(57)【要約】      （修正有）【課題】レプチンは脂肪組織で発現していることが知られており、細胞外に分泌シグナルを持ち、血流中に分泌されるホルモンであるが、非脂肪細胞からのレプチンを測定することによる妊娠の判断方法および癌または子宮関連疾患の判定のためのレプチン測定方法を提供する。【解決手段】生体試料中の非脂肪組織由来のレプチンを測定することによる疾患のスクリーニング方法であって、抗ヒトレプチン抗体を用いた免疫測定方法および免疫組織測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の非脂肪組織由来のレプチンを測定することによる疾患のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は肥満遺伝子産物であるレプチンを測定することによる癌または妊娠疾患の検出方法および妊娠の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レプチンは遺伝性の肥満マウス（ｏｂ/ｏｂマウス）が欠失している遺伝子としてポジショナルクローニングされた肥満遺伝子（ｏｂ遺伝子）の産物としてJ．F．Friedmanらにより発見され、マウスｏｂ遺伝子を用いてヒト組織細胞由来のｃＤＮＡライブラリーからヒトｏｂ遺伝子のｃＤＮＡをクローン化した(3)。レプチンは脂肪組織で発現していることが知られており、細胞外に分泌シグナルを持ち、血流中に分泌されるホルモンである。分泌されたレプチンは脳の視床下部の食欲中枢に作用し、摂食活動をコントロールして、脂肪摂取を抑えるものと考えられている。
【０００３】
最近、マウスおよびヒトレプチン受容体（ｏｂ−Ｒ）がクローン化され、サイトカイン受容体スーパーファミリーであるｇｐ１３０ファミリーに属する単一の膜１回貫通型受容体タンパク質であることが報告され（11）、組換えｏｂ−Ｒがレプチンと特異的に強く結合することも確認された。ｏｂ−Ｒは腎臓、肺で強く発現しており、脳、その他では心臓、肝臓、平滑筋でも発現が確認されている（1、13、14、15、23）。ｏｂ−Ｒにはいくつかのイソ型が存在し、生理活性を有するｏｂ−Ｒｂイソ型は脳、特に満腹中枢である視床下部で最も豊富に発現されている（12、13、14、15、16、17）。肥満マウス（ｄｂ/ｄｂマウス）では遺伝子の点突然変異によるｏｂ−Ｒｂの欠損が、肥満ラット（ｆａ/ｆａラットおよびｆａk/ｆａkラット）ではｏｂ−Ｒ遺伝子の変異によるｏｂ−Ｒの変異が報告されており（15、24、25）、これらの動物はいずれもレプチン抵抗性で、肥満を起こし、ｏｂ/ｏｂマウスと同様の肥満関連表現型を示すことが明らかとなった（26）。
これらのことは肥満症がｏｂ遺伝子またはその受容体遺伝子の変異、欠失によりレプチンのホルモンとして正常に作用しないことに起因していることを示している。
ｏｂ遺伝子の発現およびレプチンの分泌は肥満モデル動物およびヒト肥満においてその重症度に比例して増加することが報告されている（3、5、18、19、20、21、22）。抗肥満効果を調べるためにｏｂ/ｏｂマウスや正常のレプチンを持つ肥満マウスに組換えマウスレプチンおよびヒトレプチンを投与したところ、体温上昇、エネルギー消費量（基礎代謝量）の増大を引き起こし、体重の減少が観察されたことから体重調節因子（1、2、3）や満腹因子（3、4、5、6、7、8、9、10）であると考えられる。
【０００４】
また、レプチンは神経内分泌系および生殖系の重要な調節物質でもある。ｏｂ/ｏｂマウス、糖尿病モデル動物であるｄｂ/ｄｂマウスおよびｆａ/ｆａラットがいくつかの内分泌異常を有する不妊であることが知られており（26）、雌のｏｂ/ｏｂマウスにレプチンを投与すると、摂食や体重の変化とは無関係に不妊を治療できることが報告されている（27）。正常の絶食マウスにレプチンを投与すると、血漿中の性腺刺激ホルモンとチロキシンのレベルが上昇し、副腎皮質刺激ホルモンとコルチコステロンのレベルが低下することも報告されている（28、29）。
【０００５】
現在、日常臨床検査における妊娠診断の補助薬として尿中ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を検出する方法が妊娠の指標として広く用いられている。ｈＣＧは受精・着床により、胎盤の絨毛組織から分泌される分子量約３８，０００の糖タンパクホルモンである。尿中のｈＣＧは、妊娠第５週より上昇し、第９から１４週で最高値を示した後やや減少するものの分娩までほぼ同様のレベルが維持される。従って、尿中のｈＣＧは妊娠診断の指標とされる他、ｈＣＧの存在が絨毛組織の存在を意味し、絨毛性疾患の診断や管理にも用いられている。しかし、ｈＣＧはヒト黄体ホルモン（ｈＬＨ）、ヒト濾胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ｈＴＳＨ）やヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ）との交叉性が認められ、特異性が問題とされている。妊娠診断においてｈＣＧが他のホルモン類と交叉性を示すことから、妊娠判定マーカーとして完全なものではなかった。
【０００６】
さらに、ホルモンには腫瘍診断の指標としての有用性も期待できる。本来ホルモンを産生していない組織が腫瘍化することにより産生されるホルモンを異所性ホルモンと言い、異所性ホルモンを産生する腫瘍を異所性ホルモン産生腫瘍と言う。異所性ホルモン産生腫瘍の診断は（１）ホルモン過剰の症状または検査所見の異常、（２）腫瘍組織の摘出によりホルモン過剰症状の改善、（３）腫瘍組織からの正常組織より高いホルモン活性の証明が基準となる。異所性ホルモンとしては副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、膵分泌性トリプシンインヒビター（ＰＳＴＩ）、成長ホルモン、バソプレッシンおよびソマスタチンなど多数が知られており、レプチンも同様の有用性が期待できる。腫瘍診断には異所性ホルモン以外に多くの腫瘍マーカーを測定する方法が開発されている。現在有用とされている腫瘍マーカーは特定疾患への特異性が低く、それらの多くは、たとえ癌患者であっても血中濃度は極めて低いために、例えば、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）や癌胎児抗原（ＣＥＡ）、膵癌胎児性抗原（ＰＯＡ）などの多くの測定は高感度が要求される。放射性免疫測定法（ＲＩＡ）を用いれば高感度な測定が行えるが、有効期限や廃棄物処理などの様々な規制が問題となっている。最近の科学の進歩により、抗原や単クローン抗体の作成の簡便性や新しい酵素基質、蛍光剤の開発により、酵素免疫法（ＥＩＡ）や蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）でも高感度が得られるようになった。しかし、経済性や簡便性から十分といえる腫瘍マーカーは報告されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまでの報告からレプチンは脂肪細胞で産生・分泌される肥満因子であり、体脂肪調節において重要な役割を担っており、神経内分泌系や生殖系においても重要な生理活性調節物質であることが推測される。現在、レプチンが摂食およびエネルギー支出の調節に関与する脂肪細胞由来循環肥満因子であり、肥満症の診断・治療への有用性および臨床ヘの応用が検討されている。しかしながら、非脂肪細胞からのレプチン産生や神経内分泌系や生殖系における生理活性調節機能に関してはまだほとんど解明されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
妊娠女性の血漿レプチン量が非妊娠女性の体型指数（ＢＭＩ）から推測される量と比較して有意に上昇し、肥満者の血漿レプチン量（18、20、21）とほぼ同等の値を示すことを見出した。そして、レプチン発現細胞を調べるためにヒト妊娠子宮細胞の免疫組織染色およびノーザンブロット分析を行ったところ、非脂肪細胞である胎盤絨毛膜組織、平滑筋絨毛膜、羊膜、詳細には、栄養膜細胞、合胞体栄養膜細胞層および羊膜細胞でレプチンが産生されていることを見出した。
【０００９】
また、ヒト妊娠絨毛膜癌転移巣由来のＢｅＷｏ細胞でも同様の分析を行ったところ、レプチンが産生されていること、さらに、絨毛性疾患である胞状奇胎や絨毛膜癌などの栄養膜疾患の患者において血漿レプチン量が有意に上昇し、外科的治療または化学療法後には低下することを見出した。このことから、レプチンの異所性ホルモン産生腫瘍マーカーとしての有用性が期待できる。
【００１０】
本発明者らは、生体試料中の非脂肪組織由来レプチンを測定することが癌および絨毛性疾患における疾患活動性および／または治療効果を反映する有用な診断指標となること、および妊娠の判定指標に有用であることを見出した。すなわち、本発明は、
（１）生体試料中の非脂肪組織由来レプチンを測定することによる疾患のスクリーニング方法、
（２）癌である上記（１）記載の方法、
（３）癌が絨毛膜癌である上記（２）記載の方法
（４）子宮関連疾患である上記（１）記載の方法、
（５）子宮関連疾患が栄養膜疾患である上記（４）記載の方法、
（６）栄養膜疾患が胞状奇胎または絨毛膜癌である上記（５）記載の方法、
（７）癌細胞の存在、不存在を判定する方法であって、癌が疑われる患者から生体試料を採取してレプチン量を測定し、該患者と年齢および体型指数が同等の健常人の同試料中レプチン量を比較することを特徴とする方法、
（８）癌細胞の存在、不存在を判定するためのレプチン測定方法、
（９）生体試料中の非脂肪組織由来のレプチンを測定することによる妊娠の判定方法、
に関する。
【００１１】
本発明は生体試料中のレプチン発現の有無およびその量を測定した結果を基礎とする。
即ち、本発明は、患者の生体試料中の非脂肪組織での発現の有無および該組織由来のレプチン量を測定することによる疾患検出方法に関する。
脂肪組織は細胞内に脂肪を貯蔵し、糖からの脂質生合成およびその分解機能を持つ細胞で構成されている。よって、「非脂肪組織」とは脂肪組織由来のそのような細胞以外の細胞から構成される組織を意味する。
「生体試料」としては組織、血漿、血清、尿および羊水などが用い得ることができるがこれらに限定されない。
「疾患」としては癌および妊娠関連疾患などが対象となる。ここで、癌とは悪性腫瘍全般、あるいはそれによる疾病状態を指し、腫瘍細胞の形態や配列が種々の点で元の正常細胞とは異なっており、浸潤性・転移性があって放置すれば致死的である腫瘍であり、胃癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌および絨毛膜癌などが挙げられるがこれらに限定されない。また、妊娠関連疾患とは妊娠女性または非妊娠女性のいずれであっても良く、詳細には、子宮組織および胎盤、羊膜細胞ならびに漿膜など女性特有の組織を含む器官に見られる疾患を意味する。
【００１２】
また、本発明は癌細胞の存在、不存在を判定する方法に関する。詳細には、癌が疑われる患者から、生体試料として血液、尿、組織などを採取し、試料中のレプチン量を測定する。その結果を該患者と年齢および体型指数が同等の健常人の同試料中レプチン量を比較することにより癌細胞の存在、不存在を判定することにより癌を診断する。
さらに、本発明は、生体試料中の非脂肪組織由来のレプチンを測定することによる妊娠の判定法に関する。生体試料として血液、尿および羊水などを用いることが可能である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって提供されるレプチンの検出方法はレプチンの発現状態を解析するのに有用であり、癌および子宮関連疾患の原因解明や子宮関連疾患の診断および治療方法の新たな開発に有用である。また、本発明によって妊娠診断に新たな手段を提供し、レプチンの非脂肪細胞における機能の解明により、胎盤の機能、栄養細胞の分化と成熟、エネルギー代謝および妊娠の制御などを解明するのに有用であり、それによりレプチンの生理機能を解析する新たな手段を提供するのに有用である。さらに、本発明によって提供されるレプチン測定による癌または子宮関連疾患のスクリーニング方法は疾患活動性および／または治療効果を反映する妊娠栄養膜疾患および癌の有用なマーカーとして利用し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
次に本発明の工程を順次説明する。本発明において、特に指示のない限り、当該分野で公知である免疫学的手法、組織標本作製技術、細胞培養技術、ＲＮＡの分離精製方法および分析法が採用され得る。
【００１５】
抗ヒトレプチン抗体の作製 
ヒトレプチンに対する抗体は、例えば、Masuzakiら（4）が報告しているレプチンのアミノ酸配列の一部に基づいて通常のペプチド合成機で合成したペプチドや、当該分野で公知である遺伝子組換え技術を採用して作製された組換えレプチンを通常のタンパク化学的な方法で精製し、これらを免疫原として、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどの動物を免疫して、その血清由来のポリクローナル抗体を作製し得る。または、免疫したマウスやラットの牌臓またはリンパ節から細胞を摘出し、ケーラーとミルシュタインによる細胞融合法（42）によりミエローマと融合させてハイブリドーマを作製した後、該ハイブリドーマを培養し、単クローン抗体を産生させ、その培養液から単クローン抗体を分離・調製する。
【００１６】
レプチンの免疫学的定量方法 
免疫測定方法としては、例えば、放射性同位体、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼなどの酵素やアクリジニュウムやクリプテートなどの蛍光物質で標識した抗レプチン抗体またはレプチンを用いたサンドイチ法または競合法などの酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）または放射免疫測定法（ＲＩＡ）、などから選ばれる方法で定量することができる。使用する抗体はポリクローナル抗体、単クローン抗体であってもよく、石川の方法（43）などに記載されているそれ自体公知の方法を用いることができる。例えば、Hosodaらのレプチン放射性免疫測定方法（21）に従ってレプチンの定量が行える。これらの方法により臓器、組織、細胞、血液、尿や羊水などの試料中に微量に含まれるレプチンの測定が可能であるが、試料はこれらに限定されない 。
【００１７】
測定試料の調製 
血液試料は、例えば、被験者から採血後、血液を１ｍｇ/ｍｌエチレンジアミン四酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）入りシリコン処理したガラス管に分注し、４℃、１０００×ｇにて１０分間遠心分離する。遠心分離後、液体窒素で試料を凍結し、−２０℃で保存し、使用時に解凍する。羊水は、例えば、被験者から採取後、遠心分離し、上清を−２０℃で保存する。
【００１８】
癌細胞の存在、不存在を判定する方法 
癌が疑われる患者から生体試料を採取してレプチン量を測定し、該患者と年齢および体型指数が同等の健常人の同試料中レプチン量を比較することにより癌細胞の存在、不存在を判定する方法である。「体型指数」とはＢＭＩ（Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ Ｉｎｄｅｘ）と称され、「身長」と「体重の２乗の逆数」の積から算出される指数を意味する。よって、「該患者と年齢および体型指数が同等の健常人の同試料中のレプチン量」とは、その患者に癌細胞が存在していない状態の時に期待されるレプチン量を意味する。レプチン量は正常な状態であれば主として年齢および体型指数によって一定の範囲内に規定されるからである。なお、「同等」なる表現は、診断の分野において数価の数学的な一致を求めることが困難なことから、当業者が同一と認めてもよい許容範囲をもった同一性をあらわす。
【００１９】
妊娠の判定 
妊娠が疑われる女性から生体試料を採取して非脂肪組織由来のレプチンを測定することにより妊娠を判定する方法である。正常な非妊娠者のレプチン量は年齢および体型指数から一定の範囲内に規定される。レプチンは正常者であれば詣肪細胞からしか産生されていないため、体型指数から推測される範囲以上のレプチンは非脂肪細胞から産生されたものであると考えられる。よって、「非脂肪組織由来のレプチンを測定すること」とは妊娠者のレプチン量から年齢および体型指数が同等の正常な非妊娠女性の同試料中のレプチン量を差し引いた量を測定することを意味する。
【００２０】
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
妊娠女性の血漿レプチン量の測定
（１）抗レプチン抗体：免疫原として全長レプチンを用いてHosodaら(21)が作製したウサギ抗ヒトレプチン抗血清を使用した。
組換えヒトレプチン２５０μｇを含む溶液５００μｌに等量のフロイントの完全アジュバント混合した懸濁液をオス日本ウサギに皮下注射し、免疫を行った。
追加免疫は３週間毎に行い、各免疫後１０日から１４日に採取を行って、レプチン抗血清（Ｎｏ．９５-１-４）を得た。
【００２２】
（２）125Ｉによるヒトレプチンの標識：Hosodaらの方法（21）と同様に、ヒトレプチンをクロラミンＴ法により125Ｉで標識し、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラム１×３０ｃｍ（ファルマシア）を用いて精製した。
ヒトレプチン５μｇをクロラミンＴ法により125Ｉで標識し、標準液を含む反応液をＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラム１×３０ｃｍに供した。125Ｉ標識ヒトレプチンを０．１Ｍ りん酸緩衝液、ｐＨ７．４（含０．５％ ＢＳＡ、０．１％ ＮａＮ３）で溶出し、125Ｉ標識レプチン分画を得た。
【００２３】
（３）レプチンＲＩＡ：レプチンＲＩＡで使用する試薬はＲＩＡ緩衝液；０．１Ｍ りん酸緩衝液、ｐＨ７．４（含０．５％ ＢＳＡ、０．１％ ＮａＮ3）で調製した。ＲＩＡ抗体溶液は、実施例１（１）で作製したポリクローナル抗体（Ｎｏ．９５−１−４）をＲＩＡ緩衝液で２４，０００倍希釈して調製したものを用いた。各種標準ヒトレプチンまたは試料１００μｌにＲＩＡ抗体溶液１００μｌおよびＲＩＡ緩衝液２００μｌを添加し、４℃で２４時間放置した。その後、125Ｉ標識レプチン１００μｌ（１０，０００ｃｐｍ）を添加し、さらに４℃で２４時間放置した。Ｂ／Ｆ分離は二抗体法により行い、沈殿物の放射活性をγ−カウンターで測定した。
【００２４】
（４）被験者からの試料の採取：妊娠８週から３６週までの正常な妊娠女性７３名（３０．１±３．９歳）および非妊娠女性８７名（３１．２±５．１歳）から一晩絶食後、午前６時に横臥位で肘前静脈より採血を行った。妊娠女性は妊娠期および分娩後に継続的に採血を行った。分娩前の帝王切開４名は分娩１時間前および術後１、４、２４時間後に採血を行った。採取した血液試料は直ちにＥＤＴＡ・２Ｎａ（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）入りの冷やしたシリコン処理ガラス管に分注し、４℃、１，０００×ｇで１０分間遠心分離を行った。分離後は、試料を液体窒素で凍結し、使用するまで−２０℃で保存した。
【００２５】
（５）血漿中レプチンの定量：妊娠女性および非妊娠女性から採取した血漿検体中のレプチン量をレプチンＲＩＡで測定し、標準曲線から試料中のレプチン量を算出した。
得られた結果を図１に示す。被験者の体型指数（ＢＭＩ）で比較したところ、１８≦ＢＭＩ＜２２において非妊娠女性３７名（図１Ａ、レーン１）では８．９±１．７ｎｇ／ｍｌに対し妊娠女性１３名（図１Ａ、レーン２）では４１．４±５．５ｎｇ／ｍｌ（約４．７倍；Ｐ＜０．００１）、２２≦ＢＭＩ＜２５において非妊娠女性１９名（図１Ａ、レーン３）で１７．２±４．６ｎｇ／ｍｌに対し妊娠女性９名（図１Ａ、レーン４）で４０．６±６．３ｎｇ／ｍｌ（約２．４倍；Ｐ＜０．００１）、２５≦ＢＭＩ＜３２において非妊娠女性３１名（図１Ａ、レーン５）では２４．２±２．９ｎｇ／ｍｌに対し妊娠女性７名（図１Ａ、レーン６）では５５．１±１１．７ｎｇ／ｍｌ（約２．３倍；Ｐ＜０．０５）といずれも妊娠女性において有意に高い値を示した。
また、非妊娠女性（図１Ｂ、○）ではConsidineらやHosodaらの報告（20、21）と同様に血漿レプチン量とＢＭＩには正の相関が見られた（相関係数ｒ＝０．４６；Ｐ＜０．００１）。しかし、妊娠女性（図１Ｂ、●）では血漿レプチン量とＢＭＩの間に相関は見られなかった。
【００２６】
（６）妊娠女性の血漿レプチン量の経時的測定：妊娠女性４０名（２８．２±４．５歳）の血漿レプチン量をレプチンＲＩＡで経時的に測定し、非妊娠女性４１名（２６．７±３．３歳；９．０±１．９ｎｇ／ｍｌ）とＢＭＩについて比較した。得られた結果を図２、３に示す。
【００２７】
妊娠第１三半期（妊娠１週〜１２週）（図２、レーン１）で２６．７±３．２ｎｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．００１）と有意に上昇していた。妊娠第２三半期（妊娠１３週〜２６週）（図２、レーン２）で４２．７±４．３ｎｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．００１）、妊娠第３三半期（妊娠２７週〜４０週）（図２、レーン３）でも４０．６±４．５ｎｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．００１）と有意に高い値を示した。分娩後（図２、レーン４）として胎盤娩出２４時間後の血漿レプチン量を測定したところ２１．４±２．７ｎｇ／ｍｌと妊娠第１三半期より低下した。帝王切開４名（２９．３±３．２歳）（図３）については分娩１時間前で３４．８±５．２ｎｇ／ｍｌであるのに対し、分娩１時間後で１９．４±３．２ｎｇ／ｍｌ、２４時間後で１０．４±１．５ｎｇ／ｍｌと低下する傾向にあり、ＢＭＩから推定される値にまで低下していた。
妊娠女性については非妊娠女性との年齢に有意さは見られないにもかかわらず、ＢＭＩから推測される血漿レプチン量と比較して有意に上昇しており、肥満者の血漿レプチン量（18、20、21）とほぼ同等の値を示していた。この事はレプチンが妊娠子宮で産生され、かなりの量が母体循環に入ることを示唆しており、妊娠期には胎盤から母体に作用する液性信号として体重調節とは別の機能的役割を果たしていることが推測できる。
【実施例２】
【００２８】
組織中のレプチン発現
（１）ノーザンフロット解析によるレプチンｍＲＮＡの発現解析：腹部皮下脂肪の成熟脂肪細胞、胎盤絨毛膜組織（妊娠３６週）、第１三半期絨毛膜絨毛（妊娠８週）、第３三半期平滑絨毛膜（妊娠３６週）、羊膜（妊娠１６および３６週）、真性脱落膜（妊娠８週）および子宮筋層（妊娠１４週）からMasuzakiらの方法（4）に従って総ＲＮＡを抽出した。単離したＲＮＡ２０μｇを、アガロースゲル中で電気泳動にかけ、ナイロン膜ＧｅｎｅＳｃｒｅａｎＰｌｕｓ（デュポン社）に転写した。これらの膜をMasuzakiらが報告した全ヒトｏｂ ｃＤＮＡ（4）を３２Ｐで標識したものをプローブとして、ハイブリダイセーションを行った。ハイブリダイゼーションを行ったメンブレンは強調スクリーンにてＸ線フィルムに−７０℃で２４時間感光させ、それらを現像してデンシトメーターＰ−４５（ファルマシア社）で定量を行った。得られた結果を図４に示す。
ｏｂｍＲＮＡは第１三半期絨毛膜絨毛（図４、レーン３、４）で大量に発現し、第３三半期平滑絨毛膜（図４、レーン５）および羊膜（図４、レーン６）で少量の発現がみられる。真性脱落膜（図４、レーン９、１０）および子宮筋層（図４、レーン１１）ではほとんど検出されなかった。
【００２９】
（２）免疫組織染色によるレプチン産生の解析：第１三半期（妊娠６、８、９週）、第２三半期（妊娠１４、１６、１９週）および第３三半期（妊娠３１、３６、３８、３９週）に採取した胎盤絨毛膜組織、平滑絨毛膜、真性脱落膜および羊膜ならびに妊娠子宮由来子宮筋腫層組織をＯ．Ｃ．Ｔ ティシュテック（マイルス社）で包埋後、ドライアイス−アセトン中で急速に凍結した。凍結組織をミクロトームＣＲＹＯＣＵＴ １８００（ライカ社）で４μｍの凍結切片を作製し、スライドガラスＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ−Ｐｌｕｓスライド（フィッシャー・サイエンティフィック社）に乗せ、室温で２０分間乾燥させた。乾燥させた切片試料をＰＢＳ５ｍ１で１５分間３回洗浄し、実施例１（１）で作製したウサギ抗ヒトレプチン抗血清Ｎｏ．９５−１−４のＰＢＳ（含１％ ＢＳＡ）１００倍希釈液を添加し、室温で３０分間反応させた。試料をＰＢＳ（含１％ ＢＳＡ）で１５分間３回洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清（シレナスラボラトリーズ社）のＰＢＳ（含１％ ＢＳＡ）２５０倍希釈液を添加し、室温で３０分間反応させた。試料をＰＢＳ（含１％ ＢＳＡ）で１５分間３回洗浄した後、免疫蛍光顕微鏡ＢＨ２−ＲＦＣＡ（オリンパス社）で蛍光を検出した。特異性を立証するために、近接組織切片を同様の方法で処理した。ただし、ウサギ抗ヒトレプチン抗血清に代わり免疫前ウサギ血清を使用した。得られた結果を図５に示す。
レプチンは第１三半期絨毛膜絨毛組織の栄養膜（図５、１）、第３三半期絨毛膜組織の合胞体栄養細胞層（図５、２）および羊膜細胞（図５、３）でレプチン陽性に染まり、特に、絨毛膜絨毛組織では栄養膜細胞より合胞体栄養細胞層で強く染まった。線維芽細胞およびホーフバウアー細胞および免疫前ウサギ血清を用いた染色（図５、４、５、６）ではレプチン陰性であった。
【００３０】
これらの結果から、レプチンが摂食およびエネルギー支出の調節に関与する脂肪細胞由来循環満腹因子であり（1、2、3、7、8、9、10）、その遺伝子発現ならびにその分泌は成熟脂肪細胞でのみ発現している（3、4、5）と考えられていたが、非脂肪組織であるヒト妊娠胎盤および羊膜細胞で発現されていることが明らかとなった。ヒト妊娠子宮由来の胎盤栄養膜および羊膜細胞においてレプチンが産生されていること、ならびに、胎盤が妊娠において重要な役割を果たす様々なホルモンを産生している内分泌臓器であることから（32）、レプチンは胎盤ホルモンの一つであると考えられる。非妊娠女性では体内で循環しているレプチンが脂肪組織で産生されているのに対し、妊娠女性ではその数倍量が胎盤で産生されており、正常マウスにおいてレプチンを投与すると代謝率、体温、運動性が低下するのに対し、ｏｂ/ｏｂマウスでは代謝率、体温、運動性が上昇する（7）ことから、胎盤から産生されるレプチンが妊娠期に特徴的な高代謝状態に関与していると考えられる。
また、レプチン受容体（ｏｂ−Ｒ）がその形態からサイトカイン受容体ファミリーに分類され（1、13、14、15、23）、脳、末梢組織のみならず、栄養膜、脱落膜細胞、羊膜細胞でも発現されていること（データ未発表）、サイトカインであるインターロイキン−６およびその同族体受容体複合体が栄養膜で発現され（34、35）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）およびヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）の分泌を促進し（35、36）、成長ホルモン放出因子の分泌を抑制する局所的信号伝達経路を構成している（37、38）ことから、レプチンが胎盤における自己分泌または／および傍分泌調節物質として作用し、妊娠期の胎盤ホルモン産生を調節していることが示唆される。
【実施例３】
【００３１】
ＢｅＷｏ細胞におけるレプチンの発現
（１）ＢｅＷｏ細胞の培養：胎盤栄養膜がｉｎ ｖｉｔｒｏでレプチンを産生するかどうかを明らかにするため、胎盤栄養膜に特徴的な生物学的生化学的特性を多く残しているヒト妊娠絨毛膜癌転移巣由来のＢｅＷｏ細胞（30、31）を用いてｏｂ遺伝子の発現およびレプチンの分泌を測定した。
ＢｅＷｏ細胞（American Type Culture Collection）を１０％ ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（ディフコ社）中、３７℃、５％ 二酸化炭素均衡空気のもとで細胞密度が２×１０5ｃｅｌｌ/ｍｌになるまで培養した後、１０ｃｍ培養皿に培養細胞１０ｍ１を分注し、単層で維持し、実験に供した。増殖ＢｅＷｏ細胞の優先表現形は、未分化栄養膜細胞である子宮内栄養膜細胞に類似しており、アデニルシクラーゼ活性化因子であるフォルスコリンを処理することで合胞体栄養細胞層に分化することが知られている（31）。そこで、ＢｅＷｏ細胞を細胞が密集状態になるまで培養した後、培地を除去した細胞にフォルスコリン処理区には２０μＭまたは２μＭのフォルスコリン（シグマ社）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地（含１０％ ＦＣＳ）を、無処理区にはフォルスコリンを含有しない同培地を添加し、培養した。
【００３２】
（２）ＲＩＡによる培地中レプチンの定量：培地中の分泌されたレプチンをレプチンＲＩＡにより定量した。
細胞培養液１００μｌにＲＩＡ抗体溶液１００μｌおよびＲＩＡ緩衝液２００μｌを添加し、４℃で２４時間放置した。以下、実施例１（２）と同様の操作により測定し、標準曲線からレプチン量を算出した。
【００３３】
（３）培地中レプチンのゲルろ過クロマトグラフィーによる測定：培地中のレプチンをHosodaらの方法（21）に従って高性能ゲルろ過クロマトグラフィーにより分画し、レプチンＲＩＡで定量した。ＲＩＡ緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラム（１×３０ｃｍ）（ファルマシア社）に細胞培養液０．２ｍｌを供し、同緩衝液を用い、流量３０ｍｌ/ｍｌで溶出し、０．５ｍｌずつ分取した。各分画のレプチン量はレプチンＲＩＡで測定し、定量した。流量はブルーデキストラン（Ｖo）および125Ｉ（Ｖt）から算出した。
【００３４】
（４）ノーザンブロット解析による培養細胞におけるレプチンｍＲＮＡの定量：Masuzakiらの方法（4）に従ってフォルスコリン処理後４８時間培養したＢｅＷｏ細胞からの総ＲＮＡを抽出し、実施例２（１）と同様にしてノーザンブロット解析を行った。
【００３５】
（５）ｈＣＧ測定:ＢｅＷｏ細胞はフォルスコリン処理による分化のプロセスｈＣＧが増えることが知られている。そこでＢｅＷｏ細胞が培養できているかを確認するために培養液中のｈＣＧをｈＣＧ免疫測定キットＡｍｅｒｌｉｔｅ ｈＣＧ−６０（ジョンソン＆ジョンソン・クリニカル・ダイアグノスティック社）を用いて測定した。
【００３６】
ＢｅＷｏ細胞での結果を図５、図６、図７および図８に示した。ＢｅＷｏ細胞培地の段階希釈曲線（図５、●）はヒトレプチンの標準曲線（図５、○）と平行であった。
細胞培養液のゲルろ過クロマトグラフィー溶出結果（図６）はヒト血漿および一次培養ヒト脂肪細胞培地での報告（21）と同様に、ヒトレプチン様免疫反応物質が組換えヒトレプチンと同一の溶出ピークに検出された。
【００３７】
フォルスコリン処理後のレプチン産生量を経時的に測定したところ、レプチン産生量はフォルスコリン処理濃度および時間依存的に上昇し、処理後４８時間で２０μＭフォルスコリン処理区（図７Ａ、●）は無処理区（図７Ａ、○）の約４倍量、２μＭフォルスコリン処理区（図７Ａ、▲）では約３倍量に上昇していた。また、無処理区においても時間依存的にレプチンが蓄積された。
【００３８】
フォルスコリン処理後のｈＣＧ産生量を経時的に測定したところ、Burresら（30）およびWiceら（31）の報告と同様に２０μＭフォルスコリン処理区（図７Ｂ、●）、２μＭフォルスコリン処理区（図７Ｂ、▲）、無処理区（図７Ｂ、○）でフォルスコリン処理濃度および時間依存的に上昇した。
ノーザンブロット解析では、２０μＭフォルスコリン処理区（図８、レーン３）、２μＭフォルスコリン処理区（図８、レーン４）でｏｂ遺伝子が大量に発現しており、無処理区（図８、レーン１、２）では少量発現されていた。
【００３９】
これらの結果から、栄養膜細胞から合胞体栄養膜細胞層へのフォルスコリン誘発性分化の際にｏｂ遺伝子およびレプチン分泌が増強されることが明らかになった。胎盤栄養膜は未分化型の細胞である栄養膜細胞とｈＣＧやｈＰＬなどの胎盤由来ホルモンを分泌する合胞体栄養細胞層の2種類の細胞から構成されており、免疫染色において第１三半期絨毛膜組織では栄養細胞よりも合胞体栄養細胞層で強いレプチン反応を示すことと一致する。さらに、Slikerら（39）およびKosakiら（40）によって成熟脂肪細胞においてｏｂ遺伝子発現がｃＡＭＰによるダウンレギュレーションを受けていることが明らかにされた。これらのことから、栄養膜および脂肪細胞の間にob遺伝子発現とレプチンの分泌の差動調節が存在することが推測される。
【実施例４】
【００４０】
羊膜細胞におけるレプチンの産生 
実施例２においてレプチン免疫組織染色の結果、羊膜細胞が陽性を示した。そこで、羊膜細胞におけるレプチンの分泌をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで測定するため羊膜細胞の培養細胞および羊膜細胞の分泌が含まれる羊水中のレプチン量を測定した。
（１）羊水の採取：妊娠２０から３９週までのさまざまな段階にある妊娠女性および帝王切開時に羊水を採取した。採取した試料は４℃、１，０００×ｇで遠心分離し、分析まで上清を−２０℃で保存した。
【００４１】
（２）羊膜細胞の培養：羊膜細胞は妊娠３８週の自然分娩時に採取し、Itohらの方法（41）に従って、１０％ ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地中で一次培養ヒト羊膜細胞を調製した。羊膜細胞一次培養したものを分注し、細胞が密集状態になるまでさらに培養し、維持した。
【００４２】
（３）レプチン量の定量：羊膜細胞培養液および羊水中のレプチン量を定量した。羊膜細胞は密集状態から５日間培養した培養液または羊水１００μｌにＲＩＡ抗体溶液１００μｌおよびＲＩＡ緩衝液２００μｌを添加し、４℃で２４時間放置した。以下、実施例１（２）と同様に操作し測定し、標準曲線からレプチン量を算出した。培養液の希釈にはＤＭＥＭ（含０．５％ ＦＣＳ、５ｍｇ/ｍｌ ＢＳＡ）を用いた。
【００４３】
（４）培地中レプチンのゲルろ過クロマトグラフィーによる測定：羊膜細胞培養液０．２ｍｌをＲＩＡ緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラム、１×３０ｃｍ（ファルマシア社）に供し、実施例３（３）と同様に操作して、溶出・分画し、各画分のレプチン量をＲＩＡで定量した。
【００４４】
羊膜細胞での結果を図９および図１０に示す。羊水の段階希釈曲線（図９、●）はヒトレプチンの標準曲線（図９、○）と平行であった。羊膜細胞培養液のゲルろ過クロマトグラフィーによる測定結果（図１０）はＢｅＷｏ細胞培養液の測定結果（図６）と本質的には同じ溶出パターンが見られ、組換えヒトレプチンと同様の溶出時間にヒトレプチン用免疫反応性物質が一つのピークで溶出した。妊娠第２および第３三半期の羊水中のヒトレプチン量は５．０±２．７ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝５）であった。−次培養羊膜細胞から分泌されるレプチン量は約５ｎｇ／１０６ｃｅｌｌ／５ｄａｙｓであった。
【実施例５】
【００４５】
絨毛性疾患における血漿レプチン量の測定 
ＢｅＷｏ細胞がヒト絨毛膜癌転移巣由来の細胞であることから絨毛性疾患においてレプチンが産生され血液中に循環している可能性が示唆される。そこで、胞状奇胎、絨毛膜癌などの栄養膜疾患患者から血漿を採取し、レプチンの分泌の有無を確認する。
（１）血漿の採取：胞状奇胎患者３名および絨毛膜癌患者1名から治療前および治療後一晩絶食後午前6時に横臥位で肘前静脈より採血を行った。採血した試料は直ちにＥＤＴＡ・２Ｎａ（１ｍｇ／ｍｌ）入りの冷やしたシリコン処理ガラス管に分注し、４℃、１，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、液体窒素で凍結して使用するまで−２０℃で保存した。
【００４６】
（２）血漿レプチン量の測定：患者検体中のレプチン量をＲＩＡで定量した。
凍結した患者血漿を解凍後、血漿１００μｌにＲＩＡ抗体溶液１００μｌおよびＲＩＡ緩衝液２００μｌを添加し、４℃で２４時間放置した。以下、実施例１（２）と同様に操作して測定し、標準曲線からレプチン量を定量した。得られた結果を表１に示す。
【００４７】
胞状奇胎患者の治療前の血漿レプチン量は図１ｂに示した正常者のＢＭＩとレプチン量を統計処理して得られた回帰直線を用いて各患者のＢＭＩ（２６．７、２９．１および１９．１ｋｇ／ｍ2）から算出されるレプチン量（２３．４、２８．４および７．４ｎｇ／ｍｌ）に比べて顕著に高い値を示した。巨大胞状奇胎患者の血漿レプチン量（４７．９ｎｇ／ｍｌ）は奇胎組織摘出手術７日後にはレプチン量１０．２ｎｇ／ｍｌとＢＭＩ（２６．７ｋｇ／ｍ2）から予測される量にまで低下し、ｈＣＧ量も同時に低下した。測定期間中に体重に有意な変化は見られなかった（症例１）。
【００４８】
絨毛膜癌患者の血漿レプチン量（４９．０ｎｇ／ｍｌ）はＢＭＩ（２４．２ｋｇ／ｍ2）から予測されるレプチン量（１８．１ｎｇ／ｍｌ）と比較して顕著に上昇していた。メトトキサレート、アクチノマイシンＤおよびシクロフォスファミドの複合化学療法により血漿レプチン量は治療後２５日後でＢＭＩ予測値にまで低下した。また、Sanfilippoらが報告（32）と同様に血漿および尿中のｈＣＧ量も低下した。測定期間中の体重および血清クレアチニン量に有意な変化は見られなかった（症例２）。胞状奇胎または絨毛膜癌という妊娠栄養膜疾患患者では血漿レプチン量が顕著に上昇し、肥満者の値に匹敵する（18、20、21）が血液中に循環していることから、妊娠栄養膜疾患において病体生理学的役割を果たしていることが示唆される。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
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４５．J. Molecular Cloning, 190,(1982)
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】Ａは妊娠女性および非妊娠女性における血漿中レプチン量を体型指数別平均値で比較した結果を示すグラフである。Ｂは妊娠女性および非妊娠女性における血漿中レプチン量と体型指数との関係を示すグラフである。
【図２】は妊娠女性の血漿中レプチン量の妊娠段階的変化を示すグラフである。
【図３】は帝王切開前後による血漿レプチン量の経時的変化を示すグラフである。
【図４】は各種ヒト子宮組繊におけるｏｂｍＲＮＡの発現をノーザンブロット解析した結果を示す図面に代わる電気泳動の図面である。
【図５】はヒトレプチンの標準曲線およびＢｅＷｏ細胞培養液中のヒトレプチンのＲＩＡ希釈曲線を示すグラフである。
【図６】はＢｅＷｏ細胞培費液のＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムからの溶出パターンを示すグラフである。
【図７】Ａはフォルスコリン処理および無処理後のＢｅＷｏ細胞培養液中のレプチン量の経時的変化を示すグラフである。Ｂはフォルスコリン処理および無処理後のＢｅＷｏ細胞培養液中のｈＣＧ量の経時的変化を示すグラフである。
【図８】フォルスコリン処理後４８時間後のＢｅＷｏ細胞におけるｏｂｍＲＮＡの発現量をノーザンブロット解析した結果を示す図面に代わる電気泳動の図面である。
【図９】はヒトレプチンの標準曲線および羊膜細胞培養液におけるヒトレプチンのＲＩＡ希釈曲練を示すグラフである。
【図１０】は妊娠女性（３９週）の羊水のＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムからの溶出パターンを示すグラフである。
【図１】
2006267125.tif 000003
【図２】
2006267125.tif 000004
【図３】
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【図４】
2006267125.tif 000006
【図５】
2006267125.tif 000007
【図６】
2006267125.tif 000008
【図７】
2006267125.tif 000009
【図８】
2006267125.tif 000010
【図９】
2006267125.tif 000011
【図１０】
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