(57)【要約】      （修正有）【課題】リポソーム膜の外表面に親水性ポリマーが導入されたリポソームであって、リポソーム封入物質をエンドソームから脱出させ、細胞質中に放出させることができるリポソームを提供する。【解決手段】下記（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドに結合したリポソーム膜構成物質と、下記（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドに一端が結合した親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質とをリポソームに含有させる。（ａ）ＧＡＬＡと呼ばれる３０アミノ酸残基からなる合成ペプチド（ｂ）ＧＡＬＡのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、酸性条件下において脂質膜同士を融合できるペプチド【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドに結合したリポソーム膜構成物質と、下記（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドに一端が結合した親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質とを含むリポソーム。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、酸性条件下において脂質膜同士を融合できるペプチド
【請求項２】
細胞膜の表面上に存在する受容体又は抗原と結合できる物質に一端が結合した親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質をさらに含む請求項１記載のリポソーム。
【請求項３】
細胞膜の表面上に存在する受容体又は抗原と結合できる前記物質が、トラスフェリン、インシュリン、葉酸、ヒアルロン酸、抗体若しくはその断片、糖鎖、成長因子又はアポリポタンパク質である請求項２記載のリポソーム。
【請求項４】
一端が遊離末端である親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質をさらに含む請求項１〜３のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項５】
前記親水性ポリマーがポリアルキレングリコールである請求項１〜４のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項６】
前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである請求項５記載のリポソーム。
【請求項７】
細胞内へ送達しようとする目的物質が封入されている請求項１〜６のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項８】
前記目的物質が薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖又はこれらの複合体である請求項７記載のリポソーム。
【請求項９】
前記目的物質の細胞内送達用ベクターである請求項７又は８記載のリポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソーム膜の外表面に機能性分子が導入されたリポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖等の目的物質を標的部位に送達するためのベクターとして、リポソーム膜の外表面に機能性分子が導入されたリポソームの開発が盛んに行われている。
【０００３】
例えば、リポソーム膜の外表面に親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール）が導入されたリポソームが開発されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３及び特許文献４参照）。このリポソームによれば、リポソームの血中滞留性を向上させることにより、腫瘍細胞に対するリポソームの指向性を向上させることができる。
【０００４】
また、リポソーム膜の外表面に、細胞膜の表面上に存在する受容体又は抗原と結合できる物質（例えば、トラスフェリン、インシュリン、葉酸、ヒアルロン酸、抗体又はその断片、糖鎖）が導入されたリポソームが開発されている（特許文献３及び特許文献４参照）。このリポソームによれば、リポソームのエンドサイトーシス効率を向上させることができる。
【０００５】
さらに、ＧＡＬＡに結合したコレステロールを用いて、リポソーム膜の外表面にＧＡＬＡを導入したリポソームが開発されている（非特許文献１参照）。リポソームはエンドサイトーシスするとエンドソーム内に包含された状態となり、エンドソーム内のリポソームは、エンドソームがリソソームと融合することにより分解されるが、このリポソームによれば、リポソーム封入物質をエンドソームから脱出させ、細胞質中へ放出させることができる。
【０００６】
ＧＡＬＡは配列番号１記載のアミノ酸配列からなる合成ペプチドであり、Szoka等のグループによって合成され（非特許文献２参照）、現在まで数々の研究が行われている。
【０００７】
ＧＡＬＡは、ｐＨ感受性を有しており、ｐＨ７．４ではランダムコイル構造をとるが、ｐＨが５．０程度に変化すると、グルタミン酸残基の電荷が中和されて電気的反発が解消し、αヘリックス構造をとる（非特許文献２参照）。αヘリックの割合は、ｐＨ７．４では約２０％であるが、ｐＨが５．０に変化すると約７０％まで上昇する（非特許文献３参照）。
【０００８】
ＧＡＬＡは、卵黄ホスファチジルコリンからなるリポソームと酸性条件下でインキュベーションすると、リポソーム封入物質を漏出する（この効果はｐＨ５．０で最大となる）とともに、リポソーム同士の融合を引き起こす（非特許文献４参照）。ＧＡＬＡによるリポソーム封入物質の放出機構について、ＧＡＬＡがリポソーム膜に貫入し、リポソーム膜に貫入したＧＡＬＡがリポソーム膜中で８〜１２個集まり、直径５〜１０Åの大きさのポアを形成している可能性が示されている（非特許文献５参照）。
【特許文献１】特開平１−２４９７１７号公報
【特許文献２】特開平２−１４９５１２号公報
【特許文献３】特開平４−３４６９１８号公報
【特許文献４】特開２００４−１０４８１号公報
【非特許文献１】T.Kakudo等，「バイオケミストリー（Biochemistry）」，2004年，第43巻，5618-5623頁
【非特許文献２】N.K.Subbarao等，「バイオケミストリー（Biochemistry）」，1987年，第26巻，2964-2972頁
【非特許文献３】E.Goormaghtigh等，「ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー（European Journal of Biochemistry）」，1991年，第195巻，421-429頁
【非特許文献４】R.A.Parente等，「ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）」，1988年，第263巻，4724-4730頁
【非特許文献５】R. A. Parente等，「バイオケミストリー（Biochemistry）」，1990年，第29巻，8720-8728頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、リポソーム膜の外表面に親水性ポリマーが導入されたリポソームであって、リポソーム封入物質をエンドソームから脱出させ、細胞質中に放出させることができるリポソームを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、ＧＡＬＡに結合したリポソーム膜構成物質と、ＧＡＬＡに一端が結合していない親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質とを用いて、ＧＡＬＡと、ＧＡＬＡを末端に有しない親水性ポリマーとをリポソーム膜の外表面に導入した場合、リポソーム封入物質が低分子であっても、リポソーム封入物質をエンドソームから脱出させることはできないこと（比較例１参照）、並びに、ＧＡＬＡに結合したリポソーム膜構成物質を用いることなく、ＧＡＬＡに一端が結合した親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質を用いて、ＧＡＬＡを末端に有する親水性ポリマーをリポソーム膜の外表面に導入した場合、リポソーム封入物質が低分子であっても、リポソーム封入物質をエンドソームから脱出させることはできないこと（比較例２参照）を見出すとともに、ＧＡＬＡに結合したリポソーム膜構成物質と、ＧＡＬＡに一端が結合した親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質とを用いて、ＧＡＬＡと、ＧＡＬＡを末端に有する親水性ポリマーとをリポソーム膜の外表面に導入した場合、リポソーム封入物質が低分子であっても高分子であっても、リポソーム封入物質をエンドソームから脱出させ、細胞質中に放出させることができること（実施例１参照）を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明のリポソームは、下記（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドに結合したリポソーム膜構成物質と、下記（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドに一端が結合した親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質とを含むリポソームである。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ペプチド（ａ）」という場合がある。）
（ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、酸性条件下において脂質膜同士を融合できるペプチド（以下「ペプチド（ｂ）」という場合がある。）
【００１２】
本発明のリポソームがエンドソーム内にあるとき、親水性ポリマーの末端に結合したペプチド（ａ）又は（ｂ）がエンドソーム膜に作用することにより、リポソーム膜とエンドソーム膜とが接近し、リポソーム膜構成物質に結合したペプチド（ａ）又は（ｂ）がエンドソーム膜に作用することにより、リポソーム膜とエンドソーム膜とが融合し、その結果、リポソーム封入物質がエンドソームを脱出し、細胞質中に放出されるものと考えられる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のリポソームは、リポソーム膜の外表面に導入された親水性ポリマーによりリポソームの血中滞留性が向上している。また、本発明のリポソームは、リポソーム封入物質が低分子であっても高分子であっても、リポソーム封入物質をエンドソームから脱出させ、細胞質中に放出させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のリポソームは、脂質二重層構造を有する閉鎖小胞である限り、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）であってもよいし、ＳＵＶ（small unilamellar vesicle）、ＬＵＶ（large unilamellar vesicle）、ＧＵＶ（giant unilamellar vesicle）等の一枚膜リポソームであってもよい。
【００１５】
本発明のリポソームのサイズは特に限定されるものではないが、直径３０〜１０００ｎｍであることが好ましく、直径５０〜３００ｎｍであることがさらに好ましい。
【００１６】
本発明のリポソームは、ペプチド（ａ）又は（ｂ）に結合したリポソーム膜構成物質と、ペプチド（ａ）又は（ｂ）に一端が結合した親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質とを含む限り、非修飾のリポソーム膜構成物質（すなわち、ペプチド（ａ）又は（ｂ）、親水性ポリマー等に結合していないリポソーム膜構成物質）、細胞膜の表面上に存在する受容体又は抗原と結合できる物質（以下「細胞膜結合性物質」という場合がある。）に一端が結合した親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質、一端が遊離末端である親水性ポリマー（すなわち、ペプチド（ａ）又は（ｂ）、細胞膜結合性物質等に一端が結合していない親水性ポリマー）の他端に結合したリポソーム膜構成物質等を含むことができる。
【００１７】
本発明のリポソームは、細胞膜結合性物質に一端が結合した親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質を含むことが好ましい。これにより、本発明のリポソームのエンドサイトーシス効率を効果的に向上させることができる。
【００１８】
本発明のリポソームは、一端が遊離末端である親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質を含むことが好ましい。ペプチド（ａ）又は（ｂ）、細胞膜結合性物質等に一端が結合した親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質と、一端が遊離末端である親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質との配合割合を調節することにより、in vivoにおける本発明のリポソームの血中滞留性を調節することができる。
【００１９】
ペプチド（ａ）又は（ｂ）に結合したリポソーム膜構成物質の配合量は特に限定されるものではないが、リポソーム膜構成物質の総配合量の通常０．１〜１０％（モル比）、好ましくは０．５〜５％（モル比）、さらに好ましくは０．５〜２％（モル比）である。ペプチド（ａ）又は（ｂ）に結合したリポソーム膜構成物質の配合量が上記範囲にあると、本発明のリポソームがエンドソーム内にあるときにリポソーム膜とエンドソーム膜とを効果的に融合させることができる。
【００２０】
ペプチド（ａ）又は（ｂ）に一端が結合した親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質の配合量は特に限定されるものではないが、リポソーム膜構成物質の総配合量の通常０．１〜１０％（モル比）、好ましくは０．５〜５％（モル比）、さらに好ましくは０．５〜２％（モル比）である。ペプチド（ａ）又は（ｂ）に一端が結合した親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質の配合量が上記範囲にあると、本発明のリポソームがエンドソーム内にあるときにリポソーム膜とエンドソーム膜とを効果的に接近させることができる。
【００２１】
非修飾のリポソーム膜構成物質の配合量は特に限定されるものではないが、リポソーム膜構成物質の総配合量の通常５０〜９９％（モル比）、好ましくは７０〜９９％（モル比）、さらに好ましくは８５〜９５％（モル比）である。非修飾のリポソーム膜構成物質の配合量が上記範囲にあると、リポソーム封入物質を本発明のリポソーム内に効果的に保持することができる。
【００２２】
細胞膜結合性物質に一端が結合した親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質の配合量は特に限定されるものではないが、リポソーム膜構成物質の総配合量の通常０．０１〜５０％（モル比）、好ましくは０．０５〜２０％（モル比）、さらに好ましくは０．１〜２％（モル比）である。細胞膜結合性物質に一端が結合した親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質の配合量が上記範囲にあると、本発明のリポソームのエンドサイトーシス効率を効果的に向上させることができる。
【００２３】
一端が遊離末端である親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質の配合量は特に限定されるものではないが、ペプチド（ａ）又は（ｂ）、細胞膜結合性物質等に一端が結合した親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質と、一端が遊離末端である親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質との合計配合量は、リポソーム膜構成物質の総配合量の通常０．５〜５０％（モル比）、好ましくは１〜２０％（モル比）、さらに好ましくは２〜１０％である。合計配合量が上記範囲にあると、in vivoにおける本発明のリポソームの血中滞留性を効果的に向上させることができる。
【００２４】
本発明のリポソームにおいて、リポソーム膜構成物質の種類は、脂質二重層の形成を阻害しない限り特に限定されるものではなく、リポソーム膜構成物質としては、例えば、脂質、膜安定化剤、抗酸化剤、荷電物質、膜タンパク質等が挙げられる。
【００２５】
脂質は必須のリポソーム膜成分であり、その配合量はリポソーム膜構成物質の総配合量の通常５０〜１００％（モル比）、好ましくは７０〜１００％（モル比）、さらに好ましくは８５〜１００％（モル比）である。
【００２６】
脂質としては、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が挙げられる。
【００２７】
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール等）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物等が挙げられる。
【００２８】
糖脂質としては、例えば、グリセロ糖脂質（例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフィンゴ糖脂質（例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド）等が挙げられる。
【００２９】
ステロールとしては、例えば、動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例えば、チモステロール、エルゴステロール）等が挙げられる。
【００３０】
飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。
【００３１】
膜安定化剤は、リポソーム膜を物理的又は化学的に安定させたり、リポソーム膜の流動性を調節したりするために添加できる任意のリポソーム膜成分であり、その配合量は、リポソーム膜構成物質の総配合量の通常０〜５０％（モル比）、好ましくは０〜４５％（モル比）、さらに好ましくは０〜４０％（モル比）である。
【００３２】
膜安定化剤としては、例えば、ステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル等が挙げられる。
ステロールとしては、上記と同様の具体例が挙げられ、グリセリンの脂肪酸エステルとしては、例えば、トリオレイン、トリオクタノイン等が挙げられる。
【００３３】
抗酸化剤は、リポソーム膜の酸化を防止するために添加できる任意のリポソーム膜成分であり、その配合量は、リポソーム膜構成物質の総配合量の通常０〜１０％（モル比）、好ましくは０〜８％（モル比）、さらに好ましくは０〜５％（モル比）である。
【００３４】
抗酸化剤としては、例えば、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等が挙げられる。
【００３５】
荷電物質は、リポソーム膜に正荷電又は負荷電を付与するために添加できる任意のリポソーム膜成分であり、その配合量は、リポソーム膜構成物質の総配合量の通常０〜９５％（モル比）、好ましくは０〜８０％（モル比）、さらに好ましくは０〜７０％（モル比）である。
【００３６】
正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミン等の飽和又は不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン等の飽和又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられ、負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。
【００３７】
膜タンパク質は、リポソーム膜の構造を維持したり、リポソーム膜に機能性を付与したりするために添加できる任意のリポソーム膜成分であり、その配合量は、リポソーム膜構成物質の総配合量の通常０〜１０％（モル比）、好ましくは０〜８％（モル比）、さらに好ましくは０〜５％（モル比）である。
【００３８】
膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等が挙げられる。
【００３９】
ペプチド（ａ）又は（ｂ）に結合したリポソーム膜構成物質は、上記に例示したリポソーム膜構成物質のいずれであってもよいが、脂質又は膜安定化剤であることが好ましく、リン脂質、ステロール又は脂肪酸であることがさらに好ましい。ペプチド（ａ）又は（ｂ）に結合したリポソーム膜構成物質が脂質又は膜安定化剤、特にリン脂質、ステロール又は脂肪酸であると、本発明のリポソームがエンドソーム内にあるときにリポソーム膜とエンドソーム膜とを効果的に融合させることができる。
【００４０】
親水性ポリマー（ペプチド（ａ）又は（ｂ）、細胞膜結合性物質等に一端が結合しているか否かは問わない）の他端に結合したリポソーム膜構成物質の種類は特に限定されるものではないが、脂質又は膜安定化剤であることが好ましく、リン脂質、ステロール又は脂肪酸であることがさらに好ましい。親水性ポリマーの末端に結合したリポソーム膜構成物質が脂質又は膜安定化剤、特にリン脂質、ステロール又は脂肪酸であると、in vivoにおける本発明のリポソームの血中滞留性を効果的に向上させることができる。
【００４１】
ペプチド（ａ）は「ＧＡＬＡ」と呼ばれる合成ペプチドであり、ペプチド（ｂ）はペプチド（ａ）の変異型である。ペプチド（ａ）及び（ｂ）はｐＨ感受性を有しており、酸性条件下において脂質膜同士を融合することができる。なお、ペプチド（ａ）及び（ｂ）は、中性条件下及びアルカリ性条件下において脂質膜同士を融合することはできない。
【００４２】
脂質膜は、脂質二重層構造を有する限り、リポソーム膜等の人工膜であってもよいし、細胞膜、エンドソーム膜等の生体膜であってもよい。ペプチド（ａ）又は（ｂ）は、人工膜同士の融合、生体膜同士の融合、人工膜と生体膜との融合等のいずれをも媒介することができ、本発明のリポソームでは、ペプチド（ａ）又は（ｂ）によって媒介されるリポソーム膜とエンドソーム膜との融合を利用する。ペプチド（ａ）及び（ｂ）が脂質膜同士を融合できるｐＨは、通常３〜６、好ましくは４〜５．８、さらに好ましくは４．５〜５．５である。
【００４３】
配列番号１記載のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数及び位置は、ペプチド（ｂ）が酸性条件下において脂質膜同士を融合できる限り特に限定されるものではなく、アミノ酸の個数は１又は複数個、好ましくは１又は数個であり、その具体的な範囲は、欠失に関しては通常１〜４個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個であり、置換に関しては通常１〜６個、好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜２個であり、付加に関しては通常１〜１２個、好ましくは１〜６個、さらに好ましくは１〜４個である。
【００４４】
親水性ポリマーの種類は、in vivoにおけるリポソームの血中滞留性を向上させることができる限り特に限定されるものではなく、親水性ポリマーとしては、例えば、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレングリコール、ポリヘキサメチレングリコール等）、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナン等が挙げられるが、ポリアルキレングリコールが好ましく、ポリエチレングリコールがさらに好ましい。
【００４５】
親水性ポリマーがポリアルキレングリコールである場合、その分子量は、通常３００〜１００００、好ましくは５００〜１００００、さらに好ましくは１０００〜５０００である。ポリアルキレングリコールの分子量が上記範囲にあると、in vivoにおけるリポソームの血中滞留性を効果的に向上させることができる。
【００４６】
親水性ポリマーには、アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、カルボニル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基等の置換基が導入されていてもよい。
【００４７】
アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｔ−ペンチル基、ネオペンチル基等の炭素数１〜５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。
【００４８】
アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基等の炭素数１〜５の直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基が挙げられる。
【００４９】
細胞膜の表面上に存在する受容体又は抗原と結合できる物質（細胞膜結合性物質）の種類は特に限定されるものではなく、細胞膜結合性物質としては、例えば、トラスフェリン、インシュリン、葉酸、ヒアルロン酸、抗体又はその断片、糖鎖、成長因子、アポリポタンパク質等が挙げられる。
【００５０】
成長因子としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等が挙げられる。アポリポタンパク質としては、例えば、アポＡ−１、アポＢ−４８、アポＢ−１００、アポＥ等が挙げられる。抗体の断片としては、例えば、Fab断片、F(ab)'2断片、単鎖抗体(scFv)等が挙げられる。
【００５１】
リポソーム膜構成物質とペプチド（ａ）又は（ｂ）とは、リポソーム膜構成物質が有する官能基（リポソーム膜構成物質に人為的に導入された官能基を含む。）と、ペプチド（ａ）又は（ｂ）が有する官能基（ペプチド（ａ）又は（ｂ）に人為的に導入された官能基を含む。）とを反応させることにより、共有結合を介して結合させることができる。共有結合を形成できる官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基／カルボキシル基、アミノ基／ハロゲン化アシル基、アミノ基／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基／ベンゾトリアゾールカーボネート基、アミノ基／アルデヒド基、チオール基／マレイミド基、チオール基／ビニルスルホン基等が挙げられる。
【００５２】
ペプチド（ａ）又は（ｂ）が有するチオール基を利用する場合、例えば、Ｎ末端のアミノ基が−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ２)ｎ−ＳＨ［式中、ｎは１〜７の整数である。］に誘導化されたペプチド（ａ）又は（ｂ）が有するチオール基を利用することができる。また、ペプチド（ｂ）の末端に置換又は付加によって導入されたシステイン残基が有するチオール基を利用することもできる。
【００５３】
リポソーム膜構成物質は、ペプチド（ａ）又は（ｂ）のＮ末端側と結合していてもよいし、Ｃ末端側と結合していてもよい。また、リポソーム膜構成物質に結合したペプチド（ａ）又は（ｂ）は、ペプチドの塩、例えば、リポソーム膜構成物質との結合に関与していないＣ末端のカルボキシル基が−ＣＯ−ＮＨ２に誘導化されたペプチドであってもよい。
【００５４】
リポソーム膜構成物質と親水性ポリマーとは、リポソーム膜構成物質が有する官能基（リポソーム膜構成物質に人為的に導入された官能基を含む。）と、親水性ポリマーが有する官能基（親水性ポリマーに人為的に導入された官能基を含む。）とを反応させることにより、共有結合を介して結合させることができる。共有結合を形成できる官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基／カルボキシル基、アミノ基／ハロゲン化アシル基、アミノ基／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基／ベンゾトリアゾールカーボネート基、アミノ基／アルデヒド基、チオール基／マレイミド基、チオール基／ビニルスルホン基等が挙げられる。
【００５５】
リポソーム膜構成物質は、親水性ポリマーの側鎖の末端に結合していてもよいが、主鎖の末端に結合していることが好ましい。
【００５６】
親水性ポリマーとペプチド（ａ）又は（ｂ）とは、親水性ポリマーが有する官能基（親水性ポリマーに人為的に導入された官能基を含む。）と、ペプチド（ａ）又は（ｂ）が有する官能基（ペプチド（ａ）又は（ｂ）に人為的に導入された官能基を含む。）とを反応させることにより、共有結合を介して結合させることができる。共有結合を形成できる官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基／カルボキシル基、アミノ基／ハロゲン化アシル基、アミノ基／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基／ベンゾトリアゾールカーボネート基、アミノ基／アルデヒド基、チオール基／マレイミド基、チオール基／ビニルスルホン基等が挙げられる。
【００５７】
ペプチド（ａ）又は（ｂ）が有するチオール基を利用する場合、例えば、Ｎ末端のアミノ基が−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ２)ｎ−ＳＨ［式中、ｎは１〜７の整数である。］に誘導化されたペプチド（ａ）又は（ｂ）が有するチオール基を利用することができる。また、ペプチド（ｂ）の末端に置換又は付加によって導入されたシステイン残基が有するチオール基を利用することもできる。
【００５８】
親水性ポリマーは、ペプチド（ａ）又は（ｂ）のＮ末端側と結合していてもよいし、Ｃ末端側と結合していてもよい。また、親水性ポリマーに結合したペプチド（ａ）又は（ｂ）は、ペプチドの塩、例えば、親水性ポリマーとの結合に関与していないＣ末端のカルボキシル基が−ＣＯ−ＮＨ２に誘導化されたペプチドであってもよい。また、ペプチド（ａ）又は（ｂ）は、親水性ポリマーの側鎖の末端に結合していてもよいが、主鎖の末端に結合していることが好ましい。
【００５９】
親水性ポリマーと細胞膜結合性物質とは、親水性ポリマーが有する官能基（親水性ポリマーに人為的に導入された官能基を含む。）と、細胞膜結合性物質が有する官能基（細胞膜結合性物質に人為的に導入された官能基を含む。）とを反応させることにより、共有結合を介して結合させることができる。共有結合を形成できる官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基／カルボキシル基、アミノ基／ハロゲン化アシル基、アミノ基／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基／ベンゾトリアゾールカーボネート基、アミノ基／アルデヒド基、チオール基／マレイミド基、チオール基／ビニルスルホン基等が挙げられる。
【００６０】
細胞膜結合性物質が有するチオール基を利用する場合、例えば、アミノ基が−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ２)ｎ−ＳＨ［式中、ｎは１〜７の整数である。］に誘導化された細胞膜結合性物質が有するチオール基を利用することができる。
【００６１】
細胞膜結合性物質は、親水性ポリマーの側鎖の末端に結合していてもよいが、主鎖の末端に結合していることが好ましい。
【００６２】
ペプチド（ａ）又は（ｂ）のＮ末端又はＣ末端のうち、リポソーム膜構成物質又は親水性ポリマーとの結合に関与していない末端には、別のペプチド（ａ）又は（ｂ）が結合していてもよい。すなわち、ペプチド（ａ）又は（ｂ）に結合したリポソーム膜構成物質として、複数個のペプチド（ａ）又は（ｂ）からなる融合ペプチドに結合したリポソーム膜構成物質を使用することができ、ペプチド（ａ）又は（ｂ）に一端が結合した親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質として、複数個のペプチド（ａ）又は（ｂ）からなる融合ペプチドに一端が結合した親水性ポリマーの他端に結合したリポソーム膜構成物質を使用することができる。
【００６３】
本発明のリポソームは、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法等の公知の方法を用いて調製することができる。また、リポソームを所定のポアサイズのフィルターで通過させることにより、一定の粒度分布を持ったリポソームを得ることができる。また、公知の方法に従って、多重膜リポソームから一枚膜リポソームへの転換、一枚膜リポソームから多重膜リポソームへの転換を行うことができる。
【００６４】
本発明のリポソームの内部には、細胞内に送達しようとする目的物質を封入することができる。
目的物質の種類は特に限定されるものではなく、例えば、薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖又はこれらの複合体等が挙げられ、診断、治療等の目的に応じて適宜選択することができる。なお、「核酸」には、ＤＮＡ又はＲＮＡに加え、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。また、核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいずれであってもよい。
【００６５】
目的物質が水溶性である場合には、リポソームの製造にあたり脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒に目的物質を添加することにより、リポソーム内部の水相に目的物質を封入することができる。また、目的物質が脂溶性である場合には、リポソームの製造にあたり使用される有機溶剤に目的物質を添加することにより、リポソームの脂質二重層に目的物質を封入することができる。
【００６６】
目的物質を封入したリポソームは、目的物質の細胞内送達用ベクターとして使用することができる。
目的物質を送達すべき細胞が由来する生物種は特に限定されるものではなく、動物、植物、微生物等のいずれであってもよいが、動物であることが好ましく、哺乳動物であることがさらに好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。また、目的物質を送達すべき細胞の種類は特に限定されるものではなく、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等が挙げられる。
【００６７】
本発明のリポソームは、例えば、分散液の状態で使用することができる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用してもよい。
【００６８】
本発明のリポソームは、分散液を乾燥（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等）させた状態で使用することもできる。乾燥させたリポソームは、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を加えて分散液とすることができる。
【００６９】
本発明のリポソームは、in vivo及びin vitroのいずれにおいても使用することもできる。本発明のリポソームをin vivoにおいて使用する場合、投与経路としては、例えば、静脈、腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられ、投与量及び投与回数は、リポソームに封入された目的物質の種類や量等に応じて適宜調節することができる。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明を具体的に説明する。
実施例及び比較例においてリポソーム膜の外表面を修飾する際に使用した各種物質は、以下のように調製又は入手した。
（１）次式：Ｃｈｏｌ−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＧＡＬ−ＣＯＮＨ２［式中、Ｃｈｏｌはコレステロール残基を表し、−Ｏ−はコレステロールのヒドロキシル基に由来し、ＧＡＬはＧＡＬＡ残基を表し、−ＮＨ−はＧＡＬＡのＮ末端のアミノ基に由来し、−ＣＯＮＨ２はＧＡＬＡのＣ末端のカルボキシル基に由来する。］で表されるＧＡＬＡ誘導体（Ｉ）の調製
【００７１】
ＧＡＬＡ（配列番号１）をＦｍｏｃ固相法により合成し、次式：ＮＨ２−ＧＡＬ−ＣＯ−ＮＨ−担体［式中、ＧＡＬはＧＡＬＡ残基を表し、−ＮＨ２はＧＡＬＡのＮ末端のアミノ基を表し、−ＣＯ−はＧＡＬＡのＣ末端のカルボキシル基に由来し、−ＮＨ−は担体のアミノ基に由来し、担体はＲｉｎｋアミド樹脂（ノバビオケム製）である。］で表されるＧＡＬＡ誘導体（ＩＩ）（分子量：３６９５．９）を得た。
【００７２】
ＧＡＬＡ誘導体（ＩＩ）を反応容器内でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）によって洗い込み、ＤＭＦに浸して室温で２０分間放置することにより脱コンパクションした。１等量のＧＡＬＡ誘導体（ＩＩ）に対して３等量のコレステリルクロロホルメート（Ｃｈｏｌ−Ｏ−ＣＯＣｌ）（分子量：４４９．１）を量り取り、ＤＭＦ ５００〜７００ｍＬに溶解した。微量のＧＡＬＡ誘導体（ＩＩ）を残しておき、残りのＧＡＬＡ誘導体（ＩＩ）をコレステリルクロロホルメートのＤＭＦ溶液に加えた後、トリエチルアミン（ＴＥＡ）をＧＡＬＡ誘導体（ＩＩ）に対して３等量加えた。その際、まず１／３量（１等量）のＴＥＡを加えて室温で１５分間回転攪拌し、次に１／３量（１等量）のＴＥＡを加えて室温で１５分間回転攪拌し、最後に残り（１等量）のＴＥＡを加えて室温で３時間回転攪拌した。反応物をＤＭＦで５回、メタノールで３回、ジエチルエーテルで３回洗浄した。残しておいたＧＡＬＡ誘導体（ＩＩ）ととともに、この反応物をニンヒドリンと反応させ、色の変化がないことを確認した。こうして、次式：Ｃｈｏｌ−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＧＡＬ−ＣＯ−ＮＨ−担体で表されるＧＡＬＡ誘導体（ＩＩＩ）を得た。
【００７３】
次いで、反応物をスリ付きの遠心管に移し、エタンジチオール（ＥＤＴ）を０．２ｍＬ加えた後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を０．８ｍＬ加え（ＴＦＡ：ＥＤＴ＝９５：５）、室温で３時間攪拌した。攪拌終了後、ガラスフィルターで吸引濾過して回収し、エバポレーターでＴＦＡを留去した。ゲル状になったことを確認して、氷水中でジエチルエーテルを加えて２０分攪拌した。この時、白いパウダー状の固体が存在していることを確認した。その後、３，２００ｒｐｍ及び室温の条件で５分間遠心し、上清を捨てジエチルエーテルで２回洗浄した。再び上清を捨て、５０％酢酸溶液で懸濁溶解させ、１５ｍＬチューブに移し、ＭＩＬＬＩ ＷＲＡＰで覆って凍結乾燥を行った。こうして、ＧＡＬＡ誘導体（Ｉ）を得た。
【００７４】
得られたＧＡＬＡ誘導体（Ｉ）をＤＭＦに溶解し、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心して不溶物を沈殿させ、上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用のサンプルとし、以下の条件で逆相ＨＰＬＣを行い、ＧＡＬＡ誘導体（Ｉ）を精製した。
【００７５】
カラム：ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ４−ＡＲ−３００
濃度勾配：５０Ｂ％→９５Ｂ％（２０分），９５Ｂ％→９５Ｂ％（２０分）
９５Ｂ％→９５Ｂ％（５分，洗浄）
９５Ｂ％→５０Ｂ％（５分，平衡化）
流速：２．０ ｍＬ／ｍｉｎ
温度：室温
検出波長：２１５ｎｍ
【００７６】
また、分取したサンプルに関し、同条件下のＨＰＬＣによる純度の確認と、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる分子量の測定とを行った。分子量測定時にはマトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシシナミン酸（ＣＨＣＡ）を使用した。
【００７７】
（２）次式：ＭＰＡ−ＮＨ−ＧＡＬ−ＣＯＮＨ２［式中、ＭＰＡは３−メルカプトプロピオニル基を表し、ＧＡＬはＧＡＬＡ残基を表し、−ＮＨ−はＧＡＬＡのＮ末端のアミノ基に由来し、−ＣＯＮＨ２はＧＡＬＡのＣ末端のカルボキシル基に由来する。］で表されるＧＡＬＡ誘導体（ＩＶ）の調製
ＨＰＬＣによって精製したＧＡＬＡ誘導体（Ｉ）と３−(２−ピリジルジチオ)プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＳＰＤＰ）とを、ＤＭＦと水との混合溶媒中で１：２（モル比）で混合して３７℃で３時間反応させた後、Sephadex G-25 Fine gel（アマシャムバイオサイエンス製）を用いて反応副生物を除去し、次式：ＰＤＰ−ＮＨ−ＧＡＬ−ＣＯＮＨ２［式中、ＰＤＰは３−(２−ピリジルジチオ)プロピオニル基を表し、ＧＡＬはＧＡＬＡ残基を表し、−ＮＨ−はＧＡＬＡのＮ末端のアミノ基に由来し、−ＣＯＮＨ２はＧＡＬＡのＣ末端のカルボキシル基に由来する。］で表されるＧＡＬＡ誘導体（Ｖ）の溶液を得た。次いで、最終濃度が５０ｍＭとなるようにジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加して室温で３０分間反応させた後、microcon YM-3（ミリポア製）を用いて限外濾過し、ＧＡＬＡ誘導体（ＩＶ）の溶液を得た。
【００７８】
（３）ＭＰＡ−ＮＨ−Ｔｆ［式中、ＭＰＡは３−メルカプトプロピオニル基を表し、Ｔｆはトランスフェリン残基を表し、−ＮＨ−はトランスフェリンのアミノ基に由来する。］で表されるトランスフェリン誘導体（Ｉ）の調製
トランスフェリンとＳＰＤＰとをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ(−)）中で１：１．５（モル比）で混合し、室温で３０分間反応させ、次式：ＰＤＰ−ＮＨ−Ｔｆ［式中、ＰＤＰは３−(２−ピリジルジチオ)プロピオニル基を表し、Ｔｆはトランスフェリン残基を表し、−ＮＨ−はトランスフェリンのアミノ基に由来する。］で表されるトランスフェリン誘導体（ＩＩ）の溶液を得た。次いで、最終濃度が５０ｍＭとなるようにＤＴＴを添加して室温で３０分間反応させた後、Sephadex G-25 Fine gel（アマシャムバイオサイエンス製）を用いて反応副生物を除去し、トランスフェリン誘導体（Ｉ）の溶液を得た。
【００７９】
（４）次式：ｍＰＥＧ−ＣＯ−ＮＨ−ＤＳＰＥ［式中、ｍＰＥＧはメトキシ(ポリエチレングリコール)残基を表し、ＤＳＰＥは１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン残基を表し、−ＮＨ−は１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンのアミノ基に由来する。］で表されるポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−２０００]）は、Avanti社より購入した。ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）の構造式は以下の通りである。
【００８０】
【化１】
2006028030.tif 000002
【００８１】
（５）次式：Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＣＯ−ＮＨ−ＤＳＰＥ［式中、Ｍａｌはマレイミド基を表し、ＰＥＧはポリエチレングリコール残基を表し、ＤＳＰＥは１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン残基を表し、−ＮＨ−は１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンのアミノ基に由来する。］で表されるポリエチレングリコール誘導体（ＩＩ）は、日本油脂社より購入した。ポリエチレングリコール誘導体（ＩＩ）の構造式は以下の通りである。
【００８２】
【化２】
2006028030.tif 000003
【００８３】
〔実施例１〕
（１）リポソームの調製
脂質組成が卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）：コレステロール：ポリエチレングリコール誘導体（Ｉ）：ポリエチレングリコール誘導体（ＩＩ）＝２：１：０．１２：０．０６（モル比）であるリポソームをＲＥＶ法により調製した後、ポアサイズ４００ｎｍ及び１００ｎｍのメンブレンを通過させた。この段階において、リポソーム膜の外表面には、メトキシ（ポリエチレングリコール）と、マレイミド基を末端に有するポリエチレングリコールとが導入される。
【００８４】
ＲＥＶ法によるリポソームの調製は、次のように行った。上記脂質組成物をＣＨＣｌ３に溶解して最終容積を１ｍＬとし、そこにジイソプロピルエーテル１ｍＬを加えてボルテックスにより混合し、１ｍＬずつに分注した。スルホローダミンＢ（Ｒｈ）溶液又はフルオレセインイソチオシアネート−ウシ血清アルブミン（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）のＰＢＳ(−)溶液５００μＬをそれぞれに加えてボルテックスにより混合し、約６０秒間超音波処理し、エマルジョン形成させた。エマルジョン形成後、窒素ガスエバポレーションによりリポソーム溶液を得た。
【００８５】
次いで、リポソーム溶液にＧＡＬＡ誘導体（Ｉ）（リポソーム膜を構成する総脂質に対して０．５〜１％（モル比））を加えて３７℃で１時間インキュベーションした。この段階において、リポソーム膜の外表面にはＧＡＬＡが導入される。
次いで、リポソーム溶液にＧＡＬＡ誘導体（ＩＶ）及びトランスフェリン誘導体（Ｉ）を加えて４℃でＯ／Ｎ攪拌した。この段階において、リポソーム膜の外表面に導入されたポリエチレングリコールが末端に有するマレイミド基に、−Ｓ−を介してＧＡＬＡ誘導体（ＩＶ）及びトランスフェリン誘導体（Ｉ）が結合する。
【００８６】
以上のように、ＧＡＬＡと、ＧＡＬＡを末端に有するポリエチレングリコールと、トランスフェリンを末端に有するポリエチレングリコールと、ＧＡＬＡ及びトランスフェリンを末端に有しないポリエチレングリコールとがリポソーム膜の外表面に導入されたリポソームを調製した。
【００８７】
ＧＡＬＡ誘導体（Ｉ）及びＧＡＬＡ誘導体（ＩＶ）の使用量は、リポソーム膜を構成する総脂質に対して０．５％又は１％（モル比）とした。また、トランスフェリン誘導体（Ｉ）の使用量は、リポソーム膜を構成する総脂質に対して０．５％（モル比）とした。
ＧＡＬＡ誘導体（Ｉ）及びＧＡＬＡ誘導体（ＩＶ）の使用量が０．５モル％であるリポソームには、５ｍＭ Ｒｈ溶液又は３００μＭ ＦＩＴＣ−ＢＳＡ溶液（ＦＩＴＣ換算）を封入し、ＧＡＬＡ誘導体（Ｉ）びＧＡＬＡ誘導体（ＩＶ）の使用量が１モル％であるリポソームには、４００μＭ ＦＩＴＣ−ＢＳＡ溶液（ＦＩＴＣ換算）を封入した。
【００８８】
（２）リポソームの細胞内導入
各リポソームを１×１０５細胞／ｍＬのＫ５６２細胞とともに、５％ＣＯ２存在下３７℃で１８時間インキュベーションした後、共焦点レーザースキャン顕微鏡（ＣＬＳＭ）観察を行い、リポソームが導入された細胞の数、リポソームが導入された細胞のうちリポソームがエンドサイトースした細胞の数、及びリポソームが導入された細胞のうちリポソーム封入物質（Ｒｈ又はＦＩＴＣ−ＢＳＡ)がエンドソームを脱出して細胞質中に放出された細胞の数を評価した。
結果を表１に示す。
【００８９】
【表１】
2006028030.tif 000004
【００９０】
表１に示すように、リポソーム封入物質がＲｈ等の低分子及びＢＳＡ等の高分子のいずれの場合であっても、リポソーム封入物質はエンドソームを脱出し、細胞質中に放出された。
【００９１】
〔比較例１〕
ＧＡＬＡ誘導体（ＩＶ）を用いない点を除き、実施例１と同様にしてリポソームを調製した。すなわち、ＧＡＬＡを末端に有するポリエチレングリコールをリポソーム膜の外表面へ導入しない点を除き、実施例１と同様にリポソーム膜の外表面を修飾した。
ＧＡＬＡ誘導体（Ｉ）の使用量は、リポソーム膜を構成する総脂質に対して１モル％とした。リポソームには、５ｍＭ Ｒｈ溶液を封入した。
リポソームを１×１０５細胞／ｍＬのＫ５６２細胞とともに、５％ＣＯ２存在下３７℃で１８時間インキュベーションした後、ＣＬＳＭ観察を行い、リポソームが導入された細胞の数、リポソームが導入された細胞のうちリポソームがエンドサイトースした細胞の数、及びリポソームが導入された細胞のうちリポソーム封入物質（Ｒｈ)がエンドソームを脱出して細胞質中に放出された細胞の数を評価した。
結果を表２に示す。
【００９２】
【表２】
2006028030.tif 000005
【００９３】
表２に示すように、リポソーム封入物質がＲｈ等の低分子であっても、リポソーム封入物質はエンドソームを脱出することはできなかった。
【００９４】
〔比較例２〕
ＧＡＬＡ誘導体（Ｉ）を用いない点を除き、実施例１と同様にしてリポソームを調製した。すなわち、ＧＡＬＡをリポソーム膜の外表面へ導入しない点を除き、実施例１と同様にリポソーム膜の外表面を修飾した。
ＧＡＬＡ誘導体（ＩＶ）の使用量は、リポソーム膜を構成する総脂質に対して１モル％とした。リポソームには、５ｍＭ Ｒｈ溶液を封入した。
リポソームを１×１０５細胞／ｍＬのＫ５６２細胞とともに、５％ＣＯ２存在下３７℃で１８時間インキュベーションした後、ＣＬＳＭ観察を行い、リポソームが導入された細胞の数、リポソームが導入された細胞のうちリポソームがエンドサイトースした細胞の数、及びリポソームが導入された細胞のうちリポソーム封入物質（Ｒｈ)がエンドソームを脱出して細胞質中に放出された細胞の数を評価した。
結果を表３に示す。
【００９５】
【表３】
2006028030.tif 000006
【００９６】
表３に示すように、リポソーム封入物質がＲｈ等の低分子であっても、リポソーム封入物質はエンドソームを脱出することはできなかった。
【配列表】
2006028030000001.app