(57)【要約】【課題】  蛋白質の機能をより簡便に識別することができる蛋白質の機能識別方法を提供する。【解決手段】  任意の第１の蛋白質のアミノ酸配列と、その配列をコードするｍＲＮＡに対して相補的なｍＲＮＡと、を用いて、前記第１の蛋白質の生物活性能を識別する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意の第１の蛋白質のアミノ酸配列と、その配列をコードするｍＲＮＡに対して相補的なｍＲＮＡと、を用いて、前記第１の蛋白質の生物活性能を識別することを特徴とする蛋白質の機能識別方法。
【請求項２】
任意の第１の蛋白質が特異的結合する任意の第２の蛋白質のアミノ酸配列と、その配列をコードするｍＲＮＡに対して相補的なｍＲＮＡと、を用いて、前記第１の蛋白質の生物活性阻止能を識別することを特徴とする蛋白質の機能識別方法。
【請求項３】
任意の第１の蛋白質が結合する二重鎖ＤＮＡ配列を普遍的なコドン表に基づいて作成した３種類の仮想アミノ酸配列と、その仮想のセンスｍＲＮＡ又は仮想のアンチｍＲＮＡと、を用いて、前記第１の蛋白質の生物活性抑制能を識別することを特徴とする蛋白質の機能識別方法。
【請求項４】
前記第１の蛋白質がインヒビター又はリプレッサー蛋白質と称されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の蛋白質の機能識別方法。
【請求項５】
前記二重鎖ＤＮＡ配列がプロモーター又はオペレーター領域と称されることを特徴とする請求項４に記載の蛋白質の機能識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質の活性阻止又は抑制能等の機能を識別する蛋白質の機能識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２種類の蛋白質と蛋白質との結合様式、又は蛋白質とその結合する任意の二重鎖ＤＮＡ配列との結合様式を識別するためには遺伝子組み替え技術と細胞（例えば、ツーハイブリッドシステム）等を使って、生物活性評価を行うことによって、所望の活性の有無を同定することが知られている。しかしながら、この方法は擬陽性の結果が多いので経済的負担も大きく、より優れた簡便な識別方法の開発が望まれている。
【０００３】
【非特許文献１】N. Numao et al., Chem. Parm. Bull., 51, 550-559(2003); ibidem,1217-1219(2003); ibidem, 52, 337-339 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、蛋白質の機能をより簡便に識別することができる蛋白質の機能識別方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意検討した結果、任意の２種類の蛋白質同士の結合様式を識別するために、それらの天然型アミノ酸配列とそれらのアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡに対して相補的なＲＮＡ（以下、アンチｍＲＮＡと称す）を使って、非特許文献１に記載の数理的計算方法に基づいた計算を行うことにより、何れか一方の蛋白質が他方の蛋白質の生物活性を阻止することが推定出来ることを見出した。但し、非特許文献１には蛋白質のアンチｍＲＮＡを使った数理的解析方法が全く言及されていない。
【０００６】
本発明者は、更に、下記の方法により、ＲＮＡポリメラーゼの転写活性を抑制する蛋白質が推定できることを見出した。
（Ｉ）；先ず、任意の蛋白質（Ａ、Ｂ又はＣ）のアミノ酸配列とその配列をコードするｍＲＮＡに対しするアンチｍＲＮＡを使い、非特許文献１に記載の数理的計算方法に基づいて計算する。
（ＩＩ）；次に、その任意の蛋白質が結合する二重鎖ＤＮＡ配列（Ｄ）（例えば、プロモーター／オペレーター塩基配列）を３種類の仮想アミノ酸配列に変換し、更にそれらの仮想のｍＲＮＡ（又は仮想のアンチｍＲＮＡ）を使って、非特許文献１に記載の数理的計算方法に基づいて計算する。但し、二重鎖ＤＮＡ配列（Ｄ）のうち、ｍＲＮＡの転写開始地点から３’方向約１０００塩基下流以内に任意の蛋白質のアミノ酸翻訳開始コドン（ａｕｇ；Ｍｅｔ）のある配列を本明細書では仮想センス核酸配列とする。
（ＩＩＩ）；最後に、（Ｉ）と（ＩＩ）とを非特許文献１に記載の方法で処理する。
【０００７】
そして、本発明の生物活性発現を阻止又は抑制する任意の蛋白質の特定方法は上記何れかの方法を用いたことを特徴とする。
【０００８】
即ち、本願の第１の発明に係る蛋白質の機能識別方法は、任意の第１の蛋白質のアミノ酸配列と、その配列をコードするｍＲＮＡに対して相補的なｍＲＮＡと、を用いて、前記第１の蛋白質の生物活性能を識別することを特徴とする。
【０００９】
本願の第２の発明に係る蛋白質の機能識別方法は、任意の第１の蛋白質が特異的結合する任意の第２の蛋白質のアミノ酸配列と、その配列をコードするｍＲＮＡに対して相補的なｍＲＮＡと、を用いて、前記第１の蛋白質の生物活性阻止能を識別することを特徴とする。
【００１０】
本願の第３の発明に係る蛋白質の機能識別方法は、任意の第１の蛋白質が結合する二重鎖ＤＮＡ配列を普遍的なコドン表に基づいて作成した３種類の仮想アミノ酸配列と、その仮想のセンスｍＲＮＡ又は仮想のアンチｍＲＮＡと、を用いて、前記第１の蛋白質の生物活性抑制能を識別することを特徴とする。なお、第３の発明においては、第１の蛋白質として、転写を阻止又は抑制する蛋白質を選択することが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、蛋白質の機能（生物活性阻止又は抑制能）を、そのアミノ酸配列及びアンチｍＲＮＡを使って数理学的に識別するため、容易に識別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明に係わる方法は、種々の蛋白質の色々な生物活性を阻止する蛋白質、又はオペレーター（又はプロモーター）領域と称されるＤＮＡ配列に結合してＲＮＡポリメラーゼ等による転写を阻止する蛋白質を推測する一般的方法である。また、高速演算用コンピュータと非特許文献１のパラメータを使って、任意の蛋白質の別の蛋白質に対するインヒビター活性能や他のＤＮＡ塩基配列に対するリプレッサー活性能を推測するプログラムの作製も容易にできる。更に、本方法の基本概念と、遺伝子工学に関する公知技術を使えば、特定の抗原蛋白質（又は塩基配列）に対する中和抗体蛋白質も人為的に作製できることは自明である。従って、生物活性阻止または抑制を有する新規蛋白質（医薬品や診断薬など）の開発及びその探索用スクリーニングシステムの開発も容易に推測できるので、この開発の際に本発明に係る方法を実施することは、本発明の技術的範囲に属する。また、以下の実施例に記載されていない蛋白質又はＤＮＡ配列に対して、本発明に係わる方法を適用することも本発明の技術的範囲に属する行為である。
【実施例１】
【００１３】
−酵母由来のＧＡＬ４蛋白質とＧＡＬ８０蛋白質との特異的結合−
２０種類のアミノ酸側鎖及び核酸残基の物理化学的パラメータとして疎水度数値（アミノ酸は１文字表記とする。即ち、Ｌ＝３．２９，Ｉ＝３．６４，Ｎ＝１６．１４，Ｇ＝１４．７９，Ｖ＝７．５０，Ｅ＝１４．６４，Ｐ＝７．５７，Ｈ＝１２．７９，Ｋ＝１６．２１，Ａ＝１２．０７，Ｙ＝４．５７，Ｗ＝２．５７，Ｑ＝１４．３６，Ｍ＝６．５７，Ｓ＝１４．９３，Ｃ＝８．２９，Ｔ＝１３．６４，Ｆ＝２．６４，Ｒ＝１５．９３，Ｄ＝１６．２９；核酸残基は１文字表記とする。即ち、ｕ＝０．６９，ｃ＝０．６２，ａ＝０．２６，ｇ＝０．４４）を使い、非特許文献１に記載の数理的計算方法に従って計算した。ここで、具体的な操作法について、酵母由来のＧＡＬ４蛋白質とＧＡＬ８０蛋白質を取り上げ、本発明方法に基づいてＧＡＬ４蛋白質のポジティブな転写活性がＧＡＬ８０蛋白質によって阻止されることを説明する（S. Marc et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5922-5926 (1992)）。
【００１４】
ＧＡＬ４蛋白質に対して、
操作（１）；８８１個のアミノ酸で構成されたＧＡＬ４蛋白質の各アミノ酸残基に対して、上記の疎水度数値を与えて親媒性の数値列を作製する。作製された数値列についてポイント数４０９６で離散的フーリエ解析を行う。そして、解析結果について、縦軸を相対強度、横軸を出現頻度数（又は周波数値；０〜０．５）とする図形を描く。
操作（２）；ＧＡＬ４蛋白質の８８１残基のアミノ酸配列をコードしている２６４３塩基のｍＲＮＡ配列の各核酸側鎖に対して、上記の疎水度数値を与え数値列を作製する。作製された数値列についてポイント数４０９６で離散的フーリエ解析を行う。作製された数値列についてポイント数４０９６で離散的フーリエ解析を行う。そして、解析結果について、縦軸を相対強度、横軸を出現頻度数（又は周波数値；０〜０．５）とする図形を描く。
操作（３）；上記（２）で記載したｍＲＮＡ配列に対応する相補的な（又はアンチ）ｍＲＮＡに対して上記の疎水度数値を与え数値列を作製する。作製された数値列についてポイント数４０９６で離散的フーリエ解析を行う。そして、解析結果について、縦軸を相対強度、横軸を出現頻度数（又は周波数値；０〜０．５）とする図形を描く。
操作（４）；上記（３）で作製された相補的なアンチｍＲＮＡに対して普遍的コドンを用いて翻訳された仮想の（又は相補的な）８８１個のアミノ酸配列の各アミノ酸残基に対しても上記の疎水度数値を与えた数値列を作製する。そして、作製された数値列について、ポイント数４０９６で離散的フーリエ解析を行う。
操作（５）；上記の操作（１）と操作（３）のスペクトルを数理的に掛け合わせたクロススペクトルを作製する。そして、出現したピークのうち高いピーク１５本を選択する。
操作（６）；上記の操作（２）と操作（４）のスペクトルを数理的に掛け合わせたクロススペクトルを作製する。そして、出現したピークのうち高いピーク１５本を選択する。
操作（７）；操作（６）で得られた１５本のピークの出現頻度定数値に対して０．５から出現頻度定数値を引いた数値を与える。
操作（８）；操作（５）で選択された１５本のピークから、操作（６）で得られた１５本のピークの出現頻度数値と一致乃至近似な値を持つピークを選択する（ＧＡＬ４蛋白質の対称性１を有するピークと称す）。
操作（９）；操作（５）で選択された１５本のピークから、操作（７）で得られた１５本のピークの出現頻度数値と一致乃至近似な値を持つピークを選択する（ＧＡＬ４蛋白質の対称性２を有するピークと称す）。
【００１５】
次に、ＧＡＬ８０蛋白質のアミノ酸配列（アミノ酸残基数；４３５個）と核酸配列（核酸残基数；１３０５個）についても、上記の一連の操作（１）〜（９）を行い、操作（８）の段階でＧＡＬ８０蛋白質に対する対称性１を有するピークを選択する。また、操作（９）の段階でＧＡＬ８０蛋白質に対する対称性２を有するピークを選択する。
【００１６】
操作（１０）；最後に、ＧＡＬ４蛋白質とＧＡＬ８０蛋白質の結合様式を識別するために、先ず、ＧＡＬ４蛋白質の対称性１を有するピーク値とＧＡＬ８０蛋白質の対称性１を有するピーク値とが一致するピーク値を数理的処理によって求める。次に、ＧＡＬ４蛋白質の対称性２を有するピーク値とＧＡＬ８０蛋白質の対称性２を有するピーク値の何れか一方のピーク値に対して０．５から出現品後数値（ｆ値）を引く操作を行い、互いに一致するピーク値を数理的処理によって求める。こうして、ＧＡＬ４蛋白質とＧＡＬ８０蛋白質の何れか一方の蛋白質において対称性１を有するピーク値と対称性２を有するピーク値の総和が約０．５になれば特異的結合とする。但し、両者の蛋白質が同時に１本成立することは除外する。
【００１７】
その結果、ＧＡＬ４蛋白質由来の特徴的なピーク２本（ｆ＝０．１８０２，０．３２１８）のうちの１本（ｆ＝０．１８０２）がＧＡＬ８０蛋白質由来の特徴的なピークの１本（ｆ＝０．１８９９）と一致することが本発明より明らかとなった。更に、同一条件下、ＧＡＬ４蛋白質とＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ３、ＧＡＬ５、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ１１、又はＭＥＬ１蛋白質との間にはそのような特異的な相関関係が見出されなかった。従って、ＧＡＬ４蛋白質とＧＡＬ８０蛋白質の結合様式は選択的である。
【実施例２】
【００１８】
−ラムダファージ由来のｃＩ蛋白質とｐＬプロモーター／オペレーター領域（ＤＮＡ配列）との特異的結合−
ｃＩ蛋白質（アミノ酸残基数；２３７個、核酸残基数；７１１個）はｐＬ（又はｐＲ）プロモーター／オペレーター領域の二重さＤＮＡ配列に結合し、その下流にあるＮ蛋白質（又はｃｒｏ蛋白質）の遺伝子発現を阻止するリプレッサー蛋白質である（M. Ptashne et al., Science, 194, 156-161 (1976)）。
２０種類のアミノ酸側鎖及び４種類の核酸側鎖の物理化学的パラメータとして、上記の疎水度数値を使い実施例１記載の操作法に従い、ｃＩ蛋白質の対称性１を有するピーク１５本と対称性２を有するピーク１５本を導く。
【００１９】
一方、ｃＩ蛋白質が結合するｐＬプロモーター／オペレーター領域の核酸配列領域は以下の様に設定した。即ち、その計算領域はＮ蛋白質の最初アミノ酸（ａｕｇ；Ｍｅｔ）のａ（＋１）から５’方向へ５００塩基（範囲；−１→−５００）までとした。但し、計算範囲はこの塩基数に限定されるものではなく、本方法で用いているフーリエ解析法を低下させない塩基数を使うことが望ましい。好ましくは、範囲は約１００塩基以上あればよい。
本実施例では、センスの塩基配列に対して（−５００→−１）、（−４９９→−１）、（−４９８→−１）まで、５’側の核酸塩基を１個ずつシフトさせて仮想のアミノ酸配列を作製した。同時に、対応する仮想のアンチセンスアミノ酸配列も作製する。これらを用いた具体的な操作法は、実施例１で説明したＧＡＬ４蛋白質の代わりにそれらの３種類の仮想アミノ酸配列を計算すればよい。結果として、（−５００→−１）、（−４９９→−１）及び（−４９８→−１）から対称性１を有するピークと対称性２を有するピークを導く。合計で３セット用意する。
次いで、上記記載の操作（１０）に従い、ｃＩ蛋白質と（−５００→−１）、（−４９９→−１）及び（−４９８→−１）からの仮想アミノ酸配列から、対称性の保存されたピークを求めればよい。
【００２０】
解析結果は以下の通りである。
（解１）ｃＩ蛋白質由来の特徴的なピーク２本（ｆ＝０．１３８７，０．３６０４）のうちの１本（ｆ＝０．１３８７）が（−５００→−１）由来の仮想アミノ酸配列の特徴的なピークの１本（ｆ＝０．１３２８）と一致することが本発明より明らかとなった。
（解２）ｃＩ蛋白質由来の特徴的なピーク２本（ｆ＝０．１３８７，０．３６０４）のうちの１本（ｆ＝０．１３８７）が（−４９９→−１）由来の仮想アミノ酸配列の特徴的なピークの１本（ｆ＝０．１３２８）と一致することが本発明より明らかとなった。
（解３）ｃＩ蛋白質由来の特徴的なピーク２本（ｆ＝０．１３８７，０．３６０４）のうちの１本（ｆ＝０．１３８７）が（−４９８→−１）由来の仮想アミノ酸配列の特徴的なピークの１本（ｆ＝０．１３２８）と一致することが本発明より明らかとなった。
【実施例３】
【００２１】
−酵母由来ＭＩＧ１蛋白質とＧＡＬ１−ＧＡＬ１０プロモーター領域（ＤＮＡ配列）との特異的結合−
ＭＩＧ１蛋白質（アミノ酸残基数；５０４個、核酸残基数；１５１２個）（E. Frolova et al., Nucleic acids Res., 27, 1350-1358 (1999)）は、ＧＡＬ１−ＧＡＬ１０プロモーター領域（ＤＮＡ配列）の二重鎖ＤＮＡ配列（６８０個）（M. Johnson et al., Mol. Cell. Biol., 4, 1440-1448 (1984)）に特異的に結合し、その下流のＧＡＬ１蛋白質又はＧＡＬ１０蛋白質の遺伝子発現を抑制することが知られている。
２０種類のアミノ酸側鎖及び核酸残基の物理化学的パラメータとして、上記記載の疎水度数値を使い、実施例１と同様にして、ＭＩＧ１蛋白質の対称性１を有するピーク１５本と対称性２を有するピーク１５本を導く。
【００２２】
他方、ＭＩＧ１蛋白質が結合するＧＡＬ１−ＧＡＬ１０プロモーター領域の二重鎖ＤＮＡ配列（６８０個）に対しては、その下流にあるＧＡＬ１蛋白質の最初のアミノ酸（ａｕｇ；Ｍｅｔ）とＧＡＬ１０蛋白質の最初のアミノ酸（ａｕｇ；Ｍｅｔ）に挟まれた二重鎖鎖ＤＮＡ配列（６８０個）を互いに、３種類の仮想アミノ酸配列に翻訳した。この場合、その二重鎖ＤＮＡ配列は互いに下流にＧＡＬ１蛋白質とＧＡＬ１０蛋白質がコードされているので、何れの塩基配列も本明細書では仮想センス塩基配列になりうるので、具体的には２種類の計算プロセスが生じることになる。
先ず、下流にＧＡＬ１蛋白質をコードする塩基配列、即ち（−６８０→−１）、（−６７９→−１）、（−６７８→−１）に対して、５’側の核酸塩基を１個ずつシフトさせて仮想のセンスアミノ酸配列を作製する。同時に、対応する仮想のアンチセンスアミノ酸配列も作製する。こうして、下流にＧＡＬ１蛋白質をコードする塩基配列を翻訳した仮想のアミノ酸配列に対して、実施例２で例示した操作を行い、対称性１を有するピーク１５本と対称性２を有するピーク１５本を導く。
次に、下流にＧＡＬ１０蛋白質をコードする塩基配列（−６８０→−１）、（−６７９→−１）、（−６７８→−１）に対しても、５’側の核酸塩基を１個ずつシフトさせて仮想センスアミノ酸配列を作製した。同時に、対応する仮想のアンチセンスアミノ酸配列も作製する。こうして、下流にＧＡＬ１０蛋白質をコードする塩基配列を翻訳した仮想のアミノ酸配列に対して、実施例２でした操作を行い、対称性１を有するピーク１５本と対称性２を有するピーク１５本を導く。
最後に、上記操作（１０）に従って、ＭＩＧ１蛋白質のアミノ酸配列とＧＡＬ１−ＧＡＬ１０プロモーター領域（ＤＮＡ配列）由来の２種類の仮想センスアミノ酸配列から、対称性の保存された特徴的なピークの有無を検討する。
【００２３】
（その１）ＭＩＧ１蛋白質と３’下流にＧＡＬ１蛋白質をコードしているＧＡＬ１−ＧＡＬ１０プロモーター領域（ＤＮＡ配列）に関する解析結果は以下の通り。
（解析結果１）；ＭＩＧ１蛋白質由来の特徴的なピーク（ｆ＝０．１２００）が（−６８０→−１）由来の仮想アミノ酸配列由来の特徴的なピーク２本（ｆ＝０．１２５０，０．３７３０）ののうちの１本（ｆ＝０．１２５０）と一致した。
（解析結果２）；ＭＩＧ１蛋白質由来の特徴的なピークと（−６７９→−１）由来の仮想アミノ酸配列由来の特徴的なピークとの間には一致するピークは存在しなかった。
（解析結果３）；ＭＩＧ１蛋白質由来の特徴的なピークと（−６７８→−１）由来の仮想アミノ酸配列由来の特徴的なピークとの間には一致するピークは存在しなかった。
更に、同一条件下、ＧＡＬ４蛋白質と３’下流にＧＡＬ１蛋白質をコードしているＧＡＬ１−ＧＡＬ１０プロモーター領域（ＤＮＡ配列）との間には上記のような結果が得られなかった。
【００２４】
（その２）ＭＩＧ１蛋白質と３’下流にＧＡＬ１０蛋白質をコードしているＧＡＬ１−ＧＡＬ１０プロモーター領域（ＤＮＡ配列）に関する解析結果は以下の通り。
（解析結果１）；ＭＩＧ１蛋白質由来の特徴的なピーク（ｆ＝０．１２９９）が（−６８０→−１）由来の仮想アミノ酸配列由来の特徴的なピーク２本（ｆ＝０．１２５０，０．３７３０）のうちの１本（ｆ＝０．１２５０）と一致した。
（解析結果２）；ＭＩＧ１蛋白質由来の特徴的なピークと（−６７９→−１）由来の仮想アミノ酸配列由来の特徴的なピークとの間には一致するピークは存在しなかった。
（解析結果３）；ＭＩＧ１蛋白質由来の特徴的なピーク（ｆ＝０．１２９９）が（−６７８→−１）由来の仮想アミノ酸配列由来の特徴的なピーク２本（ｆ＝０．１２５０，０．３７３０）のうちの１本（ｆ＝０．１２５０）と一致した。
更に、同一条件下、ＧＡＬ４蛋白質と３’下流にＧＡＬ１０蛋白質をコードしているＧＡＬ１−ＧＡＬ１０プロモーター領域（ＤＮＡ配列）との間には上記のような結果が得られなかった。