(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞播種後、特に、細胞培養下において、新たな細胞接着パターニングの形成およびサイズ変更が可能な、細胞を固定化した基板の作製方法を提供する。【解決手段】基板上に光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物を固定化し、光照射により前記光分解性保護基の少なくとも一部を脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させ、前記露出した末端官能基の少なくとも一部に細胞を吸着させるか、または、前記光分解性保護基の少なくとも一部に細胞接着抑制物質を吸着させ、光照射により前記細胞接着抑制物質が吸着した光分解性保護基の少なくとも一部を脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させ、前記露出した末端官能基の少なくとも一部に細胞を吸着させるか、または、前記露出した末端官能基の少なくとも一部に細胞接着促進物質を吸着させ、前記細胞接着促進物質の少なくとも一部に細胞を吸着させる方法、及び基板の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を固定化した基板の作製方法であって、
基板上に光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物を固定化し、
光照射により前記光分解性保護基の少なくとも一部を脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させ、
前記露出した末端官能基の少なくとも一部に細胞を吸着させることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
前記細胞吸着後、前記光照射により脱離しない光分解性保護基の少なくとも一部を光照射によって脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させ、
前記露出した末端官能基の少なくとも一部に、前記細胞と同種または異種の細胞を吸着させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞を固定化した基板の作製方法であって、
基板上に光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物を固定化し、
前記光分解性保護基の少なくとも一部に細胞接着抑制物質を吸着させ、
光照射により前記細胞接着抑制物質が吸着した光分解性保護基の少なくとも一部を脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させ、
前記露出した末端官能基の少なくとも一部に細胞を吸着させることを特徴とする、前記方法。
【請求項４】
前記細胞吸着後、前記光照射により脱離しない前記細胞接着抑制物質が吸着した光分解性保護基の少なくとも一部を光照射によって脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させ、
前記露出した末端官能基の少なくとも一部に、前記細胞と同種または異種の細胞を吸着させる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞を固定化した基板の作製方法であって、
基板上に光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物を固定化し、
前記光分解性保護基の少なくとも一部に細胞接着抑制物質を吸着させ、
光照射により前記細胞接着抑制物質が吸着した光分解性保護基の少なくとも一部を脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させ、
前記露出した末端官能基の少なくとも一部に細胞接着促進物質を吸着させ、
前記細胞接着促進物質の少なくとも一部に細胞を吸着させることを特徴とする、前記方法。
【請求項６】
前記細胞吸着後、前記光照射により脱離しない前記細胞接着抑制物質が吸着した光分解性保護基の少なくとも一部を光照射によって脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させ、
前記露出した末端官能基の少なくとも一部に前記細胞接着促進物質と同種または異種の細胞接着促進物質を吸着させ、
前記細胞接着促進物質の少なくとも一部に、前記細胞と同種または異種の細胞を吸着させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記光照射をフォトマスクを介して行う、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記末端官能基がカルボキシル基である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞を固定化した基板が細胞アレイである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
基板上に光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物が固定化された基板であって、前記光分解性保護基の少なくとも一部に細胞接着抑制物質が吸着している、前記基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を固定化した基板の作製方法および前記方法に使用され得る基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、培養基板上の規定した領域に細胞を接着させた、いわゆる細胞アレイにおいて細胞を培養することが行われている。特に、組織工学、細胞基盤センサー開発、細胞生物学的な基礎研究などの多岐にわたる分野において、細胞に対して接着性と非接着性の二種類以上の化学種をパターン化した細胞アレイを用いて、細胞の接着領域と非接着領域を規定する技術（細胞パターニング）の確立が求められている。中でも、熱、電気や光などの外部刺激に応じて培養基板上の特定領域の細胞接着性を変換（スイッチング）する技術は、次世代の培養技術として注目を集めている。この技術は、同種・異種細胞間の細胞間情報伝達の研究ツールとして、薬物・毒物スクリーニング用の細胞アレイ作製技術として応用可能である。
【０００３】
特に近年開発が進められている、外部刺激に応じて細胞接着性を変換する技術においては、外部刺激に応じて相転移、酸化・還元、化学反応などの表面化学種が変換する機能性材料が用いられている。そのような機能性材料を用いた、細胞接着のスイッチング技術が、例えば、非特許文献１〜８に開示されている。非特許文献１および２には、温度応答性高分子膜を利用して、細胞接着性／非接着性をスイッチングする技術が提案されている。非特許文献３〜６には、電気化学活性のある単分子膜を利用して、細胞を接着・脱着する技術が提案されている。また、非特許文献７には、マイクロ電極を用いて局所的に酸化剤を発生させて細胞接着抑制性のウシ血清アルブミンを変性させて細胞接着性へと変換する技術が提案されている。非特許文献８には、フォトクロミック化合物であるスピロピランを側鎖にもつ光応答性高分子を用いて、細胞接着性を変換する技術が提案されている。
【０００４】
しかし、非特許文献１〜６に記載の技術は、基板全体に熱や電位をかけるために、あらかじめ細胞接着性を変換できる領域を規定しておく必要があり、培養基板の製造工程が複雑であった。また、あらかじめ接着性を変換できる領域が規定されているために、細胞播種後に細胞の接着の様子を顕微鏡観察した後で、その変換領域を変更することはできなかった。
【０００５】
一方、非特許文献７および８に記載の技術によれば、細胞播種後に新たに細胞接着のパターニングを形成したり、そのサイズを変更することができる。しかしながら、非特許文献７に記載の技術では、局所的に酸化剤を発生させるためにマイクロ電極を必要とし、且つ、マイクロ電極を基板に接近させるために、細胞の無菌環境を保つことは困難と考えられる。また、発生する酸化剤の細胞への影響も懸念される。さらに、その酸化剤の拡散範囲が分解能を決定するため、微細パターンを形成することが困難であることが予想される。
【０００６】
一方、非特許文献８に記載の技術では、スピロピランの光異性化効率がよくないために、細胞接着性の変化効率が悪く、実用レベルに達していない。また、光異性化反応に高出力光源を必要とするため、コストや操作技術の面で実用性に乏しい。また、この技術で使用する化合物は、光によって可逆的に異性化するため、時間が経つと可視光などの吸収によって元の構造に戻ることも懸念される。
【非特許文献１】Makromol. Chem.Rapid.Comm 11: 571-576 (1990)
【非特許文献２】Biomaterials 23: 1121-1130 (2002)
【非特許文献３】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 5992-5996 (2001)
【非特許文献４】ChemBioChem 7: 590-3 (2001),
【非特許文献５】J. Amer. Chem. Soc. 125: 14994-14995 (2003)
【非特許文献６】J. Amer. Chem. Soc. 125: 2366-2367 (2003)
【非特許文献７】Langmuir 20: 16-19 (2004)
【非特許文献８】Polymer Preprints, Japan 53: 1933 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、細胞播種後、特に、細胞培養下において、新たな細胞接着パターニングの形成およびサイズ変更が可能な、細胞を固定化した基板の作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成する手段は、以下の通りである。
[請求項１]細胞を固定化した基板の作製方法であって、
基板上に光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物を固定化し、
光照射により前記光分解性保護基の少なくとも一部を脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させ、
前記露出した末端官能基の少なくとも一部に細胞を吸着させることを特徴とする、前記方法。
[請求項２]前記細胞吸着後、前記光照射により脱離しない光分解性保護基の少なくとも一部を光照射によって脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させ、
前記露出した末端官能基の少なくとも一部に、前記細胞と同種または異種の細胞を吸着させる、請求項１に記載の方法。
[請求項３]細胞を固定化した基板の作製方法であって、
基板上に光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物を固定化し、
前記光分解性保護基の少なくとも一部に細胞接着抑制物質を吸着させ、
光照射により前記細胞接着抑制物質が吸着した光分解性保護基の少なくとも一部を脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させ、
前記露出した末端官能基の少なくとも一部に細胞を吸着させることを特徴とする、前記方法。
[請求項４]前記細胞吸着後、前記光照射により脱離しない前記細胞接着抑制物質が吸着した光分解性保護基の少なくとも一部を光照射によって脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させ、
前記露出した末端官能基の少なくとも一部に、前記細胞と同種または異種の細胞を吸着させる、請求項３に記載の方法。
[請求項５]細胞を固定化した基板の作製方法であって、
基板上に光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物を固定化し、
前記光分解性保護基の少なくとも一部に細胞接着抑制物質を吸着させ、
光照射により前記細胞接着抑制物質が吸着した光分解性保護基の少なくとも一部を脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させ、
前記露出した末端官能基の少なくとも一部に細胞接着促進物質を吸着させ、
前記細胞接着促進物質の少なくとも一部に細胞を吸着させることを特徴とする、前記方法。
[請求項６]前記細胞吸着後、前記光照射により脱離しない前記細胞接着抑制物質が吸着した光分解性保護基の少なくとも一部を光照射によって脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させ、
前記露出した末端官能基の少なくとも一部に前記細胞接着促進物質と同種または異種の細胞接着促進物質を吸着させ、
前記細胞接着促進物質の少なくとも一部に、前記細胞と同種または異種の細胞を吸着させる、請求項５に記載の方法。
[請求項７]前記光照射をフォトマスクを介して行う、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
[請求項８]前記末端官能基がカルボキシル基である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
[請求項９]前記細胞を固定化した基板が細胞アレイである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
[請求項１０]基板上に光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物が固定化された基板であって、前記光分解性保護基の少なくとも一部に細胞接着抑制物質が吸着している、前記基板。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞を固定化した基板の作製方法によれば、細胞播種後、特に細胞培養下において、新たな細胞接着パターニングの形成およびサイズ変更を容易に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の第一の態様は、細胞を固定化した基板の作製方法であって、基板上に光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物を固定化し、光照射により前記光分解性保護基の少なくとも一部を脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させ、前記露出した末端官能基の少なくとも一部に細胞を吸着させることを特徴とする、前記方法である。
本発明の第二の態様は、細胞を固定化した基板の作製方法であって、基板上に光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物を固定化し、前記光分解性保護基の少なくとも一部に細胞接着抑制物質を吸着させ、光照射により前記細胞接着抑制物質が吸着した光分解性保護基の少なくとも一部を脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させ、前記露出した末端官能基の少なくとも一部に細胞を吸着させることを特徴とする、前記方法である。
本発明の第三の態様は、細胞を固定化した基板の作製方法であって、基板上に光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物を固定化し、前記光分解性保護基の少なくとも一部に細胞接着抑制物質を吸着させ、光照射により前記細胞接着抑制物質が吸着した光分解性保護基の少なくとも一部を脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させ、前記露出した末端官能基の少なくとも一部に細胞接着促進物質を吸着させ、前記細胞接着促進物質の少なくとも一部に細胞を吸着させることを特徴とする、前記方法である。
以下、本発明の第一、第二、第三の態様を、本発明の方法ともいう。
【００１１】
本発明の方法では、まず、基板上に光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物（以下、「光分解性保護基含有化合物」ともいう）を固定化する。
前記光分解性保護基含有化合物は、光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物であって、光照射によって光分解性保護基が脱離し、末端官能基が露出するものである。
光分解性保護基は、光照射により脱離する任意の基をいい、例えば、ニトロベンジル基、ニトロフェニルエチルエステル基（NPE）、ジメトキシニトロベンジルエステル基（DMNB）、ブロモヒドロキシクマリン（Bhc）基、ジメトキシベンゾイン基、２−ニトロピペロニルオキシカルボニル（ＮＰＯＣ）基、２−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）基、α−メチル−２−ニトロピペロニルオキシカルボニル（ＭｅＮＰＯＣ）基、α−メチル−２−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＭｅＮＶＯＣ）基、２，６−ジニトロベンジルオキシカルボニル（ＤＮＢＯＣ）基、α−メチル−２，６−ジニトロベンジルオキシカルボニル（ＭｅＤＮＢＯＣ）基、１−（２−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（ＮＰＥＯＣ）基、１−メチル−１−（２−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（ＭｅＮＰＥＯＣ）基、９−アントラセニルメチルオキシカルボニル（ＡＮＭＯＣ）基、１−ピレニルメチルオキシカルボニル（ＰＹＭＯＣ）基、３′−メトキシベンゾイニルオキシカルボニル（ＭＢＯＣ）基、３′，５′−ジメトキシベンゾイルオキシカルボニル（ＤＭＢＯＣ）基、７−ニトロインドリニルオキシカルボニル（ＮＩＯＣ）基、５，７−ジニトロインドリニルオキシカルボニル（ＤＮＩＯＣ）基、２−アントラキノニルメチルオキシカルボニル（ＡＱＭＯＣ）基、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、５−ブロモ−７−ニトロインドリニルオシキカルボニル（ＢＮＩＯＣ）基等を挙げることができ、中でも、２−ニトロベンジル誘導体骨格を有する基は、原料コストや合成の容易性の観点から好ましい。また、光分解性保護基として２−ニトロベンジル誘導体骨格を有する基を持つ光分解性保護基含有化合物は、通常の蛍光灯や白熱灯等の室内照明程度では光分解しないため、化合物自体の取り扱いや該化合物が固定化された基板の取り扱いが容易であるという利点もある。
【００１２】
本発明の第二および第三の態様では、後述するように、前記光分解性保護基の少なくとも一部に細胞接着抑制物質を吸着させるため、光分解性保護基は、使用する細胞接着抑制物質が良好に吸着するという観点から選択することが好ましい。
一方、本発明の第一の態様では、後述するように、前記光分解性保護基の少なくとも一部を光照射によって脱離して末端官能基を脱離させ、その露出した末端官能基の少なくとも一部に細胞を吸着させることにより、細胞パターニングを形成する。そのため、第一の態様では、露出した末端官能基に細胞を選択的に吸着させるために、光分解性保護基は、使用する細胞に対して吸着性を有さないものであることが好ましい。
【００１３】
前記光分解性保護基含有化合物において、光分解性保護基によって保護された末端官能基は、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基、チオール基、ヒドロキシル基、リン酸基であることができ、カルボキシル基であることが好ましい。
本発明の第一および第二の態様では、光照射によって脱保護されて露出した末端官能基に細胞を吸着させる。そのため、第一および第二の態様では、末端官能基は、使用する細胞を良好に吸着するものであることが好ましい。
一方、本発明の第三の態様では、末端官能基に細胞接着促進物質を吸着させるため、末端官能基は、使用する細胞接着促進物質を良好に吸着するものであることが好ましい。
【００１４】
前記光分解性保護基含有化合物は、自己組織化単分子膜を形成する化合物であることが好ましい。光分解性保護基含有化合物が、基板への固定化後に自己組織化単分子膜を形成すれば、光分解性保護基が基板の最表面に整列し、その後光照射によって保護基を脱離することにより、基板の最表面に末端官能基を露出させることができる。このような基板上に、第一および第二の態様では細胞を吸着させ、第三の態様では細胞接着促進物質を吸着させた後に細胞を吸着させれば、最表面に細胞が吸着した基板を得ることができる。自己組織化単分子膜を形成する化合物としては、アルキルシロキサン系化合物、アルカンチオール系化合物、アクリル化合物を挙げることができる。
【００１５】
本発明で使用される光分解性保護基含有化合物は、光分解性保護基によって末端官能基が保護されたアルキルシロキサン系化合物であることができる。光分解性保護基含有化合物がアルキルシロキサン系化合物であれば、特にガラス基板上へ容易に固定化することができる。そのようなアルキルシロキサン系化合物のシラン部は、トリハロロシランまたはトリアルコキシシランであることができる。また、アルキルシロキサン系化合物のアルキル部は、直鎖または分岐の飽和アルキル鎖または不飽和アルキル鎖であることができる。基板表面に固定化された自己組織化膜のパッキングが優れているという点では、アルキル部は、直鎖アルキル鎖であることが好ましい。その炭素数は、例えば１〜２０の範囲の整数であることができ、自己組織化膜のパッキングおよび原料の入手の容易性を考慮すると、４〜２０の範囲の整数であることが好ましい。
【００１６】
具体的には、光分解性保護基によって末端官能基が保護されたアルキルシロキサン系化合物としては、ｏ−ニトロベンジルエステルによってカルボキシル基を保護した、以下に示すシラン化合物を挙げることができる。その合成方法については、Chem.Lett.2000,228-229を参照することができる。
【００１７】
【化１】
2006006214.tif 000002
【００１８】
上記シラン化合物は、光照射によって光分解性保護基であるニトロベンジル基を脱離することにより、末端官能基としてカルボキシル基が誘導される。そのような化合物の具体例としては、以下に示す５−トリクロロシリルペンタン酸（２−ニトロフェニル）エチルエステルを挙げることができる。
【００１９】
【化２】
2006006214.tif 000003
【００２０】
一方、光照射によって末端官能基としてアミノ基が誘導されるシラン化合物としては、下記一般式〔１〕に示す化合物を挙げることができる。
【００２１】
【化３】
2006006214.tif 000004
【００２２】
一般式〔１〕中、Ｘはアルコキシ基又はハロゲン原子を表し、アルコキシ基であることが好ましい。
Ｘで表されるアルコキシ基としては、炭素数は特に制限されるものではないが、炭素数１〜６のアルコキシ基であることが好ましく、具体的には、メトキシ基、エトキシ基、プロポシキ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基等を挙げることができ、これらの中でもメトキシ基、エトキシ基が特に好ましく、また、Ｘで表されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子等を挙げることができる。
【００２３】
一般式〔１〕中、Ｒ1はアルキル基を表す。Ｒ1で表されるアルキル基は、直鎖状であってもよいし、分岐状であってもよく、また不飽和結合を有していてもよく、メトキシ基、エトキシ基等のアルコキシ基や、ホルミル基、アセチル基等のアシル基などの置換基を有していてもよい。上記アルキル基としては、炭素数は特に制限されるものではないが、炭素数１〜６のものが好ましく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基等のアルキル基や、ビニル基、アリル基、２−プロペニル基、２−ブテニル基、２−ペンテニル基、２−ヘプチニル基等のアルケニル基や、プロパルギル基等のアルキニル基等を具体的に挙げることができ、これらの中でも特にメチル基を好適なものとして挙げることができる。
【００２４】
一般式〔１〕中、ｍは１〜３の整数を表し、基板への固定化が容易となる点から、その数が大きいほど好ましい。また、一般式〔１〕中、ｎは整数を表し、出発原料の入手の容易さの点から、１〜２０の整数であることが好ましく、２〜１５の整数であることがより好ましい。
【００２５】
一般式〔１〕中、Ｙは光分解性保護基を表す。光分解性保護基は、前述のように、光照射により離脱する任意の基をいい、例えば、２−ニトロベンジル誘導体骨格を有する基、ジメトキシベンゾイン基、２−ニトロピペロニルオキシカルボニル（ＮＰＯＣ）基、２−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）基、α−メチル−２−ニトロピペロニルオキシカルボニル（ＭｅＮＰＯＣ）基、α−メチル−２−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＭｅＮＶＯＣ）基、２，６−ジニトロベンジルオキシカルボニル（ＤＮＢＯＣ）基、α−メチル−２，６−ジニトロベンジルオキシカルボニル（ＭｅＤＮＢＯＣ）基、１−（２−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（ＮＰＥＯＣ）基、１−メチル−１−（２−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（ＭｅＮＰＥＯＣ）基、９−アントラセニルメチルオキシカルボニル（ＡＮＭＯＣ）基、１−ピレニルメチルオキシカルボニル（ＰＹＭＯＣ）基、３′−メトキシベンゾイニルオキシカルボニル（ＭＢＯＣ）基、３′，５′−ジメトキシベンゾイルオキシカルボニル（ＤＭＢＯＣ）基、７−ニトロインドリニルオキシカルボニル（ＮＩＯＣ）基、５，７−ジニトロインドリニルオキシカルボニル（ＤＮＩＯＣ）基、２−アントラキノニルメチルオキシカルボニル（ＡＱＭＯＣ）基、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、５−ブロモ−７−ニトロインドリニルオシキカルボニル（ＢＮＩＯＣ）基、ブロモヒドロキシクマリン（Bhc）基等を挙げることができるが、下記一般式〔２〕で表されるシラン化合物におけるように、２−ニトロベンジル誘導体骨格を有する基が特に好ましい。
【００２６】
【化４】
2006006214.tif 000005
【００２７】
上記一般式〔１〕で表されるシラン化合物の中でも、上記一般式〔２〕で表されるシラン化合物が好ましく、かかる一般式〔２〕中、Ｒ2は水素原子又はアルキル基を表し、Ｒ2で表されるアルキル基は、直鎖状であってもよいし、分岐状であってもよく、また不飽和結合を有していてもよく、メトキシ基、エトキシ基等のアルコキシ基や、ホルミル基、アセチル基等のアシル基などの置換基を有していてもよい。上記アルキル基としては、炭素数が制限されるものではないが、炭素数１〜６のものが好ましく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基等のアルキル基や、ビニル基、アリル基、２−プロペニル基、２−ブテニル基、２−ペンテニル基、２−ヘプチニル基等のアルケニル基や、プロパルギル基等のアルキニル基等を具体的に挙げることができ、これらの中でも特にメチル基を好適なものとして挙げることができる。
【００２８】
一般式〔２〕中、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立して水素原子又はアルコキシ基を表す。すなわち、Ｒ3及びＲ4は同一の置換基であってもよいし、異なる置換基であってもよいが、同一の基であることが好ましく、アルコキシ基であることが好ましい。Ｒ3及びＲ4で表されるアルコキシ基としては、炭素数は特に制限されるものではないが、炭素数１〜６のアルコキシ基であることが好ましく、具体的には、メトキシ基、エトキシ基、プロポシキ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基等が挙げられ、これらの中でもメトキシ基、エトキシ基が特に好ましい。
【００２９】
一方、光照射によって末端官能基としてスルホ基が誘導されるシラン化合物としては、下記一般式〔３〕に示す化合物を挙げることができる。
【００３０】
【化５】
2006006214.tif 000006
【００３１】
一般式〔３〕中、Ｘはアルコキシ基又はハロゲン原子を表し、Ｙは光分解性保護基を表し、Ｒ1はアルキル基を表す。ｍは１〜３の整数を表し、ｎは整数を表す。一般式〔３〕におけるＸ、Ｙ、Ｒ1については、一般式〔１〕におけるＸ、Ｙ、Ｒ1と同様である。一般式〔３〕におけるｍ、ｎについても、一般式〔１〕におけるｍ、ｎと同様である。
【００３２】
【化６】
2006006214.tif 000007
【００３３】
上記一般式〔３〕で表されるシラン化合物の中でも、上記一般式〔４〕で表されるシラン化合物が好ましく、かかる一般式〔４〕中、Ｒ2は水素原子又はアルキル基を表し、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立して水素原子又はアルコキシ基を表す。一般式〔４〕におけるＲ2、Ｒ3、Ｒ4については、一般式〔２〕におけるＲ2、Ｒ3、Ｒ4と同様である。
【００３４】
一方、光照射によって末端官能基としてチオール基が誘導される化合物としては、下記一般式〔５〕に示す化合物を挙げることができる。
【００３５】
【化７】
2006006214.tif 000008
【００３６】
一般式〔５〕中、Ｘはアルコキシ基又はハロゲン原子を表し、Ｙは光分解性保護基を表し、Ｒ1はアルキル基を表す。ｍは１〜３の整数を表し、ｎは整数を表す。一般式〔５〕におけるＸ、Ｙ、Ｒ1については、一般式〔１〕におけるＸ、Ｙ、Ｒ1と同様である。一般式〔５〕におけるｍ、ｎについても、一般式〔１〕におけるｍ、ｎと同様である。
【００３７】
【化８】
2006006214.tif 000009
【００３８】
上記一般式〔５〕で表されるシラン化合物の中でも、上記一般式〔６〕で表されるシラン化合物が好ましく、かかる一般式〔６〕中、Ｒ2は水素原子又はアルキル基を表し、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立して水素原子又はアルコキシ基を表す。一般式〔６〕におけるＲ2、Ｒ3、Ｒ4については、一般式〔２〕におけるＲ2、Ｒ3、Ｒ4と同様である。
【００３９】
光照射によって末端官能基としてリン酸基が誘導されるシラン化合物としては、下記一般式〔９〕に示す化合物を挙げることができる。
【００４０】
【化９】
2006006214.tif 000010
【００４１】
一般式〔９〕中、Ｘはアルコキシ基又はハロゲン原子を表し、Ｙは光分解性保護基を表し、ＷはＹ又は水素原子を表し、Ｒ1はアルキル基を表す。ｍは１〜３の整数を表し、ｎは整数を表し、ｌは０又は１を表す。一般式〔９〕におけるＸ、Ｙ、Ｒ1については、一般式〔１〕におけるＸ、Ｙ、Ｒ1と同様である。一般式〔９〕におけるｍ、ｎについても、一般式〔１〕におけるｍ、ｎと同様である。
【００４２】
【化１０】
2006006214.tif 000011
【００４３】
上記一般式〔９〕で表されるシラン化合物の中でも、上記一般式〔１０〕又は一般式〔１１〕で表されるシラン化合物が好ましく、かかる一般式〔１０〕及び〔１１〕中、Ｒ2は水素原子又はアルキル基を表し、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立して水素原子又はアルコキシ基を表す。一般式〔１０〕及び〔１１〕におけるＲ2、Ｒ3、Ｒ4については、一般式〔２〕におけるＲ2、Ｒ3、Ｒ4と同様である。
【００４４】
上記一般式〔１〕〜〔６〕及び一般式〔９〕〜〔１１〕で表されるシラン化合物（ｍが０の場合も含む）の中でも、特に一般式〔２〕、一般式〔４〕、一般式〔６〕、一般式〔１０〕及び一般式〔１１〕で表されるシラン化合物が好ましく、これらの中でもｍが１〜３の整数である化合物が好ましく、具体的には１−（２−ニトロフェニル）エチル−Ｎ−（３−（トリエトキシシリル）プロピル）カルバマート（具体例１）、１−（２−ニトロフェニル）エチル−Ｎ−（３−（トリメトキシシリル）プロピル）カルバマート（具体例２）、１−（２−ニトロフェニル）エチル−Ｎ−（３−（メチルジエトキシシリル）プロピル）カルバマート（具体例３）、１−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニル）エチル−Ｎ−（３−（トリエトキシシリル）プロピル）カルバマート（具体例４）、１−（２−ニトロフェニル）エチル−Ｎ−（１１−トリエトキシシリル）プロピル）カルバマート（具体例５）、２−ニトロベンジル−４−（トリメトキシシリル）ブタンスルホネート（具体例６）、２−ニトロベンジル−４−（トリエトキシシリル）ブタンスルホネート（具体例７）、２−ニトロベンジル−３−（トリメトキシシリル）プロピルスルフィド（具体例８）等を挙げることができる。
【００４５】
【化１１】
2006006214.tif 000012
【００４６】
上記シラン化合物の合成方法などの詳細については、特開２００３−３２１４７９号公報を参照することができる。
【００４７】
光分解性保護基含有化合物として、光分解性保護基によって末端官能基が保護されたアルキルシロキサン系化合物を使用する場合、該化合物を固定化する基板は、ガラス基板であることが好ましい。アルキルシロキサン系化合物のガラス基板への固定化は、公知の方法で行うことができる。例えば、アルキルシロキサン系化合物を適当な溶媒に溶解してガラス基板にコーティングし、アルキルシロキサン系化合物を基板にカップリングさせることによって、アルキルシロキサン系化合物をガラス基板上に固定化することができる。コーティングの手段としては、塗布、スプレー、ディッピング等が挙げられ、中でもディッピングが好ましい。固定化は、室温処理によって行うことができ、還流処理を施すことが好ましい。ガラス基板には、固定化処理前に前処理を行うこともできる。前処理は、酸性溶液を基板上にコーティングすることにより行うことができる。酸性溶液としては、硫酸、塩酸、硝酸、過酸化水素等が挙げられ、これらは単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよいが、硫酸及び過酸化水素の併用が好ましい。コーティングの手段としては、例えば、塗布、スプレー、ディッピング等が挙げられる。この前処理により基板上に親水性基（シラノール基）を形成することができる。
【００４８】
更に、本発明では、金属表面を有する基板を用いる場合、光分解性保護基含有化合物として、光分解性保護基によって末端官能基が保護されたアルカンチオールや、分子内にジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を有する化合物のような硫黄含有化合物を用いることができる。これらの硫黄含有化合物は、金属−硫黄結合によって金属基板上に固定化することができる。
【００４９】
そのような硫黄含有化合物としては、以下に示す化合物を挙げることができる。
【００５０】
【化１２】
2006006214.tif 000013
式中、Ｘ’は、目的とする官能基を誘導する基であり、好ましくはカルバメート基、カルボン酸エステル基、カーボネート基、エーテル基、チオカーボネート基、チオエーテル基またはスルホン酸エステル基である。これらの基は、下記のような配置でチオール系化合物またはジスルフィド系化合物中に存在し、光脱離性保護基（Ｙ’）の脱離により、右欄に記載の官能基を誘導する。なお、下表において、ｚは、Ｚに結合する結合手を表し、ｙはＹ’に結合する結合手を表す。
【００５１】
【表１】
2006006214.tif 000014
【００５２】
Ｙ’は、光脱離性保護基であり、所定の反応工程においてはＸ’を保護し、光照射により脱離する性質を有する。このような光脱離性保護基としては、好ましくは下記式[１５]にて示される光脱離性保護基を例示できる。
【００５３】
【化１３】
2006006214.tif 000015
【００５４】
Ｒ11は、水素またはメチル基であり、
ｂは、１〜４の整数、好ましくは１〜２の整数であり、
Ｒ12は、水素またはメトキシ基であり、ｂが２以上の場合は、２つのＲ12は共同して酸素を含んでいてもよい環（たとえばメチレンジオキシ基）を形成してもよい。
したがって、好ましい光脱離性保護基としては、下記構造のものを例示できる。
【００５５】
【化１４】
2006006214.tif 000016
【００５６】
上記のような光脱離性保護基Ｙ’は、光照射によりＸ’から脱離し、上記表に示した基を誘導する。なお、Ｙ’の脱離に際して、Ｘ’の一部もともに脱離する場合がある。たとえば、上記表において、カルバメート基からアミン基が誘導される際には、カルバメート基中のＣＯＯ基も光脱離性保護基Ｙ’とともに脱離する。
Ｚは、ヘテロ原子を含有していてもよい二価の炭化水素基であり、単分子膜の形成を損なわない限り、特に限定はされないが、
好ましくは−（ＣＨ2）c−、−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）d−、
【００５７】
【化１５】
2006006214.tif 000017
【００５８】
から選ばれる。ここで、ｃ、ｄ、ｅ、ｆは、それぞれ好ましくは１〜３０の整数、さらに好ましくは１〜２０の整数である。また、Ｚは、上記の基の組み合わせであってもよい。この場合、ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆは、好ましくは１〜４０、さらに好ましくは１〜２０程度である。
したがって、Ｚが、−（ＣＨ2）c−単独で構成される場合には、ｃは、好ましくは１〜３０の整数、さらに好ましくは１〜２０の整数であり、
Ｚが、−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）d−単独で構成される場合には、ｄは、好ましくは１〜３０の整数、さらに好ましくは１〜２０の整数であり、
Ｚが、−（Ｐｈ）e−単独で構成される場合には、ｅは、好ましく１〜３０の整数、さらに好ましくは１〜２０の整数であり、
Ｚが、−（Ｐｈ−Ｏ）f−単独で構成される場合には、ｆは、好ましく１〜３０の整数、さらに好ましくは１〜２０の整数である。
【００５９】
上記した構成単位は、上述したように、任意の組み合わせで２種以上含まれていてもよい。このようなＺの構成例としては、下記の基を例示できる。
−（ＣＨ2）c1−（Ｐｈ）e1−（ＣＨ2）c2−
（ｃ１は、１〜２０の整数、ｅ１は１〜２０の整数、ｃ２は１〜２０の整数であり、ｃ１＋ｅ１＋ｃ２は４０以下である）
−（ＣＨ2）c3−（Ｐｈ−Ｏ）f1−
（ｃ３は、１〜２０の整数、ｆ１は１〜２０の整数、ｃ３＋ｆ１は４０以下である）
−（ＣＨ2）c4−（Ｐｈ−Ｏ）f2−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）d1−
（ｃ４は、１〜２０の整数、ｆ２は１〜２０の整数、ｄ１は１〜２０の整数であり、ｃ４＋ｆ２＋ｄ１は４０以下である）
なお、式[１３]において、複数のＸ’、Ｙ’、Ｚはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００６０】
また、式[１４]において、ａは０〜１０の整数、好ましくは０〜３の製数である。したがって、式[１４]における好ましい環状スルフィド部分（Ｓ−Ｓ結合含有環）は、下記式にて示される。なお、下記式中ｚは、上記Ｚに結合する結合手を示す。
【００６１】
【化１６】
2006006214.tif 000018
【００６２】
上記硫黄含有化合物の合成方法などの詳細については、特開２００４−５１６２４号公報を参照することができる。このような硫黄含有化合物の金属表面を有する基板への固定化は、公知の方法で行うことができる。例えば、硫黄含有化合物を含む溶液に基板を浸漬し、例えば室温で所定時間放置することにより、硫黄含有化合物を金属表面を有する基板に固定化することができる。
【００６３】
本発明において、光分解性保護基含有化合物を固定化する基板は、固定化する物質に応じて適宜選択することができる。基板としては、例えば、ガラス基板、金属を蒸着したガラス基板、金属基板、ポリスチレン基板を挙げることができる。前述のように、光分解性保護基含有化合物がアルキルシロキサン系化合物である場合は、ガラス基板を用いることが好ましく、光分解性保護基含有化合物が硫黄含有化合物である場合は、金属表面を有する基板を用いることが好ましい。金属表面を有する基板としては、金基板、銀基板、白金基板等の貴金属基板、または金、銀、白金等の貴金属を蒸着させたガラス基板を用いることができる。これらの基板は、公知の方法で作製することができ、市販品として入手することもできる。
【００６４】
次に、本発明の各態様について説明する。
[第一の態様]
本発明の第一の態様では、基板上に光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物を固定化し、次いで、光照射により光分解性保護基の少なくとも一部を脱離して末端官能基の少なくとも一部を露出させる。そして、露出した末端官能基の少なくとも一部に細胞を吸着させることにより、細胞を固定化した基板を作製する。ここで、部分的に光を照射して光分解性保護基の一部を脱離して末端官能基を露出させ、その上に細胞を吸着させれば、細胞が吸着したパターンを有する基板を作製することができる。更に、一種の細胞パターンを形成した後に、基板の他の部分において再度同様の操作を行い、新たな細胞を吸着させれば、同種または異種の複数の細胞パターンを有する基板を得ることができる。
【００６５】
光分解性保護基の脱離に使用する光は、光分解性保護基が脱離して末端官能基が露出することができれば特に制限はなく、例えば、紫外光（波長１〜４００ｎｍ）を使用することができ、脱離させる光分解性保護基の光分解能によって、適宜長波長（例えば３６５ｎｍ）の光を使用することができる。
光照射は、基板の光分解性保護基含有物質が固定化された面側から行うこともでき、その反対の面から行うこともできる。反対面から行う場合、基板は光透過性の材質、例えばガラスからなるものであることが好ましい。また、パターンを形成したフォトマスクを介して光照射を行えば、所望の位置の光分解性保護基を選択的に脱離することができる。光脱離性保護基の脱離の条件は、光分解性保護基の種類により様々であり、一概には決定できないが、一般的には、室温程度の温度で、十分な光量の紫外線を照射することにより、光分解性保護基を脱離することができる。
【００６６】
前述の光分解性保護基の光分解反応は、例えば、光源として蛍光顕微鏡に備えられた水銀ランプを使用することによって行うことができる。標準的な蛍光顕微鏡を使用した光照射系の一例を、図１に基づいて説明する。まず、図１に示すように、視野絞りと呼ばれる部分に、フォトマスクを挿入する。フォトマスクには、基板上に形成したい細胞パターンに応じたパターンを設ける。このフォトマスクは、例えばＯＨＰシートに所望のパターンを印刷することによって作製することができる。その後、水銀光源からの光を励起フィルターに通して、光分解性保護基に応じた所望の波長の光を選択的に照射することにより、光分解性保護基を脱離させることができる。
【００６７】
このように光分解性保護基を脱離することによって、末端官能基を露出させる前後に、基板を洗浄することが好ましい。基板の洗浄は、公知のバッファーを用いて行うことができる。
【００６８】
必要により基板を洗浄した後、露出した末端官能基の少なくとも一部に細胞を吸着させる。細胞の吸着は、前述のように一部の末端官能基を露出させた基板を、細胞を含む培地存在下に置き、所定時間インキュベートすることによって行うことができる。細胞接着に適した末端官能基としては、＋に荷電した表面に細胞（特に神経細胞や遺伝子導入した細胞）が接着し易いと言う知見に基づくと、アミノ基を挙げることができる。但し、−に荷電した表面や中性の表面に対しても、細胞は接着することもあるため、末端官能基の種類は、細胞に応じて適宜選択することが好ましい。
【００６９】
第一の態様では、末端官能基が露出した部分以外の基板表面への細胞の吸着を抑制するために、光分解性保護基は、使用する細胞に対して吸着性を有さないことが好ましい。これにより、基板全体を細胞存在下においても、末端官能基にのみ選択的に細胞を吸着させることができる。親水的な表面には細胞が接着しにくい傾向があるため、光分解性保護基の親水性が高ければ、細胞接着を効果的に抑制することができる。また、光分解性保護基含有化合物として、水素結合アクセプターを持った基を有する中性化合物を用いることにより、末端官能基が露出した部分以外の基板表面への細胞吸着を効果的に抑制できる場合がある。
【００７０】
本発明の第一、第二、および第三の態様において使用される細胞は、神経、内皮、皮膚、肺、筋肉、腎臓、肝臓、腸など由来の初代培養細胞、およびそのガン化細胞や細胞株（HepG2、HUVEC、CHO、PC12、HeLa、MDCKなど）であることができる。また、体性・胚性幹細胞ならびに遺伝子導入した組換え体細胞なども使用することができる。更に、ほ乳類の細胞以外も用いることができ、その生物種は問わない。本発明では、例えば、HEK293細胞、COS７細胞、NIH3T3細胞を用いることができる。
【００７１】
前記培地に加える細胞数は、接着領域が満たされる程十分多ければ、その数を問わない。実用的には、２時間程度で細胞と接着領域が衝突し得るのに十分多い細胞数を加えることが適当である。例えば、直径3.5 cmディッシュに対して、0.25 mm2程度の細胞接着領域を形成する場合は、105オーダーの細胞を加えれば十分である。また、使用する培地は、それぞれの細胞の培養に適した培地から適宜選択することができ、公知の培地を用いることができる。細胞を厳密に接着領域にとどめたい際は、細胞播種時は血清を含まない培地を用い、１〜２時間後に血清を含む正常培地に置換することが好ましい。
【００７２】
以上の操作後、別のパターンを形成したフォトマスクを用いて光照射を行って、先の光照射により脱離しなかった光分解性保護基の一部を脱離して末端官能基を露出させ、前記露出した末端官能基の少なくとも一部に、先に吸着させた細胞と同種または異種の細胞を吸着させれば、新たな細胞パターンを形成することができる。新たな細胞パターンの形成は、基板を含む培地を細胞を含まない培地に置換した後に、新たなパターンに対応したフォトマスクを用いて光照射を行い、その後新たな細胞を培地に添加することによって行うことができる。この際、先に吸着させた細胞とは別の種類の細胞を吸着させれば、二種類の細胞パターンを有する基板を形成することができる。更に同様の操作を行えば、三種以上の細胞パターンを形成することも可能である。
【００７３】
[第二の態様]
本発明の第二の態様では、基板上に光分解性保護基含有化合物を固定化した後、光分解性保護基の少なくとも一部に細胞接着抑制物質を吸着させる。細胞接着抑制物質の吸着は、細胞接着抑制物質を含む溶液に基板を浸漬し、または、細胞接着抑制物質を含む溶液を基板上に滴下して所定時間放置することによって行うことができる。細胞接着抑制物質の吸着前に、例えばエタノールによって基板に滅菌処理を施すこともできる。また、細胞接着抑制物質を吸着させる前後に、基板を洗浄することが好ましい。基板の洗浄は、公知のバッファーを用いて行うことができる。
【００７４】
細胞接着抑制物質としては、例えば、タンパク質（血清アルブミン、オボアルブミン、カゼイン、キニノゲンなど）、高分子（ポリエチレングリコール、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（MPC）、アガロース、ポリサッカライド、およびその誘導体）、低分子化合物（オリゴエチレングリコール、マンニトール、およびその誘導体、天然・合成リン脂質（フォスファチジルコリンなど））を用いることができ、使用する細胞に応じて選択することが好ましい。中でも、多くの細胞に対して接着抑制効果を有するため、血清アルブミンを用いることが好ましい。また、ここに例示した細胞接着抑制物質は、多くの細胞種に適用可能であるが、細胞接着抑制性タンパク質を消化するプロテアーゼを分泌する細胞もあり、その際は、高分子・低分子化合物、またはリン脂質を使用することが好ましい。また、細胞接着抑制物質の選択にあたっては、光分解性保護基に対する吸着性も考慮することが好ましい。
【００７５】
細胞接着抑制物質を含む溶液は、細胞接着抑制物質を適当なバッファーに溶解することによって調製することができる。溶液中の細胞接着抑制物質の濃度は、使用する細胞接着抑制物質の細胞接着抑制効果等に応じて適宜調整することが好ましく、例えば、1 μg/ml〜20 mg/mlとすることができる。バッファーとしては、中性付近に緩衝能を有するものを用いることができ、例えば、リン酸バッファー、炭酸バッファー、HEPESバッファー等を用いることができる。また、バッファーの濃度は、緩衝能を発揮する濃度範囲であり、且つ、細胞接着抑制性物質の活性が失われない程度の濃度であることが好ましく、例えば、１００〜２００ｍＭが実用的である。
【００７６】
その後、光照射によって細胞接着抑制物質が吸着した光分解性保護基の少なくとも一部を脱離して末端官能基の少なくとも一部を露出させる。この光照射による光分解性保護基の脱離については、先に第一の態様について述べた通りであり、部分的に光照射を行うことによって、基板上の所望の位置に末端官能基を露出させることができる。こうして露出させた末端官能基に細胞を吸着させることにより、細胞を固定化した基板を得ることができる。細胞の吸着方法については、先に第一の態様について述べた通りである。第二の態様では、末端官能基が露出した部分以外の基板表面は、細胞接着抑制物質が吸着しているため、細胞接着が抑制される。そのため、基板全体を細胞存在下においても、末端官能基にのみ選択的に細胞を吸着させることができるという利点がある。
【００７７】
第二の態様においても、別のパターンを形成したフォトマスクを用いて光照射を行って、先の光照射によって脱離しなかった光分解性保護基（細胞接着抑制物質が吸着している）の一部を脱離して末端官能基を露出させ、露出した末端官能基に先に吸着させた細胞と同種または異種の細胞を吸着させれば、新たな細胞パターンを形成することができる。新たな細胞パターンの形成は、基板を含む培地を、細胞を含まない培地に置換した後、新たなパターンに対応したフォトマスクを用いて光照射を行い、その後新たな細胞を培地に添加することによって行うことができる。この際、先に吸着させた細胞とは別の種類の細胞を吸着させれば、二種類の細胞パターンを有する基板を形成することができる。更に同様の操作を行えば、三種以上の細胞パターンを形成することも可能である。
【００７８】
[第三の態様]
本発明の第三の態様では、光分解性保護基の少なくとも一部に細胞接着抑制物質を吸着させ、光照射により前記細胞接着抑制物質が吸着した光分解性保護基の少なくとも一部を脱離して前記末端官能基の少なくとも一部を露出させる。これらの操作については、先に第二の態様について述べた通りであり、部分的に光照射を行うことによって、基板上の所望の位置に末端官能基を露出させることができる。その後、露出した末端官能基の少なくとも一部に細胞接着促進物質を吸着させる。細胞接着促進物質の吸着は、細胞接着促進物質を含む溶液に基板を浸漬し、または、細胞接着促進物質を含む溶液を基板上に滴下して所定時間放置することによって行うことができる。細胞接着促進物質を吸着させる前後に、基板を洗浄することが好ましい。基板の洗浄は、公知のバッファーを用いて行うことができる。
【００７９】
細胞接着促進物質としては、例えば、タンパク質（フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、テネイシンなど）、高分子（ポリリジン、RGDペプチド修飾高分子など）、低分子化合物（接着タンパク質模倣ペプチド（RGDペプチド、PHSRNペプチド）など）を用いることができ、使用する細胞に応じて選択することが好ましい。中でも、フィブロネクチンは、多数の細胞に対して細胞接着性を有するため好ましい。細胞接着促進物質としては、使用する細胞種の細胞膜中に発現している受容体蛋白質に対するリガンドとなるもの（蛋白質、その模倣物質およびその断片）を使用することが好ましい。例えば、神経細胞であればラミニンが、内皮細胞、肝細胞、筋肉細胞などはコラーゲンが効果的である。また、神経細胞や遺伝子導入した細胞に関しては、ポリリジンなどの＋に荷電した高分子化合物も有効である。また、細胞接着促進物質の選択にあたっては、末端官能基に対する吸着性も考慮することが好ましい。
【００８０】
細胞接着促進物質を含む溶液は、細胞接着促進物質を適当なバッファーに溶解することによって調製することができる。溶液中の細胞接着促進物質の濃度は、使用する細胞接着促進物質の細胞接着性等に応じて適宜調整することが好ましく、例えば、1 μg/ml〜20 mg/mlとすることができる。また、バッファーとしては、中性付近に緩衝能を有するものを用いることができ、例えば、リン酸バッファー、炭酸バッファー、HEPESバッファー等を用いることができる。また、バッファーの濃度は、緩衝能を発揮する濃度範囲であり、且つ、細胞接着促進物質の活性が失われない程度の濃度であることが好ましく、例えば、１００〜２００ｍＭが実用的である。
【００８１】
細胞接着促進物質を吸着させた後、細胞接着促進物質の少なくとも一部に細胞を吸着させることにより、細胞を固定化した基板を得ることができる。細胞の吸着は、先に第一の態様について説明した方法と同様の方法で行うことができる。特に、第三の態様では、細胞接着促進物質に細胞を吸着させるため、第一、第二の態様の方法と比べて、細胞の吸着が良好に行われるという利点がある。また、第三の態様も、第二の態様と同様に、末端官能基が露出した部分以外の基板表面は、細胞接着抑制物質が吸着しているため、細胞接着が抑制される。そのため、基板全体を細胞存在下においても、細胞を基板上の細胞接着促進物質に選択的に接着させることができるという利点もある。
【００８２】
第三の態様においても、別のパターンを形成したフォトマスクを用いて光照射を行って、先の光照射によって脱離しなかった光分解性保護基（細胞接着抑制物質が吸着している）の一部を脱離して末端官能基を露出させ、露出した末端官能基の少なくとも一部に先に吸着させた細胞接着促進物質と同種または異種の細胞接着促進物質を吸着させ、その細胞接着促進物質の少なくとも一部に、先に吸着させた細胞と同種または異種の細胞を吸着させれば、新たな細胞パターンを形成することができる。新たな細胞パターンの形成は、新たなパターンに対応したフォトマスクを用いて光照射を行い、光照射の前または後に、基板を含む培地を、細胞接着促進物質を含む培地に置換し、その後新たな細胞を培地に添加することによって行うことができる。この際、先に吸着させた細胞とは別の種類の細胞を吸着させれば、二種類の細胞パターンを有する基板を形成することができる。更に同様の操作を行えば、三種以上の細胞パターンを形成することも可能である。
【００８３】
以上説明した本発明の第一、第二、第三の態様の方法によれば、細胞播種後に、新たな細胞接着パターニングの形成およびサイズの変更を行うことができる。特に、本発明の方法における光分解性保護基の脱離、細胞、細胞接着抑制物質、細胞接着促進物質の吸着は、細胞培養下でも容易に行うことができる。よって、本発明の方法によれば、細胞培養下において新たな細胞接着パターニングの形成およびサイズの変更を容易に行うことができる。
【００８４】
本発明の方法によって得られる細胞を固定化した基板は、細胞アレイであることができる。細胞アレイとは、細胞を固定化したスポットがアレイ状に形成されている基板をいう。本発明の方法によれば、パターンを有するフォトマスクを介して光照射を行い、基板上の所望の位置の光分解性保護基を選択的に脱離させることにより、所望の細胞パターンを有する細胞アレイを容易に作製することができる。
【００８５】
更に、本発明は、基板上に光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物が固定化された基板であって、前記光分解性保護基の少なくとも一部に細胞接着抑制物質が吸着している、前記基板にも関する。本発明の基板の作製方法は、先に説明した通りである。本発明の基板は、本発明の第二および第三の態様に使用することができる。
【実施例】
【００８６】
以下、本発明を実施例により説明する。
[実施例１、比較例]
（１）光分解性保護基含有化合物の基板への固定化
Chem. Lett. 29, 228-229 (2000)に従い、5-トリクロロシリルペンタン酸(2-ニトロフェニル)エチルエステル（TCS-PNPE）を合成した。
カバーガラス（マツナミ製）をH2SO4：H2O2の混合溶液中90〜100℃で１時間半加熱した。次いで、純水で洗浄後超音波処理を行った。TCS-PNPEのベンゼン溶液（12 mM）にカバーガラスを入れて、１時間還流後室温で５分放置した。メタノール、クロロホルムで洗浄後、クロロホルム中で超音波処理を行い、窒素気流で表面を乾燥させ、TCS-PNPEが固定化されたカバーガラスを得た。
【００８７】
（２）タンパク質の表面吸着及び細胞播種
TCS-PNPEを固定化したカバーガラスの破片をガラスボトムディッシュ（ＭａｔＴｅｋ製）の底面に置き、エタノールで滅菌後に、10 mg/ml ウシ血清アルブミン（BSA、和光純薬製）のPBS溶液中（ダルベッコＰＢＳ、和光純薬製）で室温１時間静置し、基板表面にＢＳＡを吸着させた。PBSで洗浄後、カールツァイス製の蛍光顕微鏡Axiovert 200（103W水銀光源を付属）下で励起フィルター（330 ± 40 nm）と10倍の対物レンズ（Plan Apochromat, Zeiss）を用いて光照射した（150秒）。その際、必要とする細胞パターンをOHPシートに印刷したフォトマスクを同顕微鏡の視野絞りスライダーの位置に挿入して、パターン化照射を行った。光照射後、再びPBS洗浄し、続いて25 μg/ml フィブロネクチン（ＢＤ製）を含むPBS溶液に置換して、30分室温でインキュベートした。再度PBS洗浄し、血清を含まないMEM培地にバッファー置換し、4 - 8 x 105個のHEK293細胞（ＪＣＲＢ製）を播種し、CO2インキュベーター内で２時間細胞を接着させた後に、血清を含む正常培地に置換した。同様の操作を、COS７細胞、NIH3T3細胞（ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ製）を用いて行った。更に、光分解性保護基を有さない有機シロキサン（2-トリクロロシリル酢酸メチルエステル）を用いて、HEK293細胞について同様の操作を行った（比較例）。蛍光顕微鏡を用いて10倍あるいは20倍の位相差対物レンズ（Plan Neofluar, Zeiss）を用いて位相差像を撮影することにより、細胞を観察した。図２（ａ）は、光照射領域を示し、図２（ｂ）は、HEK293細胞播種２時間後、図２（ｃ）はHEK293細胞播種６３時間後の位相差写真を示す。図２（ｄ）は、光分解性保護基を有さないアルキルシロキサンを用いた比較例の結果、図２（ｅ）は、COS７細胞播種後１８時間後、図２（ｆ）はNIH3T3細胞播種１８時間後の位相差写真を示す。
【００８８】
（３）細胞接着の光スイッチングの結果
図２から、円形の光照射領域（図２(a)）に対応して、HEK293細胞が光照射領域に選択的に接着し（図２(b)）、そして約３日間その照射領域内にとどまって増殖することが分かった（図２(c)）。また、HEK293細胞以外にも、COS７細胞、NIH3T3細胞でも同様の現象が観察された（図２(e)、(f)）。一方、このような光照射による細胞接着のスイッチングは、光分解性保護基を有さない有機シロキサン（2-トリクロロシリル酢酸メチルエステル）では観察されなかった（図２(d)）。
【００８９】
また、光照射の過程における表面吸着タンパク質を免疫染色法で解析した結果を図２（ｇ）、（ｈ）に示す。光照射領域において、まずＢＳＡが脱離し（図２(ｇ)）、次いでフィブロネクチンが吸着する様子が観察された（図２（ｈ））。これにより、本発明の方法において、光照射領域において選択的にBSAとフィブロネクチンの交換が起こり、細胞の接着を促進していることが分かった。フィブロネクチンは、数多くの細胞種の接着を促進することが知られているため、本発明の方法において光照射によってフィブロネクチンの接着のパターンが形成されるということは、本発明の方法がここで示した３種類の細胞以外にも一般的に適用可能な方法であることを意味している。
【００９０】
[実施例２]
様々な細胞接着パターン形成
様々なパターンを得るために、サイズの異なるアレイのスポットを印刷したフォトマスクを使って、細胞の接着領域を形成した。図３（ａ）、（ｂ）、（ｄ）は、所望のパターンを印刷したフォトマスクを蛍光顕微鏡の視野絞りに挿入し、実施例１と同様の方法で作製した基板における、ＨＥＫ２９３細胞播種一日後の位相差写真、図３（ｃ）は、所望のパターンを印刷したフォトマスクを蛍光顕微鏡の視野絞りに挿入し、実施例１と同様の方法で作製した基板を、ＨＥＫ２９３細胞播種２時間後にパラホルムアルデヒドで固定化した写真である。図３（ｃ）における矢印は、細胞の接着斑が形成されたことによる節状の構造を示す。
図３に示すように、本発明の方法により、マルチセル（図３（ａ）、120μm）、シングルセル（図３（ｂ）、30μm）、サブセル（図３（ｃ）、6μm）サイズの細胞スポットや、ストライプ状（図３（ｄ）、６０μｍ）の細胞接着領域を形成することができた。以上の結果から、本発明の方法によれば、任意のサイズ・位置の細胞接着領域を非常に簡単に形成することが可能であり、その空間分解能は、細胞のサイズよりも小さい（サブセル）レベルまで達することが分かった。
【００９１】
[実施例３]
先に接着させた一細胞の培養環境下におけるその近傍への別の一細胞のポジショニング
実施例１に記載の方法によって、ＨＥＫ２９３細胞（未染色）が吸着した基板を作製し、一晩培養した。その後、先に吸着させた細胞の近傍に新たな細胞を吸着させるため、パターンを形成したフォトマスクを用いて光照射を行った（図４（ａ）の四角い領域）。その後、培地を、25 μg/mlフィブロネクチンを添加した正常培地に置換した後、あらかじめ蛍光色素Cell Tracker Green CMFDA（Molecular Probes）で染色した4 - 8 x 105個のＨＥＫ２９３細胞を播種した。CO2インキュベーター内で３時間細胞を吸着させた後に、正常培地に置換した。蛍光顕微鏡を用いて10倍あるいは20倍の位相差対物レンズ（Plan Neofluar, Zeiss）を用いて位相差像を撮影し、未染色の細胞を観察し、Cell Trackerで染色した細胞の蛍光像を、励起フィルター（475 ± 10 nm）、蛍光フィルター（545 ± 18 nm）とダイクロイックミラー（500DRLP）を用いて撮影した。結果を図４に示す。図４（ａ）は、未染色のＨＥＫ２９３細胞の細胞パターンを示す位相差像であり、図４（ｂ）は、ＨＥＫ２９３細胞を吸着させた１４時間後の位相差写真、図４（ｃ）はその蛍光写真である。図４（ｂ）、（ｃ）に示すように、本発明の方法によれば、細胞が光照射領域に選択的に接着することが観察された。このように、本発明の方法によれば、細胞培養環境下で、先に接着している細胞のすぐ近傍に別の一細胞をポジショニングすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によれば、細胞接着領域を自由自在にデザインでき、且つその形成を標準的な蛍光顕微鏡下で行うことができる。このように、本発明の方法によれば、細胞接着領域を逐次形成させることによって、一つの基板上で複数種類の細胞を共培養させることが可能である。本発明の方法は、同種・異種細胞間相互作用の研究ツールとして有用であり、しかも、標準的な蛍光顕微鏡下で容易に実施できるユーザーフレンドリーな方法である。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】標準的な蛍光顕微鏡を使用した光照射系の一例を示す。
【図２】実施例１および比較例の結果を示す。
【図３】実施例２の結果を示す。
【図４】実施例３の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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