(57)【要約】【課題】  恐怖体験に対する心的障害の発生を防止する向精神薬や、空間認知、記憶に関する能力を高める向精神薬の開発等に利用できるＰＫＮ１ａノックアウト動物、及び向精神薬のスクリーニング方法などを提供すること。【解決手段】  本発明は、相同染色体上のＰＫＮ１ａ遺伝子を破壊することによって、ＰＫＮ１ａの発現が抑制されたノックアウト動物等を提供する。作製したＰＫＮ１ａノックアウトマウスは、行動検査において恐怖学習能の低下に加えて空間記憶能の亢進が認められるなど、ユニークな特徴を有するマウスであった。また、ＰＫＮ１ａを阻害もしくは活性化する物質の探索は、向精神薬のスクリーニング方法として有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
相同染色体上のＰＫＮ１ａ遺伝子の一部又は全部の改変或いは欠損のため、ＰＫＮ１ａ遺伝子が正常に機能しないノックアウト非ヒト動物。
【請求項２】
ＰＫＮ１遺伝子のエクソン１ａの少なくとも開始コドンを含む領域を、相同組み換えにより他の塩基配列に置換することにより作製されたことを特徴とする請求項１記載のノックアウト動物。
【請求項３】
正常動物に比し恐怖記憶能が低下し、かつ、空間記憶能が亢進していることを特徴とする請求項１記載のノックアウト動物。
【請求項４】
野生型と比較して扁桃体の神経細胞においてＬＴＰ（long-term potentiation：長期増強）が減弱していることを特徴とする請求項１記載のノックアウト動物。
【請求項５】
海馬ＣＡ１領域の神経細胞においてheterosynaptic ＬＴＤ（異シナプス性長期抑圧）が誘発されることを特徴とする請求項１記載のノックアウト動物。
【請求項６】
マウス又はラットであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のノックアウト動物。
【請求項７】
相同染色体上のＰＫＮ１遺伝子の全部または一部が欠損又は改変され、ＰＫＮ１ａの発現が抑制されていることを特徴とする動物細胞。
【請求項８】
ＰＫＮ１ａを活性化又は阻害する物質をスクリーニングすることを特徴とする向精神薬のスクリーニング方法。
【請求項９】
向精神薬が、抗恐怖薬、心的トラウマ改善剤、又は記憶改善薬であることを特徴とする請求項８記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項１記載のノックアウト動物を用いることを特徴とする請求項８記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、蛋白質リン酸化活性を有するタンパク質。
【請求項１２】
請求項１１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡである請求項１２記載の遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列中、第６５〜２９２０番目の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列中の少なくとも１００塩基以上の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、蛋白質リン酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＫＮ１ノックアウト動物と向精神薬開発に関し、より詳しくは、正常動物に比し恐怖記憶能が低下し、空間記憶能が亢進しているＰＫＮ１ａノックアウト非ヒト動物、同ノックアウト動物又はＰＫＮ１ａを用いた向精神薬のスクリーニング方法、更にＰＫＮ１ｂタンパク質およびそれをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＫＮは、一次構造上プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）とその触媒領域において高い相同性を有しながら、ロイシンジッパー様配列を含む特徴的な制御領域をもつ蛋白質リン酸化酵素（プロテインキナーゼ）である。
【０００３】
ＰＫＮには、ＰＫＮ１（＝PKNα/PRK1），ＰＫＮ２（＝PRK2），ＰＫＮ３（＝PKNβ）の３つのアイソフォームが存在する（下記の非特許文献１参照）。このうちＰＫＮ１は、脾臓や胸腺といった免疫系の臓器や、精巣、脳に比較的豊富に含まれるが、どの臓器にもほぼ普遍的に存在している。ＰＫＮ１は、in vitroにおいて低分子量ＧＴＰ結合蛋白質Ｒｈｏや、アラキドン酸などの不飽和脂肪酸によって活性化されることが報告されている。Ｒｈｏは、神経の極性の決定や軸索伸長など、神経の形態形成において重要な働きをしていることが明らかになっており、さらに最近では神経の可塑性にも関与していることが示唆されている。また、アラキドン酸は、プロスタグランジンやロイコトリエンといった生理活性物質の前駆体としてよく知られているが、それ自体が海馬の長期増強現象（long term potentiation：ＬＴＰ）における逆行性情報伝達物質（retrograde messenger）である可能性が示唆されるなど、不飽和脂肪酸のシナプス伝達における重要性が指摘されている。
しかしながら、ＰＫＮ１がこれらのシグナルを媒介しているのかどうかを含めて、中枢神経系でのＰＫＮ１の生理機能は未だ十分に解明されていない。
【非特許文献１】Mukai,H. (2003). The structure and function of PKN, a protein kinase having a catalytic domain homologous to that of PKC. J. Biochem. 133, 17-27.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のように、ＰＫＮ１は中枢神経系において細胞内シグナル伝達に介在することが示唆されているが、その機能については依然不明な点が多い。ＰＫＮ１の機能を解明することは、神経系における細胞内シグナル伝達の仕組みや、記憶・学習などの神経活動を総合的に理解し解明することにもつながり、その臨床応用が期待されるものである。
本発明は、上記の問題点に着目してなされたものであり、その目的は、恐怖体験に対する心的障害の発生を防止する向精神薬や空間認知、記憶に関する能力障害の治療剤などの向精神薬の開発等に使用できるＰＫＮ１ａノックアウト動物を提供すること、また、ＰＫＮ１ａの機能抑制或いは向上、阻害活性の測定による向精神薬のスクリーニング方法を提供すること、更に新規な蛋白質リン酸化酵素ＰＫＮ１ｂ及びその遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
我々は、ＰＫＮ１に少なくとも２種類のスプライシングフォームが存在することを見出した。以前に我々が見出し報告したＰＫＮ１（本明細書において「ＰＫＮ１ａ」と称する。）は、脳と心臓に選択的に発現していた。これに対して、今回新たに見出したスプライシングフォーム（本明細書において「ＰＫＮ１ｂ」と称する。）は、脾臓や胸腺といった末梢臓器に豊富に存在していた。
さらに、脳や心臓でドミナントに発現が認められるＰＫＮ１ａのノックアウトマウスを作製した。このＰＫＮ１ａノックアウトマウスは、明瞭な形態異常を示さなかったものの、行動検査において恐怖学習能の低下に加えて空間記憶能の亢進が認められた。電気生理学的解析においても野生型とは異なるユニークな特徴を有するマウスであることが見出され、これにより本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は第１に、ゲノム中のＰＫＮ１遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変或いは欠損させることにより得られ、相同染色体上の双方のＰＫＮ１遺伝子が破壊され、ＰＫＮ１ａの発現が抑制されたことを特徴とするノックアウト非ヒト動物を提供するものである。
本発明における「ＰＫＮ１遺伝子が破壊され」とは、換言すれば、ＰＫＮ１遺伝子領域の配列が人為的に改変されることによって、ＰＫＮ１遺伝子の正常な発現が阻害されていること、そしてその結果、ＰＫＮ１ａ全長タンパク質の発現が抑制され、生体（特に脳）においてＰＫＮ１ａが正常に機能していないことを意味する。
なお、本発明のノックアウト動物は、後述のＰＫＮ１ｂを発現するものであってもよいし、本来の機能を発揮しないＰＫＮ１ａ断片を発現するものであってもよい。
本発明の「ゲノム中のＰＫＮ１遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変或いは欠損させること」における「全部」とは、ＰＫＮ１ゲノムＤＮＡのエクソン１ａ（後述）の５’端から最後のエクソンの３’端までの領域をいう。また、「一部」とは、この領域の一部であって、ＰＫＮ１遺伝子の正常な発現を阻害するのに必要な範囲・長さの領域、をいう。さらに、「改変」とは、単一または複数のヌクレオチドを置換、欠失、挿入、及び／又は転位させることにより、ゲノムＤＮＡ中の対象領域の塩基配列を他の塩基配列に改変することをいう。
【０００７】
本発明のノックアウト動物は、公知の方法で製作することができる。例えば、後述のように遺伝子ターゲッティング法を用いて作製することができる。同方法において、ＰＫＮ１遺伝子のエクソン１ａの少なくとも開始コドンを含む領域を相同組み換えにより他の塩基配列に置換することは、ＰＫＮ１ａの正常な発現を阻害できるため、好ましいものである。また、本発明のノックアウト動物は、同方法によって作製されたノックアウト動物のみならず、さらにその子孫をも含むものであり、好ましくは以下の１又は２以上の特徴を有する。
（ａ）  野生型と比較して空間記憶能が相対的に亢進している。
（ｂ）  野生型と比較して恐怖学習能が相対的に低下している。
（ｃ）  野生型と比較して扁桃体の神経細胞においてＬＴＰ（長期増強）が減弱している。
（ｄ）  海馬ＣＡ１領域の神経細胞においてheterosynaptic ＬＴＤ（異シナプス性長期抑圧）が誘発される。
本発明のノックアウト動物としては、実験動物として多用されているマウス又はラットであることが好ましいが、これに限定されるものではなく、他の非ヒト哺乳動物であってもよい。
【０００８】
本発明はまた、産業上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｇ）の発明を包含するものである。
Ａ）  ゲノム中のＰＫＮ１遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変することにより得られ、相同染色体上のＰＫＮ１遺伝子が破壊され、ＰＫＮ１ａの発現が抑制されたことを特徴とするノックアウト動物細胞。
Ｂ）  ＰＫＮ１ａの機能を阻害或いは向上する物質をスクリーニングすることを特徴とする向精神薬のスクリーニング方法。
Ｃ）  向精神薬が、抗恐怖薬、心的トラウマ改善剤、又は記憶改善薬であることを特徴とする上記Ｂ）記載のスクリーニング方法。
Ｄ）  本発明のＰＫＮ１ａノックアウト動物を用いることを特徴とする上記Ｂ）記載のスクリーニング方法。
Ｅ）  以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、蛋白質リン酸化活性を有するタンパク質。
Ｆ）  上記Ｅ）記載のタンパク質をコードする遺伝子。
Ｇ）  以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡである上記Ｆ）記載の遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列中、第６５〜２９２０番目の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列中の少なくとも１００塩基以上の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、蛋白質リン酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施形態、具体的態様等について説明する。
本発明のＰＫＮ１ノックアウト動物は、遺伝子ターゲッティング法などの公知の方法を用いて作製することができる。以下では、遺伝子ターゲッティング法を用いたＰＫＮ１ノックアウト動物の作製方法について簡単に説明する（詳細は後述の実施例にて図面を参照しながら説明する。）。
【００１０】
〔１〕ターゲッティングベクターの作製
まず、ターゲッティングベクター（ターゲッティングコンストラクト）の作製のため、対象となる動物のＰＫＮ１遺伝子の一部を単離する。例えば、ノックアウトマウスを作製する場合は、マウスのゲノムＤＮＡライブラリーからＰＫＮ１遺伝子をスクリーニングすればよい。スクリーニングの条件、方法は特に限定されず、スクリーニングに用いるプローブについてもゲノムＤＮＡやｃＤＮＡからＰＣＲ法などを用いて容易に調製することができる。
【００１１】
上記スクリーニングにより得られたゲノムＤＮＡクローンを用いて、相同組み換えのためのターゲッティングベクターを構築する。ゲノムＤＮＡクローンは勿論遺伝子全長である必要はなく、ＰＫＮ１遺伝子を破壊しＰＫＮ１ａの発現を抑制するために必要な領域のみクローニングすればよい。後述の実施例（マウス）においては、ＰＫＮ１ゲノムＤＮＡのエクソンＥ１ａ・Ｅ１ｂ（図１）を含む領域をサブクローニングし、そのうちＥ１ａの開始コドンを含む領域を、相同組み換えにより他の塩基配列に置換することによってノックアウトマウスを作製した。
【００１２】
ターゲッティングベクターは、公知の方法により作製することができ、大略、市販のプラスミドをバックボーンとして、上記ゲノムＤＮＡクローン、ポジティブセレクション用のマーカー（ＰＧＫｎｅｏカセット等）、およびネガティブセレクション用のマーカー（ＤＴ−Ａ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子等）などの各フラグメントを適切に連結することにより作製することができる。このとき、目的とする制限酵素切断部位が適切な位置に配されるようターゲッティングベクターを設計するとよい。また、ターゲッティングの効率は相同領域の長さに依存するので、相同領域はできるだけ長いほうが好ましい。さらに、ターゲッティングベクターは環状より直鎖状のほうが好ましいので、直鎖状化のため相同領域以外の部分に一カ所適当な制限酵素切断部位を設けておくとよい。
【００１３】
〔２〕ＰＫＮ１ノックアウト動物の作製
上記方法により作製したターゲッティングベクターを、受精卵、初期胚、又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの個体形成能（分化全能性）をもつ細胞にエレクトロポレーション法等により導入し、その後、目的とする相同組み換えが起こった細胞を選別する。選別は、ポジティブ−ネガティブ選択法により薬剤を用いて効率よくスクリーニングできる。選別後、目的とする相同組み換えが起こった細胞を、サザンブロットやＰＣＲ法などによって確認する。最終的に所望の相同組み換えが確認された細胞を、妊娠中の輸卵管または子宮から採取された８細胞期胚または胚盤胞（ブラストシスト）に導入する。８細胞期胚または胚盤胞への細胞の導入は、マイクロインジェクション法等により行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００１４】
上記８細胞期胚または胚盤胞を常法に従い仮親に移植する。仮親から生まれた生殖系列キメラ動物（好ましくは雄）と、野生型ＰＫＮ１遺伝子をホモで持つ野生型動物（好ましくは雌）とを交配させることにより、第１世代（Ｆ１）として、相同染色体上の一方のＰＫＮ１遺伝子が相同組み換えにより破壊されたヘテロ接合体を得ることができる。さらに、これらヘテロ接合体同士を交配させることにより、第２世代（Ｆ２）として、相同染色体上の双方のＰＫＮ１遺伝子が破壊されたホモ接合体、即ち本発明のＰＫＮ１ノックアウト動物を得ることができる。ホモ接合体の同定は、体の一部（例えば尻尾）を切断し、ＤＮＡを抽出してサザンブロットやＰＣＲ法などによって遺伝子型を調べればよい。また、第２世代（Ｆ２）として、ＰＫＮ１ノックアウト動物と同腹の野生型動物（野生型遺伝子をホモで持つ）を得ることができるが、この野生型動物は対照実験に好適に用いることができる。
【００１５】
ＰＫＮ１ノックアウト動物の対象となる動物は、特に限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。これらのうち、実験動物として用いるには、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットが好ましく、なかでも齧歯目がさらに好ましく、近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウス及びラットが、特に好ましい。
【００１６】
以上説明した遺伝子ターゲッティング法は、あくまでその一例を示すものであって、公知の種々の変更が可能であることはいうまでもない。また、本発明以降に新たに開発された方法を使用するものであってもよい。
本発明のノックアウト動物細胞についても、上述した遺伝子ターゲッティング法によって作製可能である。
【００１７】
〔３〕ＰＫＮ１ノックアウト動物の利用法（有用性）
本発明のＰＫＮ１ノックアウト動物は、ＰＫＮ１aの脳での発現が抑制されており、中枢神経系におけるＰＫＮ１a及びこれを阻害或いは活性化する物質の機能・役割について解析する研究ツールとして有用である。
【００１８】
後述の実施例に示すように、実際にＰＫＮ１aノックアウトマウスを作製し種々の解析を行った結果、ＰＫＮ１ａの発現が抑制されたこのＰＫＮ１aノックアウトマウスは明瞭な形態異常を示さず、また行動検査上、移動反応（locomotion）や立ち上がり反応（rearing）および驚愕刺激に対する反応も正常であった。しかしながら、ＰＫＮ１aノックアウトマウスは、恐怖記憶能の影響を強く受けるとされる積極的回避学習検査において有意な機能低下を示す一方、逆に水迷路検査では野生型マウスに比べてより早くプラットフォームの位置を学習することができ、空間記憶能が亢進している実験結果が得られた。
【００１９】
また、ＰＫＮ１ノックアウトマウスの脳スライス標本を用いた電気生理学的解析では、扁桃体において高頻度電気刺激後の同シナプス性ＬＴＰ（homosynaptic long-term potentiation）の減弱が観察された。一方、ＰＫＮ１ノックアウトマウスの海馬ＣＡ１領域においては、正常に同シナプス性ＬＴＰが起こったが、同時に、野生型マウスでは通常認められない異シナプス性ＬＴＤ（heterosynaptic long-term depression）が観察された。
【００２０】
これらの実験結果から、ＰＫＮ１ａは、扁桃体における同シナプス性ＬＴＰの減弱および海馬における異シナプス性ＬＴＤの誘発に関与し、ＰＫＮ１ａの欠損は海馬の同シナプス性ＬＴＰの選択的維持につながること、その結果、ＰＫＮ１ノックアウトマウスでは恐怖記憶能が低下する一方、空間学習能が亢進されることが推測された。ＰＫＮ１aノックアウトマウスは、ＬＴＰの異常が認められた扁桃体においても神経細胞数の変化などの形態異常は認められず、そのため、このような学習能・記憶能の変化はＰＫＮ１ａの機能的抑制によって生じたものと考えられる。つまり、ＰＫＮ１ａの阻害剤や活性化剤を投与し、恐怖学習能の変化や空間記憶能の亢進などの変化を測定することによって、恐怖抑制剤、記憶改善剤などの向精神薬の候補物質の選択に用いることができる。
【００２１】
このことは、ＰＫＮ１aの特異的阻害剤が向精神薬として医薬応用できることを示している。例えば、ＰＫＮ１a阻害剤によって恐怖学習（記憶）能を選択的に抑制する効果が得られ、臨床的には、ＰＫＮ１阻害剤を術前投与することにより、手術治療による心的トラウマの発生防止に利用したり、その他苦痛・恐怖を伴う経験による心的トラウマ防止薬として利用したり、その他ＰＴＳＤ（心的外傷後ストレス症候群）の予防、各種の精神神経疾患などに臨床応用することができる。特に繰り返し手術を受けなければならない場合など、以前の経験がトリガーとなってフラッシュバック（flash back）を起こすのを防ぐのに有効である。また、ＰＫＮ１a阻害剤を、空間記憶能を亢進する薬剤として、つまり心的外傷を引き起こさずに、学習・記憶能力を亢進する薬剤として臨床応用することができる。
【００２２】
〔４〕ＰＫＮ１の機能に着目した向精神薬のスクリーニング方法
上記のようにＰＫＮ１ａの機能阻害物質は、心的トラウマ、心的ストレスに対する予防薬、その他の心的作用、向精神作用を有する向精神薬として医薬応用し得ることが今回の解析の結果明らかになった。そこで本発明は、ＰＫＮ１ａの機能阻害物質をスクリーニングすることを特徴とする向精神薬のスクリーニング方法を提供するものである。
【００２３】
ＰＫＮ１ａの機能阻害物質としては、（ａ）ＰＫＮ１ａの酵素活性を阻害する物質のほかに、（ｂ）ＰＫＮ１ａの発現を抑制することによってＰＫＮ１ａの機能を阻害する物質、（ｃ）ＰＫＮ１ａの制御領域とアクチベーター（上流因子）との結合を阻害することによってＰＫＮ１ａの機能を阻害する物質、が挙げられる。
【００２４】
ＰＫＮ１ａの触媒領域（kinase domain）はプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーと相同性を有するので、ＰＫＮ１ａの特異的・選択的阻害剤の探索のため、触媒領域よりアミノ末端側に位置し、ユニークな配列をもつ制御領域（１〜６００番目のアミノ酸）に着目したスクリーニングは好ましい方法である。具体的には、アクチベーター（低分子量ＧＴＰ結合蛋白質ＲｈｏＡや、アラキドン酸等の不飽和脂肪酸など）とＰＫＮ１ａの制御領域との結合をin vitro又はin vivoにおいて阻害する物質を探索する方法である。
【００２５】
この場合のスクリーニング方法としては、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば、ＰＫＮ１ａの制御領域（又はその一部領域であるアクチベーターとの結合領域）を大腸菌等を用いて大量に発現させて精製し、試験管内でＰＫＮ１ａとアクチベーターとの結合阻害の有無をウエスタンブロット法などによって検出・測定する系を構築することができる。また、阻害剤のマススクリーニングに向けて98 wellまたは384 wellのマイクロタイタープレート等にＰＫＮ１ａの制御領域を固定し、それに結合したアクチベーターを酵素、蛍光色素などで標識した抗体によって検出する系を確立することも可能である。
【００２６】
さらに同様の方法により、ＰＫＣなどの他の蛋白質リン酸化酵素と当該アクチベーターとの結合阻害も調べ、ＰＫＮ１ａの制御領域と当該アクチベーターとの結合のみを選択的に阻害する物質を検索することは好ましい方法である。
【００２７】
ＰＫＮ１ａとりわけその制御領域の高次構造の情報は、ＰＫＮ１ａとアクチベーターとの結合を特異的に阻害する阻害剤の分子設計に有用であるので、このような情報を利用するものであってもよい。
【００２８】
そのほか、（１）ＰＫＮ１ａの制御領域をカラムに固定してこれと結合する物質を検索する方法や、（２）免疫沈降―免疫ブロット法を用いてＰＫＮ１ａとアクチベーターとの結合を阻害する物質を検索する方法、（３）酵母two-hybrid法を用いて、ＰＫＮ１ａの制御領域とアクチベーターとの結合を検出する方法など、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を本発明のスクリーニング方法に適用可能である。また、本発明以降に新たに開発されたスクリーニング方法を使用するものであってもよい。
【００２９】
ＰＫＮ１ａとアクチベーターとの結合阻害剤をスクリーニングする方法の場合、使用するＰＫＮ１ａは全長蛋白質であってもよいが、上述のように制御領域（又はその一部領域）に相当する部分蛋白質であっても勿論よい。同様に、アクチベーターにＲｈｏＡ等の蛋白質を使用する場合、アクチベーターは全長蛋白質であってもよいし、部分蛋白質であってもよい。
【００３０】
ＰＫＮ１ａ、ＲｈｏＡ等の各蛋白質については、ヒト由来のもののほか、マウスホモログやラットホモログ、その他の生物の各ホモログを用いて本発明のスクリーニングを行ってもよい。また、常法に従ってこれら野生型蛋白質の一部アミノ酸を置換または欠失させ、あるいはリン酸化を施したり、別のアミノ酸配列を付加する等して改変した蛋白質を使用してもよい。
【００３１】
また、このようなスクリーニング方法によって得られた結合阻害剤について、さらに扁桃体の神経細胞においてＬＴＰを抑制する性質の有無、海馬の神経細胞においてheterosynaptic ＬＴＤ（異シナプス性長期抑圧）を誘発する性質の有無を調べることによって、向精神薬を開発する方法は好ましい。
【００３２】
勿論、本発明のスクリーニング方法として、ＰＫＮ１ａの酵素活性を測定して被検物質のＰＫＮ１ａに対する阻害効果、又は活性化効果を調べる方法を採用してもよい。例えば、精製したＰＫＮ１ａとその基質（MARCKS、vimentin、tau、MBP等）を用いて酵素活性の変化を測定する試験管内活性測定系（cell-free system）でのスクリーニング方法を挙げることができる（J. Biochem. (1995) 310,657-64; J. Biochem. (1999) 126,475-84; Methods Mol. Biol. (2003) 233,21-34.参照）。この方法の場合、多数の有機化合物のマススクリーニングのため、基質のリン酸化の有無を蛍光等で検出する測定系を用いることが好ましい。
【００３３】
ＰＫＣ等の活性阻害も全く同様の方法で並行して測定し、ＰＫＮ１ａを選択的に阻害するものを選び出すことができる。このとき、仮に選択性を持たない阻害剤しか上記スクリーニングで発見できない場合でも、その物質をＰＫＮ１ａ選択的阻害剤を分子設計により作り出すリード化合物として用いることができる。この分子設計の過程で、ＰＫＮ１ａとりわけその触媒領域（６００〜９００番目のアミノ酸）の高次構造の情報が非常に有用である。
【００３４】
精製酵素ではなく、細胞のcrude fractin（粗精製画分）を用いて、ＰＫＮの活性測定を行ってもよい。この場合、ＰＫＮ１ａ以外の蛋白質リン酸化酵素も存在するので、ＰＫＮ１ａ特異的な基質のリン酸化の有無を検出する系を構築するなどの工夫が必要である。また、上記の方法は、試験管内反応系（cell-free system）でのスクリーニング方法であったが、培養細胞等を用いて細胞内で酵素活性を測定することによりスクリーニングを行ってもよい。培養細胞内でのＰＫＮの酵素活性の測定系の一例として、ＦＲＥＴ（fluorescent resonance energy transfer, 蛍光共鳴エネルギー移動）を用いた系の利用を挙げることができ、これにより、細胞内でのＰＫＮの活性に影響をもつ因子をスクリーニングすることが可能である。
【００３５】
ＦＲＥＴによるスクリーニングの具体例としては、ＰＫＮのアミノ末端、カルボキシル末端に、それぞれＣＦＰ（cyan fluorescent protein）とＹＦＰ（yellow fluorescent protein）を融合したプローブ（ＦＲＥＴプローブ）を細胞内に発現させ、ＦＲＥＴ値の変化を蛍光分光光度計や蛍光顕微鏡によって観察測定する。これにより、被検物質に対するＰＫＮの細胞内での構造変化（活性化）を捕らえる方法である。あるいは、ＰＫＮ１ａの特異的基質配列ペプチドと、FHA2ドメインなどのリン酸化トレオニン結合蛋白質、そして上記ＦＲＥＴプローブを融合蛋白質として発現させるベクターを構築し、ＰＫＮが細胞内で活性化してこのペプチドをリン酸化した際に、プローブの立体構造の変化をＦＲＥＴ値の変化をもとに検出する方法を採用してもよい。この方法は、ＰＫＣなど他の酵素において有効性が確かめられている方法である。
【００３６】
我々は、有効なＰＫＮ特異的活性阻害ペプチドの作製に成功している（J Biochem 1999 126(3):475-84）。このペプチドは、ＰＫＣの活性を抑制せずにＰＫＮを特異的に効率よく抑制する。このペプチドの立体情報等は、ＰＫＮ１ａの阻害剤設計において大変有用である。
【００３７】
その他、細胞内でのＰＫＮ１ａの発現に影響を与え、その発現量を変化させる物質の探索には、常法に従ってＰＫＮ１ａのｍＲＮＡ量を定量する方法、あるいはＰＫＮ１ａ蛋白質の発現量を定量する方法などを採用することができる。
【００３８】
〔５〕ＰＫＮ１の新規スプライシングフォームＰＫＮ１ｂ
今回の解析の結果、ＰＫＮ１にはスプライシングによる少なくとも２つのアイソフォームＰＫＮ１ａ・ＰＫＮ１ｂが存在し、ＰＫＮ１遺伝子から異なったアミノ末端をコードする２つのｍＲＮＡが産生されることが予想された。配列データより、これらのｍＲＮＡは、図１のエクソン１ａ（Ｅ１ａ）又はエクソン１ｂ（Ｅ１ｂ）から、ともにエクソン２（Ｅ２）へとつながっていく選択的スプライシング（alternative splicing）によって生成されることが考えられた。
【００３９】
そこで、エクソン１ａ又はエクソン１ｂ内のプライマーとエクソン３内のプライマーとを使用した後述のＲＴ−ＰＣＲ解析により野生型マウスの各臓器におけるＰＫＮ１ａおよびＰＫＮ１ｂの発現を検討したところ、ＰＫＮ１ａのｍＲＮＡは主に脳や心臓に局在しているのに対して、ＰＫＮ１ｂのｍＲＮＡは、脾臓や胸腺などの臓器に主に存在していた。
【００４０】
このように、既知のＰＫＮ１であるＰＫＮ１ａのほかに、今回ＰＫＮ１の新規スプライシングフォームＰＫＮ１ｂが見出された。即ち、ＰＫＮ１ｂは、今回はじめて同定され、その配列が決定された新規遺伝子・新規タンパク質であり、これらも本発明に含まれる。
【００４１】
本発明のＰＫＮ１ｂタンパク質には、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、蛋白質リン酸化活性を有するタンパク質、が含まれる。配列番号２は、マウス由来のＰＫＮ１ｂタンパク質のアミノ酸配列である。
【００４２】
本発明のＰＫＮ１ｂタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、たとえばHisやMyc、flag等によってエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
【００４３】
また、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の変異タンパク質作製法により欠失、置換及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、換言すれば、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。また、上記（ｂ）のタンパク質は、マウス以外のＰＫＮ１ｂタンパク質であってもよい。
【００４４】
本発明の遺伝子は、本発明のＰＫＮ１ｂタンパク質をコードする遺伝子であり、（ａ）配列番号１に示される塩基配列中、第６５〜２９２０番目の塩基配列を有するＤＮＡ、および（ｂ）配列番号１に示される塩基配列中の少なくとも１００塩基以上（好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、蛋白質リン酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、が含まれる。
【００４５】
本発明の「遺伝子」としてはｃＤＮＡが好ましいが、特に限定されるものではなく、ＲＮＡであってもゲノムＤＮＡであってもよい。また、本発明の「遺伝子」は、ＰＫＮ１ｂタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００４６】
上記「ストリンジェントな条件下」でのハイブリダイゼーションは、たとえばMolecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Current Protocols in Molecular Biology; Wiley Interscienceに記載の方法によって行うことができ、具体的には以下の方法が例示される。
【００４７】
ｃＤＮＡライブラリー等のＤＮＡ分子を膜に転写し、これと標識したプローブ（即ち、上記「相補的な塩基配列からなるＤＮＡ」）とをハイブリダイゼーションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションバッファーの組成は、たとえば０．１重量％ＳＤＳ、５重量％デキストラン硫酸、１／２０容のブロッキング試薬、および２〜７×ＳＳＣからなる。ブロッキング試薬としては、たとえば１００×Denhardt's solution 、２％（重量／容量）Bovine serum albumin、２％（重量／容量）ポリビニルピロリドンを５倍濃度で調製したものを１／２０に希釈して使用する。
【００４８】
ハイブリダイゼーションの温度は、４０〜８０℃、より好ましくは５０〜７０℃、更に好ましくは５５〜６５℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行った後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、またはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は、好ましくは０．１〜６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液であり、ＳＳＣの濃度を変えながら洗浄バッファーで数回膜を洗浄する。その後、プローブがハイブリダイズしたＤＮＡ分子を、プローブに付された標識を利用して検出する。
【００４９】
本発明のＰＫＮ１ｂ遺伝子・タンパク質は研究用試薬として、また、そのキナーゼ活性を利用した種々の産業応用が可能である。ＰＫＮ１ｂが属するＰＫＮファミリーは、生体において多岐にわたる生理機能を有する（Mukai,H. (2003). J. Biochem. 133, 17-27）。ＰＫＮ１ｂは、このＰＫＮファミリーに関する各種研究に有用であることは勿論であるが、脾臓や胸腺といった免疫系の臓器に比較的豊富に発現が認められることから、特に免疫系の研究での利用、およびその臨床への応用が期待できる。
【実施例】
【００５０】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
〔方法〕
［1-1］ＰＫＮ１ａノックアウトマウスの作製
図１は、本実施例のＰＫＮ１ａノックアウトマウスの作製に使用した遺伝子ターゲッティング法を説明する図である。図中、上から順に、正常のＰＫＮ１遺伝子（Wild type allele）、ＰＫＮ１ａノックアウトマウス作製のためのターゲッティングベクター（Targeting construct）、相同組み換えを起こしたＰＫＮ１遺伝子破壊（変異）アレル（Disrupted allele）の構造をそれぞれ模式的に示す。
【００５１】
まずターゲッティングベクター作製のため、マウスＰＫＮ１のゲノムＤＮＡ約１９０ｂｐをＰＣＲによって調製した。これをプローブとして、マウス１２９ＳｖのゲノムＤＮＡライブラリー（Stratagene）をプラークハイブリダイゼーションによってスクリーニングし、５’側マウスＰＫＮ１ゲノムＤＮＡを単離した。得られたクローンをもとに、エクソン１ａ（Ｅ１ａ）の上流〜１．６ｋｂｐのHindIII/NaeI fragmentと、下流〜４．０ｋｂｐのXbaI/SmaI fragmentをアームとして、Ｎｅｏ耐性遺伝子の両側に挿入し、ターゲッティングベクターを作製した（図１）。なお、このターゲッティングベクターのバックボーンはpBluescript IIであり、非相同領域にジフテリア毒素Ａ遺伝子（MC1pro-DT-A）を配置している。
【００５２】
上記ターゲッティングベクターを直鎖化後、１２９Ｓｖ ＥＳ細胞にエレクトロポレーションによって導入した。抗生物質Ｇ４１８耐性クローンをピックアップし、そのゲノムＤＮＡを図１に示す５’プローブ（5’probe）および３’プローブ（3’probe）を用いたサザンブロッティングによって解析し、目的の相同組み換えが起こったアレル（Disrupted allele）を有するクローンを選択した。
【００５３】
相同組み換えが起こった上記ＥＳ細胞のクローンを、公知の方法（Genes Dev. (1994) 8, 707-719）に従ってマウス初期胚にマイクロインジェクションすることにより、キメラマウスを得た。さらにこのキメラマウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配し、得られたヘテロ接合体マウスの雌雄を交配することにより、ＥＳ細胞由来の変異アレルをホモで有するＰＫＮ１ａノックアウトマウス（以下、「ＰＫＮ１ａ（-/-）マウス」という。）を得ることができた。
【００５４】
上記ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスについて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊとの戻し交配を５回繰り返した後、１２９ＳｖとＣ５７ＢＬ／６Ｊ間で多型が認められるマイクロサテライトマーカー（１００マーカー）を用いて、戻し交配率を測定した。戻し交配率の高かったマウス（９６％以上のもの）を選んで、さらにその後４回の戻し交配を行い、得られたＰＫＮ１ａ（-/-）マウスについて後述の行動実験を行った。
【００５５】
［1-2］免疫化学的解析
ポリクローナル抗体αＣ６は、ラットＰＫＮ１のＣ末端アミノ酸863-946に相当する組換え蛋白質をウサギに免疫して作製した（J. Biol. Chem. (1997) 272, 4740-4746）。マウスの各組織は、９倍volumeの氷冷した 5 mM EDTA, 5mM EGTA, 10μg/ml leupeptin, 10μg/ml pepstatin, and 2 mM phenylmethyl sulfonateを含む20 mM Tris-HCl, pH 7.4にて、ポリトロンを用いてホモジェナイズし、SDS-PAGE sample bufferと混和した。サンプルをＳＤＳ電気泳動後、polyvinylidene difluoride膜（Millipore, Bedford, MA）に転写し、１次抗体としてαＣ６（1:2000）、そして２次抗体として、HRP-conjugated donkey anti-rabbit IgG（Amersham, Buckinghamshire, UK）をPBS-T（0.01 M PBS, pH 7.4,containing 0.3% Triton X-100）で希釈して使用した。免疫反応バンドの検出は、enhanced chemiluminescence detection kit（Amersham Biosciences）を用いて行った。
【００５６】
［1-3］免疫組織学的検査
組織切片の作製と免疫組織学的な解析は、既述の方法に従った（Brain Res. Mol. Brain Res. (1996) 37, 309-316）。以下に要点を記す。脳を４％パラホルムアルデヒド入りの０．１Ｍリン酸バッファー（PB, pH 7.4）で灌流固定し、その後２４時間同液で後固定を行った。そして30% sucrose in 0.1M PBで２日間置いた後、クリオスタットで20μmの切片を調製した。切片は、0.3% H2O2と5% normal goat serum入りのPBS-T溶液で処理した後、１次抗体とインキュベートした。
【００５７】
［1-4］ＲＴ−ＰＣＲ
マウス各臓器からのｍＲＮＡの調製には、QuickPrep micro mRNA purification kit（Amersham Biosciences）を用いた。ＲＴ−ＰＣＲは、以下のプライマーセットを使用し、Ready To Go RT-PCR beads（Amersham Biosciences）を用いて行った。すなわち、エクソン１ａ由来のｍＲＮＡの検出用には、下記プライマー「1a-F」と「3-R」を、そして、エクソン１ｂ由来のｍＲＮＡの検出用には、下記プライマー「1b-F」と「3-R」を使用した（図１参照）。
1a-F：5’-ATGGCCGGCGACGCCGTACAGAGTGAG-3’（配列番号３）
1b-F：5’-ATGGCAGCTGATCCCCCTTTGGATTCG-3’（配列番号４）
3-R：5’-CTGCCATTGCTATAGGTCTGGATCATG-3’（配列番号５）
【００５８】
［1-5］行動学的検査
［1-5-1］オープンフィールドテスト（OF）
実験装置は天井部のない立方体の箱であった。側面および床面は厚さ5mmの透明アクリル版製で、内寸は、床部が29cm×29cm、高さが29.5cmであった。実験装置は防音箱（縦62cm×横45cm×高さ49cm）の中に格納された。実験装置の各側面外側、床面から2cmの位置には、それぞれ2個の赤外線ビームが10cm間隔で内向きに設置されていた。各側面の2個の赤外線ビームについてフリップフロップ回路を構成し、被験体が2個のビームの前方を連続して遮断すると移動反応（locomotion）として検出された。更に、向かい合う2側面の床面から4.5cmの位置にもそれぞれ12個の赤外線ビームが2.6cm間隔で内向きに並置され、これらのビームの前方が遮断されると立ち上がり反応（rearing）として検出された。防音箱内の天井部には40Wの白熱灯と行動観察カメラを設置した。白熱灯点灯時の実験箱内の照度は床面で110 luxであった。また、防音箱背面の下部には小型の換気扇（直径9cm）を取り付け、換気を行うと共に、その駆動音をマスキング・ノイズとした。音圧は実験箱の床面中央部で約45dB(c)であった。
【００５９】
各被験体に20分間のセッションを与えた。被験体を実験装置の中央部に置いた後、速やかに防音箱を閉じてセッションを開始した。セッションの開始は照明の点灯により規定した。行動指標として、locomotionとrearingを採用した。locomotionは、被験体が前述した10cm間隔の2つの赤外線ビームを連続で遮断した回数、rearingは、被験体が床面から4.5cmの高さに設置された赤外線ビームを遮断した回数として得点化した。被験体の反応の記録は自家製のオープンフィールドコントロールシステムとCASE社製ADB SAMPLERを介してパソコン（Apple社製Power Macintosh 6300/120）で行った。
【００６０】
［1-5-2］聴覚性驚愕反射強度の馴化およびPPIテスト（SPPI）
マウス用聴覚性驚愕反射測定およびPPI（プレパルスインヒビション）テスト用実験装置を用いた。防音箱を兼ねた実験装置（縦約48 cm×横約36 cm×高さ約36 cm）内には直方体の被験体保持ケースが水平に設置出来るようになっていた。保持ケースは透明アクリル板製で、内寸は床部が10cm×7cm、高さが7cmであった。実験装置内には、驚愕音を提示するためのスピーカと音プレパルスを提示するためのスピーカが、それぞれ保持ケースの前方に設置されていた。また、光プレパルスを提示するための棒状パトライトが保持ケースの上方に設置されていた。驚愕音は、音圧115dB(c)、提示時間0.05秒のホワイトノイズであった。音プレパルスは音圧85dB(c)のクリック音、光プレパルスは棒状パトライトの白色LED光で、提示時間はいずれも30msであった。保持ケースの床面裏側には加速度センサー（KEYENCE社製GH-313A）が取り付けられていた。被験体の保持ケース内における全ての動きは振動として加速度センサーにより検出された。センサーからの電圧出力はローパスフィルター（60Hz, FV-624, NF）を通過した後に400HzでA/D変換され、1ms単位で記録された。刺激提示の制御と反応の記録は自家製のインターフェースとADInstruments社製 MacLab / 4sを介してパソコン（Apple社製Power Macintosh 7600 / 200）で行った。
【００６１】
各被験体に、76試行より構成されるセッションを1回与えた。セッション開始から40試行は馴化機能を検討するための試行であり、驚愕音を単独で提示した（馴化訓練期）。その後の36試行はPPIテストのための試行であった（PPIテスト期）。36試行の内24試行が驚愕音にプレパルス刺激が先行するプレパルス試行、残り12試行が驚愕音のみの試行であった。プレパルス試行は、プレパルス刺激のモダリティ（音Nと光Lの2種類）とリードタイム（プレパルス刺激の終結から驚愕音提示開始の間隔で50、100、200msの3種類）の組み合わせによる6種類（図４参照）で、それぞれ4試行ずつであった。6種類のプレパルス試行と驚愕音のみの試行順序はランダムであった。平均試行間間隔は25秒であった（範囲: 15 - 45秒）。
【００６２】
セッション開始から40試行（馴化訓練期）のデータを用いて驚愕音に対する馴化機能を分析した。各試行において、驚愕音提示開始から200ms内の電圧出力を1ms毎にサンプリングし、その積分値を驚愕反射の指標とした。
【００６３】
セッション後半36試行（PPIテスト期）中の驚愕音単独提示試行12回の平均反応強度をS、6種類のプレパルス試行それぞれ4回の平均反応強度をPPとし、PP / Sの式によりPPI率を算出した。プレパルスインヒビションが生じた場合、PPI率は1未満となる。
【００６４】
［1-5-3］受動的回避学習（PA）
マウス用回避学習箱（縦41cm×横16cm×高さ26 cm）を用いた。回避学習箱の側面部と天井部は厚さ5mmのアクリル板製、床部は直径3mmのステンレス棒が10mm間隔（芯-芯間隔）で39本並列されたグリッド床であった。ボックス内をアクリル製の仕切り板2枚と上下スライド式のギロチンドアによって区分けし、暗室（縦10cm×横10cm×高さ20cm）と明室（縦10cm×横10cm×高さ20cm）を構成した。両室はギロチンドアによって仕切られ、手動で開閉出来た。暗室は側面壁と天井部が黒色、明室は側面壁が白色で天井部が透明であった。暗室内の側面部床上15mm、ギロチンドアから50mmの位置には、被験体の反応検出用の赤外線ビームが設置されていた。反応の記録と電撃の提示は、CASE社製ADB Sampler Systemおよびスクランブラー付きのショッカーを介し、パソコン（NEC社製PC-VA45H）で制御した。
【００６５】
シャトルボックスの明室へ被験体を入れ、5秒後に両室を仕切るギロチンドアを開いた。被験体が暗室へ移動したらすぐにギロチンドアを閉じ、移動反応が検出されてから10および18秒後にグリッド床から160Vの交流電撃を提示した。提示時間はいずれも3秒間であった。
【００６６】
条件づけの24時間後に受動的回避テストを1試行実施した。条件づけ試行と同様に、被験体を明室へ入れ、自発的に暗室へ移動するまでの潜時を測定した。電撃は提示しなかった。180秒の受動的回避（移動反応なし）で試行を打ち切った。
【００６７】
［1-5-4］積極的回避学習（AA）
受動的回避学習で使用したものと同一のマウス用回避学習箱を用いた。回避学習箱は防音箱（35×75×32cm）に格納されていた。明・暗室を仕切るギロチンドアを取り外し、被験体は両室間を自由に移動することが可能であった。明・暗室内それぞれの側面部床上15mm、両室連結部から50mmの位置には、被験体の反応検出用の赤外線ビームが設置されていた。被験体が、隣室より移動してこの赤外線ビームを遮断すると移動反応として検出された。
【００６８】
各被験体に、1セッション50試行からなる回避訓練を1日1セッション、3日連続で行った。条件刺激（以下CS）は、1500Hz、音圧85dB(c)の純音、無条件刺激（以下US）は、グリッド床から提示される140Vの交流電撃であった。CS提示開始から5秒後にUS提示が開始された。CS提示は被験体の移動反応が生起するまで持続された。移動反応がCS提示開始から5秒以内に生起した場合、CSは停止し、USは提示されなかった。CS提示開始から5秒経過しても被験体が隣室へ移動しない場合、US提示が開始し、隣室へ移動するまで持続した。被験体の移動反応が生起しない場合、CSは最大20秒、USは最大15秒持続した。学習の指標として、CS提示開始から移動反応が生起するまでの時間（回避潜時）と回避反応数を採用した。
【００６９】
［1-5-5］水迷路学習（WM）
実験装置は円筒形のプールと逃避台からなっていた。プールの内径は90cm、高さは36cmで、内壁は黒色に塗装されていた。逃避台は直径11cm、厚さ9mmの円形アクリル版に台座を取り付けたもので、高さは21cmであった。プールは実験室の壁とL字型の衝立（高さ130cm）で囲まれた140cm×130cmのスペースの中央部に設置され、仮想の東西南北方向の壁ないし衝立には、それぞれ、B4サイズのケント紙に直径25cmの黒色円形図形を貼り付けたもの（北）、B4サイズの黒画用紙に直径25cmの白色円形図形を貼り付けたもの（南）、全長25cmの黒いヌイグルミ（東）、行動観察用のテレビカメラ（西）が取り付けられていた。逃避台を仮想の北方向の象限内に設置し、水位を逃避台の台面上約5mmに調節した。水は墨汁で濁らせた。逃避台の中心からプールの中心までの距離は25cmであった。水温は21℃（±1℃）に維持した。
【００７０】
1日1セッション5試行からなる獲得訓練を行った。逃避台のない北以外の3象限いずれかの壁際から被験体をプールに投入して自由に遊泳させ、逃避台に達するまでの潜時を計測した。被験体が逃避台に載ると、10秒間そこに留めた。プールへ投入後60秒以内に被験体が逃避台に達しない場合は、実験者が逃避台の上へ誘導し、そこに10秒間留めた。投入する象限の順序は被験体毎にランダムとした。試行間間隔（逃避台から取り去ってから次にプールへ投入されるまでの時間）は30秒であった。
【００７１】
〔結果〕
［2-1］ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスにおけるＰＫＮ１ａの発現抑制
前述のように、ＰＫＮ１にはスプライシングによる少なくとも２つのアイソフォームＰＫＮ１ａ・ＰＫＮ１ｂが存在し、ＰＫＮ１遺伝子から異なったアミノ末端をコードする２つのｍＲＮＡが産生されることが予想された。配列データより、これらのｍＲＮＡは、図１のエクソン１ａ（Ｅ１ａ）もしくはエクソン１ｂ（Ｅ１ｂ）を使用して、ともにエクソン２（Ｅ２）へとつながっていく選択的スプライシング（alternative splicing）によって生成されることが考えられた。
【００７２】
そこで、エクソン１ａおよびエクソン１ｂ内のプライマーを使用して、野生型マウスの各臓器からＲＴ−ＰＣＲ解析を行った結果、野生型マウスにおいて、ＰＫＮ１ａのｍＲＮＡ（エクソン１ａを使用する）は、主に脳や心臓に局在しているのに対し、ＰＫＮ１ｂのｍＲＮＡ（エクソン１ｂを使用する）は、脾臓・胸腺などの臓器に主に存在していた。
【００７３】
脳におけるＰＫＮ１の機能を明らかにするため、図１に示すように、エクソン１ａの開始コドンを含む領域をＮｅｏ耐性遺伝子で置き換えるターゲッティングベクターを構築し、ＰＫＮ１ａのノックアウトマウスを作製した。全体的な肉眼的および脳・腎臓・心臓・脾臓・肺の光学顕微鏡検査において、ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスは野生型マウスと明らかな差を認めなかった。特に中枢神経系に注意して観察を行ったが、皮質・海馬・線条体・小脳・視床・視床下部に明らかに異常な顕微鏡所見を認めなかった。また、子の遺伝子型は、正常のメンデル遺伝に従っていた。
【００７４】
ＲＴ−ＰＣＲによって、ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスの臓器からは、ＰＫＮ１ａのｍＲＮＡは検出されないものの、ＰＫＮ１ｂのｍＲＮＡは野生型マウス同様検出することができた。
【００７５】
ＰＫＮ１ａおよびＰＫＮ１ｂに共通であると考えられるＰＫＮ１のＣ末端を認識する抗体（αＣ６）を用いたイムノブロッティングの結果では、ＰＫＮ１ａ（-/-）マウス脳においては、野生型に比べて全ＰＫＮ１含量は約１／１０以下に減少していたが、脾臓や胸腺といった臓器では約１／２に減少しているのみであり、ＲＴ−ＰＣＲの結果とあわせて、ＰＫＮ１ａは脳や心臓にドミナントに存在するスプライシングフォームであることを示唆していた。
【００７６】
また上記抗体αＣ６を用いて、ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスの免疫組織学的検査を行ったところ、脳においてはほぼ全般的に免疫反応性の低下を認めていたが、特に扁桃体の外側核においては、その免疫反応性の低下は顕著であった。
【００７７】
［2-2］ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスにおける恐怖記憶能の低下
ＰＫＮ１ａ欠損が、マウスの基礎的な神経機能に及ぼす影響を検討するため、ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスの行動学的検査を行った。
その結果、図２および図３に示すように、ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスは、正常の移動反応と立ち上がり反応を示し、また聴覚性驚愕反射強度の馴化も正常に起こり、プレパルスインヒビションも正常に誘発された（図４）。なお、これらの図中、「Group KO」はＰＫＮ１ａ（-/-）マウス群の結果を、「Group WT」は野生型マウス群の結果をそれぞれ示す（以下同じ）。
受動的回避学習テストにおいても、ＰＫＮ１ａ（-/-）マウス群（ＫＯ群）と野生型マウス群（ＷＴ群）との間で有意な差は認められなかった（図５）。しかしながら、恐怖記憶能を反映するとされる能動的回避学習テストでは、ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスは野生型マウスに比べてわずかではあるが有意に機能低下を認め（図６および図７）、恐怖記憶の障害を持つ可能性が示された。
【００７８】
［2-3］ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスにおける空間記憶能の亢進
次に空間学習や記憶に障害があるかどうかを検討するため、モリス水迷路学習テストを行った（図８）。
驚くべきことに、ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスは、野生型マウスに比べて有意に、より早く隠れたプラットフォームに到達することができた。一般に、水迷路学習の成績には、プラットフォームが何処にあるかを記憶する空間認知機能、有利な遊泳方略を学習する機能、遊泳へのモチベーション、遊泳の技能、筋力等々が関係していると考えられる。しかし、このＰＫＮ１ａ（-/-）マウスの場合、水泳スピードは野生型マウスと比べて有意差を示さなかったことや、上述のようにオープンフィールドで有意差なく能動的回避学習テストではかえって機能低下を示していることから、選択的に空間記憶能が亢進していると考えられる。
【００７９】
［2-4］海馬ＣＡ１領域における異シナプス性ＬＴＤの誘発
ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスにおいて観察された、恐怖記憶能の低下および空間記憶能の亢進のメカニズムを明らかにするため、ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスの脳スライス標本を用いた電気生理学的実験を行った。
【００８０】
まず扁桃体において高頻度電気刺激を行って、同シナプス性ＬＴＰ（homosynaptic long-term potentiation）を観察したところ、ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスにおいて有意な減弱が観察された。能動的回避学習には扁桃体が大きく関与していることが知られていることから、このＬＴＰの減弱は、ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスが示した恐怖記憶能の低下と呼応することが推測される。
【００８１】
次に、空間記憶能と深い関わりを持つとされる海馬を用いて、Schaffer collateralの高頻度刺激を行い、ＣＡ１領域での観察を行った。その結果ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスでも、正常に同シナプス性ＬＴＰが誘発されたが、しかし同時に、野生型マウスでは通常認められない異シナプス性ＬＴＤ（heterosynaptic long-term depression）が記録された。この結果は、ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスにおいて海馬の同シナプス性ＬＴＰの選択的維持につながり、空間記憶能の亢進が観察された可能性を示すものといえる。
【００８２】
［2-5］本実施例の結果と考察
今回ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスにおいて、恐怖記憶能の低下や空間記憶能の亢進が認められ、また電気生理学的検査において、扁桃体における同シナプス性ＬＴＰの低下と海馬ＣＡ１領域における異シナプス性ＬＴＤの誘発という現象が認められた。
【００８３】
ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスがこれらの現象を引き起こした分子メカニズムについては今後更なる解析を要するが、近年ＬＴＰやＬＴＤの誘発に、ＡＭＰＡ受容体をはじめとするグルタミン酸受容体の、シナプス膜への出入りが重要であることが明らかになってきた。ＰＫＮ１は細胞内の小胞成分（vesicular component）に存在し、レセプターの転位・移動（trafficking）に関わっていることも報告されていることから、ＰＫＮ１がこれらのグルタミン酸受容体のtraffickingに何らかの変化を起こすことで、記憶能に影響を与えていることも考えられる。
【００８４】
これまでにも遺伝的に操作されたマウスで、空間記憶能の向上を認め、ＬＴＰの解析を行っている報告が数例存在する。ＮＭＤＡ受容体ＮＲ２Ｂを過剰発現するトランスジェニックマウス（Nature (1999) 401, 63-69）や、ノシセプチン（nociceptin）受容体（Nature (1998) 394, 577-581）、ＧＡＢＡA受容体α５サブユニット（J. Neurosci. (2002) 22, 5572-5580）、Na2+/Ca2+交換輸送体２（Na2+/Ca2+ exchanger 2）（Neuron (2003) 38, 965-976）それぞれのノックアウトマウス等である。
【００８５】
しかし、これまでのところ細胞内情報伝達因子である特定のリン酸化酵素のノックアウトマウスが、空間記憶能の亢進を認めたとする報告は行われていなかった。また上述のどの場合も、海馬ＣＡ１領域においてＬＴＰの亢進を認めており、またＧＡＢＡA受容体α５サブユニットノックアウトマウス以外では、同時に恐怖記憶能の亢進も示唆されている。
【００８６】
今回ＰＫＮ１ａ（-/-）マウスにおいては、空間記憶能の亢進が認められるものの、海馬ＣＡ１領域におけるＬＴＰは正常で、異シナプス性ＬＴＤが誘発されるという現象はユニークであり、さらに空間記憶能の亢進と同時に、恐怖記憶能の低下を示す所見が得られたことも特筆に価する。このことは、ＰＫＮ１の特異的阻害薬の探索が、心的外傷を引き起こさずに、学習・記憶能力亢進のための新薬開発につながることを示すものである。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】本発明の実施例に係るＰＫＮ１ａノックアウトマウスの作出に用いた遺伝子ターゲッティング法を説明する図である。
【図２】オープンフィールドテストにおける移動反応の測定結果を示すグラフである。
【図３】オープンフィールドテストにおける立ち上がり反応の測定結果を示すグラフである。
【図４】ＰＰＩテスト（ＳＰＰＩ）の測定結果を示すグラフである。
【図５】受動的回避学習のテスト結果を示すグラフである。
【図６】能動的回避学習テストにおける回避（逃避）潜時の測定結果を示すグラフである。
【図７】能動的回避学習テストにおける回避（逃避）回数の測定結果を示すグラフである。
【図８】水迷路学習のテスト結果を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００８８】
配列番号１：マウスＰＫＮ１ｂのｃＤＮＡ配列とそれによってコードされるアミノ酸配列
配列番号２：マウスＰＫＮ１ｂのアミノ酸配列
配列番号３：ＰＫＮ１ａ ｍＲＮＡ検出用フォワードプライマー配列
配列番号４：ＰＫＮ１ｂ ｍＲＮＡ検出用フォワードプライマー配列
配列番号５：配列番号３及び４のフォワードプライマーと共に使用されるリバースプライマーの配列
【図１】
2006238762.tif 000002
【図２】
2006238762.tif 000003
【図３】
2006238762.tif 000004
【図４】
2006238762.tif 000005
【図５】
2006238762.tif 000006
【図６】
2006238762.tif 000007
【図７】
2006238762.tif 000008
【図８】
2006238762.tif 000009
【配列表】
2006238762000001.app