(57)【要約】【課題】  磁気ビーズを死滅目的ではなく、生存目的に利用できるようにし、磁気ビーズを用いて特定細胞の生存率を向上させて細胞群を磁場処理できるようにする。【解決手段】  種類の異なる細胞が混在する細胞群のうち特定細胞に該特定細胞の抗原に特異的に結合可能な抗体を有した磁気ビーズを結合させてなる当該細胞群を含む処理物が入れられる容器と、容器を保持する容器保持部１０と、容器保持部１０に保持された容器内の処理物に磁場強度０．０１≦Ｔ（テスラ）≦１，１〜３００Ｈｚの正弦波状の変動磁場を印加する変動磁場発生部２０とを備え、容器内の細胞群に正弦波状の変動磁場を印加して、特定細胞の生存比率を該特定細胞以外の非特定細胞の生存比率より増加させて処理する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
種類の異なる細胞が混在する細胞群に磁場を印加して処理する細胞の処理方法において、
上記細胞群のうち特定細胞に該特定細胞の抗原に特異的に結合可能な抗体を有した磁気ビーズを結合させ、該細胞群に正弦波状の変動磁場を印加して、上記特定細胞の生存比率を該特定細胞以外の非特定細胞の生存比率より増加させて処理することを特徴とする細胞の処理方法。
【請求項２】
上記印加する磁場強度を、０．０１≦Ｔ（テスラ）≦１としたことを特徴とする請求項１記載の細胞の処理方法。
【請求項３】
上記正弦波状の変動磁場の周波数を、１〜３００Ｈｚにしたことを特徴とする請求項１または２記載の細胞の処理方法。
【請求項４】
上記特定細胞の温度ｔを、４℃≦ｔ≦３７℃としたことを特徴とする請求項１，２または３記載の細胞の処理方法。
【請求項５】
５ｍｉｎ〜２４０ｍｉｎ間、磁場を印加することを特徴とする請求項１，２，３または４記載の細胞の処理方法。
【請求項６】
上記非特定細胞の分裂速度を促進する分裂速度促進剤を添加することを特徴とする請求項１，２，３，４または５記載の細胞の処理方法。
【請求項７】
上記分裂速度促進剤として、ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＨＡ），ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（ＣｏｎＡ），リンパ球特異的ペプチド，リンパ球特異的モノクローナル抗体，ガラクトシルセラミド，セラミド，ガンクリオシド，ジアシルグリセオール，テトラデカノイル  ホルボールアセテート（ＴＰＡ）の少なくとも１つの物質を用いることを特徴とする請求項６記載の細胞の処理方法。
【請求項８】
種類の異なる細胞が混在する細胞群のうち特定細胞に該特定細胞の抗原に特異的に結合可能な抗体を有した磁気ビーズを結合させてなる当該細胞群を含む処理物が入れられる容器と、該容器を保持する容器保持部と、該容器保持部に保持された容器内の処理物に磁場強度０．０１≦Ｔ（テスラ）≦１，１〜３００Ｈｚの正弦波状の変動磁場を印加する変動磁場発生部とを備えたことを特徴とする細胞の処理装置。
【請求項９】
上記変動磁場発生部を、上記容器保持部に保持された容器を挟んで配置され回転させられる一対の回転盤と、該各回転盤に設けられ回転により正弦波状の変動磁場を発生させる永久磁石と、該回転盤を回転駆動するモータとを備えて構成したことを特徴とする請求項８記載の細胞の処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種類の異なる細胞が混在する細胞群に磁場を印加して細胞を処理する細胞の処理方法及び細胞の処理装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、この種の細胞の処理方法としては、例えば、特許文献１（特開２００４−４９１０５号公報）に掲載されたものが知られている。
これは、図７に示すように、種類の異なる細胞が混在する細胞群のうち癌細胞等の標的細胞Ｓａに、この標的細胞の抗原に特異的に結合可能な抗体を有した磁気ビーズＢａを結合させ、この細胞群に、シングルパルス及びマルチパルスの少なくともいずれかのパルス磁場を印加し、この標的細胞Ｓａを選択的に死滅させようとするものである。
この死滅の原理は、磁気ビーズＢａはパルス磁場の刺激を受けると磁気ビーズＢａが瞬時に移動し、標的細胞Ｓａが磁気ビーズにＢａより表面が強く引っ張られ、物理的に破砕されて死滅すると考えられている。
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−４９１０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、この従来の細胞の処理技術においては、磁気ビーズＢａを用いて標的細胞Ｓａを死滅させているが、このような磁気を用いた細胞処理においては、必ずしも標的細胞の死滅を目的とせずに、生存させることを目的としたい場合もあり、その場合には、当該方法をでは対応ができないという問題があった。
【０００５】
本発明は、上記の問題点に鑑みなされたもので、磁気ビーズを死滅目的ではなく、生存目的に利用できるようにし、磁気ビーズを用いて特定細胞の生存率を向上させて細胞群を磁場処理できるようにする細胞の処理方法及び細胞の処理装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような課題を解決するため、本発明の細胞の処理方法は、種類の異なる細胞が混在する細胞群に磁場を印加して処理する細胞の処理方法において、上記細胞群のうち特定細胞に該特定細胞の抗原に特異的に結合可能な抗体を有した磁気ビーズを結合させ、該細胞群に正弦波状の変動磁場を印加して、上記特定細胞の生存比率を該特定細胞以外の非特定細胞の生存比率より増加させて処理する構成としている。
【０００７】
本願発明者らは、変動磁場の条件、特に、正弦波状の変動磁場においては、磁気ビーズを特定細胞に結合させることにより、上記従来のパルス磁場とは逆に、むしろ、磁気ビーズを結合させない細胞に比較して、特定細胞の失活が抑制されることをつきとめた。
そのメカニズムとしては、正弦波状の変動磁場に置かれた細胞においては、イオンを主体とする核内物質が変動磁場中で移動する際に繰り返し磁気力を受けることにより、正規の分裂過程から外れ、細胞分裂が異常終了して細胞が死に至り、あるいは、細胞膜の構造異常の誘導が行なわれ、あるいはまたＤＮＡ合成の障害が生じる等の影響が少なからず生じるが、磁気ビーズを結合させた特定細胞においては、正弦波状の磁場の特徴として、急激に磁力線の方向が繰り返し反転することから磁気ビーズの移動が追従しにくくなると考えられ、そのため、磁場の細胞内小器官あるいは細胞骨格タンパクへの直接の磁場の影響を吸収（あるいは緩衝）して細胞への磁場障害効果を軽減するため、これらの傷害が抑制されることに起因すると考えられる。
【０００８】
この構成により、例えば、分裂の速度が比較的速い癌細胞等の悪性細胞以外の特定細胞に磁気ビーズを結合させ、悪性細胞の非特定細胞には磁気ビーズを結合させないで、正弦波状の変動磁場を印加し、特定細胞の生存率を増加させるようにして、非特定細胞の分裂能を失活させ、死滅あるいは減少を促進させることができるようになり、医療の分野での利用が期待される。
【０００９】
そして、必要に応じ、上記印加する磁場強度を、０．０１≦Ｔ（テスラ）≦１としている。望ましくは、０．０５≦Ｔ（テスラ）≦０．７である。この範囲で、特定細胞の生存比率を有効に増加させることができる。
【００１０】
また、必要に応じ、上記正弦波状の変動磁場の周波数を、１〜３００Ｈｚにした構成としている。望ましくは、５〜１００Ｈｚである。この範囲で、特定細胞の生存比率を有効に増加させることができる。
【００１１】
更に、必要に応じ、上記細胞の温度ｔを、４℃≦ｔ≦３７℃とした構成としている。望ましくは、上記細胞の温度ｔを、２５℃≦ｔ≦３７℃とした。これにより、細胞が、人体の血液などと一緒に処理される場合には、良質細胞に与える影響が低減される。即ち、温度が４℃より低い、あるいは、３７℃より高いと、特定細胞への影響が大きくなる。
【００１２】
更にまた、５ｍｉｎ〜２４０ｍｉｎ間、磁場を印加する構成としている。この場合、時間が５ｍｉｎより短いと、十分な効果が得られない。一方、時間が２４０ｍｉｎより長いと、特定細胞への影響が大きくなる。
【００１３】
そして、必要に応じ、上記非特定細胞の分裂速度を促進する分裂速度促進剤を添加する構成としている。これにより、非特定細胞が活性化（細胞分裂が刺激）され、より強力かつ効果的に非特定細胞の生存率を低下させることができるようになる。
【００１４】
上記分裂速度促進剤として、ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＨＡ），ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（ＣｏｎＡ），リンパ球特異的ペプチド，リンパ球特異的モノクローナル抗体，ガラクトシルセラミド，セラミド，ガンクリオシド，ジアシルグリセオール，テトラデカノイル  ホルボールアセテート（ＴＰＡ）の少なくとも１つの物質を用いることが有効である。これらの物質は、主に免疫系の細胞を刺激する物質であり、通常は必ずしも悪い作用を持つわけではなく、例えば、リンパ球特異的モノクローナル抗体は白血病の治療薬としても用いられている。
一般に、それぞれの免疫細胞（Ｔ細胞やＮＫ細胞）は特定の分子（ペプチド，たんぱく質，抗体あるいは糖，脂質）より活性化されるものの他の分子による活性化をほとんど受けない。そのため、異常をきたした特定の免疫細胞（細胞）を活性化させて（分裂増殖刺激を与える）変動磁場を負荷すれば、正常の免疫細胞に障害を与えることなく異常な免疫細胞のみを選択的に、副作用なく取り除くことが可能となる。
【００１５】
また、上記課題を解決するための本発明の細胞の処理装置は、種類の異なる細胞が混在する細胞群のうち特定細胞に該特定細胞の抗原に特異的に結合可能な抗体を有した磁気ビーズを結合させてなる当該細胞群を含む処理物が入れられる容器と、該容器を保持する容器保持部と、該容器保持部に保持された容器内の処理物に磁場強度０．０１≦Ｔ（テスラ）≦１，１〜３００Ｈｚの正弦波状の変動磁場を印加する変動磁場発生部とを備えた構成にしている。これにより、細胞に正弦波状の変動磁場を確実に印加することができる。
【００１６】
そして、必要に応じ、上記変動磁場発生部を、上記容器保持部に保持された容器を挟んで配置され回転させられる一対の回転盤と、該各回転盤に設けられ回転により正弦波状の変動磁場を発生させる永久磁石と、該回転盤を回転駆動するモータとを備えて構成している。装置を比較的簡易で高価にならないようにすることができ、処理も容易で簡素化でき、汎用性の向上が図られる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の細胞の処理方法及び細胞の処理装置によれば、特定細胞の生存比率を非特定細胞の生存比率より増加させて処理できる。そのため、例えば、悪性細胞以外の特定細胞に磁気ビーズを結合させ、悪性細胞の非特定細胞には磁気ビーズを結合させないで、正弦波状の変動磁場を印加し、特定細胞の生存率を増加させるようにして、非特定細胞の分裂能を失活させ、死滅あるいは減少を促進させることができるようになり、輸血用血液の精製など医学分野などへの応用が期待できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、添付図面に基づいて本発明の実施の形態に係る細胞の処理方法及び細胞の処理装置について説明する。
実施の形態に係る細胞の処理方法は、実施の形態に係る細胞の処理装置によって実現されるので、その作用において説明する。この実施の形態に係る処理装置は、例えば、処理物として人体から採取された血液中の細胞を処理できる。細胞としては、白血病等の各種癌細胞，ウイルス感染細胞等の悪性細胞を含んだ細胞等を対象とすることができる。
【００１９】
図１乃至図３に示すように、この処理装置Ｋは、処理する種類の異なる細胞が混在する細胞群を含む処理物を収納する容器１を備えている。容器１としては、例えば、図２に示すように、試験管状の樹脂製本体２に蓋３が樹脂ヒンジ４で一体に設けられたものが用いられる。図４に示すように、細胞群のうち特定細胞Ｓの抗原には、特異的に結合可能な抗体を有した磁気ビーズＢが結合させられている。磁気ビーズＢとしては、特定細胞に応じて、適宜のものが用いられる。
【００２０】
容器１は、樹脂製の容器保持部１０に保持される。容器保持部１０は、図２に示すように、機台５にネジ手段１４（図１）などで着脱可能に固定されるベース１１と、ベース１１に立設され容器１が嵌合保持される複数の凹部１２が所定の円周上に複数（実施の形態では４つ）設けられた保持板１３と、保持板１３の両面にクリップ１５などで着脱可能に付設され凹部１２に嵌合された容器１の脱落を阻止する一対の押え板１６とを備えて構成されている。保持板１３及び押え板１６の中央には、後述の変動磁場発生部２０の回転軸２２が挿通される一端が開放した凹所１７が形成されている。
【００２１】
また、機台５には、変動磁場発生部２０が設けられている。変動磁場発生部２０は、容器保持部１０に保持された容器１内の処理物に磁場強度０．０１≦Ｔ（テスラ）≦１、実施の形態では０．５Ｔ，１〜３００Ｈｚ、実施の形態では５０Ｈｚの正弦波状の変動磁場を印加する。
詳しくは、変動磁場発生部２０は、容器保持部１０に保持された容器１を挟んで配置され回転させられる一対の回転盤２１Ａ，２１Ｂを備えている。回転盤２１Ａ，２１Ｂは、１つの回転軸２２に支持されている。回転軸２２の両端部は、軸受けスタンド２３，２４に回転可能に支持されている。
【００２２】
各回転盤２１Ａ，２１Ｂには、図３に示すように、回転により正弦波状の変動磁場を発生させる永久磁石２５が設けられている。具体的には、一方の回転盤２１Ａの容器保持部１０に面する側に、上記凹部１２が設けられる円周に対応した円周上に等角度関係で、磁極を交互に異にする永久磁石２５が６個設けられている。他方の回転盤２１Ｂの容器保持部１０に面する側に、上記凹部１２が設けられる円周に対応した円周上に等角度関係で、磁極を交互に異にし、かつ、一方の回転盤２１Ａの永久磁石２５とは１つ位相をずらした位置関係で、永久磁石２５が６個設けられている。即ち、保持板１３を挟んで、交互に磁極の異なる永久磁石２５の組が、６対配置されている。
【００２３】
一方の軸受けスタンド２４には、回転盤２１Ａ，２１Ｂの回転軸２２を回転駆動するモータ２６が設けられている。モータ２６の回転数は、１０００ＲＰＭであり、これにより、５０Ｈｚの正弦波状の変動磁場を印加することができる。
【００２４】
更に、処理装置Ｋは、容器１内の温度を一定範囲に保持する恒温槽（図示せず）内に置かれる。恒温槽内の温度は、例えば、４℃≦ｔ≦３７℃の範囲、望ましくは、２５℃≦ｔ≦３７℃に保持される。実施の形態では、例えば、ｔ＝２５℃に設定される。
【００２５】
そして、処理装置Ｋにより、容器１を容器保持部１０に保持し、容器保持部１０の保持板１３を変動磁場発生部２０の回転盤２１Ａ，２１Ｂ間に位置させ、５ｍｉｎ〜２４０ｍｉｎ間、正弦波状の変動磁場を印加する。実施の形態では、例えば、１２０ｍｉｎに設定してある。
【００２６】
従って、この実施の形態に係る処理装置Ｋにより、細胞群を処理するときは、例えば、分裂の速度が比較的速い癌細胞等の悪性細胞以外の特定細胞Ｓに磁気ビーズＢを結合させ、悪性細胞の非特定細胞には磁気ビーズＢを結合させないでおく。即ち、図４に示すように、予め、特定細胞Ｓの抗原に特異的に結合可能な抗体を有した磁気ビーズＢを結合させる。そして細胞群を容器１に入れる。それから、容器１を容器保持部１０に保持し、容器保持部１０の保持板１３を変動磁場発生部２０の回転盤２１Ａ，２１Ｂ間に位置させ、モータ２６を作動させて、所定時間変動磁場中に保持する。
【００２７】
これにより、分裂速度の速い悪性細胞に対して変動磁場が作用すると、細胞群に正弦波状の変動磁場が印加され、悪性細胞の死滅あるいは減少が促進される。即ち、悪性細胞の分裂刺激時には核の分裂を伴う細胞の分化が行なわれるが、イオンを主体とする核内物質が磁場中で移動する際に磁場から磁気力を受け、正規の分裂過程から外れるようになって、細胞障害が生じ、これにより、分裂能が失活していくのである。そして、悪性細胞は分裂速度が速く、分裂時の磁場刺激の機会が多くなることから、悪性細胞は死滅しあるいは無秩序な分裂増加が妨げられて減少していく。
一方、悪性細胞以外の特定細胞Ｓにおいては、磁気ビーズＢの作用により、特定細胞Ｓの生存率が増加させられる。即ち、免疫機能変化，細胞障害性などの影響が防止される。
【００２８】
また、上記の実施の形態においては、必要に応じ、非特定細胞の分裂速度を促進する分裂速度促進剤を添加することが有効である。例えば、免疫系の細胞において、異常をきたした特定の免疫細胞（細胞）があって、これを除去したい場合に、分裂速度促進剤として、ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＨＡ），ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（ＣｏｎＡ），リンパ球特異的ペプチド，リンパ球特異的モノクローナル抗体，ガラクトシルセラミド，セラミド，ガンクリオシド，ジアシルグリセオール，テトラデカノイル  ホルボールアセテート（ＴＰＡ）の少なくとも１つの物質を用いることが有効である。
【００２９】
一般に、それぞれの免疫細胞（Ｔ細胞やＮＫ細胞）は特定の分子（ペプチド，たんぱく質，抗体あるいは糖，脂質）より活性化されるものの他の分子による活性化をほとんど受けない。そのため、異常をきたした特定の免疫細胞（細胞）を活性化させて（分裂増殖刺激を与える）変動磁場を負荷すれば、正常の免疫細胞に障害を与えることなく異常な免疫細胞のみを選択的に、副作用なく取り除くことが可能となる。従って、この分裂速度促進剤の添加により、細胞が活性化（細胞分裂が刺激）され、より強力かつ効果的に異常細胞を除去することができるようになる。
【００３０】
そしてまた、上記の実施の形態においては、非特定細胞を失活させる失活補助剤を添加することが有効である。例えば、癌細胞を除去したい場合に、失活補助剤として、ビタミンＡ，甲状腺ホルモン，グルココルチコイド，シクロフォスファミド，アザチオプリン，アドリアマイシン，ブレオマイシン，代謝拮抗薬，アルキル化薬，植物アルカロイド（ビンアルカロイド），細胞骨格障害薬の少なくとも１つの物質を用いることが有効である。これらは、癌の治療に用いられる薬物として知られており、これらの物質の添加により、主に、癌細胞の失活処理を高効率で行なうことができるようになる。即ち、磁場による細胞の失活に加えて、失活補助剤による失活も行なわれるので、効果が相乗的になり、より一層細胞の除去効率が向上させられる。
【実験例】
【００３１】
次に、実験例を示す。
図５に示すように、細胞として、ＣＤ８・Ｔ細胞と、ＣＤ４・Ｔ細胞を用いた。磁気ビーズＢとして、ＣＤ３抗体を結合させたものを用いた。これらの細胞において、磁気ビーズＢを結合させたものと、結合させないものとを作成し、分裂速度促進剤を添加（ＰＨＡ投与）して、上記処理装置Ｋを用い、正弦波状の磁場下での、各細胞の生存比率を比較した。
【００３２】
試験条件は、
周波数：５０Ｈｚ
磁場強度：０．５Ｔ
保持温度：ｔ＝２５℃
磁場印加時間：１２０ｍｉｎとした。
【００３３】
結果を図６に示す。ＣＤ４・Ｔ細胞においては、磁気ビーズＢを結合させないものは、生存率が６５％であるのに対し、磁気ビーズＢを結合したものは８６％となり、生存率の増加が顕著に見られた。
また、ＣＤ８・Ｔ細胞においては、磁気ビーズＢを結合させないものは、生存率が８３％であるのに対し、磁気ビーズＢを結合したものは９１％となり、これにおいても、生存率の増加が見られた。
【００３４】
このように，磁気ビーズＢを結合させると細胞障害が軽減する可能性があることが分かる。即ち、従来，特定の細胞の機能のみを変調させることは困難であったが、特定の細胞を認識する物質（薬物あるいはモノクローナル抗体）を用いて、標的とする細胞を特異的に認識する物質（実験では抗ＣＤ３モノクローナル抗体）に磁気ビーズを結合させた複合体を準備して、ＣＤ３抗体−磁気ビーズ複合体をヒト末梢血から調製した白血球に結合させる。この場合ＣＤ３抗体はＴリンパ球（ＣＤ４リンパ球及びＣＤ８リンパ球）のみに結合するので、Ｔリンパ球のみが磁場と磁気ビーズの影響を受ける。そのため、磁場強度（変動磁場）の調節によって、標的とする細胞に対して細胞の保護を図ることが可能になる。強力な変動磁場の下では，Ｔリンパ球の生存率が低下するが，磁気ビーズを結合させたＴリンパ球では生存率が向上する。
【００３５】
尚、細胞としては、血液以外にどのような細胞でもよく、適宜変更して差支えない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の実施の形態に係る細胞の処理装置を示す斜視図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る細胞の処理装置において容器及び容器保持部の構成を示す斜視図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る細胞の処理装置において、変動磁場発生部の回転盤の構成を示し、（ａ）は図１中Ａ視図、（ｂ）は図１中Ｂ視図である。
【図４】特定細胞と磁気ビーズとの関係を示す図である。
【図５】実験例における特定細胞と磁気ビーズとの関係を示す図である。
【図６】正弦波状の磁場印加環境化においてＴ細胞に与える磁気ビーズの影響を実験した結果を示し、対照群の細胞数を１００％として、細胞数の増減を示すグラフ図である。
【図７】従来の死滅を目的とした標的細胞と磁気ビーズとの関係を示す図である。
【符号の説明】
【００３７】
Ｋ  処理装置
Ｓ  特定細胞
Ｂ  磁気ビーズ
１  容器
１０  容器保持部
２０  変動磁場発生部
２１Ａ，２１Ｂ  回転盤
２２  回転軸
２３，２４  軸受けスタンド
２５  永久磁石
２６  モータ
【図１】
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【図２】
2006094802.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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