(57)【要約】【課題】金属キレート・アフィニティクロマトグラフィに適したキャリアーマトリックスまたは磁性体粒子に用いることのできる金属キレート化合物及びその製造方法に関するもので、極めて結合能力が大きく、且つ安価な金属キレート樹脂を提供することを目的とする。【解決手段】シリルプロピルエチレンジアミン３酢酸を加水分解し、磁性体粒子表面に結合させ、それにニッケル原子をキレート結合させる。この縦の繋がりをニッケルキレート樹脂の一単位とする。図1には左方の一単位と右方の一単位が示されているが、各単位の珪素原子Siは―O−Si−O−結合を介して互いに横方向に接続され、構造が強化され磁性体粒子の表面から剥離しにくくなっていおり、またヒスチジンの吸着能力も高く安価である。【選択図】図１
2006334562.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性酸化鉄の表面近傍の金属原子に酸素原子を結合させ、前記酸素原子には
珪素原子の第一の結合手を結合させ、前記珪素原子の第二の結合手には（CH2）ｎからな
る鎖状炭化水素（ｎ＝３から１０とする）の一端の炭素原子を結合させ、鎖状炭化水素の
他端の炭素原子にはエチレンジアミン三錯酸の窒素原子のうち、CH2COO基１個に結合
している窒素原子を結合させ、エチレンジアミン三錯酸の三個のCH2COO基には２価金
属例えばニッケル又はコバルト原子を配位結合させて一単位の金属キレート化合物とした
ものにおいて、前記一単位の金属キレート化合物の複数個を接続する為に、前記珪素原子
の少なくとも第三の結合手に（―O―Si−）ｍ−O―（ｍ＝整数）で表される結合を介して
隣接する同様な構造式を持つ別の一単位の金属キレート化合物の珪素原子を結合させたこ
とを特徴とする、前記一単位の金属キレート化合物が複数個結合された金属キレート化合
物を製造する際に、前記磁性酸化鉄を超音波を用いて液中に分散させ、次にマグネットを
用いて磁性酸化鉄を捕集した後、液体部分を除去し、次に減衰する交番磁界を用いて磁性
酸化鉄の残留磁化を消磁し、更に超音波を用いて別の液中に分散させたことを特徴とする
前記一単位の金属キレート化合物が磁性体粒子の表面に複数個結合された金属キレート化
合物の分散液。
【請求項２】
磁性酸化鉄の表面近傍の金属原子に酸素原子を結合させ、前記酸素原子には
珪素原子の第一の結合手を結合させ、前記珪素原子の第二の結合手には（CH2）ｎからな
る鎖状炭化水素（ｎ＝３から１０とする）の一端の炭素原子を結合させ、鎖状炭化水素の
他端の炭素原子にはエチレンジアミン三錯酸の窒素原子のうち、CH2COO基１個に結合
している窒素原子を結合させ、エチレンジアミン三錯酸の三個のCH2COO基には２価金
属例えばニッケル又はコバルト原子を配位結合させて一単位の金属キレート化合物とした
ものにおいて、前記一単位の金属キレート化合物の複数個を接続する為に、前記珪素原子
の少なくとも第三の結合手に（―O―Si−）ｍ−O―（ｍ＝整数）で表される結合を介して
隣接する同様な構造式を持つ別の一単位の金属キレート化合物の珪素原子を結合させたこ
とを特徴とする、前記一単位の金属キレート化合物が複数個結合された金属キレート化合
物の分散液。
【請求項３】
請求項１および請求項２において（―O―Si−）ｍ−O―結合中のSiの第三
の結合手は酸素を介して磁性体粒子表面の金属原子に結合されていることを特徴とする、
珪素原子を介して複数個結合された金属キレート化合物が磁性体粒子の表面に複数個結合
された金属キレート化合物の分散液。
【請求項４】
請求項１および請求項２において（―O―Si−）ｍ−O―結合中のSiの第四
の結合手には水酸基（OH基）が接続されていることを特徴とする、珪素原子を介して複
数個結合された金属キレート化合物が磁性体粒子の表面に複数個結合された金属キレート
化合物の分散液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は金属キレート・アフィニティクロマトグラフィに適したキャリアーマトリック
スまたは磁性体粒子に用いることのできる金属キレート化合物及びその製造方法に関する
ものである。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質の分離精製方法として、蛋白質の末端に複数個のヒスチジンを遺伝子組み換えの
手法を用いて接続し所謂His  Tag融合蛋白質とする。
今アガロース等のキャリアーマトリックスまたは磁性体粒子の表面にあるCH2COO基
にキレート結合で結合され固定化されたNi２+、Co２+のような金属イオンがあるとき、
蛋白質の末端に取り付けた前記複数個のヒスチジンのイミダゾール側鎖に位置する電子付
与性基と可逆的に相互作用を行う。
即ちHis  Tag融合蛋白質は電子付与性基が部分的に非プロトン化した形で存在するｐ
H値の緩衝液中でNi２+、Co２+のような金属イオンに結合し、次いで電子付与性基がプ
ロトン化される低いｐH値の緩衝液中でNi２+、Co２+のような金属イオンから溶離する。
従来用いられていたイミノ２酢酸はCH2COO基を２個しか持たず、このためCH2COO
基にキレート結合したNi２+、Co２+のような金属イオンにたいし、前記複数個のヒスチ
ジンのイミダゾール側鎖に位置する電子付与性基と可逆的に相互作用する際においてその
結合力が弱く、Ni２+、Co２+のような金属イオンはCH2COO基から離れやすく、しばし
ば洗い出されてしまう欠点があった。（特許文献１）
しかしNi−NTA（ニッケルニトリロ３酢酸）は３個のCH2COO基を有し、Ni２+や
Co２+イオンは６配位を持つので、その内３配位は３個のCH2COO基の二重結合を持た
ない三つの酸素と配位し、１配位は窒素と配位する。そして残りの２配位の各１づつが２
個のヒスチジンのイミダゾール側鎖と配位する。
このためNi２+、Co２+のような金属イオンはCH2COO基から離れにくく洗い出され
にくいと言う長所があった。しかしNi−NTA（ニッケルニトリロ３酢酸）をキャリアー
マトリックスまたは磁性体粒子に結合させるとき、スペーサーを介して結合するために
AB−NTAという化合物が考案され、このAB−NTA樹脂は極めて高価で、例えばメーカ
ーの一つである同仁化学のAB−NTA樹脂の価格は１ｇで１１万円にも上っている。
このように高価なAB−NTAを用いて例えば磁性体粒子（直径１５０ｎｍ）の表面を
AB−NTA樹脂で覆う為には１Kｇの磁性体粒子に対しAB−NTA樹脂を損耗分も含めて
３００ｇ用いなければならず、その価格は３００×１１万円＝３，３００万円にも上る。
事実AB−NTA樹脂をマグネタイトを内包したアガロース球に結合させた、市販の製品
はこのように極めて高価であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
金属キレート・アフィニティクロマトグラフィにおいて、特に磁性体粒子を用いた精製
は重要な意味を持つ。
従来の非磁性アガロース球（３から１００μ）を液体クロマトグラフのカラムにぎっし
り詰めて、アフィニティクロマトグラフィ精製を行う場合には先ず蛋白質や各種不純物を
含んだ所謂ライセートをカラムの上方から供給するが、カラムの上方のアガロース球の隙
間にはHis Tag融合蛋白質は特異的に吸着されるが、同時に各種不純物もアガロース球の
隙間に物理的に挟み込まれ非特異的に吸着するのは避けられない。
カラムの下方に行くほど不純物の非特異的な吸着は少なくなるが、次にHis Tag融合蛋
白質を低いｐH値の緩衝液を流して洗い出す際に、この不純物も洗い出されてくるのは避
けられない。
その為１回のカラム通過では到底His Tag融合蛋白質精製の純度が上がらず、何回もカ
ラムを通過させる必要があった。
そしてアガロース球の使用寿命は高々４回であり、４回ごとにカラムを分解してアガロ
ース球を捨て、新しいアガロース球に詰め替えていた。
このため到底連続精製は出来ず、バッチ法となっていた。
【０００４】
一方磁性体粒子を用いた精製方法は、緩衝液中に分散させた磁性体粒子の表面にHis 
Tag融合蛋白質を特異的に吸着させるので、ピペッティング等により磁性体粒子を液中で
攪拌することは容易で、このため前記各種不純物は粒子間に物理的に挟み込まれず容易に
液中に溶離され、マグネットを用いて磁性体粒子を容器の内壁に吸着したとき、残液には
不純物及びHis Tag融合蛋白質以外の蛋白質が溶離し、残液を容易に除去できる。次に低
いｐH値の緩衝液を流してHis Tag融合蛋白質を洗い出せば純度の高いHis
Tag融合蛋白
質を捕集できるので、容易にHis Tag融合蛋白質の精製度を上げることが出来る。
しかもその精製速度はカラムに比べて速く、また連続精製に向いているので、早くから
大量精製の有力な手法として、この磁性体粒子法が注目されていた。
【０００５】
しかし前述のように金属キレート樹脂を結合した磁性体粒子の価格があまりにも高価な
ので、良いことは分かっていてもHis Tag融合蛋白質の大量精製には用いることが出来な
かった。
もし金属キレート樹脂を結合した磁性体粒子の価格が安価で、且つAB−NTA樹脂のよ
うにNi２+、Co2+イオンに対し、強い結合力を持つCH2COO基を３個持つ金属キレート
樹脂があれば、上記の問題は即座に解決されHis Tag融合蛋白質の大量精製には用いるこ
とが出来るようになるのは明らかである。本発明は上記の問題を解決する為のものである。
【０００６】
キャリアーマトリックスまたは磁性体粒子に用いることのできる金属キレート化合物を
キャリアーマトリックスまたは磁性体粒子に直接接続せず、所謂スペーサーと称する分子
連鎖を介してスペーサーの末端に金属キレート化合物を接続する従来の手法の目的は、
His Tag融合蛋白質のヒスチジンの部分が、フォールディングにより蛋白質の３次元構造
の奥まった部分にあったとしても、そこにあるヒスチジンに金属キレート化合物の金属の
部分が近接できるようにするために、所謂スペーサーを用いている。
このスペーサーは必須である。金属キレート化合物その物は安価であるのに、従来用い
られているスペーサーを接続した金属キレート化合物が極めて高価である理由を考察した
結果、安価なスペーサーをもつ金属キレート化合物があればよいことが判明した。そのた
めの努力を行った結果、安価なスペーサーを持つ金属キレート化合物の開発に成功した。
【０００７】
その結果磁性酸化鉄の表面近傍の金属原子に酸素原子を結合させ、前記酸素原子には珪
素原子の第一の結合手を結合させ、前記珪素原子の第二の結合手には（CH2）ｎからなる
鎖状炭化水素（ｎ＝３から１０とする）の一端の炭素原子を結合させ、スペーサーとした。    
そして前記鎖状炭化水素の他端の炭素原子にはエチレンジアミン三錯酸の窒素原子のう
ち、CH2COO基１個に結合している窒素原子を結合させ、エチレンジアミン三錯酸の三
個のCH2COO基には２価金属例えばニッケル又はコバルト原子を配位結合させて一単位
の金属キレート化合物としたものにおいて、前記一単位の金属キレート化合物の複数個を
接続する為に、前記珪素原子の少なくとも第三の結合手に（―O―Si−）ｍ−O―（ｍ＝整
数）で表される結合を介して隣接する同様な構造式を持つ別の一単位の金属キレート化合
物の珪素原子を結合させたことを特徴とし、且つ（―O―Si−）ｍ−O―結合中のSiの第
三の結合手は酸素を介して磁性体粒子表面の金属原子に結合されていることを特徴とする、
珪素原子を介して複数個結合された金属キレート化合物を製造することに成功し、この複
数個結合された金属キレート化合物を表面に持つマグネタイト磁性体粒子（５０nmまた
は４００nm）を製作できた。そしてピペッティングにより磁性体粒子を液中で攪拌し、マ
グネットを用いて磁性体粒子を捕集する公知の磁性体粒子法により、His Tag融合蛋白質
を精製した結果、従来よりもHis Tag融合蛋白質の収量が多く、しかも非特異的な夾雑物
の吸着が極めて少ない金属キレート化合物を表面に持つマグネタイト磁性体粒子の開発に
成功した。
しかもその材料原価はマグネタイト磁性体粒子１Kｇあたり８０万円と極めて安価であ
ることを確認した。
【０００８】
その原因は次の通りである。
AB−NTA（N-(5
Amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid）自体の合成は極めて高価
な工程を要する。NTA（ニッケルニトリル３酢酸）は１個の窒素原子に３個の―CH2COOH
基が結合した簡単な構造であるため、それにスペーサーとしてのNH2―（CH２）5―を
結合させるには1個のCH2COOH基のうちCH２の部分の１個の水素原子だけを取り去
り、その跡にNH2―（CH２）5―の右端の炭素原子を接続しなければならない。その為
高価となるのは避けられない。高価であればその使用量は少量に止まるので、ますますコ
ストダウンは困難になっていた。
【０００９】
この問題を解決する為に、極めて安価で多用されているエチレンジアミン４酢酸
（EDTA）のNa塩を用いた。そして１個の−CH2COONaを取り去り、その後にスペー
サーとしてトリメトキシ・シリルプロピル基を接続することは比較的安価な工程で出来る
ことを見出した。
事実既存化学物質としてN−（トリメトキシ・シリルプロピル）エチレンジアミン３酢
酸があり、このNa塩の５０％水溶液は２５ｇで１８、０００円と極めて安価に市販され
ている。本発明ではこの市販されているN−（トリメトキシ・シリルプロピル）エチレン
ジアミン３酢酸を用いた。そしてマグネタイト表面にこれを効率よく、また強固に結合さ
せるために、この物質を改変した。
【００１０】
まずN−（トリメトキシ・シリルプロピル）エチレンジアミン３酢酸のNa塩の５０％
水溶液を５０μｌ（５０M）用意し、これにテトラ・アルコキシシラン例えばテトラ・メ
トキシシラン、またはテトラ・エトキシシランを少量加える。
これに純水を３ｍｌ加え次に３５％アンモニア水を少量加え、マグネチックスターラで
攪拌する。このビーカーをビーカー１とする。
次に別のフラスコにマグネタイト粒子を０．１ｇ採り、３ｍｌの純水を入れる。それに
界面活性剤Tween２０を１２μｌ入れてマグネチック・スターラーで攪拌する。その後減
衰する交番磁界をかけて磁性体粒子の残留磁化を消磁する。消磁の目的はマグネットを当
てた時、磁性体が残留磁化を持ったままでは、磁性体粒子は互いにクラスターをつくり、
粒子1個1個がほぐれにくいからである。次に超音波をかけてマグネタイトを分散させる。
それにビーカー１の内容物を加え、振とう器でシラン化反応を行わせる。
その後マグネットで磁性体粒子を捕集し液部のみを除き、純水でマグネタイト部を1回
洗浄する。それに減衰する交番磁界をかけて磁性体粒子の残留磁化を消磁する。
【００１１】
その後１０ｍMの塩化ニッケルと５ｍMのグリシン（PH=8）水溶液を２０ｍｌを加え
る。振とう器で3時間振とうする。
その後マグネットで磁性体粒子を捕集し液部のみを除き純水でマグネタイト部を1回洗
浄する。それに減衰する交番磁界をかけて磁性体粒子の残留磁化を消磁する。これに１ｍ
ｌの純水を加えボトルに移す。これでNiキレート化合物を表面に有するマグネタイト磁
性体粒子の分散液ができる。前記減衰する交番磁界は同一出願人の「特許文献３」に図示
してあるので、ここでは図示しないが、磁気テープのバルクイレーサーやACモータのス
テーター内部の磁界と類似の磁界である。減衰する交番磁界の他の実施例はマグネットを
回転させて回転磁界を造りこれを遠ざけて減衰する交番磁界とすることも出来る。これば
前記請求項１で述べた内容の詳細である。（特許文献３）
【００１２】
この分散液中のマグネタイトの表面に結合されているNiキレート化合物の構造を図１
に示す。
一単位の金属キレート化合物の複数個を接続する為に、金属キレート化合物中の珪素原
子のマグネタイトの表面の酸素原子と結合していない前記第三の結合手に（―O―Si−）
ｍ−O―（ｍ＝整数）で表される結合を介して隣接する同様な構造式を持つ別の一単位の
金属キレート化合物の珪素原子を結合させた。金属キレート化合物は珪素原子を介して複
数個結合された金属キレート化合物になっており、また（―O―Si−）ｍ−O―結合の中の
Siの第三の結合手は酸素を介して磁性体粒子表面の金属原子に結合されていることを特
徴とする、金属キレート化合物になっている。
それに加え前記テトラ・アルコキシシラン即ちテトラ・メトキシシランあるいはテトラ・
エトキシシラン等が加水分解して（―O―Si−）ｍ−O―（ｍ＝整数）結合が出来、前記一
単位の金属キレート化合物が珪素原子を介して複数個結合し、マグネタイト表面に強固に
金属キレート化合物を結合させる為のいわゆる「横方向」の架橋として（―O―Si―）ｍ
−O―結合が寄与し、隣接する複数個の金属キレート化合物中の珪素同士がその基底部で
横方向に（―O―Si−）ｍ−O―結合を介して結合されており、且つ（―O―Si−）ｍ−O
―結合中のSiの第三の結合手は酸素を介して磁性体粒子表面の金属原子に結合されてい
ることを特徴とする、金属キレート化合物を作成した。
ここではテトラ・メトキシシランを用いているので（―O―Si−）ｍ−O―結合中のSi
の第四の結合手には水酸基がついている。
またアルキル・トリ・アルコキシシランを用いることも可能である。この場合は図１の
水酸基（OH基）がアルキル基で置き換わる。
図１は前記請求項４で述べた内容である。
ここで「横方向」の定義は下記の通りである。磁性体粒子表面を下方に見て金属キレー
ト化合物のスペーサーの伸びる方向を「縦方向」と定義した時、隣接する複数個の金属キ
レート化合物中の珪素同士がその基底部で（―O―Si−）ｍ−O―結合を介して結合されて
いる方向を「横方向」と定義する。
磁性体粒子表面B1は、B１の側が磁性体粒子の内部を示す。Siは磁性体粒子表面の珪
素原子を示す。この珪素原子に酸素Oを介してSiで示す珪素原子が結合されSiには上方
に伸びているプロピルエチレンジアミン３酢酸にNiで示すニッケル原子がキレート結合
している。Siを含めた呼称はシリルプロピルエチレンジアミン３酢酸である。この縦の繋
がりをニッケルキレート樹脂の一単位とする。
左方の一単位と右方の一単位が示されているが、各単位の珪素原子Siは（―O―Si−O―）
結合を介して互いに横方向に接続されている。ここでは二単位を示したが複数単位でも同
様である。そして（―O―Si−O―）のSiの第三の結合手は酸素を介して磁性体粒子表面
の珪素原子に結合されている。
しかしアルキル・トリ・アルコキシシラン例えばメチル・トリメトキシシランあるいは
テトラ・アルコキシシランを用いない実施例である図３では図１と事情が異なる。
図３において
プロピルエチレンジアミン３酢酸にNiで示すニッケル原子がキレート結合している部分
は三叉で示してあるが、エチレンジアミン３酢酸はNTAより空間的に広がりを持つので
図１のような（―O―Si−O―）結合を介して互いに横方向に接続しない場合、2個のエチ
レンジアミン３酢酸はあまりにも近接しやすく互いの距離が適当でない。
しかしこれに比べ図１は距離も適当でプロピルエチレンジアミン３酢酸の所要量も少な
くて済み安価で、且つ磁性体粒子表面の珪素原子への結合も確保されている。
【発明の効果】
【００１３】
テトラ・アルコキシシランは加水分解するので、前記N−（トリメトキシ・シリルプロ
ピル）エチレンジアミン３酢酸のトリメトキシの加水分解と共に相働いて、N−（トリメ
トキシ・シリルプロピル）エチレンジアミン３酢酸のトリメトキシ・シリルプロピル部分
が加水分解して、マグネタイト表面の金属原子又はマグネタイト表面に形成したSiO2の
珪素原子と結合し、その後シリルプロピルの隣接する珪素原子同士が（―O―Si−）ｍ−O
―結合し、横方向の架橋となって強固なNiキレート群を形成する。マグネタイトの表面
は鉄原子が直接出ていても、SiO2の膜で覆われていても良い。
【００１４】
また横方向の架橋で強化され、三個のCH2COO基を持つNiキレート樹脂は、His
Tag
融合蛋白質の大量精製に特に向いている。His Tag融合蛋白質の大量精製を磁性体粒子法
で行うときは、磁性体粒子はある程度激しく攪拌されるので磁性体粒子表面のNiキレー
ト樹脂が磁性体粒子表面から剥離しないように強固に磁性体粒子表面に固着されている必
要があり、この点からも（―O―Si−）ｍ−O―結合による横方向の架橋を基底部で行い、
強く磁性体粒子表面に結合されたNiキレート樹脂を有する安価で性能の良い磁性体粒子
はこの目的に適っている。
また高価なAB−NTA樹脂を用いないで三個のCH2COO基を持つNiキレート樹脂を
提供できるので、ポストゲノムの重要な課題である蛋白質の低コスト且つ迅速な捕集精製
に道を開いたことになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
磁性酸化鉄の表面近傍の金属原子に酸素原子を結合させ、前記酸素原子には珪素原子の
第一の結合手を結合させ、前記珪素原子の第二の結合手には（CH2）ｎからなる鎖状炭化
水素（ｎ＝３から１０とする）の一端の炭素原子を結合させ、鎖状炭化水素の他端の炭素
原子にはエチレンジアミン三錯酸の窒素原子のうち、CH2COO基１個に結合している窒
素原子を結合させ、エチレンジアミン三錯酸の三個のCH2COO基には２価金属例えばニ
ッケル又はコバルト原子を配位結合させて一単位の金属キレート化合物としたものにおい
て、前記一単位のNiキレート化合物の複数個を接続する為に、前記珪素原子の少なくと
も第三の結合手に（―O―Si−）ｍ−O―（ｍ＝整数）で表される結合を介して隣接する同
様な構造式を持つ別の一単位のNiキレート化合物の珪素原子を結合させたことを特徴と
し、且つ（―O―Si−）ｍ−O―結合の中のSiの第三の結合手は酸素を介して磁性体粒子
表面の金属原子に結合されていることを特徴とする、珪素原子を介して複数個結合された
金属キレート化合物を製造することが最良の形態である。
ここで（―O―Si−）ｍ−O―結合のｍの値は０以上の整数である。もちろん図３のよう
にｍ＝０の場合でも使用目的によっては充分使用に耐える。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
本発明はポストゲノムの蛋白質の高精製度・低コスト・高速・連続大量捕集精製に道を開
くものである。His Tag融合蛋白質を磁性体粒子から溶出することにより、His
Tag融合
蛋白質を大量捕集精製できる。His Tagの部分は酵素を用いて除去でき、His
Tagのない
蛋白質とすることができる。
また創薬スクリーニングシステムを構築できる。His Tag融合蛋白質を固定したままの
磁性体粒子を例えば生体の腹水の中に分散させたとき、His Tag融合蛋白質を抗原とする
抗体やHis Tag融合蛋白質に特に親和性のある蛋白質、ＤＮＡなどが、His
Tag融合蛋白
質に特異的に吸着してくるので、マグネットを用いて磁性体粒子を回収し、それら抗体、
蛋白質、ＤＮＡ等を溶出することにより精製が出来る。
従来でも磁性体粒子を用いた抗体精製等は試験的に行われていたが、磁性体粒子があま
りにも高価であったため、大量精製には到底用いうるものではなかった。
しかし本発明により安価な磁性体粒子が提供できるので、従来出来なかったHis
Tag融
合蛋白質を抗原とする抗体やHis Tag融合蛋白質に特に親和性のある蛋白質、ＤＮＡの大
量捕集・精製が可能である。
また磁性酸化鉄はその表面をシリカ被覆した又はシリカ被覆しないマグネタイト、ニッ
ケル亜鉛フェライト、マンガン亜鉛フェライトのいずれかであることを特徴とする金属キ
レート樹脂であっても良く、いずれの場合でも磁性体粒子表面の金属原子にN−（トリメ
トキシ・シリルプロピル）エチレンジアミン３酢酸が加水分解して―O―Si−で繋がるこ
とが出来るのは明白である。
また本発明で言うエチレンジアミン三錯酸とは、N−CH2−CH2―Nの左端のNには2
個のCH2COO基が結合し、右端のNには１個のCH2COO基が結合したエチレンジアミ
ン三錯酸である。
【実施例】
【００１７】
まずN−（トリメトキシ・シリルプロピル）エチレンジアミン３酢酸のNa塩の５０％
水溶液を５０μｌ（５０M）用意し、これにテトラ・エトキシシランを少量加える。
これに純水を３ｍｌ加え次に３５％アンモニア水を少量加え、マグネチックスターラで
攪拌する。このビーカーをビーカー１とする。
次に別のフラスコにマグネタイト粒子を０．１ｇ採り、３ｍｌの純水を入れる。それに
界面活性剤Tween２０を１２μｌ入れてマグネチック・スターラーで攪拌する。その後減
衰する交番磁界をかけて磁性体粒子の残留磁化を消磁する。消磁の目的はマグネットを当
てた時、磁性体が残留磁化を持ったままでは、磁性体粒子は互いにクラスターをつくり、
粒子1個1個がほぐれにくいからである。次に超音波をかけてマグネタイトを分散させる。
それにビーカー１の内容物を加え振とう器でシラン化反応を行わせる。
その後マグネットで磁性体粒子を捕集し液部のみを除き、純水でマグネタイト部を1回
洗浄する。それに減衰する交番磁界をかけて磁性体粒子の残留磁化を消磁する。
【００１８】
その後１０ｍMの塩化ニッケルと５ｍMのグリシン（PH=8）水溶液を２０ｍｌを加え
る。振とう器で3時間振とうする。
その後マグネットで磁性体粒子を捕集し液部のみを除き純水でマグネタイト部を1回洗浄
する。それに減衰する交番磁界をかけて磁性体粒子の残留磁化を消磁する。これに１ｍｌ
の純水を加えボトルに移す。これでNiキレート化合物を表面に有するマグネタイト磁性
体粒子の分散液ができる。
【００１９】
一例として大腸菌を用いてβガラクトシダーゼを発現させるときに、遺伝子組み換えの
方法を用いてＣ末端に６個のヒスチジンを付けたHis Tag融合蛋白質を発現させる。
次に大腸菌を超音波で破砕しその上清を採り、これを元ライセートとする。
１ｍｌのエッペンチューブにこのライセート２００μｌを採り、磁性体粒子の分散液２
００μＬを加えピペッティングで攪拌し、溶液を混合した後、室温で２分間インキュベー
トする。
チューブの側壁に３０秒間マグネットを当て、磁性体粒子がマグネットに捕捉されてい
る状態で溶液部をピペットで除去する。そしてマグネットを遠ざける。
次に２０ｍＭのイミダゾールを含むＷash  Buffer1を加えピペッティングで攪拌し、チ
ューブの側壁に３０秒間マグネットを当て、磁性体粒子がマグネットに捕捉されている状
態で溶液部をピペットで除去する。そしてマグネットを遠ざける。
次に２０ｍＭのイミダゾールを含むＷash  Buffer２を加えピペッティングで攪拌し、
チューブの側壁に３０秒間マグネットを当て、磁性体粒子がマグネットに捕捉されている
状態で溶液部をピペットで除去する。そしてマグネットを遠ざける。
さらに４０ｍＭのイミダゾールを含むＷash  Buffer３を加えピペッティングで攪拌し、
チューブの側壁に３０秒間マグネットを当て、磁性体粒子がマグネットに捕捉されている
状態で溶液部をピペットで除去する。そしてマグネットを遠ざける。
最後に３００ｍＭのイミダゾールを含むElution Bufferを加えピペッティングで攪拌し、
チューブの側壁に３０秒間マグネットを当て、磁性体粒子がマグネットに捕捉されている
状態で溶液部をピペットで吸引し別のチューブに取分けると、このチューブにHis
Tag融
合蛋白質が捕集されている（図２のＥ１）。Elutionはもう一回行った（図２のＥ２）。
【００２０】
捕集されたHis Tag融合蛋白質をＳＤＳ  ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動）にかける。
【００２１】
その結果を図２に示す。
図中左に示してあるバンドは外国他社の高価なNiアガロース・マグネタイト磁性体粒
子を用いて精製したもので、バンドの濃さは薄く収量は少ないことを示している。
図中右に示してあるバンドは、本発明の磁性体粒子を用いて精製したもので。
バンドの濃さは濃く収量が多いことを示している。Ｅ１は第一回目のElution画分、Ｅ２
とは第二回目のElution画分を示す。図中右に示してあるバンドはＥ２でもまだHis
Tag
融合蛋白質がElutionできており、この点からもHis Tag融合蛋白質の捕集能力が大きい
ことを示している。
また通常His Tag融合蛋白質のバンドの濃さが濃くなるに従って非特異的な吸着のバン
ドも濃くなるのが通例であるが、  図中右に示してあるバンドはHis Tag融合蛋白質のバ
ンドが濃いにもかかわらず、非特異的な吸着のバンドは見えない。
【００２２】
本実験は本発明のＮｉキレート樹脂でHis Tag融合蛋白質を捕集・精製する際、蛋白質
の末端に存在する６個のヒスチジンタグをきわめて選択的に吸着できることを示している。
また特許文献２で言及されている非特許文献１に示すＮ，Ｎ，Ｎ−エチレンジアミン三
酢酸の欠点であるHis Tag融合蛋白質の捕集能力の少なさという難点が、本発明のＮｉキ
レート樹脂を有する磁性体粒子では解決されていることを示している。
【特許文献１】Porah,  Nature258,598-599,(1975)
【特許文献２】特開平８−９９９４４
【非特許文献１】Haner.M,  Anal.Biochem,138,229-234(1984)
【特許文献３】特願２００３−３６７６３７  「生体構成物質の分離」
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】磁性体粒子表面B1は、B１の側が磁性体粒子の内部を示す。Siは磁性体粒子表面の珪素原子を示す。この珪素原子に酸素Oを介してSiで示す珪素原子が結合されSiには上方に伸びているプロピルエチレンジアミン３酢酸にNiで示すニッケル原子がキレート結合している。Siを含めた呼称はシリルプロピルエチレンジアミン３酢酸である。この縦の繋がりをニッケルキレート樹脂の一単位とする。左方の一単位と右方の一単位が示されているが、各単位の珪素原子Siは（―O―Si−O―）結合を介して互いに横方向に接続されている。ここでは二単位を示したが複数単位でも同様である。そして（―O―Si−O―）のSiの第三の結合手は酸素を介して磁性体粒子表面の珪素原子に結合されている。
【図２】図中左に示してあるバンドは外国他社の高価な磁性体粒子を用いて精製したものでバンドの濃さは薄く収量は少ない。図中右に示してあるバンドは、本発明の磁性体粒子を用いて精製したもので、バンドの濃さは濃く収量が多い。Ｅ１は第一回目のElution、Ｅ２とは第二回目のElutionを示す。図中右に示してあるバンドはＥ２でもまだHis Tag融合蛋白質がElutionできており、この点からもHis Tag融合蛋白質の捕集能力が大きいことを示している。
【図３】磁性体粒子表面B1は、B１の側が磁性体粒子の内部を示す。Siは磁性体粒子表面の珪素原子を示す。この珪素原子に酸素Oを介してSiで示す珪素原子が結合されSiには上方に伸びているプロピルエチレンジアミン３酢酸にNiで示すニッケル原子がキレート結合している。Siを含めた呼称はシリルプロピルエチレンジアミン３酢酸である。この縦の繋がりをニッケルキレート樹脂の一単位とする。プロピルエチレンジアミン３酢酸にNiで示すニッケル原子がキレート結合している部分は三叉で示してあるが、エチレンジアミン３酢酸はNTAより空間的に広がりを持つので図１のような（―O―Si−O―）結合を介して互いに横方向に接続しない場合、2個のエチレンジアミン３酢酸はあまりにも近接しやすく互いの距離が適当でない。
【符号の説明】
【００２４】
B1；磁性体粒子の表面を示し、B1の側が磁性体粒子内部を示す。
Ni；ニッケル原子。
Si；珪素原子。
O；酸素原子。
OH；水酸基。
Siの上方に伸びているジグザグ線と三叉線；プロピルエチレンジアミン３酢酸を示す。
【図１】
2006334562.tif 000003
【図２】
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【図３】
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