(57)【要約】      （修正有）【課題】複製可能な組換えブタポックスウイルスであって、ブタポックスウイルスＤＮＡと、当該組換えブタポックスウイルスが導入される動物中には天然に存在しないようなＲＮＡをコードする外来ＤＮＡとを具備する、組換えブタポックスウイルスを提供する。【解決手段】ブタポックスウイルスチミジンキナーゼをコードするオープンリーディングフレーム内に位置したＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組換えブタポックスウイルス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタポックスウイルスチミジンキナーゼをコードするオープンリーディングフレーム内に位置したＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組換えブタポックスウイルス。
【請求項２】
請求項１に記載の組換えブタポックスウイルスであって、前記ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位がＡｓｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位で置き換えられている組換えブタポックスウイルス。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
この出願は、1992年１月13日に提出された米国特許出願 第07/820,154号、および1993年７月13日に出願された米国特許出願第08/097,554号の一部継続出願であり、これら先の出願の内容は参照として本出願の中に組み込まれる。本出願の中では、括弧内のアラビア数字によって幾つかの刊行物が参照される。これら刊行物の完全な引用は、請求の範囲の直前の本明細書末尾に列記されている。これら刊行物の開示は、本発明が属する技術の状態をより完全に記述するために、参照としてこの出願の中に組み込まれる。
【発明の背景】
【０００２】
ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）は、ポックスウイルス科  (Poxviridae)に属する。このグループに属するウイルス類は、ホスト細胞の原型質内で特徴的に発生する大きな二重鎖ウイルスである。ＳＰＶは、スイポックスウイルス(Suipoxvirus)属の唯一のメンバーである。ＳＶＰは、幾つかの特徴によって他のブタポックスウイルスから区別される。広いホスト範囲を示すワクシニアのような他のポックスウイルス類に比較すると、ＳＰＶは種特異性を示す（１８）。組織培養細胞のＳＰＶ感染もまた、他のポックスウイルス類とは劇的に異なっている（２４）。また、ＳＰＶはワクシニアウイルスとの抗原的交差反応性を示さず、ＤＮＡレベルでも、オルトポックスウイルス、レプロポックスウイルス、アビポックスウイルスまたはエントモポックスウイルスと間での大雑把で検出可能な何等の相同性をも示さない。従って、他のポックスウイルスに関する従来技術で公知の記載された事実は、ブタポックスウイルスについても先天的に適合するものではない。
【０００３】
ＳＰＶは中程度に病原性であるに過ぎず、これについては皮膚および局部リンパ節でのみ検出される病巣についての自己制限的感染(self-limiting infection)によって特徴付けられている。ＳＰＶ感染は完全に制限的であるが、ＳＰＶ病が治癒したブタはＳＰＶの攻撃に対して耐性であり、能動免疫の発生を示している（１８）。
【０００４】
本発明は、ワクチン抗原および治療剤をブタに投与するためのベクターとして、ＳＰＶを使用することに関する。ＳＰＶの以下の特性は、この原理を支持している。即ち、ＳＰＶはブタにおいて中程度に病原性であるに過ぎず、ＳＰＶは種特異的であり、またＳＰＶは防御的な免疫応答を誘発する。従って、ＳＰＶはウイルスベクター輸送系(viral vector delivery system)のための優れた候補であり、ベクターのワクチン特性および治療特性によってもたらされる利益から差し引くべき本質的なリスクは少ない。
【０００５】
本発明に対する従来技術は、第一に、バクテリアプラスミド中ではあるが、ＤＮＡをクローン化および分析する能力に基づいている。現時点で有用な技術は、その殆どの部分が Maniatis et al.,1983 および Sambrook et al.,1989 に詳述されている。これらの刊行物は、一般的な組換えＤＮＡ技術の状態を教示している。
【０００６】
ポックスウイルスのうち、５種類（ワクシニア、ニワトリポックス、カナリヤポックス、ハトポックス、アライグマポックス）が、本願の開示に先立って、外来ＤＮＡ配列を含むように加工されている。ワクシニアウイルスは、外来遺伝子を運ぶために広範に使用されており（２５）、米国特許第4,603,112号および同第4,722,848号の主題でもある。同様に、ニワトリポックスは外来遺伝子を運ぶために用いられており、幾つかの特許出願、即ちEPA 0 284 416号、PCT WO 89/03429号、およびPCT WO 89/12684号の主題である。アライグマポックス（１０）およびカナリヤポックス（３１）は、狂犬病ウイルス(rabies virus)由来の抗原を発現させるために利用されている。ポックスウイルスに外来遺伝子を挿入するこれらの例には、スイポックスウイルス属由来の例が含まれていない。従って、これらの従来例は、ブタポックスウイルスを遺伝指摘に加工する方法、即ち、ブタポックスウイルス内の何処に挿入し、どのようにして発現するかを教示してはいない。
【０００７】
抗原類の輸送系として生ウイルスを用いるアイデアは、最初の生ウイルスワクチンにまで遡るほどに非常に長い歴史を有している。ここで輸送される抗原類は外来のものではなく、ワクチンの生ウイルスによって天然に発現されるものである。近代的な胃ｍで、外来抗原を輸送するためのウイルスを使用することは、組換えワクシニアウイルスの研究で明らかになった。ここで、ワクシニアウイルスはベクターであり、他の疾病原因ウイルス由来の種々の抗原は外来抗原であり、またワクチンは遺伝子工学によって創製された。その一般的概念はこれらの開示によって明らかになったが、自明でないのは、最良のウイルスベクター候補は何かとの実際的な疑問に対する回答は自明なものではない。この問題に対する回答においては、害ウイルスの詳細な病原性、その複製部位、それが誘発する免疫応答の種類、それが外来抗原を発現する能力、その遺伝子加工適性、それが監督機関によって認可される可能性等の全てのファクターを選択しなければならない。従来技術はこれら有用性に関する疑問に対して何らの教示も与えていない。
【０００８】
治療剤を輸送するポックスウイルスの使用に関する従来技術は、インターロイキン−２を輸送するワクシニアウイルスの使用に関するものである（１２）。この場合、インターロイキン−２はワクシニアベクターに対する緩和効果を有するが、ホストは何等の治療的利益を示さなかった。
【０００９】
本発明のウイルスベクターによって輸送される治療剤は、ブタポックスウイルス複製の副生成物としての生物学的分子であるに違いない。これによって、最初の分析における治療剤はＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパクの何れかに限定される。これら化合物に由来する治療剤の例として、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ（１６）、リボザイム（３４）、サプレッサｔＲＮＡ（２）、インターフェロン誘発性二本鎖ＲＮＡの形の化合物、並びにホルモン類（例えばインスリン）からリンホカイン類（例えばインターフェロンおよびインターロイキン）および天然のオピエートに至る多くのタンパク治療剤の例が存在する。これら治療剤の発見およびその構造および機能の解明は、それらをウイルスベクター輸送系において使用する能力を自明とするものではない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、複製可能な組換えブタポックスウイルスであって、ブタポックスウイルスＤＮＡと、当該組換えブタポックスウイルスが導入される動物中には天然に存在しないようなＲＮＡをコードする外来ＤＮＡとを具備する、組換えブタポックスウイルスを提供する。外来ＤＮＡは、ブタポックスウイルスＤＮＡの複製に不可欠ではなく且つプロモータの制御下にある部位において、該ＤＮＡに挿入される。
【００１１】
本発明は、外来ＤＮＡをブタポックスウイルスのゲノムＤＮＡに挿入することによって組換えブタポックスウイルスを製造するための相同ベクターであって、二本鎖ＤＮＡ分子を含むベクターを提供する。この分子は実質的に、当該組換えブタポックスウイルスが導入される動物中には天然に存在しないＲＮＡをコードする二本鎖外来ＤＮＡからなる。この外来ＤＮＡの一端には、二本鎖ブタポックスウイルスＤＮＡがあり、該ＤＮＡはブタポックスウイルスの複製に不可欠ではないゲノムＤＮＡ部位の一方の側に位置するゲノムＤＮＡに対して相同性である。前記外来ＤＮＡの他端には、前記ゲノムＤＮＡにおける同一部位の他方の側に位置するゲノムＤＮＡに対して相同性を有する二本鎖ブタウイルスＤＮＡがある。
【００１２】
以下、図面について説明する。
【００１３】
図１Ａおよび１Ｂ：
独特の長い末端繰り返し（ＴＲ）領域を含むＳＰＶゲノムＤＮＡ（Kasza株）の詳細図である。酵素ＨｉｎｄIIIのための制限地図が示されている（２３）。フラグメントには、大きさが小さくなる順にアルファベット文字を付した。なお、末端繰り返しの大きさは2.1ｋｂよりも大きく、9.7ｋｂよりも小さい。
【００１４】
図２Ａおよび２Ｂ：
相同ベクター 515-85.1に由来するＤＮＡ配列を示している。相同ベクター 515-85.1の二つの領域の配列が示されている。第一の領域（図２Ａ）（配列番号１）は、図３に示す独特のＡｃｃＩ部位に隣接した５９９塩基対をカバーしている。１１５アミノ酸ＯＲＦの最初（Ｍｅｔ）および最後（Ｖａｌ）が、ＤＮＡ配列の下のアミノ酸の翻訳によって示されている。第二の領域（図２Ｂ）（配列番号３）は、図３に示す独特のＨｉｎｄIII部位の上流の８９９塩基対をカバーしている。２２０アミノ酸ＯＲＦの最初（Ａｓｐ）および最後（Ｉｌｅ）が、ＤＮＡ配列の下のアミノ酸の翻訳によって示されている。
【００１５】
図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ：
515.85.1 ＯＲＦとワクシニアウイルス 01L ＯＲＦとの間に存在する相同性を示している。図３Ａは二つの地図を示している。図３Ａの第一の線は、ＳＰＶ・ＨｉｎｄIII・Ｍフラグメントの制限酵素地図であり、また第二の線は、プラスミド515-85.1内におけるＤＮＡ挿入物の制限酵素地図である。また、地図にはこの515-85.1［VV 01L様］ＯＲＦの位置も示されている。図３Ｂおよび３Ｃに示したＤＮＡ配列の位置は、図３Ａにおいて地図の下の太線によって示されている。図３Ｂは、夫々のＮ末端部分におけるVV 01L ORF（配列番号５）と515.85.1 ＯＲＦ（配列番号６）との間の相同性を示している。図３Ｃは、夫々のＣ末端部分でのV 01L ORF（配列番号７）と515.85.1 ＯＲＦ（配列番号８）との間の相同性を示している。
【００１６】
図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ：
相同ベクター 520-17.5におけるＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図４Ａには、プラスミド520-17.5の中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、夫々のフラグメントの起源を示す表とが含まれている。図４Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡおよびＢの夫々に位置する配列を示しており、また図４Ｃは、ジャンクションＣおよびＤに位置する配列を示している（配列番号９，１０，１３，および１６）。更に、図４Ｂおよび４Ｃには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位が記載されており、また各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。これら合成リンカー配列には、太いバーで下線を付してある。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置も与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）、初期プロモータ１（early promoter；ＥＰ１）、後期プロモータ２（late promoter；ＬＰ２）、ラクトースオペロンＺ遺伝子（ｌａｃＺ）および大腸菌（E. coli)である。
【００１７】
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃおよび５Ｄ：
相同ベクター 538-46.16中におけるＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図５Ａには、プラスミド 538-46.16の中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、夫々のフラグメントの起源を示す表とが含まれている。図５Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡおよびＢの夫々に位置する配列を示し、図５ＣはジャンクションＣに位置する配列を示し、また図５ＤはジャンクションＤおよびＥに位置する配列を示している（配列番号１７，１８，２１，２６および２８）。更に、図５Ｂ〜５Ｄには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位が記載されており、また各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。これら合成リンカー配列には、太いバーで下線を付してある。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置も与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、ｇ５０（ｇｐＤ）、糖タンパク６３（ｇｐ６３）、初期プロモータ１（ＥＰ１）、後期プロモータ１（ＬＰ１）（配列番号４６）、後期プロモータ２（ＬＰ２）、ラクトースオペロンＺ遺伝子（ｌａｃＺ）および大腸菌（E. coli)である。
【００１８】
図  ６：
ＰＲＶに対する抗血清を用いた、組換えＳＰＶ感染細胞溶解物のウエスタンブロットである。レーン（Ａ）は非感染Ｖｅｒｏ細胞溶解物(uninfected Vero cell lysate)、レーン（Ｂ）は S-PRV-000（仮性狂犬病ウイルス S62/26）感染細胞溶解物、レーン（Ｃ）は予染色された分子量マーカ、レーン（Ｄ）は非感染ＭＥＳＫ細胞溶解物、レーン（Ｅ）はS-SPV-000感染細胞溶解物、レーン（Ｆ）はS-SPV-003感染細胞溶解物、レーン（Ｇ）はS-SPV-008感染細胞溶解物である。これらの細胞溶解物は、感染細胞溶解物の調製の項で説明するようにして調製した。全溶解サンプルの略１／５を各レーンにロードした。
【００１９】
図  ７：
ＮＤＶヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ遺伝子（ＨＮ）のＤＮＡ配列である（配列番号２９）。NDV HN cDNAの1907塩基対の配列が示されている。ＨＮ遺伝子の翻訳開始および翻訳停止が、ＤＮＡ配列の下のアミノ酸翻訳によって示されている。
【００２０】
図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄ：
相同ベクター 538-46.26中におけるＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図８Ａには、プラスミド 538-46.26の中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、夫々のフラグメントの起源を示す表とが含まれている。図８Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡおよびＢの夫々に位置する配列を示し、図８ＣはジャンクションＣおよびＤに位置する配列を示し、また図８ＤはジャンクションＥに位置する配列を示している（配列番号３１，３２，３４，３７および４０）。更に、図８Ｂおよび８Ｄには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位、並びに各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。これら合成リンカー配列には、太いバーで下線を付してある。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置も与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、初期プロモータ１（ＥＰ１）、後期プロモータ１（ＬＰ１）、後期プロモータ２（ＬＰ２）、ラクトースオペロンＺ遺伝子（ｌａｃＺ）および大腸菌（E. coli)である。
【００２１】
図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃ：
相同ベクター 561-36.26中におけるブタポックスウイルス S-SPV-010およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図９Ａには、プラスミド 561-36.26の中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、夫々のフラグメントの起源を示す表とが含まれている。図９Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡおよびＢの夫々に位置する配列を示しており、また図９Ｃは、ジャンクションＣおよびＤに位置する配列を示している（配列番号４７，４８，４９，および５０）。更に、図９Ｂおよび９Ｃには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位、並びに各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置も与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）、大腸菌（E. coli)、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ）である。
【００２２】
図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃおよび１０Ｄ：
相同ベクター 570-91.21中におけるブタポックスウイルス S-SPV-011およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図１０Ａには、プラスミド 570-91.21の中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、夫々のフラグメントの起源を示す表とが含まれている。図１０Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡおよびＢの夫々に位置する配列を示し、図１０ＣはジャンクションＣに位置する配列を示し、また図１０Ｄはジャンクション１０Ｄおよび１０Ｅに位置する配列を示している（配列番号５１，５２，５３，５４，５５）。更に、図１０Ｂ〜１０Ｄには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位、並びに各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置も与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、大腸菌（E. coli)、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、ポックス合成初期プロモータ２（ＥＰ２）（配列番号４５）、ｇIII（ｇｐＣ）、塩基対（ＢＰ）である。
【００２３】
図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃおよび１１Ｄ：
相同ベクター 570-91.41中におけるブタポックスウイルス S-SPV-012およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図１１Ａには、プラスミド 570-91.41の中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、夫々のフラグメントの起源を示す表とが含まれている。図１１Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡおよびＢの夫々に位置する配列を示し、図１１ＣはジャンクションＣに位置する配列を示し、また図１１ＤはジャンクションＤおよびＥに位置する配列を示している（配列番号５６，５７，５８，５９，６０）。更に、図１１Ｂ〜１１Ｄには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位、並びに各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置が与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、大腸菌（E. coli)、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、ポックス合成初期プロモータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）（配列番号４３）、ｇIII（ｇｐＣ）、塩基対（ＢＰ）である。
【００２４】
図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃおよび１２Ｄ：
相同ベクター 570-91.64中におけるブタポックスウイルス S-SPV-013およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図１２Ａには、プラスミド 570-91.64の中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、夫々のフラグメントの起源を示す表とが含まれている。図１２Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡおよびＢの夫々に位置する配列を示し、図１２ＣはジャンクションＣに位置する配列を示し、また図１２ＤはジャンクションＤおよびＥに位置する配列を示している（配列番号６１，６２，６３，６４，６５）。更に、図１２Ｂ〜１２Ｄには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位、並びに各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置が与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、大腸菌（E. coli)、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）（配列番号４４）、ｇIII（ｇｐＣ）、塩基対（ＢＰ）である。
【００２５】
図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄ：
相同ベクター 599-65.25中におけるブタポックスウイルス S-SPV-014およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図１３Ａには、プラスミド 599-65.25の中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、夫々のフラグメントの起源を示す表とが含まれている。図１３Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡおよびＢの夫々に位置する配列を示し、図１３ＣはジャンクションＣに位置する配列を示し、また図１３ＤはジャンクションＤおよびＥに位置する配列を示している（配列番号６６，６７，６８，６９，７０）。更に、図１３Ｂ〜１３Ｄには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位、並びに各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置が与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴ）、大腸菌（E. coli)、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、ポックス合成初期プロモータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、糖タンパクＧ（ｇｐＧ）、塩基対（ＢＰ）である。
【００２６】
図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃおよび１４Ｄ：
相同ベクター 624-20.1C中におけるブタポックスウイルス S-SPV-016およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図１４Ａには、プラスミド 624-20.1Cの中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、夫々のフラグメントの起源を示す表とが含まれている。図１４Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡおよびＢの夫々に位置する配列を示し、図１４ＣはジャンクションＣに位置する配列を示し、また図１４ＤはジャンクションＤおよびＥに位置する配列を示している（配列番号７１，７２，７３，７４，７５）。更に、図１４Ｂ〜１４Ｄには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位、並びに各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置が与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴ）、大腸菌（E. coli)、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、糖タンパクＩ（ｇｐＩ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）である。
【００２７】
図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃおよび１５Ｄ：
相同ベクター 614-83.18中におけるブタポックスウイルス S-SPV-017およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図１５Ａには、プラスミド 614-83.18の中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、夫々のフラグメントの起源を示す表とが含まれている。図１５Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡおよびＢに位置する配列を示し、図１５ＣはジャンクションＣに位置する配列を示し、また図１５ＤはジャンクションＤおよびＥに位置する配列を示している。更に、図１５Ｂ〜１５Ｄには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位、並びに各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置が与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴ）、大腸菌（E. coli)、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、糖タンパクＧ（ｇｐＧ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）である。
【００２８】
図１６：
ポリクローナルヤギ抗ＰＲＶ・ｇIII（ｇｐＣ）を用いた、組換えＳＰＶ感染細胞溶解物のウエスタンブロットである。レーン（Ａ）はS-PRV-002（1989年10月31日に発行された米国特許第4,877,737号）感染細胞溶解物、レーン（Ｂ）は分子量マーカー、レーン（Ｃ）は擬感染ＥＭＳＫ細胞溶解物、レーン（Ｄ）はS-SPV-011感染細胞溶解物、レーン（Ｅ）はS-SPV-008感染細胞溶解物、レーン（Ｆ）はS-SPV-011感染細胞溶解物、レーン（Ｇ）はS-SPV-012感染細胞溶解物、レーン（Ｈ）はS-SPV-013感染細胞溶解物である。これらの細胞溶解物は、感染細胞溶解物の調製の項で説明するようにして調製した。全溶解サンプルの略１／５を各レーンにロードした。
【００２９】
図１７：
相同ベクター 515-85.1に挿入された、3,628塩基対のＢｇｌII−ＨｉｎｄIIIブタポックスウイルスＤＮＡフラグメントを示す地図である。二つのオープンリーディングフレーム、即ち、Ｏ２ＬおよびＯ１Ｌが、夫々のオープンリーディングフレーム中にコードするアミノ酸の数と共に示されている。相同ベクター 738-94.5は、ヌクレオチド1381〜2133のＳＰＶ・ＤＮＡ（配列番号１１３）の欠失を含んでいる。この領域にｌａｃＺ遺伝子が挿入され、Ｏ１Ｌプロモータから発現された。ＡｃｃＩ、ＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIIIが示されている。
【００３０】
図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１８Ｄ：
相同ベクター 723-59A9.22中におけるブタポックスウイルス S-SPV-034およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図１８Ａには、プラスミド 723-59A9.22の中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、夫々のフラグメントの起源を示す表とが含まれている。図１８Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡおよびＢに位置する配列を示し、図１８ＣはジャンクションＣに位置する配列を示し、また図１８ＤはジャンクションＤおよびＥに位置する配列を示している。更に、図１８Ｂ〜１８Ｄには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位、並びに各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置が与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）、ウマインフルエンザウイルス（ＥＩＶ）、大腸菌（E. coli)、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、プラーク（ＰＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）である。
【００３１】
図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃおよび１９Ｄ：
相同ベクター 727-54.60中におけるブタポックスウイルス S-SPV-015およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図１９Ａには、プラスミド 727-54.60の中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、夫々のフラグメントの起源を示す表とが含まれている。図１９Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡおよびＢに位置する配列を示し、図１９ＣはジャンクションＣに位置する配列を示し、また図１９ＤはジャンクションＤおよびＥに位置する配列を示している。更に、図１９Ｂ〜１９Ｄには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位、並びに各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置が与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、大腸菌（E. coli)、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、プラーク（ＰＲ）、糖タンパクＢ（ｇＢ）、塩基対（ＢＰ）である。
【００３２】
図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃおよび２０Ｄ：
相同ベクター 727-67.18中におけるブタポックスウイルス S-SPV-031およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図２０Ａには、プラスミド 727-67.18の中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、夫々のフラグメントの起源を示す表とが含まれている。図２０Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡおよびＢに位置する配列を示し、図２０ＣはジャンクションＣに位置する配列を示し、また図２０ＤはジャンクションＤおよびＥに位置する配列を示している。更に、図２０Ｂ〜２０Ｄには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位、並びに各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置が与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）大腸菌（E. coli)、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、ポックス合成初期プロモータ１後期プロモータ２（ＥＰ１ＬＰ２）、抗原（Ａｇ）、塩基対（ＢＰ）である。
【００３３】
図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃおよび２１Ｄ：
相同ベクター 732-18.4中におけるブタポックスウイルス S-SPV-033およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図２１Ａには、プラスミド 732-18.4の中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、各フラグメントの起源を示す表とが含まれている。図２１Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡおよびＢに位置する配列を示し、図２１ＣはジャンクションＣに位置する配列を示し、また図２１ＤはジャンクションＤおよびＥに位置する配列を示している。更に、図２１Ｂ〜２１Ｄには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位、並びに各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置が与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）、大腸菌（E. coli)、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ウマインフルエンザウイルス（ＥＩＶ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、アラスカ（ＡＫ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、塩基対（ＢＰ）である。
【００３４】
図２２Ａ、２２Ｂ、および２２Ｃ：
相同ベクター 741-80.3中におけるブタポックスウイルス S-SPV-036およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図２２Ａには、プラスミド 741-80.3の中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、各フラグメントの起源を示す表とが含まれている。図２２Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡ、ＢおよびＣに位置する配列を示し、また図２２ＣはジャンクションＤ、ＥおよびＦに位置する配列を示している。更に、図２２Ｂおよび２２Ｃには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位、並びに各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置が与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、大腸菌（E. coli)、ヒトサイトメガロウイルス即時初期(immediate early)（ＨＣＭＶ・ＩＥ）、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、ポリアデニル化部位（polyＡ）、塩基対（ＢＰ）である。
【００３５】
図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃおよび２３Ｄ：
相同ベクター 741-84.14中におけるブタポックスウイルス S-SPV-035およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図２３Ａには、プラスミド 741-84.14の中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、各フラグメントの起源を示す表とが含まれている。図２３Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡおよびＢに位置する配列を示し、図２３ＣはジャンクションＣに位置する配列を示し、また図２３ＤはジャンクションＤおよびＥに位置する配列を示している。更に、図２３Ｂ〜２３Ｄには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位、並びに各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置が与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、大腸菌（E. coli)、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、糖タンパクＸ（ｇＸ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、配列（ｓｅｑ）、塩基対（ＢＰ）である。
【００３６】
図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃおよび２４Ｄ：
相同ベクター 744-34中におけるブタポックスウイルス S-SPV-038およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図２４Ａには、プラスミド 744-34の中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、各フラグメントの起源を示す表とが含まれている。図２４Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡおよびＢに位置する配列を示し、図２４ＣはジャンクションＣに位置する配列を示し、また図２４ＤはジャンクションＤおよびＥに位置する配列を示している。更に、図２４Ｂ〜２４Ｄには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位、並びに各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置が与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）、ウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）、大腸菌（E. coli)、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、糖タンパクＢ（ｇＢ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、配列（ｓｅｑ）、塩基対（ＢＰ）である。
【００３７】
図２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｃおよび２５Ｄ：
相同ベクター 744-38中におけるブタポックスウイルス S-SPV-09およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図である。図２５Ａには、プラスミド 744-38の中に組み立てられたＤＮＡフラグメントの向きを示す図と、各フラグメントの起源を示す表とが含まれている。図２５Ｂは、各フラグメントの間のジャンクションＡおよびＢに位置する配列を示している。図２５Ｃは、ジャンクションＣに位置する配列を示し、また図２５ＤはジャンクションＤおよびＥに位置する配列を示している。更に、図２５Ｂ〜２５Ｄには、各フラグメントを生じさせるために用いた制限酵素部位、並びに各フラグメントを連結するために用いられた合成リンカー配列が夫々のジャンクションについて記載されている。また、幾つかの遺伝子コード領域および調節要素の位置が与えられている。次の二つの表記法が用いられた。即ち、括弧（  ）内の数字はアミノ酸を示し、ブラケット［  ］内の制限酵素部位は構築の間に破壊される部位の残部を示している。次の略記法が使用された。即ち、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）、ウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）、大腸菌（E. coli)、ポックス合成後期プロモータ１（ＬＰ１）、ポックス合成後期プロモータ２初期プロモータ２（ＬＰ２ＥＰ２）、糖タンパクＤ（ｇＤ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、配列（ｓｅｑ）、塩基対（ＢＰ）である。
【発明の詳細な説明】
【００３８】
本発明は、当該組換えブタポックスウイルスが導入された動物内で複製可能な組換えブタポックスウイルス（ＳＰＶ）であって、ブタポックスウイルスＤＮＡと、当該組換えブタポックスウイルスが導入される動物中には天然に存在しないようなＲＮＡをコードする外来ＤＮＡとを具備し、この外来ＤＮＡは、ブタポックスウイルスＤＮＡの複製に不可欠ではなく且つプロモータの制御下にある部位において、前記ブタポックスウイルスＤＮＡに挿入されている、組換えブタポックスウイルスを提供する。
【００３９】
本発明の目的において、「複製可能なブタポックスウイルス」は、当業者に周知の組換え法、例えば材料および方法の項の「組換えＳＰＶのための相同組換え法」で述べる方法によって創製されたブタポックス生ウイルスであり、該組換えブタポックスウイルスの複製に不可欠な遺伝子物質は欠失していなかった。
【００４０】
本発明の目的において、「ブタポックスウイルスの複製に不可欠でない挿入部位」とは、当該部位のＤＮＡ配列が当該ウイルスゲノムの複製に必要とされないもの、例えば、複合タンパク結合配列、逆転写酵素または必須糖タンパクをコードする配列、パッケージングに必要なＤＮＡ配列などであるような、ブタポックスウイルスにおける位置をいう。
【００４１】
本発明の目的において、「プロモータ」とは、外来ＲＮＡポリメラーゼが結合して該外来ＲＮＡの転写が開始される、ＤＮＡ分子上の特異的なＤＮＡ配列である。
【００４２】
本発明は更に、ポリペプチドをコードする外来ＲＮＡを提供する。好ましくは、このポリペプチドは動物における抗原性を有している。好ましくは、この抗原性ポリペプチドは、ペプチド結合によって連結された１０個より多いアミノ酸からなる線形ポリマーであり、動物を刺激して抗体を産生させる。
【００４３】
本発明は更に、ブタポックスウイルスＤＮＡのＨｉｎｄIII  Ｍフラグメントのうち、大きい方のＨｉｎｄIII〜ＢｇｌIIサブフラグメント中に存在する挿入部位を提供する。好ましくは、この挿入部位はＨｉｎｄIII〜ＢｇｌIIサブフラグメント中に含まれるオープンリーディングフレーム内にある。好ましくは、この挿入部位はＨｉｎｄIII〜ＢｇｌIIサブフラグメントの中に位置するＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位である。
【００４４】
本発明は更に、ブタポックスウイルスチミジンキナーゼをコードするオープンリーディングフレーム内の挿入部位を提供する。好ましくは、この挿入部位はブタポックスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子内に位置するＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位である。
【００４５】
本発明の目的において、「オープンリーディングフレーム」とは、アミノ酸配列に翻訳され得るＲＮＡとして転写されることができるコドンを含み、且つ終止コドンを含まないＤＮＡ切片である。
【００４６】
本発明は更に、検出可能なマーカーとしてのポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可能なブタポックスウイルスを提供する。好ましくは、この検出可能なマーカーはポリペプチドの E. coli βガラクトシダーゼである。好ましくは、E. coli βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡの挿入部位は、ブタポックスウイルスＤＮＡのＨｉｎｄIII・Ｍフラグメント内に位置するＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位である。好ましくは、この組換えブタポックスウイルスは、S-SPV-003（ＡＴＣＣ受付番号 VR 2335）と称されるものである。このS-SPV-003ブタポックスウイルスは、特許手続き上の微生物の国際的寄託に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2335号の下に、アメリカ合衆国20852メリーランド州ロックウィルパークローンドライブ12301に所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの特許カルチャーコレクションに寄託されている。
【００４７】
本発明の目的において、「検出可能なマーカーとしてのポリペプチド」には、ポリペプチドの２量体 、３量体および４量体が含まれる。 E. coli βガラクトシダーゼは、４つのポリペプチドから構成される４量体またはモノマーサブユニットである。
【００４８】
本発明は更に、抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含んだ複製可能な組換えブタポックスウイルスであって、前記抗原性ポリペプチドは仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇｐＤ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）II（ｇｐＢ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇIII（ｇｐＣ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパクＨ、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパクＥ、伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）糖タンパク195、伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）マトリックスタンパク、ブタロタウイルス糖タンパク３８、ブタパルボウイルスキャプシドタンパク、Serpulina hydooysenteriae 保護抗原、牛ウイルス性下痢（ＢＶＤ）糖タンパク５５、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ、ブタｆｌｕヘマグルチニンまたはブタｆｌｕノイラミニダーゼであるか、またはこれらに由来するものである組換えブタポックスウイルスを提供する。好ましくは、前記抗原性ポリペプチドは仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇｐＤ）である。好ましくは、前記抗原性タンパクはニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼである。
【００４９】
本発明は更に、複製可能な組換えブタポックスウイルスであって、抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含み、該抗原性ポリペプチドが Serpulina hydooysenteriae、足口病ウイルス、ブタコレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、アフリカブタ熱ウイルス若しくは Mycoplasma hyopneumoniaeであるか、またはこれらに由来するものである組換えブタポックスウイルスを提供する。
【００５０】
本発明は更に、複製可能な組換えブタポックスウイルスであって、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇｐＤ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ組換えブタポックスウイルスを提供する。この組換えブタポックスウイルスを更に加工して、E. coli・βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含ませることができる。ＰＲＶ・ｇ５０（ｇｐＤ）および E. coli・βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡの挿入に適した、ブタポックスウイルスゲノム内の好ましい部位は、ブタポックスウイルスＤＮＡのＨｉｎｄIII・Ｍフラグメント内にあるＡｃｃＩ部位である。好ましくは、この組換えブタポックスウイルスは、S-SPV-008（ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2339号）と称するものである。このS-SPV-008ブタポックスウイルスは、特許手続き上の微生物の国際的寄託に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2339号の下に、アメリカ合衆国20852メリーランド州ロックウィルパークローンドライブ12301に所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの特許カルチャーコレクションに寄託されている。
【００５１】
本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇIII（ｇｐＣ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組換えブタポックスウイルスを提供する。また、この組換えブタポックスウイルスを更に加工して、E. coli・βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含ませることができる。ＰＲＶ・Ｃ遺伝子および E. coli・βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡの挿入に適した、ブタポックスウイルスゲノム内の好ましい部位は、ブタポックスウイルスＤＮＡのＨｉｎｄIII・Ｍフラグメント内にあるＡｃｃＩ部位である。好ましくは、この組換えブタポックスウイルスは、S-SPV-011、S-SPV-012またはS-SPV-013と称するものである。このS-SPV-013と命名されたブタポックスウイルスは、特許手続き上の微生物の国際的寄託に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ 号の下に、アメリカ合衆国20852メリーランド州ロックウィルパークローンドライブ12301に所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの特許カルチャーコレクションに寄託されている。
【００５２】
本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇII（ｇｐＢ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組換えブタポックスウイルスを提供する。また、この組換えブタポックスウイルスを更に加工して、E. coli・βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含ませることができる。ＰＲＶ・ｇII遺伝子および E. coli・βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡの挿入に適した、ブタポックスウイルスゲノム内の好ましい部位は、ブタポックスウイルスＤＮＡのＨｉｎｄIII・Ｍフラグメント内にあるＡｃｃＩ部位である。好ましくは、この組換えブタポックスウイルスは、S-SPV-015（ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ 号）と称するものである。このS-SPV-015と命名されたブタポックスウイルスは、1994年７月22日に、特許手続き上の微生物の国際的寄託に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ       号の下に、アメリカ合衆国20852メリーランド州ロックウィルパークローンドライブ12301に所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの特許カルチャーコレクションに寄託されている。
【００５３】
本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇｐＤ）をコードする外来ＤＮＡおよび仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇIII（ｇｐＣ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組換えブタポックスウイルスを提供する。また、この組換えブタポックスウイルスを更に加工して、E. coli・βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含ませることができる。ＰＲＶ５０、ＰＲＶ・ｇIIIおよび E. coli・βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡの挿入に適した、ブタポックスウイルスゲノム内の好ましい部位は、ブタポックスウイルスＤＮＡのＨｉｎｄIII・Ｍフラグメント内にあるＡｃｃＩ部位である。
【００５４】
本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇｐＤ）をコードする外来ＤＮＡおよび仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇII（ｇｐＢ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組換えブタポックスウイルスを提供する。また、この組換えブタポックスウイルスを更に加工することにより、E. coli・βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含ませることができる。ＰＲＶ５０、ＰＲＶ・ｇIIおよび E. coli・βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡの挿入に適した、ブタポックスウイルスゲノム内の好ましい部位は、ブタポックスウイルスＤＮＡのＨｉｎｄIII・Ｍフラグメント中にあるＡｃｃＩ部位である。
【００５５】
本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇIII（ｇｐＣ）をコードする外来ＤＮＡおよび仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇII（ｇｐＢ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組換えブタポックスウイルスを提供する。また、この組換えブタポックスウイルスを更に加工することにより、E. coli・βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含ませることができる。ＰＲＶ・ｇIII（ｇｐＣ）、ＰＲＶ・ｇII（ｇｐＢ）および E. coli・βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡの挿入に適した、ブタポックスウイルスゲノム内の好ましい部位は、ブタポックスウイルスＤＮＡのＨｉｎｄIII・Ｍフラグメント中にあるＡｃｃＩ部位である。
【００５６】
本発明は更に、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇｐＤ）をコードする外来ＤＮＡ、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇIII（ｇｐＣ）をコードする外来ＤＮＡおよび仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇII（ｇｐＢ）をコードする外来ＤＮＡを含んだ、複製可能な組換えブタポックスウイルスを提供する。また、この組換えブタポックスウイルスを更に加工することにより、E. coli・βガラクトシダーゼのような検出マーカをコードする外来ＤＮＡを含ませることができる。ＰＲＶ・ｇ５０（ｇｐＤ）、ＰＲＶ・ｇIII（ｇｐＣ）、ＰＲＶ・ｇII（ｇｐＢ）および E. coli・βガラクトシダーゼをコードする外来ＤＮＡの挿入に適した、ブタポックスウイルスゲノム内の好ましい部位は、ブタポックスウイルスＤＮＡのＨｉｎｄIII・Ｍフラグメント内にあるＡｃｃＩ部位である。
【００５７】
本発明は更に、抗原性ポリペプチドのニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼをコードするＲＮＡをコードする外来ＤＮＡを含み、更に検出マーカーとしてのポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを具備した、複製可能な組換えブタポックスウイルスを提供する。好ましくは、この組換えブタポックスウイルスは、S-SPV-009（ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2344号）と称するものである。このS-SPV-009ブタポックスウイルスは、特許手続き上の微生物の国際的寄託に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2344号の下に、アメリカ合衆国20852メリーランド州ロックウィルパークローンドライブ12301に所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの特許カルチャーコレクションに寄託されている。
【００５８】
本発明は更に、ブタポックスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含んだ組換えブタポックスウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は感染性ウシ鼻気管炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードし、且つ当該組換えブタポックスウイルスに感染したホスト内で発現され得る組換えブタポックスウイルスを提供する。このような抗原性ポリペプチドの例は、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖タンパクＥおよび糖タンパクＧである。本発明の好ましい態様は、S-SPV-017およびS-SPV-019である。
【００５９】
本発明は更に、ブタポックスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組換えブタポックスウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は感染性喉頭気管炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードし、且つ当該組換えブタポックスウイルスに感染したホスト内で発現され得る組換えブタポックスウイルスを提供する。このような抗原性ポリペプチドの例は、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパクＧおよび糖タンパクＩである。本発明の好ましい態様は、S-SPV-014およびS-SPV-016である。
【００６０】
本発明は更に、ブタポックスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組換えブタポックスウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列はヒト病原体に由来する抗原性ポリペプチドをコードし、且つ当該組換えブタポックスウイルスに感染したホスト内で発現され得る組換えブタポックスウイルスを提供する。
【００６１】
例えば、ヒト病原体の抗原性ポリペプチドは、ヒトヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、単純ヘルペスウイルス−２、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン-バーウイルス、水痘-帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス−６、ヒトヘルペスウイルス−７、ヒトインフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスに由来するものである。更に、前記ヒト病原体の抗原性ポリペプチドは、Plasmodium falciparum、Bordetella pertusisおよび悪性腫瘍からなる群から選択されるマラリアまたは悪性腫瘍に関連するものであってもよい。
【００６２】
本発明の１態様において、組換えブタポックスウイルスはＢ型肝炎ウイルスのコアタンパクをコードする外来ＤＮＡ配列を含んでいる。好ましくは、かかる組換えウイルスはS-SPV-031と命名されたものである。
【００６３】
本発明は更に、ブタポックスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組換えブタポックスウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は当該組換えブタポックスウイルスに感染したホストにおいて免疫を刺激することができるサイトカインをコードし、且つ前記感染したホスト内で発現され得る組換えブタポックスウイルスを提供する。
【００６４】
例えば、上記サイトカインはインターロイキン２、インターロイキン６、インターロイキン１２、インターフェロン類、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、およびインターロイキン受容体であり得るが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
本発明の１態様において、組換えブタポックスウイルスはヒト・インターロイキン２をコードする外来ＤＮＡ配列を含んでいる。好ましくは、かかる組換えウイルスはS-PV-035と命名されたものである。
【００６６】
本発明は更に、ブタポックスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組換えブタポックスウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列はウマ病原体に由来する抗原性ポリペプチドをコードし、且つ当該組換えブタポックスウイルスに感染したホスト内で発現され得る組換えブタポックスウイルスを提供する。
【００６７】
ウマ病原体の抗原性ポリペプチドは、ウマ・インフルエンザウイルスまたはウマ・ヘルペスウイルスから誘導することができる。このような抗原性ポリペプチドの例は、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／プラーク５６ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／マイアミ６３ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー８１ノイラミニダーゼ、ウマ・ヘルペスウイルス１型糖タンパクＢ、およびウマ・ヘルペスウイルス１型糖タンパクＤである。このような組換えウイルスの好ましい態様は、S-SPV-033、S-SPV-03４、S-SPV-038およびS-SPV-039と命名されたものである。
【００６８】
本発明は更に、ブタポックスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組換えブタポックスウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ウシ呼吸器合胞体ウイルス(bovine respiratory syncytial virus)またはウシ・パラインフルエンザウイルスに由来する抗原性ポリペプチドをコードし、且つ当該組換えブタポックスウイルスに感染したホスト内で発現され得る組換えブタポックスウイルスを提供する。
【００６９】
例えば、ウシ呼吸器合胞体ウイルス(bovine respiratory syncytial virus)およびウマ病原体に由来する抗原性ポリペプチドは、ウマ・インフルエンザウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス付着タンパク（ＢＲＳＶ  Ｇ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク（ＢＲＳＶ  Ｆ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルスヌクレオキャプシドタンパク（ＢＲＳＶ  Ｎ）、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型融合タンパク、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型ヘマグルチニンノイラミニダーゼから誘導することができる。
【００７０】
ウシ呼吸器合胞体ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含む組換えウイルスの好ましい態様は、S-SPV-020、S-SPV-029、およびS-SPV-030と命名されたものである。また、ウシパラインフルエンザウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードしている外来ＤＮＡを含んだ組換えウイルスの好ましい態様は、S-SPV-028と命名されたものである。
【００７１】
本発明は更に、ブタポックスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組換えブタポックスウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、ウシ・ウイルス性下痢ウイルス糖タンパク４８または糖タンパク５３をコードし、且つ当該組換えブタポックスウイルスに感染したホスト内で発現され得る組換えブタポックスウイルスを提供する。このようなウイルスの好ましい態様は、S-SPV-032およびS-SPV-040と命名されたものである。
【００７２】
本発明は更に、ブタポックスゲノムの非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組換えブタポックスウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は、感染性嚢胞病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードし、且つ当該組換えブタポックスウイルスに感染したホスト内で発現され得る組換えブタポックスウイルスを提供する。このような抗原性ポリペプチドの例は、感染性嚢胞病ウイルスポリタンパクおよびＶＰ２である。かかるウイルスの好ましい態様は、S-SPV-026およびS-SPV-027と命名されたものである。
【００７３】
本発明は更に、前記外来ＤＮＡ配列がプロモータの支配下にあるものを提供する。好ましくは、このプロモータはブタウイルスプロモータである。好ましくは、このプロモータは合成ポックスウイルスプロモータである。本発明の目的にとって、このプロモータは当業者に周知の方法、例えば、「材料および方法」の項の「合成ポックスウイルスプロモータ類の構築のための基本方針」で述べた方法によって作成された。本発明の目的において、合成ポックスプロモータには、合成後期ポックスプロモータ、合成初期ポックスプロモータ又は合成初期／後期ポックスプロモータが含まれる。
【００７４】
本発明は、ブタポックスウイルスのゲノムＤＮＡに外来ＤＮＡを挿入することにより組換えポックスウイルスを製造するための、相同ベクターを提供する。この相同ベクターは、当該組換えブタポックスウイルスが導入される動物中に天然には存在しないＲＮＡをコードする二本鎖外来ＤＮＡから実質的になる二本鎖ＤＮＡを具備し、この外来ＤＮＡの一端には、ブタポックスウイルスの複製に不可欠ではないゲノムＤＮＡ部位の一方の側に位置するゲノムＤＮＡに対して相同的な二本鎖ブタポックスウイルスＤＮＡがあり、また前記外来ＤＮＡの他端には、前記ゲノムＤＮＡにおける同一部位の他方の側に位置するゲノムＤＮＡに対して相同的な二本鎖ブタウイルスＤＮＡがある。好ましくは、このＲＮＡはポリペプチドをコードする。
【００７５】
一つの態様において、前記ポリペプチドは検出マーカである。好ましくは、検出マーカである当該ポリペプチドは E. coliβガラクトシダーゼである。
【００７６】
１実施例において、前記ポリペプチドは動物において抗原性である。好ましくは、この抗原性ポリペプチドは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇ５０（ｇｐＤ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）II（ｇｐＢ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇIII（ｇｐＣ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパクＨ、伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）糖タンパク195、伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）マトリックスタンパク、ブタロタウイルス糖タンパク３８、ブタパルボウイルスキャプシドタンパク、Serpulina hydooysenteriae 保護抗原、牛ウイルス性下痢（ＢＶＤ）糖タンパク５５、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ、ブタｆｌｕヘマグルチニンまたはブタｆｌｕノイラミニダーゼであるか、またはこれらに由来するものである。好ましくは、前記抗原性ポリペプチドは、Serpulina hydooysenteriae、足口病ウイルス、ブタコレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、アフリカブタ熱ウイルス若しくは Mycoplasma hyopneumoniaeであるか、またはこれらに由来するものである。
【００７７】
本発明の１態様において、前記相同ベクター中の二本鎖の外来ＤＮＡ配列は、ヒト病原由来の抗原性ポリペプチドをコードする。
【００７８】
例えば、ヒト病原の抗原性ポリペプチドは、ヒトヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、単純ヘルペスウイルス−２、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン-バーウイルス、水痘-帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス−６、ヒトヘルペスウイルス−７、ヒトインフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスに由来するものである。更に、前記ヒト病原体の抗原性ポリペプチドは、Plasmodium falciparum、Bordetella pertusisおよび悪性腫瘍からなる群から選択されるマラリアまたは悪性腫瘍に関連するものであってもよい。
【００７９】
本発明の１態様において、前記相同ベクター中の二本鎖の外来ＤＮＡ配列は、ヒト免疫応答を刺激することができるサイトカインをコードする。
【００８０】
例えば、上記サイトカインはインターロイキン２、インターロイキン６、インターロイキン１２、インターフェロン類、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、およびインターロイキン受容体であり得るが、これらに限定されるものではない。
【００８１】
本発明の１態様において、前記相同ベクター中の二本鎖の外来ＤＮＡ配列は、ウマ病原体由来の抗原性ポリペプチドをコードする。
【００８２】
上記ウマ病原体の抗原性ポリペプチドは、ウマ・インフルエンザウイルス又はウマ・ヘルペスウイルスから誘導することができる。このような抗原性ポリペプチドの例は、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／プラーク５６ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／マイアミ６３ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー８１ノイラミニダーゼ、ウマ・ヘルペスウイルス１型糖タンパクＢ、およびウマ・ヘルペスウイルス１型糖タンパクＤである。
【００８３】
本発明の１態様において、前記相同ベクターの二本鎖の外来ＤＮＡ配列は、ウシ呼吸器合胞体ウイルス又はウシ・パラインフルエンザウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする。
【００８４】
例えば、ウシ呼吸器合胞体ウイルス(bovine respiratory syncytial virus)およびウマ病原体に由来する抗原性ポリペプチドは、ウマ・インフルエンザウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス付着タンパク（ＢＲＳＶ  Ｇ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク（ＢＲＳＶ  Ｆ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルスヌクレオキャプシドタンパク（ＢＲＳＶ  Ｎ）、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型融合タンパク、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型ヘマグルチニンノイラミニダーゼから誘導することができる。
【００８５】
本発明の１態様において、前記相同ベクターの二本鎖の外来ＤＮＡ配列は、感染性嚢胞病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする。このような抗原性ポリペプチドの例は、感染性嚢胞病ウイルスポリペプチドおよび感染性嚢胞病ウイルスＶＰ２である。
【００８６】
本発明の他の態様において、上記相同ベクターの二本鎖ブタポックスウイルスＤＮＡは、ブタポックスウイルスＤＮＡのＨｉｎｄIII  Ｍフラグメントのうちで、大きい方のＨｉｎｄIII〜ＢｇｌIIサブフラグメント中に存在する挿入部位を提供する。好ましくは、この挿入部位はＨｉｎｄIII〜ＢｇｌIIサブフラグメント中に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。好ましくは、この二本鎖ブタポックスウイルスＤＮＡは、このＨｉｎｄIII〜ＢｇｌIIサブフラグメント中に含まれるオープンリーディングフレーム内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。好ましくは、この二本鎖ブタポックスウイルスＤＮＡは、ＨｉｎｄIII〜ＢｇｌIIサブフラグメントに位置しているＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の中に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。
【００８７】
本発明の目的において、「相同ベクター」とは、ブタポックスウイルスゲノムの特定部位に、外来遺伝子を挿入するために構築されたプラスミドである。
【００８８】
本発明の１態様において、上記相同ベクターの二本鎖ブタポックスウイルスＤＮＡは、ブタポックスチミジンキナーゼをコードするオープンリーディングフレーム内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。好ましくは、この二本鎖ブタポックスウイルスＤＮＡは、ブタポックスチミジンキナーゼをコードしているオープンリーディングフレーム中のＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位内に存在するゲノムＤＮＡに対して相同性である。
【００８９】
本発明は更に、その前記外来ＤＮＡ配列が当該外来ＤＮＡ配列の上流に位置するプロモータの支配下にある、上記の相同ベクターを提供する。
【００９０】
このプロモータは、内因性のブタポックスウイルスプロモータ又は外因性プロモータであり得る。このプロモータは、合成ポックスウイルスプロモータ又はヒト・サイトメガロウイルス即時型初期遺伝子プロモータであり得る。
【００９１】
本発明は更に、有効免疫量の本発明の組換えブタポックスウイルスと、適切なキャリアとを含有するワクチンを提供する。
【００９２】
仮性狂犬病ウイルスのための適切なキャリアは当該技術において周知であり、タンパク、糖などが含まれる。かかる適切なキャリアの一例は、安定化された、タンパク加水分解物、ラクトース等のような１以上の安定化剤を含有する生理学的にバランスのとれた培地である。
【００９３】
本発明の目的において、本発明の組換えブタポックスウイルスの「有効免疫量」は、１０３〜１０９ＰＦＵ／１回投与の範囲である。
【００９４】
本発明はまた、動物を免疫化する方法であって、該動物がヒト、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、またはヒツジである方法を提供する。本発明の目的において、これには１以上の疾患を引き起こす１以上のウイルス、即ち、仮性狂犬病ウイルス伝染性胃腸炎ウイルス、ブタロタウイルス、ブタパルボウイルス、Serpulina hydooysenteriae、牛ウイルス性下痢ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ブタｆｌｕ、足口病ウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタ熱ウイルスまたは Mycoplasma hyopneumoniaeに対して動物を免疫化することが含まれる。また、本発明の目的において、この免疫化方法には、このセクションの既述の部分で述べたヒト病原体、ウシ病原体、ウマ病原体、トリ病原体に対して動物を免疫化することが含まれる。
【００９５】
この方法は、有効免疫量の本発明のワクチンを動物に投与することを具備する。ワクチンは、当業者に周知の何れかの方法、例えば筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射又は静脈内注射によって投与すればよい。或いは、該ワクチンは鼻腔投与または経口投与してもよい。
【００９６】
本発明はまた、ブタを試験して、そのブタが既に本発明のワクチン、特に組み換えブタポックスウイルスS-SPV-008（ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2339号）でワクチン接種されているか否か、または天然に存在する野生型の仮性狂犬病ウイルスに感染しているか否かを決定する方法を提供する。この方法は、試験すべきブタから適切な体液サンプルを取得することと、該サンプルにおいて、仮性狂犬病ウイルスに対する抗体の存在を検出することとを具備し、かかる抗体の不存在によって該ブタが未だワクチン接種されておらず、感染してもいないことが示され、また仮性狂犬病ウイルスに対する抗体が存在するブタについては、そのサンプルにおいて、天然に存在する仮性狂犬病ウイルスに感染したブタの体液中に通常存在するが、ワクチン接種されたブタには存在しないような仮性狂犬病ウイルス抗原に対する抗体の不存在を検出することによって、そのブタがワクチン接種され且つ感染していないことが示される。
【００９７】
本発明はまた、複製可能な組換えブタポックスウイルスに感染したホスト細胞を提供する。１実施例において、このホスト細胞は哺乳動物細胞である。好ましくは、該哺乳動物細胞はＶｅｒｏ細胞である。好ましくは、該哺乳動物細胞はＥＳＫ−４細胞、ＰＫ−１５細胞、またはＥＭＳＫ細胞である。
【００９８】
本発明の目的において、「ホスト細胞」とは、ベクターおよびその挿入物を増殖させるために用いる細胞である。該細胞の感染は、当業者に周知の方法、例えば「材料および方法」の項の「感染、トランスフェクション法」に記載した方法によって達成された。
【００９９】
上記の組換えブタポックスウイルスを構築し、選択し、生成するための方法については、以下の「材料および方法」の項において詳細に説明する。
【０１００】
材料及び方法
ブタポックスウイルス貯蔵試料の調製
２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００単位／ｍｌのストレプトマイシン（これらの成分はシグマ(Sigma)又は同様の供給業者より得た）を含有するイスコーブの改変ダルベッコ培地(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)（ＩＭＤＭ）とＲＰＭＩ１６４０培地との１：１混合物中（以後、ＥＭＳＫ陰性培地と称する）において、０．０１ＰＦＵ／細胞の感染多重度(multiplicity of infection)にて、ブタ胎児腎臓（ＥＭＳＫ）細胞、ＥＳＫ−４細胞、ＰＫ−１５細胞またはＶｅｒｏ細胞に感染させることにより、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）のサンプルを調製した。感染に先立って、単層の細胞をＥＭＳＫ陰性培地により１回洗浄して痕跡量のウシ胎児血清を除去した。次いで、半時間ごとに再分散させながら、最初の接種物（１０ｃｍプレートに対しては０．５ｍｌ、Ｔ１７５ｃｍフラスコに対しては１０ｍｌ）中に含まれるＳＰＶを、２時間に亘って該単層細胞に吸収させた。この時間の後、完全ＥＭＳＫ培地（ウシ胎児血清を５％加えたＥＭＳＫ陰性培地）を添加することにより、元の接種物を、推奨量にした。細胞変性(cytopathic)作用が完結するまで、５％ＣＯ2中において３７℃で該プレートをインキュベートした。培地及び細胞を集め、５０ｍｌのコニカルスクリューキャップ試験管中において、−７０℃で凍結させた。３７℃で解凍した直後に貯蔵ウイルスを１．０ｍｌバイアル瓶に等分配し、−７０℃で再凍結させた。力価は通常、約１０6ＰＦＵ／ｍｌであった。
【０１０１】
ＳＰＶのＤＮＡの調製
ブタポックスウイルスのＤＮＡを単離するために、Ｔ１７５ｃｍ2フラスコ中の集密的なＥＭＳＫ単層細胞に０．１の多重度で感染させ、該細胞が１００％の細胞変性作用を示すまで４−６日インキュベートした。次いで、細胞を掻き取って培地中に加え、臨床用遠心分離機内において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、感染した細胞を集めた。上澄の培地を除き、細胞のペレットを１．０ｍｌのリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ：Ｈ2Ｏ１リットル当り１．５ｇのＮａ2ＨＰＯ4、０．２ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．８ｇのＮａＣＬおよび０．２ｇのＫＣｌ）中に（Ｔ１７５ごとに）穏やかに再懸濁し、２回の連続的な冷凍および解凍(freeze-thaws)と（−７０℃から３７℃まで）を行う。最後の解凍の際に、間に４５秒間の冷却時間を挿入して、それぞれ３０秒間で２回、細胞（氷上）を超音波処理した。次いで、４℃のＨＢ４ローター内において、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離すること（サーボール(Sorvall)ＲＣ−５Ｂ超高速遠心分離機）
により、細胞破片を除去した。次いで、上清中に存在するＳＰＶのウイルス粒子を、４℃のＳＳ３４ローター（サーボール）内において、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによりペレット化し、１０Ｍトリス（ｐＨ７．５）中に再懸濁した。次いで、この画分を３６％ショ糖濃度勾配（ｐＨ７．５の１０ｍＭトリス中でｗ／ｖ）上に重層し、４℃でＳＷ４１ローター（ベックマン(Beckman)）内において、１８，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離した（ベックマンＬ８−７０Ｍ超遠心分離機）。ウイルス粒子のペレットをｐＨ７．５の１０ｍＭトリス１．０ｍｌ中に再懸濁し、氷上で３０秒間超音波処理した。この画分を２０％から５０％までの連続ショ糖濃度勾配上に重層し、４℃のＳＷ４１ローター内において、１６，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離した。該濃度勾配の、上から約４分の３のところに位置するＳＰＶウイルス粒子のバンドを採集し、２０％ショ糖で希釈し、かつ４℃のＳＷ４１ローター内において、１８，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離することによりペレット化した。次いで、その結果得られたペレットをｐＨ７．５の１０ｍＭトリスにより１回洗浄して痕跡量のショ糖を除去し、最終的にｐＨ７．５の１０ｍＭトリス中に再懸濁した。次いで、ＥＤＴＡ、ＳＤＳおよびプロティナーゼＫをそれぞれの最終濃度が２０ｍＭ、０．５％および０．５ｍｇ／ｍｌとなるように添加することにより溶菌（６０℃で４時間）を誘発して、精製されたウイルス粒子からＳＰＶのＤＮＡを抽出した。消化後に、３回のフェノール：クロロホルム（１：１）抽出を行い、２容量部のアブソリュート・エタノールの添加と−２０℃での３０分間のインキュベーションとにより試料を沈殿させた。
【０１０２】
次いで、該試料をエッペンドルフ(Eppendorf)のミニフュージ(minifuge)中で５分間、フルスピードで遠心分離した。上清を除き、ペレットを風乾し、且つ４℃において１ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．０１Ｍトリス（ｐＨ７．５）中に再び水和させた。
【０１０３】
感染細胞溶解産物の調製
細胞溶解産物を調製するために、無血清培地を用いた。１００μｌのウイルス試料を用いて、２５ｃｍ2フラスコまたは６０ｍｍペトリ皿の中の集密的な単層細胞（ＳＰＶについてＥＭＳＫ細胞、ＥＳＫ−４細胞、ＰＫ−１５細胞もしくはＶｅｒｏ細胞、またはＰＲＶについてＶＥＲＯ細胞）に感染させた。細胞変性作用が完結した後に、培地及び細胞を集め、３０００ｒｐｍで５分間、臨床用遠心分離機に掛けて該細胞をペレット化した。細胞のペレットを２５０μｌの破砕用緩衝液（２％ドデシル硫酸ナトリウム，２％β−メルカプトエタノール）中に再懸濁した。この試料を氷上において３０秒間超音波処理し、−２０℃で貯蔵した。
【０１０４】
ウェスタン・ブロッティングの手順
レムリ(Laemnli)（１９７０）の手順にしたがって、溶解産物および標準タンパク質の試料をポリアクリルアミドゲルに掛けて流した。ゲル電気泳動後、タンパク質を移写し、サムブルック(Sambrook)ら（１９８２）に従って処理した。１次抗体は、脱脂ドライミルクを５％含有するトリス−塩化ナトリウムおよび窒化ナトリウム（ＴＳＡ：Ｈ2Ｏ１リットル当りトリス−ＨＣｌが６．６１ｇ、トリス塩基が０．９７ｇ、ＮａＣｌが９．０ｇおよび窒化ナトリウムが２．０ｇ）により１：１００希釈されたブタ抗ＰＲＶ血清（ショープ(Shope)株；ｌｏｔ３７０、ＰＤＶ８２０１、ＮＶＳＬ、アイオワ州、エイムズ(Ames)）であった。２次抗体は、ＴＳＡにより１：１０００希釈されたヤギ抗ブタアルカリホスファターゼ複合体であった。
【０１０５】
分子生物学的な技術
制限エンドヌクレアーゼによる消化のような手順を含むバクテリアおよびＤＮＡの操作技術、ゲル電気泳動、ゲルからのＤＮＡ抽出、ライゲーション（連結）
、キナーゼによるリン酸化、ホスファターゼ処理、細菌培養物の増殖、ＤＮＡによるバクテリアの形質転換およびそのほかの分子生物学的な方法は、マニアティス(Maniatis)ら（１９８２）およびサムブルック(Sambrook)ら（１９８９）により記載されている。注意を喚起したところを除けば、それらは比較的重要でない変化(minor variation)を伴って用いられた。
【０１０６】
ＤＮＡ配列決定
ＵＳＥシーケナーゼ・キット(Sequenase Kit)および35Ｓ−ｄＡＴＰ（ＮＥＮ）を用いて配列決定を行った。ｄＧＴＰ混合物及びｄＩＴＰ混合物の両方を用いて反応を実施し、圧縮領域(areas of compression)を明らかにした。あるいは、圧縮された領域をホルムアミドゲルにより解明した。テンプレート（鋳型）は２本鎖のプラスミド・サブクローン又は単鎖のＭ１３サブクローンであり、プライマーは、配列決定すべき挿入物の丁度外側のベクターに対してか、または先に得られた配列に対してかのいずれかが作成された。ディーナスター(Dnastar)ソフトウエアを用いて、得られた配列を組み立て、比較した。コラル・ソフトウエア(Coral Software)のスーパークローンTM(Superclone TM)プログラムおよびスーパーシーTM(Supersee TM)プログラムにより、得られた配列の操作および比較を行った。
【０１０７】
ポリメラーゼ連鎖反応によるクローニング
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、様々なＤＮＡの操作に有益な制限部位を導入した。用いられた手順は、イニス(Innis)ら（１９９０）により説明されている。一般的に、増幅されたフラグメントは５００塩基対未満の大きさであり、増幅されたフラグメントの重要な領域をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１０８】
それぞれの事例で用いられたプライマーは、以下の相同ベクターの構築についての記述において詳細に示される。
【０１０９】
組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順
この方法は、ブタポックスウイルスＤＮＡおよびトランスフェクトされたプラスミド相同ベクターを共に含む組織培養細胞中において生じる、ブタポックスウイルスＤＮＡとプラスミド相同ベクターとの間の相同的組換によるものである。
【０１１０】
相同的組換を生じさせるために、０．０１ＰＦＵ／細胞の感染多重度でＳ−ＳＰＶ−００１（カザ(Kasza)ＳＰＶ株，１７）を単層のＥＭＳＫ細胞に感染させ、複製するＳＰＶ（すなわちＤＮＡ合成）を細胞に導入する。次いで、「感染−トランスフェクションの手順」にしたがって、プラスミド相同ベクターＤＮＡを上記の細胞にトランスフェクトさせる。この手順において用いられる相同ベクターの構築を以下に説明する。
【０１１１】
感染−トランスフェクションの手順
ＥＭＳＫ陰性培地中において、０．０１ＰＦＵ／細胞の感染多重度でＳ−ＳＰＶ−００１を６ｃｍプレートのＥＭＳＫ細胞（集密性約８０％）に感染させ、５％ＣＯ2の加湿された環境内において５時間、３７℃でインキュベートした。用いられたトランスフェクション手順は、基本的にリポフェクチンTM(Lipofectin TM)試薬（ＢＲＬ）について推奨されているものである。手短にいえば、それぞれの６ｃｍプレートについて、１５μｇのプラスミドＤＮＡをＨ2Ｏで１００μｌとなるように希釈した。それとは別に、５０マイクログラムのリポフェクチン試薬をＨ2Ｏで１００μｌとなるように希釈した。次いで、ポリスチレン製の、スナップ式の蓋の付いた５ｍｌ試験官内に含まれている希釈プラスミドＤＮＡに、１００μｌの希釈リポフェクチン試薬を滴下して加え、穏やかに混合した。次いで、この混合物を室温で１５−２０分間インキュベートした。この時間内に、ウイルス接種物を６ｃｍプレートから除去し、ＥＭＳＫ陰性培地を用いて単層の細胞を１回洗浄した。次いで、３ｍｌのＥＭＳＫ陰性培地をプラスミドＤＮＡ／リポフェクチン混合物に添加し、その内容物をピペットで単層の細胞上に滴下した。５％ＣＯ2の加湿された環境内において３７℃で一夜（約１６時間）、該細胞をインキュベートした。翌日、３ｍｌのＥＭＳＫ陰性培地を除去し、５ｍｌのＥＭＳＫ完全培地に置換した。ウイルスによる細胞変性作用が８０−１００％となるまで、５％ＣＯ2中において３−７日間、３７℃で細胞をインキュベートした。貯蔵ウイルスを調製するために、上記のようにしてウイルスを集菌した。この貯蔵物をトランスフェクション貯蔵物と称することとし、続いて、「組換えブタポックスウイルスについてのブルオガル（ＢＬＵＯＧＡＬ）でのスクリーニングまたは組換えブタポックスウイルスについてのＣＰＲＧでのスクリーニング」によって、組換えウイルスについてのスクリーニングを行った。
【０１１２】
β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶについてのスクリーニング（ブルオガルおよびＣＰＲＧによるアッセイ）
組換えウイルスに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が組み込まれていた場合、その組換え体を含んでいるプラークは、２種類の単純な方法の内の１つにより可視化された。第１の方法においては、プラークのアッセイにおいて、アガロースのオーバーレイにブルオガル(Bluogal)TM（ベセズダ・リサーチ・ラボ(Bethesda Research Labs)）という化学物質を含有させ（２００μｇ／ｍｌ）、活性のβ−ガラクトシダーゼを発現するプラークを青に変色させた。次いで、青色プラークを選び採って新鮮な細胞（ＥＭＳＫ）に加え、さらなる青色プラーク単離により精製した。第２の方法においては、プラークのアッセイにおいて、アガロースのオーバーレイにＣＰＲＧ（ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim)）を含有させ（４００μｇ／ｍｌ）、活性のβ−ガラクトシダーゼを発現するプラークを赤に変色させた。次いで、赤色プラークを選び採って新鮮な細胞（ＥＭＳＫ）に加え、さらなる赤色プラーク単離により精製した。双方の場合において典型的には、プラーク精製を３回繰り返してウイルスを精製した。
【０１１３】
黒色プラークアッセイを用いた、組換えＳＰＶにおける外来遺伝子の発現についてのスクリーニング
組換えブタポックスウイルスにより発現される外来抗原の発現を分析するために、単層のＥＭＳＫ細胞に組換えＳＰＶを感染させ、含栄養アガロース培地で薄く覆い、プラークの形成が起こるように、３７℃で６−７日間インキュベートした。次いで、アガロースのオーバーレイをシャーレから除去し、室温で１０分かけて１００％メタノールにより細胞を固定し、該細胞を風乾した。特定の表面抗原の発現は、未固定の細胞を用いても検出し得るとは言え、細胞を固定することによって、表面抗原の検出と同様に細胞質抗原も検出されることになる。次いで、ＰＢＳにより適切な希釈度に１次抗体を希釈し、室温で２時間、単層の細胞上でインキュベートした。Ｓ−ＳＰＶ−００８からのＰＲＶ−ｇ５０（ｇｐＤ）の発現を検出するために、ブタ抗ＰＲＶ血清（ショープ株；ｌｏｔ３７０、ＰＤＶ８２０１、ＮＶＳＬ、アイオワ州、エイムズ）を用いた（１：１００に希釈）。
【０１１４】
Ｓ−ＳＰＶ−００９からのＮＤＶ・ＨＮ発現を検出するために、ＨＮタンパク質に対して特異的なウサギ抗血清（ウサギ抗ＮＤＶ＃２）を用いた（１：１０００に希釈）。次いで、室温でＰＢＳにより３回細胞を洗浄することにより、結合していない抗体を除去した。ヤギ抗ブタ（ＰＲＶ ｇ５０（ｇｐＤ）；Ｓ−ＳＰＶ−００８）またはヤギ抗ウサギ（ＮＤＶ・ＨＮ；Ｓ−ＳＰＶ−００９）のいずれかである２次抗体の、セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体をＰＢＳにより１：２５０に希釈し、細胞と共に室温で２時間インキュベートした。次いで、室温でＰＢＳにより細胞を３回洗浄することにより、結合していない２次抗体を除去した。次いで、新たに調製された基質溶液（１００μｇ／ｍｌの４−クロロ−１−ナフトール，０．００３％のＨ2Ｏ2を含有するＰＢＳ）と共に、室温で１５−３０分間、細胞をインキュベートした。適切な(correct)抗原が発現したプラークは黒く着色する。
【０１１５】
診断方法として用いるためのウイルス糖タンパク質の精製手順
抗体アフィニティカラムを用いて、ウイルスの糖タンパク質を精製する。モノクローナル抗体を産生させるために、８週齢から１０週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに、１０7ＰＦＵのＳ−ＳＰＶ−００９、Ｓ−ＳＰＶ−０１４、Ｓ−ＳＰＶ−０１６、Ｓ−ＳＰＶ−０１７、Ｓ−ＳＰＶ−０１８またはＳ−ＳＰＶ−０１９を、２週から４週のインターバルで腹腔内に７回ワクチン接種する。最後のワクチン接種の３週後、４０ｍｇの、対応するウイルス糖タンパク質をマウスに腹腔内注射する。最後の抗原投与の３日後に、該マウスから脾臓を除去する。
【０１１６】
オーイ及びハーゼンバーグ(Oi and Herzenberg)、（４１）を改良した手順により、脾臓細胞をマウスＮＳ１／Ａｇ４形質細胞腫細胞と融合させる。３００×ｇで１０分間の遠心分離により、脾臓細胞と形質細胞腫細胞とを一緒にペレット化する。１分間以上攪拌するようにして、該細胞ペレットに１ｍｌの５０％ポリエチレングリコール溶液（分子量１３００−１６００）を添加する。その細胞に、３分間以上に渡って、ダルベッコの改変イーグル培地(Dulbecco's modified Eagles's medium)（５ｍｌ）を加える。３００×ｇで１０分間の遠心分離により細胞をペレット化し、ウシ胎児血清を１０％、並びに１００ｍＭのヒポキサンチン、０．４ｍＭのアミノプテリンおよび１６ｍＭのチミジンを含有する培地（ＨＡＴ）中に再懸濁する。１００ｍｌの健常脾臓フィーダー層細胞(normal spleen feeder layer cells)を含有する、８枚から１０枚の９６ウェル組織培養プレートのウェルに細胞（１００ｍｌ）を加え、３７℃でインキュベートする。３日から４日ごとに、新鮮なＨＡＴ培地を該細胞に供給する。
【０１１７】
１００ｎｇのウイルス糖タンパク質で被覆された９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、ＥＬＩＳＡアッセイによりハイブリドーマ培養上清を試験する。黒色プラークアッセイおよびウェスタン・ブロッティングにより、反応性ハイブリドーマからの上清をさらに分析する。２回の限界希釈法により、選択されたハイブリドーマをクローン化する。プリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに５×１０6のハイブリドーマ細胞を腹腔内注射することにより、腹水を産生させる。
【０１１８】
「感染細胞溶解産物の調製」において記載されたようにして、Ｓ−ＳＰＶ−００９、Ｓ−ＳＰＶ−０１４、Ｓ−ＳＰＶ−０１６、Ｓ−ＳＰＶ−０１７、Ｓ−ＳＰＶ−０１８またはＳ−ＳＰＶ−０１９からの細胞溶解産物を得る。製造者の使用説明（ＡＦＣメディウム(AFC Medium)，ニュー・ブリュンズウィック・サイエンティフィック(New Brunswick Scientific)，ニュージャージー州，エジソン(Edison)）にしたがって、２０ｍｇの糖タンパク質に対するモノクローナル抗体を固定化した２ｍｌのアガロースアフィニティ樹脂に、糖タンパク質含有細胞溶解産物（１００ｍｌｓ）を通した。そのカラムを、１００ｍｌの０．１％ノニデット(Nonidet)Ｐ−４０含有リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、非特異的結合物質を除去する。ｐＨ１０．６の１００ｍＭ炭酸緩衝液（４０）により、結合した糖タンパク質を溶出する。ＥＬＩＳＡ実験系におけるＳＰＶモノクローナル抗体への反応性により、溶出前および溶出後の画分を、純度についてモニターする。
【０１１９】
ＥＬＩＳＡアッセイ
標準的な酵素結合免疫吸着剤試験法（ＥＬＩＳＡ）のプロトコールを用いて、ワクチン接種および抗原投与の後のウシの免疫状態を測定する。
【０１２０】
４℃で１８時間かけて、糖タンパク質抗原溶液（ＰＢＳ中にｎｇ／ｍｌで１００ｍｌ）をマイクロタイター・シャーレのウェルに吸収させる。そのコートされたウェルをＰＢＳで１回濯ぐ。２５０ｍｌの１％ＢＳＡ（シグマ(Sigma)）含有ＰＢＳを加え、３７℃で１時間インキュベートすることにより、ウェルをブロックする。そのブロックされたウェルを、０．０２％トゥイーン(Tween)２０含有ＰＢＳで１回濯ぐ。５０ｍｌの試験血清（前もって１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中に１：２に希釈されたもの）をウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートする。抗血清を除去し、０．０２％トゥイーン(Tween)２０含有ＰＢＳで該ウェルを３回洗浄する。５０ｍｌの、セイヨウワサビペルオキシダーゼに連結された抗ウシＩｇＧを含有する溶液（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中に１：５００に希釈されたもの、カークガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ社製(Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.)）を加えて、特定の抗原に対する抗体を含むウェルを可視化する。該溶液を３７℃で１時間インキュベートし、次いでそれを除去して、０．０２％トゥイーン２０含有ＰＢＳで該ウェルを３回洗浄する。それぞれのウェルに１００ｍｌの基質溶液（ＡＴＢＳ、カークガード・アンド・ペリー・ラボラトリー社製）を加え、１５分間かけて発色させる。０．１Ｍシュウ酸を添加して、反応を停止させる。自動平板読取り器(anautomatic plate reader)により、４１０ｎｍの吸光度で発色を読み取る。
【０１２１】
合成ポックスウイルス
プロモーターの構築に関する基本方針(strategy)
組換えブタポックスベクターに対して、合成ポックスプロモーターは、外来遺伝子発現の強度および時機を制御する能力を含む幾つかの利点を提供する。我々は、ワクシニアウイルスにおいて定義されているプロモーター（１、７および８）に基づいた、ＬＰ１、ＥＰ１およびＬＰ２の３つのプロモーターカセットを設計することを選択した。いかなる順序又は組み合わせにおいても該カセットを組み合わせて用い得る制限部位が隣接する、ワクチニアにおいて定義されたＤＮＡ配列を含むように、それぞれのカセットを設計した。それぞれのカセットに、開始メチオニンをもまた組み込むように設計することにより、ＥｃｏＲＩ部位又はＢａｍＨＩ部位のいずれかにおいて、読み枠内融合(inframe fusions)がなされ得るようにした。３つのリーディング・フレームすべてにおける翻訳停止コドンのセットおよび初期(early)転写終結信号（９）もまた、読み枠内融合部位の下流側に配置された。標準的な技術に従って、それぞれのカセットの遺伝情報を担うＤＮＡを合成し、適切な相同ベクターにクローン化した（図４、５および８を参照）。
【０１２２】
仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質遺伝子を含む組換えブタポックスウイルスを用いた、ブタにおけるワクチン接種の研究
仮性狂犬病に罹患していない群由来の離乳した若年ブタを用いて、１以上の仮性狂犬病ウイルスの糖タンパク質遺伝子（ＳＰＶ／ＰＲＶ）を含む組換えブタポックスウイルスの有効性を試験する。約１０3から１０7のプラーク形成単位（ＰＦＵ）の組換えＳＰＶ／ＰＲＶウイルスを、皮内に、又は経口的に子ブタに接種する。
【０１２３】
ＰＲＶ血清の抗体レベルを測定することおよびワクチン接種されたブタを仮性狂犬病ウイルスの病原性株で攻撃することにより、免疫性を定量する。ワクチン接種の３週から４週後に、仮性狂犬病ウイルスの病原性株（ＶＤＬ４８９２）により、ワクチン接種された群とワクチン接種されていない群との両方のブタを攻撃する。攻撃後は、仮性狂犬病の臨床的徴候について１４日間毎日、ブタを観察する。
【０１２４】
ワクチン接種時、攻撃時、および１週間のインターバルでワクチン接種後の２週から３週の間に血清試料を採取し、血清中和抗体について定量する。
【０１２５】
相同ベクター５１５−８５．１
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド５１５−８５．１を構築した。これは、外来ＤＮＡを挿入しうるＡｃｃＩ制限酵素部位を１つだけ有している。ＡｃｃＩ部位に外来ＤＮＡ挿入を含んでいるプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来ＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。相同ベクター５１５−８５．１におけるＤＮＡ挿入の制限地図を図４に示す。次ぎに示す起源由来の２つの制限フラグメントを繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および２９）を利用してそれを構築することができる。第１のフラグメントは、ｐＳＰ６４（プロメガ(Promega)）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメントである。第２のフラグメントは、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約３６２８塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢｇｌＩＩまでの制限サブフラグメント(restriction sub-fragment)である（２３）。
【０１２６】
相同ベクター５２０−１７．５
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド５２０−１７．５を構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を有する。該マーカー遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。該マーカー遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、マーカー遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が、合成された初期／後期(early/late)ポックス・プロモーターの制御下にあることに注意しなければならない。該プラスミドの詳細な記載を図４に示す。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを図４に示される合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用してそれを構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約２１４９塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３００６塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント３は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＡｃｃＩからＢｇｌＩＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。
【０１２７】
相同ベクター５３８−４６．１６
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド５３８−４６．１６を構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびＰＲＶ ｇ５０（ｇｐＤ）遺伝子を有する。該外来遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｇ５０（ｇｐＤ）遺伝子が合成された初期／後期ポックス・プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。該プラスミドの詳細な記載を図５に示す。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを図５に示される合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用してそれを構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約２１４９塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３００６塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント３は、ＰＲＶのＢａｍＨＩフラグメント７の、約１５７１塩基対のＥｃｏＲＩからＳｔｕＩまでの制限サブフラグメントである（２１）。ＰＣＲクローニングによりこのフラグメントにＥｃｏＲＩ部位が導入されたことに注意しなければならない。この手順において、ｐＳＰ６４にサブクローン化されたＰＲＶのＢａｍＨＩ＃７フラグメントからなるテンプレートと併せて、下記のプライマーを用いた。第１のプライマー８７．０３（５´−ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＴＣＧＣＡＧＣＧＣＴＡＴＴＧＧＣ−３´）（配列番号４１）は、ほぼアミノ酸３の位置でＰＲＶｇ５０（ｇｐＤ）配列（２６）上に着座し(sits down)、遺伝子の３´末端方向にプライミングする。第２のプライマー８７．０６（５´−ＧＴＡＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧ−３´）（配列番号４２）は、ほぼアミノ酸１７４の位置で反対側のストランド上に着座し、遺伝子の５´末端方向にプライミングする。このＰＣＲ生成物を、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩとを用いて消化することにより、約５０９塩基対のフラグメントを生成させ得る。次いで、ＰＲＶのＢａｍＨＩ＃７の約１０４９塩基対のＳａｌＩからＳｔｕＩまでのサブフラグメントを約５０９塩基対のＥｃｏＲＩからＳａｌＩまでのフラグメントに連結させて、約１５５８塩基対のＥｃｏＲＩからＳｔｕＩまでのフラグメント３を産生させることができる。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＡｃｃＩからＢｇｌＩＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。
【０１２８】
相同ベクター５７０−９１．２１
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド５７０−９１．２１を構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇｐＣ）遺伝子を有する。該外来ＤＮＡ遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｇＩＩＩ（ｇｐＣ）遺伝子が合成された初期ポックス・プロモーター（ＥＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。該プラスミドの詳細な記載を図１０に示す。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを図１０に示される合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用してそれを構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３００２塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント３は、プラスミド２５１−４１．Ａの約２３７８塩基対のＮｃｏＩからＮｃｏＩまでのフラグメントであり、ＰＲＶのＢａｍＨＩ＃２および＃９のサブフラグメントである。このフラグメントの両末端の位置の、ＮｃｏＩとＮｃｏＩとの部位(the Nco I and Nco I sites)を、ＥｃｏＲＩリンカーに置換した。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント１およびフラグメント４におけるＡｃｃＩ部位を、合成ＤＮＡリンカーを用いてＰｓｔＩ部位に変換した。
【０１２９】
相同ベクター５７０−９１．４１
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド５７０−９１．４１を構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇｐＣ）遺伝子を有する。該外来ＤＮＡ遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｇＩＩＩ（ｇｐＣ）遺伝子が合成された初期・後期ポックス・プロモーター(early late pox promoter)（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。該プラスミドの詳細な記載を図１１に示す。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを図１１に示される合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用してそれを構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３００２塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント３は、プラスミド２５１−４１．Ａの約２３７８塩基対のＮｃｏＩからＮｃｏＩまでのフラグメントであり、ＰＲＶのＢａｍＨＩ＃２および＃９のサブフラグメントである。このフラグメントの両末端の位置のＮｃｏＩとＮｃｏＩとの部位(the Nco I and Nco I sites)を、ＥｃｏＲＩリンカーに置換した。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント１およびフラグメント４におけるＡｃｃＩ部位を、合成ＤＮＡリンカーを用いてＰｓｔＩ部位に変換した。
【０１３０】
相同ベクター５７０−９１．６４
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド５７０−９１．６４を構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびＰＲＶ ｇＩＩＩ（ｇｐＣ）遺伝子を有する。該外来ＤＮＡ遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｇＩＩＩ（ｇｐＣ）遺伝子が合成された後期・初期ポックス・プロモーター(late early pox promoter)（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。該プラスミドの詳細な記載を図１２に示す。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを図１２に示される合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用してそれを構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３００２塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント３は、プラスミド２５１−４１．Ａの約２３７８塩基対のＮｃｏＩからＮｃｏＩまでのフラグメントであり、ＰＲＶのＢａｍＨＩ＃２および＃９のサブフラグメントである。このフラグメントの両末端の位置のＮｃｏＩとＮｃｏＩとの部位を、ＥｃｏＲＩリンカーに置換した。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｄＩＩＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント１およびフラグメント４におけるＡｃｃＩ部位を、合成ＤＮＡリンカーを用いてＰｓｔＩ部位に変換した。
【０１３１】
相同ベクター５３８−４６．２６
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド５３８−４６．２６を構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）のヘマグルチニン（赤血球凝集素）−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を有する。該外来ＤＮＡ遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＨＮ遺伝子が合成された初期／後期ポックス・プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。該プラスミドの詳細な記載を図８に示す。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを図８に示される合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用してそれを構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約２１４９塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、ＮＤＶのＨＮ ｃＤＮＡクローンの、約１８１０塩基対のＡｖａｌＩからＮａｅＩまでの制限フラグメントである。ＨＮ ｃＤＮＡクローンの配列を図７に示す。標準的なｃＤＮＡクローニング技術（１４）を用いて、ＮＤＶのＢ１株にｃＤＮＡクローンを産生させた。フラグメント３は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３００６塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＭの、約１４８４塩基対のＡｃｃＩからＢｇｌＩＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。
【０１３２】
相同ベクター５９９−６５．２５
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド５９９−６５．２５を構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびＩＬＴ ｇｐＧ遺伝子を有する。該外来遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＬＴ ｇｐＧ遺伝子が合成された初期／後期ポックス・プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。該プラスミドの詳細な記載を図１３に示す。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを図１３に示される合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を利用してそれを構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、約１０７３塩基対のＥｃｏＲＩからＭｂｏＩまでのフラグメントである。ＰＣＲクローニングによりＥｃｏＲＩ部位を導入したことに注意しなければならない。この手順において、下記のプライマーをＩＬＴウイルスゲノムの５．１ｋｂＡｓｐ７１８Ｉフラグメントの、２．６ｋｂのＳｓｔ ＩからＡｓｐ７１８Ｉまでのサブフラグメントからなる鋳型（テンプレート）とともに用いた。第１のプライマー９１．１３（５´−ＣＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＣＴＴＣＡＧＴＡＡＣＡＴＡＧＧＡＴＣＧ−３´）（配列番号８１）は、アミノ酸２の位置でＩＬＴ ｇｐＧ配列上に着座する。そのプライマーは、アミノ酸１とアミノ酸２との間に付加的なアスパラギン残基を加え、ＥｃｏＲＩ制限部位をも導入する。第２のプライマー９１．１４（５´−ＧＴＡＣＣＣＡＴＡＣＴＧＧＴＣＧＴＧＧＣ−３´）（配列番号８２）は、ほぼアミノ酸１９６の位置で反対側のストランド上に着座し、遺伝子の５´末端方向にプライミングする。このＰＣＲ生成物を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとを用いて消化することにより、約４５４塩基対のフラグメントを生成させる。ＩＬＴ Ａｓｐ７１８Ｉ（５．１ｋｂ）フラグメントの約４８５塩基対のＭｂｏＩサブフラグメントを、約４５４塩基対のＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでのフラグメントに連結して、長さとして約９３９塩基対（２９３アミノ酸）である、ＥｃｏＲＩからＭｂｏＩまでのフラグメント２を産生する。フラグメント３は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３００２塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでのサブフラグメントである。
【０１３３】
フラグメント１およびフラグメント４のＡｃｃＩ部位を、合成ＤＮＡリンカーを用いてＰｓｔＩ部位に変換した。
【０１３４】
相同ベクター６２４−２０．１Ｃ
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド６２４−２０．１Ｃを構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびＩＬＴ ｇｐＩ遺伝子を有する。該外来遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＬＴ ｇｐＩ遺伝子が合成された後期／初期ポックス・プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。該プラスミドの詳細な記載を図１４に示す。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを図１４に示される合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を利用してそれを構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、ＰＣＲクローニングにより合成され、ＩＬＴ ｇｐＩ遺伝子のアミノ酸コーディング配列全体を含んでいる、両端にＥｃｏＲＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位とを有する約１０９０塩基対のフラグメントである。２つの別個のＰＣＲ反応により、ＩＬＴ ｇｐＩ遺伝子を合成した。この手順において、下記のプライマーを８．０ｋｂのＩＬＴ Ａｓｐ７１８Ｉフラグメントからなる鋳型（テンプレート）とともに用いた。第１のプライマー１０３．６（５´−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＣＴＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧ−３´）（配列番号８３）は、アミノ酸番号２の位置でＩＬＴ ｇｐＩ配列上に着座し、ＩＬＴ ｇｐＩ遺伝子の５´末端の位置にＥｃｏＲＩ部位を導入する。第２のプライマー１０３．３（５´−ＣＡＴＴＧＴＣＣＣＧＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧ−３´）（配列番号８４）は、プライマー１０３．６に対して反対側のストランド上の、ほぼアミノ酸２６９の位置でＩＬＴ ｇｐＩ配列上に着座し、遺伝子の５´末端方向にプライミングする。このＰＣＲ生成物を、ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩ（ＢｇｌＩは、５´からプライマー２までが１７９塩基対である、アミノ酸２０９にほぼ位置する。）とを用いて消化することにより、ＩＬＴ ｇｐＩ遺伝子の５´末端に一致する、長さが６２５塩基対のフラグメントを生成させる。第３のプライマ−１０３．４（５´−ＣＧＣＧＡＴＣＣＡＡＣＴＡＴＣＧＧＴＧ−３´）（配列番号８５）は、ほぼアミノ酸１５３の位置でＩＬＴ ｇｐＩ遺伝子上に着座し、遺伝子の３´末端方向にプライミングする。第４のプライマー１０３．５（５´ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＴＴＣＡＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＣ−３´）（配列番号８６）は、ＵＧＡ停止コドンを１４塩基対越えて、ＩＬＴ ｇｐＩ遺伝子の３´末端に着座し、ＢａｍＨ��制限部位を導入すると共に、遺伝子の５´末端方向にプライミングする。このＰＣＲ生成物を、ＢｇｌＩ（アミノ酸２０９に位置する）とＢａｍＨＩとを用いて消化することにより、ＩＬＴ ｇｐＩ遺伝子の３´末端に一致する、長さが４７６塩基対のフラグメントを生成させる。フラグメント２は、連結されて一緒になった２つのＰＣＲ反応の生成物からなり、長さとして約１１０１塩基対（３６１アミノ酸）の、ＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでのフラグメントとしてのＩＬＴ ｇｐＩ遺伝子である。フラグメント３は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３００２塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでのサブフラグメントである。フラグメント１およびフラグメント４のＡｃｃＩ部位を、ＮｏｔＩリンカーを用いて単独の(unique)ＮｏｔＩ部位に変換した。
【０１３５】
相同ベクター６１４−８３．１８
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド６１４−８３．１８を構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびＩＢＲ ｇｐＧ遺伝子を有する。該外来遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＲ ｇＧ遺伝子が合成された後期／初期ポックス・プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。該プラスミドの詳細な記載を図１５に示す。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを図１５に示される合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を利用してそれを構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、ＰＣＲクローニングにより両端にＥｃｏＲＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位とを有するように合成され、ＩＢＲ ｇｐＧ遺伝子のアミノ酸２からアミノ酸３６２までのアミノ酸コーディング配列を含んでいる、約１０８５塩基対のフラグメントである。ＰＣＲクローニングの手順において、下記のプライマーをＩＢＲ−０００ウイルス（クーパー(Cooper)株）からなる鋳型（テンプレート）とともに用いた。第１のプライマー１０６．９（５´−ＡＴＧＡＡＴＴＣＣＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＧＧＡＣＣＧＧＣＡＣＣ−３´）（配列番号８７）は、アミノ酸番号１の位置でＩＢＲ ｇｐＧ配列上に着座し、ＩＢＲ ｇｐＧ遺伝子の５´末端の位置においてＥｃｏＲＩ部位を、およびアミノ酸１とアミノ酸２の間に２つの付加的アミノ酸を導入する。第２のプライマー１０６．８（５´−ＣＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＧＡＧＣＧＧＧＣＴＣＣ−３´）（配列番号８８）は、プライマー１に対して反対側のストランド上の、ほぼアミノ酸３６２の位置でＩＢＲ ｇｐＧ配列上に着座し、ＩＢＲ ｇｐＧ遺伝子の５´末端方向に合成をプライミングする。ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとを用いてこのＰＣＲ生成物を消化することによりフラグメント２を作成し、ＩＢＲ ｇｐＧ遺伝子のアミノ末端側の３６２アミノ酸（約８０％）に対応する、長さが１０８５塩基対のフラグメントを作成した。フラグメント３は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３００２塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでのサブフラグメントである。フラグメント１およびフラグメント４のＡｃｃＩ部位を、ＮｏｔＩリンカーを用いて単独���ＮｏｔＩ部位に変換した。
【０１３６】
Ｓ−ＳＰＶ−０１９を構築するための相同ベクター（ＬａｃＺ／ＩＢＲ ｇｐＥ相同ベクター）
このＬａｃＺ／ＩＢＲ ｇｐＥ相同ベクターを用いてＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入する。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびＩＢＲ ｇｐＥ遺伝子を有する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーターの制御下にあり、ｇｐＥ遺伝子が合成された後期／初期ポックス・プロモーターの制御下にあることに注意しなければならない。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを、適切な合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して該相同ベクターを構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。上流のＳＰＶホモロジーは、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１１４６塩基対のＢｇｌＩＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。ＩＢＲｇＥ遺伝子は、ＰＣＲクローニングによりＥｃｏＲＩ末端とＢａｍＨＩ末端とを有するように合成された約１８８８塩基対のフラグメントである。ＰＣＲクローニングの手順において、下記のプライマーをＩＢＲ−０００ウイルス（クーパー株）からなる鋳型（テンプレート）とともに用いた。第１のプライマー４／９３．１７ＤＲ（５´−ＣＴＧＧＴＴＣＧＧＣＣＣＡＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＧＧＴＣＴＣＧＣＧＣＧＧＣＴＣＧＴＧＧ−３´）（配列番号８９）は、アミノ酸番号１の位置でＩＢＲ ｇｐＥ遺伝子上に着座し、ＩＢＲ ｇｐＥ遺伝子の５´末端の位置においてＥｃｏＲＩ部位を導入するとともに該タンパク質のアミノ末端に２つの付加的アミノ酸を加える。第２のプライマー４／９３．１８ＤＲ（５´−ＣＴＣＧＣＴＣＧＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＣＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡＣＴＴＧＡＧＴＣＧ−３´）（配列番号９０）は、プライマー１に対して反対側のストランド上の、ほぼアミノ酸６４８の位置でＩＢＲ ｇｐＥ配列上に着座し、ＩＢＲｇｐＥ遺伝子の５´末端方向に合成をプライミングする。ｌａｃＺプロモーターおよびマーカー遺伝子は、プラスミド５２０−１７．５において用いられたものと同一である。下流のＳＰＶホモロジーは、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約２１５６塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。ＳＰＶ相同ベクターにおけるＡｃｃＩ部位を、単独のＸｂａＩ部位に変換した。
【０１３７】
Ｓ−ＳＰＶ−０１８を構築するための相同ベクター（ＬａｃＺ／ＰＲＶ ｇｐＥ相同ベクター）
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、この相同ベクターを構築する。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびＰＲＶ ｇｐＥ遺伝子を有する。該外来遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶ ｇｐＥ遺伝子が合成された初期／後期ポックス・プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を利用して相同ベクターを構築する。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、プラスミド５２０−１７．５において用いられたものと同一である、ｌａｃＺプロモーターおよびマーカー遺伝子である。フラグメント３は、ＰＲＶのＢａｍＨＩ＃７ＤＮＡフラグメントに由来する、ＰＲＶの約２４８４塩基対のＤｒａＩからＭｌｕＩまでのサブフラグメントである。そのＤｒａＩ部位を、合成ＤＮＡリンカーの使用によりＥｃｏＲＩ部位に変換する。ＤｒａＩ部位は、天然のｇｐＥ開始コドンの４５塩基対上流に位置しており、該タンパク質のアミノ末端において、１５アミノ酸にわたってオープン・リーディング・フレームを伸長する。合成ポックス・プロモーター／ＥｃｏＲＩ ＤＮＡリンカーは、さらに４アミノ酸を付与する。したがって、その処理されたｇｐＥ遺伝子は、ｇｐＥのアミノ末端に融合した１９の付加アミノ酸を含む。その１９のアミノ酸は、Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒである。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでのサブフラグメントである（２３）。フラグメント１およびフラグメント４のＡｃｃＩ部位を、合成ＤＮＡリンカーを用いてＰｓｔＩ部位に変換する。
【０１３８】
相同ベクター５２０−９０．１５
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド５２０−９０．１５を構築した。これは、外来ＤＮＡを挿入しうる単独のＮｄｅＩ制限酵素部位を含む。ＮｄｅＩ部位に外来ＤＮＡ挿入を含むプラスミドを、「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来ＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。次ぎに示す起源由来の２つの制限フラグメントを繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用してプラスミド５２０−９０．１５を構築した。第１のフラグメントは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメントである。第２のフラグメントは、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＧの、約１７００塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。
【０１３９】
相同ベクター７０８−７８．９
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド７０８−７８．９を構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子および感染性ウシ鼻気管炎ウイルス(the infectious bovine rhinotracheitis virus)（ＩＢＲＶ）ｇＥ遺伝子を有する。該外来遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＲＶ ｇＥ遺伝子が合成された後期／初期ポックス・プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を利用してそれを構築することができる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、両端にＥｃｏＲＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位とを有する、約４７５塩基対のフラグメントである。ＰＣＲクローニングによりＥｃｏＲＩ部位およびＢａｍＨＩ部位を合成する。このＰＣＲ生成物は、ＩＢＲＶ ｇＥ遺伝子の全アミノ酸をコードする配列を含む。そのＰＣＲクローニングの手順において、下記のプライマーをＩＢＲ−０００ウイルス（クーパー株）からなる鋳型（テンプレート）とともに用いた（４４）。第１のプライマー２／９４．５ＤＲ（５´−ＣＴＧＧＴＴＣＧＧＣＣＣＡＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＡＣＣＣＡＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧ−３´）（配列番号１１６）は、アミノ酸番号１の位置でＩＢＲ ｇｐＥ遺伝子上に着座し、ＩＢＲＶ ｇＥ遺伝子の５´末端の位置においてＥｃｏＲＩ部位を導入し、且つタンパク質のアミノ末端に２つの付加的アミノ酸を加える。第２のプライマー４／９３．１８ＤＲ（５´−ＣＴＣＧＣＴＣＧＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＣＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡＣＴＴＧＡＧＴＣＧ−３´）（配列番号１１７）は、第１のプライマーに対して反対側のストランド上の、ほぼアミノ酸６４８の位置でＩＢＲＶ ｇＥ配列（４４）上に着座し、ＩＢＲＶ ｇＥ遺伝子の５´末端方向に合成をプライミングする。このＰＣＲ生成物を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとを用いて消化することにより、ＩＢＲＶｇＥ遺伝子に一致する、長さとして約１９５０塩基対のフラグメントを生成させた。フラグメント３は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３００２塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでのサブフラグメントである。フラグメント１およびフラグメント４のＡｃｃＩ部位��、ＮｏｔＩリンカーを用いて単独のＮｏｔＩ部位に変換した。
【０１４０】
相同ベクター７２３−５９Ａ９．２２
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド７２３−５９Ａ９．２２を用いた。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびウマ・インフルエンザウイルスＮＡ ＰＲ／５６遺伝子を有する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いたならば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＥＩＶのＰＲ／５６ ＮＡ遺伝子が合成された後期／初期ポックス・プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。該プラスミドの詳細な記載を、図１８Ａ、、１８Ｂ、１８Ｃおよび１８Ｄに示す。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを適切な合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して相同ベクターを構築した。そのプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｎｉｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＭの、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、次の両プライマーすなわち、ＰＣＲのために５´−ＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＧＡＡＡＡＧＴＡＴＴＴＡＡＴＴＴＧＴＧＣ−３´（配列番号１１９）と組み合わせられた、ｃＤＮＡプライミングのための５´−ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴＴＴ−３´（配列番号１１８）を利用して約１４５０塩基対のＢａｍＨＩフラグメントとしてクローン化された、ウマインフルエンザＡ／プラーグ(Prague)／５６（血清型１（Ｎ７）ウイルス）からのＮＡ遺伝子コーディング領域である（「ウマインフルエンザウイルスの赤血球凝集素遺伝子及びノイラミニダーゼ遺伝子のクローニング」を参照）。フラグメント３は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。ＳＰＶ相同ベクターにおけるＡｃｃＩ部位を、単独のＮｏｔＩ部位に変換する。
【０１４１】
相同ベクター７２７−５４．６０
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド７２７−５４．６０を構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ（ｇｐＢ）遺伝子を有する。該外来遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＰＲＶのｇＢ遺伝子が合成された後期／初期ポックス・プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。該プラスミドの詳細な記載を、図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、および１９Ｄに示す。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを、図１９Ａから図１９Ｄに示される合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を利用してそれを構築しうる。そのプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＢｇＩＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、ゲノムＰＲＶ ＤＮＡのＫｐｎＩ Ｃフラグメント中にＰＲＶ ｇＢ遺伝子についてのコーディング配列を含む約３５００塩基対のフラグメントである（２１）。フラグメント２は、ＰＲＶ ｇＢ遺伝子のアミノ末端を含む約５３塩基対の合成フラグメント、ＰＲＶ ＫｐｎＩ Ｃゲノムフラグメントからの約７８塩基対のＳｍａＩからＮｈｅＩまでのフラグメント、およびＰＲＶ ＫｐｎＩ Ｃゲノムフラグメントからの約３３７０塩基対のＮｈｅＩからＥｃｏＲＩまでのフラグメントを含む（２１）。フラグメント３は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ限フラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでのサブフラグメントである。フラグメント１およびフラグメント４におけるＡｃｃＩ部位を、ＮｏｔＩリンカーを用いて単独のＮｏｔＩ部位に変換した。
【０１４２】
相同ベクター７２７−６７．１８
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド７２７−６７．１８を構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびＢ型肝炎ウイルスのコア抗原遺伝子を有する。該外来遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、Ｂ型肝炎のコア抗原遺伝子が合成された初期／後期ポックス・プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。該プラスミドの詳細な記載を、図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、および２０Ｄに示す。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを、図２０Ａから図２０Ｄに示される合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を利用してそれを構築しうる。そのプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶの＃ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＨｇＩＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３００２塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント３は、両端においてＢａｍＨＩＩ制限部位およびＥｃｏＲＩ制限部位を有する、約５８９塩基対のフラグメントである。このフラグメントは、Ｂ型肝炎のコア抗原をコードする配列（アミノ酸２５−２１２）を含む（４５、５０を参照。）。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでのサブフラグメントである。フラグメント１およびフラグメント４におけるＡｃｃＩ部位を、ＮｏｔＩリンカーを用いて単独のＮｏｔＩ部位に変換した。
【０１４３】
ウマインフルエンザウイルスの赤血球凝集素遺伝子及びノイラミニダーゼ遺伝子のクローニング
基本的に、ヒトインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子について、カッツ(Katz)ら（４２）により記載されたようにウマインフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子をクローン化し得る。標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用することにより、まず、ＭＤＢＫ細胞（インフルエンザＡ／ウマ／アラスカ／９１およびインフルエンザＡ／ウマ／マイアミ／６３について）ならびにＭＤＣＫ細胞（インフルエンザＡ／ウマ／プラーグ(Prague)／５６およびインフルエンザＡ／ウマ／ケンタッキー／８１について）中において増殖したウイルスから調製されたウイルスＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。次いで、標的遺伝子領域のＰＣＲクローニング（５１）のためのテンプレートとしてそのｃＤＮＡを用いる。ＥＨＶ中における発現のための適切な信号を含むベクター中に、増幅されたコーディング領域のクローン化を可能にする制限部位を有するように、ＰＣＲプライマーを設計する。それぞれのコーディング領域に対して、一組(One pair)のオリゴヌクレオチドプライマーが必要であろう。次の両プライマーすなわち、ＰＣＲのために５´−ＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＣＡＴＣＴＧＡＴＧＴＴＧＣＣ−３´（配列番号１２１）を組み合わせて、ｃＤＮＡプライミングのための５´−ＧＧＡＧＧＣＣＴＴＣＡＴＧＡＣＡＧＡＣＡＡＣＣＡＴＴＡＴＴＴＴＧＡＴＡＣＴＡＣＴＧＡ−３´（配列番号１２０）を利用して、血清型２（Ｈ３）ウイルス（インフルエンザＡ／ウマ／マイアミ／６３、インフルエンザＡ／ウマ／ケンタッキー／８１およびインフルエンザＡ／ウマ／アラスカ／９１）由来のＨＡ遺伝子コーディング領域をクローン化しうる。次の両プライマーすなわち、ＰＣＲのために５´−ＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＡＴＡＣＡＡＡＴＡＧＴＧＣＡＣＣＧＣＡ−３´（配列番号１２３）を組み合わせて、ｃＤＮＡプライミングのための５´−ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＣＡＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＴＴＡＧ−３´（配列番号１２２）を利用して、血清型１（Ｈ７）ウイルス（インフルエンザＡ／ウマ／プラーグ／５６）由来のＨＡ遺伝子コーディング領域をクローン化しうる。次の両プライマーすなわち、ＰＣＲのために５´−ＧＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＡＴＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＡＡＡ−３´（配列番号１２５）を組み合わせて、ｃＤＮＡプライミングのための５´−ＧＧＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＴＣＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＴＡＡ−３´（配列番号１２４）を利用して、血清型２（Ｎ８）ウイルス（インフルエンザＡ／ウマ／マイアミ／６３、インフルエンザＡ／ウマ／ケンタッキー／８１およびインフルエンザＡ／ウマ／アラスカ／９１）由来のＮＡ遺伝子コーディング領域をクローン化しうる。次の両プライマーすなわち、ＰＣＲのために５´−ＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＧＡＡＡＡＧＴＡＴＴＴＡＡＴＴＴＧＴＧＣ−３´（配列番号１１９）
を組み合わせて、ｃＤＮＡプライミングのための５´−ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴＴＴ−３´（配列番号１１８）を利用して、血清型１（Ｎ７）ウイルス（インフルエンザ／Ａ／ウマ／プラーグ／５６）由来のＮＡ遺伝子コーディング領域をクローン化しうる。ウマインフルエンザＡウイルスの別の株由来のＨＡ遺伝子およびＮＡ遺伝子のコーディング領域をクローン化するために、この一般的手法(general strategy)を用い得ることに注意しなければならない。ＳＰＶ相同ベクターのＬＰ２ＥＰ２プロモーターの後の平滑末端化されたＥｃｏＲＩ部位に、平滑末端化されたＳａｌＩフラグメントまたはＢａｍＩフラグメントとしてＥＩＶのＨＡ遺伝子またはＮＡ遺伝子をクローン化する。
【０１４４】
相同ベクター７３２−１８．４
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド７３２−１８．４を用いた。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびウマインフルエンザウイルスＡＫ／９１ ＮＡ遺伝子を有する。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いたならば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＥＩＶのＡＫ／９１ ＮＡ遺伝子が合成された後期／初期ポックス・プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。該プラスミドの詳細な記載を、図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃおよび２１Ｄに示す。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを適切な合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２および３０）を利用して相同ベクターを構築した。そのプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＭの、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、次の両プライマーすなわち、ＰＣＲのために５´−ＧＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＡＴＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＡＡＡ−３´（配列番号１２５）を組み合わせて、ｃＤＮＡプライミングのための５´−ＧＧＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＴＣＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＴＡＡ−３´（配列番号１２４）を利用して、約１４５０塩基対のＳａｌＩフラグメントとしてクローン化されたウマインフルエンザＡ／アラスカ／９１（血清型２（Ｎ８）ウイルス）由来のＮＡ遺伝子コーディング領域である（「ウマインフルエンザウイルスの赤血球凝集素遺伝子及びノイラミニダーゼ遺伝子のクローニング」を参照）。フラグメント３は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの制限サブフラグメンである（２３）。ＳＰＶ相同ベクターにおけるＡｃｃＩ部位を、単独のＮｏｔＩ部位に変換する。
【０１４５】
相同ベクター７４１−８０．３
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド７４１−８０．３を構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を有する。該外来遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子がヒト・サイトメガロウイルス即時初期(immediate early)プロモーター（ＨＣＭＶ ＩＥ）の制御下にあることに注意しなければならない。該プラスミドの詳細な記載を、図２２Ａ、２２Ｂおよび２２Ｃに示す。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを、図２２Ａから図２２Ｃに示される合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を利用してそれを構築しうる。そのプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、ＨＣＭＶ ＩＥプロモーターを含むＨＣＭＶの２．１ｋｂのＰｓｔＩフラグメントに由来する、１１５４塩基対のＰｓｔＩからＡｖａＩＩまでのフラグメントである（４６）。フラグメント３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃＺ遺伝子を含むｐＪＦ７５１プラスミド（４９）に由来する、３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでのフラグメントである。フラグメント４は、ＰＲＶのｇＸ遺伝子のカルボキシ末端の１９アミノ酸およびポリアデニル化信号を含むＰＲＶ ＢａｍＨＩ ＃７に由来する、約７５０塩基対のＮｄｅＩからＳａｌＩまでのフラグメントである。フラグメント５は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでのサブフラグメントである。フラグメント１およびフラグメント５におけるＡｃｃＩ部位を、ＮｏｔＩリンカーを用いて単独のＮｏｔＩ部位に変換した。
【０１４６】
相同ベクター７４１−８４．１４
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド７４１−８４．１４を構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびヒト・インターロイキン−２（ＩＬ−２）遺伝子を有する。該外来遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ヒトＩＬ−２遺伝子が合成された後期／初期ポックス・プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。ヒトＩＬ−２タンパク質をコードする配列をそのアミノ末端で、ＰＲＶ ｇＸの膜輸送のための信号配列に融合する。該プラスミドの詳細な記載を、図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ、および２３Ｄに示す。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを、図２３Ａから図２３Ｄに示される合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を利用してそれを構築しうる。そのプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、両端にＥｃｏＲＩ制限部位とＢｇｌＩＩ制限部位とを有する約４７５塩基対のフラグメントである。ＥｃｏＲＩ部位は、ＰＣＲクローニングにより合成され、ＢｇｌＩＩ部位は、ヒトＩＬ−２ ｃＤＮＡの３´末端である（４３、４７）。このＰＣＲ生成物は、ＰＲＶ ｇＸ信号配列−ヒトＩＬ−２遺伝子の全アミノ酸をコードする配列を含む。この手順において、下記のプライマーをＰＲＶ ｇＸ信号配列−ヒトＩＬ−２についてのｃＤＮＡからなる鋳型（テンプレート）とともに用いた（４３）。第１のプライマー５／９４．２３（５´−ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＧＣ−３´）（配列番号１２６）は、アミノ酸番号１の位置でＰＲＶ ｇＸ信号配列上に着座し、遺伝子の５´末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。第２のプライマー５／９４．２４（５´−ＣＡＧＴＴＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡ−３´）（配列番号１２７）は、プライマー５／９４．２３に対して反対側のストランド上の、３´非翻訳領域の範囲にあるヒトＩＬ−２遺伝子配列上に着座し、遺伝子の５´末端方向にプライミングする。このＰＣＲ生成物を、ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩ（ＢｇｌＩＩは、ヒトＩＬ−２遺伝子にとっての停止コドンを約３ヌクレオチド越えて位置する。）とを用いて消化したことにより、ＰＲＶ ｇＸ信号配列−ヒトＩＬ−２遺伝子に一致する、長さが４７５塩基対のフラグメントを生成させた。フラグメント３は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメン���である（１１）。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでのサブフラグメントである。フラグメント１およびフラグメント４のＡｃｃＩ部位を、ＮｏｔＩリンカーを用いて単独のＮｏｔＩ部位に変換した。
【０１４７】
相同ベクター７４４−３４
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド７４４−３４を構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびウマ・ヘルペスウイルス・タイプ１ ｇＢ遺伝子を有する。該外来遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＥＨＶ−１のｇＢ遺伝子が合成された後期／初期ポックス・プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。該プラスミドの詳細な記載を、図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ、および２４Ｄに示す。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを、図２４Ａから図２４Ｄに示される合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を利用してそれを構築しうる。そのプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、両端にＥｃｏＲＩ制限部位とＰｍｅＩ制限部位とを有する約２９４１塩基対のフラグメントである。フラグメント２は、約２９４１塩基対のＥｃｏＲＩからＰｍｅＩまでのフラグメントである。ＥＨＶ−１のゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ“ａ”フラグメントの範囲内において、合成によるＥｃｏＲＩ部位と天然のＢａｍＨＩ部位とを有している遺伝子の５´末端における約４２９塩基対のＰＣＲフラグメント、およびＥＨＶ−１のゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ“ｉ”フラグメントの範囲内において、ＢａｍＨＩからＰｍｅＩまでの遺伝子の３´末端における約２５１２塩基対の制限フラグメントとして、フラグメント２を合成した（４８）。その５´末端ＰＣＲフラグメントを作成するための手順において、下記のプライマーをＥＨＶ−１のＢａｍＨＩ“ａ”フラグメントおよび“ｉ”フラグメントからなる鋳型（テンプレート）とともに用いた。第１のプライマー５／９４．３（５´−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＧＧＴＴＧＣＣＧＴ−３´）（配列番号１２８）は、アミノ酸番号２の位置でＥＨＶ−１ ｇＢ配列上に着座し、ＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子の５´末端におけるＥｃｏＲＩ部位、およびＡＴＧ開始コドンを導入する。第２のプライマー５／９４．４（５´−ＧＡＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＧＧＣＧＧＴ−３´）（配列番号１２９）は、プライマー５／９４．３に対して反対側のストランド上の、約アミノ酸１４４の位置でＥＨＶ−１ ｇＢ配列上に着座し、遺伝子の５´末端方向にプライミングする。そのＰＣＲ生成物を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとを用いて消化したことにより、ＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子の５´末端に一致する、長さが４２９塩基対のフラグメントを生成させ���。フラグメント２は、長さが約２９４１塩基対（９７９アミノ酸）のＥｃｏＲＩからＰｍｅＩまでのフラグメントとしてのＥＨＶ−１ ｇＢ遺伝子となるように一緒に連結された、ＰＣＲ反応の生成物（ＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまで）および制限フラグメント（ＢａｍＨＩからＰｍｅＩまで）からなる。フラグメント３は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでのサブフラグメントである。フラグメント１およびフラグメント４のＡｃｃＩ部位を、ＮｏｔＩリンカーを用いて単独のＮｏｔＩ部位に変換した。
【０１４８】
相同ベクター７４４−３８
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド７４４−３８を構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびウマ・ヘルペスウイルス・タイプ１ ｇＤ遺伝子を有する。該外来遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＥＨＶ−１のｇＤ遺伝子が合成された後期／初期ポックス・プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。該プラスミドの詳細な記載を、図２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｃ、および２５Ｄに示す。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを、図２５Ａから図２５Ｄに示される合成ＤＮＡ配列と繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を利用してそれを構築しうる。そのプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、ＥＨＶ−１のＢａｍＨＩ“ｄ”フラグメントの範囲内における約１２４０塩基対のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントである（４８）。フラグメント３は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでのサブフラグメントである。フラグメント１およびフラグメント４のＡｃｃＩ部位を、ＮoｔＩリンカーを用いて単独のＮｏｔＩ部位に変換した。
【０１４９】
パラインフルエンザ−３ウイルスの融合(fusion)遺伝子および赤血球凝集素遺伝子のクローニング
基本的に、ヒトインフルエンザのＨＡ遺伝子について、カッツ(Katz)ら（４２）により記載されたようなＰＣＲクローニングの手順により、パラインフルエンザ−３ウイルス融合（Ｆ）遺伝子および赤血球凝集素（ＨＮ）遺伝子をクローン化した。標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用することにより、まず、メイディン−ダービー（Madin-Darby）ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞中において増殖したウシＰＩ−３ウイルスから調製されたウイルスＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。次いで、標的とされる領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるクローニング（１５）のためのテンプレートとしてそのｃＤＮＡを用いた。ＳＰＶ中における発現のための適切な信号を含むベクター中に、増幅されたコーディング領域のクローン化を可能にする制限部位を有するように、ＰＣＲプライマーを設計した。それぞれのコーディング領域に対して、一組(One pair)のオリゴヌクレオチドが必要とされた。次の両プライマーすなわち、ＰＣＲのために５´−ＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＡＣＣＡＴＡＡＴＣＡＴＡＧＣＣ−３´（配列番号１３１）を組み合わせて、ｃＤＮＡプライミングのための５´−ＴＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＴＧＴ−３´（配列番号１３０）を用いて、ＰＩ−３株ＳＦ−４（ＶＲ−２８１）由来のＦ遺伝子コーディング領域をクローン化した。次の両プライマーすなわち、ＰＣＲのために５´−ＣＡＴＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＡＡＴＡＴＴＧＧＡＡＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣＡＧＣＡＣ−３´（配列番号１３３）を組み合わせて、ｃＤＮＡプライミングのための５´−ＣＧＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＴＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧＴＴＴＴＧＡ−３´（配列番号１３２）を利用して、ＰＩ−３株ＳＦ−４（ＶＲ−２８１）由来のＨＮ遺伝子コーディング領域をクローン化した。ＰＩ−３の別の株由来のＦ遺伝子およびＨＮ遺伝子のコーディング領域をクローン化するために、この一般的手法(general strategy)を用いることに注意しなければならない。ＰＩ−３のＨＮまたはＦについてのＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩで消化して、それぞれ、１７３０ｂｐまたは１６２０ｂｐのフラグメントを作成した。ＳＰＶ相同ベクターのＬＰ２ＥＰ２プロモーターに隣接するＢａｍＨＩ部位に、ＰＩ−３のＨＮフラグメントをクローン化する。ＳＰＶ相同ベクターのＬＰ２ＥＰ２プロモーターに隣接するＢａｍＨＩ部位に、ＰＩ−３のＦフラグメントをクローン化し、相同ベクター７１３−５５．１０を作成する。
【０１５０】
ウシ・ウイルス性下痢症ウイルス（BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUS）のｇｐ４８遺伝子およびｇｐ５３遺伝子のクローニング
基本的に、ヒトインフルエンザのＨＡ遺伝子について、カッツ(Katz)ら（４２）により記載されたようなＰＣＲクローニングの手順により、ウシ・ウイルス性下痢のｇｐ４８遺伝子およびｇｐ５３遺伝子をクローン化した。標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用することにより、まず、メイディン−ダービー・ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞中において増殖したＢＶＤウイルス・シンガー(Singer)株から調製されたウイルスＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。次いで、標的とされる領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるクローニング（１５）のためのテンプレートとしてそのｃＤＮＡを用いた。ＳＰＶ中における発現のための適切な信号を含むベクター中に、増幅されたコーディング領域のクローン化を可能にする制限部位を有するように、ＰＣＲプライマーを設計した。それぞれのコーディング領域に対して、一組のオリゴヌクレオチドが必要とされた。次の両プライマーすなわち、ＰＣＲのために５´−ＡＣＡＴＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡＴＡＡＣＡＣＡＧＴＧＧＡＡＣＣ−３´（配列番号１３５）を組み合わせて、ｃＤＮＡプライミングのための５´−ＡＣＧＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＴＡＣＣＡＡＡＣＣＡＣＧＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＧＴＴＴＴＣＣ−３´（配列番号１３４）を用いて、ＢＶＤＶシンガー株由来のｇｐ４８遺伝子コーディング領域（４９）をクローン化した。次の両プライマーすなわち、ＰＣＲのために５´−ＣＡＴＡＧＡＴＣＴＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＴＣＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡ−３´（配列番号１３７）を組み合わせて、ｃＤＮＡプライミングのための５´−ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＧＧＴＡＴＣＧＴＣＴＡＣ−３´（配列番号１３６）を用いて、ＢＶＤＶシンガー株由来のｇｐ５３遺伝子コーディング領域（４９）をクローン化した。ＢＶＤＶの別の株由来のｇｐ４８遺伝子およびｇｐ５３遺伝子のコーディング領域をクローン化するために、この一般的手法を用いることに注意しなければならない。ＢＶＤＶのｇｐ４８についてのＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩで消化して、６７８ｂｐのフラグメントを作成した。ＢＶＤＶのｇｐ５３についてのＤＮＡフラグメントをＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで消化して、１１８７ｂｐのフラグメントを作成した。ＳＰＶ相同ベクターのＬＰ２ＥＰ２プロモーターに隣接するＢａｍＨＩ部位に、ＢＶＤＶのｇｐ４８ＤＮＡフラグメントまたはｇｐ５３ＤＮＡフラグメントをクローン化し、７２７−７８．１および７３８−９６のそれぞれの相同ベクターを作成した。
【０１５１】
ウシ呼吸器合胞体ウイルスの（BOVINE RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS）融合(fusion)遺伝子、ヌクレオカプシド遺伝子および糖タンパク質遺伝子のクローニング
基本的に、ヒトインフルエンザのＨＡ遺伝子について、カッツ(Katz)ら（４２）により記載されたようなＰＣＲクローニングの手順により、ウシ呼吸器合胞体ウイルスの融合（Ｆ）遺伝子、ヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子および糖タンパク質（Ｇ）遺伝子をクローン化した。標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用することにより、まず、ウシ鼻甲介（ＢＴ）細胞中において増殖したＢＲＳＶウイルスから調製されたウイルスＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。次いで、標的とされる領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるクローニング（１５）のためのテンプレートとしてそのｃＤＮＡを用いた。
【０１５２】
ＳＰＶ中における発現のための適切な信号を含むベクター中に、増幅されたコーディング領域のクローン化を可能にする制限部位を有するように、ＰＣＲプライマーを設計した。それぞれのコーディング領域に対して、一組のオリゴヌクレオチドが必要とされた。次の両プライマーすなわち、ＰＣＲのために５´−ＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴＡＣＡＧＣＣＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＣＡＴＣＡＧＣ−３´（配列番号１３９）を組み合わせて、ｃＤＮＡプライミングのための５´−ＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＴＡＣＴＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡＴＴＧＴＴＧＡＴ−３´（配列番号１３８）を用いて、ＢＲＳＶ株３７５（ＶＲ−１３３９）由来のＦ遺伝子コーディング領域をクローン化した。次の両プライマーすなわち、ＰＣＲのために５´−ＣＴＴＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴＴＡＧＣＡＡＧＧＴＣＡＡＡＣＴＡＡＡＴＧＡＣ−３´（配列番号１４１）を組み合わせて、ｃＤＮＡプライミングのための５´−ＣＧＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＣＡＣＡＧＴＴＣＣＡＣＡＴＣＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＡＴ−３´（配列番号１４０）を利用してＢＲＳＶ株３７５（ＶＲ−１３３９）由来のＮ遺伝子コーディング領域をクローン化した。次の両プライマーすなわち、ＰＣＲのために５´−ＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＣＣＣＡＴＣＡＴＣＴＴＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＣＡＴＴＡ−３´（配列番号１４３）を組み合わせて、ｃＤＮＡプライミングのための５´−ＣＧＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＡＴＴＴＧＴＧＴＧＡ−３´（配列番号１４２）を利用してＢＲＳＶ株３７５（ＶＲ−１３３９）由来のＧ遺伝子コーディング領域をクローン化した。ＢＲＳＶの別の株由来のＦ遺伝子、Ｎ遺伝子およびＧ遺伝子のコーディング領域をクローン化するために、この一般的手法を用いることに注意しなければならない。ＢＲＳＶのＦ、ＮおよびＧについてのＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩで消化して、１７２２ｂｐ、１１７３ｂｐまたは７７１ｂｐの、それぞれのフラグメントを作成した。ＳＰＶ相同ベクターのＬＰ２ＥＰ２プロモーターに隣接するＢａｍＨＩ部位に、ＢＲＳＶのＦ、ＮおよびＧのＤＮＡフラグメントをクローン化し、７２７−２０．１０、７１３−５５．３７および７２７−２０．５のそれぞれの相同ベクターを作成した。
【０１５３】
相同ベクター６８９−５０．４
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド６８９−５０．４を構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子および伝染性曩病ウイルス(the infectious bursal disease virus)（ＩＢＤＶ）ポリプロテイン(polyprotein)遺伝子を有する。該外来遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＤＶのポリプロテイン遺伝子が合成された後期／初期ポックス・プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を利用してそれを構築しうる。そのプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、プラスミド２−８４／２−４０由来の、両端にＳｍａＩ制限部位とＨｐａＩ制限部位とを有する約３４００塩基対のフラグメントである（５１）。このフラグメントは、ＩＢＤＶのポリプロテインをコードする配列を含む。フラグメント３は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでのサブフラグメントである。フラグメント１およびフラグメント４のＡｃｃＩ部位を、ＮｏｔＩリンカーを用いて単独のＮｏｔＩ部位に変換した。
【０１５４】
相同ベクター６８９−５０．７
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために、プラスミド６８９−５０．７を構築した。これは、ＳＰＶのＤＮＡが隣接した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子および伝染性曩病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子を有する。該外来遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約１４８４塩基対のフラグメントである。該外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡの、約２１４９塩基対のフラグメントである。このプラスミドを「組換えＳＰＶを生じさせるための相同的組換手順」にしたがって用いれば、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子が合成された後期ポックス・プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子が合成された後期／初期ポックス・プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意しなければならない。次ぎに示す起源由来の制限フラグメントを繋ぎ合わせることにより、標準的な組換えＤＮＡ技術（２２、３０）を利用してそれを構築しうる。そのプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の、約２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限フラグメント由来である。フラグメント１は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントＭの、約１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限サブフラグメントである（２３）。フラグメント２は、両端にＢｃｌＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位とを有する約１０８１塩基対のフラグメントである。このフラグメントは、ＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードし、ＩＢＤＶのｃＤＮＡクローンの全長に由来する（５１）。フラグメント３は、ｐＪＦ７５１プラスミドの、約３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限フラグメントである（１１）。フラグメント４は、ＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントＭの、約２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでのサブフラグメントである。フラグメント１およびフラグメント４のＡｃｃＩ部位を、ＮｏｔＩリンカーを用いて単独のＮｏｔＩ部位に変換した。
【実施例】
【０１５５】
実施例１
相同ベクター515-85.1
相同ベクター515-85.1 は、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するのに有用なプラスミドである。プラスミド515-85.1は、外来ＤＮＡがクローン化されるユニークなAccI制限部位を含んでいる。外来ＤＮＡを含むＳＰＶを生成するためには、このような外来ＤＮＡ挿入物を含むプラスミドを、「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」(HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV）に従って使用してもよい。この方法を成功させるためには、挿入部位（AccI）が、ＳＰＶの複製に不可欠ではない領域にあることが重要であり、また、該挿入部位が、ウイルスとプラスミドＤＮＡの間の相同組換えを行なうに適切なブタポックスウイルスＤＮＡに隣接することが重要である。我々は、相同ベクター515-85.1中のAccI部位が、外来ＤＮＡを少なくとも三つの組換ええＳＰＶ中に挿入することに使用され得ることを実証した（実施例２〜４参照）。
【０１５６】
適切な挿入部位を規定するために、SPV Hind III制限フラグメントのライブラリーを作製した。これらの制限フラグメントのうちいくつか（Hind III G, J, M, 図１Ａおよび１Ｂ参照）を制限酵素部位マッピングの分析に供した。各フラグメント中に、挿入可能部位として二つの制限酵素部位を確認した。これらの制限部位には、フラグメントＧの HpaI および NruI 部位、フラグメントＪの BalI および XbaI 部位、フラグメントＭの AccI および PstI 部位がある。該可能部位の各々に、βガラクトシダーゼ（lac Z)マーカー遺伝子を挿入した。その結果得られたプラスミドを、「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」(HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV）に使用した。組換えウイルスの作製は、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」(SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRESSISNG  β-GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS))によって確認された。６つの部位の内の４部位は、組換えウイルスを発現したことがわかったが、これらの個々の組換えウイルスが親ＳＰＶから精製分離される能力は大きく異なっていた。あるケースでは、ウイルスは、１％のレベルを超える精製はできなかった。またあるケースでは、５０％レベルを超える精製はできなかった。第三のケースでは９０％レベルを超える精製はできなかった。これらの精製が不可能であるウイルスは、挿入部位が不安定であるからである。これによって、その対応部位が外来ＤＮＡを挿入するに不適切となる。しかしながら、挿入が相同ベクター515-85.1のAccI部位 一ヶ所の場合には、得られたベクターが１００％まで簡単に精製でき（実施例２参照）、外来ＤＮＡの挿入の適切な部位が明確に規定された。
【０１５７】
相同ベクター515-85.1は、更に、ＤＮＡ配列分析によって特徴づけされる。相同ベクターの二つの領域が配列決定された。第一の領域は、特徴的なAccI部位（図２Ａおよび２Ｂ参照）に隣接する５９９塩基対の配列をカバーする。第二の領域は、特徴的なHind III部位（図２Ａおよび２Ｂ参照）の上流の８９９塩基対の配列をカバーする。第一の領域の配列は、ゲーベルら（Goebel et al., 1990）（図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ参照）によって確認されたワクシニアウイルス（VV）（O1L）のオープンリーデイングフレームのアミノ酸１〜１１５に対して相同性を示すオープンリーデイングフレーム（ORF）をコードする。第二領域の配列は、同じワクシニアウイルス（O1L）のオープンリーデイングフレーム（図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ参照）のアミノ酸５６８から６６６に対して相同性を示すオープンリーデイングフレーム（ORF）をコードする。これらのデータは、AccI部位が、およそアミノ酸４１でワクシニアウイルス（O1L）の推定オープンリーデイングフレームを阻止していることを示唆し、このORFがＳＰＶの複製に不可欠でない遺伝子をコードしている事を示唆している。ゲーベル（Goebel）らは、VV O1L ORFが、ある真菌類の転写調節タンパクに特徴的なロイシン・ジッパーモチーフを含んでいる事を示唆しているが、これらの遺伝子がウイルスの複製に不可欠であるかどうかについては不明であるとしている。VV O1L ORF の上流に位置している（図２Ａ参照）ＤＮＡ配列は、ブタポックスウイルスのプロモータを含んでいると期待される。このブタポックスウイルスのプロモータは、ブタポックスゲノムに導入される外来ＤＮＡの制御要素として有用となろう。
【０１５８】
実施例２
S-SPV-003
S-SPV-003は、外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ 遺伝子）をSPV 515-85.1 ORFに挿入した。外来遺伝子(lacZ)は、合成初期／後期プロモータ（EP1LP2) の制御下におかれる。
【０１５９】
S-S  PV-003は、S-SPV-001（kasza 株）から誘導した。これは「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」(HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV）において、相同性ベクター520ー17.5（「材料及び方法」参照）とS-SPV-001を利用して完遂された。トランスフェクショ  ストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」(SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS)に従ってスクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、SーSPV-003と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスはβガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路によって分析した。精製を最初の三回行った後、観察された全てのプラークは青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来の遺伝子を発現していることを示している。ここに記載した分析はVERO細胞及びEMSK細胞で実施され、VERO細胞がＳＰＶ組換えワクチン生産に適した基質である事がわかった。 SーSPV-003は，ＡＴＣＣに認可番号VR 2335で寄託されている。
【０１６０】
実施例３
S-SPV-008
S-SPV-008は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼの遺伝子（lac Z遺伝子）及び偽狂犬病ウイルス（PRV）g50（gpD）（26）の遺伝子をSPV 515ー85.1 ORF中に挿入した。lacZ 遺伝子は、合成後期プロモータの（LP1）の制御下に、g50（gpD)遺伝子は、合成初期／後期プロモータ（EP1LP2）の制御下におかれる。
【０１６１】
S-SPV-008は、S-SPV-001(kasza 株）から誘導された。これは「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」(HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV）において、相同性ベクター538ー46.16（「材料及び方法」参照）とS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」(SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS)）に従ってスクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、SーSPV-008と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスをβガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について「「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路よって分析した。精製を最初の三回行った後、観察された全てのプラークは青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、標識遺伝子を発現していることを示している。
【０１６２】
S-SPV-008は、ＰＲＶ特異的抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現のためのブラックプラークスクリーン」（BLACK PLAQUE SCREEN FOR FOREIGN GENE EXPRESSION IN RECOMBINANT SPV) を使用して分析した。ブタ抗ＰＲＶ血清は、S-SPV-008プラークと特異的に反応したが、S-SPV-009陰性対照プラークとは反応しない事がわかった。プラークの観察された全てのS-SPV-008がブタの抗血清と反応したことは、ウイルスが安定的に、ＰＲＶ外来遺伝子を発現している事を示している。ブラックプラーク分析はまた、未固定単層上で行なわれた。未固定単層上のＳＰＶプラークは、ブタ抗ＰＲＶ血清と特異的反応を示し、被感染細胞表面上でＰＲＶ抗原が発現している事を示している。
【０１６３】
PRV g50(gpD)遺伝子生産物の発現を確認するために、細胞にＳＰＶを感染させ、被感染細胞溶融物のサンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットして「ウエスタンブロット法」を使用して分析した。ブタ抗ＰＲＶ血清を使用して、ＰＲＶ特異的タンパクの発現を検出した。図６に示すように、S-SPVー008に感染した細胞からの溶融物は、PRV g50 (gpD)の報じられているサイズ, 約４８ｋｄの特異バンドを示す（35)。
【０１６４】
PRV g50 (gpD)は、 HSV-1（26)のｇ50（gpD)相同物である。HSV-1g50（gpD）を発現するVVは、HSV-1による免疫感作に対して、マウスを保護することが何人かの研究者から報告されている（６，３４）。それ故、S-SPV-008、ＰＲＶ病に対してブタを保護するワクチンとして貴重であろう。
【０１６５】
いくつかの他のＰＶＲ糖タンパクは、ＰＶＲ病に対する予防を行うための組換えブタポックスワクチンの作製に有用であると期待される。これらのＰＲＶ糖タンパクには、gpII (28), gpIII (27), gpH (19)がある。該PRV gpIII コード領域は、いくつかの合成ポックスプロモータの後に構築される。S-SPV-008を作製する為に使用される技術は、これらのＰＲＶ糖タンパク遺伝子の４つ全てを発現する組換えブタポックスウイルスの作製に使用される。このような組換えブタポックスウイルスは、ＰＲＶ 病に対するワクチンとして有用であろう。ここに記載した該ＰＲＶワクチンは、PRV gpX または gpIを発現しないので、被感染動物からワクチン感作された動物を区別するために利用される現行のＰＲＶ診断テスト(gX HerdChek, gI HerdChek 及び ClinEase)に適切である。S-SPV-008は、ＡＴＣＣに、認可番号VR 2339 で寄託されている。
【０１６６】
実施例４
S-SPV-011
S-SPV-011 は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ(lacZ)の遺伝子及び偽狂犬病ウイルスgIII (gpC)遺伝子を、相同ベクター570-33.32の特徴的なPstI 制限部位（特徴的なAccI部位に挿入されたPstIリンカー）に挿入した。lac Z 遺伝子は、合成後期プロモータ(LP1)の制御下に置かれ、PRV gIII (gpC) 遺伝子は合成初期プロモーター(EP2)の制御下に置かれる。
【０１６７】
S-SPV-011は、S-SPV-001(Kasza株）から誘導された。これは「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法 」(HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV）において、相同性ベクター570ー91.21（材料及び方法参照）とS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」(SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS)）に従ってスクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、SーSPV-011と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスをβガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路よって分析した。精製を最初の三回行った後、観察された全てのプラークは青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現していることを示している。
【０１６８】
S-SPV-011は、ＰＲＶ特異的抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現のためのブラックプラークスクリーン」（BLACK PLAQUE SCREEN FOR FOREIGN GENE EXPRESSION IN RECOMBINANT SPV) を使用して分析された。ポリクローナルヤギ抗PRV-gIII (gpC) 抗体は、S-SPV-011プラークと特異的に反応するが、S-SPV-001陰性対照プラークとは反応しない事がわかった。プラークの観察された全てのS-SPV-011が、ブタの抗ＰＲＶ血清と反応したことは、ウイルスが安定的に、ＰＲＶ外来遺伝子を発現している事を示している。この分析はEMSK細胞で実施され、EMSK細胞が、ＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した基質である事がわかった。
【０１６９】
PRV gIII (gpC)遺伝子生産物の発現を確認するために、細胞にＳＰＶを感染させ、被感染細胞溶融物サンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットして「ウエスタンブロット法」を使用して分析した。ヤギ抗PRV gIII (gpC) 抗体を使用して、ＰＲＶ特異的タンパクの発現を検出した。図６に示すように、S-SPVー011に感染した細胞からの溶融物は、(PRV gIII (gpC) の報告されているサイズ、約９２ｋｄの特異バンドを示した（37)。
【０１７０】
組換え体の発現したPRV gIII (gpC)は、マウスとブタで重篤な免疫反応を誘導した（37 38)。更に、gIII (gpC) が、gII (gpB) およびg50 (gpD) とともに発現すると、伝染性ＰＲＶの感作からの顕著な防御が可能である(39)。それ故、S-SPV-011は、ＰＲＶ病に対してブタを保護するワクチンとして貴重であろう。ここに記載した該ＰＲＶワクチンは、PRV gpX 及び gpIを発現しないので、被感染動物からワクチン感作された動物を区別するために利用される現行のＰＲＶ診断テスト(gX HerdChek, gI HerdChek 及び ClinEase)に適切である。
【０１７１】
実施例５
S-SPV-012
S-SPV-012 は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ(lacZ)の遺伝子及び偽狂犬病ウイルスgIII(gpC) の遺伝子を、相同ベクター570-33.32の特徴的なPstI 制限部位（特徴的なAccI部位に挿入されたPstIリンカー）に挿入した。lacZ 遺伝子は、合成後期プロモータ(LP1)の制御下に置かれ、PRV gIII (gpC) 遺伝子は合成後期プロモーター(EP1LP2)の制御下に置かれる。
【０１７２】
S-SPV-012は、S-SPV-001(Kasza株）から誘導された。これは「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」(HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV）において、相同性ベクター570ー91.41（「材料及び方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」(SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS)）に従ってスクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、SーSPV-012と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスをβガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路よって分析された。精製を最初の三回行った後、観察された全てのプラークは青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現していることを示している。
【０１７３】
S-SPV-012は、ＰＲＶ特異的抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現のためのブラックプラークスクリーン」（BLACK PLAQUE SCREEN FOR FOREIGN GENE EXPRESSION IN RECOMBINANT SPV) を使用して分析された。ポリクローナルヤギ抗PRV-gIII (gpC) 抗体は、S-SPV-012プラークと特異的に反応するが、S-SPV-001陰性対照プラークとは反応しない事がわかった。プラークの観察された全てのS-SPV-012が、ブタの抗ＰＲＶ血清と反応したことは、ウイルスが安定的に、ＰＲＶ外来遺伝子を発現している事を示している。ここに記載した分析はEMSK細胞及びVERO細胞で実施され、EMSK細胞が、ＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した基質である事がわかった。
【０１７４】
PRV gIII(gpC)遺伝子生産物の発現を確認するために、細胞にS-SPV-012を感染させ、被感染細胞溶融物サンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットして「ウエスタンブロット法」を使用して分析した。ポリクローナルヤギ抗PRV gIII (gpC) 抗体を使用して、ＰＲＶ特異的タンパクの発現を検出した。図６に示すように、S-SPVー012に感染した細胞からの溶融物は、PRV gIII (gpC) 報告されているサイズの９２ｋｄ(成熟型)及び７４ｋｄ(前ゴルジ型)の二つの特異的バンドを示した。
【０１７５】
組換え体によって発現されたPRV gIII (gpC)は、マウス及びブタにおいて顕著な免疫反応を誘発する事がわかった(37, 38)。更に、gIII (gpC) は、gII (gpB) およびg50 (gpD) とともに発現し、伝染性ＰＲＶの感作からの顕著な防御をなし得た(39)。それ故、S-SPV-012は、ＰＲＶ病に対してブタを保護するワクチンとして貴重であろう。ここに記載した該ＰＲＶワクチンは、PRV gpX または gpIを発現しないので、被感染動物からワクチン感作された動物を区別するために利用される現行のＰＲＶ診断テスト(gX HerdChek, gI HerdChek 及び ClinEase)に適合するであろう。
【０１７６】
実施例６
S-SPV-013
S-SPV-013 は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ(lacZ)の遺伝子及び偽狂犬病ウイルスgIII(gpC) の遺伝子を、相同ベクター570-33.32の特徴的なPstI 制限部位（特徴的なAccI部位に挿入されたPstIリンカー）に挿入した。lacZ 遺伝子は、合成後期プロモータ(LP1)の制御下に置かれ、PRV gIII (gpC) 遺伝子は合成後期/初期プロモーター(LP2EP2)の制御下に置かれる。
【０１７７】
S-SPV-013は、S-SPV-001(Kasza株）から誘導された。これは「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」(HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV）において、相同性ベクター570ー91.64（「材料及び方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」(SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS)）に従ってスクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、SーSPV-013と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスは、βガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路よって分析された。精製を最初の三回行った後、観察された全てのプラークは青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現していることを示している。
【０１７８】
S-SPV-013は、ＰＲＶ特異的抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現のためのブラックプラークスクリーン」（BLACK PLAQUE SCREEN FOR FOREIGN GENE EXPRESSION IN RECOMBINANT SPV) を使用して分析された。ポリクローナルヤギ抗PRV gIII (gpC) 抗体は、S-SPV-013プラークと特異的に反応するが、S-SPV-001陰性対照プラークとは反応しない事がわかった。プラークの観察された全てのS-SPV-013が、ブタの抗ＰＲＶ血清と反応したことは、ウイルスが安定的に、ＰＲＶ外来遺伝子を発現している事を示している。ここの記載した分析はEMSK細胞及びVERO細胞で実施され、EMSK細胞が、ＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した基質である事がわかった。
【０１７９】
PRV gIII(gpC)遺伝子生産物の発現を確認するために、細胞にＳＰＶを感染させ、被感染細胞溶融物サンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットして「ウエスタンブロット法」を使用して分析した。ポリクローナルヤギ抗PRV gIII (gpC) 抗体を使用して、ＰＲＶ特異的タンパクの発現を検出した。図１６に示すように、S-SPVー013に感染した細胞からの溶融物は、PRV gIII (gpC (37) の報じられているサイズである９２ｋｄ（成熟型）及び７４ｋｄ（前ゴルジ型）の二つの特異的バンドを示した。
【０１８０】
組換え体により発現されたPRV gIII (gpC)は、マウス及びブタにおいて顕著な免疫反応を誘導する事がわかった(37, 38)。更に、gIII (gpC) は、gII (gpB) およびg50 (gpD) とともに発現し、伝染性ＰＲＶによる感作を顕著に防御でき(39)、それ故、S-SPV-013は、ＰＲＶ病に対してブタを保護するワクチンとして貴重となろう。ここに記載した該ＰＲＶワクチンは、PRV gpX 及び gpIを発現しないので、被感染動物からワクチン感作された動物を区別するために利用される現行のＰＲＶ診断テスト(gX HerdChek, gI HerdChek 及び ClinEase)に適合するであろう。S-SPV-013は、ＡＴＣＣに、認可番号 で寄託されている。
【０１８１】
組換え豚ポックスウイルスワクチンS-SPV-008 
および S-SPV-013を使用するオージェスキー
（Aujeszky's )病の予防
【０１８２】
S-SPV-008 およびS-SPV-013（1-10６PFU／ml）（二つのウイルス１：１の混合物2 ml）を含むワクチンを二つの豚の群（一群五匹）に皮内接種または口腔／咽頭噴霧にて投与した。対照群の五匹の豚は、S-SPV-001 の皮内及び口腔／咽頭接種を受けた。豚は、ワクチン投与後３週間して、鼻腔内接種による伝染性PRV4892株の感作を受けた。表は、臨床反応の要約を示す。S-SPV-001ワクチンによる感作による対照群に比べて、S-SPV-008 およびS-SPV-013のワクチン投与体におけるオージェスキー病に対する防御性が向上する事がデーターによって裏付けられる。
【表１】
2006238887.tif 000002
【０１８３】
実施例７
S-SPV-015
S-SPV-015 は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ(lacZ)の遺伝子及び偽狂犬病ウイルスPRV gII (gpB) の遺伝子を、相同ベクター617-48.1 ORF（特徴的なAccI制限部位に置換されたNotI制限部位）に挿入した。lacZ 遺伝子は、合成後期プロモータ(LP1)の制御下に置かれ、PRV gB 遺伝子は合成後期/初期プロモーター(LP2EP2)の制御下に置かれる。
【０１８４】
S-SPV-015は、S-SPV-001(Kasza株）から誘導された。これは「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」(HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV）において、相同性ベクター727-54.60（「材料と方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」(SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS)）に従ってスクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、SーSPV-0151と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスをβガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路よって分析された。精製を最初の三回行った後、観察された全てのプラークは青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現していることを示している。
【０１８５】
S-SPV-015は、ＰＲＶ特異的抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現のためのブラックプラークスクリーン」（BLACK PLAQUE SCREEN FOR FOREIGN GENE EXPRESSION IN RECOMBINANT SPV) を使用して分析された。ポリクローナルブタ抗ＰＲＶ血清は、S-SPV-015プラークと特異的に反応するが、S-SPV-001陰性対照プラークとは反応しない事がわかった。プラークの観察された全てのS-SPV-015が、抗血清と反応したことは、ウイルスが安定的に、ＰＲＶ外来遺伝子を発現している事を示している。この分析は、ESK-04 細胞で実施され、ESK-4 細胞が、ＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した基質である事を示した。
【０１８６】
PRV gIII遺伝子生産物の発現を確認するために、細胞にS-SPV-015を感染させ、被感染細胞溶融物サンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットして「ウエスタンブロット法」を使用して分析した。ポリクローナル・ブタ抗ＰＲＶ血清を使用して、ＰＲＶ特異的タンパクの発現を検出した。S-SPVー015に感染した細胞からの溶融物は、PRV gII糖タンパクの 予想サイズである120 kd, 67 kd および 58 kdに対応したバンドを示した。
【０１８７】
S-SPV-015は、偽狂犬病ウイルスに対するブタのワクチンとして有用である。ブタにおける偽狂犬病を防御する為の優れたワクチンが、S-SPV-008 (PRV-g50)、S-SPV-013（PRV gIII)  およびS-SPV-015 を組み合わせる事により作成される。
【０１８８】
それ故、S-SPV-015は、ＰＲＶ病に対してブタを保護するワクチンとして貴重であろう。ここに記載した該ＰＲＶワクチンは、PRV gpX 及び gpIを発現しないので、被感染動物からワクチン感作された動物を区別するために利用される現行のＰＲＶ診断テスト(gX HerdChek, gI HerdChek 及び ClinEase)に適合するであろう。S-SPV-015は、ＡＴＣＣに、認可番号 で寄託されている。
【０１８９】
実施例８
ＰＲＶ糖タンパクのうちただ一つだけを発現する組換えブタポックスウイルスを使用することによって得られる対ＰＲＶ感染防御能よりも優れた防御能を持つ組換えブタポックスウイルスを得る為に、狂犬病ウイルスに対する中和抗体の生産を誘発できる、偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）糖タンパクを一つ以上発現する組換えブタポックスウイルスを構築する。
【０１９０】
図１Ａおよび１Ｂ：
ＰＲＶ糖タンパクを一つ以上発現するこのような組換えブタポックスウイルスには、いくつかの例がある。たとえば、PRV g50 (gpD) およびgIII (gpC)を発現する組換えブタポックスウイルス、PRV g50 (gpD) および PRV gII (gpB)を発現する組換えブタポックスウイルス, gII (gpB)およびgIII (gpC)を発現する組換えブタポックスウイルス, PRV g50 (gpD), gIII (gpC) および gII (gpB) を発現する組換えブタポックスウイルスがある。上記に引用したウイルスの各々はまた、組換えブタポックスウイルスのクローニングを促進する大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ)遺伝子を含み、発現するように工作されている。
【０１９１】
下記に掲載したのは、PRV g50 (gpD), gIII (gpC)およびgII (gpB)及び大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ)を発現する組換えブタポックスウイルスの三つの例である。
【０１９２】
ａ）PRV g50 (gpD)遺伝子, PRV gIII (gpC)遺伝子、PRV gII (gpB)遺伝子及びlacZ遺伝子を含み、発現する組換えブタポックスウイルス。４つの全ての遺伝子は、ブタポックスウイルスのゲノムのHind III M フラグメント内の特徴的なAccI制限エンドヌークリエース部位に挿入される。PRV g50 (gpD) 遺伝子は合成初期/後期プロモータ（EP1LP2)制御下に、PRV gIII (gpC)遺伝子は、合成初期プロモータ（EP2)制御下に、PRV gII(gpB)遺伝子は、合成後期/初期プロモータ（LP2EP2)制御下に、lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ(LP1)の制御下に置かれる。
【０１９３】
b）PRV g50 (gpD)遺伝子、 PRV gIII (gpC)遺伝子、およびPRV gII (gpB)遺伝子及びlacZ)遺伝子を含み、発現する組換えブタポックスウイルス。４つの全ての遺伝子は、ブタポックスウイルスのゲノムのHind III M フラグメント内の特徴的なAccI制限エンドヌークリエース部位に挿入される。PRV g50 (gpD) 遺伝子は合成初期/後期プロモータ（EP1LP2)制御下に置かれる。PRV gIII (gpC)遺伝子は、合成初期/後期プロモータ（EP1LP2)制御下に置かれる。PRV gII (gpB)遺伝子は合成後期/初期プロモータ（LP2EP2)制御下に, lacZ遺伝子は合成後期プロモータ(LP1)の制御下に置かれる。
【０１９４】
c）PRV g50 (gpD)遺伝子、 PRV gIII (gpC)遺伝子、およびPRV gII (gpB)遺伝子及びlacZ遺伝子を含み、発現する組換えブタポックスウイルス。４つの全ての遺伝子は、ブタポックスウイルスのゲノムのHind III M フラグメント内の特徴的なAccI制限エンドヌークリエース部位に挿入される。PRV g50 (gpD) 遺伝子は合成初期/後期プロモータ（EP1LP2)制御下に, PRV gIII (gpC)遺伝子は、合成後期/初期プロモータ（LP2EP2)制御下に, PRV gII (gpB)遺伝子は合成後期/初期プロモータ（LP2EP2)制御下に, およびlacZ遺伝子は、合成後期プロモータ(LP1)の制御下に置かれる。
【０１９５】
実施例９
S-SPV-009
S-SPV-009 は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ(lacZ)の遺伝子及びニューカッスル病ウイルス)血球凝集素(HN)遺伝子をSPV515-85.1 ORF ベクターに挿入した。lacZ 遺伝子は、合成後期プロモータ(LP1)の制御下に置かれ、HN 遺伝子は合成初期/後期プロモーター(EP1LP2)の制御下に置かれる。
【０１９６】
S-SPV-009は、S-SPV-001(Kasza株）から誘導された。これは「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」(HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV）において、相同性ベクター538ー46.26（「材料及び方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」(SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS)）に従ってスクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、SーSPV-009と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスをβガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路よって分析された。精製を最初の三回行った後、観察された全てのプラークは青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現していることを示している。
【０１９７】
S-SPV-009は、ＰＲＶ特異的抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現のためのブラックプラークスクリーン」（BLACK PLAQUE SCREEN FOR FOREIGN GENE EXPRESSION IN RECOMBINANT SPV) を使用して分析された。ラビット抗NDV HN血清は、S-SPV-009プラークと特異的に反応するが、S-SPV-008陰性対照プラークとは反応しない事がわかった。プラークの観察された全てのS-SPV-009が、ブタの抗ＰＲＶ血清と反応したことは、ウイルスが安定的に、ＮＤＶ外来遺伝子を発現している事を示している。S-SPV-009は、ＡＴＣＣに、認可番号VR 2344で寄託されている。
【０１９８】
NDV HN 遺伝子生産物の発現を確認するために、細胞にＳＰＶを感染させ、被感染細胞溶融物サンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットして「ウエスタンブロット法」を使用して分析した。ラビット抗NDV HN血清を使用して、ＨＮタンパクの発現を検出した。S-SPVー009に感染した細胞からの溶融物は、NDV HN の報じられているサイズの約７４ｋｄの特異的バンドを示した(29)。
【０１９９】
実施例１０
S-SPV-014
S-SPV-014 は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ(lacZ)の遺伝子及び感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク G (ILT gpG)の遺伝子をSPV 570-33.32 ORF (特異的PstI部位が、AccI部位と置き変わっている）に挿入した。lacZ 遺伝子は、合成後期プロモータ(LP1)の制御下に置かれ、ILT gpG 遺伝子は合成初期/後期プロモーター(EP1LP2)の制御下に置かれる。
【０２００】
S-SPV-014は、S-SPV-001(Kasza株）から誘導された。これは「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」(HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV）において、相同性ベクター599ー65.25（「材料及び方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」(SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS)）によってスクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、SーSPV-014と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスをβガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路よって分析した。精製を最初の三回行った後、観察された全てのプラークは青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現していることを示している。ここに記載した分析は、ESK-4細胞にて行われ、ESK-4細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した基質であることがわかった。
【０２０１】
ILT gpG 遺伝子生産物の発現を確認するために、細胞にSPV-014を感染させ、被感染細胞溶融物サンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットして「ウエスタンブロット法」を使用して分析した。ILT gpG に対するペプチド抗血清を使用して、ILT特異的タンパクの発現を検出した。S-SPVー014に感染した細胞からの溶融物は、ILT gpG の予想サイズである約４３ｋｄにバンドを示し、更に、ILT gpGの欠失変異では存在しないタンパクの糖化した型を示す高分子のバンドを示した。
【０２０２】
該ウイルスは、ILT糖タンパクＧ(gpG)を発現するための発現ベクターとして使用される。このようなILT gpGは、gpG欠失ILTウイルスに対して向けられる抗体とは反対に、野生型ILT ウイルスに対して向けられる抗体を確認するための抗原として使用される。該ウイルスはまた、ILT gpG  特異的モノクローナル抗体の生産用抗原として使用される。このような抗体は、ILT gpGタンパクに特異的な診断テストの開発に有用である。モノクローナル抗体は、該ウイルスを使用して、「診断に使用されるウイルス性糖タンパクの作製方法」（PROCEDURE FOR PURIFICATION OF VIRAL GLYCOPROTEINS FOR USE AS DIAGNOSTICS)（材料及び方法）に従ってマウス中で生成される。 
【０２０３】
実施例１１
S-SPV-016
S-SPV-016 は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ(lacZ)の遺伝子及び感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパクI (ILT gpI)の遺伝子をSPV 617-48.1 ORF (特異的NotI制限部位が特異的AccI部位に置き変わっている）に挿入した。lacZ 遺伝子は、合成後期プロモータ(LP1)の制御下に置かれ、ILT gpI 遺伝子は合成後期/初期プロモーター(LP2EP2)の制御下に置かれる。
【０２０４】
S-SPV-016は、S-SPV-001(Kasza株）から誘導された。これは「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」(HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV）において、相同性ベクター624ー20.1C（「材料と方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」(SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS)）によってスクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、SーSPV-016と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスをβガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について,「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路よって分析した。精製を最初の三回行った後、観察された全てのプラークは青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現していることを示している。
【０２０５】
S-SPV-016は、ILT gpI及びβガラクトシダーゼ特異的抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現のためのブラックプラークスクリーン」（BLACK PLAQUE SCREEN FOR FOREIGN GENE EXPRESSION IN RECOMBINANT SPV) を使用して、分析された。ポリクローナルチキン抗ILT抗体は、S-SPV-016プラークと特異的に反応するが、S-SPV-017陰性対照プラークとは反応しない事がわかった。プラークの観察された全てのS-SPV-016が、チキン抗血清と反応したことは、ウイルスが安定的に、ILT外来遺伝子を発現している事を示している。ここに記載した分析は、ESK-4細胞にて行われ、ESK-4細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した基質であることがわかった。
【０２０６】
ILT gpI 遺伝子生産物の発現を確認するために、細胞にSPV-016を感染させ、被感染細胞溶融物サンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットして「ウエスタンブロット法」を使用して分析した。ポリクローナルチキン抗ILT 抗体を使用して、ILT特異的タンパクの発現を検出した。S-SPVー016に感染した細胞からの溶融物は、抗ILT抗体 と反応性のある40 - 200 kd にバンド領域を示し、更に、ILT gpIが重篤に修飾されている可能性を示している。
【０２０７】
該ウイルスは、ILT糖タンパクＩ(gpI)を発現するための発現ベクターとして使される。このようなILT gpIは、gpI欠失ILTウイルスに対して向けられる抗体とは反対に、野生型ILT ウイルスに対して向けられる抗体を確認するための抗原としても使用される。該ウイルスは、またILT gpI特異的モノクローナル抗体の生産用抗原として使用される。このような抗体は、ILT gpGタンパクに特異的な診断テストを開発するために有用である。モノクローナル抗体は、該ウイルスを使用して、「診断に使用されるウイルス性糖タンパクの作製方法」（PROCEDURE FOR PURIFICATION OF VIRAL GLYCOPROTEINS FOR USE AS DIAGNOSTICS)（「材料及び方法」）に従ってマウス中で生成される。
【０２０８】
実施例１２
S-SPV-017
S-SPV-017 は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ(lacZ)の遺伝子及び感染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖タンパクG(IBR gpG)の遺伝子をSPV 617-48.1 ORF (特異的NotI制限部位が、特異的AccI部位に置き変わっている）に挿入した。lacZ 遺伝子は、合成後期プロモータ(LP1)の制御下に置かれ、IBR gpG 遺伝子は合成後期/初期プロモーター(LP2EP2)の制御下に置かれる。
【０２０９】
S-SPV-017は、S-SPV-001(Kasza株）から誘導された。これは「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」(HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV）において、相同性ベクター614ー83.18（「材料及び方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」(SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS)）によってスクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、SーSPV-017と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスをβガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について,「材料及び方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路よって分析した。精製を最初の三回行った後、観察された全てのプラークは青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現していることを示している。
【０２１０】
S-SPV-017は、IBR 特異的抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現のためのブラックプラークスクリーン」（BLACK PLAQUE SCREEN FOR FOREIGN GENE EXPRESSION IN RECOMBINANT ＳＰＶ) を使用して分析された。モノクローナル抗体及びIBR gpGに対するペプチド抗血清は、S-SPV-017プラークと特異的に反応したが、S-SPV-016陰性対照プラークとは反応しなかった。プラークの観察された全てのS-SPV-017が、抗血清と反応したことは、ウイルスが安定的に、IBR外来遺伝子を発現している事を示している。ここに記載した分析は、ESK-4細胞にて行われ、ESK-4細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した基質であることがわかった。
【０２１１】
IBR gpG 遺伝子生産物の発現を確認するために、細胞にSPV-017を感染させ、被感染細胞溶融物サンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットして「ウエスタンブロット法」を使用して分析した。IBR gpG に対する抗血清を使用して、IBR特異的タンパクの発現を検出した。S-SPVー017に感染した細胞からの溶融物は、IBR gpG タンパクの予想サイズである約４３ｋｄにバンドを示し、更に、IBR gpGの欠失変異では存在しないタンパクの糖化した型である高分子のバンドを示した。
【０２１２】
該ウイルスは、IBR糖タンパクＧ (gpG) を発現するための発現ベクターとして使用される。このようなIBR gpGは、gpG欠失IBRウイルスに対して向けられる抗体とは反対に、野生型IBR ウイルスに対して向けられる抗体を確認するための抗原として使用される。該ウイルスは、またIBR gpG特異的モノクローナル抗体の生産用抗原としても使用される。このような抗体は、IBR gpGタンパクに特異的な診断テストを開発するために有用である。モノクローナル抗体は、該ウイルスを使用して、「診断に使用されるウイルス性糖タンパクの作製方法」（PROCEDURE FOR PURIFICATION OF VIRAL GLYCOPROTEINS FOR USE AS DIAGNOSTICS)（「材料及び方法」）に従ってマウス中で生成される。
【０２１３】
実施例１３
S-SPV-019
S-SPV-019 は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ(lacZ)の遺伝子及び感染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖タンパク (IBRV) gEの遺伝子をSPV 617-48.1 ORF (特異的NotI制限部位が、特異的AccI部位に置き変わっている）に挿入した。lacZ 遺伝子は、合成後期プロモータ(LP1)の制御下に置かれ、(IBRV) gE 遺伝子は合成後期/初期プロモーター(LP2EP2)の制御下に置かれる。
【０２１４】
S-SPV-019は、S-SPV-001(Kasza株）から誘導された。これは「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」(HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV）において、相同性ベクター708ー78.9（[材料及び方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」(SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS)）によってスクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、SーSPV-019と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスをβガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について,「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路よって分析した。精製を最初の三回行った後、観察された全てのプラークは青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現していることを示している。
【０２１５】
該ウイルスは、IBR糖タンパクE (gpE) を発現するための発現ベクターとして使される。このような(IBR) gpEは、gpE欠失IBRウイルスに対して向けられる抗体とは反対に、野生型IBR ウイルスに対して向けられる抗体を確認するための抗原として使用される。該ウイルスは、またIBR gpE特異的モノクローナル抗体の生産用抗原として使用される。モノクローナル抗体は、IBR gpE タンパクに特異的な診断テストを開発するために有用である。このうな抗体は、該ウイルスを使用して、「診断に使用されるウイルス性糖タンパクの作製方法」（PROCEDURE FOR PURIFICATION OF VIRAL GLYCOPROTEINS FOR USE AS DIAGNOSTICS)（「材料及び方法）に従ってマウス中で生成される。
【０２１６】
実施例１４
S-SPV-018
S-SPV-018 は、少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ(lacZ)の遺伝子及び偽狂犬病ウイルス糖タンパク E(ＰＲＶ gpE)の遺伝子をSPV 570-33.32 ORF (特異的PstI制限部位が、特異的AccI部位に置き変わっている）に挿入した。lacZ 遺伝子は、合成後期プロモータ(LP1)の制御下に置かれ、PRV gpE 遺伝子は合成初期/後期プロモーター(EP1LP2)の制御下に置かれる。
【０２１７】
S-SPV-018は、S-SPV-001(Kasza株）から誘導された。これは「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」(HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV）において、最終的な相同性ベクターとウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」(SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS)）によってスクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、SーSPV-018と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスをβガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について,「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路よって分析した。精製を最初の三回行った後、観察された全てのプラークは青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現していることを示している。
【０２１８】
該ウイルスは、ＰＶＲ糖タンパクE (gpE) を発現するための発現ベクターとして使される。このようなPRV gpEは、gpE欠失ＰＲＶウイルスに対して向けられる抗体とは反対に、野生型ＰＲＶ ウイルスに対して向けられる抗体を確認するための抗原としても使用される。該ウイルスは、またPRV gpE特異的モノクローナル抗体の生産用抗原として使用される。このような抗体は、PRV gpEタンパクに特異的な診断テストを開発するために有用である。モノクローナル抗体は、該ウイルスを使用して、「診断に使用されるウイルス性糖タンパクの作製方法」（PROCEDURE FOR PURIFICATION OF VIRAL GLYCOPROTEINS FOR USE AS DIAGNOSTICS)（「材料及び方法」）に従ってマウス中で生成される。 
【０２１９】
実施例１５
相同ベクター520-90.15  
相同ベクター520-90.15は、外来ＤＮＡをＳＰＶに挿入するために有用なプラスミドである。プラスミド520-90.15は、外来ＤＮＡがクローン化される特徴的なNdeI制限部位を含んでいる。該外来ＤＮＡを含むＳＰＶを作製するために、このような外来ＤＮＡ挿入物を含むプラスミドが、「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」(HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV）に従って使用されてきた。この手法を成功させるためには、挿入部位が、ＳＰＶの複製に不可欠ではない領域にあることが重要であり、また、該挿入部位が、ウイルスとプラスミドＤＮＡの間の相同組換えを行なうに適切なブタポックスウイルスＤＮＡに隣接することが重要である。プラスミド520-90.15中の特徴的なNdeI制限部位は、ＳＰＶチミジンキナーゼ遺伝子のコード領域内に位置している(32)。それ故、ブタポックスのチミジンキナーゼ遺伝子はＤＮＡ複製に不可欠ではく、適切な挿入部位であることを我々は実証している。
【０２２０】
実施例１６
S-PRV-010 
S-PRV-010は、外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ遺伝子）をチミジンキナーゼ遺伝子内の特徴的なNedI 制限部位に挿入する。外来遺伝子(lacZ) を合成後期プロモータ（LP1) の制御下におく。
【０２２１】
我々は、ブタポックスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子が、ウイルスの複製に不可欠ではなく、適切な挿入部位であることを示した。
【０２２２】
HindIII G フラグメントよりサブクローンされた1739塩基対のHindIII-BamHIフラグメントは、ブタポックスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を含み、相同ベクター520-90.15と呼称される。該相同ベクター520-90.15は、NdeIで消化され、AscIリンカーはチミジンキナーゼ遺伝子内のこの特徴的な部位に挿入された。AscIリンカーを持つLP1プロモーターlacZカセットをチミジンキナーゼ遺伝子内のAscI部位に連携した。該組換え相同ベクター561-36.26をウイルスS-SPV-001とともに、「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」(HOMOLOGOUS RECOMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV）によって、共トランスフェクトし、βガラクシダーゼを発現するウイルスプラーク を、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」(SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRESSISNG  βGALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS))によって選択した。青及び赤プラークを精製して最終的に、SーSPV-010と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスをβガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路によって分析した。精製を最初の三回行った後、観察された全てのプラークは青で、ウイルスが純粋で、安定で、外来の遺伝子を発現していることを示している。ここに記載した分析は、ESK-4細胞にて行われ、ESK-4細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した基質であることがわかった。
【０２２３】
実施例１７
種々の疾病を引き起こす微生物に由来する抗原を発現するブタポックスウイルスを利用したワクチンは、工学的に開発することが可能である。
【０２２４】
＜感染性胃腸炎ウイルス＞
ブタポックスウイルスベクターに使用される感染性胃腸炎ウイルス(TGE)の主要中和抗原である糖タンパク195がクローンされている。中和抗原のクローンは、1987 年7月 27日に提出された合衆国特許出願第078,519号に開示されている。SPV 中でPRV g50 (gpD)を発現する為に使用されてきた手法で、ここに開示されている手法が、ＴＧＥに応用できるのではないかと考えられている。
【０２２５】
＜ブタ(PORCINE)のパルボウイルス＞
我々は、ブタポックスウイルスベクターに使用されるブタ・パルボウイルス(PPV)の主要キャプシドタンパクをクローンした。キャプシドタンパクのクローンは、1991年11月26日に発行された合衆国特許第5,068,192号に開示されている。SPV 中でPRV g50 (gpD)を発現する為に使用されてきており、且つここに開示されている手法が、PPVに応用できると考えられる。
【０２２６】
＜ブタ(SWINE)ロタウイルス＞
我々は、ブタポックスウイルスベクターに使用されるブタ・ロタウイルスの主要中和抗原である糖タンパク38をクローンした。糖タンパク38のクローンは、1991年11月26日に発行された合衆国特許第5,068,192号に開示されている。SPV 中でPRV g50 (gpD)を発現する為に使用されてきており、且つここに開示されている手法が、SRVに応用できると考えられる。
【０２２７】
＜ブタ(HOG)コレラウイルス＞
ウシのウイルス性下痢(BVD)の主要中和抗原は、1988年7月27日に提出された合衆国特許出願第225,032号に開示されているようにクローンした。BVD及びブタ（HOG)コレラウイルスは、交差反応性であり(31)、BVDウイルス抗原は、ブタポックスウイルスベクターに使用される事を目的としている。SPV 中でPRV g50 (gpD)を発現する為に使用されてきており、且つここに開示されている手法が、BVDに応用できると考えられる。
【０２２８】
＜セルピュリナ  ヒョダイセンテリア
(SERPURINA HYODYSENTERIAE) ＞
ブタポックスウイルスベクターに使用されるセルピュリナ  ヒョダイセンテリア(SERPURINA HYODYSENTERIAE)防御性抗原 をクローンした。SPV 中でPRV g50 (gpD)を発現する為に使用されてきており、且つここに開示されている手法が、セルピュリナ  ヒョダイセンテリア(SERPURINA HYODYSENTERIAE）に応用できると考えられる。
【０２２９】
下記の微生物由来の抗原も、動物ワクチンを開発するために利用され得る：ブタインフルエンザウイルス、手足病ウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、ブタ(HOG)コレラウイルス、マイコプラズマハイポニュモニア(Mysoplasma hyopneumoniae),ブタ（porcine)複製及び呼吸器シンドローム/ブタ不妊および呼吸器シンドローム(PRRS/SIRS)。
【０２３０】
下記の微生物由来の抗原も、動物ワクチンを開発するために利用され得る：ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫欠損ウイルス、ネコ・ヘルペルウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、イヌヘルペスウイルス、イヌコロナウイルス、イヌパルボウイルス、動物における寄生性疾病（犬猫におけるイヌ糸状虫を含む）、ウマ伝染性貧血症、ストレプトコッカス・エキュイ、コクシジア、エメリア、チキン貧血症ウイル、ボッレリア・バーグドレフェリ（Borrelia bergdorferi)、ウシコロナウイルス、パスチュレア、ヘモリテイカ。
【０２３１】
実施例１８
組換えブタポックスウイルスは、ウマ・インフルエンザウイルス  タイプA/Alaska 91, ウマ・インフルエンザウイルス・タイプA/プラーク56、ウマインフルエンザウイルス  タイプ1 gB または、ウマインフルエンザウイルス  タイプ1 gD遺伝子を発現する。S-SPV-033 及びS-SPV-034は、ウマ・インフルエンザ感染に対するワクチンとして有用であり、S-SPV-038 及びS-SPV-039は、ウマ鼻気管炎およびウマの堕胎を引き起こすウマ・ヘルペスウイルス感染に対するワクチンとして有用である。これらのウマ・インフルエンザ抗原およびウマ・ヘルペス抗原は、動物において防御的免疫反応を惹起する鍵である。組換えウイルスは単独または有効なワクチンと組み合わせて使用される。ブタポックスウイルスは、本疾病において、急速に進化する変異体に対しての防御をするために、ウマ・インフルエンザウイルス(EIVA/Miami/63 及びEIVA/Kentucky/81を含む）の他のサブタイプをクローニングするに有用である。S-SPV-033, S-SPV-034, S-SPV-038, 及びS-SPV-039もまた、ウマ・インフルエンザ抗原またはウマ・ヘルペス抗原を発現する発現ベクターとして有用である。このようなウマ・インフルエンザ抗原またはウマ・ヘルペス抗原は、野生型ウマ・インフルエンザウイルスまたはウマ・ヘルペスウイルス対して向けられる抗体を確認するに有用である。これらのウイルスは、モノスペシフィックなポリクローナル抗体またモノクローナル抗体を産生するための抗原を生成するにも有用である。このような抗体は、ウイルス性タンパクに特異的な診断試験の開発に有用である。モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、これらのウイルスを使用して「診断用に使用されるウイルス性糖タンパクの精製方法」（PROCEDURE FOR PURIFICATION OF VIRAL GLYCOPROTEINS FOR USE AS DIAGNOSTIC (Material and Methods)に従ってマウス中で生成される。
【０２３２】
実施例１８Ａ
S-SPV-033
S-SPV-033は少なくとも二つの外来遺伝子を発現する組換えブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ)の遺伝子及びウマ・インフルエンザウイルスタイプA/Alaska 91ノイラミダーゼの遺伝子をSPV617-48.1 ORF (特徴的なNotI制限部位が特徴的なAccI制限部位と置き変わっている）に挿入された。該lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1)のコントロール下に置かれ、EIVAK/91 NA遺伝子は、合成後期/初期プロモータ(LP2EP2)のコントロール下に置かれている。
【０２３３】
S-SPV-033 は、S-SPV-001 (Kasza 株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」（HOMOLOGOUS COMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV) において、相同性ベクター732-18.4（「材料と方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」（SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS) に従って、スクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、S-SPV-033と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスは、βガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路によって分析された。精製を最初三回行った後、観察された全てのプラークは、青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現している事を示している。
【０２３４】
実施例１８Ｂ
S-SPV-034
S-SPV-034は少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ)の遺伝子及びウマ・インフルエンザウイルスタイプA/Praque 56ノイラミダーゼの遺伝子が、SPV617-48.1 ORF (特徴的なNotI制限部位が特徴的なAccI制限部位と置き変わっている）に挿入された。該lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1)のコントロール下に置かれ、EIV PR/56 NA遺伝子は、合成後期/初期プロモータ(LP2EP2)置かれる。
【０２３５】
S-SPV-034 は、S-SPV-001 (Kasza 株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶ作製の為の相同組換え法」（HOMOLOGOUS COMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV) において、相同性ベクター59A-9.22（「材料と方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」（SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRRESSING β GALACTOSIDASE BLUOGAL AND CPRG ASSAYS) に従って、スクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、S-SPV-034と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスは、βガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路によって分析された。精製を最初の三回行なった後、観察された全てのプラークは、青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現している事を示している。
【０２３６】
S-SPV-034は、EIV特異的抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現の為のブラックプラークスクリーン(BLACK PLAQUE SCREEN FOR FOREIGN GENE EXPRESSION IN RECOMBINANT SPV)を使用して分析された。EIV PR/56 NAに対するモノスペシフィックなポリクローナル抗体は、S-SPV-034プラークと特異的に、反応するが、S-SPV-001陰性対照プラークとは反応しないことがわかった。プラークの観察された全てのS-SPV-034 が抗血清と反応したことは、該ウイルスが安定的にEIV PR/56 NA 遺伝子を発現していることを示している。ここで記載された分析は、ESK-4 細胞で実施され、ESK-4 細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産に適切な基質であることがわかった。
【０２３７】
実施例１８Ｃ
S-SPV-038
S-SPV-038は少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ)の遺伝子及びウマ・ヘルペスウイルス・タイプ1 糖タンパクＢの遺伝子が、SPV617-48.1 ORF (特徴的なNotI制限部位が特徴的なAccI制限部位と置き変わっている）に挿入されている。該lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1)のコントロール下に置かれ、EHV-1 gB遺伝子は、合成後期/初期プロモータ(LP2EP2)置かれる。
【０２３８】
S-SPV-038 は、S-SPV-001 (Kasza 株）から誘導される。これは、「組換えＳＰＶ作製の為の相同組換え法」（HOMOLOGOUS COMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV) において、相同性ベクター744-34（「材料と方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」（SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRRESSING β GALACTOSIDASE BLUOGAL AND CPRG ASSAYS) に従って、スクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、S-SPV-038と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスは、βガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路によって分析された。精製を最初の三回行なった後、観察された全てのプラークは、青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現している事を示している。
【０２３９】
実施例１８Ｄ
S-SPV-039
S-SPV-039は少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ)の遺伝子及びウマ・ヘルペスウイルス・タイプ1 糖タンパクＤの遺伝子が、SPV617-48.1 ORF (特徴的なNotI制限部位が特徴的なAccI制限部位と置き変わっている）に挿入されている。該lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1)のコントロール下に置かれ、EHV-1 gD遺伝子は、合成後期/初期プロモータ(LP2EP2)置かれる。
【０２４０】
S-SPV-039 は、S-SPV-001 (Kasza 株）から誘導される。これは、「組換えＳＰＶ作製の為の相同組換え法」（HOMOLOGOUS COMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV) において、相同性ベクター744-38（「材料と方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」（SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRRESSING β GALACTOSIDASE BLUOGAL AND CPRG ASSAYS) に従って、スクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、S-SPV-039と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスは、βガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路によって分析された。精製を最初の三回行なった後、観察された全てのプラークは、青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現している事を示している。
【０２４１】
実施例１９
組換えブタポックスウイルスは、ウシ呼吸器系合胞体ウイルス付着タンパク（BRSV G), BRSV融合タンパク（BRSV F), BRSV核キャプシドタンパク(BRSV N),  ウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV) gp8、BVDV gp53、 ウシ・パラインフルエンザウイルス・タイプ３(BPI-3)F, またはBPI-3 HNを発現する。S-SPV-020, S-SPV-029, S-SPV-030, およびS-SPV-032、S-SPV-028は、ウシの疾病に対するワクチンとして有用である。これらのBRSV, BVDV, BPI-3抗原は、防御的な免疫反応を惹起する鍵である。組換えウイルスは単独または有効なワクチンと組み合わせて使用される。ブタポックスウイルスは、本疾患において、急速に進化する変異体に対しての防御をするために、BRSV, BVDV, BPI-3の他のサブタイプをクローニングするに有用である。S-SPV-020, S-SPV-019, S-SPV-030, S-SPV-032, S-SPV-028もまた、BRSV, BVDV, およびBPI-3抗原の発現する発現ベクターとして有用である。このようなBRSV, BVDV,およびBPI-3抗原は、野生型BRSV, BVDV, およびBPI-3 に対して向けられる抗体を確認するのに有用である。該ウイルスは、モノスペシフィックなポリクローナル抗体またモノクローナル抗体を産生するための抗原を生成するに有用である。このような抗体は、ウイルスタンパクに特異的な診断試験の開発に有用である。モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、これらのウイルスを使用して「診断用に使用されるウイルス性糖タンパクの精製方法」（PROCEDURE FOR PURIFICATION OF VIRAL GLYCOPROTEINS FOR USE AS DIAGNOSTIC (Material and Methods)を使用してマウス中で生成される。
【０２４２】
実施例１９Ａ
S-SPV-020
S-SPV-020は少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ)の遺伝子及びウシ呼吸器系合胞体ウイルス付着タンパク（BRSV） Gの遺伝子が、SPV617-48.1 ORF (特徴的なNotI制限部位が特徴的なAccI制限部位と置き変わっている）に挿入された。該lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1)のコントロール下に置かれ、BRSV G遺伝子は、合成後期/初期プロモータ(LP2EP2)のコントロール下に置かれる。
【０２４３】
S-SPV-020 は、S-SPV-001 (Kasza 株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」（HOMOLOGOUS COMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV) において、相同性ベクター727-20.5（「材料と方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」（SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS) に従って、スクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、S-SPV-020と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスは、βガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路によって分析された。精製を最初の三回行なった後、観察された全てのプラークは、青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現している事を示している。
【０２４４】
S-SPV-020は、BRSV特異的抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現の為のブラックプラークスクリーン(BLACK PLAQUE SCREEN FOR FOREIGN GENE EXPRESSION IN RECOMBINANT SPV)を使用して分析された。ウシ抗BRSV FITC(Accurate Chemcials)は、S-SPV-020と特異的に反応するが、S-SPV-003陰性対照プラークとは反応しないことがわかった。プラークの観察された全てのS-SPV-020 が抗血清と反応したことは、該ウイルスが安定的にBRSV外来遺伝子を発現していることを示している。ここで記載された分析は、ESK-4 細胞で実施され、ESK-4 細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産に適切な基質であることがわかった。
【０２４５】
BRSV G 遺伝子生産物の発現を確認するために、細胞にS-SPV-020を感染させ、被感染細胞溶融物のサンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットして「ウエスタンブロット法」を使用して分析した。ウシ抗BRSV FITC(Accurate Chemical)を使用して、BRSV特異的タンパクの発現を検出した。
【０２４６】
S-SPV-020に感染した細胞殻の溶融物は、BRSV Gタンパク非グリコシレート型の予想サイズである３６ｋｄにバンドを示し、BRSV Gタンパクグリコシレート型の予想サイズである43-45kd及び80-90にバンドを示した。
【０２４７】
実施例１９Ｂ
S-SPV-029
S-SPV-029は少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ)の遺伝子及びウシ呼吸器系合胞体ウイルス（BRSV） FをSPV617-48.1 ORF (特徴的なNotI制限部位が、特徴的なAccI制限部位と置き変わっている）に挿入された。該lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1)のコントロール下に置かれ、BRSV F 遺伝子は、合成後期/初期プロモータ(LP2EP2)置かれている。
【０２４８】
S-SPV-029 は、S-SPV-001 (Kasza 株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶ作製の為の相同組換え法」（HOMOLOGOUS COMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV) において、相同性ベクター727-20.10(「材料と方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」（SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRRESSING β GALACTOSIDASE BLUOGAL AND CPRG ASSAYS) に従って、スクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、S-SPV-029と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスは、βガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路によって分析された。精製を最初の三回行なった後、観察された全てのプラークは、青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現している事を示している。
【０２４９】
S-SPV-029は、BRSV特異的抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現の為のブラックプラークスクリーン(BLACK PLAQUE SCREEN FOR FOREIGN GENE EXPRESSION IN RECOMBINANT SPV)を使用して分析された。ウシ抗BRSV FITC(Accurate Chemical)は、S-SPV-029プラークと特異的に反応したが、S-SPV-003陰性対照プラークとは反応しないことがわかった。プラークの観察された全てのS-SPV-029 が抗血清と反応したことは、該ウイルスが安定的にBRSV 外来遺伝子を発現していることを示している。ここで記載された分析は、ESK-4 細胞で実施され、ESK-4 細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産に適切な基質であることがわかった。
【０２５０】
実施例１９Ｃ
S-SPV-030
S-SPV-030は少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ)の遺伝子及びウシ呼吸器系合胞体ウイルス（BRSV） Nの遺伝子が、SPV617-48.1 ORF (特徴的なNotI制限部位が特徴的なAccI制限部位と置き変わっている）に挿入された。該lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1)のコントロール下に置かれ、BRSV N 遺伝子は、合成後期/早期プロモータ(LP2EP2)置かれる。
【０２５１】
S-SPV-030 は、S-SPV-001 (Kasza 株）から誘導される。これは、「組換えＳＰＶ作製の為の相同組換え法」（HOMOLOGOUS COMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV) において、相同性ベクター713-55.37（「材料と方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」（SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRRESSING β GALACTOSIDASE BLUOGAL AND CPRG ASSAYS) に従って、スクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、S-SPV-030と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスは、βガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路によって分析された。精製を最初の三回行なった後、観察された全てのプラークは、青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現している事を示している。
【０２５２】
S-SPV-030は、BRSV特異的抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現の為のブラックプラークスクリーン](BLACK PLAQUE SCREEN FOR FOREIGN GENE EXPRESSION IN RECOMBINANT SPV)を使用して分析された。ウシ抗BRSV FITC(Accurate Chemical)は、S-SPV-030プラークと特異的に反応したが, S-SPV-003陰性対照プラークとは反応しないことがわかった。プラークの観察された全てのS-SPV-030 が抗血清と反応したことは、該ウイルスが安定的にBRSV外来遺伝子を発現していることを示している。ここで記載された分析は、ESK-4 細胞で実施され、ESK-4 細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産に適切な基質であることがわかった。
【０２５３】
BRSV N 遺伝子生産物の発現を確認するために、細胞にS-SPV-030を感染させ、被感染細胞溶融物のサンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットして「ウエスタンブロット法」を使用して分析した。ウシ抗BRSV FITC(Accurate Chemical)を使用してBRSV特異的タンパクの発現を検出した。
【０２５４】
S-SPV-030に感染した細胞からの溶融物は、BRSV N タンパクの予想サイズである４３ｋｄにバンドを示した。
【０２５５】
実施例１９Ｄ
S-SPV-028
S-SPV-028は少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ)の遺伝子及びウシ・パラインフルエンザ  ウイルス  タイプ３（BPI-3)Fの遺伝子が、SPV617-48.1 ORF (特徴的なNotI制限部位が特徴的なAccI制限部位と置き変わっている）に挿入された。該lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1)のコントロール下に置かれ、BPI-3F 遺伝子は、合成後期/初期プロモータ(LP2EP2)のコントロール下に置かれる。
【０２５６】
S-SPV-028 は、S-SPV-001 (Kasza 株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」（HOMOLOGOUS COMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV) において、相同性ベクター713-55.10(「材料と方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」（SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS) に従って、スクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、S-SPV-028と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスは、βガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路によって分析された。精製を最初の三回行なった後、観察された全てのプラークは、青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現している事を示している。
【０２５７】
S-SPV-028は、BRI-3特異的抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現の為のブラックプラークスクリーン」(BLACK PLAQUE SCREEN FOR FOREIGN GENE EXPRESSION IN RECOMBINANT SPV)を使用して分析された。ウシ抗BPI-3 FITC(Accurate Chemical)は、S-SPV-028プラークと特異的に反応したが、S-SPV-003陰性対照プラークとは反応しないことがわかった。プラークの観察された全てのS-SPV-028 が抗血清と反応したことは、該ウイルスが安定的にBPI-3外来遺伝子を発現していることを示している。ここで記載された分析は、ESK-4 細胞で実施され、ESK-4 細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産に適切な基質であることがわかった。
【０２５８】
BPI-3 遺伝子生産物の発現を確認するために、細胞にS-SPV-028を感染させ、被感染細胞溶融物のサンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットして「ウエスタンブロット法」を使用して分析した。ウシ抗BPI-3  FITC(Accurate Chemical)を使用してBPI-3特異的タンパクの発現を検出した。
【０２５９】
S-SPV-028に感染した細胞からの溶融物は、BPI-3 Fタンパクの予想サイズである４３および７０ｋｄにバンドを示した。
【０２６０】
実施例１９Ｅ
S-SPV-032
S-SPV-032は少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ)の遺伝子及びウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV)gp48遺伝子が、SPV617-48.1 ORF (特徴的なNotI制限部位が特徴的なAccI制限部位と置き変わっている）に挿入された。該lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1)のコントロール下に置かれ、（BVDV)gp48 遺伝子は、合成後期/初期プロモータ(LP2EP2)のコントロール下に置かれている。
【０２６１】
S-SPV-032 は、S-SPV-001 (Kasza 株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」（HOMOLOGOUS COMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV) において、相同性ベクター727.78.1(「材料と方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」（SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS) に従って、スクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、S-SPV-032と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスは、βガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路によって分析された。精製を最初の三回行なった後、観察された全てのプラークは、青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現している事を示している。
【０２６２】
実施例１９Ｆ
S-SPV-031
S-SPV-031は少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ)の遺伝子及びウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV)gp53遺伝子が、をSPV617-48.1 ORF (特徴的なNotI制限部位が特徴的なAccI制限部位と置き変わっている）に挿入された。該lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1)のコントロール下に置かれ、（BVDV)gp53 遺伝子は、合成後期/初期プロモータ(LP2EP2)のコントロール下に置かれる。
【０２６３】
S-SPV-031 は、S-SPV-001 (Kasza 株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」（HOMOLOGOUS COMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV) において、相同性ベクター738-96(「材料と方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」（SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS) に従って、スクリーンした。赤プラークを精製して最終的に、S-SPV-031と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスは、βガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路によって分析された。精製を最初の三回行なった後、観察された全てのプラークは、青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現している事を示している。
【０２６４】
実施例１９Ｇ
輸送熱ワクチン
輸送熱ワクチンまたはウシ呼吸器系疾病（BRD)症候群は、家畜の伝染性疾病とストレス関連要素が付加的に組み合わさった結果発症する。ストレスの病態生理学的影響によって高められた呼吸器系ウイルスの伝染性は、多くのメカニズムによって、家畜のパスツレァ病原体に対する家畜の感染率を変える。BRDをおこすウイルス性感染を制御する事は、該疾病症候群を予防するのに不可欠である（53)。
【０２６５】
BRDに貢献する主要な伝染病の病原には、伝染性ウシ鼻気管炎ウイルス(IBRV), パラインフルエンザウイルス・タイプ３（PI-3)、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（BRSV)、およびパスツレラ・ヘモリテイカ(53)があるが、これらには限定されない。BRD を引き起こす微生物に対する防御性抗原を発現する組換えブタポックスウイルスは、ワクチして有用である。S-SPV-020, S-SPV-029, S-SPV-030, S-SPV-032及びS-SPV-028は、このようなワクチンの成分として有用である。
【０２６６】
実施例２０
組換えブタウイルスS-SPV-031およびS-SPV-035 は、ヒト疾病に対するワクチンとして有用である。S-SPV-031は、Ｂ型肝炎ウイルスのコア抗原を発現する。S-SPV-031は、ヒトにおけるＢ型肝炎感染に対して有用である。S-SPV-035は、サイトカイン、インターロイキンー２を発現し、ヒトにおいて免疫反応を高める免疫モジュレータとして有用である。S-SPV-031 および S-SPV-035を組み合わせれば、Ｂ型肝炎に対する優れたワクチンが生産される。
【０２６７】
実施例２０Ａ
S-SPV-031
S-SPV-031は少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ)の遺伝子及びＢ型肝炎コア抗原遺伝子が、SPV617-48.1 ORF (特徴的なNotI制限部位が特徴的なAccI制限部位と置き変わっている）に挿入された。該lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1)のコントロール下に置かれ、Ｂ型肝炎抗原遺伝子は、合成初期/後期プロモータ(EP1LP2)のコントロール下に置かれる。
【０２６８】
S-SPV-031 は、S-SPV-001 (Kasza 株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」（HOMOLOGOUS COMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV) において、相同性ベクター727-67.18(「材料と方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」（SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS) に従って、スクリーンした。 赤プラークを精製して最終的に、S-SPV-031と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスは、βガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路によって分析された。精製を最初の三回行なった後、観察された全てのプラークは、青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現している事を示している。
【０２６９】
S-SPV-031は、Ｂ型肝炎コア抗原特異的抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現の為のブラックプラークスクリーン」(BLACK PLAQUE SCREEN FOR FOREIGN GENE EXPRESSION IN RECOMBINANT SPV)を使用して分析された。Ｂ型肝炎コア抗原に対するラビット抗血清は、S-SPV-031 プラークと特異的に反応したが、S-SPV-001陰性対照プラークとは反応しない事がわかった。
【０２７０】
S-SPV-031の全ての観察されたプラークが抗血清と反応したことは、該ウイルスが安定的にＢ型肝炎コア抗原遺伝子を発現していることを示している。ここで記載された分析は、ESK-4 細胞で実施され、ESK-4 細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産に適切な基質であることがわかった。
【０２７１】
Ｂ型肝炎コア抗原遺伝子生産物の発現を確認するために、細胞にSPV-031を感染させ、被感染細胞溶融物のサンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットして「ウエスタンブロット法」を使用して分析した。Ｂ型肝炎コア抗原に対するラビットの抗血清を使用して、Ｂ型肝炎特異的タンパクの発現を検出した。S-SPV-031に感染した細胞からの溶融物は、Ｂ型肝炎コア抗原の予想サイズである２１kdにバンドを示した。 
【０２７２】
実施例２０Ｂ
S-SPV-035
S-SPV-035は少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ)の遺伝子及びヒトIL-2遺伝子が、SPV617-48.1 ORF (特徴的なNotI制限部位が特徴的なAccI制限部位と置き変わっている）に挿入された。該lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1)のコントロール下に置かれ、ヒトIL-2遺伝子は、合成後期/初期プロモータ(LP2EP2)のコントロール下に置かれる。
【０２７３】
S-SPV-035は、S-SPV-001 (Kasza 株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」（HOMOLOGOUS COMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV) において、相同性ベクター741-84.14(「材料と方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」（SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS) に従って、スクリーンした。 赤プラークを精製して最終的に、S-SPV-035と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスは、βガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路によって分析された。精製を最初の三回行なった後、観察された全てのプラークは、青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現している事を示している。
【０２７４】
実施例２１ 
＜ベクターとして組換えブタウイルスを用いた
ヒト・ワクチン＞
組換えブタポックスウイルスは、ヒト疾病に対するワクチンとして有用である。例えば、ヒト・インフルエンザウイルスは、その中和性ウイルスエピトープが急速に変化する進化の迅速なウイルスである。有用な組換えブタポックスワクチンは、ワクチン中のインフルエンザウイルス中和性エピトープが、インフルエンザウイルスの新規株に対して防御するように、組換えＤＮＡ技術によって急速に適応させられるワクチンである。ヒト・インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＮ）及びノイラミダーゼ遺伝子は、「ウマ・インフルエンザウイルス赤血球凝集素及びノイラミダーゼ（NA)遺伝子のクローニング」（EQUINE INFLUENZA VIRUS HEMAGGLUTININ AND NEURAMINIDASE GENES)（「材料と方法」および実施例１７参照）に記載したようにして、ブタポックスウイルス中にクローン化される。
【０２７５】
組換えブタポックスウイルスは、該ブタポックスウイルスベクター中の下記疾病または病原体に由来する外来抗原が発現されれば、他のヒト疾病に対するワクチンとして有用である。前記疾病または病原体には、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原およびコア抗原、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫欠損ウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス-1、単純ヘルペスウイルス-２、ヒト・サイトメガロウイルス、エプスタイン・バー（Epstein -barr)ウイルス, ヴァリセラ・ゾースター（varicella Zoaster）ウイルス, ヒトヘルペスウイルス-6，ヒト・ヘルペスウイルス-7, ヒト・インフルエンザ、麻疹ウイルス、ハンターン（hantaan)・ウイルス,  肺炎ウイルス、鼻気管炎ウイルス、ポリオウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、レトロウイルス、ヒトＴ細胞白血球ウイルス、狂犬病ウイルス、耳下腺炎ウイルス、マラリア・ウイルス（Pasmodium falciparum)、 百日咳,ジフテリア、発疹チフスリッケチア、ヒトライム病菌、破傷風毒素、悪性腫瘍抗原が含まれる。
【０２７６】
更に、S-SPV-035（実施例２０）は、ブタポックスウイルスインターロイキンと組み合わせれば、ヒトにおける免疫反応を高めるために有用である。追加されるサイトカインには、ブタポックスウイルスゲノムの非不可欠部位に導入され、続いて発現されてたときに免疫刺激効果を有する、インターロイキン-2、インターロイキン-6、インターロイキン-12，インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激ファクター、並びにヒトおよび他の動物のインターロイキン受容体が含まれるが、これらのみには限定されない。
【０２７７】
組換えヒトブタポックスウイルスは、ヒト細胞系において外来遺伝子を発現する。我々は、βガラクトシダーゼ活性を測定することによって、S-SPV-003(lacZ遺伝子を発現するEP1LP2プロモータ）が、THPヒト単核細胞系中で lacZ 遺伝子を発現する事を実証した。我々は、THPヒト単核細胞に対するブタポックスウイルスの細胞毒性効果を観察しなかったが、このことは、組換えブタポックスウイルスはヒト細胞系において外来遺伝子を発現できるが、ヒト細胞系において生産的に感染したり、複製することはない事を示している。我々は、ヒトブタポックスウイルスがESK-4細胞（ブタ胎児腎臓）において良好に複製されることを立証したが、このことは、ESK-4細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産に適した基質である事を示している。
【０２７８】
実施例２２Ａ 
ベクターとして、組換えブタポックスウイルスを使用している鳥類のワクチン
S-SPV-026は少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ)の遺伝子及び伝染性包嚢病（bursal disease)ウイルスの遺伝子(IBDV)が、SPV617-48.1 ORF (特徴的なNotI制限部位が特徴的なAccI制限部位と置き変わっている）に挿入された。該lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1)のコントロール下に置かれ、IBDV遺伝子は、合成初期/後期プロモータ(EP1LP2)のコントロール下に置かれる。
【０２７９】
S-SPV-026は、S-SPV-001 (Kasza 株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」（HOMOLOGOUS COMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV) において、相同性ベクター689-50.4 (「材料と方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」（SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS) に従って、スクリーンした。  赤プラークを精製して最終的に、S-SPV-026と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスは、βガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路によって分析された。精製を最初の三回行なった後、観察された全てのプラークは、青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現している事を示している。
【０２８０】
S-SPV-026は、IBDVポリプロテイン特異的抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現の為のブラックプラークスクリーン」(BLACK PLAQUE SCREEN FOR FOREIGN GENE EXPRESSION IN RECOMBINANT SPV)を使用して分析された。IBDVポリプロテインに対するラットの抗血清は、S-SPV-026プラークと特異的に反応したが、S-SPV-001陰性対照プラークとは反応しないことがわかった。S-SPV-026 の全ての観察されたプラークが、抗血清と反応したことは、該ウイルスが安定的にIBDVポリプロテイン遺伝子を発現している事を示めしている。 ここで記載された分析は、ESK-4 細胞で実施され、ESK-4 細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産に適切な基質であることがわかった。
【０２８１】
IBDVポリプロテイン遺伝子生産物の発現を確認するために、細胞にS-SPV-026を感染させ、被感染細胞溶融物のサンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットして「ウエスタンブロット法」を使用して分析した。IBDVタンパクVP2, VP3, 及びVP4に対するラット抗血清及びIBDV VP2に対するモノクローナル抗体R63を使用して, IBDVタンパクの発現を検出した。S-SPV-026に感染した細胞からの溶融物は、IBDVタンパクの予想サイズである３２から４０ｋｄにバンドを示した。
【０２８２】
実施例２２Ｂ
S-SPV-027
S-SPV-027は少なくとも二つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ)の遺伝子及び伝染性包嚢病（bursal disease)ウイルスの遺伝子(IBDV) VP2(40kd)が、SPV617-48.1 ORF (特徴的なNotI制限部位が特徴的なAccI制限部位と置き変わっている）に挿入された。該lacZ遺伝子は、合成後期プロモータ（LP1)のコントロール下に置かれ、IBDV VP2遺伝子は、合成初期/後期プロモータ(EP1LP2)のコントロール下に置かれる。
【０２８３】
S-SPV-027は、S-SPV-001 (Kasza 株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」（HOMOLOGOUS COMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV) において、相同性ベクター689-50.7 (「材料と方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」（SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS) に従って、スクリーンした。  赤プラークを精製して最終的に、S-SPV-027と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスは、βガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路によって分析された。精製を最初の三回行なった後、観察された全てのプラークは、青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現している事を示している。
【０２８４】
S-SPV-027は、IBDV VP2特異的抗原の発現について、「組換えＳＰＶにおける外来遺伝子発現の為のブラックプラークスクリーン」(BLACK PLAQUE SCREEN FOR FOREIGN GENE EXPRESSION IN RECOMBINANT SPV)を使用して分析された。IBDVタンパクに対するラット抗血清は、S-SPV-027プラークと特異的に反応したが、S-SPV-001陰性対照プラークとは反応しないことがわかった。S-SPV-027 の全ての観察されたプラークが、抗血清と反応したことは、該遺伝子が安定的にIBDV VP2  遺伝子を発現している事を示している。 ここで記載された分析は、ESK-4 細胞で実施され、ESK-4 細胞がＳＰＶ組換えワクチンの生産に適切な基質であることがわかった。
【０２８５】
IBDV VP2遺伝子生産物の発現を確認するために、細胞にS-SPV-027を感染させ、被感染細胞溶融物のサンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットして「ウエスタンブロット法」を使用して分析した。IBDVタンパクに対するラット抗血清及びIBDV VP2に対するモノクローナル抗体R63を使用してIBDV VP2特異的タンパクの発現を検出した。S-SPV-027に感染した細胞からの溶融物は、IBDVタンパクの予想サイズである４０ｋｄにバンドを示した。
【０２８６】
S-SPV-026 およびS-SPV-027は、チキンにおける伝染性包嚢病（bursal disease)に対するワクチンとして、また、IBDVタンパクの発現ベクターとしても有用である。組換えブタポックスウイルスは、下記の疾病または病原体由来の外来抗原が、ブタポックスウイルスベクター中で発現された場合、他の鳥類疾病に対するワクチンとして有用である。該疾病または病原体には、マレック病(Marek's disease)ウイルス、伝染性咽頭気管炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス及びチキン貧血病ウイルスガある。
【０２８７】
実施例２３
S-SPV-036
S-SPV-036は一つの外来遺伝子を発現するブタポックスウイルスである。大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ)の遺伝子)が、SPV617-48.1 ORF (特徴的なNotI制限部位が特徴的なAccI制限部位と置き変わっている）に挿入された。該lacZ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス即時型初期プロモータ（HCMC 1E)のコントロール下に置かれている。
【０２８８】
S-SPV-036は、S-SPV-001 (Kasza 株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」（HOMOLOGOUS COMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV) において、相同性ベクター741-80.3 (「材料と方法」参照）とウイルスS-SPV-001を利用する事で完遂された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」（SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS) に従って、スクリーンした。  赤プラークを精製して最終的に、S-SPV-036と呼称される組換えウイルスを得た。このウイルスは、βガラクトシダーゼの発現、純度、挿入安定性について、「材料と方法」に記載したように、青プラーク分析によってモニターされる複数経路によって分析された。精製を最初の三回行なった後、観察された全てのプラークは、青で、これは、ウイルスが純粋で、安定で、外来遺伝子を発現している事を示している。
【０２８９】
HCMV IEプロモータに由来する lacZ が発現されると、ブタポックスにおける外来遺伝子の発現の為の強力なプロモータが提供される。S-SPV-036 は、新規かつ予期せずに実証された、ポックスウイルスにおける外来遺伝子の発現を推進するヘルペスウイルス・プロモータである。S-SPV-036は、ヒトワクチンを作製する際に有用であり、組換えブタポックスウイルスは、ヒト病原由来の中和性抗原の発現のために有用であろう。THPヒト単核細胞系において、S-SPV-003(EP1LP2)(lacZ 遺伝子を発現するプロモータ）によってβガラクトシダーゼが発現されたことによって実証されたように、組換えブタポックスウイルスは、ヒト細胞系において外来遺伝子を発現した。THPヒト単核細胞系において S-SPV-003（lacZ 遺伝子を発現するEP1LP2プロモータ）により発現されたβガラクトシダーゼによって実証されるように、組換えブタポックスウイルスはヒト細胞系において外来遺伝子を発現した。THPヒト単核細胞は、ヒトワクチンとして組換えブタポックスウイルスを生産するのに有用である。ブタポックスウイルスが複製される他の細胞系には、Vero 細胞（モンキー）、ＳＴ細胞（ブタ（swine)精巣）、ＰＫー１５（ブタ（Porcine)腎臓）、及びESK-4細胞（胎児ブタ(swine)腎臓）が含まれるが、これらに限定されることはない。
【０２９０】
実施例２４
相同性ベクター  738-94.5
相同性ベクター738-94.5は、外来遺伝子を一つ発現するブタポックスベクターである。大腸菌βガラクトシダーゼ(lacZ)を発現する遺伝子を、O1Lオープン・レーデイング・フレーム（配列番号第115）中に挿入した。lacZ遺伝子は、O1Lプロモータ中のコントロール下におかれる。  相同ベクター738-94.5は、SPV DNAの欠損部分を含む。該欠損部分は、ヌクレオチド1381〜2133（配列番号第113; 図17)までで、O1L ORFの部分を欠いている。
【０２９１】
ＤＮＡプライマーである 5'-GAAGCATGCCCGTTCTTATCAATAGTTTAGTCGAAAATA-3'(配列番号第185)及び 5'-CATAAGATCTGGCATTGTGTTATTATACTAACAAAAATAAG-3'（配列番号第186)を使用して、ポリメラーゼ・チェインリアクションによって上流のＳＰＶ配列が合成され、BglIII および SphI 末端を有する871塩基対のフラグメントが作製された。O1Lプロモータは、このフラグメント上にある。下流のＳＰＶ配列が、ＤＮＡプライマーである 5'-CCGTAGTCGACAAAGATCGACTTATTAATATGTATGGGATT-3'(配列番号第187)及び 5'-GCCTGAAGCTTCTAGTACAGTATTTACGACTTTTGAAAT-3'(配列番号第188)を用いたポリメラーゼ・チェインリアクションによって合成され、SalI およびHindIII末端を有する 1123塩基対のフラグメントが作製された。組換えブタポックスウイルスは、「組換えＳＰＶを作製するための相同組換え法」（HOMOLOGOUS COMBINATION PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT SPV) において、相同ベクター738-94.5およびS-SPV-001(KASZA株）を利用して誘導された。トランスフェクションストックを、「βガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶのスクリーニング」（THE SCREEN FOR RECOMBINANT SPV EXPRRESSING β GALACTOSIDASE (BLUOGAL AND CPRG ASSAYS) に従って、スクリーンした。  赤プラークを精製して、最終的にS-SPV-036と称される組換えウイルスを得た。このウイルスは、βガラクトシダーゼの発現、純度および挿入安定性について、「材料と方法」に記載したようにして、青プラーク分析でモニターされる複数経路によって分析された。最初の三回の精製を行なった後に観察された全てのプラークは青であり、これはウイルスが純粋かつ安定に外来遺伝子を発現している事を示している。相同ベクター738-94.5から誘導される組換えブタポックスウイルスを発現ベクターに用いて外来抗原を発現し、また、ワクチンとして用いることにより、組換えブタポックスウイルスに表現された外来遺伝子に対する防御性免疫反応を動物中で惹起させた。O1Lプロモータの他に、LP1, EP1LP2, LP2EP2, HCMV即時型初期プロモータを含む他のプロモータが欠損領域に挿入され、一以上の外来遺伝子がこれらのプロモータによって発現される。
【図面の簡単な説明】
【０２９２】
【図１】独特の長い末端繰り返し（ＴＲ）領域を含むＳＰＶゲノムＤＮＡ（Kasza株）の詳細図。
【図２】相同ベクター 515-85.1に由来するＤＮＡ配列。
【図３−１】515.85.1 ＯＲＦとワクシニアウイルス 01L ＯＲＦとの間に存在する相同性を示す図。
【図３−２】515.85.1 ＯＲＦとワクシニアウイルス 01L ＯＲＦとの間に存在する相同性を示す図。
【図４−１】相同ベクター 520-17.5におけるＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図４−２】相同ベクター 520-17.5におけるＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図５−１】相同ベクター 538-46.16中におけるＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図５−２】相同ベクター 538-46.16中におけるＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図６】ＰＲＶに対する抗血清を用いた、組換えＳＰＶ感染細胞溶解物のウエスタンブロット。
【図７】ＮＤＶヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ遺伝子（ＨＮ）のＤＮＡ配列。
【図８−１】相同ベクター 538-46.26中におけるＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図８−２】相同ベクター 538-46.26中におけるＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図９−１】相同ベクター 561-36.26中におけるブタポックスウイルス S-SPV-010およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図９−２】相同ベクター 561-36.26中におけるブタポックスウイルス S-SPV-010およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図１０−１】相同ベクター 570-91.21中におけるブタポックスウイルス S-SPV-011およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図１０−２】相同ベクター 570-91.21中におけるブタポックスウイルス S-SPV-011およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図１１−１】相同ベクター 570-91.41中におけるブタポックスウイルス S-SPV-012およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図１１−２】相同ベクター 570-91.41中におけるブタポックスウイルス S-SPV-012およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図１２−１】相同ベクター 570-91.64中におけるブタポックスウイルス S-SPV-013およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図１２−２】相同ベクター 570-91.64中におけるブタポックスウイルス S-SPV-013およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図１３−１】相同ベクター 599-65.25中におけるブタポックスウイルス S-SPV-014およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図１３−２】相同ベクター 599-65.25中におけるブタポックスウイルス S-SPV-014およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図１４−１】相同ベクター 624-20.1C中におけるブタポックスウイルス S-SPV-016およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図１４−２】相同ベクター 624-20.1C中におけるブタポックスウイルス S-SPV-016およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図１５−１】相同ベクター 614-83.18中におけるブタポックスウイルス S-SPV-017およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図１５−２】相同ベクター 614-83.18中におけるブタポックスウイルス S-SPV-017およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図１６】ポリクローナルヤギ抗ＰＲＶ・ｇIII（ｇｐＣ）を用いた、組換えＳＰＶ感染細胞溶解物のウエスタンブロット。
【図１７】相同ベクター 515-85.1に挿入された、3,628塩基対のＢｇｌII−ＨｉｎｄIIIブタポックスウイルスＤＮＡフラグメントを示す地図。
【図１８−１】相同ベクター 723-59A9.22中におけるブタポックスウイルス S-SPV-034およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図１８−２】相同ベクター 723-59A9.22中におけるブタポックスウイルス S-SPV-034およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図１９−１】相同ベクター 727-54.60中におけるブタポックスウイルス S-SPV-015およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図１９−２】相同ベクター 727-54.60中におけるブタポックスウイルス S-SPV-015およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図２０−１】相同ベクター 727-67.18中におけるブタポックスウイルス S-SPV-031およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図２０−２】相同ベクター 727-67.18中におけるブタポックスウイルス S-SPV-031およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図２１−１】相同ベクター 732-18.4中におけるブタポックスウイルス S-SPV-033およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図２１−２】相同ベクター 732-18.4中におけるブタポックスウイルス S-SPV-033およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図２２−１】相同ベクター 741-80.3中におけるブタポックスウイルス S-SPV-036およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図２２−２】相同ベクター 741-80.3中におけるブタポックスウイルス S-SPV-036およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図２３−１】相同ベクター 741-84.14中におけるブタポックスウイルス S-SPV-035およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図２３−２】相同ベクター 741-84.14中におけるブタポックスウイルス S-SPV-035およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図２４−１】相同ベクター 744-34中におけるブタポックスウイルス S-SPV-038およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図２４−２】相同ベクター 744-34中におけるブタポックスウイルス S-SPV-038およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図２５−１】相同ベクター 744-38中におけるブタポックスウイルス S-SPV-09およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【図２５−２】相同ベクター 744-38中におけるブタポックスウイルス S-SPV-09およびＤＮＡ挿入物の詳細な説明図。
【参考文献】
【０２９３】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【配列表】
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