(57)【要約】【課題】試料中に含まれる標的核酸を簡便かつ高感度に検出する手法を提供する。【解決手段】試料中に含まれる標的核酸を簡便かつ高感度に検出する手法において、標的核酸の一部または全部と相補的な塩基配列を有し、かつ、相互作用により一方の信号が変化する二つの標識物質で標識され、二つの標識物質に挟まれた塩基配列中に少なくとも一つのリボ核酸を有する核酸プローブを信号の変化する標識物質が固定化部分に近く配置される方向で固相担体に固定化した核酸アレイであって、標的核酸と核酸プローブのDNA/RNAハイブリッドをRibonuclease Hで切断することで解消される標識物質の信号を検出する方法。【選択図】  図１
2006191856.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程からなることを特徴とする標的核酸を検出する方法。
（１）標的核酸の一部または全部の連続する塩基配列に対して相補的な２本鎖形成用の塩基配列と、該二本鎖形成用の塩基配列に対して所定の間隔で結合された一対の標識物質と、を有し、核酸部分がデオキシリボ核酸(DNA)からなる部分と、核酸部分がリボ核酸(RNA)からなる部分と、からなり、前記一対の標識物質が、前記所定の間隔において相互作用することで、少なくとも一方の標識物質からの信号が変化する核酸プローブを用意する工程。
（２）前記核酸プローブを前記信号が変化する一方の標識物質が固相担体に対する結合位置に近く配置される方向で該固相担体の表面に固定する工程。
（３）前記核酸プローブと標的核酸をハイブリダイズしてハイブリッドを形成させる工程。
（４）前記標的核酸と核酸プローブのハイブリッドにリボヌクレアーゼ（Ribonuclease） Hを作用させ、該ハイブリッドのリボ核酸を含む部分で切断し、該ハイブリッドの有する一対の標識物質の相互作用を解消させる工程。
（５）前記一対の標識物質の相互作用を解消した結果として惹き起こされた、前記少なくとも一つの標識物質の信号の変化の解消を検出する工程。
【請求項２】
前記標識物質が蛍光色素である請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記標識物質のうち、前記核酸プローブの結合位置から遠い位置に配置された標識物質がクエンチャー物質である請求項１記載の検出方法。
【請求項４】
上記標識物質の信号の変化が蛍光共鳴エネルギー移動である請求項1記載の検出方法。
【請求項５】
標的核酸の一部または全部の連続する塩基配列に対して相補的な２本鎖形成用の塩基配列と、該二本鎖形成用の塩基配列に対して所定の間隔で結合された一対の標識物質と、を有し、核酸部分がデオキシリボ核酸(DNA)からなる部分と、核酸部分がリボ核酸(RNA)からなる部分と、からなり、該リボ核酸(RNA)からなる部分が前記一対の標識物質の結合部の間に位置し、かつ、該一対の標識物質が、前記所定の間隔において相互作用することで、少なくとも一方の標識物質からの信号が変化し、該信号が変化する一方の標識物質が固相担体に対する結合位置に近く配置される方向で該固相担体の表面に固定が可能な官能基を有する核酸プローブ。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸プローブを固相担体に固定化したプローブ担体。
【請求項７】
核酸検出キットであって、
請求項６に記載のプローブ担体およびリボヌクレアーゼ（Ribonuclease） Hを少なくとも含み構成される核酸検出キット。
【請求項８】
下記工程からなることを特徴とするプローブ担体の製造方法。
（１）標的核酸の一部または全部の連続する塩基配列に対して相補的な２本鎖形成用の塩基配列と、該二本鎖形成用の塩基配列に対して所定の間隔で結合された一対の標識物質と、を有し、核酸部分がデオキシリボ核酸(DNA)からなる部分と、核酸部分がリボ核酸(RNA)からなる部分と、からなり、該リボ核酸(RNA)からなる部分が前記一対の標識物質の結合部の間に位置し、かつ、該一対の標識物質が、前記所定の間隔において相互作用することで、少なくとも一方の標識物質からの信号が変化する核酸プローブを用意する工程。
（２）前記核酸プローブを前記信号が変化する一方の標識物質が固相担体に対する結合位置に近く配置される方向で該固相担体の表面に固定する工程。
【請求項９】
下記工程からなることを特徴とする標的核酸を検出する方法。
（１）請求項６に記載のプローブ担体を準備する工程
（２）前記核酸プローブと標的核酸をハイブリダイズしてハイブリッドを形成させる工程。
（３）前記標的核酸と核酸プローブのハイブリッドにリボヌクレアーゼ（Ribonuclease） Hを作用させ、該ハイブリッドのリボ核酸を含む部分で切断し、該ハイブリッドの有する一対の標識物質の相互作用を解消させる工程。
（４）前記一対の標識物質の相互作用を解消した結果として惹き起こされた、前記少なくとも一つの標識物質の信号の変化の解消を検出する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する標的配列を有する核酸の検出方法、なかでも核酸アレイを用いた検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子解析技術の進歩の結果、ヒトを含むさまざまな動植物のゲノム解析が可能となり、既に、多くの遺伝子が特定され、その配列が明らかとされてきた。また、網羅的な遺伝子発現解析から特定された疾病関連遺伝子は、治療薬の開発対象としてだけではなく、早期発見が可能な診断マーカーとしても有用であり、遺伝病、あるいはウイルス、菌などに起因する感染症の診断に利用されている。
【０００３】
上記のように、核酸配列を利用した診断法の中で最も一般的な方法が、核酸アレイを用いた方法であるが、診断対象となる標的核酸は一般にごく微量であり、アレイでの診断前に、別途、Polymerase Chain Reaction(以下、PCR)などの標的核酸の増幅操作が必要である。また、アレイ上の核酸プローブとハイブリダイズした標的核酸を検出するためには、蛍光色素などのレポーター分子で標的核酸を標識する必要もあり、PCR時に標識を行うのが一般的である。現在の核酸アレイでは、感度、標識の面から、PCRを除くことはできず、実際の診断前に、多くの操作、時間を必要とする。
【０００４】
上記の核酸アレイは、検出する標的核酸をPCRなどで増幅する際に標識するが、逆にプローブの側を標識して用いるモレキュラービーコン(Biochemistry, 34, 285-292, 1995)などの方法がある。モレキュラービーコンは、標的核酸とハイブリダイズする核酸プローブの両方の末端にそれぞれ、蛍光物質と消光物質を結合させたプローブである。プローブのみの状態では、自身でヘアピン構造を形成するようにデザインされており、この状態では末端の蛍光物質から消光物質へエネルギーが移動し、蛍光物質の蛍光は観測されない。これに対し、標的核酸とハイブリダイズし、蛍光物質と消光物質との距離が離れると蛍光が観測されるようになる。また、同様の検出方法として、TaqManプローブ(Genet. Anal., 14, 143, 1999)を用いる方法がある。TaqManプローブはモレキュラービーコンと同様、蛍光物質と消光物質を結合したプローブを標的核酸のプライマー結合部位より下流に結合し、PCRを行う。ここで、モレキュラービーコンと異なり、TaqManプローブの蛍光色素は二本鎖構造をとっている状態でも蛍光物質は消光されている。PCRに用いるDNAポリメラーゼは5'エキソヌクレアーゼ活性を有しており、TaqManプローブと標的核酸の二本鎖領域まで達すると、TaqManプローブの末端が切断され、蛍光分子が遊離される。これにより、消光が解消し、蛍光物質が蛍光を発し、検出が可能となる。また、標識プローブの分解により生じる信号を検出する手段として、サイクロンプローブ法（タカラバイオ株式会社）がある。この方法は、モレキュラービーコン、TaqManプローブと同様、プローブの両末端にそれぞれ、蛍光物質と消光物質を結合しているが、プローブ中の少なくとも一ヌクレオチドがリボ核酸(RNA)であることを特徴とする。このプローブを標的核酸とハイブリダイズするとDNA/RNAハイブリッドが形成するが、そのDNA/RNAハイブリッドを特異的に認識し、加水分解する酵素Ribonuclease H(以下、RNase H)を作用することで、プローブを分解し、蛍光物質からの蛍光を検出する。
【０００５】
上記のモレキュラービーコン、TaqManプローブあるいはサイクリングプローブを用いる方法は、プローブを固体表面に固定化しなくても、検出が可能であり、PCRで標的核酸を増幅する際の進行状況をモニターすることができる。特に、TaqManプローブ、サイクリングプローブは、標的核酸に結合すると酵素により分解されるので、次々とプローブが標的核酸に結合、分解を繰り返し、その結果、得られる蛍光強度が増大し、高感度な検出が可能となる。また、上記の各プローブには消光物質による蛍光の消光−再発光だけでなく、二種類の蛍光色素同士の蛍光共鳴エネルギー移動を利用することも可能である。しかし、プローブを標識する上記各方法は、固体表面に固定せず、溶液中で適用されるため、同時に二つ以上のプローブを用いる場合、プローブの種類と同じ数の色素の組み合わせを用意しなければならず、事実上、核酸アレイと同等のプローブ数を一度に分析することは不可能である。また、複数のプローブを分析するためにプローブ毎に反応溶液を用意する場合、増幅および検出に必要な酵素などの試薬が反応溶液ごとに必要とる。さらに、使用する酵素は要時調製しなければ活性を失ってしまうため、分析の度に反応溶液を調製しなければならず、時間と手間がかかるなどのデメリットがある。
【０００６】
上記の核酸アレイを用いる方法、標識プローブを用いる方法の両方のメリットを併せ持つ検出方法として、標識RNAプローブを固定化したアレイを用いる手法がある(特開2003-225099号公報)。この方法は、標的核酸とハイブリダイズした蛍光標識RNAプローブがRNase Hによって分解され、固体表面上の蛍光標識RNAプローブが減少する結果、測定されるシグナルが標的核酸を含まない対照試料よりも低い場合に、試料中に標的核酸が存在すると判定する方法である。この方法は、アレイ上のプローブに標識を行うため、標的核酸の標識が不要であり、また、酵素による分解を利用するため、高感度な検出が可能である。さらに、固体表面に固定化することで複数のプローブからの信号を位置で判定することが可能である。しかし、上記の標識プローブを用いる方法とは異なり、標的核酸が存在しない場合でも蛍光が検出されるため、対照試料との蛍光強度の比較としてしか判定が不可能である。そのため、常に対照試料が必要であること、また、対照試料の信号は一定でなければならない。一般に、蛍光物質はクエンチングなどを起こしやすく、蛍光強度を一定に保つことは難しい。
【特許文献１】特開2003-225099号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
標識プローブを用いた方法や酵素によるDNA/RNAハイブリッドの分解を用いるなど、上述した方法は簡便かつ高感度な検出が可能であるが、一度の検出に利用できるプローブ数に限りがある、対照試料の信号を制御しなければならないなどといった課題が残されている場合がある。本発明は、上記従来技術の抱える課題を解決し、より簡便かつ高感度な標的核酸の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は上記課題を解決するために為された。
【０００９】
本発明の標的核酸を検出する方法の一態様は、下記工程からなることを特徴とする。
（１）標的核酸の一部または全部の連続する塩基配列に対して相補的な２本鎖形成用の塩基配列と、該二本鎖形成用の塩基配列に対して所定の間隔で結合された一対の標識物質と、を有し、核酸部分がデオキシリボ核酸(DNA)からなる部分と、核酸部分がリボ核酸(RNA)からなる部分と、からなり、前記一対の標識物質が、前記所定の間隔において相互作用することで、少なくとも一方の標識物質からの信号が変化する核酸プローブを用意する工程。
（２）前記核酸プローブを前記信号が変化する一方の標識物質が固相担体に対する結合位置に近く配置される方向で該固相担体の表面に固定する工程。
（３）前記核酸プローブと標的核酸をハイブリダイズしてハイブリッドを形成させる工程。
（４）前記標的核酸と核酸プローブのハイブリッドにリボヌクレアーゼ（Ribonuclease） Hを作用させ、該ハイブリッドのリボ核酸を含む部分で切断し、該ハイブリッドの有する一対の標識物質の相互作用を解消させる工程。
（５）前記一対の標識物質の相互作用を解消した結果として惹き起こされた、前記少なくとも一つの標識物質の信号の変化の解消を検出する工程。
【００１０】
本発明の核酸プローブは、
標的核酸の一部または全部の連続する塩基配列に対して相補的な２本鎖形成用の塩基配列と、該二本鎖形成用の塩基配列に対して所定の間隔で結合された一対の標識物質と、を有し、核酸部分がデオキシリボ核酸(DNA)からなる部分と、核酸部分がリボ核酸(RNA)からなる部分と、からなり、該リボ核酸(RNA)からなる部分が前記一対の標識物質の結合部の間に位置し、かつ、該一対の標識物質が、前記所定の間隔において相互作用することで、少なくとも一方の標識物質からの信号が変化し、該信号が変化する一方の標識物質が固相担体に対する結合位置に近く配置される方向で該固相担体の表面に固定が可能な官能基を有することを特徴とする核酸プローブである。
【００１１】
本発明のプローブ担体は、上記の核酸プローブを固相担体に固定化したものである。
【００１２】
本発明の核酸検出キットは、上記のプローブ担体およびリボヌクレアーゼ（Ribonuclease） Hを少なくとも含み構成される核酸検出キットである。
【００１３】
本発明のプローブ担体の製造方法は、下記工程からなることを特徴とする。
（１）標的核酸の一部または全部の連続する塩基配列に対して相補的な２本鎖形成用の塩基配列と、該二本鎖形成用の塩基配列に対して所定の間隔で結合された一対の標識物質と、を有し、核酸部分がデオキシリボ核酸(DNA)からなる部分と、核酸部分がリボ核酸(RNA)からなる部分と、からなり、該リボ核酸(RNA)からなる部分が前記一対の標識物質の結合部の間に位置し、かつ、該一対の標識物質が、前記所定の間隔において相互作用することで、少なくとも一方の標識物質からの信号が変化する核酸プローブを用意する工程。
（２）前記核酸プローブを前記信号が変化する一方の標識物質が固相担体に対する結合位置に近く配置される方向で該固相担体の表面に固定する工程。
【００１４】
本発明の標的核酸を検出する方法の他の態様は、下記工程からなることを特徴とする。
（１）上記のプローブ担体を準備する工程
（２）前記核酸プローブと標的核酸をハイブリダイズしてハイブリッドを形成させる工程。
（３）前記標的核酸と核酸プローブのハイブリッドにリボヌクレアーゼ（Ribonuclease） Hを作用させ、該ハイブリッドのリボ核酸を含む部分で切断し、該ハイブリッドの有する一対の標識物質の相互作用を解消させる工程。
（４）前記一対の標識物質の相互作用を解消した結果として惹き起こされた、前記少なくとも一つの標識物質の信号の変化の解消を検出する工程。
【発明の効果】
【００１５】
本発明による手法は、従来の標識した標的核酸を検出する核酸アレイと異なり、RNaseHによる標的核酸と検出用プローブのDNA/RNAハイブリッド部分の分解により生じる信号を検出することで高感度な検出が可能である。また、溶液中で増幅時に検出を行う手法とは異なり、固体表面上に固定化することで、複数のプローブを位置として判別することが可能であるため、一度に多数のプローブを使用することが可能であり、ハイブリダイゼーション反応溶液、使用酵素などの少量化が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明にかかる標的核酸検出方法に用いるプローブは、標的核酸と二本鎖を形成する領域に、互いに相互作用する一対の標識物質が所定間隔で結合し、この間隔内にRNAからなる部分（少なくとも１つのヌクレオチドがRNAからなる部分）の少なくとも１つをDNAからなる部分中に挿入配置した構成を有することでそのRNA部分から酵素切断可能な構造を有する。更に、この一対の標識物質はこれらがDNA鎖に結合している状態での距離において相互作用し、RNA部分から切断されることでこの相互作用が解消される特性を有する。このプローブの構造を用いることにより、一対の標識物質が標的核酸とハイブリダイズしない場合に所望の信号を発することがない状態を形成でき、対照試料が不要となる。また、酵素による分解を利用することで高感度な検出が可能である。さらに、標識プローブを固体表面上に固定化することで位置により複数のプローブの信号を検出することが可能であり、一度に多数のプローブを分析することが可能となる。
【００１７】
本発明の標的核酸の検出方法では、まず、標的核酸の一部または全部と相補的な塩基配列を有し、互いに相互作用を及ぼし、少なくとも一方の信号に変化が生じるような二つの標識物質１および２(図1)で標識され、標識物質1および2の間に少なくとも一ヌクレオチドがリボ核酸(RNA)である核酸部分3を有する核酸プローブ4を設計する。この際、プローブは、信号に変化が生じる標識物質1が結合位置に近く配置される方向で基板表面６に固定できるような結合部5を有する。ここで、標識物質1および2とは、たとえばCy-Dye、TAMRA、Fluorescein、Dabcylなどの蛍光物質および消光物質から選択して用いることができる。具体的には、相互作用可能な２種の蛍光物質の組合せや、相互作用可能な蛍光物質と消光物質の組合せを挙げることができる。なお、蛍光物質としては、蛍光色素やその誘導体で、本発明に必要な特性を有するものであればよく、消光物質も、蛍光色素の発光のクエンチャーとして作用する化合物やその誘導体で、本発明に必要な特性を有するものであればよい。例えば、蛍光物質として、FAM、HEX、TET、Cy3、ROX、Cy3.5、Cy5があり、これらに対する消光物質として、TAMRA、BHQ1、BHQ2を使用するのが好ましい。
【００１８】
蛍光物質は、物質により固有の特定波長の光を吸収して励起し、基底状態へと戻る際に、蛍光または熱としてエネルギーを放出する物質である。蛍光スペクトルが重なり合うような二つの蛍光物質が近くに存在する際、低波長側に蛍光スペクトルを有する蛍光物質を励起させるべく励起光を照射した際に、そのエネルギーが長波長側に蛍光スペクトルを持つ蛍光物質へと移動し、長波長側にスペクトルを持つ蛍光物質から蛍光が観測されることがある。この現象は蛍光エネルギー共鳴移動(以下、FRET)と呼ばれる現象であり、FRETは、二つの蛍光物質の距離が100Å以下である場合に起こるとされている。同一プローブに二つの蛍光物質を標識する本発明は、FRETが起こるのに十分な条件である。また、光の吸収により、蛍光を消光する作用を有する消光物質を一方の標識として用いることも可能である。このように、一対の標識物質間の距離は、用いる標識物質の相互作用を得るために必要な距離とされ、用いる標識物質の種類とその相互作用によって選択できる。更に、この距離は、標的核酸との二本鎖形成に必要な相補配列の長さとの関係から好適な範囲を選定するとよい。
【００１９】
たとえば、本発明の実施形態の一例としてFRETを利用する場合、上記プローブの官能基を介し、固体表面に固定化する際、二つの蛍光物質のうち、低波長側に蛍光スペクトルを有する蛍光物質Aを固体表面との結合部分に近い位置となるようにし、遠い位置に長波長側に蛍光スペクトルを有する蛍光物質Bが来るようにする。ここで、二つの蛍光物質AおよびBはFRETを起こす組み合わせとする。このように作製した核酸アレイに対し、蛍光物質Aを励起させる光を照射すると、蛍光物質Aから蛍光物質Bへとエネルギー移動が起こり、その結果として、蛍光物質A由来の蛍光は検出されず、蛍光物質B由来の蛍光が検出される。この核酸アレイに対し、標的核酸をハイブリダイズさせ、DNA/RNAハイブリッドを特異的に認識し、ハイブリッドのRNA部分のみを選択的に加水分解するエンドヌクレアーゼ、Ribonuclease Hを導入する。このRNase Hにより、上記プローブの二つの蛍光物質A−B間に存在する少なくとも一つのリボ核酸が分解され、結合部分に遠い位置にある蛍光物質Bが固体表面上から遊離し、その結果、FRETが起こらない距離まで蛍光物質Aと蛍光物質Bが離れるとき、蛍光物質Aを励起させるべく照射した光によって蛍光物質A由来の蛍光が検出されるようになる。この蛍光物質Aの蛍光を検出することで、試料中に標的核酸が存在すると判定する方法である。
【００２０】
また、本発明の別の実施形態の一例として、消光物質を利用することが可能である。この場合、上記プローブの結合部分に近い位置にある蛍光物質の蛍光を消光する作用のある消光物質を結合部分から遠い位置に標識する。このプローブを上記方法と同様に固体表面上に固定化した核酸アレイを作製した場合、蛍光物質を励起しても、消光物質による消光作用により、蛍光は検出されない。しかし、標的核酸とハイブリダイズを行い、RNase Hを導入し、蛍光物質と消光物質の間の少なくとも一つのリボ核酸が分解され、消光物質による消光が起こらない距離まで消光物質と蛍光物質が離れる場合、蛍光物質由来の蛍光が検出される。本発明の実施形態の例として挙げた上記二手法では、標識物質の信号の検出手段として、微小な反応容器を使用することで、通常の蛍光検出器の他に、共焦点顕微鏡で簡便に検出することも可能である。
【００２１】
上述のように、標的核酸の一部または全部と相補的な塩基配列を有し、かつ、相互作用により一方の信号が変化する二つの標識物質で標識され、二つの標識物質に挟まれた塩基配列中に少なくとも一つのリボ核酸を有する核酸プローブを信号の変化する標識物質が固定化部分に近く配置される方向で固相担体に固定化した核酸アレイ（プローブ担体）を作製し、標的核酸と核酸プローブのDNA/RNAハイブリッドをRNase Hで切断することで解消される標識物質の信号を検出することで、試料中に標的核酸が存在すると判定する方法である。
【００２２】
プローブのRNAからなる部分は、その部分を構成する核酸がRNAからなるものであり、２以上のリボヌクレオチドから形成することができる。更に、RNAからなる部分は、一対の標識物質に挟持された領域内にその１以上を設けることもできる。すなわち、少なくとも１つのRNAからなる部分が含まれていればよい。また、この領域全体がRNAからなるものでもよい。標識物質の結合部がRNAからなる部分であってもよいが、一対の標識物質の一方はDNAからなる部分に結合させてリボヌクレアーゼＨでの切断後にも固相担体に結合している側に残るようにする。
【００２３】
上記構成のプローブを固相担体に固定したプローブ担体と、リボヌクレアーゼＨとを少なくとも用いて核酸検出用のキットを構成することができる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
(実施例1)
(1)核酸アレイの作製
1-1  ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ：25 mm×75 mm×1 mm、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリのラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中に浸した後、20分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で20分超音波洗浄を行った。次に80℃に加熱した１Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液中に10分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、核酸アレイ用の石英ガラス基板を用意した。
1-2  基板表面処理
シランカップリング剤KBM-603(信越シリコーン社製)を、1 %の濃度となるように純水中に溶解し、2時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、20分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥した。次に乾燥した基板を120 ℃に加熱したオーブン中で1時間ベークし、カップリング剤処理を完結し、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製のN-マレイミドカプロイロキシスクシイミド(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide)（以下、EMCS）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの1:1混合溶媒中に最終濃度が0.3 mg/mlとなるように溶解したEMCS溶液を用意した。ベークが終了したガラス基板を放冷し、調製したEMCS溶液中に室温で2時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とEMCSのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。EMCS溶液から引き上げたガラス基板を、先述のEMCSを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールに洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
1-3  標識プローブの合成
DNA合成業者（株式会社ベックス）に依頼して配列番号1、配列2に記載の一本鎖核酸を合成した。配列1、2に記載のプローブは1-2で表面処理を行ったガラス基板に結合させるために5'末端側にリンカーを介してチオール基(SH)を結合した。また、dT(F)はFluoresein-dTを表し、プローブの3'末端にはTAMRAを標識した。配列2記載のプローブ中、小文字で標記した塩基はリボ核酸(RNA)骨格を有することを示す。
配列1：5' HS(CH2)6OP(O2)O-ACTGGC CG dT(F) CGTTTTACA−TAMRA  3'（配列番号：１）
配列2：5’HS(CH2)6OP(O2)O−ACTGGC CG dT(F) CgttttacA−TAMRA  3’
配列3：5’TGTAAAACGACGGCCAGT  3’ （配列番号：２）
1-4  BJプリンターによる核酸プローブ吐出、および基板への結合
グリセリン7.5 wt%、チオジグリコール7.5 wt%、尿素7.5 wt%、アセチレノールEH(川研ファインケミカル社製)1.0 wt%を含む水溶液を用意した。続いて、先に用意した配列1、2に記載の核酸プローブを上記の混合溶媒に規定濃度となるようにそれぞれ溶解した。得られた核酸プローブ溶液をバブルジェットプリンター（商品名：BJF-850  キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００２５】
なお、ここで用いたバブルジェットプリンターは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約5ピコリットルのDNA溶液を約120マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【００２６】
続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、2枚のガラス基板に対して配列1、2に記載のプローブをそれぞれ印字し、配列1，2に記載のプローブをそれぞれ固定化した核酸アレイを作製した。印字が確実に行われていることを確認した後、30分間加湿チャンバー内に静置後、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応した。
1-5  洗浄
30分間の反応後、100 mMのNaClを含む10 mMのリン酸緩衝液(pH 7.0)により表面に残った核酸溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖核酸プローブが固定した核酸アレイを得た。
【００２７】
(2)標的核酸とのハイブリダイゼーション
上記(1)の過程で作製した配列1、2記載のプローブを固定化したそれぞれの核酸アレイを40 mM Tris−HCl(pH 7.7)、4 mM  MgCl2溶液中に浸漬し、相補的な塩基配列を有する配列3記載の核酸を1 nM、RNaseH(TakaRa社製)を1Uとなるように添加し、40℃で30分間ハイブリダイゼーション反応を行った。40 mM Tris−HCl(pH 7.7)で洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥し、核酸アレイ用蛍光検出装置(Axon社製、GenePix 4000B)を用いで蛍光測定を行った(励起波長532 nm、フォトマル電圧400V)。測定結果を表1に示す。なお、本実施例では、配列1、2を固定化した基板を各2枚用いのでそれぞれの結果を示した。
【００２８】
【表１】
2006191856.tif 000003
【００２９】
表１中の蛍光輝度の数値は、ピクセル平均輝度(解像度5 μm)を示した。また、S/N比は、測定機付属の解析ソフト(Axon社製、GenePix Pro Ver.3.0)で測定したバックグラウンド平均値で蛍光輝度を除したものを示した。
【００３０】
表１で明らかなように、二つの標識物質の間にリボ核酸を有する配列2記載のプローブを固定化した核酸アレイのみから、シグナルを高感度に検出することができた。
【００３１】
(実施例2)
上記実施例１に記載の手順に従い、以下に示す配列4、5に記載のプローブを固定化した核酸アレイを作製した。ここで、Dabsylは消光物質であるDabsyl基を示す。
配列4：5' HS(CH2)6OP(O2)O-ACTGGC CG dT(F) CGTTTTACA−Dabsyl  3'
（塩基配列は配列番号：１と同じ）
配列5：5’HS(CH2)6OP(O2)O−ACTGGC CG dT(F) CgttttacA−Dabsyl  3’
（塩基配列は配列番号：１と同じ）
上記の核酸アレイを実施例１と同様の条件で処理を行い、蛍光測定を行った結果を表2に示す。
【００３２】
【表２】
2006191856.tif 000004
【００３３】
表2で明らかなように、二つの標識物質の間にリボ核酸を有する配列5記載のプローブを固定化した核酸アレイのみからシグナルを高感度に検出することができた。また、クエンチャー物質を用いることで、バックグラウンドを低減することができた。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明に用い得るプローブの構造を模式的に示す図である。
【符号の説明】
【００３５】
1  標識物質1
2  標識物質2
3  少なくとも一つのリボ核酸を有する部分
4  標的核酸の一部または全部と相補的な塩基配列を有する部分
5  固体表面に固定するためのリンカー部分
6  固体表面
【図１】
2006191856.tif 000005
【配列表】
2006191856000001.app