(57)【要約】      （修正有）【課題】骨格筋に注射された医薬品と核酸のデリバリー効率を調整するための方法を提供する。【解決手段】医薬品と核酸を骨格筋に注射後、２５Ｖ／ｃｍ〜２００Ｖ／ｃｍの低い電解強度に調整された、５０μｓ〜５０００μｓの持続時間の方形二極性パルスの形態で、２パルス〜３０，０００パルス、前記骨格筋に印加する事により刺激し、前記骨格筋を医薬品と核酸に対して半透過性することにより、デリバリー効率を調整する構成とする。 【選択図】 図１
2006061701.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
in vivoで、哺乳動物の骨格筋にある分子を送達する方法であって、
哺乳動物の骨格筋内に該分子を注射するステップと、
電極を通って移動する電流が注射部位を通過するように注射部位の近くに電極の位置決めするステップと、
25V/cm〜200V/cmの電界強度を有する電流によって筋肉を電気的に刺激するステップと
を含んでなる分子送達方法。
【請求項２】
前記電気的刺激が単一の方形二極性パルスの形態で与えられることを特徴とする請求項1に記載の分子送達方法。
【請求項３】
前記二極性パルスが約50μs〜5000μsの間に持続時間を有することを特徴とする請求項2に記載の分子送達方法。
【請求項４】
前記電気的刺激が約2〜30,000にある方形二極性パルスの形態でデリバリーされることを特徴とする請求項1に記載の分子送達方法。
【請求項５】
前記二極性パルスが約10ms〜12,000msの間に合計持続時間を有することを特徴とする請求項4に記載の分子送達方法。
【請求項６】
前記二極性パルスが少なくとも2列（トレイン）の形態で与えられることを特徴とする請求項5に記載の分子送達方法。
【請求項７】
前記電気的刺激の周波数が約0.5Hz〜1000Hzにあることを特徴とする請求項6に記載の分子送達方法。
【請求項８】
前記分子は核酸であって、前記核酸が、前記筋細胞において、前記核酸がコードするタンパク質の発現を指示するプロモーターに、作用可能に結合されていることを特徴とする請求項1に記載の分子送達方法。
【請求項９】
in vivoで、核酸を前記哺乳動物の骨格筋内に形質転移することによって哺乳動物を遺伝子的に免疫化する方法であって、
前記筋肉の中で、前記核酸がコードするタンパク質の発現を指示するプロモーターに、作用可能に結合されている核酸を哺乳動物の骨格筋に注射するステップと、
電極の中を移動する電流が、前記核酸注射部位を通過するように前記核酸注射部位の近くに電極の位置決めするステップと、
約25V/cm〜200V/cmの電界強度を有する電流で筋肉を刺激するステップと
を含んでなる方法。
【請求項１０】
前記電気的刺激が単一の方形二極性パルスの形態で与えられることを特徴とする請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記二極性パルスが約50μs〜5000μsの間に持続時間を有することを特徴とする請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記電気的刺激が約2〜30,000にある方形二極性パルスの形態で与えられることを特徴とする請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
前記二極性パルスのパルス持続時間の合計が、約10ms〜12,000msの間にあることを特徴とする請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記二極性パルスが少なくとも2列の形態で与えられることを特徴とする請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記電気的刺激の周波数が、約0.5Hz〜100Hzの間にあることを特徴とする請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物においてタンパク質を全身に送達方法であって、
前記筋肉において、前記核酸がコードするタンパク質の発現を指示するプロモーターに、作用可能に結合されている核酸を哺乳動物の筋肉に注射するステップと、
電極の中を移動する電流が前記核酸注射部位を通過するように前記核酸注射部位の近くに電極の位置決めするステップと、
25V/cm〜200V/cmの電界強度を有する電流によって筋肉を刺激するステップと
を含んでなる方法。
【請求項１７】
前記電気的刺激が、単一の方形二極性パルスの形態で与えられることを特徴とする請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記二極性パルスが、約50μs〜5000μsの間の持続時間を有することを特徴とする請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記電気的刺激が、約2〜30,000の間にある方形二極性パルスの形態で与えられることを特徴とする請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記二極性パルスのパルス持続時間の合計が、約10ms〜12,000msの間にあることを特徴とする請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記二極性パルスが少なくとも2列の形態で与えられることを特徴とする請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記電気的刺激の周波数が、約0.5Hz〜1000Hzの間にあることを特徴とする請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
a)  哺乳動物の骨格筋内に医薬品を注射することと、
b)  電極の中を移動する電流が注射部位を通過するように注射部位の近くに電極の位置決めすることと、
c)  25V/cm〜200V/cmの間にある電界強度を有する電流により筋肉を電気的に刺激することと
によって、in vivoで、骨格筋への投与から成る治療において使用される医薬品として製造される薬物の使用。
【請求項２４】
前記電気的刺激が単一の方形二極性パルスの形態で与えられることを特徴とする請求項23に記載されている薬物の使用。
【請求項２５】
前記二極性パルスが、約50μs〜5000μsの間の持続時間を有することを特徴とする請求項23または請求項24に記載されている薬物の使用。
【請求項２６】
前記電気的刺激が、約2〜30,000の間にある方形二極性パルスの形態でデリバリーされることを特徴とする請求項23〜25のいずれかに記載されている薬物の使用。
【請求項２７】
前記二極性パルスが、約10ms〜12,000msの間に合計持続時間を有することを特徴とする請求項23〜26のいずれかに記載されている薬物の使用。
【請求項２８】
前記二極性パルスが少なくとも2列の形態で与えられることを特徴とする請求項23〜27のいずれかに記載されている薬物の使用。
【請求項２９】
前記電気的刺激の周波数が、約0.5Hz〜1000Hzの間にあることを特徴とする請求項23〜28のいずれかに記載されている薬物の使用。
【請求項３０】
前記薬物が核酸から成り、前記核酸は、前記筋細胞において前記核酸がコードするタンパク質の発現を指示するプロモーターに、作用可能に結合されていることを特徴とする請求項23〜29のいずれかに記載されている薬物の使用。
【請求項３１】
前記薬物が単鎖核酸より成ることを特徴とする請求項23〜29のいずれかに記載されている薬物の使用。
【請求項３２】
薬物が検出可能な標識を有することを特徴とする請求項23〜31のいずれかに記載されている薬物の使用。
【請求項３３】
医薬品あるいは治療用薬物の送達に感受性のある細胞組織を作成するための装置であって、
a) 25V/cm〜200V/cmの電界強度を備えた電界をデリバリーすることができる電圧制御装置と、
b) 哺乳動物の身体部分の周囲に配置されるのに適し、また該身体部分に電界を提供することができる電極と
を含んでなる電圧制御装置。
【請求項３４】
電界が段階を追ってあるいはパルス発生の方法で提供されることを特徴とする請求項33に記載されている装置。
【請求項３５】
電界が0.5〜1000Hzの範囲内にある周波数を提供されることを特徴とする請求項34に記載されている装置。
【請求項３６】
電界が単一の方形二極性パルスの形態で与えられることを特徴とする請求項33〜35のいずれかに記載されている装置。
【請求項３７】
電界が50〜5000μsの持続時間を有する二極性パルスとして与えられることを特徴とする請求項36に記載されている装置。
【請求項３８】
電界が好ましくは2〜30,000方形二極性パルスといった複数のパルスの形態で与えられることを特徴とする請求項33〜35のいずれかに記載されている装置。
【請求項３９】
方形二極性パルスの持続時間が10ms〜12,000msの間にあることを特徴とする請求項38に記載されている装置。
【請求項４０】
方形二極性パルスが少なくとも2列の形態で与えられることを特徴とする請求項39に記載されている装置。
【請求項４１】
細胞組織に対して医薬品あるいは治療用薬物を送達するためのものであることを特徴とする請求項33〜40のいずれかに記載されている装置の使用。
【請求項４２】
細胞組織が骨格筋組織であることを特徴とする請求項41に記載されている装置の使用。
【請求項４３】
細胞組織が哺乳動物の骨格筋細胞組織であることを特徴とする請求項41あるい42に記載されている装置の使用。
【請求項４４】
医薬品あるいは治療用薬物が核酸分子であることを特徴とする請求項41〜43のいずれかに記載されている装置の使用。
【請求項４５】
核酸分子が、筋細胞内において核酸がコードするタンパク質の発現を指示するプロモーターに、作用可能に結合されていることを特徴とする請求項44に記載されている装置の使用。
【請求項４６】
核酸が単鎖核酸であることを特徴とする請求項44に記載されている装置の使用。
【請求項４７】
電界が、筋線維をおおよそ横切るその電界線によって位置決めされることを特徴とする請求項41〜46のいずれかに記載されている装置の使用。
【請求項４８】
細胞組織の刺激が、医薬品あるいは治療用薬物の細胞組織への注射に関連して行われることを特徴とする請求項41〜47のいずれかに記載されている装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品と核酸の骨格筋への導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
［１．発明の分野］
本発明は、骨格筋を医薬品と核酸に対して半透過性にするための方法に関する。さらに詳細には本発明は、骨格筋に医薬品と核酸を注射後、低い電界強度でその筋肉を電気的に刺激することによって半透過性にすることに関する。
【０００３】
［２．技術的背景］
科学者たちは、乳癌、大腸癌、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症といった数多くのヒト疾病の原因となっている遺伝子を継続して発見している。さらに、科学者たちは継続して、細菌やウイルス抗原（例えば、ウイルスキャプシッドタンパク質）をコードする遺伝子を発見しつつある。これらの新しい発見があるにもかかわらず、医療関係者の前に立ちはだかって大きな障害になっているものがある。それは、疾病の治療、あるいは遺伝的な免疫化のために、患者に対してこれらの薬品の有効性が認められる分量をどのように安全にデリバリー（送達）すればよいのかという問題である。
【０００４】
現在では、ほとんどの医薬品は経口的あるいは経静脈的に投与されている。しかし、経口と経静脈的に投与する薬物と遺伝子の送達の方法には、不十分な点がいくつかある。第一に、経口的に、あるいは経静脈的に送達された薬物の大きなパーセントが標的臓器あるいは細胞に到達する前にその身体により分解されることである。胃腸の中に存在する酸や酵素は、例えば、多くの医薬品薬物を分解することができる。同様に、遺伝子は、ＤＮＡを分解する血中や肝臓にみられるタンパク質によって急速に破壊されるであろう。さらに、経静脈的にデリバリーされた薬物は疾患をもった臓器あるいは細胞に到達する前に肝臓あるいは免疫システムによって隔離される。第二に、経口的ならびに経静脈的に投与された薬物と遺伝子のデリバリーは非特異的である。これは、その薬物あるいは遺伝子が標的と非標的細胞の両方にデリバリーされることを意味する。
【０００５】
骨格筋は、薬物デリバリー、遺伝子治療、遺伝子的免疫化にとって有望視される候補の一つである。第一に、骨格筋はヒトの標準体重の50%以上を構成しており、そのほとんどが他の身体組織や臓器に比較して容易にアクセスすることができる。第二に、筋肉には、薬物や遺伝子のデリバリーの対象となる疾患、例えば、デュシャンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、糖尿病、高脂質血症、心血管系疾患などの遺伝的または後天性の異常がたくさん存在する。第三に、容易にアクセスでき、また筋肉の中で作られたタンパク質が分泌され、免疫反応を誘発するので、筋肉は遺伝子的免疫化にとっては理想的な部位の一つである。最後に、骨格筋細胞は非分裂的であるため、骨格筋細胞は、継続して分裂している他の細胞の型で期待されるよりも長い期間にわたって遺伝子がコードするタンパク質を発現させることができる。タンパク質が発現されるのが長期にわたればわたるほど、その分だけ治療回数が少なくて済むのである。
【０００６】
しかし現在は、in vivoにおいて、骨格筋の中に薬物とDNAを効果的にデリバリーする非ウイルス的方法がない。DNAの筋肉内注射など、薬物とDNAを骨格筋の中に移送するための方法で当業者には公知のものがいくつかある。なお、直接筋肉注射という臨床的な方法は、トランスフェクション効率が低く、つまり典型的には1％に満たないであることを主な理由で一部に限定されたものになっている。再生する筋肉内にDNA注射が行われる場合には、トランスフェクションの有効性を改善できることが証明されている。DNA注射の3日前に薬物ビブカイン（Bivucain）が注射される。ビブカイン注射によって誘発され再生する筋肉へのDNA注射はより高いトランスフェクション効率を示すが、その筋肉に重度の損傷を引き起こしてしまうことから、ヒトにおいてはその方法の利用が限られたものになっている。
【０００７】
以上の記述から、薬物やDNAを疾患をもった臓器や細胞にのみにデリバリーするための非ウイルス的方法を提供することは当技術分野におけるひとつの進歩であると理解されることであろう。医薬品やDNAを直接的に骨格筋の中へデリバリーする電気穿孔（electroporation）法を提供することができれば、それは当技術分野においてもう一歩前進したことになるであろう。医薬品やDNAの治療的に有効性が認められる分量を骨格筋の複数の部位に同時にデリバリーすることができれば、それは当技術分野においてさらにもう一歩前進したことになるであろう。そのデリバリー効率を調節することができるのあれば、それはもう一歩進んでさらに前進したことになるであろう。
【０００８】
そのような一つの方法をここに開示する。
【０００９】
【特許文献１】国際公開第９６／３２１５５号パンフレット
【発明の開示】
【００１０】
［３．発明の概要］
本発明は、薬物やDNAを骨格筋内にデリバリー（送達）する、あるいはトランスフェクションするための一つの方法である。理論によって拘束されるわけではないが、この方法は電気穿孔法と同種のものと考えられる。電気穿孔法は、電流を通すことが一般的にはできない電気的なキャパシターのひとつとして細胞が作用するという原則に則って作動する。したがって、高い電圧の電界に細胞をさらすことで、細胞膜に一時的な透過性構造あるいは微小孔が作り出される。こうした微小孔であれば、薬物、DNAや他の極性組成物が細胞の内部にアクセスできるという意味では大きさとしては十分である。時間経過とともに、細胞膜のその微小孔は閉じて、細胞は再び不透過性になる。
【００１１】
しかし、従来の電気穿孔法は0.4〜数kV/cmという高い電界強度を用いる。その電気穿孔法とは対照的に、本発明で使用されている電界強度は約25V/cm〜250V/cmの範囲にある。これらの低い電界強度は、トランスフェクション効率を犠牲にすることなく、実際にはトランスフェクション効率は増加するのだが、筋肉の損傷を起こすことが少なくなると考えられる。さらに、本発明の方法を使用すると、トランスフェクション効率は、周波数、パルス持続時間、パルス数などのパラメータを改変することによって確実に調節することができる。
【００１２】
DNAトランスフェクション効率の増加はDNA注射直後、あるいは間もなくしてその筋肉が電気的な刺激を受ける場合にのみ観察される。したがって、その刺激によって誘発される組織の半透過性は可逆性のものである。さらに言えば、組織の半透過性は筋肉を通過する電流に依存しており、つまり、神経を通して誘発される活性はトランスフェクション効率には影響を及ぼさない。
【００１３】
一旦トランスフェクションされると、筋細胞は、核酸がコードするタンパク質を発現させることができる。したがって、本発明のトランスフェクション方法は、例えば、遺伝子的免疫化（例えば、DNAワクチン）のために発現ベクターをトランスフェクションするのに使用することができる。一つの実施態様では、ウサギにラットアグリンのcDNAを含むプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションされた筋肉は、アグリンタンパク質を作り出し、分泌した。トランスフェクションの19日後には、ウサギの血清にラットアグリンに対する有意な抗体が含まれていた。
【００１４】
第二の実施態様では、マウスとラットに本発明の方法を使用して、ヒト毛様体神経親和性因子（human ciliary neurotrophic factor）のアゴニスト性変種であるDH-CNTF、ヒト毛様体神経親和性因子のアンタゴニスト性変種であるAADH-CNTF、DH-CNTFの分泌された形態であるsec-DHCNTFに使用されるコード配列を含む3つの異なった真核生物発現ベクターの一つあるいはそれ以上をトランスフェクションした。筋肉は電気的な刺激を受けなかったか、あるいはDNA注射直後に刺激を受けたかのいずれかであった。さまざまな時間経過の時点で採血され、抗体力価が求められた。ラットとマウスの両方で、DNA注射直後に電気的刺激を与えることによって、単にDNA注射しただけのものよりもおよそ5〜10倍高い抗体力価となった。
【００１５】
本発明のトランスフェクション方法は疾病を治療するためにタンパク質を全身的にデリバリーするのに使用することもできる。一つの好ましい実施態様では、エリスロポエチン（EPO）遺伝子を内部にもつDNAプラスミドを骨格筋内に注射し、本発明の方法により電気的な刺激を与えた。対照群では電気的な刺激を受けなかったか、あるいはEPO遺伝子を内部にもっていない対照ベクターがトランスフェクションされた。14日後に、本発明の方法によってEPOをトランスフェクションされたマウスでのみ、そのトランスフェクションされた筋肉でEPOのかなりの量を生じさせ、また血流の中に分泌することができたことを示すヘマトクリット（hematocrit:Ht）の増加を呈示した。
【００１６】
非核酸分子もまた本発明の方法によりトランスフェクションすることが可能である。一つの実施態様では、ローダミン複合デキストランが注射され、その後に電気的刺激が施行された。3〜5日後に、筋肉は液体窒素の中で凍結され、低温維持装置上で切開された。蛍光が注射と刺激を受けた細胞内で観察された。ローダミン複合デキストランが筋細胞内に入り、また残留したことが示された。
【００１７】
本発明のこれらと他の目的と長所は、添付の図とグラフを参照する際に、また以下の詳細な説明、書き添えられている特許請求の範囲を読む際に明らかになるであろう。
【００１８】
［４．図面の概要］
簡単に上述されている本発明のさらに詳細な説明が添付の図とグラフを参照して供せられる。これらの図とグラフは、本発明の典型的な実施態様に関する情報を提供するだけであり、したがって、その請求の範囲の制限が考慮されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
［５．発明の詳細な説明］
本発明は、骨格筋組織の透過性を増大させるための新規性を有する方法を目指したものであり、そのため、薬物と核酸を細胞に入れる、あるいはトランスフェクションすることができるようにしている。本発明の方法は、骨格筋組織中に所定の電流量を通すものである。だが、前述の電気穿孔法とは違い、本発明の方法のパラメータはユニークなものであり、とくに使用された低い電界強度と生じる損傷の量に関するパラメータはユニークである。列（トレイン）の数、周波数、パルス数、パルス持続時間などの他のパラメータはデリバリーされる薬物あるいは核酸の量を調節する目的でさまざまに変化させることができる。
【００２０】
図1に図示されているように、一般的には、骨格筋を露出させて、分子の所定量が筋肉に注射される。一つの実施態様では、DNAを0.9%の塩化ナトリウム（NaCl）中に溶解する。なお、その溶媒そのものは本発明には重要なものではない。例えば、ショ糖などの他の溶媒は骨格筋におけるDNA摂取を増加させることができることは、当業者には周知の事実である。他の物質もまた、さまざまな利便的な理由から興味の対象となっている分子をコトランスフェクションすることができるであろう。例えば、電気的に透過性を与えられた膜を密封することが知られている、P188（Leeら、PNAS., 4524-8, 10, 89 (1992)）はトランスフェクションされた筋線維の生存率を増加させることによってトランスフェクション効率に利便的な効果を与えることができると考えられている。
【００２１】
続けて図1を参照すると、電極はその分子が注射された領域の付近に約1〜4mm離して筋肉上に置かれる。電極の厳密な位置あるいは設計についてであるが、注射された分子の領域において筋線維の向きに直交する方向に電流が筋繊維を通過することができさえすれば、さほど重要なことではない。
【００２２】
一旦電極が位置決めされると、筋肉は電気穿孔（electroporated）あるいは刺激を受ける。図2に説明されているように、刺激は、所定の振幅と持続時間を有する方形の二極性パルスとしてデリバリーされる。トランスフェクション効率を最適化する目的で、これらのパラメータは広範に変化させてトランスフェクション効率が比較された。例えば、電圧はおよそ0〜50ボルトまでの範囲で変化させ、パルス持続時間は5μs〜5msまでの範囲で変化させ、パルス数は1パルス〜30,000パルスまでの範囲で変化させ、列内のパルス周波数は0.5Hz〜1000Hzの範囲で変化させた。
【００２３】
これらの結果から得た結論は、電界強度が約50V/cmよりも上であれば、他のパラメータは所望された実験の条件によってさまざまに変化させられることもありうるということである。上限は検出されなかったが、有効性を有するトランスフェクション効率がさらにずっと高い電界強度で観察された。刺激の電界強度は以下の公式を使用して計算することができる。
【００２４】
E = V/（2r ln(D/r)）
これはD>>rであれば、ワイヤ間の電界を表す。この式では、V＝電圧＝10V、D＝ワイヤ中央間の距離＝0.1〜0.4cm、r＝電極の直径＝0.06cmである。E. Neumann, A. E. Sowers, C. A. Jordan編『Electroporation and electrofusion in cell biology』の中のHofmann, G. A.「Cells in electric fields」（389〜407頁）、Plenum Publishing Corporation刊、1989年を参照のこと。10ボルトでは、電界強度は163V/cmと43V/cmの間である（電極間はそれぞれ0.1〜0.4cm）。Dはrよりもずっと大きくなることはないので、大きな平行板の間に生じる電界については、以下の公式を使用することがより適当であると考えられる。
【００２５】
E = V/D
これによると、100V/cm〜25V/cmの間にあるほぼ同じ電界強度が得られる（電極間がそれぞれ0.1〜0.4cm）。他のパラメータだけではなく、電界強度もトランスフェクションされた組織によって影響を受け、したがって、最適条件はさまざまに変化することがある。しかし、本発明で与えられたパラメータを使用すると、当業者であれば最適パラメータは容易に得ることができる。
【００２６】
図3と図5〜8に図示されているように、本発明の方法は、骨格筋内への薬物とDNAデリバリーの効率を劇的に増加させた。一つの実施態様では、ラットのヒラメ筋あるいはEDL筋（足の長指伸筋）にβガラクトシダーゼ遺伝子（lac Z）含むDNAプラスミドが注射された。βガラクトシダーゼ遺伝子は、視覚的に分析する、あるいは分光光度的に測定可能な青色の基質に無色の基質を変換することができるタンパク質を産生する。図3では、さまざまな刺激パラメータを使用してβガラクトシダーゼ遺伝子をトランスフェクションした典型的なヒラメ筋とEDL筋が描出されている。
【００２７】
図3aでは、本発明によりトランスフェクションされたヒラメ筋とEDL筋のDNAデリバリー効率が改善されたことが図示されている。ヒラメ筋とEDL筋（n＝3）はまず、坐骨神経を横切することによって神経除去される。これは、観察された増加トランスフェクション効率にその原因をまず間違いなく帰することができると考えられる神経誘発活性の影響を全て取り除くために行われた。神経除去の3日後に、上述のように、その筋肉にβガラクトシダーゼ遺伝子が注射された。DNA注射後、筋肉は治療を受けなかったか、あるいは本発明の方法によりDNA注射直後に筋肉は刺激を受けたかのいずれかであった。
【００２８】
DNA注射後15日でヒラメ筋とEDL筋が分析された。図3aに図示されているように、DNA注射直後に刺激を受けた筋細胞（一番下のパネル）はより多くのβガラクトシダーゼ遺伝子が筋細胞内に導入されたことを示す青色の産生物を多く含んでいる。トランスフェクション効率は、図4に図示されているように、青色の産生物を含んだ筋肉の1mm横断面内の筋線維の本数を数えることによって定量化された。図5aの棒グラフによって図示されているように、本発明の方法を使用してトランスフェクションされたヒラメ筋では、刺激を受けなかった筋肉よりも47倍増加したことが示された。同様に、本発明の方法を使用してトランスフェクションされたEDL筋では、刺激を受けなかった筋肉よりも12倍増加したことが示された。
【００２９】
神経活性がトランスフェクション効率に影響を及ぼしたかどうかを判定するために、本発明の方法により、上述のように、神経刺激を受けた（横切していない坐骨神経）ヒラメ筋とEDL筋と神経を除去した（横切した坐骨神経）ヒラメ筋とEDL筋について実施された。図3bに図示されているように、DNA注射の15日後に、神経刺激と神経が除去された筋肉の両方でβガラクトシダーゼ遺伝子の高い移送効率を示す青色の産生物を豊富な量産生した。図5bに図示されているように、トランスフェクションされた筋線維の定量化により、神経刺激と神経除去された筋肉の両方で高いトランスフェクション効率が確認された。
【００３０】
観察されたその増加トランスフェクション効率は、筋肉活性が原因となっていたのではないという可能性を除外するため、坐骨神経の直接刺激と筋肉（n＝5）の刺激が比較された。筋肉活性が原因でトランスフェクション効率の増加が起きたのであれば、神経を経由して刺激を受けた筋肉のトランスフェクション効率が直接的な筋肉の刺激を受けた場合と同様の効率を生じて然るべきである。図3cに図示されているように、直接神経刺激では、直接筋肉刺激に比較してトランスフェクション効率は有意に増加しなかった。図5cに図示されているように、ヒラメ筋とEDL筋の両方で、直接的な筋肉の刺激ではトランスフェクション効率の10倍増が観察された。
【００３１】
図3dに図示されているように、増加した効率は電気穿孔法に関して言えば、一貫して一過性のものである。DNA注射後に直接的に刺激を受けた筋肉ではDNA注射以前に刺激を受けた筋肉よりもより青く染色されていることが有意に示されている。事実、DNA注射後直接的に刺激を受けた筋肉では、DNA注射10分前に刺激を受けた筋肉よりも10〜25倍の間にあるトランスフェクション効率が示された（図5d）。
【００３２】
図6には、本発明の結果が要約されている。いくつかの異なった実験といくつかの異なったDNAのバッチから得られた筋肉は、一緒にグループ化されている。SOL SとEDL Sとネームされた各棒グラフでは、筋肉（各群で16）がDNAの注射後直接刺激を受けた。SOL NSとEDL NSとネームされた各棒グラフでは、筋肉（各群で10）が神経に刺激を受けたが、全く刺激を受けなかったか、あるいはDNA注射10分前に直接刺激を受けたかのいずれかであった。
【００３３】
実験に使用された電気的刺激装置はFHC（Brunswick，ME04011）により製造されたものである。パルサー6bpとパルサー6bp-a/s刺激装置の両方が使用された。パルサー6bp-a/sは最高電圧150Vと最大電流50mAを供給する。デリバリーすることができる最高電圧には電極間に3000オーム以上の抵抗が必要になる。刺激装置は定常電圧モードで作動した。筋肉内の抵抗が低いため、電圧は以下の実施態様で論じられているように低めにした。全ての実験で、電流は50mAに維持された。
【００３４】
数多くの他の電極の機器形態が採用可能であることは、当業者であれば、理解することができるであろう。例えば、図9では二つの異なった電極の機器形態を使用して得られた結果が図示されている。（A）の電極は、筋線維に対して直交するように置かれている。この電極は、直径（d）0.6mmの銀ワイヤと（C）の電極（これは（B）におけるものを除き全ての実験で使用された電極である）から構成されている。電極は一つずつ筋肉のそれぞれの側に配置された。筋肉の中間の1/3の短い部分はLac Z染色（A）に対して陽性であり、限局性の発現を示している。（B）では、絶縁された銀ワイヤから作られた1.5cmの電極が使用された（d＝0.3mm）。（D）では、絶縁体は、2mm間隔でワイヤに沿って短い部分（0.5〜1.0mm）から取り除かれた。その電極を筋線維と平行に筋肉に穿刺した。電極の二つのワイヤのうちの一本を、筋線維と平行に筋肉に穿刺した。第二のワイヤは筋肉の表面上に置かれ、また筋線維と平行に置かれた。電極の両方のタイプ（図9cと9d）ではトランスフェクションされた筋線維の数とほぼ同じ数が数えられた（およそ250本）。なお、筋線維と平行している長めの電極を使用すると、さらに広範に広がった染色が得られ、また、筋線維またはトランスフェクションもしくはその両方の増加がみられた長い部分に沿ってトランスフェクションされていることが示された。
【００３５】
当業者であれば周知の方法によって、筋肉は全量でLac Z染色された。染色後、でき上がった筋肉の最も青くなった側で写真が撮られた。それ以降は、筋肉は図2にみられるように3つの切片に切断された。筋肉の中間部から得た約1mmの厚さの切片の中にある青色の筋線維の数が数えられた（その切片から遠位あるいは近位にトランスフェクションされた筋線維はしたがって数えなかった）。トランスフェクションされた筋線維を数える目的で、解剖顕微鏡下で単一の筋線維が区別を付けられるように、その切片はより小さな束に切開された。
【００３６】
4つの筋肉で、pSV40-luc構築物が使用された。それがヒラメ筋の中に注射され、3日後に、その筋肉が取り出され、またルシフェラーゼ活性がプロメガルシフェラーゼ測定システムを使用して測定された（Davisetら、1993）。同じラットから得られた注射を受けなかったEDL筋が対照として使用された。
【００３７】
本発明の方法により、いずれの核酸でも、例えば、プラスミドDNA、直鎖DNA、アンチセンスDNA、RNAもまた使用することができる。一つの好適な実施態様では、その核酸は、当業者であれば周知のタイプのDNA発現ベクターである。一般的には、発現ベクターには、ポリアデニール化シグナルなどの終止シグナルが後続するが、興味の対象となっているタンパク質をコードするDNA分子に対して操作可能な状態でリンクされているプロモーターが含まれている。細菌増殖や適当な哺乳類のプロセシングに要求される他の要素、例えば、βラクタマーゼコード領域、fl起点、ColEl由来のプラスミド複製起点などが含まれる。興味の対象となっているDNAコード領域を含む同様の構築物は当業者であれば、構築することができる。
【００３８】
以下の例で図示されているように、核酸よりも分子が本発明の技術を使用して筋肉にデリバリーすることができる。一つの実施態様では、本発明により筋肉注射され、また刺激を受けたローダミン共役デキストランは筋細胞に入り込むことができた。さらに、核酸とタンパク質は電気穿孔された筋肉に同時に導入することができる。一つの実施態様では、ラージT抗原核限局性シグナルがLac Zに対応するDNAコード領域を含むプラスミドと混合された。ラージT抗原核限局性シグナルはDNAを結合させ、細胞の核の中にそれを移送するのを容易にしている。他のシステムでは、ラージT抗原核限局性シグナルはトランスフェクション効率を増加させることが示された。本発明の方法を使用すると、ラージT抗原核限局性シグナルはまた、そのタンパク質がDNAと結合し、また筋細胞に入ることができたことを示すLac Zのトランスフェクション効率を増加させた。
【実施例】
【００３９】
［６．例］
以下の例は、本発明に従って行われるさまざまな実施態様を説明するためのものである。以下の例が、本発明に従って行うことができる多くのタイプの実施態様の完璧あるいは余すところのないものではないことは理解されるべきものである。
【００４０】
［例1−刺激を受けた筋肉対刺激を受けなかった筋肉］
トランスフェクション効率は、骨格筋に注射してpSV40-lucリポーター構築物（reporter construct）をヒラメ筋の中に入れることによって求められた。注射の3日後に、その筋肉は取り出され、またルシフェラーゼ活性が製造業者のプロトコルによりプロメガルシフェラーゼ測定システム（Madison，WI）を使用して測定された。同じラットから得た刺激を受けなかったEDL筋が対照として使用された。データは下の表1に示す。
【００４１】
【表１】
2006061701.tif 000003
【００４２】
［例2−トランスフェクション効率対周波数］
ラットにlac Zの遺伝子を運搬している1mg/μlプラスミドを50μl注射した。注射直後に、電極が2〜3mm離して置かれ、筋肉が以下の刺激パラメータによって刺激を受けた。すなわち、電圧＝30ボルト、パルス持続時間＝0．2ms（合計0.4ms、二極性）、列（トレイン）＝30、1分間1秒オン1秒オフの繰り返しであった。トランスフェクションされた筋線維が筋肉の中間部分から得られた1mm切片で数えられた。トランスフェクションされた筋線維の数を下の表2に示し、図7で図示する。これらのデータもまた、本発明の方法により表面筋線維だけでなくさらに深いところでもトランスフェクションされていることを示している。幾層かさらに深い細胞層でも筋線維はトランスフェクションされている。
【００４３】
【表２】
2006061701.tif 000004
【００４４】
［例3−トランスフェクション効率対パルス］
ウイスターラットのヒラメ筋（200〜270g）に、50μL 0.9%のNaCl中にRSVルシフェラーゼDNAプラスミド50μLを加えた溶液を注射した。注射後間もなくして、筋肉は以下のパラメータを使用して電気的に刺激を受けた。すなわち、周波数1000Hz、200μs持続時間の各列で0〜1000間の二極性パルスを１分間に30回、筋肉に適用した。トランスフェクションの3日後に筋肉が取り出され、液体窒素の中で凍結された。筋肉から採取されて低温維持装置上で切開された薄い切片は、ヘマトキシリン、エオジン、サフランで染色された（実施例9を参照）。下の例４で記述されているように、残りの切片は均質化された。図10〜12に図示されているように、トランスフェクション効率は筋肉にデリバリーされたパルス数に伴い増加した。
【００４５】
［例4−トランスフェクション効率に及ぼす電圧の効果判定］
ウイスターラット（245〜263g）のEDL筋およびヒラメ筋に50μLの0.9%のNaCl中にRSV駆動ルシフェラーゼプラスミドDNA 25μgを加えた溶液を注射した。注射後間もなくして、注射された筋肉は以下のパラメータを使用して電気的に刺激を受けた。すなわち、100Hz、200μs持続時間の各列で100二極性パルス、電圧は0から47.5までの間でさまざまに変化させた。筋肉は注射ならびに刺激を受けた4日後に取り出され、プロメガ（Madison，WI）ルシフェラーゼ測定緩衝液の中で均質化され、また、蛍光物質が製造業者のプロトコルにより測定された。マッキントッシュコンピュータとLabWiev捕捉プログラムが最初の電圧パルスを捕捉するために使用された。記録は、刺激電極と並行して行われた。電圧測定は、刺激の開始後、10パルスでおよそ100msの最高電圧の平均値としてプリントされた紙の上に手書きで記録された。
【００４６】
図13aに図示されているように、電圧増加に伴いトランスフェクション効率にはっきりとした増加がみられた。図13bに図示されているように、この実験の条件下では、13ボルトあるいはそれより高い電圧で刺激を受けた筋肉では、5ボルトあるいはそれより低い電圧で刺激を受けた筋肉に比較してルシフェラーゼ活性が40倍大きいことが示された。
【００４７】
［例5−最適パルス持続時間の判定］
ウイスターラット（200〜270g）のヒラメ筋に50μLの0.9% NaCl中にβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を含むDNAプラスミド50μgを加えた溶液を注射した。注射後間もなく、筋肉は以下のパラメータを使用して電気的な刺激を受けた。すなわち、100Hz、25ボルト、5〜200μsの範囲にあるパルス持続時間の各列で100二極性パルスであった。トランスフェクションされた筋線維は、解剖顕微鏡下で筋肉の中間部分から採られた1mmの厚さの切片で数えられた。ラットの第二組には、50μLの0.9% NaCl中にRSV駆動ルシフェラーゼプラスミドDNA25μgを加えた溶液を注射し、パルス持続時間は50〜2000μsとさまざまに変化することを除けば上と同じパラメータで電気的な刺激を受けた。下の表3と図14に示されているように、これらの刺激パラメータの下では、最適パルス持続時間は約50μsから約200μsの範囲である。この方法は、他の刺激パラメータのパルス持続時間を最適化する目的で使用することができる。
【００４８】
【表３】
2006061701.tif 000005
【００４９】
［例6−電流対パルス数］
6匹のウイスターラット（178〜193g）のヒラメ筋に50μl 0.9%のNaCl中にβガラクトシダーゼ遺伝子を含むDNAプラスミド50μgを加えた溶液を注射した。注射後間もなく、パルス持続時間がさまざまに変わったのを除けば、筋肉は上述のとおりに電気的な刺激を受けた。以下の電気穿孔法のパラメータが比較された。すなわち、（1） 50μs持続時間×100パルス対5000μs×1パルス、（2） 50μs×100パルス×10列対5000μs×10パルス、であった。筋肉は14日後に取り出され、また低温維持装置上で薄片に切断された。横断面は前述のように染色された。トランスフェクションされた筋線維の数が数えられた。図15に図示されているように、パルス持続時間が長ければ長いだけトランスフェクション効率は高くなった。
【００５０】
［例7−DNA濃度］
6匹のウイスターラット（178〜193g）のEDL筋に、50μl 0.9%のNaCl中にβガラクトシダーゼ遺伝子を含むDNAプラスミド1μg/μlか5μg/μlのいずれかを加えた溶液を注射した。注射後間もなく、筋肉は200μs×100パルス×30列で電気的な刺激を受けるか、全く刺激を受けなかったかのいずれかであった。14日後に筋肉は取り出され、低温維持装置上で薄片に切断された。横断面は前述のとおりに染色され、またトランスフェクションされた筋線維の本数が数えられた。図16に図示されているように、DNA濃度が高くなるに伴い、より大きなトランスフェクション効率が得られた。
【００５１】
［例8−ラージT抗原核限局性シグナル］
ウイスターラットの筋肉に、ラージT抗原核限局性シグナルの100：1モル濃度過剰を含むβガラクトーシダーゼ遺伝子を含むDNAプラスミドを注射した。これは、トランスフェクションを改善するために他のトランスフェクション研究で示されているものである（P．Collasら、Transgenic Res．，6: 451-8 (1996)）。筋肉は50μs持続時間×100パルス×10列で刺激された。ラージT抗原核限局性シグナルを含む筋肉では最も多い数のトランスフェクションされた筋線維がみられた。とくに、ラージT抗原核限局性シグナルをコトランスフェクションされた筋肉では、DNAのみをトランスフェクションされた筋肉の7.3本と4.7本のトランスフェクション筋線維に比べて、それぞれ100本と38本のトランスフェクション筋線維数を数えた。これらのデータでは、トランスフェクション効率はDNAを非核酸分子と一緒に混合することによって促進可能であることが示されている。さらに、このデータでは、非核酸分子はまた本発明の電気穿孔技術を使用して筋肉にデリバリーすることが可能であることが示されている。注射後に刺激を受けなかった細胞では何らの改善もみられなかった。
【００５２】
［例9−刺激から結果的に起こる筋肉損傷］
例3から得られた筋肉が電気穿孔が原因となって起こる筋肉の損傷を評価するために薄片に切断され、染色された。図17aに図示されているように、刺激を受けなかった筋肉の大半は損傷を受けなかったが、注射のみでも何らか損傷は起こりうる。300パルスで刺激された筋肉では、より多くの損傷が観察された（図17b）。図17cに図示されているように、1000パルス×30列で刺激された筋肉はより大きな損傷を示しており、損傷は刺激の程度に比例していることが示された。図17dでは、図17cの筋肉の条件下で刺激された筋肉は14日後には完全に再生され、また修復されることを示している。
【００５３】
最も高い刺激量（1000パルス×30列）を受けたもう一つの筋肉には、グリーン蛍光タンパク質（GFP）をコードするプラスミドDNAも含まれていた。図17eにはGFPをトランスフェクションされた筋肉が図示されている。損傷を受けた領域の近傍でトランスフェクションされた筋線維をみることができる（図17f）。トランスフェクションされた再生筋線維は、電気穿孔を施行した3日後では横断面には全く観察されなかった。
【００５４】
［例10−ウサギの遺伝子免疫化］
雌ウサギ（4.5kg）の右直大腿筋にCMVプロモータによって駆動されるラット神経アグリンcDNAを含むDNAプラスミド1μg/μlの2ミリリットルを注射した（Cohenら、MCN，9，237-53 (1997)）。最初の1ミリリットルは、筋肉の表面の10箇所に均等に注射され、その後、1000Hzの周波数で1000パルス×10列がデリバリーされた。もう1ミリリットルは筋肉にさらに深いところに置かれた。ウサギの血清を試験するために、ラットの筋肉とCOS細胞が同じ構築物でトランスフェクションされた。筋肉はトランスフェクションの5日後に取り出され、COS細胞はトランスフェクションの4日後に染色された。
【００５５】
血液は0、19、50、81、106日目に採取され、1:100と1:1000で希釈された。19日後に採取された血液には、血清中に十分な抗体が含まれており、トランスフェクションされた筋線維の染色を和らげるため希釈の際に1:10とした。陽性対照としてモノクローナル抗体（mAb）AG-86が使用された。Hochら、EMBOJ，12 (13): 2814-21 (1994)を参照のこと。免疫前血清ではトランスフェクションされた筋線維の染色は全くみられなかった。後の採血では全て血清中にアグリン抗体がみられた。50日目あるいはそれより後に採取された血液には十分に抗体が含まれており、切片は1:1000の希釈率で染色された。
【００５６】
図18aには、免疫化されたウサギから採取した抗血清で染色されたアグリントランスフェクションCOS細胞（希釈率1:100）とフルオレセイン複合第二抗体が図示されている。COS細胞をまず最初に、1.5%パラホルムアルデヒドの中で10分間固定して染色し、その後30分間リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した。細胞をその後0.2%ウシ血清アルブミン、トリトンX-100、0.1MのPBS中0.1%で4分間遮断した。同じ溶液の中で希釈された血清が細胞に加えられ、20分間保温培養できるようにした。細胞はPBS中で4分間洗浄され、10分間第二抗体（Cappel,55646）で保温培養され、その後PBS中で洗浄された。マウス第一mAb Agr-86が同じ抗体混合の中に含められており、ローダミン複合第二抗体（Sigma T-5393,St.Louis,MO）が希釈率1:100で使用された。図18bでは、mAb Ag-86/ローダミン複合物によって染色された同じ細胞が図示されている。これらのデータには、遺伝子免疫化あるいはDNAワクチン技術に関する本発明の技術の潜在能力が図示されている。
【００５７】
［例11−マウスの遺伝子免疫化］
2ヵ月齢の雄Sprague Dawleyラット群で、サイトメガロウイルスの前初期プロモーターと、以下のタンパク質のコード配列を含む3つの異なった真核生物発現ベクターの200μgの全量（生理食塩水中にDNA 1mg/ml溶液4×50μl）がEDL筋とヒラメ筋の両側で保温培養された。すなわち、ヒト毛様体神経親和性因子のアゴニスト性変種であるDH-CNTF（Saggioら、EMBO J．14，3045-3054，1995）、ヒト毛様体神経親和性因子のアンタゴニスト性変種であるAADH-CNTF（Di Marcoら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93，9247-9252，1996）、DH-CNTFの分泌された形態であるsec-DHCNTFである。筋肉は、電気的な刺激を受けなかったか、あるいはそれぞれ100ないしは1000の方形二極性パルス×30列（持続時間200μs；振幅設定150V；効果的な電圧〜25V）を使用して、DNA注射直後に連続列の間に2秒間隔を置いて1000Hzの周波数でデリバリーして刺激を受けたかのいずれかであった。
【００５８】
2ヵ月齢の雄CD1マウス群では大腿四頭筋で、sec-DHCNTFプラスミドの100μg（生理食塩水中に1mg/mlのDNAを加えた溶液2×50μl）が両側で保温培養され、またDNA注射直後に筋肉の電気的刺激を与えるか、あるいは与えなかった。刺激条件は、連続列の間に2秒間の間隔を置いて1000Hzの周波数でデリバリーされた1000方形二極性パルス×10列（振幅設定150V）であった。
【００５９】
血液は選択された経過時間の時点で眼窩後洞から採取し、血清は作成して-20℃で保存された。ラットとマウスの血清の抗CNTF抗体の有無はELISA法で判定された。組換えヒトCNTFで覆われているマイクロ力価プレートは血清の連続希釈液で保温培養され、その後ラットあるいはマウスIgG（Pierce）に対するアルカリホスファターゼ複合抗体で保温培養された。プレートはその後、p-ニトロフェニールリン酸を加えて保温培養し、また405nmでの吸光度がマイクロプレート読み取り器を使用して求められた。抗体力価は、抗CNTF抗血清の飽和濃度で得られたものの50%に等しい吸光度読み取り値を生じさせる血清の希釈度として定義された。
【００６０】
その結果は図19に示す。力価は正確に平均値をとることができなかったが、それは動物によっては抗体の検出可能な分量を発育することができなかったという事実が原因となっていた。したがって、データは低いあるいは検出不可能な抗体力価（相互力価3/4 100）を表わす1:100の値で個々の動物に関して提示された。結果は、図19に描出されているように、ラットやマウスだけでなく、使用された全てプラスミドに関しては同様であった。同様な結果がまた、関係のないウイルスタンパク質をコードするもう一つのプラスミドによってラットとマウスの両方で得られた（データは提示せず）。ラットとマウスの両方で、DNA注射直後の電気的な刺激を施行したものでは、単にDNA注射をしたものよりもおよそ5〜10倍抗体力価が高くなった。このことは、高いあるいは低いパルス数での刺激の両方で真実であった。これらの結果から電気穿孔法はDNA媒介免疫化の効率を増加させることが証明された。
【００６１】
［例12−系統的生物学的活性による分泌タンパク質］
サイトメガロウイルス前初期プロモーターの制御下でマウスエリスロポエチンのcDNAを含む真核生物発現プラスミド（CMV-EPO）の50μg（0.9%のNaCl中に1mg/ml溶液50μl）が3ヵ月齢129×Balb/C雌マウスの左大腿四頭筋に注射された。5匹のマウス（群1）では、筋肉は、200μs持続時間×1000方形二極性パルス×10列を使用して、連続列の間は2秒間の間隔を置いて、DNA注射直後に電気的な刺激を受けた。列の周波数は1000Hzで、振幅設定は150Vであった（効果的な電圧は〜25V）。5匹のマウスのもう一つの群（群2）では、筋肉はDNA注射後刺激を受けなかった。対照としては、4匹のマウスの群（群3）にCMVプロモーターの制御下にグリーン蛍光タンパク質のコード配列を含むプラスミド（CMV-GFP）を注射し、その後、群1と同じ条件で電気的刺激を与えた。群4は電気的刺激を与えずに生理食塩水溶液のみを注射された5匹のマウスから構成されている。
【００６２】
血液は選択された経過時間の時点で眼窩後洞から採取され、ヘマトクリット値が末梢血管の血液に遠心沈降法を用いて測定された。血清サンプルは、市場に出回っているELISAキット（R&D System）を使用してEPOの有無について分析された。その結果は表4に示す。EPO構築物を注射され、またその直後に電気的に刺激を受けたものを除いて、マウスの全ての群で、循環EPO値はELISAキットの検出限界以下であった（<15mU/ml）。対照的に、EPO構築物を注射され、また電気的な刺激を受けたマウスは注射5日後に血清EPO値が著明に上昇した（平均でおよそ50mU/ml）。EPOの血清濃度はDNA注射の28日後までは上昇したままであった（一番最後の時点で調べられたが、データは提示せず）。EPOのこれらの値はヘマトクリット値における増加を生み、注射前の46.2%からDNA注射の14日後と28日後でそれぞれ70%と76.7%まで上昇した。これらの値は両方の対照群（群3と4）で得られたものや筋肉の電気的な刺激を受けずにEPO発現ベクターを注射されたマウスのもの（群2）とは著しく異なっていた。実際には、後者の値は両対照群のヘマトクリット値からは著しく異なってはいなかった（表4参照）。これらの結果から電気穿孔法は、分泌されたタンパク質発現の含量という点と、分泌されたタンパク質により媒介される生物学的効果が生じるという点の両方から、単にDNA注射を行う方法よりも優れていることが証明されている。
【００６３】
【表４】
2006061701.tif 000006
【００６４】
［例13−非核酸分子のデリバリー］
筋肉にGPFプラスミドDNA1μg/μlと2μg/μlローダミン複合デキストランを混合した50μlを注射した（分子プローブから10kD）。3〜5日後、筋肉（n=6）は液体窒素で凍結し、低温維持装置上で薄片に切断した。図20に図示されているように、刺激を受けた筋肉（一番下）にはローダミン複合デキストラン（一番上）とGFP（中）がトランスフェクションされた。さらに図示されているように、同じ筋線維にGFPとローダミン複合デキストランの両方をトランスフェクションした。これらのデータでは、非核酸分子は本発明の技術を使用して筋細胞にデリバリーすることができることが示されている。
【００６５】
図４
全筋肉ならびにその中間部分から切断した1mm厚さの切片。トランスフェクションされた筋線維数を小さな束に分けた後に数えられ、解剖顕微鏡を通して単一の筋線維を見ることができた。筋肉領域のいくつかの領域では、大半の筋線維がトランスフェクションされていた（黒い矢印）。これらの領域は、電気的刺激の間その位置が定まっていた電極部位の近くにあった。
【００６６】
図９
二つの異なった電極がトランスフェクション効率を改善するために使用された。注射過程と刺激パターン（100Hz）は前述のものと同じであった。（A）の電極は筋線維に直交するように置かれている。この電極は、0.6mmの直径（d）をもった銀ワイヤと（C）の電極本体（これは（B）での例外を除いて、全ての実験で使用された電極である）から構成されている。電極は一つずつ、筋肉のそれぞれの側に置かれている。筋肉の中間1/3にある短い部分ではLac Z染色（A）に陽性であり、限局性の発現を示している。（B）では、絶縁された銀ワイヤから作られた1.5cm電極が使用された（d=0.3mm）。
【００６７】
（D）では、絶縁体は2mm間隔でワイヤに沿った短い部分（0.5〜1.0mm）から除去された。筋線維と平行して筋肉の中に電極を穿刺した。第二の電極は筋肉の表面上に置かれた。陽性であることを示す青色の染色が筋肉の中間1/3の部分に限局されているおよそ250本の筋線維で観察された。（B）では、筋線維が広範に染色されていることが示され、筋線維および/または形質転換発現の増加が起こった長い部分に沿ってトランスフェクションされたことが示されている。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図1は、本発明の骨格筋に薬物とDNAをデリバリーする方法をグラフ的に図示している。
【図２】図2は、本発明の方法により、デリバリーされた電気的刺激のグラフ的な説明図である。
【図３】図3は、1μg/μlの濃度でRSV-Lac ZプラスミドDNA溶液50μgを注射された筋肉の全量を図示している。図3aと3bの筋肉はDNA注射の15日後に取り出されたものである。図3cと3dの筋肉はDNA注射の7日後に取り出された。筋肉は全て同じラットから採取された一対ずつのものである。
【図４】図4は、全筋肉とトランスフェクションされた筋肉の1mm切片の画像である。暗染色は、暗沈降を起こすためにβ-ガラクトシダーゼによって筋肉内で触媒作用を受けたo-ニトロフェニール-b-D-ガラクトピラノシド（ONPG）を示す。矢印は本発明の方法を使用して成功裡にトランスフェクションされた筋線維を図示している。
【図５】図5には、図3に示されている骨格筋各群の平均トランスフェクション筋線維数を含めて図示されている。
【図６】図6は、いくつかの異なった実験と、一緒にグループ化されたDNAのいくつかの異なったバッチから得られた筋肉の平均トランスフェクション筋線維を図示する棒グラフである。SOL S（ヒラメ筋への電気的刺激）とEDL S（足の長指伸筋への電気的刺激）と名付けられている棒グラフでは、筋肉（各群で16）はDNAの注射後に直接刺激を受けた。SOL NS（ヒラメ筋神経への電気的刺激）とEDL NS（足の長指伸筋神経への電気的刺激）と名付けられた棒グラフでは、筋肉（各群で10）は神経を刺激されたが、全く刺激を受けなかったか、あるいはDNA注射の10分前に直接刺激を受けたかのいずれかであった。
【図７】図7は、トランスフェクションされた骨格筋線維数対刺激周波数の時間的推移記録を図示するグラフである。
【図８】図8は、トランスフェクションされた筋肉の写真であり、図7のデータはこれから作成された。
【図９】図9では、本発明の方法により二つの異なった電極を使用して筋肉の全量にトランスフェクションされた時点で達成された結果が写真と図によって示されている。
【図１０】図10は、パルス数と周波数を比較しつつ、それらの増加に伴ってトランスフェクションされる骨格筋線維数を図示するグラフである。
【図１１】図11は、骨格筋線維数対定常周波数におけるパルス数を図示するグラフである。
【図１２】図12は、平均ルシフェラーゼ活性対パルス数を図示するグラフである。
【図１３】図13は、本発明の刺激方法の電圧依存性を図示するグラフである。図13aでは、さまざまな電圧によって刺激される筋肉のルシフェラーゼ活性が図示されている。図13bでは、13ボルトより上と5ボルトより下の振幅によって刺激を受けた筋肉の平均ルシフェラーゼ活性が図示されている。
【図１４】図14は、トランスフェクション効率に関するパルス持続時間の効果を図示するグラフである。
【図１５】図15は、さまざまなパルス持続時間ならびにパルス数についてトランスフェクション効率の比較を図示する棒グラフである。
【図１６】図16は、トランスフェクション効率に関してDNA濃度の効果を図示する棒グラフである。
【図１７】図17は、短期間の後筋肉の刺激と再生によって起こる損傷を図示するトランスフェクションされた筋肉の写真である。図17aでは、注射は受けたが刺激は受けなかった筋肉が図示されている。図17bでは、筋肉刺激後の筋肉の損傷が図示されている。図17cでは、より激しい刺激条件下で刺激を受けた筋肉が図示されている。図17dでは、図17cに示されている筋肉の条件下で刺激を受けた筋肉が14日後には完全に再生され、また修復されることが図示されている。図17eでは、グリーン蛍光タンパク質（GFP）をトランスフェクションされた筋肉が図示されている。図17fでは、損傷を受けた領域の近くでトランスフェクションされた筋線維をみることができることが図示されている。
【図１８】図18は、本発明の刺激技術を使用して、ラットアグリンをコードする発現ベクターにより遺伝的に免疫化されたウサギから得られた抗アグリン多価クローナル抗体で染色した細胞の写真である。
【図１９】図19は、本発明の刺激技術を使用して、マウスとラットの遺伝的免疫化が改善されたことを図示するグラフである。
【図２０】図20は、ローダミン共役デキストラン（rhodamine-conjugated dextran）とグリーン蛍光タンパク質がトランスフェクションされた筋肉の写真である。上は、ローダミン共役デキストランから得られたローダミン蛍光である。中は、上と同じ部分であるが、フィルターでGFP蛍光を顕在化している。下は、隣接部分をヘマトキシリン（hematocxilin）とエオジン（eosin）で染色したもの。
【図１】
2006061701.tif 000007
【図２】
2006061701.tif 000008
【図３】
2006061701.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ−Ｄ】
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【図１７Ｅ−Ｆ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１８Ｃ−Ｄ】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年9月1日(2005.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
in vivoで、哺乳動物の骨格筋にある分子を送達する装置の制御方法であって、
前記装置が、刺激装置と前記刺激装置に接続された電極とを有し、
前記刺激装置により、前記分子を有する前記骨格筋における部位を通過する電流の電界強度が25V/cm〜200V/cmに調整されるステップを含む方法。
【請求項２】
前記電流が、50μs〜5000μsの間の持続時間を有する単一の方形二極性パルスの形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電流が、パルス数が2〜30,000にある方形二極性パルスの形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記分子が、タンパク質をコードする核酸であって、前記核酸が、前記筋細胞において、前記核酸がコードする前記タンパク質の発現を指示するプロモーターに、作用可能に結合されている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
in vivoで、哺乳動物の骨格筋にある分子を送達する装置の作動方法であって、
前記装置が、刺激装置と前記刺激装置に接続された電極とを有し、
前記刺激装置が、前記骨格筋における前記分子を有する部位を通過させる電流の電界強度を25V/cm〜200V/cmに調整するための信号を送信するステップと、
前記信号に基づき、前記電極が作動するステップと
を含む方法。
【請求項６】
前記電流が、50μs〜5000μsの間の持続時間を有する単一の方形二極性パルスの形態である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記電流が、パルス数が2〜30,000にある方形二極性パルスの形態である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記分子が、タンパク質をコードする核酸であって、前記核酸が、前記筋細胞において、前記核酸がコードする前記タンパク質の発現を指示するプロモーターに、作用可能に結合されている、請求項６に記載の方法。