(57)【要約】  【課題】  アメロゲニンを効率良く、大量に生産する。  【解決手段】  アメロゲニンがシスタチンのカルボキシ末端又はアミノ末端と融合してなるアメロゲニン融合タンパク質；当該アメロゲニン融合タンパク質をコードする遺伝子；当該遺伝子を挿入した組換えベクターを宿主細胞に導入し、得られる形質転換体を培養して当該遺伝子を発現させ、宿主細胞又は培養物中に生成蓄積されたタンパク質を採取することを特徴とするアメロゲニン融合タンパク質の製造法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アメロゲニンがシスタチンのカルボキシ末端又はアミノ末端と融合してなるアメロゲニン融合タンパク質。
【請求項２】
アメロゲニンのシスタチンが融合していない末端に、更にグルタチオンＳトランスフェラーゼが融合してなる請求項１記載のアメロゲニン融合タンパク質。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアメロゲニン融合タンパク質。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ特異的プロテアーゼによる切断によりアメロゲニン様活性を示すタンパク質
【請求項４】
アメロゲニンが以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質であり、シスタチンが以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質である請求項１又は２記載のアメロゲニン融合タンパク質。
（ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアメロゲニン様活性を示すタンパク質。
（ｃ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号６で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つシスタチン様活性を示すタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載のアメロゲニン融合タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるアメロゲニン融合タンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ特異的プロテアーゼによる切断によりアメロゲニン様活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項７】
請求項５又は６に記載の遺伝子を挿入した組換えベクターを宿主細胞に導入し、得られる形質転換体を培養して当該遺伝子を発現させ、宿主細胞又は培養物中に生成蓄積されたタンパク質を採取することを特徴とするアメロゲニン融合タンパク質の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アメロゲニン融合タンパク質及びその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯の表面を覆うエナメル質は、成熟状態では約９５％ｗ／ｗがアパタイト結晶で構成されているが、タンパク質と水に富む柔らかい組織であるエナメルマトリックスを前駆体とし、形成される。エナメルマトリックス内に存在するタンパク質は、エナメルマトリックスタンパク質と言われ、一般的に１２０，０００ダルトン未満の分子量を有し、アメロゲニン、非アメロゲニン、プロリンリッチ非アメロゲニン、アメリンおよびタフリンが含まれる。エナメルマトリックスタンパク質には、硬組織すなわちエナメル質の形成作用（特許文献１参照）を始め、硬組織間結合を促進すること（特許文献２及び３参照）や歯周組織内の未分化細胞の分化を促進し、歯周組織を再生する効果があることが報告されている（非特許文献１参照）。
【０００３】
アメロゲニンは、歯牙の形成時期に特異的にエナメル芽細胞から発現する疎水性のタンパク質であるが（非特許文献２参照）、近年、アメロゲニンが歯のセメント質（非特許文献３参照）や歯髄（非特許文献４参照）の再生を促進させることが報告され、このタンパク質が歯科治療の修復材料として期待されている。
【０００４】
アメロゲニン遺伝子は、ヒトのＸ染色体、Ｙ染色体に位置しており、それぞれ７つのエキソンからなる。そして、その遺伝子産物はＲＮＡスプライシングやプロテオリシスなどによって構造上の多様性を有している（図１）  遺伝子工学的手法を用いたアメロゲニンの生産は、これまでに、組換え大腸菌を用いたマウス由来アメロゲニンの発現（非特許文献５参照）及びヒト由来アメロゲニンの発現（非特許文献６参照）が報告されている。しかし、組換え大腸菌でのタンパク質を発現する場合、発現産物は分泌されずに細胞内で不溶性の凝集物として留まり、タンパク質の精製過程に負担がかかる等の問題が指摘されている（非特許文献７参照）。
【特許文献１】米国特許第４，６７２，０３２号明細書
【特許文献２】欧州特許第３３７９６７号明細書
【特許文献３】欧州特許第２６３０８６号明細書
【非特許文献１】「歯周組織再生の向上」石川列訳、クインテッセンス
【非特許文献２】Sakaki, S., & Shiokawa, H., Int. J. Dev. Biol., 39:127,(1995)
【非特許文献３】Hammarstrom, L., J. Clin. Periodontol, 24:358(1997)
【非特許文献４】Goldberg, M., Abstracts of International Meeting of Pulp and Dentin,p.28(2001)
【非特許文献５】Simmer, J.P.,et al., Calcif Tissue Int., 54:312(1994)
【非特許文献６】Deutsch, D., et al.,.Adv. Dent. Res., 10:187(1996)
【非特許文献７】饗場ら、「組換えタンパク質生産法（生物化学実験法45）」，7,(2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、アメロゲニンを効率良く、大量に生産することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、遺伝子工学的手法を用いたアメロゲニンの製造について、種々検討した結果、シスタチンをコードする遺伝子の上流又は下流にアメロゲニンをコードする遺伝子を組込み、これを発現させると、アメロゲニンが可溶性の融合タンパク質として効率よく生産できることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、アメロゲニンがシスタチンのカルボキシ末端又はアミノ末端と融合してなるアメロゲニン融合タンパク質に関するものである。
【０００８】
また本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアメロゲニン融合タンパク質に関するものである。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ特異的プロテアーゼによる切断によりアメロゲニン様活性を示すタンパク質
【０００９】
また本発明は、上記アメロゲニン融合タンパク質をコードする遺伝子に関するものである。
【００１０】
また本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるアメロゲニン融合タンパク質をコードする遺伝子に関するものである。
（ａ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ特異的プロテアーゼによる切断によりアメロゲニン様活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１１】
更に本発明は、上記遺伝子を挿入した組換えベクターを宿主細胞に導入し、得られる形質転換体を培養して当該遺伝子を発現させ、宿主細胞又は培養物中に生成蓄積されたタンパク質を採取することを特徴とするアメロゲニン融合タンパク質の製造法に関するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、セメント質や歯髄の再生促進等の効果を発揮し、口腔衛生用素材としての利用が期待されるアメロゲニンを、可溶性の融合タンパク質として、効率良く製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のアメロゲニン融合タンパク質は、アメロゲニンがシスタチンのカルボキシ末端又はアミノ末端と融合してなるものである。
【００１４】
本発明において、アメロゲニンとは、ヒトをはじめとする哺乳類の形成期エナメル質に含まれている有機成分のひとつであり、プロリン、ロイシン、グルタミン、ヒスチジンに富む特異なアミノ酸組成をもつ疎水性タンパク質を指し、ヒトアメロゲニン、ブタアメロゲニン、マウスアメロゲニン、ウシアメロゲニン等のいずれでもよい。尚、ヒトアメロゲニン遺伝子は、Ｘ染色体及びＹ染色体に位置し、それぞれ７つのエキソンからなり、その遺伝子産物はＲＮＡスプライシングやプロテオリシスなどによって構造上の多様性を有していることが知られているが（図１）、本発明においては、それらのいずれの遺伝子産物であってもよい。
斯かるアメロゲニンの好適な例として、例えば以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質が挙げられる。
（ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアメロゲニン様活性を示すタンパク質。
ここで、配列番号４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号４のアミノ酸配列と等価のアミノ酸配列であり、依然としてアメロゲニンの生理学的活性（アメロゲニン様活性）を示す配列を意味する。好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。アメロゲニンの生理学的活性とは、アパタイト結晶への選択的吸着、アパタイト結晶の成長抑制等の生理活性をいう。
なお、上記のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、公知の部位特異的変異誘発法により実施することができる。
【００１５】
シスタチンとは、システインプロテアーゼ阻害剤の総称であり、その起源や種類に限定されず、ファミリー１（ステフィンファミリー）、ファミリー２（シスタチンファミリー）及びファミリー３（キニノーゲンファミリー）に分類される全てのシスタチンスーパーファミリー並びに、システインプロテアーゼに対する阻害活性を有する特開平７−１２６２９４号公報に記載の新規システインプロテアーゼインヒビター、特表２００１−５１２９６６号公報に記載のＣＳＴＩＮのようなシスタチン様タンパク質が挙げられる。
【００１６】
斯かる、１）ファミリー１としては、ヒトシスタチンＡ、ヒトシスタチンＢ、ラットシスタチンα、ラットシスタチンβ、ヒトｃ−Ha−ras oncogene product−p21、オリザシスタチンＩ、オリザシスタチンＩＩ、コーンシスタチン、ソヤシスタチン等が挙げられ、２）ファミリー２としては、ヒトシスタチンＣ、ヒトシスタチンＳ、ヒトシスタチンＳＮ、ヒトシスタチンＳＡ、ヒトシスタチンＤ、ヒトシスタチンＭ、ヒトロイコシスタチン（シスタチンＦ）、ラットシスタチンＣ、ラットシスタチンＳ、マウスシスタチンＣ、マウスロイコノシスタチン、チキンシスタチン、ウズラシスタチン、ウシ初乳シスタチン、カープシスタチン、タイワンコブラ毒シスタチン、カブトガニシスタチン、チャムサーモンシスタチン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉａシスタチン、サーコシスタチン、マムシ毒シスタチン等が挙げられ、３）ファミリー３としては、ヒト低分子量キニノ−ゲン、ヒト高分子量キニノーゲン、ウシ低分子量キニノーゲン、ウシ高分子量キニノーゲン、ラット低分子量キニノーゲン、ラット高分子量キニノーゲン、ラットＴ−キニノーゲン１、ラットＴ−キニノーゲン２等が挙げられる。このうち、ヒトシスタチンＳ、ヒトシスタチンＳＡが好ましい。
斯かるシスタチンの好適な例として、例えば以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質が挙げられる。
（ｃ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号６で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つシスタチン様活性を示すタンパク質。
ここで、配列番号６で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号６のアミノ酸配列と等価のアミノ酸配列であり、依然としてシスタチン様活性を示す配列を意味する。シスタチン様活性とは、システインプロテアーゼの阻害等の生理活性をいう。
【００１７】
本発明のアメロゲニン融合タンパク質において、アメロゲニンは、シスタチンのカルボキシ末端或いはアミノ末端のいずれ側で結合していてもよいが、好ましくはシスタチンのアミノ末端と結合するのが望ましい。
【００１８】
また、本発明のアメロゲニン融合タンパク質には、融合タンパク質の精製の効率性の点から、更にアメロゲンのシスタチンの結合していない方の末端にグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が融合してなるのが好ましい。グルタチオンＳトランスフェラーゼを融合させることにより、組換え大腸菌で高発現できる、可溶性のタンパク質として発現させることができる、既に確立されているグルタチオンＳトランスフェラーゼのアフィニティ精製技術を利用できる等の利点がある。
【００１９】
本発明のアメロゲニン融合タンパク質としては、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質であるのが好ましい。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ特異的プロテアーゼによる切断によりアメロゲニン様活性を示すタンパク質
【００２０】
ここで、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１のアミノ酸配列と等価のアミノ酸配列であり、特異的プロテアーゼによる切断した場合に依然としてアメロゲニンの生理学的活性（アメロゲニン様活性）を示す配列を意味する。
尚、ここでいう、特異的プロテアーゼとしては、血液凝固因子Xa、レニン、エンテロキナーゼ等のプロテアーゼが挙げられる。
【００２１】
本発明のアメロゲニン融合タンパク質をコードする遺伝子は、上述したアメロゲニンがシスタチンのカルボキシ末端又はアミノ末端と融合してなるアメロゲニン融合タンパク質、或いは配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであればよいが、特に、（ａ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ特異的プロテアーゼによる切断によりアメロゲニン様活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ、からなる遺伝子であるのが好ましい。
【００２２】
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、例えばMolecular cloning - a Laboratory manual 2nd edition (Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５Ｘデンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００２３】
本発明のアメロゲニン融合タンパク質は、本発明のアメロゲニン融合タンパク質をコードするＤＮＡをベクターに挿入して組換えベクターを作製し、それを宿主に挿入して形質転換体を作製し、その形質転換体を培養し、宿主細胞又は培養物中に生成蓄積されたタンパク質を採取することにより、製造することができる。
以下、本発明のアメロゲニン融合タンパク質の製造法を説明する。
（１）アメロゲニン及びシスタチン遺伝子の調製
アメロゲニン及びシスタチンをコードする遺伝子は、公知の方法、例えば Molecular cloning - a Laboratory manual 2nd edition (Sambrookら、1989)に記載の方法、または、公知のポリメラアーゼ・チェイン・リアクション法（Innisら, PCR Protocols, A guide to methods and applications, Academic Press (1990)）などによって生体からの抽出や増幅、あるいは生体から抽出したゲノムＤＮＡから目的とするエキソン部分を増幅し接続することによって構築することができる。あるいは公知のアミノ酸配列に基づき化学的合成等の公知の方法により取得することができる。
アメロゲニン遺伝子としては、例えば配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアメロゲニン様活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられ、シスタチン遺伝子としては、例えば配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は当該塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つシスタチン様活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ストリンジェントな条件とは前記と同様である。
【００２４】
（２）プラスミドベクターの構築
本発明のアメロゲニン融合タンパク質の発現に用いることができるプラスミドベクターとしては、宿主細胞内で複製可能であり、適当な形質転換マーカー遺伝子等をもち、導入した宿主細胞で機能するプロモーターの制御下、シスタチン遺伝子の上流又は下流にアメロゲニン遺伝子を接続した場合にシスタチンと融合した状態でアメロゲニンを発現させることのできるものであれば如何なるものでもよいが、特にグルタチオンＳトランスフェラーゼ遺伝子を持つものが好ましく、また、シスタチン−アメロゲニンｃＤＮＡ挿入のため、適当な制限酵素サイト（例えば、BamH Iサイト、Sal Iサイト等）があることが望ましい。斯かるベクターとしては、例えば大腸菌用発現ベクターであるｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャム）、ｐＧＥＸ−１λＴ（アマシャム）、ｐＧＥＸ−２Ｔ（アマシャム）、ｐＧＥＸ−２ＴＫ（アマシャム）、ｐＧＥＸ−３Ｘ（アマシャム）、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１（アマシャム）、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２（アマシャム）、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３（アマシャム）、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（アマシャム）、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２（アマシャム）、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３（アマシャム）、ｐＧＥＸ−６Ｐ−２（アマシャム）、ｐＧＥＸ−６Ｐ−３（アマシャム）等が挙げられる。
斯かるプラスミドは、例えば、プロモーター配列、タグ配列の下流に本発明のＤＮＡを挿入する方法、例えばカルモジュリン結合ペプチドをコードするＤＮＡの下流に、読み取り枠を揃え、本発明のＤＮＡを挿入する方法等により作製することができる。
【００２５】
プロモーター配列、タグ配列等は、上記ベクターを導入する各々の宿主細胞で機能しうるものであれば特に限定されないが、大腸菌を宿主細胞として用いる場合は、例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、カルモジュリン結合ペプチド、マルトース結合ペプチド、セルロース結合ペプチド、キチン結合ペプチド、Ｈｉｓタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｆｌａｇタグ等が挙げられる。
【００２６】
（３）形質転換体の作製
得られた組換えＤＮＡを用いて、宿主細胞を形質転換することにより、形質転換体を作製する。本発明においてアメロゲニン融合タンパク質を生産するための宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、メガテリウム菌、ブレビス菌、パン酵母、Ｐｈｉｃｈｉａ属酵母等を用いることができるが、大腸菌が好ましい。
尚、形質転換は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、塩化ルビジウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リチウム法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、ウイルス等により行えばよい。
【００２７】
（４）融合タンパク質の採取
以上のようにして得られた形質転換体を適当な培地にて培養し、公知の方法に従って、宿主細胞又は培養物から採取することにより本発明のアメロゲニン融合タンパク質を得ることができる。例えば、培養物を遠心分離、濾過し、菌体を分離した後、菌体内タンパク質を抽出し、精製すればよい。
【００２８】
形質転換体を培養する方法は、その宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。具体的には、例えばＬＢ培地、Ｈ培地、ＳＯＢ培地、ＳＯＣ培地、ＮＺＹＭ培地、Ｍ９培地、２×ＹＴＡ培地が挙げられる。また、培地のｐＨは６．０〜９．０に調節することが適当であり、pHの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行えばよい。培養は、２６〜４２  ℃、好ましくは３０〜３８℃で、４〜１２時間、更に好ましくは５〜８時間行い、必要により通気や攪拌を加えてもよい。また、培養中には必要に応じて、ＩＰＴＧ、ＩＡＡ等を添加してもよい。
【００２９】
発現させた融合タンパク質を単離、精製するためには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。例えば、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、必要に応じて超音波破砕機、フレンチプレス、ガラスビーズ、シリカビーズ等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製することにより得ることができる。
また、得られたアメロゲニン融合タンパク質は、化学的切断、血液凝固因子Xa、レニン、エンテロキナーゼ等により、アメロゲニンのみを切り出すことができる。
【実施例】
【００３０】
１．実験材料及び方法
（１）使用菌株
組換えタンパク質生産用大腸菌宿主として、大腸菌 BL21株（アマシャム）、およびサブクローニング用宿主として大腸菌 HB101株（宝酒造）を使用した。組換え大腸菌用発現ベクターとしてpGEX-6P-1（アマシャム）を使用した。ヒト顎下腺由来のcDNAからクローニングしてきたシスタチンS遺伝子を含むプラスミドとしてpUSA3（Saitoh,E., and Isemura,S., J.Biochem.116,:399,(1994)）を使用した。
【００３１】
（２）遺伝子工学的手法
遺伝子断片の増幅にはポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）法を用いた。PCR法には、Pyrobest DNAポリメラーゼ（宝酒造）を用いて、鋳型DNA5ng、順方向プライマー及び逆方向プライマー各20pmolとして、PCR（変性温度：９４℃-１分、アニール温度：５４℃-０．５分、DNA鎖伸張温度：７２℃−４分を１サイクルとして３０回繰り返す）をDNA Thermal Cycler（パーキン・エルマ社）を用いて行った。増幅された遺伝子断片の塩基配列をABI PRISM3100（アプライドバイオシステム社）により決定し、PCR法による配列のエラーが起こっていないことを確認した。構築した組換えプラスミドの大腸菌BL21株への導入は、Z-Competent E. coliTransformation Kit（ZYMO RESEARCH）を用い、LB（Ap）寒天培地上にて組換え大腸菌を得た。
【００３２】
（３）使用培地、培養条件
組換え大腸菌用の生産培地として、2×YTA培地（トリプトン１．６％、酵母エキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）を使用し、以下の培養条件で行った。すなわち、大型試験管（シード培地、５ｍＬ仕込）にて１５時間培養した前培養液を、５００ｍＬ坂口フラスコ（メイン培地、１００ｍＬ仕込）に１％植菌した。培養温度３７℃、回転数２１０ｒｐｍで３〜４時間培養後、ＩＰＴＧを添加（最終濃度０．１ｍＭ）し２〜３時間培養することによって、融合したタンパク質の発現を誘導した。
【００３３】
（４）組換え菌生産物の抽出、精製
培養後の培養液（１００ｍＬ）を遠心分離し培養上清と菌体を得た。菌体をコンプリート・ミニ１タブレットを加えたＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）  ５ｍＬに懸濁し、室温で２０分間ゆるやかに振盪することにより、菌体内タンパク質を抽出した。遠心分離し得られた上清を菌体抽出物とした。菌体抽出物からの融合タンパク質の精製にはBulk and RediPack GST Purification Modulesを用い、マニュアルに従い行った。
【００３４】
（５）組換え菌生産物の解析
組換え菌生産物中のタンパク質濃度の定量には、プロテインアッセイキットII（バイオラッド）を用い、マニュアルに従い測定した。
SDSポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）はレディゲルJ (分離ゲル濃度15%、バイオラッド)を用い、泳動後のゲルをクイックCBB（関東化学）にてタンパク質染色した。
抗体染色はSDS-PAGEで分離したタンパク質をゲルからPVDFフィルター（ミリポア、Immobilonトランスファー膜）上へ電気的に転写後、一次抗体に組換え大腸菌由来のシスタチンSから調整したマウスポリクローナル抗体（特願２００３−２０４５９９）、二次抗体にHRP標識の抗マウスIg抗体（アマシャム ファルマシア バイオテク社）を用い、ECL Plusウェスタンブロッティング検出システム（アマシャム ファルマシア バイオテク社）によって、シスタチンSの検出を行った。
同様にSDS-PAGEで分離したタンパク質をゲルからPVDFフィルター（ミリポア、Immobilonトランスファー膜）上へ電気的に転写後、一次抗体に青葉らの方法(Aoba, T., et al., Archs. Oral. Biol., 37, 249, (1991))にて調製したウサギポリクローナル抗体、二次抗体にHRP標識の抗ウサギIg抗体（アマシャム ファルマシア バイオテク社）を用い、ECL Plusウェスタンブロッティング検出システム（アマシャム ファルマシア バイオテク社）によって、アメロゲニンの検出を行った。
【００３５】
実施例１  アメロゲニン遺伝子断片の調製
ヒトゲノム上のX連鎖型アメロゲニン遺伝子の中に存在するエキソン2、6、および7を連結させて構築したアメロゲニン遺伝子断片（AMG2-6-7、図1）は以下の手順で調製した。
ヒト胎盤由来のゲノムDNAはSeegeneから購入した。本ゲノムDNAを鋳型として、5’側プライマーAme2u(5’-aaccatcaagaaatgggg-3’（配列番号７）)および3’側プライマーAme2-6d(5’-cgtaaccataggaagggtaaggcatggcaaaagct-3’（配列番号８）)を用いたPCRによりアメロゲニンのエキソン2に相当する遺伝子断片E2（0.06kb）を増幅した。さらにゲノムDNAを鋳型として、5’側プライマーAme2-6u(5’-agcttttgccatgccttacccttcctatggttacg-3’（配列番号９）)および3’側プライマーAme6-7d(5’-ctctcatcttctgatcttttaatccacttcctcccgcttg-3’（配列番号１０）)を用いたPCRによりアメロゲニンのエキソン6に相当する遺伝子断片E6（0.4kb）を増幅した。さらにゲノムDNAを鋳型として、5’側プライマーAme6-7u(5’-caagcgggaggaagtggattaaaagatcagaagatgagag-3’（配列番号１１）)および3’側プライマーAme7d(5’-tgatttttaatgcattttattgtct-3’（配列番号１２）)を用いたPCRによりアメロゲニンのエキソン7に相当する遺伝子断片E7（0.2kb）を増幅した。得られた遺伝子断片E2、E6、E7を鋳型に5’側プライマーAme2u、および3’側プライマーAme7dを用いたPCRにより0.7kbの遺伝子断片を得た。この0.7kb断片の塩基配列をサンガー法により決定しエキソン2、6、および7が読み枠をあわせて融合していることを確認し、遺伝子断片AMG2-6-7を得た。
【００３６】
実施例２  GST、AMG2-6-7およびシスタチンSからなる融合タンパク質の発現
GST、AMG2-6-7およびシスタチンSからなる融合タンパク質（GST-AMG-US）の発現ベクターは以下の手順で行った。AMG2-6-7遺伝子断片を鋳型とし5’側プライマーとしてGSTAMGu（5’-ctgggatccATCGAAGGTCGTatgccttacccttcctatg-3’（配列番号１６） ;下線部はBamH Iサイト、大文字はFactor Xa認識サイトをコードする）および3’側プライマーUSAMd（5’-ggagctcgaatccacttcctcccgc-3’（配列番号１３））を用いたPCRによってAMG2-6-7遺伝子断片、およびBamH Iサイト、Factor Xa切断認識部位（Ile-Gluを含む遺伝子断片AMG（4.7kb）を得た。同様に、pH237-US4を鋳型とし5’側プライマーとしてAMUSu（5’-aagtggattcgagctccaaggagga-3’（配列番号１４））および3’側プライマーUSSld（5’-ccgtcgacactaggcttcttgacacctgg-3’（配列番号１５）;下線部はSal Iサイトをコードする）を用いたPCRによってシスタチン遺伝子のC末端側下流にSalIサイトを付与した遺伝子断片US（4.4kb）を得た。遺伝子断片AMGおよびUSを鋳型とし、5’側プライマーとしてGSTAMGu、および3’側プライマーUSSldを用いたPCRによって、遺伝子断片AMGUS（9.1kb）を得た。この9.1ｋb断片の塩基配列をサンガー法により決定しAMG遺伝子中のカルボキシ末端にシスタチンS遺伝子が読み枠を合わせて融合していることを確認した。AMG2-6-7、またはAMGUSは BamH I およびSal I にて得られた9.1kb断片とプラスミドpGEX-6P-1をBamH I及びSalI処理後、T4DNAリガーゼを用いて結合し、この結合反応物を大腸菌HB101株に導入し、5μg/mLテトラサイクリンを含むLB培地を用いて形質転換体を選択した。組換え大腸菌の保持する組換えプラスミドを常法［D.,M.,Glover, DNA Cloning Volume II,IRL PRESS, Oxford,Washington DC,(1985)］にしたがって調製し、断片の塩基配列をサンガー法により決定しpGEX-6P-1上のGST遺伝子の下流にFactor Xa切断認識部位をはさんでAMG2-6-7遺伝子断片が融合していることを確認し、組換えプラスミドpGEX-AMGUSを得た（図4）。本プラスミドを大腸菌BL21株に導入し、得られた組換え大腸菌を培養し、GST-AMG-USの発現を促した。得られた発現産物について簡易精製後、電気泳動的解析を行ったところ、GST単独の分子量に相当する相当する26kDaのタンパク質バンド以外にも複数のバンドの存在が認められた（図5）、そこで抗シスタチン抗体を用いた抗体染色を試みたところ、強く発色するタンパク質バンドが確認され、その分子量は57kDa付近にあるものと認められた。この値は塩基配列から予想される分子量（57kDa）に相当するものであった。同時に抗アメロゲニン抗体を用いた抗体染色を試みたところ、分子量57kDaに相当するタンパク質バンドの発色が認められた（図6）ことより、構造内にアメロゲニンおよびシスタチンを含む目的の融合タンパク質が生産されているものと考えられた。
【００３７】
参考例１  グルタチオンSトランスフェラーゼとアメロゲニン遺伝子断片からなる融合タンパク質の発現
GSTとAMG2-6-7遺伝子断片からなる融合タンパク質（GST-AMG）を発現する組換えベクターの構築は以下の手順で行った。AMG2-6-7遺伝子断片の増幅には5’側プライマーとしてGSTAMGu（5’-ctgggatccATCGAAGGTCGTatgccttacccttcctatg-3’（配列番号１６） ;下線部はBamH Iサイト、大文字はFactor Xa認識サイトをコードする）を用い、AMG2-6-7遺伝子断片のN末端側上流にBamH Iサイト、およびFactor Xaによる切断認識部位（Ile-Glu-Gly-Arg）を付与した。また、3’側プライマーとしてAMGSld（5’-ccgtcgacactaatccacttcctcccgc-3’（配列番号１７）;下線部はSal Iサイトをコードする）を用い、AMG2-6-7遺伝子断片のC末端側下流にSalIサイトを付与した。得られたAMG2-6-7遺伝子断片（4.4kb）とプラスミドpGEX-6P-1をBamH I及びSal I処理後、T4DNAリガーゼを用いて結合し、この結合反応物を大腸菌HB101株に導入し、5μg/mLテトラサイクリンを含むLB培地を用いて形質転換体を選択した。組換え大腸菌の保持する組換えプラスミドを常法［D.,M.,Glover, DNA Cloning Volume II,IRL PRESS, Oxford,Washington DC,(1985)］にしたがって調製し、断片の塩基配列をサンガー法により決定しpGEX-6P-1上のGST遺伝子の下流にFactor Xa切断認識部位をはさんでAMG2-6-7遺伝子断片が融合していることを確認し、組換えプラスミドpGEX-AMGを得た（図2）。本プラスミドを大腸菌BL21株に導入し、得られた組換え大腸菌を培養し、GST-AMGの発現を促した。得られた発現産物について精製を行い電気泳動的解析を行った。同時にpGEX-6P-1を導入した組換え大腸菌についても培養を行い、単独発現させたGSTについても電気泳動的解析を行いGST-AMGと比較したところ、両者とも分子量26kDaに相当する位置にタンパク質バンドが認められた（図3）。よって、GST-AMGは組換え大腸菌内でプロテアーゼ分解していることが考えられ、分解物がグルタチオンセファロース担体に吸着することからAMGに相当する部分が分解を受けていることが予想された。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ヒトアメロゲニン遺伝子の構造を示す図である。
【図２】ＧＳＴ−ＡＭＧ発現用プラスミドの構築図である。
【図３】ｐＧＥＸ−ＡＭＧ発現産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動図である。
【図４】ＧＳＴ−ＡＭＧ−ＵＳ発現用プラスミドの構築図である。
【図５】ｐＧＥＸ−ＡＭＧＵＳ発現産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動図である。
【図６】ｐＧＥＸ−ＡＭＧＵＳ発現産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動図である（抗アメロゲニン染色）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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