(57)【要約】【課題】  口腔癌細胞を高精度に検出することができ、また口腔癌の診断における早期発見、或いは前癌病変と早期癌との区別が可能となる方法を提供する。【解決手段】  検体中の検体染色体全体或いはその一部のＤＮＡのコピー数を測定することで口腔癌細胞またはその前癌病変細胞をスクリーニングする方法であって、前記コピー数を測定する染色体領域が、明細書中表１記載の２２種の常染色体領域の少なくともひとつを含むことを特徴とする細胞のスクリーニング方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体染色体全体或いはその一部のＤＮＡのコピー数を測定することで口腔癌細胞またはその前癌病変細胞をスクリーニングする方法であって、前記コピー数を測定する染色体領域が明細書中表１記載の２２種の常染色体領域の少なくともひとつを含むことを特徴とする細胞のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記測定したコピー数と、健常人の染色体ＤＮＡコピー数とを比較することで細胞のスクリーニングを行なう請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記染色体領域が、明細書中表２記載の７種の染色体領域の少なくともひとつであることを特徴とする請求項１記載の口腔癌細胞のスクリーニング方法。
【請求項４】
染色体８番長腕２２−２３部位のコピー数の増大を検出することを特徴とする請求項３記載の口腔癌細胞のスクリーニング方法。
【請求項５】
染色体ＤＮＡのコピー数を測定し、健常人より染色体３番短腕１４−２１部位のコピー数が減少していることを検出することを特徴とする口腔癌細胞の検出方法。
【請求項６】
染色体ＤＮＡのコピー数を測定し、健常人より染色体５番短腕１２−２２部位のコピー数が減少していることを検出することを特徴とする口腔癌細胞検出方法。
【請求項７】
請求項１〜６記載の染色体のクローンが基板上に固定されているアレイデバイス。
【請求項８】
前記基板上に固定されたクローンに健常人の標識ＤＮＡがハイブリダイゼーション反応によって結合されている請求項７に記載のアレイデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、早期口腔癌のスクリーニング方法に関する。また、前癌状態の細胞（前癌病変細胞）と口腔癌細胞とを区別し、早期口腔癌細胞を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
口腔領域の癌は地球上で６番目に多いと推定されており、特にアジアの一部の地域でその頻度が高いとされている。口腔癌は左右頬の奥の上顎洞癌、口の中の舌癌、鼻やのどの奥の上咽頭癌、声帯周辺の喉頭癌等、非常にポピュラーな癌であるにもかかわらず、予後が悪く再発率の高い癌で、死に到るケースも多い。その原因のひとつは早期発見が困難なことが挙げられ、かなり進行するまで自覚症状が少なく、鼻や耳の症状や舌の痛みが始まり確定診断が行なわれる頃には、すでに転移や浸潤などを起こして切除不可能な場合も少なくない。このため、早期発見が強く求められている。また、当該癌の悪性度を知ることが、効果的治療を施す上からも重要である。
【０００３】
診断方法として用いられている方法は、対象部位に関して病理学的な方法によるものであり、染色した組織を顕微鏡下で観察し、経験豊富な病理専門医により診断される。
【０００４】
しかし、口腔癌における病理学的手法による診断は、生検サンプルの質により検出が困難な場合があるばかりではなく、医療担当者の診断能力、経験の差、或いは顕微鏡等の検査装置の性能による差が大きく、早期発見が困難であるという問題があった。
【０００５】
腫瘍マーカーによる方法においても、口腔癌の場合、通常用いられる腫瘍マーカーＥＧＦＲ及びＨｅｒ２の発現の度合いと口腔癌の進行度の関連性は薄く、癌を予知するための遺伝子マーカーは全くないのが現状であり、腫瘍マーカーによる検出、予知ならびに早期診断は不可能である。
【０００６】
上記課題に対して、癌の診断に染色体ＤＮＡのコピー数異常を指標とする方法が提案されている。染色体ＤＮＡのコピー数の増減を検出する方法として、ＣＧＨ法が知られている（例えば、特許文献１参照）。この方法は、ＤＮＡを抽出後、直接蛍光標識したＤＮＡプローブを用いて、標識正常ＤＮＡと競合的に、正常な分裂中期染色体上にｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行い、その結果をＣＣＤカメラにて画像取り込みを行い、腫瘍／正常の蛍光強度比を測定するものである。腫瘍細胞、正常細胞はそれぞれ別の色素による標識がなされており、もし、腫瘍細胞と正常細胞が等量であれば、その比は１となる（或いは常に一定の値となる）。その比が高い染色体領域では、腫瘍細胞でコピー数の増加、つまり、染色体領域の増幅が、比が低い領域ではコピー数の減少、つまり、染色体領域の欠失があると判断される。
【０００７】
生検（術前の病理学的検査）検体のＤＮＡコピー数異常解析をめざしてドイツのＷｅｂｅｒらは、小さい検体やパラフィン包埋材料のＣＧＨに取り組み、症例数は多くないが、同一患者の病変について浸潤癌部、上皮内癌部、及び異形成上皮部からマイクロダイセクション法で腫瘍細胞を純度高く集め精度の高いデータを報告している。
【０００８】
口腔癌についても、いくつかの症例及び細胞株を用いた検討がなされている（例えば、非特許文献１）が、いくつかの共通性の高い領域の指摘はあるものの諸家一致している状況ではなく、多数の症例を癌の進行度との関連で分析している例はない。従って、スクリーニングに必要な染色体領域の特定及び前癌病変と癌とを区別可能な染色体領域に関する開示もない。
【特許文献１】特表平０７−５０５０５３号公報
【非特許文献１】医学書院『応用サイトメトリー』  天神美夫監修
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記に示したように、癌診断のためにＤＮＡコピー数異常を解析しようとする試みはなされてはいるが、口腔癌細胞においてＤＮＡコピー数異常が発生する染色体領域が未だ解明されておらず、早期診断のための解決法は未だに見出されていなかった。また、現状悪性度評価は治療前にはほとんど不可能であった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、口腔癌患者と健常人の染色体ＤＮＡについて、上記ＣＧＨ法による解析を行い、口腔癌と高い関連性を有する染色体ＤＮＡの増減が見られる領域を抽出することに成功した。そして、サンプル検体中における染色体ＤＮＡの量を健常人と比較することにより、高精度に口腔癌患者を見分けることができることを見出した。また、これらの領域におけるＤＮＡコピー数の増減と患者組織の病理解析結果とを相関解析し、癌の進行度やリンパ節転移能と関連の深い染色体ＤＮＡのコピー数の増減を元に癌の進行度を予知する方法を考案した。
【００１１】
すなわち本発明は、口腔癌患者で特異的な染色体ＤＮＡのコピー数の増減を元に、早期発見のために有効な染色体領域、或いは前癌病変と早期癌を区別するために有効な染色体領域、さらには悪性度評価及び抗癌開発・化学予防のターゲットとして有効な染色体領域を提示し、これを用いて口腔癌細胞またはその前癌病変細胞をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。また、口腔癌細胞またはその前癌病変細胞の検出に有効な染色体領域のクローンが基板上に固定されたＤＮＡアレイを提供する。
【００１２】
すなわち、本発明に係る細胞のスクリーニング方法は、検体染色体全体或いはその一部のＤＮＡのコピー数を測定することで口腔癌細胞またはその前癌病変細胞をスクリーニングする方法であって、前記コピー数を測定する染色体領域が、明細書中表１記載の２２種の常染色体領域の少なくともひとつを含むことを特徴とする。
【００１３】
測定したコピー数と、健常人の染色体ＤＮＡコピー数とを比較することで細胞のスクリーニングを行なうことが好ましい。
【００１４】
染色体領域が、表２記載の７種の染色体領域の少なくともひとつであると更に好ましい。
【００１５】
染色体８番長腕２２−２３部位のコピー数の増大を検出することが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、口腔癌細胞の検出方法をも提供する。
【００１７】
すなわち、本発明に係る口腔癌細胞の第一の検出方法は、染色体ＤＮＡのコピー数を測定し、健常人より染色体３番短腕１４−２１部位のコピー数が減少していることを検出することを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係る口腔癌細胞の第二の検出方法は、染色体ＤＮＡのコピー数を測定し、健常人より染色体５番短腕１２−２２部位のコピー数が減少していることを検出することを特徴とする。
【００１９】
そして、本発明は、上述の染色体のクローンが基板上に固定されたアレイデバイスをも提供する。
【００２０】
基板上に固定されたクローンに健常人の標識ＤＮＡがハイブリダイゼーション反応によって結合されていると好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、口腔癌細胞を高精度に検出することができ、また口腔癌の診断における早期発見、或いは前癌病変と早期癌との区別が可能となる。さらには悪性度評価に有効な方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明について詳しく説明するが、いずれの記述も本発明内容を好適に実施する為の一例であり、本発明による他の実施形態を制限するものではない。
【００２３】
（１）口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ＝ｏｒａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）と異形成上皮（ＤＹＳ＝ｄｙｓｐｌａｓｉａ）におけるＤＮＡコピー数異常部位
口腔癌患者３５名について、癌組織及び隣接する前癌病変異形成部位をバイオプシーにより採取した。癌患者の内訳は、１３名が軽度、１１名が中等度、１１名が重度であり、４８歳から９１歳までの男性１８名、女性１７名である。検体は全てインフォームドコンセントを取得後、検討に用いられた。
【００２４】
これらのサンプルから抽出したＤＮＡについて、癌由来のＤＮＡはニックトランスレーション法によりＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ−ｄＵＴＰ  （Ｖｙｓｉｓ社製）で標識し、リンパ球から抽出した健常人のＤＮＡはＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ−ｄＵＴＰ（Ｖｙｓｉｓ社製）で標識して、染色体ＤＮＡの増減をＣＧＨ法により比較した。関連性を有する染色体領域は図１に示す。図中のＰは相関関数を示す。検体染色体全体或いはその一部のＤＮＡのコピー数が健常人のコピー数に対して１．２以上の比率の時に増幅、０．８以下の場合に欠失とし、染色体地図上にマップした。染色体の右側がＤＮＡのコピー数の増幅箇所で、左側が欠失部位である。また、実線が口腔癌で破線が前癌病変部位のものである。その中で、コピー数変化の顕著な染色体領域を、組織病理学的にみた前癌病変の悪性度によって分類したのが表１である。染色体領域の２２箇所でＤＮＡコピー数が健常人に比べて増加、或いは減少している。
【００２５】
前癌病変の軽度な状態では、表１における２２染色体領域のうちの２１領域で、ＤＮＡコピー数はほとんど健常人とは変わらない。それらが、病変組織の悪化に伴って、コピー数の変動が発生し、口腔癌になると、それぞれの領域で、検体総数の３０％から８０％の検体が増大・或いは減少を示す。
【００２６】
従って、表１記載の２２の部位を指標にすることにより、口腔癌をスクリーニングすることが可能である。２２部位のうち、口腔癌患者の半数以上でコピー数の異常が観察される部位７箇所（表２）がさらに確度の高いスクリーニングに用い得る。
【００２７】
図１からわかるように、８番染色体長腕のコピー数の増加がほとんどの検体で観察される。実際、表１で示すように８番染色体長腕２２−２３部位のコピー数は、前癌病変の軽度な場合でも約半数で増大が見られる。さらに増幅部位を詳細に調べると（図２）、８ｑ２２部位で口腔癌及び前癌病変に共通にコピー数の増大が見られる。つまり、上記染色体８ｑ２２−ｑ２３部位は、軽度のサンプルで４６％、中等度で９０％以上、重度で８０％以上でコピー数の増大が観察されている。
【００２８】
従って、この部位のコピー数に注目し、８ｑ２２部位のコピー数が健常人より増加していることを検出することで、口腔癌患者、或いは、なりやすい人（前癌病変の人）を簡便にスクリーニングすることができるといえる。
【００２９】
次に、表１によると、軽度から中等度への移行には、３ｑ２６−ｑｔｅｒ、５ｐ１５、８ｑ１１−ｑ２１、８ｑ２４．１−ｑｔｅｒで増幅がみられ、１８ｑ２２−ｑｔｅｒではコピー数の減少が見られる。
【００３０】
中等度から重度への移行では１１ｑ１３、１４ｑ、１７ｑ１１−２２、２０ｑで増幅が見られ、一方、９ｐでは欠損が観察される。
【００３１】
表１に示す他の染色体領域２２箇所も、さらに口腔癌のスクリーニングに効果的な染色体領域として、スクリーニングに利用可能である。
【００３２】
前癌病変組織と口腔癌として診断された組織を比較すると、３ｐ１４−２１及び５ｑ１２−２２での欠損が顕著である。これらの染色体領域のＤＮＡコピー数変動を調べることにより、前癌状態から口腔癌への移行を診断可能である。
【００３３】
また、表１の染色体領域２２箇所はコピー数が異常な染色体領域と特定されることから、その領域をさらに詳細に検討して遺伝子を特定することで、その遺伝子の増幅・欠失を抑制する抗癌剤の開発に貢献できる。
【００３４】
すなわち、抗癌剤開発・化学予防においてのターゲットとして有効な染色体領域であることがわかる。
【００３５】
【表１】
2006094760.tif 000002
【００３６】
【表２】
2006094760.tif 000003
【００３７】
（２）ＣＧＨ法
染色体ＤＮＡのコピー数の増減を検出する方法として知られているＣＧＨ法は、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎの略で、腫瘍ＤＮＡ中の遺伝子コピー数の増加ないし欠失を、１回のハイブリダイゼーションで同時に検出し、しかもそれらの領域を全ての染色体上にマッピングできる優れた方法である（Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：８１８−８２１，１９９２）。
【００３８】
本発明では、上記ＣＧＨ法を元に染色体上でＤＮＡコピー数の増減を調べ、（１）で記載した染色体領域に着目して、その増減により、口腔癌をスクリーニングする方法、或いは口腔癌の診断に供せられる口腔癌細胞の検出方法を提供する。
【００３９】
（３）クローンチップ
本発明では、染色体ＤＮＡの増減をより簡便に検出するために、（１）で示した染色体領域を網羅するバッククローン等の遺伝子を基板上に固定した、いわゆるＤＮＡマイクロアレイを用いた検出をも提供する。
【００４０】
つまり、定法により調整されたヒトゲノム全領域のバッククローンライブラリーの中から、上記口腔癌のスクリーニングに必要な染色体領域を含むバッククローンを選び出す。これらのバッククローンは各領域に対して１クローンでも良いし、複数でも良い。
【００４１】
固定される担体は、ガラス基板のような平板でも良いし、ビーズ等でも可能であるが、各バッククローンとの対応が明確になるよう、例えば基板上のアドレスとの対応が必要である。
【００４２】
ガラス基板上に固定されたマイクロアレイを元に説明するが、発明の形態はこれに限られるものではない。
【００４３】
ガラス基板は、あらかじめシランカップリング剤処理、クロスリンケージに必要な処理等を行い、バッククローンが固定可能であるよう準備する。これらの処理を施されたガラス基板に、バッククローンの各溶液を、ピン法或いはインクジェット法によりスポットし、基板表面と反応させ固定する。この時、インクジェット法を用いる方法は、各スポットに含まれるバッククローンの量を均一にすることができるため、より好ましい。通常はＣＧＨ法では、サンプルゲノムと健常人ゲノムの競合的な反応を利用するため、スポット量のばらつきは問題にならないように設定されている。しかし、もし、バッククローンの量を均一にコントロールできる場合には、評価結果の再現性が期待でき、口腔癌と健常人とでコピー数が同じである染色体領域のバッククローンを内部標準とすることにより、それとの比を求めることにより、サンプルのみでの評価が可能となる。また、健常人との競合反応をより簡便にするために、健常人のゲノムＤＮＡを、サンプルとは異なる標識を施して、あらかじめマイクロアレイ上に結合させておいても良い。
【００４４】
本発明のプローブはバッククローンに限るものではなく、同等の性能を出せるものであれば、合成オリゴヌクレオチドをプローブとして使用することも可能である。
【００４５】
（４）染色体ＤＮＡコピー数の評価
染色体ＤＮＡコピー数の増大・減少は、健常人のコピー数とサンプルのコピー数の比率を元に判断する方法が挙げられる。つまり、マイクロダイセクションにより得られたサンプルを緑色蛍光で標識し、健常人を赤色で標識した場合、もしコピー数が等量（正常）であれば、得られる蛍光は二種類の蛍光の中間色、つまり黄色蛍光となる。しかし、サンプルでの染色体の増幅が見られる場合には、蛍光は緑色が多くなるため、評価結果は緑に傾く。一方、その逆に、サンプルに欠損がある場合には、両者の蛍光の和は赤色となる。
【００４６】
健常人との比率は、βアクチン等の標準物質で１となるように補正し、それを元に各染色体領域でのＤＮＡコピー数を判断する。Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションにおいては、サンプル／健常人の比が１．２以上が増幅、０．８以下が欠損の目安とし、各染色体領域のコピー数の増減を判断する。ただし、本発明はこの数値に限定されるものではなく、バッククローンのマイクロアレイの場合には、その製造方法に合わせて最適化する必要がある。
【００４７】
また、より正確な精度で計測が可能である場合、サンプル細胞中の異なる染色体領域同士のコピー数の相対比によって判定してもよい。
【００４８】
以下に実施例を用いて、より詳細に本発明を説明する。
【実施例１】
【００４９】
ＣＧＨ法による細胞のスクリーニング
１．ＤＮＡ抽出
ＣＧＨにおける異常の検出感度を最大限に引き出すために、サンプルはマイクロダイセクション法を用いた癌細胞を選択的に採取した。
【００５０】
具体的には、バイオプシー検体は‐８０℃にて保管され、９μｍ厚の組織切片を作成後、メチルグリーン染色、或いはヘマトキシリン−エオシン染色後、レーザーキャプチャーダイセクションにより１５μｍのスポットとして回収し、ＳｅｐａＧｅｎｅキット（三光純薬）でＤＮＡ抽出を行なった。
【００５１】
２．ＤＯＰ−ＰＣＲ
ユニバーサルプライマー６−ＭＷ（５’−ＣＣＧＡＣＴＣＧＡＧＮＮＮＮＮＮＡＴＧＴＧＧ−３’）を用いてＤＯＰ（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｐｒｉｍｅｄ）−ＰＣＲを行なった。
【００５２】
より具体的に説明すると、マイクロダイセクションにより得られたＤＮＡ１μｌに４μｌのシーケナーゼ緩衝液を加え、１Ｕのトポイソメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、商品名Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を加えて３７℃で３０分加温した。次に、その溶液を２０Ｕのサーモシーケナーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製、商品名Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）で９４℃１分間、３０℃２分間、３７℃２分間を５サイクル行なった。９５℃で１０分間加熱後、４５μｌのＰＣＲ溶液に２．５Ｕ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製，商品名Ｓｉｇａ）を加えて、９４℃１分、５６度１分、７２℃３分のＰＣＲサイクルを３５回行った。リンパ球から得られたコントロールＤＮＡ（正常ＤＮＡ）についても同様にＤＯＰ−ＰＣＲを行なった。
【００５３】
３．ニックトランスレーションによるＤＮＡの標識
ＣＧＨ  Ｎｉｃｋ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｖｙｓｉｓ社製）を用いて、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｇｒｅｅｎ，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｒｅｄでそれぞれ、癌ＤＮＡ、正常ＤＮＡを標識した。
【００５４】
４．ＣＧＨ法
４−１．プローブの単鎖化処理
１）プローブの作製
Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｔ−１ＤＮＡ                            １０μｌ
健常者リンパ球ＤＮＡ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｒｅｄ  標識）  １０μｌ
腫瘍ＤＮＡ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｇｒｅｅｎ標識）          ２０μｌ
３Ｍ酢酸ナトリウム                                      ４０μｌ
１００％エタノール                                    １１０μｌ
上記試薬を上から順番に加え、遮光しながら非常によく転倒混和し、−８０℃に最低２０分間入れた後、１４０００ｒｐｍ、４℃、３０分間遠心した。
【００５５】
２）上清を捨て、残った水分を吸い取り、遮光しながらよく乾かした（一時間程度）。
【００５６】
３）マスターミックス（デキストラン  サルフェート  １ｇ、２０ｘＳＳＣ  １ｍｌ、ホルムアミド  ５ｍｌ）を１０μｌ加え、泡立てないように良くピペッティングし、管壁についた水分を遠心して落として、３７℃の恒温槽につけておいた。
【００５７】
４−２．染色体標本の単鎖化処理
１）染色体標本（スライドガラス）を７０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣにて７２℃２５分間単鎖化処理を行なった。
２）７０、８５、１００％エタノールにて２分間ずつ脱水した。
【００５８】
４−３．ハイブリダイゼーション反応
１）４−２で作製した染色体標本のスライドガラスに、４−１で作成したプローブミックス１０μｌを載せ、１８ｍｍＸ１８ｍｍのカバーガラスをかけて１０分間３７℃のホットプレート上に置き、その後３７℃のＣＯ２インキュベーターにて３〜４晩ハイブリダイゼーション反応を行なった。
２）５０％フォルムアミド／２ｘＳＳＣにて４５℃、７分間洗浄する。これをさらに２回繰り返した。
３）２ｘＳＳＣにて４５℃７分間洗浄した。その後ＰＮ緩衝液にて室温５分間、蒸留水にて室温で洗浄・乾燥を行なった。
４）０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌＤＡＰＩ‐ＩＩを８μｌかけ、カバーグラスで封入して観察した。
【００５９】
４−４．検出
１）ＣＣＤカメラ付きオリンパスＢＸ６５０蛍光顕微鏡でイメージ画像を得、デジタルイメージングアナリシスシステム（ＱＵＩＰＳＴＭＸＬ、Ｖｙｓｉｓ社製）を用いて解析した。
２）癌と正常のＤＮＡコピー数を比較し、その比が１．２以上の時には増幅、０．８以下の場合には欠損と判断した。比が１．４を超えるものについてはコピー数が特に高く増大しているものとした。
【００６０】
４−５．解析
１）これらのコピー数の変化について、癌患者の癌の進行度との相関解析を行い、関与する遺伝子を特定した。
２）４−４の指標に従い、コピー数の増幅・欠損が見られた染色体領域を図１及び表１に示す。
【実施例２】
【００６１】
バッククローンマイクロアレイの作製
スライドガラスを洗浄し、アミノシランカップリング剤処理を定法に従って行なった。
【００６２】
また、定法により作成したバッククローンライブラリーの中から、実施例１で得られた解析結果（表１）を元に、口腔癌のスクリーニングに有効である染色体領域に対応するクローンを選び出した。これらのクローン溶液を９６穴マイクロタイタープレートに注入し、ＤＮＡマイクロアレイ作製装置によりスライドガラス上にスポットした。室温に放置し固定化反応を行なった後、実施例１と同様に、健常人とサンプルの双方を異なる蛍光色素で標識し、競合的にハイブリダイゼーション反応を行なうことにより、検体ＤＮＡのコピー数と健常人のＤＮＡとの比を求めた。その比が１．２以上の時には増幅、０．８以下の場合には欠損と判断すると、得られた結果は、実施例１とほぼ同様であった。
【実施例３】
【００６３】
健常人ＤＮＡがあらかじめ固定されたバッククローンマイクロアレイの作製
実施例２と同様にバッククローンマイクロアレイを作製し、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｒｅｄ  で標識された健常人リンパ球ＤＮＡをハイブリダイゼーションにより固定した。
【００６４】
健常人ＤＮＡがバッククローンに結合したマイクロアレイに、サンプルＤＮＡをＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｇｒｅｅｎで標識してハイブリダイゼーション反応を行なった。
【００６５】
最初に結合していた健常人ＤＮＡの赤色の蛍光は、サンプルＤＮＡ由来の緑色蛍光に置換され、両者の比率は実施例２と同様な結果を示した。
【実施例４】
【００６６】
バッククローンのコピー数が同数になるよう各バッククローンの濃度を調整し、実施例２と同様にマイクロアレイを作成した。その後、標識したサンプルを反応させ解析を行なった。この際、健常人検体は反応させず、競合的なハイブリダイゼーション反応は行なわない。
【００６７】
口腔がん患者５サンプルについて実験を行い、その蛍光量を比較したところ、染色体１番の短腕部、染色体１１番長腕部のクローンに、５サンプルでほぼ同じ値を示す領域を観測した。これらの領域は図１において、増幅も欠失も見られない領域（例えば染色体１番の短腕部、染色体１１番長腕部）に対応する。これらの蛍光量をコントロールとして、単位長さ辺りの蛍光量を指標として算出し、それに対する各染色体領域の蛍光量比を算出し、増幅、欠失を判定した。
【００６８】
その結果、全てのサンプルにおいて、８番長腕２２−２３部位でコピー数の増大を検出することができた。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】口腔扁平上皮癌と異形成上皮におけるＤＮＡコピー数異常部位を示す図である。
【図２】８ｑ２２部位で口腔癌及び前癌病変にコピー数の増大を示す図である。
【図１】
2006094760.tif 000004
【図２】
2006094760.tif 000005