(57)【要約】【課題】  ＳＬＥ患者の自己抗体による免疫原決定基を有するペプチドを提供する。【解決手段】  ＳＬＥ患者の抗体とまったく同様に特異的であるモノクローナル抗体および抗イディオタイプ抗体を形成する。これらのモノクローナル抗体またはＳＬＥ患者の自己抗体それぞれに対する抗イディオタイプ抗体を作る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の体液中で、自己抗体により認識される、抗原または免疫原決定基を有するペプチドにおいて、単一文字符号で表わしたアミノ酸配列が、（１）ＫＰＫＡＡ ＫＰＫＡＡ ＫＰＫＡＡ ＫＰＫＫＡ ＡＰＫＫＫ（２）ＰＥＰＡＫ ＳＡＰＡＰ ＫＫＧＳＫ ＫＡＶＴＫ ＡＱＫＫＤ ＧＫＫＲＫ ＲＳＥＫＥ および（３）ＳＹＳＶＹ ＶＹＫＶＬ ＫＱＶＨＰ ＤＴＧＩＳ ＳＫＡＭＧ ＩＭＮＳＦ ＶＮＤＩＦ ＥＲＩＡＧＥであることを特徴とするペプチド。
【請求項２】
抗原性または免疫原性を実質的に変えないまま、−ＣＯＮ（ＣＨ3）−、−ＣＨ2−ＣＨ2−および−ＣＯ−ＣＨ2−のような改変ペプチド結合および／または１つまたはそれ以上のアミノ酸の挿入および／または除去および／または置換により改変されたペプチドを有する請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
その一部が、少なくとも１つの抗原または免疫原決定基（エピトープ）を有することを特徴とする請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列部分が、ヒストンＨ１のＣ末端領域内および／またはヒストンＨ２ＢのＮ末端領域内に本質的にあることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
ヒストンＨ１の配列部分１８７−２１１または少なくとも１つの抗原もしくは免疫原決定基（エピトープ）を有するその一部を本質的に含むことを特徴とする請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
ヒストンＨ２Ｂの配列部分１−３５または少なくとも１つの抗原もしくは免疫原決定基（エピトープ）を有するその一部を本質的に含むことを特徴とする請求項４に記載のペプチド。
【請求項７】
ヒストンＨ２Ｂの配列部分３６−７６または少なくとも１つの抗原もしくは免疫原決定基（エピトープ）を有するその一部を本質的に含むことを特徴とする請求項４に記載のペプチド。
【請求項８】
末端領域に、自己抗体と交差反応が可能な配列および電荷相同を有する前記請求項１〜請求項７のうちのいずれか１つに記載のペプチド。
【請求項９】
ヒストンＨ２ＢのＮ末端およびヒストンＨ１のＣ末端であることを特徴とする請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
ＳＬＥの診断物質としての前記請求項１〜請求項９のうちのいずれか１つに記載のペプチド。
【請求項１１】
ＳＬＥ患者の自己抗体濃度を測定するための請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
該自己抗体が少なくとも２つのペプチドと交差反応が可能である、ＳＬＥ患者の自己抗体濃度を測定するための請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
ヒストンＨ１とヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ１とヒストンＨ２ＢのＮ末端の少なくとも１つの配列部分、ヒストンＨ２ＢとヒストンＨ１のＣ末端の少なくとも１つの配列部分、またはヒストンＨ１のＣ末端の少なくとも１つの配列部分とヒストンＨ２ＢのＮ末端の少なくとも１つの配列部分の組合せである請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
ヒストンＨ１のＣ末端が、配列部分１８７−２１１を本質的に含み、ヒストンＨ２ＢのＮ末端が、配列部分１−３５および／または３６−７６を本質的に含むことを特徴とする請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
ペプチドまたはペプチドの組合せそれぞれの抗原または免疫原決定基（エピトープ）を認識することを特徴とする請求項１〜請求項１２のうちのいずれか１つに記載の少なくとも１つのペプチドに対するモノクローナル抗体または請求項１３もしくは請求項１４に記載のペプチドの組合せにおけるペプチドに対するモノクローナル抗体。
【請求項１６】
体液内の抗体、更に詳しくは、ＳＬＥ患者の血清内に存在する自己抗体を認識することを特徴とする請求項１に記載の自己抗体または請求項１５に記載のモノクローナル抗体それぞれに対する抗イディオタイプ抗体。
【請求項１７】
ＳＬＥの診断用／または治療用である請求項１６に記載の抗イディオタイプ抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の体液中の自己抗体により認識されることのできる、抗原または免疫原決定基を有するペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
“リューマチ群”疾病は、多数の臨床現象および広範囲の自己抗体を示すという特徴がある。後者は、正常細胞の種々の異なる成分と反応する。この疾病としては、自然に発病するかあるいは薬物により発病する可能性のある全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）が挙げられる。ＳＬＥの場合、細胞核の成分（抗核抗体、ＡＮＡ）に対する自己抗体が特に頻繁に発生する。これらの自己抗体としては、酵素のほか、とりわけ二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＳ−ＤＮＡ）、ヒストン蛋白質、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡとヒストンの複合体などが挙げられる。ヒストンは、多数のクラスの蛋白質、即ち、ヌクレオソーム中に見出されるいわゆるコアヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ５、並びにクロマチン形成時に結合作用をするリンカーヒストンＨ１およびＨ５からなっている。特別の抗原に対する自己抗体の頻度を、いくつかのリューマチ症候群と関連づけようとする試みが、多数行なわれている。
【０００３】
ＳＬＥ患者の場合、ヒストンに対する自己抗体（ＡＨＡ、抗ヒストン自己抗体）が、更に頻繁に発生することが見出されている。患者および健常対照被検者の血清を精製細胞成分（即ち抗原）でテストする場合、通常は、“酵素結合免疫吸着測定法”（ＥＬＩＳＡ）が測定に利用される。なかでも、純ヒストンが、ＳＬＥ血清の試験用抗原として用いられる。
【０００４】
さらに、合成ペプチドまたは天然ヒストンの分解により作られるペプチドが用いられ、これらのペプチドは、該ヒストンの配列部分からなる。
この点に関し、個々のヒストンおよびヒストンペプチドを使用する場合、次のことがわかっている。
（ｉ）ＥＬＩＳＡにおける陽性反応の頻度は、５０％以下である。
（ｉｉ）他のリューマチ病に関連する患者血清の場合における陽性反応の頻度は大きい（偽陽性結果）。
【０００５】
最近、非特許文献１：ＳＬＥ患者のＡＨＡの認識予測値に関する研究から、次の結論が得られた。ＳＬＥ患者の９５％はＬＥ試験で陽性であったが、ＬＥ試験が陽性の患者がＳＬＥにかかっている可能性は、２７％に過ぎなかった。
【０００６】
【非特許文献１】ＳＬＥ患者のＡＨＡの認識予測値に関する研究（ＬＥ細胞試験による、Ｓｍｅｅｎｋ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌ． ５６， ７８−９２ （１９８５））
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、ＳＬＥの診断試験の予測値を改善することができれば、即ち、偽陽性結果に対して真陽性結果の割合を高めることができれば、それは貴重な貢献となるであろう。
【０００８】
さらに、ＳＬＥ患者の抗体とまったく同様に特異的であるモノクローナル抗体および抗イディオタイプ抗体を形成することができれば、そして、これらのモノクローナル抗体またはＳＬＥ患者の自己抗体それぞれに対する抗イディオタイプ抗体（モノクローナル抗体）を作ることができれば、それは有効であろう。
【０００９】
本発明の１つの目的は、これらの目標を達成することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的および／または本明細書、請求範囲からわかる他の目的を達成するために、本発明においては、特に全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の体液中で、自己抗体により認識される、抗原または免疫原決定基を有するペプチドは、単一文字符号（下記参照）で表わしたアミノ酸配列が、（１）ＫＰＫＡＡ ＫＰＫＡＡ ＫＰＫＡＡ ＫＰＫＫＡ ＡＰＫＫＫ（２）ＰＥＰＡＫ ＳＡＰＡＰ ＫＫＧＳＫ ＫＡＶＴＫ ＡＱＫＫＤ ＧＫＫＲＫ ＲＳＥＫＥ および（３）ＳＹＳＶＹ ＶＹＫＶＬ ＫＱＶＨＰ ＤＴＧＩＳ ＳＫＡＭＧ ＩＭＮＳＦ ＶＮＤＩＦ ＥＲＩＡＧＥであることを本質的に特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の更に有利な展開および便利な形態は、その後の請求範囲および次の記載からわかるであろう。
【００１２】
次の天然および合成ペプチドを試験した（下記のように、単一文字符号で表わす）。
ＧＬＹ＝Ｇ、ＡＬＡ＝Ａ、ＶＡＬ＝Ｖ、ＬＥＵ＝Ｌ、ＩＬＥ＝Ｉ、ＰＨＥ＝Ｆ、ＰＲＯ＝Ｐ、ＳＥＲ＝Ｓ、ＴＨＲ＝Ｔ、ＣＹＳ＝Ｃ、ＭＥＴ＝Ｍ、ＴＲＰ＝Ｗ、ＴＹＲ＝Ｙ、ＡＳＮ＝Ｎ、ＧＬＮ＝Ｑ、ＡＳＰ＝Ｄ、ＧＬＵ＝Ｅ、ＬＹＳ＝Ｋ、ＡＲＧ＝Ｒ、ＨＩＳ＝Ｈ
【００１３】
ヒストンＨ１ペプチドＨ１ Ｎ末端：３−３１ＡＰＡＡＰ ＡＡＡＰＰ ＡＥＫＴＰ ＶＫＫＫＡ ＡＫＫＰＡ ＧＡＨ１：５５−７５ＲＳＧＶＳＬＡＡＬＫ ＫＡＬＡＡ ＡＧＹＤＶＥＨ１：９７−１１６ＴＫＧＴＧ ＡＳＧＳＦ ＫＬＮＫＫ ＡＡＳＧＥＨ１：７６−１１６ＫＮＮＳ ＲＩＫＬＧ ＬＫＳＬＶ ＳＫＧＴＬ ＶＥＴＫＧ ＴＧＡＳＧ ＳＦＫＬＮ ＫＫＡＡＳ ＧＥＨ１：６６−１１６ＡＬＡＡ ＡＧＹＤＶ ＥＫＮＮＳ ＲＩＫＬＧ ＬＫＳＬＶ ＳＫＧＴＬ ＶＥＴＫＧ ＴＧＡＳＧ ＳＦＫＬＮ ＫＫＡＡ ＳＧＥＨ１：５５−１６６ＲＳＧＶＳ ＬＡＡＬＫ ＫＡＬＡＡ ＡＧＹＤＶ ＥＫＮＮＳ ＲＩＫＬＧＬＫＳＬＶ ＳＫＧＴＬ ＶＥＴＫＧ ＴＧＡＳＧ ＳＦＫＬＮ ＫＫＡＡＳＧＥＨ１ Ｃ末端：１８７−２１１ＫＰＫＡＡ ＫＰＫＡＡ ＫＰＫＡＡ ＫＰＫＡＡ ＡＰＫＫＫ
【００１４】
ヒストンＨ２ＢペプチドＨ２Ｂ：１−３５ＰＥＰＡＫ ＳＡＰＡＰ ＫＫＧＳＫ ＫＡＶＴＫ ＡＱＫＫＤ ＧＫＫＲＫＲＳＥＫＥＨ２Ｂ：３６−７６ＳＹＳＶＹ ＶＹＫＶＬ ＫＱＶＨＰ ＤＴＧＩＳ ＳＫＡＭＧ ＩＭＮＳＦＶＮＤＩＦ ＥＲＩＡＧ ＥＨ２：７７−９３ＡＳＲＬＡ ＨＹＮＫＲ ＳＴＩＴＳ ＲＥＨ２Ｂ：９４−１０５ＩＱＴＡＶ ＲＬＬＬＰ ＧＥＨ２Ｂ：１０６−１１３ＬＡＫＨＡ ＶＳＥＨ２Ｂ：１１３−１２５ＧＴＫＡＶ ＴＫＹＴＳ ＳＫＨ２Ｂ：Ｎ末端１−２１ＰＥＰＡＫ ＳＡＰＡＰ ＫＫＧＳＫ ＫＡＶＴＫＡＨ２Ｂ：Ｎ末端４−１１ＡＫＳＡＰＡＰＫ
【００１５】
ヒストンＨ２ＡペプチドＨ２Ａ Ｎ末端ＳＧＲＧＫ ＱＧＧＫＡ ＲＡＫＡＫ ＴＲＳＳＲ ＡＧ
【００１６】
ヒストン配列Ｈ２Ａ：ＳＧＲＧＫ ＱＧＧＫＡ ＲＡＫＡＫ ＴＲＳＳＲ ＡＧＬＱＦ ＰＶＧＲＶ ＨＲＬＬＲ ＫＧＮＹＡ ＥＲＶＧＡ ＧＡＰＶＹ ＬＡＡＶＬ ＥＹＬＴＡ ＥＬＬＥＬ ＡＧＮＡＡ ＲＤＮＫＫ ＴＲＩＩＰ ＲＨＬＱＬ ＡＩＲＮＤ ＥＥＬＮＫ ＬＬＧＫＶ ＴＩＡＱＧ ＧＶＬＰＮ ＩＱＡＶＬ ＬＰＫＫＴ ＥＳＨＨＫ ＡＫＧＫ
【００１７】
ＥＬＩＳＡにより、１２２のリューマチおよびＳＬＥ血清の自己抗体（８０ＳＬＥ血清、４２リューマチ血清を含む）のエピトープをＨ１、Ｈ２ＢおよびＨ２Ａペプチドでチャートにとった。ＳＬＥ血清の８０％および全血清の６６％が、Ｈ１のＣ末端とＨ２ＢのＮ末端の両方に陽性に反応した。よって、この２つの領域の組合せは、マーカー配列、従って、ＳＬＥ患者の判別基準と考えられるべきである。これらの領域に関する構造データおよび抗原性計算から、生体内および生体外で生成された患者自身の抗体の同種エピトープが、Ｈ２ＢのＮ末端およびＨ１のＣ末端の優性抗原形質を明らかにしている。
【００１８】
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）については、特別の高活性表面を有するヌンク社のＦ１６モジュールを使用した。試験の目的に応じて、被試験抗体（直接ＥＬＩＳＡまたはサンドイッチ試験で）あるいは抗原（間接ＥＬＩＳＡで）のいずれかが、マイクロタイトレーションプレートの表面に結合した。抗原を、５０μｇ／ｍｌの濃度で、ｐＨ９．７の０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液に溶解した。抗体溶液、細胞からの上澄み液および尿サンプルを、同一緩衝液に１〜３倍に希釈し、それぞれの場合について、１００μｌをマイクロタイトレーションプレート上にピペットで分注した。４℃、２４時間で、結合が起こった。翌日、ディッシュを空にした後、ディッシュ当り２５０μｌの遮断薬で、３６℃にて、マイクロタイトレーションプレートの活性基をブロックした。このためには、次の異なる遮断溶液を使用した。
【００１９】
ゼラチンの０．５％（ｗ／ｖ）ＰＢＳ／アジド溶液；ＢＳＡの１％（ｗ／ｖ）ＰＢＳ／アジド溶液；ＢＳＡの５％（ｗ／ｖ）ＰＢＳ／アジド溶液；ウマ血清の１０％（ｖ／ｖ）ＰＢＳ／アジド溶液
【００２０】
次いで、１００μｌの細胞培養上澄み液（一次抗体）または１〜２５０の希釈血清をそれぞれ添加し、暗所で、室温にて１時間インキュベートした。ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）溶液（０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０と１５０ｍＭＮａＣｌからなる）でマイクロタイトレーションプレートを１回洗浄した後、１００μｌの複合体（０．３％（ｖ／ｖ）ウサギ抗（マウス−ＩｇＧ）ＩｇＧ−ＨＲＰまたはウサギ−抗（ヒト−ＩｇＧ）ＩｇＧ−ＨＲＰ）をそれぞれピペットで加え、室温で１時間インキュベートした。ツイーン溶液で５回洗浄することにより、未結合抗体を除去した。
【００２１】
１００μｌのマッキルバニー（ＭｃＩｌｖａｎｉｅ）緩衝液（１１６ｍＭＮａ2ＨＰＯ4＋２Ｈ2Ｏ2、４２ｍＭクエン酸、ｐＨ５．６、１．５ｍＭのオルトフェニレンジアミンと０．９ｍＭのＨ2Ｏ2を含む）を添加した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼをウサギまたはヒツジ抗体とそれぞれ結合させ、１００μｌの２ＭＨ2ＳＯ4で反応を抑制しながら、暗所で呈色反応を完了させた。ブラインドサンプル（ｂｌｉｎｄ ｓａｍｐｌｅ）に対して照合した後、ミニリーダー（Ｍｉｎｉｒｅａｄｅｒ）ＩＩを用いて、４９０ｎｍで個々のディッシュの吸光度を測定し、得られた値をプリントアウトした。
【００２２】
自己抗体について、ＥＬＩＳＡで１２２のＳＬＥ血清を試験し、Ｈ２ＢのＮ末端範囲（１−３５）およびＨ１のＣ末端範囲（１８７−２１１）がＳＬＥ自己抗体の好ましいエピトープを表わすことがわかった。更に、希釈率が１〜２５０であると、広範囲の高タイターおよび低タイター血清をＥＬＩＳＡで検出するのに特に好適であることがわかった。この点で、本発明者らは、主な注意をＩｇＧ−自己抗体に向けた。
【００２３】
結果は、次のように評価された。すなわち、患者についてのＥＬＩＳＡは、両吸光度＞０．２（カットオフ（ｃｕｔ ｏｆｆ）＝ダミー測定値（ｄｕｍｍｙｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）から０．２で、ストレイ値（ｓｔｒａｙ ｖａｌｕｅｓ）の場合の補正率＞０．２）であり、他の全てのペプチドと比較してこれらの値よりも明白に高ければ、陽性と評価されるだけであった。
【００２４】
これらの１２２の血清のうち、６８％は、ペプチドの組合せに関し陽性であった。これらの１２２の血清は、８０のＳＬＥ血清と４２のリューマチ血清からなっていた。リューマチグループはＳＬＥ疾患を含む。４２リューマチ血清の意味は、ＳＬＥ血清とは異なるリューマチ血清の意味である。８０人のエリテマトーデス患者のうち、８０％は、Ｈｉ−ＣＴ（ヒストンＨ１のＣ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ（ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ））およびＥ１（ヒストンＨ２ＢのＮ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ（ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ））陽性であり、一方、４２人のリューマチ患者のうち、４５％は、やはりＨｉ−ＣＴおよびＥ１陽性であった。従って、Ｈ２ＢのＮ末端範囲（１−３１）およびＨ１のＣ末端範囲（１８７−２１１）が、エリテマトーデス患者の自己抗体から検出された主抗原決定基を構成していた。従って、これらの２つのペプチドの組合せは、ＳＬＥ患者を類別し、リューマチ患者から区別する判別基準として作用する。
【００２５】
ＳＬＥ患者の体液内の自己抗体に対するモノクローナル抗体（抗ヒストン抗体）を生成するために、本発明で採用された方法は、次の通りであった（スケジュールＩ）。
【００２６】
（１）ヒストン配列（数学モデル）の解析
【００２７】
（２）抗原範囲の予測
【００２８】
（３）抗原範囲によるペプチドの合成；このペプチドは、一部は遊離状態で生成され、一部はキャリアー（テンタゲル（ＴｅｎｔａＧｅｌ））に結合している。
【００２９】
（４ａ）（３）による合成ペプチドでの動物（マウス）の免疫；キャリアー（例えばテンタゲル上）に結合したペプチドを使用しなければならない。
【００３０】
（４ｂ）（３）による合成ペプチドでの生体外脾臓細胞の免疫；この場合、遊離またはキャリアー結合ペプチドを用いることができる。
【００３１】
（５）脾臓細胞の分離およびハイブリドーマ細胞を得るための癌細胞との融合；個々の（陽性）クローンの選択
【００３２】
（６）滲出した抗ヒストン抗体（ＡＨＡ）の分離
【００３３】
（７）抗原として（３）による合成ペプチドを用いた、ＥＬＩＳＡによる合成ＡＨＡの特異性と活性の調査
【００３４】
本発明による抗イディオタイプ抗体を生成するための本発明による方法は、次の通りであった（スケジュールＩＩ）。
【００３５】
（１．１）抗原の選択；抗原は、例えば、ＳＬＥ患者の血清中の自己抗体における、ヒストンペプチドＨ１（１８７−２１１）およびＨ２Ｂ（１−３５）に対するエピトープであるか、または、（１．２）このペプチド／ペプチドの組合せに対して生じたモノクローナル抗体における、相当するエピトープである。
【００３６】
（２）抗原の生成（２．１）ＳＬＥ血清の抗体画分を、常法により濃縮する。
【００３７】
（２．２．１）（１）で規定したエピトープを有するこれらの自己抗体を、アフィニティークロマトグラフィーにより、ＳＬＥ血清の濃縮抗体画分から選択的に除去する。この目的のために、（１）で規定したペプチドを、適当な方法で、適当なキャリアー物質上に化学的または吸着的に結合させる。別の方法として、適当なキャリアー物質、例えばテンタゲル上で、ペプチドを合成することも可能である。従って、まず、ＳＬＥ血清の濃縮抗体画分を、キャリアー−Ｈ１（１８７−２１１）−複合体のカラムに通し、それを洗浄し、次いで、複合体に結合している自己抗体を適当な方法で溶出することができる。次いで、第２工程で、キャリアー−Ｈ２Ｂ（１−３５）−複合体のカラムに、この自己抗体画分を通す。次ぎに、問題の二重特異性（ｄｏｕｂｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）または交差特異性（ｃｒｏｓｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）自己抗体を保持し、適当な方法でカラムを洗浄した後、溶出してもよい。更に、アフィニティー工程の順序を変えること、即ち、まずキャリアー−Ｈ２Ｂ（１−３５）を使用し、次いでキャリアーＨ１Ｃを使用することも可能である。
【００３８】
（２．２．２）（１．２）に従って二重特異性エピトープを有するモノクローナル抗体を、スケジュールＩ（６）に従って分離し、次いで精製する。
【００３９】
（３）免疫法（３．１）生体内免疫；（２）に従って生成された自己抗体またはモノクロナール抗体を、通常の方法で免疫に使用する。それらは、適当なアジュバントと組み合わせて、あるいはテンタゲルのような適当なキャリアーに結合させて、自由に用いることができる。
【００４０】
（３．２）生体外免疫；適当な実験動物の脾臓細胞を、常法により生体外で免疫するために、（２）に従って生成された抗体を用いてもよい。
【００４１】
（４）抗イディオタイプ抗体を生成する脾臓細胞の分離およびハイブリドーマ細胞を得るための適当な癌細胞との融合
【００４２】
（５）個々のクローンの選択および培養
【００４３】
（６）モノクローナルイディオタイプ抗体の分離および精製
【００４４】
工程（３）を使用せず、ＳＬＥ患者（または自己免疫疾患の動物）の血液からＢ−リンパ球を分離して、腫瘍細胞と融合し、（１）に述べた特異性を有する得られたハイブリドーマ細胞から、これらのクローンを分離することも可能であろう。これらのクローンの同定は、本発明によるペプチド／ペプチドの組合せを使用して、通常の試験、例えばＥＬＩＳＡにより行なわれる。
【００４５】
ＳＬＥ患者の自己抗体（抗ヒストン抗体）の濃度測定が、ＥＬＩＳＡ型の方法に限定されるものでないことは、明らかである。
【００４６】
更に、Ｈ２Ｂの放射性標識Ｎ末端ペプチドおよびＨ１の放射性標識Ｃ末端ペプチドを用いるラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により、あるいは蛍光を発するように標識したＨ２ＢのＮ末端ペプチドおよびＨ１のＣ末端ペプチドを用いた蛍光免疫測定法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）により、ＡＨＡ濃度を測定してもよい。ＡＨＡに関する濃度の検出および確認が、例えば尿のような、血清以外の他の体液およびその成分で行なわれてもよいことは、当業者にとって明らかであろう。
【００４７】
合成されたモノクロナール抗体とヒトの病原性自己抗体の両方が、ヒストンＨ１およびＨ２の抗原決定基の特徴であることが、本発明によって見出された。非常にわずかで弱い免疫原性ヒストンの自己原性性質を改善するために、精製等級のヒストンまたは選択された合成ペプチドを別のキャリアーに結合させる。
【００４８】
グルタルアルデヒド架橋ヒストン複合体での生体内免疫により、コンフォーメーション抗原に対するＩｇＭ抗体（１／Ａ８／Ｂ１）が生ずる。ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）Ｃに結合したヒストンＨでの生体内免疫によれば、更に３つのモノクローナルＩｇＭ抗体、即ち１／Ｈ４／Ｃ３（ＩｇＧ2a）、Ｉ／Ｈ４／Ｃ６（ＩｇＧ2a）および１／Ｈ４／Ｃ１０（ＩｇＧ2a）が生じ、この３つは、全て軽鎖のカッパ特異性を有している。この３つのモノクローナル抗体のエピトープは、Ｈ１のＣ末端（１８７−２１１）にあった。これらの抗体のＨ２ＢのＴ末端（２２−３５）との交差反応は、２つの末端ヒストン範囲の配列および電荷相同によるべきである。ユーパージットに結合した、Ｈ２Ｂからの２つのＮ末端ペプチドを、生体内免疫に使用した。
【００４９】
抗原としては、遊離ヒストン、遊離ペプチドおよびキャリアーに結合したペプチドを使用した。遊離ヒストンＨ１での生体外免疫により、カッパ鎖を有するＩｇＧ2a抗体が生じ、そのエピトープも、Ｈ１のＣ末端である。
【００５０】
本発明によれば、新しい合成キャリアー物質としてテンタゲルを使用して、好結果の生体外免疫を行なうことができた。テンタゲルは、新しいクラスのグラフト共重合体粒子を構成し、そのポリスチレン核は、“周辺ブラッシ状”ポリオキシエチレン触手で囲まれている。これらのキャリアーは、ペプチド合成後直ちに、“一工程法”で生体外免疫に用いてもよい。テンタゲルは、非常に高い生物学的適合性、化学的不活性、良好な親水性、そして最後に大切なことは、免疫応答性細胞との接触のための均一なハプテン構造の最適露出を特徴としている。
【００５１】
生成したモノクローナル抗体は、連続フローメトリイを実施するために蛍光を発するイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合後、免疫拡散法、血球凝集法、ドットブロット法、種々のＥＬＩＳＡ系のような種々の免疫試験系と、ウエスターンブロット試験の両方で用いられる。
【００５２】
また、ＳＬＥ患者の体液中の病原性ＳＬＥ自己抗体によって認識される抗原決定基（エピトープ）を有するヒストンペプチドの使用による全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を診断及び／又は治療する方法は、以下の通りである。
すなわち、２つのヒストンペプチドが選択されることと、第１のヒストンペプチドが、少なくとも１つのエピトープ（Ｈ１−エピトープ）を含むヒストンＨ１のＣ末端のアミノ酸配列１８７〜２１１またはその一部であることと、第２のヒストンペプチドが、少なくとも１つのエピトープ（Ｈ２Ｂ−エピトープ）を含むヒストンＨ２ＢのＮ末端のアミノ酸配列１〜３５またはその一部であることと、少なくとも１つのエピトープを含む両ヒストンペプチドまたはその一部を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで動物または脾臓細胞を免疫化し、Ｈ１およびＨ２Ｂ上の両エピトープに対応して認識し、それにより特異性に関してＳＬＥ患者中のＳＬＥ自己抗体に類似するモノクローナル抗ヒストン抗体を産生することと、前記モノクローナル抗ヒストン抗体を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで別の動物または脾臓細胞を免疫化し、抗ヒストン抗体を認識し、それによりＳＬＥ自己抗体も認識するモノクローナル抗イディオタイプ抗体を産生することと、診断及び／又は治療のために、前記モノクローナル抗イディオタイプ抗体を患者の血清と反応させて、これらの患者の血清中の病原性ＳＬＥ自己抗体を検出及び／又は除去することと、を特徴とする、ＳＬＥ患者の体液中の病原性ＳＬＥ自己抗体によって認識される抗原決定基（エピトープ）を有するヒストンペプチドの使用による全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を診断及び／又は治療する方法である。
また、前記選択されたヒストンペプチドのペプチド結合が、
−ＣＯＮ（ＣＨ３）−、
−ＣＨ２−ＣＨ２−、
−ＣＯ−ＣＨ２−、
などで改変される。
【００５３】
ＳＬＥの診断または治療のためのモノクローナル抗イディオタイプ抗体の生産は具体的には以下の通りである。
ポイント１：ａ）ヒストンＨ１アミノ酸シーケンス１８７−２１１例えば１のルーパスアンティゲンエピトープ（ｏｎｅ  ｌｕｐｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ）とともに、ｂ）ヒストンＨ２Ｂアミノ酸シーケンス１−３５例えば１のルーパスアンティゲンエピトープ（ｏｎｅ  ｌｕｐｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ）とともに、を選択する。
ポイント２：２つのコンタクトポイントを有するアンチＨ１／Ｈ２Ｂ抗体（ａｎｔｉ−Ｈ１／Ｈ２Ｂ−ａｎｉｂｏｄｉｅｓ）の生産のため、上記ａ）とｂ）とによる第１の動物細胞または脾臓細胞への免疫付与（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）。
２つのコンタクトポイントを有するアンチＨ１／Ｈ２Ｂ抗体（ａｎｔｉ−Ｈ１／Ｈ２Ｂ−ａｎｉｂｏｄｉｅｓ）は、第１のコンタクトポイントが上記ルーパス抗原エピトープ（ｌｕｐｕｓ  Ｈ１−ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｐｉｔｏｐｅ）を用いてロック（ｌｏｃｋ）する。その第２のコンタクトポイントが上記ルーパス抗原エピトープ（ｌｕｐｕｓ  Ｈ２Ｂ−ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｐｉｔｏｐｅ）を用いてロック（ｌｏｃｋ）する。
このアンチＨ１／Ｈ２Ｂ抗体（ａｎｔｉ−Ｈ１／Ｈ２Ｂ−ａｎｉｂｏｄｉｅｓ）が、ＳＬＥ抗体に一致する。
ポイント３：選択された腫瘍細胞（ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）とともにポイント２による、モノクローナルアンチＨ１／Ｈ２Ｂ抗体（ａｎｔｉ−Ｈ１／Ｈ２Ｂ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）の生産又は形成。
ポイント４：ポイント３による上記モノクローナルアンチＨ１／Ｈ２Ｂ抗体（ａｎｔｉ−Ｈ１／Ｈ２Ｂ−ａｎｉｂｏｄｙ）の生産のため、上記ａ）とｂ）とによる第２の動物細胞または脾臓細胞への免疫付与。
アンチ（アンチＨ１／Ｈ２Ｂ抗体）、ａｎｔｉ−（ａｎｔｉ−Ｈ１／Ｈ２Ｂ−ａｎｉｂｏｄｙ）は、ＳＬＥオートアンチボディズ（ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）に対して向けられ、対応する２つのコンタクト（１）、（２）とともにあるアンチイディオティピック抗体、ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙと同等である。
ポイント５：選択した腫瘍細胞とともにポイント４によるモノクローナルアンチイディオチピック（ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）抗体の生産又は形成。
【００５４】
また、本願は要約すると以下の内容を含む。
すなわち、第１発明は、ヒストンＨ１のカルボキシ末端におけるアミノ酸残基１８７−２１１に対応する、下記の配列識別番号１に記述するアミノ酸配列を有するペプチドと、ヒストンＨ２Ｂのアミノ末端におけるアミノ酸残基１−３５に対応する、下記の配列識別番号２に記述するアミノ酸配列を有するペプチドの両方と、特異的に結合することを特徴とするモノクローナル抗体である。
（１） Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ala Ala
187                197
Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Lys Ala
201                206
Ala Pro Lys Lys Lys (配列識別番号１)
（２） Pro Glu Pro Ala Lys Ser Ala Pro Ala Pro
5                10
Lys Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys
15                20
Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys
25                30
Arg Ser Glu Lys Glu (配列識別番号２)
35
第２発明は、ペプチド結合を有する認識されたアミノ酸配列が、
-CON(CH3)-
-CH2-CH2-
-CO-CH2-
から構成される群より選択された１によって改変される第１発明に係るモノクローナル抗体である。
第３発明は、前記モノクローナル抗体が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を病む患者の血清内に見られる自己抗体と同様な、前記ペプチドに対する特異度を呈することを特徴とする第１発明に係るモノクローナル抗体である。
第４発明は、第１発明に記載のモノクローナル抗体と、ＳＬＥ患者の自己抗体とに特異的に結合することを特徴とする抗イディオタイプ抗体である。
第５発明は、ＳＬＥの診断用、及び／又は治療用であることを特徴とする第３発明又は第４発明に記載の抗イディオタイプ抗体である。
【００５５】
本発明によれば、ＳＬＥの診断を高度な確実性を持って行なうことができ、自己抗体に対するモノクロナール抗体は、ＳＬＥの治療薬を製造するのに適している。
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月15日(2005.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗イディオタイプモノクローナル抗体を産生するためのモノクローナル抗体で、
抗イディオタイプモノクローナル抗体は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の体液中の全身性エリテマトーデスの診断および治療のためで、
抗イディオタイプモノクローナル抗体は、ヒストンペプチドを使用することにより、その患者の血清と反応して患者の血清中から病原性ＳＬＥ自己抗体を検知および／または除去するもので、
ＳＬＥ患者の体液中のＳＬＥ病原抗体によって認識される抗原決定基（エピトープ）を有する２つのヒストンペプチドが選択され、
第１のヒストンペプチドが、少なくとも１つのエピトープ（Ｈ１−エピトープ）を含むヒストンＨ１のＣ末端のアミノ酸配列１８７〜２１１またはその一部であり、
第２のヒストンペプチドが、少なくとも１つのエピトープ（Ｈ２Ｂ−エピトープ）を含むヒストンＨ２ＢのＮ末端のアミノ酸配列１〜３５またはその一部であり、
少なくとも１つのエピトープを含む両ヒストンペプチドまたはその一部を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで動物または脾臓細胞を免疫化し、Ｈ１およびＨ２Ｂ上の両エピトープに対応して認識し、それにより特異性に関してＳＬＥ患者中のＳＬＥ自己抗体に類似するモノクローナル抗ヒストン抗体を産生し、
上記モノクローナル抗ヒストン抗体を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで別の動物または脾臓細胞を免疫化し、抗ヒストン抗体を認識し、それによりＳＬＥ自己抗体も認識するモノクローナル抗イディオタイプ抗体を産生することを特徴とする、モノクローナル抗体。
【請求項２】
上記選択されたヒストンペプチドのペプチド結合が、
−ＣＯＮ（ＣＨ３）−、
−ＣＨ２−ＣＨ２−、
−ＣＯ−ＣＨ２−、
などで改変されることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明の更に有利な展開および便利な形態は、以下の請求の範囲および次の記載からわかるであろう。
すなわち、請求項１に記載の発明は、抗イディオタイプモノクローナル抗体を産生するためのモノクローナル抗体で、抗イディオタイプモノクローナル抗体は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の体液中の全身性エリテマトーデスの診断および治療のためで、抗イディオタイプモノクローナル抗体は、ヒストンペプチドを使用することにより、その患者の血清と反応して患者の血清中から病原性ＳＬＥ自己抗体を検知および／または除去するもので、ＳＬＥ患者の体液中のＳＬＥ病原抗体によって認識される抗原決定基（エピトープ）を有する２つのヒストンペプチドが選択され、第１のヒストンペプチドが、少なくとも１つのエピトープ（Ｈ１−エピトープ）を含むヒストンＨ１のＣ末端のアミノ酸配列１８７〜２１１またはその一部であり、第２のヒストンペプチドが、少なくとも１つのエピトープ（Ｈ２Ｂ−エピトープ）を含むヒストンＨ２ＢのＮ末端のアミノ酸配列１〜３５またはその一部であり、少なくとも１つのエピトープを含む両ヒストンペプチドまたはその一部を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで動物または脾臓細胞を免疫化し、Ｈ１およびＨ２Ｂ上の両エピトープに対応して認識し、それにより特異性に関してＳＬＥ患者中のＳＬＥ自己抗体に類似するモノクローナル抗ヒストン抗体を産生し、上記モノクローナル抗ヒストン抗体を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで別の動物または脾臓細胞を免疫化し、抗ヒストン抗体を認識し、それによりＳＬＥ自己抗体も認識するモノクローナル抗イディオタイプ抗体を産生することを特徴とする、モノクローナル抗体である。
また、請求項２に記載の発明は、上記選択されたヒストンペプチドのペプチド結合が、−ＣＯＮ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＯ−ＣＨ２−、などで改変されることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体である。