(57)【要約】    【課題】  移植などにより皮膚、角膜、心筋、弁、膜等の表層を覆う、あるいは膜状で機能する生体組織の少なくとも一部分を代替できる移植可能な厚みのあるバイオシートを与える結合組織を形成させるための基材を提供する。    【解決手段】  体内に埋入または挿入させて、その表面に細胞と細胞外マトリックス成分よりなる結合組織シート（バイオシート）を成長させる結合組織形成基材。主として、平面なシート状のもの、円柱状のものがある。【選択図】  無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
体内に挿入することによって、細胞を含む結合組織シート（バイオシート）を与える結合組織形成基材。
【請求項２】
移植先の形状に合わせたバイオシートを与える請求項１記載の結合組織形成基材。
【請求項３】
立体起伏のあるバイオシートを与える請求項１または２記載の結合組織形成基材。
【請求項４】
移植用皮膚、移植用心筋、移植用弁、移植用膜および移植用角膜のバイオシートを与える請求項１から３いずれか記載の結合組織形成基材。
【請求項５】
請求項１から４いずれか記載の結合組織形成基材を用いてバイオシートを作製する製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、欠損組織の代替材としてのシート状の結合組織シート（バイオシート）を与える結合組織形成基材ならびに該バイオシートの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
【特許文献１】特開２００３−１８０８１８号公報
【特許文献２】ＵＳ３，７１０，７７７
【０００３】
近年生化学的研究の発展により、生体内の細胞を用いて、欠損組織の代替材を作成する技術の開発が進められている。代表例として、生体内から採取した細胞を増殖させた後に足場基材の表面あるいは内部に播種、接着させて生体外で人工的に組織を作製する方法が知られている。
【０００４】
この場合、自己の細胞を使用すれば免疫上の問題は無く、また生体外で細胞を増殖できるため採取する組織は小量でよく、そのため患者の負担軽減につながるという利点がある。
【０００５】
しかし、生体外での細胞操作は厳密な無菌環境下において、数ヶ月にわたる煩雑な培養操作の繰り返しを必要とする問題点があり、操作時に細菌に感染する危険性を常に有している。また、培養に用いる動物由来の血清などにより移植後の炎症や拒絶反応などが起こり得ることが考えられる。さらに、立体的な形状を有する足場基材において均一に細胞を播種、培養することは困難であるため、通常の培養方法では、移植の目的とする部位の形状に合わせて組織形成させることはできない。そのため、平面にて作製した組織を裁断などによって立体形状に成型加工しなくてはならない。
【０００６】
生体内において移植用の組織を形成させる方法は、管状の組織に関してのみ報告されている。これらは生体の有する自己防衛反応による繊維芽細胞などによるカプセル形成能を利用するもので、例えば、特許文献１には、細胞非接着性ならびに抗血栓性を有する管状の足場基材を生体内に埋入させることによる形成方法が開示されている。これによると、細胞は生体内に埋入された細い棒状の足場基材の表面を覆うように成長することが記載されており、一定期間細胞を含む組織層を成長させた後に、足場基材を取り除くことにより自己細胞と細胞外マトリックスからなる結合組織による中空の菅腔体が形成されることが記載されている。このような中空菅腔体は、気管、胆管、腸管、尿道菅、尿管、卵管等の各種の組織菅腔として活用することができると示されている。
【０００７】
また、特許文献２には、血管代替物に限定した生体内での管状の結合組織体の形成に関することが開示されている。さらに、このような自己細胞組織による中空の菅腔体をつくる方法としてカプセル化を利用した同様な方法は、古くから行われており、多くの報告例がある。
【０００８】
一方、人工的な平面状の組織の作製には、生体外での細胞操作によってのみ行われている。培養中の細胞を培養基材から剥離する際には、通常トリプシン酵素処理で行うが、その場合、細胞間の結合も解裂するため、細胞は個々に分散する。従って、通常の培養系では、細胞から組織を作成することは、二次元の平面状であっても不可能である。
【０００９】
そのため、特殊な培養皿が考案され、培養系においてシート状の細胞集団として回収できる技術が開発されている。その培養皿は、表面を感温性ポリマーの一種であるＮ-イソプロピルアクリルアミドポリマーをグラフトしたものであり、生理的な温度変化で培養皿表面の親水／疎水性が調節できる。これによって、温度変化させることでコンフルエントな単層培養細胞のシートを細胞間の接着を損なうことなく回収できる。しかし、この方法のみでは、層状の三次元組織体を作成することはできない。そのため、得られた単層細胞シートを積層化させることによる三次元化法が開発されている。なお、細胞シートを積層化させることは物理的には何層でも可能であるが、組織層が厚くなると内部への栄養の供給や酸素の透過が困難になるため内部組織で壊死が生じる。従って、積層できる細胞シートは数枚程度が限界であるため、得られえる組織層は極薄くなり、縫合を伴う移植に耐え得る強度は有していない。
【００１０】
また、シート状の人工足場基材に細胞を播種、培養することで有る程度の厚みのあるシート状の組織体が作製され、人工皮膚などへの応用がなされている。しかし、前述したように、生体外での細胞操作には高度なクリーンルーム施設を必要とし、製作並びに移植後においても、感染、炎症、拒絶反応などを伴う危険性を有しており、かつ人工物が含まれるため異物反応や分解物による炎症反応が起こる可能性もある。さらに、患者の正常組織を犠牲にしなければならないため、治療における生活の質（QOL：クオリティ・オブ・ライフ）が低い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
生体内でのカプセル化を利用した組織形成法は、いずれも円筒形で形成され血管を中心に各種菅腔形状の欠損組織への代替材として利用されており、平面状の組織に使う試みは全くなされていない。
【００１２】
生体内でカプセル化を利用して形成させる組織には厚みがあり、生体組織と縫合できる十分な強度を有していることから、本発明者は、欠損組織の代替材として、シート状の結合組織シート（バイオシート）が利用できることを見出した。また、結合組織形成基材を移植部の形状と同様の平面形状または立体形状とすることで、形状にそったバイオシートを得ることができるため、移植部位の形状に合わせてバイオシートを移植前に予め成型加工することが容易である。
【００１３】
本発明は、移植などにより皮膚、角膜、心筋、弁、膜等の表層を覆う、あるいは膜状で機能する生体組織の少なくとも一部分を代替できる移植可能な厚みのあるバイオシートを与える結合組織を形成させるための基材を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の結合組織シート（バイオシート）を与える結合組織形成基材（請求項１）は、体内に埋入または挿入させて、その表面に細胞と細胞外マトリックス成分よりなる結合組織シートを成長させる足場基材である。その主な形状はシート状であるが、平面のバイオシートが得られるならば基材の形状は特に限定されるものではなく、円柱状やブロック状等でもよい。このような結合組織形成基材は、幾何学的な形状でなくてもよく、移植先の形状になるよう複雑な形のものでもよい（請求項２）。また、移植部位の形状に合わせる立体的なシート状のバイオシートを得るために、三次元的な構造をした基材や立体的な起伏を有する基材も利用される（請求項３）。
【００１５】
このようなバイオシートを与える結合組織形成基材は、シリコーン、アクリル樹脂、エステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂等を含む高分子素材の群から選ばれた材料であるものが好ましいが、他のの高分子素材でもよい。また、これらに加えて、チタンやステンレスなどの金属等、並びにガラスやアパタイト等の無機材料を加えてもよい。
【００１６】
また、基材の表面をコーティングするなどして表面の化学的性質や物理的性質を変化させても良い。さらに、細胞増殖因子などを表面に固定化させることで、バイオシートの形成速度を高めることも可能である。
【００１７】
生体内で結合組織を作製する方法、つまりカプセル化を利用した方法であれば、埋入基材と結合組織間は全く接着していないため、何の操作もなく細胞を破壊することなく厚みのある結合組織を取り出せる。従って、温度応答性基材などで使用されている特殊な表面処理や温度調節など余分な作業は全く必要ない。
【００１８】
また、本発明のバイオシートを与える結合組織の製造方法は、主にシート形状である高分子材料等を体内に埋入し、その材料の周囲に組織を成長させ、周囲に組織が成長した基材と共に体外に取り出し、基材と分離することによって、シート状のバイオシートを得ること（請求項５）を特徴としている。形成されたバイオシートは一定の厚みを有し、このバイオシートを移植用皮膚、移植用心筋、移植用弁、移植用膜、移植用角膜などとして使うのが好ましい（請求項４）。
【００１９】
本発明のバイオシートを与える結合組織形成基材（請求項１）は、主としてシート状のものであり、その表面で細胞が増殖し、組織が成長することによってシート状の結合組織シート（バイオシート）を形成することができる。
【００２０】
この成長した組織は、生体外で細胞培養したものに比して多層構造的に成長していることが特徴であり、勝つ組織内部には栄養血管である毛細血管網が一体構築されている。これにより、生体内に一定期間留置した結合組織形成基材を周囲に形成された結合組織と共に摘出し、結合組織を基材から剥離することにより、バイオシートを得、種々の移植用材料として使用することができる。
【００２１】
バイオシートの大きさや形状は基材の形状を設計することで自由に調節することができる（請求項２および３）ため、必要形状の裁断作業を極力少なくすることができる。必要な形状を狙って細胞を結合させるため、余分細胞を結合させる必要が無く、細胞レベルで見ると患者への負担を極力抑えられるものも特徴である。
【００２２】
また、得られたバイオシートは、凍結乾燥によって長期保存が可能であるため、移植対象患者の都合に合わせた作製ができる。また、脱細胞化などの処理を施すことで、免疫原性が消失し、異種移植なども可能となり、動物の体内にて作製したバイオシートを人に移植することもできる。また、形成基材の表面をスポンジ状の薄膜で密着して被膜化させておけば、スポンジを含んだバイオシートが形成され、より厚く、取扱い易く、移植時の操作性を向上させることが可能である。
【００２３】
さらに、前記結合組織形成基材の材質や種類をかえることで、形成されるバイオシートの物理的性質を調節できるため、移植の目的部位の組織物性に合うバイオシートを形成させることができる。
【００２４】
バイオシートは体内において形成され、結合組織形成基材の体内の留置部位は皮下組織内が好ましいが、腹腔内などでもよく、また移植部位の臓器や組織の表面や内部でも良い。
【００２５】
バイオシートは体内で成長させた自己組織であるため、前記結合組織が移植用皮膚、移植用心筋、移植用弁、移植用膜、移植用角膜として使っても、免疫上の問題が無い（請求項４）。
【００２６】
またバイオシートの形成、摘出操作はわずかな切開創から正常組織に傷害を与えることなく行える。従って、従来の皮膚移植などに比べて、ほとんど傷跡を残さないので、患者のQOLを高めた治療法が提供されると考えられる。
【００２７】
本発明のバイオシートの製造方法は、高分子材料等からなる主としてシート形状の基材を体内に埋入し、その基材の周囲に厚みのある細胞を成長させることができることが特徴である（請求項５）。周囲を覆う結合組織シートを体外にて分離し、厚みのあるバイオシートを容易に得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明のバイオシートを与える結合組織形成基材は、主として平面なシート状のものであるが、シート状のバイオシートが得られるのであれば形状は特に限定されるものではなく、立体形状をしていても良い。シート形状の結合組織形成基材は、厚さは０．０１〜０．２ｍｍが好ましい。また、立体形状のものを含めて、その大きさは、体内への影響度およびその取扱性から最大１０ｃｍ以下であるのが好ましい。しかし、特に制限されるものではなく、移植部位の面積に合わせて調整される。
【００２９】
結合組織形成基材の材料表面と形成されたバイオシートとの界面は、いずれの材質においても固着しておらず、バイオシートに全く損傷を与えることがなく、結合組織形成基材を容易に抜去し、バイオシートを得ることができる。
【００３０】
前記したように、バイオシートを与える結合組織形成基材に使用できる材料として、シリコーン、アクリル樹脂、エステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂等を含む高分子素材の群から選ばれた材料であるものが好ましい。しかし、他の高分子素材であってもよく、これらに加えて、チタンやステンレスなどの金属等、ならびにガラスやアパタイト等の無機材料も利用することができる。また基材の表面をコーティングするなどして表面の化学的性質や物理的性質を変化させることも可能である。さらに、細胞増殖因子などを表面に固定化させることで、バイオシートの形成速度を高めることも可能である。高分子材料として、シリコーンを用いた場合、短期間で比較的硬いバイオシートを与える。一方、アクリル樹脂を用いた場合には、形成速度は比較的遅いが柔軟で伸縮性に富むバイオシートが得られ、基材の材質を選ぶことで移植部位の物性に合わせたバイオシートを作製することができる。
【００３１】
移植先の形状が立体的である場合、その形に結合組織形成基材を加工した後、皮下に埋入することで、煩雑な形状の移植先であっても対応が取れる。また、移植先の形状が、二次元的に煩雑であっても、その形状の通り結合組織形成基材を加工するので、移植先の形状に応じた細胞の結合組織を得ることができる。結合組織形成基材の加工は、シリコーン、アクリル樹脂、ポリエステル樹脂などの高分子基材を用いることで、熱曲げ、切取り等容易に行うことができる。
【００３２】
また、本実施の形態ではラットの皮下に結合組織形成基材を埋入させ、バイオシートを形成させたが、人の皮下に結合組織形成基材を埋入させることにより得られるバイオシートは種々の移植用組織として使用することができるため好ましい。特に、移植用皮膚、移植用心筋、移植用弁、移植用膜、移植用角膜として用いるのが好ましい。
【００３３】
さらに、このバイオシートは、患者自身の細胞を患者の体内において成長させているため、移植しても異物反応が無いことが特徴である。また、脱細胞化することにより、他人や動物からの同種あるいは異種移植が可能であり、移植採取にともなう患者の負担の低減によりQOLをさらに向上できる。
【実施例】
【００３４】
［実施例１］
体重３００ｇのウイスターラットの背部皮下に、滅菌したシリコーン製円柱棒１０（直径１ｃｍ長さ２ｃｍ）を埋入し、通常の飼育条件で一ヶ月飼育した後、カプセル化によって形成されたシリコーン製円柱棒の周囲を取り巻く結合組織膜を摘出して、バイオシートが得られるかを確かめた。
【００３５】
皮下で形成された結合組織の外観を図１に示す。結合組織の膜で覆われたシリコーン製円柱棒１０は、皮下組織より容易に摘出することができた。摘出したシリコーン棒周囲に形成された結合組織膜１１の外観を図２に示す。組織は主として繊維芽細胞とコラーゲンから構成され、赤く（図１から３においては黒い部分）見えるところが、毛細血管が発達した部位である（図２においてシリコーン棒１０の下の黒い部分はシリコーン棒の影である）。しかし、図２の内部のシリコーン棒は周囲の結合組織膜とは全く接着しておらず、両者は損傷無く容易に分離することができた。得られた結合組織膜１１を切り出すことでシート状の結合組織膜１１であるバイオシート１１（結合組織膜）が回収できた。得られたバイオシートは、弾性と強靭性の両方を持っており、引伸ばして固定することも可能であった。その様子を図３に示す。しかし、円筒形の基材を使って作製したバイオシート１１は、円筒形の上面および下面の余分な部分を含んでおり、さらに円柱形の癖が残っているため、シート状に伸ばすと皺ができ、また厚みに偏りがある。円筒形の結合組織形成基材の上面および下面部に形成される結合組織膜は無駄になるため非効率である。円筒形の結合組織形成基材でバイオシートを形成できたが、形成されたバイオシートは品質において最良ではなかった。
【００３６】
［実施例２］
体重３００ｇのウイスターラットの背部皮下に滅菌したシリコーン膜２０（２×３ｃｍ）を埋入し、通常の飼育条件で１ヶ月飼育した後、カプセル化によって形成されたシリコーン膜の周囲を取り巻く結合組織膜を摘出して、バイオシートが得られるかを確かめた。
【００３７】
皮下でシリコーン膜２０の周囲に形成された結合組織の外観を図４に示す。内部にシリコーン膜２０を含む結合組織膜２１は皮下組織とは全く接着しておらず容易に摘出することができた（図５）。シリコーン膜で形成された結合組織も棒からのものと同様に繊維芽細胞とコラーゲンから構成されていた。赤く見える部位（図４から５においては黒い部分）で毛細血管が発達している。内部のシリコーン膜２０と結合組織２１とは全く接着しておらず、図６に示すように全くストレス無く内部のシリコーン膜２０を抜去でき、シート状の結合組織膜２１であるバイオシート２１（結合組織膜）が得られた。得られたバイオシート２１は、シリコーン棒から形成されたものに比べて、平面状態で得られるため、皺が無く、厚みが均一であるため品質安定性に優れ、さらに作製量は必要際少量でよいため効率が良いことが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ウイスターラット背部に結合組織形成基材であるシリコーン製円柱棒（直径１ｃｍ長さ２ｃｍ）を埋入し、一月後の摘出写真である。
【図２】結合組織形成基材であるシリコーン棒の周囲を、形成された細胞の結合組織が覆っている摘出後の写真である。
【図３】細胞の結合組織を結合組織形成基材から剥離し、シートの状態で引き延ばして固定した写真である。
【図４】ウイスターラット背部皮下に結合組織形成基材であるシリコーン膜（２×３ｃｍ）を埋入し、一月後の摘出写真である。
【図５】シリコーン棒と同様に細胞の結合組織できれいに覆われている摘出後の写真である。
【図６】結合組織形成基材であるシリコーン膜から細胞の結合組織を剥がして展開している写真である。
【符号の説明】
【００３９】
１０  シリコーン製円柱棒
１１  結合組織膜（バイオシート）
２０  シリコーン膜
２１  結合組織膜（バイオシート）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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