(57)【要約】      （修正有）【課題】廃水等に含まれる硝酸イオンを基質として脱窒を行うことができる新規な微生物、特に、中程度高温条件下で脱窒を行うことのできる新規な微生物を提供する。【解決手段】土壌、河川、活性汚泥を分離源として、目的の微生物を単離、同定した結果、ジオバチルス（Geobacillus）属に属し、硝酸イオンを基質としてN2ガスを生成する能力を有する新規微生物を見出した。更に、当該微生物を用いた廃水処理方法、及び廃水処理装置を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジオバチルス（Geobacillus）属に属し、硝酸イオンを基質としてN2ガスを生成する能力を有する微生物。
【請求項２】
以下の表１〜３のいずれかに記載された菌学的性質を有することを特徴とする請求項１記載の微生物。
【表１】
2006238794.tif 000009
【表２】
2006238794.tif 000010
【表３】
2006238794.tif 000011
【請求項３】
37〜60℃の条件下において、硝酸イオンを基質としてN2ガスを生成する能力を有する請求項１記載の微生物。
【請求項４】
受領番号FERM AP-20412、FERM AP-20413及びFERM AP-20414からなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項１記載の微生物。
【請求項５】
硝酸イオンを含む廃水に請求項１〜４いずれか１項記載の微生物を接触させる工程を含む廃水処理方法。
【請求項６】
上記廃水を37〜60℃とすることを特徴とする請求項５記載の廃水処理方法。
【請求項７】
上記微生物を接触させた後、廃液中に含まれる窒素ガスを除去する工程を更に含む、請求項５記載の廃水処理方法。
【請求項８】
硝酸イオンを含む廃水に請求項１〜４いずれか１項記載の微生物を接触させる脱窒槽を備える廃水処理装置。
【請求項９】
上記廃水の温度を所望の温度に制御する温度制御手段を更に備える、請求項８記載の廃水処理装置。
【請求項１０】
上記温度制御手段は、脱窒槽における廃水の温度を37〜60℃に制御することを特徴とする請求項９記載の廃水処理装置。
【請求項１１】
上記温度制御手段は、上記脱窒槽及び/又は上記脱窒槽に接続された硝化槽内の温度を制御することを特徴とする請求項９記載の廃水処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば廃水に含まれる硝酸イオンを基質として窒素ガスを生成する新規微生物に関し、さらに当該新規微生物を用いた廃水処理方法及び廃水処理装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば廃水に含まれる硝酸イオンは、水環境における富栄養化問題の原因の一つであり、閉鎖海域等における総量規制が課せられている物質である。水環境に含まれる硝酸イオンは、一般的に、微生物による脱窒により窒素ガスにまで還元し除去される。より詳細には、廃水等に含まれるアンモニウムイオンを好気状態で硝酸イオン及び/又は亜硝酸イオン等に酸化し、続いて嫌気状態で窒素ガスまで還元する。
【０００３】
しかしながら、従来、脱窒能を有する微生物に関する研究報告としては、20〜30℃の常温で生育する微生物によるものが殆どであり、高温条件では亜硝酸イオンを基質とする微生物しか報告されていない（非特許文献１）。高温条件では、気体である窒素ガスの水への溶解度が低下するため、より効果的な脱窒反応が期待される。非特許文献１の研究では高温菌であるBacillus属細菌を用いて培養10-20時間で1mmol（50ppm）の亜硝酸が消費され、0.4-0.5mmolの亜酸化窒素が生成されている（ほぼ定量的な反応）。培養温度は60℃である。
【０００４】
しかしながら、この研究において基質とする亜硝酸は硝酸から生ずる中間生成物であるため、廃水等の脱窒を目的とする場合には、従来の微生物では十分な効果を期待することができない。すなわち、現状では高温条件下での効率的な脱窒技術は存在していない。
【０００５】
【非特許文献１】N.Gokceら、Applied and Environmental Microbiology, Vol.55, No.4, p.1023-1025, 1989
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、廃水等に含まれる硝酸イオンを基質として脱窒を行うことができる新規な微生物、特に、中程度高温条件下で脱窒を行うことのできる新規な微生物を提供することを目的とし、更に、当該微生物を用いた廃水処理装置及び廃水処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を達成するため、本発明者等は、土壌、河川或いは活性汚泥を分離源として目的の特性を有する微生物を単離、同定すべく鋭意検討した結果、従来公知の微生物には分類されない、複数の新規微生物を単離、同定することができた。本発明は、これら新規微生物が有する硝酸イオンを基質として脱窒を行うことができるといった知見に基づいてなされたものである。単離、同定した新規微生物は、全て同一の新種に属すると考えられ、従来公知の種には分類されない。
【０００８】
本発明に係る新規微生物は、ジオバチルス（Geobacillus）属に属し、37〜60℃で生育し、硝酸イオンを基質として窒素ガスを生成する能力を有する。本発明者らが単離、同定した新規微生物のうちTDN-01、TDN-02及びTDN-03は、以下の表１〜３のいずれかに記載された菌学的性質を有する。
【０００９】
【表１】
2006238794.tif 000002
【００１０】
【表２】
2006238794.tif 000003
【００１１】
【表３】
2006238794.tif 000004
本発明者らが単離、同定した複数の新規微生物のうち、５種類の微生物（それぞれ、TDN-01、TDN-02、TDN-03、TDN-04及びTDN-05と命名した）に関して16S rRNAをコードする遺伝子（以下、16S rDNAと称する）の塩基配列を決定した。TDN-01の16S rDNAの塩基配列を配列番号１に示し、TDN-02の16S rDNAの塩基配列を配列番号２に示し、TDN-03の16S rDNAの塩基配列を配列番号３に示し、TDN-04の16S rDNAの塩基配列を配列番号４に示し、TDN-05の16S rDNAの塩基配列を配列番号５に示す。
【００１２】
これら配列番号１〜５に示す塩基配列をもとにデータベース（GenBank/DDBJ/EMBL）及びホモロジー検索ソフト（BLAST）を用いてホモロジー検索したところ、配列番号１〜５全てにおいて、“Geobacillus kaue strain BGSC W9A78 16S ribosomal RNA gene”として登録された塩基配列と最も高い相同性（97〜99%）を示し、続いて“Geobacillus uzenensis strain BGSC 92A2 16S ribosomal RNA gene”登録された塩基配列と高い相同性(97〜99%)を示した。しかしながら、配列番号１〜５に示す塩基配列の全てにおいて、99.8％以上の相同性を示す、在来の微生物は存在しなかった。
【００１３】
以上の菌学的性質を、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）、第２巻（1986）に照らし、また、16S rDNAの塩基配列解析の結果に基づいて本発明に係る新規微生物の分類学的位置を調べたところ、これら新規微生物はGeobacillus属に属する新種に分類された。
【００１４】
新種に属する新規微生物のうちTDN-01、TDN-02及びTDN-03については、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に2005年2月18日に、それぞれ受領番号FERM AP-20412、FERM AP-20413及びFERM AP-20414として寄託した。
【００１５】
特に、本発明に係る微生物は、中程度高温条件下において硝酸イオンを基質としてN2ガスを生成する能力を有している。ここで、中程度高温条件下とは、処理対象の廃水温度が37〜60℃、好ましくは50〜60℃である。
【００１６】
一方、本発明に係る廃水処理方法及び廃水処理装置は、上述した本発明に係る微生物を利用して廃水に含まれる硝酸イオンを中程度高温条件下で除去するものである。本発明に係る廃水処理方法及び廃水処理装置は、上述した微生物を使用することによって、従来の脱窒細菌を用いた方法では除去できなかった硝酸イオンを中程度高温条件下で除去することができる。また、本発明に係る廃水処理方法及び廃水処理装置は、中程度高温条件の廃水を、上述した微生物で処理することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、廃水等に含まれる硝酸イオンを基質として脱窒することができる新規な微生物を提供することができる。特に、本発明に係る新規な微生物は、中程度高温条件下においても硝酸イオンを基質として脱窒することができる。本発明に係る新規な微生物を利用することによって、廃水等に含まれる窒素成分を除去することができる廃水処理方法及び廃水処理装置を提供することができる。これら廃水処理方法及び廃水処理装置においては、処理対象の廃水温度を中程度高温条件とすることができるため、脱窒効率に優れるとともに低コスト化を実現することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る新規微生物は、ジオバチルス（Geobacillus）属に属し、硝酸イオンを基質としてN2ガスを生成する能力を有している。本発明に係る新規微生物は、Geobacillus kaue及びGeobacillus uzenensisとは異なる、ジオバチルス属の新種に分類される。本発明に係る新規微生物は、中程度高温条件下、すなわち処理対象の溶液の温度が37〜60℃、好ましくは50〜60℃で、硝酸イオンを基質としてN2ガスを生成する能力を発現することができる。
【００１９】
当該新種に属する微生物は、例えば、下水処理場の嫌気層の活性汚泥、田畑、河川水・底土等の環境から単離することができる。具体的な手法としては、先ず、上記各種環境から採取したサンプルを、中程度高温条件下で培養し、脱窒能の有無を基準に選択を行う。ここで、サンプルは、嫌気的条件で保管することが好ましい。また、対象の微生物について脱窒能を検討する際には、従来公知の手法、すなわち、培養液中の硝酸及び亜硝酸の濃度低下をモニターする方法を適用することができる。例えば、硝酸及び亜硝酸の検出には、Griess-romijn(GR)試薬を用いることができる。GR試薬にはGriess-romijn nitrate試薬とGriess-romijn nitrite試薬があり、それぞれ硝酸と亜硝酸を検出することができる。より具体的には、培養液を遠心分離(例えば15000rpm、15分間、室温)し、上清を試験管に回収してGR nitrate試薬またはGR nitrite試薬を少量入れて混合後、静置して色の変化を観察することで、培養液中の硝酸イオンまたは亜硝酸イオンを検出することができる。硝酸イオン及び亜硝酸イオンの量により、溶液は透明から薄桃、濃い赤色に呈色する。
【００２０】
本発明に係る微生物を用いることで、新規な廃水処理方法及び廃水処理装置を構築することができる。すなわち、上記微生物を利用して処理対象の廃水を脱窒するものであれば、処理ステップ、装置構成の相違に拘わらず全て本発明に係る廃水処理方法及び廃水処理装置に含まれる。
【００２１】
廃水処理装置としては、例えば、図１に示すように、本発明に係る微生物による脱窒を行う脱窒槽１と、硝化槽２と、脱窒槽１に対して熱を供給するコージェネレーション装置３と、脱窒槽１で脱窒した結果として生じた窒素ガスを除去するための曝気槽４とを備える。コージェネレーション装置３とは、一つのエネルギーから複数のエネルギーを取り出すシステムであり、例えば、エンジン、タービン及び/又は燃料電池（FC）等を挙げることができる。これらエンジン、タービン及び/又は燃料電池（FC）等のコージェネレーション装置３は、電気エネルギーの他に排熱回収による熱エネルギーを生じる。図１に示す廃水処理装置においては、コージェネレーション装置３で生じた熱エネルギーを脱窒槽１内の廃液に供給するような構成となっている。なお、コージェネレーションからの熱量が、脱窒槽の加温のための熱量より少ない場合は、付属のボイラ等で不足分の加熱を行うことも可能である。
【００２２】
図１に示す廃水処理装置においては、先ず、硝化槽２に処理対象の廃水を供給し、その後、硝化槽２で廃水に対して空気を導入して廃水中のアンモニウムイオンを硝酸イオンに硝化する。具体的には、硝化槽２内部では、好気的条件下で硝化能を有する微生物により硝化反応が進行する。硝化能を有する微生物としては、特に種を限定するものではなく、アンモニア性の窒素を硝酸イオンへと消化する硝酸化成菌であれば良い。一例としては、アンモニアから亜硝酸への酸化、及び亜硝酸から硝酸への酸化は、Nitrosomonas属細菌、Nitrobacter属細菌、Nitrococcus属細菌等を利用して行うことができる（大森俊雄編著、環境微生物学、ｐ25-28、昭晃堂、2000年）。アンモニウムイオンを硝酸イオンに硝化した後の廃水は、硝化槽２から脱窒槽１に供給される。
【００２３】
次に、脱窒槽１において、上述した新規微生物により、廃水中に含まれる硝酸イオンを基質とする脱窒反応を進行させる。図１に示す廃水処理装置では、都市ガス等を燃料としたコージェネレーション装置３からの熱エネルギーが脱窒槽１に供給され、脱窒槽１内の廃液を中程度高温条件とする。脱窒槽１では、中程度高温条件下で廃水中に含まれる硝酸イオンを基質として脱窒反応を実行することができる。
【００２４】
本発明に係る廃水処理装置においては、従来と比較して高温条件下で脱窒反応を行うことができるため、優れた反応効率を達成することができる。したがって、本発明に係る廃水処理装置は、脱窒槽１の小型化することも可能であり、低コスト化することができる。さらに、高温ではガス成分の溶解度が低下することから、脱窒反応の結果として生ずる窒素ガスを効率よく除去することができる。
【００２５】
なお、本発明に係る廃水処理装置は、図１に示す構成に限定されず、例えば図２に示すように、コージェネレーション装置３からの熱エネルギーを、硝化槽２に導入する空気にも与えるような構成を有していてもよい。図２に示す廃水処理装置においても、コージェネレーション装置３からの熱エネルギーによって、硝化槽２内の廃液を中程度高温条件とすることができる。その結果、図２に示す廃液処理装置でも、同様に、脱窒槽１では、中程度高温条件下で廃水中に含まれる硝酸イオンを基質として脱窒反応を実行することができる。図２に示す廃液処理装置は、空気の加温を行うため硝化槽２の温度低下を抑制することができるため、硝化槽２の反応効率を高められるとともに、脱窒槽１の流入部の温度低下を抑制することが可能になる。
【００２６】
また、本発明に係る廃液処理装置は、廃液の温度を制御する手段としてコージェネレーション装置３を有するものに限定されず、例えば図３及び４に示すように、廃液の温度を制御する手段としてボイラ５を有するような構成であってもよい。図３又は４に示す廃液処理装置でも、同様に、脱窒槽１では、中程度高温条件下で廃水中に含まれる硝酸イオンを基質として脱窒反応を実行することができる。
【００２７】
さらに、本発明に係る廃液処理装置をメタン発酵の廃液（消化残渣液）の処理に使用する場合は、図５及び６に示すような構成をとるのが望ましい。メタン発酵槽６と、メタン発酵槽６に接続された固液分離装置７とを更に備え、メタン発酵槽６で生成したメタン等のバイオガスをコージェネレーション装置３或いはボイラ５に供給する。メタン発酵槽６でメタン発酵したした後の廃液（消化液残渣）は、固液分離装置７での処理が行われ、分離された液分が硝化槽２に供給される。図５及び６に示す廃液処理装置においては、固液分離装置７の手前に貯留槽を設けても良い。また、必要に応じて、固液分離装置７は省略することもできる。図５及び６に示す廃液処理装置においては、コージェネレーション装置３或いはボイラ５の駆動に必要な燃料の少なくとも一部をメタン発酵槽６で生成したバイオガスで賄うことができる。なお、コージェネレーション装置３或いはボイラ５の駆動に必要な燃料としては、メタン発酵槽６で生成したバイオガスに加えて都市ガス等を混合して供給しても良い。図５及び６に示す廃液処理装置においても、同様に、脱窒槽１では、中程度高温条件下で廃水中に含まれる硝酸イオンを基質として脱窒反応を実行することができる。メタン発酵においては、中温〜高温（35〜60℃）で発酵が行われるため、廃水（消化液残渣）の温度が高く、図５及び６に示す廃液処理装置では、図１〜４の排水処理装置に比べ、脱窒槽１へ供給すべき熱量は低減する。なお、図５及び６に示す装置は、図２及び図４と同様に硝化槽２へ供給する空気を加熱しても良い。
【００２８】
以上、説明した廃水処理装置及び廃水処理方法は、開放系（実験室内のような閉鎖系に対して）で行われる微生物プロセスとすることができる。一般的に開放系で微生物プロセスを実施した場合には、常に周辺環境から多くの微生物が混入し、その廃水処理装置内の環境に応じた微生物生態系が形成される。また、この微生物生態系は比較的安定ながら緩やかに変遷を続けている。
【００２９】
本発明に係る廃水処理装置及び廃水処理方法においては、特に、脱窒槽１内の温度が37〜60℃、好ましくは50〜60℃といった中程度高温条件下で処理している。このため、本発明に係る廃水処理装置及び廃水処理方法では、周辺環境から混入する微生物のほとんどは増殖できず、開放系とした場合であっても純粋培養に近いプロセスを実現することが可能である。
【００３０】
また、本発明に係る廃水処理装置及び廃水処理方法においては、脱窒槽１内の温度が37〜60℃、好ましくは50〜60℃といった中程度高温条件下で処理していることで、脱窒槽１内における気体の水への溶解度を低くすることができる。従って、嫌気条件で行う脱窒においては、脱窒槽１内の溶存酸素濃度の低下が期待でき、嫌気条件をより作りやすくなる。また、脱窒槽１内に発生する窒素ガスの溶解度も常温に比べてより低くなるため、反応性生物である窒素ガスが系外に放出されることで、反応の平衡がより窒素ガス生成に傾くことになる。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３２】
〔実施例１〕新規微生物の単離、同定
培養条件
微生物の分離源として、下水処理場の嫌気層の活性汚泥、さいたま市内の田畑、河川水・底土等を用いて集積培養による脱窒菌の単離を試みた。用いた微生物分離源は以下の通りである。
土壌：さいたま市内の田畑土壌約50ヶ所
河川水・底土：芝川および生活排水路６ヶ所
活性汚泥：西部第２下水処理場嫌気槽
【００３３】
土壌は採取後直ちにチャック付きビニール袋に入れて密閉し、２−３日中に使用した。河川水、底土、活性汚泥はペットボトル等を用いて容量ぎりぎりまで採取し、なるべく空気に触れないようにした。さらにアスコルビン酸を少量添加し、２−３日中に使用するか、使用時まで冷蔵保存した。脱窒反応は嫌気的な条件で起こるため、サンプルの採取と保存においては酸素に触れることがないように注意した。
【００３４】
培地の組成は表４に示した。脱窒反応では微生物が生育するための炭素源が必要である。本実験では炭素源としてコハク酸を用いた。
【００３５】
【表４】
2006238794.tif 000005
【００３６】
微生物の取得には500ml容枝付き三角フラスコ又は100m1容褐色バイアル瓶を用いた。500ml容枝付き三角フラスコには400mlの培地を作成・分注後、微生物源を添加した。ブチルゴム栓等で密閉し、アルゴンガスを用いて気相を置換して嫌気状態にして培養を行った。培養は120rpm、30℃あるいは60℃の条件で２日−１週間振とう下にて行った。菌体の生育が認められた培養液については、硝酸イオン、亜硝酸イオンをGriess-romijn試薬で検出した。脱窒反応の認められたサンプルは新たな培地に植継ぎ、再び２日−１週間の培養を行った。
【００３７】
100ml容褐色バイアル瓶には70mlの培地を作成し、ダーラム管と微生物源を添加した。ダーラム管を入れると微生物が生産するガスを捕集して観察することができる。ブチルゴム栓等で密閉し、アルゴンガスを用いて気相を置換して嫌気状態にした。30℃あるいは60℃の恒温槽で２日−１週間静置培養を行った。菌体の生育が認められた培養液については、硝酸イオン、亜硝酸イオンをGriess-romijn試薬で検出した。脱窒反応の認められたサンプルは新たな培地に植継ぎ、再び２日−１週間の培養を行った。
【００３８】
分析方法
硝酸イオンと亜硝酸イオンの検出にはGriess-romijn(GR)試薬を用いた。GR試薬にはGriess-romijn nitrate試薬とGriess-romijn nitrite試薬があり、それぞれ硝酸と亜硝酸を検出するのに用いる。各イオンの量により透明から薄桃、濃い赤色に呈色する。培養液を遠心分離(15000rpm、15分間、室温)し、上清を試験管に回収してGR nitrate試薬またはGR nitrite試薬を少量入れて混合後、静置して色の変化を観察した。
【００３９】
実験結果
30℃で菌体生育が認められたサンプルについて、GR試薬による硝酸と亜硝酸の検出を行った。培地には硝酸が添加されているので、脱窒が進めば硝酸は減少する。また硝酸が亜硝酸に還元されるのみの反応では亜硝酸も検出される。脱窒が進んだ場合には硝酸(−)かつ亜硝酸(−)が観察される。結果を表５にまとめた。
【００４０】
【表５】
2006238794.tif 000006
【００４１】
表５から判るように、No.２−４のサンプルに脱窒能が認められ、特にNo.２とNo.４には強い脱窒能が期待された。
【００４２】
次に、60℃で菌体生育が認められ、ガスの発生も認められたサンプルについて検討した。すなわち、ダーラム管内に気体が捕集されているか、培地の表面に泡が発生しているサンプルについて、GR試薬による硝酸と亜硝酸の検出を行った。結果を表６に示した。
【００４３】
【表６】
2006238794.tif 000007
【００４４】
表６から判るように、No.５−７のサンプルに脱窒能が認められ、特にNo.５には強い脱窒能が期待された。またNo.２−４はやや弱いながらも脱窒を行っている可能性があった。
【００４５】
微生物の単離は希釈平板培養法を用いた。BM培地にGellum  gumを7％添加して平板固体培地を作成した。脱窒反応が確認されている混合微生物系を滅菌水にて適宜希釈して、固体平板培地に塗沫後、60℃で嫌気的に培養を行った。
【００４６】
次に、脱窒能が認められたサンプルから以下のようにして脱窒能を有する微生物を単離した。具体的には、先ず、数日間、固体平板培地を観察して、コロニー（1つの細胞より増殖したと考えられる微生物の集団。通常、直径数ｍｍの円形状として観察される）形成が見られたものから、順次コロニーを採取して、新鮮な培地に植菌して保存用サンプルとした。
【００４７】
保存したサンプルは再度液体培養に供し、60℃での脱窒反応の有無を硝酸からのガス発生を指標に確認した。脱窒反応が確認されたサンプルは再度、滅菌水にて適宜希釈して、固体平板培地に塗沫後、60℃で嫌気的に培養を行った。肉眼観察によって単一細菌であることを確認し、再度コロニーを採取して、新鮮な培地に植菌して保存用サンプルとした。この一連の操作を数回繰り返して、脱窒活性の安定した純粋な微生物サンプルを得た。
【００４８】
以上の実験から、60℃の温度条件で安定的に生育し、硝酸から窒素ガスを生成する能力を有する微生物を5菌株取得した。各々をTDN-01株からTDN-05株とした。脱窒活性が安定し、比較的高かったTDN-01株、TDN-02株及びTDN-03株の3菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に2005年2月18日に、それぞれ受領番号FERM AP-20412、FERM AP-20413及びFERM AP-20414として寄託した。
【００４９】
また、これらTDN-01株からTDN-05株のゲノムDNAを抽出して、16S-ｒDNAの塩基配列を決定した。16S-ｒDNAの塩基配列の決定（シークエンス）方法は、「微生物学実験法（杉山ら編、講談社、1999年）」のｐ180-183およびｐ239-244に記載してある一般的なジデオキシ法を基本とした。この方法は目的とする微生物の16S-ｒDNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅しながら、ジデオキシヌクレオチド三リン酸の添加によってランダムな長さを有するDNA断片を取得し、これをシークエンスするものである。
PCRに用いたプライマーは表７に示した。
【００５０】
【表７】
2006238794.tif 000008
【００５１】
上記プライマー及びゲノムDNAを含む反応液を、96℃で30秒処理した後、96℃で30秒、50℃で5秒及び60℃で2分からなるサイクルを25サイクル処理し、その後、60℃で2分処理した。反応後は反応液は4℃で保存した。得られたDNA断片の配列決定は、自動シークエンス装置（ABI  PRISMTM   310NT  Genetic Analyzer）にて行った。上記複数のプライマーを用いたシークエンスデータを繋ぎ合わせて、約500塩基対（大腸菌の16S-ｒDNAにおける5‘側より10番目から500番目付近）のデータとした。
【００５２】
以上により決定した、TDN-01株の16S rDNAの塩基配列を配列番号１に示し、TDN-02株の16S rDNAの塩基配列を配列番号２に示し、TDN-03株の16S rDNAの塩基配列を配列番号３に示し、TDN-04株の16S rDNAの塩基配列を配列番号４に示し、TDN-05株の16S rDNAの塩基配列を配列番号５に示した。
【００５３】
これら配列番号１〜５に示す塩基配列をもとにデータベース（GenBank/DDBJ/EMBL）及びホモロジー検索ソフト（BLAST）を用いてホモロジー検索したところ、いずれも相同性97-99％でGeobasillus属細菌に類縁と判断された。TDN-01株からTDN-05株の16S-ｒDNAの部分塩基配列に基づいて各菌株間の相同性を計算したところ、96-99％の相同性を示した。近縁種との系統樹図を作成した結果を図７に示す。系統樹図からは、TDN-01株、TDN-02株およびTDN-03株は他のGeobasillus属細菌と明らかに別のグループ（クラスター）を形成しており、さらに他のGeobasillus属細菌のクラスターとの分岐が根（各分岐が1つになる場所）に近い。このことはTDN-01株、TDN-02株およびTDN-03株が分子進化的には早い時期（年代としてはより古い時期）に分岐したことを示している。従って、これらTDN-01株、TDN-02株およびTDN-03株は、Geobasillus属に属する新属であると結論付けられた。なお、一般的に16S-rDNAで99.8％以上の相同性を有するものが同一の種であると考えられている（杉山ら編、新版微生物学実験法、ｐ241-242、講談社サイエンティフィク、1999年）。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明を適用した廃水処理装置の一例を示すブロック図である。
【図２】本発明を適用した廃水処理装置の一例を示すブロック図である。
【図３】本発明を適用した廃水処理装置の一例を示すブロック図である。
【図４】本発明を適用した廃水処理装置の一例を示すブロック図である。
【図５】本発明を適用した廃水処理装置の一例を示すブロック図である。
【図６】本発明を適用した廃水処理装置の一例を示すブロック図である。
【図７】TDN-01株、TDN-02株並びにTDN-03株及び近縁種を含む系統樹図である。
【符号の説明】
【００５５】
１…脱窒槽、２…硝化槽、３…コージェネレーション装置、４…曝気槽、５…ボイラ、６…メタン発酵槽、７…固液分離装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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