(57)【要約】      （修正有）【課題】目的タンパク質発現細胞株の樹立方法、詳しくは抗甲状腺刺激ホルモン受容体（TSHR）抗体を高感度に検出可能なTSHR発現細胞株の樹立方法、抗TSHR抗体の機能評価系を提供する。【解決手段】目的タンパク質をコードする遺伝子、およびキャリアータンパク質をコードする遺伝子を坦持するベクターを動物細胞に導入する工程と、磁気細胞分離システムにより目的タンパク質の安定発現細胞株のクローニングを行なう工程とを含む細胞株の樹立方法。またこの方法によって得られるTSHR安定発現細胞株を血清で刺激し、該細胞株におけるcAMP上昇活性を測定して、血清中のTSHRに対する刺激型抗体および抑制型抗体の活性を測定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む細胞株の樹立方法；
１）目的タンパク質をコードする遺伝子、およびキャリアータンパク質をコードする遺伝子を担持するベクターを動物細胞に導入する工程、
２）磁気細胞分離システムにより目的タンパク質の安定発現細胞株のクローニングを行う工程。
【請求項２】
キャリアータンパク質が細胞膜上に発現するタンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
キャリアータンパク質がCD4である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
目的タンパク質が甲状腺刺激ホルモン受容体（TSHR）である請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
TSHR遺伝子がTSHRの細胞外部分をコードするDNAである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
TSHR遺伝子がヒトまたはブタ由来である請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法により得られる目的タンパク質の安定発現細胞株。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法により得られる目的タンパク質の安定発現細胞株を用いて目的タンパク質の機能を解析する方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法により得られる目的タンパク質の安定発現細胞株を用いて血清中の目的タンパク質に対する抗体を検出する方法。
【請求項１０】
以下の工程を含む血清中のTSHRに対する刺激型抗体および抑制型抗体の活性を測定する方法；
１）請求項４〜６のいずれか1項に記載の方法により得られるTSHR安定発現細胞株を該血清で刺激する、
２）該細胞株におけるcAMP上昇活性を測定する。
【請求項１１】
血清が哺乳動物由来である請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
血清がバセドウ病患者由来である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
血清がマウス由来である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
マウスがバセドウ病モデルマウスである請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的タンパク質を安定発現する細胞株の樹立方法に関するものである。より詳しくは、甲状腺刺激ホルモン受容体（thyroid-stimulating  hormone  receptor；以下、TSHR）を安定発現する細胞株の樹立方法、および該方法により樹立されたTSHR発現細胞株に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムDNAに目的遺伝子をインテグレートしたトランスフェクタント（安定発現細胞株）は恒常的発現が可能となるため、タンパク質の機能解析のための有効なツールとなる。しかしながら、そうした安定発現細胞株の樹立には多くの時間と労力が必要であった。
【０００３】
臓器特異的自己免疫疾患であるバセドウ病は、TSHRに対する自己抗体がTSHRと結合し、受容体刺激活性を亢進させることにより発症する。バセドウ病の病態の解析にはTSHRに対する自己抗体の産生機序の解明が不可欠であり、そのためには該自己抗体の高感度検出系が必須となる。
【０００４】
抗TSHR抗体には刺激型抗体と抑制型抗体がある（非特許文献1）。TSHRに対する刺激型抗体（TSAb）とは、TSH受容体に結合しTSH様の甲状腺刺激作用（甲状腺細胞内cAMP産生の増加、甲状腺ホルモンの産生・分泌の亢進）を示すが、TSHRに対する抑制型抗体（TSBAb）は、TSH受容体に結合するが甲状腺刺激活性は有せずTSHの甲状腺受容体結合を阻害し、TSHの甲状腺刺激作用を抑制する。（非特許文献1）。
TSHRに対する刺激型抗体の活性は、一般にTSHRを発現している細胞のcAMP上昇活性により評価される。また、抑制型の抗体もTSHRを発現している細胞のTSH添加によるcAMP上昇活性を抑制する抗体の存在として検出される。
【非特許文献１】Yoshida T, Ichikawa Y, Ito K, Homma M:, J Biol Chem (1988),31,pp16341-16347
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、目的タンパク質発現細胞株の樹立方法、詳しくは抗TSHR抗体を高感度に検出可能なTSHR発現細胞株の樹立方法、および抗TSHR抗体の機能評価系の構築を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、磁気細胞分離システムを使用し、簡便、安全、かつ効率的に目的タンパク質を安定発現する細胞株の樹立方法を確立し、これを用いてTSHR発現細胞株の樹立に成功し、抗TSHR抗体の機能評価系の構築を達成し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、
１．以下の工程を含む細胞株の樹立方法；
１）目的タンパク質をコードする遺伝子、およびキャリアータンパク質をコードする遺伝子を担持するベクターを動物細胞に導入する工程、
２）磁気細胞分離システムにより目的タンパク質の安定発現細胞株のクローニングを行う工程、
２．キャリアータンパク質が細胞膜上に発現するタンパク質である前項１に記載の方法、
３．キャリアータンパク質がCD4である前項１または２に記載の方法、
４．目的タンパク質が甲状腺刺激ホルモン受容体（TSHR）である前項１〜３のいずれか1項に記載の方法、
５．TSHR遺伝子がTSHRの細胞外部分をコードするDNAである前項４に記載の方法、
６．TSHR遺伝子がヒトまたはブタ由来である前項４または５に記載の方法、
７．前項１〜６のいずれか1項に記載の方法により得られる目的タンパク質の安定発現細胞株、
８．前項１〜６のいずれか1項に記載の方法により得られる目的タンパク質の安定発現細胞株を用いて目的タンパク質の機能を解析する方法、
９．前項１〜６のいずれか1項に記載の方法により得られる目的タンパク質の安定発現細胞株を用いて血清中の目的タンパク質に対する抗体を検出する方法、
１０．以下の工程を含む血清中のTSHRに対する刺激型抗体および抑制型抗体の活性を測定する方法；
１）前項４〜６のいずれか1項に記載の方法により得られるTSHR安定発現細胞株を該血清で刺激する、
２）該細胞株におけるcAMP上昇活性を測定する、
１１．血清が哺乳動物由来である前項９または１０に記載の方法、
１２．血清がバセドウ病患者由来である前項１１に記載の方法、
１３．血清がマウス由来である前項１２に記載の方法、
１４．マウスがバセドウ病モデルマウスである前項１３に記載の方法、
からなる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の細胞株の樹立方法は、簡便、安全、かつ効率的であるという利点を有しており、様々な目的タンパク質の機能解析、該タンパク質の関連する疾患の病態解析および病態評価に役立つ。また、本発明のTSHR発現細胞株は、バセドウ病の病態解析、病態評価、およびバセドウ病モデルマウス血清中の抗TSHR抗体の検出による該モデルマウスの評価に使用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。
【００１０】
本発明の一態様は、以下の工程を含む細胞株の樹立方法である；
１）目的タンパク質をコードする遺伝子、およびキャリアータンパク質をコードする遺伝子を担持するベクターを動物細胞に導入する工程、
２）磁気細胞分離システムにより目的タンパク質の安定発現細胞株のクローニングを行う工程。以下、各工程を説明する。
【００１１】
１）目的タンパク質をコードする遺伝子、およびキャリアータンパク質をコードする遺伝子を担持するベクターを動物細胞に導入する工程
工程１）は目的タンパク質をコードする遺伝子、およびキャリアータンパク質をコードする遺伝子を担持するベクターを動物細胞に導入および選択する工程である。ここで、キャリアータンパク質は、発現細胞の選択のため細胞膜上に発現するタンパク質が望ましく、一例としてCD4が挙げられる。
【００１２】
目的タンパク質は、有用タンパク質あるいは生理活性タンパク質であればいずれのものであってよく、好ましくは細胞膜上に発現するタンパク質である。このようなタンパク質としては、各種ホルモン[甲状腺ホルモン（TSH）、下垂体ホルモン放出因子、オキシトシン、バソプレッシン、副甲状腺ホルモン（PTH）、副甲状腺ホルモン関連ペプチド（PTHrP）、成長ホルモン（GH）、プロラクチン、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、インスリン、グルカゴン、カルシトニン]の受容体、各種リンフォカインあるいはサイトカイン[例えば、インターロイキン−1（IL−1）、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−15、腫瘍壊死因子（TNF）、インターフェロンα（IFNα）、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンω、インターフェロンτ）、造血因子（例えば、エリスロポエチン（EPO）、トロンボポエチン（TPO）、顆粒球コロニー刺激因子（G−CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M−CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）、血液幹細胞増殖因子（SCF）]の受容体、各種成長因子あるいは増殖因子[例えば、血管上皮成長因子（VEGF）、神経成長因子（NGF）、繊維芽細胞増殖因子（FGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、トランスフォーミング増殖因子β（TGF−β）、白血球遊走阻止因子（LIF）、毛様体神経栄養因子（CNTF）、オンコスタチンＭ（OSM）]の受容体、免疫グロブリン[例えば、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はそれらの断片、Fv、scFv（single  chain  Fv）、scFvダイマー]等が挙げられる。
【００１３】
目的タンパク質がTSHRである場合、用いるTSHR遺伝子は哺乳動物由来のものであればよいが、ヒト（human TSHR: NM174206）、ブタ（porcineTSHR:NM214297）、ウシ（bovineTSHR: NM174206）由来のものが好ましく、ブタ由来のものがより好ましい。
【００１４】
目的タンパク質をコードする遺伝子は天然に存在するものであってよく、また該遺伝子に、置換、欠失、付加又は挿入等の変異を導入したものであってもよい。変異を導入する手段は自体公知の手段を利用できる。好ましい変異としては、目的タンパク質がTSHRの場合、TSHRの細胞外部分（N末端から1〜289番目のアミノ酸）やN型糖鎖結合部位の置換などを発現する遺伝子が好ましい。
【００１５】
遺伝子を動物細胞に導入する手段は、望ましくはインテグレーションさせる方法、例えばリポソーム法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等によるのが好ましい。しかし一過性に発現させるリポソーム法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクター法、アテロコラーゲン法等の方法であってもよい。用いるベクターは特に限定されず、公知のプラスミド、ファージ、コスミド、BAC、YAC、組換えウイルス、トランスポゾン等、通常の組み換え実験によって挿入DNA断片を導入することが可能な全ての組換えベクターに適用することができる。
【００１６】
ベクターは、当然に自体公知の組合せが好適であるプロモーター、エンハンサーと共に構築することができる。例えば、通常宿主に適したプロモーターが挿入されている市販のタンパク質発現ベクターを用いることができる。
【００１７】
また、ベクターの目的タンパク質とキャリアータンパク質の間にリボソーム結合部位（IRES）配列が位置していることが望ましい。IRES配列により、転写産物の5´末端とIRES配列からの同時翻訳が行われることにより、一つの細胞で目的タンパク質とキャリアータンパク質の療法ともが単一の転写産物から合成されることとなり、一つの細胞で両タンパク質が発現される確率が高められることとなる。
【００１８】
さらに、ベクターには抗生物質耐性選択マーカーをコードするDNAが含まれていることが望ましい。該選択マーカーにより抗生物質によるクローニングが可能となる。該抗生物質の一例としては、ネオマイシン、プレオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン等が挙げられる。本発明に用いるベクターの具体例として、pC1-IRES-Vector（Novagen社、製造中止）等が挙げられる。
【００１９】
遺伝子を導入する動物細胞は特に限定されないが、培養細胞として株化されているものが望ましく、CHO-K1細胞、COS細胞、HEK293細胞等が好適な例として挙げられる。
【００２０】
２）磁気細胞分離システムにより目的タンパク質の安定発現細胞株のクローニングを行う工程。
工程２）は工程１）において細胞に導入したキャリアータンパク質に対する抗体を用いた磁気細胞分離システムにより、目的タンパク質の発現細胞のクローニングを行う工程である。詳しくは、磁性マイクロビーズを結合させたキャリアータンパク質に対する抗体を利用して、工程１）においてベクターを導入した細胞を磁気標識する。その後、該細胞を磁石を設置した分離カラム内を通過させた後、分離カラムに保持される細胞を溶出することにより、目的タンパク質非発現細胞が除去され、目的タンパク質発現細胞が得られる。磁気細胞分離システムは市販のキットを広く用いることができ、具体例としてMACSシステム（第一化学薬品社）が挙げられる。
【００２１】
また、前記抗生物質耐性選択マーカーを利用して、該マーカーを発現している細胞を選択した後に、該細胞を用いて磁気細胞分離システムを実施することにより、クローニング効率を高めることができる。詳しくは、前記抗生物質を細胞用培地に添加し、細胞を培養することにより前記マーカーを発現している細胞の選択を行う。
【００２２】
さらに、公知の細胞株のクローニング方法、例えば限界希釈法、pick  up法等を用いて、磁気細胞分離システムにおいて分離カラムから溶出された細胞から目的タンパク質発現細胞株をクローニングすることができる。限界希釈法とは、1細胞以下の濃度で培養容器（例えば96ウェルプレート）で増殖させる方法である。pick  up法は希薄細胞由来のコロニーを円筒の筒（クローニングシリンダー）で隔離分離する方法である。
【００２３】
前記目的タンパク質発現細胞株における目的遺伝子導入効率はキャリアーに対する抗体、目的タンパク質に対する抗体を用いたフローサイトメーター等の公知の手段により評価することができる。
【００２４】
本発明の別の一態様は、前記方法により得られる目的タンパク質の安定発現細胞株である。該目的タンパク質の安定発現細胞株は、目的タンパク質の機能解析に用いることができる。したがって、本発明のまた別の一態様は、前記方法により得られる目的タンパク質の安定発現株を用いて目的タンパク質の機能を解析する方法である。
【００２５】
本発明のさらに別の一態様は、前記方法により得られる目的タンパク質の安定発現細胞株を用いて、血清中の目的タンパク質に対する抗体を検出する方法である。具体例として、TSHR安定発現細胞株を用いて血清中のTSHRに対する刺激型抗体および抑制型抗体の活性を測定することができる。
【００２６】
したがって、本発明の一態様は、以下の工程を含む血清中のTSHRに対する刺激型抗体および抑制型抗体の活性を測定する方法である；１）前記方法により得られるTSHR安定発現細胞株を血清で刺激する、２）該細胞株におけるcAMP上昇活性を測定する。cAMPの上昇活性は市販のキットを用いて測定することができ、例えばキット「ヤマサ」（ヤマサ醤油）を用いることができる。
【００２７】
血清は、ヒト、マウス等の哺乳動物由来であればよい。一例として、バセドウ病患者の血清によりTSHR安定発現細胞株を刺激し、cAMP上昇活性を測定することにより、血清中の自己抗体を検出し、バセドウ病の病態を評価することができる。また、TSHR安定発現株はバセドウ病モデルマウスの確立に用いることもできる。詳しくは、バセドウ病モデルマウスの作製において、該マウス血清によりTSHR安定発現株を刺激し、cAMP上昇活性を測定することにより、血清中の自己抗体を検出し、作製されたバセドウ病モデルマウスを評価することができる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【００２９】
実施例１：TSHR発現細胞株の樹立
＜材料と方法＞
１）TSHR発現ベクターの作製
TSHR発現ベクターとしてpC1-IRES-ΔCD4（図１）を使用した。このベクターにヒトTSHR全長遺伝子（human TSHR: AY429111）および細胞外領域をEcoRIサイトで組み込み、pC1-TSHR-IRES-ΔCD4を作製した。インサートの接合部の塩基配列はDNAシークエンスにより確認した。図２に示すように、pC1-TSHR-IRES-ΔCD4を用いることにより、理論上CD4を発現する全ての細胞に、同時にTSHRを発現させることが可能である。
【００３０】
２）細胞培養
チャイニーズハムスター卵巣細胞由来CHO-K1細胞は10% FBSを含むF-12(HAM)培地を用いて5％ CO2の存在下、37℃において培養した。
【００３１】
３）遺伝子導入法
0.3〜0.5μgのpC1-TSHR-IRES-ΔCD4を細胞数6×105個／9.6cm2ディッシュのCHO-K1細胞に、リポフェクション試薬であるFuGENE63μL/ウエル（Roche-Diagnostic社））を用いて導入した。
【００３２】
４）ΔCD4発現細胞の濃縮
図３に示すように、磁気細胞分離システム（MACS）および、磁性マイクロビーズを結合させた抗CD4抗体を利用し、細胞の濃縮を行った。遺伝子導入の24時間後、このCD4に対する抗体と遺伝子導入細胞を反応させる事により、ΔCD4陽性細胞を磁気標識した。これらの細胞を磁石に設置した分離カラムを通過させた後、分離カラムに保持されたΔCD4陽性細胞を溶出した。MACS処理の間隔は１週間程度とし、その間はG418を1mg/mlの濃度で培地に加え、TSHR非発現細胞を除いた。G418とは、遺伝子工学実験における選択試薬である。アミノグリコシド系抗生物質であり、トランスポゾンTn5のneo遺伝子にコードされるアミノグリコシド3'-ホスホトランスエステラーゼにより不活性化される。一般的に、このことを利用して、neo遺伝子を用いトランスフェクションした目的の遺伝子が恒常的に発現している細胞を単離する操作で、その形質転換細胞のみを選択するために、培地中に添加して使用される。
【００３３】
５）TSHR安定発現細胞株のクローニング
限界希釈法によってTSHR安定発現細胞株を単離した。４）で得られた細胞を0.3個/穴の濃度で96穴プレートに播き込むことによりクローニングを行った。
【００３４】
６）TSHR遺伝子導入効率の確認
FACSキャリバー（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて、TSHR導入細胞におけるTSHR遺伝子導入効率の確認を行った。TSHR導入細胞は、PE（phycoerythrin）ラベル化抗CD4抗体および、モノクローナル抗TSHR抗体(2C11)とFITC（Fluoresceinisothiocyanate）ラベル化抗マウスIgs抗体を用いて解析した。2C11はTSHRの細胞外領域である354-359番目のアミノ酸配列をエピトープとする抗体である。
【００３５】
７）cAMPの測定
1 mM EDTA（pH8.0）、0.3% BSAを含むPBSでTSHR発現細胞を回収した後、Tyrode-Hepes buffer（14.mM NaCl、2.7mMKCl、1.8mMCaCl2、12mM NaHCO3、5.6mM D-Glucose、0.49ｍＭ  ＭｇＣｌ2、0.37ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、25mMHepes、pH7.4）に2×104個/100 μl/チューブで懸濁し、0.5 mM IBMX（isobutylmethylxanthine）存在下に各種濃度のTSHを加え37℃で30分インキュベートした。最終濃度0.1Mの塩酸を加え、煮沸後の細胞抽出液中のcAMP量をサイクリックAMPキット「ヤマサ」（ヤマサ醤油）を使用し測定した。
【００３６】
＜結果＞
CHO-K1細胞にpC1-IRES-ΔCD4-TSHRベクターを遺伝子導入し、24時間後、フローサイトメーターにより遺伝子導入効率を調べたところ、6.0%であった。そこで、MACSシステムを使用し遺伝子導入細胞の濃縮を試みた。その結果、図４に示すように、MACS処理後の、ΔCD4陽性細胞の率は一回目で27.8％、二回目で30.7%、三回目で42.8%であった。そして、四回目で最終的にΔCD4陽性細胞を67.3％まで濃縮することができた。
【００３７】
その後、前記濃縮された細胞からクローニングを行い、最終的に34個のクローンを得た。フローサイトメーターによる解析の結果、CD4陽性の細胞は32個、陰性の細胞は2個であった。これらのクローンはΔCD4の発現パターン、すなわちフローサイトメーターのヒストグラムから6種類のグループに分類された。代表する6クローンを2C11を用いて解析した結果、TSHR陽性のクローンは2種類のみであった。この2つのクローンのうちTSHRの発現が高いクローン12を選択し、CHO-TSHR-AHK12と名付け（以下、AHK12）、cAMPの測定に用いた。
【００３８】
図５に示すようにAHK12におけるcAMPの産生は、TSH濃度依存的に増加し、無刺激群に対して10 mU/ml添加群では80倍以上の上昇を示した。TSHのEC50は約0.1mU/mlであった。
このAHK12をG418を1 mg/ml加え、さらに2ヶ月間培養を続けた後、再びフローサイトメーターで解析したところ、図６に示すようにAHK12におけるTSHRの発現低下は認められなかった。また、AHK12をリクローニングしたクローンはすべて親株のAHK12と同様のTSHR発現パターンを示したことから、AHK12は完全に安定なTSHR発現細胞株であると考えられた。
【００３９】
実施例２：バセドウ病モデルマウスの作製
＜材料と方法＞
１）TSHR発現ベクターの作製
TSHR発現ベクターとしてpC1-IRES-ΔCD4（図１）とpBacMam2（図７）を用いた。バセドウ病ではTSHRの第一細胞膜貫通ドメインまでの細胞外領域が初期の抗原認識、および抗TSHR抗体との結合に重要であるとされている。そのため、2種類のベクターそれぞれにTSHR-wildtype(TSHR-WT)と細胞外領域であるTSHR-289His（N末から1〜289番目のアミノ酸）を組み込んだ発現ベクターを計4種類作製した。さらに、生体内（in  vivo）EP法の基礎検討を行うためにpBacMam2にLacZを組み込んだベクターを作製した。
【００４０】
２）生体内（in  vivo）EP法の基礎検討
エレクトロポレーターとしてネッパジーン社のCUY21 EDITを用い、生体内（in  vivo）EP法の基礎検討を行った。ネンブタールをsalineで10倍希釈した後、50mg/kgの用量を5週齢の雌のICRマウスに腹腔内投与した。麻酔下、大腿部の皮膚を0.5cm程度切り開き、平行ニードル固定型電極を筋肉に挿入した。電極間の大腿部筋肉にpBacMam2-LacZを50μg/部位（final 0.9% NaCl）で注入した。発現ベクター注入後、50V、負荷時間50 m秒の条件で6回のパルスを与えた。この操作を左右の大腿で行い、施術後皮膚を縫合した。
DNAワクチネーションを行った群を生体内（in vivo） EP法の対照に用いた。DNAワクチネーションは、ワクチネーションを行う1週間前に、10μM cardiotoxinを50 μlずつ予定した発現ベクター投与部位に注入後（cardiotoxin前処置）、リン酸緩衝生理食塩水溶解プラスミドベクターDNAを筋肉内に注射した。
導入遺伝子発現の範囲を調べるために、導入3、7日後の筋肉組織を採取した。また、遺伝子発現の経時的変化を調べるために、導入1、3、5、7、10、14、21日後の筋肉組織を採取した。
【００４１】
３）筋組織におけるβ-gal発現の確認
TSHR発現ベクター筋注部位の大腿部筋肉を摘出し、該筋肉組織におけるβ-gal発現の確認を行った。細切した筋肉組織片とクリオスタット（LEICA社、Jung Frigocutt 2800E）により10 μmに薄切した凍結切片を10％ ホルマリン液で固定した後、X-galを含む基質溶液を滴下して青色の発色を観察した。
【００４２】
４）筋組織におけるβ-gal活性の測定
TSHR発現ベクター筋注部位におけるβ-gal活性の測定を行った。発現ベクター筋注部位の大腿部筋肉を摘出し、湿重量の3倍量のバッファーA(15mMTris-HCl(pH8.0)、60 mM KCl、15 mM EDTA、500 mM DTT、0.4 mM p-ABSF)を加え、氷上でホモジナイズした。氷上で15サイクルの超音波粉砕［Duty50、Output 2］を行い、14000 rpm、4 ℃、10分間で遠心分離した上清を採取した。基質としてONPG（o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシド）を加え、37℃で3時間インキュベートして生成したo-ニトロフェノールの吸光度を415nmの波長で測定した。さらにタンパク定量を行った後、活性値(unit)/mg タンパク質に換算した。
【００４３】
５）バセドウ病モデルマウスの作製
5週齢の雌のBALB/cマウスを用いて2と同様の操作を行った。1回目の発症実験には、pC1-IRES-ΔCD4を発現ベクターとして用いた。コントロールとしてpC1-IRES-ΔCD4、さらにTSHR-WT、TSHR-289Hisを組み込んだ3種類の発現ベクターを50μg/部位で生体内（in  vivo）EP法を用いて筋肉内に導入した。この操作を3週間おきに全3回行った。
また、TSAb活性を測定する為に2、3回目のEP後、7日目の血清をそれぞれ採取した。例数は、pC1-IRES-ΔCD4-TSHR-WT、TSHR-289Hisを各25匹、コントロール15匹、sham9匹とした。
2回目の発症実験では、発現ベクターとしてpBacMam2を用い、手技、投与スケジュール、例数などの条件は1回目の発症実験と同様とした。
【００４４】
＜結果＞
図８左に示すように、pBacMam-LacZを生体内（in  vivo）EP法により導入した群において、筋線維に沿ったβ-galの発現が認められた。また、図８右に示すように筋線維の横断面から観察したところ生体内（in  vivo）EP処置を施した一部の領域に集中してβ-galの活性が認められた。
【００４５】
図９に示すように、生体内（in  vivo）EP処置群においてβ-galの酵素活性は7日目に最大値を示し、14日でほぼ消失した。DNAワクチネーション処置群においては、1日後に最大値を示し、3日目でコントロール群とほぼ同程度の値まで減少した。cardiotoxin前処置後にDNAワクチネーションを行った群と比較して、生体内（in  vivo）EP処置群において7日後で最大60倍のβ-gal活性が示された。
【００４６】
実施例３：TSHR発現細胞株を用いたバセドウ病モデルマウス血清におけるTSAbの測定
＜材料と方法＞
実施例１で樹立したTSHR発現細胞株を用いて、実施例２で作製したバセドウ病モデルマウス血清におけるTSAbを測定した。実施例１で作製したマウスから採取した血液を12000rpm、4℃で10分間遠心分離し血清を採取した。TSAb活性は実施例１において樹立したヒトTSHR発現株CHO-K1-TSHR-AHK12を用いて評価した。5%マウス血清でCHO-K1-TSHR-AHK12を刺激した後、TSAbのcAMP上昇活性をcAMPキット「ヤマサ」を用いて実施例１の７）と同様に測定した。さらにマウスより甲状腺を摘出し、甲状腺の形態変化を観察するとともに、甲状腺組織をHE染色により観察した。
【００４７】
＜結果＞
cAMP上昇活性においてコントロール群の平均値+3SDの値を基準とし、これを上回った検体をTSAb陽性と判定した。その結果、pC1-IRES-ΔCD4-TSHR-WTをinvivo EP法により導入した群では2回目EP後TSAb陽性個体は0/25匹、3回目EP後TSAb陽性個体は2/25匹、4回目EP後TSAb陽性個体は0/25匹であった。TSHR-289Hisでは、図１０に示すように2回目のEP後TSAb陽性個体は10/24匹、3回目のEP後TSAb陽性は18/23匹、4回目のEP後TSAb陽性は11/23匹であった。同様に、図１０に示すように、pBacMam2ベクターにおいては3回目のEP後TSHR-WTは11/25匹であり、TSHR-289Hisでは19/25匹であった。また、pBacMam2 -TSHR-289Hisの2回EP後のTSAb活性は、最大でコントロールの平均値の15倍の値を示した。さらに図１１および１２に示すように、TSAb陽性固体においては組織学的にも甲状腺の肥大が見られた。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の細胞株の樹立方法は、簡便、安全、かつ効率的であり、様々な目的タンパク質の機能解析、該タンパク質の関連する疾患の病態解析および病態評価に役立つ。また、本発明のTSHR発現細胞株は、バセドウ病患者の病態解析、病態評価、およびバセドウ病モデルマウス血清中の抗TSHR抗体の検出によるモデルマウスの評価に使用可能である。さらに、発現細胞から精製した目的タンパク質は、他の自己抗体の測定系の抗原等として利用も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】TSHR発現ベクターであるpC1-IRES-ΔCD4の構造を示す。（実施例１）
【図２】pC1-TSHR-IRES-ΔCD4を用いることにより、理論上CD4を発現する全ての細胞に、同時にTSHRを発現させることが可能である。（実施例１）
【図３】磁気細胞分離システム（MACS）および、磁性マイクロビーズを結合させた抗CD4抗体を利用し、細胞の濃縮を行った。（実施例１）
【図４】MACSによりΔCD4陽性細胞の濃縮を行った結果を示す。（実施例１）
【図５】CHO-TSHR-AHK-12におけるTSHの用量反応曲線を示す。（実施例１）
【図６】CHO-TSHR-AHK-12における安定的発現を示す。（実施例１）
【図７】TSHR発現ベクターであるpBacMam2の構造を示す。（実施例２）
【図８】pBacMam2を生体内（in  vivo）EP法により導入した群における、筋繊維に沿ったβ-galの発現（左）、および筋繊維の横断面におけるβ-galの活性（右）を示す。（実施例２）
【図９】生体内（in  vivo）EP処置によるβ-galの酵素活性の変化を示す。（実施例２）
【図１０】pC1ベクターおよびpBacMam2ベクターにおけるTSAbの誘導を示す。（実施例３）
【図１１】TSAb陽性個体の甲状腺の形態変化を示す。（実施例３）
【図１２】甲状腺組織像（HE染色）を示す。（実施例３）
【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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