(57)【要約】【課題】少量のサンプルから短時間でサンプルの注入、攪拌、洗浄／乾燥が行われ、ユーザーによる偏差が少ない、自動ハイブリダイゼーションシステムを提供する。【解決手段】バイオチップ支持体およびサンプル投入口を備える第１カバーを含む少なくとも１つのハイブリダイゼーションチャンバを備えるチャンバ装置、前記ハイブリダイゼーションチャンバの両端に連結された１対のエアーチャンネル、前記１対のエアーチャンネルにそれぞれ設置された１対の弁、前記１対のエアーチャンネルが連結された統合エアーチャンネル、および前記統合エアーチャンネルに設置されたエアーポンプを有する攪拌装置、ならびに前記１対のエアーチャンネルの何れか一方に分岐弁を介して連結された流路、前記流路に連結されたフローポンプ、および前記フローポンプを基準に前記流路の反対側に設置された緩衝液投入口を有する洗浄／乾燥装置を備える、バイオチップのハイブリダイゼーションシステムである。【選択図】図７
2006162625.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオチップ支持体、およびサンプル投入口を備える第１カバーを含む少なくとも１つのハイブリダイゼーションチャンバを備えるチャンバ装置と、
前記ハイブリダイゼーションチャンバの両端に連結された１対のエアーチャンネル、前記１対のエアーチャンネルにそれぞれ設置された１対の弁、前記１対のエアーチャンネルが連結された統合エアーチャンネル、および前記統合エアーチャンネルに設置されたエアーポンプを有する攪拌装置と、
前記１対のエアーチャンネルの何れか一方に分岐弁を介して連結された流路、前記流路に連結されたフローポンプ、および前記フローポンプを基準に前記流路の反対側に設置された緩衝液投入口を有する洗浄／乾燥装置と、
を備える、バイオチップのハイブリダイゼーションシステム。
【請求項２】
前記バイオチップ上に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ペプチド、および蛋白質からなる群より選択される生体分子が固定化されていることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項３】
前記第１カバーのサンプル投入口を覆うキャップを含む第２カバーを更に備えることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項４】
前記キャップと接触する前記サンプル投入口の上部の側面、端側、または前記サンプル投入口と接触する前記キャップの下部の側面に空気排出口をさらに備えることを特徴とする、請求項３に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項５】
前記第１カバーの下面と一体化され、前記ハイブリダイゼーションチャンバを取り囲む密閉要素をさらに備えることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項６】
前記密閉要素は、前記ハイブリダイゼーションチャンバの内側の凸部および前記ハイブリダイゼーションチャンバ外側の凹部を備えることを特徴とする、請求項５に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項７】
前記ハイブリダイゼーションチャンバの下部に設置されたヒーターをさらに備えることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項８】
前記ハイブリダイゼーションチャンバは、ペルチェ素子を用いて加熱または冷却されることを特徴とする、請求項７に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項９】
前記ハイブリダイゼーションチャンバの末端に連結された前記エアーチャンネルは、前記サンプル投入口の側壁と連結されることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項１０】
前記エアーチャンネルまたは前記流路は断面が円形であり、断面が半円形である溝を備えた上部の基板および下部の基板が重ね合わさって、形成されていることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項１１】
前記上部の基板または前記下部の基板と一体化し、前記上部の基板または前記下部の基板の溝を取り囲む密閉要素をさらに備えることを特徴とする、請求項１０に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項１２】
前記密閉要素は、エアーチャンネルまたは流路の内側の凸部、およびエアーチャンネルまたは流路の外側の凹部を備えることを特徴とする、請求項１１に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項１３】
前記２つの弁のうち、１つを開いて、他の１つを閉じた状態でエアーポンプへ空気を送り、開いていた弁を閉じ、閉じていた弁を開いてエアーポンプから空気を抜き、開いた弁および閉じた弁の状態を変えずに、エアーポンプへ空気を送り、閉じていた弁を開き、開いていた弁を閉じてエアーポンプから空気を抜くことを含む工程を繰り返すことによって、前記ハイブリダイゼーションチャンバ内の溶液を攪拌することを特徴とする、請求項１に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項１４】
前記攪拌装置の弁は、複数のハイブリダイゼーションチャンバへの空気の供給を制御するための分岐弁であることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項１５】
前記洗浄／乾燥装置の流路は、分岐弁を介して前記攪拌装置のエアーチャンネルに連結され、前記エアーチャンネルは、サンプル注入口の側壁に連結されていることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項１６】
前記洗浄／乾燥装置の流路に、分岐弁を介して連結されている乾燥用のエアーラインをさらに備えることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項１７】
複数の緩衝液の供給を制御し、前記洗浄／乾燥装置の流路の反対側に、複数の緩衝液投入口と連結されている分岐弁をさらに備えることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項１８】
弁の開閉、ポンプの作動、およびヒーターの温度を自動制御するコンピュータ中央処理装置、ならびにシステムの作動状態を表示するモニタをさらに備えることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項１９】
前記上部の基板および前記下部の基板のうちの１つの表面に連結し、前記上部の基板および前記下部の基板の重ね合わせにより形成されたスペースを取り囲み、スペースの内側の凸部およびスペースの外側の凹部を含む一体型の密閉要素を備えることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項２０】
前記スペースは、チャンバまたはチャンネルであることを特徴とする、請求項１９に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項２１】
前記凸部は、前記スペースの内側に傾斜していることを特徴とする、請求項１９に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項２２】
前記密閉要素は、圧縮時に変形しうる、柔軟なポリマーから構成されていることを特徴とする、請求項１９に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【請求項２３】
前記柔軟なポリマーは、シリコン材料であることを特徴とする、請求項２２に記載のハイブリダイゼーションシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーションシステムに係り、更に具体的には、サンプルの拡散、サンプルの攪拌、チップの洗浄、およびチップの乾燥などのバイオチップのハイブリダイゼーションのための操作が自動化されているハイブリダイゼーションシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオチップは、支持体上に分析される生体分子プローブを高密度で固定化させることにより形成されている。生体分子プローブとしては、ＤＮＡ、蛋白質などが挙げられる。前記プローブがサンプル内の標的物質とハイブリダイズされているかどうかを検出することによって、遺伝子発現の特徴、遺伝子の欠陥、蛋白質の分布、反応の特徴などが分析されうる。バイオチップは、使用されるプローブの種類により、ＤＮＡチップ、蛋白質チップなどに分類される。さらに、プローブの固定化している形態により、固体支持体上に固定化されたマイクロアレイチップ、およびマイクロチャンネル上に固定化されたＬＯＣ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）に分類される。バイオチップは、サンプル内の標的物質とプローブとの効果的なハイブリダイゼーション反応を実施するために、ハイブリダイゼーションチャンバ、攪拌システム、および洗浄／乾燥システムを必要とする。
【０００３】
従来、図１のように、スライドガラスとカバーガラスとの間に形成されたハイブリダイゼーションチャンバ内で、手作業によりハイブリダイゼーション反応が行われている。これは、ユーザーによる実験条件の偏差を発生させ、１６ないし１７時間という長い試験時間、および１００μｌに至るまでのサンプルを必要とする。
【０００４】
このような欠点を克服するために、ハイブリダイゼーション、洗浄、および乾燥を、自動的に実施するための自動化システムが開発されている。フラクチュエーションを用いた自動化システムの使用は、結果としてハイブリダイゼーションの効率を向上させ、ユーザーによる偏差を低減させ、２時間以下という短い試験時間、および５０μｌ以下という少量のサンプルしか必要としない。
【０００５】
図２Ａおよび図２Ｂは、特許文献１に開示されている、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社により開発された従来の自動ハイブリダイゼーションシステムの写真である。図２Ａおよび図２Ｂに示すように、ハイブリダイゼーションチャンバは、流体移送システムによりポンプと連結されており、流体の循環によりハイブリダイゼーションが促進される。また、サンプルローディング、攪拌、洗浄、および乾燥が１つのシステムで実施される。しかし、このような装置においては、蠕動ポンプ、および循環流体流路を使用するため、大量のサンプルが必要となる。このため、１６時間ハイブリダイゼーションが実施された後、ＤＮＡチップは洗浄され、ロータリーオーブンを用いて乾燥される。また、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社から得られるチップのみがカートリッジとして使用される、すなわちこの装置は互換性がない。
【０００６】
図３Ａおよび図３Ｂは、特許文献２に開示されているＴｅｃａｎ社により開発された従来の自動ハイブリダイゼーションシステムである。図３Ａ及び図３Ｂに示すように、溶液の攪拌、およびスライドの乾燥はボード上で実施され、サンプルを投入した後、ハイブリダイゼーション、洗浄、および乾燥が自動的に行われる。ハイブリダイゼーションチャンバの両端に二つのチャンネルが連結されており、それぞれのチャンネルは、攪拌のための膜、およびチップ上のプローブと標的溶液との間のハイブリダイゼーションを促進するための二つのマイクロポンプを備える。しかし、このような装置においては、チャンバ内の効果的な攪拌のために、標的溶液をチャンバのカバーまで満たした後サンプルを混合するため、ハイブリダイゼーションチャンバがひどく汚染される。
【０００７】
図４Ａおよび図４Ｂは、Ｍｅｍｏｒｅｃ社により開発された、従来の自動ハイブリダイゼーションシステムの写真および図である。図４Ａおよび図４Ｂに示すように、サンプルを投入した後、ハイブリダイゼーション、洗浄、および乾燥が自動化されている。このハイブリダイゼーションシステムは、活発な循環を実施するために用いられるダイヤフラムポンプを備える。しかしこの場合、サンプルが循環されなければならないため、２２０μｌに至るまでの多量のサンプルが必要とされる。
【０００８】
図５Ａおよび図５Ｂは、Ｂｉｏｍｉｃｒｏ社から入手できる、ＭＡＵＩハイブリダイゼーションシステムの写真および図である。図５Ａおよび図５Ｂに示すように、同一条件で４枚のチップが試験されうる。しかしこの場合、チップ上にパッチまたはガスケットを装着し、サンプル注入した後に、洗浄および乾燥を別々に行わなければならない。
【０００９】
図６Ａおよび図６Ｂは、特許文献３に開示されている、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ社から入手できるハイブリダイゼーションシステムの写真および図であり、複数のチップ内の流体の流量および温度の制御が可能である。しかしこの場合、ハイブリダイゼーションシステムは、サンプルの拡散のための攪拌装置を備えていない。
【特許文献１】米国特許第６，３９１，６２３号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／００１３１８４号明細書
【特許文献３】米国特許第６，４３２，６９６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、少量のサンプルから短時間でサンプルの注入、攪拌、および洗浄／乾燥が行われ、ユーザーによる偏差が少ない、自動ハイブリダイゼーションシステムを提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記従来技術の問題点に鑑み、鋭意研究した結果、閉鎖系でポンプおよび弁を制御することにより、効果的な自動化ハイブリダイゼーションシステムの具現が可能であるということを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明の課題を解決するために、本発明は、バイオチップ支持体、およびサンプル投入口を備える第１カバーを含む少なくとも１つのハイブリダイゼーションチャンバを備えるチャンバ装置と、前記ハイブリダイゼーションチャンバの両端に連結された１対のエアーチャンネル、前記１対のエアーチャンネルにそれぞれ設置された１対の弁、前記１対のエアーチャンネルが連結された統合エアーチャンネル、および前記統合エアーチャンネルに設置されたエアーポンプを有する攪拌装置と、前記１対のエアーチャンネルの何れか一方に分岐弁を介して連結された流路、前記流路に連結されたフローポンプ、および前記フローポンプを基準に前記流路の反対側に設置された緩衝液投入口を有する洗浄／乾燥装置と、を備えるバイオチップのハイブリダイゼーションシステムを提供する。
【００１３】
本発明のハイブリダイゼーションシステムにおいて、前記バイオチップを形成する支持体上に固定化された生体分子は、好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ：ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ：ロックト核酸）、ペプチド、および蛋白質からなる群より選択されるが、これらに限定されるものではない。支持体は、ガラス、シリコン、プラスチックなどの固体基質が好ましい。バイオチップは、必要ならば外部の会社から入手できる。バイオチップは、本発明によるハイブリダイゼーションシステムのカバーを開いた後、バイオチップの支持体上に設置される。
【００１４】
本発明のハイブリダイゼーションシステムにおいて、前記カバーの１つの端は、他の端の動作によりハイブリダイゼーションチャンバが開閉されうるように、ヒンジにより支持体と連結されている。
【００１５】
本発明のハイブリダイゼーションシステムは、前記第１カバーのサンプル投入口を覆うキャップを備えた第２カバーを更に備えうる。
【００１６】
本発明のハイブリダイゼーションシステムにおいて、前記第２カバーの１つの端は、前記第２カバーの他の端の動作によりサンプル投入口が開閉されるように、ヒンジによって前記第１カバーと連結しうる。
【００１７】
本発明のハイブリダイゼーションシステムは、前記キャップと接触するサンプル投入口の上部側、または前記サンプル投入口と接触する前記キャップの下部側に空気排出口を備えうる。
【００１８】
本発明のハイブリダイゼーションシステムは、カバーの下面と一体化され、前記ハイブリダイゼーションチャンバを取り囲む密閉要素を、さらに備えうる。
【００１９】
本発明のハイブリダイゼーションシステムにおいて、前記密閉要素は、前記ハイブリダイゼーションチャンバの内側に形成された凸部およびハイブリダイゼーションチャンバの外側に形成された凹部を備えうる。
【００２０】
本発明のハイブリダイゼーションシステムは、前記ハイブリダイゼーションチャンバの下部に設置されたヒーターを備えうる。
【００２１】
本発明のハイブリダイゼーションシステムにおいて、前記ハイブリダイゼーションチャンバは、ペルチェ素子を用いて加熱または冷却されうる。
【００２２】
本発明のハイブリダイゼーションシステムにおいて、前記ハイブリダイゼーションチャンバの末端に連結されたエアーチャンネルは、前記サンプル投入口の側壁に連結されうる。
【００２３】
本発明のハイブリダイゼーションシステムにおいて、前記エアーチャンネルまたは流路は、断面が円形であり、断面が半円形である溝を備えた上部および下部の基板を重ね合わせて、形成されうる。
【００２４】
本発明のハイブリダイゼーションシステムにおいて、前記上部の基板または下部の基板と一体化し、前記上部の基板または前記下部の基板の溝を取り囲む密閉要素をさらに備えうる。
【００２５】
本発明のハイブリダイゼーションシステムにおいて、前記密閉要素は、エアーチャンネルまたは流路の内側の凸部、およびエアーチャンネルまたは流路の外側の凹部を備えうる。
【００２６】
本発明のハイブリダイゼーションシステムにおいては、前記１対の弁のうち、１つを開いて、他の１つを閉じた状態でエアーポンプへ空気を送り、開いていた弁を閉じ、閉じていた弁を開いてエアーポンプから空気を抜き、開いた弁及び閉じた弁の状態を変えずにエアーポンプへ空気を送り、閉じていた弁を開き、開いていた弁を閉じてエアーポンプから空気を抜くことを含む工程を繰り返して、前記ハイブリダイゼーションチャンバ内の溶液を攪拌しうる。
【００２７】
本発明のハイブリダイゼーションシステムに備えられる攪拌装置は、従来のハイブリダイゼーションチャンバ内の溶液の循環による攪拌とは異なり、チャンバ内の溶液が、エアーチャンネル内の空気の流動により、前記エアーチャンネルの両端が閉鎖された系で攪拌されることを特徴とする。したがって、従来とは異なり、多量のサンプルを必要とせず、少量のサンプルでもハイブリダイゼーション反応を行えるという長所がある。
【００２８】
本発明のハイブリダイゼーションシステムにおいて、前記攪拌装置の弁は、複数のハイブリダイゼーションチャンバへの空気の供給を制御するための分岐弁でありうる。前記分岐弁は、複数のチャンネルに連結されている。この場合、各チャンネルは独立して開閉されうる。
【００２９】
本発明のハイブリダイゼーションシステムにおいて、前記分岐弁の例としては、デッドボリュームの少ない電磁弁が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３０】
本発明のハイブリダイゼーションシステムにおいて、前記統合エアーチャンネルは、エアーポンプ内に含まれうる。この場合、１つのエアーポンプから２本のエアーチャンネルが出ている。
【００３１】
本発明のハイブリダイゼーションシステムにおいて、前記エアーポンプは、電気的な信号により前記エアーチャンネル内の空気の圧力を上昇または下降させうるいかなるポンプでも用いられうる。好ましくは、前記エアーポンプは、マイクロメーターの単位で体積が調節されうるステッピングモータ方式のマイクロポンプである。
【００３２】
本発明のハイブリダイゼーションシステムにおいて、前記洗浄／乾燥装置の流路は、分岐弁を介して前記攪拌装置のエアーチャンネルに連結され、前記エアーチャンネルは、サンプル注入口の側壁に連結されうる。
【００３３】
本発明のハイブリダイゼーションシステムは、前記洗浄／乾燥装置の流路に、前記分岐弁を介して連結している乾燥用のエアーラインをさらに備えうる。
【００３４】
本発明のハイブリダイゼーションシステムにおいては、前記エアーラインを介して例えば窒素（Ｎ２）ガスが供給されうる。
【００３５】
本発明のハイブリダイゼーションシステムにおいて、前記フローポンプは、電磁操作マイクロポンプでありうる。しかし、電気的な信号を用いることにより、前記エアーチャンネル内の流体の流れを引き起こすことが可能ないかなるポンプもまた、使用されうる。
【００３６】
本発明のハイブリダイゼーションシステムは、複数の緩衝液の供給を制御でき、前記フローポンプを基準に前記洗浄／乾燥装置の流路の反対側に設置されている複数の緩衝液投入口と連結している、分岐弁をさらに備えうる。
【００３７】
本発明のハイブリダイゼーションシステムはさらに、弁の開閉、ポンプの作動、およびヒーターの温度を自動制御するコンピュータ中央処理装置（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ：ＣＰＵ）、およびシステムの作動状態を表示するモニタを備えうる。
【００３８】
本発明の他の実施形態によれば、本発明のハイブリダイゼーションシステムは、前記上部の基板および前記下部の基板のうちの１つの表面に連結し、前記上部の基板または下部の基板により形成されたスペースを取り囲み、スペースの内側の凸部およびスペースの外側の凹部を含む一体型の密閉要素を備えうる。
【００３９】
前記スペースは、ＬＯＣまたはＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ）等に一般的に使用されるチャンバまたはチャンネルでありうる。しかし、前記上部の基板および下部の基板を重ね合わせることにより形成されるいかなるスペースもまた、使用されうる。
【００４０】
一体型の前記密閉要素は、圧縮時に変形しうるいかなる柔軟なポリマーからも構成され得、好ましくは、シリコン材料から構成されうる。
【００４１】
一体型の前記密閉要素において、前記凸部は、スペースの内側に傾斜していてもよく、前記上部の基板および前記下部の基板が重なり合うとき、凸部の変形が、凸部に隣接した凹部によって吸収される。
【００４２】
本発明によれば、前記上部の基板及び前記下部の基板のうちのいずれかが、凸部および凹部を有する。従来、上部の基板および下部の基板のそれぞれが凹部を有し、それゆえ、ゴム製のＯリングが必要とされてきた。しかし、本発明によれば、マイクロチャンネルまたはチャンバを製造する工程は単純化され、マイクロチャンネルおよびチャンバの汚染は防止されうる。さらに、前記密閉要素および基板の一体化は、分離および洗浄のしやすさに貢献する。
【００４３】
本発明のハイブリダイゼーションシステムは、チップに対して標的溶液を効果的に拡散させるために用いられうる。標的溶液が、チップに固定化されているプローブに対して効果的に結びつくように、マイクロポンプは２つの方向に交互に空気を送り、弁を閉鎖系内で制御する。
【００４４】
本発明において、マイクロアレイまたはＬＯＣなどへの使用に適するように、弁およびポンプのサイズは、数ないし数十μｍに小型化されうる。
【発明の効果】
【００４５】
本発明によるハイブリダイゼーションシステムは、少量のサンプルでも攪拌が可能であり、ポンプおよび弁の操作のみで、閉鎖系内でのサンプルの混合が可能であるため、短時間でサンプルの注入、攪拌、および洗浄／乾燥が行われ、ユーザーによる偏差が少ない、自動ハイブリダイゼーションシステムの提供が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
以下、図面を参照して本発明を詳細に説明する。
【００４７】
図７は、本発明の一実施形態によるハイブリダイゼーションシステムの概略図である。図７に示すように、本発明のハイブリダイゼーションシステムは、チャンバ装置１０、攪拌装置２０、および洗浄／乾燥装置３０を備える。チャンバ装置１０は、バイオチップ１２のための支持体、およびサンプル投入口を有するカバーを含む少なくとも１つのハイブリダイゼーションチャンバ１１を備える。攪拌装置２０は、ハイブリダイゼーションチャンバ１１の両端に連結された１対のエアーチャンネル２１および２１’、前記エアーチャンネルにそれぞれ設置された１対の弁２２および２２’、前記１対のエアーチャンネルが連結された統合エアーチャンネル２４、及び前記統合エアーチャンネルに設置されたエアーポンプ２５を備える。洗浄／乾燥装置３０は、エアーチャンネル２１’に分岐弁２７を介して連結された流路３１、前記流路３１に連結されたフローポンプ３２、および前記フローポンプ３２を基準にして前記流路３１の反対側に設置された緩衝液投入口３３を備える。
【００４８】
図７において、チャンバ装置１０は、４つのハイブリダイゼーションチャンバ１１を有し、スライド＃１ないし＃４は、バイオチップの機能を果たし、それぞれハイブリダイゼーションチャンバ１１の支持体上に配置されている。ハイブリダイゼーションチャンバ１１は、前記支持体上のカバーを押すことにより形成されている。前記ハイブリダイゼーションチャンバ１１は、バイオチップの形状により長方形であってもよく、エアーチャンネル２１および２１’を通して注入される空気によって、ハイブリダイゼーションチャンバ１１に圧力が均一に加えられるように流線型であることが好ましい。サンプルは、マイクロピペットを用いてカバーに備えられたサンプル投入口を通して手動でロードされるが、自動サンプル投入装置を用いてロードすることも可能である。ロードされたサンプルに含まれる標的分子は、ハイブリダイゼーションチャンバ１１内のバイオチップに設置されたプローブとハイブリダイズされる。
【００４９】
本実施形態の攪拌装置２０のエアーチャンネル２１および２１’に設置された弁２２および２２’は、ハイブリダイゼーションチャンバ１１への空気の供給を制御するための分岐弁でありうる。本実施形態では、スライド＃１ないし＃４に空気を供給するために、４方向の分岐を備える弁が前記分岐弁として使用されうる。ハイブリダイゼーションチャンバ１１に含まれるサンプルは、弁２２および２２’が交互に開閉されたときにエアーポンプ２５から空気を抜くおよびエアーポンプ２５へ空気を送ることにより、拡散されうる。具体的には、ハイブリダイゼーションチャンバ１１に含まれるサンプルは、次の操作を繰り返すことにより攪拌される：弁２２を開いて、弁２２’を閉じた状態でエアーポンプ２５へ空気を送り、弁２２を閉じ、弁２２’を開いてエアーポンプ２５から空気を抜き、弁２２および弁２２’の状態を変えずに、エアーポンプ２５へ空気を送り、弁２２を開き、弁２２’を閉じてエアーポンプ２５から空気を抜く。ハイブリダイゼーションチャンバ１１に含まれる溶液は、これらの操作を繰り返すことにより混合されうる。エアーポンプ２５と隣接した弁２３は、３方向の分岐を有する弁であり、発生した出口圧力の所定量を、エアーポンプ２５からエアーチャンネル２１および２１’へ送る連結部の役割を果たし、弁２６は、ハイブリダイゼーションチャンバ１１、ならびにエアーチャンネル２１および２１’の圧力を外部に放出する。
【００５０】
洗浄／乾燥装置３０の流路３１は、第１分岐弁２７を通してエアーチャンネル２１’に連結されている。本実施形態では、第１分岐弁２７は、４方向の分岐を有する弁である。詳細には、第１分岐弁２７は、ハイブリダイゼーションチャンバに連結している流路、エアーポンプ２５に連結している流路、前記流路３１、および排出口とそれぞれ連結している４方向の分岐を有する。したがって、洗浄／乾燥装置３０の流路３１は、エアーチャンネル２１’を介してハイブリダイゼーションチャンバ１１に連結されている。この場合、攪拌用の空気、洗浄用の緩衝液、および乾燥用の空気は、１つの流路、すなわちエアーチャンネル２１’を通して通過しうる。乾燥空気を供給するエアーライン３７は、第１分岐弁２７に直接連結されるか、または洗浄／乾燥装置の流路３１に設置されている第２分岐弁３６を介して、前記第１分岐弁２７と間接的に連結されうる。前記第２分岐弁３６は、ハイブリダイゼーションチャンバに連結している流路、緩衝液に連結される流路、およびエアーライン３７に連結している流路にそれぞれ連結する３方向の分岐を有する弁である。前記エアーライン３７を介してＮ２ガスが供給されうる。
【００５１】
前記フローポンプを基準にして、前記洗浄／乾燥装置３０の流路３１の反対側には、緩衝液投入口３３が緩衝液容器３４と連結されて設置されている。緩衝液容器３４は、ハイブリダイゼーションシステムの内部または外部に位置しうる。緩衝液容器３４がシステムの外部に位置する場合には、緩衝液投入口３３が、ハイブリダイゼーションシステムに形成された緩衝液ライン入口を介して外側へ連結される。好ましくは、前記流路３１と緩衝液投入口３３との間に、第３分岐弁３５をさらに備えうる。第３分岐弁３５は、複数の緩衝液投入口３３に連結され、複数の緩衝液の供給を制御する。第３分岐弁３５は、６個の緩衝液容器３４から緩衝液を受け取る、６方向の分岐を有する弁でありうる。
【００５２】
図８Ａは、本発明の一実施形態によるハイブリダイゼーションシステムの側面の透視図である。図８Ａに示すように、ヒンジ１１２によって本体４００に連結されている第１カバー１１０は、フック１１１によって閉じられている。ヒンジ１２２によって第１カバー１１０に連結されている第２カバー１２０は、フック１２１から離れている。サンプルは、マイクロピペット１５を用いて、サンプル投入口１３を通してハイブリダイゼーションチャンバ１１に投入される。前記第２カバー１２０は、第１カバー１１０のサンプル投入口１３を覆うキャップ１４を備える。前記ハイブリダイゼーションチャンバ１１の下部には、ヒーター４１０が備えられている。本体４００は、攪拌装置（図示せず）；第１分岐弁２７、第２分岐弁３６、および第３分岐弁３５を備える洗浄／乾燥装置；緩衝液容器と連結され、システムの外側に設置される緩衝液ライン投入口４５０；本体４００の内部に発生する熱を除去するエアーファン４３０；およびエアーポンプ４４０を備えている。また、本体４００の斜めの外面には、システムの作動状態を表示する液晶ディスプレイ（ＬＣＤ：Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ）モニタ４２０が備えられている。
【００５３】
図８Ｂは、図８Ａに示しているハイブリダイゼーションシステムの平面図である。図８Ｂに示すように、４つのハイブリダイゼーションチャンバ１１を備えるチャンバ装置がハイブリダイゼーションシステムの左側下部に設置されており、システムの作動状態を表示するＬＣＤモニタ４２０は、ハイブリダイゼーションシステムの右側に設置されており、複数の緩衝液ライン投入口４５０は、ハイブリダイゼーションシステムの外側に設置されている。
【００５４】
図８Ｃは、本発明の一実施形態によるハイブリダイゼーションシステムの正面図である。図８Ｃに示すように、第１カバー１１０は、本体４００の上に設置されており、ヒーター４１０は、ハイブリダイゼーションシステムの下部に設置されており、システムの作動状態を表示するＬＣＤモニタ４２０は、ハイブリダイゼーションシステムの右側上部に設置されており、ポンプの動作およびヒーター４１０の温度を自動的に制御するコンピュータ中央処理装置４６０は、本体４００の下部に設置されており、電気を供給する電源４７０が本体４００の下部に設置されている。
【００５５】
図９は、図８Ａに示したハイブリダイゼーションシステムを備える製品の一例を示す写真である。ハイブリダイゼーションシステムのサイズは、最大で３０×３０×２５（単位ｃｍ）となり、＄７，５００以下のコストで量産されうる。さらに、ハイブリダイゼーションシステムはＰＣとの接続が可能である；ハイブリダイゼーションシステムは、他のハイブリダイゼーションシステムと接続可能である：ハイブリダイゼーションシステムは、それ自身が独立して作動できるようにコントローラおよびＬＣＤモニタを備える；同時に４枚の試験チップが用いられうる；ハイブリダイゼーションシステムは、０〜８０℃の温度で作動しうる；ハイブリダイゼーションのための攪拌は、ポンプを用いて行われる；洗浄は、ポンプを用いて発生する流体の流れを用いて行われる；乾燥のために、エアーブローが用いられる。
【００５６】
図１０Ａは、図８Ａに示したハイブリダイゼーションシステム内のハイブリダイゼーションチャンバ１１の水平断面図である。図１０Ａに示したように、ハイブリダイゼーションチャンバ１１は、ハイブリダイゼーションチャンバの両端に形成されたサンプル投入口１３を介して、エアーチャンネル２１および２１’に連結されている。エアーチャンネル２１および２１’は、ヒンジと同じ方向に配置され、それによりカバーの開閉を可能にしている。図１０Ｂは、図１０Ａに示した太線に沿って抜き出した水平断面図であり、密閉要素１１３を示す図面である。図１０Ｂによれば、ハイブリダイゼーションチャンバの支持体の上に固定化されたバイオチップ１２は、第１カバー１１０によって覆われている。ヒーター４１０は、ハイブリダイゼーションチャンバ１１の下部に設置されている。密閉要素１１３は、第１カバー１１０と一体化され、第１カバー１１０の下面に設置されており、ハイブリダイゼーションチャンバ１１の密閉要素１１３は、ハイブリダイゼーションチャンバ１１の内側の凸部１１３ａおよびハイブリダイゼーションチャンバ１１１の外側の凹部１１３ｂを備える。前記密閉要素１１３は、圧縮時に変形しうるいかなる柔軟なポリマーからも構成されうるが、好ましくは、シリコン材料から構成されうる。
【００５７】
図１１Ａないし図１１Ｃは、密閉要素１１３の作用の様子を示す図面である。図１１Ａないし図１１Ｃに示すように、支持体上に固定化されているハイブリダイゼーションチャンバのバイオチップ１２は、第１カバー１１０によって覆われる。最初は、第１カバー１１０は完全に閉じられず、前記密閉要素１１３の凸部１１３ａは変形していない（図１１Ａ参照）。この際、ハイブリダイゼーションチャンバ１１の高さは、本来のチャンバの高さ０．２ｍｍと凸部の高さ０．５ｍｍとの合計で０．７ｍｍとなる。次に、第１カバー１１０が完全に閉じられると、前記凸部１１３ａが圧縮されて変形する（図１１Ｂ参照）。前記凸部１１３ａの変形は、隣接した凹部１１３ｂにより吸収される。この際、ハイブリダイゼーションチャンバ１１の高さは、本来のハイブリダイゼーションチャンバの高さである０．２ｍｍとなる。その後、ハイブリダイゼーションチャンバ１１は圧縮されて０．１５ｍｍの高さとなり、サンプルの量を低減できる（図１１Ｃ参照）。
【００５８】
図１２Ａは、図８Ａに示したハイブリダイゼーションシステムのエアーチャンネル２１および２１’の水平断面図である。図１２Ａに示したように、ハイブリダイゼーションチャンバ１１は、その両端に形成されたサンプル投入口１３を介して、エアーチャンネル２１および２１’と連結されている。エアーチャンネル２１および２１’は、ヒンジと同じ方向に配置され、それによりカバーの開閉を可能にしている。図１２Ｂないし図１２Ｄは、図１２Ａに示した太線に沿って抜き出した水平断面図であり、密閉要素２１３を示す図面である。図１２Ｂに図示したように、断面が円形であるチャンネルまたは流路は、断面が半円形である溝を備えた上部の基板２２０および下部の基板２１０を重ね合わせることにより形成される。上部の基板２２０および下部の基板２１０と一体化した密閉要素２１３は、上部の基板２２０および下部の基板２１０の外側に形成される。前記密閉要素２１３は、チャンネルまたは流路の内側に形成された凸部２１３ａ、およびチャンネルまたは流路の外側に形成された凹部２１３ｂを備える。前記密閉要素２１３は、圧縮時に変形しうるいかなる柔軟なポリマーからも構成されうるが、好ましくは、シリコン材料から構成されうる。図１２Ｃは、上部の基板２２０が、下部の基板２１０と完全には合わさっていない状態である。図１２Ｄは、上部の基板２２０が下部の基板２１０と完全に合わさっている状態であり、前記凸部２１３ａが圧縮されて変形している。凸部２１３ａの変形が隣接した凹部２１３ｂにより吸収されて、結果としてエアーチャンネル２１が形成される。
【００５９】
図１３Ａは、図８Ａに示したハイブリダイゼーションシステムのサンプル投入口１３、ならびにエアーチャンネル２１および２１’の水平断面図である。ハイブリダイゼーションチャンバ１１は、その両端に形成されたサンプル投入口１３を介してエアーチャンネル２１および２１’と連結されている。エアーチャンネル２１および２１’は、ヒンジと同じ方向に配置され、それによりカバーの開閉を可能にしている。図１３Ｂは、図１３Ａに示した太線に沿って切り取った断面図であり、第１カバー１１０および第２カバー１２０の拡大図である。図１３Ｂに示したように、第１カバー１１０にサンプル投入口１３が形成され、前記サンプル投入口１３は、第２カバー１２０に形成されたキャップ１４により閉じられる。エアーチャンネル２１は、サンプル投入口１３の側壁に連結されて、最終的にハイブリダイゼーションチャンバ１１の末端に連結される。空気排出口１４ｂはサンプル投入口１３の上部の一部に形成される。前記空気排出口１４ｂは、キャップ１４の上部の下面１４ａが第１カバー１１０の上面に接触し、サンプル投入口１３内へキャップの先端１４ｃが挿入されると、サンプル注入口内の空気圧を減少させる役割を果たす。したがって、空気圧によるハイブリダイゼーションチャンバ１１内に含まれるサンプルの移動が防止されうる。前記キャップの先端１４ｃは、サンプル投入口の側面と離れている。それゆえ、洗浄後に残留した緩衝液は、毛管現象によりキャップの先端１４ｃとサンプル投入口１３との間に形成されたスペースへ漏れうる。よって、残留緩衝液によるハイブリダイゼーションチャンバの汚染が防止されうる。スペースが形成されない場合、残留緩衝液は、乾燥工程の際に、ハイブリダイゼーションチャンバ１１の中へ漏れ、ハイブリダイゼーションチャンバが汚染される。
【００６０】
図１３Ｃは、図８Ａに示したハイブリダイゼーションシステムのパッキング装置の一例を示す図である。図１３Ｃに示したように、パッキング装置は、キャップ１４と接触するサンプル投入口１３の上部側面に形成された空気排出口１４ｂを備えている。空気排出口１４ｂは、サンプル投入口１３の側壁の上面から所定の深さの溝状に形成されている。空気排出口１４ｂは、キャップ１４がサンプル投入口１３に挿入されると、キャップ１４の体積により発生する空気圧を、矢印の方向に放出しうる。
【００６１】
図１３Ｄは、図８Ａに示したハイブリダイゼーションシステムのパッキング装置の一例を示す図である。図１３Ｄに示したように、空気排出口１４ｂは、チャンバの上部のカバーに形成されるサンプル投入口１３と接触する、キャップ１４の下端の側面に形成されている。空気排出口１４ｂは、キャップ１４がサンプル投入口１３に挿入されると、キャップ１４の体積により発生する空気圧を、矢印の方向に放出しうる。サンプル投入口１３は、キャップ１４の上部の下面１４ａとサンプル投入口１３が密着することにより密封される。キャップ１４の上部の下面１４ａの直径はサンプル投入口１３の直径より大きい。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。これらの実施例は、単に、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されてはならない。
【００６３】
実施例：本発明によるハイブリダイゼーションシステムの適用実験
本発明のハイブリダイゼーションシステムを用いてハイブリダイズされたＭＯＤＹ３チップと、従来のカバーガラスおよびスライドガラスを用いたハイブリダイゼーションの方法を用いてハイブリダイズされたＭＯＤＹ３チップとを比較した。実験に使用したプローブは、下記の表１の通りである。
【００６４】
【表１】
2006162625.tif 000003
【００６５】
まず、ＭＯＤＹ３に対応するプローブを基板上に固定化し、マイクロアレイを形成した。詳細には、分子量１００００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、０．０２５Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）、およびホルムアミドを１：１：２の質量比で混合した溶液に、野生型プローブ（ＷＰ）または変異プローブ（ＭＰ）を加えた。得られた溶液をシリコンウェハの上に、バイオロボットプリンタ（Ｍｏｄｅｌ  ＰｉｘＳｙｓ  ５００、米国カリフォルニア州、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手できる。）を用いてスポットした。その後、３７℃で４時間、ウェットインキュベータで放置した。このとき、背景ノイズは、スポットされていないシリコンウェハの部分が適切な反応を受け、それによってウェハの表面に結合しているアミノ基に負電荷を与えるように制御された。そのため、シリコンウェハへの付着は防止された。得られたシリコンウェハを乾燥器に入れた。標的核酸（配列番号９）の本体または両端は、Ｃｙ３−ｄＵＴＰで蛍光標識された。前記標的核酸のハイブリダイゼーション条件は、０．１％６×ＳＳＰＥＴ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を０．１％含むリン酸−エチレンジアミン四酢酸緩衝液）溶媒に溶解させた、１８７ｎＭの標的核酸およびマイクロアレイを、３７℃で１６時間反応させた。それとは別に、０．１％６×ＳＳＰＥＴ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を０．１％含むリン酸−エチレンジアミン四酢酸緩衝液）溶媒に溶解させた１８７ｎＭの標的核酸およびマイクロアレイを、本発明の一実施形態によるハイブリダイゼーションシステムを用いてハイブリダイズさせた。チップのそれぞれは、０．０５％６×ＳＳＰＥＴ、および０．０５％３×ＳＳＰＥＴ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を０．０５％含むリン酸−エチレンジアミン四酢酸緩衝液）でそれぞれ５分間洗浄し、５分間常温で乾燥させた後にアクソンのスキャナー（モデル  ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ、米国カリフォルニア州、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）を用いてスキャンさせた。スキャニングデータは、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ３.０（米国カリフォルニア州、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社から入手した。）を使用して分析され、比率成分および強度成分が得られた。表２は、実施した２つの実験条件を比較した表である。
【００６６】
【表２】
2006162625.tif 000004
【００６７】
スポット強度の平均、ＰＭ／ＭＭ比（ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈ／ＭｉｓｓＭａｔｃｈ比）、および変動係数（ＣＶ）は、従来の方法により２０枚のテストチップを試験し、本発明のハイブリダイゼーションシステムにより２０枚のテストチップを試験することにより求めた。その実験結果を、表３に示す。
【００６８】
【表３】
2006162625.tif 000005
【００６９】
表３に示すように、本発明の一実施形態によるハイブリダイゼーションシステムを用いたときのほうが、従来の方法を用いたときよりも、スポット強度のＣＶおよびＰＭ／ＭＭ比のＣＶが非常に小さいことが分かる。
【００７０】
本発明を、実施例と関連させて説明したが、特許請求の範囲に定義された本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形式や詳細における様々な変形がなされうるということは、当業者によって容易に理解されるであろう。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、ハイブリダイゼーションシステムに関連した技術分野に好適に適用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】従来の技術である、手作業によりハイブリダイゼーションを行うときに用いられる、スライドガラスおよびカバーガラスの写真である。
【図２Ａ】従来の技術である、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のハイブリダイゼーションシステムを示す写真である。
【図２Ｂ】従来の技術である、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のハイブリダイゼーションシステムを示す写真および図である。
【図３Ａ】従来の技術である、Ｔｅｃａｎ社のハイブリダイゼーションシステムを示す写真である。
【図３Ｂ】従来の技術である、Ｔｅｃａｎ社のハイブリダイゼーションシステムを示す図面である。
【図４Ａ】従来の技術である、Ｍｅｍｏｒｅｃ社のハイブリダイゼーションシステムを示す写真である。
【図４Ｂ】従来の技術である、Ｍｅｍｏｒｅｃ社のハイブリダイゼーションシステムを示す図である。
【図５Ａ】従来の技術である、ＢｉｏＭｉｃｒｏ社のＭＡＵＩハイブリダイゼーションシステムを示す写真である。
【図５Ｂ】従来の技術である、ＢｉｏＭｉｃｒｏ社のＭＡＵＩハイブリダイゼーションシステムを示す図である。
【図６Ａ】従来の技術である、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ社のハイブリダイゼーションシステムを示す写真である。
【図６Ｂ】従来の技術である、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ社のハイブリダイゼーションシステムを示す図である。
【図７】本発明の一実施形態によるハイブリダイゼーションシステムの概略図である。
【図８Ａ】本発明の一実施形態によるハイブリダイゼーションシステムの側面の透視図である。
【図８Ｂ】本発明の一実施形態によるハイブリダイゼーションシステムの平面図である。
【図８Ｃ】本発明の一実施形態によるハイブリダイゼーションシステムの正面図である。
【図９】図８Ａに示した本発明の一実施形態によるハイブリダイゼーションシステムを備える製品の一例を示す写真である。
【図１０Ａ】本発明の一実施形態であるハイブリダイゼーションシステムのハイブリダイゼーションチャンバの水平断面図である。
【図１０Ｂ】図１０Ａに示した太線に沿って抜き出した水平断面図であり、密閉要素を示す図である。
【図１１Ａ】本発明の一実施形態によるハイブリダイゼーションシステムが備えるハイブリダイゼーションチャンバの、密閉要素の作用の様子を示す図である。
【図１１Ｂ】本発明の一実施形態であるハイブリダイゼーションシステムが備えるハイブリダイゼーションチャンバの、密閉要素の作用の様子を示す図である。
【図１１Ｃ】本発明の一実施形態であるハイブリダイゼーションシステムが備えるハイブリダイゼーションチャンバの、密閉要素の作用の様子を示す図である。
【図１２Ａ】本発明の一実施形態であるハイブリダイゼーションシステムのエアーチャンネルの水平断面図である。
【図１２Ｂ】図１２Ａに示した太線に沿って抜き出した水平断面図であり、密閉要素を示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ａに示した太線に沿って抜き出した水平断面図であり、密閉要素を示す図である。
【図１２Ｄ】図１２Ａに示した太線に沿って抜き出した水平断面図であり、密閉要素を示す図である。
【図１３Ａ】本発明の一実施形態であるハイブリダイゼーションシステムのサンプル投入口、およびエアーチャンネルの水平断面図である。
【図１３Ｂ】図１３Ａに示した第１カバーおよび第２カバーの拡大図である。
【図１３Ｃ】本発明の一実施形態であるハイブリダイゼーションシステムのパッキング装置の一例を示す概略図である。
【図１３Ｄ】本発明の一実施形態によるハイブリダイゼーションシステムのパッキング装置の一例を示す概略図である。
【符号の説明】
【００７３】
１０    チャンバ装置
１１    ハイブリダイゼーションチャンバ
１２    バイオチップ
１３    サンプル投入口
１４    キャップ
１４ａ    キャップの上部の下面
１４ｂ    空気排出口
１４ｃ    キャップの先端
１５    マイクロピペット
２０    攪拌装置
２１、２１’    エアーチャンネル
２２、２２’、２３、２６    弁
２４    統合エアーチャンネル
２５    エアーポンプ
２７    第１分岐弁
３０    洗浄／乾燥装置
３１    流路
３２    フローポンプ
３３    緩衝液投入口
３４    緩衝液容器
３５    第３分岐弁
３６    第２分岐弁
３７    エアーライン
１１０    第１カバー
１１１、１２１    フック
１１２    ヒンジ
１１３、２１３    密閉要素
１１３ａ    ハイブリダイゼーションチャンバの内側の凸部
１１３ｂ    ハイブリダイゼーションチャンバの外側の凹部
１２０    第２カバー
２１０    下部の基板
２１３ａ    凸部
２１３ｂ    凹部
２２０    上部の基板
４００    本体
４１０    ヒーター
４２０    ＬＣＤモニタ
４３０    ファン
４４０    エアーポンプ
４５０    緩衝液ライン接続口
４６０    コンピュータ中央処理装置
４７０    電源
＃１、＃２、＃３、＃４    スライド
【図１】
2006162625.tif 000006
【図２Ａ】
2006162625.tif 000007
【図２Ｂ】
2006162625.tif 000008
【図３Ａ】
2006162625.tif 000009
【図３Ｂ】
2006162625.tif 000010
【図４Ａ】
2006162625.tif 000011
【図４Ｂ】
2006162625.tif 000012
【図５Ａ】
2006162625.tif 000013
【図５Ｂ】
2006162625.tif 000014
【図６Ａ】
2006162625.tif 000015
【図６Ｂ】
2006162625.tif 000016
【図７】
2006162625.tif 000017
【図８Ａ】
2006162625.tif 000018
【図８Ｂ】
2006162625.tif 000019
【図８Ｃ】
2006162625.tif 000020
【図９】
2006162625.tif 000021
【図１０Ａ】
2006162625.tif 000022
【図１０Ｂ】
2006162625.tif 000023
【図１１Ａ】
2006162625.tif 000024
【図１１Ｂ】
2006162625.tif 000025
【図１１Ｃ】
2006162625.tif 000026
【図１２Ａ】
2006162625.tif 000027
【図１２Ｂ】
2006162625.tif 000028
【図１２Ｃ】
2006162625.tif 000029
【図１２Ｄ】
2006162625.tif 000030
【図１３Ａ】
2006162625.tif 000031
【図１３Ｂ】
2006162625.tif 000032
【図１３Ｃ】
2006162625.tif 000033
【図１３Ｄ】
2006162625.tif 000034
【配列表】
2006162625000001.app