(57)【要約】【課題】  コハク酸を生成する生物の成長や増殖を維持させながらコハク酸を得る方法を提供する。【解決手段】  生物を用いてコハク酸を生成させる際、コハク酸を使用しなくてもエネルギー代謝を進めることができるグリオキシル酸回路を使用するので、コハク酸を生成する生物の成長や増殖を維持させながらコハク酸を得ることができる。生物が生成したコハク酸を用いて生分解性プラスチックを生産することができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物のグリオキシル酸回路によりコハク酸を生成させることを特徴とするコハク酸の製造方法。
【請求項２】
前記生物のイソクエン酸リア−ゼの活性を高めてコハク酸を生成させることを特徴とする請求項１記載のコハク酸の製造方法。
【請求項３】
前記生物のコハク酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させてコハク酸を生成させることを特徴とする請求項１記載のコハク酸の製造方法。
【請求項４】
コハク酸生成時には前記生物のスクシニルＣｏＡシンテターゼの活性を高め、コハク酸消費時には前記生物のスクシニルＣｏＡシンテターゼの活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のコハク酸の製造方法。
【請求項５】
グリオキシル酸回路を有する生物により生成されたことを特徴とするコハク酸。
【請求項６】
生分解性プラスチックの原料として使用されることを特徴とする請求項５記載のコハク酸。
【請求項７】
生物において消費される量より多くのコハク酸を前記生物に生成させる処理と、生成された前記コハク酸を分離する処理と、分離した前記コハク酸を精製する処理と、精製された前記コハク酸を用いて生分解性プラスチックを生産する処理とを有することを特徴とする生分解性プラスチックの製造方法。
【請求項８】
前記生物のイソクエン酸リア−ゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼおよび／またはスクシニルＣｏＡシンテターゼを発現する遺伝子は、前記コハク酸をより多く生成するように組み替えられていることを特徴とする請求項７記載の生分解性プラスチックの製造方法。
【請求項９】
前記コハク酸を分離した前記処理の後、前記生物を収集し前記コハク酸を生成させる前記処理に投入して前記生物を再利用する処理をさらに有することを特徴とする請求項７または８に記載の生分解性プラスチックの製造方法。
【請求項１０】
グリオキシル酸回路を有する生物のクエン酸回路および／またはグリオキシル酸回路で生成させたコハク酸を含むことを特徴とする生分解性プラスチック。            
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物を利用したコハク酸の製造方法、コハク酸、生分解性プラスチックの製造方法および生分解性プラスチックに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来からプラスチックや食品や化粧品に使用されているコハク酸は、工業的に広く生産されている。コハク酸を製造する方法としてよく知られているものとして、例えば、石油から生成された無水マレイン酸に加水してマレイン酸とし、これを電解還元または接触還元して水素を添加し、脱色と再結晶で精製することでコハク酸を製造する方法がある。また近年は細菌を利用してコハク酸を製造する方法も検討されている。具体的には、嫌気性細菌であるAnaerobiospirillum succiniciproducensを用いてコハク酸を効率的に生成する方法や（特許文献１および２）、好気性コリネ型細菌（coryneform bacteria）を用いてコハク酸等の有機酸を生成する方法（特許文献３，４および５）がある。
【０００３】
【特許文献１】特許第２８７２７２３号公報（請求項１等）
【特許文献２】特許第２９４４１５７号公報（請求項１等）
【特許文献３】特開平１１−１１３５８８号公報（請求項１等）
【特許文献４】特開平１１−１９６８８７号公報（請求項１等）
【特許文献５】特開平１１−１９６８８８号公報（請求項１等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、コハク酸は生分解性プラスチックの原料（モノマー）としても使用されている。生分解性プラスチックは使用後に自然界で分解され、自然環境に負担をかけない素材である。ところがその生分解性プラスチックの原料として石油から製造されたコハク酸を使用するのは、環境保護としての役割を十分果たしているとは言い難い。一方、上記従来技術を用いて生物から得られるコハク酸を利用して生分解性プラスチックを製造することもできるが、環境保護が強く要求されている現在、更なる検討が期待されている。
【０００５】
本発明者らは、コハク酸を生成する生物の成長や増殖を維持させながらコハク酸を製造する方法を発見するに至った。
本発明は、生物を利用したコハク酸の製造方法、コハク酸、生分解性プラスチックの製造方法および生分解性プラスチックを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる目的のもとになされた本発明のコハク酸の製造方法は、生物のグリオキシル酸回路によりコハク酸を生成させることを特徴とするものである。本発明のコハク酸の製造方法においては、生物のイソクエン酸リアーゼの活性を高めてコハク酸の生産を増やすことができる。また、コハク酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させてコハク酸の消費を抑えることもできる。さらに、コハク酸生成時にはスクシニルＣｏＡシンテターゼの活性を高めてコハク酸の生産を増やすことができる。また、コハク酸消費時にはスクシニルＣｏＡシンテターゼの活性を低下させてコハク酸の消費を抑えることもできる。
【０００７】
本発明のコハク酸は、グリオキシル酸回路を有する生物により生成されたことを特徴とするものである。このコハク酸は、生分解性プラスチックの原料として使用されることが好ましい。
【０００８】
本発明の生分解性プラスチックの製造方法は、生物において消費される量より多くのコハク酸を生物に生成させる処理と、生成されたコハク酸を分離する処理と、分離したコハク酸を精製する処理と、精製されたコハク酸を用いて生分解性プラスチックを生産する処理とを有することを特徴とするものである。
【０００９】
本発明の生分解性プラスチックの製造方法では、コハク酸を生成する生物のイソクエン酸リアーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼおよび／またはスクシニルＣｏＡシンテターゼを発現する遺伝子は、コハク酸をより多く生成するように組み替えられていることが好ましい。また、コハク酸を分離した処理の後、生物を収集し、コハク酸を生成させる処理に投入してその生物を再利用する処理をさらに有することができる。
【００１０】
その他、本発明の生分解性プラスチックは、グリオキシル酸回路を有する生物のクエン酸回路および／またはグリオキシル酸回路で生成させたコハク酸を含むことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、コハク酸を生成する生物の成長や増殖を維持させながらコハク酸を得ることができ、また生物から得られたコハク酸を用いて生分解性プラスチックを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
図１は、生物のグリオキシル酸回路を示す図であり、図２は生物のクエン酸回路を示す図である。本発明では、エネルギーの代謝経路として図１に示すようなグリオキシル酸回路や図２に示すようなクエン酸回路を有する生物を利用し、コハク酸を生成させる。以下、その詳細を説明する。
【００１３】
生物の生体内においては、細胞内に存在するクエン酸回路やグリオキシル酸回路でエネルギーが代謝されている。生物が一般的に有するクエン酸回路では、図２に示すようにエネルギーを代謝する過程においてイソクエン酸から２−オキサロ酢酸が生成され、２−オキサロ酢酸からスクシニルＣｏＡが生成され、スクシニルＣｏＡからスクシニルＣｏＡシンテターゼを介してコハク酸が生成され、コハク酸はコハク酸デヒドロゲナーゼを介してフマル酸となる。したがって、クエン酸回路でエネルギーを代謝する際には必ずコハク酸が生成され、また消費される。
【００１４】
一方、グリオキシル酸回路の場合、図１の矢印(a)に示すようにイソクエン酸からイソクエン酸リアーゼを介してコハク酸とグリオキシル酸が生成され、ここで一旦２つの経路に分かれて代謝が進む。生成されたグリオキシル酸から延びる経路では、アセチルＣｏＡを利用してリンゴ酸が生成される。また生成されたコハク酸から延びる経路では、フマル酸を介してリンゴ酸が生成される。その後、これら２つの経路で生成されたリンゴ酸は再び同じ経路で代謝されてオキサロ酢酸となる。このように、グリオキシル酸回路を持つ生物はグリオキシル酸を介してエネルギーを代謝する経路を有するので、もう一方の経路で生成されたコハク酸の全てを消費しなくてもリンゴ酸を生成することができ、エネルギーの代謝経路を止めることがない。そこで本発明では、クエン酸回路やグリオキシル酸回路を有する生物、特にグリオキシル酸回路を持つ生物を利用することで、その生物の成長や増殖を維持したまま効率的にまた安価にコハク酸を得ることを可能とした。
【００１５】
本発明におけるグリオキシル酸回路を有する生物として、高等植物や微生物を挙げることができる。具体的には、培養法や遺伝子改良法等が確立している生物が好ましく、例えば原核生物である大腸菌(Escherichia coli)や、真核生物である酵母(Saccharomyces sp.)が挙げられる。これらはセルロース等の植物由来の糖類等の栄養素で培養する等、培養法が容易であり、遺伝子組み替え等を行う際の遺伝的・生化学的操作手法も確立している。その他、Brevibacterium flavum、B. ammoniagenes、Corynebacterium glutamicum、B. lactofermentum等のコリネ型細菌（coryneform bacteria）を用いることもできる。
【００１６】
本発明では、上記したような生物を適宜培養してコハク酸を生成させる際、コハク酸をより効率的に得るためにコハク酸を通常生産する量より多く生成させたり蓄積させることが好ましい。具体的な方法として、生物においてグリオキシル酸回路のイソクエン酸リアーゼの活性を高める方法、グリオキシル酸回路やクエン酸回路のコハク酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させる方法、クエン酸回路のスクシニルＣｏＡシンテターゼの活性を低下させるまたは活性を高める方法等を挙げることができる。ただし、クエン酸回路のイソクエン酸からリンゴ酸に至る間で生産される物質にエネルギー代謝に重要なＮＡＤＨ、ＧＴＰ、ＦＡＤＨ2等があるので、クエン酸回路を完全に停止させないように注意を払う必要がある。
【００１７】
イソクエン酸リアーゼの活性を高める方法では、グリオキシル酸回路において図１の矢印(a)に示すようにイソクエン酸からコハク酸とグリオキシル酸を生成させる酵素「イソクエン酸リアーゼ」の活性を高めることにより、グリオキシル酸と共にコハク酸の生成量を増加させることができる。イソクエン酸リアーゼの活性を高めるには、例えばイソクエン酸リアーゼの量を増大させるように、生物のイソクエン酸リアーゼを生成する遺伝子の量を増大させたり、発現を制御することにより実現できる。
【００１８】
ここで遺伝子の量を増大させるには、例えばイソクエン酸リアーゼの完全長の遺伝子をｃＤＮＡやゲノムのＤＮＡライブラリーの中から特定し、その遺伝子の配列をプライマーにしてＰＣＲ法やハイブリッド選択法によって単離する。そして単離した遺伝子を宿主となる生物(大腸菌、酵母等)に導入する。遺伝子を導入するには、例えばトランスフェクション法として、細胞がＤＮＡリン酸カルシウムの沈殿物をエンドサイトーシスで取り込む性質を利用したリン酸カルシウム法、リボソームとＤＮＡで電気的な相互作用により複合体を形成させて細胞に取り込ませるリボフェクション法、細胞とＤＮＡの浮遊液に高電圧バルスを加えて細胞に取り込ませるエレクトロボレーション法（電気穿孔法）等を挙げることができ、ウイルスによる導入方法として、担体としてアデノウイルスベクターを用いる方法、レトロウイルスを用いる方法を挙げることができ、その他、直接ガラスピペットを用いて細胞核へ注入する方法等を用いることができる。なお遺伝子を単離した際には、イソクエン酸リアーゼの遺伝子の発現調節領域を発現量の多い遺伝子の発現調節領域と交換して遺伝子発現量を多くするような遺伝子と交換することもできる。また、遺伝子の発現を制御するには、遺伝子の転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾等を制御するために転写活性因子を導入することにより実現することができる。
【００１９】
その他イソクエン酸リアーゼを活性を高める方法として、生物の培養中にイソクエン酸リアーゼの生成物であるコハク酸を除去することでコハク酸を生成する反応をさらに進め易くしたり、二酸化炭素を添加する等の処置を行って反応条件を最適化することによりイソクエン酸リアーゼの活性を高めることもできる。
【００２０】
次に、コハク酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させる方法では、グリオキシル酸回路において図１の矢印(b)に示すようにコハク酸を酸化させてフマル酸を生成させる酵素「コハク酸デヒドロゲナーゼ」の活性を低下させることにより、コハク酸の消費量を低下させて、コハク酸の生成量（蓄積量）を増加させることができる。コハク酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させるには、例えばコハク酸デヒドロゲナーゼの量を減らすように、コハク酸デヒドロゲナーゼを生成する遺伝子の量を破壊したり減少させたりすることにより実現できる。
【００２１】
ここで遺伝子量を破壊させたり減少させるには、例えばアンチセンス法やリボザイム法を挙げることができる。アンチセンス法では、コハク酸デヒドロゲナーゼを発現する標的遺伝子のｍＲＮＡと相補的な配列を持ったＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）を用いて遺伝子の発現を阻害する。ここで標的としているコハク酸デヒドロゲナーゼを含むクエン酸回路は生物の増殖や生命維持に重要なものであり、ＮＡＤＨ、ＧＴＰ、ＦＡＤＨ2等を生成する経路であるため、コハク酸デヒドロゲナーゼのアンチセンスＲＮＡはコハク酸が生成されたときのみに発現させるように調節する。例えば、アンチセンスＲＮＡの調節領域を光や温度等を定めた特定の条件下で発現するものとして宿主に導入することで、コハク酸の生産状態に応じて遺伝子量を適宜調節することができる。リボザイム法では、標的遺伝子のｍＲＮＡの特異的分離を誘導し(リボザイムはその認識部位と相補的な配列を持つＲＮＡを認識して切断)。また、リボザイムの遺伝子の調節領域も光、温度等ある特定の条件下で発現するものとして宿主に導入することができる。
【００２２】
その他、コハク酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させるには生物の培養中にコハク酸デヒドロゲナーゼが消費するコハク酸を除去したり、反応条件を適宜調整することによりコハク酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させることもできる。
【００２３】
さらに、イソクエン酸リアーゼの活性を高めた上でスクシニルＣｏＡシンテターゼの活性を低下させる方法では、クエン酸回路において図２の矢印(c)に示すようにスクシニルＣｏＡより可逆的にコハク酸を生成させる酵素「スクシニルＣｏＡシンテターゼ」の活性を低下させる。図１のグリオキシル酸回路にてコハク酸が生成されても、このコハク酸がスクシニルＣｏＡシンテターゼによりスクシニルＣｏＡに変換されてしまう。そこで、生成されたコハク酸が変換されないように、スクシニルＣｏＡシンテターゼの活性を低下させ、コハク酸の生成量（蓄積量）を増加させることができる。スクシニルＣｏＡシンテターゼの活性を低下させる方法としては、前述したコハク酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させる方法と同様の方法を用いることができる。
【００２４】
その他、クエン酸回路増強によりコハク酸の生産を上げるためのスクシニルＣｏＡシンテターゼの活性を高める方法では、クエン酸回路において図２の矢印(c)に示すスクシニルＣｏＡシンテターゼを単に活性を高めるだけでは、生成されたコハク酸がスクシニルＣｏＡへと戻ってしまう。そこで、コハク酸を反応系外に出すことでスクシニルＣｏＡシンテターゼがコハク酸を生産する方向に反応が進むようにして、スクシニルＣｏＡシンテターゼの活性を高めることができる。なお、この方法を用いる場合、生物はグリオキシル酸回路を有しなくてもよい。
【００２５】
以上述べたコハク酸を通常より多く生成させたり蓄積させる方法は、各方法を単独で用いることもできるが、複数の方法を適宜組み合わせて用いることもできる。また、コハク酸は生物のクエン酸回路またはグリオキシル酸回路またはその両方で生成されるものであってもよいが、上述したようにグリオキシル酸回路を用いるとコハク酸の生成量を増加させることができるので、グリオキシル酸回路で生成されるコハク酸の割合が多くなる。ただし、コハク酸はどちらの経路で生成されても性質的には差がない生成物として得られる。
【００２６】
このようにして、本発明においてはコハク酸を生物のグリオキシル酸回路やクエン酸回路にて通常生産する量より多く生成させ、生物で消費される以上の量のコハク酸を蓄積させる。そして、蓄積された過剰のコハク酸を後述するように生物から分離収集することで、生物の成長や増殖を抑制させることなく生物を保護しながら、効率的に環境保護に即したコハク酸を得ることができる。
【００２７】
本発明では、生物に生成させたコハク酸を原料として使用し生分解性プラスチック生物を製造することができる。図３は、生物によるコハク酸の生成から生分解性プラスチックを製造するまでの工程の概略図である。
【００２８】
まず、上述したようにして生物を培養してコハク酸を生成・蓄積させる。そして、生成されたコハク酸を生物から分離する。具体的な方法としては、生物を培養した培養液や培地から遠心分離機にかけて、生物とコハク酸とを分離することができる。また、限外ろ過、ミクロろ過、電気透析等を用いて分離しても良い。ここでコハク酸の分離と同時に、またはコハク酸を分離した後に、コハク酸を生成させた生物をコハク酸の生成に再利用する為に収集することができる。この工程で分離されて収集される生物は、生成されたコハク酸を取り上げられながらもグリオキシル酸回路を有するおかげでエネルギーの代謝経路が止まることなく成長・増殖している。そこで、これら生物はコハク酸を生成する工程に戻して再利用することができる。
【００２９】
上述の処理にて分離されたコハク酸は、適宜な方法にて精製することにより、工業的に使用できるコハク酸とすることができる。具体的な精製方法としては、カラム法や再結晶法等を挙げることができる。カラム法では、カチオン交換体やアニオン交換体で処理して、プラス電荷やマイナス電荷の不純物を除去させる。
【００３０】
次に、精製されたコハク酸を用いて生分解性プラスチックを生産する。生分解性プラスチックを生産する方法では、従来公知のものを適用することができ、例えばコハク酸にエチレングリコールまたは１，４−ブタンジオールを添加して高温下の容器内で重合させてポリエチレンサクシネートまたはポリブチレンサクシネート等の融点が高く生分解性に優れたポリアルキレンサクシネートを生産することができる。このようにして得られる生分解性プラスチックは、使用後に自然界にて分解されるので環境汚染の原因となりづらいだけではなく、生物から生成されたコハク酸を原料として生産されている。したがって、石油から得られるコハク酸を使わず、生産から一貫して環境に配慮した生分解性プラスチックを得ることができる。
【００３１】
なお、本発明で生物により生成され、さらに分離精製されたコハク酸は食品や医薬品や工業用化合物として生分解性プラスチック以外の用途に使用することができる。
【００３２】
その他、本発明においては、本発明の主旨を逸脱しない限り、上記実施の形態で示した構成に対し、構成の変更、削除、追加等を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】グリオキシル酸回路を説明する図である。
【図２】クエン酸回路を説明する図である。
【図３】コハク酸の生成から生分解性プラスチックを製造するまでの工程の概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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