(57)【要約】【課題】  糖尿病で併発する神経障害を予防または治療するアルドースリダクターゼ阻害剤等を提供する。【解決手段】  裸子植物（針葉樹）である樹木の幹や枝を粉砕して水やエタノールでエキスを抽出することで、簡単にまた、人体にとって安全性の高いアルドースリダクターゼ阻害剤を得ることができる。樹木としては、抽出されるエキスのアルドースリダクターゼ阻害率が５０％のときの有効成分濃度が１６ｐｐｍ未満となるエキスが抽出できるものを用いるのが好ましい。アルドースリダクターゼ阻害剤を抽出するには、抽出液として水、低級アルコール、酢酸エチルなどの有機溶剤などを使用することができるが、特に、水および／またはエタノールを使用することが好ましい。水とエタノールは人体に対する安全性が高いからである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
裸子植物である樹木の幹または枝から抽出されたエキスを由来成分とすることを特徴とするアルドースリダクターゼ阻害剤。
【請求項２】
前記エキスは、有効成分濃度を１００ｐｐｍとしたときのアルドースリダクターゼ阻害効果が４０％以上であることを特徴とする請求項１に記載のアルドースリダクターゼ阻害剤。
【請求項３】
前記エキスのアルドースリダクターゼ阻害率が５０％のときの有効成分濃度が１６ｐｐｍ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載のアルドースリダクターゼ阻害剤。
【請求項４】
裸子植物である樹木の幹または枝から、有効成分を抽出する抽出工程と、
前記有効成分からアルドースリダクターゼ阻害剤を得る阻害剤形成工程と、
を含むことを特徴とするアルドースリダクターゼ阻害剤の製造方法。
【請求項５】
前記有効成分をエタノール及び／または水で抽出することを特徴とする請求項４に記載のアルドースリダクターゼ阻害剤の製造方法。
【請求項６】
前記有効成分をエタノール濃度が３０％以上の含水エタノールで抽出することを特徴とする請求項５に記載のアルドースリダクターゼ阻害剤の製造方法。
【請求項７】
前記樹木の幹または枝を粉砕する粉砕工程を経た後、粉砕された前記樹木から前記抽出工程にて前記有効成分を抽出し、前記阻害剤形成工程では、前記有効成分を粉末化してエキス粉末を得た後、前記エキス粉末を用いて前記アルドースリダクターゼ阻害剤を形成することを特徴とする請求項４から６のいずれか１項に記載のアルドースリダクターゼ阻害剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然由来成分から得ることができるアルドースリダクターゼ阻害剤、アルドースリダクターゼ阻害剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、糖尿病の合併症として発症する糖尿病性の神経障害の治療について様々な研究がなされている。糖尿病による高血糖の状態においては、細胞内のグルコース濃度が高くなった際、通常の解糖系（主経路）で代謝しきれない過剰のグルコースは、アルドースリダクターゼと呼ばれる酵素によりソルビトールへ変換される。ソルビトールは代謝される速度が遅いため、多量に生成されると細胞内に蓄積されてしまう。その結果、細胞内の浸透圧が高まり、細胞の膨化と細胞膜変異を引き起こし、神経障害の原因となりうると考えられている。
【０００３】
そこで、アルドースリダクターゼを阻害することによりソルビトールの生成を抑制することができる「アルドースリダクターゼ阻害剤」について研究がなされている。例えば、合成化合物のアルドースリダクターゼ剤としてエパルレスタット（商品名：キネダック錠）が開発された。
【０００４】
また、アルドースリダクターゼ阻害剤として天然物由来の化合物も知られており、例えばフクギ抽出成分（特許文献１）、褐藻類抽出成分（特許文献２）、ビテキシンを有効成分とするトケイ草抽出成分（特許文献３）、アルファバッカ抽出物（特許文献４），ネムノキ属植物由来成分（特許文献５）、シポー・エスカーダ抽出成分（特許文献６）、ハマゴウ属植物抽出成分（特許文献７）、フトモモ抽出成分（特許文献８）、シャペウ・デ・コウロ抽出成分（特許文献９）、ストロベリーリーフ、セージ、西河柳、仙鶴草、ミサキノハナの葉、チャービルの葉、チャイブスの葉、大黄の抽出物を一種類以上配合したもの（特許文献１０）、メドゥスイートの地上部、マテ茶、アルニカの花または茎、チャーブルの地上部、オールスパイス、テン茶、グアバの葉、オオハナサルスベリの地上部、タンジーの花または茎の抽出物を一種類以上配合したもの（特許文献１１）、Myrcia multiflora DC.の葉からの抽出成分（特許文献１２）等がある。
【０００５】
【特許文献１】特開平７−１１２９３８号公報（請求項１等）
【特許文献２】特開２０００−２２６３３３号公報（請求項１等）
【特許文献３】特開平６−２９３６５７号公報（請求項１等）
【特許文献４】特開平９−５９１６８号公報（請求項１等）
【特許文献５】特開２０００−１２８７９８号公報（請求項１等）
【特許文献６】特開平１０−１５８１８５号公報（請求項１等）
【特許文献７】特開２０００−１２８７９９号公報（請求項１等）
【特許文献８】特開２０００−１４３５２５号公報（請求項１等）
【特許文献９】特開平６−９４１６号公報（請求項１等）
【特許文献１０】特開２００３−１２８６５７号公報（請求項１等）
【特許文献１１】特開２００２−２５５８３７号公報（請求項１等）
【特許文献１２】特開２０００−１４３５号公報（請求項１等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、アルドースリダクターゼ阻害剤としては様々な物質から得られたものが存在するが、人体に対する安全性が必ずしも保障されているとは限らない。また、これらのアルドースリダクターゼ阻害剤は、生成や抽出にかなり手間がかかるものも多い。例えば、高温で抽出する必要があったり、人体にとって有毒である物質、例えばメチルアルコール等を用いて抽出され、最終的に人体に対して安全性が高いものとするための精製に手間がかかるものがある。
さらに、植物から抽出した有効成分を用いる場合、抽出された有効成分から少しでも効能の高いアルドースリダクターゼ阻害剤が得られるのが望ましい。
【０００７】
本発明は、このような技術的課題に基づいてなされたもので、比較的手間をかけずに得ることができるアルドースリダクターゼ阻害剤、その製造方法、アルドースリダクターゼ阻害剤を含有する健康食品、および医薬品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような技術的課題を鑑み、本発明者らが鋭意研究を行ったところ、本発明者らは、食品として食されていた歴史が長い茸類に着目し、茸類、特に万年茸にアルドースリダクターゼ阻害成分が含有されていることを発見するに至った。さらに研究を行った結果、茸類の生育に用いる種木（樹木）にも、アルドースリダクターゼ阻害成分が含有されていることを見出した。そこで、本発明者らは、樹木に着目し、さらに研究を重ねた。
このようにしてなされた本発明のアルドースリダクターゼ阻害剤は、裸子植物（針葉樹）の幹または枝から抽出されたエキスに含まれる有効成分を由来成分とすることを特徴とするものである。ここで、有効成分濃度を１００ｐｐｍ（＝エキス１ｍｌあたりの有効成分量[μｇ／ｍｌ]）としたときのアルドースリダクターゼ阻害効果が４０％以上であるエキスを用いるのが好ましい。また、アルドースリダクターゼ阻害率が５０％のときの有効成分濃度が１６ｐｐｍ以下であるエキスを用いるのが好ましい。
このようにして、樹木のエキスから、高いアルドースリダクターゼ阻害効果を有するアルドースリダクターゼ阻害剤を得ることができる。
【０００９】
本発明は、裸子植物である樹木の幹または枝から、有効成分を抽出する抽出工程と、有効成分からアルドースリダクターゼ阻害剤を得る阻害剤形成工程と、を含むことを特徴とするアルドースリダクターゼ阻害剤の製造方法として捉えることもできる。
この場合、抽出工程では、有効成分をエタノール及び／または水で抽出することができ、特に、有効成分をエタノール濃度が３０％以上の含水エタノールで抽出するのが好ましい。
また、樹木の幹または枝を粉砕する粉砕工程を経た後、粉砕された樹木から抽出工程にて有効成分を抽出し、阻害剤形成工程では、有効成分を粉末化してエキス粉末を得た後、エキス粉末を用いてアルドースリダクターゼ阻害剤を形成することもできる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、アルドースリダクターゼを阻害することにより、高血糖時にポリオール代謝系が亢進されることで蓄積するソルビトールの生成を抑制でき、糖尿病合併症である糖尿病性白内障、網膜症、腎不全、神経障害、動脈硬化などの予防及び治療に有効であるアルドースリダクターゼ阻害剤を、比較的手間をかけずに簡単に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、添付図面に示す実施の形態に基づいてこの発明を詳細に説明する。
本発明では、アルドースリダクターゼ阻害剤（有効成分）を裸子植物（針葉樹）である樹木、より詳しくは樹木の幹または枝から抽出して得る。
このような樹木としては、そてつ科、いちょう科、いちい科、まき科、いぬがや科、まつ科、こうやまき科、すぎ科、ひのき科等の樹木がある。
【００１２】
これらの樹木のうち、これらの樹木から抽出したエキスの、アルドースリダクターゼ阻害率が５０％のときの有効成分濃度（以下、ＩＣ50濃度）が１６ｐｐｍ以下である樹木を用いるのが好ましい。また、これらの樹木から抽出した１００ｐｐｍのエキスのアルドースリダクターゼ阻害効果が４０％以上である樹木を用いるのが好ましい。
また、用いる樹木は、入手が容易であるものが好ましい。さらに、自然保護の観点から言えば、他の用途で用いられた樹木の廃物利用等も好ましい。
これらの点からして、本発明を適用する樹木としては、すぎ科のスギ、まつ科のカラマツ等が特に適している。
【００１３】
樹木からアルドースリダクターゼ阻害剤を得るには、樹木の幹や枝を細かく粉砕し、エキスを抽出する。樹木の幹や枝は、例えば回転刃の付いた破砕装置等でチップ状に粉砕する。なお、粉砕することで得られるチップの大きさは、例えば１０ｍｍ以下とするのが好ましい。
【００１４】
続けて、抽出工程により微粉砕物からアルドースリダクターゼ阻害剤を含んだエキスを抽出する。アルドースリダクターゼ阻害剤を抽出するには、抽出液として水、低級アルコール、酢酸エチルなどの有機溶剤などを使用することができるが、特に、水および／またはエタノールを使用することが好ましい。水とエタノールは人体に対する安全性が高く、万が一抽出されたエキスに残っていても安全性に対する問題はない。また、水および／またはエタノールを用いて抽出すると、アルドースリダクターゼ阻害率に優れたアルドースリダクターゼ阻害剤を得ることができる。水とエタノールを混合した含水エタノールを抽出液として使用する場合、その含水率（混合比率）はどのようなものであってもよい。さらに、抽出工程の抽出時における水および／またはエタノールの温度は例えば８０℃など、温度が高い場合において若干アルドースリダクターゼ阻害率が高くなる傾向がみられるが、加熱せずに例えば１〜３０℃程度のいわゆる室温や１５〜２５℃のいわゆる常温であっても抽出したアルドースリダクターゼ阻害剤のアルドースリダクターゼ阻害率は優れたものとなる。
【００１５】
このように本実施の形態においては、人体にとって安全な樹木から、人体にとって安全な水やエタノールを用いてアルドースリダクターゼ阻害剤を抽出することができる。さらに、抽出においては水とアルコールの混合比率や、温度などの細かい条件を気にすることなく、優れたアルドースリダクターゼ阻害率を有するアルドースリダクターゼ阻害剤を抽出することができる。したがって、抽出時に加熱することなく、室温下で抽出することもでき、抽出にかかる手間やエネルギーコストを抑えることができる。
【００１６】
なお、抽出工程の後、得られたアルドースリダクターゼ阻害剤を含有するエキスを濃縮する濃縮工程を設けることができる。濃縮工程では、例えば水やエタノールなどの抽出液を常圧あるいは減圧雰囲気下で蒸発させることで、エキスに含まれるアルドースリダクターゼ阻害剤の濃度を高めることができる。
【００１７】
また、抽出工程や濃縮工程の後には、アルドースリダクターゼ阻害剤のエキスを健康食品や医薬品として形成する形成工程を設けることもできる。この工程では、抽出工程や濃縮工程で得られたエキスを粉末化工程においてスプレードライヤ等で粉末化した後、得られたエキス粉末をカプセルに充填したり、バインダ等を混合して所定形状に成形してタブレットの打錠を行ったりすることで、所定の形態の製品を得る。また、粉末化する際に所定粒度の微粉末あるいは顆粒状としたり、これを液体に混合してドリンク剤とすること等も可能である。なおアルドースリダクターゼ阻害剤のエキスは−２０℃で溶液のまま保存することもでき、また凍結乾燥や減圧濃縮した後に固形物として保存することができる。このような保存したものを形成工程で使用することもできる。
【００１８】
以上のようにして得られるアルドースリダクターゼ阻害剤は、医薬品または食品の形態で提供することができ、糖尿病に合併して発症する神経障害において、その障害の予防及び／または改善を期待することができる。なお、健康食品や医薬品として用いられる場合は、経口剤、貼布剤、点眼剤、注射剤等どのような剤型であっても良い。例えば、経口剤としては、散剤、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル、液剤などを挙げることができる。医薬品として用いて投与する場合には、経口投与、非経口投与、吸入、経直腸投与、局所投与などの各種投与形態を採用することができる。このうち、非経口投与には、皮下注射、静脈内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与または注入などが含まれる。用量は、一般に１回当たり約０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であり、通常１日に１〜５回投与される。ただし、正確な用量は、患者の年齢、体重、症状、投与経路などを考慮して、前記範囲内から決められる。また食品として用いられる場合には、ガム、キャンディ、ゼリー、錠菓、飲料などの形で提供することもできる。これらの健康食品や医薬品は、必要に応じて安定剤、賦形剤、増量剤等を含むことができる。
【実施例１】
【００１９】
（各種樹木抽出エキスのアルドースリダクターゼ阻害活性効果）
樹木として、スギ、カラマツを用いた。
それぞれの樹木の幹あるいは枝を細断して得たチップを、７０℃、濃度７０％の含水エタノールに対して４ｗｔ％添加し、抽出を１時間行った（含水エタノール抽出）。残渣を９０メッシュで篩い分け、更に５Ｃろ紙で吸引ろ過し、エキスを得た。得られたエキスをエキス終濃度（最終的な有効成分濃度）が１〜５０ｐｐｍとなるように希釈し、次に述べるアルドースリダクターゼ阻害活性（以下、ＡＲ阻害活性）としてアルドースリダクターゼ阻害率（以下、ＡＲ阻害率）を測定した。
【００２０】
ＡＲ阻害活性測定では、ヒト筋肉細胞由来のアルドースリダクターゼの全コーディング領域を含むｃ−ＤＮＡをバキュロウイルス−昆虫細胞系で発現したアルドースリダクターゼ（分子量：約３６０００、酵素活性：１ｕｎｉｔ／ｍｌ）を酵素液に用いた。なお、このアルドースリダクターゼはヒト筋肉及び網膜組織から抽出精製した酵素と同等の機能を有する。反応液の調整方法は次のとおりである。
（１）リン酸緩衝液（ｐＨ６．２）
（２）ＮＡＤＰＨ水溶液
（３）グリセルアルデヒド水溶液
（１）−（３）を用いて表１に示す組成に従って混合し、ＡＲ反応液を用意した。ブランクは酵素液の代わりに蒸留水を用いた。なお、以下の（１）以外の試薬は使用量に合わせて、都度調製したものを用いた。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
測定では、測定する反応液を２５℃に予備加熱した後、酵素液を５μl加え、２５℃に保ち、約１分後の３４０ｎｍにおける吸光度変化を５分程度にわたり記録した。１分間あたりの吸光度変化量をΔＡ／ｍｉｎとし、以下の計算式に従って、ＡＲ阻害活性とＡＲ阻害率を算出した。
ＡＲ阻害活性Ｘは、
Ｘ（ｕｎｉｔ／ｍｌ）＝（ΔＡ＿ｔｅｓｔ／ｍｉｎ−ΔＡ＿ｂｌａｎｋ／ｍｉｎ）×１／６．２／０．００５
１        ：反応液の全量（ｍｌ）
６．２    ：ＮＡＤＰＨの３４０ｎｍにおけるマイクロモル吸光係数
０．００５：反応に使用した酵素液量（ｍｌ）
という計算式で求められる。ＡＲ阻害率Ｙは、
Ｙ（％）＝｛１−（ＸSample／ＸControl）｝×１００
という計算式で求められる。ここで、ＸSampleは、エキスを添加した場合のＡＲ阻害活性（表１の“Ｓａｍｐｌｅ”）であり、ＸControlは、エキスの代わりに蒸留水を添加した場合のＡＲ阻害活性（表１の“Ｃｏｎｔｒｏｌ”）である。
【００２３】
結果を表２、表３に示す。また、表２に基づくＡＲ阻害率とエキス終濃度の関係を図１に示す。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
【表３】
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【００２６】
表２、図１からわかるように、各樹木とも、エキス終濃度に依存してＡＲ阻害率は増加した。図１の近似曲線から各樹木のＩＣ50濃度（ＡＲ阻害率５０％となるエキス終濃度）を算出したところ、表３に示すようになった。すなわち、いずれも、ＩＣ50濃度は１６ｐｐｍ以下であった。
図２は、有効成分濃度１００ｐｐｍの抽出エキスを添加したときのＡＲ阻害率を示すものである。この図２に示すように、濃度１００ｐｐｍの抽出エキスを添加したときのＡＲ阻害率は、いずれも４０％以上であった。
【実施例２】
【００２７】
（抽出法によるＡＲ阻害活性効果の検討）
実施例１と同様にして、スギのエキスを抽出し、ＡＲ阻害活性を測定し、ＡＲ阻害率を得た。ただし、抽出液として、熱水（１００℃）、７０％含水エタノール、１００％エタノールとした。
得られたエキス終濃度とＡＲ阻害率を含水エタノールのエタノール含有率（エタノール濃度）毎に表４に示す。また、それぞれの抽出液を用いて得られたエキスのＡＲ阻害率とエキス終濃度の関係のグラフを図３に示す。さらに、図３のデータの近似曲線から得られる、エキスのＩＣ50濃度を表５に示す。
【００２８】
【表４】
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【００２９】
【表５】
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【００３０】
図３に示すように、いずれの抽出液においても、ＡＲ阻害率はエキス終濃度に依存して増加した。また、熱水を用いて抽出した場合に比較し、含水エタノールを用いて抽出したエキスのＡＲ阻害率が明らかに高い。表５に示したように、ＩＣ50濃度においても、熱水を用いて抽出した場合に比較し、含水エタノールを用いて抽出したエキスのほうが、ＩＣ50濃度が低い。したがって、抽出には、熱水よりも含水エタノールを用いたほうが有利であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１における抽出エキスのＡＲ阻害効果におけるＡＲ阻害率とエキス終濃度の関係を示すグラフである。
【図２】実施例１において、１００ｐｐｍの抽出エキスにおけるＡＲ阻害率を示すグラフである。
【図３】実施例２において、熱水を抽出に用いた場合と、含水エタノールを抽出に用いた場合のＡＲ阻害率とエキス終濃度の関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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