(57)【要約】      （修正有）【課題】  真珠の品質を決める真珠ナノ構造の形成に直接関わる蛋白質、遺伝子、プラスミド、組替えベクター、形質転換体、プライマー、効率よく生産するマベガイを作出するためのマベガイの選別方法を提供する。【解決手段】  良質真珠を産するマベガイの外套膜に特異的に発現するマベガイ真珠の品質に関わる蛋白質であり、蛋白質が、マベガイ由来の特定なアミノ酸配列を含む。または、上記のＮ端側アミノ酸配列をコードする蛋白質を含む。マベガイの外套膜より得ることができる蛋白質の分子量は、１６．６ｋＤａ，１８．４ｋＤａ，２６．１ｋＤａ，２６．２ｋＤａ，３３．４ｋＤａの何れかである。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
良質真珠を産するマベガイの外套膜に特異的に発現することを特徴とする、マベガイ真珠の品質に関わる蛋白質。
【請求項２】
前記蛋白質が、配列番号２〜５の何れかに記載のＮ端側アミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のマベガイ真珠の品質に関わる蛋白質。
【請求項３】
前記配列番号２〜５の何れかに記載のＮ端側アミノ酸配列をコードする蛋白質を含むことを特徴とする、請求項２に記載のマベガイ真珠の品質に関わる蛋白質。
【請求項４】
前記配列番号２〜５の何れかに記載のＮ端側アミノ酸配列を含む蛋白質又はその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡでコードされることを特徴とする、請求項２に記載のマベガイ真珠の品質に関わる蛋白質。
【請求項５】
前記配列番号２〜５の何れかに記載のＮ端側アミノ酸配列を含む蛋白質のアミノ酸配列の一部が欠出、置換及び／又は挿入してなることを特徴とする、請求項２に記載のマベガイ真珠の品質に関わる蛋白質。
【請求項６】
マベガイの外套膜より得ることができ、分子量が、１６．６ｋＤａ，１８．４ｋＤａ，２６．１ｋＤａ，２６．２ｋＤａ，３３．４ｋＤａの何れかであり、良質真珠を産するマベガイの外套膜に特異的に発現することを特徴とする、マベガイ真珠の品質に関わる蛋白質。
【請求項７】
良質真珠を産するマベガイの外套膜に特異的に発現することを特徴とする、マベガイ真珠の品質に関わる遺伝子。
【請求項８】
前記遺伝子が、配列番号６に記載の塩基配列、又は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項７に記載のマベガイ真珠の品質に関わる遺伝子。
【請求項９】
前記配列番号６に記載の塩基配列又は配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、請求項７に記載のマベガイ真珠の品質に関わる遺伝子。
【請求項１０】
前記配列番号６に記載の塩基配列又は配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする蛋白質をコードすることを特徴とする、請求項７に記載のマベガイ真珠の品質に関わる遺伝子。
【請求項１１】
前記配列番号６に記載の塩基配列又は配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質のアミノ酸配列の一部が欠出、置換及び／又は挿入してなることを特徴とする、請求項７に記載のマベガイ真珠の品質に関わる遺伝子。
【請求項１２】
請求項７〜１１の何れかに記載の遺伝子を含有することを特徴とする、プラスミド。
【請求項１３】
請求項７〜１１の何れかに記載の遺伝子を含有することを特徴とする、組替えベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組替えベクターを含むことを特徴とする、形質転換体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の形質転換体を培養する工程が含まれることを特徴とする、蛋白質の製造方法。
【請求項１６】
配列番号８又は９に記載のプライマーを含むことを特徴とする、マベガイ真珠の品質に関わるプライマー。
【請求項１７】
配列番号７〜９の何れかに記載のプライマーを用いた逆転写法により、マベガイの遺伝子発現を測定し、良質の真珠を産するマベガイを判定することを特徴とする、マベガイの選別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マベガイの良質真珠層形成に有用な蛋白質及び遺伝子の配列構造に係り、蛋白質、遺伝子、プラスミド、組替えベクター、形質転換体、プライマー及びマベガイの選別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨や歯はリン酸カルシウムによるバイオミネラルであるのに対し、貝殻は炭酸カルシウムのバイオミネラルである。真珠は、二枚貝の貝殻内に入り込んだ異物を、貝が貝殻と同質のバイオミネラルで被覆することによりでき上がったものである。その中でも、真珠貝の作る真珠は、貝殻の真珠層と同質の真珠層で形成被覆されており、真珠層真珠と呼ばれている。この真珠は、日本ではアコヤガイやマベガイの養殖により生産されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
図１０は、真珠の二枚貝の貝殻の断面を模式的に示す図である。
真珠を形成する二枚貝の貝殻は通常、外殻の稜柱層と中殻及び内殻の真珠層の二層からなるが、稜柱層はカルサイトの多結晶構造であり、真珠層はアラゴナイトの多結晶構造である。真珠層真珠は、真珠層が真珠の中心に対して同心円状に形成されており、アラゴナイト結晶はｃ軸を真珠の中心から表面に向けて放射状に並んでいる。
【０００４】
しかも、真珠貝のアラゴナイト結晶は、可視光線の波長範囲（４００〜７００ｎｍ）の厚さの板状であり、そのため真珠層真珠は装飾品として珍重される美しい真珠光沢を持つと考えられている。また貝殻の真珠層も同様に、美しい真珠光沢を持っている。
【０００５】
真珠層では、プレート状のアラゴナイト結晶がブロックを積み重ねたような構造になっており、各結晶はコンキオリンという複合蛋白質によって結合している。真珠の光沢が発生するメカニズムは次のように考えられている。真珠層に入射してきた光ｉは、真珠の表面及び結晶層の境にある層間基質のコンキオリン層で反射光を出しながら真珠層を透過するため、反射光どうしの干渉が起こる。そこで屈折角をθ、結晶層の厚さをｄ、結晶層での屈折率をμとすると、その光路差は、２ｄμｃｏｓθである。したがって、白色光を入射した場合、光の波長をλとすると、２ｄμｃｏｓθ＝ｎλ（ｎ＝１、２、・・・)に相当する光は強められ、２ｄμｃｏｓθ＝（２ｎ＋１）λ／２ｎ＝１、２、・・・) に相当する光は弱められる。この関係は薄膜による回折格子の理論と同じで、層が多ければかなり鮮やかな虹色を呈するはずである。
以上のことから、真珠の美しい光沢を発生させる一つの条件として、結晶層の厚さ、すなわち、アラゴナイト結晶の厚さが可視光の波長領域（およそ４００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲）であることが挙げられる。
【０００６】
今までに、アコヤガイのアラゴナイト結晶の厚さは３５０〜５００ｎｍ、クロチョウガイは５００〜８００ｎｍ、マベガイは３００〜６００ｎｍと報告されている。
しかし、たとえばサザエの結晶層の厚さも、およそ４００ｎｍ〜６００ｎｍと報告されており、結晶層の厚さは真珠光沢を与える必要十分条件ではない。また結晶層の厚さは、同じ貝殻の内部でも季節など貝の生息環境の変化によって一定ではない。この結晶層厚さの不均一さも、真珠層の光沢を損なう一つの原因となっている。
【０００７】
従来、良質の真珠を選別するあるいは生産する手法としては、品質のよい真珠を産する母貝を遺伝的にかけ合わせることにより選抜しているが、必ずしも良い真珠を産するとは
限らない。養殖真珠などは、長年にわたって厳選された優れた種の貝だけを、ほぼ同一の環境の中で育て真珠を生成させているわけだから、極めて歩留まりよく真珠が得られても良さそうなものである。また、稚貝から真珠となるまでに６年もの年月が掛かる。このことは、真珠の光沢が単にアラゴナイト結晶による結晶層の厚さだけではなく、他の因子にも影響を受けていることを意味する。
【０００８】
【非特許文献１】和田  浩爾  著、「真珠の科学」第１版、株式会社真珠出版社発行、１９９３年３月２０日
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、実際には、商品価値のある真珠は浜揚げの時点で全体の１０％程度しかない。マべ真珠は、加工処理真珠を合わせても全体の４０〜５０％程度しか商品価値が得られないという課題がある。
したがって、品質のよい真珠を産する母貝をどのようにして判定するかが重要であるが、未だにその良好な方法が得られていないという課題がある。
【００１０】
上記課題に鑑み、本発明は、真珠の品質を決める真珠ナノ構造の形成に直接関わる蛋白質、遺伝子、プラスミド、組替えベクター、形質転換体、プライマー、効率よく生産するマベガイを作出するためのマベガイの選別方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、マベガイの真珠層のナノ構造の形成に、直接関わる蛋白質、遺伝子について鋭意研究を行い、良質の真珠を産するマベガイ個体の外套膜分泌液由来の蛋白質成分について品質の劣る真珠を産するマベガイ個体との間で異なるものをクロマトグラフィー及び電気泳動法により明らかにし、その蛋白質を単離精製し、部分一次構造を明らかにした。さらに、これらの遺伝子のクローニング及び部分塩基配列の解析を行ない、良質の真珠を産するマベガイに特異的に発現する蛋白質の構造から特異的プライマーを設計した。このプライマーを用いれば、逆転写法により、マベガイの遺伝子発現を測定し、良質の真珠を産するマベガイを判定できるとの知見を得て、本発明に至ったものである。
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明のマベガイ真珠の品質に関わる蛋白質は、良質真珠を産するマベガイの外套膜に特異的に発現することを特徴とする。
上記構成において、好ましくは、蛋白質は、配列番号２〜５の何れかに記載のＮ端側アミノ酸配列を含む。
また、好ましくは、配列番号２〜５の何れかに記載のＮ端側アミノ酸配列をコードする蛋白質を含む。
好ましくは、配列番号２〜５の何れかに記載のＮ端側アミノ酸配列を含む蛋白質又はその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡでコードされる。
または、配列番号２〜５の何れかに記載のＮ端側アミノ酸配列を含む蛋白質のアミノ酸配列の一部が欠出、置換及び／又は挿入してなっていてもよい。
【００１３】
本発明のマベガイ真珠の品質に関わる蛋白質は、マベガイの外套膜より得ることができ、分子量が、１６．６ｋＤａ，１８．４ｋＤａ，２６．１ｋＤａ，２６．２ｋＤａ，３３．４ｋＤａの何れかであり、良質真珠を産するマベガイの外套膜に特異的に発現することを特徴とする。
【００１４】
本発明のマベガイ真珠の品質に関わる遺伝子は、良質真珠を産するマベガイの外套膜に特異的に発現することを特徴とする。
上記遺伝子は、好ましくは、配列番号６に記載の塩基配列又は配列番号７に記載のアミ
ノ酸配列を含む。
好ましくは、配列番号６に記載の塩基配列又は配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードする。
好ましくは、配列番号６に記載の塩基配列又は配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする蛋白質をコードする。
また、好ましくは、配列番号６に記載の塩基配列又は配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質のアミノ酸配列の一部が欠出、置換及び／又は挿入してなる。
【００１５】
本発明のプラスミドは、上記に記載の何れかの遺伝子を含有することを特徴とする。
【００１６】
本発明の組替えベクターは、上記に記載の何れかの遺伝子を含有することを特徴としている。
【００１７】
本発明の形質転換体は、上記組替えベクターを含有することを特徴とする。
【００１８】
本発明の蛋白質の製造方法は、上記形質転換体を培養する工程が含まれることを特徴とする。
【００１９】
本発明のマベガイ真珠の品質に関わるプライマーは、配列番号８又は９に記載のプライマーを含むことを特徴とする。
【００２０】
本発明のマベガイの選別方法は、配列番号７〜９の何れかに記載のプライマーを用いた逆転写法により、マベガイの遺伝子発現を測定し、良質の真珠を産するマベガイを判定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、良質のマベガイに特異的に発現している蛋白質成分を明らかにしたので、良質の真珠を生産するマベガイを選別し、効率よく生産するマベガイを作出するための方法を開発できるという効果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
最初に、本発明の良質真珠を産するマベガイの貝殻の真珠層について説明する。
図１（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ、良質マベガイ真珠及び品質の劣るマベガイ真珠の外観を比較する光学写真像を示す図である。この良質な真珠が得られるマベガイでは、真珠層の光沢も良好である。なお、これらのマベガイは、田崎真珠（株）の奄美大島養殖場で６年間の養殖後に採取したものである。
【００２３】
次に、良質マベガイ真珠が得られた貝殻のアラゴナイト結晶の配向性をＸ線回折装置を用いて測定した結果について説明する。
図２は、Ｘ線回折装置の光学系を示す模式図である。Ｘ線回折装置１は、Ｘ線源２と、貝殻試料３を載置するステージ４と、Ｘ線検出器５と、目視用の光学顕微鏡６と、から構成されている。
さらに、Ｘ線回折装置１（Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ社製、Ｄ８ＤＩＳＣＯＶＥＲ）は、Ｘ線源２のほかには、グラファイトモノクロメーター７と直径０．１ｍｍの全反射キヤピラリーコリメーター８を有している。Ｘ線は４０ｋＶ、４０ｍＡで発生させたＣｕＫα線を用いた。また、Ｘ線検出器５としては２次元検出器（Ｈｉ−ＳＴＡＲ)を使用した。真珠層のアラゴナイト結晶の配向は、（１１１）面と（００２）面の回折を利用し、Ｂｒａｇｇ角が１５．５６°で測定した。
【００２４】
アラゴナイト結晶板の大きさは、おおよそ５μｍ以下である。この場合、直径０．１ｍｍのコリメータを用いたことにより、入射Ｘ線のビーム径は入射方向に沿って少なくとも約０．３７３ｍｍへ伸長する。このため、貝殻試料３表面の照射領域は楕円形となり、その面積は約０．１１７ｍｍ2である。したがって、照射領域内には少なくとも５×１０5 個ほどのアラゴナイト結晶が存在することになる。
【００２５】
図３（ａ），（ｃ）は、それぞれ、良質及び不良真珠層中のアラゴナイト結晶の（００２）面極点図であり、（ｂ），（ｄ）はそれらの（１１１）面極点図を示す図であり、（ｅ）は、アラゴナイト結晶の（００１）面標準投影図である。極点図の中心方向は真珠層側貝殻表面の法線方向とほぼ一致させている。
図３（ａ）及び（ｃ）で示すように、ｃ軸に垂直な面である（００２）面は、上述のように、貝殻表面の法線方向に対して強く配向していることがわかる。これについては良質、不良の間に明瞭な差異は見られない。
しかしながら、（１１１）面の分布を見てみると（図３（ｂ）、（ｄ））、良質真珠層では、ほぼ対称位置に６つの極が見られるのに対して、不良真珠層では明瞭な極は見られず、同心円で帯状の回折となった。
これにより、良質真珠層では、アラゴナイト結晶はｃ軸に加えて、ａ，ｂ軸も強く配向しているのに対し、不良真珠層ではａ，ｂ軸はｃ軸回りに分散していることが分かった。この傾向は、貝殻の広い領域で、また複数のマベガイ個体で確認した。以上のことから、美しい真珠光沢を持つ良質真珠層では、ａ，ｂ，ｃ軸の３軸配向性が強まっていることが明らかとなった。結晶層の厚さに加えて、このアラゴナイト結晶の強い配向性、もしくはこの配向性を与える原因となる層間基質が、反射光の干渉に影響を及ぼしているものと推定される。
【実施例１】
【００２６】
以下に、実施例をあげて本発明を詳しく説明する。
実施例１として、良質の真珠を産するマベガイの外套膜分泌液から蛋白質成分を精製した。
最初に、良質の真珠を産するマベガイの外套膜分泌液を集め（各個体から約５０ｃｍ3 ）、蒸留水に対し透析、凍結乾燥した。
次に、凍結乾燥したサンプル５０ｍｇを５０ｃｍ3 の蒸留水に溶解し、５０００Ｇで１０分間遠心分離し、不溶性成分を除去して蛋白質成分の上清を得た。
【００２７】
（比較例１）
比較例１として、品質の劣るマベガイを用いた以外は、実施例１と同様にして、蛋白質成分を精製した。
【００２８】
次に、実施例１及び比較例１の上清をＰｏｒｏｓ−ＨＳカラム（４．５ｍｍ×１００ｍｍ）（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた強陽イオン交換クロマトグラフィー（ＰＯＲＯＳ−ＨＳ  ｃｏｌｕｍｎ）に注ぎ、１０ｍＭ（１０-3モル）カチオン緩衝液（ＭＥＳ−ＨＥＰＥＳバッファー）中において、塩化ナトリウム濃度を０Ｍから１Ｍまでの直線勾配に変化させて溶出した。
【００２９】
図４及び図５は、それぞれ、実施例１の良質マベガイ及び比較例１の品質の劣るマベガイの外套膜分泌液蛋白質の強陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたｐＨスカウティングによる分析結果を示す図である。各図（ａ）〜（ｆ）は、それぞれ、ｐＨが５．０から７．５に対応している。図において横軸は時間を示し、左縦軸は強陽イオン交換クロマトグラム（任意強度）を、右縦軸は伝導度（ｍＳ）を示している。
ｐＨ５．０から７．５までのｐＨスカウティングにより分離条件を検討したところ、図４及び図５から明らかように、ｐＨ＝６．５において最もよい分離を示した。
【００３０】
図６は、実施例１の良質マベガイ及び比較例１の品質の劣るマベガイにおける外套膜分泌液蛋白質のｐＨ６．５での強陽イオン交換クロマトグラムの比較を示す図である。図において横軸は時間を示し、左縦軸は強陽イオン交換クロマトグラム（任意強度）を、右縦軸は伝導度（ｍＳ）を示している。
図６から明らかなように、ｐＨ６．５の条件において、良質の真珠を産するマベガイ及び品質の劣る真珠を産するマベガイの外套膜分泌液サンプルからの溶出により、ＨＳ−ＡからＨＳ−Ｆで示す大きく６つに分画したピークが観測された。これらの分画分のうち、ＨＳ−Ｃ及びＨＳ−Ｄに差異がみられた。
特に、ＨＳ−Ｄに関しては、対応するピークが比較例１の品質の劣る真珠を産するマベガイ個体には観測されず、実施例１の良質のマベガイに特異的な蛋白質であると考えられる。
【実施例２】
【００３１】
次に、実施例１で抽出した蛋白質ＨＳ−ＡからＨＳ−Ｆの各ピークに含まれる蛋白質成分をＳＤＳ電気泳動法により分析した。
図７は、実施例１の良質マベガイ及び比較例１の外套膜分泌液蛋白質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による質量分析結果を示す図であり、それぞれ、（ａ）が実施例１の非還元条件、（ｂ）が実施例１の還元条件、（ｃ）が比較例１の非還元条件、（ｄ）が比較例１の還元条件の場合を示している。
図７において、縦軸は分子量（ｋＤａ）を示し、横軸の各列は、その上部に示すように、それぞれ、Ｍが分子量マーカー蛋白質を、１がＨＳ−Ａを、２がＨＳ−Ｂを、３がＨＳ−Ｃを、４がＨＳ−Ｄを、５がＨＳ−Ｅを、６がＨＳ−Ｆを、７がＨＳ−Ｄ1を、８がＨＳ−Ｄ２及び３を示している。
図７から明らかなように、各列において質量が異なっていることが分かる。そして、ＨＳ−Ｃ及びＨＳ−Ｄ以外の蛋白質では、さらに、ＨＳ−Ｅにおいて、良質マベガイと品質の劣るマベガイとの間で、分子量１８．４ｋＤａ及び２６．２ｋＤａに相当する蛋白質の量に差違が認められた。したがって、分子量１８．４ｋＤａ及び２６．２ｋＤａに対応する蛋白質は、良質マベガイに特異的な蛋白質であると推定できる。
【００３２】
次に、実施例１で抽出した蛋白質に含まれているＨＳ−ＡからＨＳ−Ｆの各蛋白質成分をさらに詳しく調べるために、逆相液体高速クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）及び飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて解析した。
逆相ＨＰＬＣにおいては、カラムとしてＲｅｓｏｕｒｃｅ  ＲＰＣ（５ｃｍ3 ）を用い、６ｍＭのＨＣｌ（Ａ）及び８０％ＴＦＡ６ｍＭ（Ｂ）からなる溶離液を用い、０％から７０％の直線濃度勾配により分離した。
図８（ａ）〜（ｆ）は、それぞれ、実施例の良質マベガイの外套膜分泌液蛋白質成分のＨＳ−ＡからＨＳ−Ｆの逆相ＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。図の横軸は時間（分）を示し、左縦軸は図の実線データである信号強度（任意強度）を、右縦軸は図の点線データである伝導度（ｍＳ）を示している。
図８から明らかなように、逆相ＨＰＬＣにより実施例１で抽出した蛋白質が分画されていることが分かる。
【００３３】
次に、逆相ＨＰＬＣで分画した各画分を飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて解析した。その結果、実施例１の良質のマベガイにおいては、蛋白質に含まれているＨＳ−ＡからＨＳ−Ｆの分子量は、以下のように求めることができた。
表１は、ＨＳ−ＡからＨＳ−Ｆの蛋白質に関する分子量を示す表である。表には、後述するＮ端末アミノ酸配列も示している。
表１から明らかなように、ＨＳ−Ａは分子量１５．７ｋＤａサブユニットの２量体（３１．４ｋＤａ）の単一蛋白質であることが分かった。ＨＳ−Ｂは、１５．８ｋＤａ及び１
６．５ｋＤａのヘテロ２量体（３３ｋＤａ）の蛋白質であることが分かった。
ＨＳ−Ｃは２６．１1 ｋＤａの蛋白質であることが分かった。
ＨＳ−Ｄは、１６．６ｋＤａの蛋白質（ＨＳ−Ｄ1 ）と、１６．７ｋＤａサブユニットの２量体（３３．４ｋＤａ）の蛋白質（ＨＳ−Ｄ２）、及び２６．１ｋＤａの蛋白質（ＨＳ−Ｄ３）からなることが分かった。
ＨＳ−Ｅは３３．２ｋＤａ、２６．２ｋＤａ、１８．４ｋＤａ及び１６．５ｋＤａの蛋白質であることが分かった。
ＨＳ−Ｆは主に１８．４ｋＤａの蛋白質であることが判明した。
【表１】
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【実施例３】
【００３４】
次に、実施例３として、良質真珠マベガイの外套膜分泌液に特異的な蛋白質群のアミノ酸配列の解析を行なった。
最初に、実施例１で精製した良質真珠マベガイの外套膜分泌液蛋白質を還元し、カルボキシアミドメチル化により遊離システインを修飾した。
次に、逆相ＨＰＬＣにより分離したサブユニットを、島津製作所製プロテインシーケンサー（島津製作所製、ＰＰＳＱ−１０）で分析して、各蛋白質のＮ端側アミノ酸配列を決定した。このようにして得たＨＳ−Ａ，ＨＳ−Ｃ，ＨＳ−Ｄ１、ＨＳ−Ｄ２，ＨＳ−Ｄ３のＮ端側アミノ酸配列を、配列番号１〜５に示す。
【００３５】
ＨＳ−Ｄ２については、還元した後に、カルボキシアミドメチル化により遊離システインを修飾した後、クロストリパイン（ベーリンガー社製）で酵素消化後、クロマトカラム（東ソー社製、ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ  １２０Ｔ）による逆相液体ＨＰＬＣでペプチド断片を分離して、濃縮した後、プロテインシーケンサー（島津製作所製、ＰＰＳＱ−１０）により各ペプチド断片のアミノ酸配列を決定した。
【実施例４】
【００３６】
次に、実施例３の良質真珠マベガイの外套膜分泌液に特異的な蛋白質群のアミノ酸をコードしている塩基配列を含有する遺伝子を調べた。
最初に、ｐｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡの調製について説明する。
良質真珠マベガイの外套膜組織１ｇから、ＡＧＰＣ法（Ａｃｉｄ  Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ
Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法により全ＲＮＡを抽出した。
次に、イソプロパノールで沈殿後、７５％エタノールで洗浄し、遠心分離により上清を除去して、沈殿をすばやく乾燥させた後、１ｃｍ3 の０．１％ＳＤＳを含むＲｎａｓｅフリーの滅菌水に溶解し、全ＲＮＡ標品とした。
これにより、６００μｇの全ＲＮＡを得た。
【００３７】
得られた全ＲＮＡ標品から、Ｍｉｃｒｏ−ＦａｓＴｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡを調製し、１μｇのｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを得た。
【００３８】
次に、上記で得たｐｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡ増幅キット（クローンテック製、ＭａｒａｔｈｏｎTM）を利用して、実施例３の良質真珠マベガイの外套膜のｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【実施例５】
【００３９】
次に、ｃＤＮＡのクローニング及び全ｃＤＮＡの塩基配列について説明する。
実施例１で得たマベガイ外套膜分泌蛋白質ＨＳ−Ｄ２の部分アミノ酸配列を参考にして、特異的縮重オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、実施例３で作成したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりレクチンをコードするｃＤＮＡ断片を増幅して、ｃＤＮＡクローニングを得た。
【実施例６】
【００４０】
実施例５で得たｃＤＮＡクローニングを、ＰＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へサブクローニングし、これを大腸菌Ｔｏｐ１０株に導入し、形質転換株を得た。
【実施例７】
【００４１】
次に、実施例６で得た形質転換体を、５０μｍｏｌのアニピリンを含む２ＸＹＴ液体培地５ｃｍ3 に植菌した後、３７℃で一晩培養した後、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを精製した。
【実施例８】
【００４２】
実施例８として、実施例６で得たプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定した。
塩基配列の決定のための反応は、ダイターミネーターＤＮＡ塩基配列決定試薬キット（ＡＢＩ社製）を用いて、ＡＢＩ社指定のマニュアルに従って行った。プライマーは、ＳＰ６プライマーとＴ７プライマーを用いた。
【００４３】
塩基の配列は、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社製、３７７Ａ）を用いて決定した。決定した部分塩基配列をもとにプライマーを合成し、ｃＤＮＡライブラリーの５' 及び３'末端に付加しているアダプター配列に特異的なプライマーを用いて、５' ＲＡＣＥ法及び３' ＲＡＣＥ法によりＨＳ−Ｄ２の全塩基配列を決定した。
【００４４】
ＨＳ−Ｄ２の全塩基配列は、蛋白質からの部分アミノ酸配列と一致した。このように決定された塩基配列を配列番号６に示す。それにより明らかにされたアミノ酸配列を配列番号７に示す。
全アミノ酸配列が明らかとなったＨＳ−Ｄ２は、その他にＨＳ−Ｄ１及び良質真珠マベガイと品質の劣るマベガイで共通にみられたＨＳ−Ａ蛋白質とも相同性を有していた。
この他、良質マベガイに特異的に含まれていた蛋白質ＨＳ−Ｃ及びＨＳ−Ｄ３は、いずれも約２６ｋＤａの蛋白質でＮ末端側アミノ酸配列において有意な相同性を示した。
【実施例９】
【００４５】
次に、マベガイの遺伝子発現について説明する。
良質マベガイに特異的に含まれていた蛋白質のＮ末端側アミノ酸配列に基づくプライマーを設計し、ＰＣＲ法により良質真珠を産するマベガイ個体及び品質の劣る真珠を産するマベガイにおいて、遺伝子の発現を比較した。
プライマーとしては、ＨＳ−Ａ、ＨＳ−Ｄ１及びＨＳ−Ｄ２に対応する約１６ｋＤａ及び３３ｋＤａ蛋白質の配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号７）と、ＨＳ−Ｃ及びＨＳ−Ｄ３に対応する約２６ｋＤａの蛋白質の配列に基づくプライマー（配列番号８）とアダプター配列プライマー（配列番号９）を用いた。
【００４６】
図９は、ＰＣＲ法によるマベガイ外套膜蛋白質の発現解析の結果を示す図であり、それぞれ、（ａ）が配列番号７のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた場合を示し、（ｂ）が配列番号８のプライマーを用いた場合を示している。図において、ｍａｂｅ＃２及びｍａｂｅ＃３が良質真珠を産するマベガイであり、ｍａｂｅ＃４が品質の劣る真珠を産するマベガイである。
図９（ａ）から明らかなように、マベガイ個体外套膜ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行なったところ、約１６ｋＤａ（図９（ａ）の矢印（←）参照）及び３３ｋＤａ蛋白質においては、良質真珠を産するマベガイ及び品質の劣る真珠の場合で遺伝子の発現に差はないことが分かった。
一方、図９（ｂ）から明らかなように、マベガイ個体外套膜ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行った結果は、ＨＳ−Ｃ及びＨＳ−Ｄ３に対応する２６ｋＤａ蛋白質で良質マベガイに特異的に増幅がみられた（図９（ｂ）の矢印（←）参照）。また、配列番号９のアダプター配列プライマーを用いたＰＣＲにおいても、配列番号８のプライマーと同様な結果を得た。
これにより、良質マベガイに特異的に含まれていた蛋白質のＮ末端側アミノ酸配列に基づくプライマー（配列番号８及び９）を用いると、マベガイの真珠の品質を判別することができた。
【００４７】
上記実施例から、本発明の良質真珠を産するマベガイの外套膜に特異的に発現する蛋白質は、配列番号２〜５の何れかに記載のＮ端側アミノ酸配列を含むことが判明した。また、この蛋白質は、上記Ｎ端側アミノ酸配列をコードする蛋白質でもよい。また、この蛋白質は、配列番号２〜５の何れかに記載のＮ端側アミノ酸配列を含む蛋白質又はその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡでコードされていてもよい。さらに、この蛋白質は、配列番号２〜５の何れかに記載のＮ端側アミノ酸配列を含む蛋白質のアミノ酸配列の一部が欠出、置換及び／又は挿入してもよい。
【００４８】
さらに、上記実施例から、本発明の良質真珠を産するマベガイの外套膜に特異的に発現する蛋白質は、マベガイの外套膜より得ることができ、分子量が、１６．６ｋＤａ，１８．４ｋＤａ，２６．１ｋＤａ，２６．２ｋＤａ，３３．４ｋＤａの何れかであることが判明した。
また、良質真珠を産するマベガイの外套膜に特異的に発現する遺伝子は、配列番号６に記載の塩基配列又は配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むことが判明した。この遺伝子は、配列番号６に記載の塩基配列又は配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードする。また、この遺伝子は、配列番号６に記載の塩基配列又は配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする蛋白質を
コードしてもよい。さらに、この遺伝子は、配列番号６に記載の塩基配列又は配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質のアミノ酸配列の一部が欠出、置換及び／又は挿入してもよい。
【００４９】
また、上記実施例から、プラスミド又は組替えベクターは、良質真珠を産するマベガイの外套膜に特異的に発現する遺伝子を含有させて形成することができることが分かった。また、上記実施例から、形質転換体を形成できた。この形質転換体を培養する工程が含まれる製造方法により、良質真珠を産するマベガイの蛋白質を製造することができた。
【００５０】
また、上記実施例から、配列番号８又は９に記載のプライマーを、マベガイ真珠の品質に関わるプライマーとして使用することができることが分かった。さらに、配列番号７〜９の何れかに記載のプライマーを用いた逆転写法により、マベガイの遺伝子発現を測定し、良質の真珠を産するマベガイを判定できることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ、良質マベガイ真珠及び品質の劣るマベガイ真珠の外観を比較する光学写真像を示す図である。
【図２】Ｘ線回折装置の光学系を示す模式図である。
【図３】（ａ），（ｃ）は、それぞれ、良質及び不良真珠層中のアラゴナイト結晶の（００２）面極点図であり、（ｂ），（ｄ）はそれらの（１１１）面極点図を示す図であり、（ｅ）は、アラゴナイト結晶の（００１）面標準投影図である。
【図４】実施例１の良質マベガイの外套膜分泌液蛋白質の強陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたｐＨスカウティングによる分析結果を示す図である。
【図５】比較例１の品質の劣るマベガイの外套膜分泌液蛋白質の強陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたｐＨスカウティングによる分析結果を示す図である。
【図６】実施例１による良質マベガイ及び比較例１による品質の劣るマベガイにおける外套膜分泌液蛋白質のｐＨ６．５での強陽イオン交換クロマトグラムの比較を示す図である。
【図７】実施例１の良質マベガイ及び比較例１の外套膜分泌液蛋白質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による質量分析結果を示す図であり、それぞれ、（ａ）が実施例１の非還元条件、（ｂ）が実施例１の還元条件、（ｃ）が比較例１の非還元条件、（ｄ）が比較例１の還元条件の場合を示している。
【図８】（ａ）〜（ｆ）は、それぞれ、実施例の良質マベガイの外套膜分泌液蛋白質成分のＨＳ−ＡからＨＳ−Ｆの逆相ＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図９】ＰＣＲ法によるマベガイ外套膜蛋白質の発現解析の結果を示す図であり、それぞれ、（ａ）が配列番号７のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた場合を示し、（ｂ）が配列番号８及び９のプライマーを用いた場合を示している。
【図１０】二枚貝の貝殻の断面を模式的に示す図である。
【符号の説明】
【００５２】
１：Ｘ線回折装置
２：Ｘ線源
３：貝殻試料
４：ステージ
５：Ｘ線検出器
６：光学顕微鏡
７：グラファイトモノクロメーター
８：全反射キヤピラリーコリメーター
【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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