(57)【要約】【課題】再生医療を早期実用化する。【解決手段】歯乳頭由来の間葉系幹細胞及び神経幹細胞；歯乳頭から間葉系幹細胞及び神経幹細胞を採取することを特徴とする高増殖性の間葉系幹細胞及び神経幹細胞の調製方法。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯乳頭由来の幹細胞であって、間葉系幹細胞及び神経幹細胞からなる群から選ばれるいずれかの幹細胞。
【請求項２】
前記幹細胞が間葉系幹細胞である、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項３】
前記幹細胞が神経幹細胞である、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項４】
前記神経幹細胞がneurosphereを形成する請求項３に記載の幹細胞
【請求項５】
前記幹細胞が間葉系幹細胞であって、ＣＤ３４およびＣＤ４５を有さず、ＣＤ２９＋，ＣＤ９０及びＣＤ１０５からなる群から選ばれる少なくとも１種の表面抗原発現を有する請求項２に記載の幹細胞。
【請求項６】
WST-1法による細胞増殖能が、歯小嚢及び骨髄由来幹細胞よりも高い請求項１〜５のいず
れかに記載の幹細胞。
【請求項７】
歯乳頭がヒトの歯乳頭である請求項１〜６のいずれかに記載の幹細胞。
【請求項８】
歯乳頭が、ヒトの第三大臼歯の歯乳頭である請求項７に記載の幹細胞。
【請求項９】
歯乳頭の接着細胞を採取することを特徴とする間葉系幹細胞の調製方法。
【請求項１０】
歯乳頭の浮遊細胞を採取することを特徴とする神経幹細胞の調製方法。
【請求項１１】
歯乳頭を蛋白質の分解酵素で処理し、得られた間葉系幹細胞を培養容器で培養し、該培養容器に接着した間葉系幹細胞を接着しないものから分離し、培養することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
歯乳頭から分離採取された間葉系幹細胞を初期培養した後、蛋白質の分解酵素で処理し、継代培養を行い増殖させる事を特徴とする歯乳頭由来の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項１３】
蛋白質の分解酵素がコラゲナーゼ、トリプシン、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼおよびディスパーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１２に記載の方法
【請求項１４】
歯乳頭由来の間葉系幹細胞及び神経幹細胞から選択されるいずれかの幹細胞を、必要に応じて培養増殖後に分化誘導を行うことを特徴とする幹細胞の分化誘導方法。
【請求項１５】
歯乳頭がヒトの歯乳頭である請求項９〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
歯乳頭由来の間葉系幹細胞及び神経幹細胞から選択されるいずれかの幹細胞の組織又は臓器の再生ないし修復のための使用。
【請求項１７】
歯乳頭由来の間葉系幹細胞及び神経幹細胞から選択されるいずれかの幹細胞或いはその分化誘導細胞を移植することを特徴とする、組織又は臓器の再生ないし修復のための方法。
【請求項１８】
歯乳頭由来の間葉系幹細胞及び神経幹細胞から選択される少なくとも１種の幹細胞の凍結保存細胞。
【請求項１９】
組織保存液と共に凍結してなる凍結保存歯胚もしくは歯乳頭。
【請求項２０】
歯乳頭由来の間葉系幹細胞及び神経幹細胞から選択される少なくとも１種の幹細胞を細胞凍結保存液にて凍結保存することを特徴とする歯乳頭由来幹細胞の凍結保存方法。
【請求項２１】
歯乳頭又は歯胚を組織凍結保存液にて凍結保存することを特徴とする歯乳頭又は歯胚の凍結保存方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載の凍結保存細胞、請求項１９に記載の凍結保存歯胚もしくは歯乳頭、請求項２０に記載の方法により得られた凍結保存細胞、請求項２１に記載の方法により得られた凍結保存歯胚もしくは歯乳頭の、組織又は臓器の再生ないし修復のための使用。
【請求項２３】
請求項１９に記載の凍結保存歯胚もしくは歯乳頭または請求項２０に記載の方法により得られた凍結保存歯胚もしくは歯乳頭を解凍し、請求項１２または１３に記載の処理を行うことを特徴とする間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項２４】
歯乳頭由来の間葉系幹細胞または歯乳頭由来の神経幹細胞から分化誘導された細胞を直接又は生体材料に担持された状態で、ヒトを含む哺乳動物の患部に自家移植することを特徴とする移植方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は歯乳頭由来の幹細胞及び該幹細胞の分離採取方法、該幹細胞の培養及び分化誘導方法、この分化誘導された又はされていない幹細胞を用いて組織又は臓器を再生する方法及び幹細胞又は歯乳頭／歯胚の凍結保存物及び凍結保存して利用する方法に関する。本発明は、特にヒトの歯乳頭を用いてヒト歯乳頭由来間葉系幹細胞および／又は神経幹細胞を得、これをヒトの組織又は臓器の再生ないし修復、或いは疾患の治療のために使用する。
【背景技術】
【０００２】
種々の臓器障害を細胞を用いて治療する再生医療が発展してきている。従来治療として臓器移植が考慮されるが、ドナー不足は深刻である。人工臓器も重要な選択肢であるが、生物機能を有さないのでその治療効果は短期的且つ限定的である。
【０００３】
この解決策として、多能性を有する骨髄間葉系幹細胞を用いて細胞そのものを移植する細胞療法が試みられているが、骨髄間葉系幹細胞を採取するための骨髄穿刺は必須であり、健常部(例えば腸骨)への新たな外科的侵襲を避ける事はできない。そのため、新たな間葉系幹細胞の細胞源及び細胞採取方法の開発が求められている。
【０００４】
口腔組織から間葉系幹細胞を採取する方法は４例知られている（特許文献１〜４）。
【０００５】
特許文献１では、間葉系幹細胞を採取する組織が歯槽骨の骨髄、口蓋又は歯槽骨の骨膜に限られている。歯乳頭からの採取方法、培養方法及びその細胞を使った組織再生方法は開示されていない。
【０００６】
特許文献2では、細胞が歯周組織幹細胞に限られており間葉系幹細胞ないし神経幹細胞
ではない。さらに、細胞によって再生される組織が歯周組織に限られている。
特許文献3では、細胞が歯嚢細胞と歯髄細胞に限られており、歯乳頭由来の間葉系幹細胞
は含まれていない。また、浮遊細胞である神経幹細胞は含まれていない。
特許文献４ では、細胞が歯嚢から単離された非胚性組織から得る事ができる幹細胞に限
られており、歯乳頭は含まれていない。
【０００７】
神経幹細胞は、ＥＳ細胞或いは胎児の中脳細胞などから得られるが、いずれも倫理上の問題があり、入手することは困難である。
【特許文献１】特開2003-52365
【特許文献２】特開2004-497
【特許文献３】特開2004-201612
【特許文献４】特表2005-516616
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来、再生医療に用いられている間葉系幹細胞は、治療への必要性が発生してから、ヒトより採取され培養されているため、組織の修復部への移植には1カ月近い期間を要して
いる。また、幹細胞の採取に当たっては、ドナーの健常部への新たな外科的侵襲を加えて実施されている。これらの課題を解決し、再生医療の早期実用化が求められている。
【０００９】
一方、ヒトの脳は100億以上のニューロンとその10倍以上にもおよぶグリアからなり、
部位ごとによって多様な形態をもつ細胞がありながらも連携し見事に機能する。神経幹細
胞は、その多様な細胞群を生み出す源であるといえる。
【００１０】
神経幹細胞は、発達期の脳において神経細胞やグリア細胞を供給するのみならず、成体の脳においても継続的に神経細胞を産生し、脳の機能維持に関与していると考えられている。
【００１１】
このように、神経幹細胞は脳神経系の各種疾患の治療に有用であり、新たな入手方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、従来、歯科治療に伴い破棄されていた歯胚の歯乳頭組織から多能性を有する間葉系幹細胞及び神経幹細胞を分離採取する方法を見出した。
【００１３】
本発明は、以下の発明を提供する。
１．  歯乳頭由来の幹細胞であって、間葉系幹細胞及び神経幹細胞からなる群から選ばれるいずれかの幹細胞。
２．  前記幹細胞が間葉系幹細胞である、項１に記載の幹細胞。
３．  前記幹細胞が神経幹細胞である、項１に記載の幹細胞。
４．  前記神経幹細胞がneurosphereを形成する項３に記載の幹細胞
５．  前記幹細胞が間葉系幹細胞であって、ＣＤ３４およびＣＤ４５を有さず、ＣＤ２９＋，ＣＤ９０及びＣＤ１０５からなる群から選ばれる少なくとも１種の表面抗原発現を有する項２に記載の幹細胞。
６．  WST-1法による細胞増殖能が、歯小嚢及び骨髄由来幹細胞よりも高い項１〜５のい
ずれかに記載の幹細胞。
７．  歯乳頭がヒトの歯乳頭である項１〜６のいずれかに記載の幹細胞。
８．  歯乳頭が、ヒトの第三大臼歯の歯乳頭である項７に記載の幹細胞。
９．  歯乳頭の接着細胞を採取することを特徴とする間葉系幹細胞の調製方法。
１０．  歯乳頭の浮遊細胞を採取することを特徴とする神経幹細胞の調製方法。
１１．  歯乳頭を蛋白質の分解酵素で処理し、得られた間葉系幹細胞を培養容器で培養し、該培養容器に接着した間葉系幹細胞を接着しないものから分離し、培養することを特徴とする項９に記載の方法。
１２．  歯乳頭から分離採取された間葉系幹細胞を初期培養した後、蛋白質の分解酵素で処理し、継代培養を行い増殖させる事を特徴とする歯乳頭由来の間葉系幹細胞の培養方法。
１３．  蛋白質の分解酵素がコラゲナーゼ、トリプシン、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼおよびディスパーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種である項１２に記載の方法
１４．  歯乳頭由来の間葉系幹細胞及び神経幹細胞から選択されるいずれかの幹細胞を、必要に応じて培養増殖後に分化誘導を行うことを特徴とする幹細胞の分化誘導方法。
１５．  歯乳頭がヒトの歯乳頭である項９〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．  歯乳頭由来の間葉系幹細胞及び神経幹細胞から選択されるいずれかの幹細胞の組織又は臓器の再生ないし修復のための使用。
１７．  歯乳頭由来の間葉系幹細胞及び神経幹細胞から選択されるいずれかの幹細胞或いはその分化誘導細胞を移植することを特徴とする、組織又は臓器の再生ないし修復のための方法。
１８．  歯乳頭由来の間葉系幹細胞及び神経幹細胞から選択される少なくとも１種の幹細胞の凍結保存細胞。
１９．  組織保存液と共に凍結してなる凍結保存歯胚もしくは歯乳頭。
２０．  歯乳頭由来の間葉系幹細胞及び神経幹細胞から選択される少なくとも１種の幹細
胞を細胞凍結保存液にて凍結保存することを特徴とする歯乳頭由来幹細胞の凍結保存方法。
２１．  歯乳頭又は歯胚を組織凍結保存液にて凍結保存することを特徴とする歯乳頭又は歯胚の凍結保存方法。
２２．  項１８に記載の凍結保存細胞、項１９に記載の凍結保存歯胚もしくは歯乳頭、項２０に記載の方法により得られた凍結保存細胞、項２１に記載の方法により得られた凍結保存歯胚もしくは歯乳頭の、組織又は臓器の再生ないし修復のための使用。
２３．  項１９に記載の凍結保存歯胚もしくは歯乳頭または項２０に記載の方法により得られた凍結保存歯胚もしくは歯乳頭を解凍し、項１２または１３に記載の処理を行うことを特徴とする間葉系幹細胞の培養方法。
２４．  歯乳頭由来の間葉系幹細胞または歯乳頭由来の神経幹細胞から分化誘導された細胞を直接又は生体材料に担持された状態で、ヒトを含む哺乳動物の患部に自家移植することを特徴とする移植方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、従来、歯科治療時に廃棄されていた歯乳頭から、多能性を有する間葉系幹細胞及び／又は神経幹細胞を採取することができる。また、ヒトの歯乳頭及び／又は歯胚を凍結保存しておき、神経、組織等の修復が必要な時に解凍し、歯乳頭由来の間葉系幹細胞及び／又は神経幹細胞の培養を行うことができるため、従来の手法に比べて組織の修復が必要になった時点において短時間で対処出来る効果がある。
【００１５】
また、歯乳頭由来の間葉系幹細胞は骨髄及び歯小嚢由来の幹細胞と比較して分化能および増殖能が優れており、多くの幹細胞が得られるだけでなく、種々の修復ないし再生すべき組織に幹細胞或いはその分化誘導細胞として移植したときに、組織の再生、修復能においても優れている。例えば歯乳頭由来の間葉系幹細胞は増殖出来るのみならず、種々の添加因子を加えることにより、生体外で骨細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、神経細胞、心筋細胞などの各種細胞への分化誘導も可能である。それ故、間葉系幹細胞自体又はこれらの分化細胞を各臓器ないし組織の修復部に移植して、組織を再生させることが可能となる。
【００１６】
ヒトの脳では１度障害された神経細胞は補充されないと考えられてきたが、神経幹細胞を用いて移植治療を行うことによって、パーキンソン病、ALS (筋萎縮性側索硬化症)、アルツハイマー病、てんかんの抑制に深く関わっているそれぞれの脳神経細胞を再生させることができる。こういった移植治療は、脳細胞の異常によって起こる難病を根本的に治療できる可能性がある。
【００１７】
例えばパーキンソン病は、中脳黒質の神経細胞（ドーパミンニューロン）が侵され、神経伝達物質であるドーパミンが減少し、手足などの運動障害が徐々に進行して行く病気である。本発明で得られる神経幹細胞を用いてドーパミン産生細胞を脳内に植え付けることができれば、パーキンソン病の治療が可能である。
【００１８】
岡野教授(慶應大学医学部生理学教室  教授)らは、ＥＳ細胞からパーキンソン病に関わりのあるドーパミン作動性神経細胞、ALSに関わりのある脊髄運動神経細胞、アルツハイ
マー病と関わりのある前脳型アセチルコリン作動性神経細胞、てんかん抑制と関わりのあるGABA 作動性神経細胞を作り出すことをすでに成功させている。しかしながら、ES細胞
を培養し、目的の神経細胞に分化・誘導することはきわめて難しい作業である。
【００１９】
一方、神経幹細胞からドーパミン作動性神経細胞、脊髄運動神経細胞、前脳型アセチルコリン作動性神経細胞、GABA 作動性神経細胞を作り出すことは、ＥＳ細胞を用いるより
もはるかに容易である。
【００２０】
従って、本発明で得られた歯乳頭由来の神経幹細胞は、パーキンソン病、ALS、アルツ
ハイマー病、てんかんの治療に極めて有用である。
【００２１】
なお、パーキンソン病は、中絶胎児の中脳から取った組織を移植する実験的治療がスウェーデンなどで行われ、改善が認められている。中絶胎児の細胞を使用することは倫理的にも供給面でも問題があるが、本発明の歯乳頭由来の神経幹細胞を使用すれば、このような問題なく脳神経系疾患の根本的な治療法を確立することができる。しかも、本人の凍結保存した歯乳頭又は歯胚を使用すれば、拒絶反応の問題も生じない。
【００２２】
歯乳頭は、歯並びの矯正或いは虫歯の治療時に得られる第三大臼歯（通称：親知らず）を利用することができる。特に、歯乳頭の石灰化により確認が可能な年齢（例えば１１〜１２才程度又はそれ以上、例えば１８〜２０才程度またはそれ以下、特に、１３〜１７才ないし１４〜１６才）において親不知の歯乳頭を摘出する場合、増殖能の高い間葉系幹細胞及び神経幹細胞を多く得ることができるため望ましい。
【００２３】
歯科矯正と同時或いは別個に歯胚もしくは歯乳頭を摘出した場合、該歯胚もしくは歯乳頭或いはそれから分離された間葉系幹細胞もしくは神経幹細胞は長期間（数年から数十年又はそれ以上）凍結保存することができ、脳、脊髄を含む神経、各種の臓器ないし組織の修復、再生、障害の治療が必要になった時点で解凍して使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
歯と歯周組織の原基である歯胚について説明する。
【００２５】
歯胚は最初、口腔粘膜上皮と間葉組織の増殖したものであり(図１)、その増殖したものが成熟し、エナメル器、歯乳頭、歯小嚢となる（図２）。歯胚は、エナメル器、歯乳頭、歯小嚢の３つの組織からなり、顎骨の中で歯に変化し、歯肉の上に萌出し歯としての機能を持つ。歯胚のエナメル器はエナメル質、歯乳頭は歯髄と象牙質、歯小嚢はセメント質、歯根膜、歯槽骨になり(図３)、歯が完成すると、エナメル質、象牙質、歯髄、セメント質、歯根膜、歯槽骨となる(図４)。
【００２６】
本発明でいう歯胚は、図４のような完成した歯を含まない。歯胚は歯乳頭を有するものであれば特に限定されず、図１のような初期の歯胚を利用することも可能であるが、通常は図２ないし図３のような歯乳頭と歯小嚢を有する段階のものが利用される。歯胚をレントゲンで確認する場合には、エナメル器などに石灰化が生じている方が望ましい。一方、歯乳頭の石灰化が進行しすぎると歯乳頭由来の間葉系幹細胞及び／又は神経幹細胞の取得が難しくなり、間葉系幹細胞／神経幹細胞の分化能と増殖能は低下する傾向にある。ヒトから歯乳頭を得る場合、約１０才〜約１８才程度（より好ましくは約１２才〜約１７才）の石灰化があまり進行していないヒトの歯乳頭を利用するのが好ましいが、もちろんより低年齢或いは高年齢のヒトであっても、間葉系幹細胞／神経幹細胞が分離できる歯乳頭であれば広く利用できる。ヒト以外の哺乳動物の場合にも、同様に石灰化していないか石灰化の程度が少ない歯乳頭を好ましく利用できる。
【００２７】
歯乳頭の供給源として、ヒト及び哺乳動物のいずれの歯乳頭も使用できるが、霊長類の歯乳頭が好ましく、特にヒト由来の歯乳頭が望ましい。ヒト由来の歯乳頭は、歯科矯正治療の前処置などによって施行される骨性埋伏の第三大臼歯の抜歯に伴い廃棄される歯胚を好ましく利用できる。
【００２８】
上記のように、歯胚はエナメル器、歯乳頭、歯小嚢の３つの組織からなるが、本発明の間葉系幹細胞と神経幹細胞は、歯乳頭から得られる。
【００２９】
歯乳頭を切り刻み、適当な緩衝液中において蛋白分解酵素を用いて処理し、間葉系幹細胞および神経幹細胞を遊離させ、これを他の細胞及び組織片と分離することで歯乳頭由来の間葉系幹細胞及び神経幹細胞を分離することができる。蛋白分解酵素としては、特に限定されないが、コラゲナーゼ、トリプシン、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、ディスパーゼが例示され、コラゲナーゼが好ましく使用される。
【００３０】
間葉系幹細胞は、接着細胞として分離することができ、神経幹細胞はneurosphereを形
成する浮遊細胞として分離することができる。
【００３１】
本発明の１つの実施形態における、歯乳頭から間葉系幹細胞及び神経幹細胞を採取する方法を以下に例示する。
【００３２】
（歯乳頭由来間葉系幹細胞の調製方法）
まずPBS（リン酸緩衝生理食塩水）にて摘出された歯胚(歯乳頭と歯小嚢)を十分に洗浄
し、歯乳頭を分離後、PBSに溶解させた0.04%コラゲナーゼ液中で歯乳頭を細かく切り刻む。その組織懸濁液を37℃に設定した振とう機で30分間振とうさせ、歯乳頭中の間葉系幹細胞及び神経幹細胞を遊離させた後、細胞培養用のα-MEM培地（Minimum Essential Medium-α）を加える。このようにして得られた細胞懸濁液（組織懸濁液にコラゲナーゼを反応
させて細胞を抽出したもの）を遠心分離機を用いて1500rpm、５分間遠心分離させ、上清
を取り除いた後、残留物にα-MEM培地を加えて再懸濁させる。この細胞懸濁液を直径10cmの細胞培養用培養皿に播種し、37℃、５％CO2に設定したインキュベーター内にて培養す
る。この様にして培養された間葉系幹細胞は、培養皿に接着するため、他のもの（浮遊細胞としての神経幹細胞や組織片）と分離して採取できる。同時に、神経幹細胞は、浮遊細胞からneurosphereを分離することにより得ることができる。
【００３３】
（歯乳頭由来神経幹細胞の調製方法）
まずPBS（リン酸緩衝生理食塩水）にて摘出された歯胚(歯乳頭と歯小嚢)を十分に洗浄
し、歯乳頭を分離後、PBSに溶解させた0.04%コラゲナーゼ液中で歯乳頭を細かく切り刻む。その組織懸濁液を37℃に設定した振とう機で30分間振とうさせ、細胞培養用のα-MEM培地（Minimum Essential Medium-α）を加える。このようにして得られた細胞懸濁液（組
織懸濁液にコラゲナーゼを反応させて細胞を抽出したもの）を遠心分離機を用いて1500rpm、５分間遠心分離させ、上清を取り除いた後、残留物にDMEM/F12 mediumに20ng/ml EGF(epidermal growth factor),20ng/ml FGF-basic(fibroblast growth factor-basic),10ng/ml LIF(leukemia inhibitory factor)および20μl/ml B-27 supplementを加えた培地７mlにて再懸濁させる。全量をT-25フラスコに播種し、37℃、５％CO2に設定したインキュベ
ーター内にて浮遊培養する。この様にして浮遊培養された神経幹細胞は、neurosphereと
呼ばれる細胞塊を形成する。
分離採取した間葉系幹細胞及び神経幹細胞は、それ自体を神経、組織再生などの移植用に使用してもよいが、分離採取した間葉系幹細胞／神経幹細胞は数が少ないので、初代培養、継代培養し間葉系幹細胞／神経幹細胞を増殖させて再生させる組織等に用いることができる。継代培養は、通常２〜６代、好ましくは２〜４代行う。
培養して得られた間葉系幹細胞及び神経幹細胞は、ひきつづいて添加因子を加えて分化誘導を行い組織の再生および治療用の細胞を調整することができる。添加因子としては：
骨細胞への分化：デキサメサゾン、β-グリセロホスフエイト、ビタミンC。
軟骨細胞への分化：デキサメサゾン、ビタミンC、ITS(インシュリントランスフェリンセ
レニウム)、リノレン酸 、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸 Na、 L-プロリン、TGF-β3
、BMP-2(骨形成蛋白)。
肝細胞への分化： ITS(インシュリントランスフェリンセレニウム)、ウシ血清アルブミン、デキサメサゾン、HGF(肝細胞増殖因子)。
膵臓細胞への分化：HGF、exexdin-4、activin-A、b-FGF(線維芽細胞成長因子)、DMSO（dimethylsulfoxide）、BHA (buthylated hydroxyanisole)、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、EGF(上皮細胞成長因子)、ニコチンアミド。
【００３４】
脂肪細胞への分化：デキサメサゾン、メチルイソブチルキサンチン、インシュリン。
【００３５】
神経細胞への分化：β-メルカプタノール(BME)、DMSO（dimethylsulfoxide）,BHA (buthylated hydroxyanisole)などが例示される。
【００３６】
以下に、歯乳頭から採取・分離した間葉系幹細胞及び神経幹細胞の培養方法を説明する。
（歯乳頭由来間葉系幹細胞の継代培養方法）
前記記載のコラゲナーゼ処理にて得られた歯乳頭由来の培養間葉系幹細胞を、直径10cmの細胞培養用培養皿に播種し、37℃、５％CO2に設定したインキュベーター内にて初代培
養を行う。使用する培養液は、ウシ胎児血清(FBS)を含有した細胞培養用のα-MEM培地で
ある。培養液は１週間に３回の割合で交換する。培養液の交換の際に細胞の増殖を顕微鏡観察し、コンフルエント状態になったらトリプシン-EDTA溶液(0.05%トリプシン0.53mM EDTA)を用いて細胞を回収し、細胞数を計測する。900rpm、3分間遠心分離させ上清を取り除いた後、残留物にα-MEM培地を加えて再懸濁させる。5x105個の細胞を13mlのα-MEM培地
に懸濁しT-75のフラスコに播種し37℃、５％CO2に設定したインキュベーター内にて継代
培養する。なお、この継代培養にて細胞は増殖し細胞数を増加させることができる。
【００３７】
（歯乳頭由来神経幹細胞の継代培養方法）
neurosphereと呼ばれる細胞塊はトリプシン処理をすることにより継代培養することが
できる。フラスコよりneurosphereを含む細胞懸濁液を15mlチューブに移し、遠心分離機
を用いて900rpm、５分間遠心分離させ、上清を取り除いた後、残留物に1mlのトリプシン-EDTA溶液(0.05%トリプシン0.53mM EDTA)を用いて3分間インキュベートしピペットにてピ
ペッティングしneurosphere（細胞塊）をバラバラにし1mlのTI(トリプシンインヒビター)にてトリプシン-EDTA溶液の反応を停止させる。10mlのDMEM/F12 mediumを洗い用培地として加え、900rpm、５分間遠心分離させ、上清を取り除いた後、再びDMEM/F12 mediumに20ng/ml EGF(epidermal growth factor),20ng/ml FGF-basic(fibroblast growth factor-basic),20ng/ml LIF(leukemia inhibitory factor)および10μl/ml B-27 supplementを加え
た培地７mlにて再懸濁させ、全量をT-25フラスコに播種し、37℃、５％CO2に設定したイ
ンキュベーター内にて浮遊培養する。
【００３８】
このように、この培養により間葉系幹細胞及び神経幹細胞を増殖させる事が可能で、この培養間葉系幹細胞ないし培養神経幹細胞を用いて、種々疾患の治療が可能である。例えば、骨・軟骨再生には間葉系幹細胞の濃度を１×１０６〜１×１０８  個／mlの比較的高濃度に調整し、これを種々セラミックス、金属材料、生体吸収性あるいは非吸収性ポリマーなどの足場材に播種し、１〜２４時間の短期間培養することによって足場材に高密度で接着せしめた後、直接骨欠損あるいは軟骨欠損等に移植することにより、間葉系幹細胞が移植された部位で骨組織あるいは軟骨組織に分化させる事が可能である。
【００３９】
虚血性の心筋の回復や拡張型心筋症の治療、もしくは慢性末梢性動脈閉塞性疾患（糖尿病性壊死、動脈硬化性閉塞症、バージャー病など）においては間葉系幹細胞そのものを患部に注入する。その場合用いられる細胞数は患部あたり１×１０７〜１×１０９個が例示される。
【００４０】
さらに、脊髄疾患たとえば脊髄損傷の脊髄に細胞を移植することも可能である。
【００４１】
また、幹細胞は障害組織に蓄積されることがわかってきたので、この培養間葉系幹細胞／神経幹細胞は種々の疾患の治療に全身投与される事も可能である。例えば、神経幹細胞は、パーキンソン病、ALS、アルツハイマー病、てんかん等の治療のために、必要に応じ
て適切な神経細胞に分化させた後に投与使用され得る。また、間葉系幹細胞は、肝疾患、心疾患、膵疾患等に投与され得る。
【００４２】
さらにこの培養間葉系幹細胞又は神経幹細胞に種々分化誘導因子を添加し、骨芽細胞、軟骨細胞、肝細胞、神経細胞（ドーパミン作動性神経細胞、脊髄運動神経細胞、前脳型アセチルコリン作動性神経細胞、GABA 作動性神経細胞等）など各種細胞への分化誘導し、
この分化細胞を各組織の修復部に移植して、組織を再生する事も可能である。
【００４３】
たとえば、骨欠損等を有する骨疾患の場合、間葉系細胞をハイドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウム系セラミックに播種して培養する。培地の交換の際にデキサメサゾン、β−グリセロ燐酸、ビタミンＣを添加して１０日から２８日ほど培養することにより、骨芽細胞と骨基質を誘導することが可能であり、この分化細胞（骨芽細胞）と骨基質を骨欠損部に移植する。
【００４４】
上記記載の培養液において、ウシ胎児血清(FBS)を含有した細胞培養用のα-MEM培地以
外にヒト血清を含有した細胞培養用のα-MEM培地にて培養する事も可能である。また、α-MEM溶液の成分系と実質的に同等な培地であれば、その培地も使用可能である。
【００４５】
本発明の１つの実施形態において、培養した間葉系幹細胞及び／又は神経幹細胞を、将来の必要時のために凍結保存する方法を提供する。分離培養した間葉系幹細胞もしくは神経幹細胞、或いはそれを初代培養および継代培養した細胞を細胞保存液にて凍結保存する。間葉系幹細胞及び神経幹細胞の場合、細胞の継代操作の際に継代培養に使用する細胞懸濁液以外の余った細胞懸濁液を900rpm、3分間遠心分離させ上清を吸引し、残留した細胞
を回収し、DMSO（dimethylsulfoxide）が含まれる細胞保存液にて再懸濁し-80℃以下の冷凍庫にて凍結保存させることができる。
【００４６】
細胞保存液としては、セルバンカー(日本全薬製)、バンバンカー(リンフォテック製)、Cellvation(Celox Laboratories製)などが例示される。
【００４７】
そして、患者の治療に幹細胞が必要になった時は、凍結保存していた細胞を急速解凍し細胞培養用の培地にて懸濁する。900rpm、3分間遠心させ上清を取り除いた後、残留物に
α-MEM培地を加えて間葉系幹細胞を再懸濁させる。5x105個の細胞を13mlのα-MEM培地に
懸濁しT-75のフラスコに播種し37℃、５％CO2に設定したインキュベーター内にて培養す
る。神経幹細胞は、上記の調製、培養条件を参照して、同様に凍結保存歯胚ないし凍結保存歯乳頭から容易に調製及び培養することができる。
【００４８】
この培養により間葉系幹細胞ないし神経幹細胞を増殖する事が可能で、この解凍後の培養間葉系幹細胞もしくは神経幹細胞を用いて、種々疾患の治療が可能である。
【００４９】
疾患治療の際の播種される細胞濃度、疾患の種類等は、非凍結／解凍の間葉系幹細胞／神経幹細胞と同様である。
【００５０】
本発明の別の実施形態においては、歯乳頭もしくは歯乳頭を含む歯胚を、将来の必要時のために凍結保存する。歯乳頭もしくは歯乳頭を含む歯胚そのものをUW液［University of Wisconsin solution(ViaSpan製)］などの組織保存液にて浸漬しプログラムフリーザー
にて冷却し-80℃以下の冷凍庫にて凍結保存させる。そして、患者の治療に間葉系幹細胞
もしくは神経幹細胞が必要になった時は、凍結保存していた組織を解凍しPBSにて十分に
洗浄し、以下、凍結・解凍していない歯乳頭と同様に処理することにより間葉系幹細胞および神経幹細胞を得ることができ、必要に応じてさらに分化された細胞に導くことができる。
【００５１】
本発明の歯乳頭由来の間葉系幹細胞は、以下の表面抗原発現パターンを有する。
(1) CD29，CD90及びCD105からなる群から選ばれる少なくとも１種の表面抗原を発現する
。
(2) CD34を有さない（CD34が陰性(negative)である；CD34-）
(3) CD45を有さない（CD45が陰性(negative)である；CD45-）
歯乳頭由来の間葉系幹細胞は、150日間増殖し続け(図５)、その後も増殖し続けている
。さらに、歯乳頭由来の間葉系幹細胞は骨髄由来の間葉系幹細胞及び歯小嚢由来の間葉系幹細胞と比較しても明らかに増殖能が高い（図１２）。神経幹細胞も間葉系幹細胞と同様に高い増殖能が期待される。
【００５２】
本発明の歯乳頭由来の間葉系幹細胞は、肝細胞にほぼ１００％分化する点に特徴を有し、膵臓細胞、胆嚢細胞等への分化も容易に行えると期待される。
【００５３】
また、本発明の歯乳頭由来の間葉系幹細胞及び神経幹細胞は、分化誘導によりマーカーを発現するだけでなく、機能的にも優れた分化細胞に誘導することができ、再生医療において非常に有用なツールとなる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１）
（ヒト歯乳頭由来間葉系細胞の分離）
骨性埋伏第３大臼歯抜歯時に摘出される歯胚(歯乳頭と歯小嚢)を、10%抗生剤入りPBSにて十分に洗浄後歯乳頭と歯小嚢を分離し、コラゲナーゼをPBSに溶解させた0.04%コラゲナーゼ液中で歯乳頭を細かく切り刻む。その組織懸濁液を37℃に設定した振とう機で30分間振とうさせ、細胞培養用のα-MEM培地（Minimum Essential Medium-α）を加える。作製し
た細胞懸濁液を遠心分離機を用いて1500rpm、５分間遠心分離させ、上清を取り除いた後
、残留物にα-MEM培地を加えて再懸濁させる。5x105個の細胞を13mlのα-MEM培地に懸濁
しT-75のフラスコに播種し37℃、5％CO2に設定したインキュベーター内にて培養する。以後、週に数回培地を交換するごとに浮遊細胞が除去され、フラスコに接着する間葉系幹細胞が増殖する。
実施例２）
（ヒト歯乳頭由来間葉系細胞のクローン化）
歯乳頭から分離採取された細胞から間葉系細胞を前記のごとく増殖させたのち、希釈法によりクローニングを試みた。これにより、一つの歯乳頭より、36のクローニング細胞が得られ、150日間増殖しつづけたデータが確認され(図５)、その後も増殖し続けている。
歯乳頭由来の間葉系幹細胞１個から、１５０日間の培養で１×１０１８個を超える数まで増殖可能であることを確認した。
【００５５】
このように、歯乳頭由来間葉系幹細胞から種々のクローン細胞が得られる。
【００５６】
歯乳頭由来間葉系幹細胞の表面抗原発現を調べた結果を図１１に示す。
歯乳頭由来間葉系幹細胞の表面抗原発現パターンは、CD29+，CD34-, CD45-, CD90+及びCD105+であった。
【００５７】
また、歯乳頭由来間葉系幹細胞と骨髄由来の間葉系幹細胞と歯小嚢由来の間葉系幹細胞
の増殖能をWST-1法にて比較した結果を図１２に示す。図１２は、歯乳頭由来間葉系幹細
胞の増殖能が明らかに大きいことを示す。
実施例３）
（骨細胞への分化）
歯乳頭組織から分離採取された間葉系幹細胞の培養時の培地交換の際に100nMデキサメ
サゾン、10mM β-グリセロ燐酸、20.5μg/ml  ビタミンCを添加し14日間分化誘導させ、
骨組織の修復部に移植して組織の再生を行う。本細胞は、骨細胞に特徴的なアルカリファオスファターゼ活性(ALP活性)を示し(図６)、カルシウムの沈着を示すアリザリンレッド
染色にて染色された(図７)。また、歯乳頭、歯小嚢及び骨髄由来の間葉系幹細胞の石灰化度を、カルシウム親和性蛍光色素（カルセイン）を加えて培養し、その蛍光強度（カルセイン値）を用いて比較した結果を図１３に示し、骨分化誘導による歯乳頭及び歯小嚢由来の間葉系幹細胞のオステオカルシン（骨特異的タンパク質）の発現量の比較を図１４に示す。
【００５８】
歯乳頭由来の骨細胞は歯小嚢、骨髄由来の骨細胞と比較して石灰化度が有意に高く、オステオカルシンのタンパク量は９倍近く高値であり、歯乳頭由来の間葉系幹細胞が骨への分化誘導能が著しく高いことが証明された。
実施例４）
（歯乳頭から分離採取された間葉系幹細胞と生体材料との複合体による骨組織の再生）
骨再生に関しては、歯乳頭由来の培養間葉系幹細胞を１×１０４〜１×１０６  cells／
ｍLに調整し、水酸アパタイト、多孔質の三燐酸カルシウム等のリン酸カルシウム系セラ
ミックおよび多孔体の炭酸カルシウム、表面多孔体構造を持つアルミナ、チタンを主成分とする生体用金属に一様に播種する。その後、定期的にβ-グリセロ燐酸、ビタミンC及びデキサメサゾンを添加した培地の交換を行い、７日以上２８日未満の間培養し免疫不全ラットへ移植し、骨組織を確認する（図８）。
実施例5）
（軟骨細胞への分化）
歯乳頭由来の培養間葉系幹細胞を15mlファルコンチューブの中に３×１０５の細胞を入れ4℃ 900rpm 5minにて遠心しペレット作製。DMEM培地(high glucose)に100nM デキサメ
サゾン、50μg/ml  ビタミンC、6.25μg/ml ITS(インシュリントランスフェリンセレニウム)、 5.33μg/mlリノレン酸、 1.25mg/mlウシ血清アルブミン、100μg/ml  ピルビン酸 Na、 40μg/ml L-プロリンを添加した培地にて培養し、培地交換ごとに10ng/ml TGF-β3
、 125ng/ml  BMP-2(骨形成蛋白)を添加し培養することで、軟骨細胞への分化が確認できた。軟骨細胞分化の確認はトルイジンブルー染色にて確認された。
実施例６）
（肝細胞への分化）
歯乳頭由来の培養間葉系幹細胞をさらにDMEM培地(low glucose) に 1.0g/l ITS(インシュリントランスフェリンセレニウム)、1mg/mlウシ血清アルブミン、10nM デキサメサゾン、20ng/ml HGF(肝細胞増殖因子) および10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したものを用いた。この培養によりすべての細胞からアクチンの発現がみられたが、肝細胞の合成蛋白であるアルブミンの発現が見られない細胞もHGF(肝細胞増殖因子)添加によりアルブミンのmRNA
の発現が確認され、肝細胞への分化が確認できた。（図９）
実施例７）
（脂肪細胞への分化）
歯乳頭由来の培養間葉系幹細胞を15%ウシ胎児血清(FBS)を含有した細胞培養用のDMEM培地(low glucose)にて培養後、DMEM培地に1μMのデキサメサゾン、0.5 mMのメチルイソブ
チルキサンチンを添加した培地にて３日間培養し、DMEM培地に10μg/mlのインシュリンを単独添加した維持培地と交換して１日培養し、同処理を２回繰り返して１週間維持培地にて培養すると脂肪細胞への分化がみられた。脂肪細胞への分化はオイルレッドO染色によ
る染色にて確認された。
実施例8）
（神経細胞への分化）
歯乳頭由来の培養間葉系幹細胞を20％ウシ胎児血清(FBS)を含有した細胞培養用のDMEM
培地(low glucose)にて培養後、20％ウシ胎児血清(FBS)を含有した細胞培養用のDMEM培地に1mM β-メルカプタノール(BME)を添加したもので24時間培養し、PBSにて洗浄後しDMEM
培地に1-10mM BMEを添加したもので培養後、DMEM培地に2% DMSO （dimethylsulfoxide）
、200μM BHA (buthylated hydroxyanisole)を添加したもので培養し神経細胞に分化させる。これにより神経幹細胞のマーカーであるネスチンを強く発現する細胞が現れ、さらに培養を続けると神経細胞を想定される細胞突起を有する多数の細胞がみられた。(図１０)実施例9）
さらに、歯乳頭由来の培養間葉系幹細胞をDMSO（dimethylsulfoxide）が含まれる細胞
保存液にて再懸濁し-80℃以下の冷凍庫にて凍結保存させる事が可能であるが、表１に示
すように少なくとも２ヶ月以上-80℃以下の冷凍庫にて凍結保存し解凍した細胞の生存率
は90％以上であることが確認された。
【００５９】
歯乳頭組織から分離採取された間葉系幹細胞細胞をDMSO（dimethylsulfoxide）が含ま
れる細胞保存液にて再懸濁し-80℃以下の冷凍庫にて凍結保存させ解凍後の細胞の生存率
を示す表。少なくとも２ヶ月以上の凍結保存した細胞はいずれも90％以上の生存率を示す。
【００６０】
【表１】
2006238875.tif 000003
【００６１】
なお、神経幹細胞についても、凍結保存歯胚ないし凍結保存歯乳頭を解凍後の細胞生存率は９０％以上であると予測される。
実施例１０）
歯乳頭をDMEM/F12 mediumに20ng/ml EGF(epidermal growth factor),20ng/ml FGF-basic(fibroblast growth factor-basic),10ng/ml LIF(leukemia inhibitory factor)および20μl/ml B-27 supplementを加えた培地にて浮遊培養して得られたNeurosphere(細胞塊)をpoly-L-ornitineにてコーティングした培養容器にプレートし浮遊培養の培地からEGF(epidermal growth factor),FGF-basicおよびLIFを除き、１％FBS(ウシ胎児血清)を加えて２
週間培養すると、グリア細胞のマーカーであるGFAP(grail fibrillary acidic protein)
を発現する細胞が認められた。
【００６２】
図１５に、Neurosphere(細胞塊)を示し、図１６にグリア細胞（アストロサイトの一種
）を示す。
実施例１１)間葉系幹細胞の膵臓細胞への分化
歯乳頭由来の培養間葉系幹細胞を、20％ウシ胎児血清(FBS)を含有した細胞培養用のDMEM培地(high glucose)にて24時間培養した。その後、20％ウシ胎児血清(FBS)を含有した細胞培養用のDMEM培地(high glucose)に10ng/ml b-FGF(線維芽細胞成長因子)を添加したも
ので24時間培養し、続いてDMEM培地(high glucose)に１% DMSO（dimethylsulfoxide）、100μM BHA (buthylated hydroxyanisole)、10nmol/ml exexdin-4（糖尿病薬の１種）を添
加したもので24時間培養する。さらに10％ウシ胎児血清(FBS)を含有したRPMI培地(Gibco)に11.1mmol/l  グルコース1mM、10mmol/l  HEPES、1.0mmolピルビン酸ナトリウム、20ng/ml b-FGF、 20ng/ml EGF(上皮細胞成長因子)、10nmol/ml exexdin-4を添加したもので4日間培養する。最後に、RPMI培地(Gibco)に2.5mmol/l  グルコース、10mmol/l  HEPES、10mmol/l  ニコチンアミド、100pmol/l HGF(肝細胞増殖因子)、10nmol/ml exexdin-4、activin-Aを添加したもので7日間培養し膵臓細胞に分化させる。これにより膵臓β細胞に特異
的なマーカーであるISL1のｍRNAの発現が見られ、膵臓細胞に分化したことが確認された
。
実施例１２) 歯乳頭由来の培養間葉系幹細胞の未分化マーカーの発現
歯乳頭由来の培養間葉系幹細胞のクローニングによって得られた細胞のmRNAの発現を調べたところ、ES細胞の未分化マーカーであるOct-4、Rex-1、Nanogの発現がみられ、歯乳
頭由来の培養間葉系幹細胞がES細胞様の未分化な細胞であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】口腔粘膜上皮と間葉組織からなる初期の歯胚を示す。
【図２】エナメル器、歯乳頭、歯小嚢を有する成熟した歯胚を示す。
【図３】歯胚から歯の完成の中間段階を示す。この段階で、エナメル器はエナメル質、歯乳頭は歯髄と象牙質、歯小嚢はセメント質、歯根膜、歯槽骨になる。
【図４】エナメル質、象牙質、セメント質、歯根膜からなる完成した歯を示す。
【図５】歯乳頭組織から分離採取された間葉系幹細胞細胞を細胞数1cell/wellにて播種し１５０日間培養し増殖させた。その培養日数と細胞数の増加を表すグラフ。
【図６】Dex（＋）：歯乳頭組織から分離採取された間葉系幹細胞細胞を100nM デキサメサゾン、10mM β-グリセロ燐酸、20.5μg/ml  ビタミンC添加にて分化誘導し、測定したDNA量あたりのアルカリファオスファターゼ活性値(ALP活性値)のグラフ。Dex（-）：歯乳頭組織から分離採取された間葉系幹細胞細胞をβ-グリセロ燐酸、20.5μg/mlのみ添加し培養し測定したDNA量あたりのアルカリファオスファターゼ活性値(ALP活性値)のグラフ。骨細胞に特徴的なアルカリファオスファターゼ活性値(ALP活性値)がDex（-）と比較してDex（＋）にて高値を示す。
【図７】Dex（＋）：歯乳頭組織から分離採取された間葉系幹細胞細胞を100nMデキサメサゾン、10mM β-グリセロ燐酸、20.5μg/ml  ビタミンC添加にて分化誘導し、アリザリンレッド染色した写真。Dex（-）：β-グリセロ燐酸、20.5μg/mlのみ添加し培養し、アリザリンレッド染色した写真。骨分化の石灰化沈着に染色性を示すアリザリンレッド染色において、Dex（-）と比較してDex（＋）にて高い染色性を示す。
【図８】歯胚(歯乳頭と歯小嚢)組織から分離採取された間葉系幹細胞細胞をハイドロキシアパタイトに１×１０７個／ml播種し、ヌードラットの皮下に６週間移植後摘出したヘマトキシリンエオジン染色の標本にて骨組織の確認を示す図。
【図９】歯乳頭組織から分離採取された間葉系幹細胞細胞を肝細胞へ分化誘導し、肝細胞の合成酵素であるアルブミンのmRNA発現を示す図。１はα−MEM培地に15%FBSを用いて培養し、アルブミンのmRNA発現を示していない。２はDMEM培地(low glucose) に1.0g/l ITS(インシュリントランスフェリンセレニウム)、1mg/ml BSA、10nM デキサメサゾン、20ng/ml HGF および10%FBSを添加したものを用いて培養し、アルブミンのmRNA発現を示した。
【図１０】歯乳頭組織から分離採取された間葉系幹細胞細胞を、20％ウシ胎児血清(FBS)を含有した細胞培養用のDMEM培地(low glucose)にて培養後、20％ウシ胎児血清(FBS)を含有した細胞培養用のDMEM培地に1mM β-メルカプタノール(BME)を添加したもので24時間培養し、PBSにて洗浄後しDMEM培地に1-10mM BMEを添加したもので培養後、DMEM培地に2% DMSO （dimethylsulfoxide）、200μM BHA (buthylated hydroxyanisole)を添加したもので培養し神経細胞に分化させた細胞の顕微鏡所見。
【図１１】歯乳頭由来間葉系幹細胞の表面抗原発現。
【図１２】歯乳頭由来間葉系幹細胞と骨髄由来間葉系幹細胞と歯小嚢由来間葉系幹細胞のWET-1法による増殖能の比較。
【図１３】デキサメサゾンによって骨分化誘導させた歯乳頭細胞と歯小嚢細胞と骨髄細胞の石灰化度をカルシウム親和性蛍光色素（カルセイン）を加えて培養し、その蛍光強度によって比較した。その結果、歯小嚢細胞と比較して歯乳頭細胞の石灰化度が著しく高値を示した。
【図１４】デキサメサゾンによって骨分化誘導させた歯乳頭細胞と歯小嚢細胞のオステオカルシン（骨特異的マーカー）のタンパク量を比較した。その結果、歯小嚢細胞と比較して歯乳頭細胞のオステオカルシン発現量が著しく高値を示した。
【図１５】歯乳頭由来神経幹細胞を浮遊培養し形成されたneurosphereを示す。
【図１６】歯乳頭由来神経幹細胞が形成したneurosphere(神経幹細胞が形成する凝集塊)を、DMEM/F12に1%FBS(ウシ胎児血清)および2%B-27supplementを添加した分化誘導培地で培養させた。その結果、中枢神経系を形成するアストロサイト(神経幹細胞が分化した細胞で、中枢神経系を構成する主要な細胞腫の１つ。)が認められ、免疫染色によってGFAP(アストロサイトマーカー)の染色が確認された。
【図１】
2006238875.tif 000004
【図２】
2006238875.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2006238875.tif 000010
【図８】
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【図９】
2006238875.tif 000012
【図１０】
2006238875.tif 000013
【図１１】
2006238875.tif 000014
【図１２】
2006238875.tif 000015
【図１３】
2006238875.tif 000016
【図１４】
2006238875.tif 000017
【図１５】
2006238875.tif 000018
【図１６】
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