(57)【要約】【課題】  短時間に環境微生物の群集構造を低コストで分析可能なＴ−ＲＦＬＰ法を提供すること。【解決手段】  サンプルを採取する採取行程Ｓ１と、採取された微生物の集合について、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子を、５’末端側にはある色の蛍光ラベルをもちいたプライマーにより、３’末端側には前記蛍光ラベルとは異なる色の蛍光ラベルをもちいたプライマーにより増幅する増幅工程Ｓ３と、増幅された産物の前記５’末端側と３’末端側との間に挟まれた配列の少なくとも二カ所を制限酵素により切断する切断行程Ｓ４と、切断された配列の長さを蛍光ＤＮＡシーケンサにより測定する測定行程Ｓ５と、測定行程で測定された５’末端側の切断断片サイズと３’末端側の配列の切断断片サイズとに基づいて、サンプル中の微生物の種ないし属を決定（同定）する微生物種同定行程Ｓ６と、を含んだことを特徴とする。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境微生物を評価するＴ−ＲＦＬＰ法であって、
サンプルを採取する採取行程と、
採取行程により採取された微生物の集合について、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の一部を、５’末端側にはある色の蛍光ラベルをもちいたプライマーにより、３’末端側には前記蛍光ラベルとは異なる色の蛍光ラベルをもちいたプライマーにより順方向と逆方向に増幅する増幅工程と、
増幅された産物を制限酵素により切断する切断行程と、
切断されたＤＮＡ断片のサイズを蛍光ＤＮＡシーケンサにより測定する測定行程と、
測定行程で測定された５’末端側のＤＮＡ断片サイズと３’末端側のＤＮＡ断片サイズとに基づいて、サンプル中の微生物種を粗くても属レベルで同定する微生物種同定行程と、
を含んだことを特徴とするＴ−ＲＦＬＰ法。
【請求項２】
微生物の量を、微生物種同定行程により同定された属ないし種毎に、蛍光ピークに基づいて評価する微生物量評価行程を含んだことを特徴とする請求項１に記載のＴ−ＲＦＬＰ法。
【請求項３】
プライマーによって１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の増幅範囲を、ＰＣＲ増幅効率が低下しない程度の長さとなる所定の保存領域の組合せとすることを特徴とする請求項１または２に記載のＴ−ＲＦＬＰ法。
【請求項４】
制限酵素を４塩基認識制限酵素としたことを特徴とする請求項１、２または３に記載のＴ−ＲＦＬＰ法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一つのＴ−ＲＦＬＰ法に使用するデータベースであって、環境微生物の１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の増幅片が制限酵素によって切断された場合の蛍光ラベルのついた５’末端側ＤＮＡ断片サイズと蛍光ラベルのついた３’末端側ＤＮＡ断片サイズとを組として、環境微生物の種ないし属毎に記憶したことを特徴とするデータベース。
【請求項６】
微生物を利用して、廃水処理、土壌浄化、食品廃棄物処理、その他の環境保全処理ないし環境改善処理をおこなうに際し、請求項１〜４のいずれか一つに記載のＴ−ＲＦＬＰ法をもちいて当該環境中に多く存在する微生物をつきとめ、当該環境中に当該微生物を更に投入し、または、当該環境中における当該微生物の増殖を促進させる条件を整え、分解処理を促進することを特徴とする環境改善処理方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一つに記載のＴ−ＲＦＬＰ法をもちいて体内微生物を評価することを特徴とする体内微生物評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ−ＲＦＬＰ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法に関し、特に、土中や海中など、わずかな体積の中に多数種の微生物がそれぞれ大量に存在する環境下において、その微生物群集構造を簡便に評価するＴ−ＲＦＬＰ法およびその関連技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
土中や水中など、自然界における微生物群は多様であり、また、各微生物の数も著しく多い。従来では、このような自然環境中に多種大量に存在する微生物、いわゆる環境微生物について、どのような種類がどの程度存在しているか、といった分析をおこなう場合、たとえば、培養によって評価する方法が採用されていた。しかしながら、培養をもちいる手法では、増殖に時間がかかるという問題点と、増殖する環境に依存して微生物が選択されたり、どのような割合で実際に存在していたかが不明となったりするなど、把握が困難であるという問題点があった。
【０００３】
このような問題点を打開する方法として、近年、Ｔ−ＲＦＬＰ法やＤＧＧＥ（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法といった分子生物学的手法が開発された。これは、ＰＣＲによって増幅した特定遺伝子断片に基づいて生物群を評価する方法である。ここで、ＤＧＧＥ法ではＧＣクランプがついたプライマーをもちいるため、アニーリング温度の違いによる増幅効率の差が出てしまうといった解像度や再現性に問題があり、相対的な評価しかできないという問題点があった。一方、Ｔ−ＲＦＬＰ法では、一度に連続した大量のサンプルの群集モニタリングが確実にできるといった利点があった。
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−８１７６号公報
【特許文献２】特開２００３−２６５１９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の技術では以下の問題点があった。
すなわち、従来のＴ−ＲＦＬＰ法では、制限酵素による塩基配列の切断長が等しくなってしまう微生物は分別できないため、複数種類の制限酵素をもちいた多角的な同定作業が必要であり冗長な作業を要し時間と分析コストがかかるという問題点があった。
【０００６】
本発明は上記に鑑みてなされたものであって、短時間に環境微生物の群集構造を低コストで分析可能なＴ−ＲＦＬＰ法を提供することを目的とする。
【０００７】
また、微生物をもちいた効率的な環境保全処理ないし環境改善処理をおこなう方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載のＴ−ＲＦＬＰ法は、環境微生物を評価するＴ−ＲＦＬＰ法であって、サンプルを採取する採取行程と、採取行程により採取された微生物の集合について、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の一部を、５’末端側にはある色の蛍光ラベルをもちいたプライマーにより、３’末端側には前記蛍光ラベルとは異なる色の蛍光ラベルをもちいたプライマーにより順方向と逆方向に増幅する増幅工程と、増幅された産物を制限酵素により切断する切断行程と、切断されたＤＮＡ断片のサイズを蛍光ＤＮＡシーケンサにより測定する測定行程と、測定行程で測定された５’末端側のＤＮＡ断片サイズと３’末端側のＤＮＡ断片サイズとに基づいて、サンプル中の微生物種を粗くても属レベルで同定する微生物種同定行程と、を含んだことを特徴とする。
【０００９】
すなわち、請求項１にかかる発明は、順方向と逆方向からの二つの切断断片サイズにより、一回のＰＣＲと一回のシーケンサ解析によって、微生物を細かく分別可能となる。これにより、短時間に環境微生物の群集構造を低コストで分析可能なＴ−ＲＦＬＰ法を提供可能となる。なお、「５’末端側・・・プライマー」とはいわゆるフォワードプライマーをいい、「３’末端側・・・プライマー」とはいわゆるリバースプライマーをいう。
【００１０】
また、請求項２に記載のＴ−ＲＦＬＰ法は、請求項１に記載のＴ−ＲＦＬＰ法において、微生物の量を、微生物種同定行程により同定された属ないし種毎に、蛍光ピークに基づいて評価する微生物量評価行程を含んだことを特徴とする。
【００１１】
すなわち、請求項２にかかる発明は、どのような微生物がどの程度存在するかを把握可能とする。請求項２にかかる発明によれば、微生物種の量的関係、たとえば優占種を、微生物同定行程により同定された属ないし種毎に、蛍光ピークに基づいて評価可能となる。なお、評価に際してはピークを描く曲線の面積をもちいても良い。
【００１２】
また、請求項３に記載のＴ−ＲＦＬＰ法は、請求項１または請求項２に記載のＴ−ＲＦＬＰ法において、プライマーによって１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の増幅範囲を、ＰＣＲ増幅効率が低下しない程度の長さとなる所定の保存領域の組合せとすることを特徴とする請求項１または２に記載のＴ−ＲＦＬＰ法。
【００１３】
すなわち、請求項３にかかる発明は、ほぼすべての原核生物に適用可能なプライマーをもちいて、４００〜６００塩基の配列断片を効率的に増幅可能とする。このような組合せとしては、たとえば、５’末端側からみて３４１番目（番号は大腸菌の１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子に基づく、ＧＥＮＢＡＮＫ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｖ００３４８によるものである）からと９０７番目からの配列や、９６８番目からと１３７８番目からの配列を挙げることができる。
【００１４】
また、請求項４に記載のＴ−ＲＦＬＰ法は、請求項１、２または３に記載のＴ−ＲＦＬＰ法において、制限酵素を４塩基認識制限酵素としたことを特徴とする。
【００１５】
すなわち、請求項４にかかる発明は、確率的に２５６塩基配列長に一カ所の割合で配列を切断するので、ＰＣＲ増幅効率の落ちない４００〜６００の塩基配列に対して２ないし３カ所程度切断し、順方向側の切断断片サイズと、逆方向側の切断断片サイズを効率的に検出可能とする。特に、複数箇所の切断であれば、１カ所の切断である場合より、微生物の同定効率が向上することとなる。
【００１６】
また、請求項５に記載のデータベースは、請求項１〜４のいずれか一つのＴ−ＲＦＬＰ法に使用するデータベースであって、環境微生物の１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の増幅片が制限酵素によって切断された場合の蛍光ラベルのついた５’末端側からの長さと蛍光ラベルのついた３’末端側からの長さとを組として、環境微生物の種ないし属毎に記憶したことを特徴とする。
【００１７】
すなわち、請求項５にかかる発明は、効率的なソート、または、属ないし種の候補の出力を実現する。
【００１８】
また、請求項６に記載の環境改善処理方法は、微生物を利用して、廃水処理、土壌浄化、食品廃棄物処理、その他の環境保全処理ないし環境改善処理をおこなうに際し、請求項１〜４のいずれか一つに記載のＴ−ＲＦＬＰ法をもちいて当該環境中に多く存在する微生物をつきとめ、当該環境中に当該微生物を更に投入し、または、当該環境中における当該微生物の増殖を促進させる条件を整え、分解処理を促進することを特徴とする。
【００１９】
すなわち、請求項６にかかる発明は、処理環境に適した微生物をもちいて廃水処理、土壌浄化、食品廃棄物処理などを効率的におこなう。
【００２０】
また、請求項７に記載の体内微生物評価方法は、請求項１〜４のいずれか一つに記載のＴ−ＲＦＬＰ法をもちいて体内微生物を評価することを特徴とする。
【００２１】
請求項７にかかる発明によれば、たとえば、腸内フローラ、口腔フローラなどの医薬品や健康食品等の開発における製品評価（摂取前後の優先種の種別および量の変化に基づく健康状態評価）や、病院・老人ホーム等の食事療法をおこなう際の健康状態の把握が可能となる。
【発明の効果】
【００２２】
以上説明したように、本発明（請求項１〜４）によれば、短時間に環境微生物の群集構造を低コストで分析可能なＴ−ＲＦＬＰ法を提供することが可能となる。また、本発明（請求項６）によれば、微生物をもちいた効率的な環境保全処理ないし環境改善処理をおこなう方法を提供可能となる。また、本発明（請求項７）によれば、微生物をもちいた効率的な健康状態の評価が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の実施例を図面を参照しながら詳細に説明する。
ここでは、多段土壌層中の土をサンプリングし、その微生物群集を実際にモニタリングした方法を説明する。図１は、多段土壌層の構成例を示した仮想断面図である。図示したように、多段土壌層とは、土壌層と通水層（ゼオライトを主成分とするなど水が通りやすい層）とを積層させたものであって、汚水が土場層下部に浸透していく間に浄化されるようにしたものである。
【００２４】
図２は、本実施例の処理流れを示したフローチャートである。
まず、調べたい土を採取した（ステップＳ１）。多段土壌層の位置によって活性な微生物が異なる場合も想定されるので、複数箇所採取しても良い。採取する土の量は、０．５ｇで十分である。
【００２５】
次いで、この試料から公知の方法によりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲグレードまで精製した（ステップＳ２）。ＤＮＡの抽出・精製法は種々採用でき、たとえば、リゾチームとＳＤＳ、プロテアーゼなどを加え、フェノール・クロロホルムで精製する方法が挙げられる。
【００２６】
次に、両端に異なる蛍光ラベルを付したプライマーにより１６Ｓ−ｒＤＮＡ遺伝子を増幅した（ステップＳ３）。具体的には、５’末端側からはＦＡＭで蛍光ラベルしたフォワードプライマーにより順方向に（５’側から３’側へ）、３’末端側からはＨＥＸで蛍光ラベルしたリバースプライマーにより逆方向に（３’側から５’側へ）、ＤＮＡを増幅した。
【００２７】
ここで、プライマーとしては、ほぼすべての原核生物に適用可能な３４１Ｆ／９０７Ｒ部分を増幅するプライマーをデザインした。３４１Ｆについてのフォワードプライマーの配列を配列表１に示す。９０７Ｒについてのリバースプライマーの配列を配列表２に示す。
【００２８】
ＰＣＲの増幅に関しては、たとえば、変性温度を９４℃として５分間維持し、その後、９４℃１分→５５℃１分→７２℃１分というサイクルを単位として３０サイクル行い、その後７２℃を５分維持することによって実現できる。
【００２９】
続いて、ＰＣＲ産物を、４塩基認識制限酵素であるＭｓｐＩによって切断し（ステップＳ４）、これをキャピラリーＤＮＡシーケンサに通し、切断された配列の長さを決定した（ステップＳ５）。キャピラリーＤＮＡシーケンサとしては、アプライドバイオシステムズ社製ＰＲＩＳＭ３１００−Ａｖａｎｔをもちい、キャピラリーは５０ｃｍとした。また、切断された配列の長さは、同社のＧｅｎｅ  ｓｃａｎソフトウェアをもちいた。
【００３０】
なお、ＭｓｐＩは、配列ＣＣＧＧを認識し、ランダムな塩基列であれば確率的に２５６組に一組の割合でＣＣＧＧという配列が出現する（すなわち切断できる配列が出現する）が、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子データベースの解析をした結果、この増幅領域でのＭｓｐＩの平均切断箇所は３．８２であった。したがって、３４１Ｆ／９０７Ｒが複数箇所切断される微生物が多く存在し、次に説明する順方向と逆方向との二つのサイズにより微生物の属ないし種の絞込みを効率的におこなうことができることとなる。
【００３１】
図３は、ＤＮＡシーケンサによる切断断片サイズを示した結果である。図４は、切断長と蛍光ピークのエリアの関係を示した表である。ここで、切断箇所が微生物種の属レベルで異なることに着目し、ＦＡＭで蛍光ラベルをした順方向側からの切断断片サイズと、ＨＥＸで蛍光ラベルした逆方向側からの切断断片サイズの二つの切断断片サイズにより、属を特定した（ステップＳ６）。
【００３２】
属の特定に際しては、あらかじめ構築してあるデータベースをもちいた。具体的には、制限酵素の種別と、その制限酵素をもちいた場合の順方向の切断断片サイズと逆方向の切断断片サイズと、その微生物の属ないし種とを対応させたデータベースである。このようなデータベースは、公共ＤＮＡデータベースであるＧｅｎｂａｎｋ（米国）、ＥＭＢＬ（ＥＵ）、ＤＤＢＪ（日本）に登録されている原核生物の１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子であって、もちいるプライマーにしたがって増幅可能な領域（この場合は、３４１Ｆ〜９０７Ｒ）を含み、かつ、微生物種の少なくとも属名が同定されているものから構築できる。なお、データベースによっては重複（同一）遺伝子が存在するので、それを削除して検索の効率性を高めたものを使用することが好ましい。
【００３３】
図５は、ＤＮＡシーケンサによる切断断片サイズと蛍光強度との結果に基づき、蛍光強度が１００以上のピークについて、順方向側からの切断断片サイズと、逆方向側からの切断断片サイズとをいずれかを有する微生物名（全２９６種）を示したものである。図中、順方向で蛍光強度が強かったシグナル、すなわち、図４のＳｉｚｅに示した１０２．１９，１３６．８８，１６１．７２，１６２．８４に対応する正鎖長（それぞれ、１０２，１３７，１６２，１６３として処理）の背景を灰色で示している。同様に、逆方向で蛍光強度が強かったシグナル、すなわち、図４のＳｉｚｅおよび図３に示した２４５．１８，２４６．０７，３１０．２４，３１１．９７，４２０．２５に対応する逆鎖長（それぞれ、２４５、２４６，３１０，３１２，４２０として処理）の背景を灰色で示している。そして、両方向とも該当するものについては、微生物名の背景を灰色で示している。
【００３４】
ここで比較のデータとして、図６を示す。図６は、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の３４１Ｆ／９０７Ｒ部分をＭｓｐＩで切断した場合に、順方向の切断長が１０２，１３７，１６２，１６３である微生物の候補数と、逆方向の切断長が２４５、２４６，３１０，３１２，４２０である微生物の候補数と、順方向逆方向いずれかが該当する微生物の候補数と、蛍光レベルがしきい値以上であって順方向逆方向いずれもが該当する微生物の候補数と、を示した図である。
【００３５】
図示したように、順方向では４０６属４４２５種が、逆方向では３６７属２６４３種が、正逆両方向では１９９属２９６種が、しきい値（蛍光強度１００）以上を考慮した場合では１５３属２１２種が該当する。種で考えると、順方向または逆方向のいずれか一方で生物種を特定しようとした場合、数千種類の候補が挙げられるものの、本発明によれば２１２種まで候補が絞られていることが分かる。すなわち、従来のＴ−ＲＦＬＰ法では、数千種類といった非常に多くの候補種までしか絞り込めないところ、本発明によれば、数百種類の候補種まで絞り込めることが確認できた。
【００３６】
本実施例に関しては、多段土壌中に多く存在する微生物種が属レベルで特定できればよいので、所定のしきい値により蛍光ピークが一定以上のものを評価すればよく、図６から明らかなように、蛍光強度を考慮することにより属ないし種の絞込ができるが、評価に要求される精度に応じて、別の制限酵素をもちいて同様の方法を採用してさらなる絞込みを行ってもよい。なお、このとき、蛍光ピークの大きさでなく、ピークエリアによってしきい値を設定するようにしても良い。
【００３７】
以上の手法によれば、一回のＰＣＲ増幅と一回の蛍光ＤＮＡシーケンサ操作（もしくは、必要に応じて数回のＰＣＲ増幅と一回の蛍光ＤＮＡシーケンサ操作）により大まかな微生物の属ないし種、および、その群集構造が評価可能となるので、簡便、短時間、かつ低コストで多段土壌層中の微生物のモニタリングが可能となる。
【００３８】
多段土壌層中では、汚水の化学成分を栄養分とする微生物が活性化し、その数が多くなる。したがって、多段土場層中で活性度の高い微生物を上記手法によってモニタリングして優占種を決定し、その微生物を更に投入したり、温度、ｐＨなどを調整するなど更に活性度を高くする方策をとるなどしたりすれば、浄化が促進されることとなる。
【００３９】
なお、以上の例は、１６Ｓ−ｒＤＮＡの３４１Ｆ／９０７Ｒをもちいたが、この他、これと同様にほぼすべての原核生物に適用可能な９６８Ｆ／１３７８Ｒの部位を増幅可能なプライマーをもちいることができる。９６８Ｆについてのフォワードプライマーの配列を配列表３に示す。１３７８Ｒについてのリバースプライマーの配列を配列表４に示す。
【００４０】
また、採用しうる制限酵素の他の例としては、特に、ＭａｅＩＩ（ＡＣＧＴ）、ＭｂｏＩ（ＧＡＴＣ）、ＣｖｉＲＩ（ＴＧＣＡ）、ＸｓｐＩ（ＣＴＡＧ）、ＴａｑＩ（ＴＣＧＡ）、ＨｈａＩ（ＧＣＧＣ）、ＮｌａＩＩＩ（ＣＡＴＧ）は高い有効性が期待できる。
【００４１】
なお、蛍光ＤＮＡシーケンサをもちいた場合、整数として切断長が出ない場合が多い。実際、図４に示した例でも、５２．７２といった小数を伴う場合がある。したがって、切断長から微生物の候補を挙げる場合には、前後の切断長となる微生物種も候補に挙げる態様であっても良い。
【００４２】
また、本発明は、本実施例に挙げた多段土壌層への適用に限らず、河川、湖沼、海、地下水等の自然水中の微生物群の評価にも応用可能であり、微生物を含む試料が採取可能であれば特に限定されるものではない。たとえば、工業用水の評価ないし分解、防腐処理プロセスの評価、ヒトまたは動物の腸内微生物の評価ないし有用微生物の増殖、口腔微生物または皮膚微生物の評価、植物付着微生物の評価、病院等の建物内の大気中の微生物の評価、空調機器への付着微生物の評価、コンポスト等の固形物処理微生物の評価ないし増殖、発酵プロセス中の微生物群の評価などへ適用可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
以上は原核生物の例を示したが、たとえば、昆虫などに関しては１８Ｓ−ｒＤＮＡなどのＳＳＵ  ｒＲＮＡ遺伝子をもちいればよい。このような特異なｒＤＮＡをもちいることにより、古代の地層や化石を分子生物学的観点から評価可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】多段土壌層の構成例を示した仮想的な断面斜視図である。
【図２】本実施例の処理流れを示したフローチャートである。
【図３】ＤＮＡシーケンサによる切断断片サイズを示した結果である。
【図４】切断長と蛍光ピークのエリアの関係を示した表である。
【図５】ＤＮＡシーケンサによる切断断片サイズと蛍光強度との結果に基づき、蛍光強度が１００以上のピークについて、順方向側からの切断断片サイズと、逆方向側からの切断断片サイズとをいずれも有する微生物名（全２９６種）を示した表である。各図中、各行では左から順に、通し番号、細菌名、正鎖長、逆鎖長を示す。
【図６】１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の３４１Ｆ／９０７Ｒ部分をＭｓｐＩで切断した場合に、順方向の切断長が１０２，１３７，１６２，１６３である微生物の候補数と、逆方向の切断長が２４５、２４６，３１０，３１２，４２０である微生物の候補数と、順方向逆方向いずれかが該当する微生物の候補数と、蛍光レベルがしきい値以上であって順方向逆方向いずれもが該当する微生物の候補数と、を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図６】
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【配列表】
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