(57)【要約】【課題】他の細胞との物理的接触・細胞間インタラクションのある状態での心筋拍動細胞ネットワークを持つ心筋細胞バイオアッセイを可能にする。【解決手段】基板上に、４個以上の心筋拍動細胞を隣接して特定の空間配置の中に閉じ込めておくための複数の区画壁と区画壁間を結ぶ溝またはトンネルを有し、細胞の電位変化を計測するための複数の電極パターンが各溝またはトンネルに設けられ、区画壁の上には、光学的に透明な半透膜および培養液槽が配置されていることを特徴とする集合細胞マイクロアレーを形成し、複数の微小区画のそれぞれに一つの心筋拍動細胞を収納し、微小区画のそれぞれに検査試料を添加し、前記微小区画のそれぞれに収納された細胞の電位変化ないし形状の変化を観測してバイオアッセイを行う。【選択図】図１
2006094703.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４個以上の心筋拍動細胞ネットワークを各細胞が観察できる状態に配置する手段、
各細胞の電気的刺激あるいは応答を１細胞ごとに制御および計測する手段、
各細胞の空間配置が培養中の条件変化を防ぐ手段と、
を有することを特徴とする心筋細胞バイオアッセイチップ。
【請求項２】
４個以上３２個以下の心筋拍動細胞ネットワークを各細胞が観察できる状態に配置する手段、
各細胞の電気的刺激あるいは応答を１細胞ごとに制御および計測する手段、
各細胞の空間配置が培養中の条件変化を防ぐ手段と、
を有することを特徴とする心筋細胞バイオアッセイチップ。
【請求項３】
心筋拍動細胞を1細胞ずつ保持できる複数の微小区画と、
前記複数の微小区画の隣接する微小区画間をつなぐ溝またはトンネルと、
あらかじめ細胞１個ずつが挿入されている前記隣接する４以上の微小区画と、
前記各微小区画に心筋拍動細胞の培養液を供給する手段と、
を有することを特徴とする心筋細胞バイオアッセイチップ。
【請求項４】
基板と、
前記基板上に、４個以上の心筋拍動細胞がお互いに隣接するように配置された微小区画と、
前記各微小区画をつなぐ溝またはトンネルと、
前記各微小区画に心筋拍動細胞の培養液を供給する手段と、
を有することを特徴とする心筋細胞バイオアッセイチップ。
【請求項５】
心筋拍動細胞を１細胞ずつ保持できる複数の微小区画と、
前記複数の微小区画の隣接する微小区画間をつなぐ溝またはトンネルと、
あらかじめ細胞１個ずつが挿入されている隣接する４ないし３２の微小区画と、
前記各微小区画に心筋拍動細胞の培養液を供給する手段と、
を有することを特徴とする心筋細胞バイオアッセイチップ。
【請求項６】
基板と、
前記基板上に、心筋拍動細胞4個以上３２個以下がお互いに隣接するように配置した微小区画と、
前記複数の微小区画の各区画をつなぐ溝またはトンネルと、
前記各微小区画に心筋拍動細胞の培養液を供給する手段と、
を有することを特徴とする心筋細胞バイオアッセイチップ。
【請求項７】
前記複数の微小区画を形成する材料の材質がアガロースである請求項１ないし６のいずれか一つに記載の心筋細胞バイオアッセイチップ。
【請求項８】
基板上に、４個以上の心筋拍動細胞を隣接して特定の空間配置の中に閉じ込めておくための複数の区画壁と区画壁間を結ぶ溝またはトンネルを有し、細胞の電位変化を計測するための複数の電極パターンが各溝またはトンネルに設けられ、区画壁の上には、光学的に透明な半透膜および培養液槽が配置されていることを特徴とする集合細胞マイクロアレー。
【請求項９】
基板上に形成されるとともに互いに溝またはトンネルで連絡された複数の微小区画のそれぞれに一つの心筋拍動細胞を収納し、前記複数の微小区画の隣接する８個以上の微小区画のそれぞれに検査試料を添加し、前記微小区画のそれぞれに収納された細胞の電位変化ないし形状の変化を観測するバイオアッセイ。
【請求項１０】
前記検査試料がペプチドやアミノ酸などの生体物質ないし内分泌かく乱物質や毒性を疑われる化学物質である請求項９記載のバイオアッセイ。
【請求項１１】
基板上に、４個以上の心筋拍動細胞を隣接して特定の空間配置の中に閉じ込めておくための複数の区画壁と区画壁間を結ぶ溝またはトンネルを有し、細胞の電位変化を計測するための複数の電極パターンが各溝またはトンネルに設けられ、区画壁の上には、光学的に透明な半透膜および培養液槽が配置されていることを特徴とする集合細胞マイクロアレーを使用して、各溝またはトンネルに配置する電極を用いて細胞間に電気的刺激を与え、細胞が応答する電位変化ないし形状変化を計測するバイオアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋拍動細胞の状態を電位応答あるいは顕微鏡観察しながら、細胞の集団的性質を最小限の細胞数で観測する新しいバイオアッセイシステム、および、心筋拍動細胞を用いたバイオアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の状態の変化や、細胞の薬物等に対する応答を観察するのに多用されているのはバイオアッセイである。従来のバイオアッセイでは、一般的に培養細胞を用いることが多い。この系では複数の細胞を用いてアッセイを行うので、細胞集団の値の平均値をあたかも一細胞の特性であるかの様に観察してきた。
【０００３】
しかし、実際には細胞は集団の中で細胞周期が同調しているものはまれであり、各々の細胞が異なった周期でタンパク質を発現している。このため、刺激に対する応答の結果を解析するときにゆらぎの問題が常に付きまとう。
【０００４】
すなわち、細胞の反応機構自体が普遍的に持つ応答のゆらぎが存在するために、常に、平均的なレスポンスしか得ることができない。これらの問題を解決するために、同調培養等の手法が開発されているが、常に同じステージにある細胞群を使用することは、常にそのような細胞を供給し続けなければならないということで、バイオアッセイを広く一般に広める障害となっている。
【０００５】
また、細胞に対する刺激（シグナル）は、細胞周辺の溶液に含まれるシグナル物質、栄養、溶存気体の量によって与えられるものと、他の細胞との物理的接触・細胞間インタラクションによるものの２種類があることからも、ゆらぎについての判断が難しいのが実情であった。
【０００６】
細胞の物理的接触・細胞間インタラクションの問題は、バイオアッセイを組織断片のような細胞塊で行うことである程度解決できる。しかしこの場合、培養細胞と異なり、常に均一な素性の細胞塊を得ることができない。そのため、得られるデータがばらついたり、集団の中に情報が埋もれてしまったりする問題がある。
【０００７】
細胞の状態を測定する手段としては、たとえば、神経細胞において、人工的に少数の神経細胞からなる比較的単純な神経回路網を構築し、完全に制御した環境下で細胞ネットワークが情報処理機能を明らかにしようとする研究も盛んに行われている（非特許文献１−３）。
【０００８】
細胞群の細胞の１つ１つを最小構成単位とする情報処理モデルの計測のために重要なものは、多点同時計測技術と、細胞ネットワークパターンの制御技術であるが、電極アレー（ＭＥＡＳ）基板上での神経細胞の培養計測法が開発されている。
【０００９】
また、細胞のネットワークパターンを化学的、あるいは物理的な手法を用いて制御する技術についても古くから多くの研究がなされている。たとえば、化学的方法では、Letourneau達が神経細胞を培養する基板表面にラミニンなどの細胞接着性の基質でパターンを描き、神経突起をパターンに沿って伸展させることに成功している（例えば、非特許文献４）。
【００１０】
物理学的方法では、基板表面に神経細胞の伸展にとって障壁となる段差を構築した基板上で培養することで、障壁の高さが１０μｍ程度以上であれば神経細胞の伸展・移動を制限することが可能という報告がある（例えば、非特許文献５−６）。
【００１１】
発明者らのグループは、特定の一細胞のみを選択し、その一細胞を細胞株として培養する技術、及び細胞を観察する場合に、細胞の溶液環境条件を制御し、かつ、容器中での細胞濃度を一定に制御する技術、あるいは相互作用する細胞を特定しながら培養観察する技術を開発している（特許文献１）。また、細胞培養を行いながら集束光を照射して加熱した領域の細胞培養容器の形状を自在に変化させることが可能な細胞培養マイクロチャンバーを開発している（特許文献２）。
【００１２】
【特許文献１】特開２００４−８１０８６号公報
【特許文献２】特開２００４−８１０８５号公報
【非特許文献１】Dichter, M.A. Brain Res., 149, 279-293 (1978) や、Mains R.E., Patterson P. H. J. Cell. Biol., 59, 329-345 (1973)
【非特許文献２】Potter S.M., DeMarse T.B., J. Neurosci. Methods, 110, 17-24 (2001)
【非特許文献３】Jimbo Y., Tateno T., Robinson H.P.C., Biophys. J. 76, 670-678 (1999)
【非特許文献４】Letourneau P.C.: Dev. Biol., 66, 183-196 (1975)
【非特許文献５】Stopak D. et al.: Dev. Biol., 90, 383-398 (1982)
【非特許文献６】Hirono T.,Torimitsu K., Kawana A., Fukuda J., Brain Res., 446, 189-194 (1988)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従来のバイオアッセイでは、細胞を組織断片として扱うか、培養細胞のように１細胞として扱うかのいずれかであった。細胞の数が多すぎると上記従来技術の項で述べたように、得られる情報が平均的なものになってしまい、薬剤などに対するレスポンスが正確に得られない問題がある。細胞を１細胞ずつ用いる場合は、本来、多細胞組織の細胞として機能している細胞を、引き離された独立した状態の細胞として使用するために、細胞同士のインタラクションの影響が現れなくなることとなり、やはり正確な薬剤レスポンスすなわちバイオアッセイデータを得る上で問題がある。従って、必要最小限の細胞群でバイオアッセイを行えるデバイスやシステムを開発することが唯一上記問題を解決する道である。
【００１４】
本発明は、以上のような従来技術の問題点を解消し、細胞の機能を明らかにするため、また、薬剤などに対する細胞レスポンス検査（バイオアッセイ）を行える手法と装置の開発を目的している。すなわち、少数の細胞間ネットワークを完全に制御しながら、細胞ネットワークの刺激応答の変化を計測することのできる新しい技術手段を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、上記の課題を解決するものとして、細胞が集団として機能する細胞数を実験的に求めた結果をもとに、最小の細胞数のネットワークをチップ上に構築している。すなわち、細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めておくための複数の細胞培養区画を構成し、隣接する区画間は細胞の通り抜けることができない溝またはトンネルでお互いを連結する。必要に応じて、溝またはトンネルあるいは細胞培養区画に、細胞の電位変化を計測するための複数の電極パターンを持つ構造の集合細胞マイクロアレー（バイオアッセイチップ）を構築している。
【００１６】
ここで重要なのは必要な細胞数であるが、上記集合細胞マイクロアレーの細胞培養区画に入れられた細胞間で具体的にインタラクションできるようにして、細胞数を変化させて生化学レスポンスを測定し、組織構成上の最小の細胞数を発見した。さらに、バイオアッセイチップに最適な細胞ネットワークとして心筋拍動細胞を用いることで、バイオアッセイを容易にできるようにしている。
【発明の効果】
【００１７】
最小の細胞単位を最小数でインタラクションできるように用いることで、本来の多細胞状態を反映した高精度なバイオアッセイが可能となる。さらに、このことにより再現性の良いバイオアッセイが可能となる。さらに、心筋拍動細胞ネットワークを用いることで、可視的あるいは電気的にデータが容易に取れるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（実施例１）
図１は本発明の実施例１に係る心筋細胞バイオアッセイチップの構造の１例を模式的に示した上面図である。図２は、図１のＡ−Ａ位置において矢印方向に見た断面図である。ただし、心筋細胞は図示していない。１は基板であり、すべての構造物は基板１の上に構築されている。２は心筋細胞保持区画であり、所定の間隔で周期的に複数個構築されている。３は溝またはトンネルであり、隣接する心筋細胞保持区画２を互いに結んでいる。心筋細胞はお互いに溝またはトンネル３を介して突起を伸ばし接触してギャップジャンクションを形成している。１００はアガロースゲルであり、基板１の上に形成され、心筋細胞保持区画２とこれらの間を連絡する溝またはトンネル３は、アガロースゲル１００を部分的に除去して形成されている。４−１、４−２は電極であり、電極４−１は溝またはトンネル３のすべてに、電極４−２は心筋細胞保持区画２のすべてに設けられる。電極４は細胞観察の邪魔にならないように、透明電極（ＩＴＯ）で構成されており基板１の表面に蒸着で付けてある。５は外部端子であり、基板１の周辺で電極４に対応してその近傍に設けられる。６は配線で電極４と外部端子５とを接続する。なお、配線６は、図が煩雑となるので、図２では省略されている。電極４ならびに配線６は、１００ｎｍ程度の厚みであり、透明なＩＴＯ製である。１−１は壁であり、基板１上に設けられ、アガロースゲル１００の周辺部を、この壁で形成、保持するものとしている。９は半透膜であり、心筋細胞保持区画２とこれらの間を連絡する溝またはトンネル３を形成したアガロースゲル１００の上面に密着して設けられる。２２は上部ハウジングであり、半透膜９の上に適当なスペースをとってアガロースゲル１００の上面の全域を覆う。２２−１は、上部ハウジング２２の立下り部である。２１は半透膜９と上部ハウジング２２との間に形成される培養液槽である。２３は、上部ハウジング２２に設けられた開口部であり、これを通して培養液が培養液槽２１に供給される。１４は共通電極であり、培養液槽２１に設けられる。半透膜９を通して培養液が心筋細胞保持区画２に保持された細胞に供給されることにより、培養中の条件変化を防ぐことができる。
【００１９】
作成手順は、基板１上に、電極４、配線６、端子５を形成した後、壁１−１を基板１上面に貼り付け、壁１−１内に熱融解したアガロース１００を入れる。２％アガロースゲル（融解温度６５℃）を電子レンジで加熱し、融解させる。６５℃に加熱した基板１の外壁１−１の内側に融解したアガロース溶液を添加し、直ちにスピンコーターを用いて均一の厚さに広げる。ここではアガロースゲル膜が０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍ厚になるようにアガロースゲルの添加量とスピンコーターの回転速度を調整する。装置やアガロースゲルのロットにより厚みが異なるが、５０ｒｐｍ，１５秒間、続いて２００ｒｐｍ１０秒間で良い結果を得ている。湿潤箱の中で２５℃１時間放置することでアガロースゲル膜１００を形成する。この時点では、アガロースゲル膜は基板１の外壁１−１の内側全面に形成されている。次に、アガロースゲル１００で心筋細胞保持区画２を形成するために、アガロースゲル１００を形成した後、心筋細胞保持区画２の部分を取り除く。これは、水に吸収のある波長帯域(たとえば１４８０ｎｍ)のレーザーを用いることで容易に取り除くことができる。
【００２０】
図２には心筋細胞保持区画２の作成が終わったアガロース製電極付心筋細胞バイオアッセイチップの断面図と、アガロースゲル１００に溝またはトンネル３を作成する光学系と制御系を模式的に示している。アガロースゲル１００の上面は、半透膜９として、セルロース膜（例えば、分画分子量３万ダルトンのものを用いる）を用いる。たとえば、加熱溶融したアガロースをスピンコーターでセルロース膜表面に塗布、片面にアガロース薄膜を形成したものを予め作成し、これを、細胞を心筋細胞保持区画２に入れた後にアガロース塗布面がアガロースゲル１００に接するように乗せればよい。あるいは、アガロースゲル１００を形成するときに、ストレプトアビジンコンジュゲートアガロースを少量添加して固める。このアガロースゲル誘導体の表面にはストレプトアビジンが露出している。別途、過ヨウ素酸酸化によりアルデヒド基を導入したセルロース膜にビオチンヒドラジドを反応させ、ハイドロボレーション反応で還元して得るビオチン修飾セルロース膜を調製する。アガロースゲル誘導体とビオチン修飾セルロース膜をビオチン―アビジン反応を用いて固定することで、アガロース構造体に細胞を封じ込めた構造体を形成することができる。セルロース膜周辺部は、壁１−１の外側で、基板１に上記と同様にビオチン―アビジン反応で貼り付ければよい。すなわち、セルロース膜はビオチン修飾されているので、壁１−１とその外側の基板１表面にストレプトアビジンを固定して用いればよい。ストレプトアビジンの固定には、基板にシランカップリング反応でグリシドキシ基を導入してストレプトアビジンのアミノ基と直接反応させて固定したり、あるいは、基板をアミノシラン化して、ストレプトアビジンのアミノ基との間をグルタルアルデヒドのような２価性試薬で架橋してやればよい。さらに、この上に、上部ハウジング２２の立下り部２２−１を貼り付ければよい。
【００２１】
照射するレーザーは水に吸収される１４８０ｎｍのレーザー１４１を用いる。レーザービーム１４２はエキスパンダー１４３を通り、７４０ｎｍ以上の赤外光を反射するが１４８０ｎｍ（±２０ｎｍ）の光を透過するフィルター１４４を通過し、さらに７００ｎｍ以上の光を透過する蒸着フィルター１４５を通り抜け、集光レンズ１４６で基板１の上面に焦点が合う。１４８０ｎｍの収束光はアガロース層に含まれる水に吸収され、近傍の温度が沸点近くまで上昇する。レーザーパワーが２０ｍＷでは、収束光の当った近傍が２０μｍ程度の線幅でアガロースが融解し、熱対流により除去される。問題は基板１の電極の有る無しでアガロースに吸収される収束光の強度が変化することである。そこで、アガロースゲル温度を推定してフィードバック制御によりレーザーパワーを制御し常に収束光照射での温度コントロールをできるように工夫してある。アガロース部に到達した収束光は熱に変換されると共に赤外光を発する。赤外光はフィルター１４５を通過し、フィルター１４４で反射され赤外カメラ１６０−１に到達する。赤外カメラ１６０−１の画像データをビデオ記録機構付き演算装置１６１に取り込み、光検出強度から温度を推計し、レーザー１４１のパワーを調製する。レーザーパワーのみで温度コントロールが困難な場合は、演算装置からの出力でステージ１６４の移動速度をコントロールし、常に収束光照射部のアガロース温度が維持されるようにする。即ち、演算装置１６１によりステッピングモータ１６２の回転を制御し、ステッピングモータの回転は動力伝達装置１６３によりステージ１６４が動く仕掛けになっている。
【００２２】
ステージ１６４には基板１が装着されており、自在にアガロースゲルに溝またはトンネル３を形成することができる。溝またはトンネル３にはＩＴＯ透明電極４−１が予め形成されている。また、心筋細胞拍動観察やアガロース加工の進捗状況をモニターするために、光源１７０からの透過光を検出する光学系も組み込まれている。光源１７０からの光は透明な上部ハウジング２２を透過し、アガロース部分で散乱しながら対物レンズ１４６を透過し、可視光を反射する蒸着フィルター（ミラー）でＣＣＤカメラ１６０−２で画像として取り込まれる。画像データは演算装置１６１に送られ、赤外カメラ１６０−１とオーバーラップさせて、レーザー照射による温度上昇部と構造体のパターンの確認などに用いられる。すなわち、このシステムでは、顕微観察と電極の両方、あるいは、いづれか片方を用いて心筋拍動を測定できる。
【００２３】
アガロースゲル１００の上面は培養液槽２１となっていて、開口部２３より供給排出される培養液が常に循環している。或いは開口部２３より細胞の刺激物質や内分泌かく乱物質を始めとする種々化学物質を添加し、電極や顕微観察で心筋細胞の拍動状態をモニターできる。このとき、電極による測定に影響のあるイオン性の物質のバイオアッセイには顕微観察、色素などの顕微観察に向かない物質のバイオアッセイには電極を用いる。
【００２４】
図１に示す心筋細胞バイオアッセイチップの構造の主要なサイズを示すと以下のようである。心筋細胞保持区画２の大きさは３０μｍ×３０μｍ、深さは、アガロースゲル１００の厚さと同じ０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍである。隣接する心筋細胞保持区画２の距離は、５０μｍとし、隣接する心筋細胞保持区画２を繋ぐトンネル３は、高さが５０μｍ〜３００μｍ、幅が５μｍである。トンネル３の高さが５０μｍとしたとき、アガロースゲル１００の厚さが０．０５ｍｍであるときは、トンネルではなく、溝となる。ここで、細胞培養区画２に細胞を入れる方法についてみると、いくつかの方法が考えられる。例えば、細胞を入れた容液中にマイクロキャピラリを挿入し、先端に細胞を一つ捕らえて、これを細胞培養区画２に入れる方法がある。あるいは、細胞培養区画２とアガロースゲル１００の領域の上面に細胞を含む液滴を垂らし、余分な液を押し出すように上面をなぞることにより、細胞培養区画２に細胞を入れることができる。後者の場合、細胞培養区画２と細胞のサイズがほぼ同じ程度であることが必要である。
【００２５】
実施例１の心筋細胞バイオアッセイチップでは、心筋細胞保持区画と一つの溝またはトンネル３に電極を二つ設けたので、心筋細胞の電位変動を捕らえやすくなっている。各電極はそれぞれ配線６で端子５に結合しており、独立にあるいは対として電気的計測ができるようになっている。
【００２６】
図３は実施例１の心筋細胞チップの全ての区画に心筋拍動細胞数を収納した透過顕微鏡像を示す図である。この顕微鏡像は、図２で言うと、光源１７０から心筋細胞チップに照射され透過する光をＣＣＤカメラ１６０−２で観察したものである。この観察時には赤外レーザー１４０や赤外カメラ１６０−１は使用しない。勿論、通常の倒立形顕微鏡にＣＣＤカメラ１６０−２を取り付けた構造のもので観察することができるのは言うまでも無い。３２は心筋細胞保持区画で図１の２に対応する。３３は溝またはトンネルで、図１、図２ではトンネル３に対応する。この図３（写真）では、心筋細胞保持区画３２のすべてに心筋細胞３４があらかじめ配置され、各細胞はトンネル３３に突起を伸ばし接触してギャップジャンクションを形成している。すなわち、細胞同士が接触している状態である。
【００２７】
（実施例２）
実施例２では、心筋細胞バイオアッセイチップとして、心筋拍動細胞のネットワークを構成するために必要な細胞数の検討結果について述べる。
【００２８】
図１、図２で説明した心筋細胞バイオアッセイチップを用いる。このチップによれば、全ての心筋細胞保持区画に心筋拍動細胞数を収納して、最大、心筋拍動細胞数を９個としたネットワークが形成できる。図４（Ａ）、図４（Ｂ）は、図１、図２で説明した心筋細胞バイオアッセイチップを用いて、心筋細胞の心拍時の電位あるいは透過画像から解析される、着目した一つの心筋細胞の拍動（細胞が振動する状態）をグラフ化したときの一般的な結果を示す図である。ここでピーク５１は細胞が拍動したとき、ピーク５１とピーク５１の間隔５２は拍動間隔を表す。横軸は時間である。図４（Ａ）は、心筋細胞バイオアッセイチップの９個の心筋細胞保持区画のうちの１個のみを使用し、一つの心筋拍動細胞を収納して心筋細胞の拍動を計測した測定結果を模式的に示す図である。すなわち、心筋拍動細胞が独立した状態での測定結果である。すなわち、孤立している状態での心筋細胞の拍動を示し、図から分かるように拍動間隔がばらついている。図４（Ｂ）は心筋細胞バイオアッセイチップの９個の心筋細胞保持区画の周辺部の８個の心筋細胞保持区画に心筋細胞を入れ、心筋細胞８個が突起を伸ばし接触してギャップジャンクションを形成して、お互いの細胞とインタラクションしている状態で心筋細胞の拍動を計測した測定結果を模式的に示す図である。図４（Ａ）と比較して明らかなように、拍動間隔が安定し、ほぼ一定となっている。
【００２９】
図５は、１個、３個、４個、８個、９個の心筋細胞保持区画にそれぞれ心筋拍動細胞を収納して、各細胞の拍動間隔を６４回測定しＣＶ（標準偏差を平均値で割った値）を求めた結果をプロットした図である。プロット６１、６２、６３、６４、６５はそれぞれ心筋拍動細胞１個、３個、４個、８個、９個の拍動周期測定値のＣＶ、曲線６２は各プロットの間を補完した曲線である。単独の心筋拍動細胞では拍動のばらつきが５０％にも達するが、心筋拍動細胞がネットワークを形成すると拍動のばらつきが低下することを発見した。ネットワークを形成する心筋拍動細胞数が８以上では拍動周期のばらつきがほぼ１０％にまで低下し、且つ安定している。
【００３０】
このことは、心筋拍動細胞数が８以上のネットワークでバイオアッセイを行うことで再現性の良いバイオアッセイデータを得ることができることを示している。あるいは、細胞数が１個と３個のばらつきの点を通る線分と、細胞８個と１０個のばらつきのデータを通る線分の交点における細胞数は４個となる。この点を指標とすると、ネットワークの心筋細胞数が４個以上であれば、拍動周期のばらつきがほぼ一定値まで低下したものとすることができる。
【００３１】
他方、細胞数が多くなりすぎると、拍動周期のばらつきという点では、より安定するが、細胞数が増えることによるその他の要因が増すのであまり多くなることは好ましくない。たとえば細胞数が１０００のバイオアッセイチップを作ることは可能であるが、先に、背景技術の項で述べたように、得られる情報が平均的なものになってしまい、薬剤などに対するレスポンスが正確に得られない問題が出てくる。また、ネットワーク細胞数が多くなると電極などが増えるためチップ作成コストや計測装置のコストが上がる問題や作成時間がかかるなどの問題もある。バイオアッセイ用には３２もあれば十分である。
【００３２】
ここで、心筋細胞バイオアッセイチップの心筋拍動細胞の配置と、細胞数について考えると、細胞の生体で活動しているのと似た環境にするという点から見ると、できるだけ、纏まった形態、すなわち、正方形に近い形にするのが良い。従って、細胞数を４個とする場合は心筋細胞保持区画は２×２とするのが良く、細胞数を３２とする場合は心筋細胞保持区画は６×６として四隅を除いた形とするが良い。すなわち、バイオアッセイに用いる心筋細胞ネットワークの細胞数としては、４から３２細胞の範囲のものを作製すれば良いことがわかる。ばらつきの少なく、より正確なデータを得るには８から３２細胞の範囲の心筋細胞ネットワークを用いればより良いことが導き出される。
【００３３】
８個の心筋細胞保持区画にそれぞれ心筋細胞を収納した心筋ネットワークからなる心筋細胞バイオアッセイチップを用いたバイオアッセイの手順を示す。
【００３４】
図１の各電極４-１あるいは４−２と共通電極１４の間の電気信号をモニターしながら、あるいは顕微画像をモニターして各心筋拍動細胞の輝度変化を測定しながら、図２の培養液槽２１に測定したい添加物を添加する。それぞれの細胞における拍動信号５１の間隔５２を測定し拍動周期とする。細胞に対する影響がない添加物質では拍動周期に変化が見られない。影響がある添加物質では、拍動周期が変動する。ここで、電気信号のモニターに使用する電極は、トンネル３の電極４-１と心筋細胞保持区画２の電極４−２のいずれでもよいが、単に各細胞の拍動を見るという点から見れば、心筋細胞保持区画２の電極を使用すれば良い。
【００３５】
本発明による心筋細胞バイオアッセイチップで得られる拍動周期データは、ばらつきが１０％以下なので、２ＳＤ（標準偏差の２倍の範囲を示す値）としてほぼ２０％以上の変動があると、真の影響として判断することができる。細胞１個ではばらつきが５０％なので、拍動周期が倍以上変動しないと添加物の影響があったかどうか判断できない。このため、８細胞以上の心筋ネットワークからなる本発明の心筋細胞バイオアッセイチップを用いることで、添加物の影響をより高精度に測定できるメリットがある。他方、大規模な数の細胞を用いるバイオアッセイでは、その分、各細胞に対する添加物濃度が低下したり、細胞群の持つ特性のばらつきに由来するばらつきが大きくなったりする。
【００３６】
（実施例３）
実施例３では、心筋細胞バイオアッセイチップをガラス基板で形成する例である。心筋細胞保持区画２を、３０μｍの径、深さ２０μｍ、５０μｍピッチとし、溝３を幅５μｍ、深さ１０μｍとして、ガラス基板１上にエッチングで作成し、表面にシランカップリング反応でアミノ基を導入し、無水コハク酸を作用させてアミノ基にカルボキシル基を導入し、このカルボキシル基とストレプトアビジンを水溶性カルボジイミドで縮合結合させたものを作成する。毛細管ピペットを用いて細胞を各心筋細胞保持区画２に挿入し、ビオチン化セルロース膜で蓋をして用いても良い。この上に図２と同様な上部循環漕２１を取り付けて常に上部循環漕内の液を循環させる、あるいは、アッセイ用の試薬を添加する構造を設ける。
【００３７】
（実施例４）
図６は実施例４の心筋細胞バイオアッセイチップの、図２に対応する断面図である。実施例４の心筋細胞バイオアッセイチップは、図６と図２とを対応して明らかなように、循環漕２１が紙面に垂直な方向の３個の心筋細胞保持区画ごとに仕切りを入れ、３分割されている点を除けば、実施例１と同じである。このように、紙面に垂直な方向の３個の心筋細胞保持区画ごとに循環漕２１を分離し、それぞれ異なる溶液を循環できるようにして、真ん中の循環漕のみにバイオアッセイ試薬を添加、他の上部循環漕には通常の緩衝液（培養液）のみを流して心筋の拍動を測定してもよい。なお、ここでは、上部ハウジング２２に設けられた開口部２３を、図の便宜上、隣接して示したが、紙面に垂直な方向の３個の心筋細胞保持区画のそれぞれに、より良く溶液が循環できる位置に配置すべきは当然である。
【００３８】
このように、真ん中の循環漕のみにバイオアッセイ試薬を添加、他の上部循環漕には通常の緩衝液（培養液）のみを流して心筋の拍動を測定すると、隣接する細胞からの拍動同期信号の乱れを容易に測定できる。すなわち、たとえば薬剤を投与したときにおける直接の細胞毒性以外に、細胞間のコミュニティーエフェクトに関する影響の測定ができるので、従来は薬を飲むと体調が優れないとか、優れるとか、の主観的な感覚で表現されるような影響を数値化できる可能性がある。
【００３９】
（その他）
実施例３でも述べたように、本発明に係る心筋細胞バイオアッセイチップの心筋細胞保持区画間の連絡ルートは、トンネルに限らず、溝としても良い。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明に関する心筋細胞バイオアッセイチップおよびこれを用いたバイオアッセイに関する産業上の利用の形態についてみると、研究者あるいは製薬会社等の心筋細胞バイオアッセイチップを利用する立場と、心筋細胞バイオアッセイチップを供給するメーカの立場での利用があり得る。利用する立場から言えば、心筋細胞保持区画にそれぞれ心筋細胞を収納した心筋ネットワークを構成しているチップを供給されるのが簡便である。しかし、チップの状態では心筋細胞保持区画に収納された心筋細胞は長時間生存し得ないので、チップを供給するメーカは、使用期限を短期間に限った形でのチップの供給、あるいは、基板１、電極関係４、端子５、配線６の部分と基板１上のアガロースゲル１００よりなる部分と、半透膜９および上部ハウジング２２の部分とを分離して、セットとしてのチップの供給とがあり得る。セットとしてのチップの供給の場合は、心筋細胞保持区画への心筋細胞の収納および全体の組み立てはユーザに任せることになる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】実施例１に係る心筋細胞バイオアッセイチップの構造の１例を模式的に示した上面図。
【図２】図１のＡ−Ａ位置において矢印方向に見た断面図。
【図３】実施例１の心筋細胞チップの全ての区画に心筋拍動細胞数を収納した透過顕微鏡像を示す図。
【図４】（Ａ）は、心筋細胞バイオアッセイチップの９個の心筋細胞保持区画のうちの１個のみを使用し、一つの心筋拍動細胞を収納して心筋細胞の拍動を計測した測定結果を模式的に示す図、（Ｂ）は心筋細胞バイオアッセイチップの９個の心筋細胞保持区画の周辺部の８個の心筋細胞保持区画に心筋細胞を入れ、心筋細胞８個が突起を伸ばし接触してギャップジャンクションを形成して、お互いの細胞とインタラクションしている状態で心筋細胞の拍動を計測した測定結果を模式的に示す図。
【図５】１個、３個、４個、８個、９個の心筋細胞保持区画にそれぞれ心筋拍動細胞を収納して、各細胞の拍動間隔を６４回測定しＣＶを求めた結果をプロットした図。
【図６】実施例４に係る心筋細胞バイオアッセイチップの構造の１例を図２に対応する断面で示す図。
【符号の説明】
【００４２】
１…基板、１−１…壁、２，３２…心筋細胞保持区画、３，３３…溝またはトンネル、４，４−１，４−２…電極、５…外部端子、６…配線、９…半透膜、１４…共通電極、２１…培養液槽、２２…上部ハウジング、２２−１…上部ハウジング２２の立下り部、２３…上部ハウジング２２に設けられた開口部、３４…心筋細胞、５１…ピーク、５２…ピーク５１の間隔、６１，６２，６３，６４，６５…プロット、１００…アガロースゲル、１４１…レーザー、１４２…レーザービーム、１４３…エキスパンダー、１４４…フィルター、１４５…蒸着フィルター、１４６…集光レンズ、１６０−１…赤外カメラ、１６１…ビデオ記録機構付き演算装置、１６２…ステッピングモータ、１６３…動力伝達装置、１６４…ステージ。
【図１】
2006094703.tif 000003
【図２】
2006094703.tif 000004
【図３】
2006094703.tif 000005
【図４】
2006094703.tif 000006
【図５】
2006094703.tif 000007
【図６】
2006094703.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月30日(2004.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2006094703.tif 000009