(57)【要約】【課題】  破骨細胞を効率的に機能させることにより、リン酸カルシウム多孔体の吸収を早め、骨芽細胞による骨基質の形成を促進して、骨組織のリモデリングの速度を向上する。【解決手段】  リン酸カルシウム多孔体２に粉末状の象牙質物質３を含有させてなる骨補填材１を提供する。  本発明に係る骨補填材１によれば、破骨細胞を活性化して、リン酸カルシウム多孔体２の吸収を促進し、代謝を促進して骨欠損部を早期に修復することができるという効果がある。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸カルシウム多孔体に粉末状の象牙質物質を含有させてなる骨補填材。
【請求項２】
リン酸カルシウム多孔体に破骨細胞遊走因子を含有させてなる骨補填材。
【請求項３】
破骨細胞分化因子を含有させてなる請求項２に記載の骨補填材。
【請求項４】
リン酸カルシウム多孔体に、骨芽細胞と、破骨細胞またはその前駆細胞とを含有させてなる骨補填体。
【請求項５】
リン酸カルシウム多孔体に骨芽細胞と破骨細胞遊走因子とを含有させてなる骨補填体。
【請求項６】
破骨細胞分化因子を含有させてなる請求項５に記載の骨補填体。
【請求項７】
粉末状の象牙質物質を含有させてなる請求項４から請求項６のいずれかに記載の骨補填体。
【請求項８】
間葉系幹細胞を含む細胞懸濁液をリン酸カルシウム多孔体に播種して培養し、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させるステップと、
粉末状の象牙質物質とともに破骨細胞またはその前駆細胞を培養するステップと、
骨芽細胞を含有するリン酸カルシウム多孔体に、培養された破骨細胞を播種するステップとを備える骨補填体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、骨補填材、骨補填体およびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨細胞に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを吸収し、骨芽細胞が新しい骨を形成する、いわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄間葉系細胞を骨補填材とともに培養することにより製造される培養骨を使用することが提案されている。培養されることにより骨補填材を足場にして増殖した多くの骨髄間葉系細胞を含む培養骨を骨欠損部に補填するので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【非特許文献１】植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、患者にかかる負担をさらに低減するためには、術後の骨欠損部の修復速度をさらに高めることが必要であり、新たに骨基質を形成する骨芽細胞の活性化を図るのみならず、β−ＴＣＰを吸収する破骨細胞を効率的に機能させあるいは破骨細胞を活性化させて代謝の促進を図ることが必要である。
【０００５】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、破骨細胞を効率的に機能させることにより、リン酸カルシウム多孔体の吸収を早め、骨芽細胞による骨基質の形成を促進して、骨組織のリモデリングの速度を向上することができる骨補填材、骨補填体およびその製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、リン酸カルシウム多孔体に粉末状の象牙質物質を含有させてなる骨補填材を提供する。
象牙質物質は、リン酸カルシウム、コラーゲンタンパク質およびＳｒ、Ｂｒ、Ｚｎなどの金属を含有しているため、これに接触する骨芽細胞や破骨細胞の成長を促進する作用がある。したがって、本発明の骨補填材に骨芽細胞や破骨細胞を播種することにより、迅速に吸収されかつ迅速に骨基質が形成される培養骨を製造することができる。また、本発明の骨補填材をそのまま生体内の骨欠損部に補填することにより、周囲の骨芽細胞や破骨細胞の成長を促進して、骨欠損部の迅速な修復を行うことが可能となる。この場合に、象牙質物質を粉末状に形成することで、骨補填材内に均一に分布するように含有させることができ、各部位における均一な代謝を図ることができる。
【０００７】
また、本発明は、リン酸カルシウム多孔体に破骨細胞遊走因子を含有させてなる骨補填材を提供する。
本発明に係る骨補填材を骨欠損部に補填することにより、破骨細胞遊走因子の作用により、生体内に存在する破骨細胞の前駆細胞をリン酸カルシウム多孔体の近傍に誘引することができる。破骨細胞の前駆細胞は、生体内に存在するので、破骨細胞遊走因子が存在しなくても、時間をかけることによりリン酸カルシウム多孔体近傍に浮遊してくるが、破骨細胞遊走因子によって積極的に誘引することにより、早期に破骨細胞によるリン酸カルシウム多孔体の吸収を開始させることができる。誘引された破骨細胞の前駆細胞は、生体内に存在する骨芽細胞から供給される破骨細胞分化因子の作用により、成熟破骨細胞に分化させられて、リン酸カルシウム多孔体の吸収を開始するようになる。破骨細胞遊走因子としては、例えば、Ｍ−ＣＳＦ（Macrophage-Colony
Stimulating Factor）が挙げられる。
【０００８】
上記発明においては、破骨細胞分化因子を含有させてなることが好ましい。破骨細胞分化因子は骨芽細胞から供給されるが、予めリン酸カルシウム多孔体に含有させておくことにより、骨芽細胞からの供給を待たずに、破骨細胞の前駆細胞を成熟破骨細胞に分化させることができ、早期にリン酸カルシウム多孔体の吸収を開始させることが可能となる。
破骨細胞分化因子としては、例えば、ｓＲＡＮＫＬ（soluble Receptor Activator of
Nuclear factor-kB Ｌigand
）が挙げられる。
【０００９】
また、本発明は、リン酸カルシウム多孔体に、骨芽細胞と、破骨細胞またはその前駆細胞とを含有させてなる骨補填体を提供する。
本発明に係る骨補填体によれば、リン酸カルシウム多孔体を吸収する破骨細胞またはその前駆細胞と、骨基質を形成する骨芽細胞とが予め含有されているので、骨組織の欠損部に補填することにより、破骨細胞によるリン酸カルシウム多孔体の吸収と、骨芽細胞による骨基質の形成とがバランスよく行われ、代謝が促進されて、早期に骨組織に置き換えて、欠損部を修復することができる。骨芽細胞は、破骨細胞遊走因子や破骨細胞分化因子を分泌するので、破骨細胞の前駆細胞が予め含有されている場合においても、成熟破骨細胞への分化が促進され、同様に、早期に骨欠損部を修復することができる。
【００１０】
また、本発明は、リン酸カルシウム多孔体に、骨芽細胞と、破骨細胞遊走因子とを含有させてなる骨補填体を提供する。
本発明に係る骨補填体によれば、骨組織の欠損部に補填することにより、破骨細胞遊走因子の作用により、生体内に存在する破骨細胞の前駆細胞をリン酸カルシウム多孔体の近傍に誘引することができる。これにより、早期に破骨細胞によるリン酸カルシウム多孔体の吸収を開始させることができる。誘引された破骨細胞の前駆細胞は、リン酸カルシウム多孔体内に含有されている骨芽細胞から供給される破骨細胞分化因子の作用により、成熟破骨細胞に分化させられてリン酸カルシウム多孔体の吸収を開始するようになる。
【００１１】
上記発明においては、破骨細胞分化因子を含有させてなることが好ましい。
破骨細胞分化因子を予め含有させておくことにより、骨芽細胞からの破骨細胞分化因子の供給を待たずに、破骨細胞遊走因子により誘引されてきた破骨細胞の前駆細胞を成熟破骨細胞に分化させることができ、早期にリン酸カルシウム多孔体の吸収を開始させることが可能となる。
【００１２】
また、上記発明においては、粉末状の象牙質物質を含有させてなることが好ましい。
本発明によれば、象牙質物質により活性化された破骨細胞によって、リン酸カルシウム多孔体が迅速に吸収され、また、象牙質物質により活性化された骨芽細胞によって、骨基質が迅速に形成される。これにより、骨欠損部の迅速な修復を行うことが可能となる。この場合に、象牙質物質を粉末状に形成することで、骨補填体内に均一に象牙質物質を分布させ、各部位における均一な代謝を図ることができる。
【００１３】
また、本発明は、間葉系幹細胞を含む細胞懸濁液をリン酸カルシウム多孔体に播種して培養し、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させるステップと、粉末状の象牙質物質とともに破骨細胞またはその前駆細胞を培養するステップと、骨芽細胞を含有するリン酸カルシウム多孔体に、培養された破骨細胞を播種するステップとを備える骨補填体の製造方法を提供する。
【００１４】
本発明によれば、リン酸カルシウム多孔体に播種されて培養された間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化させられることにより骨基質を産生する。一方、粉末状の象牙質物質とともに培養された破骨細胞またはその前駆細胞は、象牙質物質の作用により増殖させられるとともに、その機能を活性化させられる。そして、このような破骨細胞またはその前駆細胞を骨芽細胞を含有するリン酸カルシウム多孔体に播種することにより、早期にリン酸カルシウムの吸収を開始する骨補填体が製造される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、破骨細胞を活性化して、リン酸カルシウム多孔体の吸収を促進し、代謝を促進して骨欠損部を早期に修復することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の一実施形態に係る骨補填材１について、図１および図２を参照して説明する。
本実施形態に係る骨補填材１は、立方体ブロック状のβ−ＴＣＰ多孔体２に、粉末状の象牙質物質３を含有した構造のものである。
【００１７】
象牙質物質３としては、象牙、歯等が挙げられる。象牙質物質３は、ハイドロキシアパタイトを主成分として、コラーゲンタンパク質およびＳｒ，Ｂｒ，Ｚｎ等の金属を若干量含有している。象牙質物質３は、例えば、１００μｍ〜１ｍｍ程度の平均粒径を有するように粉末化されている。粉末状の象牙質物質３は、例えば、凍結粉砕や機械的粉砕法により、含有されるコラーゲンタンパク質等を変性させるような熱を加えることなく製造することができる。
【００１８】
本実施形態に係る骨補填材１を製造するには、まず、例えば、図２（ａ）に示されるように、浅底の箱状容器４内に、粉末状のβーＴＣＰと粉末状の象牙質物質とを混合し所定の媒体に混合してなるスラリー５を所定の深さになるまで注入し、これを焼結する。これにより、同図（ｂ）に示されるように、平板状のβ−ＴＣＰ多孔体６を製造する。次いで、これを賽の目に切断することにより同図（ｃ）に示されるように立方体ブロック状のβ−ＴＣＰ多孔体２に粉末状の象牙質物質３を均一に含有してなる本実施形態の骨補填材１が得られる。
【００１９】
このように構成された本実施形態に係る骨補填材１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る骨補填材１には、象牙質物質３が含有されているので、象牙質物質３の成分であるハイドロキシアパタイトにより、細胞の接着性が確保されている。また、象牙質物質３に若干量含有されているＳｒ，Ｂｒ，Ｚｎ等の金属によって、細胞の増殖が促進される作用がある。
【００２０】
すなわち、本実施形態に係る骨補填材１によれば、純粋なβ−ＴＣＰ多孔体からなる骨補填材と比較して、細胞の増殖を促進することができるという効果を有する。したがって、本実施形態に係る骨補填材１をそのまま、生体内の骨欠損部に補填すると、骨欠損部の周囲に存在する破骨細胞および骨芽細胞が象牙質物質３によって活性化させられる。その結果、破骨細胞によるβ−ＴＣＰ多孔体の吸収が促進され、かつ、骨芽細胞による骨基質の産生が促進されて、β−ＴＣＰ多孔体が迅速に骨組織に置き換えられていくことになる。
【００２１】
特に、象牙質物質３がブロック状のβ−ＴＣＰ多孔体２の内部にまで均一に分散するように含有されているので、β−ＴＣＰ多孔体２の内部にまで浸透した細胞に対しても、象牙質物質３による成長促進効果を達成することができる。
【００２２】
なお、本実施形態に係る骨補填材１は、象牙質物質３を粉末状にしてβ−ＴＣＰと混合したスラリーを焼結することにより製造しているが、これに代えて、象牙質物質３を含まないβ−ＴＣＰを含有するスラリーを焼結してβ−ＴＣＰ多孔体２を製造した後に、１００μｍ〜１ｍｍ程度の平均粒径を有するように粉砕した粉末状の象牙質物質３をβ−ＴＣＰ多孔体２の表面に振りかけることにしてもよい。象牙質物質３の成分であるコラーゲンタンパク質は、細胞が産生する細胞外基質を構成する成分であり、これに接触する細胞の接着性を増大させる作用がある。このようにすることで、象牙質物質３を過熱させないので、象牙質物質３の一成分であるコラーゲンタンパク質を変性させることなく骨補填材１を製造でき、コラーゲンタンパク質による細胞の接着性増大作用をも発揮させることができる。
【００２３】
次に、本発明の第２の実施形態に係る骨補填材について説明する。
以下の説明においては、上述した第１の実施形態の説明と共通する構成要素に同一符号を付して説明を省略する。
本実施形態に係る骨補填材は、β−ＴＣＰ多孔体２に、破骨細胞遊走因子を含有させたものである。破骨細胞遊走因子としては、例えば、Ｍ−ＣＳＦが挙げられる。
このように構成された本実施形態に係る骨補填材を生体内の骨欠損部に補填すると、破骨細胞遊走因子の作用により、骨欠損部の周囲に浮遊している破骨細胞の前駆細胞が誘引されてきて、β−ＴＣＰ多孔体２に接着するようになる。骨欠損部の周囲には骨芽細胞も存在しているので、骨芽細胞がβ−ＴＣＰ多孔体２に接着して骨基質を産生するようになると、同時に分泌される破骨細胞分化因子の作用により、誘引されてきた破骨細胞の前駆細胞が成熟破骨細胞に分化させられて、β−ＴＣＰ多孔体２を吸収するようになる。
【００２４】
すなわち、成熟破骨細胞によるβ−ＴＣＰ多孔体２の吸収と、骨芽細胞による骨基質の産生とが行われることにより、骨欠損部が修復されることになる。この場合において、本実施形態によれば、破骨細胞遊走因子の作用により、破骨細胞の前駆細胞が積極的にβ−ＴＣＰ多孔体２に生着するように誘引されるので、破骨細胞による吸収の開始時期が早められ、したがって、骨欠損部の早期修復が可能となる。
【００２５】
次に、本発明の第３の実施形態に係る骨補填材について説明する。
本実施形態に係る骨補填材は、第２の実施形態に係る骨補填材に、さらに、破骨細胞分化因子を含有させたものである。破骨細胞分化因子としては、ｓＲＡＮＫＬが挙げられる。
このように構成された本実施形態に係る骨補填材を生体内の骨欠損部に補填すると、破骨細胞遊走因子の作用により、骨欠損部の周囲に浮遊している破骨細胞の前駆細胞が誘引されてきて、β−ＴＣＰ多孔体２に接着するようになる。誘引されてきた破骨細胞の前駆細胞は、β−ＴＣＰ多孔体２に含有されている破骨細胞分化因子の作用により、成熟破骨細胞に分化させられて、β−ＴＣＰ多孔体を吸収するようになる。
【００２６】
すなわち、誘引されてきた破骨細胞の前駆細胞を成熟破骨細胞とする破骨細胞分化因子を予め含有させておくことにより、骨芽細胞から破骨細胞分化因子が分泌されるのを待つことなく、さらに早期に、β−ＴＣＰ多孔体２の吸収を開始させることができるという利点がある。
【００２７】
なお、第２、第３の実施形態に係る骨補填材においては、第１の実施形態に係る骨補填材１と同様に、象牙質物質３を含有させておくことが好ましい。破骨細胞遊走因子の作用により、積極的に破骨細胞の前駆細胞を誘引し、破骨細胞分化因子の作用により、成熟破骨細胞の形成を促進することで、β−ＴＣＰ多孔体２の吸収開始を早めるとともに、象牙質物質３の作用により、骨芽細胞および成熟破骨細胞の活性化を図ることにより、代謝を促進して迅速なリモデリングを行うことができるという効果がある。
【００２８】
また、第１〜第３の実施形態に係る骨補填材においては、基材として立方体ブロック状のβ−ＴＣＰ多孔体２を採用したが、これに代えて、顆粒状のβ−ＴＣＰ多孔体２を採用してもよい。このようにすることで、骨欠損部の形状に柔軟に適応して、骨欠損部を隙間なく埋めることができる。
【００２９】
次に、本発明の第１の実施形態に係る骨補填体について、図３を参照して説明する。
本実施形態に係る骨補填体は、立方体ブロック状のβ−ＴＣＰ多孔体２に、骨芽細胞と破骨細胞とを含有している。
【００３０】
骨芽細胞は、例えば、骨髄液から抽出した間葉系幹細胞を一次培養して増殖させた後に、所定の分化誘導因子を添加して培養することにより間葉系幹細胞から分化させたものを用いる。β−ＴＣＰ多孔体２に播種された骨芽細胞を所定期間にわたり培養することにより、骨基質をある程度産生させておくことが効果的である。
また、破骨細胞は、患者の体内から採取したものを播種する。破骨細胞は、あまり多く体内に存在していないので、次の方法により培養して増殖させたものを使用することが好ましい。
【００３１】
破骨細胞の培養は、例えば、図３に示されるように、底面を区画壁１０ａにより区画したシャーレ１０のそれぞれの区画内に、１００μｍ〜１ｍｍ程度の平均粒径を有する粉末状の象牙質物質３を投入し、シャーレ１０内に所定の培地１１を貯留した状態で行う。象牙質物質３は、上述したように、ハイドロキシアパタイトを主成分としているので、細胞の接着性が良好であり、また、残存しているコラーゲンタンパク質により、さらに接着性を向上するため、破骨細胞が容易に接着して成長を開始し易い環境を形成する。また、象牙質物質３は、Ｓｒ，Ｂｒ，Ｚｎのような金属を若干量含有しているため、破骨細胞の増殖を促進する作用がある。このようにして培養することにより、破骨細胞が十分に増殖させられる。
【００３２】
なお、シャーレ１０内の区画壁１０ａは、シャーレ１０を傾斜等させたときに、各区画内に粉末状の象牙質物質３が残るようにしたものであり、必須の構成ではない。また、図４に示されるように、β−ＴＣＰ多孔体２あるいはハイドロキシアパタイトからなるプレート１２をシャーレ１０内に配置し、該プレート１２上において破骨細胞を培養することにしてもよい。プレート１２は平板でもよく、また図３と同様の区画壁１２ａが備えられていてもよい。
【００３３】
破骨細胞をさらに大量に増殖することが望まれる場合には、図５に示されるように、筒状のカラム１３内に粉末状の象牙質物質３を充填し、その両側の出入口に、象牙質物質３よりも細かく破骨細胞より大きな穴を有するフィルタ１４を配置したバイオリアクタ１５を用いることにしてもよい。バイオリアクタ１５の出入口には、培地調製槽１６に接続するチューブ１７，１８が接続されており、入口側チューブ１７の途中位置にはポンプ１９が配置されている。培地調製槽１６内の培地１１内に、患者から採取した破骨細胞を浮遊させておき、ポンプ１９を作動させて培地１１を循環させることにより、破骨細胞を培地１１とともにバイオリアクタ１５内に導く。
【００３４】
バイオリアクタ１５内には象牙質物質３が充填されているので、フィルタ１４を透過してバイオリアクタ１５内に入った破骨細胞は、象牙質物質３の表面に接着して成長を開始する。象牙質物質３は、上述したように破骨細胞の増殖促進作用があるとともに、粉末状に形成されることにより、培養面積が拡大されているため、多量の破骨細胞を得ることができる。フィルタ１４は象牙質物質３より小さい穴を有しているので、カラム１３内から象牙質物質３が漏れ出ないように保持されるようになっている。
【００３５】
得られた破骨細胞は、トリプシンのようなタンパク質分解酵素によって象牙質物質３から分離された形態でβ−ＴＣＰ多孔体２に播種してもよいし、象牙質物質３とともに播種してもよい。象牙質物質３とともに播種することにより、象牙質物質３の有する成長促進効果によって破骨細胞および骨芽細胞の成長が促進されるので好ましい。この場合、象牙質物質３は凍結粉砕することにより、細胞を死滅させておくことができるので、免疫拒絶等の問題も生ずることがない点で好ましい。
【００３６】
このように構成された本実施形態に係る骨補填体によれば、破骨細胞によるβ−ＴＣＰ多孔体２の吸収と、骨芽細胞による骨基質の産生により、骨欠損部への移植後、早期に骨欠損部の修復を開始することができる。
なお、本実施形態に係る骨補填体においては、破骨細胞をβ−ＴＣＰ多孔体２に播種することとしたが、これに代えて、破骨細胞の前駆細胞を播種することにしてもよい。前駆細胞を播種することにより、骨芽細胞から供給される破骨細胞分化因子の作用によって前駆細胞が成熟破骨細胞に迅速に分化され、β−ＴＣＰ多孔体２の吸収が早期に開始される。
【００３７】
また、骨髄液から抽出した間葉系幹細胞を培養工程によって分化させた骨芽細胞をβ−ＴＣＰ多孔体２に播種することとしたが、これに代えて、間葉系幹細胞をβ−ＴＣＰ多孔体２に播種したものを培養して骨芽細胞に分化させてもよい。また、間葉系幹細胞を抽出するのではなく、骨髄液をそのままβ−ＴＣＰ多孔体２に播種したものを培養して、骨芽細胞を形成することにしてもよい。
【００３８】
また、象牙質物質３とともに培養した破骨細胞または破骨細胞の前駆細胞を、象牙質物質３とともにβーＴＣＰ多孔体２に播種することにより、象牙質物質３に含有されている成分による細胞増殖促進作用を利用することとしてもよいが、象牙質物質３の代わりに、Ｓｒ，Ｂｒ，Ｚｎのような金属を若干量含む合金あるいは金属イオンを、単独でβ−ＴＣＰ多孔体に混入させることにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る骨補填材を説明する一部を破断した斜視図である。
【図２】図１の骨補填材を製造する製造工程を説明する図である。
【図３】本発明の第１の実施形態に係る骨補填体の製造方法の内、破骨細胞の培養工程に用いられる培養容器を説明する図である。
【図４】図３の変形例であって、破骨細胞を載置して培養するプレートを示す斜視図である。
【図５】図３の他の変形例であって、バイオリアクタを用いた破骨細胞の培養方法を説明する図である。
【符号の説明】
【００４０】
１  骨補填材
２  βーＴＣＰ多孔体（リン酸カルシウム多孔体）
３  象牙質物質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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