(57)【要約】【課題】  本発明は毛包形成または毛包再生を調節する分子の作用をコントロールすることにより、ヒト毛包再生を促す方法の確立を目指して、ヒトＤＰＣを活性化できるような因子を探索するため、毛包誘導能を有することがわかっているマウスＤＰＣにおける毛包誘導を調節している因子の同定を目的とする。【解決手段】  本発明は、Ｓ１００ａ６、Ｃｔｇｆ、Ｇｓｔｏ１、Ｇａｓ６、Ｋｌｆ２、Ｔｈｂｓ１およびＴｈｂｄから成る群から選ばれる毛包形成抑制能を有する１または複数の遺伝子の発現を抑制させることにより毛包を再生する方法を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ６遺伝子（Ｓ１００ａ６）、結合組織成長因子遺伝子（Ｃｔｇｆ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼオメガ１遺伝子（Ｇｓｔｏ１）、増殖停止特異的６遺伝子（Ｇａｓ６）、クルッペル様因子２（Ｋｌｆ２）、トロンボスポンジン１（Ｔｈｂｓ１）およびトロンボモジュリン（Ｔｈｂｄ）から成る群から選ばれる毛包形成抑制能を有する１または複数の遺伝子の発現を抑制させることにより毛包を再生する方法。
【請求項２】
Ｓ１００ａ６、Ｃｔｇｆ、Ｇｓｔｏ１、Ｇａｓ６、Ｋｌｆ２、Ｔｈｂｓ１およびＴｈｂｄから成る群から選ばれる毛包形成抑制能を有する１または複数の遺伝子の発現を抑制させることを特徴とする、毛乳頭細胞を培養する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は毛包形成抑制能を有する遺伝子の発現の抑制を図ることで毛包を再生・形成する方法、およびかかる遺伝子の発現を抑制させることを特徴とする毛乳頭細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢などに伴う頭髪減少を補おうとする需要は高く、一般に育毛剤の使用のみならず、さらには植毛など、医療機関などにおける施術も行われている。一方、近年における幹細胞研究の進展による技術面のブレークスルーと、組織適合性などの問題を原因とする深刻なドナー不足や脳死判定問題などの倫理面からの要請に伴い、従来の臓器移植に代わる先端医療として再生医療技術への過剰ともいえる期待感が高まっており、再生医療のモデル器官として毛包再生研究にもこれまでにない注目が集まっている。
【０００３】
発生段階における毛包形成機序については比較的よく研究されており、上皮系細胞（表皮細胞）とその直下の間葉系細胞（毛乳頭細胞またはＤＰＣ)間のシグナル伝達などによる複雑な相互作用の結果、毛包は形成されることがわかっている（R. Pauseら、N. Engl. J. Med. 341, 491-497, 1999（非特許文献１)； K.S. Stennら、Physiol. Rev. 81, 449-494, 2001（非特許文献２)； S. E. Millerら、J. Invest. Dermatol. 118, 216-225, 2002(非特許文献３）。また、一旦形成された毛包は成長期、退行期、休止期を繰り返す周期的な再生が起こる器官であり、多くの成長因子、サイトカイン、ホルモン、神経ペプチドなどの生理活性物質がその調節に関わっていることが知られるが、それら生理活性物質は発生段階の毛包形成機序に関与するものとは必ずしも一致しない。
【０００４】
ヌードマウスを用いたマウス毛包再構成実験から、上皮系細胞と間葉系細胞の両方が毛包再生に必須で、また一定量以上の細胞数がなくては毛包再生が誘導されないことがわかっている（J. Kishimoto ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 7336-7341, 1999（非特許文献４））。さらには、マウスＤＰＣとヒト上皮細胞からなるキメラ毛包の再生が可能であることが示されているが（特願２００４−０４８３２２；江浜ら、第２６回日本分子生物学年会  講演要旨集2PC-024, 2003（非特許文献５））、未だ完全なヒト毛包の再生には至っていない。その理由の一つは、毛包誘導能を有するヒトＤＰＣを移植に利用できるほど充分量に得ることが困難なためである。
【０００５】
特定の条件下、例えばバーシカンを発現しているＤＰなどの細胞が、特異的に毛包誘導を有することが示されているが（J. Kishimoto ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 7336-7341, 1999（非特許文献４））、分子レベルにおける毛包形成誘導の現象は未だ不明な点が多い。
【０００６】
【非特許文献１】R. Pauseら、N. Engl. J. Med. 341, 491-497, 1999
【非特許文献２】K.S. Stennら、Physiol. Rev. 81, 449-494, 2001
【非特許文献３】S. E. Millerら、J. Invest. Dermatol. 118, 216-225, 2002
【非特許文献４】J. Kishimoto ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 7336-7341, 1999
【非特許文献５】江浜ら、第２６回日本分子生物学年会  講演要旨集2PC-024, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は毛包形成または毛包再生を調節する分子の作用をコントロールすることにより、ヒト毛包再生を促す方法の確立を目指して、ヒトＤＰＣを活性化できるような因子を探索するため、毛包誘導能を有することがわかっているマウスＤＰＣにおける毛包誘導を調節している因子の同定を目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、毛乳頭細胞は培養されることによりその毛包誘導能が消失するが、一定以上の高い密度で培養された場合、その誘導能が保持される傾向があることを見出し、毛乳頭細胞を高密度（具体的には、３〜７×１０5個／ｃｍ2）および低密度（具体的には、５〜９×１０4個／ｃｍ2）条件で培養し、発現する遺伝子について調べたところ、低密度条件下で培養されることで毛包の形成できなかった毛乳頭細胞において、以下の特定の遺伝子の発現が特異的に亢進されることを見出した。
・Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ６遺伝子（Ｓ１００ａ６））
・結合組織成長因子遺伝子（Ｃｔｇｆ）
・グルタチオンＳ−トランスフェラーゼオメガ１遺伝子（Ｇｓｔｏ１）
・増殖停止特異的６遺伝子（Ｇａｓ６）
・クルッペル様因子２（Ｋｌｆ２）
・トロンボスポンジン１（Ｔｈｂｓ１）
・トロンボモジュリン（Ｔｈｂｄ）
従って、このような特定の遺伝子が毛包の形成・再生の抑制に深く関わり、毛包形成抑制能を有するものと結論付け、本発明に至った。
【０００９】
従って、本発明は、Ｓ１００ａ６、Ｃｔｇｆ、Ｇｓｔｏ１、Ｇａｓ６、Ｋｌｆ２、Ｔｈｂｓ１およびＴｈｂｄから成る群から選ばれる毛包形成抑制能を有する１または複数の遺伝子の発現を抑制させることにより毛包を再生する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、Ｓ１００ａ６、Ｃｔｇｆ、Ｇｓｔｏ１、Ｇａｓ６、Ｋｌｆ２、Ｔｈｂｓ１およびＴｈｂｄから成る群から選ばれる毛包形成抑制能を有する１または複数の遺伝子の発現を抑制させることを特徴とする、毛乳頭細胞を培養する方法を提供する。このようにして培養した毛乳頭細胞は、頭皮への細胞移植による毛髪再生施術あるいは植毛のために有利に利用され得る。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、新規且つ従来技術に比べ有利な育毛方法、植毛方法の提供が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明者は、後述の実施例の結果から明らかなとおり、下記の遺伝子が毛包形成・再生誘導能を消失した毛乳頭細胞で特異的に発現することを見出した。
・Ｓ１００ａ６（S 100 calcium binding protein A6；別名「カルシクリン」)
カルシウム結合蛋白スーパーファミリーS100のひとつで、核膜上に発現し、細胞周期を調節して細胞増殖に寄与すると考えられている（A. Tomas ら、J. Biol. Chem., 278, 20210-20216, 2003、E.C. Breenら、J Cell Biochem., 88, 848-854, 2003）。
・Ｃｔｇｆ（connective tissue growth factor)
細胞外マトリックス中に液性増殖因子として分泌され、細胞接着促進作用を有し、TGFβによる線維症誘導のターゲット遺伝子であることが報告されている（A. Leaskら、J. Biol. Chem., 278, 13008-13015, 2003）。
・Ｇｓｔｏ１(glutathione S-transferase omega 1）
グルタチオン依存性チオール転移酵素活性、デヒドロアスコルビン酸還元酵素活性を有し、ストレス防御遺伝子であることが示唆されている（R. Kodymら、J. Biol. Chem., 274, 5131-5137, 1999）。
・Ｇａｓ６（growth arrest specific 6）
間葉系細胞に対する細胞増殖因子で、βカテニン安定化作用も報告されている（S. Goruppiら、Mol. Cell. Biol., 21, 902-915, 2001、K. Nagaiら、J. Biol. Chem., 278, 18229-18234, 2003）。
・Ｋｌｆ２(Kruppel-like factor 2）
Sp1ファミリーに属する転写因子で、脂肪細胞などで分化抑制機能が報告されている（S.S. Banerjeeら、J. Biol. Chem., 278, 2581-2584, 2003、J. Kaczynskiら、Gemome Biology, 4, 206.1-206.8, 2003）。
・Ｔｈｂｓ１（thrombospondin 1）
接着性の糖蛋白質で細胞間および細胞-細胞外マトリックス間の相互作用を調節し、特に内因性の抗血管新生物質として知られる。また毛周期においては退行期特異的に誘導されることが報告されている（K. Yano, J Invest Dermatol., 120, 14-9, 2003）。
・Ｔｈｂｄ（thrombomodulin）
トロンビンと１：１複合体を形成して、プロテインC活性化による抗凝固作用およびプロカルボキシペプチダーゼBの活性化による抗線維化作用を示す。また、炎症性細胞と血管内皮細胞の接着阻害による抗炎症効果作用も報告されている（E.M.Conwayら、J. Exp. Med., 196: 565-577,2002）。
【００１２】
従って、上記遺伝子の発現を抑制させることで、毛包形成・再生を誘導し、頭部などの育毛を図ることが可能となる。かかる遺伝子の発現の抑制は、そのような作用を有する薬剤を頭部などに適用することにより達成し得る。従って、このような薬剤を活性成分として含有する組成物、特に皮膚外用剤は、ヒトを始めとする哺乳動物において、優れた育毛・発毛促進作用が期待され、ヘアーケアー用の医薬品、医薬部外品又は化粧品として有用である。
【００１３】
毛乳頭細胞の上記遺伝子の発現の抑制は、様々な遺伝子工学的技術、例えばＲＮＡ干渉法、アンチセンスＲＮＡ・ＤＮＡ法、ペプチド及びＲＮＡ・ＤＮＡアプタマー、部位特異的欠失、相同組換え、ドミナントネガティブ対立遺伝子、イントラボディーなど、様々な技術により達成できる。
【００１４】
細胞中の上記遺伝子の発現は、例えば該細胞からｍＲＮＡを抽出し、その量を測定することにより決定することができる。ｍＲＮＡの抽出、測定は当業界において周知であり、例えばRNAの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により行われる。また、上記遺伝子の発現は、毛乳頭細胞中の上記遺伝子の発現産物の量を直接測定することにより決定することができる。例えば、この測定は上記遺伝子発現産物に特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素などを利用する免疫染色法、ウェスタンブロット法、免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法など、様々な方法により実施できる。また、以上の他、上記遺伝子発現産物の既知の生物活性を測定することにより上記遺伝子の発現量を測定することもできる。他に、上記遺伝子の発現はin situハイブリダイゼーション法やその生物活性の測定を通じて決定することができる。
【００１５】
本発明はさらに、毛乳頭細胞を培養する方法も提供する。この方法は、毛乳頭細胞を、毛包形成抑制能を有する上記遺伝子の発現を抑制させる条件下で培養することを特徴とし、このようにして培養した毛乳頭細胞は毛包再生・形成能が亢進されているため、細胞移植による毛包・毛髪再生や植毛において有利に利用できる。冒頭において述べたとおり、毛包誘導能を有するヒト毛乳頭細胞を移植に利用できるほどに充分量で獲得することは従来技術においては困難であったが、本発明に従って毛乳頭細胞を培養すれば、少量の毛乳頭細胞からでも、移植に充分な量の毛包誘導能を有する毛乳頭細胞の調製が可能となる。毛包形成抑制能を有する上記遺伝子の発現の抑制は、上述のとおり、例えば上記遺伝子の発現を抑制させる薬剤の存在下で培養を実施することにより、または上述のとおり遺伝子工学的に形質転換させることで上記遺伝子の発現の抑制された毛乳頭細胞を培養することで行われる。培養は、適当な培地、例えばＤＭＥＭの中で、好ましくはＣＯ2の雰囲気下で、常温〜約３７℃、好ましくは約３７℃で１〜７日間行う。
【００１６】
「毛乳頭細胞」とは、間葉系細胞として毛包内の毛球部の内部に位置する毛乳頭を構成する主な細胞で、毛包の自己再生のために毛包上皮細胞などに活性化シグナルを送る、いわば司令塔の役割を担っている細胞をいう（特願２００３−３４６９３７）。活性化毛乳頭細胞のみを含有する毛乳頭細胞調製品は、例えばKishimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), Vol.96, pp. 7336-7341）に記載のとおり、トランスジェニックマウスを使用し、調製できる。しかしながら、収量などの点で好ましくは、例えば皮膚組織から表皮組織を取り除くことで得た真皮組織画分をコラーゲン処理して細胞懸濁物を調製し、次いで当該細胞懸濁物を凍結保存することで毛胞上皮細胞を死滅させることで調製することができる。
【００１７】
上記凍結保存による方法は、具体的には、例えば以下の通りにして実施できる。
１．哺乳動物の表皮を用意する。
２．この表皮を、必要ならタンパク質分解酵素溶液、例えばトリプシン溶液の中に適当な時間、例えば一晩静置し、その後表皮部分をピンセットなどで取り除き、残った真皮をコラゲナーゼで処理し、細胞懸濁液を調製する。
３．必要ならセルストレーナーにより懸濁液をろ過し、静置により沈殿物を除去する。
４．細胞数を計測し、適当な細胞密度、好ましくは１ｘ１０5〜１ｘ１０8/ｍｌ程度の細胞密度にて凍結保護液で再懸濁し、必要なら小分け分注し、通常の細胞保存方法に従い、凍結保存する。
５．適当な期間保存後、融解し、使用する。
【００１８】
凍結方法は特に限定されることはないが、−２０℃以下、好ましくは−５０℃以下、より好ましくは−８０℃以下の超低温冷凍庫中で、又は液体窒素中で保存する。凍結保存期間も特に限定されることがないが、上皮細胞が死滅するよう、例えば１日以上、好ましくは３日以上、より好ましくは１週間以上の期間とする。尚、液体窒素中で４ヶ月保存しても、毛乳頭細胞は生存し続けていることが確認された。凍結保護液としては細胞の保存において使用されている通常の保存液、例えばセルバンカー２細胞凍結保存液（カタログＮｏ．ＢＬＣ−２）（日本全薬工業製）が使用できる。
【００１９】
本発明の毛乳頭細胞はあらゆる哺乳動物、例えばヒト、チンパンジー、その他の霊長類、家畜動物、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、他に実験用動物、例えばラット、マウス、モルモット、より好ましくはヌードマウス、スキッドマウス、ヌードラットの表皮に由来し得る。
【００２０】
このようにして獲得した毛乳頭細胞を、本発明に従い、毛包形成抑制能を有する上記遺伝子の発現を抑制させる条件下で培養し、しかるのち適当な上皮細胞と混合し、その培養毛乳頭細胞−上皮細胞混合物を植毛に用いることができる。
【００２１】
「上皮系細胞」は、皮膚の表皮または上皮の大部分を構成する細胞であり、真皮に接する１層の基底細胞から生じる。マウスを例にすると、上皮系細胞としては新生仔（もしくは胎児）に由来する上皮系細胞が好ましく使用できるが、成熟した皮膚、例えば休止期毛の表皮又は成長期毛の表皮に由来する細胞でも、ケラチノサイトの形態にある細胞の培養物であってもよい。かような細胞は、当業者周知の方法により所望のドナー動物の皮膚から調製することができる。
【００２２】
好適な態様において、上皮系細胞は以下のとおりにして調製できる。
１．哺乳動物の表皮を用意する。
２．この表皮を、必要なら０.２５％トリプシン／ＰＢＳ中で４℃下で一晩静置することでトリプシン処理する。
３．ピンセットなどにより表皮部分のみ剥離し、細切後、適当な培養液（例えばケラチノサイト用培養液）中で４℃で約１時間懸濁処理する。
４．この懸濁物を適当なポアサイズを持つセルストレーナーに通し、次いで遠心分離器にかけて上皮系細胞を回収する。
５．この細胞調製品をＫＧＭあるいはＳＦＭ培地に所望の細胞密度で懸濁し、使用直前まで氷上に静置しておく。
【００２３】
本発明の上皮系細胞は毛乳頭細胞と同様、あらゆる哺乳動物、例えばヒト、チンパンジー、その他の霊長類、家畜動物、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、他に実験用動物、例えばラット、マウス、モルモット、より好ましくはヌードマウス、スキッドマウス、ヌードラットの表皮に由来し得る。また、その表皮部位は有毛部位、例えば頭皮でも、無毛部位、例えば包皮であってもよい。
【００２４】
培養毛乳頭細胞、対、上皮系細胞の細胞数の比は、毛包形成のため、１：３〜１０：１、更に好ましくは１：１〜１０：１、更により好ましくは１：１〜３：１、最も好ましくは１：１としてよい。
【００２５】
毛乳頭細胞と上皮系細胞との組み合わせは同種系でも、異種系でもよい。例えば、毛乳頭細胞調製品がマウスに由来する場合、上皮系細胞はマウスに由来するか（同種系）、又はその他の種、例えばラット、ヒトに由来してもよい（異種系）。従って、植毛用の組成物は、例えば、培養毛乳頭細胞及び上皮系細胞が共にマウスに由来する組み合わせ、共にラットに由来する組み合わせ、もしくは共にヒトに由来する組み合わせでも（以上、同種）、又は培養毛乳頭細胞がマウスに由来し、上皮系細胞がラットに由来する組み合わせ、培養毛乳頭細胞がラットに由来し、上皮系細胞がマウスに由来する組み合わせ、培養毛乳頭細胞がマウスに由来し、上皮系細胞がヒトに由来する組み合わせ、培養毛乳頭細胞がラットに由来し、上皮系細胞がヒトに由来する組み合わせ、培養毛乳頭細胞がヒトに由来し、上皮系細胞がマウスに由来する組み合わせ、培養毛乳頭細胞がヒトに由来し、上皮系細胞がラットに由来する組み合わせ（以上、異種）、等であってよい。
【００２６】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００２７】
毛乳頭細胞の調製
新生仔ＩＣＲ系統マウスをエタノール、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳ）で洗浄後、背部皮膚を切除し全層皮膚を摘出した。トリプシン溶液上に浮かべて４℃で一晩静置後、表皮をピンセットで除去して得られる真皮をコラゲナーゼで処理、細胞懸濁液を得た。セルストレーナーによりこの懸濁液をろ過、静置により沈殿物を除去してＤＰ画分を得た。１×１０5〜／１×１０8ｍｌの細胞密度になるように凍結保護液に再懸濁し、凍結チューブに分注し、通常の細胞凍結法に従い液体窒素内で１週間以上保存した。これを、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）中で融解、高密度（３〜７×１０5個／ｃｍ2）または低密度（５〜９×１０4個／ｃｍ2）で１〜４日間３７℃、ＣＯ2中、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）の中で培養した。
【００２８】
上皮細胞画分の調製
新生仔ＩＣＲ系統マウスをエタノール、ＰＢＳで洗浄後、背部皮膚を切除し全層皮膚を摘出した。トリプシン溶液上に浮かべて４℃で一晩静置後、ピンセットで表皮部分を剥離し、細切してケラチノサイト用培養液（以下、ＳＦＭ）中、４℃で約１時間攪拌懸濁した。セルストレーナーで固形物を除去後、遠心分離機（×９００ｇ、１０分）にかけて得られたペレットをＳＦＭ培地で再懸濁し、上皮細胞画分を得た。使用直前まで氷上に静置した。
【００２９】
ヌードマウス背部皮膚への細胞移植による毛包再生評価系
上記のようにして４日間培養することにより調製したＤＰ画分（高密度培養または低密度培養５〜１０×１０6個）および上皮画分（２匹分、およそ１×１０7個）を静かに混合し、遠心して上清を除去したペレットを、あらかじめヌードマウスに外科的に埋め込んだシリコンチャンバー内の筋膜上に播種した。１週間後シリコンチャンバーの上部を切除し、２週間後にシリコンチャンバーを除去した。細胞移植後、３〜４週間後の外観観察および組織観察により毛包形成を判定した。その結果を図１に示す。
【００３０】
図１から明らかなとおり、高密度条件下で培養した毛乳頭細胞を用いて移植を行った場合には発毛が認められ、毛包形成したが、低密度条件下で培養した毛乳頭細胞を用いて移植を行った場合、発毛は認められず、毛包形成されないことが実証された。従って、培養毛乳頭細胞を移植して毛包を形成させるためには、毛乳頭細胞を所定以上の高い細胞密度条件下で培養する必要があることが明らかである。
【００３１】
マイクロアレイ実験
上記のようにして１又は４日間培養することにより調製したＤＰ画分（高密度培養または低密度培養５〜１０×１０6個）にＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）１ｍｌを加え、マニュアルに従い５０〜１００μｇのトータルＲＮＡを抽出した。さらにＲＮｅａｓｙＭｉｎｉ（キアゲン）のＲＮＡ  ｃｌｅａｎｕｐの方法に従い、得られたトータルＲＮＡを精製し、バイオアナライザー２１００システム（アジレント）により分解物の混入が認められないことを確認した。得られたトータルＲＮＡ  ５００ｎｇをＬｏｗ  ＲＮＡ  Ｉｍｐｕｔ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（アジレント）によりマニュアルに従い、Ｃｙ５−ＣＴＰまたはＣｙ３−ＣＴＰ（ともにパーキン・エルマー）を用いてそれぞれの蛍光色素のラベル化ｃＲＮＡを調製した（例えば高密度培養ＤＰ由来ＲＮＡはＣｙ５ラベル、低密度培養ＤＰ由来ＲＮＡはＣｙ３ラベル）。それぞれの蛍光色素ラベルｃＲＮＡ各１μｇをハイブリダイゼーションキットＰｌｕｓ（アジレント）を用いて、マニュアルに従い、マウス発生オリゴ（アジレントＧ４１２０Ａ）またはマウスオリゴ（アジレントＧ４１２１Ａ）マイクロアレイスライド上で６０℃で１７時間競合的ハイブリダイゼーションに供した。洗浄・乾燥後、直ちにマイクロアレイスキャナー（アジレントＧ２５６５ＡＡ）によりマイクロアレイの画像化を行った。得られた画像はＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア（アジレントＧ２５６６ＡＡ）により各スポットの蛍光強度の数値化を行い、解析に用いた。各遺伝子の発現量を以下の表に示す。
【００３２】
【表１】
2006028169.tif 000002
【表２】
2006028169.tif 000003
【表３】
2006028169.tif 000004
【００３３】
以上の結果から、毛乳頭細胞を毛包形成可能な高密度条件下で培養したときと、毛包形成されない低密度条件下で培養したときとでは、特定の遺伝子の発現量が変わることが明らかとなった。遺伝子Ｓ１００ａ６、Ｃｔｇｆ、Ｇｓｔｏ１、Ｇａｓ６、Ｋｌｆ２、ＴｈｂｓおよびＴｈｂｄについては、高密度条件下に比べ、毛包形成されない低密度条件下で毛乳頭細胞培養した場合の方が、それぞれの発現量が高まることが明らかとなり、これらの遺伝子は毛包形成を抑制する働きを有するものと考えられる。
【００３４】
毛包形成抑制能因子によるマウス発毛への影響の検討
以上の実験により毛包形成を抑制する能力を有するものと予想されるＣｔｇｆをマウス皮膚に注入し、発毛の抑制について確認した。
実験方法
［−２日目］
８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス１２匹（４匹３群）の背部を毛刈し、背部中央付近にマーキング（入墨）をした。そのマーキング箇所に、０．１％のＰＢＳ−ＢＳＡに溶解した結合組織成長因子（Ｃｔｇｆ）（Biovendor Laboratory Medicine, Inc.）を０（コントロール）、１００又は３３３ｎｇ／１００μｌにて皮内注射した。
［−１日目］
上記マウスのマーキング箇所に、−２日目と同様、０．１％のＢＳＡ−ＰＢＳに溶解したＣｔｇｆを０（コントロール）、１００又は３３３ｎｇ／１００μｌにて皮内注射した。
［０日目］
上記マウスのマーキング箇所にワックス脱毛を施し、次いで−１日目と同様、０．１％のＢＳＡ−ＰＢＳに溶解したＣｔｇｆを０（コントロール）、１００又は３３３ｎｇ／１００μｌにて皮内注射した。
［＋１日目］
上記ワックス脱毛を施した箇所に＋１日目と同様、０．１％のＢＳＡ−ＰＢＳに溶解したＣｔｇｆを０（コントロール）、１００又は３３３ｎｇ／１００μｌにて皮内注射した。
［＋４〜＋８日目］
上記ワックス脱毛箇所の発毛状態を目視観察し、また背部皮膚の黒みをメキサメーター（narrow-band reflectance spectrophotometer（メキサメーターＭＸ  １６０、ＣＯＵＲＡＧＥ＋ＫＨＡＺＡＫＡ  ｅｌｅｔｒｉｃ  ＧｍｂＨ、ケルン、ドイツ））で測定することにより毛包形成度を評価した。
【００３５】
実験結果
ワックス脱毛処理を施したマウス背部にＣｔｇｆを直接皮内注射することにより、注射量依存式に発毛・毛包形成が顕著に遅延することが目視及びメキサメーターにより観察された。＋７日目及び＋８日目の結果を図２に示す。従って、Ｃｔｇｆが毛包形成抑制能を有することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】高密度および低密度培養毛乳頭細胞移植したマウスの毛包形成の比較。
【図２】マウス発毛に対するＣｔｇｆの皮内注射の影響。
【図２】
2006028169.tif 000005
【図１】
2006028169.tif 000006