(57)【要約】【課題】モナティン製造に有用な光学活性ＩＨＯＧの製造方法、光学活性モナティンの製造方法、及び当該方法に用いるアルドラーゼを提供する。【解決手段】インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）から、光学活性モナティン合成における中間体として有用な光学純度の高い４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を合成することができる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列と少なくとも相同性が７０％以上であって、４Ｒ−アルドラーゼ活性を有するタンパク質、
のいずれかに記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、
インドール−３−ピルビン酸及びピルビン酸又はオキサロ酢酸に作用させ、
光学純度７０％以上の下記式（１）で示される（４Ｒ）−４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（４Ｒ−ＩＨＯＧ）又はその塩を生成させることを特徴とする、４Ｒ−ＩＨＯＧ又はその塩の製造方法。
【化１】
2006204285.tif 000025
【請求項２】
下記（ａ）又は（ｂ）
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列と少なくとも相同性が７０％以上であって、４Ｒ−アルドラーゼ活性を有するタンパク質、
のいずれかに記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、
インドール−３−ピルビン酸及びピルビン酸又はオキサロ酢酸に作用させ、
４Ｒ−ＩＨＯＧ又はその塩を優先的に生成させる第１の工程、及び、
前記第１の工程によって得られた４Ｒ−ＩＨＯＧ又はその塩のカルボニル基をアミノ基に変換し、光学純度９０％以上の下記式（２）で示される４Ｒ−モナティン又はその塩を得る第２の工程、
を含むことを特徴とする４Ｒ−モナティン又はその塩の製造方法。
【化２】
2006204285.tif 000026
（式中、波線の結合はＲ−配置及びＳ−配置の両方を含むことを表す。）
【請求項３】
前記第２の工程において、カルボニル基のアミノ基への変換が、４Ｒ−ＩＨＯＧに酵素を作用せしめてアミノ化することにより行なわれるものである、請求項２記載の４Ｒ−モナティン又はその塩の製造方法。
【請求項４】
前記第２の工程において、カルボニル基のアミノ基への変換が、反応液に含まれる４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を、中性又はアルカリ性条件下において下記一般式（３）
【化３】
2006204285.tif 000027
（上記一般式（３）において、Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。）
で表されるアミン化合物又はその塩と反応せしめ、下記式（４）に示される４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸（ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ）を生成させ、生成したＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ又はその塩の４Ｒ体を晶析し、
得られた４Ｒ体のＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ又はその塩を還元し、生成した光学純度９０％以上の４Ｒ−モナティン又はその塩を採取するものである、請求項２に記載の４Ｒ−モナティン又はその塩の製造方法。
【化４】
2006204285.tif 000028
【請求項５】
前記一般式（３）で表されるアミン化合物が、ヒドロキシルアミン、メトキシアミン、ベンジルオキシアミンからなる群より選ばれる少なくとも一種のアミン化合物である、請求項４に記載の４Ｒ−モナティン又はその塩の製造方法。
【請求項６】
４Ｒ体のＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ又はその塩の還元が、水素及び水素添加触媒の存在下で実施されることを特徴とする請求項４又は５に記載の４Ｒ−モナティン又はその塩の製造方法。
【請求項７】
前記第２の工程において、晶析により（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを採取することを特徴とする請求項４〜６のいずれか一項に記載の４Ｒ−モナティン又はその塩の製造方法。
【請求項８】
前記第２の工程において、晶析溶媒として水、アルコール溶媒又は含水アルコール溶媒を用いることを特徴とする請求項４〜７のいずれか１項に記載の４Ｒ−モナティン又はその塩の製造方法。
【請求項９】
前記方法に用いられるタンパク質が、スフィンゴモナス属又はバークホルデリア属細菌から選ばれる微生物に由来するタンパク質である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記微生物は、スフィンゴモナス  エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＡＪ１１０３２９株又はＡＪ１１０３７２株、バークホルデリア  エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＪ１１０３７１株であることを特徴とする請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列と少なくとも相同性が７０％以上であって、４Ｒ−アルドラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項１２】
配列番号２記載のアミノ酸配列と少なくとも相同性が７０％以上であって、４Ｒ−アルドラーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号１３又は１５のいずれかに記載のタンパク質である、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
下記（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列又は同配列中塩基番号２１０〜１００４の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号１記載の塩基配列若しくは同配列中塩基番号２１０〜１００４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項１５】
配列番号１記載の塩基配列若しくは同配列中塩基番号２１０〜１００４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが、（ｆ）配列番号１２記載の塩基配列若しくは同配列中塩基番号３９９〜１２５３の塩基配列からなるＤＮＡ、又は（ｇ）配列番号１４記載の塩基配列若しくは同配列中塩基番号５３１〜１３８５の塩基配列からなるＤＮＡのいずれかのＤＮＡである、請求項１４に記載のＤＮＡ。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載のＤＮＡとベクターＤＮＡを接続して得られることを特徴とする組換えＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項１６記載の組換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
【請求項１８】
請求項１７記載の細胞を培地中で培養し、培地及び／又は細胞中にアルドラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするアルドラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モナティンの前駆体である４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）を生成する新規アルドラーゼ、及びこれを用いた４Ｒ−ＩＨＯＧの製造方法、ならびに４Ｒ−モナティンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
下記構造式で示される４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−グルタミン酸（３−（１−アミノ−１，３−ジカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブタン−４−イル）−インドール）（以下、「モナティン」と称する。）は、植物シュレロチトン  イリシホリアス（Ｓｃｈｌｅｒｏｃｈｉｔｏｎ  ｉｌｉｃｉｆｏｌｉｕｓ）の根に含有され、甘味強度が著しく高いことから、特に低カロリー甘味料として期待される化合物である（特開昭６４−２５７５７号公報参照）。
【０００３】
【化１】
2006204285.tif 000002
【０００４】
上記モナティンは２つの不斉（２位、４位）が存在し、立体異性体は、（２Ｓ，４Ｓ）体と報告されていた。その他に３種の立体異性体の存在が確認され、何れもショ糖の数十倍から数千倍の甘味強度を有することが確かめられている（表１）。
【０００５】
【表１】
2006204285.tif 000003
【０００６】
表１に示すように、（２Ｓ，４Ｓ）−モナティンのみならず、その他の立体異性体の何れもがそれぞれ高倍率の甘味度を有しているが、特に、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンは甘味度がショ糖の２７００倍と著しく高く、甘味剤或いは甘味剤成分（甘味料）として最も期待される異性体である。従って、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成する方法の開発が望まれる。
【０００７】
本発明者らは、試薬として購入可能であるインドールピルビン酸とピルビン酸とを用いて、下記の反応（ａ）及び（ｂ）からなる新たなモナティンの合成方法を開発した（特許文献１）。
（ａ）インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）のアルドール縮合により前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を合成する反応工程
（ｂ）ＩＨＯＧの２位をアミノ化する反応工程
【０００８】
【化２】
2006204285.tif 000004
【０００９】
特許文献２は、上記モナティンの合成ルートにおける（ａ）のアルドール縮合反応について、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）から前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を生成することができる酵素として、シュードモナス  タエトロレンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ）及びシュードモナス  コロナファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ）由来のアルドラーゼ等を開示している。これらのアルドラーゼは、ＩＨＯＧ以外にも、４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＰＨＯＧ）等のケト酸を生成する反応を触媒することが分かっている。
【００１０】
ＩＨＯＧには４Ｒ体と４Ｓ体の２つの異性体が存在するが、最も甘味度の高い異性体である（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成するためには、上記モナティンの合成ルートにおける（ａ）のアルドール縮合反応において、４Ｒ体のＩＨＯＧ（以下「４Ｒ−ＩＨＯＧ」、４Ｓ体を「４Ｓ−ＩＨＯＧ」という。）を優先的に生成させ、４Ｒ体リッチなＩＨＯＧを得ることが望ましい。また、キラル分子は、異性体ごとに異なる生理活性を示すことが多々あるが、ＩＨＯＧについても異性体ごとに異なる性質を有している可能性があり、４Ｒ体と４Ｓ体を作り分けることにより、モナティンの前駆体以外で他の用途に利用することも考えられる。したがって、４Ｒ−ＩＨＯＧ、４Ｓ−ＩＨＯＧのうち一方の異性体を優先的に生成する方法の開発は、工業上極めて有用である。
【００１１】
【特許文献１】国際公開第０３／０５６０２６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０４／０１８６７２号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、従来の化学合成系では、生成するＩＨＯＧは、４Ｒ体と４Ｓ体の混合物（ラセミ体）であった。また、本発明者らはＩＨＯＧの合成に好適なアルドラーゼとして、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ由来のアルドラーゼを取得しているが、当該アルドラーゼによって生成されるＩＨＯＧは４Ｒ体リッチではなく、反応の条件にもよるが、むしろやや４Ｓ体リッチなＩＨＯＧを生成することが明らかとなっていた。（特許文献１、特許文献２）。また、４Ｒ−ＩＨＯＧを優先的に生成するアルドラーゼについては、今までのところ、報告されてない。したがって、現状では、４Ｒ−ＩＨＯＧ、特に、４Ｒ体リッチなＩＨＯＧを効率的に生成する方法が確立されていない。
【００１３】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、ＰＨＯＧやＩＨＯＧ、特に４Ｒ−ＩＨＯＧを生成する新規アルドラーゼ、及びこれを用いたＩＨＯＧの製造方法、ならびにモナティンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ある種の微生物に、目的とする４Ｒ−ＩＨＯＧの合成に好適に利用できるアルドラーゼが存在することを見出し、これらを用いることにより、４Ｒ−ＩＨＯＧ及び４Ｒ−モナティンの製造方法に関する本発明に想到した。
【００１５】
即ち、本発明は以下の内容を含むものである。
［１］
下記（ａ）又は（ｂ）
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列と少なくとも相同性が７０％以上であって、４Ｒ−アルドラーゼ活性を有するタンパク質、
のいずれかに記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、
インドール−３−ピルビン酸及びピルビン酸又はオキサロ酢酸に作用させ、
光学純度７０％以上の下記式（１）で示される（４Ｒ）−４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（４Ｒ−ＩＨＯＧ）又はその塩を生成させることを特徴とする、４Ｒ−ＩＨＯＧ又はその塩の製造方法。
【化３】
2006204285.tif 000005
【００１６】
［２］
下記（ａ）又は（ｂ）
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列と少なくとも相同性が７０％以上であって、４Ｒ−アルドラーゼ活性を有するタンパク質、
のいずれかに記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、
インドール−３−ピルビン酸及びピルビン酸又はオキサロ酢酸に作用させ、
４Ｒ−ＩＨＯＧ又はその塩を優先的に生成させる第１の工程、及び、
前記第１の工程によって得られた４Ｒ−ＩＨＯＧ又はその塩のカルボニル基をアミノ基に変換し、光学純度９０％以上の下記式（２）で示される４Ｒ−モナティン又はその塩を得る第２の工程、
を含むことを特徴とする４Ｒ−モナティン又はその塩の製造方法。
【化４】
2006204285.tif 000006
（式中、波線の結合はＲ−配置及びＳ−配置の両方を含むことを表す。）
［３］
前記第２の工程において、カルボニル基のアミノ基への変換が、４Ｒ−ＩＨＯＧに酵素を作用せしめてアミノ化することにより行なわれるものである、［２］記載の４Ｒ−モナティン又はその塩の製造方法。
［４］
前記第２の工程において、カルボニル基のアミノ基への変換が、反応液に含まれる４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を、中性又はアルカリ性条件下において下記一般式（３）
【化５】
2006204285.tif 000007
（上記一般式（３）において、Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。）
で表されるアミン化合物又はその塩と反応せしめ、下記式（４）に示される４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸（ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ）を生成させ、生成したＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ又はその塩の４Ｒ体を晶析し、
得られた４Ｒ体のＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ又はその塩を還元し、生成した光学純度９０％以上の４Ｒ−モナティン又はその塩を採取するものである、［２］記載の４Ｒ−モナティン又はその塩の製造方法。
【化６】
2006204285.tif 000008
［５］
前記一般式（３）で表されるアミン化合物が、ヒドロキシルアミン、メトキシアミン、ベンジルオキシアミンからなる群より選ばれる少なくとも一種のアミン化合物である、［４］記載の４Ｒ−モナティン又はその塩の製造方法。
［６］
４Ｒ体のＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ又はその塩の還元が、水素及び水素添加触媒の存在下で実施されることを特徴とする［４］又は［５］に記載の４Ｒ−モナティン又はその塩の製造方法。
［７］
前記第２の工程において、晶析により（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを採取することを特徴とする［４］〜［６］のいずれか一項に記載の４Ｒ−モナティン又はその塩の製造方法。
［８］
前記第２の工程において、晶析溶媒として水、アルコール溶媒又は含水アルコール溶媒を用いることを特徴とする［４］〜［７］のいずれか１項に記載の４Ｒ−モナティン又はその塩の製造方法。
［９］
前記方法に用いられるタンパク質が、スフィンゴモナス属又はバークホルデリア属細菌から選ばれる微生物に由来するタンパク質である、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の製造方法。
［１０］
前記微生物は、スフィンゴモナス  エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＡＪ１１０３２９株又はＡＪ１１０３７２株、バークホルデリア  エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＪ１１０３７１株であることを特徴とする［９］記載の製造方法。
【００１７】
［１１］
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列と少なくとも相同性が７０％以上であって、４Ｒ−アルドラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
［１２］
配列番号２記載のアミノ酸配列と少なくとも相同性が７０％以上であって、４Ｒ−アルドラーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号１３又は１５のいずれかに記載のタンパク質である、［１１］記載のタンパク質。
［１３］
［１１］又は［１２］に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
［１４］
下記（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列又は同配列中塩基番号２１０〜１００４の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号１記載の塩基配列若しくは同配列中塩基番号２１０〜１００４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［１５］
配列番号１記載の塩基配列若しくは同配列中塩基番号２１０〜１００４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが、（ｆ）配列番号１２記載の塩基配列若しくは同配列中塩基番号３９９〜１２５３の塩基配列からなるＤＮＡ、又は（ｇ）配列番号１４記載の塩基配列若しくは同配列中塩基番号５３１〜１３８５の塩基配列からなるＤＮＡのいずれかのＤＮＡである、［１４］記載のＤＮＡ。
［１６］
［１４］又は［１５］に記載のＤＮＡとベクターＤＮＡを接続して得られることを特徴とする組換えＤＮＡ。
［１７］
［１６］記載の組換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
［１８］
［１７］記載の細胞を培地中で培養し、培地及び／又は細胞中にアルドラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするアルドラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のアルドラーゼを用いることにより、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）から４Ｒ−ＩＨＯＧを優先的に生成できる。また、生成した４Ｒ−ＩＨＯＧをアミノ化することにより４Ｒ−モナティンを生成できるため、高甘味度モナティンの製造にきわめて有利に用いることができる。
【００１９】
また、従来は、ラセミ体のＩＨＯＧ（４Ｒ、４Ｓ−ＩＨＯＧ）から４Ｒ体を単離しようとする場合、４Ｒ、４Ｓ−ＩＨＯＧをオキシム化し、得られた４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸（以下「ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ」という。）にキラルアミンを作用させて４Ｒ体のＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ（以下「４Ｒ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ」という。）を晶析する必要があった。これに対し、本発明によれば、アルドール縮合反応の段階で４Ｒ体リッチなＩＨＯＧを生成させることができるため、晶析の際、キラルアミンを用いて光学分割する必要がなく、オキシム化後、そのまま４Ｒ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅを晶析させることができる。したがって、４Ｒ−ＩＨＯＧの精製処理プロセスを軽減することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明者らの研究により、ある種の微生物に、４Ｒ−ＩＨＯＧを優先的に合成する活性を有するアルドラーゼを生成する菌株が存在することが確認され、４Ｒ−ＩＨＯＧ及び４Ｒ−モナティンの製造方法が見出された。
【００２１】
以下、本発明について、
［Ｉ］  光学活性ＩＨＯＧの製造方法
［ＩＩ］  光学活性モナティンの製造方法
の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。
【００２２】
［Ｉ］  光学活性ＩＨＯＧの製造方法
（１）反応
本発明の４Ｒ−ＩＨＯＧの製造方法について述べる。本発明の４Ｒ−ＩＨＯＧの製造方法は、下記式（５）
【化７】
2006204285.tif 000009
で示されるインドールピルビン酸と、
下記一般式（６）
【化８】
2006204285.tif 000010
（式中、Ｒは水素原子又はカルボキシル基）
で示されるピルビン酸又はオキサロ酢酸とを反応せしめることにより、
下記式（１）
【化９】
2006204285.tif 000011
で示される４Ｒ−ＩＨＯＧを優先的に製造する方法であって、
当該反応を触媒するタンパク質存在下で反応を実施する点に特徴を有する。
【００２３】
前記「反応を触媒するタンパク質」とは、好ましくは４Ｒ−アルドラーゼ活性を有するタンパク質であって、微生物に由来するものであっても、化学的に合成されたタンパク質であっても良い。すなわち、４Ｒ−アルドラーゼ活性とは、前記一般式（５）で表されるインドールピルビン酸と、前記一般式（６）で表されるピルビン酸又はオキサロ酢酸とのアルドール縮合により、前記一般式（１）で示される４Ｒ−ＩＨＯＧを優先的に生成する反応、及び／又は、フェニルピルビン酸とピルビン酸から４Ｒ−ＰＨＯＧを優先的に生成する反応を触媒できる活性をいう。このようなタンパク質であれば、特に限定なく本発明において使用可能である。本明細書において、「４Ｒ−ＩＨＯＧを優先的に」製造するとは、生成されるＩＨＯＧの４位の光学純度がＲ体となる比率がＳ体となる比率よりも高いことを指し、好ましくは光学純度７０％以上、特に好ましくは９０％以上でＲ体となる反応効率を達成し得ることを指す。反応諸条件によっては、光学純度の比率は変動するが、当業者であれば反応の至適条件を容易に設定可能なため、最適な条件付近で上記比率が達成される方法であれば、反応条件を変動させた場合に上記比率が達成されない場合があっても本発明の方法に含まれる。また、４Ｒ体と４Ｓ体の混合比率を適宜調整する目的で、本発明に用いることの出来るタンパク質を用い、反応条件を調整することにより上記比率以下の反応を実施する場合も、本発明の製造方法に含まれる。なお、４Ｒ−ＩＨＯＧの光学純度は、鏡像体過剰率（％ｅ．ｅ．）として（［４Ｒ−ＩＨＯＧ］−［４Ｓ−ＩＨＯＧ］）／（［４Ｒ−ＩＨＯＧ］＋［４Ｓ−ＩＨＯＧ］）＊１００により決定できる。
【００２４】
当該反応を触媒するタンパク質としては、（２）アルドラーゼ活性を有するタンパク質の項において後述するアルドラーゼが好ましい。反応に当たっては、当該反応を触媒するタンパク質（アルドラーゼ）を生成する菌体を培養して得たアルドラーゼを用いても良いし、組み換えＤＮＡ技術により当該反応を触媒するタンパク質を生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養して得たアルドラーゼを用いても良い。
当該反応を触媒するタンパク質は、４Ｒ−ＩＨＯＧを優先的に合成する反応を触媒可能な限り、いかなる形態で反応系に添加してもよい。すなわち、当該反応を触媒するタンパク質を単体で反応系に添加してもよいし、当該反応を触媒するタンパク質（アルドラーゼ）を含むアルドラーゼ活性を有する組成物の形態で反応系に添加してもよい。
【００２５】
ここで「アルドラーゼ活性を有する組成物」とは、当該反応を触媒するタンパク質（アルドラーゼ）を含むものであればよく、具体的には培養物、培地（培養物から菌体を除去したもの）、菌体（培養菌体、洗浄菌体のいずれも含む）、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物、前記培地及び／又は細胞を精製処理することにより得られるアルドラーゼ活性を有する組成物（粗酵素液、精製酵素）などを含む。例えば、アルドラーゼ産生菌又は組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を用いて、光学活性ＩＨＯＧを製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよいし、当該菌体処理物からアルドラーゼを回収し、粗酵素液として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して用いてもよい。すなわち、アルドラーゼ活性を有する画分であれば、どのような形態であっても本発明の４Ｒ−ＩＨＯＧの製造方法に使用することが可能である。
【００２６】
アルドラーゼ又はアルドラーゼ活性を有する組成物を用いてアルドール反応を進行させるには、インドールピルビン酸、及び、ピルビン酸又はオキサロ酢酸、当該反応を触媒するタンパク質又はアルドラーゼ含有物を含む反応液を２０〜５０℃の適当な温度に調整し、ｐＨ６〜１２に保ちつつ、３０分〜５日静置、振とう、又は攪拌すればよい。
ここで、より立体選択的にＩＨＯＧを生成せしめる場合に、自発的なアルドール縮合を抑制することにより、より高い立体選択性をもって目的とする４Ｒ−ＩＨＯＧを生成せしめることも出来る。ここで、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸をアルドール縮合せしめてＩＨＯＧを生成させる場合を例として挙げる。本反応はｐＨをアルカリ側、例えばｐＨ９〜１２あたりで反応せしめることにより、自発的にアルドール縮合する。この自発的なアルドール縮合により生成したＩＨＯＧは、４位の立体に関しては選択性が低く、４Ｒと４Ｓの混合物（ラセミ体）を与える。そこで本発明の一態様においては、反応を触媒するタンパク質を作用せしめる際の、反応ｐＨをｐＨ９〜ｐＨ７、より好ましくはｐＨ８．７〜ｐＨ８付近に制御することにより、自発的なＩＨＯＧの生成が抑制され、一方で当該タンパク質によって４Ｒ−ＩＨＯＧ選択的にアルドール縮合せしめるため、結果として生成したＩＨＯＧの４Ｒ選択性を上げることができる。このような反応条件については、当該業者であれば簡単な予備的検討によって条件を決定することが出来る。
【００２７】
また、本発明で開示するアルドラーゼは２価カチオンを添加することにより酵素活性が増加する、いわゆるクラスＩＩのアルドラーゼに属すると考えられる。ここで反応系に添加する２価カチオンの濃度についても、自発的なアルドール縮合の進行に影響を与えることから、結果として生成するＩＨＯＧの４位の立体選択性に影響を与えることがある。反応系に添加する２価カチオンの種類や濃度については、当該業者であれば簡単な予備検討により好適な条件を決定することができる。
【００２８】
また、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+などの２価のカチオンを当該反応液に添加することによって反応速度を向上させることもできる。コスト等の面から、好ましくはＭｇ2+を用いることがある。ここで、２価カチオンを反応液に添加する際は、反応を阻害しない限りにおいてはいずれの塩を用いてもよいが、好ましくはＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、ＭｎＳＯ4等を用いることがある。これら２価カチオンの添加濃度は当該業者であれば簡単な予備検討によって決定することができるが、２価カチオンとして、Ｍｇ2+を添加した場合の例をあげると、添加するＭｇ2+を１ｍＭ以下、好ましくは０．５ｍＭ以下、より好ましくは０．１ｍＭ以下にすることにより、自発的なＩＨＯＧの縮合速度を抑制し、結果としてアルドラーゼを作用せしめた場合に生成するＩＨＯＧの４Ｒ選択性を上げることが出来る。
【００２９】
以下、本発明のＩＨＯＧの製造方法を実施する際の好ましい反応条件の一例を挙げれば、１００ｍＭ  バッファー、３００ｍＭ  インドール−３−ピルビン酸、６００ｍＭ  ピルビン酸、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液に、酵素源としてアルドラーゼ発現Ｅ．ｃｏｌｉの洗浄菌体を１０％（ｗ／ｖ）となるように添加し、３７℃で４時間振とう反応させることにより、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）が得られる。
【００３０】
生成したＩＨＯＧは、公知の手法により分離精製することができる。例えば、イオン交換樹脂に接触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、これを溶離後晶析する方法又は溶離後、活性炭等による脱色濾過し晶析する方法等が挙げられる。また、生成したＩＨＯＧを含有する反応溶液を次の反応工程にそのまま用いることも可能である。
【００３１】
一例を挙げると、本発明の方法に従ってＩＨＯＧを生成させた場合の４Ｓ−ＩＨＯＧと４Ｒ−ＩＨＯＧの生成比は、例えば、３００ｍＭのインドール−３−ピルビン酸と６００ｍＭのピルビン酸を基質として、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2存在下、ｐＨ８．７〜ｐＨ８．０の反応条件では、ＳｐＡＬＤではＳ−ＩＨＯＧとＲ−ＩＨＯＧを約４：９６の比で生成することが確認されている（実施例１２参照）。更に、このようにして得られた４Ｒ−ＩＨＯＧを含有する反応液を、後述するオキシム化反応を経て晶析すると、４Ｒ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅの４位の光学純度は９０％以上を達成することが可能となる。なお、ヒドロキシルアミンをもちいてＩＨＯＧをＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅへ変換する反応は４位の光学選択性を有さないため、光学純度の測定はいずれの形態で測定した場合も同等となる。このようにして得られる４Ｒ−ＩＨＯＧは４Ｒ−モナティン製造のための中間体として極めて有用である。
【００３２】
（２）アルドラーゼ活性を有するタンパク質（アルドラーゼ）
本発明の製造方法に用いる、４Ｒ−アルドラーゼ活性を有するタンパク質（以下単に、「４Ｒ−アルドラーゼ」ということがある。）は、前記の反応を触媒する性質を有するものであるが、４Ｒ−アルドラーゼは、４Ｒ−アルドラーゼ活性を有する微生物から得ることもでき、当該微生物は、以下のスクリーニング方法によって得ることが出来る。
【００３３】
（ｉ）４Ｒ−アルドラーゼ活性を有する微生物
（ａ）４Ｒ−アルドラーゼ活性を有する微生物のスクリーニング方法
４Ｒ−アルドラーゼを産生する微生物は、土壌、水等の自然界から取得することができる。即ち、モナティン、ＩＨＯＧ、ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ、ＰＨＧ、ＰＨＯＧ、ＰＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ等の目的とするアルドラーゼが基質とする化合物を炭素源もしくは窒素源として、好ましくは、単一炭素源もしくは単一窒素源として、培地中に添加し、微生物源となるサンプルを接種の上、培養することが望ましい。また、それらの添加物はラセミ混合物を用いてもよいが、好ましくは４Ｒ−体、更に好ましくは、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンとすることが望ましい。炭素源以外の有機栄養源としては、通常の培地成分を適宜選択することが出来る。窒素源としては有機酸のアンモニウム塩、硝酸塩、およびペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用できる。他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類などの通常用いられる栄養源を適宜混合できる。このような集積培養において生育可能な微生物はアルドラーゼ活性菌が多く含まれる。
【００３４】
次に、上記培地の集積菌から単コロニーを取得し、取得したコロニーを、再度目的とする基質を単一炭素源とした培養プレート上で生育を確認し、アルドラーゼ活性を評価する。スクリーニングの際の培養条件は、前記炭素源以外は、通常の培養条件を用いることができるが、一例としては、後述する（ｃ）アルドラーゼ活性を有する微生物の培養方法の項で説明する条件が挙げられる。
【００３５】
微生物の産生するアルドラーゼ活性の評価方法としては、微生物菌体より酵素を精製し、その酵素標品を用いて酵素反応を評価することが望ましい。具体的にはｉ）ＩＨＯＧあるいはＰＨＯＧを基質として、遊離するピルビン酸を検出する方法（分解活性検出）、ｉｉ）インドールピルビン酸、もしくはフェニルピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）を基質としてアルドール縮合によって産生されるＩＨＯＧ、あるいはＰＨＯＧを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定によって検出する方法（合成活性検出）、が挙げられる。さらに、ｉｉ）のアルドール縮合によって産生されるＩＨＯＧ、あるいはＰＨＯＧをＨＰＬＣによって４位の不斉を確認することで、４Ｒ選択性を評価することが望ましい。
【００３６】
具体的には、１００ｍＭ  バッファー、３００ｍＭ  インドール−３−ピルビン酸、６００ｍＭピルビン酸、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液にアルドラーゼを添加し、３７℃で４時間振とう反応させ、ＨＰＬＣにて生成したＩＨＯＧ量を定量することにより、アルドラーゼ活性を見積もることができる。
【００３７】
ＩＨＯＧの定量は、例えば、ジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２」（５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）を利用したＨＰＬＣ分析にて定量できる。分析条件の一例を以下に示す。
【００３８】
移動相：４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／５ｍＭ  リン酸二水素テトラブチルアンモニウム溶液
流速：        １ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：  ４０℃
検出：        ＵＶ２１０ｎｍ
【００３９】
（ｂ）スクリーニングにより取得された微生物
本発明者らは、上記スクリーニングの結果、集積菌からスフィンゴモナス属に属する微生物及びバークホルデリア属に属する微生物を選択し、両属に属する微生物又はこれらに近縁の微生物から、本発明に使用可能なアルドラーゼが産生されることを見出した。従って、本発明に用いることが出来るアルドラーゼ活性を有する微生物としては、スフィンゴモナス属、バークホルデリア属、又はこれらに近縁の属に属する微生物が挙げられる。スフィンゴモナス属の近縁の属としては、例えば、リゾモナス属、ブラストモナス属、エリスロマイクロビウム属、ポルフィロバクター属、アグロバクテリウム属、エリスロバクター属が挙げられる。なお、スフィンゴモナス属については、近年再分類の提案がなされており、スフィンゴビウム属、ノボスフィンゴビウム属又はスフィンゴピキシス属と呼ばれる場合もあるが（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００１），  ５１，１４０５−１４１７）、本明細書においては、これらも含む意味でスフィンゴモナス属の用語を用いる。
【００４０】
スフィンゴモナス属に属する微生物としては、例えば、以下のものを例示することができる。
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｔｒｕｅｐｅｒｉ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ａｄｈａｅｓｉｖａ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐｒｕｎｉ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｉ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｅｃｈｉｎｏｉｄｓ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃａ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ａｇｒｅｓｔｉｓ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｒｏｓａ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｕｂａｒｃｔｉｃａ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｔｙｇｉａ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｅ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｍａｃｒｏｇｏｌｔａｂｉｄｕｓ，  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｔｅｒｒａｅ，  Ｒｈｉｚｏｍｏｎａｓ  ｓｕｂｅｒｉｆａｃｉｅｎｓ，  Ｂｌａｓｔｏｍｏｎａｓ  ｎａｔａｔｏｒｉａ，  Ｂｌａｓｔｏｍｏｎａｓ  ｕｒｓｉｎｃｏｌａ，  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｍ，  Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｎｇｕｓ，  Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ等が挙げられる。
【００４１】
バークホルデリア属に属する微生物としては、例えば以下のものを例示することができる。
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃａｒｉｂｅｎｓｉｓ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｋｕｒｕｒｉｅｎｓｉｓ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｂｒａｓｉｌｅｎｓｉｓ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｔｈｅｉ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｖａｎｄｉｉ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｏｃｏｖｅｎｅｎａｎｓ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ，  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｉｓ等が挙げられる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  ４２  （２００１），  ｐｐ．  ２６９−２７５）。
【００４２】
特に好ましくは、以下の微生物が挙げられる。これらの微生物の寄託先を下記に示す。
・Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３２９株（Ｃ７７株）
（ｉ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２７
（ｉｉ）原寄託申請の受託日    ２００４年５月２１日
（ｉｉｉ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
・Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３７２株（Ｃ４３株）
（ｉ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５６
（ｉｉ）原寄託申請の受託日    ２００４年１０月２８日
（ｉｉｉ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
・Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３７１株（Ｃ２４株）
（ｉ）受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５５
（ｉｉ）原寄託申請の受託日    ２００４年１０月２８日
（ｉｉｉ）寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
【００４３】
尚、ＡＪ１１０３２９株（Ｃ７７株、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２７）は、以下の分類実験の結果、上述のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．であることが同定された。
ＡＪ１１０３２９株のゲノムＤＮＡよりＰＣＲにより１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）のうち、５’末端側約５００ｂｐの領域を増幅し、塩基配列を決定した（配列番号１６）。得られた配列の相同性解析を、ＭｉｃｒｏＳｅｑ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ５００  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｖ．００２３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）をデータベースとし、ＭｉｃｒｏＳｅｑ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖ．１．４．１．を用いて解析した。その結果、ＡＪ１１０３２９株１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列と一致する既知配列は存在せず、相同率９６．６％でＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｃａｐｓｕｌａｔａの１６Ｓ  ｒＤＮＡに対し最も高い相同性を示した。分子系統樹上でもＡＪ１１０３２９株の１６Ｓ  ｒＤＮＡはＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓの１６Ｓ  ｒＤＮＡが形成するクラスター内に含まれた。また、表２に示す菌学的性質についても上記１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列解析結果と矛盾するものではなく、ＡＪ１１０３２９株をＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．と推定した。
【００４４】
ＡＪ１１０３７２株（Ｃ４３株、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５６）は、以下の分類実験の結果、上述のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．であることが同定された。
ＡＪ１１０３７２株のゲノムＤＮＡよりＰＣＲにより１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）のうち、５’末端側約５００ｂｐの領域を増幅し、塩基配列を決定した（配列番号１７）。得られた配列の相同性解析を、ＭｉｃｒｏＳｅｑ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ５００  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｖ．００２３  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）をデータベースとし、ＭｉｃｒｏＳｅｑ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖ．１．４．１．を用いて解析した。その結果、ＡＪ１１０３７２株１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列と一致する既知配列は存在せず、相同率９８．９４％でＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｙａｎｏｉｋｕｙａｅの１６Ｓ  ｒＤＮＡに対し最も高い相同性を示した。分子系統樹上でもＡＪ１１０３７２株の１６Ｓ  ｒＤＮＡはＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｙａｎｏｉｋｕｙａｅの１６Ｓ  ｒＤＮＡが形成するクラスター内に含まれ、ＡＪ１１０３７２株をＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．と推定した。
【００４５】
ＡＪ１１０３７１株（Ｃ２４株、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５５）は、以下の分類実験の結果、上述のＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．であることが同定された。
ＡＪ１１０３７１株のゲノムＤＮＡよりＰＣＲにより１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）のうち、５’末端側約５００ｂｐの領域を増幅し、塩基配列を決定した（配列番号１８）。得られた配列の相同性解析を、ＭｉｃｒｏＳｅｑ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ５００  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｖ．００２３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）をデータベースとし、ＭｉｃｒｏＳｅｑ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖ．１．４．１．を用いて解析した。その結果、ＡＪ１１０３７１株１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列と一致する既知配列は存在せず、相同率９５．２１％でＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍの１６Ｓ  ｒＤＮＡに対し最も高い相同性を示した。分子系統樹上でもＡＪ１１０３７１株の１６Ｓ  ｒＤＮＡはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａの１６Ｓ  ｒＤＮＡが形成するクラスター内に含まれた。また、表３に示す菌学的性質についても上記１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列解析結果と矛盾するものではなく、ＡＪ１１０３７１株をＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．と推定した。
【００４６】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３２９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２７）の菌学的性質は、以下の表２に記載の通りである。
【表２】
2006204285.tif 000012
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３７１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１５５）の菌学的性質は、以下の表３に記載の通りである。
【表３】
2006204285.tif 000013
参考文献および使用キット
１）ＢＡＲＲＯＷ，（Ｇ．Ｉ．）ａｎｄ  ＦＥＬＴＨＡＭ，（Ｒ．Ｋ．Ａ）：Ｃｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉａ．  ３rd  ｅｄｉｔｉｏｎ．１９９３，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．
２）坂崎利一・吉崎悦郎・三木寛二：新細菌培地学講座・下〈第二版〉．１９８８，近大出版，東京．
３）細菌同定キットＡＰＩ２０，ＮＥ，
（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ．ｆｒ／ｈｏｍｅ＿ｅｎ．ｈｔｍ）．
【００４７】
（ｃ）アルドラーゼ活性を有する微生物の培養方法
アルドラーゼの取得源となる微生物の培養形態は液体培養、固体培養いずれも可能であるが、工業的に有利な方法は、深部通気撹拌培養法である。栄養培地の栄養源としては、微生物培養に通常用いられる炭素源、窒素源、無機塩及びその他の微量栄養源を使用できる。使用菌株が利用できる栄養源であればすべてを使用できる。
【００４８】
通気条件としては、好気条件を採用する。培養温度としては、菌が発育し、アルドラーゼが生産される範囲であれば良い。従って、厳密な条件は無いが、通常１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃である。培養時間は、その他の培養条件に応じて変化する。例えば、アルドラーゼが最も生産される時間まで培養すれば良く、通常５時間〜７日間、好ましくは１０時間〜３日間程度である。
【００４９】
（ｄ）微生物からのアルドラーゼの取得方法
アルドラーゼ活性を有する微生物を培養した後、菌体を遠心分離（たとえば、１０，０００ｘｇ、１０分）により集菌する。アルドラーゼの大部分は菌体中に存在するので、この菌体を破砕、又は溶菌させることにより、アルドラーゼの可溶化を行う。菌体破砕には、超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方法を用いることができ、また溶菌させる場合には、卵白リゾチームや、ペプチダーゼ処理又はこれらを適宜組み合わせた方法が用いられる。
【００５０】
アルドラーゼ産生菌由来のアルドラーゼを精製する場合、酵素可溶化液を出発材料として精製することになるが、未破砕あるいは未溶菌残渣が存在するようであれば、可溶化液を再度遠心分離操作に供し、沈殿する残渣を除いた方が、精製に有利である。
【００５１】
アルドラーゼの精製には、通常酵素の精製を行うために用いられる全ての常法、例えば硫安塩析法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等を採用することができる。その結果、より比活性が高いアルドラーゼ含有画分を得ることができる。
【００５２】
精製されたアルドラーゼ標品を調製した後、エドマン分解法（Ｅｄｍａｎ，Ｐ．，Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．４，２２７（１９５０））によるプロテインシーケンサーに供することによって、Ｎ末端アミノ酸配列を知ることが出来る。さらに、ペプチダーゼ処理を施した後、逆相ＨＰＬＣによりペプチド標品を分取精製し、エドマン分解法によるプロテインシーケンサーに供することによって、内部アミノ酸配列を知ることが出来る。
【００５３】
明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、これをコードするＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮＡの塩基配列を演繹するには、ユニバーサルコドンを採用することが出来る。
【００５４】
演繹された塩基配列に基づいて、３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を合成する方法はＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２，１８５９（１９８１）に開示されている。また、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のシンセサイザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分子は、アルドラーゼをコードするＤＮＡ全長を、アルドラーゼ産生菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する際に、プローブとして利用できる。あるいは、本発明のアルドラーゼをコードするＤＮＡをＰＣＲ法で増幅する際に、プライマーとして利用できる。ただし、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡはアルドラーゼをコードするＤＮＡ全長を含んでいない場合もあるので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡをプローブとして用いて、アルドラーゼをコードするＤＮＡ全長をアルドラーゼ産生菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する。
【００５５】
ＰＣＲ法の操作については、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．５，１８５（１９８９）等に記載されている。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
【００５６】
単離されたアルドラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（１９８５）に記載されている。また、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定することができる。
【００５７】
アルドラーゼ産生菌よりアルドラーゼをコードするＤＮＡを取得する方法としては、本発明のアルドラーゼをコードするＤＮＡの全長あるいは、部分配列をプローブとしてハイブリダイズするＤＮＡを取得する方法も挙げられる。
【００５８】
アルドラーゼ産生菌よりアルドラーゼをコードするＤＮＡを取得する方法としては、本発明のアルドラーゼのアミノ酸配列をアライメントすることによって、保存性の高いアミノ酸部分から演繹されるＤＮＡ配列をプローブＤＮＡとして利用することが出来る。もしくはＰＣＲ法のプライマーとして利用することが出来る。ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡはアルドラーゼをコードするＤＮＡ全長を含まない場合があるので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡをプローブとして用いて、アルドラーゼをコードするＤＮＡ全長をアルドラーゼ産生菌染色体遺伝子ライブラリーから単離することが出来る。
このようにして、アルドラーゼ活性を有する微生物を取得し、取得された微生物からアルドラーゼ及びアルドラーゼをコードするＤＮＡを取得することが出来る。
【００５９】
（ｉｉ）アルドラーゼ
本発明者らは、上記スクリーニング方法により選択された、Ｃ７７株（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３２９株）より、アルドラーゼを取得し、ＳｐＡＬＤと命名した。前述の方法によって特定された本発明のＳｐＡＬＤをコードするＤＮＡを配列表の配列番号１（ＣＤＳ：塩基番号２１０〜１００４）、ＳｐＡＬＤのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００６０】
本発明者らは更に微生物スクリーニングを実施し（実施例において詳述する）、配列番号１記載の塩基配列の一部をプローブとしたサザン解析、コロニーハイブリダイゼーションにより、Ｃ４３株（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３７２株）及びＣ２４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３７１株）から新規なアルドラーゼ遺伝子を取得し（配列番号１２及び１４）、配列番号１３のアミノ酸配列を有するタンパク質（ＳｐＡＬＤ２）及び配列番号１５のアミノ酸配列を有するタンパク質（ＢｕＡＬＤ）を得た。ＳｐＡＬＤ、ＳｐＡＬＤ２、ＢｕＡＬＤの配列を比較した結果を図１に示す。３種のアルドラーゼに共通するアルドラーゼのコア配列（配列番号２３）を図中の上段に示した。３種のアルドラーゼに共通するアミノ酸残基数は２００個存在し全体の７０．２％を占め、更に、３種のアルドラーゼ中２種に共通するアミノ酸残基は７６残基存在し、コア配列と合わせた合計は実に全体の９６．８％を占める。また、ＳｐＡＬＤ／ＳｐＡＬＤ２間の相同性は８８．４％、ＳｐＡＬＤ／ＢｕＡＬＤ間の相同性は７４．７％である。
【００６１】
更に、その他公知の配列との相同性を調査した結果、配列表の配列番号２のアミノ酸配列は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｃ株由来の２，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔ−２−ｅｎｅ−１，７−ｄｉｏｉｃ  ａｃｉｄ  ａｌｄｏｌａｓｅ  （ＨｐｃＨ）（Ｓｔｒｉｎｇｆｅｌｌｏｗ  ＪＭら、Ｇｅｎｅ．  １９９５  １６６（１）：７３−６）と２０％の相同性を有している。その他では、既知のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ細菌由来のＩＨＯＧ  ａｌｄｏｌａｓｅ（遺伝子名ＰｔＡＬＤ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ細菌由来のＩＨＯＧ  ａｌｄｏｌａｓｅ（遺伝子名ＰｃＡＬＤ）（国際公開第０３／０５６０２６号パンフレット）、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｅｒｏｎｉ  ＡＴＣＣ４９２４９由来の４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（遺伝子名ｐｒｏＡ）、あるいはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｒａｍｉｎｅａ由来の４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（遺伝子名ｐｒｏＡ）とは、いずれも１０％以下と、ほとんど相同性が無く、本発明等が見出したアルドラーゼが極めて新規なタンパク質であることがわかる。本発明者らが見出した３種のアルドラーゼもまた、本発明の一部を構成し、以下総称して「本発明のアルドラーゼ」ということがある。
【００６２】
なお、ここでの相同性の解析は、遺伝子解析ソフト「Ｇｅｎｅｔｙｘ  ｖｅｒ．６」（ゲネティクス社）を用い、パラメータを初期設定値として算出した値である。
【００６３】
従って、配列番号２記載のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは７４％以上、更に好ましくは８０％以上、とりわけ好ましくは８５％以上、極めて好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質は、いずれも、同様の酵素活性を有するものであって、本発明に用いることが出来る。更に、配列番号２記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ、配列番号２３記載のアルドラーゼのコア配列を有するタンパク質であれば、極めて好適に用いることが出来る。
【００６４】
従って、本発明の製造方法に用いる、４Ｒ−アルドラーゼ活性を有するタンパク質としては、本発明のアルドラーゼを含み、好ましくは、下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質が挙げられる。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列と少なくとも相同性が７０％以上であって、４Ｒ−アルドラーゼ活性を有するタンパク質
更に、上記（ｂ）のタンパク質としては、以下の（ｃ）のタンパク質も含まれる。
（ｃ）配列番号１３又は１５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
【００６５】
また、本発明のアルドラーゼとしては、以下のタンパク質が含まれる。
（ｄ）配列番号２、１３又は１５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号２、１３又は１５のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質
【００６６】
ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、アルドラーゼ活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、１〜９０個、好ましくは１〜７５個、さらに好ましくは１〜５７個、とりわけ好ましくは１〜４３個、極めて好ましくは１〜１５個である。ただし、配列表の配列番号２、１１又は１３のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列の場合には、３３℃、ｐＨ９の条件下で配列表の配列番号２、１１又は１３のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上のアルドラーゼ活性、好ましくは４Ｒ−アルドラーゼ活性をそれぞれ保持していることが望ましい。
【００６７】
上記のような置換、欠失、挿入又は付加は、アルドラーゼ活性が維持されるような保存的変異が含まれる。保存的変異は、代表的には保存的置換である。アルドラーゼの元々のアミノ酸を置換し、かつ、保存的置換とみなされるアミノ酸としては、ＡｌａからＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐへの置換、及び、ＶａｌからＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が挙げられる。
【００６８】
ここに、アルドラーゼ活性とは、本発明の製造方法において用いられる場合は前記の４Ｒ−アルドラーゼ活性をいい、本発明のアルドラーゼ（タンパク質）の性質としては、光学選択性を厳密に要求するものではないが、４Ｒ−アルドラーゼ活性がより好ましい。以下、「アルドラーゼ活性」の用語を用いる場合において、本発明の製造方法に用いる場合は４Ｒ−アルドラーゼ活性を指し、前記（１）反応の項で述べたように、インドールピルビン酸と、ピルビン酸又はオキサロ酢酸とのアルドール縮合により、４Ｒ−ＩＨＯＧを優先的に生成する反応を触媒できる活性である。ここに、「４Ｒ−ＩＨＯＧを優先的に」生成するとは、生成されるＩＨＯＧの４位の光学純度がＲ体となる比率がＳ体となる比率よりも高いことを指し、好ましくは光学純度７０％以上、特に好ましくは９０％以上でＲ体となる反応効率を達成し得ることを指す。一方、「アルドラーゼ活性」が、本発明のタンパク質の活性を意味する場合は、光学選択性を要求しないアルドラーゼ活性を意味し、光学選択性を要求しないアルドラーゼ活性とは、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）からＩＨＯＧを合成する活性を意味し、光学選択性を問わない。光学選択性の程度を問わず、本発明のアルドラーゼは有用だからである。
【００６９】
次に、精製されたＳｐＡＬＤ，ＢｕＡＬＤについて調べた酵素化学的性質を以下に述べる。
ＳｐＡＬＤ及びＢｕＡＬＤは、インドールピルビン酸と、ピルビン酸又はオキサロ酢酸とを反応せしめることにより、４Ｒ−ＩＨＯＧを優先的に製造する反応を触媒する。
【００７０】
ＳｐＡＬＤの至適ｐＨは、３７℃において、約７．１−８．０付近にある。また、ｐＨ８以下でｐＨ安定性を有する。また、５０℃以下で温度安定性を有し、特に３０℃以下の範囲内で高い温度安定性を有する。
【００７１】
ＳｐＡＬＤの分子量をゲル濾過法により測定したところ約１５５ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定したところ約３０ｋＤａであったことから、ＳｐＡＬＤは、分子量約３０ｋＤａのサブユニット６量体構造をとると推察される。
したがって、本発明のタンパク質の別の様態は、
（Ａ）インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する活性、及び／又は、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する活性を有し、
（Ｂ）（Ａ）記載の活性の至適ｐＨが３７℃において約７．５−８．０であり、
（Ｃ）ｐＨ８以下でｐＨ安定性を有し、
（Ｄ）５０℃以下で温度安定性を有し、かつ、
（Ｅ）ゲルろ過法により測定した分子量が約１５５ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定したサブユニットあたりの分子量が約３０ｋＤａである
ことを特徴とするタンパク質である。
【００７２】
ＢｕＡＬＤの至適ｐＨは、３７℃において、約６．５−７．５付近にある。また、ｐＨ７．５以下でｐＨ安定性を有する。また、３７℃以下で温度安定性を有し、特に３０℃以下の範囲内で高い温度安定性を有する。
【００７３】
ＢｕＡＬＤの分子量をゲル濾過法により測定したところ約１６０ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定したところ約３０ｋＤａであったことから、ＢｕＡＬＤは、分子量約３０ｋＤａのサブユニット６量体構造をとると推察される。
従って、本発明のタンパク質の別の態様は、
（Ａ）インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する活性、及び／又は、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する活性を有し、
（Ｂ）（Ａ）記載の活性の至適ｐＨが３７℃において約６．５−７．５であり、
（Ｃ）ｐＨ８．５以下でｐＨ安定性を有し、
（Ｄ）３７℃以下で温度安定性を有し、かつ、
（Ｅ）ゲルろ過法により測定した分子量が約１６０ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定したサブユニットあたりの分子量が約３０ｋＤａである
ことを特徴とするタンパク質である。
【００７４】
なお、ここで、数値に付された「約」という用語は、その数値の２０％の偏差範囲を含み得ることを示し、許容される偏差としてより好ましくは１０％、さらに好ましくは５％、さらに好ましくは２．５％を示すものである。
【００７５】
（ｉｉｉ）アルドラーゼをコードするＤＮＡ
本発明者らは、前記（ｉ）（ｉｉ）記載の通り、本発明者らが単離したアルドラーゼ産生菌であるＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３２９株（Ｃ７７株）より、配列表の配列番号１の塩基配列を有する本発明のアルドラーゼ遺伝子、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３７２株（Ｃ４３株）より、配列番号１２の塩基配列を有する本発明のアルドラーゼ遺伝子、及び、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３７１株（Ｃ２４株）より、配列番号１４の塩基配列を有する本発明のアルドラーゼ遺伝子を得た。これらの遺伝子は、本発明の、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）からＩＨＯＧを合成する反応を触媒するアルドラーゼをコードしており、本発明に含有される。
【００７６】
なお、アルドラーゼをコードするＤＮＡは、配列表の配列番号１、１２及び１４に示されるＤＮＡだけではない。すなわち、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）からＩＨＯＧを合成する反応を触媒するアルドラーゼを生成するＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属及びＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属のうち、種及び株ごとに、塩基配列の違いが観察されるはずだからである。
【００７７】
すなわち、配列番号２記載のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは７４％以上、更に好ましくは８０％以上、とりわけ好ましくは８５％以上、極めて好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質であって、アルドラーゼ活性、好ましくは４Ｒ−アルドラーゼ活性を有するタンパク質、又は、配列番号２記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ、配列番号２３記載のアルドラーゼのコア配列を有するタンパク質であって、アルドラーゼ活性、好ましくは４Ｒ−アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば、本発明のＤＮＡに含まれる。
【００７８】
また、本発明のＤＮＡは単離されたアルドラーゼをコードするＤＮＡのみではなく、当然ながら、アルドラーゼ産生菌の染色体ＤＮＡから単離されたアルドラーゼをコードするＤＮＡに人工的に変異を加えたＤＮＡであっても、アルドラーゼをコードする場合には、本発明のＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に用いられるものとして、Ｍｅｔｈｏｄ．  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４（１９８７）に記載されている部位特異的変異導入法が挙げられる。
【００７９】
また、配列表配列番号１、１２又は１４のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、アルドラーゼ活性、好ましくは４Ｒ−アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である３７℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。ここに、「アルドラーゼ活性」又は「４Ｒ−アルドラーゼ活性」とは、前記（ｉｉ）アルドラーゼの項で述べた説明と同義である。ただし、配列表の配列番号１，１２又は１４のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、３３℃、ｐＨ９の条件下で配列表の配列番号２，１３又は１５のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上のアルドラーゼ活性、好ましくは４Ｒ−アルドラーゼ活性をそれぞれ保持していることが望ましい。
【００８０】
さらに、配列表の配列番号１，１２又は１４のいずれかに記載のＤＮＡがコードするアルドラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。すなわち、
（ａ）配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号２１０〜１００４の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１２記載の塩基配列のうち、塩基番号３９９〜１２５３の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号１４記載の塩基配列のうち、塩基番号５３１〜１３８５の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列若しくは同配列中塩基番号２１０〜１００４の塩基配列、配列番号１２記載の塩基配列若しくは同配列中塩基番号３９９〜１２５３の塩基配列、又は配列番号１４記載の塩基配列若しくは同配列中塩基番号５３１〜１３８５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号２、１３又は１５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号２、１３又は１５のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号２、１３又は１５のいずれか記載のアミノ酸配列と７０％以上相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
も本発明のＤＮＡに含まれる。ここで、「１若しくは数個」の意義は、前記（ｉｉ）アルドラーゼの項で述べたものと同じである。
【００８１】
（３）アルドラーゼの製造方法
次に本発明のアルドラーゼの製造方法について説明する。本発明のアルドラーゼの製造方法としては、（ｉ）アルドラーゼ産生菌を微生物培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させる方法と、（ｉｉ）組み換えＤＮＡ技術によりアルドラーゼを生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させる方法の２つがある。（ｉ）については、アルドラーゼ産生菌の取得方法、アルドラーゼ産生菌を微生物培養する方法として、前記（２）（ｉ）の項で述べた。以下に、（ｉｉ）について説明する。
【００８２】
（ｉｉ）組み換えＤＮＡ技術による製法
組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。
【００８３】
図２は、本発明のアルドラーゼの製造工程のフローチャートである。
先ず、本発明のアルドラーゼをコードするＤＮＡを調製する（ステップＳ１）。
次に、調製したＤＮＡをベクターＤＮＡと接続して組み換えＤＮＡを作製し（ステップＳ２）、該組み換えＤＮＡによって細胞を形質転換して形質転換体を作製する（ステップＳ３）。続いて、該形質転換体を培地中で培養し、培地中及び／又は細胞中にアルドラーゼを生成蓄積させる（ステップＳ４）。
その後、ステップＳ５に進み、該酵素を回収・精製することによって精製アルドラーゼを製造する。
また、ステップＳ５で生産した精製アルドラーゼ又はステップＳ４のアルドラーゼが蓄積された培地及び／又は細胞をアルドール反応に用いることで、目的とする光学活性ＩＨＯＧを大量に製造することができる（ステップＳ６）。
【００８４】
なお、ベクターＤＮＡと接続されるＤＮＡは、本発明のアルドラーゼが発現可能であればよい。
【００８５】
ここで、ベクターＤＮＡに接続されるアルドラーゼ遺伝子としては、上述の（２）アルドラーゼ（ｉｉｉ）ＤＮＡの項に記載したいずれのＤＮＡをも用いることが出来る。
【００８６】
タンパクを組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、該タンパクを生産する形質転換体内で該タンパクが会合し、タンパクの封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を形成させることが好ましい。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点及び目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
【００８７】
このようにして得られるタンパク封入体は、タンパク変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパクに変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
【００８８】
タンパク封入体から活性型タンパクを得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパクを生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパクを菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
【００８９】
目的タンパクを封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパクを単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパクとの融合タンパクとして発現させる方法がある。
【００９０】
さらに、融合タンパクとして発現させた後に、目的のタンパクを切り出すため、制限プロテアーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効である。
【００９１】
タンパクを組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができる。宿主−ベクター系が開発されている細菌細胞としてはエシェリヒア属細菌、シュードモナス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、バチルス属細菌などが挙げられるが、好ましくはエシェリヒア・コリが用いられる。エシェリヒア・コリを用いてタンパクを大量生産する技術について数多くの知見があるためである。以下、形質転換された大腸菌を用いてアルドラーゼを製造する方法を説明する。
【００９２】
アルドラーゼをコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。
【００９３】
アルドラーゼを融合タンパク封入体として生産させるためには、アルドラーゼ遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク遺伝子とする。このような他のタンパクをコードする遺伝子としては、融合タンパクの蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパクの溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ１０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
【００９４】
これらの遺伝子とアルドラーゼをコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
【００９５】
アルドラーゼ又はアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクをコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、Ｃｏｌ  Ｅ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミド、あるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
【００９６】
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
【００９７】
プロモータ、アルドラーゼ又はアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクをコードする遺伝子、ターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得る。
【００９８】
該組み換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、アルドラーゼ又はアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクが発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、特にエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（ＤＥ３）株、ＪＭ１０９株が好ましい。形質転換を行う方法、及び形質転換体を選別する方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている。
【００９９】
融合タンパクとして発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、アルドラーゼ内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてアルドラーゼを切り出せるようにしてもよい。
【０１００】
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
【０１０１】
アルドラーゼ又はアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクを回収するには、以下の方法などがある。アルドラーゼあるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりアルドラーゼあるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、アルドラーゼあるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
【０１０２】
タンパク封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパクとともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
【０１０３】
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパクとして再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
【０１０４】
再生工程時のタンパク濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したアルドラーゼが自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
【０１０５】
アルドラーゼをコードするＤＮＡとして、配列表配列番号１，１２又は１４に示されるＤＮＡを用いた場合には配列番号２，１３又は１５に記載のアミノ酸配列を有するアルドラーゼがそれぞれ生産される。
【０１０６】
［ＩＩ］光学活性モナティンの製造方法
本発明の光学活性モナティンの製造方法は、［Ｉ］光学活性ＩＨＯＧの製造方法の項に記載した方法により光学活性ＩＨＯＧを製造した後、当該ＩＨＯＧをモナティンに変換する方法である。本発明の方法に従い生産されるＩＨＯＧは、４Ｒ−ＩＨＯＧが優位に生産されているため、本発明において製造されるＩＨＯＧからは、４Ｒ体の光学活性モナティン、すなわち（２Ｒ，４Ｒ）−モナティン及び（２Ｓ，４Ｒ）−モナティンが優位に生成される（以下、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティン及び（２Ｓ，４Ｒ）−モナティンを総称して４Ｒ−モナティンという）。
【０１０７】
モナティンの異性体４種のうち、最も甘味度の高い異性体である（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生産するためには、４Ｒ体リッチなＩＨＯＧを用いることが好ましい。この場合、ＩＨＯＧの全体量に対する４Ｒ−ＩＨＯＧの割合が、５５％超となることが好ましく、より好ましくは、６０％超、さらに好ましくは７０％超、特に好ましくは８０％超である。
【０１０８】
ＩＨＯＧをモナティンに変換する方法は特に限定されず、化学反応法、酵素法等の公知の方法を用いることができる。
【０１０９】
（１）化学反応法
化学反応法によって光学活性ＩＨＯＧから光学活性モナティンを製造する方法としては、光学活性ＩＨＯＧをオキシム化し、対応する下記式（４）記載のＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ又はその塩を化学的に還元して光学活性モナティンを生成する方法を挙げることができる。
【化１０】
2006204285.tif 000014
【０１１０】
好ましくは、４Ｒ体リッチなＩＨＯＧをオキシム化し、この４Ｒ体リッチなＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅを含有する溶液から晶析によって４Ｒ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ又はその塩を単離し、この４Ｒ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ又はその塩を化学的に還元して４Ｒ−モナティンを生成する。
【０１１１】
ＩＨＯＧのオキシム化は、中性又はアルカリ性条件下において、ＩＨＯＧと、下記一般式（３）
【化１１】
2006204285.tif 000015
（上記一般式（３）において、Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。）
に表されるアミン化合物又はその塩とを反応せしめることによって行う。ここに、Ｒがアルキル基、アリール基又はアラルキル基である場合、Ｒは炭素原子を１〜３有するアルキル基、又は、側鎖に置換基を有していてもよいアリール基又はアラルキル基が好ましく、結晶化の観点からより好ましくは、Ｒはメチル基、エチル基、ベンジル基から選択される。
【０１１２】
このオキシム化反応は、ＩＨＯＧを含むアルドラーゼ反応液に、直接上記一般式（３）のアミンを添加することによって行うことができる。この４Ｒ体リッチなＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅを含有する溶液から、４Ｒ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ又はその塩を晶析することによって、４Ｒ体を単離することができる。晶析溶媒としては、水、アルコール溶媒又は含水アルコール溶媒を用いることが好ましい。
【０１１３】
晶析によって得られた４Ｒ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ又はその塩を還元することによって４Ｒ−モナティンを得ることができる。４Ｒ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ又はその塩の還元は、水素及び水素添加触媒の存在下で実施する。水素添加触媒としては、シリカ、アルミナ、チタニア、マグネシア、ジルコニア、活性炭などの担体に、白金、ロジウム、パラジウム、ニッケル、コバルトなどの金属触媒を担持させた金属担持触媒を用いることが好ましい。
【０１１４】
従来は、光学活性ＩＨＯＧを効率的に生成させることができなかったため、ラセミ体のＩＨＯＧ（４Ｒ、４Ｓ−ＩＨＯＧ）から４Ｒ−ＩＨＯＧを単離するには、４Ｒ、４Ｓ−ＩＨＯＧをオキシム化した後、キラルアミンを作用させて４Ｒ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅを晶析させる必要があった。これに対し、本発明によれば、アルドール縮合反応の段階で４Ｒ体リッチなＩＨＯＧを生成させることができるため、晶析の際、キラルアミンを用いて光学分割する必要がなく、４Ｒ体リッチなＩＨＯＧをオキシム化した後、そのまま４Ｒ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅを晶析させることができる。したがって、４Ｒ−ＩＨＯＧの精製処理プロセスに要するコストを軽減することが可能となる。
【０１１５】
化学的還元法によって得られる４Ｒ−モナティンは、（２Ｒ、４Ｒ）−モナティン及び（２Ｓ、４Ｒ）−モナティンのラセミ混合物となる。（２Ｒ、４Ｒ）−モナティンを単離する場合は、晶析によって（２Ｒ、４Ｒ）−モナティンを析出させればよい。具体的には国際公開第０３／０５９８６５号パンフレットに記載の方法を用いることが出来る。
【０１１６】
（２）酵素法
酵素法によって４Ｒ−ＩＨＯＧから４Ｒ−モナティンを製造する場合、４Ｒ−ＩＨＯＧの２位をアミノ化する反応を触媒する酵素の存在下で４Ｒ−ＩＨＯＧをアミノ化すればよい。当該反応を触媒する酵素としては、例えば４Ｒ−ＩＨＯＧに対してアミノ基転移反応を触媒するアミノトランスフェラーゼ、また、４Ｒ−ＩＨＯＧの還元的アミノ化反応を触媒するデヒドロゲナーゼ等を例示することができるが、アミノトランスフェラーゼを用いることがより好ましい。
【０１１７】
アミノトランスフェラーゼを用いる場合、アミノトランスフェラーゼ及びアミノ基供与体の存在下で、４Ｒ−ＩＨＯＧを反応させることによって、４Ｒ−モナティンを生成することができる。具体的には、国際公開第０３／０５６０２６号パンフレットに記載の方法を用いることが出来る。
【０１１８】
この際、アミノトランスフェラーゼとしてはＬ−アミノトランスフェラーゼ及びＤ−アミノトランスフェラーゼのいずれも使用することが可能である。Ｌ−アミノトランスフェラーゼを用いた場合は、ＩＨＯＧの２位にＬ−アミノ酸のアミノ基を転移することによって２Ｓ−モナティンを選択的に生成することができる。また、Ｄ−アミノトランスフェラーゼを用いた場合は、ＩＨＯＧの２位にＤ−アミノ酸のアミノ基を転移することによって２Ｒ−モナティンを選択的に生成することができる。したがって、甘味度の高い（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを選択的に生成するには、Ｄ−アミノトランスフェラーゼを用いて、４Ｒ−ＩＨＯＧを反応させることが好ましい。
アミノトランスフェラーゼを用いてモナティンを生成させる反応は、上記のアルドール縮合を行った後に生成した４Ｒ−ＩＨＯＧを一旦単離精製してから行ってもよいし、アルドラーゼとアミノトランスフェラーゼを共存させて同一系内で反応を実施してもよい。同一系内で反応を実施する場合、アルドラーゼをコードするＤＮＡとアミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを共発現する微生物を用いてもよく、また、別途酵素を調製し、反応系内に添加することでもよい。アルドラーゼをコードするＤＮＡとアミノトランスフェラーゼをコードしているＤＮＡを共発現する微生物（宿主細胞）は、上記したようなアルドラーゼをコードするＤＮＡを機能的に含有する発現ベクターとアミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを機能的に含有する発現ベクターとの共形質導入やアルドラーゼをコードするＤＮＡとアミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡとを、宿主細胞内で活性を有した状態で発現し得るような形態で含有する発現ベクターによる形質転換等によって調製することができる。
【実施例】
【０１１９】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、実施例において、基質として用いたＩＨＯＧ、ＰＨＯＧ及び（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンは、参考例１、２及び３に記載の方法により合成したものである。
【０１２０】
なお、本実施例におけるＩＨＯＧ及びＰＨＯＧの定量はジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２  」（５μｍ，  ４．６×２５０ｍｍ）を利用したＨＰＬＣ分析を用いて行った。分析条件は、以下に示す通りである。
移動相：４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／５ｍＭ  リン酸二水素テトラブチルアンモニウム溶液
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
また、生成したＩＨＯＧあるいはＰＨＯＧの４位の不斉の解析は、ジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３」（５μｍ，４．６×１６０ｍｍ）と住化分析センター製「ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−７１００」（５μｍ，４．６×２５０ｍｍ）を順に直結したＨＰＬＣ分析にて解析した。分析条件は、以下に示すとおりである。
移動相Ａ：５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
移動相Ｂ：５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
０〜９０分まで移動相Ａで溶出し、９０分〜１２０分まで移動相Ｂで溶出・洗浄
流速：０．４ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：１７℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
【０１２１】
実施例１  自然界からのＩＨＯＧ  アルドラーゼ活性菌の採取
（２Ｒ，４Ｒ）−モナティン（以下ＲＲモナティン）を単一炭素源とした培地を用いて集積培養を行うことにより、４Ｒ−ＩＨＯＧ光学選択的アルドラーゼ活性菌株を自然界より単離・取得した。
【０１２２】
ＲＲモナティン単一Ｃ源培地（ＲＲ−モナティン・１カリウム塩  ０．４ｇ／ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ）０．６７ｇ／ｌ）１ｍｌを含む試験管に土壌試料を接種し、３０℃で７日間振とう培養した。得られた培養液０．１ｍｌを再度ＲＲモナティン単一Ｃ源培地１ｍｌを含む試験管に接種し、再度３０℃で７日間振とう培養した。得られた培養液を滅菌生理食塩水で適宜希釈した後に、ＣＭ２Ｇ平板培地（グルコース  ５ｇ／ｌ、酵母エキス  １０ｇ／ｌ、ペプトン  １０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、寒天末２０ｇ／ｌ（ｐＨ７．０））に塗布し、３０℃で２４時間培養してコロニーを単離した。
【０１２３】
集積により得られた菌株からアルドラーゼ活性株を選抜した。ブイヨン平板培地（栄研化学）に供試微生物を接種し、３０℃で２４時間培養した。これを酵素生産培地（グリセロール  ５ｇ／ｌ、フマル酸  ５ｇ／ｌ、酵母エキス  ３ｇ／ｌ、ペプトン  ２ｇ／ｌ、硫安  ３ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4  ３ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4  １ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．５ｇ／ｌ、フタル酸ナトリウム  ２．５ｇ／ｌ、寒天末  ２０ｇ／ｌ（ｐＨ６．５））を含むプレートに接種し、３０℃で２４時間培養した。得られた菌体を湿菌体重量で約１％（ｗ／ｖ）となるように、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＰＨＯＧ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  リン酸カリウム溶液（ＫＰｉ）、１％（ｖ／ｖ）トルエンからなる反応液に接種し、３０℃で２４時間反応させた。該反応液中の遊離ピルビン酸濃度はｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｅ（ＬＤＨ）を用いた酵素法にて定量した。１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＮＡＤＨ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２５Ｕ／ｍｌ  ＬＤＨからなる反応液２００μｌにサンプル１０μｌを添加し、３０℃で１０分間インキュベートした。反応後の３４０ｎｍの吸光度を測定し、ＮＡＤＨの減少量からサンプル中のピルビン酸量を定量した。
【０１２４】
また生成フェニルピルビン酸量はジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２」（５μｍ，４．６×２５０ｍｍ）を利用したＨＰＬＣ分析にて定量した。分析条件は、以下に示す通りである。
移動相：２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ  ２１０ｎｍ
本条件により、ＰＨＯＧは約９．８分に、フェニルピルビン酸は約１２分の保持時間に溶出され、それぞれ分別、定量できた。
【０１２５】
供試菌体添加区においてＰＨＯＧより生成したピルビン酸ないしフェニルピルビン酸量より対照区（菌体無添加区）の生成量を差し引いた値をアルドラーゼによる生成量とした。その結果、ＰＨＯＧを基質としたアルドラーゼ活性菌株を見出した。
【０１２６】
次に採取したアルドラーゼ活性菌株を用いてＩＨＯＧ合成反応を実施した。供試菌株を酵素生産培地（グリセロール  ５ｇ／ｌ、フマル酸  ５ｇ／ｌ、酵母エキス  ３ｇ／ｌ、ペプトン  ２ｇ／ｌ、硫安  ３ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4  ３ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4   １ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．５ｇ／ｌ、フタル酸ナトリウム  ２．５ｇ／ｌ（ｐＨ６．５））を３ｍｌを含む試験管に接種し、３０℃で１６時間培養した。得られた菌体を湿菌体重量で約１％（ｗ／ｖ）となるように、下記のＩＨＯＧ合成反応溶液に懸濁して反応を行った。
【０１２７】
ＩＨＯＧ合成反応溶液：１００  ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５），３００ｍＭインドールピルビン酸，７５０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム，  １ｍＭ  ＭｇＣｌ2，  ５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）
【０１２８】
反応液を３７℃で１６時間インキュベートした後に、生成したＩＨＯＧを定量し、さらに反応生成物の４位の不斉についても解析した。その結果、集積菌Ｃ７７株において表４に示す通り、４Ｒ−ＩＨＯＧ優先的なアルドール縮合活性を見出した。
【０１２９】
【表４】
2006204285.tif 000016
【０１３０】
実施例２  Ｃ７７株（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３２９株）由来ＩＨＯＧアルドラーゼ（ＳｐＡＬＤ）の精製
Ｃ７７株（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３２９株）の可溶性画分からＩＨＯＧアルドラーゼの精製を以下の通り行った。アルドラーゼ活性測定は、ＰＨＯＧを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。
反応条件：５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ  ＰＨＯＧ、０．２５ｍＭ  ＮＡＤＨ、０．２ｍＭ  ＫＰｉ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１６Ｕ／ｍｌ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、３μｌ酵素／６００μｌ反応液、３０℃、３４０ｎｍの吸光度を測定。
【０１３１】
（１）可溶性画分の調製
ブイヨン平板培地で３０℃、２４時間培養したＣ７７株（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３２９株）菌体を一白金耳かきとり、５０ｍｌの酵素生産培地（５ｇ／ｌ  グリセロール、５ｇ／ｌ  フマル酸、５  ｇ／ｌ  硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4、１ｇ／ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、３ｇ／ｌ、酵母エキス、２ｇ／ｌ  ペプトン、２．５ｇ／ｌ  フタル酸ナトリウム、（Ｓｉｇｍａ社製）、ｐＨ６．５にＫＯＨで調整）を含む５００ｍｌ容フラスコに接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。該培養液０．５ｍｌを酵素生産培地５０ｍｌを含む５００ｍｌ容フラスコ２０本に接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６））に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。得られた洗浄菌体を８０ｍｌのバッファーＡに懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離（ｘ８０００ｒｐｍ、１０分間×２回）により菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。
【０１３２】
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー：Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ
上記の可溶性画分４０ｍｌをバッファーＡで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ  ２６／１０（ファルマシア社製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をバッファーＡを用いて洗い流した後、ＫＣｌ濃度を０Ｍから０．７Ｍまで直線的に変化させて（ｔｏｔａｌ  １４０ｍｌ）吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分についてＰＨＯＧアルドラーゼ活性を検出したところ、約０．４Ｍ相当の画分にＰＨＯＧアルドラーゼ活性のピークを検出した。同様のクロマト操作を２度繰り返して実施した。
【０１３３】
（３）疎水性クロマトグラフィー：Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ＨＲ  １６／１０
アルドラーゼ活性が検出された溶液をバッファーＢ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．６）に対して４℃で一晩透析し０．４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液を、バッファーＢで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ＨＲ  １６／１０（ファルマシア社製）に供した。この操作によりアルドラーゼは担体に吸着した。
担体に吸着しなかった非吸着タンパク質をバッファーＢを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍから０Ｍまで直線的に変化させてアルドラーゼを溶出させた。得られた各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、硫酸アンモニウム濃度がおよそ０．４〜０．５Ｍの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
【０１３４】
（４）ゲルろ過クロマトグラフィー：Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００  ＨＰ  １６／６０
アルドラーゼを含む画分をそれぞれ集めて、バッファーＡに対して透析し、０．４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液を、限外ろ過膜ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、バッファーＣ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ，０．１Ｍ  ＫＣｌ，ｐＨ７．６）で平衡化されたゲルろ過Ｓｅｐｈａｄｅｘ２００  ＨＰ  １６／６０（ファルマシア社製）に供し、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出した。この操作によりアルドラーゼは６６ｍｌ付近の画分に溶出された。活性のピークの溶出位置より、該アルドラーゼの分子量は約１５５ｋＤａと見積もられた。
【０１３５】
（５）陰イオン交換クロマトグラフィー：Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ５／５
得られた画分を０．４５μｍのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、バッファーＡで平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーカラム  Ｍｏｎｏ−Ｑ  ＨＲ  ５／５（ファルマシア社製）に供した。この操作により、アルドラーゼは担体に吸着した。バッファーＡにより非吸着タンパク質を洗い流した後、ＫＣｌ濃度を直線的に０ｍＭから７００ｍＭへ変化させてタンパク質の溶出をおこなった（Ｔｏｔａｌ  ２４ｍｌ）。各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、ＫＣｌ濃度が約０．４Ｍの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、活性画分には１０本程度のバンドが認められた。その中で、活性プロフィールとＳＤＳ−ＰＡＧＥバンド強度のプロフィールが一致する約３０ｋＤａのバンドが存在し、当該バンドをアルドラーゼの候補としてＳＤＳ−ＰＡＧＥから切り出し、アミノ酸配列解析に供した。
【０１３６】
【表５】
2006204285.tif 000017
【０１３７】
実施例３  ＩＨＯＧ  ａｌｄｏｌａｓｅの内部アミノ酸配列の決定
精製したアルドラーゼ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、３０ｋＤａに相当するバンドを切り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の試料をトリプシン処理し（ｐＨ８．５、３５℃、２０時間）、逆相ＨＰＬＣに供して断片ペプチドを分離した。分取したフラクションのうち、２つのフラクションについてそれぞれ１７残基、１２残基分のアミノ酸配列（配列番号３、４）を下記表６の通り決定した。
【０１３８】
【表６】
2006204285.tif 000018
【０１３９】
実施例４  Ｃ７７株（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３２９株）由来ＩＨＯＧアルドラーゼ遺伝子のクローニング
（１）染色体ＤＮＡの調製
Ｃ７７株（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３２９株）を５０ｍｌのＣＭ２Ｇ培地を用いて３０℃で一晩培養した（前培養）。この培養液５ｍｌを種菌として、５０ｍｌのブイヨン培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２０００ｘｇ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体ＤＮＡを調製した。
【０１４０】
（２）ＰＣＲによる内部配列の取得
決定したＩＨＯＧアルドラーゼの内部アミノ酸配列をもとに、表７記載のミックスプライマー（配列番号５、６）を合成した。
【０１４１】
【表７】
2006204285.tif 000019
【０１４２】
作製したミックスプライマーを用いて、Ｃ７７株（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３２９株）の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによる増幅を行った。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ＰＥＲＳＯＮＥＬ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて行い、以下の条件で３０サイクル行った。
９４℃  ３０秒
５５℃  ３０秒
７２℃  １分
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約２００ｂｐの断片の増幅が認められた。該ＤＮＡ断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ  （Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングし、塩基配列を決定したところ、取得したＤＮＡ断片から推定されるアミノ酸配列が、ＩＨＯＧアルドラーゼの内部アミノ酸配列と一致しており、目的のアルドラーゼ遺伝子が取得されたことが確認された。
【０１４３】
（３）コロニーハイブリダイゼーションによる全長遺伝子の取得
ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を用いて、サザン解析及びコロニーハイブリダイゼーションによって全長遺伝子の取得を行った。ＤＮＡプローブの作製はＤＩＧＨｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ（ロシュダイアグノスティック社製）を使用して、説明書通りに３７℃でＯ／Ｎインキュベートしてプローブの標識を行った。サザン解析は染色体ＤＮＡ  １μｇを各種制限酵素で完全に消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動したのちに、ナイロンメンブレンにブロッティングし、以下マニュアルに従って行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行い、５０℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブを添加して、Ｏ／Ｎでハイブリダイゼーションさせた。バンドの検出はＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて行った。その結果、該ＰＣＲ断片をプローブとして強くハイブリダイゼーションする約３．２ｋｂｐのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ断片を検出した。次に、このＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ断片をコロニーハイブリダイゼーションにて取得した。染色体ＤＮＡ  ２０μｇをＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩで処理後アガロースゲル電気泳動に供し約３．２ｋｂｐの大きさの断片を回収した。これをｐＵＣ１９に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９にてライブラリーを作製した。コロニーをナイロンメンブレンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマシャム社製）にうつし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂを用いて行った。フィルターをバッファー中に浸し、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、作成した標識プローブを添加し、４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ＳＳＣでの洗浄後、プローブとハイブリダイズするコロニーの検出をＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行った。その結果、プローブと強くハイブリダイゼーションするクローンを取得した。
【０１４４】
取得したクローンより回収したプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定したところ、配列番号１に記載の塩基配列を有することが明らかになった。決定した内部アミノ酸配列に対応する塩基配列（配列番号１にて５１９〜５６９番目、及び、６６６〜７０１番目）を含む８５５  ｂｐのｏｒｆを見出し、目的とするアルドラーゼの全長を取得した。
【０１４５】
実施例５  Ｅ．ｃｏｌｉでのＩＨＯＧアルドラーゼ（ＳｐＡＬＤ）の大量発現
（１）ｔｒｐプロモーター及びｒｒｎＢターミネーター搭載プラスミドｐＴｒｐ４の構築
Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０染色体ＤＮＡ上のｔｒｐオペロンのプロモーター領域を表８に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（配列番号７及び配列番号８の組み合わせ）により目的遺伝子領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からｔｒｐプロモーターの方向がｌａｃプロモーターと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＥｃｏＯ１０９ｉ／ＥｃｏＲＩにて処理して得られるｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９ｉ／ＥｃｏＲＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ１と命名した。次にｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩにて処理し、得られたｒｒｎＢターミネーターを含むＤＮＡ断片とｐＴｒｐ１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ２と命名した。次にｐＴｒｐ２を鋳型として表８に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（配列番号７及び配列番号９の組み合わせ）によりｔｒｐプロモーター領域を増幅した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＯ１０９ｉ／ＮｄｅＩにより処理し、ｐＴｒｐ２のＥｃｏＯ１０９ｉ／ＮｄｅＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐ４と命名した。
【０１４６】
【表８】
2006204285.tif 000020
【０１４７】
（２）アルドラーゼ遺伝子発現プラスミドｐｔｒｐＳｐＡＬＤの構築とＥ．ｃｏｌｉでの発現
表９に示すプライマー（配列番号１０及び１１）を用いてＣ７７株（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３２９株）の染色体ＤＮＡより増幅した断片をＮｄｅＩ／ＰｓｔＩ消化し、ｐＴｒｐ４のＮｄｅＩ／ＰｓｔＩサイトに挿入したプラスミドｐｔｒｐＳｐＡＬＤを構築した。このプラスミドは配列番号１に記載の塩基配列のうち２１０番目のＡＴＧを翻訳開始コドンとして１００４番目まで翻訳することにより得られる、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼ遺伝子を発現する。
【０１４８】
【表９】
2006204285.tif 000021
【０１４９】
構築した発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地５０ｍｌに１白金耳接種し、３７℃で１６時間振盪させた。培養終了後、得られた培養液１ｍｌを集菌、洗浄し、１ｍｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）に懸濁し、超音波破砕にて菌体を破砕した。破砕液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
【０１５０】
該粗酵素液を用いてアルドラーゼ活性を測定した。アルドラーゼ活性測定は、ＰＨＯＧを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。
反応条件：５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ  ＰＨＯＧ、０．２５ｍＭ  ＮＡＤＨ、０．２ｍＭ  ＫＰｉ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１６Ｕ／ｍｌ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、３μｌ酵素／６００μｌ反応液、３０℃、３４０ｎｍの吸光度を測定
測定した結果、ｐＴｒｐ４を導入したＥ．ｃｏｌｉ（コントロール）においてはアルドラーゼ活性は検出されなかったのに対して、ｐｔｒｐＳｐＡＬＤ導入株においては３３．６Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎのアルドラーゼ活性が検出された。これにより、ＳｐＡＬＤ高発現プラスミドの構築と併せて、確かに目的とするアルドラーゼをクローニングしたことも確認できた。
【０１５１】
実施例６  Ｃ７７株（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３２９株）由来アルドラーゼの組み換え酵素の精製
Ｃ７７株（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３２９株）由来アルドラーゼ（ＳｐＡＬＤ）を高発現させたＥ．ｃｏｌｉの可溶性画分から組み換えＳｐＡＬＤの精製を以下の通り行った。アルドラーゼ活性測定は、ＰＨＯＧを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。
反応条件：５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ  ＰＨＯＧ、０．２５ｍＭ  ＮＡＤ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１６Ｕ／ｍｌ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、３μｌ酵素／６００μｌ反応液、３０℃、３４０ｎｍの吸光度を測定
【０１５２】
（１）可溶性画分の調製：
ＬＢ−ａｍｐ平板培地で３７℃、１６時間培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ／  ｐｔｒｐＳｐＡＬＤ菌体を一白金耳かきとり、ＬＢ−ａｍｐ培地５０ｍｌを含む５００ｍｌ容フラスコ１０本に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ，ｐＨ７．６）に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。得られた洗浄菌体を２０ｍｌのバッファーＡに懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離（ｘ８０００ｒｐｍ、１０分間×２回）により菌体残渣を除き、得られた上清を粗抽出画分とした。
【０１５３】
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー：Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ
上記の可溶性画分２０ｍｌをバッファーＡで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ  ２６／１０（ファルマシア社製、ＣＶ＝２０  ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をバッファーＡを用いて洗い流した後、ＫＣｌ濃度を０Ｍから０．７Ｍまで直線的に変化させて（ｔｏｔａｌ  １４０ｍｌ）吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分についてＰＨＯＧアルドラーゼ活性を検出したところ、約０．４Ｍ相当の画分にＰＨＯＧアルドラーゼ活性のピークを検出した。
【０１５４】
（３）疎水性クロマトグラフィー：Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ＨＲ  １６／１０
アルドラーゼ活性が検出された溶液をバッファーＢ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．６）に対して４℃で一晩透析し０．４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液を、バッファーＢで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ＨＲ  １６／１０（ファルマシア社製）に供した。この操作によりアルドラーゼは担体に吸着した。
担体に吸着しなかった非吸着タンパク質をバッファーＢを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍから０Ｍまで直線的変化させてアルドラーゼを溶出させた。得られた各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、硫酸アンモニウム濃度がおよそ０．４〜０．５Ｍの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
【０１５５】
（４）ゲルろ過クロマトグラフィー：Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００  ＨＰ  １６／６０
アルドラーゼを含む画分をそれぞれ集めて、バッファーＡに対して透析し、０．４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液を、限外ろ過膜ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、バッファーＣ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ，０．１Ｍ  ＫＣｌ，ｐＨ７．６）で平衡化されたゲルろ過Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００  ＨＰ  １６／６０（ファルマシア社製）に供し、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出した。この操作によりアルドラーゼは６６ｍｌ付近の画分に溶出された。
【０１５６】
（５）陰イオン交換クロマトグラフィー：Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ５／５
得られた画分を０．４５μｍのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、バッファーＡで平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＭｏｎｏ−Ｑ  ＨＲ  ５／５（ファルマシア社製）に供した。この操作により、アルドラーゼは担体に吸着した。バッファーＡにより非吸着タンパク質を洗い流した後、ＫＣｌ濃度を直線的に０  ｍＭから７００ｍＭへ変化させてタンパク質の溶出をおこなった（Ｔｏｔａｌ  ２４ｍｌ）。各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、ＫＣｌ濃度が約０．４Ｍの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
【０１５７】
以上のカラムクロマト操作により精製した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、約３０ｋＤａに相当する位置にＣＢＢ染色で単一なバンドとして検出された。取得した組み換えＳｐＡＬＤ溶液はバッファーＡに対して４℃で一晩透析した。上記の操作により、４５２Ｕ／ｍｌのＳｐＡＬＤ溶液を１．５ｍｌ取得した。
【０１５８】
実施例７  ＳｐＡＬＤを用いたインドール−３−ピルビン酸とピルビン酸からの４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）の合成
実施例６にて作製したＳｐＡＬＤを酵素源として用いて、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸からの４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）の合成を実施した。１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、３００ｍＭ  インドール−３−ピルビン酸、７５０ｍＭ  ピルビン酸、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2からなる反応液にＳｐＡＬＤを７．９ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で３分間反応させた。酵素反応液を適宜希釈してＨＰＬＣ分析に供し、生成したＩＨＯＧを定量した。その結果、該アルドラーゼによるＩＨＯＧ生成を確認した。当該条件でのＩＨＯＧ合成反応初速度は、４５１Ｕ／ｍｇと見積もられた。
【０１５９】
実施例８  ＳｐＡＬＤの酵素学的諸性質
実施例６で調製したＳｐＡＬＤを用いて、以下に掲げる項目について検討した。
基本測定条件：５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ  ＰＨＯＧ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１６Ｕ／ｍｌ  Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、３０℃にて３４０ｎｍの吸光度の減少を測定。
【０１６０】
（１）ＰＨＯＧを基質とした速度論定数
図３示す結果から、Ｖｍａｘ（ｆｏｒ  ＰＨＯＧ）＝９７９μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、Ｋｍ（ｆｏｒ  ＰＨＯＧ）＝０．６０ｍＭ、Ｋｍ（ｆｏｒ  ＭｇＣｌ2）＝０．０３４ｍＭとそれぞれ決定した。また、ＫＰＢ添加によるアルドラーゼ活性の上昇は認められなかった。
【０１６１】
（２）ｐＨ安定性
ｐＨ３〜１０の範囲におけるｐＨ安定性を測定した。測定に用いた緩衝液は以下の通り。クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３，  ４，  ４．５）、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４，  ４．５，  ５，  ５．５，  ６，  ６．５）、リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６，  ６．５，  ７，  ７．５，  ８，  ８．５）、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨバッファー（ｐＨ７．５，  ８，  ８．５，  ９，  ９．５）、ＣＡＰＳ−ＮＡＯＨバッファー（ｐＨ９，  ９．５，  １０）。ＳｐＡＬＤを１００  ｍＭのそれぞれの緩衝溶液中で３７℃で３０分間インキュベートした残存活性を基本測定条件にて測定した。結果を図４に示す。
【０１６２】
（３）温度安定性
２５℃〜７０℃にて１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）及び１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨバッファー（ｐＨ８．５）中でＳｐＡＬＤを３０分間インキュベートした後、残存活性を基本測定条件にて測定した。結果を図５に示す。
（４）至適ｐＨ
３０℃におけるＰＨＯＧ分解活性を比色法で測定した（図６）。結果、ＰＨＯＧアルドール分解反応の至適ｐＨはｐＨ７．５付近であることが明らかとなった。
また、３００ｍＭ  ＩＰＡと７５０ｍＭ  ピルビン酸を基質としたＩＨＯＧ合成活性をそれぞれのｐＨで測定した（反応条件：１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５），３００ｍＭ  ＩＰＡ，７５０ｍＭ  ＰＡ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ2，３７℃，１６ｈ）。酵素添加区のＩＨＯＧ生成量から酵素無添加区のＩＨＯＧ生成量を差し引いた値を図７に示す。結果、ＳｐＡＬＤによるＩＨＯＧアルドール縮合の至適ｐＨはｐＨ８．０付近であることが明らかとなった。
【０１６３】
実施例９  ＳｐＡＬＤによるＩＨＯＧ合成
ＬＢ−ａｍｐ平板培地で３７℃、１６時間培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐｔｒｐＳｐＡＬＤ菌体を一白金耳かきとり、５０ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地を含む５００ｍｌ容フラスコ１２本に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ，ｐＨ７．６）に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。遠心分離にて調製した菌体（湿菌体重量で約３ｇ）を、以下の組成の反応液３００ｍｌに懸濁した。
ＩＨＯＧ合成反応溶液：５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５），３００ｍＭ  インドールピルビン酸，７５０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム，１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５），（６Ｎ  ＫＯＨにてｐＨ８．５に調整）
菌体を懸濁した反応液にアルゴンガスを通気し、以後、アルゴンガス雰囲気下で反応を実施した。反応は３７℃で攪拌しながら、２０時間行った。反応終了後、遠心分離により除菌してアルドール反応液３００ｍｌを得た。
【０１６４】
実施例１０  アルドール反応液のオキシム化及び４Ｒ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅの単離
実施例９で取得したアルドール反応液に、８Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ値を９に保ちながら、ヒドロキシルアミン塩酸塩１８．８ｇ（２７０ｍｍｏｌ）を加え、２５℃にて３時間１０℃にて一晩攪拌した。得られた反応液中のＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ量をＨＰＬＣ分析にて定量した。その結果、反応液中に２５ｍｍｏｌの４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸（ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ）が生成した。４位の不斉について分析を行ったところ、４Ｒ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅが２１．４ｍｍｏｌ、４Ｓ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅが３．６ｍｍｏｌ生成しており、光学純度７１．３％ｅ．ｅ．で４Ｒ体が優先的に生成していることを確認した。
【０１６５】
濃塩酸を用いて得られた反応液のｐＨ値を２にし、有機物を酢酸エチルで抽出した。有機層を濃縮して残渣を得た。残渣に２８％アンモニア水１２ｍｌ及び水２５ｍｌを添加し、２−プロパノール１３８ｍｌを加えて結晶化を行い、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の２アンモニウム塩９．７６ｇ（湿重量）を結晶として得た。得られた結晶を６０ｍｌの水に溶解させた後に、５０℃にて２−プロパノール５０ｍｌを加え、さらに５０℃にて２−プロパノール１５０ｍｌを３時間かけて滴下した。得られた結晶をろ過し減圧乾燥することによって５．３８ｇ（１５．８ｍｍｏｌ）のＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ・２アンモニウム塩を得た。得られた結晶の４位の不斉について分析を行ったところ、４Ｒ体としての光学純度９９．０％ｅ．ｅ．であり、高純度の４Ｒ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ・アンモニウム塩を２−プロパノールからの晶析により単離・取得することができた。
【０１６６】
実施例１１  ４Ｒ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅの化学的還元による４Ｒ−モナティンの生成
実施例１０で得た（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩５．３８ｇ（１５．８ｍｍｏｌ）を２８％アンモニア水６０ｍｌに溶解し、５％ロジウム炭素（５０％含水品）２．８４ｇを加えて室温にて１ＭＰａの水素圧で反応を行った。１７時間後に触媒を濾過し（０．２ミクロンフィルター）、その濾過液に炭酸カリウム１．０４ｇ（７．５ｍｍｏｌ）を溶解した。その溶解液を濃縮し、得られた濃縮物１５．４ｇにエタノール２０ｍｌを加え２５℃で撹拌し、更にエタノール３０ｍｌを３時間かけて滴下した後、２５℃で１７時間攪拌した。
【０１６７】
得られた湿結晶２．９３ｇを水４ｍｌに溶解し、３５℃にてエタノール８ｍｌを添加した後、更に３５℃にてエタノール１７ｍｌを３時間かけて滴下した。このエタノール溶液を１０℃まで４時間かけて冷却した後、１０℃で１時間攪拌した。得られた湿結晶２．３０ｇを減圧乾燥し、目的とする（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンのＫ塩１．９９ｇを得た。得られたモナティンは光学純度９９．６％ｄ．ｅ．であった。
1ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ：２．０６（ｄｄ，Ｊ＝１１．８，１５．３Ｈｚ，１Ｈ），２．６７（ｄｄ，Ｊ＝２．０，１５．２Ｈｚ，１Ｈ），３．０８（ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．２８（ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．６３（ｄｄ，Ｊ＝２．２，１２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１２−７．１６（ｍ，１Ｈ），７．２０−７．２４（ｍ，２Ｈ），７．４８−７．４９（ｍ，１Ｈ），７．７１−７．７３（ｍ，１Ｈ）。
ＥＳＩ−ＭＳ  計算値  Ｃ14Ｈ16Ｎ2Ｏ5＝２９２．２９，分析値２９１．２８［Ｍ−Ｈ］-
【０１６８】
実施例１２  ＳｐＡＬＤによるＩＨＯＧ合成の改良
ＬＢ−ａｍｐ平板培地で３７℃、１６時間培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐｔｒｐＳｐＡＬＤ菌体を一白金耳かきとり、５０ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地を含む５００ｍｌ容フラスコ１２本に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ，ｐＨ７．６）に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。遠心分離にて調製した菌体（湿菌体重量で約３ｇ）を、以下の組成の反応液３００ｍｌに懸濁した。
ＩＨＯＧ合成反応溶液：５０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ８．７），３００ｍＭ  インドールピルビン酸，６００ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム，０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2（６Ｎ  ＫＯＨにてｐＨ８．５に調整）
菌体を懸濁した反応液にアルゴンガスを通気し、以後、アルゴンガス雰囲気下で反応を実施した。反応は３７℃で攪拌しながら、２０時間行った。反応終了後、遠心分離により除菌してアルドール反応液３００ｍｌを得た。得られた反応液を実施例１０と同様にオキシム化した後にＨＰＬＣにて生成ＩＨＯＧを定量した。その結果、６３．６ｍＭの４Ｒ−ＩＨＯＧが光学純度９２．２％ｅ．ｅ．で生成しており、ＳｐＡＬＤの反応条件の改善により４Ｒ選択性を向上せしめることが出来た。
【０１６９】
実施例１３  Ｃ２４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３７１株）からのアルドラーゼ遺伝子（ｂｕａｌｄ）のクローニングおよびＥ．ｃｏｌｉでの大量発現
実施例１にて採取し、４Ｒ−ＩＨＯＧ  ａｌｄｏｌａｓｅ活性を見出した集積菌のうち、Ｃ２４株から４Ｒ−ＩＨＯＧ  ａｌｄｏｌａｓｅ（以下ＢｕＡＬＤ）をコードする遺伝子を取得した。また、ｐｔｒｐ４にｂｕａｌｄ遺伝子を連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９で大量発現せしめた。
【０１７０】
（１）染色体ＤＮＡの調製
Ｃ２４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３７１株）を５０ｍｌのＣＭ２Ｇ培地を用いて３０℃で一晩培養した（前培養）。この培養液５ｍｌを種菌として、５０ｍｌのブイヨン培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２，０００ｘｇ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体ＤＮＡを調製した。
【０１７１】
（２）サザン解析・コロニーハイブリダイゼーションによるｂｕａｌｄ遺伝子の取得
ＳｐＡＬＤ遺伝子の全長をコードするＤＮＡ断片をプローブとして用いて、サザン解析及びコロニーハイブリダイゼーションによってｂｕａｌｄ遺伝子の取得を行った。表９に示すプライマー（配列番号１０及び１１）を用いてＣ７７株（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３２９株）の染色体ＤＮＡよりｓｐａｌｄ遺伝子全長をＰＣＲによって増幅した。増幅した断片を用いたＤＮＡプローブの作製はＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ（ロシュダイアグノスティック社製）を使用して、説明書通りに３７℃でＯ／Ｎインキュベートしてプローブの標識を行った。サザン解析は、Ｃ２４株から調製した染色体ＤＮＡ  １μｇを各種制限酵素で完全に消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動したのちに、ナイロンメンブレンにブロッティングし、以下マニュアルに従って行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行い、５０℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブを添加して、Ｏ／Ｎでハイブリダイゼーションさせた。バンドの検出はＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて行った。その結果、該ＰＣＲ断片をプローブとして強くハイブリダイゼーションする約２．３  ｋｂｐのＰｓｔＩ／ＳｍａＩ断片を検出した。次に、このＰｓｔＩ／ＳｍａＩ断片をコロニーハイブリダイゼーションにて取得した。染色体ＤＮＡ  ２０μｇをＰｓｔＩ／ＳｍａＩで処理後アガロースゲル電気泳動に供し約２．３ｋｂｐの大きさの断片を回収した。これをｐＵＣ１８に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９にてライブラリーを作製した。コロニーをナイロンメンブレンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマシャム社製）にうつし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂを用いて行った。フィルターをバッファー中に浸し、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、作成した標識プローブを添加し、４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ＳＳＣでの洗浄後、プローブとハイブリダイズするコロニーの検出をＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行った。その結果、プローブと強くハイブリダイゼーションするクローンを取得した。
取得したクローンより回収したプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定したところ、配列番号１４に記載の塩基配列を有することが明らかになり、目的とするｂｕａｌｄ遺伝子の全長を取得した。
【０１７２】
（３）アルドラーゼ遺伝子発現プラスミドｐｔｒｐＢｕＡＬＤの構築とＥ．ｃｏｌｉでの発現
表１０に示すプライマー（配列番号１９及び２０）を用いてＣ２４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３７１株）の染色体ＤＮＡより増幅した断片をＮｄｅＩ／ＰｓｔＩ消化し、ｐＴｒｐ４のＮｄｅＩ／ＰｓｔＩサイトに挿入したプラスミドｐｔｒｐＢｕＡＬＤを構築した。このプラスミドは配列番号１４に記載の塩基配列のうち５３１番目のＡＴＧを翻訳開始コドンとして１３８５番目まで翻訳することにより得られる、配列番号１５記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼ遺伝子を発現する。
【０１７３】
【表１０】
2006204285.tif 000022
【０１７４】
構築した発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地５０ｍｌに１白金耳接種し、３７℃で１６時間振盪させた。培養終了後、得られた培養液１ｍｌを集菌、洗浄し、１ｍｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）に懸濁し、超音波破砕にて菌体を破砕した。破砕液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
該粗酵素液を用いてアルドラーゼ活性を測定した。アルドラーゼ活性測定は、ＰＨＯＧを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。
反応条件：５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ  ＰＨＯＧ、０．２５ｍＭ  ＮＡＤＨ、０．２ｍＭ  ＫＰｉ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１６Ｕ／ｍｌ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、３μｌ酵素／６００μｌ反応液、３０℃、３４０ｎｍの吸光度を測定
測定した結果、ｐＴｒｐ４を導入したＥ．ｃｏｌｉ（コントロール）においてはアルドラーゼ活性は検出されなかったのに対して、ｐｔｒｐＢｕＡＬＤ導入株においては２３１Ｕ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎのアルドラーゼ活性が検出された。これにより、ＢｕＡＬＤ高発現プラスミドの構築と併せて、確かに目的とするアルドラーゼをクローニングしたことも確認できた。
【０１７５】
実施例１４  Ｃ２４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３７１株）由来アルドラーゼの組み換え酵素の精製
Ｃ２４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３７１株）由来アルドラーゼ（ＢｕＡＬＤ）を高発現させたＥ．ｃｏｌｉの可溶性画分から組み換えＢｕＡＬＤの精製を以下の通り行った。アルドラーゼ活性測定は、ＰＨＯＧを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。
反応条件：５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ  ＰＨＯＧ、０．２５ｍＭ  ＮＡＤ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１６Ｕ／ｍｌ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、３μｌ酵素／６００μｌ反応液、３０℃、３４０ｎｍの吸光度を測定
【０１７６】
（１）可溶性画分の調製：
ＬＢ−ａｍｐ平板培地で３７℃、１６時間培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐｔｒｐＢｕＡＬＤ菌体を一白金耳かきとり、ＬＢ−ａｍｐ培地５０  ｍｌを含む５００  ｍｌ容フラスコ１０本に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ，ｐＨ７．６）に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。得られた洗浄菌体を２０ｍｌのバッファーＡに懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離（ｘ８０００ｒｐｍ、１０分間×２回）により菌体残渣を除き、得られた上清を粗抽出画分とした。
【０１７７】
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー：Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ
上記の可溶性画分２０ｍｌをバッファーＡで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ  ２６／１０（ファルマシア社製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をバッファーＡを用いて洗い流した後、ＫＣｌ濃度を０  Ｍから０．７Ｍまで直線的に変化させて（ｔｏｔａｌ  １４０ｍｌ）吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分についてＰＨＯＧアルドラーゼ活性を検出したところ、約０．３５Ｍ相当の画分にＰＨＯＧアルドラーゼ活性のピークを検出した。
【０１７８】
（３）疎水性クロマトグラフィー  ：Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ＨＲ  １６／１０
アルドラーゼ活性が検出された溶液をバッファーＢ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．６）に対して４℃で一晩透析し０．４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液を、バッファーＢで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ＨＲ  １６／１０（ファルマシア社製）に供した。この操作によりアルドラーゼは担体に吸着した。
担体に吸着しなかった非吸着タンパク質をバッファーＢを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍから０Ｍまで直線的変化させてアルドラーゼを溶出させた。得られた各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、硫酸アンモニウム濃度がおよそ０．４〜０．５Ｍの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
【０１７９】
（４）ゲルろ過クロマトグラフィー：Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００  ＨＰ  １６／６０
アルドラーゼを含む画分をそれぞれ集めて、バッファーＡに対して透析し、０．４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液を、限外ろ過膜ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  １０を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、バッファーＣ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ，０．１Ｍ  ＫＣｌ，ｐＨ７．６）で平衡化されたゲルろ過Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００  ＨＰ  １６／６０（ファルマシア社製）に供し、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出した。この操作によりアルドラーゼは６６ｍｌ付近の画分に溶出された。
【０１８０】
（５）陰イオン交換クロマトグラフィー：Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ５／５
得られた画分を０．４５μｍのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、バッファーＡで平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーカラム  Ｍｏｎｏ−Ｑ  ＨＲ  ５／５（ファルマシア社製）に供した。この操作により、アルドラーゼは担体に吸着した。バッファーＡにより非吸着タンパク質を洗い流した後、ＫＣｌ濃度を直線的に０  ｍＭから７００ｍＭへ変化させてタンパク質の溶出をおこなった（Ｔｏｔａｌ  ２４ｍｌ）。各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、ＫＣｌ濃度が約０．４Ｍの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
【０１８１】
以上のカラムクロマト操作により精製した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、約３０ｋＤａに相当する位置にＣＢＢ染色で単一なバンドとして検出された。取得した組み換えＢｕＡＬＤ溶液はバッファーＡに対して４℃で一晩透析した。上記の操作により、１２４１Ｕ／ｍｌのＢｕＡＬＤ溶液を１．５ｍｌ取得した。
【０１８２】
実施例１５  ＢｕＡＬＤの酵素学的諸性質
実施例１４で調製したＢｕＡＬＤを用いて、以下に掲げる項目について検討した。
基本測定条件：５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ  ＰＨＯＧ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１６Ｕ／ｍｌ  Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、３０℃にて３４０ｎｍの吸光度の減少を測定。
【０１８３】
（１）ＰＨＯＧを基質とした速度論定数
図８−１および図８−２に示す結果から、Ｖｍａｘ（ｆｏｒ  ＰＨＯＧ）＝４８３μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、Ｋｍ（ｆｏｒ  ＰＨＯＧ）＝０．６６ｍＭ、Ｋｍ（ｆｏｒ  ＭｇＣｌ2）＝０．０２１ｍＭとそれぞれ決定した。また、ＫＰＢ添加によるアルドラーゼ活性の上昇は認められなかった。
【０１８４】
（２）ｐＨ安定性
ｐＨ３〜１０の範囲におけるｐＨ安定性を測定した。測定に用いた緩衝液は以下の通り。クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３，  ４，  ４．５）、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４，  ４．５，  ５，  ５．５，  ６，  ６．５）、リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６，  ６．５，  ７，  ７．５，  ８，  ８．５）、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨバッファー（ｐＨ７．５，  ８，  ８．５，  ９，  ９．５）、ＣＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ９，  ９．５，  １０）。ＢｕＡＬＤを１００ｍＭのそれぞれの緩衝溶液中で３７℃で３０分間インキュベートした残存活性を基本測定条件にて測定した。結果を図９に示す。
【０１８５】
（３）温度安定性
２５℃〜７０℃にて１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）及び１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨバッファー（ｐＨ８．５）中でＢｕＡＬＤを３０分間インキュベートした後、残存活性を基本測定条件にて測定した。結果を図１０に示す。
【０１８６】
実施例１６  ＢｕＡＬＤおよびＳｐＡＬＤによるＩＨＯＧ合成とオキシム化
ＬＢ−ａｍｐ平板培地で３７℃、１６時間培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐｔｒｐＢｕＡＬＤあるいはＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐｔｒｐＳｐＡＬＤ菌体を一白金耳かきとり、５０ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地を含む５００ｍｌ容フラスコ４本にそれぞれ接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ，ｐＨ７．６）に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。遠心分離にて調製した菌体（湿菌体重量で約１ｇ）を、以下の組成の反応液１００ｍｌに懸濁した。
ＩＨＯＧ合成反応溶液：５０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ８．０），３００ｍＭ  インドールピルビン酸，６００ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム，０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2,（６Ｎ  ＫＯＨにてｐＨ８．０に調整）
菌体を懸濁した反応液にアルゴンガスを通気した後に、反応は３７℃で攪拌しながら、１８時間行った。反応終了後、遠心分離により除菌してアルドール反応液約１００ｍｌを得た。
取得したアルドール反応液約９６ｍｌに、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ値を９に保ちながら、ヒドロキシルアミン塩酸塩６．２５ｇ（９０ｍｍｏｌ）を加え、２５℃にて６時間，１０℃にて一晩攪拌した。得られた反応液中のＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ量をＨＰＬＣ分析にて定量した。その結果、（表１１）ＢｕＡＬＤ区、ＳｐＡＬＤ区ともに、４Ｒ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅが優先的に生成していた。
【０１８７】
【表１１】
2006204285.tif 000023
【０１８８】
実施例１７  Ｃ４３株（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３７２株）からのアルドラーゼ遺伝子（ＳｐＡＬＤ２）のクローニングおよびＥ．ｃｏｌｉでの大量発現
実施例１にて採取し、４Ｒ−ＩＨＯＧ  ａｌｄｏｌａｓｅ活性を見出した集積菌のうち、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  Ｃ４３株から４Ｒ−ＩＨＯＧ  ａｌｄｏｌａｓｅ（以下ＳｐＡＬＤ２）をコードする遺伝子を取得した。また、ｐｔｒｐ４にｓｐａｌｄ２遺伝子を連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９で大量発現せしめた。
【０１８９】
（１）染色体ＤＮＡの調製
Ｃ４３株（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３７２株）を５０ｍｌのＣＭ２Ｇ培地を用いて３０℃で一晩培養した（前培養）。この培養液５ｍｌを種菌として、５０ｍｌのブイヨン培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２，０００ｘｇ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体ＤＮＡを調製した。
【０１９０】
（２）サザン解析・コロニーハイブリダイゼーションによるｓｐａｌｄ２遺伝子の取得
ＳｐＡＬＤ遺伝子の全長をコードするＤＮＡ断片をプローブとして用いて、サザン解析及びコロニーハイブリダイゼーションによってｓｐａｌｄ２遺伝子の取得を行った。表９に示すプライマー（配列番号１０及び１１）を用いてＣ７７株（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１０３２９株）の染色体ＤＮＡよりｓｐａｌｄ遺伝子全長をＰＣＲによって増幅した。増幅した断片を用いたＤＮＡプローブの作製はＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ（ロシュダイアグノスティック社製）を使用して、説明書通りに３７℃でＯ／Ｎインキュベートしてプローブの標識を行った。サザン解析は、Ｃ４３株から調製した染色体ＤＮＡ  １μｇを各種制限酵素で完全に消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動したのちに、ナイロンメンブレンにブロッティングし、以下マニュアルに従って行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行い、５０℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブを添加して、Ｏ／Ｎでハイブリダイゼーションさせた。バンドの検出はＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて行った。その結果、該ＰＣＲ断片をプローブとして強くハイブリダイゼーションする約３ｋｂｐのＰｓｔＩ断片を検出した。次に、このＰｓｔＩ断片をコロニーハイブリダイゼーションにて取得した。染色体ＤＮＡ２０μｇをＰｓｔＩで処理後アガロースゲル電気泳動に供し約３ｋｂｐの大きさの断片を回収した。これをｐＵＣ１１８に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９にてライブラリーを作製した。コロニーをナイロンメンブレンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマシャム社製）にうつし、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂを用いて行った。フィルターをバッファー中に浸し、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、作成した標識プローブを添加し、４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ＳＳＣでの洗浄後、プローブとハイブリダイズするコロニーの検出をＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行った。その結果、プローブと強くハイブリダイゼーションするクローンを取得した。
取得したクローンより回収したプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定したところ、配列番号１２に記載の塩基配列を有することが明らかになり、目的とするｓｐａｌｄ２遺伝子の全長を取得した。
【０１９１】
（３）アルドラーゼ遺伝子発現プラスミドｐＵＣＳｐＡＬＤ２の構築とＥ．ｃｏｌｉでの発現
表１２に示すプライマー（配列番号２１及び２２）を用いてＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  Ｃ４３株の染色体ＤＮＡより増幅した断片をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ消化し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩサイトに挿入したプラスミドｐＵＣＳｐＡＬＤ２を構築した。このプラスミドは配列番号１２に記載の塩基配列のうち３９９番目のＡＴＧを翻訳開始コドンとして１２５３番目まで翻訳することにより得られる、配列番号１３記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼ遺伝子を発現する。
【０１９２】
【表１２】
2006204285.tif 000024
【０１９３】
構築した発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１ｍＭ  Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地５０ｍｌに１白金耳接種し、３０℃で１６時間振盪させた。培養終了後、得られた培養液１ｍｌを集菌、洗浄し、１ｍｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）に懸濁し、超音波破砕にて菌体を破砕した。破砕液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
【０１９４】
該粗酵素液を用いてアルドラーゼ活性を測定した。アルドラーゼ活性測定は、ＰＨＯＧを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。
反応条件：  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ  ＰＨＯＧ、０．２５ｍＭ  ＮＡＤＨ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１６Ｕ／ｍｌ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、  ３μｌ酵素／６００μｌ反応液、３０℃、３４０ｎｍの吸光度を測定
測定した結果、ｐＵＣ１８を導入したＥ．ｃｏｌｉ（コントロール）からはアルドラーゼ活性が検出されなかったのに対して、ｐＵＣＳｐＡＬＤ２導入株においては０．６８Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎのアルドラーゼ活性が検出された。これにより、ＳｐＡＬＤ２高発現プラスミドの構築と併せて、確かに目的とするアルドラーゼをクローニングしたことも確認できた。
【０１９５】
実施例１８  ＳｐＡＬＤ２によるＩＨＯＧおよびＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ合成
ＬＢ−ａｍｐ平板培地で３０℃、１６時間培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＵＣＳｐＡＬＤ２菌体を一白金耳かきとり、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＬＢ培地５０ｍｌ培地を含む５００ｍｌ容フラスコ４本にそれぞれ接種し、３４℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ，ｐＨ７．６）に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。遠心分離にて調製した菌体（湿菌体重量で約１ｇ）を、以下の組成の反応液１００ｍｌに懸濁した。
ＩＨＯＧ合成反応溶液：５０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ８．０），３００ｍＭ  インドールピルビン酸，６００ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム，０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ2,（６Ｎ  ＫＯＨにてｐＨ８．０に調整）
菌体を懸濁した反応液にアルゴンガスを通気した後に、反応は３７℃で攪拌しながら、１８時間行った。反応終了後、遠心分離により除菌してアルドール反応液約１００ｍｌを得た。
取得したアルドール反応液約９６ｍｌに、５０％ヒドロキシルアミン水溶液５．９５ｍｌ（９０ｍｍｏｌ）を加え、２５℃にて６時間，１０℃にて一晩攪拌した。得られた反応液中のＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅ量をＨＰＬＣ分析にて定量した。その結果、４Ｒ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅが３．８４ｍｍｏｌ、４Ｓ−ＩＨＯＧ−ｏｘｉｍｅが０．１５ｍｍｏｌ生成しており、光学純度９２．４％ｅ．ｅ．で４Ｒ体が優先的に生成していることを確認した。
【０１９６】
参考例１  ４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸（ＩＨＯＧ）の合成
水酸化カリウム１８．９１ｇ（２８６．５ｍｍｏｌ、含量８５重量％）を溶解した水６４．４５ｍｌに、インドール−３−ピルビン酸７．５０ｇ（３５．８ｍｍｏｌ、含量９７．０重量％）とオキサロ酢酸１４．１８ｇ（１０７．４ｍｍｏｌ）を加えて溶解させた。この混合溶液を３５℃にて２４時間攪拌した。
更に、３Ｎ−塩酸４０．０ｍｌを加えて中和（ｐＨ＝７．０）し、１５３．５ｇの反応中和液を得た。この反応中和液には、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸が５．５５ｇ含まれており、収率５３．３％（対インドールピルビン酸）であった。
この反応中和液に水を加え、１６８ｍｌとし、合成吸着剤（三菱化学製  ＤＩＡＩＯＮ−ＳＰ２０７）８４０ｍｌにて充填された樹脂塔（直径４．８ｃｍ）に通液した。更に、流速２３．５ｍｌ毎分にて純水を通液し、１．７３〜２．５５（Ｌ／Ｌ−Ｒ）を収集することにより、高純度の４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸を３．０４ｇ含む水溶液を、収率５４．７％（樹脂への投入量に対して）にて得た。
（ＮＭＲ測定）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：３．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．６Ｈｚ），３．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．６Ｈｚ），３．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１８．１Ｈｚ），３．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１８．１Ｈｚ），７．０６−７．１５（ｍ，３Ｈ），７．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）．
13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：３５．４３，４７．９１，７７．２８，１０９．４９，１１２．０５，１１９．４４，１１９．６７，１２１．９１，１２５．４２，  １２８．４１，１３６．２１，１６９．７８，１８１．４３，２０３．５８
【０１９７】
参考例２  ４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸（ＰＨＯＧ）の合成
水酸化カリウム（純度８５％）１３．８ｇを溶解した水２５ｍｌに対し、フェニルピルビン酸５．０ｇ（３０．５ｍｍｏｌ）、オキサル酢酸１２．１ｇ（９１．４ｍｍｏｌ）を加えて室温にて７２時間反応させた。濃塩酸を用いて反応液のｐＨ値を２．２に調節し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥を行った後に、濃縮して残渣を得た。残渣を酢酸エチルとトルエンから再結晶を行い、４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸２．８ｇ（１１．３ｍｍｏｌ）を結晶として得た。
（ＮＭＲ測定）
1Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ：２．４８（ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，０．１８Ｈ），２．６０（ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，０．１８Ｈ），２．８５−３．３０（ｍ，３．６４Ｈ），７．１７−７．３６（ｍ，５Ｈ）
（分子量測定）
ＥＳＩ−ＭＳ計算値Ｃ12Ｈ12Ｏ6＝２５２．２３，分析値２５１．２２（ＭＨ-）
【０１９８】
参考例３  ４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の製造
１．６ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液９１７ｇに、インドール−３−ピルビン酸７３．８ｇ（３５２ミリモル）を加えて溶解した。反応溶液を３５℃とし、３０％水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ値を１１．１に保ちながら、５０％ピルビン酸水溶液３１０．２ｇ（１７６１ミリモル）を２時間かけて滴下した。更に４．５時間反応させて、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸を含有する反応溶液を得た。これに、３０％水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ値を７に保ちながら、４０％ヒドロキシルアミン塩酸塩水溶液３６７．２ｇ（２１１４ミリモル）を加え、５℃にて１７．５時間攪拌した。濃塩酸を用いて反応液のｐＨ値を２にし、有機物を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、濃縮して残渣を得た。残渣に２８％アンモニア水６０ｍｌと２−プロパノール１３５０ｍｌから再結晶を行い、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の２アンモニウム塩４３．４ｇ（１４２ミリモル：収率４０％対インドール−３−ピルビン酸）を結晶として得た。
【０１９９】
参考例４  （４Ｓ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（Ｒ）−（＋）−１−フェニルエチルアミン塩の製造
４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩４４．７ｇ（０．１３１モル）を２５℃で水５００ｍｌに溶解後、３６％塩酸２５．５ｇにてその水溶液のｐＨを２にした。酸性溶液を酢酸エチル１３００ｍｌで抽出し、その酢酸エチル溶液を飽和食塩水２００ｍｌで洗浄した。得られた酢酸エチル溶液に炭酸ナトリウム水溶液５００ｍｌ（炭酸ナトリウム  １３．９ｇ  ０．１３１モル）を加え攪拌し、アルカリ水溶液と酢酸エチルを分離した。得られたアルカリ水溶液に３６％塩酸２３．１ｇを添加し液のｐＨを２にした。この酸性水溶液に（Ｒ）−（＋）−１−フェニルエチルアミン６．９９ｇ（５７．６ミリモル）を滴下し２５℃にて１時間攪拌する。得られた結晶を濾過し、減圧乾燥して（４Ｓ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（Ｒ）−（＋）−１−フェニルエチルアミン塩２１．８ｇ（４７．８ミリモル）を得た（収率７２．７％、光学純度８７．４％）。
（ＮＭＲ測定）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：１．４８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ），２．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ），２．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．１Ｈｚ），３．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．１Ｈｚ），４．４０（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），６．９１−７．５４（ｍ，１０Ｈ）。
【０２００】
参考例５  （４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（Ｓ）−（−）−１−フェニルエチルアミン塩の製造
参考例４で得られた結晶濾過液に、更に（Ｓ）−（−）−１−フェニルエチルアミン７．１２ｇ（５８．７ミリモル）を滴下し２５℃にて１時間攪拌した。得られた結晶を濾過し、減圧乾燥して（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（Ｓ）−（−）−１−フェニルエチルアミン塩２３．８ｇ（５３．３モル）を得た（収率８１．１％、光学純度９２．１％）。
【０２０１】
参考例６
（１）（４Ｓ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩の製造
２５℃にて、（４Ｓ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（Ｒ）−（＋）−１−フェニルエチルアミン塩２１．８ｇ（５１．０ミリモル）に水２００ｍｌ及び２８％アンモニア水１８．５ｇを加えて溶解させた後、さらにトルエン２００ｍｌを加えて攪拌した。分層して得られた水層を６０℃に加温し、その水溶液に２−プロパノール９００ｍｌを２時間かけて滴下した。この２−プロパノール水溶液を１０℃まで５時間かけて冷却した後、１０℃で１０時間攪拌した。得られた結晶を濾過し、減圧乾燥して（４Ｓ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩１４．７５ｇを得た（収率８５．１％、光学純度９９．０％）。
融点；２０５℃（分解）
比旋光度［α］20D＋１３．４（ｃ＝１．００，Ｈ2Ｏ）
（２）（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩の製造
上記参考例と同様に、（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（Ｒ）−（＋）−１−フェニルエチルアミン塩２３．８ｇ（５３．３ミリモル）から（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩１６．２ｇを得た（収率８９．３％、光学純度９９．９％）。
比旋光度［α］20D−１３．６（ｃ＝１．００，Ｈ2Ｏ）
【０２０２】
参考例７  （２Ｒ，４Ｒ）モナティンの製造
参考例６で得た（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩１３．２ｇ（３８．７ミリモル）を２８％アンモニア水１３５ｍｌに溶解し、５％ロジウム炭素（５０％含水品）６．９３ｇを加えて２５℃にて１ＭＰａの水素圧で反応を行った。２４時間後に触媒を濾過し（０．２ミクロンフィルター）、その濾過液に炭酸カリウム２．５４ｇ（１８．４ミリモル）を溶解した。その溶解液を濃縮し、得られた濃縮物３２．７ｇに水２０ｍｌ及びエタノール４５ｍｌを加え２５℃で撹拌し、更にエタノール６０ｍｌを３時間かけて滴下した後、２５℃で２０時間攪拌し晶析を行った。得られた湿結晶９．７８ｇを水１２ｍｌに溶解し、エタノール２４ｍｌを添加した後、更にエタノール５１ｍｌを３時間かけて滴下した。このエタノール溶液を１５℃まで４時間かけて冷却した後、１５℃で１０時間攪拌した。得られた湿結晶７．０８ｇを減圧乾燥し、目的とする（２Ｒ，４Ｒ）モナティンのカリウム塩５．７ｇを得た。
【産業上の利用可能性】
【０２０３】
以上のように、本発明のアルドラーゼを用いることによって、ＩＨＯＧ及びＰＨＯＧを光学選択的に生成することが可能となる。本発明のアルドラーゼは、モナティンの合成ルートにおけるアルドール縮合反応の段階において、効率的な不斉導入を可能とするものであり、光学活性ＩＨＯＧ、及び、光学活性モナティンの製造に好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】本発明のアルドラーゼのホモロジー比較を示す図である。
【図２】本発明のアルドラーゼの製造工程を示すフローチャートである。
【図３−１】ＳｐＡＬＤのＰＨＯＧを基質とした反応速度を示すグラフである。
【図３−２】ＳｐＡＬＤのＭｇＣｌ2濃度に対する反応速度を示すグラフである。
【図４】ＳｐＡＬＤのｐＨ安定性を測定した結果を示すグラフである。
【図５】ＳｐＡＬＤの温度安定性を測定した結果を示すグラフである。
【図６】ＳｐＡＬＤのアルドール分解活性における反応至適ｐＨを示すグラフである。
【図７】ＳｐＡＬＤのアルドール縮合活性における反応至適ｐＨを示すグラフである。
【図８−１】ＢｕＡＬＤのＰＨＯＧを基質とした反応速度を示すグラフである。
【図８−２】ＢｕＡＬＤのＭｇＣｌ2濃度に対する反応速度を示すグラフである。
【図９】ＢｕＡＬＤのｐＨ安定性を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】ＢｕＡＬＤの温度安定性を測定した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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