(57)【要約】【課題】セル内全体の溶液中の抗原抗体反応後の標識色素を励起させることが可能で、かつ励起により放出された蛍光を透明板に伝播させて外部に放射させ、実質的に蛍光のみの強度を受光素子で検出することが可能な免疫反応測定用検査装置を提供する。【解決手段】透明板と、この透明板の表面に少なくとも１箇所に配置され、試薬および検体の溶液が収容されるセル、このセル底部の前記透明板に形成され、蛍光を前記透明板に入射させるためのグレーティング、および前記セルから隔てられた前記透明板の表面に形成され、前記グレーティングにより前記透明板に伝播された蛍光を外部に放出させるための光学要素を有するセンサチップと、前記センサチップのセルに励起光をそのセルの深さ方向に沿って照射するための励起光照射手段と、前記センサチップの光学要素から放出される蛍光を受光するための受光手段とを具備したことを特徴とする。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明板と、この透明板の表面の少なくとも１箇所に配置され、試薬および検体の溶液が収容されるセルと、このセル底部の前記透明板に形成され、蛍光を前記透明板に入射させるためのグレーティングと、前記セルから隔てられた前記透明板の表面に形成され、前記グレーティングにより前記透明板に伝播された蛍光を外部に放出させるための光学要素とを有するセンサチップと、
前記センサチップのセルに励起光をそのセルの深さ方向に沿って照射するための励起光照射手段と
前記センサチップの光学要素から放出される蛍光を受光するための受光手段と
を具備したことを特徴とする免疫反応測定用検査装置。
【請求項２】
前記セルと前記光学要素の間に対応し、光が反射する前記透明板の面には、さらに金属薄膜が形成されていることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の免疫反応測定用検査装置。
【請求項３】
前記セルと前記光学要素の間に対応し、光が反射する前記透明板の面には、さらに励起光の波長近傍の光を吸収する薄膜が形成されていることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の免疫反応測定用検査装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光色素を利用した免疫反応測定用検査装置に関し、特に臨床検査分野で利用される免疫反応測定用検査装置に係わる。
【背景技術】
【０００２】
蛍光を色素で標識した抗体を用いて免疫反応を測定する方法が知られている。この方法は、次のような検査装置を用いてなされる。すなわち、この検査装置は、マイクロプレートと呼ばれる樹脂製容器を備えている。励起光源（例えばキセノンフラッシュランプ）は、前記マイクロプレートの上方側に配置されている。この光源と容器の光路には、光源に対してマイクロプレートの表面と平行して配置されたハーフミラーおよび第１集光レンズが配置されている。受光素子は、前記マイクロプレートの直上に配置されている。この受光素子は、励起光に比べて微弱な蛍光を検出するために、例えば光電子増倍管のような高感度のものが用いられる。前記受光素子とマイクロプレートの光路には、受光素子側から光学フィルタ、第１集光レンズより大きな第２集光レンズ、前記ハーフミラーおよび第１集光レンズが配置されている。
【０００３】
前記検査装置による免疫反応測定は、まず、前記マイクロプレートに抗原を固定し、このマイクロプレート内に蛍光を色素で標識した抗体および検体を入れて一定時間反応（検体を介して抗原抗体反応）させた後、未反応の抗体および検体を洗い流す。つづいて、励起光源から励起光をハーフミラーで反射し、第１集光レンズで集光して前記マイクロプレート内の溶液に向かって照射する。このとき、抗原抗体反応された抗体の標識色素が励起されて蛍光をマイクプレート外に放射する、つまり抗原抗体反応量に応じた蛍光がマイクプレート外に放射される。放射された蛍光は、主に前記第２集光レンズで集光され、受光素子に受光されて蛍光強度を検出している。この検出において、マイクロプレート外に放射される光は蛍光だけではなく、マイクロプレート内で散乱された励起光も放射されるので、光学フィルタで励起光が受光素子に侵入するのを防いで蛍光のみの強度を検出、測定している。
【０００４】
しかしながら、前記抗原抗体反応、励起光の照射、放射蛍光の強度検出において、光学フィルタで励起光と免疫反応によって得られる蛍光を分離しているものの、励起光の強度と蛍光の強度を比較すると通常３桁以上励起光強度が強いため、両者を分離することが困難になり、蛍光強度を高精度で測定する、つまり抗原抗体反応量を高精度で測定することが困難になる。
【０００５】
このようなことから、免疫反応量の測定において光導波路を用いた検査装置が実用化されている。この検査装置は、表面に光導波路が形成された例えばガラス基板と、この光導波路表面に形成され、試薬および検体を収容するセルとを有するセンサチップを備えている。励起光源は、前記チップの下方に配置され、その励起光は前記光導波路を入射させてその光導波路を伝播する。受光素子（例えば光電子増倍管）は、前記センサチップのセルの上方に配置されている。前記センサ側の受光素子近傍には光学フィルタが配置されている。
【０００６】
前記検査装置による免疫反応測定は、センサチップのセル内で前述した抗原抗体反応を行い、未反応の抗原および検体を洗い流した後、励起光源から励起光を前記センサチップの光導波路に入射させてその光導波路を伝播させる。この励起光の伝播において、光導波路表面から励起光のエバネッセント光が生じるため、前記セル位置で前述したようにエバネッセント光により抗原抗体反応された抗体の標識色素が励起されて蛍光をマイクプレート外に放射する。放射された蛍光は、光学フィルタを通して受光素子に受光されて蛍光強度を検出する。このような検査装置では、センサチップのセルからは蛍光のみが放射されるため、蛍光強度を高精度で測定することが可能になる。
【０００７】
しかしながら、励起光をセンサチップの光導波路を伝播させてエバネッセント光を発生させる場合、エバネッセント光は通常、光導波路表面から１００ｎｍ程度しか染み出さないため、光導波路表面から１００ｎｍ以上離れた箇所に位置する免疫反応（例えば抗原抗体反応）による標識色素を励起することが困難になる。これは、免疫反応測定において２種類の蛍光色素を同時に利用し、抗原抗体反応後に溶液状態にて免疫反応量（例えば抗原抗体反応量）をリアルタイムで測定することが可能なＦＲＥＴ法(Fluorescence Resonance Energy Transfer)に適用する場合、測定精度が低下する等の不利益をもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、セル内全体の溶液中の免疫反応後の標識色素を励起させることが可能で、かつ励起により放出された蛍光を透明板に伝播させて外部に放射させ、実質的に蛍光のみの強度を受光素子で検出することが可能な免疫反応測定用検査装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によると、透明板と、この透明板の表面の少なくとも１箇所に配置され、試薬および検体の溶液が収容されるセルと、このセル底部の前記透明板に形成され、蛍光を前記透明板に入射させるためのグレーティングと、前記セルから隔てられた前記透明板の表面に形成され、前記グレーティングにより前記透明板に伝播された蛍光を外部に放出させるための光学要素とを有するセンサチップと、
前記センサチップのセルに励起光をそのセルの深さ方向に沿って照射するための励起光照射手段と、
前記センサチップの光学要素から放出される蛍光を受光するための受光手段と
を具備したことを特徴とする免疫反応測定用検査装置が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれれば、セル内の蛍光色素を含む溶液全体に励起光を照射するため、蛍光励起効率が高く、チップ表面に抗体を固相化し蛍光色素標識した２次抗体を反応させるＥＬＩＳＡ法のみならず、２種類の蛍光色素で標識した抗体を検体とともにセル内に溶液状態で混合するＦＲＥＴ法にも適用が可能で、効率的に蛍光と励起光とを分離することができ、抗原抗体反応量の高精度の測定が可能な免疫反応測定用検査装置を提供できる。
【００１１】
また、センサチップが小型であることと、蛍光と励起光の分離ができることによって、特に寸法の小型化が難しいダイクロイックを使わなくてもフィルタだけで光学系全体を構成することができるため小型化が可能な免疫反応測定用検査装置を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態に係る免疫反応測定用検査装置を詳細に説明する。
【００１３】
（第１実施形態）
この第１実施形態に係る免疫反応測定用検査装置は、センサチップを備えている。このセンサチップは、透明板と、この透明板の表面に少なくとも１箇所に配置され、試薬および検体の溶液が収容されるセルと、このセル底部の前記透明板に形成され、蛍光を前記透明板に入射させるためのグレーティングと、前記セルから隔てられた前記透明板の表面に形成され、前記グレーティングにより前記透明板に伝播された蛍光を外部に放出させるための光学要素とを有する。励起光照射手段である励起光源は、前記センサチップのセルに励起光をそのセルの深さ方向に沿って照射する。受光手段である受光素子は、前記センサチップの光学要素から放出される蛍光を受光する。
【００１４】
このような構成の免疫反応測定用検査装置において、センサチップのセル内に蛍光色素で標識された抗体溶液と検体とを入れ、免疫反応である抗原抗体反応を行った後、励起光源から励起光を透明板の下面からその下面に垂直に照射する。励起光は、セル内の蛍光色素を励起した後、セル外に放射される。セル内で発生した蛍光は、全方位に向かって放射されるため、透明板側に向かって進む蛍光の一部はセル下面のグレーティングで回折されて進行方向を変えて透明板内を伝播する。透明板内を伝播する蛍光は、前記セルから所望距離隔てた透明板表面に形成された光学要素から透明板の外へ放射され、受光素子によりその蛍光強度を測定する。
【００１５】
したがって、励起光源からの励起光はセル内の全ての蛍光色素を励起でき、かつセル外に抜けて放射できる。一方、蛍光の一部はセル下面のグレーティングから透明板を伝播して光学要素から放射されるため、その蛍光の受光素子で測定することによって、励起光が混在しない蛍光を高感度で測定する、つまり抗原抗体反応量を高精度で測定することが可能となる。
【００１６】
次に、２種類の蛍光色素を同時に利用して抗原抗体反応量を測定するＦＲＥＴ法の一種であるＴＲＡＣＥ法に適用される免疫反応測定用検査装置を図１を参照してより具体的に説明する。
【００１７】
センサチップ１は、透明板、例えばガラス基板２を備えている。このガラス基板２の表面には、第１グレーティング３および光学要素である第２グレーティング４が互いに所望距離隔てて形成されている。これらのグレーティング３，４は、例えば窒化シリコン、アモルファスシリコン、酸化チタン、酸化亜鉛等の薄膜をスパッタ等の成膜手段で前記ガラス基板表面に成膜した後、レジスト膜の塗布、ステッパによるレジスト膜の露光、現像処理によりレジストパターンを形成し、さらにレジストパターンをマスクとして前記薄膜をリアクティブイオンエッチング（ＲＩＥ）等により選択的にエッチングすることによって作られる。前記各グレーティング３，４は、０．５μｍ以下のラインアンドスペースで形成されることが好ましい。典型的には、ガラス基板２は無アルカリガラスで、厚さ０．７ｍｍ、幅６．５ｍｍ、長さ１７ｍｍの寸法を有し、第１、第２のグレーティング３，４はいずれも４ｍｍ×３ｍｍの面積で、０．５μｍのラインアンドスペースで形成されている。前記ガラス基板２の表面には、検体溶液を保持するための例えば円筒状のセル５がその底に前記第１グレーティング３が位置するように形成されている。このセル５は、例えば黒色ＡＢＳ樹脂、黒色アクリル樹脂から作られ、ＵＶ硬化型接着剤を用いて前記ガラス基板上に固定されている。
【００１８】
励起光源６は、例えば前記セル５が位置する前記ガラス基板２の下面側に配置されている。前記ガラス基板２側の前記励起光源６近傍には、光学系、例えばレンズ７が配置されている。前記励起光源６から放射された励起光は、レンズ７でコリメートされ、ガラス基板２下面からセル５底面に入射され、上方に抜ける。前記励起光源６としては、例えばガスレーザ、ＹＡＧレーザ、キセノンフラッシュランプ、ブラックライト、水銀ランプ、ＬＥＤ、半導体レーザ等が用いられる。
【００１９】
第１受光素子８は、前記ガラス基板２の第２グレーティング４側にその第２グレーティング４から放射された光を受光するために配置されている。この第１受光素子８の近傍には、その第１受光素子８側から前記ガラス基板２に向けて第１光学フィルタ９および第１光学レンズ１０が配置されている。第２受光素子１１は、前記ガラス基板２の下面にそのガラス基板２下面から放射された光を受光するために配置されている。この第２受光素子１１の近傍には、その第２受光素子１１側から前記ガラス基板２に向けて第２光学フィルタ１２および第２光学レンズ１３が配置されている。前記第１、第２の受光素子８，１１としては、例えば高感度の光電子増倍管、アバランシェフォトダイオード等が用いられる。前記第１光学フィルタ９には、例えば波長約６６０ｎｍのアクセプター側蛍光を通過させる干渉フィルタが用いられ、前記第２光学フィルタ１２には例えば波長約６２０ｎｍのドナー側蛍光を通過させる干渉フィルタが用いられる。
【００２０】
次に、前述した図１に示す検査装置による抗原抗体反応量を測定する方法を図２を参照して説明する。
【００２１】
まず、検体（例えばタンパク）とドナー側蛍光色素およびアクセプター側蛍光色素でそれぞれ標識されたＦＲＥＴ用抗体からなる試薬とを混合した溶液２１をセンサチップ１のセル５内に滴下し、収容する。セル５内では、ターゲットタンパクにドナー側蛍光色素で標識した抗体と、アクセプター側蛍光色素で標識した抗体とが結合する抗原抗体反応がなされる。抗原抗体反応後、励起光源６から励起光２２を放射し、レンズ７でコリメートしてセンサチップ１のガラス基板２下面からセル５底面に入射し、セル５内の溶液２１に照射する。このとき、セル５内の全ての溶液２１中のドナー側蛍光色素から蛍光が放射されるが、アクセプター側蛍光色素からは蛍光は放射されない。ただし、前記抗原抗体反応によりターゲットタンパクに結合したドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素の距離が非常に近くなるため、ドナー側蛍光色素から蛍光が放射されると、これに近接したアクセプター蛍光色素が蛍光により励起される、エネルギー移動が起こり、アクセプター側蛍光色素から蛍光が放射される。なお、ドナー側の蛍光色素にクリプテート、アクセプター側の蛍光色素にＸＬ６６５を利用するＦＲＥＴ法の一種であるＴＲＡＣＥ法の場合はドナー側の蛍光波長が約６２０ｎｍ、アクセプター側の蛍光波長が約６６０ｎｍになる。
【００２２】
このような励起光２２の照射において、励起光２２はセル５下面の第１グレーティング３で回折するが、０次光、１次光ともセル５上面へ抜けるために、ガラス基板２内に伝播しない。
【００２３】
一方、前述したようにセル５内で発生した蛍光は全方向に向かって放射されるため、ガラス基板２側に向かって進む蛍光２３の一部はセル５下面の第１グレーティング３で回折されて進行方向を変えてガラス基板２内を伝播し、第２グレーティング４に達する。伝播された蛍光がこの第２グレーティング４から放射される際、一部はガラス基板２上面から放射され、一部はガラス基板２下面から放射される。ガラス基板２上面から放射された蛍光２４は、第１光学レンズ１０でコリメートされ、波長約６６０ｎｍのアクセプター側蛍光を通過させる第１光学フィルタ９で分離され、第１受光素子（例えば光電子増倍管）８で受光され、アクセプター側蛍光の強度が測定される。ガラス基板２下面から放射された蛍光２５は、第２光学レンズ１３でコリメートされ、波長約６２０ｎｍのドナー側蛍光を通過させる第２光学フィルタ１２で分離され、第２受光素子（例えば光電子増倍管）１１で受光され、ドナー側蛍光の強度が測定される。
【００２４】
前記第１、第２の受光素子８，１１で受光したアクセプター側蛍光強度とドナー側蛍光強度の比から検体中のターゲット（例えばタンパク）濃度を求める。すなわち、励起光の照射においてドナー側蛍光色素が励起されて蛍光が放射されるとともに、前記抗原抗体反応によりターゲットタンパクに結合した抗体の標識色素であるドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素の距離が非常に近くなることによりドナー側蛍光色素から放射される蛍光によってアクセプター蛍光色素が励起されて蛍光が放射されるため、アクセプター蛍光色素からの蛍光の強度は抗原抗体反応の量に比例することになる。このため、アクセプター側蛍光強度とドナー側蛍光強度の比から検体中のターゲット（例えばタンパク）濃度を求めることが可能になる。
【００２５】
したがって、図１、図２に示す免疫反応測定用検査装置によれば抗原抗体反応量を測定するＦＲＥＴ法の一種であるＴＲＡＣＥ法においてアクセプター側蛍光強度およびドナー側蛍光強度を第１、第２の受光素子８，１１によりそれぞれ高感度で受光できるため、それらアクセプター側蛍光強度とドナー側蛍光強度の比から検体中のターゲット（例えばタンパク）濃度を高精度で測定することが可能になる。
【００２６】
また、セル５内の標識色素から励起された蛍光をガラス基板２に伝播させ、光学要素である第２グレーティング４で外部に放射させることによって、受光素子８，１１を励起光の照射領域であるセル５から離れたガラス基板２の領域に配置でき、比較的大きな光電子増倍管を用いることができるため、高感度の蛍光測定が可能になる。
【００２７】
なお、第１実施形態に係る免疫反応測定用検査装置において光学要素である第２グレーティングの代わりに、通常の石英プリズム、三角溝を切り込んだ樹脂性シートであるプリズムシートをガラス基板に貼り付けてもよい。
【００２８】
（第２実施形態）
図３は、この第２実施形態に係る免疫反応測定用検査装置を示す概略断面図である。なお、図３において図１と同様な部材は同符号を付して説明を省略する。
【００２９】
この検査装置は、セル４と第２グレーティング４の間に対応し、光が反射するガラス基板２の面、例えばセル４と第２グレーティング４間に位置するガラス基板２表面に例えばアルミニウム、チタンのような金属薄膜１４を形成した構成を有する。
【００３０】
このような構成によれば、金属薄膜（例えばアルミニウム）１４をセル４と第２グレーティング４間に位置するガラス基板２表面に形成することによって、光導波路技術の金属クラッドとして機能するためガラス基板２中を伝播する光のＴＭモードの光を効率よく吸収することが可能になる。その結果、励起光源６の放射側に偏向フィルタ（図示せず）を配置し、励起光をこの偏光フィルタでＴＭモードの偏光を持たせてガラス基板２下面からセル５底面に入射させることによって、その励起光がガラス基板２中に侵入しても、前記金属薄膜１４でＴＭモードの偏光を持つ励起光を吸収できるため、ガラス基板２内に侵入した励起光を取り除くことができる。なお、偏光させた励起光を用いても前述したＦＲＥＴ法でセル５内の標識色素を励起し、蛍光を放出する場合、蛍光は偏光しないため、その蛍光がガラス基板２を伝播する過程で金属薄膜１４により減衰される量を低減できる。なお、偏向フィルタの代わりの偏向を放射するレーザを用いてもよい。
【００３１】
したがって、抗原抗体反応量を測定するＦＲＥＴ法の一種であるＴＲＡＣＥ法においてアクセプター側蛍光強度およびドナー側蛍光強度を第１、第２の受光素子８，１１によりそれぞれより一層高感度で受光できるため、それらアクセプター側蛍光強度とドナー側蛍光強度の比から検体中のターゲット（例えばタンパク）濃度をより高精度で測定することが可能になる。
【００３２】
なお、第２実施形態において金属薄膜１４は単層でも多層でもよい。
【００３３】
また、前記金属薄膜１４はセル４と第２グレーティング４間に位置するガラス基板２表面に限らず、セル４と第２グレーティング４間に対応するガラス基板２の裏面、または両面に形成してもよい。
【００３４】
（第３実施形態）
図４は、この第３実施形態に係る免疫反応測定用検査装置を示す概略断面図である。なお、図４において図１と同様な部材は同符号を付して説明を省略する。
【００３５】
この検査装置は、セル４と第２グレーティング４の間に対応し、光が反射するガラス基板２の面、例えばセル４と第２グレーティング４間に対応するガラス基板２の裏面に例えば酸化チタンのような励起光の波長近傍の光を吸収する薄膜１５を形成した構成を有する。
【００３６】
このような構成によれば、励起光に使用される光が通常、紫外線など短波長の光であるため、ガラス基板２裏面の所定の箇所に前記薄膜１５を形成することによりその励起光がガラス基板２に侵入しても、吸収して取り除くことができる。
【００３７】
具体的には、励起光として３２０ｎｍのＮ2レーザ光を用いる場合、ガラス基板裏面に３５０ｎｍより短波長の光を吸収する酸化チタン薄膜を形成することによって、ガラス基板２に侵入した励起光を減衰させることができる。
【００３８】
したがって、抗原抗体反応量を測定するＦＲＥＴ法の一種であるＴＲＡＣＥ法においてアクセプター側蛍光強度およびドナー側蛍光強度を第１、第２の受光素子８，１１によりそれぞれより一層高感度で受光できるため、それらアクセプター側蛍光強度とドナー側蛍光強度の比から検体中のターゲット（例えばタンパク）濃度をより高精度で測定することが可能になる。
【００３９】
なお、前記励起光の波長近傍の光を吸収する薄膜１５はセル４と第２グレーティング４間に対応するガラス基板２裏面に限らず、セル４と第２グレーティング４間に位置するガラス基板２の表面、または両面に形成してもよい。
【００４０】
また、励起光の波長近傍の光を吸収する薄膜１５は酸化チタン薄膜の代わりに励起光を吸収する色素を含む有機物薄膜を用いてもよい。
【００４１】
（第４実施形態）
図５は、この第３実施形態に係る免疫反応測定用検査装置を示す概略断面図である。なお、図５において図１と同様な部材は同符号を付して説明を省略する。
【００４２】
この検査装置は、セル５からガラス基板２の他端に向かう表面にアルミニウムまたはチタンのような金属薄膜１６を形成し、この金属薄膜１６に蛍光出射窓１７を設け、さらに蛍光出射窓１７を含む金属薄膜１６表面に三角溝を切り込んだ樹脂性シートであるプリズムシート１８を接着した構成を有する。
【００４３】
前記第１実施形態で説明したように光学要素としてプリズムシートを用い、これをガラス基板の蛍光の出射位置に直接貼り付けることも可能である。この場合、プリズムシートをガラス基板に正確に貼り付けることが困難になり、蛍光の出射位置が変動する虞がある。
【００４４】
第４実施形態によれば、蛍光出射窓１７を含む金属薄膜１６表面にプリズムシート１８を接着剤で貼り付けることによって、蛍光の出射位置がプリズムシート１８の貼り付け精度に依存せず、金属薄膜１６の蛍光出射窓１７の位置精度で決定できる。この蛍光出射窓１７は、フォトリソグラフィ技術などの微細加工技術を用いて金属薄膜１に形成できるため、その蛍光出射窓１７の高い位置精度を確保することが可能となる。
【００４５】
また、金属薄膜としてアルミニウム薄膜を用いれば、前述した第２実施形態と同様な効果を発揮することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の第１実施形態に係る免疫反応測定用検査装置を示す概略断面図。
【図２】図１の免疫反応測定用検査装置による抗原抗体反応量の測定方法を説明するための概略断面図。
【図３】本発明の第２実施形態に係る免疫反応測定用検査装置を示す概略断面図。
【図４】本発明の第３実施形態に係る免疫反応測定用検査装置を示す概略断面図。
【図５】本発明の第４実施形態に係る免疫反応測定用検査装置を示す概略断面図。
【符号の説明】
【００４７】
１…センサチップ、２…ガラス基板、３…第１グレーティング、４…第２グレーティング（光学要素）、５…セル、６…励起光源、８，１１…受光素子、９，１２…光学フィルタ、１４、１６…金属薄膜、１５…励起光の波長近傍の光を吸収する薄膜、１７…蛍光出射窓、１８…プリズムシート。
【図１】
2006267052.tif 000003
【図２】
2006267052.tif 000004
【図３】
2006267052.tif 000005
【図４】
2006267052.tif 000006
【図５】
2006267052.tif 000007