(57)【要約】【課題】  迅速かつ高収率な糖ペプチド製造方法を提供する。【解決手段】  糖アミノ酸を用いる糖ペプチドの製造方法において、マイクロ波を照射しながらペプチド結合形成反応を行うことを特徴とする糖ペプチドの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖アミノ酸を用いる糖ペプチドの製造方法において、マイクロ波を照射しながらペプチド結合形成反応を行うことを特徴とする糖ペプチドの製造方法。
【請求項２】
糖アミノ酸のアミノ酸残基が、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸及びトリプトファンからなる群より選択される請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
糖アミノ酸の糖残基が、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコース、フコース、シアル酸、イズロン酸及びグルクロン酸並びにこれらの構成糖単位を含むオリゴ糖からなる群より選択される請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
糖アミノ酸の糖残基とアミノ酸残基とが、グリコシド結合、アミド結合又は炭素−炭素結合により結合している請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
マイクロ波の波長が２３００〜２６００ＭＨｚである請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖ペプチドを効率的に合成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は核酸やタンパク質と並んで生体を構成する主要成分であり、生体のエネルギー源としてよく知られているが、近年、生体内の情報伝達、タンパク質の品質管理、構造安定化、タンパク質輸送のための標識など、様々な高次機能を担っていることが明らかとなってきた。
【０００３】
しかしながら、糖鎖は、糖鎖単独ではなく脂質やタンパク質などと結合した複合糖質として機能していることが多く、その機能の発現機構は非常に複雑であり、その複合糖質の構造と機能の研究は未解明部分が極めて多い。また、タンパク質の研究分野でも糖鎖と協同してその機能を果たしていると思われるものが多数見つかっているが、その詳細な機構の研究は現状ではきわめて困難である。
【０００４】
これらの研究を推し進め、さらに医薬などへと活用するためには、糖鎖単独ではなく糖ペプチドのような複合糖質の状態で均一な試料を用意する必要がある。しかしながら、糖ペプチドは糖鎖とペプチドとの双方が極めて多様性に富んでいるため、必要な糖ペプチドをそのつど天然物から調達することは事実上不可能である。このようなことから、糖ペプチドの迅速な合成法の開発が期待されている。
【０００５】
糖ペプチド合成法としては、糖アミノ酸を原料として用いる固相合成法が挙げられる。しかしながら、糖アミノ酸の立体障害が大きいため、通常の糖アミノ酸残基を含まないペプチド合成に比べ、その収率及び反応速度が低下するという問題がある。また、糖アミノ酸は通常のアミノ酸に比べ大量に調製するのが困難であり、糖ペプチドの合成において糖アミノ酸は小過剰量でしか使用できないという問題がある。
【０００６】
また、これまでの糖ペプチドの合成例はほとんどがその糖部分が単糖であり、オリゴ糖（特に生体内では一般的な糖鎖構造である分岐型のオリゴ糖）を有する糖ペプチド合成の報告例は極めて少なく、その調製に時間を要し、また収率も極めて低かった。
【０００７】
また、生体高分子が介在する反応を促進する方法として、その生体高分子を含む反応系（例えば、酵素反応、抗体抗原反応等）にマイクロ波を照射することを特徴とする方法が知られているが（例えば、特開２００１−２６５１７５号公報）、糖ペプチドの合成については何ら開示していない。
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−２６５１７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記従来技術の諸問題を解決し、種々の糖鎖及びペプチドからなる糖ペプチドを迅速且つ効率的に製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、糖ペプチドの合成において、糖アミノ酸と他の糖アミノ酸残基又はアミノ酸残基とのペプチド結合形成反応がマイクロ波の照射により促進されることを見出し、本願発明を完成させるに至った。
【００１１】
即ち、本願発明は以下の発明を包含する。
（１）糖アミノ酸を用いる糖ペプチドの製造方法において、マイクロ波を照射しながらペプチド結合形成反応を行うことを特徴とする糖ペプチドの製造方法。
（２）糖アミノ酸のアミノ酸残基が、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸及びトリプトファンからなる群より選択される前記（１）記載の製造方法。
（３）糖アミノ酸の糖残基が、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコース、フコース、シアル酸、イズロン酸及びグルクロン酸並びにこれらの構成糖単位を含むオリゴ糖からなる群より選択される前記（１）又は（２）記載の製造方法。
（４）糖アミノ酸の糖残基とアミノ酸残基とが、グリコシド結合、アミド結合又は炭素−炭素結合により結合している前記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）マイクロ波の波長が２３００〜２６００ＭＨｚである前記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、単一の糖ペプチドを短時間で効率的に合成する方法が提供される。また、本発明の方法では、ペプチド結合形成反応が選択的に促進されるため、例えば、エステル系保護基のペプチド鎖中のアミノ基への転移反応等の副反応が相対的に低減し、目的とする糖ペプチドを良好な収率で得ることができる。また、高効率でペプチド形成反応が進行するので、大過剰の原料糖アミノ酸を必要とせず、調製や入手が困難な糖アミノ酸の使用量を大幅に低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で用いられる「糖アミノ酸」とは、アミノ酸に糖残基が結合した化合物のことを言う。
【００１４】
本明細書でいうアミノ酸とは、同一分子内に−ＮＨ２又は−ＮＨ−及び−ＣＯＯＨを有する化合物で、α−、β−、γ−及びδ−アミノ酸等が挙げられる、また、Ｌ−及びＤ−アミノ酸のいずれでもよい。糖アミノ酸のアミノ酸として好ましいものは、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸及びトリプトファン等である。
【００１５】
また、糖残基としては単糖及びオリゴ糖（２〜２０糖、好ましくは２〜１０糖、さらに好ましくは２〜５糖）のいずれでもよく、また、各構成糖はペントース、ヘキソース及びヘプトース等のいずれであってもよい。３糖以上のオリゴ糖である場合には直鎖状糖鎖及び分岐状糖鎖のいずれでもよい。糖残基の具体例としては、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコース、フコース、シアル酸、イズロン酸及びグルクロン酸等の単糖類、並びにこれらの構成糖単位を含み直鎖状又は分岐状に結合したオリゴ糖が挙げられる。糖残基中に存在する水酸基、アミノ基及び／又はカルボキシル基は、通常用いられる保護基（例えば、アセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、レブリノイル基、ホルミル基、フタロイル基、メチル基、エチル基、ベンジル基、アリル基、硫酸基、硫酸エステル基、リン酸基、リン酸エステル基等）で保護していてもよい。
【００１６】
糖アミノ酸は、上記アミノ酸と上記糖残基とが結合したものであるが、その結合様式は特に限定されるものではなく、例えば、グリコシド結合（Ｏ−グリコシド、Ｎ−グリコシド、Ｓ−グリコシド、Ｃ−グリコシド等）、アミド結合及び炭素−炭素結合等が挙げられる。
【００１７】
次に、本発明の糖ペプチドの製造工程について詳細に説明する。
本発明の方法は、以下のように、原料として糖アミノ酸を用い、通常のペプチド合成反応系にマイクロ波を照射しながら行う。
【００１８】
本発明の方法は、慣用のペプチド固相合成を利用して行うのが好ましい。ペプチド固相合成法を利用する場合は以下のようにして行うことができる。
【００１９】
まず、固相担体に最初の糖アミノ酸（又はアミノ酸）のＮ末端アミノ基又はＣ末端カルボキシル基を結合し（例えば、Ｃ末端のカルボキシル基をクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合する）、所望により縮合剤を用いて、順次糖アミノ酸（又はアミノ酸）を結合していく。
【００２０】
縮合剤としては、例えば、ジフェニルホスホリルアジド(ＤＰＰＡ)、ジエチルホスホリルシアニデート、アジドトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩等の有機リン化合物、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１,２−ジハイドロキノリン(ＥＥＤＱ)、１−イソブチル−２−イソブチル−１,２−ジヒドロキシキノリン等のキノリン系ペプチド縮合剤、２-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(ＨＢＴＵ）、ＤＣＣ等のカルボジイミド類等があげられる。
【００２１】
本発明では、この固相合成反応をマイクロ波を照射しながら行う。本明細書で言う「マイクロ波」とは波長約０．３〜３０ｃｍ程度の電磁波（１〜１００ＧＨｚに相当する）のことをいう。マイクロ波の波長としては、好ましくは２３００〜２６００ＭＨｚであるが、さらに好ましくは２３５０〜２５５０ＭＨｚ、特に好ましくは２４００〜２５００ＭＨｚである。
【００２２】
本発明者らは、固相合成反応においてマイクロ波を照射することにより、ペプチド形成反応が促進されるという予想外の効果を見出した。これは、マイクロ波は誘電率の高い分子のみを活性化するが、固相合成反応系に存在する反応種の中で最も極性が高いのはアミノ基及びカルボン酸であるので、マイクロ波を照射するとこれらの官能基が誘電分極して選択的に活性化・加熱され、ペプチド形成反応が促進されるものと推察される。他の官能基は活性化されないので副反応を大幅に低減することができる。
【００２３】
マイクロ波照射によりペプチド形成反応が促進され、従来法と比較して大幅に反応時間を減らすことができる。さらに、マイクロ波は固相担体の内部にまで到達するので、従来は反応の進行が困難な部位（例えば、固相担体の内部）に存在するような反応種でも反応させることが可能となる。
【００２４】
さらに、マイクロ波照射と同時に、振動や超音波を加えて固相合成反応を行ってもよい。
【００２５】
この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護するのが好ましい。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ），ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニル、９ーフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。カルボキシル基の保護基としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられる。
【００２６】
固相合成における反応温度は、特に限定されないが、通常０〜８０℃とするが、好ましくは２５〜５０℃である。反応時間は、反応温度やマイクロ波の出力等にもよるが、例えば０．１〜１２０分であり、好ましくは１〜６０分、さらに好ましくは１〜３０分である。従来法による糖アミノ酸のカップリング法では室温において通常数時間〜２４時間程度の反応時間を必要とするが、これと比較すると本発明の製造方法では上記のように短時間でペプチド結合形成反応が完了し、非常に効率的である。その他の反応条件は、通常のペプチド固相合成を参考にすることができる。
【００２７】
縮合反応終了後、場合により保護基を除去し、そして得られた糖ペプチドのＣ末端と担体樹脂との結合を切断する。切り離された糖ペプチドは通常の方法にしたがって精製され、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて精製できる。
【００２８】
合成した糖ペプチドの配列は、例えば、エドマン分解法でＮ−末端からアミノ酸配列を読み取るプロティンシークエンサー、MALDI-TOF MS/MS等で分析することができる。
【００２９】
本発明の製造方法は、特には糖アミノ酸残基を１〜３０個程度有する糖ペプチドを製造するのに好適である。また、試薬・溶媒の供給、反応系の制御、洗浄等のペプチド固相合成の各工程を自動化した市販の一般的な自動ペプチド固相合成装置にマイクロ波を発生するためのマイクロは出力手段を備えた糖ペプチド自動合成装置を用いて、本発明の製造方法を自動化して行うことも可能である。
【実施例】
【００３０】
以下の実施例より本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
本実施例で用いられる略語は以下の意味を有する。
DMF：N,N-ジメチルホルムアミド
DCM：ジクロロメタン
HOBT：N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DIEA：ジイソプロピルエチルアミン
Fmoc-Ala-OH：N-α-Fmoc-L-アラニン
Fmoc-Gly-OH：N-α-Fmoc-L-グリシン
Fmoc-Pro-OH：N-α-Fmoc-L-プロリン
Fmoc-Arg(Pbf)-OH：N-α-Fmoc-Nγ-(2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル)-L-アルギニン
Fmoc-Asp(OtBu)-OH：N-α-Fmoc-L-アスパラギン酸 β-t-ブチルエステル
Fmoc-Val-OH：N-α-Fmoc-L-バリン
Fmoc-His(Trt)-OH：N-α-Fmoc-N-トリチル-L-ヒスチジン
Fmoc-Thr(Ac7core2)-OH：N-α-Fmoc-O-{O-(2',3',4',6'-テトラ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノシル)-(1'→3)-O-[2''-アセトアミド-3'',4'',6''-トリ-O-アセチル-2''-デオキシ-β-D-グルコピラノシル-(1''→6)]-2-アセトアミド-2-デオキシ-α-D-ガラクトピラノシル}-L-スレオニン
Fmoc-Ser(Ac7core2)-OH：N-α-Fmoc-O-{O-(2',3',4',6'-テトラ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノシル)-(1'→3)-O-[2''-アセトアミド-3'',4'',6''-トリ-O-アセチル-2''-デオキシ-β-D-グルコピラノシル-(1''→6)]-2-アセトアミド-2-デオキシ-α-D-ガラクトピラノシル}-L-セリン
【００３２】
また、本実施例で行ったマイクロ波照射下における実験は、マイクロ波の出力可変により温度制御の可能なマイクロ波式有機化学合成装置グリーン・モチーフ・Ｉ（東京電子株式会社製）を用いて行った。
【００３３】
（実施例１）
以下のようにして固相担体（TentaGel S RAM resin，0.25mmol/g，ラップポリマー社製）にFmoc-Ala-OHを担持した。
【００３４】
Fmoc-Ala-OH(127mg)を0.4M HBTU，HOBT/DMF溶液(1.03ml)に溶解し、続いてDIEA(141μl)を添加した。この溶液を固相担体(547mg)に加えて室温で2時間攪拌した。反応終了後、固相担体をDMF(15ml)で5回洗浄した後、20％ピペリジン/DMF溶液(15ml)を添加して室温で20分間攪拌した。樹脂をDMF(15ml)で5回、DCM(15ml)で5回洗浄して20時間乾燥した。
【００３５】
次いで、以下のようにして、マイクロ波照射下において、アラニン担持固相担体とCore2と呼ばれる分岐型3糖のアセチル保護体がスレオニンの水酸基に結合したFmoc-糖アミノ酸(Fmoc-Thr(Ac7core2)-OH)との縮合反応を行った。
【００３６】
Fmoc-Thr(Ac7core2)-OH(46.9mg)を0.4M HBTU，HOBT/DMF溶液(97.4μl)に溶解し、続いてDIEA(13.3μl)を添加した。この溶液を固相担体(100mg)に加え、反応容器をグリーン・モチーフ・Ｉに入れ、上部からは熱電対を差込み、側面からは振盪器を取り付けて反応容器を振盪させながら、50℃においてマイクロ波(40W、2450MHz)を照射した。4分後、マイクロ波照射を停止し、樹脂をDMF(5ml)で5回、DCM(5ml)で5回洗浄し、20時間乾燥した。Fmoc基の定量により縮合反応率は94％と算出された。
【００３７】
（実施例２）
以下のようにして、実施例１において調製した、Fmoc-Thr(Ac7core2)-OHが結合したアラニンを担持した固相担体と、Core2のアセチル保護体がセリンの水酸基に結合したFmoc-糖アミノ酸(Fmoc-Ser(Ac7core2)-OH)との縮合反応を行った。
【００３８】
実施例１において調製した、Fmoc-Thr(Ac7core2)-OHが結合したアラニンを担持した固相担体に20％ピペリジン/DMF溶液(5ml)を加えた。20分後、樹脂をDMF(5ml)で5回、DCM(5ml)で5回洗浄して20時間乾燥した。Fmoc-Ser(Ac7core2)-OH(21.4mg)を0.4M HBTU，HOBT/DMF溶液(44.9μl)に溶解し、続いてDIEA(6.15μl)を添加した。この溶液を固相担体(59.3mg)に加え、反応容器をグリーン・モチーフ・Ｉに入れ、上部からは熱電対を差込み、側面からは振盪器を取り付けて反応容器を振盪させながら、50℃においてマイクロ波(40W、2450MHz)を照射した。20分後、マイクロ波照射を停止し、樹脂をDMF(5ml)で5回、DCM(5ml)で5回洗浄し、20時間乾燥した。Fmoc基の定量により縮合反応率は85％と算出された。
【００３９】
（実施例３）
以下のようにして、アラニン担持固相担体にCore2のアセチル保護体を有する糖ペプチド鎖(MUC1)を担持した。
【００４０】
実施例１において用いた固相担体(59.3mg)に以下のFmoc-糖アミノ酸又はFmoc-アミノ酸を順にマイクロ波照射下にて縮合反応させた：Fmoc-Ser(Ac7core2)-OH(21.4mg)、Fmoc-Gly-OH(10.7mg)、Fmoc-Pro-OH(12.1mg)、Fmoc-Ala-OH(11.3mg)、Fmoc-Pro-OH(12.1mg)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH(23.3mg)。Fmoc-糖アミノ酸は0.4M HBTU，HOBT/DMF溶液(44.9μl)として用い、Fmoc-アミノ酸は0.4M HBTU，HOBT/DMF溶液(89.8μl)として用いた。また、塩基として添加したDIEAは、Fmoc-糖アミノ酸を用いる場合には6.15μlを用い、Fmoc-アミノ酸を用いる場合には12.3μlを用いた。各縮合反応は、実施例１と同様にしてグリーン・モチーフ・Ｉ反応装置を用いて、50℃においてマイクロ波(40W、2450MHz)を照射して行った。マイク照射時間は、Fmoc-糖アミノ酸を用いる場合においては30分間、Fmoc-アミノ酸を用いる場合においては10分間とした。
【００４１】
各縮合反応終了後、樹脂をDMF(5ml)で5回洗浄し、20％ピペリジン/DMF溶液に入れて3分間マイクロ波(40W、2450MHz)を照射した。Fmoc基を脱保護し、樹脂をDMF(5ml)で5回洗浄した。このようにして、縮合反応と脱保護とを繰り返し、ペプチド鎖の伸長反応を行った。
【００４２】
次いで、得られた固相担体の一部(28.0mg)に、以下のFmoc-糖アミノ酸又はFmoc-アミノ酸を順にマイクロ波照射下で縮合させた：Fmoc-Thr(Ac7core2)-OH(8.10mg)、Fmoc-Asp(OtBu)-OH(9.31mg)、Fmoc-Pro-OH(7.63mg)、Fmoc-Ala-OH(7.04mg)、Fmoc-Ser(Ac7core2)-OH(13.5mg)、Fmoc-Thr(Ac7core2)-OH(6.81mg)、Fmoc-Val-OH(15.4mg)、Fmoc-Gly-OH(13.5mg)、Fmoc-His(Trt)-OH(28.04mg)、Fmoc-Ala-OH(7.04mg)。Fmoc-Thr(Ac7core2)-OHは0.4M HBTU，HOBT/DMF溶液(14.1μl)として用い、Fmoc-Ser(Ac7core2)-OHは0.4M HBTU，HOBT/DMF溶液(28.3μl)として用い、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH及びFmoc-Ala-OHは0.4M HBTU，HOBT/DMF溶液(56.6μl)として用い、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OHは0.4M HBTU，HOBT/DMF溶液(113.1μl)として用いた。
【００４３】
上記各縮合反応も同様にしてグリーン・モチーフ・Ｉ反応装置を用いて、50℃においてマイクロ波(40W、2450MHzMHz)を照射して行った。マイクロ波照射時間は、Fmoc-糖アミノ酸を用いる場合においては30分間、Fmoc-アミノ酸を用いる場合においては15分間とした。
【００４４】
各縮合反応終了後、樹脂をDMF(5ml)で5回洗浄し、20％ピペリジン/DMF溶液に入れて3分間マイクロ波(40W、2450MHzMHz)を照射した。Fmoc基を脱保護し、樹脂をDMF(5ml)で5回洗浄した。このようにして、縮合反応と脱保護とを繰り返し、ペプチド鎖の伸長反応を行った。
【００４５】
Fmoc基の定量により縮合反応率は37％と算出された。
【００４６】
（比較例１）
以下のようにして、実施例２に対する比較実験を行った。
実施例１と同様にしてFmoc-Thr(Ac7core2)-OHが結合したアラニンを担持した固相担体から、脱Fmoc化した乾燥固相担体を得た(7.4mg)。Fmoc-Ser(Ac7core2)-OH(2.67mg)を0.4M HBTU，HOBT/DMF溶液(5.60μl)に溶解し、次いでDIEA(0.77μl)を添加した。この溶液を先の固相担体に添加し、室温で12時間振盪した。反応終了後、樹脂をDMF(5ml)で5回、DCM(5ml)で5回洗浄して20時間乾燥した。Fmoc基の定量により縮合反応率は76％と算出された。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
糖ペプチドはその生理活性や機能が注目されており、医薬への応用も期待されている。従来は、均一な（単一の）糖ペプチド、特にオリゴ糖残基を有する糖ペプチドを合成することは困難であったが、本発明の方法はそのような糖ペプチドでも短時間で効率的に合成でき、糖ペプチドを利用する医薬品開発や糖ペプチドライブラリ合成、生化学研究用サンプル調製に有用である。