(57)【要約】      （修正有）【課題】生体材料の薄切片の作製や染色処理を行う際の操作性を向上させる。【解決手段】試料薄片を接着させる粘着フイルムの粘着面の周囲を囲む  窓枠状ガイドを設ける。このガイドは非粘着部を持ち、粘着フイルムを保持するホルダーと合わせて、前記ガイドによって囲まれる開口に対応する粘着部を有するガイド付き粘着フィルムとする。ガイドは各種の可撓性を有するプラスチックで構成し、薄片試料よりも厚く設定する。ホルダの形状は粘着フイルムの固定・保護を目的とするので寸法は限定されず、粘着フイルムに合わせて設計する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガイドに対応する非粘着部と、前記ガイドによって囲まれる開口に対応する粘着部を有するガイド付き粘着フィルム。
【請求項２】
複数の粘着部が一定の間隔で連続的に形成されてなる請求項１に記載のガイド付き粘着フィルム。
【請求項３】
中心側の端部が巻取軸に固定されたプレフィルムと、該プレフィルムを収容するフィルム収納部と、渦巻き状のフィルム支持部を有するガイド付き粘着フィルムのホルダ、前記プレフィルムの周辺側の端部がフィルム入口から外部に延ばされた構造を有する、ガイド付き粘着フィルムのホルダ。
【請求項４】
請求項３に記載のホルダの前記プレフィルムの周辺側端部と請求項１または２に記載のガイド付き粘着フィルムの一端を連結し、前記巻取軸を回転させることを特徴とする、ガイド付き粘着フィルムをホルダ内に収容する方法。
【請求項５】
固形試料の上部と請求項１または２に記載のガイド付き粘着フィルムを接触させて、該試料を粘着フィルムに接着する工程、前記試料を薄片状に切断する工程を含む、薄切片標本の作製方法。
【請求項６】
ガイド付き粘着フィルムを収容するための平面状ホルダであって、該ホルダはガイド付き粘着フィルムを保持する背面部と、ガイド付き粘着フィルムが導入される空間を確保する側面部と、ガイド付き粘着フィルムのガイドをホルダ内に保持するための突部を有する平面状ホルダ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガイド付き粘着フィルム、該粘着フィルムを保持するためのホルダ、該粘着フィルムを該ホルダに収容する方法に関する。また、本発明は、薄切片標本の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物や植物の組織切片などの生体組織の観察を行う方法の一つとして、パラフィンやワックス、樹脂などに包埋するか凍結するなどして固化させた試料を、薄切り（厚さ１〜２０μｍ程度）したスライドグラス標本を作製し、観察を行う方法がある。
【０００３】
通常はミクロトームなどによって薄切片にした試料をスライドグラスに貼着し、その貼着した試料に対し脱水や染色などの多くの処理が行われている。しかしスライドグラス標本の作製は、試料の切り出しの際に試料切片が巻いてしまうことがあり、スライドグラス上に水滴とともに乗せて加熱し、水の表面張力により伸展させ、その後水を蒸発させるなど工程が煩雑である。また、そのようにして作製したスライドグラス標本も組織によっては処理中に試料が剥離しやすいものも存在し、実行できる処理の種類が制限される。
【０００４】
一方、試料を粘着フィルムに貼着する場合、固化させた試料に直接粘着フィルムを貼り付け、ミクロトームなどによって薄切片を切り出すといった方法で組織切片を作製する方法が知られている。この場合、スライドグラス標本のときのように、試料切片が巻くことがなく、試料を伸展し貼着する工程の必要がないために処理の短縮ができる。また、試料を処理する上で組織が剥離することがないといった利点を持っている。さらに、長い帯状の粘着フィルムに試料を貼り付けることによって処理の自動化も可能である。
【０００５】
しかし、粘着フィルムを使用すると、薄切り用の工具へフィルムが貼り付き、或いはフィルムどうしがからまるため、薄切片の作製や染色処理の際の操作性が悪い。また、自動化されたものも、粘着フィルムの両端から張力を加える必要があるため大がかりな装置になり、小規模の研究室などでは利用しがたいものである。
【特許文献１】特開平９−１０１２４７号公報
【特許文献２】特開２００１−２３５４０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来の装置をそのまま使用可能な簡易な構成でありながら、粘着フィルムを用いた薄切片の作製や染色処理を行う際の操作性を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題に鑑み検討を重ねた結果、試料薄片を接着させる粘着面の周囲を囲むガイドを設けることにより、薄切片の作製や染色処理などの操作性を大幅に向上できることを見出した。さらに、このガイド付き粘着フィルムを収容するのに適したホルダを作製した。
【０００８】
本発明は、以下のガイド付き粘着フィルム、該粘着フィルムを保持するためのホルダ、該粘着フィルムを該ホルダに収容する方法並びに薄切片標本の作製方法に関する。
１．  ガイドに対応する非粘着部と、前記ガイドによって囲まれる開口に対応する粘着部を有するガイド付き粘着フィルム。
２．  複数の粘着部が一定の間隔で連続的に形成されてなる項１に記載のガイド付き粘着フィルム。
３．  中心側の端部が巻取軸に固定されたプレフィルムと、該プレフィルムを収容するフィルム収納部と、渦巻き状のフィルム支持部を有するガイド付き粘着フィルムのホルダ、前記プレフィルムの周辺側の端部がフィルム入口から外部に延ばされた構造を有する、ガイド付き粘着フィルムのホルダ。
４．  項３に記載のホルダの前記プレフィルムの周辺側端部と項１または２に記載のガイド付き粘着フィルムの一端を連結し、前記巻取軸を回転させることを特徴とする、ガイド付き粘着フィルムをホルダ内に収容する方法。
５．  固形試料の上部と項１または２に記載のガイド付き粘着フィルムを接触させて、該試料を粘着フィルムに接着する工程、前記試料を薄片状に切断する工程を含む、薄切片標本の作製方法。
６．  ガイド付き粘着フィルムを収容するための平面状ホルダであって、該ホルダはガイド付き粘着フィルムを保持する背面部と、ガイド付き粘着フィルムが導入される空間を確保する側面部と、ガイド付き粘着フィルムのガイドをホルダ内に保持するための突部を有する平面状ホルダ。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、以下の効果が得られる：
・粘着フィルムの粘着面に、例えば窓枠状のガイドを設け、さらに、ガイド付き粘着フィルムを保持するホルダを用いることで、切り出しや染色処理の際の操作性が向上する。
・切り出しの際には専用の装置を用いる必要が無く、従来の装置をそのまま使用できる。
・試料切片の厚みはガイドの厚みより薄い場合が多く、切り出した切片と刃表面との接触を防ぐことができる。特に、連続して切り出しを行う場合、従来のガイドがない状態では先に切り出した試料が刃表面と接触し、剥がれや破れが起こることがあったが、本発明ではこのような不都合を防止できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
ガイド付き粘着フィルム
図１（Ａ）に示すように、本発明の１つの実施形態において、ガイド付き粘着フィルム１は、ガイド２と粘着フィルム３から構成され、ガイドによって囲まれる粘着部４を有する。
【００１１】
ガイド２は、粘着フィルムの薄切片が付着していない部分において、フィルムとフィルムの間或いはフィルムと他のもの（例えば薄切り用の工具）との間の接着を防止し、操作性をよくするものである。
【００１２】
ガイド２は、粘着フィルムの長手方向に、粘着面の両側部分2aを全体的あるいは部分的に覆うものである。また、ガイド２は長手方向だけでなく、粘着面の両側部分2aをつなぐ幅方向部分2bを有することが好ましい。
【００１３】
該ガイド２において、両側部分2aが長手方向に連続していると粘着フィルムの長手方向の強度を補強することができる。また、ガイドの幅方向部分2bを有すると、フィルムが幅方向に重なり、フィルム間で付着するのを防止できる。但し、粘着フィルムが幅方向に十分な強度を有する（例えば粘着面の裏面に補強材を有する）場合には、幅方向部分2bはなくてもよい。また、粘着フィルムが長手方向に十分な強度を有する（例えば粘着面の裏面に補強材を有する）場合には、粘着面の両側部分2aは間欠的（不連続）でもよい。
【００１４】
ガイドの形状や寸法は対象となる試料に合わせて設計されるものであり、特に制限されないが、好適に使用されるものとしてスライドグラスの寸法（例えば２６ｍｍ×７６ｍｍ）を考慮したものが例示される。例えば連続切片を作製したい場合には、粘着部の長手方向を長くしても良い。
本発明の好ましい実施形態において、ガイド付き粘着フィルムは連続した帯状のガイド（図１Ｂ）あるいは、各々独立した窓枠状のガイドを有していてもよい。
【００１５】
なお、帯状または窓枠状のガイドにおいて、幅方向部分2bの一方が、サンプルの情報を書き込むタグ部位2cであるのが好ましい。
【００１６】
ガイドの材質としては、プラスチック（ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）などのポリエステル、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレンまたはポリエチレンなどのポリオレフィン等）が挙げられ、ガイドが長手方向に連続する両側部分を有する場合には、フィルムが切断装置の形状に追随するのに十分な可撓性を有する素材が好ましい。
【００１７】
ガイドの厚さは、薄切片よりも厚いのが好ましく、通常、１０〜１００μｍ程度、好ましくは１５〜８０μｍ程度、より好ましくは、２０〜６０μｍ、特に好ましくは３０〜５０μｍ程度である。薄切片とガイドとの高さの差は、通常５〜８０μｍ程度、好ましくは１０〜６０μｍ程度、より好ましくは１５〜４０μｍ程度である。
【００１８】
粘着フィルムについては、薄切片及びガイドが粘着できる限り特に限定されず、公知の粘着フィルムが広く使用できる。
【００１９】
本発明のガイド付き粘着フィルムは、１つの粘着部を有する１つのサンプル用のものであっても良いが、複数の粘着部がガイドにより形成され、サンプル切断装置により連続的に切片を形成できるものが好ましい。
【００２０】
本発明のガイド付き粘着フィルムの好ましい実施形態について説明する。
【００２１】
第１の具体例は、スライドグラス状の形状を有するガイド付き粘着フィルム（図１Ａ）である。
【００２２】
スライドグラス大の平面状ホルダ（幅２６ｍｍ）に設置できるように幅２０ｍｍ前後の粘着フィルムを使用する。スライドグラスのタグ部位の長さに合わせて、長手方向の一方には１６ｍｍ(2c)、もう一方(2b)と両脇(2a)には幅２ｍｍのガイドを設ける。タグ部位(2c)は、操作の際に把持することで試料の損傷や汚染を防ぐことができ、また、試料の情報を書き込むこともできる。
【００２３】
第２の具体例は、帯状のガイド付き粘着フィルム（図１Ｂ）である。
【００２４】
例えば、長手方向に連続した長い帯状のガイド付き粘着フィルムであり、両脇には２ｍｍ、長手方向には６０ｍｍごとに１５ｍｍのガイドを設ける。両脇(2a)だけでなく幅方向(2b, 2c)にもガイドを設けることにより、幅方向の強度を増す効果もある。幅方向部分(2b)の切断位置を端部（破線）にすることで、タグ部位を形成することができる。
【００２５】
帯状のガイド付き粘着フィルムは、長い帯状のまま使用するだけでなく、試料の切り出し、染色、観察、保存など各工程において適宜、切断して使用することもできる。
【００２６】
なお、ガイド付き粘着フィルムをスライドグラスと同一の寸法にすることにより、処理や保存に際して、市販のスライドグラス用バスケットなどを流用することが可能であり、利便性がよくなる。
ガイド付き粘着フィルムの収納に適した渦巻き状ホルダ及びホルダへのガイド付き粘着フィルムの収容方法
本発明のホルダ11は、ガイド付き粘着フィルム１を収納するために適したものであり、該ホルダに収納した状態で処理（脱水、染色、固定等）あるいは保存することができる。
【００２７】
図２Ａ、図２Ｂ（図２ＡのＡ−Ａ’ 断面図）に示されるように、該ホルダ11は、渦巻き状のフィルム支持部12、フィルム収納部13、該フィルム支持部の中心部に巻取軸14を有し、ガイド付き粘着フィルム１が収納されるフィルム収納部13には、プレフィルム15が収納されている。このプレフィルムの一端15aは巻取軸14に固定されており、プレフィルムの他端15bはフィルム支持部の周辺部の入口12aから外部に延ばされている。このプレフィルムのホルダ外に延ばされた端部15bをガイド付き粘着フィルム１の一端と、粘着部４が巻取軸14側を向くように連結して巻取軸14を回転させると、プレフィルムが巻取軸に巻き取られるのに伴い、ガイド付き粘着フィルム１は入口12aからフィルム収容部内に収容され、ガイド付き粘着フィルム１とプレフィルム15の連結部15bがフィルム収納部13の中心付近まで巻き取られると、巻取軸の回転が止まるように構成されている。このような構成とすることで、ガイド付き粘着フィルム１をガイドのフィルム収納部13に容易に収納することができる。
【００２８】
フィルム支持部12は、図２Ｂに示すように片側（図では巻取軸側）が開放されており、この開放部から種々の薬液が収容されたガイド付き粘着フィルム１に供給され、脱水、染色、固定などの処理を行えるようになっている。また、この開放部側を粘着部が向くようにガイド付き粘着フィルム１を巻き取ることで、粘着部４とフィルム支持部12が粘着することを防止できる。
【００２９】
なお、フィルム支持部12の内側に突出した突部12bはガイド付き粘着フィルム１のガイドと係合するようになっている。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態において、ホルダの断面形状は、ガイド付き粘着フィルムを保持する背面部12cと、ガイド付き粘着フィルムが導入される空間を確保する側面部12dと、ガイド部分を押さえる突部12bとを含む略Ｃ字型である。ガイド付き粘着フィルムの固定や保護が目的であるため、寸法は限定されず、ガイド付き粘着フィルムに合わせて設計される。
【００３１】
本発明のホルダでは、試薬の出入を考慮して周回毎に隙間を空けておくのがよい。図２Ｃに示されるように、強度の必要に応じて、半径方向に梁16を設けてもよい。
薄切片標本の作製方法
本発明のガイド付き粘着フィルムは、公知の切断装置にセットして薄切片標本を作製することができる。
例えばパラフィン等に包埋し固化した、或いは凍結した植物、動物などの組織標本２１を切断装置で切断する。連続切片標本が必要な場合には、薄切片を一枚切り出すごとにガイド付き粘着フィルム１を適当な間隔ずつ送り、組織標本を切断することで、１つの粘着部に複数の薄切片が連続して貼着されるか、連続する各粘着部に少なくとも１つの薄切片が連続して貼着された一連の薄切片標本を得ることができる。
図３は、本発明の薄切片標本の作製方法の様子を模式的に示すものである。図３において、Ａ−Ａ’は、刃22から試料21が十分離れている状態を示し、Ｂ−Ｂ’は、切断直前の状態を示し、Ｃ−Ｃ’は、切断後の状態を示す。なお、試料21は常に同じ位置に固定され、刃22とガイド付き粘着フィルム１を移動させる。
Ａ−Ａ’のように、刃22から試料21が十分離れている状態では、切片の厚みに対応する刃の高さｈ（試料21表面からの高さ）が設定され、刃22の位置（22a、破線）はガイド２と重なっている（ガイド２の高さは切片の厚みよりも厚いため）。
【００３２】
次に、Ｂ−Ｂ’の切断直前では、試料21と刃22の高さは固定されているため変化しないが、一方、ガイド２は刃22（或いはそれと一体である案内部23）により押し上げられ、刃22の位置（22a、破線）とガイド２の表面の位置は一致する。このため、試料21と接着している粘着フィルム3が撓んだ状態となる。
【００３３】
Ｃ−Ｃ’の切断後では、粘着フィルム3は元の状態に戻り、試料切片21aはガイド２の高さにより、刃22（或いはそれと一体である案内部23）の表面と接触せずに移動することになる。
上記のように、本発明によれば、薄切片の位置はガイドの内側とすることができ、ガイドにより保護される。連続して切り出しを行う場合、従来のガイドがない状態では先に切り出した試料が刃表面と接触し、剥がれや破れが起こることがあったが、本発明ではこのような不都合を防止できる。
ガイド付き粘着フィルムの収納に適した平面状ホルダ
該平面状ホルダ31は、ガイド付き粘着フィルムを収容するためのものである。特に、平面状ホルダをスライドグラスと同様な寸法にすることにより、処理や保存に際して、市販のスライドグラス用バスケットなどのスライドグラス用の器具、装置を使用することが可能であり、利用者にとっても普段から扱い慣れているため利便性がよい（図６）。
【００３４】
図２Ｄ〜図２Ｇに示すように、該平面状ホルダ31は、スライドグラス形状のガイド付き粘着フィルム１を保持する背面部32と、ガイド付き粘着フィルム１が導入される空間を確保する側面部33と、ガイド付き粘着フィルムのガイドをホルダ内に保持するための突部34を有する。該ホルダ31の左右の端部35, 35は開放されていても良いが、一端が閉じられていてもよい。一端が閉じられていれば、閉じられた側を下にして、例えば従来のスライドグラス用バスケットに立てることができる。なお、前記突部34は、ガイド付き粘着フィルム１の両側部分2aと接触し、粘着部４とはほとんど或いは全く接触せず、試料切片21aを傷つけることはない。
【００３５】
該平面状ホルダ31は、渦巻き状ホルダと同様に、ガイド付き粘着フィルムを内部に収容して脱水、染色等の操作を行っても良く、脱水、染色等の処理が終わったガイド付き粘着フィルムの薄切片標本を平面状ホルダ31に収容し、顕微鏡観察、画像データの取り込み当の操作をさらに行っても良い。
【実施例】
【００３６】
本発明を、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
実施例１：薄切片標本の作製及び生体組織内の特定部位の三次元情報の構築
以下のプロトコールに従い、ガイド付き粘着フィルムに連続した薄切片標本（試料切片）を作製する（図４参照）。
(1)生体組織(a)をワックスブロックへの包埋により固化した試料を作製する(b)。
(2)試料を固定し、観察対象となる部位が現れるまで、表面を除去する(c)。
(3)試料に帯状のガイド付き粘着フィルムを貼着し(d)、厚さ８μmの試料切片を切り出す(e)。（このときガイドの厚みがあるが、刃によってガイドは押し上げられ、試料と貼着している粘着フィルムはそのままの位置にあるため、設定どおりの厚さに切断される）
(4)切り出した薄切片が順番に並ぶように、試料の新たな切断面にガイド付き粘着フィルムを貼着して(f)、上記工程を繰り返し、連続した試料切片を作製する(g,h)。
次に、得られた試料切片を以下の手順に従って処理し、生体組織内の特定部位の三次元情報を構築する（図５参照）。
(5)帯状のガイド付き粘着フィルムを用いて染色を行う際は、渦巻き状ホルダにガイド付き粘着フィルムを設置する(i)（渦巻き状ホルダにはあらかじめ、導入用のプレフィルムが設けられている。ガイド付き粘着フィルムをプレフィルムの外側の端部に貼着し、染色用ホルダの中心に設けた巻取軸でプレフィルムを巻き取ることにより、ホルダ内にガイド付き粘着フィルムが導入される。）。
(6)ホルダごと試薬に浸け所定の染色処理を行う（j）。
(7)観察は、ガイド付き粘着フィルムを顕微鏡のステージ上を移動させ、試料切片１つずつの画像を取り込む。データ処理は切片の厚さを考慮し、二次元情報である試料切片の画像を、順番どおりに高さ方向に重ねることにより、もとの生体組織の特定部位の三次元情報を得ることができる(k〜n)。
実施例２：スライドグラス大のガイド付き粘着フィルムおよび平面状ホルダの使用
ガイド付き粘着フィルム１を試料21に貼着し、実施例１と同様に試料切片の切り出しを行う。
・連続する試料切片を有するガイド付き粘着フィルム１を各スライドグラスサイズに切断し、スライドグラス大の平面状ホルダ31に設置する。該ホルダ31を従来スライドグラス標本に処理を行う際に使用されるスライドグラス用バスケット32に収容する。（図６）
実施例３：観察時バリエーション
帯状のガイド付き粘着フィルムを使用した標本を観察する際に、平面状ホルダ31を併用する例を記載する（図７）。
【００３７】
帯状のガイド付き粘着フィルムを渦巻き状ホルダ11aに保存し、平面状ホルダ31を顕微鏡のステージ上に固定する。
【００３８】
ガイド付き粘着フィルム１を顕微鏡上の平面状ホルダ31に通し、先端を別の渦巻き状ホルダ11bのプレフィルムに貼着し、２つの渦巻き状ホルダ11a、11b間において、順次移動させながら、薄切片の観察及び画像データの取り込みを行う。
【００３９】
連続する薄切片の画像データを取り込み、二次元情報である試料切片の画像を、順番どおりに高さ方向に重ねることにより、もとの生体組織の特定部位の三次元情報を得ることができる。これにより任意の方向の切断面での画像データを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明のガイド付き粘着フィルムを示す。
【図２−１】本発明のホルダを示す。
【図２−２】本発明のホルダを示す。
【図３】本発明の薄切片標本の作製方法の様子を模式的に示す。
【図４】ガイド付き粘着フィルムに連続した薄切片標本（試料切片）を作製する手順を示す。
【図５】生体組織内の特定部位の三次元情報を構築する手順を示す。
【図６】スライドガラスの大きさの平面状ホルダをスライドグラス用バスケットに収納するときの様子を示す。
【図７】渦巻き状ホルダに収納された薄切片試料の観察及び画像取り込みの様子を示す。
【符号の説明】
【００４１】
１  ガイド付き粘着フィルム
２  ガイド
2a  長手方向の両側部分
2b  幅方向部分
2c  タグ部分
３  粘着フィルム
４  粘着部
11  渦巻き状ホルダ
11a 渦巻き状ホルダ
11b 渦巻き状ホルダ
12  フィルム支持部
12a フィルム支持部の周辺部入口
12b 突部
12c 背面部
12d 側面部
13  フィルム収納部
14  巻取軸
15  プレフィルム
15a プレフィルムの巻取軸側端部
15b プレフィルムの周辺側端部／ガイド付き粘着フィルムとの連結部
16  梁
21  試料
21a 試料切片
22  刃
22a 刃の位置
23  案内部
ｈ  試料表面からの高さ
31  平面状ホルダ
32  平面部
33  側面部
34  突部
35  平面状ホルダの左右の端部
【図１】
2006267039.tif 000003
【図２−１】
2006267039.tif 000004
【図２−２】
2006267039.tif 000005
【図３】
2006267039.tif 000006
【図４】
2006267039.tif 000007
【図５】
2006267039.tif 000008
【図６】
2006267039.tif 000009
【図７】
2006267039.tif 000010