(57)【要約】【課題】  組立時や移動時の高精度な光軸調整を不要にして製造コスト・メンテナンスコストを低減し、光学部品点数を減らして光損失を低減できるようにする。【解決手段】発光部（２）から試料面（Ｗ）に焦点を結ぶように参照光を照射する参照光照射系（Ｓ１）の光路（ＯＰ１）と、参照光の照射により発せられる試料面（Ｗ）からの観察光を受光する受光部（３）を備えた観察光検出系（Ｓ２）の光路（ＯＰ２）の光路長を等しくして夫々に等価光学系を形成し、発光部（２）及び受光部（３）を、光軸に対して直交するＸＹ軸方向に独立して移動可能で、且つ、観察時には対応するＸＹ方向に同期して移動制御される一対のスキャニングテーブル（Ｔ１，Ｔ２）に取り付けた。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光部から試料面に焦点を結ぶように参照光を照射する参照光照射系と、参照光の照射により発せられる試料面からの観察光を受光する受光部を備えた観察光検出系とを備え、前記受光部で検出された観察光の試料面上における空間分布に基づいてその切片画像を再現する共焦点顕微鏡において、
前記参照光照射系の発光部から試料面に至る光路と、前記観察光検出系の受光部から試料面に至る光路の光路長が等しく設計されると共に、夫々の光路上には等価光学系が形成され、
前記発光部及び受光部が、光軸に対して直交するＸＹ軸方向に独立して移動可能で、且つ、観察時には対応するＸＹ方向に同期して移動制御される一対のスキャニングテーブルに夫々取り付けられたことを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
前記スキャニングテーブルが、光軸をＺ方向とするＸＹ軸方向に独立して移動可能で、且つ、観察時には対応するＸＹＺ方向に同期して移動制御される請求項１記載の共焦点顕微鏡。
【請求項３】
前記参照光照射系及び観察光検出系が試料面の上方に位置して正立型に形成され、試料面から観察光検出系の受光部に至る光路が、前記発光部から試料面に至る光路の途中に配されたダイクロイックミラーを介して分岐されて成る請求項１又は２記載の共焦点顕微鏡。
【請求項４】
前記参照光照射系が試料面の上方に位置し、前記観察光検出系が試料面の下方に位置するように配されて倒立型に形成された請求項１又は２記載の共焦点顕微鏡。
【請求項５】
前記発光部が、光源に接続された光ファイバの光出射端で形成され、前記光出射端から拡散照射される光を集光させる集光レンズと共に参照光照射系のスキャニングテーブルに取り付けられた請求項１又は２記載の共焦点顕微鏡。
【請求項６】
前記受光部が、光検出器に接続された光ファイバの光入射端で形成され、前記光入射端に観察光を集光させる集光レンズと共に観察光検出系のスキャニングテーブルに取り付けられた請求項１又は２記載の共焦点顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料面上に焦点を結ぶ参照光を走査してその試料面で発する蛍光などの観察光の空間分布を記録して、その切片画像を再現する共焦点顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
図４に示される従来の共焦点顕微鏡５１は、レーザ発光部５２から試料面５３に焦点を結ぶようにレーザ光を照射する参照光照射系５４と、レーザ光の照射により生ずる試料面５３からの観察光を受光する光検出器（受光部）５５を備えた観察光検出系５６とを備え、レーザ光を走査させることにより試料面５３上における観察光の空間分布をコンピュータ５７上に記録し、このデータに基づいて画像構築処理を施してその切片画像を再現するものである。
【特許文献１】特開２００５−１７６４２公報
【０００３】
例えば、正立型顕微鏡の場合、参照光照射系５４及び観察光検出系５６が試料面の上方に位置して、参照光照射系５４のレーザ発光部５２から試料面５３に至る光路５８が、試料面５３から観察光検出系５６の光検出器５５に至る光路５９の途中に配されたダイクロイックミラー６０により分岐されて形成されている。
【０００４】
そして、レーザ発光部５２から照射された励起用レーザ光は光路５８に沿って、コリメートレンズ６１で平行化され、ダイクロイックミラー６０で試料面５３側に反射された後、スキャナユニット６２、リレーレンズ６３ａ及び６３ｂ、対物レンズ６４を経て試料面５３に照射されるようになっている。
【０００５】
ここで、試料面５３に励起用レーザ光が照射されて蛍光（観察光）を発すると、その蛍光は光路５９に沿って、対物レンズ６４、瞳リレーレンズ６３ａ及び６３ｂ、Ｘ−Ｙスキャナユニット６２、ダイクロイックミラー６０、集光レンズ６５を経て、共焦点位置に配されたピンホール６６でノイズや迷光が取り除かれて光検出器５５に達する。
【０００６】
このときに、スキャナユニット６２でレーザ光を二次元方向に走査させ、所定間隔でその試料面５３上におけるレーザ光の照射位置（ＸＹ座標）及び信号強度をコンピュータ５７に記録していく。
そして、走査終了した時点で、記録されたＸＹ座標に、その信号強度に応じた強度の光により画像構築処理を施せば、試料面５３の拡大像を得ることができる。
【０００７】
ところで、ピンホール６６は、予め機械的に光軸調整されており、これが少しでもずれると共焦点効果がなくなり、鮮明な画像を得ることができないという問題を有する。
一般にスキャナユニット６２は、Ｘ軸方向及びＹ軸方向にレーザ光をスキャンするために、二枚一対のガルバノミラー６７ｘ、６７ｙが配されているが、試料面５３上のＸＹ座標が夫々のミラー６７ｘ、６７ｙの傾斜角で決まるため、レーザ光軸を夫々の回転軸の位置に正確に一致させなければならない。
即ち、共焦点顕微鏡の組立時にはピンホール６６やガルバノミラー６７ｘ、６７ｙの高精度な光軸調整が必要であるため、作業が面倒で組立コストが嵩み、組立後装置を移動したりしたたときは、その都度、光軸調整をし直さなければならないため、メンテナンスコストも嵩むという面倒があった。
【０００８】
また、レーザ光を走査させても共焦点位置が動かないように、スキャナユニット６２はダイクロイックミラー６０と対物レンズ６４の間に配されるため、レーザ発光部５２から試料面５３に照射されたレーザ光が光検出器５５に至るまでガルバノミラー６７ｘ、６７ｙだけでも合計４回反射される。
さらにスキャナユニット６２としてガルバノミラー６７ｘ、６７ｙを使用する場合は、同一焦点距離の２枚一組のリレーレンズ６３ａ及び６３ｂが使用される。
しかし、光が光学素子を透過する場合、その一つの界面での反射損失は垂直入射の場合でも４〜５％程度、非反射コーティング（ＡＲコーティング）が施されていても１.５％程度である。
したがって、１枚のレンズを透過する場合に少なくとも３％の損失が見込まれ、２枚になると６％の損失が見込まれる。
蛍光観察する場合、その蛍光は励起光に比して１／１０万と極めて弱いため、損失を少しでも抑えることが要請されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで本発明は、組立時や移動時に高精度な光軸調整が不要で、製造コスト・メンテナンスコストを低減し、また、光学部品点数を減らして光損失を低減することを技術的課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この課題を解決するために、本発明は、発光部から試料面に焦点を結ぶように参照光を照射する参照光照射系と、参照光の照射により発せられる試料面からの観察光を受光する受光部を備えた観察光検出系とを備え、前記受光部で検出された観察光の試料面上における空間分布に基づいてその切片画像を再現する共焦点顕微鏡において、前記参照光照射系の発光部から試料面に至る光路と、前記観察光検出系の受光部から試料面に至る光路の光路長が等しく設計されると共に、夫々の光路上には等価光学系が形成され、前記発光部及び受光部が、光軸に対して直交するＸＹ軸方向に独立して移動可能で、且つ、観察時には同期して移動制御される一対のスキャニングテーブルに夫々取り付けられたことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る共焦点顕微鏡によれば、発光部から試料面に至る光路と、受光部から試料面に至る光路の光路長が等しく設計されており、夫々の光路上には等価光学系が形成されているので、発光部から試料面に焦点を結ぶように参照光を照射したときに、試料面から発せられる観察光は受光部で焦点を結ぶこととなる。
【００１２】
そして、発光部及び受光部は、対応するＸＹ軸方向に独立して移動可能な一対のスキャニングテーブルに夫々取り付けられているので、発光部から参照光を照射させた状態で受光部のスキャニングテーブルを移動させて受光強度がもっとも高くなる点にあわせれば、光軸合せが完了する。
したがって、光軸合せは受光強度が最も大きくなる点を見つければよく、ガルバノミラーを使用する場合と異なり、高精度の光軸合せは不要になるというメリットがある。
【００１３】
この状態で、発光部をＸ及びＹ方向に一定距離移動させたときに、受光部をＸ及びＹ方向に等距離移動させれば、共焦点の位置関係が維持される。
なお、組立精度により等距離移動させたときに共焦点位置関係がずれる場合は、発光部をＸ及びＹ方向にそれぞれ一定距離移動させたときに、受光部での受光強度が最大となる位置までの移動距離を求めておき、その比率に応じて、受光部を同期的に移動させれば共焦点の位置関係が維持される。
このように、発光部及び受光部をＸ−Ｙ方向に移動させて参照光を走査できるので、ガルバノミラーを用いたスキャナユニット及びリレーレンズが不要となり、部品点数を減らして光損失を減少させることができるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本例では、組立時や移動時に高精度な光軸調整が不要で、製造コスト・メンテナンスコストを低減し、また、光学部品点数を減らして光損失を低減するという目的を、ガルバノミラーによるスキャナユニットを使用することなく達成した。
【００１５】
図１は本発明に係る共焦点顕微鏡の一例を示す説明図、図２は光軸合せの処理を示すフローチャート、図３は他の実施形態を示す説明図である。
【実施例１】
【００１６】
図１に示す共焦点顕微鏡１は、発光部２から試料面Ｗに焦点を結ぶように参照光を照射する参照光照射系Ｓ１と、参照光の照射により発する蛍光などの試料面Ｗからの観察光を受光する受光部３を備えた観察光検出系Ｓ２が試料面Ｗの上方に配された正立型で、参照光を走査させることにより試料面Ｗ上における観察光の空間分布をコンピュータ４に記録し、このデータに基づいて画像構築処理を施してその切片画像を再現するものである。
【００１７】
参照光照射系Ｓ１の発光部２から試料面Ｗに至る光路ＯＰ１と、観察光検出系Ｓ２の受光部３から試料面Ｗに至る光路ＯＰ２の光路長が等しく設計され、夫々の光路ＯＰ１及びＯＰ２上には等価光学系が形成されている。
【００１８】
すなわち、発光部２は光源５に接続された光ファイバ６の光出射端６outで形成され、発光部２から試料面Ｗに至る光路ＯＰ１上に、光出射端６outから拡散照射される参照光を集光させる集光レンズＬ１と、照射光から必要な波長成分のみを透過させる励起フィルタＦ１、観察光を分岐するためのダイクロイックミラー７、光を平行にするスキャニングレンズ８、参照光を試料面Ｗ上に集光させる対物レンズ９が介装されて、参照光照射系Ｓ１が形成されている。
【００１９】
また、受光部３は光検出器１０に接続された光ファイバ１１の光入射端１１inで形成され、試料面Ｗから受光部３に至る光路ＯＰ２が、参照光照射系Ｓ１の光路ＯＰ１の途中に配されたダイクロイックミラー７を介して分岐形成されている。
そして、前記光路ＯＰ２は、試料面Ｗからダイクロイックミラー７まで光路ＯＰ１に重なり、ダイクロイックミラー７で分岐された後、観察光から必要な波長成分のみを透過させる吸収フィルタＦ２が参照光照射系Ｓ１の励起フィルタＦ１と対応して設けられ、吸収フィルタＦ２を透過した光を受光部３に集光させる集光レンズＬ２が参照光照射系Ｓ１のレンズＬ１と対応して設けられて、観察光検出系Ｓ２が形成されている。
なお、光検出器１０としては、パワーメーター、フォトマル、分光器などを使用できる
【００２０】
また、発光部２及び受光部３は、それぞれの集光レンズＬ１及びＬ２と共に、ＸＹＺの直交３軸方向に移動可能なスキャニングテーブルＴ１及びＴ２に取り付けられている。
スキャニングテーブルＴ１及びＴ２の直交３軸方向は互いに対応関係にあり、テーブルＴ１をＸ及びＹ方向に移動したときに受光側の共焦点位置が移動する方向がそれぞれテーブルＴ２のＸ及びＹ方向であり、光軸方向がＺ方向である。
そして、各テーブルＴ１及びＴ２は駆動制御装置１２によりコントロールされ、非観察時は夫々独立して移動可能であり、観察時には対応するＸＹＺ方向に同期して移動させることができる。
【００２１】
このスキャニングテーブルＴ１及びＴ２は電動精密位置決めステージを使用する。
駆動装置Ｍとしては、ステッピングモータやサーボモータが用いられる。
発光部２の光出射端６outを距離Ｄだけ移動させたときの試料面Ｗ上のスポット偏位量ｄは、次式であらわされる。
ｄ＝（ｆａ／ｆｂ）Ｄ
ｆａ：対物レンズ９の焦点距離
ｆｂ：スキャニングレンズ８の焦点距離
対物レンズ９に焦点距離ｆａ＝１.８ｍｍの１００倍油浸レンズ、スキャニングレンズ８に焦点距離ｆｂ＝１００ｍｍのレンズを用いると、スキャニングテーブルＴ１を１ｍｍ移動させた時の試料面Ｗ上の偏位量ｄは１８μｍとなる。
ここで、０.１μｍステップで試料面Ｗを走査することができれば、蛍光観察画像以上に鮮明な共焦点画像を作成することができる。
試料面Ｗ上を０.１μｍ移動させるためのスキャニングテーブルＴ１の移動量Ｄを逆算するとＤ＝５.５μｍとなり、一般的に市販されている電動精密位置決めステージであればコントロール可能な移動量である。
そして、１０２４×１０２４ピクセルの画像を構築しようとする場合、スキャニングテーブルＴ１を５.５μｍピッチで１０２４ステップ移動させれば足り、このときのストロークは５.６ｍｍとなるから、±３ｍｍのストロークを持つ電動精密位置決めステージを用いればよい。
【００２２】
なお、光検出器１０及び駆動制御装置１２はコンピュータ４に接続されており、光検出器１０からコンピュータ４に入力される光強度と、コンピュータ４から駆動制御装置１２に出力されたスキャニングテーブルＴ１のＸＹＺ座標データに基づいて画像構築処理が施され、その画像がディスプレイ装置１３に表示される。
また、各スキャニングテーブルＴ１及びＴ２はコンピュータ４から出力されるＸＹＺ座標データに基づいて駆動制御装置１２により、非観察時は個別に、観察時は同期して移動制御される。
【００２３】
以上が本発明の一例構成であって、次にその作用を説明する。
本例の共焦点顕微鏡１で観察を行うためには、発光部２の光出射端６outと受光部３の光入射端１１inが、試料面Ｗ上で同じスポットに焦点を結ぶことが絶対条件となる。
しかし、設計上の共焦点となる位置に各光ファイバ６及び１１をセットしただけでは組み付け誤差などが存在する。
そこで共焦点位置を探し出すプログラムにより自動で共焦点位置を設定する。
【００２４】
図２はそのプログラムを示すフローチャートである。
試料面Ｗにミラーを置きスタートさせると、ステップＳＴＰ１でスキャニングテーブルＴ１及びＴ２が原点に位置決めされ、ステップＳＴＰ２で光源５及び光検出器１０をオンする。
次いで、ステップＳＴＰ３でスキャニングテーブルＴ２をＸＹ方向に移動させて受光強度が最大になる点を見つけ、ステップＳＴＰ４では最大受光強度が得られるＸＹ座標を固定したままＺ方向に移動させて、さらに受光強度が最大になる点を探す。
なお、必要があればステップＳＴＰ３及びステップＳＴＰ４を繰り返し行い、受光強度が最大となるスキャニングテーブルＴ２のＸＹＺ座標が見つかったときに、ステップＳＴＰ５でその座標を原点（共焦点位置）としてコンピュータ４に記憶させる。
【００２５】
そして、ステップＳＴＰ６でスキャニングテーブルＴ１をＸ方向に予め設定された一定距離（単位長さ）Ｘ１移動させたときにスキャニングテーブルＴ２で最大受光強度が得られるＸ方向移動量Ｘ２を検出し、同様に、ステップＳＴＰ７及びステップＳＴＰ８でスキャニングテーブルＴ１のＹ方向及びＺ方向移動量Ｙ１及びＺ１に対するスキャニングテーブルＴ２のＹ方向及びＺ方向移動量Ｙ２及びＺ２を検出する。
ステップＳＴＰ９ではこれらのデータに基づき、以下のようにＸＹＺ方向の計数α、β、γを算出し、これらの値を記憶して処理を終了する。
Ｘ２＝αＸ１
Ｙ２＝βＹ１
Ｚ２＝γＺ１
【００２６】
これにより、観察時は、一度記憶した共焦点位置を原点とし、スキャニングテーブルＴ１を観察開始点ＰＸ１（ｘ１、ｙ１、ｚ１）に位置させると共に、スキャニングテーブルＴ２を観察開始点ＰＸ２（ｘ２、ｙ２、ｚ２）＝ＰＸ２（αｘ１、βｙ１、γｚ１）に位置させて、スキャニングテーブルＴ１を所定の方向に所定ピッチで移動させながら、スキャニングテーブルＴ２をこれに対応する方向に対応する量だけ同期的に移動させて、観察光の受光強度を光検出器１０で検出する。
そして、各観測点ごとに、その座標データと検出器１０で検出された受光強度をコンピュータ４に記憶していき、これをＸＹＺ座標上に表わせば３次元画像が構築される。
【００２７】
このように本例によれば、光を走査するためにガルバノミラーを必要としないため、組立時に高精度の光軸調整を行う必要がなく、その分、製造コストが低減される。
また、光学素子の点数も少なくて済むので、反射損失も減少し、蛍光のような弱い観察光でも効率的に検出することができる。
さらに、発光部２と受光部３の光軸合せを自動化することもできるので、分解組立を行っても簡単に光軸を合わせることができるので、夫々の部品を自由に着脱することができメンテナンス作業も容易となる。
【実施例２】
【００２８】
図３は倒立型に形成した共焦点顕微鏡２１を示し、図１と重複する部分は同一符号を付して詳細説明を省略する。
本例では、参照光照射系Ｓ１が試料面Ｗの上方に形成され、観察光検出系Ｓ２が試料面Ｗの下方に位置するように配されており、試料面を透過してきた観察光を受光部４に案内するようになされている。
【００２９】
そして本例でも、発光部２から試料面Ｗに至る参照光照射系Ｓ１と、試料面Ｗを透過した観察光が受光部３に至る観察光検出系Ｓ２の光路長が等しく、それぞれの光路ＯＰ１及びＯＰ２に沿って等価光学系が配されている。
すなわち、発光部２から試料面Ｗに至る光路ＯＰ１上に、光出射端６outから拡散照射される参照光を集光させる集光レンズＬ１と、照射光から必要な波長成分のみを透過させる励起フィルタＦ１、光を平行にする発光側スキャニングレンズ８、参照光を試料面Ｗ上に集光させるスポット形成レンズ２２が介装されて、参照光照射系Ｓ１が形成されている。
【００３０】
また、試料面Ｗから受光部３に至る光路ＯＰ２は、試料面Ｗを透過した観察光を平行化する対物レンズ２３及びその光を集束させる受光側スキャニングレンズ２４が、前記スポット形成レンズ２２及び発光側スキャニングレンズ８に対応して設けられ、ミラー２５により折り曲げられた観察光から必要な波長成分のみを透過させる吸収フィルタＦ２が前記励起フィルタＦ１と対応して設けられ、さらに、吸収フィルタＦ２を透過した光を受光部３に集光させる集光レンズＬ２が参照光照射系Ｓ１のレンズＬ１と対応して設けられて、観察光検出系Ｓ２が形成されている。
【００３１】
そして、本例でも、発光部２及び受光部３が夫々の集光レンズＬ１及びＬ２と共に、スキャニングテーブルＴ１及びＴ２に取り付けられて、光軸調整する場合などの非観察時には独立してＸＹＺ方向に移動可能で、観察時には前例と同様に対応する方向に対応する距離だけ同期して移動させることができるようになっており、各観測点ごとにその座標データと検出器１０で検出された受光強度をコンピュータ４に記憶していき、これをＸＹＺ座標上に表わせば３次元画像が構築される。
【００３２】
なお、上述の説明では、スキャニングテーブルＴ１及びＴ２をＸＹＺの３軸方向に移動させる場合について説明したが、平面的なものを観察する場合は、ＸＹの２軸方向にのみ移動できるようになっていてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
以上述べたように、本発明は、試料面上に焦点を結ぶ参照光を走査してその試料面で発する蛍光などの観察光の空間分布を記録して、その切片画像を再現する用途に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明に係る共焦点顕微鏡の一例を示す説明図。
【図２】光軸合せの処理を示すフローチャート。
【図３】他の実施形態を示す説明図。
【図４】従来装置を示す説明図。
【符号の説明】
【００３５】
１    共焦点顕微鏡
２    発光部
３    受光部
Ｗ    試料面
Ｓ１  参照光照射系  
Ｓ２  観察光検出系
ＯＰ１  光路
ＯＰ２  光路  、
５    光源
６    光ファイバ
Ｌ１  集光レンズ  
Ｆ１  励起フィルタ
７    ダイクロイックミラー  
８    スキャニングレンズ
９  対物レンズ
１０  光検出器
１１  光ファイバ
Ｆ２  吸収フィルタ、
Ｌ２  集光レンズ
Ｔ１、Ｔ２  スキャニングテーブル
１２  駆動制御装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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