(57)【要約】【課題】  本発明は、ｐ５３のDNA結合能を活性化させる物質を提供することにより、抗癌剤として有用な化合物の提供を目的とする。【解決手段】式【化１】2006008533.tif 000048[式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ同一あるいは相異なって水素原子、炭素原子数１〜６個のアルキル基などを示し、nは１〜５の整数を示し、ｍは１又は２を示し、Ａは置換アルキレン基、置換シクロアルキレン基、ナフタレンジイル基、置換キサンテンジイル基、置換トリアゾリレン基などで示される基を示す]で表される化合物又はその医薬上許容される塩。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2006008533.tif 000041
[式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素原子、炭素原子数１〜６個のアルキル基を示すか、又はそれらが結合している窒素原子と一緒になって飽和複素環を形成し、
nは１〜５の整数を示し、ｍは１又は２を示し、
Ａは置換アルキレン基、置換シクロアルキレン基、ナフタレンジイル基、置換キサンテンジイル基、置換トリアゾリレン基、
式
【化２】
2006008533.tif 000042
（式中、Ｅは単結合、アルキレン基、アルケニレン基、式−ＣＨ2Ｏ−、または式−ＣＨ2Ｓ(ＣＨ2)2Ｏ−を示し、Ｇは単結合、アルキレン基、アルケニレン基、式−ＯＣＨ2−、または式−Ｏ(ＣＨ2)2ＳＣＨ2−を示し、Ｒ3,Ｒ4, Ｒ5およびＲ6は同一あるいは相異なって水素原子、ハロゲン原子、炭素原子数１〜６個のアルキル基、炭素原子数１〜１８個のアルコキシ基、ニトロ基、トリフルオロメチル基またはトリフルオロメトキシ基を示す）で示される基、
式
【化３】
2006008533.tif 000043
（式中、Ｊは単結合、アルキレン基、式−ＣＨ2Ｏ−、または式−ＣＨ2ＳＣＨ2−を示し、Ｌは単結合、アルキレン基、置換アルキレン基、アルケニレン基、式−Ｏ−、式−ＣＯ−、式−Ｓ−Ｓ−、式−ＳＯ2−、式−Ｏ(ＣＨ2)pＯ−（式中、ｐは１〜１０の整数を示す）、または式−ＮＨＣＯ−(ＣＨ2)q−ＣＯＮＨ−（式中、ｑは１〜５の整数を示す）を示し、Ｍは単結合、式−ＯＣＨ2−、または式−ＣＨ2ＳＣＨ2−を示し、Ｒ7,Ｒ8,Ｒ9,Ｒ10,Ｒ11,Ｒ12,Ｒ13およびＲ14は同一あるいは相異なって水素原子、ハロゲン原子を示す）で示される基、
式
【化４】
2006008533.tif 000044
で示される基、
式
【化５】
2006008533.tif 000045
で示される基、
式
【化６】
2006008533.tif 000046
で示される基、
または式
【化７】
2006008533.tif 000047
で示される基を示す]で表される化合物又はその医薬上許容される塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ結合タンパク質であるｐ５３のＤＮＡ結合能を活性化させる化合物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
p53は転写活性化因子として機能するDNA結合タンパク質であり、細胞周期停止やアポトーシス誘導に関わるタンパク質の転写・発現を司り、癌細胞を排除する作用を有している（非特許文献１〜４）。p53は癌遺伝子活性化、紫外線あるいは放射線によりDNAに障害が生ずると活性化され、各々の刺激に対応した様々な分子の関与によって癌抑制作用を発揮することが知られている（非特許文献５〜７）。多くの癌ではp53自身及びp53の活性化に関わる遺伝子群の変異が起こっており、p53の活性化に障害を与えていることが報告されている（非特許文献８〜１０）。このようにp53自身の変異あるいはp53活性化経路の異常はp53の活性化を抑制し、細胞を癌化に導く一つの機序であると考えられる（非特許文献１１）。
【０００３】
従って、癌細胞において不活性化したp53を薬剤により活性化し、正常な機能を回復させることは、癌細胞に細胞死を誘導するといった新規な機序を有する癌の治療剤として有用であると考えられる。
【０００４】
【非特許文献１】Koら, Genes & Development. 10, 1054-1072 (1996)
【非特許文献２】El-dairyら Cell, 75, 817-825 (1993)
【非特許文献３】Miyashitaら Cell. 80, 293-299 (1995)
【非特許文献４】OdaらScience. 288(5468) 1053-1058 (2000)
【非特許文献５】Kamijoら Cell, 91, 649-659 (1997)
【非特許文献６】LakinらOncogene. 18, 3989-3995 (1999)
【非特許文献７】ShiehらGenes & Development. 14, 289-300 (2000)
【非特許文献８】Savitskyら Human Molecular Genetics. 4, 2025-2032 (1995)
【非特許文献９】Andersonら 26, 275-285 (1999)
【非特許文献１０】FaderlらClinical Cancer Research. 5, 1855-1861 (1999)
【非特許文献１１】水谷  実験医学 18, 2237-2243 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ｐ５３のDNA結合能を活性化させる物質の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、課題を解決するために鋭意検討した結果、ある種の化合物が変異によって非活性型となったｐ５３のDNA結合活性を回復させることを見出し本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、
式
【０００８】
【化１】
2006008533.tif 000002
【０００９】
[式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ水素原子、炭素原子数１〜６個のアルキル基を示すか、又はそれらが結合している窒素原子と一緒になって飽和複素環を形成し、
nは１〜５の整数を示し、ｍは１又は２を示し、
Ａは置換アルキレン基、置換シクロアルキレン基、ナフタレンジイル基、置換キサンテンジイル基、置換トリアゾリレン基、
式
【００１０】
【化２】
2006008533.tif 000003
【００１１】
（式中、Ｅは単結合、アルキレン基、アルケニレン基、式−ＣＨ2Ｏ−、または式−ＣＨ2Ｓ(ＣＨ2)2Ｏ−を示し、Ｇは単結合、アルキレン基、アルケニレン基、式−ＯＣＨ2−、または式−Ｏ(ＣＨ2)2ＳＣＨ2−を示し、Ｒ3,Ｒ4, Ｒ5およびＲ6は同一あるいは相異なって水素原子、ハロゲン原子、炭素原子数１〜６個のアルキル基、炭素原子数１〜１８個のアルコキシ基、ニトロ基、トリフルオロメチル基またはトリフルオロメトキシ基を示す）で示される基、
式
【００１２】
【化３】
2006008533.tif 000004
【００１３】
（式中、Ｊは単結合、アルキレン基、式−ＣＨ2Ｏ−、または式−ＣＨ2ＳＣＨ2−を示し、Ｌは単結合、アルキレン基、置換アルキレン基、アルケニレン基、式−Ｏ−、式−ＣＯ−、式−Ｓ−Ｓ−、式−ＳＯ2−、式−Ｏ(ＣＨ2)pＯ−（式中、ｐは１〜１０の整数を示す）、または式−ＮＨＣＯ−(ＣＨ2)q−ＣＯＮＨ−（式中、ｑは１〜５の整数を示す）を示し、Ｍは単結合、式−ＯＣＨ2−、または式−ＣＨ2ＳＣＨ2−を示し、Ｒ7,Ｒ8,Ｒ9,Ｒ10,Ｒ11,Ｒ12,Ｒ13およびＲ14は同一あるいは相異なって水素原子、ハロゲン原子を示す）で示される基、
式
【００１４】
【化４】
2006008533.tif 000005
【００１５】
で示される基、
式
【００１６】
【化５】
2006008533.tif 000006
【００１７】
で示される基、
式
【００１８】
【化６】
2006008533.tif 000007
【００１９】
で示される基、
または式
【００２０】
【化７】
2006008533.tif 000008
【００２１】
で示される基を示す]で表される化合物又はその医薬上許容される塩である。
【００２２】
本発明において、炭素原子数１〜６個のアルキル基とは炭素原子１〜６個を有する直鎖又は分岐鎖状の飽和または不飽和のアルキル基を意味し、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、tert−ブチル基、sec−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基，ネオペンチル基、tert-ペンチル基、n-ヘキシル基、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基、ブテニル基、イソブチレニル基、イソプレニル基、アセチレニル基などを挙げることができる。
【００２３】
少なくとも1個の窒素原子を含有する飽和複素環とは少なくとも１個の窒素原子を含み、更に、酸素原子、硫黄原子を含んでいてもよく、炭素原子数１〜６個のアルキル基で置換されていてもよい３〜８員の飽和複素環を意味し、ピロリジン、ピペリジン、２−メチルピペリジン、モルホリンなどを挙げることができる。
【００２４】
アルキレン基とは炭素原子数１〜１０個を有する直鎖又は分岐鎖状のアルキレン基を意味し、例えばメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、１，１−ジメチルメチレン基、テトラメチレン基、１−メチルトリメチレン基、２−メチルトリメチレン基、１，１−ジメチルエチレン基、ペンタメチレン基、１，１−ジメチルトリメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基、ノナメチレン基、デカメチレン基などを挙げることができる。
【００２５】
置換アルキレン基とは例えばフェニル基、ハロゲン原子で置換されたフェニル基、ニトロ基で置換されたフェニル基、ベンジル基、ベンジリデン基、シンナミリデン基、ベンジルオキシカルボキサミド基、１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル基、トリフルオロメチル基などから選ばれる１〜２個の基で置換されたアルキレン基を挙げることができる。
【００２６】
シクロアルキレン基とは炭素原子数３〜７個を有するシクロアルキレン基を意味し、例えばシクロプロピレン基、１，２−シクロブチレン基、１，３−シクロブチレン基、１，２−シクロペンチレン基、１，３−シクロペンチレン基、１，２−シクロヘキシレン基、１，３−シクロヘキシレン基、１，４−シクロヘキシレン基、１，２−シクロヘプタニレン基、１，３−シクロヘプタニレン基、１，４−シクロヘプタニレン基などを挙げることができる。
【００２７】
置換シクロアルキレン基とは例えばフェニル基などで置換されたシクロアルキレン基を挙げることができる。
【００２８】
ナフタレンジイル基とは例えば１，４−ナフタレンジイル基、２，３−ナフタレンジイル基、２，６−ナフタレンジイル基などを挙げることができる。
【００２９】
置換キサンテンジイル基とは例えば炭素原子数１〜６個のアルキル基などから選ばれる１〜８個の基で置換されたキサンテンジイル基を挙げることができる。
【００３０】
置換トリアゾリレン基とは例えばベンジル基などで置換されたトリアゾリレン基を挙げることができる。
【００３１】
アルケニレン基とは炭素原子数２〜６個を有する直鎖又は分岐鎖状のアルケニレン基を示し、例えばビニレン基、１−メチルビニレン基、プロペニレン基、１−ブテニレン基、２−ブテニレン基、１−ペンテニレン基、２−ペンテニレン基などを挙げることができる。
【００３２】
ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子である。
【００３３】
炭素原子数１〜１８個のアルコキシ基とは炭素原子１〜１８個を有する直鎖又は分岐鎖状のアルコキシ基を意味し、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、sec-ブトキシ基、tert-ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、オクタデカノキシ基、アリルオキシ基などを挙げることができる。
【００３４】
また、製薬学的に許容される塩とは、アルカリ金属類、アルカリ土類金属類、アンモニウム、アルキルアンモニウムなどとの塩、鉱酸又は有機酸との塩である。それらは、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、アルミニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、ぎ酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、エチルコハク酸塩、ラクトビオン酸塩、グルコン酸塩、グルコヘプトン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、アジピン酸塩、システインとの塩、Ｎ−アセチルシステインとの塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、よう化水素酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、ピクリン酸塩、チオシアン酸塩、ウンデカン酸塩、アクリル酸ポリマーとの塩、カルボキシビニルポリマーとの塩などを挙げることができる。
【００３５】
本発明の化合物は、例えば以下に示す方法によって合成することができる。すなわち、
下記式（ａ）
【００３６】
【化８】
2006008533.tif 000009
【００３７】
（式中、ｍは前記と同意義であり、P1はアミンの保護基を表す。ここで、アミンの保護基とはベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基等が挙げられる）で表される化合物と下記式（ｂ）
【００３８】
【化９】
2006008533.tif 000010
【００３９】
（式中、Ｒ1，Ｒ2，ｎは前記と同意義である。）で表される化合物とをアミド結合を形成する通常の方法を用いて反応させ、下記式（ｃ）
【００４０】
【化１０】
2006008533.tif 000011
【００４１】
（式中、Ｒ1，Ｒ2，ｍ，ｎ，Ｐ1は前記と同意義である。）で表される化合物を得、アミン保護基Ｐ1を通常用いられる方法で脱保護し、下記式（ｄ）
【００４２】
【化１１】
2006008533.tif 000012
【００４３】
（式中、Ｒ1，Ｒ2，ｍ，ｎは前記と同意義である。）で表される化合物を得、下記式（ｅ）
【００４４】
【化１２】
2006008533.tif 000013
【００４５】
（式中、Aは前記と同意義である。）で表される化合物とアミド結合を形成する通常の方法を用いて反応させ、下記式（ｆ）
【００４６】
【化１３】
2006008533.tif 000014
【００４７】
（式中、Ｒ1，Ｒ2，ｍ，ｎ，Ａは前記と同意義である。）で表される本発明化合物を合成することができる。
【００４８】
また、本発明化合物は例えば以下に示す方法によっても合成することができる。すなわち、上記式（ｅ）で表される化合物と下記式（ｇ）
【００４９】
【化１４】
2006008533.tif 000015
【００５０】
（式中、ｍは前記と同意義であり、P2はカルボン酸の保護基を表す。ここで、カルボン酸の保護基とはｔ−ブチル基、ベンジル基等が挙げられる。）で表される化合物とをアミド結合を形成する通常の方法を用いて反応させ、下記式（ｈ）
【００５１】
【化１５】
2006008533.tif 000016
【００５２】
（式中、ｍ，Ａ，Ｐ2は前記と同意義である。）で表される化合物を得、カルボン酸保護基Ｐ2を通常用いられる方法で脱保護し、下記式（ｉ）
【００５３】
【化１６】
2006008533.tif 000017
【００５４】
（式中、ｍ，Ａは前記と同意義である。）で表される化合物を得，上記式（ｂ）で表される化合物とアミド結合を形成する通常の方法を用いて反応させ、上記式（ｆ）で示される本発明化合物を合成することができる。
【００５５】
上記反応においてアミド結合を形成する通常の方法とは、カルボン酸とアミンとをジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤と必要に応じて１−ヒドロキシベンゾトリアゾール等の添加剤を用いて溶媒中縮合させる方法又は、カルボン酸を塩化チオニル等のハロゲン化剤と溶媒中あるいは無溶媒中反応させ酸ハライドとした後、アミンと溶媒中塩基存在下反応させる方法等が挙げられる。上記反応で塩基を用いる場合の塩基としては例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化ナトリウム、ジムシルナトリウム、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、tert−ブチルカリウム等のアルカリ金属塩類、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ピロリジン、ピペリジン等のアミン類、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等である。反応溶媒としては、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、tert−ブチルアルコール等のアルコール類、ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、塩化メチレン、クロロホルム、アセトン、酢酸、ベンゼン等の反応に不活性な溶媒を用いることができる。
【００５６】
この目的のためには、本発明の化合物を常用の増量剤、ｐＨ調節剤、溶解剤などを添加し、常用の製剤技術によって錠剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、液剤、懸濁剤、注射剤などに調整し、経口的あるいは注射剤、塗布剤として投与することができる。
【００５７】
本発明の化合物は、成人の患者に対して１〜１０００ｍｇ／日を数回に分けて投与することができる。この投与量は疾病の種類、患者の年齢、体重、症状により適宜増減することができる。
【発明の効果】
【００５８】
本発明の化合物はp53タンパクのDNA結合能を活性化させる効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
以下、実施例及び試験例により本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００６０】
化合物５９の合成
【００６１】
【化１７】
2006008533.tif 000018
【００６２】
（１）Ｎ−ベンジルオキシカルボニルグルタミン酸（15.21g）のジメチルホルムアミド（250ml）溶液に１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（14.66g）とジシクロヘキシルカルボジイミド（27.29g）とＮ，Ｎ−ジエチル−１，３−プロパンジアミン（14.13g）を氷冷下加え、室温で６２時間攪拌した。反応混合物を濾過して濾液の溶媒を留去し、得られた残渣をNH型のシリカゲル（富士シリシア化学株式会社製  Chromatorex）フラッシュカラムクロマトグラフィーでクロロホルムを溶媒に用いて精製し、［１，３−ビス（３−ジエチルアミノプロピルカルバモイル）プロピル］カルバミド酸ベンジルエステル（12.06g）を得た。
1H NMR (200MHz, CDCl3) δ ppm: 1.00 (6H, t, J = 7 Hz), 1.02 (6H, t, J = 7 Hz), 1.50-1.74 (4H, m), 1.92-2.37 (4H, m), 2.37-2.62 (12H, m), 3.20-3.44 (4H, m), 4.17 (1H, dt, J = 6 and 6 Hz), 5.10 (2H, s), 6.31 (1H, bd, J = 6 Hz), 7.22-7.45 (5H, m), 7.73 (1H, bs), 7.97 (1H, bs)
【００６３】
（２）［１，３−ビス（３−ジエチルアミノプロピルカルバモイル）プロピル］カルバミド酸ベンジルエステル（12.03g）のメタノール（100ml）溶液に5%パラジウム／カーボン（4.88g）を加え、水素雰囲気下室温で３０時間攪拌した。さらに５％パラジウム／カーボン（2.01g）を加え、水素雰囲気下室温で１４時間攪拌した。反応混合物をセライトで濾過して濾液の溶媒を留去し、得られた残渣をNH型のシリカゲル（富士シリシア化学社製  Chromatorex）フラッシュカラムクロマトグラフィーでクロロホルムとメタノールの混合溶媒を用いて精製し、２−アミノ−Ｎ，Ｎ' −ビス（３−ジエチルアミノプロピル）ペンタンジアミド（4.87g）を得た。
1H NMR (200MHz, CDCl3) δ ppm: 1.01 (6H, t, J = 7 Hz), 1.02 (6H, t, J = 7 Hz), 1.48-2.12 (8H, m), 2.28 (2H, t, J = 7 Hz), 2.41-2.61 (12H, m), 3.21-3.44 (5H, m), 7.57 (1H, bs), 7.95 (1H, bs)
【００６４】
（３）２，４，５，６−テトラフルオロイソフタル酸（0.90g）のベンゼン（13ml）溶液に塩化チオニル（3ml）を加え、還流条件下1日攪拌した。更に塩化チオニル（10ml）を加え、還流条件下2時間半攪拌した。反応混合物の溶媒を留去して、未精製の２，４，５，６−テトラフルオロイソフタロイルジクロリドを得た。２−アミノ−Ｎ，Ｎ' −ビス（３−ジエチルアミノプロピル）ペンタンジアミド（2.80g）の塩化メチレン（20ml）溶液にトリエチルアミン（0.83g）を加え、更に未精製の２，４，５，６−テトラフルオロイソフタロイルジクロリド（1.00g）の塩化メチレン（10ml）溶液を氷冷下滴下し、室温で８日間攪拌した。反応混合物から溶媒を留去し得られた残渣をNH型のシリカゲル（富士シリシア化学社製  Chromatorex）フラッシュカラムクロマトグラフィーでクロロホルムとメタノールの混合溶媒を用いて溶出後、更にアルミナカラムクロマトグラフィーでクロロホルムとメタノールの混合溶媒を用いて溶出させた後、ヘキサンとクロロホルムとメタノールの混合溶媒を用いて再結晶し、本発明の化合物５９（624mg）を得た。
1H NMR (200MHz, CDCl3) δ ppm: 1.01 (24H, t, J = 7 Hz), 1.53-1.76 (8H, m), 2.00-2.63 (32H, m), 3.20-3.40 (8H, m), 4.55 (2H, dt, J = 6 and 6 Hz), 7.66 (2H, m), 7.92 (2H, m), 8.11 (2H, bd, J = 6 Hz)
【実施例２】
【００６５】
化合物９４の合成
【００６６】
【化１８】
2006008533.tif 000019
【００６７】
（１）２，７−ジ−ｔ−ブチル−９，９−ジメチルキサンテン−４，５−ジカルボン酸（5.08g）のベンゼン（70ml）溶液に塩化チオニル（5ml）とジメチルホルムアミド１滴を加え、還流条件下３時間攪拌した。更に塩化チオニル（5ml）を加え、還流条件下４時間攪拌した。反応混合物の溶媒を留去して、未精製の２，７−ジ−ｔ−ブチル−９，９−ジメチルキサンテン−４，５−ジカルボニルジクロリドを得た。グルタミン酸ジベンジルエステルｐ−トルエンスルホン酸塩（12.71g）の塩化メチレン（80ml）溶液にトリエチルアミン（5.15g）を加え、更に未精製の２，７−ジ−ｔ−ブチル−９，９−ジメチルキサンテン−４，５−ジカルボニルジクロリド（1.00g）の塩化メチレン（90ml）溶液を氷冷下滴下し、室温で１５時間半攪拌した。反応混合物に食塩水を加え、クロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去し得られた残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒を用いて精製し、２−｛［５−（１，３−ビス−ベンジルオキシカルボニル−プロピルカルバモイル）−２，７−ジ−ｔ−ブチル−９，９−ジメチルキサンテン−４−カルボニル］アミノ｝ペンタン二酸ジベンジルエステル（9.75g）を得た。
1H NMR (200MHz, CDCl3) δ ppm: 1.35 (18H, s), 1.66 (6H, s), 2.27-2.58 (8H, m), 4.87 (2H, dt, J = 7 and 7 Hz), 5.04 (4H, s), 5.13 (4H, s), 7.17-7.35 (20H, m), 7.57 (2H, d, J = 2 Hz), 7.81 (2H, d, J = 2 Hz), 8.13 (2H, d, J = 7 Hz)
【００６８】
（２）２−｛［５−（１，３−ビス−ベンジルオキシカルボニル−プロピルカルバモイル）−２，７−ジ−ｔ−ブチル−９，９−ジメチルキサンテン−４−カルボニル］アミノ｝ペンタン二酸ジベンジルエステル（9.73g）のメタノール（80ml）溶液に5%パラジウム／カーボン（3.87g）を加え、水素雰囲気下室温で１４時間攪拌した。さらに５％パラジウム／カーボン（3.87g）を加え、水素雰囲気下室温で４時間攪拌した。反応混合物を濾過して濾液の溶媒を留去した。得られた粗生成物をメタノール（120ml）に溶解させ、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（60ml）を加え50度で7時間攪拌した。１M塩酸水溶液（120ml）を加え酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去し未精製の２−｛［２，７−ジ−ｔ−ブチル−５−（１，３−ジカルボキシ−プロピルカルバモイル）−９，９−ジメチルキサンテン−４−カルボニル］アミノ｝ペンタン二酸（5.05g）を得た。
1H NMR (200MHz, DMSO-d6) δ ppm: 1.32 (18H, s), 1.67 (6H, s), 1.97-2.45 (8H, m), 4.47 (2H, dt, J = 7 and 7 Hz), 7.69-7.82 (4H, m), 8.98 (2H, d, J = 7 Hz), 12.32 (4H, bs)
【００６９】
（３）２−｛［２，７−ジ−ｔ−ブチル−５−（１，３−ジカルボキシ−プロピルカルバモイル）−９，９−ジメチルキサンテン−４−カルボニル］アミノ｝ペンタン二酸（507mg）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（474mg）のジメチルホルムアミド（4ml）溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（890mg）を氷冷下加え、室温で10分間攪拌した。さらにＮ−（３−アミノプロピル）カルバミド酸ｔ−ブチルエステル（555mg）のジメチルホルムアミド（3ml）溶液を氷冷下加え、室温で一晩攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣をNH型のシリカゲル（富士シリシア化学株式会社製  Chromatorex）フラッシュカラムクロマトグラフィーでクロロホルムを溶媒に用いて精製し、下記中間体Ａ（658mg）を得た。
1H NMR (200MHz, CDCl3) δ ppm: 1.35 (18H, s), 1.39 (18H, s), 1.41 (18H, s), 1.51-1.76 (14H, m), 2.20-2.54 (8H, m), 3.01-3.48 (16H, m), 4.68 (2H, bs), 5.04-5.26 (4H, m), 6.89-7.17 (2H, m), 7.52-7.62 (2H, m), 7.69-7.87 (4H, m), 8.20-8.49 (2H, m)
【００７０】
中間体Ａ
【００７１】
【化１９】
2006008533.tif 000020
【００７２】
（４）中間体Ａ（558mg）にトリフルオロ酢酸（2ml）と塩化メチレン（18ml）の混合溶液を加え、室温で４時間半攪拌した。反応混合物から溶媒を留去し、得られた残渣をNH型のシリカゲル（富士シリシア化学社製  Chromatorex）フラッシュカラムクロマトグラフィーでクロロホルムとメタノールの混合溶媒を用いて精製し、本発明の化合物９４（99mg）を得た。
1H NMR (200MHz, CDCl3) δ ppm: 1.36 (18H, s), 1.47-2.00 (22H, m), 2.22-2.55 (8H, m), 2.60-2.85 (8H, m), 3.12-3.49 (8H, m), 4.68 (2H, m), 7.25-7.40 (2H, m), 7.52-7.63 (2H, m), 7.75-7.90 (2H, m), 7.90-8.13 (2H, m), 8.33-8.55 (2H, m)
【００７３】
実施例
対応する原料を用いて実施例１と同様の操作を行い、表１に示した化合物１〜５８、６０〜９３、９５〜１１５を得た。
【００７４】
【表１−１】
2006008533.tif 000021
【００７５】
【表１−２】
2006008533.tif 000022
【００７６】
【表１−３】
2006008533.tif 000023
【００７７】
【表１−４】
2006008533.tif 000024
【００７８】
【表１−５】
2006008533.tif 000025
【００７９】
【表１−６】
2006008533.tif 000026
【００８０】
【表１−７】
2006008533.tif 000027
【００８１】
【表１−８】
2006008533.tif 000028
【００８２】
【表１−９】
2006008533.tif 000029
【００８３】
【表１−１０】
2006008533.tif 000030
【００８４】
【表１−１１】
2006008533.tif 000031
【００８５】
【表１−１２】
2006008533.tif 000032
【００８６】
【表１−１３】
2006008533.tif 000033
【００８７】
【表１−１４】
2006008533.tif 000034
【００８８】
【表１−１５】
2006008533.tif 000035
【００８９】
【表１−１６】
2006008533.tif 000036
【００９０】
【表１−１７】
2006008533.tif 000037
【００９１】
【表１−１８】
2006008533.tif 000038
【００９２】
【表１−１９】
2006008533.tif 000039
【００９３】
【表１−２０】
2006008533.tif 000040
【００９４】
試験例１
Recombinant p53 タンパク質の生成
リコンビナントヒト非活性型p53タンパク質は文献（Kaku ら Biochemical and Biophysical Research Communications. 280, 204-211 (2001)）の方法に準じ、Poly histidine tag(6 x His)との融合タンパク質としてバキュロウィルスを用いSf9昆虫細胞に発現させた。100mlのSf9昆虫細胞の懸濁培養液(2x106cells/ml)へリコンビナントバキュロウィルスをMOI 5で感染させ、48時間後細胞を回収し精製に用いた。細胞を細胞溶解液[50mM Tris-HCl(8.5)、100mM KCl、 5mM 2-mercaptoethanol、1mM PMSF, 1% NP-40]中に溶解した。これを15000rpm、30分間遠心し上清を得た。
【００９５】
得られた上清を緩衝液A[20mM Tris-HCl(8.5)、500mM KCl、20mM imidazole、5mM 2-mercaptoethanol、10% glycerol]で平衡化した0.5ml Ni-NTA agaroseカラムへ通した。本カラムを5mlの緩衝液A、1mlの緩衝液B[20mM Tris-HCl(8.5)、1M KCl、5mM 2-mercaptoethanol、10% glycerol]、1ml緩衝液Aの順に洗浄した。Ni-NTAに結合した6 x His p53タンパク質を緩衝液C[20mM Tris-HCl(8.5)、100mM KCl、100mM imidazole、5mM 2-mercaptoethanol、10% glycerol]で溶出した。精製タンパク質を緩衝液D[20mM Hepes-NaOH(7.9)、100mM KCl、0.2mM EDTA、2 mM EGTA、2mM DTT、20% glycerol]中に透析し、-80℃で保存した。
【００９６】
p53のDNA結合試験系
DNA結合試験用プローブの作成
このDNA結合試験系には、プローブは、文献（El-dairyら Nature genetics, 1, 45-49 (1992)）により報告されたp53のコンセンサス配列（5'-AGGCATGCCTAGGCATGCCT-3'）を使用した。DNA合成により、得られたセンス鎖とアンチセンスのオリゴヌクレオチドをアニーリングして二本鎖（ds）DNAを得た。このdsDNA 100 ngを、T4 polynucleotide kinase で、[32P-γ]ATPを用いエンドラベルしたものをプローブとした。
【００９７】
T4 polynucleotide kinase反応は  5'-End-Labelling Kit （ファルマシア）を用い、以下の様に行った。
【００９８】
エッペンドルフ社製の1.5mlチューブに5μl ddH2O, 2 μl 10 x kinase buffer (添付されているもの), 2μl dsDNA プローブ（100 ng）,1μl T4 polynucleotide kinase, 3 μl 33P-γATPの各試薬を分注し、全容量を ddH2O にて 20μl にあわせた。これを37℃で１時間インキュベートし反応を進行させた。反応終了後、30μlのddH2Oを加え、容量を 50μlにした。これを、50mlのphenol/chloroform (1:1)で処理し、水相をG50 spinカラムに通し（7000rpm, 2分）て、プローブから未反応のATPを除いた。
【００９９】
DNA結合反応
p53のDNA結合活性は、文献（El-dairy ら Nature genetics, 1, 45-49 (1992)）に基づき以下のように測定した。
【０１００】
p53タンパク質（通常 100ng/assay）はbinding buffer [10 mM Tris-HCl(7.9), 25 mM KCl, 0.1mM EDTA, 2mM MgCl2, 0.5mM DTT,0.25% NP-40, 2 mM spermidine and 60ng/assay poly-dIdC]及び被検化合物のDMSO溶液中、氷中4℃で30分間インキュベートした。引き続き30000 cpmのds DNA プローブを添加し、さらに30分間インキュベートした(total volume 20μl)。この反応溶液10μlを、100Vで30分間 pre-runした4% native PAGE (in 0.5 x TBE)中、200Vで約30分電気泳動した。ゲルを乾燥後、バンドをホスホイメージングプレート（BAS2000: 富士写真工業）で検出・定量した。活性化の程度はp53タンパク質単独のプローブへの結合を基準にし、p53のDNA結合活性化能を有するp53抗体Pab421エピトープペプチド（SelivanovaらNeture Medicine, 3, 632-638 (1997)） 10μg/20 μl assayによる活性化を100%としてその割合で表した。
【０１０１】
100μMでの化合物１１の活性化の割合は79.8%、100μMでの化合物５９の活性化の割合は78.4%であった。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明の化合物は、ヒト及び動物におけるp53が関わる疾患、例えば癌の治療薬として有用である。