）が高頻度に存在することが判明した（図１３）。M. intracellulare同様に、これら基準株とは異なる配列を有する臨床分離株検出用のシグナルプローブを加えミックスプローブ化することにより、M. gordonaeの同定率を高めることが可能となった。
【００６４】
また、M. kansasiiにも、基準株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列とは異なる配列を有する臨床分離株（sqv.II＆III＆VI）が存在することが判明した。３セット作製したM. kansasii/M. gastri検出用のプローブのなかで、これらの配列を有する臨床分離株も検出可能なプローブを選択することにより、M. kansasiiの同定率を高めることが可能となった。
【００６５】
我々の検討結果では、M. terraeのsqv.IIIの配列を有する株はすべてＤＤＨ法でM. nonchromogenicumと同定された。したがって、M. terrae検出用のプローブは、M. terraeのsqv.Ｉ（基準株）とsqv.IIだけを検出するものにした(図１５)。一方、M. nonchromogenicumとM. terraeを同時に検出するプローブの設定領域には、M. terraeの基準株と異なる配列を有する臨床分離株（sqv.II）が存在したことから、シグナルプローブをミックスプローブ化することで対処した。
【００６６】
シークエンス解析の結果、ＤＤＨ法でM. fortuitumと判定される臨床分離株の中に、M. fortuitumと遺伝学的に非常に近縁なM. senegalense, M. farcinogenes, M. porcinumという菌種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する株が存在した。そこで、これらの菌種を同定するプローブの作製を試みた。M. fortuitum complexと言われている菌種の１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子配列を詳細に検討し慎重にプローブをデザインを行ったところ、M. fortuitumの基準株以外に、M. farcinogenesとM. senegalensとM. houstonenseの３菌種を、また、M. porcinuとM. boenickeiとM. neworleansenseの３菌種をそれぞれ検出するプローブを作製することが可能であった。
【００６７】
一方、M. avium、M. chelonaeおよびM. nonchromogenicumの臨床分離株には、データベースに登録されていない、基準株とは異なる配列を有する株が存在した。そこで、それぞれ３セット作製したプローブのなかで、これらの配列を有する株も検出可能なプローブを選択した。
【００６８】
このように、主に１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の５’側配列の超可変領域を利用し、インベーダー法を用いることで、結核菌群（M. tuberculosis complex）、M. avium、およびM. intracellulareなど臨床的に重要な抗酸菌が同定可能となった。なお、基準株あるいは臨床分離株を使用した特異性試験の結果を図１７と図１８に示す。臨床分離株６６８株を用いた検討では、ＤＤＨ法で同定できた臨床分離株６１２例中５６９例（９３．０％）はインベーダー法の結果と一致した。また、インベーダー法では、混合感染も同定可能であった。
【００６９】
一方、ＤＤＨ法で１８菌種以外・判定不能となり、本インベーダー法でM. gordonaeと判定された臨床分離株が１７株確認された。また、ＤＤＨでM. scrofulaceumと判定され、本インベーダー法で３３菌種以外と判定されたものが５株あるなど、ＤＤＨ法と本インベーダー法とで結果が乖離する臨床分離株も確認された。
【００７０】
「ＤＤＨマイコバクテリウム極東」（極東製薬工業）の添付書類に「相関」に関する以下のような記述がある。「保存抗酸菌236菌株を被検菌として、生化学的性状試験による「極東 抗酸菌同定キット」との間で相関を検討した。全体では、本法の同定率は89％（211/236）、従来法との一致率は84％（199/236）でした。菌種ごとでは従来法でM. scrofulaceumと同定される抗酸菌の27％（7/26）、同様にM. gordonaeの27％（4/15）、M. nonchromogenicum complexの48％（11/23）、M. fortuitumの7％（2/29）、M. chelonaeの10％（1/10）が本法では反応しませんでした。これらの菌種以外では、一致率および同定率は100％を示しました。と記載されている。
【００７１】
ＤＤＨ法で同定できなかったM. gordonae  １７例は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子とＩＴＳ１領域のシークエンス解析の結果、すべてM. gordonaeと考えられた。M. gordonaeには、ＤＤＨ法で同定されない臨床分離株が存在することが知られている。ＤＤＨ法の開発者である楠木ら（ＪＣＭ、第２９巻、１５９６−１６０３ページ、１９９１年）は、その論文の中で、ＤＤＨ法でM. gordonaeの同定用にプレートに固相されている基準株（ＡＴＣＣ １４４７０Ｔ）と全染色体ＤＮＡの類似度が７０％以下で、ＤＤＨ法では「１８菌種以外」と判定されてしまう臨床分離株がいることが記述されている。さらに、伊藤ら（ＪＣＭ、第４１巻、１６５６−１６６３ページ、２００３年）は、このようなＤＤＨ法では「１８菌種以外」と判定されてしまうM. gordonaeについて、コロニーの形態・増殖温度・生化学性状・遺伝子解析（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ遺伝子：ｒｐｏＢなど）など詳細な検討を行っている。この論文によると、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の解析からM. gordonaeと判定された臨床分離株３４株は、ｒｐｏＢにより４つのクラスター（Ａ  ９株、Ｂ  ４株、Ｃ  ３株、Ｄ  １５株）に分類された。それぞれ一株ずつしか検討がなされてないが、クラスターＡとＢはＤＤＨ法でM. gordonaeと判定され、一方、クラスターＣとＤは、１８菌種以外と判定されてしまうという結果であった。こららの結果などから、筆者らは、クラスターＣに属するM. gordonaeはM. gordonaeの亜種で、クラスターＤの臨床分離株は「M. gordonae-like」としながらも新菌種の可能性があると述べている。
【００７２】
さらに、ＤＤＨ法とインベーダー法の結果が乖離した臨床分離株について検討した。ＤＤＨ法でM. scrofulaceumと判定されるが、インベーダー法で３３菌種以外と判定された５株について１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のシークエンス解析を行ったところ、そのうち４株はM. parascrofulaceumと判定された。M. parascrofulaceumは２００４年にＴｕｒｅｎｎｅら（ＩＪＳＥＭ、第５４巻、１５４３−１５５１ページ、２００４年）によって同定された新菌種で、M. simiaeと相同性の高い１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子とＩＴＳ１領域を有するが、生化学性状はM. scrofulaceumに似ている菌種である。M. parascrofulaceumは、、M. scrofulaceumには見られないが、発育の早いいわゆる迅速菌とM. simiae complexの遅速菌に見られる１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の超可変領域（Ｖ３）に存在する１２塩基を有していることが特徴的である。一方、ＩＴＳ１領域の配列は、M. simiaeとM. scrofulaceumに非常に相同性の高い配列を有している。我々の検討でも、４株はM. parascrofulaceumに特徴的な１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子およびＩＴＳ１配列を有していた。以上のことから、ＤＤＨ法ではM. parascrofulaceumをM. scrofulaceumと間違って同定してしまうことが示唆された。
【００７３】
また、本インベーダー法やシークエンス解析結果から、M. farcinogenes/M. senegalense/M. houstonenseあるいはM. porcinum/M. boenickei/M. neworleansenseのいずれかの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特徴を有する臨床分離株は、ＤＤＨ法でM. fortuitumと判定された。これらの菌種とM. peregrinumとM. septicumなど加えたグループを「M. fortuitum complex」と称することがあるように、遺伝学的には非常に近縁な菌種である。特に、M. houstonense, M. boenickei, M. neworleansenseは、２００４年に新たな菌種で登録される以前は、すべてM. fortuitumのthird biovariant complexと分類されていた（Ｓｃｈｉｎｓｋｙら、ＩＪＳＥＭ、第５４巻、１６５３−１６６７ページ、２００４年）。
【００７４】
我々の検討では、M. senegalense（ＡＴＣＣ ３５７５３）, M. houstonense（ＡＴＣＣ ４９４０３）, M. porcinum（ＡＴＣＣ ３３７７６）などの基準株が、ＤＤＨ法ではM. fortuitumと判定されてしまうことがあることを確認している。
【００７５】
さらに、M. marinumと遺伝学的に近縁なM. ulceransをM. marinumと間違って判定してしまうことが報告されている（鹿住ら、結核、第７９巻、４３７−４４１ページ、２００４年）。ＤＤＨ法は、「全染色体ＤＮＡの絶対類似度が７０％以上であれば、同じ菌種として良い」という細菌分類学の菌種同定の基準を利用した方法である。しかし、この方法では、臨床分離株がどの菌種の基準株と最も近いかという結果は得られるが、算出された数値は相対類似度であり、分類学で扱う絶対類似度とは隔たりがある場合が多い。ＤＤＨ法の判定基準は、被検体から分離したＤＮＡをビオチン標識した後、１８菌種とブランクである大腸菌のＤＮＡが固相化してあるマイクロプレートに反応させた後、６３０ｎｍの吸光度を測定し、感度（最も吸光度の高かった菌種とブランクの吸光度が）１．９倍以上、相対類似度（２番目に反応性の良かった菌種の特異吸光度が感度の）７０％以下のものを同定結果とする。したがって、被検検体の全染色体ＤＮＡと固相化されている基準株の類似度が７０％未満でも、上記の条件を満たしてしまえば、間違った菌種と誤判定されてしまうことになる。また、この原因の一因は、抽出したＤＮＡ量を最適濃度に合わせていないことも考えられる。
【００７６】
以上のように、ＤＤＨ法では一部の菌種を間違って同定してしまうことが少なからず起こりえることが判明した。
【００７７】
ＤＤＨ法で１８菌種以外の抗酸菌あるいは判定不能とされた臨床検体１５株の１６  ｒＲＮＡ遺伝子シークエンス解析から、M. lentiflavum（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、ＪＣＭ、第３４巻、１１００−１１０７ページ、１９９６年）, M. intermedium（Ｍｅｉｅｒら、ＩＪＳＢ，第４３巻、２０４−２０９ページ、１９９３年）などの菌株が比較的高頻度に分離検出されることが判明した。これら２菌種をそれぞれ特異的に検出するプローブを本キットに組み込むことにより、従来のキットでは検出できなかったこれらの菌種を、本発明により同定することが可能となった。
【００７８】
また、これらの臨床検体から、M. mucogenicum, M. triplex, M. shimoidei, M. asiaticum, M. frederiksbergense (M. fluoroanthenivoranse), M. neoaurum, M. tokaiense/M. murale, M. chubuense, M. mageritenseなどの菌種も確認された。しかし、これらの菌種は臨床検体から分離されることは非常に稀であると考えられることから、これらの菌種検出用プローブは本発明キットに加えなかった。
【００７９】
一方、喀痰、気管支洗浄液あるいは胃液や、あるいはそれらの材料から培養した菌株から調製したＤＮＡを使用して抗酸菌を同定する場合、培養の処理として、一般的にアルカリ処理を行う。アルカリ処理は、前述のように抗酸菌以外の細菌を除菌する目的で行われる。しかし、この処理を行ってもStaphylococcus aureusなどの細菌が混入してくるケースが確認されている。そこで、調製したＤＮＡが抗酸菌属の細菌由来のものであるかどうか確認できるように、抗酸菌属特異的な１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を検出する「Ｇｅｎｕｓ」プローブを作製した。
【００８０】
現行のインベーダー法の場合、２種類の蛍光色素ＦＡＭおよびＲｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤを使用することにより、１つのウェルでＳＮＰのタイピングが可能である。本発明においても、これら２種類の蛍光色素を使用することにより、１つのウェルで複数の菌種を同定することが可能となれば、アッセイの効率化および試薬コストの削減が可能となる。
【００８１】
一般的なインベーダー法では、検出する遺伝子配列のセンス鎖かアンチセンス鎖のどちらか一方にハイブリダイズするプローブセット（ＳＮＰに対応する塩基のみが異なる２種類のシグナルプローブと１種類のインベーダーオリゴ）が使われる。
【００８２】
一方、本発明の場合、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の５’側配列の超可変領域、特にその中の４０塩基に集中した領域に大半のプローブを設定している。さらには、センス鎖とアンチセンス鎖を対象としたプローブが混在している。２セットのプローブを溶液中でミックスした場合、インベーダー反応の特異性や反応性が極端に低下する現象が観察された。これは、互いのプローブがアニールし易くなった結果、プローブのハイブリダイズする効率が低下したり、また、目的とは異なる塩基でCleavase酵素が認識するような３塩基の重複構造が形成されることが原因と考えられる。
【００８３】
センス鎖アンチセンス鎖に関係なく、プローブがハイブリダイズする領域が極力重ならないように、また、仮に重なってもその重なり度が少なくなるように工夫するなど試行錯誤を繰り返しながら、上記のプローブの組み合わせを完成させた。
【００８４】
本発明により、１検体につき２４ウェル（１２種類のプローブでの２重測定）の使用で、計３３菌種の抗酸菌属細菌を同定（グループで検出する菌種も含め）することが可能となった。解析例を図１９に示す。
【００８５】
インベーダー反応の検出感度は、ヒトのＳＮＰｓの場合、３８４ウェルプレートの１ウェルあたりおよそ４０ｎｇ（１．２×１０４コピー）である。抗酸菌の全色体ＤＮＡは、１コピーあたり３．３ｆｇであるので、１ウェルあたりおよそ４０ｐｇのＤＮＡがあれば検出可能な計算になる。本キットは、１検体あたり２４ウェル（１２種類のプローブでの２重測定）を使用するので、再検査分を考慮するとおよそ２ｎｇのＤＮＡがあれば本インベーダー法により抗酸菌の同定が可能であると考えられた。
【００８６】
抗酸菌は、脂質に富んだ硬い細胞壁に包まれていることから、そこから効率良くＤＮＡを抽出するためには、細胞を十分に壊すために破砕ビーズが必要である。我々の検討では、破砕を十分に行えば、その後の操作は一般的なフェノール・クロロフォルム抽出とエタノール沈殿を組み合わせた方法であろうが、磁気ビーズを利用した精製法であろうとも効率良くＤＮＡを抽出することが可能であった。以下の検討には、前者の方法を利用しているＭＯＲＡ−ＥＸＴＲＡＣＴ（極東製薬工業）を用いてＤＮＡの抽出を行った。
【００８７】
小川培地で培養した、M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulareなどを含む３８菌種の抗酸菌基準株を２分の１白金時利用してＤＮＡを抽出したところ、７．２５±３．５１μｇ（平均±標準偏差）のＤＮＡが抽出可能であった。これは本インベーダー法で同定を行うのに十分なＤＮＡ量であった。
【００８８】
現在では、その迅速性からＭＧＩＴ培地で分離培養を行うようになっている。しかし、ＤＤＨ法で抗酸菌の同定を実施する場合、多量のＤＮＡが必要なため、ＭＧＩＴ陽性直後の菌体数では十分量のＤＮＡが抽出できない。そのため、ＭＧＩＴ陽性後にＤＤＨ法を実施する場合、小川培地による増菌培養が必須である。なお、ＭＧＩＴ陽性時の抗酸菌の菌数は、菌種により若干の違いはあるがおよそ１×１０６〜１０７ＣＦＵであることが知られている。
【００８９】
我々は、ＭＧＩＴ培養陽性後の菌体から抽出したＤＮＡで、本インベーダー法による抗酸菌の同定が可能かどうか検討した。鏡検陽性検体８７検体を用いてＭＧＩＴ培養を行い、培養陽性時の菌体のおよそ半量を用いてＤＮＡ抽出を行ったところ、９５１±９４６ｎｇと菌体によって抽出されたＤＮＡ量に大きな違いがあった。これらのＤＮＡを用いてインベーダー法を実施したところ、８１検体（９３．１％）で菌種を判定することが可能であった。判定可能であった８１例の内訳は、結核菌群４２検体、M. avium２２検体、M. intracellulare１０検体、M. chelonae５検体、M. kansasii２検体、M. gordonae１検体及びM. fortuitum１検体であり、ＤＤＨ法の結果とすべて一致していた。なお、ＭＧＩＴ陽性時に他の細菌の混入が確認された検体が５検体確認されたが、そのうち３検体はインベーダー法で同定可能であった。
【００９０】
本検出法では、ＤＤＨ法で必要な小川培地での増菌培養は必ずしも必要なく、ＭＧＩＴ培養陽性時の菌株から破砕ビーズを用いた方法でＤＮＡを抽出することにより、必要量のＤＮＡ量を得ることが可能であった。したがって、結果が得られるまでの日数は、ＤＤＨ法より２週間ほど短縮できることになる。
【００９１】
一方、本発明で検出可能な計３３菌種の抗酸菌属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子あるいはＩＴＳ１領域を同時に増幅できるようなＰＣＲプライマーを使用することにより、喀痰などの生検体からも迅速に菌種の同定が可能となった。例えば、「アンプリコア（登録商標）マイコバクテリウム」（ロシュ・ダイアグノスティクス社）キットで得られるアルカリ変性済みのＰＣＲプロダクトを、塩酸等で中和し、ＴＥバッファー等で希釈したものを使用することができる。等量の０．１Ｎ塩酸で中和し、ＴＥバッファーで１０倍希釈したＰＣＲプロダクトを用いた場合、１０分の１量のCleavase酵素を使用しても、反応時間１５分〜２時間で同定可能であった。なお、このキットで使用されているＰＣＲプライマーでは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のみの増幅でかつM. lentiflavumなどの菌種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は増幅されないため、他の配列を有するＰＣＲプライマーを使用する必要がある。
【００９２】
このように、本発明キットを使用することにより、確定診断用として、培養菌株の抗酸菌属細菌の菌種同定だけでなく、喀痰などの生検体からの迅速診断にも適応可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】抗酸菌属細菌３２菌種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント（１０４番塩基〜１５３番塩基）と各菌種検出用プローブ設定部位を表す。四角で囲んだ塩基は、プローブのデザイン時にＳＮＰと見立てた塩基である。センス鎖に設定したプローブは「Ｓ」で、一方、アンチセンス鎖に設定したプローブは「ＡＳ」で示した。
【図２】抗酸菌属細菌３２菌種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント（１５４番塩基〜２０３番塩基）と各菌種検出用プローブ設定部位を表す。四角で囲んだ塩基は、プローブのデザイン時にＳＮＰと見立てた塩基である。センス鎖に設定したプローブは「Ｓ」で、一方、アンチセンス鎖に設定したプローブは「ＡＳ」で示した。
【図３】抗酸菌属細菌３２菌種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント（２０４番塩基〜２５３番塩基）と各菌種検出用プローブ設定部位を表す。四角で囲んだ塩基は、プローブのデザイン時にＳＮＰと見立てた塩基である。センス鎖に設定したプローブは「Ｓ」で、一方、アンチセンス鎖に設定したプローブは「ＡＳ」で示した。
【図４】抗酸菌属細菌３２菌種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント（２５４番塩基〜３０３番塩基）と各菌種検出用プローブ設定部位を表す。四角で囲んだ塩基は、プローブのデザイン時にＳＮＰと見立てた塩基である。センス鎖に設定したプローブは「Ｓ」で、一方、アンチセンス鎖に設定したプローブは「ＡＳ」で示した。
【図５】抗酸菌属細菌３２菌種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント（３０４番塩基〜３５３番塩基）と各菌種検出用プローブ設定部位を表す。
【図６】抗酸菌属細菌３２菌種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント（３５４番塩基〜４０３番塩基）と各菌種検出用プローブ設定部位を表す。
【図７】抗酸菌属細菌３２菌種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント（４０４番塩基〜４５３番塩基）と各菌種検出用プローブ設定部位を表す。四角で囲んだ塩基は、プローブのデザイン時にＳＮＰと見立てた塩基である。アンチセンス鎖に設定したプローブは「ＡＳ」で示した。
【図８】抗酸菌属細菌３２菌種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント（４５４番塩基〜５０３番塩基）と各菌種検出用プローブ設定部位を表す。四角で囲んだ塩基は、プローブのデザイン時にＳＮＰと見立てた塩基である。センス鎖に設定したプローブは「Ｓ」で示した。
【図９】M. simiaeのＩＴＳ１領域のアライメントとM. simiae検出用プローブ設定部位を表す。四角で囲んだ塩基は、プローブのデザイン時にＳＮＰと見立てた塩基である。センス鎖に設定したプローブは「Ｓ」で、一方、アンチセンス鎖に設定したプローブは「ＡＳ」で示した。シグナルプローブのアニールする塩基を下線で示した。
【図１０】M. kansasiiとM. gastriのＩＴＳ１領域のアライメントとM. gastri検出用プローブ設定部位を表す。四角で囲んだ塩基は、プローブのデザイン時にＳＮＰと見立てた塩基である。センス鎖に設定したプローブは「Ｓ」で、一方、アンチセンス鎖に設定したプローブは「ＡＳ」で示した。シグナルプローブのアニールする塩基を下線で示した。
【図１１】M. chelonaeとM. abscessusのＩＴＳ１領域のアライメントとM. chelonae検出用プローブ設定部位を表す。四角で囲んだ塩基は、プローブのデザイン時にＳＮＰと見立てた塩基である。センス鎖に設定したプローブは「Ｓ」で、一方、アンチセンス鎖に設定したプローブは「ＡＳ」で示した。シグナルプローブのアニールする塩基を下線で示した。
【図１２】M. avium、M. intracellulareの基準株と変異株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメントとM. intacellulare検出用プローブ設定部位を表す。四角で囲んだ塩基は、プローブのデザイン時にＳＮＰと見立てた塩基である。基準株（sqv.Ｉ）とsqv.Ｖを検出するプローブと、sqv.II〜IVを検出するプローブをセンス鎖に設定した。
【図１３】M. gordonaeの基準株と変異株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメントとM. gordonae検出用プローブ設定部位を表す。四角で囲んだ塩基は、プローブのデザイン時にＳＮＰと見立てた塩基である。基準株（sqv.Ｉ）を検出するプローブと、sqv.II〜Ｖを検出するプローブをセンス鎖に設定した。
【図１４】M. kansasiiの基準株と変異株およびM. gastriの基準株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメントとM. kansasii/M. gastri検出用プローブ設定部位を表す。四角で囲んだ塩基は、プローブのデザイン時にＳＮＰと見立てた塩基である。M. gastriとM. kansasiiのsqv.Ｉ〜VIすべてを検出するプローブを設定した。
【図１５】M. terraeの基準株と変異株の基準株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメントとM. terrae検出用およびM. nonchromogenicum/M. terrae検出用プローブ設定部位を表す。四角で囲んだ塩基は、プローブのデザイン時にＳＮＰと見立てた塩基である。M. terraeのsqv.ＩとIIのみを検出するプローブとアンチセンス鎖に設定した。また、M. nonchromogenicumとM. terraeのsqv.Ｉ〜IIIすべてを検出するプローブをアンチセンス鎖に設定した。
【図１６】M. fortuitum complexの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメントとM. fortuitum基準株検出用、M. farcinogene/M. senegalens/M. houstonense検出用およびM. porcinu/M. boenicke/M. neworleansense検出用プローブ設定部位を表す。四角で囲んだ塩基は、プローブのデザイン時にＳＮＰと見立てた塩基である。M. fotuitumのみを検出するプローブをセンス鎖に設定した。M. farcinogeneとM. senegalensとM. houstonenseを検出するプローブをセンス鎖に設定した。M. porcinuとM. boenickeとM. neworleansenseを検出するプローブをアンチセンス鎖に設定した。M. peregrinumとM. septicumを検出するプローブをアンチセンス鎖に設定した。
【図１７−１】基準株を用いたプローブの特異性試験の結果を表す。
【図１７−２】基準株を用いたプローブの特異性試験の結果を表す。
【図１７−３】基準株を用いたプローブの特異性試験の結果を表す。
【図１７−４】基準株を用いたプローブの特異性試験の結果を表す。
【図１８−１】ＤＤＨ法とインベーダー法との結果相関を表す。
【図１８−２】ＤＤＨ法とインベーダー法との結果相関を表す。
【図１９−１】インベーダー法の解析例を表す。小川培地で培養した臨床分離株４株（Ｓ１：M. intracellulare、Ｓ２：M. fortuitum、Ｓ３：M. avium、Ｓ４：M. gordonae）を解析した際のもので、１２セットのプローブのうちセット１を反応させた際のグラフである。白の棒グラフは蛍光色素ＦＡＭのＦＯＺ値を、また、黒の棒グラフは蛍光色素Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤのＦＯＺ値を示している。
【図１９−２】インベーダー法の解析例を表す。小川培地で培養した臨床分離株４株（Ｓ１：M. intracellulare、Ｓ２：M. fortuitum、Ｓ３：M. avium、Ｓ４：M. gordonae）を解析した際のもので、１２セットのプローブのうちセット２を反応させた際のグラフである。白の棒グラフは蛍光色素ＦＡＭのＦＯＺ値を  また、黒の棒グラフは蛍光色素Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤのＦＯＺ値を示している。Ｓ３のみＭＡＶのプローブと反応している。
【図１９−３】インベーダー法の解析例を表す。小川培地で培養した臨床分離株４株（Ｓ１：M. intracellulare、Ｓ２：M. fortuitum、Ｓ３：M. avium、Ｓ４：M. gordonae）を解析した際のもので、１２セットのプローブのうちセット３を反応させた際のグラフである。白の棒グラフは蛍光色素ＦＡＭのＦＯＺ値を、また、黒の棒グラフは蛍光色素Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤのＦＯＺ値を示している。Ｓ１のみＭＩＮのプローブと反応している。
【図１９−４】インベーダー法の解析例を表す。小川培地で培養した臨床分離株４株（Ｓ１：M. intracellulare、Ｓ２：M. fortuitum、Ｓ３：M. avium、Ｓ４：M. gordonae）を解析した際のもので、１２セットのプローブのうちセット４を反応させた際のグラフである。白の棒グラフは蛍光色素ＦＡＭのＦＯＺ値を、また、黒の棒グラフは蛍光色素Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤのＦＯＺ値を示している。４株とも、Ｇｅｎｕｓプローブと反応している。
【図１９−５】インベーダー法の解析例を表す。小川培地で培養した臨床分離株４株（Ｓ１：M. intracellulare、Ｓ２：M. fortuitum、Ｓ３：M. avium、Ｓ４：M. gordonae）を解析した際のもので、１２セットのプローブのうちセット５を反応させた際のグラフである。白の棒グラフは蛍光色素ＦＡＭのＦＯＺ値を、また、黒の棒グラフは蛍光色素Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤのＦＯＺ値を示している。Ｓ４のみＭＧＯのプローブと反応している。
【図１９−６】インベーダー法の解析例を表す。小川培地で培養した臨床分離株４株（Ｓ１：M. intracellulare、Ｓ２：M. fortuitum、Ｓ３：M. avium、Ｓ４：M. gordonae）を解析した際のもので、１２セットのプローブのうちセット６を反応させた際のグラフである。白の棒グラフは蛍光色素ＦＡＭのＦＯＺ値を、また、黒の棒グラフは蛍光色素Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤのＦＯＺ値を示している。Ｓ２のみＭＦＯのプローブと反応している。
【図１９−７】インベーダー法の解析例を表す。小川培地で培養した臨床分離株４株（Ｓ１：M. intracellulare、Ｓ２：M. fortuitum、Ｓ３：M. avium、Ｓ４：M. gordonae）を解析した際のもので、１２セットのプローブのうちセット７を反応させた際のグラフである。白の棒グラフは蛍光色素ＦＡＭのＦＯＺ値を、また、黒の棒グラフは蛍光色素Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤのＦＯＺ値を示している。
【図１９−８】インベーダー法の解析例を表す。小川培地で培養した臨床分離株４株（Ｓ１：M. intracellulare、Ｓ２：M. fortuitum、Ｓ３：M. avium、Ｓ４：M. gordonae）を解析した際のもので、１２セットのプローブのうちセット８を反応させた際のグラフである。白の棒グラフは蛍光色素ＦＡＭのＦＯＺ値を、また、黒の棒グラフは蛍光色素Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤのＦＯＺ値を示している。
【図１９−９】インベーダー法の解析例を表す。小川培地で培養した臨床分離株４株（Ｓ１：M. intracellulare、Ｓ２：M. fortuitum、Ｓ３：M. avium、Ｓ４：M. gordonae）を解析した際のもので、１２セットのプローブのうちセット９を反応させた際のグラフである。白の棒グラフは蛍光色素ＦＡＭのＦＯＺ値を、また、黒の棒グラフは蛍光色素Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤのＦＯＺ値を示している。
【図１９−１０】インベーダー法の解析例を表す。小川培地で培養した臨床分離株４株（Ｓ１：M. intracellulare、Ｓ２：M. fortuitum、Ｓ３：M. avium、Ｓ４：M. gordonae）を解析した際のもので、１２セットのプローブのうちセット１０を反応させた際のグラフである。白の棒グラフは蛍光色素ＦＡＭのＦＯＺ値を、また、黒の棒グラフは蛍光色素Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤのＦＯＺ値を示している。
【図１９−１１】インベーダー法の解析例を表す。小川培地で培養した臨床分離株４株（Ｓ１：M. intracellulare、Ｓ２：M. fortuitum、Ｓ３：M. avium、Ｓ４：M. gordonae）を解析した際のもので、１２セットのプローブのうちセット１１を反応させた際のグラフである。白の棒グラフは蛍光色素ＦＡＭのＦＯＺ値を、また、黒の棒グラフは蛍光色素Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤのＦＯＺ値を示している。
【図１９−１２】インベーダー法の解析例を表す。小川培地で培養した臨床分離株４株（Ｓ１：M. intracellulare、Ｓ２：M. fortuitum、Ｓ３：M. avium、Ｓ４：M. gordonae）を解析した際のもので、１２セットのプローブのうちセット１２を反応させた際のグラフである。白の棒グラフは蛍光色素ＦＡＭのＦＯＺ値を、また、黒の棒グラフは蛍光色素Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＲＥＤのＦＯＺ値を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図１９−６】
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【図１９−７】
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【図１９−８】
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【図１９−９】
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【図１９−１０】
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【図１９−１１】
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【図１９−１２】
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【配列表】
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