(57)【要約】【課題】簡易な操作で組織片を培養面へ接着させて組織片培養を開始することができる培養方法を提供する。【解決手段】組織片の培養方法において、前記組織片を遠心力によって培養面に接着させる接着工程と、該接着工程後の前記組織片を前記培養面上で培養する組織片培養工程と、を具備するようにする。組織片に対して培養面方向の遠心力を作用させることで、組織片の培養開始に適した接着状態を得ることができる。【選択図】図１
2006204168.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織片の培養方法であって、
前記組織片を遠心力によって培養面に接着させる接着工程と、
該接着工程後の前記組織片を前記培養面上で培養する組織片培養工程と、
を具備する培養方法。
【請求項２】
前記組織片培養工程は、前記培養面を含む培養容器を静置した状態で培養する工程を有する、請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記組織片培養工程は、組織片培養工程中の前記組織片を遠心力によって培養面に押圧させる工程を有する、請求項１又は２に記載の培養方法。
【請求項４】
前記組織片を、前記組織片を構成する細胞外マトリクス成分を分解する酵素によって前記組織片の形状が維持される範囲で酵素処理をする酵素処理工程を備える、請求項１〜３のいずれかに記載の培養方法。
【請求項５】
前記酵素は、コラゲナーゼである、請求項４に記載の培養方法。
【請求項６】
前記組織片は、少なくとも線維芽細胞を含有する、請求項１〜５のいずれかに記載の培養方法。
【請求項７】
前記組織片培養工程は、前記培養面を含む培養容器を用いて実施し、前記培養面は、前記組織片を載置可能な載置領域と、前記組織片から増殖する細胞が遊走可能な増殖領域と、を有し、前記載置領域と前記増殖領域とは前記載置領域を前記培養容器の底部近傍に有する凹状面を構成している、請求項１〜６のいずれかに記載の培養方法。
【請求項８】
組織片の処理方法であって、
前記組織片を遠心力によって培養面に接着させる接着工程を備える、処理方法。
【請求項９】
組織片培養容器であって、
組織片の培養面が、組織片を載置可能な載置領域と、組織片から増殖する細胞が遊走可能な増殖領域と、を有し、前記載置領域と前記増殖領域とは前記載置領域を前記組織片培養容器の底部近傍に有する凹状面を構成しており、組織片を遠心力によって前記載置領域に接着させることが可能な培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織片培養（Explant Culture）を容易におこなうことのできる培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を研究や製品等に使用する場合、細胞を入手することが必須である。その入手方法としては、器官や組織を入手し、そこから細胞を単離する方法が一般的となっている。
【０００３】
組織からの細胞単離方法としては大別すると組織片をそのまま培養して細胞を遊走させ培養する組織片培養法（Explant Culture）と組織片を消化酵素等により分散させ細胞を培養する細胞分散法とがある。細胞分散法はより操作が簡易という利点がある一方で、酵素処理の効果が強すぎると細胞にダメージを与ええて得られる生細胞数が少なくなってしまうことがあるため、試料となる組織や使用する酵素のロットの種類によって酵素の濃度、処理温度を調整しなければならない。他方、組織片培養法（Explant Culture）では、培養によって組織片から細胞が遊走（アウトグロース：out-growth）するため、より少量の組織片からの細胞の単離が可能であるとともに、細胞にダメージを与える可能性が少ないという利点がある。特に、皮膚組織（真皮組織）の組織片培養で、線維芽細胞が必要な場合には好ましく利用されている。
【０００４】
組織片培養では、培養開始にあたり、組織片を培養器に接着させる必要があるが、組織片は細胞と異なり培養面に接着しにくい。このため、従来、組織片を培養器に載置した後、培地を添加せずに数１０分以上組織片が接着するまで載置し、その後、培地を注入して培養を開始することが行われている（特許文献１）。さらに、組織片を培養面に接着させるために、組織片の上部に物体を載せて培養面に対して押圧する方法やコラーゲンゲルを接着剤として使用する方法など種々の方法が開発されている（非特許文献１）。
【特許文献１】特表平１１−５１００６９号
【非特許文献１】動物細胞培養入門、学会出版センター（１９９３年）、ｐ．７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、培地を添加しないで組織片を固定する方法では、組織片を培地がない状態で静置する間、組織片が空気に触れる状態にあるので、乾燥しないように注意して作業を行う必要がある。また、組織片を培養面に一旦接着した後であっても、急激に液体培地を注入すると、組織片が培養面から離れてしまう可能性があるため、この操作も熟練を要するものとなっている。
【０００６】
また、組織片を押圧する方法では、組織片に障害を与えないようにしつつ培養面から離れないように注意深く操作する必要があった。また、接着剤として接着性材料を用いる場合も材料の使用方法や種類に注意が必要であり、材料そのものの安全性も求められる。
【０００７】
このように、従来の組織片培養においては、組織片を接着させるまでの工程がオペレータの負担となるばかりでなく、熟練を要するものとなっていた。そして、この工程の良し悪しによって細胞増殖の状態が異なるため、オペレータの熟練度の違いや作業状況によっては、良好な細胞増殖状態を得られないことがあり、安定して所望量の培養細胞が得られにくかった。さらに、従来の手法によっては、一旦、接着した組織片であっても少しの振動で培養面から剥離してしまうため、安定した細胞増殖状態を維持することも困難であった。
【０００８】
そこで、本発明は、簡易な操作で組織片を培養面へ接着させて組織片培養を開始することができる培養方法、特に、組織片の培養方法を提供することを一つの目的とする。また、本発明によれば、安定した細胞増殖状態を維持できる培養方法を提供することを他の一つの目的とする、さらに、本発明によれば、簡易な操作で組織片を培養面に接着させることができる組織片の処理方法を提供することを他の一つの目的とする。さらにまた、本発明は、組織片の接着及び培養に適した培養容器を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記した課題を解決するべく検討した結果、組織片に対して培養面方向の遠心力を作用させることで、組織片の培養開始に適した接着状態を得られることを見出した。また、こうした接着状態から組織片の培養を開始すると安定した細胞増殖状態が得られることを見出した。したがって、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【００１０】
本発明によれば、組織片の培養方法であって、前記組織片を遠心力によって培養面に接着させる接着工程と、該接着工程後の前記組織片を前記培養面上で培養する組織片培養工程と、を具備する培養方法が提供される。この態様においては、前記組織片培養工程は、前記培養面を含む培養容器を静置した状態で培養する工程を有していてもよい。また、これらの態様においては、前記組織片培養工程は、組織片培養工程中の前記組織片を遠心力によって培養面に接着させる工程を有していてもよい。
【００１１】
さらに、上記したいずれかの態様の培養方法は、前記組織片を、前記組織片を構成する細胞外マトリクス成分を分解する酵素によって前記組織片の形状が維持される範囲で酵素処理をする酵素処理工程を備えることができる。この態様においては、前記酵素は、コラゲナーゼとすることができる。
【００１２】
また、これらの態様においては、前記組織片は、少なくとも線維芽細胞を含有することができる。
【００１３】
さらに、これらの態様においては、前記組織片培養工程は、前記培養面を含む培養容器を用いて実施し、前記培養面は、前記組織片を載置可能な載置領域と、前記組織片から増殖する細胞が遊走可能な増殖領域と、を有し、前記載置領域と前記増殖領域とは前記載置領域を前記培養容器の底部近傍に有する凹状面を構成することができる。
【００１４】
また、本発明によれば、組織片の培養方法であって、前記組織片を、前記組織片を構成する細胞外マトリクス成分を分解する酵素によって前記組織片の形状が維持される範囲で酵素処理をする酵素処理工程と、前記組織片を遠心力によって培養面に接着させる接着工程と、該接着工程後の前記組織片を前記培養面上で培養する組織片培養工程と、を具備する培養方法が提供される。
【００１５】
さらに、本発明によれば、組織片の処理方法であって、前記組織片を遠心力によって培養面に接着させる接着工程を備える、処理方法が提供される。さらにまた、組織片培養容器であって、前記組織片を載置可能な載置領域と、前記組織片から増殖する細胞が遊走可能な増殖領域と、を有し、前記載置領域と前記増殖領域とが、前記載置領域を前記組織片培養容器の底部近傍に有する凹状面を構成しており、組織片を遠心力によって前記載置領域に接着させることが可能な培養容器が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の培養方法は、組織片を遠心力によって培養面に接着させる接着工程と、該接着工程後の前記組織片を前記培養面上で培養する組織片培養工程と、を備えることを特徴としている。また、本発明の組織片の処理方法は、前記組織片を遠心力によって培養面に接着させる接着工程を備えることを特徴としている。これらの発明によれば、組織片の培養面の接着を遠心力により行うため、簡易な操作により組織片を培養面に接着できるので、オペレータの操作熟練度や作業状況にかかわらず組織片の培養に適した状態を容易に実現することができる。
【００１７】
本発明者らが得た知見は、組織片の培養に先立って、組織片に遠心力を作用させることにより、組織片を培養面に接着させ、その後もその接着状態を維持して培養できることを初めて明らかにするものである。なお、本明細書において「接着」とは、接着工程後の組織片培養工程において、組織片が容易に培養面から剥離しない程度の状態を意味している。
【００１８】
また、遠心力によって組織片を培養面に接着させることで、その後の組織片培養工程において組織片が培養面に安定して保持され、これにより安定した細胞増殖状態を確保することができる。
【００１９】
さらに、これらの発明において、前記組織片を、前記組織片に含まれる細胞外マトリクス成分を分解する酵素によって前記組織片の形状が維持される範囲で酵素処理をする酵素処理工程を備えることができる。このような酵素処理工程によれば、組織片の培養面への接着性を高めることができる。したがって、より容易に安定した細胞増殖状態を得ることができる。
【００２０】
また、本発明の組織片培養容器は、前記組織片を載置可能な載置領域と、前記組織片から増殖する細胞が遊走可能な増殖領域と、を有し、前記載置領域と前記増殖領域とが、前記載置領域を前記組織片培養容器の底部近傍に有する凹状面を構成することを特徴としている。この組織片培養容器によれば、培養面は載置領域と遊走領域とが所定の凹状面を構成しているため、遠心力によって培養面の載置領域に容易に組織片を接着できるとともに、その接着状態も容易に維持できる。したがって、安定した増殖状態を容易に得ることができる。
【００２１】
以下図１に示す本発明の培養方法及び処理方法における組織片の接着工程の一例を適宜参照しながら、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２２】
（組織片の培養方法）
（組織片）
本発明の培養方法を適用する組織片としては、特に限定しないで各種の生体、特にヒト及び非ヒト動物を含む生体あるいはその一部から採取された組織片が挙げられる。組織片の大きさや厚みは、当該分野において一般的に組織片であると認められるものであればよい。
【００２３】
組織片としては、例えば、骨組織片、骨膜組織片、軟骨組織片、腱組織片、靭帯組織片、筋肉組織片、真皮組織片、上皮組織片、血管内皮などの内皮組織片、脂肪組織片、神経組織片のほか、角膜組織片、血管外膜組織片、歯肉などの歯周組織片、心臓弁組織片、食道組織片、気管組織片、膀胱組織片、心膜組織片、小腸組織片等の各種臓器又は組織に由来する組織片が挙げられる。なかでも組織片としては、線維芽細胞を含有することが好ましい。線維芽細胞を含有する線維芽細胞系の組織片は、培養面への接着状態が確保されることによって安定した増殖状態を得るのにより効果的だからである。具体的には、皮膚組織片、真皮組織片に好適である。
【００２４】
（接着工程）
本発明においては、組織片を遠心力によって培養面に接着させる。接着工程は、例えば、組織片のはいった培養容器を、培養容器の培養面に遠心力が作用するようにして遠心回転することによって行うことができる。遠心操作の条件は、通常、回転数（ｒｐｍ）又は遠心力（ｇ）及び時間である。このような操作条件は、一般に、機械的に高精度に制御することができる。したがって、遠心操作を接着操作として用いることにより、高い再現性で同じ接着条件を実現して安定して組織片を接着できるようになる。
【００２５】
接着工程を実施するための遠心条件は、組織片を培養面に接着させることができる程度であれば特に限定しないが、組織片の種類によっても異なるため、予め培養対象と同じ種類の組織片で実験して決定することが好ましい。このようにして遠心条件（接着条件）を決定すれば、その後、組織片を容易に、かつ安定して培養面に接着させることができる。この結果、オペレータの熟練の差や操作状況の差に依存することなく、安定して組織片を接着させることができ、容易かつ安定して細胞増殖をおこなうことができる。
【００２６】
遠心操作にあっては、組織片は当該組織片に適合した液状媒体とともに遠心されることが好ましい。これは空気等に曝露されることによる細胞への障害を回避するためである。好ましくは、組織片培養工程に用いる培養液とともに遠心する。
【００２７】
組織片を培養面に接着させるための遠心条件としては、対象となる組織片の種類などによって異なるが、例えば、２０ｇ以上３５，０００ｇ以下とすることができる。この範囲であると、多くの組織片について、組織片に障害を与えることなく効果的に培養面に接着させることができる。より好ましくは９０ｇ以上であり、また、１０，０００ｇ以下である。更に好ましくは、２０００ｇ以下である。
【００２８】
接着工程は、培養面に組織片を接着させるものであり、その後段の組織片培養工程は、組織片が接着された培養面上で培養するものである。したがって、遠心操作時において、組織片を接着して培養しようとする培養面を備える培養容器を用いることが好ましい。こうすることで、一旦接着工程を実施した組織片に外力が加わる機会を低減させることができる。遠心操作時における培養面は、遠心チューブ（遠沈管）などの遠心用容器に培養面を備えるシートを敷設するなどして形成してもよい。組織片を接着させた培養シートはその後適当な培養容器に移して組織片培養工程を実施することができる。
【００２９】
培養面としては、通常、接着性細胞の培養や組織片培養に用いられているものを用いることができる。
【００３０】
培養容器を遠心操作時においても用いる場合には、培養容器の備える培養面は、遠心操作時における遠心力負荷方向に位置されるようになっていることが好ましい。また、培養面は凹状面を構成していることが好ましい。培養面が凹状面を構成していることで、遠心力に対する強度を確保しやすいとともに、遠心時において組織片が凹状面の底部近傍において安定されるため、組織片が培養面に接着されやすくなる。
【００３１】
凹状面の形態は特に限定しないで、いわゆる一般的な遠心チューブの底部のような半球状であってもよいし、遠心チューブの側面のような種々の凹状断面を有する長尺体状であってもよい。凹状面は、連続する曲面であってもよいし、段差を有していてもよいが、好ましくは連続する曲面である。このような凹状面としては、他に波状の凹凸形状、すり鉢形状などが挙げられる。
【００３２】
培養容器の培養面は、通常、組織片を載置して培養可能な載置領域と、組織片から増殖してくる細胞が遊走可能な増殖領域とを備えており、載置領域を凹状面に形成した培養容器の底部近傍に有していることが好ましい。なお、培養容器の底部とは、組織片培養工程を実施するときにおける底部である。載置領域を、凹状面に形成した培養容器の底部近傍に備えることで、遠心操作時に容易に組織片を培養面に接着できる。また、組織片を培養するとき、培養容器の持ち運びや各種操作によって組織片に外力がかかっても組織片が培養面に沿って移動しにくくなっている。このため組織片を安定して培養面に保持し、接着状態を容易に維持あるいは復元させて、安定した増殖状態を確保できる。
【００３３】
例えば、組織片培養工程中、組織片の一部が培養面から剥離し浮遊可能な状態となったとしても、組織片は凹状面の底部近傍で揺動はするものの底部近傍に最も収まりやすくなっているため、そのまま増殖を維持させることができる。また、組織片の安定保持の観点からは、載置領域が組織片とほぼ同等の面積であることが好ましい。
【００３４】
組織片の培養面への接着をより効果的に行うには、組織片を、その細胞外マトリックス成分を分解する酵素により組織片の形状が維持される範囲で酵素処理をする酵素処理工程を実施することができる。推論であって、本発明を拘束するものではないが、細胞外マトリックスの一部分解によって組織片が遠心操作時に培養面に容易に追従可能な可撓性を備えることと、細胞外マトリックスが一部分解されることによって細胞の培養面表層へのアクセスが容易になることによるものと考えられる。また、この酵素処理によって、細胞増殖の効率を向上させることもできる。
【００３５】
組織片の形状が維持される範囲は、原則的には目視によって組織片が酵素処理前の形状をほぼ維持していると認められる範囲、すなわち細胞分散される前の状態であればよい。なお、予め、培養しようとする組織片に対して各種酵素を用いて培養面への接着性とその後の増殖安定性の観点から好適な酵素処理条件を設定しておくこともできる。
【００３６】
細胞外マトリックス成分の分解酵素は、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼなどの各種プロテアーゼ、各種ペプチダーゼ、各種糖分解酵素を用いることができる。組織片の種類によって細胞外マトリックスの組成も異なるが、本発明においてはコラゲナーゼを用いることが好ましい。コラゲナーゼを用いると遠心力による細胞接着に好ましい程度に細胞外マトリックスを緩めることができるとともに、酵素処理による細胞障害も回避し、細胞増殖を活性化できる。
【００３７】
（組織片培養工程）
組織片培養工程では、接着工程後の組織片を培養面上で培養する。培養方法は、組織片の種類に応じた方法で行えばよい。一旦接着工程を実施した後は、組織片培養工程においては特に培養面方向に遠心力を作用させる必要はない。なお、遠心力を、細胞の脱分化抑制などを目的として、そのような目的を達成できる遠心条件で作用させることもできる。この場合は、遠心力の作用方向は特に限定しないで、組織片の脱分化抑制に好ましい方向性で遠心操作を行うが、培養面以外に遠心力が作用する状態で組織片を培養する工程としてもよい。組織片培養工程の全工程においてこうした目的の遠心力下の組織片培養工程を実施してもよいし、その一部として実施してもよい。
【００３８】
本組織片培養工程では、培養容器を静置状態とし、培養面に組織片が載置された状態で培養する工程を有することが好ましい。静置培養とすることで、接着工程における組織片の接着状態を維持して良好な細胞増殖状態を得ることができる。こうした静置培養にて本組織片培養工程の全工程を実施してもよい。
【００３９】
一方、組織片が浮遊、揺動あるいは増殖状態が不安定など、組織片の接着強度が弱いかあるいは接着強度が低下したと認められる場合には、組織片培養工程中であっても、適宜遠心力による組織片の培養面への接着工程を再度実施することができる。こうすることで、接着状態を簡単に復元して良好な細胞増殖状態を形成させることができる。また、本接着工程は操作が短時間であるため、組織片培養工程中であっても、当該工程への影響を抑制して組織片の接着工程を行うことができる。
【００４０】
（細胞の回収工程及び細胞培養工程）
組織片培養工程を終了したら、組織片を適切なディスパーゼ、トリプシン等の細胞分散用酵素で処理をして分散させ、細胞を回収する細胞回収工程を実施することができる。必要に応じ、こうして回収した細胞をさらに細胞培養工程に供し、細胞を培養して所望量の細胞を得ることができる。
【００４１】
以上説明した本発明の培養方法によれば、遠心力によって組織片を培養面に接着させることで組織片培養における接着作業を簡易化することができる。したがって、オペレータに手間や負担を掛けさせることなく容易に組織片培養を行うことができる。また、オペレータの熟練度の差に依らず、安定した細胞増殖を得ることができる。また、この培養方法によれば、組織片の接着を促進し、組織片の接着を早期に実現することができる。これらの結果、より早期にしかも安定した細胞増殖状態を容易に得ることができるものとなっている。したがって、本発明の培養方法によれば、組織片から容易かつ安定して所望量の細胞を得ることができるものとなっている。さらに、本発明の培養方法は、組織片を用いた各種の研究方法や探索方法にも有用である。
【００４２】
（組織片の処理方法）
本発明の組織片の処理方法は、既に説明した組織片の培養方法における接着工程を備えることができる。こうした組織片の接着工程を実施することで、組織片に障害を与えることなく、容易に培養面に組織片を接着させ、組織片培養を容易化できるとともに、その後の組織片の取り扱い（培養容器の取り扱いなど）を容易化できる。また、この処理方法は、組織片の接着を早期化及び安定化し、さらに、この結果細胞の遊走を早期化できるため、組織分化等を目的とした２種類以上の組織片を共培養する培養方法に好ましく適用できる。さらに、この処理方法は、細胞の遊走を指標とした生理活性物質等の探索方法に好ましく適用できる。
【００４３】
（組織片培養容器）
また、本発明の組織片培養容器は、既に説明した組織片の培養方法の接着工程で用いる培養容器とすることができる。こうした培養容器は本発明の組織片の培養容器に好適である。
【実施例１】
【００４４】
以下、本発明を、実施例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４５】
（実施例１：遠心操作による接着工程）
実験用試料には、インフォームド・コンセントにより了承を得た患者から採取されたヒト皮膚組織および歯肉組織を使用した。採取された組織は、ペニシリン，ストレプトマイシンおよびアンフォテリシンＢを含む抗生剤溶液にて30分間消毒した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄して実験に供した。
【００４６】
（組織片の培養）
ディスパーゼ処理した皮膚組織片（約３ｍｍ径）から、表皮層をピンセットにより除去した後、真皮層をメスで三分割した。分割した組織片はさらにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄しコラゲナーゼ溶液で短時間浸漬処理し試料として供した。
【００４７】
このように調製した試料５片を1片ずつチューブ（遠沈管）に挿入し、培地を5ｍｌ注入した。培地には１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）を使用した。なお、チューブには、ポリスチレン製の遠沈管を使用した。
【００４８】
次いで、各チューブを遠心機にセットし、表１の条件で遠心力（本実施例における３０００ｒｐｍでの遠心時には、約１７００ｇの遠心力が得られている。以下の実施例においても同様である）を加えた。この接着工程の後、各チューブをチューブ立てに載置し、このように静置した状態で３７℃、５％ＣＯ２の環境条件で培養した。培養は全体で21日間行い、組織片培養を２週間（１４日間）おこなった後、１５日目にチューブ内の組織片及び遊走した細胞を酵素処理によって分散して回収し、７日間の細胞培養を実施した。１５日目の細胞分散工程は各チューブ内の培地を吸引除去し、ＰＢＳで洗浄した後、トリプシンを注入して細胞を分散させた。所定時間後、トリプシンの活性を停止させたその後、分散した細胞を回収し、培養フラスコに再播種し、平な面を培養面とした状態で３７℃、５％ＣＯ２の環境条件で培養した。
【００４９】
【表１】
2006204168.tif 000003
【００５０】
（細胞増殖状態の評価）
接着工程直後にチューブ内の組織片の状態を観察し、培養５日後にチューブ内の状態を顕微鏡で観察した。また、細胞培養を実施する前、すなわち細胞分散工程の直前のチューブ内における組織片を肉眼観察した。さらに、細胞培養７日後での各チューブの生細胞数を計測した。生細胞数の計測は、各チューブをＰＢＳで洗浄した後、トリプシンを注入して分散した細胞を顕微鏡下でカウントすることによって行った。これらの結果を表２〜表５に示す。
【００５１】
表２に示すように、接着工程直後では、遠心による接着工程を行わなかった試料Ａ〜Ｃは、わずかな振動でも組織片が左右動（揺動）し、接着していないことが明らかだった。一方、遠心による接着工程をおこなった試料Ｄ及びＥは、接着工程直後であっても容易に左右動しない程度には培養面に接着しており、チューブの取扱い等が容易であった。
【表２】
2006204168.tif 000004
【００５２】
また、表３に示すように、組織片培養５日後においては、試料Ｄ及びＥでは遊走（アウトグロース）した多数の細胞が明確に観察された。
【表３】
2006204168.tif 000005
【００５３】
さらに、表４に示すように、細胞培養開始直前（組織片培養終了）の時点で、試料Ａ及びＣはチューブを揺らすと、組織片が左右動（揺動）し、接着していないことが明らかだった。試料Ａ及びＣについては遠心工程がなく、組織片が底面に接着するのに十分な遠心力が加わらなかったためと考えられる。但し、同様の条件の試料Ｂについては接着が認められた。また、試料Ｄ及びＥで接着が認められ、さらに表３で示したように遊走も早期に認められた。これは遠心力により底面への組織片の接着が早期に起こったためであると考えられた。
【表４】
2006204168.tif 000006
【００５４】
表５に示すように、細胞培養５日後の時点で、遠心を実施して組織片の接着が認められた試料Ｄ及びＥで最も多くの細胞数が得られた。一方、遠心無しで組織片の接着が認められた試料Ｂは、組織片が接着しなかった試料Ａ及びＣと比較して多くの細胞数が回収できたが、遠心を実施した試料Ｄ及びＦと同程度の細胞数には及ばなかった。以上の結果から、遠心工程を実施することで、組織片が培養面に接着しやすくなり、遊走も早期に認められ、結果として同培養期間においてより多くの細胞数を得られること、すなわち細胞の単離効率が上がることが明らかとなった。
【表５】
2006204168.tif 000007
【実施例２】
【００５５】
（実施例２：コラゲナーゼによる酵素処理工程）
（実験１）
実験１では、後述の実験２に先立って、酵素処理の組織片培養に与える影響に関して実験を行った。採取したヒト歯肉組織は、６００PU/mlディスパーゼ（登録商標）に１時間浸漬しリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した後、表皮層と真皮層を分離し、真皮層のみを実験に供した。さらに真皮層は０．５％コラゲナーゼに浸漬して酵素処理をおこなった。処理時間は表６に記載された時間で行った。
【表６】
2006204168.tif 000008
【００５６】
このように調製した試料６片を各培養ウェル底面に載置し、３０分間３７℃でインキュベートすることにより培養ウェル底面に接着（３０００ｒｐｍ、１０分）させた後、培地を1ウェルにつき1ｍｌ注入した。培地には１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）を使用した。組織片を培養ディッシュに常法により接着させて培地を注入した後、静置した状態で３７℃、５％ＣＯ２の環境条件で培養した。遊走してアウトグロースした細胞がサブコンフルエントに達した時に細胞を分散して回収し、より面積の大きなフラスコへ播種して細胞培養を実施した。表７に２５日間培養したときの各試料における生細胞数を示す。但し、試料Ｄは細胞数が多かったため、培養２３日後の生細胞数を示す。生細胞数の計測は、培養した細胞の入ったフラスコから培地を吸引除去し、ＰＢＳで洗浄した後、トリプシンを注入して分散した細胞を顕微鏡下でカウントすることによって行った。表中の×は生細胞が検出されなかったことを意味する。
【表７】
2006204168.tif 000009
【００５７】
表７に示すように、真皮層の組織片培養において、接着工程時にコラゲナーゼ処理を適切な時間だけ行うことにより、細胞単離効率が上がるという結果が得られた。これにより、組織片を構成する細胞外マトリクスを分解する酵素で前処理を行うことが好ましいことがわかった。
【００５８】
（実験２）
実験２では、実験１で得られた酵素処理条件の本発明への影響について検討した。採取したヒト皮膚組織片（約３ｍｍ径）は、６００PU/mlディスパーゼ（登録商標）に１時間浸漬し、表皮層をピンセットにより除去した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し真皮層をメスで三分割した。分割した組織片のうち試料Ａ、Ｂ及びＣの各１組織片はそのまま1片ずつチューブに挿入し、培地を５ｍｌ注入した。培地には１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）を使用した。チューブには、ポリスチレン製の遠沈管を使用した。一方、試料Ｄ及びＥの各１組織片には０．５％コラゲナーゼに浸漬して酵素処理を行った。処理時間は表８に記載された時間で行った。このように調製した試料２片を試料Ａ、Ｂ及びＣと同様に１片ずつ各チューブに挿入し、培地を５ｍｌ注入した。
【表８】
2006204168.tif 000010
【００５９】
次いで、試料Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの各チューブを遠心機にセットし、３０００rpm １０分間の条件で遠心力を加えた。この接着工程の後、各チューブをチューブ立てに載置し、このように静置した状態で３７℃、５％ＣＯ２の環境条件で培養した。培養は全体で２１日間行い、組織片培養を２週間（１４日間）おこなった後、１５日目にチューブ内の組織片及び遊走した細胞を酵素処理によって分散して回収し、７日間の細胞培養を実施した。１５日目の細胞分散工程は各チューブ内の培地を吸引除去し、ＰＢＳで洗浄した後、トリプシンを注入して細胞を分散させた。トリプシンの活性を停止させた後、分散した細胞を回収し、培養フラスコに再播種し、平らな面を培養面とした状態で３７℃、５％ＣＯ２の環境条件で培養した。
【００６０】
（細胞増殖状態の評価）
接着工程直後にチューブ内の組織片の状態を観察し、培養５日後にチューブ内の状態を顕微鏡で観察した。また、細胞培養を実施する前、すなわち細胞分散工程の直前のチューブ内における組織片を肉眼観察した。さらに、細胞培養７日後での各チューブ内の生細胞数を計測した。生細胞数の計測は、各チューブをＰＢＳで洗浄した後、トリプシンを注入して分散した細胞を顕微鏡下でカウントすることによって行った。これらの結果を表９〜表１２に示す。
【００６１】
表９に示すように、接着工程直後では、遠心による接着工程を行った試料全てにおいて、接着工程直後であっても容易に左右動しない程度には培養面に接着しており、チューブの取扱い等が容易であった。
【表９】
2006204168.tif 000011
【００６２】
また、培養５日目の観察では、培養面が半球形状のため、観察が困難であったが、表１０に示すように、試料Ｄ及びＥでは遊走（アウトグロース）した多数の細胞が明確に観察された。一方、試料Ａ、Ｂ及びＣでは、試料Ｄ及びＥほどの顕著な遊走は観察できなかった。
【表１０】
2006204168.tif 000012
【００６３】
さらに、表１１に示すように、細胞培養直前（組織片培養終了）の時点で、試料Ａはチューブを揺らすと、組織片が左右動（揺動）し、接着していないことが観察された。これは、接着していた組織片が、遠心接着工程後の何らかの衝撃によって剥がれたものと推察される。但し、このような場合であっても、再度遠心接着工程を経ることによって、細胞を増殖させることが可能である。これに対し、試料Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥでは接着が認められた。
【表１１】
2006204168.tif 000013
【００６４】
表１２に示すように、細胞培養７日の時点で、コラゲナーゼ処理を実施した試料D及びＥで最も多くの細胞数が得られた。一方、コラゲナーゼ処理無しで組織片の接着が認められた試料Ｂ及びＣは、組織片が接着しなかった試料Ａと比較して多くの細胞数が回収できたが、コラゲナーゼ処理を実施した試料Ｄ及びＥと同程度の細胞数には及ばなかった。
【表１２】
2006204168.tif 000014
【００６５】
以上の結果から、コラゲナーゼ処理を組織片へ実施することで、組織片培養工程において細胞の遊走が早期に認められ、結果として同一培養期間においてより多くの細胞数を得られること、すなわち細胞の単離効率が上がることが分かった。また、遠心接着工程直後において、コラゲナーゼ処理を行った試料の方が、コラゲナーゼ処理をおこなわなかった試料に対して確実に培養面に接着していることが、目視で観察された。
【実施例３】
【００６６】
（実施例３：コラゲナーゼ処理の有無の比較）
ディスパーゼ処理をした歯肉組織片から、表皮層をピンセットにより除去した後、真皮層をメスで約２mm角に分割した。分割した組織片はさらにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し試料として供した。このように調整した組織片を培養プレートの各ウェルに１片ずつ置き、３７℃、５％CO２の環境条件で３０分静置し、組織片を固定させた。このように処理した６片を試料Ａとする。一方、他の組織片については０．５%コラゲナーゼ溶液で１０分間浸漬処理をした後、培養プレートの各ウェルに１片ずつ置き、３７℃、５%ＣＯ２の環境条件で３０分静置し、組織片を固定させた。このように処理をした６片を試料Ｂとする。
【００６７】
すべての試料について固定させた後、組織片が浸かる程度の量の培地を添加し３７℃、５%CO２の環境条件で一晩培養した。その後、Millipore社製のMillicellをこれらの試料の上に乗せ、組織片の固定のための重しとして使用し、その状態のまま３７℃、５%CO２の環境条件で再び培養した。表１３に、細胞の遊走が最も早期に確認された時点を示す。
【表１３】
2006204168.tif 000015
【００６８】
表１３に示すように、培養４日後にコラゲナーゼ処理を実施した試料Ｂの内、組織片２つにおいて細胞の遊走が最も早く認められた。一方、コラゲナーゼ処理無しの試料Ａについては最も早くに細胞の遊走が認められたのは、培養６日後であった。これらのことから、従来の細胞固定方法においても、細胞接着の促進及び細胞の早期の遊走のためには、コラゲナーゼ処理が有効であることがわかった。
【００６９】
さらに、遊走が認められた組織片についての細胞培養を組織片培養８日後に実施した。細胞培養に関しては、実施例１および２と同様に、トリプシン処理によって細胞を分散し、回収したものを培養フラスコに再播種することによっておこなった。コラゲナーゼ処理を実施した各組織片から回収した細胞を試料Ｂとして一つにまとめて再播種した。また、コラゲナーゼ処理なしの各組織片から回収した細胞も同様に試料Ａとして一つにまとめて再播種した。その後、各試料がサブコンフルエントに達した時点で継代を実施し任意の細胞密度となるフラスコを選択し培養を続けた。培養２２日後での各試料の測定生細胞数を表１４に示す。生細胞数の計測は各フラスコをＰＢＳで洗浄した後、トリプシンを注入して分散した細胞を顕微鏡下でカウントすることによって行った。
【表１４】
2006204168.tif 000016
【００７０】
表１４に示すように、試料Ａよりもコラゲナーゼ処理を実施した試料Ｂでより多くの細胞数が得られた。
以上の結果から、組織片培養を行う時にコラゲナーゼ処理を実施することで、細胞の接着組織片からの遊走が早期に認められ、結果として同培養期間においてより多くの細胞数を得られる事、すなわち細胞の単離効率が上がることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の培養方法の工程の一例を示す図。
【図１】
2006204168.tif 000017