(57)【要約】      （修正有）【課題】肺癌とＭＵＣ１の遺伝子多型性の関係を明らかにし、それによって肺癌の病態進行を予測するための新たな方法を提供すること。【解決手段】ＭＵＣ１の繰り返し配列の数が多いと、肺などにおける腺癌の予後が悪いという知見が得られた。よってこの数を指標として、癌の病態進行を予測する事が可能となり、癌の診断及び治療のための新たな途を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＵＣ１における繰り返し配列の数を指標として癌の病態進行を予測する方法。
【請求項２】
被験者から採取した検体からDNAを抽出し、抽出された該DNAについてＭＵＣ１の繰り返し配列領域の認識配列をプローブとして用いてブロッティング解析を行なうことによりＭＵＣ１アレルの長さを測定し、ＭＵＣ１アレルの長さからＭＵＣ１の繰り返し配列の数を推定し、該被験者におけるＭＵＣ１の繰り返し配列の数と健常者群における繰り返し配列の数を比較することにより、該被験者におけるＭＵＣ１の繰り返し配列の数が該健常者群におけるＭＵＣ１の繰り返し配列の数よりも有意に多い場合に該被験者において癌の予後が悪いと評価する工程からなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記癌が肺癌である請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記癌が肺腺癌である請求項１から請求項３のいずれか一つの請求項記載の方法。
【請求項５】
前記検体が血液である請求項２記載の方法。
【請求項６】
ＭＵＣ１蛋白質の分子量を指標として癌の病態進行を予測する方法。
【請求項７】
ＭＵＣ１の繰り返し配列領域を認識する配列からなるプローブを含み、ＭＵＣ１の繰り返し配列の数を測定することを可能とする、癌の病態進行を予測するための診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＭＵＣ１の繰り返し配列の数を指標として癌の病態進行を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＵＣ１ムチンは極めて高度にグリコシル化されたＩ型膜糖蛋白質であり、20個のアミノ酸（PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA）からなる固有の繰り返し配列（tandem repeat）を有する。ＭＵＣ１は原則的には上皮系細胞に発現し、細胞膜上で直線状に200nm以上もの長さで直立する極めて背丈が高い分子である。従ってＭＵＣ１ムチンには、上皮系細胞の細胞接着を物理空間的に阻害する作用があると考えられている。
【０００３】
ＭＵＣ１における上記の繰り返し配列の数は遺伝子アレルに依存し、25から125まで変化する。すなわちＭＵＣ１は繰り返し配列の数が変化する領域（variable number of tandem repeats : ＶＮＴＲ）を含み、その繰り返し配列の数は各アレルによって変わるので、ムチンの遺伝子は高度に多型性である。ＶＮＴＲの多型は特定の疾患の遺伝的な素因と関係していると言われている。例えば、特定のＭＵＣ３のＶＮＴＲアレルは潰瘍性大腸炎と関連していることが知られている。またＭＵＣ１は多くの上皮癌、特に乳癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌、および肺癌において過剰発現していることが知られている。
【０００４】
癌細胞においてＭＵＣ１が高発現していると、転移の可能性が高く予後も悪いと言われている。正常な上皮細胞はその先端表層のみにＭＵＣ１を発現し、それによって外部からの細胞-細胞および細胞-基層接着だけを抑制する。しかし、癌細胞は先端に限定されないＭＵＣ１の異常な発現パターンを有して細胞-細胞および細胞-基層接着を阻害し、それによって癌細胞の移動と転移を促進する。
【０００５】
なおＭＵＣ１遺伝子多型と胃癌が関連しているという報告がなされている。繰り返し配列の数が少ない小さなＭＵＣ１アレルを有すると、胃癌の進展の危険性が増加するという報告がCarvalho Fらによってなされている（Carvalho F, Seruca R, David L et al., Glycoconj J 14: 107-111, 1997）。その後Carvalhoらは、同型接合した小さなＭＵＣ１ ＶＮＴＲアレルは胃癌の病変の前段階である慢性の萎縮性胃炎および腸上皮化生が関連しており、これらの前段階を介して胃癌へ進展すると報告している（Siava F, Carvalho F, Peixoto A et al., Eur. J. Hum. Genet. 9: 548-552, 2001）。すなわちCarvalhoらは、ＭＵＣ１の遺伝子多型は胃癌というよりも、その前段階の病変に関連しているという結論を得た。これまで癌細胞においてＭＵＣ１の発現量が増加することは報告されていたが、ＭＵＣ１の遺伝子多型性と結びつけた知見は不足しており、特に肺癌とＭＵＣ１アレル長さの多型性の関連を検討した知見は存在しなかった。
【０００６】
【非特許文献１】Carvalho F, Seruca R, David L et al., Glycoconj J 14: 107-111, 1997
【非特許文献２】Siava F, Carvalho F, Peixoto A et al., Eur. J. Hum. Genet. 9: 548-552, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
悪性細胞の浸潤と転移の促進においてＭＵＣ１は重要な役割を果たし、更にＭＵＣ１は悪性腫瘍細胞に対する免疫による抵抗性を障害していると考えられる。それを考えて本発明者らは、ＭＵＣ１アレル長さの多様性（可変性の繰り返し配列の数の多様性）が肺の腺癌の予後に関連しているのではないかと考えた。肺癌の予後の悪さを考えると、肺癌の病態進行の予測に役立つ新たな検査方法に対する需要は臨床においても大きい。よって肺癌とＭＵＣ１の遺伝子多型性の関係を明らかにし、肺癌の病態進行を予測するための新たな方法を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を達成するために、本発明者らは非小細胞肺癌を有する患者のＭＵＣ１遺伝子のＶＮＴＲドメインについて検討し、これらの患者におけるＭＵＣ１アレル長さの多型性と、良性の肺疾患または健常者におけるＭＵＣ１アレルの長さの多型性を比較した。そして肺癌患者のＭＵＣ１アレル長さの多型性と、生存率で評価される患者の病態進行が関係しているという結論を得た。よって本発明は、ＭＵＣ１の繰り返し配列の数を指標として癌の病態進行を予測する方法を提供するものである。更に本発明は、被験者から採取した検体からDNAを抽出し、抽出された該DNAについてＭＵＣ１の繰り返し配列領域の認識配列をプローブとして用いてブロッティング解析を行なうことによりＭＵＣ１アレルの長さを測定し、ＭＵＣ１アレルの長さからＭＵＣ１の繰り返し配列の数を推定し、該被験者におけるＭＵＣ１の繰り返し配列の数と健常者群における繰り返し配列の数を比較することにより、該被験者におけるＭＵＣ１の繰り返し配列の数が該健常者群におけるＭＵＣ１の繰り返し配列の数よりも有意に多い場合に該被験者において癌の予後が悪いと評価する工程からなる、上記の方法も提供するものである。なお本発明において、前記癌が肺癌であること、特に肺腺癌であることは好ましい態様である。また本発明において、前記検体が血液であることは好ましい態様である。また更に本発明は、ＭＵＣ１の繰り返し配列領域を認識する配列からなるプローブを含み、ＭＵＣ１の繰り返し配列の数を測定することを可能とする、癌の病態進行を予測するための診断キットを提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ＭＵＣ１の繰り返し配列の数を指標として癌の病態進行を予測する方法が与えられた。ＭＵＣ１の繰り返し配列の数を指標として癌の病態進行を予測する方法はこれまで知られていなかったために、本発明は癌の診断と治療のために有用な新たな手段を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
下記の実施例において詳しく述べるように、本発明者らは、非小細胞肺癌の患者（肺癌群）、良性の呼吸器疾患（疾病対照群）および健康ボランティア（健常対照群）から末梢血液のサンプルを得、そのサンプルについてサザンブロット解析を行なうことによってＭＵＣ１遺伝子多型を評価した。その結果、繰り返し数が多いＭＵＣ１アレルの存在と肺の腺癌の病態進行（生存率）は有意に関連していることが見出された。この結果は、ＭＵＣ１アレルの繰り返し数から肺の腺癌の病態進行を予測できることを示唆するものである。
【００１１】
なお本発明の方法は肺癌の発症と予後を評価することに限定されるものではない。ＭＵＣ１は上皮細胞で発現していることを考えると、本発明の方法を腺癌など他の上皮性癌の評価に用いることができると考えられる。またＭＵＣ１の主要な発現部位は、肺、乳腺および膵臓であるから、本発明の方法を乳腺や膵臓の腺癌の発症と病態進行を予測するために使用することもできると考えられる。
【００１２】
本願明細書において「病態進行」とは本発明の方法によって診断を行なった被験者における経過の良否を意味するものであり、主として生存率によって評価される。なお病態進行後に影響する因子には腺癌の発症、転移および再発なども含まれ、本発明において表す「病態進行」とは、被験者の腺癌に対する感受性や転移の危険性なども包含する広い概念である。
【００１３】
本発明の方法においてはまず被験者から血液などの検体を採取し、採取した検体から直接にDNAを抽出する。そして抽出されたDNAについてＭＵＣ１の繰り返し配列領域を認識するプローブを用いてサザンブロッティングを行なうことにより、ＭＵＣ１の繰り返し配列領域を検出する。なおここで用いるサザンブロッティングの手法は本技術分野で良く知られている。ここで用いるプローブは、ＭＵＣ１の繰り返し配列領域を認識するものであれば特に限定されるものではなく、種々の配列をプローブとして用いることができる。ＭＵＣ１の繰り返し配列はPDTRPAPGSTAPPAHGVTSA（Pro Asp Tyr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala : 配列番号１）という20アミノ酸配列からなるので、このアミノ酸配列を基にして当業者は解析の目的に適切なプローブを設計することが可能である。なお下記の実施例において上記のアミノ酸配列から設計したプローブである5’TGAGTATGACCAGCAGCGTACT3’（配列番号２）と5’TGGCTGGGAATTGAGAATGGAG3’（配列番号３）を組み合わせて用いたが、このプローブによりサザンブロット解析を行なうことはヒトの肺癌の評価を行なう目的においては好ましい態様である。
【００１４】
そしてサザンブロッティングを用いて検出されたＭＵＣ１アレルの長さから、ＭＵＣ１の繰り返し配列の数を推定する。上記で述べたようにＭＵＣ１の繰り返し配列は20アミノ酸からなるので、それをコードする塩基は60塩基対であり、よって繰り返し配列の１単位は60塩基対となる。なお下記の実施例においては繰り返し配列が30から82（1800塩基対から4920塩基対に対応する）の範囲でＭＵＣ１アレルの多型性を検討しているが、検体によって繰り返し配列の数の範囲は異なるので、検討するべき繰り返し配列の数は実施例において述べられた範囲に限定されるものではない。
【００１５】
そのようにして検出したＭＵＣ１の繰り返し配列の数を、健常者群の繰り返し配列の数と比較する。そして、被験者におけるＭＵＣ１の繰り返し配列の数が健常者群と比較して有意に多い場合には、その被験者において肺腺癌の予後が悪い可能性が高いと評価される。下記の実施例において健常者郡と肺腺癌の患者群におけるアレル頻度分散を検討したところ、ＭＵＣ１繰り返し配列数のピークはそれぞれ38と39となった。そして繰り返し配列の数が38以下の群と39以上の群で肺癌患者の病態進行を比較したところ、繰り返し配列の数が39以上のＭＵＣ１アレルの遺伝子型を同型接合で有する患者群では予後が悪いという結果を得ている。しかし検体を採取した組織、癌の種類および人種などの種々の因子によってＭＵＣ１繰り返し配列の数の分布もピークとなる繰り返し数も異なるので、健常者群と腺癌患者群におけるＭＵＣ１アレルの長さの分布から、検討の目的に応じて適切な閾値を適宜設定する必要がある。
【００１６】
なおサザンブロッティングの手段のみならず、ＭＵＣ１蛋白質に対する特異的な抗体を用いて、ウエスタンブロッティングによりＭＵＣ１蛋白質を検出することも可能であると考えられる。即ち、血液などの検体から蛋白質の抗原性を損なわない手段によって蛋白質を抽出し、その中に含まれる蛋白質を電気泳動によって分離し、分離した蛋白質についてＭＵＣ１蛋白質に対する特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティングで検出することにより、ＭＵＣ１蛋白質の分子量を解析することができる。よって遺伝子の転写産物であるＭＵＣ１蛋白質の分子量から、ＭＵＣ１の繰り返し配列を評価することも可能であり、かかる態様も本発明の範囲内である。
【００１７】
また使用する検体は下記の実施例において行なっているように血液が好ましいが、それに限定されるものではなく、リンパ液、髄液などの被験者に由来する他の体液も適宜使用することが可能である。更に使用できる検体は体液に限定されるものでもなく、肺、乳腺あるいは膵臓などから採取した組織検体であることも可能である。そのような組織検体は、生体組織検査（バイオプシー）法により採取したり、あるいは手術時に手術検体として採取することができる。
【００１８】
また、ＭＵＣ１の繰り返し配列領域を認識する配列からなるプローブを含み、ＭＵＣ１の繰り返し配列の数を測定することを可能とする、癌の病態進行を予測するための診断キットも本発明の範囲内である。本キットはＭＵＣ１の繰り返し配列領域を認識する配列からなるプローブを必須の構成要件として含み、必要に応じて他にDNAの抽出試薬、制限酵素、サザンブロッティング法を行なうための緩衝液、DNAを転写する膜、ハイブリダイゼーション用の緩衝液、鋳型DNAなどを含むことができる。
【００１９】
なお実際の臨床の場においては、予め多数の健常者群および多数の予後が不良の肺癌患者群でＭＵＣ１の繰り返し配列の数を解析しておき、統計学的な検討により、各種の癌の病態進行を判断するための指標となる閾値を設定しておく事が可能であろう。即ち、広く適用することができる閾値を予め決定しておけば、多数の患者において日常的にＭＵＣ１の繰り返し配列の数をスクリーニングし、予後の良否を簡単且つ迅速に予測して治療の指針を決定する一助となすことができるであろう。よって本発明は癌の診断のための新たな途を提供するものである。
【実施例】
【００２０】
下記の実施例において本発明を更に詳しく説明するが、その記載は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００２１】
本発明者らは160人の被験者でＭＵＣ１遺伝子の多型を評価した。この被験者の中には非小細胞肺癌の患者（肺癌群：n=56）、良性の呼吸器疾患（疾病対照群：n=52）および健康ボランティア（健常対照群：n=52）が含まれていた。なお肺癌群は35人の腺癌患者、20人の扁平上皮癌患者、および1人の腺扁平上皮細胞癌患者から構成されており、疾病対照群は17人の気管支喘息患者、27人の慢性気管支炎患者、4人の特発性間質性肺炎、および4人のコラーゲン疾患関連間質性肺炎から構成されていた。疾病対照群の平均年齢は、肺癌群および健康ボランティアよりも高かった（それぞれ、71±10対64±11および65±6）。男性対女性の比率は各群の間で有意差はなかった。書面での同意を得たのちに、広島大学病院、長崎病院および広島赤十字・原爆病院の患者から、2002年から2004年間に血液サンプルを得た。これらの血液から白血球を分離し、DNA抽出を行なうまで-70℃で保存した。
【００２２】
フレキシジーン・DNAキット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用いてゲノムDNAを単離した。DNAをAlu1（ＭＵＣ１遺伝子の繰り返し配列のフランキング領域を認識する制限酵素）で消化し、１％アガロースゲル上で電気泳動を行って約50Vで17-20時間分離し、その後ナイロン膜（ハイボンド-N、アマシャム・バイオサイエンス、ピツキャタウェイ、ニュージャージー州、USA）へ転写した。繰り返し配列のフランキング領域のプライマーを用いて、ＭＵＣ１繰り返し配列領域の認識プローブ（ＭＵＣ１プローブ）を構築した（センスプライマー：5’TGAGTATGACCAGCAGCGTACT3’（配列番号２）；アンチセンスプライマー：5’TGGCTGGGAATTGAGAATGGAG3’（配列番号３））。2650塩基対（bp）のバンドをゲルから切り出し、ジェネクリーン（Qbiogne、モントリオール、カナダ）を用いて単離し、ＭＵＣ１プローブのための鋳型DNAとして使用した。
【００２３】
プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、50%ホルムアミド、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5% SDS、および100μg/mlのシアー処理したサケ精子DNAにより、45℃で18時間行なった。ビカベスト標識キット（東洋紡、東京、日本）を用いて、ＭＵＣ１プローブを[α-32P]dCTP（アマシャム・バイオサイエンス）で標識した。増感紙と共に、-70℃で膜をオートラジオグラフィーに曝した。オートラジオグラフを4-12時間現像した。1kbpマーカー（東洋紡）の断片の大きさと比較することにより、種々の大きさのＭＵＣ１遺伝子アレルを評価した。繰り返し配列の長さを計算し、それを「ＭＵＣ１アレル長さ」と規定した。
【００２４】
ＭＵＣ１アレル長さの多型性を比較するのにマンホイットニーＵ検定を使用した。患者の生存曲線は、診断日から死亡日の生存を測ってカプラン・マイヤー統計法により作成した。統計学的な有意差をp<0.05で検討した。
【００２５】
28の異なった遺伝子アレルを同定した。各々のアレルにおける繰り返し配列の数は30から82（1800塩基対から4920塩基対）の間の範囲となり、各群におけるアレル頻度分散は、38または39の反復でピークとなった。各群におけるアレル頻度分散を表１と図１に示す。
【００２６】
【表１】
2006238823.tif 000002
【００２７】
ＭＵＣ１アレルの長さの中央値は、肺癌群では2380塩基対であり、疾病対照群と健常対照群の両者では2280塩基対であった。健常対照群において観察された中央値である2280塩基対のアレル長さを基準として、2280塩基対より大きいＭＵＣ１アレル長さをラージＭＵＣ１アレル（Ｌ）、2280塩基対と同等またはより小さいＭＵＣ１アレル長さをスモールＭＵＣ１アレル（Ｓ）と定義した。これらのアレルは結合し、同型接合の遺伝子型（ＬＬ，ＳＳ）および異型接合の遺伝子型（ＬＳ）を形成する。肺癌群の全体（腺癌群＋扁平上皮癌群）および扁平上皮細胞癌群の遺伝子型頻度分布については、2つの対象群（疾病対照群と健常対照群）の遺伝子型頻度分布と有意差を示さなかった。しかし、腺癌の患者の遺伝子型頻度分布については、疾病対照群における遺伝子型頻度分布（表２；p=0.0164;マンホイットニーＵ検定）および健常対照群（表２；p=0.0171）と有意な差が認められた。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
次に肺癌患者の遺伝子型と予後の相関関係を検討した。腺癌群（図２）と扁平上皮癌群群（図３）において、各遺伝子型（ＬＬ、ＬＳ、ＳＳ）における生存月数を示す。肺癌群全体（腺癌群＋扁平上皮癌群）においては遺伝子型と予後は有意な相関関係を示さなかったが、腺癌群においてＬＬの遺伝子型を有する患者の生存率は、ＬＳの遺伝子型とＳＳの遺伝子型を有する腺癌患者を合計した（ＬＳ＋ＳＳ）生存率よりも低かった（図２）。よって同型接合した繰り返し数の多いアレルを有する腺癌患者の予後は、繰り返し数の少ないアレルを有する腺癌患者よりも悪かった。しかし扁平上皮細胞癌群については、遺伝子型と生存率の間に有意な相関関係は認めらなかった（図３）。これらの結果から、ＭＵＣ１アレルの繰り返し数により、肺癌患者の病態進行を予測することが可能であることが判った。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明の方法により、ＭＵＣ１における繰り返し配列の数を指標として癌の病態進行を予測することが可能となった。本発明の方法は、ＭＵＣ１の繰り返し配列の数を指標として癌の病態進行を予測する方法を初めて与えるものであって癌の診断と治療において有用であり、更にはルーチンの臨床検査として採用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は各群において、ＭＵＣ１における繰り返し配列のアレル頻度分散を示す。
【図２】図２は腺癌群において、遺伝子型と経時的な生存率の関係を示す。
【図３】図３は扁平上皮細胞癌群において、遺伝子型と経時的な患者生存率の関係を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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