(57)【要約】      （修正有）【課題】均一な照射と正確な検出に向けて、光路を最適化することによって、横方向に分布する部位からの蛍光信号を同時にモニターするための改良されたデバイスを提供する。【解決手段】複数の個々の部位のアセンブリ３を備える平面支持体２を保持するための手段１；少なくとも1つの励起周波数を含む光を放射する光源４；複数の個々の部位のアセンブリアセンブリからの蛍光信号１７を受信する変換器５；光源からの励起光１６をアセンブリに送り、アセンブリからの蛍光信号を変換器に送る視野レンズ６；光源からの励起光を視野レンズに送る励起レンズ配置物１０；視野レンズからの蛍光信号を変換器に送る結像レンズ配置物１２、を含み、視野レンズが、アセンブリの平面支持体に対して、０°より大きい入射角αを有する励起光を形成し；励起光および蛍光信号の結像は、視野レンズの物体側においてテレセントリックである；蛍光信号を結像するための光学機器。【選択図】図１
2006215025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の個々の部位のアセンブリ３を備える平面支持体２を保持するための保持手段１；
少なくとも１つの励起周波数を含む光を放射する少なくとも１つの光源４；
該複数の個々の部位のアセンブリ３からの蛍光信号を受信するように配置され、計算可能な一次データを作成する変換器５；
該光源４からの励起光１６を該複数の個々の部位のアセンブリ３に送り、該複数の個々の部位のアセンブリ３からの蛍光信号１７を変換器５に送る視野レンズ６；
該光源４からの励起光１６を該視野レンズ６に送る励起レンズ配置物１０；
該視野レンズ６からの蛍光信号１７を該変換器５に送る結像レンズ配置物１２、
を含み、該視野レンズ６が、該複数の個々の部位のアセンブリ３の該平面支持体２に対して、０°より大きい入射角αを有する励起光１６を形成し；
該励起光１６および複数の個々の部位からの蛍光信号の該結像は、該視野レンズ６の物体側においてテレセントリックである；
複数の個々の部位からの蛍光信号を結像するための光学機器。
【請求項２】
励起光１６の入射角αが２０°未満、好ましくは１０°未満、最も好ましくは５°未満である請求項１記載の光学機器。
【請求項３】
入射角αが、
【数１】
2006215025.tif 000007
であり、Ａ１が励起光学素子の開口半角であり、Ａ２が蛍光結像光学素子の開口半角である請求項１〜２記載の光学機器。
【請求項４】
前記結像レンズ配置物１２が前記変換器５に連結されて、結像ユニット１３が形成される請求項１〜３記載の光学機器。
【請求項５】
１つ、２つまたはそれより多くのフォールディングミラーを含む光ビームフォールディングユニット１１をさらに含み、該フォールディングユニットが、前記光源からの光、および複数の個々の部位のアセンブリからの蛍光信号を折畳む請求項１〜４記載の光学機器。
【請求項６】
前記アセンブリの個々の部位がウェルであり、励起光１６が該ウェルの側壁に関して２０°未満の角度を有し、前記ウェルに充填される溶液が蛍光色素を含む請求項１〜５記載の光学機器。
【請求項７】
前記アセンブリの個々の部位が、平面支持体上のスポットであり、蛍光色素が該スポットに付着している請求項１〜５記載の光学機器。
【請求項８】
請求項１〜７記載の光学機器；
各々がＰＣＲ反応を行うことができる反応混合物を含む１つ以上のウェルを有する支持体を加熱および冷却するための手段、
を含むリアルタイムＰＣＲ機器。
【請求項９】
複数の個々のアッセイのアセンブリを含む平面支持体２；
少なくとも１つの励起周波数を含む光を放射する少なくとも１つの光源４；
該複数のアッセイからの蛍光信号を受信するように配置され、計算可能な一次データを作成する変換器５；
該複数の個々のアッセイのアセンブリのテレセントリック励起と、前記複数の個々のアッセイのアセンブリ３の個々のアッセイの各々において発生される前記蛍光信号１７のテレセントリック結像とによって特徴づけられる、前記光源４から前記変換器５までのビーム経路、
を含み、該テレセントリック励起の励起光１６は、複数の個々のアッセイのアセンブリ３の平面支持体２に対して０°より大きい入射角を有する、
複数のアッセイの蛍光信号を結像するための装置。
【請求項１０】
前記変換器５に連結されて結像ユニット１３を形成する、結像レンズ配置物１２をさらに含む、請求項９記載の装置。
【請求項１１】
視野レンズをさらに含み、前記ビーム経路が該視野レンズを２回通過する請求項９〜１０記載の装置。
【請求項１２】
入射角αが、
【数２】
2006215025.tif 000008
であり、Ａ１が励起光学素子の開口半角であり、Ａ２が蛍光結像光学素子の開口半角である請求項９〜１１記載の装置。
【請求項１３】
各々がＰＣＲ反応を行うことができる反応混合物を含む複数の個々の部位を有するマルチウェルプレート；
蛍光ＤＮＡ結合実体；
マルチウェルプレート全体をテレセントリック光で照射し、計算可能な一次データを作成するために、対応する蛍光信号を受信するように配置された変換器によって前記マルチウェルプレートの各ウェルからの蛍光信号を検出する、請求項１〜７記載の光学機器を含む請求項８記載のリアルタイムＰＣＲ機器、
を含む、リアルタイムで同時に複数のＰＣＲ反応を行い、モニターするための装置。
【請求項１４】
ＰＣＲ反応を行うことが出来る組成物または反応混合物を提供する工程；
該複数の標的ＤＮＡ配列の増幅が起こり得るようなサーモサイクリングプロトコルに反応混合物を供する工程；
蛍光ＤＮＡ結合実体および請求項８記載のリアルタイムＰＣＲ機器を用いる複数の増幅サイクル後に各ＤＮＡ配列の存在および量を少なくとも１回モニターする工程、
を含む、複数の標的ＤＮＡ配列を増幅、検出および／または定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はDNA解析の分野に関する。特に、本発明は複数の部位における蛍光強度の平行結像用のデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光技術を様々に応用して生物試料の分析を行うことが当業者によって知られている。電気泳動技術の場合、タンパク質またはDNAを蛍光プローブで標識して、それらの電気泳動バンドをゲルまたはカラム中で可視化する。さらに、これまでのバイオチップ用途の大半は、蛍光読み取りに基づいており、固体支持体に固定化されたプローブ分子への、蛍光標識された標的分子の特異的結合をモニターするものである。液相におけるDNA解析に対する用途には、2つの蛍光プローブとエネルギー転移を利用する、二本鎖DNA結合色素SybrGreenIまたはFRET（Fluorescent Resonance Energy Transfer）プローブなどの蛍光ハイブリダイゼーションプローブが含まれる。液相における蛍光技術に対する非常に重要な用途は、リアルタイムでのＰＣＲ産物の定量、いわゆるリアルタイムＰＣＲである。
【０００３】
上記のすべての場合において、アッセイの蛍光標識を励起する特定の波長の光を提供するとともに、ある程度異なる波長で放たれる前記標識からの蛍光を検出することのできる蛍光読み取りデバイスが必要である。全ての蛍光読み取りデバイスの一つの大きな問題は、色素によって発せられる蛍光に比べて、甚大な励起光の強度であり、従って、蛍光信号を正確にモニターするためには、励起ビームが検出器にあたらないようにしなければならない。言い換えれば、励起光の光路は少なくとも部分的に蛍光の光路と異なっていなければならない。
【０００４】
例えば毛細管の液相において1種類の蛍光プローブのみがモニターされなければならない場合、蛍光原理の実現は比較的易しい。ここでは、たとえば、二色性ミラーとフィルターのセットを備えた白色光源が、この要件を満たすのには十分である。しかしながら、試料中に１種類より多い蛍光標識が存在する場合には、固体支持体上に横方向に分布するスポットまたはマイクロタイタープレートの蛍光をモニターする必要があり、蛍光読み取りデバイスに対する要件を満たすことはさらに難しくなる。
【０００５】
原理上、横方向に分布する部位の蛍光を励起してモニターするには、2つの異なった戦略が存在する。第1の戦略は、横方向に分布する部位を走査することにより、個々の部位を1回に1つずつ順に分析していくことである。第2の戦略は、分布する部位全体に同時に照射を行って、例えばCCDチップ上の対応する蛍光を結像するものである。この走査戦略は、支持体を二次元的に移動させる必要がある（特許文献１および特許文献２）か、検出器を支持体に関して移動させる必要があるか（特許文献３）、検出器を一次元的に移動させて支持体を他の次元に移動させる必要があるか、もしくは光学素子が1または2次元の走査手段、すなわちガルボミラーを含む必要があるという明白な欠点を有している。一方、支持体全体を同時に照射する戦略の主たる難点は、均一な照射を分布部位全体に行わなければならない点である。均一な照射を分布部位全体に行うことの代替法は、光源アレイの使用であり、これにより個々の部位はその各自の光源によって照射される。特許文献４は、複数のウェルを備えたサーマルサイクラー中で、照射のためにビームスプリッタおよびLEDアレイを用いてPCRの評価を行うための上記戦略について記載している。特許文献５は、蛍光信号の暗視野モニタリングについて記載しており、ここでも、マイクロアレイをLEDアレイによって照射するが、この態様においては、ビームスプリッタは必要とされていない。
【０００６】
蛍光及び励起ビームの光路を少なくとも部分的に分割するための要件に関して、この場合も2つの異なる可能性が存在する。第1の可能性としては、ビームスプリッタを利用し、励起ビームおよび蛍光が光学列の少なくとも一部を共用するいわゆる落射照明である。第2の可能性は、斜照明を用いることである。ここでは、励起ビームを、支持体表面の法線に対して一定の角度を有し、該励起ビームに対応する反射が検出装置の受光角外にくるように構成する（たとえば、特許文献６および特許文献７）。
【０００７】
特許文献８は、ビームスプリッタを用いてプローブ内の複数の蛍光色素を同時に観測する光学装置を記載している。特許文献９は、ビームスプリッタと、視野レンズと、各ウェルに光の焦点を合わせるレンズアレイを用いて、マイクロタイタープレートのウェル内で発生する蛍光信号を同時にモニターする装置を開示している。検出は、光を光ダイオードのアレイまたはCCDチップ上に結像することによって行われる。この装置の本態様において集光される蛍光は、集光レンズの光錐によって励起される色素の量によって決まるため、ウェルの充填度に依存することになる。特許文献１０は、温度循環ブロック内の複数のバイアルにおけるPCR反応を同時にモニターするための機器を請求している。この機器の光学部品としても、ビームスプリッタと、視野レンズと、各バイアルに個々の光ビームの焦点を合わせるバイアルレンズアレイと、たとえばCCD検出器上で発光の焦点を合わせる検出手段とが含まれる。バイアルレンズアレイが必要であるために、個々の部位の大きさと横方向の密度が制約される。特許文献１１は、複数のウェルにおいて発生する蛍光をモニターする蛍光測定装置を記載している。光学部品は、ビームスプリッタと、ウェルの深さ方向に平行な光によってウェルを一括して照射するレンズ装置とを含む。しかしながら、この画像形成光学装置は、検出手段上に光を集める。特許文献１２は、テレセントリックレンズを含む対物レンズを用いた結像アッセイ法を開示している。特許文献１３は、フレネルレンズを含む、サンプル支持体を結像するための結像デバイスを請求している。
【特許文献１】国際公開第０３／０６９３９１号パンフレット
【特許文献２】独国特許発明第１０２  ００  ４９９号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００２／１５９０５７号明細書
【特許文献４】独国特許発明第１０１  ３１  ６８７号明細書
【特許文献５】独国特許発明第１０１  ５５  １４２号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００２／０００５４９３号明細書
【特許文献７】欧州特許出願公開第１  ２７５  ９５４号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００３／００１１７７２号明細書
【特許文献９】独国特許出願公開第１９７  ４８  ２１１号明細書
【特許文献１０】国際公開第９９／６０３８１号パンフレット
【特許文献１１】特開２００２−０１４０４４号公報
【特許文献１２】米国特許第６，４９８，６９０号明細書
【特許文献１３】米国特許第６，２４６，５２５号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、均一な照射と正確な検出に向けて、光路を最適化することによって、横方向に分布する部位からの蛍光信号を同時にモニターするための改良されたデバイスを提供することにある。本発明の1つの態様において、解決すべき問題は、マイクロタイタープレート形式の多重化リアルタイムPCRのモニタリングにおける改良に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
即ち、本発明の要旨は、以下のとおりである：
[１]  複数の個々の部位のアセンブリ３を備える平面支持体２を保持するための保持手段１；
少なくとも１つの励起周波数を含む光を放射する少なくとも１つの光源４；
該複数の個々の部位のアセンブリ３からの蛍光信号を受信するように配置され、計算可能な一次データを作成する変換器５；
該光源４からの励起光１６を該複数の個々の部位のアセンブリ３に送り、該複数の個々の部位のアセンブリ３からの蛍光信号１７を変換器５に送る視野レンズ６；
該光源４からの励起光１６を該視野レンズ６に送る励起レンズ配置物１０；
該視野レンズ６からの蛍光信号１７を該変換器５に送る結像レンズ配置物１２、
を含み、該視野レンズ６が、該複数の個々の部位のアセンブリ３の該平面支持体２に対して、０°より大きい入射角αを有する励起光１６を形成し；
該励起光１６および複数の個々の部位からの蛍光信号の該結像は、該視野レンズ６の物体側においてテレセントリックである；
複数の個々の部位からの蛍光信号を結像するための光学機器、
[２]  励起光１６の入射角αが２０°未満、好ましくは１０°未満、最も好ましくは５°未満である前記[１]記載の光学機器、
[３]  入射角αが、
【００１０】
【数１】
2006215025.tif 000003
【００１１】
であり、Ａ１が励起光学素子の開口半角であり、Ａ２が蛍光結像光学素子の開口半角である前記[１]〜[２]記載の光学機器、
[４]  前記結像レンズ配置物１２が前記変換器５に連結されて、結像ユニット１３が形成される前記[１]〜[３]記載の光学機器、
[５]  １つ、２つまたはそれより多くのフォールディングミラーを含む光ビームフォールディングユニット１１をさらに含み、該フォールディングユニットが、前記光源からの光、および複数の個々の部位のアセンブリからの蛍光信号を折畳む前記[１]〜[４]記載の光学機器、
[６]  前記アセンブリの個々の部位がウェルであり、励起光１６が該ウェルの側壁に関して２０°未満の角度を有し、前記ウェルに充填される溶液が蛍光色素を含む前記[１]〜[５]記載の光学機器、
[７]  前記アセンブリの個々の部位が、平面支持体上のスポットであり、蛍光色素が該スポットに付着している前記[１]〜[５]記載の光学機器、
[８]  前記[１]〜[７]記載の光学機器；
各々がＰＣＲ反応を行うことができる反応混合物を含む１つ以上のウェルを有する支持体を加熱および冷却するための手段、
を含むリアルタイムＰＣＲ機器、
[９]  複数の個々のアッセイのアセンブリを含む平面支持体２；
少なくとも１つの励起周波数を含む光を放射する少なくとも１つの光源４；
該複数のアッセイからの蛍光信号を受信するように配置され、計算可能な一次データを作成する変換器５；
該複数の個々のアッセイのアセンブリのテレセントリック励起と、前記複数の個々のアッセイのアセンブリ３の個々のアッセイの各々において発生される前記蛍光信号１７のテレセントリック結像とによって特徴づけられる、前記光源４から前記変換器５までのビーム経路、
を含み、該テレセントリック励起の励起光１６は、複数の個々のアッセイのアセンブリ３の平面支持体２に対して０°より大きい入射角を有する、
複数のアッセイの蛍光信号を結像するための装置、
[１０]  前記変換器５に連結されて結像ユニット１３を形成する、結像レンズ配置物１２をさらに含む、前記[９]記載の装置、
[１１]  視野レンズをさらに含み、前記ビーム経路が該視野レンズを２回通過する前記[９]〜[１０]記載の装置、
[１２]  入射角αが、
【００１２】
【数２】
2006215025.tif 000004
【００１３】
であり、Ａ１が励起光学素子の開口半角であり、Ａ２が蛍光結像光学素子の開口半角である前記[９]〜[１１]記載の装置、
[１３]  各々がＰＣＲ反応を行うことができる反応混合物を含む複数の個々の部位を有するマルチウェルプレート；
蛍光ＤＮＡ結合実体；
マルチウェルプレート全体をテレセントリック光で照射し、計算可能な一次データを作成するために、対応する蛍光信号を受信するように配置された変換器によって前記マルチウェルプレートの各ウェルからの蛍光信号を検出する、前記[１]〜[７]記載の光学機器を含む前記[８]記載のリアルタイムＰＣＲ機器、
を含む、リアルタイムで同時に複数のＰＣＲ反応を行い、モニターするための装置、並びに
[１４]  ＰＣＲ反応を行うことが出来る組成物または反応混合物を提供する工程；
該複数の標的ＤＮＡ配列の増幅が起こり得るようなサーモサイクリングプロトコルに反応混合物を供する工程；
蛍光ＤＮＡ結合実体および前記[８]記載のリアルタイムＰＣＲ機器を用いる複数の増幅サイクル後に各ＤＮＡ配列の存在および量を少なくとも１回モニターする工程、
を含む、複数の標的ＤＮＡ配列を増幅、検出および／または定量する方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、均一な照射と正確な検出に向けて、光路を最適化することによって、横方向に分布する部位からの蛍光信号を同時にモニターするための改良されたデバイスが提供され得る。本発明の1つの態様において、マイクロタイタープレート形式の多重化リアルタイムPCRのモニタリングにおける改良に関する問題が解決され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
発明の簡単な説明
このように、本発明は、複数の個々の部位のアセンブリの蛍光を結像する光学機器であって、全アセンブリ領域にわたって均一な励起を行うことと、対応する蛍光信号を正確に結像することを含む光学機器に関する。
【００１６】
より詳細には、本発明は、マイクロタイタープレートのウェル中で起こっている複数のPCR増幅をリアルタイムで同時に分析するか、もしくは特定の標的／プローブの相互作用の尺度としてマイクロアレイの蛍光強度を結像する光学機器に関する。
【００１７】
本発明の1つの主題は、複数の個々の部位からの蛍光信号を結像するための光学機器であって、該機器は、
−複数の個々の部位のアセンブリ３を備える平面支持体２を保持するための保持手段１、
−少なくとも１つの励起周波数を含む光を放射する少なくとも１つの光源４、
−該複数の個々の部位のアセンブリ３からの蛍光信号を受信するように配置され、計算可能な一次データを作成する変換器５、
−該光源４からの励起光１６を該複数の個々の部位のアセンブリ３に送り、該複数の個々の部位のアセンブリ３からの蛍光信号１７を変換器５に送る視野レンズ６、
−該光源４からの励起光１６を該視野レンズ６に送る励起レンズ配置物１０、
−該視野レンズ６からの蛍光信号１７を該変換器５に送る結像レンズ配置物１２を含み、
該視野レンズ６が、該複数の個々の部位のアセンブリ３の該平面支持体２に対して、０°より大きい入射角αを有する励起光１６を形成し、該励起光１６および複数の個々の部位からの蛍光信号の該結像は、該視野レンズ６の物体側においてテレセントリックである。
【００１８】
本発明の文中において、複数の個々の部位のアセンブリとは、空間的に分離され、横方向に分布した2つ以上の部位からなる物体の総称である。部位は、例えばマイクロタイタープレートのウェル、またはスライドグラスの官能化表面領域であり得る。殆どの場合において、複数の個々の部位のアセンブリは、均一に配置され、多重分析を実施するためにそれぞれの部位が異なる内容物を有する。本発明の範囲内において、アセンブリの平面支持体は、平面状の固相である。マイクロアレイの場合、アセンブリの平面支持体は、部位が配置された平面状固相の面である。マイクロタイタープレートの場合、アセンブリの平面支持体は、ウェルの開口部が配置された単調なものである。アセンブリの平面支持体は、光路内において、個々の部位の各々の位置を所望の位置に安定化させるために、保持手段によって固定される。
【００１９】
本発明の範囲において、「光源（LS）」という表現には、単一の周波数を有する光または複数の異なる周波数を有する光を発する発光体が含まれる。さらに、光源は、1つより多い前記発光体の配置物であってもよい。
【００２０】
本発明の文中において、変換器（Det）とは、可視光をコンピューターによって処理可能な電子信号に変換することのできるデバイス、たとえばCCDチップである。
【００２１】
本発明の範囲内において、テレセントリック光学素子とは、開口絞りと物体の間の光学要素によって無限遠に投射される開口絞りを備えた光学素子のことをいう。換言すれば、テレセントリック光学素子の主光線は、物体空間において略平行である。主光線という用語は、開口絞りの中央を通るすべての光線に対して用いられる。物体、物体面および物体空間という用語は、複数の個々の部位のアセンブリ3を備えた平面支持体2を記述するために用いる。前記テレセントリック光学素子において、励起レンズ配置物10および結像レンズ配置物12は、いずれもそれぞれ独自の開口絞りを有する。前記テレセントリック光学素子は、励起経路および検出経路に対してテレセントリックである。光軸に垂直な平面における各物体点は、検出主光線のみならず励起主光線にも対応する。全検出主光線と同様に全励起主光線も略平行であるので、物体面において良好な横方向の均一性が確保され、アセンブリの中央に位置する部位がアセンブリの境界部に位置する部位と同等になる。
【００２２】
本発明全体をとおして、テレセントリック光学素子は常に視野レンズを含む。本発明の文中において、視野レンズは目的物に最も近く、励起光および蛍光信号を通過させ、1つ以上の部品を含んでもよく、装置のさらなる光学部品と組み合わせて物体および／または結像空間におけるテレセントリック性に寄与する。視野レンズの1つ以上の部品は、空間的に分離されたレンズ要素自体であってもよい。
【００２３】
本発明の視野レンズは、光源からの励起光を複数の個々の部位のアセンブリに送るとともに、複数の個々の部位のアセンブリからの蛍光信号を変換器に送る。このことは、追加の光学部品が、ビーム経路内、たとえば光源と視野レンズの間、視野レンズと変換器の間、または視野レンズと複数の個々の部位のアセンブリの間に導入されることを除外するものではない。
【００２４】
入射角αは、励起光ビームの略平行な主光線と、本発明の範囲におけるアセンブリの支持体である界面の法線の間の角度として定義される。
【００２５】
本発明の別の態様は、
本発明による光学機器と、
各々がＰＣＲ反応を行うことができる反応混合物を含む１つ以上のウェルを有する支持体を加熱および冷却するための手段と、を含むリアルタイムＰＣＲ機器である。
【００２６】
本発明の範囲において、加熱および冷却手段には、核酸の周期的PCR増幅を実施するために、複数の個々の部位のアセンブリの温度を周期的に制御および変化させることのできる任意の手段が含まれる。好ましくは、保持手段は、複数の個々の部位のアセンブリの平面支持体と熱接触させた状態で加熱および冷却することができる。
【００２７】
本発明のさらに別の態様は、複数のアッセイの蛍光信号を結像するための装置であり、該装置は、
−複数の個々のアッセイのアセンブリを含む平面支持体２；
−少なくとも１つの励起周波数を含む光を放射する少なくとも１つの光源４；
−該複数のアッセイからの蛍光信号を受信するように配置され、計算可能な一次データを作成する変換器５；
−該複数の個々のアッセイのアセンブリのテレセントリック励起と、前記複数の個々のアッセイのアセンブリの個々のアッセイの各々において発生される前記蛍光信号１７のテレセントリック結像とによって特徴づけられる、前記光源４から前記変換器５までのビーム経路を含み、
該テレセントリック励起の励起光１６は、複数の個々のアッセイのアセンブリの平面支持体２に対して０°より大きい入射角を有する。
【００２８】
複数の個々のアッセイのアセンブリは、並行分析を実現するために空間的に分離された2つ以上のアッセイからなる物体を総称するものである。これらのアッセイは、たとえば、マイクロタイタープレートのウェル中またはスライドグラスの官能化表面領域上で実施されてもよい。
【００２９】
ビーム経路という言い回しは、本発明を通して、光源から少なくとも視野レンズを通って複数の個々のアッセイのアセンブリに至るまでの過程、および複数の個々のアッセイのアセンブリから少なくとも視野レンズを通って変換器に至る過程において、光ビームが横切るすべての領域を総称するために用いる。
【００３０】
本発明の別の主題は、リアルタイムで同時に複数のＰＣＲ反応を行い、モニターするための装置であり、該装置は、
−各々がＰＣＲ反応を行うことができる反応混合物を含む複数の個々の部位を有するマルチウェルプレート；
−蛍光ＤＮＡ結合実体、および
−マルチウェルプレート全体をテレセントリック光で照射し、計算可能な一次データを作成するために、対応する蛍光信号を受信するように配置された変換器によって前記マルチウェルプレートの各ウェルからの蛍光信号を検出する、本発明の光学機器を含む本発明のリアルタイムＰＣＲ機器を含む。
【００３１】
本発明全体を通して、蛍光DNA結合実体はいずれも、増幅されたDNAの検出に使用可能な当業者によって公知の全蛍光色素または蛍光色素のアセンブリ、即ち、たとえば、二本鎖DNA結合色素、TagManプローブ、分子ビーコン、単一標識プローブまたはFRETハイブリダイゼーションプローブである。
【００３２】
本発明のさらに別の主題は、複数の標的ＤＮＡ配列を増幅、検出および／または定量する方法であって、
−ＰＣＲ反応を行うことが出来る組成物または反応混合物を提供する工程、
−該複数の標的ＤＮＡ配列の増幅が起こり得るようなサーモサイクリングプロトコルに反応混合物を供する工程、および
−蛍光ＤＮＡ結合実体および本発明のリアルタイムＰＣＲ機器を用いる複数の増幅サイクル後に各ＤＮＡ配列の存在および量を少なくとも１回モニターする工程、を含む方法である。
【００３３】
PCR反応を行うことのできる組成物または反応混合物は、本発明を通して、バッファー、ヌクレオチド、酵素、プライマーおよび蛍光DNA結合実体を含む。
【００３４】
サーモサイクリングプロトコールは、PCR組成物の時間を追った（chronological）温度処理、融解およびアニーリング温度、増幅サイクルの回数、並びに加熱および冷却のための時間を規定するプロトコールである。
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明の1つの主題は、複数の個々の部位からの蛍光信号を結像するための光学機器であって、該機器は、
−複数の個々の部位のアセンブリ３を備える平面支持体２を保持するための保持ユニット１、
−少なくとも１つの励起周波数を含む光を放射する少なくとも１つの光源４、
−該複数の個々の部位のアセンブリ３からの蛍光信号を受信するように配置され、計算可能な一次データを作成する変換器５；
−該光源４からの励起光１６を該複数の個々の部位のアセンブリ３に送り、該複数の個々の部位のアセンブリ３からの蛍光信号１７を変換器５に送る視野レンズ６、
−該光源４からの励起光１６を該視野レンズ６に送る励起レンズ配置物１０；
−該視野レンズ６からの蛍光信号１７を該変換器５に送る結像レンズ配置物１２を含み、
該視野レンズ６が、該複数の個々の部位のアセンブリ３の該平面支持体２に対して、０°より大きい入射角αを有する励起光１６を形成し、該励起光１６および複数の個々の部位からの蛍光信号の該結像は、該視野レンズ６の物体側においてテレセントリックである。
【００３６】
蛍光信号の結像を行うことのできる多くの機器が当業者によって知られている。光学機器が、複数の個々の部位のアセンブリ、例えばマイクロタイタープレートのウェルまたはマイクロアレイのスポットの蛍光信号を同時に結像できるべきである場合、アセンブリの中央およびアセンブリの境界部における色素の励起および蛍光信号の結像が同等であることを保証しなければならない。さらに、光ビーム全体にわたる均一な強度分布の要件が満たされたとしても、支持体全体が励起光学素子だけでなく結像光学素子の焦点面内にあるようにするためには、平面支持体の位置合わせがまだなお重要である。マイクロタイタープレートの場合のように支持体が深さを有する場合には、加えていくつかの特有の問題が生じる。
【００３７】
上記問題に対する解決策は、テレセントリック光学素子を使用することである。テレセントリック光学素子において、各物点から発散する主光線は略平行である。したがって、有限視野内のすべての物点はほぼ同じ遠近感および同じ強度で観察され、換言すると、テレセントリック光学素子は大きな視野深さと均一な励起または結像プロファイルを有している。
【００３８】
光学素子の特性は、その開口数（NA）によって特徴づけることができ、該開口数は一般には高い感度と良好な結像解像度を実現するためにできるだけ大きくすべきである。
NA=n・sin A
（式中、nは媒体の屈折率であり、Aは開口角である）
【００３９】
横方向に分布する部位のテレセントリック励起と、前記部位からの蛍光信号のテレセントリック結像のための光学機器を設計するためには、いくつかの局面を考慮に入れる必要がある。
【００４０】
まず、NA値はできるだけ大きくすべきであるが、これは結像光学素子に対してNA値が小さいと、結像解像度が悪くなり、励起光学素子に対してNA値が小さいと励起のための照射力が損なわれる。一方で、NA値を最小化することで、マイクロタイタープレートの場合のように、個々の部位のアセンブリが一定の深さを有する場合には最大の重要点となるテレセントリック光学素子の焦点の深さを増大させることができる。さらに、低開口光学素子は一般に製造コストが安いため、商業的な観点からも、小さいNA値が好ましい。
【００４１】
テレセントリック光学機器を全範囲の周波数に適用可能にすべき場合には、光学素子も無色のものとしなければならない。蛍光結像自身に関して、対処すべき要件はさらに多いが、これは蛍光結像が、変換器上で横方向に分布する部位を正確に再現するためには、正しいスケーリングを有していなければならないからである。さらに、球面または色収差、コマ収差、非点収差または視野の湾曲などの結像誤差も制御しなければならない。
【００４２】
テレセントリック光学素子の作成するためにはいくつかの方法がある。一般に、テレセントリック光学素子は、ビーム路内に１つより多いレンズを順に配置した複数要素からなるレンズ設計である。テレセントリック光学素子は、物体面においてテレセントリック、結像面においてテレセントリック、またはいわゆる二重テレセントリック光学素子である、両方の面においてテレセントリックなものとして構成することができる。さらに、テレセントリック光によって物体を照射することおよび／または物体をテレセントリックにモニターすることができる。一般には、物体面においてテレセントリック性を有する光学素子を提供するだけで十分であるが、これは、このことですでに、物体全体を横方向ならびに第3の次元に均一に照射できるとともに、物体からの放射光を正確に集光できるからである。
【００４３】
当該分野の状況から、蛍光信号を結像するためにテレセントリック光学素子を使用する機器が知られているものの、励起は通常は非テレセントリックな様式で、たとえば背面照明、斜照明によって、またはエバネッセント場によって行われている。本発明においては全体を通して、複数の個々の部位からの蛍光信号の結像だけでなく、複数の個々の部位の励起のいずれもテレセントリックな様式で行う。
【００４４】
図1および図2は、下記に詳細に説明する本発明の好ましい態様による2つの光学機器の概略図を示す。
【００４５】
すべてのテレセントリック光学素子の中心部は視野レンズである。このレンズは、物体に最も近く、機器の視野の直径を決めるものである。したがって、このレンズの直径は、複数の個々の部位のアセンブリが大きな面積にわたって分布している場合には、そのサイズが大きくなる傾向にある。視野レンズはシングレット（１つの単レンズ）として、または、たとえば互いに貼付られた2つのレンズを含む色消しレンズとして存在する。なお、本発明に用いることのできる特有の視野レンズは、フレネルレンズである。フレネルレンズは、視野レンズと同じテレセントリック特性を提供する少なくとも1つの光学的に有効な表面上に、複数のテーパー部を有する独特の複雑な湾曲を有している。ほとんどの場合、フレネルレンズは光軸に垂直な平坦面によって支持される複数のテーパー部を有する表面を一つしか有しないので、通常の視野レンズに比べてより薄い。特定の場合において、湾曲した支持面をさらに有するか、またはレンズの両面に複数のテーパー部を有するフレネルレンズが提供される。さらに、フレネルレンズはプラスチックで形成される場合があり、したがって、ガラスからなる大きな視野レンズよりも安価であり得る。しかしながら、一方で、これらのフレネルレンズの結像の質、特にコントラストとクロストークに関しては、通常の視野レンズに比べて劣ることになる。これは、不連続な湾曲を有するレンズの上記点において光が散乱するためである。
【００４６】
あらゆる蛍光結像機器が共通して有する問題は、励起光と蛍光信号の間の大きな強度の差である。結果として、励起光が蛍光信号と一緒に変換器にあたった場合に、結像に対しての信号対雑音比が不十分になる。この問題を回避するには大きく2つの戦略、すなわちビームスプリッタを使用することと斜照明がある。
【００４７】
ビームスプリッタは通常は、光をその波長によって透過または反射する二色性ミラーであるので、光ビームの2つの要素を空間中の異なる方向に分離するために用いることができる。蛍光信号を結像するための光学機器における用途において、この二色性ミラーは、励起光を反射し、蛍光を透過させるものであるか、もしくはその逆でなければならない。ビームスプリッタを使用する大きな欠点は、所定の周波数ウィンドウ内にある励起周波数および蛍光信号を有する一定の限られた数の蛍光色素とともにしか利用できないことにある。したがって、他の蛍光色素が用いられるべき場合、当該光学機器に対して別のビームスプリッタを設けなければならない。これには費用や手間がかかる。
【００４８】
斜照明を用いることにより、ビームスプリッタを回避することができる。この場合には、励起光ビームは、複数の個々の部位のアセンブリ3の平面支持体2に対して0°より大きい入射角を有する。その結果、前記励起光ビームの反射も、前記平面支持体に対して対応する角度で起こり、また、平面支持体に対して法線方向に向けられた変換器から離れるように指向される。光学機器の他の光学部品に依存して、この設定は、ビームスプリッタ設定に比べてより広い範囲の周波数で使用することができ、また光学機器を変えることなく種々の蛍光色素を使用することができる。
【００４９】
使用する光学部品の用途およびパラメータに応じて、励起光ビームに対する適当な入射角は異なる。ほぼ任意の深さを有する複数の個々の部位のアセンブリの場合には、入射角は40°前後の大きさであり得るが、これは蛍光色素の画分の励起を妨害し得るような照射影が起こらないためである。このような複数の個々の部位のアセンブリの例は、平面固体支持体上の官能化スポットのアレイである。
【００５０】
たとえば、マイクロタイタープレートまたは一定の三次元構造を有する任意の支持体の場合、入射角に関する状況は異なる（図4を参照のこと）。入射角が増大すればするほど、支持体の構造がより多くの影を生み出す。特にマイクロタイタープレートのウェルについては、入射角が大きければ、ウェルの内側の画分のみが照射されるという影響が及ぼされる。その結果、マイクロタイタープレートに対しては入射角が20°未満であることが適当である。
【００５１】
本発明の光学機器の好ましい態様において、励起光16の入射角αは20°未満であり、好ましくは10°未満であり、最も好ましくは5°未満である。
【００５２】
一方で、入射角αはまた、励起光学素子と結像光学素子の両方のゼロより大きい有限開口のために、小さい値に向かって限定されることに留意する。
【００５３】
本発明の光学機器の別の好ましい態様において、入射角αは、
【００５４】
【数３】
2006215025.tif 000005
【００５５】
であり、A1は励起光学素子の開口半角であり、A2は結像光学素子の開口半角である。
【００５６】
励起光学素子と結像光学素子の両方の開口半角Aiは、対応する開口数NAiによって、NAi＝ni・sin Ai（式中、niは物体とそれぞれの光学素子の間の媒体の屈折率であり、i=1は励起光学素子を表し、i=2は結像光学素子を表す）として定義される。入射角αが上記等式によって定義されるよりも小さいと、図4において説明するように変換器にあたる励起光ビーム反射の量が増大する。このことは、マイクロタイタープレートに対してだけでなく、平面固体支持体上の官能化スポットのアレイに対してもあてはまる。
【００５７】
別の好ましい変形において、本発明の光学機器は、前記光源から前記複数の個々の部位のアセンブリに向けて、他の複数の周波数を遮断しながら少なくとも1つの励起周波数を送ることのできる励起フィルター装置8をさらに含む。
【００５８】
このような追加の励起フィルター装置は、蛍光色素に対して問題となり得る光源からの特定の周波数を遮断することができる。適切な励起フィルター装置は、たとえば、異なる光学特性を有する一定数の個々のフィルターを含むいわゆるフィルターホイールである。このようなフィルターホイールを用いることで、励起周波数を変化させるための簡単な手段が提供される。特有の励起フィルター装置は、たとえば、赤外（IR）周波数または紫外（UV）光を吸収するフィルターである。このような特有の励起フィルター装置は、薄膜フィルターなどの別個の光学部品の形態、または装置の他の光学部品上の光学活性コーティングの形態で実現することができる。
【００５９】
さらに好ましい態様において、本発明の光学機器は、励起周波数を有する光を遮断しながら、複数の個々の部位のアセンブリからの蛍光信号17を前記変換器に送ることのできる結像フィルター装置9をさらに含む。
【００６０】
このような追加の結像フィルター装置は、結像処理に問題を来すおそれのある、複数の個々の部位において発生するか励起反射からの特定の周波数を遮断することができる。この場合も、適切な結像フィルター装置は、異なるフィルターを含んだフィルターホイールである。励起フィルター装置の場合と同様に、特有の結像フィルター装置は、たとえば、赤外線（IR）フィルターまたは紫外線（UV）フィルターであり得る。このような特有の結像フィルター装置は、薄膜フィルターなどの別個の光学部品の形態、または装置の他の光学部品上の光学活性コーティングの形態で実現することができる。別の結像フィルター装置は、検出器による分散光の検出を回避するフィルター装置である。
【００６１】
前述のように、本発明の光学機器は、励起レンズ配置物10を含み、前記励起レンズ配置物は、前記光源4からの光を前記視野レンズ6に送る。
【００６２】
このことは、光源からの光が、複数の個々の部位のアセンブリ上において、視野レンズ6および励起レンズ配置物10を含む励起光学素子を用いて、結像されることを意味している。前記励起光学素子は、視野レンズ6の物体側上にテレセントリックな励起光を与えるので、テレセントリック励起光学素子である。励起レンズ配置物は、光源の出力の利用性を高めるべく、励起開口を増大させるために、少なくとも1つのレンズを含み、好ましくは少なくとも3つのレンズを含む。レンズの量を減らすべき場合には、励起レンズ配置物は、非球面(asphere)なものを含んでもよい。好ましくは、テレセントリック励起光学素子は、励起波長に関係なく、複数の個々の部位のアセンブリ全体に均一な強度分布を実現するために、無色に設計される。
【００６３】
本発明の別の態様において、前記光源は複数の周波数を含む光を発し、好ましくは、前記光源は白色光源であり、最も好ましくは、前記光源はキセノン灯もしくは水銀灯などの放電灯、またはタングステン灯などのフィラメント灯である。
【００６４】
本発明のさらに別の態様において、前記光源は単一の周波数を有する光を発し、好ましくは、前記光源はレーザーであり、最も好ましくは、前記光源はLEDである。
【００６５】
種々の周波数を有する光を発する光源の使用は、励起フィルター装置および／または結像フィルター装置を変えるだけで、種々の蛍光色素に対してこの光源を用いることができるという利点を有する。ある蛍光色素から他のものに容易に切り替えるために、一定量のフィルターを含む励起フィルター装置および／または結像フィルター装置としてのフィルターホイールを用いることが好ましい。一方、光源が単一の周波数のみを有する光を発する場合、フィルターセットの要件を満たすのは簡単であるが、光学機器は限定量の蛍光色素に固定される。
【００６６】
本発明の一態様において、光源ウィンドウは、IRおよび／またはUV光を吸収するために、特別の励起フィルター装置として作用する光学活性コーティングを有する。
【００６７】
本発明のさらに好ましい変形において、前記光源は１つより多い発光体、好ましくは１つより多いレーザー、最も好ましくは１つより多いLEDの組み合わせを含む。
【００６８】
この好ましい態様において、１つより多い励起周波数を有する本発明の光学機器を提供するために、種々の発光体のアセンブリを用いる。例えば本発明の2つの異なる光源を有するかかる態様において、各光源は好ましくは、自身の励起フィルター装置8および励起レンズ配置物10を有する。
【００６９】
本発明の別の変形において、前記光源は、1つ以上の前記発光体を選択するための装置をさらに含む。
【００７０】
前記発光体のうちの1つを選択する装置を、種々の方法で実現することができる。一つの可能性は、選択した発光体の光を光路内に投入するために回転式ミラーを使用することである。もう一つの可能性は、選択した発光体の光を光路内に投入するために発光体の配置を移動することである。
【００７１】
本発明のテレセントリック励起光学素子は、視野レンズ6、励起フィルター装置8および励起レンズ配置物10に加えて、いくつかの追加の部品を含み得る。一つの態様において、テレセントリック励起光学素子は、光ガイド14をさらに含み、光源からの光を光学装置の光学部品に送るために、光源からの光を前記光ガイド14に結合する。光ガイドを用いて、種々の光源からの光を結合し、この結合光を同時に光学部品に送ることができる。あらゆる種類の光ガイドが本発明の目的のために適用できる。可能な光ガイドとしては、たとえば、流体光ガイド、ファイバー光ガイドまたはファイバー光ガイドの束がある。本発明の態様において、前記光ガイドの一端または両端は、IRおよび／またはUV光を吸収するために、特別の励起フィルター装置として作用する光学活性コーティングを有する。
【００７２】
必要であれば、励起光の方向を変えるために、テレセントリック励起光学素子は追加のミラー7を含み得る。かかるミラー7を、図1の態様に示す。
【００７３】
本発明のさらに別の態様において、テレセントリック励起光学素子は、光ミキサー15をさらに含み、前記光源からの光を混合し、前記光ミキサー15の照射表面を複数の個々の部位のアセンブリ上に結像する。
【００７４】
光ミキサー15は、断面全体にわたって均一な強度分布を有する光を供給する光源として使用され得る、非常に均一な照射表面を有する装置である。光ミキサーは、光学透過性材料からなるやや長い実体であり、一方で前記実体の境界は光路に平行である。言い換えれば、光ミキサーは一種の光学ファイバーである。前記光ミキサーに投入される光は、非常に均一に照射されるファイバーの一端の断面積をもたらす光学透過性材料の内側の界面で複数の全反射を受ける。光学透過性材料の内側界面での全反射は、単に前記界面での屈折率の変化に基づき、または反射性コーティングによって支持されうる。前記光ミキサーのその断面積に対する長さの比は、照射の均一性のために重要である。前記比は好ましくは2より大きい。
【００７５】
光源からの、特に光ミキサーの一端における断面積からの光は、視野レンズ6および励起レンズ配置物10を含むテレセントリック励起光学素子を用いて、複数の個々の部位のアセンブリ上に結像される。したがって、本発明の本態様において、複数の個々の部位の励起を、物体空間においてテレセントリックな励起光学素子で行う。
【００７６】
本発明の光学機器は、化学発光および生物発光の結像にも適用可能である。これらの場合において励起光は必要ないので、光源4、励起レンズ配置物10および励起フィルター装置8を省略することができる。
【００７７】
さらに好ましい変形において、本発明の光学機器は、1、2つ以上のフォールディングミラーを含む光ビームフォールディングユニット11をさらに含み、前記フォールディングユニットは、前記光源からの光および前記複数の個々の部位のアセンブリからの蛍光信号17をフォールドする。
【００７８】
本発明の範囲において、光ビームフォールディングユニットは、長い光路を提供するユニットであり、一方で同時に、限定量の空間を必要とするだけである。この結果を、たとえば、図1および図2に示すような2つのフォールディングミラーの配置物によって達成することができる。開口絞り付近において主光線の最大角を制限するために、変更可能な1つのパラメータとして、光が横断すべき光路がある。光路を広げることにより、最大主光線角が、開口絞りに隣接する励起フィルター装置8上でも低減される。励起フィルター装置8の性能が損なわれるので、主光線角度が大きくなる場合、光路はむしろ長くすべきである。大きな機器は適切でないので、長い光路を実現するためにフォールディングミラーを使用でき、同時に機器の大きさを抑える。
【００７９】
前述のように、本発明の光学機器は結像レンズ配置物12を含み、前記結像レンズ配置物12は前記視野レンズ6から前記変換器5に光を送る。
【００８０】
このことは、複数の個々の部位のアセンブリで発生する蛍光信号17が、視野レンズ6及び結像レンズ配置物12を含むテレセントリック結像光学素子によって、変換器5上に結像されることを意味する。本発明の他の態様において、テレセントリック結像光学素子は、たとえば光ビームフォールディングユニット11および／または特別の結像フィルター装置9をさらに含む。
【００８１】
テレセントリック結像光学素子を、変換器の大きさおよび複数の個々の部位のアセンブリの空間的大きさについて最適化しなければならない。励起レンズ配置物10の場合のように、結像レンズ配置物12は、少なくとも1つのレンズ、好ましくは少なくとも5つのレンズのアセンブリを含む。励起光学素子に比べて、結像光学素子にはより高い要件が課せられなければならないので、結像レンズ配置物に対しては多数のレンズが必要である。蛍光結像は、変換器上で側方に分散する部位の正確な再現のために正しい縮尺を有さなければならない。さらに、球面または色収差、コマ収差、非点収差、特別の誤差または視野の湾曲のような結像誤差は制御されなければならない。変換器上への蛍光信号の結像によって、視野レンズ6の物体サイトにおいてのみテレセントリックな結像光学素子を用いて蛍光結像が行われる。
【００８２】
本発明の光学機器のさらなる好ましい変形において、前記結像レンズ配置物12は、前記変換器5に連結されて、結像ユニット13を形成する。
【００８３】
本発明のこの好ましい態様において、テレセントリック結像光学素子は、標準的な対物レンズとは異なり、その中で全レンズが対物レンズを構成する所定の様式で配置および固定され、前記対物レンズ全体が変換器と物体の間に配置されていることに注目する。全く対照的に、本発明のこの好ましい態様において、結像レンズ配置物12は変換器5に連結され、結像ユニット13を構成する。結像解像度および精度に関する要件を満たすために、結像レンズ配置物および変換器の位置決めが特に重要である。本態様において、これらの要件は、最適化された位置を固定する前に、結像レンズ配置物と変換器の間での位置を最適化することで満たされる。結像レンズ配置物と変換器の間での前記連結は、目的とした使用の間、維持され、位置決めの再最適化が必要になる場合にのみ解除される。
【００８４】
本発明の光学機器の態様において、前記変換器は半導体デバイスまたは好ましくは電荷結合デバイスを含む。
【００８５】
本発明の内容において、変換器は、光をコンピューターで処理可能な電気信号に変換することのできるデバイスである。これを、検出すべき蛍光信号に対応するエネルギーよりも小さいバンドギャップを有する半導体デバイスによって行うことができる。デバイスの照射によって半導体の導電帯域で発生した電子が、計算可能なデータに翻訳されうる測定可能な信号を生み出す。これらの半導体デバイスの例としては、光ダイオードまたは電荷結合デバイス（CCD）がある。
【００８６】
本発明の光学機器のさらなる好ましい変形は光学機器であり、その中で前記アセンブリの個々の部位がウェルであり、励起光16が前記ウェルの側壁に関して20°未満の角度を有し、前記ウェルに充填される溶液が蛍光色素を含む。
【００８７】
光学機器のこのさらなる好ましい変形の例としては、マイクロタイタープレートの個々のウェル中で行なうPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅の同時モニタリング用の装置がある。ウェル内の充填高に関係なく、多量のウェルの内部を照射するために、励起光はウェルの側壁に対して20°未満の角度を有する。励起用ならびに蛍光結像用のテレセントリック光学素子が用いられているので、プレート中央におけるウェルからの結果は、プレート境界部にあるウェルからの結果と同等になる。
【００８８】
個々のウェル内で実施されるPCR増幅の場合、全蛍光実体は、二本鎖核酸に特異的に結合する蛍光色素として適用可能である。本発明の内容において、これらの蛍光色素は蛍光DNA結合実体と呼び、一方で蛍光DNA結合実体は、それらが二本鎖DNAに結合する場合、特有の蛍光を提供する分子または一対の分子である。リアルタイムPCRモニタリングの分野において、以下の検出様式が知られている。DNA結合色素様式（たとえばSybrGreenI）,TaqManプローブ、分子ビーコン、単一標識化プローブ（SLP）様式またはFRETハイブリダイゼーションプローブ。
【００８９】
本発明の光学機器の好ましい態様としてはまた光学機器があり、その中で前記アセンブリの個々の部位が平面支持体上のスポットであり、前記スポットに蛍光色素が付加される。
【００９０】
光学機器のこの好ましい態様の例としては、平面アレイの種々のスポットから同時に蛍光信号を結像する装置がある。特定の態様において、かかるアレイはDNAアレイであり、側方限定領域が種々の配列を有するDNAプローブによって官能化される。この場合、本発明の光学機器は、たとえば相補的DNA鎖を蛍光色素で標識する場合、核酸を含む試料とのハイブリダイゼーション事象をモニタすることができる。試料中のDNA分子を標識するかわりに、ハイブリダイゼーション事象を、二本鎖核酸結合蛍光色素によっても可視化することができる。
【００９１】
本発明はまた、
本発明の光学機器および、
各々がＰＣＲ反応を行うことができる反応混合物を含む１つ以上のウェルを有する支持体を加熱および冷却するための手段、
を含むリアルタイムPCR機器に関する。
【００９２】
本発明の範囲において、加熱および冷却手段は、核酸の周期的PCR増幅を実施するために、複数の個々の部位のアセンブリの温度を周期的な方法で制御および変化させ得る任意の手段を含む。各PCRサイクルはいくつかの種々の工程、すなわち、温度を低下させるアニーリング工程、蛍光色素を用いた検出ステップとともに行う比較的低温での酵素増幅工程および高温での融解工程を含む。
【００９３】
本発明はさらに、複数のアッセイの蛍光信号を結像するための装置に関し、該装置は、
−複数の個々のアッセイのアセンブリを含む平面支持体２；
−少なくとも１つの励起周波数を含む光を放射する少なくとも１つの光源４；
−該複数のアッセイからの蛍光信号を受信するように配置され、計算可能な一次データを作成する変換器５；
−該複数の個々のアッセイのアセンブリのテレセントリック励起と、前記複数の個々のアッセイのアセンブリ３の個々のアッセイの各々において発生される前記蛍光信号１７のテレセントリック結像とによって特徴づけられる、前記光源４から前記変換器５までのビーム経路、
を含み、該テレセントリック励起の励起光１６は、複数の個々のアッセイのアセンブリ３の平面支持体２に対して０°より大きい入射角を有する。
【００９４】
複数の個々のアッセイのアセンブリは、並行分析を実現するために空間的に分離された2つ以上のアッセイからなる物体を総称する。これらのアッセイは、たとえばマイクロタイタープレートのウェル中またはスライドガラスの官能化表面領域上で実施されうる。大半の場合において、複数の個々のアッセイのアセンブリは、均一に配置され、多重分析を実施するためにそれぞれのアッセイが異なる内容物を有する。DNAマイクロアレイの場合、アレイの各スポットはある配列を有するオリゴマーによって官能化され、一方でイムノアッセイの場合、アレイの各スポットは、例えば、種々の親和性を有するタンパク質によって官能化される。マイクロタイタープレートの場合、各ウェル中で、例えば異なるPCRを行なう。
【００９５】
本発明の複数のアッセイの蛍光信号を結像する装置の好ましい態様において、前記装置は、視野レンズをさらに含み、一方で前記ビーム路は前記視野レンズを2回通過する。
【００９６】
本発明の複数のアッセイの蛍光信号を結像する装置の別の好ましい態様において、前記装置は結像レンズ配置物12をさらに含み、一方で前記結像レンズ配置物12は、前記変換器5に連結されて結像ユニット13を構成する。
【００９７】
本発明の装置の別の好ましい態様において、入射角αは、
【００９８】
【数４】
2006215025.tif 000006
【００９９】
であり、A1は励起光学素子の開口半角であり、A2は蛍光結像光学素子の開口半角である。
【０１００】
本発明の複数アッセイの蛍光信号を結像するための装置のさらに好ましい態様は、前記光源から前記複数の個々の部位のアセンブリに少なくとも1つの励起周波数を転送可能な励起フィルター装置をさらに含み、一方で励起周波数を有する光を遮断しつつ、複数の他の周波数をブロックしおよび／または前記複数の個々の部位のアセンブリから前記変換器に蛍光信号を転送可能な結像フィルター装置をさらに含む。
【０１０１】
本発明の別の側面は複数のPCR反応をリアルタイムで同時に実施およびモニタする装置に関し、該装置は、
−各々がPCR反応を行うことができる反応混合物を含む複数の個々の部位を有するマルチウェルプレート、
−蛍光DNA結合実体および、
−マルチウェルプレート全体をテレセントリック光で照射し、計算可能な一次データを作成するために対応する蛍光信号を受信するように配置された変換器によって、前記マルチウェルプレートの各ウェルからの蛍光信号を検出する本発明の光学機器を含むリアルタイムPCR機器
を含む。
【０１０２】
一般に、増幅DNAのリアルタイム検出のための蛍光DNA結合実体について種々の様式が存在し、以下のものが周知であり、当該分野において一般的に使用される。
【０１０３】
a）DNA結合色素様式
二本鎖増幅産物の量は通常、分析すべき試料中に元から存在する核酸の量を超えるので、二本鎖DNA特異的色素を使用してもよく、該色素は適切な波長で励起されるとき、それらが二本鎖DNAに結合している場合に限り、蛍光の増大を示す。好ましくは、例えば、PCR反応の効率に影響を及ぼさないSybrGreenIのような色素だけが使用されうる。
【０１０４】
当該分野において公知の他のすべての様式は、その標的核酸に結合した際に蛍光を発するだけの蛍光標識されたハイブリダイゼーションプローブの設計を必要とする。
【０１０５】
b）TaqManプローブ
一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを2つの成分で標識する。第1の成分が適切な波長の光によって励起される時、吸収エネルギーは、蛍光共鳴エネルギー移動の法則にしたがって、第2の成分（いわゆるクエンチャー）に移される。PCR反応のアニーリング工程の間に、ハイブリダイゼーションプローブが標的DNAに結合し、連続伸長段階の間にTaqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。結果として、励起蛍光成分およびクエンチャーが空間的に互いに分離され、第1の成分の蛍光発光を測定できる（US 5,538,848）。
【０１０６】
c）分子ビーコン
これらのハイブリダイゼーションプローブはまた、第1の成分およびクエンチャーによって標識され、標識は好ましくはプローブの両端に置かれる。プローブの二次構造の結果として、両成分が溶液中で空間的に接近した状態になる。標的核酸へのハイブリダイゼーションの後、適切な波長の光で励起した後に第1の成分の蛍光発光が測定可能となるように、両成分を互いに分離する（US 5,118,801）。
【０１０７】
d）単一標識プローブ（SLP）様式
本検出様式は、5'または3'末端のいずれかにおいて単一の蛍光色素によって標識された単一のオリゴヌクレオチドを含む（WO 02／14555）。G-クエンチング(quenching)プローブおよびニトロインドール-デクエンチング(dequenching)プローブの2つの異なる設計をオリゴ標識のために用いることができる。
【０１０８】
G-クエンチングの態様においては、蛍光色素をオリゴ5'-または3'-末端のCに付加する。2つのGがCの反対側の標的鎖上および相補的オリゴヌクレオチドプローブの脇の位置1に位置する場合において、プローブが標的にハイブリダイズする時、蛍光が著しく減少する。
【０１０９】
ニトロインドールデクエンチング（dequenching）の態様においては、蛍光色素を、オリゴヌクレオチドの5'-または3'-末端においてニトロインドールに付加する。ニトロインドールは、遊離のプローブの蛍光シグナリングをいくらか低減させる。デクエンチング効果のためにプローブが標的DNAにハイブリダイズされる時、蛍光は増大する。
【０１１０】
e）FRETハイブリダイゼーションプローブ
FRETハイブリダイゼーションプローブ試験様式は、あらゆる種類の均一のハイブリダイゼーションアッセイに対して特に有用である（Matthews, J.A., および Kricka, L.J., Anal. Biochem. 169 （1988） 1-25）。これは、同時に用いられおよび増幅された標的核酸の同一鎖の隣接部位に相補的である、2つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブ対によって特徴付けられる。両プローブは種々の蛍光成分によって標識される。適切な波長の光で励起される時、両ハイブリダイゼーションプローブが検出すべき標的分子の隣接部位に結合する時、第2の成分の蛍光発光を測定できるように、蛍光共鳴エネルギー移動の原理にしたがって、第1の成分が第2の成分に吸収エネルギーを移す。
【０１１１】
標的配列にアニールされる時、ハイブリダイゼーションプローブは、頭から尾の配置において、互いに非常に近づくにちがいない。通常、第1のプローブの標識3'末端と第2のプローブの標識5'末端の間隔はできるだけ小さく、すなわち1〜5塩基である。これにより、FRET供与体化合物とFRET受容体化合物が非常に接近することができ、その距離は典型的には10〜100オングストロームである。
【０１１２】
FRET受容体化合物の蛍光の増大をモニタリングする代わりに、FRET供与体化合物の蛍光の減少を、ハイブリダイゼーション事象の定量測定としてモニタすることもできる。
【０１１３】
特に、FRETハイブリダイゼーションプローブ様式は、増幅された標的DNAを検出するために、リアルタイムPCRにおいて使用されうる。リアルタイムPCRの分野で公知のすべての検出様式のなかで、FRET-ハイブリダイゼーションプローブ様式は、非常に感度よく、正確かつ信頼性があることが証明されている（WO 97／46707; WO 97／46712; WO 97／46714）。けれども、適切なFRETハイブリダイゼーションプローブ配列の設計は、検出すべき標的核酸配列の特有の特性によってしばしば制限されうる。
【０１１４】
2つのFRETハイブリダイゼーションプローブを使用する代わりとして、蛍光標識されたプライマーおよび１つだけ標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いることもできる（Bernard, P. S．ら, Anal. Biochem. 255 （1998） 101-107）。この点に関して、プライマーをFRET供与体またはFRET受容体化合物で標識するかは任意で選択されうる。
【０１１５】
本発明はさらに、複数の標的DNA配列を増幅、検出、および／または定量する方法に関し、該方法は、
−PCR反応を行うことができる組成物または反応混合物を提供すること、
−前記複数の標的DNA配列の増幅が起こり得るようなサーモサイクリングプロトコルに前記反応混合物を供すること、および
−蛍光DNA結合実体および本発明のリアルタイムPCR機器を用いた複数の増幅サイクルの後、各DNA配列の存在および量を少なくとも1回、モニターすること、を含む。
【０１１６】
以下の実施例、参考文献および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の請求項に列挙されている。本発明の精神を逸脱しない限り列挙した手順において変更がなされ得ることが理解される。
【実施例】
【０１１７】
以下の実施例は、詳細な説明において説明しおよび図3に図示した光学機器を用いて行った。テレセントリック励起光学素子は、450〜650 nmの周波数に対応するように調整され、テレセントリック結像光学素子は500〜740 nmの周波数に対応するように調整された。光源はキセノン灯であり、変換器としては1024 x 1344画素からなる冷却2／3"CCDチップを用いた。光学機器は、96ウェル（距離9 mm;直径5 mm）および384（距離4.5 mm;直径3 mm）のマイクロタイタープレート（MTP）を使用できるように、83 mm x 117 mmの面積を結像するように設計された。ある蛍光色素に対する励起および結像のための適切な波長を、フィルターホイールによって調整した。
【０１１８】
テレセントリック励起光学素子は、光源側に0.35、MTP側に0.014の開口数を有した。幾何学的な理由のために、光源はCCDチップに対して垂直に配置され、励起光線は追加のミラーによってMTPに向けられなければならなかった。励起光線自体は、MTPに対して2°の入射光を有し、物体視野（88 mm x 122 mm）の強度変化が10%未満であった。結像光学素子は物体側で0.O14の開口を有し、800 mmの物体−画像間距離と共に-0.075の再現スケールを有した。この大きな距離を、2つのフォールディングミラーを用いて実現した。結像光学素子は、+/- 3 mmの視野深度を有した。
【０１１９】
実施例１
感度および再現性
前述の光学機器の感度を、フルオレセインナトリウム水溶液を用いた系列希釈によって評価した。3つの異なるタイプのMTP、つまり黒色MTP（MTP 1）、透明MTP（MTP 2）および白色MTP（MTP 3）を調べ、すべてがほぼ同じ感度を与えた。測定を、1000 msの積分時間で58℃にて行い、図5のグラフのすべての点について50回繰り返した。
【０１２０】
上述の50回の測定値を用いて、光学機器の再現性を調べ、2つの異なる光学機器に対して黒色MTPを例に挙げて、強度の経過を図6に示す。2つのMTP型および2つの異なる光学機器を用いた4つの異なるウェルにおいて、85nmol／lのフルオレセインナトリウム水溶液濃度に対する測定値20〜50を用いて、以下の変動：MTP 1に対しては0.25%、MTP 2に対しては0.39%の変動が得られた。白色MTPに対して、21nmol／lの濃度を用いて同じことを行い、0.98%の変動を生じた。
【０１２１】
実施例２
クロストーク
5つのウェル中のフルオレセインナトリウムを用いた透明MTPの画像を図7に示す。MTPの画像は、蛍光ウェルの2つの反射の型を示す。第1の反射は、隣接ウェルまでの距離内で検出され、ウェル自体と同じ直径を有しおよびウェル自体と約0.5%の強度を有した。第2の反射はウェル自体の直径の約2〜3倍の直径を有し、強度は2・104〜3・104の係数で低下していた。
【０１２２】
まとめると、隣接ウェルでの平均強度は、黒色MTPに対して3・104の係数で低下し、白色MTPならびに透明MTPに対して約1・103の係数で低下する。
【０１２３】
実施例３
充填高
本実施例は、ウェル内の充填高についての蛍光信号の依存性を評価するために行った。結果を図8に示す。169nmol／lの濃度を有する種々の量のフルオレセインナトリウム溶液をウェルにピペッティングし、図8は10個の種々のウェルの平均強度を示す。ウェル内の充填高に依存しない結像を予想したように、蛍光強度と一定濃度のアプライ量の間に線形従属性が認められた。
【０１２４】
文献一覧
Bernard, P. S.ら、 Anal. Biochem. 255 (1998) 101-107
DE 101 31 687
DE 101 55 142
DE 102 00 499
DE 197 48 211 A1
EP 1 275 954 A2
JP 2002014044
Matthews, J. A.およびKricka, L. J.、Anal. Biochem. 169 (1988) 1-25
US 2002/0005493 A1
US 2002/159057
US 2003/0011772 A1
US 5,118,801
US 5,538,848
US 6,246,525 B1
US 6,498,690 B1
WO 02/14555
WO 03/069391
WO 97/46707
WO 97/46712
WO 97/46714
WO 99/60381
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】本発明による光学機器の一態様の概略図。
【図２】光ビームホールディングユニット11を含む本発明による光学機器の別の態様の概略図であり、A）は励起、B）は結像を示す。
【図３】光ビームホールディングユニット11を含む本発明による光学機器の態様の3D図。
【図４】光学機器のパラメータ間の相関関係を示す概略図。
【図５】光学機器の感度。
【図６】蛍光結像の再現性。
【図７】マイクロタイタープレートの蛍光画像。
【図８】ウェルの充填高に依存する蛍光強度。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図７】
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【外国語明細書】
2006215025000001.pdf