(57)【要約】【課題】  簡単な操作でかつ短時間のうちに、細胞の懸濁液から夾雑物を取り除く方法        、およびその細胞精製デバイスを提供すること。【解決手段】  細胞および夾雑物を含む細胞懸濁液から、夾雑物を除去し、細胞を精製する方法を提供する。該方法は：三次元多孔質体に水分を含ませること；三次元多孔質体へ、細胞の懸濁液をチャージすること；該懸濁液を、該三次元多孔質体に導入させること；および、細胞を該三次元多孔質体に捕捉させ、かつ該懸濁液中の夾雑物を該三次元多孔質体を通過させること；を含む。本発明は、該方法に使用するためのデバイスも提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞および夾雑物を含む細胞懸濁液から、夾雑物を除去し、細胞を精製する方法であって、該方法は：
三次元多孔質体に水分を含ませること；
三次元多孔質体へ、細胞懸濁液をチャージすること；
該懸濁液を、該三次元多孔質体に導入させること；
細胞を該三次元多孔質体に捕捉させ、かつ該懸濁液中の夾雑物を、液体とともに該三次元多孔質体を通過させること；
を含み、
ここで、該三次元多孔質体は、厚みが５００μｍ以上１ｃｍ以下であり、
該三次元多孔質体は、孔径が１０μｍ以上８００μｍ以下である、縦長形状の細孔を含み、
該細孔は、三次元多孔質体の一方または両方の面に開孔し、該開孔部は細胞懸濁液の出口および入口として機能し、入口として機能する開孔部の孔径は２００μｍ以上８００μｍ以下であり、出口として機能する開孔部の孔径は１μｍ以上１００μｍ以下であり、かつここで、該細孔が一方の面に開孔する場合は、該縦長形状の細孔は互いに連通し得ることを特徴とする方法。
【請求項２】
夾雑物が、細胞の分解物、細胞の分泌物、培地成分および培養操作で混入する微粒子からなる群より選ばれる少なくとも１種以上を含む、請求項１の精製方法。
【請求項３】
三次元多孔質体材料が、生体適合性材料を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
細胞懸濁液が、骨髄液、末梢血、リンパ液、粘液、脂肪組織分解液に由来することを特徴とする請求項１の方法。
【請求項５】
除去される夾雑物が、単球、顆粒球、リンパ球、赤血球、および血小板からなる群より選ばれる少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項６】
細胞を捕捉させた三次元多孔質体に、三次元多孔質体を通過した液体を逆方向から通過させることにより、精製された細胞を回収することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項７】
回収液が、緩衝液、培地、およびタンパク質分解酵素からなる群より選ばれる少なくとも１種以上である請求項１の方法。
【請求項８】
デバイスであって、該デバイスは三次元多孔質体を備え、
ここで、該三次元多孔質体は、厚みが５００μｍ以上１ｃｍ以下であり、
該三次元多孔質体は、孔径が１０μｍ以上８００μｍ以下である、縦長形状の細孔を含み、
該細孔は、三次元多孔質体の一方または両方の面に開孔し、該開孔部は細胞懸濁液の出口および入口として機能し、入口として機能する開孔部の孔径は２００μｍ以上８００μｍ以下であり、出口として機能する開孔部の孔径は１μｍ以上１００μｍ以下であり、
かつここで、該細孔が一方の面に開孔する場合は、該縦長形状の細孔は互いに連通しており、
かつここで、
三次元多孔質体に水分を含ませ、
三次元多孔質体へ、細胞懸濁液をチャージし、
該懸濁液を、該三次元多孔質体に導入させ、
細胞を該三次元多孔質体に捕捉させ、かつ該懸濁液中の夾雑物を該三次元多孔質体を通過させ、
それによって、細胞および夾雑物を含む細胞懸濁液から、細胞を精製し得ることを特徴とする、デバイス。
【請求項９】
夾雑物が、細胞の分解物、細胞の分泌物、培地成分および培養操作で混入する微粒子からなる群より選ばれる少なくとも１種以上を含む、請求項８のデバイス。
【請求項１０】
三次元多孔質体材料が、生体適合性材料を含む、請求項８のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞懸濁液に含まれる、目的とした細胞以外の夾雑物を取り除き、細胞を精製するための方法、および当該方法における使用に適したデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、患者本人または提供者（ドナー）の組織から細胞を採取し、それらをインビトロで加工・増幅したものを患部へ移植する再生医療が盛んに研究されている。活きた細胞を用いるという従来の医療とは全く異なるアプローチであるため、有効な治療法が存在しなかった疾患を治療できる可能性がある。既に、皮膚、骨、軟骨、角膜などの臓器では一部の疾患においてその安全性と有効性が示されており、患者に有益な再生医療の社会的な普及が待望されている（非特許文献１）。その一方、インビトロで加工・増幅された細胞を生体内に移植するので、その発ガン性や培養工程での夾雑物の混入（例えば細胞由来の分解物、分泌物、増幅に使用した牛血清等の動物由来成分）など、安全性や作業性の面で克服すべき課題が多い。
【０００３】
移植用に細胞を加工・増幅するには、患者からの組織採取、セルプロセシングセンターへの輸送、血液成分との分離、目的細胞の単離、血清入り培地とのインキュベーション、細胞の継代、細胞懸濁液の調製、移植するための三次元多孔質体への播種など、多段階の製造工程を経るため、最終製品に含まれる培養細胞の純度が低くなる恐れがある。移植を目的とした通常の細胞増幅操作（例えば、トリプシン処理、遠心処理）では、培養した細胞自身の分泌物や分解生成物といった夾雑物、培養に使用した牛血清やサイトカイン等の動物由来成分といった夾雑物、および目的細胞以外に起因する夾雑物、例えば単球、顆粒球、リンパ球、赤血球、血小板が除去されずに、そのまま移植細胞と共に生体内へ持ち込む可能性がある。しかしながら、このような夾雑物が引き起こす生体反応や免疫原性など種々の問題について、十分に議論されてはいない。また、培養増幅した細胞を純化し、それを移植に供する方法についても十分に検討されてはいない。
【０００４】
例えば、特公平6-6155号公報（特許文献１）では、生分解性材料である、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリラクト酸、コラーゲンの共重合体、混合物およびそれらの組み合わせから形成される三次元多孔質体に軟骨細胞を植え付けたものを患部へ縫合移植する方法が提案されている。しかしながら、特定の内部構造を用いることで、培養工程で生じた夾雑物が除去可能になるとの記載は一切ない。
【０００５】
同様に、特開2004-194944号公報（特許文献２）では、架橋された１μｍ〜５００μｍのポアサイズを有するコラーゲンスポンジを三次元多孔質体として軟骨培養をする方法が提案されている。しかしながら、特定の内部構造を用いることで、培養工程で生じた夾雑物が除去可能になるとの記載は一切ない。
【０００６】
また、特開平11-9270号公報（特許文献３）では、平均孔径が１０μｍ以上１００μｍ未満の多孔質素子に平均繊維径が０．０１μｍ 以上１．０μｍ 未満の網目状構造を形成している繊維構造体を保持させてなる細胞捕捉材を含有する細胞分離回収器に、有核細胞含有液を通液することにより、有核細胞を分離回収し、赤血球や血小板等を除去する方法が提案されている。しかしながら、この細胞分離回収器は、多孔質素子に平均繊維径が０．０１μｍ 以上１．０μｍ 未満の網目状構造を形成している。
【特許文献１】特公平6-6155号
【特許文献２】特開2004-194944号
【特許文献３】特開平11-9270号公報
【非特許文献１】Robert P. Lanza, Robert Langer, Joseph Vacantiら：再生医学                                        ティッシュエンジニアリングの基礎から最先端技術まで(２００２                    年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、簡単な操作でかつ短時間のうちに、細胞の懸濁液に含まれる、目的とした細胞以外の夾雑物を取り除くための方法、および当該方法における使用に適したデバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
驚くべきことに、細胞懸濁液を、ある種の三次元多孔質体に通過させることによって、大量の細胞を三次元多孔質体に捕捉させながら、懸濁液に含まれる目的細胞以外の夾雑物を除くことができる。また、本発明は、回収液を逆方向から流すことにより、高率にかつ容易に細胞を回収することもできる。よって本発明は提供するのは、以下のとおりである：
[１]
細胞および夾雑物を含む細胞懸濁液から、夾雑物を除去し、細胞を精製する方法であって、該方法は：
三次元多孔質体に水分を含ませること；
三次元多孔質体へ、細胞懸濁液をチャージすること；
該懸濁液を、該三次元多孔質体に導入させること；
細胞を該三次元多孔質体に捕捉させ、かつ該懸濁液中の夾雑物を、液体とともに該三次元多孔質体を通過させること；
を含み、
ここで、該三次元多孔質体は、厚みが５００μｍ以上１ｃｍ以下であり、
該三次元多孔質体は、孔径が１０μｍ以上８００μｍ以下である、縦長形状の細孔を含み、
該細孔は、三次元多孔質体の一方または両方の面に開孔し、該開孔部は細胞懸濁液の出口および入口として機能し、入口として機能する開孔部の孔径は２００μｍ以上８００μｍ以下であり、出口として機能する開孔部の孔径は１μｍ以上１００μｍ以下であり、かつここで、該細孔が一方の面に開孔する場合は、該縦長形状の細孔は互いに連通し得ることを特徴とする方法。
[２]
夾雑物が、細胞の分解物、細胞の分泌物、培地成分および培養操作で混入する微粒子からなる群より選ばれる少なくとも１種以上を含む、[１]の精製方法。
[３]
三次元多孔質体材料が、生体適合性材料を含む、[１]の方法。
[４]
細胞懸濁液が、骨髄液、末梢血、リンパ液、粘液、脂肪組織分解液に由来することを特徴とする[１]の方法。
[５]
除去される夾雑物が、単球、顆粒球、リンパ球、赤血球、および血小板からなる群より選ばれる少なくとも１種以上であることを特徴とする[１]の方法。
[６]
細胞を捕捉させた三次元多孔質体に、三次元多孔質体を通過した液体を逆方向から通過させることにより、精製された細胞を回収することをさらに含む、[１]の方法。
[７]
回収液が、緩衝液、培地、およびタンパク質分解酵素からなる群より選ばれる少なくとも１種以上である[１]の方法。
[８]
デバイスであって、該デバイスは三次元多孔質体を備え、
ここで、該三次元多孔質体は、厚みが５００μｍ以上１ｃｍ以下であり、
該三次元多孔質体は、孔径が１０μｍ以上８００μｍ以下である、縦長形状の細孔を含み、
該細孔は、三次元多孔質体の一方または両方の面に開孔し、該開孔部は細胞懸濁液の出口および入口として機能し、入口として機能する開孔部の孔径は２００μｍ以上８００μｍ以下であり、出口として機能する開孔部の孔径は１μｍ以上１００μｍ以下であり、
かつここで、該細孔が一方の面に開孔する場合は、該縦長形状の細孔は互いに連通し得、
かつここで、
三次元多孔質体に水分を含ませ、
三次元多孔質体へ、細胞懸濁液をチャージし、
該懸濁液を、該三次元多孔質体に導入させ、
細胞を該三次元多孔質体に捕捉させ、かつ該懸濁液中の夾雑物を該三次元多孔質体を通過させ、
それによって、細胞および夾雑物を含む細胞懸濁液から、細胞を精製し得ることを特徴とする、デバイス。
[９]
夾雑物が、細胞の分解物、細胞の分泌物、培地成分および培養操作で混入する微粒子からなる群より選ばれる少なくとも１種以上を含む[８]のデバイス。
[１０]
三次元多孔質体材料が、生体適合性材料を含む[８]のデバイス。
【発明の効果】
【０００９】
簡単な操作でかつ短時間のうちに、特定な多孔質構造を有する三次元多孔質体に細胞懸濁液を通液することにより、細胞を三次元多孔質体に捕捉せしめると同時に、細胞懸濁液に含まれる夾雑物が除去可能となる。よって細胞分解物や培地成分などの混入が少ない、より純度の高い細胞が得られる。該細胞は再生医療に貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書にいう細胞は、動物、植物または微生物の細胞であってよい。好ましくは、哺乳動物の細胞でありえる。より好ましくは、ヒトの細胞であり得る。特に好ましくは、間葉系細胞、なお特に好ましくは、間葉系幹細胞であり得る。
本明細書にいう細胞懸濁液は、細胞が、液体中に懸濁されている任意の流体を意味する。具体的には細胞懸濁液とは、体液由来、例えば、骨髄液、末梢血液などの血液、リンパ液、粘液、細胞の液体中の懸濁液、それらを培養した細胞の懸濁液、脂肪組織の分解液であり得る。
【００１１】
ここでいう液体は、任意の水性溶液であり得る。好ましくは液体は、緩衝液、生理食塩水、培養液であり得る。
【００１２】
本明細書にいう夾雑物は、細胞懸濁液に含まれる目的細胞以外の微粒子、例えば、細胞の分解物、細胞の分泌物、培地成分および培養操作で混入する微粒子、単球、顆粒球、リンパ球、赤血球、および血小板であり得る。
【００１３】
本明細書にいう、培地成分とは、細胞培養で使用する成分、例えば、動物血清、生物由来添加物、電解質、アミノ酸、ペプチド、糖類、脂質、成長因子、ホルモン、抗生物質などを一つ以上含む水溶液であり得る。
【００１４】
本明細書にいう、培養操作で混入する微粒子とは、例えば、空気中に浮遊する塵、ピペット操作による綿、培養容器や細胞培養皿などからのプラスチック等の細かい破片、培地作製に使用した精製水に含まれる塵であり得る。
【００１５】
本明細書にいう、精製とは、細かい点にまで気を配って念を入れて、目的細胞から可能な限り夾雑物を減らすことを意味する。つまり、細胞懸濁液を三次元多孔質体に導入し通過させる際、捕捉される目的細胞以外の微粒子を通過せしめることを意味する。
【００１６】
細胞を三次元多孔質体にチャージするために、細胞懸濁液を、三次元多孔質体に、滴下、または注入し得る。
細胞懸濁液を、三次元多孔質体にチャージする前に、三次元多孔質体内に、水分を含ませる。水分は前記液体と同じものを使用してもいいし、他の液体を使用してもよい。水分を含ませる方法は特に限定されないが、好ましくは、密閉可能なチャンバーにおいて、三次元多孔質体を液体中に浸漬し、チャンバー内圧力を減圧し、ついで環境圧力に戻すことによって、水分包含を達成し得る。
【００１７】
本明細書にいう三次元多孔質体は、多数の微細な孔または空隙を有する成形物を意味する。例えば、三次元多孔質体は、細胞を内部に内在化すると同時に血清成分や栄養因子、また老廃物等の循環が円滑に行われるような構造を持つ、細胞培養のための三次元多孔質体であってもよい。
【００１８】
三次元多孔質体の形状は、三次元であれば限定されないが、球状、粒状、平膜状、繊維状、中空糸状、直方体、立方体、概平板状等いずれも有効に用いられる。三次元多孔質体内の細胞懸濁液を十分かつ均等に通過する等の点から概平板状が好ましい。また、三次元多孔質体を平板状にまず作製した後、これを厚みを有する円筒状（チューブ状）、角柱状等の形状に変形させたものを用いることもできる。
【００１９】
好ましくは、本明細書にいう三次元多孔質体は、孔径１０μｍ以上８００μｍ以下、孔５００μｍ以上１ｃｍ以下の縦長形状の孔が並列的に配置された構造を有することを特徴とする。並置された各孔間は孔径１μｍ以上１０μｍ以下の小孔で連通してもよい。
【００２０】
縦長形状は、少なくとも一方の孔径は、細胞を捕捉するために、十分小さいべきである。このような縦長形状は、円錐状、角柱状であってもよいが、好ましくは紡錘状である。
【００２１】
本明細書にいう三次元多孔質体は、孔径が１０μｍ以上８００μｍ以下、好ましくは１０μｍ以上５００μｍ以下である、縦長形状の細孔を有し得る。該細孔は、三次元多孔質体の一方または両方の面に開孔し、該開孔部は細胞懸濁液の出口および入口として機能し得る。該細孔が、一方の面にしか開孔しない場合は、各孔間は孔径１μｍ以上１０μｍ以下の小孔で連通し得る。また、出口として機能する開孔部の孔径は、夾雑物が通過し、かつ細胞が通過しないために、孔径1μｍ以上100μｍ以下、好ましくは１μｍ以上50μｍ以下、より好ましくは１μｍ以上30μｍ以下、もっとも好ましくは１μｍ以上１０μｍ以下であり得る。
【００２２】
入口として機能する開孔部の孔径は、２００μｍ以上８００μｍ以下であり得る。該孔径を得るために、開孔処理によることができる。開孔処理された開孔部は、好ましくは、２００μｍ以上３００μｍ以下、さらに好ましくは５０μｍ以上１５０μｍ以下であることもある。
【００２３】
ここにいう「開孔処理」とは孔径を拡大させることを意味し、公知の方法、例えばＷＯ２００４／０３５１０１に開示されるような方法によって処理し得る。具体的には、以下のような塩溶出法による開孔処理、剥離法による開孔処理等が挙げられる。
【００２４】
塩溶出法とは、三次元多孔質体を作製する時に、片面の表層部についてのみ、リーチング法と呼ばれる塩溶出処理操作を組み合わせた方法である。これにより、片面を孔拡大することができ、さらにロート状の形状をとることにより、孔への細胞導入を効率的に行うことができる。
【００２５】
剥離法とは、後述の本発明の凍結乾燥法で作製した三次元多孔質体が、例えば紡錘状の縦長形状の孔の厚み方向の中央付近に広面と並行に空隙あるいは結晶境界を形成することを活用し、三次元多孔質体を中心部あたりで縦に割く形で、つまり平板方向に剥離して作製する方法である。これにより、一方の面（剥離面）に、細胞が容易に通過できる孔径平均５０μｍ以上１５０μｍ以下の孔を確保できる。
【００２６】
好ましくは、開孔面に任意のサイズから成る食塩などの水溶性粒子を散りばめることで成し得る。それによって、細胞が容易に通過できる孔径約２００μｍ以上８００μｍ以下、好ましくは約２００μｍ以上３００μｍ以下、さらに好ましくは５０μｍ以上１５０μｍ以下の孔を確保できる。
【００２７】
なお、本明細書にいう孔径の測定は、例えば、走査型電子顕微鏡（S-3000N、日立製作所製）を利用することで容易に計測することができる。
【００２８】
三次元多孔質体の開孔部の一方は、細胞懸濁液の入口として機能し得、他方は出口として機能し得る。細胞懸濁液は、多孔質体に適用される陰圧にしたがって該入口を経由して細孔内に導入される。驚くべきことに、実質的に細胞のみが該三次元多孔質体の細孔内に捕捉され、実質的に夾雑物および液体のみが、三次元多孔質体を通過し得る。それによって細胞懸濁液から細胞のみを精製し得る。
【００２９】
上記孔の孔長は２０μｍ以上１ｃｍ以下であるが、三次元多孔質体内の細胞懸濁液通過の点から、好ましくは５０μｍ以上５ｍｍ以下である。
【００３０】
本明細書にいう三次元多孔質体では、並置された各孔間は孔径１０μｍ以下の小孔で連通した構造となってもよい。「孔径１０μｍ以下の小孔で連通した構造」とは、上記縦長形状の孔の全個数の５０％以上、好ましくは７０％以上が、孔径１０μｍ以下である小孔で互いに連結された構造を意味する。この小孔は、細胞懸濁液等の溶液は通すが、細胞は通さない程度のものである。
【００３１】
本明細書にいう三次元多孔質体において、有孔率は７０％以上であることが好ましいが、細胞密度確保の点から７０〜９５％のものがより好ましい。ここで「有孔率」とは、三次元多孔質体における縦長形状の孔と小孔との合計の割合をいい、単位体積あたりの三次元多孔質体材料の重量から算出したものである。
【００３２】
また、孔径及び孔長は、電子顕微鏡観察による単位視野あたりに存在するすべての孔の内径、長さの測定を最低３視野について行い、このデータを統合することにより算出する。
【００３３】
本明細書にいう三次元多孔質体の構造としては、不織布、フォーム、スポンジ、織物構造等が挙げられるが、機械的強度を考慮してフォーム構造又は、縦長形状の細孔であって該細孔は、三次元多孔質体の一方または両方の面に開孔し、ここで、該細孔が一方の面に開孔する場合は、該縦長形状の細孔は互いに連通している構造が好ましい。
【００３４】
本発明のより好ましい態様として、厚み方向に縦長な形状の孔が面方向に並列的に配置された概平板形状を有し、一方の面が開孔処理されている三次元多孔質体を挙げることができる。該三次元多孔質体は、厚みが５００μｍ以上１ｃｍ以下であり得る。
【００３５】
ここで、「厚み方向」とは縦長孔の縦長方向を意味し、「縦長な形状の孔が面方向に並列的に配置」とは縦長孔を同じ方向に並置することを意味する。また、「概平板形状」とは完全な平板形状はもちろんのこと、平板形状に近い形状であるものを全て含むものである。
【００３６】
本明細書にいう三次元多孔質体の材質は特に限定されないが、生理学的条件下で体内に吸収される物質、つまり生体適合性材料が好ましく、これは天然のものでも合成物質でもよい。
【００３７】
三次元多孔質体を構成する生体適合性材料としては、天然物から得られるものと合成により得られるものが挙げられるが、加工性、滅菌性、感染性の点から、加水分解により分解し得る合成ポリマーが好ましく、特にα及びβ−ヒドロキシカルボン酸の加水分解性ポリマーが好ましい。このような生体適合性材料の例としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸／グリコール酸共重合体、ポリεカプロラクトン、乳酸／εカプロラクトン共重合体等が挙げられる。
【００３８】
本発明で使用されるグリコール酸と乳酸との共重合体（ＰＬＧＡ）等の共重合体としては、グリコール酸と乳酸との重量比が、９９：１〜１：９９である共重合体、特に７５：２５〜２５：７５である共重合体が好ましい。また、他の共重合体についても、乳酸以外のコモノマーと乳酸との重量比は、上述したグリコール酸と乳酸との重量比と同じ範囲にあることが好ましい。
【００３９】
本明細書にいう三次元多孔質体は、厚さを適宜設定し、細胞懸濁液の通過を調節することができる。本明細書にいう三次元多孔質体の厚さの例は、５０μｍ〜１ｃｍ、１〜４ｍｍである。
【００４０】
次に三次元多孔質体の製造法について説明する。
【００４１】
本明細書にいう三次元多孔質体の製造法は、下記の工程からなることを特徴とする：
ａ）三次元多孔質体材料を有機溶媒に溶解し、
ｂ）調製した溶液を型枠に流し込んだ後、３℃／分以上の冷却速度で凍結し、
ｃ）凍結した溶液を真空乾燥して、有機溶媒を除去する。
【００４２】
なお、当該製造法を本発明の凍結乾燥法ともいい、特に両面から同時に３℃／分以上の冷却速度で急速に凍結することを特徴とする。
【００４３】
凍結乾燥処理に先立ってこれら三次元多孔質体材料を溶液状にするにあたり、溶媒としては、通常種々の有機溶媒を用いることができるが、好ましくはクロロホルム、ジオキサン、ポリエチレングリコール等である。
【００４４】
また、溶解させた三次元多孔質体材料の溶液を流し込む型枠について、その材質は特に限定されるものではないが、凍結乾燥処理に耐える材質である金属、ガラス製等が好ましい。
【００４５】
また、上記型枠の形状は特に限定されず、例えば軟骨損傷治療の場合には、軟骨の構造に類似する概平板形状を用いる等、再生を目指す各組織の形状の構築を基本とするものであれば、各疾患の治療上有効な形状については、すべて使用することができる。
【００４６】
凍結による固化は、少なくとも３℃／分の温度低下、つまり３℃／分以上の冷却速度となるように急速に凍結させることが必要となる。当該冷却速度は、好ましくは５℃／分以上、１０℃／分以下である。また、特に両面から急速に凍結させることが好ましい。
【００４７】
当該冷却速度は、三次元多孔質体材料を有機溶媒に溶解して得た溶液を型枠に流し込んだものを−４０℃のフリーザーに入れ、当該溶液が固化するまでの時間から算出したものである。
【００４８】
上記冷却速度（温度低下）は、例えば、超低温フリーザーや液体窒素を用いることにより可能となるが、特に、三次元多孔質体材料含有溶液の両面（当該溶液を型枠に流し込み、その上面にガラス板等で蓋をする）に、−４０℃に冷えたブロック（物体）を接触させることにより、急速冷凍することが好ましい。
【００４９】
この後、凍結した溶液を真空乾燥して、有機溶媒を除去することにより、三次元多孔質体を得ることができる。
【００５０】
本発明の好ましい態様である、厚み方向に縦長な形状の孔が面方向に並列的に配置された概平板形状を有し、一方の面が開孔処理されている三次元多孔質体は、剥離法を用いた下記の工程から製造することができる：
ａ）三次元多孔質体材料を有機溶媒に溶解し、
ｂ）調製した溶液を、概平板形状になるような型枠に流し込んだ後、３℃／分以上の冷却速度で凍結し、
ｃ）凍結した溶液を真空乾燥して、有機溶媒を除去し、
ｄ）乾燥後の三次元多孔質体を厚み方向の中心部で平板方向に剥離する。
【００５１】
なお、本明細書において、「厚み方向の中心部で平板方向に剥離する」とは、三次元多孔質体の厚み方向の中央付近で、平板の上下方向に剥離することを意味する。
【００５２】
上記概平板形状を有し、一方の面が開孔処理されている三次元多孔質体は、塩溶出法を用いた下記の工程から製造することもできる：
ａ）三次元多孔質体材料を有機溶媒に溶解し、
ｂ）概平板形状になるような型枠に粒状塩を分散させ、
ｃ）調製した溶液を上記型枠に流し込んだ後、３℃／分以上の冷却速度で凍結し、
ｄ）凍結した溶液を真空乾燥して、有機溶媒を除去し、
ｅ）粒状塩を水洗により除去する。
【００５３】
ここで、粒状塩とは、粒子径５０００μｍ以下の結晶性物質を意味し、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ2のような無機塩、各種アンモニウム塩、クエン酸三ナトリウムのような有機化合物の塩等が挙げられる。粒子径の点から、クエン酸三ナトリウムが特に好ましい。
【００５４】
粒状塩の粒子径としては、好ましくは５０〜２０００μｍ、より好ましくは２００〜８００μｍである。
【００５５】
塩溶出法を用いた本発明の方法で三次元多孔質体を作製した場合、三次元多孔質体の厚みの１〜５０％で塩溶出処理部による孔が形成され、残りの５０％〜９９％で上記縦長形状の孔が形成された構造となる。
【００５６】
三次元多孔質体は、両方の面に約１０μｍの孔を有し、厚み方向に縦長な形状の孔が面方向に並列的に配置された概平板状形状を有し、一方または両方の面が開孔処理されているものである、前記多孔質体を含む。概平板状形状とは、完全な平板形状はもちろんのこと、平板形状に近い形状であるものをすべて含む。
【００５７】
本発明の方法によれば、捕捉される細胞数は、１ｘ１０3ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3三次元多孔質体以上、１ｘ１０8ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3三次元多孔質体以下であることが可能である。細胞数の測定は、三次元多孔質体にチャージする前の細胞懸濁液に含まれる総細胞数から、チャージして通過した液体に含まれる総細胞数を差し引き、それを該三次元多孔質体の体積で除することによって求められる。総細胞数は、細胞懸濁液に含まれる細胞を血球計算盤で数えることによって得られる。
【００５８】
細胞の懸濁液を、三次元多孔質体に導入させるために、三次元多孔質体の、細胞がチャージされない面に、陰圧を適用し得る。陰圧は、細胞が陰圧にもかかわらず三次元多孔質体にほぼ捕捉されるが、夾雑物が陰圧によって三次元多孔質体を通過する程度の強度であり得る。具体的には、厚み約３ｍｍ、開孔処理されている開孔部孔径約500μｍ、開孔処理されていない開孔部孔径約10μｍ、紡錘状の細孔の孔径約10μｍ以上800μｍ以下であるＰＬＧＡ（ポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体）からなる三次元多孔質体を使用する場合、陰圧の強度（ゲージ圧表記）は、−0.1ＭＰaから−0.001ＭＰａ、好ましくは、−0.08ＭＰaから−0.005ＭＰａ、より好ましくは−0.06ＭＰaから−0.01ＭＰａであり得る。もっとも、該強度は、三次元多孔質体の種類、大きさ、孔径などによって変化し得るが、該陰圧の強度は、当業者が実験的または経験的に決定し得る。圧力の測定は、例えば、真空計（A型SUS −0.1ＭＰa〜0ＭＰa、ジーエル サイエンス社）を利用することで容易に計測することができる。
【００５９】
陰圧を、三次元多孔質体の１面に適用する場合、三次元多孔質体を、フィルター上に置き、フィルターを介して三次元多孔質体に陰圧を適用するのが簡便である。フィルターは、滅菌可能であり、その平面が該三次元多孔体と密着することが可能であり、かつ細胞懸濁液がチャージされない下面の陰圧を保持できる構造を有するものが好ましい。フィルター孔径は、三次元多孔質体を保持しつつ、流体例えば空気または水が流通可能であれば、いずれのサイズでもよい。具体的には、孔径0.05μｍ以上７０μｍ以下、好ましくは0.1μｍ以上10μｍ以下、より好ましくは0.15μｍ以上1μｍ以下、もっとも好ましくは0.2μｍ以上0.4μｍ以下であり得る。
【００６０】
具体的にはフィルターの例は、ろ過滅菌用に市販されている孔径0.22μｍのフィルター（150mL ボトルトップフィルター、ベクトン・ディキンソン社）がある。他方の面に、陰圧を、公知の器具によって適用しえる。該器具は、真空ポンプ、シリンジ、水道圧によるアスピレーションなどにより達せられる。
【００６１】
細胞の回収のために、三次元多孔質体を、ひっくりかえしてフィルター上に置き、液体を細胞懸濁液をチャージした方向と逆方向から通過させることにより、精製された細胞を回収することができる。細胞回収は例えば、以下のように実施できる。液体、例えば細胞培養液、生理食塩水、リン酸緩衝液などを、該三次元多孔質体にチャージしつつ、前記と同様に、三次元多孔質体に陰圧を適用する。それによって、出来る限り導入した細胞を洗い出す。この手順を１回好ましくは複数回、例えば３回繰り返し、デバイス内に捕捉せしめた細胞を回収する。このようにして得た細胞回収液を遠心処理することで、精製された細胞を回収することが達せられる。
【００６２】
好ましくは、細胞を導入した該三次元多孔質体に、酵素、例えばトリプシンを処理し、細胞が三次元多孔質体から脱離するのが容易化してもよい。具体的には、１ｍｌの０．２５％トリプシン溶液をのせ、１分間３７℃のＣＯ2インキュベーターに置く。トリプシン処理した三次元多孔質体を、フィルター、例えば７０μｍのセルストレナー（ベクトン・ディキンソン社）の上に、細胞懸濁液をチャージした面を下にして置き、吸引操作により、そのトリプシン溶液を回収してもよい。
【００６３】
次に、図２を参照して、本発明の細胞精製方法を実施するための細胞精製デバイスの使用方法を例示する。器具の組み合わせ方は以下の通りである：５０ｍLの遠沈管（２−１）（2345-052、IWAKI社）の側壁に穴を空け（２−２）、チューブを介して陰圧適用器具、例えば、吸引ポンプと接続しえるバルブなど（２−３）を設置する。遠沈管の上部に、フィルター例えば、孔径７０μｍのセルストレナー（２−４）（ベクトン・ディキンソン社）をはめ込む。三次元多孔質体の下面と同一形状、同一サイズを切り抜いた膜（２−５）を、セルストレーナ上面（２−６）に置く。セルストレーナーの、三次元多孔質体との接触部以外の流体流通を抑制することによって、三次元多孔質体に陰圧が十分適用されるために、膜を使用することが望ましい。任意の実質的に流体流通しない膜、好ましくは樹脂膜を使用できるが、好ましくはPVDF（ポリフッ化ビニリデン）膜を使用する。これによって、陰圧適用器具を作動させた場合、該遠沈チューブ内（２−７）の真空度を高める。そして、細胞を導入するための３次元多孔質体（２−８）を、膜上に配置する。このように器具を組み合わせることにより、細胞懸濁液をチャージしない下面に、陰圧を適用することが可能となる。三次元多孔質体の上面にシリンジなどによって細胞懸濁液をチャージする（２−９）と、陰圧により、細胞の導入が可能となる。なお、細胞を捕捉させた、生物適合性材料からなる三次元多孔質体は、細胞−支持体の結合体として、再生医療目的のために、患者の体内、例えば軟骨内に移植することが可能である。
【００６４】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）培養したヒト骨髄由来間葉系細胞懸濁液に含まれる、目的細胞以外の夾雑物の除去、および細胞懸濁液の、細胞精製デバイスへのチャージ
孔径が１０μｍ以上８００μｍ以下の紡錘状な多孔質構造（図１）を有する、縦２０ｍｍ、横２０ｍｍ、厚さ３ｍｍの、開孔処理された開孔部径 約200μｍ以上800μｍ以下、他方の開孔部径 約10μｍ以上20μｍ以下のＰＬＧＡ（ポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体、重量比75:25）からなり、連通孔を有する細胞精製デバイスを、２０ｍＬのMEMα培地（インビトロジェン社製）と共に１００ｍＬシリンジ（JS-S00S、ジェイ・エム・エス社製）内に入れた。そのシリンジ付属の押し子と三方活栓（テルフュージョン、テルモ社製）を取り付けて空気を吐出させ、シリンジ内部を密閉環境にせしめた後、押し子を上下させることによりシリンジ内圧力を減圧、ついで環境圧力に戻すことによって、細胞精製デバイス内の水分包含を行った。そのデバイスを図２のようにセルストレナー（孔径７０μｍ、ベクトン・ディキンソン社）の上に置き、装置の気密性を高める為にデバイス幅を切り抜きしたPVDF（ポリフッ化ビニリデン）膜（孔径0.45μm、PV4HY912FO、GE Osmonics社）をセルストレナー横に置いた。次に、ヒト骨髄液（VERITAS社）を平面フラスコで培養（牛血清添加MEMα培地、CO2インキュベーター、３７℃で２週間）することで得られるヒト間葉系細胞を、リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）で２回洗った後、タンパク質分解酵素（０.２５％トリプシン）を用いて培養フラスコから回収した。それを同量の血清含有培地で懸濁し、遠心処理（１２００ｒｐｍ、５分間）で細胞を集め、血清未含有培地で細胞懸濁液を調製した（２ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。この懸濁液（５ｍｌ）を吸引（−０．０３ＭＰa）しながら細胞精製デバイスに滴下した。圧力は圧力計（A型SUS −0.1ＭＰa〜0ＭＰa、ジーエル サイエンス社）によって測定した。
【００６６】
細胞懸濁液はスムーズに通液された。そして、細胞懸濁液に含まれる夾雑物がどのくらい除去されたかを評価する為、通液前の細胞懸濁液と通液後の濾液を、フローサイトメーター（FACS Canto、ベクトン・ディキンソン社）に供し、含まれる粒子の前方散乱光（FSC）と側方散乱光（SSC）を測定し評価した（488nm blue laser、FSC 300volt、SSC 280volt）。その結果を図３と表１に示す。通液後の濾液に含まれる粒子は、通液前の細胞懸濁液のそれらと比較して、間葉系細胞（P1）の割合が激減し、目的細胞以外の夾雑物が大幅に増加したことが判明した。この実験により、間葉系細胞は細胞精製デバイスへ選択的に捕捉されるが、不必要な夾雑物は該デバイスを通り抜けることによって、細胞懸濁液から除去されることがわかった。なお、培養細胞の懸濁液から目的細胞以外の夾雑物を取り除く操作、およびデバイスによる細胞精製処理に要した時間は約１分であった。
【００６７】
【表１】
2006094718.tif 000002
（実施例２）実施例１で細胞精製デバイスに捕捉された培養細胞の様子
細胞懸濁液に含まれる目的細胞が、どのように細胞精製デバイスに捕捉されたかを、蛍光顕微鏡を用いて観察した。実施例１で示した操作によりヒト間葉系細胞の懸濁液（１ｘ１０7ｃｅｌｌｓ）を通液した細胞精製デバイスを、１０％ホルムアルデヒドで固定し、ＯＣＴ溶液（Sakura Finetechnical Co,Ltd）で包埋を行った後、凍結切片作製装置（HM505E、マイクロエッジインスツルメント社）を用いて１０μｍの凍結切片を作製した。ヨウ化プロピジウム（１μg／ｍｌ）で核染色を行い、倒立型蛍光顕微鏡（IX71、オリンパス社）でその様子を観察した。その結果を図４に示した。これにより、培養したヒト間葉系細胞は細胞精製デバイスに効率的に捕捉されることが分かった。また、下層には空隙がまだ残存しているので、これ以上の細胞数も捕捉可能であることも判明した。
【００６８】
（実施例３）精製された細胞の回収
細胞精製デバイスに捕捉された細胞が、回収可能かどうかを調べた。実施例１で示した操作と同様に、ヒト間葉系細胞の懸濁液（１ｘ１０7ｃｅｌｌｓ）を通液した細胞精製デバイスを３コ作製した。これを逆さまにして、その上に１ｍｌの０．２５％トリプシン溶液をのせた。１分間３７℃のＣＯ2インキュベーターで保存し、次いで吸引操作より、そのトリプシン溶液を回収した。さらに１ｍｌのリン酸緩衝液で３回洗浄した。この手順を３回繰り返し、デバイス内に捕捉された細胞を出来る限り回収した。この際、トリプシンを中和する目的で、血清含有培地を細胞回収液に添加した。この細胞懸濁液の一部を取り出し、０．４％トリパンブルー染色液（GIBCO社製）を１：１で加えて染色した。血球計算盤を用いて、トリパンブルーにより染色された細胞（死細胞）を除外し、含まれる生細胞数を求めた。その結果を表２に示した。この結果、夾雑物が除去された間葉系細胞を高率に回収することが可能であることが判明した。なお、回収率（％）は、回収率（％）＝〔（洗浄液に含まれた生存細胞数）/（滴下した細胞懸濁液に含まれた生存細胞数）〕x 100  で示した。
【００６９】
【表２】
2006094718.tif 000003
（比較例１）縦長形状ではない多孔質構造を有する三次元多孔質体への通液
縦長形状ではない多孔質構造（図５）を有する、縦２０ｍｍ、横２０ｍｍ、厚さ３ｍｍのＰＬＧＡ（ポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体、ポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体の重量比75:25）からなる三次元多孔質体を、セルストレナー（孔径７０μｍ）の上に置いた（図２）。該三次元多孔質体は、スポンジ状の概ね独立的気泡状の孔隙を有する（図５）。次に、実施例１と同様の操作により、ヒト間葉系細胞の懸濁液を三次元多孔質体に供し吸引処理（−０．０３ＭＰa）を行った。しかしながら、細胞懸濁液は通液されなかった。つまり、縦長形状ではない三次元多孔質体では、三次元多孔質体内が十分に陰圧とならない為、細胞懸濁液を通液できないことが分かった。この実験により、縦長形状ではない多孔質構造を有する三次元多孔質体では、細胞を精製することが出来ないとわかった。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】縦長形状の細孔を有する三次元多孔質構造を有するPLGAから成る三次元多孔質体からなる細胞懸濁液の精製用デバイスの電子顕微鏡写真を表す（倍率５０倍）。
【図２】細胞の懸濁液から目的細胞以外の夾雑物を除去する方法の実施態様を示した  模式図。
【図３】フローサイトメーターによる分析による、通液前と後での違いを示す（左            ：通液前、右：通液後）。
【図４】細胞精製デバイスに捕捉された細胞の様子（倍率４０倍）
【図５】縦長形状ではない多孔質構造を有する三次元多孔質体の電子顕微鏡写真          （倍率５０倍）。
【図２】
2006094718.tif 000004
【図１】
2006094718.tif 000005
【図３】
2006094718.tif 000006
【図４】
2006094718.tif 000007
【図５】
2006094718.tif 000008