(57)【要約】【課題】  複数種のプローブを用いた大量解析に対応可能かつ簡便、迅速な塩基配列決定等を可能とする核酸配列解析方法と装置の提供。【解決手段】  各標的核酸に対し標的核酸の少なくとも一部に対する完全及び／又は不完全マッチプローブからなるプローブ群を準備し、複数種の標的核酸を含む試料と各プローブ群とを適宜の条件で接触させ、ハイブリッド体シグナル強度を該完全及び／又は不完全マッチプローブに各々対応して測定し、完全マッチプローブ対応の第一シグナルデータ、並びに／又は不完全マッチプローブ対応の第二シグナルデータを取得し、各プローブ群の第一及び／又は第二シグナルデータから、プローブ群に関連づけられた最適反応条件でのデータを第一及び／又は第二試験データとして抽出し、第一及び／又は第二試験データにフィルタリング処理を行い、試料核酸における標的核酸の配列を判定し、全種標的核酸の判定結果を統合する核酸配列解析方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種の標的核酸の配列を解析する方法であって、
各標的核酸に対して、該標的核酸の少なくとも一部に対して完全に相補的な完全マッチプローブ、及び／又は該完全マッチプローブと１塩基以上が異なる不完全マッチプローブからなるプローブ群を準備するステップ（１）、
複数種の標的核酸を含む試料と、各プローブ群とを、各標的核酸が各プローブ群とハイブリダイゼーションするのに適した反応条件で接触させ、得られたハイブリッド体に由来するシグナル強度を、該完全マッチプローブ及び／又は該不完全マッチプローブに各々対応させて測定するステップ（２）、
各プローブ群について、全反応条件において、前記完全マッチプローブの塩基配列、前記反応条件、及び前記シグナル強度を要素として含む第一シグナルデータ、並びに／又は、前記不完全マッチプローブの塩基配列、該反応条件、及び前記シグナル強度を要素として含む第二シグナルデータを取得するステップ（３）、
各プローブ群に対応する前記第一シグナルデータ及び／又は前記第二シグナルデータから、該プローブ群に関連づけられた最適反応条件におけるデータを、第一試験データ及び／又は第二試験データとして各々抽出するステップ（４）、
各プローブ群について、該第一試験データ及び／又は該第二試験データに対してフィルタリング処理を行い、前記試料核酸における標的核酸の配列を判定するステップ（５）、
及び、全種標的核酸の前記判定の結果を統合するステップ（６）を有することを特徴とする核酸配列解析方法。
【請求項２】
前記フィルタリング処理において、前記第一試験データの絶対シグナル強度に基づく閾値を設定することを特徴とする請求項１に記載の核酸配列解析方法。
【請求項３】
前記フィルタリング処理において、前記第一及び／又は第二試験データの絶対シグナル強度、前記第二試験データに対する前記第一試験データの相対シグナル強度、並びに、前記第一試験データと前記第二試験データのシグナル強度順位から選ばれる１種以上に基づく閾値を設定することを特徴とする請求項１に記載の核酸配列解析方法。
【請求項４】
前記フィルタリング処理において、前記第二試験データの絶対シグナル強度；前記第二試験データ中の最強度の絶対シグナル強度の、前記第二試験データ中の最強度の絶対シグナル強度以外の絶対シグナル強度、に対する相対シグナル強度；及び、前記第二試験データのシグナル強度順位から選ばれる１種以上に基づく閾値を設定することを特徴とする請求項１に記載の核酸配列解析方法。
【請求項５】
前記ステップ（１）において、全種標的核酸に対応する前記プローブ群が一の担体表面に配置されたアレイを準備し、
前記ステップ（２）において、反応条件あたり少なくとも一の前記アレイで前記接触を行い、シグナル強度の測定を、各アレイにおけるエンドポイントアッセイによって行う請求項１ないし４のいずれかに記載の核酸配列解析方法。
【請求項６】
前記ステップ（１）において、全種標的核酸に対応する前記プローブ群が一の担体表面に配置されたアレイを準備し、
前記ステップ（２）において、一のアレイ上で複数の反応条件における前記接触を行うカイネティックアッセイを行い、前記ステップ（３）において、データ取得をカイネティックに行うことを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の核酸配列解析方法。
【請求項７】
前記ステップ（２）において、一定反応条件下で一定シグナル強度を示す標準物質を前記条件に供し、該標準物質のシグナル強度値を基準として、前記ハイブリッド体に由来するシグナル強度を補正する請求項１ないし６のいずれかに記載の核酸配列解析方法。
【請求項８】
前記標準物質が、予め蛍光標識され担体表面に固相化された核酸であることを特徴とする請求項７に記載の核酸配列解析方法。
【請求項９】
一塩基多型（ＳＮＰ）の判定用であることを特徴とする請求項１ないし８に記載の核酸配列解析方法。
【請求項１０】
複数種の標的核酸の配列を解析する装置であって、
複数種の標的核酸を含む試料と、該標的核酸の少なくとも一部に対して完全に相補的な完全マッチプローブ及び／又は該完全マッチプローブと１塩基以上が異なる不完全マッチプローブからなるプローブ群とを、各標的核酸が各プローブ群とハイブリダイゼーションするのに適した反応条件で接触させて得られたハイブリッド体に由来するシグナル強度を、該完全マッチプローブ及び／又は該不完全マッチプローブに各々対応させて測定する測定手段、
各プローブ群について、全反応条件において、前記完全マッチプローブの塩基配列、前記反応条件、及び前記シグナル強度を要素として含む第一シグナルデータ、並びに／又は、前記不完全マッチプローブの塩基配列、該反応条件、及び前記シグナル強度を要素として含む第二シグナルデータを取得するデータ取得手段、
各プローブ群に対応する前記第一シグナルデータ及び／又は前記第二シグナルデータから、該プローブ群に関連づけられた最適反応条件におけるデータを、第一試験データ及び／又は第二試験データとして各々抽出する抽出手段、
各プローブ群について、該第一試験データ及び／又は該第二試験データに対してフィルタリング処理を行い、前記試料核酸における標的核酸の配列を判定する判定手段、
及び、全種標的核酸の前記判定の結果を統合する統合手段を有することを特徴とする核酸配列解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の配列を解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、オリゴヌクレオチドプローブと、検体ＤＮＡ等の試料核酸との相補性に着目して、ＤＮＡアレイを利用した配列決定（シーケンシング）、遺伝子発現解析、変異解析などの核酸配列解析が行われている。
例えば、ＤＮＡアレイを利用して検体ＤＮＡの塩基配列を決定する方法として、シーケンシング・バイ・ハイブリダイゼーション（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  ＳＢＨ）法が知られている（特許文献１）。ＳＢＨ法は、プローブとして、ある長さのオリゴヌクレオチドを構成する場合の、ヌクレオチドの可能な組合せ配列の全てを網羅するような全オリゴヌクレオチドを基板上に並べ、検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応によって形成される完全に相補的なハイブリッド体を選択的に検出することで、検体ＤＮＡの塩基配列を決定するものである。
【０００３】
また例えば、ＤＮＡアレイを利用して検体ＤＮＡにおける特定の標的塩基配列の有無を判定する遺伝子の配列解析、および、遺伝子の量を解析する発現解析が知られている。この配列解析や発現解析は、検出しようとする標的塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるプローブを基板上に並べ、検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応によって形成されるハイブリッド体を選択的に検出することで、検体ＤＮＡにおける標的塩基配列の有無を判定するものである。
【０００４】
オリゴヌクレオチドプローブと検体ＤＮＡの相補性を調べる場合、一般に、検出しようとする標的塩基配列、あるいは配列決定しようとする核酸領域長さに応じて設定されるプローブの種類ごとに、ハイブリダイズ反応の最適条件は異なる。
したがって、検体ＤＮＡにおける標的配列の存在量などによって、各プローブと検体ＤＮＡの相補鎖形成におけるＴｍ値が変動し、温度条件によってはハイブリダイズしない場合がある。このため、最適なハイブリダイズ反応条件を設定する必要がある。
【０００５】
したがって、従来、ＤＮＡアレイを利用した核酸配列解析においては、互いに同じプローブを並べた複数のアレイを各種の反応条件に置いて、ハイブリッド体シグナル結果を得て、得られた結果をアレイ別に一つずつ解析していた。
また、ＳＢＨのアッセイと、遺伝子発現解析とを同一サンプルについて行う場合、複数のマイクロアレイを準備して各々別個の条件で反応させ、アレイごとの解析値を用いて評価していた。
【０００６】
ところで、一般にオリゴヌクレオチドプローブと検体ＤＮＡの相補性を調べる場合には、ひとつの塩基配列について１種類のプローブのみでハイブリッド形成の有無を判定することは非常に難しい。理由の一つとして、ハイブリッドの安定性自体がそれぞれの配列に依存して変動するものであることが挙げられる。また特定の測定結果が得られれば完全に相補的なハイブリッドが形成されていると判断できるような「測定値の絶対値」というものが存在しないためでもある。
そこで、完全マッチのハイブリッド体と、完全マッチのものより幾分強度が弱くなる１塩基のミスマッチを含むハイブリッド体のシグナル強度を比較して判定する方法が開発されている（非特許文献１）。この方法では、まず、１５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドのプローブ配列の中心部分に１塩基ミスマッチを配した１塩基ミスマッチプローブを用意する。ついで、完全マッチプローブと１塩基ミスマッチプローブのそれぞれが検体ＤＮＡとの間で形成するハイブリッドからのシグナル強度を測定・比較し、完全マッチプローブに対応するシグナル強度の方が１塩基ミスマッチプローブに対応するシグナル強度よりも大きいときに、その完全マッチプローブに相補的な配列が検体ＤＮＡ中に存在すると判定している。
【特許文献１】米国特許第５２０２２３１号明細書
【特許文献２】欧州特許第０８３４５７６Ｂ１号明細書
【非特許文献１】チーら（Ｃｈｅｅ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．）、「サイエンス」（”Ｓｃｉｅｎｃｅ”）、（米国）、１９９６年、２７４巻、ｐｐ．６１０‐６１４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、従来は、複数の反応条件に置かれた複数のアレイを用いて得られたハイブリッド形成結果を、アレイごとの解析値として評価していた。ここで、標的配列の有無や特定領域の配列構成について何らかの判定結果を得るには、複数の反応条件の結果を考え合わせて、各プローブに応じた最適ハイブリッド条件における結果を人間が用手法で抽出し、最終判定を下す必要があった。このように、種々のハイブリダイズ反応条件で得られた結果を一つずつ解析して考え合わせることは、非常に煩雑であった。
また、こうした複合的なアレイの結果を用いて、標的配列の有無や特定領域の配列構成について明確な最終判定を下す方法はなかった。
【０００８】
さらに、上記の煩雑さは、大量解析等の要望に伴って、近年いっそう増大している。例えば、複数のＳＢＨプローブ群を用いたり、多数の標的塩基配列に対応するプローブを用いることによって、シグナル取得の情報量がさらに増えている。また、反応の高速化によって、解析はさらに複雑になっている。また、カイネティックにマイクロアレイでの反応を行うマイクロアレイシステムなどの登場により、シグナル取得の情報量がさらに増え、用手法による結果の判定は時間が非常にかかっている。
【０００９】
さらに、ハイブリッド形成の有無の判定の信頼性向上を図るために、完全マッチプローブ及びミスマッチプローブを利用する方法を適用する場合にも、結果の判定は非常に煩雑となる。理由の一つは、ハイブリダイズ反応条件の設定が特に複雑となることである。これは、完全マッチのハイブリッド体のシグナル強度と、１塩基ミスマッチのハイブリッド体のシグナル強度との違いを、適正に検出できるような条件、例えば温度や塩濃度などの反応条件が、解析しようとする核酸配列によって様々に異なるためである。
【００１０】
本発明はこのような問題点に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、複数の反応条件におけるプローブと試料核酸とのハイブリダイゼーション結果を利用して、複数種類のプローブを用いた大量解析に対応可能であり、かつ簡便、迅速な塩基配列決定ないし標的塩基配列の存否判定を可能ならしめる核酸配列解析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
かかる課題を解決するため、請求項１記載の発明は、複数種の標的核酸の配列を解析する方法であって、
各標的核酸に対して、該標的核酸の少なくとも一部に対して完全に相補的な完全マッチプローブ及び／又は該完全マッチプローブと１塩基以上が異なる不完全マッチプローブからなるプローブ群を準備するステップ（１）、
複数種の標的核酸を含む試料と、各プローブ群とを、各標的核酸が各プローブ群とハイブリダイゼーションするのに適した反応条件で接触させ、得られたハイブリッド体に由来するシグナル強度を、該完全マッチプローブ及び／又は該不完全マッチプローブに各々対応させて測定するステップ（２）、
各プローブ群について、全反応条件において、前記完全マッチプローブの塩基配列、前記反応条件、及び前記シグナル強度を要素として含む第一シグナルデータ、並びに／又は、前記不完全マッチプローブの塩基配列、該反応条件、及び前記シグナル強度を要素として含む第二シグナルデータを取得するステップ（３）、
各プローブ群に対応する前記第一シグナルデータ及び／又は前記第二シグナルデータから、該プローブ群に関連づけられた最適反応条件におけるデータを、第一試験データ及び／又は第二試験データとして各々抽出するステップ（４）、
各プローブ群について、該第一試験データ及び／又は該第二試験データに対してフィルタリング処理を行い、前記試料核酸における標的核酸の配列を判定するステップ（５）、
及び、全種標的核酸の前記判定の結果を統合するステップ（６）を有することを特徴とする核酸配列解析方法である。
請求項２記載の発明は、前記フィルタリング処理において、前記第一試験データの絶対シグナル強度に基づく閾値を設定することを特徴とする請求項１に記載の核酸配列解析方法である。
請求項３記載の発明は、前記フィルタリング処理において、前記第一及び／又は第二試験データの絶対シグナル強度、前記第二試験データに対する前記第一試験データの相対シグナル強度、並びに、前記第一試験データと前記第二試験データのシグナル強度順位から選ばれる１種以上に基づく閾値を設定することを特徴とする請求項１に記載の核酸配列解析方法である。
請求項４記載の発明は、前記フィルタリング処理において、前記第二試験データの絶対シグナル強度；前記第二試験データ中の最強度の絶対シグナル強度の、前記第二試験データ中の最強度の絶対シグナル強度以外の絶対シグナル強度、に対する相対シグナル強度；及び、前記第二試験データのシグナル強度順位から選ばれる１種以上に基づく閾値を設定することを特徴とする請求項１に記載の核酸配列解析方法である。
請求項５記載の発明は、前記ステップ（１）において、全種標的核酸に対応する前記プローブ群が一の担体表面に配置されたアレイを準備し、
前記ステップ（２）において、反応条件あたり少なくとも一の前記アレイで前記接触を行い、シグナル強度の測定を、各アレイにおけるエンドポイントアッセイによって行う請求項１ないし４に記載の核酸配列解析方法である。
請求項６記載の発明は、前記ステップ（１）において、全種標的核酸に対応する前記プローブ群が一の担体表面に配置されたアレイを準備し、
前記ステップ（２）において、一のアレイ上で複数の反応条件における前記接触を行うカイネティックアッセイを行い、前記ステップ（３）において、データ取得をカイネティックに行うことを特徴とする請求項１ないし５に記載の核酸配列解析方法である。
請求項７記載の発明は、前記ステップ（２）において、一定反応条件下で一定シグナル強度を示す標準物質を前記条件に供し、該標準物質のシグナル強度値を基準として、前記ハイブリッド体に由来するシグナル強度を補正する請求項１ないし６のいずれかに記載の核酸配列解析方法である。
請求項８記載の発明は、前記標準物質が、予め蛍光標識され担体表面に固相化された核酸であることを特徴とする請求項７に記載の核酸配列解析方法である。
請求項９記載の発明は、一塩基多型（ＳＮＰ）の判定用であることを特徴とする請求項１ないし８に記載の核酸配列解析方法である。
請求項１０記載の発明は、複数種の標的核酸の配列を解析する装置であって、
複数種の標的核酸を含む試料と、該標的核酸の少なくとも一部に対して完全に相補的な完全マッチプローブ及び／又は該完全マッチプローブと１塩基以上が異なる不完全マッチプローブからなるプローブ群とを、各標的核酸が各プローブ群とハイブリダイゼーションするのに適した反応条件で接触させて得られたハイブリッド体に由来するシグナル強度を、該完全マッチプローブ及び／又は該不完全マッチプローブに各々対応させて測定する測定手段、
各プローブ群について、全反応条件において、前記完全マッチプローブの塩基配列、前記反応条件、及び前記シグナル強度を要素として含む第一シグナルデータ、並びに／又は、前記不完全マッチプローブの塩基配列、該反応条件、及び前記シグナル強度を要素として含む第二シグナルデータを取得するデータ取得手段、
各プローブ群に対応する前記第一シグナルデータ及び／又は前記第二シグナルデータから、該プローブ群に関連づけられた最適反応条件におけるデータを、第一試験データ及び第二試験データとして各々抽出する抽出手段、
各プローブ群について、該第一試験データ及び／又は該第二試験データに対してフィルタリング処理を行い、前記試料核酸における標的核酸の配列を判定する判定手段、
及び、全種標的核酸の前記判定の結果を統合する統合手段を有することを特徴とする核酸配列解析装置である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の核酸配列解析方法によれば、複数の反応条件におけるプローブと試料核酸とのハイブリダイゼーション結果を利用して、複数種類のプローブを用いた大量解析に対応可能であり、かつ簡便、迅速な塩基配列決定ないし標的塩基配列の存否判定を可能とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本願明細書においては、以下の用語を以下に定義した意味において用いる。
「核酸」とは、ＤＮＡ、人工的ヌクレオチドを含むＤＮＡ、ＲＮＡ、及び人工的ヌクレオチドを含むＲＮＡ、ＰＮＡ、人工ヌクレオチドを含むＰＮＡの何れをも意味する。
「ハイブリッド」とは、上記の核酸の何れかの間に形成される二重鎖を意味する。
「シグナル」とは、適当な手段により適宜検出・測定可能な信号であって、蛍光、放射能、化学発光等が含まれる。
「標的核酸」とは、本発明の方法により塩基配列の有無、ないし遺伝子型を特定しようとする核酸領域のことをいう。
また、プローブの種類とは、プローブの塩基配列の別をいう。
「プローブ群」とは、ある標的核酸の少なくとも一部に対応する完全マッチプローブ、不完全マッチプローブ、又は完全マッチプローブと不完全マッチプローブの組み合わせを意味する。
【００１４】
本発明の核酸配列解析方法は、複数種の標的核酸の配列を解析する方法であって、
各標的核酸に対して、該標的核酸の少なくとも一部に対して完全に相補的な完全マッチプローブ、及び／又は該完全マッチプローブと１塩基以上が異なる不完全マッチプローブからなるプローブ群を準備するステップ（１）、
複数種の標的核酸を含む試料と、各プローブ群とを、各標的核酸が各プローブ群とハイブリダイゼーションするのに適した反応条件で接触させ、得られたハイブリッド体に由来するシグナル強度を、該完全マッチプローブ及び／又は該不完全マッチプローブに各々対応させて測定するステップ（２）、
各プローブ群について、全反応条件において、前記完全マッチプローブの塩基配列、前記反応条件、及び前記シグナル強度を要素として含む第一シグナルデータ、並びに／又は、前記不完全マッチプローブの塩基配列、該反応条件、及び前記シグナル強度を要素として含む第二シグナルデータを取得するステップ（３）、
各プローブ群に対応する前記第一シグナルデータ及び／又は前記第二シグナルデータから、該プローブ群に関連づけられた最適反応条件におけるデータを、第一試験データ及び／又は第二試験データとして各々抽出するステップ（４）、
各プローブ群について、該第一試験データ及び／又は該第二試験データに対してフィルタリング処理を行い、前記試料核酸における標的核酸の配列を判定するステップ（５）、
及び、全種標的核酸の前記判定の結果を統合するステップ（６）を有する。
【００１５】
・ステップ（１）
本発明の方法では、まず、各標的核酸に対して、該標的核酸の少なくとも一部に対して完全に相補的な完全マッチプローブ及び／又は該完全マッチプローブと１塩基以上が異なる不完全マッチプローブとからなるプローブ群を準備するステップ（１）を行う。
（プローブ群）
本発明に用いられるプローブ群は、完全マッチプローブ及び／又は不完全マッチプローブからなる。前記完全マッチプローブは、各標的核酸に対して、該標的核酸の少なくとも一部に対して完全に相補的な塩基配列を有するものであればよい。不完全マッチプローブは、該完全マッチプローブと１塩基以上が異なるものであればよい。本発明においては、完全マッチプローブのみを含む場合でもよく、不完全マッチプローブのみを含む場合でもよく、また、完全マッチプローブと不完全マッチプローブとの双方を１のプローブ群に含む場合でもよい。このとき、プローブ群に複数種類の不完全マッチプローブが含まれていても構わない。
ここで、前記完全マッチプローブを、当該標的核酸の既知の正常型又は変異型塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列を有するものとすれば、本発明によって標的遺伝子の発現解析を行うことができる。
本発明によって１塩基多型（ＳＮＰ）や変異解析における塩基のタイピングを行うことができる。さらに、１のプローブ群に、完全マッチプローブと１塩基以上の置換の関係にある複数種類の不完全マッチプローブを含ませれば、近傍（例えば、数塩基対（ｂｐ）以内）に存在している複数箇所のＳＮＰや変異のタイピングを行うことができる。
【００１６】
・ステップ（２）
前記ステップ（１）の後、複数種の標的核酸を含む試料と、各プローブ群とを、各標的核酸が各プローブ群とハイブリダイゼーションするのに適した反応条件で接触させ、得られたハイブリッド体に由来するシグナル強度を、該完全マッチプローブ及び／又は該不完全マッチプローブに各々対応させて測定するステップ（２）を行う。
ステップ（２）は、例えば、以下の方式で行うことができる。
すなわち、前記ステップ（１）において、全種標的核酸に対応する前記プローブ群を一の担体表面に配置するが、プローブ群ごと、さらには完全マッチプローブと不完全マッチプローブとを別個のプローブスポットに固相化したアレイと、試料を緩衝液に溶解させたハイブリダイズ溶液とを準備する。まず、このアレイの表面に、このハイブリダイズ溶液を接触させる。ついで、好ましくはアレイ表面を洗浄してハイブリッド体を形成していない核酸を除去する。その後、プローブスポットごとに、ハイブリッド体に由来するシグナルを検出し、その強度を測定する。
（試料）
本発明の方法で複数種の標的核酸の配列を解析される試料は、上記「核酸」として定義される物質を含めば特に限定されず、検体等から抽出されたものであっても、さらに増幅処理等が施されたものであってもよい。後述のシグナル強度を測定する手段として、試料に予め標識処理を施しておくことができる。
（反応条件）
ステップ（２）では、各標的核酸が各完全マッチプローブ又は各不完全マッチプローブとハイブリダイゼーションするのに適した反応条件を用いる。反応条件の要素としては、上記ハイブリダイゼーション溶液における試料濃度、塩濃度、溶媒の種類；ハイブリダイゼーション温度；上記マイクロアレイと上記ハイブリダイゼーション溶液との接触時間、接触回数；洗浄の方式等が例示される。本発明において、一定反応条件とは、あらかじめ定められた反応条件のことであり、上述した種々の条件について、所望の一定値でもよいし、変更を含む所定の条件であってもよい。例えば温度であれば、「条件」というとき所望の一定温度も含まれるし、温度を変更することも含まれる。
【００１７】
（シグナル強度測定）
ステップ（２）におけるシグナル強度測定は、例えば、上記に例示したような、全種標的核酸に対応する前記プローブ群が一の担体表面に配置されたアレイを用意し、反応条件あたり少なくとも一のアレイで試料とプローブ群との接触を行い、各アレイにおいて、ある一時点におけるハイブリダイゼーションシグナル（ハイブリッド体に由来するシグナル）を測定するエンドポイントアッセイによって行うことができる。
また、一のアレイ上で複数の反応条件における接触を行うような、いわゆるカイネティックアッセイを行い、ステップ（３）において、データ取得をカイネティックに行うことも可能である。
従来は、エンドポイントのアッセイ結果を解析する場合に、各アッセイごとにアレイを用意し、その都度の結果をまとめて、解析を行っていて、体系的な解析方法が構築されていなかった。これに対し、大量解析を図るために、例えば特願２００２―０１７２７２に記載の、カイネティックな解析方法が提案されている。この方法は、反応条件あるいは検出条件を各プローブ毎に適した条件となるように変更しながら、マイクロアレイでのハイブリダイズ反応およびシグナルのデータ取得をカイネティックに行う方法である。このように反応条件等の変更およびデータ取得をカイネティックに行って大量解析を図る場合には、さらに扱う情報量が増えるので、従来の用手法による結果の判定は時間が非常にかかっていた。これに対し、本発明によれば、エンドポイントアッセイであっても、カイネティックな方式であっても、ハイブリダイズ結果を利用して最終判定を下すまでの煩雑さは解消され、カイネティックな方式を採用してその利点を発揮させることが容易となる。
【００１８】
また、ステップ（２）において、一定反応条件下で一定シグナル強度を示す標準物質を試料と同様の反応条件に供し、該標準物質のシグナル強度値を基準として、前記ハイブリッド体に由来するシグナル強度を補正することが好ましい。ここで、前記標準物質を、予め蛍光標識され担体表面に固相化された核酸とし、試料核酸に該蛍光標識を予め施しておき、ステップ（２）に供することが好ましい。
【００１９】
・ステップ（３）
ステップ（２）の後、各プローブ群について、全反応条件において、前記完全マッチプローブの塩基配列、前記反応条件、及び前記シグナル強度を要素として含む第一シグナルデータ、並びに／又は、前記不完全マッチプローブの塩基配列、該反応条件、及び前記シグナル強度を要素として含む第二シグナルデータを取得するステップ（３）を行う。
ステップ（３）で取得したデータを、ステップ（４）での抽出に供すべく、そのまま抽出手段等へ伝送してもよいし、取得したデータを、データベース等の記憶手段にいったん格納してもよい。
【００２０】
・ステップ（４）
ステップ（３）の後、各プローブ群に対応する前記第一シグナルデータ及び／又は前記第二シグナルデータから、該プローブ群に関連づけられた最適反応条件におけるデータを、第一試験データ及び／又は第二試験データとして各々抽出するステップ（４）を行う。
（最適反応条件）
前記最適反応条件は、予めプローブ群に関連づけられている。このことは、複数反応条件におけるハイブリダイゼーション結果から、核酸配列解析の回ごとに、なおかつプローブ群ごとに、最適反応条件の結果を判別して採用する手間が軽減され、解析の簡便・迅速性に貢献するものである。
ここで、プローブ群に関連づける最適反応条件とは、プローブ群が完全マッチプローブのみの場合、完全マッチプローブと標的核酸がハイブリダイゼーションするための最適条件である。プローブ群が完全マッチプローブと不完全マッチプローブとの組み合わせである場合、当該最適反応条件下で上記ステップ（２）を行った際に、プローブと試料との完全マッチハイブリッド体が形成された場合のシグナル強度と、不完全（ミスマッチ含有）ハイブリッド体が形成された場合のシグナル強度との差を判別することが容易か否かを基準として決定する。プローブ群が不完全マッチプローブのみの場合、各不完全マッチプローブと標的核酸との不完全（ミスマッチ含有）ハイブリッド体が形成されたときの、最強度のシグナル強度と二番目以降の強度のシグナル強度の差を判別することが容易か否かを基準として決定する。
（第一、第二試験データ）
以下、一のプローブ群を構成する完全マッチプローブ及び不完全マッチプローブに各々対応する第一試験データ及び第二試験データを、併せて「試験データ」と称する場合がある。
【００２１】
・ステップ（５）
ステップ（４）の後、各プローブ群について、該第一試験データ及び／又は該第二試験データに対してフィルタリング処理を行い、前記試料核酸における標的核酸の配列を判定するステップ（５）を行う。
（フィルタリング処理）
フィルタリング処理においては、プローブ群が完全マッチプローブのみの場合、第一試験データの絶対シグナル強度に基づく閾値を設定することが好ましい。具体的には、例えば、シグナル強度として蛍光強度を用いる場合、パーフェクトマッチとして認めるためには、蛍光強度１００以上、等を閾値として設定することが好ましい。
また、プローブ群が完全マッチプローブと不完全マッチプローブとの組み合わせである場合、前記第一及び／又は第二試験データの絶対シグナル強度、前記第二試験データに対する前記第一試験データの相対シグナル強度、並びに、前記第一試験データと前記第二試験データのシグナル強度順位、から選ばれる１種以上に基づく閾値を設定することが好ましい。このうち、絶対シグナル強度、相対シグナル強度及びシグナル強度順位の３種に基づいて閾値を設定することが、判定の確度を向上させる点で好ましい。より具体的には、例えば、シグナル強度として蛍光強度を用いる場合、パーフェクトマッチとして認めるためには、蛍光強度１００以上、蛍光強度順位が１位であること、第二試験データに対する第一試験データの相対シグナル強度が１．３倍以上であること、等を閾値として設定することが好ましい。
また、プローブ群が不完全マッチプローブのみの場合、各不完全マッチプローブと標的核酸との不完全（ミスマッチ含有）ハイブリッド体が形成されたときの、最強度の絶対シグナル強度及び／又は二番目以降の絶対シグナル強度；二番目以降の絶対シグナル強度に対する最強度の絶対シグナル強度の相対値；各シグナル強度の順位、から選ばれる１種以上に基づく閾値を設定することが好ましい。このうち、これら３種に基づいて閾値を設定することが、判定の確度を向上させる点で好ましい。
【００２２】
・ステップ（６）
ステップ（５）の後、全種標的核酸の前記判定の結果を統合するステップ（６）を行う。このことにより、人は非常に少ない操作数で、考察に必要な最終判定結果のみを得ることができる。
【００２３】
以上説明した本発明の核酸配列解析方法により、複数の標的核酸の配列を、簡便かつ迅速に解析することができる。ここで、統合結果を演算装置に出力させることで、試料核酸における遺伝子型、塩基配列等についての最終判定を容易に得ることができる。このことにより、複数種類のプローブを用いた解析を容易かつ迅速にすることができる。
しかも、一括して解析する標的核酸数の増加、サンプル数の増加等の大量解析の要望や、解析内容の多様化、いわゆるカイネティックアッセイの適用等の解析の高度化に対し、容易に対応することができる。
【００２４】
以下、図１を参照して、本発明の核酸配列解析方法の一実施態様を、プローブ群として完全マッチプローブと不完全マッチプローブの組み合わせを用いた場合について説明する。
この態様は、試料核酸について、複数種の標的核酸Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの配列を解析する例である。
まず、標的核酸Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの各々少なくとも一部に対して完全に相補的な完全マッチプローブと、該完全マッチプローブと１塩基以上が異なる不完全マッチプローブとからなるプローブ群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅを、それぞれ準備する。
この例では、標的核酸Ａ〜Ｅに対応するプローブ群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅを、１枚の担体表面に配置したマイクロアレイを準備する。ここで、プローブ群どうし、さらに各プローブ群を構成する完全マッチプローブと、不完全マッチプローブとは、各々別個のプローブスポットに固相化されている。
【００２５】
次いで、標的核酸Ａ〜Ｅを含み、標識処理済みの試料（試料核酸）を、上記のようにプローブ群Ａ〜Ｅが固相化されたマイクロアレイ表面に、いずれかの標的核酸とプローブ群とがハイブリダイゼーションしやすいような反応条件１〜３において接触させ、形成されたハイブリッド体に由来するシグナル（例えば上記標識処理に特異的な蛍光シグナル）を、プローブスポットごとに測定し、数値化する。
その後、演算装置によって行われる以下の工程に移行する。
反応条件１〜３の各々に対応して、プローブ群Ａ〜Ｅについて、完全マッチプローブの塩基配列、反応条件、及びシグナル強度を要素として含む第一シグナルデータ、並びに、不完全マッチプローブの塩基配列、該反応条件、及び前記シグナル強度を要素として含む第二シグナルデータをそれぞれ取得し、この反応条件１〜３に対応するデータ群１〜３としてデータベースに登録する。
【００２６】
この例では、プローブ群Ａ、Ｄに対して、反応条件１が、最適反応条件としてあらかじめ関連づけられている。また、プローブ群Ｃに反応条件２が、プローブ群Ｂ、Ｅに反応条件３が、それぞれ最適反応条件として、あらかじめ関連づけられている。
上記関連づけにしたがい、データベースに登録されたデータ群１〜３のうち、反応条件１に対応するデータ群１から、プローブ群Ａ、Ｄに対応する第一及び第二シグナルデータをそれぞれ抽出し、これらをプローブ群Ａ、Ｄの試験データとする。同様に、データ群２から、プローブ群Ｃに対応する第一及び第二シグナルデータを抽出し、これをプローブ群Ｃの試験データとする。また、データ群３から、プローブ群Ｂ、Ｅに対応する第一及び第二シグナルデータをそれぞれ抽出し、これらをプローブ群Ｂ、Ｅの試験データとする。
【００２７】
この例では、完全マッチプローブ又は不完全マッチプローブと試料核酸との完全ハイブリッド形成あり（パーフェクトマッチ）又はなし（ミスマッチ）を判定する判定フィルタＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅが、プローブ群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅにそれぞれ対応して設定されている。
上記で抽出された、プローブ群Ａ〜Ｅの試験データ、即ち第一試験データ及び第二試験データの組に対して、上記判定フィルタによるフィルタリング処理を行い、試料核酸における標的核酸Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの核酸配列を判定する。
例えば、プローブ群Ａを構成する完全マッチプローブが既知の正常遺伝子型に対応しており、この完全マッチプローブと試料核酸とのパーフェクトマッチという判定結果が得られた場合、試料核酸において、標的核酸Ａは正常遺伝子型であることが判明する（「標的核酸Ａの判定」。）。
以上のように、プローブ群Ａ〜Ｅに対応する試験データのフィルタリング処理で得られた、標的核酸Ａ〜Ｅの判定結果を統合する。この例では、演算装置により、統合結果を出力する。
【００２８】
以上示した態様により、標的核酸Ａ〜Ｅの配列を、簡便かつ迅速に解析することができる。ここで、統合結果を演算装置に出力させることで、試料核酸における遺伝子型、塩基配列等についての最終判定を容易に得ることができる。
【００２９】
本発明の核酸配列解析装置は、複数種の標的核酸の配列を解析する装置であって、
複数種の標的核酸を含む試料と、該標的核酸の少なくとも一部に対して完全に相補的な完全マッチプローブ及び／又は該完全マッチプローブと１塩基以上が異なる不完全マッチプローブからなるプローブ群とを、各標的核酸が各完全マッチプローブ又は各プローブ群とハイブリダイゼーションするのに適した反応条件で接触させて得られたハイブリッド体に由来するシグナル強度を、該完全マッチプローブ及び／又は該不完全マッチプローブに各々対応させて測定する測定手段、
各プローブ群について、全反応条件において、前記完全マッチプローブの塩基配列、前記反応条件、及び前記シグナル強度を要素として含む第一シグナルデータ、並びに／又は、前記不完全マッチプローブの塩基配列、該反応条件、及び前記シグナル強度を要素として含む第二シグナルデータを取得するデータ取得手段、
各プローブ群に対応する前記第一シグナルデータ及び／又は前記第二シグナルデータから、該プローブ群に関連づけられた最適反応条件におけるデータを、第一試験データ及び／又は第二試験データとして各々抽出する抽出手段、
各プローブ群について、該第一試験データ及び／又は該第二試験データに対してフィルタリング処理を行い、前記試料核酸における標的核酸の配列を判定する判定手段、
及び、全種標的核酸の前記判定の結果を統合する統合手段を有する。
以下、図２を参照して、本発明の核酸配列解析装置の一実施態様をプローブ群として完全マッチプローブと不完全マッチプローブの組み合わせを用いた場合について説明する。
この例は、前記完全マッチプローブ、前記不完全マッチプローブにそれぞれ対応するシグナル強度を、第一シグナルデータ及び第二シグナルデータにそれぞれ変換する変換部と前記第一及び第二試験データを抽出する抽出部と、前記判定を行う判定部と、判定結果を統合する統合部とを有し、変換部と抽出部との間にデータを格納する記憶部をさらに有する例である。
【００３０】
本発明の核酸配列解析方法および核酸配列解析装置は、多種のプローブを用いて同時に解析を行う場合に特に有効であり、解析対処のプローブのシグナル強度の差が小さい場合でも、信頼性の高い解析を行うことができる。本発明を適用するとき、プローブの種類が２０種類以上であれば効果が顕著であり、１００種類以上であれば特に顕著な効果を発揮する。
【実施例】
【００３１】
本願発明に基づいて行った、ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）の  ｇｒｌＡ、ｇｒｌＢ、及びｇｙｒＡ、ｍｅｃＡを同時に検査する実験を行ったときのソフトウエアによる解析方法について説明する。
ＭＲＳＡについて、ｇｙｒＡのコドン８８、コドン８４、コドン８５部位、ｇｒｌＡのコドン４７、コドン７９、コドン８０、コドン８４、ｇｒｌＢのコドン４５１の点突然変異の有無と、ｍｅｃＡの配列の有無の決定を、以下の方法を用いて行った。
【００３２】
＜Ａ．ブドウ球菌のＤＮＡ抽出＞  
−８０℃で凍結保存してあるＭＲＳＡ株を、ブレイン・ハートインフュージョン培地（日水製薬（株）製）で１０時間培養し、この培養液１ｍｌを、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、２．５Ｋ×ｇ、４℃で５分間遠心して得られた沈殿をＤＮＡ抽出キットＩＳＯＰＬＡＮＴ（日本ジーン製）にて抽出処理し、ＤＮＡ溶液を得た。
すなわち、前記沈殿にＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを３００μｌ添加し、１〜２秒間遠心した。さらに、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩを１５０μｌ添加し、６秒間遠心した。これを、５０℃で１５分間インキュベートし、次いで、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩを１５０μｌ添加し２秒間遠心し、氷上で１５分静置した。これを、１２Ｋ×ｇ、４℃で１５分間遠心し、水相分を除去し、２．５倍量のエタノールを添加し、混合した。さらに、１２Ｋ×ｇ、４℃で１０分間遠心を行い、沈殿を得た。この沈殿を７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、１００μｌのＴＥ（ｐＨ８．０）に溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
【００３３】
＜Ｂ．マルチプレックスＰＣＲ＞  
上記のように調整したＤＮＡ溶液をテンプレートに用いて、マルチプレックスＰＣＲを行った。「Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＯＬＩＧＯ  ｖｅｒ．６」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ製）を用い、下記に示す配列番号で表される各プライマーを加えたマルチプレックスＰＣＲが可能なように設計した。
ｇｒｌＡ及びｇｒｌＢ（１４５７ｂｐ）：配列番号１／  配列番号２
ｇｙｒＡ（１２５５ｂｐ）：配列番号３／配列番号４
ｍｅｃＡ（１６３ｂｐ）：配列番号４３／配列番号４４
マルチプレックスＰＣＲには、「Ｅｘ  Ｔａｑ」（ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付のＢｕｆｆｅｒ、２００μＭｄＮＴＰ、２．５Ｕ  ＥＸ  Ｔａｑ、および、１００ｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ、０．５μＭずつの上記の６種類のＦＩＴＣ標識プライマーを用いて反応液を調整し、９４℃・１ｍｉｎ、５０℃・２ｍｉｎ、７２℃・１ｍｉｎ、４０サイクルのＰＣＲ増幅を行った。
その結果、１４５７ｂｐ（ｇｒｌＡ及びｇｒｌＢは１つの増幅物で得られる）、１２５５ｂｐ（ｇｙｒＡ）、１６３ｂｐ  （ｍｅｃＡ）は、電気泳動でも予想されたサイズの位置に明確なバンドで見られ、ハイブリダイゼーションに十分量の増幅産物が得られた。
【００３４】
＜Ｃ．マイクロアレイの作製＞
３次元型フロースルー構造をもつ多孔質基板から成る「ＰａｍＣｈｉｐ」（登録商標）に、ブドウ球菌のｇｒｌＡにおけるコドン４７の野生型又は突然変異型のうち少なくとも１つを検出することができ、配列番号９〜１２で表されるプローブを各々個別の位置にスポットした。
同様に、コドン７９及びコドン８０については配列番号１７〜２８で表されるプローブ群、コドン８４については配列番号１３〜１６で表されるプローブ群を、また、ｇｒｌＢにおけるコドン４５１については配列番号５〜８で表されるプローブ群、ｇｙｒＡにおけるコドン８８については配列番号２９〜３２で表されるプローブ群、コドン８４又は８５については配列番号３３〜４０で表されるプローブ群、ｍｅｃＡの配列の有無の確認については配列番号４１〜４２で表されるプローブ群をスポットした。
マイクロアレイにおけるそれぞれのプローブのスポット位置を図３に示す。図３は、マイクロアレイを示す平面図であり、各升目はプローブスポットを表している。また、升目の中の数字は、そのプローブスポットに固相化されたプローブに対応する配列番号を示している。
【００３５】
＜Ｄ．最適反応条件の検討＞  
上記ＤＮＡ溶液をマルチプレックスＰＣＲによって増幅反応と蛍光標識して得られたサンプル溶液を熱変性（９５℃・３ｍｉｎ、４℃に急冷）させた後、サンプル溶液３５μｌを１５μｌの２０ｘＳＳＰＥと混合した（終濃度６ｘＳＳＰＥ）。
これを、予め５０℃で２０分間ｐｒｅ−ｈｅａｔ（予熱）し、５０μｌの０．１％界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ２０」）で１サイクルの前洗浄を行ったマイクロアレイのウェルに添加し、一定速度（ポンプ駆動容量５０μｌ：速度２５μｌ  ｓｅｃ−１  ｈｏｌｄ  ５ｓｅｃ）で繰り返し透過させることによりハイブリダイゼーション（５２℃、３０サイクル）を行った。
ハイブリダイゼーション後、５０μｌの６ｘＳＳＰＥで１サイクルの洗浄を行い、洗浄後のシグナルをＣＣＤカメラで２００ｍｓの露光時間で撮像した。続いて、０．５ｘＳＳＰＥで５サイクルの洗浄を行い、２００ｍｓの露光時間で撮像した。
ハイブリダイゼーション反応から画像取得まで、一連の作業工程は、「ＰＡＭマイクロアレイシステムＦＤ１０」（オリンパス株式会社製）によって行った。これらの各画像を、変異画像解析ソフト「ＭＡｎａｌｙｓｉｓ」（オリンパス株式会社製）にて解析した。
【００３６】
各画像（６ｘＳＳＰＥでの解析画像及び０．５ｘＳＳＰＥでの解析画像）ごとに解析した各スポットの蛍光強度値をデータベースに登録した。
【００３７】
図４は、１つのブドウ球菌株（Ｓｔｒａｉｎ１）より抽出したＤＮＡを、上述のマイクロアレイにおいてプローブと反応させた後に取得した画像を解析した時のイメージ図である。すなわち、図４においてマイクロアレイには、配列表に示す各配列番号で表されるプローブが固相化されている。また、図４（ａ）は、６ｘＳＳＰＥにおけるハイブリダイゼーション後の画像を示し、図４（ｂ）は、０．５ｘＳＳＰＥにおけるハイブリダイゼーション後の画像を示している。以下、配列番号ｎで表されるプローブが固相化されたプローブスポットを「プローブスポットｎ」と示す場合がある。
【００３８】
図４（ａ）に示す６ｘＳＳＰＥでの解析画像において、ｇｙｒＡのコドン８４／８５の遺伝子型検出用のプローブスポット３３〜４０に着目すると、複数のプローブスポットにおけるシグナル強度が、明度を互いに区別できない程度に近似していた。また、仮の判定基準とした閾値Ａ（当該スポットの蛍光強度１００以上、順位１位、かつ、順位１位のスポットと、２位とのシグナル強度差３０％以上）からは、いずれのプローブスポットも完全マッチハイブリッド体の形成（パーフェクトマッチ）として認められず、遺伝子型は特定できなかった。
ｇｒｌＢのコドン４５１を解析するプローブスポット群では、６ｘＳＳＰＥでの解析画像においてプローブスポット間で、明確なシグナルとシグナルが認められないプローブスポットとの差異が明確に認められた。このシグナルに対して、仮の判定基準とした閾値Ａ（蛍光強度１００以上、順位１位、１位と２位の強度比差３０％以上）からはパーフェクトマッチとして認められ、このブドウ球菌のｇｒｌＢのコドン４５１の遺伝子型は、配列番号９で表されるプローブに対応することが分かり、遺伝子型が特定できた。同様に、ｇｙｒＡのコドン８８についても、６ｘＳＳＰＥでの解析画像において、プローブスポット間のシグナル強度を区別することができた。また、上記閾値Ａを仮の判定基準として、ｇｙｒＡのコドン８８についても、遺伝子型を特定することができた。
また、図４（ｂ）に示す、０．５ｘＳＳＰＥにおけるハイブリダイゼーション後の解析画像では、ｇｒｌＡのコドン４７、コドン７９／８０、コドン８４、ｇｙｒＡのコドン８４／８５に対応するプローブスポットにおいて、プローブスポット間のシグナル強度が区別可能であった。また、ｇｒｌＡのコドン４７、コドン７９／８０、コドン８４、ｇｙｒＡのコドン８４／８５が閾値Ａによってパーフェクトマッチとして認められる遺伝子型が特定できた。
また、ｍｅｃＡに対応するプローブスポット４１、４２では、６ｘＳＳＰＥの画像でシグナルが観察された。６ｘＳＳＰＥの画像で閾値Ｂ（蛍光強度５００以上）以上のシグナルが存在することにより、ｍｅｃＡの陽性が特定できた。一方、０．５ｘＳＳＰＥの画像では、シグナルが弱く、シグナルが確認されなくなった。これは、０．５ｘＳＳＰＥを用いたときの塩濃度ではＴｍ以上となり、ハイブリダイゼーションを維持できなくなったためと推測される。
【００３９】
以上より、ｇｒｌＢのコドン４５１、ｇｙｒＡのコドン８８、ｍｅｃＡ、ｇｙｒＡのコドン８４／８５、ｇｒｌＡのコドン４７、コドン７９／８０、及びコドン８４という各標的領域を解析するプローブ群ごとに、最適なハイブリダイズ反応条件、撮像条件と閾値条件を各々推定した。
【００４０】
＜実施例１＞
試料核酸と、標的領域検討用のプローブからなるプローブ群とを接触させて得られるハイブリッド体由来のシグナル強度について、プローブの塩基配列、塩濃度等の反応条件、及びシグナル強度を要素として含むプローブデータを、全プローブ群及び全反応条件について取得しデータベースに登録するステップと、プローブ群ごとに、該プローブ群に対応したプローブ群最適反応条件におけるデータを試験データとして抽出するステップと、プローブ群ごとに、該試験データに対してフィルタリング処理を行い、試料核酸の遺伝子型を判定するステップと、全種プローブ群の前記判定の結果を統合するステップとを有するソフトウエアを作成した。
このソフトウエアにおいて、上記検討により決定した最適反応条件と判定フィルタとを、解析しようとするコドンに対応した各プローブ群に関連付けて設定した。解析をより簡便に行うため、データ抽出条件（画像名、スポット位置）、閾値条件、これらの両方の情報を予め設定した。
【００４１】
上記「Ｄ．最適反応条件の検討」と同様の手順で、ブドウ球菌株（Ｓｔｒａｉｎ１）より抽出したＤＮＡを、マイクロアレイにおいてプローブと反応させた後、撮像を行って、各塩濃度条件に対応する画像を取得した。引き続いて、演算装置上で上記ソフトウエアを作動させた。このソフトウエアで、各スポットによって最適な反応条件の判定結果を処理し、両条件の結果を統合させ、各コドンに対応する遺伝子型を出力した。
【００４２】
＜実施例２＞
その他のＭＲＳＡのサンプル（Ｓｔｒａｉｎ２２８）より抽出したＤＮＡについて、実施例１と同様の解析を行ったところ、サンプルではもともとのＤＮＡ量が少なかったため、解析したハイブリッドシグナルデータに関して、通常０．５ｘＳＳＰＥで解析を行うｇｒｌＡのコドン４７プローブのシグナルが弱かったため、閾値からの判定が不可能であった。
そのため、再度、データを抽出する塩濃度条件を変更し、６ｘＳＳＰＥのデータを抽出し、閾値の再設定も行って判定を行い（閾値；蛍光強度８０以上、順位１位、１位と２位の強度比差３０％以上）、遺伝子型を特定することができた。
この場合、コドン４７プローブ部位の解析結果は、通常用いられる０．５ｘＳＳＰＥのデータではなく、６ｘＳＳＰＥのデータを抽出した。また、これらの判定は、自動的にソフトウエア上で行われた。
【００４３】
以上のように、実施例１、２において、サンプルのＤＮＡについて遺伝子型を迅速・簡便に解析することができた。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の核酸解析方法の一実施態様を示すフローチャートである。
【図２】本発明の核酸解析装置の一実施態様を示す概念図である。
【図３】実施例において使用したマイクロアレイを示す平面図である。
【図４】実施例において、ブドウ球菌株（Ｓｔｒａｉｎ１）を、図３のマイクロアレイにおいてプローブと反応させた後のハイブリダイゼーションシグナル結果を示す平面図である。
【図１】
2006006220.tif 000002
【図２】
2006006220.tif 000003
【図３】
2006006220.tif 000004
【図４】
2006006220.tif 000005
【配列表】
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