(57)【要約】  【課題】  概日リズムのメカニズムの解明、概日リズム調整剤または概日リズム調整方法を提供すること、抗がん剤を提供すること、及び、概日リズムの異常・がん発症リスク・ストレスを検出する手段を提供すること。  【解決手段】  １５ｄ−ＰＧＪ２（１５−デオキシ−デルタ１２，１４−プロスタグランジンＪ２）がｐｅｒ２遺伝子の発現を促進するという新知見に基づき、ｐｅｒ２遺伝子の発現を促進する１５ｄ−ＰＧＪ２、及び、１５ｄ−ＰＧＪ２を用いたｐｅｒ２遺伝子の発現を促進する方法、を提供する。また、１５ｄ−ＰＧＪ２を含有する概日リズム調整剤、抗がん剤、及び、１５ｄ−ＰＧＪ２を用いた概日リズム調整方法、を提供する。さらに、概日リズムの異常・がん発症リスク・ストレスを検出するマーカーとしての１５ｄ−ＰＧＪ２、及び、１５ｄ−ＰＧＪ２をマーカーとして用いた概日リズムの異常・がん発症リスク・ストレスを検出する方法、を提供する。  【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐｅｒ２遺伝子の発現を促進する１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩。
【請求項２】
１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩、若しくは、１５ｄ−ＰＧＪ２誘導体又はその塩、を含有する概日リズム調整剤。
【請求項３】
睡眠障害の予防剤又は治療剤であることを特徴とする請求項２記載の概日リズム調整剤。
【請求項４】
不眠症の予防剤又は治療剤であることを特徴とする請求項２記載の概日リズム調整剤。
【請求項５】
時差ぼけの予防剤又は治療剤であることを特徴とする請求項２記載の概日リズム調整剤。
【請求項６】
１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩、若しくは、１５ｄ−ＰＧＪ２誘導体又はその塩、を含有する抗がん剤。
【請求項７】
１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩を用いたｐｅｒ２遺伝子の発現を促進する方法。
【請求項８】
１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩を用いた概日リズム調整方法。
【請求項９】
概日リズムの変調を検出するマーカーとしての１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩。
【請求項１０】
がん発症リスクマーカーとしての１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩。
【請求項１１】
ストレス検出マーカーとしての１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩。
【請求項１２】
１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩をマーカーとして用いた概日リズムの変調を検出する方法。
【請求項１３】
１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩をマーカーとして用いたがん発症リスク検出方法。
【請求項１４】
１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩をマーカーとして用いたストレス検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１５ｄ−ＰＧＪ２（１５−デオキシ−デルタ１２，１４−プロスタグランジンＪ２）、及び、１５ｄ−ＰＧＪ２を用いた方法に関する。より詳細には、ｐｅｒ２遺伝子の発現を促進する１５ｄ−ＰＧＪ２、１５ｄ−ＰＧＪ２を含有する概日リズム調整剤、１５ｄ−ＰＧＪ２を含有する抗がん剤、及び、１５ｄ−ＰＧＪ２を用いたｐｅｒ２遺伝子の発現促進方法、１５ｄ−ＰＧＪ２を用いた概日リズム調整方法、並びに、概日リズム変調検出マーカー及び概日リズム変調検出方法、がん発症リスク検出マーカー及びがん発症リスク検出方法、ストレス検出マーカー及びストレス検出方法、に関する。
【背景技術】
【０００２】
概日リズム（サーカディアンリズム）は、約２４時間を周期とする生物リズムであり、単細胞生物からヒトに至るまで、多くの生物に普遍的に見られる生体内現象である。
【０００３】
ヒトを含む哺乳類では、脳視床下部の視交叉上核に「体内時計」があると考えられており、個体レベルでの概日リズムの調節は、脳視床下部の視交叉上核で行われていると推定されている。
【０００４】
哺乳類をはじめ多くの生物では、概日リズムは、「時計遺伝子」によって調節されている。時計遺伝子は、概日リズムの形成に関与する遺伝子である。時計遺伝子としては、例えば、ｐｅｒ（ｐｅｒｉｏｄ）遺伝子、ｃｌｏｃｋ遺伝子、Ｂｍａｌ１遺伝子などが知られている。ｐｅｒ遺伝子は、ｐｅｒ１、ｐｅｒ２、ｐｅｒ３の各遺伝子が発見されている。
【０００５】
哺乳類では、時計遺伝子の発現量が脳視床下部の視交叉上核で特に高い。即ち、時計遺伝子は、細胞レベルの概日リズムだけでなく、哺乳類の個体レベルでの概日リズムにも強く関与していると考えられている（以上の事項に関して、非特許文献１参照）。
【０００６】
また、概日リズムとがんには関連性があることが、すでに明らかにされている。例えば、非特許文献２は、時計遺伝子（ｐｅｒ２）ががん抑制遺伝子として機能する可能性があること、及び、その機能が妨げられるとがん細胞が増殖すること、を示した実験報告を掲載している。
【０００７】
ここで、本発明と関連性の高い「１５ｄ−ＰＧＪ２」について説明する。「１５ｄ−ＰＧＪ２（１５−デオキシ−デルタ１２，１４−プロスタグランジンＪ２）」は、ＰＧＤ２（プロスタグランジンＤ２）の代謝産物であり、生体内に存在することが知られている。また、１５ｄ−ＰＧＪ２は、脂肪代謝の発現制御に関わるとされる核内受容体、ＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖応答性受容体γ：Peroxisome Proliferator Activated Receptor γ）のリガンドとして知られている。その他、１５ｄ−ＰＧＪ２は、抗炎症剤などへの利用が検討されている。
【０００８】
特許文献１〜３には、概日リズム調整剤が開示されている。特許文献４〜６は、１５ｄ−ＰＧＪ２について開示されている。非特許文献１には、概日リズムや時計遺伝子について、非特許文献２には、時計遺伝子とがんとの関連性について、記載されている。
【特許文献１】特開２００１−３１６２８１号公報
【特許文献２】特開２００３−８１８２９号公報
【特許文献３】特開２００３−３３５６６９号公報
【特許文献４】特開平１１−１８９５３７号公報
【特許文献５】特開平１１−１９９４７８号公報
【特許文献６】特開２００２−２７９９８号公報
【非特許文献１】「時計遺伝子の分子生物学」、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社、岡村均・深田吉孝編、２００４年４月５日発行
【非特許文献２】Loning Fu, et al“The Circadian Gene Period2 Plays an Important Role in Tumor Suppression and DNA Damage Response In Vivo”; Cell, Vol.111, 41-50, October 4 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、概日リズムのメカニズムの解明、概日リズム調整剤または概日リズム調整方法を提供すること、抗がん剤を提供すること、及び、概日リズムの異常・がん発症リスク・ストレスを検出する手段を提供すること、を主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明では、まず、ｐｅｒ２遺伝子の発現を促進する１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩、及び、１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩を用いたｐｅｒ２遺伝子の発現を促進する方法、を提供する。
【００１１】
ここで、１５ｄ−ＰＧＪ２は、「１５−デオキシ−デルタ１２，１４−プロスタグランジンＪ２」の略であり、下記の化学構造を持つ（以下同じ）。
【００１２】
【化１】
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【００１３】
本発明に至る過程で、本発明者らは、概日リズムのメカニズムを解明するために、時計遺伝子ｐｅｒ２の発現を促進する因子を同定するためのスクリーニング系を構築した。そのスクリーニング系を用いて、時計遺伝子ｐｅｒ２の発現を促進する因子の探索を行った。
【００１４】
その結果、時計遺伝子ｐｅｒ２の発現を促進する因子として、１５ｄ−ＰＧＪ２を同定した。即ち、１５ｄ−ＰＧＪ２に、ｐｅｒ２遺伝子の発現を促進する作用があることが分かった。従って、１５ｄ−ＰＧＪ２（その塩を含む）を用いることにより、ｐｅｒ２遺伝子の発現を促進することができる。
【００１５】
次に、本発明では、１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩、若しくは、１５ｄ−ＰＧＪ２誘導体又はその塩、を含有する概日リズム調整剤、及び、１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩を用いた概日リズム調整方法、を提供する。ここで、１５ｄ−ＰＧＪ２誘導体は、１５ｄ−ＰＧＪ２分子内の小部分の化学変化によって生成する化合物をいい、例えば、生体内における１５ｄ−ＰＧＪ２の前駆物質である、アラキドン酸、ＰＧＨ２（プロスタグランジンＨ２）、ＰＧＤ２（プロスタグランジンＤ２）、ＰＧＪ２（プロスタグランジンＪ２）、デルタ１２−ＰＧＪ２（デルタ１２−プロスタグランジンＪ２）などは、１５ｄ−ＰＧＪ２誘導体に含まれる（以下同じ）。
【００１６】
概日リズムが変調している場合、１５ｄ−ＰＧＪ２を用いてｐｅｒ２遺伝子の発現を促進することにより、概日リズムを調整することができる。即ち、例えば、本発明に係る１５ｄ−ＰＧＪ２を用いてｐｅｒ２遺伝子発現の概日リズムを調整することにより、生体全体の概日リズムを調整できる。従って、本発明に係る１５ｄ−ＰＧＪ２（その塩、及び、誘導体と誘導体の塩を含む）は、概日リズムの調整に適用できる。
【００１７】
概日リズムが変調している場合とは、例えば、睡眠障害、覚醒障害、時差ぼけ、不眠症、自律神経失調症、うつ病、老人性痴呆、夜間勤務・交代勤務など生活リズムの不規則化による体調の悪化、自閉症などにおける生活リズムの不規則化による消耗、などをいう。また、概日リズムの変調が誘因となる疾患として、例えば、夜間勤務による看護婦などの乳がん発生率上昇などがある。本発明に係る概日リズム調整剤及び概日リズム調整方法は、これらの病態に対して適用できる。
【００１８】
また、本発明では、１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩、若しくは、１５ｄ−ＰＧＪ２誘導体又はその塩、を含有する抗がん剤を提供する。
【００１９】
前記の通り、ｐｅｒ２遺伝子は、がん抑制遺伝子としての機能も有するため、１５ｄ−ＰＧＪ２（その塩、及び、誘導体と誘導体の塩を含む）を用いてｐｅｒ２遺伝子の発現を促進することにより、がん細胞の増殖を抑制できる。
【００２０】
次に、本発明者は、概日リズムの変調を検出するマーカーとしての１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩、及び、１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩をマーカーとして用いた概日リズムの変調を検出する方法、を提供する。
【００２１】
１５ｄ−ＰＧＪ２は、生体内における概日リズムのメカニズムの上流に位置する。即ち、１５ｄ−ＰＧＪ２がｐｅｒ２遺伝子の発現を調節し、ｐｅｒ２遺伝子の発現が概日リズムを調節している。従って、１５ｄ−ＰＧＪ２（その塩を含む）は、概日リズムの変調を検出するためのマーカーとして用いることができる。
【００２２】
また、本発明では、がん発症リスクマーカーとしての１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩、及び、１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩をマーカーとして用いたがん発症リスク検出方法、を提供する。
【００２３】
生体内において、１５ｄ−ＰＧＪ２の低下はｐｅｒ２遺伝子の発現を抑制し、ｐｅｒ２遺伝子発現の抑制はがん細胞の増殖を促すため、１５ｄ−ＰＧＪ２（又はその塩）は、がん発症リスクのマーカーとして有用である。
【００２４】
さらに、本発明では、ストレス検出マーカーとしての１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩、及び、１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩をマーカーとして用いたストレス検出方法、を提供する。
【００２５】
本発明者らは、ｐｅｒ２遺伝子の発現量をストレスとの間に、相関関係があることを新規に見出した。即ち、ストレスが負荷されると、ｐｅｒ２遺伝子の発現が促進されることを新規に見出した。このことは、生体内において、ストレスの負荷により、１５ｄ−ＰＧＪ２が増加し、ｐｅｒ２遺伝子の発現を促進する、という作用機序が存在することを示唆する。従って、１５ｄ−ＰＧＪ２（又はその塩）は、ストレス検出マーカーとして有用である。
【００２６】
上記のように、１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩をマーカーとして用いる場合として、例えば、血中・尿中などの１５ｄ−ＰＧＪ２を検出する方法がある。血中・尿中などの１５ｄ−ＰＧＪ２をマーカーとして検出することにより、概日リズムの変調・がん発症リスク・ストレスなどを簡易に検出できる。また、本発明には、血中・尿中などの１５ｄ−ＰＧＪ２の量を計測することにより、概日リズムの変調・がん発症リスク・ストレスなどを数値化できるという有利性がある。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係る１５ｄ−ＰＧＪ２は、ｐｅｒ２遺伝子の発現を促進する効果を有する。また、１５ｄ−ＰＧＪ２をマーカーとして用いた場合、概日リズムの変調・がん発症リスク・ストレスなどを検出できる。
【実施例１】
【００２８】
実施例１では、時計遺伝子ｐｅｒ２の発現に関与する因子を同定するためのスクリーニング系を構築し、候補物質のスクリーニングを行った。具体的な手順は以下のとおりである。
【００２９】
まず、ルシフェラーゼ発光ベクターｐＧＬ３  ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、時計遺伝子ｐｅｒ２のプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した。次に、この組換えベクターを、培養細胞（ＲＡＴ１細胞）にトランスフェクトし、組換え細胞を単離し、継代した。
【００３０】
前記の組換えベクターは、ｐｅｒ２のプロモーター領域と、ルシフェラーゼ（発光性酵素）をコードする領域を持つ。従って、ｐｅｒ２のプロモーター領域にｐｅｒ２遺伝子の転写因子が結合すると、ルシフェラーゼが発現するため、培養細胞が発光する。
【００３１】
次に、前記組換え培養細胞を用いて候補物質の探索（スクリーニング）を行った。組換え培養細胞に、候補物質を加え（１μＭ又は１０μＭ）、３日間１５分ごとに、ルシフェラーゼ発光量を計測した。スクリーニングの際には、血清無添加培地に候補物質を加え１時間培養し、その後は、１％血清添加培地で培養した。ルシフェラーゼ発光の計測には、微弱発光計測装置（浜松ホトニクス株式会社製）を用いた。スクリーニングを行った候補物質は、Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌｉｐｉｄ  ｌｉｂｒａｒｙ（ＢＩＯＭＯＬ社製）の２０３種類の脂質である。
【００３２】
なお、ネガティブコントロールとして、通常の培養条件のみで培養したものについても、同様に、３日間１５分ごとに、ルシフェラーゼ発光量を計測した。（図１）。また、ポジティブコントロールとして、組換え培養細胞に、最終濃度が培地の５０％になる量の血清を加え、同様に、３日間１５分ごとに、ルシフェラーゼ発光量を計測した（図２）。血清中には、時計遺伝子の発現を促進する因子が含まれていることが知られており、ポジティブコントロールとして好適である。
【００３３】
図１、図２において、横軸は時間（分）、縦軸は発光量（発光個数）を示している。図２は、図１と比較して、１４４０分前後（約１日経過前後）に発光量が増大している。これは、血清を高濃度に加えることにより、時計遺伝子ｐｅｒ２の発現が促進され、ルシフェラーゼ発光量が増大したことを示す。
【００３４】
スクリーニングの結果、１５ｄ−ＰＧＪ２が、時計遺伝子ｐｅｒ２の発現を促進する因子として同定された。即ち、図３では、１５ｄ−ＰＧＪ２を加えることにより、図２のポジティブコントロールと同様に、１４４０分前後に発光量が増大している。従って、１５ｄ−ＰＧＪ２が、時計遺伝子ｐｅｒ２の発現を促進することが分かった。なお、図３中、横軸は時間（分）、縦軸は発光量（発光個数）を示している。
【実施例２】
【００３５】
従来、実施例１で同定された１５ｄ−ＰＧＪ２は、核内受容体ＰＰＡＲγのリガンドとして知られている。そこで、実施例２では、作用機序解明の一助として、核内受容体ＰＰＡＲγが、１５ｄ−ＰＧＪ２による時計遺伝子ｐｅｒ２の発現促進に関与しているのかどうかについて調べた。
【００３６】
実験は、実施例１とほぼ同じ手順で行った。組換え培養細胞に、核内受容体ＰＰＡＲγのアゴニストを１μＬ加え、ルシフェラーゼ発光量を１５分ごとに３日間計測した。また、核内受容体ＰＰＡＲγのアンタゴニスト５μＭを加えて１時間前処理を行った後に、核内受容体ＰＰＡＲγのアゴニスト１μＬを加えた場合についても、同様に、ルシフェラーゼ発光量を１５分ごとに３日間に計測した。
【００３７】
なお、核内受容体ＰＰＡＲγのアゴニストには、１５ｄ−ＰＧＪ２のほかに、Ａｚ−ＰＡＦ（Ｃａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を、アンタゴニストには、ＧＷ９６６２（ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。
【００３８】
結果を図４に示す。図４中、上段の４つのグラフ（アンタゴニスト無添加のもの）を比較すると、「１５ｄ−ＰＧＪ２」を添加した場合は、１４４０分（１日）経過前後に発光量が増大しているのに対し、「Ａｚ−ＰＡＦ」を添加した場合は、ネガティブコントロール（図４上段中、一番右のグラフ）の場合とほとんど同じ変化しか示さなかった。
【００３９】
また、図４中、アンタゴニストを添加しなかった場合（上段のグラフ）とアンタゴニストで前処理した場合（下段のグラフ）を比較すると、１５ｄ−ＰＧＪ２、Ａｚ−ＰＡＦ、ポジティブコントロール（Ｓｅｒｕｍ）、ネガティブコントロール、のいずれの場合も、両グラフは、ほぼ同じ結果を示した。
【００４０】
以上の結果は、１５ｄ−ＰＧＪ２による時計遺伝子ｐｅｒ２の発現促進が、核内受容体ＰＰＡＲγを介さない、別のシグナル経路で行われていることを示している。即ち、今回新規に見出された１５ｄ−ＰＧＪ２による時計遺伝子ｐｅｒ２の発現促進作用は、従来知られている１５ｄ−ＰＧＪ２の作用とは全く異なる機序に基づくものであることを示唆している。
【００４１】
なお、図４に示した各グラフ中、横軸は時間（分）、縦軸は発光量（発光個数）を示している。図４中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はネガティブコントロールの結果を、「Ｓｅｒｕｍ」はポジティブコントロールの結果を（最終濃度が培地の５０％になる量の血清を加えた場合のもの）、「−」（図４中、下段の４つのグラフ）はアンタゴニスト加えていないもの、「＋」（図４中、上段の４つのグラフ）はアンタゴニストを加えたもの、をそれぞれ示す。
【実施例３】
【００４２】
実施例３は、ストレス負荷とｐｅｒ２遺伝子発現の相関関係を明らかにした実験である。手順は以下のとおりである。
【００４３】
まず、マウスを第１群から第６群に分けた（各群は６匹ずつ）。実験には、ＳＬＣ社から購入したＩＣＲマウス（オス、５週齢）を用いた。次に、全群のマウスについて、概日リズムを同調させた。即ち、マウスを、二週間、８時から２０時まで明条件、２０時から翌８時まで暗条件にした部屋で飼育して、概日リズムを同調させた。次に、全群のマウスについて、８時から３６時間（翌日の２０時まで）暗条件にした部屋で飼育した。
【００４４】
次に、マウス第１群から第６群について、それぞれ、ストレス負荷開始時刻（採血時刻の１時間前）・採血時刻を設定し、ストレス負荷開始時刻から１時間ストレスを与えた後、採血した。なお、各群の採血時刻（ストレス負荷開始時刻）を４時間ごとに設定することにより、ストレス負荷の概日変化も調べることができるようにした。
【００４５】
即ち、第１群のマウスは、１９時（暗条件終了１時間前）から１時間ストレスを与えるように設定し、第２群は２３時（暗条件終了後、以下同じ）から、第３群は３時から、第４群は７時から、第５群は１１時から、第６群は１５時から、それぞれ１時間ストレスを与えるように設定した。
【００４６】
そして、ストレス１時間負荷後、第１群は２０時（暗条件終了時）、第２群は２４時（暗条件終了後、以下同じ）、第３群は翌４時、第４群は翌８時、第５群は翌１２時、第６群は翌１６時、にそれぞれ採血した。このように採血時刻を設定することより、一日の各時間帯における血液を調べることができるため、ストレス負荷の概日変化も調べることができる。
【００４７】
ストレス負荷は、次の方法で行った。マウスを、尾静脈注射の際に用いるマウス固定アジャスター（ＳＡＮＰＬＡＴＥＣ社、商品コード１３３０２Ｅ）に１時間入れた。これにより、マウスは、動きを制限され、ストレスを受けた。
【００４８】
次に、採取した血液を群ごとに混合し、血液中の白血球におけるｐｅｒ２遺伝子の発現レベルを調べた。具体的な手順は、次の通りである。
【００４９】
まず、採取した血液を群ごとに混合後、ＮｙｃｏＰｒｅｐ１．０７７  Ａｎｉｍａｌ（ＮＹＣＯＭＥＤ  ＰＨＡＲＭＡ社）を用いて、密度勾配法により、白血球を分離した。次に、Ｐｒｏｍｅｇａ  ｔｏｔａｌ  ＳＶ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。次に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、逆転写ＰＣＲを行い、抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡの中から、ｐｅｒ２の転写産物を増幅させ、ｐｅｒ２のｃＤＮＡを合成した。そして、合成したｐｅｒ２のｃＤＮＡ量をもとに、ｐｅｒ２遺伝子の発現レベルを求めた。
【００５０】
なお、コントロールとして、ストレスを与えないマウス（第１群から第６群）についても、上記と全く同様の手順で、実験を行った。即ち、マウス第１群から第６群について、にストレスを付加しないで採血し、上記の手順により、ｐｅｒ２遺伝子の発現レベルを求めた。
【００５１】
上記実験において、ＰＣＲ装置には、Ｐｒｉｓｍ７０００（ＡＢＩ社）を用いた。ＰＣＲの際には、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ社）を用いて、５０℃、２分／９５℃、１０分／（９５℃、１５秒／６０℃、１分）×４０サイクルを行った。ｐｅｒ２遺伝子のプライマーには、配列番号１に示したセンスプライマーと配列番号２に示したアンチセンスプライマーを用いた。
【００５２】
上記実験において、ｐｅｒ２遺伝子の発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子の発現量を基準に算定した相対的な値である。まず、上記実験手順中、逆転写ＰＣＲを行う際に抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡの中から、β−アクチン及びＧ３ＰＤＨの転写産物を同時に増幅させて、β−アクチン及びＧ３ＰＤＨのｃＤＮＡを合成した。β−アクチン及びＧ３ＰＤＨは、ハウスキーピング遺伝子であり、発現量（ｃＤＮＡ量）がほぼ一定である。そこで、ｐｅｒ２遺伝子のｃＤＮＡ量を、β−アクチン又はＧ３ＰＤＨのｃＤＮＡ量と比較することにより、相対的なｐｅｒ２遺伝子の発現レベルを算定した。なお、発現レベルの算定に際して、二種類のハウスキーピング遺伝子（β−アクチン、Ｇ３ＰＤＨ）を用いてｐｅｒ２遺伝子の発現レベルを求め、β−アクチンを用いた場合とＧ３ＰＤＨを用いた場合の誤差を補正・調整することにより、ｐｅｒ２遺伝子の発現レベルの正確性を向上させた。
【００５３】
結果を図５に示す。図５中、「Ｗｉｌｄ」はストレスを与えなかったマウス群を、「Ｓｔｒｅｓｓ」はストレスを与えたマウス群を指す。図５中、横軸は、マウスの第１群から第６群及び各採血時刻を示す。但し、概日変化を示すため、横軸を、採血時刻の順番に並べ換え、左から、第４群、第５群、第６群、第１群、第２群、第３群の順にした。
【００５４】
図５中、棒グラフは、ｐｅｒ２発現レベルを示している。この場合の縦軸（左側）は、ｐｅｒ２発現レベル（上記方法により算定した値）を示している。この棒グラフが示すとおり、全群で、ストレスを与えたマウス群のほうが、ストレスを与えないマウス群よりも有意にｐｅｒ２発現レベルが高かった。このことは、ストレスが負荷されることにより、ｐｅｒ２の発現が顕著に増加することを示している。
【００５５】
また、本実験により明らかになったストレス負荷とｐｅｒ２遺伝子発現の相関関係は、ストレスの負荷により、１５ｄ−ＰＧＪ２が増加し、ｐｅｒ２遺伝子の発現を促進する、という作用機序が存在する可能性を強く示唆している。従って、１５ｄ−ＰＧＪ２が、ストレス検出マーカーとなりうることを示唆している。
【００５６】
その他、本実験では、図５に示すとおり、特に、第４群（８時に採血したもの）において、ストレスを与えたマウス群とストレスを与えないマウス群の、ｐｅｒ２発現レベルの差が顕著であった。また、第５群（１２時に採血したもの）、第６群（１６時に採血したもの）、第７群（２０時に採血したもの）でも、ｐｅｒ２発現レベルに有意な差があった。従って、例えば、血中の１５ｄ−ＰＧＪ２を、ストレス検出マーカーとして検出する場合、８時から２０時に採血することが好ましく、８時前後又は８時から１２時までに採血することが特に好ましいと考えられる。
【００５７】
図５中の折れ線グラフは、血漿中のコルチコステロン量を示す。この場合の縦軸（右側）は、血漿中コルチコステロン量（ｎｇ／ｍｌ）を示す。図５中、「ＣＯＲＴ」はコルチコステロンを示す。コルチコステロンは、ストレス負荷時に血漿濃度が上昇することが知られているホルモンである。
【００５８】
図５が示すとおり、ストレスを与えたマウス群では、ストレスを与えなかったマウス群と比較して、有意に血漿中のコルチコステロン量が上昇した。従って、本実験で用いたストレス負荷方法は、ストレス負荷モデルの作製手段として、有効である。
【００５９】
なお、血漿中コルチコステロン量は、各群マウスの採取血液について、ＥＬＩＳＡ法を行って求めた。ＥＬＩＳＡ法は、Ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｓ  Ｉｎｃ製）を用いた。一次抗体には、ロバ抗ヒツジＩｇＧ抗体を、二次抗体には、ヒツジポリクローナル抗体を用いた。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明に係るｐｅｒ２遺伝子の発現を促進する１５ｄ−ＰＧＪ２（その塩を含む）、及び、１５ｄ−ＰＧＪ２を用いたｐｅｒ２遺伝子の発現促進方法は、例えば、ｐｅｒ２遺伝子発現用キットなどに利用できる可能性があり、産業上利用できる可能性がある。
【００６１】
本発明に係る１５ｄ−ＰＧＪ２（その塩、または、１５ｄ−ＰＧＪ２誘導体又はその塩）は、例えば、概日リズムの変調に関わる疾患の予防剤・治療剤、抗がん剤などに適用できる可能性があるほか、サプリメント、食品添加剤、実験用試薬などにも適用可能であり、産業上有用である。
【００６２】
本発明に係る１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩を用いた概日リズム調整方法は、概日リズム調整を目的としたサービス業、健康増進サービス業、リラクゼーションサービス業、などに利用できる可能性があり、産業上利用できる可能性がある。
【００６３】
本発明に係るマーカーとしての１５ｄ−ＰＧＪ２（その塩を含む）、及び、本発明に係る１５ｄ−ＰＧＪ２又はその塩をマーカーとして用いた方法は、例えば、概日リズムの変調・がん発症リスク・ストレスを検出するキットなどに利用できる可能性があり、産業上利用できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ネガティブコントロールのルシフェラーゼ発光量の経時的変化。
【図２】ポジティブコントロールのルシフェラーゼ発光量の経時的変化。
【図３】１５ｄ−ＰＧＪ２のルシフェラーゼ発光量の経時的変化。
【図４】核内受容体ＰＰＡＲγのアゴニストを加えた場合の、ルシフェラーゼ発光量の経時的変化の比較。
【図５】ストレスを与えた場合の、ｐｅｒ２発現レベルを示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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