(57)【要約】【課題】  プレート等に核酸を添加したのちに核酸導入試薬や添加剤を添加することなく、そこに細胞を播種、培養するだけで該細胞に核酸を導入し、発現させることができる核酸導入用マイクロアレイを提供することを課題とする。【解決手段】  アテロコラーゲン、遺伝子導入剤および核酸をプレート等に備えた核酸導入用マイクロアレイを調製することによる。該マイクロアレイに核酸導入用細胞を播種し、培養することで、細胞培養後にウイルスベクターや核酸と核酸導入剤の混合物を調製する必要なく、または核酸導入剤や添加剤の添加の必要なく核酸を細胞に導入することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテロコラーゲン、核酸導入剤および核酸を備えた核酸導入用セルトランスフェクションアレイ。
【請求項２】
アテロコラーゲンを細胞毒性を軽減しうる量備える請求項１に記載の細胞導入用セルトランスフェクションアレイ。
【請求項３】
核酸導入剤が、リポソーム若しくは非リポソーム系脂質、ウイルスベクター、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウムまたはデンドリマーから選択されるいずれかである請求項１または２に記載のセルトランスフェクションアレイ。
【請求項４】
核酸導入剤が、リポソームである請求項１〜３のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイ。
【請求項５】
核酸が、プラスミドＤＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、リボザイムまたはｓｉＲＮＡである請求項１〜４のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイの調製方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイ調製用キット。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイを使用する細胞への核酸導入方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイに、細胞を播種することを特徴とする細胞への核酸導入方法。
【請求項１０】
アテロコラーゲン、核酸導入剤および核酸を備えた核酸導入用セルトランスフェクションアレイを調製する工程と、該セルトランスフェクションアレイに細胞を播種する工程を含む細胞への核酸導入方法。
【請求項１１】
請求項１０の核酸導入方法において、アテロコラーゲンを細胞毒性を軽減しうる量備えることを含む核酸導入用セルトランスフェクションアレイを調製する工程と、該セルトランスフェクションアレイに細胞を播種する工程を含む細胞への核酸導入方法。
【請求項１２】
核酸導入剤が、リポソーム若しくは非リポソーム系脂質、ウイルスベクター、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウムまたはデンドリマーから選択されるいずれかである請求項１０または１１に記載の核酸導入方法。
【請求項１３】
核酸導入剤が、リポソームである請求項１２に記載の核酸導入方法。
【請求項１４】
核酸が、プラスミドＤＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、リボザイムまたはｓｉＲＮＡである請求項１０〜１３のいずれか１に記載の核酸導入方法。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイを含む核酸導入用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な核酸導入用セルトランスフェクションアレイに関する。より詳細には、コラーゲンを用いた核酸導入用セルトランスフェクションアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子研究の手法のひとつである宿主となりうる細胞への核酸の導入（トランスフェクション）は、遺伝子の機能を解析するための有用な方法である。具体的にはプラスミドＤＮＡ，ウイルスベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡなどを細胞に導入し、遺伝子発現後の細胞機能の変化、あるいは遺伝子の発現抑制による細胞機能の変化を観察することが行われる。すでに様々な種のゲノムが解読され、遺伝子研究においてはその遺伝子の機能を細胞レベルで解析する技術がおおいに注目されている。近年のマルチイメージングアナライザーやプレートリーダー等の細胞機能解析装置の発達によって、マルチウェルプレートで培養した多検体の細胞の機能を短時間に解析することができるようになり、核酸のトランスフェクションと細胞機能解析装置を組み合わせた細胞レベルでの遺伝子機能解析は、その重要性を増している。
【０００３】
しかし、従来の核酸の導入は、培養容器に細胞を播種、培養後に導入を目的とする核酸を組み込んだウイルスベクターを感染させる、あるいは核酸を導入剤と混合して培地に加えることにより行われており、そのつどウイルスベクターや核酸と導入剤の混合物を調製する必要があり煩雑で、特に多種多検体の核酸を導入する場合は大変な労力を要する。またそれらの方法は、ウイルスや導入剤の細胞毒性のために、細胞増殖、アポトーシス等のアッセイの際の障害となり、正確に細胞機能を判定できないという問題があった。
【０００４】
そこでスライドグラスにあらかじめ遺伝子を備え、使用時に導入剤の添加、細胞の播種を行うトランスフェクション方法が開発されている（非特許文献１）。
【０００５】
また、アテロコラーゲンと核酸を混合したものをプレコーティングしたプレートによるセルトランスフェクションアレイを使用して遺伝子発現の促進あるいは抑制による細胞機能の変化から、遺伝子をスクリーニングする方法についての報告がある（非特許文献２、特許文献１）。
【非特許文献１】Nature 411, 107, 2001
【非特許文献２】Biochemical and Biophysical Research Communications 289, 1075-1081(2001)
【特許文献１】国際公開WO 03/000297号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、細胞に遺伝子を導入するに際し、所望の核酸を備えた固相に細胞を播種し培養するだけで、該細胞に核酸を導入し、効果的に発現させることができる核酸導入用セルトランスフェクションアレイを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、細胞の培養前に、固相にコラーゲン、核酸導入剤および所望の核酸を備えたセルトランスフェクションアレイを利用することにより、細胞の培養後にウイルスベクターや核酸、核酸導入剤等を該培養細胞に加える必要なく細胞に核酸を導入しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、以下よりなる。
１．アテロコラーゲン、核酸導入剤および核酸を備えた核酸導入用セルトランスフェクションアレイ。
２．アテロコラーゲンを細胞毒性を軽減しうる量備える前項１に記載の細胞導入用セルトランスフェクションアレイ。
３．核酸導入剤が、リポソーム若しくは非リポソーム系脂質、ウイルスベクター、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウムまたはデンドリマーから選択されるいずれかである前項１または２に記載のセルトランスフェクションアレイ。
４．核酸導入剤が、リポソームである前項１〜３のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイ。
５．核酸が、プラスミドＤＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、リボザイムまたはｓｉＲＮＡである前項１〜４のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイ。
６．前項１〜５のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイの調製方法。
７．前項１〜５のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイ調製用キット。
８．前項１〜５のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイを使用する細胞への核酸導入方法。
９．前項１〜５のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイに、細胞を播種することを特徴とする細胞への核酸導入方法。
１０．アテロコラーゲン、核酸導入剤および核酸を備えた核酸導入用セルトランスフェクションアレイを調製する工程と、該セルトランスフェクションアレイに細胞を播種する工程を含む細胞への核酸導入方法。
１１．前項１０の核酸導入方法において、アテロコラーゲンを細胞毒性を軽減しうる量備えることを含む核酸導入用セルトランスフェクションアレイを調製する工程と、該セルトランスフェクションアレイに細胞を播種する工程を含む細胞への核酸導入方法。
１２．核酸導入剤が、リポソーム若しくは非リポソーム系脂質、ウイルスベクター、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウムまたはデンドリマーから選択されるいずれかである前項１０または１１に記載の核酸導入方法。
１３．核酸導入剤が、リポソームである前項１２に記載の核酸導入方法。
１４．核酸が、プラスミドＤＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、リボザイムまたはｓｉＲＮＡである前項１０〜１３のいずれか１に記載の核酸導入方法。
１５．前項１〜５のいずれか１に記載のセルトランスフェクションアレイを含む核酸導入用キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、核酸導入効率、適当な核酸導入、細胞毒性の軽減された状態で遺伝子の長期発現が実現され、さらには核酸を導入可能な状態で、核酸導入用セルトランスフェクションアレイを長期保存することができる。また、本発明の核酸導入用セルトランスフェクションアレイ（以下単に「セルトランスフェクションアレイ」ともいう。）は、異なる核酸ごとに培養環境が区別されているため、例えば異なる核酸の導入による細胞の分泌物の変化を、各培養液を回収して調べるというような細胞外環境を評価することも可能となる。さらに、汎用されている培養用マルチウェルプレートをセルトランスフェクションアレイの基材とすることができるため、既存の細胞機能解析用試薬や細胞機能解析装置に適用できるという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のセルトランスフェクションアレイに備えられ、細胞に導入されうる核酸は、その種類に制限はなく、具体的にはプラスミドＤＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、リボザイム、短い干渉ＲＮＡ（small interferring ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）等のいかなる核酸であっても使用することができ、一本鎖、二本鎖およびこれら類縁体のいずれでも良い。
【００１１】
本発明に使用する核酸が、二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡである場合には、直鎖状または環状のいずれの形態であっても良い。また所望の配列を有する核酸は、ベクターに組み込まれた状態でも良く、プラスミドの形態であっても良い。当該プラスミドは、発現プラスミドまたは非発現プラスミドであっても良い。
【００１２】
本発明に使用する核酸がオリゴヌクレオチドである場合、導入するオリゴヌクレオチドの種類に制限はなく、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、またはこれらの類縁体のいずれも用いることができる。具体的には、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド、2-O（2-メトキシ）エチル−修飾核酸（2'-MOE-修飾核酸）、ｓｉＲＮＡ、架橋型核酸（Locked Nucleic Acid:LNA; Singh, et al., Chem. Commun., 455(1998)）、ペプチド核酸（Peptide Nucleic Acid:PNA; Nielsen, et al., Science, 254, 1497,1991）またはモルフォリノ・アンチセンス核酸（Morpholino antisense; Sumerton and Weller, Antisense & Nucleic Acid Drug Development, 7, 187, 1997）などを挙げることができる。
【００１３】
本発明に使用される核酸導入剤は、自体公知のものを使用することができ、具体的にはリポソーム、非リポソーム系脂質、ウイルスベクター、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム、デンドリマー等を挙げることができ、好ましくはリポソームであり、より好ましくはカチオン性リポソームを使用することができる。
【００１４】
核酸導入剤の使用量は、コラーゲン使用量との関係で適宜選択することができる。具体的には、核酸導入剤溶液の濃度は0.01ng/mL〜100ng/mL、好ましくは0.1ng/mL〜50ng/mLの範囲の何れかで使用することができる。例えば市販のものであれば核酸導入剤の使用取り扱い説明書等に記載の量の1/1〜1/100の量の範囲で使用することができ、好ましくは1/2〜1/50の範囲で使用することができる。
【００１５】
本発明に使用されるコラーゲンは、アテロコラーゲンが好適であり、その種類、由来、型等特に制限はない。種類としては酵素可溶化コラーゲン（アテロコラーゲン）及びその修飾物を挙げることができる。修飾物としては、側鎖アミノ基、カルボキシル基の化学修飾、あるいは化学的・物理的架橋物を用いることができる。また、由来として、ウシ、ブタ、ウマ、ヒト等の哺乳動物、鳥、魚類を由来とするいずれのコラーゲンも用いることが可能であるが、細胞が培養される温度で変化しない熱安定性を持つことが望ましい。具体的には、哺乳動物、鳥由来のコラーゲンが望ましく、若しくはそれらの遺伝子組み換えにより得られたコラーゲンが望ましい。コラーゲンの型については、特に制限はないが、入手の容易さよりＩ、ＩＩ，ＩＩＩ型などを使用することができる。
【００１６】
コラーゲンは、細胞に及ぼす毒性を軽減しうる量使用することができる。例えば核酸導入剤によって、細胞に毒性が及ぶことが危惧される。具体的には、コラーゲン溶液の濃度は0.00001〜3％（0.0001〜30mg/mL）の範囲で使用することができ、好ましくは0.0001〜0.1％、より好ましくは0.0005〜0.05％の範囲で使用することができる。
【００１７】
コラーゲン、核酸導入剤、核酸混合溶液中の核酸の濃度は、0.001〜1000μg/mLの範囲で可能であり、好ましくは0.01〜200μg/mL、より好ましくは0.05〜100μg/mLの範囲で使用することができる。
【００１８】
前記核酸および核酸導入剤をコラーゲンの中に混合し、固相上に備えることで本発明のセルトランスフェクションアレイを調製することができる。コラーゲン溶液、核酸導入剤、核酸はどのような順番で混合しても良く、またどのような割合でも混合することができるが、核酸と核酸導入剤を混合した後にコラーゲン溶液を混合するのが好ましい。核酸および核酸導入剤を含む溶液とコラーゲン溶液の割合は、１：９９〜９９：１の範囲で混合することができ、好ましくは１０：９０〜９０：１０、より好ましくは３０：７０〜７０：３０の範囲で混合することができる。
【００１９】
本発明のセルトランスフェクションアレイは、細胞培養が可能な固相を使用することができる。すなわち、細胞が死滅せず、かつ本発明の核酸導入による細胞内への核酸の取り込みに支障をもたらさないものであれば、いかなる固相も使用することができる。また、異なる核酸ごとに培養環境が区分されている固相であることが好ましく、具体的には細胞培養用プレートを使用することができる。より好ましくは6ウェル、24ウェル、48ウェル、96ウェル、384ウェル、1536ウェル等の培養環境が区分されているウェルを有する市販の細胞培養用プレートを使用することができる。
【００２０】
本発明のセルトランスフェクションアレイの調製に際し、上記細胞培養用プレートを使用する場合には、コラーゲン、核酸導入剤および核酸の混合液を各ウェルに0.1〜3000μL/cm2、好ましくは1〜1500μL/cm2の範囲で添加して備えることができる。
【００２１】
コラーゲン、核酸導入剤および核酸を本発明のセルトランスフェクションアレイに備えるために、核酸と核酸導入剤を混合したものをさらにコラーゲン溶液に混合したものをプレートに添加することができ、または、核酸導入剤とコラーゲンの混合溶液に核酸を加えたものをプレートに添加することもできる。さらに、核酸と核酸導入剤を混合プレートに添加した後に、コラーゲン溶液を添加することもできる。核酸と核酸導入剤を混合し、しばらく室温にて放置した後に、コラーゲン溶液を混合し、それをプレートに添加するのが好ましい。
【００２２】
導入される核酸と、核酸導入剤およびコラーゲンの混合溶液をプレート等の固相に添加した後に乾燥させるか、あるいは乾燥させずに核酸、核酸導入剤およびコラーゲンをプレートに吸着させる等のいずれの方法によっても本発明のセルトランスフェクションアレイを調製することができる。
【００２３】
上記のように調製して得られたセルトランスフェクションアレイに、細胞を播種し、培養し、形質転換細胞を得ることができる。細胞の種類としては、所望の遺伝子の宿主となりうる細胞であれば良く、例えば酵母菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等を使用することができる。添加する細胞は、例えば96穴のマイクロプレートの１ウェルあたりに10〜106cells／well、好ましくは102〜105cells／wellとなるように公知の細胞培養用培地を用いて調製したものを使用することができる。
【００２４】
本発明は、上記セルトランスフェクションアレイ、その調製方法、上記セルトランスフェクションアレイを用いた核酸導入方法並びに本発明のセルトランスフェクションアレイを含む核酸導入法に関する。さらに、本発明は核酸導入剤およびコラーゲンを含むセルトランスフェクションアレイの調製用キットにもおよび、さらに上記セルトランスフェクションアレイを含む核酸導入用キットにもおよぶ。
【実施例】
【００２５】
本発明の理解を深めるために、以下に実施例および実験例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるまでもないことが明らかである。
【００２６】
（実施例１）セルトランスフェクションアレイの調製
１）材料
核酸（遺伝子）としてプラスミドＤＮＡを用い、緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現するpEGFP-N1（クローンテック社製）を用いた。核酸導入剤としてカチオン性リポソームを含む市販のリポフェクトアミン2000（Lipofectamine2000 (Invitrogen社製)、以下単に「LF」または「LF2000」という。）を用いた。
２）方法
セルトランスフェクションアレイは図１のフローチャートに従って調製した。原則として、図１に示すプラスミドＤＮＡ（核酸）、LF2000（核酸導入剤）およびアテロコラーゲン（コラーゲン）を混合したものを96穴のマイクロプレートに添加したものをセルトランスフェクションアレイとした。以下の実験例では、マイクロプレートに添加する条件を各種変動させたものについて、細胞増殖、遺伝子導入および遺伝子の発現効果等を調べた。
【００２７】
（実験例１）  核酸導入剤の使用量を変更したときの遺伝子導入効率の確認
実施例１の手法に従い、各種使用量のLF2000を用いた系でのセルトランスフェクションアレイを調製した。該セルトランスフェクションアレイにＰＣ１２細胞（ラット副腎褐色細胞腫由来細胞）に遺伝子を導入したときの細胞に対する影響および遺伝子導入効率を確認した。
ＰＣ１２細胞をDMEM培地にウマ血清10％およびウシ胎児血清（FBS）を5％添加した培地を用いて増殖させ、細胞数2×105cells/mlに調製したものを各ウェルに100μL播種し、３日間培養した。
【００２８】
細胞への遺伝子の導入は、細胞に緑色蛍光タンパク質（EGFP）が発現したことによる蛍光を観察することにより確認した。遺伝子導入効率は、ある視野における全細胞あたりのEGFPを発現している細胞の割合で示した。
【００２９】
LF2000試薬の使用量は添付文書によれば、0.8 μg/wellであるが、使用量を1/2から1/10量まで変化させて遺伝子導入効率を確認した結果、図２および図３に示すようにLF2000の使用量依存的に遺伝子導入効率を示したが、LF2000の使用量を1/4以上としたときに、従来の核酸導入法と同等に約25％以上の遺伝子導入効率が認められた。
【００３０】
（実験例２）  核酸導入剤の使用量を変更したときの遺伝子導入効率の確認
実施例１の手法に従い、各種使用量のLF2000を用いた系でのセルトランスフェクションアレイを調製した。該セルトランスフェクションアレイに２９３細胞に遺伝子を導入したときの遺伝子導入効率を確認した。
２９３細胞（ヒト胎児腎由来細胞；アデノウイルスにより形質変換された細胞）は、DMEM培地にウシ胎児血清(FBS)10％を添加した培地を用いて増殖させ、細胞数2×105cells/mlに調製したものを各ウェルに100μL播種し、３日間培養した。遺伝子導入効率の測定は、実験例１と同様に行った。
【００３１】
LF2000試薬の使用量を1/5から1/10量まで変化させて遺伝子導入効率を確認した結果、図４に示すように、LF2000試薬使用量1/6量以上のときに安定的に35％以上の遺伝子導入が認められた。
【００３２】
（実験例３）  核酸導入剤の使用量を変更したときの遺伝子導入効率の確認
実施例１の手法に従い、各種使用量のLF2000を用いた系でのセルトランスフェクションアレイを調製した。該セルトランスフェクションアレイに、ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳癌由来細胞）を播種し、遺伝子を導入したときの細胞に及ぼす影響および遺伝子導入効率を確認した。
ＭＣＦ−７細胞は、RPMI1640培地にウシ胎児血清10％を添加した培地を用いて増殖させ、細胞数2×104cells/mlに調製したものを各ウェルに100μL播種し、５日間培養した。
【００３３】
細胞増殖度は、各ウェルに、Tetra color one proliferation assay試薬を10μL添加し、37℃のCO2インキュベーターで１時間インキュベート後、波長450nmでの吸光度（O.D450）を波長630nmでの吸光度（O.D630）を対照として測定した。遺伝子導入効率は、実験例１と同様に行った。
【００３４】
上記の結果、添付文書における使用量の1/40量より少ないLF2000を用いた場合に細胞毒性が軽減された（図５）。また、1/40量を使用した場合に遺伝子の導入効果が認められた（表１）。
これにより、LF2000を添付文書に記載の使用量の1/40量の核酸導入剤を添加したセルトランスフェクションアレイを使用すると細胞毒性が軽減化され、遺伝子導入効果も得られることが確認された。
【表１】
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【００３５】
（実験例４）  アテロコラーゲンの有無による細胞および発現効率に対する影響
実施例１の手法に従い、添付文書における使用量の1/40量のLF2000を用い、さらにアテロコラーゲンの添加の系および無添加の系でのセルトランスフェクションアレイを調製した。該セルトランスフェクションアレイに、実験例３と同様にＭＣＦ−７細胞を播種し、遺伝子を導入したときおよび遺伝子を導入しないときのコラーゲンの有無による細胞に対する影響を検討した。細胞増殖度の測定は実験例３と同様に行い、遺伝子導入効率の測定方法は実験例１と同様に行った。
【００３６】
上記の結果、アテロコラーゲンを用いたセルトランスフェクションアレイに細胞を播種した場合、良好な細胞の増殖が認められ、細胞毒性が軽減された（図６）。また1/20量、1/40量のLF2000を用いて調製したセルトランスフェクションアレイでの細胞に遺伝子の導入が観察された。また、その効果は培養後１日目および５日目のいずれの場合においてもアテロコラーゲンを添加した系のほうが優れていた（図７、８）。
これにより、アテロコラーゲンを添加したセルトランスフェクションアレイを使用すると高い遺伝子導入効果が得られることが確認された。
【００３７】
（実験例５）  アテロコラーゲンの有無による細胞および導入効率に対する影響
実施例１の手法に従い、添付文書における使用量の1/4量のLF2000を用い、さらにアテロコラーゲンの添加の系および無添加の系でのセルトランスフェクションアレイを調製した。該セルトランスフェクションアレイに、実験例１と同様にＰＣ１２細胞を播種し、３日間培養した。遺伝子を導入したときおよび遺伝子を導入しないときのコラーゲンの有無による細胞に及ぼす影響を検討した。遺伝子導入については、実験例１と同様の手法で測定した。
【００３８】
上記の結果、上記セルトランスフェクションアレイに細胞を播種したところ、アテロコラーゲンを添加した系について培養後３日目において高い遺伝子導入が認められた（図９）。これにより、アテロコラーゲンを添加したセルトランスフェクションアレイを使用すると高い遺伝子導入効果が得られることが確認された。
【００３９】
（実験例６）  アテロコラーゲンの有無による細胞に及ぼす影響
実施例１の手法に従い、添付文書における使用量から２倍に希釈したLF2000を用い、セルトランスフェクションアレイを調製した。該セルトランスフェクションアレイに、実験例１と同様にＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞）を、DMEM培地にウシ胎児血清10％を添加した培地を用いて増殖させ、細胞数1×105cells/mlに調製したものを各ウェルに100μL播種し、３日間培養した。また、従来法として、本法と同量のLF2000試薬を使用し、添付文書に従って遺伝子導入を行った。顕微鏡観察によりそれぞれの方法で遺伝子導入した細胞の状態を確認した。遺伝子導入は、蛍光顕微鏡を用いてEGFPの発現を観察することにより確認した。
【００４０】
上記の結果、上記セルトランスフェクションアレイに細胞を播種したところ、培養後３日目において細胞毒性の軽減が認められた（図１０）。これにより、アテロコラーゲンを添加したセルトランスフェクションアレイを使用すると、細胞毒性が軽減され、かつ高い遺伝子導入効果が得られることが確認された。
【００４１】
（実験例７）  アテロコラーゲンの有無による遺伝子発現期間の違い
実施例１の手法に従い、実験例１と同様にＰＣ１２細胞に遺伝子を導入した。その結果を蛍光顕微鏡を用い、倍率100倍でEGFPの発現を経時的に観察した。
【００４２】
上記の結果、上記セルトランスフェクションアレイに細胞を播種したところ、顕微鏡観察下では培養後３日後であればアテロコラーゲンの有無に関係なく遺伝子発現が認められたが、培養後７日目では、アテロコラーゲンを添加しない系ではEGFPの発現が激減しているのに対して、アテロコラーゲンを添加した系ではEGFPの発現が維持されており、アテロコラーゲンの添加により、長期間の遺伝子発現が可能になることが示された（図１１）。
【００４３】
（実験例８）  セルトランスフェクションアレイの保存安定性
実施例１の手法に従ってセルトランスフェクションアレイを調製した直後および各時間保存した後に細胞を播種して３日間培養したときの遺伝子導入効率を調べ、保存安定性を確かめた。遺伝子導入効率の測定は、実験例１と同様に行った。
【００４４】
上記の結果、セルトランスフェクションアレイ調製後４週間経過後であっても、調製直後と同等の遺伝子導入効率が確認された（図１２）。それにより、保存安定性があることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
上記説明した結果、本発明のセルトランスフェクションアレイを用いると、細胞播種時に核酸導入剤等の添加の必要なく効果的に宿主細胞中に遺伝子を発現させることが可能となる。さらに、調製したセルトランスフェクションアレイは４週間程度の保存に耐えうるものである。これにより、セルトランスフェクションアレイを調製後、運搬、流通させることができる。そこで、多種類の核酸をプレーティングしたセルトランスフェクションアレイを調製し、流通させれば、ユーザーはそのセルトランスフェクションアレイに細胞を播種するだけで、多検体の遺伝子を細胞レベルで解析できることが可能となるため、各研究機関における遺伝子機能解析、創薬におけるスクリーニング、各臨床検査機関での検査等への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明のセルトランスフェクションアレイの調製方法を示す図である。（実施例１）
【図２】本発明のセルトランスフェクションアレイを調製する際に添加する核酸導入剤の濃度を変えたときの、ＰＣ１２細胞への遺伝子導入効率を示す図である。（実験例１）
【図３】本発明のセルトランスフェクションアレイを調製する際に添加する核酸導入剤の濃度を変えたときの、ＰＣ１２細胞への遺伝子導入効率を示す図である。（実験例１）
【図４】本発明のセルトランスフェクションアレイを調製する際に添加する核酸導入剤の濃度を変えたときの、２９３細胞への遺伝子導入効率を示す図である。（実験例２）
【図５】本発明のセルトランスフェクションアレイを調製する際に添加する核酸導入剤の濃度を変えたときの、遺伝子導入細胞ＭＣＦ−７細胞の増殖を示す図である。（実験例３）
【図６】本発明のセルトランスフェクションアレイを調製する際のコラーゲンの有無による細胞増殖に及ぼす効果を示す図である。（実験例４）
【図７】本発明のセルトランスフェクションアレイを調製する際のコラーゲンの有無による遺伝子導入効率に及ぼす効果を示す図である。（培養１日目）（実験例４）
【図８】本発明のセルトランスフェクションアレイを調製する際のコラーゲンの有無による遺伝子導入効率に及ぼす効果を示す図である。（培養５日目）（実験例４）
【図９】本発明のセルトランスフェクションアレイを調製する際のコラーゲンの有無による遺伝子導入効率に及ぼす効果を示す図である。（実験例５）
【図１０】本発明のセルトランスフェクションアレイを調製する際のコラーゲンの有無による細胞に及ぼす影響を示す図である。（実験例６）
【図１１】本発明のセルトランスフェクションアレイを調製する際のコラーゲンの有無による遺伝子発現期間に及ぼす効果を示す図である。（実験例７）
【図１２】セルトランスフェクションアレイを調製した直後および各時間保存した後にセルトランスフェクションアレイを用いた時の遺伝子導入効率に及ぼす効果を示す図である。（実験例８）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１０】
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【図１１】
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