(57)【要約】【課題】生産性の向上したポリヒドロキシアルカノエート生産菌株の提供すること。【解決手段】ポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊して、ポリヒドロキシアルカノエート生産効率が向上したポリヒドロキシアルカノエート生産菌を得る。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子が破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌。
【請求項２】
ポリヒドロキシアルカノエート生産菌であるシュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. ＹＮ２１、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５６９）の同質遺伝子系統であってポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ PZ１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. PZ１、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７１）。
【請求項３】
ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌を培養し、培養液からポリヒドロキシアルカノエートを回収することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項４】
下記（ａ）または（ｂ）に示す相同組換えのためのＤＮＡと、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊のための部分と、ベクターと、を有し、これらが機能的に連結してなるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクター；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部。
【請求項５】
ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対するポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターであって、
（１）下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（２）外来性ＤＮＡ、
（３）該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、
（４）接合起点遺伝子、及び
（５）ベクター
とを有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクター。
【請求項６】
ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対するポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターであって、
（１）下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（２）該（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部に挿入された外来性ＤＮＡ、
（３）該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、
（４）感受性遺伝子、
（５）接合起点遺伝子、及び
（６）ベクター
を有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクター。
【請求項７】
感受性遺伝子がレヴァンスクラーゼ遺伝子である、請求項６に記載のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクター。
【請求項８】
外来性DNAがゲンタマイシン耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子である請求項５から７のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクター。
【請求項９】
請求項４から８のいずれかに記載の遺伝子ターゲティングベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
原核性宿主である請求項９記載の宿主細胞。
【請求項１１】
大腸菌である請求項１０記載の宿主細胞。
【請求項１２】
ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法であって、請求項４に記載の遺伝子ターゲティングベクターＤＮＡとポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体ＤＮＡ上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子との相同組換えによりポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子を破壊することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の製造方法。
【請求項１３】
ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法であって、請求項９から１１のいずれかに記載の宿主細胞とポリヒドロキシアルカノエート生産菌との接合により、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体ＤＮＡ上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子との相同組換えを惹起しポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子を破壊することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌および該生産菌を用いたポリヒドロキシアルカノエートの生産方法に関する。またポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子を破壊するための遺伝子ターゲティングベクターおよび該遺伝子ターゲティングベクターを用いたポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、多くの微生物がポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)あるいはその他のポリ-３-ヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)を生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,Ｐ178-197(1995))。これらのポリマーは従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。さらに、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全分解されるという利を有しており、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【０００３】
特に最近、微生物産生ＰＨＡのより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮して、アルキル基以外の置換基を側鎖に導入したＰＨＡ「unusual ＰＨＡ」が極めて有用であることが期待されている。このような置換基の例としては、芳香環を含むもの(フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基等)や、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシド、チオエーテルなどが挙げられる。
【０００４】
微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、このようなPHAを産生する微生物については様々な研究が成され、PHAの生合成経路は比較的よく調べられてきた。
【０００５】
これまでのところポリヒドロキシアルカノエート合成酵素はその基質特異性とサブユニット構成により、3つのクラスに分類されている。
【０００６】
「第1のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素はRalstonia eutrophaやAeromonas punctataなどに見出されるもので、炭素数３から５の短い鎖長の３−ヒドロキシアルカン酸と、補酵素CoAとのチオエステル体を基質として利用する。
【０００７】
「第2のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素はPseudomonas oleovolansやPseudomonas aeruginosaなどに見出されるもので、炭素数６から１４の中鎖長３−ヒドロキシアルカン酸のほか様々な「unusual」な３−ヒドロキシアルカン酸と補酵素CoAとのチオエステル体を基質として利用する。
【０００８】
第1、第2のクラスともに、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素は分子量６１から７３ｋDaの単一のサブユニットから構成されている。
【０００９】
「第3のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素はAllochromatium vinosumやEctothiorhodospira shaposhnikoviiなどに見出され、約４０ｋDaの相異なる2種類のサブユニットから構成される。基質特異性は、第1のクラスのポリヒドロキシアルカノエート合成酵素に似て、炭素数３から５の短い鎖長の３−ヒドロキシアルカン酸と補酵素CoAとのチオエステル体を利用する。
【００１０】
一方PHAの分解経路については不明な点が多い。The Journal of Biological Chemistry 266, 2191(1991)には上記「第2のクラス」に属する基質特異性を有するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するPseudomonas oleovolansに対する化学変異原処理によって細胞内ＰＨＡを分解できない変異株を取得し、これを利用してPHA分解活性を相補する遺伝子をクローニングしたことが開示されている。これによれば、PHA合成酵素遺伝子(phaC1, phaC2)とPHA分解酵素遺伝子(phaZ)はクラスターを形成し、phaC1-phaZ-phaC2という構成をとっている。その後、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas sp.61-3、Pseudomonas resinovolans、Pseudomonas putida U、Pseudomonas mendocinaなど、Pseudomonas oleovolansと同じ第2のクラスに属する基質特異性を有するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有する他の細菌においても、同じphaC1-phaZ-phaC2という遺伝子構成をとっていることが明らかになっている。
【００１１】
ところで、これらの研究の過程でPHA分解酵素遺伝子の機能しない変異株が単離されたものの、PHA分解酵素活性と細胞内PHAの蓄積量との関係についてはわかっていない。
【００１２】
一方、特開平11−113574号公報には「第1のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するアルカリゲネス・ユートロファスから単離されたポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)の分解酵素が提示されている。また、特開平9−191887号公報には「第1のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するアルカリゲネス・フェリカスから単離されたポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)の分解酵素が提示されている。さらに、特開平6−086681号公報には「第1のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するズーグロエア・ラミゲラから単離されたポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)の分解酵素が提示されている。
【特許文献１】特開平11−113574号公報
【特許文献２】特開平9−191887号公報
【特許文献３】特開平6−086681号公報
【非特許文献１】「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,Ｐ178-197(1995)
【非特許文献２】The Journal of Biological Chemistry 266, 2191(1991)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
機能性ポリマーとして期待されているPHAを、安価にかつ大量に安定的に得るためにはその生産性を向上させることが必要である。このためには、単にPHAを産生する微生物の生合成効率を高めるのみでなく、その分解を抑えることが重要であると考えられる。従来知られていた第1のクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有する微生物から単離されたポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)の分解酵素は、炭素数３から５の短い鎖長の３−ヒドロキシアルカン酸を構成単位とするＰＨＡの分解に関与するものであるので、機能性ポリマーとして期待されているPHA(特にunusual PHA)を、安価にかつ大量に安定的に得るためには、利用できない。本発明の解決しようとする課題の第1は、第２のクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有する微生物のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を破壊(gene-disruption)することにより、生産能の向上したunusual PHA産生微生物の同質遺伝子系統を提供することである。
【００１４】
そのような菌株を得る一般的な方法は、ランダム変異導入法により変異導入した菌株の中からスクリーニングするという煩雑な実験操作を要するものであり、簡便なポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたunusual PHA産生微生物の取得方法が望まれるところである。本発明の解決しようとする課題の第2は、簡便なポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたunusual PHA産生微生物の取得方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは鋭意研究を行い、unusual PHA産生微生物の一種である、シュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株よりPHA分解酵素遺伝子を単離するとともに、その遺伝子の塩基配列を利用してポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターを構築した。構築した遺伝子ターゲティングベクターを用いることによって、unusual PHA産生微生物の一種であるシュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株の同質遺伝子系統であり、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とする菌株を新たに取得することができた。また、構築した遺伝子ターゲティングベクターを用いれば、他の第２のクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するポリヒドロキシアルカノエート産生微生物のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素も特異的に遺伝子破壊できることを見出した。さらに、新たに取得したポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されている菌株を用いると、炭素数６から１４の中鎖長３−ヒドロキシアルカン酸のほか様々な「unusual」な３−ヒドロキシアルカン酸を構成単位とするＰＨＡの生産性を従来よりも向上できることを見出し本発明の完成に至った。
【００１６】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌は、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子が破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌である。本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエート生産菌の一態様は、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. ＹＮ２１、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５６９）の同質遺伝子系統であってポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ PZ１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. PZ１、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７１）である。
【００１７】
本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌を培養し、培養液からポリヒドロキシアルカノエートを回収することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。
【００１８】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子が破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌を得るためのターゲッティングベクターは、下記（ａ）または（ｂ）に示す相同組換えのためのＤＮＡと、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊のための部分と、ベクターと、を有し、これらが機能的に連結してなるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターである。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部。
【００１９】
本発明のターゲッティングベクターの他の態様は、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対するポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターであって、
（１）下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（２）外来性ＤＮＡ、
（３）該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、
（４）接合起点遺伝子、及び
（５）ベクター
とを有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターである。
【００２０】
本発明のターゲッティングベクターの他の態様は、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対するポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターであって、
（１）下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（２）該（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部に挿入された外来性ＤＮＡ、
（３）該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、
（４）感受性遺伝子、
（５）接合起点遺伝子、及び
（６）ベクター
を有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターである。
【００２１】
本発明の細胞接合によるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子は破壊のための宿主細胞は、上記の遺伝子ターゲティングベクターによって形質転換された宿主細胞である。
【００２２】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌の製造方法は、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法であって、請求項４に記載の遺伝子ターゲティングベクターＤＮＡとポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体ＤＮＡ上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子との相同組換えによりポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子を破壊することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の製造方法である。
【００２３】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌は、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法であって、請求項９から１１のいずれかに記載の宿主細胞とポリヒドロキシアルカノエート生産菌との接合により、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体ＤＮＡ上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子との相同組換えを惹起しポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子を破壊することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の製造方法である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌は、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素が破壊されていることから、合成されたＰＨＡを分解することができないので、通常の生産菌に比べてＰＨＡの生産性が向上すると考えられる。ポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. ＹＮ２１、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５６９）は、本発明者らによって単離され、様々なunusualＰＨＡを合成することができる。したがってＹＮ２１株の同質遺伝子系統であってポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とする本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ ＰＺ１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. ＰＺ１、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７１）を用いれば、unusual PHAを従来より高い生産性で製造することができる。
【００２５】
また、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されているポリヒドロキシアルカノエート生産菌を培養し、培養液からポリヒドロキシアルカノエートを回収することを特徴とするが、従来よりも高い生産能を有する生産菌株を用いることで、より高い生産性でPHAを製造することができる。
【００２６】
さらに、本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターは、前記第2のクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を効率的に破壊することができる。
【００２７】
またさらに、本発明の、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法は、前記本発明の遺伝子ターゲティングベクターＤＮＡとポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体ＤＮＡ上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子との相同組換えにより、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子を簡便に破壊することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明に供されるポリヒドロキシアルカノエート生産菌とは、従来よりポリヒドロキシアルカノエートを生産することの知られている微生物の内、下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
と生理的条件下、すなわち微生物細胞内で、染色体上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有したポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を具備しているものであれば特に限定されない。このような微生物としては、シュードモナス オレオボランス(Pseudomonas oleovorans)（Makromol.Ｃheｍ.,191,1957-1965(1990)及びMacroｍolecules,24,5256-5260(1991)）、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)（Can.J.Microbiol.,41，32-43(1995)及び Polymer International,39，205-213(1996)）、シュードモナス・レジノボランス(Pseudomonas resinovorans)（Appl.Environ.Microbiol,５８(２),746 (1992)）、シュードモナス sp.61-3株(Pseudomonas sp.61-3 strain)（Int.Ｊ.Biol.Macromol.,１６(３)、119 (1994)）、シュードモナス・チコリアイ ＹＮ2株(Pseudomonas cichorii ＹＮ2；ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・チコリアイ Ｈ45株(Pseudomonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シュードモナス・ジェッセニイＰ161株(Pseudomonas jessenii Ｐ161、ＦＥＲＭ ＢＰ-7376)などが挙げられるが、上記相同性を具備するものであれば、これらに限られず、また将来新たに見出されるポリヒドロキシアルカノエート生産菌も本発明に供することができる。
【００２９】
本発明者らはフェニル吉草酸を基質として用いて、３−ヒドロキシフェニル吉草酸モノマーユニットを含むＰＨＡを生産する能力を有する微生物の探索を行った。その結果、土壌より所望の能力を有する微生物株を分離することに成功し、ＹＮ２１株とした。
【００３０】
以下に述べる菌学的性質から、バージェーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー・第１巻（Ｂｅｒｇｅｙ‘ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ１）（１９８４年）、及び、バージェーズ・マニュアル・オブ・ディタミネーティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ‘ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第９版（１９９４年）に基づいて検索したところ、ＹＮ２１株はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属すると判明した。従って、この菌株をシュードモナス・スピーシーズ・ＹＮ２１株とそれぞれ命名した。
【００３１】
unusualな置換基を有するポリヒドロキシアルカノエート生産菌として本発明者らが土壌より分離した微生物である、シュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株(Pseudomonas sp. ＹＮ２１)は特に本発明に好適に供し得る。ＹＮ２１株は寄託番号「FERM BP-08569」として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(茨木県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。なお、ＹＮ２１株の菌学的性質を列挙すれば以下の通りである。
＜YN21株の菌学的性質＞
１）形態学的性質
細胞の形と大きさ：桿菌、0.8μｍ×1.5〜2.0μｍ
細胞の多形性：なし
運動性：あり
胞子形成：なし
グラム染色性：−
コロニー形状：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、半透明
２）生理学的性質
カタラーゼ活性：＋
オキシダーゼ活性：＋
O/F試験：酸化型
硝酸還元：＋
インドール産生：−
アルギニンジヒドロラーゼ：＋
エスクリン加水分解：−
ゼラチン加水分解：−
King's B寒天での蛍光色素産生：＋
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積   ：−
Tween 80 の加水分解：＋
41℃生育：−
グルコン酸還元：−
レバン産生：−
ジャガイモ腐敗：−
タバコ過敏感反応：−
スクロース：−
カゼイン：−
チロシナーゼ：＋
硫化水素：−
ペクチン：−
レシチナーゼ：−
リトマスミルク：B
デンプン：−
３）基質資化能
ブドウ糖：＋
Ｌ-アラビノース：＋
Ｄ-マンノース：＋
Ｄ-マンニトール：−
マルトース：−
グルコン酸：＋
D-キシロース：(＋)
ラフィノース：−
サリシン：−
グリセリン：＋
D-セロビオース：−
D-メレチトース：−
ラクトース：−
ガラクトース：＋
D-ソルビトール：−
α-メチル-D-グルコシド：−
D-リボース：(＋)
スクロース：−
イノシトール：−
D-フルクトース：＋
L-ラムノース：−
D-アラビノース：−
ズルシトール：−
メリビオース：−
アドニトール：−
デンプン：−
エリスリトール：−
トレハロース：−
ベタイン：＋
DL-乳酸：＋
D-酒石酸：−
L-酒石酸：(＋)
メソ酒石酸：＋
n-カプリン酸：＋
L-リンゴ酸：(＋)
クエン酸：＋
D-サッカラート：＋
レブリン酸：＋
メサコン酸：−
マロン酸：＋
コハク酸：＋
酢酸：＋
プロピオン酸：＋
n-酪酸：＋
ギ酸：−
グルタル酸：＋
D-キナ酸：＋
セバシン酸：＋
p-ヒドロキシ安息香酸：＋
アントラニル酸：−
ペラルゴン酸：＋
グリセリン酸：＋
γ-アミノ酪酸：＋
L-ロイシン：＋
L-セリン：＋
ヒスチジン：＋
L-イソロイシン：＋
L-アルギニン：＋
β-アラニン：＋
L-チロシン：＋
L-バリン：＋
ホモセリン：−
サルコシン：＋
トリアセチン：＋
トリゴネリン：＋
5-フェニル吉草酸：＋
3-ヒドロキシ酪酸：＋
L-アスパラギン：＋
YN21株は従来菌株であるPseudomonas cichorii YN2株（FERM BP-7375）と硝酸塩還元性、インドール生成、ブドウ糖酸性化、アルギニンジヒドロラーゼ活性、Ｄ-マンノース資化能などの生理学的性質及び基質資化能の違いを示すことができる。また同様に従来菌株であるPseudomonas cichorii H45 株（FERM BP-7374）とは硝酸塩の還元性、アルギニンジヒドロラーゼ活性、Ｌ-アラビノース資化能、Ｄ-マンニトール資化能において、Pseudomonas jessenii P161 株（FERM BP-7376）とはＤ-マンニトール資化能において、Pseudomonas putida P91 株（FERM BP-7373）とは硝酸塩還元性、Ｌ-アラビノース資化能、Ｄ−マンノース資化能においてそれぞれ特性を異にする。
【００３２】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌は、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対して、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコ−ドする遺伝子配列の変性に帰結する変異原処理や、該酵素をコ−ドする遺伝子配列へのトランスポゾンの組み込み、該酵素をコ−ドする遺伝子が発現しないような遺伝工学的変性、例えば、アンチセンス遺伝子阻害、さらにまたは選択的遺伝子破壊によって取得し得るものである。
【００３３】
突然変異を起こすのに有用な化学変異原は、例えば、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)、エチルメタンスルホネート(EMS)及びジエチルスルフェイト(DES)のようなアルキル化剤である。ヒドロキシルアミン、及び亜硝酸のようなDNA塩基を脱アミノ化する化学薬品もまた有用である。電離放射線（γ一及びＸ−線）並びに紫外線照射 (UV)は、突然変異誘発で有用な物理的誘発原である。
【００３４】
ランダム変異導入法により変異導入した菌株の中からポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊された株を取得するには、例えば、変異導入した菌株をＰＨＡの構成単位として利用し得るアルカン酸を含む寒天プレート上で培養し、細胞内にＰＨＡを合成できる菌を、ナイルレッド染色等により細胞内ＰＨＡを蛍光染色することによって、1次スクリーニングし、その後、貧栄養状態で細胞内ＰＨＡを分解・再利用できない菌を、ナイルレッドによる細胞内ＰＨＡの蛍光染色性の残存によって2次スクリーニングすればよい。
【００３５】
選択的遺伝子破壊によってポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌を取得するには、直鎖ＤＮＡを用いる相同組換えによる方法を用いることもできるが、特に本出願に係る発明の一つで開示されるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターを用いると、菌に対するダメージを軽減し、より効率的に該遺伝子の破壊されているポリヒドロキシアルカノエート生産菌を取得することが出来る。
【００３６】
一般に、遺伝子の機能解明や実用菌株の育種で望ましくない性質に関わる遺伝子を選択的に破壊するために、染色体上の標的部位への相同組み換えによる選択的遺伝子破壊法が利用されており、選択的遺伝子破壊の方法としては遺伝子挿入破壊法と遺伝子置換破壊法の二つが用いられている（図４）。これらの方法はいずれも、生物の生体において自然に起こり得る遺伝子相同組換えを、該生物の染色体上に存在する内在性ゲノムＤＮＡと外来性ターゲティングＤＮＡ（ターゲティングベクター）との間で人為的に起こさせることにより、該内在性ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列中に該外来性ターゲティングＤＮＡ中に含まれる所望の外来性遺伝子を組込むことを基本原理とするものである。本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌を製造するには、前記遺伝子挿入破壊法と前記遺伝子置換破壊法のいずれの方法も用いることができる。
【００３７】
本発明における遺伝子ターゲティングベクターとは、相同組換えにより、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌の内在性ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮＡ（ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素）をコードする遺伝子を破壊するために用いられるＤＮＡ構造体を意味する。ここで当該「破壊」（gene disruption）とはターゲティングＤＮＡと内在性ゲノムＤＮＡとの相同組換えにより、該内在性ゲノムの一部に導入される下記のようなＤＮＡ配列の改変を意味する。
【００３８】
（１）該標的ＤＮＡの一部ＤＮＡ配列の欠失
（２）該標的ＤＮＡの一部ＤＮＡ配列の外来性ＤＮＡとの置換
（３）該標的ＤＮＡのＤＮＡ配列中への外来性ＤＮＡの挿入
遺伝子挿入破壊法で達成されるDNA配列の改変は前記（３）による改変であり、遺伝子置換破壊法で達成されるDNA配列の改変は前記（１）、（２）または（３）による改変である。これらの改変によりポリヒドロキシアルカノエート生産菌の内在性ゲノムＤＮＡ中のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子は実質機能を失い、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子が転写・翻訳・あるいは活性を保持したポリヒドロキシアルカノエート分解酵素タンパク質が生合成されることを無くすることができる。
【００３９】
本発明に係るポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターの基本構造は、どのような手法で遺伝子破壊を行うかによって異なり、次の３つの基本構造をとり得る。
（Ｉ）基本的に、相同組換えのための下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡと、所望の遺伝子破壊のための領域と、がベクターに連結してなる構成を有するもの。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部。
（II）遺伝子挿入破壊法にて標的遺伝子を破壊する場合には、本発明の遺伝子ターゲティングベクターは、該標的DNA配列に相同なDNA配列（相同領域）として、下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
を含有し、さらに該内在性ゲノムDNAにとって外来である所望の外来性DNAを有するという基本構造からなるもの。
（III）遺伝子置換破壊法にて標的遺伝子を破壊する場合には、本発明の遺伝子ターゲティングベクターは、該標的DNA配列に相同なDNA配列（相同領域）として、下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
を含有し、かつ該標的DNA配列に相同なＤＮＡ配列（相同領域）中に該内在性ゲノムＤＮＡにとって外来である所望の外来性ＤＮＡが挿入された基本構造からなるもの。
【００４０】
ここで、基本構造（Ｉ）、（II）、（III）における「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズ」するＤＮＡとは、以下に示すＤＮＡをいう。すなわち、（１）高イオン濃度下[例えば、6xSSC(900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム)等が挙げられる。]  に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより配列番号１で示される塩基配列を含むＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下[例えば、0.1xSSC(15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム)等が挙げられる。]  に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも該ハイブリッドが維持されるＤＮＡをいう。具体的には、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、その一部が、所望の遺伝子破壊機能を損なわない範囲内で、欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡなどが挙げられる。かかるＤＮＡは自然界からクローニングされたＤＮＡであってもよいし、自然界からクローニングされたＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加が人為的に導入されたＤＮＡであってもよく、また、人為的に合成されたＤＮＡであってもよい。また基本構造（Ｉ）、（II）、（III）における「（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部」はポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードする必要はなく、生理的条件下、すなわち微生物細胞内で、染色体上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有していればよい。このような相同性としては、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性が挙げられる。またポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊株の作製に用いるＤＮＡは、染色体上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を破壊できる程度の大きさであれば、前記（a）または（b）に示すＤＮＡの一部であってもよい。ここで一部とは、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の長さを有するもので、所望の遺伝子破壊機能を有する部分が挙げられる。
【００４１】
遺伝子ターゲティングベクターに設ける（a）または（b）に示すDNAの「一部」について具体的な配列を例示するならば、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５である。
【００４２】
基本構造（I）におけるベクターは特に限定されないが、一般的な広域宿主ベクターが使用可能であり、例えばpJRD215（Davidson et al.,Gene, 51,275-280(1987)）及びpBBR1MCSシリーズ（Kovach et al., Gene, 166,175-176(1995)）等を例示することができる。
【００４３】
基本構造（II）、（III）における「外来性ＤＮＡ」としては、例えばマーカー遺伝子、レポーター遺伝子、遺伝子増幅遺伝子、内在性ゲノムＤＮＡ中の標的DNA配列に対する欠失・置換または挿入により、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の実質的な機能停止に至る様な性質を付加し得る遺伝子発現制御ＤＮＡ配列、あるいはそれらの１つ以上を含むＤＮＡ配列を挙げることができる。ここで「マーカー遺伝子」としては、遺伝子組換え技術分野において通常使用されるいかなるマーカー遺伝子も用いることができる。例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、ゲンタマイシンまたはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示される。また「レポーター遺伝子」としては、ルシフェラーゼや緑色蛍光タンパク質（GFP）、βラクタマーゼなどの遺伝子が例示される。さらにまた「遺伝子増幅遺伝子」としては、染色体DNAを鋳型としたPCR法による破壊株の特異的遺伝子増幅産物が得られるような所望のプライマー結合配列を有するDNA配列が例示される。
【００４４】
基本構造（II）、（III）の遺伝子ターゲティングベクターには、接合起点遺伝子（OriT）を含有するMobサイトを含有させることにより、大腸菌運動性株（mobilizer strain, 例えばＳ１７−１株(ATCC 47055)）に形質転換しプラスミド供与菌体として用いた場合、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌への効率的な導入が可能になり、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に与えるダメージを軽減し、より簡便にまた効率的にポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊された菌株を取得することができるのでより好ましい。これは大腸菌運動性株がtra遺伝子を有しているために、接合伝達における、mob+, tra- の遺伝子ターゲティングベクターをヘルパープラスミドの助けなしに接合伝達することができる(R.Simon et al.(1983) Bio-Technology 1: 784)からである。
【００４５】
基本構造（III）の遺伝子ターゲティングベクターには、プラスミド受容菌をある条件下に致死に導く遺伝子（感受性遺伝子）を含有させることが望ましい。
【００４６】
感受性遺伝子としては、例えばバチルス サブチルス （Buccilus subtilis）由来のレヴァンスクラーゼ（Levansucrase, sacB）が、多くのグラム陰性菌にとって、ショ糖が５重量％を超えて含有する培地において、致死にいたることが見出されており（Gay et al. J. Bacteriol.164, 918）、またシュードモナス スピーシーズ YN21株においても機能することが、発明者らによって確認されたので、本発明においても好適に用いることができる。
【００４７】
基本構造（III）の遺伝子ターゲティングベクターでは、前記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部への選択マーカーの挿入位置は、該ベクターに組込まれた該（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部の長さを１０としたとき、１から９の間、好ましくは２から８の間、より好ましくは４から６の間である。選択マーカーの挿入位置が前記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部の一端に偏ると、感受性遺伝子の作用を利用した二重相同組換え体の取得効率が下がるので好ましくない。
【００４８】
基本構造（I）、（II）、または（III）の遺伝子ターゲティングベクターを構築するには、上記基本構造の構成要件である各DNAを通常の分子生物学的手法を用いてベクターに組込んでいけばよいが、予めポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、接合起点遺伝子および感受性遺伝子を備えた可動性ベクターを利用すると、本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターをより短い工程で作製することができるので有用である。このような可動性ベクターとして、たとえばpEX100T(ATCC 87436)、pJQ200（ATCC 77482）、pDMS197(ATCC 87694)、pRE107(ATCC 87691)などを挙げることができ、本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターを構築する際に好適に用いることができる。
【００４９】
例えば基本構造（III）の遺伝子ターゲティングベクターを構築するためには、上記可動性ベクターに、前記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部、及び選択マーカーを組込めばよい。これらを組込む順番について制限はないが、その手順の一例を示すならばまず、上記可動性ベクターに適当な制限酵素を作用させ、得られたベクターＤＮＡ断片と、前記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部とを混合し、これにＤＮＡリガーゼを作用させる。次に前記制限酵素とは別の認識部位を切断する制限酵素を作用させ、上記ベクターの一部、または上記ベクターに組込まれた前記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部で切断する。得られたベクターＤＮＡ断片を、前記選択マーカーを含むDNA断片と混合し、これにＤＮＡリガーゼを作用させることによって選択マーカーを挿入する。なお以上の工程中、必要に応じ当該分野で知られたリンカー付与、ブラントエンド化等の処理を加えることもできる。
【００５０】
基本構造（I）の遺伝子ターゲティングベクターを用いてポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を破壊するには、該遺伝子ターゲティングベクターをポリヒドロキシアルカノエート生産菌に導入する。遺伝子ターゲティングベクターを導入する方法としてはコンピテント細胞に接触せしめる方法や、エレクトロポレーション法など当業者によく知られた方法から適宜選択して用いることが出来る。
続いて例えば、ＰＨＡの構成単位として利用し得るアルカン酸を含む寒天プレート上で培養し、細胞内にＰＨＡを合成できる菌を、ナイルレッド染色等により細胞内ＰＨＡを蛍光染色することによって、1次スクリーニングし、その後、貧栄養状態で細胞内ＰＨＡを分解・再利用できない菌を、ナイルレッドによる細胞内ＰＨＡの蛍光染色性の残存によって2次スクリーニングする。
【００５１】
基本構造（II）または（III）の遺伝子ターゲティングベクターを用いてポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を破壊するには、基本構造（I）の遺伝子ターゲティングベクターを用いる場合と同様に行うこともできるが、まず該遺伝子ターゲティングベクターを前記大腸菌運動性株に形質転換する。次に形質転換された大腸菌運動性株とポリヒドロキシアルカノエート生産菌との接合転移を利用して、遺伝子ターゲティングベクターをポリヒドロキシアルカノエート生産菌体内に転移させる。  前記選択マーカーで選択することによって遺伝子ターゲティングベクターと染色体ＤＮＡとの相同組換えの結果、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊された株を取得することができる。なお、宿主であるポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体と遺伝子ターゲティングベクターには前記選択マーカーの前後に２箇所の相同部位が存在するので、この段階で得られる相同組換え体の大部分は、遺伝子ターゲティングベクターに由来する配列が相異なる位置で挿入された染色体構造を有する相異なる2種類の組換え体であって、選択マーカー前後の２箇所の相同部位で同時に交叉の生じた相同組換え体の割合は非常に少ないと考えられる。ただし、遺伝子ターゲティングベクターに由来する配列が挿入されることにより、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子は破壊される。
基本構造（III）の遺伝子ターゲティングベクターを用いた場合には、続いて感受性遺伝子の機能に基づいた選択を行う。この選択により、プラスミド受容菌から、前記選択マーカーで選択された組換え体の、染色体へ挿入された遺伝子ターゲティングベクターに由来する配列の内、可動性ベクター部分が欠失除去された変異株を取得することができる。これは前段階の相同組換えの際に、利用されなかった他方の相同部位での相同組換えが起こることにより成される。従ってこの段階で、前段階の相異なる染色体構造を有する2種類の組換え体は、同じ染色体構造の（ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子が選択マーカーで分断された）組換え体になる。
【００５２】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターを用いて取得される組換え体の、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されていることの確認は、前述の方法にて組換え体のポリヒドロキシアルカノエート分解活性の消失を確認するか、組換え体の染色体ＤＮＡを制限酵素で切断した後、サザンハイブリダイゼーション法を用いるか、適当なプライマーを用いて染色体ＤＮＡに対してＰＣＲ法を用いるなどして行うことができる。
【００５３】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターは、適当な宿主細胞内で、自律的に複製、増幅するので、このベクターを宿主細胞中へ導入して形質転換を行って得られた形質転換体を培養することで、このベクターのコピーを製造することができる。このような宿主細胞としては、上記で得られたポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターで形質転換でき、かつこのベクターの安定維持、複製が可能であるようなものであれば、グラム陰性菌あるいはグラム陽性菌の区別なく、さらには、下等細胞あるいは高等細胞の区別なく、動物由来細胞であろうと植物由来細胞であろうと使用できる。宿主細胞にポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターを導入するためには、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターをコンピテント細胞に接触せしめる、エレクトロポレーションなど当業者によく知られた方法から適宜選択して用いることが出来る。
【００５４】
本発明にかかるＰＨＡの製造方法に用いるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊株の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる破壊株の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、破壊株の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地(肉汁培地、酵母エキスなど)や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。
【００５５】
培養は液体培養、固体培養等該破壊株が増殖し、ＰＨＡを生産する培養方法ならいかなる培養方法でも用いることができる。さらに、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。また、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
【００５６】
ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊株を用いて生産できるPHAの組成や構造、特に側鎖に置換基を有するunusual PHAの種類は、この同質遺伝子系統であるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子非破壊株の性質により規定されるが、シュードモナス スピーシーズ YN21株の同質遺伝子系統でありポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズPZ1株を用いると、例えば下記化学式[１]から[16]に示すポリマーユニットからなる群から選ばれた少なくとも１種類のポリマーユニットをポリマー分子中に含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートを製造することができる。
【００５７】
【化１】
2006204256.tif 000002
【００５８】
（ただし式中R1およびａの組合せが下記のいずれかであるポリマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。
（１）R1が水素原子（H）でありaが1から10の整数のいずれかであるポリマーユニット、
（２）R1がハロゲン元素であり、aが1から10の整数のいずれかであるポリマーユニット、
（３）R1が、
【００５９】
【化２】
2006204256.tif 000003
【００６０】
であり、ａが1から8の整数のいずれかであるポリマーユニット)
【００６１】
【化３】
2006204256.tif 000004
【００６２】
(式中R2は芳香環への置換基を示し、R2は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、およびKのいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH=CH2基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中bは0から7の整数のいずれかを表す。)
【００６３】
【化４】
2006204256.tif 000005
【００６４】
(式中R3は芳香環への置換基を示し、R3は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、SCH3基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中cは0から7の整数のいずれかを表す。)
【００６５】
【化５】
2006204256.tif 000006
【００６６】
(式中R4は芳香環への置換基を示し、R4は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中dは0から7の整数のいずれかを表す。)
【００６７】
【化６】
2006204256.tif 000007
【００６８】
(式中R5は芳香環への置換基を示し、R5は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す）基、SO2R"（R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中eは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００６９】
【化７】
2006204256.tif 000008
【００７０】
(式中R6は芳香環への置換基を示し、R6は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す）基、SO2R"（R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中fは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００７１】
【化８】
2006204256.tif 000009
【００７２】
(式中gは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００７３】
【化９】
2006204256.tif 000010
【００７４】
(式中hは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００７５】
【化１０】
2006204256.tif 000011
【００７６】
(式中iは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００７７】
【化１１】
2006204256.tif 000012
【００７８】
(式中jは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００７９】
【化１２】
2006204256.tif 000013
【００８０】
(式中R7はシクロヘキシル基への置換基を示し、R7は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中kは0から8の整数のいずれかを表す。)
【００８１】
【化１３】
2006204256.tif 000014
【００８２】
(式中R8はシクロヘキシルオキシ基への置換基を示し、R8は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中mは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００８３】
【化１４】
2006204256.tif 000015
【００８４】
(式中nは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００８５】
【化１５】
2006204256.tif 000016
【００８６】
(式中pは3または5のいずれかの整数を表す。)
【００８７】
【化１６】
2006204256.tif 000017
【００８８】
(式中q1は1から8の整数のいずれかを表し、q2は0から8の整数のいずれかを表す。)
【００８９】
【化１７】
2006204256.tif 000018
【００９０】
(式中R9は水素原子(Ｈ)、Na原子またはK原子であり、式中rは1から8の整数のいずれかを表す。)
ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊株を用いて、３-ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを製造する場合は、ＰＨＡ生産用の原料としてそれぞれ対応するアルカン酸またはアルカンと、破壊株の増殖用炭素源とを少なくとも含んだ無機培地などを用いることができる。
【００９１】
増殖用炭素源としては、酵母エキスやポリペプトン、肉エキス、カザミノ酸などの天然物由来の培地成分を用いることが可能であり、更に、糖類、ＴＣＡサイクルに関与する有機酸(ＴＣＡ回路中の中間体として生じる有機酸及びＴＣＡ回路から一段階ないしは二段階の生化学反応を経て生じる有機酸)或いはその塩等、β酸化サイクルを経ずにアセチルＣoＡを生じる化合物であれば、いかなる化合物でも用いることができ、用いる菌株に対する基質としての有用性で適宜選択することができる。
【００９２】
これらのうち、糖類としては、グリセロアルデヒド、エリスロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、グリセロール、エリスリトール、キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００９３】
また、有機酸或いはその塩としては、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸などがその例であり、或いはその塩から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【００９４】
これらの中でも、特に糖類を用いるのが好ましく、中でもグルコース、フルクトース、マンノースからなる群から選択される少なくとも一つであることがより好ましい。
ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊株にＰＨＡを生産・蓄積させる方法としては、一旦十分に増殖させて後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態で更に培養すると生産性が向上する場合がある。具体的には、前記の工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。例えば、Ｄ-グルコースを 0.05重量％から 5.0重量％程度、および、アルカン酸またはアルカンを 0.01重量％から 1.0重量％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、菌体を遠心分離等で回収したのち、アルカン酸またはアルカンを 0.01重量％から 1.0重量％程度含んだ、窒素源を制限した、あるいは実質的に存在しない無機培地でさらに培養する方法がある。
【００９５】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩等)、窒素源(例えば、アンモニウム塩、硝酸塩等)等、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、ＭＳＢ培地、Ｅ培地(J.Ｂiol.Ｃheｍ.,218，97-106(1956))、Ｍ９培地等を挙げることができる。
なお、本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成は以下の通りである。
【００９６】
Ｎa2ＨＰＯ4:    6.2g
ＫＨ2ＰＯ4 :    3.0g
ＮaＣl    ：    0.5g
ＮＨ4Ｃl  ：    1.0g
(培地１リットル中、pＨ 7.0)
更に、良好な増殖及びＰＨＡの生産のためには、上記の無機塩培地に培地に以下に示す微量成分溶液を 0.3％(v/v)程度添加するのが好ましい。
微量成分溶液
ニトリロ三酢酸:     1.5g
ＭgＳＯ4      :     3.0g
ＭnＳＯ4      :     0.5g
ＮaＣl        :     1.0g
ＦeＳＯ4      :     0.1g
ＣaＣl2       :     0.1g
ＣoＣl2       :     0.1g
ＺnＳＯ4      :     0.1g
ＣuＳＯ4      :     0.1g
ＡlＫ(ＳＯ4)2  :    0.1g
Ｈ3ＢＯ3       :    0.1g
Ｎa2ＭoＯ4     :    0.1g
ＮｉＣｌ2        :    0.1g
(１リットル中)
培養温度としてはポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば 15〜40℃、好ましくは 20〜35℃、更に好ましくは 20℃から 30℃程度が適当である。
【００９７】
具体的な例としては、Ｄ-グルコースを 0.05重量％から 5.0重量％程度、および、アルカン酸またはアルカンを 0.01重量％から 1.0重量％程度含んだ無機培地等で培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは全くない所望のＰＨＡを抽出することができる。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。Ｄ-グルコースの代わりに同量のＴＣＡサイクルに関与する有機酸や、酵母エキス、ポリペプトンを与えても良い。また、それらの組み合わせを用いてもよい。
【００９８】
本発明にかかる培養液からのＰＨＡの取得には、通常行なわれている方法を適用することができる。ＰＨＡが培養液中に分泌される場合は、培養液からの抽出精製方法が、また、菌体に蓄積される場合は、菌体からの抽出精製方法が用いられる。例えば、微生物の培養菌体からのＰＨＡの回収には、通常行なわれているクロロホルムなどの有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、クロロホルム以外にジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトンが用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡ等の薬剤による処理によってＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、ＰＨＡを回収する方法を用いることもできる。
【００９９】
なお、本発明の微生物の培養、本発明の微生物によるＰＨＡの生産と菌体への蓄積、並びに、本発明における菌体からのＰＨＡの回収は、上記の方法に限定されるものではない。
【実施例】
【０１００】
ポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ YN２１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. YN２１、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５６９）の薬剤耐性に関する予備検討の結果、アンピシリンとクロラムフェニコールに対しては耐性で、ゲンタマイシンに対しては感受性であることがわかったので、ゲンタマイシンに対する薬剤耐性遺伝子をマーカーにしてポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターを構築した。構築した遺伝子破壊ベクターは配列番号１に示す塩基配列の塩基番号３６から塩基番号７０８の部分配列（途中、配列番号１の塩基番号３４５の位置で制限酵素XbaIにより切断されるように塩基配列が置換されている）を含む環状プラスミドDNA（pPZ1（配列番号１０））である。以下その手順について説明する。図１はその手順の概略について図示したものである。
【０１０１】
１）ゲノムDNAの調製
シュードモナス スピーシーズ YN２１株を0.5％(w/v)ポリペプトンを含むM9培地で、３０℃、２４時間培養した。培養液から菌体を集菌した後、Wizard Genomic DNA Purification System(プロメガ(株)製)を用いて、YN2１株のゲノムDNAを調製した。
２）インサートDNA断片の調整
YN２１株のゲノムDNAをテンプレートとして、phaZ-f1（配列番号２）およびphaZ-r1（配列番号３）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いて、PCR（ポリメラーゼチェーン反応）を行った。以下の反応混合液を調製した。
【０１０２】
【表１】
2006204256.tif 000019
【０１０３】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６５℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で１分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、約３３０塩基対の断片が増幅された。約３３０塩基対のＰＣＲ増幅産物をアガロースゲルから切出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてＤＮＡ断片を回収した。回収した約３３０塩基対のＤＮＡ断片およびphaZ-r2（配列番号４）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用い、YN２１株のゲノムDNAをテンプレートとして、PCRを行った。以下の反応混合液を調製した。
【０１０４】
【表２】
2006204256.tif 000020
【０１０５】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６８℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で１分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、約６９０塩基対の断片が増幅された。約６９０塩基対のＰＣＲ増幅産物をアガロースゲルから切出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてＤＮＡ断片を回収した。約６９０塩基対のＰＣＲ増幅産物の塩基配列を、phaZ-f1（配列番号２）、phaZ-r1（配列番号３）、に示す塩基配列のDNA、配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNA、およびphaZ-r2（配列番号４）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用い、ジェネティックアナライザーCEQ8000（ベックマン コールター製）で解析した。増幅産物は配列番号１のDNAの塩基番号３６から塩基番号７０８までの６７３塩基分の部分配列（途中、配列番号１の塩基番号３４５の位置で制限酵素XbaIにより切断されるように塩基配列が置換されている）に相当することが確認できた。上記PCRに用いたプライマー；phaZ-f1（配列番号２）中には制限酵素SacIの認識部位、phaZ-r1（配列番号３）中には制限酵素XbaIの認識部位、phaZ-r2（配列番号４）中には制限酵素BamHIの認識部位がそれぞれ予め含まれている。約６９０塩基対のＰＣＲ増幅産物を制限酵素BamHIとSacIで消化した。
また、上記約６９０塩基対は、（１）高イオン濃度下[6xSSC(900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム)  に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより配列番号１で示される塩基配列を含むＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下[0.1xSSC(15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム)]  に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも該ハイブリッドが維持され、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡであることが確認された。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの検出はAlkPhos Direct Labelling and Detection System（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて行った。
【０１０６】
３）ベクターDNA断片の調製
pEX100T（ATCCナンバー87436）をテンプレートに、pEX-f1（配列番号５）およびpEX-r1（配列番号６）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いPCRを行った。
以下の反応混合液を調製した。
【０１０７】
【表３】
2006204256.tif 000021
【０１０８】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６５℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で6分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、約5.6kbの断片が増幅された。用いたプライマーpEX-f1（配列番号５）中には制限酵素BamHIの認識部位、pEX-r1（配列番号６）中には制限酵素SacIの認識部位がそれぞれ予め含まれている。約5.6kbのPCR産物を制限酵素BamHIとSacIで消化した後、Calf Intestine Alkaline Phosphatase（宝酒造（株）製）を用いて5'末端を脱リン酸化処理した。
【０１０９】
４）ライゲーション
前記２）で調製した約６９０塩基対のBamHI・SacI消化産物（インサート）と、前記３）で調整した約5.6kbのBamHI・SacI消化産物（ベクター）とを、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造（株）製）を用いてライゲーションした。以下にライゲーション反応液の組成を示す。
【０１１０】
【表４】
2006204256.tif 000022
【０１１１】
ライゲーション反応液を１６℃の恒温槽で１時間保持した後、Escherichia coli JM109コンピテントセルに形質転換した。アンピシリン100μg/mlを含むLB寒天プレート上で増殖可能なコロニーを選択した。その結果、プラスミドpEX-phaZ（配列番号７）を得た。プラスミドpEX-phaZの制限酵素切断地図を図２に示す。
【０１１２】
５）ゲンタマイシンカセットの挿入
前記４）で調整したプラスミドpEX-phaZを制限酵素XbaIで消化したした後、Calf Intestine Alkaline Phosphatase（宝酒造（株）製）を用いて5'末端を脱リン酸化処理した。pDONR207(インビトロジェン(株)製)をテンプレートに、gen-f1(配列番号８)およびgen-r1（配列番号９）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いてPCRを行った。
以下の反応混合液を調製した。
【０１１３】
【表５】
2006204256.tif 000023
【０１１４】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６５℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で1分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、約850塩基対の断片が増幅された。用いたプライマーgen-f1（配列番号８）およびgen-r1（配列番号９）中には制限酵素XbaIの認識部位が予め含まれており、制限酵素XbaIを用いて、約850塩基のPCR産物を消化した。前記約８５０塩基対のXbaI消化産物（インサート）と、pEX-phaZのXbaI消化産物（ベクター）とをライゲーションした。以下にライゲーション反応液の組成を示す。
【０１１５】
【表６】
2006204256.tif 000024
【０１１６】
ライゲーション反応液を１６℃の恒温槽で１時間保持した後、Escherichia coli JM109コンピテントセルに形質転換した。ゲンタマイシン15μg/mlを含むLB寒天プレート上で増殖可能なコロニーを選択した。その結果、プラスミドpPZ１（配列番号１０）を得た。プラスミドｐPZ1（ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクター）の制限酵素切断地図を図３に示す。
【０１１７】
（実施例２）
[ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ PZ1株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. PZ1、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７１）の取得]
実施例１で構築したポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクター（プラスミドpPZ１、配列番号１０）で大腸菌mobilizing strain Escherichia coli S17-1（ATCCナンバー47055）をエレクトロポーレーション法により形質転換した。エレクトロポーレーションの条件は、2.5kV、25μF、200Ωで、0.2cmギャップのセル（ジーンパルサーキュベット0.2cm、バイオラッド社製）で市販のエレクトロポーレーション装置（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ，バイオラッド社製）を用いて行った。ゲンタマイシン15μg/mlを含むLB寒天プレート上で増殖可能なコロニーとして取得したS17-1株のpPZ1形質転換体を、アンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地５mlで、３０℃、１２時間振とう培養した。また、シュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株をアンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地５mlで、３０℃、１２時間振とう培養した。E. coli S17-1株のpPZ1形質転換体の培養液１50μｌをアンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地150mlに接種し、600nmでの吸光度（対照として滅菌したＬＢ液体培地を用いた）を随時モニターしながら３０℃で振とう培養した。同様にＹＮ２１株の培養液１50μｌをアンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地150mlに接種し、600nmでの吸光度（対照として滅菌したＬＢ液体培地を用いた）を随時モニターしながら３０℃で振とう培養した。E. coli S17-1株のpPZ1形質転換体の培養液（600nmでの吸光度は0.35であった）の4.5ｍｌと、ＹＮ２１株の培養液（600nmでの吸光度は0.39であった）の0.5ｍｌとを、混合し、ニトロセルロース製フィルター（ポアサイズ0.45μm、直径25mm、ミリポア製white surfactant free HATF）を用いて、ろ過して集菌した。
【０１１８】
ニトロセルロース製フィルターの集菌した面を上に向け、ＬＢ寒天プレート上に乗せて、乾燥しないように蓋をかぶせ、30℃で90分間恒温保持した。アンピシリン100μg/mlを含むＬＢ液体培地の１ｍｌで、フィルター上の菌体をピペッティングにより懸濁し、懸濁液の適量をゲンタマイシン15μg/ml、およびクロラムフェニコール10μg/mlを含むＬＢ寒天プレートに蒔種した。30℃で2日間培養後出現したコロニーを、ゲンタマイシン15μg/ml、クロラムフェニコール10μg/ml、およびシュークロース％(w/v)を含むＬＢ寒天プレートに画線して、30℃で2日間培養した。ゲンタマイシン15μg/ml、およびクロラムフェニコール10μg/ml、シュークロース％(w/v)を含むＬＢ寒天プレート上に生育したコロニーの幾つかを、ゲンタマイシン15μg/ml、クロラムフェニコール10μg/mlおよび0.5％(w/v)ポリペプトンを含むM9培地で、３０℃、２４時間培養した。培養液から菌体を集菌した後、Wizard Genomic DNA Purification System(プロメガ(株)製)を用いて、ゲノムDNAを調製した。調製したゲノムＤＮＡ、および対照としてＹＮ２１株のゲノムＤＮＡ（前記１）で調製したもの）をテンプレートとして、phaZ-f1（配列番号２）と phaZ-r2（配列番号４）に示す塩基配列のＤＮＡをプライマーとして用いPCRを行った。以下の反応混合液を調製した。
【０１１９】
【表７】
2006204256.tif 000025
【０１２０】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６４℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で２分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により行った。その結果、新たに取得したコロニーから調製したゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いた場合には約1.5 kbのDNA断片が、また対照のYN21株から調製したゲノムDNAをテンプレートとして用いた場合には約690塩基対のDNA断片がそれぞれ増幅された。これは、新たに取得されたコロニーではポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の中程に、ゲンタマイシン耐性遺伝子を含むDNAが挿入され、この分だけPCRによって増幅されるDNA断片の長さが長くなったことを表しており、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子が破壊されていることを意味する。
【０１２１】
（実施例３）
[ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズ PZ１株を用いたPHA生産]
0．5％（w/v）ポリペプトン、0．5％（w/v）グルコース、１２ｍＭ 5-フェニル吉草酸（ＰＶＡ）を含むＭ９培地 200ｍLに、PZ1株または対照としてＹＮ21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。１３８時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラム:ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により測定した。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。それらの結果を表８に示す。
【０１２２】
【表８】
2006204256.tif 000026
【０１２３】
表８の結果から明らかなように、ＰＺ１株の方がポリヒドロキシアルカノエートの生産性が高く、本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌がunusualなＰＨＡの生産に有用であることがわかった。
【０１２４】
（実施例４）
[ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズ PZ１株を用いたPHA生産]
0．２％（w/v）ポリペプトン、0．２％（w/v）グルコース、０．１％（v/v）ノナン酸を含むＭ９培地 200ｍLに、PZ1株または対照としてＹＮ21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。９０時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラム:ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により測定した。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。それらの結果を表９に示す。
【０１２５】
【表９】
2006204256.tif 000027
【０１２６】
表９の結果から明らかなように、ＰＺ１株の方がポリヒドロキシアルカノエートの生産性が高く、本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌がusualなＰＨＡの生産にも有用であることがわかった。
【０１２７】
（実施例５）
[ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズ PZ１株を用いたPHA生産]
０．５％（w/v）ポリペプトン、０．５％（w/v）グルコース、１２ｍＭ 5-フェニル吉草酸（ＰＶＡ）を含むＭ９培地 ５０ｍLに、PZ1株または対照としてＹＮ21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で、24時間、48時間、96時間、または195時間振盪培養した。
また、０．５％（w/v）ポリペプトン、０．５％（w/v）グルコース、１２ｍＭ 5-フェニル吉草酸（ＰＶＡ）を含むＭ９培地 ５０ｍLに、PZ1株または対照としてＹＮ21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で48時間振盪培養後、菌体を遠心分離によって回収し、炭素源を含まないＭ９培地２００ｍＬに再懸濁し、更に30℃、125ストローク/分で１４７時間振盪培養した。それぞれの菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１２８】
得られたＰＨＡの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラム:ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により測定した。これらの結果を表１０および表１１に示す。
【表１０】
2006204256.tif 000028
【０１２９】
【表１１】
2006204256.tif 000029
【０１３０】
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。結果、製造されたＰＨＡは3-ヒドロキシ-5-フェニル吉草酸のホモポリマーであった。
【０１３１】
以上の結果から明らかなように、ＰＺ１株はポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子が破壊されているため、従来のポリヒドロキシアルカノエート生産菌であるＹＮ２１株よりも生産性が向上しており、ＰＨＡの生産に有用であることがわかった。
【０１３２】
（実施例６）
[ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズ PZ１株を用いたPHA生産]
０．５％（w/v）ポリペプトン、および０．５％（w/v）グルコースを含むＭ９培地 ５０ｍLに、次の表に示すアルカン酸を個別に加えた培地をそれぞれ調製した。
【０１３３】
【表１２】
2006204256.tif 000030
【０１３４】
ＰＺ１株または対照としてＹＮ21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で、96時間振盪培養した。それぞれの菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１３５】
得られたＰＨＡのモノマーユニット比を、1H−NMR（FT−NMR：BrukerDPX４００；共鳴周波数：４００MHｚ；測定核種：１H；使用溶媒：CDCｌ３；ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：キャピラリ封入TMS／CDCｌ３；測定温度：室温）によってもとめた。ポリマー乾燥重量（PDW）およびモノマーユニット比の結果を表１３（１）及び（２）に示す。
【０１３６】
【表１３】
2006204256.tif 000031
【０１３７】
【表１４】
2006204256.tif 000032
【０１３８】
以上の結果から明らかなように、ＰＺ１株は従来のポリヒドロキシアルカノエート生産菌であるＹＮ２１株よりも生産性が向上しており、ＰＨＡの生産に有用であることがわかった。
【０１３９】
（実施例７）
［YN２１株の取得］
ポリペプトン0．5％、フェニル吉草酸0．1％、ミネラル溶液0．3％、粉末寒天1.2%を含むＭ９培地をオートクレーブ滅菌し、50℃に冷却後、ナイルレッドを0.05%含有するDMSO溶液を0．1％添加し、滅菌シャーレに15mlずつ分注し、寒天を固化させて寒天培地を作製した。
【０１４０】
なお、M9培地及びミネラル溶液の組成は以下に示す。
[M9培地]
Ｎa2ＨＰＯ4：６.２g、ＫＨ2ＰＯ4：３.０ｇ、ＮaＣl：０.５g、ＮＨ4Ｃl：１.０g（培地１リットル中、pＨ７.０）
[ミネラル溶液]
ニトリロ三酢酸：1.5 g、ＭgＳＯ4：3.0 g、ＭnＳＯ4：0.5 g、ＮaＣl：1.0 g、ＦeＳＯ4：0.1 g、ＣaＣl2：0.1 g、ＣoＣl2：0.1 g、ＺnＳＯ4：0.1 g、ＣuＳＯ4：0.1 g、ＡlＫ(ＳＯ4)2：0.1 g、Ｈ3ＢＯ3：0.1 g、Ｎa2ＭoＯ4：0.1 g、ＮiＣl2：0.1 g（１リットル中、pH7.0）
次に、野外から採取した土壌試料5gを10mlの滅菌蒸留水に添加し、1分間攪拌した。この土壌懸濁液0．5mlを4．5mlの滅菌水に添加・攪拌し、10倍希釈液を作製した。同様の操作を繰り返し、100倍希釈液、1000倍希釈液、10000倍希釈液を作製した。10倍〜10000倍希釈液を先に作製した寒天培地に各0．1mlずつ分注し、寒天表面に均一になるように広げた。これを培養器に移し、30℃で5日間培養した。培養後、PHAを合成したと思われる赤色のコロニーのうち、形態の異なる株を分離した。こうして野生株を十数株取得した。次に、ポリペプトン0．5％、グルコース0．5％、フェニル吉草酸0．1％、ミネラル溶液0．3％を含むＭ９培地（pH7.0）50mlに上記野生株を保存寒天培地のコロニーから植菌し、500ml容坂口フラスコにて30℃、125ストローク／分で振盪培養した。また上記培地をpH5.0、pH8.5にそれぞれ調整した培地に関しても同様に培養を行った。72時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて洗浄した後、真空乾燥した。この乾燥菌体ペレットを酢酸エチル１０ｍｌに懸濁し、３５℃で１５時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させ、沈澱物のみを回収して真空乾燥し、得られたＰＨＡを秤量してポリマー乾燥重量（PDW）を求めた。得られたＰＨＡのモノマーユニット比を、１Ｈ−ＮＭＲ（ＦＴ−ＮＭＲ：ＢｒｕｋｅｒＤＰＸ４００；共鳴周波数：４００ＭＨｚ；測定核種：１Ｈ；使用溶媒：ＣＤＣｌ３；ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ３；測定温度：室温）によって求めた。以上により得られたポリマー乾燥重量（PDW）及びモノマーユニット比を各野生株及び従来菌株に関して比較することで、PHA生産性を有するYN21株を取得した。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】実施例１で例示したポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターを構築する手順の概略を図示したものである。
【図２】実施例１で構築したプラスミドpEX-phaZの制限酵素切断地図である。
【図３】実施例１で構築したプラスミドpPZ1（ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクター）の制限酵素切断地図である。
【図４】遺伝子挿入破壊法と遺伝子置換破壊法による選択的遺伝子破壊の方法を図示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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