(57)【要約】【課題】ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の進化工学的改変に好適な、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の基質供給系酵素を完備した宿主−ベクター系を提供すること。【解決手段】  ポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子を破壊して同質遺伝子系統を形成する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子が破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統株。
【請求項２】
ポリヒドロキシアルカノエート生産菌であるシュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. ＹＮ２１、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５６９）の同質遺伝子系統であって、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするシュードモナス スピーシーズ PC１2株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. PC１2、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７０）。
【請求項３】
下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、かつ／または下記（ｃ）または（ｄ）に示す相同組換えのためのＤＮＡと、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子破壊のための部分と、ベクターと、を有し、これらが機能的に連結してなるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクター；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部。
【請求項４】
ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターであって、
（１）下記（ａ）〜（ｂ）に示すＤＮＡのいずれか；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（２）外来性ＤＮＡ、
（３）該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、
（４）接合起点遺伝子、及び
（５）ベクター
を有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクター。
【請求項５】
ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターであって、
（１）下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（２）下記（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（３）該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、
（４）感受性遺伝子、
（５）接合起点遺伝子、
（６）該（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡと、該（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡとの間に挿入された外来性ＤＮＡ、及び
（７）ベクター
を有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクター。
【請求項６】
感受性遺伝子がレヴァンスクラーゼ遺伝子である、請求項５に記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクター。
【請求項７】
外来性DNAがゲンタマイシン耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子である請求項４から６のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクター。
【請求項８】
請求項３から７のいすれかに記載の遺伝子ターゲティングベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
原核性宿主である請求項８記載の宿主細胞。
【請求項１０】
大腸菌である請求項９記載の宿主細胞。
【請求項１１】
ポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法であって、請求項３から７のいずれかに記載の遺伝子ターゲティングベクターとポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体上のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子との相同組換えによりポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子を破壊することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法。
【請求項１２】
ポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法であって、請求項８から１０のいずれかに記載の宿主細胞とポリヒドロキシアルカノエート生産菌との接合伝達により、遺伝子ターゲティングベクターとポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体上のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子との相同組換えを惹起しポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子を破壊することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統において組換えポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子を形質転換することにより得られた形質転換体を培養し、培養液からポリヒドロキシアルカノエートを回収することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統およびポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子を破壊するための遺伝子ターゲティングベクターおよび該遺伝子ターゲティングベクターを用いたポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子の破壊方法に関する。またポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統に組換えポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を発現させることによりポリヒドロキシアルカノエートを生産させることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、多くの微生物がポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)あるいはその他のポリ-３-ヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)を生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,Ｐ178-197(1995))。これらのポリマーは従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。さらに、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全分解されるという利を有しており、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。特に最近、微生物産生ＰＨＡのより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮して、アルキル基以外の置換基を側鎖に導入したＰＨＡ「unusual ＰＨＡ」が極めて有用であることが期待されている。このような置換基の例としては、芳香環を含むもの(フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基等)や、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシド、チオエーテルなどが挙げられる。
【０００３】
微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、このようなPHAを産生する微生物については様々な研究が成され、PHAの生合成経路は比較的よく調べられてきた。これまでのところポリヒドロキシアルカノエート合成酵素はその基質特異性とサブユニット構成により、3つのクラスに分類されている。
【０００４】
「第1のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素はRalstonia eutrophaやAeromonas punctataなどに見出されるもので、炭素数３から５の短い鎖長の３−ヒドロキシアルカン酸と、補酵素CoAとのチオエステル体を基質として利用する。このクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素は分子量６１から７３ｋDaの単一のサブユニットから構成されている。
【０００５】
「第2のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素はPseudomonas oleovolansやPseudomonas aeruginosaなどに見出されるもので、炭素数６から１４の中鎖長３−ヒドロキシアルカン酸と補酵素CoAとのチオエステル体を基質として利用する。このクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素は分子量６１から７３ｋDaの単一のサブユニットから構成されているが、その遺伝子は一般に２つあり（phaC1とphaC2）、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子(phaZ)とphaC1-phaZ-phaC2というクラスターを構成している。
【０００６】
「第3のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素はAllochromatium vinosumやEctothiorhodospira shaposhnikoviiなどに見出され、基質特異性は、第1のクラスのポリヒドロキシアルカノエート合成酵素に似て、炭素数３から５の短い鎖長の３−ヒドロキシアルカン酸と補酵素CoAとのチオエステル体を利用する。このクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素は約４０ｋDaの相異なる2種類のサブユニットから構成される。
【０００７】
ところでPHAの生産性を向上させたり、新規なPHAを生産できる微生物を開発したりする目的で、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を進化工学的に改変しようという研究が行われている。APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 68, 2411(2002)にはAeromonas caviae由来の「第1のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子に進化工学的改変を加えて、大腸菌に、(R)-特異的エノイル-ＣｏＡヒドラターゼ(phaJ)と、グラニュール結合タンパク質（phaP）と共に形質転換し、形質転換体をスクリーニングした結果、３−ヒドロキシ酪酸（PHB）と３−ヒドロキシヘキサン酸のランダム共重合したＰＨＡの生産性を向上し、３−ヒドロキシヘキサン酸のユニット比を増大できたことが開示されている。また、Applied Microbiology and Biotechnology, 59, 477(2002)にはAeromonas punctata由来の「第1のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子にランダムな変異を加えて、大腸菌に、Ralstonia eutropha由来のβ-ケトチオラーゼ（phaA）とアセトアセチル-CoAレダクターゼ（phaB）と共に形質転換し、形質転換体をスクリーニングした結果、野生型酵素に比べて活性の高い変異型酵素を取得することが出来、重量平均分子量が増大して、ＰＨＡの細胞内蓄積量も増加できたことが開示されている。
【０００８】
また、The Journal of Biochemistry, 133, 139(2003)にはPseudomonas sp.61-3由来の「第2のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子に進化工学的改変を加えて、大腸菌に、Ralstonia eutropha由来のβ-ケトチオラーゼ（phaA）とアセトアセチル-CoAレダクターゼ（phaB）と共に形質転換し、形質転換体をＰＨＢ合成能によりスクリーニングすることによって、第2のクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を第1のクラスに属する合成酵素に近い基質特異性を有するものに改変できたことが開示されている。
【非特許文献１】「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,Ｐ178-197(1995)
【非特許文献２】APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 68, 2411(2002)
【非特許文献３】Applied Microbiology and Biotechnology, 59, 477(2002)
【非特許文献４】The Journal of Biochemistry, 133, 139(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
機能性ポリマーとして期待されているPHA(特にunusual PHA)を、安価にかつ大量に安定的に得るためには、その微生物のもつポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の活性を高めることによって、生産性を向上させることが必要である。また新規なunusual PHAを生産できる微生物を開発するためにはその微生物のもつポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の基質特異性を改変することが必要である。これまでのところ、unusual PHAを生産できる微生物の大部分は第2のクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子を有していることがわかっているので、上記の目的ためには第2のクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子をターゲットとして、この遺伝子の進化工学的改変を行うことが必要である。しかしながら、現状これが実施されていないのは、第2のクラスに属する合成酵素の基質供給系酵素群を完備した宿主−ベクター系が構築されていないためである。ここで第2のクラスに属する合成酵素の基質供給系とは、unusual PHAを生産し得る微生物において、ポリマーの原料（通常unusualな置換基を有する脂肪酸）を添加した培養液で培養する場合に、微生物によってポリマー原料が受ける生化学的変換を触媒する全ての酵素群を指し、この中には、アシル-ＣｏＡシンテターゼ、アシル-ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、（Ｌ）-エノイル-ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル-ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ケトアシル-ＣｏＡチオラーゼ、（Ｒ）−エノイル-ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル-ＣｏＡエピメラーゼ、ケトアシル-ＣｏＡレダクターゼなどの酵素の一部または全てが含まれる。
【００１０】
本発明が解決しようとする課題の第1は、第2のクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の進化工学的改変を実施する上で有用な、前記基質供給系酵素群を具備した宿主である、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統を提供することである。なお、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素欠損株として従来、ラルストニア・ユートロファPHB-4やシュードモナス・プチダGPp104（特開2001-008689）、シュードモナス・チコリアイYN2ml株（特開2003-011312）などが知られている。しかしながら特にunusual PHAの生産性を向上させる目的でポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の進化工学的改変を実施するためには、unusualな置換基を側鎖に導入したアルカンまたはアルカン酸を利用できる基質供給系酵素を具備したポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統を使用する必要があるが、上記従来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素欠損株はそのような基質供給系を必ずしも具備していないため使用できない。本発明が解決しようとする課題の第1は特に、広範な基質特異性を有する基質供給系酵素を具備しているとして発明者らにより単離されたシュードモナス スピーシーズ YN21株の同質遺伝子系統であり、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統を提供することである。
【００１１】
そのような菌株を得る一般的な方法は、ランダム変異導入法により変異導入した菌株の中からスクリーニングするという煩雑な実験操作を要するものであり、簡便なポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊された菌株の取得方法が望まれるところである。本発明の解決しようとする課題の第2は、簡便なポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の取得方法を提供することである。
【００１２】
さらに本発明の解決しようとする課題の第3は、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統に組換えポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を形質転換し、該形質転換体を用いて、ポリヒドロキシアルカノエートを生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意研究を行い、unusual PHA産生微生物の一つである、シュードモナス  スピーシーズ ＹＮ２１株よりPHA合成酵素遺伝子を単離することにより、該菌株のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子（phaC1およびphaC2）がポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子(phaZ)と、phaC1-phaZ-phaC2なるクラスターを構成していることを見出した。phaC1およびphaC2の遺伝子塩基配列の相同性に関するデータベース検索の結果に基づいて、phaC1に特異的な塩基配列からなるＤＮＡとphaC2に特異的な塩基配列からなるＤＮＡとを利用することによって、phaC1とphaC2を個別にあるいは同時に遺伝子破壊（gene-disruption）できる遺伝子ターゲティングベクターを設計・構築した。
構築した遺伝子ターゲティングベクターを用いることによって、シュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株の同質遺伝子系統であり、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子の破壊されている菌株を新たに取得することができた。また構築した遺伝子ターゲティングベクターを用いれば、他の前記第2のクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するポリヒドロキシアルカノエート産生微生物のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素も簡便に遺伝子破壊できることを見出した。さらに、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子破壊株に組換えポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を発現させると野生株に比べてそのポリヒドロキシアルカノエート生産性を向上させたり、合成酵素の基質特異性の違いにより、野生株とは異なる組成のPHAを合成するのに有用であることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１４】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統株は、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子が破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統株である。
【００１５】
また、この同質遺伝子系統株の一態様は、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌であるシュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. ＹＮ２１、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５６９）の同質遺伝子系統であって、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするシュードモナス スピーシーズ PC１2株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. PC１2、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７０）である。
【００１６】
本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターの一態様は、下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、かつ／または下記（ｃ）または（ｄ）に示す相同組換えのためのＤＮＡと、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子破壊のための部分と、ベクターと、を有し、これらが機能的に連結してなるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターである。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部。
【００１７】
本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターの他の態様は、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターであって、
（１）下記（ａ）〜（ｂ）に示すＤＮＡのいずれか；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（２）外来性ＤＮＡ、
（３）該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、
（４）接合起点遺伝子、及び
（５）ベクター
を有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターである。
【００１８】
本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターの他の態様は、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターであって、
（１）下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（２）下記（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（３）該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、
（４）感受性遺伝子、
（５）接合起点遺伝子、
（６）該（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡと、該（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡとの間に挿入された外来性ＤＮＡ、及び
（７）ベクター
を有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターである。
【００１９】
本発明にかかる同質系統株を得るために有用な宿主細胞は、上記の遺伝子ターゲティングベクターによって形質転換された宿主細胞である。
【００２０】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法は、上記の遺伝子ターゲティングベクターとポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体上のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子との相同組換えによりポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子を破壊することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法である。
【００２１】
更に、本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法の他の態様は、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法であって、上記の宿主細胞とポリヒドロキシアルカノエート生産菌との接合伝達により、遺伝子ターゲティングベクターとポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体上のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子との相同組換えを惹起しポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子を破壊することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法である。
【００２２】
本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、上記のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子が破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統において組換えポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子を形質転換することにより得られた形質転換体を培養し、培養液からポリヒドロキシアルカノエートを回収することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統は、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素が破壊されているためにポリヒドロキシアルカノエートを合成することは出来ないが、その基質供給系酵素を具備しているので、この微生物を宿主として用い、適当な発現ベクターを用いてポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子を形質転換すれば、再びポリヒドロキシアルカノエートを合成できる。この際用いる発現ベクターの種類や、発現プロモーターを適宜変更することによって、合成酵素の発現量や発現の時期を制御することが可能になる。また異なる基質特異性を有するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を形質転換することによって、新規な組成のポリヒドロキシアルカノエートを生産することが可能になる。これらはポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の進化工学的改変を実施する上で好適な性質である。
【００２４】
また、本発明のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターは、シュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素のみならず、他の第2のクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素も特異的に破壊できるので有用である。
【００２５】
また、本発明のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法は、上記遺伝子ターゲティングベクターを用いることにより、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体ＤＮＡ上のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子との相同組換えにより、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子を選択的に効率よく破壊することが出来、簡便にポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統を製造することができる。
【００２６】
また、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の発現量や発現時期及び／又は基質特異性を変化させることによって、ポリヒドロキシアルカノエートの生産量および生産されるＰＨＡの組成を変化させることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明に供されるポリヒドロキシアルカノエート生産菌は、従来よりポリヒドロキシアルカノエートを生産することの知られている微生物の内、下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはその一部をphaC1'と略し、下記（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ、またはその一部をphaC2'と略したとき；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
phaC1'、phaC2'の双方と生理的条件下、すなわち微生物細胞内で、染色体上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子を破壊(gene-disruption)することができる程度の相同性を有したポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子を具備しているものであれば特に限定されない。このような微生物としては、シュードモナス オレオボランス(Pseudomonas oleovorans)（Makromol.Chem.,191,1957-1965(1990)及びMacromolecules,24,5256-5260(1991)）、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)（Can.J.Ｍicrobiol.,41，32-43(1995)及び Polymer International,39，205-213(1996)）、シュードモナス・レジノボランス(Pseudomonas resinovorans)（Appl.Environ.Microbiol,５８(２),746 (1992)）、シュードモナス sp.61-3株(Pseudomonas sp.61-3 strain)（Int.Ｊ.Biol.Macromol.,１６(３)、119 (1994)）、シュードモナス・チコリアイ ＹＮ2株(Pseudomonas cichorii ＹＮ2；ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス・チコリアイ Ｈ45株(Pseudomonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シュードモナス・ジェッセニイＰ161株(Pseudomonas jessenii Ｐ161、ＦＥＲＭ ＢＰ-7376)などが挙げられる。またこの性質を具備するものであれば、将来新たに見出されるポリヒドロキシアルカノエート生産菌も本発明に供することができる。
【００２８】
本発明者らはフェニル吉草酸を基質として用いて、３−ヒドロキシフェニル吉草酸モノマーユニットを含むＰＨＡを生産する能力を有する微生物の探索を行った。その結果、土壌より所望の能力を有する微生物株を分離することに成功し、ＹＮ２１株とした。
【００２９】
以下に述べる菌学的性質から、バージェーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー・第１巻（Ｂｅｒｇｅｙ‘ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ１）（１９８４年）、及び、バージェーズ・マニュアル・オブ・ディタミネーティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ‘ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第９版（１９９４年）に基づいて検索したところ、ＹＮ２１株はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属すると判明した。従って、この菌株をシュードモナス・スピーシーズ・ＹＮ２１株とそれぞれ命名した。
【００３０】
unusualな置換基を有するポリヒドロキシアルカノエート生産菌として本発明者らが土壌より分離した微生物であるシュードモナス・スピーシーズ・ＹＮ２１株(Pseudomonas sp. ＹＮ２１)は、培地に添加されたunusualな置換基を有するアルカン酸からポリヒドロキシアルカノエートを合成するための基質供給系酵素群を具備していると考えられ、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の進化工学的改変を実施するための宿主を作製する上で有用であり、特に本発明に好適に供し得る。ＹＮ２１株は寄託番号「FERM BP-08569」として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(茨木県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。ＹＮ２１株の菌学的性質を列挙すれば以下の通りである。
＜YN21株の菌学的性質＞
１）形態学的性質
細胞の形と大きさ：桿菌、0.8μｍ×1.5〜2.0μｍ
細胞の多形性：なし
運動性：あり
胞子形成：なし
グラム染色性：−
コロニー形状：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、半透明
２）生理学的性質
カタラーゼ活性：＋
オキシダーゼ活性：＋
O/F試験：酸化型
硝酸還元：＋
インドール産生：−
アルギニンジヒドロラーゼ：＋
エスクリン加水分解：−
ゼラチン加水分解：−
King's B寒天での蛍光色素産生：＋
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積：−
Tween 80 の加水分解：＋
41℃生育：−
グルコン酸還元：−
レバン産生：−
ジャガイモ腐敗：−
タバコ過敏感反応：−
スクロース：−
カゼイン：−
チロシナーゼ：＋
硫化水素：−
ペクチン：−
レシチナーゼ：−
リトマスミルク：B
デンプン：−
３）基質資化能
ブドウ糖：＋
Ｌ-アラビノース：＋
Ｄ-マンノース：＋
Ｄ-マンニトール：−
マルトース：−
グルコン酸：＋
D-キシロース：(＋)
ラフィノース：−
サリシン：−
グリセリン：＋
D-セロビオース：−
D-メレチトース：−
ラクトース：−
ガラクトース：＋
D-ソルビトール：−
α-メチル-D-グルコシド：−
D-リボース：(＋)
スクロース：−
イノシトール：−
D-フルクトース：＋
L-ラムノース：−
D-アラビノース：−
ズルシトール：−
メリビオース：−
アドニトール：−
デンプン：−
エリスリトール：−
トレハロース：−
ベタイン：＋
DL-乳酸：＋
D-酒石酸：−
L-酒石酸：(＋)
メソ酒石酸：＋
n-カプリン酸：＋
L-リンゴ酸：(＋)
クエン酸：＋
D-サッカラート：＋
レブリン酸：＋
メサコン酸：−
マロン酸：＋
コハク酸：＋
酢酸：＋
プロピオン酸：＋
n-酪酸：＋
ギ酸：−
グルタル酸：＋
D-キナ酸：＋
セバシン酸：＋
p-ヒドロキシ安息香酸：＋
アントラニル酸：−
ペラルゴン酸：＋
グリセリン酸：＋
γ-アミノ酪酸：＋
L-ロイシン：＋
L-セリン：＋
ヒスチジン：＋
L-イソロイシン：＋
L-アルギニン：＋
β-アラニン：＋
L-チロシン：＋
L-バリン：＋
ホモセリン：−
サルコシン：＋
トリアセチン：＋
トリゴネリン：＋
5-フェニル吉草酸：＋
3-ヒドロキシ酪酸：＋
L-アスパラギン：＋
YN21株は従来菌株であるPseudomonas cichorii YN2株（FERM BP-7375）と硝酸塩還元性、インドール生成、ブドウ糖酸性化、アルギニンジヒドロラーゼ活性、Ｄ-マンノース資化能などの生理学的性質及び基質資化能の違いを示すことができる。また同様に従来菌株であるPseudomonas cichorii H45 株（FERM BP-7374）とは硝酸塩の還元性、アルギニンジヒドロラーゼ活性、Ｌ-アラビノース資化能、Ｄ-マンニトール資化能において、Pseudomonas jessenii P161 株（FERM BP-7376）とはＤ-マンニトール資化能において、Pseudomonas putida P91 株（FERM BP-7373）とは硝酸塩還元性、Ｌ-アラビノース資化能、Ｄ−マンノース資化能においてそれぞれ特性を異にする。
【００３１】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌は、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対して、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコ−ドする遺伝子配列の変性に帰結する変異原処理や、該酵素をコ−ドする遺伝子配列へのトランスポゾンの組み込み、該酵素をコ−ドする遺伝子が発現しないような遺伝工学的変性、例えば、アンチセンス遺伝子阻害、さらにまたは選択的遺伝子破壊によって取得し得るものである。
【００３２】
突然変異を起こすのに有用な化学変異原は、例えば、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)、エチルメタンスルホネート(EMS)及びジエチルスルフェイト(DES)のようなアルキル化剤である。ヒドロキシルアミン、及び亜硝酸のようなDNA塩基を脱アミノ化する化学薬品もまた有用である。電離放射線（γ一及びＸ−線）並びに紫外線照射 (UV)は、突然変異誘発で有用な物理的誘発原である。
【００３３】
ランダム変異導入法により変異導入した菌株の中からポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊された株を取得するには、例えば次の様にすればよい。先ず変異導入した菌株をＰＨＡの構成単位として利用し得るアルカン酸を含む寒天プレート上で培養し、ナイルレッド染色等により細胞内ＰＨＡを蛍光染色することによって、ＰＨＡを合成できない菌を1次スクリーニングする。次にこうして得られたクローンの細胞破砕液を調製し、破砕液のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素活性を測定することによって、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊された株を取得する。ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素活性は、例えば、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の基質となり得る3-ヒドロキシアルカン酸の補酵素Ａ（CoA）とのチオエステル体を、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を含有する酵素液と接触させ、補酵素CoAの解離速度を公知の方法にて測定すればよい。
【００３４】
選択的遺伝子破壊によってポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統を取得するには、直鎖ＤＮＡを用いる相同組換えによる方法を用いることもできるが、特に本出願に係る発明の一つで開示されるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターを用いると、菌に対するダメージを軽減し、より効率的に該遺伝子の破壊されているポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統を取得することが出来る。
【００３５】
一般に、遺伝子の機能解明や実用菌株の育種で望ましくない性質に関わる遺伝子を選択的に破壊するために、染色体上の標的部位への相同組み換えによる選択的遺伝子破壊法が利用されており、選択的遺伝子破壊の方法としては遺伝子挿入破壊法と遺伝子置換破壊法の二つが用いられている（図６）。これらの方法はいずれも、生物の生体において自然に起こり得る遺伝子相同組換えを、該生物の染色体上に存在する内在性ゲノムＤＮＡと外来性ターゲティングＤＮＡ（ターゲティングベクター）との間で人為的に起こさせることにより、該内在性ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列中に該外来性ターゲティングＤＮＡ中に含まれる所望の外来性遺伝子を組込むことを基本原理とするものである。
【００３６】
本発明における遺伝子ターゲティングベクターとは、相同組換えにより、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌の内在性ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮＡ（ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素）をコードする遺伝子を破壊するために用いられるＤＮＡ構造体を意味する。ここで当該「破壊」（gene disruption）とはターゲティングＤＮＡと内在性ゲノムＤＮＡとの相同組換えにより、該内在性ゲノムの一部に導入される下記のようなＤＮＡ配列の改変を意味する。
（１）該標的ＤＮＡの一部ＤＮＡ配列の欠失
（２）該標的ＤＮＡの一部ＤＮＡ配列の外来性ＤＮＡとの置換
（３）該標的ＤＮＡのＤＮＡ配列中への外来性ＤＮＡの挿入
遺伝子挿入破壊法で達成しうるDNA配列の改変は前記（３）による改変であり、遺伝子置換破壊法で達成しうるDNA配列の改変は前記（１）、（２）または（３）による改変である。これらの改変によりポリヒドロキシアルカノエート生産菌の内在性ゲノムＤＮＡ中のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子は実質機能を失い、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子が転写・翻訳・あるいは活性を保持したポリヒドロキシアルカノエート合成酵素タンパク質が生合成されることを無くすることができる。
【００３７】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統を製造するには、該ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子が２つあり（phaC1とphaC2）、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子(phaZ)とphaC1-phaZ-phaC2というクラスターを構成していることから、phaC1とphaC2を個別に破壊しようとする目的では前記遺伝子挿入破壊法と前記遺伝子置換破壊法のいずれの方法も用いることができるが、phaC1とphaC2を同時に破壊しようとする目的では前記遺伝子挿入破壊法は用いることは出来ず、前記遺伝子置換破壊法でのみ行うことができる。
【００３８】
本発明に係るポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターは、前記遺伝子挿入破壊法か遺伝子置換破壊法のいずれの方法で遺伝子破壊を行うかによって、またphaC1とphaC2を個別に破壊するかあるいは同時に破壊するかによって、以下に述べるそれぞれ異なる基本構造のものを用いる。
【００３９】
遺伝子置換破壊法によって、phaC1とphaC2を同時に破壊するために用いるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターとしては、次の（I）、若しくは(ＩＩＩ)の基本構造を有する遺伝子ターゲティングベクターを使用する。すなわち、
（Ｉ）相同組換えのための、下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはその一部；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
と、下記（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ、またはその一部；
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
と、所望の遺伝子破壊のための領域と、ベクターと、を有し、これらが機能的に連結してなる基本構造を有する遺伝子ターゲティングベクター。
（ＩＩＩ）下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
と、下記（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部；
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
を含有し、かつ該「（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部」と該「（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部」との間にポリヒドロキシアルカノエート生産菌の内在性ゲノムＤＮＡにとって外来である所望の外来性ＤＮＡが挿入された基本構造を有する遺伝子ターゲティングベクター。
【００４０】
遺伝子置換破壊法によって、phaC1とphaC2を個別に破壊するために用いるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターとしては、次の（I'）、（I''）、(ＩＩＩ')、若しくは(ＩＩＩ'')の基本構造を有する遺伝子ターゲティングベクターを使用する。
【００４１】
すなわち、
（I'）相同組換えのための、下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはその一部；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡと、
所望の遺伝子破壊のための領域と、ベクターと、を有し、これらが機能的に連結してなる基本構造を有する遺伝子ターゲティングベクター。
（I''） 相同組換えのための、下記（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ、またはその一部；
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
と、所望の遺伝子破壊のための領域と、ベクターと、を有し、これらが機能的に連結してなる基本構造を有する遺伝子ターゲティングベクター。
（ＩＩＩ'）下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
を含有し、かつ該「（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部」の一部にポリヒドロキシアルカノエート生産菌の内在性ゲノムＤＮＡにとって外来である所望の外来性ＤＮＡが挿入された基本構造を有する遺伝子ターゲティングベクター。
（ＩＩＩ''）下記（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部；
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
を含有し、かつ該「（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部」の一部にポリヒドロキシアルカノエート生産菌の内在性ゲノムＤＮＡにとって外来である所望の外来性ＤＮＡが挿入された基本構造を有する遺伝子ターゲティングベクター。
【００４２】
遺伝子挿入破壊法によって、phaC1とphaC2を個別に破壊するために用いるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターとしては、次の（I'）、（I''）、(ＩＩ)、若しくは(ＩＩ')の基本構造を有する遺伝子ターゲティングベクターを使用する。すなわち、
（I'）相同組換えのための、下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはその一部；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
と、所望の遺伝子破壊のための領域と、ベクターと、を有し、これらが機能的に連結してなる基本構造を有する遺伝子ターゲティングベクター。
（I''）相同組換えのための、下記（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ、またはその一部；
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
と、所望の遺伝子破壊のための領域と、ベクターと、を有し、これらが機能的に連結してなる基本構造を有する遺伝子ターゲティングベクター。
（ＩＩ）下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
を含有し、さらに該内在性ゲノムDNAにとって外来である所望の外来性DNAを有する遺伝子ターゲティングベクター。
（ＩＩ'）下記（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部；
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
を含有し、さらに該内在性ゲノムDNAにとって外来である所望の外来性DNAを有する遺伝子ターゲティングベクター。
【００４３】
ここで、基本構造（I）、（I'）、（I''）、(ＩＩ)、(ＩＩ')、(ＩＩＩ)、(ＩＩＩ')、（ＩＩＩ''）における「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズ」するＤＮＡとは、以下に示すＤＮＡをいう。すなわち、（１）高イオン濃度下[例えば、6xSSC(900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム)等が挙げられる。] に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより配列番号１あるいは２で示される塩基配列を含むＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下[例えば、0.1xSSC(15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム)等が挙げられる。] に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも該ハイブリッドが維持されるＤＮＡをいう。具体的には、例えば、配列番号１あるいは２で示される塩基配列において、その一部が、所望の遺伝子破壊機能が損なわれない範囲内で、欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡなどが挙げられる。かかるＤＮＡは自然界からクローニングされたＤＮＡであってもよいし、自然界からクローニングされたＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加が人為的に導入されたＤＮＡであってもよく、また、人為的に合成されたＤＮＡであってもよい。また基本構造（I）、（I'）、（I''）、(ＩＩ)、(ＩＩ')、(ＩＩＩ)、(ＩＩＩ')、（ＩＩＩ''）における「（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部」あるいは「（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部」はポリヒドロキシアルカノエート合成酵素活性を有するタンパク質をコードする必要はなく、生理的条件下、すなわち微生物細胞内で、染色体上のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有していればよい。このような相同性としては、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性が挙げられる。またポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊株の作製に用いるＤＮＡは、染色体上のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子を破壊できる程度の大きさであれば、本発明のＤＮＡの一部であってもよい。ここで一部とは、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の長さを有するもので、所望の遺伝子破壊機能を有する部分が挙げられる。
【００４４】
遺伝子ターゲティングベクターに設ける（a）または（b）に示すDNAの「一部」について具体的な配列を例示するならば、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５である。
【００４５】
基本構造（I）におけるベクターは特に限定されないが、一般的な広域宿主ベクターが使用可能であり、例えばpJRD215（Davidson et al.,Gene, 51,275-280(1987)）及びpBBR1MCSシリーズ（Kovach et al., Gene, 166,175-176(1995)）等を例示することができる。
【００４６】
基本構造（I）、（ＩＩＩ）の遺伝子ターゲティングベクターにおいては、該「（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡまたはそれらの一部」と、該「（c）または（d）に示すＤＮＡまたはそれらの一部」は、同じ方向で可動性ベクターへ組込む必要がある。ターゲティングベクターに組込まれる該「（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡまたはそれらの一部」の長さを１としたとき、該ターゲティングベクターに組込まれる該「（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡまたはそれらの一部」の長さは、0.4から2.5、好ましくは0.5〜2、より好ましくは0.8から1.25である。これらの長さが偏ると、二重相同組換え体の取得効率が下がるので好ましくない。
【００４７】
基本構造(ＩＩ)、(ＩＩ')、(ＩＩＩ)、(ＩＩＩ')、（ＩＩＩ''）における「外来性ＤＮＡ」としては、例えばマーカー遺伝子、レポーター遺伝子、遺伝子増幅遺伝子、内在性ゲノムＤＮＡ中の標的DNA配列に対する欠失・置換または挿入により、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の実質的な機能停止に至る様な性質を付加し得る遺伝子発現制御ＤＮＡ配列、あるいはそれらの１つ以上を含むＤＮＡ配列を挙げることができる。ここで「マーカー遺伝子」としては、遺伝子組換え技術分野において通常使用されるいかなるマーカー遺伝子も用いることができる。例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、ゲンタマイシンまたはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示される。また「レポーター遺伝子」としては、ルシフェラーゼや緑色蛍光タンパク質（GFP）、βラクタマーゼなどの遺伝子が例示される。さらにまた「遺伝子増幅遺伝子」としては、染色体DNAを鋳型としたPCR法による破壊株の特異的遺伝子増幅産物が得られるような所望のプライマー結合配列を有するDNA配列が例示される。
【００４８】
(ＩＩ)と(ＩＩ')、あるいは(ＩＩＩ')と（ＩＩＩ''）に用いられる外来性DNAは相異なるものであることが望ましい。
【００４９】
基本構造（ＩＩＩ'）の遺伝子ターゲティングベクターにおいては、該「（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡまたはそれらの一部」への外来性ＤＮＡの挿入位置は、該ベクターに組込まれた該「（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡまたはそれらの一部」の長さを１０としたとき、１から９の間、好ましくは２から８の間、より好ましくは４から６の間である。外来性ＤＮＡの挿入位置が前記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡまたはそれらの一部の一端に偏ると、二重相同組換え体の取得効率が下がるので好ましくない。
【００５０】
基本構造（ＩＩＩ''）の遺伝子ターゲティングベクターにおいては、該「（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡまたはそれらの一部」への外来性ＤＮＡの挿入位置は、該ベクターに組込まれた該「（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡまたはそれらの一部」の長さを１０としたとき、１から９の間、好ましくは２から８の間、より好ましくは４から６の間である。外来性ＤＮＡの挿入位置が前記（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡまたはそれらの一部の一端に偏ると、二重相同組換え体の取得効率が下がるので好ましくない。
【００５１】
基本構造（ＩＩ）、（ＩＩ'）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ'）、（ＩＩＩ''）の遺伝子ターゲティングベクターには、接合起点遺伝子（OriT）を含有するMobサイトを含有させることにより、大腸菌運動性株（mobilizer strain, 例えばＳ１７−１株(ATCC 47055)）に形質転換しプラスミド供与菌体として用いた場合、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌への効率的な導入が可能になり、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に与えるダメージを軽減し、より簡便にまた効率的にポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊された菌株を取得することができるのでより好ましい。これは大腸菌運動性株がtra遺伝子を有しているために、接合伝達における、mob+, tra- の遺伝子ターゲティングベクターをヘルパープラスミドの助けなしに接合伝達することができる(R.Simon et al.(1983) Bio-Technology 1: 784)からである。
【００５２】
基本構造（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ'）、（ＩＩＩ''）の遺伝子ターゲティングベクターには、プラスミド受容菌をある条件下に致死に導く遺伝子（感受性遺伝子）を含有させることが望ましい。感受性遺伝子としては、例えばバチルス サブチルス （Buccilus subtilis）由来のレヴァンスクラーゼ（Levansucrase, sacB）が、多くのグラム陰性菌にとって、ショ糖が５重量％を超えて含有する培地において、致死にいたることが見出されており（Gay et al. J. Bacteriol.164, 918）、またシュードモナス スピーシーズ YN21株においても機能することが、発明者らによって確認されたので、本発明においても好適に用いることができる。
【００５３】
上記基本構造（I）、（I'）、（I''）、(ＩＩ)、(ＩＩ')、(ＩＩＩ)、(ＩＩＩ')、（ＩＩＩ''）の遺伝子ターゲティングベクターを構築するには、上記基本構造の構成要素である各DNAを通常の分子生物学的手法を用いてベクターに組込んでいけばよいが、特に基本構造(ＩＩ)、(ＩＩ')、(ＩＩＩ)、(ＩＩＩ')、（ＩＩＩ''） の遺伝子ターゲティングベクターを構築するには、予めポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、接合起点遺伝子および感受性遺伝子を備えた可動性ベクターを利用すると、本発明のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターをより短い工程で作製することができるので有用である。このような可動性ベクターとして、たとえばpEX100T(ATCC 87436)、pJQ200（ATCC 77482）、pDMS197(ATCC 87694)、pRE107(ATCC 87691)などを挙げることができ、本発明のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターを構築する際に好適に用いることができる。
例えば基本構造（ＩＩＩ）の遺伝子ターゲティングベクターを構築するためには、上記可動性ベクターに、前記「（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部」、前記「（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部」及び選択マーカーを組込めばよい。これらを組込む順番について制限はないが、その手順の一例を示すならばまず、上記可動性ベクターに適当な制限酵素を作用させ、得られたベクターＤＮＡ断片と、前記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部とを混合し、これにＤＮＡリガーゼを作用させる。次に前記制限酵素とは別の認識部位を切断する制限酵素を作用させ、上記ベクターの一部、または上記ベクターに組込まれた前記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部で切断する。得られたベクターＤＮＡ断片を、前記選択マーカーを含むDNA断片と混合し、これにＤＮＡリガーゼを作用させることによって選択マーカーを挿入する。なお以上の工程中、必要に応じ当該分野で知られたリンカー付与、ブラントエンド化等の処理を加えることもできる。
【００５４】
基本構造（I）、（I'）、あるいは（I''）の遺伝子ターゲティングベクターを用いてポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子を破壊するには、該遺伝子ターゲティングベクターをポリヒドロキシアルカノエート生産菌に導入する。遺伝子ターゲティングベクターを導入する方法としてはコンピテント細胞に接触せしめる方法や、エレクトロポレーション法など当業者によく知られた方法から適宜選択して用いることが出来る。
【００５５】
続いてたとえば、脂肪酸を単一炭素源とする寒天プレート上で生育できない性質を利用して１次スクリーニングし、取得されたクローンについてポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊されていることを確認する。
【００５６】
基本構造（ＩＩ）、（ＩＩ'）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ'）、（ＩＩＩ'）の遺伝子ターゲティングベクターを用いてポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子を破壊するには、前記基本構造（I）、（I'）、あるいは（I''）の遺伝子ターゲティングベクターを用いる場合と同様に行うこともできるが、まず該遺伝子ターゲティングベクターを前記大腸菌運動性株に形質転換する。次に形質転換された大腸菌運動性株とポリヒドロキシアルカノエート生産菌との接合転移を利用して、遺伝子ターゲティングベクターをポリヒドロキシアルカノエート生産菌体内に転移させる。
【００５７】
前記選択マーカーで選択することによって遺伝子ターゲティングベクターと染色体ＤＮＡとの相同組換えの結果、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊された株を取得することができる。なお、宿主であるポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体と遺伝子ターゲティングベクターには前記選択マーカーの前後に２箇所の相同部位が存在するので、この段階で得られる相同組換え体の大部分は、遺伝子ターゲティングベクターに由来する配列が相異なる位置で挿入された染色体構造を有する相異なる2種類の組換え体であって、選択マーカー前後の２箇所の相同部位で同時に交叉の生じた相同組換え体の割合は非常に少ないと考えられる。ただし、遺伝子ターゲティングベクターに由来する配列が挿入されることにより、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子は破壊される。
基本構造（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ'）、あるいは（ＩＩＩ''）の遺伝子ターゲティングベクターを用いた場合には、続いて感受性遺伝子の機能に基づいた選択を行う。この選択により、プラスミド受容菌から、前記選択マーカーで選択された組換え体の、染色体へ挿入された遺伝子ターゲティングベクターに由来する配列の内、可動性ベクター部分が欠失除去された変異株を取得することができる。これは前段階の相同組換えの際に、利用されなかった他方の相同部位での相同組換えが起こることにより成される。従ってこの段階で、前段階の相異なる染色体構造を有する2種類の組換え体は、同じ染色体構造の（ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子が選択マーカーで分断された）組換え体になる。
【００５８】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターを用いて取得される組換え体の、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊さていることの確認は、前述の方法にて組換え体のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素活性の消失を確認するか、組換え体の染色体ＤＮＡを制限酵素で切断した後、サザンハイブリダイゼーション法を用いるか、適当なプライマーを用いて染色体ＤＮＡに対してＰＣＲ法を用いるなどして行うことができる。
【００５９】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターは、適当な宿主細胞内で、自律的に複製、増幅するので、このベクターを宿主細胞中へ導入して形質転換を行って得られた形質転換体を培養することで、このベクターのコピーを製造することができる。このような宿主細胞としては、上記で得られたポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターで形質転換でき、かつこのベクターの安定維持、複製が可能であるようなものであれば、グラム陰性菌あるいはグラム陽性菌の区別なく、さらには、下等細胞あるいは高等細胞の区別なく、動物由来細胞であろうと植物由来細胞であろうと使用できる。宿主細胞にポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターを導入するためには、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターをコンピテント細胞に接触せしめる方法や、エレクトロポレーション法など当業者によく知られた方法から適宜選択して用いることが出来る。
【００６０】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統において組換えポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を発現させるための遺伝子発現ベクターは、該同質遺伝子系統細胞内で自立的に複製でき、かつ機能的なポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を発現できるものであれば制限は無いが、たとえば広域宿主ベクターが使用可能であり、例えばpJRD215（Davidson et al.,Gene, 51,275-280(1987), ATCC 37533）及びpBBR1MCSシリーズ（Kovach et al., Gene, 166,175-176(1995)）、pBHR1、pLA2917 (ATCC 37355)等を例示することができる。
【００６１】
これらのベクターへのポリヒドロキシアルカノエート合成酵素のクローニングは、プロモーター、リボソーム結合部位、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片、転写終結配列を用いて、慣用の方法で行うことができる。
【００６２】
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、trp プロモーター、tac プロモーター、lac プロモーター、lpp プロモーター、tufBプロモーター、recAプロモーター、ＰL プロモーター、ＰR プロモーター、T7プロモーターなどの大腸菌やファージなどに由来するプロモーターや、ribosomal RNAプロモーター（rRP）等のような恒常的かつ高活性で発現するプロモーターなどが用いられる。
細菌への組換え体DNAの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Current Protocols in Molecular Biology, 1巻, 1.8.1 頁，1994年）やエレクトロポレーション法（Current Protocols in Molecular Biology, 1巻，1.8.4 頁, 1994年）などが挙げられる。
【００６３】
本発明にかかるＰＨＡの製造方法に用いるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子破壊株の組換えポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子形質転換体の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる形質転換体の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、形質転換体の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地(肉汁培地、酵母エキスなど)や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。
【００６４】
培養は液体培養、固体培養等該形質転換体が増殖し、ＰＨＡを生産する培養方法ならいかなる培養方法でも用いることができる。さらに、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。また、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
【００６５】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子破壊株の組換えポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子形質転換体を用いて生産できるPHAの組成や構造、特に側鎖に置換基を有するunusual PHAの種類は、この同質遺伝子系統であるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子非破壊株の性質と組換えポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の基質特異性により規定されるが、シュードモナス スピーシーズ YN21株の同質遺伝子系統でありポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズ PC12株にシュードモナス スピーシーズ YN21株由来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子(phaC1あるいはphaC2)を形質転換した形質転換体を用いると、例えば下記化学式[１]から[16]に示すポリマーユニットからなる群から選ばれた少なくとも１種類のポリマーユニットをポリマー分子中に含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートを製造することができる。
【００６６】
【化１】
2006204257.tif 000002
【００６７】
（ただし式中R1およびａの組合せが下記のいずれかであるポリマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。
（１）R1が水素原子（H）であり、aが1から10の整数のいずれかであるポリマーユニット、
（２）R1がハロゲン元素であり、aが1から10の整数のいずれかであるポリマーユニット、
（３）R1が、
【００６８】
【化２】
2006204257.tif 000003
【００６９】
であり、ａが1から8の整数のいずれかであるポリマーユニット)
【００７０】
【化３】
2006204257.tif 000004
【００７１】
(式中R2は芳香環への置換基を示し、R2は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、およびKのいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH=CH2基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中bは0から7の整数のいずれかを表す。)
【００７２】
【化４】
2006204257.tif 000005
【００７３】
(式中R3は芳香環への置換基を示し、R3は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、SCH3基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中cは0から7の整数のいずれかを表す。)
【００７４】
【化５】
2006204257.tif 000006
【００７５】
(式中R4は芳香環への置換基を示し、R4は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中dは0から7の整数のいずれかを表す。)
【００７６】
【化６】
2006204257.tif 000007
【００７７】
(式中R5は芳香環への置換基を示し、R5は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す）基、SO2R"（R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中eは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００７８】
【化７】
2006204257.tif 000008
【００７９】
(式中R6は芳香環への置換基を示し、R6は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す）基、SO2R"（R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中fは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００８０】
【化８】
2006204257.tif 000009
【００８１】
(式中gは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００８２】
【化９】
2006204257.tif 000010
【００８３】
(式中hは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００８４】
【化１０】
2006204257.tif 000011
【００８５】
(式中iは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００８６】
【化１１】
2006204257.tif 000012
【００８７】
(式中jは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００８８】
【化１２】
2006204257.tif 000013
【００８９】
(式中R7はシクロヘキシル基への置換基を示し、R7は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中kは0から8の整数のいずれかを表す。)
【００９０】
【化１３】
2006204257.tif 000014
【００９１】
(式中R8はシクロヘキシルオキシ基への置換基を示し、R8は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中mは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００９２】
【化１４】
2006204257.tif 000015
【００９３】
(式中nは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００９４】
【化１５】
2006204257.tif 000016
【００９５】
(式中pは3または5のいずれかの整数を表す。)
【００９６】
【化１６】
2006204257.tif 000017
【００９７】
(式中q1は1から8の整数のいずれかを表し、q2は0から8の整数のいずれかを表す。)
【００９８】
【化１７】
2006204257.tif 000018
【００９９】
(式中R9は水素原子(Ｈ)、Na原子またはK原子であり、式中rは1から8の整数のいずれかを表す。)
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子破壊株の組換えポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子形質転換体を用いて、３-ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを製造する場合は、ＰＨＡ生産用の原料としてそれぞれ対応するアルカン酸またはアルカンと、破壊株の増殖用炭素源とを少なくとも含んだ無機培地などを用いることができる。
【０１００】
増殖用炭素源としては、酵母エキスやポリペプトン、肉エキス、カザミノ酸などの天然物由来の培地成分を用いることが可能であり、更に、糖類、ＴＣＡサイクルに関与する有機酸(ＴＣＡ回路中の中間体として生じる有機酸及びＴＣＡ回路から一段階ないしは二段階の生化学反応を経て生じる有機酸)或いはその塩等、β酸化サイクルを経ずにアセチルＣoＡを生じる化合物であれば、いかなる化合物でも用いることができ、用いる菌株に対する基質としての有用性で適宜選択することができる。
これらのうち、糖類としては、グリセロアルデヒド、エリスロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、グリセロール、エリスリトール、キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
また、有機酸或いはその塩としては、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸などがその例であり、或いはその塩から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【０１０１】
これらの中でも、特に糖類を用いるのが好ましく、中でもグルコース、フルクトース、マンノースからなる群から選択される少なくとも一つであることがより好ましい。
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子破壊株の組換えポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子形質転換体にＰＨＡを生産・蓄積させる方法としては、一旦十分に増殖させて後に、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の発現を惹起し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態で更に培養すると生産性が向上する場合がある。具体的には、前記の工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。例えば、Ｄ-グルコースを 0.05重量％から 5.0重量％程度、および、アルカン酸またはアルカンを 0.01重量％から 1.0重量％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、菌体を遠心分離等で回収したのち、アルカン酸またはアルカンを 0.01重量％から 1.0重量％程度含んだ、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の発現を惹起する条件でさらに培養する方法がある。
【０１０２】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩等)、窒素源(例えば、アンモニウム塩、硝酸塩等)等、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、ＭＳＢ培地、Ｅ培地(J.Ｂiol.Ｃheｍ.,218，97-106(1956))、Ｍ９培地等を挙げることができる。
【０１０３】
なお、本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成は以下の通りである。
【０１０４】
Ｎa2ＨＰＯ4:    6.2g
ＫＨ2ＰＯ4 :    3.0g
ＮaＣl    ：    0.5g
ＮＨ4Ｃl  ：    1.0g
(培地１リットル中、pＨ 7.0)
更に、良好な増殖及びＰＨＡの生産のためには、上記の無機塩培地に培地に以下に示す微量成分溶液を 0.3％(v/v)程度添加するのが好ましい。
微量成分溶液
ニトリロ三酢酸:     1.5g
ＭgＳＯ4      :     3.0g
ＭnＳＯ4      :     0.5g
ＮaＣl        :     1.0g
ＦeＳＯ4      :     0.1g
ＣaＣl2       :     0.1g
ＣoＣl2       :     0.1g
ＺnＳＯ4      :     0.1g
ＣuＳＯ4      :     0.1g
ＡlＫ(ＳＯ4)2  :    0.1g
Ｈ3ＢＯ3       :    0.1g
Ｎa2ＭoＯ4     :    0.1g
ＮｉＣｌ2        :    0.1g
(１リットル中)
培養中は発現ベクターが脱落しないように、発現ベクターに組込まれた抗生物質耐性遺伝子に応じてカナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インデューサーを培地に添加することもできる。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG) 、インドールアクリル酸(IAA) 等を培地に添加することができる。
【０１０５】
培養温度としてはポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子破壊株の組換えポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子形質転換体が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば 15〜40℃、好ましくは 20〜35℃、更に好ましくは 20℃から 30℃程度が適当である。
【０１０６】
具体的な例としては、Ｄ-グルコースを 0.05重量％から 5.0重量％程度、および、アルカン酸またはアルカンを 0.01重量％から 1.0重量％程度含んだ無機培地等で培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは全くない所望のＰＨＡを抽出することができる。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。Ｄ-グルコースの代わりに同量のＴＣＡサイクルに関与する有機酸や、酵母エキス、ポリペプトンを与えても良い。また、それらの組み合わせを用いてもよい。
【０１０７】
本発明にかかる培養液からのＰＨＡの取得には、通常行なわれている方法を適用することができる。ＰＨＡが培養液中に分泌される場合は、培養液からの抽出精製方法が、また、菌体に蓄積される場合は、菌体からの抽出精製方法が用いられる。例えば、微生物の培養菌体からのＰＨＡの回収には、通常行なわれているクロロホルムなどの有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、クロロホルム以外にジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトンが用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡ等の薬剤による処理によってＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、ＰＨＡを回収する方法を用いることもできる。
【０１０８】
なお、本発明の微生物の培養、本発明の微生物によるＰＨＡの生産と菌体への蓄積、並びに、本発明における菌体からのＰＨＡの回収は、上記の方法に限定されるものではない。
【実施例】
【０１０９】
（実施例１）
ポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ YN２１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. YN２１、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５６９）の薬剤耐性に関する予備検討の結果、アンピシリンとクロラムフェニコールに対しては耐性で、ゲンタマイシンに対しては感受性であることがわかったので、ゲンタマイシンに対する薬剤耐性遺伝子をマーカーにしてポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターを構築した。構築した遺伝子破壊ベクターは配列番号１に示す塩基配列の塩基番号３３１から塩基番号１２１５の部分配列および配列番号２に示す塩基配列の塩基番号１０４０から塩基番号１６６７の部分配列を含む環状プラスミドDNA（ｐＰＣ２１（配列番号１０））である。以下その手順について説明する。図１は手順の概略について図示したものである。
【０１１０】
１）ゲノムDNAの調製
シュードモナス スピーシーズ YN２１株を0.5％（w/v)ポリペプトンを含むM9培地で、３０℃、２４時間培養した。培養液から菌体を集菌した後、Wizard Genomic DNA Purification System(プロメガ(株)製)を用いて、YN2株のゲノムDNAを調製した。
２）インサートDNA断片の調整
YN２１株のゲノムDNAをテンプレートとして、YC1-upN（配列番号3）およびYC1-2/3C（配列番号4）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いて、PCR（ポリメラーゼチェーン反応）を行った。以下の反応混合液を調製した。
【０１１１】
【表１】
2006204257.tif 000019
【０１１２】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６５℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で１分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。
ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度重量１％）により行った。その結果、約８８０塩基対の断片が増幅された。約８８０塩基対のＰＣＲ産物（YC1-up1/3N）をアガロースゲルから切出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてＤＮＡ断片を回収した。約８８０塩基対の断片は、（１）高イオン濃度下[6xSSC(900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム)  に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより配列番号１で示される塩基配列を含むＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下[0.1xSSC(15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム)]に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも該ハイブリッドが維持され、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡであることが確認された。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの検出はAlkPhos Direct Labelling and Detection System（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて行った。
【０１１３】
次に、YN２１株のゲノムDNAをテンプレートとして、YC2-2/3N（配列番号5）およびYC2-Ct（配列番号6）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いて、PCR（ポリメラーゼチェーン反応）を行った。以下の反応混合液を調製した。
【０１１４】
【表２】
2006204257.tif 000020
【０１１５】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６５℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で１分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、約５６０塩基対の断片が増幅された。約５６０塩基対のＰＣＲ産物(YC2-1/3C)をアガロースゲルから切出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてＤＮＡ断片を回収した。  約５６０塩基対の断片は、（１）高イオン濃度下[6xSSC(900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム)  に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより配列番号２で示される塩基配列を含むＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下[0.1xSSC(15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム)]  に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも該ハイブリッドが維持され、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡであることが確認された。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの検出はAlkPhos Direct Labelling and Detection System（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて行った。
【０１１６】
プライマーYC1-2/3C（配列番号4）およびYC2-2/3N（配列番号5）には予め制限酵素ＸｂａＩの認識配列が組込まれており、これを利用して上記約８８０塩基対のＰＣＲ産物（YC1-up1/3N）と約５６０塩基対のＰＣＲ産物(YC2-1/3C)とを連結した。まず、YC1-up1/3NとYC2-1/3Cを各々ＸｂａＩで消化した。消化断片を核酸精製用スピンカラム(MicroSpin S-400HR, アマシャム バイオサイエンス（株）製)を用いて精製後、両者をDNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造（株）製）を用いてライゲーションした。
【０１１７】
以下にライゲーション反応液の組成を示す。
【０１１８】
【表３】
2006204257.tif 000021
【０１１９】
ライゲーション反応液を１６℃の恒温槽で１時間保持した後、反応液を核酸精製用スピンカラムに通すことにより、脱塩・精製した。この内１μｌに対して、YC1-upN（配列番号3）およびYC2-Ct（配列番号6）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いPCRを行った。以下の反応混合液を調製した。
【０１２０】
【表４】
2006204257.tif 000022
【０１２１】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６８℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で１分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、約１４４０塩基対の断片が増幅された。約１４４０塩基対のＰＣＲ産物をアガロースゲルから切出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてＤＮＡ断片を回収した。約１４４０塩基対のＰＣＲ増幅産物の塩基配列を、YC1-upN（配列番号3）、YC1-2/3C（配列番号4）、YC2-2/3N（配列番号5）およびYC2-Ct（配列番号6）に示す塩基配列のDNA、YC1-2/3C（配列番号4）およびYC2-2/3N（配列番号5）に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAをプライマーとして用い、ジェネティックアナライザーCEQ8000（ベックマン コールター製）で解析した。増幅産物は、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号３３１から塩基番号１２１５の部分配列および配列番号２に示す塩基配列の塩基番号１０４０から塩基番号１６６７の部分配列が連結されたものに相当することが確認できた。上記PCRに用いたプライマー；YC1-upN（配列番号3）およびYC2-Ct（配列番号6）中には制限酵素ＸｍａIの認識部位が各々含まれている。約１４４０塩基対のＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＸｍａIで消化した。
【０１２２】
３）ベクターDNA断片の調製
pEX100T（ATCCナンバー87436）を制限酵素ＸｍａIで消化し、約５.８kb直鎖状ＤＮＡ断片を得た。Calf Intestine Alkaline Phosphatase（宝酒造（株）製）を用いて5'末端を脱リン酸化処理した。
４）ライゲーション
前記２）で調製した約１４４０塩基対のＸｍａI消化断片（インサートＤＮＡ）と、前記３）で調製した約５.８kbのＸｍａI消化産物（ベクターＤＮＡ）とを、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造（株）製）を用いてライゲーションした。
以下にライゲーション反応液の組成を示す。
【０１２３】
【表５】
2006204257.tif 000023
【０１２４】
ライゲーション反応液を１６℃の恒温槽で１時間保持した後、Escherichia coli JM109コンピテントセルに形質転換した。アンピシリン100μg/mlを含むLB寒天プレート上で増殖可能なコロニーを選択した。その結果、プラスミドpEX-phaC（配列番号７）を得た。プラスミドpEX-phaCの制限酵素切断地図を図２に示す。
５）ゲンタマイシンカセットの挿入
前記４）で調製したプラスミドpEX-phaCを制限酵素XbaIで消化したした後、Calf Intestine Alkaline Phosphatase（宝酒造（株）製）を用いて5'末端を脱リン酸化処理した。pDONR207(インビトロジェン(株)製)をテンプレートに、gen-f1(配列番号８)およびgen-r1（配列番号９）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いてPCRを行った。
以下の反応混合液を調製した。
【０１２５】
【表６】
2006204257.tif 000024
【０１２６】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６５℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で1分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、約850塩基対の断片が増幅された。用いたプライマーgen-f1（配列番号８）およびgen-r1（配列番号９）中には制限酵素XbaIの認識部位が含まれており、制限酵素XbaIを用いて、約850塩基のPCR産物を消化した。前記約８５０塩基対のXbaI消化産物（インサート）と、pEX-phaCのXbaI消化産物（ベクター）とをライゲーションした。以下にライゲーション反応液の組成を示す。
【０１２７】
【表７】
2006204257.tif 000025
【０１２８】
ライゲーション反応液を１６℃の恒温槽で１時間保持した後、Escherichia coli JM109コンピテントセルに形質転換した。ゲンタマイシン15μg/mlを含むLB寒天プレート上で増殖可能なコロニーを選択した。その結果、プラスミドpPC１2（配列番号１０）を得た。プラスミドpPC12（ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクター）の制限酵素切断地図を図３に示す。
【０１２９】
（実施例２）
［ポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統であり、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズ ＰＣ１２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. PC12、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５７０）の取得］
実施例１で構築したポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクター（プラスミドｐＰＣ１２、配列番号１０）で大腸菌mobilizing strain Escherichia coli S17-1（ATCCナンバー47055）をエレクトロポーレーション法により形質転換した。エレクトロポーレーションの条件は、2.5kV、25μF, 200Ω, 0.2cmギャップのセル（ジーンパルサーキュベット0.2ｃｍ，バイオラッド社製）で市販のエレクトロポーレーション装置（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ，バイオラッド社製）を用いて行った。ゲンタマイシン15μg/mlを含むLB寒天プレート上で増殖可能なコロニーとして取得したS17-1株のpPC12形質転換体を、アンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地５mlで、３０℃、１２時間振とう培養した。また、シュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株をアンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地５mlで、３０℃、１２時間振とう培養した。E. coli S17-1株のpPC12形質転換体の培養液１50μｌをアンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地150mlに接種し、600nmでの吸光度（対照として滅菌したＬＢ液体培地を用いた）を随時モニターしながら３０℃で振とう培養した。また、ＹＮ２１株の培養液１50μｌをアンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地150mlに接種し、600nmでの吸光度（対照として滅菌したＬＢ液体培地を用いた）を随時モニターしながら３０℃で振とう培養した。
【０１３０】
E. coli S17-1株のpPC12形質転換体の培養液（600nmでの吸光度は0.35であった）の4.5ｍｌと、ＹＮ２１株の培養液（600nmでの吸光度は0.39であった）の0.5ｍｌとを、
混合し、ニトロセルロース製フィルター（ポアサイズ0.45μm、直径25mm、ミリポア製white surfactant free HATF）を用いて、ろ過して集菌した。ニトロセルロース製フィルターの集菌した面を上に向け、ＬＢ寒天プレート上に乗せて、乾燥しないように蓋をかぶせ、30℃で90分間恒温保持した。アンピシリン100μg/mlを含むＬＢ液体培地の１ｍｌで、フィルター上の菌体をピペッティングにより懸濁し、懸濁液の適量をゲンタマイシン15μg/ml、およびクロラムフェニコール10μg/mlを含むＬＢ寒天プレートに蒔種した。30℃で2日間培養後出現したコロニーを、ゲンタマイシン15μg/ml、クロラムフェニコール10μg/ml、およびシュークロース％(w/v)を含むＬＢ寒天プレートに画線して、30℃で2日間培養した。
ゲンタマイシン15μg/ml、およびクロラムフェニコール10μg/ml、シュークロース％(w/v)を含むＬＢ寒天プレート上に生育したコロニーの幾つかを、ゲンタマイシン15μg/ml、クロラムフェニコール10μg/mlおよび0.5％（w/v)ポリペプトンを含むM9培地で、３０℃、２４時間培養した。培養液から菌体を集菌した後、Wizard Genomic DNA Purification System(プロメガ(株)製)を用いて、ゲノムDNAを調製した。
【０１３１】
調製したゲノムＤＮＡ、および対照としてＹＮ２１株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、YC1-upN（配列番号３）と YC2-Ct（配列番号６）に示す塩基配列のＤＮＡをプライマーとして用いPCRを行った。以下の反応混合液を調製した。
【０１３２】
【表８】
2006204257.tif 000026
【０１３３】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６４℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で５分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により行った。その結果、新たに取得したコロニーから調製したゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いた場合には約2.2kbpのDNA断片が、また対照のYN21株から調製したゲノムDNAをテンプレートとして用いた場合には約4.8kbpのDNA断片がそれぞれ増幅された。これは、新たに取得されたクローンでは２つのポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子phaC1とphaC2がそれぞれ約570bpと約540bpに断片化されていることによって双方ともその機能を失い、かつそれぞれの断片の間にゲンタマイシン耐性遺伝子を含むDNA(850bp)が挿入され、PCRによって、phaC1遺伝子の上流約220bpを含む全体(220 + 560 + 850 + 540 bp)増幅されていることを意味する。
【０１３４】
（実施例３）
［ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子(phaC1)発現ベクターの構築］
６）インサートＤＮＡの調製
実施例１の１）で調製したYN２１株のゲノムDNAをテンプレートとして、YC1-upN-f1（配列番号１１）およびYC1-N-r1（配列番号１２）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いて、PCR（ポリメラーゼチェーン反応）を行った。以下の反応混合液を調製した。
【０１３５】
【表９】
2006204257.tif 000027
【０１３６】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６５℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で１分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。
ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により行った。その結果、約５３０塩基対の断片が増幅された。約５３０塩基対のＰＣＲ産物をアガロースゲルから切出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてＤＮＡ断片を回収した。
回収した約５３０塩基対のＤＮＡ断片およびYC1-C-r1（配列番号１３）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用い、YN２１株のゲノムDNAをテンプレートとして、PCRを行った。以下の反応混合液を調製した。
【０１３７】
【表１０】
2006204257.tif 000028
【０１３８】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６８℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で３分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。
ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により行った。その結果、約2.2kbpの断片が増幅された。約2.2kbpのＰＣＲ産物をアガロースゲルから切出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてＤＮＡ断片を回収した。
用いたプライマーYC1-upN-f1（配列番号１１）中には制限酵素Bam HIの認識部位、YC1-N-r1（配列番号１２）中には制限酵素Xba Iの認識部位、YC1-C-r1（配列番号１３）中には制限酵素Sac Iの認識部位がそれぞれ予め含まれている。約2.2kbのPCR産物を制限酵素Bam HIとSac Iで消化した。
【０１３９】
７）ベクターDNA断片の調製
広域宿主ベクターpBBR122（MoBiTech, GmbH）をテンプレートに、pBBR/Bam-f1（配列番号１４）およびpBBR/Sac-r1（配列番号１５）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いPCRを行った。以下の反応混合液を調製した。
【０１４０】
【表１１】
2006204257.tif 000029
【０１４１】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６５℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で５分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により行った。その結果、約５kbの断片が増幅された。用いたプライマーpBBR/Bam-f1（配列番号１４）中には制限酵素BamHIの認識部位、pBBR/Sac-r1（配列番号１５）中には制限酵素SacIの認識部位がそれぞれ予め含まれている。約５kbのPCR産物を制限酵素BamHIとSacIで消化した後、Calf Intestine Alkaline Phosphatase（宝酒造（株）製）を用いて5'末端を脱リン酸化処理した。
【０１４２】
８）ライゲーション
前記６）で調製した約2.2kbpのBamHI・SacI消化産物（インサート）と、前記７）で調整した約５kbのBamHI・SacI消化産物（ベクター）とを、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造（株）製）を用いてライゲーションした。以下にライゲーション反応液の組成を示す。
【０１４３】
【表１２】
2006204257.tif 000030
【０１４４】
ライゲーション反応液を１６℃の恒温槽で１時間保持した後、Escherichia coli JM109コンピテントセルに形質転換した。カナマイシン３０μg/mlを含むLB寒天プレート上で増殖可能なコロニーを選択した。その結果、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子(phaC1)発現ベクター（プラスミドpBBR-phaC1、配列番号１６）を得た。プラスミドpBBR-phaC1の制限酵素切断地図を図４に示す。
【０１４５】
（実施例４）
［ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子(phaC2)発現ベクターの構築］
９）インサートＤＮＡの調製
実施例１の１）で調製したYN２１株のゲノムDNAをテンプレートとして、YC2-N-f1（配列番号１７）およびYC2-C-r1（配列番号１８）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いて、PCR（ポリメラーゼチェーン反応）を行った。以下の反応混合液を調製した。
【０１４６】
【表１３】
2006204257.tif 000031
【０１４７】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６３℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で２分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により行った。その結果、約1.7kbpの断片が増幅された。約1.7kbpのＰＣＲ産物をアガロースゲルから切出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてＤＮＡ断片を回収した。用いたプライマーYC2-N-f1（配列番号１７）中には制限酵素Xba Iの認識部位、YC2-C-r1（配列番号１８）中には制限酵素SacIの認識部位がそれぞれ予め含まれている。約1.7kbのPCR産物を制限酵素Xba IとSac Iで消化した。
【０１４８】
１０）ベクターDNA断片の調製
実施例３で調製したポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子(phaC1)発現ベクター（プラスミドpBBR-phaC1、配列番号１６）を制限酵素Xba IとSac Iで消化した後、Calf Intestine Alkaline Phosphatase（宝酒造（株）製）を用いて5'末端を脱リン酸化処理した。消化産物をアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）によって分画し、約5.4kbpのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてＤＮＡ断片を回収した。
【０１４９】
１１）ライゲーション
前記９）で調製した約1.7kbpのXba I・Sac I消化産物（インサート）と、前記１０）で調整した約５.4kbのXba I・Sac I消化産物（ベクター）とを、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造（株）製）を用いてライゲーションした。以下にライゲーション反応液の組成を示す。
【０１５０】
【表１４】
2006204257.tif 000032
【０１５１】
ライゲーション反応液を１６℃の恒温槽で１時間保持した後、Escherichia coli JM109コンピテントセルに形質転換した。カナマイシン３０μg/mlを含むLB寒天プレート上で増殖可能なコロニーを選択した。その結果、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子(phaC2)発現ベクター（プラスミドpBBR-phaC2、配列番号１９）を得た。プラスミドpBBR-phaC2の制限酵素切断地図を図５に示す。
【０１５２】
（実施例５）
実施例３および実施例４で構築したポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子発現ベクターpBBR-phaC1およびpBBR-phaC2を用いて、実施例２で取得したシュードモナス スピーシーズ ＰＣ１２株をエレクトロポーレーション法により形質転換した。エレクトロポーレーションの条件は、1.5kV、25μF, 800Ω, 0.2cmギャップのセル（ジーンパルサーキュベット0.2ｃｍ，バイオラッド社製）で市販のエレクトロポーレーション装置（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ，バイオラッド社製）を用いて行った。カナマイシン３０μg/mlを含むLB寒天プレート上で増殖可能な形質転換体（PC12/pBBR-phaC1およびPC12/pBBR-phaC2）を選択した。０．５％（w/v）ポリペプトン、０．１％（v/v）ノナン酸を含むＭ９培地 200ｍLに、PC12/pBBR-phaC1およびPC12/pBBR-phaC2または対照としてPC12株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。４５時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
得られたＰＨＡの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラム:ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により測定した。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。それらの結果を表１５に示す。
【０１５３】
【表１５】
2006204257.tif 000033
【０１５４】
対照のPC12株では痕跡量のポリ(3-ヒドロキシ酪酸)が検出されただけであった。表１の結果から明らかなように、本発明のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊されたことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統がポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の基質供給系酵素を完備した宿主として有用であり、PhaC1とPhaC2ではその基質特異性に差がみられることから、組換えポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の基質特異性の違いによって異なる組成のPHAを合成したり、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の進化工学的改変を実施する上でも有用であることがわかった。
【０１５５】
（実施例６）
実施例５で調製した形質転換体PC12/pBBR-phaC1を用いてunusualなＰＨＡを生産させた。０．５％（w/v）ポリペプトン、１２ｍＭ  フェニル吉草酸を含むＭ９培地 200ｍLに、PC12/pBBR-phaC1、対照としてPC12株およびYN21株をそれぞれ個別に植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。４５時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラム:ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により測定した。
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。それらの結果を表１６に示す。
【０１５６】
【表１６】
2006204257.tif 000034
【０１５７】
表１６の結果から明らかなように、本発明のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊されたことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統がポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の基質供給系酵素を完備した宿主として有用であり、PhaC1を発現させることにより（PC12/pBBR-phaC1）、再びＰＨＡを合成できる。この際、PC12/pBBR-phaC1株によるＰＨＡの生産量はＹＮ２１株の生産量よりも増大していることがわかった。これはベクタープラスミドのコピー数に応じてPhaC1の発現量が、ＹＮ２１株でのポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の発現量よりも増大しているためと考えられた。
【０１５８】
（実施例７）
[ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の進化工学的改変]
実施例４で作製したポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子(phaC2)発現ベクタープラスミドpBBR-phaC2（配列番号１９）をテンプレートにしてError-prone PCRを行うことによって、ランダムな変異の導入されたポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ライブラリー（phaC2M）を作製した。変異の導入はGeneMorph PCR Mutagenesis Kit（Stratagene社製）を用いて行った。
【０１５９】
１２）Error-prone PCR
プラスミドをテンプレートとして、YC2-N-f1（配列番号１７）およびYC2-C-r1（配列番号１８）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いて、PCR（ポリメラーゼチェーン反応）を行った。以下の反応混合液を調製した。
【０１６０】
【表１７】
2006204257.tif 000035
【０１６１】
PCRは、変性[９６℃で３０秒間]、アニーリング[６０℃で３０秒間]、伸長反応[７２℃で３分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％）により行った。その結果、約1.7kbpの断片が増幅された。増幅率からGeneMorph PCR Mutagenesis Kit（Stratagene社製）付属のマニュアルに従って変異導入率を計算すると、ｋｂあたり４．５個所であると推定された。約1.7kbpのＰＣＲ産物をアガロースゲルから切出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてＤＮＡ断片を回収した。用いたプライマーYC2-N-f1（配列番号１７）中には制限酵素Xba Iの認識部位、YC2-C-r1（配列番号１８）中には制限酵素SacIの認識部位がそれぞれ予め含まれている。約1.7kbのPCR産物を制限酵素Xba IとSac Iで消化した。      
【０１６２】
１３）phaC2M発現ベクターの作製
前記１２）で作製した約1.7kbpのＰＣＲ産物の制限酵素Xba IとSac Iで消化物と、実施例４の１０）で作製したベクターＤＮＡ断片とを用いてライゲーション反応を行い、変異導入phaC2ライブラリー発現ベクター（pBBR-phaC2M）を調製した。
【０１６３】
１４）ＰＨＡ生産性向上株の取得
変異導入phaC2ライブラリー発現ベクター（pBBR-phaC2M）を用いてシュードモナス スピーシーズ ＰＣ１２株をエレクトロポーレーション法により形質転換した。エレクトロポーレーションの条件は、1.5kV、25μF, 800Ω, 0.2cmギャップのセル（ジーンパルサーキュベット0.2ｃｍ，バイオラッド社製）で市販のエレクトロポーレーション装置（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ，バイオラッド社製）を用いて行った。カナマイシン３０μg/ml、０．５％（w/v）ポリペプトン、１２ｍＭ ５−フェニル吉草酸を含むＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。４５時間後、培養液の１５ｍLを採取しＮｉｌｅ Ｒｅｄによる細胞内ＰＨＡ顆粒の染色を行った。以下に染色液の組成を示す。
【０１６４】
【表１８】
2006204257.tif 000036
【０１６５】
染色液を氷上で２時間保持した後、セルソーター（Epics Altra、ベックマン コールター社製）を用いて、ナイルレッドの蛍光強度に基づくソーティングを行った。ナイルレッドの蛍光強度が強く、細胞内ＰＨＡの蓄積量が高いと考えられる細胞集団（上位約０．００５％）を回収した。
【０１６６】
回収された細胞集団を３０μg/mlカナマイシン、０．５％（w/v）ポリペプトン、１２ｍＭ ５−フェニル吉草酸を含むＭ９培地 200ｍLに植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。４５時間後、菌体を回収し常法に従ってプラスミドを抽出した。
【０１６７】
抽出されたプラスミドを上記１２）の工程のテンプレートとして用いる以上１２）から１４）の工程を５ラウンド繰返した。
【０１６８】
最終ラウンドで回収された細胞集団を３０μg/mlカナマイシン、０．５％（w/v）ポリペプトン、１２ｍＭ ５−フェニル吉草酸、５０μg/mlナイルレッドを含むＭ９寒天プレートに播種し３０℃で培養することによりシングルコロニーを形成させた。紫外線照射下に最も赤色の蛍光をしめすコロニー（PC12/pBBR-phaC2M01株）を単離した。
【０１６９】
形質転換体PC12/pBBR-phaC2M01株から常法に従いプラスミドpBBR-phaC2M01を抽出した。得られたプラスミドを制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｃＩに消化し、約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（phaC2M01）を回収した。
【０１７０】
約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（phaC2M01）は、（１）高イオン濃度下[6xSSC(900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム)  に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより配列番号２で示される塩基配列を含むＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下[0.1xSSC(15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム)]  に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも該ハイブリッドが維持され、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡであることが確認された。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの検出はAlkPhos Direct Labelling and Detection System（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて行った。
【０１７１】
（実施例８）
実施例７で調製した形質転換体PC12/pBBR-phaC2M01株を用いてunusualなＰＨＡを生産させた。０．５％（w/v）ポリペプトン、１２ｍＭ  フェニル吉草酸を含むＭ９培地 200ｍLに、PC12/pBBR-phaC2M01株、対照としてPC12/pBBR-phaC2株およびＹＮ２１株をそれぞれ個別に植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。４５時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラム:ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により測定した。
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。それらの結果を表１９に示す。
【０１７２】
【表１９】
2006204257.tif 000037
【０１７３】
表１９の結果から明らかなように、本発明のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊されたことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統がポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の基質供給系酵素を完備した宿主として有用であり、変異導入PhaC2M01を発現させることにより（PC12/pBBR-phaC2M01）、再びＰＨＡを合成できる。この際、PC12/pBBR-phaC2M01株によるＰＨＡの生産量はＹＮ２１株およびPC12/pBBR-phaC2株による生産量よりも増大していることがわかった。これはランダムな変異導入とスクリーニング操作を繰返すことによる進化工学的改変により、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の基質親和性、触媒反応速度、または細胞質中での酵素の安定性などが向上したためと考えられる。
【０１７４】
（実施例９）
[PC12/pBBR-phaC2M01株を用いたPHA生産]
０．５％（w/v）ポリペプトン、および０．５％（w/v）グルコースを含むＭ９培地 ５０ｍLに、次の表２０に示すアルカン酸を個別に加えた培地をそれぞれ調製した。
【０１７５】
【表２０】
2006204257.tif 000038
【０１７６】
PC12/pBBR-phaC2M01株または対照としてＹＮ21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で、96時間振盪培養した。それぞれの菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０１７７】
得られたＰＨＡのモノマーユニット比を、1H−NMR（FT−NMR：BrukerDPX４００；共鳴周波数：４００MHｚ；測定核種：１H；使用溶媒：CDCｌ３；ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：キャピラリ封入TMS／CDCｌ３；測定温度：室温）によってもとめた。ポリマー乾燥重量（PDW）およびモノマーユニット比の結果を表２１に示す。
【０１７８】
【表２１】
2006204257.tif 000039
【０１７９】
表２１の結果から明らかなように、新規ＰＨＡ生産菌ＹＮ２１株は様々なモノマーユニットを有するＰＨＡの生産に有用である。ＰＨＡ生産菌ＹＮ２１株の同質遺伝子系統でありポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊されたことを特徴とするＰＣ１２株はポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の基質供給系酵素を完備した宿主として有用であり、変異導入PhaC2M01を発現させることにより（PC12/pBBR-phaC2M01）、再びＰＨＡを合成できる。この際、PC12/pBBR-phaC2M01株によるＰＨＡの生産量はＹＮ２１株およびPC12/pBBR-phaC2株による生産量よりも増大していることがわかった。これはランダムな変異導入とスクリーニング操作を繰返すことによる進化工学的改変により、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の基質親和性、触媒反応速度、または細胞質中での酵素の安定性などが向上したためと考えられる。すなわち本発明のＰＣ１２株は、改変されたＰＨＡ合成酵素あるいは異種由来のＰＨＡ合成酵素の導入によるＰＨＡ生産のための宿主として有用であることがわかった。
【０１８０】
（実施例１０）
ポリペプトン0．5％、フェニル吉草酸0．1％、ミネラル溶液0．3％、粉末寒天1.2%を含むＭ９培地をオートクレーブ滅菌し、50℃に冷却後、ナイルレッドを0.05%含有するDMSO溶液を0．1％添加し、滅菌シャーレに15mlずつ分注し、寒天を固化させて寒天培地を作製した。
【０１８１】
なお、M9培地及びミネラル溶液の組成は以下に示す。
[M9培地]
Ｎa2ＨＰＯ4：６.２g、ＫＨ2ＰＯ4：３.０ｇ、ＮaＣl：０.５g、ＮＨ4Ｃl：１.０g（培地１リットル中、pＨ７.０）
[ミネラル溶液]
ニトリロ三酢酸：1.5 g、ＭgＳＯ4：3.0 g、ＭnＳＯ4：0.5 g、ＮaＣl：1.0 g、ＦeＳＯ4：0.1 g、ＣaＣl2：0.1 g、ＣoＣl2：0.1 g、ＺnＳＯ4：0.1 g、ＣuＳＯ4：0.1 g、ＡlＫ(ＳＯ4)2：0.1 g、Ｈ3ＢＯ3：0.1 g、Ｎa2ＭoＯ4：0.1 g、ＮiＣl2：0.1 g（１リットル中、pH7.0）
次に、野外から採取した土壌試料5gを10mlの滅菌蒸留水に添加し、1分間攪拌した。この土壌懸濁液0．5mlを4．5mlの滅菌水に添加・攪拌し、10倍希釈液を作製した。同様の操作を繰り返し、100倍希釈液、1000倍希釈液、10000倍希釈液を作製した。10倍〜10000倍希釈液を先に作製した寒天培地に各0．1mlずつ分注し、寒天表面に均一になるように広げた。これを培養器に移し、30℃で5日間培養した。培養後、PHAを合成したと思われる赤色のコロニーのうち、形態の異なる株を分離した。こうして野生株を十数株取得した。次にポリペプトン0．5％、グルコース0．5％、フェニル吉草酸0．1％、ミネラル溶液0．3％を含むＭ９培地（pH7.0）50mlに上記野生株を保存寒天培地のコロニーから植菌し、500ml容坂口フラスコにて30℃、125ストローク／分で振盪培養した。また上記培地をpH5.0、pH8.5にそれぞれ調整した培地に関しても同様に培養を行った。72時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて洗浄した後、真空乾燥した。この乾燥菌体ペレットを酢酸エチル１０ｍｌに懸濁し、３５℃で１５時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させ、沈澱物のみを回収して真空乾燥し、得られたＰＨＡを秤量してポリマー乾燥重量（PDW）を求めた。得られたＰＨＡのモノマーユニット比を、１Ｈ−ＮＭＲ（ＦＴ−ＮＭＲ：ＢｒｕｋｅｒＤＰＸ４００；共鳴周波数：４００ＭＨｚ；測定核種：１Ｈ；使用溶媒：ＣＤＣｌ３；ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ３；測定温度：室温）によって求めた。以上により得られたポリマー乾燥重量（PDW）及びモノマーユニット比を各野生株及び従来菌株に関して比較することで、PHA生産性を有するYN21株を取得した。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】実施例１で例示したポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクターを構築する手順の概略を図示したものである。
【図２】実施例１で構築したプラスミドpEX-phaCの制限酵素切断地図である。
【図３】実施例１で構築したプラスミドpPC12（ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子ターゲティングベクター）の制限酵素切断地図である。
【図４】実施例３で構築したプラスミドpBBR-phaC1の制限酵素切断地図である。
【図５】実施例４で構築したプラスミドpBBR-phaC2の制限酵素切断地図である。
【図６】遺伝子挿入破壊法と遺伝子置換破壊法による選択的遺伝子破壊の方法を図示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2006204257.tif 000044
【図６】
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【配列表】
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