(57)【要約】【課題】  本発明は、成体型造血幹細胞を効率的に識別することができる因子を同定することを目的とする。【解決手段】  本発明は、一部、本発明者らが、エンドムチン自体が予想外に、成体型造血幹細胞を胎児型造血幹細胞から効率よく識別することができるマーカー機能を有ることをも見出したことによって、上記課題を解決した。したがって、本発明は、エンドムチンをコードする核酸配列またはその一部を含む核酸分子に対する特異的な因子を含む、成体型造血幹細胞の検出組成物を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドムチンの同定手段を含む、成体型造血幹細胞の検出組成物。
【請求項２】
前記成体型造血幹細胞は、長期骨髄再構築能を有する細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記同定手段は、エンドムチンまたはその一部を含むポリペプチド、あるいはエンドムチンをコードする核酸配列またはその一部を含む核酸分子に対する特異的な因子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記エンドムチンは、
（ａ）配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１、３、５、７または９に記載の塩基配列の対立遺伝子変異体またはスプライス変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記エンドムチンは、配列番号２、４、６、８または１０に示される配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記核酸分子は、配列番号１、３、５、７または９に示される配列を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記エンドムチンの同定手段は、抗エンドムチン抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記エンドムチンの同定手段は、エンドムチンをコードする核酸配列またはその一部に対して相補的な配列を含む核酸分子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記同定手段は、標識されているかまたは標識可能である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記標識は、放射性物質、化学発光物質、蛍光物質、燐光物質、発色剤、リガンド、ハプテンおよびそれらの原材料からなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
さらなるマーカーの同定手段を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記さらなるマーカーは、ＣＤ３４、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）、ｃ−Ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、Ｆｌｔ３／Ｆｌｋ２、ＣＤ４１およびＣＤ４５からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記さらなるマーカーは、ＣＤ４１およびＣＤ４５からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記さらなるマーカーは、ＣＤ４１およびＣＤ４５を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記マーカーは、胎児型造血前駆細胞と成体型造血幹細胞とを識別する能力を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記成体型造血幹細胞は、多能性を保持する細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記成体型造血幹細胞は、胚性幹細胞由来の細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記成体型造血幹細胞は、骨髄移植に使用される細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記成体型造血幹細胞は、胚性幹細胞から胚様体を形成させて生産される細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記標識は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）およびビオチンからなる群より選択される少なくとも１つの色素を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項２１】
サンプルにおいて成体型造血幹細胞を検出するための方法であって、
Ａ）該サンプルとエンドムチンの同定手段とを接触させる工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
さらに、
Ｂ）前記エンドムチン陽性の細胞が見出されたときに、成体型造血幹細胞が存在すると判定する工程、
を包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｃ）ＣＤ４１およびＣＤ４５からなる群より選択されるマーカー因子の同定手段と前記サンプルとを接触させる工程をさらに包含する、
請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＤ４１陽性の細胞が見出されたとき、および前記ＣＤ４５陽性の細胞が見出されたときからなる群より選択される少なくとも１つの場合に、成体型造血幹細胞が存在すると判定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記サンプルは、胚性幹細胞を含むかまたは含むと予想されるサンプルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
サンプルにおいて成体型造血幹細胞を検出するためのキットであって、該キットは：
Ａ）エンドムチンの同定手段
を備える、キット。
【請求項２７】
成体型造血幹細胞が分離または濃縮された組成物を生産する方法であって、
Ａ）成体型造血幹細胞を含むかまたは含むと予想される供給源を提供する工程；
Ｂ）該供給源とエンドムチンの同定手段とを接触させる工程；
Ｃ）エンドムチン陽性細胞を分離または濃縮する工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
前記同定手段は抗エンドムチン抗体であり、前記濃縮はフローサイトメトリーにより行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
さらに、ＣＤ４１陽性細胞を濃縮する工程を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
さらに、ＣＤ４５陰性細胞を濃縮する工程を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＤ３４、ＣＤ４１、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）およびｃ−Ｋｉｔからなる群より選択されるさらなるマーカーに対するサンプルの反応性を決定し、該ＣＤ３４、該ＣＤ４１および該ｃ−Ｋｉｔの遺伝子発現は、該候補細胞が幹細胞であることを示し、該Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）の遺伝子の陰性発現は、該候補細胞が幹細胞であることを示すことによってさらに成体型造血幹細胞を濃縮する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記分離または濃縮は、抗体非動化ディッシュによるパニング、フローサイトメトリーまたは磁気ビーズを用いて行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記分離または濃縮は、ＦＡＣＳおよび磁気ビーズを組み合わせて行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
成体型造血幹細胞が分離または濃縮された組成物を生産するキットであって、
Ａ）エンドムチンの同定手段；
Ｂ）該同定手段と成体型造血幹細胞を含むかまたは含むと予想される供給源とを接触させる手段；および
Ｃ）エンドムチン陽性細胞を分離または濃縮する手段、
を備えるキット。
【請求項３５】
請求項２７に記載の方法によって調製された、成体型造血幹細胞組成物。
【請求項３６】
エンドムチンを発現し、かつ、ＣＤ４１を発現する細胞が濃縮された、成体型造血幹細胞組成物。
【請求項３７】
前記成体型造血幹細胞組成物は、ＣＤ４５を発現しない細胞が濃縮されている、請求項３６に記載の成体型造血幹細胞組成物。
【請求項３８】
候補細胞が成体型造血幹細胞であるかどうかを判定する方法であって、
（Ｉ）判定されるべき候補細胞を提供する工程；
（ＩＩ）エンドムチンをコードする核酸分子もしくはその一部、またはエンドムチンポリペプチドまたはその一部に特異的に反応する因子を、該候補細胞に接触させる工程；および
（ＩＩＩ）該因子と該エンドムチンをコードする核酸分子もしくはその一部、またはエンドムチンポリペプチドまたはその一部との特異的反応を検出することによって、該エンドムチンの遺伝子が該候補細胞において発現しているかどうかを確認する工程、
を包含し、ここで、該候補細胞における該エンドムチンの遺伝子発現は、該候補細胞が成体型造血幹細胞であることを示す、方法。
【請求項３９】
前記発現の確認は、フローサイトメトリーによって行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＣＤ３４、ＣＤ４１、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）およびｃ−Ｋｉｔからなる群より選択されるマーカーに対して特異的な少なくとも１つの因子を、前記候補細胞に接触させる工程をさらに包含し、ここで、
該候補細胞における該ＣＤ３４、該ＣＤ４１および該ｃ−Ｋｉｔの遺伝子発現は、該候補細胞が幹細胞であることを示し、該Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）の遺伝子の陰性発現は、該候補細胞が幹細胞であることを示す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
分化抗原陽性（ｌｉｎｅａｇｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞を枯渇させる工程をさらに包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記枯渇工程は、ＭＡＣＳによって行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記枯渇工程は、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、ＴＥＲ１１９、ＣＤ４、ＣＤ８およびＢ２２０からなる群より選択される少なくとも1つのＬＩＮ（Ｌｉｎｅａｇｅ）マーカーを用いて行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
候補細胞が成体型造血幹細胞であるかどうかを判定するキットであって、
（Ｉ）エンドムチンの同定手段；
（ＩＩ）該同定手段により候補細胞におけるエンドムチンの発現を検出する手段
を備え、ここで、該候補細胞における該エンドムチンの遺伝子発現は、該候補細胞が成体型造血幹細胞であることを示す、キット。
【請求項４５】
成体型造血幹細胞の移植を必要とする被検体の処置、予防または予後のための方法であって、
（Ｉ）移植されるべき細胞においてエンドムチンの遺伝子が発現しているかどうかを確認する工程；
（ＩＩ）該エンドムチンの遺伝子を発現している細胞を分離または濃縮する工程；および
（ＩＩＩ）該分離または濃縮された細胞を、該被検体に移植する工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
成体型造血幹細胞の移植を必要とする被検体の処置、予防または予後のためのシステムであって、
（Ｉ）エンドムチンの同定手段；
（ＩＩ）該エンドムチンの遺伝子を発現している細胞を分離または濃縮する手段；および
（ＩＩＩ）該分離または濃縮された細胞を、該被検体に移植する手段、
を備える、システム。
【請求項４７】
成体型造血幹細胞の移植を必要とする被検体の処置、予防または予後のための医薬であって、
Ａ）エンドムチンを発現する幹細胞が濃縮された細胞集団、
を含む、医薬。
【請求項４８】
エンドムチンの、成体型造血幹細胞の判定のための使用。
【請求項４９】
エンドムチンを発現する幹細胞の、成体型造血幹細胞の移植のための医薬を製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療および幹細胞に関する。よりとく詳細には、本発明は、成体型造血幹細胞に関連するマーカー、それに関連する判定する方法、キットおよびシステム、それを利用する治療および予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医学（再生医療）による疾患治療が最近注目を浴びている。しかし、これを臓器ないし組織機能不全を呈する多くの患者に対して日常的に適応するまでには至っていない。現在まで、そのような患者の治療として、臓器移植のほか、医療機器での補助システムの利用がごく限られた患者に適応されているにすぎない。しかし、これらの治療法には、ドナー不足、拒絶、感染、耐用年数などの問題がある。特に、ドナー不足は深刻な問題であり、骨髄移植の場合、国内外で骨髄ないし臍帯血バンクが次第に充実してきたといっても、限られたサンプルを多くの患者に提供することが困難である。従って、これらの問題を克服するために幹細胞治療とその応用を中心とした再生医学に対する期待がますます高まっている。
【０００３】
生物の体は一生の間に外傷や病気によって臓器の一部を失ったり、大きな傷害を受けたりする。その場合、損傷した臓器が再生できるか否かは、臓器によって（または動物種によって）異なる。自然には再生できない臓器（または組織）を再生させ、機能を回復させようというのが再生医学である。組織が再生したかどうかは、その機能が改善したかにどうかによって判定することができる。哺乳動物は、組織・器官（臓器）を再生する力をある程度備えている（例えば、皮膚、肝臓および血液の再生）。しかし、心臓、肺、脳などの臓器は再生能力に乏しく、一旦損傷すると、その機能を再生させることができないと考えられてきた。従って、従来であれば、例えば、臓器が損傷した場合、臓器移植による処置しかほとんど有効な措置がなかった。
【０００４】
再生能力の高い臓器には幹細胞が存在することが古くから想定されていた。この概念が正しいことは動物モデルを用いた実験的骨髄移植によって証明された。そして、その後の研究によって骨髄中の幹細胞がすべての血液細胞再生の源であることが明らかにされた。幹細胞は骨髄、皮膚等の再生能力の高い臓器に存在することも明らかにされた。さらに、再生されないと長年思われてきた脳にさえ、幹細胞が存在することが明らかとなってきた。すなわち、体内のあらゆる臓器には幹細胞が存在し、多かれ少なかれ、各臓器の再生を司っていることがわかってきた。また、各組織に存在する幹細胞には予想以上に可塑性があり、ある臓器中の幹細胞は他の臓器の再生にも利用できる可能性が指摘されている。
【０００５】
幹細胞は今まで不可能であった臓器の再生にも利用できる可能性がある。幹細胞治療を中心として、再生医学はその注目度を増している。近年、医学・医療分野から再生に関する研究の必要性が高まるにつれて、幹細胞または器官形成に関する知見が毎年、増大している。例えば、全能性を有する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の樹立と成体体細胞からのクローン個体の作製が特に注目されている。幹細胞治療に発生・再生に関する技術を利用できるからで、幹細胞を用いた再生医学は各分野で臨床応用を目的とした、準備段階にはいっている。また、すでに実用化がすすんでいる分野もある。
【０００６】
再生医学においては、器官・臓器の再構築が最重要となる。この場合、大きく分けて生体外で器官を構築し人工器官として用いる方法と、生体内で器官を再構築させる方法とがある。いずれの場合でも、器官の構築には幹細胞が必要となる。ここで用いられる幹細胞にとって重要な性質としては、多能性および自己複製能がある。
【０００７】
幹細胞には大きく分けて、胚性幹細胞と体性（組織）幹細胞とが存在する。体性幹細胞の中でも古くから注目されていたものとして、造血幹細胞がある。寿命の短い成熟血球をヒトの一生の間維持するためには、造血幹細胞の自己複製能と多分化能とが必要であり、このことは、１９６１年にすでに提唱されていた（非特許文献１）。１９７２年にマウスモデルを用いた骨髄移植法が確立され（非特許文献２）、造血系再構築を調べることにより造血幹細胞を検出することができるようになって以来、造血幹細胞の研究は飛躍的に進展した。その後の研究により、自己複製能と多分化能との両方を有する造血幹細胞の存在が示された（非特許文献３）。しかし、造血幹細胞は、マウスの場合でも１０万個の骨髄細胞中に数個程度という低い頻度で存在することから、実際の研究または臨床応用する場合には、濃縮・純化する必要がある。
【０００８】
従来から造血幹細胞移植治療は行われていたが、天然の細胞を濃縮したものを使用していたことから、種々の副作用があった。例えば、大量抗癌剤または放射線照射を用いた移植前処置による副作用（ＲＲＴ）が存在していた。また、前処置による骨髄抑制中の細菌・真菌感染症、出血；他人からの移植の場合、ドナーの白血球が生着して増えてきた時に患者臓器を異物（他人）とみなして攻撃する反応（移植片対宿主病＝ＧＶＨＤ）；サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）肺炎を中心とする様々な肺合併症；血管内皮細胞（血管の内側を覆っている細胞）の障害による種々の内臓障害；生着後にも遷延する免疫抑制状態（少なくとも１〜２年）の間に罹患する様々な感染症；遷延し様々な症状を呈する慢性ＧＶＨＤ；二次性発癌、性腺機能障害、不妊などの晩期障害などの副作用があった。
【０００９】
以上のような合併症のために、移植を行ったがために、かえって一時的に全身状態が悪くなるということはしばしば起こる。また、合併症のために死亡する患者も、自家移植でも１０〜２０％、他人からの移植では２０〜４０％程度認められる。また、これらの合併症を乗り越えても、もとの病気が再発する可能性があり、現在の移植治療の限界があった。
【００１０】
骨髄移植後の合併症による早期死亡を予防することを目的に幹細胞を分離・純化し、生体外で幹細胞から前駆細胞を大量に産生し、それを幹細胞とともに移植することによって行う治療法が登場し、すでに臨床試験が試みられようとしている。
【００１１】
ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）が１９８０年代に提唱されて以来、ＦＡＣＳを使用した方法が造血幹細胞の濃縮・純化に多用されている。多重染色した骨髄細胞からＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を分離することによって純度の高い造血幹細胞が得られることが明らかになっている（非特許文献４）。上述のように、多分化能および自己複製能は幹細胞の本質である。その能力を十二分に引き出すためには幹細胞を濃縮・純化し、それを体外培養によって増幅することが重要となる。しかし、臨床応用するために必要な濃縮は、種々のマーカーを用いる必要があり、しかも、そのマーカーによる選択が１００％移植適合性または幹細胞の未分化性と相関しているとはいえないことから、治療効果が必ずしも充分ではないと言うことも指摘されている。
【００１２】
幹細胞の分化を調節する機構として種々のタンパク質が重要な役割を果たす。例えば、幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒまたはｓｔｅｅｌ  ｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦともいう）は、造血幹細胞では注目されている因子である。
【００１３】
ＳＣＦは、骨髄ストローマ細胞により生成され、多能性幹細胞、ＣＦＵ−ＧＭのＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−Ｍｅｇなどの骨髄系細胞、リンパ系幹細胞に作用し、これらの分化を支持する。すなわち造血幹細胞から分化細胞へのほぼすべての系統の分化段階の細胞に作用して、他のサイトカインによる最終分化段階への分化誘導する作用を助けるとされる（非特許文献５）。しかし、このような分化因子は、マーカーとはなりえない。
【００１４】
ＣＤ３４、Ｌｉｎ（ｌｉｎｅａｇｅマーカー）、ｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１といった細胞表面マーカーは、幹細胞を識別するために一般に用いられている。しかし、これらのマーカーは、特異性が弱く、しかも単独では移植適合性、幹細胞未分化性を判断するには不十分であるという点が欠点として挙げられている。また、これらのマーカーを組み合わせても、成体型の幹細胞を１００％近く分離することができるかどうかについては疑問がある。
【００１５】
造血細胞には  卵黄嚢におけるヘマンギオブラスト（血管内皮細胞と一次造血細胞の共通の前駆細胞）から発生し胎児中期の造血を担う一次造血と、傍大動脈生殖中腎領域（ＡＧＭ領域）の背側大動脈などの大動脈の血管内皮細胞から派生し、胎児肝造血、さらには成体の骨髄造血を担う二次造血にわけられる（非特許文献６〜８  ）。現時点では、成体骨髄造血を再構築可能な成体型造血幹細胞は胎生１１日前後の傍大動脈生殖中腎領域に初めて出現するとされている  （非特許文献８〜９）。一方、この時期の卵黄嚢細胞に認められる造血幹細胞は新生児肝臓に注入した場合のみ生着可能であり、直接骨髄に生着するために必須なホーミング分子などの発現に問題があるものと想定されている  （非特許文献１０）．
いずれにしても、造血幹細胞の発生は血管内皮細胞と密接な関連を有しており、造血幹細胞と血管内皮細胞は共通の分子を多く発現している。したがって、血管内皮細胞特異的な膜表面抗原の多くは  造血幹細胞の同定にも有用であり、これまでにいくつかの分子が検討されている。例えば、Ｔｉｅ−２やＰＣＬＰ−１、Ｓｃａ−１は背側大動脈の血管内皮細胞の中でも成体型造血幹細胞を産生しうる能力を有するｈｅｍｏｇｅｎｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍの同定やｈｅｍｏｇｅｎｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍから派生した成体型造血幹細胞の同定に有用である  （非特許文献８、１１〜１２）。  一方、ＥＳ細胞からも胎児型造血、成体型造血が誘導しうることが明らかとなり、Ｆｌｋ−１陽性ＶＥ−カドヘリン陽性細胞が造血内皮（ｈｅｍｏｇｅｎｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）とされている  （非特許文献１３）。胚様体を用いた誘導系においては、成体骨髄造血を長期に再構築しうる造血幹細胞が発生することが骨髄移植の系を用いて証明されている（非特許文献１４〜１５）。ＥＳ細胞から発生する、あるいは胎児において発生する成体型（二次造血）造血幹細胞を含む未分化造血細胞のマーカーとしてｃ−ＫｉｔやＣＤ４１などが現時点では用いられている（非特許文献１５〜１８）。しかし、これらは胎児型（一次造血）造血前駆細胞にも発現するとともに、これらのマーカーによる造血幹細胞の純化度は不十分であり、より造血幹細胞に特異的なマーカーが必要とされている。
【００１６】
他方でエンドムチンという細胞膜に存在する分子が報告されている（非特許文献１９〜２３）。エンドムチンは血管内皮細胞特異的に発現するシアロムチン膜蛋白である（非特許文献１９）。申請者らはエンドムチンが成体型造血幹細胞にも特異的に発現していることを同定し、エンドムチンを認識するモノクローナル抗体を用いてエンドムチンの発現がＣＤ３４-ＫＳＬ造血幹細胞およびＣＤ３４＋ＫＳＬ造血前駆細胞にほぼ限局していること、骨髄移植を用いた解析から長期骨髄再構築能を有する造血幹細胞はすべてエンドムチンを発現していることを確認し、エンドムチンを新規の造血幹細胞マーカーとして特許出願をした（特願２００３−３９１５１４、未公開）。
【００１７】
しかし、この分子は、成体型造血幹細胞の判別をし得るかどうか分かっていない。
【非特許文献１】Ｔｉｌｌ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．、Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．１４：２１３−２２２、１９６１
【非特許文献２】Ｍｉｃｋｌｅｍ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，７９：２９３−２９８，１９７２
【非特許文献３】Ｄｉｃｋ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｃｅｌｌ  ４２；７１−７９，１９８５
【非特許文献４】Ｏｓａｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：２４２−２４５，１９９６
【非特許文献５】北村聖（Ｓ．Ｋｉｔａｍｕｒａ）、サイトカインの最前線、羊土社、平野俊夫（Ｔ．Ｈｉｒａｎｏ）編、１７４頁〜１８７頁、２０００
【非特許文献６】Ｐａｌｉｓ  Ｊ，  Ｙｏｄｅｒ  ＭＣ．（２００１）．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２９，  ９２７−９３６
【非特許文献７】Ｄｚｉｅｒｚａｋ  Ｅ．  （２００３）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１０，２２９−３４．
【非特許文献８】ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎ，  Ｍ．Ｆ．，  Ｍａ，  Ｘ．，  Ｒｏｂｉｎ，  Ｃ．，  Ｏｔｔｅｒｓｂａｃｈ，  Ｋ．，  Ｓａｎｃｈｅｚ，  Ｍ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｄｚｉｅｒｚａｋ，  Ｅ．  （２００２）．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６，  ６７３−８３
【非特許文献９】Ｍｕｌｌｅｒ，  Ａ．Ｍ．，  Ｍｅｄｖｉｎｓｋｙ，  Ａ．，  Ｓｔｒｏｕｂｏｕｌｉｓ，  Ｊ．，  Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｄｚｉｅｒｚａｋ，  Ｅ．  （１９９４）．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １，  ２９１−３０１．
【非特許文献１０】Ｙｏｄｅｒ，  Ｍ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｈｉａｔｔ，  Ｋ．  （１９９７）．Ｂｌｏｏｄ  ８９，  ２１７６−２１８３
【非特許文献１１】Ｈａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｉ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｘ．Ｌ．，  Ｔａｋａｋｕｒａ，  Ｎ．，  Ｔａｄａ，  Ｊ．，  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｙ．，  Ｋｏｄａｍａ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｓｕｄａ，  Ｔ．  （１９９９）  Ｂｌｏｏｄ  ９３，  １５４９−１５５６
【非特許文献１２】Ｈａｒａ，  Ｔ．，  Ｎａｋａｎｏ，  Ｙ．，  Ｔａｎａｋａ，  Ｍ．，  Ｔａｍｕｒａ，  Ｋ．，  Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，  Ｔ．，  Ｍｉｎｅｈａｔａ，  Ｋ．，  Ｃｏｐｅｌａｎｄ，  Ｎ．Ｇ．，  Ｊｅｎｋｉｎｓ，  Ｎ．Ａ．，  Ｏｋａｂｅ，  Ｍ．，  Ｋｏｇｏ，  Ｈ．，  Ｍｕｋｏｕｙａｍａ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｍｉｙａｊｉｍａ，  Ａ．  （１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１，  ５６７−７８
【非特許文献１３】Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ＳＩ，  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｓ，  Ｈｉｒａｓｈｉｍａ  Ｍ，  Ｍａｔｓｕｙｏｓｈｉ  Ｎ，  Ｋｏｄａｍａ  Ｈ．（１９９８）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２５，１７４７−１７５７．
【非特許文献１４】Ｋｙｂａ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｄａｌｅｙ，  Ｇ．Ｑ．  （２００３）Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ３１，  ９９４−１００６
【非特許文献１５】Ｂｕｒｔ  ＲＫ，  Ｖｅｒｄａ  Ｌ，  Ｋｉｍ  ＤＡ，  Ｏｙａｍａ  Ｙ，  Ｌｕｏ  Ｋ，  Ｌｉｎｋ  Ｃ．（２００４）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９，  ８９５−９０４．
【非特許文献１６】Ｓａｎｃｈｅｚ  ＭＪ，  Ｈｏｌｍｅｓ  Ａ，  Ｍｉｌｅｓ  Ｃ，  Ｄｚｉｅｒｚａｋ  Ｅ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ５，  ５１３−５２５．
【非特許文献１７】Ｆｅｒｋｏｗｉｃｚ，  Ｍ．Ｊ．，  Ｓｔａｒｒ，  Ｍ．，  Ｘｉｅ，  Ｘ．，  Ｌｉ，  Ｗ．，  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｓ．Ａ．，  Ｓｈｅｌｌｅｙ，  Ｗ．Ｃ．，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｐ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｙｏｄｅｒ，  Ｍ．Ｃ．  （２００３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０，  ４３９３−４４０３．
【非特許文献１８】Ｍｉｋｋｏｌａ，  Ｈ．Ｋ．Ａ．，  Ｆｉｊｉｗａｒａ，  Ｙ．，  Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，  Ｔ．Ｍ．，  Ｔｒａｖｅｒ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｏｒｋｉｎ，  Ｓ．Ｈ．  （２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１，  ５０８−５１６．
【非特許文献１９】Ｍｏｒｇａｎ  Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  93、ｐ１６５−１７５（１９９９）
【非特許文献２０】Ｌｉｕ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＲＣ  ２８８，１２９−１３６（２００１）
【非特許文献２１】Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４９９．１２１−１２６（２００１）
【非特許文献２２】Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＲＣ  ２８７，５０１−５０６（２００１）
【非特許文献２３】Ｓａｍｕｌｏｗｉｔｚ  Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌ．，１６０，１６６９−１８１，２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、成体型造血幹細胞を効率的に識別することができる因子を同定することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、一部、本発明者らが、鋭意検討した結果、エンドムチン自体が、予想外に、成体型造血幹細胞を、特に、胎児由来型から効率よく識別することができるマーカー機能を有することを見出したことによって、上記課題を解決した。
【００２０】
エンドムチンは血管内皮細胞特異的に発現するシアロムチン膜蛋白である。本発明者らは、本発明において、ＥＳ細胞から成体型造血細胞が発生する過程におけるエンドムチンの発現を、汎造血細胞マーカーであるＣＤ４５と造血発生早期に発現を認める未分化造血細胞マーカーＣＤ４１との関連において詳細に検討した。その結果、ＥＳ細胞から胚様体を形成させて培養後４〜７日の胚様体においてはほとんどがＣＤ４５陰性細胞であり、ＣＤ４１＋エンドムチン＋、ＣＤ４１＋エンドムチン-、ＣＤ４１-エンドムチン＋、ＣＤ４１-エンドムチン-の４つの細胞群に分画されること、ＣＤ４１＋エンドムチン＋細胞分画に高度に多能性前駆細胞が濃縮されていることが明らかとなった。また、７日目以降の胚様体においてＣＤ４５陽性のより成熟した血液細胞が出現するが、そのほとんどがエンドムチン陽性であった。同様の所見はＥＳの胚様体５日目に相当する胎生１０．５日胎仔における成体型造血の発生部位、ＡＧＭ領域においても確認され、ＣＤ４５陰性細胞におけるＣＤ４１＋エンドムチン＋、ＣＤ４１＋エンドムチン-、ＣＤ４１-エンドムチン＋、ＣＤ４１-エンドムチン-の４分画の中で、ＣＤ４１＋エンドムチン＋細胞分画に高度に多能性前駆細胞が濃縮され、さらに成体骨髄造血を長期に再建可能な造血幹細胞が含まれることを確認した。また、胎児型造血の場である胎生８．５日の卵黄嚢においてはエンドムチンの発現が全く認められないことから、Ｃ−ＫｉｔやＣＤ４１と異なり、エンドムチンは成体型造血幹細胞の特異的なマーカーであると判断された。ＥＳ細胞からの造血発生と胎児造血発生の結果から、エンドムチンは成体造血幹細胞に特異的な新規マーカーであり、既知のマーカーよりもより高度に成体型造血幹細胞を濃縮しうる有用な分子であることが明らかとなった。これらの知見を今後ヒトＥＳ細胞に応用しうれば、産業上の利用価値は高いものと考える。
【００２１】
従って、本発明は、以下を提供する。
（１）エンドムチンの同定手段を含む、成体型造血幹細胞の検出組成物。
（２）上記成体型造血幹細胞は、長期骨髄再構築能を有する細胞を含む、上記項目に記載の組成物。
（３）上記同定手段は、エンドムチンをコードする核酸配列またはその一部を含む核酸分子に対する特異的な因子を含む、上記項目に記載の組成物。
（４）上記エンドムチンは、
（ａ）配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１、３、５、７または９に記載の塩基配列の対立遺伝子変異体またはスプライス変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
を含む、上記項目に記載の組成物。
（５）上記エンドムチンは、配列番号２、４、６、８または１０に示される配列を含む、上記項目に記載の組成物。
（６）上記核酸分子は、配列番号１、３、５、７または９に示される配列を含む、上記項目に記載の組成物。
（７）上記エンドムチンの同定手段は、抗エンドムチン抗体である、上記項目に記載の組成物。
（８）上記エンドムチンの同定手段は、エンドムチンをコードする核酸配列またはその一部に対して相補的な配列を含む核酸分子である、上記項目に記載の組成物。
（９）上記同定手段は、標識されているかまたは標識可能である、上記項目に記載の組成物。
（１０）上記標識は、放射性物質、化学発光物質、蛍光物質、燐光物質、発色剤、リガンド、ハプテンおよびそれらの原材料からなる群より選択される、上記項目に記載の組成物。
（１１）さらなるマーカーの同定手段を含む、上記項目に記載の組成物。
（１２）上記さらなるマーカーは、ＣＤ３４、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ４１およびＣＤ４５からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを含む、上記項目に記載の組成物。
（１３）上記さらなるマーカーは、ＣＤ４１およびＣＤ４５からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを含む、上記項目に記載の組成物。
（１４）上記さらなるマーカーは、ＣＤ４１およびＣＤ４５を含む、上記項目に記載の組成物。
（１５）上記マーカーは、胎児型造血前駆細胞と成体型造血幹細胞とを識別する能力を有する、上記項目に記載の組成物。
（１６）上記成体型造血幹細胞は、多能性を保持する細胞である、上記項目に記載の組成物。
（１７）上記成体型造血幹細胞は、胚性幹細胞由来の細胞である、上記項目に記載の組成物。
（１８）上記成体型造血幹細胞は、骨髄移植に使用される細胞である、上記項目に記載の組成物。
（１９）上記成体型造血幹細胞は、胚性幹細胞から胚様体を形成させて生産される細胞である、上記項目に記載の組成物。
（２０）上記標識は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）およびビオチンからなる群より選択される少なくとも１つの色素を含む、上記項目に記載の組成物。
（２１）サンプルにおいて成体型造血幹細胞を検出するための方法であって、
Ａ）上記サンプルとエンドムチンの同定手段とを接触させる工程
を包含する、方法。
（２２）  さらに、
Ｂ）上記エンドムチン陽性の細胞が見出されたときに、成体型造血幹細胞が存在すると判定する工程、
を包含する、上記項目に記載の方法。
（２３）  Ｃ）ＣＤ４１およびＣＤ４５からなる群より選択されるマーカー因子の同定手段と上記サンプルとを接触させる工程をさらに包含する、
上記項目に記載の方法。
（２４）  上記ＣＤ４１陽性の細胞が見出されたとき、および上記ＣＤ４５陽性の細胞が見出されたときからなる群より選択される少なくとも１つの場合に、成体型造血幹細胞が存在すると判定される、上記項目に記載の方法。
（２５）上記サンプルは、胚性幹細胞を含むかまたは含むと予想されるサンプルである、上記項目に記載の方法。
（２６）サンプルにおいて成体型造血幹細胞を検出するためのキットであって、上記キットは：
Ａ）エンドムチンの同定手段
を備える、キット。
（２７）成体型造血幹細胞が分離または濃縮された組成物を生産する方法であって、
Ａ）成体型造血幹細胞を含むかまたは含むと予想される供給源を提供する工程；
Ｂ）上記供給源とエンドムチンの同定手段とを接触させる工程；
Ｃ）エンドムチン陽性細胞を分離または濃縮する工程、
を包含する、方法。
（２８）上記同定手段は抗エンドムチン抗体であり、上記濃縮はフローサイトメトリーにより行われる、上記項目に記載の方法。
（２９）さらに、ＣＤ４１陽性細胞を濃縮する工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（３０）さらに、ＣＤ４５陰性細胞を濃縮する工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（３１）  ＣＤ３４、ＣＤ４１、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）およびｃ−Ｋｉｔからなる群より選択されるさらなるマーカーに対するサンプルの反応性を決定し、上記ＣＤ３４、上記Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）、上記ＣＤ３４、上記ＣＤ４１および上記ｃ−Ｋｉｔの遺伝子発現は、上記候補細胞が幹細胞であることを示し、上記Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）の遺伝子の陰性発現は、上記候補細胞が幹細胞であることを示すことによってさらに成体型造血幹細胞を濃縮する工程をさらに包含する、上記項目に記載の方法。
（３２）上記分離または濃縮は、抗体非動化ディッシュによるパニング、フローサイトメトリーまたは磁気ビーズを用いて行われる、上記項目に記載の方法。
（３３）上記分離または濃縮は、ＦＡＣＳおよび磁気ビーズを組み合わせて行われる、上記項目に記載の方法。
（３４）成体型造血幹細胞が分離または濃縮された組成物を生産するキットであって、
Ａ）エンドムチンの同定手段；
Ｂ）上記同定手段と成体型造血幹細胞を含むかまたは含むと予想される供給源とを接触させる手段；および
Ｃ）エンドムチン陽性細胞を分離または濃縮する手段、
を備えるキット。
（３５）上記項目に記載の方法によって調製された、成体型造血幹細胞組成物。
（３６）エンドムチンを発現し、かつ、ＣＤ４１を発現する細胞が濃縮された、成体型造血幹細胞組成物。
（３７）上記成体型造血幹細胞組成物は、ＣＤ４５を発現しない細胞が濃縮されている、上記項目に記載の成体型造血幹細胞組成物。
（３８）候補細胞が成体型造血幹細胞であるかどうかを判定する方法であって、
（Ｉ）判定されるべき候補細胞を提供する工程；
（ＩＩ）エンドムチンをコードする核酸分子もしくはその一部、またはエンドムチンポリペプチドまたはその一部に特異的に反応する因子を、上記候補細胞に接触させる工程；および
（ＩＩＩ）上記因子と上記エンドムチンをコードする核酸分子もしくはその一部、またはエンドムチンポリペプチドまたはその一部との特異的反応を検出することによって、上記エンドムチンの遺伝子が上記候補細胞において発現しているかどうかを確認する工程、
を包含し、ここで、上記候補細胞における上記エンドムチンの遺伝子発現は、上記候補細胞が成体型造血幹細胞であることを示す、方法。
（３９）上記発現の確認は、フローサイトメトリーによって行われる、上記項目に記載の方法。
（４０）ＣＤ３４、ＣＤ４１、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）およびｃ−Ｋｉｔからなる群より選択されるマーカーに対して特異的な少なくとも１つの因子を、上記候補細胞に接触させる工程をさらに包含し、ここで、
上記候補細胞における上記ＣＤ３４、上記ＣＤ４１および上記ｃ−Ｋｉｔの遺伝子発現は、上記候補細胞が幹細胞であることを示し、上記Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）の遺伝子の陰性発現は、上記候補細胞が幹細胞であることを示す、上記項目に記載の方法。
（４１）分化抗原陽性（ｌｉｎｅａｇｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞を枯渇させる工程をさらに包含する、上記項目に記載の方法。
（４２）上記枯渇工程は、ＭＡＣＳによって行われる、上記項目に記載の方法。
（４３）上記枯渇工程は、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、ＴＥＲ１１９、ＣＤ４、ＣＤ８およびＢ２２０からなる群より選択される少なくとも1つのＬＩＮ（Ｌｉｎｅａｇｅ）マーカーを用いて行われる、上記項目に記載の方法。
（４４）候補細胞が成体型造血幹細胞であるかどうかを判定するキットであって、
（Ｉ）エンドムチンの同定手段；
（ＩＩ）上記同定手段により候補細胞におけるエンドムチンの発現を検出する手段
を備え、ここで、上記候補細胞における上記エンドムチンの遺伝子発現は、上記候補細胞が成体型造血幹細胞であることを示す、キット。
（４５）成体型造血幹細胞の移植を必要とする被検体の処置、予防または予後のための方法であって、
（Ｉ）移植されるべき細胞においてエンドムチンの遺伝子が発現しているかどうかを確認する工程；
（ＩＩ）上記エンドムチンの遺伝子を発現している細胞を分離または濃縮する工程；および
（ＩＩＩ）上記分離または濃縮された細胞を、上記被検体に移植する工程、
を包含する、方法。
（４６）成体型造血幹細胞の移植を必要とする被検体の処置、予防または予後のためのシステムであって、
（Ｉ）エンドムチンの同定手段；
（ＩＩ）上記エンドムチンの遺伝子を発現している細胞を分離または濃縮する手段；および
（ＩＩＩ）上記分離または濃縮された細胞を、上記被検体に移植する手段、
を備える、システム。
（４７）成体型造血幹細胞の移植を必要とする被検体の処置、予防または予後のための医薬であって、
Ａ）エンドムチンを発現する幹細胞が濃縮された細胞集団、
を含む、医薬。
（４８）エンドムチンの、成体型造血幹細胞の判定のための使用。
（４９）エンドムチンを発現する幹細胞の、成体型造血幹細胞の移植のための医薬を製造するための使用。
【００２２】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によって、簡便に成体型造血幹細胞を識別し、分離、濃縮することができるようになった。また、本発明によって、簡便にしかも効率よく、成体型造血幹細胞の移植適合性を判定することができるようになった。
【００２４】
本発明の方法で用いられる移植としては、たとえば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に由来する、成体型造血幹細胞の移植が代表例として挙げられる。ここで、幹細胞のうちでも、成体型造血幹細胞の移植の目的と対象疾患としては、例えば以下が挙げられる。１）質的および／または量的に異常のある幹細胞を正常の幹細胞に置き換えることが必要な疾患：重症再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、サラセミア、先天性免疫不全症候群など；２）超大量の化学療法または放射線照射による不可逆的なリンパ組織または造血器組織の障害を回避することが必要な疾患：白血病（慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は除く）、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、固形がん（例えば、乳がん、神経芽細胞腫、肺小細胞がん、卵巣がんなど）；３）恒久的な酵素の補足が必要な疾患：先天性代謝異常症など。
【００２５】
本発明の方法を用いて成体型造血幹細胞を効率よく選択、分離および濃縮することができるようになったことによって、上記のような成体型造血幹細胞の移植手術においてさらに効率よい治療および副作用の軽減を行うことができるようになった。また、増幅因子などを用いれば、成体型造血幹細胞を少量効率よく取り出した後に、治療に必要な量を調製することも可能である。必要な量を調製した後に、さらに本発明の成体型造血幹細胞の判定法により適切な細胞を濃縮してもよい。このような場合、拒絶反応（例えば、移植片対宿主病など）が軽減するか起こりえなくなる。
【００２６】
エンドムチンは成体造血幹細胞に特異的な新規マーカーであり、既知のマーカーよりもより高度に成体型造血幹細胞を濃縮しうる有用な分子であることが明らかとなったことから、。と考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下に本発明の好ましい形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」、「ｕｎａ」、「ｅｌ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００２８】
（定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２９】
（エンドムチン）
本明細書において「エンドムチン」（ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ）とは、配列番号１、３、５、７または９（核酸配列）および配列番号２、４、６、８または１０（アミノ酸配列）に示されるような配列を有する因子および他の種の動物において対応する因子（オルソログ）をいう。エンドムチンは、血管内皮細胞特異的に発現する膜表面分子として同定されたシアロムチンタンパク質である（Ｍｏｒｇａｎ  Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  93、ｐ１６５−１７５（１９９９）；Ｌｉｕ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＲＣ  ２８８，１２９−１３６（２００１））。細胞外にスレオニン残基およびセリン残基が多い（３５％）２４８アミノ酸（マウス）のＩ型膜タンパク質であるといわれており、Ｏ−シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼによる分解を受けやすいことも知られている（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．同上）。ヒトでは、２６１アミノ酸を有する分子として知られている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．同上）。この分子は、シアリダーゼおよびＯ−グリコシダーゼによって見かけ上の分子量は４５ｋＤａになるといわれている。さらに、２００１年には、ヒトにおいてエンドムチン１とエンドムチン２とが存在するという報告がされた（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４９９．１２１−１２６（２００１））。これらの分子は、多重グリコシル化モチーフを持つ約２５ｋＤａのＩ型膜タンパク質分子であってＯ−シアロ糖たんぱく質エンドペプチダーゼ消化を受けやすい分子として同定された。その性状から細胞外マトリクスへの細胞接着をネガティブに調節しているという示唆がされている。
【００３０】
エンドムチンは、マウス胚の背大動脈において特に内皮細胞において強く発現することが報告され、その中で、全長配列に加えて４つのスプライス変異体（全長＝１ａ＝１〜２６１（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａらの報告と同一）、１ｂ＝１３０〜１４２が欠損（Ｍｏｒｇａｎらの報告と同一）、１ｃ＝９２〜１２９が欠損、１ｄ＝９２〜１４２が欠損）が存在することが報告された（Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＲＣ  ２８７，５０１−５０６（２００１））（それぞれ、配列番号１−２、配列番号３−４、５−６、７−８（奇数番号は核酸配列であり、偶数番号はアミノ酸番号））。本明細書では、１ａが全長配列であり、配列番号１および２（奇数番号は核酸配列であり、偶数番号はアミノ酸番号）に示される配列を有するものであることが理解される。本発明では、これらすべての変異体がマーカーとして使用することができることが理解される。また、ヒトにもエンドムチンが存在し、配列番号９および１０（奇数番号は核酸配列であり、偶数番号はアミノ酸番号）に示される配列を有することが示されており、上述のスプライス変異体が存在し得ることが理解される。
【００３１】
エンドムチンは、Ｌ−セレクチンリガンドとしての可能性も最近になって報告されている（Ｓａｍｕｌｏｗｉｔｚ  Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌ．，１６０，１６６９〜１８１，２００２）。
【００３２】
しかし、これらの報告では、エンドムチンは、血管内皮（特に、静脈内皮、毛細血管；動脈内皮にはあまり発現されない）に特異的に発現することが示されただけで、その機能は知られておらず、癌診断、細胞外マトリクスとの関連における使用が示唆されているものの、幹細胞における発現解析はされておらず、ましてや移植適合性のマーカーになることは知られていなかったが、本発明者らは、特願2003-391514において、幹細胞および移植適合性のマーカーとなることを確認した。
【００３３】
エンドムチンは、ヒトのほか、ラットおよびマウスなどを含む哺乳動物一般でそのホモログが知られている。従って、本明細書においてエンドムチンは、通常、ヒトのほか、哺乳動物一般において存在するエンドムチンを指す。また、エンドムチンは、種々スプライス変異体（あるいは、アイソフォーム）が知られているが、それらのすべてのスプライス変異体がマーカーとして使用され得ることが理解される。
【００３４】
本発明において用いられるエンドムチンは、人工的に作製したり、合成により作製することもできる。そのような人工的に作製されたエンドムチンとしては、変異が導入されたエンドムチンが挙げられる。
【００３５】
エンドムチンであるかどうかを判断するには、エンドムチンの活性のうち少なくとも１つで有意な活性が判定することができることで十分である。そのような、エンドムチン活性としては、例えば、エンドムチン特異的単クローナル抗体により認識される分子であり、o-グリコシド結合型の糖鎖の付加に富み、in vitroで特定の細胞株に高発現させると接着を阻害する性質を有することなどが挙げられるがそれらに限定されない。そのような活性を確認する方法としては、例えば、糖鎖の同定アッセイ、細胞を形質転換させて接着阻害を見るアッセイなどが挙げられるがそれらに限定されず、当業者であれば、そのような活性を判定する方法を適宜構築することができることが理解される。
【００３６】
本発明において用いられるエンドムチンについて、糖鎖が付加され得る部分としては、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンなどが結合するＮ−グルコシド結合可能な部分（アサウパラギン−Ｘ−セリン／スレオニン）、およびＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、シアル酸などのＯ−グリコシド結合をする部分（セリンまたはスレオニン残基が頻出する部分）が挙げられる。本明細書において使用されるエンドムチンまたはエンドムチンは、糖鎖の有無は特に活性に影響を与えるというわけではないが、これらの糖鎖が付加されたタンパク質は、通常生体内での分解に対して安定であり、強い生理活性を有し得る。従って、これら糖鎖が付加されたポリペプチドもまた、本発明の範囲内にある。
【００３７】
（細胞）
本発明では、未分化状態および／または移植適合性を判定することが企図される細胞が対象であり、通常幹細胞が使用され得るが本発明の因子による処理によって所望の細胞になることができる細胞であれば、どのような細胞でも使用することができる。
【００３８】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能と多分化能を有した細胞と定義され、実際には組織が傷害を受けたときに少なからずその組織を再生することができる細胞をいう。本発明において使用される幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ）または組織幹細胞（組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。従って、本発明の１つの好ましい実施形態では、細胞として胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓとＥｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ）が使用され得る。別の好ましい実施形態では、組織幹細胞（例えば、骨髄細胞（例えば、造血幹細胞））が使用され得る。
【００３９】
本明細書において「前駆細胞」とは、ある細胞について言及するとき、その細胞に分化する能力を有する細胞をいう。従って、造血細胞の前駆細胞は、分化すると、造血細胞になり得ることが理解される。本明細書では、「幹細胞」と「前駆細胞」とは、同義で用いられる。
【００４０】
本明細書において「血管芽細胞（hemangioblast）」とは、血管および血球のもとになる，中胚葉由来の細胞をいう。初めは孤立的な細胞集団をなし、血島とも呼ばれる。その周辺部のものは扁平となり、内皮細胞に分化する。中心部にある細胞は造血幹細胞となり、これから種々の血球が分化する。血島はやがて癒合して連続した血管となる。従って、血管芽細胞は、血球系および血管系の始原細胞ということができる。
【００４１】
本明細書において「成体型造血幹細胞」とは、「成体型造血幹細胞」または「成体型造血前駆細胞」と交換可能に使用され、傍大動脈生殖中腎領域（AGM領域）の背側大動脈などの大動脈の血管内皮細胞から派生し、胎児肝造血、さらには成体の骨髄造血を担う二次造血を担う幹細胞をいう（非特許文献６〜８）。現時点では、成体骨髄造血を再構築可能な成体型造血幹細胞は胎生11日前後の傍大動脈生殖中腎領域に初めて出現するとされている(非特許文献８〜９）。一方、この時期の卵黄嚢細胞に認められる造血幹細胞は新生児肝臓に注入した場合のみ生着可能であり、直接骨髄に生着するために必須なホーミング分子などの発現に問題があるものと想定されている(非特許文献１０）。ES細胞からも胎児型造血、成体型造血が誘導しうることが明らかとなり、Flk-1陽性ＶＥ−カドヘリン陽性細胞が造血内皮とされている (非特許文献１３）。胚様体を用いた誘導系においては、成体骨髄造血を長期に再構築しうる造血幹細胞が発生することが骨髄移植の系を用いて証明されている（非特許文献１４〜１５）。
【００４２】
本明細書において、「胎児型造血幹細胞」とは、卵黄嚢におけるヘマンギオブラスト（血管内皮細胞と一次造血細胞の共通の前駆細胞）から発生し胎児中期の造血を担う一次造血を担う幹細胞をいう。成体型とは機能が異なり、胎児型造血幹細胞は、成体型の機能を完全に担うことはできないことから、成体型造血幹細胞を必要とする患者では、造血幹細胞の中でも成体型のものを提供することが必要である。胎児型造血幹細胞は、胎生8.5日の卵黄嚢においてよく生産されるとされている。
【００４３】
本明細書において使用される、成体型幹細胞などの幹細胞の測定方法としては、例えば、コロニーアッセイ法（例えば、幹細胞培養法）、ＣＤ３４を指標としたフローサイトメトリー（ＦＣＭ）法（例えば、蛍光ヒストグラム表示法＝ＦＬ表示従来法、蛍光一側方散乱光表示法＝ＦＬ−ＳＳＣ法）などが挙げられるがそれらに限定されない。コロニーアッセイ法では、培地上で幹細胞を培養し得られたコロニー数を計数することによって増殖能および数を評価することができる。蛍光ヒストグラム表示法では、蛍光標識した抗ＣＤ３４抗体によって染色した後、ＦＣＭによって計数し、コントロール以上のＦＬ値を示す細胞をすべて陽性細胞として数えることによって判定される。したがって、蛍光ヒストグラム表示法は、数の評価法ということができる。ただし、この表示法は、一部の単球を含めて算定されることから、著しく高い値になることがある。ＦＬ−ＳＳＣ法では、蛍光標識した抗ＣＤ３４抗体によって染色した後、ＦＣＭによって計数し、ＦＬ値とＳＳＣ値とで描いた二次元グラフ上で他と明確に分離される幹細胞領域のみを陽性細胞として計数する。これもまた数の評価法ということができる。さらに、ＦＬ−ＳＳＣ法では、単球の影響をほとんど受けないことから、コロニーアッセイとの相関が極めてよいという特徴がある。
【００４４】
幹細胞の指標としては、例えば、ＣＤ４１（配列番号３３〜３６）、ＣＤ４５（配列番号３７〜４０）、ＣＤ３４（配列番号１３〜１６）、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）、ｃ−Ｋｉｔ（配列番号２５〜２６）、Ｓｃａ−１（配列番号２７〜２８）およびＦｌｔ３／Ｆｌｋ２（配列番号１１〜１２）などのマーカーが挙げられるがそれらに限定されない。
【００４５】
本明細書において「Ｌｉｎ（マーカー）」、「Ｌｉｎｅａｇｅ（マーカー）」、および「分化抗原（マーカー）」は互換可能に用いられ、分化状態のマーカーをいい、陽性となると分化しており、陰性となると分化していないものをいう。Ｌｉｎマーカーとしては、例えば、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１（配列番号１７−１８）、ＴＥＲ１１９、ＣＤ４（配列番号１９−２０）、ＣＤ８（配列番号２１−２２）およびＢ２２０（配列番号２３−２４）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００４６】
組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が比較的限定されている細胞であり、組織中に存在し、未分化な細胞内構造をしている。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。従って、本発明の１つの好ましい実施形態において、細胞として血液細胞へと方向付けられた組織幹細胞が使用され得る。
【００４７】
組織幹細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉、内胚葉由来の幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の組織幹細胞には、脳に存在する神経幹細胞、皮膚存在にする表皮幹細胞、毛包幹細胞および色素幹細胞が含まれる。中胚葉由来の組織幹細胞には、骨髄中および血液中に認められるに血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞が含まれる。内胚葉由来の組織幹細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膵幹細胞、腸管上皮幹細胞が含まれる。そのほかに精層および卵層には生殖系幹細胞（ｇｅｒｍ  ｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）が存在する。本発明の好ましい実施形態では、中胚葉由来の幹細胞が使用され得る。本発明のより好ましい実施形態では、骨髄細胞（例えば、造血幹細胞）が使用され得る。
【００４８】
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。本発明の１つの実施形態では、予想外に骨髄細胞が好適であることが判明した。
【００４９】
好ましい実施形態において、本発明では、骨髄細胞をそのまま供給源として使用することもできるし、濃縮または純化したある特定の細胞集団（例えば、組織幹細胞）を細胞供給源として用いることができる。
【００５０】
本明細書において「再生」とは、損傷した組織ないし臓器が元通りに回復することをいい、病理的再生ともいう。生物の体は一生の間に外傷や病気によって臓器の一部を失ったり、大きな傷害を受けたりする。その場合、損傷した臓器が再生できるか否かは、臓器によって（または動物種によって）異なる。自然には再生できない臓器（または組織）を再生させ、機能を回復させようというのが再生医学である。組織が再生したかどうかは、その機能が改善したかにどうかによって判定することができる。哺乳動物は、組織・器官（臓器）を再生する力をある程度備えている（例えば、皮膚、肝臓および血液の再生）。しかし、心臓、肺、脳などの臓器は再生能力に乏しく、一旦損傷すると、その機能を再生させることができないと考えられてきた。従って、従来であれば、例えば、心臓が損傷した場合、心臓移植による処置しかほとんど有効な措置がなかった。
【００５１】
再生能力の高い臓器には幹細胞が存在することが古くから想定されていた。この概念が正しいことは動物モデルを用いた実験的骨髄移植によって証明された。そして、その後の研究によって骨髄中の幹細胞がすべての血液細胞再生の源であることが明らかにされた。幹細胞は骨髄、皮膚等の再生能力の高い臓器に存在することも明らかにされた。さらに、再生されないと長年、思われてきた脳、心臓などにも幹細胞が存在することが明らかとなってきた。すなわち、体内のあらゆる臓器には幹細胞が存在し、多かれ少なかれ、各臓器の再生を司っていることがわかってきた。また、各組織に存在する幹細胞には予想以上に可塑性があり、ある臓器中の幹細胞は他の臓器の再生にも利用できる可能性が指摘されている。したがって、本発明において見出された増幅作用は、このような種々の組織幹細胞においても有効であり、その用途は無限大にある。
【００５２】
本明細書において「分化」または「細胞分化」とは、１個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的・機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団（細胞系譜）が、特定のタンパク質の産生などはっきりした特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を，ゲノム中の特定の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態をもたらす細胞内あるいは細胞外の因子または条件を探索することにより細胞分化を同定することができる。細胞分化の結果は原則として安定であって、特に動物細胞では，別の型の細胞に分化することは例外的にしか起こらない。従って、「未分化」とは、形態的・機能的に質的な差を未だ持たない細胞の状態をいう。
【００５３】
本明細書において未分化状態の「維持」は、多能性を保持することをいう。従って、未分化状態が維持されているかどうかは、多能性を保持しているかどうかを判定することによって判断することができる。
【００５４】
本明細書において幹細胞の「増幅（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」とは、その幹細胞の自己増幅能および多能性（多分化能）を保持したまま細胞数が増加することをいう。
【００５５】
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、骨格筋細胞、神経細胞、心筋細胞、血液細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、胆管細胞、血液細胞（例えば、赤血球、血小板、Ｔ細胞、Ｂ細胞など）、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。従って、本発明の１つの実施形態において、ある原料細胞を本発明の因子（たとえば、エンドムチンポリペプチドまたは核酸）で処理することによって、白血球のような分化細胞に分化させることができる場合、そのような分化細胞もまた本発明の範囲内にある。
【００５６】
本発明の供給源として使用される細胞は、本発明において使用されるポリペプチド、核酸、組成物、キットおよび／または医薬での処理により、造血系の細胞へと分化することができる。
【００５７】
本明細書において「多能性」または「多分化能」とは、互換可能に使用され、細胞の性質をいい、種々の組織または器官（臓器）に属する細胞に分化し得る能力をいう。通常、細胞の多能性は発生が進むにつれて制限され，成体では一つの組織または器官を構成する分化細胞が別の組織または器官の細胞に変化することは少ない。したがって多能性は通常失われている。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）と呼ばれる。しかし間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。従って、本発明の原料細胞としては、多能性を有する細胞自体であることが好ましくあり得るが、これは必ずしも必要ではない。
【００５８】
本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は「全能性」といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ただし、明確に区別する場合は、全能性と多能性とは区別され得、前者はどのような細胞へも分化し得る能力をいい、後者は、複数の方向を有するが、生物が可能なすべての方向には分化できない能力を有することをいう。また、１つの方向にのみ分化する能力は、単能性ともいう。
【００５９】
本明細書において全能性と多能性とは、例えば、受精後の日数により判定することができ、例えば、マウスであれば、受精後約８日を基準として区別され得る。理論に束縛されないが、マウスでは、受精後、以下のような経過をたどることが通常である。受精後６．５日（Ｅ６．５とも表記する）では、原始線条（原条ともいう）がエピブラストの片側に出現し、胚の将来の前後軸が明らかになる。原条は、胚の将来の後方端を示し、外胚葉を横切って円筒の遠位端まで達する。原条は、細胞運動が行われる領域であり、その結果、将来の内胚葉と中胚葉とが形成されることになる。Ｅ７．５までに結節の前方に頭部突起が出現し、この部分には脊索と、それを取り囲んで下層には将来の内胚葉、上層には神経板が形成されることになる。結節は、Ｅ６．５日ごろから現れ、後方へと移動し、軸構造が前から後ろへと形成される。Ｅ８．５日までに胚は幾分丈が長くなり、その前端には大部分前方神経板からなる大きな頭部ヒダが形成される。体節はＥ８日から１．５時間に１個の割合で前方から後方へと形成され始める。この時期を越えた細胞は、仮に胎盤に戻したとしても、脱分化をしない限りもはや全能性を示さず、個体を形成しない。これより前では特別の処理をしなくても全能性を示し得ることから、この点が全能性の分岐点であるといえる。このことは、ＥＳ細胞がこれ以降の胚から樹立することが困難であり、これ以降の胚からは通常ＥＧ（生殖細胞由来）細胞と呼ばれる細胞が樹立されることから、そのような意味でも分岐点であるといえる。造血幹細胞などの組織幹細胞は、このようなＥＳ細胞を分離する時期よりも後の時期の個体から分離することができる。
【００６０】
（生化学・分子生物学）
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされ得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）などが挙げられる。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。特に言及する場合、本発明の「ポリペプチド」は、エンドムチンまたはエンドムチンを指すこともある。
【００６１】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified cytosine）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzerら、NucleicAcid Res. 19: 5081(1991); Ohtsukaら、J. Biol. Chem. 260: 2605-2608(1985);Rossoliniら、Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994)）。
【００６２】
本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。本発明において用いられる場合、エンドムチンはまた、この核酸形態をとり得る。特に、エンドムチンは、種々スプライス変異を受けることが明らかとなっており、そのマーカーとしての機能はどれにもあると推定されることから、そのすべてが幹細胞の未分化状態および／または移植適合性のマーカーとして使用されることが理解される。
【００６３】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する遺伝子を調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００６４】
本明細書ではアミノ酸および塩基配列の類似性、相同性および同一性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。特に言及される場合、同一性の検索は例えば、NCBIのBLAST 2.2.9 (2004.5.12 発行)を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【００６５】
本明細書において「リガンド」とは、あるタンパク質に特異的に結合する物質をいう。例えば，細胞膜上に存在する種々のレセプタータンパク質分子と特異的に結合するレクチン、抗原、抗体、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリクスなどがリガンドとして挙げられる。したがって、本発明のエンドムチンに対するリガンドは、本発明のマーカーを検出する因子として使用することができることが理解される。
【００６６】
本明細書において「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning 2nd ed.，Current Protocols in Molecular Biology，Supplement1〜38、DNA Cloning 1:  Core Techniques，A Practical Approach，Second Edition，OxfordUniversity Press(1995)などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。従って、本発明において使用されるポリペプチド（例えば、エンドムチン１またはそのスプライス改変体など）には、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。
【００６７】
本明細書において「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号２、４、６、８または１０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。核酸配列の相同性は、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌら（J.Mol.Biol.215,403-410(1990)）が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、ｓｃｏｒｅで類似度が示される。
【００６８】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Sambrook et al.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、ColdSpring Harbor Laboratory(Cold Spring Harbor,N,Y.1989)、同第3版（2001）;およびAnderson etal.、Nucleic Acid Hybridization: A Practical approach、IV、IRL Press Limited(Oxford，England). Limited，Oxford，Englandを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Andersonet al.、Nucleic Acid Hybridization: a Practical Approach、第4章、IRL Press Limited(Oxford，England)を参照のこと。
【００６９】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Tm（℃）＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(%G+C)-600/N-0.72（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
【００７０】
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
【００７１】
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
【００７２】
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１ＭＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Suggsら、DevelopmentalBiology Using Purified Genes、683頁、Brown and Fox(編)(1981)を参照のこと）。
【００７３】
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、細胞、核酸またはタンパク質、あるいはそれらに対する因子など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。細胞の場合は、ある特定の性質を有する細胞（例えば、成体型造血幹細胞）が、別の性質の細胞（例えば、分化細胞、胎児型幹細胞など）から分離され、単離されていることをいう。
【００７４】
本明細書において「精製された」または「純化された」生物学的因子（例えば、細胞、核酸またはタンパク質、あるいはそれらに対する因子など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。細胞の場合は、ある特定の性質を有する細胞（例えば、成体型造血幹細胞）が、別の性質の細胞（例えば、分化細胞、胎児型幹細胞など）から分離され、純化・精製されていることをいう。
【００７５】
本明細書中で使用される用語「純化された」、「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。
【００７６】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。好ましい実施形態では、そのような発現されたポリペプチドは、糖鎖修飾されたエンドムチンであり得る。本発明では、発現は、転写および翻訳の両方を含むことが理解される。したがって、本発明のエンドムチンの遺伝子の発現を確認する場合、転写物の存在および翻訳物の存在の両方またはその一方を確認することが企図されることが理解されるべきである。
【００７７】
本明細書において「発現」が「陰性」、「弱陽性」、「陽性」または「強陽性」であるとは、タンパク質の発現で観察する場合、一次抗体（例えば、ビオチン化抗エンドムチン抗体）および二次抗体（例えば、PE標識ストレプトアビジン）を用いた際のfluorescence intensity (FI)で示される。ここで、A: 強陽性（High(++)）：FI>500；B: 弱陽性（dull (+)）：100<FI<500；C:陰性（negative(-)）：FI<100であると定義され、A+Bを総称して陽性（positive）という。エンドムチンの場合はエンドムチン陽性などと称する。「発現」が「陰性」、「弱陽性」、「陽性」または「強陽性」は、本明細書では、代替的に、−、±、＋、＋＋であらわすことがある。
【００７８】
ｍＲＮＡレベルの発現強度は、RT-PCRまたはマイクロアレイを用いた発現分析を用いることができる。ＲＴ−ＰＣＲを用いた場合は、相対的にデンシトメーターを用いて定量化することができ、より詳細に数値化する場合は、マイクロアレイにおいてハウスキーピング遺伝子であるＨＲＰＴに対してそれより少ない発現は陰性、同等を弱陽性およびそれより強い（統計学的に強い）レベルを強陽性であらわすことができる。
【００７９】
本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。したがって、あるマーカーの存在を確認するために、そのマーカーに特異的な因子を使用する場合、その因子とマーカーとの相互作用を確認することによって、そのマーカーの存在を確認することができる。
【００８０】
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。したがって、本発明のエンドムチンの発現を確認する場合、それに特異的な因子を用いて結合を確認することによって、エンドムチンの発現が確認されていることが確認されたと理解される。
【００８１】
本明細書中で使用される用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「改変する（ｍｏｄｉｆｙ）」は、特定の活性またはタンパク質の量、質または効果における増加または減少あるいは維持を意味する。
【００８２】
エンドムチンまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１、３、５、７または９などの核酸配列の全部または一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。好ましいエンドムチンまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４２℃の温度で  ７％ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ  ＮａＣｌ；６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；１％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；０．１％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１、３、５、７または９に示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
【００８３】
本明細書において、エンドムチンの「同定手段」とは、エンドムチン（例えば、エンドムチンポリペプチド、エンドムチン核酸など）を同定することができる任意の手段をいう。本明細書において用いられる手段としては、エンドムチンの発現が同定され得る限り、当該分野において公知の任意の手段を用いることができることが理解され、例えば、プローブ、プライマー、抗体、特異的結合を有する他の因子などを挙げることができる。例えば、本発明のエンドムチンをコードする核酸またはその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸分子は、プローブとして使用することができる。このような核酸分子は、他の分子と交差的に結合したとしても、エンドムチンをコードする核酸を結合することができることから、プローブとして有用であることが理解され得る。このような同定手段は、通常、直接または間接的に、標識されるか、または標識可能である。
【００８４】
本明細書において「マーカー」とは、ある分子（例えば、エンドムチン）の存在を確認することができる指標をいい、例えば、ＣＤ抗原（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ４１、ＣＤ４５など）を挙げることができるがそれらに限定されない。
【００８５】
本明細書において「検出組成物」とは、ある分子（例えば、エンドムチン）の存在を検出するための組成物をいう。
【００８６】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
【００８７】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。好ましくは、プローブは標識で標識され得る。
【００８８】
プローブとして通常用いられるタンパク質としては、例えば、抗体またはその誘導体が挙げられるがそれらに限定されない。プローブとして、タンパク質が用いられる場合も、直接または間接的に標識で標識され得る。
【００８９】
本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：  ４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：  ２４４４−２４４８  （１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：  １９５−１９７  （１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：  ４４３−４５３  （１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明においてマーカーとして使用されるエンドムチンまたは他のマーカー（ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ３４など）などには、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
【００９０】
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求めることも可能である。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列(他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする)と比較したときに、付加または欠失(すなわちギャップ)が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（８）：  ２４４４−２４４８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５  （３）：  ４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２）：  ４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：  ３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：  ４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：  ２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  （ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：  ２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：  ４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：  ２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：  ３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。
【００９１】
（１）  ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２）  ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３）  ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４）  ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５）  ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
【００９２】
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：  ２２６７−２２６８を参照のこと）。
【００９３】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【００９４】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【００９５】
本明細書において「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。
【００９６】
本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体である。
【００９７】
本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、上述のＤ型アミノ酸、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。
【００９８】
本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
【００９９】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
【０１００】
その文字コードは以下のとおりである。
アミノ酸
３文字記号  １文字記号  意味
Ａｌａ      Ａ          アラニン
Ｃｙｓ      Ｃ          システイン
Ａｓｐ      Ｄ          アスパラギン酸
Ｇｌｕ      Ｅ          グルタミン酸
Ｐｈｅ      Ｆ          フェニルアラニン
Ｇｌｙ      Ｇ          グリシン
Ｈｉｓ      Ｈ          ヒスチジン
Ｉｌｅ      Ｉ          イソロイシン
Ｌｙｓ      Ｋ          リジン
Ｌｅｕ      Ｌ          ロイシン
Ｍｅｔ      Ｍ          メチオニン
Ａｓｎ      Ｎ          アスパラギン
Ｐｒｏ      Ｐ          プロリン
Ｇｌｎ      Ｑ          グルタミン
Ａｒｇ      Ｒ          アルギニン
Ｓｅｒ      Ｓ          セリン
Ｔｈｒ      Ｔ          トレオニン
Ｖａｌ      Ｖ          バリン
Ｔｒｐ      Ｗ          トリプトファン
Ｔｙｒ      Ｙ          チロシン
Ａｓｘ                  アスパラギンまたはアスパラギン酸
Ｇｌｘ                  グルタミンまたはグルタミン酸
Ｘａａ                  不明または他のアミノ酸。
塩基
記号  意味  
ａ    アデニン
ｇ    グアニン
ｃ    シトシン
ｔ    チミン
ｕ    ウラシル
ｒ    グアニンまたはアデニンプリン
ｙ    チミン／ウラシルまたはシトシンピリミジン
ｍ    アデニンまたはシトシンアミノ基
ｋ    グアニンまたはチミン／ウラシルケト基
ｓ    グアニンまたはシトシン
ｗ    アデニンまたはチミン／ウラシル
ｂ    グアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｄ    アデニンまたはグアニンまたはチミン／ウラシル
ｈ    アデニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｖ    アデニンまたはグアニンまたはシトシン
ｎ    アデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル、不明、または他の塩基。
【０１０１】
本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。また、本発明のエンドムチンでは、対応するアミノ酸は、例えば、リン酸化される部位であり得る。別の実施形態では、本発明のエンドムチンでは、対応するアミノ酸は、グリコシル化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。
【０１０２】
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、マウスのエンドムチンなどの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（ヒト、ラット、ブタ、ウシなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウスのエンドムチンなどの遺伝子）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【０１０３】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド型核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【０１０５】
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう（例えば、核酸分子またはポリペプチド、およびそれに対して特異的な因子）。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、相補配列を有する核酸分子同士、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。このような特異的相互作用を利用して、本発明の同定手段は、エンドムチンを同定することができる。
【０１０６】
したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
【０１０７】
本明細書において「因子」（ａｇｅｎｔ）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１０８】
本明細書中で使用される「化合物」は、任意の識別可能な化学物質または分子を意味し、これらには、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこのような化合物は、天然物または合成物であり得る。
【０１０９】
本明細書において「有機低分子」とは、有機分子であって、比較的分子量が小さなものをいう。通常有機低分子は、分子量が約１０００以下のものをいうが、それ以上のものであってもよい。有機低分子は、通常当該分野において公知の方法を用いるかそれらを組み合わせて合成することができる。そのような有機低分子は、生物に生産させてもよい。有機低分子としては、例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１０】
本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、化合物を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在し得る。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。
【０１１１】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子がリガンドである場合、その生物学的活性は、そのリガンドが対応するレセプターに結合する活性を包含する。本発明のエンドムチンの場合は、その生物学的活性は、少なくともエンドムチンが有する活性の少なくとも１つ（細胞外マトリクスへの細胞接着をネガティブに調節する能力、エンドムチン特異的抗体への結合能など）を包含する。
【０１１２】
本明細書において生物学的活性をアッセイする方法としては、（例えば、上述のエンドムチンを判定するためのアッセイ）を利用したアッセイが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１３】
本発明において使用されるポリペプチドを製造する方法としては、例えば、そのポリペプチドを産生する初代培養細胞または株化細胞を培養し、培養上清などから単離または精製することによりそのポリペプチドを得る方法が挙げられる。あるいは、遺伝子操作手法を利用して、そのポリペプチドをコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み込み、これを用いて発現宿主を形質転換し、この形質転換細胞の培養上清から組換えポリペプチドを得ることができる。上記宿主細胞は、生理活性を保持するポリペプチドを発現するものであれば、特に限定されず、従来から遺伝子操作において利用される各種の宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、動物細胞など）を用いることが可能である。このようにして得られた細胞に由来するポリペプチドは、天然型のポリペプチドと実質的に同一の作用を有する限り、アミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換、付加および／または欠失していてもよく、糖鎖が置換、付加および／または欠失していてもよい。
【０１１４】
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【０１１５】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Kyte  J. and  Doolittle，R.  F.  J.  Mol.  Biol.  157(1):  105-132，1982）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【０１１６】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
【０１１７】
親水性指数もまた、本発明のアミノ酸配列を改変するのに有用である。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【０１１８】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１９】
本明細書において「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体、スプライス変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、本発明のエンドムチンのオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【０１２０】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。
【０１２１】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【０１２２】
本明細書において「ペプチドアナログ」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログが付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
【０１２３】
本発明のポリペプチドがポリマーに結合している、化学修飾されたポリペプチド組成物は、本発明の範囲に包含される。このポリマーは、水溶性であり得、水溶性環境（例えば、生理学的環境）でこのタンパク質の沈澱を防止し得る。適切な水性ポリマーは、例えば、以下からなる群より選択され得る：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物に基づくポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール。この選択されたポリマーは、通常は改変され、単一の反応性基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有し、その結果、重合度は制御され得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、そして、このポリマーは分枝状でも分枝状でなくてもよく、そしてこのようなポリマーの混合物はまた、使用され得る。この化学修飾された本発明のポリマーは、治療用途に決定付けられる場合、薬学的に受容可能なポリマーが使用するために選択される。
【０１２４】
このポリマーがアシル化反応によって改変される場合、このポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。あるいは、このポリマーが還元アルキル化によって改変される場合、このポリマーは単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。好ましい反応性アルデヒドは、ポリエチレングリコール、プロピオンアルデヒド（このプロピオンアルデヒドは、水溶性である）または、そのモノＣ１〜Ｃ１０の、アルコキシ誘導体もしくはアリールオキシ誘導体である（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号（これは、本明細書中で全体が参考として援用される）を参照のこと）。
【０１２５】
本発明のポリペプチドのＰＥＧ化（Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、例えば、以下の参考文献に記載されるような、当該分野で公知の、任意のＰＥＧ化反応によって実施され得る：Focus on Growth Factors 3,4-10(1992);EP 0 154 316;およびEP 0 401 384（これらの各々は、本明細書中で、全体が参考として援用される）。好ましくは、このＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施される。本発明のポリペプチド（例えば、エンドムチンまたはその活性型あるいはその活性化因子など）のＰＥＧ化のための好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書中で使用される場合、「ポリエチレングリコール」は、ＰＥＧの任意の形態の包含することを意味し、ここで、このＰＥＧは、他のタンパク質（例えば、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコールまたはモノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アリールオキシポリエチレングリコール）を誘導体するために使用される。
【０１２６】
本発明のポリペプチドの化学誘導体化を、生物学的に活性な物質を活性化したポリマー分子と反応させるのに使用される適切な条件下で、実施され得る。ＰＥＧ化した本発明のポリペプチドを調製するための方法は、一般に以下の工程を包含する：（ａ）エンドムチンまたはその活性型あるいはその活性化因子が１以上のＰＥＧ基に結合するような条件下で、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの、反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とこのポリペプチドを反応させる工程および（ｂ）この反応生成物を得る工程。公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて、最適な反応条件またはアシル化反応を選択することは当業者に容易である。
【０１２７】
ＰＥＧ化された本発明のポリペプチドは、一般に、本明細書中に記載のポリペプチドを投与することによって、緩和または調節され得る状態を処置するために使用され得るが、しかし、本明細書中で開示された、化学誘導体化された本発明のポリペプチド分子は、それらの非誘導体分子と比較して、さらなる活性、増大された生物活性もしくは減少した生物活性、または他の特徴（例えば、増大された半減期または減少した半減期）を有し得る。本発明のポリペプチド、それらのフラグメント、改変体および誘導体は、単独で、併用して、または他の薬学的組成物を組み合わせて使用され得る。
【０１２８】
本発明では、発現されるものが恒常的または一過的にエンドムチンを生成するものであれば、核酸形態（核酸分子）も使用することができる。このような核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のエンドムチンと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
【０１２９】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【０１３０】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、癌マーカー、神経疾患マーカーなど）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【０１３１】
本発明において使用されるポリペプチドは、任意の生物由来であり得る。好ましくは、その生物は、脊椎動物（例えば、哺乳動物、爬虫類、両生類、魚類、鳥類など）であり、より好ましくは、哺乳動物（例えば、齧歯類（マウス、ラットなど）、霊長類（ヒトなど）など）であり得る。本発明において使用されるポリペプチドは、所望の効果を発揮するかぎり、合成されたものでもよい。そのようなポリペプチドは、当該分野において周知の合成方法によって合成され得る。例えば、自動固相ペプチド合成機を用いた合成方法は、Stewart，J.  M.  et al.  (1984).  Solid Phase Peptide Synthesis，PierceChemical Co.;  Grant，G.  A.  (1992).Synthetic Peptides: A User’s Guide，W.  H.  Freeman;  Bodanszky，M.  (1993).  Principlesof Peptide Synthesis，Springer-Verlag;  Bodanszky，M.  et al.(1994).  The Practiceof Peptide Synthesis，Springer-Verlag;  Fields，G.  B.  (1997).  Phase PeptideSynthesis，Academic Press;  Pennington，M.  W.  et al.  (1994).  Peptide SynthesisProtocols，Humana Press;  Fields，G.  B.  (1997).  Solid-Phase Peptide Synthesis，AcademicPressにおいて記載されている。
【０１３２】
本発明において使用されるポリペプチド（例えば、エンドムチンポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して特異的な因子）は、抗体のヒンジ領域部分のみとの融合タンパク質を発現させて、ジスルフィド結合にて２量体を形成させる方法、もしくは活性に影響を与えないほかの方法でジスルフィド結合を生じさせる形態で、Ｃ末端、Ｎ末端または他の場所において発現するように作製された融合タンパク質を含む二量体以上高い比活性を有する多量体型ポリペプチドもまた利用され得る。また、配列を直列で並べて多量体構造を持たせる方法も本発明において利用可能である。従って遺伝子工学技術により作製される任意の二量体またはそれを超える形態は、本発明の範囲内にある。あるいは、本発明の二量体またはそれを超える形態に含まれるモノマーは、同種であってもよく異種であってもよい。
【０１３３】
（免疫学）
本明細書において「抗体」とは、当該分野で通常使用される意味で用いられ、本明細書においては、抗体の全部およびそのフラグメント、誘導体、結合体なども包含する。好ましくは、本発明において使用されるポリペプチドを認識する抗体であり、より好ましくは、本発明において使用されるポリペプチドを特異的に認識する抗体である。そのような抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。本発明の１実施形態において、そのような抗体もまた、本発明の範囲内に包含される。
【０１３４】
本明細書において「抗原」とは、抗体と結合したり、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球などの特異的レセプターに結合して、抗体産生および／または細胞障害などの免疫反応をひきおこす物質（例えば、タンパク質、脂質、糖などが挙げられるがそれらに限定されない）をいう。抗体またはリンパ球レセプターとの結合性を、「抗原性」（ａｎｔｉｇｅｃｉｔｙ）という。抗体産生などの免疫応答を誘導する特性を「免疫原性」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）という。抗原として使用される物質は、例えば、その目的とする物質（例えば、タンパク質）を少なくとも１つ含む。含まれる物質は、全長が好ましいが、免疫を惹起し得るエピトープを少なくとも一つ含んでいれば、部分配列でもよい。本明細書において「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体またはリンパ球レセプターが結合する抗原分子中の部位をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
【０１３５】
エピトープは、必ずしもその正確な位置および構造が判明していないとしても使用することができる。従って、エピトープには特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、Ｔ細胞の場合は、Ｔ細胞レセプタータンパク質および／もしくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビボまたはインビトロで、エピトープは、分子の特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷）であり、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むエピトープは、エピトープに独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のこのようなアミノ酸からなる。エピトープの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフォメーションを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
【０１３６】
従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。エピトープは線状であってもコンフォメーション形態であってもよい。
【０１３７】
高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）は種々のレベルの構成に関して記述され得る。この構成の一般的な議論については、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  （第３版、１９９４）、ならびに、Ｃａｎｔｏｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ、 Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ｉ： Ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ （１９８０）を参照。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に配置された三次元構造をいう。これらの構造はドメインとして一般に公知である。ドメインは、ポリペプチドの緻密単位を形成し、そして代表的には５０〜３５０アミノ酸長であるそのポリペプチドの部分である。代表的なドメインは、βシート（βストランドなど）およびα−ヘリックスのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）のような、部分から作られる。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有的会合により形成される三次元構造をいう。異方性に関する用語は、エネルギー分野において知られる用語と同様に使用される。したがって、本発明において使用されるポリペプチドは、エンドムチンと同等の能力を有するような高次構造を有する限り、どのようなアミノ酸配列のポリペプチドをも包含し得る。
【０１３８】
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、生体内の特定の部位または時期において少なくとも１つの他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。従って、本発明のエンドムチンをコードする遺伝子は、発現が所望される部位または時期に特異的に発現するように操作することができる。そのような技術は、当該分野において周知であり、本明細書において援用した文献に記載されている。
【０１３９】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J.et al.(1989).Molecular Cloning:  A Laboratory Manual，ColdSpring Harborおよびその3rd Ed.(2001);  Ausubel，F.  M.  (1987).  Current Protocols inMolecular Biology，Greene Pub.  Associates and Wiley-Interscience;  Ausubel，F.  M.  (1989).ShortProtocols in Molecular Biology:  A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Pub.  Associates and Wiley-Interscience;  Innis，M.  A.  (1990).  PCRProtocols:  A Guide to Methods and Applications，Academic Press;  Ausubel，F.  M.  (1992).ShortProtocols in Molecular Biology:  A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Pub.  Associates;  Ausubel，F.  M.(1995).Short Protocolsin Molecular Biology:  A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology，Greene Pub.  Associates;  Innis，M.  A.  et al.(1995).PCRStrategies，Academic Press;  Ausubel，F.  M.  (1999).Short Protocols in MolecularBiology:  A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，andannual updates;  Sninsky，J.  J.  et al.(1999).PCR Applications:  Protocols forFunctional Genomics，Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１４０】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Gait，M.  J.  (1985).  Oligonucleotide Synthesis:  A Practical Approach，IRL  Press;  Gait，M.  J.  (1990).  OligonucleotideSynthesis:  A Practical Approach，IRL Press;  Eckstein，F.(1991).  Oligonucleotidesand Analogues:  A Practical Approach，IRL Press;  Adams，R.  L.  et  al.  (1992).  TheBiochemistry of the Nucleic Acids，Chapman  &  Hall;  Shabarova，Z.  et al.  (1994).  AdvancedOrganic Chemistry of Nucleic Acids，Weinheim;  Blackburn，G.  M.  etal.(1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology，Oxford University Press;  Hermanson，G.  T.  (I996).BioconjugateTechniques，Academic Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１４１】
（遺伝子工学）
本発明において用いられるエンドムチンなどならびにそのフラグメントおよび改変体ならびにそれに対する因子（例えば、抗体など）は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
【０１４２】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、動物個体などの宿主細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。本明細書において、ベクターはプラスミドであり得る。
【０１４３】
本明細書において「ウイルスベクター」とは、ベクターのうち、ウイルス由来のものをいう。本明細書において「ウイルス」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをゲノムとして有する、感染細胞内だけで増殖する感染性の微小構造体をいう。ウイルスとしては、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科およびヘパドナウイルス科からなる群より選択される科に属するウイルスが挙げられる。本明細書において「レトロウイルス」とは、ＲＮＡの形で遺伝情報を有し、逆転写酵素によってＲＮＡの情報からＤＮＡを合成するウイルスをいう。
【０１４４】
本明細書において「レトロウイルスベクター」とは、レトロウイルスを遺伝子の担い手（ベクター）として使用した形態をいう。本発明において使用される「レトロウイルスベクター」としては、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ（ＭＭＬＶ）、Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ（ＭＳＣＶ）にもとづいたレトロウイルス型発現ベクターなどが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、レトロウイルスベクターとしては、ｐＧｅｎ−、ｐＭＳＣＶなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１４５】
本明細書において「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。ヒトの場合、本発明に用いる発現ベクターはさらにｐＣＡＧＧＳ（Niwa H et al，Gene;  108:  193-9(1991)）を含み得る。
【０１４６】
本明細書において「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、動物個体などの宿主細胞において自律複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
【０１４７】
本明細書において、動物細胞に対する「組換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平3-22979、Cytotechnology，3,133(1990)）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３（J.Biochem.，101，1307  (1987)）、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ（J.  Biol.  Chem.，268，22782-22787  (1993)）、ｐＣＡＧＧＳ（NiwaH et al，Gene;  108:  193-9  (1991)）などが例示される。
【０１４８】
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターとしては、哺乳動物由来のターミネーターのほかに、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、タバコＰＲ１ａ遺伝子のターミネーターが挙げられるが、これに限定されない。
【０１４９】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
【０１５０】
本明細書において、遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、生物（例えば、動物）の部位（例えば、動物の場合、心臓、心筋細胞など）におけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、生物（たとえば、動物）の特定の段階（例えば、発作時など）に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。そのような特異性は、適切なプロモーターを選択することによって、所望の生物に導入することができる。
【０１５１】
本明細書において「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。植物において使用する場合、エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前初期エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好ましい。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
【０１５２】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【０１５３】
本発明は、任意の動物において利用され得る。そのような動物における利用のための技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ausubel F.  A.  et al.編(1988)、 Current Protocols in MolecularBiology、 Wiley、New York、NY; Sambrook J. et al.(1987) Molecular Cloning: ALaboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
【０１５４】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、動物細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。
【０１５５】
本明細書において「動物」は、当該分野において最も広義で用いられ、脊椎動物および無脊椎動物を含む。動物としては、哺乳綱、鳥綱、爬虫綱、両生綱、魚綱、昆虫綱、蠕虫綱などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、動物は、哺乳動物を含む。
【０１５６】
本発明において使用されるポリペプチド、核酸、キット、システム、組成物および方法は、哺乳動物だけでなく他の動物を含む動物全体において機能することが企図される。なぜなら、エンドムチンは、哺乳動物以外の生物においても存在することが予想されるからである。
【０１５７】
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。
【０１５８】
本明細書において、生物の「組織」とは、細胞の集団であって、その集団において一定の同様の作用を有するものをいう。従って、組織は、臓器（器官）の一部であり得る。臓器（器官）内では、同じ働きを有する細胞を有することが多いが、微妙に異なる働きを有するものが混在することもあることから、本明細書において組織は、一定の特性を共有する限り、種々の細胞を混在して有していてもよい。
【０１５９】
本明細書において「器官（臓器）」とは、１つ独立した形態をもち、１種以上の組織が組み合わさって特定の機能を営む構造体を形成したものをいう。動物では、胃、肝臓、腸、膵臓、肺、気管、鼻、心臓、動脈、静脈、リンパ節（リンパ管系）、胸腺、卵層、眼、耳、舌、皮膚等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１６０】
本明細書において「エンドムチンまたはエンドムチンを活性化する因子で処理」するとは、本発明のエンドムチンまたはエンドムチンを活性化する因子に細胞を暴露して増幅させるようにすることをいう。したがって、そのような処理には、直接接触させることのほか、細胞に一過的に発現させるように形質転換してその発現を誘導することなどの技術が含まれる。
【０１６１】
本明細書において「トランスジェニック」とは、特定の遺伝子がある生物に組み込むことまたは組み込まれた生物（例えば、動物（マウスなど）または植物を含む）をいう。
【０１６２】
本発明においてトランスジェニック生物が利用される場合、そのようなトランスジェニック生物は、マイクロインジェクション法（微量注入法）、ウィルスベクター法、ＥＳ細胞法（胚性幹細胞法）、精子ベクター法、染色体断片を導入する方法（トランスゾミック法）、エピゾーム法などを利用したトランスジェニック動物の作製技術を使用して作製することができる。そのようなトランスジェニック動物の作成技術は当該分野において周知である。
【０１６３】
（スクリーニング）
本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物またはマーカーが提供されることも企図される。
【０１６４】
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質（例えば、エンドムチン）などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよく、インシリコ（コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。
【０１６５】
１実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質または本発明のポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分に結合するか、またはこれらの活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチの任意のものを使用して得られ得、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアクセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０１６６】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：  ６９０９；  Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ  ９１： １１４２２； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ  ３７： ２６７８；  Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１： １３０３；  Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３： ２０５９；  Ｃａｒｅｌｌ   ｅｔ  ａｌ．（１９９４） Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３： ２０６１；  およびＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．３７： １２３３。
【０１６７】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２〜４２１，１９９２）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４，１９９１）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：  ５５５〜５５６，１９９３）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ、上記）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５〜１８６９，１９９２）またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：  ３８６〜３９０；  Ｄｅｖｌｉｎ  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：  ４０４〜４０６；  Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：  ６３７８〜６３８２；  Ｆｅｌｉｃｉ  （１９９１）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：  ３０１〜３１０；  Ｌａｄｎｅｒ上記）において示され得る。
【０１６８】
本発明は、他の実施形態において、本発明の活性成分（例えば、エンドムチンポリペプチドまたは核酸またはその同定手段）と同等に有効な因子をスクリーニングするための道具として、コンピューターによる定量的構造活性相関（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ＝ＱＳＡＲ）モデル化技術を使用して得られる化合物もまた、本発明に包含される。ここで、コンピューター技術は、いくつかのコンピューターによって作成した基質鋳型、ファーマコフォア、ならびに活性部位の相同モデルの作製などを包含する。一般に、インビトロで得られたデータから、ある物質に対する相互作用物質の通常の特性基をモデル化することに対する方法は、ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭ  ファーマコフォア法（Ｅｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：  ４７７〜４８９，１９９９；  Ｅｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ＆  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８８：  ２１〜２９，１９９９；  Ｅｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ＆  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９０：  ４２９〜４３８，１９９９；  Ｅｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ＆  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９１：  ４２４〜４３３，１９９９）および比較分子電界分析（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｉｅｌｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ；ＣｏＭＦＡ）（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ＆  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，２４：  １〜６，１９９６）などを使用して示されている。本発明において、コンピュータモデリングは、分子モデル化ソフトウェア（例えば、ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭバージョン４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）など）を使用して行われ得る。
【０１６９】
例えば、エンドムチンの活性部位に対する化合物のフィッティングは、当該分野で公知の種々のコンピュータモデリング技術のいずれかを使用してで行うことができる。視覚による検査および活性部位に対する化合物のマニュアルによる操作は、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，１９９２）、ＳＹＢＹＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，１９９２）、ＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，１０６：  ７６５−７８４，１９８４）、ＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｃｈｅｍ．，４：  １８７〜２１７，１９８３）などのようなプログラムを使用して行うことができる。これに加え、ＣＨＡＲＭＭ、ＡＭＢＥＲなどのような標準的な力の場を使用してエネルギーの最小化を行うこともできる。他のさらに特殊化されたコンピュータモデリングは、ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，２８：  ８４９〜８５７，１９８５）、ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１：  ２９〜３４，１９９１）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ｏｌｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：  １９５〜２０２，１９９０）、ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，１６１：  ２６９〜２８８，（１９８２））などを含む。さらなる構造の化合物は、空白の活性部位、既知の低分子化合物における活性部位などに、ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ａｉｄ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｄｅｓｉｇｎ，６：  ６１〜７８，１９９２）、ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ  ａｎｄ  Ｉｔａｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７：  ８９８５，１９９１）、ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などのようなコンピュータープログラムを使用して新規に構築することもできる。このようなモデリングは、当該分野において周知慣用されており、当業者は、本明細書の開示に従って、適宜本発明の範囲に入る化合物（例えば、エンドムチンまたはそれに特異的な因子の等価物）を設計することができる。
【０１７０】
（投与・注入・医薬）
本発明によって調製された細胞（例えば、成体型造血幹細胞、それを含む移植物、それから分化した細胞（例えば、造血系の細胞））または細胞組成物は、生物への移入に適した形態であれば、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。
【０１７１】
投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、患部への直接投与などが挙げられる。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。本発明の組成物および医薬は、全身投与されるとき、発熱物質を含ない、経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能なタンパク質溶液の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などに相当な注意を払うことを条件として、当業者の技術範囲内である。
【０１７２】
本発明において医薬の処方のために使用される溶媒は、水性または非水性のいずれかの性質を有し得る。さらに、そのビヒクルは、処方物の、ｐＨ、容量オスモル濃度、粘性、明澄性、色、滅菌性、安定性、等張性、崩壊速度、または臭いを改変または維持するための他の処方物材料を含み得る。同様に、本発明の組成物は、有効成分の放出速度を改変または維持するため、または有効成分の吸収もしくは透過を促進するための他の処方物材料を含み得る。
【０１７３】
本発明は、医薬または医薬組成物として処方される場合、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４改正およびその追補、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）と、所望の程度の純度を有する選択された組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。
【０１７４】
そのような適切な薬学的に受容可能な因子としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または農学的もしくは薬学的アジュバント。代表的には、本発明の医薬は、本発明の活性成分（例えば、ポリペプチドまたは核酸など）を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに組成物の形態で投与され得る。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。そのような受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
【０１７５】
本発明の組成物またはキットはまた、さらに生体親和性材料を含み得る。この生体親和性材料は、例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン、グリコール酸・乳酸の共重合体、エチレンビニル酢酸共重合体、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレートからなる群より選択される少なくとも１つを含み得る。成型が容易であることからシリコーンが好ましい。生分解性高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、α−ヒロドキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸など）およびヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸など）からなる群より選択される１種以上から無触媒脱水重縮合により合成された重合体、共重合体またはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸など）、無水マレイン酸系共重合体（例えば、スチレン−マレイン酸共重合体など）のポリ酸無水物などが挙げられる。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよく、α−ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−体、Ｌ−体、ＤＬ−体のいずれでも用いることが可能である。好ましくは、グリコール酸・乳酸の共重合体が使用され得る。
【０１７６】
細胞などを含む注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法も使用され得る。例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、本発明の医薬は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。その溶液のｐＨはまた、種々のｐＨにおいて、本発明の活性成分（例えば、ポリペプチドまたは核酸など）の相対的溶解度に基づいて選択されるべきである。
【０１７７】
本発明の製剤の処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、投与すべきポリペプチド量および細胞量を決定することができる。
【０１７８】
１つの実施形態において、本発明の組成物および医薬は、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態で投与される場合、活性成分（例えば、核酸またはポリペプチド）は、徐々に放出されるので、長期にわたり薬効が期待される場合に有効である。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状（ペレット状、シリンダー状、針状など）、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤（持続性投与剤）を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型の乳濁製注射液など）とする方法などが挙げられる。
【０１７９】
別の実施形態では、本発明では、さらに他の薬剤もまた投与することも企図される。そのような薬剤は、当該分野において公知の任意の医薬であり得、例えば、そのような薬剤は、薬学において公知の任意の薬剤（例えば、抗生物質など）であり得る。当然、そのような薬剤は、２種類以上の他の薬剤であり得る。そのような薬剤としては、例えば、日本薬局方最新版、米国薬局方最新版、他の国の薬局方の最新版において掲載されているものなどが挙げられる。
【０１８０】
他の実施形態において、本発明の方法によって調製された細胞は２種類以上の細胞を含み得る。２種類以上の細胞を使用する場合、類似の性質または由来の細胞を使用してもよく、異なる性質または由来の細胞を使用してもよい。
【０１８１】
本発明の方法において使用されるポリペプチド、核酸、組成物、医薬および細胞の量は、使用目的、対象物の齢、サイズ、性別、既往歴、ポリペプチド、核酸、組成物、医薬もしくは細胞の形態または種類、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。
【０１８２】
本発明の組成物を対象物に対して与える頻度もまた、使用目的、対象物の齢、サイズ、性別、既往歴、および処置経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、一日に１回〜数回、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
【０１８３】
本発明では、エンドムチンまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子を用い、成体型造血幹細胞を誘導することなどによる遺伝子治療が有用であり得る。
【０１８４】
核酸分子を含む本発明の組成物を投与する場合、核酸分子は、非ウイルスベクター形態またはウイルスベクター形態による投与、またはｎａｋｅｄ  ＤＮＡでの直接投与の形態などで投与され得る。このような投与形態は、当該分野において周知であり、例えば、別冊実験医学「遺伝子治療の基礎技術」羊土社、１９９６；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに詳説されている。
【０１８５】
特定の実施形態において、本発明の正常な遺伝子の核酸配列、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０１８６】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法は、以下のとおりである。
【０１８７】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：  ８７−９５  （１９９１）；  Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ３２：  ５７３−５９６  （１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：  ９２６−９３２  （１９９３）；  ならびにＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６２：  １９１−２１７  （１９９３）；  Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：  １５５−２１５  （１９９３）を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ  （１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０１８８】
非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクチン法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などが利用され得る。発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＡＧＧＳ（Gene 108: 193-9、Niwa H，Yamamura K,Miyazaki J(1991)）、ｐＢＪ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅなどから入手可能である）などが挙げられる。
【０１８９】
ＨＶＪ−リポソーム法は、脂質二重膜で作製されたリポソーム中に核酸分子を封入し、このリポソームと不活化したセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ、ＨＶＪ）とを融合させることを包含する。このＨＶＪ−リポソーム法は、従来のリポソーム法よりも、細胞膜との融合活性が非常に高いことを特徴とする。ＨＶＪ−リポソーム調製法は、別冊実験医学「遺伝子治療の基礎技術」羊土社、１９９６；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７に詳述されている。ＨＶＪとしては、任意の株が利用可能であり（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９０７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１０５など）、Ｚ株が好ましい。
【０１９０】
本発明の組成物は、ウイルスベクターの核酸形態で提供される場合、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターが利用される。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、エンドムチンをコードする核酸またはエンドムチンをコードする核酸を導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。これらウイルスベクターでは、アデノウイルスの感染効率が他のウイルスベクターによる効率よりも遙かに高いことから、アデノウイルスベクター系を用いることが好ましい。
【０１９１】
Ｎａｋｅｄ  ＤＮＡ法の場合、上述の非ウイルスベクターである発現プラスミドを生理食塩水などに溶解し、そのまま投与する。例えば、Ｔｓｕｒｕｍｉ  Ｙ，Ｋｅａｒｎｅｙ  Ｍ，Ｃｈｅｎ  Ｄ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｍ，Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  Ｓ，Ｙａｎｇ  Ｊ，Ｓｙｍｅｓ  ＪＦ，Ｉｓｎｅｒ  ＪＭ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８  （Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ）、３８２−３８８  （１９９７）に記載される方法により、生物の器官の組織などに直接注入することができる。
【０１９２】
従って、本発明の組成物およびキットにおいて含まれる活性成分としてのポリペプチド（例えば、エンドムチンなど）の量は、例えば、成人（体重約６０ｋｇ）の場合、約１μｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約５μｇ〜約１００ｍｇであり得る。このポリペプチドの量の範囲の下限は、例えば、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇなど、約１μｇ〜約１ｍｇの間の任意の数値であり得る。このポリペプチドの量の範囲の上限は、例えば、約１０００ｍｇ、約９００ｍｇ、約８００ｍｇ、約７００ｍｇ、約６００ｍｇ、約５００ｍｇ、約４００ｍｇ、約３００ｍｇ、約２００ｍｇ、約１００ｍｇ、約７５ｍｇ、約５０ｍｇ、約２５ｍｇ、約１０ｍｇ、約５ｍｇなど、約１０００ｍｇ〜約１ｍｇの任意の数値であり得る。
【０１９３】
本発明の活性成分が核酸形態（例えば、エンドムチンをコードする核酸またはエンドムチンをコードする核酸など）の場合、成人（体重約６０ｋｇ）の場合、約１μｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１μｇ〜約１０００μｇ、より好ましくは約５μｇ〜約４００μｇであり得る。この核酸の量の範囲の下限は、例えば、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇなど、約１μｇ〜約２０μｇの間の任意の数値であり得る。この核酸の量の範囲の上限は、例えば、約１０ｍｇ、約９ｍｇ、約８ｍｇ、約７ｍｇ、約６ｍｇ、約５ｍｇ、約４ｍｇ、約３ｍｇ、約２ｍｇ、約１ｍｇ、約７５０μｇ、約５００μｇ、約２５０μｇ、約１００μｇなど、約１０ｍｇ〜約１０μｇの任意の数値であり得る。２種類以上の細胞生理活性物質（ＳＣＦなど）が含まれる場合も、上記の量が個々に適用される。ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターとして投与される場合は、通常、０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ、より好ましくは０．０１〜１ｍｇである。投与頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。
【０１９４】
本発明において調製された細胞を含む組成物において含まれる細胞の量は、例えば、約１×１０３細胞〜約１×１０１１細胞、好ましくは約１×１０４細胞〜約１×１０１０細胞、より好ましくは約１×１０５細胞〜約１×１０９細胞などであり得る。これらの細胞は、例えば、約０．１ｍｌ、０．２ｍｌ、０．５ｍｌ、１ｍｌの生理食塩水のような溶液として存在し得る。細胞の量の範囲の上限としては、例えば、約１×１０１１細胞、約５×１０１０細胞、約２×１０１０細胞、約１×１０１０細胞、約５×１０９細胞、約２×１０９細胞、約１×１０９細胞、約５×１０８細胞、約２×１０８細胞、約１×１０８細胞、約５×１０７細胞、約２×１０７細胞、約１×１０７細胞などが挙げられる。細胞の量の下限としては、例えば、約１×１０３細胞、約２×１０３細胞、約５×１０３細胞、約１×１０４細胞、約２×１０４細胞、約５×１０４細胞、約１×１０５細胞、約２×１０５細胞、約５×１０５細胞、約１×１０６細胞などが挙げられる。
【０１９５】
本発明において濃縮または分離された細胞を含む組成物（移植物、医薬など）において含まれる幹細胞の量は、全体に占める割合のうち、例えば、通常少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、少なくとも約９５％などが挙げられる。そのような細胞の組成は、本発明のエンドムチンの発現量を検出または定量することによって検定することができる。
【０１９６】
本明細書においてポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ＦＡＣＳを含む蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。
【０１９７】
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
【０１９８】
本明細書において「指示書」は、本発明の細胞医薬などを投与する方法を医師、患者など投与を行う人に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の医薬などの投与方法などを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、骨格筋などの投与（例えば、注射などによる）する場所および方法を指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０１９９】
本発明が対象とする「疾患」は、一定量の成体型造血幹細胞またはそれに由来する分化細胞、組織、臓器を必要とするものであれば、どのようなものでもよい。本発明により処置され得る疾患または障害は、本発明の成体型造血幹細胞が分化し得る分化細胞、組織または臓器の障害に関連する疾患または障害であり得る。
【０２００】
このようなものの代表例な実施形態では、従来骨髄細胞あるいは純化した造血幹細胞を用いて治療を行うことができる、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、狭心症、心筋梗塞、各種動脈硬化症に伴う虚血性疾患などが対象の代表例として挙げられる。骨髄細胞あるいは純化した造血幹細胞の投与によって、側副血管が新生されるからである。理論に束縛されることを望まないが、この新生は、造血細胞が血管になるか、および／または造血細胞からでる因子によって血管新生が刺激されるかのいずれかまたは両方のメカニズムが関与していると考えられる。
【０２０１】
１つの実施形態において、上記分化細胞、組織または臓器は循環器系（血液細胞など）であり得る。そのような疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：貧血（例えば、再生不良性貧血（特に重症再生不良性貧血）、腎性貧血、癌性貧血、二次性貧血、不応性貧血など）、癌または腫瘍（例えば、白血病）およびその化学療法処置後の造血不全、血小板減少症、急性骨髄性白血病（特に、第１寛解期（Ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ群）、第２寛解期以降の寛解期）、急性リンパ性白血病（特に、第１寛解期、第２寛解期以降の寛解期）、慢性骨髄性白血病（特に、慢性期、移行期）、悪性リンパ腫（特に、第１寛解期（Ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ群）、第２寛解期以降の寛解期）、多発性骨髄腫（特に、発症後早期）など。
【０２０２】
本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞（例えば、脊椎動物、無脊椎動物）でもよい。好ましくは、脊椎動物由来の細胞が用いられ、より好ましくは、哺乳動物（例えば、霊長類、齧歯類など）由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、霊長類由来の細胞が用いられる。最も好ましくはヒト由来の細胞が用いられる。
【０２０３】
本明細書において「生体内」または「インビボ」（ｉｎ  ｖｉｖｏ）とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする組織または器官が配置されるべき位置をいう。
【０２０４】
本明細書において「インビトロ」とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。
【０２０５】
本明細書において「エキソビボ」とは、遺伝子導入を行うための標的細胞を被験体より抽出し、インビトロで治療遺伝子または因子を導入した後に、再び同一被験体に戻す場合、一連の動作をエキソビボという。本発明の増幅因子は、エキソビボ治療のためにも有用である。
【０２０６】
本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。
【０２０７】
本明細書において「レシピエント」（受容者）とは、移植片または移植体を受け取る個体といい、「宿主」とも呼ばれる。これに対し、移植片または移植体を提供する個体は、「ドナー」（供与者）という。
【０２０８】
本明細書において「自己」または「自家」とは、移植物についていうとき、移植対象となる個体に由来する移植物をいう。本明細書において自己移植片というときは、広義には遺伝的に同じ他個体（例えば一卵性双生児）からの移植片をも含み得る。
【０２０９】
本明細書において「同種」（同種異系）とは、同種であっても遺伝的には異なる他個体から移植されることをいう。遺伝的に異なることから、同種異系移植片は、移植された個体（レシピエント）において免疫反応を惹起し得る。そのような移植片の例としては、子供に対する親由来の移植片などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２１０】
本明細書において「異種」とは、異種個体から移植されることをいう。従って、例えば、ヒトがレシピエントである場合、ブタからの移植片は異種移植片という。
【０２１１】
（本発明を実施するための最良の形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【０２１２】
本発明は、幹細胞（例えば、成体型造血幹細胞）の状態を簡便および／または効率よく判定する技術を提供する。成体型造血幹細胞を簡便に分離・濃縮できたことによって、本発明は、成体型造血幹細胞を用いた治療（たとえば移植）に多大なる貢献をすることは明らかであり、当該分野において驚くべき効果を提供する。
【０２１３】
（エンドムチンの同定手段を用いた成体型造血幹細胞検出組成物）
１つの局面において、本発明は、エンドムチンの同定手段を含む、成体型造血幹細胞の検出組成物を提供する。本発明は、エンドムチンに、成体型造血幹細胞を、胎児型造血幹細胞から識別することができる能力を見出したことによって完成された。
【０２１４】
１つの実施形態において、本発明において用いられる成体型造血幹細胞は、長期骨髄再構築能を有する細胞であり得る。
【０２１５】
１つの実施形態において、本発明において用いられる同定手段は、エンドムチンまたはその一部を含むポリペプチド、あるいはエンドムチンをコードする核酸配列またはその一部を含む核酸分子に対する特異的な因子であり得る。このような因子としては、例えば、抗エンドムチン抗体、またはエンドムチンをコードする核酸またはその一部あるいはそれらにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る核酸（例えば、相補鎖をコードする核酸分子などを挙げることができる。
【０２１６】
本明細書において使用される同定手段は、標識されているかまたは標識可能であり、標識は、放射性物質、化学発光物質、蛍光物質、燐光物質、発色剤、リガンド、ハプテンおよびそれらの原材料などであり得る。このような標識は、標識は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）およびビオチンからなる群より選択される少なくとも１つの色素であり得る。
【０２１７】
好ましい実施形態では、本発明は、さらなるマーカーの同定手段を含み得る。このようなマーカーは、幹細胞の同定の補助になる限り、どのようなマーカーでもよく、例えば、ＣＤ３４、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）、ｃ−Ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、Ｆｌｔ３／Ｆｌｋ２、ＣＤ４１およびＣＤ４５などを挙げることができるがそれらに限定されない。胎児型では、ＣＤ３４、ＣＤ４１、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）およびｃ−Ｋｉｔなどが好ましく、ここで、ＣＤ３４、ＣＤ４１およびｃ−Ｋｉｔの遺伝子発現は、候補細胞が幹細胞であることを示し、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）の遺伝子の陰性発現は、候補細胞が幹細胞であることを示す。これらの組み合わせは、胎児型において用いることができる。好ましくは、さらなるマーカーは、ＣＤ４１およびＣＤ４５からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーであり得、さらに好ましくは、この両方を含む。ＣＤ４１の陽性およびＣＤ４５の陰性は、幹細胞または多能性の好ましい指標であるからである。ただし、ＣＤ４１およびＣＤ４５は、胎児型造血前駆細胞と成体型造血幹細胞とを明確に区別できないので、エンドムチンは胎児型造血前駆細胞と成体型造血幹細胞とを明確に区別するために重要である。
【０２１８】
１つの実施形態において、本発明が対象とする成体型造血幹細胞は、多能性を保持する細胞であり得る。
【０２１９】
１つの実施形態において、本発明が対象とする成体型造血幹細胞は、胚性幹細胞由来の細胞または胎児由来の細胞であり得る。胚性幹細胞由来の細胞であることが好ましい。樹立された胚性幹細胞由来の細胞であれば、倫理的な問題が少ないからである。胚性幹細胞由来の細胞の造血幹細胞を識別可能にしたことは、胎児型の幹細胞の使用が制限されているとき、あるいは制限すべきときに重要であり、そのような局面において本発明重要な役割を果たすことが期待される。ここで、胚性幹細胞から成体型造血幹細胞は、胚性幹細胞から胚様体を形成させることによって生産され得る。具体的には、例えば、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡでほぐしたＥＳ細胞を５０μｌの培養液中に１００細胞の濃度で浮遊させ、ハンギングドロップ法（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ）にて５０μｌの培養滴の中で逆さにしたバクテリア用ペトリディッシュにつり下げた状態で培養することにより胚様体を形成させる。２４〜４８時間後に胚様体を各培養滴より回収し、バクテリア用ペトリディッシュ内でさらに培養することにより、胚様体内で造血幹細胞が発生する。あるいは、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡでほぐしたＥＳ細胞をストローマ細胞上に直接播種し、ストローマ細胞との共培養を繰り返すことにより造血幹細胞が発生する。このような具体的な手順は、実施例においても例示され、実証されている。
【０２２０】
（成体型造血幹細胞マーカー−核酸形態に対する因子）
１つの実施形態では、本発明は、エンドムチンをコードする核酸配列またはその一部を含む核酸分子に対する特異的な因子を含む、成体型造血幹細胞の検出組成物を提供する。したがって、本発明は、幹細胞においてエンドムチンの発現（例えば、ｍＲＮＡ）を確認することができるような因子であれば、どのような因子でも用いることができる。ここで、診断、予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明では、エンドムチンの発現が、成体型造血幹細胞に対応していることが明らかになったことによって、そのような状態、性質を同定するために効率よく使用される。
【０２２１】
好ましい実施形態において、本発明の因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される因子であり得る。このような因子は、本発明の核酸分子に特異的に結合するものであれば、どのようなものでもよいことが理解され得る。
【０２２２】
好ましい実施形態において、本発明の因子は、標識されているかまたは標識と結合し得るものであることが有利であり得る。そのように標識がされている場合、本発明の因子によって測定することができる種々の状態を直接および／または容易に測定することができる。そのような標識は、識別可能に標識される限り、どのような標識でもよく、例えば、蛍光、リン光、化学発光、放射能、発色剤、リガンド、ハプテン、酵素基質反応および抗原抗体反応などの技法が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、その因子が抗体などの免疫反応を利用して相互作用する場合、ビオチン−ストレプトアビジンのような免疫反応においてよく利用される系を用いてもよい。
【０２２３】
好ましい実施形態では、本発明の因子は、核酸分子である。本発明の因子が核酸分子である場合、そのような核酸分子は、少なくとも８の連続するヌクレオチド長であり得、好ましくはエンドムチンの核酸配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１など）に対して特異的に結合し得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも１０の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、９、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、マーカー、プライマー、プローブ）として使用することができるかまたは所定の因子と相互作用することができる限り、その上限の長さは、配列番号１、３、５、７、９、１１などに示す配列またはその相補体の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約８のヌクレオチド長であり得、好ましくは約１０ヌクレオチド長、さらに好ましくは約１５ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約１５ヌクレオチド長であり得、好ましくは約１７ヌクレオチド長であり得る。
【０２２４】
従って、１つの例示的な実施形態において、本発明の因子は、エンドムチンをコードするポリヌクレオチドの核酸配列に対して相補的な配列またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を有する核酸分子であり得る。
【０２２５】
別の例示的な実施形態において、本発明の因子は、（ａ）配列番号１、３、５、７または９に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、のいずれかのエンドムチン遺伝子の核酸配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子であり得る。ストリンジェンシーは、高くても、中程度であっても、低くてもよく、ストリンジェンシーの程度は、当業者が適宜状況に応じて決定することができる。
【０２２６】
あるいは、本発明の因子は、配列番号１、３、５、７または９で示される配列またはその相補体を含む核酸分子に対して特異的な因子であることが好ましい。このような配列は、特に造血幹細胞系の未分化性を同定することができることから、造血系の組織または個体の分化の程度を調べるために有用であるがそれに限定されない。
【０２２７】
１つの実施形態において、本発明のマーカーによって見出される幹細胞は、組織幹細胞であり、好ましくは、造血幹細胞であるが、それに限定されず、この他の代表例としては、血管内皮細胞および血管内皮細胞と血液細胞の共通の前駆細胞であるへマンギオブラストなどもまた対象として含まれ得ることが理解される。
【０２２８】
１つの実施形態において、本発明のエンドムチンは、（ａ）配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（ｂ）配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；（ｃ）配列番号１、３、５、７または９に記載の塩基配列の対立遺伝子変異体またはスプライス変異体によってコードされる、ポリペプチド；（ｄ）配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を含む。
【０２２９】
さらに好ましくは、本発明のエンドムチンは、配列番号２、４、６、８または１０に示される配列を含み得る。あるいは、本発明のエンドムチンをコードする核酸配列を含む核酸分子は、配列番号１、３、５、７または９に示される配列を含み得る。
【０２３０】
１つの好ましい実施形態において、上記（ｃ）における置換、付加および欠失の数は、限定され、例えば、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、配列番号２、４、６、８または１０に示されるアミノ酸配列を含むエンドムチンと類似するかまたは実質的に同一の活性を有する）限り、多い数であってもよい。
【０２３１】
別の好ましい実施形態において、上記改変体ポリペプチドが有する生物学的活性としては、例えば、配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、未分化性維持、細胞外マトリクスとの相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、そのような生物学的活性は、未分化性維持を含む。エンドムチンは細胞の未分化性維持に重要な働きをしていると考えられる。この活性を測定するためには、遺伝子導入実験、遺伝子欠損実験、ＲＮＡｉ実験、抗体によるタンパク質機能阻害実験等が考えられる。
【０２３２】
別の好ましい実施形態において、対立遺伝子変異体は、配列番号１、３、５、７または９に示す核酸配列と少なくとも９０％の相同性を有することが好ましい。同一系統内のものなどでは、例えば、そのような対立遺伝子変異体は少なくとも９９％の相同性を有することが好ましい。
【０２３３】
上記種相同体は、その種の遺伝子配列データベースが存在する場合、そのデータベースに対して、本発明の配列番号２、４、６、８または１０に示されるアミノ酸配列を含むエンドムチンポリペプチドの全部または一部のアミノ酸配列、または配列番号１、３、５、７または９に示される核酸配列を含む、エンドムチンをコードする核酸分子の全部または一部の核酸配列をクエリ配列として検索することによって同定することができる。あるいは、本発明のエンドムチンの核酸配列の全部または一部をプローブまたはプライマーとして、その種の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。そのような同定方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載される文献にも記載されている。種相同体は、例えば、配列番号１、３、５、７または９に示す核酸配列と少なくとも約３０％の相同性を有することが好ましい。種相同性は、好ましくは、配列番号１、３、５、７または９に示す核酸配列と少なくとも約５０％の相同性を有する。
【０２３４】
好ましい実施形態において、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。
【０２３５】
好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、少なくとも８の連続するヌクレオチドであり得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも１０の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、９、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、マーカー）として使用することができる限り、その上限の長さは、配列番号１、３、５、７または９に示す配列の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約８のヌクレオチド長であり得、好ましくは約１０ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約１５ヌクレオチド長であり得、好ましくは約１７ヌクレオチド長であり得る。
【０２３６】
より好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１、３、５、７または９に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；または（ｂ）配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであり得る。
【０２３７】
ある好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、その構造において、細胞外ドメインは２つのＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）以外に多数のＳｅｒおよびＴｈｒ残基を有し約２５箇所のポテンシャルな０−グリコシル化部位が存在する。細胞内ドメインにはプロテインキナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）Ｃによるリン酸化部位が３つ存在している（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｘ−Ｌｙｓ）。これらの特徴的なドメインの対応する位置のものが保存されていることが１つの実施形態において好ましいがそれらに限定されない。
【０２３８】
ここで、より好ましい実施形態では、上記（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。
【０２３９】
好ましい実施形態において、本発明のエンドムチンをコードする核酸分子またはそのフラグメントおよび改変体は、少なくとも８の連続するヌクレオチド長であり得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも１０の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、９、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、マーカー、プライマー、プローブ、所定の因子と相互作用し得ること）として使用することができる限り、その上限の長さは、配列番号１、３、５、７または９に示す配列の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約８のヌクレオチド長であり得、好ましくは約１０ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約１５ヌクレオチド長であり得、好ましくは約１７ヌクレオチド長であり得る。
【０２４０】
１つの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ３４、ＣＤ４１、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）およびｃ−Ｋｉｔからなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸分子に対して特異的な少なくとも１つの因子をさらに含んでいてもよい。このような追加の因子は、好ましくは少なくとも２種類、より好ましくは３種類、さらに好ましくは４種類、さらにより好ましくは５種類含んでいることがより好ましい。ここで、Ｌｉｎは複数のマーカーの組み合わせであることから、それらのマーカーは、変動し得ることが理解される。Ｌｉｎマーカーとしては、例えば、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、ＴＥＲ１１９、ＣＤ４、ＣＤ８およびＢ２２０などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２４１】
より好ましくは、本発明において用いられるＣＤ３４は、配列番号１３または１５に示される核酸配列またはその一部あるいはその改変体を含み、本発明において用いられるＬｉｎは、配列番号１７、１９、２１および／または２３に示される核酸配列またはその一部あるいはその改変体を含み、本発明において用いられるｃ−Ｋｉｔは、配列番号２５に示される核酸配列またはその一部あるいはその改変体を含み、本発明において用いられるＳｃａ−１は、配列番号２７に示される核酸配列またはその一部あるいはその改変体を含み、本発明において用いられるＦｌｔ３／Ｆｌｋ２は、配列番号１１に示される核酸配列またはその一部あるいはその改変体を含む。
【０２４２】
本明細書において使用されるＧｒ−１（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）はＬｙ−６Ｇ（２１から２５  ｋＤａのｇｌｙｃｏ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＧＰＩ）結合型膜タンパク質）を認識する（ＴＪ  Ｆｌｅｍｉｎｇ，ＭＬ  Ｆｌｅｍｉｎｇ  ａｎｄ  ＴＲ  Ｍａｌｅｋ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １５１，Ｉｓｓｕｅ  ５  ２３９９−２４０８，１９９３を参照）。従って、本明細書においてこのＧｒ−１は分化状態の指標として用いられる。
【０２４３】
Ｂ２２０は、抗体ＴＥＲ１１９によって認識される（Ｋｉｎａ  Ｔ，Ｉｋｕｔａ  Ｋ，Ｔａｋａｙａｍａ  Ｅ，Ｗａｄａ  Ｋ，Ｍａｊｕｍｄａｒ  ＡＳ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＩＬ，Ｋａｔｓｕｒａ  Ｙ、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０００  Ｍａｙ；１０９（２）：２８０−７．）。従って、本明細書においてこのＧｒ−１は分化状態の指標として用いられる。
【０２４４】
これらの追加の因子もまた、標識で標識され得る。このような場合、標識は、各因子によって変動させることが好ましい。複数の標識が用いられる場合、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、ＰＥ、ＦＩＴＣ、ＡＰＣ、ビオチンなどの標識を用いることができる。Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｂｌｕｅ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｒｅｄは、ＤＮＡ染色色素として用いることができる。
【０２４５】
（幹細胞マーカー−ポリペプチド形態に対する因子）
別の実施形態において、本発明は、エンドムチンポリペプチドまたはその一部に対して特異的に結合する因子を含む、成体型造血幹細胞の検出組成物を提供する。そのような因子としては、例えば、ポリペプチド（例えば、抗体、単鎖抗体）、ポリヌクレオチド、糖鎖、脂質、およびそれらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。このような因子は、本発明のポリペプチドに特異的に結合するものであれば、どのようなものでもよいことが理解され得る。より好ましくは、本発明の因子は、抗体またはその誘導体（例えば、単鎖抗体）である。従って、本発明の因子は、プローブおよび／またはインヒビターとして使用することができる。
【０２４６】
好ましい実施形態において、本発明の因子は、標識されているかまたは標識と結合し得るものであることが有利であり得る。そのように標識がされている場合、本発明の因子によって測定することができる種々の状態を直接および／または容易に測定することができる。そのような標識は、識別可能に標識される限り、どのような標識でもよく、例えば、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応などの技法が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、その因子が抗体などの免疫反応を利用して相互作用する場合、ビオチン−ストレプトアビジンのような免疫反応においてよく利用される系を用いてもよい。本発明において使用される標識は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ビオチンであってもよい。Hoechst Blue、Hoechst 33342、Hoechst Red、は、ＤＮＡ染色色素として用いることができる。
【０２４７】
好ましい実施形態では、本発明の上記因子は、抗体であり得る。抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体であってもよく、それらの、ヒト化抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体などであってもよい。このような抗体は、本発明の遺伝子の発現を判定する道具として用いることができ、従ってスクリーニングに使用することができる。
【０２４８】
好ましい実施形態において、本発明のエンドムチンのポリペプチドは、（ａ）配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（ｂ）配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；（ｃ）配列番号１、３、５、７または９に記載の塩基配列の対立遺伝子変異体またはスプライス変異体によってコードされる、ポリペプチド；（ｄ）配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を含み得る。
【０２４９】
さらに好ましくは、本発明のエンドムチンは、配列番号２、４、６、８または１０に示される配列を含み得る。
【０２５０】
１つの好ましい実施形態において、上記（ｂ）における置換、付加および欠失の数は限定されていてもよく、例えば、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、配列番号２、４、６、８または１０に示される配列を有するエンドムチンと類似するかまたは実質的に同一の活性を有する）限り、多い数であってもよい。
【０２５１】
別の好ましい実施形態において、上記（ｃ）における対立遺伝子変異体は、配列番号２、４、６、８または１０に示すアミノ酸配列と少なくとも約９０％の相同性を有することが好ましい。好ましくは（ｃ）における対立遺伝子変異体は、配列番号２、４、６、８または１０に示すアミノ酸配列と少なくとも約９９％の相同性を有する。
【０２５２】
別の好ましい実施形態において、上記種相同体は、本明細書中上述のように同定することができ、配列番号２、４、６、８または１０に示すアミノ酸配列と少なくとも約３０％の相同性を有することが好ましい。種相同性は、好ましくは、配列番号１、３、５、７または９に示す核酸配列と少なくとも約５０％の相同性を有する。
【０２５３】
別の好ましい実施形態において、上記（ｅ）における上記改変体ポリペプチドが有する生物学的活性としては、例えば、配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、細胞外マトリクスとの相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、そのような生物学的活性は、未分化性維持を含む。エンドムチンは、細胞の未分化性維持に重要な働きをしていると考えられる。この活性を測定するためには、遺伝子導入実験、遺伝子欠損実験、ＲＮＡｉ実験、抗体によるタンパク質機能阻害実験等が考えられる。
【０２５４】
好ましい実施形態において、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。
【０２５５】
本発明のポリペプチドは、通常、少なくとも３の連続するアミノ酸配列を有する。本発明のポリペプチドが有するアミノ酸長は、目的とする用途に適合する限り、どれだけ短くてもよいが、好ましくは、より長い配列が使用され得る。従って、好ましくは、少なくとも４アミノ酸長、より好ましくは５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長であってもよい。さらに好ましくは少なくとも１５アミノ酸長であり得、なお好ましくは少なくとも２０アミノ酸長であり得る。これらのアミノ酸長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明のポリペプチドは、目的とする用途（例えば、免疫原、マーカー）として使用することができる限り、その上限の長さは、配列番号２、４、６、８または１０に示す配列の全長と同一であってもよく、それを超える長さであってもよい。
【０２５６】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、その構造において、細胞外ドメインは2つのN-グリコシル化部位(Asn-X-Ser/Thr)以外に多数のSerおよびThr残基を有し約２５箇所のポテンシャルな0-グリコシル化部位が存在する。細胞内ドメインにはプロテインキナーゼ（Proteinkinase）Cによるリン酸化部位が3つ存在している(Ser/Thr-X-Lys)。従って、本発明のポリペプチドは、これらの特徴的なドメインの対応する位置のもののうち少なくとも１つ好ましくはすべてが保存されていることが１つの実施形態において好ましいがそれらに限定されない。上記領域は、ポリペプチド配列では、配列番号２、４、６、８または１０に記載のアミノ酸配列における該当する配列、あるいはそれらに対応するポリペプチド（例えば、配列番号２、４、６、８または１０に示されるアミノ酸配列によってコードされる遺伝子）の対応する位置のものがあるがそれらに限定されない。このような配列は、当業者は、周知の技術を用いて同定することができる。
【０２５７】
ここで、さらに好ましい実施形態において、上記（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。
【０２５８】
１つの好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドを含む組成物は、ＣＤ３４、ＣＤ４１、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）およびｃ−Ｋｉｔからなる群より選択されるポリペプチドに対して特異的な少なくとも１つの因子をさらに含んでいてもよい。このような追加の因子は、好ましくは少なくとも２種類、より好ましくは３種類、さらに好ましくは４種類含んでいることがより好ましい。ここで、Ｌｉｎは複数のマーカーの組み合わせであることから、それらのマーカーは、変動し得ることが理解される。
【０２５９】
より好ましくは、本発明において用いられるＣＤ３４は、配列番号１４または１６に示されるアミノ酸配列またはその一部あるいはその改変体を含み、本発明において用いられるＬｉｎは、配列番号１８、２０、２２および２４を含む群より選択される少なくとも１つに示されるアミノ酸配列またはその一部あるいはその改変体を含み、本発明において用いられるｃ−Ｋｉｔは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列またはその一部あるいはその改変体を含み、本発明において用いられるＳｃａ−１は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列またはその一部あるいはその改変体を含み、本発明において用いられるＦｌｔ３／Ｆｌｋ２は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列またはその一部あるいはその改変体を含む。
【０２６０】
１つの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ３４、ＣＤ４１、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）およびｃ−Ｋｉｔからなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸分子に対して特異的な少なくとも１つの因子をさらに含んでいてもよい。このような追加の因子は、好ましくは少なくとも２種類、より好ましくは３種類、さらに好ましくは４種類含んでいることがより好ましい。ここで、Ｌｉｎは複数のマーカーの組み合わせであることから、それらのマーカーは、変動し得ることが理解される。
【０２６１】
好ましくは、この組成物は、ＣＤ３４の発現が陰性または弱陽性であることが判定できるような因子を含む。あるいは、この組成物は、ｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１の発現が陽性、特に強陽性であることが判定できるような因子を含む。あるいは、本発明の組成物は、Ｌｉｎの陰性発現を判定できるような因子を含む。そのような、陰性、弱陽性、陽性および強陽性は、好ましくは定量的ＰＣＲにおいて採用される発現強度に基づき得る。そのような場合、発現強度は、ＰＣＲにより相対的に決定されるレベルによって決定される。あるいは、ＨＲＰＴのようなハウスキーピング遺伝子の発現強度を基準にマイクロアレイなどを用いて発現強度を決定することができる。したがって、陽性の程度を感度よく判断することができる因子が好ましく、そのような因子としては、たとえば、完全マッチの相補配列を含む核酸分子、１塩基ミスマッチの相補配列を含む核酸分子、まったくランダムな配列およびそれらの組み合わせなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２６２】
より好ましくは、本発明において用いられるＣＤ３４は、配列番号１３または１５に示される核酸配列またはその一部あるいはその改変体を含み、本発明において用いられるＬｉｎは、配列番号１７、１９、２１および／または２３に示される核酸配列またはその一部あるいはその改変体を含み、本発明において用いられるｃ−Ｋｉｔは、配列番号２５に示される核酸配列またはその一部あるいはその改変体を含み、本発明において用いられるＳｃａ−１は、配列番号２７に示される核酸配列またはその一部あるいはその改変体を含み、本発明において用いられるＦｌｔ３／Ｆｌｋ２は、配列番号１１に示される核酸配列またはその一部あるいはその改変体を含む。
【０２６３】
これらの追加の因子もまた、標識で標識され得る。このような場合、標識は、各因子によって変動させることが好ましい。複数の標識が用いられる場合、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、ＰＥ、ＦＩＴＣ、ＡＰＣ、ビオチンなどの標識を用いることができる。
【０２６４】
別の局面において、本発明は、エンドムチンポリペプチドまたはその一部に対する特異的な因子を含む、移植物の移植適合性を判定するための組成物を提供する。本発明のエンドムチンのポリペプチドの発現が陽性であると判断された細胞は、移植適合性があることが示された。また、陽性であると判断されなかった細胞は、移植適合性がないことも示された。したがって、エンドムチンの陽性・陰性の判断は、そのまま移植適合性の有無に使用することができることが本発明によって初めて示された。したがって、本発明のエンドムチンポリペプチドまたはその一部に対して特異的な因子は、移植物（たとえば、幹細胞を含む調製物）の移植適合性の判断を行うことができるという有用性を有する。
【０２６５】
好ましい実施形態において、本発明のエンドムチンポリペプチドまたはその一部に対して特異的な因子は、幹細胞を含む移植物の移植適合性を判断することができる。より好ましくは、この幹細胞は、造血幹細胞を含む。
【０２６６】
本発明の移植物の移植適合性を判定するための組成物において使用される、本発明のエンドムチンポリペプチドまたはその一部に対して特異的な因子は、上述の（幹細胞マーカー−ポリペプチド形態に対する因子）において示される核酸分子および因子のうち任意の形態を使用することができる。
【０２６７】
１つの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ３４、ＣＤ４１、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）およびｃ−Ｋｉｔからなる群より選択されるポリペプチドに対して特異的な少なくとも１つの因子をさらに含んでいてもよい。このような追加の因子は、好ましくは少なくとも２種類、より好ましくは３種類、さらに好ましくは４種類含んでいることがより好ましい。ここで、Ｌｉｎは複数のマーカーの組み合わせであることから、それらのマーカーは、変動し得ることが理解される。
【０２６８】
好ましくは、この組成物は、ＣＤ３４の発現が陰性または弱陽性であることが判定できるような因子を含む。あるいは、この組成物は、ｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１の発現が陽性、特に強陽性であることが判定できるような因子を含む。あるいは、本発明の組成物は、Ｌｉｎの陰性発現を判定できるような因子を含む。そのような、陰性、弱陽性、陽性および強陽性は、好ましくはＦＡＣＳまたは磁気ビーズを用いた技術において採用される発現強度に基づき得る。ＦＡＣＳまたは磁気ビーズは、当該分野において周知の技法に基づき、本明細書において例示されるような手順を用いて行うことができる。したがって、陽性の程度を感度よく判断することができる因子が好ましく、そのような因子としては、たとえば、特異性が高いモノクローナル抗体、特異的リガンドまたはその改変体もしくはフラグメントなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２６９】
より好ましくは、本発明において用いられるＣＤ３４は、配列番号１４または１６に示されるアミノ酸配列またはその一部あるいはその改変体を含み、本発明において用いられるＬｉｎは、配列番号１８、２０、２２および／または２４に示されるアミノ酸配列またはその一部あるいはその改変体を含み、本発明において用いられるｃ−Ｋｉｔは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列またはその一部あるいはその改変体を含み、本発明において用いられるＳｃａ−１は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列またはその一部あるいはその改変体を含み、本発明において用いられるＦｌｔ３／Ｆｌｋ２は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列またはその一部あるいはその改変体を含む。
【０２７０】
これらの追加の因子もまた、標識で標識され得る。このような場合、標識は、各因子によって変動させることが好ましい。複数の標識が用いられる場合、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、ＰＥ、ＡＰＣ、ＦＩＴＣ、ビオチンなどの標識を用いることができる。Hoechst Blue、Hoechst 33342、Hoechst RedはＤＮＡ染色色素として用いることができる。
【０２７１】
このような特異的因子を用いたＦＡＣＳによる分析の具体的な手順としては、以下が挙げられるがそれに限定されない。
【０２７２】
（１）試料となる細胞をたとえば骨髄など（大腿骨、脛骨など）から採取し、ＰＢＳなどの緩衝液中に浮遊させ、ナイロンフィルターなどのフィルター（たとえば、７０μｍ）を通して、細胞塊、筋肉などの混入した組織を除去する。
【０２７３】
（２）細胞数を計数する。通常１×１０７個〜１×１０８個の試料細胞を得る。
【０２７４】
（３）細胞濃度をＰＢＳ（0.1モル リン酸緩衝液1000 ml中にNaCl 9 gを溶解する）で１×１０７／ｍｌに調整し、５ｍｌのフィコールなどの密度勾配遠心分離のための媒体に重層する。
【０２７５】
（４）室温、４００×ｇ、２０分間遠心分離を行う。
【０２７６】
（５）境界面の細胞を回収して、ＳＭ（染色媒体＝５％ＦＢＳ、０．０５％ＮａＮ３を含むＰＢＳ）に懸濁する。
【０２７７】
（６）細胞数を数える。フィコールでの分離の場合、細胞数の約半数が回収される。
【０２７８】
（７）適量のビオチン化ｌｉｎｅａｇｅ抗体（Ｇｒ−１抗体（例えば、ＲＢ６−８Ｃ５）、Ｍａｃ−１抗体（例えば、Ｍ１／７０）、Ｔｅｒ１１９抗体、Ｂ２２０抗体（例えば、ＲＡ３−６Ｂ２）、ＣＤ４抗体（例えば、ＲＭ４−５）、ＣＤ８抗体（例えば、５３．６．７）の混合物）を加えて、氷上で３０分間反応させる。
【０２７９】
（８）ＳＭで２回洗浄し、１００μｌのＳＭに再浮遊させる。
【０２８０】
（９）必要量のストレプトアビジン化したＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｍ−２８０、Ｄｙｎａｌ，ノルウェー）（５−６ビーズ／細胞）をとり、マグネットスタンドを使用してＳＭで洗浄する。洗浄後のＤｙｎａｂｅａｄｓをＳＭで再浮遊させる。
【０２８１】
（１０）氷上で３０分間反応させる。
【０２８２】
（１１）７ｍｌのＳＭを加えた後、マグネットスタンドを用いて陰性選択（ビーズと結合したｌｉｎｅａｇｅ陽性細胞を除去する）を行う。
【０２８３】
（１２）細胞数を数える。ｌｉｎｅａｇｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ後には約５〜１０％の細胞が残る。
【０２８４】
（１３）遠心分離（４℃、４００×ｇ、５分間）後、細胞ペレットの状態で以下の抗体を加える。
【０２８５】
（１４）ビオチン化ｌｉｎｅａｇｅ抗体を再度加える。（ここでは、ビオチン化ｌｉｎｅａｇｅ抗体による染色は、ｌｉｎｅａｇｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎの前後で２回行う必要がある）（最初に用いた量の５〜１０％の量）。
【０２８６】
（１５）例えば、必要量のＰＥ−抗Ｓｃａ−１抗体（例えば、Ｅ１３−１６１．７）およびＡＰＣ−ｃ−Ｋｉｔ抗体（例えば、ＡＣＫ２または２Ｂ８）、ＦＩＴＣ−ＣＤ３４抗体（ＲＡＭ３４）を同時に加える。
【０２８７】
（１６）氷上でのインキュベーション後、細胞を洗浄しストレプトアビジン−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄを加える。
【０２８８】
（１７）氷上でのインキュベーション後、細胞を洗浄し５×１０５／ｍｌを目安に細胞を浮遊液を調整する。
【０２８９】
（１８）ＦＡＣＳ（例えば、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）などの２レーザーを装着したフローサイトメトリーを利用）による分析および／またはソーティングを行う。
【０２９０】
本発明の成体型造血幹細胞が移植に適しているかどうかは、試料を移植した後の適合性を判断することによって確認することができる。そのような方法の具体的手順を以下に例示する。
【０２９１】
（１）キャピラリーチューブ（たとえば、１００μｌ）に０．１Ｍ  ＥＤＴＡ・Ｎａ２／Ｈ２Ｏを毛細管現象を用いて少量取る。
【０２９２】
（２）対象生物を必要に応じて麻酔する。
【０２９３】
（３）キャピラリーチューブがいっぱいになるまで眼窩静脈などより採血する。
【０２９４】
（４）他のチューブ（エッペンドルフチューブなど）に移し、よく攪拌する。
【０２９５】
（５）別の生物個体からも同様に採血する。
【０２９６】
（６）たとえば、２，０００ｒｐｍで数秒間遠心分離して血液を沈降させる。
【０２９７】
（７）たとえば、３５０μｌの蒸留水を加え、約３０秒間室温放置する。
【０２９８】
（８）２倍濃度のＰＢＳを３５０等量（たとえば、３５０μｌ）加えよく攪拌する。
【０２９９】
（９）２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。
【０３００】
（１０）溶血した赤血球を含む上清を捨てる。
【０３０１】
（１１）血球をＳＭ（染色媒体＝５％ＦＢＳ、０．０５％ＮａＮ３を含むＰＢＳ）に懸濁し、二等分して遠心分離する。この際、例えば、丸底９６ウェルプレートに移してから遠心分離すると、多数のサンプルの抗体染色が容易である。
【０３０２】
（１２）細胞ペレットに対して例えば２種類の抗体染色を行う。例えば、二等分した一方にビオチン化Ｌｙ５．１（Ａ２０）抗体、ＦＩＴＣ−Ｌｙ５．２抗体（１０４）抗体、ＰＥ−Ｍａｃ−１抗体、ＰＥ−Ｇｒ−１抗体およびＡＰＣ−Ｂ２２０抗体を加える。この染色は、骨髄系統（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｉｎｅａｇｅ）およびＢリンパ球系統の再構築を判定するために用いられる。二等分した他方のサンプルには、例えば、ビオチン化Ｌｙ５．１（Ａ２０）抗体、ＦＩＴＣ−Ｌｙ５．２（１０４）抗体、ＰＥ−ＣＤ４抗体およびＰＥ−ＣＤ８抗体を加える。この染色によりＴリンパ球系統の再建築の判定を行うことができる。
【０３０３】
（１３）４℃でインキュベーションした後、細胞を洗浄し、ストレプトアビジン−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄを加える。
【０３０４】
（１４）４℃でインキュベーションした後、細胞を洗浄し、２００μｌのＳＭに再浮遊させてＦＡＣＳによる解析を行い、ソーティングの後判定を行う。
【０３０５】
（１５）キメリズム、再構築単位（ＲＵ）、競合再構築単位（ＣＲＵ）は、いかのようにし求めることができる。ＲＵは造血幹細胞活性量を表し、ＣＲＵは、造血幹細胞数を表す。
【０３０６】
キメリズムの計算方法：
総キメリズム（％）＝（％Ｌｙ５．１細胞×１００）／（％Ｌｙ５．１細胞＋％Ｆ１細胞）
Ｂリンパ球系統キメリズム（％）＝（％Ｂ２２０＋Ｌｙ５．１細胞×１００）／（％Ｂ２２０＋Ｌｙ５．１細胞＋％Ｂ２２０＋Ｆ１細胞）
Ｔリンパ球系統キメリズム（％）＝（％ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｌｙ５．１細胞×１００）／（％ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｌｙ５．１細胞＋％ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｆ１細胞）
骨髄系統キメリズム（％）＝（％Ｍａｃ−１＋Ｇｒ−１＋Ｌｙ５．１細胞×１００）／（％Ｍａｃ−１＋Ｇｒ−１＋Ｌｙ５．１細胞＋％Ｍａｃ−１＋Ｇｒ−１＋Ｆ１細胞）。
【０３０７】
ＲＵの算出方法はＨａｒｒｉｓｏｎの定義に従い（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  Ｄ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．：  Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２１：２０６−２１９、１９９３）、ＦＡＣＳ解析で得たデータを用いていかに計算式によって求めることができる。
【０３０８】
ＲＵ＝（％Ｌｙ５．１細胞×（競合細胞数／１０５））／％Ｆ１細胞。
【０３０９】
上記例において２×１０５の骨髄細胞を競合細胞として用いる場合、
ＲＵ＝（％Ｌｙ５．１細胞×２）／％Ｆ１細胞
で求めることができる。
【０３１０】
幹細胞は、ＣＲＵによってもあらわすことが可能である。ＣＲＵの頻度は、試験細胞数と、陰性マウスとの比率とを、最大尤度法の計算式に当てはめることによって求めることができる。陽性マウスとは、３系統とも１％以上のキメリズムを示すマウスであり、陰性マウスとはそれ未満のマウスであると本明細書において定義される。計算式は、Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ  Ｓ．Ｆ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４９，Ｒ１１−Ｒ２３，１９８２に記載されている。
【０３１１】
幹細胞の平均活度（ｍｅａｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ＝ＭＡＳ）は、造血幹細胞の１個当たりのＲＵを意味し、以下の計算式で求めることができる。
【０３１２】
ＭＡＳ＝ＲＵ／ＣＲＵ  （ＲＵ／細胞）。
【０３１３】
本明細書では、移植に適合しているとは、キメリズムが１％以上、好ましくは１０％以上であることを意味する。
【０３１４】
本発明の方法で用いられる移植としては、成体型造血幹細胞をそのまま移植することのほか、成体型造血幹細胞を分化または増幅させた細胞を移植させることも挙げられる。ここで、成体型造血幹細胞の移植の目的と対象疾患としては、例えば以下が挙げられる。１）質的および／または量的に異常のある幹細胞を正常の幹細胞に置き換えることが必要な疾患：重症再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、サラセミア、先天性免疫不全症候群など；２）超大量の化学療法または放射線照射による不可逆的なリンパ組織または造血器組織の障害を回避することが必要な疾患：白血病（慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は除く）、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、固形がん（例えば、乳がん、神経芽細胞腫、肺小細胞がん、卵巣がんなど）；３）恒久的な酵素の補足が必要な疾患：先天性代謝異常症など。
【０３１５】
本発明の方法を用いて移植に適した細胞を効率よく選択、分離および濃縮することができるようになったことによって、上記のような幹細胞移植においてさらに効率よい治療および副作用の軽減を行うことができるようになった。また、高効率で移植適合性細胞を選択することができることから、自己由来のみの原料を用いて移植治療を行うことが可能である。また、増幅因子などを用いれば、移植適合性の細胞を少量効率よく取り出した後に、治療に必要な量を調製することも可能である。必要な量を調製した後に、さらに本発明の移植適合性判定法により適切な細胞を濃縮してもよい。このような場合、拒絶反応（例えば、移植片対宿主病など）が軽減するか起こりえなくなる。また、移植に適合している細胞が濃縮されたものを使用する場合、移植後の回復（例えば、造血系の回復）の速度は、移植適合性を判定していないものよりも速い。したがって、治療効果が早く現れるという効果も奏される。
【０３１６】
（エンドムチン自体）
別の局面において、本発明は、エンドムチンをコードする核酸分子またはその一部を含む、成体型造血幹細胞の識別のための組成物を提供する。エンドムチン自体もまた、成体型造血幹細胞のマーカーとなることから、それ自体もまた、成体型造血幹細胞の検出組成物またはそれを調製するための組成物として使用することができる。特に、エンドムチンを用いて、それに対して特異的な因子をスクリーニングすることができることから、本発明は、成体型造血幹細胞の識別および／または判定のための組成物として有用であることが理解される。そのようなスクリーニング方法としては、例えば、エンドムチンをコードする核酸分子またはその一部を提供する工程、候補となる化学物質をその核酸分子またはその一部に接触させる工程、特異的に結合する候補を選択する工程を包含する。
【０３１７】
好ましくは、このエンドムチンをコードする核酸分子は、上述の（成体型造血幹細胞マーカー−核酸形態に対する因子）において示される核酸分子のうち任意の形態を使用することができる。より好ましくは、本発明のエンドムチンをコードする核酸分子は、配列番号１、３、５、７または９に示される核酸配列またはその一部を含む。あるいは、本発明のエンドムチンをコードする核酸分子は、配列番号２、４、６、８または１０に示されるアミノ酸配列またはその一部をコードする配列を含む。
【０３１８】
別の局面において、本発明は、エンドムチンポリペプチドまたはその一部を含む、成体型造血幹細胞の識別のための組成物を提供する。エンドムチン自体は、細成体型造血幹細胞のマーカーとなることから、それ自体もまた、成体型造血幹細胞の検出組成物またはそれを調製するための組成物として使用することができる。特に、エンドムチンを用いて、それに対して特異的な因子をスクリーニングすることができることから、本発明は、成体型造血幹細胞の識別および／または判定のための組成物として有用であることが理解される。そのようなスクリーニング方法としては、例えば、エンドムチンポリペプチドまたはその一部を提供する工程、候補となる化学物質または抗体をそのポリペプチドまたはその一部に接触させる工程、特異的に結合する候補を選択する工程を包含する。
【０３１９】
好ましくは、このエンドムチンは、上述の（成体型造血幹細胞マーカー−ポリペプチド形態に対する因子）において示されるポリペプチドのうち任意の形態を使用することができる。より好ましくは、本発明のエンドムチンは、配列番号２、４、６、８または１０に示されるアミノ酸配列またはその一部を含む。
【０３２０】
（成体型造血幹細胞判定法）
別の局面において、本発明は、候補細胞が成体型造血幹細胞であるかどうかを判定する方法であって、（Ｉ）判定されるべき候補細胞を提供する工程；（ＩＩ）エンドムチンをコードする核酸分子もしくはその一部、またはエンドムチンポリペプチドまたはその一部に特異的に反応する因子を、該候補細胞に接触させる工程；および（ＩＩＩ）該因子と該エンドムチンをコードする核酸分子もしくはその一部、またはエンドムチンポリペプチドまたはその一部との特異的反応を検出することによって、該エンドムチンの遺伝子が該候補細胞において発現しているかどうかを確認する工程、を包含し、ここで、該候補細胞における該エンドムチンの遺伝子発現は、該候補細胞が成体型造血幹細胞であることを示す、方法を提供する。
【０３２１】
ここで、候補細胞を提供する工程は、当該分野において周知の任意の手法を用いて実施することができる。そのような細胞は、移植目的のものであっても、分化させる目的のものであってもよく、そのような目的に限定されないことが理解される。そのような細胞は、例えば、対象となる動物の骨髄、末梢血、臍帯血などから得ることができる。
【０３２２】
また、エンドムチンをコードする核酸分子もしくはその一部、またはエンドムチンポリペプチドまたはその一部に特異的に反応する因子は、上述の（成体型造血幹細胞マーカー−核酸形態）および（成体型造血幹細胞マーカー−ポリペプチド形態）に記載されるものが使用される。そのような因子は、例えば、核酸分子であれば、合成などの化学的手法またはＰＣＲなどの分子生物学的手法、あるいは遺伝子工学的手法などの周知技術によって調製することができる。因子が抗体の場合は、当該分野において周知のように、特異的な対象となるエンドムチンなどでウサギなどの免疫されるべき動物を免疫し、必要に応じて追加免疫し、免疫された動物から血清を取り出し、必要に応じて血清を精製することによって得るか、あるいは、ハイブリドーマを作製して、モノクローナル抗体を産生する細胞を調製することによって抗体を調製することが可能である。因子が低分子化合物の場合は、同定された構造に基づいて、当該分野において周知の技術を用いて合成するか、あるいは、天然物と同じ場合は、そのような天然物を含む原料からクロマトグラフィーなどによって精製または分離することによって得ることができる。
【０３２３】
このような因子と、細胞を含む試料との接触は、単に混合させるか、あるいは、クロマトグラフィーなどの担体に因子を保持させてそのカラム中を細胞を通過させることによって達成され得る。
【０３２４】
特異的反応の検出は、単に、対象となる細胞が因子に結合しているかどうかを確認することによって行うことができる。クロマトグラフィーなどの担体を用いる場合は、結合している細胞が存在しているかどうかを指標にすることができる。
【０３２５】
好ましい実施形態において、本発明が判定することができる幹細胞には、造血幹細胞が含まれるがそれに限定されない。このような幹細胞は、好ましくは、骨髄細胞に由来するものが含まれることが好ましいがそれに限定されない。あるいは、このような候補細胞は、ＥＳ細胞またはその分化細胞など成体型造血幹細胞が豊富に存在することが予測される試料を用いることができる。
【０３２６】
好ましい形態では、ＣＤ４１が陽性であり、および／またはＣＤ４５が陰性であること指標に成体型造血幹細胞を判定することがでいる。
【０３２７】
好ましい実施形態では、本発明の成体型造血幹細胞判定法では、ＣＤ４１、ＣＤ３４、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）、およびｃ−Ｋｉｔからなる群より選択されるマーカーに対して特異的な少なくとも１つの因子を、前記候補細胞に接触させる工程をさらに包含し、ここで、候補細胞におけるＣＤ３４およびＣＤ４１の陽性発現、該Ｌｉｎの陰性発現、該ｃ−Ｋｉｔの陽性発現(好ましくは強陽性発現）は、該候補細胞が幹細胞であることを示す。
【０３２８】
ある一つの実施形態では、前記ＣＤ３４が陰性の発現が陰性または弱陽性である場合、前記候補細胞はより未分化状態が高いと判定される細胞が多いことが特徴として挙げられる。未分化状態が高い状態は、例えば、多系統の細胞からなるｎｍＥＭコロニーを形成する能力、および致死量の放射線を照射した生物の造血を長期にわたり再建し維持する能力からなる群より選択される能力を維持することなどによって特徴付けることができる。
【０３２９】
あるいは、ＣＤ３４が陰性の発現が陽性である場合、候補細胞はより未分化状態が低いと判定される細胞が多いことが特徴として挙げられる。未分化状態の低下は、例えば、多系統の細胞からなるｎｍＥＭコロニーを形成する能力の低下、および致死量の放射線を照射した生物の造血を長期にわたり再建し維持する能力の欠如または短期間のみの維持能力からなる群より選択される能力などによって特徴付けることができる。
【０３３０】
上記発現の確認は、磁気ビーズまたはＦＡＣＳを用いて行うことができる。磁気ビーズおよびＦＡＣＳは、当該分野において周知の方法を利用することができ、これらを組み合わせることも可能である。
【０３３１】
好ましい実施形態では、本発明の成体型造血幹細胞の判定法では、分化抗原陽性（ｌｉｎｅａｇｅ  陽性）細胞を枯渇させる工程がさらに包含される。この枯渇工程は、ＭＡＣＳによって行われる。ＭＡＣＳ技術は、磁性マイクロビーズで標識した細胞を強力磁場にセットしたカラムに通して目的の細胞を分離するシステムである。ＭＡＣＳ技術は以下のとおりである。
【０３３２】
まず、細胞を磁性マイクロビーズ標識する。この標識としては、直接標識と間接標識とがあるが状況に応じて使い分けることができる。これらのマイクロビーズを直接に細胞と免疫反応させる方法を直接標識といい、目的の細胞に対する抗体磁性マイクロビーズがない場合などは、細胞に対する手持ちの特異抗体を一次標識させた後、この抗体に対する抗体標識マイクロビーズを二次標識する方法を間接標識という。直接標識の利点としては、分離速度が早い、高い純度の細胞フラクションがえられるなどの利点が考えられる。間接標識の利点としては、例えば、種々のコンビィネーションがとれ、抗体標識が増感されるなどの効果が挙げられるがそれらに限定されない。
【０３３３】
標識した細胞は、ポジティブ選択（標的細胞を標識して単離する方法）および枯渇のいずれかの方法で分離することができる。ポジティブ選択は、標識を指標に単離する方法である。枯渇法は、マイクロビーズ標識していない、磁場を素通りした陰性細胞を分離する方法であり、分離したい細胞が、抗体により活性化されず、細胞に特異的な抗体がない場合にも分離できるという特徴があり、ポジティブ選択と枯渇法とを組み合わせることもできる。
【０３３４】
この枯渇工程は、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、ＴＥＲ１１９、ＣＤ４、ＣＤ８およびＢ２２０からなる群より選択される少なくとも1つのＬｉｎマーカーを用いて行うことができる。
【０３３５】
好ましい実施形態において、このＬｉｎマーカーは、ＩｇＧ  ＭＡＣＳビーズと結合体化されていてもよい。
【０３３６】
本発明の好ましい実施形態において、候補細胞としては、密度勾配遠心分離によって分離された細胞を含み得る。このような密度勾配遠心分離には、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌ、スクロースなどの分離媒体（多くは、糖または糖誘導体）を用いることができる。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明の成体型造血幹細胞の判定方法は、成体型造血幹細胞を含む検体を密度勾配遠心分離して候補細胞を調製する工程をさらに包含する。
【０３３７】
（成体型造血幹細胞調製法）
別の局面において、本発明は、成体型造血幹細胞が分離または濃縮された組成物を生産する方法であって、Ａ）成体型造血幹細胞を含むかまたは含むと予想される供給源を提供する工程；Ｂ）該供給源とエンドムチンの同定手段とを接触させる工程；Ｃ）エンドムチン陽性細胞を分離または濃縮する工程、を包含する、方法を提供する。
【０３３８】
ここで、成体型造血幹細胞を含むかまたは含むと予測されるサンプルは、当該分野において周知の手法を用いて提供することができ、例えば、ＥＳ細胞またはＥＳ細胞からの分化、骨髄採取、末梢血採取、臍帯血採取などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０３３９】
上記因子およびサンプルへの接触ならびにエンドムチンの発現の確認は、上記（成体型造血幹細胞判定法）において説明したような任意の形態を採用することができる。
【０３４０】
好ましくは、使用される同定手段は抗エンドムチン抗体であり、濃縮はフローサイトメトリーにより行われる。
【０３４１】
エンドムチンが発現している細胞を分離または濃縮には、ＦＡＣＳおよび／または磁気ビーズを用いることができる。特に、このような場合、抗体を用いることが好ましい。そのような抗体は、標識されていることが好ましく、そのような標識は、本明細書において別の場所において説明されるように任意の標識を用いることができる。
【０３４２】
１つの好ましい実施形態において、本発明の方法において用いられる好ましい分離または濃縮としては、抗体非動化ディッシュによるパニング、ＦＡＣＳまたは磁気ビーズあるいはそれらの組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。
【０３４３】
本発明はまた、成体型造血幹細胞が分離または濃縮された組成物を生産するキットであって、Ａ）エンドムチンの同定手段；Ｂ）該同定手段と成体型造血幹細胞を含むかまたは含むと予想される供給源とを接触させる手段；およびＣ）エンドムチン陽性細胞を分離または濃縮する手段、を備えるキットをも提供する。
【０３４４】
同定手段は、本明細書において上述されるとおりであり、例えば、エンドムチンに対する抗体、相補的配列を含む核酸分子などを挙げることができる。
【０３４５】
好ましくは、本発明は、成体型造血幹細胞を調製するためのキットであって、（Ｉ）エンドムチン遺伝子またはエンドムチン遺伝子産物に特異的な因子；（ＩＩ）該エンドムチン遺伝子が該サンプル中の細胞において発現しているかどうかを確認する手段；および（ＩＩＩ）該エンドムチン遺伝子が発現している細胞を分離または濃縮する手段、を備える、キットを提供する。細胞の分離または濃縮についてもまた、本明細書において上記（成体型造血幹細胞調製法）において説明される任意の形態を用いることができることが理解される。
【０３４６】
ここで、上記因子または同定手段は、上記（成体型造血幹細胞マーカー−核酸形態に対する因子）および（成体型造血幹細胞マーカー−ポリペプチド形態に対する因子）において説明される任意の形態を採ることができることが理解される。エンドムチンが発現しているかどうかを確認するための手段としては、例えば、標識または標識と結合する部分であり得る。そのような標識は、識別可能に標識される限り、どのような標識でもよく、例えば、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応などの技法が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、その因子が抗体などの免疫反応を利用して相互作用する場合、ビオチン−ストレプトアビジンのような免疫反応においてよく利用される系を用いてもよい。本発明において使用される標識は、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、ＰＥ、ＡＰＣ、ＦＩＴＣ、ビオチンなどであってもよい。Hoechst Blue、Hoechst 33342、Hoechst Redなどは、ＤＮＡ染色色素として用いることができる。
【０３４７】
１つの実施形態において、本発明のキットは、さらに、他の幹細胞マーカーが発現しているかどうかを確認する手段を備える。このキットは、好ましくは、ＣＤ４１および／またはＣＤ４５のマーカーに対して特異的な因子を含み得る。そのような手段としては、例えば、ＣＤ３４、ＣＤ４１、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）およびｃ−Ｋｉｔからなる群より選択されるマーカーに対して特異的な少なくとも１つの因子、ならびに該因子が前記サンプル中の細胞において発現しているかどうかを確認する手段が挙げられるがそれらに限定されない。このような別のマーカーについては、上述の（成体型造血幹細胞判定法）において説明される判定基準が採用され得る。
【０３４８】
別の実施形態において、本発明のキットは、ｌｉｎｅａｇｅマーカーに対して特異的な少なくとも１つの因子、ならびに該因子が前記サンプル中の細胞において発現しているかどうかを確認する手段をさらに備える。そのような手段としては、例えば、Ｌｉｎマーカーとして、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、ＴＥＲ１１９、ＣＤ４、ＣＤ８およびＢ２２０からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを含む。このような別のマーカーについては、上述の（成体型造血幹細胞判定法）において説明される判定基準が採用され得る。簡略化して言えば、これらのｌｉｎｅａｇｅマーカーは、すべて陰性であることが好ましい。
【０３４９】
（成体型造血幹細胞調製物）
別の局面において、本発明は、本発明の成体型造血幹細胞調製法によって調製された、幹細胞に関する。このような成体型造血幹細胞は、エンドムチン発現細胞が濃縮されていることから、従来の細胞とは異なるといえる。このような発現細胞は、単離されていることが好ましい。しかも、エンドムチン発現細胞が濃縮されていることによって、予想外に移植適合性が格段に上昇したことから、本発明の幹細胞は、従来の幹細胞からは予測できない顕著な効果を奏するともいえる。
【０３５０】
代替の局面において、本発明は、エンドムチンが発現する細胞が濃縮された、細胞集団を提供する。従来エンドムチンは細胞のマーカーとしては用いられておらず、したがって、そのようなものを指標に濃縮された細胞は存在してなかった。このような細胞集団は、幹細胞を豊富に含む点および移植適合性が格段に上昇している点などが従来技術とは顕著に異なるといえる。
【０３５１】
（成体型造血幹細胞を用いた治療、予防、および予後の方法および医薬）
別の局面において、本発明は、成体型造血幹細胞の移植を必要とする被検体の処置、予防または予後のための方法であって、（Ｉ）移植物においてエンドムチンの遺伝子が発現しているかどうかを確認する工程；（ＩＩ）該エンドムチンの遺伝子が発現している幹細胞を含む移植物を分離または濃縮する工程；および（ＩＩＩ）該分離または濃縮された移植物を、該被検体に移植する工程、を包含する、方法を提供する。ここで、エンドムチンの遺伝子発現（転写物および／または翻訳物の発現を含み得る）の確認は、それに特異的な因子を用いることおよびその特異的結合を確認・検出することによって実施することができる。このようにエンドムチンが発現していることが確認された細胞を分離または濃縮する手段もまた、本明細書において説明されるように、例えば、特異的抗体を用いたＦＡＣＳおよび／または磁気ビーズによる分離などが挙げられるがそれらに限定されない。このように濃縮または分離された細胞は、好ましくは、エンドムチン陽性細胞のみを含んでいることが有利である。このことによって移植適合性が格段に上昇するからである。また、移植適合性と、エンドムチンの発現との相関が極めて高い（ほぼ１００％）であることが判明したからである。
【０３５２】
好ましい実施形態において、本発明は、（Ｉａ）前記移植物において、さらに、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ３４、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）、およびｃ−Ｋｉｔからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーが発現しているかどうかを確認する工程；および（ＩＩａ）該移植物において、該ＣＤ４１陽性は幹細胞であることの指標であり、ＣＤ４５陰性は幹細胞であることの指標であり、該ＣＤ３４、該Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）、該ｃ−Ｋｉｔおよび該Ｓｃａ−１の遺伝子が、それぞれ陰性発現もしくは弱陽性発現、陰性発現、陽性発現および陽性発現をしている幹細胞を含む移植物を分離または濃縮する工程、をさらに包含する。これらのマーカーでのさらなる選別によって、移植適合性の信頼度が格段に上昇すること、およびこれらのマーカーが従来使用されていることから、従来の知見を活用できるという利点がさらに加わるという効果が奏される。
【０３５３】
さらなる好ましい実施形態において、本発明における前記工程（ＩＩａ）は、前記ｃ−Ｋｉｔおよび前記Ｓｃａ−１の遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子が強陽性発現している成体型造血幹細胞を含む移植物を分離または濃縮することをさらに包含する。これらのマーカーの強発現は、移植適合性とより強い相関性が見出されたことから、成体型造血幹細胞の移植適合性をより確実に判定するためにはこれらの強発現をみることが好ましい。
【０３５４】
本発明の移植方法において、成体型造血幹細胞を含む移植物は、エキソビボで行われる。したがって、この移植物は、被検体自体に由来していることが好ましいがそれに限定されない。免疫反応が気になる場合（例えば、臍帯血由来の場合）は、免疫抑制方法が実行されてもよい。拒絶反応を回避する手順は当該分野において公知であり、例えば、新外科学体系、第12巻、心臓移植・肺移植  技術的，倫理的整備から実施に向けて（改訂第3版）、中山書店に記載されている。そのような方法としては、例えば、免疫抑制剤、ステロイド剤の使用などの方法が挙げられる。拒絶反応を予防する免疫抑制剤は、現在、「シクロスポリン」（サンディミュン／ネオーラル）、「タクロリムス」（プログラフ）、「アザチオプリン」（イムラン）、「ステロイドホルモン」（プレドニン、メチルプレドニン）、「Ｔ細胞抗体」（ＯＫＴ３、ＡＴＧなど）があり、予防的免疫抑制療法として世界の多くの施設で行われている方法は、「シクロスポリン、アザチオプリン、ステロイドホルモン」の３剤併用である。免疫抑制剤は、本発明の併用療法と同時期に投与されることが望ましいが、必ずしも必要ではない。従って、免疫抑制効果が達成される限り免疫抑制剤は本発明の併用療法の前または後にも投与され得る。
【０３５５】
あるいは、別の好ましい実施形態では、成体型造血幹細胞を含む移植物は、ＥＳ細胞、ＥＳ細胞から分化させた細胞、骨髄、臍帯血または末梢血に由来することが有利である。このような原料には成体型造血幹細胞が含まれるか含むと予想されているからである。
【０３５６】
別の局面において、本発明は、成体型造血幹細胞の移植を必要とする被検体の処置、予防または予後のための医薬であって、Ａ）エンドムチンを発現する成体型造血幹細胞が濃縮された細胞集団、を含む、医薬を提供する。このような細胞は、ＣＤ４１が陽性であり、および／またはＣＤ４５が陰性であることが好ましい。さらに好ましくは、ＣＤ３４、ＣＤ４１、Ｌｉｎ（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）およびｃ−Ｋｉｔの遺伝子が、それぞれ陽性発現、陽性発現、陰性発現および陽性発現をしていることが有利である。このような細胞は、移植適合性を有していることが本発明によって明らかにされたからである。このような医薬の調製法は、本明細書において上記されており、その任意の形態を用いることができる。
【０３５７】
（使用）
別の局面において、本発明は、エンドムチンの、成体型造血幹細胞の判定のための使用を提供する。ここで、エンドムチンとしては、本明細書において上記される任意の形態を用いることが可能である。
【０３５８】
他の局面において、本発明は、エンドムチンの、移植適合性を判定するための使用を提供する。移植適合性が調べられる移植物は、成体型造血幹細胞を含むことが好ましい。ここで、エンドムチンおよび因子または同定手段としては、本明細書において上記される任意の形態を用いることが可能である。
【０３５９】
他の局面において、本発明は、エンドムチンポリペプチドもしくはその一部、またはエンドムチンをコードする核酸配列もしくはその一部を含む核酸分子に対して特異的な因子の、成体型造血幹細胞の判定のための使用を提供する。
【０３６０】
別の局面において、本発明は、エンドムチンポリペプチドもしくはその一部、またはエンドムチンをコードする核酸配列もしくはその一部を含む核酸分子に対して特異的な因子の、成体型造血幹細胞を含む医薬を製造するための使用を提供する。ここで、エンドムチンおよび因子または同定手段としては、本明細書において上記される任意の形態を用いることが可能である。
【０３６１】
他の局面において、本発明は、エンドムチンを発現する幹細胞の、成体型造血幹細胞移植のための医薬を製造するための使用を提供する。医薬およびエンドムチンに関する説明は、本明細書において上記されており、上記される任意の形態を用いることが可能である。
【０３６２】
（細胞組成物）
別の局面において、本発明は、エンドムチンを発現する細胞を含む組成物を提供する。好ましくは、この細胞は、ＣＤ４１陽性であり、あるいはＣＤ４５陰性である。さらに好ましくは、この細胞は、ＣＤ４１陽性でり、かつＣＤ４５陰性である。この細胞は、さらに、ＣＤ３４発現が陰性または弱陽性である。さらに好ましくは、この細胞は、ｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１発現が陽性（より好ましくは強陽性）である。好ましくは、この細胞は、Ｌｉｎの発現が陰性である。
【０３６３】
従って、本発明は、エンドムチンを発現し、かつ、ＣＤ４１を発現する細胞が濃縮された、成体型造血幹細胞組成物を提供する。さらに、あるいは、本発明の成体型造血幹細胞組成物では、成体型造血幹細胞組成物は、ＣＤ４５を発現しない細胞が濃縮されている。
【０３６４】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって得られた細胞、その細胞から得られた組織および臓器に関する。
【０３６５】
本発明の好ましい局面において、本発明は、本発明の方法によって得られた成体型造血幹細胞組成物を含む医薬組成物を提供する。そのような医薬組成物には、必要に応じて、薬学的キャリアおよびさらなる薬効成分が含まれていてもよい。
【０３６６】
本発明の別の局面において、本発明は、成体型造血幹細胞組成物またはそれに由来する分化細胞を必要とする疾患または障害を処置または予防するための方法を提供する。この方法は、Ａ）本発明によって得られた細胞をそのような処置または予防を必要とする被検体に投与する工程、を包含する。
【０３６７】
本発明の別の局面において、本発明は、本発明によって得られた成体型造血幹細胞組成物の、成体型造血幹細胞組成物またはそれに由来する分化細胞を必要とする疾患または障害を処置または予防するための使用に関する。そのような細胞の使用技術は、当該分野において周知であり、当業者は、適宜選択することができる。
【０３６８】
別の局面において、本発明は、上記成体型造血幹細胞組成物を増幅およびその多能性もしくは自己複製能を維持するための方法によって調製された幹細胞を提供する。この方法は、インビボまたはインビトロで使用することができる。本発明の方法によって調製された成体型造血幹細胞組成物は、一定の品質を確保することができ、大量に調製することも可能であるように、従来にない特徴を有することから、好ましい治療効果を有し得る。
【０３６９】
このように、本発明により成体型造血幹細胞組成物をより効率的に提供するができるようになった。従って、このような効果は、従来技術にはない格別な効果であるといえ、その有用性は筆舌に尽くしがたい。
【０３７０】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０３７１】
以下に示した実施例において使用した試薬は、特に言及しない限り和光純薬、Sigmaから、細胞関連の試薬はＧｉｂｃｏから得た。動物の飼育は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈｇ作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．８６−２３，１９８５，改訂）に遵って、東京大学および日本政府が規定する基準に遵い、動物愛護精神に則って行った。
【０３７２】
（実施例１：造血幹細胞の膜上に発現する分子の探索）
本実施例では、造血幹細胞を高頻度に含むＣＤ３４−ＫＳＬ細胞（ＣＤ３４−、ｃ−Ｋｉｔ＋、Ｓｃａ−１＋、ｌｉｎｅａｇｅ−骨髄細胞分画）において膜上に発現する分子の検索を行った。
【０３７３】
ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の調製は以下のとおりに行った。
【０３７４】
８−１０週齢のＣ５７ＢＬ／６  Ｌｙ５．１マウスの骨髄液を採取し、比重（密度勾配）遠心分離により単核球を分離した。単核球を各種の単クローン抗体で染色後（抗ＣＤ３４，抗ｃ−Ｋｉｔ，抗Ｓｃａ−１，Ｌｉｎｅａｇｅ−ｍａｒｋｅｒ  ｍｉｘｔｕｒｅ（ＣＤ４，ＣＤ８，Ｂ２２０，Ｇｒ−１，Ｍａｃ−１、Ｔｅｒ１１９））、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ細胞分取器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて  ＣＤ３４−／ｌｏｗｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋Ｌｉｎｅａｇｅ−ｍａｒｋｅｒ−（ＣＤ３４−ＫＳＬ）の造血幹細胞分画を９６マルチタイタープレートに１００細胞／ウェルずつ選別した。培養液は無血清培地である  Ｘ−ｖｉｖｏ−１０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を２００μｌ／ウェルで用い、サイトカインとしては  ＳＣＦ（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）およびＴＰＯ（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）をそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌで添加した。
【０３７５】
また、対照として、ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞、ＫＳＬ、ＴＥＲ１１９、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、Ｂ２２０、ＴＨｙ−１、ＮＫ１．１、ＤＮ、ＤＰ、ＣＤ４ＳＰ、ＣＤ８ＳＰ（マウス）；ＣＤ３４＋／３８−、ＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／１３＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１５＋、ＧＰＡ＋、ＧＰＡ＋、ＣＤ７１＋、ＣＤ４１＋、ＣＤ３＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ５６＋（ヒト）の細胞群も調製した。
【０３７６】
次に、この細胞５０００個から、ｃＤＮＡライブラリーを定法により作製し、改変型シグナルシークエンストラップ法を用いて造血幹細胞の膜上に発現する分子を探索した。
【０３７７】
この結果、エンドムチン（１ａ）が候補分子として同定された。
【０３７８】
従って、この候補分子であるエンドムチンに関して、ＲＴ−ＰＣＲにより種々の細胞分画におけるエンドムチン遺伝子の発現量を比較した。そのプロトコールを以下に示す。ＲＴ−ＰＣＲのプライマーとしては、以下の配列を用いた
（マウス）
センス：5'-ACAACTGAAGGTCCCCTAAGG-3'（配列番号２９）；
アンチセンス：TTGGTTTTCCCCTGTGCAGAG-3'（配列番号３０）。
【０３７９】
（ヒト）
センス  5'-ACCAGGTAGTGTTCTACAACC-3'（配列番号３１）；
アンチセンス  5'-AGTGCTCACCAGACTCATGAG-3'（配列番号３２）。
【０３８０】
その結果、幹細胞が濃縮されていると考えられる細胞群にのみエンドムチンの発現が見られた。エンドムチンは、ｍＲＮＡレベルにおいて造血幹細胞に特異的に発現していることが示された。
【０３８１】
（実施例２：抗体を用いたエンドムチン発現解析）
次に、本実施例では種々の抗体を用いてエンドムチンポリペプチドが幹細胞においてどのように発現されているかを調べた。本実施例において用いられる抗体は、Ｄｒ．  Ｖｅｓｔｗｅｂｅｒ  Ｄ．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＺＭＢＥ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｕｎｓｔｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ．から入手したが、当業者は、エンドムチンポリペプチドを適宜調製して、当該分野において周知の技法で抗体を作成することができることが理解される。
【０３８２】
まず、ＳＰ（ｓｉｄｅ  ｐｏｌｕｌａｔｉｏｎ）細胞を調製した。幹細胞の共通な特徴としてヘキスト３３３４２という色素をよく排出することが報告されている。骨髄にもヘキスト３３３４２をよく排出するために染まらないＳＰ細胞分画が骨髄細胞中に約０．１％存在し、造血幹細胞が濃縮されていることが知られている。（Ｇｏｏｄｅｌｌ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１７９７，１９９６）。ＳＰ細胞の調製手順を以下に示す。
【０３８３】
実施例１に記載されるＣＤ３４−ＫＳＬ細胞の調製手順において標識抗体の代わりにHoechst Blue、Hoechst 33342、Hoechst Redを用いて、ＦＡＣＳを行った。ここで、Hoechst BlueおよびHoechstRedで弱陽性の細胞をSP細胞として取り出した。この細胞は、造血幹細胞が濃縮されていると報告されていることから、本実施例では、簡便な造血幹細胞の濃縮法として用いた。
【０３８４】
次に、抗ラットPEとエンドムチンとを用いて細胞を選択した。そのプロトコールを以下に示す。
【０３８５】
マウス（Ｌｙ５．１）の大腿骨および脛骨より骨髄細胞を２５Ｇの針と２．５ｍｌシリンジを用いて採取し、５ｍｌのＰＢＳを用いて骨髄を抽出した。骨髄細胞浮遊液を６ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（アマシャムファルマシアバイオテック社）に重層し、４００×ｇで２０分間室温で遠心した後、中間層の単核細胞を回収した。回収した細胞を１０ｍｌの染色液（ＳＭ：５％ＦＣＳ＋０．０５％ＮａＮ３＋ＰＢＳ）で洗い、無標識分化抗原（Ｌｉｎｅａｇｅ）抗体を加えた。氷上で２０分反応後、ＳＭで洗浄し抗ラットＩｇＧ抗体を結合したマグネットビーズと混合した。さらに氷上で１５分反応させ、マグネットビーズと結合していないＬｉｎｅａｇｅ抗原陰性細胞をマグネットスタンドに固定した枯渇用カラム（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ）に細胞を通し、カラムにトラップされずに流れ出てきた細胞を回収した（Ｌｉｎｅａｇｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ細胞）。回収した細胞にビオチン標識抗エンドムチン抗体、ＰＥ−Ｃｙ５．５標識抗Ｓｃａ−１抗体、ＡＰＣ標識抗ｃ−Ｋｉｔ抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４抗体を加え氷上で３０分後、さらにストレプトアビジン化ＰＥを加え６０分間反応させた。細胞をＳＭで洗浄し４ｍｌのＳＭに混濁後、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトンディッキンソン社）を用いて、エンドムチン陽性細胞分画を９６穴プレートに分離した。
【０３８６】
その結果、ＳＰ細胞にはエンドムチン発現細胞が濃縮されていることが明らかになった。また、全骨髄細胞のおよそ０．８％がエンドムチン陽性であった。また、
他の分化マーカーを用いて選択した細胞群（実施例１において調製）を用いて同様のエンドムチン発現を見た。
【０３８７】
この結果から、１％未満のＭａｃ−１弱陽性、Ｂ２２０陽性の細胞に、エンドムチン細胞が検出された。この結果からエンドムチンは分化抗原陽性細胞にはほとんど発現されていないが、B220陽性細胞の一部（１％未満）および未分化な細胞が含まれているとされるMac-1弱陽性の一部に発現されていることが示された。
【０３８８】
以上を総合すると、骨髄ＫＳＬ細胞の約９０％がエンドムチン陽性であった。
【０３８９】
次に、同様のＦＡＣＳ選択によって、ＫＳＬ細胞をＣＤ３４とエンドムチンの発現パターンで４つ分画した。その結果、ＣＤ３４−エンドムチン−分画は、約３％存在し、ＣＤ３４−エンドムチン＋分画は約２３％存在し、ＣＤ３４＋エンドムチン＋分画は約６５％存在し、ＣＤ３４＋エンドムチン−分画は約９％存在していた。これらにより、ＣＤ３４−ＫＳＬの約９０％以上はエンドムチン陽性であり、エンドムチンが造血幹細胞のマーカーのひとつとなることが実証された。
【０３９０】
（実施例３：コロニー形成アッセイ）
次に、本実施例において、実施例２で分離した４分画について、インビトロの培養アッセイを行ってコロニー形成の様子を見た。これは、幹細胞が含まれていることを培養により確認することを目指す。各分画の細胞の分化誘導条件で培養した。そのプロトコールを以下に示す。
【０３９１】
単核球からＬｉｎ陽性細胞を約１／５０以下にＭＡＣＳ（磁気細胞分離システム）技術を用いて枯渇させた。ＭＡＣＳ技術は、磁性マイクロビーズで標識した細胞を強力磁場にセットしたカラムに通して目的の細胞を分離するシステムである。ＭＡＣＳ技術は以下のとおりである。
【０３９２】
まず、細胞をＬｉｎ陽性細胞に特異的な抗体を有する磁性マイクロビーズ標識し、標識した細胞を、枯渇法で、マイクロビーズ標識していない、磁場を素通りした陰性細胞を分離することによってＬｉｎ陽性細胞を約１／５０以下にした。
【０３９３】
ＫＳＬ細胞を、ＣＤ３４およびエントムチンの発現によってゲートした。そのプロトコールは以下のとおりである。
【０３９４】
マウス（Ｌｙ5.1）の大腿骨および脛骨より骨髄細胞を25Gの針と2.5mlシリンジを用いて採取し、5mlのPBSを用いて骨髄を抽出した。骨髄細胞浮遊液を6mlのFicoll-Paque（アマシャムファルマシアバイオテック社）に重層し、400×gで20分間室温で遠心した後、中間層の単核細胞を回収した。回収した細胞を10mlの染色液(SM,5％FCS+0.05%NaN3+PBS)で洗い、無標識分化抗原（Lineage）抗体を加えた。氷上で２０分反応後、SMで洗浄し抗ラットIgG抗体を結合したマグネットビーズと混合した。さらに氷上で１５分反応させ、マグネットビーズと結合していないLineage抗原陰性細胞をマグネットスタンドに固定したdepletioncolumnに細胞を通し、カラムにトラップされずに流れ出てきた細胞を回収した(Lineage-negative細胞）。
【０３９５】
回収した細胞にビオチン標識抗Endomucin抗体、PE-Cy5.5標識抗Sca-1抗体、APC標識抗c-Kit抗体、FITC標識抗ＣＤ３４抗体を加え氷上で３０分後、さらにストレプトアビジン化ＰＥを加え６０分間反応させた。細胞をＳＭで洗浄し４ｍｌのＳＭに混濁後、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（ベクトンディッキンソン社）を用いて、各種細胞分画を９６穴プレートに各ウエルに細胞を一個ずつ分離し培養を行った。
【０３９６】
各分画から４８の細胞を抽出してＳ−クローン培地（１０ｎｇ／ｍｌ  幹細胞因子（ＳＣＦ）、１０  ｎｇ／ｍｌ  ｍＩＬ３、５０ｎｇ／ｍｌ  ｈＴＰＯ、２Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯおよび１０％ウシ胎仔血清を補充）にプレートした。細胞を１５日間培養し、表現型をＭａｙ−Ｇｉｅｍｍｓａ染色によって染色した。そのプロトコールは以下のとおりである。
【０３９７】
１５日培養後、各ウエルに増殖した細胞をスライドグラスに吹きつけたサイトスピン標本を作成し、細胞をMay染色液で５分染色・固定後、Giemsa染色液で２０分さらに染色し、水洗後、風乾し、光学顕微鏡下で細胞の形態を観察した。
【０３９８】
その結果、多分化能の指標となる好中球／マクロファージ／赤芽球／巨核球の細胞系譜を含む混合コロニーは、ＣＤ３４−エンドムチン＋細胞に多く見られた。したがって、エンドムチンは、幹細胞の効率よいマーカーであることが示される。
【０３９９】
（実施例４：骨髄再構築アッセイ）
実施例３において、ＣＤ３４−エンドムチン−の分画からも好中球／マクロファージ／赤芽球／巨核球の細胞系譜を含む混合コロニーが観察されたことから、直接造血幹細胞を観察するために、骨髄再構築アッセイを行った。そのプロトコールを以下に示す。
【０４００】
細胞をFACSを用いて選別し、それぞれＣ５７ＢＬ／６  Ｌｙ５．２マウス骨髄細胞２×１０５と混ぜた。致死量の放射線を照射された５７ＢＬ／６  Ｌｙ５．２マウスに細胞を尾静脈から注入した。細胞を移植後定期的に末梢血を採取し、移植した細胞の末梢血におけるキメリズムをＦｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて観察した。骨髄移植から１５週後には、エンドムチン陽性画分の細胞を移植した群では、骨髄の再構築が認められたのに対して、エンドムチン陰性画分の細胞を移植した群では、骨髄の再構築はまったく認められなかった。従って、エンドムチンは、移植適合性を判断する指標であることが明らかになった。
【０４０１】
（実施例５：エンドムチン発現量と未分化性との相関）
本実施例では、エンドムチンゲートで分離した細胞画分のＫＳＬ細胞の分布を観察し、その未分化性との相関を検証した。
【０４０２】
まず、エンドムチンＰＥを用いて５種類の発現強度に応じて１−ｅ（エンドムチンＰＥの強度がそれぞれ、１−５、５−３５、３５−１５０、１５０−４００、４００−１５００）の分類を行った。それぞれ存在比率は、１８．６％、５６％、２０．１％、１．５８％、０．２６％であった。
【０４０３】
その結果、エンドムチンの高発現は、Ｓｃａ−１とｃ−Ｋｉｔとの両方の高発現と相関していることがわかる。
【０４０４】
（実施例６：ＣＤ３４およびエンドムチンの発現によってゲートされるｃ−Ｋｉｔｈｉｇｈ，Ｓｃａ−１ｈｉｇｈ細胞の分布）
次に、単核球を、ＭＡＣＳ技術によってｌｉｎｅａｇｅ陽性細胞を１／２１にまで枯渇させた細胞を用いて、ｃ−Ｋｉｔ、Ｓｃａ−１およびＣＤ３４とエンドムチン発現との関係をさらに検証した。
【０４０５】
枯渇細胞は、上述の実施例に記載されるように枯渇処理を行った。この細胞を、エンドムチン、ｃ−Ｋｉｔ（ａ）、Ｓｃａ−１（ｂ）およびＣＤ３４（ｃ）について、ｌｉｎｅａｇｅ陰性細胞における発現相互関係を見た。
【０４０６】
その結果、ＣＤ３４−エンドムチンｈｉｇｈ細胞は、ｃ−Ｋｉｔｈｉｇｈ，Ｓｃａ−１ｈｉｇｈ細胞と相関性が高い、つまり、幹細胞および移植適合性のより効率よい指標であることが確認された。
【０４０７】
以上の結果から、エンドムチンは、骨髄細胞および脾臓細胞におけるｌｉｎｅａｇｅ表面マーカーと共発現されるわけではないことが示され、７０−９０％のＣＤ３４−ＫＳＬ細胞がエンドムチン陽性であり、ＣＤ３４−Ｌｉｎ−ｃ−Ｋｉｔ＋＋Ｓｃａ−１＋＋細胞は、１００％がエンドムチン陽性であることが明らかになった。
【０４０８】
ＣＤ３４−ＫＳＬエンドムチン＋細胞は、ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞と同等の多分化能を保持していた。
【０４０９】
ＣＤ３４−ＫＳＬエンドムチン＋細胞が造血系細胞の再構築をすることに好ましいことが明らかになった。
【０４１０】
（実施例７：ＥＳ細胞におけるエンドムチン発現−胚様体の形成と細胞染色）
（胚様体の形成および細胞染色）
Ｅ１４．１  ＥＳ細胞は放射線照射した胎児線維芽細胞上で培養した。培養はＤＭＥＭ、１５％ウシ胎仔血清、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ），１０００Ｕ／ｍｌ白血病阻害因子（ＬＩＦ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を用いて行った。ＥＳ細胞を分化させる際はＥＳ細胞をまず０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でほぐし、ＥＢＤ培養液［Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）、１５％ウシ胎仔血清、２００μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ），１５０μＭモノチオグリセロール（Ｓｉｇｍａ），５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ），２ｍＭＬ−グルタミン］に浮遊させた。胎児線維芽細胞を除くためにＴ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で細胞を４５分間培養し、非接着細胞を回収した。細胞は５  μｌの培養液中に１００細胞の濃度で浮遊させ、ハンギングドロップ法（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ）にて５０μｌの培養滴の中で逆さにしたバクテリア用ペトリディッシュにつり下げた状態で培養した。２４時間後に細胞を各培養滴より回収し、ＥＢＤ培養液を用いて１０ｃｍバクテリア用ペトリディッシュ内でさらに培養した。培養液は３日ごとに半分ずつ交換した。ハンギングドロップを開始した日をＥＢ  ｄａｙ  ０とした。回収した胚様体は０．２５％トリプシン（Ｓｉｇｍａ）でほぐした後、２％血清入りＰＢＳで２回洗浄した。５ｘ１０５浮遊細胞をＰＥ標識抗Ｆｌｋ１抗体とＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４１抗体、あるいはＰＥ  標識抗ＣＤ４５抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とビオチン化抗Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ抗体（クローンＶ７ｃ７）、ＡＰＣ標識ストレプトアビジンで染色し、ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）またはＭｏ−ｆｌｏ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて細胞表面抗原の発現を解析するとともに、細胞の分取を行った。
【０４１１】
（ＯＰ９細胞の培養）
ＯＰ９細胞は０．１％ゼラチン処理をした４チャンバー培養スライド（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ，ＭＡ）あるいは２４穴培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の１穴当たり４０，０００細胞の濃度でＥＳ細胞との共培養開始前日に播種した。ＦＡＣＳにて分取した胚様体細胞の一部をＯＰ９細胞上にまき、α−ＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭＬ−グルタミン，５×１０−４Ｍ  ２−メルカプトエタノール，１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｓｉｇｍａ），１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン，１０  ｎｇ／ｍｌマウス組み換えＩＬ−３，１０ｎｇ／ｍｌマウスＳＣＦ，２Ｕ／ｍｌエリスロポイエチン、および５０ｎｇ／ｍｌトロンボポイエチン  （ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）の条件で培養した。培養２日目に形成コロニー数を観察した。次いで６日目にトリプシン処理による細胞を浮遊させ、血球計算板を用いて増殖した血液細胞数を検定した。
【０４１２】
（結果）
上記発現解析の結果を図１（マウスＥＳ細胞から形成される胚様体におけるエンドムチンの発現（１））に示す。胚様体構成細胞のＦｌｋ−１、ＣＤ４１、ＣＤ４５の発現とエンドムチンの関連をＦＡＣＳを用いて検討した。Ｆｌｋ−１は中胚葉系に分化が決定された細胞群に早期に発現される受容体型チロシンキナーゼであり、ＣＤ４１は胚様体において発生する造血前駆細胞の特異的なマーカーとされている（非特許文献１７〜１８）。一方ＣＤ４５は汎血球マーカーとして用いられている。エンドムチンはＥＳ細胞から胚様体を形成させて５日目前後から発現し始める。培養後４〜７日の胚様体においてはほとんどがＣＤ４５陰性細胞であり、ＣＤ４１＋Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ＋、ＣＤ４１＋Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ-、ＣＤ４１-Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ＋、ＣＤ４１-Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ-の４つの細胞群に分画されることが明らかとなった。また、７日目以降の胚様体においてＣＤ４５陽性のより成熟した血液細胞が出現するが、そのほとんどがＥｎｄｏｍｕｃｉｎ陽性であった。
【０４１３】
図２には、マウスＥＳ細胞から形成される胚様体におけるエンドムチンの発現の別の実施結果を示す。（ａ）胚様体形成後のＦｌｋ−１、ＣＤ４１、ＣＤ４５の発現とエンドムチンの発現の変化を折れ線グラフで示した。（ｂ）培養後５〜７日の胚様体細胞はＣＤ４１＋Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ＋、ＣＤ４１＋Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ-、ＣＤ４１-Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ＋、ＣＤ４１-Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ-の４つの細胞群に分画される。（ｃ）ｂにおけるＥＢ９，７５のエンドムチン陽性細胞はＣＤ４１陰性とＣＤ４１弱陽性、ＣＤ４１陽性の３分画に分けられ、ＣＤ４１弱陽性、ＣＤ４１陽性の大部分の細胞がＣＤ４５陽性の血液細胞である。一方、ＣＤ４１陰性細胞の大部分はＣＤ４５陰性であり、血管内皮細胞と想定される。
【０４１４】
４日目と６日目の胚様体細胞のＣＤ４５-細胞をＣＤ４１＋Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ＋、ＣＤ４１＋Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ-、ＣＤ４１-Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ＋、ＣＤ４１-Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ-の４つの細胞群に分画し、各分画の細胞を分取しＯＰ９細胞との共培養を行った。その結果を図３に示す。その結果、発生期の造血前駆細胞のマーカーであるＣＤ４１陽性細胞中に２〜３％の割合でエンドムチン陽性細胞が含まれ、このＣＤ４１＋Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ＋細胞分画に高度に造血活性の強い多能性前駆細胞が濃縮されていることが明らかとなった。
【０４１５】
このように、本発明において、エンドムチンの発現が、成体型造血幹細胞の指標となることが分かる。
【０４１６】
（実施例８：胎児造血の解析）
胎生８．５日の胎児より卵黄嚢および胎児を１０．５日から卵黄嚢および傍大動脈生殖中腎領域をそれぞれ分離および回収した。各組織を０．０５％コラゲナーゼで処理して浮遊細胞化し、胚様体の場合と同様に抗体で染色後ＦＡＣＳを用いて対象細胞分画を分取し、ＯＰ９細胞との共培養を行った。コロニー形成能の解析はα−ＭＥＭ１．２％メチルセルロース（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ），３０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ），１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ），１０−４２−メルカプトエタノール，１０ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−３，１０ｎｇ／ｍｌマウスＳＣＦ，２Ｕ／ｍｌエリスロポイエチンおよび５０ｎｇ／ｍｌトロンボポイエチンの培養条件を用いて行った。胎児型赤芽球前駆細胞から形成されるコロニーは培養２−３日目に、成人型造血前駆細胞から形成されるコロニーは培養１２日目に観察した。
【０４１７】
（結果）
その結果を図４に示す（卵黄嚢におけるエンドムチンの発現）。胎児型造血が行われる卵黄嚢におけるエンドムチンの発現を検討した。（Ａ）胎生８．５の卵黄嚢においてはＣＤ４５陰性ＣＤ４１陽性の胎児型造血前駆細胞にエンドムチンの発現はほとんど認められなかった。一方ＣＤ４５陽性ＣＤ４１陽性の一部はエンドムチン陽性であった。胎児型造血前駆細胞である初期赤芽球系始原細胞（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）（ＥｒｙＰ）、コロニー形成単位マクロファージ（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）（ＣＦＵ−Ｍ）の分布を調べるためにメチルセルロースコロニーアッセイを行ったところ、ＣＤ４５陽性・陰性に関わらず胎児型造血前駆細胞はＥｎｄｏｍｕｃｉｎを発現しないことが明らかとなった。      
【０４１８】
（Ｂ）  胎生１０．５の卵黄嚢においてはＣＤ４５陽性・陰性に関わらずＣＤ４１陽性の一部がＥｎｄｏｍｕｃｉｎ  陽性であった。メチルセルロースコロニーアッセイを行ったところ、ＣＤ４５陽性・陰性に関わらず成人型赤芽球前駆細胞（ｂｕｒｓｔ  ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｎｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ：ＢＦＵ−Ｅ，ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｎｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ：ＣＦＵ−Ｅ）にエンドムチンは発現せず、Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎは多分化能を示すコロニー形成細胞（ｍｉｘｅｄ  ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｎｉｎｇ  ｕｎｉｔ）に選択的に形成することが明らかとなった。
【０４１９】
このように、エンドムチンは、胎児型造血幹細胞では発現していないことが分かり、成体型造血幹細胞を識別可能であることが分かる。
【０４２０】
（実施例９：競合的骨髄再建能の検定）
（再建能の検定）
Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．２マウスからテスト細胞をＦＡＣＳで分取し、１×１０５の競合細胞（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．１マウスの総骨髄細胞）とともに致死量照射Ｌｙ５．１マウスの脛骨骨髄内に直接摂取した。さらに２×１０５  の競合細胞を尾静脈から注入した（競合細胞数は計３×１０５）。移植後、末梢血を採取し、ビオチン標識抗Ｌｙ５．１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ），ＦＩＴＣ標識抗Ｌｙ５．２抗体，ＡＰＣ標識抗Ｇｒ−１抗体，ＡＰＣ標識抗Ｍａｃ−１，ＰＥ標識抗ＣＤ４抗体，ＰＥ標識抗  ＣＤ８  抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ），ＰＥ−Ｃｙ７標識抗Ｂ２２０（Ｃａｌｔａｇ），Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、ＦＡＣＳにてキメリズムを解析した。キメリズムは以下のように算出した。総キメリズム（％）＝ドナー由来細胞／（ドナー由来細胞＋競合細胞由来細胞）×１００，各分化系列細胞のキメリズム（％）＝ドナー由来各分化系列細胞／（ドナー由来各分化系列細胞＋競合細胞由来各分化系列細胞）×１００。
【０４２１】
（結果）
図５は、傍大動脈生殖中腎領域におけるエンドムチンの発現結果を示す。（Ａ）成体骨髄に生着可能な成体型造血幹細胞が初めて出現する胎生１０．５日の傍大動脈生殖中腎領域におけるエンドムチンの発現を検討した。ＣＤ４５-細胞におけるＣＤ４１とエンドムチンの発現を観察したところ、ＣＤ４１-Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ-、ＣＤ４１-Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ-、ＣＤ４１＋Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ-  、ＣＤ４１＋Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ＋の４つの分画に分かれた。  （Ｂ）ＯＰ９との共培養の系でＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３およびＥＰＯ存在下において、各分画の細胞１０００個当たりに形成されるコロニー数を検討したところ、ＣＤ４１＋Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ＋が有意に高いコロニー形成能を示すとともに、（Ｃ）高い増殖活性と多分化能を示した。（Ｄ）競合的骨髄再建能の検討において各分画の長期骨髄再構築活性を検定した。各分画７５０細胞を一匹の致死量放射線照射レシピエントマウスに競合細胞とともに接種し、移植後の生着を観察したところ、ＣＤ４１＋Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ＋細胞を移植したマウスでのみ全例で生着が確認された。（Ｅ）このレシピエントマウスにおける末梢血のドナー細胞のキメリズムは低いものの、長期にわたる造血への寄与が確認された。（Ｆ）生着した細胞の分化傾向はＢ細胞優位であったが、低いながら骨髄球、Ｔ細胞も認められ、多能性造血幹細胞の生着が確認された。
【０４２２】
このように、本発明の成体型造血幹細胞は、臨床応用可能なことがわかる。
【０４２３】
（実施例１０：エンドムチンを用いた幹細胞の分離・濃縮）
抗エンドムチン抗体をマグネットビーズに非動化し、骨髄細胞と反応させる。マグネットスタンドに固定したカラムに細胞を通し、カラムにトラップされた細胞を回収することによりエンドムチン陽性細胞を純化する。この細胞分画は高度に造血幹細胞が濃縮された細胞分画であり、ワンステップの操作により造血幹細胞の濃縮が可能となる。
【０４２４】
（実施例１１：エンドムチン遺伝子の強制発現）
ＦＡＣＳにより９６穴プレートに造血幹細胞ＣＤ３４−ＫＳＬ１００個を選別し１００ｎｇ／ｍｌ  マウスＳＣＦおよび１００ｎｇ／ｍｌ  ヒトＴＰＯ存在下にＳ  ｃｌｏｎｅ培養液（三光純薬）で前培養を２４時間行う。その後、細胞にＭＯＩ  ６００で濃縮エンドムチンレトロウイルスを加え、２４時間ウイルスを感染させる。レトロウイルスにより遺伝子導入したＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を２０ｎｇ／ｍｌ、マウスＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ、ヒトＴＰＯでさらに液体培養した後、培養７および１４日目に２０ｎｇ／ｍｌ、マウスＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ、ヒトＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍｌ、マウスＩＬ−３および５ｕｎｉｔ／ｍｌ  ＥＰＯ存在下にメチルセルロース培地を用いたコロニーアッセイを行い、１０日目に混合コロニー（ＣＦＵ−Ｍｉｘ／ＣＦＵ−ｎｍｅＭ）の数を計測する。
【０４２５】
また、コロニーアッセイと同時に、培養した細胞の一部を、２×１０５個の競合細胞（Ｌｙ５．２）と共に９．５Ｇｙの致死量放射線照射したマウス（Ｌｙ５．２）の尾静脈より移植し、３ヶ月ごの末梢血におけるエンドムチン遺伝子導入細胞のキメリズムを測定することによりエンドムチン遺伝子の成体型造血幹細胞における強制発現の効果を判定する（競合的骨髄移植実験）。
【０４２６】
このようにしてエンドムチン遺伝子の強制発現の効果が実証される。
【０４２７】
（実施例１２：エンドムチンポリペプチドの直接導入）
上述の遺伝子を用いる形態に代えて、エンドムチンを直接使用して、幹細胞の能力を保持することができるかどうかを調べた。
【０４２８】
エンドムチン細胞外ドメインとヒトＩｇＧのＦｃ部分とのキメラタンパク質を作成する（Ｅｎｄ−Ｆｃタンパク質）。エンドムチン陽性細胞をＦＡＣＳを用いて選別し、２０ｎｇ／ｍｌ  マウスＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍｌ  マウスＩＬ−３および５ｕｎｉｔ／ｍｌ  ＥＰＯ存在下にメチルセルロース培地を用いたコロニーアッセイを行う際に、Ｅｎｄ−Ｆｃタンパク質を加えることにより、造血幹細胞上のエンドムチン分子機能の中和を行うことによるＣＦＵ−Ｍｉｘ／ＣＦＵ−ｎｍｅＭの数の変化を検定する。またエンドムチン陽性細胞にＥｎｄ−Ｆｃタンパク質を加えた状態で一定期間液体培養後、競合的骨髄移植実験を行い、３ヶ月ごの末梢血におけるエンドムチン遺伝子導入細胞のキメリズムを測定する。
【０４２９】
このことにより造血幹細胞上のエンドムチン分子機能の中和による効果が判定しうる。
【０４３０】
このエンドムチンを用いてコロニーアッセイおよび骨髄移植アッセイをすると、効果は弱いものの、同様の効果が得られたことが示される。
【０４３１】
（実施例１３：エンドムチン改変体による効果）
上述のエンドムチン１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄのスプライス変異体の種類の違いと幹細胞未分化性および移植適合性との相関を検証する。
【０４３２】
ＦＡＣＳにより９６穴プレートに造血幹細胞ＣＤ３４−ＫＳＬ  １００個を選別し１００ｎｇ／ｍｌ  マウスＳＣＦおよび１００ｎｇ／ｍｌヒトＴＰＯ存在下にＳ  ｃｌｏｎｅ培養液（三光純薬）で前培養を２４時間行う。その後、細胞にＭＯＩ  ６００で濃縮した各スプライス変異体エンドムチンレトロウイルスを加え、２４時間ウイルスを感染させる。レトロウイルスにより遺伝子導入したＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を２０ｎｇ／ｍｌマウスＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌヒトＴＰＯでさらに液体培養した後、培養７、１４日目に２０ｎｇ／ｍｌマウスＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌヒトＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−３および５ｕｎｉｔ／ｍｌ  ＥＰＯ存在下にメチルセルロース培地を用いたコロニーアッセイを行い、１０日目に混合コロニー（ＣＦＵ−Ｍｉｘ／ＣＦＵ−ｎｍｅＭ）の数を計測する。
【０４３３】
また、コロニーアッセイと同時に、培養した細胞の一部を、２×１０５個の競合細胞（Ｌｙ５．２）と共に９．５Ｇｙの致死量放射線照射したマウス  （Ｌｙ５．２）の尾静脈より移植し、３ヶ月ごの末梢血におけるエンドムチン遺伝子導入細胞のキメリズムを測定することによりエンドムチン遺伝子の各スプライス変異体の成体型造血幹細胞における強制発現の効果を判定する（競合的骨髄移植実験）。
【０４３４】
（実施例１４：エンドムチンと相互作用する物質のスクリーニング）
本発明では、エンドムチンを用いることもできるが、エンドムチンを相互作用する因子もまた有用である。そこで、本実施例では、エンドムチンを相互作用する因子のスクリーニングを行う。何も結合していないエンドムチンを用意し、そのエンドムチンが候補因子の提供によって活性化されるかどうかを確認することによってエンドムチンの相互作用因子をスクリーニングし、同定することができる。
【０４３５】
このようにして選別された化合物は、エンドムチンを特異的に相互作用することから、幹細胞の未分化に関連する因子または移植適合性のマーカーとして使用することができる。このような物質は、エンドムチンに結合し、重合することによってエンドムチンを活性化する低分子であり得る。
【０４３６】
本実施例において、ある物質が、エンドムチンであるかどうかは、その因子が膜上に存在し得ることおよび／またはエンドムチン特異的コンセンサス配列に結合する能力を有することを判定することによって、判断することができる。本実施例では、エンドムチン遺伝子を細胞にトランスフェクトし、抗エンドムチン抗体を用いて免疫染色し、候補化合物を投与したときに、膜への局在が存在するかを確認することで判定することができる。そのような因子がタンパク質など候補化合物の場合は、直接細胞内に導入し、その後、膜にそのような因子が移行するかどうかを、その因子に特異的な抗体を用いて免疫染色することによって確かめることができる。そのような技術は、当該分野において周知である。
【０４３７】
エンドムチンコンセンサス配列に結合する能力を判断するために、エンドムチン結合塩基配列として用いられている塩基配列を含む２本鎖オリゴヌクレオチドを用いたゲルシフトアッセイで調べる。候補化合物を投与したときに、あるエンドムチンと、この塩基配列を含む核酸分子とを反応させ、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動および分離後、エンドムチンと、コンセンサス配列を含む核酸分子との複合体の形成を同定することによって判定することができる。通常は、複合体の形成が有意に確認することができれば、その因子は、エンドムチンと同一の機能を有すると判断することができる。
【０４３８】
エンドムチンであるかどうかを判断するには、以上の少なくとも１つで有意な活性が判定することができることで十分である。
【０４３９】
（実施例１５：エンドムチン相互作用因子の利用）
実施例１４で調製されたエンドムチンと相互作用する因子を用いて、幹細胞の未分化状態の判定、移植適合性の判定、および幹細胞の未分化化、移植適合の増強を行うことができる。このような化合物がエンドムチン発現を活性化する場合、幹細胞に投与して、一定期間培養すると、幹細胞が成体型造血幹細胞となり、あるいは移植適合性が獲得されるまたは増強されることがわかる。
【０４４０】
（実施例１６：蛍光色素を融合させたエンドムチンのノックイン）
本発明のエンドムチンをコードする核酸配列に、蛍光色素（Ｖｅｎｕｓ色素）をコードする配列を融合した融合核酸配列を含むノックインベクターを構築した。
【０４４１】
エンドムチン１ｓｔ  ｅｘｏｎ内のＡＴＧに蛍光色素であるＶｅｎｕｓをＫｎｏｃｋ−ｉｎしたＥＳ細胞をを当該分野において周知の技法を用いて作製する。このＥＳ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させ、Ｖｅｎｕｓを指標にエンドムチンが幹細胞に発現されていることをｉｎ  ｖｉｔｒｏの系を用いて確認する。
【０４４２】
このＥＳ細胞を用いてマウス個体を当該分野において周知の技法により作製し、マウス個体においてＶｅｎｕｓを指標にエンドムチンが幹細胞に発現されていることを確認する。ホモマウスにおいてはエンドムチン遺伝子が欠損することから、エンドムチン遺伝子欠損マウスにおいてその成体型造血幹細胞における機能異常を解析することにより、エンドムチンの機能を特定することができる。
【０４４３】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０４４４】
本発明により、幹細胞の未分化状態および／または移植適合性を簡易におよび効率よく判定する組成物がはじめて提供される。このような組成物は、造血幹細胞および分化細胞を種々の治療に使用するために使用され、非常に有用である。このような組成物は医薬または診断薬として使用され得ることから、特に、製薬業において非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０４４５】
【図１】本発明におけるエンドムチンの効果として、マウスＥＳ細胞から形成される胚様体におけるエンドムチンの発現を示す。胚様体構成細胞のＦｌｋ−１、ＣＤ４１、ＣＤ４５の発現とエンドムチンの関連をＦＡＣＳを用いて検討した結果を示す。左から、１日目、３日目、５日目、７日目および１０日目の結果を示す。縦軸がエンドムチンであり、横軸は、それぞれ、Ｆｌｋ−１、ＣＤ４１、ＣＤ４５である。
【図２】図２には、マウスＥＳ細胞から形成される胚様体におけるエンドムチンの発現の別の実施結果を示す。（ａ）胚様体形成後のＦｌｋ−１、ＣＤ４１、ＣＤ４５の発現とエンドムチンの発現の変化（相対値）を折れ線グラフで示す。横軸（日数）の目盛りは２日目、４日目、６日目、８日目、および１０日目を示す。（ｂ）培養後５〜７日の胚様体細胞をＣＤ４１＋Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ＋、ＣＤ４１＋Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ-、ＣＤ４１-Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ＋、ＣＤ４１-Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ-の４つの細胞群に分類した。パネルは、左からＥＢ５．７５（５日目）、７．７５（７日目）、９．７５（９日目）を示す。（ｃ）ｂの横軸に従って、ＣＤ４５による陽性・陰性に基づき分布を示した。ｂにおけるＥＢ９，７５のエンドムチン陽性細胞はＣＤ４１陰性とＣＤ４１弱陽性、ＣＤ４１陽性の３分画に分けられ、ＣＤ４１弱陽性、ＣＤ４１陽性の大部分の細胞がＣＤ４５陽性の血液細胞を示す。ＣＤ４１陰性細胞の大部分はＣＤ４５陰性であり、血管内皮細胞と想定される。
【図３】図３は、４日目（ＥＢ４）および６日目（ＥＢ６）の胚様体細胞のＣＤ４５-細胞をＣＤ４１＋Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ＋、ＣＤ４１＋Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ-、ＣＤ４１-Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ＋、ＣＤ４１-Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ-の４つの細胞群に分画し、各分画の細胞を分取しＯＰ９細胞との共培養を行った結果を示す。図３ａ，ｂの表はＯＰ−９上に播種した各分画の細胞数を、真ん中は６日後の時点で観察されたＯＰ−９上で増殖した血液細胞数を、右は増殖した血液細胞数を各分画細胞１０００個当たりに換算した値を示す。Ｃはこの１０００個当たりに換算した結果をグラフ化したものである。Ｅ＋はエンドムチン陽性を示し、ＤＰは両方ともが陽性のものを示し、４１＋はＣＤ４１陽性を示し、ＤＮは両方ともが陰性にものを示す。
【図４】図４は、卵黄嚢におけるエンドムチンの発現を示す。この実験では、胎児型造血が行われる卵黄嚢におけるエンドムチンの発現を検討した。（Ａ）胎生８．５の卵黄嚢においてはＣＤ４５陰性ＣＤ４１陽性の胎児型造血前駆細胞にエンドムチンの発現はほとんど認められなかった。一方ＣＤ４５陽性ＣＤ４１陽性の一部はエンドムチン陽性であった。胎児型造血前駆細胞である初期赤芽球系始原細胞（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）（ＥｒｙＰ）、コロニー形成単位マクロファージ（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）（ＣＦＵ−Ｍ）の分布を調べるためにメチルセルロースコロニーアッセイを行ったところ、ＣＤ４５陽性・陰性に関わらず胎児型造血前駆細胞はＥｎｄｏｍｕｃｉｎを発現しないことが明らかとなった。（Ｂ）胎生１０．５日の卵黄嚢においてはＣＤ４５陽性・陰性に関わらずＣＤ４１陽性の一部がエンドムチン陽性であった。メチルセルロースコロニーアッセイを行ったところ、ＣＤ４５陽性・陰性に関わらず成人型赤芽球前駆細胞（ｂｕｒｓｔ  ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｎｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ：ＢＦＵ−Ｅ，ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｎｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ：ＣＦＵ−Ｅ）にエンドムチンは発現せず、エンドムチンは多分化能を示すコロニー形成細胞（ｍｉｘｅｄ  ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｎｉｎｇ  ｕｎｉｔ）に選択的に形成することが明らかとなった。Ｅ＋はエンドムチン陽性、Ｅ−はエンドムチン陰性を示し、４１＋はＣＤ４１陽性を示し、４１−はＣＤ４１陰性を示す。ＣＤ４５＋はＣＤ４５陽性を示し、ＣＤ４５−は、ＣＤ４５陰性を示す。
【図５】図５は、傍大動脈生殖中腎領域におけるエンドムチンの発現結果を示す。（Ａ）は胎生１０．５のＡＧＭ細胞の中で造血幹細胞活性が認められるＣＤ４５陰性分画のＦＡＣＳパターンであり、ＣＤ４１とエンドムチンの発現により４分画に分けられる。数字は存在比率を示す。（Ｂ，Ｃ）この４分画にＣＤ４５陽性分画を加えた計５分画についてＯＰ−９細胞との共培養におけるコロニー形成率を検定した。（Ｂ）播種した細胞１０００個当たりのコロニー形成率（ＣＤ４５陽性およびＣＤ４５陰性細胞に分類し、ＣＤ４５陰性については、ＣＤ４１陽性／陰性（＋／−）およびエンドムチン陽性／陰性（＋／−）に分類した）を示す。播種した細胞１０００個当たりのコロニー形成率はＣＤ４５陰性ＣＤ４１陽性エンドムチン陽性細胞が有意に高い値を示した。（Ｃ）６日後の時点で観察されたＯＰ−９上で増殖した血液細胞数を播種細胞５０００個当たりに換算した数値である。この場合も、ＣＤ４５陰性ＣＤ４１陽性エンドムチン陽性細胞が有意に多いことが確認された。（Ｄ）５分画の細胞を致死量放射線照射マウス１匹あたり７５０個ずつ直接骨髄内に移植したところ、ＣＤ４５陰性ＣＤ４１陽性エンドムチン陽性細胞を移植されたマウスにおいてのみ全例にドナー細胞による造血の再構築が認められた。この再構築の寄与率は低率であり（Ｅ）、またＢ細胞有意に再構築が認められているが（Ｆ）、このような傾向はＥ１０．５ＡＧＭの細胞を成人マウスに移植した場合に特徴的に認められる所見である。この造血への寄与は長期にわたって認められ、移植したＣＤ４５陰性ＣＤ４１陽性エンドムチン陽性細胞分画のみ造血幹細胞活性を有することを示す所見である。
【配列表フリーテキスト】
【０４４６】
（配列表の説明）
配列番号１は、エンドムチン（１ａ＝全長）の核酸配列である（マウス）。
配列番号２は、エンドムチン（１ａ＝全長）のアミノ酸配列である（マウス）。
配列番号３は、エンドムチン（１ｂ）の核酸配列である（マウス）。
配列番号４は、エンドムチン（１ｂ）のアミノ酸配列である（マウス）。
配列番号５は、エンドムチン（１ｃ）の核酸配列である（マウス）。
配列番号６は、エンドムチン（１ｃ）のアミノ酸配列である（マウス）。
配列番号７は、エンドムチン（１ｄ）の核酸配列である（マウス）。
配列番号８は、エンドムチン（１ｄ）のアミノ酸配列である（マウス）。
配列番号９は、ヒトエンドムチン全長の核酸配列である。
配列番号１０は、ヒトエンドムチン全長のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、Ｆｌｔ３／Ｆｌｋ２（ヒト）の核酸配列である。
配列番号１２は、Ｆｌｔ３／Ｆｌｋ２（ヒト）のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ＣＤ３４（マウス）の核酸配列である。
配列番号１４は、ＣＤ３４（マウス）のアミノ酸配列である。
配列番号１５は、ＣＤ３４（ヒト）の核酸配列である。
配列番号１６は、ＣＤ３４（ヒト）のアミノ酸配列である。
配列番号１７は、Ｍａｃ−１（マウス）の核酸配列である。
配列番号１８は、Ｍａｃ−１（マウス）のアミノ酸配列である。
配列番号１９は、ＣＤ４（マウス）の核酸配列である。
配列番号２０は、ＣＤ４（マウス）のアミノ酸配列である。
配列番号２１は、ＣＤ８（マウス）の核酸配列である。
配列番号２２は、ＣＤ８（マウス）のアミノ酸配列である。
配列番号２３は、Ｂ２２０（マウス）の核酸配列である。
配列番号２４は、Ｂ２２０（マウス）のアミノ酸配列である。
配列番号２５は、ｃ−Ｋｉｔ（マウス）の核酸配列である。
配列番号２６は、ｃ−Ｋｉｔ（マウス）のアミノ酸配列である。
配列番号２７は、Ｓｃａ−１（マウス）の核酸配列である。
配列番号２８は、Ｓｃａ−１（マウス）のアミノ酸配列である。
配列番号２９は、マウスエンドムチン同定用プライマー（センス）である。
配列番号３０は、マウスエンドムチン同定用プライマー（アンチ）である。
配列番号３１は、ヒトエンドムチン同定用プライマー（センス）である。
配列番号３２は、ヒトエンドムチン同定用プライマー（アンチ）である。
配列番号３３は、マウスＣＤ４１の核酸配列である。
配列番号３４は、マウスＣＤ４１のアミノ酸配列である。
配列番号３５は、ヒトＣＤ４１の核酸配列である。
配列番号３６は、ヒトＣＤ４１のアミノ酸配列である。
配列番号３７は、マウスＣＤ４５の核酸配列である。
配列番号３８は、マウスＣＤ４５のアミノ酸配列である。
配列番号３９は、ヒトＣＤ４５の核酸配列である。
配列番号４０は、ヒトＣＤ４５のアミノ酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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