(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトにおける動脈硬化発症の危険因子を検出する方法、そのために用いる検出キットを提供する。【解決手段】ヒトの動脈硬化に対する易罹患性を判定する方法であって、以下の工程：（ａ）被験者から、ゲノムＤＮＡを含有する生体試料を採取する工程、（ｂ）工程（ａ）において得られた生体試料中のゲノムＤＮＡ上に存在する特定の配列からなる配列で表される塩基配列からなるLMNA遺伝子のプロモーター領域である多型（ＳＮＰ）の存在する第２８４番目の塩基に相当するする塩基の種類を決定する工程、及び（ｃ）工程（ｂ）において得られた結果に基づいて、当該被験者の動脈硬化に対する易罹患性を判定する工程、を包含することを特徴とする動脈硬化に対する易罹患性判定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの動脈硬化に対する易罹患性を判定する方法であって、以下の工程：
（ａ）  被験者から、ゲノムＤＮＡを含有する生体試料を採取する工程、
（ｂ）  工程（ａ）において得られた生体試料中のゲノムＤＮＡ上に存在する
配列番号１で表される塩基配列からなるLMNA遺伝子のプロモーター領域である多型（ＳＮＰ）の存在する第２８４番目の塩基に相当するする塩基の種類を決定する工程、及び
（ｃ）  工程（ｂ）において得られた結果に基づいて、当該被験者の動脈硬化に対する易罹患性を判定する工程、を包含することを特徴とする動脈硬化に対する易罹患性判定方法。
【請求項２】
ヒトの動脈硬化に対する易罹患性の判定を、配列番号１で表される塩基配列からなるLMNA遺伝子のプロモーター領域である多型（ＳＮＰ）の存在する第２８４番目に相当する塩基の種類がＣＴ型またはＴＴ型の場合に、ＣＣ型の場合より動脈硬化に対する罹患性が高いとする判定基準に基づいて行なうことを特徴とする請求項１記載の動脈硬化に対する易罹患性判定方法
【請求項３】
ＬＭＮＡ遺伝子のプロモーター領域の部分を含む配列からなるプライマーを主要構成要素として含有してなる、動脈硬化に対する易罹患性判定用キット。
【請求項４】
前記プライマーが配列番号２の塩基配列からなるプライマー、及び 配列番号３の塩基配列からなるプライマーを主要構成要素として含有してなる、動脈硬化に対する易罹患性判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検者のＬＭＮＡ遺伝子のプロモーター領域の多型を解析することにより動脈硬化に対する易罹患性を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子多型（gene polymorphism）とは、一つの生物種における個体間の遺伝情報の相違をいい、通常、集団の１％以上の頻度で存在するものを指す。代表的な遺伝子多型として、(1)DNA配列の1箇所の塩基配列が別な塩基に変わっている一塩基多型（SNP:single nucleotide
polymorphism）と、(2)２個から４個の単位の配列が数回から数十回繰り返す、「繰り返し配列」の繰り返し回数の個人差のマイクロサテライト多型（microsatellite polymorphism）の二つがある。SNPはヒトゲノム上で最も数多く存在する多型で、平均約1000塩基ごとに一箇所の割合で存在し、ゲノム全体では200万箇所以上存在すると考えられる。また、マイクロサテライト多型は3万〜10万塩基に一箇所の割合で存在し、ヒトゲノム全体では約10万個存在すると考えられる。
【０００３】
ところで、動脈硬化を併発し易い患者と、併発しにくい患者とが存在するが、これも、各人の遺伝的素因、特に上記の遺伝子多型に基づいてかなりの部分を説明できるものと考えられる。従来、動脈硬化の危険因子としては、総コレステロール・収縮期血圧・喫煙・肥満・ホモシステイン・ＩＭＴ等により推定されることが多く、動脈硬化への罹り易さ（易罹患性）の遺伝子レベルでの評価は多数の遺伝子多型が複雑に絡み合っているとともに、発症に関する多型が全て同定されているわけでなないことや各遺伝子多型がどのような組み合わせのときに発症リスクが高まり、さらにそれにどのような外部要因が組合わさったとき、より一層、動脈硬化発症リスクが高まるか等の基礎的知見が不十分なために、未だ実用化された評価系はない。
【特許文献１】特開2005-110608号公報
【特許文献２】特開2002-209585号公報
【非特許文献１】J Pediatr. 146(3):336-341(2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、動脈硬化発症予防さらには動脈硬化を始めとする生活習慣病予防のために、その発症に関与する遺伝子多型（ＳＮＰ）を明らかにし、動脈硬化への易罹患性の実用的な評価系を得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、動脈硬化の易罹患性への実用的な遺伝子レベルでの評価系を得るべく、核ラミンをコードしその変異が早老症やリポジストロフィーに関連するＬＭＮＡ遺伝子に着目し、その多型（ＳＮＰ）と動脈硬化の関連を鋭意検討した結果、当該遺伝子の特定位置における変異が動脈硬化症発症と関連することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明は、下記(1)〜(2)に示す動脈硬化の易罹患性判定方法並びに下記(3)〜(4)に示す判定用キットを提供する。
(1) ヒトの動脈硬化に対する易罹患性を判定する方法であって、以下の工程：
（ａ）  被験者から、ゲノムＤＮＡを含有する生体試料を採取する工程、
（ｂ）  工程（ａ）において得られた生体試料中のゲノムＤＮＡ上に存在する
配列番号１で表される塩基配列からなるLMNA遺伝子のプロモーター領域である多型（ＳＮＰ）の存在する第２８４番目の塩基の種類を決定する工程、及び
（ｃ）  工程（ｂ）において得られた結果に基づいて、当該被験者の動脈硬化に対する易罹患性を判定する工程、を包含することを特徴とする動脈硬化に対する易罹患性判定方法。
【０００７】
(2) ヒトの動脈硬化に対する易罹患性の判定を、配列番号１で表される塩基配列からなるLMNA遺伝子のプロモーター領域である多型（ＳＮＰ）の存在する第２８４番目に相当する塩基の種類がＣＴ型またはＴＴ型の場合に、ＣＣ型の場合より動脈硬化に対する罹患性が高いとする判定基準に基づいて行なうことを特徴とする請求項１記載の動脈硬化に対する易罹患性判定方法
【０００８】
(3) ＬＭＮＡ遺伝子のプロモーター領域の部分を含む配列からなるプライマーを主要構成要素として含有してなる、動脈硬化に対する易罹患性判定用キット。
(4) 前記プライマーが配列番号２の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号３の塩基配列からなるプライマーを主要構成要素として含有してなる、動脈硬化に対する易罹患性判定用キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、動脈硬化に対する易罹患性の判定方法、および判定用のSNP
検出用キットを提供する。これらはヒトの動脈硬化に対する易罹患性の判定方法として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明に用いるＬＭＮＡ遺伝子は核膜の主要な構成タンパク質であるラミンＡ/Ｃをコードする遺伝子である。ラミンＡタンパク質は、核膜内膜と細胞核内部との間にあって、線維状の網目構造を形成している核ラミナの重要な構成要素であり、核ラミナは、核膜の内膜と外膜、核膜孔複合体と共に核膜を形成し、細胞核と細胞質を分離している。核ラミナは、細胞核において主に構造的な役割を果たすと考えられていたがそれ以外にも、細胞核と細胞質の間での分子の輸送やシグナル伝達の場面やクロマチンのアンカーポイントを指定して核の高次構造を決定する場面でも重要な役割を果たすことが分かってきた。そのラミンＡ/Ｃをコードする遺伝子（LMNA）では，遺伝子異常の起こる位置によって，骨格筋・心筋・脂肪細胞などの「細胞死」を特徴とした多彩な臨床症状が引き起こされる．また、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群（HGPS）の発症にも関わる。HGPSは重症の早期老化症状が数多く現われ、この疾患に罹患した子供たちは、通常、大人になる前に心臓病や脳卒中で死亡する。Ｃｏｌｌｉｎｓらは早老症にとどまらず人間ひとりひとりにとっても、このラミンＡ/Ｃタンパク質の安定した形態が長寿と関係があるかもしれないという考えのもとに、長寿者のLMNA遺伝子を調査している［Sternberg,
S., "Aging Disorder Gene Revealed," USA Today, page 8D (April 17,
2003)］。
【００１１】
本発明者らは、生活習慣病の遺伝的発症要因の探索を行ってきた。心筋梗塞、脳梗塞その他多くの病因である動脈硬化症の発症の遺伝的要因の探索の一環として上記ＬＭＮＡ遺伝子に着目し、その関連を検討したところ、当該遺伝子のプロモーター領域に見出された多型（ＳＮＰ）が動脈硬化症発症と関連することを新たに見出し、動脈硬化への易罹患性の実用的な評価系を得るに至り、本発明を完成した。
【００１２】
本発明の実施に用いるＬＭＮＡ関連DNA分子は、一般的遺伝子工学的手法により製造・取得することができる[参考文献；Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring
Harbor Lab. Press
(1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法I、II、III」、日本生化学会編（1986）]。すなわち、該ＬＭＮＡ遺伝子を被験者より、常法に従ってcDNAまたはゲノムDNAを抽出し、適当なプローブ、制限酵素、抗体などを用いて所望クローンを選択することにより取得することができる。かかるクローンの選択は常法により行うことができる[参考文献；Proc. Natl. Acad.
Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science, 222,
778 (1983)]。
【００１３】
上記cDNAまたはゲノムDNAは、被験者の各種細胞、組織、これらに由来する培養細胞などより取得することができる。具体的には、口腔粘膜、血液（血清、血漿などを含む）、唾液、リンパ、気道粘液、尿、精液などの体液からRNAの分離、mRNAの分離および精製、cDNAの取得、そのクローニングなどを常法により行うことができる。
【００１４】
ＬＭＮＡ明遺伝子をcDNAライブラリーからスクリーニングする方法は、定法により行うことができる。すなわち、ＬＭＮＡ配列に選択的に結合し得る部分を含むプローブを作成し、これを用いたハイブリダイゼーション、例えばコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション等により実施する。上記スクリーニング用プライマーは、ＬＭＮＡ遺伝子の塩基配列より設定されるフォワード・プライマーおよびリバース・プライマーとして自動合成装置等の定法により合成することができる。
【００１５】
抽出した遺伝子あるいはmRNAは、本発明の解析及び判定の精度を高くするために、PCR法[Saiki, R.K., Bugawan, T.L., et al., Nature,
324, 163-166(1986)]等により増幅させることができる。PCR法以外にも、例えば、SDA法[Walker, G.T., Little, M.C., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
89,392-396 (1992)]やNASBA法[Comptom, J., Nature, 650, 91-92(1991)]等の遺伝子増幅法を用いても良い。これらの方法により増幅された遺伝子は、その増幅物の特性に応じて、本発明に
係るＬＭＮＡ遺伝子の多型（ＳＮＰ）の検出に供される。
【００１６】
DNA配列の決定および多型の検出は、例えば以下に示すような各種の方法に従って実施することができる。
(a) ヌクレオチド直接塩基決定法によるDNA配列の決定、例えばマキサム−ギルバート法[Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)]、ダイデオキシ法[Sanger, et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)]。
(b) 対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド−ドットプロット法によるDNA配列の決定および遺伝子多型(SNP)の検出[Conner, B.J., et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., 80, 278-282(1983)]。
(c) Kinetic PCR (Real time PCR)法・TaqMan 法[T. Morris, B. Robertson, M. Gallagher, J. Clin. Microbiol., 34,
2933 (1996)；M.A. Doll, D.W. Hein,
Anal. Biochem., 288, 106 (2001)；K.J. Livak, J. Marmaro, J.A. Todd, Nature Genet., 9, 341 (1995)]。
【００１７】
更に、以下に挙げる方法によってもＬＭＮＡ遺伝子のＳＮＰの検出を行うことができる。
(d) インベーダー法[Lyamichev, V., et al., Nat. Bioltechnol., 17(3)292-296(1999)]。
(e) PCR-単鎖高次構造多型(SSCP)分析法[Orita, M.,
Iwahara, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86, 2776-2770(1989)]。
(g) ピロシーケンス法[米国特許第6,159,693号]。
(h) PCR-DGGE/GCクランプ法[Shefield,V.C.,et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA,86,232-236(1989)]。
(i) RNase保護アッセイ法[Finkelstein,J., et al., Genomics, 7, 167-172(1990))]。
(j) in situ RT-PCR法[Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)]。
【００１８】
ＬＭＮＡ遺伝子の製造・取得、およびその多型（ＳＮＰ）の検出は上記の方法で達成されるが、これらは例示であり、他のいかなる方法でも本特許の趣旨に沿うものであれば本特許の適用の範囲から外れるものではない。
【００１９】
本発明による動脈硬化に対する易罹患性の判定は本発明の提供する被験者のＬＭＮＡ遺伝子のＳＮＰ検出キットを用いることにより簡便に実施することができる。本発明キットは、少なくともヒトLMNA遺伝子のプロモーター部位のSNP部分を含む塩基配列もしくはその相補的塩基配列にハイブリダイズするDNA断片、を構成成分として含むことが必須である。更に他の成分として、標識剤、PCR法に必須な試薬（例えば、TaqDNAポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、DNA増幅用プライマーなど）を挙げることができる。標識剤としては、放射性同位元素または発光または蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げられる。更に当該試薬キットには、更に適当な反応希釈液、洗浄剤、緩衝液、標準抗体、反応停止液などが含まれていてもよい。
【００２０】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００２１】
大阪大学老年腎臓内科学講座内の健常人32人の末梢血から抽出したgenomic DNAを用いＬＭＮＡ遺伝子の新規の多型の探索を以下の手順で行った。ゲノムＤＮＡを被験者の末梢血白血球より常法により抽出した後、得られたゲノムＤＮＡ―1.0μL、フォワードプライマー：5'-ACAAACAAACAGAGGATGAGGTG-3'：配列番号10(50pmol/μL)―0.1μL、リバースプライマー；5'-CAGGGGATTTCTTTCGGTTCTTA-3'：配列番号11(50pmol/μL)―0.1μL、Hot StarTaq&#61668; Master Mix (QIAGEN Inc.)―10.0μL、DDW―7.8μL、合計20.0μLを、95℃―15 分を１回、95℃―30秒、60℃―30秒、2℃―1分のサイクルを３０回、72℃―3分を１回でＰｒｅ−ＰＣＲ反応を行った。不純物を取り除いた後のPCR産物を新たな96 wellプレートに1.0&#61549;Lずつ分注し、そこに、フォワードプライマー(50pmol/μL)― 0.4μL、Big Dye&#8482; Ver.1.1 (Applied Biosystems Inc.)―2.0μL、Big Dye Buffer―1.0μL、DDW―5.6μL、を加えて合計10.0μLとして、96℃―1分と、96℃―10秒、50℃―5秒、60℃―4分のサイクルを25回のsequence反応を行った。
【００２２】
その後定法によりエタノール沈殿を行ったのち、ABI
3100 (Applied Biosystems Inc.)を用いてと蛍光測定を行った。この結果、配列番号１で表されるLMNA遺伝子のプロモーター領域の塩基配列の第２８４番目の塩基にＳＮＰを見出した。すなわち、被験者の28人が“CC”型であったのに対し、4人が“CT”型であるという多型であった。
【実施例２】
【００２３】
本発明者らは、地域一般住民の遺伝子多型と動脈硬化の関連を検討するために、北海道常呂郡端野町・有珠郡壮瞥町住民で２００３年に住民検診を受診し、インフォームドコンセントの得られた者のうち、高血圧・高脂血症・糖尿病治療中の者を除いた被験者について遺伝子解析と動脈硬化の評価を行った。
【００２４】
動脈硬化の評価は被験者の四肢血圧（上腕/足首）同時測定装置による上腕・足首大動脈波伝播速度測定（baPWV）で行った。
【００２５】
ＳＮＰ解析は本発明者の見出したプロモーターのＳＮＰ；配列番号１の第２８４番目のＳＮＰと比較対象として既知のexon10におけるＳＮＰ(rs4641)の両者についておこなった。
【００２６】
プロモーター部位のＳＮＰ解析については以下のようにしておこなった。すなわち、ゲノムＤＮＡを被験者の末梢血白血球より常法により抽出した後、得られたゲノムＤＮＡを用い
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によりＳＮＰ解析を行った。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応液は、１μLの被験者より得られたＤＮＡ(10ng/μL)、０．１２５μLの４０×プライマーとプローブ混合物；フォワードプライマー（配列番号２：5'-CCACTACCTTCTTTCTGGCTGAA-3）、リバースプライマー（配列番号３：5'-ACTAGGTCCCAGATTTCTGTGGTT-3'）、ＴａｑＭａｎプローブ（Ｃアレル用：5'-Vic-CAGCCAATGTTGGGTC-MGB-3'：配列番号４、Ｔアレル用：5'-Fam-ACAGCCAATATTGGGTC-MGB-3'：配列番号５）、と２．５μLの２×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、と１．３７５μLのＤＤＷからなり、全容量は５．０μLとした。ＰＣＲ反応は、９５℃・１０分を１回、９２℃・１５秒と６０℃・６０秒のサイクルを４０回繰り返すことにより行なった。反応物はABI PRISM 7900HT Sequence Detector (Applied Biosystems Inc.)を用いて蛍光測定を行った。
【００２７】
exon10のＳＮＰ解析は以下のようにして行った。すなわち、プロモーター部位のＳＮＰ解析と同じ条件で、プライマーとプローブを以下のものを用いて行った。フォワードプライマー（配列番号６：5'-CGAGGATGAGGATGGAGATGAC-3'）、リバースプライマー（配列番号７：5'-CCTCAGCGGCGGCTAC-3'）、ＴａｑＭａｎプローブ（Ｃアレル用：5'-Vic-CACTCACGTGGTGGTG-MGB-3'：配列番号８、Ｔアレル用：5'-Fam-CACTCACATGGTGGTG-MGB-3'：配列番号９）。
【００２８】
baPMVの値を目的変数とすると、プロモーターの遺伝子型がCCの場合は被験者数：125、平均baPWV：1671cm/s、CT+TT型の場合は被験者数；31, 平均baPWV：1518cm/sであり、両集団間のｔ検定で p＝0.0067となり CC型が有意に高値であった。exon10の多型では有意差を認めなかった。以上の結果より、配列番号１の第２８４番目に相当する塩基の種類がＣＴ型またはＴＴ型の場合に、ＣＣ型の場合より動脈硬化に対する罹患性が高いことが判明した。
【００２９】
なお、本発明において開示した塩基配列についてまとめると以下のようになる。配列番号１：ＬＭＮＡ遺伝子のプロモーター部位；配列番号２：プロモーター部位のフォワードプライマー；配列番号３：プロモーター部位のリバースプライマー；配列番号４：プロモーター部位のＴａｑＭａｎプローブ：Ｃアレル用；配列番号５：プロモーター部位のＴａｑＭａｎプローブ：Ｔアレル用；配列番号６：ｅｘｏｎ１０部位のフォワードプライマー；配列番号７：ｅｘｏｎ１０部位の部位のリバースプライマー；配列番号８：ｅｘｏｎ部位のＴａｑＭａｎプローブ：Ｃアレル用；配列番号９：ｅｘｏｎ部位のＴａｑＭａｎプローブ：Ｔアレル用
配列番号１０：ＬＭＮＡ遺伝子のフォワードプライマー；配列番号１１：ＬＭＮＡ遺伝子のリバースプライマー。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
上記のように、本発明によりＬＭＮＡ遺伝子のプロモーター領域上に存在する配列番号１の第２８４番目の位置の多型が動脈硬化と関連していることが明らかにされた。この遺伝子多型を遺伝子診断技術として応用することにより、動脈硬化の進展リスクを予測することができる。一般に、動脈硬化のような多因子性の疾患のリスク予測は難しいとされている。したがって、その遺伝的な素因を予測できることの意義は大きい。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ヒトＬＭＮＡ遺伝子のプロモーター領域上に存在するSNPの位置を示した模式図である。
【図２】TaqManPCRによるSNPタイピングの原理を示した図である。
【図１】
2006314259.tif 000002
【図２】
2006314259.tif 000003
【配列表】
2006314259000001.app