(57)【要約】      （修正有）【課題】ラクトシルセラミドのガラクトース残基にシアル酸を転移してガングリオシドＧＭ3を合成する酵素及びその酵素をコードするＤＮＡを提供する。【解決手段】浮遊系癌細胞である白血病患者の白血病細胞株を分化誘導剤を用いて上記酵素を発現する状態に分化させる。その細胞から逆転写ＰＣＲによりｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡライブラリーを哺乳類細胞に形質転換を行ない、ＧＭ３の生成を解析し、上記酵素をコードする配列を収集する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１における塩基番号２０２〜１２７８で示される塩基配列からなる、請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２に記載のＤＮＡで形質転換された細胞を好適な培地で培養し、当該ＤＮＡがコードするポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、その培養物から当該ポリペプチドを採取することを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項５】
形質転換された細胞が、哺乳類由来の培養細胞である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
哺乳類由来の培養細胞が、３ＬＬ−ＨＫ４６である、請求項５に記載のポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シアル酸転移酵素及びそれをコードするＤＮＡに関する。より詳細にはラクトシルセラミドのガラクトース残基にシアル酸を転移してガングリオシドＧＭ3を合成する酵素及びその酵素をコードするＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０は悪性転換により無限増殖能を獲得した細胞株であり、白血病細胞のモデルとして一般的に広く用いられている（非特許文献１及び２）。上記細胞株は、培養を続けた際にも分化することはなく未分化な細胞のまま増殖を続けるが、上記細胞株の培養培地に分化誘導剤として広く用いられているホルボールエステルを添加して培養を続けると、細胞増殖を停止し、単球或いはマクロファージと同様な形態を示すようになり、分化が誘導される。その過程でガングリオシドの一種であるＧＭ3量が顕著に増大すること（非特許文献３）、及び上記ガングリオシドＧＭ3を外来性に添加した際もホルボールエステルを添加した際と同様の変化、すなわち単球系分化が細胞に起こることが報告されている（非特許文献４）。また、この分化の過程において、ＧＭ3そのものが分化誘導活性を有していること（非特許文献５）、さらに化学合成ＧＭ3によっても分化が誘導されることが証明されている（非特許文献６及び７）。
【０００３】
一方、シアル酸含有糖脂質、その中でも特にガングリオシドが様々な生物現象において重要な機能を担っていることが明らかとなり、その機能のみならず生合成が解明されつつある。脊椎動物において、多くのガングリオシド（ガングリオ系ガングリオシド）は主要ガングリオシドのうちで最も単純な構造を持つＧＭ3を共通の前駆体としており、主要な機能を持つガングリオシドの生合成の根幹をＧＭ3の合成がなしている。
【０００４】
上述のようにガングリオシドＧＭ3はそれ自体が細胞・組織の増殖・分化に関与するとともに脊椎動物においては様々な機能を有するより高級なガングリオシド群の前駆体となっていることが示唆されている。
【０００５】
ＧＭ3は、ＣＭＰ−シアル酸：ラクトシルセラミドシアル酸転移酵素（CMP-NeuAc;Galβ1-4Glcβ1-1'Cerα2,3-sialyltransferase:SAT-1）によってラクトシルセラミド中のガラクトース残基にシアル酸が転移することによってラクトシルセラミドから合成されると考えられているが、当該酵素の単離、またその遺伝子も特定されていない。
【０００６】
ガラクトシド構造にシアル酸をα２−３ケトシド結合を介して転移する酵素については、非特許文献８〜１２、特許文献１などが知られているが、いずれの酵素もＧＭ3の合成への関与は知られておらず、ラクトシルセラミドにシアル酸をα２−３ケトシド結合で転移する酵素活性を示してはいない。Sandhoff,K.らは、α２−８シアル酸転移酵素（ＳＡＴ４）と、ＧＭ3を合成する酵素が同一であると推定している（非特許文献１３）が、それは間接的な方法に基づく推定であり、物質として同一であることを裏付けているものではない。
【非特許文献１】Collins, S.J., Gallo, R.C., and Gallagher, R.E., Nature (London), 270, 347-349(1977)
【非特許文献２】Collins, S.J., Blood, 70, 1223(1987)
【非特許文献３】Nojiri, H., Takaku, F., Tetsuka, T., and Saito, M., Blood, 64, 534-541(1984)
【非特許文献４】Saito, M., Terui, Y., and Nojiri, H., Biochem. Biophys. Res. Commun., 132, 223-231(1985)
【非特許文献５】Nojiri, H., Takaku., F., Miura, Y., and Saito, M., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 782-786(1986)
【非特許文献６】Sugimoto, M. and Ogawa, T., Glycoconj. J., 2, 5-9(1985)
【非特許文献７】Saito, M., Nojiri, H., Ogino, H., Yuo, A., Ogura, H., Itoh, M., Tomita, K., Ogawa, T., Nagai, Y., and Kitagawa, S., FEBS Lett., 271, 85-88(1990)
【非特許文献８】Wienstein et al., J. Biol. Chem., 257, 13835(1982)
【非特許文献９】Gillespie et al., Glycoconj., 7, 469(1990)
【非特許文献１０】Gillespie, W., Kelm, S. and Paulson, JC., J. Biol. Chem., 267, p21001-21010(1992)
【非特許文献１１】Lee, YC., Kojima, N., Wada, E., Kurosawa, N., Nakaoka, T., Hashimoto, T. and Tsuji, S., J. Biol. Chem., 269, p10028-10033(1994)
【非特許文献１２】Kim, YJ., Kim, KS., Kim, SH., Kim, CH., Ko, JH., Choe, IS., Tsuji, S. and Lee, YC., Biochem. Biophys. Res. Commun., 228, p324-327(1996)
【特許文献１】特開平５−３３６９６３号公報
【非特許文献１３】J. Biol. Chem., 268, 5341(1993)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ガングリオシドＧＭ3の重要性が明らかになるにつれてその生合成を解明、制御する試みがなされてきたが、ＧＭ3の合成に深く関わる上記シアル酸転移酵素はその酵素タンパク質精製の困難性のため未だ単離されておらず、遺伝子発現調節機構はもとより、タンパク質化学的解析及び酵素学的解析でさえ未だなされていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記シアル酸転移酵素の遺伝子発現調節機構、タンパク質化学的解析及び酵素学的解析を進めることにより、細胞分化の制御を解明すべく鋭意検討を重ねた結果、発現クローニング法により上記ＧＭ3合成に関与するシアル酸転移酵素をコードする塩基配列を有するｃＤＮＡの単離に成功し、当該ｃＤＮＡの塩基配列をもとに上記シアル酸転移酵素の構造を明らかにした。その結果、当該酵素が既知のシアル酸転移酵素と比して相同性が低く、また前記Sandhoff,K.らが同一と推定したα２−８シアル酸転移酵素とも別の新規酵素であることが明らかとなった。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のものを提供する。
［１］  配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［２］  ［１］に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［３］  配列番号１における塩基番号２０２〜１２７８で示される塩基配列からなる、［２］に記載のＤＮＡ。
［４］  請求項２に記載のＤＮＡで形質転換された細胞を好適な培地で培養し、当該ＤＮＡがコードするポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、その培養物から当該ポリペプチドを採取することを特徴とする、［１］に記載のポリペプチドの製造方法。
［５］  形質転換された細胞が、哺乳類由来の培養細胞である、［４］に記載の製造方法。
［６］  哺乳類由来の培養細胞が、３ＬＬ−ＨＫ４６である、［５］に記載のポリペプチドの製造方法。
【００１０】
なお、本明細書において「酵素をコードする」とは、当該酵素のポリペプチドをコードすることを意味する。また、本明細書中では、以下、シアル酸供与体からシアル酸受容体であるラクトシルセラミドに含まれるガラクトース残基の３位水酸基へ選択的にシアル酸を転移してガングリオシドＧＭ3を生成する活性を有する本発明のシアル酸転移酵素を便宜的にシアル酸転移酵素−１又はＳＡＴ−１とも記載する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によりラクトシルセラミドから細胞分化を誘導するガングリオシドＧＭ3を合成するα２−３シアル酸転移酵素（ＳＡＴ−１）のＤＮＡが提供される。また、本発明により、ＧＭ3合成酵素であるα２−３シアル酸転移酵素が、上記ＤＮＡを使用することで容易に得られる。
【００１２】
本発明により、ＳＡＴ−１をコードするＤＮＡが得られたので、その発現機構を解明することによる細胞分化のメカニズムの解明が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
【００１４】
＜１＞本発明のシアル酸転移酵素−１をコードするＤＮＡ（本発明ＤＮＡ）
本発明ＤＮＡには、それが有する塩基配列によってコードされるポリペプチドを含むシアル酸転移酵素が以下のような理化学的性質を有するものが包含される。
【００１５】
(i)作用：
シアル酸供与体から、シアル酸受容体であるラクトシルセラミドに含まれるガラクトース残基の３位水酸基へ選択的にシアル酸を転移してガングリオシドＧＭ3を生成する。すなわち、上記シアル酸受容体のガラクトース残基の３位の水酸基以外には実質的にシアル酸を転移しない。シアル酸供与体としてはＣＭＰ−シアル酸が好適には挙げられる。
(ii)至適反応ｐＨ：
本酵素は、実施例中に記載の酵素活性測定方法において、酵素反応液のｐＨ６．０〜７．０の範囲、特にｐＨ６．５付近で高いシアル酸転移活性を有する。
(iii)阻害及び活性化：
１０ｍＭ  Ｍｎ2+存在下で、非存在下と比して１．５倍以上に活性が上がる。
【００１６】
また、本発明ＤＮＡには、それが有する塩基配列によってコードされるポリペプチドを含むシアル酸転移酵素が、上記(i)の作用を有し、アミノ酸配列のＣ末端に配列番号５のアミノ酸配列を有するもの、並びに、上記(i)の作用を有し、配列番号６のアミノ酸配列を有するものも包含される。配列番号６のアミノ酸配列はシアル酸転位酵素に存在するいわゆるシアリルモチーフに相当する配列であり、通常には、シアル酸転移酵素のポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号１３６〜１８３の部分に相当する部分に存在する。
【００１７】
本発明ＤＮＡには、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードしているものが包含され、これらのポリペプチドをコードしているのであればその塩基配列は特に限定されない。
【００１８】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつシアル酸供与体からシアル酸受容体であるラクトシルセラミドに含まれるガラクトース残基の３位水酸基へ選択的にシアル酸を転移してガングリオシドＧＭ3を生成する酵素活性を有するポリペプチド。
【００１９】
すなわち、配列番号２のアミノ酸配列は、シアル酸供与体から、シアル酸受容体であるラクトシルセラミドに含まれるガラクトース残基の３位水酸基へ選択的にシアル酸を転移する活性を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよく、そのようなアミノ酸配列の置換、欠失、挿入又は転位を有するポリ
ペプチドをコードする、塩基配列の置換、欠失、挿入及び転位を有するＤＮＡのいずれもが本発明ＤＮＡに包含される。本明細書における「アミノ酸の数個」とは当該酵素の活性が失われない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば３６０アミノ酸残基からなるポリペプチドの場合、２０程度以下の数を示す。当該酵素の活性の測定法は公知の方法（特開平７−３２７６７８号公報）において宿主細胞に導入するｃＤＮＡと酵素の基質を変更することによって容易に行うことが可能であり、例えば本明細書中において具体的に示した方法により当業者であれば容易に実施可能であるため、目的とする酵素活性の有無を指標として、該活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択することができる。ＤＮＡの塩基配列の置換、欠失、挿入又は転位は、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未変異ＤＮＡが有する塩基配列の相当する部分と入れ換えることにより、ＤＮＡに導入することができる。また、部位特異的変異法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol.,
154, 350(1987);Kunkel,T.A. et al., Meth. in Enzymol.,154,367(1987)）などの方法によっても、ＤＮＡに置換、欠失、挿入又は転位を導入することができる。
【００２０】
本発明ＤＮＡとして具体的には配列番号２のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列又はその部分塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましいがこれに限定はされない。上記の「部分塩基配列を有するＤＮＡ」とは、例えばシアル酸転移酵素−１のポリペプチドをコードするＤＮＡとハイブリダイズしシアル酸転移酵素−１のＤＮＡを検出するためのプローブとして使用することができる又はそれによってコードされるポリペプチドがシアル酸転移酵素−１活性を有するあるいはシアル酸転移酵素−１と同様の抗原性を有するＤＮＡを示す。上記ハイブリダイズは、一般にスクリーニング等のＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡをハイブリダイズさせる際に用いられている方法によって行えばよく、例えば、ＤＮＡのスクリーニングなどに使用される条件としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／ＥＤＴＡ緩衝液）、５×デンハルト溶液（Denhaedt's solution）、０．５％ＳＤＳと５０μｇ／ｍｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で目的ＤＮＡをプレハイブリダイズし、32Ｐラベルした本発明ＤＮＡ（例えば配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ）を添加し、４２℃で１６時間ハイブリダイズさせた後、５５℃で１×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、さらに０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳにより洗浄することが挙げられる。一般的なハイブリダイズは上述のような条件下で行われることが多いが、当業者であれば同様のハイブリダイズを目的として各溶液の組成や詳細な条件を変更することにより同様のハイブリダイズを行うことが可能であるため、同様な効果を得ることが可能な条件であれば上述の条件に特に限定はされない。
【００２１】
本発明ＤＮＡが有する塩基配列としてより具体的には、配列番号１に示す全塩基配列又はその部分配列を有するＤＮＡが挙げられ、かつ好ましい。このようなＤＮＡとして具体的には、配列番号１における塩基番号２０２〜１２７８の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
【００２２】
配列番号１に示す塩基配列においては、シアル酸転移酵素−１のｃＤＮＡのオープンリーディングフレームの５’末端部に３つのイン・フレームのＡＴＧコドンが含まれている。３つのＡＴＧコドンの周囲の塩基配列は、全て−３の位置のプリンが保存されている。このことは効率的な翻訳に関するＫｏｚａｋの知見（Kozak, M. (1986)Cell, 44,283-292）を満足しており、いずれのＡＴＧコドンも開始コドンとして機能する可能性がある。
【００２３】
ところで、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、フレーム内に２つのＡＴＧコドンを含むことが知られている（Nakazawa, K. et al. (1988) J. Biochem, 104, 165-168、Shaper, N. et al. (1988) J. Biol. Chem., 263, 10420-10428）。また、Shaperらは、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、２箇所からの翻訳開始の結果、長いものと短いものとの両方の形態が合成されることを示している。さらに、Lopezらは
、長い形態のものは原形質膜を優先的に標的とし、短い形態のものは主としてゴルジ体内に存在することを示唆する証拠を示している（Lopez, L. et al. (1991) J. Biol. Chem., 266, 15984-15591）。同様に、シアル酸転移酵素−１についても、複数のＡＴＧコドンが開始コドンとして機能する可能性はあるが、定かではない。しかし、いずれのＡＴＧコドンが開始コドンであっても、上記のシアル酸転移酵素−１のポリペプチドをコードする点では同じであり、第２番目、第３番目のＡＴＧコドンから始まる塩基配列を有するＤＮＡも本発明に包含されるものである。
【００２４】
配列番号１の最初のＡＴＧコドンで始まる単一のオープンリーディングフレームからは、３５９アミノ酸残基からなり、分子量４１，２４４Ｄａ、Ｎ−結合グリコシレーション部位である可能性がある２カ所の部位を有するタンパク質が予測される。このアミノ酸配列から作成したハイドロパシープロット（図３）から、Ｎ末端から１６〜２９番目のアミノ酸残基に渡る長さ１４残基の連続した１つの顕著な疎水性部分が認められ、トランスメンブレンドメイン（膜貫通領域）を有することが予想される。
【００２５】
尚、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列を有するＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含されることは、当業者であれば容易に理解されるところである。
【００２６】
また、本発明ＤＮＡには、本発明ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はＲＮＡも包含される。さらに本発明ＤＮＡは、ＳＡＴ−１をコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよく、この一本鎖およびこれと相補的な配列を有するＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖からなる二本鎖であってもよい。
【００２７】
また、本発明ＤＮＡは、ＳＡＴ−１のポリペプチド全体をコードするコード領域全長の塩基配列を有していてもよく、またＳＡＴ−１のポリペプチドの一部分をコードする塩基配列を有するものであってもよい。
【００２８】
ところで、一般に哺乳動物のシアル酸転移酵素では、アミノ酸配列に高い相同性を有することが知られており、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドも、種間におけるアミノ酸配列の相同性は約６５％以上と想定される。従って、本発明で具体的に開示しているＤＮＡがコードするポリペプチドと高い相同性を有するポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡも本発明に包含される。上述のようにＳＡＴ−１のポリペプチドは膜貫通領域を有するが、膜内の末端にあたるＮ末端部から当該膜貫通領域を含む領域を欠失したＳＡＴ−１のポリペプチドの部分もまた本発明に包含される。このようなポリペプチドを具体的に例示すると、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号３８〜３５９などが挙げられる。
【００２９】
＜２＞本発明ＤＮＡの製造方法
以下、本発明ＤＮＡを得る方法について説明する。本発明によりＳＡＴ−１のポリペプチドのアミノ酸配列が明らかにされたので、その配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法）によって染色体ＤＮＡあるいはｍＲＮＡから本発明ＤＮＡを増幅することによって取得することも可能であり、また、特に以下の各工程からなる発現クローニング法により製造することも可能である。
【００３０】
（１）癌細胞を分化誘導剤で処理することにより分化させる。
（２）分化した癌細胞からｃＤＮＡライブラリーを作成し、宿主細胞に導入する。
（３）ガングリオシドを細胞膜上に発現した宿主細胞を検出する。
（４）上記で検出された宿主細胞をソーティングして、ライブラリーを濃縮する。
（５）濃縮したライブラリーから導入した遺伝子を切り出す。
【００３１】
スクリーニングによって、通常には上記ＳＡＴ−１の完全長ｃＤＮＡを選択する。
以下に、本発明ＤＮＡを製造する方法の一例を具体的に説明する。
【００３２】
（１）癌細胞の分化誘導
癌細胞としては、浮遊系細胞が好ましく、そのような癌細胞として血球系のリンパ種及び白血病の細胞が挙げられ好ましい。培養法としては使用する細胞によって適した条件下で行えばよいが、通常、一般的な細胞培養条件として５〜７vol％ＣＯ2、９５〜９３vol％空気条件下で３７〜３８℃が挙げられる。分化誘導剤としては例えばホルボールエステル（12-O-テトラデカノイルホルボールエステル(TPA)など）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、レチノイン酸（ＲＡ）及び1α,25-ジヒドロキシビタミンD3（1α,25(OH2D3)）等が挙げられ、特に限定はされないが、その中でもＴＰＡが多くの白血病細胞株に対して比較的同様な分化誘導活性を有するため好ましい。
【００３３】
（２）分化した癌細胞からのｃＤＮＡの構築
(i)分化した癌細胞からのＲＮＡの調製
上記（１）で分化を誘導した癌細胞を好ましくは５００〜２０００×ｇで遠心処理により回収し、細胞から例えばグアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法（Kingston, R. E.,(1991) in Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 14, Unit 4.2, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, New York）等の公知の方法により全ＲＮＡを調製する。このようにして得られる全ＲＮＡから、オリゴｄＴ（oligo-(dT)）セルロースカラムクロマトグラフィー等によってポリ(A)+ＲＮＡを精製する。
【００３４】
(ii)ポリ(A)+ＲＮＡからのｃＤＮＡの構築
上記ポリ(A)+ＲＮＡを鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーを用いた逆転写ＰＣＲにより、癌細胞由来のｃＤＮＡを増幅することができる。ＰＣＲは、通常の方法と同様にして行えばよいが、具体的方法を示すならば以下の通りである。１μｌのポリ(A)+ＲＮＡ、それぞれ１００ｐｍｏｌのオリゴｄＴとランダムオリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ５００μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、２００単位のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ギブコＢＲＬ(Gibco BRL)）、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１２０単位のＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）インヒビター（宝酒造（株）製）を含む緩衝液（終体積２０μｌ）を５０℃で６０分間インキュベートし、ｃＤＮＡ一次鎖を合成する。次に、上記の逆転写反応混合液５μｌ、各１００ｐｍｏｌのランダムオリゴヌクレオチドプライマー、それぞれ２５０μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、１．２５単位のＴａｑポリメラーゼを含む反応液（終体積５０μｌ）に対し、９５℃１分、４６〜６２℃１分、７２℃２分を３５サイクル繰り返して行う。
【００３５】
このようにして得られた癌細胞のｃＤＮＡは、発現ベクターに保持させた後、宿主細胞に導入して宿主細胞をスクリーニングするために使用される。宿主細胞としては、哺乳類由来の細胞株で、ラクトシルセラミド陽性である細胞であれば用いることができる。そのような細胞株としては例えばヒトナマルバ（Namalwa）細胞（細井ら：Cytotechnology,1,151(1988)）、チャイニーズハムスター由来のＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１等）、サル由来のＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０等）、マウス由来の３ＬＬ細胞（Taniguchi,S.,（信州大学加齢適応研究センター））などが挙げられる。しかし、本発明においてＳＡＴ−１の酵素活性の検出をより容易にすることが可能であるため、更にＧＭ3陰性の培養細胞が好ましい。そのような細胞としては３ＬＬ細胞の突然変異株である３ＬＬ−ＨＫ４６細胞（Inokuchi,J.,（生化学工業（株）））が挙げられ、好ましい。発現ベクターとしてはｐＣＥＶ１８（Maruyama,K.（東京大学医科学研究所、現東京医科歯科大学）より恵与）、ｐＣＸＮ２（Niwa, H., Yamamura, K. and Miyazaki, J. (Gene, 108, p193-200(1991)）、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２（Eastman Kodak製）、ｐＡＧＥ１０７（Miyaj
iら, Cytotechnology, 3, 133(1990)）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５号公報）、ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ（特開平５−３３６９６３号公報）、ｐｃＤ２（Chen,C.ら, Mol. Cell. Biol., 7, 2745-2452(1987)）などが挙げられ、使用する宿主細胞に合わせて適宜選択される。例えば宿主細胞として３ＬＬ−ＨＫ４６を使用した場合は、ｐＣＥＶ１８を発現ベクターとして使用することが好ましい。ベクターへの上記で癌細胞のポリ(A)+ＲＮＡを基に調製されたＰＣＲ産物の導入は、公知の方法から使用するベクターに適した方法が選択される。
【００３６】
(iii)ｃＤＮＡライブラリーの宿主細胞への導入
上記の方法により構築したｃＤＮＡライブラリーを公知の手法を用いて宿主細胞へトランスフェクションする。具体的には、例えばエレクトロポレーション法（Miyajiら,Cytotechnology, 3, 133(1990)）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号公報）及びリポフェクション法（Philip, L.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 84, 7413(1987)）などが挙げられ適宜選択されるが、エレクトロポレーション法が好ましい。また、ＳＡＴ−１をコードするｃＤＮＡを検出する際に、より正確な酵素活性の検出を行うため、ＧＭ3から合成されることが知られており、細胞膜上に発現し、容易に検出が可能であるＧＤ3をＧＭ3から直接合成する酵素である、ヒトα２−８シアル酸転移酵素をコードするＤＮＡ（特開平７−３２７６７８号公報など）を宿主細胞に前もってトランスフェクションしておくこと、及び、同時にトランスフェクションすることも可能であり、また、好ましい。従って、例えばベクターとしてｐＣＥＶ１８を使用して構築したｃＤＮＡライブラリーを、宿主細胞としてのＧＤ3合成経路を持たない３ＬＬ−ＨＫ４６細胞に導入する際には、ライブラリーのｃＤＮＡを保持したｐＣＥＶ１８を、通常の３ＬＬ−ＨＫ４６細胞に直接トランスフェクションしてもよいし、予め３ＬＬ−ＨＫ４６細胞にα２−８シアル酸転移酵素のｃＤＮＡを、ｐＣＥＶ１８等の真核生物発現ベクターを用いて導入して作成した遺伝子組み換え体３ＬＬ−ＳＴ２８にトランスフェクションしてもよいし、また、α２−８シアル酸転移酵素のｃＤＮＡ導入したベクターと同時に３ＬＬ−ＨＫ４６細胞にトランスフェクションしてもよい。
【００３７】
（３）ガングリオシドを発現した宿主細胞の検出
ｃＤＮＡライブラリーを導入した宿主細胞は、一般的な細胞培養条件下で培養される。ｃＤＮＡを導入した２４時間以降、好ましくは３６〜４８時間後に宿主細胞を抗ガングリオシド抗体あるいはガングリオシドに結合するレクチンを用いた免疫染色により染色するが、抗体を用いる染色法がより正確であり好ましい。例えば、宿主細胞として３ＬＬ−ＨＫ４６を用いた場合には、細胞膜上に発現したＧＭ3を認識する例えば抗ＧＭ3モノクローナル抗体  Ｍ２５９０（Ｌ６１２(ATCC CRL10724)が産生するモノクローナル抗体：J. Biol. Chem., 260, 13328-13333(1985)）を用いて検出する。免疫染色は一般的な方法に従って行えばよい。また、宿主細胞として例えば上記の３ＬＬ−ＳＴ２８を用いた場合には、本発明ＤＮＡが導入された際に生成されるＧＭ3から合成されるＧＤ3を検出する。ＧＤ3を検出するための免疫染色法としては通常用いられる一般的な方法（特開平２−３２７６７８号公報）によって行うことができる。その際は、使用する一次抗体としてはＧＤ3を認識する抗体であれば特に限定はされないが、モノクローナル抗体が好ましく、そのような抗体としては例えば抗ＧＤ3モノクローナル抗体  Ｒ２４（ハイブリドーマ(ATCC HB8445)が産生するモノクローナル抗体：Cancer Res., 49, p191-196(1989)）などが挙げられ、好ましい。上記の一般的な抗体を用いる免疫染色法として具体的には、上記培養後の宿主細胞（１×１０5個）をＢＳＡ溶液（０．１％ＢＳＡ  ＰＢＳ（＋））で２〜３回程度遠心洗浄し、一次抗体を含む１００μｌの前記ＢＳＡ溶液に懸濁する。３０分間氷冷下で反応させた後、上記ＢＳＡ溶液で２回程度洗浄する。さらに一次抗体に対するＦＩＴＣ標識二次抗体１μｌを含むＢＳＡ溶液１００μｌ中で、氷冷条件下で３０分間反応させる。ＢＳＡ溶液で１回洗浄し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ：ベクトン・デッキンソン(Becton Dickinson)製）で、蛍光が強い細胞を検出する。蛍光の強い、例
えば全体の５％の細胞をセルソーターで選別し、これからプラスミドＤＮＡを抽出する。プラスミドＤＮＡの宿主細胞からの抽出は一般的な公知の方法によって行われる。
【００３８】
（４）ＳＡＴ−１のｃＤＮＡのソーティングとｃＤＮＡの取得
上記の操作により得られたプラスミドＤＮＡを、適当な宿主細胞株にトランスフェクションし、上記抗ＧＭ3抗体を用いる免疫染色と例えばフローサイトメーターによる全体の５％の強い蛍光を発する細胞の回収を２回以上繰り返し、目的のｃＤＮＡをソーティングにより濃縮する。前記ソーティングに用いる宿主細胞としては、哺乳類の培養細胞が好ましく、特に３ＬＬ−ＨＫ４６が好ましい。また、使用するベクターとしては哺乳類細胞用の発現ベクターであれば特に限定はされないが、ｐＣＥＶ１８が好ましい。ソーティングによって濃縮した目的のｃＤＮＡを保持した前記ベクターを、ｐＢＫＣＭＶ（ストラタジーン社製）などの哺乳類細胞用の発現ベクターに公知の方法により前記のヒトα２−８シアル酸転移酵素のｃＤＮＡを導入した発現ベクターと同時に３ＫＫ−ＨＫ４６細胞等のＧＤ3合成経路を有さない哺乳類由来の培養細胞にトランスフェクションし、上記と同様に免疫染色及びフローサイトメーターによる検出を行い、強蛍光を発する全体の５％の細胞を得る。この細胞から公知の方法によりプラスミドＤＮＡを抽出する。
【００３９】
このプラスミドＤＮＡから一般的な方法によって切り出すことで得られるｃＤＮＡにより、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（E. coli DH10B：ギブコ社製）を形質転換し、これらを一穴あたり１００コロニーを形成するよう植菌し、シブセレクションを行うことにより、最終的に約２．１Ｋｂｐのインサート（４Ｃ７）を含む単一のクローン、ｐＣＥＶ４Ｃ７を得ることができる。
【００４０】
（５）ＳＡＴ−１をコードするｃＤＮＡ  ４Ｃ７の塩基配列の決定
上記のようにして得られたｃＤＮＡはそのままあるいはｐＣＲIIなどの適当なプラスミドにサブクレーニングして、既知の一般的な方法により塩基配列を決定することができる。
【００４１】
上記のようにして決定されたＳＡＴ−１をコードするｃＤＮＡの塩基配列及びこの塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。
【００４２】
また、膜貫通領域を欠失した、すなわち可溶化タンパク質形態のＳＡＴ−１のポリペプチドをコードするＤＮＡは以下のようにして取得することが可能である。すなわち、まず配列番号１に示す塩基配列に基づき、当該酵素のポリペプチドのＮ−末端側で適当な短縮化形態となるように選択したプライマーを合成し、クローン化したＳＡＴ−１のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅する。例えば、Ｎ−末端の３７アミノ酸残基が欠失した短縮化形態のポリペプチドをコードするＤＮＡを得る場合には、例えば目的とする塩基配列の３’及び５’末端部に存在する塩基配列を基にオリゴヌクレオチドプライマーを合成する。例えば配列番号３及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ５’プライマー及び３’プライマーとして用いてＰＣＲを行えばよい。次いで、増幅して得られたＰＣＲ産物を必要により精製して目的ＤＮＡを得ることが可能である。
【００４３】
＜３＞本発明ＤＮＡの塩基配列によってコードされるＳＡＴ−１のポリペプチドの全部又は部分からなるポリペプチド
本発明は、上記の本発明ＤＮＡによってコードされるＳＡＴ−１のポリペプチドの全部又は部分からなるポリペプチドも提供する。本明細書において、上記のポリペプチドの「部分」とは、シアル酸転移酵素−１活性を有する、抗原性を有するなどの何らかの活性ないし機能を有する部分を意味する。本ポリペプチドは単独であってもよいし、他のポリペプチドと融合していてもよい。また、膜貫通領域を欠失していてもよい。
【００４４】
本ポリペプチドは、糖鎖を有していても有していなくてもよい。また、糖鎖の種類にも特に限定はない。
【００４５】
このようなポリペプチドは、例えば、後記のポリペプチドの製造方法によって得ることができ、また、上記の活性ないし機能の有無を判定することは、特開平７−３２７６７８号公報記載の酵素活性測定法において、宿主細胞に導入するｃＤＮＡと酵素の基質を変更することにより実施することが可能であり、例えば本明細書中に具体的に記載されている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。
【００４６】
＜４＞本発明ＤＮＡを利用したＳＡＴ−１のポリペプチドの製造方法
上記本発明ＤＮＡで形質転換された細胞を、好適な培地で培養し、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドを培養物中に生成蓄積させ、その培養物からＳＡＴ−１のポリペプチドを採取することによって、ＳＡＴ−１のポリペプチドを製造することができる。
【００４７】
本発明ＤＮＡで形質転換された細胞は、公知の発現ベクターに本発明ＤＮＡの断片を挿入して組換えプラスミドを構築し、この組換えプラスミドを用いて形質転換を行うことによって得ることができる。細胞としては大腸菌等の原核細胞や、哺乳類細胞等の真核細胞が例示される。大腸菌などの原核細胞を用いた際は、本発明ＤＮＡの発現によって生じるＳＡＴ−１のポリペプチドに糖鎖の付加が起こらないため、純粋にＳＡＴ−１のポリペプチドのみを得ることが可能であり、また、哺乳類細胞等の真核細胞を用いた際は、本発明ＤＮＡの発現によって生じるＳＡＴ−１のポリペプチドに糖鎖の付加がなされる。そのため、糖鎖も含む通常のＳＡＴ−１と同様の形態で得ることが可能である。
【００４８】
本製造方法においては、タンパク質の製造に通常用いられる宿主−ベクター系を使用することができる。３ＬＬ−ＨＫ４６細胞、３ＬＬ−ＳＴ２８細胞又はＣＯＳ−１細胞等の哺乳類由来の培養細胞とｐＣＥＶ１８、ｐＭＥ１８Ｓ（丸山ら,Med. Immunol., 20, 27(1990)）等の哺乳類細胞用発現ベクターとの組み合わせを採用することが好ましいが、特に限定はされない。培地や培養条件は、用いる宿主すなわち細胞に合わせて適宜選択される。
【００４９】
本発明ＤＮＡは全長を直接発現させてもよいが、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現させてもよい。また、本発明ＤＮＡの一部を部分ペプチドとして発現させてもよい。
【００５０】
上記融合ポリペプチドを発現する組み換えプラスミドの構築の具体例としては以下の方法が挙げられる。すなわち、本発明のＤＮＡをｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡ（Kitagawa,H. and Paulson,J.C., J. Biol. Chem.. 269, 1394-1401(1994)）等のプラスミドに導入した遺伝子を融合タンパクとして発現させるように構築されたベクターに通常の方法により組み込み、複数のタンパク質をの遺伝子を同一読み出し領域に有するベクターを構築する。ついで、このベクターから融合タンパク質をコードするＮｈｅＩ断片を切り出し、上記と同様の操作によりｐＣＥＶ１８等の適当なベクターに連結させる。
【００５１】
培養物からの本発明ポリペプチドの採取は、公知のポリペプチドの精製方法によって行うことができる。具体的には例えば、ラクトシルセラミドあるいはＣＭＰ−シアル酸などを結合したセファロースカラムを用いたアフィニティ−クロマトグラフィーが挙げられる。融合ポリペプチドとして発現させた場合は、宿主細胞の培養物を上記アフィニティーカラムのほか、ＳＡＴ−１と融合したポリペプチドに対し親和性の高い物質（例えば抗体など）を結合したアフィニティークロマトグラフィーなどによって精製することが可能である。さらに、融合ポリペプチド中のＳＡＴ−１と他のタンパク質のポリペプチドとの間に
、例えば特定のタンパク分解酵素が認識して切断するアミノ酸配列を有するリンカーを予め組み込んでおくことにより、融合ポリペプチドを精製した後にリンカー部位で融合ポリペプチドを切断することにより、従来精製が困難であったＳＡＴ−１を得ることが可能である。上記特定のタンパク質分解酵素とそれが認識する特定の配列の組合せとしては例えばプロインスリンの合成時に働くシグナルペプチダーゼとインスリンのシグナルペプチドの組合せが挙げられる。なお上記の培養物には、培地および当該培地中の細胞が包含される。
【００５２】
シアル酸転移酵素の活性の測定方法としては、一般的なガングリオシド合成の測定法（特開平７−３２７６７８号公報など）において酵素の基質を変更することにより実施することが可能である。例えば上記培養物又は上記方法によって精製した酵素適量を、１００ｍＭ  カコジル酸ナトリウム、１０ｍＭ  塩化マンガン、０．２ｍＭ  ＣＭＰ−放射性物質標識シアル酸、０．４ｍＭ  ラクトシルセラミド、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−５４を含む反応液をｐＨ６．５に調整し、３７℃で２時間保温した後、一般的な薄層クロマトグラフィーにより反応産物を展開し、フジックスＢＡＳ２０００バイオ・イメージング・アナライザー（富士写真フィルム（株）製）により活性の測定を行うことができる。
【実施例】
【００５３】
以下に本発明を実施例によりさらに詳説するが、本発明の目的を超えない限りこれに限定されるものではない。
【００５４】
（１）ＳＡＴ−１のｃＤＮＡを発現した細胞のＧＭ3合成
配列番号１に示す塩基配列をコードするｃＤＮＡを発現ベクターｐＣＥＶ１８に導入したｐＣＥＶ４Ｃ７を、エレクトロポレーション法により３ＬＬ−ＨＫ４６に導入し、４８時間培養後のこの細胞のＧＭ3合成活性を以下の方法により測定した。０．１ｍＭ ＣＭＰ−[14C]−シアル酸（２×１０3ＣＰＭ）、０．４ｍＭラクトシルセラミド、０．３％(W/V)Ｔｒｉｔｏｎ ＣＦ−５４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ カコジル酸ナトリウム、１５０μｇのｐＣＥＶ４Ｃ７を導入した３ＬＬ−ＨＫ４６のホモジナイズ液及び１ｍＭのシアリダーゼ阻害剤（2,3−デヒドロ-2-デオキシ-N-アセチルシアル酸(2,3-dehydro-2-deoxy-NeuAc)：ベーリンガー・マンハイム社製）を含むｐＨ６．５の２０μｌの反応液を、３７℃で２時間インキュベートした後、１０μｌのメタノールを添加して反応を停止した。反応液８μｌをＣ１８逆相系薄層クロマトグラフィープレート（ＲＰ−１８Ｗ ＨＰＴＬＣプレート）（メルク社製）にかけ、水で１０分間展開した。放射性物質標識反応産物を原点から掻き取り、ＧＭ３をクロロホルム−メタノール（１：１、V/V）３００μｌにて抽出回収した。抽出物を乾固後、シリカゲル薄層クロマトグラフィー ６０ＨＰＴＬＣプレート（メルク社製）に共した。クロロホルム−メタノール−０．５％ＣａＣｌ2水溶液（55:45:10,V/V/V）にて展開後、オルシノール硫酸により発色すると共に、ガングリオシドに取り込まれた放射活性をフジックスＢＡＳ２０００バイオ・イメージング・アナライザー（富士写真フィルム（株）製）で測定した。その結果、14ＣのガングリオシドＧＭ3への取り込みが起こっていることが明らかとなり、ＳＡＴ−１によるＧＭ3合成がＳＡＴ−１ｃＤＮＡ導入細胞で検出された。
【００５５】
ＧＭ3合成活性は、ｐＨ６．０〜７．０、特にｐＨ６．５付近で高く、また、１０ｍＭ
Ｍｎ2+存在下で１．５倍以上上昇した。
【００５６】
（２）ＳＡＴ−１のアミノ酸配列
配列番号１の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。アミノ酸配列から予測される構造の模式図を図１に示す。ハイドロパシープロット（図３）による解析の結果、Ｎ末端部１６番目から２９番目のアミノ酸残基の領域に膜貫通領域（図１中のＴＭ）が存在する２型膜タンパク質であることが判明した。この配列をGenBankに登録され
ている遺伝子データベースで検索した結果、高度に相同性を示す配列は認められなかった。しかし、シアル酸転移酵素の配列の中央部及びＣ末端側領域に存在するシアル酸転移酵素相同領域のシアリルモチーフ（Ｌ及びＳ）については、多少の置換が見られたものの、比較的高い相同性が認められた（図２）。比較に用いたシアル酸転移酵素は、h2,3ST; 特開平５−３３６９６３号公報、rSTX; J. Biol. Chem., 268, 11504-11507(1993)、rST3N-1; J. Biol. Chem., 267, 21011-21019(1992)、hST3N-2; J. Biol. Chem., 268, 22782-22787(1993)、pST30-1; J. Biol. Chem., 267, 21004-21010(1992)、mST30-2; Eur. J. Biochem.,216, 377-385(1993)、mST4'; NCBI Seq. ID 558532、hSAT4(a); Gycbiology, 5, 319-325(1995)、hST6N; Nuc. Acids Res., 18, 667(1990)、rST6N; J. biol. Chem., 262, 17735-17743(1987)、h2,8ST; 特開平７−３２７６７８号公報のそれぞれに記載の１１種である。更にアミノ酸配列からＮ−グリコシレーションサイトにコンセンサスな配列が４つ存在することが示された（図１中、△で示す）が、Ｎ末端側の二つの部位は、膜貫通領域の近傍及びシアリルモチーフ内に存在するので、Ｃ末端側の二つの部位よりもＮ−グリコシル化されている可能性が低い。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明のα２−３シアル酸転移酵素（ＳＡＴ−１）の構造の模式図。△は、アミノ酸配列から推定されるＮ−グリコシレーション部位である。ＴＭはアミノ酸配列から推定される膜貫通領域である。
【図２】ＳＡＴ−１のシアリルモチーフ（Ｌ及びＳ）領域のアミノ酸配列と、他のシアル酸転移酵素のシアリルモチーフ領域との対比を示す図。配列の下に付した*は他のシアル酸転移酵素のシアリルモチーフに見られる共通配列である。配列の上に付した*はSAT-1の、当該シアリルモチーフの共通配列とアミノ酸が同一の部分であり、-は異なる部分である。
【図３】本発明ＤＮＡから推定したＳＡＴ−１のアミノ酸配列のハイドロパシープロット。
【図１】
2006314320.tif 000003
【図２】
2006314320.tif 000004
【図３】
2006314320.tif 000005
【配列表】
2006314320000001.app