(57)【要約】【課題】  固形ガンその他の血管新生を伴う疾病の治療に利用可能な、低分子のＶＥＧＦ阻害剤を提供することを課題とする。【解決手段】  ＶＥＧＦレセプターＦＬＴの細胞外領域の第１イムノグロブリン様ドメイン及び第２イムノグロブリン様ドメインを含み、かつ第６イムノグロブリン様ドメイン及び第７イムノグロブリン様ドメインを含まないポリペプチドが、ＶＥＧＦ阻害活性を有することを見い出した。【選択図】    図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦに結合してＶＥＧＦの活性を阻害することができる、ＦＬＴの細胞外領域の第１イムノグロブリン様ドメインおよび第２イムノグロブリン様ドメインを含み、かつ第６イムノグロブリン様ドメインおよび第７イムノグロブリン様ドメインを含まないポリペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項５】
請求項１記載のポリペプチドからなる医薬。
【請求項６】
請求項１記載のポリペプチドからなる分析試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生阻害剤として有用なポリペプチド、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幾つかの疾病では、その症状や病因と密接に関連した病理的血管新生を伴うことが知られている。中でも代表的な疾病は固形ガンで、ガン組織が直径１〜２ｍｍを越えて増殖するためには、既存血管から新生血管が延びてガン組織まで到達することが必要であり（J. Folkman, J.Natl. Cancer Inst., 82:4 (1990)）、 また血管がガン組織に到達するとガン組織の増殖が爆発的に加速される。また、糖尿病性網膜症では網膜に病理的血管新生を伴い、それが原因でしばしば失明することがある。更に慢性関節リューマチ、乾癬、血管腫、強皮症、血管新生緑内障などの疾病においても病理的血管新生を伴い、それが主な症状の一つとなっている（J. Folkman, N. Engle. J. Med., 320:1211 (1989)）。従って血管新生を阻害する物質はガンや前述の疾病の治療に利用できる可能性がある。
【０００３】
血管内皮細胞は血管の最も内側の層を形成している細胞である。血管新生は血管内皮細胞が成長因子や生理活性物質または機械的損傷などの刺激を受けて、増殖することによって行われる。直接または間接的に血管内皮細胞の増殖を刺激する成長因子として、ｂＦＧＦ（basic Fibroblast Growth Factor）、ａＦＧＦ（acidic Fibroblast Growth Factor）、ＶＥＧＦ（Vascular Endothelial cell Growth Factor）、ＰＤ−ＥＣＧＦ（Platelet-Derived Endothelial Cell Growth Factor）、ＴＮＦ−α（Tumour Necrosis Factor-α）、ＰＤＧＦ（Platelet Derived Growth Factor）、ＥＧＦ（Epidermal Growth Factor）、ＴＧＦ−α （Transforming Growth Factor-α）、ＴＧＦ−β（Transforming Growth Factor-β）、ＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor）が知られている（L. Diaz-Flores et al., Histol.Histopath., 9:807 (1994)）。特にＶＥＧＦは、血管内皮細胞に極めて特異的に作用する点で他の成長因子と区別できる。言い換えれば、ＶＥＧＦのレセプターは、血管内皮細胞以外ではごく限られた細胞でしか発現していない。
【０００４】
ＶＥＧＦは分子量４万〜４万５千の糖タンパク質で２量体として存在する（P. W. Leung et al., Science 246:1306 (1989)、P. J. Keck et al., Science:246:1319(1989)）。ＶＥＧＦはＶＥＧＦレセプターに結合することによって作用し、細胞の増殖を促進し、また膜透過性を促進する。
【０００５】
ＶＥＧＦとガンとの関係を示唆する以下のような報告がある。多くのガン細胞はＶＥＧＦを分泌する（S. Kondo et al., Bichem. Biophys. Res. Commun., 194:1234(1993)）。ガン組織切片を抗ＶＥＧＦ抗体で染色するとガン組織およびその周辺の新生血管が強く染色される（H. F. Dvorak et al., J. Exp. Med. 174:1275(1991).、L. F. Brown at al., Cancer Res., 53:4727 (1993)）。ＶＥＧＦレセプターの一つが遺伝的に不活化されたマウスでは移植されたガンの増殖が抑制される（B. Millauer et al., Nature, 367:576 (1994)）。抗ＶＥＧＦ中和抗体が担ガンマウスに対して抗腫瘍活性を示す（K. J. Kim et al., Nature, 362:841 (1993)、S. Kondo et al., Bichem. Biophys. Res. Commun., 194:1234(1993)）。以上の事実から、ガン細胞が分泌するＶＥＧＦが腫瘍血管新生において主要な役割を果していると考えられる。
【０００６】
ＶＥＧＦのレセプターは、ヒトではＦＬＴ（M. Shibuya, et al., Oncogene, 5:519 (1990)）とＫＤＲ（B. I. Terman et al., Bichem. Biophys. Res. Commun., 187:1579 (1992)）の２種類が知られている。ＦＬＴの細胞外領域は、図１ に示されるような７つのイムノグロブリン様ドメインからなる構造を有している（C. DeVries et al., Science, 255:989 (1992)）。ＦＬＴに関しては、可溶性型レセプターのｃＤＮＡがクローニングされている（R. L. Kendal and K. A. Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90:10705 (1993)）。このｃＤＮＡ によりコードされるポリペプチドは、ＦＬＴの細胞外領域の７つあるイムノグロブリン様ドメインのうち、第１〜第６イムノグロブリン様ドメインと対応しており、本来のＦＬＴと同程度の親和性でＶＥＧＦと結合しＶＥＧＦ活性を阻害した。また、ＫＤＲについても遺伝子工学的に発現させた細胞外領域の第１〜第６ドメインがＶＥＧＦに結合することが知られている（R. L. Kendal et al., Bichem. Biophys. Res. Commun., 201:326 (1994)）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
マウスの抗ＶＥＧＦ中和モノクローナル抗体は抗腫瘍性を示すことから、抗ガン剤として利用可能であると期待できる。しかしながら、マウスの抗体を人に投与するとマウス抗体に対するヒト抗体が産生され、中和されたりアナフィラキシーショックを引き起こしたりする場合がある。このようなことを回避するためには、マウス抗体のキメラ化（S. L. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81:6851 (1989)）やヒト化を行い、中和能を損なわないようにしながらマウス抗体のアミノ酸配列をヒト抗体のアミノ酸配列に近づける必要がある。そのためには高度の技術と知識、経験、労力が必要であり、成果はケースバイケースで必ずしも成功するとは限らない。またこの方法でも１００％はヒト化できない。他の方法としてはヒト抗体そのものを産生するトランスジェニックマウスを用いて免疫する方法があるが（S. Wagner et al., Nucleic Acid Res., 22:1389(1994)）、やはり高度の専門的な技術が必要である。
【０００８】
前述のように、ＶＥＧＦレセプターの細胞外領域は、ＶＥＧＦに対し特異的に高親和性で結合しＶＥＧＦ活性を阻害できるので、血管新生阻害剤として利用することが考えられる。しかも元々ヒト由来のポリペプチドであるために人に投与しても抗体出現率は低いことが期待できる。しかしながら本来体内に多量に存在しないポリペプチドを投与すると極めて速やかに代謝されてしまうことが報告されている。例えば、ＨＩＶのレセプターであるＣＤ４の可溶性型の血中半減期は１５分であり（D. J. Capon et al., Nature, 337:525 (1989)）、インターフェロンγの場合は血中半減期は３０分であった（I. Rutenfranz and H. Kirchner, J. Interferon Res., 8:573 (1988)）。
【０００９】
血中半減期を延長する方法として、抗体分子のような血中半減期の長い分子との融合ポリペプチドを遺伝子工学的に作成し利用する方法が知られている。ＣＤ４の例では抗体ＩｇＧ１のＦｃ領域とのキメラにした場合に血中半減期が１５分から４８時間に延長された（D. J. Capon et al., Nature, 337:525 (1989)）。また抗体のＦｃ領域との融合ポリペプチドにすることによって抗体が持っているエフェクター機能、即ち捕体依存性細胞障害活性（D. B. Amos et al., Transplantation, 7:220 (1969)）および抗体依存性細胞障害活性（A. Y. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 84:3439 (1987)）を誘導できる効果も期待 できる。更にＦｃ領域を介して２量体化されるので、１分子が２箇所でリガンドに結合できるようになるため、膜表面や細胞外マトリクスなどの固相上のリガンドに結合する場合には親和性が見かけ上、格段に向上する効果も期待できる。
【００１０】
抗体との融合ポリペプチドを利用する場合には、融合により分子量が大きくなるので、元のポリペプチドは分子量が小さいことが望ましい。何故なら、分子量が大きいと遺伝子操作で融合ポリペプチドを生産する組換え宿主を作成する際に、扱うＤＮＡの分子量が大きくなるからである。一般に導入するＤＮＡの分子量が大きい程、宿主への導入効率が悪くなり、組換え体が得られる頻度が低下する。また一般に生産させようとする組換えポリペプチドの分子量が大きい程、産生量が低くなる傾向がある。更に固形ガンの治療に利用する場合には、分子量の大きいポリペプチドは患部への浸潤性が悪いことが報告されている（D. M. Lane et al., Br. J. Cancer, 70:521 (1994)）。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ＶＥＧＦを特異的に阻害することにより血管新生を阻害できるポリペプチド、特にＶＥＧＦレセプターの細胞外領域に関するポリペプチドのうち分子量が小さいポリペプチドを見いだすことを目的として鋭意努力した。その結果、ＦＬＴの細胞外領域の第１イムノグロブリン様ドメインおよび第２イムノグロブリン様ドメインを含むポリペプチドがＶＥＧＦに特異的かつ高親和性で結合し、ＶＥＧＦ活性を阻害できることを見いだした。なお、本明細書において「ポリペプチド」とは、アミノ酸同士がペプチド結合によって共有結合しているもの一般を指し、長さの制限はないものとする。
【００１２】
本発明のポリペプチドには、ＦＬＴの細胞外領域の第１イムノグロブリン様ドメインおよび第２イムノグロブリン様ドメインのみからなるものの他に、他のドメインを含んでいるものも含まれる。例えば、第１イムノグロブリン様ドメイン〜第４イムノグロブリン様ドメインの全てを含むポリペプチド、第１イムノグロブリン様ドメイン〜第５イムノグロブリン様ドメインの全てを含むポリペプチドも本発明のポリペプチドに含まれる。なお、第１イムノグロブリン様ドメイン〜第６イムノグロブリン様ドメインの全てを含むポリペプチドまたは第１イムノグロブリン様ドメイン〜第７イムノグロブリン様ドメインの全てを含むポリペプチドは、分子量が大きすぎるので「組換えＤＮＡ技術による発現が行い易く、患部への浸潤も速やかである」という本願発明の効果を充分に奏し得ないものであると考えられ、本願発明のポリペプチドからは除外される。なお、ＦＬＴの各ドメインの境界は明確に区別されるものではないが、本明細書においては各ドメインは、それぞれ、以下の残基番号のアミノ酸配列を含むドメインと定義される。［なお、残基番号は、配列番号：１のものと同じである。即ち、成熟ＦＬＴのＮ末端（配列番号１の１位の「Ｓｅｒ」）から数えた残基番号を示す。］
第１イムノグロブリンドメイン  １〜１１０
第２イムノグロブリンドメイン  １１１〜２０８
第３イムノグロブリンドメイン  ２０９〜３１１
第４イムノグロブリンドメイン  ３１２〜４０７
第５イムノグロブリンドメイン  ４０８〜５３５
第６イムノグロブリンドメイン  ５３６〜６４０
第７イムノグロブリンドメイン  ６４１〜７３６
更に本発明は、上記ＦＬＴの細胞外領域と他のタンパク質（例えば、イムノグロブリンのＦｃ領域）とが融合したポリペプチドも含む。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のポリペプチドはＶＥＧＦ刺激による血管新生を阻害することができるので固形ガンその他の病理的血管新生を伴う疾病の治療に利用できる。また、ヒト由来のアミノ酸からなるのでヒトに長期投与しても抗体ができにくい。更に、従来のポリペプチド（R. L. Kendal and K. A. Thomas, Proc. Natl., Acad. Sci., U. S. A., 90:10705 (1993)）より分子量が小さいので組換えＤＮＡによる 発現が行い易く、患部への浸潤も速やかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
これらのペプチドは次のような手順を経て生産することができる。ヒト血管内皮細胞、例えばヒト臍帯由来血管内皮細胞（岩城硝子、森永乳業、クラボウなどから販売）を培養し酸性フェノール法（P. Chomzynski and N. Sacchi, Anal. Biochem., 162:156 (1987)）により全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴセルロースに よってポリ（Ａ）+ＲＮＡを調製する。これを鋳型として逆転写酵素とオリゴｄ Ｔ（１２〜１６）プライマーを用いて１本鎖ｃＤＮＡまたは２本鎖ｃＤＮＡを合成する。ポリ（Ａ）+ＲＮＡの調製法、ｃＤＮＡの調製法については「J. Sambrook  et al.,”Molecular Cloning”,Cold Spring Harbor Laboratly Press, 1989」に従って行うことができる。また市販のポリ（Ａ）+ＲＮＡ調製試薬（Oligotex-dT30、宝酒造製）やｃＤＮＡ合成キット（ファルマシアバイオシステム社 製）を用いても行うことができる。既にｃＤＮＡライブラリーからクローニングされたｆｌｔｃＤＮＡがある場合は、直接、発現させようとする領域のＤＮＡを適当な制限酵素で切り出し、発現ベクターに導入してもよい。
【００１５】
次に得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法（「”PCR Protocols”, Academic Press Inc., 1990」参照）により目的部分のＤＮＡを増幅することができる。例えば、以下のようなプライマーを使用すればよい。プライマーＤＮＡはＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ製、日本ミリポアリミテッド製など）で合成するか、カスタムＤＮＡを注文することができる（サワディテクノロジー社）。例えば第１イムノグロブリン様ドメイン〜第４イムノグロブリン様ドメインをコードするｃＤＮＡを得る場合は、
上流プライマー：5'-Ｎ(3〜5)Ｘ(6)CGTCGCGCTCACCATGGTCAG-3'（配列番号：２）
下流プライマー：5'-Ｎ(3〜5)Ｙ(6)TTATTCGTAAATCTGGGGTTTCAC-3'（配列番号：３）を用いればよい。
【００１６】
配列中、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの何れか、ＸまたはＹは制限酵素認識配列、括弧内の数字は塩基数を表す。具体的には、Ｎ(3〜5)はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの何れかが３〜５個存在することを示し、Ｘ(6)またはＹ(6)は、６塩基を認識する制限酵素の認識部位を示す。これらの制限酵素認識配列は、増幅しようとするＤＮＡ断片およびそれを挿入しようとするベクターには存在しない配列にすることが望ましい。配列番号：１に記載の塩基配列を参考にして適宜下流プライマーを設計し、所望のＣ末端をコードするＤＮＡ断片を増幅することができる。また発現ベクターに組み込まれた時には、ポリペプチドのコーディング配列はプロモーターに対して順方向に配置していなければならない。プライマー配列中、ｆｌｔＤＮＡ配列と対応する部分は必ずしも２１塩基に限定する必要はなく１７〜２５塩基程度でもよい。ＰＣＲの条件は前述の「PCR Protocols」記載の標準的条件でよいが、鋳 型の量やプライマー配列によって反応の進み方が異なるので、効率よく行うために、各パラメーター（例えばＭｇ++濃度、アニーリング温度、延長反応時間、サイクル数など）を適宜変更し、至適化することができる。ＰＣＲに使用するＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼよりプルーフリーディング（３’エクソヌクレアーゼ）活性のあるＰｆｕポリメラーゼ（Stratagene社）かＴａｑポリメラーゼにＰｆｕポリメラーゼを添加したものを用いた方が、ＰＣＲ増幅時の信頼性（Fiderity）が増す（W. M. Barnes, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 91:2216 (1994)）。
【００１７】
この場合のＰＣＲで増幅しようとするＤＮＡ断片は配列が既知なので、増幅後アガロースゲル電気泳動でサイズを確認し、またゲルより回収して、適当な制限酵素で消化し、その電気泳動パターンを調べることにより目的のＤＮＡ断片が得られたかどうか判断することができる。アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片のゲルからの回収、制限酵素による切断は前述の「Molecular Cloning」に従って 行うことができる。またＤＮＡのゲルからの回収には市販のグラスビーズを利用したキット（例えばPrep-A-Gene、バイオラッド社）を使用することができる。
【００１８】
回収したＤＮＡ断片は、Ｘ(6)およびＹ(6)を切断できる制限酵素で断片の両端を消化し、フェノール処理により除タンパクを行い、エタノール沈澱し、適当なバッファー、例えばＴＥ（10mM Tris-HCl(pH7.5)/1 mM EDTA）に溶かす。同様にして適当な発現ベクターのクローニング用部位を、Ｘ(6)およびＹ(6)を切断できる制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動を行い、ベクターＤＮＡを回収する。このようにすることによってＸ(6)およびＹ(6)切断部位間の小さな断片を除くことができる。これらの挿入しようとするＤＮＡ断片および切断したベクターＤＮＡを例えば、ベクターＤＮＡ：挿入ＤＮＡ断片の比が１：５〜１：１０になるように加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーション反応を行う。ライゲーション産物を大腸菌コンピテント細胞に加え、形質転換を行い、ベクターにコードされた選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性など）に対応する抗生物質を含む培地でまず抗生物質耐性の形質転換体を選択する。
【００１９】
発現ベクターにＤＮＡ断片が挿入された組換え体は、抗生物質耐性の各形質転換体が持つプラスミドの制限酵素切断パターンを調べて選択する。または各形質転換体を菌体ごと鋳型として、挿入しようとするＤＮＡ断片を増幅したプライマーを用いてＰＣＲすることにより、目的とするＤＮＡ断片が増幅されるか否かで組換え体かどうか調べることができる。これらの大腸菌の組換え体を得る一連の操作は前述の「Molecular Cloning」に従って行うことができる。
【００２０】
本発明のポリペプチドを生産させるために様々な宿主を利用することができる。例えばEscherichia coli、Pseudomonos属細菌、Bacillus subtilis、 Bacillus brevis、Bacillus liqueniformis、Bacillus thuringensisなどのグラム陰性 またはグラム陽性細菌、Pichia pastoris、Schizosaccharomyces pombe、Saccharomises cerevisiaeなどのような酵母、Aspergillus属のような真菌類、Sf9（Spodoptera frugiperda由来）、Sf21、TN5（Trichoplusia ni由来）、BN4（Bombyx moli由来）などのような昆虫細胞、CHO（cninese hamster ovary由来）、Ｃ ＯＳ細胞（サル腎臓由来）などのようなほ乳類細胞が利用できる。ベクターは宿主の種によってそれぞれ適したベクターを利用すればよい。最終的な形質転換細胞を得る前に、本発明のポリペプチドを生産しようとする宿主と大腸菌とのシャトルベクターを用い、一度大腸菌で組換えＤＮＡを得るのがより容易であろう。本発明のポリペプチドを生産する組換え宿主を得るための形質転換方法は、大腸菌ではコンピテント細胞、Bacillus属ではコンピテント細胞法（K. Bott and G. A. Willson, J. Bacteriol., 94:562 (1967)）、プロトプラスト法（M. Mandel and A. Higa, J. Mol. Biol., 53:159(1970)）、酵母ではプロトプラスト法（M. Broker et al., BioTechniques, 5:516 (1987)）、昆虫細胞およびほ乳類細胞ではリポフェクチン法（R. W. Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 86:6077 (1989)）、リン酸カルシウム法（F. L. Graham and A. J. van der Eb, Virology, 52:456 (1973)）により行うことができる。またエレクトロポレーション法（BIORAD社パンフレット等参照）は前述の全ての細胞に応用可能である。
【００２１】
基本的には使用する宿主内で複製可能なプラスミドまたはウイルスＤＮＡを用い、発現させたい部分をコードするＤＮＡをその宿主内で機能する強力なプロモーターの下流に組入れればよい。発現させようとする遺伝子に翻訳開始コドンがない場合にはこれを付加する必要がある。また原核細胞を宿主に用いる場合はリボソーム結合配列が（J. R. MacLaughlin et al., J. Biol. Chem., 256:11283 (1981)）必要である。宿主染色体ＤＮＡの一部を有し、宿主内で複製できないベクターを用いて宿主染色体と相同組換えを起こさせ、宿主染色体内にベクターごと組込む方法も利用することができる（特開平４−２７８０９２号公報、D. J. King et al., Biochem. J., 281:317 (1992)）。また培養細胞ではなく、動物または植物固体を宿主とする方法も利用可能である。例えばカイコのウイルスであるBmNPVの組換えウイルスを作成しカイコに接種することにより、培養細胞を宿主とする場合に比べ、より高い生産性でカイコ体液からポリペプチドが得られるであろう（河合秀樹、下群洋一郎、バイオインダストリー、8:39 (1991) ）。pSV系ベクターの組換え体で形質転換したマウスミエローマ細胞をSCIDマウスやヌードマウスの腹腔に移植し腹水から、組換えポリペプチドを回収することも可能であろう。本発明のＤＮＡを用いたトランスジェニック動物（G. Wright at al., Bio/Technology, 9:830 (1991)）またはトランスジェニック植物（M. Owen et al., Bio/Technology, 10:790 (1992)）を宿主として利用することも可能であろう。
【００２２】
本発明のポリペプチドを細胞外に分泌させるには、真核細胞を宿主に用いる場合はＦＬＴのシグナルペプチドコーディング部分をそのまま使用すればよい。細菌では使用する宿主の分泌ポリペプチドのシグナルペプチドをコードするＤＮＡを利用することができるであろう。例えば、大腸菌では外膜タンパク質であるOmpA、OmpF、フォスファターゼであるPhoA、マルトース結合タンパク質であるMalB
、Bacillus属では塩基配列が既知のアミラーゼ、アルカリフォスファターゼ、セリンプロテアーゼなどのシグナルペプチドをコードするＤＮＡを利用することができる。また細胞内に発現させる場合には開始コドン以外のシグナルペプチドコーディング部分を除いて利用すればよい。細菌の細胞内で外来性のポリペプチドを高発現させた場合にはしばしば封入体の形成が起こるが、その場合は８Ｍ尿素で可溶化後、数μｇ／ｍｌのポリペプチド濃度まで希釈し透析により徐々に尿素を除くことで活性の何割かが回収できるであろう。また、大腸菌内で、大腸菌チオレドキシンを同時に高発現させることにより、封入体を生じさせにくくさせることも可能である。
【００２３】
前述のような方法で得られた本発明のポリペプチドは、一般的な生化学的方法により精製することができる。例えば硫酸アンモニウム沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィーなどを利用することができる。本発明のポリペプチドはヘパリン親和性を有するので、ヘパリン樹脂によるアフィニティクロマトグラフィーを利用することができる。他のポリペプチドとの融合ポリペプチドの場合は、相手のポリペプチドが有する特性を利用して精製することが可能である（M. Uhlen et al., Methods Enzymol.,185:129 (1990)）。例えば融合ポリペプチドの相手が抗体のＦｃ領域である場合にはプロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロース（E. Harlow and D. Lane, "Antibodies", Cold Spring Harbor Laboratoly Press,1988）、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である場合にはグルタチオンセファロース（D. B. Smith and F. S. Johnson, Gene, 67:31 (1988)）、クロラムフェニコールトラン スフェラーゼである場合にはクロラムフェニコールセファロース、ヒスチジンオリゴマーである場合にはNi++-NTA(nitryltriacetic acid)アガロースを用いたアフィニティクロマトグラフィー（F. H. Arnold, Bio/Tecnology, 9:151 (1991) ）を利用することができる。
【００２４】
本発明のポリペプチドを含む画分は本ポリペプチドに反応する抗体を用いたＥＩＡまたはウェスタン解析によって検出することができる。本発明のポリペプチドと反応する抗体は、Ｎ末端より２４番目〜３０番目にアミノ酸配列に対応するオリゴペプチドを合成し、牛血清アルブミンまたはＫＬＨ(keyhole lymphet hemocyanine)などのキャリアータンパク質とのコンジュゲイトを作成しウサギなどに標準的な方法で免疫することで得られる（E. Harlow anr D. Lane, "Antibodies", Cold Spring Harbor Press,1988）。また本発明ポリペプチドと他のポリペプチドとの融合ポリペプチドを大腸菌で生産し、前述のように融合相手のポリペプチドの特性を利用して精製して免疫原として用いても本発明のポリペプチドに反応する抗体は得られる。
【００２５】
本発明のポリペプチドはＶＥＧＦに結合するので、その活性を指標として精製することもできる。例えばＥＩＡ用に抗体固相化プレートを調製するのと同様の要領で、精製前の本発明のポリペプチドを含む溶液を適当に希釈し、９６穴のポリスチレン製マイクロタイタープレートをコートしてブロッキング処理したプレートを作成する。このプレートはＶＥＧＦを特異的に結合するので、125Ｉ標識 ＶＥＧＦを使用すればウェルに残る放射活性から結合が確認できる。本発明のポリペプチドを精製するために行ったクロマトグラフィーの画分と125Ｉ−ＶＥＧＦをプレインキュベートしてからこのプレートのウェルに移し、残る放射活性を測定する。その画分に本発明のポリペプチドが存在すればプレインキュベーション中にＶＥＧＦに結合し、プレート上の本発明のポリペプチドと拮抗してプレートに結合しにくくなることで存在が確認できる。
【００２６】
本発明のポリペプチドはＶＥＧＦに高い親和性（Kd=5x10-11程度）で結合してＶＥＧＦがＶＥＧＦレセプターに結合することを阻害する。従って本発明のポリペプチドは低濃度でＶＥＧＦ活性を阻害することができる。本発明のポリペプチドはＶＥＧＦ活性を阻害するのでＶＥＧＦ刺激による血管内皮細胞の増殖を阻害する。また、本発明のポリペプチドはＶＥＧＦによる血管透過性促進を阻害する。更に、本発明のポリペプチドはインビボでＶＥＧＦによる血管新生を阻害し、本腫瘍の増殖を阻害する。
【実施例】
【００２７】
Ｉ．第１〜第４イムノグロブリン様ドメインおよび第１〜第５イムノグロブリン様ドメインからなるポリペプチドに関する実施例
［実施例１］ＦＬＴ細胞外領域を発現する組換えバキュロウイルスの作成
１）ＦＬＴの第１〜第４イムノグロブリン様ドメインを発現する組換えウイルスの作成  基本的にはサンブルック（J. Sambrook）らの「Molecular Cloning」に記載された方法に従い図２に示す手順でベクターの構築を行った。ＦＬＴの第１〜第４イムノグロブリン様ドメインを発現する組換えウイルスを得るために、プラスミドｐｆｌｔ３−７（M. Shibuya et al., Oncogene, 5:519 (1990)）のＤＮＡを 制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により分離した約１．６ｋｂｐのＥｃｏＲＩ-ＮｄｅＩ ＤＮＡ断片を調製した。一方プラスミドｐＭＥ１８ＳＮｅｏのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により分離した約５．５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩＤＮＡ断片を調製した。ＮｄｅＩ末端をＸｈｏＩ末端に変換するためにアダプターとして、「5'TATTAATGATCTAGATGAC 3'」（配列番号：４）と「5'TCGAGTCATTCTAGATCATTAA 3'」（配列番号：５）のオリゴヌクレオチドを室温で混合し、更に前記「１．６ｋｂｐのＥｃｏＲＩ-ＮｄｅＩＤＮＡ断片」と「５．５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片」とを混合してＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応を行い、大腸菌に導入した。得られた組換えプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ｐＶＬ１３９３（PharMingen社）のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位に導入した。このプラスミドＤＮＡを精製し、ポヘドリンコード領域を欠失したバキュロウイルスＤＮＡであるBaculoGold（PharMingen社）を用いてマニュアルに従って組換えウイルスを得た。この組換えバキュロウイルスを「Ｂ４Ｎ」と名付けた。組換えバキュロウイルス「Ｂ４Ｎ」をＳｆ９細胞を用いてマニュアルに従って増幅し、以降の実験に使用した。なお、「Ｂ４Ｎ」はＦＬＴのＮ末端から４５７残基までのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んでいる。
【００２８】
２）ＦＬＴの第１〜第５イムノグロブリン様ドメインを発現する組換えウイルスの作成
基本的にはサンブルック（J. Sambrook）らの「Molecular Cloning」に記載された方法に従い図３に示す手順でベクターの構築を行った。プラスミドｐｆｌｔ３−７ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで切断し、１．９ｋｂｐのＥｃｏ ＲＩ−ＨｉｎｄIIIＤＮＡ断片を調製した。ＨｉｎｄIII末端をＸｈｏＩに変換するためにアダプターとして、オリゴヌクレオチド「5'AGCTTTTAATGATCTAGAATGAC 3'」（配列番号：６）と「5'TCGAGTCATTCTAGATCATTAAA 3'」（配列番号：７）とを混合して加え、前述のプラスミドｐＭＥ１８ＳＮｅｏの５．５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片と連結し、これを用いて大腸菌を形質転換し、組換 えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた１．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ｐＶＬ１３９３（PharMingen社）のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位に導入した。このプラスミドＤＮＡを精製し、ポヘドリンコード領域を欠失したバキュロウイルスＤＮＡであるBaculoGold（PharMingen社）を用いてマニュアルに従って組換えウイルスを得た。この組換えバキュロウイルスを「Ｂ５Ｎ」と名付けた。組換えバキュロウイルス「Ｂ５Ｎ」をＳｆ９細胞を用いてマニュアルに従って増幅し、以降の実験に使用した。なお、「Ｂ５Ｎ」はＦＬＴのＮ末端から５６０残基までのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んでいる。
【００２９】
［実施例２］発現産物の免疫化学的解析
昆虫細胞ＨｉＦｉｖｅ（Invitrogen Corp.製）をＥｘＣｅｌｌ４００培地（岩城硝子社製）で培養し、組換えバキュロウイルス「Ｂ４Ｎ」または「Ｂ５Ｎ」を感染させ培養上清を回収した。このサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動しウェスタンブロッティングを行った。１次抗体にウサギ抗ＦＬＴ細胞外領域ポリクローナル抗体を用い、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ使用し、ＮＴＢ(Nitroblue tetazolium chrolide)／ＢＣＩ Ｐ(5-Bromo-4-chrolo-3-indolylphosphate p-toluidine salt)（Gibco BRL製）で発色させた。その結果この抗体との特異的な反応性が確認された（図４）。レーン１はＢ４Ｎ感染細胞培養上清２μｌ、レーン２はＢ４Ｎ感染細胞抽出液１０μｌ、レーン３はＢ５Ｎ感染細胞培養上清２μｌ、レーン４はＢ５Ｎ感染細胞抽出液１０μｌを泳動したものである。免疫化学的に反応したバンドの移動度は予想される分子量と一致した。以後これらの産物を「４Ｎ−ＦＬＴ」および「５Ｎ−ＦＬＴ」と称する。また培養上清サンプル中におよそ２μｇ／ｍｌの「４Ｎ−ＦＬＴ」または「５Ｎ−ＦＬＴ」が含まれていると判定された。
【００３０】
［実施例３］発現産物のＶＥＧＦとの親和性
ＨｉＦｉｖｅ細胞に組換えウイルス「Ｂ４Ｎ」または「Ｂ５Ｎ」を感染させ、得られた培養上清をＰＢＳで４倍に希釈しマイクロタイタープレート（「イムロン２」ダイナテック社製）のウェルに１００μl入れ４℃で一夜置き、ウエルか ら除去した。ウェルをＰＢＳ−０．１％ＢＳＡで３回洗浄し、次にＰＢＳ−１％ＢＳＡを２５０μl入れ、室温で２時間放置しブロッキングした。ウェルの中の 液を捨て、１００μl中に比活性66,000cpm/ngの125Ｉ−ＶＥＧＦ165（ＶＥＧＦ のＮ末端から１６５番目までの残基からなるペプチド／アマシャム社製）20280cpmに非標識のＶＥＧＦ165を0〜15000pg混合した溶液を入れ室温で３時間放置した。ウェルの中の液を捨てＰＢＳ−０．１％ＢＳＡで３回洗浄し、各ウェルに残った放射活性ををγカウンターで測定しスカッチャード解析を行った（図５）。図５Ａ、Ｂはそれぞれ「Ｂ４Ｎ」「Ｂ５Ｎ」発現培養上清をコートしたプレートを用いた結果である。この時にコントロールウイルス感染Ｓｆ９細胞の培養上清でコートしたプレートには125Ｉ−ＶＥＧＦ165はほとんど結合しないので、結合放射活性は挿入遺伝子からの発現産物への125Ｉ−ＶＥＧＦ165の結合であると考えられる。「Ｂ４Ｎ」または「Ｂ５Ｎ」感染細胞の培養上清中の発現産物のＶＥＧＦ165に対する親和性は共にＫｄ（解離定数）がおよそ３〜４．５×１０-11でありＦＬＴ（J. Waltenberger, et al., J. Biol. Chem., 269:26988 (1994)）または可溶性型ＦＬＴ（R. L. Kendal and K. A. Thomas, Proc. Natl., Acad. Sci., U. S. A., 90:10705 (1993)）について報告されている値に近かった。
【００３１】
［実施例４］発現産物によるＶＥＧＦの生物活性の阻害
１）ＶＥＧＦの透過性促進活性の阻害
ＶＥＧＦの透過性促進活性に対する「４Ｎ−ＦＬＴ」または「５Ｎ−ＦＬＴ」の阻害効果を調べた。モルモットの心臓内に０．５ｍｌの１％エバンスブルー色素液を注入し、３０分後にＶＥＧＦと共に０．２ｍｌの「４Ｎ−ＦＬＴ」または「５Ｎ−ＦＬＴ」発現培養上清を剃毛した皮下に注入し、更に３０分後に色素の漏出を観察した（表１）。この結果から「４Ｎ−ＦＬＴ」および「５Ｎ−ＦＬＴ」はＶＥＧＦの透過性促進活性を阻害することが明らかになった。
【００３２】
【表１】
2006094861.tif 000003
２）ラット類洞壁内皮細胞のＶＥＧＦ依存性増殖の阻害
ＶＥＧＦ依存性の増殖に対する「４Ｎ−ＦＬＴ」または「５Ｎ−ＦＬＴ」の阻害効果を調べた。ラットの肝臓より記載の方法で類洞壁内皮細胞を調製し、２４穴プレートに１０4／ウェルで撒き、表２に示したサンプル存在下で４日間培 養し、ウェル内の細胞数を測定した。表２の細胞数の欄の数値は撒いた直後の細胞数を１００と表した時の相対値である。「４Ｎ−ＦＬＴ」「５Ｎ−ＦＬＴ」のサンプルはそれぞれの組換えウイルス感染ＨｉＦｉｖｅ培養上清を使用し、含有量はウェスタン解析の結果を元に算出した。この結果から「４Ｎ−ＦＬＴ」および「５Ｎ−ＦＬＴ」はＶＥＧＦの内皮細胞増殖活性を投与量依存的に阻害することがわかる。
【００３３】
【表２】
2006094861.tif 000004
ＩＩ．第１〜第２イムノグロブリン様ドメインからなるポリペプチドに関する実施例
［実施例５］ＦＬＴ細胞外領域（ＥＤＦ）と反応するポリクローナル抗体の作成
１）ヒト臍帯由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）ｃＤＮＡの調製
ＨＵＶＥＣ（クラボウ製）約１×１０7個の細胞に１ｍｌのＩＳＯＧＥＮ（和 光純薬工業製）を加えペッスルで細胞を破砕し更に９ｍｌのＩＳＯＧＥＮを加え５分間振とうした。この溶液に１ｍｌのクロロフォルムを添加し１分間振とうし、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清液を回収し、１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を添加して混合し更に２．５容のエタノールを添加した。遠心して沈澱を回収し、７５％エタノールで沈澱を洗浄し乾燥して１００μｌの加熱滅菌した純水に溶解した。１０２μｇのＲＮＡが得られた。この溶液に１０％ＳＤＳを１μｌ添加し１００μｌの「Oligotex-dT30（宝酒造製）」を添加し６５℃で５分間保温した後、氷中にて急冷した。この溶液に２０μｌの５Ｍ塩化ナトリウムを混合し３７℃で１０分間保温した。この懸濁液を１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、沈澱を１００μｌの加熱滅菌した純水に懸濁し６５℃で５分間保温した。この懸濁液を１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心した上清を回収してエタノール沈澱を行った。乾燥した沈澱を２０μｌの加熱滅菌した純水に溶解し、ＨＵＶＥＣポリ（Ａ）+ＲＮＡとした。以下この溶液を用いファルマシアのｃＤＮＡ合成キットを用い、マニュアルに従ってオリゴｄＴでプライミングされたＨＵＶＥＣ２重鎖ｃＤＮＡ溶液１００μｌを得た。
【００３４】
２）ＦＬＴ細胞外領域（ＥＤＦ）コーディングＤＮＡのクローニング
１）で得たＨＵＶＥＣ由来ｃＤＮＡを鋳型として、以下の条件でＰＣＲを行った。
【表３】
2006094861.tif 000005
プライマー配列は、以下の通りである。
プライマー1: 5'-CTCGGATCCGGATCTAGTTCAGGTTCAAAA-3'（配列番号：８）
プライマー2: 5'-CTCGAATTCACTCCAGATTAGACTTGTCCGA-3'（配列番号：９）
「プライマー１」の下線部は成熟ＦＬＴのＮ末端コーディング配列に、「プライマー２」の下線部は、ＦＬＴ細胞外領域Ｃ末端コーディング配列に対応する。
【００３５】
反応液２００μｌをミネラルオイルを除くために等量のクロロフォルムで処理し、水層を回収し、１０％ＳＤＳを４μｌ添加し、６０℃で５分間保温した。この溶液を等量のＴＥ飽和フェノールで処理した水層を回収し、エタノール沈澱しＤＮＡ断片を回収した。乾燥した沈澱を３０μｌのＴＥに溶解し、アガロースゲル電気泳動にかけた。およそ２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、「Prep-A-Gene」（BIORAD製）を使用しマニュアルに従いＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡ断片をHincII、HindIII、HhaIまたはPstIで消化し、切断パターンがＦＬＴ細胞外領域コーディングＤＮＡの塩基配列から予想されるパターンと一致することを確認した。次にこのＤＮＡ断片をEcoRIおよびBamHIで消化し、その反応液を等量のＴＥ飽和フェノールで処理し、水層から「Prep-A-Gene」を用いてEcoRI、BamHI消化ＤＮＡ断片を回収した。同様にプラスミドベクターｐＧＥＸ２Ｔ（ファルマシアバイオシステム製）１μｇをEcoRIおよびBamHIで消化し、その反応液を等量のＴＥ飽和フェノールで処理し、その水層から「Prep-A-Gene」を用いてEcoRI、BamHI消化ｐＧＥＸ２ＴＤＮＡを回収した。
【００３６】
このようにして得られたＤＮＡ断片とプラスミドＤＮＡを１０：１のモル比で混合し、ライゲーション（ライゲーションキット、宝酒造製）を行った。このライゲーション溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造製）を形質転換し、７５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＴＹ培地（１ｌ中１６ｇトリプトン、１０ｇ酵母エキス、５ｇ塩化ナトリウム、１．５ｇ寒天）にプレーティングし３７℃で一夜培養した。出現するアンピシリン耐性コロニーを爪楊枝で突き、前述のＰＣＲ反応液から鋳型を除いた溶液１５μｌに移し、サイクル数を３０回にして前述と同様にＰＣＲを行った。ＰＣＲ後の反応液をアガロースゲル電気泳動し、２．２ｋｂｐのバンドを与えるコロニーから更にシングルコロニーを単離し、少量の培養液からプラスミドＤＮＡを調製した。（「J. Sambrook,et al.,"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989」の方法に従った。）これらのプラスミドＤＮＡをBamHIおよびEcoRIで消化し、２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が生じることを確認した。これらのプラスミドＤＮＡの一つを前記「primer1」または「primer2」を用いて配列決定を行い（「J. Sambrook,et al.,"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989
」の方法に従った）、上流および下流から約１５０塩基の配列を調べたところ、ＦＬＴ細胞外領域（ＥＤＦ）コーディングＤＮＡの塩基配列と一致した。
【００３７】
３）ＧＳＴ−ＥＤＦ融合ポリペプチドの調製
前述の塩基配列の一部を確認したプラスミドを有する大腸菌クローンを５００ｍｌの５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２×ＴＹ培地で、３０℃で振とう培養を行い、波長６００ｎｍの吸光度が１．０に達した時にＩＰＴＧを０．１ｍＭとなるように添加し、更に２０時間培養した。遠心して細胞を回収し、グルタチオンセファロース（ファルマシアバイオシステム）を用いてマニュアルに記載された方法に従って、純度６０％程度のＧＳＴ−ＥＤＦ融合ポリペプチドを約７．１ｍｇ調製した。レムリ法でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した結果、この融合ポリペプチドは分子量６０，０００であり、ＧＳＴの分子量２８，０００を差し引くと融合ポリペプチドの相手の分子量は３２，０００程度である。グルタチオンセファロースに結合することからＧＳＴ部分はほとんど分解していないと考えられるので、ＥＤＦのＮ末端側が分子量３２，０００程度残り、ＥＤＦの後半部が欠失していると考えられた。
【００３８】
４）ＧＳＴ−ＥＤＦ融合ポリペプチドに対する抗体の調製
上記３）で調製したＧＳＴ−ＥＤＦ融合ポリペプチドをフロイントコンプリートアジュバントと混合し、ウサギ１羽につきＧＳＴ−ＥＤＦ融合ポリペプチドを初回２００μｇ、以後２週間ごとに１００μｇずつ、７回皮下に免疫した。抗原をコートしたプレートによって力価測定を行った結果、血清を６４，０００倍以上希釈しても十分な免疫反応があった。ウサギ２羽の血清から「E. Harlow and D. Lane」の「Antibodies」に記載された方法に従い、１５０ｍｇのＩｇＧ画分 を得た。
【００３９】
［実施例６］
ＥＤＦおよびその部分断片を発現する組換えバキュロウイルスの作成
１）ＥＤＦおよびその部分断片を発現する組換えバキュロウイルスの作成用組換えトランスファーベクターの構築
プラスミドｐｆｌｔ３−７（M. Shibuya et al., Oncogene, 5:519 (1990)）を鋳型として以下の条件でＰＣＲを行った。
【００４０】
【表４】
2006094861.tif 000006
上記反応に用いたプライマー配列は、以下の通りである。
プライマー3:5'-TTTCTCGGATCCTATAAATATGGTCAGCTACTGGGACACC-3'（配列番号：１０）
プライマー4:5'-GTGGTGGTGGTGGTGGTGACGCTCCAGATTAGACTTGTCCGA-3'（配列番号：１１）
「プライマー３」の下線部は成熟ＦＬＴのＮ末端コーディング配列に、「プライマー４」の下線部は、ＦＬＴ細胞外領域Ｃ末端コーディング配列に対応する。
【００４１】
またポリアデニレーションシグナルを含むＤＮＡ断片を得るために、プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ（Invitrogen corp.製）を鋳型として牛成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニレーションシグナルを含むＤＮＡ（０．３ｋｂｐ）を得るために以下の条件でＰＣＲを行った。
【００４２】
【表５】
2006094861.tif 000007
上記反応に用いたプライマー配列は、以下の通りである。
プライマー5:5'-CACCACCACCACCACCACTAACTAGAGCTCGCTGATC-3'（配列番号：１２）
プライマー6:5'-TTCTCGAATTCTCCCCAGCATGCCTGC-3'（配列番号：１３）
「プライマー５」「プライマー６」の下線部は、pRc/RSVのウシ成長ホルモン 遺伝子由来のポリアデニレーションシグナルの前後に対応する。
【００４３】
得られた各々の反応液 200μlを等量のクロロフォルムで処理し、水層を回収 し、0.5％SDS、0.1M Tris-HCl(pH6.8)、5 mM EDTA、200μg/mlプロテネースＫ（proteinase K）となるように各試薬を添加し、３７℃で３０分間保温した。これらの溶液をＴＥ飽和フェノールで処理し、水層をエタノール沈澱し、ＥＤＦをコードするＤＮＡ断片およびポリアデニレーションシグナルを含むＤＮＡをＴＥに溶解した。これらのＤＮＡ溶液をアガロースゲル電気泳動にかけ、各々から２．２ｋｂｐ、０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し、各々５０μlのＴＥ溶液とした。次にこれらのＤＮＡ断片をＰＣＲにより融合させる（R. Higuchi, "PCR Protocols", Academic Press Inc.,177 (1990)参照）ために以下の条件でＰＣＲを行った。
【００４４】
【表６】
2006094861.tif 000008
得られた反応液 200μlを等量のクロロフォルムで処理し、水層を回収し、0.5％SDS、0.1M Tris-HCl(pH6.8)、5 mM EDTA、200μg/mlプロテネースＫとなるよう に各試薬を添加し、３７℃で３０分間保温した。この溶液をＴＥ飽和フェノールで処理し、水層をエタノール沈澱し、ＤＮＡをＴＥに溶解した。このＤＮＡ溶液をアガロースゲル電気泳動にかけ、ＥＤＦをコードするＤＮＡ断片とポリアデニレーションシグナルを含むＤＮＡ断片が融合したと考えられる２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し５０μlのＴＥ溶液として調製した。このＤＮＡ断片の両端をBamHIおよびEcoRIで消化したＤＮＡ断片を調製した。一方組換えバキュロウイルス用トランスファーベクターであるプラスミドｐＶＬ１３９３（PharMingen社）の１μｇをBamHIおよびEcoRIで切断したものを実施例５の２）に記載したのと同様の方法で調製した。このプラスミドＤＮＡとプラスミドｐｆｌｔ３−７からＰＣＲにより増幅したＥＤＦをコードするＤＮＡ断片をBamHIおよびEcoRIで消化したＤＮＡ断片をモル比およそ１：５で混合し、ライゲーションキット（宝酒造製）で処理し、大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルに形質転換し、実施例５の２）に記載したのと同様の方法で組換えプラスミドを有するクローンを６種選択した。各クローンの３ｍｌの培養液からアルカリ法でプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列の決定を行い、挿入断片の上流約３００塩基と下流約５００塩基を調べたところ正しい配列は２種類のクローン由来のプラスミドであった。これらのプラスミドを「ｐＥＤＦＨ１０」および「ｐＥＤＦＨ１１」と名付けた。これらのプラスミドを持つ大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌの２×ＴＹ培地で３７℃で１夜培養し、回収した菌体からアルカリ法（「J. Sambrook,et al.,"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989」の記載に従う）でプラスミドＤＮＡを抽出し、マニュアルに従ってイオン交換カラム（Diagen GimbH、QIAGEN社製）で精製し、各々２００μlのＴＥに溶解した約 １００μgのプラスミドＤＮＡを得た。
【００４５】
２）ＥＤＦおよびその部分断片を発現する組換えバキュロウイルスの作成
ＴＭＮ−ＦＨ培地（PharMingen社製）で培養した８０％コンフルエンシーの状態のＳｆ９細胞（Invitrogen Corp.社製）をピペッティングで剥し、２ｘ１０6 個の細胞を直径６０ｍｍのディッシュに撒き３０分放置して表面に吸着させた後、培地を無血清培地であるＥｘ−Ｃｅｌｌ４００（岩城硝子製）２ｍｌに置換した。「ｐＥＤＦＨ１０」または「ｐＥＤＦＨ１１」を８μl（４μg）、欠失バキュロウイルスＤＮＡ（BaculoGold、PharMingen社製）２μl（４０ｎｇ）を１６μl中に混合した溶液と、リポフェクチンを滅菌純水で２倍希釈した溶液１６μlとを混合し１５分放置した後、全量３２μlを前述のディッシュに添加し混合した。このディッシュを湿潤箱に入れ２７℃で６時間３０ｒｐｍで振とう培養した後、培地を２．５ｍｌのＴＭＮ−ＦＨに置換し２７℃で５日間静置培養した。培地を回収し遠心した上清をオリジナルウイルスストック（それぞれ「ＢＥＤＦＨ１０」、「ＢＥＤＦＨ１１」と称する）とした。「Invitrogen corp.」のマニュアルに従いプラークアッセイを行った結果、これらのウイルスタイターは共におよそ３×１０6であった。各々のウイルスについて２クローンずつ（「ＢＥＤＦＨ １０」からは「ＢＥＤＦＨ１０１」「ＢＥＤＦＨ１０２」、「ＢＥＤＦＨ１１」からは「ＢＥＤＦＨ１１１」「ＢＥＤＦＨ１１２」）プラーク単離を行い、Invitrogen corp. のマニュアルに従って４段階に増幅したウイルス溶液約２００ｍｌ（タイターはおよそ５×１０7／ｍｌ）を得た。
【００４６】
［実施例７］組換えウイルス感染Ｓｆ９細胞発現産物の解析
１）125Ｉ−ＶＥＧＦ121との共有結合架橋産物
上記の組換えウイルスをm.o.i.０．３（m.o.i.とはウイルス粒子：細胞数の比のこと）で感染させたＳｆ９細胞２×１０5に、125Ｉ−ＶＥＧＦ121（150,000cpm/ng）を１８０，０００ｃｐｍ添加し、１００μｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ中で室温で１時間置いた。遠心により２回、同バッファーで洗浄し、再度１００μｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡに懸濁した。この溶液に５０ｍＭジサクシニルスベレート(disuccinylsuberate)／ジメチルスルホキシド(dimethylsulfoxide)を１／１０容混合し室温で４０分間置いた後、1M Tris-HCl(pH6.8)を１／１０容混合した。このサンプルをレムリ法で還元条件でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、オートラジオグラフィによりシグナルを検出した（図７）。プラスミド「ｐＥＤＦＨ１０」を用いて作成した組換えウイルスである「ＢＥＤＦＨ１０」から分離した２クローンの感染細胞では、分子量１３０，０００の共有結合架橋産物が検出できた（図７Ａ、レーン１、２）のに対して、プラスミド「ｐＥＤＦＨ１１」を用いて作成した組換えウイルスである「ＢＥＤＦＨ１１」から分離した２クローンの感染細胞では分子量５０，０００の共有結合架橋産物が観察された（図７Ａ、レーン３、４）。一方、ＥＤＦをコードするＤＮＡをプロモーターとは逆向きに挿入した組換えトランスファーベクターを用いて作成したコントロールウイルス感染細胞では共有結合架橋産物は検出できなかった。図７Ｂのレーン１はコントロールウイルス感染細胞を使用し、レーン２は「ＢＥＤＦＨ１１」感染細胞を使用し、レーン３はレーン２の反応に２１４倍の非標識ＶＥＧＦを添加したサンプルである。ＶＥＧＦ121モノマーの分子量が２０，００ ０であるので、それぞれの共有結合架橋産物の分子量から差し引くと、１１０，０００と３０，０００である。このことから「ＢＥＤＦＨ１０」感染細胞はＥＤＦの全長を生産しており「ＢＥＤＦＨ１１」感染細胞はＥＤＦの断片を発現していると考えられた。「ＢＥＤＦＨ１１」から発現されるＥＤＦの断片を「ＥＤＦΔ１１」と名付けた。
【００４７】
２）ＶＥＧＦとの親和性
Ｓｆ９細胞に組換えウイルス「ＢＥＤＦＨ１０」または「ＢＥＤＦＨ１１」をm.o.i.５で感染させ、７日間培養した培養上清をマイクロタイタープレート（イムロン２、ダイナテック社製）のウェルに１００μl入れ４℃で一夜置いた。 その後ウェルの中の液を捨て、ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡで３回洗浄し、次にＰＢＳ−１％ＢＳＡを２５０μl入れ、室温で２時間放置しブロッキングした。ウェルの中の液を捨て、１００μl中に比活性78,000cpm/ngの125Ｉ−ＶＥＧＦ165（アマシャム社製）１１３００ｃｐｍに非標識のＶＥＧＦ165を０〜１２５００ｐｇ混合した溶液を入れ室温で３時間放置した。ウェルの中の液を捨てＰＢＳ−０．１％ＢＳＡで３回洗浄し、各ウェルに残った放射活性をγカウンターで測定しスカッチャード解析を行った（図８）。図８Ａ、ＢはそれぞれＥＤＦまたは「ＥＤＦΔ１１」の発現培養上清をコートしたプレートを用いた結果である。この時にコントロールウイルス感染Ｓｆ９細胞の培養上清でコートしたプレートには125Ｉ−ＶＥＧＦ165ほとんど結合しないので、結合放射活性は挿入遺伝子からの発現産物への125Ｉ−ＶＥＧＦ165の結合であると考えられる。「ＢＥＤＦＨ１０」または「ＢＥＤＦＨ１１」感染細胞の培養上清中の発現産物のＶＥＧＦ165に対する親和性は共にＫｄ（解離定数）がおよそ５×１０-11でありＦＬＴ（J. Waltenberger, et al., J. Biol. Chem., 269:26988 (1994)）または可溶性型ＦＬＴ（R. L. Kendal and K. A. Thomas, Proc. Natl., Acad. Sci., U. S. A., 90:10705 (1993)）について報告されている値に近かった。
【００４８】
３）組換えトランスファーベクターへの挿入ＤＮＡの塩基配列解析
プラスミド「ｐＥＤＦＨ１０」および「ｐＥＤＦＨ１１」にクローニングしたＤＮＡの塩基配列を確認するために塩基配列の決定を行った結果、「ｐＥＤＦＨ１０」の挿入ＤＮＡのＦＬＴ細胞外領域と対応する領域の塩基配列はＦＬＴと完全に一致していた。「ｐＥＤＦＨ１１」の挿入ＤＮＡのＦＬＴ細胞外領域と対応する領域の塩基配列はＦＬＴと比較して、配列番号：１で１０５３番目のＣが欠失していた。その結果、オープンリーディングフレームが配列番号：１のＦＬＴアミノ酸配列のー２２番から２４６番までに対応するようになっていた。この部分はＦＬＴの第一ドメインと第二ドメインを含んでいる。
【００４９】
４）発現産物の精製
１００ｍｌの三角フラスコに３０ｍｌＴＭＮ−ＦＨを入れ２７℃、７０ｒｐｍで培養したＳｆ９細胞９０ｍｌ（１．５×１０6／ｍｌ）に組換えウイルス「ＢＥＤＦＨ１０」または「ＢＥＤＦＨ１１」をm.o.i.５で感染させ、２０時間後に遠心して培地を６０ｍｌ（３０ｍｌ×２）のＥｘ−ｃｅｌｌ４０５（岩城硝子製）に置換して４８時間培養し、１／１００容の３３０ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド(phenylmethylsulfonyl fluoride)／エタノールと１／１０００容の100μg／mlアンチパイン(antipain)、200μg／mlアプロチニン(aprotinin)、200μg／mlロイペプチン(leupeptin)を添加し上清を回収した。「ＢＥＤＦＨ１０」感染細胞の培養上清は「Immercible CX-10」（日本ミリポアリミテッド製）で８倍濃縮し、20 mM Tris-HCl(pH7.8)／50 mM KCl／0.1％ ノニデット(Nonidet)P-40／1 mM イミダゾール-塩酸(pH7.8)で平衡化したNi++-NTA（QIAGEN、Diagen GimbH）を添加して４℃で１時間混合した。１０，０００ｒｐｍで遠心して沈澱に３０ｍｌの150 mM KCl／0.1％ ノニデット P-40/40 mM イミダゾール-塩酸(pH7.8)を添加し４℃で１５分間混合し、遠心して沈澱を回収し、更に２回同バ ッファーで洗浄した。沈澱に０．２ｍｌの250 mM イミダゾール-塩酸(pH7.8)を 添加し室温で１５分間混合し遠心して上清を回収した。再度沈澱に０．２ｍｌの250 mMイミダゾール-塩酸(pH7.8)を添加し同様にして上清を回収し、前回の上清と併せて精製ＥＤＦサンプルとした。「ＢＥＤＦＨ１１」感染細胞の培養上清は０．３ＭになるようＮａＣｌを添加してＦＰＬＣ（ファルマシアバイオシステム製）でヘパリンカラム（ファルマシアバイオシステム製）を用いて分画した。サンプル負荷のあと０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）−０．３Ｍ  ＮａＣｌで２８０ｎｍの吸光度が十分下がるまで洗浄し、０．３−１．０Ｍ  ＮａＣｌのリニアグラディエントで溶出した。２８０ｎｍの吸収がある画分を回収しＶＥＧＦアフィニティクロマトグラフィーを行った。ＰＢＳでサンプルを２倍に希釈して、１．４ｍｇのＶＥＧＦをセファロース４Ｂに共有結合したカラム０．４ｍｌに負荷した。２０ｍｌのＰＢＳ−０．５Ｍ  ＮａＣｌでカラムを洗浄し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で、０．０５ｍｌの２Ｍ Tris-HCl(pH8.0)を入れたチューブに０．５ｍｌ／チューブで溶出した。各フラクションをレムリ法でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、銀染色した（図９Ａ、レーン番号はフラクション番号と一致）。また各フラクションをＰＢＳ−０．１％ＢＳＡで１０倍希釈して、等容の125Ｉ−ＶＥＧＦ165と混合し、１時間後に１００μlの混合液を実施例３の２）で使用したマイクロタイタープレートでＶＥＧＦの 結合を調べた。その結果、電気泳動で共有結合架橋実験での予想とほぼ一致する分子量３５，０００バンドが観察されたフラクションにＶＥＧＦの結合阻害が見られた（図９Ｂ）。
【００５０】
５）免疫化学的解析
ＥＤＦまたは「ＥＤＦΔ１１」をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、「E. Harlow and D. Lane」の「Antibodies」に記載の方法に従ってウェス タンブロティングを行った。１次抗体として実施例１の４）の抗体を２μg/mlで使用し、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ（E. Y. Laboratories）を５０００倍希釈して使用し、ＮＴＢ(Nitroblue tetazolium chrolide)／ＢＣＩＰ(5-Bromo-4-chrolo-3-indolylphosphste p-toluidine salt)（Gibco BRL社製）で発色させた。その結果、約３５ｋｄの単一バンドが観察され、この抗体との特異的な反応性が確認された（図１０Ｂ）。以上のことから「ＥＤＦΔ１１」はＦＬＴのＮ末端２６７に相当するポリペプチドであることがわかった。図１０Ａにおいてレーン１はヘパリンカラム後のサンプル、レーン２はＶＥＧＦアフィニティクロマトグラフィー後のサンプルを電気泳動して銀染色したものである。図１０Ｂは、図１０Ａと同じサンプルでウェスタンブロットを行った図である。
【００５１】
６）ＶＥＧＦの生物活性の阻害
ＶＥＧＦによるヒト臍帯由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のチミジン取り込み促進に対する「ＥＤＦ」発現培養上清、「４Ｎ−ＦＬＴ」発現培養上清または「ＥＤＦΔ１１」発現培養上清による阻害を調べた。ＨＵＶＥＣ（クラボウ社製）を９６穴コラーゲンコートプレート（岩城硝子製）に３０００個／ウェル／１００μl（ＥＧＭ−ＵＶ培地、クラボウ製）で撒き、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間培養する。ＰＢＳで２回洗浄し、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ165を５０μlとサンプル５０μlをウェルに添加して４日間培養した。５０μＣｉ／２ｎｍｏｌｅｓ／ｍｌの3Ｈ−チミジンを１０μlウェルに添加して更に２４時間培養した。ＰＢＳで２回洗浄した後、トリプシン／ＥＤＴＡで細胞を剥し、セルハーベスター（Cambridge Technology Inc.製）でグラスフィルターに回収し液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した（図６）。対照として用いた野生株（wt）ウイルス感染培養上清をサンプルとして添加した場合に比べ、組換えウイルスを用いた「ＥＤＦ」「４Ｎ−ＦＬＴ」「ＥＤＦΔ１１」発現培養上清を添加した場合は、有意にＶＥＧＦ依存性チミジン取り込みが阻害された。この結果から「ＥＤＦ」「４Ｎ−ＦＬＴ」または「ＥＤＦΔ１１」は、ＶＥＧＦによるＨＵＶＥＣのチミジン取り込みの促進、即ちＤＮＡ合成の促進を阻害することが明らかになった。
【００５２】
III．第１〜第２イムノグロブリン様ドメインとヒトＩｇＧ1−Ｆｃ領域との融合タンパク質に関する実施例
［実施例８］  
１）ヒトＩｇＧ1−Ｆｃ ｃＤＮＡの単離
ＩｇＧ生産株であるヒトリンフォブラストーマ、ＩＭ９（大日本製薬）をRPMI1640培地で培養した上清を、Human IgG subclass profile kit(Zymed)を用いて調べたところ、ヒトＩｇＧ1を生産していることがわかった。４ｘ１０7個のＩＭ９細胞から、ＩＩの［実施例５］（１）記載と同様の方法でｃＤＮＡ溶液を調製した。このｃＤＮＡから、表７に示す条件で２段階のＰＣＲによりヒトＩｇＧ1−Ｆｃ ｃＤＮＡ断片を増幅した。  
【００５３】
【表７】
2006094861.tif 000009
プライマー配列は、以下の通りである。
プライマー７：5'-TCTTGTGACAAAACTCACACATGC-3'（配列番号：１４）
プライマー８：5'-CGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTG-3'（配列番号：１５）
プライマー９：5'-GAGCCCAAATCTTGTGACAAAA-3'（配列番号：１６）
プライマー10：5'-TTCTCGGATCCTTATTTACCCGGAGACAGGGA-3'（配列番号：１７）
Bam  STP hIgG1-Fc term
プライマー10の「Bam」は制限酵素BamHI認識配列、「STP」は終止コドン、「hIgG1-Fc term」はヒトＩｇＧ1−Ｆｃコーディング領域のＣ末端部分を意味する。ただしプライマー８とプライマー10はアンチセンス鎖である。ヒトＩｇＧ1−Ｆｃコーディング領域とプライマー位置の対応を図１１に示した。ＰＣＲ反応液をＩＩの［実施例５］（２）の記載と同様の方法で処理し、アガロースゲル電気泳動にかけ、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、フィルターチューブSUPEREC-01（宝酒造）で遠心しＤＮＡを回収した。このＤＮＡ断片の AvaI、HpaII、RsaI、SmaIの各制限酵素切断パターン（表８）を調べ、既報のヒトＩｇＧ1−Ｆｃ ｃＤＮＡ配列（J.W. Ellison, B. J. Berson and L. E. Hood, Nucleic Acid Res., 10:4071 (1982)）と合致することを確認した。
【００５４】
【表８】
2006094861.tif 000010
【００５５】
［実施例９］
第１〜第２イムノグロブリン様ドメインとヒトＩｇＧ1−Ｆｃ領域との融合タンパク質の発現系の構築
１）大腸菌外膜タンパク質 OmpA のシグナルペプチドコーディングＤＮＡの単離
大腸菌株ＨＢ１０１を３ｍｌの２ｘＴＹ培地で３７℃、一夜培養し、遠心して菌体を回収し、０．５ｍｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した。２０ｍｇ／ｍｌの卵白リゾチームを２５μｌ加えて室温に１５分置き、溶菌させた後、５０μｌの１０％ＳＤＳと０．５ｍｌＴＥ飽和フェノールを加え、５分間激しく振とうし、遠心して水層を回収し、当量のクロロホルムで処理し、フェノールを除いた。２容のエタノールを加えＤＮＡを沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し、乾燥後、沈澱を２００μｌの２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ溶液に溶解し、大腸菌ゲノムＤＮＡ溶液とした。これを鋳型として表９の条件でＰＣＲを行い、OmpA のシグナルペプチドコーディングＤＮＡを増幅した。
【００５６】
【表９】
2006094861.tif 000011
プライマー配列は、以下の通りである。
プライマー11：5'-TAACCTGGCGATAACGAGGCGCAAATAATGAAAAAG -3'（配列番号：18）
trx term       SD         omp init
プライマー12：5'-CTGAACTAGATTTCGGAGCGGCCTGCGCTA-3'（配列番号：１９）
mflt       omp SP term       
プライマー11の「trx term」は大腸菌チオレドキシン遺伝子（trxA）コーディング末端部分、「SD」は、omp Aのリボソーム結合配列、「omp init」は、omp Aの開始コドン周辺を意味する。プライマー12の「mflt」は成熟ＦＬＴのＮ末端コーディング領域、「omp SP term」は、Omp Aシグナルペプチドコーディング領域末端部分を意味する。ただし、プライマー12はアンチセンス鎖である。なおチオレドキシン遺伝子に関する配列は、「B. J. Wallace and S. R. Kushner, Gene 32:399 (1984)」を、omp Aに関する配列は「E. Beck and E. Bremmer, Nucleic Acid Res., 8:3011(1980)」を参考とした。このＰＣＲ反応液を前述と同様に処理し、得られたＤＮＡ断片をOmp AシグナルペプチドＤＮＡとした（図１２、図１４）。
【００５７】
（２）大腸菌チオレドキシン遺伝子の増幅と単離
前述のように、大腸菌で外来性タンパク質を高発現させると不溶性の封入体となり易いことが知られている。封入体を変性・可溶化・再活性化するのは回収率が悪く労力を要する。このような場合に大腸菌内で、大腸菌チオレドキシンを同時に高発現させると、外来性タンパク質が正常なフォールディング構造をとることができ、封入体が生じにくくなることが報告されている（T. Yasukawa et al., J. Biol. Chem. 270:25328(1995)）。そこでチオレドキシンを同時に高発現させるために遺伝子を単離した。
【００５８】
以下の条件でＰＣＲを行い、大腸菌チオレドキシン遺伝子を増幅した。
【００５９】
【表１０】
2006094861.tif 000012
プライマー配列は、以下の通りである。
プライマー13：5'-TTCTCGAATTCCCTGTGGAGTTATATATGAGC-3'（配列番号：２０）
Eco        SD       trx init    
プライマー14：5'-GCCTCGTTATCGCCAGGTTAGCGTCGAGGA-3'（配列番号：２１）
ompSD       trx term         
プライマー13の「Eco」は制限酵素 EcoRI の認識切断部位、「SD」は、大腸菌チオレドキシン遺伝子のリボソーム結合配列、「trx init」は、trxAの開始コドン周辺を意味する。プライマー14の「ompSD」は、omp Aのリボソーム結合配列を意味する。プライマー14はアンチセンス鎖である。このＰＣＲ反応液を前述と同様に処理し、得られたＤＮＡ断片をチオレドキシンＤＮＡとした（図１２、図１４）。           
【００６０】
（３）ＦＬＴ第１〜第２イムノグロブリン様ドメインコーディングＤＮＡとヒトＩｇＧ1−Ｆｃ領域コーディングＤＮＡの融合
ＥＤＦΔ１１バキュロ発現ベクターｐＥＤＦＨ１１を鋳型として表１１の条件でＰＣＲを行い、ＦＬＴ第１〜第２イムノグロブリン様ドメインコーディングＤＮＡを増幅し、前述と同様にして精製し、ＥＤＦ１２ ＤＮＡとした（図１３）。
【表１１】
2006094861.tif 000013
プライマー配列は、以下の通りである。
プライマー15：5'-CGCTCCGAAA TCTAGTTCAGGTTCAAAATT-3'（配列番号：２２）
ompSP term     mFLT               
プライマー16：5'-TTTgTCACAAgATTTgggCTCT gTgCTTATTTggACATCTAT-3'
hIgG-Fc hinge        214-FLT-208
（配列番号：２３）
プライマー16の「hIgG-Fc hinge」はヒトＩｇＧ1のヒンジコーディングＤＮＡ、「214-FLT-208」はＦＬＴの２０８位〜２１４位のアミノ酸コーディングＤＮＡを意味する。プライマー16はアンチセンス鎖である。
【００６１】
このようにして得たＦＬＴ第１〜第２イムノグロブリン様ドメインコーディングＤＮＡ（EDF12 DNA）と［実施例８］の（１）で得られたＩｇＧ1−Ｆｃ  ｃＤＮＡを鋳型として用い、表１２の条件で組換えＰＣＲ（R. Higuchi, In "PCR Protocols", ed. by M. A. Innis et al., Academic Press Inc. (1990)）を行い、両ＤＮＡ断片を融合・増幅し、これまでと同様に精製し、ＥＤＦ１２Ｆｃ ＤＮＡとした（図１３、図１４）。
【００６２】
【表１２】
2006094861.tif 000014
（４）発現ベクターの作製
［実施例９］の（１）のOmp AシグナルペプチドＤＮＡと［実施例９］の（２）のチオレドキシンＤＮＡと［実施例９］の（３）のＥＤＦ１２Ｆｃ ＤＮＡを鋳型として用い、表１３の条件で組換えＰＣＲを行い、３つのＤＮＡ断片を融合・増幅し精製した（図１３、図１４）。図１３においてレーンＭ、１、２、３はそれぞれ、分子量スタンダード、ＥＤＦ１２ ＤＮＡ、ＩｇＧ1 Ｆｃ ＤＮＡ、ＥＤＦ１２Ｆｃ ＤＮＡである。図１４の「Ec」、「Bm」はそれぞれ、制限酵素EcoRI、BamHIの認識配列の存在箇所を表す。
【００６３】
【表１３】
2006094861.tif 000015
このようにして得られた約１．７ＫｂｐのＤＮＡ断片は、プライマー10とプライマー13に含められた EcoRI と BamHI 認識切断配列を末端に持つ。この１．７Ｋｂｐの融合ＤＮＡ断片をEcoRIとBamHIで消化した。一方、大腸菌発現ベクターｐＴＴＱ１８（（株）アマシャムジャパン製）をEcoRIとBamHIで消化した。これらの制限酵素消化反応液を［実施例５］の（２）と同様の方法で処理し、ＤＮＡを回収した。ライゲーションキット（宝酒造製）を用い、ベクター：インサートのモル比３：１で連結反応を行った。この反応液と大腸菌JM109のコンピテントセル（宝酒造製）を用いて形質転換を行い、アンピシリン含有寒天培地にて生育する形質転換体を選択した。更にこの中から［実施例５］の（２）と同様の方法で、１．７Ｋｂｐの挿入ＤＮＡを持つ組換え体が数クローン得られ、その一つをJM109(pEDF12Fc)とした。
【００６４】
図１２レーンＭ、１、２、３、４、５、６はそれぞれ、分子量スタンダード、チオレドキシンＤＮＡ、Omp A シグナルペプチドＤＮＡ、ＥＤＦ１２Ｆｃ ＤＮＡ、チオレドキシンＤＮＡ−Omp A シグナルペプチドＤＮＡ-ＥＤＦ１２Ｆｃ ＤＮＡ融合断片、pEDF12Fc DNAのEcoRI＋BamHI消化、pTTQ18 DNAのEcoRI＋BamHI消化である。（丸印は未消化プラスミドである。）
【００６５】
［実施例１０］発現した融合タンパク質の解析
（１）粗抽出液の調製
JM109(pEDF12Fc)を７０ｍｌの１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｘＴＹ培地で、３７℃で振とう培養をおこない、波長６００ｎｍの吸光度が１．０に達した時にＩＰＴＧを０．５ｍＭ添加し、更に１２時間培養した。培養終了後、培養液を急冷し、培養液にプロテアーゼインヒビターとして、３３μＭ ｐＡＰＭＳＦ（和光純薬工業）を７０μｌを添加し、遠心して菌体を回収した。菌体を５ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／３３ｎＭ ｐＡＰＭＳＦに懸濁し、ソニケーターを用いて菌体の９５％以上を超音波破砕した。これを１０，０００ｘｇで２０分遠心し、沈澱を５ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１Ｍ  ＫＣｌ／３３ｎＭ ｐＡＰＭＳＦ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００／０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０に溶解し、２０，０００ｘｇで遠心して不溶成分を除いた上清を粗抽出液として以下の解析に用いた。同時に対照としてベクター部分のみを持つJM109(pTTQ18)から同様にして粗抽出液を調製した。
【００６６】
（２）ＥＩＡによる融合タンパク質発現の確認
ＶＥＧＦと抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたサンドイッチＥＩＡによって確認した。ＶＥＧＦコートプレートを作成するために、ＶＥＧＦ165（Ｒ＆Ｄ社製）を５０ｎｇ／ｍｌになるようにＰＢＳで希釈し、イムロン２マイクロタイタープレートに１ウェル当たり１００μｌ分注し、４℃で一夜置いた後、［実施例７］の（２）と同様にしてブロッキングした。JM109(pTTQ18)およびJM109(pEDF12Fc)の粗抽出液をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで２０倍希釈した溶液１００μｌを、ウェルに加え室温で１時間置いた後、ウェルをＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで６回洗浄した。次にＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（ＭＢＬ製＃ＩＭ−０８３７）を１００μｌ、ウェルに加え室温で１時間放置し、上述のようにウェルを６回洗浄した。この後、ペルオキシダーゼ基質溶液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、０．０１％過酸化水素、オルトフェニレンジアミンタブレット（和光純薬製）１錠／２０ｍｌ）１００μｌをウェルに加え、室温で３０分呈色反応を行い、更に１００μｌの２Ｎ硫酸を加えて反応を停止し、４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果、組換え体JM109(pEDF12Fc)抽出液は対照と比較して強く発色した（表１４）。これはＶＥＧＦと抗ヒトＩｇＧ抗体とのサンドイッチＥＩＡであるので、この結果から組換え体抽出液中に、ＶＥＧＦに結合し、かつ抗ヒトＩｇＧ抗体と結合する分子が含まれることが示唆された。  
【００６７】
【表１４】
2006094861.tif 000016
（３）組換えタンパク質の分子量の確認
組換えタンパク質の分子量を調べるため、［実施例７］の（５）と同様の方法で粗抽出液をウェスタンブロットにかけた。粗抽出液をレムリ法でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動し、ＰＤＶＦ膜にエレクトロブロットし、ブロッキングした後、１次抗体として、抗ヒトＩｇＧ1−Ｆｃモノクローナル抗体（ＭＢＬ＃ＩＭ−０２８０）０．４μｇ／ｍｌで、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ製）を４０００倍希釈して使用した。
その結果、JM109(pEDF12Fc)粗抽出液のレーンにのみ、還元条件でおよそ分子量６０００の免疫化学的に反応するバンドが検出された（図１５）。図１５においてレーン１、２のサンプルはそれぞれ、JM109(pTTQ18)粗抽出液、JM109(pEDF12Fc)粗抽出液である。予想される組換え体は４４６アミノ酸残基であるので、妥当なサイズである。
【００６８】
（４）125ＶＥＧＦ165との共有結合架橋産物の解析
組換えタンパク質とＶＥＧＦとの結合複合体の分子量を調べるため、各粗抽出液１００μｌと125ＶＥＧＦ165  １４０，０００ｃｐｍを混合し、２時間室温で置いた後、サンブルックらの「Molecular Cloning」記載の方法で、プロテインＡセファロース（ファルマシア製）を用いて免疫沈降し、［実施例７］の（１）と同様の方法で架橋反応を行った。沈澱物をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動し、オートラジオグラフィーによりシグナルを検出した（図１６）。その結果、対照抽出液ではＶＥＧＦの弱いシグナルのみが検出される（レーン２）のに対し、組換え体JM109(pEDF12Fc)の抽出液では、還元条件で分子量がおよそ１５２万の架橋産物が検出された（レーン１）。この結果から、組換えタンパク質はＶＥＧＦに結合し安定な複合体を形成でき、プロテインＡとも結合することがわかる。
【００６９】
（５）組換えタンパク質のＶＥＧＦ親和性の測定
組換えタンパク質のＶＥＧＦに対する結合親和性を知るために［実施例７］の（１）と同様の方法でスカッチャード解析（Ｎ＝３）を行った（図１７Ａ、Ｂ）。イムロン２にプロテインＡ（カッペル製）２０μｇ／ｍｌを１ウェル当たり１５０μｌでコートし、ブロッキングした後、粗抽出液を１ウェル当たり１５０μｌ加え、室温で１時間置いた。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．２５％ジェラチン／０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０で３回洗浄した。125ＶＥＧＦ165を洗浄する時も同じバッファーで洗浄した。その結果、組換えタンパク質はＥＤＦと同程度のＶＥＧＦ親和性を有していることが示された。
【００７０】
以上の結果から本実施例の組換えタンパク質であるＦＬＴ第１〜第２イムノグロブリン様ドメイン−ヒトＩｇＧ1 Ｆｃ融合タンパク質は、ＥＤＦと同程度に高親和的にＶＥＧＦと結合し、ヒトＩｇＧ1 Ｆｃ特異的なモノクローナル抗体によって認識され、またプロテインＡとも結合するというヒトＩｇＧ1 Ｆｃの生化学的特性を有していることが示された。また本融合タンパク質は、ＥＤＦのＶＥＧＦ親和性という生化学的特性が、融合によっても損なわれていないことから、ＥＤＦと同様にＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦの活性を阻害できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ＦＬＴ細胞外領域のドメインの構成を表す模式図である。
【図２】４Ｎ−ＦＬＴを発現する組換えバキュロウイルスの構築過程の概要を示す図である。
【図３】５Ｎ−ＦＬＴを発現する組換えバキュロウイルスの構築過程の概要を示す図である。
【図４】Ｂ４ＮまたはＢ５Ｎ組換えバキュロウイルスを感染させた細胞の培養上清および抽出液のウェスタンブロットを示す図である。
【図５】４Ｎ−ＦＬＴまたは５Ｎ−ＦＬＴとＶＥＧＦ断片との相互作用に関するスカッチャード解析を示す図である。
【図６】ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ依存性チミジン取り込み促進のＥＤＦ、４Ｎ−ＦＬＴまたはＥＤＦΔ１１発現培養上清による阻害を示す図である。
【図７】ＥＤＦまたはＥＤＦΔ１１を発現する組換えバキュロウイルスを感染させた細胞と125Ｉ−ＶＥＧＦ121との共有結合架橋産物の電気泳動後のオートラジオフラフィーを示す図である。
【図８】ＥＤＦまたはＥＤＦΔ１１とＶＥＧＦ断片との相互作用に関するスカッチャード解析を示す図である。
【図９】ＥＤＦΔ１１の精製過程のＶＥＧＦアフィニティクロマトグラムと各フラクションの電気泳動パターンを示す図である。
【図１０】精製ＥＤＦΔ１１の電気泳動パターンとウェスタン解析を示す図である。
【図１１】ヒトイムノグロブリンＩｇＧ1のＦｃ領域の模式図と、単離するのに用いたプライマーの位置の対応を示す図である。
【図１２】ＰＣＲで増幅・精製したＤＮＡと制限酵素切断した組換えプラスミドのアガロースゲル電気泳動パターンを示す図である。
【図１３】ＰＣＲで増幅・精製したＤＮＡのアガロースゲル電気泳動パターンを示す図である。
【図１４】各ＤＮＡ断片の単離からＦＬＴ第１〜第２−ヒトＩｇＧ1-Ｆｃ発現組換えプラスミド構築までの過程の概略を示す図である。
【図１５】組換え大腸菌粗抽出液の抗ヒトＩｇＧ1-Ｆｃモノクローナル抗体によるウェスタンブロットを示す図である。
【図１６】組換え大腸菌粗抽出液と125Ｉ−ＶＥＧＦ165の共有結合架橋産物のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンを示す図である。
【図１７】Ａは組換え大腸菌粗抽出液と125Ｉ−ＶＥＧＦ165結合曲線、Ｂはそのスカッチャード解析を示す図である。
【図１】
2006094861.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2006094861.tif 000033
【配列表】
2006094861000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月10日(2005.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
５）免疫化学的解析
ＥＤＦまたは「ＥＤＦΔ１１」をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、「E. Harlow and D. Lane」の「Antibodies」に記載の方法に従ってウェスタンブロティングを行った。１次抗体として実施例１の４）の抗体を２μg/mlで使用し、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ（E. Y. Laboratories）を５０００倍希釈して使用し、ＮＴＢ(Nitroblue tetazolium chloride)／ＢＣＩＰ(5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate p-toluidine salt)（Gibco BRL社製）で発色させた。その結果、約３５ｋｄの単一バンドが観察され、この抗体との特異的な反応性が確認された（図１０Ｂ）。以上のことから「ＥＤＦΔ１１」はＦＬＴのＮ末端２６８アミノ酸に相当するポリペプチドであることがわかった。図１０Ａにおいてレーン１はヘパリンカラム後のサンプル、レーン２はＶＥＧＦアフィニティクロマトグラフィー後のサンプルを電気泳動して銀染色したものである。図１０Ｂは、図１０Ａと同じサンプルでウェスタンブロットを行った図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦに結合してＶＥＧＦの活性を阻害することができる、ＦＬＴの細胞外領域の第１イムノグロブリン様ドメインおよび第２イムノグロブリン様ドメインを含み、かつ第３イムノグロブリン様ドメインの一部と第４イムノグロブリン様ドメインから第７イムノグロブリン様ドメインとを含まないポリペプチドであって、ここで第３イムノグロブリン様ドメインの一部とは、配列番号：１のアミノ酸番号247からアミノ酸番号311までである、ポリペプチド。
【請求項２】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と融合している、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項６】
請求項１または２に記載のポリペプチドからなる医薬。
【請求項７】
請求項１または２に記載のポリペプチドからなる分析試薬。