(57)【要約】  【課題】  巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化を誘導および／または促進する因子を同定するための、生体事象を反映した多検体処理が可能な簡便な方法を提供することを目的とする。また、本発明は巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化を阻害および／または抑制する因子を同定するための、生体事象を反映した多検体処理が可能な簡便な方法を提供することを目的とする。また、本発明は、上記の方法によって同定された巨核球から血小板へと分化する過程を誘導、促進、阻害および／または抑制する因子を提供することを目的とする。  【解決手段】  巨核球としての性質を持つ培養細胞株ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞を用いて、巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化を誘導、促進、阻害および／または抑制する因子を同定するための方法を構築した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
巨核球から血小板への分化を誘導および／または促進する因子の同定方法であって、以下：
（１）候補因子をＵＴ−７／ＴＰＯ細胞に添加する工程、および
（２）ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞が血小板に分化したか否かを判定する工程
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法によって同定された、巨核球から血小板への分化を誘導および／または促進する因子。
【請求項３】
巨核球から巨核球胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）への分化を誘導および／または促進する因子の同定方法であって、以下：
（１）候補因子をＵＴ−７／ＴＰＯ細胞に添加する工程、および
（２）ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞が巨核球胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）に分化したか否かを判定する工程
を含む方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法によって同定された、巨核球から巨核球胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）への分化を誘導および／または促進する因子。
【請求項５】
巨核球から血小板への分化を阻害および／または抑制する因子の同定方法であって、以下：
（１）フィブロネクチンおよび候補因子をＵＴ−７／ＴＰＯ細胞の培養液中に添加する工程、
（２）ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞から血小板への分化が阻害および／または抑制されたか否かを判定する工程
を包含する方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法によって同定された、巨核球から血小板への分化を阻害および／または抑制する因子。
【請求項７】
巨核球から巨核球胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）への分化を阻害および／または抑制する因子の同定方法であって、以下：
（１）フィブロネクチンおよび候補因子をＵＴ−７／ＴＰＯ細胞の培養液中に添加する工程、
（２）ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞から巨核球胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）への分化が阻害および／または抑制されたか否かを判定する工程
を包含する方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法によって同定された、巨核球から巨核球胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）への分化を阻害および／または抑制する因子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、巨核球（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ）から巨核球胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）および／または血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）への分化を誘導および／または促進する因子の同定方法に関する。また、本発明は、巨核球から巨核球胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）および／または血小板への分化を阻害および／または抑制する因子の同定方法に関する。また、本発明は、上記の方法を用いて同定された、巨核球から巨核球胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）および／または血小板への分化に関連する因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板は、造血幹細胞から巨核球前駆細胞、巨核球（本明細書中、巨核球前駆細胞および巨核球を総称して巨核球系細胞という）、さらに巨核球胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）に至る種々の分化段階を経る。巨核球の分化および／または成熟の機構は、近年の細胞生物学および分子生物学の進展によって、徐々に解明されつつある。例えば、１９９４年に同定されたトロンボポエチン（ＴＰＯ）は、この機構の解明に大きく貢献した。ＴＰＯは、巨核球前駆細胞から巨核球に至る分化段階の細胞に作用する、巨核球の産生に必須の可溶性蛋白質である（非特許文献１および２を参照のこと）。しかし、ＴＰＯは、巨核球前駆細胞から巨核球になる初期の分化には作用するが、巨核球から血小板が形成される段階には作用しないことが明らかとなり、巨核球から血小板が形成される機構には未だ不明な部分が多く残されている。
【０００３】
血小板は、傷口の周囲に血栓を形成し止血することが主要な役割である。何らかの理由で血小板数が減少すると止血機構が破綻し出血傾向となる。血小板数の減少と関連する疾患としては、血小板減少症が挙げられる。血小板減少症の原因としては、骨髄における血小板産性の抑制および末梢での血小板の消費が挙げられる。例えば、癌化学療法または放射線療法によって生じる、骨髄での血小板産生の抑制によって引き起こされる血小板減少症の治療方法としては、血小板輸血が挙げられる。しかし、健常人から供給される血液から調製される輸血用血小板は、保存可能期間が短く、調製後の細菌による感染、提供者由来のウィルス感染、および輸血後拒絶反応などの問題点がある。血小板減少症の他の治療方法としては、ＴＰＯを用いた方法が挙げられる。ＴＰＯは、前臨床試験および臨床試験において、血小板増加作用や癌化学療法剤投与時の血小板減少の改善作用が確認されており、血小板減少症の治療薬の候補と考えられている。しかし、ＴＰＯは血小板産生の後期の段階（巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化段階）に顕著な活性を示さないので、ＴＰＯによる血小板増加は巨核球数の増加に付随して生じるものであり、ＴＰＯを用いても血小板のみを増加することはできない。
【０００４】
一方、血小板数が増加し過ぎると血栓が出来やすい状態となる。血小板の増加と関連する疾患としては、血小板増加症が挙げられる。血小板増加症の治療方法としては、血栓の形成を抑制する治療が挙げられる。血小板増加症は血中の血小板が異常増加している状態であり、原因として、原発性と二次性のものがある。前者では骨髄増殖性疾患（例えば、本態性血小板血症、慢性骨髄性白血病、または特発性骨髄線維症）が原因疾患となる。後者では感染症、悪性腫瘍、薬剤などが原因となる。従って、通常の治療は原疾患の治療が重要であり、対症療法として抗血栓治療が行なわれる。
【０００５】
上記のような血小板と関連する疾患（例えば、血小板減少症または血小板増加症）の治療剤および／または治療方法の開発には、巨核球系細胞から血小板への分化機構の解明、特に、巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化機構の解明が重要である。現在、巨核球から血小板への分化機構、および巨核球から血小板への分化に関与する因子についての報告はほとんどなく、高密度リポ蛋白質（ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）（ＨＤＬ）とアンチトロンビンＩＩＩあるいはＣ１インヒビターの複合体がマウス骨髄由来初代培養細胞からの巨核球胞体突起の形成を促進するという報告（非特許文献３）、およびヒトフィブロネクチンがプロテインキナーゼＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ）の活性化剤との併用でヒト巨核球株ＣＨＲＫ−２８８細胞に対して巨核球胞体突起構造の誘導を促進するとの報告（非特許文献４）があるのみである。
【０００６】
巨核球から血小板への分化を誘導、促進、阻害および／または抑制する生体内因子あるいはそのような機能を持つ低分子化合物がほとんど見つかっていない原因として、確立された同定方法が極めて少ないことが挙げられる。現在、同定方法の１つとしてマウス骨髄由来の初代培養細胞が用いられている。この同定方法は、動物取り扱いの技術の習得、質の良い骨髄細胞の調製、培養の至適条件の検討、評価に用いるための巨核球への分化条件の検討などに相当の期間を要する。また、同定方法に使用するためには純度の高い巨核球を大量に必要とするが、初代培養細胞は培養細胞株と比較して得られる細胞数が非常に少なく、スクリーニングに必要な細胞数を確保するためには多数の動物が必要になる。このように、上記のマウス骨髄由来の初代培養細胞を用いる方法は、大規模なスクリーニングの実施には不向きである。近年、ヒト臍帯血由来の血球系細胞を用いて巨核球の分化、血小板産生の研究が行なわれるようになってきた。しかしながら、一般の研究者がヒト臍帯血を日常的および／または継続的に入手することは困難であり、長期間に及ぶスクリーニングに使用することは不可能である。
【０００７】
大規模なスクリーニングには、培養細胞株を用いる方法が好都合である。培養細胞株を用いる方法は、入手も取り扱いも上記の初代培養細胞を用いる方法と比較して簡便である。その一方で、培養細胞株を用いる方法は、その細胞株が本来の巨核球および／または血小板の性質を維持しているかを精査する必要がある。巨核球から血小板、特に、巨核球から巨核球胞体突起への移行を示す培養細胞株は、現在ほとんど知られていない。最近、Ｊｉａｎｇらは、ヒトフィブロネクチンおよびＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）の同時添加によって巨核球胞体突起の構造を形成する、ＣＨＲＦ−２８８という細胞株を報告している（非特許文献４を参照のこと）。しかしながら、この細胞株の巨核球胞体突起への構造変化は、マウス骨髄由来の初代培養細胞を用いる方法と比較研究していないので、生体内での血小板産生過程をどれだけ反映しているのかは不明である。また、ＣＨＲＦ−２８８細胞株は巨核球前駆細胞様であり、巨核球へと成熟させるための操作が必要であり、至適条件の設定の必要性や煩雑さが問題である。また、マウスのＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を用いて、本来の機能を備えた血小板の産生を誘導できることも報告されている（非特許文献５を参照のこと）。しかし、この方法は、分化支持能を持つストローマ細胞株との共培養が必要で手間がかかること、すべてのＥＳ細胞が巨核球および／または血小板に分化するわけではなく様々な細胞の集合体となることなどから、スクリーニングへの使用には適していない。
【０００８】
上記のように、現在色々な方向から血小板産生についての研究がなされているが、未だ、生体内の事象を反映した簡便かつ多検体処理が可能な血小板分化関連因子の同定方法は存在しない。
【０００９】
【非特許文献１】ｄｅ  Ｓａｕｖａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３６９，５３３−５６５（１９９４）
【非特許文献２】Ｂａｒｔｌｅｙ  Ｔ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．７７，１１１７−１１２４（１９９４）
【非特許文献３】Ｉｓｈｉｄａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，ｖｏｌ．８５，３４９−５５．（２００１）
【非特許文献４】Ｊｉａｎｇ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．９９，３５７９−３５８４．（２００２）
【非特許文献５】Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  Ｔ．Ｔ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０２，４０４４−４０５１，（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の課題は、生体事象を反映した多検体処理が可能であり簡便な、巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化に関与する因子の同定方法を提供すること、ならびに、そのような同定方法によって同定された巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化に関与する因子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、巨核球としての性質を持つ培養細胞株ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞が巨核球から巨核球胞体突起に分化すること、およびその分化機構は生体内事象を反映したものであることを見出した。本発明者らは、この知見に基づき、巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化に関与する因子の同定方法を構築し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下からなる。
［１］巨核球から血小板への分化を誘導および／または促進する因子の同定方法であって、以下：
（１）候補因子をＵＴ−７／ＴＰＯ細胞に添加する工程、および
（２）ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞が血小板に分化したか否かを判定する工程
を含む方法、
［２］［１］に記載の方法によって同定された、巨核球から血小板への分化を誘導および／または促進する因子、
［３］巨核球から巨核球胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）への分化を誘導および／または促進する因子の同定方法であって、以下：
（１）候補因子をＵＴ−７／ＴＰＯ細胞に添加する工程、および
（２）ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞が巨核球胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）に分化したか否かを判定する工程
を含む方法、
［４］［３］に記載の方法によって同定された、巨核球から巨核球胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）への分化を誘導および／または促進する因子、
［５］巨核球から血小板への分化を阻害および／または抑制する因子の同定方法であって、以下：
（１）フィブロネクチンおよび候補因子をＵＴ−７／ＴＰＯ細胞の培養液中に添加する工程、
（２）ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞から血小板への分化が阻害および／または抑制されたか否かを判定する工程
を包含する方法、
［６］［５］に記載の方法によって同定された、巨核球から血小板への分化を阻害および／または抑制する因子、
［７］巨核球から巨核球胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）への分化を阻害および／または抑制する因子の同定方法であって、以下：
（１）フィブロネクチンおよび候補因子をＵＴ−７／ＴＰＯ細胞の培養液中に添加する工程、
（２）ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞から巨核球胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）への分化が阻害および／または抑制されたか否かを判定する工程
を包含する方法、
［８］［７］に記載の方法によって同定された、巨核球から巨核球胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）への分化を阻害および／または抑制する因子。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、生体事象を反映した多検体処理が可能であり簡便な、巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化に関与する因子の同定方法が提供される。また、本発明の同定方法によって、巨核球から血小板への分化に関与する因子の提供が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明者らは上記課題を解決すべく、巨核球としての性質を持つ培養細胞株であるＵＴ−７／ＴＰＯ細胞を用いて巨核球から血小板への分化に関与する因子を同定するための方法を構築した。ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞とは、巨核芽球性白血病（ｍｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）患者から分離されたＵＴ−７細胞の亜株（ｓｕｂ−ｌｉｎｅ）でＴＰＯ依存的増殖能および巨核球への分化能を持つ。これまでの詳細な生化学および／または分子生物学的研究により、ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞は巨核球前駆細胞および巨核球としての性質を維持していることが明らかとなっている（Ｋｏｍａｔｓｕ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．８７，４５５２−４５６０，（１９９６））。しかし、このＵＴ−７／ＴＰＯ細胞が巨核球から血小板に分化および／または成熟するか否かは検討されていない。
【００１５】
本発明者らは、ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞は、自然発生的な巨核球胞体突起形成は起こさないが、特定の培養条件において巨核球から巨核球胞体突起への形態変化を示すことを見出した。具体的には、ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞は自然発生的な巨核球胞体突起の形成は全く起こさない（すなわち、通常の継代操作および培養操作では巨核球から巨核球胞体突起に変化しない）が、フィブロネクチンを添加した培養条件において巨核球から巨核球胞体突起への分化を示す。
【００１６】
さらに、本発明者らは、この形態変化は、生体内事象を反映したものであることを見出した。具体的には、巨核球から巨核球胞体突起への分化に関連する因子の同定において確立された方法であるマウス骨髄細胞由来の初代培養細胞を用いる方法においても、ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞において設定された条件と類似の条件下（すなわち、フィブロネクチン添加）で、巨核球から巨核球胞体突起への形態変化が促進されることを見出した。これにより本発明者らは、ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞を用いた巨核球から巨核球胞体突起への分化に関連する因子の同定方法が、生体内での巨核球から巨核球胞体突起への分化段階を反映した方法であることを確認した。ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞を用いる本発明の方法は、ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞の培養に手間がかからないので、多検体を簡便かつ短時間で実施することができる。一般に、インビトロで巨核球を血小板に分化誘導しても巨核球胞体突起までしか分化しないことが知られている。巨核球胞体突起の細胞は血小板の直前段階の細胞であること、および巨核球胞体突起まで誘導できれば血小板までの分化は十分に方向付けられていることから、本発明者らは、ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞を用いれば巨核球から巨核球胞体突起への分化に関連する因子だけでなく、巨核球から血小板への分化に関連する因子も同定できると考えている。
【００１７】
本明細書において、「巨核球前駆細胞」とは、造血幹細胞から、骨髄系前駆細胞を経て、さらに巨核球系細胞へと分化したものである。この巨核球前駆細胞がさらに分化すると巨核球となる。
【００１８】
本明細書において、「巨核球」とは、巨核球系前駆細胞がさらに分化したものであり、細胞質の分裂を伴わないＤＮＡ合成（ｅｎｄｏｍｉｔｏｓｉｓ）によって、核内のＤＮＡ量は、８〜３２Ｎとなっている。細胞質は広く、ピンク色を呈し、微細なアズール好性顆粒が認められ、大型な細胞で１００μｍを超えるものもある。分子マーカー的には、ＣＤ４１陽性である。
【００１９】
本明細書において、「巨核球胞体突起」とは、血小板の直前段階の細胞を意味する。巨核球胞体突起は、成熟した巨核球が核数の増加を伴わずに変化する、ひも状の構造を特徴とする細胞の形態で、このひも状構造が細かく切断され血小板になると考えられている。
【００２０】
本明細書において、「血小板」とは、巨核球が、巨核球胞体突起と呼ばれる形態変化を経て、そのひも状構造の細胞質が断片化されて、形成されたものである。血小板は、止血機構に重要な役割を果たす、核を有しない円盤状の直径２〜４μｍの小さな血球成分であり、分子マーカーは、ＣＤ４１陽性である。
ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞とは、巨核芽球性白血病（ｍｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）患者から分離されたＵＴ−７細胞の亜株である。ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞は、文献に記載の方法（Ｋｏｍａｔｓｕ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．８７，４５５２−４５６０，（１９９６））に従ってＵＴ−７細胞にＴＰＯを作用させることによって入手可能である。これまでの詳細な生化学および／または分子生物学的研究により、ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞は巨核球前駆細胞および巨核球としての性質を維持していることが明らかとなっている（Ｋｏｍａｔｓｕ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．８７，４５５２−４５６０，（１９９６））。しかし、このＵＴ−７／ＴＰＯ細胞が巨核球から血小板に分化または成熟するか否かは検討されていない。
【００２１】
本発明の方法において、無血清培地に懸濁した細胞を９６ウェルプレートなどの培養用プレートに播種し、試験サンプルを添加し３７℃でＣＯ２インキュベータ中で培養する。巨核球から血小板への分化に関与するか否かを試験する候補因子の添加は、細胞の播種の前であっても、播種と同時であっても、播種の後であってもよいが、好ましくは、細胞の播種と同時である。培養用プレートはコラーゲンコートを施したものであってもコラーゲンコートを施していないものであってもよいが、コラーゲンコートを施した培養用プレートが好ましい。好ましくは約１〜６時間、より好ましくは約１〜３時間培養した後、細胞の形態変化を観察することによって候補因子の活性を評価する。
【００２２】
評価する細胞が巨核球、巨核球胞体突起、または血小板のいずれかであることの判断は、細胞の形態変化によって行なう。巨核球、巨核球胞体突起、または血小板の分化マーカーとして一般に使用されるＣＤ４１やフォンビルブラント因子は三者間で共通に発現しており、分化マーカーのみを用いて巨核球、巨核球胞体突起、および血小板を識別することはできず、顕微鏡またはカメラ等による目視が必須である。形態の観察は、細胞を染色せずに実施してもよいし、細胞を染色してから観察してもよいが、細胞を染色してから観察することが好ましい。酵素活性に基づく染色または免疫染色によって細胞の形態をより明確にすることができる。酵素活性に基づく染色としては、例えば、コリンエステラーゼ染色が挙げられる。免疫染色に用いることができる抗体としては、抗ＣＤ４１抗体、抗フォンビルブラント因子抗体等が挙げられる。以下の実施例にも記載するように、巨核球、巨核球胞体突起または血小板の膜蛋白質特異的マーカーとしてＣＤ４１（インテグリンａＩＩ、ＧＰＩＩｂ）およびフォンビルブラント因子を用い、これらのマーカーの局在性を免疫染色により解析した。これらのマーカーは、巨核球表面にも血小板の膜表面にも局在する。これらのマーカーが、形態変化した巨核球の突起部分にも存在するならば、この突起構造は血小板形成の過程で現れるものと考えられる。
【００２３】
本発明者らは、ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞がフィブロネクチンの添加により、再現性良く巨核球胞体突起に形態変化することを見出した。フィブロネクチンとしては、哺乳動物由来のフィブロネクチンが挙げられる。ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、またはウマ由来のフィブロネクチンが好ましく、ヒト由来のフィブロネクチンがより好ましく、ヒト血清由来のフィブロネクチンがさらにより好ましい。細胞に添加するフィブロネクチンの濃度としては、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ、より好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬ〜８μｇ／ｍＬである。
【００２４】
本発明によって、巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化を誘導および／または促進する因子を同定することができる。具体的には、（１）ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞に候補因子を添加し、（２）候補因子を添加したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞が巨核球胞体突起および／または血小板に形態変化したときに、その候補因子を巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化を誘導および／または促進する因子として同定することができる。
【００２５】
また、本発明によって、フィブロネクチンを陽性コントロールとして用いて巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化を誘導および／または促進する因子を同定することができる。具体的には、（１）一方のＵＴ−７／ＴＰＯ細胞にフィブロネクチンを添加し、他方のＵＴ−７／ＴＰＯ細胞に候補因子を添加し、（２）候補因子を添加したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞が、フィブロネクチンを添加した細胞と比較して同様に巨核球胞体突起および／または血小板に形態変化したときに、その候補因子を巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化を誘導および／または促進する因子として同定することができる。
【００２６】
あるいは、フィブロネクチンを用いて、巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化を阻害および／または抑制する因子を同定することができる。具体的には、（１）巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化を誘導および／または促進する濃度のフィブロネクチンならびに候補因子をＵＴ−７／ＴＰＯ細胞に添加し、（２）ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞が巨核球のままである場合に、その候補因子を巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化を阻害および／または抑制する因子として同定することができる。細胞に添加するフィブロネクチンの濃度としては、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ、より好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬ〜８μｇ／ｍＬである。
【００２７】
さらに、フィブロネクチンを用いて、巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化をフィブロネクチンと共同して誘導および／または促進する因子を同定することができる。具体的には、（１）（Ａ）巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化は誘導しないが巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化を方向付ける濃度のフィブロネクチンと（Ｂ）候補因子を、ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞に添加し、（２）そのＵＴ−７／ＴＰＯ細胞が血小板および／または巨核球胞体突起への分化したときに、その候補因子を、巨核球から血小板および／または巨核球胞体突起への分化をフィブロネクチンと共同して誘導および／または促進する因子として同定することができる。本明細書において、「巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化は誘導しないが巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化を方向付ける濃度」とは、その濃度のフィブロネクチン単独では巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化を誘導も促進もしないが、共同して作用する因子の存在下で巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化を誘導および／または促進するようなフィブロネクチンの濃度をいう。巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化は誘導しないが巨核球から巨核球胞体突起および／または血小板への分化を方向付けるフィブロネクチンの濃度とは、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜１２５ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜６２．５ｎｇ／ｍＬの範囲である。
【００２８】
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
（実施例１．ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞を用いた血小板への分化誘導）
（１．１．ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞を用いた形態変化の誘導）
５％  ＣＯ２インキュベータ中、継代用培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）＋１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＭＯＲＥＧＡＴＥ社製）＋６ｎｇ／ｍＬ  ＴＰＯ（ＰＥＰＲＯ  ＴＥＣＨ  ＥＣ  ＬＴＤ社製））を用いて２５ｃｍ２フラスコにて培養したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞の懸濁液（１０ｍＬ）を１５ｍＬ遠沈管に入れ、約２時間自然沈降させた。上清を７ｍＬ除去後、新たに７ｍＬの継代用培地を加え、懸濁して細胞数を測定した。約２ｍＬの細胞懸濁液を、室温にて１，０００ｒｐｍで、５分間遠心した。上清を捨て２．０×１０５個／ｍＬになるように形態変化誘導用培地（３００μｇ／ｍＬ  トランスフェリン（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を含むＤｕｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（ＳＩＧＭＡ社製））にて細胞を懸濁した。形態変化誘導用培地にて１６μｇ／ｍＬ  フィブロネクチン（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）溶液を調製した。
【００３０】
Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ９６−ウェル（旭テクノグラス社製）のウェル中でフィブロネクチン溶液の２倍系列希釈液を作製した。液量は２０μＬ／ウェルとし、１６μｇ／ｍＬを最高濃度として１１段階の希釈を行った。それぞれのウェルに上記の調製した細胞懸濁液２０μＬを添加して混合後、５％  ＣＯ２インキュベータ中、３７℃にて約１時間保温した。各ウェルの容量は４０μＬで、フィブロネクチンの最終濃度は７．８ｎｇ／ｍＬから８μｇ／ｍＬまでとした。また、２０μＬ／ウェルずつの形態変化誘導用培地と細胞懸濁液とを混合したコントロールも用意した。形態変化の割合は顕微鏡観察により評価した。
【００３１】
観察された形態変化は、いくつかの特徴があった（図１）。成熟化が進んだと考えられる大型の細胞から比較的高頻度で突起の出現が見られたが、小型の細胞でも形態変化が誘導された。突起構造は細胞からほぼ直線的に伸びる形で出現し、多い場合はひとつの細胞から４〜５本現れた（図１，下の矢印で示した細胞）。通常は直線上の突起構造のみが観察されたが、時々突起の中間部付近に節状の円形の構造物が観察された。一本の突起構造からの枝分かれは観察されなかった。形態変化は、突起物の出現が特徴であって、通常細胞自体には大きな変化は伴わないが、特に小型の細胞の場合でまれに細胞側も変化して、全体として紡錘状の形態を示すこともあった（図１，上の矢印で示した細胞）。
【００３２】
２本以上の突起が形成されている細胞が鏡検（倍率１００倍）一視野あたり平均５以上存在する場合を＋、１以上５未満の場合を±、１未満の場合を−として、誘導条件の検討を行った。その結果、コラーゲンコートしたプレート上、フィブロネクチン濃度２５０ｎｇ／ｍＬ以上で形態変化が誘導され、フィブロネクチン濃度４〜８μｇ／ｍＬで最も高い効率が得られることがわかった（表１）。形態変化する細胞は、最高で全体の約５％であった。コラーゲンコートしたプレート上で、８μｇ／ｍＬ  フィブロネクチンの刺激により形態が変化した細胞の例を図１に示した。
【００３３】
【表１】
2006094827.tif 000002
【００３４】
（１．２．形態変化を誘導したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞の抗ＣＤ４１抗体を用いた免疫染色）
５％  ＣＯ２インキュベータ中、継代用培地（ＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳ＋６ｎｇ／ｍＬ  ＴＰＯ）を用いて２５ｃｍ２フラスコにて培養したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞の懸濁液（１０ｍＬ）を１５ｍＬ遠沈管に入れ、約２時間自然沈降させた。上清を７ｍＬ除去後、新たに７ｍＬの継代用培地（ＩＭＤＭ＋１０％  ＦＢＳ＋６ｎｇ／ｍＬ  ＴＰＯ）を加え、懸濁して細胞数を測定した。約２ｍＬの細胞懸濁液を、室温にて１，０００ｒｐｍで、５分間遠心した。上清を捨て３．８×１０５個／ｍＬになるように、形態変化誘導用培地（３００μｇ／ｍＬ  トランスフェリンを含むＤＭＥＭ）にて調製した。１６μｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液を、形態変化誘導用培地にて調製した。上記の調製した細胞懸濁液（４０μＬ）と、調製したフィブロネクチン溶液（４０μＬ）を混合した。Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  Ｃｅｌｌｗａｒｅ  ８−ｗｅｌｌ  ＣｕｌｔｕｒｅＳｌｉｄｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用意し、上記の混合液を４ウェルにスポットした。その後５％  ＣＯ２インキュベータ中、３７℃にて約１時間保温し、形態変化を誘導させた。
【００３５】
形態変化誘導処理を行った細胞を含むＣｕｌｔｕｒｅＳｌｉｄｅに、１００μＬの１０％  ホルマリン溶液を細胞液スポット上に滴下した。室温にて１０分間放置し、細胞を固定した。固定後、細胞をＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｔｓ（ＰＢＳ）（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ社製）（０．１ｍＬ）で３回洗浄した。０．７５％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を含むＰＢＳ（１００μＬ）で、細胞を室温にて約１時間ブロッキングした。ブロッキング後、細胞をＰＢＳ（０．１ｍＬ）で３回洗浄し、一次抗体（抗ＣＤ４１抗体（フナコシ社製）あるいは陰性コントロール用抗体（ノーマルマウスＩｇＧ：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製））を添加した。抗ＣＤ４１抗体は４滴／ウェル添加し、陰性コントロール用抗体は２５０倍希釈したものを５０μＬ／ウェル添加した。約１〜１．５時間室温にて放置した。細胞をＰＢＳ（０．１ｍＬ）で３回洗浄し、１００倍希釈した二次抗体（ＦＩＴＣ−ヤギ抗マウスＩｇＧ：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）を５０μＬ／ウェル添加した。このＣｕｌｔｕｒｅＳｌｉｄｅをアルミホイルで遮光して、約１〜１．５時間室温にて放置した。ＰＢＳ（０．１ｍＬ）で３回洗浄し、ＣｕｌｔｕｒｅＳｌｉｄｅのチャンバーをはずした。ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を１滴／ウェル滴下した。カバーガラスをつけ、トップコートでシールした後、蛍光顕微鏡で鏡検した。鏡検終了後、作製したプレパラートは、アルミホイルで遮光して冷蔵保存した。プレパラート作製後、一週間以内に共焦点レーザー顕微鏡で鏡検した。
【００３６】
作製したプレパラートを蛍光顕微鏡で鏡検したところ、抗ＣＤ４１抗体を添加した細胞のみが染色され、陰性コントロール用抗体を添加した細胞は染色されなかった。さらに、共焦点レーザー顕微鏡で鏡検したところ、抗ＣＤ４１抗体を添加した細胞では細胞の周縁部と突起部分が顕著に染色されており、陰性コントロール用抗体を添加した細胞では染色が確認されなかった（図２）。
【００３７】
（１．３．形態変化を誘導したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞の抗フォンビルブラント因子抗体を用いた免疫染色）
５％  ＣＯ２インキュベータ中、継代用培地（ＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳ＋６ｎｇ／ｍＬ  ＴＰＯ）を用いて２５ｃｍ２フラスコにて培養したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞の懸濁液（１０ｍＬ）を１５ｍＬ遠沈管に入れて、約２時間自然沈降させた。上清を７ｍＬ除去後、新たに７ｍＬの継代用培地（ＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳ＋６ｎｇ／ｍＬ  ＴＰＯ）を加え、懸濁して細胞数を測定した。約２ｍＬの細胞懸濁液を、室温にて１，０００ｒｐｍで、５分間遠心した。上清を捨て３．８×１０５個／ｍＬになるように、形態変化誘導用培地（３００ｍｇ／ｍＬ  トランスフェリンを含むＤＭＥＭ）にて調製した。１６μｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液を、形態変化誘導用培地にて調製した。上記の調製した細胞懸濁液（４０μＬ）と、調製したフィブロネクチン溶液（４０μＬ）を混合した。Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  Ｃｅｌｌｗａｒｅ  ８−ｗｅｌｌ  ＣｕｌｔｕｒｅＳｌｉｄｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用意し、上記の混合液を４ウェルにスポットした。その後５％  ＣＯ２インキュベータ中、３７℃にて約１時間保温し、形態変化を誘導させた。
【００３８】
形態変化誘導処理を行った細胞を含むＣｕｌｔｕｒｅＳｌｉｄｅに、１００μＬの１０％  ホルマリン溶液を細胞液スポット上に滴下した。室温にて１０分間放置し、細胞を固定した。固定後、ＰＢＳ（０．１ｍＬ）で３回洗浄した。０．７５％  ＢＳＡを含むＰＢＳ（１００μＬ）で、室温にて約１時間ブロッキングした。ブロッキング後、細胞をＰＢＳ（０．１ｍＬ）で３回洗浄し、一次抗体｛抗フォンビルブラント因子抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）あるいは陰性コントロール用抗体（ノーマルヤギＩｇＧ：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）｝を添加した。抗フォンビルブラント因子抗体は１００倍希釈したものを５０μＬ／ウェル添加し、陰性コントロール用抗体は２５０倍希釈したものを５０μＬ／ウェル添加した。約１〜１．５時間室温にて放置した。細胞をＰＢＳ（０．１ｍＬ）で３回洗浄し、１００倍希釈した二次抗体（ＦＩＴＣ−ロバ抗ヤギＩｇＧ：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）を５０μＬ／ウェル添加した。このＣｕｌｔｕｒｅＳｌｉｄｅをアルミホイルで遮光して、約１〜１．５時間室温にて放置した。細胞をＰＢＳ（０．１ｍＬ）で３回洗浄し、ＣｕｌｔｕｒｅＳｌｉｄｅのチャンバーをはずした。ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を１滴／ウェル滴下した。カバーガラスをつけ、トップコートでシールした後、蛍光顕微鏡で鏡検した。鏡検終了後、作製したプレパラートは、アルミホイルで遮光して冷蔵保存した。プレパラート作製後、一週間以内に共焦点レーザー顕微鏡で鏡検した。
【００３９】
作製したプレパラートを蛍光顕微鏡で鏡検したところ、抗フォンビルブラント因子抗体を添加した細胞のみが染色され、陰性コントロール用抗体を添加した細胞は染色されなかった。さらに、共焦点レーザー顕微鏡で鏡検したところ、抗フォンビルブラント因子抗体を添加した細胞では周縁部と突起部分が顕著に染色されており、陰性コントロール用抗体を添加した細胞は染色されなかった（図３）。
【００４０】
免疫染色したサンプルを共焦点レーザー顕微鏡で観察した実験によって、抗ＣＤ４１抗体および抗フォンビルブラント因子抗体が細胞表面および突起部分に特異的に結合することが明らかになった（図２および３）。これは、フィブロネクチンによって分化を誘導したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞の細胞表面および突起部分に血小板のマーカー蛋白質であるＣＤ４１およびフォンビルブラント因子が発現していることを示す。一方、コントロール抗体ではシグナルはほとんど検出されなかった。また、正常の巨核球がポリリジンプレート上に接着する際に生じる糸状偽足（ｆｉｌｏｐｏｄｉａ）の中にはフォンビルブラント因子は存在しないことが報告されているので、この突起が接着に関係したものである可能性は低い。従って、本実施例の結果は、ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞の形態変化（突起形成）がヒトの巨核球から血小板形成への分化によるものであることを示唆する。
【００４１】
（実施例２．マウス骨髄由来巨核球細胞を用いた血小板への分化誘導）
実施例１のＵＴ−７／ＴＰＯ細胞を用いる方法が妥当であるか否かを検討するために、巨核球から血小板への分化および／または誘導の研究において確立されているマウス骨髄由来巨核球を用いて、本質的に実施例１と同様の実験を行い比較検討した。
【００４２】
（２．１．マウス骨髄由来巨核球細胞を用いた巨核球胞体突起の形成）
まず、マウス骨髄を採取し、培養するために以下の操作を行なった。１回のマウス骨髄採取につき、ｄｄｙマウス（日本ＳＬＣ、５週齢以上）１０匹を準備し、その体重を測定した。ｄｄｙマウス１匹あたり、大腿骨を２本摘出し、ＰＢＳ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ社製）（２０ｍＬ入りのシャーレ（旭テクノグラス社製）内へ湿保存した。全１０匹のマウス大腿骨を採取後、それに付随している肉片をおおまかにトリミングした。このときＰＢＳ（−）２０ｍＬ入りのシャーレは、適宜新たなものに交換し、できるだけ大腿骨以外のもの例えば肉片や体毛を、次のステージに持ち越さないようにした。続いて滅菌したキムワイプなどを用い、大腿骨に付随する肉片をさらにトリミングした。大腿骨の両端をダイヤモンド刃付きの動物解剖用ハサミにてカット後、ＨＢＳＳ（−）（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）（２０ｍＬ入りシャーレ内で、２５Ｇ×１針付き１ｍＬシリンジ（ともにテルモ社製）を用い、ＨＢＳＳ（−）にてサスペンドするようにして骨髄を採取した。骨髄採取後、その細胞懸濁液２０ｍＬを５０ｍＬ遠沈管へ移した。シャーレをさらにＨＢＳＳ（−）５ｍＬで洗い込みをし、その細胞懸濁液を先の５０ｍＬ遠沈管へと移した。５０ｍＬ遠沈管内の約２５ｍＬの細胞懸濁液を、軽く均一にサスペンドした後、１０分間静置した。１０分後、５０ｍＬ遠沈管内の上清を回収して、細胞をカウントした。細胞をカウント後、上記上清を室温にて１，０００ｒｐｍで、５分間遠心した。遠心終了後、沈殿物を巨核球増殖培地（ＩＭＤＭ＋１０％  ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＰＯ）２０ｍＬにてサスペンドした。培養には、浮遊細胞用７５ｃｍ２フラスコ（住友ベークライト社製）を用いることとし、８個用意した。そして７５ｃｍ２フラスコ１個あたり、先の細胞懸濁液２．５ｍＬと巨核球増殖培地１７．５ｍＬを混合し、５％  ＣＯ２インキュベータ中、３７℃にて５日間培養した。
【００４３】
次に、マウス骨髄由来巨核球を選択的に培養するために以下の操作を行なった。上記のように、５％  ＣＯ２インキュベータ中、７５ｃｍ２フラスコにて５日間培養したマウス骨髄細胞（２０ｍＬ）を８個用意し、その骨髄細胞培養液を、５０ｍＬ遠沈管４本へ移した（約４０ｍＬ×４本）。そして室温にて１，０００ｒｐｍで、５分間遠心した。遠心終了後、沈殿物を巨核球誘導培地（ＩＭＤＭ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＰＯ＋１０μｇ／ｍＬ  インシュリン（和光純薬社製）＋５μｇ／ｍＬ  トランスフェリン＋０．１％  ＢＳＡ）４０ｍＬにてサスペンドした（遠沈管１本あたり１０ｍＬとした）。培養は、浮遊細胞用２５ｃｍ２フラスコ（住友ベークライト社製）を用いることとし、８個用意した。そして２５ｃｍ２フラスコ１個あたり、先の細胞懸濁液５ｍＬを分注し、５％  ＣＯ２インキュベータ中、３７℃にて２日間培養した。
【００４４】
次いで、マウス骨髄由来巨核球を調製するために以下の操作を行なった。上記のように、５％  ＣＯ２インキュベータ中、２５ｃｍ２フラスコにて２日間培養したマウス骨髄細胞（５ｍＬ）を８個用意し、その骨髄細胞培養液を、１５ｍＬ遠沈管４本へ移し（約１０ｍＬ×４本）、１時間静置させ、細胞を自然沈降させた。１時間の自然沈降後、１５ｍＬ遠沈管の下部２．０ｍＬを採取した（２．０ｍＬ×４本）。新たに１５ｍＬ遠沈管を２本用意し、各１本ずつその底部から１６％  ＢＳＡ／ＨＢＳＳ（−）１．５ｍＬ、４％  ＢＳＡ／ＨＢＳＳ（−）３．０ｍＬ、２％  ＢＳＡ／ＨＢＳＳ（−）１．５ｍＬ、そして最上段に自然沈降を終えたサンプル４．０ｍＬを静かに重層し、１時間静置させ、ＢＳＡ／ＨＢＳＳ（−）密度勾配沈降法を行った。上記のように１時間のＢＳＡ／ＨＢＳＳ（−）密度勾配沈降法を実施した後、１５ｍＬ遠沈管各１本ずつより下部２．０ｍＬを採取した。続いて、２本の遠沈管内の細胞溶液を１本にまとめた（２．０ｍＬ×２本を４．０ｍＬへ）。さらにＩＭＤＭ  ６．０ｍＬを加え、軽くサスペンドし室温にて１，０００ｒｐｍで、５分間遠心することによって、選択的に培養したマウス骨髄由来巨核球を回収した。遠心終了後、沈殿物（マウス骨髄由来巨核球）を、巨核球突起形成培地（ＩＭＤＭ＋１０μｇ／ｍＬ  インシュリン＋５μｇ／ｍＬ  トランスフェリン＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−６（ｕｐｓｔａｔｅ社社）＋２０μＭ  硫酸亜鉛（和光純薬社製）＋０．１％  ＢＳＡ）１．０ｍＬにてサスペンドし、細胞をカウントした。細胞をカウントした後、実験の目的に応じた細胞溶液濃度に、巨核球突起形成培地を用い希釈した。これによって回収したマウス骨髄由来巨核球を実験の目的に応じた細胞溶液濃度に調製した。
【００４５】
上記のように調製したマウス骨髄由来巨核球を用いて、以下のような巨核球胞体突起細胞への分化を調べた。上記の調製した巨核球をＣｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ９６−ｗｅｌｌ（旭テクノグラス社製）へ７００細胞／ウェルで播種した。液量は、７５μＬ／ウェルとした。巨核球突起形成培地を用いてフィブロネクチン溶液を作製し、５１２μｇ／ｍＬを最高濃度として８μｇ／ｍＬまで７段階の２倍系列希釈液を作製した。上記の細胞を播種したそれぞれのウェルに、上記で調製したフィブロネクチン溶液２５μＬを添加して混合後、５％  ＣＯ２インキュベータ中、３７℃にて培養を開始した。各ウェルの容量は１００μＬで、フィブロネクチンの最終濃度は２μｇ／ｍＬから１２８μｇ／ｍＬまでとした。またコントロールとして、巨核球突起形成培地のみを添加して混合したサンプルも用意した。
【００４６】
１日間の培養後、倒立顕微鏡Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩＬにて鏡検し、ウェルあたりの巨核球胞体突起数を計測した。図４に誘導された巨核球胞体突起細胞の形態を示す。また、図５にフィブロネクチンの濃度と誘導された巨核球胞体突起様細胞の数との関係を示した。
【００４７】
マウス骨髄由来巨核球を用いた場合も、フィブロネクチンによって巨核球胞体突起細胞への形態変化が観察された（図４および５）。
【００４８】
本実施例において、フィブロネクチンを添加したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞の形態変化（実施例１）は、フィブロネクチンを添加したマウス骨髄由来巨核球の形態変化（実施例２）と同様の変化であったことが実証された。上記にも説明したように、マウス骨髄由来巨核球細胞は、巨核球から血小板への分化誘導の研究において頻繁に使用されている細胞である。信頼性のあるマウス骨髄由来巨核球細胞を用いる方法と同様の分化形態を示すことから、ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞を用いる方法も巨核球から血小板への分化プロセスを反映した方法であるといえる。さらに、ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞は自然発生的な巨核球胞体突起形成を起こさないので実験に使用し易く、巨核球から血小板へ分化を誘導、促進、阻害、または抑制する因子の同定に好適であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、フィブロネクチン刺激によりＵＴ−７／ＴＰＯ細胞に認められる突起状形態変化を示す。Ａ．フィブロネクチン非添加。Ｂ．８μｇ／ｍＬのフィブロネクチンを添加した際の細胞の形態。矢印は典型的な形態変化を起こした細胞を示す。
【図２】図２は、フィブロネクチン刺激により形態変化したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞におけるＣＤ４１の局在性を示す。二次抗体にＦＩＴＣ−ヤギ抗マウスＩｇＧを用い、共焦点レーザー顕微鏡にて鏡検した。Ａ：一次抗体は、抗ＣＤ４１抗体を用いた。Ｂ：一次抗体は、陰性コントロール用抗体（ノーマルマウスＩｇＧ）を用いた。
【図３】図３は、フィブロネクチン刺激により形態変化したＵＴ−７／ＴＰＯ細胞におけるフォンビルブラント因子の局在性を示す。二次抗体にＦＩＴＣ−ロバ抗ヤギＩｇＧを用い、共焦点レーザー顕微鏡にて鏡検した。Ａ：一次抗体は、抗フォンビルブラント因子抗体を用いた。Ｂ：一次抗体は、陰性コントロール用抗体（ノーマルヤギＩｇＧ）を用いた。
【図４】図４は、マウス骨髄細胞由来巨核球からフィブロネクチンによって誘導された巨核球胞体突起細胞の形態を示す。フィブロネクチン含有培地中で一晩培養した巨核球の形態を顕微鏡により観察した。巨核球胞体突起に特徴的なひも状構造が観察された。１〜３．フィブロネクチンの添加によって巨核球胞体突起形態変化を起こした細胞。１〜３は各々、同一条件下での細胞である。４．フィブロネクチン非存在下で培養したコントロール細胞（巨核球）。
【図５】図５は、フィブロネクチンがマウス骨髄細胞由来巨核球から巨核球胞体突起細胞への分化に与える効果を示す。ｄｄｙマウス大腿骨由来骨髄細胞から成熟させた巨核球（７００細胞／ウェル／９６ウェルプレート）を、種々の濃度のフィブロネクチンを含む培地中で９６ウェルプレートを用いて一晩培養した後、巨核球胞体突起形態変化を起こした細胞数を測定した。各濃度３連にて実験を行い、平均値を示した。エラーバーは標準偏差を示す。縦軸はウェルあたりの巨核球胞体突起細胞の数を示し、横軸はフィブロネクチンの濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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