(57)【要約】【課題】  ＤＮＡのアレイ化が不要で、低コストのタンパク質の定量分析技術を提供する。【解決手段】  流路中の基体に、標的タンパク質を特異的に捕捉するための、基体に結合した第一の結合部と、第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と、標的タンパク質に特異的に会合し、情報伝達部が結合した第二の結合部とを有する構造体を結合し、外部から、流路中に、情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとｄＮＴＰとＤＮＡ複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、情報伝達部との相補作用による２本鎖ＤＮＡを生成し、その２本鎖ＤＮＡを増幅し、検出することにより、タンパク質を定量分析する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路中に、
基体と、
標的タンパク質を特異的に捕捉するための、当該基体に結合した第一の結合部と、
当該第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、
当該標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と、
当該標的タンパク質に特異的に会合し、当該情報伝達部と結合した第二の結合部と
を有する２本鎖ＤＮＡ生成セクションと、
生成した２本鎖ＤＮＡを増幅するための２本鎖ＤＮＡ増幅セクションと、
増幅した２本鎖ＤＮＡを検出するための２本鎖ＤＮＡ検出セクションと
を有するタンパク質検出デバイス。
【請求項２】
外部から、前記流路中に、前記情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとｄＮＴＰとＤＮＡ複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、前記情報伝達部との相補作用により２本鎖ＤＮＡを生成し、かつ当該２本鎖ＤＮＡを増幅することのできる、請求項１に記載のタンパク質検出デバイス。
【請求項３】
前記２本鎖ＤＮＡ増幅セクションが加熱可能である、請求項１または２に記載のタンパク質検出デバイス。
【請求項４】
前記２本鎖ＤＮＡ検出セクションが、前記タンパク質信号増幅体を流路に投入開始した時から検出を開始するまでの時間により、前記標的タンパク質を定量分析できる、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
【請求項５】
前記第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が抗体を含んでなる、請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
【請求項６】
前記第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が、前記基体、標的タンパク質および情報伝達部からなる群から選ばれた少なくとも一つと、アビジン−ビオチン結合、オリゴヒスチジン−金属錯体結合またはｈＡＧＴとアルキルグアニン誘導体によって生じる結合で結合している、請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
【請求項７】
前記情報伝達部が核酸である、請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
【請求項８】
前記タンパク質信号増幅体が、２本鎖ＤＮＡに対する特異的蛍光発光インタカレータを含む、請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
【請求項９】
前記２本鎖ＤＮＡ検出セクションが蛍光を検出する能力を有する、請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
【請求項１０】
流路中の基体に、
標的タンパク質を特異的に捕捉するための、当該基体に結合した第一の結合部と、
当該第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、
当該標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と
当該標的タンパク質に特異的に会合し、当該情報伝達部と結合した第二の結合部と
を有する構造体を結合し、
外部から、当該流路中に、当該情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとｄＮＴＰとＤＮＡ複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、当該情報伝達部との相補作用による２本鎖ＤＮＡを生成し、
当該２本鎖ＤＮＡを増幅し、検出する
タンパク質の定量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の定量分析技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
１９９０年代に入って進められてきたヒトゲノム計画は、各国が分担してヒトの遺伝暗号をすべて解読しようとする試みであり、２０００年夏にドラフト版が完成したことが公表された。今後、機能ゲノム科学や構造ゲノム科学の進展によって、解読されたヒトゲノム配列情報の各々の箇所がどのような機能に係わっているかが明らかにされていくものと予想される。
【０００３】
このヒトゲノム計画は、ライフサイエンスに関わりを持つ科学技術並びに産業に対して、大きなパラダイムの変化をもたらした。たとえば糖尿病は、血糖値が高くなるという病状に基づいて分類が行われ、発症の原因としては患者の体内でインシュリン産生能がどの程度あるかに基づいてＩ型（体内でインシュリンを産生できない）、ＩＩ型（体内でインシュリン量の調整ができない）のような分類が行われてきた。
【０００４】
ヒトゲノム計画は、血糖とインシュリンの検出、合成、分解などの調整に係わっている酵素やレセプターなどのタンパク質のアミノ酸配列構造、ならびにそのようなタンパク質の存在量の制御に係わっている遺伝子のＤＮＡ配列の情報をすべて我々に提示している。
【０００５】
このような情報を使うと、血糖値の調整が正常に行われないという現象としての糖尿病は、血糖とインシュリンの検出、合成、分解などの一連の処理に係わるそれぞれのタンパク質のどれが不調なのかによって、サブタイプに分類でき、それによって適切な診断と治療を行うことが可能になるはずである。
【０００６】
特に、ヒトゲノム配列に基づいて特定のタンパク質に対する薬剤を開発するゲノム創薬が精力的に進められており、このような一連の機能的にかかわりのあるタンパク質の状態を把握してゲノム創薬薬剤を投与し、症状の緩和や治癒を行う時代がくると予想される。
【０００７】
しかし、このような一連の機能的に関わりのあるタンパク質の存在量を簡便に測定できる技術は、プロテオーム解析技術として発展途上にある。現在確立されている方法として、二次元電気泳動と質量分析機の組み合わせで測定が行われているが、これには比較的大がかりな装置が必要になる。従って、臨床の現場、たとえば病院の検査室やベッドサイドで患者の症状を把握するためにはあらたな技術の開発が必要とされている。
【０００８】
いわゆるＤＮＡチップにおいては、測定対象であるＤＮＡをあらかじめＰＣＲ反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって増幅（増量）する際に蛍光色素を導入し、アレイ状に配した相補ＤＮＡ鎖と結合した試料中のＤＮＡ量を蛍光強度によって定量することが可能である。しかしながら、タンパク質はＰＣＲ反応に相当する増幅を行うことができない。
【０００９】
微量タンパク質を捕らえるために用いられている手法としてはＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法などがある。ＥＬＩＳＡ法では、１次抗体を使い標的タンパク質を捕捉し、標的タンパク質の別部位を認識できる２次抗体を使用する。
【００１０】
この際の認識手段としては、従来、２次抗体と蛍光標識抗体とを使い、蛍光標識抗体の蛍光発色により標的タンパク質の有無を確認していたが、その定量性の信頼性が低いという問題があった。
【００１１】
その後改良が加えられ、２次抗体として酸化還元酵素連結抗体が使われるようになり、化学発光もしくは電気化学測定により標的タンパク質を確認することにより、定量性はかなり改善され、電気化学測定においてさらに改善されたという報告がある。
【００１２】
このようなＥＬＩＳＡ法の標的になっているものは、生体内で微量に存在する物質である。そのため試料を検査項目毎に分割すれば、分割した数に比例して感度が低下することは避けられず、しかも、微量サンプルの厳密な分割は困難である。
【００１３】
また、サンプル中の標的タンパク質を固定する部位をアレイ化することにより定量する方法も考えられるが、サンプル溶液が各アレイに均等に行き渡る必要があり、その制御は非常に困難である。さらに、タンパク質をアレイ化する際にはタンパク質の変性を避けることが困難である。
【特許文献１】特開平７−２６５０７６号公報（特許請求の範囲）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従ってタンパク質の定量分析には、ＤＮＡの配列情報を介する方法が現実的であると考えられる。しかしながら、種々のタンパク質の定量分析を可能とするにはＤＮＡのアレイ化が必須であり、アレイ化を行う微細加工に必要な高コスト問題を避けることができない（例えば特許文献１参照。）
本発明は、上記問題を解決し、ＤＮＡのアレイ化を不要としたタンパク質の定量分析技術を提供することを目的としている。本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一態様によれば、流路中に、
基体と、
標的タンパク質を特異的に捕捉するための、基体に結合した第一の結合部と、
第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、
標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と、
標的タンパク質に特異的に会合し、情報伝達部が結合した第二の結合部と
を有する２本鎖ＤＮＡ生成セクションと、
生成した２本鎖ＤＮＡを増幅するための２本鎖ＤＮＡ増幅セクションと、
増幅した２本鎖ＤＮＡを検出するための２本鎖ＤＮＡ検出セクションと
を有するタンパク質検出デバイスが提供される。
【００１６】
本発明態様により、ＤＮＡのアレイ化をしなくてもタンパク質の定量分析が可能となるデバイスを提供できる。
【００１７】
外部から、流路中に、情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとｄＮＴＰとＤＮＡ複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、情報伝達部との相補作用により２本鎖ＤＮＡを生成し、かつ２本鎖ＤＮＡを増幅することのできること、２本鎖ＤＮＡ増幅セクションが加熱可能であること、２本鎖ＤＮＡ検出セクションが、タンパク質信号増幅体を流路に投入開始した時から検出を開始するまでの時間により、標的タンパク質を定量分析できること、第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が抗体を含んでなること、第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が、基体、標的タンパク質および情報伝達部からなる群から選ばれた少なくとも一つと、アビジン−ビオチン結合、オリゴヒスチジン−金属錯体結合またはｈＡＧＴとアルキルグアニン誘導体によって生じる結合で結合していること、情報伝達部が核酸であること、タンパク質信号増幅体が、２本鎖ＤＮＡに対する特異的蛍光発光インタカレータを含むこと、２本鎖ＤＮＡ検出セクションが蛍光を検出する能力を有することおよび、２本鎖ＤＮＡ生成セクションを並列に複数有することが好ましい。
【００１８】
本発明の他の一態様によれば、
流路中の基体に、
標的タンパク質を特異的に捕捉するための、基体に結合した第一の結合部と、
第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、
標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と
標的タンパク質に特異的に会合し、情報伝達部が結合した第二の結合部と
を有する構造体を結合し、
外部から、流路中に、情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとｄＮＴＰとＤＮＡ複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、情報伝達部との相補作用による２本鎖ＤＮＡを生成し、
その２本鎖ＤＮＡを増幅し、検出する
タンパク質の定量分析方法が提供される。
【００１９】
本発明態様により、ＤＮＡのアレイ化をしなくてもタンパク質を定量分析することができる。
【００２０】
２本鎖ＤＮＡ生成後の増幅段階で加熱すること、検出段階で、タンパク質信号増幅体を流路に投入開始した時から検出を開始するまでの時間により、標的タンパク質を定量分析すること、第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が抗体を含んでなること、第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が、基体、標的タンパク質および情報伝達部からなる群から選ばれた少なくとも一つと、アビジン−ビオチン結合、オリゴヒスチジン−金属錯体結合またはｈＡＧＴとアルキルグアニン誘導体によって生じる結合で結合していること、情報伝達部が核酸であること、タンパク質信号増幅体が、２本鎖ＤＮＡに対する特異的蛍光発光インタカレータを含むこと検出段階で蛍光を検出することが好ましい形態である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、ＤＮＡのアレイ化をしなくてもタンパク質の定量分析が可能となる。デバイスの製造コストの低減を図ることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に、本発明の実施の形態を図、実施例等を使用して説明する。なお、これらの図、実施例等及び説明は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の趣旨に合致する限り他の実施の形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。図中、同一の符号は同一の要素を表す。
【００２３】
本発明は、上記の課題を解決するため、アレイ化を行う代わりに、種々のタンパク質を分離せずに保持し、かつ、これらタンパク質のそれぞれの存否または量情報を読み出せる機能を有するドメインを設け、そこから随時量情報を読み出せるようにしたタンパク質検出デバイスを提供するものである。本発明に係るデバイスは、上記説明のように、タンパク質に関する存否または量情報を随時読み出せるため、タンパク質検出ライブラリと呼称することもできる。なお、本発明においては、ＤＮＡのアレイ化のようにタンパク質を整理して保持することが必要なく、種々雑多のまま上記ドメインに保持でき、しかも種々のタンパク質の存否または量情報を随時呼び出すことができるという特徴も有している。
【００２４】
本発明に係るタンパク質検出デバイスは、流路中に、基体と、標的タンパク質を特異的に捕捉するための、基体に結合した第一の結合部と、第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と、標的タンパク質に特異的に会合し、情報伝達部が結合した第二の結合部とを有する２本鎖ＤＮＡ生成セクションと、生成した２本鎖ＤＮＡを増幅するための２本鎖ＤＮＡ増幅セクションと、増幅した２本鎖ＤＮＡを検出するための２本鎖ＤＮＡ検出セクションとを有する。
【００２５】
次に本発明を図を使用して説明する。図１は本発明に係る２本鎖ＤＮＡ生成セクション１と２本鎖ＤＮＡ増幅セクション２と２本鎖ＤＮＡ検出セクション３と流路５とを有するタンパク質検出デバイス４の概念図であり、図２は２本鎖ＤＮＡ生成セクション１を拡大した様子を示す概念図である。
【００２６】
２本鎖ＤＮＡ生成セクション１は、図２に示すように、基体２１および、標的タンパク質を特異的に捕捉するための第一の結合部２２と、標的タンパク質２３と、第二の結合部２４と、標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部２５とを有する構造体２６を含んでいる。第二の結合部２４は標的タンパク質２３に特異的に会合し、情報伝達部２５に結合している。図１の２本鎖ＤＮＡ生成セクション１には構造体２６と結合させた基体２１も示されている（構造体２６自体は示されていない）。
【００２７】
このような構造体を完成させるには公知のどのような方法を採用してもよい。たとえば、基体上に結合した第一の結合部により標的タンパク質を特異的に捕捉し、ついで第二の結合部が標的タンパク質２３に特異的に会合し、その第二の結合部に情報伝達部を結合させることでこの構造体を得ることができる。
【００２８】
また、標的タンパク質を特異的に捕捉した第一の結合部を基体に結合させてもよい。さらに、標的タンパク質に第一の結合部と第二の結合部と情報伝達部とを予め結合させた後基体に結合させてもよい。
【００２９】
基体に第一の結合部を結合させる方法、第一の結合部により標的タンパク質を特異的に捕捉する方法、第二の結合部を標的タンパク質に特異的に会合させる方法および情報伝達部を第二の結合部に結合させる方法については、本発明の趣旨に反しない限りどのような方法を採用してもよい。
【００３０】
典型的な例では第一の結合部や第二の結合部として抗体を使用し、情報伝達部として核酸を使用するが、そのような場合には、基体に第一の結合部を結合させる方法として、抗体を基体に結合させる公知の方法を採用することができる。第一の結合部により標的タンパク質を特異的に捕捉する方法、第二の結合部を標的タンパク質に特異的に会合させる方法および情報伝達部を第二の結合部に結合させる方法についても同様である。
【００３１】
具体的には、これらの結合または捕捉には、アビジン−ビオチン結合、オリゴヒスチジン−金属錯体結合またはｈＡＧＴとアルキルグアニン誘導体によって生じる結合を利用することができる。ただし、一般に、結合の解離定数が大きいと、基体上の上記構造体の量が急速に減少したり、上記構造体の構造が不完全になりやすいので、できるだけ結合の解離定数が小さいものが好ましい。例えば解離定数が１０-5以下のものが好ましい。
【００３２】
本発明に係る基体としては、本発明の趣旨に反しない限りどのような材質のものも使用することができる。具体的には、ガラス、シリコン、セラミック、プラスチック等を例示することができる。また、本発明に係る流路についても同様に、本発明の趣旨に反しない限りどのような材質のものも使用することができる。
【００３３】
本発明に係る第一の結合部または第二の結合部としては、本発明の趣旨に反しない限りどのようなものも使用することができるが、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られる産物、蛋白質に対して親和性を有する有機化合物、蛋白質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれた少なくとも一つの物質よりなるものを挙げることができる。
【００３４】
本発明に係る情報伝達部は、標的タンパク質に一対一対応する。ここで、「一対一対応する」とは、情報伝達部と標的タンパク質とが１：１対応しており、情報伝達部の有する情報を読みとることにより、標的タンパク質の情報が読みとれることを意味する。具体的には、標的タンパク質と特異的に会合できる第二の結合部毎に、互いに区別できる特定の情報伝達部を結合させることにより、このような機能を発揮させることができる。
【００３５】
本発明に係る情報伝達部としては、上記の機能を有するものであればどのようなものを使用してもよい。具体的にはＤＮＡ、ＲＮＡを含む核酸であって標的タンパク質に一対一対応するものを挙げることができる。また、情報伝達部が核酸以外の構造を有していてもよい。情報伝達部に第二の結合部としての機能を持たせることも可能である。そのような場合には、情報伝達部と第二の結合部とが分離して区別できない場合もあり得る。本発明の範疇にはこのような場合も含まれる。
【００３６】
本発明ではこのような２本鎖ＤＮＡ生成セクションから情報を読み出す。すなわち二本鎖ＤＮＡを生成する。このためには、このような２本鎖ＤＮＡ生成セクションを有する流路中に、外部から、核酸の断片であるプライマーであって上記情報伝達部の配列を認識し得るものと、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシン三リン酸）、ｄＣＴＰ（デオキシシチジン三リン酸）およびＴＴＰ（チミジン三リン酸）を含むｄＮＴＰ（デオキシヌクレオシド三リン酸）と、ＤＮＡ複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、情報伝達部との相補作用により２本鎖ＤＮＡを生成させる。このように本発明におけるタンパク質信号増幅体は、標的タンパク質に一対一対応する核酸配列を生成または増幅する機能を有する。
【００３７】
本発明に係るプライマーは情報伝達部と相補結合できるとして選択されているので、このプライマーが核酸と相補的に結合し、このプライマーの持つ情報に従い、ＤＮＡ複製酵素が増幅部位を決定することにより、ｄＮＴＰを原料にして、 情報伝達部の有する情報を含む２本鎖ＤＮＡが生成される。
【００３８】
本発明に係るＤＮＡ複製酵素としては、高熱耐性ＤＮＡ複製酵素Ｔａｑポリメレースが好適として挙げられるが、流路内の温度で安定であれば、いかなるDNA複製酵素でもよい。
【００３９】
このようにして生成した２本鎖ＤＮＡは通常その量が少ないので、本発明では、増幅（すなわち、複製によりその量を増大）してから検出する。この増幅は、２本鎖ＤＮＡ増幅セクションにおいてｄＮＴＰとプライマーとＤＮＡ複製酵素とにより行うことができる。ただし、特に２本鎖ＤＮＡ増幅セクションを明示的に設ける必要はなく、２本鎖ＤＮＡ生成セクションと２本鎖ＤＮＡ検出セクションとの間に一定の保持時間があれば十分である。２本鎖ＤＮＡ生成セクションと２本鎖ＤＮＡ検出セクションとの間にある流路部分を２本鎖ＤＮＡ増幅セクションと考えてもよい。この保持時間は、定量分析したいタンパク質の量、上記流路を流れるタンパク質信号増幅体の流量等により、実状に応じて定めることができる。
【００４０】
なお、２本鎖ＤＮＡの増幅は一般に高温ほど有利であるが、タンパク質は熱に弱いので、２本鎖ＤＮＡ増幅セクションを加熱し、２本鎖ＤＮＡ生成セクションは加熱しないで室温程度に保つことが好ましい。２本鎖ＤＮＡ増幅セクションの温度範囲としては３０〜６０℃の範囲が好ましい。
【００４１】
２本鎖ＤＮＡ検出セクションでは２本鎖ＤＮＡを検出するが、その方法としては、公知のどのような方法を使用してもよい。たとえば、後述するように、タンパク質信号増幅体を流路に投入開始した時から検出を開始するまでの時間により、上記標的タンパク質を定量分析することができる。上記タンパク質信号増幅体は、プライマーとｄＮＴＰとＤＮＡ複製酵素とを含む水溶液であるが、これに、２本鎖ＤＮＡに対する特異的蛍光発光インタカレータを含ませておき、２本鎖ＤＮＡ検出セクションでその蛍光を検出する方法が信頼性が高く、好ましい。
【００４２】
ここで、２本鎖ＤＮＡに対する特異的蛍光発光インタカレータとは２本鎖ＤＮＡに特異的にインタカレーションし、その際、蛍光を発光する物質を意味する。特異的蛍光発光インタカレータとしては、サイバーグリーン１、ＹＯＹＯ１等を挙げることができる。なお、タンパク質信号増幅体には、この他、インタカレータの代わりに蛍光・消光一本短鎖DNA（taqman probe等）が含まれていてもよい。
【００４３】
このようにして、標的タンパク質の有する情報が情報伝達部とプライマーとを介して２本鎖ＤＮＡに伝えられるので、この２本鎖ＤＮＡを検出することで標的タンパク質を定量分析することが可能となる。従って、本発明により、ＤＮＡのアレイ化をしなくてもタンパク質の定量分析が可能となる。アレイ化のための加工費用が不要となるのでデバイスの製造コストの低減を図ることもできる。
【００４４】
なお、本発明において、「標的タンパク質の定量分析」とは、２本鎖ＤＮＡ生成セクションに捕捉されている標的タンパク質の定量を意味するが、本発明を利用すれば、サンプル液中におけるタンパク質を２本鎖ＤＮＡ生成セクションに捕捉させることにより、特定タンパク質の有無の確認および定量を行うことも可能である。
【００４５】
２本鎖ＤＮＡ生成セクションには複数種類のタンパク質を同時に存在させてもよい。それぞれとの一対一対合を通じて、それぞれの標的タンパク質の情報を読み出し、それぞれの定量分析に供することができる。図２について説明すれば、図２の三つの標的タンパク質２３がそれぞれ別種である場合には、三つの情報伝達部２５も別種になり、従って、三種類の２本鎖ＤＮＡが生じ、それぞれの分析をすれば、それぞれの標的タンパク質の定量分析が可能となるのである。従って、本発明により、ＤＮＡのアレイ化をしなくても複数種のタンパク質の定量分析が可能となる。
【００４６】
本発明に係るタンパク質検出デバイスは、２本鎖ＤＮＡ生成セクションを並列に複数有するものであってもよい。タンパク質検出デバイスが複数あれば、複数のタンパク質の定量をより迅速に行うことができる。この場合、２本鎖ＤＮＡ増幅セクションおよび／または２本鎖ＤＮＡ検出セクションが複数あるものであってもよい。
【００４７】
次に、本発明に係るタンパク質の定量分析方法について説明する。本発明に係るタンパク質の定量分析方法は、流路中の基体に、標的タンパク質を特異的に捕捉するための、基体に結合した第一の結合部と、第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と標的タンパク質に特異的に会合し、情報伝達部が結合した第二の結合部とを有する構造体を結合し、外部から、流路中に、情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとｄＮＴＰとＤＮＡ複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、情報伝達部との相補作用による２本鎖ＤＮＡを生成し、その２本鎖ＤＮＡを増幅し、検出することで行うことができる。
【００４８】
本発明に係るタンパク質の定量分析方法は、上記のタンパク質検出デバイスを使用して実行することが好ましいが、他のデバイスを使用してもよいことはいうまでもない。たとえば、流路中に、基体と２本鎖ＤＮＡ検出セクションとを有するデバイスについて、その基体に、標的タンパク質を特異的に捕捉するための第一の結合部と、第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と標的タンパク質に特異的に会合し、情報伝達部が結合した第二の結合部とを有する構造体を結合し、外部から、流路中に、情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとｄＮＴＰとＤＮＡ複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、上記と同様に２本鎖ＤＮＡを生成し、増幅し、検出することができる。
【００４９】
なお、本発明に係るタンパク質の定量分析方法における用語の意味および好ましい形態は上記の本発明に係るタンパク質検出デバイスにおける用語の意味および好ましい形態と同様に考えることができる。
【００５０】
以下に、標的タンパク質の定量分析を具体的に例示すると次のようになる。
【００５１】
（１）あるサンプル中に特定のタンパク質Ａが含まれているかどうかの確認
第一の結合体および第二の結合体として、タンパク質Ａに特異的に結合または会合する抗体を選択し、情報伝達部として、タンパク質Ａと一対一対応する核酸を選択し、このサンプルを使用して２本鎖ＤＮＡ生成セクションを構成する作業を行う。このようにして得たタンパク質検出デバイスに、外部から、流路中に、上記情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとｄＮＴＰとＤＮＡ複製酵素と、特異的蛍光発光インタカレータとを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給して、２本鎖ＤＮＡを生成させる操作を行い、必要であれば２本鎖ＤＮＡ増幅セクションを加熱し、２本鎖ＤＮＡ検出セクションで、特異的蛍光発光インタカレータの発光の有無を検出する。この特異的蛍光発光インタカレータは、生成した２本鎖ＤＮＡとインタカレーションした場合にのみ蛍光を発するので、容易に生成した２本鎖ＤＮＡの有無を検出でき、従ってタンパク質Ａの存否を判定できる。
【００５２】
（２）あるサンプル中に含まれる特定のタンパク質Ａ量の測定
第一の結合体および第二の結合体として、タンパク質Ａに特異的に結合または会合する抗体を選択し、情報伝達部として、タンパク質Ａと一対一対応する核酸を選択し、それらの十分な量とこのサンプルを使用して２本鎖ＤＮＡ生成セクションを構成する作業を行う。このようにして得たタンパク質検出デバイスに、外部から、流路中に、上記情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとｄＮＴＰとＤＮＡ複製酵素と、特異的蛍光発光インタカレータとを含んでなる、十分な量のタンパク質信号増幅体を供給し、必要であれば２本鎖ＤＮＡ増幅セクションを加熱し、２本鎖ＤＮＡ検出セクションで、特異的蛍光発光インタカレータの発光を検出する。
【００５３】
発光は時間と共に指数関数的に増大するが、最初に２本鎖ＤＮＡ生成セクションに捕捉された量が多いほど早く検出される。従って、２本鎖ＤＮＡ検出セクションで、タンパク質信号増幅体を流路に投入開始した時から検出を開始するまでの時間により、標的タンパク質を定量分析すれば、その量の多寡を測定することができる。この場合、タンパク質Ａの濃度が既知のサンプルについてのタンパク質信号増幅体を流路に投入開始した時から検出を開始するまでの時間と比較すれば、サンプル中の絶対量を知ることもできる。具体的には、通常、図３のような結果が得られるので、例えば蛍光強度が最大値の５％に達した時までの時間を採用して比較することができる。上記の十分な量は、使用量を変えて実験することにより容易に知ることができる。使用量が過剰であっても差し支えないので、大過剰量を使用することが実際的である。
【００５４】
本発明によって実現されるタンパク質検出デバイスおよびタンパク質の定量分析方法は、プロテオームチップ上へのタンパク質のライブラリ化への応用に最も期待できる。バイオメムスなどの検出器部分に、本発明に係るタンパク質検出デバイスを導入することにより、現在の微細加工の限界を超えた集積化が可能になり、低コスト化が可能になる。
【００５５】
多種類のタンパク質を少量のサンプルから定量するという需要は様々な疾病において存在する。例えば糖尿病において肝細胞がインシュリンの受容状態に応じて細胞内グリコーゲン代謝を切り換えるなどの場合に、インシュリン受容体からグリコーゲン分解酵素に至る一連のタンパク質相互作用ネットワークの一部が低下ないし昂進していることを捉えようとするものがある。本件技術を使うことによって、リン酸化や糖鎖付加などのいわゆる翻訳後修飾も含めて、タンパク質のポピュレーションを捉えることが可能になるであろう。
【００５６】
これにより、従来のように症状として現れた現象を大括りにして糖尿病と捉えるのではなく、相互作用ネットワークに係わるある特定のタンパク質の機能低下が糖代謝の不全を起こしているなどを把握できるようになり、機能不全の原因に対応して適切な診断と治療、ならびに治療結果の検証が可能になる。
【００５７】
もちろん同様の手法は、糖尿病に限らず、高血圧症、高脂血症やその他の多因子性疾患全般に対して適用が可能である。
【実施例】
【００５８】
次に本発明の実施例及び比較例を詳述するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００５９】
［実施例１］
（ｃＤＮＡの定量）
ラット肝臓組織からの末端チオール化オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてＧｕｂｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ法に基づいてｃＤＮＡを基体上に結合させた。
【００６０】
アミノ末端磁気ビーズを２官能性（マレイイミド−スクシンイミド）試薬で処理してアミノ末端とスクシンイミド基とを反応させ、ビーズの表面にマレインイミド官能基を露出させた状態にした後、マレイミド基と上記チオール基とを反応させることによりｃＤＮＡライブラリーを基体上に固定した。
【００６１】
本操作の代わりに好熱細菌由来のアビジンがコートされた磁気ビーズと末端ビオチン化オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いることでも同様のことが可能である。
【００６２】
本基体を用いてｃＤＮＡ濃度が各々２桁以上異なる３組のｃＤＮＡについてその定量を試みた。ＤＮＡ逐次読み出しはＩＣＡＮ法を用いることにより行った。結果は、図３について説明した場合と同様に、３組の間にはっきりとした差が認められた。
【００６３】
本例は、タンパク質を使用せず、情報伝達部としてのｃＤＮＡを直接基体に結合させた例であるが、本発明では、情報伝達部がタンパク質と一対一対応するので、本例から、タンパク質を使用した場合にも同様の効果が得られることが容易に理解される。
【００６４】
［実施例２］
（タンパク質の定量）
図４に模式的に示した流路を有するタンパク質検出デバイス４を使用した。基体２１として、アマシャムバイオサイエンス社製のビーズを使用した。
【００６５】
このような構成で、２本鎖ＤＮＡ生成セクション1を挟んで、インレット４１−アウトレット４２間に、N末ビオチン修飾一本鎖ＧＳＴ抗体（ＳｃＦｖ）溶液を流した後に決まった濃度のＧＳＴを流し、第一の結合部としてのＧＳＴ抗体と標的タンパク質としてのＧＳＴを結合させた複合体を基体に結合した。
【００６６】
ついで、インレット４１−アウトレット４２間に、ＲＮＡ標識されており、ＧＳＴに特異的に会合する抗体の水溶液を流した後、インレット４１−アウトレット４２間およびインレット４３−アウトレット４２間をバッファー液で洗浄した。このＲＮＡが本発明に係る情報伝達部、抗体が本発明に係る第二の結合部に該当する。この抗体-RNAコンジュゲートはN末6-alkylguanine-DNA alkyltransferase融合scFvと5’末端6-アルキルグアニン修飾RNAから合成した。その結果、標的タンパク質の配列情報に対応した配列情報を有することになる。このようにして、２本鎖ＤＮＡ生成セクション１（図４上、２本鎖ＤＮＡ生成セクション１は基体２１と同一個所に見えている。）を完成した。
【００６７】
ついで、インレット４１−アウトレット４４間に、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラプライマー，ｄＮＴＰ、ＲＮＡａｓｅＨ、鎖置換型ＤＮＡポリメレース（ＩＣＡＮ法試薬）、ＡＭＶ逆転写酵素およびＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  １を含む水溶液を流し、生成する２本鎖ＤＮＡの量をＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎを用いることにより、蛍光を検出できる２本鎖ＤＮＡ検出セクション３を使用して定量した。上記水溶液が、本発明に係るタンパク質信号増幅体、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  １が、本発明に係る、２本鎖ＤＮＡに対する特異的蛍光発光インタカレータである。２本鎖ＤＮＡ生成セクション１から２本鎖ＤＮＡ検出セクション３までの流路４５が、本発明に係る２本鎖ＤＮＡ増幅セクション２に該当する。タンパク質検出デバイスは、２本鎖ＤＮＡ生成セクション１は３７℃に、それ以外は６０℃に維持した。
全ての操作の間、室温に保った。
【００６８】
結果は、図３と同様に濃度と代謝時間に相関関係が認められた。
【００６９】
［実施例３］
（タンパク質の定量）
実施例２と同じ図４に模式的に示した構成で、２本鎖ＤＮＡ生成セクション１を挟んで、インレット４１−アウトレット４２間に、Ｎ末ビオチン修飾一本鎖ＧＳＴ抗体（ＳｃＦｖ）とＮ末ビオチン修飾一本鎖ＧＦＰ抗体（ＳｃＦｖ）混合溶液を流し、更にＧＳＴとＧＦＰの混合物を流した後についで、インレット４１−アウトレット４２間に、ＲＮＡ標識されており、ＧＳＴに特異的に会合する抗体及びＲＮＡ標識されており、ＧＦＰに特異的に会合する抗体の水溶液を流した後、実施例２と同様の手法でＧＳＴについて定量し、ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、同様の手法でＧＦＰについて定量した。
【００７０】
なお、上記に開示した内容から、下記の付記に示した発明が導き出せる。
【００７１】
（付記１）
流路中に、
基体と、
標的タンパク質を特異的に捕捉するための、当該基体に結合した第一の結合部と、
当該第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、
当該標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と、
当該標的タンパク質に特異的に会合し、当該情報伝達部と結合した第二の結合部と
を有する２本鎖ＤＮＡ生成セクションと、
生成した２本鎖ＤＮＡを増幅するための２本鎖ＤＮＡ増幅セクションと、
増幅した２本鎖ＤＮＡを検出するための２本鎖ＤＮＡ検出セクションと
を有するタンパク質検出デバイス。
【００７２】
（付記２）
外部から、前記流路中に、前記情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとｄＮＴＰとＤＮＡ複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、前記情報伝達部との相補作用により２本鎖ＤＮＡを生成し、かつ当該２本鎖ＤＮＡを増幅することのできる、付記１に記載のタンパク質検出デバイス。
【００７３】
（付記３）
前記２本鎖ＤＮＡ増幅セクションが加熱可能である、付記１または２に記載のタンパク質検出デバイス。
【００７４】
（付記４）
前記２本鎖ＤＮＡ検出セクションが、前記タンパク質信号増幅体を流路に投入開始した時から検出を開始するまでの時間により、前記標的タンパク質を定量分析できる、付記１〜３のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
【００７５】
（付記５）
前記第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が抗体を含んでなる、付記１〜４のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
【００７６】
（付記６）
前記第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が、前記基体、標的タンパク質および情報伝達部からなる群から選ばれた少なくとも一つと、アビジン−ビオチン結合、オリゴヒスチジン−金属錯体結合またはｈＡＧＴとアルキルグアニン誘導体によって生じる結合で結合している、付記１〜５のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
【００７７】
（付記７）
前記情報伝達部が核酸である、付記１〜６のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
【００７８】
（付記８）
前記タンパク質信号増幅体が、２本鎖ＤＮＡに対する特異的蛍光発光インタカレータを含む、付記１〜７のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
【００７９】
（付記９）
前記２本鎖ＤＮＡ検出セクションが蛍光を検出する能力を有する、付記１〜８のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
【００８０】
（付記１０）
前記２本鎖ＤＮＡ生成セクションを並列に複数有する、付記１〜９のいずれかに記載のタンパク質検出デバイス。
【００８１】
（付記１１）
流路中の基体に、
標的タンパク質を特異的に捕捉するための、当該基体に結合した第一の結合部と、
当該第一の結合部に捕捉された標的タンパク質と、
当該標的タンパク質に一対一対応し、かつ、プライマーにより配列を認識し得る情報伝達部と
当該標的タンパク質に特異的に会合し、当該情報伝達部と結合した第二の結合部と
を有する構造体を結合し、
外部から、当該流路中に、当該情報伝達部の配列を認識し得るプライマーとｄＮＴＰとＤＮＡ複製酵素とを含んでなるタンパク質信号増幅体を供給することにより、当該情報伝達部との相補作用による２本鎖ＤＮＡを生成し、
当該２本鎖ＤＮＡを増幅し、検出する
タンパク質の定量分析方法。）
（付記１２）
前記２本鎖ＤＮＡ生成後の増幅段階で加熱する、付記１１に記載のタンパク質の定量分析方法。
【００８２】
（付記１３）
前記検出段階で、前記タンパク質信号増幅体を流路に投入開始した時から検出を開始するまでの時間により、前記標的タンパク質を定量分析する、付記１１または１２に記載のタンパク質の定量分析方法。
【００８３】
（付記１４）
前記第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が抗体を含んでなる、付記１１〜１３のいずれかに記載のタンパク質の定量分析方法。
【００８４】
（付記１５）
前記第一の結合部と第二の結合部との少なくともいずれか一方が、前記基体、標的タンパク質および情報伝達部からなる群から選ばれた少なくとも一つと、アビジン−ビオチン結合、オリゴヒスチジン−金属錯体結合またはｈＡＧＴとアルキルグアニン誘導体によって生じる結合で結合している、付記１１〜１４のいずれかに記載のタンパク質の定量分析方法。
【００８５】
（付記１６）
前記情報伝達部が核酸である、付記１１〜１５のいずれかに記載のタンパク質の定量分析方法。
【００８６】
（付記１７）
前記タンパク質信号増幅体が、２本鎖ＤＮＡに対する特異的蛍光発光インタカレータを含む、付記１１〜１６のいずれかに記載のタンパク質の定量分析方法。
【００８７】
（付記１８）
前記検出段階で蛍光を検出する、付記１１〜１７のいずれかに記載のタンパク質の定量分析方法。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明に係る２本鎖ＤＮＡ生成セクションと２本鎖ＤＮＡ増幅セクションと２本鎖ＤＮＡ検出セクションと示す模式図である。
【図２】２本鎖ＤＮＡ生成セクションを拡大した様子を示す概念図である。
【図３】ＤＮＡの蛍光強度を縦軸に、タンパク質信号増幅体を流路に投入開始した時から検出を開始するまでの時間を横軸にしたグラフである。
【図４】本発明に係るタンパク質検出デバイスの模式的斜視図である。
【符号の説明】
【００８９】
１    ２本鎖ＤＮＡ生成セクション
２    ２本鎖ＤＮＡ増幅セクション
３    ２本鎖ＤＮＡ検出セクション
４    タンパク質検出デバイス
５    流路
２１  基体
２２  第一の結合部
２３  標的タンパク質
２４  第二の結合部
２５  情報伝達部
２６  構造体
４１  インレット
４２  アウトレット
４３  インレット
４４  アウトレット
４５  流路
【図１】
2006191886.tif 000002
【図２】
2006191886.tif 000003
【図３】
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【図４】
2006191886.tif 000005