(57)【要約】【課題】本発明は、ヒトの軟骨細胞を、細菌・ウイルスによる感染の恐れがなく、しかも、正常な軟骨細胞またはその細胞塊を含有する移植用軟骨組成物を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、軟骨細胞の細胞培養により形成される軟骨細胞組織それ自体を含有する移植用軟骨組成物であり、また、軟骨細胞の細胞培養により形成される軟骨細胞組織を更に組織培養に付して得られる軟骨ブロックを含有する移植用軟骨組成物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨細胞の細胞培養により形成される軟骨細胞組織それ自体を含有する移植用軟骨組成物。
【請求項２】
軟骨細胞の細胞培養により形成される軟骨細胞組織を更に組織培養に付して得られる軟骨ブロックを含有する移植用軟骨組成物。
【請求項３】
該組織培養をin vitroにおいて行うことを特徴とする請求項２記載の移植用軟骨組成物。
【請求項４】
該組織培養をin vivoにおいて行うことを特徴とする請求項２記載の移植用軟骨組成物。
【請求項５】
該細胞培養において血清を添加することを特徴とする請求項１乃至４記載の移植用軟骨組成物。
【請求項６】
該細胞培養において自家血清を添加することを特徴とする請求項１乃至４記載の移植用軟骨組成物。
【請求項７】
フィブリンを含有することを特徴とする請求項１乃至４記載の移植用軟骨組成物。
【請求項８】
自家フィブリンを含有することを特徴とする請求項１乃至４記載の移植用軟骨組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は外傷、先天奇形、異物除去部、加齢による変性などにより生じた軟骨や骨の欠損部の修復に使用するために適した移植用軟骨組成物に関わる。
【背景技術】
【０００２】
軟骨細胞単独ではなく軟骨組織が他の組織と異なるのは豊富な線維や基質を形成していることである。In vitroでの軟骨細胞の培養においても、培養過程では軟骨細胞自身がコラーゲン、アグリカン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等を産生し、所謂、軟骨組織を形成することが知られている（小谷野康彦、骨と軟骨のバイオロジー：基礎から臨床への展開、143-149頁、金原出版・東京(2002)、Mok SS,Masuda K,Hauselmann HJ,et al: Aggrecan synthesized by mature bovine chondrocytes suspended in alginate.Indentification of two distinct metabolic matrix pools, J Biol Chem 269:33021-33027(1994)）。従来、培養軟骨細胞を移植する線維や基質から単離された軟骨細胞それ自体を移植に使用していた（M.Brittberg, New England Journal of Medicine, Vol.331, No.14, p.889-895(1994)、特に890頁、図１参照）。しかし、この方法では上述の軟骨細胞を含む組織を分解することになり、単離される軟骨細胞は数にしてせいぜい2.6〜5X106個、容量にして50〜100μl程度の量しか得られず、移植には不十分である（上記引用文献参照）。
【０００３】
また、移植前の細胞継代培養においてトリプシンなどの酵素処理を行い細胞を単離する操作を繰り返すと、移植後の軟骨は線維芽細胞へと脱分化が促進され、目的とする軟骨の形成が阻害される（小谷野康彦・骨と軟骨のバイオロジー：基礎から臨床への展開、143-149・金原出版・東京(2002））。
【０００４】
従来法として、トリプシン処理して単離した培養軟骨細胞を、ポリグリコールやポリ乳酸、アルギン酸などの人工又は天然の+吸収性ポリマーの鋳型scaffold （足場）へ播種することで再度軟骨細胞に細胞外マトリックスを産生させ、その後、生体（動物）へ移植し、軟骨を形成させるという手法も行われてきた（Vacanti CA, Langer R, Schloo B, Sythetic biodegradable polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation. Plast. Reconstr. Surg. 88:753-759, (1991), Cao YL, Vacanti JP, Paige KT ,Upton J, Vacanti CA, Transplantation of chondrocytes utilizing a polymer- cell construct to produce tissue -engineered cartilage in he shape of a human ear. Plast. Reconstr. Surg. 100:297-302(1997)）。しかしながら、この手法は、使用された人工のポリマーが生体に移植後に吸収されるときに炎症が生じ、そのために軟骨細胞自体が損傷されて吸収されると言う事態が起きる。このため、移植後に患部において充分な軟骨を形成させることができなかった。
【０００５】
更に、従来法では、軟骨細胞の細胞培養に当たり、ＦＢＳ（牛胎児血清）を使用し、或いは、牛由来のコラーゲンを足場に用いる等、自己以外の種々の生体由来の成分を使用している（安達伸生et al, 医学の歩み、Vol.200、No.３、258−２５９（2002）,／アテロコラーゲンゲルを使用、小谷野康彦・骨と軟骨のバイオロジー：基礎から臨床への展開、143-149・金原出版・東京(2002)/コラーゲンゲル、アガロース、アルギネートビーズ使用／Vacanti CA, Langer R, Schloo B,  Sythetic biodegradable polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation. Plast. Reconstr. Surg, 88:753-759 (1991), Cao YL, Vacanti JP,Paige KT ,Upton J, Vacanti CA(1997) Transplantation of chondrocytes utilizing a polymer-cell construct to produce tissue -engineered cartilage in he shape of a human ear. Plast. Reconstr. Surg. 100:297-302）。かかる外来物の使用は種々の病原ウィルスや感染性プリオン等が移植軟骨に混入し、患者に感染する可能性を有するという欠点がある。
【非特許文献１】Mok SS,Masuda K,Hauselmann HJ,et al: Aggrecan synthesized by mature bovine chondrocytes suspended in alginate.Indentification of two distinct metabolic matrix pools, J Biol Chem 269:33021-33027(1994)
【非特許文献２】小谷野康彦・骨と軟骨のバイオロジー：基礎から臨床への展開、  143-149・金原出版・東京(2002）
【非特許文献３】Vacanti CA, Langer R, Schloo B, Sythetic biodegradable polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation. Plast. Reconstr. Surg. 88:753-759, (1991)
【非特許文献４】Cao YL, Vacanti JP, Paige KT ,Upton J, Vacanti CA,   Trans- plantation of chondrocytes utilizing a polymer- cell construct to produce tissue -engineered cartilage in he shape of a human ear, Plast. Reconstr. Surg. 100:297-302(1997)
【非特許文献５】安達伸生et al, 医学の歩み、Vol.200、No.３、258−２５９（2002）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記した従来法の欠陥を解決した移植用軟骨組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
即ち、本発明者は、従来法の欠陥を解決するための移植用軟骨につき多くの研究を行い、軟骨細胞をin vitroで細胞培養して得られる軟骨細胞を含む組織をそのまま移植できることを発見し、本発明をなすに至った。
【０００８】
かくして、本発明は、（１）軟骨細胞の細胞培養により形成される軟骨細胞組織それ自体を含有する移植用軟骨組成物であり、（２）軟骨細胞の細胞培養により得られる軟骨細胞組織を更に組織培養に付して得られる軟骨ブロックを含有する移植用軟骨組成物である。
【０００９】
更に、本発明は、（３）組織培養をin vitroで行うことにより得られる軟骨ブロックを含有する移植用軟骨組成物であり、或いは（４）組織培養をin vivoで行うことにより得られる軟骨ブロックを含有する移植用軟骨組成物である。
【００１０】
本発明に関わる移植用軟骨組成物は、頭蓋顔面、耳介、鼻、関節などの外傷、先天奇形、異物除去部、加齢による変性などにより生じた軟骨や骨の欠損部の修復に適用することができる。
【００１１】
軟骨細胞は、in vitroにおける細胞培養において、例えば、線維細胞、コラーゲン線維、アグリカン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、その他の基質で取り囲まれた軟骨細胞組織を形成するため、酵素処理を行わずに培養器から物理的に剥がして採取することが可能である。かくして得られる軟骨細胞及び軟骨細胞自身が産生した軟骨基質からなる軟骨細胞組織それ自体を移植用軟骨組成物として使用することができる。軟骨細胞組織それ自体含む移植用軟骨組成物を移植することで移植後に一般に起こる軟骨細胞から線維芽細胞への脱分化が起こることなく、移植後に早期に軟骨形成が認められ、また幹細胞を含むため従来にない長期の移植された軟骨組織の維持が望めることが判明した。本発明によれば、患者から採取され、トリプシン処理などを経て単離された軟骨細胞の約1〜5ｘ103〜104  個を細胞培養に付し、軟骨細胞と軟骨細胞が産生する基質を合わせて採取することにより、約2〜6ｘ107個の細胞数を含む軟骨細胞組織が約5〜10ｍｌのゲル状の溶液として得られ、従来の移植量の問題が解決され、移植に必要な量が得られる。
【００１２】
更に、軟骨細胞組織に細胞の足場又は担体（scaffold）としてフィブリンを加え、生体に移植すると、従来得られなかった大きさの軟骨のブロックが形成されることが判明した。この場合において、自家フィブリンを用いることが不測の副作用を避ける意味で好ましい。
【００１３】
また、これまで、培養軟骨細胞移植方法は、目的とする移植部（患部）に軟骨細胞を直接移植する方法が行われてきた。この方法では軟骨細胞が移植後に1〜3カ月以上経過したのち成熟した軟骨を形成するため、希望する形や大きさの軟骨が得られなかった。そこで、予め、細胞培養で得られた軟骨細胞組織を更に組織培養に付して,軟骨ブロックを形成させ、軟骨の形、大きさを整形したのち、目的部位（患部）に移植すると、これまでできなかった移植後の形を制御することができ、例えば、耳介の形を所望の大きさ及び形に形成させることが可能となった。
【００１４】
細胞培養で得られた軟骨細胞組織の組織培養は、該組織の増殖に適した組織培養液でin vitro培養するか、或いは、生体の他の部位（傷が目立たない腹部など）に軟骨細胞組織を移植して軟骨ブロックを形成させる（in vivo培養）ことにより行うことができる。
【００１５】
安全な移植用軟骨組成物は、ヒト由来でかつ自家組織からなることが望ましい。また、ヒトへ移植することを目的とした軟骨細胞の製法においては動物由来の異種蛋白や人工物を用いないことが望ましい。その理由は移植された動物由来の異種蛋白や人工物が生体側の免疫反応等を刺激して炎症反応を惹起させ、その結果移植された細胞までが拒絶反応により生体から除去されてしまうことが起きるからである。また、外来物による種々の病原ウィルスやヒトへの感染性のあるプリオン等の感染する可能性がつきまとう。
【００１６】
そこで、本発明では、拒絶反応を回避するとともに、種々の生体由来の外来物による病原ウィルスやヒトへの感染性のあるプリオン等に感染する可能性を無くすために、自家軟骨細胞、自家細胞外マトリックス、自家血清、自家フィブリン（自家の細胞の足場：scaffold）を用いることが推奨される。なお、自家フィブリンが採取できない場合は医療用として承認され市販されているフィブリン製剤の使用も可能である。今後、フィブリン以外にその他の生体材料、人工物の安全性が確認されたものであれば担体として用いることが可能である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の移植用軟骨組成物を用いることにより、移植後に一般に起こる軟骨細胞から線維芽細胞への脱分化が起こることなく、移植後に早期に軟骨形成が認められる。
【００１８】
本発明の移植用軟骨組成物は、容易に移植に必要な量が得られるため、移植量の問題が解決される。
【００１９】
軟骨細胞の細胞培養で得られた軟骨細胞組織を更に組織培養に付して形成させた軟骨ブロックを、軟骨の形、大きさを整形したのち、目的部位（患部）に移植する方法により、移植に先立ち軟骨の整形が可能となり、例えば、これまでできなかった耳介の形を形成させることが可能となった。また、移植に必要な量がより容易に得られる。
【００２０】
本発明の移植用軟骨組成物を用いることにより、拒絶反応を避けることができるとともに、外来生体物による種々の病原ウィルスやヒトへの感染性のあるプリオン等による感染の問題を回避することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
１．細胞培養の概要
軟骨細胞の細胞培養においては、培地にFCS(牛胎児血清)を用いず、ヒト血清、好ましくはヒト自家血清を用いる。ヒト血清は自家血液を軟骨組織採取と同時に採血し、遠心分離して血球成分を除去し、血清（自家の増殖因子含有）と自家フィブリンに分離する。自家血清と自家フィブリンはおのおの凍結し、適時解凍して使用すると良い。軟骨細胞培養培地にはDME培地に10％のヒト血清、好ましくはヒト自家血清を加えて培養を行う。ヒトフィブリン、好ましくはヒト自家フィブリンを保存する場合は、好ましくは、-20℃〜196℃凍結保存する。軟骨細胞を培養器で培養し、初代培養開始後、1-2継代培養し、得られる約5X10７〜1X10８/1mlの量の軟骨細胞組織を移植に供する。
また、上述の凍結しておいたフィブリン塊を解凍し、その中に、好ましくは、約5X10７〜1X10８/1mlの量の軟骨細胞組織を加え、移植に供することが好ましい。軟骨細胞はフィブリンの中で安定し、塊として集合する。細菌、マイコプラズマ等の感染については1週間ごとに培地の細菌・マイコプラズマ培養を行い、陰性であることを確認する。この細胞培養において、一連の培養過程で自家組織を使用すれば、自家外からの病源細菌ならびに不測のウイルス・プリオン感染を防ぐことができる。
【００２２】
本発明により得られる移植用軟骨組成物は耳介軟骨、鼻中隔軟骨肋軟骨、関節軟骨、椎間軟骨、気管軟骨、喉頭蓋を含むヒトの総ての軟骨組織の移植・形成に用いることができる。
【００２３】
２．軟骨細胞の単離
約1X1cmの耳介軟骨片,  肋軟骨片又は関節軟骨片を採取し、  軟骨片をペニシリンＧ(800u/ml)およびカナマイシン(1mg/ml)およびファンギーソン(2.5ug/ml)で除菌し、次にメスで細切した後、好ましくは0.3%の濃度のコラゲナーゼtypeII(Worthington Biochemical )を含むF-12培地中で、４℃で一晩静置した。翌日３７℃で2-4時間振とうした後、ナイロンメッシュでろ過し、遠心して軟骨細胞を単離した。
【００２４】
３．軟骨細胞の細胞培養用培地
ヒト軟骨細胞の細胞培養は、軟骨細胞の培養に適した公知の培地を用いることができる。また、培地にはヒドロコルチゾン(HC)、ヒトbFGF、ヒトIGF-1等の増殖因子を適宜添加する(Cuevas et al、Biochem. Biophy. Res. Commun. Vol.156, p.611-618,(1988) ; Froger-Gaillard et al、Endocrinol. Vol.124, p.2365-2372(1989))。そのような培地の例として、DME(H)培地に、自家血清（好ましくは１０％程度）を添加し、ヒト・リコンビナントbFGF（好ましくは100ng/ml以下：科研製薬）、Hydrocortisone（好ましくは100ng/ml以下）、ヒト・リコンビナントIGF-1（好ましくは50ng/ml以下：GIBCO）を添加した培地を例示することができる。
【００２５】
４．初代培養
上記細胞画分を上記培地を用いて底面積７５cm2のフラスコに細胞を、好ましくは1X10 4〜5個の密度で播種した。このフラスコをCO2 Incubator中でCO2濃度を１０％に設定して培養した。培地は週２回交換した。その結果、軟骨細胞は、約１０〜１４日間の培養により単層で集蜜的になった。得られた細胞を次の継代培養に使用した。
【００２６】
５．継代培養
継代培養は、初代培養により得られた細胞を、好ましくは約１×１０6個の密度で底面積１７５ｃｍ2フラスコに播種して、初代培養と同じ条件で行った。７日間の培養により単層で集蜜的になり(図1)、得られた細胞を次の継代培養に使用した。その結果、４継代で細胞数が初代の１０００倍程度増加した。継代培養において得られた軟骨細胞，を好ましくは約１×１０6個/cm2の密度で、更に細胞培養を実施した。好ましくは約3〜4週間培養後、軟骨細胞組織が形成された。
【００２７】
６．細胞培養における軟骨細胞組織の形成の確認
軟骨細胞組織が形成されたことは、（1）この軟骨細胞塊についてヘマトキシリンーエオジン(H.E)染色したところ、細胞が重層化して細胞同士が基質を介して結合していること（図2）、また、（2）軟骨細胞組織の分子マーカーであるII型コラーゲンについて免疫染色を行ったところ、細胞外基質に染色を呈し、当該細胞外基質が軟骨に特異的なコラーゲンを形成していること（図3）、（3）培地中のコンドロカルシン（II型コラーゲンより切断・遊離されたC末端ペプタアイド）を測定した結果、コンドロカルシンが産生されていた(図4)こと等により確認された。これ等の事実は培地中に軟骨細胞が産生したII型コラーゲンが分解・放出され、軟骨細胞組織が形成されていることを示す。更に、培地中のアルカリフォスファターゼ（ALP）を測定した結果、アルカリフォスファターゼが産生されていた(図4)。これは軟骨が分化したことを示している。
【００２８】
７．軟骨細胞組織の移植
先ず継代培養後周密的に凝集した軟骨細胞を含む組織を、フラスコから培地を除去した後、注射筒内などに吸引して採取した。次に軟骨細胞組織とフィブリン、好ましくは自家フィブリンを混合したものを皮下および生体の軟骨欠損部位に移植した。
【００２９】
８．軟骨細胞組織の組織培養
上記の細胞培養で得られた軟骨細胞組織を、移植前に、組織培養に付して更に増殖させ軟骨ブロックとすることができる。組織培養は、in vitro及びin vivoの何れによっても行うことが可能である。
【００３０】
in vitro組織培養は、細胞培養により得られた軟骨細胞組織を人工体液など生態環境に近い条件下で培養を行う方法であり、例えば、市販されている、Dulbecco's minimal essential medium (Biological Industries,  Beit-Haemek, Israel) 、或いはDulbecco's modified Eagle's mediumにアスコルビン酸（５０μg/ml）、抗生物質としてペニシリン、ストレプトマイシン（100U/ml）及び血清、好ましくは自家血清（５％）を加えたものを使用することができる。６穴プレートに軟骨細胞組織を入れ、５％CO2存在下に３７℃で培養する。通常、培養液は2日毎に交換する。培養期間は通常は3週間が好ましいが、必要に応じて延長、短縮しても良い。
【００３１】
in vivo培養は、細胞培養で得られた軟骨細胞組織にフィブリン、好ましくは自家フィブリンを加えて、生体の適当な部位（腹部など目立たないところが好ましい）に、一旦移植して、軟骨ブロックを形成させる方法である。その後一度体外に取り出して軟骨の形を整形して目的とする部位に移植できる。これは耳介などの細かい形を形成させる場合に優れた方法である。この移植6月後に、移植部位から一部採取して組織学的に検討した。この結果、ヘマトキシリンーエオジン(H.E)染色したところ、細胞が重層化して細胞同士が基質を介して結合しているが示された。また、軟骨組織の分子マーカーであるII型コラーゲンについて免疫染色を行ったところ、細胞外基質に染色を呈し、当該細胞外基質が軟骨に特異的な基質であることが示された（図5）。さらに、トルイジン・ブルー染色でメタクロマジーが示され、軟骨のマーカーであるアグリカンの存在を示唆された（図6）。以上から、移植した軟骨細胞組織は正常な軟骨組織を形成していることが示された。
【００３２】
８．実際の移植例
小耳症（先天的に耳のない小児）の遺残軟骨（約1cmの大きさ）を採取し、上述の方法にて軟骨細胞を細胞培養した。得られた自家軟骨細胞組織と自家フィブリンを混合したものを腹部皮下に移植後約6カ月後、大人の耳介が作製可能な大きな軟骨（約8Ｘ4cmで厚さ1cm）が得られた（図7）、（図８a,b）。形成された軟骨の大きさは耳介の形体を形成するに充分なものであった。これを耳介型に整形して耳介欠損部へ移植した（図９）。
従来小耳症手術では8〜10歳の小児の肋軟骨を3〜4本採取する必要がり、このため、軟骨部の採取部（胸廓）の変形や瘢痕も生じる等、ドナーの犠牲は大きかった。本発明によれば、かかる犠牲を最小限度に押さえることができ、また、患者の希望に沿うように整形し、或いは形成させることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】培養下の軟骨細胞が増殖し、集密的になり、軟骨細胞組織を形成した状態状態を示す。
【図２】培養後の軟骨細胞組織についてヘマトキシリンーエオジン(H.E)染色を行った結果を示す。細胞が重層化して細胞同士が基質を介して結合しているが示されている。
【図３】培養後の軟骨細胞組織の分子マーカーであるII型コラーゲンについて免疫染色を行った結果を示す。細胞外基質に染色を呈し、当該細胞外基質が軟骨に特異的なマトリックスを形成していることが示されている。
【図４】培地中のコンドロカルシンおよびアルカリフォスファターゼを測定した結果、これらが産生されていることを経時的に示す。
【図５】移植6月後の移植部位から採取した軟骨細胞組織の分子マーカーであるII型コラーゲンについて免疫染色を行った結果を示す。
【図６】移植6月後の移植部位から採取した軟骨細胞組織についてトルイジン・ブルー染色を行った結果を示す。
【図７】本法を用い、腹部皮下に移植後約6カ月後、大人の耳介が作製可能な大きな軟骨が得られたことを示す。
【図８】Ａは、形成された軟骨の大きさをメジャーとともに提示し、耳介の形を形成させるために充分なものであることを示す。Ｂは、形成された軟骨を曲げると弾力性があることを示す。
【図９】培養軟骨により形成された移植用軟骨組成物により耳介型のフレームを作製できたことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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