(57)【要約】【課題】  本発明は結核菌の迅速かつ簡便な検出同定に関するものである。【解決手段】  結核菌遺伝子の塩基配列をもとに結核菌特異的オリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し合成する。該プライマーを用いた遺伝子増幅を検出することによる結核菌同定方法を確立し、さらに該プライマーを用いた結核菌同定用キットを作製する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
結核菌１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子塩基配列から又はその相補的塩基配列から選ばれた、標的領域塩基配列を増幅するための塩基配列で、結核菌特異的ゲノムにアニーリングを起こす塩基配列および該塩基配列の３’末端側塩基配列に相補的な塩基配列で、該塩基配列の５’末端側に連結する塩基配列を含むプライマー。
【請求項２】
結核菌１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列又はその相補的塩基配列から選ばれた塩基配列１ＧＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧ、塩基配列２ＡＴＣＣＣＧＴＧＧＴＣＣＴＡＴＣＣＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＧ、塩基配列３ＴＡＣＣＣＧＴＣＧＴＣＧＣＣＴＴＧ、塩基配列４ＧＣＧＣＴＴＴＡＧＣＧＧＴＧＴＧＧＣＣＧＴＣＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＣＡを含む請求項１のプライマー。
【請求項３】
塩基配列がＡＧＡＣＣＣＡＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧおよび／又はＣＣＧＣＧＧＣＣＴＡＴＣＡＧＣであるループプライマー。
【請求項４】
結核菌特異的遺伝子の増幅法がＬＡＭＰ法である請求項１から請求項３のプライマー。
【請求項５】
請求項１から請求項３のプライマーを用いるＬＡＭＰ法による結核菌特異的遺伝子の増幅法。
【請求項６】
請求項５の増幅法による結核菌の同定方法。
【請求項７】
請求項１から請求項４のプライマーを含む結核菌用同定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【背景技術】
【０００１】  結核は結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）によって発症する感染性疾患である。感染性疾患の診断には感染起因菌の迅速で確実な同定が必要である。現在、結核の病原の診断には、主に喀痰を検体として塗沫鏡検および培養検査が行われている。【０００２】  結核菌のなかで、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓはヒト型結核菌であり、Ｍ．ｂｏｖｉｓはウシ型結核菌である。臨床上、結核の起因菌はヒト型結核菌である。従って、実質的臨床的に結核起因菌Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの検出が問題である。【０００３】  塗沫鏡検は迅速性と簡便性に優れており低費用であるが、検出感度が低いことが欠点である。さらに、塗沫鏡検によっては、検出特異度が低い、すなわち、起因菌種Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまでの確定は困難である。例えば、特殊染色法であるチール−ニールセン染色法によって、供試菌が抗酸菌であることは推測されるが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓであると同定できない。【０００４】  培養検査は、小川培地などを用いて検体から起因菌を培養するものであるから、培養陽性であれば病原診断に有用である。しかし、結核菌の発育はきわめて遅いため臨床的に十分な診断法となっていない。【０００５】  このような問題を解決するために、検体中の結核菌特異的ＤＮＡ塩基配列を増幅検出する結核診断用ＰＣＲ法（ＴＢ−ＰＣＲ法）（青木ら、ＰＣＲ法を利用した抗酸菌ＤＮＡ検出キット（アンプリコア  マイコバクテリウム）による臨床検体からの抗酸菌迅速検出、臨床検査６９、５９３−６０５、１９９４）が開発され、臨床で広く使用されている。【０００６】  ＴＢ−ＰＣＲ法では、臨床検体から結核菌特異的なＤＮＡ塩基配列を検出できるため、従来の結核診断法に比べて迅速性、特異度、感度に優れているとされており、現在、ＴＢ−ＰＣＲは我国では保険適用が認められている。しかし、ＴＢ−ＰＣＲ法は手技が煩雑な上に様々な阻害物質の影響を受けやすい。又、複雑な温度制御のための特別の反応装置のない検査室では実施できないなどの問題がある。【０００７】  このような問題点を解決する新規の遺伝子増幅法として、ＬＡＭＰ法（Ｎｏｔｏｍｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８，ｅ６３  ｉ−ｖｉｉ，２０００）が開発された。【０００８】  ＬＡＭＰ法は、１）１種類の酵素を使用して遺伝子増幅反応を定温で進行する、２）特異性、増幅効率が高く、短時間で増幅可能である、３）Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キットは、ＬＡＭＰ法を用いてターゲットＤＮＡを増幅させるための簡易試薬キットで、一定温度（６０〜６５℃、通常は６３℃）に保ち、一定時間（標準で１時間）反応するだけでＤＮＡを増幅できる（Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット、栄研化学（株）、説明書）。【０００９】  ＬＡＭＰ法を用いた結核菌遺伝子診断法システム（Ｉｗａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１，２６１６−２６２２，２００３）が報告されている。このシステムでは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、およびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅが検出同定できるとされており、ＰＣＲ法と同等の検出感度が得られることが示されている。しかし、増幅反応に１時間を要する（３５分に短縮すると検出感度が１０〜１００倍低下する）ことは、迅速性が十分にいかされたシステムとは言い難く、さらに迅速な検出法が求められる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  本発明は結核菌の迅速かつ簡便な検出同定に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  結核菌遺伝子の増幅法としてＬＡＭＰ法を行った。【００１２】  結核菌に特異的な遺伝子プライマーおよび遺伝子増幅を加速するためのループプライマー（ｌｏｏｐ  ｐｒｉｍｅｒ）を設計し、このプライマーシステムを用いた結核菌検出用ＬＡＭＰ法（ＴＢ−ＬＡＭＰ法）を行うことによって結核菌特異的で迅速かつ簡便な結核菌検出が可能になることを見いだして、本発明に至った。【００１３】  ＬＡＭＰ法に用いるプライマーの設計にあたっては、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベースからＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属を含む細菌の小サブユニット−リボソームＤＮＡの塩基配列を取得し、ＤＮＡ解析ソフト（Ｇｅｎｅｔｙｘ  Ｍａｃ  Ｖｅｒ１２，Ｇｅｎｅｔｙｘ，東京）を用いて多重並列解析したデータをもとに、結核菌遺伝子配列のなかで６ケ所の特異的塩基配列を特定する（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  １６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅ．Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２９１７）。【００１４】  特定した６ケ所の特異的塩基配列をもとに、ＬＡＭＰ法に用いるプライマーとして、結核菌に特異的な４種類のオリゴヌクレオチド（２種類はインナープライマー（ｉｎｎｅｒｐｒｉｍｅｒ）で他の２種類はアウタープライマー（ｏｕｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ））を設計する。ここで、フォワード−およびバックワードインナープライマーをそれぞれＦＩＰおよびＢＩＰと呼ぶ。又、フォワード−およびバックワードアウタープライマーをＦ３およびＢ３と呼ぶ。さらに、ＴＢ−ＬＡＭＰ法を行うにあたって、２種類のループプライマーを設計する。【００１５】  本設計プライマーを用いたＬＡＭＰ法による特異的塩基配列の増幅には、これらの塩基配列が起点構造をもつことが必要である。この起点構造の塩基配列をＤＮＡ解析ソフト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１，３４０６−３４１５，２００３およびＪ．Ｓ．Ｌｕｃｉａ，Ｊｒ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，９５，１４６０−１４６５，１９９８）上で計算できる。すなわち、ＬＡＭＰ反応温度下で想定される自己会合を起こした２次元構造（起点構造）を確認することができる。
【発明の効果】
【００１６】  本発明は、結核菌の小サブユニットリボソームＤＮＡの結核菌特異的塩基配列をもとに設計したオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＬＡＭＰ法を行うことによって結核菌を検出するものである。従来のＰＣＲ法および／又はＬＡＭＰ法よりも、検出感度および検出特異度ともに高く、操作が簡便であり、遺伝子増幅時間は１５分ときわめて迅速である。さらに、本発明のプライマーセットを用いたときの結核菌の検出下限は２菌体相当量ゲノムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】結核菌検出の検体
結核菌検出の検体として用いられるものは、結核菌感染者又は結核患者から採取される臨床検体、例えば喀痰、胃液、咽頭分泌物、血液、組織、腸液など、あるいは培養菌体などの材料を用いることができる。これらの検体をＬＡＭＰ法の材料として用いるには、前処理として菌体の濃縮と分離、菌体からの核酸の単離、濃縮などを行ってよい。【００１８】鋳型ＤＮＡの抽出
マイコバクテリウム属細菌は小川培地で、一般細菌は普通寒天培地で培養した発育集落から菌体を採取し、常法によるフェノール・クロロフォルム抽出後に蒸留水に溶解したものを鋳型ＤＮＡにすることができる。カンジダ属真菌はサブロー・グルコース寒天培地上の発育集落からＭａｍｉｍｕｒａらの迅速法（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０，３５８−３６４，１９９４）によってＤＮＡを抽出し、これた鋳型ＤＮＡにすることができる。又、ヒトの全血から常法によって白血球を採取し、これをＱＬＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン、ＵＳＡ）で精製したものをＤＮＡ標品にすることができる。【００１９】喀痰からの核酸検出検体の調製
喀痰検体を調製法（アンプリコア・マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ロシュ、ＵＳＡ）に従って、Ｎ−アセチル−システイン−ＮａＯＨ法で処理後の遠沈物をＬＡＭＰ法の検体として用いることができる。【００２０】増幅産物の検出
増幅産物の検出には公知の技術を適用できる。増幅反応の産物を、常法に従ってアガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロミド染色後、紫外線照射によって増副産物に特異的なラダー状の泳動像を確認することができる。【００２１】又、ＬＡＭＰ反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムによる反応液の白濁を肉眼的に観察することによって、あるいはこの白濁を分光光度計を用いて測定することによって、増幅をきわめて簡便に確認できる。【００２２】  本発明は、結核菌に特異的な遺伝子プライマーおよび遺伝子増幅を加速するためのループプライマーの設計にその特徴がある。これらのプライマーを用いたＴＢ−ＬＡＭＰ法を行うことによって結核菌特異的で迅速かつ簡便な結核菌検出が可能になる。又、ループプライマーは１種類でも２種類でもよい。【００２３】  ＬＡＭＰ法に用いるプライマーの設計にあたっては、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベースからマイコバクテリウム属を含む細菌の小サブユニットリボソームＤＮＡの塩基配列を取得し、ＤＮＡ解析ソフト（Ｇｅｎｅｔｙｘ  Ｍａｃ  Ｖｅｒ１２，Ｇｅｎｅｔｙｘ，東京）を用いて多重並列解析したデータをもとに、結核菌遺伝子配列のなかで６ケ所の特異的塩基配列を特定する（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  １６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅ．Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．Ｘ５２９１７）。【００２４】  特定した６ケ所の特異的塩基配列をもとに、ＬＡＭＰ法に用いるプライマーとして、結核菌に特異的な４種類のオリゴヌクレオチドを設計する。さらに、ＴＢ−ＬＡＭＰ法を行うにあたって、２種類のループプライマーを設計する。【００２５】  設計されたオリゴヌクレオチド配列に基づいたＤＮＡオリゴヌクレオチドは公知の技術β−シアノエチルアミダイト法（キアゲン、東京）によって合成することができる。【００２６】ＰＣＲ法
本発明のＴＢ−ＬＡＭＰ法と比較のための喀痰検体のＴＢ−ＰＣＲ法は、アンプリコア・マイコバクテリウム・ツベルクローシス（ロシュ、ＵＳＡ）を用いて行うことができる。又、鋳型ＤＮＡのＰＣＲ法は、ｐｕＲｅ  Ｔａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を用いて行うことができる。マイコバクテリウム属を含む細菌には、小サブユニット−リボソームＤＮＡの共通配列、真菌には大サブユニット−リボソームＤＮＡの共通配列、ヒトではヒトβ−グロブリン遺伝子配列を用いることができる。増幅反応には、サーマルサイクラーによる逐次的サイクル反応を行う。鋳型ＤＮＡの有無の判定は、常法によるアガロース電気泳動法で特異的サイズのバンドの有無によって確認する。
【実施例】
【００２７】以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。【００２８】実施例１  結核菌特異的遺伝子プライマーの設計
ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベースからマイコバクテリウム属細菌の小サブユニット−リボソームＤＮＡの塩基配列を取得し、ＤＮＡ解析ソフト（Ｇｅｎｅｔｙｘ  Ｍａｃ  Ｖｅｒ１２，Ｇｅｎｅｔｙｘ，東京）を用いて多重並列解析したデータをもとに、結核菌遺伝子配列のなかで６ケ所の特異的塩基配列を特定した（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  １６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡｇｅｎｅ．Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５２９１７）。【００２９】  特定した塩基配列は３１ｇｇａａａｇｇｔｃｔｃｔｔｃｇｇａｇａｔａｃｔｃｇａｇｔｇｇｃｇａａｃｇ（Ｆ３）ｇｇｔｇａｇｔａａｃａｃｇｔｇｇｇｔｇａｔｃｔｇｃｃｃｔｇｃａｃｔｔｃｇｇ（ＦＩＰ（Ｆ２））ｇａｔａａｇｃｃｔｇｇｇａａａｃ  ｔｇｇｇｔｃｔ（ｌｏｏｐＦ）ａａｔａｃｃｇｇａｔａｇｇａｃｃａｃｇｇｇａｔ（ＦＩＰ（Ｆｌ））ｇｃａｔｇｔｃｔｔｃｔｇｇｔｇｇａａａｇｃｇｃｔｔｔａｇｃｇｇ（ＢＩＰ（Ｂ１））ｔｇｔｇｇｇａｔｇａｇｃｃｃｇｃｇｇｃｃｔａｔｃａｇｃ（ｌｏｏｐ  Ｂ）ｔｔｇｔｔｇｇｔｇｇｇｇｔｇａｃｇｇ（ＢＩＰ（Ｂ２））ｃｃｔａｃｃａａｇｇｃｇａｃｇａｃｇｇｇｔａ（Ｂ３）ｇｃｃｇｇｃｃｔｇａｇａｇｇｇｔｇｔｃｃｇｇｃｃａｃａｃｔｇｇｇａ２８０である。ここで、配列における塩基番号を両端に示した。下線部は各プライマー設計に対応する塩基配列部位を表し、それに対応するプライマー名を配列後に括弧を付けて示した。【００３０】各プライマーと塩基配列  Ｆ３：ＧＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧ、ＦＩＰ：ＡＴＣＣＣＧＴＧＧＴＣＣＴＡＴＣＣＧ（Ｆ１ｃ）ＴＣＴＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＧ（Ｆ２）、Ｂ３ｃ：ＴＡＣＣＣＧＴＣＧＴ  ＣＧＣＣＴＴＧ、ＢＩＰ：ＧＣＧＣＴＴＴＡＧＣＧＧＴＧＴＧＧ（Ｂ１）ＣＣＧＴＣＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＣＡ（Ｂ２ｃ）を設計した。ここで、Ｆ３は標的遺伝子Ｆ３領域の塩基配列、ＦＩＰは５’末端側にＦ１と相補的な領域（Ｆ１ｃ）をもち、標的遺伝子Ｆ２領域を３’末端側に連結した塩基配列、Ｂ３ｃは標的遺伝子のＢ３領域に相補的な塩基配列、ＢＩＰは５’末端側に標的遺伝子Ｂ１領域をもち（Ｂ１）、Ｂ２と相補的な配列（Ｂ２Ｃ）を３’末端側に連結した塩基配列、である。【００３１】  さらに、ＴＢ−ＬＡＭＰ法を行うにあたって、２種類のループプライマー、ループプライマーＦ：ＡＧＡＣＣＣＡＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧおよびループプライマーＢ：ＣＣＧＣＧＧＣＣＴＡＴＣＡＧＣを設計した。【００３２】  設計されたオリゴヌクレオチド配列に基づいたプライマーは公知の技術β−シアノエチルアミダイト法（キアゲン、東京）によって合成した。【００３３】実施例２  ＴＢ−ＬＡＭＰ法の検出特異度
マイコバクテリウム属のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ  ２菌株、非Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  １０菌株、さらに非マイコバクテリウム属１２菌株およびヒト白血球細胞１株を用いた（表１）。【００３４】  鋳型ＤＮＡの調製  マイコバクテリウム属菌株は小川培地で室温にて２週間、一般細菌は普通寒天培地で３７℃にて１８時間培養した。各々数個の発育集落を採取し、常法に従ってＤＮＡをフェノール・クロロフォルム抽出後、蒸留水に溶解して鋳型ＤＮＡを得た。カンジダ・アルビカンスはサブロー・グルコース寒天培地上で３７℃にて２４時間培養して得た菌体からＭａｋｉｍｕｒａらの迅速法によってＤＮＡを抽出した。又、ヒトのＥＤＴＡ加全血４０ｍｌを３，０００ｘＧ、７分間遠沈後、白血球を採取し、これをキアゲンのキット（前出）で精製したものをＤＮＡ標品とした。【００３５】  ＬＡＭＰ反応のための反応液組成  本発明で得たプライマー系を用いたＬＡＭＰ反応を行うための基準反応液の組成を示す。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ、ＫＣｌ  １０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  ８ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １０ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ  ２０  １．１０％、Ｂｅｔａｉｎｅ  １．６Ｍ、ｄＮＴＰｓ  １．４ｍＭ、プライマーとしてＦＩＰ  ４０ｐＭ、ＢＩＰ  ４０ｐＭ、Ｆ３  １０ｐＭ、Ｂ３  １０ｐＭ、ｌｏｏｐ  Ｆ  ４０ｐＭ、ｌｏｏｐ  Ｂ  ４０ｐＭ、さらにＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ１．０μｌ、鋳型ＤＮＡ  １−３μｌ、および蒸留水で全量を２５μｌ／チューブにした。【００３６】  ＬＡＭＰ反応  本発明で設計、合成したプライマー系を用いたＬＡＭＰ反応をＬｏｏｐａｍｐＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学、東京）で行った。反応は６５℃の固定温度下で６０分間行い、８０℃２分間加熱して反応を停止後に増幅の有無を判定した。【００３７】  増幅反応の産物を、ＴＢＥ緩衝液、１．２％アガロースゲルにて１００Ｖ４０分電気泳動後、エチジウムブロミド染色し、紫外線照射によって増副産物に特異的なラダー状の泳動像を確認した。【００３８】  又、ＬＡＭＰ反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムによる反応液の白濁を肉眼的に観察することによって増幅を確認した。表１に示したように、マイコバクテリウム属結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ｂｏｖｉｓ）のみで増幅が確認された。【００３９】ＰＣＲ法
ＴＢ−ＬＡＭＰ法との比較  結核の疑いのある患者から採取した喀痰を検体としてＴＢ−ＰＣＲ法を実施した。【００４０】    アンプリコア・マイコバクテリウム・ツベルクローシス（ロシュ、ＵＳＡ）の添付説明書に従って実施した。鋳型ＤＮＡのＰＣＲ法は、ｐｕＲｅ  Ｔａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を用い、プライマーには各々、マイコバクテリウム属を含む細菌には、小サブユニット−リボソームＤＮＡの共通配列Ｆ５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’、Ｂ５’−ＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧ−３’、真菌には大サブユニット−リボソームＤＮＡの共通配列Ｆ５’−ＡＡＧＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＧＧＡＧＧ−３’、Ｂ５’−ＧＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＡＡＧＡＣＧＧ−３’、ヒトではヒトβ−グロブリン遺伝子配列Ｆ５’−ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ−３’、Ｂ５’−ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ−３’を用いた。増幅反応には、サーマルサイクラー（ＡＢＩ２４００、パーキンエルマー、ＵＳＡ）を用い、（１）９５℃、６０秒、（２）５５℃、１２０秒、（３）７２℃、９０秒の条件で逐次的に３０サイクルの反応を行った。鋳型ＤＮＡの有無の判定は、常法によるアガロース電気泳動法で特異的サイズのバンドの有無によって確認した。表１に示したように、マイコバクテリウム属結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ｂｏｖｉｓ）のみで増幅が確認された。【００４１】
【表１】
2006061134.tif 000002
2006061134.tif 000003
【００４２】実施例３  ＴＢ−ＬＡＭＰ法の検出感度
本発明のプライマー系を用いたＬＡＭＰ法の検出感度について検討した。  ＬＡＭＰ反応は実施例２に示した条件で行った。【００４３】  Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＳＭＵ１株を小川培地で室温にて２週間培養した後に、数個の発育集落を採取し、常法に従って本菌のＤＮＡをフェノール・クロロフォルム抽出した。これを蒸留水に溶解して鋳型ＤＮＡとした。ＬＡＭＰ反応のための反応液組成（前述）のなかの鋳型ＤＮＡの濃度を、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの２０，０００菌体相当量１００ｐｇ／チューブから同０．００２菌体相当量１０ａｇ／チューブまで１０倍段階希釈したものとした。ＬＡＭＰ反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムによる反応液の白濁を肉眼的に観察するきわめて簡便な方法によって増幅を確認した。又、増幅反応の産物を、ＴＢＥ緩衝液、１．２％アガロースゲルにて１００Ｖ４０分電気泳動後、エチジウムブロミド染色し、紫外線照射によって増副産物に特異的なラダー状の泳動像を確認した。本ＴＢ−ＬＡＭＰ法では、表２に示すように、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの２菌体相当量１０ｆｇ／チューブまで検出することができた。【００４４】
【表２】
2006061134.tif 000004
【００４５】実施例４  ＴＢ−ＬＡＭＰ法の反応速度（ループプライマーの効果）
本発明のプライマー系を用いたＬ−ＡＭＰ法の反応速度におけるループプライマーの効果について検討した。  ＴＢ−ＬＡＭＰ反応は実施例２に示した条件で、増幅の確認は実施例３に示した方法に従った。【００４６】  実施例３で調製したＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＳＭＵ１株の鋳型ＤＮＡを用いた。ＴＢ−ＬＡＭＰ反応系に含まれるループプライマーが、両ループプライマー（ＦおよびＢ）、ループプライマーＦのみ、ループプライマーＢのみ、であるＴＢ−ＬＡＭＰ反応系、および両ループプライマーとも含まれないＴＢ−ＬＡＭＰ反応系を設定した。又、反応時間は０、５、１０、１５、２０、３０、４５、６０分とした。【００４７】  各ＴＢ−ＬＡＭＰ反応系の各反応時間経過後の増副産物の有無を確認した。両ループプフイマーとも含まれないＴＢ−ＬＡＭＰ反応系では、４５分、６０分で増幅産物を確認した。ループプライマーＦ又はループプライマーＢのみが含まれる場合は反応時間２０分で増幅産物を確認した。さらに、両ループプライマーが含まれる場合は１５分で増幅産物を確認した。【００４８】実施例５  臨床検体のＴＢ−ＬＡＭＰ法と他の検出法との比較
結核が疑われる患者からの採取した喀痰１０検体を用いて、ＴＢ−ＬＡＭＰ法、ＴＢ−ＰＣＲ法および培養法によるマイコバクテリウム属検出の成績を比較した。【００４９】    喀痰からの核酸検出検体は、調製法（アンプリコア・マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ロシュ、ＵＳＡ）に従って、Ｎ−アセチル−システイン−ＮａＯＨ法で処理後の遠沈物を検体として用いた。ＴＢ−ＬＡＭＰ反応は実施例２に示した条件で、増幅の確認は実施例３に示した方法に従った。ＴＢ−ＰＣＲ法は実施例２に示した条件で行った。【００５０】  結果を表３に示した。喀痰１０検体のうち５検体（検体１から検体５）がＴＢ−ＬＡＭＰ法陽性、５検体（検体６から検体１０）が陰性であった。この結果はＴＢ−ＰＣＲ法の結果に一致した。【００５１】  喀痰培養法では、ＴＢ−ＬＡＭＰ法で陽性の全５検体からＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓが分離同定された。ＴＢ−ＬＡＭＰ法で陰性の５検体中３検体からＭ．ａｖｉｕｍ又はＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅが分離同定された。【００５２】
【表３】
2006061134.tif 000005
【００５３】実施例５  結核菌用同定キット
本発明のプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ、および反応基質を含むＬＡＭＰ法による結核菌同定用反応液キットを作製した。【００５４】    反応液キット  １反応分組成Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ、ＫＣｌ１０ｍＭ、ＭｇＳＯ４８ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４１０ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０１．１０％、Ｂｅｔａｉｎｅ  １．６Ｍ、ｄＮＴＰｓ  １．４ｍＭ、プライマー６種類（ＦＩＰ  ４０ｐＭ、ＢＩＰ  ４０ｐＭ、Ｆ３  １０ｐＭ、Ｂ３  １０ｐＭ、ｌｏｏｐ  Ｆ  ４０ｐＭ、ｌｏｏｐ  Ｂ４０ｐＭ）、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ１．０μｌ、および蒸留水適量（μｌ）。この反応液に鋳型ＤＮＡ（核酸検出検体）１−３μｌを添加し、全量を２５μｌ／チューブにする。
【産業上の利用可能性】
【００５５】  本発明によって、結核菌保菌者および／又は患者からの検出感度および検出特異度の高い、さらに従来よりも迅速な結核菌検出を可能にする。