(57)【要約】【課題】  これまで技術的に維持・継代が困難であった優性精子形態形成不全が引き起こされ男性不妊症を再現できるモデル動物や、かかる男性不妊症モデル動物の維持・継代方法や、かかる男性不妊モデル動物を用いた男性不妊症の予防・治療剤のスクリーニング方法や、男性不妊症の原因物質のスクリーニング方法や、男性不妊症の診断方法などを提供すること。【解決手段】  コートアクチンをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、コートアクチンを発現する機能が低下した、遺伝子変異を片アリルに有するマウス等の非ヒト動物を男性不妊症モデル動物とする。例えば、男性不妊モデルマウスでは、セルトリ細胞中の特殊接合装置（ＥＳ）に含まれるアクチン繊維層に異常が生じており、伸長精子細胞の形態異常および精上皮からの剥離が起こっていた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コートアクチンをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、コートアクチンを発現する機能が低下した、あるいは失なった非ヒト動物からなることを特徴とする男性不妊症モデル動物。
【請求項２】
遺伝子変異を片アリルに有することを特徴とする請求項１記載の男性不妊症モデル動物。
【請求項３】
歩行異常などの行動異常を示すことを特徴とする請求項１又は２記載の男性不妊症モデル動物。
【請求項４】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の男性不妊症モデル動物。
【請求項５】
マウス精細胞（独立行政法人 理化学研究所バイオリソースセンター寄託番号０１１３６）を用いて作製されたことを特徴とする請求項４記載の男性不妊症モデル動物。
【請求項６】
コートアクチンをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、コートアクチンを発現する機能が低下した、あるいは失なった非ヒト動物から採取した精子細胞を野生型未受精卵に注入して培養後の４〜８細胞胚を、偽妊娠させた非ヒト動物の卵管に移植し、産仔を得ることを特徴とする男性不妊症モデル動物の維持・継代方法。
【請求項７】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項６記載の男性不妊症モデル動物の維持・継代方法。
【請求項８】
精子細胞がマウス精細胞（独立行政法人 理化学研究所バイオリソースセンターに寄託番号０１１３６）であることを特徴とする請求項７記載の男性不妊症モデル動物の維持・継代方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか記載の男性不妊症モデル動物に、被検物質を投与し、造精機能障害の症状改善の程度を測定・評価することを特徴とする男性不妊症の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなる、その発現機能低下又は発現機能喪失が男性不妊症の原因となるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアクチンとの結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつアクチンとの結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列；
（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつアクチンとの結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアクチンとの結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
【請求項１１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなる、その発現機能低下又は発現機能喪失が男性不妊症の原因となるタンパク質。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がアクチンとの結合活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がアクチンとの結合活性を有するアミノ酸配列；
【請求項１２】
検体中のヒトコートアクチン遺伝子の異常の有無を調べることを特徴とする男性不妊症の診断方法。
【請求項１３】
検体中のヒトコートアクチンタンパク質の異常の有無を調べることを特徴とする男性不妊症の診断方法。
【請求項１４】
ヒトコートアクチン遺伝子又はヒトコートアクチン遺伝子が発現ベクターにインテグレートされた組換えベクターを有効成分として含有することを特徴とするヒトコートアクチン遺伝子やヒトコートアクチンタンパク質の異常に起因する男性不妊症の治療薬。
【請求項１５】
請求項１４記載の男性不妊症の治療薬を、精巣に投与することを特徴とするヒトコートアクチン遺伝子やヒトコートアクチンタンパク質の異常に起因する男性不妊症の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、これまで技術的に維持・継代が困難であった優性精子形態形成不全が引き起こされ男性不妊症を再現できるモデル動物や、かかる男性不妊症モデル動物の維持・継代方法や、かかる男性不妊症モデル動物を用いた男性不妊症の予防・治療剤のスクリーニング方法や、男性不妊症の原因物質のスクリーニング方法や、男性不妊症の診断方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
生殖は、自身の遺伝情報を次世代に伝え生命の連続性を保つ、生物にとって極めて基本的な現象である。哺乳類を含む多細胞生物の場合、体細胞が個体の生命を維持するために分化し、一代限りで役割を終えるのに対して、生殖細胞はその個体を離れ、次世代の個体を形成する。雄性配偶子である精子は、体外に排出され雌性配偶子である卵と受精するが、哺乳類は胎生であるため、受精の場は雌の体内となり、かつ一度に排卵される卵の数も制限される。従って、哺乳類の雄は受精の機会を確実にするため多くの精子を連続的に生産し、かつ送りだすための機構を発達させている。この機構を理解する為に、精子形成に関与する遺伝子の単離と解析が進められている。
【０００３】
（男性不妊）
ヒトにおいては、約１０〜１５％の夫婦に不妊症状が見られ、その数は増加傾向にあると言われている。かつて不妊は女性側の問題が大きいと考えられていたが、現在の知見では男女の寄与はほぼ半々であると言われており、男性不妊の診断、治療の重要性が高まっている。臨床的に見た男性不妊の原因は、以下の３つに大別される。このうち最も多いのは造精機能障害で、男性不妊の約７０〜９０％がこれに分類される。
（１）造精機能障害：睾丸（精巣）で精子を造る機能に関する障害。精液中の精子数・奇形精子率・運動性などに応じて、無精子症・乏精子症・精子無力症・精子奇形症などの症状に分類される。
（２）精管通過障害：精巣上体・尿道など精子が通る器官の障害。閉塞性無精子症・精巣上体炎・逆行性射精など。
（３）性機能障害：性行為に関する障害。勃起障害（ＥＤ）・射精障害など。
【０００４】
現在行われている男性不妊の治療は、主にホルモン剤や漢方等の薬物療法と、体外受精・顕微授精などの生殖補助技術（assisted reproductive technology；ＡＲＴ）を用いる方法である。精管閉塞の場合外科的に精管再建術を施す場合もあるが、改善が見られないケースも多い。ＡＲＴを用いる方法が現在のところ最も強力で、特に顕微授精（intracytoplasmic sperm injection；ＩＣＳＩ）によって、精巣内に完成精子のない完全無精子症の患者も、伸長精子細胞があれば子供を得ることができる。顕微授精は「現状で最も妊娠を望める方法」として適用数が増加しているが、問題点も議論されている。まずＡＲＴを用いる方法は患者に対する経済的な負担が小さくない。また、本来であれば次世代には伝わらないはずの遺伝的要素を人為的に残してしまうことへの懸念も議論されている。ＩＣＳＩを受けて生まれた男子がまた不妊であったケースも報告されている（例えば、非特許文献１、２参照）。
【０００５】
（Ｙ染色体微少欠失）
造精機能障害には染色体異常などの先天的なものと、環境要因や感染症などによる後天的なものがある。しかし、実際には臨床の場で造精機能障害の原因を判別することは困難であり、多くは原因不明の「突発性造精機能障害」と診断されるため、造精機能障害のどの程度が遺伝的要因または環境要因によるものかを正確に知るのは難しい。これまでにいくつかの推測値が出されており、Lilfordらは男性不妊の６０％が遺伝的要因であり、その多くが常染色体上の変異であるとしているが、常染色体上の男性不妊因子の多くは明らかにされていない（例えば、非特許文献３参照）。
【０００６】
精子形成障害の遺伝的要因のうち最もよく知られ、研究が進められているのはＹ染色体の微小欠失で、男性不妊患者のおよそ５％に認められる。Ｙ染色体上には現在までに４つの無精子症因子（azoospermia factor）領域ＡＺＦａ，ＡＺＦｂ，ＡＺＦｃ，ＡＺＦｄがマップされている。ＡＺＦａにはＵＳＰ９Ｙ（ubiquitin-specific protease 9, Y chromosome），ＤＢＹ（dead box on the Y），ＵＴＹ（ubiquitous TPR motif on the Y），ＡＺＦａＴ１（AZFa transcript 1）の４つの遺伝子が知られている。ＡＺＦｂにはＲＢＭＹ（RNA binding motif on Y chromosome）遺伝子ファミリーと呼ばれるＲＮＡ結合モチーフを持つタンパク質をコードする遺伝子がヒトの場合２０〜５０個存在し、さらに多くの偽遺伝子が存在する。ＡＺＦｃは、これもＲＮＡ結合モチーフを持つＤＡＺ（deleted in azoospermia）遺伝子ファミリーに属する遺伝子を複数含んでいる。これらＡＺＦ領域にマップされる遺伝子については詳細な解析が進められているが、造精機能障害の責任遺伝子はまだ判っていない。領域中の複数の遺伝子が関与している可能性も示唆されている（例えば、非特許文献４、５参照）。
【０００７】
（男性不妊の環境要因・内分泌撹乱物質の影響）
後天的な男性不妊は生活環境からのストレスや細菌・ウィルスの感染症など様々な原因で起こり得るが、近年、環境中の内分泌撹乱物質への暴露による生殖機能の障害が注目されている。そもそもこの問題の発端は、１９９２年のSkakkebaek らによる、この５０年間にヒトの精子数が半減しているという報告である（例えば、非特許文献６参照）。さらに１９９８年同グループによって、精巣腫瘍発生率の上昇傾向と精子数減少との相関が報告され（例えば、非特許文献７参照）、その中で、これらの現象は共に環境中のホルモン様作用を持つ物質、すなわち内分泌撹乱物質の影響であるという可能性が指摘された。Skakkebaek らの研究は過去の文献調査に基づくメタアナリシスによるものであり、その方法論と統計処理をめぐって議論がなされた。以降、様々な調査・研究がなされ、肯定・否定双方の意見が出されているが、本当にヒトの精子は減少しているのか、もしそうであるならばそれは内分泌撹乱物質の影響なのか、研究者間でも見解は一致していない。生殖の問題は人類の存続にも関わる問題であり、もし内分泌撹乱物質がヒトの精子数減少に寄与しているのであれば、その原因となりうる化合物の規制など、社会としての対策が必要であろう。その基盤となる客観的かつ科学的なリスク評価が求められている。
【０００８】
（雄性生殖器官）
雄性生殖器官である精巣（testis）は、精細管（seminiferous tubule）と呼ばれる体外に通じる管の集合体から成っている。その管の内壁は精上皮（seminiferous epithelium）と呼ばれる組織で、支持細胞であるセルトリ細胞（Sertoli cell）の細胞質に生殖細胞が包まれて存在している（図１参照）。生殖細胞は精細管の外側（基底部）から内側の管腔に向けて分化しつつ移動し、完成した精子が管腔（lumen）に放出される。精細管は精巣網（rete testis）で集合し、集合管である精巣上体を通過中に成熟する。そして交尾の際に前立腺液、精嚢液とともに射出される。精細管外の間質にはライディッヒ細胞（Leydig cell）という体細胞が存在し、アンドロジェンの産生など、ホルモンによる精巣機能の調節を担っている。
【０００９】
（哺乳類の精子形成過程）
雄の胎子期に胚体外の卵黄嚢に由来した始原生殖細胞（Primordial Germ Cell：ＰＧＣ）は、胎生１２日目前後に生殖隆起（genital ridge）に入る。この過程は雌雄ほぼ同様である。雄のＰＧＣが定住することによって、雄の生殖巣原基は初めて精巣への分化を開始し、形態的に卵巣と区別できるようになる。生殖隆起は皮質と髄質からなり、精巣へと分化する際には皮質に入り込んでいたＰＧＣが髄質に移る。ＰＧＣは、生殖隆起にたどりついた後も増殖を続けるが、いったん細胞分裂の休止期に入る。その間に精細管が形成されＰＧＣは中胚葉由来のセルトリ細胞とともに精細管内の細胞となる。この時期からＰＧＣは精原細胞（spermatogonia：核型は２Ｎ）と呼ばれるようになる。性成熟が近付くと精原細胞は細胞分裂を再開し、減数分裂を開始する。そして性成熟とともに成熟精子が射出されるようになる。減数分裂の開始から成熟精子の完成までは数週間を要する。マウス、ラットなど性成熟の早い動物（５〜８ｗ）では出生直後からこの過程が開始する。雌の卵形成と異なり、雄はほぼ一生のあいだ、生殖細胞の増殖と分化を続ける。この精原細胞の分裂から精子完成までの過程を精子形成（spermatogenesis）と呼ぶ。マウス精細管の構造を図１に示した。
【００１０】
精原細胞にはＡ型（type A）とＢ型（type B）の２種類がある。Ａ型細胞は幹細胞として精細管の基底部（＝最外層）にとどまる細胞である。Ａ型細胞は分裂してＡ型細胞それ自身と、減数分裂を開始するＢ型細胞に分かれる。Ｂ型細胞は徐々に精細管腔方向（＝内側）に移動しながらＤＮＡ合成を行ない、一次精母細胞（primary spermatocyte：４Ｎ）となる。一次精母細胞は卵母細胞と同様、第一減数分裂の前期（prophase）が長く、レプトテン（leptotene：細糸）、ザイゴテン（zygotene：接合糸）、パキテン（pachytene：厚糸）、ディプロテン（diplotene：複糸）、の各期に分けられる。第一減数分裂が終了すると、二次精母細胞（secondary spermatocyte：２Ｎ）となる。二次精母細胞はすみやかに第二減数分裂を開始し、減数分裂後半数体の精子細胞（spermatid：Ｎ）となる。配偶子形成においては、２Ｎ→４Ｎ→２Ｎ→Ｎという核型の変化を経て最終的に半数体（Ｎ）の配偶子が作られるが、卵形成の場合、減数分裂は不等分裂であり極体（polar body）放出というかたちで片方の細胞は捨てられるため、一個の卵祖細胞から一個の配偶子（卵）しか作られない。それに対して精子形成では一個の精原細胞から等価な４つの配偶子（精子）が作られる。
【００１１】
減数分裂終了直後の精子細胞は円形精子細胞（round spermatid）と呼ばれる。減数分裂後の半数体精子細胞は未受精卵に直接注入することにより、正常に個体発生することができる。このことは、減数分裂直後の円形精子細胞はすでに個体発生に必要十分な遺伝情報を持っていることを示している。しかし、生体内では卵と受精するために精子細胞が機能的な精子に変化する必要がある。円形精子細胞から機能的な精子の完成までには著しい形態および生化学的変化が起こる。この段階を精子完成（spermiogenesis）と呼ぶ。この過程で起こることは、核の濃縮、運動機能の獲得、受精能の獲得（受精タンパク質、卵活性化物質）である。円形精子細胞の核が濃縮し、完成精子に至る途中の精子細胞は伸長精子細胞（elongated spermatid）と呼ばれる。
【００１２】
通常細胞核内のＤＮＡはヒストンと結合して染色体を形成しているが、精子ではヒストンがプロタミンに置換され運動に好都合なコンパクトなかたちにまとめられている。核の凝縮によって精子はある程度の物理的および化学的変化に対する耐性を得る。一方で核の凝縮に伴って遺伝子の転写は困難になると考えられ、精子形態形成に関与する遺伝子のなかには翻訳調節を受けているものも存在する。例えば、核の凝縮前の精子細胞では過剰量のＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）が転写されているが、翻訳されている量は比較的少なく、翻訳調節機構の存在が示唆されている。次に精子が運動するための尾部（鞭毛）が形成される。これは精子細胞の中心子が伸長することでできる。鞭毛の頭部には中片（midpiece）と呼ばれるやや太い部分があり、ミトコンドリアがらせん状に巻き付いている。このミトコンドリアが精子の運動に必要なエネルギーを供給する。精巣内の精子にもある程度の尾部の運動が見られるが、前進性など精子本来の運動性を獲得するのは精巣上体においてである。精子頭部には先体（acrosome）と呼ばれる部分ができる。先体には加水分解酵素など受精に必要な様々なタンパク質が含まれている。また精子頭部には卵を活性化する因子が含まれている。完成した精子は精細管内に放出され、精巣上体での成熟を経て体外に放出される。
【００１３】
精子形成過程は非常に厳密に制御されており、効率良く大量の精子を作り出している。その制御には精巣内環境が重要であり、特に精細胞とセルトリ細胞の相互作用が不可欠である。セルトリ細胞は精細管の基底部から管腔方向に向かって伸びる柱状の体細胞である。核は不整形で内部に大きな核小体を持つ。セルトリ細胞は構造的に精細胞を支持しているだけではなく、種々のタンパク質（ホルモン）を分泌することで精子形成の一連の過程を制御しているため、セルトリ細胞の異常は精子形成異常につながる。セルトリ細胞と生殖細胞の接着は生殖細胞の分化に重要な役割を果たしていると考えられているが、その詳細はあまり分かっていない。精細管基底部にあるセルトリ細胞−セルトリ細胞結合（タイトジャンクション）は血液精巣関門（Blood Testis Barrier；ＢＴＢ）と呼ばれ、体循環と生殖細胞を隔離している。哺乳類では出生後に精子形成が開始するため、精子特異的タンパク質に対しては胎児期から出生直後に獲得する自己免疫寛容が機能しない。そのため血液中に抗精子抗体が存在する場合があり、血液循環と精巣内環境を隔離する必要があると考えられている。
【００１４】
（内分泌系による精巣機能の調節）
哺乳類の生殖機能は内分泌系の制御下にある。内分泌調整系の最上位にある視床下部から分泌される性腺刺激ホルモン放出ホルモン（gonadotropin releasing hormone；ＧｎＲＨ）に反応して、下垂体前葉から性腺刺激ホルモン（gonadotropin）が分泌される。性腺（精巣・卵巣）における生殖細胞の分化は、性腺刺激ホルモンによる調節を受ける（図２参照）。下垂体前葉から分泌される性腺刺激ホルモンにはＦＳＨ（follicle stimulatinghormone）とＬＨ（luteinizing hormone）がある。これらのホルモンは糖タンパク質の２つのサブユニットから構成されている。精巣機能はＦＳＨおよびＬＨによる調節を受けている。胎生期および新生仔期のセルトリ細胞の分裂はＦＳＨで促進され、ＦＳＨにより、精子形成の各段階をサポートする、セルトリ細胞の様々な機能が促進される。セルトリ細胞に対するＦＳＨのアンドロジェン結合タンパク質（androgen binding protein；ＡＢＰ）の産生促進効果は重要で、間質のライディッヒ細胞（Leydig cell）で産生されるアンドロジェン（テストステロン，Testosterone）が機能する為に必要である。ＬＨの精巣機能に対する主な作用は、ライディッヒ細胞のアンドロジェン生成促進作用である。精巣内のアンドロジェン濃度は血中よりも高く、この高濃度が精子形成には必須である。アンドロジェン受容体は生殖細胞にはなく、セルトリ細胞に存在することから、アンドロジェンは直接生殖細胞に働くのではなく、セルトリ細胞を介して作用していると考えられている。
【００１５】
（セルトリ−精子細胞特殊接合装置）
セルトリ細胞は全ての分化段階の精子形成細胞と接しており、精子形成をサポートしている。セルトリ細胞質中の伸長精子細胞と接している部分にはセルトリ−精子細胞特殊接合装置（Sertoli-spermatid ectoplasmic specialization，ＥＳ）と呼ばれる特殊な構造が見られる。ＥＳ構造を図３に示した。ＥＳ構造はSertoli cell plasma membrane, actin filament layer, endoplasmic reticulum の三層から成り、セルトリ細胞膜の内側にアクチン繊維が層を成す構造をしている。ＥＳ構造の機能には未だ不明な部分が多いが、アクチン繊維を破壊する薬剤であるサイトカラシンＤ（Cytochalasin D）処理によって、ＥＳのアクチン層が障害を受け、精子細胞とセルトリ細胞の乖離が起こること（例えば、非特許文献８参照）、また beta-estradiol 3-benzoate (E2B) 等のエストロジェン作用を持つ化合物を投与することによってもＥＳアクチン層が障害を受け、精子細胞の奇形と精上皮からのはく離（exfoliation）が起こること（例えば、非特許文献９参照）など、精巣毒性の研究からＥＳ構造の障害例が報告されており、これらから、ＥＳは精子細胞の形態形成を補助し、適切な時期の放出（spermiation）までセルトリ細胞と精子細胞の結合を保持する為に必要であると考えられている（例えば、非特許文献１０参照）。
【００１６】
（精子形成サイクル）
成熟精巣の精細管では、一定の分化段階にある生殖細胞の組み合わせ（ステージ，ステップ）が連続的かつ周期的に並んでいる（図４参照）。マウスの場合、ステージはＩからXIIまでの１２段階に分けられている。仮にある場所で精細管を輪切りにしたとすると、あるステージの断面が見え、同じ精細管を別の場所で切るとまた別のステージが見られる。あるステージの精細管には決まった分化段階の生殖細胞の組み合わせが見られる。ステップ（Step）とは減数分裂後の精子細胞の分化段階を表す数字で、マウスの場合１〜１６までの１６段階に分けられている。ステップ１〜８の精子細胞は円形をしており、円形精子細胞（round spermatid）と呼ばれる。ステップ８以降の精子細胞は伸長精子細胞（elongated spermatid）と呼ばれ、核の形態変化や尾部の形成を経て完成精子となっていく。例えばステージVIの精細管には、精細管の最も外側にＢ型精祖細胞（Type-B spermatogonia）、その内側にパキテン期の精母細胞（spermatocyte）、その内側にステップ６円形精子細胞（Step6 round spermatid）、さらにステップ１５伸長精子細胞（Step 15 elongated spermatid）が見られる。
【００１７】
おおまかな精細管のステージ判別は、精子細胞の様子を観察することでできる。管腔に放出される直前のステップ１６精子細胞は、精上皮のもっとも管腔側（精上皮の外）に位置している。従って管腔に面して精子細胞が並んでいる像から、その精細管がステージVII〜VIIIであると判別できる。ステップ１５精子細胞は、頭部形態はほぼ完成しているが、頭部を精上皮中に突っ込んでいる。従って、濃縮した精子頭部（核染色により容易に判別できる）が精上皮中にある像からステージＩ〜VIを判別できる。ステージIX〜XII精細管は伸長精子細胞の核の濃縮が完全ではないことと円形精子細胞が存在しないことから判別できる。特に精子放出直後のステージIX精細管にはステップ９精子細胞があるが、ステップ９精子細胞は核の濃縮が完全ではなく、核染色がそれ以降のステップより薄いことから判別できる。より詳しい判別（特にステージＩ〜VI）は、円形精子細胞に生じるアクロソームをＰＡＳ染色などで観察することで行なうことができる。
【００１８】
（雄性不妊マウス）
これまで述べてきたように、哺乳類の精子形成は体細胞と生殖細胞の相互作用を必要とし、またホルモンや細胞増殖因子など様々な因子によって制御される高次の生命現象である。精子形成に必要な多くの因子を体外で再現することは難しく、試験管内（インビトロ）での精子形成は現在までに成功していない。従って、精子形成の研究は個体レベルでのインビボ解析が中心である。なかでも精子形成に関与する遺伝子のノックアウトマウスは精子形成機構の解明に大きく貢献している。これまで精子形成の各段階に異常をきたす種々のノックアウトマウスが報告されている。例えば、減数分裂後の精子細胞に発現している遺伝子の例として、転写因子ＣＲＥＭ（cyclic AMP-responsive element modulator）が挙げられる。ＣＲＥＭノックアウトマウスは精子細胞の分化停止とアポトーシスを起こし、不妊となる。このことからＣＲＥＭは精子細胞での多くの遺伝子発現を制御していると考えられる（例えば、非特許文献１１、１２参照）。また精子でヒストンに代わってＤＮＡと結合しているプロタミン（Prm-1, -2）のノックアウトマウスは精子数の減少、精子の奇形、精子の化学耐性低下といった症状を示し、不妊となる。プロタミンノックアウトマウスは変異を片アリルに持っていれば症状が出ることが大きな特徴である（例えば、非特許文献１３参照）。これらの他にも近年多くのノックアウトマウスが報告され、精子形成機構の解明に貢献している。
【００１９】
ＣＲＥＭやプロタミンような生殖細胞で発現している遺伝子が重要であることはもちろんであるが、セルトリ細胞などの体細胞で機能している遺伝子も精子形成にとって同様に重要である。細胞接着分子であるネクチン（nectin）−２ノックアウトマウスでは減数分裂後、伸長精子細胞頭部の奇形や精子の運動性低下を示す。ネクチン−２はセルトリ細胞で発現し、生殖細胞では発現していないことから、精子細胞とセルトリ細胞の接着に関与するセルトリ細胞側の因子であると考えられる（例えば、非特許文献１４、１５参照）。効率的な精子形成にセルトリ細胞が果たす役割は大きく、この他にも多くの生殖細胞−セルトリ細胞間相互作用に関わる分子があると考えられる。上記のようなノックアウトマウス以外に、突然変異による不妊マウスも報告されており、解析が行なわれているが、ノックアウトマウスの解析に比べ、突然変異マウスの解析は遅れている。
【００２０】
（遺伝子先行型アプローチと表現型先行型アプローチ）
一般的に遺伝子の機能解析にはノックアウトマウス・トランスジェニックマウスのような遺伝子先行型のアプローチ（gene-driven approach）と、表現型を指標にして変異体を単離し原因を探る表現型先行型のアプローチ（phenotype-driven approach）がある。前者は逆遺伝学（reverse genetics）、後者は“順方向”遺伝学（”forward” genetics）とも呼ばれる。両者は互いに相補的であり、同時に進められることが望ましい。しかし、生殖の分野では変異体の維持・継代が難しく、また遺伝学的な解析が困難であるため、これまで表現型先行型のアプローチが遅れていた。特に優性の不妊突然変異マウスに関しては、これまで原因遺伝子が決定された例はない。しかし、生殖工学が発達し、例え不妊のマウスからであっても子孫が得られるようになったことや、マウスの全ゲノム配列が決定され、変異部位の同定が比較的容易に行えるようになったことで、表現型先行型のアプローチが可能になってきた。実際に生殖細胞をターゲットにしたマウス変異体作製プロジェクトも始まっている（例えば、非特許文献１６参照）。今後生殖に関する変異体の解析が進み、より多くの知見がもたらされることが期待されている。
【００２１】
（コートアクチン）
コートアクチンは分子量８０〜８５ｋＤのアクチン結合タンパク質である。ＨＳ１リピートと呼ばれるおよそ３６アミノ酸の繰り返し配列を含んでおり、Ｃ末端にＳＨ３ドメインを持つ。ＨＳ１リピートの数によって少なくとも３種類のスプライスバリアント（コートアクチン−Ａ：６回，−Ｂ：５回，−Ｃ：４回）が報告されている（図１０参照）。さらに繰り返し回数の少ないタイプ（３，２回）も発現量は少ないながら存在するらしい。コートアクチンと種々のタンパク質との相互作用が報告されており、Ｎ末端を介してＡｒｐ２／３コンプレックス，Ｎ−ＷＡＳＰと、ＨＳ１リピートを介してＦ−アクチンと結合することが知られている。さらにＣ末端のＳＨ３ドメインを介してＺＯ−１，Shank３などの構造タンパク質と結合することが報告されている。タンパク質中のいくつかのＳｅｒ，ＴｈｒおよびＴｙｒ残基がリン酸化を受けることが知られている。これらのことからコートアクチンは細胞内からのリン酸化シグナルを受け取って、アクチン細胞骨格の制御を行なうタンパク質であると考えられている。コートアクチンはヒト乳がんの１５％で遺伝子増幅による発現の増加が見られ、乳がん発症への関与などが報告されているものの、コートアクチンのノックアウトマウスは現在まで報告されておらず、生体内での機能は不明な部分が多いが、Post-Synaptic Density（ＰＳＤ）やTightJunctionへの局在から、細胞の接着や形態変化に関与している可能性が高い（例えば、非特許文献１７〜２０参照）。
【００２２】
【非特許文献１】Kubo H. Sanka to Fujinka (Japanese) 2003; 6: 703-709
【非特許文献２】Matsumiya K. Sanka to Fujinka (Japanese) 2003; 6: 751-756
【非特許文献３】Lilford R, Jones AM, Bishop DT, Thornton J, Mueller R. Case-control study of whether subfertility in men is familial. Bmj 1994; 309: 570-573
【非特許文献４】Buch B, Galan JJ, Lara M, Ruiz R, Segura C, Real LM, Martinez-Moya M, Ruiz A. Scanning of Y-chromosome azoospermia factors loci using real-time polymerase chain reaction and melting curve analysis. Fertil Steril 2003; 80: 907-913.
【非特許文献５】Foresta C, Moro E, Ferlin A. Y chromosome microdeletions andalterations of spermatogenesis. Endocr Rev 2001; 22: 226-239
【非特許文献６】Carlsen E, Giwercman A, Keiding N, Skakkebaek NE. Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years. Bmj 1992; 305: 609-613
【非特許文献７】Skakkebaek NE, Rajpert-De Meyts E, Jorgensen N, Carlsen E, Petersen PM, Giwercman A, Andersen AG, Jensen TK, Andersson AM, Muller J. Germ cell cancer and disorders of spermatogenesis: an environmental connection. Apmis 1998; 106: 3-11; discussion 1
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【非特許文献２０】Schafer DA. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Curr Opin Cell Biol 2002; 14: 76-81
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
近年ヒトの不妊治療に対する需要は大きくなりつつあり、その基盤となる生殖生物学の進歩が望まれるが、生殖細胞形成の分子機構は未だ十分に理解されているとは言い難い。これは生殖細胞形成に関する変異体の解析が十分ではないことがひとつの要因となっている。特に、男性不妊のモデル動物を作製した場合、子孫を作製することが出来ないため、多くの変異マウスが報告されているにも関わらず、原因遺伝子の同定まで至った例はない。本発明の課題は、これまで技術的に維持・継代が困難であった優性精子形態形成不全が引き起こされ男性不妊症を再現できるモデル動物や、かかる男性不妊症モデル動物の維持・継代方法や、かかる男性不妊モデル動物を用いた男性不妊症の予防・治療剤のスクリーニング方法や、男性不妊症の原因物質のスクリーニング方法や、男性不妊症の診断方法などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者らは、インプリンティング遺伝子ＰＥＧ８／ＩＧＦ２ＡＳの機能を調べる目的でトランスジェニックマウス作製した。トランスジェニックマウスが作製される過程では、受精卵に注入された外来のＤＮＡがゲノム上のランダムな場所に挿入されるが、その結果、挿入部位の遺伝子破壊が生じることがある。これを挿入変異（insertional mutation）と呼ぶ。一般的に、トランスジェニックマウスの数％に挿入変異による不妊マウスが生じると言われている。導入配列が本来のマウスゲノムには存在しない配列であった場合、その配列をタグとして変異部位を同定できる。近年マウスの全ゲノム配列が解読され、さらに一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphisms：ＳＮＰｓ）の情報が利用できるようになった結果、これまでよりも比較的簡便にゲノム上の変異部位を調べることが可能になった。また挿入変異には、しばしば染色体の転座や欠失など大規模なゲノムの異常が伴うが、これもゲノム情報の利用によって比較的容易に解析することができるようになった。
【００２５】
インプリンティング遺伝子ＰＥＧ８／ＩＧＦ２ＡＳトランスジェニックマウスの一系統に発生した、精子形態形成不全を示す挿入突然変異マウスを見い出した。哺乳類の精子形成機構解明の為にこのような突然変異マウスは貴重であると考え、挿入変異体である系統の解析を進めた。通常交配ではこの雄から産仔を得ることができず、系統を維持することができないため、体外受精（ＩＶＦ：in vitro fertilization）を行なうことを考えたが、精巣上体に精子がほとんどなくＩＶＦは不可能であった。そこで精巣から採取した精子細胞を未受精卵に注入するＩＣＳＩ（intracytoplasmic sperm injection；顕微授精）を行なったところ、これによって産仔を得ることができ、変異を継代し、このモデルマウスを維持することに成功した。また、変異マウスがもつ遺伝子領域の欠損をＳＮＰsデーターベースを活用することにより解析した。この結果、これまで技術的に維持・継代が困難であった優性精子形成不全マウスの解析に成功し、染色体の片側でコートアクチン遺伝子が欠損したマウスでは、コートアクチンタンパク質の発現量が半分に低下することにより、精子形態形成不全が引き起こされるという男性不妊症が再現できた。また、この遺伝子は小脳でも発現し、このモデルマウスは歩行異常などの行動異常もみられることから、行動制御研究に関するモデルマウスとしても、重要であることがわかった。
【００２６】
以上のように、本発明者らはＰＥＧ８トランスジェニックマウスの一系統に優性の挿入変異Ｄｓｐｄ（Dominant spermiogenesis defect）を見い出し、以下のことを明らかにした。
（１）セルトリ細胞中の特殊接合装置（ＥＳ）に含まれるアクチン繊維層に異常が生じており、伸長精子細胞の形態異常および精上皮からの剥離が起こっていた。
（２）７番染色体と１４番染色体の間に転座が生じていた。７番染色体テロメア近傍に約１Ｍｂのゲノムの欠失があり、そこにマップされるコートアクチンの発現量が低下していた。
（３）正常マウス精巣においてコートアクチンは伸長精子細胞周辺に局在しており、Ｄｓｐｄマウスにおいて精子細胞の異常が起こる時期とよく一致していた。Ｄｓｐｄマウス精巣ではコートアクチンタンパク質およびアクチンの局在が乱れていた。
【００２７】
これらの結果から、Ｄｓｐｄマウスにおいては、コートアクチンの片アリル欠失と発現量の減少が、セルトリ細胞のアクチン繊維（特にＥＳ構造のアクチン層）の制御異常につながり、結果として精子細胞の形態異常と精上皮からの精子細胞の剥離が起こっているという可能性が示された（図１５参照）。このような知見に基づいて、本発明は完成するに至ったものである。
【００２８】
すなわち本発明は、（１）コートアクチンをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、コートアクチンを発現する機能が低下した、あるいは失なった非ヒト動物からなることを特徴とする男性不妊症モデル動物や、（２）遺伝子変異を片アリルに有することを特徴とする上記（１）記載の男性不妊症モデル動物や、（３）歩行異常などの行動異常を示すことを特徴とする上記（１）又は（２）記載の男性不妊症モデル動物に関する。
【００２９】
また本発明は、（４）非ヒト動物がマウスであることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の男性不妊症モデル動物や、（５）マウス精細胞（独立行政法人 理化学研究所バイオリソースセンター寄託番号０１１３６）を用いて作製されたことを特徴とする上記（４）記載の男性不妊症モデル動物や、（６）コートアクチンをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、コートアクチンを発現する機能が低下した、あるいは失なった非ヒト動物から採取した精子細胞を野生型未受精卵に注入して培養後の４〜８細胞胚を、偽妊娠させた非ヒト動物の卵管に移植し、産仔を得ることを特徴とする男性不妊症モデル動物の維持・継代方法に関する。
【００３０】
また本発明は、（７）非ヒト動物がマウスであることを特徴とする上記（６）記載の男性不妊症モデル動物の維持・継代方法や、（８）精子細胞がマウス精細胞（独立行政法人 理化学研究所バイオリソースセンターに寄託番号０１１３６）であることを特徴とする上記（７）記載の男性不妊症モデル動物の維持・継代方法や、（９）上記（１）〜（５）のいずれか記載の男性不妊症モデル動物に、被検物質を投与し、造精機能障害の症状改善の程度を測定・評価することを特徴とする男性不妊症の予防・治療剤のスクリーニング方法に関する。
【００３１】
また本発明は、（１０）以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなる、その発現機能低下又は発現機能喪失が男性不妊症の原因となるタンパク質をコードするＤＮＡに関する。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアクチンとの結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつアクチンとの結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列；
（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつアクチンとの結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアクチンとの結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
さらに、（１１）以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなる、その発現機能低下又は発現機能喪失が男性不妊症の原因となるタンパク質に関する。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がアクチンとの結合活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質がアクチンとの結合活性を有するアミノ酸配列；
【００３２】
また本発明は、（１２）検体中のヒトコートアクチン遺伝子の異常の有無を調べることを特徴とする男性不妊症の診断方法や、（１３）検体中のヒトコートアクチンタンパク質の異常の有無を調べることを特徴とする男性不妊症の診断方法や、（１４）ヒトコートアクチン遺伝子又はヒトコートアクチン遺伝子が発現ベクターにインテグレートされた組換えベクターを有効成分として含有することを特徴とするヒトコートアクチン遺伝子やヒトコートアクチンタンパク質の異常に起因する男性不妊症の治療薬や、（１５）上記（１４）記載の男性不妊症の治療薬を、精巣に投与することを特徴とするヒトコートアクチン遺伝子やヒトコートアクチンタンパク質の異常に起因する男性不妊症の治療方法に関する。
【発明の効果】
【００３３】
男性不妊の原因解明には、変異モデル動物の役割が非常に大きい。本発明では精子形成不全に関する優性の変異を継代し、変異部位を決定した。本発明のコートアクチン遺伝子変異を片アリルに有する変異マウスをもちいた顕微授精を行えば、貴重なモデル動物の維持が可能となり、遺伝子解析も進むことが期待される。また、コートアクチンのように、特定の構造体形成に関与することが明らかになれば、他の構造体遺伝子を含めての不妊のスクリーニングが可能となる。すなわち、本発明によると、これまで技術的に維持・継代が困難であった優性精子形態形成不全が引き起こされ男性不妊症を再現できるモデル動物や、かかる男性不妊症モデル動物の維持・継代方法や、かかる男性不妊モデル動物を用いた男性不妊症の予防・治療剤のスクリーニング方法や、男性不妊症の原因物質のスクリーニング方法や、男性不妊症の診断方法などを提供することができる。
【００３４】
一遺伝子のhaploinsufficiencyによって不妊となるような例は、これまでプロタミン−１，−２（protamine-1,-2）が知られるのみだが ［非特許文献１３，Tanaka H, Miyagawa Y, Tsujimura A, Matsumiya K, Okuyama A, Nishimune Y. Single nucleotide polymorphisms in the protamine-1 and -2 genes of fertile and infertile human male populations. Mol Hum Reprod 2003; 9: 69-73］、ヒトの男性不妊の状況から考えて、このような優性の変異が他にもあることが予想される。精子形成機構の解明、また、ヒト不妊の理解に向けて、Ｄｓｐｄのような、これまで解析できなかった突然変異マウスの解析は重要な意味を持っている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明の男性不妊症モデル動物としては、コートアクチンをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、コートアクチンを発現する機能が低下した、あるいはコートアクチンを発現する機能を失なった男性不妊を発症する非ヒト動物であれば特に制限されないが、遺伝子変異を片アリルに有する非ヒト動物、及び／又は歩行異常などの行動異常を示す非ヒト動物が好ましく、上記非ヒト動物としては、コートアクチンの発現が認められるマウスやラットの他、イヌ、ネコ、ウシ、サル、トリ、魚（ゼブラフィッシュ）、カエル（アフリカツメガエル）、ハエ（ショウジョウバエ）等を例示することができるが、取扱い易さからマウスが好ましい。以下、コートアクチンをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、コートアクチンを発現する機能が低下したコートアクチン遺伝子変異を片アリルに有する男性不妊症モデルマウスについて説明する。
【００３６】
コートアクチン遺伝子変異を片アリルに有する男性不妊症モデルマウスは、後述する実施例に記載のように、トランスジーンをマウス受精卵の雄性前核に注入し、処置受精卵を仮親である偽妊娠雌マウスの卵管に移植して仮親から産まれた産仔（変異マウス）から採取した円形および伸長精子細胞を野生型未受精卵に注入し、４８時間培養の後、４〜８細胞胚を偽妊娠させた雌マウスの卵管に移植し、産仔を得ることもできる。産仔（変異マウス）から採取した伸長精子細胞の一例が、独立行政法人 理化学研究所バイオリソースセンターに寄託番号０１１３６として寄託されている。
【００３７】
また上記実施例記載の方法の他、通常のノックアウトマウスの作製方法を利用することにより得ることもできる。具体的には、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、コートアクチン遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたコートアクチン遺伝子 を組換えＤＮＡ技術により、コートアクチン遺伝子の全部又は一部を、例えばネオマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子で置換し、５'末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入してターゲティングベクターを作製し、この作製されたターゲッティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。
【００３８】
上記組換えＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスと交配させると、コートアクチン遺伝子変異を片アリルに有するヘテロ接合体マウスを得ることができる。このヘテロ接合体マウスから採取した円形および伸長精子細胞を野生型未受精卵に注入し、４８時間培養の後、４〜８細胞胚を偽妊娠させた雌マウスの卵管に移植し、産仔を得ることもできる。なお、このヘテロ接合体マウスを交配させることによって、コートアクチンノックアウトマウスを得ることができるが、ノックアウトマウスが生まれない可能性がある。そのため、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム等を使用して条件的に（例えばセルトリ細胞のみで）欠損させることもできる。
【００３９】
そして、かかる変異マウス（ヘテロ接合体マウス）におけるコートアクチン遺伝子が染色体上で片アリルに欠損していることを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスの精巣からＲＮＡを単離して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法およびウエスタンブロッティング法で、マウス精巣におけるコートアクチン遺伝子とコートアクチンタンパク質の発現量を調べる方法や、このマウスの精子細胞等から抽出したタンパク質をイムノブロット分析等により調べる方法等を挙げることができる。
【００４０】
本発明の男性不妊症モデル動物は、男性不妊症を発症することから、男性不妊発症のメカニズムの解析に有用であり、また、本発明の男性不妊症モデル動物を用いて、男性不妊症の予防・治療剤のスクリーニングに使用することができる。本発明の男性不妊症の予防・治療剤のスクリーニング方法としては、本発明の男性不妊症モデル動物に、被検物質を投与し、造精機能障害の症状改善の程度を測定・評価するスクリーニング方法であれば特に制限されず、造精機能障害の症状改善の程度の測定・評価は、以下の実施例に記載されているように、精巣組織の形態観察を行い、伸長精子細胞の数や配列の乱れ、セルトリ細胞の形態の乱れ、精巣上体管における精子の数などの程度を測定し、対照となる野生型と比較する方法を挙げることができる。
【００４１】
他方乏精子症患者の射出精液中に未成熟精子細胞が多く見られる症例がある一方で、本発明により、コートアクチンの発現量低下がＥＳ構造体の形成不全を引き起こし、精子形成不全となる道筋が明かとなった。また、特殊接合装置の異常、精子細胞の精上皮からの剥離は主に、エストロジェン投与、テストステロン減少などホルモン異常のラット・マウスで観察されてきた現象である。このＥＳ構造体の形成不全は、ダイオキシンをはじめとする環境ホルモンによる精子形成異常の際にも観察されることから、環境ホルモンのターゲット遺伝子がコートアクチンである可能性が高まった。環境ホルモンのターゲット遺伝子であることが確認できれば、環境有害物質のスクリーニングにこの遺伝子の発現解析が非常に有用であることになる。また、環境ホルモンは精子形成だけで無く、行動異常の原因となると考えられており、現在問題になっているキレる子供の増加との関係が示唆されている。神経系への影響は精子形成の１／１００の量でも見られると考えられることから、このような環境有害物質の検出は、現代社会において不可欠である。コートアクチンは中枢神経系（特に、小脳）での発現が観察されており、モデル動物にも歩行異常が確認されている。
【００４２】
そこで、本発明の男性不妊症の原因物質のスクリーニング方法としては、非ヒト動物に被検物質を投与し、コートアクチン遺伝子やコートアクチンタンパク質の異常の有無を調べる方法であれば特に制限されず、上記非ヒト動物としては、コートアクチンの発現が認められるマウスやラットの他、トリ、魚、カエル等を例示することができるが、取扱い易さからマウスが、また、変異の出現し易さから鯉や鮒等の魚が好ましい。これら非ヒト動物のコートアクチン遺伝子の塩基配列としては、マウス（GenBankアクセッションナンバー：15030314）、ラット（GenBankアクセッションナンバー：11177917）、ニワトリ（GenBankアクセッションナンバー：45382632）、ゼブラフィッシュ（GenBankアクセッションナンバー：33417208）、アフリカツメガエル（GenBankアクセッションナンバー：17826995）、ハエ（GenBankアクセッションナンバー：3869203）を挙げることができる。
【００４３】
また、上記被検物質としては、動植物や微生物からの抽出物、各種ペプチド・タンパク質、多糖類、化学合成物質など特に制限されない。
【００４４】
上述の本発明により、コートアクチンの発現機能低下又は発現機能喪失が男性不妊症の原因となることから、コートアクチンが男性不妊症を防除する機能を有するタンパク質であることを見い出した。このような機能に注目したコートアクチンやコートアクチン遺伝子、コートアクチンやコートアクチン遺伝子の使用も本発明に包含される。以下、これらについて説明する。
【００４５】
本発明の“発現機能低下又は発現機能喪失が男性不妊症の原因となるタンパク質をコードするＤＮＡ”としては、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列（ヒトコートアクチン）をコードする塩基配列；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアクチンとの結合活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつアクチンとの結合活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列（ヒトコートアクチンをコードするＤＮＡ）；（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつアクチンとの結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアクチンとの結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；の何れかの塩基配列からなるＤＮＡであれば特に制限されず、また、本発明の“発現機能低下又は発現機能喪失が男性不妊症の原因となるタンパク質”としては、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアクチンとの結合活性を有するアミノ酸配列；又は（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつアクチンとの結合活性を有するアミノ酸配列；の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質であれば特に制限されず、ここで「アクチンとの結合活性を有するタンパク質」とは、アクチンとの結合に何らかの形で関与するタンパク質を意味し、その具体的な作用機構は特に限定されないが、アクチンとの結合能を好適に例示することができる。
【００４６】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
【００４７】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００４８】
上記「配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列との相同性が６０％以上であれば特に制限されるものではなく、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であることを意味する。
【００４９】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００５０】
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００５１】
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列又は塩基配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
【００５２】
本発明の“その発現機能低下又は発現機能喪失が男性不妊症の原因となるタンパク質”の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来の単離タンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
【００５３】
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明の“その発現機能低下又は発現機能喪失が男性不妊症の原因となるタンパク質”を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。
【００５４】
さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示す配列番号１に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてヒト以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、動物細胞用発現ベクターに組み込み適当な動物細胞で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。
【００５５】
コートアクチンが、精子形成に重要なＥＳ構造体に含まれること、変異マウスでは細胞内局在が変化していることを明らかにしたことから、このタンパク質の発現量の低下が男性不妊の原因となる可能性が高い。また、現在でも、このような症例の場合、顕微授精法によって子供を得ることができるが、本来起きないはずの男性不妊症を遺伝させた例がすでに報告されている。顕微受精後、受精卵診断をすることにより、正常遺伝子をもった個体を子宮に戻すことにより、このような医療に伴うリスクを無くすことが可能となる。このように、ヒトコートアクチン遺伝子の変異やヒトコートアクチンタンパク質の変異のスクリーニングにより、ヒトにおいて男性不妊症患者の診断を行うことが可能になる。本発明の男性不妊症の診断方法としては、検体中のヒトコートアクチン遺伝子の異常の有無やヒトコートアクチンタンパク質の異常の有無を調べる方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、かかる遺伝子配列決定法を利用した遺伝子診断は、ターゲットとするヒトコートアクチン遺伝子を精子細胞から単離したのち、増幅・精製し、遺伝子の塩基配列決定用装置を用いて、ヒトコートアクチン遺伝子の塩基配列を読むことによって行うことができるが、その操作に膨大な作業量と非常に長い時間、さらには多大のランニングコストを要することから、種々提案されている改良法（特開２００４−０９３２９７号公報、特開２００３−２１５０３１号公報、特開２００３−１５９０５４号公報、特開２００３−１５６４７６号公報、特開２００２−３４０８５９号公報、特開２００２−３４０８５８号公報、特開２００２−３４０８５７号公報、特開２００２−３３３４４４号公報、特開２００２−１７１９８８号公報参照）を有利に用いることができる。また、ヒトコートアクチンタンパク質の異常の有無は、タンパク質の構造異常の他、その発現量や局在の異常を測定することにより調べることができる。
【００５６】
本発明のヒトコートアクチン遺伝子やヒトコートアクチンタンパク質の異常に起因する男性不妊症の治療薬としては、ヒトコートアクチン遺伝子又はヒトコートアクチン遺伝子が発現ベクターにインテグレートされた組換えベクターを有効成分として含有するとする予防・治療剤を挙げることができ、発現ベクターとしては、例えば、非分裂細胞を含む全ての細胞（血球系以外）での一過性発現に用いられるアデノウイルスベクター（Science,252, 431-434, 1991）や、分裂細胞での長期発現に用いられるレトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology, 158, 1-23, 1992）や、非病原性、非分裂細胞にも導入可能で、長期発現に用いられるアデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992）や、リポソーム等を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これらの中でも、高い効率で細胞系や生体の臓器における遺伝子発現が可能なアデノウイルスベクターが特に好ましい。また、これらの発現ベクターへのヒトコートアクチン遺伝子の導入は常法によって行うことができ、例えばこれら発現ベクター中の適当なプロモーターの下流にヒトコートアクチン遺伝子等を挿入することにより発現ベクターを構築することができる。ヒトコートアクチン遺伝子は、プラスミドＤＮＡを単独で投与する方法、遺伝子キャリアー分子を使った方法、デンドリティックポリリジンを用いた遺伝子デリバリー法等の遺伝子治療を目指した従来公知の遺伝子デリバリー技術により精巣までデリバリーされ、コートアクチンを発現する。
【００５７】
これら予防・治療薬は、男性患者の不妊症発症の予防や、不妊症を発症した男性患者の治療等に用いることができる。医薬品として用いる場合、経口的あるいは非経口的に投与することができるが、静脈投与等の非経口的投与が好ましい。非経口投与剤として注射剤、経皮製剤あるいは座薬等とすることができる。また、経口投与剤としては散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤などの液状製剤とすることができる。これらの製剤は活性成分に薬理学的、製剤学的に認容される助剤を加えることにより常法に従って製造することができる。助剤としては、例えば、経口剤および粘膜投与剤にあっては、軽質無水ケイ酸、澱粉、乳糖、結晶セルロース、乳糖カルシウム等の賦形剤、カルボキシメチルセルロ−ス等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシム等の滑沢剤などの製剤用成分が、また注射剤にあっては、生理食塩水、マンニトール、プロピレングリコ−ル等の溶解剤ないし溶解補助剤、界面活性剤などの懸濁化剤などの製剤用成分が、さらに外用剤にあっては、水性ないし油性の溶解剤ないし溶解補助剤、粘着剤などの製剤用成分が使用される。また、投与量は、対象疾患の種類、患者の年齢、性別、体重、症状、投与形態に応じて適宜決定することができる。
【００５８】
本発明のヒトコートアクチン遺伝子やヒトコートアクチンタンパク質の異常に起因する男性不妊症の治療方法としては、上記のヒトコートアクチン遺伝子やヒトコートアクチンタンパク質の異常に起因する男性不妊症の治療薬を、精巣に投与する方法であれば特に制限されず、生体への遺伝子導入法としては、実際にインビボエレクトロポレーション法でセルトリ細胞の障害をレスキューした例が報告［Yomogida K, Yagura Y, Nishimune Y. Electroporated transgene-rescued spermatogenesis in infertile mutant mice with a sertoli cell defect. Biol Reprod 2002; 67: 712-717］されていることからして、インビボエレクトロポレーション法 ［ Muramatsu T, Shibata O, Ryoki S, Ohmori Y, Okumura J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochem Biophys Res Commun 1997; 233: 45-49，Yamazaki Y, Fujimoto H, Ando H, Ohyama T, Hirota Y, Noce T. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biol Reprod 1998; 59: 1439-1444］を操作の簡便さ・安全性の点で好適に例示することができる。導入効率のみを考えるならば、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウィルス等のウィルスベクターが有効である。
【００５９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６０】
（マウスの単離と表現型解析）
ＰＥＧ８／ＩＧＦ２ＡＳトランスジェニックマウスの一系統に、トランスジーンの挿入変異により雄マウスが重度の精子形成不全を示し不妊となる変異マウス系統が発生した。トランスジェニックマウスを作製する際には数％の割合で不妊マウスが発生することが従来から知られているが、このような変異マウスは維持・継代が難しく、また本来の実験の目的から外れてしまうために解析されずに失われることが多かった。しかし、不妊変異マウスの解析は生殖生物学にとって重要であると考え、この不妊マウスの解析を進めることにした。表現型解析の結果、不妊マウスの精巣では精子形態形成の異常が起こっていることが明らかになったため、変異マウスはＤｓｐｄ（Dominant spermiogenesis defect）と名付けた。
【００６１】
通常の交配からは産仔を得ることができず、解析を進めることができないため、精子細胞（spermatid）の核を未受精卵に直接注入するＩＣＳＩ（intracytoplasmic sperm injection）の技術を用いることにした。ＩＣＳＩは既にヒトにも応用されている生殖補助技術である。完成精子が無くても、伸長精子細胞さえあれば子を得ることができるため、男性不妊の治療に非常に強力な方法であるが、マウスに応用することで不妊変異マウスの維持・継代が可能となる。Ｄｓｐｄ変異マウスの異常は減数分裂後の異常であったため、ＩＣＳＩを適用することで変異を維持し、それに続く解析を行なうことが可能になった。
【００６２】
［実験方法］
１．トランスジェニックマウスの作製
ヒトＰＥＧ８／ＩＧＦ２ＡＳ ｃＤＮＡ全長（GenBank Accession Number：ＡＢ０３０７３３） ［ Okutsu T, Kuroiwa Y, Kagitani F, Kai M, Aisaka K, Tsutsumi O, KanekoY, Yokomori K, Surani MA, Kohda T, Kaneko-Ishino T, Ishino F. Expression and imprinting status of human PEG8/IGF2AS, a paternally expressed antisense transcript from the IGF2 locus, in Wilms' tumors. J Biochem (Tokyo) 2000; 127: 475-483］をｐＣＡＧＧＳ発現ベクターに組み込み、制限酵素Ｂａｍ ＨＩおよびＳａｌ Ｉで切り出した４．５ｋｂの断片をコンストラクトとして用いた。ニワトリアクチンプロモータおよびＣＭＶ−ＩＥエンハンサーの影響下でＰＥＧ８／ＩＧＦ２ＡＳが発現するよう設計されているこのコンストラクトをマウス受精卵（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＣ３Ｈ）Ｆ1の雄性前核に注入し、処置受精卵を仮親である偽妊娠雌マウスの卵管に移植した。仮親から産まれた産仔の尾からゲノムＤＮＡを採取し、コンストラクトをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションによってトランスジーンの有無を確認し、トランスジェニックマウスを選別した。
【００６３】
２．ＲＴ−ＰＣＲによるトランスジーンの発現確認
作製したトランスジェニックマウス各系統雄の精巣から、組織（精巣一個）を１ｍｌのＩＳＯＧＥＮ（Nippon Gene）中でホモジェナイズした。０．２ｍｌのクロロホルムを加え、激しく混和した後、遠心（１５，０００ｒｐｍ，１０分間，４℃）して、水層（約０．５ｍｌ）を回収し、等容のイソプロパノールを加え混和し、遠心後、ペレットを２５０μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解し、０．７５ｍｌのＩＳＯＧＥＮ−ＬＳを加え、上記操作を再度繰り返した。１０ｘＤＮａｓｅ buffer，ＤＮａｓｅを加え、室温にて３０分間ＤＮａｓｅ処理を行った。フェノール抽出を２回、クロロホルム抽出を２回行ない、タンパク質を除去した。エタノール沈殿の後１００μｌ ＤＥＰＣ水に溶解した。以上の手順で全ＲＮＡを調製した。
【００６４】
調製したＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、それを鋳型として下記のプライマーを用いてＰＥＧ８／ＩＧＦ２ＡＳを増幅するＰＣＲを行なうことで、トランスジーンの発現を確認した。ｃＤＮＡの調製法は SUPERSCRIPT preamplification system（GIBCO BRL）に従った。
ＰＥＧ８−Ｆ：５'-ＴＧＧＡＣＡＣＡＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＧ-３'（配列番号３）ＰＥＧ８−Ｒ：５'-ＣＣＴＧＧＧＡＡＴＧＣＴＣＡＴＴＣＡＴＧ-３'（配列番号４）
【００６５】
３．顕微授精
変異マウスから採取した精細胞を保存液（ＰＢＳ（−）中，７．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ），７．５％グリセロール）中で凍結保存した。融解後、円形および伸長精子細胞を野生型未受精卵に注入した。４８時間培養の後、４〜８細胞胚を偽妊娠させた雌ＩＣＲマウスの卵管に移植し、産仔を得た。［ Ogura A, Matsuda J, Asano T, Suzuki O, Yanagimachi R. Mouse oocytes injected with cryopreserved round spermatids can develop into normal offspring. J Assist Reprod Genet 1996; 13: 431-434、Ogura A, Ogonuki N, Inoue K, Mochida K. New microinsemination techniques for laboratory animals. Theriogenology 2003; 59: 87-94］
【００６６】
４．ウエスタンブロッティング法によるＰＥＧ８／ＩＧＦ２ＡＳタンパク質の発現確認
ヒスチジンタグを付加したＰＥＧ８タンパク質（Ｈｉｓ−ＰＥＧ８）を大腸菌内で合成し、Probond Nickel-Chelating Resin（Invitrogen）を用いて精製した。Ｈｉｓ−ＰＥＧ８で免疫されたウサギから抗ＰＥＧ８血清を得た。トランスジェニックマウス各系統の精巣から細胞抽出液（whole cell extract）を調製し、１０μｇのタンパク質を含む抽出液を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、泳動されたタンパク質をＨｙｂｏｎｄ−Ｐ（Amersham）メンブレンに転写した。Ｈｉｓ−ＰＥＧ８をポジティブコントロールとして同時に泳動した。メンブレン上のタンパク質と抗ＰＥＧ８血清を反応させ、ECL ウエスタンブロッティング detection system（Amersham）を用いて可視化した。
【００６７】
５．組織形態観察
光学顕微鏡による観察：精巣および精巣上体をBouin’s solution（０．９％ピクリン酸，９％ホルムアルデヒド，５％酢酸）で一晩固定し、７０％エタノール中での洗浄の後、定法によりパラフィン包埋した。厚さ３〜４μｍの切片を切り出し、キシレン中での脱パラフィン、エタノール溶液系列中での置換の後、ヘマトキシレン−エオジン（Ｈ−Ｅ）染色を行なった。光学顕微鏡下で１５匹のＤｓｐｄ／ｗｔ雄マウスを観察し、同様の所見を得た。精子細胞の減少を定量するため、光学顕微鏡で組織切片上の精子細胞数を調べた。ステージＩ〜VI（ステップ１５）とステージVII〜VIII（ステップ１６）、それぞれのステージの精細管あたりの精子細胞数を数えた。正常マウスとＤｓｐｄ／ｗｔマウスを３個体ずつ、一個体あたり各ステージ１０本ずつの精細管を調べ、精細管あたり精子細胞数の平均値を比較した。
【００６８】
透過電子顕微鏡による観察：精巣組織の小片を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）中２．５％グルタールアルデヒド，２％パラホルムアルデヒド溶液での固定の後、１％  オスミウムテトラオキシドで固定した。脱水後、組織をエポン／アラルダイト樹脂に包埋し、超薄切片を作製した。切片を酢酸ウラニル・クエン酸鉛による染色後電子顕微鏡（ＪＥＭ−１２１０，ＪＥＯＬ）で観察した。電子顕微鏡で４匹のＤｓｐｄ／ｗｔ雄マウスを観察し、同様の所見を得た。
【００６９】
［結果］
ヒトのインプリンティング遺伝子ＰＥＧ８／ＩＧＦ２ＡＳの機能を調べるためにトランスジェニックマウスが作製された。ＰＥＧ８／ＩＧＦ２ＡＳはWilms 腫瘍発生の原因遺伝子である可能性が示唆されていたが、４系統（１Ｌ，１１Ｌ，１６Ｌ，１９Ｌ）作製されたトランスジェニックマウスのいずれにも腫瘍は認められなかった。４系統のうち、１Ｌ系統の雄マウスが不妊であった。他の系統のマウスには表現型の異常は認められなかった。各系統の雄の精巣におけるトランスジーンの発現をＲＴ−ＰＣＲで調べたところ、全ての系統でＰＥＧ８のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルでの発現を確認した（図５（Ｃ））。１Ｌ，１１Ｌ，１９Ｌは同程度の発現量を示し、１６Ｌではそれらに比べ発現量は少なかった。さらに、抗ＰＥＧ８血清を用いたウエスタンブロッティング解析の結果、１Ｌ，１９Ｌの精巣で、ＰＥＧ８タンパク質を検出することはできなかった（図５（Ｄ））。
【００７０】
全ての系統でトランスジーンのｍＲＮＡが発現しており、また、ウエスタンブロッティング解析の結果からＰＥＧ８がタンパク質として機能しているとは考えにくいことから、１Ｌ系統における不妊の原因は、ＰＥＧ８トランスジーンの発現ではなく、トランスジーンがゲノムに挿入された際に挿入部位の遺伝子を破壊した挿入変異である可能性が高いと考えた。ＰＥＧ８遺伝子の機能を調べる目的でトランスジェニックマウスを作製したが、哺乳類の精子形成機構解明の為にこのような突然変異マウスは貴重であると考え、挿入変異体である１Ｌ系統の解析を進めた。通常交配では１Ｌ雄から産仔を得ることができず、系統を維持することができないため、体外受精（ＩＶＦ：in vitro fertilization）を行なうことを考えたが、精巣上体に精子がほとんどなくＩＶＦは不可能であった。そこで精巣から採取した精子細胞を未受精卵に注入するＩＣＳＩ（intracytoplasmic sperm injection）を行なったところ、これによって産仔を得ることができた。ＩＣＳＩにより変異を継代し、これに続く解析が可能になった（図５参照）。なお、精子細胞の一例が、独立行政法人 理化学研究所バイオリソースセンターに寄託番号０１１３６として寄託されている。
【００７１】
トランスジーンを受け継いだＴｇ（＋）雄マウスは全て不妊であったが、Ｔｇ（＋）雌およびＴｇ（−）雄には表現型の異常は認められなかった。変異（トランスジーン）を片アリルに持っていれば不妊となる、すなわち優性の変異であることは興味深い。Ｔｇ（＋）雌からは通常の交配で産仔を得ることができたが、正常なマウスに比べて一回の出産数が少ない傾向（平均３．０匹，Ｓ．Ｄ．＝１．１，ｎ＝１２）が見られた。続いて、不妊の原因をより詳細に調べるため精巣組織の形態観察を行なったところ、精子形態形成過程（spermiogenesis）での異常が明らかになった。そこで、この変異をＤｓｐｄと命名した。Ｄｓｐｄマウスの精巣および精巣上体の組織像を図６に示した。
【００７２】
Ｄｓｐｄマウス（Ｄｓｐｄ／ｗｔ）精巣では円形精子細胞（round spermatid）は正常であったが、伸長精子細胞（elongated spermatid）の数が減少しており、伸長精子細胞の配列も乱れていた。セルトリ細胞の形態が乱れており、精上皮中に空隙が見られるものもあった。精細管（ステージＩ〜VI）あたりのステップ１５伸長精子細胞の数は正常個体のおよそ３０％であった。伸長精子細胞の大部分が異常な形態の核（頭部）を持っていた。精上皮の最も管腔側に位置したステップ１６精子細胞は著しく減少していた。精細管（ステージVII〜VIII）あたりのステップ１６精子細胞の数は正常個体の７％であった。精上皮中には多核の精子細胞も散見された。ライディッヒ細胞（Leydig cell）は形態的には正常であった。精巣上体尾部の観察では、正常マウス（ｗｔ／ｗｔ）の精巣上体管が完成精子で満たされていたのに対して、変異マウスの精巣上体管にはほとんど精子が見られず、また数少ない精子の頭部も形態異常を示していた。興味深いことに精巣上体には未成熟な精子細胞の残骸が多く見られた。これは精上皮から剥離（exfoliation）した精子細胞が精巣上体に流れてきたものと思われる。
【００７３】
精子細胞の精上皮からの剥離は、電子顕微鏡観察によってより明らかになった（図７参照）。未成熟な精子細胞が精上皮からはがれ、管腔に遊離している像が得られた。遊離した伸長精子細胞は異常な形態の核を持っており、いくつかの細胞はおそらくセルトリ細胞のものと思われる細胞質を伴って上皮からはがれていた。少数の円形精子細胞も管腔に遊離している像が見られたが、これらは形態的には正常であった。これらの観察結果から、Ｄｓｐｄマウスの精巣では、伸長精子細胞が完成精子に向かって成熟していく過程で、多くの細胞が精上皮からはく離してしまい、結果として完成精子数の著しい減少が起こっていると考えられる。精子細胞の奇形と精上皮からのはく離は、エストロジェン化合物であるＥ２Ｂ（beta-estradiol 3-benzoate）を投与されたマウスに見られる現象である（非特許文献９参照）。同様な現象が、やはりエストロジェン作用を持つ化合物であるＢＰＡ（bisphenol A）投与マウスにも見られる。Ｅ２Ｂ投与マウスのセルトリ細胞では、セルトリ−精子細胞特殊接合装置（Sertoli-spermatid ectoplasmic specialization；ＥＳ）と呼ばれる精子細胞との結合構造に異常が生じており、それが精子細胞の形態異常や精上皮からのはく離につながっていると考えられている。Ｄｓｐｄマウスの精巣組織像がＥ２Ｂ投与マウスのそれと類似していたことからＥＳ構造の異常が疑われた。電子顕微鏡観察によって変異マウスのＥＳ構造を調べたところ、アクチン層が全くないもの、一部欠損したもの、アクチン繊維の配列が異常なもの等が認められた（図７参照）。これはＥ２Ｂ投与マウスと同様な現象がこの変異マウスで起こっていることを示唆している。エストロジェン投与によってＥＳ構造が障害を受ける機構は現在のところ全く分かっておらず、Ｄｓｐｄマウスの解析がこの機構の解明に寄与する可能性がある。
【実施例２】
【００７４】
（Ｄｓｐｄマウスのゲノム解析）
通常、遺伝学的にゲノム上の変異部位を同定（マッピング）するためには、1)変異マウスを正常マウスと交配し、2)表現型を受け継いだ子孫を選別し、3)多型マーカーなどを利用してゲノムのどの部分を変異マウスから受け継いだか調べる、という手順を何世代も繰り返す必要がある。ＳＮＰｓなどゲノム配列の情報が整備されたことで、従来よりも非常に精度の高いマッピングが可能となったとはいえ、マウスは妊娠期間がおよそ２０日、繁殖年齢に達するまでにおよそ２ヶ月かかるため、上記の一サイクルには少なくとも３ヶ月が必要で、この方法には多くの時間を要する。またＤｓｐｄのような不妊変異にはこのような解析を行なうことは難しい。点突然変異はこのような方法で変異部位を同定するしかないが、それに対して挿入変異の場合には、外来ＤＮＡ配列をタグとして利用し、一世代（一個体）から比較的短時間で変異部位を同定できるという大きな利点がある。
【００７５】
おおまかに変異部位を同定するため、まずＦＩＳＨ（fluorescein in situ hybridization）法によって、どの染色体上にトランスジーンが挿入されているのかを調べた。続いてトランスジーンの配列をプローブとして、ゲノムライブラリーから変異部位を含むクローンを得、トランスジーンに隣接する配列から変異部位を同定した。先に述べたように、挿入変異はしばしば染色体転座や欠失など大規模なゲノムの異常を伴う。中西らは、作製したＧＦＰトランスジェニックマウス系統の約５％に染色体の転座が見られたことを報告している［ Nakanishi T, Kuroiwa A, Yamada S, Isotani A, Yamashita A, Tairaka A, Hayashi T, Takagi T, Ikawa M, Matsuda Y, Okabe M. FISH analysis of 142 EGFP transgene integration sites into the mouse genome. Genomics 2002; 80: 564-574］。このような染色体転座はしばしば大規模なゲノムの欠失を伴う。従来、特に大規模なゲノムの欠失を解析するのは容易ではなかったが、ＳＮＰｓを用いることで、比較的容易に欠失の大きさを決定することができるようになった。そこで変異部位に生じたゲノムの欠失の大きさを一塩基多型（single nucleotide polymorphisms；ＳＮＰｓ）の情報が含まれたCelera Genomics社のゲノムデータベースを用いて解析した。
【００７６】
［実験方法］
１．ＦＩＳＨ解析
トランスジーン全長をプローブとしてＦＩＳＨ解析を行なった。Ｔｇ（＋）のＦ1雄とＦ3雌を一匹ずつ、計２個体を解析した。
【００７７】
２．ゲノミックライブラリーのスクリーニング
Ｄｓｐｄマウスから採取したゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化した後、コスミドベクターSupercos I（Stratagene）とライゲーションした。その産物をGigapack III XL（Stratagene）を用いてパッケージングし、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに感染させた。このように作製したコスミドライブラリーを、ＰＥＧ８ ｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニングした。
【００７８】
３．ＳＮＰｓを用いたゲノム欠失領域の解析
Ｄｓｐｄ変異を持つ（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ２）Ｆ1マウスを、ＩＣＳＩによって作製した。得られたＦ1マウス（Ｔｇ（＋），Ｔｇ（−）それぞれ３匹ずつ）からゲノムＤＮＡを採取し、ＤＢＡ２とＣ５７ＢＬ／６の間に多型のある配列をＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ産物の配列をdirect sequencing法で読むことで多型の有無を確認した。マウス系統間の多型情報はCelera Genomics社のデータベース（Celera Discovery System, Celera Genomics, HYPERLINK http://www.celera.com/ http://www.celera.com/）から得た。解析に使用した多型の名称（mCV---）とプライマー配列は以下の通り。
７番染色体
ｍＣＶ２４６６０８２５：
５'-ＣＡＴＧＧＧＡＣＴＧＴＧＡＴＧＧＴＡＡＣ-３'（配列番号５），５'-ＧＣＡＴＧＴＧＴＡＴＣＴＧＣＴＣＡＡＧＧ-３' （配列番号６）
ｍＣＶ２４８５４７５０：
５'-ＡＣＡＣＧＣＡＧＡＴＧＣＴＣＴＧＴＡＧ-３'（配列番号７），５'-ＡＴＧＴＡＴＣＴＡＡＣＡＧＴＧＡＡＧＧＣＣ-３'（配列番号８）
ｍＣＶ２３７０５２３９
５'-ＧＡＡＧＣＡＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧＣ-３'（配列番号９），５'-ＧＴＡＡＡＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＣＡＧＴＧ-３'（配列番号１０）
ｍＣＶ２２８１０８４０：
５'-ＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣ-３'（配列番号１１），５'-ＡＡＣＴＣＴＣＣＣＡＧＧＴＴＴＧＴＴ-３'（配列番号１２）
ｍＣＶ２４８５６１１５：
５'-ＣＣＡＴＧＴＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＧＧ-３'（配列番号１３），５'-ＧＡＴＣＴＧＴＣＡＴＴＧＡ  ＧＴＧＴＡＣＣＣ-３'（配列番号１４）；
ｍＣＶ２４３１７９０４：
５'-ＴＣＧＧＡＧＣＡＧＴＡＡＣＴＣＴＧＴＧ-３'（配列番号１５），５'-ＧＧＡＧＴＡＣＡＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＧ-３'（配列番号１６）
ｍＣＶ２２５３２４０３：
５'-ＧＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡＣＡＣＴＡＡＧＣ-３'（配列番号１７），５'-ＡＧＴＡＡＡＴＧＣＡＧＡＡＡＴＡＧＣＴＧＧ-３'（配列番号１８）
ｍＣＶ２２９８９８３６：
５'-ＣＣＡＡＧＧＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＡＡＧ-３'（配列番号１９），５'-ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＴＧＴＧＡＴＣＡＧ-３'（配列番号２０）
１４番染色体
ｍＣＶ２４９７５９６０：
５'-ＣＡＡＣＴＧＴＧＴＣＡＣＡＧＴＡＴＧＧ-３'（配列番号２１），５'-ＧＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＴＧＴＧＧ-３'（配列番号２２）；
ｍＣＶ２２７６４７６７：
５'-ＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴＧＡＴＣＴＣ-３'（配列番号２３），５'-ＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＧ-３'（配列番号２４）；
ｍＣＶ２４９８６２６４：
５'-ＴＧＴＧＣＡＣＡＣＴＧＴＡＡＣＡＡＡＣＣ-３'（配列番号２５），５'-ＧＣＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣＡＴＴＧＴＴＣＣ-３'（配列番号２６）；
ｍＣＶ２４６１６５６４：
５'-ＣＴＧＣＡＧＣＣＡＴＡＡＡＡＣＴＴＣＣ-３'（配列番号２７），５'-ＣＡＡＧＧＧＴＣＴＴＴＡＴＣＡＣＣＡＣ-３'（配列番号２８）；
ｍＣＶ２３８５９８２２：
５'-ＴＴＣＡＧＧＴＴＧＣＴＴＧＴＡＡＧＣＣ-３'（配列番号２９），５'-ＴＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＧＡ  ＴＴＧＣＴＧ-３'（配列番号３０）
【００７９】
［結果］
ＦＩＳＨ解析の結果、Ｄｓｐｄマウスの染色体には転座が起こっていることが明らかになった。７番染色体のテロメア近傍に１４番染色体のＣ−Ｅ領域が結合した長い融合染色体と、１４番染色体の近位部を含んだ短い染色体が観察された。トランスジーンは融合染色体の７番と１４番の結合部に挿入されていた（図８（Ａ））。調べた２個体（Ｆ1とＦ3各一個体）は同じ核型であった。このことは転座の結果生じた２本の異常染色体が対になって遺伝していることを示唆している。前章で述べた、Ｄｓｐｄ変異を持つ雌の一回の出産数が少ない傾向（平均３．０匹）は、減数分裂時の異常染色体の組み合わせによって発生しない卵ができてしまうことによる可能性が高い。ゲノミックライブラリーから単離したトランスジーンに隣接する配列は７番染色体と１４番染色体にマップされた。これはＦＩＳＨの結果と矛盾しない。続いて、トランスジーン挿入部位にゲノムの欠失が起こっているかどうかを調べるために２つのマウス系統（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ２）間のＳＮＰｓを用いてアリルの有無を調べた。ＳＮＰｓのマッピング情報と名称はCelera genomics社のデータベースに基づいた。ＳＮＰｓ解析の結果を図８（Ｂ）にまとめた。
【００８０】
１４番染色体については、調べた全てのマーカーについて、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）とＤＢＡ２（Ｄ２）両方のアリルを検出した。トランスジーンとマウスゲノムの結合部（Tg-genome ジャンクション）から、最も近いマーカーであるｍＣＶ２４６１６５６４までの物理的距離はおよそ１メガベース（Ｍｂ）である。これはこの領域に１Ｍｂを超える欠失は生じていないことを示している。従って、最も近くにマップされている遺伝子Ｓｆｔｐｄは両アリルとも揃っている。Tg-genomeジャンクションからｍＣＶ２４６１６５６４までの１Ｍｂは現在のところ解析できていない。これはこの領域が反復配列を多く含んでおり、ゲノム配列が未完成であることによる。しかし、この領域のドラフト配列を調べた結果から、機能を持った遺伝子がある可能性は低いと考えている。一方で７番染色体の変異部位では、Tg-genomeジャンクションよりも遠位側（テロメア側）ではＤ２アリルのみが検出された。ジャンクションよりも近位側にある遺伝子Ｄｈｃｒ７近傍のマーカーでは両アリルが検出された。ｍＣＶ２４８５４７５０からｍＣＶ２２５３２４０３までの全てのマーカーではＢ６アリル（すなわち転座が生じている異常アリル）の欠失が起こっていた。ジャンクションからｍＣＶ２２５３２４０３（欠失している最も遠いマーカー）までの距離はおよそ１．２Ｍｂである。よりテロメア寄りのマーカーｍＣＶ２２９８９８３６で再びＢ６アリルを検出した。これは７番染色体の、ジャンクションからｍＣＶ２２５３２４０３までの１Ｍｂを超える領域が欠失していることを示している。ｍＣＶ２２５３２４０３とｍＣＶ２２９８９８３６の間には遺伝子はマップされていない。これらのデータからＤｓｐｄマウスの変異部位を図９にまとめた。７番染色体はトランスジーンを介して１４番染色体Ｃ−Ｅ領域と結合している。１４番染色体近位部は７番染色体のテロメアと結合していると思われる。７番染色体テロメア近傍の１Ｍｂを越える領域が欠失している。１４番染色体には少なくとも１Ｍｂよりも大きな欠失は見られない。
【００８１】
７番染色体の欠失領域には６個の既知遺伝子（Ｃｔｔｎ，Ｆａｄｄ，Ｆｇｆ３，Ｆｇｆ４，Ｆｇｆ１５，Ｃｃｎｄ１）と、少なくとも５個の機能未知遺伝子（ＬＯＣ２３３９７７，ＡＵ０４０５７６，２２１００１０Ｎ１０Ｒｉｋ，ＢＣ０２５８９０，ＢＣ０１９７１１）が存在する。既知の遺伝子のうち、Ｃｔｔｎを除く５個の遺伝子（Ｆａｄｄ，Ｆｇｆ３，Ｆｇｆ４，Ｆｇｆ１５，Ｃｃｎｄ１）についてはノックアウトマウスの報告があり、精子形成に関する異常は報告されていない[Yeh WC, Pompa JL, McCurrach ME, Shu HB, Elia AJ, Shahinian A, Ng M, Wakeham A, Khoo W, Mitchell K, El-Deiry WS, Lowe SW, Goeddel DV, Mak TW. FADD: essential for embryo development and signaling from  some, but not all, inducers of apoptosis. Science 1998; 279: 1954-1958、Zhang J, Cado D, Chen A, Kabra NH, Winoto A. Fas-mediated apoptosis and activation-induced T-cell proliferation are defective in mice lacking FADD/Mort1. Nature 1998; 392: 296-300、Mansour SL, Goddard JM, Capecchi MR. Mice homozygous for a targeted disruption of the proto-oncogene int-2 have developmental defects in the tail and inner ear. Development 1993; 117: 13-28、Moon AM, Boulet AM, Capecchi MR. Normal limb development in conditional mutants of Fgf4. Development 2000; 127: 989-996、Ornitz DM, Itoh N. Fibroblast growth factors. Genome Biol 2001; 2: REVIEWS3005、Sicinski P, Donaher JL, Parker SB, Li T, Fazeli A, Gardner H, Haslam SZ, Bronson RT, Elledge SJ, Weinberg RA. Cyclin D1 provides a link between development and oncogenesis in the retina and breast. Cell 1995; 82: 621-630]（表１参照）。
【００８２】
【表１】
2006006311.tif 000002
【００８３】
したがってこれらの５遺伝子の欠失は、少なくともそれぞれ単独では、Ｄｓｐｄの表現型を説明できない。しかし、複数の遺伝子の欠失が組み合わされて精子形成異常を引き起こす可能性は否定できない。Ｆａｄｄ，Ｆｇｆ４，Ｆｇｆ１５のホモ変異マウスは胎児期に致死（但しヘテロでは異常なし）であることが報告されていることから、Ｄｓｐｄのホモ変異体は、もし作られたとすると、胎児期致死であることが予想される。他の５個の機能未知遺伝子が表現型に寄与している可能性は現在のところ排除できない。これらのなかで、アミノ酸配列から、ＬＯＣ２３３９７７はレセプタータイプのprotein tyrosine phosphatase、ＢＣ０２５８９０は膜６回貫通型のイオンチャンネルタンパク質、ＢＣ０１９７１１はＧタンパク質共役受容体であると予想された。欠失が見られたマウス７番染色体遠位部はヒト１１番染色体長腕（１１ｑ１３）と相同性が高く、遺伝子の配列もほぼ完全に保存されている。従って、ヒトでも１１ｑ１３の欠失によって、Ｄｓｐｄマウスと同様の組み合わせで遺伝子の欠失が起こり得る。しかし、現在までに１１ｑ１３とヒトの男性不妊の関連は報告されていない。Ｄｓｐｄの表現型の責任遺伝子として、様々な可能性が残されているものの、その局在と予想される機能からＣｔｔｎ遺伝子が最も有力な候補であると考えられる。Ｃｔｔｎはアクチン結合タンパク質であるコートアクチンをコードしている。コートアクチンは細胞内からのリン酸化シグナルを受け取って、アクチン細胞骨格の制御を行なうタンパク質であると考えられている。
【実施例３】
【００８４】
（Ｄｓｐｄマウスで片アリル欠失していたコートアクチンの解析）
Ｄｓｐｄマウスにおいて片アリルの欠失が見られたＣｔｔｎ遺伝子とその産物であるコートアクチンタンパク質について解析した。また、ラット精巣においてコートアクチンが精子細胞周辺に局在しているという報告［Chapin RE, Wine RN, Harris MW, Borchers CH, Haseman JK. Structure and control of a cell-cell adhesion complex associated with spermiation in rat seminiferous epithelium. J Androl 2001; 22: 1030-1052］があり、コートアクチンがＤｓｐｄの原因遺伝子として有力な候補であると考えられた。また電子顕微鏡での表現型解析からＤｓｐｄマウスではセルトリ細胞と精子細胞の相互作用に異常が起こっていると考えられ、そのことから考えてもアクチン細胞骨格の制御因子であるコートアクチンが関与している可能性が高い。そこで、まずＲｅａｌ−ｔｉｍｅＲＴ−ＰＣＲ法およびウエスタンブロッティング法で、マウス精巣におけるＣｔｔｎ遺伝子とコートアクチンタンパク質の発現量を定量した。次にマウス精巣におけるコートアクチンタンパク質とアクチンの局在を調べ、正常マウスとＤｓｐｄマウスを比較した。
【００８５】
［実験方法］
１．リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
実施例１記載の方法で精巣からＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ABI PRISM 7700システムを使用して下記の手順でＲＴ−ＰＣＲをおこない、得られた増幅曲線からｃＤＮＡサンプル中のＣｔｔｎおよびＤｈｃｒ７のコピー数を計算した。内部コントロールとしてＧａｐｄｈを用いた。
【００８６】
生後１０週齢のＴｇ（＋）（Ｄｓｐｄ／ｗｔ）２個体とＴｇ（−）（ｗｔ／ｗｔ）４個体を解析した。一個体あたりＣｔｔｎ，Ｄｈｃｒ７とＧａｐｄｈそれぞれ４回の測定を行い、Ｃｔｔｎ，Ｄｈｃｒ７の測定値（コピー数）をＧａｐｄｈの測定値（コピー数）の平均値で除した。正常マウスの一匹（ｗｔ／ｗｔ＿１）の発現量を１とし、各個体の相対値をグラフに示した。各個体のＣｔｔｎ／Ｇａｐｄｈ値（相対値）から、等分散を仮定したunpaired t-test（有意水準０．０１）によってＤｓｐｄ／ｗｔとｗｔ／ｗｔの有意差を検定した。
【００８７】
２．リアルタイムＰＣＲ（ABI PRISM 7700 Sequence Detector使用）
（１）スタンダードＤＮＡ（Ｃｔｔｎ，Ｇａｐｄ）の希釈系列（２×１０5、２×１０4、２×１０3、２×１０2、２×１０1 ｃｏｐｙ／μｌ）を作製した。（スタンダードＤＮＡは、ＰＣＲ産物をＴＡクローニングしたプラスミドＤＮＡを、セシウム密度勾配遠心法で精製したものを使用した。）
（２）調製したｃＤＮＡを１ｎｇ／μｌに希釈した。
（３）反応液調製：鋳型５μｌ（従って、スタンダードＤＮＡは反応あたり１０6、１０5、１０4、１０3、１０2コピー、ｃＤＮＡは５ｎｇとなる。）、プライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）各０．１２５μｌ、SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）１２．５μｌ、超純水７．５μｌ
（４）９５℃で１０分間変性し、９５℃で１５秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で１分間を４０サイクル繰り返す条件でＰＣＲを行ない、増幅曲線を得た。
使用プライマー
Ｃｔｔｎ＿Ｆ：５'-ＴＣＴＴＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣ-３'（配列番号３１）
Ｃｔｔｎ＿Ｒ：５'-ＧＣＡＴＴＧＡＴＣＣＴＣＡＴＧＴＡＴＣＣＣ-３' （配列番号３２）
Ｄｈｃｒ７＿Ｆ：５’−ＡＧＡＡＣＧＴＡＴＣＡＣＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧ−３’ （配列番号３３）
Ｄｈｃｒ７＿Ｒ：５’−ＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＡＧＡＴＡＡＧＣＣ−３’ （配列番号３４）
Ｇａｐｄｈ＿Ｆ：５'-ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＧＡＴＧＣ-３' （配列番号３５）
Ｇａｐｄｈ＿Ｒ：５'-ＣＴＣＴＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＴＴＧＣ-３' （配列番号３６）
【００８８】
３．ウエスタンブロッティングによるコートアクチンタンパク質定量
１０週齢のマウス精巣から以下の方法で抽出液を調製した。摘出したマウス精巣を１ｍｌの抽出バッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１００ｍＭＫＣｌ，１２ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ，１７％グリセロール）中でホモジェナイズした。１５，０００ｒｐｍ，４℃，１０分間の遠心を行い、上清（可溶性画分）を回収した。この調製した精巣抽出液を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、メンブレンに転写した後、以下の手順でタンパク質を検出した。タンパク質量の内部コントロールとしてDNA ligase IIIを用いた。DNA ligase IIIは精巣ではパキテン期の精母細胞で発現している［ Chen J, Tomkinson AE, Ramos W, Mackey ZB, Danehower S, Walter CA, Schultz RA, Besterman JM, Husain I. Mammalian DNA ligase III: molecular cloning, chromosomal localization, and expression in spermatocytes undergoing meiotic recombination. Mol Cell Biol 1995; 15: 5412-5422、Mackey ZB, Ramos W, Levin DS, Walter CA, McCarrey JR, Tomkinson AE. An alternative splicing event which occurs in mouse pachytene spermatocytes generates a form of DNA ligase III with distinct biochemical properties that may function in meiotic recombination. Mol Cell Biol 1997; 17: 989-998］。Ｄｓｐｄマウスの精母細胞は正常であるため、コントロールとして問題はない。
【００８９】
４．ウエスタンブロッティング
５％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ中で、室温１時間のブロッキング反応を行った後、ＴＢＳ−Ｔ洗浄（１５分×３）を行った。抗コートアクチン抗体（Rabbit, polyclonal, Cell Signaling社 #3502）を１：５００、DNA ligase III抗体（Mouse, polyclonal, GeneTex社 MS-LIG30UP50）を１：１０００の希釈率で５ｍｌＰＢＳ−ＭＬＫ（３％スキムミルクを含むＰＢＳ）に希釈し、メンブレンに乗せ、室温３時間の一次抗体反応を行った後、ＴＢＳ−Ｔ洗浄（１５分×４）を行った。それぞれの一次抗体に結合する二次抗体（Horse radish peroxidase結合）で二次抗体反応した後、ＴＢＳ−Ｔ洗浄（１５分×４）を行った。次いで、ECL-Plus Western blotting detection system（Amersham）を使用してタンパク質を検出した。
【００９０】
５．抗体染色によるコートアクチンの局在解析
マウスから、１０倍希釈したネンブタール麻酔液（ダイナボット）による麻酔下で、臓器を摘出した。速やかにカミソリで割面を入れ、固定液（２０％ホルマリン、５％ショ糖）に浸漬し、途中数時間に一度固定液を交換しながら一晩震盪固定した。定法に従いパラフィン包埋し、切片（３〜４μｍ厚）を作製した。切片をキシレン中での脱パラフィン、エタノール溶液中での置換の後、以下の手順で抗体染色した。
（１）抗原賦活化：１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で９８℃，１０分間加熱後、室温にて３０分間放置した。その後ＰＢＳで洗浄した。
（２）内在性ぺルオキシダーゼの阻害：１％Ｈ2Ｏ2中で室温にて１０分間処理した後ＰＢＳで洗浄した。
（３）正常血清処理：５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）にて室温５分間処理した。（ＰＢＳ洗浄なし）
（４）一次抗体反応：抗コートアクチン抗体（ウサギポリクローナル，Cellsignaling社より市販されている，＃３５０２）を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液にて５０倍に希釈した。一次抗体溶液を組織に乗せ、室温にて１時間反応させた後ＰＢＳで洗浄した。
（５）二次抗体反応：二次抗体としてanti-rabbit ENVISION Plus（DAKO Glostrup）を用いた。再度５％ＮＧＳで処理した後、二次抗体溶液を組織に乗せ、室温にて１時間反応した後ＰＢＳで洗浄した。
（６）発色（ＤＡＢ反応）：発色液（１００ｍｌの０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．６）＋２０ｍｇ ＤＡＢ（3,3-diaminobenzidine，DOTITE）＋６５ｍｇ sodium azide）中にて、３分間の反応を行なった。
（７）核染色・封入：メチルグリーンにて核染色を行ない、定法により封入した。
【００９１】
６．ローダミン−ファロイジン染色によるアクチンの局在解析
マウスから麻酔下で精巣を摘出し、カミソリで割面を入れた後、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ），５％ショ糖／ＰＢＳ中で一晩の震盪固定を行なった（途中２回固定液を交換）。続いてショ糖／ＰＢＳ溶液中で震盪し、ＰＦＡを洗浄した。数時間ごとに溶液を交換し、段階的にショ糖の濃度を上げていった（１０％，１５％，２０％，２５％：各二回ずつ）。その後、組織を液体窒素で冷却したイソペンタン（＝ジメチルブタン）中でＯＣＴコンパウンドに包埋した。作製した凍結ブロックを薄切し（５〜１０μｍ厚）、切片を作製した。このように作製した固定凍結切片を以下の手順で染色した。
【００９２】
７．ローダミン−ファロイジン染色  切片をＰＢＳで洗浄の後、０．１％ＮＰ４０を含むＰＢＳ（−）で室温５分間処理し、再びＰＢＳ洗浄し、ローダミン−ファロイジン染色液（５μＭ Rhodamine-Phalloidin（Molecular Probes社, Cat#R-415）＋５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）にて室温で３０分間の処理（遮光）を行なった後、ＰＢＳで洗浄し、核染色液（１μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩを含むＰＢＳ）で室温２時間処理（遮光）した後、ＰＢＳ洗浄し、褪色防止剤入り封入剤（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ９．０），１０％ポリビニルアルコール，５％グリセロール，２．５％ ＤＡＢＣＯ）にて封入後、蛍光顕微鏡にて観察した。
【００９３】
［結果］
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法での定量の結果、Ｄｓｐｄマウスの精巣において、Ｃｔｔｎ遺伝子の発現量が正常個体に比べ有意に減少していた（Ｐ＜０．０１）（図１１（Ａ））。Ｄｈｃｒ７遺伝子には減少は見られなかった。さらに抗コートアクチン抗体によるウエスタンブロッティング解析で、コートアクチンタンパク質が減少していることを確認した（図１１（Ｂ））。この結果はＣｔｔｎ遺伝子が片アリル欠失しているというＳＮＰｓ解析の結果を支持するものである。コートアクチンタンパク質の抗体染色の結果（図１２）、正常マウス精細管においては全ステージの精細管周辺部に比較的弱い陽性像が見られた。これはセルトリーセルトリ間のTight junctionに含まれるものと思われる。ステップ８〜１５伸長精子細胞周辺にも中程度の陽性像が見られた。さらにステップ１６成熟精子細胞付近に強いドット状の陽性像が見られた（図１３（Ａ， inset））。これら伸長精子細胞周辺の局在は、コートアクチンが精子形態形成の過程で機能していることを示唆している。コートアクチンの局在は、ほとんど細胞質を持たないステップ１６精子細胞の頭部とドット状の陽性像が必ずしも重なっていないことから、精子細胞ではなく、セルトリ細胞中の局在であると考えている。精巣以外の臓器では、特に小脳顆粒層と腎臓尿細管周辺に特徴的な局在を認めた。コートアクチンはｍＲＮＡレベルでは、ほぼ全ての組織で普遍的に発現しているが、タンパク質レベルでは組織ごとに異なる局在を示し、それぞれの組織において異なる役割を持っていることが示唆された。
【００９４】
Ｄｓｐｄマウスの精細管においては、精細管全体に弱い陽性像が見られたものの、精子細胞周辺の強い局在が見られなかった。Ｄｓｐｄマウス精細管には、少数のステップ１６成熟精子細胞も見られたが、それらの周辺にもコートアクチンのドット状の局在が認められなかった。この結果はＤｓｐｄマウス精巣において、コートアクチンの局在に異常が生じていることを示している。この局在の異常がコートアクチン自身の片アリル欠失および発現量低下に起因するものか、因果関係は不明である。小脳，腎臓での局在には異常は認められなかった。伸長精子細胞周辺のコートアクチンの局在はＤｓｐｄマウスにおいて、精子細胞の異常（核の異常形態、上皮からのはく離）が起こる時期とよく一致していた。さらに、ステップ１６精子細胞近傍のドット状のシグナルはコートアクチンが何らかの構造体を作っていることを示唆している。この構造体は精子細胞とセルトリ細胞の接着に重要な役割を果たしており、Ｄｓｐｄ精巣ではその構造体が作られないためにセルトリ細胞と精子細胞の接着が不十分であると考えられる。
【００９５】
続いて正常マウス精巣に対してローダミン−ファロイジン染色を行ったところ、ステージごとに異なるアクチンの局在を示した。ステージIII-IVの精細管において精上皮中に存在する伸長精子細胞（ステップ１５）の周辺に強いアクチンの集中が見られた。これは特殊接合装置に含まれるアクチンである。ステージVII-VIIIの精子細胞（ステップ１６）の近傍にもアクチンの集中が見られた。円形精子細胞のアクロソームにもアクチンのシグナルが得られた。これはアクロソームの形成にアクチンが機能していることを示唆している。また、全てのステージで基底部付近のセルトリ−セルトリ結合部（血液精巣関門，ＢＴＢ）にアクチンが局在していた。これらの観察は、アクチンが精子細胞の変形から完成精子の放出にかけて重要な役割を担っていることを示している。Ｄｓｐｄ精細管においては、伸長精子細胞数の減少、精子細胞の配列の乱れが見られた。また精上皮中に空隙が目立った。空隙は本来なら精子細胞があるべき場所から精子細胞がはく離してしまった為に生じていると考えられる。数少ない伸長精子細胞（形態は異常なものが多い）の周辺には正常精巣と同様にアクチンの集中が見られた。しかし伸長精子細胞に附随しない、正常には見られない位置にも異常なアクチンの集中が見られた。アクチンの乱れはセルトリ細胞の形態が乱れていることを反映していると思われる。それがコートアクチンの減少によるものかどうか因果関係は不明であるが、コートアクチンがセルトリ細胞骨格の制御に関わっており、その減少によってセルトリ細胞が正常なかたちを保てなくなっているという可能性が考えられる。
【実施例４】
【００９６】
（Ｄｓｐｄマウス精巣へのコートアクチン遺伝子の導入）
正常マウス精巣で発現しているコートアクチン−Ａ又は−Ｂと、マーカーとしてＥＧＦＰを共発現するプラスミドベクターを作製し、Ｄｓｐｄマウス精巣にインビボエレクトロポレーション法により導入した結果、セルトリ細胞および生殖細胞でのＥＧＦＰとコートアクチンの発現を確認した（導入後一週間）（図１４参照）。
【００９７】
（考察）
上記実施例２及び３で述べたように、Ｄｓｐｄマウスでは７番染色体のＣｔｔｎ遺伝子を含む領域が片アリル欠失しており、Ｃｔｔｎの発現量が半減していた、また精巣におけるコートアクチンタンパク質およびアクチンの局在に異常が見られた。
【００９８】
前述したように、減数分裂後の精子細胞は大きな形態の変化を経て完成精子となる。セルトリ細胞は精子細胞の変化と同時にその形態を変える。セルトリ細胞の動きがどのように精子細胞の形態形成に関わっているかはまだ充分な知識が得られていないが、セルトリ細胞の変性が精子細胞の異常につながることは、精巣毒性の研究から示されてきた。精子形態形成の過程ではセルトリ細胞は精子細胞の変形や、管腔への移動と合わせてその形を大きく変える必要がある。コートアクチンの局在は、そのセルトリ細胞のダイナミックな変化を制御するために必要である可能性が高い。
【００９９】
コートアクチンの局在はＥＳの構成タンパク質の一つであるespinの局在と類似している ［ Bartles JR, Wierda A, Zheng L. Identification and characterization of espin, an actin-binding protein localized to the F-actin-rich junctional plaques of Sertoli cell ectoplasmic specializations. J Cell Sci 1996; 109 ( Pt 6): 1229-1239］。またコートアクチンは精巣において、これもＥＳに含まれるβ１−integrinと相互作用することが報告されている［３１］。さらに、コートアクチンはSrc protein kinase
familyに属するＦｙｎによってリン酸化を受けることが知られているが、Ｆｙｎノックアウトマウスは生後３〜４週齢でＥＳ構造の異常を示すことが報告されている ［ Maekawa M, Toyama Y, Yasuda M, Yagi T, Yuasa S. Fyn tyrosine kinase in Sertoli cells is involved in mouse spermatogenesis. Biol Reprod 2002; 66: 211-221］。
これらの知見はコートアクチンのＥＳ構造への関与を示唆しており、コートアクチンの異常がＥＳの異常につながることを示している。
【０１００】
Ｄｓｐｄが優性の変異であることは興味深い。遺伝子の欠失はホモにした時のみ表現型として現れることが多いが、いくつかの構造タンパク質や、複合体のコンポーネントは片アリル欠失による発現量の減少で表現型が現れることが知られている（haploinsufficiency）。例えば、desmosomal plaqueの主要な構成タンパク質であるdesmoplakinは片アリル欠失によって掌蹠（しょうせき）角皮症（palmoplantar keratoderma）を引き起こすことが示されている ［ Armstrong DK, McKenna KE, Purkis PE, Green KJ, Eady RA, Leigh IM, Hughes AE. Haploinsufficiency of desmoplakin causes a striate subtype of palmoplantar keratoderma. Hum Mol Genet 1999; 8: 143-148］。また、post-synaptic densityのコンポーネントであり、コートアクチンと直接相互作用しているshank3のhaploinsufficiencyは精神遅滞等の原因であると考えられている［Boeckers TM, Bockmann J, Kreutz MR, Gundelfinger ED. ProSAP/Shank proteins - a family of higher order organizing molecules of the postsynaptic density with an emerging role in human neurological disease. J Neurochem 2002; 81: 903-910、Wilson HL, Wong AC, Shaw SR, Tse WY, Stapleton GA, Phelan MC, Hu S, Marshall J, McDermid HE. Molecular characterisation of the 22q13 deletion syndrome supports the role of haploinsufficiency of SHANK3/PROSAP2 in the major neurological symptoms. J Med Genet 2003; 40: 575-584］。これらと同様にコートアクチンもhaploinsufficiencyによって影響が現れている可能性がある。
【０１０１】
構造体が動的なものであった場合、つまり構造体に含まれる分子が速い速度で入れ替わっている場合、構造体を維持する為に、細胞内に一定のタンパク質濃度が必要である場合がある。アクチンフィラメントは動的な構造であり、フィラメントの長さが変わらないように見えるときでも、連続的にアクチン分子が片方の端に重合し、もう一方の端から解離するという平衡状態を保っている（トレッドミル状態）。アクチンの重合速度は細胞内のアクチン分子濃度に依存しており、ある濃度で、重合と解離の速度が等しくなり平衡状態となる。
【０１０２】
免疫染色の結果から、コートアクチンは、セルトリ細胞と精子細胞の接点でアクチンフィラメントの制御を行なっていると考えられ、その構造体はアクチンフィラメントの動きに対応する動的なものであることが考えられる。それを維持するためにはセルトリ細胞内にある閾値以上のコートアクチン濃度が必要である可能性がある。他にもＤｓｐｄの優性を説明し得るいくつかの可能性が残っている。１）トランスジーンの挿入やゲノムの欠失がある遺伝子の一部のみを破壊した場合、正常な遺伝子産物の機能を拮抗的に阻害するdominant negativeタイプのタンパク質が生じる可能性がある。この可能性を検証するため
、トランスジーン挿入部位および欠失領域の端に遺伝子を探したが、現在までにこのような遺伝子は見つかっていない。２）また染色体転座やトランスジーン（エンハンサーを含んでいる）の挿入が、周辺の遺伝子の発現に影響を及ぼす可能性もある。少なくともDhcr7に関しては正常個体と同じレベルの発現量であることがリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で確認された（図１０参照）。他の変異部位周辺に存在する遺伝子（Sftpd，Rbmxrt）に関しては、通常のＲＴ−ＰＣＲで、全て正常個体精巣で発現しており、Ｄｓｐｄ精巣でもほぼ同じレベルの発現量であることを確認した。３）ゲノミックインプリンティング（genomic imprinting）は父親由来と母親由来のゲノムに機能的な差異が生じる現象であり、インプリンティングを受ける遺伝子に関しては片アリルの変異が表現型に現れ易い。Ｄｓｐｄの変異部位は７番染色体遠位部のインプリンティング領域に近く、インプリンティングの関与が考えられた。しかしＤｓｐｄ変異を父親・母親どちらから受け継いでも同じ表現型を示すことから、この可能性は排除できると思われる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】マウス精細管の構造を示す図である。
【図２】内分泌系による精巣機能の調節を示す概略図である。
【図３】マウスセルトリ−精子細胞 特殊接合装置を示す概略図である。セルトリ細胞と伸長精子細胞の間には、アクチン層を含む特殊な構造（ectoplasmic）が見られる。セルトリ細胞膜の内側にアクチンの層があり、精子細胞側の構造であるアクロソーム（Ａｃ）を囲んでいる。ＥＳ構造の機能は不明であるが、精子細胞の形態変化をサポートし、適切な時期の放出までセルトリ細胞と精子細胞の接着を維持するのに必要であるとされている。
【図４】マウス精子形成サイクル(Lonnie D.Russel et al.,Evaluation of the Testis より、一部改変) を示す図である。マウスの場合、精細管のステージはＩ−XIIまでの１２段階に分けられている。ある精細管の断面には縦に並んだ種類の細胞の組み合わせが見られる。精祖細胞 (spermatogonia)の自己増殖と精母細胞への分化（青ワク）、精母細胞 (spermatocyte)の減数分裂（緑ワク）を経て、半数体の精子細胞 (spermatid)となる。精子細胞は大きな形態の変化を経て完成精子となる（赤ワク）この過程のことを spermiogenesis と呼ぶ。精子細胞の分化段階はステップ１〜１６までの数字で表されている。
【図５】ＰＥＧ８トランスジーンやＰＥＧ８トランスジェニックマウスの家系を示す図である。
【図６】Ｄｓｐｄマウス精巣，精巣上体を示す図である。Ｄｓｐｄマウス精細管では、伸長精子細胞の数が減少していた。また精子細胞の奇形が見られた。（Ａ），（Ｃ）正常マウス精巣上体は完成精子で満たされているが（Ｆ），（Ｈ）、Ｄｓｐｄマウス精巣上体では精子数が減少していた。（Ｅ），（Ｇ）Ａ，Ｂ，Ｅ，Ｇ Ｂａｒ＝１００μｍ，Ｃ，Ｄ，Ｇ，Ｈ Ｂａｒ＝２００μｍ，ｉｎｓｅｔｓ Ｂａｒ＝５μｍ
【図７】ＤｓｐｄマウスのＥＳ構造を示す図である。
【図８】Ｄｓｐｄマウスの変異部位を示す拡大図である。赤い矢印はゲノミックライブラリーからクローニングしたＴｇ  とゲノムのジャンクションを表している。７番染色体と１４番染色体の長い融合染色体をピンクの線で、１４番染色体近位部を含む短い染色体をブルーの線で表している。ブルーの点線はゲノム配列が完成しておらず解析できなかった領域を表している。７番染色体はトランスジーンを介して１４番染色体Ｃ−Ｅ領域と結合している。１４番染色体近位部は７番染色体のテロメアと結合していると思われる。７番染色体テロメア近傍の１Ｍｂを越える領域が欠失している。１４番染色体には少なくとも１Ｍｂよりも大きな欠失は見られない。１４番染色体変異部位の最も近くにある遺伝子Ｓｆｔｐｄは欠失していない。
【図９】コートアクチンの構造と機能を示す拡大図である。
【図１０】Ｄｓｐｄマウス精巣におけるコートアクチンの発現量を示す図である。
【図１１】Ｄｓｐｄマウス精巣におけるコートアクチンの発現量を示す図である。
【図１２】精細管におけるアクチンの局在を示す図である。正常マウス精細管では伸長精子細胞周辺に強いアクチンの局在を認めた。特にステップ１５精子細胞周辺に強いアクチンの集中が見られた（Ａ）−（Ｃ）。これはspermiogenesis の過程にアクチンが重要な役割を果たしていることを示唆している。Ｄｓｐｄ精巣においては異常なアクチンの集中が見られた(Ｉ，Ｌ矢印)。精子頭部（Ｈ矢印）には正常精巣と同様にアクチンの集中が見られた。
【図１３】コートアクチン抗体染色の結果を示す図である。
【図１４】インビボエレクトロポレーション法によるマウス精巣への遺伝子導入を示す図である。
【図１５】Ｄｓｐｄマウス病態モデルを示す図である。コートアクチンの発現量の低下により、コートアクチンを含む構造体が正常に作られない。その結果アクチン繊維の制御が乱れ、ＥＳ構造の異常が起こり、精子細胞の奇形や精上皮からのはく離が起こる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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