(57)【要約】【課題】  微生物をはじめとする細胞の生育を抑制することなく、しかも有用物質について高い生産性を保持したまま、ギ酸や酢酸をはじめとする生育に有害な短鎖脂肪酸に対して耐性を付与する方法、及び、短鎖脂肪酸存在下において微生物を効率良く培養する手段や、発酵により有用な短鎖脂肪酸を製造するための手段を、提供すること。【解決手段】  細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入して発現させることを特徴とする短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞の育種方法、該細胞を用いることを特徴とする高密度菌体培養法、及び、該細胞を、該細胞が短鎖脂肪酸を生成する条件下で培養することを特徴とする短鎖脂肪酸を含有する発酵液の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入して発現させることを特徴とする短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞の育種方法。
【請求項２】
細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の細胞の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３０１〜２０７３からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３０１〜２０７３からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の細胞の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３３１〜２１５４からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３３１〜２１５４からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の細胞の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１００２〜１７２４からなる塩基配列、及び塩基番号１７２４〜２５００からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１００２〜１７２４からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、及び、配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１７２４〜２５００からなる塩基配列を含むＤＮＡであって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１００２〜１７２４からなる塩基配列、及び、配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１７２４〜２５００からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１００２〜１７２４からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、及び、配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１７２４〜２５００からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の細胞の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号８に記載の塩基配列のうち、塩基番号２４９〜１０２５からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号８に記載の塩基配列のうち、塩基番号２４９〜１０２５からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
短鎖脂肪酸が、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、又は、吉草酸であることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれかに記載の細胞の育種方法。
【請求項７】
細胞が微生物細胞であることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれかに記載の方法で育種された細胞。
【請求項８】
微生物細胞が、酢酸菌、大腸菌、又はバチルス属に属する細菌細胞であることを特徴とする請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞を用いることを特徴とする高密度菌体培養法。
【請求項１０】
細胞を短鎖脂肪酸存在下で培養することを特徴とする請求項９に記載の高密度菌体培養法。
【請求項１１】
請求項８に記載の細胞を、該細胞が短鎖脂肪酸を生成する条件下で培養することを特徴とする短鎖脂肪酸を含有する発酵液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞の育種方法に関し、詳しくは、短鎖脂肪酸耐性遺伝子を微生物等の細胞に導入し発現させて短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞を育種するための方法、並びに、該方法により得られる微生物細胞の用途としての、有用物質を生産するための高密度菌体培養法、及び短鎖脂肪酸を含有する発酵液の効率的な製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微生物の工業的培養時には、栄養源としてグルコースなどの炭素源、ペプトンなどの窒素源、硫酸塩やリン酸塩、ナトリウムなどの無機物質、カルシウムや亜鉛などの微量元素、プリン、ピリミジンなどの生育因子等の栄養源を、培地中に添加している。
しかしながら、これらの栄養源が微生物の増殖によって消費されてしまうと、微生物はギ酸や酢酸など微生物の生育にとって毒性のある短鎖脂肪酸を培地中に生成し、その結果、更なる微生物の生育が停止してしまうという課題があった。
【０００３】
特に、組換えタンパク質生産によく使用される大腸菌（Escherichia coli）は、高密度での好気的発酵における宿主菌として広く用いられている。大腸菌の好気的な高密度培養の際には、増殖培地に適当量のグルコースを添加することが一般的であるが、これに起因して培養中に酢酸を主成分とする短鎖脂肪酸が生成される。これらの短鎖脂肪酸は、高密度培養を阻害する主要因子であり、組換えタンパク質の生成をも阻害する（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照）。
【０００４】
この課題を解消するために、微生物の培養においては、培養時間の経過に応じて連続的または間欠的に栄養源を培地へ流加する流加培養法（例えば、非特許文献３参照）や、菌体外生産物を培養系の外へ透析膜などを用いて除去させる透析培養法（例えば、非特許文献４参照）などが用いられている。
流加培養法によれば、培地中の特定成分の濃度を任意に制御することが可能であり、例えば、糖濃度を、該培地で培養される微生物の至適範囲に一定に保持することができる。このため、目的とする微生物を効率的に培養することができ、広く採用されている。しかし、この流加培養法においても、有機酸の生成を抑えることはできず、生成した有機酸による増殖率の低下や組換えタンパク質の収量の低下が起こるなど、問題点は多い。
また、透析培養においては、菌体外生産物を除去することにより、生成した短鎖脂肪酸の影響を少なくすることができるものの、装置が特殊で工程が複雑化する等の問題点がある。
【０００５】
また、大腸菌における好気的条件下でのグルコース代謝において、ＴＣＡサイクルの処理能力を超える量の炭素源が添加された場合、酢酸が生成され細胞外へと排出され、これにより生育の阻害や組換えタンパク質の生成が阻害される（例えば、非特許文献５参照）。
酢酸は、ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）および酢酸キナーゼ（ＡＣＫ）によってアセチル−ＣｏＡから生合成されることから、非特許文献５においては、大腸菌についてこれらの酵素（ＰＴＡ及びＡＣＫ）遺伝子の欠損変異株が作製されている。しかしながら、これらの変異株においては、酢酸の生合成系（ＰＴＡ及びＡＣＫ）を不活性化しても、酢酸の生成のための他の経路が依然として存在するので、酢酸の生成量を低下させられるものの、完全に生成しないことはなかった。また、上記欠損変異株は、乳酸やピルビン酸など酢酸以外の有機酸を過剰に蓄積するものであった（例えば、非特許文献６及び非特許文献７参照）。
このように、微生物の培養の際に生成されるギ酸や酢酸などの生育に有害な短鎖脂肪酸を全く生成しない微生物は、いまだ開発途上にあり、成功していない。
一方、微生物の発酵により、これらの短鎖脂肪酸を工業的に生産しようとする場合に、短鎖脂肪酸を効率良く大量に生産できる方法の開発が望まれている。その場合には、短鎖脂肪酸に対し充分な耐性を有する微生物が必要であるが、そのような微生物もまだ開発されていない。
【０００６】
一方、本発明者らによって酢酸菌由来の酢酸耐性向上機能を有する遺伝子が数多く取得されているが、これらの遺伝子の中には、ＡＴＰバインディングカセット（ATP-binding cassette）のモチーフを有する遺伝子群がある（例えば、特許文献１参照）。
これらのＡＴＰバインディングカセットのモチーフを有する遺伝子は、一般的にＡＢＣトランスポーターファミリー（ABC transporter family）と総称され、代謝産物や薬剤などを細胞内から細胞外へ、あるいは細胞外から細胞内へと輸送するトランスポーターの機能を有するタンパク質をコードしていると推定されている。
これらのＡＢＣトランスポーターファミリーを構成する遺伝子（ＡＢＣトランスポーター遺伝子）の一つを、多コピー数ベクターに連結し、酢酸菌に導入した場合に、得られる形質転換株（酢酸菌）は、酢酸耐性が向上するものの、他の有機酸への耐性には影響がなかった（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−２８９８６８号公報
【非特許文献１】「アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Appl．Environ．Microbiol．）」、５６巻、ｐ．１００４−１０１１（１９９０年）
【非特許文献２】「バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Biotechnol．Bioeng．）」、３９巻、ｐ．６６３−６７１（１９９２年）
【非特許文献３】「トレンズ・オブ・バイオテクノロジー（Trends Biotechnol．）」、１４巻、ｐ．９８−１００（１９９６年）
【非特許文献４】「アプライド・アンド・マイクロバイオロジカル・バイオテクノロジー（Appl．Microbiol．Biotechnol．）」、４８巻、ｐ．５９７−６０１（１９９７年）
【非特許文献５】「バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Biotechnol. Bioeng.）」、３５巻、ｐ．７３２−７３８（１９９０年）
【非特許文献６】「バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Biotechnol. Bioeng.）」、３８巻、ｐ．１３１８−１３２４（１９９１年）
【非特許文献７】「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotechnol．Biochem．）」、５８巻、ｐ．２２３２−２２３５（１９９４年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、第一に、微生物をはじめとする細胞の生育を抑制することなく、しかも有用物質について高い生産性を保持したまま、ギ酸や酢酸をはじめとする生育に有害な短鎖脂肪酸に対して耐性を付与する方法の提供を目的とする。
また、本発明は、第二に、上記微生物の用途として、短鎖脂肪酸存在下において微生物を効率良く培養する手段や、発酵により有用な短鎖脂肪酸を製造するための手段を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するための手段を模索する過程で、短鎖脂肪酸の１つである酢酸に注目し、この酢酸に対して強力な耐性を持ち、かつ食酢の製造において酢酸発酵を行う際に利用されている酢酸菌の保有するＡＢＣトランスポーターファミリーと推定される酢酸菌由来の遺伝子群に着目した。そしてＡＢＣトランスポーターファミリーを構成するＡＢＣトランスポーター遺伝子を、もとの酢酸菌以外の異種細胞に導入して発現させることができるかどうか、検討を重ねた。
その結果、酢酸菌とは全く異なる属に属し、本来アルコール酸化能が低い大腸菌（Escherichia coli）や、酢酸菌であるが酢酸発酵能の低いグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）においても、形質転換体を得ることができることを見出した。そして、該形質転換体は、酢酸菌の場合とは異なり、酢酸以外の短鎖脂肪酸（炭素数５以下）による生育阻害を受けないこと、すなわち、短鎖脂肪酸耐性を有するという予想外の結果をも見出した。また、遺伝子導入によりこれらの微生物がもともと生産する有用物質や、外部から導入した組換えタンパク質の生産性が低下しないことも確認された。
【００１０】
また、ＡＢＣトランスポーター遺伝子の短鎖脂肪酸に対する耐性増強機能がどのように発揮されるのか、酢酸菌の形質転換株を用いてそのメカニズムを解明したところ、細胞内の酢酸濃度が元株に対して低下したことから、細胞内から細胞外である培地へ酢酸を排出する機能が付与されたことを確認することができ、この機能は酢酸菌だけでなく異種細胞の短鎖脂肪酸耐性向上のメカニズムとして敷衍できるものと推測された。
【００１１】
そして、該遺伝子の導入された微生物を高密度菌体培養したところ、遺伝子の導入されていない微生物と比べて、短鎖脂肪酸の存在下でも充分に生育することができたことから、工業的培養において有用であることをも見出した。
更に、プロピオン酸などの短鎖脂肪酸の蓄積濃度を向上させることができることをも見出した。
本発明は、係る知見に基くものである。
【００１２】
すなわち本発明は、以下の（１）〜（１１）からなるものである。
（１）細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入して発現させることを特徴とする短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞の育種方法。
【００１３】
（２）細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする上記（１）に記載の細胞の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３０１〜２０７３からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３０１〜２０７３からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１４】
（３）細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする上記（１）に記載の細胞の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３３１〜２１５４からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３３１〜２１５４からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１５】
（４）細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡであることを特徴とする上記（１）に記載の細胞の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１００２〜１７２４からなる塩基配列、及び塩基番号１７２４〜２５００からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１００２〜１７２４からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、及び、配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１７２４〜２５００からなる塩基配列を含むＤＮＡであって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１００２〜１７２４からなる塩基配列、及び、配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１７２４〜２５００からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１００２〜１７２４からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、及び、配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１７２４〜２５００からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコードするＤＮＡ。
【００１６】
（５）細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が下記の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする上記（１）に記載の細胞の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号８に記載の塩基配列のうち、塩基番号２４９〜１０２５からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号８に記載の塩基配列のうち、塩基番号２４９〜１０２５からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１７】
（６）短鎖脂肪酸が、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、又は、吉草酸であることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞の育種方法。
（７）細胞が微生物細胞であることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法で育種された細胞。
【００１８】
（８）微生物細胞が、酢酸菌、大腸菌、又はバチルス属に属する細菌細胞であることを特徴とする上記（７）に記載の細胞。
（９）上記（８）に記載の細胞を用いることを特徴とする高密度菌体培養法。
（１０）細胞を短鎖脂肪酸存在下で培養することを特徴とする上記（８）に記載の高密度菌体培養法。
（１１）上記（８）に記載の細胞を、該細胞が短鎖脂肪酸を生成する条件下で培養することを特徴とする短鎖脂肪酸を含有する発酵液の製造方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、短鎖脂肪酸に対する耐性を付与し、短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞を育種することができる。また、微生物細胞に本発明の育種方法を適用した場合には、培養中に生成する生育に有害な短鎖脂肪酸による影響を受けない細胞を効率的に育種することができる。
本発明により得られる短鎖脂肪酸耐性の微生物細胞は、短鎖脂肪酸が生成する高密度菌体培養に適用することも可能である。また、短鎖脂肪酸を高濃度に含有する発酵液の製造に利用することも可能である。特に短鎖脂肪酸耐性が付与された大腸菌などの場合には、培養における増殖能が顕著に向上し、高濃度の短鎖脂肪酸を効率良く蓄積することができるので、産業上有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明の目的は、細胞内から細胞外へ短鎖脂肪酸を排出する機能を有する遺伝子（短鎖脂肪酸耐性遺伝子）を導入した細胞の育種方法、該育種方法により育種された細胞、並びに該細胞を用いた高密度菌体培養法並びに有用短鎖脂肪酸を含有する発酵液の製造方法を提供することにある。
【００２１】
〔１〕本発明の育種方法
本発明の短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞の育種方法は、請求項１に記載するように、細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子（短鎖脂肪酸耐性遺伝子）を細胞に導入して発現させることを特徴とする。
ここで、細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質とは、本発明の育種方法の対象である細胞において、該細胞に取り込まれた又は代謝など細胞内の機能により生産された短鎖脂肪酸を細胞外に排出する機能を発揮することができるタンパク質を意味し、例えば、生育に影響を与える酢酸濃度を添加した培地において、元株に対して、細胞内の酢酸濃度を１５〜２０％以上低下させるタンパク質を意味する。このようなタンパク質として、具体的には、配列表の配列番号２、４、又は９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、及び配列番号６及び７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質複合体を挙げることができる。
尚、配列表の配列番号２、４、及び９に示される各アミノ酸配列において、１又は複数個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に置換、欠失、挿入、付加、逆位等の変異を含んでいるタンパク質も、細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質である限り、上記タンパク質に含まれる。また、配列番号６及び／又は７に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、１又は複数個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に置換、欠失、挿入、付加、逆位等の変異を含んでいるタンパク質複合体も、同様に、細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質である限り、上記タンパク質に含まれる。
【００２２】
また、上記タンパク質をコードする遺伝子（短鎖脂肪酸耐性遺伝子）とは、上記タンパク質のコード領域を含み、かつ細胞内に導入し発現させることの可能な遺伝子を意味する。このような遺伝子の代表的なものとしては、ＡＢＣトランスポーターファミリーと推定される酢酸菌由来の遺伝子群を構成するＡＢＣトランスポーター遺伝子を挙げることができる。ＡＢＣトランスポーター遺伝子は、ＡＴＰバインディングカセット（ATP-binding cassette）のモチーフを有する遺伝子、または該モチーフを有する遺伝子とオペロンを形成しタンパク質複合体をコードする遺伝子を意味する。ＡＴＰバインディングカセット（ATP-binding cassette）のモチーフを有する遺伝子は、一般的にＡＢＣトランスポーターファミリー（ABC transporter family）と称され、代謝産物や薬剤などを細胞内から細胞外へ、あるいは細胞外から細胞内へと輸送するトランスポーターの機能を有するタンパク質をコードしていると推定されている。
【００２３】
このようなＡＢＣトランスポーター遺伝子としては、例えば、配列表の配列番号２、４、６、７又は９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするコード領域を含む遺伝子を挙げることができ、具体的には、請求項２〜５の（ａ）に記載するように、配列番号１、３、５、又は８に記載の塩基配列のうち、配列番号１の塩基番号３０１〜２０７３からなる塩基配列、配列番号３の塩基番号３３１〜２１５４からなる塩基配列、配列番号５の塩基番号１００２〜１７２４からなる塩基配列及び塩基番号１７２４〜２５００からなる塩基配列、又は配列番号８の塩基番号２４９〜１０２５からなる塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。
これらのＤＮＡは、上記特定の塩基配列を含むものであれば良く、例えば、配列表の配列番号１、３、５又は８のそれぞれに記載の塩基配列の全長からなるＤＮＡを用いることも可能である。
【００２４】
これらのＤＮＡは、配列番号１、３、５又は８に示される塩基配列をもとに設計したプライマーをもとに、酢酸菌（アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌）の遺伝子を鋳型としたＰＣＲ法にて容易に取得できる。特に、配列表の配列番号１及び３記載の各塩基配列からなるＤＮＡは、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）  Ｎｏ．１０２３株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８３年６月２７日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託されている。）を鋳型としてそれぞれ入手することができる。また、配列表の配列番号５及び８記載の各塩基配列からなるＤＮＡは（Gluconacetobacter entanii）の一種であるアセトバクター・アルトアセチゲネス（Acetobacter altoacetigenes）ＭＨ−２４株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８４年２月２３日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託されている。）を鋳型としてそれぞれ入手することができる。
【００２５】
また、本発明においては、短鎖脂肪酸耐性遺伝子として、請求項２，３及び５の（ｂ）に記載するように、配列番号１、３、又は８に記載の塩基配列のうち、配列番号１の塩基番号３０１〜２０７３からなる塩基配列、配列番号３の塩基番号３３１〜２１５４からなる塩基配列、若しくは該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡをも、同様に用いることができる。
そして、請求項４の（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に記載するように、（ｂ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１００２〜１７２４からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、又は、配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１７２４〜２５００からなる塩基配列を含むＤＮＡであって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコードするＤＮＡや、（ｃ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１００２〜１７２４からなる塩基配列、及び、配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１７２４〜２５００からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコードするＤＮＡや、（ｄ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１００２〜１７２４からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、及び、配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号１７２４〜２５００からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作製したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質複合体をコードするＤＮＡをも、同様に用いることができる。
【００２６】
なお、ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度にて６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
【００２７】
上記した短鎖脂肪酸耐性遺伝子が、細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質をコードすることの確認は、例えば、後述の実施例で説明するように、遺伝子を実際に細胞に導入して発現させ、該細胞（形質転換体）を、短鎖脂肪酸を含有する培地で培養した際の生育の有無や、該培地における生育量の増加（増殖程度）を判別することにより確認することができる。
ここで、短鎖脂肪酸とは、炭素数１〜５の直鎖又は分岐鎖構造の脂肪酸を意味し、不飽和結合を有していても有していなくても良い。本発明の育種方法により得られる細胞は、特に炭素数１〜５の直鎖又は分岐鎖構造の飽和脂肪酸、つまり請求項６に記載するようにギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、又は、吉草酸に対し、強い耐性を有するものである。
【００２８】
本発明の育種方法の対象は、上記短鎖脂肪酸耐性遺伝子が導入され発現可能な細胞であれば、特に限定されるものではない。細胞としては、大腸菌、枯草菌、乳酸菌等の細菌細胞、酵母細胞、アスペルギルス属に属する微生物などの真菌細胞といった微生物細胞が挙げられる。
中でも、請求項７に記載するように微生物細胞を対象とすることにより、短鎖脂肪酸耐性機能を増強して工業的培養、特に高密度菌体培養法による培養における培養効率や、短鎖脂肪酸の発酵生産における生産効率を向上させることができる点で好ましい。
微生物細胞としては、特に、請求項８に記載するように、酢酸菌、大腸菌又はバチルス属に属する細菌細胞を挙げることができる。細菌細胞のうち、大腸菌や、グルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属の酢酸菌など、本来アルコール酸化能が低い細菌細胞を対象とすると、その短鎖脂肪酸の生産量や生産効率、菌体の生育量を著しく増大させることができるので、好ましい。
【００２９】
酢酸菌としては、アセトバクター（Acetobacter）属及びグルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属に属する酢酸菌を挙げることができる。
アセトバクター属の細菌として、具体的にはアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙げられ、具体的には、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）Ｎｏ．１０２３株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８３年６月２７日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託されている。）、アセトバクター・アセチ・サブスペシイズ・ザイリナム３２８８（Acetobacter aceti subsp．xylinum IFO3288）株、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）ＩＦＯ３２８３株などを用いることができる。
グルコンアセトバクター属の細菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス（Gluconacetobacter europaeus）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）が挙げられ、具体的には、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス（Gluconacetobacter europaeus）ＤＳＭ６１６０株、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）ＡＴＣＣ４９０３７株、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の一種であるアセトバクター・アルトアセチゲネス（Acetobacter altoacetigenes）ＭＨ−２４株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８４年２月２３日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託されている。）を用いることができる。
【００３０】
大腸菌としては、エシェリチア（Escherichia）属に属する細菌が好ましい。
エシェリチア属に属する細菌としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）が挙げられ、具体的には、大腸菌Ｋ１２株、大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５ａ株、大腸菌Ｃ６００株、大腸菌ＢＬ２１株、大腸菌Ｗ３１１０株などを用いることができる。
また、バチルス属（Bacillus）に属する細菌としては、例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）や納豆菌（Bacillus subtilis）が挙げられ、具体的には、枯草菌Ｍａｒｂｕｒｇ１６８株などを用いることができる。
酵母細胞としては、例えば、サッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Shizosaccharomyces pombe）などを用いることができる。
特に、短鎖脂肪酸耐性遺伝子として本発明の請求項２又は請求項３に係るＤＮＡを用いる場合は、これらの細胞のうち、大腸菌やグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）を対象とすることが好ましい。大腸菌は、本来アルコール酸化能が極めて低く、また、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカスは酢酸菌であるが酢酸発酵能が低いことから、これらの微生物に短鎖脂肪酸耐性を付与することによりその有用性を充分に高めることができる。
【００３１】
本発明の育種方法における細胞への短鎖脂肪酸耐性遺伝子の導入・発現は、組換えベクターを利用して行うことができる。すなわち、適当なベクターに、短鎖脂肪酸耐性遺伝子を連結した組換えベクターを用いて細胞を形質転換することによって、該遺伝子の細胞内のコピー数を増幅する方法、または、適当なベクターに、短鎖脂肪酸耐性遺伝子の構造遺伝子と、該細胞中で効率良く機能するプロモーター配列とを連結した組換えベクターを用いて細胞を形質転換することによって、該遺伝子の細胞内のコピー数を増幅する方法により、実現することができる。
【００３２】
組換えベクターの作製に用いるためのベクターとしては、宿主で自律的に増殖し得るファージベクター又はプラスミドベクターなどを使用することができる。
プラスミドベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＥＴ１６ｂ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹｅｐ１３、Ｙｃｐ５０等）などが挙げられ、ファージベクターとしてはλファージ（λｇｔ１０、λＺＡＰ等）などが挙げられる。
さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などを用いて形質転換体を作製することもできる。
【００３３】
また、マルチコピーベクター又はトランスポゾンなどを用いて目的のＤＮＡを宿主に導入することもでき、本発明においてはそのようなマルチコピーベクター又はトランスポゾンも本発明の組換えベクターに含まれるものとする。
マルチコピーベクターとしては、ｐＵＦ１０６（例えば、「セルロース（Cellulose）、ｐ．１５３−１５８（１９８９年）参照」、ｐＭＶ２４（例えば、「アプライド・アンド・エンバイロマンタル・マイクロバイオロジー（Appl．Environ．Microbiol．）」、５５巻、ｐ．１７１−１７６（１９８９年）参照）、ｐＧＩ１８（例えば、後述の製造例１参照）、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特開昭６０−９４８８号公報参照）などが挙げられる。また、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric．Biol．Chem．）」、５２巻、ｐ．３１２５−３１２９（１９８８年）参照）も挙げられる。
更に、トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。
【００３４】
短鎖脂肪酸耐性遺伝子をベクターに連結して組換えベクターを作製する際には、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
ここで、得られる組換えベクターは、細胞に導入された際に、短鎖脂肪酸耐性遺伝子のコードする細胞内から細胞外に短鎖脂肪酸を排出する機能を有するタンパク質を発現して前記機能が発揮されることが必要である。そのため、組換えベクターには、短鎖脂肪酸耐性遺伝子やプロモーター配列のほかに、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などをも連結して挿入することができる。
ここで、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００３５】
また、染色体ＤＮＡ上の、短鎖脂肪酸耐性遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、または大腸菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列に置き換えることもでき、その際は、相同組換え用のベクターを構築し、該ベクターを用いて微生物の染色体に相同組換えを起こすようにすればよい。
そのようなプロモーター配列としては、例えば、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ３９６（タカラバイオ社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなど、酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列が挙げられる。
相同組換えのためのベクター構築に関しては、当業者に周知である。このようにして微生物における内因性の短鎖脂肪酸耐性遺伝子を強力なプロモーターの制御下に配置することによって、該短鎖脂肪酸耐性遺伝子からのコピー数が増幅され、発現が増強される。
【００３６】
このような組換えベクターとして、具体的には、配列表の配列番号１、３、５及び８記載の各塩基配列からなるＤＮＡを、それぞれ酢酸菌−大腸菌シャトルベクター（マルチコピーベクター）ｐＧＩ１８に連結して得られるｐＡＢＣ１１１、ｐＡＢＣ１１２、ｐＡＢＣ３１、及びｐＡＢＣ４１を挙げることができる。
【００３７】
本発明の育種方法における細胞への短鎖脂肪酸耐性遺伝子の導入・発現は、上記組換えベクターを用いて常法に従って行うことができる。例えば、細菌細胞の場合、カルシウムイオンを用いる方法（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric．Biol．Chem．）」、４９巻、ｐ．２０９１−２０９７（１９８５年）参照）、エレクトロポレーション法（例えば、「プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス  ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．）」、８７巻、ｐ．８１３０−８１３４（１９９０年）、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotech．Biochem．），５８巻，９７４頁，１９９４年等参照）等によることができる。また、酵母細胞に用いる（宿主とする）場合は、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
尚、形質転換体の選択は、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して実施することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を用いた場合には、アンピシリン薬剤に抵抗性を示す細胞を選択することができ、具体的には、選択培地としてアンピシリンを適当量（例えば、１００μｇ／ｍｌ程度）を添加したものを用いて、形質転換株を塗布し、培養し、選択培地上に生育したコロニーを形質転換株とすることがでいる。また、ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、Ｇ４１８薬剤に抵抗性を示す細胞を選択することができる。
【００３８】
本発明の育種方法においては、このようにして短鎖脂肪酸耐性遺伝子を細胞に導入して発現させることにより、短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞を得ることができる。育種された細胞の短鎖脂肪酸耐性が向上したかどうかの確認は、細菌細胞の場合には、短鎖脂肪酸を０．０１〜３％程度添加した培地において１５時間以上培養し、生育度を吸光度や乾燥菌体重量を測定して、形質転換をしなかった元の細胞が全く又は充分に生育しないと比べて大きく上回る生産量を示すことを確認することにより行うことができる。
このように短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞として、本発明者らは、後述の実施例に示すように、上述した組換えベクターｐＡＢＣ１１１を酢酸菌アセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３株へ導入して得られるＮｏ．１０２３／ｐＡＢＣ１１１株、組換えベクターｐＡＢＣ１１１を大腸菌ＪＭ１０９株へ導入して得られるＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１１株、同様に組換えベクターｐＡＢＣ１１１をグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカスＡＴＣＣ４９０３７株へ導入して得られるＡＴＣＣ４９０３７／ｐＡＢＣ１１１株、組換えベクターｐＡＢＣ１１２を大腸菌ＪＭ１０９株へ導入して得られるＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１２株、同様に組換えベクターｐＡＢＣ３１を大腸菌ＪＭ１０９株へ導入して得られるＪＭ１０９／ｐＡＢＣ３１株、組換えベクターｐＡＢＣ４１を大腸菌ＪＭ１０９株へ導入して得られるＪＭ１０９／ｐＡＢＣ４１株を実際に得ることができた。これらの形質転換株のうち５株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されており、その寄託番号は、ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１１株がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８４、ＡＴＣＣ４９０３７／ｐＡＢＣ１１１株がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８６、ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１２株がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８５、ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ３１株がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８２、ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ４１株がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０１９４である。
【００３９】
〔２〕本発明の高密度培養法
本発明の高密度菌体培養法は、請求項９に記載するように、請求項８に記載の細胞を用いること、すなわち、前記〔１〕で説明した本発明の育種方法により短鎖脂肪酸耐性遺伝子を酢酸菌、大腸菌又はバチルス属に属する細菌細胞に導入して発現させて育種される、短鎖脂肪酸耐性の向上した酢酸菌、大腸菌又はバチルス属に属する細菌細胞を用いることを特徴とする。
ここで、高密度菌体培養法とは、細菌細胞（菌体）を高密度、一般には培地における密度が５０〜２００ｇ（乾燥菌体）／Ｌとなる条件で培養する方法を意味する。培地、培養時間、培養条件については細胞の種類などにより適宜設定でき、例えば大腸菌の場合には、天然培地や合成培地のいずれの培地でもよく、例えば、グルコース添加ＬＢ培地において、２８℃〜３７℃における通気培養とすることができる。
細菌細胞により培地中の栄養源が消費されてしまうと、通常、培地中に短鎖脂肪酸が生成され生育阻害の原因となるが、本発明の高密度菌体培養法は、短鎖脂肪酸耐性の向上した細菌細胞を用いるので、生育阻害を阻むことができる。すなわち、請求項１０に記載するように、細胞をギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、又は、吉草酸など生育にとって毒性のある短鎖脂肪酸存在下で培養しても生育が阻害されず、微生物がもともと生産する有用物質や、外部から導入した組換えタンパク質の生産性を維持することができる。ここで、有用物質としては、微生物を利用することにより製造できる物質であればどのような形態のものでも良く、特に制限されない。１つの例としては、微生物菌体そのものが挙げられる。また、本発明の細胞を用いれば、細胞の最終密度を向上させることができるため、通常の代謝によって生産される物質であってもきわめて効率良く製造することができる。この例としては、脂肪酸、アミノ酸、抗生物質、酵素、ビタミンおよびアルコールなどが挙げられる。実施例６で示したように、培地中への有機酸の生成量を上げることができる。また、組換えタンパク質としては、例えば、ヒトの成長ホルモンやペプチド、インターロイキン１β、インターフェロンなどが挙げられる。
特に、大腸菌の場合は、上記の炭素数５以下の短鎖脂肪酸以外にクエン酸、リンゴ酸、コハク酸、ピログルタミン酸などの有機酸を効率良く生産することができる。
【００４０】
高密度菌体培養法として実験室レベルから工業的生産レベルまで広く用いられているものとして、流加培養、透析培養を例示することができる。
流加培養は、培養時間の経過に応じて特定の栄養源を培地へ連続的または間欠的に流加して培養する方法である。流加の対象となる栄養源としては、細胞の増殖やタンパク質生産を阻害する短鎖脂肪酸の直接的な原料となるグルコース、グリセロールなどの炭素源であることが好ましい。流加のスケジュールは、培地中の炭素源の濃度および／または菌体の生育濃度を一定に保つことができるように、指数関数的に流加速度を増加していく方式、培地中の炭素源濃度を規定濃度以下に保ちながら段階的（一般的には、２〜５時間おきに）に流加速度（流加量）を増加していく方式とすることができる。培地の種類、温度、湿度、ｐＨ、時間、攪拌の有無など培養条件については、細菌細胞の種類や状態により適宜定めることができる。
従来の流加培養においては、微生物培養中に生成する酢酸を初めとする短鎖脂肪酸による細胞の増殖阻害や、タンパク質生産阻害などを避けるため、生成する短鎖脂肪酸を抑えるべくグルコース等の流加速度を調整するだけでなく、培地中の溶存酸素量を細かく調整する必要があったが、本発明の短鎖脂肪酸耐性の向上した酢酸菌、大腸菌又はバチルス属に属する細菌細胞は、短鎖脂肪酸の影響を受けずに生産性を維持することができるので、従来のような調整の手間を省くことができる。
【００４１】
また、透析培養は、酢酸等の菌体外生産物を、培養系の外へ透析膜などを用いて除去しながら培養を行う方法である。
従来の透析培養においては、特殊な装置が必要であったが、本発明の短鎖脂肪酸耐性の向上した酢酸菌、大腸菌又はバチルス属に属する細菌細胞は、短鎖脂肪酸の影響を受けずに生産性を維持することができるので、単純な装置（例えば、ジャーファーメンター）でも実施することができる。
【００４２】
〔３〕短鎖脂肪酸を含有する発酵液の製造方法
本発明の発酵液の製造方法は、請求項８に記載の細胞を、該細胞が短鎖脂肪酸を生成する条件下で培養することを特徴とする。
請求項８に記載の細胞とは、前記〔１〕で説明した本発明の育種方法により短鎖脂肪酸耐性遺伝子を酢酸菌、大腸菌又はバチルス属に属する細菌細胞に導入して発現させて育種される、短鎖脂肪酸耐性の向上した酢酸菌、大腸菌又はバチルス属に属する細菌細胞を意味し、この中から所望の短鎖脂肪酸生産能を有する細菌細胞を選択して用いることができる。例えば、大腸菌は短鎖脂肪酸全般を生産でき、酢酸菌は、酢酸を選択的に生産することができる。尚、短鎖脂肪酸とは、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸の他、乳酸やプロピオン酸をも意味する。
【００４３】
本発明の発酵液の製造方法は、対象である細菌細胞が短鎖脂肪酸を生成する条件下で培養する必要があり、このような条件は、細菌細胞の種類や生成対象である短鎖脂肪酸の種類によって適宜定めることができるが、通常は、短鎖脂肪酸に対応する短鎖アルコールを適量添加することになる。
【実施例】
【００４４】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００４５】
（製造例１）大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の開発
酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８は、アセトバクター・アルトアセチゲネス（Acetobacter altoacetigenes）  ＭＨ−２４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）由来の約３．１ｋｂのプラスミドｐＧＩ１とｐＵＣ１８とから作製した。図１にプラスミドｐＧＩ１８作製の概略を示す。
【００４６】
まず、アセトバクター・アルトアセチゲネスからプラスミドｐＧＩ１を作製した。
すなわち、アセトバクター・アルトアセチゲネス（Acetobacter altoacetigenes）  ＭＨ−２４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の培養液より、菌体を集菌し、水酸化ナトリウムやドデシル硫酸ナトリウムを用いて溶菌後、フェノール処理し、更にエタノールによりプラスミドＤＮＡを精製した。
得られたプラスミドは、ＨｉｎｃＩＩで３ヶ所、また、ＳｆｉＩで１ヶ所の認識部位を有する環状二本鎖ＤＮＡプラスミドであり、プラスミド全体の長さは約３１００塩基対（３．１ｋｂｐ）であった。また、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位は有していなかった。このプラスミドをｐＧＩ１と命名して、ベクターｐＧＩ１８の作製に用いた。
【００４７】
上記のようにして得られたプラスミドｐＧＩ１を、ＰＣＲ法によって増幅し、ＡａｔＩＩで切断した。この断片をｐＵＣ１８（２．７ｋｂｐ、タカラバイオ（株）製）の制限酵素ＡａｔＩＩ切断部位に挿入し、プラスミドｐＧＩ１８を作製した。
ＰＣＲ法は、具体的には以下のようにして実施した。鋳型として、プラスミドｐＧＩ１を用いて、また、プライマーとして、制限酵素ＡａｔＩＩ認識部位を有するプライマーＡ（配列表の配列番号１０記載の塩基配列参照）及びプライマーＢ（配列表の配列番号１１記載の塩基配列参照）を用いた。上記の鋳型及びプライマーによるＰＣＲを、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績（株）製）を用いて、９４℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、６８℃  ３分を１サイクルとして、３０サイクルの条件で実施した。
その結果得られたプラスミドｐＧＩ１８は、図１に示すように、ｐＵＣ１８及びｐＧＩ１のいずれをも含有しており、全体の長さは約５８００塩基対（５．８ｋｂｐ）であった。
このプラスミドｐＧＩ１８の塩基配列は、配列表の配列番号１２に示す通りであった。
【００４８】
（実施例１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡで形質転換したアセトバクター・アセチにおける酢酸の排出
（１）形質転換株の取得
配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡがクローニングされたｐＡＢＣ１（図１２）を制限酵素ＰｓｔＩで切断し、得られた約２．５Ｋｂの断片を、製造例１で調製した酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＰｓｔＩ切断部位にライゲーションして、プラスミドｐＡＢＣ１１１を作製した。
このようにして作製したｐＡＢＣ１１１を、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）  Ｎｏ．１０２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）にエレクトロポレーション法（「プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．）」、８７巻、ｐ．８１３０−８１３４（１９９０年）参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸を添加したＹＰＧ培地で選択した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００４９】
（２）形質転換株の酢酸排出
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＢＣ１１１を保有するアンピシリン耐性の形質転換株（Ｎｏ．１０２３／ｐＡＢＣ１１１株）について、酢酸を添加したＹＰＧ培地で生育させ、細胞内の酢酸濃度について、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入したアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（Ｎｏ．１０２３／ｐＧＩ１８株）と比較した。
すなわち、ステイナーらの方法（例えば、「バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Biotechnol．Bioeng．）」、８４巻、ｐ．４０−４４、２００３年参照）に従って、酢酸カリウムを１、２、３及び４重量／容量％の各濃度で含有する１００ｍｌのＹＰＧ培地でＮｏ．１０２３／ｐＡＢＣ１１１株およびＮｏ．１０２３／ｐＧＩ１８株を培養した。５０ｍｌの培養液から集菌、アルカリ溶菌を行った後、各培養液から得られた細胞内の酢酸濃度（Ｍ）をＦ−キット（ロッシュ）を用いて測定し比較した。
表１に、各培養液における細胞内の酢酸カリウム濃度の結果を示す。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
表１に示すように、形質転換株であるＮｏ．１０２３／ｐＡＢＣ１１１株、及び非形質転換株であるＮｏ．１０２３／ｐＧＩ１８株のいずれも、培養液中の酢酸カリウム濃度が高くなるに従って細胞内の酢酸カリウム濃度も上昇していたが、その上昇度は、形質転換株（Ｎｏ．１０２３／ｐＡＢＣ１１１株）の方が比較的遅く、特に、培養時の酢酸カリウム濃度が４重量／容量％の時には、Ｎｏ．１０２３／ｐＡＢＣ１１１株はＮｏ．１０２３／ｐＧＩ１８株の８４％の蓄積しかなかった。このことは、形質転換株Ｎｏ．１０２３／ｐＡＢＣ１１１株は、細胞内の酢酸が細胞外へ排出されていることを示すものである。
このことから、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡは、酢酸を細胞内から細胞外へ排出する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが示された。
【００５２】
（実施例２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡで形質転換した大腸菌の短鎖脂肪酸耐性
（１）形質転換株の取得
実施例１で作製したｐＡＢＣ１１１を、大腸菌ＪＭ１０９株へ定法に従ってエレクトロポレーション法により形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地にて形質転換株を選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析し、酢酸耐性遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
このようにして得られた形質転換株ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８４である。
【００５３】
（２）形質転換株の短鎖脂肪酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＢＣ１１１を有するアンピシリン耐性の形質転換株（ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１１株）について、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸の各短鎖脂肪酸を添加したＬＢ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した大腸菌（ＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株）と比較した。
すなわち、短鎖脂肪酸として、ギ酸０．１０％、酢酸０．１５％、プロピオン酸０．１０％、酪酸０．１０％、イソ酪酸０．１５％、およびｎ−吉草酸０．２５％のいずれか、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むＬＢ培地（ｐＨ５．０：短鎖脂肪酸添加培地）にて、３７℃で、ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１１株およびＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株の振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行った。また、比較のため短鎖脂肪酸を添加しない他は上記短鎖脂肪酸添加培地と同様の組成とした未添加培地で同様の培養を行った。各培地において、経時的に６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、各細胞の増殖の程度（生育量）の指標として各培地間で比較した。図２及び図３に、各培地における生育量（吸光度（６６０ｎｍ））の経時的変化を示す。
【００５４】
図２及び図３に示すように、未添加培地ではいずれの細胞も生育可能であったのに対し、各短鎖脂肪酸添加培地においては、非形質転換株であるＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株は生育ができないまたは非常に弱かったのに対し、形質転換株であるＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１１株では、増殖が可能であった。すなわち、非形質転換株（ＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株）は短鎖脂肪酸の存在による影響を受けていたのに対し、形質転換株（ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１１株）はいずれの短鎖脂肪酸に対しても耐性を備えていた。
このことから、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを大腸菌細胞に導入することにより、各種の短鎖脂肪酸に対する耐性の向上した大腸菌を育種することができることが示された。
【００５５】
（実施例３）配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡで形質転換した大腸菌の短鎖脂肪酸耐性
（１）形質転換株の取得
配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、得られる断片を、製造例１で調製した酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションして、プラスミドｐＡＢＣ１１２を作製した。
ＰＣＲ法は、具体的には以下のようにして実施した。鋳型として、アセトバクター・アルトアセチゲネス（Acetobacter altoacetigenes）  ＭＨ−２４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）のゲノムＤＮＡを用いて、また、プライマーとして、プライマー１（配列表の配列番号１３記載の塩基配列参照）及びプライマー２（配列表の配列番号１４記載の塩基配列参照）を用いた。上記の鋳型及びプライマーによるＰＣＲを、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績（株）製）を用いて、９４℃  １５秒、６０℃  ３０秒、６８℃  ２分を１サイクルとして、３０サイクルの条件で実施した。
【００５６】
このようにして作製したｐＡＢＣ１１２を、大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株にエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotech．Biochem．），５８巻，９７４頁，１９９４年参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保有するプラスミドを保持していることを確認した。
このようにして得られた形質転換株ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１２株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８５である。
【００５７】
（２）形質転換株の短鎖脂肪酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＢＣ１１２を有するアンピシリン耐性の形質転換株（ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１２株）について、ギ酸及び酢酸の各短鎖脂肪酸を添加したＬＢ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した大腸菌（ＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株）と比較した。
具体的には、短鎖脂肪酸としてギ酸０．１０％または酢酸０．１５％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むＬＢ培地（ｐＨ５．０）にて、３７℃で、ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１２株およびＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株の静置培養、または振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行った。各短鎖脂肪酸添加培地において、経時的に６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、各細胞の増殖の程度（生育量）の指標として各短鎖脂肪酸添加培地間で比較した。図４に、各培地における生育量（吸光度（６６０ｎｍ））の経時的変化を示す。
【００５８】
図４に示すように、形質転換株であるＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１２株は、各短鎖脂肪酸添加培地のいずれにおいても増殖が可能であったのに対して、非形質転換株であるＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株は生育できなかった。すなわち、非形質転換株（ＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株）は短鎖脂肪酸の存在による影響を受けていたのに対し、形質転換株（ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１２株）はギ酸及び酢酸のいずれに対しても耐性を有していた。
このことから、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを大腸菌細胞に導入することにより、短鎖脂肪酸に対する耐性の向上した大腸菌を育種することができることが示された。
【００５９】
（実施例４）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡで形質転換した大腸菌の短鎖脂肪酸耐性
（１）大腸菌形質転換株の取得
配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、得られる断片を、製造例１で調製した酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションして、プラスミドｐＡＢＣ３１を作製した。
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。鋳型として、アセトバクター・アルトアセチゲネス（Actobacter altoacetigenes）  ＭＨ−２４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）のゲノムＤＮＡを用いて、また、プライマーとして、プライマー３（配列表の配列番号１５記載の塩基配列参照）及びプライマー４（配列表の配列番号１６記載の塩基配列参照）を用いた。上記の鋳型及びプライマーによるＰＣＲを、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績（株）製）を用いて、９４℃  １５秒、６０℃  ３０秒、６８℃  １分を１サイクルとして、３０サイクルの条件で実施した。
アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株のゲノムＤＮＡにおける配列番号５記載の塩基配列の制限酵素地図と配列番号５記載の塩基配列の位置、及びプラスミドｐＡＢＣ３１への挿入断片の概略図を、図５に示す。
【００６０】
このようにして作製したｐＡＢＣ３１を、大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株にエレクトロポレーション法により形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保有するプラスミドを保持していることを確認した。
このようにして得られた形質転換株ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ３１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８２である。
【００６１】
（２）形質転換体の短鎖脂肪酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＢＣ３１を有するアンピシリン耐性の形質転換株（ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ３１株）について、ギ酸及び酢酸の各短鎖脂肪酸を添加したＬＢ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した大腸菌（ＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株）と比較した。
具体的には、短鎖脂肪酸としてギ酸０．１０％または酢酸０．１５％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むＬＢ培地（ｐＨ５．０）にて、３７℃で、ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ３１株およびＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株の静置培養、または振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行った。各短鎖脂肪酸添加培地において、経時的に６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、各細胞の増殖の程度（生育量）の指標とし、各短鎖脂肪酸添加培地間で比較した。図６に、各培地における生育量（吸光度（６６０ｎｍ））を示す。
【００６２】
図６に示すように、形質転換株ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ３１株では各短鎖脂肪酸添加培地のいずれにおいても増殖が可能であったのに対して、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株では生育ができなかった。すなわち、非形質転換株（ＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株）は短鎖脂肪酸の存在による影響を受けていたのに対し、形質転換株（ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ３１株）はギ酸及び酢酸のいずれに対しても耐性を有していた。
このことから、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡを大腸菌細胞に導入することにより、短鎖脂肪酸に対する耐性の向上した大腸菌を育種することができることが示された。
【００６３】
（実施例５）配列表の配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡで形質転換した大腸菌の短鎖脂肪酸耐性
（１）大腸菌形質転換株の取得
配列表の配列番号８に記載のＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、得られる断片を、製造例１で調製した酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションして、プラスミドｐＡＢＣ４１を作製した。
ＰＣＲ法は、具体的には以下のようにして実施した。鋳型としてアセトバクター・アルトアセチゲネス（Acetobacter altoacetigenes）  ＭＨ−２４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）のゲノムＤＮＡを用いて、また、プライマーとして、プライマー５（配列表の配列番号１７記載の塩基配列参照）及びプライマー６（配列表の配列番号１８記載の塩基配列参照）を用いた。上記の鋳型及びプライマーによるＰＣＲを、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績（株）製）を使用し、９４℃  １５秒、６０℃  ３０秒、６８℃  １分を１サイクルとして、３０サイクルの条件で実施した。
【００６４】
このようにして作製したｐＡＢＣ４１を大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株へエレクトロポレーション法により形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保有するプラスミドを保持していることを確認した。
配列表の配列番号８に記載の塩基配列中には、塩基番号２４９〜１０２５にかけて、配列番号９記載のアミノ酸２５９個からなるアミノ酸配列をコードするオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の存在が確認された。また、配列表の配列番号９に記載のアミノ酸配列は、既知の配列との相同性は、３０％と低かったことから、配列表の配列番号８に記載の塩基配列からなる遺伝子は本発明者がはじめて発見した、新規な遺伝子であることが明らかとなった。
アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株のゲノムＤＮＡにおける配列番号８記載の塩基配列の制限酵素地図と配列番号８記載の塩基配列の位置、及びプラスミドｐＡＢＣ４１への挿入断片の概略図を、図８に示す。
このようにして得られた形質転換株ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ４１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０１９４である。
【００６５】
（２）形質転換体の短鎖脂肪酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＢＣ４１を有するアンピシリン耐性の形質転換株（ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ４１株）について、ギ酸及び酢酸の各短鎖脂肪酸を添加したＬＢ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した大腸菌（ＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株）と比較した。
具体的には、短鎖脂肪酸としてギ酸または酢酸を０．１５％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むＬＢ培地（ｐＨ５．０）にて、３７℃で、ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ４１株およびＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株の静置培養、または振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行った。各短鎖脂肪酸添加培地において、経時的に６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、各細胞の増殖の程度（生育量）の指標とし、各短鎖脂肪酸添加培地間で比較した。図７に、各培地における生育量（吸光度（６６０ｎｍ）の経時的変化）を示す。
【００６６】
図７に示すように、形質転換株ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ４１株では、各短鎖脂肪酸添加培地のいずれにおいても増殖が可能であったのに対して、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株では生育ができなかった。すなわち、非形質転換株（ＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株）は短鎖脂肪酸の存在による影響を受けていたのに対し、形質転換株ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ４１株はギ酸及び酢酸に対し耐性を有していた。
このことから、配列表の配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡを大腸菌細胞に導入することにより、短鎖脂肪酸に対する耐性の向上した大腸菌を育種することができることが示された。
【００６７】
（実施例６）大腸菌形質転換体の高密度培養
（１）グルコース添加ＬＢ培地での培養
実施例２で得られた、プラスミドｐＡＢＣ１１１を有する大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換株（ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１１株）について、ＬＢ培地にグルコースを添加した培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した大腸菌株（ＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株）と比較した。
具体的には、５リッターのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−２Ａ）を用いて、グルコース２０％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（ｐＨ７．０）をフィルター滅菌にて、３７℃、５００ｒｐｍ、０．３ｖｖｍの通気培養を行った。培養中及び培養終了時の生育量、並びに培養液中の酢酸量及び全有機酸量を、形質転換株と非形質転換株とで比較した。
生育量は、６６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）として測定した。一方、培養液中の全有機酸量及び酢酸量は、培養液から菌体を遠心分離し、上清液を適当に希釈し、島津高速液体クロマトグラフ有機酸分析システム（カラム：ShodexRSpak KC-811、移動相：４ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸、反応液：４ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸、８０μＭ  ＥＤＴＡ、１６ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）にて、上清液中の全短鎖脂肪酸（有機酸）濃度（クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、酢酸、ピログルタミン酸の各濃度の合計値）、及び酢酸濃度として測定した。
図９に各細胞の生育量、並びに培養液中の全有機酸量及び酢酸量の推移を示した。また、表２に培養開始後２２時間目の生育量、並びに培養液中の全短鎖脂肪酸量及び酢酸量をまとめた。
【００６８】
【表２】
2006191908.tif 000003
【００６９】
図９の結果から、生育量、全短鎖脂肪酸（有機酸）量及び酢酸量ともに、形質転換株であるＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１１株の方が非形質転換株であるＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株よりも高いことが確認できた。
また、表２の結果から、培養開始後２２時間目の生育量、全有機酸量及び酢酸量についても、形質転換株（ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１１株）のほうが、非形質転換株（ＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株）よりも高いことが確認できた。
このことから、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを大腸菌細胞に導入して得られる大腸菌は、高密度菌体培養において、短鎖脂肪酸による生育阻害を受けないこと、及び、酢酸をはじめとする短鎖脂肪酸だけでなく、有機酸を多く生成できることが明らかとなった。
【００７０】
（２）グルコース流加培養
実施例２で得られたプラスミドｐＡＢＣ１１１を有する大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換株（ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１１株）を用いて、培養中に培地へグルコースを添加する流加培養での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した大腸菌（ＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株）と比較した。
培養には、２リッターのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−２Ａ）、ｐＨコントローラー（三ツワ理化学工業社製；デジタルｐＨコントローラーＭＰＨ−２Ｃ）を用いた。
【００７１】
また、培養培地としては、ミネラル培地（Mineral medium:２．０ｇ  Ｎａ２ＳＯ４，２．４６８ｇ  （ＮＨ４）２ＳＯ４，０．５ｇ  ＮＨ４Ｃｌ，１４．６ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４，３．６ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ，１．０ｇ  （ＮＨ４）２−Ｈ−citrate，０．０５ｇ  Thiamin／ｌ）１リッターに対して、１ＭのＭｇＳＯ４を３ｍｌ、微量元素溶液（Trace element solution：０．５ｇ  ＣａＣｌ２，０．１８ｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．１ｇ  ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ，２０．１ｇ  ＥＤＴＡ−Ｎａ２，１６．７ｇ  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ，０．１６ｇ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，０．１８ｇ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（培養培地１ｌあたり））を３ｍｌ添加したものを用いた。
温度、ｐＨ、攪拌速度、及び通気量が、それぞれ３５℃、６．８、７００ｒｐｍ、０．５ｌ／ｍｉｎとなるように制御しながら培養を行った。ｐＨの調整は、２９％アンモニア溶液を添加して行った。
【００７２】
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地５ｍｌにて６時間培養した培養液を集菌し、前記の培養培地５ｍｌで再懸濁したものを、１リッターの培地に接種し、１６．５時間通気攪拌培養した。
その後、２６．５時間目まで５０％グルコース溶液を連続的に、表３に示したスケジュールに従って、培養時間の経過に伴い、順次、流加速度及び流加量を上げながら流加していき、通気攪拌培養（通気量；０．５ｖｖｍ、攪拌速度；７００ｒｐｍ）を行いながら培養を行った。
【００７３】
【表３】
2006191908.tif 000004
【００７４】
菌体の増殖は、６６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）における生育量、及び菌体乾燥重量を測定することにより確認した。
グルコースの流加培養における生育量（ＯＤ６６０ｎｍ）の推移を、図１０に示した。
図１０から明らかなように、形質転換株（ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１１株）のほうが、生育量がＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株を上回ることが確認できた。
また、培養終了時において、最終菌体量（乾燥菌体重量（ｇ：ＤＣＷ（Dried Cell Weight））及び消費グルコース量を測定し、菌体濃度（培地１Ｌあたりの乾燥菌体重量ｇ／ｌ）及び菌体収率（ｗ／ｗ％）を算出した。更に、単位時間あたりの菌体の増殖速度として平均増殖速度（ｇ／ｈ）を算出した。各菌におけるこれらの結果を表４にまとめた。
【００７５】
【表４】
2006191908.tif 000005
【００７６】
表４の結果から、形質転換株（ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１１株）のほうが、菌体量、菌体濃度、菌体収率、単位時間あたりの増殖速度のいずれにおいてもＪＭ１０９／ｐＧＩ１８株より値が高かったこと。
このことから、グルコースの流加培養による高密度培養の有用性が確認できた。
【００７７】
（実施例７）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡで形質転換したグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカスの短鎖脂肪酸耐性
（１）形質転換株の取得
実施例１で作製したｐＡＢＣ１１１を、酢酸発酵能力を有しない酢酸菌の１つであるグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）  ＡＴＣＣ４９０３７株に、エレクトロポレーション法によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ培地で選択した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保有するプラスミドを保持していることを確認した。
このようにして得られた形質転換株ＡＴＣＣ４９０３７／ｐＡＢＣ１１１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８６である。
【００７８】
（２）形質転換体の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＢＣ１１１を有するアンピシリン耐性の形質転換株（ＡＴＣＣ４９０３７／ｐＡＢＣ１１１株）について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入したグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカスＡＴＣＣ４９０３７株（ＡＴＣＣ４９０３７／ｐＧＩ１８株）と比較した。
具体的には、酢酸０．０５％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行い、経時的に６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、各細胞の増殖の程度（生育量）の指標として比較した。図１１に、各培地における生育量（吸光度（６６０ｎｍ）の経時的変化）を示す。
【００７９】
その結果、図１１に示すように、形質転換株（ＡＴＣＣ４９０３７／ｐＡＢＣ１１１株）では酢酸０．０５％添加したＹＰＧ培地で増殖が可能であるのに対し、ＡＴＣＣ４９０３７／ｐＧＩ１８株は生育できないことが確認できた。
このことから、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを、酢酸を生産しない酢酸菌であるグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカスに導入することにより、その酢酸耐性を増強させることができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明によれば、短鎖脂肪酸に対する耐性を付与し、短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞を育種することができる。また、微生物細胞に本発明の育種方法を適用した場合には、培養中に生成する生育に有害な短鎖脂肪酸による影響を受けない細胞を効率的に育種することができる。
本発明により得られる短鎖脂肪酸耐性の微生物細胞は、短鎖脂肪酸が生成する高密度菌体培養に適用することも可能である。また、短鎖脂肪酸を高濃度に含有する発酵液の製造に利用することも可能である。特に短鎖脂肪酸耐性が付与された大腸菌などの場合には、培養における増殖能が顕著に向上し、高濃度の短鎖脂肪酸を効率良く蓄積することができるので、産業上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の構築を示した概略図である。
【図２】実施例１における形質転換体及び未形質転換体の（ａ）未添加培地、（ｂ）ギ酸含有培地、（ｃ）酢酸添加培地及び（ｄ）プロピオン酸添加培地での生育量の経時的変化を示す。
【図３】実施例１における形質転換体及び未形質転換体の（ａ）酪酸含有培地、（ｂ）イソ酪酸含有培地、及び（ｃ）ｎ−吉草酸添加培地での生育量の経時的変化を示す。
【図４】実施例２における形質転換体及び未形質転換体の（ａ）ギ酸含有培地、及び（ｂ）酢酸添加培地での生育量の経時的変化を示す。
【図５】グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片の制限酵素地図と短鎖脂肪酸耐性遺伝子の位置、及びプラスミドｐＡＢＣ３１への挿入断片の概略図である。
【図６】実施例３における形質転換体及び未形質転換体の（ａ）ギ酸含有培地、及び（ｂ）酢酸添加培地での生育量の経時的変化を示す。
【図７】実施例４における形質転換体及び未形質転換体の（ａ）ギ酸含有培地、及び（ｂ）酢酸添加培地での生育量の経時的変化を示す。
【図８】クローニングされたグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片の制限酵素地図と短鎖脂肪酸耐性遺伝子の位置、及びプラスミドｐＡＢＣ４１への挿入断片の概略図を示す。
【図９】実施例６（１）における各細胞の生育量、並びに培養液中の全有機酸量及び酢酸量の推移を示す。
【図１０】実施例６（２）におけるグルコースの流加培養における生育量の推移を示す。
【図１１】実施例７における形質転換体及び未形質転換体の酢酸含有培地での培養経過を示す。
【図１２】配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡの制限酵素地図と探査脂肪酸耐性遺伝子の位置、及びプラスミドｐＡＢＣ１への挿入断片の概略図を示す。
【図１】
2006191908.tif 000006
【図２】
2006191908.tif 000007
【図３】
2006191908.tif 000008
【図４】
2006191908.tif 000009
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2006191908000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年12月28日(2005.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
これらのＤＮＡは、配列番号１、３、５又は８に示される塩基配列をもとに設計したプライマーをもとに、酢酸菌（アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌）の遺伝子を鋳型としたＰＣＲ法にて容易に取得できる。特に、配列表の配列番号１及び３記載の各塩基配列からなるＤＮＡは、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）  Ｎｏ．１０２３株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８３年６月２７日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託されている。）を鋳型としてそれぞれ入手することができる。また、配列表の配列番号５及び８記載の各塩基配列からなるＤＮＡは（Gluconacetobacter entanii）の一種であるアセトバクター・アルトアセチゲネス（Acetobacter altoacetigenes）ＭＨ−２４株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８４年２月２３日付で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託されている。）を鋳型としてそれぞれ入手することができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
酢酸菌としては、アセトバクター（Acetobacter）属及びグルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属に属する酢酸菌を挙げることができる。
アセトバクター属の細菌として、具体的にはアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙げられ、具体的には、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）Ｎｏ．１０２３株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８３年６月２７日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託されている。）、アセトバクター・アセチ・サブスペシイズ・ザイリナム３２８８（Acetobacter aceti subsp．xylinum IFO3288）株、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）ＩＦＯ３２８３株などを用いることができる。
グルコンアセトバクター属の細菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス（Gluconacetobacter europaeus）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）が挙げられ、具体的には、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス（Gluconacetobacter europaeus）ＤＳＭ６１６０株、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）ＡＴＣＣ４９０３７株、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の一種であるアセトバクター・アルトアセチゲネス（Acetobacter altoacetigenes）ＭＨ−２４株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８４年２月２３日付で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託されている。）を用いることができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
大腸菌としては、エシェリチア（Escherichia）属に属する細菌が好ましい。
エシェリチア属に属する細菌としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）が挙げられ、具体的には、大腸菌Ｋ１２株、大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株、大腸菌Ｃ６００株、大腸菌ＢＬ２１株、大腸菌Ｗ３１１０株などを用いることができる。
また、バチルス属（Bacillus）に属する細菌としては、例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）や納豆菌（Bacillus subtilis）が挙げられ、具体的には、枯草菌Ｍａｒｂｕｒｇ１６８株などを用いることができる。
酵母細胞としては、例えば、サッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Shizosaccharomyces pombe）などを用いることができる。
特に、短鎖脂肪酸耐性遺伝子として本発明の請求項２又は請求項３に係るＤＮＡを用いる場合は、これらの細胞のうち、大腸菌やグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）を対象とすることが好ましい。大腸菌は、本来アルコール酸化能が極めて低く、また、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカスは酢酸菌であるが酢酸発酵能が低いことから、これらの微生物に短鎖脂肪酸耐性を付与することによりその有用性を充分に高めることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本発明の育種方法における細胞への短鎖脂肪酸耐性遺伝子の導入・発現は、上記組換えベクターを用いて常法に従って行うことができる。例えば、細菌細胞の場合、カルシウムイオンを用いる方法（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric．Biol．Chem．）」、４９巻、ｐ．２０９１−２０９７（１９８５年）参照）、エレクトロポレーション法（例えば、「プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス  ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．）」、８７巻、ｐ．８１３０−８１３４（１９９０年）、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotech．Biochem．），５８巻，９７４頁，１９９４年等参照）等によることができる。また、酵母細胞に用いる（宿主とする）場合は、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
尚、形質転換体の選択は、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して実施することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を用いた場合には、アンピシリン薬剤に抵抗性を示す細胞を選択することができ、具体的には、選択培地としてアンピシリンを適当量（例えば、１００μｇ／ｍｌ程度）を添加したものを用いて、形質転換株を塗布し、培養し、選択培地上に生育したコロニーを形質転換株とすることができる。また、ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、Ｇ４１８薬剤に抵抗性を示す細胞を選択することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
本発明の育種方法においては、このようにして短鎖脂肪酸耐性遺伝子を細胞に導入して発現させることにより、短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞を得ることができる。育種された細胞の短鎖脂肪酸耐性が向上したかどうかの確認は、細菌細胞の場合には、短鎖脂肪酸を０．０１〜３％程度添加した培地において１５時間以上培養し、生育度を吸光度や乾燥菌体重量を測定して、形質転換をしなかった元の細胞が全く又は充分に生育しないのと比べて大きく上回る生産量を示すことを確認することにより行うことができる。
このように短鎖脂肪酸耐性の向上した細胞として、本発明者らは、後述の実施例に示すように、上述した組換えベクターｐＡＢＣ１１１を酢酸菌アセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３株へ導入して得られるＮｏ．１０２３／ｐＡＢＣ１１１株、組換えベクターｐＡＢＣ１１１を大腸菌ＪＭ１０９株へ導入して得られるＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１１株、同様に組換えベクターｐＡＢＣ１１１をグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカスＡＴＣＣ４９０３７株へ導入して得られるＡＴＣＣ４９０３７／ｐＡＢＣ１１１株、組換えベクターｐＡＢＣ１１２を大腸菌ＪＭ１０９株へ導入して得られるＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１２株、同様に組換えベクターｐＡＢＣ３１を大腸菌ＪＭ１０９株へ導入して得られるＪＭ１０９／ｐＡＢＣ３１株、組換えベクターｐＡＢＣ４１を大腸菌ＪＭ１０９株へ導入して得られるＪＭ１０９／ｐＡＢＣ４１株を実際に得ることができた。これらの形質転換株のうち５株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されており、その受託番号は、ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１１株がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８４、ＡＴＣＣ４９０３７／ｐＡＢＣ１１１株がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８６、ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１２株がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８５、ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ３１株がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８２、ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ４１株がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９４である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
〔３〕短鎖脂肪酸を含有する発酵液の製造方法
本発明の発酵液の製造方法は、請求項８に記載の細胞を、該細胞が短鎖脂肪酸を生成する条件下で培養することを特徴とする。
請求項８に記載の細胞とは、前記〔１〕で説明した本発明の育種方法により短鎖脂肪酸耐性遺伝子を酢酸菌、大腸菌又はバチルス属に属する細菌細胞に導入して発現させて育種される、短鎖脂肪酸耐性の向上した酢酸菌、大腸菌又はバチルス属に属する細菌細胞を意味し、この中から所望の短鎖脂肪酸生産能を有する細菌細胞を選択して用いることができる。例えば、大腸菌は短鎖脂肪酸全般を生産でき、酢酸菌は、酢酸を選択的に生産することができる。尚、短鎖脂肪酸とは、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸の他、乳酸をも意味する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
（実施例２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡで形質転換した大腸菌の短鎖脂肪酸耐性
（１）形質転換株の取得
実施例１で作製したｐＡＢＣ１１１を、大腸菌ＪＭ１０９株へ定法に従ってエレクトロポレーション法により形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地にて形質転換株を選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析し、酢酸耐性遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
このようにして得られた形質転換株ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８４である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
このようにして作製したｐＡＢＣ１１２を、大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株にエレクトロポレーション法（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotech．Biochem．），５８巻，９７４頁，１９９４年参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保有するプラスミドを保持していることを確認した。
このようにして得られた形質転換株ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ１１２株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８５である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
このようにして作製したｐＡＢＣ３１を、大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株にエレクトロポレーション法により形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保有するプラスミドを保持していることを確認した。
このようにして得られた形質転換株ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ３１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８２である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
このようにして作製したｐＡＢＣ４１を大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株へエレクトロポレーション法により形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保有するプラスミドを保持していることを確認した。
配列表の配列番号８に記載の塩基配列中には、塩基番号２４９〜１０２５にかけて、配列番号９記載のアミノ酸２５９個からなるアミノ酸配列をコードするオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の存在が確認された。また、配列表の配列番号９に記載のアミノ酸配列は、既知の配列との相同性は、３０％と低かったことから、配列表の配列番号８に記載の塩基配列からなる遺伝子は本発明者がはじめて発見した、新規な遺伝子であることが明らかとなった。
アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株のゲノムＤＮＡにおける配列番号８記載の塩基配列の制限酵素地図と配列番号８記載の塩基配列の位置、及びプラスミドｐＡＢＣ４１への挿入断片の概略図を、図８に示す。
このようにして得られた形質転換株ＪＭ１０９／ｐＡＢＣ４１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１９４である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
（実施例７）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡで形質転換したグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカスの短鎖脂肪酸耐性
（１）形質転換株の取得
実施例１で作製したｐＡＢＣ１１１を、酢酸発酵能力を有しない酢酸菌の１つであるグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）  ＡＴＣＣ４９０３７株に、エレクトロポレーション法によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ培地で選択した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保有するプラスミドを保持していることを確認した。
このようにして得られた形質転換株ＡＴＣＣ４９０３７／ｐＡＢＣ１１１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１８６である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
【図１】大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の構築を示した概略図である。
【図２】実施例１における形質転換体及び未形質転換体の（ａ）未添加培地、（ｂ）ギ酸含有培地、（ｃ）酢酸添加培地及び（ｄ）プロピオン酸添加培地での生育量の経時的変化を示す。
【図３】実施例１における形質転換体及び未形質転換体の（ａ）酪酸含有培地、（ｂ）イソ酪酸含有培地、及び（ｃ）ｎ−吉草酸添加培地での生育量の経時的変化を示す。
【図４】実施例２における形質転換体及び未形質転換体の（ａ）ギ酸含有培地、及び（ｂ）酢酸添加培地での生育量の経時的変化を示す。
【図５】グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片の制限酵素地図と短鎖脂肪酸耐性遺伝子の位置、及びプラスミドｐＡＢＣ３１への挿入断片の概略図である。
【図６】実施例３における形質転換体及び未形質転換体の（ａ）ギ酸含有培地、及び（ｂ）酢酸添加培地での生育量の経時的変化を示す。
【図７】実施例４における形質転換体及び未形質転換体の（ａ）ギ酸含有培地、及び（ｂ）酢酸添加培地での生育量の経時的変化を示す。
【図８】クローニングされたグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片の制限酵素地図と短鎖脂肪酸耐性遺伝子の位置、及びプラスミドｐＡＢＣ４１への挿入断片の概略図を示す。
【図９】実施例６（１）における各細胞の生育量、並びに培養液中の全有機酸量及び酢酸量の推移を示す。
【図１０】実施例６（２）におけるグルコースの流加培養における生育量の推移を示す。
【図１１】実施例７における形質転換体及び未形質転換体の酢酸含有培地での培養経過を示す。
【図１２】配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡの制限酵素地図と短鎖脂肪酸耐性遺伝子の位置、及びプラスミドｐＡＢＣ１への挿入断片の概略図を示す。