(57)【要約】【課題】  D-グルタミン酸またはその類縁化合物を有効成分として含有する、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有する薬剤および、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有する化合物の同定方法の提供を課題とする。【解決手段】  除脳カイコ幼虫標本に薬物を注入する方法により筋肉収縮を引き起こす神経伝達物質の検索を試みた結果、D-グルタミン酸、カイニン酸、およびD-アスパラギン酸が筋収縮を引き起こすことが判明した。L-グルタミン酸は筋収縮を引き起こさず、逆にカイニン酸およびD-グルタミン酸による筋収縮を阻害した。また、カイニン酸の投与や、D-グルタミン酸を混入した餌の摂取によりカイコ幼虫が死滅することが判明した。以上の結果から、本発明の非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有するD-グルタミン酸およびその類縁化合物は、殺虫薬・農薬として有効と考えられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、およびL-グルタミン酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸を有効成分として含有する、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有する薬剤。
【請求項２】
非ヒト動物が無脊椎動物である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
無脊椎動物が昆虫である、請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、およびL-グルタミン酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸を非ヒト動物に投与する工程を含む、該非ヒト動物の行動を抑制または該非ヒト動物を殺傷する方法。
【請求項５】
非ヒト動物が無脊椎動物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
無脊椎動物が昆虫である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸の誘導体について、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用の有無を評価する方法。
（ａ）D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸の誘導体を提供する工程
（ｂ）該誘導体を非ヒト動物に投与する工程
【請求項８】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有するD-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸の誘導体のスクリーニング方法。
（ａ）請求項７に記載の評価方法により、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、およびL-グルタミン酸の誘導体から選択される複数の誘導体について、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用の有無を評価する工程
（ｂ）複数の誘導体から、非ヒト動物に対して殺傷作用を有すると評価された誘導体を選択する工程
【請求項９】
非ヒト動物が無脊椎動物である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
無脊椎動物が昆虫である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
昆虫がカイコである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に被験タンパク質を接触させる工程を含む、被験タンパク質について、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する結合活性の有無を評価する方法。
【請求項１３】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸の受容体のスクリーニング方法。
（ａ）請求項１２に記載の評価方法により、複数の被験タンパク質について、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する結合活性の有無を評価する工程
（ｂ）複数の被験タンパク質から、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する結合活性を有すると評価されたタンパク質を選択する工程
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸の受容体をコードするDNAのスクリーニング方法。
（ａ）請求項１２に記載の評価方法により、複数の被験タンパク質について、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する結合活性の有無を評価する工程
（ｂ）複数の被験タンパク質から、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する結合活性を有すると評価されたタンパク質を選択する工程
（ｃ）選択された被験タンパク質をコードするDNAをクローニングする工程
【請求項１５】
D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に被験タンパク質を接触させる工程を含む、被験タンパク質について、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性の有無を評価する方法。
【請求項１６】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性を有するタンパク質のスクリーニング方法。
（ａ）請求項１５に記載の評価方法により、複数の被験タンパク質について、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性の有無を評価する工程
（ｂ）複数の被験タンパク質から、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性を有すると評価されたタンパク質を選択する工程
【請求項１７】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性を有するタンパク質をコードするDNAのスクリーニング方法。
（ａ）請求項１５に記載の評価方法により、複数の被験タンパク質について、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性の有無を評価する工程
（ｂ）複数の被験タンパク質から、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性を有すると評価されたタンパク質を選択する工程
（ｃ）選択されたタンパク質をコードするDNAをクローニングする工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、D-グルタミン酸またはその類縁化合物を有効成分として含有する、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有する薬剤および非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有する化合物の同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタミン酸は高等動物の中枢において神経伝達物質として作用し、記憶や学習に重要な役割を演じている(非特許文献１〜３)。後シナプスに存在する種々のグルタミン酸受容体が分子生物学的手法により同定されている。それらは、アゴニストに対する感受性により、NMDA受容体、AMPA受容体およびカイニン酸受容体というカテゴリーに分類されている(非特許文献４)。
【０００３】
最近、D-セリンがグルタミン酸受容体に結合し、その活性を調節することが明らかにされている。D-セリン等のD-アミノ酸は、哺乳動物の中枢に存在することが以前から指摘されており、神経伝達物質として機能する可能性が考えられている(非特許文献５および６)。
【０００４】
無脊椎動物においては、神経筋接合部においてグルタミン酸受容体が存在していることが知られている。ショウジョウバエにおいて、少なくとも２種類のグルタミン酸受容体がクローニングされ、グルタミン酸に結合した情報がイオンチャンネルとカップルして伝達する能力があることが、アフリカツメガエルの卵を用いた電気生理学的研究により明らかにされている(非特許文献７および８)。しかしながら、L-グルタミン酸が昆虫の幼虫において筋肉収縮の生理的アゴニストとして作用していることを示す直接の証拠は得られていない。
【０００５】
D-グルタミン酸は、生物界に広く存在する、L-グルタミン酸というアミノ酸の異性体である。この物質はバクテリアの細胞壁に含まれており(非特許文献９)、したがって、環境のいたるところに存在している(非特許文献１０〜１３)。しかしながら、ヒトを含めて、高等動物や植物における生理活性物質ではないとされている。また、カイニン酸およびD-アスパラギン酸はグルタミン酸受容体のアゴニストとして知られている。カイニン酸は、虫下しとして古くから使われているが、その作用ははっきり分かっていない。
【０００６】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Fonnum Glutamate: a neurotransmitter in mammalian brain. J. Neurochem. 42, 1-11 (1984)
【非特許文献２】Ottersen and Storm-Mathisen Neurons containing or accumulating transmitter amino acids. Classical transmitter and transmitter receptors in the CNS. Elsevier, Amsterdam pp.141-246 (1984)
【非特許文献３】Collingridge and Lester Excitatory amino acid receptors in the vertebrate central nervous system. Pharmacol. Rev. 40, 145-260 (1989)
【非特許文献４】Hollmann and Heinemann Cloned glutamate receptors. Annu. Rev. Neurosci. 17, 31-108 (1994)
【非特許文献５】Hashimoto and Oka Free D-aspartate and D-serine in the mammalian brain and periphery. Prog. Neurobiol. 52, 325-353 (1997)
【非特許文献６】Imai et al. Analytical chemistry and biochemistry of D-amino acids. Biomed. Chromatogr. 10, 303-312 (1996)
【非特許文献７】Schuster et al. Molecular cloning of an invertebrate glutamate receptor subunit expressed in Drosophila muscle. Science 254:112-114 (1991)
【非特許文献８】Petersen et al. Genetic analysis of glutamate receptors in Drosophila reveals a retrograde signal regulating presynaptic transmitter release. Neuron 19, 1237-1248 (1997)
【非特許文献９】Liu et al. Compensation for D-glutamate auxotrophy in E.coli WM335 by D-amino acid aminotransferase gene and regulation of murI expression. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 193-195 (1998)
【非特許文献１０】Corrigan D-Amino acids in animals, Science 164, 142-149 (1969)
【非特許文献１１】Kera et al. Presence of free D-glutamate and D-aspartate in rat tissues. Biochim. Biophys, Acta 1243, 282-286. (1995)
【非特許文献１２】Kera et al. D-Aspartate oxidase and free acidic D-amino acids in lower vertebrates. J. Mol. Catal. B. 12, 121-129 (2001)
【非特許文献１３】Tarui et al. N-Methyl-D-glutamate and N-methyl-L-glutamate in Scapharca broughtonii (Mollusca) and other invertebrates. Comp. Biochem. Physiol. B. 134,79-87 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、これまで生理的意義が不明であったD-グルタミン酸の非ヒト動物における役割を明らかにし、その利用方法を提供することを課題とする。具体的には、D-グルタミン酸またはその類縁化合物を有効成分として含有する、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有する薬剤および非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有する化合物の同定方法の提供を課題とする。また、D-グルタミン酸またはその類縁化合物の受容体の同定方法、およびD-グルタミン酸またはその類縁化合物の分解酵素の同定方法の提供も課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、除脳カイコ幼虫標本に薬物を注入する方法により、筋肉収縮を引き起こす神経伝達物質の検索を試みた。その結果、D-グルタミン酸、カイニン酸、およびD-アスパラギン酸が筋収縮を引き起こすことが明らかとなった。L-グルタミン酸は筋収縮を引き起こさず、逆にカイニン酸およびD-グルタミン酸による筋収縮を阻害した。カイニン酸やD-グルタミン酸による筋収縮は、神経節を除去したカイコ幼虫筋肉標本でも観察された。また、本発明者は、カイコ幼虫にカイニン酸を注入することにより、カイコ幼虫が死に至ることを明らかにした。さらに、D-グルタミン酸を混入した飼料（餌）を摂取したカイコ幼虫が死に至ることを明らかにした。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１７〕を提供するものである。
〔１〕D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、およびL-グルタミン酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸を有効成分として含有する、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有する薬剤。
〔２〕非ヒト動物が無脊椎動物である、〔１〕に記載の薬剤。
〔３〕無脊椎動物が昆虫である、〔２〕に記載の薬剤。
〔４〕D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、およびL-グルタミン酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸を非ヒト動物に投与する工程を含む、該非ヒト動物の行動を抑制または該非ヒト動物を殺傷する方法。
〔５〕非ヒト動物が無脊椎動物である、〔４〕に記載の方法。
〔６〕無脊椎動物が昆虫である、〔５〕に記載の方法。
〔７〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸の誘導体について、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用の有無を評価する方法。
（ａ）D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸の誘導体を提供する工程
（ｂ）該誘導体を非ヒト動物に投与する工程
〔８〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有するD-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸の誘導体のスクリーニング方法。
（ａ）〔７〕に記載の評価方法により、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、およびL-グルタミン酸の誘導体から選択される複数の誘導体について、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用の有無を評価する工程
（ｂ）複数の誘導体から、非ヒト動物に対して殺傷作用を有すると評価された誘導体を選択する工程
〔９〕非ヒト動物が無脊椎動物である、〔７〕または〔８〕に記載の方法。
〔１０〕無脊椎動物が昆虫である、〔９〕に記載の方法。
〔１１〕昆虫がカイコである、〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に被験タンパク質を接触させる工程を含む、被験タンパク質について、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する結合活性の有無を評価する方法。
〔１３〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸の受容体のスクリーニング方法。
（ａ）〔１２〕に記載の評価方法により、複数の被験タンパク質について、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する結合活性の有無を評価する工程
（ｂ）複数の被験タンパク質から、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する結合活性を有すると評価されたタンパク質を選択する工程
〔１４〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸の受容体をコードするDNAのスクリーニング方法。
（ａ）〔１２〕に記載の評価方法により、複数の被験タンパク質について、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する結合活性の有無を評価する工程
（ｂ）複数の被験タンパク質から、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する結合活性を有すると評価されたタンパク質を選択する工程
（ｃ）選択された被験タンパク質をコードするDNAをクローニングする工程
〔１５〕D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に被験タンパク質を接触させる工程を含む、被験タンパク質について、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性の有無を評価する方法。
〔１６〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性を有するタンパク質のスクリーニング方法。
（ａ）〔１５〕に記載の評価方法により、複数の被験タンパク質について、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性の有無を評価する工程
（ｂ）複数の被験タンパク質から、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性を有すると評価されたタンパク質を選択する工程
〔１７〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性を有するタンパク質をコードするDNAのスクリーニング方法。
（ａ）〔１５〕に記載の評価方法により、複数の被験タンパク質について、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性の有無を評価する工程
（ｂ）複数の被験タンパク質から、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性を有すると評価されたタンパク質を選択する工程
（ｃ）選択されたタンパク質をコードするDNAをクローニングする工程
【発明の効果】
【００１０】
現在使用されている殆どの農薬は、バクテリアにより分解されにくく、土壌に残留するという問題点を有している。また、ヒトに対して強い毒性を示すため、その使用に著しい制限が必要とされている。土壌中のバクテリアにより分解され、しかもヒトに対する毒性がない農薬が理想であるが、そのような性格を有し、しかも害虫を効率よく殺傷する物質がないのが現状である。
【００１１】
本発明者は、D-グルタミン酸およびその類縁化合物が、筋収縮または筋弛緩によってカイコ幼虫の行動を抑制することを見出した。また、該化合物がカイコ幼虫を殺傷することも見出した。すなわち、本発明者により提供された非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有するD-グルタミン酸およびその類縁化合物は、殺虫薬・農薬として用いることができる。D-グルタミン酸およびその類縁化合物は微生物による分解を受けるため、土壌中に残留する可能性が無く、従来使用されている農薬と比較して有効である。
【００１２】
また、本発明によりD-グルタミン酸およびその類縁化合物がカイコ幼虫における筋収縮の生理的アゴニストとして機能することが明らかになったことから、筋収縮や筋弛緩を指標として、昆虫等の無脊椎動物を含む非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有する化合物をスクリーニングできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明者は、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、およびL-グルタミン酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸の投与によりカイコ幼虫の行動が抑制された状態（一例として、筋収縮または筋弛緩により行動が抑制された状態）になること、また、カイコ幼虫が殺傷されることを見出した。さらに本発明者は、D-グルタミン酸の投与によりマウスの行動が抑制された状態（痙攣により行動が抑制された状態）になることを見出した。本発明はこの知見に基づき、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、およびL-グルタミン酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸を有効成分として含有する、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有する薬剤を提供する。
【００１４】
D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、およびL-グルタミン酸は、市販のものを利用することができる。例えば、D-グルタミン酸はAldrichおよびシグマ社から、カイニン酸はCalbiochem社から、D-アスパラギン酸はシグマ社から、L-グルタミン酸はナカライ社およびシグマ社から購入し、利用することができる。
【００１５】
本発明の行動抑制作用または殺傷作用を有する薬剤の製薬化にあたっては、常法に従い、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００１６】
本発明における非ヒト動物としては、例えば、コイなどの魚類、トカゲなどのハ虫類、カエルなどの両生類、スズメなどの鳥類が挙げられるが、これらに制限されるものではない。本発明における非ヒト動物は、好ましくは無脊椎動物であり、例えば、ナメクジ、昆虫、昆虫以外の節足動物（ムカデ、クモ）、およびその他の無脊椎動物（カイチュウなどの寄生虫、マラリア原虫など）が挙げられるが、これらに制限されるものではない。さらにより好ましくは、本発明における無脊椎動物は昆虫であり、例えば、カイコ、蛾、蝶、ハエ、蚊またはシロアリが挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００１７】
本発明の、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、およびL-グルタミン酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸を有効成分として含有する薬剤を非ヒト動物に投与することによって、投与対象の非ヒト動物の行動を抑制、または非ヒト動物を殺傷することができる。
【００１８】
上記薬剤の非ヒト動物への投与は、経口的であっても、注射剤のように非経口的であってもよい。また、飼料（餌）に添加して投与することも可能である。この場合、本発明の薬剤にはD-グルタミン酸と餌成分とが含まれる。投与量および投与形態については、当業者であれば投与対象の非ヒト動物や薬剤の種類に応じて適宜選択することができる。例えばカイコ幼虫にカイニン酸を注射によって投与する場合、体液での終濃度に換算しておよそ10マイクロモルの濃度でカイコ幼虫を死に至らしめることができる。
【００１９】
本発明は、このような、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、およびL-グルタミン酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸を非ヒト動物に投与する工程を含む、該非ヒト動物の行動を抑制または該非ヒト動物を殺傷する方法も提供する。
【００２０】
また、本発明は、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸の誘導体について、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用の有無を評価する方法を提供する。
【００２１】
本発明の評価方法としては、まず、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸の誘導体を提供する。該誘導体を合成する場合、これらのアミノ酸が有しているアミノ基、カルボン酸基および側鎖の構造に対して、様々な化学構造を有する残基、例えばメチル基、エチル基などのアシル基、あるいは硫酸基などのイオン性残基、あるいはフッ素等の元素を導入することが考えられるが、それに限らない。これらアミノ酸の誘導体には無限の種類があり、すでに数多くの誘導体について有機化学者らが合成方法を報告している。例えば、D-グルタミン酸の誘導体は、D-およびL-グルタミン酸の混合体として有機合成し、それを分けることで提供される。
【００２２】
本発明の評価方法としては、次いで、該誘導体を非ヒト動物に投与する。
投与対象となる非ヒト動物としては、マウス、ラット等のほ乳類、魚類、鳥類、ハ虫類、昆虫類（カイコ、蛾、蝶、ハエ、蚊、シロアリ）、昆虫以外の節足動物（ムカデ、クモ）、およびその他の無脊椎動物（カイチュウなどの寄生虫、マラリア原虫など）が挙げられるが、好ましくは無脊椎動物、より好ましくは昆虫、さらにより好ましくはカイコが挙げられる。
【００２３】
該誘導体を製薬化して投与する場合、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。添加される担体は上述のとおりである。
【００２４】
該誘導体の非ヒト動物への投与方法としては、経口的に投与しても、注射剤として血液・体液内へ非経口的に投与してもよい。また、餌に添加して投与することも可能である。また、投与量および投与形態については、当業者であれば対象となる非ヒト動物等に応じて適宜選択することができる。
【００２５】
本発明の評価方法においては、該誘導体の投与により投与対象の非ヒト動物の行動が抑制、または該非ヒト動物が死に至った場合に、該誘導体が非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有すると判定される。一例としては、該誘導体の投与により非ヒト動物の筋肉が収縮あるいは弛緩された状態になる場合、それにより行動が抑制された状態になる場合、該誘導体は非ヒト動物に対して行動抑制作用または殺傷作用を有すると判定される。他の例としては、該誘導体が添加された餌を摂取した非ヒト動物が死に至る場合、該誘導体は非ヒト動物に対して行動抑制作用または殺傷作用を有すると判定される。
【００２６】
さらに、本発明は、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有するD-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸の誘導体のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法においては、上記評価方法を利用して、該誘導体について、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有するか否かを評価し、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有すると評価された誘導体を選択する。
【００２７】
上記方法により同定された非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有する誘導体は、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸と同様の活性を有するため、非ヒト動物の行動を抑制、または非ヒト動物を殺傷するのに利用できる。非ヒト動物が昆虫である場合は、殺虫薬・農薬として用いることができる。
【００２８】
なお、上記評価方法やスクリーニング方法を、D-グルタミン酸等の誘導体以外の被験化合物から非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有する化合物を同定する方法に応用できることはいうまでもない。この場合は、非ヒト動物の筋肉収縮あるいは筋肉弛緩を判定基準として用いることが好ましい。
【００２９】
また、本発明は、被験タンパク質について、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する結合活性の有無を評価する方法を提供する。
【００３０】
本発明の評価方法としては、まず、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に被験タンパク質を接触させる。被験タンパク質の状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。被験タンパク質に接触させる本発明のアミノ酸は、担体に結合させた形態であっても、他のタンパク質と融合させた形態であってもよい。
【００３１】
本発明において「接触」は、被験タンパク質の状態に応じて行う。例えば、被験タンパク質が精製された状態であれば、被験タンパク質に本発明のアミノ酸を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に本発明のアミノ酸を添加することにより行うことができる。
【００３２】
本発明の評価方法では、次いで、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する被験タンパク質の結合活性を測定する。例えば、ウエストウエスタンブロッティング法（Skolnik, E. Y. et al.,Cell (1991) 65, 83-90）を用いて行うことができる。具体的には、本発明のアミノ酸と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞、組織よりファージベクター（λgt11, ZAPなど）を用いたcDNAライブラリーを作製し、これをLB-アガロース上で発現させフィルターに発現させたタンパク質を固定し、精製して標識した本発明のアミノ酸と上記フィルターとを反応させ、本発明のアミノ酸と結合したタンパク質を発現するプラークを標識により検出すればよい。本発明のアミノ酸を標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、本発明のアミノ酸に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法または蛍光を利用する方法等が挙げられる。
【００３３】
また、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、本発明のアミノ酸と被験タンパク質との間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばBIAcore、Pharmacia製）。したがって、BIAcore等のバイオセンサーを用いることにより本発明のアミノ酸と被験タンパク質との結合を評価することが可能である。標識の種類は、例えば、蛍光標識、放射標識等が挙げられる。
【００３４】
本発明の評価方法の他の態様としては、分子生物学的手法により評価する方法も挙げられる。例えば、すでに知られているグルタミン酸受容体（Petersen S.A., Fetter R.D., Noordermeer J.N., Goodman C.S., DiAntonio A. (1997) Genetic analysis of glutamate receptors in Drosophila reveals a retrograde signal regulating presynaptic transmitter release. Neuron 19:1237-1248.、Schuster C.M., Ultsch A., Schloss P., Cox J.A., Schmitt B, Betz H (1991) Molecular cloning of an invertebrate glutamate receptor subunit expressed in Drosophila muscle. Science 254:112-114.）やそれと類似のアミノ酸配列を有するタンパク質のcDNAを含むベクターを宿主細胞（大腸菌など）内で発現させ、リコンビナントタンパク質を精製し、上に述べたリガンド結合試験を実施する方法が挙げられる。上記リコンビナントタンパク質の精製方法は当業者には公知である。
【００３５】
また、グルタミン酸受容体を測定する系において、結合活性を同定する方法が挙げられる（Petersen S.A., Fetter R.D., Noordermeer J.N., Goodman C.S., DiAntonio A. (1997) Genetic analysis of glutamate receptors in Drosophila reveals a retrograde signal regulating presynaptic transmitter release. Neuron 19:1237-1248.、Schuster C.M., Ultsch A., Schloss P., Cox J.A., Schmitt B, Betz H (1991) Molecular cloning of an invertebrate glutamate receptor subunit expressed in Drosophila muscle. Science 254:112-114.）。例えば、アフリカツメガエルの卵母細胞に上記cDNAを注入し、リガンドに依存した細胞膜内外の電位差を測定する方法が挙げられる。この方法は、グルタミン酸受容体の同定に広く使われており、グルタミン酸受容体へのリガンドの結合シグナルにより、イオンチャンネルが開口することを利用したものである。この方法は、培養細胞にも適用することができる。
【００３６】
さらに本発明は、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する結合活性を有するタンパク質のスクリーニング方法も提供する。上記評価方法を利用して、被験タンパク質について、本発明のアミノ酸に対する結合活性を有するか否かを評価し、結合活性を有すると評価されたタンパク質を選択する。
【００３７】
さらに本発明は、上記の方法で同定されたD-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する結合活性を有するタンパク質をコードするDNAのスクリーニング方法も提供する。得られたタンパク質から、該タンパク質をコードするDNAをクローニングする方法は、当業者には公知である。
【００３８】
上記方法により、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸の受容体が同定できれば、これらを利用して上記のアミノ酸と同様の活性を有する、非ヒト動物に対する行動抑制作用または殺傷作用を有する化合物を同定することができる。また、本発明者は、D-グルタミン酸をマウスの脳内に注射すると、マウスがけいれんを引き起こすという事実を得ているので、該受容体を利用すれば、非ヒト動物に対して中枢神経系に作用する活性を有する化合物を同定できる可能性がある。
【００３９】
本発明は、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性の有無を評価する方法を提供する。
本発明の評価方法としては、まず、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に被験タンパク質を接触させる。本発明における被験タンパク質の状態、および「接触」に関しては上述のとおりである。
【００４０】
次いで、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する被験タンパク質の分解活性を測定する。分解活性は、具体的には、それぞれのアミノ酸と分解産物を薄層クロマトグラフィーやHPLCにより分離し、それぞれの量を測定することで判定できる（D’Aniello et al. Biological role of D-amino acid oxidase and D-aspartate oxidase. J. Biol. Chem. 268, 26941-26949 (1993)）。アミノ酸と分解産物の量は、発色定量法が確立されている。また、放射性同位元素で標識されたアミノ酸を用いれば、分解されないものとされたものの放射能を測定することにより、それぞれを定量することができる。
【００４１】
また、本発明は、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性を有するタンパク質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法においては、上記評価方法を利用して、被験タンパク質について、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性を有するか否かを評価し、分解活性を有すると評価されたタンパク質を選択する。
【００４２】
さらに本発明は、上記の方法で同定されたD-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸に対する分解活性を有するタンパク質をコードするDNAのスクリーニング方法も提供する。得られたタンパク質から、該タンパク質をコードするDNAをクローニングする方法は、当業者には公知である。
【００４３】
上記方法により、D-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸の分解酵素が同定できれば、これらの酵素の活性を阻害する化合物が同定可能である。このような化合物は、本発明のD-グルタミン酸、カイニン酸、D-アスパラギン酸、またはL-グルタミン酸の作用を増強するために用いることができる。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
[実施例１]生きたカイコ幼虫の体液中へのカイニン酸の注射により引き起こされる筋収縮
本発明者は様々な薬物をカイコ５齢幼虫に注射し、その薬理効果を検索した。
カイコ幼虫は、卵(Hu/Yo x Tukuba/Ne)を愛媛蚕種(Ehime, Japan)から購入し、固形飼料（シルクメイト２Ｓ、日本農産、Yokohama, Japan）を与え５齢となるまで飼育したものを用いた。
【００４５】
試験化合物のカイコ幼虫血液への注射は、背中から29ゲージシリンジを用いて行った。カイニン酸はCalbiochem社から、D-グルタミン酸はAldrichおよびシグマ社から、L-グルタミン酸はナカライ化学社およびシグマ社から、NMDAは関東化学から、AMPAはシグマ社から購入した。4-Fluoro-7-nitro-2, 1, 3-benzoxadiazole (NBD-F)は、和光純薬より購入した。
【００４６】
その結果、グルタミン酸受容体アゴニストとして知られているカイニン酸がカイコ幼虫の筋肉を収縮することを見いだした。筋収縮に必要なカイニン酸の濃度は、体液での終濃度に換算しておよそ10マイクロモルであった。カイニン酸の注射により筋収縮したカイコ幼虫は回復することなく死亡した。
【００４７】
L-グルタミン酸をカイコ幼虫の体液に注射した場合には、筋収縮は見られず、逆に体全体の弛緩が見られた。弛緩に必要なL-グルタミン酸の体液終濃度は、およそ１ミリモルであった。L-グルタミン酸による行動抑制効果は10分程度で解消し、カイコ幼虫の運動は見かけ上正常となった。したがって、L-グルタミン酸による弛緩は一過的である。行動を抑制された状態から復帰したカイコ幼虫に同量のL-グルタミン酸を注射したところ、再び弛緩状態が引き起こされた。したがって、行動を抑制された状態からの復帰は、L-グルタミン酸に対して筋肉の収縮制御系が不感応となったためではない。
【００４８】
カイニン酸のようにカイコ幼虫に注射した場合筋収縮を引き起こすアミノ酸を検索した結果、D-グルタミン酸が収縮作用を示すことが分かった。筋収縮に必要なD-グルタミン酸の体液終濃度はおよそ１ミリモルであった。D-グルタミン酸注射後、カイコ幼虫は行動を抑制された状態となったが、およそ10分後には注射前の状態へ復帰が見られた。したがって、D-グルタミン酸の作用も一過的であった。D-グルタミン酸による行動抑制効果から復帰した幼虫に、同量のD-グルタミン酸を注射すると、再び筋収縮が認められた。したがって、収縮状態からの復帰は、筋肉の収縮制御系がD-グルタミン酸に不感応となったことによるのではない。
【００４９】
[実施例２]頭部除去カイコ幼虫標本を用いた筋肉収縮実験
カイニン酸やD-グルタミン酸およびL-グルタミン酸のカイコ幼虫の筋肉収縮に及ぼす効果をさらに理解するために、本発明者は頭部を除去した標本を用いて筋肉収縮の定量的測定を試みた。
【００５０】
カイコ幼虫（４〜６グラム）の頭部除去標本は、まず最初にハサミで断頭後、中腸内容物を内膜ごとピンセットで引き出し、さらに絹糸線を除いて作成した。筋肉収縮測定装置(transducer)に木綿糸で幼虫の尾部および最前部を固定し、28グラムの張力をかけて伸展した状態とした。頭部切除部から29ゲージシリンジを用いて0.05mLの栄養緩衝液（91mM NaCl, 2.7mM KCl, 1.8mM CaCl2, 1.05mM MgCl2, 11.9mM NaHCO3, 5.6mM glucose）に溶かした試験化合物を体腔内に注射した。注射前の標本長をx cm、注射後の標本長をy cmとしたとき、(x-y)/x の値を収縮率とした。
【００５１】
カイニン酸はこの系で至適濃度において40％の収縮を引き起こした（図１）。過剰量（10ミリモル以上）のカイニン酸を注射した場合には、収縮は抑制された(data not shown)。D-グルタミン酸もこの系で、筋肉収縮を示したが、カイニン酸のおよそ100倍の濃度が必要であった（図２）。この場合も、過剰量（60ミリモル以上）では収縮の抑制が見られた。
【００５２】
カイニン酸やD-グルタミン酸によるカイコ幼虫の筋収縮は、頭部を除去した標本で見られたので、中枢を必要としない反応である。さらに筋収縮は、神経節を除去したカイコ幼虫標本においても見られた(data not shown)。したがって、これらの化合物は神経節に作用しているのではない。
【００５３】
L-グルタミン酸はこの系で筋肉収縮効果を示さなかった（図２）。グルタミン酸受容体アゴニストとして知られている、NMDAやAMPAはこの系で筋収縮を引き起こさなかった。また、GABAも無効であった。さらに、生体内タンパク質に含まれる20種類のアミノ酸について、それぞれのL体およびD体による筋肉収縮効果の有無を検討した。その結果、D-アスパラギン酸が部分的な効果を示すことが判明した。それ以外の試験したアミノ酸の中には、筋肉収縮効果を示すものはなかった（data not shown）。
【００５４】
生きたカイコ幼虫に対して筋肉弛緩効果を示したL-グルタミン酸について、頭部除去標本における作用を探索した。その結果、標本をL-グルタミン酸により前処理すると、カイニン酸による収縮が阻害されることが判明した（図３）。また、D-グルタミン酸による収縮についても、カイニン酸と同様に阻害された。
【００５５】
この阻害効果は、NMDAやAMPAによっては引き起こされなかった。さらに、生体内タンパク質に含まれるグルタミン酸以外の19種類のアミノ酸のL体およびD体について、それぞれの前処理による筋肉収縮の阻害効果の有無を調べたが、いずれも効果を示さなかった(data not shown)。したがって、阻害効果はL-グルタミン酸に特異的である。
【００５６】
[実施例３]カイコ幼虫体液中に存在するD-グルタミン酸
D-グルタミン酸は、脊椎動物の生体内で生理活性物質として機能しているとは考えられておらず、生体内における存在の有無についてもほとんど知見がない。本発明者は、カイコ幼虫の体液中のD-グルタミン酸の存在の有無を、アミノ酸分析法により検討した。
【００５７】
カイコ幼虫体液中のD-グルタミン酸は、以下に述べる方法により定量した。
体液の５％トリクロロ酢酸可溶性画分100μLに1M NaOH 20μLを加えて中和した後、200mM ホウ酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）を加えて希釈した。試料20μLに50mM NBD-Fアセトニトリル溶液10μLを加え蛍光誘導体化し、60℃５分インキュベーション後１％TFA 470μLを添加して蛍光誘導体化反応を停止させた。0.45マイクロメートルフィルターで濾過したサンプル10μLを、HPLCシステムに注入した。HPLCシステムは、以前に報告したアスパラギン酸の光学分割のためのシステム（J. Chromatogr. B 761, 99-106 (2001)）を、グルタミン酸分析用に改善したものである。すなわち、octyl silica (C8)カラムとPirkle型のキラルカラム（OA3100、住化分析センター、大阪、日本）が自動カラムスイッチング装置により連結されている（Zhiqun Long, Noriyuki Nimura, Minako Adachi, Masae Sekine, Toshihiko Hanai, Hiroaki Kubo, and Hiroshi Homma, Determination of D- and L-aspartate in cell culturing medium, within cells of MPT1 cell line and in rat blood by a column-switching high performance liquid chromatographic method. J. Chromatogr. B 761, 99-106 (2001) 参照）。
【００５８】
上記システムにより、D-およびL-グルタミン酸のNBD誘導体を分離した（図４）。その結果、５齢カイコ幼虫体液中には約0.63mMのグルタミン酸が存在しているが、その３％がD-グルタミン酸であった。すなわち、カイコ幼虫体液中には、約0.019mMのD-グルタミン酸が存在している。
【００５９】
すでにショウジョウバエ幼虫の筋肉に局在するグルタミン酸受容体について報告されているが、その生理的アゴニストがL-グルタミン酸であるとの証明はない。本実施例の結果は、カイコ幼虫の神経筋接合部において、カイニン酸受容体が情報伝達を担っており、D-グルタミン酸が収縮を導く生理的アゴニストとして機能していることを示唆している。L-グルタミン酸は、この過程を負に制御しているものと考えられる。
【００６０】
一般に無せきつい動物では、神経筋接合部にグルタミン酸受容体が存在していると考えられている。実際、体長３センチメートルのナメクジ体腔中に20mMのD-グルタミン酸溶液0.05mLを１mLのツベルクリン注射用の注射器で注射した場合にも、筋肉の収縮が見られた。したがって、D-グルタミン酸による筋収縮は、無せきつい動物一般に普遍的である可能性が考えられる。
【００６１】
[実施例４]カイコ幼虫に対するD-グルタミン酸混入飼料の影響
カイコ３齢幼虫（体長およそ１cm）１２匹を、１gあたり２mgのD-グルタミン酸を含む人工飼料（シルクメイト、日本農産工業（株））を与えて飼育したところ、４日後に１０匹が死亡した。生き残った２匹も、ほとんど成長を示さなかった。対象としてD-グルタミン酸を含まない飼料で飼育したカイコ幼虫は体長およそ２cmまで成長した。また、この条件でカイコ幼虫を絶食させても、死ぬことはない。したがって、D-グルタミン酸はカイコ幼虫に対して致死作用を持つことが分かった。
【００６２】
[実施例５]D-グルタミン酸の脳室内注射によるマウスの痙攣
L-グルタミン酸をマウスの脳室内に注入すると、痙攣を誘発することが知られている（Stoneand Javid Effects of anticonvulsants and other agents on seizures indued by intracerebral L-glutamate Brain Research 264, 165-167 (1983)）。PBS(-)に溶解した20mM L-グルタミン酸50μLの脳室内注射により痙攣が引き起こされる条件で、20mM D-グルタミン酸も、50μLの脳室内注射により明瞭な痙攣を引き起こした。両者の痙攣は、NMDA阻害剤として知られているAP5(Olverman, H. J., Jones, A. W., Mewett K. N., and Watkins, J. C. (1988) Structure/activity relations of N-methyl-D-aspartate receptor ligands as studied by their inhibition of [3H]D-2-amino5-phosphonopentanoic acid binding in rat brain membranes. Neuroscience 26, 17-31.)を終濃度2mMで添加することにより、抑えられた。したがって、D-グルタミン酸は、NMDA受容体に作用していると考えられる。D-グルタミン酸が哺乳類の脳に存在しているという報告（Kera, Y., Aoyama, H., Matsumura, H., Hasegawa, A., Nagasaki, H., Yamada, R. (1995). Presence of free D-glutamate and D-aspartate in rat tissues. Biochim. Biophys, Acta 1243, 282-286.）と、本実施例の結果から、哺乳動物の中枢においても、D-グルタミン酸が神経伝達物質として機能している可能性が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】断頭カイコ幼虫標本を用いたカイニン酸による筋肉収縮実験結果を示す写真である。カイコ５齢幼虫を断頭して腸内容物および絹糸腺を除去し、28グラムの張力をかけて安定させた（左図）。2mMカイニン酸を含む栄養緩衝液0.05mLを体腔内に注射すると、筋肉が収縮した（右図）。
【図２】カイニン酸、およびD-グルタミン酸のカイコ幼虫の筋肉収縮効果を示す図である。種々の濃度の化合物を含む栄養緩衝液0.05mLを断頭カイコ幼虫標本に注射し、注射前後での収縮率を計算した。
【図３】L-グルタミン酸の、カイコ幼虫の筋肉収縮反応に対する阻害効果を示す図である。種々の濃度の化合物を含む栄養緩衝液0.05mLを断頭カイコ幼虫標本に注射し、さらに、0.1mMのカイニン酸を含む栄養緩衝液0.05mMを注射した。カイニン酸の注射前後での筋肉収縮率を計算した。
【図４】カイコ幼虫体液中のD-グルタミン酸の検出を示す図である。カイコ幼虫体液のトリクロロ酢酸可溶性画分中のアミノ酸をNBD-Fで蛍光誘導体化し、octyl silica (C8)カラムとキラルカラム（OA3100）とをカラムスィッチング法で組み合わせたHPLCシステム（HPLC system in which an octyl silica column and a chiral column (OA3100) are linked by automated column-switching device）により、NBD-D-グルタミン酸とNBD-L-グルタミン酸を分離した。縦軸は蛍光強度を示す。全グルタミン酸の３％がD-グルタミン酸であった。
【図２】
2006028097.tif 000002
【図３】
2006028097.tif 000003
【図４】
2006028097.tif 000004
【図１】
2006028097.tif 000005