(57)【要約】【課題】インターロイキンを阻害する新たな安全性の高い薬剤を提供すること。さらに、インターロイキンが関与すると考えられる炎症性疾患、アレルギー性疾患、リウマチ、喘息、多発性骨髄腫などの疾患の治療剤を提供すること。【解決手段】本発明のインターロイキン阻害剤およびインターロイキンが関与する疾患の治療剤は、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有する。本発明のインターロイキン阻害剤は、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−８からなる群より選択される少なくとも１つのインターロイキンが関与すると考えられる種々の疾患の治療に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有するインターロイキン阻害剤であって、該インターロイキンが、インターロイキン−４、インターロイキン−６、およびインターロイキン−８からなる群より選択される、インターロイキン阻害剤。
【請求項２】
アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有する、インターロイキン−４、インターロイキン−６、およびインターロイキン−８の少なくとも１つが関与する病態の治療剤。
【請求項３】
前記病態が、炎症性疾患、アレルギー性疾患、リウマチ、喘息、または多発性骨髄腫である、請求項２に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン阻害剤に関する。より詳細には、インターロイキン−４、インターロイキン−６、およびインターロイキン−８のうちの少なくとも１つのインターロイキンの阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の免疫応答、炎症反応、造血反応などの生体機能の発現を抑制するタンパク質因子として数多くのサイトカインが発見されている。その構造や作用が解明されるにつれて、サイトカインの作用が免疫系に限らず、生体の様々な機能に影響を及ぼし、生体の発生、分化、恒常性維持、病態生理などと深く関連することが明らかになってきた。
【０００３】
免疫応答において中心的な役割を担っているヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞に分類される（非特許文献１）。Ｔｈ２細胞は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）などのサイトカインを産生する。
【０００４】
このうち、ＩＬ−４は、ＩＬ−１３と同様に、Ｂ細胞に作用して、ＩｇＥへのクラススイッチを誘導することにより、ＩｇＥ抗体の産生を誘導する。産生されたＩｇＥ抗体はマスト細胞の表面に結合し、特異抗原がこのＩｇＥ抗体に結合すると肥満細胞（マスト細胞）が活性化される。活性化された肥満細胞からは脱類粒によって細胞内に貯蔵されたヒスタミンなどの炎症性物質が放出され、アレルギー症状が誘発される。さらに、ＩＬ−４は、抗原未感作なナイーブＴ細胞からＴｈ２細胞への分化および増殖能ならびに肥満細胞に対する活性化能も有している。
【０００５】
ＩＬ−４は、ＩｇＥ抗体の産生を誘導するとともに、肥満細胞の活性化および増殖も誘導する。また、好酸球が血管内皮細胞に接着して組織浸潤する際に機能する重要な分子であるＶＣＡＭ−１の遺伝子発現も誘導する。さらに、ＩＬ−４は、ヘルパーＴ細胞の前駆細胞であるナイーブＴ細胞に作用し、Ｔｈ２への機能的分化を誘導し、分化成熟後のＴ細胞に対しては増殖因子としても働く。さらに、Ｔｈ２は、このようなＩｇＥ抗体や肥満細胞が関与する即時型アレルギー反応のみならず、好酸球が関与する遅発型アレルギー反応をも惹起する中心的な細胞でもある。また、ＩＬ−４は、そのＴｈ２の分化増殖因子として大きな役割を担い、一方でＴｈ２から産生され、即時型および遅発型の両アレルギー反応に深く関与する重要なサイトカインである。このようなＩＬ−４の異常産生または分泌に関連する疾患としては、アレルギー性疾患、寄生虫感染症、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患、ウイルスあるいはバクテリア感染症、悪性腫瘍、ＨＶＧ（Ｈｏｓｔ−ｖｅｒｓｕｓ−Ｇｒａｆｔ）病あるいは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などが挙げられる。
【０００６】
ＩＬ−４が生物活性を示すためには、標的細胞上の特異的レセプターに結合したのち、細胞内に情報が伝達されなくてはならない。近年の分子生物学の発展により、ＩＬ−４レセプターからの細胞内情報伝達機構が解明され、主要な細胞内分子群が同定されてきた。中でもとりわけ重要な分子としてスタット６が見出されている（非特許文献２）。そのため、ＩＬ−４の阻害剤として、スタット６の活性化阻害剤が検討されている（例えば、特許文献１）。
【０００７】
Ｂ細胞の抗体産生細胞への最終分化を誘導するサイトカインとして、インターロイキン−６（ＩＬ−６）が知られている。ＩＬ−６は、Ｂ細胞の抗体産生系に重要な役割を果たしているだけでなく、Ｔ細胞に増殖分化を誘導することや、肝細胞に作用して急性期タンパク質の合成を誘導すること、造血系細胞に対して多分化能コロニーの形成を促すことなど、免疫系だけでなく造血系、神経系、肝などの生体防御系の重要な因子であることが明らかにされている。
【０００８】
ＩＬ−６の異常産生または分泌に関連する疾患としては、癌悪液質、心房粘液腫、慢性関節リウマチ、自己免疫疾患、キャッスルマン氏病、骨髄腫、レンネルトリンパ腫、メサンギウム増殖性腎炎、乾癬、エイズに伴うカポシ肉腫、閉経後骨粗鬆症などが挙げられる。これらの疾患の治療および予防の目的で、ＩＬ−６阻害剤についての種々の検討が行われている（例えば、特許文献２〜６）。
【０００９】
ＩＬ−８は、好中球、Ｔ細胞、および好塩基球に対する走化因子であり、好中球を活性化してリソゾーム酵素を放出し、好中球の血管内皮細胞への付着を変化させ、ならびにカンジダ増殖抑制を亢進する。また、関節内に注入すると大量の好中球湿潤を伴う関節滑膜の破壊が見られ、さらに、好中球上の接着因子の発現増強作用、好塩基球でのヒスタミン放出調節、人工臓器での好中球の活性化作用などの、多くの生理活性を有する。また、ＩＬ−８は炎症性サイトカインともいわれ、ＩＬ−８の異常発生やＩＬ−８への過剰反応は炎症性疾患の原因になると考えられている。
【００１０】
ＩＬ−８が関与する炎症性疾患としては、炎症性角化症（乾癬など）、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎などの炎症性皮膚疾患；慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、ベーチェット病などの慢性炎症性疾患である自己免疫疾患；クローン病、潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール性肝炎、薬物アレルギー性肝炎などの炎症性肝疾患；糸球体腎炎などの炎症性腎疾患；気管支炎などの炎症性呼吸器疾患；口内炎、声帯炎、人工臓器・人工血管使用時に起こる炎症などが挙げられる。そのため、種々のＩＬ−８阻害剤が検討されている（例えば、特許文献５〜９）。
【００１１】
このように、種々のインターロイキン阻害剤について検討されているが、ＩＬ−６とＩＬ−８とを共に阻害する阻害剤は存在するが（例えば、特許文献５および６）、ＩＬ−４も含めた広範囲のインターロイキンに対する阻害剤は知られていない。
【特許文献１】特開２０００−２２９９５９号公報
【特許文献２】特開２００５−２２９７２号公報
【特許文献３】特開平８−１６９８４０号公報
【特許文献４】特開平７−３２４０９７号公報
【特許文献５】特開平８−７３４５３号公報
【特許文献６】国際公開第２００２／０４９６３２号パンフレット
【特許文献７】特開２００４−２６９４５０号公報
【特許文献８】特開平１１−１５８０７１号公報
【特許文献９】特表２０００−５０７５５６号公報
【非特許文献１】Mosmann TRら、J. Immunol.，1986年，136巻，pp.2348-2357
【非特許文献２】McKnight、Science，1994年，265巻，pp.1701-1706
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、種々のインターロイキンに対して阻害作用を有する、新たな安全性の高い薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有するインターロイキン阻害剤を提供し、該インターロイキンは、インターロイキン−４、インターロイキン−６、およびインターロイキン−８からなる群より選択される。
【００１４】
本発明はまた、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有する、インターロイキン−４、インターロイキン−６、およびインターロイキン−８の少なくとも１つが関与する病態の治療剤を提供する。
【００１５】
好適な実施態様では、上記病態は、炎症性疾患、アレルギー性疾患、リウマチ、喘息、または多発性骨髄腫である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、新たなインターロイキン阻害剤が提供される。このインターロイキン阻害剤は、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−８からなる群より選択される少なくとも１つのインターロイキンが関与すると考えられる炎症性疾患、アレルギー性疾患、リウマチ、喘息、多発性骨髄腫などの種々の疾患の治療剤として用いられ得る。本発明のインターロイキン阻害剤は、低毒性であるため、安全性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明のインターロイキン阻害剤の有効成分であるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは、以下の式：
【００１８】
【化１】
2006008717.tif 000002
【００１９】
（ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子または脂肪酸残基である）で示されるカロテノイドの一種である。アスタキサンチンのエステルとしては、特に限定されないが、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸などの飽和脂肪酸、あるいはオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ビスホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの不飽和脂肪酸のモノエステルまたはジエステルが挙げられる。これらは単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。アスタキサンチンは、β−カロチンの骨格の両端にオキソ基とヒドロキシ基とを余分に有する構造であるため、β−カロチンとは異なり、分子の安定性が低い。これに対し、両端のヒドロキシ基が不飽和脂肪酸などでエステル化されたエステル体（例えば、オキアミ抽出物）はより安定である。
【００２０】
本発明に用いられるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは、化学的に合成されたものであっても、あるいは天然物由来のもののいずれであってもよい。後者の天然物としては、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する赤色酵母；ティグリオパス（赤ミジンコ）、オキアミなどの甲殻類の殻；緑藻類などの微細藻類などが挙げられる。本発明においては、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルの特性を利用できるものであれば、どのような方法で生産されたアスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する抽出物をも使用することができる。一般的には、これらの天然物からの抽出物が用いられ、抽出エキスの状態であっても、また必要により適宜精製したものであってもよい。本発明においては、このようなアスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する粗抽出物や破砕粉体物、あるいは必要により適宜精製されたもの、化学合成されたものを、単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。体内での安定性を考慮すると、好ましくはエステル体が用いられる。
【００２１】
本発明のインターロイキン阻害剤は、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−８からなる群より選択される少なくとも１つのインターロイキンが関与する疾患または症状を治療または予防するのに有用であり得る。このような疾患または症状としては、アレルギー性疾患、寄生虫感染症、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患、ウイルスあるいはバクテリア感染症、悪性腫瘍（形質細胞腫、多発性骨髄腫、癌悪液質、心房粘液腫、骨髄腫、レンネルトリンパ腫など）、ＨＶＧ（Ｈｏｓｔ−ｖｅｒｓｕｓ−Ｇｒａｆｔ）病あるいは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、ベーチェット病など）、キャッスルマン氏病、エイズに伴うカポシ肉腫、閉経後骨粗鬆症、炎症性皮膚疾患（炎症性角化症、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎など）、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎など）、炎症性肝疾患（Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール性肝炎、薬物アレルギー性肝炎など）、炎症性腎疾患（糸球体腎炎など）、炎症性呼吸器疾患（喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎など）、口内炎、声帯炎、人工臓器・人工血管使用時に起こる炎症などが挙げられる。
【００２２】
本発明のインターロイキンが関与する疾患の治療剤は、上記の本発明のインターロイキン阻害剤と同様に、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有する。特に、炎症性疾患、アレルギー性疾患、リウマチ、喘息、または多発性骨髄腫の治療に有用である。
【００２３】
本発明のインターロイキン阻害剤またはＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−８からなる群より選択される少なくとも１つのインターロイキンが関与する疾患の治療剤の投与経路は、経口投与または非経口投与のいずれであってもよい。その剤形は、投与経路に応じて適宜選択される。例えば、注射液、輸液、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、腸溶剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤、経腸栄養剤などが挙げられる。これは、症状に応じてそれぞれ単独でまたは組み合わせて使用することができる。これらの製剤には、必要に応じて、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤が用いられる。
【００２４】
本発明のインターロイキン阻害剤またはインターロイキンが関与する疾患の治療剤の投与量は、投与の目的や投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）に応じて異なる。通常、成人に対して、アスタキサンチンフリー体換算で、経口投与の場合、１日あたり０．１ｍｇ〜２ｇ、好ましくは４ｍｇ〜５００ｍｇ、一方、非経口投与の場合、１日あたり０．０１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜５００ｍｇで投与され得る。
【００２５】
本発明のインターロイキン阻害剤は、上記のような医薬品としてだけでなく、医薬部外品、化粧品、機能性食品、栄養補助剤、飲食物などとして使用することができる。医薬部外品または化粧品として使用する場合、必要に応じて、医薬部外品または化粧品などの技術分野で通常用いられている種々の補助剤とともに使用され得る。あるいは、機能性食品、栄養補助剤、または飲食物として使用する場合、必要に応じて、例えば、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤などの食品に通常用いられる添加剤とともに使用してもよい。また、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状などの所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれる割合は、特に限定されず、使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
（調製例１：アスタキサンチンモノエステルの調製）
アスタキサンチンモノエステルを、次のように調製した。ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pulvialis）K0084株を、２５℃にて光照射条件下３％ＣＯ２を含むガスを通気しながら栄養ストレス（窒素源欠乏）をかけて培養し、シスト化した。シスト化した細胞を、当業者が通常用いる手段によって破砕し、エタノールで油性画分を抽出した。抽出物は、アスタキサンチン類の他に、トリグリセリドなどの脂質を含んでいた。抽出物を、合成樹脂吸着剤を用いるカラムクロマトグラフィーにかけて、アスタキサンチンのモノエステルを含む精製物を得た。この精製物をＨＰＬＣによって分析し、このアスタキサンチンモノエステル精製物が、分子量８５８のモノエステルを主成分として含み、アスタキサンチンの遊離体およびジエステル体を含まず、わずかにジグリセリドを含んでいることを確認した。
【００２７】
（実施例１：ＩＬ−４放出に対する効果）
上記調製例１で得たアスタキサンチンモノエステルについて、細胞からのＩＬ−４の放出に及ぼす効果を検討した。ＩＬ−４を放出する細胞としてヒト末梢血単核細胞を用い、そしてインキュベーション緩衝液として、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＦＢＳ（ｐＨ７．４）を用いた。
【００２８】
ヒト末梢血単核細胞をインキュベーション緩衝液に３７℃にて懸濁し、ＩＬ−４放出因子としてコンカナバリンＡを添加した。そこに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したアスタキサンチンモノエステルを、２５０、２５、２．５、０．２５、および０．０２５μＭとなるように添加して、３７℃にて１６時間インキュベートした。なお、ＤＭＳＯの濃度は０．１(v/v)％とした。また、陰性コントロールには、ＤＭＳＯのみを添加した。
【００２９】
インキュベーション終了後、遠心分離して上清を回収し、上清中のＩＬ−４濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。陰性コントロールの場合のＩＬ−４濃度を１００％としたときの、アスタキサンチンモノエステルによる５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。その結果、ＩＣ５０は７４．１μＭであった。２５０μＭにおける放出の阻害率は、９９％であった。このように、アスタキサンチンモノエステルは、ＩＬ−４の放出に対して比較的低い阻害濃度かつ高い阻害率を示した。
【００３０】
（実施例２：ＩＬ−６放出に対する効果）
上記調製例１で得たアスタキサンチンモノエステルについて、細胞からのＩＬ−６の放出に及ぼす効果を検討した。ＩＬ−６を放出する細胞としてヒト末梢血単核細胞を用い、そしてインキュベーション緩衝液として、ＡＩＭ−Ｖ培地（ｐＨ７．４）を用いた。
【００３１】
ヒト末梢血単核細胞をインキュベーション緩衝液に３７℃にて懸濁し、ＩＬ−６放出因子としてリポ多糖（ＬＰＳ）を添加した。そこに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したアスタキサンチンモノエステルを、２５０、２５、２．５、０．２５、および０．０２５μＭとなるように添加して、３７℃にて１６時間インキュベートした。なお、ＤＭＳＯの濃度は０．１(v/v)％とした。また、陰性コントロールには、ＤＭＳＯのみを添加した。
【００３２】
インキュベーション終了後、遠心分離して上清を回収し、上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。陰性コントロールの場合のＩＬ−６濃度を１００％としたときの、アスタキサンチンモノエステルによる５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。その結果、ＩＣ５０は２７．２μＭであった。２５０μＭにおける放出の阻害率は、１００％であった。このように、アスタキサンチンモノエステルは、ＩＬ−６の放出に対して比較的低い阻害濃度かつ高い阻害率を示した。
【００３３】
（実施例３：ＩＬ−８放出に対する効果）
ＥＬＩＳＡにおいて抗ＩＬ−６抗体の代わりに抗ＩＬ−８抗体を用いたこと以外は、上記実施例２と同様にして、細胞からのＩＬ−８の放出について検討した。その結果、ＩＣ５０は３９．４μＭであった。２５０μＭにおける放出の阻害率は、１００％であった。このように、アスタキサンチンモノエステルは、ＩＬ−８の放出に対して比較的低い阻害濃度かつ高い阻害率を示した。
【００３４】
（参考例１：ＨＵＶＥＣに対する５０％致死濃度の測定）
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７３０）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手し、１％Antibiotic-Antimycotic（GIBCO BRL, USA）を添加した１０％ウシ胎児血清含有Endothelial Cell Growth Medium（CELL APPLICATIONS, USA））中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃にて予備培養した。
【００３５】
Matrigelマトリックス（BD Biosciences, USA）を融解して氷上で４℃にて保持し、そして５０μＬのマトリックスを９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに移した。プレートを３７℃にて少なくとも１時間インキュベートして、マトリックス溶液を固化させた。
【００３６】
一方、上記調製例１で得たアスタキサンチンモノエステルを、ＤＭＳＯに溶解し、次いで蒸留水で希釈して、４０(v/v)％ＤＭＳＯ中に25000、2500、250、25、および2.5μＭのアスタキサンチンモノエステルを含むストック試験溶液を調製した。
【００３７】
100μＬのＨＵＶＥＣ懸濁液（約２．５×１０３細胞／ウェル）を、５％ＣＯ２雰囲気下３７℃にて９６ウェルのMatrigelプレートに入れた。２４時間後、100μＬの増殖培地および上記の各ストック試験溶液またはベヒクル（４０(v/v)％ＤＭＳＯ）２μＬずつを、各２つのウェルに添加し、さらに７２時間インキュベートした。ＤＭＳＯおよびアスタキサンチンモノエステルの最終濃度は、250、25、2.5、0.25、および0.025μＭであった。
【００３８】
インキュベーション終了後、20μＬの90％alamarBlue試薬を個々のウェルに添加し、さらに６時間インキュベートした。次いで、各ウェルの蛍光強度を、Spectrafluor Plusプレートリーダーを用いて、励起波長530nmおよび発光波長590nmにて測定し、生存細胞数を計数した。これは、生存細胞が、alamarBlueを非蛍光性の酸化型（青）から蛍光性の還元型（赤）に変化させる能力に基づく。なお、５０％致死濃度は、実験開始時の細胞数の５０％になる濃度を算出した。
【００３９】
この結果、ＨＵＶＥＣに対するアスタキサンチンモノエステルの５０％致死濃度（ＬＣ５０）は２５０μＭ（ＤＭＳＯへの最大溶解濃度）以上であり、毒性が低いことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によれば、新たなインターロイキン阻害剤が提供される。このインターロイキン阻害剤は、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−８からなる群より選択される少なくとも１つのインターロイキンが関与すると考えられる炎症性疾患、アレルギー性疾患、リウマチ、喘息、多発性骨髄腫などの種々の疾患の治療剤として用いられ得る。本発明のインターロイキン阻害剤の有効成分であるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは食経験が長く、低毒性であるため、安全性が極めて高い。したがって、医薬品として使用されるだけでなく、健康食品などとして日常的に予防的に用いられ得る。