(57)【要約】【課題】ＥＳ細胞等の分化多能性を有する細胞において、そのゲノム上に機能が既知又は未知の所望の蛋白質をコードする遺伝子を導入するに際し、相同組換え効率を向上させる方法を提供する。【解決手段】この発明は、染色体上の免疫グロブリン遺伝子の下流部位に外来エンハンサーを含む非ヒト動物由来の分化多能性細胞、該分化多能性細胞の染色体の免疫グロブリン遺伝子の下流でかつ外来エンハンサーの上流の部位に所望の蛋白質をコードする遺伝子を過剰発現可能な状態で含む非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞、その樹立方法、並びに、該細胞を用いて作製されたキメラ非ヒト動物及びその子孫、それらの作製方法に関する。本発明はさらに、該キメラ非ヒト動物又はその子孫を用いて、その表現型を対照動物と比較することによって、所望の蛋白質または該蛋白質をコードする遺伝子の機能を解析する方法、および/または有用蛋白質を生産する方法に関する。【選択図】図７
2006094849.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体上の免疫グロブリン遺伝子の下流部位に外来エンハンサーを含むことを特徴とする、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞。
【請求項２】
免疫グロブリン遺伝子の下流かつ外来エンハンサーの上流の部位に所望の外来遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の分化多能性を有する細胞を非ヒト動物の宿主胚に注入して得られる、かつ所望の外来遺伝子が過剰発現している、ことを特徴とするキメラ非ヒト動物。
【請求項４】
請求項３に記載のキメラ非ヒト動物を交配することにより作製された、かつ所望の外来遺伝子が過剰発現している、ことを特徴とする子孫非ヒト動物。
【請求項５】
請求項３に記載のキメラ非ヒト動物又は請求項４に記載の子孫非ヒト動物の、過剰発現している所望の外来遺伝子に基く表現型を、対照動物と比較し、表現型の違いに基いて遺伝子の機能を解析することを含む、所望の外来遺伝子の機能を解析する方法。
【請求項６】
請求項３に記載のキメラ非ヒト動物又は請求項４に記載の子孫非ヒト動物を用いて所望の外来遺伝子を発現し、産生される該遺伝子によってコードされる蛋白質を回収することを含む、有用蛋白質を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の染色体領域における相同組換え効率が向上したES細胞等の分化多能性を有する細胞、その樹立方法、並びに該細胞を用いて作製されたキメラ非ヒト動物及びその子孫に関する。
【０００２】
本発明はまた、該キメラ非ヒト動物及びその子孫を用いて、所望の蛋白質または該蛋白質をコードする遺伝子の機能を解析する方法、および/または有用物質を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトゲノム全塩基配列決定という歴史的な研究成果（International Human Genome Sequencing Consortium, Nature, 409:860-921, 2001；非特許文献１）は、同時に膨大な数の新規遺伝子の機能解明という新たな研究課題をもたらした。例えば24本のヒト染色体中２番目に小さく、最初に全塩基配列が決定されたヒト22番染色体（Dunhamら、Nature, 402:489-495, 1999；非特許文献２）を例にとれば、合計545個の遺伝子（偽遺伝子を除く）の存在が推定された。その内訳は、塩基配列およびアミノ酸配列が既知の遺伝子が247個、既知遺伝子と相同性を示す新規遺伝子が150個、Expressed Sequense Tag（EST）データベースに登録されている機能未知の配列と相同な新規遺伝子が148個であった。加えてゲノム配列から遺伝子を直接予測するソフトウェア（GENESCAN）による解析では、さらに325個の転写産物未確認の新規遺伝子が予測された（Dunhamら、前記）。遺伝子とその産物である蛋白質の生体内における機能を明らかにすることは、生命活動のプログラムを理解する上で重要なばかりでなく、様々なヒト疾患を克服するための新たな医薬品の開発につながる可能性がある。すなわち、新規遺伝子の効率的な機能解析のための技術開発は、ポストゲノム時代の生命科学、医学研究における大きな課題である。
【０００４】
胚性幹細胞（embryonic stem cell: ES細胞）は、胚盤胞の内部細胞塊より樹立される未分化な株化細胞を言い、生殖細胞を含む様々な体組織に分化する能力を保持する。例えばマウスの場合、ES細胞をマウス初期胚（宿主胚）に注入することにより体組織の細胞がES細胞由来、及び宿主胚由来の細胞の混合物からなるキメラマウスが誕生する。特にES細胞由来の生殖細胞を保持し、ES細胞の遺伝情報を子孫に伝達できるキメラマウスをジャームラインキメラと呼ぶ。ジャームラインキメラ同士あるいはジャームラインキメラと適当なマウス系統を交配することによりＥＳ細胞由来の遺伝情報を保持するＦ１マウスが生まれる。このことを利用して、あらかじめＥＳ細胞において特定の遺伝子を改変もしくは挿入しておくと、任意のノックアウト（ＫＯ）マウス、トランスジェニック（Ｔｇ）マウスおよびノックイン（ＫＩ）マウスを作製することができる。これまでに多くの研究者によって多数のＫＯマウスが作製されてきたが、その解析結果は基礎生物学から臨床医学に至る広範な分野に重要な情報をもたらしてきただけでなく、多数のヒト疾患モデル動物を提供してきた。ＫＯマウスは今日においても遺伝子の生体内機能解明のために最も広く用いられている手法である。一方、特定の外来遺伝子が特定の遺伝子内に相同組換え（Le Mouellicら、2002年、日本国特許3,298,842号；特許文献１）あるいはランダム挿入（Gosslerら、Science, 244: 463-465, 1989；非特許文献３）により挿入されたマウスを一般的にKIマウスと呼ぶが、さらに特定のプロモーター、外来遺伝子、ポリA付加部位からなる発現ユニットを特定の染色体領域に挿入することにより作製されるマウスは多数の遺伝子の生体内機能解明に適している（富塚ら、PCT国際出願ＷＯ03/041495号；特許文献２）という報告もある。
【０００５】
しかしながらＴｇマウス、ＫＩマウスおよびＫＯマウスは共に１つの遺伝子を扱うだけでも多大な時間と労力を必要とする。相同組換えの効率は、通常ランダム挿入クローン１万個から100個に１個程度とされている。ランダム挿入体に対する相同組換え体の比率を向上させるために、これまで様々な検討がなされてきた。例えばベクターに含まれる相同領域ゲノムDNAの長さが長いほど好ましいこと（Deng & Capecchi, Mol. Cell. Biol., 12:3365-71, 1992；非特許文献４）、あるいはターゲティングを行うマウスＥＳ細胞の系統と同じマウス系統のゲノムDNA（アイソジェニックDNA）を用いることが好ましいことなどが報告された（Deng & Capecchi、前記）。さらに現在最も広く用いられている方法は、上記選択マーカーに加えて、相同領域ゲノムDNAの外側にネガティブ選択マーカーを含むＫＯベクターを用いることである。この方法は、ランダム挿入体においては有毒なネガティブマーカーが発現して細胞が死ぬが、相同組換え体ではそれが起こらないという現象を利用している。ネガティブ選択マーカーとしてはMansourらにより報告（Nature, 336:348-352, 1988；非特許文献５）されたHSV-tk遺伝子（培地中にガンシクロビル、FIAUなどのチミジンアナログを入れる必要がある）、またはYagiら（Anal. Biochem., 214:77-86, 1993；非特許文献６）により報告されたDT-A（ジフテリア毒素Ａ鎖）などが知られている。このネガティブセレクション法が理論通りに機能した場合、全てのコロニーが相同組換え体という結果が予想されるが、実際には報告により大きなばらつきがあり、その濃縮効果は一般的に数倍程度とされている。
【０００６】
変異ＥＳ細胞からのマウス作製だけでなく、相同組換えにより遺伝子改変、破壊が施された哺乳動物細胞株は、それ自体が該遺伝子の機能を解明する上で重要な材料となる。さらに、相同組換えは遺伝子欠損や変異に起因する疾患（遺伝性疾患）の究極的な治療法と考えられてきた。しかし、哺乳動物細胞株または初代培養細胞における相同組換え体とランダム挿入体の比率は、マウスＥＳにおける比率と同等か、さらに低いものであり、細胞レベルの遺伝子機能解析や遺伝子治療での応用は、上記比率の改善が望まれていた（Yanez & Poter, Gene Therapy, 5:149-159, 1998；非特許文献７）。
【０００７】
ヒトゲノム全塩基配列が決定した現在、望まれるのは、多数の新規遺伝子について網羅的な生体内機能解析を行うことができるようなシステムである。そのためには導入遺伝子を高レベルで発現する動物個体を確実、容易、かつ多種類同時に作製できることが必要である。ヒトゲノム情報がもたらす新規遺伝子のうち、サイトカイン、増殖因子、ホルモンなどと相同性を持つ分泌性の蛋白質をコードするものは、そのものが医薬品となり得る点で非常に興味深い研究対象といえる。すなわち、分泌性蛋白質をコードする遺伝子とその産物の生体内機能解析のための新たな効率的手法の開発は、ヒト疾患治療のための医薬品開発を大きく進展させることができると想像される。
【０００８】
【特許文献１】日本国特許3,298,842号
【特許文献２】PCT国際出願ＷＯ03/041495号
【非特許文献１】Nature, 409:860-921, 2001
【非特許文献２】Nature, 402:489-495, 1999
【非特許文献３】Science, 244: 463-465, 1989
【非特許文献４】Mol. Cell. Biol., 12:3365-71, 1992
【非特許文献５】Nature, 336:348-352, 1988
【非特許文献６】Anal. Biochem., 214:77-86, 1993
【非特許文献７】Gene Therapy, 5:149-159, 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、特定の染色体領域における相同組換え効率が向上したES細胞等の分化多能性を有する細胞を提供することを目的とする。また本発明は、遺伝子改変された分化多能性を有する細胞を用いて作製された、所望の遺伝子を過剰発現するキメラ非ヒト動物又はその子孫を提供することを目的とする。さらに本発明は、キメラ非ヒト動物又はその子孫を用いて対象遺伝子又は蛋白質の機能を解析するため、および/または有用な蛋白質を生産するための簡便かつ再現性の高い方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、今回、特定の染色体領域、すなわち免疫グロブリン遺伝子の下流部位に外来エンハンサーが挿入されたES細胞等の分化多能性を有する細胞を用いることで、免疫グロブリン遺伝子の下流でかつ外来エンハンサーの上流の部位への、機能既知又は未知の外因性又は内因性の蛋白質をコードする遺伝子を含むジーンターゲティングベクターのランダム挿入体に対する相同組換え体の比率が大きく改善されることを見出し、本発明を完成するに至った。染色体上の特定の領域にあらかじめ施された改変が同領域の配列を含まないターゲティングベクターを利用したジーンターゲティングにおける相同組換え効率に影響を与えることは今までに知られておらず、驚くべきことであった。
【００１１】
さらに遺伝子改変されたES細胞等の分化多能性を有する細胞をB細胞欠損宿主胚に注入することによりキメラ非ヒト動物（例えばマウス）を作製することに成功した。本発明の方法により作製されたキメラ非ヒト動物又はその子孫においては、毛色のキメラ率にかかわらず、導入された構造遺伝子由来の産物の過剰発現効果が観察された。このシステムの利用により、従来法と比較して効率良くかつ確実に導入遺伝子を高発現するキメラ非ヒト動物又はその子孫を得ることができることが確認された。
【００１２】
発明の概要
本発明は以下のとおり要約される。
（１）染色体上の免疫グロブリン遺伝子の下流部位に外来エンハンサーを含むことを特徴とする、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞。
（２）外来エンハンサーが、免疫グロブリン遺伝子の３'末端から下流側100Kb以内、好ましくは50Kb以内、さらに好ましくは30Kb以内の部位に位置する、（１）記載の細胞。
（３）外来エンハンサーが、免疫グロブリン遺伝子の３'末端から下流側30Kb以内の部位に位置する、（２）記載の細胞。
（４）外来エンハンサーが、RSエレメントの部位又はその近傍に位置する、（３）記載の細胞。
（５）外来エンハンサーがウイルス由来である、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞。
（６）ウイルスが哺乳動物感染性ウイルスである、（５）記載の細胞。
（７）哺乳動物感染性ウイルスがSV40である、（６）記載の細胞。
（８）免疫グロブリン遺伝子が重鎖又は軽鎖遺伝子の可変領域もしくは定常領域遺伝子である、（１）〜（７）のいずれかに記載の細胞。
（９）免疫グロブリン遺伝子が重鎖又は軽鎖の定常領域遺伝子である、（８）記載の細胞。
（10）免疫グロブリン遺伝子がκ軽鎖定常領域遺伝子である、（９）記載の細胞。
【００１３】
（11）非ヒト動物が哺乳動物である、（１）〜（10）のいずれかに記載の細胞。
（12）哺乳動物がげっ歯類である、（11）記載の細胞。
（13）げっ歯類がマウスである、（12）記載の細胞。
（14）分化多能性を有する細胞が胚性幹（ES）細胞である、（１）〜（13）のいずれかに記載の細胞。
（15）ES細胞がマウス由来である、（14）記載の細胞。
（16）外来エンハンサーが、その制御下にある第１の外来遺伝子(以下、「第１遺伝子」という)とともに含む、（１）〜（15）のいずれかに記載の細胞。
（17）第１遺伝子が薬剤耐性遺伝子である、（16）記載の細胞。
（18）薬剤耐性遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子である、（17）記載の細胞。
（19）（１）〜（18）のいずれかに記載の非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞の作製方法であって、
該細胞の染色体の外来エンハンサー挿入位置の５'上流領域と相同の配列と、該外来エンハンサーを含む配列と、該挿入位置の３'下流領域と相同の配列とを含むジーンターゲティングベクターを作製し、
該ベクターを、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞の中に導入して、免疫グロブリン遺伝子の下流の部位に外来エンハンサーを組み込む、
ことを含み、ここで該エンハンサーの挿入位置が免疫グロブリン遺伝子の下流部位、好ましくは免疫グロブリン遺伝子の３'末端から100Kb以下、より好ましくは50Kb以下、さらに好ましくは30Kb以下の部位である、上記方法。
（20）ベクターが、外来エンハンサーの制御下にある第１遺伝子をさらに含む、（19）記載の方法。
【００１４】
（21）第１遺伝子が薬剤耐性遺伝子である、（20）記載の方法。
（22）薬剤耐性遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子である、（21）記載の方法。
（23）外来エンハンサーがウイルス由来である、（19）〜（22）のいずれかに記載の方法。
（24）ウイルスが哺乳動物感染性ウイルスである、（23）記載の方法。
（25）哺乳動物感染性ウイルスがSV40である、（24）記載の方法。
（26）非ヒト動物が哺乳動物である、（19）〜（25）のいずれかに記載の方法。
（27）哺乳動物がげっ歯類である、（26）記載の方法。
（28）げっ歯類がマウスである、（27）記載の方法。
（29）エンハンサーの挿入位置が免疫グロブリン遺伝子の３'末端から30Kb 以下の部位である、（19）〜（28）のいずれかに記載の方法。
（30）エンハンサーの挿入位置がRSエレメントの部位又はその近傍の部位である、（29）記載の方法。
【００１５】
（31）ベクターが図７に記載の構造を有し、かつ外来エンハンサーを含む配列が図８に記載の構造を有する、（19）〜（30）のいずれかに記載の方法。
（32）分化多能性を有する細胞がES細胞である、（19）〜（31）のいずれかに記載の方法。
（33）ES細胞がマウス由来である、（32）記載の細胞。
（34）（１）〜（18）のいずれかに記載の非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞において、その染色体の免疫グロブリン遺伝子の下流かつ外来エンハンサーの上流の部位に、（機能が既知又は未知の）第2の所望の外来遺伝子(以下、「第２遺伝子」という)を発現可能な状態で相同組換えによって導入することを含む、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞の染色体に第２遺伝子を導入する方法。
（35）第２遺伝子を、それを含むジーンターゲティングベクターを用いて導入する、（34）記載の方法。
（36）ベクターが、第２遺伝子の発現を制御するプロモーターをさらに含む、（35）記載の方法。
（37）プロモーターが免疫グロブリン遺伝子プロモーターである、（36）記載の方法。
（38）ベクターが、マルチクローニング部位、ポリAシグナル配列、並びに、ポジティブ及びネガティブ選択マーカー配列をさらに含む、（35）〜（37）のいずれかに記載の方法。
（39）免疫グロブリン遺伝子が軽鎖定常領域遺伝子である、（34）〜（38）のいずれかに記載の方法。
（40）免疫グロブリン遺伝子がκ軽鎖定常領域遺伝子である、（39）記載の方法。
【００１６】
（41）ベクターが、図３に記載の構造においてマルチクローニング部位に第２遺伝子が挿入されたものである、（34）〜（40）のいずれかに記載の方法。
（42）非ヒト動物が哺乳動物である、（34）〜（41）のいずれかに記載の方法。
（43）哺乳動物がげっ歯類である、（42）記載の方法。
（44）げっ歯類がマウスである、（43）記載の方法。
（45）分化多能性を有する細胞がES細胞である、（34）〜（44）のいずれかに記載の方法。
（46）ES細胞がマウス由来である、（45）記載の方法。
（47）（１）〜（18）のいずれかに記載の非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞において、その染色体の免疫グロブリン遺伝子の下流かつ外来エンハンサーの上流の部位に、（機能が既知又は未知の）第２遺伝子をさらに含むことを特徴とする細胞。
（48）非ヒト動物が哺乳動物である、（47）記載の細胞。
（49）哺乳動物がげっ歯類である、（48）記載の細胞。
（50）げっ歯類がマウスである、（49）記載の細胞。
【００１７】
（51）分化多能性を有する細胞がES細胞である、（47）〜（50）のいずれかに記載の細胞。
（52）ES細胞がマウス由来である、（51）記載の細胞。
（53）外来エンハンサーがウイルス由来である、（47）〜（52）のいずれかに記載の細胞。
（54）ウイルスが哺乳動物感染性ウイルスである、（53）記載の細胞。
（55）哺乳動物感染性ウイルスがSV40である、（54）記載の細胞。
（56）免疫グロブリン遺伝子が軽鎖遺伝子である、（47）〜（55）のいずれかに記載の細胞。
（57）免疫グロブリン遺伝子が軽鎖定常領域遺伝子である、（56）記載の細胞。
（58）免疫グロブリン遺伝子がκ軽鎖定常領域遺伝子、例えばマウスκ軽鎖定常領域遺伝子である、（57）記載の細胞。
（59）外来エンハンサーが、免疫グロブリン遺伝子の３'末端から下流側100Kb以内、好ましくは50Kb以内、さらに好ましくは30Kb以内の部位に位置する、（47）〜（58）のいずれかに記載の細胞。
（60）外来エンハンサーが、免疫グロブリン遺伝子の３'末端から下流側30Kb以内の部位に位置する、（59）記載の細胞。
【００１８】
（61）外来エンハンサーが、RSエレメントの部位又はその近傍に位置する、（60）記載の細胞。
（62）（47）〜（61）のいずれかに記載の非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を、宿主胚への該細胞の注入を介して該非ヒト動物と同種の仮親非ヒト動物に移植し、出産によりキメラ非ヒト動物を作製することを含む、第２遺伝子が過剰発現しているキメラ非ヒト動物を作製する方法。
（63）特定の細胞及び/又は組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚（例えば、B細胞欠損宿主胚）の胚胎盤胞又は８細胞期胚に、前記分化多能性を有する細胞を注入し、該胚胎盤胞又は８細胞期胚を前記仮親非ヒト動物に移植し、出産によりキメラ非ヒト動物を作製する、（62）記載の方法。
（64）キメラ非ヒト動物がマウスである、（62）又は（63）記載の方法。
（65）（62）〜（64）のいずれかに記載の方法によって作製される、あるいは（47）〜（61）のいずれかに記載の非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を非ヒト動物の宿主胚に注入して得られる、かつ第２遺伝子が過剰発現している、ことを特徴とするキメラ非ヒト動物。
（66）動物がマウスである、（65）記載のキメラ非ヒト動物。
（67）（65）又は（66）記載のキメラ非ヒト動物を交配することにより作製された、かつ所望の外来遺伝子が過剰発現している、ことを特徴とする子孫非ヒト動物。
（68）動物がマウスである、（67）記載の子孫非ヒト動物。
（69）（65）又は（66）記載のキメラ非ヒト動物あるいは（67）又は（68）記載の子孫非ヒト動物の、過剰発現している第２遺伝子（すなわち、所望の外来遺伝子）に基く表現型を、対照動物と比較し、表現型の違いに基いて遺伝子の機能を解析することを含む、所望の外来遺伝子の機能を解析する方法。
（70）動物がマウスであり、分化多能性細胞がES細胞である、（69）記載の方法。
【００１９】
（71）（65）又は（66）記載のキメラ非ヒト動物あるいは（67）又は（68）記載の子孫非ヒト動物を用いて第２遺伝子を発現し、該遺伝子によってコードされる産生される蛋白質を回収することを含む、有用蛋白質を生産する方法。
（72）動物がマウスである、（71）記載の方法。
(73)前記動物の組織、細胞、あるいはB細胞もしくは脾臓細胞とのハイブリドーマ、のいずれかを用いて前記有用蛋白質を産生させた後、該蛋白質を回収することを含む、(71)又は(72)に記載の方法。
(74)前記組織又は細胞が、リンパ組織又はB細胞である、(73)記載の方法。
(75)前記ハイブリドーマが、B細胞もしくは脾臓細胞と増殖可能な腫瘍細胞との融合細胞である、(73)記載の方法。
【００２０】
本発明の特定の実施形態は以下のとおりである。
【００２１】
本発明は、特定の染色体領域の少なくとも片側アレルに外来エンハンサーを含む薬剤耐性マーカー遺伝子発現ユニットを挿入することにより、該染色体領域周辺における相同組換え効率が向上したＥＳ細胞を提供する。薬剤耐性マーカーを挿入する染色体領域としては、ＲＳ配列と呼ばれる遺伝子配列が好ましい。特に、免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子の下流に存在するＲＳ配列が好ましい。
【００２２】
本発明はまた、特定の染色体領域に外来エンハンサーを含む薬剤耐性マーカー遺伝子発現ユニットを挿入することによって相同組換え効率が向上したＥＳ細胞を用いて作製された遺伝子組換え非ヒト動物又はキメラ非ヒト動物を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、特定の染色体領域に外来エンハンサーを含む薬剤耐性遺伝子発現ユニットを挿入することによって相同組換え効率が向上したＥＳ細胞を用いて、特定の遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物を作製し、その表現型を対照動物と比較して調べることにより、特定遺伝子、又はそれによってコードされる蛋白質、の機能を解析する方法を提供する。
【００２４】
さらに本発明において、キメラ非ヒト動物は、マウス、ウシ、ブタ、サル、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギおよびハムスターからなる群から選ばれるものである。本発明の好ましい実施形態においては、キメラ非ヒト動物はマウスである。
【００２５】
定義
本発明に関わる用語の定義は以下の通りである。
本明細書中で使用される「外来エンハンサー」とは、人為的に導入された外因性または内因性のエンハンサーであり、ここでエンハンサーとは、転写を活性化する遺伝子調節蛋白質が特異的に結合する部位として働く制御領域であり、RNA転写開始部位に対する向きや距離に関係なく転写量を増加させるcis-actingなDNA塩基配列として同定された。エンハンサーは遺伝子のプロモーター近傍やイントロンの内部に存在する場合もあるが、遠距離から作用する例も知られている。例えばショウジョウバエのcut遺伝子座エンハンサーは、プロモーターの85kb上流域に、またT細胞受容体アルファー鎖遺伝子のエンハンサーはプロモーターの69kb下流域に存在することが知られている（Blackwoodら、Science、Vol. 281、60-63、1998）。また、ゲノムに挿入されたトランスジーンの位置非依存的な高発現を可能にするDNA塩基配列として同定されたLCR（ローカス・コントロール・リージョン）もエンハンサーとして機能する配列を含むことが知られている（Blackwoodら、前記）。
【００２６】
本明細書中で使用する「外来」という用語は、核酸等の物質について、それが外因性または内因性であるか否かに拘らず、外部から(externally)人為的に導入すること、あるいは導入されたもの、を意味する。
【００２７】
本明細書中で使用される「非ヒト動物」という用語は、ヒトを含まない動物を意味し、一般に魚類、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類からなる脊椎動物、好ましくは哺乳類（哺乳動物ともいう）から選ばれる。本発明ではキメラ非ヒト動物の作製において、分化多能性を有する細胞として胚性幹細胞を利用することが好ましいため、胚性幹細胞の樹立が可能な非ヒト動物（たとえばマウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ハムスター、サル、ヤギ、ウサギ、ラットなど）、および将来的に胚性幹細胞の樹立が可能であろうその他の非ヒト動物のすべてが、本発明の意図する非ヒト動物に包含される。
【００２８】
本明細書中で使用される「キメラ非ヒト動物」とは、分化多能性を有する細胞（後述）に由来する分化した細胞と、宿主胚に由来する分化した細胞の両者から成り立つ動物を意味する（Bradleyら, Nature, 309:255-6, 1984）。実験的には、すべての細胞が宿主胚に由来する動物（０％キメラ）や、すべての細胞が分化多能性を有する細胞に由来する動物（100％キメラ）も誕生しうるものであり、厳密にはこれらの動物は「キメラ」ではないが、便宜上「キメラ非ヒト動物」に包含されるものとする。
【００２９】
本明細書中で使用される「分化多能性を有する細胞」とは、上述したキメラ非ヒト動物を作製するにあたり、宿主胚への注入、あるいは集合胚形成によって、キメラ非ヒト動物の２種類以上の細胞または組織に分化可能な細胞を意味する。具体的には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）などが挙げられる。
【００３０】
本明細書中で使用される「胚性幹細胞」とは、ＥＳ細胞（embryonic stem cell）とも称され、未分化性（全能性）を維持したまま増殖可能なことを特徴とする初期胚由来の培養細胞を意味する。すなわち胚性幹細胞は、動物の初期胚中の胚盤胞の内部に存在する未分化幹細胞である内部細胞塊の細胞を培養し、未分化状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞株である。また「胚性生殖細胞」とは、ＥＧ細胞とも称され、上記胚性幹細胞とほぼ同等の能力を有することを特徴とする始原生殖細胞由来の培養細胞を意味する。胚性生殖細胞は、受精後数日〜数週間、例えばマウスの場合には約8.5日経過した胚から得た始原生殖細胞を培養し、未分化状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞株である。さらにまた、「胚性腫瘍細胞」とは、ES細胞と同じ分化多能性をもつ細胞であり、将来生殖細胞に分化することが運命付けられた始原生殖細胞から、白血病阻害因子（LIF）、塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)の存在下において樹立された幹細胞として知られ、多くの場合生殖細胞にも寄与し、その細胞由来の子孫を作ることができる。
【００３１】
EC細胞についてはColin L. Stewartら, The EMBO Journal, 4(13B), 3701-3709 (1985)、EG細胞についてはPatricia A. Laboskyら, Development 120, 3197-3204 (1994)などにそれぞれ記載されるとおり、EC及びEG細胞のいずれもES細胞と同様にキメラ形成能をもつこと、EC細胞ではキメラマウスにおいて外来遺伝子の発現が確認されていること、またEG細胞は生殖系列に寄与し子孫を作ることができることが知られている。このように、本発明では、ES細胞のみならず、EC細胞もEG細胞も利用可能であり、本発明に包含される。
【００３２】
本明細書中で使用される「所望の蛋白質」とは、本発明の方法により作製されるキメラ非ヒト動物の少なくとも１種類の細胞および／または組織において発現させることが試みられる蛋白質であり、その機能については既知である場合も、未知である場合もある。前記所望の蛋白質は、哺乳動物由来の機能性分泌蛋白質、機能性膜蛋白質、機能性細胞内または核内蛋白質、分泌シグナルが付加された機能性膜蛋白質の可溶性部分などとすることができる。ここで「機能性」とは、生体内において特定の働き、作用または機能をもつことを意味する。
【００３３】
機能既知の蛋白質の場合は、当該蛋白質がキメラ非ヒト動物の少なくとも１種類の細胞および／または組織における高発現の影響を観察することによって、蛋白質の機能の相互的関連について新たな知見を得られる可能性がある。機能未知の蛋白質の場合は、同じく高発現の影響を観察することによって、当該蛋白質の機能解明につながる知見を得られる可能性がある。本発明において「所望の蛋白質」は、導入するキメラ非ヒト動物において発現するが、発現させる対象となる特定の細胞および／または組織においては発現しないかもしくはわずかにしか発現しないものあってもよいし、または異種動物由来のものであってもよく、関心のあるものであればその種類を問わないものとする。
【００３４】
本明細書中で使用される「所望の蛋白質をコードする核酸配列」は、内因性または外因性DNAのいずれでもよく、また外因性DNAにはヒト由来DNAが包含される。また本明細書においては、「所望の蛋白質をコードする（構造）遺伝子」、「所望の蛋白質をコードする外来遺伝子」、「所望の外来遺伝子」という用語も同義として用いる。
【００３５】
本明細書中で使用される、蛋白質の「発現」とは、その蛋白質をコードする遺伝子の発現と同等の意味を有する。
【００３６】
本明細書中で使用される「制御領域」とは、「制御配列」、「調節配列」、「調節領域」などの総称を意味し、遺伝子発現（転写、翻訳または蛋白質合成）を制御または調節する機能を有する領域を指す。そのような制御領域としては、限定するものではないが、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどが含まれる。また本発明において「制御領域」とは、１つの機能的なエレメント（例えば１つのプロモーター配列）を含むものであってもよいし、または複数のエレメントを含むもの（例えば、１つのプロモーター配列と１つのエンハンサー配列など）であってもよい。さらに「プロモーター配列」とは、当業者に周知の制御領域の１種であり、転写開始時にRNAポリメラーゼが結合する構造遺伝子上流の塩基配列を指す。
【００３７】
本明細書中で使用する「インターナルリボゾーマルエントリーサイト」とは、IRES（internal ribosomal entry site）と略称され、ポリシストロニックな発現を可能にするエレメントとして知られており、特殊なRNA二次構造を形成し、その下流にある開始コドンからのリボゾームによる翻訳開始を可能にする部位を指す。哺乳動物の場合、IRESはリボゾームのデコードサブユニットに結合し、これにより隣接する蛋白質コード領域をデコード部位に引き込むような立体構造変化を起こして、翻訳および蛋白質合成を開始する事象に関わると推定されている（Spahnら, Science 291:1959, 2001）。
【００３８】
本明細書中で使用する「ポリＡシグナル領域」又は「ポリＡシグナル配列」とは、転写領域の終わりの部分に位置し、転写後mRNA前駆体の3’非翻訳領域へポリアデニル酸鎖付加を指令する塩基配列部分を指す。
【００３９】
本明細書中で使用する「上流」および「下流」とは、ゲノム、ポリヌクレオチドなどの核酸配列において、それぞれ5’末端及び3’末端への方向を指す。
【００４０】
本明細書中で使用する「ｂｐ（塩基対）」及び「Ｋｂ（キロ塩基対）」又は「ｋｂ（キロ塩基対）」とは、核酸配列の長さ及び距離を指し、１ｂｐが１つの塩基対を表し、１Ｋｂは1,000ｂｐに相当する。
【００４１】
本明細書中で使用する「対立遺伝子」とは、倍数体のゲノムを有する生物において、相同染色体の相同な領域に位置し、機能的にも相同な遺伝子をいう。対立遺伝子は通常全てが発現される。また「対立遺伝子排除」とは、生物個体で考えた場合、対立遺伝子の両方に由来する形質が表現されているにもかかわらず、個々の細胞では対立遺伝子のどちらかのみがランダムに発現し、他方の発現が排除されていることをいう。例えば抗体やＴ細胞受容体の遺伝子に見られ、一方の可変領域遺伝子の組換えが信号となって完全な遺伝子が１つしか完成されないことによる。
【００４２】
本明細書中で使用する「分泌シグナルを付加された膜蛋白質の可溶性部分」という用語は、膜蛋白質分子のうち、分泌シグナル（またはシグナル配列）が結合した細胞外ドメインを意味する。
【００４３】
本明細書中で使用する「免疫グロブリン遺伝子」という用語は、免疫グロブリン（Ig）分子の軽鎖（もしくはＬ鎖）又は重鎖（もしくはＨ鎖）をコードしている遺伝子を指す。軽鎖にはκ鎖やλ鎖が含まれており、可変（Ｖ）領域と定常（Ｃ）領域から構成されている。また軽鎖遺伝子は、１個の定常領域遺伝子、複数のＶ領域遺伝子、および複数の結合（J）領域遺伝子から構成されている。一方、哺乳動物の重鎖においては、重鎖遺伝子がμ、γ、α、δおよびεを含めて数種類存在し(但しδ遺伝子はヒト、サル、マウスなどには存在するが、ラット、ウシ、ウマ、ウサギなどには存在しない)、定常領域遺伝子も数種類存在する。鳥類には、重鎖遺伝子μ、γ、αが存在し、爬虫類や両生類には、重鎖遺伝子μ、γが、また魚類には重鎖遺伝子μのみがそれぞれ存在する。通常、染色体への所望蛋白質をコードする遺伝子の挿入は１箇所であることを考慮すると、哺乳動物由来のκ軽鎖定常領域遺伝子の利用が好ましい。因みに、マウスの重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子はそれぞれ、マウスの第12染色体、及び第６染色体(κ鎖遺伝子)、第16染色体(λ鎖遺伝子)に存在する。また、免疫グロブリン遺伝子は５'側から順にＶ領域を決める遺伝子とＣ領域を決める遺伝子が並んでおり、その間にＤ(diversity segment)領域とＪ(joining segment)領域を決める遺伝子が並んでいる。
【００４４】
本明細書中で使用する「特定の細胞および／または組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚」または「欠損宿主胚」という用語は、分化多能性を有する細胞を注入するための宿主非ヒト動物胚であって、当該細胞および／または組織を欠損する胚を意味する。
【００４５】
本明細書中で使用するキメラ非ヒト動物の「子孫」とは、本発明のキメラ非ヒト動物同士、あるいは本発明のキメラ非ヒト動物と同種の非ヒト動物との交配により得られ、少なくとも特定の細胞および／または組織において所望の蛋白質を発現する非ヒト動物を意味する。
【００４６】
本明細書中で使用する「表現型」とは、動物が本来持つ形質、または導入遺伝子の結果現れる動物の形質を指す。
【００４７】
本明細書中で使用する「増殖可能な腫瘍細胞」とは、腫瘍化することにより永続的な増殖能を有する細胞を意味し、例えば免疫グロブリンを産生する形質細胞腫細胞（ミエローマ細胞など）が挙げられる。
【００４８】
本明細書中で使用する「ハイブリドーマ」という用語は、本発明のキメラ非ヒト動物またはその子孫からの組織または細胞に由来する細胞と、上記増殖可能な腫瘍細胞とを融合させてできる雑種細胞を指す。
【００４９】
本明細書中で使用する「ターゲティングベクター」又は「ジーンターゲティングベクター」とは、相同組換えにより目的とする染色体領域に所望の蛋白質をコードする遺伝子の発現ユニットを導入し、該所望の蛋白質を発現させるために用いるベクターを指す。本明細書中で使用する「ノックアウトベクター」とは、相同組換えにより非ヒト動物の目的とする遺伝子を破壊または不活性化するためのベクターを指す。また「ノックアウト」もしくは「遺伝子ノックアウト」とは、目的とする遺伝子座位に相同組換えにより当該遺伝子の発現を阻害する構造を導入し、該目的の遺伝子を破壊または不活性化することを意味する。
【００５０】
本明細書中で使用する「ＲＳ（Recombining segment）エレメント」という用語は、６番染色体上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子の約２５Ｋｂ下流に位置し、nonamer及びheptamer signal sequenceを持つ、例えば以下の配列（agtttctgc acgggcagtc agttagcagc actcactgtg） を指す（Daitchら、J. Immunol., 149: 832-840, 1992）。λ鎖発現B細胞の多くは解析の結果、CκエクソンないしはJκ-Cκ領域が欠失しているが、これらの欠失はマウス６番染色体上のCκエクソン下流２５Kbに位置するDNA配列（Recombining sequence 又は RS エレメント）との組み換えによるものであることが報告されている（Durdikら、Nature, 307, 749-752, 1984; Mooreら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6211-6215, 1985; Mullerら、Eur. J. Immunol., 20, 1409-1411, 1990）。RSエレメントはJκとCκの間のイントロンに位置するサイト、ないしはVκ遺伝子と結合し、その結果組み換えが生ずる。これら組み換えはIgのV(D)J結合に用いられると同じ酵素によって行われていると考えられている（Durdikら、前記；Mooreら、前記）。B細胞の発生におけるRSによる組み換えの意義についてまだ十分な解釈は得られていないが、少なくともIg遺伝子再構成時に生じたフレームシフトによって機能しない配列構造をもつκ遺伝子が転写されるのを抑制する、λ鎖発現B細胞においてκ鎖も発現することを妨げる、という役割を担っていると考えられている。また、B細胞分化段階で生じる自己反応性B細胞は軽鎖産生を止め、軽鎖遺伝子再構成を活性化することが（Receptor editingと呼ばれる）知られているが（Radicら、J. Exp. Med., 177, 1165-1173, 1993; Tiegsら、J. Exp. Med., 177, 1009-1020, 1993）、RSエレメントを介した組み換えが受容体校正と呼ばれる機能的なκ遺伝子の不活性化を担っている可能性も指摘されている（Selsingら、IMMUNOGLOBULIN GENES, SECOND EDITION, ACADEMIC PRESS, 200-203, 1995）。
【発明の効果】
【００５１】
本発明は、分化多能性細胞の免疫グロブリン遺伝子、特にκ軽鎖定常領域遺伝子、の発現系を利用して所望の蛋白質をコードする遺伝子を相同組換え的に導入する方法、この方法によって得られた分化多能性細胞、この分化多能性細胞から作製されたキメラ非ヒト動物及びその子孫に関するが、Igκ遺伝座における相同組換え率は20％以上、25％以上、30％以上、40％以上、50％以上、好ましくは60％以上に達する。このため、本発明は、所望の蛋白質をコードする遺伝子の高発現による該蛋白質の生産、あるいは、機能未知の遺伝子または蛋白質の生体内機能解析のために使用することができる、という格別の作用効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００５３】
本発明は、染色体の免疫グロブリン遺伝子の下流部位に外来エンハンサーを含むことを特徴とする非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を提供する。
【００５４】
外来エンハンサーは、上記定義のとおり、転写を活性化する遺伝子調節蛋白質が特異的に結合する部位として働く制御配列である。一般にエンハンサーは転写開始速度を増加させる働きがあるが、本発明では、DNA結合蛋白質がエンハンサーに結合する際にクロマチン構造に何らかの変化が生じ、これによって染色体上での所望の蛋白質をコードする遺伝子、又は所望の遺伝子、の相同組換え効率が向上するものと推定される。外来エンハンサーとしては、特に限定されないが、ウイルス遺伝子エンハンサー、例えばSV（シミアンウイルス）40、ポリオーマウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスE1A、レトロウイルス、サイトメガロウイルスなどの哺乳動物感染性ウイルス遺伝子のエンハンサー、細胞の核遺伝子、例えば免疫グロブリン遺伝子、キモトリプシン遺伝子、インスリン遺伝子などのエンハンサーなどが例示される。好ましくはウイルス由来のエンハンサーである。
【００５５】
外来エンハンサーを染色体上の特定の部位に挿入する場合、ジーンターゲティング手法を用いて行うことができる。このとき、ターゲティングベクターは少なくとも、外来エンハンサーを含む配列と、染色体の外来エンハンサー挿入部位の５'上流領域と相同の配列と、該挿入部位の３'下流領域と相同の配列とを含み、さらに必要に応じて、外因性の蛋白質をコードする第１遺伝子（「第１遺伝子」ともいう）、例えば選択マーカー遺伝子、例えば薬剤耐性遺伝子（例えばネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子など）を含むことができる。このとき外来エンハンサーは、その制御下にある第１遺伝子とともに含む薬剤耐性マーカー遺伝子発現ユニットの形態で染色体上に導入されることができる。このユニットにはさらに、１以上のプロモーター、ポリAシグナル配列を含むことができる。具体的には、図８に記載されるような、SV40エンハンサー/プロモーター（SV40E/P）、HSV-TKプロモーター、Neo耐性マーカー遺伝子及びSV40ポリAを含む構造(両端にLoxP配列をもつ)からなる薬剤耐性マーカー遺伝子発現ユニットが例示される。ここで、HSV-TKは単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼを表わす。さらにまた、上流及び下流ゲノム領域の配列は、ある一定以上の塩基数で構成されていればよく、例えばそれぞれ２Kb以上、上流及び下流合わせて７Kb以上の配列で構成されるのが望ましい。
【００５６】
ターゲティングベクターはさらに、好ましくはネガティブ選択マーカーを含むことができる。ネガティブ選択マーカーはゲノム中にターゲティングベクターがランダム挿入された細胞を排除するための役割をもち、該マーカーの例は、ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子(DT-A)などである。本発明では、ネガティブ選択マーカーがターゲティングベクターが線状化された際にベクターの端部に露出しないように操作することによって、相同組換えの効率をさらに上げることができる。このためには、線状化されたターゲティングベクターにおいて、ネガティブ選択マーカーとして機能する遺伝子構造の5’端および3’端が、ターゲティングベクターのそれぞれ5’および3’端から少なくとも１Kb、好ましくは２Kb以上離れるよう操作することが望ましい。通常、ネガティブ選択マーカーの5’端または3’端の一方には、ゲノムとの相同組換えのための領域（相同組換え領域）が位置するため、ベクター端からの距離は3Kb以上となる。
【００５７】
外来エンハンサーの挿入位置は、免疫グロブリン遺伝子の３'末端から下流100Kb以内、好ましくは50Kb以内、さらに好ましくは30Kb以内の部位であり、特定例ではマウス６番染色体上の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子の約25Kb下流に位置するRSエレメント部位又はその近傍である。このときRSエレメント部位又はその近傍に外来エンハンサーを挿入することによって、RSエレメントを機能不全となるように破壊してもよいし、あるいはRSエレメントの機能を残留させることもできる。ここでRSエレメントの近傍とは、RSエレメント配列の５'上流側約数Kb以内及び３'下流側約数Kb以内を指す。ここで数Kbとは、１〜10Kb以下、例えば７Kb以下、５Kb以下、３Kb以下、及び１Kb以下を指す。
【００５８】
免疫グロブリン遺伝子は、重鎖遺伝子又は軽鎖遺伝子のいずれでもよい。重鎖及び軽鎖遺伝子、また軽鎖遺伝子の場合κ鎖及びλ鎖遺伝子はそれぞれ異なる染色体上に存在し、いずれにも可変（V）領域遺伝子と定常（C）領域遺伝子が存在する。本発明では軽鎖定常領域遺伝子が好ましく、特にマウスの分化多能性細胞を使用する場合κ軽鎖定常領域遺伝子がさらに好ましい。哺乳動物の中でも特にヒトやマウスのゲノム解析はほぼ終了しており、ゲノム情報は入手可能な状態にあること、また解析の結果、ゲノムにおける配列の相同性比較から、ヒトとマウスの間では約85％の相同率であり、かなり類似していることを考慮するならば、動物種としてマウスの分化多能性を有する細胞を使用するのが好ましいといえる。しかし、本発明では、マウス以外の動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ハムスター、サル、ヤギ、ウサギ、ラットなど）の使用も可能であり、免疫グロブリン遺伝子の配列決定がすでになされているものについては文献又はGenBank(米国NCBI)、EMBL(欧州EBI)などのデータベースからその情報を入手することができるし、配列が不明の場合には、制限酵素によるゲノムDNAの断片化、マッピング、ゲノムライブラリーの作成、クローニング、(自動)シークエンシングなどの手法を組み合わせることによって遺伝子の配列を決定できる（S.B.プリムローズ著、藤山秋佐夫監訳、ゲノム解析ベーシック、1996年、シュプリンガー・フェアラーク東京）。免疫グロブリン遺伝子の配列情報は、例えばGenBank受託番号NG004051(マウスIgGλ)、V01569（マウスIgGκ定常領域）として記載されており利用可能である。
【００５９】
本発明において分化多能性を有する細胞(又は「分化多能性細胞」ともいう)としては、上記定義に挙げたもの、すなわち胚性幹細胞（ES細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、胚性腫瘍細胞（EC細胞）のいずれもを使用することができるが、マウス由来のＥＳ細胞が好ましく使用できる。
【００６０】
本発明において非ヒト動物は、上記定義のとおり、脊椎動物、例えば魚類、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳動物のいずれも含むが、好ましくは哺乳動物である。キメラ非ヒト動物の作製において、分化多能性を有する細胞として胚性幹細胞を利用することが好ましいため、胚性幹細胞の樹立が可能な非ヒト動物である、例えばマウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類、あるいはウシ、ヒツジ、ブタ、サル、ヤギ、ウサギなど、および将来的に胚性幹細胞の樹立が可能であろうその他の非ヒト動物のすべてが本発明の対象となる。好ましい哺乳動物はげっ歯類、特にマウスである。
【００６１】
本発明はまた、特定の染色体領域に外来エンハンサーが挿入された、非ヒト動物由来の分化多能性を有する上記細胞の作製方法を提供する。
【００６２】
この方法は、分化多能性を有する細胞の染色体上の外来エンハンサー挿入位置の５'上流領域と相同の配列と、該外来エンハンサーを含む配列と、該挿入位置の３'下流領域と相同の配列とを含むジーンターゲティングベクターを作製し、該ベクターを、非ヒト動物由来の該分化多能性を有する細胞の中に導入して、免疫グロブリン遺伝子の下流の部位に外来エンハンサーを含むユニット(例えば図８)を組み込むことを含み、ここで該エンハンサーの挿入位置が免疫グロブリン遺伝子の３'末端から100Kb 以下、好ましくは50Kb以下、より好ましくは30Kb以下の部位であることを特徴とする。
【００６３】
ベクターはさらに、外来エンハンサーの制御下にある第１遺伝子を含むことができる。第１遺伝子は上記のとおり、例えば選択マーカー遺伝子、例えば薬剤耐性遺伝子（例えばネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子など）、ネガティブ選択マーカー(例えばジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子など)等を含むことができる。本発明の具体例では、第１遺伝子はネオマイシン耐性遺伝子である。ベクターとしては、PUC系プラスミド、pBI系プラスミド、ｐBluescript系プラスミドなどのプラスミドベクター、Charon32、EMBL4、λZAPなどのファージベクターなどが使用できるが、これらに限定されない。またベクターの具体例は、図１に記載のベクター（pBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3’KO-5’KO）、より具体的には図7に記載のベクター（pRS-KOSV40PE）である。ここで、５'KOはマウスRSエレメント5’上流領域、Neorはネオマイシン耐性遺伝子、３'KOはマウスRSエレメント3’下流領域、DT-AはジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびpBluescriptはクローニングベクターをそれぞれ示す。Neor又はloxP-Neo-loxPと表示した配列中にはSV40エンハンサーを含む配列(図９)が含まれている。
【００６４】
外来エンハンサー、非ヒト動物、外来エンハンサーの挿入位置、分化多能性を有する細胞については、上記定義のとおりである。
【００６５】
好ましい外来エンハンサーは、哺乳動物感染性ウイルスのエンハンサー、例えばSV40のエンハンサーである。
【００６６】
好ましい外来エンハンサー挿入位置は、免疫グロブリン遺伝子の３'末端から30Kb以下の部位、例えばRSエレメントの部位又はその近傍である。
【００６７】
好ましい非ヒト動物は、哺乳動物であり、特にげっ歯類、例えばマウスである。
【００６８】
好ましい分化多能性を有する細胞は、ES細胞、例えば哺乳動物ES細胞、特にマウスES細胞である。
【００６９】
本発明はさらに、上記の方法で作製された分化多能性細胞の染色体上の免疫グロブリン遺伝子の下流でかつ外来エンハンサーの上流の部位に、機能が既知又は未知の所望の蛋白質をコードする遺伝子（「第２遺伝子」ともいう）を発現可能な状態で相同組換えによって導入することを含む、非ヒト動物由来の分化多能性細胞の染色体に第２遺伝子を導入する方法を提供する。
【００７０】
この方法によると、染色体上への所望の蛋白質をコードする第２遺伝子の導入の相同組換え率は、従来法(約16％)より高い、20％以上、25％以上、30％以上、40％以上、50％以上又は60％以上である。この点で、本発明の方法は、染色体上での機能が既知もしくは未知の内因性又は外因性の遺伝子の相同組換えのための格別優れた方法を提供するものである。
【００７１】
本発明はまた、このような方法によって作製された、染色体に上記外来エンハンサーと上記第２遺伝子とを含むことを特徴とする非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞も提供する。具体的には、本発明は、分化多能性細胞の染色体の免疫グロブリン遺伝子の下流でかつ外来エンハンサーの上流の部位に、機能が既知又は未知の所望の蛋白質をコードする第２遺伝子を過剰発現可能な状態で含むことを特徴とする、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞に関する。
【００７２】
上記の発明において、所望の蛋白質をコードする第２遺伝子の染色体上への導入は、ジーンターゲティング法によって行うことができる。具体的には、少なくとも染色体上の遺伝子挿入位置の５'上流領域と相同の配列、該第２遺伝子配列、及び該挿入位置の３'下流領域と相同の配列を含むジーンターゲティングベクターを、第２遺伝子導入のために使用できる。上流及び下流ゲノム領域の配列は、ある一定以上の塩基数で構成されていればよく、例えばそれぞれ２Kb以上、上流及び下流合わせて７Kb以上の配列で構成されるのが望ましい。このゲノム配列は、GenBank(米国NCBI)、EMBL(欧州EBI)などのデータベースから得ることができ、この配列を鋳型にし、特異的プライマーを用いてPCRを行うことによって増幅することができる。PCRは、Taqポリメラーゼ(宝酒造)、AmpliTaq(Perkin  Elmer)、Pfuポリメラーゼ（Stratagene）などの耐熱性ポリメラーゼを用いて、例えば80〜100℃で5秒〜2分の変性工程、40〜72℃で5秒〜5分のアニーリング工程、及び65〜75℃で30秒〜10分の伸長工程を１サイクルとして10〜40サイクル行うことができる。ベクターには、上記のエレメントの他に、第２遺伝子の発現を制御するプロモーター、第２遺伝子を組み込むためのマルチクローニング部位(もしくは、配列)、第２遺伝子の転写後に転写体の３'末端にポリAを付加するための制御配列であるポリAシグナル配列、目的の遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカー配列、ネガティブ選択マーカー配列(例えばジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子など)などが適宜含まれることができる。ベクターとしては、PUC系プラスミド、pBI系プラスミド、ｐBluescript系プラスミドなどのプラスミドベクター、Charon32、EMBL4、λZAPなどのファージベクターなどが使用できるが、これらに限定されない。本発明におけるベクターの特定例は、図３に記載の構造を有するCκP2ノックインベクターであり、ここでPromoter２はマウスIgκプロモーター領域遺伝子２、MCSはマルチクローニング部位、CκはマウスIgκ遺伝子定常領域、Cκ polyAはマウスIgκ polyAシグナル領域、Puroはピューロマイシン耐性遺伝子、DT-AはジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子およびpBluescriptはクローニングベクターをそれぞれ示す。前記第２遺伝子は、図３のマルチクローニング部位に挿入される。
【００７３】
上記非ヒト動物は脊椎動物から選択されるが、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはげっ歯類、とりわけマウスである。
【００７４】
上記分化多能性を有する細胞及び上記外来エンハンサーは、上に記載したとおりのものを使用できる。
【００７５】
上記免疫グロブリン遺伝子は、重鎖(例えばμ、γ、α、δもしくはε)又は軽鎖遺伝子(例えばκもしくはμ)の可変領域又は定常領域遺伝子いずれでもよいが、好ましくは重鎖又は軽鎖定常領域遺伝子、より好ましくは軽鎖定常領域遺伝子、さらに好ましくはκ軽鎖定常領域遺伝子である。
【００７６】
本発明はさらに、上記のようにして導入された第２遺伝子を含む非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を、宿主胚への該細胞の注入を介して該非ヒト動物と同種の仮親非ヒト動物に移植し、出産により、前記第２遺伝子が過剰発現していることを特徴とするキメラ非ヒト動物を作製する方法を提供する。
【００７７】
具体的には、この方法は、特定の細胞及び/又は組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚の胚胎盤胞又は８細胞期胚に、前記分化多能性を有する細胞を注入し、該胚胎盤胞又は８細胞期胚を前記仮親非ヒト動物に移植し、出産によりキメラ非ヒト動物を作製することを包含する。好ましいキメラ非ヒト動物はマウスである。また、特定の細胞及び/又は組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚の例は、B細胞欠損宿主胚である。
【００７８】
本発明はさらに、上記の方法で作製されたキメラ非ヒト動物も提供する。本発明のキメラ非ヒト動物は、前記第２遺伝子が過剰発現していることを特徴とする。好ましい動物はげっ歯類、特にマウスである。
【００７９】
本発明はさらに、上記のキメラ非ヒト動物から交配によって作製された、かつ前記第２遺伝子が過剰発現していることを特徴とする、子孫非ヒト動物を提供する。好ましい動物はげっ歯類、特にマウスである。交配は、作出されたキメラ非ヒト動物とそれと同種の非ヒト動物との間の交配であり、これにより導入遺伝子をヘテロのもつトランスジェニック（Ｔｇ）動物を得る。さらにこのようにして得られたＴｇ動物の雌雄を交配させると、導入遺伝子をホモにもつキメラ非ヒト動物、さらには導入遺伝子が遺伝性の子孫非ヒト動物を作製することができる。
【００８０】
本発明はさらに、上記のキメラ非ヒト動物あるいはその子孫非ヒト動物において、過剰発現している前記第２遺伝子に基く表現型を、野生型分化多能性を有する細胞より作製されたキメラ非ヒト動物(すなわち、対照動物)の表現型と比較し、それらの表現型の違いに基いて該第２遺伝子、又は該第２遺伝子によってコードされる蛋白質、の機能を解析する方法を提供する。好ましい動物はげっ歯類、特にマウスである。表現型の違いは、外見的特徴、生化学的・血液学的特徴、病態学的所見に基く特徴(例えば、機能異常、機能昂進もしくは行動異常)などによって評価することができる。
【００８１】
本発明はさらに、上記のキメラ非ヒト動物あるいはその子孫非ヒト動物を用いて、所望の蛋白質をコードする第２遺伝子を発現して、該有用蛋白質を生産する方法を提供する。好ましい動物はげっ歯類、特にマウスである。この方法は、前記動物の組織、細胞、あるいはＢ細胞もしくは脾臓細胞、とのハイブリドーマのいずれかを用いて有用蛋白質を産生させた後、該蛋白質を回収することを含む。また前記組織又は細胞の例は、リンパ組織又はＢ細胞である。さらに、ハイブリドーマの例は、Ｂ細胞もしくはＢ細胞を含む脾臓細胞とミエローマ細胞との融合細胞である。
【００８２】
以下に、上記の発明について、さらに具体的に説明するが、具体的例示は説明を理解しやすくするためのものであって、限定を意図するものではないと理解されるべきである。
【００８３】
１．特定の染色体領域に所望の蛋白質をコードする核酸配列が挿入された非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞の作製
本発明のキメラ非ヒト動物の作製方法では、まず、所望の蛋白質をコードする核酸配列〔(注)本明細書中では、この核酸配列のことを構造遺伝子、導入遺伝子、もしくは第２遺伝子とも称する。〕が配置されたゲノムを含む、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞を作製する。この核酸配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるように配置されたものである。
【００８４】
また、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子は、組織特異的に発現するものであってもよいし、または構成的に発現するものであってもよい。例えば組織特異的に発現する遺伝子としては、免疫グロブリン軽鎖または重鎖遺伝子、Ｔ細胞受容体遺伝子、ミオグロビン遺伝子、クリスタリン遺伝子、レニン遺伝子、リパーゼ遺伝子、アルブミン遺伝子などが挙げられる。また構成的に発現する遺伝子としては、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子などが挙げられる。当該遺伝子がキメラ非ヒト動物において組織特異的に発現する遺伝子の場合には、後述する宿主胚として、当該遺伝子の発現する細胞および／または組織が欠損した系統の胚を採用する。当該遺伝子が構成的に発現する遺伝子の場合は、後述する宿主胚として、任意の細胞および／または組織が欠損した系統の胚を採用する。
【００８５】
所望の蛋白質をコードする核酸配列（構造遺伝子もしくは第２遺伝子）の配置（連結または挿入）は、少なくとも特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるような形態である必要がある。従って、該核酸配列は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域の下流に配置される。
【００８６】
あるいは、該所望の蛋白質をコードする核酸配列（構造遺伝子もしくは第２遺伝子）は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル領域をコードする配列の間に、インターナルリボゾーマルエントリーサイト（IRES）を配置し、そのIRESの下流に配置される。すなわち、該核酸配列は、ゲノム上において、IRESと機能的に連結された状態で、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル領域をコードする配列との間に存在する。ターゲティングベクターの構築に際して、ポリＡシグナル領域は上記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域を用いることができるが、これに限定されるものではない。例えば、シミアンウイルス40(SV40）由来のポリＡシグナル領域などの当技術分野で公知の他のポリＡ配列を用いることもできる。
【００８７】
また該所望の蛋白質をコードする核酸配列(構造遺伝子もしくは第２遺伝子)は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル領域をコードする配列の間に、第２のポリＡシグナル領域をコードする配列、そのポリＡシグナル領域の下流にプロモーター配列を配置し、さらに該プロモーター配列の下流に配置される。すなわち、該核酸配列は、ゲノム上において、プロモーター配列およびポリＡシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態で存在し、かつもともとゲノム上に存在する特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子もまたそのプロモーター配列およびポリＡシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態で存在する。ターゲティングベクターの構築に際して、ここで使用されるプロモーター配列は、上記特定の細胞および／または組織において発現を制御するものであれば特に限定されることはないが、好ましくは上記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のプロモーターが用いられる。またターゲティングベクターにプロモーターが２つ存在する場合には、その２つのプロモーターは、同じ細胞および／または組織において発現を制御するものであれば、同じものであってもよいし異なるものであってもよい。さらにターゲティングベクターの構築において使用されるポリＡシグナル領域をコードする配列としては、当技術分野で公知のポリＡシグナル領域であれば特に限定されるものではなく、例えばプロモーターと同じ由来のポリＡシグナル領域やシミアンウイルス40(SV40）由来のポリＡシグナル領域などが挙げられる。またプロモーターの場合と同様に、ターゲティングベクターに２つのポリＡシグナル領域をコードする配列が存在する場合には、その２つは同じものであってもよいし異なるものであってもよい。
【００８８】
さらにまた前記所望の蛋白質をコードする核酸配列(構造遺伝子もしくは第２遺伝子)は、上記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域の下流に、プロモーター配列、核酸配列、およびポリＡシグナル領域をコードする配列の順に配置することもできる。すなわち、該核酸配列は、プロモーターおよびポリＡシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態（カセット形式）で、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナルの下流に存在する。ターゲティングベクターの構築に際して、ここで使用されるプロモーター配列は、上記特定の細胞および／または組織において発現を制御するものであれば特に限定されることはないが、好ましくは上記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のプロモーターが用いられる。さらにターゲティングベクターの構築においてポリＡシグナル領域をコードする配列としては、当技術分野で公知のポリＡシグナル領域であれば特に限定されるものではなく、例えばプロモーターと同じ由来のポリＡシグナル領域やシミアンウイルス40(SV40）由来のポリＡシグナル領域などが挙げられる。またターゲティングベクターに２つのポリＡシグナル領域をコードする配列が存在する場合には、その２つは同じものであってもよいし異なるものであってもよい。前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域の3’端と、所望の蛋白質をコードする核酸配列の発現を制御するプロモーター配列の5’端の距離は、上記特定の細胞および／または組織において該核酸配列の発現が可能であれば特に限定されるものではないが、距離が離れるに従い、転写産物であるmRNAの安定性に好ましくない影響が生じる可能性があり、またターゲッティングベクターの構造が大きくなることからそのような構成のベクターの作製が困難になる。これらの理由からポリＡシグナル領域の3’端と、所望の蛋白質をコードする核酸配列の発現を制御するプロモーター配列の5’端の距離は１Kb以内であることが好ましい。
【００８９】
所望の蛋白質をコードする核酸配列（構造遺伝子もしくは第２遺伝子）を前記制御領域の近傍に配置する場合には、核酸配列を該制御領域の近傍に挿入してもよいし、または、ＥＳ細胞等の分化多能性を有する細胞の片側のアレルについて、単に当該細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御配列の直下に、本来の構造遺伝子を置換するような態様で配置することもできる。所望の蛋白質をコードする核酸配列に置換された本来の構造遺伝子は、もう片側のアレルによって発現されるので、細胞および／または組織は正常な状態を保ちうる。しかしながら、免疫グロブリン遺伝子のように、対立遺伝子排除が働くような遺伝子においては、ＥＳ細胞等の分化多能性を有する細胞の両側のアレルにおいて、本来の構造遺伝子の終止コドンの後に、IRES配列を介在させた後、所望の蛋白質をコードする核酸配列を配置することができる。また、本来の構造遺伝子の片側のアレルをＥＳ細胞等の分化多能性を有する細胞においてあらかじめ不活化しておき、不活化されていないアレルの本来の構造遺伝子の終止コドンの後に、IRES配列を介在させた後、所望の蛋白質をコードする核酸配列を配置することもできる。この場合、不活化されていないアレルが独占的に発現し、同時に所望の蛋白質をコードする核酸配列も高発現することが期待される。
【００９０】
免疫グロブリンκ鎖遺伝子の発現は、前述した通り多数のＶおよびＪ遺伝子断片が、組換えにより結合することより起こる。この結合の結果、各Ｖ遺伝子断片の上流近傍にあるプロモーター配列はＪ断片下流に存在するエンハンサー配列の近傍に配置される。このような状況において、エンハンサー配列は初めて該プロモーターを活性化することができる（Picardら、Nature, 307:80-2, 1984）。すなわち、前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、人為的に免疫グロブリンκ鎖遺伝子のプロモーター配列と連結した形で、前記エンハンサー配列の近傍に配置することもできる。免疫グロブリンκ鎖遺伝子座には前記エンハンサー配列以外にもさらに下流にエンハンサー配列が存在することが知られており（Meyerら、EMBO J. 8:1959-64, 1989）、該遺伝子はこのように複数のエンハンサーの影響のもとＢ細胞において高発現する。
【００９１】
上述したような所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含む非ヒト動物由来のES細胞などの分化多能性を有する細胞は、例えば以下に記載するように得ることができる。
【００９２】
２．遺伝子導入 ES細胞の取得
（１）ターゲティングベクターの構築
非ヒト動物の染色体の免疫グロブリン遺伝子の下流部位に外来エンハンサーを含む配列を導入するために、外来エンハンサー挿入位置の上流及び下流領域に対応する各ゲノム配列をもち、該挿入位置に外来エンハンサーとその制御下にある選択マーカーとを含む配列が該ゲノム配列の間に挿入されたターゲティングベクターを構築する。外来エンハンサーの挿入位置は、本発明の具体例では、マウス免疫グロブリンκ鎖遺伝子の約25Kb下流に存在するRSエレメントの位置又はその近傍である。
【００９３】
外来エンハンサー挿入位置の上流及び下流領域に対応するゲノム領域の配列は、ある一定以上の塩基数で構成されていればよく、例えばそれぞれ２Kb以上、上流及び下流合わせて７Kb以上の配列で構成されるのが望ましい。
【００９４】
選択マーカーとして、例えばネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、GFP遺伝子などを用いることができる。
【００９５】
更に、ターゲティングベクターの構造に、相同組換えの効率を上げるための改変を施すことができる。すなわち、ゲノム中にターゲティングベクターがランダム挿入された細胞を排除するためのネガティブ選択マーカーが、ターゲティングベクターが線状化された際にベクターの端部に露出しないように操作することによって、相同組換えの効率を上げることができる。
【００９６】
具体的には、線状化されたターゲティングベクターにおいて、ネガティブ選択マーカーとして機能する遺伝子構造の5’端および3’端が、ターゲティングベクターのそれぞれ5’および3’端から少なくとも１Kb、好ましくは２Kb以上離れるよう操作することが望ましい。通常、ネガティブ選択マーカーの5’端または3’端の一方には、ゲノムとの相同組換えのための領域（相同組換え領域）が位置するため、ベクター端からの距離は３Kb以上となることがほとんどである。一方、ネガティブ選択マーカーのもう一方の端は、ベクター端に近接している場合が多い。本発明では、ネガティブ選択マーカーの、相同組換え領域と隣接していない端に、線状化ベクターの末端から少なくとも１kbの距離を設けるよう操作し、それにより相同組換えの効率を上昇させる。ベクター端からの距離を確保するための配列としては、ターゲティングベクター構築の際に使用するpUCなどのプラスミドの配列をそのまま残して（すなわち線状化する際に削除しない）利用することもできるし、また、目的とするターゲティング領域に非相同な任意の新たなノンコーディング配列をネガティブ選択マーカーの隣に配置することも可能である。ベクターの線状化は、使用しているターゲティングベクターの制限酵素認識部位を精査し、ベクター端とネガティブ選択マーカーの端とが距離を確保できるような適当な制限酵素部位を選択してベクターを線状化することによって、相同組換え効率を改善させるという効果を達成することができる。また、そのような適当な制限酵素部位が見つからない場合であっても、PCRを用いた手法（Akiyamaら、Nucleic Acids Research, 2000, Vol.28, No.16, E77.）により、適当な制限酵素認識配列をターゲティングベクターの所望の位置に導入することができる。
【００９７】
上述したようなターゲティングベクター構造をとることにより、ネガティブ選択マーカーが細胞中でヌクレアーゼの攻撃を受ける頻度が低下し、相同組換えの効率が上昇するものと考えられる。
【００９８】
すなわち、本発明は、ターゲティングベクターにおいて、ネガティブ選択マーカーとして機能する遺伝子構造の5’端および3’端が、線状化したターゲティングベクターのそれぞれ5’端および3’端から少なくとも１Kb、好ましくは３Kb以上離れていることを特徴とする遺伝子ターゲティングベクター、ならびに該ターゲティングベクターを用いた遺伝子ターゲティング方法を提供する。前記ターゲティングベクターにおいて、ネガティブ選択マーカーとしては公知のものであればいずれのものも利用可能であるが、好ましくはジフテリアトキシンＡ遺伝子である。
【００９９】
（２）ターゲティング・非ヒト動物分化多能性細胞の取得
非ヒト動物分化多能性細胞(例えばマウスES細胞)は通常以下に記すような方法で樹立することができる。雌雄の非ヒト動物を交配することにより得られる受精後２．５日の胚を採取し、分化多能性細胞用培地中でインビトロ培養し、該培養胚のうち胚盤胞まで発生が進んだ胚を分離し、そして該胚を、フィーダー細胞培地中に播種して培養し、該培養胚から分化多能性細胞様形態で生育しているものの細胞塊をトリプシンを含有するES細胞用培地を用いて分散処理、及び、フィーダー細胞培地を用いて培養し、更には分化多能性細胞用培地を用いて継代培養し増殖する細胞を単離する。
【０１００】
ターゲティングベクターを用いた、RSエレメント・ターゲティング・マウスES細胞の取得は、当技術分野で公知の手法、例えば相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲティング、羊土社、1995等に記載された方法によって行うことができる。例えば、上記作製したターゲティングベクターを、エレクトロポレーション、リポフェクション法などによりマウスES細胞に導入し、RSエレメントを欠失し、かつその領域に耐性遺伝子が挿入されたマウスES細胞を取得することが出来る。上記操作によって、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子下流の染色体領域における相同組み換え効率が向上したマウスES細胞が取得される。
【０１０１】
（３）ターゲティングベクターの構築
最初に、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の近傍に上記遺伝子のプロモーター部分を含み、さらにその下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列が挿入されたターゲティングベクターを構築する。
【０１０２】
導入する核酸配列は、開始コドンから終止コドンまでを含んでいればcDNAでもイントロンを含むゲノムDNAであってもよく、該核酸配列によってコードされる蛋白質の種類はいかなるものでもよい。本発明で使用される核酸配列は、それによってコードされる蛋白質の高発現・分泌のために使用されてもよいし、該蛋白質の機能を解明するために使用されてもよい。したがって、導入する核酸配列はその塩基配列が特定されるならば、いずれの種類のものでも使用可能である。核酸配列（構造遺伝子）の例としては、哺乳動物、好ましくはヒト、由来の機能性蛋白質をコードする遺伝子、たとえば分泌蛋白質をコードする遺伝子、膜蛋白質をコードする遺伝子、細胞内または核内蛋白質をコードする遺伝子、などが挙げられる。
【０１０３】
所望の蛋白質をコードする核酸配列は、上記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域の下流に、プロモーター配列、核酸配列、およびポリＡシグナル領域をコードする配列の順に配置することもできる。すなわち、該核酸配列は、プロモーターおよびポリＡシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態（カセット形式）で、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナルの下流に存在する。ターゲティングベクターの構築に際して、ここで使用されるプロモーター配列は、上記特定の細胞および／または組織において発現を制御するものであれば特に限定されることはないが、好ましくは上記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のプロモーターが用いられる。さらにターゲティングベクターの構築においてポリＡシグナル領域をコードする配列としては、当技術分野で公知のポリＡシグナル領域であれば特に限定されるものではなく、例えばプロモーターと同じ由来のポリＡシグナル領域やシミアンウイルス40(SV40）由来のポリＡシグナル領域などが挙げられる。またターゲティングベクターに２つのポリＡシグナル領域をコードする配列が存在する場合には、その２つは同じものであってもよいし異なるものであってもよい。前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のポリＡシグナル領域の3’端と、所望の蛋白質をコードする核酸配列の発現を制御するプロモーター配列の5’端の距離は、上記特定の細胞および／または組織において該核酸配列の発現が可能であれば特に限定されるものではないが、距離が離れるに従い、転写産物であるmRNAの安定性に好ましくない影響が生じる可能性があり、またターゲッティングベクターの構造が大きくなることからそのような構成のベクターの作製が困難になる。これらの理由からポリＡシグナル領域の3’端と、所望の蛋白質をコードする核酸配列の発現を制御するプロモーター配列の5’端の距離は１Kb以内であることが好ましい。
【０１０４】
特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の近傍に所望の蛋白質をコードする核酸配列を含むように、あるいは上記遺伝子の近傍に特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子のプロモーターを含み、さらにその下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列を含むように動物のゲノムを改変するために、ターゲティングベクターを準備し、このベクターDNAに該所望の蛋白質をコードする核酸配列を挿入する。この目的のために使用可能なベクターの例は、プラスミド、ウイルスなどであり、当業者であればターゲティングンベクターとして使用可能なベクターを容易に選択し、入手することができる。ベクターの具体例は、限定するものではないが、CκP2ターゲティングベクター（後述の実施例参照）である。ターゲティングベクターは、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の終止コドンとポリＡ付加部位の間（たとえば中間点付近）に、目的の核酸配列DNAの挿入部位として適当な制限酵素切断部位が挿入され、該制限酵素切断部位には、導入する核酸配列の開始コドンから終止コドンまでを含むDNA（cDNA、ゲノムDNA）が挿入される。また、好ましくは開始コドンの上流にコザック配列等の翻訳促進配列を配置することができる。更に、ベクターには、必要に応じて選択マーカー、たとえばピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、GFP遺伝子等を含むことができる。
【０１０５】
（４）非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞へのターゲティングベクターの導入、および相同組換え体の選択
ターゲティングベクターによる非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞の形質転換は、当技術分野で公知の手法、例えば相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲティング、羊土社、1995等に記載された方法によって行うことができる。例えば、上記作製したターゲティングベクターを、エレクトロポレーション、リポフェクション法などにより分化多能性を有する細胞に導入することができる。
【０１０６】
さらに、ターゲティングベクターの構造に、相同組換えの効率を上げるための改変を施すことができる。すなわち、ゲノム中にターゲティングベクターがランダム挿入された細胞を排除するためのネガティブ選択マーカーが、ターゲティングベクターが線状化された際にベクターの端部に露出しないように操作することによって、相同組換えの効率を上げることができる。
【０１０７】
具体的には、線状化されたターゲティングベクターにおいて、ネガティブ選択マーカーとして機能する遺伝子構造の5’端および3’端が、ターゲティングベクターのそれぞれ5’および3’端から少なくとも１Kb、好ましくは２Kb以上離れるよう操作することが望ましい。通常、ネガティブ選択マーカーの5’端または3’端の一方には、ゲノムとの相同組換えのための領域（相同組換え領域）が位置するため、ベクター端からの距離は３Kb以上となることがほとんどである。一方、ネガティブ選択マーカーのもう一方の端は、ベクター端に近接している場合が多い。本発明では、ネガティブ選択マーカーの、相同組換え領域と隣接していない端に、線状化ベクターの末端から少なくとも１kbの距離を設けるよう操作し、それにより相同組換えの効率を上昇させる。ベクター端からの距離を確保するための配列としては、ターゲティングベクター構築の際に使用するpUCなどのプラスミドの配列をそのまま残して（すなわち線状化する際に削除しない）利用することもできるし、また、目的とするターゲティング領域に非相同な任意の新たなノンコーディング配列をネガティブ選択マーカーの隣に配置することも可能である。ベクターの線状化は、使用しているターゲティングベクターの制限酵素認識部位を精査し、ベクター端とネガティブ選択マーカーの端とが距離を確保できるような適当な制限酵素部位を選択してベクターを線状化することによって、相同組換え効率を改善させるという効果を達成することができる。また、そのような適当な制限酵素部位が見つからない場合であっても、PCRを用いた手法（Akiyamaら、Nucleic Acids Research, 2000, Vol.28, No.16, E77.）により、適当な制限酵素認識配列をターゲティングベクターの所望の位置に導入することができる。
【０１０８】
上述したようなターゲティングベクター構造をとることにより、ネガティブ選択マーカーが細胞中でヌクレアーゼの攻撃を受ける頻度が低下し、相同組換えの効率が上昇するものと考えられる。
【０１０９】
すなわち、本発明は、ターゲティングベクターにおいて、ネガティブ選択マーカーとして機能する遺伝子構造の5’端および3’端が、線状化したターゲティングベクターのそれぞれ5’端および3’端から１Kb以上、好ましくは２Kb以上、通常３Kb以上離れていることを特徴とする遺伝子ターゲティングベクター、ならびに該ターゲティングベクターを用いた遺伝子ターゲティング方法を提供する。前記ターゲティングベクターにおいて、ネガティブ選択マーカーとしては公知のものであればいずれのものも利用可能であるが、好ましくはジフテリアトキシンＡ遺伝子である。
【０１１０】
更に、非ヒト分化多能性細胞(例えばマウスES細胞)として免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子の下流約25KbのRSエレメント領域に薬剤耐性マーカーが挿入された胚性幹細胞を用いることでIgκ定常領域下流に目的とする遺伝子を、ターゲティングベクターを用いて挿入する効率を上げることが出来る。
【０１１１】
相同組換え体を簡便に同定するために、外来遺伝子がターゲティングされる位置に薬剤耐性遺伝子マーカーをあらかじめ挿入しておくこともできる。例えば、本明細書中実施例で用いられているマウスＥＳ細胞TT2Fは、C57BL/6系統とCBA系統との間のＦ１個体由来の細胞である。先述したように（Deng & Capecchi, Mol. Cell. Biol., 12:3365-71, 1992）、ターゲティングベクターに含まれるゲノム相同領域の配列がC57BL/6に由来する場合、TT2F細胞においてはC57BL/6由来のアレルにおいてより高率に相同組換えが起こると想像される。すなわち、あらかじめC57BL/6由来ゲノムDNAを含むターゲティングベクターを用いてC57BL/6由来のアレルに例えばG418耐性マーカーを挿入することができる。次に得られたG418耐性株について、ピューロマイシン耐性マーカーを含み、かつC57BL/6由来ゲノムDNAを含むターゲティングベクターを導入してピューロマイシン耐性かつG418感受性株を取得することができる。この株においては、ターゲティングベクターと、前記特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子との相同組換えによりG418耐性遺伝子が除去され、代わりに所望の蛋白質をコードする構造遺伝子とピューロマイシン耐性マーカーが挿入されている。このような方法により、相同組み換え体同定におけるサザン解析等の手間を省くことができる。
【０１１２】
本出願人によって出願されたPCT国際出願WO 00/10383号（2000年３月２日国際公開）に記載された方法と同様に、ピューロマイシン耐性クローンをピックアップし、ゲノムDNAを調製し、サザン解析法により相同組換え体を同定することが可能である。ターゲティングベクター中のピューロマイシン耐性遺伝子は、WO 00/10383号に記載されたLox-P Puroプラスミドに由来し、その両端に順方向にLox-P配列を含んでいる。よってWO 00/10383号に記載された方法により、同耐性遺伝子をターゲティングされた分化多能性を有する細胞から除去することができる。
【０１１３】
上述したターゲティングベクター、ならびに相同組換え効率を向上させる技術および手段は、遺伝子導入可能な細胞すべてに応用が可能であり、キメラ動物の作製に限定されない。例えば、ヒトおよびヒト細胞（例えば血液細胞や免疫細胞など）を対象とした遺伝子治療において、本明細書に記載のターゲティングベクターおよび相同組換え効率を向上させる技術を所望の遺伝子を破壊または導入するために使用することができる。
【０１１４】
３．特定の細胞および／または組織が欠損した宿主胚
本発明のキメラ非ヒト動物の作製方法では、次に、前記特定の細胞および／または組織が欠損した非ヒト動物系統の宿主胚（以下、欠損宿主胚ともいう）を用意する。そのような欠損宿主胚としては、免疫グロブリン軽鎖遺伝子を制御領域として利用する場合には、免疫グロブリン重鎖遺伝子ノックアウトによるＢ細胞欠損胚（Tomizukaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 18:722-727, 2000）、Ｔ細胞受容体遺伝子を制御領域として利用する場合には、Ｔ細胞受容体β鎖欠損によるＴリンパ球細胞欠損胚（Mombaertsら、Nature, 360: 225-227, 1992）、ミオグロビン遺伝子を制御領域として利用する場合には、マイオゲニン遺伝子ノックアウトによる筋肉組織の欠損胚（Nabeshimaら、Nature, 364:532-535, 1993）、クリスタリン遺伝子を制御領域として用いる場合には、水晶体を欠損するマウスの突然変異体であるaphakia (ak)系統由来の胚（Liegeoisら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93: 1303-1307, 1996）、レニン遺伝子を制御領域として利用する場合には、Sall1遺伝子ノックアウトによる腎臓組織の欠損胚（Nishinakamuraら、Development, 128: 3105-3115, 2001）、アルブミン遺伝子を制御領域として利用する場合には、c-Met遺伝子欠損による肝臓組織の欠損胚（Bladtら、Nature, 376: 768-770, 1995）、リパーゼ遺伝子を制御領域として用いる場合には、Pdx1遺伝子ノックアウトによる膵臓組織欠損胚（Jonssonら、Nature, 371: 606-9, 1994）などが挙げられる。好ましい欠損宿主胚を上記例示したが、本発明で使用可能な欠損宿主胚は上記のものに限定されない。
【０１１５】
また、効率的なキメラ非ヒト動物作製を行うための宿主胚の発生時期、遺伝的背景等の選択については、それぞれのＥＳ細胞株について既に検討された条件を用いることが望ましい。例えばマウスの場合、CBA×C57BL/6 F1由来のTT2細胞またはTT2F細胞（野性色、Yagiら、Analytical Biochemistry, 214:70-76, 1993）からのキメラ作製については宿主胚がBalb/c（白色、日本国日本クレア社）、ICR（白色、日本国日本クレア社）、またはMCH（ICR）（白色、日本国日本クレア社）の遺伝的背景であることが望ましい。よって前記特定の細胞および／または組織が欠損した非ヒト動物系統とこれらの系統の戻し交配により得られる非ヒト動物の胚（例えば８細胞期胚）を欠損宿主胚として用いるのが望ましい。
【０１１６】
宿主胚において欠損する細胞および／または組織は、ブラストシスト・コンプリメンテーション（ＢＣ）によって、分化多能性を有する細胞により補填されるため、前記宿主欠損胚は、キメラ動物を作製するための胚盤胞期まで発生しうるものであれば、胚性致死のものであってもかまわない。このような胚性致死胚は、遺伝子の欠損がヘテロである動物同士の交配によって原理的には４分の１の確率で生じるため、交配により得られた胚を複数取得して下記手順に従ってキメラ動物を作製し、その中から宿主胚が欠損胚であるものを選抜する。この選抜は、キメラ動物の体組織より抽出したDNAを用いたサザン解析、PCR解析等により行うことができる。
【０１１７】
４．キメラ胚の作製および仮親への移植
上記「１．分化多能性を有する細胞の作製」の項目で得られた遺伝子導入（ＥＳ）細胞株からのキメラ非ヒト動物の作製は、相沢慎一（前記）等に記載された方法で行うことができる。具体的に説明すると、作製した遺伝子導入分化多能性細胞を、上記「３．特定の細胞および／または組織が欠損した宿主胚」の項目に記載の欠損宿主胚の胚胎盤胞または８細胞期胚に毛細管などを用いて注入する。この胚胎盤胞または８細胞期胚を、直接同種の仮親非ヒト動物の卵管に移植するか、一日培養して胚盤胞まで発生したものを該仮親の子宮に移植する。その後、仮親を飼育出産させることにより、仔動物を得る。
【０１１８】
５．キメラ非ヒト動物における導入遺伝子の発現
上記「キメラ胚の作製および仮親への移植」の項目に従って作製される遺伝子導入分化多能性細胞注入胚に由来する仔動物における分化多能性細胞の貢献率は、その毛色により大まかに判定することができる。例えば、TT2F細胞（野生色）由来の遺伝子導入細胞株をMCH(ICR)（白色）バックグラウンドの宿主マウス胚に注入した場合、野生色（濃茶）の割合が分化多能性細胞の貢献率を示している。ここで毛色における貢献率は、前記欠損する細胞および／または組織以外の細胞および／または組織における遺伝子導入分化多能性細胞の貢献率と相関があるが、組織によっては毛色の貢献率と一致しない場合もある。一方、上記キメラ非ヒト動物においては、宿主胚由来の前記欠損する細胞および／または組織は存在せず、遺伝子導入分化多能性細胞由来のもののみ存在する。遺伝子導入分化多能性細胞の貢献による、キメラ非ヒト動物における欠損細胞および／または組織の回復は、FACS解析（Fluorescence-Activated Cell Sorter）、ELISA法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）等によって検出可能である。遺伝子導入分化多能性細胞由来の細胞および／または組織において挿入した核酸配列（構造遺伝子）が発現するかどうかは、当該細胞および／または組織由来のRNAを用いたRT-PCR法（Kawasakiら、P.N.A.S., 85:5698-5702, 1988）、ノーザンブロット法（Ausubelら, Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994）などにより検出される。蛋白質レベルの発現は、導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質に対する特異的抗体が既にある場合は、キメラマウス血清を用いた酵素免疫測定法（ELISA；富山・安東、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィク、1987）、ウエスタンブロット法（Ausubelら, 前記）等を利用して検出できる。また、導入される核酸配列（構造遺伝子）をコードするDNAを適当に改変し、抗体で検出可能なタグペプチドを付加しておけば、該タグペプチドに対する抗体等で導入した遺伝子の発現を検出できる（POD標識抗His6；ロシュ・ダイアグノスティックス）。
【０１１９】
上述のようにして作製されたキメラ非ヒト動物は、少なくとも特定の細胞および／または組織において、導入した核酸配列（構造遺伝子もしくは第２遺伝子）が高発現する。発現した所望の蛋白質が、血液、乳などの分泌されるような系であれば、有用蛋白質の生産系として利用することができる。また、機能未知の蛋白質を高発現させた場合には、前記高発現に伴う所見から、当該蛋白質の機能を解明していくことができる。
【０１２０】
さらに近年、体細胞核移植胚からの動物個体作製法と体細胞におけるジーンターゲティングとを組み合わせて、マウス以外の動物種（ウシ、ヒツジ、ブタ等）でもマウス同様の遺伝子改変が可能になった（McCreathら、Nature, 405: 1066-1069, 2000）。例えば免疫グロブリン重鎖のノックアウトによりＢ細胞を欠損するウシを作製可能である。さらにマウス、ウシ、ヒツジ、ブタなどのIg遺伝子あるいはその近傍に導入遺伝子を挿入し、線維芽細胞の核を移植した未受精卵を発生させ、胚盤胞期胚よりＥＳ細胞を調製可能である。このＥＳ細胞と上記Ｂ細胞欠損宿主胚との間でキメラ非ヒト動物が作製可能であり（Cibelliら, Nature Biotechnol., 16: 642-646, 1998）、マウスだけでなくその他の動物種においても同様の発現系を利用した分泌蛋白質の高発現が可能である。大動物の利用により、遺伝子機能解析だけでなく有用物質生産への適用も考えられる。
【０１２１】
６．キメラ非ヒト動物の子孫の作製
本発明のキメラ非ヒト動物の作製方法は、さらに、それと同種の非ヒト動物と交配させて導入した核酸配列をヘテロにもつトランスジェニック（Ｔｇ）動物を選択して得、このＴｇ動物の雄と雌を交配させて導入遺伝子をホモにもつＴｇ動物子孫（ホモ接合体）を得ることを含む（山村研一ら編、トランスジェニック動物、1995年、共立出版社）。
【０１２２】
７．キメラ非ヒト動物またはその子孫に由来する組織または細胞
本発明においては、前記いずれかのキメラ非ヒト動物またはその子孫に由来する組織または細胞を得ることができる。該細胞または組織は、該細胞または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする核酸配列が配置されたゲノムを含み、所望の蛋白質を発現することができるものである。
【０１２３】
前記組織および細胞には、キメラ非ヒト動物またはその子孫に由来し、かつ所望の蛋白質を発現することができるものであればいずれの組織および細胞も含まれ、例えば、Ｂ細胞、脾臓、リンパ組織などが挙げられる。
【０１２４】
前記組織および細胞は、当技術分野で公知の手法により採取・培養することができ、該組織および細胞が所望の蛋白質を発現しているかどうかも慣例的な手法に従って確認することができる。このような組織および細胞は、以下で記載するハイブリドーマの作製、蛋白質の製造などに有用である。
【０１２５】
８．ハイブリドーマの作製
本発明においては、導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列を発現するキメラ非ヒト動物の細胞、特にＢ細胞もしくはＢ細胞を含む脾臓、リンパ節などのリンパ組織からの細胞と、増殖可能な腫瘍細胞（たとえばミエローマ細胞）とを融合することによって、ハイブリドーマを得ることができる。ハイブリドーマの作製法は、たとえば安東・千葉（単クローン抗体実験操作入門、講談社サイエンティフィク、1991）に記載される手法に基くことができる。
【０１２６】
ミエローマとしては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のない細胞を用いることができるが、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば8-アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）ミエローマ株P3X63Ag8U.1(P3-U1)［Yelton, D.E.ら, Current Topics in Microbiology and Immunology, 81: 1-7（1978）］、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1) ［Kohler, G.ら, European J. Immunology, 6:511-519 （1976）］、Sp2/O-Ag14(SP-2)［Shulman, M.ら, Nature, 276:269-270 （1978）］、P3X63Ag8.653(653)［Kearney, J. F.ら, J. Immunology, 123:1548-1550（1979）］、P3X63Ag8(X63)［Horibata, K. and Harris, A. W. Nature, 256:495-497 （1975）］などを用いることが好ましい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば8-アザグアニン培地［グルタミン、2-メルカプトエタノール、ゲンタマイシンおよびウシ胎児血清（以下「FCS」という）を加えたRPMI-1640培地に8-アザグアニンを加えた培地］ 、イスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；以下「IMDM」という）、またはダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle Medium；以下「DMEM」という）で継代培養するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地（例えば、10％ FCSを含むDMEM培地）で継代培養し、融合当日に２×107以上の細胞数を確保しておく。
【０１２７】
導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質を発現する細胞として使用可能なものは、プラズマ細胞（すなわち、形質細胞）、およびその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾臓、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、またはこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾細胞が最も一般的に用いられる。
【０１２８】
導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質を発現する脾細胞をミエローマと融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコールを用いる方法である。具体的には次のように行うことができる。脾細胞とミエローマとを無血清培地（例えばDMEM）、またはリン酸緩衝生理食塩液（一般にPBSと呼ばれる）でよく洗浄し、脾細胞とミエローマの細胞数の比が通常約５：１〜約10：１になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら１mlの50％(w/v)ポリエチレングリコール（分子量1000〜4000）を含む無血清培地を滴下する。その後、10mlの無血清培地をゆっくりと加えた後遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン液およびヒトインターロイキン-６を含む正常培地（一般にHAT培地と呼ばれる）中に懸濁して培養用プレートの各ウェルに分注し、５％炭酸ガス存在下、37℃で２週間程度培養する。培養途中に適宜HAT培地を補う。
【０１２９】
ミエローマ細胞が8-アザグアニン耐性株である場合、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）欠損株である場合には、融合しなかった該ミエローマ細胞、およびミエローマ細胞どうしの融合細胞は、HAT含有培地中では生存できない。一方、脾臓細胞どうしの融合細胞、あるいは、脾臓細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができるが、脾臓細胞どうしの融合細胞には寿命がある。従って、HAT含有培地中での培養を続けることによって、脾臓細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマのみが生き残る。
【０１３０】
得られたハイブリドーマは、前記の導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質に対して特異的な抗体によるELISAでスクリーニングすることにより、導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【０１３１】
９．所望の蛋白質性有用物質の製造方法
本発明はさらに、上記のキメラ非ヒト動物またはその子孫、あるいは上記の組織または細胞、あるいは上記のハイブリドーマのいずれかを用いて所望の蛋白質を産生させた後、該蛋白質を回収することを含む、所望の蛋白質を製造する方法を提供する。具体的に説明すると、キメラ非ヒト動物またはその子孫の個体を、導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列が発現しうる条件下で飼育し、その後発現産物である蛋白質を動物の血液、腹水などから回収することができる。あるいはまた、キメラ非ヒト動物またはその子孫に由来する組織または細胞、あるいはそれを不死化したもの（例えば、ミエローマ細胞との融合により不死化したハイブリドーマ）などを、導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列が発現しうる条件下で培養し、その後発現産物である蛋白質を培養物、培養上清などから回収することができる。発現産物は、遠心分離などの公知の方法に従って回収することができ、さらに硫安分画、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなど）、分取薄層クロマトグラフィー、HPLCなどの公知の方法の１種または複数の組み合わせによって精製することができる。
【０１３２】
10．生体内機能の解析方法
本発明はさらにまた、上記のキメラ非ヒト動物またはその子孫の表現型を、所望の蛋白質をコードする核酸配列(構造遺伝子、導入遺伝子もしくは第２遺伝子)を含まない対応の野生型分化多能性を有する細胞(例えばＥＳ細胞)より作製されたキメラ非ヒト動物などの表現型と比較し、それらの表現型の違いを決定することを含む、所望の蛋白質または所望の蛋白質をコードする遺伝子の生体内機能を解析する方法を提供する。
【０１３３】
本方法では、遺伝子導入に対応して生体内に現れる任意の形質を物理化学的方法によって検出し、これによって導入した核酸配列または蛋白質の生体内機能を同定することができる。たとえば、所望の蛋白質をコードする核酸配列を含むＥＳ細胞より作製されたキメラ非ヒト動物またはその子孫、および前記所望の蛋白質をコードする核酸配列を含まない対応の野生型のＥＳ細胞より作製されたキメラ非ヒト動物の血液を採取し、血球数測定機によって分析する。測定された白血球、赤血球、血小板などの血中濃度を前記２種のキメラ非ヒト動物間で比較することによって、導入した核酸配列によってコードされる該所望の蛋白質の血球系細胞の増殖・分化に対する作用を検討することができる。後述の実施例では、導入した核酸配列としてエリスロポエチン（EPO）をコードするDNAを用いたが、この場合、キメラマウスにおいて顕著な赤血球増加（形質）が観察された。
【０１３４】
以下に、本発明のさらに好ましい実施形態として、免疫グロブリン軽鎖遺伝子を利用したシステムを例に挙げて説明する。
【０１３５】
免疫グロブリン（Ig）は血清中に分泌される蛋白質の中でも最も大量に生産されるものの一つである。例えばヒトにおいては血清蛋白質の10〜20％を占め、その濃度は10〜100mg/mlに達する。IgはＢ細胞、主にその終末分化型であるプラズマ細胞において多量に生産されるが、Ig遺伝子座における高い転写活性、mRNAの安定性、蛋白質の分泌生産に特化したプラズマ細胞の機能など、様々な要因がそのIgの高レベルの発現に寄与している。さらに、成体において、Ｂ細胞は骨髄で発生し、成熟すると共に脾臓、小腸パイエル板、リンパ節など全身のリンパ組織に移行することから、Ｂ細胞のIg遺伝子の制御領域下で産生された導入遺伝子産物はIg同様に血中またはリンパ液中に放出され、全身に速やかに行き渡る。本発明においては、このような高発現をもたらすIgの発現系を利用して所望の蛋白質をコードする核酸配列（構造遺伝子、導入遺伝子もしくは第２遺伝子）を発現させることに利点を有する。
【０１３６】
導入遺伝子の効率的な発現のための導入遺伝子挿入箇所は、Ig軽鎖、好ましくはκ軽鎖が望ましいと考えられる。例えば、マウス免疫グロブリンの95％はκ軽鎖を含み、その定常領域遺伝子は１つしか存在しない。一方で、軽鎖λは５％であり、４種の異なる遺伝子が存在してそのいずれかが使用される。また、重鎖においても定常領域はμ、γ（４種）、α、δおよびεの計８種あり、通常、導入遺伝子の挿入は１箇所であることを考慮すると、κ鎖の利用が好ましい。
【０１３７】
発現形態としては、機能的なIg軽鎖が産生される条件でさらに導入した核酸配列が発現することが望ましい。本発明のキメラ非ヒト動物またはその子孫は、免疫グロブリン軽鎖遺伝子近傍に上記遺伝子のプロモーター部分を含み、さらにその下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列（導入遺伝子）が配置されてなる遺伝子発現ユニットをゲノム上に含むことが好ましい。免疫グロブリン軽鎖遺伝子近傍に上記遺伝子のプロモーター部分を含み、さらにその下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列（導入遺伝子）を含むように動物のゲノムを改変するために、ターゲティングベクターを準備し、このベクターDNAに該所望の蛋白質をコードする核酸配列を挿入する。このベクターとしては、CκP2ターゲティングベクター（実施例５参照）が好ましい。ターゲティングベクターは、免疫グロブリン軽鎖遺伝子近傍に上記遺伝子のプロモーター部分を含み、さらにその下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列（構造遺伝子、導入遺伝子もしくは第２遺伝子）を導入する核酸配列の挿入部位として適当な制限酵素切断部位が挿入され、該制限酵素切断部位には導入する核酸配列の開始コドンから終止コドンまでを含むDNA（cDNA、ゲノムDNA）が挿入される。また、好ましくは開始コドンの上流にコザック配列等の翻訳促進配列を配置することができる。さらに、相同組換え体を簡便に同定するために、外来遺伝子が挿入される位置に薬剤耐性遺伝子マーカー、好ましくはピューロマイシン耐性遺伝子をあらかじめ挿入しておくこともできる。
【０１３８】
１つの好ましい具体例として、マウスＥＳ細胞として免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子の下流約２５KbのRSエレメント領域に薬剤耐性マーカーが挿入されたＥＳ細胞を用いることでIgκ定常領域近傍に目的とする遺伝子を、ターゲティングベクターを用いて挿入する効率を上げることができる(図10)。
【０１３９】
ターゲティングベクターによる非ヒト動物ＥＳ細胞の形質転換は、相沢慎一（前記）等に記載された方法によって行うことができる。本出願人によって出願されたPCT国際出願WO 00/10383号（2000年３月２日国際公開）に記載された方法と同様に、ピューロマイシン耐性クローンをピックアップし、ゲノムDNAを調製し、サザン解析法により相同組換え体を同定する。ターゲティングベクター中のピューロマイシン耐性遺伝子はWO 00/10383号に記載されたLox-P Puroプラスミドに由来し、その両端に順方向にLox-P配列を含んでいる。よってWO 00/10383号に記載された方法で同耐性遺伝子を遺伝子導入されたＥＳ細胞から除去することができる。
【０１４０】
本発明において、免疫グロブリン軽鎖遺伝子を利用する場合、ＥＳ細胞注入のための欠損宿主胚としては、WO 00/10383号に記載された免疫グロブリン重鎖遺伝子破壊についてホモである非ヒト動物系統を用いることが好ましい。
【０１４１】
作製した遺伝子導入ＥＳ細胞を、上記欠損宿主胚の胚盤胞期胚または８細胞期胚に毛細管などを用いて注入する。この胚盤胞期胚または８細胞期胚を、直接同種の仮親非ヒト動物の卵管に移植するか、一日培養して胚盤胞まで発生したものを該仮親の子宮に移植する。その後、仮親を飼育出産させることにより、仔動物を得る。
【０１４２】
キメラ非ヒト動物においては、宿主胚由来の成熟Ｂリンパ球は存在せず、遺伝子導入ＥＳ細胞由来のもののみ存在する。これは、宿主胚として用いる免疫グロブリン重鎖ノックアウト非ヒト動物は、成熟Ｂリンパ球（B220陽性）を欠損し、血中に免疫グロブリンが検出されないことによる（Tomizukaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:722-727, 2000）。遺伝子導入ＥＳ細胞の貢献による、キメラ非ヒト動物における成熟Ｂリンパ球および抗体産生の回復は、FACS解析、ELISA法等によって検出可能である。ノックインＥＳ細胞由来Ｂ細胞において挿入した核酸配列が発現するかどうかは、挿入したアレル（対立遺伝子ともいう）のIg軽鎖遺伝子において、部位特異的組換え反応が起こるかどうかに依存している。すなわち挿入アレルのIg軽鎖遺伝子の組換えが成功し、そのmRNAが機能的な軽鎖をコードする場合、mRNA上に同時に存在する挿入核酸配列（構造遺伝子）もIRESの働きにより蛋白質に翻訳される。さらに、挿入アレルのκ鎖遺伝子の組換えが失敗し、もう一方のアレルのκ鎖あるいはλ鎖が機能的な軽鎖をコードする場合でも、非機能的なκ鎖および導入核酸配列をコードするmRNAの転写は起こるため、挿入核酸配列由来の蛋白質は発現する。挿入核酸配列の発現が起こらないのは、もう一つのアレルのκ鎖あるいはλ鎖が先に機能的な組換えに成功し、挿入アレルのIgκ鎖の組換えが対立遺伝子排除の機構によりシャットオフされる場合である。非ヒト動物においてＢ細胞は胎生12日目頃より胎児肝組織に出現するが、出生と共に発生の場は骨髄に移動する。胎児期においてはＢ細胞は発生の初期段階、すなわち膜型免疫グロブリン受容体を発現する細胞が主体である。成体と比較してＢ細胞自体の数が少ないことおよび膜型Igを主に発現する細胞では免疫グロブリンをコードするmRNA量自体が少ないことによって、挿入核酸配列の発現も成体と比較して非常に少ないと考えられる。抗体産生は離乳期（３週齢）より増加するが、終末分化段階であるプラズマ細胞の増加によるものと想像される。以後、Ｂ細胞は、脾臓、リンパ節、小腸パイエル板などのリンパ組織に移動して抗体および挿入核酸配列を発現する。挿入核酸配列がコードする所望の蛋白質は免疫グロブリン同様、血液やリンパ液中に分泌され、全身に行き渡る。
【０１４３】
導入核酸配列のＢ細胞における発現は以下のようにして確認される。導入遺伝子によるmRNAの発現は例えば脾臓、末梢血有核細胞など、Ｂ細胞を含む組織や細胞集団由来RNAを用いたRT-PCR法、ノーザンブロット法などにより検出される。蛋白質レベルの発現は、導入核酸配列がコードする所望の蛋白質に対する特異的抗体が既にある場合は、キメラマウス血清を用いた酵素免疫測定法、ウエスタンブロット法等を利用して検出できる。また、導入核酸配列をコードするDNAを適当に改変して抗体で検出可能なタグペプチドを付加すれば、該タグペプチドに対する抗体等で導入核酸配列の発現を検出できる。
【０１４４】
上述のようにして得られたキメラ非ヒト動物は、効率よくかつ確実に導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列(構造遺伝子もしくは第２遺伝子)を高発現する。この効率の高さは、前述したが、主として以下の点に基づく：
（１）Ｂリンパ球欠損宿主胚の利用によって、キメラ非ヒト動物のＢリンパ球がキメラ率に関わらず全てES細胞などの分化多能性細胞に由来する。
（２）非ヒト動物の免疫グロブリン遺伝子(例えば、マウスκ軽鎖遺伝子)の下流約100Kb以下、好ましくは50Kb以下、さらに好ましくは30Kb以下の領域(例えば、κ軽鎖遺伝子の下流約25KbのRSエレメント領域)にエンハンサー（＋薬剤耐性マーカー）が挿入されたES細胞などの分化多能性細胞を用いることで該免疫グロブリン遺伝子近傍における相同組換え率が30％以上、40％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは60％以上の効率で起こる。
（３）免疫グロブリンの発現系を利用している。
（４）免疫グロブリンの発現は発生初期には非常に少なく、離乳期以降に爆発的な増加を示すため、高発現が胚性致死をもたらすような遺伝子を導入する場合でも、成体における機能を検討することができる。
【０１４５】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
【実施例１】
【０１４６】
マウスRSエレメントターゲティング用ベクターpBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3’KO-5’KOの作製
（１）KO基本ベクターpBlueLAB-LoxP-Neo-DT-Aの作製
ベクターに新たな制限酵素サイトを付加するため以下のDNAを合成した。
LinkA1:TCGAGTCGCGACACCGGCGGGCGCGCCC（配列番号１）
LinkA2:TCGAGGGCGCGCCCGCCGGTGTCGCGAC（配列番号２）
LinkB1:GGCCGCTTAATTAAGGCCGGCCGTCGACG（配列番号３）
LinkB2:AATTCGTCGACGGCCGGCCTTAATTAAGC（配列番号４）
【０１４７】
pBluescript II SK(-)（東洋紡）を制限酵素SalIおよびXhoIで処理した反応液をフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿した。プラスミドに新たな制限酵素サイトNruI、SgrAIおよびAscIを付加するため、LinkA1およびLinkA2を合成した。この２つのオリゴDNAからなるリンカーを制限酵素処理したプラスミドに挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpBlueLAを取得した。
【０１４８】
続いて、PBlueLAを制限酵素NotIおよびEcoRIで処理した反応液をフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿した。プラスミドに新たな制限酵素サイトPacI、FseIおよびSalIを付加するため、LinkB1およびLinkB2を合成した。この２つのオリゴDNAからなるリンカーを制限酵素処理したプラスミドに挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpBlueLABを取得した。
【０１４９】
WO 00/10383号（前掲）に記載されたpLoxP-STneoプラスミドをXhoI消化し、両端にLoxP配列を持つNeo耐性遺伝子（LoxP-Neo）を取得した。LoxP-Neoの両末端をT4 DNAポリメラーゼを用いて平滑化し、LoxP-Neo-Bを取得した。
【０１５０】
上記pBlueLABをEcoRV消化後、反応液をフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、LoxP-Neo-Bを挿入した後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpBlueLAB-LoxP-Neoを取得した。
【０１５１】
pMC1DT-A（ライフテックオリエンタル株式会社）をXhoIおよびSalI消化後、0.8％アガロースゲルにアプライし、約１Kbのバンドを分離回収し、QIAquick Gel Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い添付文書にしたがってDT-Aフラグメントを回収した。
【０１５２】
pBlueLAB-LoxP-NeoをXhoI消化後、反応液をフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、DT-Aフラグメントを挿入した後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、KO基本ベクターpBlueLAB-LoxP-Neo-DT-Aを取得した。
【０１５３】
（２）マウスRSエレメント5’上流ゲノム領域断片の取得
GenBank(米国NCBI)より取得したマウスRSエレメント遺伝子近傍ゲノムDNA配列より以下のDNA（プライマー）を合成した。
RS5’FW3：ATAAGAATGCGGCCGCAAAGCTGGTGGGTTAAGACTATCTCGTGAAGTG（配列番号５）
RS5’RV3：ACGCGTCGACTCACAGGTTGGTCCCTCTCTGTGTGTGGTTGCTGT    （配列番号６）
【０１５４】
KOD-plus-(東洋紡)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μl反応液中に上記2種のプライマー各10pmol、鋳型としてBACクローンRP23-434I4（GenBank Accession Number：AC090291）由来のDNAを添加し、94℃２分保温した後、94℃15秒および68℃5分を1サイクルとして33サイクル増幅し、得られた5kbの増幅断片を0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたPCR増幅断片をNotIおよびSalIで酵素消化し、0.8％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
【０１５５】
pBlueLABをNotIおよびSalI消化した後、反応液をフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、上記回収されたDNA断片を挿入し、それを大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調整し、挿入断片のシーケンスを行った。PCRに起因する変異が無いクローンを選択しNotIおよびSalI消化して得られる5kbの断片を、0.8％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
【０１５６】
（３）マウスRSエレメント3’下流ゲノム領域断片の取得
GenBank(米国NCBI)より取得したマウスRSエレメント遺伝子近傍ゲノムDNA配列より以下のDNA（プライマー）を合成した。
RS3’FW2：TTGGCGCGCCCTCCCTAGGACTGCAGTTGAGCTCAGATTTGA       （配列番号７）
RS3’RV3：CCGCTCGAGTCTTACTGTCTCAGCAACAATAATATAAACAGGGG     （配列番号８）
【０１５７】
KOD-plus-(日本国東洋紡)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50ul反応液中に上記2種のプライマー各10pmol、鋳型としてBACクローンRP23-434I4（GenBank Accession Number：AC090291）由来のDNAを添加し、94℃２分保温した後、94℃15秒および68℃2分を1サイクルとして33サイクル増幅し、得られた2kbの増幅断片を0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたPCR増幅断片をAscIおよびXhoIで酵素消化し、0.8％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
【０１５８】
pBlueLABをAscIおよびXhoI消化した後、反応液をフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、上記回収されたDNA断片を挿入し、それを大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、挿入断片のシーケンスを行った。PCRに起因する変異が無いクローンを選択しAscIおよびXhoI消化して得られる2kbの断片を、0.8％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
【０１５９】
（４）基本ベクターへのマウスRSエレメント3’下流ゲノム領域断片の挿入
pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-AをAscIおよびXhoIで消化後、得られる約7.6 KbのDNA断片を0.8％アガロースゲルより分離精製したものに、（３）で作製したゲノム断片を挿入した後、大腸菌XL10-Gold Ultracompetent Cells（米国STRATAGENE）に導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、連結部分の塩基配列の確認を行った。
【０１６０】
（５）マウスRSエレメント3’下流ゲノム領域断片を持つKO基本ベクターへのマウスRS領域5’上流ゲノム領域断片の挿入
（４）で得られたプラスミドをNotIおよびSalI消化後、得られる9.6kbのDNA断片を0.8％アガロースゲルより分離精製したものに、（２）で作製したゲノム断片を挿入した後、大腸菌XL10-Gold Ultracompetent Cells（米国STRATAGENE）に導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、連結部分の塩基配列の確認して、マウスRSエレメントターゲティング用ベクターpBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3’KO-5’KOを取得した。
【実施例２】
【０１６１】
Electroporation用マウスRSエレメントターゲティングベクターの調製
pBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3’KO-5’KO 60μgを、スペルミジン添加（１mM pH7.0米国シグマ）バッファー（ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Ｈバッファー）を用い、NotIを用いて37℃で５時間消化し、フェノール/クロロホルム抽出後、2.5容量の100％エタノール、および0.1容量の３M酢酸ナトリウムを加え、-20℃で16時間保存した。NotIで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、70％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で70％エタノールを除き、１時間風乾させた。0.5μg/μLのDNA溶液となるようにHBS溶液を加え、１時間室温で保存し、Electroporation用マウスRSエレメントターゲティング用ベクターpBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3’KO-5’KO -NotI（図１）の調製を行なった。
【実施例３】
【０１６２】
ゲノムサザン解析用プローブの調製
BACクローンRP23-434I4（GenBank Accession Number：AC090291）を用いた塩基配列情報を基に、5’KOの上流域573merを含むオリゴDNAを取得するため以下のDNAを合成した。
RS5’Southern FW1：CATACAAACAGATACACACATATAC（配列番号９）
RS5’Southern RV2：GTCATTAATGGAAGGAAGCTCTCTA（配列番号１０）
【０１６３】
Takara Z Taq （宝酒造）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μL反応液中に上記２種のプライマー各10pmol、鋳型としてクローン番号RP23-434IのBAC由来DNAを添加し、94℃２分保温したのち、94℃30秒、60℃20秒、および72℃１分を１サイクルとして25サイクル増幅し、得られた573merの増幅断片を0.8％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い添付文書にしたがって５'側ゲノムサザン用プローブ、５'KO-probを回収した。
【０１６４】
BACクローンRP23-434I4（GenBank Accession Number：AC090291）を用いた塩基配列情報を基に、3’KOの下流域600merを含むオリゴDNAを取得するため以下のDNAを合成した。
RS3’Southern FW1：TCTTACTAGAGTTCTCACTAGCTCT（配列番号１１）
RS3’Southern RV2：GGAACCAAAGAATGAGGAAGCTGTT（配列番号１２）
【０１６５】
Takara Z Taq （宝酒造）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μL反応液中に上記２種のプライマー各10pmol、鋳型としてクローン番号RP23-434IのBAC由来DNAを添加し、94℃２分保温したのち、94℃30秒、60℃20秒、および72℃１分を１サイクルとして25サイクル増幅し、得られた600merの増幅断片を0.8％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い添付文書にしたがって３'側ゲノムサザン用プローブ、３’KO-probを回収した。
【実施例４】
【０１６６】
RSエレメント・ターゲティング・マウスES細胞の取得
相同組換えにより、RSエレメント・ターゲティング・マウスES細胞の取得のため、実施例２において作製したpBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3’KO-5’KOを制限酵素NotI（日本国宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、1995）に従ってマウスＥＳ細胞TT2F（Yagiら、Analytical Biochem., 214:70, 1993）へ導入した。
【０１６７】
TT2Fの培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したG418耐性初代培養細胞（インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたTT2F細胞をトリプシン処理し、３×107個／mlとなるようにHBSに懸濁した。その後、0.5mlの細胞懸濁液を10μgのベクターDNAと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：0.4cm、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：960μF、電圧：240V、室温）。エレクトロポレーションした細胞を10mlのＥＳ培地に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した100mm組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。24時間後に200μg/mlのネオマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを24穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その2/3を0.2mlの保存用培地（ＥＳ培地＋10％DMSO、米国シグマ）に懸濁し、-80℃にて保存した。残りの1/3は12穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して106〜107個の細胞からゲノムDNAをPuregene DNA Isolation Kits（米国Gentra System社）により調製した。
【０１６８】
これらネオマイシン耐性TT2F細胞ゲノムDNAを制限酵素EcoRI（宝酒造）で消化し、0.8％アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ターゲティングベクター３'相同領域の下流に位置するDNA断片（３'KO-prob、実施例３参照、図２）をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型TT2F細胞ではEcoRI消化により、1本のバンド（約5.7 Kb）が検出された。相同組換え体においては、２本のバンド（約5.7Kbと約7.4Kb）が検出されることが予想されたが、ネオマイシン耐性株において約7.4Kbの新たなバンドが確認された。更に、3’KO-probによるサザン解析で相同組換えが確認されたクローンのゲノムDNAを制限酵素PstI（酒酒造）で消化し、0.8％アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ターゲティングベクター５'相同領域の上流に位置するDNA断片（５'KO-prob、実施例３参照、図２）をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型TT2F細胞ではPstI消化により、1本のバンド（約6.1 Kb）が検出された。相同組換え体においては、２本のバンド（約6.7Kbと約6.1Kb）が検出されることが予想されたが、ネオマイシン耐性株において約6.7Kbの新たなバンドが確認された。すなわち、これらのクローンはマウスRSエレメントを含む近傍染色体領域を欠失し、代わりにネオマイシン耐性遺伝子（SV40エンハンサーを含み、また両端にはターゲティングベクター由来の制限酵素サイト部位を含む。）が挿入されたものである。3’および5’KO-probによるサザン解析の結果、pBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3’KO-5’KOを制限酵素NotIで線状化した場合には72株中9株（12.5％）が相同組換え体であるという結果を得た。
【０１６９】
取得されたRSエレメント・ターゲティング・マウスES細胞の核型解析を記載（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、1995）の方法に従い実施し、取得されたES細胞に異常核型が検出されないことを確認した。
【実施例５】
【０１７０】
CκP2ターゲティングベクターの作製
（１）クローニング部位近傍断片の作製
マウス免疫グロブリンカッパ鎖（Igκ）定常領域遺伝子下流にマウス免疫グロブリンκ鎖プロモーター（P2プロモーター）、制限酵素認識配列（SalI, Fse I, Nhe I認識配列）、マウス免疫グロブリンκ鎖PolyAシグナル領域およびピューロマイシン耐性遺伝子発現ユニットが上に記載された順番に導入されたゲノム断片を作製した。以下にその方法を具体的に記す。
【０１７１】
（１．１）クローニング部位上流の断片の調製
GenBank（米国NCBI）より取得したマウスIgGκ遺伝子配列より以下のDNAを合成した。
igkc1：atctcgaggaaccactttcctgaggacacagtgatagg（配列番号１３）
igkc2：atgaattcctaacactcattcctgttgaagctcttgac（配列番号１４）
【０１７２】
5’側プライマーであるigkc1の末端にはXhoI認識配列を、3’側プライマーであるigkc2にはEcoRI認識配列を付加した。TakaLa LA-Taq（日本国宝酒造）の添付文書にしたがって反応液を調製し、50μL反応液中にプライマー各10pmolおよび鋳型としてIg軽鎖Cκ-Jκを含むλクローン由来DNA断片をpBluescript SKII(+)（日本国東洋紡）クローニングしたもの（WO 00/10383号）25ngを添加し、94℃で１分保温したのち、94℃30秒および68℃３分を１サイクルとして25サイクル増幅した。得られた反応液をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した後、EcoRIおよびXhoIで消化し、0.8％アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いて目的の断片を回収して増幅断片Ａを得た。EcoRIおよびXhoIで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したpBluescript2 KS-ベクター（米国ストラタジーン）に該増幅断片Ａを挿入し、それを大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、塩基配列を確認し、プラスミドpIgCκAを取得した。
【０１７３】
（１．２）クローニング部位下流の断片の調製
GenBank（米国NCBI）より取得したマウスIgGκ遺伝子配列より以下のDNAを合成した。
igkc3：atgaattcagacaaaggtcctgagacgccacc（配列番号１５）
igkc4：atggatcctcgagtcgactggatttcagggcaactaaacatt（配列番号１６）
【０１７４】
5’側プライマーであるigkc3の末端にはEcoRI認識配列を、3’側プライマーであるigkc4にはプライマーの5’側からBamHI、XhoIおよびSalI認識配列を付加した。TakaLa LA-Taq（日本国宝酒造）の添付文書にしたがって反応液を調製し、50μL反応液中にプライマー各10pmolおよび鋳型としてIg軽鎖Cκ-Jκを含むλクローン由来DNA断片をpBluescript SKII(+)（日本国東洋紡）クローニングしたもの（WO 00/10383号）25ngを添加し、94℃で１分保温したのち、94℃30秒、55℃30秒および72℃１分を１サイクルとして25サイクル増幅した。得られた反応液をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した後、EcoRIおよびBamHIで消化し、0.8％アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いて目的の断片を回収して増幅断片Ｂを得た。EcoRIおよびBamHIで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したpIgCκAベクターに得られた増幅断片Ｂを挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、塩基配列を確認し、プラスミドpIgCκABを取得した。
【０１７５】
（２）ピュ−ロマイシン耐性遺伝子の導入
Lox-P Puroプラスミド（WO 00/10383号）をEcoRIおよびXhoIで消化し、T4DNAポリメラーゼを用いて末端を平滑化した。0.8％アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いてloxP-ピューロマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片を回収した。pIgCκABをSalIで消化して末端平滑化したプラスミドに、得られたloxP-ピューロマイシン耐性遺伝子断片を挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、連結部分の塩基配列を確認し、プラスミドpIgCκABPを取得した。
【０１７６】
（３）IRES遺伝子の導入
GenBank（米国NCBI）より取得したencephalomyocarditis virus（脳心筋炎ウイルス）由来のIRES遺伝子配列より以下のDNAを合成した。
eIRESFW：atgaattcgcccctctccctccccccccccta（配列番号１７）
esIRESRV：atgaattcgtcgacttgtggcaagcttatcatcgtgtt（配列番号１８）
【０１７７】
5’側プライマーであるeIRESFWの末端にはEcoRI認識配列を、3’側プライマーであるesIRESRVにはプライマーの5’側からEcoRIおよびSalI認識配列を付加した。TakaLa LA-Taq（宝酒造）の添付文書にしたがって反応液を調製し、50μL反応液中にプライマー各10pmolおよび鋳型としてpIREShygプラスミド（米国クロンテック）150ngを添加し、94℃で１分保温したのち、94℃30秒、55℃30秒および72℃１分を１サイクルとして25サイクル増幅した。得られた反応液を0.8％アガロースゲル電気泳動にかけてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いて目的の断片を回収した。pGEM-Tベクター（米国プロメガ）に得られたDNA断片を挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、塩基配列を確認し、プラスミドIRES-Sal/ pGEMを取得した。このプラスミドをEcoRIで消化し、0.8％アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いて目的の断片を回収した。pIgCκABPをEcoRIで消化したプラスミドに、得られたIRES遺伝子を挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、連結部分の塩基配列を確認し、プラスミドpIgCκABPIRESを取得した。
【０１７８】
（４）pΔCκSalプラスミドの作製
WO 00/10383号に記載されている免疫グロブリン遺伝子κ軽鎖ターゲティング用ターゲティングベクタープラスミドをSacIIで消化した後、EcoRIを用いて部分消化した。0.8％アガロースゲル電気泳動にてLoxP-PGKPuro部分を切り出した残りの14.6KbのDNAを分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いて回収した。得られたDNAに以下の合成DNAを挿入することにより、SalI認識配列を導入した。
Sal1plus：agtcgaca
Sal1minus：aatttgtcgactgc（配列番号19）
得られたプラスミドを大腸菌DH5αに導入し、得られた形質転換体よりDNAを調製し、プラスミドpΔCκSalを取得した。
【０１７９】
（５）pKIκプラスミドの作製
上記（３）で得られたpIgCκABPIRESプラスミドをXhoIで消化し、0.8％アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いてCκ-IRES-loxP-ピューロマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片を回収した。上記（２）で作製されたpCκSalをSalIで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、前記DNA断片を挿入し、それを大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、連結部分の塩基配列を確認して、プラスミドpKIκを取得した。
【０１８０】
(６) CκΔIRES断片の作製
上記（３）で得られたpIgCκABPIRESプラスミドをEcoRIとBglIIで部分消化し、0.8％アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いてIRES部分を削除したDNA断片（IgCκΔIRES断片）を回収した。
【０１８１】
（７）Ｐ２プロモーター断片の調製
GenBank（米国NCBI）より取得したマウスIgκプロモーター領域遺伝子配列より以下のDNAを合成した。
P2F：CCCAAGCTTTGGTGATTATTCAGAGTAGTTTTAGATGAGTGCAT（配列番号20）
P2R：ACGCGTCGACTTTGTCTTTGAACTTTGGTCCCTAGCTAATTACTA（配列番号21）
【０１８２】
5’側プライマーであるP2FにはHind III認識配列を、3’側プライマーであるP2RにはSalI認識配列を付加した。マウスゲノムDNAを鋳型として、KOD plus（東洋紡）により増幅されたDNA断片をフェノールクロロフォルム抽出後、エタノール沈殿で回収した。回収されたDNA断片をHind IIIおよびSalIで消化し、0.8％アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いて回収した。Hind IIIおよびSalIで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したpBluescript IIKS-ベクター（米国Stratagene社）に回収された増幅断片を挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、塩基配列を確認し、Igκプロモーター領域遺伝子配列を含むプラスミドを取得した。得られたプラスミドをHind IIIおよびSalIで消化した後、0.8％アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いてＰ２プロモーター断片を回収した。
【０１８３】
（８）部分長CκpolyA断片の作製
GenBank（米国NCBI）より取得したマウスIgCκpolyA領域遺伝子配列より以下のDNAを合成した。
PPF:ACGCGTCGACGCGGCCGGCCGCGCTAGCAGACAAAGGTCCTGAGACGCCACCACCAGCTCCCC（配列番号22）
PPR：GAAGATCTCAAGTGCAAAGACTCACTTTATTGAATATTTTCTG（配列番号23）
【０１８４】
5’側プライマーであるPPFにはSalI、 FseI、 NheI認識配列を、3’側プライマーであるPPRにはBglII認識配列を付加した。マウスゲノムDNAを鋳型として、KOD plus（日本国東洋紡）により増幅されたDNA断片をフェノールクロロフォルム抽出後、エタノール沈殿で回収した。回収されたDNA断片をSalIおよびBglIIで消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いて回収した。SalIおよびBglIIで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したpSP72ベクター（米国Promega社）に回収された増幅断片を挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、塩基配列を確認し、部分長CκpolyA領域遺伝子配列を含むプラスミドを取得した。得られたプラスミドをSalIおよびBglIIで消化した後、0.8％アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いて部分長CκpolyA断片を回収した。
【０１８５】
（９）完全長CκpolyA断片の作製
GenBank（米国NCBI）より取得したマウスIgCκpolyA領域遺伝子配列より以下のDNAを合成した。
TPF: GGAATTCAGACAAAGGTCCTGAGACGCCACCACCAGCTCCCC（配列番号24）
TPR: CCCAAGCTTGCCTCCTCAAACCTACCATGGCCCAGAGAAATAAG（配列番号25）
【０１８６】
5’側プライマーであるTPFにはEcoRI認識配列を、3’側プライマーであるTPRにはHindIII認識配列を付加した。マウスゲノムDNAを鋳型として、KOD plus（日本国東洋紡）により増幅されたDNA断片をフェノールクロロフォルム抽出後、エタノール沈殿で回収した。回収されたDNA断片をEcoRIおよびHindIIIで消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いて回収した。EcoRIおよびHindIIIで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したpBluescript IIKS-ベクター（米国Stratagene社）に回収された増幅断片を挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、塩基配列を確認し、完全長CκpolyA領域遺伝子配列を含むプラスミドを取得した。得られたプラスミドをEcoRIおよびHindIIIで消化した後、0.8％アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いて完全長CκpolyA断片を回収した。
【０１８７】
(1０) 完全長CκpolyA断片、P2プロモーター断片、部分長CκpolyA断片から構成されるDNA断片Aの作製
EcoRIおよびBglIIで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したpBluescript IIKS-ベクター（米国Stratagene社）に完全長CκpolyA断片、P2プロモーター断片、部分長CκpolyA断片を挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、完全長CκpolyA断片、P2プロモーター断片、部分長CκpolyA断片の順番にDNA断片が挿入されていることを塩基配列のレベルで確認し、DNA断片A遺伝子配列を含むプラスミドを取得した。得られたプラスミドをEcoRIとBglIIで消化した後、0.8％アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いてDNA断片Aを回収した。
【０１８８】
(１１) pIgCκΔIRES ProAプラスミドの作製
大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したpIgCκΔIRES断片にDNA断片Aを挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、DNA断片Aが挿入されていることを塩基配列のレベルで確認し、DNA断片A遺伝子配列を含むpIgCκΔIRES ProAプラスミドを取得した。
【０１８９】
(１２) CκP2Hプラスミドの作製
pIgCκΔIRES ProAプラスミドをXhoIで消化した後、0.8%アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いてIgCκ上流ゲノム領域、IgCκ、DNA断片A、Lox-P Puro断片より構成されるDNA断片を回収した。SalIで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したpΔCκSalIに回収したDNA断片を挿入し、大腸菌XL10-GOLD（米国Stratagene社）に導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、IgCκ上流ゲノム領域、IgCκ、DNA断片A、Lox-P Puro断片より構成されるDNA断片が挿入されていることを塩基配列のレベルで確認し、CκP２Hプラスミドを取得した。
【０１９０】
(１３) Cκ5’genomicプラスミドの作製
GenBank（米国NCBI）より取得したマウスIgCκ及び上流ゲノム領域遺伝子配列より以下のDNAを合成した。
5GF:ATAAGAATGCGGCCGCCTCAGAGCAAATGGGTTCTACAGGCCTAACAACCT（配列番号26）
5GR: CCGGAATTCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGG（配列番号27）
【０１９１】
5’側プライマーである5GFにはNotI認識配列を、3’側プライマーである5GRにはEcoRI認識配列を付加した。マウスゲノムDNAを鋳型として、KOD plus（日本国東洋紡）により増幅されたDNA断片をフェノールクロロフォルム抽出後、エタノール沈殿で回収した。回収されたDNA断片をNotIおよびEcoRIで消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動にてDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いて回収した。NotIおよびEcoRIで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したpBluescript IIKS-ベクター（米国Stratagene社）に回収された増幅断片を挿入し、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、塩基配列を確認し、Cκ5’genomic領域遺伝子配列を含むCκ5’genomicプラスミドを取得した。
【０１９２】
(１４) CκP2KIΔDTプラスミドの作製
CκP2HプラスミドをEcoRIおよびXhoIで消化した後、0.8%アガロースゲル電気泳動にて11KbのDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いて5’末端にEcoRIサイトを3’末端にXhoIサイトを持つDNA断片を回収した。EcoRIおよびXhoIで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したCκ5’genomicプラスミドに回収したDNA断片を挿入し、大腸菌XL10-GOLD（米国Stratagene社）に導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、回収された断片がCκ5’genomicプラスミドに挿入されていることを塩基配列のレベルで確認し、CκP2KIΔDTプラスミドを取得した。
【０１９３】
(１５) DT-A断片の調製
pKIκプラスミドをXhoIおよびKpnIで消化した後、0.8%アガロースゲル電気泳動にて約1KbのDNA断片を分離し、ジーンクリーンII（米国Bio101）を用いてDT-A断片を取得した。
【０１９４】
(１６) CκP2ターゲティングベクターの作製
XhoIおよびKpnIで消化した後、大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化したCκP2KIΔDTプラスミドにDT-A断片を挿入し、大腸菌XL10-GOLD（米国Stratagene社）に導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、DT-A断片がCκP2KIΔDTプラスミドに挿入されていることを塩基配列のレベルで確認し、CκP2ターゲティングベクター（図３）を取得した。
【実施例６】
【０１９５】
CκP2ターゲティングベクターへのヒトEPO遺伝子の挿入
（1）ヒトErythropoietin DNA断片の作製
hEPO Np：CCGCTCGAGCGGCCACCATGGGGGTGCACGAATGTCCTG（配列番号28）
hEPO Rp：CCGCTCGAGCGGTCATCTGTCCCCTGTCCTGCA（配列番号29）
【０１９６】
KOD-plus-(日本国東洋紡)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50ul反応液中に上記2種のプライマー各10pmol、鋳型としてヒトEPO cDNAを添加し、94℃２分保温した後、94℃15秒および68℃1分を1サイクルとして30サイクル増幅し、得られた580bpの増幅断片を0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたPCR増幅断片をXhoIで酵素消化し、0.8％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
【０１９７】
pBluescriptIISK(-)（米国STRATAGENE）をXhoI消化し、0.8％アガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記回収されたDNA断片を挿入し、それを大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調整し、挿入断片のシーケンスを行った。PCRによる変異の無いクローンを選択しXhoI消化した後、0.8％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い添付文書にしたがってヒトErythropoietin DNA断片を回収した。
【０１９８】
（2）ヒトEPOターゲティングベクターの構築
CκP2ターゲティングベクターをSalIで消化後、仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、（1）で作製したヒトErythropoietin DNA断片を挿入した後、大腸菌XL10-Gold Ultracompetent Cells（米国STRATAGENE）に導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、連結部分の塩基配列の確認して、ヒトEPOターゲティングベクター(図４)を取得した。
【実施例７】
【０１９９】
Electroporation用ヒトEPOターゲティングベクターの調製
ヒトEPOターゲティングベクター60μgを、スペルミジン添加（１mM pH7.0米国シグマ）バッファー（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Ｈバッファー）を用い、XhoIを用いて37℃で５時間消化し、フェノール/クロロホルム抽出後、2.5容量の100％エタノール、および0.1容量の３M酢酸ナトリウムを加え、-20℃で16時間保存した。NotIで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、70％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で70％エタノールを除き、１時間風乾させた。0.5μg/μLのDNA溶液となるようにHBS溶液を加え、１時間室温で保存し、Electroporation用ヒトEPOターゲティングベクターの調製を行なった。
【実施例８】
【０２００】
ヒトEPO遺伝子導入ＥＳ細胞株の取得
マウスES細胞は通常以下に記すような方法で樹立することができる。雌雄マウスを交配することにより得られる受精後２．５日の胚を採取し、ES細胞用培地中でインビトロ培養し、該培養胚のうち胚盤胞まで発生が進んだ胚を分離し、そして該胚を、フィーダー細胞培地中に播種して培養し、該培養胚からES様形態で生育しているものの細胞塊をトリプシンを含有するES細胞用培地を用いて分散処理、及び、フィーダー細胞培地を用いて培養し、更にはES細胞用培地を用いて継代培養し増殖する細胞を単離する。
【０２０１】
ヒトEPO-cDNAが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたマウスＥＳ細胞株取得のため、実施例6で作製したヒトEPOターゲティングベクターを制限酵素NotI（宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995）に従ってマウスＥＳ細胞TT2F（Yagiら、Analytical Biochem., 214:70, 1993）へ導入した。
【０２０２】
マウスＥＳ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したG418耐性初代培養細胞（インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたTT2F細胞をトリプシン処理し、３×107個／mlとなるようにHBSに懸濁してから、0.5mlの細胞懸濁液を10μgのベクターDNAと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：0.4cm、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：960μF、電圧：240V、室温）。エレクトロポレーションした細胞を10mlのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した100mm組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。36時間後に0.8μg/mlのピューロマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーのうち計89個をピックアップし、それぞれを24穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その2/3を0.2mlの保存用培地（ＥＳ培地＋10％DMSO、米国シグマ）に懸濁し、-80℃にて保存した。残りの1/3は12穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して106〜107個の細胞からゲノムDNAをPuregene DNA Isolation Kits（米国Gentra System社）により調製した。
【０２０３】
これらのピューロマイシン耐性マウスＥＳ細胞ゲノムDNAを制限酵素EcoRI（宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、WO 00/10383号（実施例48参照）に記載の発明で使用された、Ig軽鎖Jκ-CκゲノムDNAの3’端のDNA断片（XhoI〜EcoRI、約1.4kb、図５）をプローブとして相同組換え体を検出した。その結果、89株中15株（16.9％）が相同組換え体であるという結果を得た。野生型TT2F細胞ではEcoRI消化により、１本のバンドが検出された。相同組換え体においては、このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想される（WO 00/10383号（実施例58参照））が、ピューロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認された。すなわち、これらのクローンは一方のアレルの免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトEPO-cDNAが挿入されたものである。
【実施例９】
【０２０４】
RSエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株を用いたヒトEPO遺伝子導入ＥＳ細胞株の取得
ヒトEPO-cDNAが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたマウスＥＳ細胞株取得のため、実施例７で作製したヒトEPOターゲティングベクターを制限酵素NotI（宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995）に従ってRSエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞へ導入した。
【０２０５】
RSエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したG418耐性初代培養細胞（インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたTT2F細胞をトリプシン処理し、３×107個／mlとなるようにHBSに懸濁してから、0.5mlの細胞懸濁液を10μgのベクターDNAと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：0.4cm、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：960μF、電圧：240V、室温）。エレクトロポレーションした細胞を10mlのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した100mm組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。36時間後に0.8μg/mlのピューロマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーのうち計24個をピックアップし、それぞれを24穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その2/3を0.2mlの保存用培地（ＥＳ培地＋10％DMSO、米国シグマ）に懸濁し、-80℃にて保存した。残りの1/3は12穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して106〜107個の細胞からゲノムDNAをPuregene DNA Isolation Kits（米国Gentra System社）により調製した。これらのピューロマイシン耐性RSエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞ゲノムDNAを制限酵素EcoRI（日本国宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、WO 00/10383号（実施例48参照）に記載の発明で使用された、Ig軽鎖Jκ-CκゲノムDNAの3’端のDNA断片（XhoI〜EcoRI、約1.4kb、図５）をプローブとして相同組換え体を検出した。その結果、24株中15株（62.5％）が相同組換え体であるという結果を得た。野生型TT2F細胞ではEcoRI消化により、１本のバンドが検出された。相同組換え体においては、このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想される（WO 00/10383号（実施例58参照））が、ピューロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認された。すなわち、これらのクローンは一方のアレルの免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトEPO-cDNAが挿入されたものである。
【０２０６】
実施例8および実施例9で得られた結果から、マウス６番染色体上の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子の約25Kb下流に位置するRSエレメントのうちその片側アレルがネオマイシン耐性遺伝子に置き換えられたマウス由来の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）がCκP2 ターゲティングベクターを用いた相同組換え効率の向上に寄与することが明らかとなった。
【実施例１０】
【０２０７】
ヒトEPO遺伝子導入マウスＥＳ細胞株およびＢリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、機能的なＢリンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Kitamuraら, Nature, 350:423-426, 1991）。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的なＢリンパ球は、大部分が注入したＥＳ細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:722-7, 2000）に記載された免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスについてMCH（ICR）（日本クレア社）系統への戻し交配を３回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。
【０２０８】
上記実施例8及び9で得られ、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトEPO-cDNAが挿入されていることが確認されたピュローマイシン耐性マウスＥＳ細胞株（実施例8では＃４６、実施例9では＃３０）を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリンμ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜10個注入した。ＥＳ培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、1995）で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後2.5日の仮親MCH（ICR）マウス（日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約10個のインジェクション胚を移植した。実施例8の＃４６を用いて作製されたインジェクション胚を計40個移植した結果、9匹の子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にES細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定される。誕生した9匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちＥＳ細胞の貢献の認められる個体は5匹であった。また、実施例9の＃30を用いて作製されたインジェクション胚を計80個移植した結果、65匹の子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にES細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定される。誕生した65匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちＥＳ細胞の貢献の認められる個体は19匹であった。
【０２０９】
これらの結果より、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトEPO-cDNAが挿入されているピューロマイシン耐性マウスES細胞株＃４６及び、ピュローマイシン耐性RSエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株＃３０は、キメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
【実施例１１】
【０２１０】
ヒトEPO遺伝子導入ＥＳ細胞由来キメラマウスにおける 赤血球数の増加
上記実施例１0で作製されたヒトEPO-cDNAが挿入されているピューロマイシン耐性マウスES細胞株＃４６由来のキメラマウス計５匹（キメラ率60〜5％）および非キメラマウス５匹より、８週齢の時点で眼窩採血し、血球測定装置（Bayer Medical（株）製、ADVIA 120 HEMATOLOGY SYSTEM）を用いて末梢血血球数を測定した。キメラマウス群では、キメラ率にかかわらず非キメラマウスと比較して平均1.59倍の赤血球数の増加が認められた。また、上記実施例１0で作製されたヒトEPO-cDNAが挿入されているピューロマイシン耐性RSエレメントターゲティングマウスES細胞株＃３０由来のキメラマウス計１２匹（キメラ率100〜5％）及び非キメラマウス５匹より、８週齢の時点で眼窩採血し、血球測定装置（Bayer Medical（株）製、ADVIA 120 HEMATOLOGY SYSTEM）を用いて末梢血血球数を測定した。キメラマウス群では、キメラ率にかかわらず非キメラマウスと比較して平均1.81倍の赤血球数の増加が認められた。
【０２１１】
従って、ピューロマイシン耐性RSエレメントターゲティングマウスES細胞株を用いた場合においても、顕著な赤血球数の増加が観察され、導入されたヒトEPO遺伝子によってコードされる蛋白質が、マウス血中の赤血球数を調節することが示された。すなわち、RSエレメントの片側アレルが位置する領域にネオマイシン耐性遺伝子が挿入されたマウスES細胞を胚性幹細胞として用いた場合であっても、従来のマウス胚性幹細胞と同様に、本発明に記載された方法が遺伝子およびその産物の生体内における機能解析に有用であることを示している。
【実施例１２】
【０２１２】
RSエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株からのNeo耐性マーカー遺伝子（SV40エンハンサーを含む）の除去
実施例４で取得され、正常核型かつ高いキメラ形成能を保持していることが確認されたRSエレメント・ターゲティング・マウスES細胞株RS32株（G418:Neo耐性株）のNeo耐性マーカー遺伝子（SV40エンハンサーを含む）を以下の手順により除去した。Neo耐性マーカー遺伝子の両側に挿入したloxP配列の間で部位特異的組み換えを起こすCreレコンビナーゼ遺伝子を含む発現ベクターpBS185を（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社）の方法に従いRS32細胞株へ導入した。RS32細胞をトリプシン処理し、2.5x107個/mlとなるようにHBSに懸濁してから30μgのpBS185DNAを加え、ジーンパルサー（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。960μFの容量で250Vの電圧を4mm長のエレクトロポレーションセル（165-2088、バイオラッド）を用いて印加した。エレクトロポレーションした細胞を5mlのES培地に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞をまいた100mm組織培養用プラスチックシャーレ1枚に播種した。2日後に細胞をトリプシン処理し、フィーダー細胞をまいた100mmシャーレ3枚にそれぞれシャーレあたり100、300、800細胞となるように再度播種した。7日後に生じたコロニー計96個をピックアップし、トリプシン処理した後2つに分け、フィーダー細胞をまいた48穴プレート及びゼラチンコートのみを行った48穴プレートにそれぞれ播種した。後者は200μg/mlのG418を含む培地で3日間培養し、その生存率でG418耐性を判定した。
【０２１３】
その結果、5クローンがG418存在下で死滅した。これらのG418感受性株を35mmシャーレでコンフルーエントになるまで増殖させ、その80%を0.5mlの保存用培地（ES培地＋10%DMSO）に懸濁し、-80℃にて凍結保存した。残りの20%は12穴ゼラチンコートプレートに播種し、2日間培養して、106〜107個の細胞からゲノムDNAをPuregene DNA isolation kit（Gentra System社）調製した。これらのG418感受性株のうちRS32#10G-、RS32#15G-の2株についてゲノムDNAを制限酵素EcoRIで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロットを行い、実施例4で使用した3'KO-probでNeo耐性遺伝子の除去を確認した。その結果、RS32株（RS-KOへテロ接合体）において観察される7.4kbのバンドが、感受性株においては観察されず、代わりにNeo耐性マーカーが除去された場合に予想される4.6kbのバンドが検出された（図６）。
【０２１４】
さらに以下のプライマーを用いたPCR解析により、Neo耐性マーカー遺伝子の除去を確認した。Takara EX-Taq（宝酒造）の添付文書に従って反応液を調製し、前記G418感受性株由来ゲノムDNAを鋳型とし、反応条件は『94℃、3分』×1サイクル、『94℃、15秒＋68℃、4分』×35サイクル、『68℃、3分』×1サイクルで実施した。増幅産物は得られた反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動にかけて検出した。
Neo(-)loxP FW5：GGAATTCCGATCATATTCAATAACCCTTAAT  (配列番号30)
RSwtRV3：ACTGCCAAGCCCTTAACTTTGTTATCGTAAG  (配列番号31)
【０２１５】
本プライマーを用いて前記の条件でPCR解析を実施した場合、Neo耐性マーカー保持であれば4kbのバンドが増幅、Neo耐性マーカーが除去されていれば430bpのバンドが増幅する。また、Neo(-)loxP FW5プライマーはloxP上流のプラスミド由来の配列からなっているため、野生型アレルは増幅しない。その結果、RS32#10G-、及びRS32#15G-の2株においてNeo耐性マーカー除去を示す430bpのバンドが検出された。
【０２１６】
以上の結果より、取得されたG418感受性株において確かにNeo耐性マーカー遺伝子が除去されていることが確認された。RS32#10G-株、及びRS32#15G-株より実施例10に記載された方法に従ってキメラマウスを作製した。その結果、毛色のキメラ率が100%のマウスを得た。すなわちRS32#10G-株、及びRS32#15G-株は高いキメラ形成能を保持していることが確認された。
【実施例１３】
【０２１７】
Neo耐性マーカー遺伝子（SV40エンハンサーを含む）を除去したRSエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株（RS32#10G-、及びRS32#15G-）における相同組み換え効率検討
実施例７で作製したヒトEPOターゲティングベクターを制限酵素NotI（宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995）に従ってNeo耐性マーカー遺伝子を除去したRSエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株（RS32#10G-、及びRS32#15G-）へそれぞれ導入した。RS32#10G-、及びRS32#15G-株の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（米国シグマ）処理したG418耐性初代培養細胞（インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたRS32#10G-、及びRS32#15G-株細胞をそれぞれトリプシン処理し、３×107個／mlとなるようにHBSに懸濁してから、0.5mlの細胞懸濁液を10μgのベクターDNAと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：0.4cm、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：960μF、電圧：240V、室温）。エレクトロポレーションした細胞を10mlのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した100mm組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）１枚に播種した。36時間後に0.8μg/mlのピューロマイシン（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーのうちそれぞれ計30個をピックアップし、それぞれを24穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その2/3を0.2mlの保存用培地（ＥＳ培地＋10％DMSO、米国シグマ）に懸濁し、-80℃にて保存した。残りの1/3は12穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して106〜107個の細胞からゲノムDNAをPuregene DNA Isolation Kits（米国Gentra System社）により調製した。これらのピューロマイシン耐性株ゲノムDNAを制限酵素EcoRI（宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、WO 00/10383号（実施例48参照）に記載の発明で使用された、Ig軽鎖Jκ-CκゲノムDNAの3’端のDNA断片（XhoI〜EcoRI、約1.4kb、図５）をプローブとして相同組換え体を検出した。その結果、RS32#10G-株においては30株中8株（26.7%）が、またRS32#15G-株においては30株中株2株（6.8%）が相同組換え体であるという結果を得た。コントロール野生型TT2F細胞ではEcoRI消化により、１本のバンドが検出された。相同組換え体においては、このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想される（WO 00/10383号（実施例58参照））が、ピューロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認された。すなわち、これらのクローンは一方のアレルの免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトEPO-cDNAが挿入されたものである。
【０２１８】
Neo耐性マーカー遺伝子（SV40エンハンサーを含む）を除去したRSエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株（RS32#10G-、及びRS32#15G-）においてヒトEPOターゲティングベクター(図４)を使用した場合の相同組み換え体の割合は、2クローンの結果を合計すると60株中10株（16.7%）であった。一方野生型TT2F細胞株においては、89株中15株（16.9%；実施例8）、Neo耐性マーカー遺伝子を保持するRS32細胞株においては24株中15株（62.5%：実施例9）であった。すなわち、Neo耐性マーカー遺伝子保持細胞株（RS32）におけるCκ領域での高い相同組換え効率は、Neo耐性マーカー遺伝子の除去により消失した。すなわちRSエレメント領域に挿入されたNeo耐性マーカー遺伝子中の特にSV40エンハンサー配列の存在が、25kb上流のCκ領域における相同組み換え効率を向上させていることが示された。一方でRSエレメントの欠失そのものは相同組換え効率に影響を与えないことも示された。以上の結果は、ターゲティングベクターに含まれていないが、ターゲット領域近傍にあるゲノム領域をあらかじめ改変することでターゲット領域における相同組換え効率を改善することが可能であることを示すものである。
【実施例１４】
【０２１９】
マウスRSエレメントターゲティング用ベクターpRS-KOSV40PEの作製
実施例1で構築したマウスRSエレメントターゲティングベクター（pBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3'KO-5'KO）のAscI部位（loxP-Neo-loxP配列の外側に位置する）に、SV40エンハンサー/プロモーター配列（SV40PE）を挿入することによりマウスRSエレメントターゲティングベクター〔pRS-KOSV40PE）〕を構築した(図7)。SV40エンハンサー/プロモーター配列（SV40PE；山泉、蛋白質・核酸・酵素、Vol.28、No.14、p．1599-、1983）は、72bpユニットのタンデムリピートからなるエンハンサー配列、複製起点及び初期mRNAプロモーターを含み、pBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3'KO-5'KO中のNeo耐性マーカー遺伝子ユニットに含まれる約0．35kbの領域である(図8)。上記AscI部位へのSV40PE断片挿入に際しては、SV40PE断片両側がAscI部位となるようにデザインされたプライマーを使用してPCR増幅された断片をAscI消化したものを用いることができる。構築されたRSエレメントターゲティングベクター〔pRS-KOSV40PE）〕を実施例4に記載された方法でマウスES細胞に導入し、得られるG418耐性株を実施例4に記載された方法で解析することにより、マウスRSエレメントを含む染色体領域を欠失し、代わりにSV40PE配列とNeo耐性マーカー遺伝子(両端にLoxP配列をもつ)が連結したDNA断片が挿入されたES細胞株（図9：recombinant）を取得できる。取得されたES細胞株の核型解析を実施例4と同様に実施し、取得されたES細胞株に異常核型が検出されないことを確認する。
【０２２０】
（1）SV40PE全長断片の調製
pBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3'KO-5'KOベクターよりSV40ウイルスゲノム由来の初期プロモーター/エンハンサー/複製起点領域をPCR増幅するために下記のプライマーを設計した。
SV40PE-F: GGCGCGCCGCTGTGGAATGTGTGTCAGT(配列番号32)
SV40PE-R: GGCGCGCCAAGCTTTTGCAAAAGCCTAG(配列番号33)
【０２２１】
KOD-plus-(日本国東洋紡)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μl反応液中に上記2種のプライマー各10pmol、鋳型としpBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3’KO-5’KOベクターを添加し、94℃2分保温した後、94℃20秒/60℃20秒/68℃30秒を1サイクルとして30サイクル増幅した。得られた361bpの増幅断片を制限酵素AscIで消化し、2%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い、添付文書にしたがってSV40PE/AscI断片を回収した。
【０２２２】
（2）pRS-KOSV40PEの構築
pBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3'KO-5'KOベクターを制限酵素AscIで消化し0.8％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い添付文書にしたがって約15kbの酵素処理断片を回収した。得られたpBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3’KO-5’KOベクターAscI断片を仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、（1）で作製したDNA断片を挿入した後、大腸菌XL10-Gold Ultracompetent Cells（米国STRATAGENE）に導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、連結部分の塩基配列の確認を行いpRS-KOSV40PEベクターを取得した（図7）。
【実施例１５】
【０２２３】
Electroporation用pRS-KOSV40PEベクターの調製
pRS-KOSV40PE 60μgを、スペルミジン添加（1mM pH7.0米国シグマ）バッファー（ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Hバッファー）を用い、NotIを用いて37℃で5時間消化し、フェノール/クロロホルム抽出後、2.5容量の100％エタノール、および0.1容量の3M酢酸ナトリウムを加え、-20℃で16時間保存した。NotIで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、70％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で70％エタノールを除き、１時間風乾させた。0.5μg/μLのDNA溶液となるようにHBS溶液を加え、１時間室温で保存し、Electroporation用pRS-KOSV40PE/NotIの調製を行なった。
【実施例１６】
【０２２４】
pRS-KOSV40PEによりターゲティングされたマウスES細胞の取得
実施例15において調製したpRS-KOSV40PE/NotIを確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995）に従ってマウスES細胞TT2F（Yagiら、Analytical Biochem., 214:70, 1993）へ導入した。TT2Fの培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンC（米国シグマ）処理したG418耐性初代培養細胞（インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたTT2F細胞をトリプシン処理し、3×107個／mlとなるようにHBSに懸濁した。その後、0.5mlの細胞懸濁液を10μgのベクターDNAと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：0.4cm、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：960μF、電圧：240V、室温）。エレクトロポレーションした細胞を10mlのES培地に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した100mm組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）1枚に播種した。24時間後に200μg/mlのG418（米国シグマ）を含むＥＳ培地と置き換えた。7日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを24穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その2/3を0.2mlの保存用培地（ＥＳ培地＋10％DMSO、米国シグマ）に懸濁し、-80℃にて保存した。残りの1/3は12穴ゼラチンコートプレートに播種し、2日間培養して106〜107個の細胞からゲノムDNAをPuregene DNA Isolation Kits（米国Gentra System社）により調製した。これらネオマイシン（G418）耐性TT2F細胞ゲノムDNAを制限酵素EcoRI（宝酒造）で消化し、0.8％アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ターゲティングベクター3'相同領域の下流に位置するDNA断片（3'KO-prob、実施例3参照、図2）をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型TT2F細胞ではEcoRI消化により、1本のバンド（約5.7 Kb）が検出された。相同組換え体においては、2本のバンド（約5.7Kbと約7.8Kb）が検出されることが予想されたが、G418耐性株の一部において約7.8Kb（約7.4kb＋約0.35kb SV40PE断片）の新たなバンドが確認された。更に、3’KO-probによるサザン解析で相同組換えが確認されたクローンのゲノムDNAを制限酵素PstI（酒酒造）で消化し、0.8％アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ターゲティングベクター5'相同領域の上流に位置するDNA断片（5'KO-prob、実施例3参照、図2）をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型TT2F細胞ではPstI消化により、1本のバンド（約6.1 Kb）が検出された。相同組換え体においては、2本のバンド（約6.7Kbと約6.1Kb）が検出されることが予想されたが、G418耐性株において約6.7Kbの新たなバンドが確認された。すなわち、これらのクローンはマウスRSエレメントを含む染色体領域を欠失し、代わりにNeo耐性マーカー及びSV40PE断片が挿入されたものである。3’および5’KO-probによるサザン解析の結果、pRS-KOSV40PEを制限酵素NotIで線状化した場合には40株中10株（25％）が相同組換え体であるという結果を得た。pRS-KOSV40PEによりターゲティングされたマウスES細胞の核型解析を記載（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995）の方法に従い実施し、ターゲティングされたES細胞に異常核型が検出されないことを確認した。
【実施例１７】
【０２２５】
pRS-KOSV40PEによりターゲティングされたマウスES細胞株からのNeo耐性マーカー遺伝子の除去
実施例16で取得され、正常核型であることが確認されたpRS-KOSV40PEによりターゲティングされたマウスES細胞株（G418:Neo耐性株）、RSSV40PE#8及びRSSV40PE#18のNeo耐性マーカー遺伝子を以下の手順により除去した。Neo耐性マーカー遺伝子の両側に挿入したloxP配列の間で部位特異的組み換えを起こすCreレコンビナーゼ遺伝子を含む発現ベクターpBS185を（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社）の方法に従いRSSV40PE#8及びRSSV40PE#18細胞株へそれぞれ導入した。トリプシン処理した細胞について、2.5x107個/mlとなるようにHBSに懸濁してから30μgのpBS185DNAを加え、ジーンパルサー（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。960μFの容量で250Vの電圧を4mm長のエレクトロポレーションセル（165-2088、バイオラッド）を用いて印加した。エレクトロポレーションした細胞を5mlのES培地に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞をまいた100mm組織培養用プラスチックシャーレ1枚に播種した。2日後に細胞をトリプシン処理し、フィーダー細胞をまいた100mmシャーレ3枚にそれぞれシャーレあたり100、300、800細胞となるように再度播種した。7日後に生じたコロニーをピックアップし、トリプシン処理した後2つに分け、フィーダー細胞をまいた48穴プレート及びゼラチンコートのみを行った48穴プレートにそれぞれ播種した。後者は200μg/mlのG418を含む培地で3日間培養し、その生存率でG418耐性を判定した。その結果得られたG418感受性株を35mmシャーレでコンフルーエントになるまで増殖させ、その80%を0.5mlの保存用培地（ES培地＋10%DMSO）に懸濁し、-80℃にて凍結保存した。残りの20%は12穴ゼラチンコートプレートに播種し、2日間培養して、106〜107個の細胞からゲノムDNAをPuregene DNA isolation kit（Gentra System社）調製した。RSSV40PE#8由来のG418感受性株のうちRSSV40PE8G-#32、RSSV40PE8G-#36の2株、さらにRSSV40PE#18由来のG418感受性株のうちRSSV40PE18G-#37、RSSV40PE18G-#39の2株、計4株についてゲノムDNAを制限酵素EcoRIで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロットを行い、実施例4で使用した3'KO-probでNeo耐性遺伝子の除去を確認した。その結果、RSSV40PE#8、及びRSSV40PE#18株において観察される約7.8kb（約7.4kb＋約0.35kb SVPE断片）のバンドが、上記4種の感受性株においては観察されず、代わりにNeo耐性マーカーが除去された場合に予想される約4.9kb（約4.6kb＋約0.35kb SVPE断片）のバンドが検出された（図6参照）。
以上の結果より、上記4種のG418感受性株において確かにNeo耐性マーカー遺伝子が除去されていることが確認された(図9、Neo(-))。
【実施例１８】
【０２２６】
マウスRSエレメントターゲティング用ベクターpRS-KOSV4072bpの作製
SV40エンハンサー/プロモーター配列（SV40PE；山泉、蛋白質・核酸・酵素、Vol.28、No.14、p．1599-、1983）は、72bpユニットのタンデムリピートからなるエンハンサー配列、複製起点及び初期mRNAプロモーターを含み、pBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3'KO-5'KO中のNeo耐性マーカー遺伝子ユニットに含まれる約0．35kbの領域である(図8)。実施例1で構築したマウスRSエレメントターゲティングベクター（pBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3'KO-5'KO）のAscI部位（loxP-Neo-loxP配列の外側に位置する）に、SV40エンハンサー配列（SV4072bp）のみを挿入することによりマウスRSエレメントターゲティングベクター（pRS-KOSV4072bp）を構築した(図11)。上記AscI部位へのSV4072bp断片挿入に際しては、SV4072bp断片両側がAscI部位となるようにデザインされたプライマーを使用してPCR増幅された断片をAscI消化したものを用いることができる。構築されたRSエレメントターゲティングベクター（pRS-KOSV4072bp）を実施例4に記載された方法でマウスES細胞に導入し、得られるG418耐性株を実施例4に記載された方法で解析することにより、マウスRSエレメントを含む染色体領域を欠失し、代わりにSV4072bp配列とNeo耐性マーカー遺伝子(両端にLoxP配列をもつ)が連結したDNA断片が挿入されたES細胞株（図12：recombinant）を取得できる。取得されたES細胞株の核型解析を実施例4と同様に実施し、取得されたES細胞株に異常核型が検出されないことを確認する。
【０２２７】
（1）SV40エンハンサー（72bpユニット×2、タンデムリピート）断片の調製
pBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3'KO-5'KOベクターよりSV40ウイルスゲノム由来のエンハンサー領域（72bpユニット×2、タンデムリピート）をPCR増幅するために下記のプライマーを設計した。
SV4072bp-F: GGCGCGCC GTG TGT CAG TTA GGG TGT GG(配列番号34)
SV4072bp-R: GGCGCGCC AGG GGC GGG ACT ATG GTT GC(配列番号35)
【０２２８】
KOD-plus-(日本国東洋紡)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μl反応液中に上記2種のプライマー各10pmol、鋳型としてpBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3’KO-5’KOベクターを添加し、94℃2分保温した後、94℃20秒/62℃20秒/68℃20秒を1サイクルとして30サイクル増幅した。得られた186bpの増幅断片を制限酵素AscIで消化し、2%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い、添付文書にしたがってSV40エンハンサー（AscI）断片を回収した。
【０２２９】
（2）pRS-KOSV4072bpベクターの構築
実施例14-（2）で得られたpBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3’KO-5’KOベクターAscI断片の末端を脱リン酸化したベクターに、（1）で作製したSV40エンハンサーAscI断片を挿入し、大腸菌XL10-Gold Ultracompetent Cellsに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、連結部分の塩基配列の確認を行いpRS-KOSV4072bpベクターを取得した（図11）。
【実施例１９】
【０２３０】
Electroporation用pRS-KOSV4072bpベクターの調製
pRS-KOSV4072bp60μgを、スペルミジン添加（1mM pH7.0米国シグマ）バッファー（ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Hバッファー）を用い、NotIを用いて37℃で5時間消化し、フェノール/クロロホルム抽出後、2.5容量の100％エタノール、および0.1容量の3M酢酸ナトリウムを加え、-20℃で16時間保存した。NotIで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、70％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で70％エタノールを除き、１時間風乾させた。0.5μg/μLのDNA溶液となるようにHBS溶液を加え、1時間室温で保存し、Electroporation用pRS-KOSV4072bp/NotIの調製を行なった。
【実施例２０】
【０２３１】
pRS-KOSV4072bpによりターゲティングされたマウスES細胞の取得
実施例19において調製したpRS-KOSV4072bp/NotIを確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995）に従ってマウスES細胞TT2F（Yagiら、Analytical Biochem., 214:70, 1993）へ導入した。TT2Fの培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンC（米国シグマ）処理したG418耐性初代培養細胞（インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたTT2F細胞をトリプシン処理し、3×107個／mlとなるようにHBSに懸濁した。その後、0.5mlの細胞懸濁液を10μgのベクターDNAと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：0.4cm、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：960μF、電圧：240V、室温）。エレクトロポレーションした細胞を10mlのES培地に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した100mm組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）1枚に播種した。24時間後に200μg/mlのG418（米国シグマ）を含むES培地と置き換えた。7日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを24穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その2/3を0.2mlの保存用培地（ES培地＋10％DMSO、米国シグマ）に懸濁し、-80℃にて保存した。残りの1/3は12穴ゼラチンコートプレートに播種し、2日間培養して106〜107個の細胞からゲノムDNAをPuregene DNA Isolation Kits（米国Gentra System社）により調製した。これらG418耐性TT2F細胞ゲノムDNAを制限酵素EcoRI（宝酒造）で消化し、0.8％アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ターゲティングベクター3'相同領域の下流に位置するDNA断片（3'KO-prob、実施例3参照、図2）をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型TT2F細胞ではEcoRI消化により、1本のバンド（約5.7 Kb）が検出された。相同組換え体においては、2本のバンド（約5.7Kbと約7.6Kb）が検出されることが予想されたが、G418耐性株の一部において約7.6Kb（約7.4kb＋約0.19kb SV4072bp断片）の新たなバンドが確認された。更に、3’KO-probによるサザン解析で相同組換えが確認されたクローンのゲノムDNAを制限酵素PstI（酒酒造）で消化し、0.8％アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ターゲティングベクター5'相同領域の上流に位置するDNA断片（5'KO-prob、実施例3参照、図2）をプローブとして相同組換え体を検出した。野生型TT2F細胞ではPstI消化により、1本のバンド（約6.1 Kb）が検出された。相同組換え体においては、2本のバンド（約6.7Kbと約6.1Kb）が検出されることが予想されたが、G418耐性株の一部において約6.7Kbの新たなバンドが確認された。すなわち、これらのクローンはマウスRSエレメントを含む染色体領域を欠失し、代わりにNeo耐性マーカー遺伝子、及びSV40エンハンサー（72bpユニット×2、タンデムリピート）断片が挿入されたものである。3’および5’KO-probによるサザン解析の結果、pRS-KOSV4072bpを制限酵素NotIで線状化した場合には40株中4株（10％）が相同組換え体であるという結果を得た。pRS-KOSV4072bpによりターゲティングされたマウスES細胞の核型解析を記載（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995）の方法に従い実施し、ターゲティングされたES細胞に異常核型が検出されないことを確認した。
【実施例２１】
【０２３２】
pRS-KOSV4072bpによりターゲティングされたマウスES細胞株からのNeo耐性マーカー遺伝子の除去
実施例20で取得され、正常核型であることが確認されたpRS-KOSV4072bpによりターゲティングされたマウスES細胞株（G418:Neo耐性株）、RSSV4072bp#37、及びRSSV4072bp#38のNeo耐性マーカー遺伝子を以下の手順により除去した(図12)。Neo耐性マーカー遺伝子の両側に挿入したloxP配列の間で部位特異的組み換えを起こすCreレコンビナーゼ遺伝子を含む発現ベクターpBS185を（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社）の方法に従いRSSV4072bp#37、及びRSSV4072bp#38細胞株へそれぞれ導入した。トリプシン処理した細胞を、2.5x107個/mlとなるようにHBSに懸濁してから30μgのpBS185DNAを加え、ジーンパルサー（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行った。960μFの容量で250Vの電圧を4mm長のエレクトロポレーションセル（165-2088、バイオラッド）を用いて印加した。エレクトロポレーションした細胞を5mlのES培地に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞をまいた100mm組織培養用プラスチックシャーレ1枚に播種した。2日後に細胞をトリプシン処理し、フィーダー細胞をまいた100mmシャーレ3枚にそれぞれシャーレあたり100、300、800細胞となるように再度播種した。7日後に生じたコロニーをピックアップし、トリプシン処理した後2つに分け、フィーダー細胞をまいた48穴プレート及びゼラチンコートのみを行った48穴プレートにそれぞれ播種した。後者は200μg/mlのG418を含む培地で3日間培養し、その生存率でG418耐性を判定した。
【０２３３】
その結果得られたG418感受性株を35mmシャーレでコンフルーエントになるまで増殖させ、その80%を0.5mlの保存用培地（ES培地＋10%DMSO）に懸濁し、-80℃にて凍結保存した。残りの20%は12穴ゼラチンコートプレートに播種し、2日間培養して、106〜107個の細胞からゲノムDNAをPuregene DNA isolation kit（Gentra System社）調製した。RSSV4072bp#37由来のG418感受性株のうちRSSV4072bp37G-#4、RSSV4072bp37G-#4の2株、さらにRSKOSV4072bp#38由来のG418感受性株のうちRSSV4072bp38G-#26、RSSV4072bp37G-#28の2株についてゲノムDNAを制限酵素EcoRIで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロットを行い、実施例4で使用した3'KO-probでNeo耐性遺伝子の除去を確認した。その結果、RSSV4072bp#37、及びRSSV4072bp#38株において観察される約7.6kb（約7.4kb＋約0.19kb SV4072bp断片）のバンドが、上記4種の感受性株においては観察されず、代わりにNeo耐性マーカーが除去された場合に予想される約4.8kb（約4.6kb＋約0.19kb SV4072bp断片）のバンドが検出された（図6参照）。
【０２３４】
以上の結果より、上記4種のG418感受性株において確かにNeo耐性マーカー遺伝子が除去されていることが確認された。
【実施例２２】
【０２３５】
CkP2TPO(DT-)ベクターの構築
pCkP2TPOKIベクター（国際公開WO 2003/041495号パンフレットに記載）を制限酵素KpnI、XhoIで消化し約20kbの断片を0.8%アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い、添付文書にしたがってCk TPO DT-断片を回収した。Blunting high（東洋紡）を用いて末端平滑化を行った後、自己環状化を行って大腸菌XL10-Gold Ultracompetent Cells（米国STRATAGENE）に導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、連結部分の塩基配列の確認を行いpCkP2TPO(DT-)ベクターを取得した。
【実施例２３】
【０２３６】
CκP2ターゲティングベクターへのヒトFGF7遺伝子の挿入
(1)  ヒトFGF7-DNA断片の作製
FGF7SalIFW：ACGCGTCGACCACCATGCACAAATGGATACTGACATGGA(配列番号36)
FGF7NheIRV：CTAGCTAGCTTAAGTTATTGCCATAGGAAGAAAG(配列番号37)
【０２３７】
KOD-plus-(日本国東洋紡)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50ul反応液中に上記2種のプライマー各10pmol、鋳型としてヒトFGF7cDNAを添加し、94℃2分保温した後、94℃15秒および68℃1分を1サイクルとして30サイクル増幅し、得られた603bpの増幅断片を0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたPCR増幅断片をSalI、NheIで酵素消化し、0.8％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。pBluescriptIISK(-)（米国STRATAGENE）をSalI、NheI消化し、0.8％アガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記回収されたDNA断片を挿入し、それを大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNAを調整し、挿入断片のシーケンスを行った。PCRによる変異の無いクローンを選択しXhoI消化した後、0.8％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（ドイツQIAGEN）を用い添付文書にしたがってヒトFGF7-DNA断片を回収した。
【０２３８】
(2)  pCκP2FGF7ベクターの構築
CκP2ターゲティングベクター（図3）をSalI、NheIで消化後、仔牛小腸由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、（1）で作製したヒトFGF7-cDNA断片を挿入した後、大腸菌XL10-Gold Ultracompetent Cells（米国STRATAGENE）に導入した。得られた形質転換体よりDNAを調製し、連結部分の塩基配列の確認して、CκP2ヒトFGF7ターゲティングベクター(pCκP2FGF7)を取得した。
【実施例２４】
【０２３９】
Electroporation用pCκP2TPOベクターの調製
pCκP2TPOベクター（国際公開WO 2003/041495号パンフレットに記載）60μgを、スペルミジン添加（1mM pH7.0米国シグマ）バッファー（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Hバッファー）を用い、NotIを用いて37℃で5時間消化し、フェノール/クロロホルム抽出後、2.5容量の100％エタノール、および0.1容量の3M酢酸ナトリウムを加え、-20℃で16時間保存した。NotIで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、70％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で70％エタノールを除き、１時間風乾させた。0.5μg/μLのDNA溶液となるようにHBS溶液を加え、１時間室温で保存し、Electroporation用pCκP2TPOベクターの調製を行なった。
【実施例２５】
【０２４０】
Electroporation用pCkP2TPO(DT-)ベクターの調製
実施例22で構築したpCkP2TPO(DT-)ベクター60μgを、スペルミジン添加（１mM pH7.0米国シグマ）バッファー（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Ｈバッファー）を用い、NotIを用いて37℃で５時間消化し、フェノール/クロロホルム抽出後、2.5容量の100％エタノール、および0.1容量の3M酢酸ナトリウムを加え、-20℃で16時間保存した。NotIで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、70％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で70％エタノールを除き、1時間風乾させた。0.5μg/μLのDNA溶液となるようにHBS溶液を加え、1時間室温で保存し、Electroporation用pCkP2TPO(DT-)ベクターの調製を行なった。
【実施例２６】
【０２４１】
Electroporation 用pCκP2FGF7ベクターの調製
実施例23で作製したpCκP2FGF7ベクター60μgを、スペルミジン添加（１mM pH7.0米国シグマ）バッファー（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス、制限酵素用Ｈバッファー）を用い、NotIを用いて37℃で5時間消化し、フェノール/クロロホルム抽出後、2.5容量の100％エタノール、および0.1容量の3M酢酸ナトリウムを加え、-20℃で16時間保存した。NotIで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、70％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で70％エタノールを除き、1時間風乾させた。0.5μg/μlのDNA溶液となるようにHBS溶液を加え、1時間室温で保存し、Electroporation用pCκP2FGF7ベクターの調製を行なった。
【実施例２７】
【０２４２】
pCκP2TPOベクターによるヒトTPO遺伝子導入ES細胞株の取得
ヒトTPO-cDNAが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたマウスES細胞株取得のため、実施例24で調製したpCκP2TPOベクターを確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995）に従って、野生型マウスES細胞TT2F-F8（Yagiら、Analytical Biochem., 214:70, 1993）、RS32株（実施例4）、RS32#15G-株（実施例12）、及びRSSV40PE8G-#36株（実施例17）へそれぞれ導入した。マウスES細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンC（米国シグマ）処理したG418耐性初代培養細胞（インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたTT2F細胞をトリプシン処理し、3×107個／mlとなるようにHBSに懸濁してから、0.5mlの細胞懸濁液を10μgのベクターDNAと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：0.4cm、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：960μF、電圧：240V、室温）。エレクトロポレーションした細胞を10mlのES培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した100mm組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）1枚に播種した。36時間後に0.8μg/mlのピューロマイシン（米国シグマ）を含むES培地と置き換えた。7日後に生じたコロニーのうちそれぞれ、40個（TT2F-F8）、12個（RS32）、72個（RS32#15G-）、及び72個（RSSV40PE8G-#36）をピックアップし、それぞれを24穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その2/3を0.2mlの保存用培地（ES培地＋10％DMSO、米国シグマ）に懸濁し、-80℃にて保存した。残りの1/3は12穴ゼラチンコートプレートに播種し、2日間培養して106〜107個の細胞からゲノムDNAをPuregene DNA Isolation Kits（米国Gentra System社）により調製した。これらのピューロマイシン耐性マウスES細胞ゲノムDNAを制限酵素EcoRI（宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、WO 00/10383号（実施例48参照）に記載の発明で使用された、Ig軽鎖Jκ-CκゲノムDNAの3’端のDNA断片（XhoI〜EcoRI、約1.4kb、図5）をプローブとして相同組換え体（HR体）を検出した。その結果を表1に示す。
【０２４３】
【表１】
2006094849.tif 000003
【０２４４】
Neo耐性マーカー遺伝子（SV40エンハンサーを含む）を除去したRSエレメント・ターゲティング・マウスES細胞株（RS32#15G-）においてpCκP2TPOベクターを使用した場合の相同組み換え体の割合は8%であった。また野生型TT2F-F8細胞株においては8%、一方Neo耐性マーカー遺伝子を保持するRS32細胞株においては33%であった。すなわち、ヒトEPOターゲティングベクター（実施例13）の場合と同様、野生型ES細胞株（TT2-F8）と比較して、Neo耐性マーカー遺伝子保持細胞株（RS32）のCκ領域における相同組換え効率は高く、さらにNeo耐性マーカー遺伝子の除去（RS32#15G-）により高い相同組換え効率は消失した。さらに重要なことに、RS領域のNeo耐性マーカー遺伝子が除去され、かつSV40PE配列が維持されている細胞株（RSSV40PE8G-#36）においては、高い相同組換え効率（56%）が観察された。すなわちRSエレメント領域に挿入されたSV40エンハンサー/プロモーター（SV40PE）配列の存在が、25kb上流のCκ領域における相同組み換え効率を向上させていることが示された。以上の結果は、ターゲティングベクターに含まれていないが、ターゲット領域近傍にあるゲノム領域にSV40エンハンサー/プロモーター（SV40PE）配列を挿入することでターゲット領域における相同組換え効率を改善することが可能であることを示すものである。
【実施例２８】
【０２４５】
pCkP2TPO(DT-)ベクターによるヒトTPO遺伝子導入ES細胞株の取得
ヒトトロンボポエチン（TPO）-cDNAが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたマウスES細胞株取得のため、実施例25で調製したpCkP2TPO(DT-)ベクターを確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995）に従って、RS32株（実施例4）、RS32#15G-株（実施例12）、及びRSSV40PE8G-#36株（実施例17）へそれぞれ導入した。マウスES細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンC（米国シグマ）処理したG418耐性初代培養細胞（インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたTT2F細胞をトリプシン処理し、3×107個／mlとなるようにHBSに懸濁してから、0.5mlの細胞懸濁液を10μgのベクターDNAと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：0.4cm、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：960μF、電圧：240V、室温）。エレクトロポレーションした細胞を10mlのES培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した100mm組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）1枚に播種した。36時間後に0.8μg/mlのピューロマイシン（米国シグマ）を含むES培地と置き換えた。7日後に生じたコロニーのうち各細胞株について72個をピックアップし、それぞれを24穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その2/3を0.2mlの保存用培地（ＥＳ培地＋10％DMSO、米国シグマ）に懸濁し、-80℃にて保存した。残りの1/3は12穴ゼラチンコートプレートに播種し、2日間培養して106〜107個の細胞からゲノムDNAをPuregene DNA Isolation Kits（米国Gentra System社）により調製した。これらのピューロマイシン耐性マウスES細胞ゲノムDNAを制限酵素EcoRI（宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、WO 00/10383号（実施例48参照）に記載の発明で使用された、Ig軽鎖Jκ-CκゲノムDNAの3’端のDNA断片（XhoI〜EcoRI、約1.4kb、図5）をプローブとして相同組換え体（HR体）を検出した。その結果を表2に示す。
【０２４６】
【表２】
2006094849.tif 000004
【０２４７】
Neo耐性マーカー遺伝子を除去したRSエレメント・ターゲティング・マウスES細胞株（RS32#15G-）においてpCκP2TPO(DT-)ベクターを使用した場合の相同組み換え体の割合は11%であった。一方Neo耐性マーカー遺伝子を保持するRS32細胞株においては35%であった。すなわち、ヒトEPOターゲティングベクター（実施例13）、及びpCκP2TPOベクター（実施例27）の場合と同様、Neo耐性マーカー遺伝子保持細胞株（RS32）のCκ領域における相同組換え効率は高く、さらにNeo耐性マーカー遺伝子の除去（RS32#15G-）により高い相同組換え効率は消失した。さらに重要なことに、RS領域のNeo耐性マーカー遺伝子が除去され、かつSV40PE配列が維持されている細胞株（RSSV40PE8G-#36）においては、高い相同組換え効率（47%）が観察された。すなわちRSエレメント領域に挿入されたSV40エンハンサー/プロモーター（SV40PE）配列の存在が、25kb上流のCκ領域における相同組み換え効率を向上させていることが示された。さらに本実施例では、その効果はターゲティングベクターにネガティブ選択マーカー（DT）が含まれていない場合〔pCkP2TPO(DT-)〕でも、含まれる場合（pCκP2TPO）と同等であることが示された。
【０２４８】
以上の結果より、ターゲティングベクターに含まれていないが、ターゲット領域近傍にあるゲノム領域にSV40エンハンサー/プロモーター（SV40PE）配列を挿入することでターゲット領域における相同組換え効率を改善することが可能である。そして、その効果はネガティブ選択の効率を向上させることによるものではなく、相同組換え効率自体を向上させることによる可能性が示された。
【実施例２９】
【０２４９】
pCκP2FGF7ベクターによるヒトFGF7遺伝子導入ES細胞株の取得
ヒトFGF7-cDNAが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたマウスES細胞株取得のため、実施例26で調製したpCκP2FGF7ベクターを確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995）に従って、野生型マウスES細胞TT2F-F8（Yagiら、Analytical Biochem., 214:70, 1993）、RS32株（実施例4）、RS32#15G-株（実施例12）、RSSV40PE8G-#32株（実施例17）、RSSV40PE8G-#36株（実施例17）、RSSV40PE18G-#37株（実施例17）、RSSV40PE18G-#39（実施例17）、RSSV4072bp37G-#4株（実施例21）、RSSV4072bp37G-#5株（実施例21）、RSSV4072bp38G-#26株（実施例21）、及びRSSV4072bp38G-#28株（実施例21）へそれぞれ導入した。マウスES細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンC（米国シグマ）処理したG418耐性初代培養細胞（インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたTT2F細胞をトリプシン処理し、3×107個／mlとなるようにHBSに懸濁してから、0.5mlの細胞懸濁液を10μgのベクターDNAと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：0.4cm、米国バイオラッド）にてエレクトロポレーションを行った（容量：960μF、電圧：240V、室温）。エレクトロポレーションした細胞を10mlのES培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した100mm組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国ベクトン．ディッキンソン）1枚に播種した。36時間後に0.8μg/mlのピューロマイシン（米国シグマ）を含むES培地と置き換えた。7日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを24穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その2/3を0.2mlの保存用培地（ES培地＋10％DMSO、米国シグマ）に懸濁し、-80℃にて保存した。残りの1/3は12穴ゼラチンコートプレートに播種し、2日間培養して106〜107個の細胞からゲノムDNAをPuregene DNA Isolation Kits（米国Gentra System社）により調製した。これらのピューロマイシン耐性マウスES細胞ゲノムDNAを制限酵素EcoRI（宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、WO00/10383号（実施例48参照）に記載の発明で使用された、Ig軽鎖Jκ-CκゲノムDNAの3’端のDNA断片（XhoI〜EcoRI、約1.4kb、図5）をプローブとして相同組換え体（HR体）を検出した。その結果を表3に示す。
【０２５０】
【表３】
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【０２５１】
Neo耐性マーカー遺伝子を除去したRSエレメント・ターゲティング・マウスES細胞株（RS32#15G-）においてpCκP2FGF7ベクターを使用した場合の相同組み換え体の割合は13%であった。また野生型TT2F-F8細胞株においては11%、一方Neo耐性マーカー遺伝子を保持するRS32細胞株においては67%であった。すなわち、ヒトEPOターゲティングベクター（実施例13）の場合と同様、野生型ES細胞株（TT2-F8）と比較して、Neo耐性マーカー遺伝子保持細胞株（RS32）のCκ領域における相同組換え効率は高く、さらにNeo耐性マーカー遺伝子の除去（RS32#15G-）により高い相同組換え効率は消失した。またRS領域のNeo耐性マーカー遺伝子が除去され、かつSV40PE配列が維持されている細胞株（RSSV40PE8G-#32株、RSSV40PE8G-#36株、RSSV40PE18G-#37株、RSSV40PE18G-#39）においては、高い相同組換え効率（4種計58%）が観察された。すなわちRSエレメント領域に挿入されたSV40エンハンサー/プロモーター（SV40PE）配列の存在が、25kb上流のCκ領域における相同組み換え効率を向上させていることが示された。
【０２５２】
以上の結果は、ターゲティングベクターに含まれていないが、ターゲット領域近傍にあるゲノム領域にSV40エンハンサー/プロモーター（SV40PE）配列を挿入することでターゲット領域における相同組換え効率を改善することが可能であることを示すものである。
【０２５３】
さらにRS領域のNeo耐性マーカー遺伝子が除去され、かつSV40エンハンサー（72bpユニット×2、タンデムリピート）配列が維持されている細胞株（RSSV4072bp37G-#4株、RSSV4072bp37G-#5株、RSSV4072bp38G-#26株、及びRSSV4072bp38G-#28株）においては、高い相同組換え効率（4種計50%）が観察された。すなわちRSエレメント領域に挿入されたSV40エンハンサー（72bpユニット×2、タンデムリピート）配列の存在が、25kb上流のCκ領域における相同組み換え効率を向上させていることが示された。以上の結果は、ターゲティングベクターに含まれていないが、ターゲット領域近傍にあるゲノム領域にSV40エンハンサー（72bpユニット×2、タンデムリピート）配列を挿入することでターゲット領域における相同組換え効率を改善することが可能であることを示すものである。
【０２５４】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、その全文を参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０２５５】
本発明により、従来法と比較して効率よく確実に所望の蛋白質を高発現するキメラ非ヒト動物（たとえばキメラマウス）を得ることができる。本発明では、導入した所望の蛋白質をコードする遺伝子が発現される細胞および／または組織が欠損した胚を宿主胚として使用するため、作製されるキメラ非ヒト動物における該細胞および／または組織は全て、導入した核酸配列又は遺伝子を含む分化多能性を有する細胞に由来するものであり、その結果、高効率で所望蛋白質を発現させることができる。本発明はまた、好ましくは免疫グロブリン軽鎖、特に好ましくはκ鎖、の発現系を利用するものであるが、このIgκ遺伝座における相同組換え率は、染色体上の免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子の３'末端から下流側100Kb以内、好ましくは50Kb以内、さらに好ましくは30Kb以内の部位に、例えばRSエレメントの片側アレルが位置する領域に、外来エンハンサーが、必要ならその転写調節下にある外来遺伝子とともに、挿入されたマウスES細胞を胚性幹細胞として用いた場合、50〜60％以上であり、従来法と比べて極めて高い効率である。これによって、本発明は、所望の蛋白質をコードする遺伝子の高発現による該蛋白質の生産、あるいは、機能未知の遺伝子または蛋白質の生体内機能解析のために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２５６】
【図１】この図は、マウスRSエレメントターゲティング用ベクターpBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3’KO-5’KOの構造を示す。５'KO：マウスRSエレメント5’上流領域、Neor：ネオマイシン耐性遺伝子、３'KO：マウスRSエレメント3’下流領域、DT-A：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびpBluescript：クローニングベクター。
【図２】この図はマウスRSエレメントの代わりにネオマイシン耐性遺伝子が挿入されたアレル構造およびサザン解析用プローブの位置を示す。5’genome: マウスRSエレメント5’上流領域,3’genome: マウスRSエレメント3’下流領域, 5’probe:ターゲティングベクターの5’側挿入確認用サザン解析プローブ, 3’probe: ターゲティングベクターの3’側挿入確認用サザン解析プローブ, loxP-Neo-loxP: ネオマイシン耐性遺伝子。
【図３】この図は、CκP2ターゲティングベクターの構造を示す。Promoter２：マウスIgκプロモーター領域遺伝子２、MCS：マルチクローニング部位、Cκ：マウスIgκ遺伝子定常領域、Cκ polyA：マウスIgκ polyAシグナル領域、Puro：ピューロマイシン耐性遺伝子、DT-A：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびpBluescript：クローニングベクター。
【図４】この図は、ヒトEPO遺伝子がクローニングサイトに挿入されたCκP2ターゲティングベクター構造を示す。Promoter２：マウスIgκプロモーター領域遺伝子２、hEPO：ヒトEPO遺伝子、Cκ：マウスIgκ遺伝子定常領域、Cκ polyA：マウスIgκ polyAシグナル領域、Puro：ピューロマイシン耐性遺伝子、DT-A：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、およびpBluescript：クローニングベクター。
【図５】この図は、ヒトEPOがターゲティングされたアレル構造およびサザン解析用プローブの位置を示す。P２：マウスIgκプロモーター領域遺伝子２、EPO：ヒトEPO遺伝子、Cκ：マウスIgκ遺伝子定常領域、polyA：マウスIgκ polyAシグナル領域、Puro：ピューロマイシン耐性遺伝子、DT-A：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子、probe：サザン解析用プローブ。
【図６】CreリコンビナーゼによるNeoユニットの除去を示す。
【図７】この図は、改変型マウスRSエレメントターゲティングベクターpRS-KOSV40PEの構造を示す。5’genome: マウスRSエレメント5’上流領域,3’genome: マウスRSエレメント3’下流領域, DT-A：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子，loxP-Neo-loxP: ネオマイシン耐性遺伝子。
【図８】この図は、SV40エンハンサー/プロモーター（SV40PE）、HSV-TKプロモーター、Neo耐性マーカー遺伝子、SV40ポリA及びLoxPを含む構造からなる薬剤耐性マーカー遺伝子発現ユニットを示す。HSV-TKは単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼを表わす。
【図９】この図は、pRS-KOSV40PEによりターゲティングされた改変型RSエレメント・ターゲティング・マウスES細胞株からのNeo耐性マーカー遺伝子除去の過程におけるRSエレメント近傍領域のゲノム構造を示す。
【図１０】この図は、マウスES細胞のIgκ定常領域近傍の野生型ゲノム構造（WT）、RSエレメント領域（RS）の代わりに薬剤耐性遺伝子（neor）が挿入されたゲノム構造（ΔRS）、並びにIgκ定常領域近傍に相同組換えにより所望遺伝子を導入するためのターゲティングベクターを示す。
【図１１】この図は、pRS-KOSV4072bpベクターの構造を示す。5’genome: マウスRSエレメント5’上流領域,3’genome: マウスRSエレメント3’下流領域, DT-A：ジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子，loxP-Neo-loxP: ネオマイシン耐性遺伝子。
【図１２】この図は、pRS-KOSV4072bpによりターゲティングされたマウスES細胞株からのNeo耐性マーカー遺伝子の除去を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０２５７】
配列番号１〜１８：合成オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９：SalI認識配列
配列番号２０〜２１：合成オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２：マルチクローニング部位を含む合成オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３〜３７：合成オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８：マルチクローニング部位
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2006094849.tif 000014
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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