(57)【要約】【課題】  骨髄単核細胞を簡便な操作で効率的に調製できる調製方法、及び当該方法の実施に好適な細胞調製装置を提供する。また、骨髄単核細胞の採取源（例えばヒト）に負担の少ない、骨髄単核細胞用の調製方法及び調製装置を提供する。更には、細胞の調製から移植材料の調製までを簡便に行なうことができる方法及び装置を提供する。【解決手段】  骨髄単核細胞を含む液体を多孔性フィルタに通し、該フィルタ上に骨髄単核細胞を捕捉するフィルタ処理ステップと、及び  前記フィルタ上に捕捉された骨髄単核細胞を回収する細胞回収ステップと、  を含む骨髄単核細胞の調製方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄単核細胞を含む液体を多孔性フィルタに通し、該フィルタ上に骨髄単核細胞を捕捉するフィルタ処理ステップと、及び
前記フィルタ上に捕捉された骨髄単核細胞を回収する細胞回収ステップと、
を含む骨髄単核細胞の調製方法。
【請求項２】
骨髄単核細胞を含む液体を多孔性フィルタに通し、該フィルタ上に骨髄単核細胞を捕捉するフィルタ処理ステップと、及び
骨髄単核細胞を含む前記フィルタを回収するフィルタ回収ステップと、
を含む骨髄単核細胞の調製方法。
【請求項３】
前記フィルタの孔径が30μm〜500μmである、請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項４】
前記フィルタが生体適合性材料からなる、請求項１〜３のずれかに記載の調製方法。
【請求項５】
前記フィルタ処理ステップの前に、前記フィルタよりも孔径の大きいプレフィルタでフィルタ処理するステップを実施する、請求項１〜４のいずれかに記載の調製方法。
【請求項６】
前記フィルタ処理ステップの後に、前記フィルタを洗浄して夾雑物を除去するステップを実施する、請求項１〜５のいずれかに記載の調製方法。
【請求項７】
前記の全ステップを無菌的に実施する、請求項１〜６のいずれかに記載の調製方法。
【請求項８】
前記骨髄単核細胞が間葉系幹細胞である、請求項１〜７のいずれかに記載の調製方法。
【請求項９】
骨髄単核細胞を含む前記液体が骨髄液である、請求項１〜８のいずれかに記載の調製方法。
【請求項１０】
骨髄単核細胞を含む液体を多孔性フィルタに通し、該フィルタ上に骨髄単核細胞を捕捉するフィルタ処理ステップと、
前記フィルタ上に捕捉された骨髄単核細胞を回収する細胞回収ステップと、及び
回収した骨髄単核細胞を培養する細胞培養ステップと、
を含む骨髄単核細胞の調製方法。
【請求項１１】
骨髄単核細胞を含む液体を、生体適合性材料からなる多孔性フィルタに通し、該フィルタ上に骨髄単核細胞を捕捉するフィルタ処理ステップと、
前記フィルタを回収するフィルタ回収ステップと、
回収した前記フィルタを培養液中に移し、前記フィルタに捕捉された状態のままで骨髄単核細胞を培養する細胞培養ステップと、及び
培養後の前記フィルタを回収する第２フィルタ回収ステップと
を含む骨髄単核細胞の調製方法。
【請求項１２】
骨髄単核細胞を含む液体から骨髄単核細胞を調製するための細胞調製装置であって、
前記液体を導入するための導入口と、導入された前記液体を排出するための排出口を備える容器と、及び
前記容器に収納される多孔性フィルタと、
を備える細胞調製装置。
【請求項１３】
前記フィルタの孔径が30μm〜500μmである、請求項１２に記載の細胞調製装置。
【請求項１４】
前記フィルタの孔径が50μm〜200μmである、請求項１２に記載の細胞調製装置。
【請求項１５】
前記フィルタが生体適合性材料からなる、請求項１２〜１４のいずれかに記載の細胞調製装置。
【請求項１６】
前記排出口に接続される吸引手段をさらに備える、請求項１２〜１５のいずれかに記載の細胞調製装置。
【請求項１７】
前記容器の前記導入口に接続され、前記フィルタの孔径よりもその孔径が大きいプレフィルタを内蔵するプレフィルタ装置を更に備える、請求項１２〜１６のいずれかに記載の細胞調製装置。
【請求項１８】
前記骨髄単核細胞が間葉系幹細胞である、請求項１２〜１７のいずれかに記載の細胞調製装置。
【請求項１９】
骨髄単核細胞を含む前記液体が骨髄液である、請求項１２〜１８のいずれかに記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は再生医療等の目的に使用される細胞の調製方法に関する。詳しくは、骨髄単核細胞の調製方法、調製装置等に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療が注目を集めている。再生医療は、生体より採取した幹細胞等を欠損部位に移植してする方法と、生体より採取した幹細胞等と細胞増殖用の足場材料などとを組合せて移植することによってより効果的な再生効果を得ようとする方法とに分類することができる。いずれの方法においても、最も重要な要素は細胞であると考えられている。
再生医療に使用される細胞の中において特に注目を集めているのが間葉系幹細胞（MSC：mesenchymal stem cell）である。MSCは中胚葉に由来し、骨細胞や軟骨細胞、或いは血管内皮細胞、心筋細胞など数多くの組織の細胞へと分化する。近年、MSCを利用した組織再生の成功例がいくつか報告され、一部の組織に関しては臨床応用の段階にある。
再生医療への利用が期待される細胞としては胚性幹細胞などの多能性幹細胞もあるが、MSCへの期待が高いことの背景には、MSCが上記のごとき数多くの組織に分化できる細胞であるという特徴のほかに、MSCが骨髄や末梢血などから採取できる点や、MSCを目的の組織へと分化誘導することが比較的容易である点などがある。
従来MSCは次のような方法で調製（回収）するのが一般的であった。まず、骨髄などのMSCを含む液体を生体より採取し、適当な培地で希釈した後に培養皿に播種する。次に、半日〜１日程度培養した後に未接着細胞を洗浄・除去する。そして、培養皿に接着して残っている細胞を適当な条件で培養し、増殖して得られる細胞をMSCとして回収する。MSCのその他の回収方法として、遠心分離及びFicoll法を組み合わせて単核球画分を分取し、その後は上記と同様の希釈・播種・培養の各操作を経てMSCを回収するという方法も採用されている。また、MSC細胞表面マーカーを利用してFACSやMACSによってMSC細胞を分離・回収する方法（抗体分離法）も一部で利用されている。
MSCの調製に特化した方法ではないが、フィルタを利用して組織再生用の細胞を調製する方法が提案されている（特許文献１、２、３）。しかしながらフィルタの性状と細胞回収率の関係や、回収（調製）した細胞の利用形態については十分に検討されていない。尚、本発明に関連する技術として上記各公報に開示されるものの他に、以下の特許文献４〜６に開示されるものがある。
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−３１９７７６号公報
【特許文献２】特開２００２−８７９７１号公報
【特許文献３】特開２００１−１６１３５２号公報
【特許文献４】特開２００３−２５０８２０号公報
【特許文献５】特開２００３−５２３６５号公報
【特許文献６】特開２００３−３２０００７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
以上のように組織再生用細胞の調製方法がいくつか知られているものの、高い回収率が得られなかったり、煩雑な操作を伴ったりすることから、新たな手法の開発が切望されていた。また、上記いずれの方法においても、大量の組織再生用細胞を調製しようと思えば必然的に大量の骨髄等を採取しなければならない。一方、患者の負担を考慮すれば一度に調製できる組織再生用細胞の量（数）には自ずと限界がある。従って、組織の再生に関する研究及び臨床応用が今後一層進展すると予想される現在においては、患者に過度の負担をかけることなく必要な量の組織再生用細胞を調製できる方法（及び装置）を提供することが極めて重要である。
本発明は以上の背景の下、組織再生用細胞として骨髄単核細胞（特にMSC）を簡便な操作で効率的に調製（回収）できる調製方法、及び当該方法の実施に好適な細胞調製装置を提供することを目的とする。また、骨髄単核細胞の採取源（例えばヒト）に負担の少ない、骨髄単核細胞用の調製方法及び調製装置を提供することを目的とする。更には、細胞の調製（回収）から移植材料の調製までを簡便に行なうことができる方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは以上の目的に鑑みて鋭意検討を重ねた。その結果、多孔性フィルタに骨髄単核細胞を含む液体を通すことによって、フィルタ上に骨髄単核細胞を非常に効率的に捕捉できることを見出した。また、例えば骨髄液などの生体試料を細胞源として用いる場合にはフィルタ処理後の細胞源を生体に戻すことが可能であり、このような方法は、必要な成分のみを回収するという、患者に負担の少ない（低侵襲性の）施術法となるとの知見に想到した。特に、骨髄単核細胞の効率的な回収を可能とする孔径の多孔性フィルタを用いれば、フィルタによって除去される成分は少なく、患者への負担は極めて少ない。
更に検討を進めた結果、生体吸収性材料からなる多孔性フィルタを用いれば、フィルタに骨髄単核細胞を捕捉した後、フィルタからの回収操作を経ることなく、フィルタに捕捉されたままの状態で骨髄単核細胞を患者に移植することが可能となり、骨髄単核細胞の調製から移植操作に至る過程が極めて簡素化されるとの知見を得た。
本発明は以上の知見に基づき完成されたものであって、以下の各構成を提供する。
［１］  骨髄単核細胞を含む液体を多孔性フィルタに通し、該フィルタ上に骨髄単核細胞を捕捉するフィルタ処理ステップと、及び
前記フィルタ上に捕捉された骨髄単核細胞を回収する細胞回収ステップと、
を含む骨髄単核細胞の調製方法。
［２］  骨髄単核細胞を含む液体を多孔性フィルタに通し、該フィルタ上に骨髄単核細胞を捕捉するフィルタ処理ステップと、及び
骨髄単核細胞を含む前記フィルタを回収するフィルタ回収ステップと、
を含む骨髄単核細胞の調製方法。
［３］  前記フィルタの孔径が30μm〜500μmである、［１］又は［２］に記載の調製方法。
［４］  前記フィルタが生体適合性材料からなる、［１］〜［３］のずれかに記載の調製方法。
［５］  前記フィルタ処理ステップの前に、前記フィルタよりも孔径の大きいプレフィルタでフィルタ処理するステップを実施する、［１］〜［４］のいずれかに記載の調製方法。
［６］  前記フィルタ処理ステップの後に、前記フィルタを洗浄して夾雑物を除去するステップを実施する、［１］〜［５］のいずれかに記載の調製方法。
［７］  前記の全ステップを無菌的に実施する、［１］〜［６］のいずれかに記載の調製方法。
［８］  前記骨髄単核細胞が間葉系幹細胞である、［１］〜［７］のいずれかに記載の調製方法。
［９］  骨髄単核細胞を含む前記液体が骨髄液である、［１］〜［８］のいずれかに記載の調製方法。
［１０］  骨髄単核細胞を含む液体を多孔性フィルタに通し、該フィルタ上に骨髄単核細胞を捕捉するフィルタ処理ステップと、
前記フィルタ上に捕捉された骨髄単核細胞を回収する細胞回収ステップと、及び
回収した骨髄単核細胞を培養する細胞培養ステップと、
を含む骨髄単核細胞の調製方法。
［１１］  骨髄単核細胞を含む液体を、生体適合性材料からなる多孔性フィルタに通し、該フィルタ上に骨髄単核細胞を捕捉するフィルタ処理ステップと、
前記フィルタを回収するフィルタ回収ステップと、
回収した前記フィルタを培養液中に移し、前記フィルタに捕捉された状態のままで骨髄単核細胞を培養する細胞培養ステップと、及び
培養後の前記フィルタを回収する第２フィルタ回収ステップと
を含む骨髄単核細胞の調製方法。
［１２］  骨髄単核細胞を含む液体から骨髄単核細胞を調製するための細胞調製装置であって、
前記液体を導入するための導入口と、導入された前記液体を排出するための排出口を備える容器と、及び
前記容器に収納される多孔性フィルタと、
を備える細胞調製装置。
［１３］  前記フィルタの孔径が30μm〜500μmである、［１２］に記載の細胞調製装置。
［１４］  前記フィルタの孔径が50μm〜200μmである、［１２］に記載の細胞調製装置。
［１５］  前記フィルタが生体適合性材料からなる、［１２］〜［１４］のいずれかに記載の細胞調製装置。
［１６］  前記排出口に接続される吸引手段をさらに備える、［１２］〜［１５］のいずれかに記載の細胞調製装置。
［１７］  前記容器の前記導入口に接続され、前記フィルタの孔径よりもその孔径が大きいプレフィルタを内蔵するプレフィルタ装置を更に備える、［１２］〜［１６］のいずれかに記載の細胞調製装置。
［１８］  前記骨髄単核細胞が間葉系幹細胞である、［１２］〜［１７］のいずれかに記載の細胞調製装置。
［１９］  骨髄単核細胞を含む前記液体が骨髄液である、［１２］〜［１８］のいずれかに記載の調製方法。
［２０］  液体中の骨髄単核細胞を捕捉するためのフィルタ装置であって、
前記液体を導入するための導入口と、導入された前記液体を排出するための排出口を備える容器と、及び
前記容器に収納される多孔性フィルタと、
からなるフィルタ装置。
［２１］  前記フィルタの孔径が30μm〜500μmである、［２０］に記載の細胞調製装置。
［２２］  前記フィルタの孔径が50μm〜200μmである、［２０］に記載のフィルタ装置。
［２３］  前記フィルタが生体適合性材料からなる、［２０］〜［２２］のいずれかに記載のフィルタ装置。
［２４］  前記骨髄単核細胞が間葉系幹細胞である、［２０］〜［２３］のいずれかに記載のフィルタ装置。
［２５］  骨髄単核細胞を含む前記液体が骨髄液である、［２０］〜［２４］のいずれかに記載のフィルタ装置。
［２６］  多孔性フィルタを、その導入口と排出口との間に収納した容器を用意した後、骨髄単核細胞を含む液体を、細胞源から採取するのと同時に、前記導入口を介して前記容器内に導入し、前記フィルタに通すフィルタ処理ステップと、
前記第１ステップの際に前記排出口から排出される液体を一時的に保持する液体保持ステップと、
保持した液体を、前記排出口を介して前記容器内に戻し、前記フィルタに通す第２フィルタ処理ステップと、
前記第２フィルタ処理ステップの際に前記導入口から排出される液体を前記細胞源に戻す液体還元ステップと、及び
前記容器から前記フィルタを取出すフィルタ回収ステップと、
を含む、骨髄単核細胞の調製方法。
［２７］  前記フィルタの孔径が30μm〜500μmである、［２６］に記載の調製方法。
［２８］  前記フィルタが生体適合性材料からなる、［２６］又は［２７］に記載の調製方法。
［２９］  前記フィルタ処理ステップの前に、前記フィルタよりも孔径の大きいプレフィルタでフィルタ処理するステップを実施する、［２６］〜［２８］のいずれかに記載の調製方法。
［３０］  前記フィルタ処理ステップ〜前記液体還元ステップを複数回繰り返す、［２６］〜［２９］のいずれかに記載の調製方法。
［３１］  前記の全ステップを無菌的に実施する、［２６］〜［３０］のいずれかに記載の調製方法。
［３２］  前記骨髄単核細胞が間葉系幹細胞である、［２６］〜［３１］のいずれかに記載の調製方法。
［３３］  骨髄単核細胞を含む前記液体が骨髄液である、［２６］〜［３２］のいずれかに記載の調整方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の第１の局面は骨髄単核細胞の調製方法に関し、その一態様は次のステップを含む。
フィルタ処理ステップ：骨髄単核細胞を含む液体を多孔性フィルタに通し、該フィルタ上に骨髄単核細胞を捕捉する。
細胞回収ステップ：前記フィルタ上に捕捉された骨髄単核細胞を回収する。
【０００７】
フィルタ処理ステップでは、骨髄単核細胞を含む液体を多孔性フィルタに通すことのよって、不要な成分を通過させつつ、必要な成分である骨髄単核細胞をフィルタ上に捕捉する。ここで「骨髄単核細胞」とは、骨髄に含まれる単核の細胞と、及びこれに同種であって骨髄以外の体液又は組織に含まれる細胞とを含む概念の用語として用いる。従って本発明で使用する「骨髄単核細胞を含む液体」は、骨髄由来の細胞を含むものに限定されない。
一方、「骨髄単核細胞を含む液体」とは、骨髄単核細胞がその一成分として存在する生体試料、又は当該生体試料から調製された液体（例えば、細胞分離処理、及び／又は生理食塩水や緩衝液などの添加等を経て得られる液体）をいう。ここでの生体試料としては例えば骨髄、骨膜、歯髄、末梢血、さい帯血が該当する。以上のような生体試料は、使用目的に合わせて適当な動物から採取される。採取源となる動物は、好ましくは哺乳動物であり、さらに好ましくは齧歯類又は霊長類であり、最も好ましくはヒトである。尚、以上のような生体試料の採取源（当該生体試料が存在する組織や器官など）のことを本明細書では「細胞源」とも呼ぶ。
「骨髄単核細胞を含む液体」として特に、骨髄単核細胞の一つである間葉系幹細胞を含む液体を使用することが好ましい。かかる態様の本発明によれば間葉系幹細胞が調製（回収）される。即ち、間葉系幹細胞の簡便な調製方法が提供されることとなる。間葉系幹細胞は骨組織や軟骨組織を初めとした種々の組織の再生に有用である。間葉系幹細胞を含む生体試料としては例えば骨髄、骨膜、歯髄、末梢血、臍帯血などを挙げることができる。ここで「間葉系幹細胞（以下、「MSC」ともいう）」とは、中胚葉に由来し、骨細胞、軟骨細胞、血管内皮細胞、心筋細胞など数多くの組織の細胞へと分化する幹細胞をいう。
【０００８】
フィルタ処理ステップでは多孔性フィルタを使用する。特に孔径が30μm〜500μmの範囲にある多孔性フィルタを使用することが好ましい。本発明者らの検討によって、かかる孔径の多孔性フィルタによれば他の成分（例えば赤血球）の混入を抑えつつ、骨髄単核細胞（特にMSC）を効率的に捕捉することができることが明らかとなった。骨髄単核細胞のより効率的な捕捉を可能とすべく、好ましくは孔径が50μm〜200μm、更に好ましくは孔径が50μm〜100μmの範囲にあるフィルタを使用する。これらの範囲は、後述の実施例に示す検討結果と、捕捉目的の骨髄単核細胞の大きさを考慮して定められたものである。フィルタの孔径が50μmよりも小さい場合には不要な成分も捕捉されやすくなることから、骨髄単核細胞の回収率が低下する。一方、フィルタの孔径が200μmよりも大きい場合には、フィルタに捕捉されずに素通りする骨髄単核細胞の量が増加し、即ち骨髄単核細胞の回収率が低下する。ここでの孔径は原則として、フィルタ全体の孔の平均値（平均孔径）を意味する。但し、孔径はフィルタ全体に亘って均一でなくともよい。例えば全体の孔の30％以上、好ましくは50％以上、更に好ましくは80％以上の孔が上記範囲に含まれるフィルタも、上記で規定するフィルタに含むこととする。
後述のように、不織布状のフィルタを使用してもよい。不織布状のフィルタとしては例えば、使用時の繊維径が80μm〜200μmのものを用いることができる。尚、コラーゲンなど、吸湿性ないし吸水性の材料からなる不織布状フィルタの場合、次の特性を備えるものを使用することができる。
乾燥時の繊維径：例えば10μm〜80μm（好ましくは30μm〜60μm）
湿潤時（使用時）の繊維径：例えば80μm〜200μm（好ましくは100μm〜150μm）
【０００９】
本発明に使用する多孔性フィルタの形成材料、形状及び大きさは特に問わない。フィルタの形成材料としては例えば無機材料や高分子材料（合成高分子材料及び天然高分子材料）を用いることができる。具体的には例えばナイロン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ハイドロキシアパタイト、ガラス、セルロースなどからなるフィルタを使用することができる。
本発明の一態様では生体適合性材料からなるフィルタを使用する。生体適合性の材料からなるフィルタを使用すれば、骨髄単核細胞をフィルタに捕捉した後、フィルタごと骨髄単核細胞を患者に移植するという移植術が可能となる。このような移植術によれば、フィルタからそれに捕捉された骨髄単核細胞を回収する操作及び回収した細胞を移植用に加工（培養や移植用担体への付着等）する操作が不要となり、簡便な手順による移植が可能となる。また、人為的な操作の介在が少なくなることから、安全性の面でも優れた移植が可能となる。安全性を考慮すれば、できるだけ生体適合性の高い材料からなるフィルタを使用することが好ましい。具体的には例えば生体吸収性材料製のフィルタを使用することが好ましい。生体吸収性の材料は移植後に生体内で吸収、代謝されることから、移植用材料として広範な用途に使用されている。生体吸収性材料としては、合成高分子材料（ポリグルコール酸：PGA、ポリ乳酸：PLA、ポリ-ε-カプロラクトン：PCL、及びこれらの重合体（例えばL-乳酸-グリコール酸重合体やL-乳酸-ε-カプロラクトン共重合体）、ポリ-p-ジオキサノン：PDS等）、天然高分子材料（コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、フィブリン、及び多糖類（例えばキチンやアルギニン）等）、無機材料（リン酸三カルシウム、及び炭酸カルシウム等）を例示することができる。
【００１０】
以上の材料を多孔性となるように加工することによって、本発明に使用するフィルタを作製することができる。例えば、繊維加工技術を利用して膜状ないし織物状のフィルタを作製することができる。また、ニードルパンチ法やメルトブロー法などによって不織布状のフィルタを作製することができる。或いは、繊維加工技術や凍結乾燥法などを利用してスポンジ状のフィルタを作製することもできる。
本発明では、典型的には、膜状（シート状）に加工したフィルタを使用するが、立方体形状、直方体形状、円柱状形状、及び球状形状など、液体の通過方向により厚みを有することとなる形状に加工したフィルタを使用してもよい。
所定の材料の粒子の集合体からなり、隣接する粒子間に空間（孔）が形成される（隣接する粒子同士は接着していても、していなくてもよい）フィルタを用いることもできる。例えば所定の粒子径の粒子を適当な容器に充填することによって、このようなフィルタを調製することができる。一方、繊維状の材料が規則的又は不規則的に集合し及び／又は重なることによって、隣接する繊維間に空間（孔）が形成されるフィルタ（例えば不織布からなるフィルタ）を使用することもできる。
【００１１】
本発明のフィルタ処理ステップを、孔径が同一又は異なる複数のフィルタを使用して実施することにしてもよい。
【００１２】
フィルタ処理ステップの前に、埃やゴミ或いは凝集成分などの除去を目的として、プレフィルタによる前処理を行なうことが好ましい。このような前処理を実施することによって、フィルタ処理ステップに供される液体中の夾雑物が減少し、フィルタの目詰まりを防止でき、効率的なフィルタ処理が可能となる。またフィルタへの夾雑物の付着量が減少することから、最終的に回収される骨髄単核細胞への不純物の混入量が減少することが期待される。前処理に使用するプレフィルタの孔径は、フィルタ処理に使用するフィルタの孔径よりも大きい必要があり、例えば200μm〜1mmである。
【００１３】
上記のフィルタ処理ステップの後に、フィルタを洗浄してフィルタに捕捉ないし付着した不要な成分（夾雑物）を除去するステップを実施することが好ましい。このような処理を実施すれば、調製される骨髄単核細胞への不純物の混入量を減少できる。このような洗浄ステップは例えば、生理食塩水、PBSなどの緩衝液を用いて行なうことができる。尚、当該洗浄ステップは、フィルタに捕捉された骨髄単核細胞を洗浄・除去してしまわないように比較的緩やかな条件で行なう。洗浄条件は、フィルタ処理に供される液体の種類、使用するフィルタの種類などを考慮して設定することができる。尚、当該洗浄ステップは、以下で説明する細胞回収ステップの前に実施される。
【００１４】
細胞回収ステップでは、フィルタ処理ステップによってフィルタ上に捕捉された骨髄単核細胞を回収する。回収ステップは、フィルタ処理ステップにおいて使用するフィルタの種類によって以下のように方法が異なる（但し、フィルタが異なっていても同一の方法が採用される場合もある）。
（１）非生体適合性材料製のフィルタでフィルタ処理ステップを実施した場合
この場合には原則として、捕捉した骨髄単核細胞をフィルタから剥がして骨髄単核細胞を回収する必要がある。従って例えば、フィルタ処理の結果、骨髄単核細胞が捕捉されたフィルタに適当な回収用液体（例えば、生理食塩水、PBSなどの緩衝液、骨髄単核細胞用培地（例えばMSC用培地））を通し、骨髄単核細胞を回収用液体内に回収する。回収した骨髄単核細胞は必要に応じて培養に供される。捕捉した骨髄単核細胞をフィルタから剥がす操作を得ることなく（即ちフィルタに捕捉された状態のままで）骨髄単核細胞を培養に供することもできる。
（２）生体適合性材料製のフィルタでフィルタ処理ステップを実施した場合
この場合には捕捉した骨髄単核細胞をフィルタごと生体に移植することが可能である。このような骨髄単核細胞の使用態様を採用する場合には、フィルタを回収することが骨髄単核細胞を回収することになる。即ち、フィルタを回収することによって骨髄単核細胞が調製される。生体適合性のフィルタを用いた場合にはフィルタからの骨髄単核細胞の回収及びその後の培養（必要な場合）を経ることなく移植材料を調製できる。即ち、極めて簡便な手順で且つ迅速に移植材料を調製可能な方法となる。このように調製された、骨髄単核細胞を含むフィルタを移植材料として用いれば移植後、移植材料中に血管の進入（新生）が促され、その結果、良好な再生効果が得られる。
フィルタの回収（即ち骨髄単核細胞の回収）の後、移植前にフィルタ上の骨髄単核細胞を増殖させてもよい。この場合には、回収したフィルタを骨髄単核細胞用培地内に移し、適当な条件で培養する。
以上のような培養工程の採用は、フィルタ処理によって十分な量の骨髄単核細胞の捕捉が期待できない場合に有効である。尚、フィルタ処理ステップに生体適合性のフィルタを用いた場合においても、フィルタ処理ステップに非生体適合性フィルタを用いた場合と同様に、フィルタから骨髄単核細胞を剥し取り回収してもよい。
【００１５】
本発明の一態様では、上記のフィルタを収納した容器を用意し（フィルタは、容器の導入口と排出口との間に配置される）、そして生体（細胞源）より採取した骨髄単核細胞を含む液体を当該容器にその導入口を介して導入することによってフィルタ処理を実施する（フィルタ処理ステップ）。細胞源から骨髄単核細胞を含む液体を採取すると同時にこれを容器内に導入し、続いて排出されることにしてもよい。導入された液体はフィルタを通った後に容器の排出口より排出される。排出された液体は一時的に保持された後（液体保持ステップ）、排出口を介して容器内に戻される。その結果、容器内のフィルタによるフィルタ処理が再度実施される（第２フィルタ処理ステップ）。このフィルタ処理後の液体は、それを採取した細胞源に戻される（液体還元ステップ）。以上の操作の後に、容器内よりフィルタを回収する（フィルタ回収ステップ）。非生体適合性材料製のフィルタを用いた場合には原則として、捕捉した骨髄単核細胞をフィルタから剥がして骨髄単核細胞を回収する。他方、生体適合性材料製のフィルタを用いた場合においては、フィルタを回収することによって骨髄単核細胞が調製され、調製された骨髄単核細胞はフィルタごと移植に供される（移植前に培養して骨髄単核細胞を増殖させてもよい）。以上のステップからなる調製方法によれば、フィルタに捕捉される成分のみが生体（細胞源）から回収されることとなり、生体への負担が少ない。尚、以上の方法においても、フィルタ処理ステップの前に、プレフィルタによる前処理を行なうことが好ましい。
【００１６】
上記のフィルタ処理ステップ〜液体還元ステップまでを複数回繰り返し、その後にフィルタ回収ステップを実行することとしてもよい。このような方法によれば、より多量の液体（骨髄単核細胞を含む液体）をフィルタ処理することになるので、フィルタ上に捕捉される骨髄単核細胞の量が増大し、その結果、より大量の骨髄単核細胞を得ることができる。一方で、フィルタ処理後の液体は生体に還元されることから患者への負担が大幅に増加することはない。このように以上の方法によれば、患者に過度の負担をかけることなく大量の骨髄単核細胞を調製することができる。フィルタ処理ステップ〜液体還元ステップの繰返し数は特に限定されない。使用するフィルタの大きさや孔径、一回あたりの吸引量、細胞源の種類、細胞源より採取される液体中の骨髄単核細胞数、骨髄単核細胞の目標調製量などによって異なるが、繰り返し数を例えば２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、又は９回とする。勿論、場合によっては繰返し数を１０回以上としてもよい。
【００１７】
従来の骨髄単核細胞（特にMSC）の調製方法では一般に、生体（患者）から骨髄単核細胞を含む液体（例えば骨髄液）を採取した後、分離処理などによってMSCを回収し、残りの液体は廃棄されていた。このような方法では、大量の骨髄単核細胞（例えばMSC）を得ようと思えば大量の骨髄液等を採取して処理しなければならず、生体に過度の負担がかかる。したがって、一度に調製できる骨髄単核細胞（例えばMSC）の数には自ずと限界があった。これに対して上記のごとき本発明の調製方法によれば、大量の骨髄液等を処理することによって大量の骨髄単核細胞（例えばMSC）を調製したとしても、残りの成分は生体に戻されることから生体への負担は小さい。このように本発明によれば、低侵襲性であって且つ一度に大量の骨髄単核細胞を調製可能な方法が提供されることとなる。
【００１８】
本発明の調製方法では、安全性の面から、全ての工程を無菌的に実施することが好ましい。
【００１９】
本発明の骨髄単核細胞の調製方法を用いて回収ないし調製される骨髄単核細胞（又は移植材料）は、組織の再生（再建）に利用することができる。再生対象の組織としては、骨髄単核細胞（特にMSC）が当該組織の形成に関与する組織であれば特に限定されず、例えば血管、骨、軟骨、歯、歯周、筋肉などを好適な対象組織として挙げることができる。
【００２０】
本発明の他の局面は、骨髄単核細胞用の調製装置に関する。尚、特に言及しない要素及び事項については上記の説明を援用する。本発明の細胞調製装置は、骨髄単核細胞を含む液体から骨髄単核細胞を調製するための細胞調製装置であって、容器と、その中に収納されるフィルタと、及び吸引手段とを備える。
【００２１】
容器は、骨髄単核細胞を含む液体を導入するための導入口と、導入された液体を排出するための排出口とを備える。容器は典型的には導入口及び排出口をそれぞれ一つ備えるが、これらのいずれか又は両者を複数備えていてもよい。
容器の導入口は、そこを介して液体を容易な手順で容器内に導入できるように、注射針等を装着できるような形状及び構造を有していることが好ましい。操作性の面から、使用する際に（細胞の調製時に）注射針等を特別の装置等の補助なく装着できるような導入口を採用することが特に好ましい。
【００２２】
容器内には多孔性フィルタ（上記の説明を参照）が収納される。導入口から導入された液体が一旦フィルタを通って排出口より排出されるように、容器の導入口と排出口との間（両者に挟まれる位置）にフィルタが収納される。導入された液体の全てが排出前にフィルタを通り、これによって効率的な骨髄単核細胞の捕捉が可能となるように、フィルタによって導入口と排出口が完全に隔てられることが好ましい。
【００２３】
本発明の細胞調製装置は吸引手段を更に備えていてもよい。吸引手段は容器の排出口に接続される。かかる吸引手段による吸引力を利用して、容器内にその導入口を介して液体が導入される。吸引手段は、容器の排出口に接続でき、上記のごとき液体の導入を実施することが可能なものであれば特にその種類は問わない。吸引手段として例えばポンプやピストンを採用できる。具体的には例えば注射器を吸引手段として用いることができる。
【００２４】
吸引手段が容器内からの吸引能力に加えて容器内方向への排出能力をも備えていることが好ましい。このような吸引手段によれば、その吸引能力によって導入口より容器内に導入し、フィルタを通過させ、そして排出口を介して排出した液体を、再度、排出口を介して容器内へと導入することが可能となる。容器内へと導入された液体は、フィルタを通過した後、今度は導入口を介して排出されることとなる。以上のような吸引手段による一連の吸引及び排出動作の結果、被処理液体（骨髄単核細胞を含む液体）は２回フィルタを通過した後に装置外（容器外）へと排出される。ここで、容器の導入口側を細胞源に接続した状態で上記の操作を行えば、細胞源から採取された骨髄単核細胞を含む液体はフィルタ処理後に細胞源へと還元されることになる。骨髄液からの骨髄単核細胞の調製を例に採れば、患者から採取された骨髄液は、吸引手段による上記回収操作によってその中の骨髄単核細胞がフィルタに捕捉された後に、同一患者に戻されることとなる。したがって、フィルタに捕捉された成分のみが患者から取り出されることになり、患者の負担は小さい。また、繰り返し回収操作を行っても患者の負担が大幅に増加することはない。このように、容器内からの吸引能力に加えて容器内方向への排出能力をも備えている吸引手段を採用することによって、患者への負担が極めて少ない、骨髄単核細胞の調製方法を実施可能な細胞調製装置となる。尚、ここでの「患者」とは、骨髄単核細胞が採取される対象（即ち細胞源を含む生体など）を意味し、必ずしも回収した骨髄単核細胞の移植対象と同一ではない。
以下、図面を参照しながら本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【００２５】
本発明の一実施例である細胞調製装置１を図１に示す。細胞調製装置１はフィルタ部１０、注射針２０（例えば１６〜２４ゲージ）、シリンジ（針なし）３０、及び連結部材４０から構成される。フィルタ部１０は、導入口１２及び排出口１３を備えるフィルタ用容器１１と、フィルタ用容器１１内に収納される細胞捕捉用フィルタ１４とからなる。フィルタ用容器１１は中空であって、その上面及び下面の中央部から突出するように導入口１２及び排出口１３が形成されている。導入口１２及び排出口１３はそれぞれ筒状であって、両者の内空間はフィルタ用容器本体の内空間を介して連通する。フィルタ用容器本体はその中央部において上下二つに分解でき、また連結できるようになっている。本実施例ではスクリュー式の連結方法によってこのような自由な分解及び連結を可能とする。尚、フィルタ用容器１１の材質はポリスチレンである。
使用時にはフィルタ用容器本体内に細胞捕捉用フィルタ１４が収納される。細胞捕捉用フィルタ１４は、それによってフィルタ用容器本体内を二つの空間に分けるようにフィルタ用容器本体の中央に収納される（細胞補足用フィルタ１４はフィルタ用容器１１の導入口１１と排出口１２に挟まれた状態となる）。この実施例では細胞捕捉用フィルタ１４として、乾燥時の平均繊維径が約30μm〜約60μm、湿潤時の平均繊維径が約100μm〜約150μmのコラーゲン製の不織布からなる多孔性フィルタを使用した。
フィルタ用容器１１の導入口１２には連結部４０を介して注射針２０が連結される。細胞調製装置１の使用対象（細胞源）に応じて適当な内径の注射針を採用する。本実施例では骨髄からの骨髄単核細胞の調製を行うために１８ゲージの注射針を使用した。
フィルタ用容器１１の排出口１３にはシリンジ３０が接続される。本実施例では50ml容量のシリンジを使用した。
【００２６】
次に図４のフローチャートを参照しながら、細胞調製装置１を使用した細胞調製方法を、骨髄からの骨髄単核細胞の調製を例として説明する。まず、無菌的に細胞調製装置１を用意する。次に、必要に応じて切開術を施した後、細胞調製装置１の注射針２０の先端を、細胞源である骨髄内に刺入する。続いて、この状態でシリンジ３０のプランジャー３１を引く。その結果生ずる吸引力によって、骨髄液が注射針２０を通り、次いでフィルタ用容器１１内へとその導入口１２を介して導入される。導入された骨髄液は、フィルタ用容器１１内で細胞捕捉用フィルタ１４によりろ過される（フィルタ処理ステップ：Ｓ１）。このろ過によって、細胞捕捉用フィルタ１４上に骨髄単核細胞が捕捉される。ろ過後の骨髄は、フィルタ用容器１１よりその排出口１３を介して排出され、シリンジ３０内に保持される。次に、細胞捕捉用フィルタ１４上の捕捉された骨髄単核細胞を回収するためにフィルタ用容器１１内から細胞補足用フィルタ１４を取り出す。取り出した細胞捕捉用フィルタ１４を生理食塩水や適当な緩衝液で洗浄して骨髄単核細胞を回収する（細胞回収ステップ：Ｓ２）。回収した骨髄単核細胞は必要に応じて培養に供される（培養ステップ：Ｓ３）。
以上のフィルタ処理ステップ後の細胞捕捉用フィルタ１４に捕捉された（又は吸着した）、骨髄単核細胞以外の成分（夾雑物）を除去し、最終的に回収される骨髄単核細胞の純度を高める目的で、フィルタ処理ステップと細胞回収ステップの間に、細胞捕捉用フィルタ１４を適当な液体で洗浄するステップ（夾雑物除去ステップ：Ｓ４）を実施することが好ましい。このステップは例えば次のように実施する。まず、フィルタ処理ステップの後にシリンジをフィルタ用容器１１から外す。続いて、洗浄用の液体を保持した別のシリンジをフィルタ用容器１１の排出口１３に連結する。そして、当該シリンジ内の液体をフィルタ用容器１１内にその排出口１３を介して注入する。注入された液体は細胞捕捉用フィルタ１４を通過した後、フィルタ用容器１１の導入口１２を介して容器外に排出される。以上のように洗浄用の液体が細胞捕捉用フィルタ１４を通過することによって洗浄効果が得られ、細胞捕捉用フィルタ１４上の夾雑物を除去することができる。
【００２７】
次に、細胞調製装置１を用いた、骨髄単核細の回収方法の他の例を示す（図５のフローチャートを参照）。まず、細胞調製装置１の注射針２０の先端を、細胞源である骨髄内に刺入する。続いて、シリンジ３０のプランジャー３１を引くことで注射針２０を介して骨髄液を取り込み、フィルタ処理に供する（フィルタ処理ステップ：Ｓ１１）。この段階で、注射針２０の先端を骨髄中から取り出さず、以下に説明するフィルタ回収ステップを実施する前まで、注射針２０の先端を骨髄液中に維持する。
フィルタ処理ステップを実施した結果、シリンジ３０内にはフィルタ処理後の骨髄が保持される（液体保持ステップ：Ｓ１２）。次に、シリンジ３０のプランジャー３１を押し込むことによって、シリンジ３０内に保持された骨髄を、細胞捕捉用フィルタを収納したフィルタ用容器１１内へと戻す。これによって骨髄液は再びフィルタ処理される（第２フィルタ処理ステップ：Ｓ１３）。フィルタ処理された後の骨髄液は、注射針２０を通って骨髄中に還元される（液体還元ステップ：Ｓ１４）。
以上のフィルタ処理ステップから液体還元ステップを所定回数繰り返す。所定回数終了後、細胞捕捉用フィルタを取り出す（フィルタ回収ステップ）。取り出した細胞捕捉用フィルタは、そのまま移植片（骨髄単核細胞移植用の移植片）として利用することができる。また、取り出した細胞捕捉用フィルタを適当な培地内に移しフィルタ上に捕捉された骨髄単核細胞を培養してもよい。この場合には細胞捕捉用フィルタが骨髄単核細胞の足場として利用される。或いは、取り出した細胞捕捉用フィルタから骨髄単核細胞を洗浄等の手段で回収した後に、回収された骨髄単核細胞を培養に供したり、移植に利用したりすることもできる。尚、ここでの所定回数は通常、目標量の骨髄単核細胞を細胞捕捉用フィルタ上に捕捉するのに必要と予想される回数（例えば、１〜７回）とする。
以上のような方法によれば、細胞捕捉用フィルタに捕捉される成分を除いて、生体から採取される成分は実質的にない。したがって生体への負担が大幅に軽減される。また、一度フィルタ処理された骨髄液が再びフィルタ処理されることから、細胞捕捉用フィルタ上への骨髄単核細胞の捕捉率の向上を期待できる。更に、フィルタ処理ステップから液体還元ステップを繰り返し実施することによって、大量の骨髄液がフィルタ処理に供されることとなり、より多くの骨髄単核細胞をフィルタ上に捕捉することができる。一方、以上の方法で調製された骨髄単核細胞は生体吸収性材料製のフィルタ上に捕捉されており、そのままの状態で（即ち、フィルタごと）移植片としての利用に供され得る。このように以上の方法では骨髄単核細胞の回収と移植片の調製とが同時に行なわれ、骨髄単核細胞を含有した移植材料の簡便かつ迅速な調製を可能とする。
【実施例２】
【００２８】
次に、他の実施例である細胞調製装置２についてその構成及び使用方法を説明する。尚、以降の説明に使用する図面では、細胞調製装置１と同一の部材に同一の符号を付してその説明を省略する。図２に示すように細胞調製装置２では、フィルタ部１５と、プレフィルタ部１７が備えられる。プレフィルタ部１７は、注射針２０とフィルタ部１５との間に取り付けられる。
フィルタ部１５内には、孔径が約２００μmのテフロン（登録商標：テトラフルオロエチレン）製多孔性フィルタ（細胞捕捉用フィルタ１６）が収納されている。一方、プレフィルタ部１７内には、孔径が約５００μmのテフロン（登録商標）製多孔性フィルタ（プレフィルタ１８）が収納されている。その他の構成は細胞調製装置１と同じである。このような細胞調製装置２では以下の手順で骨髄単核細胞が回収される（図６のフローチャートを参照）。尚、以下では一例として骨髄からの骨髄単核細胞の回収方法を示す。
まず、無菌的に細胞調製装置２を用意する。次に、必要に応じて切開術を施した後、細胞調製装置２の注射針２０の先端を、細胞源である骨髄内に刺入する。続いて、この状態でシリンジ３０のプランジャー３１を引く。その結果生ずる吸引力によって、骨髄液が注射針２０を通り、次いでプレフィルタ部１７内へと導入される。導入された骨髄液はプレフィルタ１８によるろ過作用を受けた後に、プレフィルタ部１７の排出口より排出される（プレフィルタ処理ステップ：Ｓ０）。このプレフィルタ１７によるろ過作用の結果、骨髄液中の骨片やゴミなどが除去される。プレフィルタ部１７から排出された骨髄液は続いてフィルタ部１５内に導入される。以降は細胞調製装置１の場合と同様にフィルタ処理ステップ（Ｓ１）、細胞回収ステップ（Ｓ２）、及び培養ステップ（Ｓ３）が順に実施される。
以上のように、細胞調製装置２を使用した場合には、細胞捕捉用フィルタ１６によるフィルタ処理ステップの前にプレフィルタ１８による前処理が実施される。この前処理によって、予め骨片などのサイズの大きな夾雑物が除去された骨髄液がフィルタ処理ステップに供されることとなる。その結果、フィルタ処理ステップにおいて、より良好なろ過作用が奏され、骨髄単核細胞の捕捉率の向上及び夾雑物量の低減が図られる。
尚、細胞調製装置１の場合と同様に、フィルタ処理ステップ（Ｓ１）と細胞回収ステップ（Ｓ２）との間に夾雑物除去ステップ（Ｓ４）を実施し、回収される骨髄単核細胞の純度を高めることが好ましい。
【００２９】
フィルタ１６として生体吸収性材料製のフィルタ（例えばコラーゲン製の不織布フィルタ）を用いた場合には特に、次の手順で骨髄単核細胞を調製することができる（図７のフローチャートを参照）。まず、無菌的に細胞調製装置を用意する。次に、必要に応じて切開術を施した後、細胞調製装置の注射針２０の先端を、細胞源である骨髄内に刺入する。続いて、この状態でシリンジ３０のプランジャー３１を引く。この操作によって、骨髄液が注射針２０を通ってプレフィルタ部１７内へと導入され、そこでプレフィルタ１８によるろ過作用を受ける（プレフィルタ処理ステップ：Ｓ１０）。この前処理の後は、上記と同様の手順で液体保持ステップ〜フィルタ回数ステップを実施し（Ｓ１１〜Ｓ１６）、生体吸収性材料からなる細胞捕捉用フィルタ上に捕捉された骨髄単核細胞を得る。以上のような方法によれば、フィルタ処理ステップにおいてより良好なろ過作用が奏され、骨髄単核細胞の捕捉率の向上及び夾雑物量の低減が図られる。また、上記の方法の場合と同様に、生体に過度の負担をかけることなく多くの骨髄単核細胞を回収することができるとともに、骨髄単核細胞を含有した移植材料の簡便かつ迅速な調製が可能となる。
【実施例３】
【００３０】
次に、更に他の実施例である細胞調製装置３についてその構成及び使用方法を説明する。尚、以降の説明に使用する図面では、細胞調製装置２と同一の部材に同一の符号を付してその説明を省略する。図３に示すように細胞調製装置３は、フィルタ部１５と、二つのプレフィルタ部１７ａ及び１７ｂを備える。プレフィルタ部１７ａの一端は容器５０に接続される。また、各フィルタ部は、容器５０側から順にプレフィルタ部１７ａ、プレフィルタ部１７ｂ、及びフィルタ部１５が並ぶように連結されている。プレフィルタ部１７ａ及び１７ｂにはそれぞれ、孔径が約５００μmのテフロン（登録商標）製多孔性フィルタ（プレフィルタ１８ａ及び１８ｂ）が収納されている。一方、フィルタ部１５には孔径が約２００μmのテフロン（登録商標：テトラフルオロエチレン）製多孔性フィルタ（細胞捕捉用フィルタ１６）が収納されている。
細胞調製装置３では、細胞源（例えば採取した骨髄液）を容器５０に入れ、重力の作用を利用して、細胞源をプレフィルタ部１７ａ、プレフィルタ部１７ｂ、及びフィルタ部１５に順次通す。以下、細胞調製装置３による骨髄単核細胞の回収方法の一例として、骨髄液を細胞源として用いた場合を説明する。
まず、無菌的に細胞調製装置３を用意する。一方、別途用意したシリンジ等を利用して腸骨等から骨髄液を採取する。次に、採取した骨髄液を容器５０に移した後、しばらく放置する。これによって骨髄液はまずプレフィルタ部１７ａ及び１７ｂを通る。この際、プレフィルタ１８ａ及び１８ｂによるろ過作用が奏され、骨髄液中の骨片やゴミなどが除去される。プレフィルタ部１７ｂから排出された骨髄液は続いてフィルタ部１５内に導入される。導入された骨髄液は、フィルタ部１５内で細胞捕捉用フィルタ１６によりろ過される。このろ過によって、細胞捕捉用フィルタ１６上に骨髄単核細胞が捕捉される。ろ過後の骨髄はフィルタ部１５の開放端より排出される。次に、細胞捕捉用フィルタ１６を回収し、これを生理食塩水や適当な緩衝液で洗浄して骨髄単核細胞を回収する。回収した骨髄単核細胞は必要に応じて培養に供される。
以上のように、細胞調製装置３を使用した場合には、細胞捕捉用フィルタ１６によるフィルタ処理ステップの前にプレフィルタ１８ａ及び１８ｂによる前処理が実施される。この前処理によって、予め骨片などのサイズの大きな夾雑物が除去された骨髄液が細胞捕捉用フィルタ１６によるフィルタ処理ステップに供されることとなる。その結果、当該フィルタ処理ステップにおいて、より良好なろ過作用が奏され、骨髄単核細胞の捕捉率の向上及び夾雑物量の低減が図られる。
【実施例４】
【００３１】
上記の細胞調製装置１を用いて骨髄からの骨髄単核細胞の調製を試みた。以下に実験方法を記載する。まず、コラーゲン不織布（多孔性フィルタ）をフィルタ容器にパッケージし、シリンジを取り付けることによって細胞調製装置１とした。細胞調製装置１を用いてウサギ腸骨より骨髄液を吸引し、再度戻す操作を行った。血液が固まらないようにコラーゲン不織布にヘパリン処理を行ったものの詰まりやすく、吸引した液を戻す操作は２〜３回が限度であった。
以上の操作の後、コラーゲン不織布を回収した。続いてコラーゲン不織布を培養液で洗浄することによって、コラーゲン不織布に捕捉（トラップ）された細胞を回収した。回収した細胞を培養に供し、その結果増殖した細胞のコロニー数及び細胞数を計測した。また、所定時間培養後に骨誘導培地を添加し、ALP活性を測定した。一方、比較対象（コントロール）として、骨髄液１〜２ｍｌより分離した単核球細胞を培養した。その結果増殖した細胞のコロニー数及び細胞数を計測した。また、上記同様に骨誘導培地を添加し、ALP活性を測定した。
各測定結果から（図示せず）、コラーゲン不織布によってトラップされた細胞からもコントロールと同程度にMSC様細胞を培養することができた。また、コントロールと同様にALP活性の上昇がみとめられ、MSC様細胞が増殖していることが確認された。コラーゲン不織布によってトラップされた細胞を用いた場合のコロニー形成数（コロニー形成能）は、コントロールである、骨髄液１〜２ｍｌから得られたコロニー数と同等であった。この結果から、上記方法は非常に有益な細胞分離法であるといえる。
【実施例５】
【００３２】
上記の細胞調製装置３を用いて、ヒト骨髄からの骨髄単核細胞の調製を試みた。以下に実験方法を記載する。平均孔径が200μmのテフロン（登録商標：テトラフルオロエチレン）製多孔性フィルタと、平均孔径が500μmのテフロン（登録商標）製多孔性フィルタを用意し、それらをそれぞれフィルタ容器にパッケージした。その後、各フィルタ容器を連結し、あわせて骨髄液を一時的に収容するための容器を取り付け、細胞調製装置３とした。一方、ヒト腸骨より骨髄液約４００ｍｌを採取した。採取した骨髄液を細胞調製装置３の容器５０に移した後、しばらくの間放置した。次に、フィルタ部１５の開放端から骨髄液の全量が排出されたのを確認した後、各フィルタ（１６、１８ａ、及び１８ｂ）を回収した。続いて、回収した各フィルタを培養液で洗浄することによって、各フィルタに捕捉（トラップ）された細胞を回収した。回収した細胞をそれぞれ培養に供し、その結果増殖した細胞のコロニー数及び細胞数を計測した。また、所定時間培養後に骨誘導培地を添加し、ALP活性を測定した。一方、比較対象（コントロール）として、骨髄液１ｍｌより分離した単核球細胞を培養した。その結果増殖した細胞のコロニー数を計測した。また、上記同様に骨誘導培地を添加し、ALP活性を測定した。
培養３日目のコロニー形成数を図８（Ａ）のグラフに示す。また、培養１０日目の細胞数を図８（Ｂ）のグラフに示す。一方、ALP活性を図９のグラフに示す。尚、図９においてSCは骨誘導をしていない群（MSCのままで培養した群）のALP活性を、indは骨誘導培地で骨誘導をした群のALP活性をそれぞれ示す。
図８に示されるように、孔径500μmのフィルタ及び孔径200μmのフィルタのいずれにおいても、コントロールと同等又はそれ以上の効率で細胞を回収できていることが分かる。また、孔径500μmのフィルタよりも、孔径200μmのフィルタの方が高い細胞回収率が得られている。一方、回収された細胞は、ALP活性の上昇がみとめられ、MSC様細胞が増殖していることが確認された（図９）。
以上の結果から、（１）多孔性フィルタを用いたフィルタ処理がMSCの回収に有効であること、（２）平均孔径500μmのフィルタであっても、平均孔径200μmのフィルタであっても良好な細胞回収率が得られること、及び（３）平均孔径500μmのフィルタよりも平均孔径200μmのフィルタの方が細胞回収率に優れること、が判明した。
【実施例６】
【００３３】
骨髄液から回収した細胞を用いた軟骨組織の再生を以下の手順で試みた。細胞の回収には上記の細胞調製装置１を使用した。まず、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）不織布（多孔性フィルタ）をフィルタ容器にパッケージし、シリンジを取り付けることによって細胞調製装置１とした。細胞調製装置１を用いてウサギ関節部の骨髄腔から骨髄液（約３ｍｌ〜５ｍｌ）を吸引した。その後、ＰＧＡ不織布を回収した。このようにして得られた細胞含有ＰＧＡ不織布を使用して以下の手順で施術した。
麻酔法：ケタミン（商品名ケタラール、三共エール薬品（株）社製）  35mg/kg im ＋ キシラジン（商品名セラクタール、バイエル社製）  5mg/kg im 
麻酔時間：25-40分、覚醒時間：60-120分
＜手術手順＞
1)ウサギ（日本白色家兎、週齢10−20）に上記の方法で麻酔をかけた。
2)シェーバー、脱毛クリームを用いて大腿から下腿にかけて脱毛した。
3)膝前方アプローチに準じたアプローチを用いた（膝前面に縦切開、膝蓋骨の内側を切離して関節内に侵入する）。
4)リューエル・ヤスリを用いて5mm程度の軟骨欠損（軟骨下骨まで達する）を作製した。
5)上記方法で調製した細胞含有ＰＧＡ不織布を軟骨欠損部に補填した（ＰＧＡ細胞（＋）群）。その際、吸収性の糸で固定することとした。尚、比較対照（コントロール）として、骨髄液を通していないＰＧＡ不織布を移植する群（ＰＧＡ細胞（−）群）、欠損部に何も移植しない群（単純欠損群）を設けた。
5)癒着防止効果も兼ねてHA＋セルロースのシート(sepra film、登録商標、ジェンザイム・ジャパン社製)を関節裂隙に置いた。閉創し、ガーゼドレッシング（dressing）、ギプス固定して手術を終了した。
【００３４】
以上の施術後、一定期間の後に移植部の組織を摘出し、肉眼的・組織学的に評価した。結果を図１０〜１２に示す。尚、図１０はＰＧＡ細胞（＋）群の移植４月後の移植部の状態を肉眼的に観察したもの（左）及び移植部切片のＨＥ染色像（右）であり、図１１はＰＧＡ細胞（−）の同様の図（左：肉眼的観察像、右：ＨＥ染色像）である。一方、図１２は単純欠損群の欠損形成２月後の欠損形成部の状態を肉眼的に観察したもの（左）及び欠損形成部切片のＨＥ染色像（右）である。
図１０〜１２に示されるようにＰＧＡ細胞（＋）群では、ＰＧＡ細胞（−）群に比較して良好な軟骨形成（再生）が認められる。また、単純欠損群との比較においても明らかな相違が認められる。以上の結果から、ＰＧＡ不織布を使用した上記の方法が軟骨組織の再生に有効であることが示された。即ち、ＰＧＡ不織布によって軟骨再生用の細胞（即ちＭＳＣ）を捕捉できることが明らかになるとともに、このようにして得られる細胞含有ＰＧＡ不織布はそのままの状態で軟骨組織再生用の移植材料として有効に利用できることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明の骨髄単核細胞の調製方法又は調製用装置は、骨髄や末梢血などから骨髄単核細胞を回収することに使用される。本発明は特に間葉系幹細胞を回収することに有用である。回収した骨髄単核細胞は、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、歯周組織、血管、靱帯、腱、筋肉、又は心筋の再建など、特に再生医療の分野において利用することができる。
【００３６】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、本発明の一実施例である細胞調製装置１を示す図である。
【図２】図２は、他の実施例である細胞調製装置２を示す図である。
【図３】図３は、他の実施例である細胞調製装置３を示す図である。
【図４】図４は、細胞調製装置１を使用した、骨髄単核細胞の調製方法のフローチャートである。
【図５】図５は、細胞調製装置１を使用した、骨髄単核細の回収方法の他の例を示すフローチャートである。
【図６】図６は、細胞調製装置２を使用した、骨髄単核細胞の調製方法のフローチャートである。
【図７】図７は、生体吸収性材料からなる細胞捕捉用フィルタを用いるとともに、プレフィルタ処理を行うこととした、骨髄単核細胞の調製方法のフローチャートである。
【図８】図８は、細胞調製装置３を使用してヒト骨髄液からMSCを回収した場合における各フィルタの細胞回収率を示す。（Ａ）は培養３日目のコロニー形成数を示すグラフ、（Ｂ）は培養７日目の細胞数を示すグラフである。
【図９】図９は、細胞調製装置３を使用してヒト骨髄液からMSCを回収した場合における、回収されたMSCの骨誘導時のＡＬＰ活性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、細胞調製装置１を使用して得られる移植材料を用いた移植実験の結果を示す図であり、ＰＧＡ細胞（＋）群の移植４月後の移植部の状態を肉眼的に観察したもの（左）及び移植部切片のＨＥ染色像（右）である。
【図１１】図１１は、細胞調製装置１を使用して得られる移植材料を用いた移植実験の結果（比較対照）を示す図であり、ＰＧＡ細胞（−）群の移植４月後の移植部の状態を肉眼的に観察したもの（左）及び移植部切片のＨＥ染色像（右）である。
【図１２】図１２は、細胞調製装置１を使用して得られる移植材料を用いた移植実験の結果（比較対照）を示す図であり、単純欠損群の欠損形成２月後の欠損形成部の状態を肉眼的に観察したもの（左）及び欠損形成部切片のＨＥ染色像（右）である。
【符号の説明】
【００３８】
１、２、３  細胞調製装置
１０  フィルタ部
１１  フィルタ用容器
１４  細胞捕捉用フィルタ（コラーゲン不織布）
１６  細胞捕捉用フィルタ（平均孔径200μmの多孔性フィルタ）
１７  １７ａ  １７ｂ  プレフィルタ部
１８  プレフィルタ
１８ａ、１８ｂ  平均孔径500μmの多孔性フィルタ
２０  注射針
３０  シリンジ
３１  プランジャー
４０  連結部材
【図１】
2006006125.tif 000003
【図２】
2006006125.tif 000004
【図３】
2006006125.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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