(57)【要約】【課題】血管新生に関わる細胞増殖抑制作用を有する網膜周皮細胞由来の細胞増殖抑制因子タンパク質を単離し、アミノ酸配列及び塩基配列を得ること。【解決手段】以下の手順により、目的とするタンパク質、そのアミノ酸配列及び塩基配列を得た。（１）網膜毛細血管周皮細胞の濃縮培地からの内皮細胞増殖抑制効果を指標にした蛋白群を絞り込み。（２）蛋白群に含まれるタンパク質を質量分析系等によってそのアミノ酸配列を同定。（３）アミノ酸配列を元に、該当アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする複数の塩基配列を決定。（４）塩基配列情報を元にＰＣＲ等で、該当する内皮細胞増殖抑制効果を持つ蛋白をコードする塩基配列の全長を決定。（５）単離した遺伝子を大腸菌等に導入して蛋白を調製。本発明のタンパク質は、内皮細胞増殖抑制作用を有し、血管新生を伴う糖尿病網膜症の治療薬に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
【請求項３】
配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３に記載のタンパク質のいずれかをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号２に記載の塩基配列のコード領域を含む請求項４に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
請求項４または５に記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
【請求項７】
遺伝子治療用である請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項６に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、請求項１〜３に記載のタンパク質のいずれかを製造する方法。
【請求項１０】
請求項１〜３に記載のタンパク質のいずれかに対する抗体。
【請求項１１】
抗体がモノクロナール抗体である請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体が、少なくともその一部をヒト化したものである請求項１０または１１に記載の抗体。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の抗体を含む、請求項１に記載のタンパク質の検出試薬。
【請求項１４】
請求項１３に記載のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、網膜周皮細胞由来の内皮細胞増殖抑制作用を有するタンパク質及び当該タンパク質をコードする遺伝子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病網膜症の網膜毛細血管では選択的に周皮細胞が脱落し、内皮細胞が増殖することで血管新生が起きている。内皮細胞と周皮細胞を共培養することで、周皮細胞が内皮細胞の増殖を抑えることが非特許文献１に開示されている。この知見は、周皮細胞に内皮細胞増殖を抑制する物質が存在することに結びつく。周皮細胞における内皮細胞増殖抑制因子を同定することは、網膜における血管新生を抑制することに結びつき、糖尿病網膜症治療薬として応用することが可能であると考えられる。
【０００３】
内皮細胞増殖抑制因子としては、形質転換因子β１[transforming growth factor-β1 (TGF-β1)］が知られており、またTGF-β1は周皮細胞に存在するときは活性を有さず、内皮細胞におけるプラスミンで活性型に変換されることが知られている（非特許文献２）。しかし、この現象はインビトロ(in vitro)では観察されるものの、インビボ(in vivo)における内皮細胞増殖抑制効果は説明できない。周皮細胞の培養濃縮液は内皮細胞増殖抑制効果を示すが、抗TGF-β1抗体でTGF-β1の作用を中和した場合、TGF-β1の効果は、周皮細胞の内皮細胞増殖抑制効果の10％程度である（非特許文献３）。また、網膜血管新生を抑制する因子としては、網膜色素上皮細胞の培養上清から単離されたタンパク質である色素上皮由来因子[pigmented epithelium-derived factor (PEDF)]がある（特許文献１）。さらに、コラーゲンXVIIIのC末端断片であるエンドスタチン(endostatin)も細胞増殖抑制因子として知られている（特許文献２）。
【０００４】
【非特許文献１】J. Cell Biol., 105, 1455-1462 (1987).
【非特許文献２】J. Cell Biol., 109, 309-315 (1989).
【非特許文献３】J. Cell Physiol., 203, 378-386 (2005).
【非特許文献４】Kondo T, Hosoya K et al., Cell Struct. Funct., 28, 145-153 (2003)
【特許文献１】特表2003-522160
【特許文献２】特表2002-501362
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記したように複数の内皮細胞増殖抑制因子が従来までに知られているが、網膜周皮細胞由来で、特異的に内皮細胞増殖抑制に作用する因子は同定されていない。これは、網膜が非常に小さな組織であるために、網膜周皮細胞から分泌される蛋白を解析できないためである。すなわち、網膜周皮細胞から分泌される特定の活性を持つ蛋白を解析する手法の確立が課題となっている。網膜周皮細胞由来で、特異的に内皮細胞増殖抑制に作用する因子が同定できれば、血管新生抑制剤、特に糖尿病網膜症治療薬として非常に有用である。糖尿病網膜症時における網膜毛細血管内皮細胞の異常増殖機構に関する知見は、未知の部分が多く、新規の内皮細胞増殖抑制因子が同定によって、新たな血管新生抑制剤や糖尿病網膜症の重傷化の防止に大いに役立つ。その様な目的で、新規な血管新生に関わる細胞増殖抑制作用を有する網膜周皮細胞由来の細胞増殖抑制因子タンパク質を単離し、そのアミノ酸配列及び塩基配列を得ることが、本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる課題を達成するために、本発明者らは網膜毛細血管周皮細胞株を樹立し（非特許文献４）、培養液を５倍濃縮して網膜毛細血管内皮細胞株で増殖抑制効果を観察したところ、約65％の阻害効果が示された。さらに、虚血誘導性網膜症モデルマウスに濃縮培地を投与しても網膜血管新生抑制効果は示された。すなわち、網膜毛細血管周皮細胞を樹立し、培養上清を用いることによって、初めて蛋白を精製することが可能となり、上記課題を解決することが可能となった。その手順の概略は以下のとおりである。
（１）網膜毛細血管周皮細胞の濃縮培地からタンパク質を分子量、電荷のフラクションで分け、内皮細胞増殖抑制効果を指標に蛋白を絞り込む。
（２）絞り込んだ蛋白群に含まれるタンパク質を質量分析系等によってそのアミノ酸配列を同定する。
（３）同定したアミノ酸配列を元に、該当アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする複数の塩基配列を決定する。
（４）決定した塩基配列情報を元にＰＣＲ法やハイブリダイゼーション法を用い、該当する内皮細胞増殖抑制効果を持つ蛋白をコードする塩基配列の全長を決定する。
（５）単離した遺伝子を用い大腸菌や哺乳類培養細胞、昆虫細胞を用い該当遺伝子がコードする蛋白を調製し、培養網膜毛細血管内皮細胞や生体内に投与することによって内皮細胞増殖抑制活性を発現させる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
本発明は、網膜周皮細胞由来の細胞増殖抑制因子タンパク質（配列番号１）と機能的に同等なタンパク質を含む。本発明において、機能的に同等なタンパク質をホモログと呼ぶ。ホモログは、具体的には、配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を含む。アミノ酸配列における変異の数や部位は、タンパク質の機能を維持できる限り制限されない。変異の数は、通常は全アミノ酸の４０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の３０％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の２０％以内である。
【０００８】
本発明のホモログは、前記アミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡに変異を導入することによって得ることができる。ＤＮＡに変異を導入するためには、例えば「Molecular Cloning: A Laboratory Manual第２版第１-３巻」（Cold Spring Harber Laboratory Press出版 New York 1989年）に記載の部位特異的変異誘発法やＰＣＲ法などの方法を用いることができる。変異を導入したＤＮＡを、適当なベクターおよび宿主系を用いて、例えば「Molecular Cloning: A Laboratory Manual第２版第１-３巻」に記載の方法により遺伝子工学的に発現させればよい。
【０００９】
本発明におけるホモログには、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質が含まれる。配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡは、本発明の網膜周皮細胞由来の細胞増殖抑制因子タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでいる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡは、構造的に相同性の高いタンパク質をコードしている可能性が高い。したがって、このようなタンパク質には機能的に同等なタンパク質が多く含まれる。本発明において、高い相同性とは、少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上の配列の同一性を言う。アミノ酸配列の相同性は、BLAST検索アルゴリズムを用いて決定することができる。
【００１０】
本発明において、ストリンジェントな条件とは、以下のような条件を示すことができる。例えばロングプローブ（５０塩基以上）でハイブリダイゼーションを行う場合には、５０％の解離を生ずる温度（Ｔｍ）の目安を下記計算式から求め、ハイブリダイゼーションの温度を以下のように設定できる。
Tm=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(% G+C)-0.63(% formamide)-(600/n)-1.5(% mismatch)
［Ｎａ＋］はＮａイオン濃度；［Ｍ］、ｎはプローブの塩基数である。
ハイブリダイゼーション温度＝Ｔｍ−２５℃
もし、１００％相同性で１００塩基以上のプローブを用いる場合には、温度条件は下記のように設定できる。
（１）６５〜７５℃（フォルムアミド無添加）
（２）３５〜４５℃（フォルムアミド存在下）
短いオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、以下の計算式を目安に設定できる。
ハイブリダイゼーション温度＝Ｔｍ−５℃＝２℃×（Ａ＋Ｔの数）＋４℃×（Ｃ＋Ｇの数）−５℃
本発明におけるストリンジェントな条件とは、上記条件下でハイブリダイズした後、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で  ６５℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のシグナルが観察されることを表す。これらの条件の組み合わせはあくまでも一例である。当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する各種の要素を調整し、目的のストリンジェンシーを経験的に設定することは自明である。ストリンジェンシーを決定する要因には上記条件の他に、例えば、プローブ濃度やハイブリダイゼーション反応時間なども含まれる。
【００１１】
ＰＣＲのような遺伝子増幅技術を用いて本発明のホモログを得ることもできる。すなわち、配列番号２に記載の塩基配列からなるDNA配列をもとにプライマーを設計し、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列またはその一部と相同性の高いＤＮＡ断片を単離することも可能である。
【００１２】
本発明において、「網膜周皮細胞由来の細胞増殖抑制因子タンパク質（配列番号１）と機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が内皮細胞増殖抑制活性を有することを指す。
【００１３】
この活性は、公知の方法によって確認することができる。具体的には、網膜毛細血管内皮細胞株の培養液に、対象となるタンパク質溶液を添加し、一定時間培養し、細胞増殖を抑制する作用であれば、該タンパク質は網膜周皮細胞由来の細胞増殖抑制因子タンパク質と機能的に同等であると判定される。
【００１４】
本発明の網膜周皮細胞由来の細胞増殖抑制因子タンパク質は、該タンパク質が発現している細胞や組織のような生体材料のみならず、これをコードする遺伝子を適当な発現系に組み込んで遺伝子組み換え体 (recombinant)として得ることもできる。網膜周皮細胞由来の細胞増殖抑制因子タンパク質を遺伝子工学的な手法によって得るためには、後に述べるように網膜周皮細胞由来の細胞増殖抑制因子タンパク質をコードする遺伝子を適当な発現系に組み込んで発現させれば良い。一方、網膜周皮細胞由来の細胞増殖抑制因子タンパク質をコードする遺伝子は、網膜周皮細胞のｃＤＮＡライブラリー等を鋳型としてＰＣＲ等で増幅することにより得ることができる。
【００１５】
本発明は、本発明のタンパク質あるいはこれらのホモログをコードするＤＮＡに関する。
本発明のＤＮＡは、配列番号１に記載のアミノ酸配列、あるいはそのホモログをコードするものであれば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、あるいは合成ＤＮＡなど、その由来は制限されない。例えば、本発明のＤＮＡは、配列番号２に記載の塩基配列のコード領域からなるＤＮＡを化学的に合成することによって得ることができる。また、網膜周皮細胞やその他の細胞・組織のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、前記塩基配列に基づいて設計したプライマーによるＰＣＲで本発明のＤＮＡを増幅することもできる。
【００１６】
本発明に含まれるＤＮＡのホモログは、配列番号２に記載の塩基配列のコード領域に対して、少なくとも８０％以上、より望ましくは９０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含むＤＮＡである。ＤＮＡを構成する塩基配列のホモロジーは、遺伝子解析ソフトGENETYX-SV/RC Ver4.01（ソフトウェア開発社製）や、遺伝子解析プログラムBLASTによって決定することができる。更に、他の種由来のｃＤＮＡを鋳型に用いることにより、本発明に基づくホモログをコードするＤＮＡを増幅することもできる。
【００１７】
網膜周皮細胞など、本発明の遺伝子を発現する細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーを、前記塩基配列からなるＤＮＡをプローブとしてスクリーニングすることによって、本発明のＤＮＡを単離することもできる。ＰＣＲと同様に他の種由来のｃＤＮＡを用いれば、他の種に由来する、網膜周皮細胞由来の細胞増殖抑制因子のホモログをコードするＤＮＡを単離することができる。プローブは、先に述べたようなストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる。ラット以外の動物としては、例えば、マウス、ウサギ、イヌ、ヒトなどが挙げられる。
【００１８】
その他、一般に真核生物の遺伝子は、インターフェロン遺伝子等で知られているように、多型現象(polymorphism)を示すと考えられており、この多型現象によって１または複数個のアミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列の変化はあってもアミノ酸は全く変わらない場合もある。これら多型に基づいて塩基配列に変異を生じたＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１９】
本発明のＤＮＡを用いて、本発明のタンパク質を組み換え体として得ることができる。組み換え体を産生するために必要な操作は、例えば前記の「Molecular Cloning」などの多くの文献に詳細に記述されている。具体的には、発現させたいＤＮＡの上流に翻訳開始コドンを付加し、下流には翻訳終止コドンを付加する。さらに、転写を制御するプロモーター配列（例えば、ｔｒｐ、ｌａｃ、Ｔ７、ＳＶ４０初期プロモーター）等の制御遺伝子を付加し、適当なベクターに組み込んで宿主細胞内で複製し、機能する発現プラスミドを作製することができる。適切な発現ベクターとしては、例えば、細菌についてはｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、  ｐＧＥＭＥＸ、ｐＫＫ２３３−２など、酵母についてはｐＹＥＳ２、昆虫細胞についてはｐＶＬ１３９３、ｐＦａｓｔＢａｃ１、動物細胞についてはｐＥＦ−  ＢＯＳ、ｐＳＲα、ｐＤＲ２、ｐＣＲ３．１等が挙げられる。
【００２０】
本発明のＤＮＡは、遺伝子治療に有用である。本発明のＤＮＡによってコードされる蛋白質は、細胞増殖抑制因子タンパク質として機能する。従って、本発明のＤＮＡを生体に導入して発現させることにより、例えば、血管新生を伴う糖尿病網膜症の治療に利用することができる。
本発明のＤＮＡは、公知の方法によって生体に導入することができる。外来遺伝子を治療を目的として生体に導入する手法は公知である。例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、あるいはアデノ随伴ウイルスベクター等に本発明のＤＮＡを組み込むことにより、本発明のＤＮＡ導入用のベクターとすることができる。このベクターを、例えば単離したリンパ球などに感染させた後、再び生体に返すことにより、エキソビボ(ex vivo)で本発明の遺伝子を生体に導入することができる。
【００２１】
発現プラスミドを適当な宿主細胞に導入すれば、形質転換体を得ることができる。宿主細胞としては、大腸菌などの原核生物、酵母などの単細胞真核生物、昆虫、哺乳類などの多細胞生物の細胞などが挙げられる。好ましくは、哺乳類の細胞であり、哺乳類の細胞としては、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、ＣＯＳ７細胞などが例示できる。この形質転換体を培養することにより、タンパク質を産生させることができる。
【００２２】
得られたタンパク質は、当業者に周知の硫安沈殿、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーを単独あるいは組み合わせて精製することができる。また、本発明のタンパク質を、ＨｉｓタグやＨＡタグのような結合親和性を持つタンパク質との融合タンパク質として発現させることにより、アフィニティクロマトグラフィーを用いた精製方法を適用することもできる。
【００２３】
本発明は、本発明のＤＮＡ、あるいはその相補鎖とハイブリダイズするＤＮＡであって、少なくとも１４ヌクレオチドの鎖長を有するＤＮＡに関する。このようなＤＮＡは、本発明のＤＮＡを合成するためのプライマーとして、あるいは本発明のＤＮＡやそれを転写したｍＲＮＡを検出するためのプローブとして用いることができる。与えられた塩基配列に基づいてプライマーの塩基配列を設計することは、当業者が通常行いうることである。また、検出すべき塩基配列と公知の塩基配列を比較して、適切なプローブを設計することも当業者には自明である。本発明のＤＮＡをプローブとして用いるときには、ジゴキシゲニンやビオチンのような親和性物質、あるいはＦＩＴＣやローダミンのような蛍光物質を利用して公知の方法によって標識することができる。必要な塩基配列を持つＤＮＡは、化学的に、あるいは酵素的に合成することによって得ることができる。
【００２４】
本発明に基づくプローブ、あるいはプライマーは、本発明のＤＮＡやそれが転写されたｍＲＮＡの検出に用いることができる。ｍＲＮＡは、ノーザンブロット法やＲＴ−ＰＣＲ法により検出することができる。
【００２５】
更に本発明は、本発明のタンパク質に対する抗体に関する。本発明の抗体は、モノクロナール抗体およびポリクロナール抗体のいずれをも含む。これらの抗体は、本発明のタンパク質、またはその断片を免疫原として公知の方法に基づいて作成することができる。
本発明のモノクロナール抗体は、例えば、次のようにして得ることができる。具体的には、本発明のタンパク質を抗原としてマウス、ラット、あるいはハムスター等を免疫する。免疫した動物の脾臓またはリンパ節からリンパ球を取り出し、ミエローマ細胞と融合させてＫｏｈｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Nature, 256, 495-497,1975）、またはその改良法であるＵｅｄａらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci.USA,79, 4386-4390, 1982）等に従ってハイブリドーマを作製する。得られたハイブリドーマのうち、目的とする反応特性を持つ抗体を産生するものをクローニングし、これを培養することによってモノクロナール抗体を産生させることができる。モノクロナール抗体は、免疫原のタンパク質に特徴的に見出される構造を認識するものを選択することにより、そのタンパク質を特異的に認識するモノクロナール抗体とすることができる。本発明のタンパク質に特徴的な構造は、例えば本発明のタンパク質を構成するアミノ酸配列に特異的に見出されるアミノ酸配列を選択することによって推測することができる。
【００２６】
本発明によるモノクロナール抗体は、その定常領域をヒトのイムノグロブリン分子に組み換えることによってキメラ抗体とすることができる。キメラ抗体は、遺伝子工学的に作製されるモノクロナール抗体のひとつである。例えば、その可変領域（Ｖ）がマウスイムノグロブリン由来の可変領域（ＶＨ、ＶＬ）であり、かつその定常領域（Ｃ）がヒトイムノグロブリン由来の定常領域（ＣＨ、ＣＬ）であるマウス／ヒトキメラモノクロナール抗体が公知である。ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥいずれのクラスに属するヒトイムノグロブリンの定常領域でも利用することができる。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域が用いられる。
【００２７】
更に、可変領域におけるフレームワークをヒト化することによって、いわゆるヒト化抗体とすることができる。ヒト型抗体（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ抗体）も、遺伝子工学的に作製されるモノクロナール抗体のひとつである。例えば、可変領域（Ｖ）中の超可変領域(Hypervariable region:HV)がマウス由来であり、その可変領域（Ｖ）のフレームワーク領域がヒトイムノグロブリンに由来するヒト化抗体が公知である。ＨＶは相補性決定領域（Complementarity determining region：CDR）とも呼ばれ、可変領域中に３箇所存在する。それぞれＨＶ１（ＣＤＲ１）、ＨＶ２（ＣＤＲ２）、ＨＶ３（ＣＤＲ３）と名づけられている。これらの領域は、可変領域において抗原結合特異性を決定する重要な領域である。
一方フレームワーク（framework region)とは、Ｖ領域においてアミノ酸配列の多様性は比較的少ない領域である。Ｖ領域においてＨＶをはさむ形で４つの領域を占めている。それぞれ  ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と呼ばれる。ヒト化抗体は可変領域のみで構成することもできる。あるいはその定常領域としてヒトのイムノグロブリン由来の構造を持たせることによって、完全なイムノグロブリン分子として構成することもできる。
【００２８】
動物の胚を操作するトランスジェニック技術により、マウスにヒト抗体遺伝子を導入し、このマウスを免疫することによってヒト抗体を作らせる方法も確立されている(日経サイエンス1995年、6月号、P40-50)。この方法によって得ることができるイムノグロブリン分子は、完全なヒト・イムノグロブリン分子である。このように、イムノグロブリンの一部、あるいは全てをヒト化したものも、その抗体が本発明の網膜周皮細胞由来の細胞増殖抑制因子タンパク質を認識するものである限り、本発明に含まれる。
【００２９】
キメラ抗体は、例えば次のようにして得ることができる
まず、本発明のマウスモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマから、活性な  ＶＨ遺伝子（Ｈ鎖可変領域をコードする再構成されたＶＤＪ遺伝子）と、活性なＶＬ遺伝子（Ｌ鎖可変領域をコードする再構成されたＶＪ遺伝子）を単離する。他方で、ヒトイムノグロブリンをコードするＤＮＡからＣＨ遺伝子（Ｈ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）と、ＣＬ遺伝子（Ｌ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を取得する。次いで、ＶＨの下流にＣＨを発現可能なように配列して発現ベクター（ｐＳＶ２ｎｅｏなど）に組み込む。同様にＶＬについても、その下流に  ＣＬを発現可能なように配列して発現ベクターに組み込む。ＶＨ＋ＣＬとＶＬ＋ＣＬは、１つのベクター上に組み込むこともできるし、別のベクターに挿入することもできる。このようにして作製した発現ベクターを適当な宿主細胞に導入する。ＶＨ＋ＣＬとＶＬ＋ＣＬを別のベクターに挿入した場合には、２種のベクターでコトランスフェクトする。スクリーニングを容易にするために、宿主細胞としては、自らは抗体を産生していない細胞株が有利である。具体的には、  Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）やＳＰ２／０  −Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）等の骨髄腫細胞を利用することができる。ベクターは、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法あるいはエレクトロポレーション法などにより形質転換することができる。形質転換細胞は、まず発現ベクターに挿入された薬物耐性遺伝子を指標としてスクリーニングされる。更に目的とする抗体分子を発現している形質転換体をスクリーニングして、目的のキメラモノクロナール抗体産生細胞を得ることができる。
【００３０】
更に、ヒト化抗体は、例えば次のようにして得ることができる。
まず、マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子とそれに対応するマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子を単離する。一方、ヒトイムノグロブリン遺伝子からは、前記マウスＨ鎖ＣＤＲに対応するヒトＨ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＨ鎖遺伝子と、マウスＬ鎖ＣＤＲに対応するヒトＬ鎖遺伝子を単離する。単離したマウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子とヒトＨ鎖遺伝子を発現可能なように適当なベクターに導入する。同様にマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子とヒトＬ鎖遺伝子を発現可能なように適当なもう一つの発現ベクターに導入する。または、マウスＨ  鎖ＣＤＲ／ヒトＨ鎖遺伝子とマウスＬ鎖ＣＤＲ／ヒトＬ鎖遺伝子を同一の発現ベクターに発現可能なように導入することもできる。このようにして作製された発現ベクターで、適当な宿主細胞を形質転換することにより、ヒト化抗体産生形質転換細胞を得られる。宿主細胞の形質転換とスクリーニングは、キメラ抗体と同様に行うことができる。
【００３１】
ポリクロナール抗体は、例えば、「Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H.D.ら編」(Cold Spring Harber Laboratory Press出版 New York 1989年)などに記載の方法に従って作製することができる。
すなわち精製した本発明のタンパク質、あるいはその断片を抗原として用いて、適切な方法で動物を免疫することにより、抗原となるタンパク質を特異的に認識する抗体を容易に作製し、精製することができる。ポリクロナール抗体を得るための免疫動物としては、一般にマウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ等が用いられる。いずれの場合においても、タンパク質断片を免疫原に用いるには、ＫＬＨやアルブミンのようなキャリアータンパク質と結合させることによって、免疫原性を高めることができる。
【００３２】
本発明の抗体は、本発明のタンパク質の検出に用いることができる。試料中のタンパク質を抗体によって検出する方法は、イムノブロット法、イムノアッセイ法、あるいは免疫染色法等として公知である。また、これらの検出方法に用いるために、抗体を直接、あるいは間接的に標識する方法も公知である。標識には、一般に酵素、放射性同位元素、あるいは蛍光物質などが用いられる。本発明の抗体は、緩衝液、安定剤、懸濁剤、塩などの溶媒および溶質を適宜組み合わせて、本発明の網膜周皮細胞由来の細胞増殖抑制因子タンパク質の検出試薬キットとすることができる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら制限されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
［実施例］
（細胞増殖抑制タンパク質の同定）
網膜毛細血管周皮細胞株の培養濃縮液から硫安沈殿によってタンパクを回収し、陰イオン交換カラム（Econo-Pac High Q 1mL cartrige; Bio-rad）に通してタンパク質を保持させた。陰イオン交換カラムからのタンパク質溶出には0.01〜1M塩化ナトリウム溶液を用いて分画した。分画サンプルの一部を限外濾過によってバッファー交換して10%ＦＢＳ−ＤＭＥＭに溶解して網膜毛細血管内皮細胞株に添加し、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(ＢｒｄＵ)の取り込み量を測定することで、細胞増殖抑制活性を評価した。合計で60に分けたフラクションの中で、No.21〜35で顕著なＢｒｄＵ取り込み抑制が示された。次に、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法によるさらなる分画のため、ＢｒｄＵ取り込み抑制が示されたフラクションのタンパク質をハイドロキシアパタイトカラム（CHT-1、セラミックハイドロキシアパタイト2mL colume; Bio-rad）に保持させ、0.01〜0.5Mリン酸緩衝液を用いて分画した。分画サンプルの一部を限外濾過によってバッファー交換して10%ＦＢＳ−ＤＭＥＭに溶解して網膜毛細血管内皮細胞株に添加し、ＢｒｄＵの取り込み量を測定すると、フラクション25付近で強いＢｒｄＵ取り込み抑制が示された。さらに、ハイドロキシアパタイトカラムで分画し、ＢｒｄＵ取り込み抑制が示されたフラクションのタンパク質を２次元電気泳動で分離した。１次元目等電点電気泳動にImmnobiline DryStrip（pH3.0〜10.0NL, 7cm；Amersham Biosciences）を用い、２次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ExcelGel 2-D Homogeneous 12.5；Amersham Biosciences）を用いて分離した。泳動後のゲルをクマーシー・ブリリアント・ブルーで染色し、可視化した。得られたスポットを切り出し、トリプシンを用いてゲル内消化によって断片化した。タンパク質量分析法としてはマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（MALDI-TOFMS, AXIMA-CFR; Shimadzu）を用いた。算出されたモノアイソトピックイオンのピーク値を基にデータベースＰｒｏＦｏｕｎｄで検索してＰＭＦ法によるタンパク質同定を行った。その結果トロポミオシン[tropomyosin(TM)]であることが示唆された。この段階ではＴＭα（MW=28.33kDa, pI=4.8, NCBI番号＝167850）、ＴＭ３（MW=28.77kDa, pI=4.7, NCBI番号＝NP476556）、ＴＭ６（MW=29.30kDa, pI=4.7, NCBI番号=Np775134）である可能性があった。ラットＴＭ３を特異的に認識するプライマーを作製してＲＴ−ＰＣＲ法でオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のクローニングを行った。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ解析からラット網膜、網膜毛細血管周皮細胞株に発現が示された。増幅された網膜毛細血管周皮細胞株のＰＣＲ産物をＤＮＡシークエンサー解析した結果、配列表２に示す配列を得た。得られた配列はラットＴＭ３、ラットＴＭ６と異なる配列を示した。さらに、塩基配列をアミノ酸に変換した（配列表１）ところ、やはり両者とは異なっていた。
【００３４】
（同定タンパク質の細胞増殖抑制活性）
配列表２にある遺伝子配列に制限酵素サイトが付くようなプライマーでＰＣＲを行い、得られた増幅ＤＮＡ断片をタンパク質発現誘導させるため、pGEX-6P-1ベクター（Amersham Biosciences）に導入した。目的遺伝子のＯＲＦを導入したpGE-6P-1溶液5μLにＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（STRATGENE）を100μL加え、ヒートショックを加え、ＳＯＣ培地200μLを加え、37℃で1時間インキュベーションした後、ＬＢ  Ａｍｐｐｌａｔｅに播き、37℃、12〜16時間インキュベーションすることによって、コロニーを形成させた。4〜5mLのＬＢ  Ａｍｐ  ｍｅｄｉｕｍに形成されたコロニーを加えて、37℃、11時間のインキュベーションによって大量培養後、遠心して集菌した。
【００３５】
集菌したＢＬ２１（ＤＥ３）をリン酸緩衝液（pH7.5）に懸濁させ、超音波細胞破砕機（MISONIX; Farmingdale, NY）で破砕後、遠心して上清を回収した。得られたタンパク質はグルタイオン・セファロース４Ｂ（Amersham Biosciences）を用いて精製した。精製したタンパク質は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによってタンパク質量の測定し、さらにプロテインシークエンサー（PPSQ-21; Shimadzu）を用いてＮ末端アミノ酸配列の解析を行い確認した。
【００３６】
網膜毛細血管内皮細胞株をコラーゲンコートプレート（Biocoat Collagen I Cellware 96-Well plate; BD Biosciences）に750セル／ウェルの割合で播種し、24時間培養した。濃縮したリコンビナントタンパク質溶液を設定した濃度になるように希釈し、各濃度のタンパク質、または、網膜毛細血管周皮細胞株の培養濃縮液（５倍、5x rPCT1-CM）を含む10%ＦＢＳ−ＤＭＥＭで48時間培養した。細胞測定は、同仁化学研究所製の細胞増殖アッセイキット(Cell Counting Kit-8)用いて行った。細胞増殖抑制活性を表１に示す。本発明のタンパク質1〜37μMにて顕著な内皮細胞増殖抑制効果を示した。
表２には同じ濃度のウシ血清アルブミンを用いた結果を示している。ウシ血清アルブミンでは同濃度を用いても内皮細胞増殖に全く影響を与えないことから、本発明で得られた内皮細胞増殖因子タンパク質の効果が特異的であることが示された。
【００３７】
【表１】
2006238844.tif 000002
Control:培地のみ
5x CM:培地に網膜毛細血管周皮細胞の培養濃縮液(５倍)を添加
0.1μM：培地に本発明タンパク質(TM3 sv)濃度0.1μMで添加
1μM：培地に本発明タンパク質濃度(TM3 sv)1μMで添加
10μM：培地に本発明タンパク質濃度(TM3 sv)10μMで添加
【００３８】
【表２】
2006238844.tif 000003
Control:培地のみ
5x CM:培地に網膜毛細血管周皮細胞の培養濃縮液(５倍)を添加
0.1μM：培地にウシ血清アルブミン(BSA)濃度0.1μMで添加
1μM：培地にウシ血清アルブミン(BSA)濃度1μMで添加
10μM：培地にウシ血清アルブミン(BSA)濃度10μMで添加
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明により、新規な血管新生に関わる細胞増殖抑制作用を有するタンパク質及びタンパク質をコードする遺伝子が得られた。本発明の遺伝子がコードするタンパク質は内皮細胞増殖抑制作用を有し、血管新生を伴う糖尿病網膜症の治療薬に有用である。さらに、本発明に係る血管新生に関わる細胞増殖抑制作用を有するタンパク質は、未熟児網膜症の血管新生を伴う疾病、悪性腫瘍における血管新生および炎症疾患における血管新生等における細胞増殖抑制剤として様々な疾病に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ラット網膜毛細血管周皮細胞由来の細胞増殖抑制因子タンパク質のアミノ酸配列である。
【図２】ラット網膜毛細血管周皮細胞由来の細胞増殖抑制因子タンパク質のDNA配列である。
【図１】
2006238844.tif 000004
【図２】
2006238844.tif 000005
【配列表】
2006238844000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月2日(2006.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006238844000001.app