(57)【要約】【課題】  ＲＮＡサイレンシングによって発現が抑制された遺伝子がコードするポリペプチドと相同なポリペプチドを発現させる新規遺伝子の発現方法を提供する。【解決手段】  ＲＮＡサイレンシングが誘発される細胞に、そのＲＮＡサイレンシングの標的となる塩基配列と相同な配列を含むサイレンシング遺伝子がコードするポリペプチドと相同なポリペプチドをコードし、かつ、そのＲＮＡサイレンシングによってサイレンシングが起きないように設計したサイレンシング回避配列を含む導入遺伝子を、発現可能に導入する。これにより、これらの処理を施した細胞（生物）は、ＲＮＡサイレンシングによって発現が抑制される遺伝子がコードするポリペプチドと相同なポリペプチドを発現させることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡサイレンシングが誘発される細胞に、
そのＲＮＡサイレンシングの標的となる塩基配列と相同な配列を含むサイレンシング遺伝子がコードするポリペプチドと相同なポリペプチドをコードし、かつ、そのＲＮＡサイレンシングによってサイレンシングが起きないように設計したサイレンシング回避配列を含む導入遺伝子を、発現可能に導入する導入工程を含むことを特徴とする遺伝子発現方法。
【請求項２】
上記サイレンシング回避配列は、サイレンシング遺伝子と相同な配列が、連続して３０塩基未満となるように設計することを特徴とする請求項１に記載の遺伝子発現方法。
【請求項３】
上記サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングを誘発するＲＮＡと相同な配列または相補的な配列を含まないように設計することを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子発現方法。
【請求項４】
上記サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングを誘発するＲＮＡと相同な配列または相補的な配列が、連続して３０塩基未満となるように設計することを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子発現方法。
【請求項５】
上記サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングを誘発する２本鎖ＲＮＡのいずれか一方の配列と相同な配列または相補的な配列が、連続して３０塩基未満となるように設計することを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子発現方法。
【請求項６】
上記サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングを誘発する低分子ＲＮＡと相同な配列または相補的な配列を含まないように設計することを特徴とする請求項１または２のいずれか１項に記載の遺伝子発現方法。
【請求項７】
上記サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングを誘発するｍｉＲＮＡと相同な配列または相補的な配列が、連続して３０塩基未満となるように設計することを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子発現方法。
【請求項８】
上記サイレンシング回避配列は、サイレンシング遺伝子に同義置換が生じるように設計することを特徴とする１または２に記載の遺伝子発現方法。
【請求項９】
上記サイレンシング回避配列は、サイレンシング遺伝子に非同義置換が生じるように設計することを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子発現方法。
【請求項１０】
上記サイレンシング回避配列は、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードするように設計することを特徴とする請求項１または２のいずれか１項に記載の遺伝子発現方法。
（ａ）サイレンシング遺伝子にコードされるポリペプチド。
（ｂ）（ａ）のポリペプチドにおいて、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加したポリペプチド。
【請求項１１】
上記サイレンシング遺伝子は、共通のドメインを有するポリペプチドをコードする複数の遺伝子からなる遺伝子ファミリーであり、
上記ＲＮＡサイレンシングによって、上記遺伝子ファミリーのうちの少なくとも１つの遺伝子の発現が抑制されており、
上記サイレンシング回避配列は、上記発現が抑制された遺伝子ファミリーのうち、少なくとも１つの遺伝子を発現するように設計することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子発現方法。
【請求項１２】
上記導入遺伝子を、上記ＲＮＡサイレンシングの誘発と同時またはそれよりも前に、発現させることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子発現方法。
【請求項１３】
上記導入遺伝子は、上記サイレンシング回避配列に加えて、さらに機能性配列を含むことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子発現方法。
【請求項１４】
上記導入遺伝子を、組織特異的に発現させることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の遺伝子発現方法。
【請求項１５】
上記導入遺伝子を、誘導的に発現させることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の遺伝子発現方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の遺伝子発現方法を用い、被抑制遺伝子または導入遺伝子の機能を解析することを特徴とする解析方法。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の遺伝子発現方法、または、請求項１６に記載の解析方法を実施するためのキットであって、
上記導入工程を行うための試薬を少なくとも備えていることを特徴とするキット。
【請求項１８】
上記導入工程を行うための試薬として、上記サイレンシング回避配列を含む試薬を備えていることを特徴とする請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の遺伝子発現方法を用いることを特徴とする形質転換細胞の生産方法。
【請求項２０】
ＲＮＡサイレンシングによって、そのＲＮＡサイレンシングの標的となる塩基配列と相同な配列を含むサイレンシング遺伝子の発現が抑制されているとともに、
上記サイレンシング遺伝子がコードするポリペプチドと相同なポリペプチドをコードし、かつ、そのＲＮＡサイレンシングによってサイレンシングが起きないように設計したサイレンシング回避配列を含む導入遺伝子が発現していることを特徴とする形質転換細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規遺伝子発現方法およびその利用に関し、より詳細には、標的遺伝子の発現を抑制する一方で、改変遺伝子を発現させる遺伝子発現方法およびその利用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、遺伝子に変異を導入する方法として、突然変異を誘発する方法、生物学的または物理的に遺伝子を導入する方法、および相同組み換え法（ジーンターゲティング）が、行われている。
【０００３】
突然変異を誘発する方法は、物理的な現象、薬剤の投与、放射線または紫外線の照射などにより、遺伝子に突然変異を誘発する方法である。
【０００４】
生物学的または物理的に遺伝子を導入する方法は、例えば、アグロバクテリウム法，およびウィルスベクターなどの生物学的方法、または、遺伝子銃（パーティクルガン），リポ脂質，電子穿孔法（エレクトロポレーション法），およびマイクロインジェクションなどの物理的方法により、外来性の遺伝子を導入する方法である。
【０００５】
相同組換え法（ジーンターゲティング）は、２本鎖ＤＮＡの相同的な塩基配列を持つ部分に起こる相同組み換えを利用して、ゲノム上の特定遺伝子に、変異を生じさせる方法である。この方法では、例えば、高等生物の細胞で、染色体上の遺伝子と外来性の相同遺伝子管の遺伝的組み換えによって、特定の位置に変異を生じさせることができる。
【０００６】
また、近年、遺伝子発現を抑制する技術として、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉまたはＲＮＡ interferenceとも称される）が、注目されている。ＲＮＡ干渉は、細胞内への２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入により、その２本鎖ＲＮＡと相同な配列を持つ標的遺伝子の発現を抑制する方法である。具体的には、ＲＮＡ干渉では、ｄｓＲＮＡの分解により生じるｓｉＲＮＡ（small intermediate RNA)を介した機構によって、標的遺伝子の発現が抑制される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前述の方法は、標的遺伝子に変異を生じさせる方法、外来性の遺伝子を導入する方法、または、内在性の遺伝子の発現を抑制する方法である。このため、標的遺伝子の発現を抑制する一方で、外来性の遺伝子を発現させることはできない。
【０００８】
すなわち、突然変異を誘発する方法では、遺伝子の変異がランダムに生じるため、変異をコントロールすることはできない。このため、標的遺伝子のみに、変異を生じさせることはできない。さらに、標的遺伝子の任意の場所に、任意の変異を導入することはできない。
【０００９】
また、生物学的または物理的に遺伝子を導入する方法は、外来性の遺伝子を導入するための方法であって、生物が発現している遺伝子に変異を生じさせることはできない。
【００１０】
また、相同組換え法を高等動物および高等植物に行うと、相同組換えが起こる効率が、極めて低い。しかも、類似する遺伝子がゲノム上に多数並んで存在する多重遺伝子の場合、相同組換え法では、その多重遺伝子に、完全に変異（特に置換）を生じさせることは困難である。さらに、この方法を多細胞生物に適用する場合、生殖細胞やＥＳ細胞への操作が必須となる。
【００１１】
さらに、ＲＮＡ干渉は、内在性の遺伝子の発現を抑制することはできるが、生存に必須な遺伝子の発現を抑制することは出来ない。生存に必須な遺伝子の発現を抑制すると、生物は生きていくことはできなくなる。また、ＲＮＡ干渉では、ｓｉＲＮＡにより標的遺伝子の発現が抑制される。このため、サイレンシングしている標的遺伝子と同じ遺伝子、あるいは、標的遺伝子の一部を改変した改変遺伝子を導入したとしても、ｓｉＲＮＡと相同な配列をもつｍＲＮＡが、ｓｉＲＮＡを介した機構によるサイレンシング機構により認識される。その結果、サイレンシングしている標的遺伝子と同じ遺伝子、または、改変遺伝子を導入したとしても、それらの遺伝子は分解されるため、導入した遺伝子を発現させることはできない。
【００１２】
このように、従来、標的遺伝子の発現を特異的に抑制し、かつ、外来性の遺伝子を発現させる方法は、見出されていない。
【００１３】
本発明の目的は、ＲＮＡサイレンシングによって発現が抑制された遺伝子がコードするポリペプチドと相同なポリペプチドを発現させる新規遺伝子の発現方法およびその利用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明にかかる遺伝子発現方法は、上記の課題を解決するために、ＲＮＡサイレンシングが誘発される細胞に、そのＲＮＡサイレンシングの標的となる塩基配列と相同な配列を含むサイレンシング遺伝子がコードするポリペプチドと相同なポリペプチドをコードし、かつ、そのＲＮＡサイレンシングによってサイレンシングが起きないように設計したサイレンシング回避配列を含む導入遺伝子を、発現可能に導入する導入工程を含むことを特徴としている。
【００１５】
上記の構成によれば、サイレンシング回避配列は、サイレンシング遺伝子と相同なポリペプチドをコードし、かつ、サイレンシング遺伝子のＲＮＡサイレンシングによってサイレンシングを受けないように設計されている。それゆえ、ＲＮＡサイレンシングによって発現が抑制されたサイレンシング遺伝子がコードするポリペプチドと相同なポリペプチドを、発現させることができる。
【００１６】
一般的に、ＲＮＡサイレンシングは、単一の遺伝子の発現だけでなく、標的配列を含む複数の遺伝子の発現を抑制しうる。サイレンシング遺伝子には、そのような複数の遺伝子が含まれる。つまり、ＲＮＡサイレンシングでは、複数の遺伝子の発現を抑制することができ、これら複数の遺伝子がコードする複数種類のポリペプチドの発現を抑制することができる。
【００１７】
上記遺伝子発現方法では、これら複数種類のポリペプチドをコードする複数のサイレンシング遺伝子から、任意に選択したサイレンシング遺伝子（標的とするサイレンシング遺伝子）に基づき、サイレンシング回避配列を設計する。この場合、複数種類のポリペプチドをコードする複数のサイレンシング遺伝子を選択して、それぞれのサイレンシング遺伝子と同じポリペプチドをコードするように、サイレンシング回避配列を設計することもできる。そして、このように設計したサイレンシング回避配列を含む導入遺伝子を発現させる。これにより、任意に選択した少なくとも１つのサイレンシング遺伝子（標的遺伝子）と相同なポリペプチドを、発現させることができる。すなわち、選択した複数のサイレンシング遺伝子と相同な複数種類のポリペプチドを、発現させることもできる。
【００１８】
上記遺伝子発現方法では、以下ようにして、サイレンシング回避配列を設計することができる。
【００１９】
（Ａ）上記サイレンシング回避配列は、サイレンシング遺伝子と相同な配列が、連続して３０塩基未満となるように設計する。
【００２０】
（Ｂ）上記サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングを誘発するＲＮＡと相同な配列または相補的な配列を含まないように設計する。
【００２１】
（Ｃ）上記サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングを誘発するＲＮＡと相同な配列または相補的な配列が、連続して３０塩基未満となるように設計する。
【００２２】
（Ｄ）上記サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングを誘発する２本鎖ＲＮＡのいずれか一方の配列と相同な配列または相補的な配列が、連続して３０塩基未満となるように設計する。
【００２３】
（Ｅ）上記サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングを誘発する低分子ＲＮＡと相同な配列または相補的な配列を含まないように設計する。すなわち、ＲＮＡサイレンシングを誘発する低分子ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡである。
【００２４】
（Ｆ）上記サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングを誘発するｍｉＲＮＡと相同な配列または相補的な配列が、連続して３０塩基未満となるように設計する。すなわち、上記ＲＮＡサイレンシングを誘発するＲＮＡが、ｍｉＲＮＡである。
【００２５】
（Ｇ）上記サイレンシング回避配列は、サイレンシング遺伝子に同義置換が生じるように設計することもできる。
【００２６】
（Ｈ）上記サイレンシング回避配列は、サイレンシング遺伝子に非同義置換が生じるように設計することもできる。
【００２７】
（Ｉ）上記サイレンシング回避配列は、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードするように設計することもできる。
（ａ）サイレンシング遺伝子にコードされるポリペプチド。
（ｂ）（ａ）のポリペプチドにおいて、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加したポリペプチド。
【００２８】
上記（Ａ）〜（Ｆ）によれば、サイレンシング回避配列が、サイレンシング遺伝子のサイレンシングによってサイレンシングを受けないようにすることができる。
【００２９】
上記（Ｇ）〜（Ｉ）によれば、サイレンシング遺伝子と相同なポリペプチド、または、そのポリペプチドの変異ポリペプチドを発現させることができる。
【００３０】
なお、（Ａ）〜（Ｉ）のサイレンシング遺伝子の設計は、少なくとも１つの方法で行えばよく、それらを組み合せて行ってもよい。
【００３１】
上記遺伝子発現方法では、上記サイレンシング遺伝子は、共通のドメインを有するポリペプチドをコードする複数の遺伝子からなる遺伝子ファミリーであり、上記ＲＮＡサイレンシングによって、上記遺伝子ファミリーのうちの少なくとも１つの遺伝子の発現が抑制されており、上記サイレンシング回避配列は、上記発現が抑制された遺伝子ファミリーのうち、少なくとも１つの遺伝子を発現するように設計することもできる。
【００３２】
上記の構成によれば、上記遺伝子発現方法は、ＲＮＡサイレンシングによって発現が抑制された遺伝子ファミリーであっても、サイレンシング回避配列を含む導入遺伝子によって、発現させることができる。
【００３３】
上記遺伝子発現方法では、上記導入遺伝子を、上記ＲＮＡサイレンシングの誘発と同時またはそれよりも前に、発現させてもよい。
【００３４】
上記の構成によれば、ＲＮＡサイレンシングの誘発する前に、サイレンシング回避配列を含む導入遺伝子を発現させている。これにより、対象生物（細胞）を死なせることなく、生存に必須なサイレンシング遺伝子の発現を抑制し、サイレンシング回避遺伝子を発現させることができる。
【００３５】
上記遺伝子発現方法では、上記導入遺伝子は、上記サイレンシング回避配列に加えて、さらに機能性配列を含んでいてもよい。
【００３６】
上記の構成によれば、導入遺伝子は、機能性配列を含んでいるため、導入遺伝子に任意の機能を付与することができる。例えば、任意の機能を有するペプチドをコードする機能性配列を用いることによって、サイレンシング回避配列がコードするポリペプチドと、その機能性配列がコードするポリペプチドとを結合した融合ポリペプチド（融合タンパク質）を発現させることができる。
【００３７】
上記遺伝子発現方法では、上記導入遺伝子を、組織特異的に発現してもよい。これにより、特定の組織（細胞）にのみ、導入遺伝子を発現させることができる。
【００３８】
上記遺伝子発現方法では、上記導入遺伝子を、誘導的に発現させてもよい。これにより、導入遺伝子の発現時期および発現量を制御することができる。
【００３９】
また、本発明にかかる解析方法は、前記いずれかの遺伝子発現方法を用い、被抑制遺伝子または導入遺伝子の機能を解析することを特徴としている。これにより、例えば、被抑制遺伝子および導入遺伝子のそれぞれ、または、両方の遺伝子産物の解析が可能である。
【００４０】
また、本発明にかかるキットは、前記いずれかの遺伝子発現方法、または、解析方法を実施するためのキットであって、上記導入工程を行うための試薬を少なくとも備えていることを特徴としている。また、上記導入工程を行うための試薬としては、例えば、上記サイレンシング回避配列を含む試薬を挙げることができる。
【００４１】
これにより、本発明にかかる遺伝子発現方法、または、解析方法を、汎用的に実施することができる。
【００４２】
本発明にかかる形質転換細胞の生産方法は、上記遺伝子発現方法のいずれかを用いることを特徴としている。また、本発明にかかる形質転換細胞は、ＲＮＡサイレンシングによって、そのＲＮＡサイレンシングの標的となる塩基配列と相同な配列を含むサイレンシング遺伝子の発現が抑制されたとともに、上記サイレンシング遺伝子がコードするポリペプチドと相同なポリペプチドをコードし、かつ、そのＲＮＡサイレンシングによってサイレンシングが起きないように設計したサイレンシング回避配列を含む導入遺伝子が発現していることを特徴とするものである。
【００４３】
これにより、ＲＮＡサイレンシングによってサイレンシングを受けたサイレンシング遺伝子にコードされるポリペプチドを、サイレンシング回避配列を含む導入遺伝子によって発現した形質転換細胞を提供することができる。
【発明の効果】
【００４４】
本発明にかかる遺伝子発現方法によれば、サイレンシング回避配列を含む導入遺伝子を発現させることによって、ＲＮＡサイレンシングによって発現を抑制される遺伝子がコードするポリペプチドと相同なポリペプチドを、発現させるさせることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明の実施の形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００４６】
本発明にかかる遺伝子発現方法は、この方法を適用した生物（細胞）に対し、発現が抑制されたサイレンシング遺伝子にコードされるポリペプチドを、サイレンシング回避配列によって発現させる方法である。なお、「ポリペプチド」とは、「ペプチド」または「タンパク質」を示す。
【００４７】
上記遺伝子発現方法は、ＲＮＡサイレンシング機構をもつ全ての生物に対して適用することができる。例えば、植物、菌類、線虫、昆虫、およびマウスやヒトを含む哺乳動物、並びに、魚、鳥を含むセキツイ動物に適用することができる。これにより、ＲＮＡサイレンシング機構を持つ全ての生物に対して、１つの細胞、胚、成長した個体の細胞、組織、または全身など、どこかの細胞で発現しているサイレンシング遺伝子の発現を抑制し、サイレンシング回避配列を含む導入遺伝子を発現させることができる。このため、サイレンシング遺伝子の発現パターン（サイレンシング遺伝子にコードされるポリペプチドの発現パターン）を、任意に変化させることができる。
【００４８】
上記遺伝子発現方法の実施対象となる細胞は、ＲＮＡサイレンシングによって発現が抑制されたサイレンシング遺伝子を含んでいる。このサイレンシング遺伝子は、ＲＮＡサイレンシングの標的となる配列（標的配列）を含んでいる。このため、この細胞は、サイレンシング遺伝子の遺伝子産物を発現していない。
【００４９】
上記遺伝子発現方法は、このようなＲＮＡサイレンシングによって発現が抑制されたサイレンシング遺伝子の遺伝子産物を発現させる方法である。すなわち、上記遺伝子発現方法の最大の特徴は、このような発現が抑制されたサイレンシング遺伝子の遺伝子産物を、サイレンシング回避配列を含む導入遺伝子によって、発現させることである。
【００５０】
上記「ＲＮＡサイレンシング」とは、ＲＮＡ干渉、コサプレッション（共抑制）、ＶＩＧＳなどを含むＰＴＧＳ（posttranscriptional gene silencing）として知られるものを示す。また、このＲＮＡサイレンシングは、内在的に誘発されたものも、人為的に誘発したものも含む。
【００５１】
上記「サイレンシング遺伝子」とは、ＲＮＡサイレンシングの標的となる塩基配列と相同な配列を含む遺伝子である。サイレンシング遺伝子は、人為的に誘発されたRNAサイレンシングによりその発現が抑制されている遺伝子と、内在性のRNAサイレンシングにより、その発現が抑制されている遺伝子とを含む。ＲＮＡサイレンシングを誘発する塩基配列が分かれば、その塩基配列を標的としてＲＮＡサイレンシングを人為的に誘発することができるため、サイレンシング遺伝子は、特に限定されるものではない。
【００５２】
上記サイレンシング遺伝子としては、例えば、RNAサイレンシングの標的となるｍRNAをコードする遺伝子，ＲＮＡサイレンシングを誘発するsiRNAと相同な配列を含む遺伝子などを挙げることができる。なお、これらのサイレンシング遺伝子の配列が分かっていれば、塩基配列が既知の遺伝子であれば、その遺伝子のコードするｍRNA内部の塩基配列を標的としたRNAサイレンシングを人為的に誘発することができるので、実際上は特に限定されない。
【００５３】
なお、一般的に、ＲＮＡサイレンシングは、単一の遺伝子の発現だけでなく、複数の遺伝子の発現を抑制しうるため、サイレンシング遺伝子には、そのような複数の遺伝子を示している。
【００５４】
一方、「サイレンシング回避配列」とは、複数のサイレンシング遺伝子の中から任意に選択したサイレンシング遺伝子について、その選択したサイレンシング遺伝子のコードするポリペプチドと相同なポリペプチドをコードし、かつ、そのサイレンシング遺伝子のRNAサイレンシングの標的となる塩基配列（標的配列）を含まないポリヌクレオチドである。つまり、サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングによって発現が抑制された細胞に、そのＲＮＡサイレンシングによって発現が抑制された遺伝子を発現させるためのものである。
【００５５】
このため、上記サイレンシング回避遺伝子は、サイレンシング遺伝子がコードするポリペプチドと相同なポリペプチドをコードするように設計し、かつ、サイレンシング遺伝子のＲＮＡサイレンシングによってサイレンシングを受けないように設計する。これにより、ＲＮＡサイレンシングによってサイレンシングを受けることなく、サイレンシング回避配列を含む導入遺伝子を、発現させることができる。
【００５６】
〔サイレンシング遺伝子の設計方法〕
上記遺伝子発現方法において、サイレンシング回避配列を設計する方法は、ＲＮＡサイレンシングの標的となる塩基配列と相同な配列を含むサイレンシング遺伝子がコードするポリペプチドと相同なポリペプチドをコードし、かつ、そのＲＮＡサイレンシングによってサイレンシングが起きないように設計するものであれば、特に限定されるものではない。
【００５７】
言い換えれば、サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングの標的となる塩基配列を発現しないように、設計すればよい。例えば、ＲＮＡサイレンシングを誘発するsiRNAと相同な配列を持つ塩基配列；ＲＮＡサイレンシング誘発するsiRNAと相補的なｍＲＮＡを転写するような配列を持つ塩基配列；ＲＮＡサイレンシングを誘発するsiRNAまたはmiRNAと相補的な配列を持つmRNAを転写するような塩基配列；またはＲＮＡサイレンシングを誘発するdsRNAと相同な配列を持つ塩基配列を、発現しないように設計すればよい。
【００５８】
サイレンシング回避配列は、例えば、以下のようにして設計することができる。
【００５９】
（Ａ）上記サイレンシング回避配列は、サイレンシング遺伝子と相同な配列が、連続して３０塩基未満となるように設計する。
【００６０】
（Ｂ）上記サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングを誘発するＲＮＡと相同な配列または相補的な配列を含まないように設計する。
【００６１】
（Ｃ）上記サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングを誘発するＲＮＡと相同な配列または相補的な配列が、連続して３０塩基未満となるように設計する。
【００６２】
（Ｄ）上記サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングを誘発する２本鎖ＲＮＡのいずれか一方の配列と相同な配列または相補的な配列が、連続して３０塩基未満となるように設計する。
【００６３】
（Ｅ）上記サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングを誘発する低分子ＲＮＡと相同な配列または相補的な配列を含まないように設計する。
【００６４】
（Ｆ）上記サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングを誘発するｍｉＲＮＡと相同な配列または相補的な配列が、連続して３０塩基未満となるように設計する。
【００６５】
（Ｇ）上記サイレンシング回避配列は、サイレンシング遺伝子に同義置換が生じるように設計する。この場合、コドンの第3塩基を改変することが好ましい。
【００６６】
（Ｈ）上記サイレンシング回避配列は、サイレンシング遺伝子に非同義置換が生じるように設計する。
【００６７】
（Ｉ）上記サイレンシング回避配列は、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードするように設計する。
【００６８】
（ａ）サイレンシング遺伝子にコードされるポリペプチド。
【００６９】
（ｂ）（ａ）のポリペプチドにおいて、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加したポリペプチド。
【００７０】
上記（Ａ）〜（Ｆ）によれば、サイレンシング回避配列が、サイレンシング遺伝子のサイレンシングによってサイレンシングを受けないようにすることができる。
【００７１】
上記（Ｇ）〜（Ｉ）によれば、サイレンシング遺伝子と相同なポリペプチド、または、そのポリペプチドの変異ポリペプチドを発現させることができる。
【００７２】
なお、（Ａ）〜（Ｉ）のサイレンシング遺伝子の設計は、少なくとも１つの方法で行えばよく、それらを組み合せて行ってもよい。
【００７３】
また、サイレンシング回避配列は、以下のように設計することもできる。
【００７４】
動物または動物細胞の場合、サイレンシング遺伝子のＲＮＡサイレンシングの標的となる塩基配列と相同な配列を含む領域から、5’末端側の領域にコードされるポリペプチドをコードする遺伝子、すなわち5’末端側ポリペプチド遺伝子のサイレンシング回避配列を含む配列を、サイレンシング遺伝子のサイレンシング回避配列として用いてもよい。例えば、siRNAを動物（動物細胞）に導入してサイレンシング遺伝子のＲＮＡサイレンシングを誘発した場合、siRNAと相同な領域から5’末端側にコードされるポリペプチドをコードする遺伝子のサイレンシング回避配列を含む配列を、サイレンシング回避配列として用いることができる。これは、動物細胞のサイレンシング遺伝子においてＲＮＡサイレンシングの標的となる塩基配列（標的配列）は、当該遺伝子のＲＮＡサイレンシングが誘発される際に標的とされる領域から3’末端側には存在しないからである。
【００７５】
また、上記（Ｅ）において、サイレンシング回避配列は、サイレンシング遺伝子に対するＲＮＡサイレンシングが誘発されている生物または細胞に含まれる16から25塩基長の低分子ＲＮＡと相同な配列を含まないように設計してもよい。具体的には、ＲＮＡサイレンシングが誘導されている生物または細胞から16から25塩基長の低分子ＲＮＡを抽出・分離し、それらの塩基配列を決定し、それらの配列に相同な配列を含まず、かつ、サイレンシング遺伝子のコードするポリペプチドと相同なポリペプチドをコードするようにポリヌクレオチドを設計し、合成したものをサイレンシング回避配列として用いる。上記の低分子ＲＮＡがサイレンシング遺伝子と相同な配列を有する場合、その低分子ＲＮＡの配列に相同な配列は、ＲＮＡサイレンシングの標的配列であり、これらの低分子ＲＮＡがサイレンシング遺伝子から転写されたｍＲＮＡと2本鎖を形成することによりＲＮＡサイレンシングが誘発されると考えられる。したがって、これらの配列を含まないようにポリヌクレオチドを設計することで、ＲＮＡサイレンシングの標的となる塩基配列が含まれないようにすることができる。すなわち、16から25塩基長の低分子ＲＮＡと相同な塩基配列を含まないように設計することで、サイレンシングによる遺伝子発現の抑制を回避することができる。16から25塩基長の低分子ＲＮＡの塩基配列を決定するには、公知の方法を用いればよい。例えば、文献（The Plant Cell, 14, 1605-1619）では、シロイヌナズナで発現している低分子ＲＮＡの塩基配列が決定されているが、例えば、これと同様な方法によって、低分子ＲＮＡの配列を決定することができる。すなわち、低分子ＲＮＡのｃＤＮＡを合成し、これをクローニングベクターに連結した後、その塩基配列を決定する方法である。
【００７６】
サイレンシング回避配列は、例えば、以下に示すサイレンシング回避配列選抜工程によって、選抜することができる。
【００７７】
サイレンシング回避配列（サイレンシング回避遺伝子）は、サイレンシング回避配列選抜工程によって選抜することができる。
【００７８】
まず、サイレンシング遺伝子のコードするポリペプチドの全部または一部をコードする縮重（ディジェネレート）ポリヌクレオチドを設計し合成する。ここで、「縮重ポリヌクレオチド」とは、上記ポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド配列が複数存在する場合、それらのすべて、あるいは、一部を含むようなポリヌクレオチドの混合物である。具体的には、上記ポリペプチドのアミノ酸配列に基づき、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを設計する際、特定のアミノ酸に対して複数のコドンが対応している場合には、それぞれのコドンを含むようなポリヌクレオチドを設計し、それらの混合物を合成する。縮重ポリヌクレオチドにはRNAサイレンシングの標的となる塩基配列を含むポリヌクレオチドとサイレンシング回避配列が含まれる。
【００７９】
次に、生物あるいは細胞で、縮重遺伝子を発現させる。ここで「縮重遺伝子」とは、縮重ポリヌクレオチドを含む遺伝子の混合物をいう。すなわち、縮重遺伝子とは、縮重ポリヌクレオチドに含まれるポリヌクレオチドを少なくとも１つ含む遺伝子の混合物である。縮重遺伝子は、縮重ポリヌクレオチドを用いてもよく、縮重ポリヌクレオチドの5’末端および／または3’末端に任意の配列を付加しても良い。縮重ポリヌクレオチドにはRNAサイレンシングの標的となる塩基配列を含むポリヌクレオチドとサイレンシング回避配列が含まれているので、縮重遺伝子は、サイレンシング遺伝子群とサイレンシング回避遺伝子群を含む混合物である。縮重遺伝子を発現させるためには、縮重遺伝子を生物あるいは細胞に発現可能に導入すればよい。導入には公知の手法が利用できるが、例えば、縮重遺伝子に適当なプライマーとターミネーターを連結したベクターを作製し、生物あるいは細胞に発現可能に導入できる。また、縮重遺伝子を発現可能に組み込んだウイルスベクターを作製し、生物あるいは細胞に導入しても良い。特に、縮重遺伝子をRNAウイルスベクターに組み込み、生物あるいは細胞に感染させることが好ましい。この場合、縮重遺伝子を組み込んだＲＮＡウイルスベクターとは、縮重遺伝子に含まれる遺伝子配列の少なくとも１つを含むウイルスベクターの混合物である。縮重遺伝子を組み込んだウイルスベクター混合物を感染可能に生物（細胞）に導入するには、該ウイルスベクター混合物をin vitroで合成して感染させてもよく、該ウイルスベクター混合物を発現可能なベクターに組み込んで感染可能に生物（細胞）に導入してもよい。該ウイルスベクターがRNAウイルスベクターである場合、該RNAウイルスベクターを感染可能に生物（植物）に導入する場合には、縮重遺伝子は発現可能であってもよいし、発現可能でなくてもよい。
【００８０】
次に、縮重遺伝子に含まれるサイレンシング遺伝子の発現を、サイレンシング遺伝子を標的としたRNAサイレンシングにより抑制する。サイレンシング遺伝子に対するRNAサイレンシングを誘発するには、前述した公知の手法を用いることができる。RNAサイレンシングの誘発は、縮重遺伝子を導入する前に行っても良いし、後に行っても良いが、RNAサイレンシングが誘発されている生物（細胞）に縮重遺伝子を導入することがより好ましい。      
【００８１】
これにより、縮重遺伝子に含まれるサイレンシング遺伝子群由来のｍRNAが速やかに分解されることによりサイレンシング遺伝子群の発現が抑制され、サイレンシング回避遺伝子群のみが発現することから、この後に行うサイレンシング回避遺伝子の回収が容易になる。縮重遺伝子をRNAウイルスベクターに組み込んだ混合ウイルスベクターを生物（細胞）に感染可能な形で導入する場合も、RNAサイレンシングの誘発は、該ウイルスベクター混合物を導入する前に行っても良いし、後に行っても良いが、RNAサイレンシングが誘発されている生物（細胞）に該ウイルスベクター混合物を導入することがより好ましい。
【００８２】
次に、縮重遺伝子が発現し、かつ、サイレンシング遺伝子に対するRNAサイレンシングが誘発されている生物（細胞）において発現しているサイレンシング回避遺伝子から、サイレンシング回避配列を回収し、選抜する。上記生物（細胞）では、縮重遺伝子から転写されるｍRNA群のうち、サイレンシング遺伝子群から転写されるｍRNAはRNAサイレンシング機構によって分解されているが、サイレンシング回避遺伝子群から転写されるｍRNAは分解されていない。換言すれば、縮重遺伝子のうちRNAサイレンシング機構によって発現が抑制されない遺伝子がサイレンシング回避遺伝子である。したがって、縮重遺伝子に含まれる遺伝子のうち、上記生物（細胞）で発現されている遺伝子群を同定することで、サイレンシング回避遺伝子群を同定することができ、さらにサイレンシング回避遺伝子に含まれるサイレンシング回避配列群を同定し、それらの塩基配列を決定することができる。上記生物（または細胞）で発現しているサイレンシング回避遺伝子群を同定し、その塩基配列を決定するには、公知の手法を用いることができる。例えば、RT−PCR法により、サイレンシング回避遺伝子群から転写されているｍRNAのｃDNAを合成し、クローニングベクターに組み込んでそれぞれの塩基配列を決定できる。縮重遺伝子を含むRNAウイルスベクターが感染しており、かつサイレンシング遺伝子に対するRNAサイレンシングが誘発されている生物（細胞）においては、サイレンシング遺伝子を含むウイルスベクターRNAは分解されるが、サイレンシング回避遺伝子を含むウイルスベクターRNAは分解されず複製する。換言すれば、縮重遺伝子を含むRNAウイルスベクターのうち、上記生物（または細胞）に感染しているRNAウイルスベクターは、サイレンシング回避遺伝子を含んでいる。サイレンシング回避遺伝子を含むRNAウイルスベクターからサイレンシング回避遺伝子を回収し、その塩基配列を決定するには、公知の手法を用いることができる。例えば、上記生物（細胞）に感染し増殖しているRNAウイルスを回収し、そのゲノムまたはサブゲノムRNAのｃDNAを合成し、クローニングベクターに組み込んで塩基配列を決定できる。回収したRNAウイルスベクターを再びサイレンシング遺伝子に対するRNAサイレンシングが誘発されている生物（細胞）に接種し、増殖したRNAウイルスベクターに含まれるサイレンシング回避遺伝子を回収し、その塩基配列を決定し、サイレンシング回避配列を決定しても良い。これにより、よりサイレンシング回避能力の高いサイレンシング回避遺伝子、またはサイレンシング回避配列を選抜することができる。
【００８３】
以下、ＲＮＡ干渉によりＲＮＡサイレンシングを誘発し、ＲＮＡサイレンシングにより発現が抑制されるサイレンシング遺伝子のコードするポリペプチドと相同なポリペプチドを、このようにして設計したサイレンシング回避配列を含む導入遺伝子により発現させた場合を例に挙げて説明する。
【００８４】
この場合、上記遺伝子発現方法は、ＲＮＡ干渉を誘発した細胞に、そのＲＮＡ干渉の標的となる塩基配列と相同な配列を含むサイレンシング遺伝子がコードするポリペプチドと相同なポリペプチドをコードし、かつ、そのＲＮＡ干渉によってサイレンシングが起きないように設計したサイレンシング回避配列を含む導入遺伝子を、発現可能に導入する導入工程を含んでいる。
【００８５】
ここで、「ＲＮＡ干渉」とは、人為的な処理により誘導したＲＮＡサイレンシングのみならず、細胞が本来有する内在性のＲＮＡサイレンシングも含むものとする。
【００８６】
上記遺伝子発現方法において、人為的にＲＮＡサイレンシングを誘導する場合、そのＲＮＡ干渉によるＲＮＡサイレンシングの誘発が必要となる。すなわち、この場合、上記導入工程は、ＲＮＡサイレンシングを誘発する工程を含むことになる。そして、導入工程は、人為的に誘導したＲＮＡサイレンシングにより発現が抑制されないように、上記サイレンシング回避配列含む導入遺伝子を細胞に発現可能に導入する工程となる。
【００８７】
以下では、ＲＮＡサイレンシングを誘発する工程と導入工程とを含む遺伝子発現法について、詳細に説明する。
【００８８】
（ａ）ＲＮＡサイレンシングを誘発する工程
上記ＲＮＡサイレンシングを誘発する工程では、この方法を適用する生物（細胞）に対し、ＲＮＡ干渉により、ＲＮＡサイレンシングを誘発する。これにより、ＲＮＡ干渉の標的となる塩基配列と相同な配列を含むサイレンシング遺伝子の発現を、人為的に抑制する。ここで、「サイレンシング遺伝子の発現を抑制」とは、少なくとも一部のサイレンシング遺伝子の機能レベル（またはその遺伝子産物）の減少を示し、サイレンシング遺伝子の機能（またはその遺伝子産物）が欠失するものであってもよい。具体的には、例えば、サイレンシング遺伝子に由来するタンパク質及び／又はｍＲＮＡの消失、サイレンシング遺伝子からｍＲＮＡの転写阻害、又はそれらのレベルの減少を示す。
【００８９】
サイレンシング遺伝子のＲＮＡサイレンシングを誘発するには、公知の手法を用いることができる。例えば、ＲＮＡ干渉法を好適に用いることができる。ＲＮＡ干渉法では、サイレンシング遺伝子のエクソン配列を含むヘアピン型ＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ（サイレンシング遺伝子のセンス鎖とアンチセンス鎖が二本鎖を形成したＲＮＡ）がＤｉｃｅｒ（ダイサー）と呼ばれるタンパク質により切断され、ｓｉＲＮＡが形成される。このｓｉＲＮＡがＡＴＰヘリカーゼにより１本鎖に解離し、各々が中間複合体（ＲＩＳＣ：RNA-induced Silencing Complex）を形成する。そして、このＲＩＳＣが、サイレンシング遺伝子から転写されたｍＲＮＡを特異的にし、そのｍＲＮＡが分解され、標的遺伝子にコードされるタンパク質の合成が阻害される。従って、ＲＮＡサイレンシングを誘発するには、例えば、対象生物に、サイレンシング遺伝子の一部に相同な、あるいは相補的な配列を含むヘアピン型ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（通常、エクソン部分を含む）、または、ｓｉＲＮＡを導入すればよい。具体的には、上記ヘアピン型ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現するようなベクターを、対象生物に発現可能に導入すればよい。また、上記ヘアピン型ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを投与してもよい。
【００９０】
また、ＲＮＡサイレンシングを誘発するには、サイレンシング遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖を発現可能に導入してもよい。また、標的遺伝子をコードするウィルスベクター（例えば、ＲＮＡウィルスベクター）を複製可能に導入してもよい。これにより、サイレンシング遺伝子のＲＮＡサイレンシングを誘発することができる。
【００９１】
なお、一般に、ＲＮＡサイレンシングの誘発に用いられるｄｓＲＮＡの長さは、２００塩基程度である。また、ＲＮＡサイレンシングでは、１９〜３０塩基程度のｓｉＲＮＡが、標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡと二本鎖形成をすることでＲＮＡサイレンシング経路が活性化し、標的遺伝子の発現を抑制するとされている。従来、ｓｉＲＮＡの長さは、１９〜２４塩基程度であるとされてきた。しかし、最近では、ｓｉＲＮＡの長さは、生物によって異なることが指摘されている。例えば、線虫では１９−２４塩基程度のｓｉＲＮＡが有効とされているが、ヒトでは２５−３０塩基程度のｓｉＲＮＡが有効であるとされている。これは、１９−２４塩基のｓｉＲＮＡがＲＩＳＣ複合体に認識される配列であることはヒトでも変わりはないが、ＲＩＳＣ複合体が、ダイサーによって１９−２４塩基に切断されたｓｉＲＮＡを直接認識するのではなく、ダイサーがまずｄｓＲＮＡを認識し、そのｄｓＲＮＡを切断しながら生じたｓｉＲＮＡをＲＩＳＣ複合体に受け渡すことがあるためであると考えられている。このため、ｓｉＲＮＡの長さは、対象生物（細胞）によって、設定することが好ましい。これにより、効率的に標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【００９２】
なお、上記ＲＮＡサイレンシングでは、サイレンシング遺伝子の発現を抑制する程度は、特に限定されるものではない。すなわち、サイレンシング遺伝子の発現を少しでも抑制すればよく、その発現を完全に抑制してもよい。
【００９３】
この場合、上記「サイレンシング遺伝子」は、上記遺伝子発現方法を適用する生物内（細胞内）で発現している遺伝子であって、その発現を抑制すべき遺伝子である。上記サイレンシング遺伝子は、その塩基配列がわかっていれば、どのような遺伝子であってもよい。
【００９４】
また、上記ＲＮＡサイレンシングの誘発によって発現が抑制される遺伝子は、上記遺伝子発現方法を適用する生物が本来有している内在性の遺伝子であってもよいし、外来性の導入遺伝子（トランスジーン）であってもよい。また、上記サイレンシング遺伝子は、相同なポリペプチドをコードする複数の内在性遺伝子を含む場合がある。また、相同な塩基配列を含む複数の内在性遺伝子を含む場合がある。サイレンシング遺伝子が複数の内在性遺伝子を含む場合としては、例えば、共通のドメインを有するポリペプチドをコードする複数の遺伝子からなる遺伝子ファミリーを挙げることができる。
【００９５】
サイレンシング遺伝子が、遺伝子ファミリーに属する複数の遺伝子を含む場合、サイレンシング遺伝子を標的としたＲＮＡサイレンシングによって、それら複数の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子の発現を抑制してもよく、または、全ての遺伝子の発現を抑制してもよい。
【００９６】
サイレンシング遺伝子は、内在性の機構により誘発されたＲＮＡサイレンシングにより、発現が抑制される遺伝子も含む。内在性の機構により誘発されるＲＮＡサイレンシングとしては、例えば、miRNAによって誘発されるＲＮＡサイレンシングを挙げることができる。
【００９７】
サイレンシング遺伝子は、野生型遺伝子を含んでもよく、また、変異遺伝子を含んでもよい。すなわち、サイレンシング遺伝子は、野生型ポリペプチドをコードする遺伝子と変異ポリペプチドをコードする遺伝子を含む。サイレンシング遺伝子が野生型遺伝子である場合は、変異ポリペプチドをコードする導入遺伝子を導入することで、野生型遺伝子の発現抑制とは独立して、変異ポリペプチドを発現させることができる。サイレンシング遺伝子が変異ポリペプチドをコードしている場合には，野生系ポリペプチドをコードする導入遺伝子を発現させることで、変異ポリペプチドの影響をうけることなく、野生系ポリペプチドを発現させることができる。
【００９８】
なお、ＲＮＡサイレンシングを誘発する工程では、サイレンシング遺伝子の発現を、一時的に抑制してもよく、恒常的に抑制してもよい。サイレンシング遺伝子の発現を恒常的に抑制する方法としては、例えば、サイレンシングを誘発するＲＮＡを恒常的に発現可能に生物に導入すれば良い。これにより、サイレンシング遺伝子の発現を恒常的に抑制した状態で、導入遺伝子を発現させることができる。
【００９９】
（ｂ）導入工程
導入工程では、前述のようにして設計したサイレンシング回避配列を含む導入遺伝子を、ＲＮＡサイレンシングを誘発した細胞に導入する工程である。すなわち、導入工程は、導入遺伝子を発現させる工程である。
【０１００】
上記サイレンシング回避配列を含む導入遺伝子は、対象生物（細胞）に導入することによって、ＲＮＡサイレンシングの標的となる塩基配列と相同な配列を含む遺伝子であるサイレンシング遺伝子の代わりに発現させる遺伝子である。上記サイレンシング回避配列は、上記サイレンシング遺伝子を改変した配列であり、上記遺伝子発現方法を適用する生物内で新たに発現させるための配列である。
【０１０１】
導入工程において、上記サイレンシング回避配列の配列は、前述の（Ａ）〜（Ｉ）に基づいて行えばよく、少なくとも以下の条件を満たすように設計する。
第１条件：サイレンシング回避配列の発現は、ＲＮＡ干渉によって誘発されたＲＮＡサイレンシングによって抑制されない。
第２条件：サイレンシング回避配列は、サイレンシング遺伝子がコードするポリペプチドと、相同なポリペプチドをコードするように、設計したものである。
【０１０２】
すなわち、上記導入工程で用いるサイレンシング回避配列は、ＲＮＡ干渉によりＲＮＡサイレンシングを誘発させても、発現が抑制されない程度に、サイレンシング遺伝子の配列に基づき設計すればよい。
【０１０３】
まず、第１条件において、ＲＮＡサイレンシングを誘発するためのＲＮＡ干渉では、実質的にｓｉＲＮＡが、サイレンシング遺伝子の発現を抑制している。このため、サイレンシング回避配列は、そのｓｉＲＮＡに認識されないように（ｓｉＲＮＡとの相同性が低くなるように）、設計することが好ましい。これにより、サイレンシング回避配列の発現が抑制されることなく、その配列を含む導入遺伝子を発現させることができる。
【０１０４】
次に、第２条件では、サイレンシング回避配列は、サイレンシング回避配列は、サイレンシング遺伝子がコードするポリペプチドと、相同なポリペプチドをコードするように設計したものである。
【０１０５】
ここで、サイレンシング回避配列は、例えば、上記２つの条件を満たすように、サイレンシング遺伝子を用いずにその塩基配列に基づき作製することもできるし、サイレンシング遺伝子の塩基配列において、１またはそれ以上の塩基を、置換、欠失、挿入、もしくは付加することを示している。
【０１０６】
例えば、サイレンシング遺伝子の塩基配列において、１またはそれ以上の塩基を、置換、欠失、挿入、もしくは付加することによって、サイレンシング遺伝子にコードされるポリペプチドと、相同なポリペプチドをコードするように、サイレンシング回避配列を設計することを示す。
【０１０７】
従って、上記サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングの誘発により発現が抑制されない程度に、かつ、サイレンシング遺伝子にコードされるポリペプチドと相同なポリペプチドをコードするように、設計する。例えば、サイレンシング遺伝子のコドンの全部、あるいは、そのほとんどのコドンについて、各コドンを構成する塩基を置換、欠失、挿入、もしくは付加することによって、サイレンシング回避配列を設計することができる。つまり、上記サイレンシング回避配列は、サイレンシング回避配列に変異を生じさせた遺伝子ともいえる。コドンの塩基を改変する場合、そのコドンのうち、少なくとも１つの塩基を改変すればよく、好ましくは全ての塩基を改変する。また、コドンの２つの塩基を改変する場合、３’末端側の２つの塩基（第２コドンおよび第３コドン）を改変することが好ましい。これは、５’末端側のコドン（第１コドン）は、同一のアミノ酸をコードするコドンに共通する場合が多いためである。
【０１０８】
上記サイレンシング回避配列は、このような２つの条件を満たすように、設計すればよい。
【０１０９】
例えば、ＲＮＡ干渉では、ｄｓＲＮＡが分解されて生じる１９〜３０塩基程度のｓｉＲＮＡを介した機構によるジーンサイレンシングが誘導される。このため、サイレンシング回避配列は、ｓｉＲＮＡを介した機構によるジーンサイレンシングを受けないように設計する必要がある。すなわち、サイレンシング回避配列が、サイレンシング遺伝子と相同な配列を、連続して１９〜３０塩基以上有していた場合、ｓｉＲＮＡにより改変遺伝子もサイレンシングする場合がある。そこで、サイレンシング回避配列は、サイレンシング遺伝子の発現を抑制するために用いたｄｓＲＮＡ由来のｓｉＲＮＡにと結合しないように設計することが好ましい。例えば、サイレンシング回避配列は、連続するサイレンシング遺伝子と相同な配列が、３０塩基未満、好ましくは２１塩基未満、より好ましくは１９塩基未満、さらに好ましくは２塩基未満、特に好ましくは全ての塩基が異なるように、設計することが好ましい。これにより、ｓｉＲＮＡを介したサイレンシング機構により分解されずに、確実にサイレンシング回避配列を含む導入遺伝子を発現させることができる。
【０１１０】
また、例えば、上記サイレンシング回避配列を、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードするように設計することができる。
【０１１１】
（ａ）サイレンシング回避配列にコードされるポリペプチド。
【０１１２】
（ｂ）サイレンシング回避配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加したポリペプチド。
【０１１３】
ここで、上記（ａ）の場合、上記サイレンシング回避配列は、サイレンシング遺伝子にコードされるポリペプチドと同じポリペプチドをコードするように設計したものである。すなわち、サイレンシング回避配列子は、サイレンシング遺伝子のコドンを同義置換したものである。
【０１１４】
なお、上記（ａ）のように、上記サイレンシング回避配列は、上記サイレンシング遺伝子にコードされるポリペプチドと、全アミノ酸配列が相同なアミノ酸をコードするように設計する他にも、サイレンシング遺伝子にコードされるポリペプチドの少なくとも一部のアミノ酸をコードする範囲で、サイレンシング遺伝子のコドンに同義置換が生じるように設計することもできる。
【０１１５】
また、上記（ｂ）の場合、サイレンシング回避配列は、サイレンシング遺伝子にコードされるタンパク質のうち、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加した変異タンパク質をコードするように設計されたものである。
【０１１６】
なお、上記（ｂ）のように、上記サイレンシング回避配列は、上記変異タンパク質と、全アミノ酸配列が相同なアミノ酸をコードするように設計する他にも、サイレンシング遺伝子にコードされるタンパク質の少なくとも一部のアミノ酸をコードする範囲で、サイレンシング遺伝子に非同義置換が生じるように設計することもできる。
【０１１７】
このように、サイレンシング遺伝子を同義置換すれば、サイレンシング遺伝子にコードされるタンパク質と相同なタンパク質（全アミノ酸をコードする改変遺伝子を設計できる。また、サイレンシング遺伝子の少なくとも一部を非同義置換すれば、サイレンシング遺伝子にコードされるタンパク質の変異タンパク質をコードするサイレンシング回避配列を設計できる。
【０１１８】
なお、上記「同義置換」とは、サイレンシング遺伝子にコードされるタンパク質と、全てのアミノ酸配列が相同となるように、サイレンシング回避配列を設計することを示す。また、上記「非同義置換」とは、サイレンシング遺伝子にコードされるタンパク質と、少なくとも１つのアミノ酸配列が異なるように、サイレンシング回避配列を設計することを示す。
【０１１９】
また、上記サイレンシング回避配列は、ＲＮＡサイレンシングを受けない程度に、サイレンシング遺伝子との相同性を低く設計することが好ましい。これにより、ＲＮＡサイレンシングによるサイレンシング回避配列の発現が抑制されることなく確実に導入遺伝子を発現させることができる。
【０１２０】
前述のように、ＲＮＡサイレンシングは、通常、複数のサイレンシング遺伝子の発現を抑制する。例えば、共通のドメインを有するポリペプチドをコードする複数の遺伝子からなる遺伝子ファミリーは、共通するドメインをコードする塩基配列を有している。このため、この遺伝子ファミリーは、ＲＮＡサイレンシングによって、同時に発現が抑制される場合が多い。
【０１２１】
上記遺伝子発現方法は、このような場合にも適用することができる。
【０１２２】
具体的には、上記サイレンシング遺伝子は、共通のドメインを有するポリペプチドをコードする複数の遺伝子からなる遺伝子ファミリーであり、上記ＲＮＡサイレンシングによって、上記遺伝子ファミリーのうちの少なくとも１つの遺伝子の発現が抑制されており、上記サイレンシング回避配列は、上記発現が抑制された遺伝子ファミリーのうち、少なくとも１つの遺伝子を発現するように設計することもできる。
【０１２３】
上記の構成によれば、ＲＮＡサイレンシングによって発現が抑制された遺伝子ファミリーのうち、少なくとも１つの遺伝子を発現するように、サイレンシング回避配列を設計している。これにより、サイレンシング回避配列を含む導入遺伝子によって、発現が抑制された一部または全ての遺伝子ファミリーにコードされるポリペプチドを発現させることができる。
【０１２４】
このように、上記遺伝子発現方法は、ＲＮＡサイレンシングによって発現が抑制された遺伝子ファミリーであっても、サイレンシング回避配列を含む導入遺伝子によって、発現させることができる。
【０１２５】
すなわち、前述のように、サイレンシング遺伝子は、共通のドメインを有するポリペプチドをコードする複数の遺伝子からなる遺伝子ファミリーである場合、ＲＮＡサイレンシングでは、その遺伝子ファミリーのうちの少なくとも１つの遺伝子の発現が抑制される。この場合、導入工程では、上記ＲＮＡサイレンシングによって抑制された複数の遺伝子のうち、少なくとも１つの遺伝子を発現可能に、サイレンシング回避配列を設計すればよい。これにより、発現が抑制された遺伝子ファミリーの少なくとも１以上のサイレンシング遺伝子を発現させることができる。
【０１２６】
このような上記サイレンシング回避配列は、対象生物（対象細胞）においてＲＮＡ干渉によって発現が抑制された内在性の遺伝子、または、対象生物（対象細胞）が本来有さない外来性の遺伝子を、新たに発現させる遺伝子であるため、「レザレクション遺伝子（ＲＳ遺伝子）」とも換言できる。
【０１２７】
なお、上記サイレンシング遺伝子が多重遺伝子群（遺伝子ファミリー）の場合、上記サイレンシング回避配列は、これらサイレンシング遺伝子の少なくとも１つの遺伝子を改変したものであればよい。これにより、互いに相同な多重遺伝子にコードされる、同一機能を有する複数のタンパク質の発現を抑制し、そのタンパク質の１つないし複数を、そのままであるいは任意の変異を導入して発現させることができる。
【０１２８】
なお、上記導入遺伝子は、少なくともそのサイレンシング回避配列を発現できる配列であればよく、その配列の他にＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の上流部分の配列（例えば、プロモーター）、または、ターミネーター配列などの非翻訳領域の配列を有していてもよい。この場合、これらの遺伝子産物を発現できる配列以外の配列は、抑制されたサイレンシング遺伝子のものと異なった配列、あるいは、サイレンシング遺伝子と相同性が低い配列を有することが好ましい。これにより、サイレンシング遺伝子のサイレンシングによって、サイレンシング回避配列を含む導入遺伝子の望まない分解を避けることができる。
【０１２９】
ところで、従来の方法では、ＲＮＡサイレンシングの誘発により、生存に必須の遺伝子の発現を抑制した細胞（生物）は、死んでしまう。このため、従来の方法では、生存に必須の遺伝子の発現を抑制することはできない。これに対し、上記遺伝子発現方法では、生存に必須の遺伝子をサイレンシングすることも可能である。
【０１３０】
具体的には、上記導入遺伝子を、上記ＲＮＡサイレンシングの誘発と同時またはそれよりも前に、発現させることによって、生存に必須の遺伝子をサイレンシングすることができる。
【０１３１】
この場合、ＲＮＡサイレンシングの誘発する前に、サイレンシング回避配列を含む導入遺伝子を発現させている。これにより、対象生物（細胞）を死なせることなく、生存に必須なサイレンシング遺伝子の発現を抑制し、サイレンシング回避遺伝子を発現させることができる。
【０１３２】
上記遺伝子発現方法では、上記導入遺伝子は、上記サイレンシング回避配列に加えて、さらに機能性配列を含んでいてもよい。
【０１３３】
上記の構成によれば、導入遺伝子は、機能性配列を含んでいるため、導入遺伝子に任意の機能を付与することができる。例えば、任意の機能を有するペプチドをコードする機能性配列を用いることによって、サイレンシング回避配列がコードするポリペプチドと、その機能性配列がコードするポリペプチドとを結合した融合ポリペプチド（融合タンパク質）を発現させることができる。
【０１３４】
これにより、例えば、導入遺伝子の発現または発現位置を容易に確認することができる。サイレンシング回避配列を含む導入遺伝子の発現または発現位置を容易に確認することができる。また、サイレンシング遺伝子にコードされる内在性のポリペプチドに影響されることなく、目的とするサイレンシング回避配列にコードされるポリペプチドの純化、局在性の改変、または機能解析が可能となる。
【０１３５】
また、上記遺伝子発現方法では、上記導入遺伝子を、組織特異的に発現てもよい。これにより、特定の組織（細胞）にのみ、導入遺伝子を発現させることができる。
【０１３６】
また、上記遺伝子発現方法では、上記導入遺伝子を、誘導的に発現させてもよい。これにより、導入遺伝子の発現時期および発現量を制御することができる。
【０１３７】
さらに、上記導入工程では、上記導入遺伝子を、誘導的に発現させるための配列を含んでいてもよい。例えば、上記導入遺伝子に、発現を誘導できるようなプロモーターを連結することにより、導入遺伝子を、誘導的に発現させることができる。これにより、導入遺伝子の発現時期または発現量を制御することができる。
【０１３８】
また、上記導入遺伝子の発現には、適当なプロモーターを用いることにより、導入遺伝子の発現時期を制御することも可能である。この場合、誘導シグナルを量的に変えることにより発現量を調節することもできる。
【０１３９】
また、サイレンシング回避配列およびサイレンシング回避配列を含む導入遺伝子は、公知のｍＲＮＡ翻訳を高効率化する手法を用いて設計することが好ましい。例えば、この手法としては、
（ｉ）導入遺伝子を発現させ生物の種類に応じて、なるべく効率よく翻訳されるコドンを選択する；
（ｉｉ）導入遺伝子から転写されたｍＲＮＡの予期せぬ分解、スプライシング、および翻訳の停止を避けるため、スプライシングシグナル配列、リボザイム配列、mRNA不安定化配列、または翻訳抑制配列を生じないようにする；あるいは
（ｉｉｉ）導入遺伝子から転写されたｍＲＮＡ（リザレクションｍＲＮＡ）の翻訳の妨げになるようなヘアピンやステムループなどの高次構造を除く；
などがあげられる。
【０１４０】
上記導入遺伝子は、公知の手法を用いて合成することができる。例えば、導入遺伝子は、前述のようにして設計した塩基配列に基づき、合成プライマーを用いたＰＣＲ法によって作製することが出来る。すなわち、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に変異を導入することによって、変異遺伝子を作製することができる。
【０１４１】
このようにして設計した導入遺伝子の導入方法は、公知の手法を用いて行えばよい。上記導入遺伝子の導入方法は、例えば、アグロバクテリウム感染法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、およびパーティクルガン法等の方法を好適に用いることができる。
【０１４２】
また、上記導入遺伝子は、導入遺伝子を発現するような適当な発現ベクターを用いて、発現させることができる。また、導入遺伝子は、一時的に発現させても良いし、形質転換によって染色体に組み込み恒常的に発現させても良い。ＲＮＡサイレンシングを誘発し、かつ導入遺伝子を発現可能に導入して作製した形質転換体（形質転換細胞）は、サイレンシング遺伝子の発現が抑制されており、かつ、導入遺伝子が発現している。この形質転換体は、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む。
【０１４３】
また、上記導入遺伝子は、全身に発現させても、組織特異的に発現させても良い。また、導入遺伝子にコードされるポリペプチドと相同な内在性のポリペプチドに影響されることなく、目的とする改変遺伝子にコードされるタンパク質の純化、局在性の改変、または機能解析が可能となる。
なお、前述のように、サイレンシング遺伝子が、共通のドメインを有するタンパク質をコードする複数の遺伝子からなる遺伝子ファミリーを含む場合、サイレンシング遺伝子に対するＲＮＡサイレンシングの誘発によって、その遺伝子ファミリーのうちの少なくとも１つの遺伝子の発現が抑制される。あるいは、その遺伝子ファミリーの全ての遺伝子の発現が抑制される。この場合、導入工程では、上記ＲＮＡサイレンシングによって抑制されたサイレンシング遺伝子のサイレンシング回避配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子を発現可能に導入すればよい。これにより、サイレンシング遺伝子に含まれる発現が抑制された遺伝子ファミリーの少なくとも１以上の遺伝子を改変した改変遺伝子を発現させることができる。
【０１４４】
サイレンシング遺伝子がＲＮＡサイレンシングによってその発現が抑制される内在性または外来性の遺伝子、すなわち被抑制遺伝子を含む場合、導入遺伝子は、上記被抑制遺伝子がコードするポリペプチドと相同なポリペプチドをコードしてもよく、また、上記被抑制遺伝子がコードするポリペプチドの変異ポリペプチドをコードしてもよい。例えば、導入遺伝子は、被抑制遺伝子がコードするポリペプチドにおいて、そのアミノ酸配列が欠失、置換したり、関係のない配列が挿入、または付加した変異ポリペプチドをコードしていてもよい。これにより、被抑制遺伝子がコードするポリペプチドと異なる性質を持ったポリペプチドを発現させることができる。換言すれば、ＲＮＡサイレンシングによって被抑制遺伝子の発現を抑制し、その変異ポリペプチドを導入遺伝子から発現することができる。また、上記導入遺伝子は、被抑制遺伝子のポリペプチド配列をコードしてもよく、被抑制遺伝子がコードするポリペプチド配列と他のポリペプチドの融合ポリペプチドであってもよい。導入遺伝子が、被抑制遺伝子がコードするポリペプチドに機能性配列を付加したポリペプチドをコードすることは、特に好ましい。ここで、機能性配列とは、ポリペプチドに付加することで、特定の性質をポリペプチドに付与するような配列であり、以下に限定されるものではないが、例えば、エピトープタグ、アフィニティタグ、蛍光タンパク質、酵素、自己切断配列、輸送シグナルペプチドなどが挙げられる。導入遺伝子が、被抑制遺伝子がコードするポリペプチドに機能性配列を付加したポリペプチドをコードすることにより、導入遺伝子の発現によって、被抑制遺伝子がコードするポリペプチドにその機能性配列によって特定の性質が与えられたポリペプチドが発現できる。換言すれば、ＲＮＡサイレンシングによって被抑制遺伝子のコードするポリペプチドの発現を抑制し、そのポリペプチドに機能性配列を付加したポリペプチドを導入遺伝子から発現させることができる。
導入遺伝子は、野生型遺伝子であってもよく、また、変異遺伝子であってもよい。すなわち、導入遺伝子は野生型ポリペプチドをコードしていてもよく、また、変異ポリペプチドをコードしていてもよい。ここで、変異遺伝子とは、野生型遺伝子に突然変異が生じた遺伝子をいい、変異ポリペプチドとは、野生型ポリペプチドに突然変異が生じたポリペプチドをいう。対象生物が変異型遺伝子を発現している場合は、前述した本発明にかかる遺伝子発現法によって変異型遺伝子の発現を抑制し、野生型の導入遺伝子を発現させることができる。変異型遺伝子が遺伝子病の原因遺伝子である場合には、その発現を抑制し野生型、すなわち、正常な導入遺伝子を発現することによって、遺伝子病を治療することができる。対象生物が野生型遺伝子を発現している場合には，前述した本発明にかかる遺伝子発現法によって、野生型遺伝子の発現をＲＮＡサイレンシングで抑制し、変異遺伝子を導入することによって、野生型遺伝子の発現を抑制し、変異型遺伝子を発現させることができる。
【０１４５】
なお「導入遺伝子」は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）である。ＤＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であってもよい。すなわち、上記導入遺伝子には、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を包含する。また、ＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。
【０１４６】
また、「サイレンシング遺伝子」および「導入遺伝子」は、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。また、サイレンシング遺伝子および導入遺伝子は、これらの遺伝子を蛍光標識するための配列などを含んでいてもよい。
【０１４７】
なお、上記サイレンシング遺伝子の発現抑制、および、上記導入遺伝子の発現は、遺伝子の場合には、例えば、Northern Blot解析やPCR、あるいはIn situ hybridization等によって確認することができる。また、発現したタンパク質は、例えば、Western Blot解析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ＥＬＩＳＡ、免疫染色、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける活性測定、ｉｎ ｖｉｖｏにおける生物活性の測定または観察によって確認することができる。
【０１４８】
以上のようにして、導入工程により導入遺伝子を発現させることができる。
【０１４９】
なお、前述の説明では、サイレンシング遺伝子のうち、人為的に誘発されたサイレンシングによりその発現が抑制される遺伝子について説明した。しかし、上記遺伝子発現方法では、サイレンシング遺伝子の発現が、内在性の機構により誘発されたＲＮＡサイレンシングによって抑制されている場合を含む。すなわち、上記導入工程では、内在的なＲＮＡサイレンシングによって上記標的遺伝子の発現が抑制された細胞を用いることもできる。この場合、上記遺伝子発現方法は、内在性のＲＮＡサイレンシングによって、導入遺伝子の発現が抑制されないように、上記導入工程を含んでいればよい。
【０１５０】
ここで、「内在性のＲＮＡサイレンシング」とは、人為的な処理を施すことなく、細胞が本来有する機構により誘導されるＲＮＡサイレンシングを示す。具体的には、動物細胞，植物細胞および菌などの真核細胞では、人為的にではなく、内在的なＲＮＡサイレンシングにより特定の遺伝子の発現が抑制されている。すなわち、真核生物の細胞では、元々ＲＮＡサイレンシングが起こっており、そのＲＮＡ干渉により発現が制御されている遺伝子が存在する。このような動植物自体が本来持っているＲＮＡサイレンシングは、その標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡとマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と２本鎖を形成することによって、引き起こされるとされている。
【０１５１】
従って、上記導入遺伝子は、前述の設計方法に基づいて、ｍｉＲＮＡと相同な配列が連続して３０塩基未満であり、かつ、サイレンシング遺伝子がコードするポリペプチドの少なくとも一部のアミノ酸配列をコードするように標的遺伝子を改変するように設計してもよい。
【０１５２】
これにより、内在性のＲＮＡサイレンシングにより発現が抑制された被抑制遺伝子を、導入遺伝子によって発現させることができる。
【０１５３】
このように、本発明の遺伝子発現方法では、「ＲＮＡサイレンシング」には、人為的に細胞内へＲＮＡを導入することによって生じるＲＮＡサイレンシングのみならず、内在性のｍｉＲＮＡによって生じ、人為的な処理を必要としない、細胞が本来有するＲＮＡサイレンシングも含まれる。
【０１５４】
（２）遺伝子発現方法の利用
上記遺伝子発現方法は、生物内での遺伝子を機能解析する解析方法に利用することができる。例えば、ＲＮＡサイレンシングにより内在性遺伝子の発現を抑制した状態で、内在性遺伝子のコードするポリペプチド配列またはその変異ポリペプチド配列をコードした導入遺伝子を発現し、導入遺伝子およびポリペプチドの機能解析を行うことができる。例えば、サイレンシング遺伝子のＲＮＡサイレンシングを誘発した生物においてアミノ酸配列レベルで自由に変異を導入した導入遺伝子を発現させることにより、in vivoにおいて、導入遺伝子およびその翻訳産物（変異ポリペプチド）の効果を検証することができる。例えば、タンパク質工学によって設計された新規なポリペプチドをコードするように導入遺伝子を設計することにより、そのポリペプチドの効果を、in vivoで容易に解析することができる。また、例えば、機能性配列を持った融合ポリペプチドをコードする導入遺伝子を発現することにより、導入遺伝子の解析が容易となる。例えば、誘導プロモーターや組織特異的プロモーターを用いて導入遺伝子の発現を行うことにより、任意の時点、あるいは任意の組織において、導入遺伝子を発現し、その効果を検証することができる。さらに、in  vitroにおいて、導入遺伝子の構造または機能を解析することができる。また、解析すべき遺伝子が多重遺伝子群であっても、ＲＮＡサイレンシングにより、それらの遺伝子の発現を抑制し、その遺伝子の少なくとも１つに任意な変異を導入した導入遺伝子を発現することで、その効果を調べることが出来る。
【０１５５】
また、上記遺伝子発現方法を実施することにより、特定の遺伝子の発現を抑制しつつ、任意の変異をもったポリペプチドを発現させる導入遺伝子の導入により、新規な動物または植物の育種方法として利用することもできる。また、例えば、誘導プロモーターや組織特異的プロモーターを用いて導入遺伝子の発現を行うことにより、任意の時点、あるいは任意の組織において、導入遺伝子を発現する新規な動物または植物の育種方法として利用することもできる。
【０１５６】
上記遺伝子発現方法または解析方法は、キット化することが好ましい。このキットは、遺伝子発現方法または解析方法を実施するためのキットである。このキットは、少なくとも上記導入工程を行うための試薬を含んでいればよく、ＲＮＡサイレンシングの誘発を実施するための試薬をさらに含んでいてもよい。導入工程を行うための試薬としては、例えば、上記サイレンシング回避配列、上記導入遺伝子、または、サイレンシング回避配列および導入遺伝子を調製するための試薬を挙げることができる。なお、上記「サイレンシング回避配列を含む試薬」とは、少なくともサイレンシング回避配列子を含むものであればよく、例えば、サイレンシング回避配列を含むベクターが例示される。また、サイレンシング回避配列を発現するような細胞（例えば、大腸菌）、アグロバクテリウム、ウィルスベクターなどの生物自身よく、サイレンシング回避配列そのものであってもよい。
その他の具体的な構成については特に限定されるものではない。例えば、必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成とすればよい。これにより、本発明にかかる遺伝子発現方法、または、解析方法を、汎用的に実施することができる。
【０１５７】
また、上記遺伝子発現方法は、遺伝子治療に利用することもできる。
【０１５８】
上記導入工程では、例えば、ウイルスベクター等の適当な方法を利用することにより、受精卵だけでなく成長した個体でも、導入遺伝子を発現させることができる。すなわち、抑制すべき遺伝子の発現をＲＮＡサイレンシングによって抑制し、その標的遺伝子に変異を生じさせたポリペプチドをコードする導入遺伝子を導入して、発現させることができる。したがって、上記遺伝子発現方法は、先天的な遺伝病だけではなく、ガンなど後天的な遺伝子の変異に起因する疾患の治療に適用することも可能である。すなわち、上記遺伝子発現方法は、遺伝子治療に利用できる。例えば、正常ポリペプチドとは異なる変異ポリペプチドを発現する遺伝子が原因となる疾患の場合、その遺伝子の発現をＲＮＡサイレンシングにより抑制するとともに、正常ポリペプチドをコードするサイレンシング回避配列を含む導入遺伝子を導入し、細胞内で発現させる。これにより、その疾患の治療が可能となる。
【０１５９】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１６０】
小胞体局在型緑色蛍光タンパク質（erＧＦＰ）を恒常的に発現する形質転換ニコチアーナベンサミアーナ植物（以下ＧＦＰ植物）は、Ｇ３Ｎｂ３（Journal of Virology Vol. 77: 11016-11026,2003）を用いた。まず、ＧＦＰ植物におけるＧＦＰ遺伝子の発現をＲＮＡ干渉によるジーンサイレンシングにより抑制するため、pBICdsGFP(FEBS Letters 532:75-79,2002)由来の35Sプロモーター下流に、可溶化型ＧＦＰ（smGFP）のセンス配列およびアンチセンス配列を、短いイントロン配列を介して連結した遺伝子を持つTiプラスミドｐＢＩＣＢＰｄｓＧＦＰを構築し（図１）、アグロバクテリウム法を用いてＧＦＰ植物に導入した。
【０１６１】
得られた形質転換植物におけるＧＦＰの発現をノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング、および蛍光顕微鏡観察によって調べ、ＲＮＡ抑制によりGFPの発現が抑制されている植物（ＧＦＰ−ＲＮＡｉ植物）を選抜した。
【０１６２】
図２は、本実施例で用いたerGFPとsmGFPのコーディング領域の塩基配列を比較した図である。
【０１６３】
次に、可溶型ＧＦＰ(smGFP)遺伝子、リザレクションsmGFP（ＲＳsmGFP）遺伝子、リザレクション可溶型青色蛍光タンパク質（ＲＳsmBFP）遺伝子、および対照としてブロムモザイクウイルスRNA2−５’末端領域（ＢＭＶ２−５’）をそれぞれコードするＰＶＸベクターＰＶＸ−ｓｍＧＦＰ、ＰＶＸ−ＲＳｓｍＧＦＰ、ＰＶＸ−ＲＳｓｍＢＦＰ、およびＰＶＸ−ＢＭＶ２−５’のｃＤＮＡを合成した。図３はこれらのＰＶＸベクターの模式図である。ＲＳsmGFP遺伝子は、smGFP遺伝子を連続した相同な塩基配列が９塩基未満となるように同義置換した遺伝子であり、コードするＲＳsmGFPのアミノ酸配列は、smGFPのアミノ酸配列と全く同一である。また、ＲＳsmGFP遺伝子は、erGFP遺伝子と連続した相同な配列が８塩基未満となるように設計されている。ＲＳsmBFPは、ＲＳsmGFPおよびsmGFPのN末端から66番目のチロシン残基をヒスチジン残基へ置換し、蛍光スペクトルを改変したGFPの変異体である（Plant Molecular Biology 36: 521-528 1998）。ＲＳsmBFP遺伝子は、smGFP遺伝子と連続した相同な塩基配列が９塩基未満となるように、かつ、erGFP遺伝子と連続した相同な塩基配列が6塩基未満となるよう設計されている。
【０１６４】
ＲＳsmGFP遺伝子およびＲＳsmBFP遺伝子の合成は、当該配列をコードする合成プライマーを用いたＰＣＲ法によって行った。図４および図５は、本実施例で用いたsmGFP遺伝子とＲＳsmGFP遺伝子のコーディング領域の塩基配列、および翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列を比較した図である。また、図６および図７は、本実施例で用いたsmGFP遺伝子とＲＳsmBFP遺伝子のコーディング領域の塩基配列、および翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列を比較した図である。
【０１６５】
なお、ＲＳsmGFP遺伝子およびＲＳsmBFP遺伝子は、mRNA不安定化配列およびスプライシングシグナル配列を含まないように設計した。
【０１６６】
接種に用いたPVXベクターRNAは、当該配列のcDNA断片の5’末端側にＴ７プロモーターを連結したものをPCR法で増幅した後、T7 RNAポリメラーゼを用いてin vitroで合成した。
【０１６７】
（１）プロトプラストにおけるリザレクション
この実施例は、植物細胞において発現している遺伝子をRNAサイレンシングによって抑制し、その抑制された遺伝子がコードするタンパク質と相同なタンパク質をコードする導入遺伝子を発現させた例を示すものである。GFP-RNAi植物からプロトプラストを調製し、それぞれのＰＶＸベクターをポリエチレングリコール法を用いて接種した。22℃で20時間インキュベートした後、全ＲＮＡおよび全タンパク質を抽出しそれぞれノーザンブロッティングおよびウェスタンブロッティングで解析した。GFP植物にPVX-smGFPを接種した場合、PVXのゲノムおよびサブゲノムRNAとPVX由来GFP ｍRNAが検出された（図８）。いっぽう、GFP-RNAi植物由来プロトプラストにPVX-smGFPを接種した場合、PVX RNAはスミア状に検出され、GFP mRNAは検出されなかった（図８）。これらの結果は、GFP-RNAi植物において誘導されているGFPのサイレンシング機構により、smGFPの配列を含むPVX-smGFPが分解されたことを示唆する。いっぽう、GFP-RNAi植物由来プロトプラストにPVX-ＲＳsmGFPを接種した場合は、GFP植物由来プロトプラストの場合と同様に、PVXのゲノムおよびサブゲノムRNAとリザレクションGFP mRNAが検出された（図８）。また、ウェスタンブロッティングにおいてもGFPに相当するバンドが確認された（図８）。以上のことから、リザレクションGFP遺伝子がin vivoで発現し機能することにより、GFPのサイレンシングが起こっている植物由来プロトプラストにおいて、GFPが発現したことが示された。
【０１６８】
（２）植物体におけるリザレクション
この実施例は、植物細胞において発現している遺伝子をRNAサイレンシングによって抑制し、その抑制された遺伝子がコードするタンパク質の変異タンパク質をコードする導入遺伝子を発現させた例を示すものである。GFP-RNAi植物葉（５週齢、第６葉）にPVX-ＲＳsmBFPを接種し、２２℃で２週間インキュベートした。感染葉から全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロッティングを行ったところ、PVX RNAおよびリザレクションＢＦＰに特異的なＲＮＡの蓄積が確認された（図９）。また、ＧＦＰとＢＦＰをともに認識する抗体を用いたウェスタンブロッティングを行ったところ、未接種のGFP-RNAi植物においてはバンドは検出されなかったが、PVX-ＲＳsmBFP接種区においては、ＢＦＰに相当する位置にバンドが検出された（図１０）。感染葉組織を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察したところ、未接種のGFP-RNAi植物ではGFPおよびBFPに特異的な蛍光は観察されなかったが、PVX-ＲＳsmGFPを接種した葉組織においてはGFP植物で観察される蛍光とはスペクトルが明らかに異なるBFPに特異的な蛍光が観察された（図１１）。以上のことから、リザレクション法により、植物個体レベルにおいて、GFPのサイレンシングが起こっている植物において、GFPとほとんど相同なアミノ酸配列を持つ変異タンパク質であるBFPが発現したことが示された。このことは、GFP植物で発現しているGFPを、リザレクション法を用いることでBFPに改変できたことを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明の遺伝子発現方法は、RNAサイレンシングが誘発されている細胞において、その発現が抑制される遺伝子と相同なポリペプチドをコードする配列を含む導入遺伝子を発現させることができる。それゆえ、本発明は、医学、薬学、農業、品種改良、微生物工業などの分野に幅広く利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】本実施例で用いたＴｉプラスミドベクターの模式図である。
【図２】本実施例で用いたerGFP遺伝子とsmGFP遺伝子のコーディング領域の塩基配列を比較した図である。
【図３】本実施例で用いたＰＶＸベクターの模式図である。
【図４】本実施例で用いたsmGFP遺伝子とＲＳsmGFP遺伝子のコーディング領域の塩基配列を比較した図である。
【図５】本実施例で用いたsmGFPとＲＳsmGFPのアミノ酸配列を比較した図である。
【図６】本実施例で用いたsmGFP遺伝子とＲＳsmBFP遺伝子のコーディング領域の塩基配列を比較した図である。
【図７】本実施例で用いたsmGFPとＲＳsmBFPのアミノ酸配列を比較した図である。
【図８】本実施例において、ＧＦＰ−ＲＮＡｉ植物由来のプロトプラストにおけるＲＳsmGFPの発現を確認した図である。
【図９】本実施例において、ＧＦＰ−ＲＮＡｉ植物葉におけるＲＳsmBFPの発現を確認した図である。
【図１０】本実施例において、ＧＦＰ−ＲＮＡｉ植物におけるＲＳsmBFPの発現を確認した図である。
【図１１】本実施例において、ＧＦＰ−ＲＮＡｉ植物におけるＲＳsmBFPの発現を確認した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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