(57)【要約】【課題】血管内皮細胞増殖を阻害する新たな薬剤を提供すること。【解決手段】本発明の血管内皮細胞増殖阻害剤は、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有する。本発明の血管内皮細胞増殖阻害剤は、腫瘍増殖、関節リウマチ、糖尿病性網膜症などの血管新生に由来する種々の疾病の治療剤として用いられ、特に、癌細胞の増殖抑制や固形腫瘍の縮小などに有用であり得る。さらに、本発明の血管内皮細胞増殖阻害剤は、低毒性であるため、安全性が高い。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有する、血管内皮細胞増殖阻害剤。
【請求項２】
アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有する、血管内皮細胞増殖を伴う疾病の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮細胞増殖阻害剤に関する。より詳細には、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有する、血管内皮細胞増殖阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮細胞は、血管内腔を裏打ちして内膜を構成する一層の細胞である。血管内皮細胞は、血液中の栄養物などの必要な成分を組織へ輸送する仲介をし、不必要に多量の成分が通過することを防ぐ作用；血液が凝固せずに円滑に循環させる作用；血管が離断したときに出血を阻止する作用；血管の緊張を一定に保つ調節作用；炎症に関与する因子を産生して炎症を制御する作用；血管における病態を制御する作用などを有している。
【０００３】
また、血管内皮細胞は、血管新生における重要な因子でもある。血管内皮細胞で産生されたプロテアーゼによる基底膜の消化、血管内皮細胞の遊走・増殖、次いで血管内皮細胞の管腔形成の順で血管新生が生じる。血管新生は、種々の増殖因子やサイトカイン、アラキドン酸代謝物、モノブチリンなどによって引き起こされると考えられている。血管新生を引き起こす増殖因子としては、繊維芽細胞増殖因子、腫瘍増殖因子、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管透過性因子などが知られている。その中でも、ＶＥＧＦは受容体が血管内皮だけに存在しており、血管内皮に選択的に作用するため、最も重要な血管新生因子と考えられている。
【０００４】
血管新生は、種々の疾患と密接に関連することが知られている。血管新生が関与する疾患としては、悪性腫瘍の増大や転移、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性症、炎症性皮膚疾患、関節リウマチ、変形性関節症などが挙げられる。
【０００５】
例えば、悪性腫瘍が増殖する際には、腫瘍細胞の増殖に必要な栄養や酸素を得るために腫瘍細胞が自ら血管新生因子による血管の新生を誘導する。悪性腫瘍が他の臓器や部位へ転移する場合も血管新生を誘導し、血流にのって腫瘍細胞が移動する。糖尿病性網膜症の場合には、糖尿病による粘性血液によって毛細血管が詰まり、網膜に出血や浮腫を生じ、さらにこれが慢性化して網膜に酸素や栄養の不足を起こすため、網膜上や神経系乳頭上に新生血管が発生し、その周囲に繊維組織が形成される。この繊維組織によって網膜が引張り上げられたり（網膜剥離）、網膜の血管が引き裂かれて出血を起こし（硝子体出血）、やがて高度視力障害や失明に至る。
【０００６】
このように、血管内皮細胞の増殖により生じる血管新生は様々な疾病の発症や進行に深く関与しているため、これら疾病の治療を目的として、血管新生や血管内皮細胞増殖を阻害する物質の探索がこれまでに数多く行われている。血管新生を阻害する作用のある物質や薬剤として、例えば、硫酸化多糖体（特許文献１）、アスコルビン酸エーテルおよび関連化合物（特許文献２）、チアゾール誘導体（特許文献３）、鮫軟骨エキス（コンドロイチンおよびムコ多糖類）（特許文献４）などがある。しかし、これまで血管新生を阻害する作用を示す物質として提案された物質は、実用的に満足できる効果を発揮し得るものではなかった。このため、血管内皮細胞増殖をより強力に阻害し、安全性の高い物質を開発することが求められている。また、血管内皮細胞増殖を阻害する目的で、上述のＶＥＧＦやＶＥＧＦ受容体をターゲットにした阻害剤も種々開発されている（例えば、特許文献５〜７）。
【０００７】
血管内皮細胞増殖あるいは血管新生が関与する疾病の１つである癌の治療法としては、一般的に外科的方法、放射線療法、化学療法（薬剤投与）などが行われている。これらのうち化学療法としては、直接腫瘍細胞に作用して腫瘍細胞を死滅させる薬剤を投与する治療法が広く適用されており、このような治療法に適用するための抗腫瘍剤についての提案は多い。しかし、このような薬剤は、腫瘍細胞を死滅させると共に正常細胞にも作用するため、癌の治療効果は高いが、副作用が非常に強いという欠点がある。また、このような薬剤は、細胞単位で効いても、腫瘍塊の深部まで届かないため、根本的な解決とならない。さらに、癌はその器官が異なると性質も異なり、抗腫瘍剤の選択や投与方法が異なることは珍しくなく、様々な種類の癌に効果を有する抗腫瘍剤が望まれている。
【０００８】
カロテノイド（カロチノイド）は、動物、植物、および微生物に広く分布し、その数約６００種におよぶ黄〜橙〜赤色を呈する脂溶性生体色素である。その一種であるアスタキサンチンは、オキアミ、エビ、カニなどの甲殻類、サケ・マスの筋肉・卵（イクラなど）、タイ・コイ・金魚などの体表などに含有されている。アスタキサンチンは、プロビタミンＡとなり得ることや顕著な抗酸化作用を有することだけでなく、抗腫瘍剤としての可能性も知られている。例えば、膀胱癌、口腔癌、および結腸癌の腫瘍形成抑制作用（非特許文献１）；抗ストレス作用（特許文献８）；アポトーシス誘導作用（特許文献９）；トポイソメラーゼ阻害作用（特許文献１０）；プロテインキナーゼ阻害作用（特許文献１１）；ＵＶ照射からの皮膚の防御作用（非特許文献２）；乳癌増殖抑制作用（非特許文献３）；アスタキサンチン誘導体の一種による腫瘍形成阻害作用（非特許文献４）；免疫応答増強作用（非特許文献５）などが報告されている。しかし、上記のような血管内皮細胞増殖阻害あるいは血管新生阻害に関しては、全く報告がない。
【特許文献１】特開昭６３−１１９５００号公報
【特許文献２】特開昭５８−１３１９７８号公報
【特許文献３】特公平６−６２４１３号公報
【特許文献４】特開平１０−１４７５３４号公報
【特許文献５】特開平１０−３２４６２５号公報
【特許文献６】特開２００２−２２０３４０号公報
【特許文献７】特表２００５−５０６２８８号公報
【特許文献８】特開平９−１２４４７０号公報
【特許文献９】特開２００１−１１４６７３号公報
【特許文献１０】特開２００１−１１４６７４号公報
【特許文献１１】特開２００１−１１４６８３号公報
【非特許文献１】T. Tanakaら、Carcinogenesis，1995年，16巻，12号，pp.2957-2963
【非特許文献２】N.M. LyonsおよびN.M. O'Brien、J. Dermatol. Sci.，2002年，30巻，pp.73-84
【非特許文献３】B.P. Chewら、Anticancer Res.，1999年，19巻，pp.1849-1853
【非特許文献４】L.M. Hixら、Cancer Lett.，2004年，211巻，pp.25-37
【非特許文献５】H. Jyonouchiら、Nutr. Cancer，2000年，36巻，1号，pp.59-65
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、血管新生を抑制するために、血管内皮細胞増殖を阻害する新たな薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記のように抗腫瘍剤としての可能性が報告されているアスタキサンチンについて種々の検討を行ったところ、アスタキサンチンが血管内皮細胞増殖阻害活性を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有する、血管内皮細胞増殖阻害剤を提供する。
【００１２】
本発明はまた、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを有効成分として含有する、血管内皮細胞増殖を伴う疾病の治療剤を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、新たな血管内皮細胞増殖阻害剤が提供される。この血管内皮細胞増殖阻害剤は、腫瘍増殖、関節リウマチ、糖尿病性網膜症などの血管新生に由来する種々の疾病の治療剤として用いられ得る。本発明の血管内皮細胞増殖阻害剤は、特に、癌細胞の増殖抑制や固形腫瘍の縮小などに有用であり得る。さらに、本発明の血管内皮細胞増殖阻害剤は、低毒性であるため、安全性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の血管内皮細胞増殖阻害剤の有効成分であるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは、以下の式：
【００１５】
【化１】
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【００１６】
（ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子または脂肪酸残基である）で示されるカロテノイドの一種である。アスタキサンチンのエステルとしては、特に限定されないが、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸などの飽和脂肪酸、あるいはオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ビスホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの不飽和脂肪酸のモノエステルまたはジエステルが挙げられる。これらは単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。アスタキサンチンは、β−カロチンの骨格の両端にオキソ基とヒドロキシ基とを余分に有する構造であるため、β−カロチンとは異なり、分子の安定性が低い。これに対し、両端のヒドロキシ基が不飽和脂肪酸などでエステル化されたエステル体（例えば、オキアミ抽出物）はより安定である。
【００１７】
本発明に用いられるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは、化学的に合成されたものであっても、あるいは天然物由来のもののいずれであってもよい。後者の天然物としては、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する赤色酵母；ティグリオパス（赤ミジンコ）、オキアミなどの甲殻類の殻；緑藻類などの微細藻類などが挙げられる。本発明においては、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルの特性を利用できるものであれば、どのような方法で生産されたアスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する抽出物をも使用することができる。一般的には、これらの天然物からの抽出物が用いられ、抽出エキスの状態であっても、また必要により適宜精製したものであってもよい。本発明においては、このようなアスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する粗抽出物や破砕粉体物、あるいは必要により適宜精製されたもの、化学合成されたものを、単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。体内での安定性を考慮すると、好ましくはエステル体が用いられる。
【００１８】
本発明の血管内皮細胞増殖阻害剤は、血管新生に由来する癌および関節リウマチの治療などに有用であり、血管内皮細胞増殖を伴う疾病の治療剤として用いられ得る。血管新生に由来する疾病としては、悪性腫瘍の増大や転移、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性症、炎症性皮膚疾患、関節リウマチ、変形性関節症などが挙げられる。
【００１９】
本発明の血管内皮細胞増殖阻害剤または血管内皮細胞増殖を伴う疾病の治療剤の投与経路は、経口投与または非経口投与のいずれであってもよい。その剤形は、投与経路に応じて適宜選択される。例えば、注射液、輸液、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、腸溶剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤、経腸栄養剤などが挙げられる。これは、症状に応じてそれぞれ単独でまたは組み合わせて使用することができる。これらの製剤には、必要に応じて、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤が用いられる。
【００２０】
本発明の血管内皮細胞増殖阻害剤または血管内皮細胞増殖を伴う疾病の治療剤の投与量は、投与の目的や投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）に応じて異なる。通常、成人に対して、アスタキサンチンフリー体換算で、経口投与の場合、１日あたり０．１ｍｇ〜２ｇ、好ましくは４ｍｇ〜５００ｍｇ、一方、非経口投与の場合、１日あたり０．０１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜５００ｍｇで投与され得る。
【００２１】
本発明の血管内皮細胞増殖阻害剤は、上記のような医薬品としてだけでなく、医薬部外品、化粧品、機能性食品、栄養補助剤、飲食物などとして使用することができる。医薬部外品または化粧品として使用する場合、必要に応じて、医薬部外品または化粧品などの技術分野で通常用いられている種々の補助剤とともに使用され得る。あるいは、機能性食品、栄養補助剤、または飲食物として使用する場合、必要に応じて、例えば、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤などの食品に通常用いられる添加剤とともに使用してもよい。また、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状などの所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれる割合は、特に限定されず、使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００２２】
（調製例１：アスタキサンチンモノエステルの調製）
アスタキサンチンモノエステルを、次のように調製した。ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pulvialis）K0084株を、２５℃にて光照射条件下３％ＣＯ２を含むガスを通気しながら栄養ストレス（窒素源欠乏）をかけて培養し、シスト化した。シスト化した細胞を、当業者が通常用いる手段によって破砕し、エタノールで油性画分を抽出した。抽出物は、アスタキサンチン類の他に、トリグリセリドなどの脂質を含んでいた。抽出物を、合成樹脂吸着剤を用いるカラムクロマトグラフィーにかけて、アスタキサンチンのモノエステルを含む精製物を得た。この精製物をＨＰＬＣによって分析し、このアスタキサンチンモノエステル精製物が、分子量８５８のモノエステルを主成分として含み、アスタキサンチンの遊離体およびジエステル体を含まず、わずかにジグリセリドを含んでいることを確認した。
【００２３】
（実施例１：血管内皮細胞に対する増殖阻害の測定）
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細胞数の変化を、生存細胞がalamarBlueを非蛍光性の酸化型（青）から蛍光性の還元型（赤）に変化させる能力に基づいて測定した。
【００２４】
まず、上記調製例１で得たアスタキサンチンモノエステルを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、次いで蒸留水で希釈して、４０(v/v)％ＤＭＳＯ中に25000、2500、250、25、および2.5μＭのアスタキサンチンモノエステルを含むストック試験溶液を調製した。
【００２５】
一方、ＨＵＶＥＣ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７３０）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手し、１％Antibiotic-Antimycotic（GIBCO BRL, USA）を添加した１０％ウシ胎児血清含有Endothelial Cell Growth Medium（CELL APPLICATIONS, USA））中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃にて予備培養した。
【００２６】
100μＬのＨＵＶＥＣ懸濁液（約２．５×１０３細胞／ウェル）を、９６ウェルのMatrigelプレートに５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃にて入れた。２４時間後、100μＬの増殖培地および上記の各ストック試験溶液またはベヒクル（４０(v/v)％ＤＭＳＯ）２μＬずつを、各２つのウェルに添加し、さらに７２時間インキュベートした。ＤＭＳＯおよびアスタキサンチンモノエステルの最終濃度は、250、25、2.5、0.25、および0.025μＭであった。また、標準参照物質であるマイトマイシン（協和発酵工業株式会社）についても同時にテストした。
【００２７】
インキュベーション終了後、20μＬの90％alamarBlue試薬を個々のウェルに添加し、さらに６時間インキュベートした。次いで、各ウェルの蛍光強度を、Spectrafluor Plusプレートリーダーを用いて、励起波長530nmおよび発光波長590nmにて測定した。以下の式に基づいて、細胞増殖の割合を算出した。
【００２８】
【数１】
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【００２９】
アスタキサンチンモノエステルおよびマイトマイシンの濃度と算出した増殖割合との関係を、図１に示す。コントロールと比較して、アスタキサンチンモノエステルは、２５０μＭの濃度で有意な増殖阻害を示した。なお、コントロールに対して５０％以下の割合を有意とした。対照のマイトマイシンでは、有意な増殖阻害は１０μＭ未満であった。
【００３０】
次いで、GraphPad Prism（GraphPad Software, USA）を用いて非線形回帰解析を行って、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）、総増殖阻害濃度（ＴＧＩ）、および５０％致死濃度（ＬＣ５０）を算出した。ＩＣ５０は、試験開始からの細胞数の増加がコントロールでの試験終了時の細胞数の５０％の細胞数となる濃度である。ＴＧＩは、試験終了時の細胞数が試験開始時の細胞数と同じになる濃度である。ＬＣ５０は、試験終了時の細胞数が試験開始時の半数になる濃度である。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
この結果、ＨＵＶＥＣに対するアスタキサンチンモノエステルの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は５１μＭであり、比較的低い濃度で細胞増殖阻害効果を有することがわかった。さらに、５０％致死濃度（ＬＣ５０）は２５０μＭ（ＤＭＳＯへの最大溶解濃度）以上であり、毒性が低いこともわかった。
【００３３】
（参考例１：血管新生阻害活性）
ＨＵＶＥＣは、内皮細胞増殖サプリメントの存在下でMatrigelにおいて、分化して毛細管様構造を形成する。そこで、上記実施例１において血管内皮細胞増殖阻害作用を有することが確認されたアスタキサンチンモノエステルが、実際に血管新生を阻害するかどうかについて、血管ネットワーク連続体の非構築を観察することによって評価した。
【００３４】
まず、Matrigelマトリックス（BD Biosciences, USA）を融解して氷上で４℃にて保持し、そして５０μＬのマトリックスを９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに移した。プレートを３７℃にて少なくとも１時間インキュベートして、マトリックス溶液を固化させた。
【００３５】
次に、200μＬのＨＵＶＥＣ懸濁液（約１．５×１０４細胞／ウェル）を、９６ウェルのMatrigelプレートに入れた。次いで、上記実施例１と同様に調製した各ストック試験溶液またはベヒクル（４０(v/v)％ＤＭＳＯ）を２μＬずつ各２つのウェルに添加し、５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃にて１８時間培養した。なお、ＤＭＳＯの最終濃度は、0.4(v/v)％であり、そしてアスタキサンチンモノエステルの最終濃度は、250、25、2.5、0.25、および0.025μＭであった。また、標準参照物質であるスラミン（Sigma, USA）についても同時にテストした。
【００３６】
インキュベーション終了後、個々のウェルの内皮細胞管の形態を、顕微鏡写真によって評価した。結果を図２に示す。図２からわかるように、アスタキサンチンモノエステルの存在下では、コントロールのベヒクルで形成されている細胞体間の連続的なネットワークの形成が不十分であった。
【００３７】
次に、各顕微鏡写真について、形成された血管の長さを測定した。コントロールに対して管の長さが３０％以上短いものを有意な阻害効果ありと判定した。結果を図３に示す。この結果、アスタキサンチンモノエステルは、ベヒクル処理コントロール群に対して血管形成に有意な阻害を生じ、最小阻害濃度（ＭＩＣ）は250μＭであった。なお、同時にテストした標準参照物質であるスラミンについては、ＭＩＣは10μＭであった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明によれば、新たな血管内皮細胞増殖阻害剤が提供される。この血管内皮細胞増殖阻害剤は、腫瘍増殖、関節リウマチ、糖尿病性網膜症などの血管新生に由来する種々の疾病の治療剤として用いられ得る。本発明の血管内皮細胞増殖阻害剤は、特に、癌細胞の増殖抑制や固形腫瘍の縮小などに有用であり得る。さらに、本発明の血管内皮細胞増殖阻害剤は、低毒性であるため、安全性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】アスタキサンチンモノエステル（□）およびマイトマイシン（＊）の濃度とＨＵＶＥＣの増殖割合との関係を示すグラフである。
【図２】アスタキサンチンモノエステルまたはスラミン存在下におけるMatrigel上でのＨＵＶＥＣによる血管形成についての顕微鏡写真（×４０）である。
【図３】種々の濃度のアスタキサンチンモノエステル（Ａ）またはスラミン（Ｂ）による、ＨＵＶＥＣの血管形成に対する阻害割合を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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