(57)【要約】【課題】非特異的吸着が少ない磁気微粒子およびその製造方法を提供すること。【解決手段】本発明の磁気微粒子の製造方法は、（ａ）目的ポリペプチドとアンカータンパク質との融合タンパク質が発現している磁気微粒子の表面から、前記融合タンパク質以外のポリペプチドを除去する工程を含む。【選択図】図９
2006314314.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）目的ポリペプチドとアンカータンパク質との融合タンパク質が発現している磁気微粒子の表面から、前記融合タンパク質以外のポリペプチドを除去する工程を含む、磁気微粒子の製造方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記工程（ａ）で用いる前記磁性微粒子は、その表面に膜を有し、
前記工程（ａ）は、前記融合タンパク質以外のポリペプチドとともに、前記膜を除去する工程を含み、
前記工程（ａ）の後、（ｂ）前記磁気微粒子の表面に別の膜を形成する工程をさらに含む、磁気微粒子の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記工程（ａ）の前に、（ｃ）前記融合タンパク質をコードするＤＮＡが挿入されているＤＮＡコンストラクトを細菌に導入し、該細菌を培養して前記磁気微粒子を生成させ、該細菌から該磁気微粒子を単離する工程をさらに含む、磁気微粒子の製造方法。
【請求項４】
請求項３において、
前記細菌は磁性細菌である、磁気微粒子の製造方法。
【請求項５】
請求項３または４において、
前記ＤＮＡコンストラクトは、発現ベクターを含み、
前記発現ベクターは、磁性細菌内で転写制御可能なＤＮＡ断片をプロモーターとして含み、かつ、前記ＤＮＡ断片の下流に、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡが挿入されている、磁気微粒子の製造方法。
【請求項６】
請求項５において、
前記ＤＮＡ断片は、下記（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡ断片である、磁気微粒子の製造方法。
（１）配列番号１、２、３および４のいずれかにより表される塩基配列を有するＤＮＡ断片、
（２）配列番号１、２、３および４のいずれかにより表される塩基配列において１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、付加されている塩基配列を有し、かつ細菌においてプロモーター活性を有するＤＮＡ断片、
（３）配列番号１、２、３および４のいずれかにより表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ細菌においてプロモーター活性を有するＤＮＡ断片。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかにおいて、
前記アンカータンパク質は、磁性細菌粒子膜タンパク質またはそのフラグメントである、磁気微粒子の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかにおいて、
前記アンカータンパク質はＭｍｓ１３である、磁気微粒子の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかにおいて、
前記工程（ａ）において、尿素、チオ尿素、界面活性剤、塩基、および塩から選択される少なくとも１つを用いて、前記融合タンパク質以外のポリペプチドを除去する、磁気微粒子の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかにおいて、
前記工程（ｂ）において、リン脂質を用いて前記別の膜を形成する、磁気微粒子の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかにおいて、
前記アンカータンパク質が、配列番号８により表されるアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸１−８７を有する、磁気微粒子の製造方法。
【請求項１２】
目的ポリペプチドとアンカータンパク質との融合タンパク質が発現している磁気微粒子の表面から、前記融合タンパク質以外のポリペプチドを除去する工程により得られる、磁気微粒子。
【請求項１３】
目的ポリペプチドとアンカータンパク質との融合タンパク質および膜が発現している磁気微粒子の表面から、前記融合タンパク質以外のポリペプチドおよび前記膜を除去する工程、および
前記磁気微粒子の表面に別の膜を形成する工程により得られる、磁気微粒子。
【請求項１４】
請求項１２または１３において、
前記アンカータンパク質が、配列番号８により表されるアミノ酸配列を有する、磁気微粒子。
【請求項１５】
請求項１２または１３において、
前記アンカータンパク質が、配列番号８により表されるアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸１−８７を有する、磁気微粒子。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれかにおいて、
前記目的ポリペプチドが抗体である、磁気微粒子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の磁気微粒子を、前記抗体と特異的に結合する細胞に接触させ、該細胞を磁気分離する工程を含む、細胞分離方法。
【請求項１８】
請求項１２〜１５のいずれかに記載の磁気微粒子を、前記目的ポリペプチドと特異的に結合するターゲット分子に接触させ、該ターゲット分子を磁気分離する工程を含む、ターゲット分子の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁気微粒子およびその製造方法、細胞分離方法、ならびにターゲット分子の分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、人工臓器やドラッグデリバリーシステム、細胞工学デバイス、バイオチップなど、医療分野を主とした幅広い分野への応用を目的として、様々な生体適合性マテリアルが開発されている。なかでも、磁気微粒子は磁気回収が容易であるため、バイオセンサやイムノセンサのためのタンパク質固定化担体、ドラッグキャリア、細胞分離技術などへの応用が期待されている。このため、磁気微粒子の作製方法やその応用に関して、多くの研究が行われている。
【０００３】
磁気微粒子の作製方法としては、例えば、鉄イオンを封入した直径３０ｎｍ以下のリポソームを作製し、反応場を制御することでリポソーム内部に３−５ｎｍのマグネタイトを生成させる方法や、鉄イオンを封入した界面活性剤の逆ミセルを作製し、反応場に二酸化ケイ素を加えることにより、シリカ膜で覆われた直径５−７ｎｍのシリカ膜マグネタイト粒子を作製する方法が報告されている。また、例えば、二酸化ケイ素に対する活性を有するタンパク質を反応場に加えて、シリカ膜を有するマグネタイト粒子を封入した逆ミセルを融合することにより、複数のシリカ膜を有するマグネタイト粒子を含む、直径５０ｎｍ前後のタンパク質含有ナノシリカ粒子を作製する方法が報告されている。
【０００４】
一方、磁性細菌の菌体内において産生される磁気微粒子が知られている。この磁気微粒子またはその菌体自体は、磁石を用いることにより溶液から容易に分離することが可能であるため、タンパク質の製造および単離、ならびに様々な物質の回収、探索、検出および定量に有用である。この磁気微粒子は、磁気微粒子膜と称されるリン脂質を主成分とする有機膜で被覆されており、この膜には種々の膜タンパク質が存在する。
【０００５】
例えば、ＡＭＢ−１株の磁気微粒子膜上に存在する膜タンパク質としては、ＭａｇＡタンパク質、ＭｐｓＡタンパク質、Ｍｍｓ１６タンパク質などが同定されている（特開平８−２２８７８２号公報，国際公開９７／３５９６４号パンフレット、特開２００２−１７６９８９号公報）。また、これらの膜タンパク質をアンカータンパク質として利用して、ルシフェラーゼ（Nakamura, T., et al., J. Biochem., 118, 23-7 (1995)）、プロテインＡ（Tanaka, T., et al., Anal. Chem., 72, 3518-22 (2000)）、Ｇタンパク質共役受容体（Yoshino, T., et al., Appl. Environ. Microbiol., 70, 2880-5 (2004)）などの有用タンパク質を発現させる方法が開発されている。
【０００６】
一方、例えば上述した用途においては、測定精度を向上させるために、分散性に優れ、かつ、非特異的吸着が少ない磁気微粒子の開発が求められている。
【特許文献１】特開平８−２２８７８２号公報
【特許文献２】国際公開９７／３５９６４号パンフレット
【特許文献３】特開２００２−１７６９８９号公報
【非特許文献１】Nakamura, T., et al., J. Biochem., 118, 23-7 (1995)
【非特許文献２】Tanaka, T., et al., Anal. Chem., 72, 3518-22 (2000)
【非特許文献３】Yoshino, T., et al., Appl. Environ. Microbiol., 70, 2880-5 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、非特異的吸着が少ない磁気微粒子およびその製造方法、ならびに前記磁気微粒子を用いた細胞分離方法およびターゲット分子の分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１．本発明の磁気微粒子の製造方法は、
（ａ）目的ポリペプチドとアンカータンパク質との融合タンパク質が発現している磁気微粒子の表面から、前記融合タンパク質以外のポリペプチドを除去する工程を含む。
【０００９】
本発明において、「ポリペプチド」とは、複数のペプチド結合を含む物質のことをいい、「ペプチド」および「タンパク質」の両方を包含する概念である。一般に、「ペプチド」とは、ポリペプチドを含む高分子のうち、分子量１万以下のものをいい、「タンパク質」とは、ポリペプチドを含む高分子のうち、分子量１万以下のものをいう。
【００１０】
また、本発明において、「目的ポリペプチド」とは、磁気微粒子の表面に発現させることが望まれる任意のポリペプチドをいう。
【００１１】
さらに、本発明において、「融合タンパク質」とは、２以上のタンパク質またはその断片が連結されている、天然には見いだされないタンパク質をいう。融合タンパク質は、それぞれのタンパク質またはその断片をコードする遺伝子をインフレームで連結させて、組換え的に発現させることにより製造することができる。
【００１２】
さらに、本発明において、「アンカータンパク質」とは、細胞膜上または磁気微粒子膜上にその一部または全部が結合して発現されるタンパク質であって、これを含む融合タンパク質を膜にアンカリングさせる役割を有する。
【００１３】
ここで、上記本発明の磁気微粒子の製造方法において、前記工程（ａ）で用いる前記磁性微粒子は、その表面に膜を有し、前記工程（ａ）は、前記融合タンパク質以外のポリペプチドとともに、前記膜を除去する工程を含み、前記工程（ａ）の後、（ｂ）前記磁気微粒子の表面に別の膜を形成する工程をさらに含むことができる。
【００１４】
また、ここで、上記本発明の磁気微粒子の製造方法において、前記工程（ａ）の前に、（ｃ）前記融合タンパク質をコードするＤＮＡが挿入されているＤＮＡコンストラクトを細菌に導入し、該細菌を培養して前記磁気微粒子を生成させ、該細菌から該磁気微粒子を単離する工程をさらに含むことができる。
【００１５】
この場合、前記細菌は磁性細菌であることができる。また、この場合、前記ＤＮＡコンストラクトは、発現ベクターを含み、
前記発現ベクターは、磁性細菌内で転写制御可能なＤＮＡ断片をプロモーターとして含み、かつ、前記ＤＮＡ断片の下流に、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡが挿入されていることができる。
【００１６】
この場合、前記ＤＮＡ断片は、下記（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡ断片であることができる。
【００１７】
（１）配列番号１、２、３および４のいずれかにより表される塩基配列を有するＤＮＡ断片、
（２）配列番号１、２、３および４のいずれかにより表される塩基配列において１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、付加されている塩基配列を有し、かつ細菌においてプロモーター活性を有するＤＮＡ断片、
（３）配列番号１、２、３および４のいずれかにより表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ細菌においてプロモーター活性を有するＤＮＡ断片。上記（１）〜（３）のＤＮＡ断片はいずれも、磁性細菌内で高いプロモーター活性を示す。
【００１８】
また、ここで、上記本発明の磁気微粒子の製造方法において、前記アンカータンパク質は、磁性細菌粒子膜タンパク質またはそのフラグメントであることができる。
【００１９】
また、ここで、上記本発明の磁気微粒子の製造方法において、前記アンカータンパク質はＭｍｓ１３であることができる。
【００２０】
また、ここで、上記本発明の磁気微粒子の製造方法において、前記工程（ａ）において、尿素、チオ尿素、界面活性剤、塩基、および塩から選択される少なくとも１つを用いて、前記融合タンパク質以外のポリペプチドを除去することができる。
【００２１】
また、ここで、上記本発明の磁気微粒子の製造方法において、前記工程（ｂ）において、リン脂質を用いて前記別の膜を形成することができる。
【００２２】
また、ここで、上記本発明の磁気微粒子の製造方法において、前記アンカータンパク質が、配列番号８により表されるアミノ酸配列を有することができる。
【００２３】
また、ここで、上記本発明の磁気微粒子の製造方法において、前記アンカータンパク質が、配列番号８により表されるアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸１−８７を有することができる。
【００２４】
本発明の磁気微粒子の製造方法によれば、（ａ）目的ポリペプチドとアンカータンパク質との融合タンパク質が発現している磁気微粒子の表面から、前記融合タンパク質以外のポリペプチドを除去する工程を含むことにより、不要なタンパク質を含まず、非特異的吸着が少ない磁気微粒子を得ることができる。これにより、抗原性が低い磁気微粒子を得ることができる。このため、生体または生体から採取した試料（例えば、血液成分や細胞）への適用が可能である。
【００２５】
また、本発明の磁気微粒子の製造方法によれば、前記工程（ａ）で用いる前記磁性微粒子は、その表面に膜を有し、前記工程（ａ）は、前記融合タンパク質以外のポリペプチドとともに、前記膜を除去する工程を含み、前記工程（ａ）の後、（ｂ）前記磁気微粒子の表面に別の膜を形成する工程をさらに含むことにより、分散性に優れ、かつ非特異的吸着が少ないため、抗原性が低い磁気微粒子を得ることができる。
【００２６】
より具体的には、本発明の磁気微粒子の製造方法によれば、プロモーターとして機能するＤＮＡ断片の下流に、前記融合タンパク質をコードする構造遺伝子（ＤＮＡ）を連結して細菌に導入することにより、磁性細菌の磁気微粒子膜、細胞膜または細胞質において、前記融合タンパク質を効率良く、かつ多量に発現させることが可能である。
【００２７】
本発明の磁気微粒子は、
目的ポリペプチドとアンカータンパク質との融合タンパク質が発現している磁気微粒子の表面から、前記融合タンパク質以外のポリペプチドを除去する工程により得られる。
【００２８】
また、本発明の磁気微粒子は、
目的ポリペプチドとアンカータンパク質との融合タンパク質および膜が発現している磁気微粒子の表面から、前記融合タンパク質以外のポリペプチドおよび前記膜を除去する工程、および
前記磁気微粒子の表面に別の膜を形成する工程により得られる。
【００２９】
ここで、上記本発明の磁気微粒子は、前記アンカータンパク質が、配列番号５〜８のいずれかにより表されるアミノ酸配列を有することができる。
【００３０】
ここで、上記本発明の磁気微粒子は、配列番号８により表されるアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸１−８７を有することができる。
【００３１】
ここで、上記本発明の磁気微粒子において、前記目的ポリペプチドが抗体であることができる。
【００３２】
本発明のターゲット分子の分離方法は、上記本発明の磁気微粒子を、前記目的ポリペプチドと特異的に結合するターゲット分子に接触させ、該ターゲット分子を磁気分離する工程を含む。
【００３３】
本発明の細胞分離方法は、上記本発明の磁気微粒子において、前記目的ポリペプチドが抗体である場合、上記本発明の磁気微粒子を、前記抗体と特異的に結合する細胞に接触させ、該細胞を磁気分離する工程を含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
１．磁気微粒子の製造方法
本発明の磁性粒子の製造方法は、（ａ）目的ポリペプチドとアンカータンパク質との融合タンパク質が発現している磁気微粒子の表面から、前記融合タンパク質以外のポリペプチドを除去する工程を含む。
【００３５】
ここで、上記工程（ａ）で用いる磁性微粒子は、その表面に膜を有することができる。この場合、上記工程（ａ）は、融合タンパク質以外のポリペプチドとともに、前記膜を除去する工程を含むことができ、上記工程（ａ）の後、（ｂ）磁気微粒子の表面に別の膜を形成する工程をさらに含むことができる。
【００３６】
また、ここで、上記工程（ａ）の前に、（ｃ）融合タンパク質をコードするＤＮＡが挿入されているＤＮＡコンストラクトを細菌に導入し、該細菌を培養して前記磁気微粒子を生成させ、該細菌から該磁気微粒子を単離する工程をさらに含むことができる。
【００３７】
以下、上記工程（ａ）〜（ｃ）についてそれぞれ説明する。
【００３８】
１．１．工程（ｃ）
上記工程（ｃ）は、本発明の磁気微粒子の製造方法において原料となる磁気微粒子（以下、「原料磁気微粒子」ともいう）を作製する工程である。本発明の磁気微粒子の製造方法において使用する原料磁気微粒子は、工程（ｃ）により得ることができる。
【００３９】
本発明において、原料磁気微粒子としては、細菌（好ましくは磁性細菌）により生成されたものを使用することができる。より具体的には、目的ポリペプチドとアンカータンパク質との融合タンパク質をコードするＤＮＡが挿入されているＤＮＡコンストラクトを細菌（好ましくは磁性細菌）に導入し、該細菌を培養することにより原料磁気微粒子を生成し、該細菌から原料磁気微粒子を単離することにより、原料磁気微粒子を得ることができる。
【００４０】
１．１．１．磁性細菌
磁性細菌とは、体内に磁気微粒子を蓄積する能力を有する細菌である。本発明においては、磁性微粒子を培養により作製するために、磁性細菌を使用することができる。
【００４１】
本発明において使用可能な磁性細菌としては、例えば、Magnetospirillum 種の微生物（例えば、Magnetospirillum magneticum AMB-1 (FERM BP-5458), MS-1 (IFO 15272, ATCC31632, DSM3856), SR-1 (IFO 15272 DSM 6361)、およびDesulfovibrio 種の微生物（例えば、Desulfovibrio sp. RS-1 (FERM P-13283)）などが挙げられる。磁性細菌の菌体内においては、粒径約５０−１５０ｎｍのマグネタイトからなる微粒子が産生され、これが磁気微粒子と称される。
【００４２】
１．１．２．ＤＮＡコンストラクト
本発明の磁気微粒子の製造方法において、ＤＮＡコンストラクトは発現ベクターを含むことができる。この場合、発現ベクターは、磁性細菌内で転写制御可能なＤＮＡ断片をプロモーターとして含み、かつ、ＤＮＡ断片の下流に、融合タンパク質をコードするＤＮＡが挿入されていることができる（例えば、図１２参照）。このようなＤＮＡ断片としては、磁性細菌内で転写制御可能であれば特に限定されないが、例えば、下記（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡ断片であることが好ましい。
【００４３】
（１）配列番号１、２、３および４のいずれかにより表される塩基配列を有するＤＮＡ断片、
（２）配列番号１、２、３および４のいずれかにより表される塩基配列において１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、付加されている塩基配列を有し、かつ細菌においてプロモーター活性を有するＤＮＡ断片、
（３）配列番号１、２、３および４のいずれかにより表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ細菌においてプロモーター活性を有するＤＮＡ断片。
【００４４】
上記（１）〜（３）のＤＮＡ断片はいずれも、磁性細菌内で高いプロモーター活性を示す。
【００４５】
ＤＮＡ断片（１）〜（３）は、特願２００４−２６３８３２号公報に記載されているように、磁性細菌から細胞膜画分を単離し、この画分に含まれるタンパク質のうち発現量の多いタンパク質を同定し、このタンパク質をコードするＤＮＡの上流領域のプロモーター活性を調べることにより同定された。
【００４６】
また、ＤＮＡ断片（１）〜（３）は、本明細書に開示される配列情報に基づいて、磁性細菌のゲノムからＰＣＲ法などの慣用の方法を用いて直接クローニングすることにより得ることができる。あるいは、本発明のＤＮＡ断片は化学合成してもよい。
【００４７】
１．１．２Ａ．ＤＮＡ断片（１）
配列番号１、２、３および４により表される塩基配列（ＤＮＡ断片（１））は、それぞれ、磁性細菌の細胞膜上または磁気微粒子膜上で発現されるタンパク質Ｍｓｐ１（ｍｍ１０）、Ｍｓｐ２（ｍｍ２４）、Ｍｓｐ３（ｍｍ１）、Ｍｍｓ１６（ｍｍｓ１６）をコードするＤＮＡの推定プロモーター領域の配列に対応する。これらの遺伝子のプロモーター領域（Ｐｍｓｐ１、Ｐｍｓｐ２、Ｐｍｓｐ３、およびＰｍｍｓ１６）の塩基配列は、それぞれ配列番号１、２、３、および４に示される。
【００４８】
これらのＤＮＡ断片はいずれも、磁性細菌内で高いプロモーター活性を示すことが見いだされた。図１０に、これらのプロモーター領域の−３５位および−１０位付近の配列ならびにリボソーム結合部位の配列を示す。
【００４９】
配列番号１、２、３および４により表される塩基配列は、それぞれ開始コドン位置から上流５００塩基の長さの配列を示すが、所望のプロモーター活性を有する限り、これらの塩基配列のうち５’側の配列はさらに短くてもよい。好ましくは、ＤＮＡ断片（１）は、配列番号１、２、３または４に示される配列において、それぞれ３’末端側の３００塩基、好ましくは２００塩基、より好ましくは１７０塩基、さらに好ましくは１５０塩基の配列を有する。
【００５０】
１．１．２Ｂ．ＤＮＡ断片（２）
ＤＮＡ断片（２）は、配列番号１、２、３または４で表される塩基配列において１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、付加されており、かつ細菌においてプロモーター活性を有する。
【００５１】
本明細書に開示される天然の遺伝子の塩基配列に基づいて、その配列の一部のヌクレオチドを欠失させたり、他のヌクレオチドを付加または置換したりすることにより遺伝子を改変する方法は当該技術分野においてよく知られている。このような方法の例としては、例えば、制限酵素による切断、エキソヌクレアーゼによる消化、他のＤＮＡ断片の挿入、部分特異的変異誘発、変異導入プライマーを用いるＰＣＲ法などが挙げられる。
【００５２】
１．１．２Ｃ．ＤＮＡ断片（３）
ＤＮＡ断片（３）は、配列番号１、２、３または４で表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ細菌においてプロモーター活性を有する。好ましくは、ＤＮＡ断片（３）は、配列番号１、２、３または４で表される塩基配列と８５％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の同一性、さらに好ましくは９５％の同一性を有する。ＤＮＡ断（３）は、上述した遺伝子の改変法を用いて作製してもよく、様々な種または株の磁性細菌から単離してもよい。
【００５３】
塩基配列の同一性は、当該技術分野において知られる相同性検索アルゴリズムを利用して決定することができる。このようなアルゴリズムの１つの例はＢＬＡＳＴであり、その使用方法は当業者にはよく知られている。
【００５４】
１．１．２Ｄ．プロモーター活性の測定
本発明のＤＮＡ断片のプロモーター活性は、例えば後述する実施例２に記載されるように、ＤＮＡ断片の下流（３’末端側）にレポーター遺伝子を連結し、これを細菌細胞に導入してレポーター遺伝子の発現を測定することにより評価することができる。そのようなレポーター遺伝子の例としては、例えば、ルシフェラーゼ，ＣＡＴ，β−ガラクトシダーゼ，アルカリフォスファターゼ、ＧＦＰなどが挙げられる。
【００５５】
１．１．２Ｅ．発現ベクター
別の観点においては、本発明は、本発明のプロモーター（例えば、上記ＤＮＡ断片（１）〜（３）のいずれか）を含む発現ベクターを提供する。本発明において、「発現ベクター」とは、細菌において複製可能であり、本発明のプロモーターの制御下に融合タンパク質の発現を指示することができるベクターである。
【００５６】
本発明のプロモーターを組み込むことができるベクターとしては、細菌内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができる。特に、細菌として磁性細菌を用いる場合には、例えば、特開平８−２２８７８２号公報に記載されるｐＲＫ４１５、特開平１１−２８５３８７号公報に記載されるｐＭＳ−Ｔ１またはその誘導体を好適に用いることができる。
【００５７】
発現ベクターは、本発明のプロモーター、複製起点、およびベクターを導入した細菌の選択を容易にするための選択マーカーを有し、好ましくは、プロモーターの下流に、遺伝子の挿入を容易にするための制限酵素部位を有する。さらに、挿入された遺伝子の発現を増強および安定化させるための３’非翻訳領域を有していてもよい。
【００５８】
１．１．２Ｆ．ＤＮＡコンストラクトの導入
細菌中にＤＮＡコンストラクトを導入することにより細菌を形質転換させるためには、当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、接合伝達、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、遺伝子銃などの公知の方法を用いることができる。形質転換した細菌を培養して、発現されたタンパク質を回収する方法は、当該技術分野においてよく知られており、また、後述の実施例において例示されている。
【００５９】
１．１．３．原料磁気微粒子
本発明の原料磁気微粒子の表面には、目的ポリペプチドとアンカータンパク質との融合タンパク質が発現している。原料磁性微粒子が磁性細菌により生成される場合、融合タンパク質は、磁性細菌の磁気微粒子膜、細胞膜、または細胞質において発現される。
【００６０】
以下、融合タンパク質、ならびに該融合タンパク質を構成する目的ポリペプチドおよびアンカータンパク質について説明する。
【００６１】
１．１．３Ａ．目的ポリペプチド
本発明の磁性微粒子において、目的ポリペプチドとしては、タンパク質、ペプチド、またはその両方であってもよく、例えば、各種の酵素、サイトカイン、細胞増殖因子、レセプター、シグナル伝達因子、転写因子、輸送タンパク質などが挙げられる。
【００６２】
また、本発明の原料磁気微粒子に、機能が未知である目的ポリペプチドを発現させることにより、本発明の磁気微粒子を前記目的ポリペプチドの機能を解明するために利用することができる。あるいは、所望の機能を有する目的ポリペプチドをスクリーニングすることを目的として、目的ポリペプチドをコードするＤＮＡとしてｃＤＮＡなどのライブラリを用いてもよい。
【００６３】
１．１．３Ｂ．アンカータンパク質
アンカータンパク質は、磁気微粒子上に安定して存在しているものであればよい。磁性細菌においては、細胞膜上または磁気微粒子膜上に存在する種々のタンパク質（磁性細菌粒子膜タンパク質）がこれまでに同定されており、そのいずれもアンカータンパク質として用いることができる。
【００６４】
アンカータンパク質としては、例えば、Magnetospirillum種の磁性細菌に由来する磁性細菌粒子膜タンパク質（例えば、Ｍｍｓ５、Ｍｍｓ６、Ｍｍｓ７、Ｍｍｓ１３など）が好適に用いられる。Ｍｍｓ５、Ｍｍｓ６、Ｍｍｓ７、Ｍｍｓ１３はそれぞれ、配列番号５〜８により表されるアミノ酸配列からなる。
【００６５】
また、配列番号５〜８により表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列はいずれも、ＤＤＢＪ／ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）／ＥＢＩデータバンクに登録されており、そのアクセス番号はＡＢ０９６０８１およびＡＢ０９６０８２である（Arakaki, A., et al., J. Biol. Chem., 278, 8745-50 (2003)）。
【００６６】
さらに、磁性細菌粒子膜タンパク質のフラグメントであって、磁気微粒子膜への局在化を指示する機能を有するフラグメントも、本発明において目的ポリペプチドとの融合タンパク質を生成するために用いることができる。
【００６７】
１．１．３Ｃ．融合タンパク質
本発明の磁気微粒子の表面に発現している融合タンパク質は、目的ポリペプチドおよびアンカータンパク質またはその断片をコードする遺伝子をインフレームで連結させて、組換え的に発現させることにより製造することができる。
【００６８】
なお、１つの磁気微粒子の表面に、異なる種類の複数の融合タンパク質が発現していてもよい。この場合、「異なる種類の複数の融合タンパク質」とは、例えば、複数の融合タンパク質がそれぞれ異なる種類の目的ポリペプチドを含む場合、複数の融合タンパク質がそれぞれ異なる種類のアンカータンパク質を含む場合、あるいはその両方であることができる。
【００６９】
本発明において、アンカータンパク質として使用可能なＭｍｓ１３は、磁気微粒子に強固に結合しているため、後述する工程（ｂ）において、融合タンパク質以外のポリペプチドを除去する際に磁気微粒子からほとんど剥離しない。これにより、本発明において、融合タンパク質を磁気微粒子に効率的にアンカリングさせるためには、Ｍｍｓ１３が特に好適である。
【００７０】
Ｍｍｓ１３のアミノ酸配列は知られている（Arakaki, A., et al., J. Biol. Chem., 278, 8745-50 (2003)）。Ｍｍｓ１３は、１２４アミノ酸からなる膜２回貫通型タンパク質であり、ＮおよびＣ末端が細胞膜表面に局在していると考えられている。したがって、Ｍｍｓ１３の全領域を用いて生成した融合タンパク質は、細胞膜上または磁気微粒子膜上へのアンカリングが可能である。また、Ｍｍｓ１３はＣ末端領域、すなわち膜貫通部位でない領域（配列番号８に示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸８８−１２４）を含む。この領域は存在していなくてもよい。すなわち、アンカータンパク質は、配列番号８に示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸１−８７を少なくとも有していればよい。
【００７１】
したがって、本発明の１つの好ましい態様においては、少なくとも、配列番号８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１−８７を有するタンパク質を含む融合タンパク質が提供される。
【００７２】
本発明の発現ベクターに融合タンパク質をコードする遺伝子を組み込んで磁性細菌を形質転換し、得られた形質転換体を適切な条件下で培養すると、菌体内に磁気微粒子が産生され、磁気微粒子を被覆している磁性微粒子膜にアンカリングした形で融合タンパク質が発現する。磁性細菌の菌体を破壊または溶解した後、磁気を利用して磁気微粒子を回収することにより、目的ポリペプチドとアンカータンパク質との融合タンパク質を容易に得ることができる。
【００７３】
磁性細菌から磁気微粒子を単離する方法は当該技術分野においてよく知られており、また、後述の実施例において例示されている。磁性細菌の細胞質、細胞膜における融合タンパク質の単離は、菌体を破壊または溶菌した後、遠心分離により分画することにより可能であり、その方法は当該技術分野においてよく知られている。
【００７４】
本発明の磁気微粒子において、融合タンパク質は、図２に示すように、目的ポリペプチドが磁気微粒子膜にアンカリングされた形で発現している。このため、目的ポリペプチドがその天然のコンフォメーションまたはそれに近いコンフォメーションをとることが可能である。したがって、本発明の磁気微粒子に含まれる目的ポリペプチドは、その種々の機能、例えば酵素活性やリガンドとの結合特性を保持していると考えられる。
【００７５】
１．２．工程（ａ）
工程（ａ）は、上述したように、目的ポリペプチドとアンカータンパク質との融合タンパク質が発現している磁気微粒子（原料磁気微粒子）の表面から、融合タンパク質以外のポリペプチドを除去する工程である。
【００７６】
上述したように、原料磁気微粒子は、上述の工程（ｃ）により得ることができる。また、上述したように、原料磁気微粒子の表面には、目的ポリペプチドとアンカータンパク質との融合タンパク質が表面に発現している。この磁気微粒子の表面には、アンカータンパク質が強固に結合しているため、融合タンパク質を磁気微粒子の表面に保持しつつ、工程（ａ）において、原料磁気微粒子の表面から、融合タンパク質以外のポリペプチドを選択的に除去することができる。これにより、非特異的吸着が少ない磁気微粒子を得ることができる。
【００７７】
工程（ａ）において、原料磁気微粒子の表面から、融合タンパク質以外のポリペプチドを除去するために用いる洗浄剤は、アンカータンパク質のイオン強度や疎水度に応じて適宜選択することができる。例えば、洗浄剤として、尿素、チオ尿素、界面活性剤、塩基、および塩から選択される少なくとも１つを用いることができる。
【００７８】
界面活性剤としては、特に限定されないが、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤、両性界面活性剤を用いることができる。
【００７９】
陰イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸系（例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム）、直鎖アルキルベンゼン系（例えば、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム）、高級アルコール系（例えば、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム）、アルファオレフィン系（例えば、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム）、ノルマルパラフィン系（例えば、アルキルスルホン酸ナトリウム）が挙げられる。
【００８０】
ノニオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸系（例えば、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド）、高級アルコール系（例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル）、アルキルフェノール系（例えば、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）が挙げられる。
【００８１】
陽イオン性界面活性剤としては、例えば、第四級アンモニウム塩系（例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩）が挙げられる。
【００８２】
より具体的には、界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド（ＯＧ）などを例示することができる。
【００８３】
塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムなどを例示することができる。また、塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどを例示することができる。
【００８４】
また、工程（ａ）で用いる原料磁気微粒子の表面に膜（脂質膜）が形成されている場合（すなわち、原料磁気微粒子が磁性細菌により生成されたものである場合）、工程（ａ）において、原料磁気微粒子の表面から、融合タンパク質以外のポリペプチドとともに、前記膜を除去することができる。
【００８５】
特に、工程（ａ）で用いる原料磁気微粒子が磁性細菌により生成されたものである場合、通常、磁気微粒子の表面には、膜（脂質二重膜）および膜タンパク質が存在する。このような原料磁気微粒子に対して、工程（ａ）において上述した洗浄剤を用いた洗浄を行なうことにより、磁気微粒子の表面から、融合タンパク質以外のポリペプチド（膜タンパク質）や膜を除去することができる。
【００８６】
特に、アンカータンパク質がＭｍｓ１３である場合、磁気微粒子の表面に非常に強固に結合しているため、上述した洗浄剤を用いて磁気微粒子を洗浄することにより、融合タンパク質を磁気微粒子の表面に保持したままで、磁気微粒子の表面から、融合タンパク質以外のポリペプチドを選択的に除去することができる。
【００８７】
１．３．工程（ｂ）
工程（ｂ）は、上述したように、（ｂ）磁気微粒子の表面に別の膜を形成する工程である。
【００８８】
工程（ｂ）において、別の膜は例えば脂質膜であることができる。この場合、別の膜は例えばリン脂質または界面活性剤を用いて形成することができる。
【００８９】
リン脂質としては、特に限定されないが、例えば、フォスファチジルコリン（ＰＧ）、フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、カルジオリピン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジン酸を用いることができる。
【００９０】
膜を形成する工程において、リン脂質以外にも、例えば、脂質を模倣したブロックコポリマーなどを用いて膜を形成することが可能である。このブロックコポリマーとしては、親水性ポリマーと疎水性ポリマーとを組み合わせた複合体であり、脂質膜を模倣したもの等が例示できる。
【００９１】
本発明の磁気微粒子の製造方法において、上記工程（ａ）の後、工程（ｂ）（磁気微粒子の表面に別の膜を形成する工程）をさらに含むことにより、分散性に優れ、かつ非特異的吸着が少ない磁気微粒子を得ることができる。
【００９２】
特に、原料磁気微粒子が磁性細菌により生成されたものである場合、上記工程（ａ）の後、工程（ｂ）において、磁気微粒子の表面に前記別の膜を容易に形成することができる。
【００９３】
１．４．作用効果
本発明の磁気微粒子の製造方法によれば、（ａ）目的ポリペプチドとアンカータンパク質との融合タンパク質が発現している磁気微粒子の表面から、融合タンパク質以外のポリペプチドを除去する工程を含むことにより、不要なタンパク質を含まず、非特異的吸着が少ない磁気微粒子を得ることができる。このため、測定感度を向上させることができる。また、非特異的吸着が少ないことから、抗原性が低い磁気微粒子を得ることができる。このため、本発明の磁気微粒子の製造方法により得られた磁気微粒子は生体内での利用可能性が高いため、例えば、バイオセンサやイムノセンサのためのタンパク質固定化担体やドラッグキャリアとして利用可能であり、細胞分離技術などにおいて好適に利用することができる。
【００９４】
また、本発明の磁気微粒子の製造方法において、上記工程（ａ）で用いる前記磁性微粒子がその表面に膜を有し、上記工程（ａ）は、前記融合タンパク質以外のポリペプチドとともに、前記膜を除去する工程を含み、上記工程（ａ）の後、工程（ｂ）（磁気微粒子の表面に別の膜を形成する工程）をさらに含むことにより、分散性に優れ、かつ非特異的吸着が少なく抗原性が低い磁気微粒子を得ることができる。さらに、磁気微粒子が磁性細菌により生成されたものである場合、上記工程（ａ）において、融合タンパク質以外のポリペプチドおよび膜を除去する工程によって、例えば、磁気微粒子を磁性細菌から抽出する際に、磁性粒子表面の膜に混入されうる外膜画分（例えば、膜成分、タンパク質）をともに除去することができるため、より抗原性が低い磁気微粒子を得ることができ、かつ、上記工程（ｂ）において、磁気微粒子の表面に別の膜を容易に形成することができる。
【００９５】
２．磁気微粒子
本発明の磁気微粒子は、上述した本発明の磁気微粒子の製造方法により得ることができる。すなわち、本発明の磁気微粒子は、例えば、目的ポリペプチドとアンカータンパク質との融合タンパク質が発現している磁気微粒子の表面から、融合タンパク質以外のポリペプチドを除去する工程により得られる。また、本発明の磁気微粒子は、例えば、目的ポリペプチドとアンカータンパク質との融合タンパク質および膜が発現している磁気微粒子の表面から、融合タンパク質以外のポリペプチドおよび膜を除去する工程、および磁気微粒子の表面に別の膜を形成する工程により得ることができる。
【００９６】
本発明の磁気微粒子を構成する融合タンパク質、ならびに融合タンパク質を構成する目的ポリペプチドおよびアンカータンパク質については、上述したとおりである。例えば、本発明の磁気微粒子を構成する融合タンパク質は、少なくとも、配列番号８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１−８７を有するタンパク質を含むことができる。
【００９７】
３．用途
本発明の磁気微粒子を用いて、目的ポリペプチドの機能解析、リガンドの同定および定量、アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング、細胞分離などを容易に行なうことができる。以下、用途の具体例について説明する。
【００９８】
３．１．ターゲット分子の分離
本発明の磁気微粒子は、ターゲット分子の分離方法に使用することができる。この場合、例えば、本発明の磁気微粒子を、目的ポリペプチドと特異的に結合するターゲット分子に接触させ、該ターゲット分子を磁気分離することにより、ターゲット分子を単離することができる。ターゲット分子は特に限定されず、タンパク質やペプチドなどのポリペプチドでもよいし、あるいは、例えば医薬品の有効成分として使用可能な低分子化合物でもよい。
【００９９】
例えば、本発明の磁気微粒子を試料と接触させ、そして、磁気微粒子に結合した物質の存在または量を測定することにより、試料中において、目的ポリペプチドと結合する物質（ターゲット分子）を検出することができる。特に、この方法は、目的ポリペプチドのリガンドのアッセイに有用である。この方法は、磁石を用いて磁気微粒子を回収することにより、磁気微粒子上の目的ポリペプチドと結合した物質（ターゲット分子）を未結合物質から容易に分離することができるという利点を有する。さらに、本発明の磁気微粒子は、有用物質のスクリーニングにおいて用いるのにも有用である。すなわち、本発明の磁気微粒子を、試験物質を含む溶液と接触させ、そして、試験物質が磁気微粒子に結合するか否かを判定することにより、目的ポリペプチドに結合しうる物質（ターゲット分子）を同定することができる。この方法は、目的ポリペプチドのアゴニスト／アンタゴニストのスクリーニングに有用である。この方法はまた、目的ポリペプチドのリガンドが不明である場合に、リガンドを同定して目的ポリペプチドの機能を解析するのに有用である。また、本発明の方法は、配列情報から特定の機能を有するポリペプチドであることが予測されるが、対応するポリペプチドが単離されていないかまたはその存在が確認されていない未知のポリペプチドについても実施することができるため、ゲノム配列情報またはｃＤＮＡ配列情報から機能が推定されているタンパク質について、その実際の機能を解析するのに特に有用である。
【０１００】
さらに、本発明の磁気微粒子を用いて、複数の試験物質を含む試料から目的ポリペプチドに結合する物質（ターゲット分子）のみを単離することができる。例えば、磁気微粒子を複数の試験物質を含む試料と接触させ、磁石を用いて磁気微粒子を回収することにより、磁気微粒子上の目的ポリペプチドと結合した物質（ターゲット分子）を容易に分離することができる。これらの物質（ターゲット分子）を単離して分析することにより、目的ポリペプチドの機能の解明に有用な情報を得ることができる。また、この方法を用いて、アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニングを容易に行なうことができる。
【０１０１】
３．２．細胞分離
本発明の磁気微粒子において、融合タンパク質に結合した目的ポリペプチドが抗体である場合、本発明の磁気微粒子を、前記抗体と特異的に結合する細胞に接触させ、該細胞を磁気分離することができる。この方法によれば、例えば動物または植物の組織または器官より採取した細胞から、特定の抗体を有する細胞のみを磁気分離することができる。
【０１０２】
４．実施例
以下に、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【０１０３】
４．１．実施例１（磁性細菌中で大量に発現されているタンパク質の同定）
磁性細菌Magnetospirillum magneticum ＡＭＢ−１（ATCC700264）はＭＳＧＭ培地（ｐＨ６．７５）を用いて培養を行った（Yang, C. D. et al., Enzyme Microb. Technol., 29, 13-19 (2001)）。培養定常期の菌体を回収し、ＨＥＰＥＳで洗浄した後、フレンチプレスに３回通して破砕した。次に、フレンチプレス破砕試料から磁石を用いて磁気微粒子を分離し、残りの試料を１００００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、その上清をさらに１６００００Ｇにて、４℃で１時間超遠心分離した。沈殿物をＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁し、１６００００Ｇにて、４℃で１時間超遠心分離して、沈殿物を回収した。これをＰＢＳ緩衝液に再懸濁して、細胞膜画分とした。
【０１０４】
この細胞膜画分を２Ｄゲル電気泳動により分離し、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットによって転写した。メンブランをCoomassie brilliant blue により染色した結果を図１に示す。発現量が多いと考えられる濃いタンパク質スポットをメスにより切り出し、タンパク質サンプルを、シマズ アミノ酸 シークエンシング システム ＰＰＳＱ−１（Shimazu amino acid sequencing system PPSQ-1(島津製作所（株）製)を用いたエドマン分解法で
解析し、Ｎ末端アミノ酸シークエンスを決定した。この配列をＡＭＢ−１株のゲノム情報から検索し、磁性細菌膜上で大量に発現されているタンパク質として、Ｍｓｐ１、Ｍｓｐ２およびＭｓｐ３が同定された（図１および図２参照）。図１および図２において、スポットａ，ｂはＭｓｐ１、スポットｃはＭｓｐ２、スポットｅはＭｓｐ３をそれぞれ示す。
【０１０５】
４．２．実施例２（プロモーター活性の測定）
実施例１で同定された高発現タンパク質について、ＡＭＢ−１のゲノムＤＮＡの配列情報（”Complete Genome Sequence of the Facultative Anaerobic Magnetotactic Bacterium Magnetospirillum sp. strain AMB-1”, Tadashi Matsunaga, Yoshiko Okamura, Yorikane Fukuda, Aris Tri Wahyudi, Yaeko Murase, Haruko Takeyama, DNA research, 12, 157-166（2005）参照）に基づいて、Ｍｓｐ１、Ｍｓｐ２およびＭｓｐ３のコーディング配列の上流領域の配列を調べ、細菌プロモーターのコンセンサス配列を比較することにより、プロモーター領域を探索した（上記論文には、プロモーターＰｍｍｓ２４の配列も掲載されている）。これらのプロモーター領域を含むＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号１、２、および３に示す。また、これらのプロモーター領域の−３５位および−１０位付近の配列ならびにリボソーム結合部位の配列を図３に示す。このようにして、プロモーターＰｍｓｐ１、Ｐｍｓｐ２およびＰｍｓｐ３のプロモーター領域を同定した。
【０１０６】
次に、ＡＭＢ−１ゲノムＤＮＡからこれらのプロモーター領域のＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、レポーターとしてルシフェラーゼをコードする遺伝子を含み大腸菌および磁性細菌の両方で複製可能なベクターｐＵＭＧＬＣ（図４参照）に挿入して、発現用ＤＮＡコンストラクトを構築した。比較のために、プロモーターＰｍａｇＡ（”ron-regulated expression and membrane localization of the magA protein in Magnetospirillum sp. strain AMB-1”. C. Nakamura, T. Kikuchi, J. G. Burgess, T. Matsunaga. J. Biochem (Tokyo). 1995 Jul;118(1):23-7.）、プロモーターＰｌａｃ、およびＰｍｍｓ１６（配列番号４に表される配列）についても、同様にして発現ベクター中に導入した。ネガティブ対照としてはプロモーターを挿入していないベクターを用いた。
【０１０７】
このようにして作製した発現用ＤＮＡコンストラクトをエレクトロポレーション法によりMagnetospirillum magneticum ＡＭＢ−１に導入した。得られた形質転換体をアンピシリン（５μｇ／ｍｌ）を含むＭＳＧＭ培地で培養した（Matsunaga, T. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 35, 651-655 (1991)）。菌体を回収し、ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄した後、ＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。菌体懸濁液に細胞溶解液を含むルシフェラーゼ発光基質（プロメガ社製）を加え、1分後の発光強度を測定した。その結果を図５に示す。
【０１０８】
図５から明らかであるように、プロモーターとしてＰｍｓｐ１およびＰｍｓｐ３を用いたときに、既知のプロモーターＰｍａｇＡおよびＰｍｍｓ１６より高いルシフェラーゼ活性が得られ、特にＰｍｓｐ３を用いたときに最も高い活性が得られた。
【０１０９】
４．３．実施例３（目的タンパク質とアンカータンパク質との融合タンパク質の発現）
磁気微粒子膜上へ効率的に機能性タンパク質を局在させるために、アンカータンパク質の選定を行った。図６に示すように、プロモーターＰｍｍｓ１６の制御下で、アンカータンパク質（ＭａｇＡ、Ｍｍｓ１６、またはＭｍｓ１３）と目的ポリペプチド（ルシフェラーゼ）との融合タンパク質が発現するよう、ＤＮＡコンストラクトを構築した。実施例２と同様にしてこれらのＤＮＡコンストラクトを磁性細菌に導入し、細菌を培養した。菌体を回収し、フレンチプレスに３回通して菌体を破砕し、磁石を用いて磁気微粒子を単離した。得られた磁気微粒子をＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄後、ＰＢＳ緩衝液に懸濁し、ルシフェラーゼ発光基質（プロメガ社）を加えて発光強度を測定した。また、実施例１で用いた方法と同様に、細胞破砕物、細胞質、および細胞膜画分を調整し、各画分のルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を図７に示す。
【０１１０】
図７から明らかであるように、アンカータンパク質としてＭｍｓ１３を用いたとき、細胞内でのルシフェラーゼ（目的ポリペプチド）の発現量が最も多く、また、磁気微粒子膜上へのアンカリング効率が、アンカータンパク質としてＭａｇＡ、Ｍｍｓ１６を用いた場合と比較して顕著に高いことが示された。これは、Ｍｍｓ１３が膜２回貫通型の小さなタンパク質であるため（図９参照）、磁気微粒子膜に安定してアンカリングしていると考えられる。さらに、プロモーターＰｍｍｓ１６のかわりに、プロモーターＰｍｓｐ１またはＰｍｓｐ３の制御下においてＭｍｓ１３とルシフェラーゼとの融合タンパク質の発現を評価したところ、プロモーターＰｍｓｐ１またはＰｍｓｐ３を用いた場合、プロモーターＰｍｍｓ１６を用いた場合と比較して３倍の発現量が得られた（図８参照）。
【０１１１】
４．４．実施例４（目的ポリペプチド（ルシフェラーゼ）とアンカータンパク質（Ｍｍｓ１３）との融合タンパク質の磁気微粒子上における安定性）
本実施例においては、目的ポリペプチド（ルシフェラーゼ）とアンカータンパク質（Ｍｍｓ１３）との融合タンパク質の磁気微粒子上における安定性を評価した。
【０１１２】
実施例３における方法と同様の方法にて、プロモーターＰｍｍｓ１６の制御下で、Ｍｍｓ１３（アンカータンパク質）とルシフェラーゼ（目的ポリペプチド）との融合タンパク質が発現するよう構築された発現用ＤＮＡコンストラクト（特願２００４−２６３８３２号）を、磁性細菌Magnetospirillum magneticum ＡＭＢ−１（ATCC700264）に導入した。磁性細菌は、ＭＳＧＭ培地（ｐＨ６．７５）を用いて培養を行った（Yang, C. D. et al., Enzyme Microb. Technol. 29, 13-19 (2001)）。次に、培養定常期の菌体を回収し、ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄した後、フレンチプレスに３回通して破砕した。次いで、フレンチプレス破砕試料から磁石を用いて磁気微粒子を分離し、ＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁させた後、超音波により分散させ、再び磁石を用いて磁気分離を行なう操作を１０回繰り返すことにより得られた粒子を、精製済み磁気微粒子とした。次いで、洗浄によるＭｍｓ１３（アンカータンパク質）とルシフェラーゼ（目的ポリペプチド）との融合タンパク質の安定性を評価するために、磁気分離およびピペッティングによる再懸濁を５回行なった後の磁気微粒子の表面に存在する融合タンパク質の量をウエスタンブロット解析により、ルシフェラーゼ発光基質（プロメガ社）を加えることにより前記磁気微粒子の酵素活性を、それぞれ評価した。
【０１１３】
図１０（ａ）は、融合タンパク質が発現された磁気微粒子から除去されたタンパク質に対するウエスタンブロット解析結果を示し、図１０（ｂ）は、洗浄および磁気分離後における、融合タンパク質が発現された磁気微粒子のルシフェラーゼの発光強度を示す。ウエスタンブロット解析においては、磁気微粒子から除去されたタンパク質について解析を行なった。なお、図１０（ａ）においては、２．５ｍｇの磁気微粒子を用い、図１０（ｂ）においては、２０μｇの磁気微粒子を用いた。
【０１１４】
その結果、５回の洗浄において、融合タンパク質は安定して存在し、かつ、酵素活性も安定に維持されていることが示された(図１０（ａ）および図１０（ｂ）参照)。
【０１１５】
さらに、精製後のＭｍｓ１３（アンカータンパク質）とルシフェラーゼ（目的ポリペプチド）との融合タンパク質が発現された磁気微粒子に対して、ウレア溶液（７Ｍ尿素水溶液、２Ｍチオ尿素水溶液、４％ＣＨＡＰＳ,４０ｍＭＴｒｉｓ  ｂａｓｅ）を添加して、前記融合タンパク質以外のポリペプチドおよび膜（脂質二重膜）を除去した（ウレア処理）。また、ウレア処理前後の磁気微粒子を、煮沸した１％ＳＤＳ溶液を用いて処理した。この処理に用いた１％ＳＤＳ溶液中の各タンパク質画分をＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより解析を行った。
【０１１６】
図１１（ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果を示し、図１１（ｂ）は、抗ルシフェラーゼ抗体を用いたウエスタンブロットによる解析結果を示す。図１１（ａ）および図１１（ｂ）において、（１）はウレア処理前の磁気微粒子の膜タンパク質の解析結果を示し、（２）はウレア処理後の磁気微粒子の膜タンパク質解析結果を示す。
【０１１７】
その結果、ウレア処理を行なうことにより、多量の粒子膜タンパク質（融合タンパク質以外のポリペプチド）が除去された。一方、Ｍｍｓ１３（アンカータンパク質）とルシフェラーゼ（目的ポリペプチド）との融合タンパク質は、ウレア処理後においても磁気微粒子の表面に安定して存在していることが示された(図１１（ａ）および図１１（ｂ）参照)。
【０１１８】
４．５．実施例５（プロテインＡのＺＺドメインが発現している磁気微粒子に対する処理）
本実施例においては、まず、Ｍｍｓ１３（アンカータンパク質）とプロテインＡのＺＺドメイン（目的ポリペプチド）との融合タンパク質が発現している磁気微粒子を作製し、次いで、この磁気微粒子に対して界面活性剤を用いて処理を行なうことにより、余分なタンパク質を除去し、さらに脂質を添加することにより、磁気微粒子の表面に膜を形成した。上記方法における各工程を図１２に示す。
【０１１９】
本実施例においては、Ｍｍｓ１３とＺＺドメインとの融合タンパク質が発現している磁気微粒子を作製し、次いで、各界面活性剤（ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、またはＯＧ）を用いて磁気微粒子の膜タンパク質（融合タンパク質以外のポリペプチド）および脂質二重膜を除去し、フォスファチジルコリン（ＰＣ）を用いて磁気微粒子の表面に膜を形成した（図１２参照）。
【０１２０】
まず、ｐＵＭ１３ＺＺプラスミドを構築した。ＺＺドメインは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインである。本実施例においては、ＡＭＢ−１株中でＺＺドメインを発現可能なベクターの構築を行った。特開平１１−２８５３８７号公報に記載されるｐＭＳ−Ｔ１およびｐＵＣ１８からなるｐＭＣ１８（Ａｍｐｒ）をＳｓｐＩで消化した。また、プロモーターとしてMagnetospirillum magneticum ＡＭＢ-１のプロモーターＰＭｍｓ１６を、アンカータンパク質としてＭｍｓ１３を用いた。プロモーターＰＭｍｓ１６およびＭｍｓ１３遺伝子は、公知の配列情報に基づいて、ＡＭＢ−１ゲノムからＰＣＲにより取得した。また、ＺＺドメインをコードする遺伝子は、Amersham BiosciencesのｐＥＺＺ１８から取得した。これらのＰＣＲ産物を上述のプラスミドに導入し、プロモーターＰＭｍｓ１６配列、およびその下流に、Ｍｍｓ１３コーディング配列（アンカータンパク質のコーディング配列）とＺＺドメインコーディング配列（目的ポリペプチドのコーディング配列）とをインフレームとなるように挿入して、Ｍｍｓ１３（アンカータンパク質）−ＺＺドメイン（目的ポリペプチド）が発現されたＤＮＡコンストラクト（プラスミドｐＵＭ１３ＺＺ）を構築した。
【０１２１】
次いで、実施例３と同様の方法にて、プロモーターＰｍｍｓ１６の制御下で、Ｍｍｓ１３（アンカータンパク質）とプロテインＡのＺＺドメイン（目的ポリペプチド）との融合タンパク質が発現するよう構築されたＤＮＡコンストラクトを作製し、このＤＮＡコンストラクトを磁性細菌に導入した。
【０１２２】
次に、実施例１と同様の方法にて、上記磁性細菌を培養し、該磁性細菌から磁気微粒子を抽出した。ＨＥＰＥＳ緩衝液で１０回洗浄した磁気微粒子に対して、１ＭのＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳ緩衝液により４回洗浄を行なった。次に、１００ｍＭのＮａＣｌおよび０．１ｍＭのＣａＣｌ２を含む１０ｍＭのＴＥＳに溶解させた１ｍＭのＳＤＳ、０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび５００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解させた１６．７ｍＭのＯＧ、または１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解させた１．６ｍＭのＣＴＡＢを１．５ｍｌ加えて、２．５時間反応させた。その後、１００ｍＭのＮａＣｌおよび０．１ｍＭのＣａＣｌ２を含む１０ｍＭのＴＥＳを用いて３回洗浄した。次いで、上記界面活性剤による処理後の磁気微粒子に対して、１５ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴＥＳに溶解させた１ｍｇ/ｍｌのフォスファチジルコリン（ＰＣ）を１ｍｌ加えて２時間反応させることにより、磁気微粒子の表面に膜を形成した。次いで、１５ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴＥＳを用いて５回洗浄することにより、表面に膜が形成された、実施例５の磁気微粒子を得た。
【０１２３】
４．６．実施例６（実施例５の磁気微粒子のＺＺドメイン活性の評価）
本実施例においては、実施例５の磁気微粒子（各界面活性剤による処理後、脂質添加により表面に膜が形成された磁気微粒子）上のＺＺドメイン（目的ポリペプチド）の活性を評価するために、実施例５の磁気微粒子に対して、アルカリフォスファターゼ標識ラビット由来抗ヤギ抗体（２５μｇ/ｍｌ）を添加して、室温で1時間インキュベートした。
【０１２４】
次に、ＰＢＳで３回洗浄操作を行った後、ルミホス５３０を加えて１分間反応させ、ルミノメーターにより発光強度を測定し、これをＺＺドメインの活性として評価した。その結果、アルカリフォスファターゼ標識ラビット由来抗ヤギ抗体を固定化させた、実施例５で得られた磁性細菌粒子はいずれも発光が確認され、磁気微粒子上に活性を保持したＺＺドメインの存在が確認された（図１３（ａ）参照）。
【０１２５】
図１３（ａ）は、アルカリフォスファターゼ標識ラビット由来抗ヤギ抗体と、実施例５（図１２参照）で得られた磁気微粒子との結合能の評価結果を示し、図１３（ｂ）は、界面活性剤処理後の磁気微粒子上におけるアンカータンパク質（Ｍｍｓ１３）と目的ポリペプチド（ＺＺドメイン）との融合タンパク質の存在を確認するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果を示す。
【０１２６】
図１３（ａ）および図１３（ｂ）において、「ＮＣ」は、ＺＺドメインが発現していない磁気微粒子 (ネガティブコントロール)を用いた場合の測定結果、「ＰＣ」は実施例５の界面活性剤による処理を行なう前の磁気微粒子(ポジティブコントロール)を用いた場合の測定結果、「ＯＧ」・「ＣＴＡＢ」・「ＳＤＳ」はそれぞれ、実施例５の各界面活性剤（ＯＧ，ＣＴＡＢ，ＳＤＳ）による処理を行なった後に表面に膜が形成された磁気微粒子を用いた場合の測定結果を示す。
【０１２７】
図１３（ａ）によれば、実施例５において、３種類の界面活性剤（ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、ＯＧ）により処理を行なった磁気微粒子はいずれも発光が確認され、ＺＺドメインの活性を確認することができた。
【０１２８】
また、界面活性剤による処理後に、１％ＳＤＳ溶液を用いて磁気微粒子について煮沸処理を行なうことにより、磁性微粒子の膜タンパク質を抽出し、この抽出液についてＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析を行った結果（図１３（ｂ）参照）と合わせて考察すると、実施例５において得られた磁気微粒子上のＺＺドメイン活性は、磁気微粒子上における、Ｍｍｓ１３とＺＺドメインとの融合タンパク質の存在量に比例していることが示された。
【０１２９】
４．７．実施例７（実施例５の磁気微粒子の電子顕微鏡による観察）
本実施例においては、実施例５において、界面活性剤としてＳＤＳを用いて処理を行なった後、表面に膜を形成した磁気微粒子を作製した場合において、図１２で示した各工程における磁気微粒子を透過型電子顕微鏡Ｈ７００−Ｈ(（株）日立製作所)により観察した（図１４（ａ）〜図１４（ｄ）参照）。
【０１３０】
ＨＥＰＥＳ緩衝液による洗浄後の粒子表面（図１４（ａ）参照）および１ＭのＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳ緩衝液による洗浄後の粒子表面（図１４（ｂ）参照）には、脂質二重膜と思われる膜の存在が確認されたのに対して、ＳＤＳ処理後では、粒子表面からの膜の除去が確認された（図１４（ｃ）参照）。さらに、フォスファチジルコリン（ＰＣ）添加後の磁気微粒子の表面には、ＰＣ由来の脂質膜と思われる膜が観察された（図１４（ｄ）参照）。
【０１３１】
以上の結果より、実施例５の各工程によれば、磁気微粒子の表面から膜が一旦除去された後、磁気微粒子の表面に膜が再形成されたことが確認された。
【０１３２】
４．８．実施例８（実施例５の磁気微粒子を用いたＣＤ１４陽性細胞の分離）
本実施例においては、実施例５の磁気微粒子を用いて、抗体固定化磁性細菌粒子を作製した。まず、実施例５の磁気微粒子（ＺＺドメインとＭｍｓ１３との融合タンパク質が発現している磁気微粒子）をラビット由来抗マウスＩｇＧ抗体溶液（１ｍｇ/ｍｌ）５００μｌに懸濁し、５分おきに超音波攪拌を施しながら室温で１時間反応させた。次に、１ｍｌのＰＢＳで５回洗浄し、未反応の抗体を取り除いた後、５００μｌのＰＢＳ（０．１％ＮａＮ３）に再懸濁し、抗体固定化磁気微粒子を作製した。次いで、ヒト末梢血１０ｍｌを１０ｍＭのＰＢＳ（２５ｍｌ）で希釈した後、ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ-１０７７（Ｓｉｇｍａ社）１５ｍｌに重層し、１８００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行った。次に、単核球層を抜き取り、ＰＢＳ（２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５％のＢＳＡを含む）を適量加え、遠心洗浄（１５００ｒｐｍ，６分間）を行った。ペレット懸濁液１８０μｌにＦｃＲ  Ｂｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（２０μｌ）を加えて室温で１５分間反応させて、遠心洗浄後のペレット懸濁液を単核球懸濁液とした。
【０１３３】
次に、単核球懸濁液１００μｌ（〜３×１０６cells）に対し、マウス由来抗ＣＤ１４モノクローナル抗体を４℃で１５分間反応させた。ＰＢＳで遠心洗浄後、ペレット懸濁液１００μｌに対し、抗マウスＩｇＧ抗体を導入した抗体固定化磁気微粒子１０μｇを４℃で１５分間反応させた。ＰＢＳで遠心洗浄後、ペレット懸濁液１００μｌに対して、ＦＩＴＣ標識抗マウス抗体２μｌを４℃で１０分間反応させた。ＰＢＳで遠心洗浄後、ペレット懸濁液に対して、洗浄および磁気回収を７回繰り返して行った。その後、細胞を含む磁性細菌粒子懸濁液を回収し、フローサイトメトリーにより解析することにより、回収した細胞（単核球）の純度を評価した。
【０１３４】
フローサイトメトリーによる単核球懸濁液のＳＳ，ＦＳの解析の結果、細胞分離前ではＣＤ１４陽性細胞以外の細胞が観察されたのに対して、細胞分離後では他の細胞のほとんどが除去されていることが示された（図１５（ａ）および図１５（ｂ）参照）。
【０１３５】
そこで、実施例５の磁気微粒子を用いた細胞分離を行ない、分離後の細胞の蛍光強度頻度を観察した（図１６（ａ）〜図１６（ｅ）参照）。なお、図１６（ｂ）〜図１６（ｅ）において、「ＰＣ」、「ＯＧ」、「ＣＴＡＢ」、「ＳＤＳ」はそれぞれ、図１３（ａ）および図１３（ｂ）と同様の意義を示す。また、図１６（ａ）〜図１６（ｅ）において、横軸は発光強度を示し、縦軸は細胞数を示す。
【０１３６】
その結果、実施例５の磁気微粒子は９８．０％以上の高純度でＣＤ１４陽性細胞の分離が可能であることが示された(表１参照)。この結果より、実施例５において、磁気微粒子に対して界面活性剤による処理を行なうことにより、磁気微粒子の表面における非特異的吸着などが原因となるタンパク質の除去を行なうことができ、かつ、実施例５において、磁気微粒子の表面に膜（脂質膜）を形成することにより、分散性が向上し、反応効率を向上させることができたと考えられた。
【０１３７】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１は、実施例１における、磁性細菌の細胞膜タンパク質画分の２Ｄゲル電気泳動の結果を示す。
【図２】図２は、実施例１において同定された、磁性細菌細胞膜上で発現されているタンパク質を示す。
【図３】図３は、実施例２において同定された、プロモーター領域の−３５位および−１０位付近の配列ならびにリボソーム結合部位の配列を示す。
【図４】図４は、実施例２において、プロモーター活性の測定に用いたルシフェラーゼ発現用ＤＮＡコンストラクトを示す。
【図５】図５は、実施例２におけるプロモーターの活性の測定結果を示す。
【図６】図６は、実施例３において、目的ポリペプチド（ルシフェラーゼ）とアンカータンパク質との融合タンパク質を発現させるために使用したＤＮＡンストラクトの構成を模式的に示す図である。
【図７】図７は、実施例３において、アンカータンパク質の違いによる融合タンパク質のＡＭＢ−１形質転換体内での局在評価を示す。
【図８】図８は、実施例３において、プロモーターの違いによるＡＭＢ−１形質転換体内でのＭｍｓ１３（アンカータンパク質）とルシフェラーゼ（目的ポリペプチド）との融合タンパク質の発現結果を示す。
【図９】図９は、本発明の磁気微粒子上に存在する、アンカータンパク質（Ｍｍｓ１３）と目的ポリペプチド融合タンパク質の局在様式の予想図を示す。
【図１０】図１０（ａ）および図１０（ｂ）は、実施例４における、磁気微粒子上におけるアンカータンパク質（Ｍｍｓ１３）と目的ポリペプチド（ルシフェラーゼ）との融合タンパク質の安定性評価の結果を示す。
【図１１】図１１（ａ）および図１１（ｂ）は、実施例４において、ウレア処理が、アンカータンパク質（Ｍｍｓ１３）と目的ポリペプチド（ルシフェラーゼ）との融合タンパク質が発現された磁気微粒子の表面の安定性に及ぼす影響について評価した結果を示す。
【図１２】図１２は、実施例５において、アンカータンパク質（Ｍｍｓ１３）と目的ポリペプチド（ＺＺドメイン）との融合タンパク質が発現された磁気微粒子の製造方法を模式的に説明する図である。
【図１３】図１３（Ａ）および図１３（Ｂ）は、実施例６において、実施例５（図１２参照）で得られた磁気微粒子上に存在するアンカータンパク質（Ｍｍｓ１３）と目的ポリペプチド（ＺＺドメイン）との融合タンパク質の解析結果を示す。
【図１４】図１４（Ａ）〜図１４（Ｄ）は、実施例７において測定された、アンカータンパク質（Ｍｍｓ１３）と目的ポリペプチド（ＺＺドメイン）との融合タンパク質が発現された磁気微粒子の電子顕微鏡写真を示す。
【図１５】図１５は、実施例８でそれぞれ得られた抗体固定化磁気微粒子を用いた細胞分離をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。
【図１６】図１６は、実施例８でそれぞれ得られた抗体固定化磁気微粒子を用いて、単核球画分からＣＤ１４陽性（＋）細胞を分離した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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