(57)【要約】【課題】細胞の活性が失われにくい状況を確保しながら、長期に亘って細胞の同一性を確認しながら同一の細胞についての細胞パラメータを経時的に取得する。【解決手段】細胞を培養する培養手段１０１に収容されている細胞を撮像した画像の細胞画像データを用いて細胞の観察を行っているため、長期に亘って同一の視野範囲で観察を行いやすくなり、長期に亘って細胞の同一性を確認しながら同一の細胞についての細胞パラメータを取得することができ、この場合、赤外光撮像手段２１１で培養中の細胞を観察するため、観察期間ないし培養期間が長期に及ぶ場合でも、細胞に対する観察光の影響を低く抑えて、細胞の活性が失われにくくなる。【選択図】        図１
2006238802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置であって、
細胞を培養する培養手段と、
赤外光線によって細胞を撮像する赤外光撮像手段を少なくとも含み前記培養手段に収容されている細胞を撮像する撮像手段と、
該撮像手段で撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識手段と、
該細胞認識手段で認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づき計測する細胞パラメータ計測手段と、
異なる時点で撮像された画像の前記細胞画像データから認識された異なる時点の細胞同士の同一性を前記細胞パラメータに基づいて判別する細胞追跡手段と、
を備えることを特徴とする細胞観察装置。
【請求項２】
前記撮像手段は、前記赤外光撮像手段によって前記細胞画像データを取得することを特徴とする請求項１に記載の細胞観察装置。
【請求項３】
前記撮像手段は、前記培養手段に収容されている細胞から発せられる光を撮像する細胞光撮像手段をさらに有し、該細胞光撮像手段によって前記細胞画像データを取得することを特徴とする請求項１に記載の細胞観察装置。
【請求項４】
所定の時点における前記細胞画像データを取得したことを認識する撮像時点認識手段と、
該撮像時点認識手段で認識した結果を操作者に報知するための報知手段と、
をさらに備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の細胞観察装置。
【請求項５】
前記培養手段に収容されている細胞を撮像した画像の中で細胞が占める度合いを示す細胞占有値を算出する占有面積算出手段と、
前記細胞占有値が所定の値になったときに、該細胞占有値が該所定の値になったことを操作者に知らせる報知手段と、
をさらに備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の細胞観察装置。
【請求項６】
前記培養手段は、前記細胞を収容する筐体を備え、
前記撮像手段は、固体撮像素子を備え、
前記筐体と前記固体撮像素子との断熱を行う断熱手段をさらに備えることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の細胞観察装置。
【請求項７】
前記細胞パラメータ計測手段で計測した前記細胞パラメータのうち前記細胞追跡手段で同一性があると判別した細胞の前記細胞パラメータ同士を関連付けて記録する記録手段をさらに備えることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１つに記載の細胞観察装置。
【請求項８】
前記細胞認識手段で認識した細胞を表す画像と複数時点の細胞についての前記細胞パラメータとを関連付けて表示する細胞パラメータ表示手段をさらに備えることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１つに記載の細胞観察装置。
【請求項９】
細胞のアポトーシスを前記細胞パラメータに基づいて検出するアポトーシス検出手段をさらに備えることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１つに記載の細胞観察装置。
【請求項１０】
前記細胞認識手段で認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出手段をさらに備えることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１つに記載の細胞観察装置。
【請求項１１】
細胞のアポトーシスを前記細胞パラメータに基づいて検出するアポトーシス検出手段と、
前記細胞認識手段で認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出するための細胞分裂検出手段と、
前記アポトーシス検出手段による検出を行うか否かと、前記細胞分裂検出手段による検出を行うか否かを、それぞれ選択する検出機能選択手段と、
をさらに備えることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１つに記載の細胞観察装置。
【請求項１２】
前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点における細胞の面積を示す細胞パラメータと面積に関する閾値とを比較するとともに、該検出対象時点における細胞の輝度を示す細胞パラメータと該検出対象時点に対して比較の対象となる時点における細胞の輝度を示す細胞パラメータとを比較し、それぞれの比較結果に基づいて該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする請求項１０又は１１に記載の細胞観察装置。
【請求項１３】
前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点よりも時系列的に前の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータの値を参照し、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする請求項１０又は１１に記載の細胞観察装置。
【請求項１４】
前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点よりも時系列的に前の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータの値を参照し、該円形度を示す細胞パラメータの値が円形度に関する閾値と所定の関係を有している細胞を撮像した判定基準時点を抽出し、該判定基準時点近傍の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータ及び面積を示す細胞パラメータの値の増減傾向に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする請求項１０又は１１に記載の細胞観察装置。
【請求項１５】
前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点における細胞の細胞核の存在範囲の面積と細胞質の存在範囲の面積とを比較した結果に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする請求項１０又は１１に記載の細胞観察装置。
【請求項１６】
前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点における細胞の微小管の局在領域を求め、細胞中の複数個所に局在しているか否かを検出することで、当該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする請求項１０又は１１に記載の細胞観察装置。
【請求項１７】
前記細胞分裂検出手段は、撮像された画像の細胞に対応する領域内で輝度に関する閾値よりも高い輝度値を示す画素について各画素の輝度値を合計した輝度総和を示す領域パラメータを、検出対象時点近傍の時点について求め、該検出対象時点近傍の時点についての前記輝度総和の変化の様子に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする請求項１０又は１１に記載の細胞観察装置。
【請求項１８】
前記細胞分裂検出手段の検出結果に基づいて細胞系譜を作成する細胞系譜作成手段をさらに備えることを特徴とする請求項１０〜１７のいずれか１つに記載の細胞観察装置。
【請求項１９】
前記細胞系譜作成手段で作成した細胞系譜を木構造で表した画像として表示する細胞系譜表示手段をさらに備えることを特徴とする請求項１８に記載の細胞観察装置。
【請求項２０】
前記細胞系譜表示手段は、前記細胞認識手段で認識した細胞を表す画像と前記細胞系譜を表す画像とを関連付けて表示することを特徴とする請求項１９に記載の細胞観察装置。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１つに記載の細胞観察装置を備える顕微鏡システムであって、
細胞を拡大投影する結像光学系を備え、
前記撮像手段は、前記結像光学系の結像面に拡大投影された細胞を撮像することを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項２２】
細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置であって、
細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識手段と、
該細胞認識手段で認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づき計測する細胞パラメータ計測手段と、
前記細胞認識手段で認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出手段と、
を備え、
前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点における細胞の面積を示す細胞パラメータと面積に関する閾値とを比較するとともに、該検出対象時点における細胞の輝度を示す細胞パラメータと該検出対象時点に対して比較の対象となる時点における細胞の輝度を示す細胞パラメータとを比較し、それぞれの比較結果に基づいて該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする細胞観察装置。
【請求項２３】
細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置であって、
細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識手段と、
該細胞認識手段で認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づき計測する細胞パラメータ計測手段と、
前記細胞認識手段で認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出手段と、
を備え、
前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点よりも時系列的に前の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータの値を参照し、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする細胞観察装置。
【請求項２４】
細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置であって、
細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識手段と、
該細胞認識手段で認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づき計測する細胞パラメータ計測手段と、
前記細胞認識手段で認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出手段と、
を備え、
前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点よりも時系列的に前の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータの値を参照し、該円形度を示す細胞パラメータの値が円形度に関する閾値と所定の関係を有している細胞を撮像した判定基準時点を抽出し、該判定基準時点近傍の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータ及び面積を示す細胞パラメータの値の増減傾向に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする細胞観察装置。
【請求項２５】
細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置であって、
細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識手段と、
該細胞認識手段で認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づき計測する細胞パラメータ計測手段と、
前記細胞認識手段で認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出手段と、
を備え、
前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点における細胞の細胞核の存在範囲の面積と細胞質の存在範囲の面積とを比較した結果に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする細胞観察装置。
【請求項２６】
細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置であって、
細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識手段と、
該細胞認識手段で認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づき計測する細胞パラメータ計測手段と、
前記細胞認識手段で認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出手段と、
を備え、
前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点における細胞の微小管の局在領域を求め、細胞中の複数個所に局在しているか否かを検出することで、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする細胞観察装置。
【請求項２７】
細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置であって、
細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識手段と、
該細胞認識手段で認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づき計測する細胞パラメータ計測手段と、
前記細胞認識手段で認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出手段と、
を備え、
前記細胞分裂検出手段は、撮像された画像の細胞に対応する領域内で輝度に関する閾値よりも高い輝度値を示す画素について各画素の輝度値を合計した輝度総和を示す領域パラメータを、検出対象時点近傍の時点について求め、該検出対象時点近傍の時点についての前記輝度総和の変化の様子に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする細胞観察装置。
【請求項２８】
細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置で細胞の観察を行う細胞観察プログラムであって、
前記細胞観察装置に、
細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識ステップと、
該細胞認識ステップで認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づいて計測する細胞パラメータ計測ステップと、
前記細胞認識ステップで認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出ステップと、
を実行させるステップを含み、
前記細胞分裂検出ステップは、検出対象時点における細胞の面積を示す細胞パラメータと面積に関する閾値とを比較するとともに、該検出対象時点における細胞の輝度を示す細胞パラメータと該検出対象時点に対して比較の対象となる時点における細胞の輝度を示す細胞パラメータとを比較し、それぞれの比較結果に基づいて当該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出するステップであることを特徴とする細胞観察プログラム。
【請求項２９】
細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置で細胞の観察を行う細胞観察プログラムであって、
前記細胞観察装置に、
細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識ステップと、
該細胞認識ステップで認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づいて計測する細胞パラメータ計測ステップと、
前記細胞認識ステップで認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出ステップと、
を実行させるステップを含み、
前記細胞分裂検出ステップは、検出対象時点よりも時系列的に前の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータの値を参照し、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出するステップであることを特徴とする細胞観察プログラム。
【請求項３０】
細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置で細胞の観察を行う細胞観察プログラムであって、
前記細胞観察装置に、
細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識ステップと、
該細胞認識ステップで認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づいて計測する細胞パラメータ計測ステップと、
前記細胞認識ステップで認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出ステップと、
を実行させるステップを含み、
前記細胞分裂検出ステップは、検出対象時点よりも時系列的に前の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータの値を参照し、該円形度を示す細胞パラメータの値が円形度に関する閾値と所定の関係を有している細胞を撮像した判定基準時点を抽出し、該判定基準時点近傍の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータ及び面積を示す細胞パラメータの値の増減傾向に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出するステップであることを特徴とする細胞観察プログラム。
【請求項３１】
細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置で細胞の観察を行う細胞観察プログラムであって、
前記細胞観察装置に、
細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識ステップと、
該細胞認識ステップで認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づいて計測する細胞パラメータ計測ステップと、
前記細胞認識ステップで認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出ステップと、
を実行させるステップを含み、
前記細胞分裂検出ステップは、検出対象時点における細胞の細胞核の存在範囲の面積と細胞質の存在範囲の面積とを比較した結果に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出するステップであることを特徴とする細胞観察プログラム。
【請求項３２】
細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置で細胞の観察を行う細胞観察プログラムであって、
前記細胞観察装置に、
細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識ステップと、
該細胞認識ステップで認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づいて計測する細胞パラメータ計測ステップと、
前記細胞認識ステップで認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出ステップと、
を実行させるステップを含み、
前記細胞分裂検出ステップは、検出対象時点における細胞の微小管の局在領域を求めて、細胞中の複数個所に局在しているか否かを検出することで、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出するステップであることを特徴とする細胞観察プログラム。
【請求項３３】
細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置で細胞の観察を行う細胞観察プログラムであって、
前記細胞観察装置に、
細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識ステップと、
該細胞認識ステップで認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づいて計測する細胞パラメータ計測ステップと、
前記細胞認識ステップで認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出ステップと、
を実行させるステップを含み、
前記細胞分裂検出ステップは、撮像された画像の細胞に対応する領域内で輝度に関する閾値よりも高い輝度値を示す画素について各画素の輝度値を合計した輝度総和を示す領域パラメータを、検出対象時点近傍の時点について求め、該検出対象時点近傍の時点についての前記輝度総和の変化の様子に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出するステップであることを特徴とする細胞観察プログラム。
【請求項３４】
細胞を培養する培養手段と、赤外光線により細胞を撮像する赤外光撮像手段を少なくとも含み前記培養手段に収容されている細胞を撮像する撮像手段と、を備えた細胞観察装置で細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察方法であって、
前記培養手段で細胞を培養しながら、培養中の細胞を前記撮像手段によって撮像して細胞の画像を取得する培養細胞撮像工程と、
該培養細胞撮像工程で取得した画像の細胞画像データから撮像された細胞を認識する細胞認識工程と、
該細胞認識工程で認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づいて計測する細胞パラメータ計測工程と、
を含み、前記培養細胞撮像工程、前記細胞認識工程及び前記細胞パラメータ計測工程を、培養期間中の複数時点で行い、
撮像した複数時点の画像から認識した細胞同士の同一性を前記細胞パラメータに基づいて判別する細胞追跡工程と、
をさらに含み、
前記培養手段で細胞を培養している最中に、該培養手段に収容されている細胞を前記赤外光撮像手段によって撮像して観察することを特徴とする細胞観察方法。
【請求項３５】
細胞を培養する培養手段と、赤外光線により細胞を撮像する赤外光撮像手段を少なくとも含み前記培養手段に収容されている細胞を撮像する撮像手段と、を備えた細胞観察装置で細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察方法であって、
前記培養手段で細胞を培養しながら、培養中の細胞を培養期間中の複数時点で前記撮像手段によって撮像して細胞の画像を取得する培養細胞撮像工程と、
該培養細胞撮像工程で取得した各時点の画像の細胞画像データから撮像された細胞を認識する細胞認識工程と、
該細胞認識工程で認識した各時点の細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づいて計測する細胞パラメータ計測工程と、
撮像した複数時点の画像から認識した細胞同士の同一性を前記細胞パラメータに基づいて判別する細胞追跡工程と、
を含み、
前記培養手段で細胞を培養している最中に、該培養手段に収容されている細胞を前記赤外光撮像手段によって撮像して観察することを特徴とする細胞観察方法。
【請求項３６】
前記培養細胞撮像工程、前記細胞認識工程、前記細胞パラメータ計測工程、及び細胞追跡工程のうちの少なくともいずれか１つの工程の前に、前記培養手段に収容されている細胞を赤外光線によって撮像することを特徴とする請求項３４又は３５に記載の細胞観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生細胞のパラメータを計測、特に、生細胞を長期間培養しながら個々の細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置、細胞観察方法、顕微鏡システム、及び細胞観察プログラムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
これまで、生細胞を観察するために様々な試みがなされてきた。光学顕微鏡を用いた細胞の観察は、古くから用いられて来た簡便な観察手法であり、現在最も広く普及している。通常は、培養装置を併せて使用し、観察時以外は培養装置内に細胞を保存することで、環境が細胞に与えるダメージを最小限に抑えるようにする。
【０００３】
また、オリンパス株式会社から販売されている米国CompuCyte社製の画像サイトメーター「iCyte」は、レーザスキャニングによる画像化機構を備え、細胞の個体毎に蛍光光量、面積、周囲長、真球度等のパラメータを測定することができる。
【０００４】
さらに、特許文献１は、培養装置への出し入れの手間を省き、環境変動による細胞へのダメージを回避するための構成を開示している。この構成では、細胞を培養しながら育成状態をチェックし、必要に応じて培養装置内で観察できるようになっている。
【０００５】
また、特許文献２は、細胞の状態を適切に維持したまま撮像し、画像処理によって細胞の識別とパラメータ計算を行った上で、個々の細胞をトラッキングする概念を開示し、さらに、細胞のパラメータを経時的に取得してなる具体的なアプリケーションも提示している。
【０００６】
【特許文献１】特表２００１−５００７４４号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／０１２８０７７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、光学顕微鏡と培養装置とを組み合わせた観察系では、培養装置への出し入れの際、環境変動により細胞に大きなダメージを与えることが知られている。また、対象を観察の度に顕微鏡に着脱するため、複数回の観察に渡って正確な観察位置を再現することは困難である。すなわち、観察した細胞を次回の観察時には見失ってしまい、観察対象の同一性を保つのが困難であった。観察毎に対象とする細胞が異なる可能性が高く、得られるのは統計的な情報のみである。
【０００８】
画像サイトメーター「iCyte」は、細胞の統計的なパラメータを高速に測定することを目的とした装置であり、元々追跡する必要がないため、生細胞を繰り返し測定するという用途は想定していない。細胞は、測定終了時に廃棄するのが普通であり、環境ダメージを抑えるための培養機構も備えていない。培養装置無しでの細胞の生存期間は高々２，３時間であり、長期間の観察は不可能である。外部の培養装置を併用することも可能であるが、この場合、上述の光学顕微鏡と培養装置とを組み合わせた観察系の場合と同様に、観察対象を同一に保つことが困難であるという問題が生じる。
【０００９】
特許文献１や特許文献２の技術では、共に細胞を長期的に観察するが、細胞の長期培養を行う上で生じる問題である長期観察に伴う細胞活性の低下を抑制しながら、効率よく所望の画像データを取得するための技術について、具体的な構成に欠けている。
【００１０】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、細胞の活性が失われにくい状況を確保し、長期に亘って細胞の同一性を確認しながら同一の細胞についての細胞パラメータを経時的に取得することができる細胞観察装置、細胞観察方法、顕微鏡システム、及び細胞観察プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、請求項１に係る細胞観察装置は、細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置であって、細胞を培養する培養手段と、赤外光線によって細胞を撮像する赤外光撮像手段を少なくとも含み前記培養手段に収容されている細胞を撮像する撮像手段と、該撮像手段で撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識手段と、該細胞認識手段で認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づき計測する細胞パラメータ計測手段と、異なる時点で撮像された画像の前記細胞画像データから認識された異なる時点の細胞同士の同一性を前記細胞パラメータに基づいて判別する細胞追跡手段と、を備えることを特徴とする。
【００１２】
請求項２に係る細胞観察装置は、上記の発明において、前記撮像手段は、前記赤外光撮像手段によって前記細胞画像データを取得することを特徴とする。
【００１３】
請求項３に係る細胞観察装置は、上記の発明において、前記撮像手段は、前記培養手段に収容されている細胞から発せられる光を撮像する細胞光撮像手段をさらに有し、該細胞光撮像手段によって前記細胞画像データを取得することを特徴とする。
【００１４】
請求項４に係る細胞観察装置は、上記の発明において、所定の時点における前記細胞画像データを取得したことを認識する撮像時点認識手段と、該撮像時点認識手段で認識した結果を操作者に報知するための報知手段と、をさらに備えることを特徴とする。
【００１５】
請求項５に係る細胞観察装置は、上記の発明において、前記培養手段に収容されている細胞を撮像した画像の中で細胞が占める度合いを示す細胞占有値を算出する占有面積算出手段と、前記細胞占有値が所定の値になったときに、該細胞占有値が該所定の値になったことを操作者に知らせる報知手段と、をさらに備えることを特徴とする。
【００１６】
請求項６に係る細胞観察装置は、上記の発明において、前記培養手段は、前記細胞を収容する筐体を備え、前記撮像手段は、固体撮像素子を備え、前記筐体と前記固体撮像素子との断熱を行う断熱手段をさらに備えることを特徴とする。
【００１７】
請求項７に係る細胞観察装置は、上記の発明において、前記細胞パラメータ計測手段で計測した前記細胞パラメータのうち前記細胞追跡手段で同一性があると判別した細胞の前記細胞パラメータ同士を関連付けて記録する記録手段をさらに備えることを特徴とする。
【００１８】
請求項８に係る細胞観察装置は、上記の発明において、前記細胞認識手段で認識した細胞を表す画像と複数時点の細胞についての前記細胞パラメータとを関連付けて表示する細胞パラメータ表示手段をさらに備えることを特徴とする。
【００１９】
請求項９に係る細胞観察装置は、上記の発明において、細胞のアポトーシスを前記細胞パラメータに基づいて検出するアポトーシス検出手段をさらに備えることを特徴とする。
【００２０】
請求項１０に係る細胞観察装置は、上記の発明において、前記細胞認識手段で認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出手段をさらに備えることを特徴とする。
【００２１】
請求項１１に係る細胞観察装置は、上記の発明において、細胞のアポトーシスを前記細胞パラメータに基づいて検出するアポトーシス検出手段と、前記細胞認識手段で認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出するための細胞分裂検出手段と、前記アポトーシス検出手段による検出を行うか否かと、前記細胞分裂検出手段による検出を行うか否かを、それぞれ選択する検出機能選択手段と、をさらに備えることを特徴とする。
【００２２】
請求項１２に係る細胞観察装置は、上記の発明において、前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点における細胞の面積を示す細胞パラメータと面積に関する閾値とを比較するとともに、該検出対象時点における細胞の輝度を示す細胞パラメータと該検出対象時点に対して比較の対象となる時点における細胞の輝度を示す細胞パラメータとを比較し、それぞれの比較結果に基づいて該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする。
【００２３】
請求項１３に係る細胞観察装置は、上記の発明において、前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点よりも時系列的に前の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータの値を参照し、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする。
【００２４】
請求項１４に係る細胞観察装置は、上記の発明において、前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点よりも時系列的に前の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータの値を参照し、該円形度を示す細胞パラメータの値が円形度に関する閾値と所定の関係を有している細胞を撮像した判定基準時点を抽出し、該判定基準時点近傍の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータ及び面積を示す細胞パラメータの値の増減傾向に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする。
【００２５】
請求項１５に係る細胞観察装置は、上記の発明において、前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点における細胞の細胞核の存在範囲の面積と細胞質の存在範囲の面積とを比較した結果に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする。
【００２６】
請求項１６に係る細胞観察装置は、上記の発明において、前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点における細胞の微小管の局在領域を求め、細胞中の複数個所に局在しているか否かを検出することで、当該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする。
【００２７】
請求項１７に係る細胞観察装置は、上記の発明において、前記細胞分裂検出手段は、撮像された画像の細胞に対応する領域内で輝度に関する閾値よりも高い輝度値を示す画素について各画素の輝度値を合計した輝度総和を示す領域パラメータを、検出対象時点近傍の時点について求め、該検出対象時点近傍の時点についての前記輝度総和の変化の様子に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする。
【００２８】
請求項１８に係る細胞観察装置は、上記の発明において、前記細胞分裂検出手段の検出結果に基づいて細胞系譜を作成する細胞系譜作成手段をさらに備えることを特徴とする。
【００２９】
請求項１９に係る細胞観察装置は、上記の発明において、前記細胞系譜作成手段で作成した細胞系譜を木構造で表した画像として表示する細胞系譜表示手段をさらに備えることを特徴とする。
【００３０】
請求項２０に係る細胞観察装置は、上記の発明において、前記細胞系譜表示手段は、前記細胞認識手段で認識した細胞を表す画像と前記細胞系譜を表す画像とを関連付けて表示することを特徴とする。
【００３１】
請求項２１に係る顕微鏡システムは、請求項１〜２０のいずれか１つに記載の細胞観察装置を備える顕微鏡システムであって、細胞を拡大投影する結像光学系を備え、前記撮像手段は、前記結像光学系の結像面に拡大投影された細胞を撮像することを特徴とする顕微鏡システム。
【００３２】
請求項２２に係る細胞観察装置は、細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置であって、細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識手段と、該細胞認識手段で認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づき計測する細胞パラメータ計測手段と、前記細胞認識手段で認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出手段と、を備え、前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点における細胞の面積を示す細胞パラメータと面積に関する閾値とを比較するとともに、該検出対象時点における細胞の輝度を示す細胞パラメータと該検出対象時点に対して比較の対象となる時点における細胞の輝度を示す細胞パラメータとを比較し、それぞれの比較結果に基づいて該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする。
【００３３】
請求項２３に係る細胞観察装置は、細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置であって、細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識手段と、該細胞認識手段で認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づき計測する細胞パラメータ計測手段と、前記細胞認識手段で認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出手段と、を備え、前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点よりも時系列的に前の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータの値を参照し、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする。
【００３４】
請求項２４に係る細胞観察装置は、細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置であって、細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識手段と、該細胞認識手段で認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づき計測する細胞パラメータ計測手段と、前記細胞認識手段で認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出手段と、を備え、前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点よりも時系列的に前の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータの値を参照し、該円形度を示す細胞パラメータの値が円形度に関する閾値と所定の関係を有している細胞を撮像した判定基準時点を抽出し、該判定基準時点近傍の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータ及び面積を示す細胞パラメータの値の増減傾向に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする。
【００３５】
請求項２５に係る細胞観察装置は、細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置であって、細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識手段と、該細胞認識手段で認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づき計測する細胞パラメータ計測手段と、前記細胞認識手段で認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出手段と、を備え、前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点における細胞の細胞核の存在範囲の面積と細胞質の存在範囲の面積とを比較した結果に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする。
【００３６】
請求項２６に係る細胞観察装置は、細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置であって、細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識手段と、該細胞認識手段で認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づき計測する細胞パラメータ計測手段と、前記細胞認識手段で認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出手段と、を備え、前記細胞分裂検出手段は、検出対象時点における細胞の微小管の局在領域を求め、細胞中の複数個所に局在しているか否かを検出することで、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする。
【００３７】
請求項２７に係る細胞観察装置は、細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置であって、細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識手段と、該細胞認識手段で認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づき計測する細胞パラメータ計測手段と、前記細胞認識手段で認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出手段と、を備え、前記細胞分裂検出手段は、撮像された画像の細胞に対応する領域内で輝度に関する閾値よりも高い輝度値を示す画素について各画素の輝度値を合計した輝度総和を示す領域パラメータを、検出対象時点近傍の時点について求め、該検出対象時点近傍の時点についての前記輝度総和の変化の様子に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出することを特徴とする。
【００３８】
請求項２８に係る細胞観察プログラムは、細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置で細胞の観察を行う細胞観察プログラムであって、前記細胞観察装置に、細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識ステップと、該細胞認識ステップで認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づいて計測する細胞パラメータ計測ステップと、前記細胞認識ステップで認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出ステップと、を実行させるステップを含み、前記細胞分裂検出ステップは、検出対象時点における細胞の面積を示す細胞パラメータと面積に関する閾値とを比較するとともに、該検出対象時点における細胞の輝度を示す細胞パラメータと該検出対象時点に対して比較の対象となる時点における細胞の輝度を示す細胞パラメータとを比較し、それぞれの比較結果に基づいて当該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出するステップであることを特徴とする。
【００３９】
請求項２９に係る細胞観察プログラムは、細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置で細胞の観察を行う細胞観察プログラムであって、前記細胞観察装置に、細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識ステップと、該細胞認識ステップで認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づいて計測する細胞パラメータ計測ステップと、前記細胞認識ステップで認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出ステップと、を実行させるステップを含み、前記細胞分裂検出ステップは、検出対象時点よりも時系列的に前の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータの値を参照し、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出するステップであることを特徴とする。
【００４０】
請求項３０に係る細胞観察プログラムは、細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置で細胞の観察を行う細胞観察プログラムであって、前記細胞観察装置に、細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識ステップと、該細胞認識ステップで認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づいて計測する細胞パラメータ計測ステップと、前記細胞認識ステップで認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出ステップと、を実行させるステップを含み、前記細胞分裂検出ステップは、検出対象時点よりも時系列的に前の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータの値を参照し、該円形度を示す細胞パラメータの値が円形度に関する閾値と所定の関係を有している細胞を撮像した判定基準時点を抽出し、該判定基準時点近傍の時点における細胞の円形度を示す細胞パラメータ及び面積を示す細胞パラメータの値の増減傾向に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出するステップであることを特徴とする。
【００４１】
請求項３１に係る細胞観察プログラムは、細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置で細胞の観察を行う細胞観察プログラムであって、前記細胞観察装置に、細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識ステップと、該細胞認識ステップで認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づいて計測する細胞パラメータ計測ステップと、前記細胞認識ステップで認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出ステップと、を実行させるステップを含み、前記細胞分裂検出ステップは、検出対象時点における細胞の細胞核の存在範囲の面積と細胞質の存在範囲の面積とを比較した結果に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出するステップであることを特徴とする。
【００４２】
請求項３２に係る細胞観察プログラムは、細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置で細胞の観察を行う細胞観察プログラムであって、前記細胞観察装置に、細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識ステップと、該細胞認識ステップで認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づいて計測する細胞パラメータ計測ステップと、前記細胞認識ステップで認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出ステップと、を実行させるステップを含み、前記細胞分裂検出ステップは、検出対象時点における細胞の微小管の局在領域を求めて、細胞中の複数個所に局在しているか否かを検出することで、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出するステップであることを特徴とする。
【００４３】
請求項３３に係る細胞観察プログラムは、細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察装置で細胞の観察を行う細胞観察プログラムであって、前記細胞観察装置に、細胞を撮像した画像の細胞画像データから細胞を認識する細胞認識ステップと、該細胞認識ステップで認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づいて計測する細胞パラメータ計測ステップと、前記細胞認識ステップで認識した細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを前記細胞パラメータに基づいて検出する細胞分裂検出ステップと、を実行させるステップを含み、前記細胞分裂検出ステップは、撮像された画像の細胞に対応する領域内で輝度に関する閾値よりも高い輝度値を示す画素について各画素の輝度値を合計した輝度総和を示す領域パラメータを、検出対象時点近傍の時点について求め、該検出対象時点近傍の時点についての前記輝度総和の変化の様子に基づいて、該検出対象時点における細胞が細胞分裂の結果生じたものであるか否かを検出するステップであることを特徴とする。
【００４４】
請求項３４に係る細胞観察方法は、細胞を培養する培養手段と、赤外光線により細胞を撮像する赤外光撮像手段を少なくとも含み前記培養手段に収容されている細胞を撮像する撮像手段と、を備えた細胞観察装置で細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察方法であって、前記培養手段で細胞を培養しながら、培養中の細胞を前記撮像手段によって撮像して細胞の画像を取得する培養細胞撮像工程と、該培養細胞撮像工程で取得した画像の細胞画像データから撮像された細胞を認識する細胞認識工程と、該細胞認識工程で認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づいて計測する細胞パラメータ計測工程と、を含み、前記培養細胞撮像工程、前記細胞認識工程及び前記細胞パラメータ計測工程を、培養期間中の複数時点で行い、撮像した複数時点の画像から認識した細胞同士の同一性を前記細胞パラメータに基づいて判別する細胞追跡工程と、をさらに含み、前記培養手段で細胞を培養している最中に、該培養手段に収容されている細胞を前記赤外光撮像手段によって撮像して観察することを特徴とする。
【００４５】
請求項３５に係る細胞観察方法は、細胞を培養する培養手段と、赤外光線により細胞を撮像する赤外光撮像手段を少なくとも含み前記培養手段に収容されている細胞を撮像する撮像手段と、を備えた細胞観察装置で細胞の特徴を示す細胞パラメータを経時的に計測する細胞観察方法であって、前記培養手段で細胞を培養しながら、培養中の細胞を培養期間中の複数時点で前記撮像手段によって撮像して細胞の画像を取得する培養細胞撮像工程と、該培養細胞撮像工程で取得した各時点の画像の細胞画像データから撮像された細胞を認識する細胞認識工程と、該細胞認識工程で認識した各時点の細胞の特徴を示す細胞パラメータを前記細胞画像データに基づいて計測する細胞パラメータ計測工程と、撮像した複数時点の画像から認識した細胞同士の同一性を前記細胞パラメータに基づいて判別する細胞追跡工程と、を含み、前記培養手段で細胞を培養している最中に、該培養手段に収容されている細胞を前記赤外光撮像手段によって撮像して観察することを特徴とする。
【００４６】
請求項３６に係る細胞観察方法は、上記発明において、前記培養細胞撮像工程、前記細胞認識工程、前記細胞パラメータ計測工程、及び細胞追跡工程のうちの少なくともいずれか１つの工程の前に、前記培養手段に収容されている細胞を赤外光線によって撮像することを特徴とする。
【発明の効果】
【００４７】
本発明に係る細胞観察装置、細胞観察方法、顕微鏡システム、及び細胞観察プログラムは、細胞を培養する培養手段に収容されている細胞を撮像した画像の細胞画像データを用いて細胞の観察を行っているため、長期に亘って同一の視野範囲で観察を行いやすくなり、長期に亘って細胞の同一性を確認しながら同一の細胞についての細胞パラメータを取得することができ、この場合、赤外光撮像手段で培養中の細胞を観察することが可能であるため、観察期間ないし培養期間が長期に及ぶ場合でも、赤外光撮像手段を用いて細胞を観察することで、細胞に対する観察光の影響を低く抑えて、細胞の活性が失われにくくすることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
以下に添付図面を参照して、本発明に係る好適な実施の形態について詳述する。
【００４９】
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１に係る細胞観察装置は、蛍光タンパクを導入した複数の生細胞を培養したまま撮像し、個々の細胞の領域を認識し、経時的な位置変化を追尾しつつ、個々の細胞の特徴を示す細胞パラメータを独立に計測する。
【００５０】
図１は、本実施の形態１に係る細胞観察装置の構成例を示す概略ブロック図である。本実施の形態１に係る細胞観察装置は、概略的には、細胞を培養する培養部１０１と、この培養部１０１に収容されている細胞を撮像する撮像部２０１と、細胞観察装置の全体の処理及び動作を制御する制御部３０１と、撮像部２０１で撮像した画像のデータや処理後のデータなどの各種データを集中して一時的或いは永続的に記録する記録部３０２と、各種情報の入力を受ける入力部３０３と、画像情報等の各種情報を表示して操作者に提示する表示部３０４とを備える他、前処理部３０５、細胞認識部３０６、パラメータ計測部３０７、細胞追跡部３０８、露出検出部３０９、撮像回数計数部３１０、占有面積算出部３１１、合焦検出部３１２を備える。これらの各部３０２〜３１２は、制御部３０１に接続され、制御部３０１により制御される。なお、図１では、制御部３０１から培養部１０１や撮像部２０１に対する制御接続は特に図示していない。なお、制御部３０１、前処理部３０５、細胞認識部３０６、パラメータ計測部３０７、細胞追跡部３０８、露出検出部３０９、撮像回数計数部３１０、占有面積算出部３１１、合焦検出部３１２によって行われる各処理は、細胞観察装置に搭載されたＣＰＵがＲＯＭ等のメモリに記憶された処理プログラムに基づいて、適宜ＲＡＭ等の記憶装置に必要なデータを書き込みながら行われる。
【００５１】
まず、培養部１０１について説明する。スライドガラス１０２は、局在化せずに発現する蛍光タンパクをあらかじめ導入した複数の生細胞Ｃを保持し、培養部１０１内に設置されている。この培養部１０１は、例えば特開２００４−１１３１７５号公報によって開示された培養容器と同様の構成である。この場合、蛍光タンパクは局在化しないものであれば何でも良く、一般的なクラゲ由来の蛍光タンパク等が利用可能で、一例としてＢＤバイオサイエンス・クロンテック社のｐＥＧＦＰ−Ｎ１を使用することができる。
【００５２】
図２は、培養部１０１の構成例を示す水平断面図であり、図３は、培養部１０１の構成例を示す縦断正面図である。培養手段としての培養部１０１は、図２及び図３に示すように、スライドガラス１０２を内部に収容可能な表裏貫通孔１０３を有する熱伝導に優れた材質、例えば、ステンレス製又はアルミニウム製の筐体１０４と、その筐体１０４の表裏貫通孔１０３を塞ぐ光学的に平滑な２枚のガラス板で形成された観察窓１０５と、筐体１０４内部に培養液Ａを供給する培養液供給パイプ１０６と、筐体１０４内部から不要となった培養液Ａを排出する培養液排出パイプ１０７と、筐体１０４への培養液Ａの出入口に設けられた２つの整流板１０８とを備えている。
【００５３】
生細胞Ｃを健全に育成するためには、スライドガラス１０２上の全域に渡って常に新鮮な培養液Ａが供給されることが望ましい。しかし、培養液Ａの流れが急激な場合、スライドガラス１０２上に着床した生細胞Ｃが剥離する可能性がある。このため、本実施の形態１は、各パイプ１０６，１０７付近に整流板１０８を設置し、培養液Ａの流れを均一に分散、回収できるようにしている。
【００５４】
図４は、整流板１０８の構成例を示す斜視図である。整流板１０８は、図４に示すように、厚さ方向に複数の貫通孔１０８ａを形成した多孔性の部材である。入口側の整流板１０８は、培養液供給パイプ１０６から流入する培養液Ａを複数の貫通孔１０８ａに分散させて流通させ、出口側の整流板１０８は、培養液排出パイプ１０７を経て一気に流出しようとする培養液Ａを複数の貫通孔１０８ａに分散させて流通させる。これにより、集中的な流れを分散流に変換し、生細胞Ｃが配置されているスライドガラス１０２近傍において、一定の流速及び流量で培養液Ａを流動させることができる。
【００５５】
培養部１０１には、温度制御ユニット１０９が取り付けられ、培養部１０１の周囲に温水Ｗを流通させる温水流路１１０を形成する。温水流路１１０に温水Ｗを循環させることにより、筐体１０４を介して温水の熱を培養液Ａに伝達させる。この時、図示しない温度センサからの温度情報が制御部３０１に所定時間間隔毎に伝達され、制御部３０１は培養部１０１内の温度が３７±０．５℃の範囲に維持されるように温水Ｗの温度と流量を制御する。
【００５６】
また、図示しないｐＨセンサによって培養液ＡのｐＨ情報が制御部３０１に所定時間間隔毎に伝達され、制御部３０１は培養液のｐＨが所定の範囲に維持されるように培養液Ａ内のＣＯ2濃度を制御する。
【００５７】
未使用の培養液は、図示しない培養液保存部に保存されており、経時的な劣化を抑えるため、図示しない保冷機構で約４℃に保冷される。保冷された培養液は、図示しない培養液加温機構によって約３７℃に加温された後、培養液供給パイプ１０６を通じて筐体１０４内に供給される。
【００５８】
培養液排出パイプ１０７を通じて排出された培養液は、図示しない廃液保存部に保存される。排出された培養液の一部を新鮮な培養液と混合して筐体１０４内に供給する構成としても良く、この場合、培養液の交換に伴う細胞への衝撃を和らげ、より長期の培養に適した構成となる。
【００５９】
図５は、培養部１０１側と撮像部２０１側との境界部分の断熱構成例を示す断面図である。培養部１０１の発する熱は、断熱手段としての断熱部３０８を設けることで、撮像部２０１側には伝達しないようにする。培養部１０１と撮像部２０１との断熱を行う断熱部３０８の設置個所は、種々考えられるが、本実施の形態１では、培養部１０１の筐体１０４と撮像部２０１を構成する撮像素子との間に断熱部３０８を設置している。断熱部３０８は、断熱性が高く伸縮性のある部材、例えばゴム、シリコン、ポリウレタン等を使用したシート状であって、対物レンズ２０２と概略同じ直径の貫通孔１１２が設けられている。培養部１０１と対物レンズ２０２とは貫通孔１１２を通して光学的に接続されており、自由に光線をやり取りできる。一方、培養部１０１の発する熱は断熱部３０８によってそのほとんどが遮られる。一般に、光学系は２５℃前後での使用を前提として調整されており、培養部１０１からの熱で加熱されると想定した性能を発揮できない。特に、撮像部２０１の備えるＣＣＤ等の固体撮像素子は、高温になる程ノイズが増加してＳ／Ｎが劣化するため、微弱な蛍光を捉えるためにはできるだけ低温（ただし、結露させない）に保つ必要がある。
【００６０】
培養手段としては、培養部１０１のように培養液の交換を行うことができるものを用いるとより好ましいが、一般的なウェルプレートを用いて細胞を観察することも可能である。ただし、一般的なウェルプレートを用いた場合には、環境状態を維持したまま培養液を交換することができないため、培養部１０１を用いる場合に比べて、細胞の代謝に伴う培養液の劣化の影響で培養期間は短期に制限されてしまう。
【００６１】
以上の構成により、培養部１０１内部の温度と培養液ＡのｐＨはほぼ一定に保たれている。測定試料となる生細胞の一例として、ヒーラ細胞を用いる。ヒーラ細胞は、子宮頸癌由来であり、創薬毒性試験等で広く用いられている。導入する蛍光タンパクの種類は、アッセイの内容に応じて変更しても良い。
【００６２】
次に、撮像部２０１について説明する。撮像部２０１は、励起光照明部２０３と、ダイクロイックミラー２０４と、対物光学系と２０５と、結像光学系２０６と、蛍光撮像部２０７と、赤外光照明部２０８と、ダイクロイックミラー２０９と、結像光学系２１０と、赤外光撮像部２１１とを有して構成されている。すなわち、本実施の形態１の撮像部２０１は、蛍光撮像系と赤外光撮像系とを有する構成とされている。
【００６３】
まず、励起光照明部２０３から放射された光は、ダイクロイックミラー２０４によって反射され、対物レンズ２０２を含む対物光学系２０５と観察窓１０５を経てスライドガラス１０２に照射される。照射された光を励起光として、スライドガラス１０２上の生細胞Ｃに導入された蛍光タンパクから蛍光が発せられ、励起光の反射光と蛍光は共に観察窓１０５から射出される。射出された光は、再度対物光学系２０５を通過し、ダイクロイックミラー２０４に到達するが、蛍光のみが透過し、励起光の反射光は遮断される。ダイクロイックミラー２０４を透過した蛍光は、結像光学系２０６によって細胞光撮像手段としての蛍光撮像部２０７が備えるＣＣＤやＣＭＯＳ等の固体撮像素子上に拡大投影されて結像する。
【００６４】
結像した測定試料の蛍光像を蛍光撮像部２０７が備える固体撮像素子によって画像データに変換し、制御部３０１による制御の下に記録部３０２において一時的或いは永続的に記録する。図６は、蛍光撮像された培養中の細胞画像の一例を示す説明図である。
【００６５】
また、赤外光照明部２０８から放射された光は、一方の観察窓１０５を経てスライドガラス１０２に照射され、その透過光が他方の観察窓１０５から射出される。射出された光は、対物光学系２０５を通過し、ダイクロイックミラー２０９に到達するが、赤外光は全て反射される。反射された赤外光は、結像光学系２１０によって赤外光撮像手段としての赤外光撮像部２１１が備えるＣＣＤやＣＭＯＳ等の固体撮像素子上に拡大投影されて結像する。結像した測定試料の赤外光像を赤外光撮像部２１１が備えるＣＣＤやＣＭＯＳ等の固体撮像素子によって画像データに変換し、制御部３０１による制御の下に、記録部３０２において一時的或いは永続的に記録する。
【００６６】
一般に、蛍光タンパクは全ての細胞に均等に導入できる訳ではなく、また導入できた場合でも直ちに発現するとは限らないため、細胞の全体像を経時的に安定して観察する手段が必要であり、本実施の形態では赤外光像がこれに当たる。赤外光像を表示する場合、初期状態では蛍光タンパクが殆ど或いは全く発現していない測定試料であっても、細胞像を視認しながら観察範囲の確認や調整を行える。
【００６７】
赤外光は、可視光と比較して生細胞に対する光毒性が低いため、可視光を用いて撮像した場合と比較して、より長期間細胞の活性を維持することができる。また、蛍光撮像用の励起光として可視光全域を使用できるようになるため、利用可能な蛍光タンパクの制約が緩和される。
【００６８】
このように、本実施の形態１の撮像部２０１によれば、蛍光撮像部２０７や赤外光撮像部２１１を用いてスライドガラス１０２上の生細胞Ｃを撮像することで、生細胞Ｃを撮像した画像の画像データである細胞画像データを取得することが可能である。本実施の形態１では、制御部３０１の制御により、あらかじめ設定した時間間隔で自動的に蛍光撮像部２０７によって撮像を行う。そして、細胞の様子を観察したいときに、必要に応じて、ユーザが所望の時期に赤外光撮像部２１１を用いた生細胞Ｃの観察を行うことができる。なお、赤外光撮像部２１１による撮像は、ユーザが所望の時期に行うばかりではなく、制御部３０１の制御によって、蛍光撮像部２０７による撮像と同期したタイミングで行えば、赤外光像と蛍光像との対応付けが容易になるだけでなく、両画像に含まれる生細胞Ｃ同士の対応付けも容易になる。その結果、生細胞Ｃを長期に培養しながら観察する場合に、細胞の活性低下を抑えながら、効率よく生細胞Ｃの観察を行うことが可能となる。蛍光像や赤外光像を撮像した時間を、表示部３０４に表示する機能を付加してもよい。
【００６９】
本実施の形態１の構成は、蛍光撮像部２０７と赤外光撮像部２１１とを備えるため、蛍光像の撮像と赤外光像の撮像とを並行して行うことができ、両者を切り替えながら撮像する場合と比較して、撮像に要する時間が大幅に短縮され、切り替え用の駆動部も不要である。
【００７０】
赤外光照明部２０８にリング絞りを加え、ダイクロイックミラー２０９から結像光学系２１０に至る光路に位相板を挿入すれば、透過観察に代えて位相差観察を行うことができる。位相差観察は、透過観察と比較して、よりコントラストの高い画像が得られる。
【００７１】
赤外光照明部２０８にポラライザとＤＩＣ（Differential Interference Contrast）素子を挿入し、ダイクロイックミラー２０９から結像光学系２１０に至る光路にＤＩＣスライダとアナライザを挿入すれば、透過観察に代えて微分干渉観察を行うことができる。微分干渉観察は、透過観察と比較して、よりコントラストの高い画像が得られる。
【００７２】
ステージ搬送機構１１３によって、スライドガラス１０２と、蛍光撮像部２０７や赤外光撮像部２１１が備える固体撮像素子との相対位置を変化させながら、複数の視野で生細胞Ｃの撮像を行う。複数の視野（撮像範囲）を切り替えながら撮像する場合は、各視野でのステージ位置を記録しておき、各視野の２回目以降の撮像に先立って、ステージ搬送機構１１３によりステージ位置を再現する。
【００７３】
ここで、露出検出部３０９により画像データ撮像時の露出が適正であったか否かを検出する。撮像時の露出が不適正だった場合、直ちに或いは他の任意の観察部位の撮像が完了した時点で、露出不適正部位の撮像をやり直す。この際、露出条件を変更しても良い。同様に、合焦検出部３１２により画像データ撮像時の焦点合わせが適正であったか否かを検出する。撮像時の焦点合わせが不適正だった場合、直ちに或いは他の任意の観察部位の撮像が完了した時点で、合焦不適正部位の撮像をやり直す。この際、焦点合わせの条件を変更しても良い。
【００７４】
また、培養部１０１内は培養液Ａが循環しているが、撮像を行うタイミングに合わせて一時的に循環を停止させても良い。これにより、培養液の流通に由来する撮像時の背景の揺らぎを回避することができる。
【００７５】
さらに、所定の視野における撮像回数を撮像時点認識手段としての撮像回数計数部３１０により計数し、所定の視野の所定回数（フレーム）の撮像後、報知手段としての表示部３０４に画像を表示し、その内容について操作者に確認を求めるようにしてもよい。内容に問題が無いと操作者が判断した場合は処理を継続し、問題ありと判断した場合は、撮像条件の再設定について操作者からの指示を受け付ける。或いは、単に処理を中止してもよい。一定時間経っても操作者からの応答が無い場合は、既定の指示に従い、処理の継続或いは中止を選択する。
【００７６】
なお、本実施の形態１では、蛍光撮像部２０７（又は、赤外光撮像部２１１）による撮像回数を計数し、所定回数の撮像後に操作者に画像の確認を求めるようにしたが、撮像回数を基準にするだけではなく、撮像時点認識手段として、観察開始から所定時間の経過を計測する手段（例えば、細胞画像データを撮像した時刻の情報も取得して、その時刻があらかじめ定めた時刻を超えた場合に、所定時点の細胞画像データを取得したことを認識する）を設けることで、画像の確認を行うようにしてもよい。
【００７７】
培養期間が長期となると、培養中の細胞に関して、想定した範囲を逸脱した増殖、死滅、画像輝度値の過大等が起こる可能性があり、或る時点で細胞観察にとって適切な画像を取得できなくなる場合も予想される。そこで、上述のように、所定の時点が経過したことを操作者に認識させたり、処理を中止したりすることで、操作者はそれまでに取得した画像や、その時点の画像を確認して、その後の細胞観察を適切に行うことが可能となる。
【００７８】
ついで、撮像した画像のうち、蛍光撮像部２０７で取得した画像データの処理手順について説明する。図７は、制御部３０１による制御の下に、前処理部３０５等により実行される画像データ処理例を示す概略フローチャートである。前述したような撮像部２０１による細胞画像の撮像（ステップＳ１）に引き続き、前処理部３０５で前処理を行い（ステップＳ２）、細胞認識手段としての細胞認識部３０６で細胞を認識する（ステップＳ３）。ついで、認識した細胞の特徴を示す細胞パラメータを細胞パラメータ計測手段としてのパラメータ計測部３０７で細胞画像データに基づき計測する（ステップＳ４）。さらに、細胞追跡手段としての細胞追跡部３０８で、異なる時点で撮像された画像の細胞画像データから認識された異なる時点の細胞同士の同一性を細胞パラメータに基づいて判別する（ステップＳ５）。或いは、さらに追跡結果を修正する（ステップＳ６）。そして、得られた追跡結果を表示部３０４に表示させ（ステップＳ７）、観察が終了するまで（ステップＳ８；Ｙｅｓ）、上述の処理ステップを同様に繰り返す。
【００７９】
なお、ステップＳ１（又は、ステップＳ１及びステップＳ２）の処理を、複数の時期においてあらかじめ行っておいて、各時期に取得した画像データに対するステップＳ２以降（又は、ステップＳ３以降）の処理を後にまとめて行うようにしてもよい。このように、複数の時期において撮像した画像データをあらかじめ取得しておいて、後にまとめて画像データの処理を行うようにする場合、撮像と画像データの処理とを並行して行う場合と比較し、装置構成が単純化され、安価な計算機を用いて応答性と安定性を向上させることができる。
【００８０】
各処理ステップの内容を個別に説明する。撮像し記録部３０２に記録された画像データを、ステップＳ２では、前処理部３０５において以下のように処理する。まず、画像データにエッジ保存型のローパスフィルタを適用する。エッジ保存型のローパスフィルタは、エッジ部における空間周波数高周波成分の劣化を抑えつつ、エッジ部以外に平滑化の効果をもたらすものであり、細胞の輪郭情報を保存したままノイズ除去ができる点で、本手法に好適である。
【００８１】
このような要件を満たすフィルタとして、バイラテラルフィルタ（Tomasi & Manduchi,"Bilateral Filtering for Gray and Color Images", Proceedings of the 1998 IEEE International Conference on Computer Vision, Bombay, India参照)が知られており、本手法でもこれを使用する。
【００８２】
次に、エッジ保存型ローパスフィルタ適用後の画像データに、さらにエッジ強調のための先鋭化フィルタを適用する。先鋭化フィルタは、注目画素とその近傍の８画素に例えば図８に示すような重み付けを行って総和を求めるフィルタであり、これを画素毎に反復実行することで、先鋭化処理が実現できる。
【００８３】
ステップＳ３では、前処理後の画像データを、細胞認識部３０６において以下のような手順で分析し、個々の細胞の占める領域を認識する。この手順に従えば、細胞が互いに隣接せずに散在する場合だけでなく、細胞が互いに隣接し、密集している場合にも個々の細胞の占める領域を認識できる。また、細胞領域のエッジが明瞭でない場合にも適用することができる。
【００８４】
まず、画像を高輝度画素の集中する領域毎に領域分割する。一般に、蛍光画像において、細胞は高輝度画素の塊の様相を呈するため、高輝度画素の集中する領域（塊）毎に領域分割することは、画像を細胞毎の領域に分割することに相当する。
【００８５】
このような要件を満たす処理として、分水嶺領域分割が知られている。本実施の形態１の細胞認識の処理手順として、この分水嶺領域分割方式を使用する(Vincent & Soille , "Watersheds in Digital Spaces: An Efficient Algorithm Based on Immersion Simulations", IEEE TRANSACTIONS ON PATTERN ANALYSIS AND MACHINE INTELLIGENCE, VOL.13, NO.6, JUNE 1991参照)。原論文における分水嶺領域分割は、画像を低輝度画素の集中する領域に分割するものであるが、ここでは輝度を反転して考え、高輝度領域の分割に適用する。得られた領域分割結果における個々の領域が細胞領域となる。
【００８６】
ここで、隣接する細胞領域の特性に応じて複数の細胞領域を統合し新たな１つの細胞領域とするような、統合処理を行っても良い。分水嶺領域分割処理の結果は、一般に、小領域に分割され易い傾向があるため、統合処理を行うことで認識結果の品質を高めることができる。
【００８７】
領域統合の第１の手法を、図９を参照して説明する。図９は、領域統合の第１の手法例を示す概略フローチャートである。まず、各細胞領域において輝度が最大となる点、すなわち輝度の頂点を求める（ステップＳ３１１）。次に、隣接する任意の２つの細胞領域を選択し（ステップＳ３１２）、それらの頂点間を結ぶ線分に沿った道のり距離ＤUWを求める（ステップＳ３１３）。道のり距離ＤUWの計算には式(１)を用いる。
【００８８】
【数１】
2006238802.tif 000003
【００８９】
ここで、Ｉ(Ｐ)は、エッジ保存型ローパスフィルタ適用後の画像における画素Ｐの輝度値、／Ｉ(ＰS)は、エッジ保存型ローパスフィルタ適用後の画像における２つの頂点の輝度値の平均、Σは、頂点間を結ぶ線分の全画素について総和を求めることを表す。
【００９０】
ステップＳ３１３で、隣接する細胞領域の全ての組み合わせについて頂点間の道のり距離ＤUWを求めた後、ステップＳ３１４で、この道のり距離ＤUWと所定の閾値ＶUWとの比較を行う。比較の結果、所定の閾値ＶUW以下である場合には（ステップＳ３１４；Ｙｅｓ）、細胞領域同士を１つの領域に統合する（ステップＳ３１５）。このような処理を全組み合わせについて完了するまで（ステップＳ３１６；Ｙｅｓ）、同様に繰り返す。
【００９１】
領域統合の第２の手法を、図１０を参照して説明する。図１０は、領域統合の第２の手法例を示す概略フローチャートである。まず、エッジ保存型ローパスフィルタの出力結果にエッジ抽出フィルタ、例えばSobelフィルタを適用してエッジ画像を得る（ステップＳ３２１）。任意の隣接する細胞領域間の境界を考えて、隣接する任意の２つの細胞領域を選択し（ステップＳ３２２）、式(２)で定義されるエッジ強度ＤUEを求める（ステップＳ３２３）。
【００９２】
【数２】
2006238802.tif 000004
【００９３】
ここで、Ｅ(Ｐ)は、エッジ画像における画素Ｐの輝度値、Σは、細胞領域間の境界に含まれる全画素について総和を求めることを表す。
【００９４】
ステップＳ３２３で、隣接する細胞領域の全ての組み合わせについてエッジ強度ＤUEを求めた後、ステップＳ３２４で、このエッジ強度ＤUEと所定の閾値ＶUEとの比較を行う。比較の結果、所定の閾値ＶUE以下である場合には（ステップＳ３２４；Ｙｅｓ）、細胞領域同士を１つの領域に統合する（ステップＳ３２５）。このような処理を全組み合わせについて完了するまで（ステップＳ３２６；Ｙｅｓ）、同様に繰り返す。
【００９５】
これらの第１，第２の領域統合の手法は、それぞれ別個に使用しても良いし、任意の順番で連続して用いても良い。
さらに、輝度情報を用いて各細胞領域の妥当性を検証しても良い。そのためには、分割された細胞領域毎に輝度値が最大となる画素を求め、その輝度値が所定の閾値Ｖtminより小さい場合、その領域は細胞領域ではないと判定し、所属する画素も含めて以降の処理の対象から除外する。これにより、蛍光タンパクの導入又は発現が不十分な細胞、及び細胞ではない背景領域を除外することができる。
【００９６】
さらに、細胞領域内の各画素の輝度を所定の閾値Ｖpminと比較し、閾値Ｖpminより輝度の小さい画素を細胞領域から除外しても良い。こうして除外された画素は、以降の処理には使用しない。これにより、細胞領域の中でもＳ／Ｎの低い低輝度部位を除外することができ、細胞領域の境界形状をより正確に認識することが可能となる。
得られた細胞領域、及び各細胞領域に属する画素の集合を記録部３０２に記録する。
【００９７】
なお、赤外光撮像部２１１が撮像した赤外光画像を用いて細胞領域を認識することも可能である。赤外光画像が位相差画像である場合、細胞の存在する領域の輝度値は、背景とは異なる輝度値として観察される。したがって、画像内の各画素について代表的な背景の輝度値ＰBGとの差を求め、差が所定の閾値ＶPGより大きな画素のみを抽出し、一般的なラベリング処理を行って隣接する画素を統合すれば、細胞領域を認識することができる。
【００９８】
図７の処理に戻り、ステップＳ４では、パラメータ計測部３０７において、細胞認識部３０６で認識した細胞領域毎に細胞パラメータを計測し、その計測結果を記録部３０２に記録する。図１１は、記録部３０２に記録された細胞パラメータの計測結果例を示す説明図である。ただし、Ｍは認識された細胞領域の数である。本実施の形態１では、細胞パラメータは、例えば、重心位置、面積、円形度、輝度の総和、平均輝度、輝度の標準偏差を測定項目対象としており、画像データ及び細胞領域と関連付けて記録部３０２に記録する。アッセイの内容に応じて、周囲長、フェレ径、長さ、幅、最大輝度等の一般的な測定項目を追加しても良い。
【００９９】
ここで、本実施の形態１は、画像内の全ての細胞の面積の総和、すなわち画像内で細胞領域の占める度合いを示す細胞占有値に相当する面積を占有面積算出手段としての占有面積算出部３１１で算出し、画像内で細胞領域の占める面積が、画像の面積に対して所定の割合を超えた場合、制御部３０１にその事象を通知する。この場合、制御部３０１はあらかじめ指定された設定に従い、報知手段としての表示部３０４を通じて操作者にさらに報知しても良いし、培養部１０１の制御状態を変更しても良い。或いは単に通知を無視しても構わない。この機能は、培養が長期になると、細胞の増殖等によって培地の空きスペースが減少することがあるので、細胞培養の過程において培地の空きスペースが不足してきていることを通知する場合に有効である。
【０１００】
占有面積計算部３１１は、細胞画像内で細胞領域の占める面積を細胞占有値として求めるものである。細胞画像は、蛍光画像或いは赤外光画像のいずれであっても構わない。蛍光画像を対象とする場合、パラメータ計測部３０７により細胞領域の面積が計測されているので、画像内の全ての細胞領域の面積を合計すれば、画像内で細胞領域の占める面積を求めることができる。赤外光画像を対象とする場合、細胞の存在する領域の輝度値は、背景とは異なる輝度値として観察される。したがって、まず画像内の各画素について代表的な背景の輝度値ＰBGとの差を求め、差が所定の閾値ＶPGより大きな画素のみを抽出する。さらに、画像内で抽出された画素の数を計数すれば、画像内で細胞領域の占める面積が得られる。
【０１０１】
以上の手順により、複数の細胞画像を含む単一の細胞画像に関して、個々の細胞の領域を求めた上で細胞パラメータを計測することができる。所定の時間間隔Δｔ毎に細胞画像の撮像とパラメータ計測とを反復して行うことで、細胞パラメータを時間経過に伴って蓄積することができる。
【０１０２】
ここで、このままの処理では、異なる時刻に計測された細胞パラメータ同士が関連付けられておらず、経時的に計測した状態とは言えない。そこで、異なる時刻に撮影された細胞画像間において、細胞領域の対応付けを行い、その結果を用いて細胞パラメータ同士の関連付けを行う必要がある。
【０１０３】
細胞領域の対応付けは、細胞追跡部３０８において、ステップＳ５，Ｓ６の処理として以下のように実行される。ここで、時刻ｔ1において認識された細胞領域をＲt1,m、時刻ｔ2において認識された細胞領域をＲt2,nと表すものとする。ただし、時刻ｔ2は時刻ｔ1より時系列的に後の時刻である。ｍ，ｎは同一画像内で重複の無い細胞領域の識別番号で、１≦ｍ≦Ｍ，１≦ｎ≦Ｎであり、ＭとＮはそれぞれ時刻ｔ1，ｔ2で認識された細胞領域の数を表す。
【０１０４】
まず、２つの細胞領域Ｒt1,mとＲt2,nの関連性に関する評価関数を式(３)で定義する。式(３)で計算される評価値Ｊ1が小さい程、２つの領域は関連性が高く、同一の細胞を示している可能性が高いと言える
【０１０５】
〔数３〕
Ｊ1＝Ｊ1(Ｒt1,m，Ｒt2,n)＝ｋdδd＋ｋaδa＋ｋcδc              ……(３)
δd：重心間の距離
δa：面積の差
δc：円形度の差
ｋd，ｋa，ｋc：所定の重み付け係数
【０１０６】
図１２は、ｍとｎの可能な組み合わせについて評価値を計算した結果を示す説明図である。ただし、図１２では記述の簡便のため、Ｊ1(Ｒt1,m，Ｒt2,n)をＪm,nと簡略表記している。
【０１０７】
ここで、時刻ｔ1の領域Ｒt1,mに対応する時刻ｔ2の領域Ｒt2,n^を式(４)に従って決定する。すなわち、Ｒt2,n^とは、領域Ｒt1,mとの間の評価値Ｊ1を最小化するような時刻ｔ2の領域である。
【０１０８】
【数４】
2006238802.tif 000005
【０１０９】
評価値Ｊ1が最小となるｎ＾が複数存在する場合、それらに対して式(５)に示す第２の評価関数を適用し、評価値Ｊ2が、より小さくなる組み合わせを決定する。第２の評価値Ｊ2が最小となる組み合わせも複数あった場合、操作者へのメッセージを表示部３０４に表示し、操作者が正しいと判断する組み合わせを入力部３０３より入力させ、入力結果に基づいて対応付けを行う。
【０１１０】
〔数５〕
Ｊ2＝Ｊ2(Ｒt1,m，Ｒt2,n)＝ｋsδs＋ｋmδm＋ｋvδv                ……(５)
δs：輝度の総和の差
δm：平均輝度の差
δv：輝度の標準偏差の差
ｋs，ｋm，ｋv：所定の重み付け係数
【０１１１】
ただし、評価値Ｊ1，Ｊ2の両方を求めず、どちらか一方のみを用いることで処理を高速化しても良い。また、操作者へのメッセージ表示、及び操作者からの入力ステップを省略し、評価値Ｊ1又はＪ2を最小化する複数の対応関係を全て記録するようにしても良い。
【０１１２】
時刻ｔ1の領域Ｒt1,mと時刻ｔ2の領域Ｒt2,n^は、同一の細胞を異なる時刻に認識した結果と考えられるから、両者の計測済みの細胞パラメータも同一の細胞に対する異なる時刻での計測値とみなせる。そこで、細胞パラメータの値を、細胞画像、細胞領域、細胞領域の対応付け情報、時刻情報と関連付け、併せて記録手段としての記録部３０２に記録することで、経時的なパラメータ計測が完了する。
【０１１３】
経時的に、蛍光タンパクが新たに発現し蛍光を発するようになった場合、観察画面外にあった細胞が観察画面内へと移動した場合、重なり合っていた複数の細胞が分かれた場合、又は細胞が分裂した場合は、細胞認識部３０６において認識される細胞領域の数が増加するため、時刻ｔ2の細胞領域に対応する時刻ｔ1の細胞領域が存在しない場合や、時刻ｔ2の複数の細胞が時刻ｔ1の１つの細胞に対応する場合が発生する。
【０１１４】
また、経時的に、蛍光タンパクの蛍光強度が低下した場合、観察画面内にあった細胞が観察画面外へと移動した場合、複数の細胞が重なり合った場合、又は細胞が死滅した場合は、細胞認識部３０６において認識される細胞領域の数が減少するため、時刻ｔ1の細胞領域に対応する時刻ｔ2の細胞領域が存在しない場合や、時刻ｔ1の複数の細胞が時刻ｔ2の１つの細胞に対応する場合が発生する。
【０１１５】
対応する細胞領域が無い場合は、対応領域が無いことを意味するフラグを記録する。１つの細胞領域に複数の細胞領域が対応する場合は、全ての対応関係を記録する。表示部３０４を通じて操作者にメッセージを表示し、操作者からの入力を元に対応関係を修正しても良い。複数の細胞領域の対応を記録する際のデータ表現は、各時刻を高さに、各細胞領域を節点に対応させた木構造を用いる。表現の自由度がより高いグラフ構造を用いても良い。
【０１１６】
なお、細胞領域の対応付けに関しては、以下のような改良を加えた変形例であってもよい。
第１の変形例は、最小の評価値Ｊが所定の閾値Ｖjmaxより大きい場合、その対応付けは無効とみなす。この場合、領域Ｒt1,mに対応する時刻ｔ2の領域は発見できなかったとし、領域Ｒt1,mに対する経時的パラメータ計測は時刻ｔ1までで打ち切る。この変形例は、ノイズの影響を低減させるために有効である。
【０１１７】
第２の変形例は、領域Ｒt1,mと対応する領域Ｒt2,n^の重心間距離を求め、重心間距離が所定の閾値Ｖdmaxより大きかった場合、その対応付けは無効とみなす。この場合、領域Ｒt1,mに対応する時刻ｔ2の領域は発見できなかったとし、領域Ｒt1,mに対する経時的パラメータ計測は時刻ｔ１までで打ち切る。この変形例は、細胞領域対応付け処理の誤りを低減させるために有効である。
以上の手順により、細胞のパラメータを経時的に計測することができる。
【０１１８】
最後に、図７の処理に戻り、ステップＳ７の処理として、細胞パラメータ表示手段としての表示部３０４にて、認識した細胞領域と計測した細胞パラメータを表示する。図１３は、処理結果の表示の一例を示す説明図である。表示部３０４が備える表示画面３１４は、２つの表示領域３１４ａ，３１４ｂを有し、表示領域３１４ａには、処理対象時点において認識された個々の細胞領域が表示される。ここで、細胞領域にはラベリング処理を適用し、領域毎に識別可能な色、輝度、線種、パターンを与え、例えばラベル画像ａ〜ｅとして表示する。ラベル画像と同じ表示範囲の赤外光画像或いは蛍光画像を連動して表示させても良いし、ラベル画像、赤外光画像、蛍光画像のうち複数を重ね合わせて表示しても良い。或いは、スーパーインポーズ表示を行っても良い。計測した細胞パラメータは、表示領域３１４ｂにおいて、時間を横軸、パラメータ値を縦軸とした折れ線チャートとして表示する。さらに、操作者による入力部３０３中のマウス操作等に応じて両者の表示内容を同期して強調表示すれば、表示内容の視認性が向上する。図１４は、例えばラベル画像ｃを強調表示の指示対象として選択指定した場合に対応する細胞パラメータの折れ線チャートも強調表示される一例を示す説明図である。この場合、操作者が片方を選択強調した場合、対応する他方も同期して強調表示する。
【０１１９】
本実施の形態１では、生細胞Ｃに蛍光タンパクを導入し観察しているが、蛍光タンパクに代えて発光遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子を導入すれば、蛍光画像に代えて発光画像が撮像できる。この場合、励起光照明部２０３及びダイクロイックミラー２０４は不要であり、構成を簡略化できる。発光画像は、細胞光撮像手段としての蛍光撮像部２０７によって撮像される。発光画像に対しては、蛍光画像と同じ手順で処理を行えば良い。このように、例えば細胞が自発光する場合や蛍光を発する場合など、細胞が赤外光以外の光を発する場合でも細胞画像データを取得して細胞観察を行うことができる。
【０１２０】
また、本実施の形態１では、細胞内に局在せずに発現する蛍光タンパクを使用しているが、細胞核、細胞質、核膜、細胞膜、或いはオルガネラに局在して発現する蛍光タンパクであっても構わない。
【０１２１】
なお、パラメータ計測部３０７において計測する細胞パラメータは、本実施の形態１に例示したものに限定されず、さらに、面積、周囲長、外接矩形位置、Ｘ方向フェレ径、Ｙ方向フェレ径、最小フェレ径、最大フェレ径、平均フェレ径、凸周囲長、円形度（真円度）、孔の数、ラフネス（凸周囲長と周囲長の比）、オイラー数、長さ、幅、扁平度、輝度の総和、最小輝度、最大輝度、平均輝度、輝度の標準偏差、輝度の分散、エントロピー、重心位置、２次モーメント、主軸方向、のいずれか或いは複数であっても良い。
【０１２２】
さらに、パラメータ計測部３０７は、任意の複数の細胞からなるグループに対して、細胞数、最小細胞間距離、最大細胞間距離、平均細胞間距離、細胞間距離の標準偏差、細胞間距離の分散、並びに個々の細胞に対して計測した各パラメータの最小値、最大値、平均値、標準偏差、分差、総和、中間値、のいずれか或いは複数を求めても良い。
【０１２３】
以上、本実施の形態１によれば、蛍光タンパクを導入した生細胞を長期間培養しながら、細胞に対する観察光の影響を抑制して細胞の活性が失われにくい状況を確保し、個々の細胞を見失うこと無く追跡し、種々の細胞パラメータを経時的に計測する装置を実現できる。
【０１２４】
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２の細胞観察装置は、実施の形態１と同様、蛍光タンパクを導入した複数の生細胞を培養したまま撮像し、個々の細胞の領域を認識し、経時的な位置変化を追尾しつつ、個々の細胞の特徴を示す細胞パラメータを独立に計測した上で、さらに細胞のアポトーシスを検出する。細胞のアポトーシスの検出とは、細胞が該細胞のプログラム死のモードに入ったかを検出することを意味する。
【０１２５】
図１５は、本実施の形態２に係る細胞観察装置の構成例を示す概略ブロック図である。図中、本細胞観察装置を制御する制御部３０１から培養系、撮像系各部への接続は特に図示していない。本実施の形態２は、実施の形態１と共通の構成として、あらかじめ蛍光タンパクで標識した複数の生細胞Ｃを保持したスライドガラス１０２、観察窓１０５、ステージ搬送機構１１３等を含む培養部１０１、撮像部２０１（対物光学系２０５、結像光学系２０６、蛍光撮像部２０７、赤外光照明部２０８、ダイクロイックミラー２０９、結像光学系２１０、赤外光撮像部２１１等）、制御部３０１、記録部３０２、入力部３０３、表示部３０４、前処理部３０５、細胞認識部３０６、パラメータ計測部３０７、細胞追跡部３０８、露出検出部３０９、撮像回数計数部３１０、占有面積算出部３１１、合焦検出部３１２を備え、これらは実施の形態１と同様に作用する。
【０１２６】
励起光照明部２０３'、ダイクロイックミラー２０４'は実施の形態１における照明部２０３、ダイクロイックミラー２０４の機能に加えて波長選択機能を有し、少なくとも２つの異なる帯域の蛍光に対応可能である。さらに、本実施の形態２の特有の構成として、アポトーシス検出手段としてのアポトーシス検出部３１５を備える。
【０１２７】
本実施の形態２で対象とする生細胞は、細胞膜と細胞内のオルガネラをそれぞれ波長特性の異なる蛍光タンパクで標識し、結果として少なくとも二重に標識されたものである。生細胞の細胞膜及び細胞内のオルガネラを蛍光タンパクで標識するには、一例としてＢＤバイオサイエンス・クロンテック社がライセンスしている細胞内局在化ベクター「BD Living Colors Subcellular Localization Vector」を使用することができる。
【０１２８】
実施の形態１と同様に測定試料、すなわち標識を行った生細胞Ｃの培養と撮像とを経時的に行い、取得した蛍光画像と赤外光画像とを記録部３０２に記録する。ただし、同一の撮像領域に対して、細胞膜を標識した蛍光タンパクの蛍光画像（以下、「細胞膜蛍光画像」という）及び細胞内のオルガネラを標識した蛍光タンパクの蛍光画像（以下、「細胞内オルガネラ蛍光画像」という）の、少なくとも２枚の蛍光画像を撮像する。この際、波長選択機能を有する励起光照明部２０３'、ダイクロイックミラー２０４'によって、各蛍光タンパクの励起に適切な励起光と透過波長をそれぞれ選択する。
【０１２９】
撮像した蛍光画像のうち、細胞膜蛍光画像を前処理部３０５及び細胞認識部３０６で処理し、細胞領域を認識する。処理手順は実施の形態１と同様である。認識した細胞領域を記録部３０２に記録する。
【０１３０】
パラメータ計測部３０７において、実施の形態１で示した細胞領域のパラメータのうち、少なくとも面積と円形度を計測する。次に、認識した個々の細胞領域毎に、細胞内オルガネラ蛍光画像の対応する領域でのエントロピーを計測する。エントロピーＨの計算には式(６)を使用する。ここで、ＡRは注目領域Ｒの面積、Ｐx,yは注目領域Ｒ内の位置(ｘ，ｙ)における輝度値、ＳRは式(７)で示すような注目領域Ｒ内の輝度総和をそれぞれ表す。ただし、輝度総和ＳRが０の場合は、エントロピーＨの値を１とする。
【０１３１】
【数６】
2006238802.tif 000006
【０１３２】
【数７】
2006238802.tif 000007
【０１３３】
細胞膜蛍光画像から抽出した細胞領域について計測したパラメータと、細胞内オルガネラ蛍光画像の対応する領域について計測したエントロピーを、細胞膜蛍光画像、細胞内オルガネラ蛍光画像、細胞領域と関連付けて記録部３０２に記録することで、パラメータ計測が完了する。
【０１３４】
細胞追跡部３０８において、異なる時刻の細胞膜蛍光画像から抽出された細胞領域の対応付けを行う。処理手順は実施の形態１と同様である。細胞領域の対応付け情報を、細胞膜蛍光画像、細胞内オルガネラ蛍光画像、細胞領域、パラメータ計測部３０７において計測した細胞パラメータ、時刻情報と関連付けて記録部３０２に記録する。
【０１３５】
次に、アポトーシス検出部３１５において、アポトーシス発生の有無を調査する。細胞認識部３０６において認識された、時刻ｔ4の細胞領域のうち、任意の１つを手動又は自動で選択する（以下、Ｒt4と記述する）。
【０１３６】
図１６は、アポトーシス検出部３１５により実行される、注目する細胞領域Ｒt4に対するアポトーシスの発生の検出処理例を示す概略フローチャートである。この処理は、図７に示したフローチャート中のステップＳ９の処理として実行される。まず、細胞領域Ｒt4のエントロピーＨ(Ｒt4)が所定の閾値ＶH未満の場合（ステップＳ２１；Ｎｏ）、アポトーシスではない（陰性）と判定し（ステップＳ２５）、アポトーシス検出処理を終了する。
【０１３７】
エントロピーＨ(Ｒt4)が閾値ＶH以上の場合（ステップＳ２１；Ｙｅｓ）、時刻ｔ4の細胞領域Ｒt4に対応する時刻ｔ3の細胞領域Ｒt3を記録部３０２から取得する。ただし、時刻ｔ3は時系列的に時刻ｔ4より所定の時間間隔だけ前の（過去の）時刻である。次に、細胞領域Ｒt3のエントロピーＨ(Ｒt3)と円形度Ｃ(Ｒt3)、細胞領域Ｒt4のエントロピーＨ(Ｒt4)と円形度Ｃ(Ｒt4)に関して、次の条件式(８)及び(９)が共に成立する場合（ステップＳ２２；Ｙｅｓ，Ｓ２３；Ｙｅｓ）、アポトーシスである（陽性）と判定する（ステップＳ２４）。少なくとも一方が成立しない場合、アポトーシスではない（陰性）と判定する（ステップＳ２５）。
【０１３８】
〔数８〕
Ｈ(Ｒt3)＜Ｈ(Ｒt4)                                            ……(８)
〔数９〕
Ｃ(Ｒt3)＜Ｃ(Ｒt4)                                            ……(９)
なお、円形度Ｃは、Ｃ＝４πＳ／Ｌ2で定義されるものであって、０≦Ｃ≦１である。ただし、Ｓは細胞の面積、Ｌは細胞の輪郭の長さ（周囲長）である。
【０１３９】
以上のアポトーシス判定手順を時刻ｔ4における全ての細胞領域に対して反復して行うことで、単一画像内の全てのアポトーシスを検出することができる。さらに、撮像した全ての時刻の画像に対してアポトーシスの検出を反復して行い、全ての画像内のアポトーシスを検出する。判定結果は、細胞領域と関連付けて記録部３０２に記録する。
【０１４０】
最後に、アポトーシス判定結果を表示部３０４にて表示する。これには、アポトーシス判定で陽性であった細胞領域と、陰性であった細胞領域を区別可能な任意の表示形式を使用できる。例えば、陽性或いは陰性の細胞領域にのみマーカを重畳表示する、陽性と陰性の細胞領域にそれぞれ異なるマーカを重畳表示する、陽性或いは陰性の細胞領域のみを表示する、陽性と陰性の細胞領域で表示色・パターン・点滅等の表示属性を変える、陽性と陰性の細胞領域で操作者操作への応答内容を変える、等の手法が適用可能であり、これらを相互に切り替えても構わない。また、異なる時刻に取得した複数の画像に対する判定結果を順次切り替えて表示すれば、経時的なアポトーシスの発生状況を視覚的に把握可能となる。
【０１４１】
以上、本実施の形態２によれば、蛍光タンパクを導入した生細胞を長期間培養しながら、個々の細胞を見失うこと無く追跡し、種々の細胞パラメータを経時的に計測した上で、さらに長期に亘って細胞を培養していくうちにアポトーシスが発生すれば、このようなアポトーシスの発生を経時的に検出することができる。
【０１４２】
（実施の形態３）
本発明の実施の形態３の細胞観察装置は、実施の形態１と同様、蛍光タンパクを導入した複数の生細胞を培養したまま撮像し、個々の細胞の領域を認識し、経時的な位置変化を追尾しつつ、個々の細胞の特徴を示す細胞パラメータを独立に計測した上で、さらに細胞の分裂を検出し、細胞の系譜を生成するものである。
【０１４３】
図１７は、本実施の形態３に係る細胞観察装置の構成例を示す概略ブロック図である。図中、本細胞観察装置を制御する制御部３０１から培養系、撮像系各部への接続は特に図示していない。本実施の形態３は、実施の形態１と共通の構成として、あらかじめ蛍光タンパクで標識した複数の生細胞Ｃを保持したスライドガラス１０２、観察窓１０５、ステージ搬送機構１１３等を含む培養部１０１、撮像部２０１（励起光照明部２０３、ダイクロイックミラー２０４、対物光学系２０５、結像光学系２０６、蛍光撮像部２０７、赤外光照明部２０８、ダイクロイックミラー２０９、結像光学系２１０、赤外光撮像部２１１等）、制御部３０１、記録部３０２、入力部３０３、表示部３０４、前処理部３０５、細胞認識部３０６、パラメータ計測部３０７、細胞追跡部３０８、露出検出部３０９、撮像回数計数部３１０、占有面積算出部３１１、合焦検出部３１２を備え、これらは実施の形態１と同様に作用する。さらに、本実施の形態３の特有の構成として、細胞分裂検出手段としての細胞分裂検出部３１６と細胞系譜作成手段としての系譜作成部３１７とを備える。
【０１４４】
本実施の形態３においても、実施の形態１と同様に測定試料、すなわち標識を行った生細胞Ｃの培養と撮像を経時的に行い、取得した蛍光画像と赤外光画像を記録部３０２に記録する。撮像した画像のうち、細胞蛍光画像を前処理部３０５及び細胞認識部３０６で処理し、細胞領域を認識する。処理手順は実施の形態１と同様である。認識した細胞領域を記録部３０２に記録する。パラメータ計測部３０７において、実施の形態１で示した細胞領域の細胞パラメータを計測する。必要な細胞パラメータは、後述する細胞分裂検出部３１６の動作に応じて異なる。計測した細胞パラメータは記録部３０２に記録する。
【０１４５】
細胞追跡部３０８において、異なる時刻の細胞蛍光画像から抽出された細胞領域の対応付けを行う。処理手順は実施の形態１と同様である。細胞領域の対応付け情報を、細胞画像、細胞領域、パラメータ計測部３０７において計測した細胞パラメータ、時刻情報と関連付けて記録部３０２に記録する。
【０１４６】
時刻ｔ2における異なる２つの細胞領域Ｒt2,n1，Ｒt2,n2が、共に時刻ｔ1の同一の領域Ｒt1,m0に対応付けられた場合、細胞分裂発生の可能性ありとみなし、細胞分裂検出部３１６により、後述の手順に従って細胞分裂の有無を判定する。
【０１４７】
細胞分裂と判定された場合、通常の経時的な細胞の対応関係（以下、「経時的対応関係」という）に加え、細胞の分裂前の１つの親細胞と分裂後の２つの娘細胞の親子間の対応関係（以下、「親子対応関係」という）も記録する。親子対応関係は、経時的対応関係に追加情報として記録しても良いし、経時的対応関係とは別に記録しても良い。前者は記憶領域を節約することができ、後者は情報を参照する際の操作が簡便になる。親子対応関係を記録する際のデータ表現は一例として、各世代を高さに、各細胞領域を節点に対応させた木構造を用いる。
【０１４８】
細胞分裂検出部３１６における細胞分裂判定には、以下に示すように複数の処理手順が存在し、これらのうち１つ以上の手順を用いて判定処理を行う。この処理は、図７に示したフローチャート中のステップＳ１０の処理として実行される。
【０１４９】
図１８は、細胞分裂判定処理の第１の処理手順を示す概略フローチャートである。図３１に示す概略フローチャートは、細胞分裂後の娘細胞の面積が通常の細胞の面積よりも小さく、かつ細胞分裂前後でそれぞれ対応する細胞の輝度の総和が概ね等しくなるという特性に基づいた細胞分裂判定処理手順を例示する。
【０１５０】
まず、細胞領域Ｒt2,n1，Ｒt2,n2の面積を所定の閾値ＶA1，ＶA2とそれぞれ比較する（ステップＳ３１，Ｓ３２）。細胞領域Ｒt2,n1，Ｒt2,n2のうちの少なくとも一方の面積が閾値ＶA1より小さい場合、或いは少なくとも一方の面積が閾値ＶA2より大きい場合（ステップＳ３１；Ｎｏ，又はステップＳ３２；Ｎｏ）、細胞分裂ではないと判定する（ステップＳ３５）。一例として、閾値ＶA1は細胞領域の平均的な面積の０.５倍、閾値ＶA2は０.９倍の値とする。
【０１５１】
さらに、細胞領域Ｒt2,n1，Ｒt2,n2の輝度総和を合算したものと領域Ｒt1,m0の輝度総和との差を求め、この差が所定の閾値ＶDより大きい場合（ステップＳ３３；Ｎｏ）、細胞分裂ではないと判定する（ステップＳ３５）。閾値ＶD以下の場合（ステップＳ３３；Ｙｅｓ）、細胞分裂であると判定する（ステップＳ３４）。
【０１５２】
また、図１９は、細胞分裂判定処理の第２の処理手順を示す概略フローチャートである。図１９に示す概略フローチャートは、細胞分裂直前の細胞が時間の経過と共に収縮しながら略球体の形状となった後、細胞分裂を行うという特性に基づいた細胞分裂判定処理手順を例示する。
【０１５３】
まず、細胞領域Ｒt1,m0の属する時刻ｔ1のフレームから所定のＮF1フレーム前まで遡り、領域Ｒt1,m0の円形度Ｃ（Ｃ＝４πＳ／Ｌ2 、ただし：Ｓは細胞の面積、Ｌは細胞の輪郭の長さ（周囲長）である。）を取得し（ステップＳ４１）、円形度Ｃが所定の閾値ＶCを超えるフレームが存在するか否かを求める（ステップＳ４２）。そのようなフレームが存在しない場合（ステップＳ４２；Ｎｏ）、細胞分裂ではないと判定する（ステップＳ４６）。
【０１５４】
存在する場合（ステップＳ４２；Ｙｅｓ）、領域Ｒt1,m0の円形度が所定の閾値を超えた最初のフレームからさらに所定のＮF2フレーム前まで遡り、領域Ｒt1,m0の円形度及び面積の時間的推移を求め、前者が概略単調増加であると同時に後者が概略単調減少であるという条件が成り立つか否かを求める（ステップＳ４３，Ｓ４４）。この条件を判定するためには、例えば回帰分析による円形度と面積の推移をそれぞれ直線近似し、円形度の推移の近似直線の傾きが所定の正の値ＶT1より大きく、かつ面積の推移の近似直線の傾きが所定の負の値ＶT2より小さいかどうかを見れば良い。
【０１５５】
２つの条件が共に成り立つ場合（ステップＳ４３；Ｙｅｓ、ステップＳ４４；Ｙｅｓ）、細胞分裂であると判定する（ステップＳ４５）。成り立たない場合、細胞分裂ではないと判定する（ステップＳ４６）。
【０１５６】
また、図２０は、細胞分裂判定処理の第３の処理手順を示す概略フローチャートである。図２０に示す概略フローチャートは、細胞分裂直前の細胞内では核膜が消失し、細胞核内の構成要素が細胞質全体に拡散するという特性に基づいた細胞分裂判定処理手順を例示する。
【０１５７】
この処理手順では、あらかじめ細胞核と細胞質を互いに独立に領域抽出可能なように標識しておく。このような標識には、一例としてＢＤバイオサイエンス・クロンテック社がライセンスしている細胞内局在化ベクター「BD Living Colors Subcellular Localization Vector」を使用することができる。
【０１５８】
まず、細胞領域Ｒt1,m0において、細胞核の存在範囲の面積と細胞質の存在範囲の面積をそれぞれ求め、前者を後者で割った比を計算し、この比が所定の閾値ＶR1以上で、所定の閾値ＶR2以下の場合（ステップＳ５１；Ｙｅｓ）、細胞分裂であると判定する（ステップＳ５２）。そうでない場合（ステップＳ５１；Ｎｏ）、細胞分裂ではないと判定する（ステップＳ５３）。ただし、ＶR1≦ＶR2である。
【０１５９】
また、図２１は、細胞分裂判定処理の第４の処理手順を示す概略フローチャートである。図２１に示す概略フローチャートは、細胞分裂直前の細胞内では微小管が２つの紡錘体を形成するとともに、この紡錘体の領域以外には殆ど存在しないという特性に基づいた細胞分裂判定処理手順を例示する。
【０１６０】
この処理手順では、あらかじめ細胞内の微小管を光学的に識別可能なように標識しておく。このような標識には、一例としてＢＤバイオサイエンス・クロンテック社がライセンスしている細胞内局在化ベクター「BD Living Colors Subcellular Localization Vector」を使用することができる。
【０１６１】
まず、細胞領域Ｒt1,m0において、微小管の濃度分布を２次元的又は３次元的に可視化した濃度分布マップを生成し（ステップＳ６１）、生成した濃度分布マップに空間ローパスフィルタ処理を施し（ステップＳ６２）、フィルタ処理後の濃度分布マップから濃度の極大点を検出し（ステップＳ６３）、検出された極大点が２つであるか否かを判断する（ステップＳ６４）。極大点が２つである場合（ステップＳ６４；Ｙｅｓ）、すなわち、領域内の２個所に濃度が局在していれば、細胞分裂であると判定する（ステップＳ６５）。そうでない場合（ステップＳ６４；Ｎｏ）、細胞分裂ではないと判定する（ステップＳ６６）。
【０１６２】
また、図２２は、細胞分裂判定処理の第５の処理手順を示す概略フローチャートである。図２２に示す概略フローチャートは、細胞分裂前後において細胞の立体形状が変化するという特性に基づいた細胞分裂判定処理手順を例示する。
【０１６３】
まず、細胞領域Ｒt1,m0において、輝度が所定の閾値ＶＬを超える画素のみを対象として輝度値を合計し、輝度総和ＳLを求める（ステップＳ７１）。輝度総和ＳLを、細胞領域Ｒt1,m0の属する時刻ｔ1のフレームから所定のＮF3フレーム前まで遡りながら求め、領域Ｒt1,m0の輝度総和ＳLの変化の様子を調べる（ステップＳ７２）。図２３は、輝度総和ＳLの時間的推移の一例を示す特性図である。輝度総和ＳLが図２３に示すように急激に増加する場合、細胞分裂であると判定し（ステップＳ７４）、最も急激に輝度総和ＳLが変化した時刻を分裂時刻とする。ここで、所定の閾値ＶJを用意し、輝度総和ＳLが閾値ＶJを超えている範囲を分裂期と判定する（ステップＳ７３）と簡便に処理を実現できる。この場合、閾値ＶJを超える範囲が無ければ細胞分裂なし（ステップＳ７５）を意味する。
【０１６４】
分裂期（細胞周期におけるＭ期）以外では、細胞は、図２４−１に示す平面図、図２４−２に示す縦断正面図、図２４−３に示す図２４−２部分の輝度分布特性のように観察される。しかし、分裂期（Ｍ期）においては、細胞の形状を維持するための微小管が紡錘体の形成に転用されるため、細胞はそれまでの形状を維持できず、細胞膜の表面張力等の影響で球形に近い形状となる。この状態では、細胞は、図２４−４に示す平面図、図２４−５に示す縦断正面図、図２４−６に示す図２４−５部分の輝度分布特性のように観察される。
【０１６５】
閾値ＶLを超える画素のみを用いて輝度総和ＳLを求めた場合、細胞の体積や発現している蛍光タンパクの量が同じであっても、立体形状によって輝度総和ＳLに関与する部位が変化する。本手法のように閾値ＶLを超える部位のみを用いて輝度総和ＳLを求めた場合、分裂期Ｍにおいて総和に関与する部位Ａは、分裂期Ｍ以外において総和に関与する部位Ｂより大きくなる。したがって、輝度総和ＳLは図２３に示したように変化する。すなわち、輝度総和ＳLが単峰性の推移を示している期間が、細胞周期におけるＭ期に対応する。
以上の説明から明らかなように、本処理手順５は細胞周期におけるＭ期の検出手法としても有効である。
【０１６６】
細胞分裂を判定する際には、上述の第１の処理手順から第５の処理手順までのいずれを用いても良い。さらに、２つ以上の処理手順を実施して判定結果を組み合わせても良く、その場合、さらに精度の高い判定が可能となる。
【０１６７】
以上の処理手順により、細胞分裂の有無を判定すると共に、細胞の親子関係を知ることができる。細胞の親子関係を複数の時刻において判定し記録部３０２に蓄積することで、個々の細胞の世代間の繋がり、すなわち細胞系譜を得ることができる。この細胞系譜は、系譜作成部３１７が細胞分裂検出部３１６の検出結果に基づいて、分裂前後の細胞を関連付けることによって生成する。ここでは、細胞の親子関係情報が２世代以上に渡って繋がったものを「系譜」と呼称し、２世代間の親子関係情報は最小の系譜である。系譜作成部３１７によって生成された系譜情報は、記録部３０２で保持される。
【０１６８】
最後に、細胞系譜表示手段としての表示部３０４にて、認識した細胞領域（細胞領域）と系譜作成部３１７により作成された細胞系譜を表示する。図２５は、時刻ｔ1〜ｔ3についての観察結果の表示の一例を示す説明図である。図２５に示すように、表示部３０４が備える表示装置の画面３１４は、４つの表示領域３１４ｃ〜３１４ｆに区画され、表示領域３１４ｃ〜３１４ｅのそれぞれには、検出対象時点である時点ｔ3を含めた３つの時点ｔ1，ｔ2，ｔ3の各細胞領域を示す画像情報が表示される。表示領域３１４ｆには、各時点の各細胞領域の対応関係が木構造（ツリー構造）で表示され、細胞分裂によって生じた細胞の系譜情報が同時に表示される。
【０１６９】
なお、画面３１４上で、全ての情報を一度に表示できない場合は、操作者の指示や表示部３０４の能力に応じて表示する内容を選択する。ここで、細胞領域にはラベリング処理を適用し、領域毎に識別可能な色、輝度、線種、パターンを与え、ラベル画像として表示する。ラベル画像の表示に代えて、同じ表示範囲の細胞赤外光画像或いは蛍光画像を表示しても、三者を切り替えられるようにしても良い。或いは、三者のうち複数を連動して表示させても良いし、重ね合わせて表示しても良い。図３８に示すように、ラベル画像の形状を実際の細胞の形状と対応させれば、さらに視認性が向上する。
【０１７０】
系譜情報は、時間を深さ方向とした木構造として表示し、木構造の節点はある時刻での細胞領域に対応する。ラベル画像の色、輝度、輪郭線の属性、パターンのうち少なくとも１つを対応する細胞領域の表示と一致させ、両者の対応を視覚的に明確化する。図３８は、両者のパターンを対応させた表示例を示している。
【０１７１】
マウス等の入力部３０３を用いた操作者の指示により、両者の表示内容が同期して強調表示されるようにすれば、表示内容の確認がより簡便となる。この場合、操作者がラベル画像における細胞領域又は木構造の接点のどちらか片方を選択した場合、選択された対象を強調表示すると共に、他方の対応する表示物も強調表示する。さらに、選択された細胞に対する系譜上の祖先（親を含む）や子孫（子を含む）も併せて強調すれば、細胞の系譜を視覚的に把握することが容易となる。
【０１７２】
図２６は、操作者が時刻ｔ2における細胞領域３２１を選択した例であり、選択された領域３２１の輪郭線幅を太くすることで強調表示すると共に、系譜上の祖先に当たる時刻ｔ1の細胞領域３２２、系譜上の子孫に当たる時刻ｔ3の細胞領域３２３、及び系譜表示において対応する節点と節点間の接続線が同期して強調される様子を表している。
【０１７３】
以上、本実施の形態３によれば、蛍光物質によって標識された複数の生細胞を経時的に撮像し、個々の細胞を認識し、経時的な位置変化を追尾しつつ、細胞の分裂を検出し、細胞の系譜情報を獲得することができる。すなわち、長期に細胞を培養していくうちに細胞分裂が発生すれば、これを検出することができ、また、長期に亘って細胞を培養していくうちに細胞分裂が発生しても、これを検出することで、細胞観察の精度が向上する。特に、上述の第１〜第５の処理手順によれば、細胞分裂を精度よく発見することができる。
【０１７４】
（実施の形態４）
本発明の実施の形態４は、実施の形態１〜３の機能を組み合わせた顕微鏡システムへの適用例を示す。本顕微鏡システムは、実施の形態１と同様に、蛍光タンパクを導入した複数の生細胞を培養したまま撮像し、個々の細胞の領域を認識し、経時的な位置変化を追尾しつつ、個々の細胞の特徴を示す細胞パラメータを独立に計測した上で、実施の形態２と同様のアポトーシス検査、又は実施の形態３と同様の細胞分裂検出を行う。
【０１７５】
図２７は、本実施の形態４に係る顕微鏡システムの構成例を示す概略ブロック図である。図中、本装置を制御する制御部３０１から培養系、撮像系各部への接続は特に図示していない。実施の形態４は、実施の形態１と共通の構成として、あらかじめ蛍光タンパクで標識した複数の生細胞Ｃを保持したスライドガラス１０２、観察窓１０５、ステージ搬送機構１１３等を含む培養部１０１、撮像部２０１（対物光学系２０５、結像光学系２０６、蛍光撮像部２０７、赤外光照明部２０８、ダイクロイックミラー２０９、結像光学系２１０、赤外光撮像部２１１等）、制御部３０１、記録部３０２、入力部３０３、表示部３０４、前処理部３０５、細胞認識部３０６、パラメータ計測部３０７、細胞追跡部３０８、露出検出部３０９、撮像回数計数部３１０、占有面積算出部３１１、合焦検出部３１２を備え、これらは実施の形態１と同様に作用する。
【０１７６】
さらに、実施の形態２と共通の構成として、励起光照明部２０３'、ダイクロイックミラー２０４'、アポトーシス検出部３１５を備え、これは実施の形態２と同様に作用する。励起光照明部２０３'とダイクロイックミラー２０４'は実施の形態１における照明部２０３とダイクロイックミラー２０４の機能を含んでいるため、アポトーシス検出を行わない場合にも使用できる。アポトーシス検出機能を使用しない代わりに、実施の形態１と同様の照明部２０３とダイクロイックミラー２０４を搭載しても良い。さらに、実施の形態３と共通の構成として、細胞分裂検出部３１６及び系譜策西部３１７を備え、これは実施の形態３と同様に作用する。
【０１７７】
上記構成のうち、本実施の形態４では、少なくとも、培養部１０１、励起光照明部２０３'、ダイクロイックミラー２０４'、対物光学系２０５、結像光学系２０６、蛍光撮像部２０７、赤外光照明部２０８、ダイクロイックミラー２０９、結像光学系２１０、赤外光撮像部２１１は顕微鏡４０１の一部をなすように構成されているが、これ以外の機能を顕微鏡４０１に含めても良い。
【０１７８】
本実施の形態４も、実施の形態１と同様に測定試料、すなわち標識を行った生細胞Ｃの培養と撮像を経時的に行い、取得した蛍光画像と赤外光画像を記録部３０２に記録する。撮像した蛍光画像を前処理部３０５及び細胞認識部３０６で処理し、細胞領域を認識する。処理手順は実施の形態１と同様である。認識した細胞領域を記録部３０２に記録する。アポトーシス検出を行う場合は、実施の形態２と同様に細胞膜蛍光画像を撮像し、これに基づいて細胞認識を行う。
【０１７９】
パラメータ計測部３０７において、実施の形態１で示した細胞領域の細胞パラメータを計測する。必要な細胞パラメータは入力部３０３からの指示によって変更できる。アポトーシス検出又は細胞分裂検出を行う場合は、それぞれの処理に必要な細胞パラメータを計測する。これらは実施の形態２又は３で述べた通りである。計測した細胞パラメータは記録部３０２に記録する。
【０１８０】
細胞追跡部３０８において、異なる時刻の細胞画像から抽出された細胞領域の対応付けを行う。処理手順は実施の形態１と同様である。細胞領域の対応付け情報を、細胞画像、細胞領域、パラメータ計測部３０７において計測した細胞パラメータ、時刻情報と関連付けて記録部３０２に記録する。
【０１８１】
さらに、アポトーシス検出部３１５において、細胞のアポトーシスを検出する。アポトーシス検出を行うかどうかは、少なくとも入力部３０３からの指示によって選択でき、検出結果を記録部３０２に記録する。また、検出結果を表示部３０４に表示しても良い。さらに、細胞分裂検出部３１６において、細胞分裂を検出する。細胞分裂検出を行うかどうかは、少なくとも入力部３０３からの指示によって選択でき、検出結果を記録部３０２に記録する。また、検出結果を表示部３０４に表示しても良い。したがって、本実施の形態の入力部３０３は、検出機能選択手段としても機能する。
【０１８２】
なお、図２７ではアポトーシス検出部３１５と細胞分裂検出部３１６との両方を搭載した構成を例示しているが、少なくとも一方を省略した構成であっても良く、その場合、処理速度の向上とコスト低減の効果が得られる。また、アポトーシス検出部３１５と細胞分裂検出部３１６との少なくとも一方を搭載した構成において、入力部３０３には公開されない指示方法によって、機能を使用禁止にしておいても良い。
【０１８３】
以上、本実施の形態４によれば、蛍光物質によって標識された複数の生細胞を経時的に撮像し、個々の細胞を認識し、経時的な位置変化を追尾しつつ、細胞のアポトーシス或いは細胞分裂を検出し、細胞の系譜情報を獲得する機能を、顕微鏡４０１をベースとした比較的安価で信頼性の高い装置として実現できる。
【０１８４】
本発明は、上述した実施の形態に限らず、本発明の趣旨を逸脱しない範囲であれば、種々の変形が可能である。例えば、前述の細胞認識部３０６、パラメータ計測部３０７、細胞追跡部３０８、アポトーシス検出部３１５、細胞分裂検出部３１６等の各部による処理手順は、あらかじめ用意された細胞観察プログラムを制御部３０１などのマイクロコンピュータで実行することにより実現するようにしてもよい。この細胞観察プログラムは、インターネットなどのネットワークを介して配布することもできる。また、この細胞観察プログラムは、ハードディスク、ＦＤ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤなどのマイクロコンピュータで読み取り可能な記録媒体に記録され、マイクロコンピュータによって記録媒体から読み出されることにより実行することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】本発明の実施の形態１に係る細胞観察装置の構成例を示す概略ブロック図である。
【図２】培養部の構成例を示す水平断面図である。
【図３】培養部の構成例を示す縦断正面図である。
【図４】整流板の構成例を示す斜視図である。
【図５】培養部側と撮像部側との境界部分の断熱構成例を示す断面図である。
【図６】蛍光撮像された培養中の細胞画像の一例を示す説明図である。
【図７】画像データ処理例を示す概略フローチャートである。
【図８】先鋭化フィルタによる重み付け例を示す図である。
【図９】領域統合の第１の手法例を示す概略フローチャートである。
【図１０】領域統合の第２の手法例を示す概略フローチャートである。
【図１１】記録部に記録された細胞パラメータの計測結果例を示す説明図である。
【図１２】ｍとｎの可能な組み合わせについて評価値を計算した結果を示す説明図である。
【図１３】処理結果の表示の一例を示す説明図である。
【図１４】強調表示の一例を示す説明図である。
【図１５】本発明の実施の形態２に係る細胞観察装置の構成例を示す概略ブロック図である。
【図１６】アポトーシスの発生の検出処理例を示す概略フローチャートである。
【図１７】本発明の実施の形態３に係る細胞観察装置の構成例を示す概略ブロック図である。
【図１８】細胞分裂判定処理の第１の処理手順を示す概略フローチャートである。
【図１９】細胞分裂判定処理の第２の処理手順を示す概略フローチャートである。
【図２０】細胞分裂判定処理の第３の処理手順を示す概略フローチャートである。
【図２１】細胞分裂判定処理の第４の処理手順を示す概略フローチャートである。
【図２２】細胞分裂判定処理の第５の処理手順を示す概略フローチャートである。
【図２３】輝度総和の時間的推移の一例を示す特性図である。
【図２４−１】分裂期以外の細胞の様子を示す平面図である。
【図２４−２】分裂期以外の細胞の様子を示す縦断正面図である。
【図２４−３】図２４−２部分の輝度分布特性を示す図である。
【図２４−４】分裂期の細胞の様子を示す平面図である。
【図２４−５】分裂期の細胞の様子を示す縦断正面図である。
【図２４−６】図２４−５部分の輝度分布特性を示す図である。
【図２５】時刻ｔ1〜ｔ3についての観察結果の表示の一例を示す説明図である。
【図２６】その強調表示の一例を示す説明図である。
【図２７】本発明の実施の形態４に係る顕微鏡システムの構成例を示す概略ブロック図である。
【符号の説明】
【０１８６】
１０１  培養部
１０４  筐体
１１１  断熱部
２０１  撮像部
２０６  結像光学系
２０７  蛍光撮像部
２１０  結像光学系
２１１  赤外光撮像部
３０２  記録部
３０３  入力部
３０４  表示部
３０６  細胞認識部
３０７  パラメータ計測部
３０８  細胞追跡部
３１０  撮像回数計数部
３１１  占有面積算出部
３１５  アポトーシス検出部
３１６  細胞分裂検出部
３１７  系譜作成部
４０１  顕微鏡
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２４−５】
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【図２４−６】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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