(57)【要約】【課題】  セサミノールトリグルコシド、セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナンまたは前記リグナンを含む基質材料から効率的にセサミノールを製造する方法を提供すること、および、ゴマ種子、ゴマ種子の一部若しくは全部破砕物、ゴマ油またはゴマ油滓(SOC)中のセサミノールの総含量を増加させること。【解決手段】  セサミノールトリグルコシド、セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナンまたは前記リグナンを含む基質材料を、バチルス属細菌およびエンテロコッカス属細菌の共存下でインキュベーションする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セサミノールトリグルコシド、セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナンまたは前記リグナンを含む基質材料を、バチルス属細菌およびエンテロコッカス属細菌の共存下でインキュベーションすることを含む、セサミノールの製造法。
【請求項２】
セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナンまたは前記リグナンを含む基質材料を、エンテロコッカス属細菌の共存下でインキュベーションすることを含む、セサミノールの製造法。
【請求項３】
バチルス属細菌がバチルス・サブチリスである、請求項１記載のセサミノールの製造法。
【請求項４】
エンテロコッカス属細菌が、エンテロコッカス・ファエシウムである、請求項１〜３のいずれか１項記載のセサミノールの製造法。
【請求項５】
バチルス属細菌および／またはエンテロコッカス属細菌が、リグナンまたは前記リグナンを含む基質材料とのインキュベーションに先立って、セサミノールTG、セサミノールDGおよびセサミノールMGからなる群より選ばれる少なくとも一つのリグナンを含む培地中で前培養される、請求項１〜４のいずれか１項記載のセサミノールの製造法。
【請求項６】
バチルス属細菌および／またはエンテロコッカス属細菌が、リグナンまたは前記リグナンを含む基質材料とのインキュベーションに先立って、５〜70質量％のゴマ油滓（SOC）および／またはゴマ種子粉砕物を含む培地中で前培養される、請求項５記載のセサミノールの製造法。
【請求項７】
セサミノールトリグルコシド、セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナンを含む基質材料を、バチルス属細菌およびエンテロコッカス属細菌の共存下でインキュベーションすることを含む、前記基質材料中の抗酸化性リグナンの総含量を増加させる方法。
【請求項８】
セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナンを含む基質材料を、エンテロコッカス属細菌の共存下でインキュベーションすることを含む、前記基質材料中の抗酸化性リグナンの総含量を増加させる方法。
【請求項９】
基質材料がゴマ種子、ゴマ種子の一部若しくは全部破砕物、ゴマ油およびゴマ油滓(SOC)からなる群より選ばれる、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
バチルス属細菌がバチルス・サブチリスである、請求項７または９項記載の方法。
【請求項１１】
エンテロコッカス属細菌が、エンテロコッカス・ファエシウムである、請求項７〜10のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
バチルス属細菌および／またはエンテロコッカス属細菌が、リグナンまたは前記リグナンを含む基質材料とのインキュベーションに先立って、セサミノールTG、セサミノールDGおよびセサミノールMGからなる群より選ばれる少なくとも一つのリグナンを含む培地中で前培養される、請求項７〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
バチルス属細菌および／またはエンテロコッカス属細菌が、リグナンまたは前記リグナンを含む基質材料とのインキュベーションに先立って、５〜70質量％のゴマ油滓（SOC）および／またはゴマ種子粉砕物を含む培地中で前培養される、請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はセサミノールの製造法に関する。特に、本発明は微生物を用いた発酵法によるセサミノールの製造法に関する。また、本発明はゴマ油滓の利用法およびその付加価値を高めることに関する。
【背景技術】
【０００２】
焙煎ゴマ、生のゴマ種子から得られるゴマ油はいずれも酸化に対して抵抗性を示し酸化に対して安定であることが知られている。この安定性は主として抗酸化性物質、セサモール（Budowski, P.J., Amer. Oil Chem. Soc. 27, 264(1959), Budowski, P., F.G.T. Menezes and F.G. Dollear, J. Amer. Oil Chem. Soc. 27:377 (1959), Budowski, P. and K.S. Markely, Chem. Rev. 48, 125 (1951)、Budowski, P., J. Amer. Oil Chem. Soc. 41, 280 (1964)、Mathur L.B. and K.S. Rilara, J. Amer. Oil Chem. Soc. 30, 447 (1953)）、γ-トコフォロール（Fukuda Y., T. Osawa and M. Namiki, Nippon Shokukhin Kogyo Gakkai-shi 28, 461 (1981)）、セサミノール（図１）およびそのエピマー（Fukuda,Y., M.Nagata, T.Osawa and M. Namiki, J. Amer. Oil Chem. Soc., 63, 1027 (1986)）の存在によるものであると考えられている。
セサミノールはゴマ種子中にごく少量見出され、その配糖体は無味、無臭、無色であり、非常に高い熱安定性を有し食品用の天然抗酸化剤としてセサミンと共に非常に重要な物質であると考えられている（Fukuda,Y., M.Nagata, T.Osawa and M. Namiki, J. Amer. Oil Chem. Soc., 63, 1027 (1986), Fukuda,Y., T.Osawa, M.Namiki and T.Ozaki, Agric. Boil. Chem. 49, 301 (1985)））。Fukudaら(1986)は、セサミノールはゴマ油精製においてブリーチング工程の際に酸触媒によってセサモリンから生成されることを報告している。セサミンはまたこのブリーチング工程においてエピセサミンに異性化する。しかしながら、セサモリンを用いたin vivoの研究により、セサモリンは消化管における吸収の際にセサモールおよびセサモリノールに転換されることが明らかになった（Kang,M.H., Y.Kawai, M.Naito and T.Osawa, J. Nutr. 129, 1885 (1999)）。セサミノールの自然界における存在は限られているため、セサミノールトリグルコシド（図３）のセサミノールへの加水分解は抗酸化剤製造において非常に有用であると考えられてきた。
【０００３】
Fukudaら（1985）は、ゴマ油滓(SOC)のエタノール抽出物をβ-グルコシダーゼで分解してリグナン型抗酸化物質を単離することができたことを報告している。また、Miyaharaら（Miyahara,Y., H.Hibasami, H.Katsuzaki, K.Imai, T.Osawa, K.Ina and T.Komiya, Int. J. Mol. Med. 7, 485 (2001)）はAbsidia corymbiferaで脱脂ゴマ種子を処理することによってセサミノールを単離したことを報告している。また、Ohtsukiら（Ohtsuki,T., J.Akiyama, T.Shimoyama, S.Yazaki, S.Ui, Y.Hirose and A.Mimura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, 2304 (2003)）はBacillus circulansによる醗酵によってゴマ油滓から抗酸化作用のあるセサミノール配糖体の生成が増強されたことを報告している。
一方、配糖体（グルコシド）の加水分解にはβ-グルコシダーゼが有用であると考えられているが、アグリコンにグルコース分子が結合している場合、そのアグリコンに近いグルコース分子を切断するためには特異的なグルコシダーゼが必要であることが知られており、セサミノール配糖体（例えばセサミノールトリグルコシド、セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシド）、特にセサミノールトリグルコシドから効率的にアグリコン、すなわちセサミノールを生成させる方法は報告されていない。
【０００４】
【非特許文献１】Fukuda,Y., M.Nagata, T.Osawa and M. Namiki, J. Amer. Oil Chem. Soc., 63, 1027 (1986)
【非特許文献２】Kang,M.H., Y.Kawai, M.Naito and T.Osawa, J. Nutr. 129, 1885 (1999)
【非特許文献３】Fukuda,Y., T.Osawa, M.Namiki and T.Ozaki, Agric. Boil. Chem. 49, 301 (1985)
【非特許文献４】Miyahara,Y., H.Hibasami, H.Katsuzaki, K.Imai, T.Osawa, K.Ina and T.Komiya, Int. J. Mol. Med. 7, 485 (2001)
【非特許文献５】Ohtsuki,T., J.Akiyama, T.Shimoyama, S.Yazaki, S.Ui, Y.Hirose and A.Mimura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, 2304 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、セサミノールトリグルコシド、セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナンまたは前記リグナンを含む基質材料から効率的にセサミノールを製造する方法を提供することである。
特に、本発明の目的は、セサミノールトリグルコシド、セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナンを含む基質材料が、ゴマ種子、ゴマ種子の一部若しくは全部破砕物、ゴマ油またはゴマ油滓(SOC；sesame oil cake)である、セサミノールを製造する方法を提供することである。
また、本発明の別の目的は、ゴマ種子、ゴマ種子の一部若しくは全部破砕物、ゴマ油またはゴマ油滓(SOC)中の抗酸化性リグナン、特にセサミン、セサミノールの（合計）総含量を増加させることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、バチルス属細菌およびエンテロコッカス属細菌、またはこれらの細菌を含む細菌群とセサミノールトリグルコシドとを共存させてインキュベーションすることにより、セサミノールが生成することを見出した。また、本発明者らは、エンテロコッカス属細菌、またはこれを含む細菌群とセサミノールジグルコシドまたはセサミノールモノグルコシドとを共存させてインキュベーションすることにより、セサミノールが生成することを見出した。
【０００７】
従って、本発明は、セサミノールトリグルコシド、セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナンまたは前記リグナンを含む基質材料を、バチルス属細菌およびエンテロコッカス属細菌の共存下でインキュベーションすることを含む、セサミノールの製造法である。
【０００８】
また、本発明は、セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナンまたは前記リグナンを含む基質材料を、エンテロコッカス属細菌の共存下でインキュベーションすることを含む、セサミノールの製造法でもある。
【０００９】
更に、本発明は、セサミノールトリグルコシド、セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナンを含む基質材料を、バチルス属細菌およびエンテロコッカス属細菌の共存下でインキュベーションすることを含む、前記基質材料中の抗酸化性リグナンの総含量を増加させる方法である。特に、本発明は、セサミノールトリグルコシド、セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナンを含む基質材料を、バチルス属細菌およびエンテロコッカス属細菌の共存下でインキュベーションすることを含む、前記基質材料中の抗酸化性リグナンの総含量を増加させる方方法であって、前記基質材料がゴマ種子、ゴマ種子の一部若しくは全部破砕物、ゴマ油およびゴマ油滓(SOC)からなる群より選ばれる、前記方法でもある。
【００１０】
また、本発明は、セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナンを含む基質材料を、エンテロコッカス属細菌の共存下でインキュベーションすることを含む、前記基質材料中の抗酸化性リグナンの総含量を増加させる方法である。特に本発明は、セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナンを含む基質材料を、エンテロコッカス属細菌の共存下でインキュベーションすることを含む、前記基質材料中の抗酸化性リグナンの総含量を増加させる方法であって、前記基質材料がゴマ種子、ゴマ種子の一部若しくは全部破砕物、ゴマ油およびゴマ油滓(SOC)からなる群より選ばれる、前記方法でもある。
【００１１】
特に、本発明においては、バチルス属細菌がバチルス・サブチリスである。また、特に本発明においては、エンテロコッカス属細菌が、エンテロコッカス・ファエシウムである。
また、本発明は、上述したセサミノールの製造法、および、上述した基質材料中の抗酸化性リグナンの総含量を増加させる方法において、基質材料をバチルス属細菌および／またはエンテロコッカス属細菌の共存下でインキュベーションをするに先立ち、前記細菌をセサミノールトリグルコシド、セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナン存在下で前培養することを更に含む。また、本発明は前培養がゴマ油滓（SOC）および／またはゴマ種子粉砕物を含む培地中で行われる、セサミノールの製造法、および、基質材料中の抗酸化性リグナンの総含量を増加させる方法でもある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、極めて効率的かつ簡便にセサミノールを製造することができる。また、本発明によればセサミンの含量を顕著に減少させずにセサミノールを生成させることができるため、ゴマ種子、ゴマ油製造の際に生ずる脱脂ゴマ残渣すなわちゴマ油滓（SOC）中の抗酸化性リグナンの総含量を増加させることができ、SOCの付加価値を高めることができる。特に、本発明により、通常廃棄物として扱われるSOCからも効率的にセサミノールを製造することができ、かつ前述のように抗酸化性リグナンの総含量を増加させることができるため、資源の有効利用も可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明においては、バチルス属細菌および／またはエンテロコッカス属細菌が使用される。ゴマ種子には、セサミノールトリグルコシド（以下「セサミノールTG」と略すことがある）、セサミノールジグルコシド（以下「セサミノールDG」と略すことがある）、セサミノールモノグルコシ（以下、「セサミノールMG」と略すことがある）が含まれることが知られており、セサミノールTGからの効率的なセサミノール生成には、バチルス属細菌およびエンテロコッカス属細菌のいずれも使用することが好ましい。本発明において好ましいバチルス属細菌には、例えば、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis又はB.subtilisとも記載する)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus、又はB.pumilus)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans、又はB.circulans)が含まれる。本発明の実施において、より好ましいバチルス属細菌は、バチルス・サブチリスまたはバチルス・プミルスであり、特に受領番号FERM AP-20118（独立行政法人産業技術研究所  特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東1-1-1  中央第6）に寄託：受領日2004年７月14日）で特定されるバチルス・サブチリスが好ましい。本発明において好ましいエンテロコッカス属細菌には、例えばエンテロコッカス・ファエシウム(Enterococcus faecium又はE.faeciumとも記載する)が含まれ、最も好ましいエンテロコッカス属細菌は受領番号FERM AP-20119（独立行政法人産業技術研究所  特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東1-1-1  中央第6）に寄託：受領日2004年７月14日）で特定されるエンテロコッカス・ファエシウムである。
【００１４】
本発明の方法においては、基質材料とインキュベーションする際に、上述した微生物に対して顕著に有害でない限り他の微生物が共存していても良い。そのような追加のまたは補足的な微生物は、例えば、上述の微生物の増殖を補助するものであっても、上述の微生物の有する酵素の触媒作用を補助するものであっても、セサミノールTG、セサミノールDG、セサミノールMGの全てまたはいずれかの物質からセサミノールを生成させる作用を有する微生物であってもよく、これらの微生物若しくはその作用に何ら正の影響を与えない微生物であっても良い。追加のまたは補足的な微生物は、セサミノール、セサミノールトリグルコシド、セサミノールジグルコシドおよびセサミノールモノグルコシドを顕著に分解しないことが好ましい。
【００１５】
本発明においては、セサミノールTG、セサミノールDG、セサミノールMGからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナンまたは前記リグナンを含む基質材料がバチルス属細菌およびエンテロコッカス属細菌、またはエンテロコッカス属細菌と共存下でインキュベーションされる。そのような基質材料には、例えば、精製または部分精製したセサミノールMG、セサミノールDGおよびセサミノールTG、およびそれらの組合せ、ゴマ種子、ゴマ種子の全部若しくは一部破砕物および搾油後のゴマ油滓(SOC)、および、これら１以上を含む混合物が含まれる。ゴマ種子は、白ゴマ、黒ゴマ、金ゴマ、茶ゴマ、黄ゴマ、緑ゴマ、紫ゴマのいずれであってもよく、収穫直後の生の種子、乾燥種子、又は、一般に「煎りゴマ」または「焙煎ゴマ」と呼ばれる加熱処理ゴマ種子であってもよい。加熱処理ゴマ種子は、セサミノールMG、セサミノールDG、セサミノールTGおよびセサミンが顕著に熱分解しない条件で加熱された種子であることが好ましい。
【００１６】
本発明において、インキュベーションは、使用するバチルス属細菌および／またはエンテロコッカス属細菌の保持する酵素、特にグルコシダーゼが不活性化しない条件で行われる。より好ましくは、インキュベーションは使用するバチルス属細菌および／またはエンテロコッカス属細菌の生理活性が維持される条件、特に好ましくはこれらの細菌が増殖し得る条件で行われる。インキュベーションは、液体、固体、半固体、流動体、半流動体環境を含む、使用するバチルス属細菌および／またはエンテロコッカス属細菌の保持する酵素、特にβグルコシダーゼが作用する環境で行うことができる。そのような環境であれば、バチルス属細菌および／またはエンテロコッカス属細菌と基質材料とを共存させてインキュベーションすることにより、セサミノールを製造することができる。
例えば、基質材料が高度に乾燥している場合、水、バッファーを含む適切な溶媒、又は培地、を適当量添加し、液体状態、半固体状態、流動体状態、半流動体状態を含む、酵素が作用し得る環境を用意することができる。本発明において、使用するバチルス属細菌および／またはエンテロコッカス属細菌の増殖に適した培地、温度、pHを使用する場合は「インキュベーション」は実質的に細菌の「培養」と同義となる。
【００１７】
本発明においては、基質材料とバチルス属細菌および／またはエンテロコッカス属細菌を共存させてインキュベーションするに先立ち、これらの細菌を前培養することが好ましい。前培養は、セサミノールTG、セサミノールDGおよびセサミノールMGからなる群より選ばれる少なくとも一つのリグナンを含む培地、より好ましくはセサミノールTGおよびセサミノールDGを含む培地またはセサミノールTGおよびセサミノールMGを含む培地、最も好ましくはセサミノールTGおよびセサミノールDGおよびセサミノールMGを含む培地を用いて行う。例えば、５〜70質量％、好ましくは５〜50質量％、特に好ましくは10〜30質量％のSOC（水分含量３〜10％程度）またはゴマ種子粉砕物（これらはその後の処理における基質材料でもある）を含む培地、例えば、前記濃度でSOCおよび／またはゴマ種子を含む水、で前培養を行うことができる。前培養は例えば、30℃〜40℃、好ましくは37℃程度にて、24時間〜72時間程度行うことができる。この条件で72時間培養すると、細菌はほぼプラトーに達している。このような前培養を行うことによって、セサミノール生成の収率を飛躍的に高めることができる。
【００１８】
基質材料と微生物とを共存させる場合の両者の比率は特に制限されないが、例えば、ゴマ種子粉砕物またはSOC（水分含量３％〜10％程度）を使用する場合、基質材料１kgに対して、バチルス属細菌および／またはエンテロコッカス属細菌の培養液（24〜72時間培養した培養液。72時間の培養では、細菌増殖はほぼプラートに達している。好ましくは、培養物１ml中に108〜1010個の細菌を含む）を総量として約5ml〜約30ml、好ましくは約10ml〜約20ml使用し、更に水を加えて全体の水分率を約30%〜95％に調節する。この培養液は、前述のような条件下で前培養したものであることが好ましい。
【００１９】
例えば、基質材料として精製されたサミノールMG、セサミノールDGまたはセサミノールTGを用いる場合は、バチルス属細菌および／またはエンテロコッカス属細菌を上述した量のSOCを含む水中で37℃にて、約24〜約72時間前培養し、続いて前培養物の適当量、例えば1mlの前培養物に１mg〜５mgの精製されたサミノールMG、セサミノールDGまたはセサミノールTGの少なくとも１つを加え、37℃にて、更に例えば24時間以上、好ましくは48時間以上インキュベーションすることによりセサミノールが得られる。一般に収量を上げるためインキュベーションは72時間またはそれ以上まで延長することができる。バチルス属細菌および／またはエンテロコッカス属細菌はセサミノールを代謝しないので、72時間以上インキュベーションすることが特に好ましい。
【００２０】
例えば、基質材料としてゴマ種子を用いる場合は、完全にまたは部分的に粉砕したゴマ種子を適当量の水と混合し、必要に応じて、加熱処理等により滅菌しておく。一方、バチルス属細菌および／またはエンテロコッカス属細菌を上述した量のSOCを含む水中で37℃にて、約24〜約72時間前培養し、続いて前述したように、前培養物の適当量を前述のゴマ種子と共に37℃にて、更に例えば24時間以上、好ましくは48時間以上インキュベーションすることによりセサミノールが得られる。一般に収量を上げるためインキュベーションは72時間またはそれ以上まで延長されるが、バチルス属細菌および／またはエンテロコッカス属細菌によるセサミノールの代謝は行われないので、72時間以上インキュベーションすることが特に好ましい。
基質材料としてゴマ油滓(SOC)を用いる場合も、上述した基質材料としてゴマ種子を用いた場合と同様にしてセサミノールを得ることができる。
また、必要に応じて、適宜サンプルを採取し、エタノール、80％エタノールおよびクロロホルムを含む適切な溶媒により振盪抽出してHPLCなどによりセサミノールの生成状況をモニターすることもできる。このような分析を行うことにより、当業者は基質材料に対する初期菌体量、培養時間、培養温度等をより適切に調整することができるであろう。
【００２１】
本発明の方法に従って、SOC 1gをBacillus subtilisおよびEnterococcus faeciumと共にインキュベーションすると、クロロホルムで抽出した場合は0.3 mg以上、好ましくは0.35 mg以上のセサミノールを得ることができる。100％エタノールで抽出した場合は収率がより高く、80％エタノールで抽出した場合には更に収率が高い。
【００２２】
本発明者らは、精製した、セサミノールTG、セサミノールDGおよびセサミノールMGをそれぞれ用いた実験により、エンテロコッカス・ファエシウムのみによってもセサミノールDG、セサミノールMGはセサミノールに転換されるが、一方エンテロコッカス・ファエシウム単独またはバチルス・サブチリス単独ではセサミノールTGからセサミノールへの転換は行われないか、極めて僅かしか行われないことを示唆するデータを得ている（実施例１）。このことは、アグリコンに結合した糖鎖の完全な切断には特異的なグルコシダーゼまたは特異的なグルコシダーゼの組合せが必要であるという一般的認識と一致する。
一方、本発明者らは、精製セサミノールTGをバチルス・サブチリスおよびエンテロコッカス・ファエシウムと共存させてインキュベーションすると、セサミノールTGは24時間以内にセサミノールDGに転換され、48時間後にはセサミノールMGがかなり出現しており、72時間後には、セサミノールTGは、90％以上、好ましくは95％以上、実質的にほぼ100％セサミノールに転換されることを示すデータも得ている。従って、本発明の方法において、インキュベーションは少なくとも24時間、好ましくは少なくとも48時間、特に好ましくは72時間以上行うことが好ましい。セサミノールおよびセサミンはバチルス・サブチリスおよびエンテロコッカス・ファエシウムのいずれによっても少なくとも120時間まではほとんど分解または代謝されないことが実験的に示されている。従って、72時間より長く、少なくとも120時間まではインキュベーションしてもよい。
【００２３】
セサミノール生成の確認は、インキュベーション中、または終了後のサンプルから適切な溶媒によってセサミノールの抽出後、逆相HPLC等によって行うことができる。適切な溶媒には、クロロホルム、エタノール、80％エタノール（水溶液）、ヘキサン、ヘキサン：酢酸エチル(9:1)、ヘキサン：酢酸エチル（7:3）、酢酸エチルが含まれる。クロロホルム、エタノール、とりわけ70〜80％エタノール（水溶液）、ヘキサン：酢酸エチル混合物がより好ましく、特にエタノール、80％エタノールが好ましい。セサミノールの抽出方法、およびHPLC分析の条件等は当業者には知られたものである（例えば、実施例、およびMiyaharaら、2001、既出、参照）。必要に応じて、少量のサンプルをHPLCにかけ、セサミノール、セサミン、エピセサミンに相当するピークの面積を測定し、各種溶媒についての抽出効率を更に比較することもできる。それによって、当業者はさらに抽出効率の良い溶媒を検討することもできるであろう。
インキュベーション終了後、培地を含む培養物または醗酵物は目的に応じてそのまま使用してもよく、ろ過、クロマトグラフィー等により、セサミノール、セサミン等のリグナン型抗酸化物質を抽出および精製することもできる。精製後の純度はHPLC、薄層クロマトグラフィー、質量分光分析等によって決定することができる。これらのゴマ由来リグナン型抗酸化物質の精製方法も当業者には知られたものである（Fukudaら、1986、既出、Miyaharaら、2001、既出、Ohtsukiら、2003、既出、等）。また、必要に応じて、FTC法、またはTBA法によって得られた物質の抗酸化作用を確認することもできる。
【実施例１】
【００２４】
実施例１．精製セサミノールトリグルコシド（セサミノールTG）からのセサミノールの生成
精製セサミノールTGからのセサミノール生成を調べた。このHPLC分析の結果を図６に示す。これは。これは以下実験における、インキュベーション時間０に相当する。
【００２５】
１）Bacillus subtilis による醗酵
Bacillus subtilisを20％ SOCを蒸留水中に含む培地で37℃にて、72時間前培養し、1.0mlの前培養物を１mgの精製セサミノールTGと共に37℃にて72時間インキュベーションした。72時間後にサンプルを採取し凍結乾燥した。この凍結乾燥サンプルを４mlの80％エタノールで27℃にて振盪抽出した。抽出後サンプルをアドバンテックNo.2フィルターでろ過し、日立HPLCシステムにより分析した。HPLCシステムは以下の通り：
【００２６】
日立Lachrom ＨＰＬＣシステム（UV-可視光検出基装備）
カラム：Wakosil II 5C18HG
流速：0.8ml/分
溶媒A：(v/v)アセトニトリル 10%, TFA 0.1%
溶媒B：(v/v)アセトニトリル 80%, TFA 0.1%
勾配：直線勾配, 0〜100% B、40分間
検出：280 nm
結果を図７に示す。セサミノールに相当するピークは観察されなかった。
【００２７】
２）Enterococcus faeciumによる醗酵
Bacillus subtilisを20％ SOCを蒸留水中に含む培地で37℃にて、72時間前培養し、1.0mlの前培養物を１mgの精製セサミノールTGと共に37℃にて72時間インキュベーションした。72時間後にサンプルを採取し凍結乾燥した。この凍結乾燥サンプルを４mlの80％エタノールで27℃にて振盪抽出した。抽出後サンプルをアドバンテックNo.2フィルターでろ過し、１）と同様に日立HPLCシステムにより分析した。
その結果を図８に示す。セサミノールに相当するピークが観察された。
【００２８】
３）Bacillus subtilisおよびEnterococcus faeciumによる醗酵
Bacillus subtilisおよびEnterococcus faeciumをそれぞれ20％ SOCを蒸留水中に含む培地で37℃にて、72時間前培養し、両方の前培養物各0.5mlを１mgの精製セサミノールTGと共に37℃にて72時間インキュベーションした。24時間ごとにサンプルを採取し凍結乾燥した。この凍結乾燥サンプルを４mlの80％エタノールで27℃にて振盪抽出した。抽出後サンプルをアドバンテックNo.2フィルターでろ過し、１）と同様に日立HPLCシステムにより分析した。
その結果を図９A〜9Cに示す。24時間後にセサミノールに相当するピークが観察され、72時間後にはかなりの量のセサミノールが観察された。
【実施例２】
【００２９】
実施例２．ゴマ種子からのセサミノールの生成
市販の白ゴマ種子（和田萬、大阪、より購入；以下の実験において使用したゴマ種子は全て和田萬より購入した）粉砕物についてのHPLC分析の結果を図10に示した。これは以下実験における、インキュベーション時間０に相当する。
１）Bacillus subtilis による醗酵
３gの細かく粉砕した市販の白ゴマ種子を３mlの水と混合し、121℃、20分間オートクレーブした。Bacillus subtilisを20％ SOCを蒸留水中に含む培地で37℃にて、72時間前培養し、1.5mlの前培養物をオートクレーブしたゴマ種子と共に37℃にて72時間インキュベーションした。72時間後にサンプルを採取し凍結乾燥した。
１gの凍結乾燥品を10mlのクロロホルムで27℃にて振盪抽出した。抽出後サンプルをアドバンテックNo.2フィルターでろ過し、ろ液を4mlに調製し（evaporation ?）、実施例１と同様に日立HPLCシステムで分析した。
分析の結果を図11に示す。セサミノールに相当するピークはほとんど観察されなかった。標準サンプルと比較して生成されたセサミノールを定量したところ、72時間のインキュベーションにより1gのゴマ種子から0.04mgのセサミノールが得られた（クロロホルム抽出による）。
【００３０】
２）Enterococcus faeciumによる醗酵
３gの細かく粉砕した市販の白ゴマ種子を３mlの水と混合し、121℃、20分間オートクレーブした。Bacillus subtilisを20％ SOCを蒸留水中に含む培地で37℃にて、72時間前培養し、1.5mlの前培養物をオートクレーブしたゴマ種子と共に37℃にて72時間インキュベーションした。72時間後にサンプルを採取し、凍結乾燥した。
１gの凍結乾燥品を１）と同様にしてHPLC分析を行った。その結果を図12に示す。セサミノールに相当する小さなピークが観察された。標準サンプルと比較して生成されたセサミノールを定量したところ、72時間のインキュベーションにより１gのゴマ種子から0.16mgのセサミノールが得られた（クロロホルム抽出による）。
【００３１】
３）Bacillus subtilisおよびEnterococcus faeciumによる醗酵
３gの細かく粉砕した市販の白ゴマ種子を３mlの水と混合し、121℃、20分間オートクレーブした。Bacillus subtilisおよびEnterococcus faeciumをそれぞれ20％ SOCを蒸留水中に含む培地で37℃にて、72時間前培養し、両方の培養物各0.75mlを、オートクレーブしたゴマ種子と共に37℃にて72時間インキュベーションした。24時間毎にサンプルを採取し、凍結乾燥した。
１gの凍結乾燥品を１）と同様にしてHPLC分析を行った。その結果を図13A〜Cに示す。24時間後にセサミノールに相当するピークが観察され、72時間後にはかなりの量のセサミノールが観察された。標準サンプルと比較して生成されたセサミノールを定量したところ、72時間のインキュベーションにより１gのゴマ種子から0.4mgのセサミノールが得られた（クロロホルム抽出による）。
【００３２】
以上の結果をまとめたのが下記の表１である。
表１．
2006061115.tif 000002
BS:バチルス・サブチリスのみ、E：エンテロコッカス・ファエシウムのみ、BS＋E：バチルス・サブチリスおよびエンテロコッカス・ファエシウム
【実施例３】
【００３３】
実施例３．ゴマ油滓(SOC)からのセサミノールの生成
市販のSOC（竹本油脂、愛知県、より購入；ゴマ油粕、肥料登録番号＝愛知県1075、N:P:K＝７：2.4：1.0、油分11.9％、水分含量4.1％）；以下の実験に使用したSOCも全て同じ）のHPLC分析結果を図14に示す。これは以下の実験におけるインキュベーション時間０に相当する。
１）１）Bacillus subtilis による醗酵
３gの市販のSOCを３mlの水と混合し、121℃、20分間オートクレーブした。Bacillus subtilisを20％ SOCを蒸留水中に含む培地で37℃にて、72時間前培養し、1.5mlの前培養物をオートクレーブしたゴマ種子と共に37℃にて72時間インキュベーションした。72時間後にサンプルを採取し凍結乾燥した。
１gの凍結乾燥品を実施例１と同様に処理してHPLC分析にかけた。その結果を図15に示す。セサミノールに相当するピークはほとんど観察されなかった。標準サンプルと比較して生成されたセサミノールを定量したところ、72時間のインキュベーションにより１gのSOCから0.04mgのセサミノールが得られた（クロロホルム抽出による）。
【００３４】
２）Enterococcus faeciumによる醗酵
３gの市販のSOCを３mlの水と混合し、121℃、20分間オートクレーブした。Enterococcus faeciumを20％ SOCを蒸留水中に含む培地で37℃にて、72時間前培養し、1.5mlの前培養物をオートクレーブしたゴマ種子と共に37℃にて72時間インキュベーションした。72時間後にサンプルを採取し凍結乾燥した。
１gの凍結乾燥品を実施例２と同様に処理してHPLC分析にかけた。その結果を図16に示す。セサミノールに相当する小さなピークが観察された。標準サンプルと比較して生成されたセサミノールを定量したところ、72時間のインキュベーションにより１gのSOCから0.14mgのセサミノールが得られた（クロロホルム抽出による）。
【００３５】
３）Bacillus subtilisおよびEnterococcus faeciumによる醗酵
３gの市販のSOCを３mlの水と混合し、121℃、20分間オートクレーブした。Bacillus subtilisおよびEnterococcus faeciumをそれぞれ20％ SOCを蒸留水中に含む培地で37℃にて、72時間前培養し、それぞれの培養物各0.75mlをオートクレーブしたゴマ種子と共に37℃にて72時間インキュベーションした。24時間毎にサンプルを採取し、凍結乾燥した。
１gの凍結乾燥品を１）と同様にしてHPLC分析を行った。その結果を図17A〜Cに示す。24時間後にセサミノールに相当するピークが観察され、72時間後にはかなりの量のセサミノールが観察された。標準サンプルと比較して生成されたセサミノールを定量したところ、72時間のインキュベーションにより１gのSOCから0.36mgのセサミノールが得られた（クロロホルム抽出による）。
【００３６】
以上の結果をまとめたのが下記の表２である。
表２．
2006061115.tif 000003
BS:バチルス・サブチリスのみ、E：エンテロコッカス・ファエシウムのみ、BS＋E：バチルス・サブチリスおよびエンテロコッカス・ファエシウム
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】セサミンの化学構造
【図２】セサミノールの化学構造式
【図３】セサミノールトリグルコシドの化学構造式
【図４】セサミノールジグルコシドの化学構造式
【図５】セサミノールモノグルコシドの化学構造式
【図６】精製セサミノールトリグルコシドのHPLC分析結果。
【図７】精製セサミノールトリグルコシドとB.subtilisとを72時間インキュベーションした培養物のHPLC分析結果。
【図８】精製セサミノールトリグルコシドとE.faeciumとを72時間インキュベーションした培養物のHPLC分析結果。
【図９Ａ】精製セサミノールトリグルコシドとB.subtilisおよびE.faeciumとを24時間インキュベーションした培養物のHPLC分析結果。
【図９Ｂ】精製セサミノールトリグルコシドとB.subtilisおよびE.faeciumとを48時間インキュベーションした培養物のHPLC分析結果。
【図９Ｃ】精製セサミノールトリグルコシドとB.subtilisおよびE.faeciumとを72時間インキュベーションした培養物のHPLC分析結果。
【図１０】白ゴマ種子粉砕物のHPLC分析結果
【図１１】白ゴマ種子粉砕物とB.subtilisとを72時間インキュベーションした培養物のHPLC分析結果。
【図１２】白ゴマ種子粉砕物とE.faeciumとを72時間インキュベーションした培養物のHPLC分析結果。
【図１３Ａ】白ゴマ種子粉砕物とB.subtilisおよびE.faeciumとを24時間インキュベーションした培養物のHPLC分析結果。
【図１３Ｂ】白ゴマ種子粉砕物とB.subtilisおよびE.faeciumとを48時間インキュベーションした培養物のHPLC分析結果。
【図１３Ｃ】白ゴマ種子粉砕物とB.subtilisおよびE. faeciumとを72時間インキュベーションした培養物のHPLC分析結果。
【図１４】SOCのHPLC分析結果。
【図１５】SOCとB.subtilisとを72時間インキュベーションした培養物のHPLC分析結果。
【図１６】SOCとE.faeciumとを72時間インキュベーションした培養物のHPLC分析結果。
【図１７Ａ】SOCとB.subtilisおよびE.faeciumとを24時間インキュベーションした培養物のHPLC分析結果。
【図１７Ｂ】SOCとB.subtilisおよびE.faeciumとを48時間インキュベーションした培養物のHPLC分析結果。
【図１７Ｃ】SOCとB.subtilisおよびE.faeciumとを72時間インキュベーションした培養物のHPLC分析結果。
【図１】
2006061115.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2006061115.tif 000008
【図６】
2006061115.tif 000009
【図７】
2006061115.tif 000010
【図８】
2006061115.tif 000011
【図９Ａ】
2006061115.tif 000012
【図９Ｂ】
2006061115.tif 000013
【図９Ｃ】
2006061115.tif 000014
【図１０】
2006061115.tif 000015
【図１１】
2006061115.tif 000016
【図１２】
2006061115.tif 000017
【図１３Ａ】
2006061115.tif 000018
【図１３Ｂ】
2006061115.tif 000019
【図１３Ｃ】
2006061115.tif 000020
【図１４】
2006061115.tif 000021
【図１５】
2006061115.tif 000022
【図１６】
2006061115.tif 000023
【図１７Ａ】
2006061115.tif 000024
【図１７Ｂ】
2006061115.tif 000025
【図１７Ｃ】
2006061115.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月17日(2005.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
２）Enterococcus faeciumによる醗酵
Enterococcus faeciumを20％ SOCを蒸留水中に含む培地で37℃にて、72時間前培養し、1.0mlの前培養物を１mgの精製セサミノールTGと共に37℃にて72時間インキュベーションした。72時間後にサンプルを採取し凍結乾燥した。この凍結乾燥サンプルを４mlの80％エタノールで27℃にて振盪抽出した。抽出後サンプルをアドバンテックNo.2フィルターでろ過し、１）と同様に日立HPLCシステムにより分析した。
その結果を図８に示す。セサミノールに相当するピークが観察された。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
２）Enterococcus faeciumによる醗酵
３gの細かく粉砕した市販の白ゴマ種子を３mlの水と混合し、121℃、20分間オートクレーブした。Enterococcus faeciumを20％ SOCを蒸留水中に含む培地で37℃にて、72時間前培養し、1.5mlの前培養物をオートクレーブしたゴマ種子と共に37℃にて72時間インキュベーションした。72時間後にサンプルを採取し、凍結乾燥した。
１gの凍結乾燥品を１）と同様にしてHPLC分析を行った。その結果を図12に示す。セサミノールに相当する小さなピークが観察された。標準サンプルと比較して生成されたセサミノールを定量したところ、72時間のインキュベーションにより１gのゴマ種子から0.16mgのセサミノールが得られた（クロロホルム抽出による）。