(57)【要約】      （修正有）【課題】複雑な試料から、プローブにより規定された核酸混合物をもたらす適切な方法を提供する。【解決手段】一実施形態では、固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドプローブを配列特異的アフィニティ試薬として用いて、ハイブリダイゼーション反応を実施するステップ、及び前記固体支持体から相補的な断片を分離させることを含む、核酸試料から規定された核酸断片混合物を単離し、増幅を促進する方法の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料から、プローブにより規定された核酸断片を単離する方法であって、
ａ）核酸試料から核酸断片を得るステップ、
ｂ）プローブの結合した固体支持体に前記核酸断片を接触させ、前記プローブを介して前記固体支持体上に相補的な断片を保持させることを含む、ハイブリダイゼーション反応を実施するステップ、及び
ｃ）前記固体支持体から前記相補的な断片を分離させることを含む、プローブにより規定された核酸断片を回収するステップ、
を包含する方法。
【請求項２】
前記核酸断片を得るステップが、前記核酸試料を断片化させて中間体断片を得るステップ、及び前記中間体断片をアダプター２本鎖に連結させて前記核酸断片を得るステップを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アダプター２本鎖が、増幅反応用のプライマー部位として用いられるように適合された、固有の配列エレメントを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アダプター２本鎖が、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記アダプター２本鎖が、前記中間体断片と連結されると、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を破壊する配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記アダプター２本鎖がタグ配列を含み、それによって前記タグ配列を含む断片を単離又は同定することができる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記アダプター２本鎖が反応性成分を含み、それによって前記反応性成分と反応するための相補的活性成分が表面に結合している基材に、前記核酸断片を結合させることができる、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記プローブにより規定された核酸断片を回収するステップが、前記固体支持体から前記相補的な断片を分離した後に、前記相補的な断片を増幅させるステップを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
さらに、
ｄ）前記プローブにより規定された核酸断片を回収するステップの後に、プローブにより規定された核酸断片を、第２のプローブセットが結合している第２の支持体と接触させ、前記プローブを介して前記第２の支持体上に前記プローブにより規定された核酸断片を保持させることを含む、第２のハイブリダイゼーション反応を実施するステップ、及び
ｅ）前記第２の支持体上に保持されている前記プローブにより規定された核酸断片を、前記第２の支持体から分離するステップ、
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２の支持体に結合しているプローブが、前記固体支持体に結合している前記プローブのサブセットである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、
ｄ）前記プローブにより規定された核酸断片を回収するステップの後に、プローブにより規定された核酸断片を用いて、ミスマッチ修復検出アッセイを実施するステップ、
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、
ｄ）前記プローブにより規定された核酸断片を回収するステップの後に、プローブにより規定された核酸断片を用いて、配列決定アッセイを実施するステップ、
を包含する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、生物学的アッセイ及び他の用途に有用な、核酸の断片化及び単離に関する。より詳細には、本発明は、規定された核酸断片を複雑な核酸混合物から得ることに関する。
【背景技術】
【０００２】
複雑なゲノムサンプルから、個別の、配列規定された遺伝子エレメントを単離することは、ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、ｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、遺伝子発現、エピジェネティック解析、遺伝的バリエーションの発見及びスコア化（例えばＳＮＰｓ及びＳＴＲｓ）をはじめとする、多くの遺伝子解析プロトコルにおいて最も重要なステップである。共通の配列エレメントを有する規定された配列エレメント（即ち、規定された断片）は、共通のプライマー（メッセンジャーＲＮＡのポリＡ尾部をターゲットとするオリゴｄＴなど（非特許文献１参照））を用いて単離することができる。規定された断片を複雑なゲノムサンプルから単離し、増幅するためのプロトコルは、現在、規定されたプライマー対及びいくつかの形態の増幅プロトコル（例えば、ＰＣＲ、定温増幅又はＬＣＲ）に依存している。しかしながら、これらの方法は、多重化の程度が通常１０〜２０プライマー対だけに限られ、それは所定の反応条件に対して同時に最適化する必要があることから、大きな制限を受ける。結果として、ＳＮＰ遺伝子型決定又は比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）など、複雑なサンプル混合物内での多数の部位又は配列エレメントの調査を必要とする遺伝子解析プロトコルは、種々のゲノム複雑度の低減化法（エレメント規定されない種々のＬＣＲ、ＰＣＲ及びランダムプライミング技法が用いられる）に依存している（非特許文献２〜７参照）。
【非特許文献１】Ｃｈｏｗらによる、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７５；６３（１９８８）
【非特許文献２】Ｋｉｎｚｌｅｒ及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎによる、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１７；３６４５（１９８９）
【非特許文献３】Ｔｅｌｅｎｉｕｓらによる、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１３；１７１８（１９９２）
【非特許文献４】Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎらによる、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６；１９（１９９４）
【非特許文献５】Ｌｕｃｉｔｏらによる、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５；４４８７（１９９８）
【非特許文献６】Ｋｅｎｎｅｄｙらによる、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１；１２３３（２００３）
【非特許文献７】Ｂｉｇｎｅｌｌらによる、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４；２８７（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
複雑な試料から、規定された核酸混合物をもたらす適切な方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、当分野における前述の問題に取り組むものであり、複雑な核酸サンプルから、規定された核酸断片の混合物を単離する方法を提供する。「エレメント規定による配列複雑度の低減化（ＥＤＳＣＲ）」と称す本発明の方法では、マイクロアレイ（複雑なゲノムサンプルから、規定された核酸断片混合物を単離し、増幅を促進するための、非常に多数にて存在する配列特異的なアフィニティー試薬）のような、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドを利用する。
【０００５】
本発明は、プローブにより規定された核酸断片を、核酸サンプルから単離する方法を提供する。当該方法は、核酸サンプルから核酸断片を得るステップを包含する。次いで、ハイブリダイゼーション反応（先のステップで得られた核酸断片を、プローブの結合している固体支持体に接触させ、核酸断片のうちプローブに相補的な断片をプローブを介して固体支持体上に保持させるステップを含む）を実施するステップを包含する。さらに、当該方法は、プローブにより規定された核酸断片を回収するステップを包含し、当該回収ステップには、相補的な断片を固体支持体から分離させるステップが含まれる。
【０００６】
本発明のさらなる目的、利点、及び新規特徴は、以下の詳細な説明並びに実施例に記載している。また当業者であれば、それらは、以下の明細書の内容を検討すれば明らかとなろうし、本発明を実施することにより習得することができよう。本発明の目的及び利点は、本明細書において説明する、添付の特許請求の範囲において特に規定した、装置、組み合わせ、組成物、及び方法により実現、達成することができる。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、複雑な試料から、規定された核酸混合物をもたらす適切な方法を提供することができる
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の上記の特徴並びにその他の特徴は、本発明の方法の代表的実施形態並びに当該方法を実施するための例示的な装置（図面あり）に関する以下の説明から理解されるであろう。よりよい理解のために、複数の図面にわたって共通する構成要素を表す場合には、差し支えない限り、同一の符号を用いた。また、図面中の構成要素は、正確な縮尺にて記載したものでないことに留意されたい。
【０００９】
本発明を詳細に説明するにあたり、本発明は、特に明記しない限り、特定の材料、試薬、反応物質、製造工程等に限定されるものではなく、それらは変更することができることを理解されたい。また、本明細書において用いる用語は、特定の実施形態を説明するために用いているに過ぎず、本発明を限定する意のないことも理解されたい。さらに、論理的に可能であれば、異なる順番にて本発明の方法ステップを実施することもできる。しかしながら、以下に記載した順番にて実施することが好ましい。
【００１０】
本明細書並びに添付の特許請求の範囲において、単数形は、別途明確に指示のない限り、複数形の意味も包含する。したがって、例えば、「固体支持体」という場合には、複数の固体支持体も包含される。また、本明細書並びに特許請求の範囲においては、別途明確に指示のない限り、以下の意味を有するものとして規定される用語を用いることとする。
【００１１】
「任意（選択）の」又は「任意（選択的）に」とは、その語に続いて記載する事物があってもなくてもよいこと、あるいはその語に続いて記載する事項を実施してもしなくてもよいことを意味する。例えば、増幅反応などの操作を任意選択的に実施するという場合、これは、増幅反応などの操作を実施してもしなくてもよいことを意味する。従って、この記載には、増幅反応を実施する実施形態と、増幅反応を実施しない実施形態の両方が包含される。
【００１２】
本明細書では、用語「オリゴマー」とは、複数のモノマーを含む化学物質を表すために用いる。本明細書で用いるとき、用語「オリゴマー」と「ポリマー」は、同義的に使用される。オリゴマー及びポリマーとしては、例えば、ポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、ポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、プリン又はピリミジン塩基のＣ−グリコシドである他の核酸、ポリペプチド（タンパク質）、多糖類（デンプン、又は高分子糖（ｐｏｌｙｓｕｇａｒ））、並びに類似の化学構造の繰り返し単位を含む他の化学物質が挙げられる。
【００１３】
本明細書で用いるとき、用語「核酸」には、例えばデオキシリボヌクレオチドやリボヌクレオチドなどのヌクレオチドから構成されるポリマー、又は、天然に存在する２つの核酸の間で起こるような配列特異的な様式にて天然に存在する核酸とハイブリダイズできる（例えばワトソン−クリックの塩基対相互作用に関与し得る）合成化合物（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号明細書及びその中で引用された参考文献に記載されているＰＮＡなど）が挙げられる。核酸断片とは、比較的長い核酸を断片化（例えば、せん断法、酵素開裂法又は核酸を切断し得る他の方法によって）させて得られる核酸である。
【００１４】
本明細書で用いるとき、用語「リボ核酸」及び「ＲＮＡ」とは、リボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。
【００１５】
本明細書で用いるとき、用語「デオキシリボ核酸」及び「ＤＮＡ」とは、デオキシリボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。
【００１６】
本明細書で用いるとき、用語「オリゴヌクレオチド」とは、その長さが、約１０〜１００ヌクレオチド長から、最高２００ヌクレオチド長までの、一本鎖ヌクレオチド多量体を意味する。
【００１７】
本明細書で用いるとき、用語「試料（サンプル）」とは、１つ又は複数の対象成分を含む物質又は物質混合物を意味し、必ずしもそうである必要はないが、通常、液状であり得る。
【００１８】
用語「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」とは、公知のプリン及びピリミジン塩基だけでなく、他の変性されたヘテロ環式塩基を含む成分を包含する意がある。そのような変性物としては、メチル化プリンやメチル化ピリミジン、アシル化プリンやアシル化ピリミジン、アルキル化リボースやアルキル化された他のヘテロ環が挙げられる。さらに、用語「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」には、従来のリボース糖及びデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も含む成分が包含される。変性ヌクレオシド又はヌクレオチドには、糖部分における修飾も含まれ、例えば、一つ以上の水酸基が、ハロゲン原子又は脂肪族基と置換されていたり、エーテルやアミン等として官能化されている。
【００１９】
語句「固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチド」とは、固体基材の表面（例えば、アレイを構成するフィーチャー、即ちスポットの部分）に固定化されたオリゴヌクレオチド若しくはその類似物（例えば、ＰＮＡ）を意味し、この場合、当該基材には様々な形態（例えば、シート、粒子、又はその他の構造）のものを用いることができる。ある実施形態では、本発明で用いられるオリゴヌクレオチドスポットの集合体は、同じ平面支持体の表面上に存在する（例えば、アレイの形態で）。
【００２０】
用語「アレイ」には、用語「マイクロアレイ」が包含され、それは、核酸等を結合させるために設けられた、秩序のある配列を意味する。アレイは、以下に非常に詳しく説明するように、一般に複数の別個の、即ち、異なるフィーチャーから構成される。本明細書では、用語「フィーチャー」は、 「フィーチャー群」、「フィーチャー要素」、「スポット」、「アドレス指定可能な領域」、「種々の成分から成る領域」、「表面又は基材に固定化されたエレメント（表面又は基材に固定化された要素）」及び「アレイエレメント（アレイ要素）」と同義的に使用され、各フィーチャーは、固体担体表面に結合させたオリゴヌクレオチドから構成されており、基材に固定化された核酸も意味する。固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドは、「プローブ」又は「プローブ分子」と称され、一方、プローブに対して相補的である移動相中の核酸は「標的（ターゲット）」、「標的（ターゲット）分子」又は「対象（となる）成分」と称する。
【００２１】
本明細書で用いるとき、用語「ストリンジェントな条件」とは、所望のレベルの特異性をもたらすのに十分に相補的な核酸（例えば、表面に結合している核酸と液相中の核酸）の結合対を形成させるには適合するが、所望のレベルの特異性をもたらすには相補性が不十分である核酸間において結合対を形成させるにはさほど適合しない条件を意味する。ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション条件と洗浄条件の両方の和、即ち組み合わせである。
【００２２】
核酸ハイブリダイゼーション（例えば、アレイにおける、サザンハイブリダイゼーションあるいはノーザンハイブリダイゼーション）の文脈における 「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、種々の実験パラメータの下で異なる。
【００２３】
「プローブにより規定された断片」という表現に見られる「プローブにより規定された」とは、１つ又は複数の核酸（例えば、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド）が、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下、固体支持体（例えば、粒子混合物又はアレイ基材）に結合しているプローブ集合体とハイブリダイズさせることによって単離されたことを意味する。プローブにより規定された断片を単離することは、通常、（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下、）アレイに結合しない核酸を除外することになり、そのため、複雑度の低減した混合物に帰着する。アレイ上のプローブは、任意の所望の配列と結合するように選択することができ、通常、比較的複雑な断片（例えば、任意のソースから得られたゲノムＤＮＡ断片又は核酸断片であって、そこから複雑性の低減された断片セットを単離することが望まれるもの）の混合物から特定の断片を単離できるように選択し得る。
【００２４】
本発明は、複雑な核酸サンプルから、プローブにより規定された核酸断片を単離する一般的な方法を開示する。「エレメント規定による配列複雑度の低減化（ＥＤＳＣＲ）」と称す本発明の方法では、マイクロアレイ（複雑なゲノムサンプルから、規定された核酸断片混合物を単離し、増幅を促進するための、非常に多数にて存在する配列特異的なアフィニティー試薬）のような、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドを利用する。得られる、規定された断片混合物の用途としては、限定はしないが、例えば、ｉ）規定された複雑度を有するクローニングライブラリーの作製、ｉｉ）ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、ｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、ＳＮＰ遺伝子型決定法、及びメチル化状態分析をはじめとする配列分析用の核酸断片混合物の調製、並びにｉｉｉ）稀に又は新規に発現した遺伝子の発見及びｍＲＮＡスプライシング部位の変異の同定をはじめとする遺伝子発現分析、を挙げることができる。
【００２５】
断片の単離に用いるためのマイクロアレイ
「マイクロアレイ」には、核酸、特にオリゴヌクレオチドやその合成類似物（即ち、上で定義したオリゴヌクレオチド）等を有する、一次元、二次元又はほぼ二次元（同様に三次元）の構造を有するアドレス指定可能な領域（即ち、例えばスポット形態のフィーチャー）が包含される。マイクロアレイが核酸マイクロアレイである場合、核酸は、当該核酸鎖上の任意の箇所にて、アレイに吸着したり、即ち物理吸着したり、化学吸着したり、又は共有結合したりし得る。
【００２６】
基材は、当該基材の表面上に配置された、１つ、２つ、４つあるいはそれ以上のアレイを有し得る。用途に応じて、いくつか又は全てのアレイを同じとしたり、互いに異なるものとしたりすることができ、且つ各アレイは、複数のスポット（即ち、フィーチャー）を含むことができる。典型的なアレイは、２０ｃｍ２未満あるいは１０ｃｍ２未満（例えば約５ｃｍ２未満、約１ｃｍ２未満、約１ｍｍ２未満、１００μｍ２、あるいは、さらにそれよりも小さい）の面積内に、１つ又は複数の（例えば、２つを超える、１０を超える、１００を超える、１０００を超える、１００００を超える）フィーチャー、あるいは１０００００を超えるフィーチャーさえ含むことができる。例えば、フィーチャーは、１０μｍ〜１．０ｃｍの範囲の幅（即ち、円形スポットの場合、直径）を有し得る。他の実施形態では、各フィーチャーは、１．０μｍ〜１．０ｍｍ、一般的には５．０μｍ〜５００μｍ、より一般的には１０μｍ〜２００μｍの範囲の幅を有し得る。円形でないフィーチャーに関しては、上記の範囲の幅（直径）を有する円形スポットと同等の範囲の面積を有し得る。少なくとも幾つかの又は全てのフィーチャーは、異なる組成物で構成される（例えば、各フィーチャー組成物の重複部を全て排除した場合、残りのフィーチャーは、フィーチャー総数に対し、少なくとも５％、１０％、２０％、５０％、９５％、９９％又は１００％の割合を占めることができる）。各フィーチャーは通常、基材に結合した１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを含んで成る。いくつかのアレイでは、１つのフィーチャー当たり１つ又は複数のオリゴヌクレオチド（例えば、１フィーチャー当たり、２つの、３つの、少なくとも約５つの、少なくとも約１０の、少なくとも約５０の、少なくとも約１００の、又はそれ以上のオリゴヌクレオチド）を含むことができ、その場合、各オリゴヌクレオチドは、そのフィーチャーを構成する他のヌクレオチドとは異なる配列を有する。マイクロアレイは、最大１０００又はそれ以上の異なるプローブ（例えば、最大５０００又はそれ以上、最大１００００又はそれ以上、最大５００００又はそれ以上、あるいは最大１０００００又はそれ以上の異なるプローブ）を有し得る。フィーチャー間の領域は、（必ずではないが）典型的に、いかなる核酸（又はフィーチャーを構成する他の種類のバイオポリマーや化学成分）も有していない状態で存在する。このようなフィーチャー間の領域は、典型的に、試薬の滴下配置を伴う工程によりアレイを形成する場合には存在するが、例えば、フォトリソグラフィーアレイ製造法を用いる場合には存在しない場合がある。当然のことながら、フィーチャー間の領域は、それが存在する場合は、様々な寸法及び形態とし得る。
【００２７】
各マイクロアレイは、２００ｃｍ２未満、あるいは５０ｃｍ２未満、５ｃｍ２未満、１ｃｍ２未満、０．５ｃｍ２未満、若しくは０．１ｃｍ２未満の面積を被覆し得る。ある実施形態では、１つ又は複数のマイクロアレイを有する基材は、ほぼ直方体（他の形でもよい）の形状を有しており、その長さは、４ｍｍを超え１５０ｍｍ未満、一般的には４ｍｍを超え８０ｍｍ未満、より一般的には２０ｍｍ未満であり；その幅は、４ｍｍを超え１５０ｍｍ未満、一般的には８０ｍｍ未満、より一般的には２０ｍｍ未満であり；その厚さは、０．０１ｍｍを超え５．０ｍｍ未満、一般的には０．１ｍｍを超え２ｍｍ未満、より一般的には０．２ｍｍを超え１．５ｍｍ未満（例えば約０．８ｍｍを超え約１．２ｍｍ未満）である。蛍光を検出することにより読み取られるアレイを用いる場合、基材は、励起光を照射される際に低い蛍光を発する物質で構成することができる。また、この場合、集束レーザー光線が非常にゆっくりと領域上を移動する場合は、入射する照射レーザー光の吸収及びその結果起こる加熱を低減し得るように、基材は比較的透明とし得る。例えば、基材は、そのような照射光の総合スペクトルの全体にわたって、あるいは代替的に５３２ｎｍ若しくは６３３ｎｍにおいて測定する際に、表面へ入射する照射光のうち少なくとも２０％あるいは５０％（又は、少なくとも７０％、９０％若しくは９５％）を透過させ得る。
【００２８】
マイクロアレイは、ｉｎ  ｓｉｔｕ作成の場合は核酸前駆体ユニット（モノマーなど）の、又は予め得た核酸の、パルスジェットによる滴下配置を利用して製造することができる。このような方法は、例えば、米国特許第６，２４２，２６６号、第６，２３２，０７２号、第６，１８０，３５１号、第６，１７１，７９７号、第６，３２３，０４３号明細書、Ｃａｒｅｎらによる１９９９年４月３０日付け米国特許出願公開第０９／３０２，８９８号明細書をはじめとする前述の引用文献、並びにそれらの中で引用された参考文献に詳しく記載されている。既に述べたように、これらの参考文献は、参照することで本明細書に取り入れることとする。本明細書において前述したように、他の滴下配置法をアレイの製造に使用することができる。また、滴下配置法の代わりに、フォトリソグラフィーアレイ製造法を使用することもできる。特に、それらの特許明細書に記載されているようなフォトリソグラフィー法でアレイを製造する場合は、フィーチャー間の領域が存在する必要は無い。
【００２９】
特に興味深い特定の実施形態では、ｉｎ  ｓｉｔｕにて調製したアレイが用いられる。ｉｎ  ｓｉｔｕにて調製したオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（例えば核酸マイクロアレイ）は、フィーチャーとフィーチャー間領域との間で基材の表面特性が著しく異なることにより特徴付けることができる。詳細には、当該マイクロアレイは、表面エネルギーの高い親水性のフィーチャーと、表面エネルギーの低い疎水性のフィーチャー間領域とを有し得る。基材の所与の領域、例えばフィーチャーやフィーチャー間領域、が、高い表面エネルギーを有するか、低い表面エネルギーを有するかは、当技術分野で公知であり且つ同時係属中のＰｅｃｋらによる２００３年５月３０日付けの出願第１０／４４９，８３８号（参照することで当文献の開示内容を本明細書中に取り入れることとする）に記載されているように、その領域の水への“接触角”を測定することにより容易に判断することができる。本発明の特定の実施形態における、特に興味深いそのようなマイクロアレイフォーマットを形成するｉｎ  ｓｉｔｕ調製マイクロアレイの他の特徴としては、限定はしないが、以下が挙げられる：フィーチャー密度、各フィーチャー内のオリゴヌクレオチド密度、フィーチャー均一性、低いフィーチャー内バックグラウンド、例えば疎水性のフィーチャー間領域に起因する、低いフィーチャー間バックグラウンド、個々のフィーチャーを構成するオリゴヌクレオチド要素の正確性（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）、マイクロアレイ／フィーチャー再現性など。上記のｉｎ  ｓｉｔｕで製造されたマイクロアレイの利点は、高複雑度のサンプルに対応するのに必要とされる、ストリンジェントな条件下での操作において、適切な感度を維持する助けとなる。
【００３０】
本発明の方法は、化学成分が結合し得る表面を有する、その上にアレイが製造された（配置された）任意の固体支持体を用いて、実施することができる。当該固体支持体は、通常、配置される物質（例えば、プローブ及び固体支持体表面にある任意の化学修飾物）を支持することができ、且つ当該固体支持体が用いられる際に遭遇し得る配置プロセス条件並びに後段の任意の処理、操作、加工条件に耐える、材料から構成されるであろう。適切な固体支持体には、種々の形態及び組成のものを用いることができ、それは、天然材料、合成的に修飾された天然材料、又は合成材料から作製し得る。適切な材料としては、限定はしないが、ニトロセルロース、ガラス、シリカ、テフロン、及び金属（例えば、金、白金など）を挙げることができる。適切な材料として、また、プラスチック（例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、及びそれらの混合物など）；アガロース（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社からＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）として市販されているもの）及びデキストラン（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社からＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）という商品名で市販されているもの）などの多糖類；ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシルエチルメタクリレート−メチルメタクリレートコポリマーなどの高分子材料も挙げられる。
【００３１】
以下、主に、マイクロアレイを用いたＥＤＳＣＲに関して、本発明の実施形態を説明する。しかしながら、特定の実施形態では、粒子混合物（各粒子が、マイクロアレイのフィーチャーに類似する規定されたオリゴヌクレオチドプローブを担持しており、ここでは、各粒子がマイクロアレイのフィーチャーに相当する）を用いてＥＤＳＣＲを実施することもできることを理解されたい。マイクロアレイを構成する全てのエレメントは、粒子混合物設計（フィーチャー密度（混合物中の粒子の数）の点で）、及び標的核酸に対するプローブの長さ及び位置について適合させることができる。粒子は、本発明の方法に適合し且つプローブ結合面をもたらす、任意の材料から作製し得る。
【００３２】
以下、本発明による、プローブにより規定された核酸断片を核酸サンプルから単離する方法について説明する。当該方法は、核酸サンプルから核酸断片を得るステップを包含する。次にハイブリダイゼーション反応（プローブの結合した固体支持体に前記核酸断片を接触させ、プローブを介して前記固体支持体上に相補的な断片を保持させるステップを含む）を実施するステップを包含する。当該方法は、さらに、プローブにより規定された核酸断片を回収するステップを包含し、この場合、該回収ステップには、相補的な断片を固体支持体から分離するステップが含まれる。以下、本発明の方法を、図面を参照しながら説明する。
【００３３】
図１を参照すると、本発明の一実施形態が記載されている。図１では、一般的なＥＤＳＣＲ工程は、核酸断片を得るステップを包含する。記載する実施形態では、核酸断片を得るために、例えばゲノムＤＮＡ試料１０２などの核酸試料を設ける。本発明の方法は、多数のソース（限定はしないが、例えば、ｉ）組織、血液、全細胞から得られたゲノムＤＮＡ、ｉｉ）組織、血液、全細胞から得られた病原体ＤＮＡ、ｉｉｉ）ウイルス又はファージＤＮＡ、ｉｖ）クローンＤＮＡライブラリー、ｖ）合成ＤＮＡライブラリー、ｖｉ）（処理前後の）ｍＲＮＡを含むＲＮＡの逆転写から得られるｃＤＮＡ、ｖｉｉ）固体支持体に結合したプローブにハイブリダイズし得る他の任意の複雑な核酸混合物ソース）から得られた核酸試料に関して実施することができる。
【００３４】
図１記載の方法は、核酸断片を得るために、以下のように実施される。記載の実施形態では、ゲノムＤＮＡ試料１０２を断片化して（矢印１０４で示す）、断片化ゲノムＤＮＡ１０６を得る。断片化１０４は、後段ステップの具体的要件に応じて、機械的又は酵素的な方法により実施し得る。例えば、後段ステップが、その境界位置が規定されている必要がないランダムな断片に適合するものであれば、各種の酵素的又は機械的なランダム断片化法を採用することができる。当該断片化法としては、ＤＮａｓｅ  １による処理や、規定されたゲージのシリンジを用いた剪断、噴霧又は超音波処理が挙げられる（例えばＤａｖｉｄｓｏｎ，Ｐ．Ｆ．による、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４５，１５６０（１９５９）；Ｓｃｈｒｉｅｆｅｒらによる、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，７４５５（１９９０）、Ｃａｖａｌｉｅｒｉ及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇによる、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８１，５１３６（１９５９）参照）。しかしながら、後段ステップによっては、断片の位置を規定することが必要となる。この場合には、ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼにより消化する。制限エンドヌクレアーゼの選択に応じて、断片化ＤＮＡは、平滑末端を有したり、３’−又は５’−の突出末端を有したりし得る。制限エンドヌクレアーゼの選択及び使用に関しては、本発明の属する技術分野の当業者には明らかであろう。制限エンドヌクレアーゼを用いる際は、最終消化混合物中の断片の平均長は、用いる酵素に依存する。例えば、長さ６塩基の認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼＤＮＡを用いて消化する場合（４６＝４，０９６−ｍｅｒ）と比較して、長さ４塩基の認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼは、平均して、ＤＮＡをより小さい断片（４４＝２５６−ｍｅｒ）へと消化する。
【００３５】
所望の用途に応じて、実験計画を構築する際に、多数の相互依存する因子を考慮する必要がある。これらの因子としては、最初の核酸サンプルの核酸配列の複雑度、所望する配列複雑度低減化の程度、マイクロアレイ上のフィーチャー数、プローブの長さ、並びに複雑度の低減化された最終的な断片混合物が用いられる特定の用途、が挙げられる（下記参照）。ほとんどの実施形態において、平均的な断片長は５０〜２０，０００ヌクレオチドである必要があり、より典型的には１００〜２，０００ヌクレオチドである必要がある。一般に、短い断片ほど、任意の非特異的相互作用及び断片間相互作用が減少するため、より高いハイブリダイゼーション特異性をもたらすであろう。しかしながら、特定のゲノム領域が、対象とする領域において若しくはその近傍において、プローブハイブリダイゼーション部位の役目を果たすのに十分な固有配列を有していない場合には、対象とする領域内に固有の部位が存在するように平均断片長を増加させることが必要であろう。例えば、ヒト遺伝子におけるエクソンの平均長は、わずか１２０塩基対である。もし全ヒトゲノムの複雑度を有するサンプルから、規定されたエクソンを単離することを対象とする用途の場合には、必要とされる特異性を有するプローブハイブリダイゼーション部位が１２０塩基対の標的部位範囲内に存在する確率はそう高くないと思われる。従って、エクソンからいくらか離れた位置にあるプローブを用いて、当該エクソンを標的とすることが必要であり、それに伴って、平均断片長を増大させることが必要となる。
【００３６】
図１記載の実施形態では、断片化１０４によって得られる断片化ゲノムＤＮＡ１０６は、「中間体断片」（即ち、それらは本発明の次なる部分で使用される前に、さらなる処理に付される）である。断片化後、当該中間体断片の末端に、規定されたプライマー又はユニバーサルプライマー部位を導入することが望ましい。これは、ＤＮＡリガーゼを用いて、上記ゲノム断片の末端に２本鎖ＤＮＡアダプター２重鎖を連結することにより達成される（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓによる、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＵＳＡ（１９８９）参照）。断片を生成するために制限エンドヌクレアーゼを用いる実施形態では、アダプター２重鎖（アダプター２本鎖）は、ゲノム断片混合物の付着末端に適合する付着末端を有し得る（Ｓａｉｋｉらによる、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０（１９８５）；及びＬｕｃｉｏらによる、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５；４４８７（１９９８）参照）。図１記載の実施形態では、これらの中間体断片（断片化ゲノムＤＮＡ１０６）をＤＮＡアダプター２本鎖１１２と連結し（矢印１１４で示す）、アダプター２本鎖が末端となる断片１１６を得る。図１記載の実施形態では、連結により得られる、アダプター２本鎖が末端となっている断片１１６が核酸断片となる。
【００３７】
特定の実施形態では、アダプター２本鎖１１２は、単離された全ての断片を増幅（後段ステップ）させるためのプライマー部位として機能するのに十分な長さの固有配列エレメントを含み得る。アダプター２本鎖内の当該プライマー部位の長さは、配列の複雑度及び／又は制限酵素により消化された消化混合物の組成によって決まり、好ましくは１０〜３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態に関しては（下記参照）、アダプター２本鎖に、（最初のステップにおいてゲノム断片を生成するために用いられる）制限エンドヌクレアーゼの認識部位が含まれることが好ましい。アダプター２本鎖上のこの制限エンドヌクレアーゼ認識部位の配列は、当該アダプターがゲノム断片混合物と連結されると、ゲノム混合物を消化するのに用いられた部位が破壊されるようなものとし得る（Ｋｅｉｔｈらによる米国特許第５，０９３，２４５号参照）。ある実施形態では、上記プライマー部位は、定温増幅法において用いるための他の制限及び／又は切断（ｎｉｃｋｉｎｇ）エンドヌクレアーゼ部位も含む。いくつかの実施形態では、アダプター２本鎖はまた、識別配列含有断片を同定したり、又はより複雑な断片混合物から得られるタグ配列含有断片の単離を促進するために用い得る、識別配列又はタグ配列を含むこともできる。タグ配列を含む断片を単離するためには、アフィニティー分離技術（タグ配列を含む断片を、（タグ配列と）相補的なタグ認識配列の結合したアフィニティー充填材に接触させ、次いでこのタグ配列を含む断片を溶出させてなる）を採用することができる。ある実施形態では、アダプター２本鎖はまた、当該アダプターを含む断片を基材表面に結合させ得る反応性成分を有し得る。当該反応性成分としては、ビオチン、活性アミン、アルデヒド、エステルなどが挙げられる。このような実施形態においては、基材表面は、典型的に、アダプター２本鎖の反応性成分と反応するための相補的な活性成分を有する。
【００３８】
アダプター２本鎖１１２が中間体断片（例えば、断片化されたゲノムＤＮＡ１０６）と連結される実施形態では、残存する未連結のアダプター２本鎖１１２を連結反応混合物から除去して、２本鎖が末端となる断片１１６を高純度化（精製）することが好ましい。これは、前記連結反応混合物を、適切な分画分子量を有するゲル濾過カラム又はフィルター膜を通過させることにより、達成し得る。アダプター含有断片はまた、例えばタグ配列のような、アダプター２本鎖内の共通配列に対し相補的なオリゴヌクレオチドプローブを含有するアフィニティー基材（例えばゲル又は粒子）によっても精製することができる。このような精製を採用する実施形態では、この精製により得られる、２本鎖が末端となっている断片１１６が核酸断片となる。
【００３９】
このように、本発明の方法は、図１記載の実施形態に関して述べたように、核酸断片を得るステップを包含する。特定の実施形態では、核酸断片には、上述のアダプター２本鎖で終端された断片（即ち、アダプター２本鎖が末端に位置する断片）が含まれ得る。特定の実施形態では、核酸断片は、核酸サンプルを断片化することにより本質的に得ることができ、それによって、（アダプター２本鎖を添加することなく）核酸断片を得ることができる。
【００４０】
本発明の一実施形態では、プローブにより規定された核酸断片を単離する方法は、上記の核酸断片を得るステップの後に、ハイブリダイゼーション反応を実施するステップを包含する。ハイブリダイゼーション反応を実施するステップは、プローブの結合した固体支持体に前記核酸断片を接触させ、プローブを介して前記固体支持体上に相補的な断片を保持させるステップを包含する。典型的な実施形態では、プローブの結合した固体支持体に核酸断片を接触させる前に、核酸断片のプローブへのハイブリダイゼーションを促進するために、前記核酸断片を変性させる。当該核酸断片は、任意の適切な方法（例えば、９５℃にて１０分間加熱した後に迅速に冷却することで２本鎖断片を変性させるか、又は弱塩基（ｐＨ１０）により処理した後に中和して、エタノール沈殿させる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓによる、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＵＳＡ（１９８９）参照））により変性させることができる。
【００４１】
次いで、予め規定されたオリゴヌクレオチドプローブセット（サンプルから単離すべきＤＮＡ断片に対し相補的な配列を有する）を含んで成るマイクロアレイにハイブリダイズさせることによって、変性された断片混合物をその構成分子に分ける。図１記載の実施形態を再び参照して、上記のようにして得られた核酸断片（２本鎖が末端に位置する断片１１６）を、プローブ１２２の結合した固体支持体１２０に接触させ（矢印１２４で示す）、プローブ１２２を介して固体支持体上に相補的な断片１２６を保持させる。「相補的な断片」とは、ハイブリダイゼーション反応時のハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件に付されている間に、固体支持体上のプローブに特異的にハイブリダイズし且つ固体支持体上に保持される、核酸断片をいう。
【００４２】
ハイブリダイゼーション反応を実施するために使用されるハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、必要とされるハイブリダイゼーション特異性を提供するために選択される。ハイブリダイゼーション及び洗浄の厳密性は、典型的には、マイクロアレイプローブとそれらに相補的な断片との間の安定なハイブリダイゼーションを提供するために選択され、一方で、あらゆる非特異的なプローブ−断片相互作用及び、より高度な要求としての断片−断片間の相互作用を脱安定化するために選択される。
【００４３】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳを含んで成るバッファー中で４２℃にて行うハイブリダイゼーション、又は５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳを含んで成るバッファー中で６５℃にて行うハイブリダイゼーションがあり、両者とも０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを用いて６５℃にて洗浄を行う。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としてはまた、４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、及び１％ＳＤＳを含んで成るバッファー中で３７℃にてハイブリダイゼーションを行い、１×ＳＳＣを用いて４５℃にて洗浄を行うものも挙げられる。
【００４４】
あるいはまた、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、６５℃にて、フィルターに結合させたＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６８℃にて洗浄を行うことも採用し得る。さらに他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、６０℃以上にて、３×ＳＳＣ（４５０ｍＭの塩化ナトリウム／４５ｍＭのクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、又は４２℃にて、３０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５％サルコシンナトリウム、５０ｍＭ ＭＥＳを含んで成るｐＨ６．５の溶液中で、インキュベーションすることが挙げられる。同様のストリンジェントな条件をもたらすために、代わりの匹敵するハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件を利用し得ることは、当業者には容易に理解されよう。
【００４５】
ハイブリダイゼーションの特異性は、ハイブリダイゼーション混合物中に種々のキャリアーＤＮＡ及び／又はキャリアーＲＮＡを含有させることでさらに促進される。最初の断片混合物中に固有のプライマーを組み込むことにより、ハイブリダイゼーション緩衝液中に種々のキャリアー核酸やブロッキング用核酸を適度な量にて取り込むことが可能になる。何故なら、最終的な溶出液（下記参照）中に存在するキャリアー核酸は、ＥＤＳＣＲ工程の最終ステップにおいて増幅されることも、断片混合物が用いられることになる後段ステップに干渉することもないからである。例えば、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ及び／又はランダムなＮ−ｍｅｒ（例えば、ランダムな２５−ｍｅｒ）のオリゴヌクレオチドを、０．０５〜０．５μｇ／ｍＬの範囲の濃度にてハイブリダイゼーション混合物中に含有させることができる。
【００４６】
あるいはまた、ハイブリダイゼーション混合物に、酵母やＥ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡなどのＲＮＡを、０．０５〜０．５μｇ／ｍＬの濃度にて含有させることができる。この場合、残存するキャリアーＲＮＡは、ＤＮＡａｓｅを含まないＲＮＡａｓｅで上記試料を処理することにより容易に除去できる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓによる、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＵＳＡ（１９８９）参照）。また、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により得られるＲＮＡ相当物に置き換えることができ、これは、上述のように、ＤＮＡａｓｅを含まないＲＮＡａｓｅによりサンプルを処理することで容易に除去できる。
【００４７】
典型的な実施形態では、図１に記載するように、核酸断片（例えば断片化ゲノムＤＮＡ１０６）を、プローブ１２２の結合した固体支持体１２０に接触１２４させた後、非特異的に結合した断片１３２を固体支持体１２０から洗浄（矢印１３４で示す）除去する。
【００４８】
洗浄条件は、ハイブリダイゼーション反応に、所望のレベルの特異性をもたらすように選択される。洗浄条件としては、例えば、塩濃度約０．０２モル、ｐＨ７、温度少なくとも約５０℃、又は約５５℃〜約６０℃；又は、約０．１５Ｍ ＮａＣｌの塩濃度、７２℃、約１５分間；又は、約０．２×ＳＳＣの塩濃度、温度少なくとも約５０℃、又は約５５℃〜約６０℃、約１５〜約２０分間；又は、ハイブリダイゼーション複合体を、０．１％ＳＤＳを含む塩濃度約２×ＳＳＣの溶液を用いた、室温、１５分間の洗浄を２回行い、次いで０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣを用いた、６８℃、１５分間の洗浄を２回行う；又は、同等の条件、を挙げることができる。洗浄のためのストリンジェントな条件はまた、例えば、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、４２℃である。
【００４９】
固体支持体からの溶出に次いで、断片を増幅することができる（下記参照）ため、ハイブリダイゼーションステップ及び洗浄ステップは、所望の相補的な断片のいくつかを洗浄除去するという犠牲を払って、特異性に関し最適化することができる。これは、非常に高密度のマイクロアレイ（１ｃｍ×１ｃｍの領域内に〜５０，０００個のフィーチャーを有する）においても、各フィーチャーの寸法は、各フィーチャー内の多数のプローブ分子（１μｍ２当たり１０，０００〜１００，０００個のプローブ分子）が非常にストリンジェントな条件下でも十分に多くの断片分子をハイブリダイズした状態に維持し得るようなものであるため、可能である。
【００５０】
図１記載の実施形態では、核酸断片のハイブリダイゼーション反応を実施するために、マイクロアレイを用いているが、ハイブリダイゼーション反応は、マイクロアレイの代わりに、プローブの結合した粒子の混合物を固体支持体に用いて実施することもできる。このような実施形態では、反応条件及びその他の実験パラメータの調整は、本発明の属する分野の当業者であれば容易に行えるであろう。
【００５１】
このように、本発明による方法は、プローブの結合した固体支持体に核酸断片を接触させ、上述のようにプローブセットを介して固体支持体上に相補的な断片を保持させるステップを含む、ハイブリダイゼーション反応を実施するステップを包含する。核酸断片は、プローブに接触させる前に変性することができる。特定の実施形態では、ハイブリダイゼーション反応は、上記のように、ストリンジェントな条件下で実施する。ある実施形態においては、上記のように、核酸断片をプローブに接触させる前に、種々のキャリアーＤＮＡ及び／又はキャリアーＲＮＡを核酸断片に添加する。
【００５２】
本発明の一実施形態では、プローブにより規定された核酸断片を単離する方法は、ハイブリダイゼーション反応を実施するステップの後に、プローブにより規定された核酸断片を回収するステップを包含する。プローブにより規定された核酸断片を回収するステップは、固体支持体から相補的な断片を分離させるステップを含む。再度図１を参照すると、図示した実施形態では、ハイブリダイゼーション反応（接触１２４及び洗浄１３４を含む）を実施した後、固体支持体１２０上に保持された相補的な断片１２６を分離し（矢印１４４で示す）、固体支持体１２０から溶液中に遊離した相補的な断片１４６を得る。
【００５３】
固体支持体から相補的な断片を遊離させ、相補的な断片を回収するために有用であるところの任意の方法を用いて、固体支持体か相補的な断片を分離させるステップを実施することができる。一実施形態では、固体支持体から相補的な断片を分離させるステップは、固体支持体からの相補的な断片の遊離に効果的な条件下で、溶出バッファーを用いて相補的な断片を溶出させ、相補的な断片を含む溶出液を回収するステップを含む。相補的断片を遊離させるのに効果的な条件には、典型的には、温度及び／又はｐＨが高く、塩濃度の低いバッファー中で、固体支持体を洗浄することが含まれる。これには、限定はしないが、７０〜９５℃の温度の、０．５×ＴＥ（ｐＨ８〜９．５）、０．０５×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳを含むバッファー条件が含まれる。相補的な断片を効果的に溶出させるべく、典型的には、ホルムアミドや尿素などの変性剤が、溶出バッファー中に含有されるであろう。
【００５４】
他の実施形態では、固体支持体から相補的な断片を分離させるステップは、アレイからプローブを解離させて溶液中に相補的な断片を遊離させ、そして相補的な断片を含む溶出液を回収するステップを含む。一実施形態では、マイクロアレイを塩基性溶液（ｐＨ〜１０）で処理することにより、ガラス製マイクロアレイ基材などの固体支持体からプローブを解離させ、その後その溶液を中和し、エタノール沈殿させることにより、相補的な断片を回収する。ある実施形態では、プローブは、化学的に開裂可能な成分を介して個体支持体に結合されており、前記化学的に開裂可能な成分は、ハイブリダイゼーション反応実施後に開裂して、固体支持体からプローブを遊離させる（相補的な断片も遊離させる）。ＤＮＡ断片はまた、固体支持体のフィーチャー含有領域（例えば、マイクロアレイ）をまず単離し、当該マイクロアレイを粉体へと粉砕し、次いでその断片含有粉体をそのまま断片増幅反応（下記）又は所望の後段ステップに用いることで、得ることができる。
【００５５】
特定の実施形態では、固体支持体から分離された相補的な断片は、さらに処理されることなく、プローブにより規定された核酸断片をもたらす。その他の実施形態では、プローブにより規定された核酸断片を回収するステップは、プローブにより規定された核酸断片をもたらすべく、相補的な断片をさらに処理するステップを含む。図１記載の実施形態では、相補的な断片をさらなる処理（矢印１５４で示す）に付し、プローブにより規定された核酸断片１５６を得る。核酸を操作する各種方法が、当業者に知られている。相補的な断片を処理し、プローブにより規定された核酸断片をもたらすことに適合するような核酸の操作方法を、本明細書中に記載の相補的な断片のさらなる処理ステップにおいて採用し得る。ある実施形態では、このさらなる処理として、固体支持体から分離された相補的な断片の高純度化（精製）を挙げることができる。当該実施形態では、プローブにより規定された核酸断片を回収するステップは、さらに、固体支持体から相補的な断片を分離した後に、プローブにより規定された核酸断片を得るために、相補的な断片を精製するステップを含む。相補的な断片の精製は、沈殿（例えば、高塩濃度条件下でのエタノール沈殿）、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又はプローブにより規定された核酸断片を得るための相補的断片の精製に適合する任意の他の好適な方法をはじめとする、任意の方法を用いて達成することができる。いくつかの実施形態では、精製した断片をさらに増幅反応において増幅するか、又はプローブにより規定された核酸断片を必要とする用途にそのまま用いることができる。
【００５６】
プローブにより規定された核酸断片を回収するステップが、相補的な断片のさらなる処理ステップを含むような実施形態の幾つかにおいては、そのさらなる処理ステップには、相補的な断片を増幅させるステップが含まれる。このような実施形態では、プローブにより規定された核酸断片を回収するステップは、固体支持体から相補的な断片を分離させた後に、相補的な断片を増幅させ、プローブにより規定された核酸断片を得るステップをさらに包含する。ＰＣＲ、ＬＣＲ又は定温増幅（Ｗａｌｋｅｒらによる、Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９；３９２（１９９２）参照）をはじめとする、多数の標準的なプライマー依存型の（即ち、プライマーを用いる）任意の増幅方法を、相補的な断片を増幅させるために用いることができる。プライマー依存型の増幅（例えば、ＰＣＲ）に用いるプライマーは、典型的には、上記のように、連結反応時に断片末端に連結されるアダプター２本鎖に組み込まれたプライマー部位に対し相補的である。定温増幅法を用いる場合には、制限エンドヌクレアーゼ及び／又は切断エンドヌクレアーゼ部位が、アダプター配列内に組み込まれるであろう（上記参照）。
【００５７】
特定の実施形態では、本発明の方法は、プローブにより規定された核酸断片を提供する。本明細書に記載の方法により単離される、プローブにより規定された核酸断片の特性は、典型的に、多数の因子（試料ソース、固体支持体に結合したプローブの数及び特性、ハイブリダイゼーション条件や洗浄条件、並びにその他の因子）に依存する。本明細書の開示内容に基づけば、これらの要素を調べ、本発明による方法を実施することは、過度の負担無く当業者が実施し得る範囲である。典型的な実施形態では、プローブにより規定された核酸断片は少なくとも５個の異なる核酸断片（例えば、少なくとも１０個の異なる核酸断片、少なくとも５０個の異なる核酸断片、少なくとも１００個の異なる核酸断片、少なくとも５００個の異なる核酸断片、少なくとも１０００個の異なる核酸断片、少なくとも５０００個の異なる核酸断片、又はそれ以上）を含む。ある実施形態では、プローブにより規定された核酸断片は、最高約１００，０００個又はそれ以上（例えば、約５０，０００個までの異なる核酸断片、約１０，０００個までの異なる核酸断片、約５００００個までの異なる核酸断片、又はそれ以上、）の異なる核酸断片を含む。
【００５８】
従って、本発明の方法の一実施形態では、当該方法は、ハイブリダイゼーション反応実施後に、固体支持体から相補的な断片を分離させるステップを含む方法を用いて、プローブにより規定された核酸断片を回収するステップを包含する。上記のように、特定の実施形態では、固体支持体から相補的な断片を分離させるステップは、溶出バッファーを用いて断片を溶出させるステップや、固体支持体からプローブを解離させて相補的な断片を遊離させるステップを含む。ある実施形態では、固体支持体から相補的な断片を分離させた後に、それらを、プローブにより規定された核酸断片をもたらすために精製及び／又は増幅することができる。
【００５９】
特定の実施形態では、必要とされる断片プールの純度及び／又は最初のサンプルの配列複雑度や最終的な混合物の所望の配列複雑度に応じて、ＥＤＳＣＲ工程を複数回繰り返し行うことができる（例えば、２回、３回、４回、５回又はそれ以上）。ＥＤＳＣＲ工程は、規定された一群のマイクロアレイを用いて逐次的に実施することができる（この場合、規定された一群のマイクロアレイの各構成要素は、（逐次的実施における）前のマイクロアレイに由来する規定されたプローブのサブセットを含む）。
【００６０】
ある実施形態では、本発明は、プローブにより規定された核酸断片を回収するステップの後に、第２のハイブリダイゼーション反応を実施するステップをさらに包含する。第２のハイブリダイゼーション反応では、プローブにより規定された核酸断片を、第２のプローブセットの結合した第２の支持体に接触させ、第２のプローブセットを介して前記第２の支持体上にプローブにより規定された核酸断片を保持させる。第２のハイブリダイゼーション反応を実施する実施形態においては、本発明の方法は、前記第２の支持体に保持されている、プローブにより規定された核酸断片を分離させるステップをさらに包含する。
【００６１】
典型的な実施形態では、第２の支持体上に保持されている、プローブにより規定された核酸断片を、ストリンジェントな条件下で、第２のプローブにハイブリダイズさせる。そして典型的には、第２の支持体上に保持されている、プローブにより規定された核酸断片を、ストリンジェントな条件下で洗浄し、非特異的結合断片を除去する。第２の支持体上に保持されている、プローブにより規定された核酸断片を、第２の支持体から分離させることで、第２のプローブセットにより規定された、プローブにより規定された核酸断片がもたらされる（即ち、第２のプローブセット中のプローブは、第２の支持体から分離される、プローブにより規定された核酸断片に「プローブにより規定された」という特徴をもたらすプローブである）。この第２の支持体には、固体支持体と本質的に同一の形態及び同一の組成のものを用いることができ、又は固体支持体に関して本明細書に開示した他の任意の形態及び組成を有するものを用いることができる。第２のプローブセットは、典型的には、固体支持体に結合したプローブのサブセットとし得る。第２のプローブセットは、典型的には、固体支持体から分離されたプローブにより規定された核酸断片に比して、第２の支持体から分離されるプローブにより規定された核酸断片の配列複雑度を低減させることができる。
【００６２】
上記のように、ＥＤＳＣＲ工程は、例えば、３回、４回、５回又はそれ以上複数回繰り返し実施することができる。このような実施形態では、本発明の方法はそれぞれ、第３のプローブセットの結合された第３の支持体、結第４のプローブセットの結合された第４の固体支持体、及び第５のプローブセットの結合された第５の固体支持体へのハイブリダイゼーション反応を実施するステップを包含する。各プローブセットは、典型的には、その前までに実施された繰り返し工程に由来する、減少したプローブセットを含む。このような実施形態では、プローブの結合した固体支持体に関して先に述べたものに類似の条件及び成分が適用され、当該実施形態の方法を実施することも、当然、本発明の範囲内である。
【００６３】
マイクロアレイのプローブ設計における留意点
ヌクレオチドの長さ及びマイクロアレイのプローブ数（フィーチャー密度）は、最初の試料混合物の配列複雑度、全体の平均断片長、及び複雑度の低減されたサンプルが用いられることになる後続ステップの要件をはじめとする、種々の点に依存するだろう。例えば、ＥＤＳＣＲプローブは、特定の「標的タイプ」（コード領域、転写調節領域、イントロン、イントロン−エクソン結合領域、メチル化部位、組換え部位及びその他の領域など）について精査し得るように設計することができる。
【００６４】
各後続ステップ（ライブラリー作製、配列分析等）や特定の標的タイプによって、プローブ設計にあたっての用途に関する基準又は配列エレメントに関する基準がもたらされるであろうが、いくつかの一般的な留意点が存在する。プローブの長さは、サンプルの配列複雑度の限界範囲内において、特異的なハイブリダイゼーションをもたらすのに十分である必要がある。好ましい実施形態では、プローブの長さは、１０〜１００ヌクレオチドであり、より好ましくは２０〜６０ヌクレオチドである。ランダムな断片群又は規定された制限断片のどちらに関しても、各プローブの正確な位置や長さは、塩基対形成特異性及び安定性、内部プローブや断片の構造、繰り返しエレメント及び潜在的変性（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を明らかにする、標準の一般的に認められている設計法を用いて決めることができる。
【００６５】
プローブに相補的な領域内部に既知及び未知のヌクレオチド変異（例えば、ＳＮＰｓ、欠失及び挿入）を有する断片を単離することができるように（下記参照）、プローブは、多くの用途において、あまりに特異的でありすぎないようにすることが望ましい。ヒトゲノム中の１ヌクレオチド変異の割合は、約１／１２５０と見積もられている（Ｖｅｎｔｅｒ，Ｃ．Ｊらによる、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１，１３０４（２００１）参照）。例えば、２０塩基からなるプローブは、ヒトゲノムの配列複雑度に等しい配列複雑度を有する混合物内で必要な断片特異性を確保するのに十分であり得る。しかしながら、標的断片の相補的領域内に１つのヌクレオチドの変異、欠失及び挿入が存在する場合、必要とされる断片特異的な厳密性における安定なハイブリダイゼーションが妨げられ得る。対照的に、６０塩基からなるプローブは、必要とされる断片特異的な厳密性を有する一方、いくつかのミスマッチ及び／又は欠失を許容し、それによって上記断片内の任意の位置における未知の変異を有する断片の単離を可能にするだろう。
【００６６】
最初のサンプル混合物の全体的な断片の長さ及びマイクロアレイのフィーチャー密度の両者によって、本発明の方法を用いて単離される、プローブにより規定された核酸断片の最終混合物の配列複雑度が決まるであろう。５００，０００，０００塩基対に近い配列複雑度を有する試料混合物に関し、マイクロアレイ構成を用いることで、１塩基ヌクレオチド特異性を達成し得ることが確認されている（Ｋｅｎｎｅｄｙらによる、Ｎａｔ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．２１；１２３３（２００３）参照）。さらに、各種のマイクロアレイを用いた最近のＣＧＨ実験によって、ヒトゲノム全体（３．２×１０９塩基対）の配列複雑度に等しい配列複雑度を有するサンプルにおいて、断片特異的なハイブリダイゼーションを達成し得ることが示されている（Ｂｒｕｈらによる、２００３年１２月２２日付けの米国特許出願第１０／７４４５９５号参照）。よって、ＥＤＳＣＲは、ヒトゲノム全体の（又はそれに相当する）配列複雑度を、個々のエレメントにより規定された、より低い配列複雑度にまで低減させるのに有用である。
【００６７】
好ましい実施形態では、マイクロアレイは、１００〜５００，０００のプローブ（フィーチャー）を有し、そこでは、各プローブは、試料混合物内の規定された断片群に相補的な配列エレメントを含んで成る。プローブの数は、最初の試料の配列複雑度や、所望の配列複雑度低減化の程度、及び断片混合物が用いられることになる後続ステップに依存するだろう。
【００６８】
一例として、規定された遺伝子群に対応する一群の断片をヒトゲノムサンプルから単離し得るようにアレイを設計することができる。エクソン及びイントロンを含むヒト遺伝子の平均全長は１４，０００塩基対である。しかし、エクソンの長さの範囲はたった数塩基対から５００塩基対の幅でしかなく、エクソンの平均長は〜１２０塩基対にすぎない。１遺伝子当たりのエクソンの平均数は約７であり、これは、平均しておよそ１，０００塩基対のコード領域を与える（Ｌａｎｄｅｒ  Ｅ．Ｓらによる、Ｎａｔｕｒｅ，４０９，８６０（２００１）参照）。この平均的遺伝子構造を考慮すると、平均的遺伝子１つ当たりの最小のプローブ数は、（各エクソンに１つとした場合の）７となる。しかしながら、イントロン−エクソン境界を含む遺伝子全体を確実に捕捉するのに十分な余剰部を有することが好ましい。またゲノム２本鎖の両方の鎖にプローブを含有させることが望ましい。即ち、遺伝子の規定されたコード領域を捕捉するための好ましい実施形態では、平均的な遺伝子１つ当たりのプローブ数は、必要とされる保証範囲に応じて、７〜３０となるであろう。このようにして、１００，０００個の規定されたプローブ（１遺伝子当たり３０個）を有するマイクロアレイを用いて、ヒトゲノムから３，０００を超える遺伝子を捕捉することができる。これはヒトゲノムの全コード領域の約１０％に相当する（Ｌａｎｄｅｒ  Ｅ．Ｓらによる、Ｎａｔｕｒｅ，４０９，８６０（２００１）；Ｖｅｎｔｅｒ，Ｃ．Ｊらによる、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１，１３０４（２００１）参照）。同様にして、〜１０，０００個のフィーチャーしか持たないより小型のマイクロアレイを用いて、〜３００の遺伝子（１遺伝子当たりのプローブ数によっては、それ以上）のコード領域を捕捉することができる。
【００６９】
特定のアレイ設計のその他の例には、規定された発現遺伝子群（ｍＲＮＡｓ）を生物学的試料から単離することを対象としたものがあるであろう。この場合、プローブは、ｍＲＮＡ混合物から生じる、規定されたｃＤＮＡ群を対象とするであろう。好ましい実施形態では、このｃＤＮＡは、全長コピーであろう。このｃＤＮＡは、イントロンが間に入っていない連続的なエクソン群を含んでなり、それ故、約１，０００ヌクレオチドの平均長を有するであろう（Ｌａｎｄｅｒ  Ｅ．Ｓらによる、Ｎａｔｕｒｅ，４０９，８６０（２００１）参照）。１遺伝子当たりのプローブ数は、従って、最初のＤＮＡサンプルの配列複雑度及びｃＤＮＡ混合物が断片化される程度に依存することになる。ｃＤＮＡ当たりのプローブの最小数は１であるが、より好ましくは３であり、最も好ましくは６である。即ち、遺伝子当たりのプローブ数が６の場合、１００，０００プローブを有するマイクロアレイを用いることで、１５，０００を超えるｃＤＮＡ種を単離でき、これは所与の時期に細胞中で発現する現実のｍＲＮＡ種の数に相当する。先述のように、プローブ数並びに所望のゲノム領域に関するそれらの位置は、最初のサンプルの配列複雑度の範囲内において、特異的ハイブリダイゼーションをもたらし得る能力により左右される。
【実施例】
【００７０】
本発明を実践するにあたり、別途明確に指示のない限り、合成化学、生化学、分子生物学などにおける従来技術を採用することとし、それは、当業者であれば容易に選択できるであろう。そのような技術は、文献において十分に説明されている。
【００７１】
以下の実施例は、本明細書において説明し、特許請求する方法の実施の仕方を当業者により完全に記載し説明するために提示するものである。数値（量、温度等）に対しては正確性を確保する努力を払っているが、いくらかの誤差及び偏差は含まれ得る。別途指示しない限り、割合は重量比であり、温度は℃、圧力は大気圧あるいは大気圧近傍とする。標準的な温度及び圧力は、２０℃、１気圧である。
【００７２】
遺伝子変異を発見するためのＥＤＳＣＲ
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）は、複雑な形質や疾患を特定の遺伝的対立因子に関連付けるための、有用な遺伝子マーカーである。ゲノムワイドな（ゲノム全体にわたる）関連性の研究は、通常、全ての又はたいていの民族において比較的よくみられる（＞１０％）共通のＳＮＰｓ群に依存している。しかしながら、多くの疾患を引き起こす対立因子、即ち、疾患に関連する対立因子は、全集団の中では稀であり、特定の民族や、特定の集団、近縁の家族に限定的であることが次第に明らかになってきた。
【００７３】
Ｆａｈａｍと共同研究者ら（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１０：１６５７−１６６４（２００１））は、ＤＮＡ配列変異を高スループットでスキャンし得る有用な方法を開発している。「ミスマッチ修復検出（ＭＲＤ）」と称されるこの方法は、個々のプールに由来する予め規定された一群のゲノム断片について、参照用の標準試料に対し変異配列を含む断片のみを選択するために、Ｅ．ｃｏｌｉのミスマッチ修復システムを利用している。ＭＲＤは、配列変異を有する形質転換体のみを特異的に選択する方法において、長いＤＮＡ範囲を共修復するバクテリアの能力を活用している。
【００７４】
ＭＲＤにおける非常に重要なステップは、対象とするゲノム領域を含む複雑な標準１本鎖のプール（ｃｏｍｌｅｘ  ｐｏｏｌ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）と、多くの個々のプールされた試料（ｐｏｏｌｅｄ  ｓａｍｐｌｅ）（ＳＮＰ又はその他の配列変異を含み得る）から得られるそれらの相補体との間で、ヘテロ２本鎖を形成することを必要とする。現在のＭＲＤ法は、３００〜５００ヌクレオチドの長さを有する数千の異なるゲノム断片に適応し得る。これは、１回のＭＲＤ反応において、約１００万塩基のゲノム配列をスキャンできることになる。即ち、現在のＭＲＤプロトコルを用いて、たった数回のＭＲＤ反応を行うだけで、理論上はヒトゲノム（〜２００Ｍｂ）の全コード領域及び関連する調節領域をスキャンすることができる。
【００７５】
しかしながら、ＭＲＤ法における現状のボトルネックは、標準的ベクターを構築するために用いる規定された数十万のゲノム断片並びにＭＲＤを実施するために用いるプールされた小集団からの相補的な断片の単離及び増幅である。所望の断片を単離及び増幅するためのプロトコルは、現在、複合ＰＣＲを用いて非常に小規模にて実施されている。しかしながら、ＭＲＤの潜在能力を完全に発揮させるには、これらの断片の単離及び増幅のために、より迅速で経済効果を有する方法が必要とされている。
【００７６】
ＥＤＳＣＲ法は、図２Ａ及び２Ｂに概略的に記載するように、ＭＲＤ用途と組み合せて用いることができる。対象のゲノムエレメントを含む所望の制限断片に適合させたプローブを有するマイクロアレイを、先に概略的に記載した基準に従って、設計し製造する。次いで、上述のプロトコル及び条件を用いて、図２Ａに従ってＥＤＳＣＲ工程を実施することによって、対象のゲノム領域に対応する標準の断片配列を含むベクター（プラスミド）を構築することができる。簡単にいえば、標準ゲノム試料２０２ａは、所望の平均断片長及び境界をもたらすように選択された制限エンドヌクレアーゼを用いて消化することにより、断片化（矢印１０４で示す）させ得る。アダプター２本鎖１１２を断片化されたＤＮＡ１０６に連結し（矢印１１４で示す）、共通であるが固有のプライマー部位（後段の増幅用）を組み込ませる。２本鎖が末端となっている断片１１６を変性させ、そしてマイクロアレイ２２０上のプローブ２２２に接触させる（矢印１２４で示す）。非特異的に結合した断片１３２を、ストリンジェントな洗浄条件を用いてマイクロアレイ２２０から洗浄（１３４）除去する。次いで、相補的な断片１２６をマイクロアレイ２２０から、例えば溶出によって分離し（矢印１４４で示す）、溶液中に相補的な断片１４６を遊離させ、次いで共通のプライマー部位に対し相補的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅する（矢印２５４で示す）。次いで、得られた、プローブにより規定された核酸断片混合物を、元の付着末端を再生し得る元の制限エンドヌクレアーゼ（ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）により消化し（矢印２６４で示す）、線状ｐＭＲＤ１００プラスミド２７２（又はそれに相当するもの）中に挿入して、最終的な標準ベクタープール２７６を調製する。
【００７７】
図２Ｂを参照すると、１０〜１，０００の個々のＤＮＡ混合物を含んでなる、プールされた実験用ゲノムＤＮＡ集団２０２ｂを、上記と同じ制限エンドヌクレアーゼを用いた消化によって断片化１０４する。アダプター２本鎖１１２を、断片化されたＤＮＡ１０６に連結１１４し、共通であるが固有のプライマー部位（後段の増幅用）を組み込む。アダプター２本鎖が末端となっている断片１１６を変性させ、そしてマイクロアレイ２２０上のプローブ２２２に接触させる１２４。非特異的に結合した断片１３２を、ストリンジェントな洗浄条件を用いてマイクロアレイ２２０から洗浄（１３４）除去する。次いで、相補的な断片１２６を、マイクロアレイ２２０から、例えば溶出によって分離し、溶液中に相補的な断片１４６を遊離させ、次いで共通のプライマー部位に相補的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅する（矢印２５４で示す）。次いで、得られた、プローブにより規定された核酸断片混合物２５６を、標準ベクタープール２７６（図２Ａ参照）と組み合わせて、Ｆａｈａｍ及び共同研究者ら（ＨｕｍａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ．（２００１）１０：１６５７−１６６４）により概略されたＭＲＤ法２８０を実施する。
【００７８】
超高スループットの配列決定のためのＥＤＳＣＲ
超高スループットにて配列決定するための多くの新規な方法が現在開発中である。これら新たに生まれる技術の多くは、単一核酸分子やそれらのクローン増幅形態の分析に関するものである（総説としてＪ．Ｓｈｅｎｄｕｒｅらによる、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５：３３５−３４５（２００４）；Ａ．Ｍａｒｚｉａｌｉ及びＭ．Ａｋｅｓｏｎによる、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３：１９５−２２３（２００１）を参照されたい）。これらの方法は、ｉ）ある種のナノ細孔若しくはナノチャネルを介した単一核酸分子の輸送（Ａｋｅｓｏｎ，Ｍらによる、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，７７，３２２７（１９９９）参照）、又はｉｉ）空間的に配置された単一分子又はその複数のコピーを含む粒子に関する、化学的又は蛍光に基づく逐次的な配列解析（Ｌｅｖｅｎｅ，Ｍ．Ｊらによる、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９，６８２（２００３）；Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙ，Ｉ．らによる、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００，３９６（２００３）；Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．による、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ；Ｔａｒｇｅｔｓ，３，１１２（２００４））を包含する。どちらの方法においても、非常に多くの核酸断片を、逐次的な方法若しくは高度に並列された（即ち、同時に非常に多くを行う）方法のいずれかで配列決定する必要がある。さらに、ほとんどの方法は、増幅や表面結合又は特定の配列決定化学作用（例えば、合成による配列解析）を促進するために、上記断片になんらかの種類の変性を施す（例えば、アダプターの連結）ことを必要とする。しかしながら、上述のように、全ゲノムのような高度な配列複雑度を有する混合物を出発物質とし、必要とされる規定された核酸断片混合物を生成する効果的な方法は現在のところ存在しない。
【００７９】
本発明のＥＤＳＣＲは、超高スループットの配列決定法を実現するのに必要となる変性を有する、所望のＤＮＡ混合物を効果的に生成するための新規な方法である。当該用途においては、ＥＣＳＣＲ法は、原則的に、先述の通りに、また図３に概略的に記載した通りに実施される。対象とするゲノムエレメントに適合させたプローブを有するマイクロアレイは、上記の基準に従って設計され、製造される。次いで、ゲノムサンプル３０２を、上記の基準により決定される平均長へとランダムに断片化（１０４）し、断片化ＤＮＡ３０６の混合物を得る。適切な配列決定プライマー部位（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｉｔｅ）及び／又は増幅プライマー部位を含むアダプター２本鎖１１２を、上記混合物に連結させる。配列決定法が、固体支持体への個々のＤＮＡ断片の共有結合を要する場合には、次いで、適切な化学成分（例えば、活性アミン、アルデヒド、エステル、ビオチン）をアダプター２本鎖１１２に組み込む。次いで、任意選択的に、この混合物を、必要なアダプター配列を含む断片に関し高濃度化（３２４）させる。これらの２本鎖が末端となっている断片１１６を変性させ、そしてマイクロアレイ２２０上のプローブ２２２に接触（１２４）させる。非特異的に結合した断片１３２を、ストリンジェントな洗浄条件を用いてマイクロアレイ２２０から洗浄（１３４）除去する。次いで、相補的な断片１２６を、マイクロアレイ２２０から、例えば溶出によって分離し、溶液中に遊離した相補的な断片１４６を得る。もし所望の配列決定に必要とされる場合は、溶液中に遊離した相補的な断片１４６を、必要に応じて、共通のプライマー部位に対し相補的なプライマーを用いた増幅反応（矢印３５４により示す）（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ又は恒温増幅など）において増幅することができる。次いで、得られた、プローブにより規定された核酸断片３５６を、採用する特定の配列決定法の工程に従って用いることができる。種々の実施形態において、配列決定法には、プローブにより規定された核酸断片を、平坦な表面に結合させるステップが包含され得る。いくつかの実施形態では、配列決定法には、プローブにより規定された核酸断片を、粒子に対して結合させ、次いでクローン増幅（例えば、ＰＣＲ又はエマルジョンＰＲＣによる）させるステップが包含され得る。ある実施形態では、プローブにより規定された核酸断片を、溶液中にて（表面に結合していない状態にて）配列決定する。
【００８０】
本発明をより完全に説明するために、上述の実施形態に関して、かなり詳細に説明してきたが、本発明の趣旨及び原理から逸脱することなく、上述の実施形態に数々の変更をなし得ることは当業者には明らかであろう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ定義されるものとする。
【００８１】
本明細書において引用した、全ての特許、特許出願、及び刊行物は、参照することで、その内容の全てを本明細書に取り入れることとする。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】エレメント規定による配列複雑度の低減化（ＥＤＳＣＲ）を実施する一般的な方法の概略説明図。
【図２ａ】ミスマッチ修復検出（ＭＲＤ）のための標準ベクタープールを調製するためのＥＤＳＣＲ法
【図２ｂ】ＭＲＤのためのプールされた試験用断片混合物を調製するためのＥＤＳＣＲ法
【図３】ＤＮＡ配列決定用のゲノムサンプルの複雑度を低減させるためのＥＤＳＣＲ法
【符号の説明】
【００８３】
１０２、２０２、３０２  核酸試料（ゲノムＤＮＡ試料）
１０６  核酸断片（ゲノムＤＮＡ断片）
１１２  アダプター２本鎖
１１６  アダプター２本鎖が末端となっている核酸断片（ゲノムＤＮＡ断片）
１２０  固体支持体
１２２  プローブ
１２６  相補的な断片
１３２  非特異的に結合した断片
１４６  溶液中の相補的な断片（遊離した相補的な断片）
１５６  プローブにより規定された核酸断片（ゲノムＤＮＡ断片）
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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