(57)【要約】【課題】  光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体を製造するための方法の提供。【解決手段】  下記式（Ｉ）で表されるケトカルボン酸誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元しうる能力を有する微生物の培養物、菌体またはその処理物を作用させ、生成する光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体を回収することにより、下記式（ＩＩ）で表される光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体が製造される。本発明によって得られる光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体は、医薬の合成原料として有用である。【化１】2006006133.tif 000012（式中、Ｒ、Ｘ、ｎはそれぞれ、明細書中のＲ、Ｘ、ｎと同意義を示す。）【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）下記式（Ｉ）で表されるケトカルボン酸誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元する能力を有する微生物の培養物、菌体またはその処理物を作用させる工程、および
（２）生成する下記式（ＩＩ）で表される光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体を回収する工程
を含む、光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体の製造方法；
【化１】
2006006133.tif 000010
（式中、Ｒは、１または複数個の置換基を有していてもよいフェニル基を示し；
Ｘは、水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を示し；
ｎは、３〜７の整数を示す。）；
【化２】
2006006133.tif 000011
（式中、Ｒ、Ｘはそれぞれ式（Ｉ）中のＲ、Ｘと同意義を示し、ｎは式（Ｉ）のｎと同じ数である。）。
【請求項２】
前記微生物が、下記の群から選択されるいずれかの属に属する微生物であり、得られる光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体が（Ｓ）体である、請求項１に記載の方法；
キャンディダ（Candida）属、
クラビスポラ（Clavispora）属、
クライベロマイセス（Kluyveromyces）属、
ナカセオマイセス（Nakaseomyces）属、
ピキア（Pichia）属、
サッカロミコプシス（Saccharomycopsis）属、
トルラスポラ（Torulaspora）属、
トリコスポロン（Trichosporon）属、
エンテロコッカス（Enterococcus）属、
ラクトバシラス（Lactobacillus）属、
ロイコノストック（Leuconostoc）属、および
ラルストニア（Ralstonia）属。
【請求項３】
前記微生物が、下記の群から選択されるいずれかの微生物である、請求項２に記載の方法；
キャンディダ・ギリエルモンディ（Candida guilliermondii）、
キャンディダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）、
キャンディダ・モギー（Candida mogii）、
キャンディダ・オオイテンシス（Candida ooitensis）、
キャンディダ・サケ（Candida sake）、
クラビスポラ・ルシタニアエ（Clavispora lusitaniae）、
クライベロマイセス・バシリスポラス（Kluyveromyces bacillisporus）、
クライベロマイセス・ロッデラエ（Kluyveromyces lodderae）、
ナカセオマイセス・バシリスポラス（Nakaseomyces bacillisporus）
ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、
ピキア・ファビアニー（Pichia fabianii）、
サッカロミコプシス・ルドウィギ（Saccharomycopsis ludwigii）、
サッカロミコプシス・フィブリジェラ（Saccharomycopsis fibuligera）、
トルラスポラ・デルブルエッキー（Torulaspora delbrueckii）、
トリコスポロン・ブラシカエ（Trichosporon brassicae）、
エンテロコッカス・スピーシーズ（Enterococcus sp.）、
ラクトバシラス・ブッフネリ（Lactobacillus buchneri）、
ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム（Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum）、および
ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）。
【請求項４】
前記フェニル基のパラ位が置換基で置換されている、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。  
【請求項５】
前記置換基が、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜３個のアルキル基、炭素数１〜３個のアルコキシ基、炭素数１〜３個のチオアルキル基、炭素数６〜１０個のアリール基、炭素数６〜１０個のアリールオキシ基、アミノ基、ニトロ基およびメルカプト基からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記置換基が、ハロゲン原子である、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種医薬品の原料あるいは合成中間体として利用されている光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体（ω-ヒドロキシ-ω-フェニルアルカン酸誘導体）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベンゼン環に置換基を有する光学活性なω-ヒドロキシ-ω-フェニルアルカン酸誘導体を製造する方法としては、Zygosaccharomyces bailii を使用した不斉還元により、(S)-5-(4-フルオロフェニル)-5-ヒドロキシペンタン酸を製造する方法が知られている（特許文献１）。
しかし、本菌株では、その変換能力は低く、反応に非常に時間を要するという問題があった。
【特許文献１】米国特許第5,618,707号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、微生物の有する還元力を有効に利用し、ベンゼン環に置換基を有する光学活性なヒドロキシカルボン酸を製造するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、このような高度な要求を満足する方法を鋭意検討した結果、微生物の有する還元力を利用して、ベンゼン環に置換基を有するケトカルボン酸誘導体（本明細書において「ケトカルボン酸誘導体」という。）を不斉還元することによって、ベンゼン環に置換基を有する光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体（本明細書において「ヒドロキシカルボン酸誘導体」という。）に有利に導き得ることを見出した。
【０００５】
既に述べたように、ケトカルボン酸誘導体を微生物によって不斉還元し、光学活性なヒドロキシカルボン酸を得る方法は公知である。しかし、従来公知の微生物では、その変換能力が低いことから、非常に生産性が低く、実用的であるとはいいがたい。
【０００６】
したがって、本発明らが得た知見は、非常に意外なことであった。更に驚くべきことに、特定の微生物が生成するヒドロキシカルボン酸の生成能力は、十分に高く、実用に際し問題の無いレベルであった。これらの知見に基づいて、本発明者らは本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の光学活性なヒドロキシカルボン酸の製造方法に関する。
【０００７】
〔１〕  （１）下記式（Ｉ）で表されるケトカルボン酸誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元する能力を有する微生物の培養物、菌体またはその処理物を作用させる工程、および
（２）生成する下記式（ＩＩ）で表される光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体を回収する工程
を含む、光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体の製造方法；
【化３】
2006006133.tif 000002
（式中、Ｒは、１または複数個の置換基を有していてもよいフェニル基を示し；
Ｘは、水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を示し；
ｎは、３〜７の整数を示す。）；
【化４】
2006006133.tif 000003
（式中、Ｒ、Ｘはそれぞれ式（Ｉ）中のＲ、Ｘと同意義を示し、ｎは式（Ｉ）のｎと同じ数である。）。
〔２〕  前記微生物が、下記の群から選択されるいずれかの属に属する微生物であり、得られる光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体が（Ｓ）体である、〔１〕に記載の方法；
キャンディダ（Candida）属、
クラビスポラ（Clavispora）属、
クライベロマイセス（Kluyveromyces）属、
ナカセオマイセス（Nakaseomyces）属、
ピキア（Pichia）属、
サッカロミコプシス（Saccharomycopsis）属、
トルラスポラ（Torulaspora）属、
トリコスポロン（Trichosporon）属、
エンテロコッカス（Enterococcus）属、
ラクトバシラス（Lactobacillus）属、
ロイコノストック（Leuconostoc）属、および
ラルストニア（Ralstonia）属。
〔３〕  前記微生物が、下記の群から選択されるいずれかの微生物である、〔２〕に記載の方法；
キャンディダ・ギリエルモンディ（Candida guilliermondii）、
キャンディダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）、
キャンディダ・モギー（Candida mogii）、
キャンディダ・オオイテンシス（Candida ooitensis）、
キャンディダ・サケ（Candida sake）、
クラビスポラ・ルシタニアエ（Clavispora lusitaniae）、
クライベロマイセス・バシリスポラス（Kluyveromyces bacillisporus）、
クライベロマイセス・ロッデラエ（Kluyveromyces lodderae）、
ナカセオマイセス・バシリスポラス（Nakaseomyces bacillisporus）
ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、
ピキア・ファビアニー（Pichia fabianii）、
サッカロミコプシス・ルドウィギ（Saccharomycopsis ludwigii）、
サッカロミコプシス・フィブリジェラ（Saccharomycopsis fibuligera）、
トルラスポラ・デルブルエッキー（Torulaspora delbrueckii）、
トリコスポロン・ブラシカエ（Trichosporon brassicae）、
エンテロコッカス・スピーシーズ（Enterococcus sp.）、
ラクトバシラス・ブッフネリ（Lactobacillus buchneri）、
ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム（Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum）、および
ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）。
〔４〕  前記フェニル基のパラ位が置換基で置換されている、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。  
〔５〕  前記置換基が、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜３個のアルキル基、炭素数１〜３個のアルコキシ基、炭素数１〜３個のチオアルキル基、炭素数６〜１０個のアリール基、炭素数６〜１０個のアリールオキシ基、アミノ基、ニトロ基およびメルカプト基からなる群から選択される少なくとも１種である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕  前記置換基が、ハロゲン原子である、〔５〕に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体を微生物を用いた不斉還元反応によって、効率的に製造することができる。本発明の方法は、高い収率を期待できるので、工業的にも有利である。本発明によって製造される光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体は、光学活性な医薬の合成原料として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、前記式（Ｉ）で示されるケトカルボン酸誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元しうる能力を有する微生物の培養物、菌体またはその処理物を作用させる工程、および、生成する前記式（ＩＩ）で表される光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体を回収する工程を含む、光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体の製造方法である。
【００１０】
本発明において、立体選択的に還元しうる能力とは、前記式（Ｉ）で示されるケトカルボン酸誘導体を基質として、（Ｒ）体、または（Ｓ）体のヒドロキシカルボン酸誘導体を生成する能力を言う。
【００１１】
微生物
本発明の微生物は、（Ｒ）体、または（Ｓ）体のヒドロキシカルボン酸誘導体を生成しうる微生物であれば、任意の微生物を用いることができる。本発明に用いる微生物は、たとえば以下に示すような属に属する微生物について、（Ｒ）体、または（Ｓ）体のヒドロキシカルボン酸誘導体を生成する能力を比較することにより得ることができる。
【００１２】
たとえば、化合物（Ｉ）を含む培地中で被験微生物を培養し、その培養物中に蓄積される光学活性ヒドロキシカルボン酸誘導体の光学純度を測定する。その結果、光学活性なヒドロキシカルボン酸の生成を確認することができれば、当該微生物を本発明に用いることができる。
【００１３】
あるいは予め培地中で増殖させた被験微生物を集菌し、適当な緩衝液中に懸濁させる。更に化合物（Ｉ）であらわされるケトカルボン酸誘導体と接触、反応させて、この緩衝液中に蓄積される光学活性ヒドロキシカルボン酸誘導体の光学純度を測定する。光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体の生成が確認できれば、当該微生物を本発明に用いることができる。このとき、被験微生物の培養時に、培地中に化合物（Ｉ）を加えておけば、この化合物を代謝するための酵素の誘導が期待できる。更に反応時に還元エネルギーを加えておけば、より生成物の蓄積が期待できる。還元エネルギー源には、糖類、アルコール類、あるいは糖アルコール類等を用いることができる。
【００１４】
光学純度の高い生成物を得るには、より選択性の高い微生物を用いることが有利であることは言うまでも無い。具体的には、その立体選択性は、たとえば９０%、通常９７%以上、好ましくは９９%以上、更に好ましくは実質的に逆の立体を生成しない、光学活性な（Ｒ）体、または（Ｓ）体のヒドロキシカルボン酸誘導体を生成しうる微生物を用いることができる。
【００１５】
本発明における「光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体」とは、ある光学異性体が別の光学異性体より多く含まれるヒドロキシカルボン酸誘導体を言う。本発明において、好ましい光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体は、通常９０％ee以上、好ましくは９７％ee以上、より好ましくは９９％ee以上、更に好ましくは９９．９％ee以上の光学純度（enantiomeric excess; ee）を有する。光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体の光学純度は、たとえば光学分割カラムなどを用いて確認することができる。本発明の「光学異性体」は、一般的に「光学活性体」および「鏡像異性体」と呼ばれる場合もある。
【００１６】
たとえば以下に示す群から選択された属に属する微生物は、前記式（Ｉ）で示されるケトカルボン酸誘導体を基質化合物として、（Ｓ）-ヒドロキシカルボン酸誘導体を生成する。
【００１７】
キャンディダ（Candida）属、
クラビスポラ（Clavispora）属、
クライベロマイセス（Kluyveromyces）属、
ナカセオマイセス（Nakaseomyces）属、
ピキア（Pichia）属、
サッカロミコプシス（Saccharomycopsis）属、
トルラスポラ（Torulaspora）属、
トリコスポロン（Trichosporon）属、
エンテロコッカス（Enterococcus）属、
ラクトバシラス（Lactobacillus）属、
ロイコノストック（Leuconostoc）属、および
ラルストニア（Ralstonia）属。
【００１８】
より具体的には、上記の群から選択された属に属する微生物として、以下の微生物を示すことができる。これらの微生物は、いずれも高い光学純度で（Ｓ）-ヒドロキシカルボン酸誘導体を生成しうる。
【００１９】
キャンディダ・ギリエルモンディ（Candida guilliermondii）、
キャンディダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）、
キャンディダ・モギー（Candida mogii）、
キャンディダ・オオイテンシス（Candida ooitensis）、
キャンディダ・サケ（Candida sake）、
クラビスポラ・ルシタニアエ（Clavispora lusitaniae）、
クライベロマイセス・バシリスポラス（Kluyveromyces bacillisporus）、
クライベロマイセス・ロッデラエ（Kluyveromyces lodderae）、
ナカセオマイセス・バシリスポラス（Nakaseomyces bacillisporus）
ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、
ピキア・ファビアニー（Pichia fabianii）、
サッカロミコプシス・ルドウィギ（Saccharomycopsis ludwigii）、
サッカロミコプシス・フィブリジェラ（Saccharomycopsis fibuligera）、
トルラスポラ・デルブルエッキー（Torulaspora delbrueckii）、
トリコスポロン・ブラシカエ（Trichosporon brassicae）、
エンテロコッカス・スピーシーズ（Enterococcus sp.）、
ラクトバシラス・ブッフネリ（Lactobacillus buchneri）、
ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム（Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum）、および
ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）。
【００２０】
本発明の方法に用いる微生物は、様々な寄託機関から細胞株として入手することができる。細胞の寄託機関としては、たとえば以下に示すような機関を示すことができる。あるいは、当業者であれば様々な試料、たとえば土壌、河川および湖沼等の水などから、必要な微生物を分離することもできる。
【００２１】
ATCC： American Type Culture Collection
CBS： Centraal bureau voor Schimmel cultures
DSMZ： Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
IAM： 東京大学応用微生物研究所
IFO： 財団法人発酵研究所
JCM： 理化学研究所微生物系統保存施設
NRIC： 東京農業大学
【００２２】
培養
前記微生物は、醗酵学の分野で公知の情報に従って培養することができる。培地としては炭素源、窒素源、無機物およびその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。培地は、液体培地または固体培地を使用することができる。
【００２３】
具体的には、炭素源として、次に示すような一般的な炭素源より、使用する微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用することができる。
糖類：グルコース、フルクトース、マルトース、ガラクトースなど
天然炭水化物：澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜、麦、とうもろこしなど
アルコール類：グリセロール、メタノール、エタノールなど
脂肪酸類：酢酸、グルコン酸、ピルビン酸、クエン酸など
アミノ酸：グリシン、グルタミン、アスパラギンなど
炭水化物類：ノルマルパラフィンなど
脂肪類：パーム核油、大豆油、オリーブ油など
【００２４】
窒素源としては、次に示すような一般的な窒素源の中から、使用する微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用することができる。
【００２５】
有機窒素化合物：肉エキス、ペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物など
【００２６】
無機窒素化合物：アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素など
【００２７】
また、微生物の光学活性ヒドロキシカルボン酸誘導体への変換能力を高めるために、誘導物質を用いることができる。誘導物質としては、目的とする光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体、もしくはケトカルボン酸誘導体を、使用する微生物に応じて使用することができる。
【００２８】
さらに、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、カリウム、カルシウム、ナトリウム、銅、亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩等より適宜一種または二種以上を選択して使用することができる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を培養液中に添加してもよい。
【００２９】
培養は前記培地成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。
【００３０】
培養条件は、微生物の種類、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、該菌株が増殖し、ケトカルボン酸誘導体からヒドロキシカルボン酸誘導体への変換能力を有しうる条件であれば特に制限はない。
【００３１】
通常は、培養開始時のpHを4から10、好ましくは6から8に調節し、15から70℃、好ましくは20から40℃の温度条件下で培養することが望ましい。培養時間はケトカルボン酸誘導体からヒドロキシカルボン酸誘導体への変換能力を有する菌体が得ることができれば特に制限はなく、通常は1日から7日、このましくは1日から3日培養する。
【００３２】
また、かかる微生物菌体の処理物としては、例えば、上記微生物の凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体自己消化物、菌体抽出物、菌体磨砕物、菌体の超音波処理物などがあげられる。
【００３３】
また、本発明の微生物菌体あるいは菌体処理物は、たとえばポリアクリルアミド法、含硫多糖ゲル法（κ-カラギーナンゲル法など）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法、イオン交換樹脂法などの公知方法により固定化して使用することもできる。
【００３４】
不斉還元
本発明における微生物による不斉還元方法は、前記微生物を酵素が誘導される適切な前記培養条件において培養を行い、得られた培養液、あるいは培養液から採取した菌体や該菌体処理物に基質化合物を加えて、不斉還元反応を行なうことにより実施できる。また、前記培養条件と同じpH、温度範囲で、1日から7日間、培養と並行しても行うことができる。
【００３５】
不斉還元反応条件としては、たとえば以下の条件を示すことができる。
pH 4.0から9.0、好ましくはpH 6.0から8.0、
温度15から50℃、好ましくは20から40℃、
反応時間は、4時間から7日間接触させる。
【００３６】
一般に、微生物の培養と不斉還元反応とは、別に行った方が良好な結果を期待できる。
【００３７】
また不斉還元反応においては、還元エネルギー源として、糖類、アルコール類、あるいは糖アルコール類などの存在下で不斉還元反応を行うことにより、さらに効率的な反応が期待できる。糖類としては、グルコース、フルクトース、シュクロース等を用いることができる。アルコール類としては、エタノール、イソプロパノール、グリセロール等が利用できる。またソルビトールなどを糖アルコール類として示すことができる。還元エネルギーのために添加する化合物は、反応基質であるケトカルボン酸誘導体量に応じて添加することができる。
【００３８】
還元エネルギー源の消費に伴って、反応液のpHに変化が見られる場合には、適当な酸、アルカリを用いてpHを一定範囲に調節することで、さらに良好な反応性を維持して、不斉還元反応を行なうことも可能である。
【００３９】
本発明において生菌体を使用した場合、反応液中に界面活性剤を添加しておけば反応時間の短縮をはかることができ好ましい。この目的に用いられる界面活性剤としては、生菌体の細胞壁の透過性をあげるものであれば特に制限はなく、臭化セチルピリミジウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、トリトンX-100、パライソオクチルフェニルエーテル、トゥイーン80、スパン60等があげられ、反応液に対して、0.0001〜1％程度使用することが好ましい。
【００４０】
また、反応液中に有機溶媒を添加することによっても、同様の効果（反応時間の短縮）を得ることができる。この目的に用いられる有機溶媒としては、生菌体の細胞壁の透過性をあげるものであれば特に制限はなく、トルエン、キシレンなどの有機溶媒があげられ、反応液に対して、0.0001〜1％程度使用することが好ましい。
【００４１】
また、反応液に添加せずとも、菌体を集菌後、界面活性剤および有機溶媒を含む水もしくはバッファーで前処理することにより、細胞壁の透過性を上げた菌体を用いてもよい。
【００４２】
前記の通り本発明の方法では、下記式（Ｉ）で表されるケトカルボン酸誘導体を基質化合物として用い、上記不斉還元により、下記式（ＩＩ）で表される光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体を得ることができる。
【００４３】
【化５】
2006006133.tif 000004
【化６】
2006006133.tif 000005
【００４４】
前記式（Ｉ）、（ＩＩ）中、Ｒは、置換基を有していてもよいフェニル基を示し、前記微生物反応を阻害しないものであればよい。
【００４５】
置換基は、ベンゼン環上のオルト位、メタ位またはパラ位に、一個または複数個存在することができる。フェニル基が置換基を有する場合、このうちでは、置換基はパラ位に存在していることが好ましい。また、置換基はベンゼン環上に一個存在していることが好ましい。
【００４６】
フェニル基の置換基としては、具体的には、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜３個のアルキル基、炭素数１〜３個のアルコキシ基、炭素数１〜３個のチオアルキル基、炭素数６〜１０個のアリール基、炭素数６〜１０個のアリールオキシ基、アミノ基、ニトロ基、メルカプト基が挙げられる。
【００４７】
これらの置換基のうちでは、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜３個のアルキル基、炭素数１〜３個のアルコキシ基、アミノ基、ニトロ基またはメルカプト基が好ましく、ハロゲン原子がさらに好ましい。
【００４８】
また、置換基が複数存在する場合、これらは互いに環を形成していてもよい。環としてはたとえば、メチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、トリメチレンジオキシ基などの炭素数１〜３個のアルキレンジオキシ基が挙げられる。
【００４９】
「ハロゲン原子」としては、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、フッ素原子が挙げられ、これらのうちでは、塩素原子、フッ素原子が好ましい。
【００５０】
「炭素数１〜３個のアルキル基」としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基が挙げられ、これらのうちでは、メチル基またはエチル基が好ましい。
【００５１】
「炭素数１〜３個のアルコキシ基」とは、前記定義の「炭素数１〜３個のアルキル基」が結合したオキシ基であることを意味し、具体的には例えば、メトキシ基、エトキシ基、１−プロピルオキシ基、２−プロピルオキシ基などが挙げられる。これらのうちでは、メトキシ基またはエトキシ基が好ましい。
【００５２】
「炭素数１〜３のチオアルキル基」とは、前記定義の「炭素数１〜３のアルキル基」に−ＳＨが結合した基であることを意味し、具体的には例えば、チオメチル基、チオエチル基、チオプロピル基などがあげられる。これらのうちでは、チオメチル基またはチオエチル基が好ましい。
【００５３】
「アミノ基」とは、基ＮＨ2−を意味し、ホルミル、アセチル、トリチル、tert-ブトキシカルボニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニルなどの当技術分野における公知の基で保護されたアミノ基を含む。アミノ基のうち好ましくはＮＨ2−である。
【００５４】
「炭素数６〜１０個のアリール基」とは、炭素数６〜１０の芳香族性の炭化水素環式基をいい、具体的には例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基などが挙げられる。これらのうちでは、フェニル基が好ましい。
【００５５】
「炭素数６〜１０個のアリールオキシ基」とは、前記定義の「炭素数６〜１０個のアリール基」が結合したオキシ基であることを意味し、具体的には例えば、フェニルオキシ基が挙げられる。
【００５６】
「炭素数１〜３個のアルキレンジオキシ基」とは、「−Ｏ−(ＣＨ2)n−Ｏ−（式中、ｎは１〜３の整数である。）」で表される基を意味する。
【００５７】
前記式（Ｉ）の化合物が金属塩を表す場合、すなわちＸが表す金属原子としては、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属などがあげられる。
これらのうちでは、アルカリ金属が好ましい。
【００５８】
前記式（Ｉ）の化合物において、炭素鎖の鎖長（ｎ）は、３（ペンタン酸骨格）から６（オクタン酸骨格）である。
【００５９】
このような本発明で用いる式（Ｉ）で表される化合物として、たとえば、5-(4-フルオロフェニル)-5-オキソペンタン酸（パラ位のＲとしてＦ、ｎ=3）、5-(4-クロロフェニル)-5-オキソペンタン酸（パラ位のＲとしてＣｌ、ｎ=3）などのパラハロフェニルケトカルボン酸化合物などが挙げられる。
【００６０】
これらの基質化合物は、公知の方法によって製造することができる（参考文献：Tetrahedron 49(15), 3193 - 3202, 1993）。
【００６１】
本発明における基質化合物である前記式（Ｉ）で表されるケトカルボン酸誘導体は、目的とする生成物を効率的に生成できるように、適切な濃度で用いることが好ましい。ケトカルボン酸誘導体は、菌体および当該反応を触媒する酵素に対して毒性を有することがあり、必ずしも高濃度反応が効率的な生産に結びつかないことがあり、注意を要する。
【００６２】
前記ケトカルボン酸誘導体の反応液中における濃度として、たとえば、好ましくは０．１〜５０%w/v、さらに好ましくは０．５〜１０%w/vである。
前記ケトカルボン酸誘導体は、一括（バッチ法）、分割添加（フェドバッチ法）あるいは連続添加（フィード法）等の任意の方法で添加することができる。
【００６３】
本発明の不斉還元反応においては、好気的条件下では通常副生成物が多くなることもある。この場合には、嫌気的、あるいは酸素の制限条件下で反応を行うことにより、高い収率を期待できる。具体的には、たとえば窒素を液中もしくは気相中に通じて反応させることにより、収率の向上を期待できる。
【００６４】
また、極端な酸性条件下では、基質化合物、生成物が分解することもある。この場合には、反応中に適当なｐHにコントロールしながら反応させることにより、分解を防ぎ、収率の向上が期待できる。
【００６５】
このようにして、本発明の反応により、前記式（Ｉ）で表されるケトカルボン酸誘導体は、不斉還元され、前記式（ＩＩ）で表される光学活性なヒドロキシカルボン酸誘導体を得ることができる。
【００６６】
生成した光学活性ヒドロキシカルボン酸誘導体は、常法に従って容易に単離することができる。たとえば、反応液から遠心分離によって、菌体などの不溶性物質を除去した後または除去しないまま、酢酸エチルなどの非水溶性エステル、メチルイソブチルケトンなどの非水溶性ケトン、ジエチルエーテルなどの非水溶性エーテル、クロロホルム、ジクロロメタンなどの含ハロゲン溶剤で抽出後、これを減圧濃縮することにより、光学活性ヒドロキシカルボン酸誘導体を結晶として、採取することができる。
【００６７】
また、反応液において、生成物であるヒドロキシカルボン酸誘導体が溶解していない場合には、水溶性溶媒、たとえばアセトニトリル、メタノール、ジメチルフルフォキシドなどを加えて完溶させた後、遠心分離によって、菌体成分などを除去した後、減圧濃縮により、添加した溶媒を留去すれば、光学活性ヒドロキシカルボン酸誘導体を結晶として、採取することができる。
【００６８】
さらに反応生成物の純度を上げるには、このものを少量のアセトンに溶解し、ヘキサン−アセトン混合溶剤で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なうことで高度に精製することができる。また、ベンゼン、トルエンあるいはヘキサン、酢酸エチル混合溶媒中に加熱溶解後冷却し、再結晶することで容易に他の不純物と分離することができる。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
また、表中菌株の株名の示す保存機関は以下のとおりである。
CBS： Centraal bureau voor Schimmel cultures
DSMZ： Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
IFO： 財団法人発酵研究所
NRIC： 東京農業大学菌株保存室
TUA： 東京農業大学菌株保存室（現NRIC）
【００７０】
［実施例１］（酵母のスクリーニング）
酵母エキス 3g/L、麦芽エキス 3g/L、グルコース 20g/L、ポリペプトン 5g/Lからなる液体培地（pH 6.0）を、18mmφ試験管に4mLずつ分注し、オートクレーブ中121℃、15分間加熱滅菌した。ここに、下表１に示す菌株を一白金耳接種し、25℃、48時間振とう培養した。
【００７１】
得られた培養液 2mLより遠心分離によって集めた菌体に、5mg 5-(4-フルオロフェニル)-5-オキソペンタン酸、30mgグルコースを含む 100mMリン酸バッファー（pH 7.0） 1mLを加え懸濁し、25℃、48時間振とう反応した。
【００７２】
反応液から遠心分離によって除菌し、得られた上清中に含まれる5-(4-フルオロフェニル)-5-ヒドロキシペンタン酸を、C18逆相カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより定量した。カラム温度を40℃とした、和光純薬株式会社製 C18逆相カラム（Wakosil II 5C18 4.6mm x 150mm）を用い、50mMリン酸バッファー（pH 2.5）：アセトニトリル ＝ 7：3 の溶離液を流速 1mL/min で通じ、254nmにおけるUV吸収を検出することで測定した。
【００７３】
また、上清液から塩酸酸性下5-(4-フルオロフェニル)-5-ヒドロキシペンタン酸を酢酸エチルで抽出し、脱溶媒した後、光学分割カラムを用いた液体クロマトグラフィーによりその光学純度を測定した。カラム温度を25℃とした、ダイセル化学工業株式会社製キラルセル OF（CHIRALCEL OF 4.6mm x 250mm）を用い、n-ヘキサン：イソプロパノール：トリフルオロ酢酸 ＝ 90：10：0.1 の溶離液を流速1mL/minで通じ、254nmにおけるUV吸収を検出することで測定を行った。
【００７４】
分析結果を表１に示す。その結果、光学活性な(S)-5-(4-フルオロフェニル)-5-ヒドロキシペンタン酸が生成していることが確認できた。
【００７５】
【表１】
2006006133.tif 000006
【００７６】
［実施例２］（乳酸菌のスクリーニング）
MRS培地（Lactobacilli MRS broth、Difco Laboratories製）を、18mmφ試験管に4mLずつ分注し、オートクレーブ中121℃、15分間加熱滅菌した。ここに、下表２に示す菌株を一白金耳接種し、30℃、48時間振とう培養した。
実施例１に従い、反応を実施し、同様にして定量および光学純度の測定を行なった。
分析結果を表２に示す。その結果、光学活性な(S)-5-(4-フルオロフェニル)-5-ヒドロキシペンタン酸が生成していることが確認できた。
【００７７】
【表２】
2006006133.tif 000007
【００７８】
［実施例３］（乳酸菌のスクリーニング）
ブイヨン培地（日水製薬製）を、18mmφ試験管に4mLずつ分注し、オートクレーブ中121℃、15分間加熱滅菌した。ここに、下表３に示す菌株を一白金耳接種し、30℃、48時間振とう培養した。
実施例１に従い、反応を実施し、同様にして定量および光学純度の測定を行なった。
分析結果を表３に示す。その結果、光学活性な(S)-5-(4-フルオロフェニル)-5-ヒドロキシペンタン酸が生成していることが確認できた。
【００７９】
【表３】
2006006133.tif 000008
【００８０】
［実施例４］（濃度向上）
下表４に示す菌株について、それぞれ実施例１、２、３に従い、培養した。得られた培養液 2mLより遠心分離によって集めた菌体に、10mg 5-(4-フルオロフェニル)-5-オキソペンタン酸、30mgグルコースを含む 100mMリン酸バッファー（pH 7.0） 1mLを加え懸濁し、培養温度と同じ温度で 48時間振とう反応した。実施例１と同様にして定量を行なった。
【００８１】
分析結果を表４に示す。その結果、基質濃度の向上によっても阻害をうけず、(S)-5-(4-フルオロフェニル)-5-ヒドロキシペンタン酸が生成していることが確認できた。
【００８２】
【表４】
2006006133.tif 000009