(57)【要約】      （修正有）【課題】  ３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸、特に３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合ポリエステルの分解を促進する方法を提供する。【解決手段】  環境中より、３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸、特に３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合ポリエステルを分解する微生物を分離する。また同菌株よりデポリメラーゼ遺伝子を単離し、当該遺伝子を宿主細胞で発現させることにより、高効率に当該デポリメラーゼを製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する微生物。
【請求項２】
３−ヒドロキシ酪酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する請求項１記載の微生物。
【請求項３】
ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合ポリエステルである請求項１又は２記載の微生物。
【請求項４】
微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｎ１８−２５−９（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２２）である請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項５】
微生物がＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ  Ｎ１８−２５−１０（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２３）である請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項６】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
以下の（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のポリヌクレオチド：
（ｄ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７記載のポリヌクレオチドの上流にプロモーター配列を連結し、かつ、下流にターミネーター配列を連結した発現カセット。
【請求項９】
請求項８記載の発現カセットを含有するベクター。
【請求項１０】
請求項９記載のベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項１１】
請求項１〜５記載の微生物、または請求項１０記載の形質転換体を培養することからなる、３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項１２】
ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合ポリエステルである請求項１１記載のポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ポリヒドロキシアルカン酸（以下ＰＨＡと略す）分解微生物に関する。また、当該ＰＨＡを分解する酵素並びに当該酵素遺伝子、さらに当該酵素の製造方法に関する。より詳しくは、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸から成るＰＨＡを効率よく分解するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌及びセルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）細菌、両微生物より単離されたＰＨＡを分解する酵素、両微生物の利用方法、並びに、両微生物を培養することによりＰＨＡを分解する酵素を製造する方法に関する。さらに、当該バチルス属細菌より単離された当該酵素遺伝子、並びに、当該酵素遺伝子発現ベクターにより形質転換された当該形質転換体を培養することによりＰＨＡを分解する酵素を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、学校給食、レストランなどから出される廃棄物を、農業に有効な製品として再利用する方法として堆肥化が推進されている。土壌改良材として用いられた堆肥は、土壌の有機物の含有量、水分と栄養分を保持する力が増すため、化学肥料の投入量を減らし、植物の病気を抑えるという望ましい効果を持つ。このように堆肥を農業に用いることにより、廃棄物処理の問題を低投入型の持続可能な農業に転換することが可能となる。
【０００３】
しかしながら、廃棄物を堆肥化し農業用途に利用するためには、その中に含まれるプラスチック廃棄物を分別除去する必要があり、このような分別除去には多大な労力を要することから、堆肥化処理の大きな課題となっている。
【０００４】
現在までに数多くの微生物において、エネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積することが知られている。３−ヒドロキシアルカン酸のホモポリマーあるいはコポリマーであるこれらのポリエステル（ＰＨＡ）は熱可塑性高分子であり、堆肥化や自然環境中で微生物によって分解されることから、環境にやさしいプラスチックとして注目されている。このためこのような生分解性プラスチックはｏｎｅ  ｗａｙの利用が求められている農業用資材、食品容器、包装材料、衛生用品、ゴミ袋などへの幅広い応用を目指して開発が進められている。特に食品容器や包装材料などは、堆肥化処理のための分別除去の必要がないため、大きな期待が寄せられている。
【０００５】
しかし、現在のプラスチック使用量を考慮すると、自然界や堆肥化施設に存在する微生物による分解を待っているだけでは処理しきれなくなることが予想される。そこで微生物による分解を促進するために生分解性素材（ポリ乳酸）に微生物培地成分を配合する方法（特許文献１）、生分解性プラスチック素材（ポリ乳酸）にリパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、乳酸脱水素酵素などの加水分解酵素を添加する方法（特許文献２）、生分解性プラスチック素材（脂肪属ポリエステル）成形品を製造する際に配合する無機及び／または有機フィラーの配合量と平均体積を特定範囲に調節し、成形品使用中の生分解及び崩壊を抑制する方法（特許文献３）が提案されている。
【０００６】
また、３−ヒドロキシ酪酸（以下３ＨＢと略す）のホモポリマーであるポリヒドロキシ酪酸（以下ＰＨＢと略す）を分解する微生物の探索も行なわれた（特許文献４）。土壌より分離したシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物が分離され、本菌株がＰＨＢを分解する酵素であるデポリメラーゼ（Ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を産生することが見出された。この微生物並びに同酵素を利用することでＰＨＢの効率の良い分解が可能となった。また、デポリメラーゼ遺伝子のクローニングと遺伝子組換え技術を応用した高効率なデポリメラーゼの生産も行なわれている（特許文献５）。さらに４−ヒドロキシアルカン酸のようなω―ヒドロキシアルカン酸のホモポリエステルまたはそれを含有する共重合ポリエステルを効果的に分解する微生物並びに分解酵素も報告されている（特許文献６）。
【０００７】
ＰＨＡはｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ  ＰＨＡ（以下ＰＨＡＳＣＬと略す；３  ｔｏ  ５Ｃ−ａｔｏｍｓ）とｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ  ＰＨＡ（以下ＰＨＡＭＣＬと略す；６  ｔｏ  １４  Ｃ−ａｔｏｍｓ）に分類されている。ＰＨＡを分解する菌株は細菌やカビに広く分布しているが、ＰＨＡＳＣＬやＰＨＡＭＣＬを分解する微生物が多数分離されている（非特許文献１）。ほとんどの細菌はＰＨＡＳＣＬまたはＰＨＡＭＣＬを特異的に分解する。また、両タイプのＰＨＡを分解できる微生物としてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｆｏｌｉａｔｕｓが見いだされているが、それぞれのタイプのＰＨＡに対応する２種類以上の分解酵素を持つために分解可能であることが分かっている。（非特許文献２、非特許文献９）。
【０００８】
環境中でのＰＨＡの分解は主として菌株が生産するデポリメラーゼによって行われるが、デポリメラーゼには菌体外に分泌されるタイプ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）と菌体内に存在するタイプ（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）に分類される。このうち前者が環境中でのＰＨＡ分解に主に寄与している。これらの菌株より種々のデポリメラーゼが精製され、酵素学的な性質が明らかにされている。ＰＨＢ、ポリヒドロキシ吉草酸（以下ＰＨＶと略す）、ポリヒドロキシオクタン酸（以下ＰＨＯと略す）などを基質として検討した結果、これらのデポリメラーゼの基質特異性はＰＨＡＳＣＬまたはＰＨＡＭＣＬのいずれかに特異的であることが明らかになった（非特許文献１、非特許文献２）。
ＰＨＡＳＣＬを分解するＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅについては現在までよく研究され、一次構造が明らかにされている。その構造は、アミノ末端にある活性残基を含む触媒ドメイン、カルボキシル末端にある疎水性高分子物質に吸着するための基質結合ドメインからなり、さらに２つのドメインの間にはリンカードメインが存在する。触媒ドメインには、活性残基としてセリン、ヒスチジン及びアスパラギン酸が存在し、このうちセリン残基はリパーゼボックス様ペンタペプチド配列内（Ｇｌｙ−Ｘａａ１−Ｓｅｒ−Ｘａａ２−Ｇｌｙ）に存在する（非特許文献１、非特許文献１０）。
ＰＨＡＭＣＬを分解するＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅについての研究例はあまりなく、分子レベルで研究されているのはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのデポリメラーゼのわずか一例である。このデポリメラーゼの一次構造にＰＨＡＳＣＬを分解するＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅが有する触媒ドメインが存在し、さらには同様な活性残基も存在する。しかしながら、触媒ドメインがカルボキシル末端にあり、ＰＨＡＳＣＬを分解するＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅと異なる構造を持つ（非特許文献１１）。
【０００９】
一方でＰＨＢや３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）の共重合ポリエステルであるＰＨＢＶのようなＰＨＡＳＣＬの応用開発も進められてきた。しかしながら、これらのＰＨＡは結晶性が高く、硬くて脆い性質を持っていることから実用的には応用範囲が限られている。この為、この性質の改良を目的とした研究がなされてきた。
【００１０】
ＰＨＡＭＣＬはＰＨＢやＰＨＢＶよりも結晶性が低く弾力に富むことが知られており（非特許文献３）、幅広い応用が期待された。しかし、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を種々の宿主に導入することによりＰＨＡＭＣＬの生産が行なわれたが、いずれも生産性が低く工業生産に適したものではなかった（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。
【００１１】
近年、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下３ＨＨと略す）の共重合ポリエステル（以下ＰＨＢＨと略す）およびその製造方法について研究がなされた（特許文献７、特許文献８）。このＰＨＢＨは３ＨＨ組成の増加にしたがって、硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、３ＨＨ組成を変えることで、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで応用可能な幅広い物性を持つことが明らかになった（非特許文献７）。また、ＰＨＢＨの生産研究も実施され、実用化に向けた取組みが加速されている（特許文献９、非特許文献８）。
【００１２】
しかしながら、ＰＨＡＳＣＬとＰＨＡＭＣＬのハイブリッド型であるＰＨＢＨの分解酵素に関する研究はほとんど行なわれていない。現在までに見出されているデポリメラーゼはＰＨＡＳＣＬまたはＰＨＡＭＣＬを特異的に分解するが、ＰＨＢＨに関しては、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓの生産するＰＨＢ分解酵素が３ＨＢと３ＨＨの結合を加水分解できないといったわずかな知見のみである（非特許文献１）。したがって、広範な用途に対して応用が期待されているＰＨＢＨを分解する微生物が望まれていた。さらに同分解酵素を安価に製造する方法が求められていた。
【特許文献１】特開平４−１６８１５０号公報
【特許文献２】特開平４−１６８１４９号公報
【特許文献３】特開平４−１４６９５３号公報
【特許文献４】特開平７−１５５１８０号公報
【特許文献５】特開平９−１９１８８７号公報
【特許文献６】特開平１０−１９１９８０号公報
【特許文献７】特開平５−９３０４９号公報
【特許文献８】特開平７−２６５０６５号公報
【特許文献９】特開２００１−３４００７８号公報
【非特許文献１】Ｊｅｎｄｒｏｓｓｅｋ等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２，ｖｏｌ５６，４０３．
【非特許文献２】Ｓｃｈｉｒｍｅｒ等，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ５９，１２２０（１９９３）
【非特許文献３】Ｍａｄｉｓｏｎ等，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，ｖｏｌ６３，２１（１９９９）
【非特許文献４】Ｍａｔｓｕｓａｋｉ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ１８０，６４５９（１９９８）
【非特許文献５】Ｍａｔｓｕｓａｋｉ等，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，４０１（２００）
【非特許文献６】Ｌａｎｇｅｎｂａｃｈ等，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ１５０，３０３（１９９７）
【非特許文献７】Ｄｏｉ等，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｖｏｌ２８，４８２２（１９９５）
【非特許文献８】Ｐａｒｋ等，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｖｏｌ２，２４８（２００１）
【非特許文献９】Ｋｌｉｎｇｂｅｉｌ等，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ１４２，２１５（１９９６）
【非特許文献１０】Ｎｏｊｉｒｉ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ１７９，６９６５（１９９７）
【非特許文献１１】Ｓｃｈｉｒｍｅｒ等，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ４１，１７０（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記現状に鑑み、ハイブリッド型のＰＨＢＨを分解する微生物を提供することを目的とする。また、当該微生物よりデポリメラーゼ遺伝子を単離し、当該遺伝子を宿主細胞で発現させることによる高効率な当該デポリメラーゼの製造方法を提供することを目的とする。本発明により、大量に廃棄されたＰＨＢＨを効率良く安価に分解することが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、寒冷稲作地帯である新潟県新津市において１次、２次発酵が行われ、作製された堆肥の抽出液よりＰＨＢＨを分解するバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、セルロモナス・セルランス（Ｃｅｌｌｕｒｏｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ）を単離した。また、バチルス・メガテリウムよりデポリメラーゼ遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を宿主細胞で発現させることにより本デポリメラーゼを製造することに成功することで、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１２）を提供するものである。
（１）３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する微生物  
（２）３−ヒドロキシ酪酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する（１）記載の微生物
（３）ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合ポリエステルである（１）又は（２）記載の微生物
（４）微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｎ１８−２５−９（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２２）である（１）〜（３）のいずれか１項に記載の微生物
（５）微生物がＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ  Ｎ１８−２５−１０（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２３）である（１）〜（３）のいずれか１項に記載の微生物
（６）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する活性を有するポリペプチド
（７）以下の（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のポリヌクレオチド：
（ｄ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつ３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（８）（７）記載のポリヌクレオチドの上流にプロモーター配列を連結し、かつ、下流にターミネーター配列を連結した発現カセット
（９）（８）記載の発現カセットを含有するベクター
（１０）（９）記載のベクターによって形質転換された形質転換体
（１１）（１）〜（５）記載の微生物、または（１０）記載の形質転換体を培養することからなる、３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する活性を有するポリペプチドの製造方法
（１２）ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合ポリエステルである（１１）記載のポリペプチドの製造方法
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明におけるＰＨＡは以下の一般式で表される。
【００１７】
【化１】
2006238801.tif 000002
【００１８】
（式中のＲは炭素数１〜１３のアルキル基、ｍは２以上の整数を表す。ｍ個のＲは同一であってもよいし、異なっていてもよい。）
本発明の微生物は、３ＨＨから構成されるＰＨＡを分解するものであり、３ＨＢから構成されるＰＨＡも分解するものが好ましい。より好ましくは、下記一般式で表される、
【００１９】
【化２】
2006238801.tif 000003
【００２０】
（式中のｍ、ｎは１以上の整数を表す）３ＨＢと３ＨＨから構成される共重合ポリエステルを分解する微生物である。
【００２１】
（ＰＨＡ分解微生物の分離）
本発明の微生物は土壌、堆肥、活性汚泥、河川、海水などの環境中より分離することができる。微生物の分離には種々の方法が知られているが（農芸化学実験書、第２巻）、３ＨＨから構成されるＰＨＡ、特にＰＨＢＨを分解する微生物を分離できればどのような分離方法を用いてもよい。一例として、環境から得られた種々のサンプルを滅菌した水や生理的食塩水に懸濁し、菌体懸濁液を作製する。この懸濁液を適当な菌濃度に希釈後、３ＨＨから構成されるＰＨＡ、特にＰＨＢＨを唯一または主な炭素源として含有する固体培地上に塗布し、菌株の生育できる温度で培養する。培養温度は微生物が生育できる温度であれば特に制限されない。また、培地中に加えるＰＨＡはどのような形状のものであっても利用できるが、微細な粉末が好適である。加える濃度は特に制限されないが、固体培地が加えたＰＨＡによって白濁する０．０５％〜５％が好適であり、０．１％〜０．５％がより好適である。３ＨＨから構成されるＰＨＡを分解する微生物は、生育してきた菌体コロニーの周囲に同ポリマーを分解したことを示すハロー（溶解ゾーン）を形成することにより、検出・分離することができる。
【００２２】
また、種々のサンプルより分離した菌体懸濁液を、３ＨＨから構成されるＰＨＡ、特にＰＨＢＨを唯一または主な炭素源とする培地中に添加し、培養することにより、当該微生物を濃縮することもできる。その後、前記方法によって当該微生物を分離することができる。
【００２３】
本発明に係る３ＨＨから構成されるＰＨＡ、特にＰＨＢＨを分解する微生物の好適な分離例は次のとおりである。
【００２４】
一般細菌用培地（ＮＢ培地）に、新潟県新津市において１次、２次発酵した堆肥から得られた堆肥抽出液を塗布し、菌体コロニーを形成させる。これらのコロニーを粉末状のＰＨＢＨを０．３％含有するＮＢ培地に塗布する。培養後、菌体コロニーの周りにＰＨＢＨの溶解ゾーンを形成した微生物を２種類分離する。これらの菌株の同定は菌学的な性質や１６ＳリボゾーマルＤＮＡの配列比較により行なうことができる。本菌株を後者によって同定した結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍならびにＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓであることが明らかになり、それぞれＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｎ１８−２５−９（受領日：平成１７年２月２２日、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２２）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ  Ｎ１８−２５−１０（受領日：平成１７年２月２２日、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２３）と命名した。この２つの菌株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００２５】
生理学的な試験は一般的な方法に従って行った（長谷川武治、微生物の分類と同定、東京大学出版会、１５５２４５（１９７５）、Ｓｎｅａｔｈ等、Ｂｅｒｇｅｙ‘ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ２，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８６））。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｎ１８−２５−９（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２２）は、グラム陽性菌で、好気性の桿菌であり、胞子を形成し、生育条件温度は２０〜４５℃で、その他の生理学的性質は以下の表１の通りであった。また、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ  Ｎ１８−２５−１０（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２３）は、グラム陽性菌で、好気性の短桿菌であり、その他の生理学的性質は以下の表１の通りであった。
【００２６】
【表１】
2006238801.tif 000004
【００２７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｎ１８−２５−９（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２２）は、グリセロール、グルコース、フルクトース、マンニトール、セルビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、ラフィノース及びグリコーゲンを酸化あるいは同化することができた。また、エスクリン及びスターチを加水分解することもできた。
また、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ  Ｎ１８−２５−１０（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２３）は、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、セルビオース、マルトース、スクロース及びグリコーゲンを酸化あるいは同化することができ、エスクリン及びスターチを加水分解することができた。
【００２８】
（デポリメラーゼ遺伝子のクローニング）
１．ゲノムライブラリーの構築
３ＨＨから構成されるＰＨＡ、特にＰＨＢＨを分解する微生物のゲノムライブラリー構築は、種々の宿主・ベクター系を利用することができる。宿主によって特に制限されないが、３ＨＨから構成されるＰＨＡ、特にＰＨＢＨを分解しない宿主が好ましく、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）がより好ましい。ベクターは宿主内で複製、維持されるものであれば特に制限されない。詳しくは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）などの実験書を参考にすることができる。
【００２９】
３ＨＨから構成されるＰＨＡ、特にＰＨＢＨを分解する微生物のＤＮＡの調製は種々の既知の方法が利用できる。一例として、当該微生物の培養液より遠心処理等によって菌体を集め、リゾチームなどの溶菌酵素処理を行なう。次に凍結融解処理を行なったあと、ＳＤＳ溶液を重層し界面を混合することにより溶菌させる。同溶菌液にフェノール・クロロホルム溶液を添加し、蛋白質等の変性処理を行ったあと水層にエタノールを加える。析出するＤＮＡをガラス棒などで巻き取ることによりゲノムＤＮＡを調製することができる。
【００３０】
調製されたゲノムＤＮＡは物理的な切断や種々の制限酵素を用いて切断することができる。切断方法は特に制限されないが、例えば制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分切断し、８〜１０ＫｂのＤＮＡ断片を精製することができる。ベクターにはプラスミドやファージなどが利用できるが、特に制限されない。挿入するＤＮＡ断片にあわせて制限酵素で処理することによりゲノムライブラリーの構築に用いることができる。例えば制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分切断された８〜１０ＫｂのＤＮＡ断片は、制限酵素ＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ１９などのベクターに挿入することができ、大腸菌に形質転換することによりゲノムライブラリーを構築することができる。
【００３１】
２．デポリメラーゼ遺伝子のクローニング
ゲノムライブラリーを、３ＨＨから構成されるＰＨＡ、特にＰＨＢＨを唯一または主な炭素源として含有する固体培地上に塗布し、菌株が生育できる温度で培養する。ゲノムライブラリーの作製に用いた宿主がデポリメラーゼを分泌する場合は、宿主のみよりも大きな同ポリマー溶解ゾーンを形成するコロニーが当該デポリメラーゼ遺伝子を含有するクローンであり、宿主が大腸菌のようにデポリメラーゼを生産しない場合は、同ポリマー溶解ゾーンを形成するコロニーが当該デポリメラーゼ遺伝子を含有するクローンである。クローニングされた遺伝子は塩基配列の解析等を行なうことにより、当該遺伝子を同定することができる。
【００３２】
本発明に係るデポリメラーゼ遺伝子の好適な例として、配列番号１または配列番号２で示されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｎ１８−２５−９（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２２）由来のデポリメラーゼ遺伝子を挙げることができる。但し、配列番号１および配列番号２で示されるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、そのＤＮＡから翻訳されたポリペプチドが３ＨＨから構成されるＰＨＡを分解する活性を有する限り、当該デポリメラーゼ遺伝子に含まれるものとする。ここでストリンジェントな条件とは、例えば塩濃度は６ｘＳＳＣ、温度が６８℃、の条件をいう（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ））。
配列番号１又は配列番号２で示されるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、配列番号１又は配列番号２で示されるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、塩濃度６ｘＳＳＣ、６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３３】
また、配列番号１または配列番号２に示す塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、当該ポリメラーゼ遺伝子に含まれるものである。より好ましくは、９０％以上の相同性、更に好ましくは９５％以上の相同性、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列である。
ここで、「相同性（％）」とは、対比される２つのポリヌクレオチドを最適に整列させ、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８、１９９４年９月、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ５３７１１；Ｒｉｃｅ、Ｐ．（１９９６）Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ＥＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｐｅｔｅｒ  Ｒｉｃｅ、Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｈｉｎｘｔｏｎ  Ｈａｌｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＣＢ１０  １ＲＱ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、および、ｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【００３４】
更に、配列番号３または配列番号４に示す配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加され、かつ３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、当該ポリメラーゼ遺伝子に含まれるものである。
「１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により欠失、置換及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されることを意味し、通常、１〜３個である。
配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、３ＨＨから構成されるＰＨＡを分解する活性を有する限り、本発明のポリヌクレオチドに包含される。
【００３５】
なお、後述するように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｎ１８−２５−９（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２２）由来のデポリメラーゼ遺伝子は、分泌配列として機能することが予測される部分を有し、配列番号２は、配列番号１の塩基配列から分泌配列として機能することが予測される部分を除いたものである。
【００３６】
（デポリメラーゼの製造方法）
１．３ＨＨから構成されるＰＨＡ、特にＰＨＢＨを分解する微生物を用いたデポリメラーゼの製造
本発明の、３ＨＨから構成されるＰＨＡを分解する活性を有するポリペプチドの製造方法は、上記微生物を培養することからなるものである。
本菌株の培養には、種々の炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の有機栄養源を任意に用いることができる。
炭素源としては、例えばグルコース、ショ糖、油脂などが利用できる。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。また、精米時に大量に得られる米糠や砂糖の生産時に副生する糖蜜等も培地として用いることもできる。
【００３７】
培養温度は、その菌が生育可能な温度であればよい。培養時間は菌体を効率よく生産できる時間であれば特に制限はない。このような培養で得られた培養液はデポリメラーゼ溶液または菌体製剤として利用することができる。また、菌体培養液を遠心分離などによって培養液と菌体とにそれぞれ分離して利用することもできる。前者はデポリメラーゼ溶液、後者は菌体製剤として利用できる。また、培養液より種々の方法によって精製されたデポリメラーゼを利用することもできる。
【００３８】
２．デポリメラーゼ遺伝子を用いたデポリメラーゼの製造
クローニングされたデポリメラーゼ遺伝子を宿主で発現させることにより、当該形質転換体でデポリメラーゼを製造することができる。すなわち、本発明の、３ＨＨから構成されるＰＨＡを分解する活性を有するポリペプチドの製造方法は、上記形質転換体を培養することからなるものである。前記デポリメラーゼ遺伝子クローニングで得られた遺伝子を導入した形質転換株は、当該デポリメラーゼを発現しているので、本形質転換株を、３ＨＨから構成されるＰＨＡ、特にＰＨＢＨを分解する菌体製剤として利用することができる。また培養液はデポリメラーゼ溶液として利用することができる。
【００３９】
当該遺伝子のより効率的な発現を行なうため、種々の宿主・ベクター系を利用することができる。宿主・ベクター系として細菌、酵母、動物細胞等の系を利用することができるが、効率よく当該遺伝子を発現、製造できれば特に制限されない。クローニングされたデポリメラーゼ遺伝子が当該遺伝子の発現に必要なプロモーター、ターミネーターを有し、かつ宿主内で発現できる場合はそのまま利用することができる。また、デポリメラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡに種々のプロモーターおよびターミネーターを接続した発現カセットを作製し、本発現カセットをベクターに組込むことにより当該発現ベクターを構築することができる。当該デポリメラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡであるポリヌクレオチドの上流にプロモーター配列を連結し、かつ、下流にターミネーター配列を連結した発現カセットも、本発明の一つである。
【００４０】
一例として大腸菌を利用する場合、効率よく遺伝子発現を行なうために種々の発現ベクターを構築することができる。ラクトースオペロンのプロモーター、トリプトファンオペロンのプロモーター、前２種類の融合プロモーターおよびλファージのプロモーター等の下流に当該遺伝子を接続し、当該遺伝子の下流にターミネーターを接続したデポリメラーゼ発現カセットを構築することができる。ターミネーターにはｒｒｎターミネーターなどが利用されうるが、特に制限されるものではない。これらの発現カセット作製において、当該宿主で分泌シグナルとして機能するＤＮＡ配列を接続することで、デポリメラーゼを菌体外に分泌させることができる。一例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｎ１８−２５−９（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２２）のデポリメラーゼ（配列番号３）は、同配列の１番目のメチオニンから２４番目のアラニンまでが分泌配列として機能することが予測されており、本配列をコードするＤＮＡは種々のデポリメラーゼの分泌に利用することができる。なお、配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号３の配列から分泌配列として機能することが予測される部分を除いたものである。
【００４１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドも、本発明の一つである。
（ａ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１または配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつ、３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−ヒドロキシヘキサン酸から構成されるポリヒドロキシアルカン酸を分解する活性を有するポリペプチド
（ｂ）における「ストリンジェントな条件」及び（ｃ）における「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸」の調製法は、上述のとおりである。
【００４２】
このようにして作製された発現カセットを宿主内で複製、維持されるベクターに導入することによりデポリメラーゼ発現ベクターを構築することができる。作製された発現ベクターを宿主に形質転換し、デポリメラーゼ形質転換株を作製することができる。本形質転換株は、発現カセットに分泌シグナルＤＮＡを含む場合にはデポリメラーゼを菌体外に分泌することができ、同配列を有しない場合には当該デポリメラーゼを菌体内に蓄積することができる。
上記発現カセットを含有するベクター、当該ベクターによって形質転換された形質転換体も、本発明の一つである。
【００４３】
本形質転換株の培養には、種々の炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の有機栄養源を任意に用いることができる。
炭素源としては、例えばグルコース、ショ糖、糖蜜、油脂などが利用できる。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
【００４４】
培養温度は、その形質転換株が生育可能な温度であればよい。培養時間はデポリメラーゼを効率よく生産できる時間であれば特に制限はない。このようにしてデポリメラーゼを効率よく製造することができる。
【発明の効果】
【００４５】
本発明によって、今後広く普及することが期待されている生分解性ポリマー（３ＨＨから構成されるＰＨＡ、特にＰＨＢＨ）からなる廃棄物の処理を、効率よく行なうことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によりその技術範囲を限定されるものではない。
（実施例１）生分解性プラスチック分解菌の単離
３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合ポリエステルＰＨＢＨ（粉末、フィルム、分子量１２０万、３ＨＨ組成６モル％）は株式会社カネカより提供された。
寒冷稲作地帯である新潟県新津市において１次、２次発酵した堆肥から得られた抽出液を用い、ＮＢ培地（表２）上でコロニーを形成した微生物をＮＢ培地に０．３％ＰＨＢＨを混合した寒天培地上で培養し、溶解ゾーンを形成する微生物を探索した。その結果、Ｎ−１８−２５−９、Ｎ−１８−２５−１０の２株が得られた。Ｎ−１８−２５−９株は炭素源としてＰＨＢを加えた寒天培地においてもポリマー溶解ゾーンを形成した。
【００４７】
【表２】
2006238801.tif 000005
【００４８】
（実施例２）分解菌の同定
１６ＳｒＤＮＡ配列を用いた微生物の同定法により、Ｎ−１８−２５−９株、Ｎ−１８−２５−１０株の同定を行った。
前記２株から染色体ＤＮＡを抽出し（方法は、実施例３参照）、ユニバーサルプライマー配列番号５、配列番号６を用いてＰＣＲ法により各菌株の１６ＳｒＤＮＡを増幅した。増幅ＤＮＡをＴ−ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）にクローニング後、同１６ＳｒＤＮＡの５‘側約５００塩基の配列を決定した。それぞれの塩基配列はＤＤＢＪにＮ−１８−２５−９（登録番号ＡＢ１９００４０）、Ｎ−１８−２５−１０（登録番号ＡＢ１９００４１）として登録されている。
それぞれの１６ＳｒＤＮＡ塩基配列をもとに、ＮＣＢＩのＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）、ＲＤＰＩＩのＳｅｑｕｅｎｃｅ  ｍａｔｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｓｅｑｍａｔｃｈ／ｓｅｑｍａｔｃｈ−ｉｎｔｒｏ．ｊｓｐ）のプログラムを利用して配列の比較を行った。その結果、Ｎ−１８−２５−９株は両プログラムを利用した解析結果からＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＡＣ４６ｂ１（Ａｊ７１７３８１）と９９％  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙを示したことから、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｎ１８−２５−９（受領日：平成１７年２月２２日、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２２）と命名した。Ｎ１８−２５−１０株は両プログラムを利用した解析結果からＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ  ＤＳＭ４３８７９（Ｘ７９４５５．１）と９８％  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙを示したことから、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕａｎｓ  Ｎ１８−２５−１０（受領日：平成１７年２月２２日、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２３）と命名した。この２つの菌株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００４９】
（実施例３）染色体ＤＮＡの調製
５０ｍｌのＮＢ培地（表２）で一晩培養したＮ−１８−２５−９株を集菌し、７．５ｍｌのｓａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  エチレンジアミン四酢酸  （ｐＨ８．０））に懸濁した。５０ｍｌ容遠心管中で、菌体懸濁液にリゾチームが最終濃度１ｍｇ／ｍｌになるように加え、よく溶解し、時々撹拌しながら３７℃で１５分間インキュベートした。粘度が増加し始めたら直ちに−８０℃のフリーザーで凍結した。粘度の増加が３０分たっても見られない場合は、リゾチームをさらに添加した。次に凍結した菌体を６０℃の湯浴にいれたあと、Ｔｒｉｓ−ＳＤＳ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ９．０）、１％ドデシル硫酸ナトリウム）を７．５ｍｌ加え、滅菌済みのガラス棒で凍結菌体とＳＤＳ溶液の界面を混合させながら溶菌させていった。粘度の増加を確認しながら、試料がほぼ６０℃に達したら１０分間インキュベートし、その後氷冷した。１５ｍｌのフェノール・クロロホルム溶液を加えた後、氷令しながら１５分間強く、振とうした。７５００ｒｐｍ、２０分、４℃の条件で遠心した後、上層の水層を新しい５０ｍｌ容の遠心管に移し、再度フェノール・クロロホルム抽出を行った。−２０℃で冷却しておいたエタノールを３０ｍｌ加え、ガラス棒でかき混ぜながら、沈殿してくるＤＮＡをガラス棒に巻き取った。得られたＤＮＡを１０ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、適当量のＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解して、染色体ＤＮＡ溶液とした。
【００５０】
（実施例４）  ゲノムライブラリーの作製
Ｎ−１８−２５−９株のＴｏｔａｌ  ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分的に処理した後、次の方法で分画した。
１０％  ｓｕｃｒｏｓｅ  ＴＥＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＥ，１０ｍＭ  ＮａＣｌ）溶液及び４０％  ｓｕｃｒｏｓｅ  ＴＥＳ溶液を用いて、１０％、１１．２５％、１２．５％、１３．７５％、１５％、１６．２５％、１７．５％、１８．７５％、２０％、２１．２５％、２２．５％、２３．７５％、２５％、２６．２５％、２７．５％、２８．７５％、３０％、３１．２５％、３２．５％、３３．７５％、３５％、３６．２５％、３７．５％、３８．７５％、４０％の濃度のｓｕｃｒｏｓｅ  ＴＥＳ溶液を作製した。これらの溶液を５００μｌずつ５０μｌ用のマイクロピペットの先端が底につくようにＢｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ  ｔｕｂｅ（１４ｘ８９ｍｍ）に取り付け、ペリスタポンプを用いて薄い溶液から濃い溶液の順で穏やかに積み上げた。ショ糖濃度勾配溶液の入ったチューブを４℃で一晩静置したあと、ＤＮＡ溶液を重層し、ＳＷ４１  Ｔｉ  ｒｏｔｏｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ）で２６０００ｒｐｍ、１８時間、１５℃の条件で遠心した。遠心後、ペリスタポンプを用いて底から５００μｌずつ分画し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片の大きさを確認した。目的の８−１０ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む画分を回収し、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿をした後、適当量のＴＥに溶解した。
以上のように調製したＤＮＡ断片を、制限酵素ＢａｍＨＩで消化後ＢＡＰ処理したｐＵＣ１９と連結した。それを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、一部を寒天培地にプレーティングしてライブラリーの大きさ、挿入効率を調べた。残りはアンピシリン入りのＬＢ培地で一晩培養し、プラスミドを抽出すると共に菌体を１５％グリセロール溶液として−８０℃で保存した。
【００５１】
（実施例５）デポリメラーゼ遺伝子のクローニング
前記ゲノムライブラリーの構築により、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｎ１８−２５−９（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２２）より約２，５００クローンより成るゲノムライブラリーを作製した。本ライブラリーを０．３％のＰＨＢＨを含有するＮＢ培地にプレーティングした結果、クリアゾーン（溶解ゾーン）を形成する１株のクローンが見出された。本クローンからプラスミドを回収し、回収プラスミド（ｐＵＣＢＭ−Ａと命名した）を再度大腸菌に形質転換したところ、当該形質転換株はポリマー溶解ゾーンを形成した。
次にポリマー溶解ゾーン形成能（ＰＨＢＨ分解能）を付与する遺伝子部位決定のために、挿入断片の塩基配列の決定を行った。当該ＤＮＡの制限酵素地図を図１に示す。
塩基配列の解析の結果、当該ＤＮＡの中に他の微生物において生分解性プラスチックを分解する酵素として知られるＰＨＢ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの保存配列が見出された。そこでｐＵＣＢＭ−Ａを制限酵素ＳａｃＩ、ＨｉｎｃＩＩで処理した後、同保存配列を有するＯＲＦ部分のみを含む約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、ｐＵＣ１９にクローニングした（ｐＵＣＢＭ−ＡＳＨと命名した）。ｐＵＣＢＭ−ＡＳＨを大腸菌ＤＨ５αに形質転換したところ、ＰＨＢＨを含有するＮＢ培地またはＰＨＢＨを含有するＬＢ培地上でポリマー溶解ゾーンを形成した。以上の結果から、本ＯＲＦ部分をデポリメラーゼ遺伝子と決定し、この遺伝子をＰｈａＺＢｍと命名した。
【００５２】
（実施例６）デポリメラーゼ遺伝子の解析
Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｎ１８−２５−９（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０４２２）のデポリメラーゼ遺伝子は、１７７３塩基（ＧＣ含量は４０．３％）、５９０アミノ酸からなり、予想分子量は６２．３ＫＤａであった。ＡＴＧ開始コドンの１０塩基上流にＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（ＴＡＡＧＧＡＧＧＡ）が存在していた。また、予想プロモーター配列−３５（ＴＴＧＡＴＴ）、−１０（ＣＡＴＣＴＴ）が見られた（図２、配列番号７）。
なお、当該デポリメラーゼ遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１と３に示し、これらの配列から、分泌配列として機能することが予測される部分を除いた塩基配列とアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２と４に示す。
現在まで知られているデポリメラーゼのＮ末端にはシグナルペプチドが付加されているケースが多い。そこでＳｉｇｎａｌＰ  ３．０  ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を利用してＰｈａＺＢｍにおけるシグナルペプチドの存在の有無を解析した。ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮ（ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ）を利用した解析を行ない、切断部位を予想するＣ  ｓｃｏｒｅ，Ｙ  ｓｃｏｒｅ、シグナルペプチドを予想するＳ  ｓｃｏｒｅを統合した結果、配列番号３で示したポリペプチドの２４番目のアラニンと２５番目のアラニンの間（ＳＳＡ−ＡＧ）で切断されることが予想された。また、ＳｉｇｎａｌＰ−ＨＭＮ（ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌｓを用いた解析結果によっても、同様の結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｎ１８−２５−９のデポリメラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片の制限酵素地図である。
【図２−１】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｎ１８−２５−９のデポリメラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片の塩基配列及びアミノ酸配列である。
【図２−２】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｎ１８−２５−９のデポリメラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片の塩基配列及びアミノ酸配列である。
【図２−３】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｎ１８−２５−９のデポリメラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片の塩基配列及びアミノ酸配列である。
【図２−４】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｎ１８−２５−９のデポリメラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片の塩基配列及びアミノ酸配列である。
【図１】
2006238801.tif 000006
【図２−１】
2006238801.tif 000007
【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【配列表】
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