(57)【要約】【課題】  新規フィブロネクチン及び関連コラーゲン結合性タンパク質のペプチド阻害剤の提供。【解決手段】  フィブロネクチンのゼラチン- 結合性ドメインに結合するヒト内皮細胞トロンボスポンジンの第二タイプ1 反復から得られたペプチドを単離し、そして合成により製造した。本ペプチドを、フィブロネクチン又は他の関連コラーゲン- 結合性タンパク質に結合させて、フィブロネクチン- 依存性細胞接着を阻害し、そしてフィブロネクチンのゼラチン- 結合性ドメインと相同性を共有する他のタンパク質のコラーゲンとの相互作用を阻害するために、使用することができる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブロネクチンのゼラチン- 結合性ドメインについての特異的な結合アフィニティーを有するペプチドであって、少なくとも5 のアミノ酸を含み、そして配列 HisTrp 及び少なくとも1 の他のトリプトファン残基を含む、前記ペプチド。
【請求項２】
ペプチドが配列 XaaHisTrp｛ここで、Xaa がセリン、トレオニン及びアラニンから成るアミノ酸の群から選ばれる。｝を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドが5 〜30アミノ酸残基を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
ペプチドが6 〜20アミノ酸を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
アミノ- 末端 N- アセチル及びカルボキシル- 末端アミドをさらに含んで成る、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
フィブロネクチンのゼラチン- 結合性ドメインについての特異的な結合アフィニティーを有するペプチドであって、30までのアミノ酸をもち、そして以下の配列(A):
Xa-Xb- His-Trp-Xc
｛ここで、XaがH 又は1 〜27アミノ酸のアミノ酸配列であり、Xbがセリン、アラニン、トリプトファン、又はトレオニンであり、そしてXcがOH、NH2 又は1 〜27アミノ酸のアミノ酸配列であり、そしてXa及びXbの中の少なくとも1 が配列(A) 内にTrp から3 アミノ酸残基内に位置するトリプトファンを含む。｝を含む、前記ペプチド。
【請求項７】
Xaがアミノ酸残基394-420 を含む連続的に生じたトロンボスポンジン・アミノ酸配列から得られた1 〜27アミノ酸のアミノ酸配列であり、Xbがセリン、アラニン又はトレオニンであり、そしてXcがアミノ酸残基424-450 を含む連続的に生じたヒト・トロンボスポンジン・アミノ酸配列から得られた1 〜27アミノ酸のアミノ酸配列である、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
ペプチドが配列番号1 、配列番号2 、配列番号3 、配列番号4 、配列番号5 、配列番号6 、配列番号7 及び配列番号8 から成る群から選ばれた配列をもつ、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
ペプチドがGlyGlyTrpXaaHisTrp｛ここで、Xaa がセリン、トレオニン及びアラニンから成るアミノ酸の群から選ばれる。｝を含んで成る、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
Xaa がアラニンである、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１１】
Xaa がセリンである、請求項４に記載のペプチド。
【請求項１２】
フィブロネクチン又は他の関連コラーゲン- 結合性タンパク質に結合するための医薬組成物であって、少なくとも1 の請求項１に記載のペプチドの有効量及び医薬として許容される賦形剤又は担体を含む、前記医薬組成物。
【請求項１３】
有効量のペプチドが配列番号1 、配列番号2 、配列番号3 、配列番号4 、配列番号5 、配列番号6 、配列番号7 及び配列番号8 から成る群から選ばれた配列をもつペプチドである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ペプチドがフィブロネクチンのゼラチン- 結合性ドメインについての特異的な結合アフィニティーを有するペプチドであって、そのペプチドが30までのアミノ酸をもち、そして以下の配列(A):
Xa-Xb- His-Trp-Xc
｛ここで、XaがH 又は1 〜27アミノ酸のアミノ酸配列であり、Xbがセリン、アラニン、トリプトファン、又はトレオニンであり、そしてXcがOH、NH2 又は1 〜27アミノ酸のアミノ酸配列であり、そしてXa及びXbの中の少なくとも1 が配列(A) 内にTrp から3 アミノ酸残基内に位置するトリプトファンを含む。｝を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
Xaがアミノ酸残基394-420 を含む連続的に生じたトロンボスポンジン・アミノ酸配列から得られた1 〜27アミノ酸のアミノ酸配列であり、Xbがセリン、アラニン又はトレオニンであり、そしてXcがアミノ酸残基424-450 を含む連続的に生じたヒト・トロンボスポンジン・アミノ酸配列から得られた1 〜27アミノ酸のアミノ酸配列である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
フィブロネクチン又は他の関連コラーゲン- 結合性タンパク質に結合するための医薬組成物であって、少なくとも1 の請求項４に記載のペプチドの有効量及び医薬として許容される賦形剤又は担体を含む前記医薬組成物。
【請求項１７】
ペプチドが配列番号1 に記載の配列をもつペプチドである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
治療の必要な患者においてフィブロネクチン又は他の関連コラーゲン- 結合性タンパク質に結合するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
フィブロネクチン、マトリックス・メタロプロテイナーゼ-2、マトリックス・メタロプロテイナーゼ-9又は他の関連コラーゲン- 結合性タンパク質に結合するための請求項１８に記載の医薬組成物であって、そのペプチドが配列番号1 、配列番号2 、配列番号3 、配列番号4 、配列番号5 、配列番号6 、配列番号7 及び配列番号8 から成る群から選ばれた配列をもつペプチドである、前記医薬組成物。
【請求項２０】
治療の必要な患者においてコラゲナーゼ及びフィブロネクチンに相同な他のプロテアーゼの酵素活性を阻害するための医薬組成物であって、医薬として許容される賦形剤又は担体内に含まれる少なくとも1 のペプチドの有効量を含み、そのペプチドが配列番号1 、配列番号2 、配列番号3 、配列番号4 、配列番号5 、配列番号6 、配列番号7 及び配列番号8 から成る群から選ばれた配列をもつペプチドである、前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、トロンボスポンジン(thrombospondin)とフィブロネクチン(fibronectin) との相互作用を仲介するトロンボスポンジンのドメインから誘導されたペプチドであって、フィブロネクチンに特異的に結合し且つフィブロネクチンのコラーゲンへの結合を阻害するペプチドに、並びにこれらのペプチドを含む医薬組成物に、そしてこれらのペプチドを使用してフィブロネクチンのコラーゲンへの結合を阻害する方法に、関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
トロンボスポンジンは、多くの巨大分子、例えば、フィブロネクチン(Lahav, et al., 1984, Cell 31:253-262; Lahav, et al. 1984, Eur. J. Biochem. 145:151-156)、ヘパリン(Lawler, et al. 1981, Thromb. Res. 22:267-279)及びコラーゲン(Lahav, et al. 1984, Cell 31:253-262, Mumby, et al., 1984 J. Cell. Biol. 98:646-652)と相互作用することができる多- 官能性タンパク質である。これらの分子のすべてが、その細胞外マトリックスの構成成分であり、これは、トロンボスポンジンがそのマトリックスへの沈着の後に他のマトリックス成分と複合体を形成することを示唆している。
Gelder and Brownは、トロンボスポンジンがゼラチンとフィブロネクチンとの相互作用を阻害すること示している(Gelder, F.B. and Brown, S.T. 1987, J. Lab. Clin. Med. 110:548-557) 。血小板トロンボスポンジン及び未同定であるが生物学的に類似の血漿タンパク質は、フィブロネクチンのゼラチン- 結合活性を阻害することが示された; しかしながら、その相互作用の原因であるトロンボスポンジンのドメイン又は配列は、未だ知られていない。この相互作用領域は、そのフィブリン結合性ドメインとフィブロネクチン上で異なる部位であると含意され(Homandberg, G.A. and Kramer-Bjerke, J. 1987, Thromb. Res. 48:329-335)、そしてトロンボスポンジンの少なくとも2 の別個のドメインがフィブロネクチンに結合することが示された(Dardik, R. and Lahaw, J. 1989, Eur. J. Biochem. 185:581-588) 。フィブロネクチンとヘパリンは、トロンボスポンジンの27 kDa断片への結合について競合し、これは、これらの2 つのタンパク質がトロンボスポンジンのN-末端ドメイン内に共通又は密に配向された結合部位を共有することを示唆している。トロンボスポンジンは、フィブロネクチン・マトリックスに付着した内皮細胞の病巣接触接着を破壊することも示されている(Murphy-Ullrich, J.E., and Hook, M. 1989, J. Cell. Biol. 109:1309-1319) 。この効果の機構は、知られていないが、硫酸化多糖類によるトロンボスポンジンの活性の阻害は、トロンボスポンジンのヘパリン- 結合性ドメインが関連していることを示唆している。
【０００３】
トロンボスポンジンからの多数の生物学的に活性なペプチドが同定され、そして単離されている。2 つのペプチド、ArgGlyAspAla(Lawyer, J. and Hynes, R.O. 1986, J. Cell Biol. 103:1635-1641)及びValThrCysGly(Prater, et al., 1991, J. Cell Biol. 112:1031-1040) は、細胞表面上のタンパク質レセプタとトロンボスポンジンとの相互作用のためのリガンドであると提案されている。トロンボスポンジンのペプチドTrpSerProTrpSer(Guo, et al. 1992,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3040-3044)は、ヘパリン及びスルファチドに結合する。しかしながら、フィブロネクチン又は関連コラーゲン結合性タンパク質に結合することができるトロンボスポンジン・ペプチドは知られていない。
【０００４】
フィブロネクチンは、細胞付着及び転移を含む様々な細胞接触過程に関連している。フィブロネクチンは、フィブロネクチンの" ゼラチン結合性ドメイン" を通じてコラーゲンと相互作用し、そしてコラーゲンとフィブロネクチンとの間のこの相互作用は、細胞外マトリックスの組織化及び支持体上でのこれらの細胞の挙動に基本的なものである(Vaberi, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:4944-4948)。フィブロネクチンは、様々な腫瘍及び癌細胞を含む多くの細胞の付着及び転移に本質的なものである。
【０００５】
従って、高いアフィニティーをもってフィブロネクチン又は関連コラーゲン- 結合性タンパク質に結合するであろうフィブロネクチンの阻害剤についての必要性が存在する。特に、コラーゲン・マトリックスへのフィブロネクチン- 依存性細胞接着を防ぎ、そしてフィブロネクチンのゼラチン- 結合性ドメインとの相同性を共有する他のタンパク質とコラーゲンとの相互作用を阻害するための、フィブロネクチン又は関連コラーゲン- 結合性タンパク質に結合するであろうような阻害剤についての必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００６】
それ故、本発明の目的は、コラーゲン・マトリックスへのフィブロネクチン- 依存性細胞接着を防ぎ、そしてそのフィブロネクチンのゼラチン- 結合性ドメインとの相同性を有する他のタンパク質とコラーゲンとの相互作用を阻害するために、フィブロネクチン又はそのフィブロネクチンのゼラチン- 結合性ドメインとの相同性を有する他のタンパク質に特異的に且つ特異的なアフィニティーをもって結合する配列をもつ高く有効なペプチドを提供することである。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、フィブロネクチン又はそのフィブロネクチン・ゼラチン- 結合性ドメインとの相同性を有する他のタンパク質に対して高いアフィニティーをもつ少なくとも1 のペプチドを含む医薬組成物を提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、治療の必要な患者においてフィブロネクチン又はそのフィブロネクチン・ゼラチン- 結合性ドメインとの相同性を有する他のタンパク質への結合方法を提供する。
【０００９】
本発明のこれらの及び他の目的は、以下の説明及び好ましい態様から並びに添付図面の助けによりさらに明確になるであろう。
【００１０】
発明の要約
本発明者らは、フィブロネクチンのゼラチン- 結合性ドメインについての特異的な結合アフィニティーをもつ生物学的に活性なペプチドであって配列HisTrp及び少なくとも1 の他のトリプトファン残基を含む少なくとも5 のアミノ酸の配列をもつものを、単離、精製、及び特徴付けし、又は合成及び特徴付けした。本発明の好ましい態様においては、本ペプチドは、配列XaaHisTrp ｛ここで、Xaa がセリン、トレオニン及びアラニンから選ばれたアミノ酸である。｝を含む。さらに好ましくは、本ペプチドは、ヘキサペプチドGlyGlyTrpXaaHisTrp｛ここで、Xaa が先に定義したものと同じである。｝を含む配列をもつ。本発明の特に好ましい態様においては、本ペプチドは、配列番号1 、配列番号2 、配列番号3 、配列番号4 、配列番号5 、配列番号6 、配列番号7 及び配列番号8 の中の1 をもつペプチドである。最も好ましいのは、ヘキサペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)である。
【００１１】
本発明の他の態様においては、フィブロネクチン又は他の関連コラーゲン- 結合性タンパク質に結合するための医薬組成物であって本発明に係る少なくとも1 のペプチドの有効量及び医薬として許容される賦形剤又は担体を含むものが提供される。
【００１２】
本発明の好ましい態様においては、本医薬組成物は、配列番号1 、配列番号2 、配列番号3 、配列番号4 、配列番号5 、配列番号6 、配列番号7 及び配列番号8 から選ばれたペプチドの中の1 の有効量並びに医薬として許容される賦形剤又は担体を含む。より好ましくは、本発明に係る医薬組成物は、配列番号1 をもつヘキサペプチドである。
【００１３】
本発明の他の態様においては、治療の必要な患者においてフィブロネクチン又は他のコラーゲン- 結合性タンパク質に結合する方法であって、フィブロネクチンのゼラチン- 結合性ドメインについての特異的結合アフィニティーをもち、そして配列HisTrp及び少なくとも1 の他のトリプトファン残基を含む少なくとも5 のアミノ酸を含むペプチドの有効量をそのような患者に投与するような方法が、提供される。本発明の好ましい態様においては、本ペプチドは、配列番号1 、配列番号2 、配列番号3 、配列番号4 、配列番号5 、配列番号6 、配列番号7 及び配列番号8 から選ばれた配列をもつペプチドである。最も好ましいには、そのペプチドがヘキサペプチド配列番号1 であるような方法である。
【００１４】
用語" コラーゲン- 結合性ペプチド" は、本明細書中、コラーゲンに特異的に結合し又はこれと相互作用することができるドメインをもつタンパク質について記載するために使用される。
【００１５】
用語" フィブロネクチンのゼラチン- 結合性ドメイン" は、本明細書中、ゼラチンと哺乳類フィブロネクチンとの相互作用の部位である哺乳類フィブロネクチンのアミノ酸配列について記載するために使用される。この" ゼラチン" は、変性コラーゲンを定義するために使用される。
【００１６】
用語" フィブロネクチンについての特異的結合アフィニティー" は、本明細書中、飽和ペプチド条件下ペプチドへのフィブロネクチンの少なくとも1 重量% の結合を意味するために使用される。記号(+) は、フィブロネクチンへの、1 〜5%の結合を示し、(++)は、5 超〜50% の結合を示し、そして(+++) は、50超の結合を示す。
【００１７】
アミノ酸のための1 文字コード及び本明細書中に使用されるその対応3 文字コードを以下に示す:
W=Trp
K=Lys
Y=Tyr
P=Pro
D=Asp
R=Arg
F=Phe
Q=Gln
E=Glu
T=Thr
G=Gly
S=Ser
A=Ala
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明に係るペプチドは、細胞外マトリックス・タンパク質トロンボスポンジンから誘導される。特に、本ペプチドは、マトリックス接着タンパク質フィブロネクチンとトロンボスポンジンとの相互作用を仲介するドメインの中の1 から誘導される。本発明に係るペプチドは、トロンボスポンジンの第二の1 型反復(the second type 1 repeat)から誘導される。トロンボスポンジンは、トロンボスポンジンへの細胞の付着に関係した3 つのドメインを含むモジュールの接着糖タンパク質である。キモトリプシン分解性50 kDaペプチドから成るトロンボスポンジンの1 領域は、2 つのマラリア・タンパク質に相同な57残基セグメントの3 つの1 型反復を含む(Lawler J. and Hynes, R.O. 1986, J. Cell. Biol. 103: 1635-1648) 。第二の1 型反復のアミノ酸配列は、引用により本明細書中に取り込まれる。
【００１９】
本発明に係るペプチドは、フィブロネクチンのゼラチン- 結合性ドメインと直接に相互作用する。フィブロネクチンのゼラチン- 結合性ドメインは、ゼラチンとフィブロネクチンとの相互作用に必要である。本発明に係る特定の且つ好ましい配列は、表1 中に表され、そして様々な分野の公知方法の中のいずれかにより作られることができる。このようなペプチド合成法は、例えば、固相ペプチド合成、発現ベクター内でそのペプチドをエンコードしているDNA のクローニングを含む遺伝子操作技術、及びトロンボスポンジンからのそのペプチドの直接的な単離、を含む。
【００２０】
表1 は、本発明に係るペプチド(FN 結合性 +、++、+++)に相同性を有しながら必須His-Trp(H-W)配列を含まない他のペプチド(FN 結合性 - )をも含む。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
本発明に係るペプチドは、フィブロネクチンのゼラチン- 結合性ドメインに特異的に結合する。本ペプチドのフィブロネクチン- 結合に責任を負う配列は、ヘパリン- 結合性ペプチドとして先に同定されたペプチド内に含まれるが、フィブロネクチンに結合するのに最適な配列は、ほんの弱いヘパリン- 結合活性をもつ(U.S.P. 出願07/801,812) 。さらに特に、トロンボスポンジンの第二1 型反復の一部を含んで成る17アミノ酸ペプチド( ペプチド246)( 配列番号7)(KRFKQDGGWSHWSPWSS) は、フィブロネクチンについての強いアフィニティーを示し、そしてゼラチンへのフィブロネクチン結合及びゼラチン・マトリックスへのフィブロネクチン- 仲介細胞接着の有効な阻害剤である。フィブロネクチンへの本ペプチドの結合は、ペプチド246 のアミノ末端の塩基性残基を必要としない。なぜなら、これらの残基を欠いたペプチド256(GGWSHWSPWSS)( 配列番号6)もフィブロネクチンに結合するからである。
【００２３】
その正確な位置における少なくとも2 のトリプトファン残基が結合のために必要である。ペプチド246(配列番号18) の中央のトリプトファン残基( 残基9)が結合のために必要である。なぜなら、このトリプトファン残基を欠いた類似のペプチド(259) は結合するのに失敗するからである( 表1 及び図1)。この17アミノ酸ペプチド246 ( 配列番号7)から誘導された重複ペプチドの中で、GlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)をもつペプチドは、最も強い結合活性をもつ( 図1 及び表1)。本発明に係るペプチドの中で最も好ましいのは、配列GlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)をもつヘキサペプチドである。
【００２４】
本発明に係るペプチドは、連続して生じるヒト・トロンボスポンジン・アミノ酸から誘導される配列を含むことができる。好ましくは、この連続して生じるアミノ酸配列は、アミノ酸394-420 及び424-450 から選ばれる。特に好ましいのは、その連続的アミノ酸410-420 及び424-434 である。
【００２５】
トロンボスポンジンの第二1 型反復から誘導された幾つかのペプチドの結合活性を図1 中に示す。100 μg/mlの飽和ペプチド濃度において、50% 超の添加フィブロネクチンが本発明に係る固定化ペプチドに結合される。ペプチド配列GlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)から成るヘキサペプチドは、その同一配列又は無傷のトロンボスポンジンを含むより大きなペプチドよりも良好にフィブロネクチンに結合し、これは、その6 残基配列がトロンボスポンジンにおいて部分的に暗号に関するものであることを示している。本発明に係るペプチドが有効なフィブロネクチン結合のための完全なヘキサペプチド配列を含むことは必要でないが、そのペプチドがそのヘキサペプチドと幾つかの配列相同性を共有することが必要である。そのヘキサペプチドの2 つのトリプトファン残基とHis 残基が本発明に係るペプチド内で必須である。なぜなら、類似アミノ酸による保存的置換でさえそのペプチドに不活性を付与するからである( 図2)。好ましくは、セリン残基が存在するが、それは必須ではない。最適結合は、セリン残基を含んで成るペプチドにより得られる( 図2B) 。トレオニン残基によるそのセリン残基の保存的置換は、約5 倍活性を減少させ、そしてアラニン残基によるそのセリン残基の置換は、そのトレオニン・アナログよりも僅かに高い阻害定数をもつ活性ペプチドを作り出す。2 つのグリシン残基の存在は、1 つだけのグリシン残基をもつペプチド・アナログに比較して活性をより強く増強する( 図2B) 。アラニンによるグリシン残基又はアスパラギン酸によるグリシン残基の両方の保存的置換は、活性を無くさせる。好ましくは、このペプチドは、2 つのグリシン残基を含んで成るが、1 又は両方のグリシン残基を欠いたペプチドは本発明の範囲内にある。
【００２６】
従って、本発明に係るペプチドは、少なくとも5 つのアミノ酸残基の配列をもつ、これは、少なくとも2 つのトリプトファン残基を含み、その中の少なくとも1 は、配列HisTrp(HW)として存在し、ここで、このペプチドは、フィブロネクチンのゼラチン- 結合性部位についての特異的な結合アフィニティーをもつ。より好ましくは、配列XaaHisTrp を含む少なくとも5 のアミノ酸残基をもつペプチドであり、ここで、Xaa はセリン、トレオニン及びアラニンから選ばれたアミノ酸であり、そしてその5 つのアミノ酸は少なくとも2 つのTrp 残基をもつ。さらにより好ましくは、ヘキサペプチドGlyGlyTrpXaaHisTrpであり、ここで、Xaa はセリン、トレオニン及びアラニンである。
【００２７】
本発明の特に好ましい態様においては、本発明に係るペプチドは、配列番号1 、配列番号2 、配列番号3 、配列番号4 、配列番号5 、配列番号6 、配列番号7 及び配列番号8 から独立して選ばれた配列をもつペプチドである。最も好ましいのは、ペプチド配列番号1 である。
【００２８】
本発明に係るペプチドは、特異的な結合アフィニティーをもってフィブロネクチンに結合するために溶液中で適当なコンホメーションを保持する。その上、本発明に係るペプチドは、フィブロネクチンのゼラチン- 結合性部位に特異的に結合し、そして好ましくは、飽和懸濁条件下で少なくとも5%の結合アフィニティーをもつ。本発明のペプチドは、ゼラチンへのフィブロネクチン結合及びゼラチン・マトリックスへのフィブロネクチン- 仲介細胞接着の有効な阻害剤である。
【００２９】
フィブロネクチンは、正常な発達の間に細胞の相互作用及び細胞外マトリックス組み立てを仲介物質する重要な細胞外マトリックス成分である。それは、恒常性及び外傷治癒にも参加し、そして細胞とのフィブロネクチンの相互作用を阻害するペプチドが動物モデルにおいて腫瘍転移を阻害することが証明されている(Humphries, M.J. Olden, K and Yamada, K., (1986) Science 233, 467-470)。
【００３０】
本発明は、新たなクラスのフィブロネクチン機能阻害剤を提示する。本発明に係るペプチドは、フィブロネクチンに特異的に結合し、そしてフィブロネクチンのための細胞表面インテグリン・レセプタとではなくコラーゲンとのフィブロネクチンの相互作用を阻害する。このように、これらのペプチドは、腫瘍形成、転移、外傷修復及び恒常性に関連する細胞マトリックス相互作用の調節において利用可能である。例えば、本ペプチドは、固定化ゼラチンへのヒト胸癌腫細胞系MDA-MB-435のフィブロネクチン- 依存性接着を阻害する。本発明に係るペプチドによるこれらの癌細胞の接着の阻害は、フィブロネクチン結合活性を欠いた相同なペプチドが接着を阻害することに失敗するということにおいて特異的である( 図6-A 、6-B 及び7 参照) 。
【００３１】
先に述べたように、ヘキサペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)との部分的な配列相同性だけが、ゼラチンへのフィブロネクチン結合を阻害するために必要である。様々なタンパク質における活性部位を含んで成る相同な配列の存在は、そのフィブロネクチン- 結合性ドメインに相同なドメインを含む他のタンパク質の活性が本発明に係るペプチドにより調節されることができるということを示唆している。例えば、マトリックス・メタロプロテイナーゼ-2及びマトリックス・メタロプロテイナーゼがそのフィブロネクチンのゼラチン- 結合性ドメインと相同性を共有するようなタンパク質は、本発明に係るペプチドにより調節されることができる。
【００３２】
トロンボスポンジン遺伝子ファミリーにおいてフィブロネクチン-結合性ヘキサペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)の高程度の保存が存在する。この配列は、マウス及びヒトThbsI 遺伝子の第二1 型反復内で及びマウス及びニワトリからのThbs2 遺伝子内で完全に保存されている(Laherty, et al. 1992, J. Biol. Chem. 267: 3274-3281) 。このサーチ配列GlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)を使用したSwiss-Protデータ・ベースのサーチは、類似の配列をもつ幾つかの他のタンパク質を産生した( 表II参照) 。Epstein-Barrウイルス・リボヌクレオチド・レダクターゼは、最も相同な配列、GlyGlyTrpPheHisTrp( 配列番号18) を含んでいる。脊椎動物のアセチルコリン・レセプタ配列の中で高く保存されているニコチン・アセチルコリン・レセプタのα- サブユニットも、配列GlyTrpLysHisTrp ( 配列番号19) を通じて上記ヘキサペプチドとの配列相同性を共有している。配列GlyTrpLysHisTrp(配列番号19) を含むアセチルコリン・レセプタのペプチドは、そのレセプタへのアセチルコリン結合において役割を演じている。さらに、他の類似配列、TrpSerXTrpSer は、有効な" 結合性(binding)"配列として同定されている(Miyazaki, et al. 1991; Embo J., 3191-3197; Yoshimura, et al. 1992,・J. Biol. Chem. 267: 11619-11625)。この部位と相互作用するリガンドは同定されていないが、そのコンセンサス配列の突然変異後のレセプタのプロセシング又は活性の損失は、タンパク質の折り畳み、細胞内プロセシング、又はシグナル変換に関連する細胞因子が有効なリガンドであることを示唆している。
【００３３】
【表２】
2006028195.tif 000003
【００３４】
本発明に係る少なくとも1 のペプチドの治療的有効量を含む組成物を、本分野において公知のいずれかの方法により調製する。例えば、本組成物を、本発明に係る少なくとも1 のペプチドと医薬として許容される担体又は賦形剤、例えば、無菌生理食塩水、リンゲル液、リンゲル乳酸塩又は5%デキストロースとの混合物を形成することにより調製する。本ペプチドを、投与に望ましい調製物の形態に依存して様々な担体化合物と混合することができる。
【００３５】
他の態様においては、本発明に係るペプチドを、好適な担体ポリマー又はタンパク質と結合させることができる。例えば、本ペプチドとの化学的結合を、標的細胞の表面タンパク質に対する抗体への付着により特定の細胞を標的化するために使用することができる。
【００３６】
ペプチド投与の様々な方法が当業者に知られている。このような投与方法は、非限定的に、表面適用、経口及び非経口的経路、関節内注射、持続性放出を介しての皮下注射、静脈内注射又は他の医薬デリバリー法、を含むことができる。
【００３７】
本発明に係るペプチドの適当な投与量は、その個々の患者により提示される症状に依存するであろう。熟練した医学研究者は、生理学的な活性と競合するのに必要な適当な投与量を決定することができるであろう。しかしながら、一般的には、約1 μg 〜100 μg/体重1kg/日の量の上記生物学的活性ペプチドが有用であるはずである。
【００３８】
以下の実施例を、本発明の原理及び実施をより十分に説明するために提供する。本実施例は、いずれの方法によるかを問わず本発明の範囲を限定することを意図されていない。
【実施例】
【００３９】
実施例1
本実施例は、フィブロネクチンへの本発明に係るペプチドの結合について説明する。
フィブロネクチンを、記載されたような(Ariyama, et al. 1985, J. Biol. Chem. 260: 4492-4500) 血小板- 減少血漿から単離し、そして記載されたような(Roberts, et al. 1987, J. Cell. Biol. 104:131-139) Iodogen (Pierce Chemical Co., Rockford, ILL) を使用してヨード化した。
【００４０】
ペプチドを、ヒト内皮細胞トロンボスポンジンのためのcDNA配列から演繹されたヒト・トロンボスポンジンの配列に対応して合成した(C Lawyer and Hynes, 1986, J. Cell. Biol. 103:1635-1648)。ペプチドを、標準的なMerrifield固相合成プロトコール及びt-Boc 化学を使用したBiosearch Model 9600ペプチド合成装置上で合成した。ペプチドを、分析し、そして適宜、さらに逆相HPLCクロマトグラフィーにより精製した。ペプチド246(配列番号7)を含むペプチドの幾つかの同定を、完全アミノ酸配列分析により確認した。ペプチド溶液を、希NaOHの添加により中和し、そして-20 ℃において溶液中に保存した。
【００４１】
固定化ペプチドへのフィブロネクチンの直接的結合を、最初に園ペプチドを、所定濃度において25℃において3 時間塩化ポリビニルマイクロタイター・プレート上に吸収させることにより行った。未結合ペプチドを、洗浄により除去し、そしてウェルを、tris-BSA(50 mM tris-HCl, pH 7-8, 110 mM NaCl, 1% BSA) 中で30分間インキュベートした。ウェルを洗浄し、そして25℃において2 時間30mlの0.5 μg/ml125 I-フィブロネクチンと共にインキュベートした。ウェルをDulbecco'sホスフェート・バッファー生理食塩水により5 回洗浄し、そして結合した放射能をカウントした。
【００４２】
表1 中に列記したペプチドを、先に記載したように合成し、そしてマイクロタイター・ウェルに吸収させた。トロンボスポンジンのI 型反復又はカルボキシ末端ドメインからテストされた大きなペプチドの中で、ペプチド246(配列番号7)だけが、標識されたフィブロネクチンに結合した。ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)が最も強い結合活性を示した。このペプチド配列は、ヒトThbsI 遺伝子の第二I 型反復内に位置する。トロンボスポンジンの第一及び第三のI 型反復内の対応位置から誘導された合成ペプチド317(配列番号15) 及び318(配列番号20) は、不活性であった。
【００４３】
結果を表1 及び図1 中に示す。図1 は、ペプチド300(△)(GlyGlyTrpSerHisTrp)(配列番号1); 246(○)( LysArgPheLysGlnAspGlyGlyTrpSerHisTrpSerProTrpSerSer)(配列番号7); 263(上黒三角)( LysArgPheLysGlnAspGlyGlyTrpSerHisTrpSerPro)( 配列番号5); 及び264(黒四角)( GlyGlyTrpSerHisTrpSerPro(配列番号4)へのI-フィブロネクチンの結合を示している。
【００４４】
実施例2
本実施例は、合成ペプチドによるトロンボスポンジン・ペプチド300(GlyGlyTrpSerHisTrp) へのフィブロネクチンの阻害の特異性について説明する。
マイクロタイター・プレート・ウェルを、実施例1 におけるように50μg/mlのペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)によりコートした。結合ペプチドへの125 I-フィブロネクチン(0.5μg/ml) の結合を、それらのペプチドの増加量の存在中で測定した: パネルA 中: ペプチドは、GlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)( ●);GlyGlyTrpSerLysTrp( 配列番号9) (上黒三角);GlyGlyTyrSerHisTrp( 配列番号10) (黒四角) ; 及びGlyGlyTrpSerHisTyr( 配列番号11)(下黒三角) であり; パネルB 中:GlyGlyTrpSerHisTrp(配列番号1)( ●);GlyGlyTrpThrHisTrp( 配列番号12) (上黒三角);GlyGlyTrpAlaHisTrp( 配列番号13) (黒四角) ; GlyTrpSerHisTrp(配列番号14)(+); AlaAlaTrpSerHisTrp( 配列番号21)(下黒三角);及びAspGlyTrpSerHisTrp( 配列番号225) (□) である。
【００４５】
結果を表2 中に示す。
固定化されたペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)へのフィブロネクチンの結合は、可溶性ペプチド300 により27μm における50% 阻害をもって阻害された。保存的な単一アミノ酸置換、GlyGlyTrpSerLysTrp( 配列番号9);GlyGlyTyrSerHisTrp(配列番号10) 及びGlyGlyTrpSerHisTyr( 配列番号11) を含む3 つのヘキサペプチドは、不活性であった。トロンボスポンジンの第一及び第三反復からの対応ヘキサペプチドも不活性であった。
【００４６】
実施例3
本実施例は、可溶性フィブロネチン、トロンボスポンジン及び合成ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrpによるトロンボスポンジン・ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrpへのフィブロネクチンの阻害について説明する。
【００４７】
ヒト血小板トロンボスポンジンを、Roberts, et al. 1985 J. Cell Biol. 104:131-139の方法に従って精製した。
50μg/mlのペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)によりコートされたマイクロタイター・プレート・ウェルへの125 I-フィブロネクチン(0.5μg/ml) の結合を、合成ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp、フィブロネクチン又はトロンボスポンジンの存在中で測定した。結果を図3 中に示す。
【００４８】
非標識フィブロネクチン及びトロンボスポンジンは、上記ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)への125 I-フィブロネクチンの結合について競合したが、幾つかの対照タンパク質、すなわち、卵白アルブミン、トランスフェリン、フェチュイン、ヤギIgG 及びネズミ・ラミニンは、競合しなかった( IC50>200μg/ml) 。
【００４９】
実施例4
本実施例は、本発明に係るペプチド及び全トロンボスポンジンが、フィブロネクチンのゼラチン- 結合性ドメインに結合することを説明する。
【００５０】
マイクロタイター・プレートを、実施例1 中に記載したように50μg/mlの合成ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)によりコートした。この結合ペプチドへの125 I-フィブロネクチン(0.5μg/ml)の結合を、Telios Pharmaceuticals, Inc. San Diego, CAから得たフィブロネクチンのタンパク質分解断片の存在中で測定した。このタンパク質分解断片は、無傷のフィブロネクチン; 30kDa ゼラチン-結合性ドメイン; 33kDa 組換え体細胞結合性ドメイン; 28kDa 組換え体細胞結合性ドメイン及びトランスフェリンを含んでいた。結果を図4 中に示す。
【００５１】
テストしたタンパク質分解断片の中で、ゼラチン- 結合性ドメインは、固定化ペプチドへの125 I-フィブロネクチン結合の最も強い阻害剤であった。細胞結合性ドメインを含む33 kDa断片は阻害性であった。しかしながら、その33 kDa断片のN-末端5kDa以外の全てを含む28kDa 断片は不活性であり、そしてその28kDa 断片と同じアミノ末端をもつ40kDa 断片は、約10倍活性が低かった。33kDa 組換え体断片の配列は、フィブロネクチンの120kDa断片内に含まれており、そしてその120kDa断片は、ほんの弱い阻害剤であり、33kDa により表された活性は、おそらく隠れた部位(cryptic site)による。この33kDa 断片の活性は、ゼラチン結合性断片の活性よりも低かった。
【００５２】
実施例5
本実施例は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrpによるゼラチンへのフィブロネクチン結合の阻害の特異性について説明する。
マイクロタイター・プレートのウェルを、Dulbecco's PBS中の2 μg/mlゼラチンにより25℃において3 時間インキュベートした。このウェルを空にし、そして1% BSAを含むDulbecco's PBSと共に30分間インキュベートした。このウェルを、空にし、そしてペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)( ●);GlyGlyTrpSerLysTrp( 配列番号9) (上黒三角);GlyGlyTyrSerHisTrp( 配列番号10) (黒四角) ; 又はGlyGlyTrpSerHisTyr( 配列番号11)(下黒三角) の存在中、25℃において2 時間0.5 μg/mlの125 I-フィブロネクチンと共にインキュベートした。ウェルを、PBS により4 回洗浄し、そのプレートから切断し、そしてその結合放射能をカウントした。結果を図5 中に示す。
【００５３】
ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)による阻害は、特異的であり、その活性配列からの単一アミノ酸置換をもつその関連ペプチドGlyGlyTrpSerLysTrp( 配列番号9);GlyGlyTyrSerHisTrp(配列番号10) 及びGlyGlyTrpSerHisTyr( 配列番号11) は不活性であった。
【００５４】
実施例6
実施例5 中に記載したようなリガンド結合性検定を実施した。但し、マイクロタイター・プレートをゼラチンの代わりに固定化された生来のI 型コラーゲンによりコートした。
【００５５】
ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)は、IC50=40 μm をもってI 型コラーゲンンへのフィブロネクチン結合を阻害し、ペプチドTrpSerHisTrpSerPro( 配列番号2);GlyGlyTrpSerLysTrp(配列番号9);GlyGlyTyrSerHisTrp(配列番号10);GlyGlyTrpSerHisTyr( 配列番号11);AlaAlaTrpSerHisTrp( 配列番号21);AspGlyTrpSerHisTrp( 配列番号22);及びGlyGlyTrpThrHisTrp( 配列番号24) は不活性であった。
【００５６】
実施例7
本実施例は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)による変性コラーゲンへのフィブロネクチン- 依存性細胞接着の阻害について説明する。
【００５７】
Dulbecco's PBS中のゼラチン(1μg/ml) を、24ウェル・プレート内のプラスチック・ディスク上にコートし、そして37℃において2 時間インキュベートした。懸濁液を除去した後、このディスクを室温において30分間 1% BSA-tris pH 7.8 により処理した。このディスクを、PBS により2 回洗浄し、そして0.4ml の0.1% BSAを含むRPMI 1640 培地及び1 μg/mlのフィブロネクチン、及び2 、20又は200 μg の阻害性ペプチドを、それらのウェルに添加した。0.1% BSAを含む0.1 mlのRPMI培地中の105 細胞の懸濁液をウェルに添加し、そして1 時間5% CO 2 と共に37℃においてインキュベートした。ディスクを洗浄して非接着細胞を除去し、そして染色した。接着細胞を顕微鏡によりカウントした。結果を図6 及び7 中に示す。
【００５８】
図6 のパネルA において、細胞系A2058 のヒト・メラノーマ細胞を上記ウェルに添加し、そして図7 のパネルA において、MDA 435s胸癌腫細胞を固定化ゼラチンに添加した。使用した濃度において、細胞は、添加フィブロネクチンの非存在中ゼラチンに弱く接着した。フィブロネクチンの存在中刺激された接着が、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)により投与量- 依存性のやり方で阻害された。その阻害は特異的であり、ここで、フィブロネクチン結合性活性を欠いた相同ペプチド、GlyGlyTrpSerLysTrp( 配列番号9)及びTrpSerHisTrpSerPro( 配列番号2)は不活性であった。
【００５９】
固定化フィブロネクチンへのA2058 細胞( 図6B) 又はMDA 435s細胞( 図7B) の直接的接着は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)又は上記対照ペプチドにより阻害されなかったが、フィブロネクチンへの上記胸癌腫細胞の接着は、ペプチドGlyArgGlyAspSer(配列番号25) により阻害された。従って、その胸癌腫細胞上のインテグリン・レセプタとフィブロネクチンとの相互作用は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)により阻害されなかった。
【００６０】
実施例8
本実施例は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)による生来のI 型コラーゲンへの胸癌腫細胞のフィブロネクチン- 仲介接着の阻害について説明している。
【００６１】
ディスクを実施例7 におけるように処理した。但し、Dulbecco's PBS中のI 型コラーゲンの1 μg/mlをそれらのディスク上にコートした。固定化Ｉ型コラーゲンへの胸癌腫細胞( 細胞系MDA 435s) の細胞接着を、フィブロネクチン単独の存在中並びにペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1);GlyGlyTrpSerLysTrp(配列番号9);TrpSerHisTrpSerPro(配列番号2)又はGlyArgGlyAspSer(配列番号25) の存在中で測定した。結果を図8 中に示す。
【００６２】
生来のI 型コラーゲンへの胸癌腫細胞のフィブロネクチン- 仲介接着は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)及びGlyArgGlyAspSer(配列番号25) により阻害されたが、GlyGlyTrpSerLysTrp( 配列番号9)又はTrpSerHisTrpSerPro( 配列番号2)によっては阻害されなかった。I 型コラーゲンへの直接的接着は、ゼラチンよりも強かった。ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)の効果は、フィブロネクチン- 仲介接着について特異的であったっが、このペプチドは、I 型コラーゲンへの細胞の直接的接着を阻害しなかった。
【００６３】
実施例9
本実施例は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrpによりゼラチナーゼの阻害について説明する。ウシ角膜内皮細胞からのならし培地中のゼラチナーゼ活性による125 I-ゼラチンの分解を、放射標識付けされた基質によりコートされ且つp-ヒドロキシ水銀ベンゾエートを使用して活性化されたならし培地と共に60又は90分間インキュベートされたマイクロタイター・プレートからの放射能の放出により測定した。所定濃度のペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)の存在中の活性を、ペプチドの非存在中で測定された対照活性として表し、そして水銀活性の非存在中で測定した背景放出について補正した。阻害を、内皮細胞ならし培地のゼラチン酵素図(zymogram)によっても測定した: a 、対照; b 、50μg/ml GlyGlyTrpSerHisTrp(配列番号1); c 、500 μg/ml GlyGlyTrpSerHisTrp(配列番号1); d 、50μg/ml GlyGlyTrpSerLysTrp(配列番号9); e 、500 μg/ml GlyGlyTrpSerLysTrp;及びf 、500 μg/mlのペプチドLysArgPheLysGlnAspGlyGlyTrpSerHisTrpSerProTrpSerSer(配列番号7)。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図1 は、フィブロネクチンの各固定化されたトロンボスポンジン・ペプチド、すなわち、SerHisTrpSerProTrpSerSer( 配列番号8)( ●); LysArgPheLysGlnAspGlyGlyTrpSerHisTrpSerProTrpSerSer( 配列番号7)( ○);LysArgPheLysGlnAspGlyGlyTrpSerHisTrpSerPro( 配列番号5)(上黒三角);GlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)( △);及びGlyGlyTrpSerHisTrpSerPro( 配列番号4)( 黒四角) へのフィブロネクチンの結合のグラフである。
【図２Ａ】図2 は、合成ペプチドによるトロンボスポンジン・ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)へのフィブロネクチン結合の阻害の特異性のグラフである。パネルA 中: ペプチドは、GlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)( ●);GlyGlyTrpSerLysTrp( 配列番号9) (上黒三角);GlyGlyTyrSerHisTrp( 配列番号10) (黒四角) ; 及びGlyGlyTrpSerHisTyr( 配列番号11)(下黒三角) であり;
【図２Ｂ】パネルB 中:GlyGlyTrpSerHisTrp(配列番号1)( ●);GlyGlyTrpThrHisTrp( 配列番号12) (上黒三角);GlyGlyTyrTrpHisTrp( 配列番号13) (黒四角) ; 及びGlyTrpSerHisTrp(配列番号14)・(+) 及びAspGlyTrpSerHisTrp( 配列番号15) ( □) である。
【図３】図3 は、可溶性フィブロネクチン、トロンボスポンジン及びペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)による、トロンボスポンジン・ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrpへのフィブロネクチン結合の阻害のグラフであり、GlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)( ●) 、フィブロネクチン(上黒三角) 及びトロンボスポンジン(黒四角) である。
【図４】図4 は、フィブロネクチンのタンパク質分解断片: 30kDa ゼラチン- 結合性ドメイン( ●) 、31 kDaフィブリン- 結合性ドメイン( ○) 、40 kDaヘパリン- 結合性ドメイン(上黒三角) 、120 kDa 細胞- 結合性ドメイン( △) 及び無傷のフィブロネクチン(黒四角) による、トロンボスポンジン・ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrpへのフィブロネクチン結合の阻害のグラフである。
【図５】図5 は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)によるゼラチンへのフィブロネクチン結合の阻害のグラフである。
【図６Ａ】図6(A)は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1)( ●);GlyGlyTrpSerLysTrp( 配列番号9)又はTrpSerHisTrpSerPro( 配列番号2)によるゼラチンへのフィブロネクチン- 仲介メラノーマ細胞A2058 接着の阻害の棒グラフである。
【図６Ｂ】図6(B)は、本発明に係るペプチドによる固定化フィブロネクチンへのA2058 細胞の直接的接着の阻害の棒グラフである。
【図７Ａ】図7 は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1);GlyGlyTrpSerLysTrp(配列番号9)又はTrpSerHisTrpSerPro( 配列番号2)によるゼラチンへのフィブロネクチン- 仲介癌腫細胞MDA4355 接着の阻害の棒グラフである。
【図７Ｂ】図7(B)は、本発明に係るペプチドによるフィブロネクチンへのMDA435s 細胞の直接的接着の阻害の棒グラフである。
【図８】図8 は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp( 配列番号1);GlyGlyTrpSerLysTrp(配列番号9);TrpSerHisTrpSerPro(配列番号2)又はGlyArgGlyAspSer(配列番号16) による生来の1 型コラーゲンへの胸癌腫細胞MDA435s のフィブロネクチン- 仲介物質接着の阻害の棒グラフである。
【図９】図9 は、ペプチド( 配列番号1)によるゼラチナーゼ活性の阻害の棒グラフである。
【図１】
2006028195.tif 000004
【図２Ａ】
2006028195.tif 000005
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
2006028195.tif 000014
【図９】
2006028195.tif 000015
【配列表】
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