(57)【要約】【課題】脆弱性材料から均一な微粒子を形成する方法を提供すること。【解決手段】材料の微粒子を形成するための改良方法が開発され、ここでこの方法は、この材料を溶媒に溶解して、希釈溶液を形成する工程、この希釈溶液を固定化する工程、次いでこの溶媒を除去して、この材料の粒子を得る工程を包含する。希釈溶液を固定化する方法は、凍結、ゲル化およびキレート化を含む。好ましい実施形態において、固定化された溶媒は、凍結乾燥、すなわち相転移を活性化するのに十分な熱の付与を回避しつつ、周囲圧を下げることによって除去される。本質的に任意の材料およびこの材料のための溶媒が、本明細書中に記載される方法で使用され得る。水性溶媒中のタンパク質およびペプチドは、好ましい系である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物材料の微細粒子を作製するための方法であって、以下：
（ａ）溶液中に沈殿を形成する工程であって、ここで、該溶液が、該薬物材料を含む、工程；および
（ｂ）相転移を引き起こさないないように十分に低い温度で、雰囲気圧を下げることによって、該溶媒を除去し、これによって、０．５ミクロンと１０ミクロンとの間の直径を有する該薬物材料を含む粒子を生じる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記薬物材料が、治療剤を含む、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記治療剤が、血管作用薬、神経刺激剤、ホルモン、抗凝固薬、免疫調節剤、細胞傷害薬剤、抗生物質、抗ウイルス薬、アンチセンス、抗原および抗体からなる群より選択される、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記治療剤が、インスリン、カルシトニン、ヘパリン、フェルバメート、およびホルモンからなる群より選択される、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記治療剤が、インスリンである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、一般に、微粒子、特にタンパク質およびペプチドから形成される粒子を作製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
均一な微粒子、すなわち粉末は、様々な用途（薬物送達および診断薬のような医用用途および薬学的用途を含む）において有用である。一例は、薬物を肺に送達するためのエアロゾル送達システムにおける用途である。直接送達される粒子のサイズは、薬物が所望のように肺に送達されるか否かに影響する。従って、均一な粒子の微粉を生じる処理方法は、肺の薬物送達ならびに他の用途に非常に所望される。
【０００３】
微細で均一な粒子をそれらのサイズ範囲で作製するための現在の材料処理技術は、マイクロミリング（ｍｉｃｒｏｍｉｌｌｉｎｇ）および溶媒からの沈殿を包含する。しかし、マイクロミリングは、タンパク質およびペプチドを変性し得る局所的に極度な条件（例えば、高温）を生じ得る。これらの変性は、脆弱性材料、特に薬学的用途における投与を意図された材料に受容されない。従って、溶媒からの沈殿が、脆弱性材料から微細粉末を生成するために広く使用されている。溶媒から沈殿させる方法の例には、アンチ溶媒系、および外部から変化された溶解度により生成される過飽和が挙げられる。
【０００４】
しかし、可変サイズの非晶質「クラスター」および微晶質粒子のアセンブリを可能にする、従来の溶媒からの沈殿方法の効果は、一般に、沈殿物の移動度により制限される。得られる粒子の塊は、主に過飽和と増大する核生成部位上への沈着に起因する枯渇（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）との間の間隔の間に、沈殿物の移動度により制御される。例えば、沈殿物が低い移動度を有する場合、形成された粒子は小さい質量を有し、一方、移動度が大きくなるにつれて、一般に、得られる粒子の質量は増加する。単なる溶液の希釈は十分ではない。なぜなら、希釈溶液は一般に、沈殿を生じないからである。従って、溶媒からの沈殿方法を使用して微粒子を得るために、溶媒の除去が行われる間、沈殿物の移動度を制御、すなわち制限し得ることが所望される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、脆弱性材料から均一な微粒子を形成する方法を提供することが、本発明の目的である。
【０００６】
溶媒除去方法を使用して減少した沈殿移動度を有する微粒子を形成する方法を提供することが、本発明の別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
材料の微粒子を形成するための改良された方法が開発され、ここで、この方法工程は、溶媒中で材料を溶解し、希釈溶液を形成する工程、希釈溶液を固定化する工程、次いで、溶媒を除去し、材料の粒子を得る工程を包含する。希釈溶液を固定化する方法は、凍結、ゲル化（ｇｅｌａｔｉｏｎ）およびキレート化を含む。好ましい実施形態において、固定化溶媒は、凍結乾燥（すなわち、相転移を促進するに十分な熱の適用を避けながら、雰囲気圧を減少する）によって除去される。本質的に、任意のカーゴ材料および材料のための溶媒が、本明細書中で記載される方法において使用され得る。水性溶媒におけるタンパク質およびペプチドが、好ましい系である。
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、さらに、以下を提供する。
（項目１）  微粒子を作製する方法であって、該方法が、以下：
（ａ）材料を溶媒に溶解して、希釈溶液を形成する工程；
（ｂ）該希釈溶液を固定する、工程；および
（ｃ）該溶媒を、該固定溶液から除去し、それにより該材料の微細粒子を得る工程、を包含する、方法。
（項目２）  前記微細粒子が、約０．５μｍと約１０μｍとの間の直径を有する、項目１に記載の方法。
（項目３）  前記材料が、タンパク質またはペプチドである、項目１に記載の方法。
（項目４）  前記溶媒が水性である、項目１に記載の方法。
（項目５）  前記固定化方法が、凍結、ゲル化、およびキレート化からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目６）  前記工程（ａ）の希釈溶液が、ゲル化剤またはキレート化剤をさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目７）  項目１に記載の方法であって、固定化溶液の雰囲気圧を下げることにより、相転移を促進するのに十分な量の熱を該溶液に加えることなく、前記溶媒が除去される、方法。
（項目８）  前記工程（ａ）の希釈溶液が固定化の直前に噴霧される、項目１に記載の方法。
（項目９）  項目８に記載の方法であって、前記希釈溶液が液体に直接噴霧され、該液体が前記材料について非溶媒であり、そして該液体が該希釈溶液を凍結するのに十分低い温度である、方法。
（項目１０）  前記液体が、窒素、アルゴン、酸素、ヘリウムおよび二酸化炭素からなる群から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）  項目８に記載の方法であって、前記希釈溶液が気体を含む容器中に直接噴霧され、該気体が前記材料について非溶媒であり、そして該気体が該希釈溶液を凍結するのに十分低い温度である、方法。
（項目１２）  項目１１に記載の方法であって、前記噴霧された希釈溶液が、重力の作用下で前記容器内に落ち、そして前記気体の向流と接触する、方法。
（項目１３）  微細粉末の形成のための装置であって、以下：
溶媒中に溶解した材料の溶液を噴霧するための、噴霧器；
噴霧後に該溶液を固定するための手段を備える、容器；および
該固定化溶液から該溶媒を除去するための、手段、
を備える、装置。
（項目１４）  項目１３に記載の装置であって、前記溶液を固定するための手段が、前記材料に対して非溶媒であり、該希釈溶液を凍結するのに十分な低温である流体を備える、装置。
（項目１５）  項目１４に記載の装置であって、前記容器が、カラムを備え、該カラムが、該カラムの頂端部の近くに排気器を有し、そして前記流体が、該カラムの底端部の近くに液体形態で存在し、ここで、該装置が、該液体に添加される熱の速度を制御するための手段をさらに備える、装置。
（項目１６）  項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法によって作製された微細粒子を含む、薬学的組成物。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
微粉は、粉末を形成する材料（すなわち、「カーゴ」）の希釈溶液を固定化し、次いで溶媒を除去することによって形成される。
【００１０】
本明細書中で使用されるように、「粉末」は、約５００μｍ未満の直径を有する粒子である。好ましい実施形態において、粒子は、約０．５μｍと約１０μｍとの間の直径を有し、この直径は、一般的に、有効な肺投与に必須である。用語「粉末」および「粒子」は、他に特に示されない限り、本明細書中で交換可能に使用される。
【００１１】
溶媒におけるカーゴの希釈溶液の液滴の形成、および引き続く溶媒の除去は、小さな残留生成物の粒子を残す。液滴が、除去の前に凍結される場合、カーゴの制限された移動性が、局所濃度の上昇にもかかわらず、液滴あたり複数のより小さな「生成物」粒子を残し、従って、好ましい処理技術を提供し得る。
【００１２】
（カーゴ）
カーゴは、任意の数の分子種、またはその非相互作用的組み合わせから選択され得る。好ましい実施形態において、カーゴは、治療剤または診断剤である。適切な分子種の型の例としては、合成無機化合物および合成有機化合物、タンパク質およびペプチド、多糖類および他の糖、脂質、ならびに治療活性、予防活性または診断活性を有する核酸の、核酸配列およびフラグメントが挙げられる。
【００１３】
代表的な分子種としては、血管作用薬、神経刺激剤、ホルモン、抗凝固薬、免疫調節剤、細胞傷害薬剤、抗生物質、抗ウイルス薬、アンチセンス、抗原および抗体が挙げられる。特定のカーゴの例としては、インスリン、ヘパリン、カルシトニン、フェルバメート、甲状腺ホルモンおよびそのフラグメント、成長ホルモン、エリスロポエチン、ＡＺＴ（アジドチミジン）、ｄｄＩ（ジダノシン（ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ））、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ラモトリジン、絨毛性性腺刺激ホルモン放出因子、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、βガラクトシダーゼ、アルガトロバン（ａｒｇａｔｒｏｂａｎ）、アゼラスチン（ａｚｅｌａｓｔｉｎｅ）、タウロリジン（ｔａｕｒｏｌｉｄｉｎｅ）およびグルカゴンが挙げられる。
【００１４】
タンパク質およびペプチドは、好ましいカーゴである。本明細書中で使用される場合、「タンパク質」は、１００個以上のアミノ酸残基からなり、そして「ペプチド」は、１００個未満のアミノ酸残基を有する。代表的な例としては、インスリンおよび他のホルモンが挙げられる。ヘパリンのような多糖類はまた、カーゴであり得る。
【００１５】
分子が、特に、肺を選択的に感染する因子（例えば、マイコプラズマ）、細菌の引き起こす肺炎およびＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｔｉｃｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）に対する防御免疫応答を誘発することが意図される場合、カーゴは、抗原として投与され得る。これらの場合において、アジュバントと組み合わせて薬物を投与し、抗原に対する免疫応答を増加することがまた有用であり得る。
【００１６】
カーゴはまた、所望の機能を置換するかまたは補うに有用であるか、あるいは所望の効果（例えば、腫瘍増殖の阻害）を達成するに有用である任意の遺伝子であり得るか、またはこの遺伝子を含み得る。本明細書中で使用される場合、「遺伝子」は、３０のヌクレオチドを超える長さ、好ましくは、１００のヌクレオチド以上の長さの単離された核酸分子である。機能を置換するかまたは補う遺伝子の例としては、失われた酵素（例えば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）（ＡＤＡ欠損症を処置するために、臨床試験において使用される））、ならびに補因子（例えば、インスリンおよび第ＶＩＩＩ凝固因子）をコードする遺伝子が挙げられる。調節をもたらす遺伝子はまた、単独、または特定の機能を補うかもしくは置換する遺伝子と組み合わせて投与され得る。例えば、特定のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制するタンパク質をコードする遺伝子か、逆も同様に、タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導するタンパク質をコードする遺伝子が、カーゴとして投与され得る。免疫応答の刺激に有用な遺伝子の例としては、ウイルス抗原および腫瘍抗原、ならびにサイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子）およびサイトカインのインデューサー（例えば、エンドトキシン）ならびに種々の薬理学的因子が挙げられる。
【００１７】
（カーゴ溶媒）
カーゴは、溶媒の固相の蒸気圧が、選択された処理圧力および温度で、カーゴの蒸気圧を超える限りは、本質的に任意の溶媒またはカーゴと互換性のある溶媒の組み合わせに溶解され得る。好ましい実施形態において、溶媒は、水または実質的に水溶液（好ましくは、重量で９０％の水を超える）である。溶媒は、特に、溶媒が、薬学的適用および医学的適用のために意図されるカーゴを処理するために使用される場合、溶媒の除去後、少なくとも任意の残留量において、非毒性であることが望ましい。
【００１８】
（粉末形成方法）
微粒子は、（ａ）溶媒に材料を溶解し、希釈溶液を形成する工程；（ｂ）希釈溶液を固定化する工程；および（ｃ）固定化溶液から溶媒を除去し、それによって、材料の微粒子を得る工程、から形成される。固定化方法は、好ましくは、凍結、ゲル化およびキレート化から選択される。固相溶媒の除去は、好ましくは、雰囲気圧を減少すること、および相転移を促進するに十分な熱を供給しないこと（すなわち、凍結乾燥）によって達成される。
【００１９】
（（ｉ）液体非溶媒における凍結）
好ましい方法において、カーゴ（例えば、ペプチド）の希釈水溶液は、噴霧器（ｎｅｂｕｌｌｉｚｅｒ）、超音波処理器または他の微粒化（ａｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ）デバイスからの微細な液滴の霧として噴霧される。霧は、（１）材料について非溶媒である液体、および（２）希釈溶液の凍結のために十分に低い温度である液体であって、それによって、カーゴ含量（この濃度は、希釈水溶液の初期濃度に相関する）を含む小さな「氷」ペレット（すなわち、凍結溶液）を形成する液体に分類され得る。次いで、液体（例えば、窒素）は、気化され、そして溶媒（例えば、水）は低圧で昇華され、カーゴ（例えば、ペプチド）の微粒子を得る。他の実施形態において、材料の希釈溶液は、（１）材料について非溶媒である液体、および（２）希釈溶液を凍結するに十分低い温度である液体に、直接微粒化され得る。好ましくは、液体は、窒素、アルゴン、酸素、ヘリウムおよび二酸化炭素から選択される。
【００２０】
上記プロセスの改変において、液体の浴内に落ちる液体の液滴は、温度が減少する領域を通過する。この移行領域内で、露点が降下する。なぜなら、露点は周囲温度を超え得ないからである。その結果、水性溶媒を使用する場合には、液滴の表面上の水蒸気の分圧が減少し、表面蒸発を引き起こす。蒸発は、水１グラムあたり５４０ｃａｌの熱を除去し、液滴の温度を下げる。一旦、液滴が０℃に達すると、水１グラムあたりさらに８０ｃａｌの熱の熱損失が、この液滴を凍結させて、「氷球」にする。この凍結プロセスは、液滴の大きさが小さいことに起因して、氷の中程度の熱伝導性にもかかわらず、迅速に起こる。この氷球の温度は、液体窒素環境内で減少し続け、対応して露点および水蒸気の分圧が低下する。この氷球の表面は昇華し、水１グラムあたり６２０ｃａｌの熱を除去し、これによってコアを収縮させる温度を低下させ、そして蒸発している表面上のカーゴ分子の濃度を増加させる。これらの分子の表面移動度が、最終製品の粒子サイズを制御する。例えば、移動度が低いほど、より小さな成長が生じ得、そして得られる粒子はより小さい。昇華プロセスはまた、動的成分を有し得、これは、表面移動度を妨害する。すなわち、迅速な表面アブレーションが表面においてジェットを生じ得、これは、粒子の運動を妨害し得る。氷球が収縮するにつれて、より濃縮されたカーゴシェルが発達する。核形成部位間の競合が、最終製品の粒子形態およびサイズ分布を決定する。従って、もとの溶液の希釈が大きいほど、一般に、より小さな粒子を生じる。
【００２１】
（（ｉｉ）真空および／または乾燥気体中での凍結）
別の実施形態において、最初の希釈溶液は、真空チャンバまたは低圧チャンバ内に直接スプレーされる。この圧力は、凍結／昇華プロフィール全体にわたって、カーゴの蒸気圧より高くなければならず（カーゴが蒸発することを防止するため）、かつ溶媒の三重点圧力より低くなければならない（液相移動度がカーゴの分離を補助することを防止するため）。発生する液滴は、表面で沸騰する。例えば、水の質量の約２０％を除去する。次いで、温度が外部蒸気圧（すなわち、分圧）における露点における終端温度に近付くにつれて、この液滴は、冷却、凍結、および昇華する。比較的遅いアブレーション速度にもかかわらず、この凍結乾燥サイクルの部分は、球状物形成により提供される。
【００２２】
別の実施形態において、最初の希釈溶液は、超乾燥ガス（好ましくは、アルゴン）内に、直接スプレーされる。溶媒の除去（プロセスチャンバの外へ）によって露点を十分に低く維持することにより、次いで、沸騰、凍結、および昇華が、減圧下で進行する。アルゴンは、さらなる空力学的抵抗力を有利に提供し、この抵抗力は、液滴／球状物が噴霧器からチャンバを通って落下する速度を制限する。任意の外部赤外線ヒーターを、透明なスプレーチャンバ壁と共に使用して、溶媒を融解することなく粉末溶媒を昇華させるために必要なエネルギーを、伝達し得る。従って、凍結乾燥は、形成と組み合わせられ得る。
【００２３】
（（ｉｉｉ）制御された向流気体ストリームを用いる反応器）
上記超乾燥アルゴンシステムの改変において、冷窒素反応器が代わりに使用される。例えば、窒素反応器は、高いカラムの形態であり、底部に液体窒素を、底部の近くに液体窒素充填ポートを、そして頂部の近くに排気器および噴霧器を有する。冷たい高密度の窒素は、液体窒素表面上に滞留する。次いで、制御された割合で熱が窒素に加えられて、温度を上昇させることなく（液体窒素は大気圧近くではその沸点の近くにあるので）この窒素の一部を蒸発させる。蒸発した窒素は、ある速度でこのカラムから「染み出し」（すなわち、排気され）、このカラムの圧力を維持する。この方法において、熱を加える割合は、重要な操作パラメーターである。例えば、多すぎる熱は、冷窒素がカラムの上まで流れる速度を増加させることにより、実際に温度を低下させる。反応器内に噴霧される希釈カーゴ溶液の液滴は、上記表面蒸発、凍結、昇華、および冷却サイクルにより、進行する。液滴／球状物は、噴霧器からカラムを通って、その重量対抵抗力比に依存する終端速度で、落下する。表面アブレーションを加速するために外部赤外線ヒーターが使用される場合には、液滴／球状物がカラムを通って落下するにつれて、液滴／球状物のサイズはさらに減少し、そして終端速度もまた、その結果として、減少する。換言すれば、液滴／球状物は、蒸発に起因して、その降下の間に減速する。従って、窒素がカラムの上まで流れる速度は、上昇する窒素ストリームと共にカラムの外に掃き出されることを回避するために、最小の所望の製品粒子の空力学的終端速度より低くなければならない。このプロセスを制御するための１つの手段は、レーザー後方散乱モニターを使用することであり、これを使用して、液体窒素の加熱速度を制御することにより、粒子の落下速度を制御し得る。液体窒素は、蒸発プロセスの間に、連続的にかまたは断続的に追加されて、比較的一定のカラムプロフィールを維持し得る。製品は、溶液の噴霧の終止後に残った窒素の蒸発に続いて、カラムの底部から収集され得る。
【００２４】
（（ｉｖ）ゲル化およびキレート化）
微粉末は、固定化技術としての凍結よりむしろ、ゲル化またはキレート化を使用して、標準的なゲル化剤またはキレート化系を用いて、形成され得る。ゲル化剤の代表的な例としては、ゼラチン、アルギネート、アガロース、およびカルボキシメチルセルロースのような、ゲル型ポリマーが挙げられる。代表的なキレート化系としては、金属イオン（例えば、塩化カルシウムの溶液）と組み合わせたアルギネートまたはアルゲン酸（ａｌｌｇｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）が挙げられる。
【００２５】
１つの実施形態において、カーゴ材料とゲル化剤との溶液（例えば、インスリンとゼラチンとの溶液）が、液滴サイズを制御する標準的なデバイスおよび技術を使用して、噴霧される。次いで、液滴が、例えばポリマーを架橋させる任意の手段（例えば、十分な強度および波長の光、または他の電磁エネルギーへの曝露）により、ゲル化される。次いで、この（ゲル化された）微粒子は、溶媒のいくらかまたは全てを除去するために、乾燥され得る。
【００２６】
別の実施形態において、カーゴ材料とキレート化剤との溶液（例えば、インスリンとアルギニン酸との水溶液）が、塩化カルシウムの溶液中に直接噴霧されて、キレート化粒子を形成する。次いで、このキレート化された粒子は、塩化カルシウム溶液から分離され、そして必要に応じて乾燥される。
【００２７】
（微粉末の適用）
本明細書中に記載されるように作製される微粉末は、種々の適用において有用であり、特に、タンパク質およびペプチドのような脆弱な材料の均一な小粒子を必要とする、薬学的および医学的適用において、有用である。１つの実施形態において、微粉末は、薬物または診断薬剤を呼吸器系（特に、肺）に送達するための、エアロゾル送達システムに含まれる。エアロゾル送達システムは、例えば、Ｐａｔｔｏｎに対する米国特許第５，７７５，３２０号および同第５，９９７，８４８号に記載される。
【００２８】
別の実施形態において、微粉末は、経口送達システムに含まれ、例えば、ここで、微粉末は、当該分野において公知の標準的な技術を使用して、錠剤に形成されるか、あるいはゼラチンまたはデンプンのカプセル内にカプセル化される。予防薬剤、診断薬剤、または治療薬剤の微粉末もまた、他の経路による投与のための処方物に、組み込まれ得る。
【００２９】
本発明の変更および改変は、上記詳細な説明から当業者に明らかである。このような変更および改変は、上記の特許請求の範囲の範囲内に入ることが、意図される。