(57)【要約】      （修正有）【課題】新規メカニズムに基づく糖尿病治療剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】前記スクリーニング方法は、（１）α/βヒドロラーゼ２を抑制する活性があるか否かを検出する工程、及び（２）α/βヒドロラーゼ２を抑制する活性がある物質を選択する工程を含む。更に、抑制は発現抑制であり、プロモーター活性抑制活性を検出する工程を含む。【選択図】図１
2006006151.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）α/βヒドロラーゼ２を抑制する活性があるか否かを検出する工程、及び
（２）α/βヒドロラーゼ２を抑制する活性がある物質を選択する工程
を含む、糖尿病治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
抑制が発現抑制である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
（１）α/βヒドロラーゼ２プロモーターに試験物質を接触させる工程、
（２）試験物質による前記プロモーター活性を抑制する活性があるか否かを検出する工程、及び
（３）前記プロモーター活性を抑制する活性がある物質を選択する工程
を含む、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
選択した物質による、血糖値、血中トリグリセライド値、及び／又は血中遊離脂肪酸値変化を検出する工程を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規メカニズムに基づく糖尿病治療剤スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の運動不足、あるいは、高脂肪食の多い食生活などといった生活スタイルの欧米化により、糖尿病、心臓病、脳卒中の生活習慣病と診断される人は年々増加している。中でも、糖尿病罹患者が最も多く、厚生省が行った我が国の平成９年度の糖尿病の実態調査によれば、「糖尿病が強く疑われる人」は６９０万人であり、その数はその後も増加を続け、２０１０年には１０８０万人になると予想されている。これらの糖尿病患者の９０％以上は、インスリン分泌の低下、あるいは、インスリン抵抗性の増大によるインスリン作用不足を特徴とする２型糖尿病である。
【０００３】
健常人においては、食事を摂取して血糖値が上昇すると、膵臓からのインスリン分泌が速やかに上昇し、そのインスリン濃度に反応して、肝臓での糖放出低下作用、並びに骨格筋及び脂肪組織での糖取り込み量の増加作用が生じ、血糖値が低下して正常ラインに戻る。しかし、インスリン分泌の低下、あるいは、インスリン抵抗性を起こしている糖尿病患者では、インスリンに応答した筋肉及び脂肪組織での糖取り込みの上昇、又は肝臓での糖放出の低下が充分ではなく、食後高血糖又は空腹時高血糖といった異常な血糖値の変動を示すようになる。糖尿病は発症しても長い間、自覚症状がなく進行し、重篤な糖尿病では糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、又は神経障害などの合併症を併発することから、糖尿病は進行の早い時期から予防又は治療することが非常に重要である。
【０００４】
糖尿病治療薬としては、インスリン注射剤の他、経口糖尿病治療薬として、膵臓のβ細胞からのインスリン分泌を促進させるスルホニル尿素系製剤（ＳＵ剤）、小腸粘膜に存在するα−グルコシダーゼを阻害することにより糖質の吸収を遅延させるα−グルコシダーゼ阻害剤、肝臓、脂肪、及び／又は骨格筋でのインスリン抵抗性の軽減を主作用とするチアゾリジン誘導体、糖新生を抑制して肝臓からのグルコース放出を低下させることにより空腹時血糖を低下させることを主作用とするビグアナイド剤などが現在臨床で使われている。しかし、合併症や副作用などの問題で慎重な投与が要求されており、副作用のない、より効果の強い薬剤が求められているのが現状である（非特許文献１、２、３）。
【０００５】
α/βヒドロラーゼ２（α/βhydrolase 2；abhd2）は、肺α/βヒドロラーゼタンパク質２（lung α/βhydrolase protein 2；labh2)とも呼ばれ、α/βヒドロラーゼフォールド（hydrolase fold）スーパーファミリーに分類される。α/βヒドロラーゼフォールドスーパーファミリーの分子はリパーゼ、エステラーゼやプロテアーゼなどの多様な酵素活性を有することが知られているが、α/βヒドロラーゼ２の機能は未だ明らかとなっていない（非特許文献４）。また、糖尿病との関連についても、何ら知られていない。
【０００６】
【非特許文献１】河盛隆造ら，「糖尿病  ２００１  からだの科学  増刊」，日本評論社，２００１年，ｐ．８６−１０８
【非特許文献２】岡，「最新医学」，２００２年，ｐ．４１−４６
【非特許文献３】岩本安彦，「病気と薬の説明ガイド２００４」，薬局５５巻２００４年１月増刊号，南山堂，２００４年，ｐ．９９２−１０３５
【非特許文献４】エドガー・エー・ジェー（Edgar, A.J.）ら，「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications）」，（米国），２００２年，第２９２巻，ｐ．６１７−６２５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、機能を修飾することで糖・脂質代謝に影響を及ぼす物質を取得し、新規な糖尿病治療剤を取得するスクリーニング系を提供することにある。
本発明者は、α/βヒドロラーゼ２遺伝子ノックアウトマウスを作成したところ（実施例１）、高脂肪食負荷ノックアウトマウス群では、通常食同腹ワイルドマウス群と比較して、明らかな肥満が観察されたにもかかわらず、随時血糖値は統計的に有意な差はなく、血中トリグリセライド値及び遊離脂肪酸値の有意な減少が認められた（実施例２）。
これらの結果より、α/βヒドロラーゼ２を発現抑制や機能阻害することで、血糖値が低下すること、並びに、肥満による血糖値、血中トリグリセライド値及び遊離脂肪酸値の上昇が抑制されることを見出し、α/βヒドロラーゼ２抑制活性を指標に、糖尿病治療剤のスクリーニングが可能であることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
［１］（１）α/βヒドロラーゼ２を抑制する活性があるか否かを検出する工程、及び
（２）α/βヒドロラーゼ２を抑制する活性がある物質を選択する工程
を含む、糖尿病治療剤のスクリーニング方法；
［２］抑制が発現抑制である、［１］に記載のスクリーニング方法；
［３］（１）α/βヒドロラーゼ２プロモーターに試験物質を接触させる工程、
（２）試験物質による前記プロモーター活性を抑制する活性があるか否かを検出する工程、及び
（３）前記プロモーター活性を抑制する活性がある物質を選択する工程
を含む、［２］に記載のスクリーニング方法；並びに
［４］選択した物質による、血糖値、血中トリグリセライド値、及び／又は血中遊離脂肪酸値変化を検出する工程を更に含む、［１］〜［３］のいずれか１つに記載のスクリーニング方法
に関する。
【０００９】
α/βヒドロラーゼ２は、肺α/βヒドロラーゼタンパク質２とも呼ばれ、α/βヒドロラーゼフォールドスーパーファミリーに分類されるタンパク質である。本明細書において、α/βヒドロラーゼ２には、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド等の公知のα/βヒドロラーゼ２、及びそれらのアレル変異体が含まれ、哺乳類α/βヒドロラーゼ２が好ましく、ヒトα/βヒドロラーゼ２がより好ましい。
【００１０】
本明細書における用語「α/βヒドロラーゼ２抑制」には、α/βヒドロラーゼ２の発現抑制と、α/βヒドロラーゼ２の機能抑制とが含まれる。
また、本明細書における用語「糖尿病治療剤」には、糖尿病である患者の治療のために使用する薬剤と、糖尿病傾向にある対象に予防的に使用する薬剤の両方が含まれる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、新規のメカニズム、すなわち、α/βヒドロラーゼ２抑制活性を指標に、糖尿病治療剤のスクリーニングを行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明者は、α/βヒドロラーゼ２遺伝子を発現抑制や機能阻害することで、血糖値が低下すること、並びに、肥満による血糖値、血中トリグリセライド値及び遊離脂肪酸値の上昇が抑制されることを見出した。従って、α/βヒドロラーゼ２の発現量変化を指標とする、又は、α/βヒドロラーゼ２機能阻害を指標とする、糖尿病治療剤（好ましくは、血糖値低下剤、血糖値上昇抑制剤、血中トリグリセライド値上昇抑制剤、及び／又は、遊離脂肪酸値上昇抑制剤）のスクリーニング方法を構築することができる。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術［N. Terrett et al., Drug Discov. Today，4(1):41,1999］によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。
【００１４】
前記スクリーニングする方法として限定はされないが、具体的には、例えば、以下のスクリーニング方法が挙げられる。
（１）α/βヒドロラーゼ２の発現抑制を指標とするスクリーニング方法
α/βヒドロラーゼ２の発現抑制により、血糖値の低下、並びに、肥満による血糖値、血中トリグリセライド値及び遊離脂肪酸値の上昇が抑制されるため、α/βヒドロラーゼ２の発現抑制を指標として糖尿病治療剤（好ましくは、血糖値低下剤、血糖値上昇抑制剤、血中トリグリセライド値上昇抑制剤、及び／又は、遊離脂肪酸値上昇抑制剤）のスクリーニングが実施可能となる。
例えば、内在性のα/βヒドロラーゼ２の発現量を分析することにより、あるいは、α/βヒドロラーゼ２のプロモーター領域を、適当なレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）の上流に連結した発現ベクターを作製し、この発現ベクターで形質転換した細胞と、試験化合物とを接触させ、前記レポーター遺伝子の発現の変化を分析することにより、スクリーニングを実施し、糖尿病治療剤（好ましくは、血糖値低下剤、血糖値上昇抑制剤、血中トリグリセライド値上昇抑制剤、及び／又は、遊離脂肪酸値上昇抑制剤）を選択することができる。
【００１５】
前記α/βヒドロラーゼ２のプロモーターとしては、特に限定されるものではないが、哺乳類由来のα/βヒドロラーゼ２プロモーターが好ましく、ヒト由来のα/βヒドロラーゼ２のプロモーターがより好ましい。更に好ましくは、配列番号２２で表される塩基配列における１９５４番〜４６１８番の塩基配列からなるプロモーター、あるいは、配列番号２２で表される塩基配列における１９５４番〜４６１８番の塩基配列を含み、その５’側に、配列番号２２で表される塩基配列における１９５３番〜１番の塩基配列の内の３’側から数えて１〜１９５３個の塩基が更に追加されている配列からなるプロモーター（すなわち、配列番号２２で表される塩基配列からなるプロモーター、あるいは、配列番号２２で表される塩基配列において、その５’側から１〜１９５３個の塩基が欠失した配列からなるプロモーター）である。
【００１６】
以下具体例を挙げて説明する。
まず、試験物質で未処理又は処理した細胞から通常用いられる方法によりＲＮＡを調製することができる。このＲＮＡ調製液から公知の方法に従ってアガロースゲル電気泳動によりＲＮＡを分離した後、ニトロセルロース膜に転写し、これをα／βヒドロラーゼ２の部分塩基配列を含むラベルした短鎖ＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット解析により、試験物質によるα／βヒドロラーゼ２塩基配列を有するＲＮＡの発現量の増減を検出することができる。これによりα／βヒドロラーゼ２の発現量を抑制する物質を試験物質の母集団中からスクリーニングすることができる。
【００１７】
あるいは、試験物質で未処理又は処理した細胞から通常用いられる方法によりタンパク質を調製することができる。このタンパク質調製液から公知の方法に従ってタンパク質電気泳動によりタンパク質を分離した後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写し、これをα/βヒドロラーゼ２特異的抗体を用いたウエスタンブロット解析により、試験物質によるα/βヒドロラーゼ２タンパク質の発現量の増減を検出することができる。これによりα/βヒドロラーゼ２タンパク質の発現量を抑制する物質を試験物質の母集団中からスクリーニングすることができる。
【００１８】
あるいは、α/βヒドロラーゼ２の部分塩基配列を含む短鎖ＤＮＡプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ法によっても、試験物質によるα／βヒドロラーゼ２塩基配列を有するＲＮＡの発現量の増減を定量的に検出することができる。これによりα／βヒドロラーゼ２の発現量を抑制する物質を試験物質の母集団中からスクリーニングすることが可能である。
【００１９】
あるいは、α/βヒドロラーゼ２のプロモーター領域を、適当なレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）の上流に連結した発現ベクターを作製し、この発現ベクターで形質転換した細胞と、試験物質とを接触させ、前記レポーター遺伝子の発現の変化を分析することによりスクリーニングを実施可能である。この方法により、プロモーター活性を調節する物質が得られ、直接的、又は、間接的にα/βヒドロラーゼ２の活性を調節する物質が得られる。具体的なスクリーニング方法としては、例えば、実施例６に記載のルシフェラーゼ活性検出系を用いた方法を挙げることができる。すなわち、実施例６に記載のルシフェラーゼ活性検出系において、プラスミドｐＧＶ−ＴＧ０００５Ｐｒｏ（２．７ｋ）又はｐＧＶ−ＴＧ０００５Ｐｒｏ（４．６ｋ）を２９３細胞にトランスフェクションした後に実施する２日間の培養の際に、培養液中に試験物質を共存させること以外は、実施例６に記載の方法を実施することにより、プロモーター活性を調節する物質をスクリーニングすることができる。プロモーター活性を抑制する物質としては、プロモーター活性化時の活性と比較して有意にレポーター活性が抑制される能力を持つ物質を選択することが望ましい。
【００２０】
血糖値、血中トリグリセライド値、及び／又は血中遊離脂肪酸値変化は、常法に従って検出することができ、例えば、実施例２に記載された方法で、正常食若しくは高脂肪食摂取マウスに試験物質を投与し、マウスの血糖値、血中トリグリセライド値、及び／又は血中遊離脂肪酸値を測定することにより変化を検出することができる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断りのない限り、公知の方法、例えば、Sambrook, J. ら, "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989、相沢慎一，「ジーンターゲティング・ES細胞を用いた変異マウスの作製」，羊土社，1995等の遺伝子操作実験マニュアルに従って実施した。
【００２２】
《実施例１：α/βヒドロラーゼ２遺伝子ノックアウトマウスの作製》
トラップベクター及びこれを用いた遺伝子トラップ法（WO01/05987）により、α/βヒドロラーゼ２遺伝子のみが破壊されたＥＳクローンの選択、α/βヒドロラーゼ２遺伝子ノックアウトマウスＦ１へテロの作製を行った。
【００２３】
α/βヒドロラーゼ２遺伝子のみが破壊されたＥＳクローンの選択は以下のように行った。まず、トラップベクター（WO01/05987）をエレクトロポレーションによりＥＳ（ＴＴ２）細胞（Yagi T. et al., Analytical Biochemistry, 214, p.70-76, 1993）に導入し、Ｇ４１８による選別を行った。形成されたコロニーのピックアップを行い、それぞれのクローンについてゲノムＤＮＡを抽出し、ベクター上に設計された２種のプライマーセットを用いたＰＣＲ及びサザンブロット解析により、トラップベクターが１コピーのみ組み込まれ、かつベクターが全部分導入されているＥＳ細胞クローンを選択した。
【００２４】
なお、２種のプライマーセットとして、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡと配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡとのセット、及び配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡと配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡとのセットを使用した。また、前記ＰＣＲでは、変性（９４℃にて４５秒間）、アニール（５８℃にて６０秒間）、及び伸長（７２℃にて９０秒間）からなるサイクルを３０サイクル実施した。前記サザンブロット解析では、ゲノムＤＮＡはＥｃｏＲＩ又はＢａｍＨＩにより切断し、プローブとしてベクター上のｐＵＣ領域を使用した。
【００２５】
続いて、プラスミドレスキュー法で回収された被トラップ遺伝子の部分配列がＧｅｎＢａｎｋ登録配列NM_018811.4の１８番〜７０７番の塩基配列に一致し、トラップベクターがα/βヒドロラーゼ２遺伝子のＯＲＦ（登録配列NM_018811.4の１８２番〜１４５９番）の上流に挿入されているＥＳクローンを選択した。
【００２６】
続いて、アグリゲーション法（Nagy A., 1993, Oxford University Press, Oxford, pp147-179）にてα/βヒドロラーゼ２遺伝子のみが破壊されたＥＳ細胞クローンとＩＣＲ系８細胞期胚を凝集させ、翌日桑実胚〜胚盤胞に発生したキメラ胚を偽妊娠誘起したＩＣＲ系雌マウス（偽妊娠誘起から３日目）の子宮へ移植した（相沢慎一，「ジーンターゲティング・ES細胞を用いた変異マウスの作製」，羊土社，1995）。移植後、１７．５日に帝王切開を行い、キメラマウスを得た。キメラマウスは４週まで、里親に保育させた（相沢慎一，「ジーンターゲティング・ES細胞を用いた変異マウスの作製」，羊土社，1995）。キメラマウスは４週で離乳し、６週で生殖系列伝達（Germline Transmission；ＧＴ）確認のため、ＩＣＲ系雌マウス２匹と交配を行った。キメラマウスとＩＣＲの産仔の組織よりゲノムＤＮＡを採取し、ベクター上に設計されたプライマーセット（配列番号７及び８）を用いたＰＣＲ解析で導入遺伝子の有無を、上述のＥＳクローン選択と同様の方法によるサザン解析でＥＳ細胞とマウスの遺伝子が一致するかを解析した。ＧＴ判定が終了したキメラ雄マウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス２匹を自然交配させ、α/βヒドロラーゼ２遺伝子ノックアウトマウスＦ１へテロを作製した。
【００２７】
このＦ１へテロノックアウト雄マウスと、妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）及びヒト絨毛性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の投与により過排卵処置を施したＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスとの体外受精（ＩＶＦ）により得られた受精卵を、精管結搾雄マウスとの交配により偽妊娠誘起処置を施したＩＣＲ系雌マウス（レシピエント）に移植することにより、Ｆ２へテロノックアウトマウスを大量に作出した。そこで得られたＦ２ヘテロノックアウトマウスを用いてＩＶＦを行い、受精卵を作製後、それらの胚をレシピエントに移植することによりＦ３ホモノックアウトマウスを作製した。
【００２８】
《実施例２：α/βヒドロラーゼ２遺伝子ノックアウトマウスの表現型解析》
正常食はＣＥ−２（日本クレア社製）を用いた。高脂肪食は、オレイン系圧搾油一番搾り（紅花食品社製）３２０ｇ、ラット用高脂肪食ＯＢＳＫ（カタログ番号ＹＴＯ４０；オリエンタル酵母社製）６７５ｇ、ＤＬ−メチオニン（和光純薬社製）５ｇ、及び水１００ｇを混合し、練り上げたものを用い、５週齡から２０週齡まで自由摂取させた。試験は、正常食ノックアウトマウス群（雄：ｎ＝６）、正常食同腹ワイルドマウス群（雄：ｎ＝６）、高脂肪食負荷ノックアウトマウス群（雄：ｎ＝６）で行った。
【００２９】
随時血糖値は、５、１０、１５、及び２０週齢時に、尾静脈より血液約５μＬを採取し、簡易型血糖測定機（デキスターＺ）により測定した。血液生化学的検査は２０週齢時に実施した。１８時間絶食させたマウスをエーテルで麻酔した後、後大静脈腹部よりヘパリン塗布注射筒で血液を採取し、１，８７０×ｇで１０分間遠心分離して得られた血漿を用いた。総コレステロール（T.Cholesterol）はＣＯＤ−ＨＤＡＯＳ法、高比重リポタンパク質中のコレステロール（HDL-Cholesterol）はダイレクト（Direct）法、トリグリセライド（Triglycerides）はＧＰＯ−ＨＤＡＯＳ法、グリセロールブランキング（glycerol blanking）法、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）はＡＣＳ−ＡＣＯＤ法、グルコース（Glucose）はヘキソキナーゼ（Hexokinase）−Ｇ−６−ＰＤＨ法を用い、自動分析装置（７１７０；株式会社日立製作所）で測定した。インスリン（Insulin）はインスリン測定キット（森永生科学研究所）、レプチン（Leptin）はマウスレプチン（Mouse Leptin）測定キット（森永生科学研究所）を用いて測定した。
【００３０】
その結果、２０週齡の高脂肪食負荷ノックアウトマウス群では、通常食同腹ワイルドマウス群と比較して、体重増加率が約１．８倍（体重比で約１．２５倍）、血中レプチン濃度が約７倍、内臓脂肪量が約３倍と、明らかな肥満が観察された。それにもかかわらず、随時血糖値は統計的に有意な差はなく（高脂肪食負荷群１４９±２０ｍｇ／ｄＬ；通常食群１３４±９ｍｇ／ｄＬ）、血中トリグリセライド値（同９±1ｍｇ／ｄＬ；１２±２ｍｇ／ｄＬ、Ｐ＜０．０１）及び遊離脂肪酸値（同１．１４±０．１９ｍＥｑ／Ｌ；１．２８±０．１４ｍｇ／ｄＬ、Ｐ＜０．０５）の有意な減少が認められた。
【００３１】
経口糖負荷試験は以下のように行った。すなわち、１９週齢時に、ステンレス製床網を敷いたケージ内で、約１６時間絶食（糖負荷前日の午後１８：００時より絶食開始）させ、尾静脈より血液約５μＬを採取し、簡易型血糖測定機（デキスターＺ）により糖負荷前（午前９：３０〜１０：００）の血糖値を測定した。次に、グルコース液を７００ｍｇ／ｋｇの用量で１回経口投与（午前１０：００〜）し、糖負荷後３０、６０、及び１２０分の血糖値を簡易型血糖測定機（デキスターＺ）により上記と同様に測定した。その結果、通常食ノックアウトマウス群は、通常食同腹ワイルドマウス群との比較において、各測定点で、血糖値の低値が観察された。また、高脂肪食負荷ノックアウトマウス群の血糖値は、各測定点で、正常食同腹ワイルドマウス群と同程度であった（図１）。
【００３２】
これらの観察結果より、α/βヒドロラーゼ２を発現抑制や機能阻害することで、（１）血糖値の低下、（２）肥満による血糖値の上昇の抑制、（３）肥満による血中トリグリセライド値の上昇の抑制、（４）肥満による遊離脂肪酸値の上昇の抑制が起こることが示唆された。
なお、以上の結果の統計学的処理は２群間の分散比のＦ検定（有意水準は５％）を行い、分散に差がない場合はスチューデント（Student）のｔ検定、差がある場合はアスピン−ウェルチ（Aspin-Welch）のｔ検定を行った。いずれの場合も有意水準を１％及び５％にした。
【００３３】
《実施例３：ヒトα/βヒドロラーゼ２遺伝子のクローニング》
マウスα/βヒドロラーゼ２遺伝子はアクセッション番号NM_018811.4（アミノ酸配列NP_061281.3）としてＧｅｎＢａｎｋに登録されていた。ヒトオルソログ配列として、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号NM_007011.4（アミノ酸配列NP_008942.3）が登録されており、４２５アミノ酸からなるヒトα/βヒドロラーゼ２ＯＲＦは、マウス配列と４２０アミノ酸が一致した。ヒト骨格筋ｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡと、配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡとをプライマーとし、ＤＮＡポリメラーゼ（Pyrobest DNA polymerase；タカラバイオ社製）を用いて、９４℃２分間の反応後、９８℃（１０秒間）、６０℃（３０秒間）、及び７２℃（１分３０秒間）のサイクルを４０回行うＰＣＲを実施した。続いて、この反応液５０分の１量を鋳型として、配列番号１１で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡと、配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡとをプライマーとし、同条件のＰＣＲを行い、アガロース電気泳動にて、生成した約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離及び抽出した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＺＥｒＯ２．１（インビトロジェン社製）のＥｃｏＲＶ部位にサブクローンし（ｐＺＥｒＯ−ＴＧ０００５と命名）、ジデオキシターミネーター法によりＤＮＡシークエンサー（ABI3700 DNA Sequencer；Applied Biosystems社製）で塩基配列を解析することにより、α/βヒドロラーゼ２遺伝子のＯＲＦ（配列番号１で表される塩基配列；ＧｅｎＢａｎｋ登録配列NM_018811.4の１８２番〜１４５９番）を取得した。現在までに、当該遺伝子α/βヒドロラーゼ２の生理機能は報告されておらず、糖・脂質代謝に関連することは全く知られていなかった。
【００３４】
（２）ヒトα/βヒドロラーゼ２タンパク質の発現プラスミドの構築
実施例３（１）で取得したプラスミドｐＺＥｒＯ−ＴＧ０００５を制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで切断することにより生じた約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、プラスミドｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧのＸｂａＩ部位及びＢａｍＨＩ部位間に挿入し、α/βヒドロラーゼ２タンパク質のＣ末にＦＬＡＧタグ（配列番号２７）の付加したタンパク質ＴＧ０００５−ＦＬＡＧを発現するためのプラスミドｐｃＤＮＡ−ＴＧ０００５−ＦＬＡＧを完成した。なお、ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧは、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（インビトロジェン社製）の制限酵素ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄIII部位に、配列番号１３で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡと配列番号１４で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡをアニールした二重鎖化したＤＮＡ断片を挿入したものである。
【００３５】
《実施例４：ヒトα/βヒドロラーゼ２タンパク質の動物細胞株での発現》
ヒトα/βヒドロラーゼ２タンパク質を発現させるため、実施例３（２）で作製した発現プラスミドｐｃＤＮＡ−ＴＧ０００５−ＦＬＡＧを、トランスフェクション試薬（FuGENETM 6 Transfection Reagent；ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて、添付指示書に従い、２９３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５７３）に導入した。プラスミド導入後、２日間培養し、目的タンパク質（すなわち、ＴＧ０００５−ＦＬＡＧタンパク質）の発現を、Ｃ末端に付加したＦＬＡＧタグに対する抗体（マウス抗FLAGモノクローナル抗体M2；Sigma社製）を用いたウエスタンブロッティングで確認した。
【００３６】
より具体的には、１５ｃｍプレートより、全培養上清２０ｍＬを回収した。続いて、前記細胞を回収し、リン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ）１０ｍＬで洗浄後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）５ｍＬに縣濁し、超音波破砕機で破砕して、細胞破砕画分とした。これを４℃、３，０００回転／分で１０分間遠心し、得られた上清を４０Ｔｉローター（ベックマン社製）を用い、４℃、３０，０００回転／分で３０分間の超遠心で得られた沈殿に２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）５ｍＬを添加し、超音波処理及びテフロンホモゲナイザー処理することにより、細胞膜画分とした。
【００３７】
これら培養上清２０μＬ、細胞破砕画分５μＬ、及び細胞膜画分５μＬをＳＤＳ／４％〜２０％アクリルアミドゲル（第一化学薬品社製）を用いて電気泳動した後、ブロッティング装置を用いてポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜に、ブロッキング試薬（ブロックエース；大日本製薬社製）を添加してブロッキングした後、ビオチン化Ｍ２抗体（シグマ社製）と、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャムバイオサイエンス社製）とを順次反応させた。反応後、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて目的タンパク質の発現を、上記細胞破砕画分及び細胞膜画分に５０ｋＤａのバンドを検出することにより確認した。
【００３８】
《実施例５：ヒトα/βヒドロラーゼ２転写開始点の推定》
ヒトα/βヒドロラーゼ２はNM_007011.4の他、NM_152924.2としてもＧｅｎＢａｎｋに登録されていた。NM_152924.2はNM_007011.4と同じＯＲＦをコードしているが、５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）に存在する６エクソンの内、連続した４エクソンを欠いていた。このように、α/βヒドロラーゼ２遺伝子の５’−ＵＴＲは長く、多数のエクソンからなり、しかも多様であるという特徴があった。そのため、公共データベースの情報だけでは、転写開始点を推定することが困難であった。この問題を解決するため、エクソン１の配列を用いたＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）を行った。
【００３９】
すなわち、ヒト脳ｃＤＮＡ又はヒト心臓ｃＤＮＡ（Marathon-Ready cDNA；クロンテック社製）を鋳型、配列番号１５で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡを５’プライマー、配列番号１６で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡを３’プライマーとし、ＬＡｔａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いて、９４℃（２分間）の反応後、９８℃（１０秒間）、７２℃（２分間）のサイクルを５回、９８℃（１０秒間）、７０℃（２分間）のサイクルを５回、続いて、９８℃（１０秒間）、６８℃（２分間）のサイクルを３０回行うＰＣＲを実施した。このＰＣＲ反応液５０分の１量を鋳型とし、配列番号１７で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡを５’プライマー、配列番号１８又は配列番号１９で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡを３’プライマーとし、ＬＡｔａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いて、９４℃（２分間）の反応後、９８℃（１０秒間）、７２℃（１分間）のサイクルを５回、９８℃（１０秒間）、７０℃（１分間）のサイクルを５回、続いて、９８℃（１０秒間）、６８℃（１分間）のサイクルを３０回行うＰＣＲを実施した。その結果、ヒト心臓ｃＤＮＡを鋳型とした場合にのみ、単一バンドとして約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片が生成した。その断片をアガロース電気泳動にて分離及び抽出し、直接、配列番号１７及び配列番号１９で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡをプライマーとし、塩基配列を解読した。その結果、ｃＤＮＡは配列番号２２で表される塩基配列の４５８４番から始まっていることが判明し、α/βヒドロラーゼ２の転写開始点と推定された。推定された転写開始点は、NM_007011.4、NM_152924.2の５’より、２０６ｂｐ上流に位置した。
【００４０】
《実施例６：ヒトα/βヒドロラーゼ２プロモーター遺伝子のクローニング》
ヒト染色体ＤＮＡ（インビトロジェン社製）を鋳型とし、配列番号２０で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡと、配列番号１８で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡとをプライマーとし、ＤＮＡポリメラーゼ（Pyrobest DNA polymerase；タカラバイオ社製）を用いて、９４℃（２分間）の反応後、９８℃（１０秒間）、６０℃（３０秒間）、７２℃（３分間）のサイクルを３５回行う１回目のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。続いて、この反応液５０分の１量を鋳型として、配列番号２１で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡと、配列番号２８で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡとをプライマーとし、同条件で２回目のＰＣＲを行い、アガロース電気泳動にて、生成した約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離及び抽出した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＺＥｒＯ２．１（インビトロジェン社製）のＥｃｏＲＶ部位にサブクローンし（ｐＺＥｒＯ−ＴＧ０００５Ｐｒｏ１と命名）、ジデオキシターミネーター法によりＤＮＡシークエンサー（ABI3700 DNA Sequencer；Applied Biosystems社製）で塩基配列を解析することにより、配列番号２２で表される塩基配列の１９２２番〜４６１８番からなる配列の３’側にＨｉｎｄIII認識部位が付加したＤＮＡ断片を得た。
【００４１】
同条件で、１回目のＰＣＲを配列番号２３で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡと配列番号２４で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡをプライマー、２回目のＰＣＲを配列番号２５で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡと配列番号２６で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡをプライマーとして行い、約２．２Ｋｂｐの断片を得た。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＺＥｒＯ２．１（インビトロジェン社製）のＥｃｏＲＶ部位にサブクローンし（ｐＺＥｒＯ−ＴＧ０００５Ｐｒｏ２と命名）、ジデオキシターミネーター法によりＤＮＡシークエンサー（ABI3700 DNA Sequencer；Applied Biosystems社製）で塩基配列を解析することにより、配列番号２２で表される塩基配列の１番〜２１５４番から成る配列の５’側にＫｐｎＩ認識部位が付加したＤＮＡ断片を得た。
【００４２】
ｐＺＥｒＯ−ＴＧ０００５Ｐｒｏ１を制限酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIIIで切断し、生じた約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片をｐＧＶ−Ｂ２（東洋インキ社製）のＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII部位に挿入し、ｐＢＶ−ＴＧ０００５Ｐｒｏ（２．７ｋ）を完成させた。すなわち、このプラスミドには配列番号２２で表される塩基配列の１９５４番〜４６１８番に相当するＤＮＡ断片がルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入されている。
【００４３】
ｐＺＥｒＯ−ＴＧ０００５Ｐｒｏ１を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIで切断し生じた約２．６ＫｂｐのＤＮＡ断片と、ｐＺＥｒＯ−ＴＧ０００５Ｐｒｏ２を制限酵素ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩで切断し生じた約２．０ＫｂｐのＤＮＡ断片とを連結し、ｐＧＶ−Ｂ２のＫｐｎＩ、ＨｉｎｄIII部位に挿入し、ｐＢＶ−ＴＧ０００５Ｐｒｏ（４．６ｋ）を完成させた。すなわち、このプラスミドには配列番号２２で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片がルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入されている。
【００４４】
これらのプラスミド（０．９μｇ）とｐＣＨ１１０（アマシャムバイオサイエンス社製：０．１μｇ）の混合液１０μＬ、トランスフェクション試薬（FuGENETM 6 Transfection Reagent；ロシュ・ダイアグノスティックス社製）５μＬ、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）１００μＬの反応液を添付指示書に従い調製した。この反応液を、１０％牛胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地１００μＬ／穴で７０〜８０％コンフルエントまで培養した２９３細胞に、１穴当たり７μＬ添加した。２日間培養を継続した後、ピカジーン（PicaGene）発色キット（東洋インキ社製）を用い、ルシフェラーゼ活性を測定した。この際、測定値は同時導入したβ−ｇａｌ発現プラスミド（ｐＣＨ１１０）より発現したβ−ｇａｌの活性値で補正した。β−ｇａｌ活性の測定はガラクトライトプラス（Galacto-Light Plus）キット（ＴＲＯＰＩＸ社製）を用いた。その結果、ｐＢＶ−ＴＧ０００５Ｐｒｏ（２．７ｋ）、ｐＧＶ−ＴＧ０００５Ｐｒｏ（４．６ｋ）とも、もとのプラスミドであるｐＧＶ−Ｂ２に比べ１０倍強のルシフェラーゼ活性の明らかな上昇が観察された。このことは前記ＤＮＡ断片中にプロモーター活性が存在することを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明は、糖尿病治療剤のスクリーニングの用途に適用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００４６】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。配列番号３〜８、１１、１２、１５、１７、２１、２５、及び２８の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列であり、配列番号１３及び１４の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したオリゴヌクレオチドであり、配列番号２７の配列で表されるアミノ酸配列は、ＦＬＡＧタグである。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】正常食ノックアウトマウス群（ＫＯ／Ｎ）、正常食同腹ワイルドマウス群（ＷＴ／Ｎ）、及び高脂肪食負荷ノックアウトマウス群（ＫＯ／Ｆ）における経口糖負荷試験の結果を示すグラフである。縦軸は、血糖値（ｍｇ／ｄＬ）を示し、横軸は、グルコース経口投与後の経過時間（分）を示す。横軸における記号「Ｂ」は、糖負荷前を意味する。
【図１】
2006006151.tif 000003
【配列表】
2006006151000001.app