(57)【要約】【課題】本発明の目的は、高、中および低脂溶性値を測定する方法を提供することである。【解決手段】本発明は、a)層を提供する段階、b)層に溶媒Aを含浸させる段階、c)含浸した層に関心対象の溶解した化合物を加える段階、d)溶媒Bを添加する段階、e)分配平衡に達した後、溶媒Bを除去する段階、およびf)少なくとも1つの溶媒相の関心対象の化合物の量を測定する段階を含む、関心対象の化合物の脂溶性を測定する新規な方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、関心対象の化合物の脂溶性を測定する方法：
a)層を提供する段階；
b)層に溶媒Aを含浸させる段階；
c)含浸した層に関心対象の化合物を加える段階；
d)溶媒Bを添加する段階；
e)分配平衡に達した後、溶媒Bを除去する段階；および
f)少なくとも1つの溶媒相の関心対象の化合物の量を測定する段階。
【請求項２】
関心対象の化合物の量が、層にくっついている相において測定される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
層が、疎水性の層である、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
溶媒Aが非極性溶媒であり、溶媒Bが極性溶媒である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
層が、親水性の層である、請求項1または2記載の方法。
【請求項６】
溶媒Aが極性溶媒であり、溶媒Bが非極性溶媒である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
非極性溶媒が、オクタノールである、請求項4または6記載の方法。
【請求項８】
層が、膜である、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
層が、チューブの底に取り付けられている、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
関心対象の化合物の脂溶性を測定するための、溶媒を含浸させた層の使用。
【請求項１１】
溶媒が、脂溶性溶媒である、請求項10記載の使用。
【請求項１２】
脂溶性溶媒が、オクタノールである、請求項11記載の使用。
【請求項１３】
溶媒が、親水性溶媒である、請求項10記載の使用。
【請求項１４】
親水性溶媒が、緩衝液である、請求項13記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高、中および低脂溶性値を測定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
脂溶性は、創薬において、重要な分子特性である。薬物の脂溶性を正確に知ることは、膜透過性、溶解度、分配量、代謝安定性およびタンパク質結合などの薬学的過程との関連にとって有用である。脂溶性は、log P(中性種用オクタノール/水分配係数)またはlog D(荷電分子用オクタノール/水分配係数)によって表される。
【０００３】
通常、脂溶性は、従来の振とうフラスコ方法によって測定される（非特許文献１参照）。手動で実施する場合には、この方法は非常に時間がかかる(1日あたりわずか2〜5の化合物)。しかし、創薬において製造される化合物の数は、急速なアナログ合成およびコンビナトリアルケミストリーにより劇的に増加した。この状況は、化合物の脂溶性を測定する迅速で効率的な方法を必要としている。
【０００４】
さらに、従来技術の方法は、低溶解性化合物に有効でない。2002年以降、基準液における化合物の沈殿または水相における試料の低濃度のためにlog D測定の約35%は失敗している(出典：RODIN およびSPCデータベース、2004年)。一方、特に高脂溶性が必要とされる薬物標的について、log D>4の高スループット測定の必要性がある。
【０００５】
従って、迅速で、低溶解性化合物の脂溶性の測定を可能にする方法の必要性がある。
【０００６】
【非特許文献１】M. M. Abraham、H. S. Chadha、J. P. Dixon、A. J. Leo. Hydrogen bonding. Part 9. The partition of solutes between water and various alcohols. 「Phys. Org. Chem.」 7: 712-716(1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、高、中および低脂溶性値を測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
a)層を提供する段階、
b)層に溶媒Aを含浸させる段階、
c)含浸した層に関心対象の溶解した化合物を加える段階、
d)溶媒Bを添加する段階、
e)分配平衡に達した後、溶媒Bを除去する段階、および
f)少なくとも1つの溶媒相の関心対象の化合物の量を測定する段階
を含む、関心対象の化合物の脂溶性を測定する方法に関する。
【０００９】
好ましくは、関心対象の化合物の量は、層にくっついている溶媒相において測定される。
【００１０】
本発明（１）は、以下の段階を含む、関心対象の化合物の脂溶性を測定する方法である：
a)層を提供する段階；
b)層に溶媒Aを含浸させる段階；
c)含浸した層に関心対象の化合物を加える段階；
d)溶媒Bを添加する段階；
e)分配平衡に達した後、溶媒Bを除去する段階；および
f)少なくとも1つの溶媒相の関心対象の化合物の量を測定する段階。
本発明（２）は、関心対象の化合物の量が、層にくっついている相において測定される、本発明（１）記載の方法である。
本発明（３）は、層が、疎水性の層である、本発明（１）または本発明（２）記載の方法である。
本発明（４）は、溶媒Aが非極性溶媒であり、溶媒Bが極性溶媒である、本発明（３）記載の方法である。
本発明（５）は、層が、親水性の層である、本発明（１）または（２）記載の方法である。
本発明（６）は、溶媒Aが極性溶媒であり、溶媒Bが非極性溶媒である、本発明（５）記載の方法である。
本発明（７）は、非極性溶媒が、オクタノールである、本発明（４）または（６）記載の方法である。
本発明（８）は、層が、膜である、本発明（１）〜（７）のいずれか一項記載の方法である。
本発明（９）は、層が、チューブの底に取り付けられている、本発明（１）〜（８）のいずれか一項記載の方法である。
本発明（１０）は、関心対象の化合物の脂溶性を測定するための、溶媒を含浸させた層の使用である。
本発明（１１）は、溶媒が、脂溶性溶媒である、本発明（１０）記載の使用である。
本発明（１２）は、脂溶性溶媒が、オクタノールである、本発明（１１）記載の使用である。
本発明（１３）は、溶媒が、親水性溶媒である、本発明（１０）記載の使用である。
本発明（１４）は、親水性溶媒が、緩衝液である、本発明（１３）記載の使用である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、a)層を提供する段階、b)層に溶媒Aを含浸させる段階、c)含浸した層に関心対象の溶解した化合物を加える段階、d)溶媒Bを添加する段階、e)分配平衡に達した後、溶媒Bを除去する段階、および、f)少なくとも1つの溶媒相の関心対象の化合物の量を測定する段階を含む、関心対象の化合物の脂溶性を測定する新規方法が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、
a)層を提供する段階、
b)層に溶媒Aを含浸させる段階、
c)含浸した層に関心対象の溶解した化合物を加える段階、
d)溶媒Bを添加する段階、
e)分配平衡に達した後、溶媒Bを除去する段階、および
f)少なくとも1つの溶媒相の関心対象の化合物の量を測定する段階
を含む、関心対象の化合物の脂溶性を測定する方法に関する。
【００１３】
好ましくは、関心対象の化合物の量は、層にくっついている溶媒相において測定される。
【００１４】
関心対象の化合物は、任意の化学的または生物学的化合物であってもよい。関心対象の化合物は、例えば、有機化合物、タンパク質、ペプチドまたは核酸であってもよい。有機化合物は、有-無機分子も含んでもよい。本明細書において使用する用語「有機-無機分子」は、少なくとも1つの無機原子が炭素原子に結合している有機分子をいう。無機原子は、ケイ素(Si)またはゲルマニウムなどのすなわち金属原子であってもよい(有機金属、すなわち、有機分子のSiまたはGeバイオイソエステル)。
【００１５】
関心対象の化合物は、固体または液体であってもよい。関心対象の化合物は、例えば、DMSO(ジメチルスルホキシド)のような好適な溶媒に溶解されてもよい。関心対象の化合物は、脂溶性化合物または親水性化合物であってもよい。親水性化合物の好適な溶媒は、好ましくは、極性溶媒であり、脂溶性化合物の好適な溶媒は、好ましくは、非極性溶媒である。
【００１６】
本明細書において使用する用語「層」は、溶媒の担体をいい、層は完全に溶媒を吸収することができる。用語「完全に吸収される」は、層に加えられる溶媒(すなわち、溶媒A)が層に結合しており、他の相(すなわち、溶媒B)に漏洩することがないことを意味する。
【００１７】
層は中空を有する。これらの中空は、孔、空洞、穴またはスロットであってもよい。中空は、例えば、メッシュを形成する繊維の場合と同様な担体材料によって形成することができる。中空は、例えば、層にイオンを浸透させることによっても形成することができる。好ましくは、層は、透過性である。
【００１８】
層は、例えば、メッシュまたは膜(例えば、Westran Clear Signal膜箔(membrane foil)(Whatman)、Immobilon-P PVDF(Millipore)、PVDF-Plus、Transfer Membrane(Koma Biotech)）であってもよい。好ましくは、層は、膜である。溶媒が非極性である場合には、担体材料は、すなわち、ポリビニルデンフルオリド(PVDF)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、環状オレフィンコポリマー(COC)、ポリプロピレン(PP)またはポリカーボネート(PC)などの疎水性であることが好ましい。溶媒が極性である場合には、担体材料は、すなわち、酢酸セルロース、ガラス繊維、親水性ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)、親水性化したポリカーボネート、および、他の親水性化したフィルター材料などの脂溶性であることが好ましい。
【００１９】
溶媒Aは、非極性溶媒または極性溶媒であってもよい。溶媒Bも、非極性溶媒または極性溶媒であってもよい。溶媒Aは、溶媒Bと混和しない、または、ほとんど混和しない。溶媒Aが非極性溶媒である場合には、溶媒Bは極性溶媒であり、溶媒Aが極性溶媒である場合には、溶媒Bは非極性溶媒である。
【００２０】
本明細書において使用する用語「非極性溶媒」は、疎水性溶媒をいう。非極性溶媒は、例えば、水などの極性溶媒と混和しない、または、ほとんど混和しない。脂溶性化合物は、通常、極性溶媒より非極性溶媒でより溶解する傾向を有する。非極性溶媒の誘電率は、通常、水の誘電率より低い。疎水性溶媒の例は、すなわち、オクタノールまたは脂肪族炭化水素(ドデカン、ヘキサデカンまたはハロゲン化炭化水素)などの有機溶媒である。
【００２１】
本明細書において使用する用語「親水性溶媒」または「極性溶媒」は、電荷が均一に分配しておらず、従って電子的に荷電している分子を有する溶媒をいう。極性溶媒は、非極性溶媒または疎水性溶媒と混和しないまたはほとんど混和しない。極性またはイオン化化合物は、極性溶媒でより溶解する傾向を有する。極性溶媒は、例えば、関心対象のpH範囲内での高い緩衝能力を有する緩衝塩の水溶液(すなわち、pH 7.4で緩衝化したリン酸塩またはTAPSO塩の水溶液)からなってもよい親水性緩衝液であってもよい。関心対象のpHは、pH 0〜14の範囲であってもよく、好ましくは、pHは、約7.4である。
【００２２】
本明細書において使用する用語「分配平衡」は、関心対象の化合物の特定の時間経過後の極性溶媒および非極性溶媒間の分配の平衡をいう。好ましくは、分配平衡は、0.1〜24 hの間に達し、さらに好ましくは、分配平衡は、2時間以内に達する。
【００２３】
層は、層に溶媒を加えることによって含浸することができ、層は溶媒を完全に吸収することができる。溶媒は、すなわち、ディスペンサーによって適用することができる。さらにまた、例えば、フィルター膜であってもよい層の表面に0.1μl〜50μl/cm2の有機調整剤(organic modifier)を分注することができるロボット液体取扱システムといった方法が当技術分野において公知である。
【００２４】
溶媒(溶媒Aまたは溶媒B)中の関心対象の化合物の量は、UVおよび／または質量分光計、キャピラリー電気泳動(CE)および高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)からなる群を含むが、それに限定されるわけではない方法によって測定することができる。
【００２５】
好ましくは、層は、チューブの底に取り付けられる。チューブは、キュベット、ウェルおよびマルチウェルプレートを含むが、それに限定されるわけではない。好ましくは、層が取り付けられるチューブは、参照により全体の内容が本明細書に組み入れられる、欧州特許出願第1232792号に記載されているチューブである。さらに好ましくは、層が取り付けられているチューブは、参照により全体の内容が本明細書に組み入れられる、欧州特許出願第05111522.8号に記載されているチューブである。
【００２６】
層が取り付けられる好ましいキュベットは、上方チャンバー17および下方チャンバー18を有し、上方チャンバー17および下方チャンバー18は、両方のチャンバーの中心を通過する共通の対称軸Y-Yを有する。上方チャンバー17および下方チャンバー18は、各々実質的に円筒形の形状を有する。上方チャンバー17の中心部分の断面は、下方チャンバー18の断面より大きい(図5)。
【００２７】
このキュベットは、開いた下方末端23を有する下方チャンバー18と開いた上方末端24および環状の底壁25を有する上方チャンバー17を有する。この底壁は、上方チャンバー17と下方チャンバー18を接続する中心の円形開口部26を有する(図5)。
【００２８】
底壁25の内側面27は、断面がキュベットの対称軸Y-Yと約80度の角度を形成する円錐面の一部であるので、上方チャンバー17と下方チャンバー18の間に断面の突然の変化がある。
【００２９】
以下の材料は、キュベットを製造するために使用することができる材料の例である：セルロースアセテート、ポリカーボネート、ポリビニリデンフルオリド(PVDF)、ポリスルホン、ポリスチレン、ポリプロピレン(PP)、環状オレフィンコポリマー(COC)。同様の収縮係数(射出成形に関連)および溶融物性を有する材料も、チューブを製造するために使用することができる。
【００３０】
好ましくは、キュベットは、アレイ11の一部である(図4)。アレイ内のキュベットは各々同じ形状および寸法を有し、隣接するキュベットは、シングルウェブ15、16によって互いに接続されている。これらのシングルウェブ15、16は、各々曲線状の形状を有する。
【００３１】
キュベットのアレイ11の一部を形成する全てのキュベット12の対称軸Y-Yは、実質的に、キュベットアレイ11の対称面である同一の面A-Aに存在する。アレイ11の中間キュベット12の上方部分は、第1のシングルウェブ15によって隣接キュベット13に接続され、隣接キュベット13は中間キュベット12の一方の側に存在し、第2のシングルウェブ16によって隣接キュベット14に接続され、隣接キュベット14は中間キュベット12の他方の側に存在する。第1のシングルウェブ15および第2のシングルウェブ16は、対称面A-Aの反対側に存在する。
【００３２】
ウェブ15、16は柔軟なので、射出成形によってキュベットアレイ11を製造するために使用される異なる材料の異なる収縮係数によるキュベットアレイ11の長さの変動にもかかわらず、キュベットホルダーへのキュベットの挿入を容易にする。
【００３３】
キュベットアレイ11のキュベットのいくつかは、キュベットの一体部分であり、キュベットホルダー52にキュベットを離脱可能であるように接続する働きをする外れ止め21および22(図4B)を有する。別の好ましい態様において、キュベットホルダー52は実質的に矩形状であり、キュベットホルダー52のコーナーの1つの外側面に各々位置する4つのセンターリブを有する(図8)。
【００３４】
キュベットアレイ11のキュベットの一部は、キュベットをキュベットホルダーの開口部32に正確に位置決めする働きをする放射状に配向されたリブ19、29(図4B)を有する。
【００３５】
キュベットアレイ11は、層を製造する選択された第2の材料と組み合わせて使用するのに特に好適な、選択された第1のプラスチック材料の射出成形によって製造される。この層は、各キュベットの少なくとも1つの開口部を被覆するためにキュベットアレイの各キュベットに密接に取り付けられるように適合される。
【００３６】
キュベットアレイを製造するための射出成形装置は、好ましくは、異なる収縮係数を有する異なる材料の射出成形が同一の装置で実施できるように構成され、寸法が決められる。
【００３７】
以下の材料は、キュベットアレイ11を製造するために使用することができる材料の例である：セルロースアセテート、ポリカーボネート、ポリビニリデンフルオリド(PVDF)、ポリスルホン、ポリスチレン、ポリプロピレン(PP)。同様の収縮係数(射出成形に関連)および溶融物性を有する材料も、キュベットアレイ11を製造するために使用することができる。
【００３８】
各キュベットへの層の取り付けは、例えば、層とキュベットを接着することによってまたは溶接工程によって実施することができる。個々のキュベット各々に取り付けられた層はこの個々のキュベットだけに取り付けられ、任意の他のキュベットまたは異なるキュベットに取り付けられている箔(foil)と接続しない。
【００３９】
キュベットへの層の取り付けは、確実にこれらの構成要素と媒体密接接続(液密接続)しなければならない。
【００４０】
層が取り付けられるさらに好ましいチューブは、上方チャンバー37および下方チャンバー38および両方のチャンバーの中心を通る共通の対称軸Y-Yを有するキュベットである。上方チャンバー37および下方チャンバー38は、各々実質的に管状形を有する。上方チャンバー37の中心部分の断面は、下方チャンバー38の断面より大きい(図7A)。
【００４１】
下方チャンバー38は、開いた下方末端33を有する。上方チャンバー37は、開いた上方末端34および環状の底壁35を有する。この底壁は、上方チャンバー37と下方チャンバー38を接続する中央の円形開口部46を有する。
【００４２】
底壁45の内側面は、断面がキュベットの対称軸Y-Yと約80度の角度を形成する円錐面の一部であるので、上方チャンバー37と下方チャンバー38の間に断面の突然の変化がある。
【００４３】
キュベットアレイ31は、層を製造する選択された第2の材料と組み合わせて使用するのに特に好適な選択された第1のプラスチック材料の射出成形によって製造される。この層は、キュベットの少なくとも1つの開口部を被覆するためにキュベットアレイの少なくとも1つのキュベットに密接に取り付けられるように適合される。同じプラスチック材料を第1のプラスチック材料および第2のプラスチック材料に使用してもよい。
【００４４】
1つ以上のキュベットへの層の取り付けは、例えば、層と1つ以上のキュベットをのりで接着することによって、または、溶接工程によって実施することができる。個々のキュベットに取り付けられた層はこの個々のキュベットだけに取り付けられ、任意の他のキュベットまたは異なるキュベットに取り付けられている層と接続しない。
【００４５】
キュベットへの層の取り付けは、確実にこれらの構成要素と媒体密接接続(液密および／または気密接続)しなければならない。
【００４６】
アレイ31の全てのキュベットは同じ形状および寸法を有し、隣接キュベットはシングルウェブ35、36によって互いに接続されている。これらのシングルウェブ35、36の各々は、柔軟で、曲線状の形状を有する(図6)。
【００４７】
キュベットアレイ31の一部を形成する全てのキュベット32の対称軸Y-Yは、実質的に、キュベットアレイ31の対称面である同一の面A-Aに存在する。アレイ31の中間キュベット32の上方部分は、第1のシングルウェブ35によって隣接キュベット33に接続され、隣接キュベット33は中間キュベット32の一方の側に存在し、第2のシングルウェブ36によって隣接キュベット34に接続され、隣接キュベット34は中間キュベット32の他方の側に存在する。
【００４８】
シングルウェブ35、36は柔軟なので、射出成形によってキュベットアレイ31を製造するために使用される異なる材料の異なる収縮係数によるキュベットアレイ31の長さの変動にもかかわらず、キュベットホルダー、例えば、キュベットホルダー52へのキュベットの挿入を容易にする。これらのシングルウェブ35、36は、面A-Aの両側のどちらに存在してもよい(図６)。
【００４９】
アレイ31のキュベットの少なくとも2つは、キュベットをキュベットホルダーに離脱可能であるように接続するためのキュベットと一体部分である手段を有する。好ましくは、これらの接続手段は、外れ止め41および42である。好ましい態様において、キュベットホルダーは、実質的に矩形状であり、図8のキュベットホルダー52のようにキュベットホルダーのコーナーの1つの外側面に各々位置する4つのセンターリブを有する。
【００５０】
好ましくは、接続手段を有するキュベットのアレイにおける分配は、公平である。2つのキュベットが接続手段を有する場合には、好ましくは、第1および最後のキュベットが各接続手段を有するか、または、第2および最後から2番目のキュベットが各接続手段を有するか、または、第3および最後から3番目のキュベットが各接続手段を有する等々である。
【００５１】
好ましい態様において、8つのキュベットのアレイでは、第1のキュベット、第3のキュベット、第4のキュベット、第5のキュベット、第6のキュベットおよび第8のキュベットが各接続手段を有する。
【００５２】
図8から理解することができるように、キュベットホルダー52によるキュベットの二次元アレイ51は、上述の特徴を有する少なくとも1つの鎖状キュベットアレイ11、31のキュベット12、32を収容するための開口部54のマトリックスアレイ53を有する。キュベットアレイ11、31のキュベット12、32の各々は、キュベットホルダー52の開口部54の1つにぴったり適合する形状および寸法を有する。
【００５３】
図9に示すように、各々図8を参照して上述した構造を有する2つ以上の二次元キュベットアレイ51および81を互いに積層して、三次元キュベットアレイを形成することができる。このようなアレイの構成要素は、それぞれのホルダーにおける同じ相対的位置を有するキュベットが、対称軸が一致した他方の上方に正確に位置決めされ、キュベットの一方が上方キュベット91の位置を取り、他方のキュベットが下方キュベット92の位置を取るように、構成され、寸法が決められる。好ましい態様において、各上方キュベット91の下方部分の一部は対応する下方キュベット92の上方チャンバー内に存在し、上方キュベット91の下方末端は、下方キュベットの上方チャンバーの底壁から所定の距離にある。
【００５４】
図10に示すように、図8を参照して上述した構造を有する二次元キュベットアレイは、標準的なマルチウェルプレートのための標準的なホルダープレート85に積層することもできる。
【００５５】
本発明の一態様は：
a)疎水性層を提供する段階、
b)層に非極性溶媒を含浸させる段階、
c)含浸した層に関心対象の化合物を加える段階、
d)親水性溶媒を添加する段階、
e)分配平衡に達した後、親水性溶媒を除去する段階、および
f)疎水性の層に存在する脂溶性の溶媒相における関心対象の化合物の量を測定する段階、
を含む、関心対象の脂溶性化合物の脂溶性を測定する方法に関する。
【００５６】
本明細書において使用する用語「疎水性層」は、非極性溶媒の担体をいう。好ましくは、疎水性層は、疎水性膜である。このような膜は、疎水性材料のメッシュとして形成されてもまたは孔を有する層として形成されてもよい。好ましくは、孔サイズまたはメッシュサイズは、0.01〜100μmの範囲内である。疎水性膜担体材料は、PVDF、PTFE、環状オレフィンコポリマー(COC)、PPまたはPCを含むが、それに限定されるわけではない。
【００５７】
関心対象の脂溶性化合物は、例えば、多環式芳香族または脂肪族炭化水素、脂溶性ビタミン、殺菌剤のような疎水性薬物、ハロゲン含有芳香族、または、脂肪族炭化水素、窒素および酸素含有芳香族または脂肪族炭化水素であってもよい。
【００５８】
非極性溶媒は、極性溶媒と混和しない、または、ほとんど混和しない。好ましい非極性溶媒は、オクタノール(オクタン-1-オール)である。好ましい極性溶媒は、水または緩衝液である。
【００５９】
本発明の別の態様は、
a)疎水性層を提供する段階、
b)層に極性溶媒を含浸させる段階、
c)含浸した層に関心対象の化合物を加える段階、
d)非極性溶媒を添加する段階、
e)非極性溶媒を除去する段階、および
f)親水性層に存在する親水性相における関心対象の化合物の量を測定する段階、
を含む関心対象の親水性化合物の脂溶性を測定する方法に関する。
【００６０】
本明細書において使用する用語「親水性層」は、極性溶媒の担体をいう。好ましくは、親水性層は、親水性膜である。このような膜は、親水性材料のメッシュまたは孔を有する層として形成することができる。好ましくは、孔サイズまたはメッシュサイズは、0.01〜100μmの範囲内である。親水性担体材料は、セルロースアセテート、ガラス繊維、親水性ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)、親水性化したポリカーボネートおよび他の親水性化したフィルター材料を含むが、それに限定されるわけではない。
【００６１】
非極性溶媒溶媒は、極性溶媒と混和しない、または、ほとんど混和しない。好ましい非極性溶媒は、オクタノール(オクタン-1-オール)である。好ましい極性溶媒は、水または緩衝液である。
【００６２】
本発明は、さらに、関心対象の化合物の脂溶性を測定するための、溶媒を含浸させた層の使用に関する。
【００６３】
層は、疎水性層、または、親水性層であってもよい。溶媒は、非極性(疎水性)溶媒または極性(親水性)溶媒であってもよい。溶媒が非極性溶媒である場合には、層は、好ましくは、疎水性である。溶媒が極性溶媒である場合には、層は、好ましくは、親水性である。
【００６４】
関心対象の化合物は、任意の化学的または生物学的化合物であってもよい。関心対象の化合物は、例えば、有機化合物、タンパク質、ペプチドまたは核酸であってもよい。有機化合物は、有機-無機分子を含んでもよい。本明細書において使用する用語「有機-無機分子」は、少なくとも1つの無機原子が炭素原子に結合している有機分子をいう。無機原子は、ケイ素(Si)またはゲルマニウムなどのすなわち金属原子であってもよい(有機金属、すなわち、有機分子のSiまたはGeバイオイソエステル)。
【００６５】
関心対象の化合物は、固体または液体であってもよい。関心対象の化合物は、例えば、DMSO(ジメチルスルホキシド)のような好適な溶媒に溶解されてもよい。親水性化合物の好適な溶媒は、好ましくは、極性溶媒であり、脂溶性化合物の好適な溶媒は、好ましくは、非極性溶媒である。
【００６６】
関心対象の化合物は、脂溶性化合物または親水性化合物であってもよい。関心対象の化合物が脂溶性化合物である場合には、層は、非極性溶媒を含浸させた疎水性層であってもよい。好ましくは、非極性溶媒は、オクタノールである。化合物が親水性化合物である場合には、層は極性溶媒を含浸させた親水性層であってもよい。好ましくは、非極性溶媒は、水または緩衝液である。
【００６７】
好ましい態様において、層は、チューブの底に取り付けられる。チューブは、キュベット、ウェルおよびマルチウェルプレートを含むが、それに限定されるわけではない。さらに好ましくは、疎水性層は、参照により全体の内容が本明細書に組み入れられる欧州特許出願第1232792号または同第05111522.8号に記載されているように、チューブに取り付けられる。好ましいチューブは、本明細書の別の箇所に記載した。
【００６８】
以下の材料は、チューブを製造するために使用することができる材料の例である：セルロースアセテート、ポリカーボネート、ポリビニリデンフルオリド(PVDF)、ポリスルホン、ポリスチレン、ポリプロピレン(PP)、環状オレフィンコポリマー(COC)。同様の収縮係数(射出成形に関連)および溶融物性を有する材料もチューブを製造するために使用することができる。
【００６９】
本発明の方法は、高脂溶性値の迅速な測定を可能にする。加えて、1つの化合物を試験するために従来より少ない量の材料を使用するだけでよく、本発明の方法は、標準的な液体取扱ワークステーションを用いて容易に自動化することができる。さらに、沈殿のリスクのある水性の基準液を必要としない。
【００７０】
ここで本発明を一般的に記載したが、同様なことが、具体的な実施例を別添の図面と関連して参照することによってより良く理解される。ここで、具体的な実施例は、例示する目的のためだけに本明細書に含まれ、特に明記しない限り限定する意図のものではない。
【実施例】
【００７１】
実施例において言及されている市販の試薬は、特に示さない限り、製造業者の取扱説明書に従って使用した。
【００７２】
実施例1：
脂溶性実験は、欧州特許出願第1232792号に記載されているように、新規なDIFI-チューブを組み合わせた96-ディープウェルマイクロタイタープレートにおいて実施した。
【００７３】
検証セットの全ての化合物は、10 mMの濃度でジメチルスルホキシドに溶解した(DMSOストック)。
【００７４】
実験は、0,45μmの疎水性PVDF膜(Immobilon-P PVDF(Millipore)およびPVDF-Plus(Whatman, Headquater:27 Great West Road, Brentford, Middlesex, TW8 9BW, UK)を正確にコーティングし、これをDIFI-チューブの底に固定して開始した。
【００７５】
各膜に、1μlオクタノールおよび1μl DMSOストックを正確に含浸させる。
【００７６】
10分間の短時間のインキュベーション後、1600μlの選択した緩衝液(50 mM TAPSO(FLUKA, BioChemika, ArtNo. 93357), pH 7.4)を正確に事前に充填しておいた96-ディープウェルプレートに、コーティングした膜を有するチューブを接続した。得られたサンドイッチ構築物は、膜が緩衝液に完全に浸漬していることを保証している(図2)。
【００７７】
次いで、プレートを密閉し、2時間振とうした。この間に、物質は、適宜、膜、オクタノールおよび緩衝液に分配した。
【００７８】
分配平衡に達したら(2時間後)、膜に依然としてくっついているオクタノール相を分析するために、チューブをディープウェルプレートの上部から慎重に取り外した。
【００７９】
従って、オクタノール相に残存する化合物を溶離液として追加のオクタノールで洗い流した。次いで、溶離液中の物質の濃度を、250〜450 nmの吸光波長のUV分光計によって測定した。
【００８０】
緩衝液とのインキュベーション前の正確な試料濃度を知るために、上述の試料プレートと同じ条件下で基準プレートを作製した。基準プレートは溶離液で直接処理し、オクタノール相の得られた基準濃度をUV分光計で測定した。
【００８１】
評価
脂溶性値log Dは、緩衝液とのインキュベーション後に分析した試料濃度(C0)および分配前の基準濃度(Cref)から算出することができる。
2006267105.tif 000002
【００８２】
全てのUV測定は同じ条件下において実施したという事実により、濃度項は、同じ波長におけるUV吸収値(Abs)によって置き換えた。
2006267105.tif 000003
【００８３】
この等式において、Vwは、オクタノール相の容量V0によって割った水相の容量である。
【００８４】
検証
文献公知のlog D値を有する14の十分に特徴付けられている化学的に種々の薬物セットを使用して本発明の方法を検証した。各化合物について、上述の方法に従って3回の測定を実施した。基準プレートおよび試料プレートの調製は、手動で実施した。
【００８５】
次いで、得られたlog D値(DIFI-log D)を文献の値(Lit. log D)と比較した。表1は、検証の結果を要約する。対応するデータを図3に使用した。
【００８６】
（表１）文献の公知のlog D値(Lot. log D)を用いる14の薬物セットの検証。異なる出展の文献値と新規方法によって得られたデータの比較は本発明の方法を検証している。
2006267105.tif 000004
a)MEDChem01, MEDChem03
b)logPおよびpKaから算出
c)Winiwarter, S., Bonham, N. M., Ax, F., Hallberg, A., Lennernas, H., Karlen, A., J. Med. Chem., 41, 4939-4949(1998)
d)Sirius Technical Application Notes Volume 2(1995)
【００８７】
HTlog Dと比べて、本発明の方法は、高log D値を測定するために極めて低いオクタノール/水比を必要とする。さらなる利点は、試料消費の少なさ、および、オクタノール相の分離の容易さ、ならびに担体固定した非極性溶媒を極性溶媒を有するマルチプルウェルに移すことにあり、分配量、それゆえ、高脂溶性化合物の測定範囲を増加する(表2)。
【００８８】
（表２）HTlog Dと新規な手法との比較
2006267105.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】従来技術の方法の略図である。関心対象の化合物を好適な溶媒に溶解し、親水性緩衝液(H)と共にマルチウェルプレート(W)に添加する。脂溶性溶媒(L)を緩衝液に添加する。プレートを密封し(S)、分配平衡に達するまで、プレートを振とうする。次いで、水相を取り出し、親水性緩衝液中の関心対象の化合物の量を測定する。容量が少ないので、相の分離が困難であり、満足しないことが多い。
【図２】本発明の方法の一態様の略図である。膜(M)をチューブ(T)に取り付ける。膜にオクタノールを含浸させ、関心対象の溶解した化合物を膜に加える。親水性緩衝液(HB)を満たしたプレート(P)にチューブ(T)を挿入し、膜を緩衝液に接触させる。平衡に達したら、チューブをプレートから単純に取り出して、相を分離することができる。
【図３】本発明の方法によって得られるlog Dの線形回帰曲線および文献による値(Lit. log D)を示す図である。文献の値は、MEDChemデータベース(DAYLIGHT Chemical Information Systems Inc, 27401 Los Alto, USAの市販のデータベース)、Winiwarter et al., J. Med. Chem, 41: 4939-49(1998)およびSirius Technical Application Notes Volume 2(1995)に見出された。
【図４】鎖状のキュベットアレイ11を示す図である。A)キュベットアレイの上面図、B)A)のキュベットアレイの平面A-Aの断面。
【図５】図4の鎖状キュベットアレイ11のキュベット12の1つの断面図である。A)層なし、B)層61が取り付けられている。
【図６】鎖状キュベットアレイ31を示す図である。A)キュベットアレイの上面図、B)A)のキュベットアレイの平面A-Aの断面。
【図７】図6の鎖状キュベットアレイ31のキュベット32の1つの断面図である。A)層なし、B)層71が取り付けられている。
【図８】2つの鎖状キュベットアレイ11が挿入されている二次元キュベットアレイ51においてキュベットホルダー52、マトリックスアレイ53およびキュベットの開口部54を有する二次元キュベットアレイ51の上面図である。
【図９】積層された二次元キュベットアレイ51および81の断面図である。
【図１０】標準的な分析マルチウェルプレート85に積層された二次元キュベットアレイ51の断面図である。
【符号の説明】
【００９０】
11  鎖状キュベットアレイ
12  キュベット
13  キュベット
14  キュベット
15  ウェブ
16  ウェブ
17  上方チャンバー
18  下方チャンバー
19  リブ
21  外れ止め
22  外れ止め
23  開いた下方末端
24  開いた上方末端
25  底壁
26  開口部
27  底壁25の内側面
29  リブ
31  アレイ
32  キュベット
33  隣接キュベット
34  隣接キュベット
35  シングルウェブ
36  シングルウェブ
37  上方チャンバー
38  下方チャンバー
41  リブ
42  リブ
43  下方の上方末端
44  開いた上方末端
45  底壁
46  開口部
51  二次元キュベットアレイ
52  キュベットホルダー
53  開口部のマトリックスアレイ
54  (キュベットを収容するための)開口部
61  層
71  層
81  二次元キュベットアレイ
82  キュベットホルダー
83  ホルダープレート
85  標準的なマルチウェルプレートのための標準的なホルダープレート
91  上方キュベット
92  下方キュベット
【図１】
2006267105.tif 000006
【図２】
2006267105.tif 000007
【図３】
2006267105.tif 000008
【図４】
2006267105.tif 000009
【図５】
2006267105.tif 000010
【図６】
2006267105.tif 000011
【図７】
2006267105.tif 000012
【図８】
2006267105.tif 000013
【図９】
2006267105.tif 000014
【図１０】
2006267105.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月25日(2006.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
キュベットアレイ11のキュベットの一部は、キュベットをキュベットホルダーの開口部52に正確に位置決めする働きをする放射状に配向されたリブ19、29(図4B)を有する。