(57)【要約】      （修正有）【課題】迅速且つ精度の高い方法で、食品、医薬品、香粧品等の製品中に存在する酵母やカビを幅広く検出する技術を提供すること。【解決手段】下記(i)及び(ii)のプライマーからなるプライマー対を、酵母及びカビ検出用のプライマー対として使用して、各種製品に存在する酵母やカビを検出する：(i)塩基配列（5'-GCCATGCGTGTCTAAGTATAAG-3'）又はその特定の変異塩基配列、及び(ii)塩基配列(5'-TAGGGGAGAGATTTGAATGAAC-3')又はその特定の変異塩基配列。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列、又は該塩基配列において、第１〜１２位の塩基の３個以下が置換、及び／又は５'末端側に１０個以下の塩基が付加されている塩基配列からな
る、酵母及びカビ検出用プライマー。
【請求項２】
配列番号２で示される塩基配列、又は該塩基配列において、第１〜１２位の塩基の３個以下が置換、及び／又は５'末端側に１０個以下の塩基が付加されている塩基配列からな
る、酵母及びカビ検出用プライマー。
【請求項３】
請求項１に記載のプライマー、及び請求項２に記載のプライマーからなる、酵母及びカビ検出用のプライマー対。
【請求項４】
下記(i)及び(ii)のプライマーからなる請求項３に記載の酵母及びカビ検出用のプライ
マー対：
(i)配列番号１で示される塩基配列からなるプライマー、及び
(ii)配列番号２で示される塩基配列からなるプライマー。
【請求項５】
検出対象となる酵母及びカビが、サッカロマイセス・ショレビッシェ、ピキア・アノマラ、カンディダ・ファマタ、デバリオマイセス・ハンセニイ、ジグロサッカロマイセス・ロウキシ、カンディダ・インターメディア、クラビスポラ・ルジタニエ、クルイベロマイセス・ラクティス、シゾサッカロマイセス・ポンブ、ピキア・メンブラニファシエンス、ペニシリウム・オブラタム、ペニシリウム・サブロサム、アスペルギルス・ニガー、フサリウム・クルークウェレンス、ジェオトリカム・カンディダム、アルターナリア・アルタネータ、アウレオバシディウム・プルランス、クラドストリウム・クラドスポリオイドス、ユウロチウム・ハーバリオラム、及びタラロマイセス・バシリスポラスよりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項３又は４に記載の酵母及びカビ検出用プライマー対。
【請求項６】
検査対象物中の酵母及びカビを検出する方法であって、
(1)検査対象物に含まれるＤＮＡを抽出する工程、
(2)前記工程(1)抽出されたＤＮＡを鋳型として、請求項３乃至５のいずれかに記載のプライマー対を用いてＰＣＲを行なう工程、及び
(3)増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程、を含有する検出方法。
【請求項７】
検査対象物が食品である、請求項６に記載の判定方法。
【請求項８】
請求項３乃至５のいずれかに記載のプライマー対を含有する、酵母及びカビ検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母及びカビ検出用のプライマーに関する。より詳細には、カビ及び酵母を幅広く検出できるように設計されているプライマーに関する。更に、本発明は、該プライマーを利用した酵母及びカビの検出方法及び酵母及びカビ検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母やカビは、自然界に広く分布しており、食品等の原材料や生活環境中に存在している。この酵母及びカビが、食品、医薬品、香粧品等の製品に混入すると、これらの製品の劣化や腐敗を引き起こすことがある。特に近年、食品分野では、低糖化、天然添加物使用、無殺菌又は低温殺菌等を謳った製品が脚光を浴びており、これに伴って酵母及びカビによる変敗が引き起こされる割合が増大してきている（非特許文献１参照）。
【０００３】
そのため、食品、医薬品、香粧品等の製品を生産・管理する上で、酵母やカビの混入の有無を判定することが不可欠となっている。特に、食品の分野では、製造から出荷までの時間の短縮が求められており、迅速にカビや酵母の汚染の検査を実施することが必要とされている。
【０００４】
現在、製品への酵母やカビの混入の有無を検査する方法としては、一般的にプレートを用いた培養法が用いられている。しかしながら、この培養法では、検査に４８時間以上もの時間を要するため、迅速な判定ができないという問題点がある。
【０００５】
一方、培養法に比べて迅速に真菌の混入を判定できる方法として、真菌由来ＤＮＡに特異的なＤＮＡ合成プライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅された真菌由来ＤＮＡ断片を検出する方法（以下、ＰＣＲ法と記す）が知られている（非特許文献２、特許文献１及び２）。しかしながら、非特許文献２のＰＣＲ法では、真菌の内、酵母を検出できるが、カビを検出することができないという欠点がある。また、特許文献１や２のＰＣＲ法では、ＤＮＡ合成プライマーが食品成分（特に、大豆、ブドウ、キウイ等の植物成分）に由来するＤＮＡとハイブリダイズしてしまうため、食品成分を含有する製品に対する酵母やカビの混入の判定には適用できないという欠点がある。
【０００６】
このような従来技術を背景として、迅速且つ精度の高い方法で、酵母やカビを幅広く検出する技術の開発が切望されている。
【非特許文献１】J. Antibact. Antifung. Agents Vol.27, No. 12, 1999, p.803〜809
【非特許文献２】Journal of Food Protection, Vol. 67, No. 2, 2004, p.357-364
【特許文献１】特開平６−３３９３９９号公報
【特許文献２】特開平６−３３９４００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、迅速且つ精度の高い方法で、食品、医薬品、香粧品等の製品中に存在する酵母やカビを幅広く検出する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決すべく日夜研究を重ねた結果、幅広い酵母やカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的にハイブリダイズできるポリヌクレオチドの塩基配列として、(i)塩基配列（5'-GCCATGCGTGTCTAAGTATAAG-3'）（配列番号１）又はその特定の変異塩基配列、及び(ii)塩基配列(5'-TAGGGGAGAGATTTGAATGAAC-3')（配列番号２）又はその特定の変異塩基配列を見出した。更に、これらのポリヌクレオチドは、植物又は動物の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子や細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子とはハイブリダイズしないこと、及びプライマーとしてＰＣＲに使用し得ることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明は、下記に掲げる酵母及びカビ検出用のプライマー、酵母及びカビ検出用のプライマー対、酵母及びカビの検出方法、及び酵母及びカビ検出用キットである：
項１．  配列番号１で示される塩基配列、又は該塩基配列において、第１〜１２位の塩基の３個以下が置換、及び／又は５'末端側に１０個以下の塩基が付加されている塩基配列からなる、酵母及びカビ検出用プライマー。
項２．  配列番号２で示される塩基配列、又は該塩基配列において、第１〜１２位の塩基の３個以下が置換、及び／又は５'末端側に１０個以下の塩基が付加されている塩基配列からなる、酵母及びカビ検出用プライマー。
項３．  項１に記載のプライマー及び項２に記載のプライマーからなる、酵母及びカビ検出用のプライマー対。
項４．  下記(i)及び(ii)のプライマーからなる項３に記載の酵母及びカビ検出用のプライマー対：
(i)配列番号１で示される塩基配列からなるプライマー、及び
(ii)配列番号２で示される塩基配列からなるプライマー。
項５．  検出対象となる酵母及びカビが、サッカロマイセス・ショレビッシェ、ピキア・アノマラ、カンディダ・ファマタ、デバリオマイセス・ハンセニイ、ジグロサッカロマイセス・ロウキシ、カンディダ・インターメディア、クラビスポラ・ルジタニエ、クルイベロマイセス・ラクティス、シゾサッカロマイセス・ポンブ、ピキア・メンブラニファシエンス、ペニシリウム・オブラタム、ペニシリウム・サブロサム、アスペルギルス・ニガー、フサリウム・クルークウェレンス、ジェオトリカム・カンディダム、アルターナリア・アルタネータ、アウレオバシディウム・プルランス、クラドストリウム・クラドスポリオイドス、ユウロチウム・ハーバリオラム、及びタラロマイセス・バシリスポラスよりなる群から選択される少なくとも１種である、項３又は４に記載の酵母及びカビ検出用プライマー対。
項６．  検査対象物中の酵母及びカビを検出する方法であって、
(1)検査対象物に含まれるＤＮＡを抽出する工程、
(2)前記工程(1)抽出されたＤＮＡを鋳型として、請求項３乃至５のいずれかに記載のプライマー対を用いてＰＣＲを行なう工程、及び
(3)増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程、を含有する検出方法。
項７．  検査対象物が食品である、項６に記載の判定方法。
項８．  項３乃至５のいずれかに記載のプライマー対を含有する、酵母及びカビ検出用キット。
【００１０】
本発明において、「酵母及びカビの検出」（「酵母及びカビ検出」や「酵母及びカビを検出」等の表記も同義）とは、酵母とカビが共存している場合であれば酵母とカビの双方を検出することを意味し、また、酵母及びカビの何れか一方が存在している場合には、酵母及びカビの何れか一方を検出することを意味する。
【００１１】
(I)酵母及びカビ検出用のプライマー及びプライマー対
本発明の酵母及びカビの検出用プライマーは、植物又は動物の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子や細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子とはハイブリダイズすることなく、酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的にハイブリダイズできるものである。このような特性により、本発明のプライマーは、通常のＰＣＲに供されることにより、酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅するが、同じ条件のＰＣＲに供されることにより植物及び動物の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅しないプライマーである。
【００１２】
本発明は、このような酵母及びカビ検出用のプライマーとして、以下の塩基配列からなるプライマー（以下、プライマー１と記す）を提供する：
(a)配列番号１で示される塩基配列、又は
(b)配列番号１で示される塩基配列において、第１〜１２位にある塩基の内３個以下の塩基が置換、及び／又は５'末端側に１０個以下の塩基が付加されている塩基配列。
【００１３】
また、本発明は、上記プライマー１の他に、酵母及びカビ検出用のプライマーとして、以下の塩基配列からなるプライマー（以下、プライマー２と記す）を提供する：
(c)配列番号２で示される塩基配列、又は
(d)配列番号２で示される塩基配列において、第１〜１２位にある塩基の内３個以下の塩基が置換、及び／又は５'末端側に１０個以下の塩基が付加されている塩基配列。
【００１４】
当該プライマー１又は２は、それぞれ配列番号１又は２で示される各塩基配列において、第１〜１２位にある塩基の内、３個以下の塩基が置換されていてもよいが、このように塩基が置換される場合、置換される塩基の数は、好ましくは２個以下、更に好ましくは１個である。このような態様で塩基が置換されているものであれば、植物又は動物の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子や細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子とはハイブリダイズすることなく、酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的にハイブリダイズして、プライマーとしての作用を発揮できる。
【００１５】
また、当該プライマー１又は２は、それぞれ配列番号１又は２で示される各塩基配列の５'末端側に１０個以下の塩基が付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよいが、このように塩基が付加される場合、５'末端側に付加される塩基の数は、好ましくは１〜５、更に好ましくは１である。このような態様で塩基が付加されたものであっても、配列番号１及び２で示される塩基配列からなるプライマーと同様の作用を発揮することが可能である。
【００１６】
なお、当該プライマー１又は２は、それぞれ配列番号１又は２で示される塩基配列において、第１〜１２位にある塩基の内、３個以下の塩基が置換されており、更に５’末端側に１０個以下の塩基が付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。
【００１７】
当該プライマー１として、好ましくは(a)配列番号１で示される塩基配列からなるものである。また、当該プライマー２として、好ましくは(c)配列番号２で示される塩基配列からなるものである。
【００１８】
なお、当該プライマー１又は２には、上記する塩基配列に相補的な塩基配列からなるものも含まれる。
【００１９】
本発明の酵母及びカビの検出用プライマーは、植物又は動物の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子や細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子とはハイブリダイズすることなく、酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的にハイブリダイズでき、ＰＣＲに供されることにより酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子を特異的に検出可能に増幅できる。
【００２０】
本発明の酵母及びカビの検出用プライマーは、幅広い酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に対してハイブリダイズできるので、その検出対象となる菌については、酵母又はカビに分類されるものであれば特に制限されるものではない。好ましい検出対象の菌の一例として、食品、医薬品又は香粧品に混入して腐敗や劣化の原因となっている酵母やカビを挙げることができる。このような酵母及びカビとしては、好ましくは、子のう菌門（Ascomycota）に属する酵母及びカビが挙げられる。より具体的には、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、カンディダ属（Candida）、デバリオマイセス属（Debaryomyces）、ジグロサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）、クラビスポラ属（Clavispora）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）等の酵母や、ペニシリウム属（Penicillium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、フサリウム属（Fusarium）、ジェオトリカム属（Geotrichum）、アルターナリア属（Alternaria）、アウレオバシディウム属（Aureobasidium）、クラドストリウム属（Cladosporium）、ユウロチウム属（Eurotium）、タラロマイセス属（Talaromyces）等のカビが例示される。
【００２１】
特に、本発明の酵母及びカビ検出用のプライマーは、植物成分等の食品成分共存下でも、食品成分由来のＤＮＡにハイブリダイズすることなく、酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的にハイブリダイズできる。このような本発明の格別の効果に鑑みれば、本発明の酵母及びカビ検出用のプライマーは、食品に混入して腐敗や劣化の原因となっている酵母及びカビ（以下、食品汚染菌ともいう）の検出に好適に使用できる。
【００２２】
本発明の酵母及びカビ検出用のプライマーの検出対象となる食品汚染菌としては、具体的には、サッカロマイセス・ショレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、カンディダ・ファマタ（Candida famata）、デバリオマイセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）、ジグロサッカロマイセス・ロウキシ（Zygosaccharomyces rouxii）、カンディダ・インターメディア（Candida intermedia）、クラビスポラ・ルジタニエ（Clavispora lusitaniae）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、シゾサッカロマイセス・ポンブ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・メンブラニファシエンス（Pichia membranifaciens）等の酵母；ペニシリウム・オブラタム（Penicillium oblatum）、ペニシリウム・サブロサム（Penicillium sabulosum）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、フサリウム・クルークウェレンス（Fusarium crookwellense）、ジェオトリカム・カンディダム（Geotrichum candidum）、アルターナリア・アルタネータ（Alternaria alternata）、アウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、クラドストリウム・クラドスポリオイドス（Cladosporium cladosporioides）、ユウロチウム・ハーバリオラム（Eurotium herbariorum）、タラロマイセス・バシリスポラス（Talaromyces bacillisporus）等のカビが例示される。
【００２３】
本発明の酵母及びカビ検出用のプライマー（プライマー１及びプライマー２）は、その塩基配列に基づいて、公知の合成方法に従って調製することができる。
【００２４】
本発明の酵母及びカビ検出用のプライマーのプライマー１とプライマー２は、それぞれ別個に酵母及びカビの検出に使用してもよいが、好ましくはこれらを組み合わせて酵母及びカビ検出用のプライマー対として使用することができる。
【００２５】
(II)酵母及びカビの検出方法
また、本発明は、プライマー１及びプライマー２から構成される「酵母及びカビ検出用のプライマー対」を使用して、検査対象物中の酵母及びカビを検出する方法を提供する。本発明に係る酵母及びカビの検出方法は、下記工程(1)〜(3)を含有することを特徴とするものである。
(1)検査対象物に含まれるＤＮＡを抽出する工程、
(2)前記工程(1)抽出されたＤＮＡを鋳型として、上記酵母及びカビ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行なう工程、及び
(3)増幅されたＤＮＡ断片の有無を検出する工程。
【００２６】
検査対象物
本判定方法における検査対象物は、酵母及びカビの存在の判定が必要とされるものであれば、その種類については特に制限されない。また、当該検査対象物の形態についても、液状、固形状、半固形状等の何れであってもよい。好ましくは液状又は半固形状の形態のものである。液状又は半固形状の形態のものは酵母及びカビの生育に適しているので、これらの形態の検査対象物における酵母及びカビの存在を判定することは極めて重要である。
【００２７】
当該検査対象物として、具体的には、食品、医薬品、香粧品、及びこれらの原材料等を挙げることができる。当該食品の具体例としては、乳酸菌飲料、牛乳、乳飲料、果汁飲料、茶類、栄養飲料、炭酸飲料、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、ソース、ゼリー、レトルト食品等が挙げられる。また、当該医薬品の具体例としては、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、流エキス剤、軟膏等が挙げられる。更に、当該香粧品の具体例としては、乳液、クリーム、ローション、オイル等が挙げられる。
【００２８】
酵母及びカビの誤検出を抑制するという観点から、本発明の検出方法における検査対象物には、酵母及びカビを使用して製造された成分が含まれていないものが望ましい。例えば、検査対象物が食品である場合、該食品は、酵母やカビを使用して製造された発酵食品以外の食品であることが望ましい。
【００２９】
上記検査対象物の中でも、特に食品は、その商品価値が鮮度に大きく作用されるので、品質管理上、迅速で精度の高い方法で酵母及びカビの汚染の有無を判定することが求められている検査対象物である。また、上記酵母及びカビ検出用のプライマー対は、植物成分等の食品成分共存下でも、食品成分由来のＤＮＡにハイブリダイズすることなく、酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的にハイブリダイズできるので、食品中の酵母及びカビの検出に特に有用である。これらの事項に鑑みれば、本判定方法において、好ましい検査対象物として食品が挙げられる。
【００３０】
食品の中でも、特に、乳酸菌飲料、発酵乳、ヨーグルト等の食品は、酵母及びカビによる汚染が特に問題となる食品であり、酵母及びカビの混入の検査を迅速且つ高い精度で実施することが強く求められている。本検出方法によれば、これらの食品に対して特に高い精度で酵母及びカビの検出が可能であるので、これらの食品は、特に好ましい検査対象物である。
【００３１】
工程(1)
工程(1)では、検査対象物に含まれるＤＮＡの抽出を行なう。
【００３２】
ＤＮＡの抽出は、検査対象物の種類や形態等に応じて、公知のＤＮＡ抽出方法を適宜採用して実施すればよい。例えば、検査対象物の形態が液状の場合であれば、検査対象物にガラスビーズ液を添加し、８０〜１００℃程度で１〜１５分間程度加熱した後、冷却し、次いでマルチビーズショッカー等で破砕し、その後、市販のDNA抽出キット等でDNA抽出を行なうことにより、ＤＮＡ抽出物を得ることができる。また、例えば、半固体状又は固体状の場合であれば、該検査対象物を水等により液状にした後に、上記ＤＮＡ抽出処理を実施すればよい。
【００３３】
上記抽出処理により得られたＤＮＡ抽出物に、ＲＮＡやタンパク質等が含まれている場合には、必要に応じて、更にＤＮＡの精製処理を行ってもよい。
【００３４】
本検出方法において、通常、検査対象物１ｇ当たりに１００ｃｆｕ(colony forming unit)程度以上の酵母及びカビが存在する場合、上記条件でＤＮＡ抽出を行なうことにより検査対象物の酵母及びカビの存在について判定可能な程度のＤＮＡを抽出できる。
【００３５】
一方、検査対象物中の酵母及びカビが上記菌数よりも少ない場合であれば、ＤＮＡ抽出操作の前に、検査対象物中の酵母及びカビを人為的に増菌させることによって、酵母及びカビの検出に必要とされる量のＤＮＡが抽出可能になる。このように、検査対象物に含まれる酵母及びカビを人為的に増菌させることは、検出感度が高められるだけでなく、検査対象物中の死菌（酵母及びカビ）が検出の精度に及ぼす影響を最小限にするという利点も得られる。
【００３６】
検査対象物に含まれる酵母及びカビを増菌する方法としては、例えば、検査対象物の所定量を真菌増殖用培地中に入れ、これを酵母及びカビの生育環境条件下で保持する方法が挙げられる。より具体的には、次の方法が例示される。ＹＰＤ培養液のような真菌増殖用液体培地に適量の検査対象物を入れ、２５℃程度で培養する。培養時間は、検査対象物中に存在する酵母及びカビの菌数によっても異なるが、通常１２〜９６時間程度とすればよい。使用した検査対象物中に酵母及びカビが存在している場合、得られた培養液中の酵母及びカビの菌数が増加している。この培養液を上記ＤＮＡ抽出処理に供すればよい。
【００３７】
検査対象物の種類によっても異なるが、例えば、検査対象物１００ｇ当たり３〜１０ｃｆｕ程度の酵母が含まれている場合であれば、該検査対象物を上記条件で２０時間程度培養することにより、検出必要量のＤＮＡが得られる程度に酵母を増菌させることができる。また、例えば、検査対象物１００ｇ当たりの酵母の菌数が１〜３ｃｆｕ程度の場合であれば、上記条件において、培地に添加する検査対象物の量を増やしたり、培養時間を延長させたりすればよい。
【００３８】
工程(2)
工程(2)では、前記工程(1)抽出されたＤＮＡを鋳型として、上記酵母及びカビ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行なう。当該ＰＣＲの条件は、目的ＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することを限度として特に制限されず、使用する装置等に応じて適宜設定することができる。使用されるＰＣＲ装置としては、例えば、ブロックタイプ、リアルタイムＰＣＲタイプ等の市販の装置が挙げられる。迅速にＤＮＡを増幅するためにはキャピラリータイプのリアルタイムＰＣＲ装置を用いることが好ましい。
【００３９】
例えば、リアルタイムＰＣＲ装置を使用する場合であれば、当該ＰＣＲの条件の一例として、以下の条件が例示される：
＜反応液＞例えば、Takara Ex TaqTMR-PCR Version （Takara Bio社製）に付属のＰＣＲ反応液
＜ＰＣＲサイクル条件＞
２本鎖ＤＮＡの熱変性条件：９５℃で５秒間、
プライマーの一本鎖ＤＮＡへのアニーリング条件：５４℃で１０秒間、
ＤＮＡ伸長条件：７２℃で２０秒間、
サイクル回数：３５サイクル程度。
【００４０】
工程(3)
工程(3)では、増幅されたＤＮＡ断片を検出する。増幅されたＤＮＡ断片を検出する方法は、特に制限されず、公知のＤＮＡ断片検出方法を使用できる。例えば、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド、サイバーグリーンＩ等の核酸染色剤で核酸染色することにより、ＤＮＡ断片を検出することができる。また、前記工程(2)において、リアルタイムＰＣＲ装置を用いてＰＣＲを行なう場合は、該装置の検出システムにより自動的に短時間で増幅されたＤＮＡの有無が確認される。例えば、ＰＣＲ反応液中にサイバーグリーンIを添加した場合では、サイバーグリーンＩが二本鎖ＤＮＡに結合したときに発する蛍光値から増幅産物量をサイクル毎にモニター可能であり、更に、ＰＣＲ後に融解曲線分析を行なうことによりＰＣＲ産物が目的のＤＮＡ断片であるかどうかを確認できる。判断が困難な場合は、増幅産物の大きさをアガロースゲル電気泳動により確認すればよい。
【００４１】
増幅されたＤＮＡ断片が存在する場合、アガロースゲル電気泳動であれば、２５０〜２７０塩基対程度の大きさの位置にバンドが検出される。
【００４２】
本工程で検出されたＤＮＡ断片の有無を指標として、検査対象物中の酵母及びカビの存在を判定することができる。本工程において、ＤＮＡ断片が検出された場合、検査対象物には酵母及びカビが存在していると判定される。一方、ＤＮＡ断片が検出されなかった場合、検査対象物には酵母及びカビが存在していないと判定される。
【００４３】
検査対象物中の酵母及びカビを更に精度よく検出する必要がある場合には、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片が酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に由来するものであることを確認してもよい。この確認方法としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を常法により決定し、その塩基配列を公知のＤＮＡデータベースの塩基配列と比較する方法が例示される。
【００４４】
(III)酵母及びカビ検出用キット
本発明の酵母及びカビ検出用キットは、前記する検査対象物中の酵母及びカビの検出方法に用いられるキットであり、上記酵母及びカビ検出用のプライマー対を含有するものである。本発明の酵母及びカビ検出用キットにおいて、上記酵母及びカビ検出用のプライマー対は、プライマー１とプライマー２の混合物であってもよく、またこれらのプライマーが別個に収容されていてもよい。当該酵母及びカビ検出用キットには、上記酵母及びカビ検出用のプライマー対の他に、ＰＣＲやＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を検出するのに必要な試薬類を更に含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００４５】
本発明の酵母及びカビ検出用のプライマーは、植物又は動物の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子や細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子とはハイブリダイズすることなく、幅広い酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に対して特異的にハイブリダイズできる。本発明のプライマーは、ＰＣＲに供されることにより、酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅するが、植物及び動物の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能に増幅しないので、酵母及びカビの検出に有用である。
【００４６】
従って、本発明の酵母及びカビ検出用のプライマー対を使用する、酵母及びカビの検出方法は、酵母及びカビの感染検査の一次スクリーニングとして実用できる。即ち、本発明の検出方法により酵母及びカビの存在が確認された場合には、食品の製造工程や製品に対する適切な措置をより迅速に執ることができる。また、必要に応じて、本発明の酵母及びカビの検出方法に組み合わせて、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の塩基配列解析を行なうことにより、菌種を同定することもできる。
【００４７】
また、食品中の酵母及びカビの検出において、従来の真菌一般を広く検出できるプライマーを使用する場合は、目的真菌以外の混入生物のＤＮＡや食品由来のＤＮＡまで検出されるが、本発明の酵母及びカビ検出用プライマーを用いることにより、食品汚染酵母及びカビを検出できると共に、食品汚染酵母及びカビ以外の混入生物由来のＤＮＡや食品由来のＤＮＡを実質的に検出せずに、高精度での酵母及びカビの検出が行なえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
以下、本発明を実施例をもって詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。
【００４９】
実施例１（食品汚染酵母及びカビ、並びにその他生物由来DNAとの反応性の確認）
下記実験により、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡプライマーと、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡプライマーとのプライマー対（Y18r230）の各生物の由来のＤＮＡに対する反応性を調べた。
１．  プライマーの合成
配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡプライマー、及び配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡプライマーをＤＮＡ合成機により調製した。
【００５０】
２．各種菌株、植物、及び動物由来のＤＮＡの調製
酵母及びカビ由来ＤＮＡの調製
表1に示す各菌株をYPD培地を用いて培養した。なお、これらの酵母及びカビ（糸状菌）は、食品汚染の代表的な原因菌である。培養して得られた酵母については、GenTLE Kit（Takara Bio社製）を用いてＤＮＡ抽出を行なった。また、培養して得られた糸状菌については、培養液にガラスビーズ液を添加し、９９℃程度で１〜１５分間程度加熱した後、冷却し、次いでマルチビーズショッカー等で破砕した後、GenTLE Kitを用いてＤＮＡの抽出を行なった。得られた各ＤＮＡ溶液中のＤＮＡ量を測定し、各酵母及びカビ由来のＤＮＡの濃度を１ng/μLに調節して、被験ＤＮＡ溶液とした。
【００５１】
細菌由来ＤＮＡの調製
表１に示す各細菌株を、それぞれの細菌に適合する培地で培養した。培養して得られた各細菌について、公知の方法（アルカリＳＤＳ法）を用いてＤＮＡ抽出を行なった。得られた各ＤＮＡ溶液中のＤＮＡ量を測定し、各細菌由来のＤＮＡの濃度を２００pg/μL程度に調節して、被験ＤＮＡ溶液とした。
【００５２】
植物由来ＤＮＡの調製
コスモバイオ社から購入したダイズ、トウモロコシ及びコムギのＤＮＡを用いて、被験ＤＮＡ溶液を調製した。ダイズ及びトウモロコシ由来のＤＮＡについては、ＤＮＡ濃度を３ng/μL程度に調節して、被験ＤＮＡ溶液とした。また、コムギ由来のＤＮＡについては、ＤＮＡ濃度を８ng/μL程度に調節して、被験ＤＮＡ溶液とした。また、メロン、ミカン、ブドウ、リンゴ及びキウイから、ISOPLANT II kit（ニッポンジーン社製）を用いてＤＮＡ抽出して、抽出されたＤＮＡ濃度をそれぞれ３ng/μL程度に調節して、被験ＤＮＡ溶液とした。
【００５３】
動物由来ＤＮＡの調製
ヒトMCF-7細胞（大日本製薬社製）からDNeasy Tissue Mini Kit(キアゲン社)を用いてヒトＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡ溶液中のＤＮＡ量を測定し、ＤＮＡの濃度を３ng/μL程度に調節して、被験ＤＮＡ溶液とした。ウシ及びニワトリ由来の精製ＤＮＡはCeMines社から購入し、ブタ由来のＤＮＡはGeneScan社から購入した。ウシ、ニワトリ及びブタ由来のＤＮＡを用いて、各ＤＮＡの濃度３ng/μL程度の被験ＤＮＡ溶液を調製した。
【００５４】
３．ＰＣＲによるＤＮＡ増幅
上記各被験ＤＮＡ溶液１μLをＰＣＲ反応用キットであるTakara Ex TaqTMR-PCR Version （Takara Bio社、Otsu、Japan）の説明書に従って、総量２０μLのＰＣＲ反応液を調製した。即ち、２μLの10×R-PCR Buffer(Mg2+free)、０．１６μLの２５０ｍＭ Mg2+Solution for R-PCR、０．４μLのdNTP Mixture(各１０ｍＭ)、０．２μLのTaKara EX TaqTM R-PCR(5 units/μL)、０．８μLの０．１２５％SYBRTMGreenI (Fmc Bioproducts社、Rockland、USA)、１ μLのDNAプライマー液（配列番号１のＤＮＡプライマー及び配列番号２のＤＮＡプライマーを各々５μＭ含有）及び１６．４４μLの蒸留水を含む１９μLの溶液に、被験ＤＮＡ溶液１μLを加えて総量２０μLにしたＰＣＲ反応液を調製した。
【００５５】
ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は、ロシュ・ダイアグノスティックス社のLightCyclerを用いて次のように行った。即ち、初期変性を９５℃で１分間行なった後、９５℃で５秒間、５４℃で１０秒間、及び７２℃で２０秒間の蛍光測定（PCRによる増幅産物の測定）を1サイクルとして、これを３５サイクル行った。次いで、増幅産物の融解曲線分析のために、９７℃で０秒、６０℃で１０秒後、０．２℃/秒の速度で９７℃まで昇温させると同時に連続的に蛍光測定により各温度に対する増幅産物の二本鎖ＤＮＡ量を測定し、最後に４０℃まで降温させた。
【００５６】
ＰＣＲ終了後、融解曲線解析を同ＰＣＲ装置上のソフトウェアで行い、増幅産物のＴｍ値を求めることで特異的な増幅産物の有無を判定した。さらに、Mupidミニゲル泳動槽（ADVANCE社）を用いて１．８％アガロースゲルによる電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液でゲルを染色して、目的バンドの増幅の有無を確認することにより、増幅ＤＮＡ断片の有無を確認した。
【００５７】
４．結果
得られた結果を表1に示す。表中＋は電気泳動によりバンドが検出されたことを示し、マイナスはバンドが検出されなかったことを示す。表１に示す結果から、配列番号１のプライマーと配列番号２のプライマーとのセットを用いたＰＣＲにより、食品汚染の代表的な原因菌である１９種の酵母及びカビの１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅できることが判明した。また、他の細菌類や、植物、動物に由来するＤＮＡを増幅しないことも判明した。以上の結果から、本発明の酵母及びカビ検出用のプライマー対を使用することにより、食品を初めとする検査対象物から、酵母及びカビを分離培養することなく一度のＰＣＲで酵母及びカビの存在を判定可能であることが明らかとなった。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
参考試験例１
特許文献１に開示されているプライマー対（B2F：5'-ACTTTCGATGGTAGGATAG-3'、及びB4R：5'-TGATCGTCTTCGATCCCCTA-3'）（以下、「プライマー対（B2FB4R）」と記す）によるカビ由来ＤＮＡ及び植物由来ＤＮＡの検出の可否について、検討するため、下記の試験を行った。
【００６０】
上記実施例と同様の方法で、Saccharomyces cerevisiae(NBRC 0282)、Aspergillus niger（ATCC 9642）、Glycine max（ダイズ）、Zea mays（トウモロコシ）、Triticum aestivum（コムギ）、Malus sp.（リンゴ）、Vitis sp.（ブドウ）、及びActinidia sp.(キウイ)由来のＤＮＡを調製した。これらのＤＮＡとプライマー対（B2FB4R）を用いて、上記実施例１と同様の方法で、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行い、増幅ＤＮＡ断片の有無を確認した。
【００６１】
得られたアガロースゲルによる電気泳動パターンを図１に示す。また、参考のために、実施例１において、同一のＤＮＡを使用した場合のアガロースゲルによる電気泳動パターンについても、図１に併せて示す。この結果、特許文献１のプライマー対（B2FB4R）では、植物由来のＤＮＡ（増幅産物は約680bp）を検出してしまうため、食品中の酵母やカビの検出には不適であることが確認された。
【００６２】
実施例２（食品中の酵母及びカビ由来18S rRNA遺伝子の検出）
酵母及びカビに汚染されていないことを前もって確認済みの市販の乳酸菌飲料に、指標菌として酵母Clavispora lusitaniae NBRC 10059株と、糸状菌Talaromyces bacillisporus NBRC 8397株を、それぞれ食品１mL当たり1×101 , 1×102 , 1×103, 1×104 cfu程度となるように添加したもの、及び無添加のものを調製した。
【００６３】
Clavispora lusitaniae NBRC 10059株を添加したサンプルはGenTLE Kit（Takara Bio社製）を用いてＤＮＡ抽出を行なった。一方、Talaromyces bacillisporus NBRC 8397株を添加したサンプルには、ガラスビーズ液を添加し、９９℃程度で１〜１５分程度加熱した後、冷却し、次いでマルチビーズショッカー等で破砕した後、GenTLE Kitを用いてＤＮＡ抽出を行なった。得られた各種ＤＮＡ溶液４μLを試料とし、実施例１と同様の方法でＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルによる電気泳動パターンを図２に示す。
【００６４】
図２の（Ａ）には、Clavispora lusitaniae NBRC 10059株を用いて試験した結果を示す。図２(Ａ)のレーン１及び９はDNA marker（φ×174 Hae III digest, TaKaRa Bio社製）である。レーン２はテンプレートＤＮＡを添加していないNegative controlであり、レーン３はClavispora lusitaniae NBRC 10059株の精製ＤＮＡ ２００pgを使用したPositive controlである。レーン４は、酵母又はカビを添加しなかったサンプルである。またレーン５、６、７及び８は、乳酸菌飲料にClavispora lusitaniae NBRC 10059株をそれぞれ1×101 , 1×102 , 1×103, 1×104 cfu添加したサンプルである。
【００６５】
また、図２の（Ｂ）には、Talaromyces bacillisporus NBRC 8397株を用いて試験した結果を示す。図２(Ｂ)のレーン１及び９はDNA marker（φ×174 Hae III digest, TaKaRa Bio社製）である。レーン２はテンプレートＤＮＡを添加していないNegative controlであり、レーン３はTalaromyces bacillisporus NBRC 8397株の精製ＤＮＡ ２００pgを使用したPositive controlである。レーン４は、酵母又はカビを添加しなかったサンプルである。またレーン５、６、７及び８は、乳酸菌飲料にTalaromyces bacillisporus NBRC 8397株をそれぞれ1×101 , 1×102 , 1×103, 1×104 cfu添加したサンプルである。
【００６６】
図２（Ａ）から明らかなように、乳酸菌飲料１mL当たり１００cfu程度の酵母が存在する場合、前記ＰＣＲ条件で、該酵母由来のＤＮＡを検出できた。また、図１（Ｂ）から分かるように、乳酸菌飲料１ｍＬ当たり１００cfu程度糸状菌が存在する場合、前記ＰＣＲ条件で、該糸状菌由来のＤＮＡを検出可能であった。
【００６７】
実施例３（食品中に微量に存在する酵母由来18S rRNA遺伝子の検出）
酵母及びカビに汚染されていないことを前もって確認済みの市販の乳酸菌飲料と発酵乳に代表的な食品汚染酵母であるClavispora lusitaniae NBRC 10059株を指標菌として、各々食品３００ｍｌ当たり４、７０、４８０cfu程度となるように添加したもの及び、無添加のものを調製した。それぞれ食品重量と等量（３００ｍｌ）のＹＰＤ液体培地（クロラムフェニコール１００μg / mL入り）を加え、２５℃で２０時間、振蘯培養した。
【００６８】
得られた培養液を１．３mL採取し、８０００×ｇで１分間遠心した後、上清を除き、沈殿物を回収した。得られた沈殿物から、GenTLE Kit（Takara Bio社製）を用いＤＮＡ抽出を行なった。得られたＤＮＡ溶液４μLを試料とし、実施例１と同様の方法でＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルによる電気泳動パターンを図３に示す。
【００６９】
図３(A)に乳酸菌飲料の場合の電気泳動パターンを示す。図３(A)のレーン１及び８はDNA marker（φ×174 Hae III digest, TaKaRa Bio社製）である。レーン２はテンプレートＤＮＡを添加していないNegative controlであり、レーン３は酵母を添加せずに２０時間培養したサンプルである。またレーン４はClavispora lusitaniaeNBRC 10059株の精製ＤＮＡを２００pg加えたもの（Positive control）である。レーン５、６及び７は乳酸菌飲料に酵母を添加して２０時間培養したサンプルである。
【００７０】
また、図３(B)に発酵乳の場合の電気泳動パターンを示す。図３（Ｂ）のレーン１及び８はDNA marker（φ×174 Hae III digest, TaKaRa Bio社製）である。レーン２はテンプレートＤＮＡを添加していないNegative controlであり、レーン３は酵母を添加せずに２０時間培養したサンプルである。またレーン４はClavispora lusitaniaeNBRC 10059株の精製ＤＮＡを２００pg加えたもの（Positive control）である。レーン５、６及び７は発酵乳に上記真菌を添加して２０時間培養したサンプルである。
【００７１】
図３（Ａ）に示すように、市販乳酸菌飲料３００mLあたり４cfu程度以上のClavispora lusitaniae NBRC 10059株（指標菌）が存在する場合、ＤＮＡ抽出前の食品中の該真菌を増菌するための培養時間を２０時間以上に設定すれば、前記ＰＣＲ条件によってその真菌ＤＮＡを検出できることが分かった。また、同様に図３（Ｂ）に示すように、発酵乳３００mLあたり４cfu程度以上のClavispora lusitaniae NBRC 10059株（指標菌）が存在する場合、ＤＮＡ抽出前の食品中の該真菌を増菌するための培養時間を２０時間以上に設定すれば、前記ＰＣＲによって、その真菌由来ＤＮＡを検出できることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、参考試験例の結果（電気泳動パターン）を示す図である。図１において、左側のレーン番号１−８には、特許文献１のプライマー対（Ｂ２ＦＢ４Ｒ）を使用した場合の結果が示されており、右側のレーン番号１−８には、本発明のプライマー対（Ｙ１８ｒ２３０）を使用した場合の結果が示されている。なお、図中の矢印の約260bp及び約680bpはPCR産物の大きさを示している。
【図２】図２は、実施例２の結果（電気泳動パターン）を示す図である。（Ａ）は、乳酸菌飲料中に存在する酵母Clavispora lusitaniae NBRC 10059株由来のＤＮＡを検出した結果を示し、（Ｂ）は、乳酸菌飲料中に存在するカビTalaromyces bacillisporus NBRC 8397株由来のＤＮＡを検出した結果を示す。なお、図中の矢印の約260bpはPCR産物の大きさを示している。
【図３】図３は、実施例３の結果（電気泳動パターン）を示す図である。（Ａ）は、乳酸菌飲料中に微量に存在する酵母由来のＤＮＡを検出した結果を示し、（Ｂ）は、発酵乳中に微量に存在する酵母由来のＤＮＡを検出した結果を示す。なお、図中の矢印の約260bpはPCR産物の大きさを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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