(57)【要約】【課題】甘草に含まれている美白性成分を可及的に純度を高めて分離精製することであり、またこれにより美白作用に対して確実に有効な成分を精選して含有する美白性皮膚外用剤およびその製造方法とすることである。【解決手段】生薬である甘草の水性溶媒抽出液から懸濁物質を除去し、分取した透明性水性溶媒抽出物を濃縮し、この濃縮物を希釈および濃縮の過程で生じた前記水性溶媒に不溶な物質を固液分離してリクイリチン非含有の液体を分取すると共に加熱濃縮し、この濃縮物から無水エチルアルコール不溶性物質を固液分離して得られる無水エチルアルコール可溶性成分を配合して美白性皮膚外用剤を製造する。甘草に含まれている不快な臭気を有しないで、しかもリクイリチン以外の美白性成分が有効成分となり、多種の成分との競合がなくて確実な美白作用を期待できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生薬である甘草の水性溶媒抽出液から懸濁物質を除去し、分取した透明性水性溶媒抽出物を濃縮し、この濃縮物を前記水性溶媒で希釈し、この希釈と前記濃縮の過程で生じた前記水性溶媒に不溶な物質を分離除去し、分取したリクイリチン非含有の液体から無水エチルアルコール不溶性物質を分離除去して液中に残存する無水エチルアルコール可溶性成分を有効成分として含有してなる美白性皮膚外用剤。
【請求項２】
生薬である甘草の水性溶媒抽出液から懸濁物質を除去し、分取した透明性水性溶媒抽出物を濃縮し、この濃縮物を希釈および濃縮の過程で生じた前記水性溶媒に不溶な物質を固液分離してリクイリチン非含有の液体を分取すると共に加熱濃縮し、この濃縮物から無水エチルアルコール不溶性物質を固液分離して得られる無水エチルアルコール可溶性成分を配合することからなる美白性皮膚外用剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、皮膚の色素沈着を予防しまたは沈着した色素を淡白化する化粧料等に用いられる美白性皮膚外用剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、ヒトの皮膚の表皮に存在するメラニン色素は、色素細胞によって産出されて皮膚の新陳代謝で自然に排出されるものであるが、多量の紫外線を浴びた後に、新陳代謝機能が充分に働かない場合は、表皮や真皮内に残存するメラニン色素が沈着してしまい、シミやソバカスなどの皮膚に異常な色素沈着症状が起こることになる。
【０００３】
ところで、漢方薬として知られる甘草は、その抽出物である甘草エキスの水溶性分画に、リクイリチンが含まれており、このリクイリチンは、メラニン色素生成阻害による美白効果を有することが知られている（特許文献１参照）。
【０００４】
また、甘草エキスの油溶性分画には、グラブリジンやグラブレンが含有され、グラブリジンやグラブレンにはチロシナーゼ阻害活性のあることが認められ、これらを美白用の化粧料に配合することが知られている（特許文献２、非特許文献１参照）。
【０００５】
【特許文献１】特開平１−６３５０６号公報
【特許文献２】特開平６−２７１４５３号公報
【０００６】
【非特許文献１】聖マリアンナ医科大学雑誌「泉：油溶性甘草エキスによるメラニン産生抑制効果」、１９９４年発行、第２２巻、第９４１〜９４８頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、上記した従来技術によると、甘草エキス中の水溶性分画にはリクイリチン、油溶性分画にはグラブリジン、グラブレンなどの美白有効成分の存在が確認されているが、これら以外にも美白効果を奏する成分のある可能性があるが、それらは未だ確認されていなかった。
【０００８】
また、甘草エキスの水溶性分画中に含まれている美白成分は、有効な成分とそれ以外の不確実な成分とが混じり合った一群の混合成分であると考えられ、単独成分で確実に奏されるべき美白作用が、多種類の成分の相互作用によって充分に発揮されていない可能性がある。
【０００９】
さらにまた、甘草エキスは、皮膚外用剤としてあまり好ましくない黄緑色の色素を含み、また糠のような独特の臭気を有しており、これらが肌に対して不快感無く塗布するための障害となっていた。
【００１０】
そこで、この発明の課題は、上記した問題点を解決して、甘草に含まれている美白性成分を可及的に純度を高めて分離精製することであり、またこれにより美白作用に対して確実に有効な成分を精選して含有する美白性皮膚外用剤およびその製造方法とすることである。
【００１１】
また、上記の課題と共にこの発明の解決すべきその他の課題としては、肌に塗布しても目立たない色であり、かつ不快な臭気を有しない美白性皮膚外用剤およびその製造方法とすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題を解決するために、本願の美白性皮膚外用剤に係る発明では、生薬である甘草の水性溶媒抽出液から懸濁物質を除去し、分取した透明性水性溶媒抽出物を濃縮し、この濃縮物を前記水性溶媒で希釈し、この希釈と前記濃縮の過程で生じた前記水性溶媒に不溶な物質を分離除去し、分取したリクイリチン非含有の液体から無水エチルアルコール不溶性物質を分離除去して液中に残存する無水エチルアルコール可溶性成分を有効成分として含有してなる美白性皮膚外用剤としたのである。
【００１３】
または、前記の課題を解決するために、本願の美白性皮膚外用剤の製造方法に係る発明では、生薬である甘草の水性溶媒抽出液から懸濁物質を除去し、分取した透明性水性溶媒抽出物を濃縮し、この濃縮物を希釈および濃縮の過程で生じた前記水性溶媒に不溶な物質を固液分離してリクイリチン非含有の液体を分取すると共に加熱濃縮し、この濃縮物から無水エチルアルコール不溶性物質を固液分離して得られる無水エチルアルコール可溶性成分を配合することからなる美白性皮膚外用剤の製造方法としたのである。
【００１４】
上記したように構成されるこの発明の美白性皮膚外用剤およびその製造方法では、甘草エキスとして水性溶媒抽出液を用いているので、その中には水溶性成分が含まれ、油溶性のグラブリジンやグラブレンは溶解されていない。
【００１５】
さらに、この抽出液から懸濁成分が分離された透明性液体を濃縮し、再び水などの水性溶媒で希釈し、この濃縮と希釈の過程で生じた不溶性物質を分離除去する操作を行なう。このときの濃縮および希釈時において、リクイリチンは、水に不溶な物質に変化し、これらは活性炭などに吸着させるなどの周知の固液分離の手法で除去できる。このとき、同時に甘草に含まれる臭気や色素も除去される。
【００１６】
すなわち、この発明においては、懸濁成分が分離された甘草の水性溶媒抽出液から濃縮時に生じた固形状のリクイリチンを分離することにより、抽出液からリクイリチンを確実に除去した。これにより、美白性皮膚外用剤は、これに美白効果のあることが確認された場合、チロシナーゼ阻害活性を有しないにも拘わらず、その他の美白有効成分が残存することによって美白作用を奏していると考えられる。
【００１７】
因みに、植物エキスに対して濃縮と希釈を繰り返すと、その濃縮液は濃く着色されることが経験的に認められるが、この現象は、濃縮時に起こる化学反応で溶解液中に不溶性の反応物が生成したためと考えられている。
【００１８】
前記した吸着剤として、活性炭もしくはタルクまたは両者の混合物を採用すると、微細な不溶物が吸着され、これを分離除去することにより、リクイリチン、甘草の色素や臭気のある物質の除去および精製を確実に行なえる。
【００１９】
また、前記した製造方法では、濃縮工程を複数回行なうことにより、濃縮時に化学反応を確実に起こさせ、これにより溶解液中に不溶性の反応物を多く生成させるから、充分にリクイリチンを除去し、確実にリクイリチン非含有の精製液を製造することができる。
【００２０】
そして、この発明では、さらにリクイリチン非含有の液体から無水エチルアルコール不溶性物質を固液分離し、無水エチルアルコール可溶性成分を得る。
【００２１】
この無水エチルアルコール可溶性成分は、甘草の水溶性分画に含まれているリクイリチン以外の美白成分からなるものであり、リクイリチン以外の特有の美白性成分を含有することが、後述の実験からも明らかになった。
【発明の効果】
【００２２】
この発明では、甘草の水性溶媒抽出液から懸濁成分を除去すると共に、これを濃縮し、次いで再び水性溶媒で希釈し、この過程で生じた不溶性物質を分離除去し、さらにこの分画中無水エチルアルコールに溶解する成分のみを有効成分として含有する美白性皮膚外用剤としたので、甘草の水溶性分画に含まれているリクイリチン以外の美白性成分が有効成分として含まれており、有効な成分同士の競合が殆ど無くなって、チロシナーゼ阻害活性を有する物質は完全に除去されているにも拘わらず、確実な美白作用を奏する美白性皮膚外用剤になるという利点がある。
【００２３】
また、これらの発明では、肌に塗布しても目立たない色であり、かつ不快な臭気を有しない美白性皮膚外用剤およびその製造方法となる利点もある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
この発明に用いる甘草は、スペイン、シベリア、中国などに産するマメ科の薬用植物であるカンゾウを乾燥して保存性を高めた生薬であり、原材料の植物の学名はグリシルリーザ  ウラレンシス  フィッシャー（Glycyrrhiza  urarelensis  Fischer）またはグリシルリ─ザ  グラブラ  エル  バ─  グランダリフェラ  レグ  エ  ヘルド（Glycyrrhiza  glabra  l  var．glandulifera  REG．Et  HERD）と称され、これらの植物もしくはその近縁種の根または根茎（葡萄茎またはストロンとも呼ばれる）を皮付きのままか、またはコルク皮を除いて、粉砕もしくは摩砕して粉末状としたものであるか、さらには水性溶媒で抽出したものを皮膚外用剤の成分として用いる。
【００２５】
有効成分を抽出する水性溶媒は、水（中性、弱酸または弱アルカリ性のいずれであってもよい。）または水を主成分として適宜に他の溶媒（有機溶媒であってもよい。）を添加した水性の抽出溶媒であり、アルコール含有の水溶液なども採用できる。
【００２６】
このような水性溶媒による抽出操作は、温水または熱水の状態で行なうことが抽出効率がよくて好ましい。特に１００℃以上、好ましくは１００〜１３０℃で抽出操作を行なうと、美白に有効な成分が効率よく抽出される。
【００２７】
この抽出液について、活性炭などの吸着剤を濾材に用いて濾過するか、または固体と液体との比重差、重力または遠心力による沈降速度の差を利用して固液分離し、懸濁物質を除去する。このようにして透明性溶媒抽出物が得られる。
【００２８】
前記の吸着剤は、多量の正吸着を起こさせるような界面を提供する物質であればよく、上記のようにして得られた透明性液体を濃縮し再び水などで希釈した後、加えられて濃縮により生じた不溶物を分離除去し、精製をより完全なものにするものである。このような吸着剤としては、活性炭のような多孔質体からなる無機系吸着剤、または合成吸着剤（有機系吸着剤）が挙げられる。
【００２９】
無機系吸着剤としては、活性アルミナ、シリカゲル、酸化チタンなどの金属酸化物、還元物、水酸化物、ベントナイト、酸性白土などの粘土鉱物、珪藻土、タルクなどのヘキ開性のある含水ケイ酸塩鉱物が挙げられる。
【００３０】
活性炭は、その材質を特に厳選して使用するものではないが、木炭、竹または椰子殻を原料としたものは、微小粒子からなる懸濁物質の吸着効率が良くて好ましいものである。
【００３１】
合成吸着剤は、微細な連続孔が粒子の内部まで形成されたイオン交換樹脂製の粒子からなり、芳香族系の架橋スチレン系の多孔質重合体、芳香族重合体の芳香核に臭素原子を化合させた置換芳香族系のもの、またはメタクリル酸エステル重合体を骨格とする親水性吸着材とするアクリル性のものなどが挙げられる。
【００３２】
このように懸濁物質を除去する固液分離その他の操作としては、活性炭の粒を詰めたカラムなどの容器に抽出液を通過させるか、または抽出液に活性炭粉末（必要に応じてタルクなどの濾過補助剤）を加えて攪拌し、その混合物をろ紙や濾布などの前記活性炭の粉末粒子を捕捉するフィルターでろ過する方法も採用でき、その他にも遠心分離、沈降速度差による周知の固液分離手段を採用することができる。
【００３３】
分離して得られる透明性水性溶媒抽出物は、次いで濃縮される。濃縮操作は、減圧操作や加熱濃縮などの周知の濃縮手段を採用できる。濃縮の割合は、２〜１００倍程度であればよいが、特に５〜５０倍程度は好ましく、通常、１０倍程度の濃縮で好ましい結果を得ている。
【００３４】
得られた濃縮物は、前記した水性溶媒抽出液またはそれに相当する水性溶媒で希釈する。希釈率は特に限定する必要はないが、前記濃縮前の体積に戻す程度の希釈率程度が好ましいと考えられ、例えば２〜１００倍程度である。
【００３５】
そして、前記濃縮と希釈の操作を１工程として、２工程以上濃縮と希釈を繰り返して複数工程行なうことが好ましい。このように濃縮および希釈時において、リクイリチンは、水に不溶な固形状の物質に変化するから、これを活性炭などに吸着させるなど、その他周知の固液分離法によって抽出液から除去できる。
【００３６】
このようにして得られたリクイリチン非含有の液体を、さらに抽出操作によって精製するには、好ましくは濃縮した後、抽出溶媒として無水アルコールを用いる。
通常、無水アルコールは、エタノール濃度９９．５％以上のものと定義される。そしてこの発明において９９．５％未満のエタノールを使用すると、水溶性分画に含まれている美白成分（リクイリチン以外の成分）を充分に抽出することが難しくなると共に、甘草に含まれる臭気や色素を確実に除去できないので、この発明の所期した効果を確実に奏することができない。
【００３７】
すなわち、リクイリチン非含有の液体を分取すると共に、好ましくは９９℃以下、より好ましくは９５℃以下に加熱濃縮し、この濃縮物から無水エチルアルコール不溶性物質を固液分離して無水エチルアルコール可溶性成分を得る。
【００３８】
固液分離して得られた無水エチルアルコール可溶性成分を有効成分として配合するには、抽出液を適当な親水性・親油性があって、皮膚付着性の良い皮膚外用剤用の基剤に混和するか、または抽出液をクリーム、軟膏、乳液などの基材に混合すればよい。
【００３９】
この発明の皮膚外用剤の製剤形態としては、特に限定するものではなく、化粧料として周知の形態をとることができるが、例えば水溶性、乳液（スキンミルク）、クリーム、軟膏、パウダーなどのように皮膚に対して塗布の容易な製剤形態にすることが好ましい。
【実施例１】
【００４０】
［抽出処理］
処理１）  甘草１００ｋｇに水１２００Ｌ（以下、リットルをＬで略記する。）を加え、ステンレス容器に入れ、９５℃にて２時間加熱し、６１９Ｇ（Ｇ：重力加速度）で２時間の遠心分離を行なって固液分離し、分取した液を３００メッシュのステンレス製振動篩でろ過して透明性液体からなる濾液を得た。
【００４１】
処理２）  得られた濾液１０００Ｌを減圧濃縮して１００Ｌとし、これに活性炭（日本エンバイロケミカルズ社製：粒状白鷺ＫＬ）２．７ｋｇを加えて、混和後に１００メッシュのステンレス製振動篩でろ過した。
【００４２】
処理３）  処理２のろ過処理で分取した濾液１００Ｌを、減圧濃縮して２Ｌに濃縮し、さらに1３０００Ｇで２０分の遠心分離により、活性炭除去と減圧濃縮によって水分４０％含有のエキスを作成した。
ここまでの処理１〜３において、処理２が一回のみで得られたエキスをＡとした。Ａに水を加え１０００Ｌとした後、２の操作を１２回繰り返して得られたエキスをＢとした。
【００４３】
処理４）  Ｂの２４０ｇに水を加えて６Ｌとし、これに希釈活性炭（和光純薬社製：活性炭素粉末）６００gを加えて攪拌すると共に、９００ｇのタルク（丸石製薬社製）を加えて更に攪拌した後、濾過（濾紙）して得られた濾液を９５℃以下に加熱してタール状の濃縮エキスＣを得た。
【００４４】
処理５）次に、濃縮エキスＣの１００ｇに９５％エタノール（丸石製薬株式会社）１４０ｍｌを加え、１８８０Ｇで２分間の遠心分離を行なって固液分離し、分取した液を９９℃以下の温度条件で加熱して濃縮物Ｄを得た。
【００４５】
処理６）
濃縮物Ｄの２４ｇに水を加えて５００ｍＬとし、これに希釈活性炭（和光純薬社製：活性炭素粉末）５０gを加えて攪拌すると共に、１００ｇのタルク（丸石製薬社製）を加えて更に攪拌した後、濾紙にて濾過し、得られた濾液を９５℃以下に加熱して得た濃縮物に９９．５％無水エタノール（コニシ株式会社）１５０ｍｌを加え、１８８０Ｇで２分間の遠心分離を行なって固液分離し、分取した液を９９℃以下に加熱して濃縮物を得た。
【００４６】
上記により得られた濃縮物に処理６と同じ操作を３回行なって、得られた濃縮物をエキスＥとした。得られたエキスＥについて、リクイリチンおよびグラブリジンの含有量を以下の条件のカラムクロマトグラフィーで調べた。
【００４７】
リクイリチン：  カラムMILLIPORE社Puresil C18、直径４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、
３０℃、２５７ｎｍ、１ｍｌ/分。移動相：  CH3CN：２%CH3COOH＝２０：８０
グラブリジン：  カラムMILLIPORE社Puresil C18、直径４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、
４０℃、２８２ｎｍ、１ｍｌ/分。移動相：  CH3CN：２%CH3COOH＝６０：４０
【００４８】
上記のカラムクロマトグラフィーによると、エキスＥからはリクイリチンおよびグラブリジンは検出されなかった。
一方、通常のカンゾウエキス（日本薬局方、日本粉末株式会社製）のリクイリチンの含有量は、４．７２ｍｇ/ｇであり、測定条件は以下の通りである。
【００４９】
［ＨＰＬＣ条件］
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２５４ｎｍ）
カラム温度：３０℃
カラム：Inertsil  ODS-2(５μm、４．６×１５０ｍｍ)
移動相：酢酸（２％）/アセトニトリル混液（８：２）
流速：０．８ｍＬ/ｍｉｎ
流入量：２０μＬ
【００５０】
次に、エキスＡ，エキスＥおよびカンゾウエキス（日本薬局方、日本粉末株式会社製）を用いた皮膚外用剤のチロシナーゼ活性阻害作用に必要な有効濃度を調べた。
【００５１】
＜吸光度法によるチロシナーゼ活性抑制作用（阻害率の計算）＞
フナコシ社製のマッシュルーム由来のチロシナーゼを用い、以下の試薬I〜Vを用いてチロシナーゼ活性阻害作用について検討した。
(I)    Ｌ−チロシン溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）                       ０．１    ｍｌ
(II)   ７．８ｍＭ アスコルビン酸を含む1/５Ｍ リン酸緩衝液(ｐＨ7.0)０．０２５ｍｌ
(III)  ０．１%硫酸銅液                                            ０．０２５ｍｌ
(IV)   チロシナーゼ溶液（３７．５mg/１００ｍｌ）                  ０．０２  ｍｌ
(V)    希釈した試料溶液                                            ０．１    ｍｌ
【００５２】
酵素反応は、大日本製薬社製マルチプレートリーダー(マルチスキャンアセント)を用い、ファルコン（FALCON）社の９６穴マルチウェルプレートで反応を行って吸光度を測定した。すなわち、最初にI,II,III,IV,Vの各液を加えて０時間での６２０ｎｍの吸光度(Iｏ)を測定した。その後３７℃で1時間インキュベートし、再び６２０ｎｍの吸光度（Iｔ）を測定した。また同時にV液の代わりに精製水を０．１ｍｌ加えた物を用意し、同様の反応を行って吸光度（Iｂ）を測定し、下記の式に従ってチロシナーゼ活性阻害率を算出した。
【００５３】
チロシナーゼ活性阻害率（％）＝［Iｂ−（Iｔ−Iｏ）／Iｂ］×１００
【００５４】
濃度と阻害率をグラフにプロットし、５０％阻害に必要な濃度を測定したところ、エキスＡの５０％チロシナーゼ活性阻害に必要な濃度は、１．２０ｍｇ／ｍｌであった。またカンゾウエキス（日本薬局方、日本粉末株式会社製）での５０％チロシナーゼ活性阻害に必要な濃度は、５．８６ｍｇ／ｍｌであった。エキスＥにはチロシナーゼ阻害活性が認められなかった。
【００５５】
次に、エキスＥに精製水を加えて３％外用剤を製造し、これを実施例とした。
また、通常のカンゾウエキス（日本薬局方、日本粉末株式会社製）に精製水を加えて３％外用剤を製造し、これを比較例とした。
【００５６】
このようにして得られた実施例と比較例を、皮膚に色素沈着のある成人のパネラー（表１中に示す例数）に対して毎日塗布させ、１ヶ月後に皮膚色素沈着の改善効果をアンケート（本人および本人以外の評価）調査した。この結果は、以下の評価基準に従って点数化し表１中に併記した。
【００５７】
非常に有効（３点）：本人及び本人以外の人も薄くなったと感じる。
有効      （２点）：本人又は本人以外の人のどちらかが薄くなったと感じる。
やや有効  （１点）：本人又は本人以外の人のどちらかが若干薄くなったと感じる。
無効      （０点）：本人及び本人以外の人のどちらも薄くなったと感じない。
【００５８】
【表１】
2006028157.tif 000002
【００５９】
表１の結果からも明らかなように、エキスＥはチロシナーゼ阻害活性を有する物質は完全に除去されているにも拘わらず美白効果を有しており、一方、複数の美白成分が混在している比較例に比べて、極めて有効に作用していることがわかる。
【００６０】
これにより、チロシナーゼ阻害活性のある美白性物質を除去して精製したエキスＥの美白有効性が確認できる。また、実施例の外用剤は、肌に塗布しても目立たない色であり、かつ不快な臭気を有しないとの好ましい評価をパネラー全員から得た。