(57)【要約】  【課題】  高感度な筋萎縮の診断方法、該診断方法を用いた抗筋萎縮作用の評価方法、及び該評価方法を用いた抗筋萎縮物質のスクリーニング方法を提供する。  【解決手段】  筋肉中の酸化ストレス誘導性蛋白質の発現量を指標とし、筋萎縮の診断、抗筋萎縮作用の評価、及び抗筋萎縮物質のスクリーニングを行なう。酸化ストレス誘導性蛋白質の例としては、ＴＮＦα、ｐＩκＢ、ＩＬ−８、ＭＣＰ１、ＩＣＡＭ１、４−ＨＮＥ修飾蛋白質が挙げられる。酸化ストレス誘導性蛋白質の発現量は、蛋白質量やｍＲＮＡ量を測定することにより評価することができる。筋肉中のミオスタチンとカルシニューリンの発現量を指標としても同様の効果がある。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋肉中における酸化ストレス誘導性蛋白質の発現量を指標として、筋萎縮を検出することを特徴とする筋萎縮の診断方法。
【請求項２】
前記酸化ストレス誘導性蛋白質は、レドックス感受性蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載の筋萎縮の診断方法。
【請求項３】
前記レドックス感受性蛋白質は、ＴＮＦα、ｐＩκＢ、ＩＬ−８、ＭＣＰ１又はＩＣＡＭ１であることを特徴とする請求項２に記載の筋萎縮の診断方法。
【請求項４】
前記酸化ストレス誘導性蛋白質は、酸化修飾蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載の筋萎縮の診断方法。
【請求項５】
前記酸化修飾蛋白質は、４−ヒドロキシ−２−ノネナール修飾蛋白質であることを特徴とする請求項４に記載の筋萎縮の診断方法。
【請求項６】
筋肉中におけるミオスタチン又はカルシニューリンの発現量を指標として、筋萎縮を検出することを特徴とする筋萎縮の診断方法。
【請求項７】
前記発現量は、蛋白質量であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の筋萎縮の診断方法。
【請求項８】
前記発現量は、ｍＲＮＡ量であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の筋萎縮の診断方法。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかに記載の筋萎縮の診断方法を用いて抗筋萎縮作用を評価する方法であって、被検物質を摂取させた動物の筋肉中における酸化ストレス誘導性蛋白質、ミオスタチン又はカルシニューリンの発現量を指標として、被検物質の抗筋萎縮作用を評価することを特徴とする抗筋萎縮作用の評価方法。
【請求項１０】
前記被検物質は、食品素材であることを特徴とする請求項９に記載の抗筋萎縮作用の評価方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の抗筋萎縮作用の評価方法を用いて被検物質の抗筋萎縮作用を評価し、所望の抗筋萎縮作用を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする抗筋萎縮物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋萎縮の診断方法、抗筋萎縮作用の評価方法、及び抗筋萎縮物質のスクリーニング方法に関し、さらに詳細には、酸化ストレス誘導性蛋白質等の発現量を指標とする高感度な筋萎縮の診断方法、該診断方法を用いた抗筋萎縮作用の評価方法、及び該評価方法を用いた抗筋萎縮物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮とは、筋蛋白の分解速度が合成速度を上回ることにより筋肉量が減少し、筋肉が痩せ細る状態をいう。筋萎縮は、筋肉を使わない状態が続くことによりおこる廃用性筋萎縮と、筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ）等の疾病による進行性筋萎縮に大別される。このうち、廃用性筋萎縮の原因となる筋肉を使わない状態は、ベッドレストやギプス固定等によって日常的に起こりうることであり、寝たきり状態となった老人にとって廃用性筋萎縮は大きな問題である。また、加齢に伴っても筋萎縮と同様の症状が起きることがあり、これは筋減弱症（サルコペニア）と呼ばれている。
【０００３】
筋萎縮が起こるメカニズムはまだ不明の点が多いが、酸化ストレスと密接に関係していることが明らかになりつつある。例えば、抗酸化物質であるビタミンＥが欠乏すると、筋萎縮が起こることが知られている。また特許文献１には、萎縮した筋肉内ではチオバルビツール反応陽性物質や酸化型グルタチオンの増加が認められることが記載されている。一方、鉄の増加が筋萎縮の進行に関与しているとの報告もある。また特許文献２には、Ｒａｓ活性化又はＲａｓの下流のシグナル伝達分子の作用により筋萎縮が阻害されることが記載されている。
【特許文献１】特開２００１−８９３８７号公報
【特許文献２】国際公開０１／００４３５４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
筋萎縮のように日常生活に大きな支障をきたす疾患は、まずは予防をすることが肝要である。そのためには、筋萎縮が起こる兆候や筋萎縮の初期段階を検出する技術が必要になる。筋萎縮を検出する方法としては、筋肉から漏れ出た各種の酵素、例えば、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、グルタミン酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、アルドラーゼ等をマーカー物質とし、それらの血中濃度を指標とする方法が一部で提案されているが、あまり一般的な方法ではない。むしろ、これらの酵素は筋肉が損傷したときに漏れ出ることが多いので、筋萎縮を正確に反映するとは考えにくい。さらに、ＧＯＴとＧＰＴは肝機能の指標でもあるので、肝機能障害と誤診する恐れもある。したがって、筋萎縮を高感度で検出でき、筋萎縮の予防に役立てることができるマーカー物質が求められている。
【０００５】
また、そのようなマーカー物質があれば、マーカー物質の量の変動を捕らえることで、
筋萎縮の改善状態のモニタリングをすることができる可能性がある。さらにまた、そのマーカー物質を指標にして、被検物質の筋萎縮に対する効果を評価したり、筋萎縮に効能がある物質をスクリーニングすることができる可能性がある。特に、そのような物質を含む食品素材があれば、それを日常的に食することによって筋萎縮の予防につなげられる。しかし、そのような筋萎縮のマーカー物質は見出されていない。
【０００６】
本発明の目的は、筋萎縮を検出することができる新しいマーカー物質を提供することにより、筋萎縮の高感度な診断等を可能にし、さらに筋萎縮に効果がある物質の評価やスクリーニングにも応用できる技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、酸化ストレス誘導性蛋白質に着目し、筋萎縮の動物モデルを用いて筋肉中の各種の酸化ストレス誘導性蛋白質の量を測定した。その結果、それらの酸化ストレス誘導性蛋白質の発現量が、筋萎縮の発症、抑制、改善の各状態に応答して変動し、筋萎縮の状態を反映することを見出した。さらに、ミオスタチンとカルシニューリンについても同様に筋萎縮の状態を反映することを見出した。さらに、該動物モデルを使用することにより、被検物質の抗筋萎縮作用の評価、及び抗筋萎縮作用を有する物質のスクリーニングに利用可能であることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
【０００８】
（１）  筋肉中における酸化ストレス誘導性蛋白質の発現量を指標として、筋萎縮を検出することを特徴とする筋萎縮の診断方法、
（２）  上記酸化ストレス誘導性蛋白質は、レドックス感受性蛋白質であることを特徴とする（１）に記載の筋萎縮の診断方法、
（３）  上記レドックス感受性蛋白質は、ＴＮＦα、ｐＩκＢ、ＩＬ−８、ＭＣＰ１又はＩＣＡＭ１であることを特徴とする（２）に記載の筋萎縮の診断方法、
（４）  上記酸化ストレス誘導性蛋白質は、酸化修飾蛋白質であることを特徴とする（１）に記載の筋萎縮の診断方法、
（５）  上記酸化修飾蛋白質は、４−ヒドロキシ−２−ノネナール修飾蛋白質であることを特徴とする（４）に記載の筋萎縮の診断方法、
（６）  筋肉中におけるミオスタチン又はカルシニューリンの発現量を指標として、筋萎縮を検出することを特徴とする筋萎縮の診断方法、
（７）  上記発現量は、蛋白質量であることを特徴とする（１）乃至（６）のいずれかに記載の筋萎縮の診断方法、
（８）  上記発現量は、ｍＲＮＡ量であることを特徴とする（１）乃至（６）のいずれかに記載の筋萎縮の診断方法。
（９）  （１）乃至（８）のいずれかに記載の筋萎縮の診断方法を用いて抗筋萎縮作用を評価する方法であって、被検物質を摂取させた動物の筋肉中における酸化ストレス誘導性蛋白質、ミオスタチン又はカルシニューリンの発現量を指標として、被検物質の抗筋萎縮作用を評価することを特徴とする抗筋萎縮作用の評価方法、
（１０）  上記被検物質は、食品素材であることを特徴とする（９）に記載の抗筋萎縮作用の評価方法、
（１１）  （９）又は（１０）に記載の抗筋萎縮作用の評価方法を用いて被検物質の抗筋萎縮作用を評価し、所望の抗筋萎縮作用を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする抗筋萎縮物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の筋萎縮の診断方法によれば、酸化ストレス誘導性蛋白質、ミオスタチン又はカルシニューリンの発現量を指標とするので、より高感度に筋萎縮を検出することができ、筋萎縮の予防に役立てることができる。
【００１０】
本発明の抗筋萎縮作用の評価方法によれば、食品素材等の被検物質の抗筋萎縮作用を正確かつ効率的に評価することができる。
【００１１】
本発明の抗筋萎縮物質のスクリーニング方法によれば、筋萎縮に効果がある食品素材等の物質をより効率的にスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
【００１３】
本発明の筋萎縮の診断方法の１つの様相は、筋肉中の酸化ストレス誘導性蛋白質の発現量を指標として筋萎縮を診断するものである。ここで「筋萎縮の診断」とは、筋萎縮が発症しているか否かを判定することのみではなく、筋萎縮の予防を目的として筋萎縮が発症するおそれの有無を判定することや、筋萎縮の改善状態や再発のモニタリングを行うことも含む。
【００１４】
また、「酸化ストレス誘導性蛋白質」とは、酸化ストレスによって誘導される蛋白質をいう。ここで、酸化ストレスとは、細胞や組織内において活性酸素群（スーパーオキサイド、過酸化水素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素、脂質ラジカルなど）や活性窒素群（一酸化窒素、ペルオキシナイトライトなど）が抗酸化能を超えて生じた結果、細胞や組織内が酸化側に傾いた状態をいう。
【００１５】
本発明の筋萎縮の診断方法の好ましい実施形態の一つは、酸化ストレス誘導性蛋白質がレドックス（ｒｅｄｏｘ）感受性蛋白質である実施形態である。レドックス感受性蛋白質は、酸化還元反応によりその機能が制御されている蛋白質の総称である。例えば、酸化ストレスによってレドックス感受性転写因子が活性化され、レドックス感受性蛋白質が誘導される。レドックス感受性蛋白質の好ましい例として、ＴＮＦα（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ、腫瘍壊死因子α）、ｐＩκＢ（Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｋａｐｐａ  Ｂ）、ＩＬ−８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８）、ＭＣＰ１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、ＩＣＡＭ１（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １）が挙げられる。
【００１６】
ＴＮＦαは、炎症性サイトカインの一種であり、筋蛋白分解作用を有することが知られている。
ｐＩκＢは、リン酸化されたＩκＢ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｋａｐｐａ  Ｂ）である。炎症性サイトカイン、ケモカイン、及び接着分子等の遺伝子を発現している転写因子ＮＦ−κＢ（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｋａｐｐａ  Ｂ）は、ＩκＢと複合体を形成している状態では不活性であるが、酸化ストレス等でＩκＢがリン酸化されると、ＮＦ−κＢはＩκＢから離れて核に移行する。この、リン酸化されたＩκＢがｐＩκＢである。
ＩＬ−８は、好中球を特異的に引き付けるケモカインである。なお、ラット等の動物ではＣＩＮＣ１（ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ−１）がＩＬ−８に相当する。また、マウスでＩＬ−８に相当する蛋白質はＫＣと呼ばれており、ＩＬ−８に相当する蛋白質は動物種によって名称が異なる。本明細書においてＩＬ−８というときは、ヒトのＩＬ−８の他に、ＣＩＮＣ１やＫＣ等の他の動物種のＩＬ−８に相当する蛋白質も含むものとする。
ＭＣＰ１は、単球（マクロファージ）を特異的に引き付けるケモカインである。
ＩＣＡＭ１は、炎症メディエーターの一種であり、筋組織や血管内皮に発現している。ＩＣＡＭ１は接着分子の一種でもあり、循環中の食細胞などと付着し、組織浸潤を促す作用を有する。
【００１７】
レドックス感受性蛋白質の他の例としては、ＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）、ＩＬ−１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）、ＩＦＮ−γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）等が挙げられる。これらのレドックス感受性蛋白質も転写因子ＮＦ−κＢによって転写制御されている。
以上のように、レドックス感受性蛋白質には、サイトカイン、ケモカイン、接着分子等の様々の活性を示す蛋白質が含まれている。
【００１８】
また、本発明の筋萎縮の診断方法の好ましい他の実施形態は、酸化ストレス蛋白質が酸化修飾蛋白質である。ここで、「酸化修飾蛋白質」とは、活性酸素等と反応することにより一部のアミノ酸残基が修飾された蛋白質をいう。アミノ酸残基の修飾の例としては、４−ヒドロキシ−２−ノネナール（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｎｏｎｅｎａｌ、４−ＨＮＥ）の付加、アクレオレイン（Ａｃｒｅｏｌｅｉｎ、ＡＣＲ）の付加、ヘキサノイルリジン（Ｈｅｘａｎｏｙｌ−ｌｙｓｉｎｅ）、ニトロチロシン（Ｎｉｔｒｏ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ）等が挙げられる。
【００１９】
また、本発明の筋萎縮の診断方法のさらに好ましい他の実施形態は、酸化修飾蛋白質が４−ＨＮＥ修飾蛋白質である。
【００２０】
４−ＨＮＥは過酸化脂質の分解産物であるアルデヒドの一種であり、酸化ストレスの亢進により生成されることが知られている。その結果、４−ＨＮＥが付加されて修飾された蛋白質（４−ＨＮＥ修飾蛋白質）が生成されることが知られている。
【００２１】
また、本発明の筋萎縮の診断方法の他の様相は、筋肉中のミオスタチン（Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）又はカルシニューリン（Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ）の発現量を指標として筋萎縮を診断するものである。ミオスタチンとカルシニューリンはいずれも筋肥大に関連するといわれている。すなわち、ミオスタチンは、筋成長を抑制する成長因子であることが知られており、ＧＤＦ８（Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｅｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ８）とも呼ばれるＴＧＦ-βスーパーファミリーの１つである。また、カルシニューリンは、プロテインホスファターゼ２Ｂとも呼ばれ、筋肉の肥大や分化を促進する作用を有することが知られている。
【００２２】
上記したレドックス感受性蛋白質、４−ＨＮＥ修飾蛋白質、ミオスタチン及びカルシニューリンは、いずれも公知物質であるが、筋肉中におけるそれらの発現量が筋萎縮の状態を反映することは、本発明者らが初めて明らかにした。
【００２３】
本発明の筋萎縮の診断方法に用いる検体としては、筋肉が好ましいが、他の組織や血液等であって筋肉中の酸化ストレス誘導性蛋白質の発現量を反映するものであれば、それらでもよい。検査材料としては、検体が筋肉や組織の場合はその抽出液を、検体が血液の場合は血漿又は血清を用いることができる。
【００２４】
本発明の筋萎縮の診断方法においては、酸化ストレス誘導性蛋白質の発現量を測定する際の測定対象によって、少なくとも２つの実施形態がある。１つの実施形態は、測定対象が酸化ストレス誘導性蛋白質自身であるもので、酸化ストレス誘導性蛋白質の量をもって発現量とする実施形態である。本実施形態では、酸化ストレス誘導性蛋白質の量を直接測定するので、より正確に筋萎縮の診断を行なうことができる。また、酸化ストレス誘導性蛋白質が４−ＨＮＥ修飾蛋白質のように翻訳後に修飾を受けた蛋白質の場合は、本実施形態によることが特に好ましい。なお、蛋白質量の測定方法は、目的の酸化ストレス誘導性蛋白質を特異的に測定できる方法であれば特に制限はなく、例えば、各種のイムノアッセイ、ウエスタンブロッティング、質量分析、クロマトグラフィー等を用いることができる。特に、目的の酸化ストレス誘導性蛋白質に対する抗体が取得されている場合は、イムノアッセイやウエスタンブロッティングが好適に用いられる。
【００２５】
イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確に酸化ストレス誘導性蛋白質の量を測定することが出来る。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、酸化ストレス誘導性蛋白質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
【００２６】
ウエスタンブロッティングにより酸化ストレス誘導性蛋白質の量を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的の酸化ストレス誘導性蛋白質を分離する。そして、膜に全蛋白質を転写して、酸化ストレス誘導性蛋白質に対する抗体を用い、膜上の酸化ストレス誘導性蛋白質を検出する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけでは酸化ストレス誘導性蛋白質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。なお、これらの酸化ストレス誘導性蛋白質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
【００２７】
質量分析によって酸化ストレス誘導性蛋白質の量を測定する場合、そのイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカー物質の量を測定することができる。さらに、担体に酸化ストレス誘導性蛋白質を固定化して、質量分析に供することもできる。例えば、担体として基板を使用したプロテインチップを用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化−飛行時間質量分析（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を行えば、酸化ストレス誘導性蛋白質の量をより正確に測定することができる。
【００２８】
クロマトグラフィーによって酸化ストレス誘導性蛋白質の量を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的の酸化ストレス誘導性蛋白質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中の酸化ストレス誘導性蛋白質の量を測定することができる。
【００２９】
本発明の筋萎縮の診断方法における他の実施形態は、測定対象が酸化ストレス誘導性蛋白質のｍＲＮＡであるもので、遺伝子の転写レベルを測定する実施形態である。本実施形態では、酸化ストレス誘導性蛋白質遺伝子の転写段階を捉えることができ、高感度の診断が可能である。ｍＲＮＡ量の測定方法は、目的の酸化ストレス誘導性蛋白質のｍＲＮＡの量を特異的に測定できる方法であれば特に制限はなく、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ、ノーザンブロッティング等を用いることができる。特に、ＲＴ−ＰＣＲによれば、測定時間が短くかつ微量のｍＲＮＡであっても測定可能であるので好適である。また、これらの方法に使用するプローブやプライマーは、各酸化ストレス誘導性蛋白質の遺伝子の転写産物に特異的にハイブリダイズ又は当該遺伝子の転写産物を特異的に増幅できるものであれば何でもよい。適宜の方法で標識されたプローブ又はプライマーを用いることで、ｍＲＮＡ量を測定することができる。なお、本発明の筋萎縮の診断方法においては、蛋白質量とｍＲＮＡ量のどちらか一方を測定すればよいが、より正確性を求める場合は両方を測定してもよい。また、発現量を測定する酸化ストレス誘導性蛋白質の数は、１個でもよいし複数でもよい。
【００３０】
なお、本発明は筋萎縮の診断方法に係るものであるが、同様の手段、すなわち、筋肉中における酸化ストレス誘導性蛋白質、ミオスタチン又はカルシニューリンの発現量を指標として筋肥大の状態を捉えることができる可能性もある。
【００３１】
本発明の筋萎縮の診断方法は、医療用機器の開発や品質管理にも使用することができる。例えば、温熱、冷却、電気、物理的刺激等の刺激を負荷することによって筋萎縮の抑制や筋肥大の促進を行なうための医療用機器を開発する場合に、本発明の筋萎縮の診断方法によって当該医療用機器を使用することによる筋萎縮の抑制や筋肥大の促進効果を評価することができる。
【００３２】
本発明の抗筋萎縮作用の評価方法は、動物に被検物質を摂取させ、該動物の筋肉中における酸化ストレス誘導性蛋白質、ミオスタチン又はカルシニューリンの発現量を指標とするものである。ここで「抗筋萎縮作用」とは、筋萎縮を治療、改善、抑制、及び／又は予防する作用をいう。本発明の抗筋萎縮作用の評価方法で用いる動物としては特に制限はなく、例えばマウス、ラット、ウサギ等を用いることができる。本発明の抗筋萎縮作用の評価方法における被検物質としては、医薬原体や食品素材が挙げられるが食品素材が好適である。すなわち、本発明の抗筋萎縮作用の評価方法で食品素材を評価することにより、機能性食品の開発に役立てることができる。なお、本発明の抗筋萎縮作用の評価方法によって、抗筋萎縮作用だけでなく筋肥大を促進する作用を評価できる可能性もある。
【００３３】
本発明の抗筋萎縮作用の評価方法は、例えば、以下のように実施することができる。まず、ラットを２群に分け、一方の群には普通食を、他方の群には被検物質を含む飼料を与えて飼育する。しばらく飼育した後に、各群のラットについて左肢座骨神経を切断して左下肢筋肉を不活動状態にし、左足に廃用性筋萎縮を起こさせる。次に、各群の左足のヒラメ筋を摘出し、ヒラメ筋中の酸化ストレス誘導性蛋白質の蛋白質量をイムノアッセイ等で測定する。そして、被検物質を含む試料を与えた群の方が酸化ストレス誘導性蛋白質の量が小さい場合は、当該被検物質が筋萎縮の抑制に効果があると評価する。この方法によれば、筋重量や筋蛋白質を指標としても筋萎縮を検出できない神経切断後の早い段階でヒラメ筋を摘出しても、筋萎縮を検出でき、被検物質の抗筋萎縮作用を評価することができる。
【００３４】
本発明は抗筋萎縮物質のスクリーニング方法は、動物に被検物質を摂取させ、該動物の筋肉中における酸化ストレス誘導性蛋白質、ミオスタチン又はカルシニューリンの発現量を指標として、被検物質の抗筋萎縮作用を評価するものである。ここで「抗筋萎縮物質」とは、筋萎縮を治療、改善、抑制、及び／又は予防する効果のある物質、すなわち、抗筋萎縮作用を有する物質をいう。本発明の抗筋萎縮物質のスクリーニング方法によれば、より効率的かつ正確に抗筋萎縮物質をスクリーニングすることができる。特に、被検物質が食品素材である場合は、スクリーニングされた食品素材を主原料とし、抗筋萎縮作用を有する機能性食品を作製することができる。そして、このような機能性食品を日常的に食することにより、筋萎縮の発症を抑制し、筋萎縮の予防につなげることができる。なお、本発明の抗筋萎縮物質のスクリーニング方法によって、抗筋萎縮物質だけでなく筋肥大を促進する物質をスクリーニングできる可能性もある。
【００３５】
本発明の抗筋萎縮物質のスクリーニング方法は、例えば、以下のように実施することができる。まず、ラットを被検物質の数に相当する群に分け、各群のラットに各被検物質を含む飼料を与えて飼育する。しばらく飼育した後に、各群のラットについて左肢座骨神経を切断して左下肢筋肉を不活動状態にし、左足に廃用性筋萎縮を起こさせる。次に、各群の左足のヒラメ筋を摘出し、ヒラメ筋中の酸化ストレス誘導性蛋白質の蛋白質量をイムノアッセイ等で測定する。そして、より小さい値を示した群に与えた被検物質を、筋萎縮の抑制に効果がある物質として選抜する。この方法によれば、筋重量や筋蛋白質を指標としても筋萎縮を検出できない神経切断後の早い段階でヒラメ筋を摘出しても、筋萎縮を検出でき、被検物質の中から抗筋萎縮物質をスクリーニングすることができる。
【００３６】
本発明の抗筋萎縮物質のスクリーニング方法は畜産分野にも有用であり、例えば、スクリーニングされた抗筋萎縮物質を含む飼料を家畜に与えて、筋萎縮を抑制したり筋肥大を促進することにより、１頭あたりの食肉の収量を増大させることができる。
【００３７】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
１．廃用性筋萎縮の動物モデル構築
９週齢のＷｉｓｔｅｒ系雄性ラットを６匹ずつ３群に分け、それぞれ普通食、ビタミンＥ（ＶＥ）添加食、及びコエンザイムＱ（ＣｏＱ）添加食を自由摂取させて飼育した。なお、ＶＥ添加食には、普通食の２５倍量のαトコフェロール（５００ＩＵ／ｋｇ）を含有するものを使用した。また、ＣｏＱ添加食には、普通食１ｋｇにつき１００ｍｇのＣｏＱを添加したものを使用した。飼育１週間後に、各群のラットについて左肢座骨神経を切断して、左下肢筋肉を不活動状態にした。その後、さらに２週間飼育を行なった後、各群のラットを屠殺し、下肢筋の一つであるヒラメ筋を左足（除神経肢）と右足（対照肢）とから摘出した。
【００３９】
まず、摘出したヒラメ筋の筋重量を微量天秤にて測定した。さらに、以下の手順で筋蛋白量を測定した。まず、摘出したヒラメ筋をホモジナイズし、５０ｍｇ分をライシスバッファー（シグマ社）に懸濁した。１時間攪拌した後、遠心処理（１４０００ｒｐｍ、１０分、４℃）を行い、上清を回収して蛋白抽出液とした。得られた上清中の蛋白濃度をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法にて測定し、筋蛋白量とした。図１（ａ）に筋重量の測定結果を、図１（ｂ）に筋蛋白量の測定結果を示す。すなわち、いずれの群も除神経した左足の方が、正常な右足に比べて筋重量、筋蛋白量とも有意に低かった（ｐ＜０．０５）。これにより、除神経することにより廃用性筋萎縮が発症することが確認された。また、ＶＥ添加食又はＣｏＱ添加食を与えた群は、普通食を与えた群に比べて左足の筋重量、筋蛋白量とも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。これにより、ＶＥ添加食又はＣｏＱ添加食を与えることにより、廃用性筋萎縮を抑制又は改善できることが確認された。以上より、廃用性筋萎縮の発症と抑制・改善の動物モデルが構築された。
【００４０】
２．各酸化ストレス誘導性蛋白質の測定（１）
上記１で調製した蛋白抽出液を試料として、以下の手順によるウエスタンブロッティングによって、４−ＨＮＥ修飾蛋白質、ＩＣＡＭ１、ＴＮＦα、及びｐＩκＢの濃度を測定した。まず、蛋白抽出液２０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、メンブレンに全蛋白質を転写した。５％スキムミルクを含むＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）にメンブレンを１時間浸漬し、ブロッキングした。次に、１次抗体液（５％スキムミルクを含むＰＢＳＴに１次抗体を溶解したもの）にメンブレンを一夜浸漬した。次に、２次抗体液（５％スキムミルクを含むＰＢＳＴに２次抗体を溶解したもの）にメンブレンを６０分間浸漬した。次に、メンブレンを化学発光させてフィルムに現像し、目的のバンドを検出した。バンドの発光強度をＮＩＨ  ｉｍａｇｅにて測定し、各バンドの濃度とした。なお、１次抗体は、４−ＨＮＥ修飾蛋白質に対してはＡＬＥＸＩＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製（品番２１０−７６７−Ｒ１００）、ＩＣＡＭ１に対してはＳａｎｔａＣｌｕｚ社製（品番ｓｃ−８４３９）、ＴＮＦαに対してはＳａｎｔａＣｌｕｚ社製（品番ｓｃ−１３４８）、ｐＩκＢに対してはＳａｎｔａＣｌｕｚ社製（品番ｓｃ−８４０４）のものを用いた。また、２次抗体はいずれもペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を用い、ｐＩκＢ、ＩＣＡＭ１、ＴＮＦαに対してはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製の品番ＮＡ９３１Ｖを、４−ＨＮＥ修飾蛋白質に対してはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製の品番ＮＡ９３４Ｖを用いた。
【００４１】
図２（ａ）に４−ＨＮＥ修飾蛋白質の測定結果を、図２（ｂ）にＩＣＡＭ１の測定結果を、図２（ｃ）にＴＮＦαの測定結果を、図２（ｄ）にｐＩκＢの測定結果を示す。なお、各グラフとも縦軸は、検出されたバンドをバックグラウンド値で数値化したものを、対照に対する相対値で表した。すなわち、正常食、ＶＥ添加食、ＣｏＱ添加食のいずれを摂取した場合でも、廃用性筋萎縮を起こした筋肉（左足）と正常型の筋肉（右足）を比較した場合、廃用性筋萎縮を起こした筋肉（左足）の方が、４−ＨＮＥ修飾蛋白質、ＩＣＡＭ１、ＴＮＦα、及びｐＩκＢのいずれの酸化ストレス誘導性蛋白質の濃度も有意に高かった（ｐ＜０．０５）。ｐＩκＢにおいては、正常型の筋肉（右足）では検出されなかった。また、普通食、ＶＥ添加食、又はＣｏＱ添加食を摂取したときの廃用性筋萎縮を起こした筋肉（左足）同士を比較した場合、４−ＨＮＥ修飾蛋白質、ＴＮＦα、及びｐＩκＢの濃度は、ＶＥ添加食とＣｏＱ添加食のいずれを摂取した場合も普通食を摂取した場合に比べて有意に低かった（ｐ＜０．０５）。また、ＩＣＡＭ１の濃度は、ＣｏＱ添加食を摂取した場合は普通食を摂取した場合に比べて有意に低かった（ｐ＜０．０５）。特に、ｐＩκＢの濃度は有意差が大きく、廃用性筋萎縮の程度を高感度に反映していた。
以上より、筋肉中の４−ＨＮＥ修飾蛋白質、ＩＣＡＭ１、ＴＮＦα、及びｐＩκＢの発現量を指標とすることにより、廃用性筋萎縮を検出することができ、さらに廃用性筋萎縮の抑制又は改善状態をモニターできる可能性が示唆された。
【００４２】
３．各酸化ストレス誘導性蛋白質の定量（２）
上記１で調製した蛋白抽出液を試料として、ＥＬＩＳＡ法によってＣＩＮＣ１及びＭＣＰ１の濃度を測定した。ＣＩＮＣ１の測定にはＩＢＬ社のキットを、ＭＣＰ１の測定にはＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社のキットを用いた。図３（ａ）にＣＩＮＣ１の測定結果を、図３（ｂ）にＭＣＰ１の測定結果を示す。なお、各グラフとも縦軸は、ｐｇ／ｍｇ蛋白質×１０-2の単位で測定された値の対照に対する相対値で表した。すなわち、正常食、ＶＥ添加食、ＣｏＱ添加食のいずれを摂取した場合でも、廃用性筋萎縮を起こした筋肉（左足）と正常型の筋肉（右足）を比較した場合、廃用性筋萎縮を起こした筋肉（左足）の方が、ＣＩＮＣ１及びＭＣＰ１のいずれの酸化ストレス誘導性蛋白質の濃度も有意に高かった（ｐ＜０．０５）。また、普通食、ＶＥ添加食、又はＣｏＱ添加食を摂取したときの廃用性筋萎縮を起こした筋肉（左足）同士を比較した場合、ＣＩＮＣ１及びＭＣＰ１の濃度は、ＶＥ添加食とＣｏＱ添加食のいずれを摂取した場合も普通食を摂取した場合に比べて有意に低かった（ｐ＜０．０５）。
以上より、筋肉中のＣＩＮＣ１（ＩＬ−８）又はＭＣＰ１の発現量を指標とすることにより、廃用性筋萎縮を検出することができ、さらに廃用性筋萎縮の抑制又は改善状態をモニターできる可能性が示唆された。
【００４３】
４．ミオスタチンとカルシニューリンの定量
以下の手順にて、筋肉中のミオスタチンとカルシニューリンのｍＲＮＡ量を測定した。まず、ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社）を用いて、上記１でホモジナイズした筋肉からＲＮＡを抽出した。次に、ＲＴ−ＰＣＲキット（タカラバイオ社）を用いて、抽出したＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。次に、得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡ断片を得た。プライマーとしては、ミオスタチン用に配列番号１（センス）と配列番号２（アンチセンス）で表されるオリゴヌクレオチドを、カルシニューリン用に配列番号３（センス）と配列番号４（アンチセンス）で表されるオリゴヌクレオチドを使用した。得られた増幅ＤＮＡ断片の量をＧｅｎｅＡｍｐ５７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にて定量し、ｍＲＮＡ量に換算した。図４（ａ）にミオスタチンのｍＲＮＡの測定結果を、図４（ｂ）にカルシニューリンのｍＲＮＡの測定結果を示す。なお、各グラフとも縦軸は対照に対する相対値である。すなわち、正常食、ＶＥ添加食、ＣｏＱ添加食のいずれを摂取した場合でも、ミオスタチンのｍＲＮＡ量は、廃用性筋萎縮を起こした筋肉（左足）と正常型の筋肉（右足）を比較した場合、廃用性筋萎縮を起こした筋肉（左足）の方が有意に高かった（ｐ＜０．０５）。一方、正常食、ＶＥ添加食、ＣｏＱ添加食のいずれを摂取した場合でも、カルシニューリンのｍＲＮＡ量は、廃用性筋萎縮を起こした筋肉（左足）と正常型の筋肉（右足）を比較した場合、廃用性筋萎縮を起こした筋肉（左足）の方が有意に低かった（ｐ＜０．０５）。また、普通食、ＶＥ添加食、又はＣｏＱ添加食を摂取したときの廃用性筋萎縮を起こした筋肉（左足）同士を比較した場合、ミオスタチンのｍＲＮＡ量は、ＣｏＱ添加食を摂取した場合に普通食を摂取した場合に比べて有意に低かった（ｐ＜０．０５）。一方、普通食、ＶＥ添加食、又はＣｏＱ添加食を摂取したときの廃用性筋萎縮を起こした筋肉（左足）同士を比較した場合、カルシニューリンのｍＲＮＡ量は有意差がなかった。
以上より、筋肉中のミオスタチン又はカルシニューリンの発現量を指標とすることにより、廃用性筋萎縮を検出することができ、さらにミオスタチンについては廃用性筋萎縮の抑制又は改善状態をモニターできる可能性が示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１（ａ）は各群における筋重量の測定結果を表すグラフであり、図１（ｂ）は各群における筋蛋白量の測定結果を表すグラフである。
【図２】図２（ａ）は各群における４−ＨＮＥ修飾蛋白質の測定結果を表すグラフであり、図２（ｂ）は各群におけるＩＣＡＭ１の測定結果を表すグラフであり、図２（ｃ）は各群におけるＴＮＦαの測定結果を表すグラフであり、図２（ｄ）は各群におけるｐＩκＢの測定結果を表すグラフである。
【図３】図３（ａ）は各群におけるＣＩＮＣ１の測定結果を表すグラフであり、図３（ｂ）は各群におけるＭＣＰ１の測定結果を表すグラフである。
【図４】図４（ａ）は各群におけるミオスタチンのｍＲＮＡの測定結果を表すグラフであり、図４（ｂ）は各群におけるカルシニューリンのｍＲＮＡの測定結果を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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