(57)【要約】【課題】  悪性腫瘍・癌等の疾患に対する治療に有効な癌細胞増殖阻害剤及びアポトーシス誘導剤並びに該癌細胞増殖阻害剤及び／又はアポトーシス誘導剤を含有する医薬品を提供することにある。【解決手段】  アルコキシテトラヒドロフラン誘導体からなる癌細胞増殖阻害剤及びアポトーシス誘導剤並びにこれらを含有する医薬品とする。前記アルコキシテトラヒドロフラン誘導体として、アルキリデンアルコキシテトラヒドロフラン誘導体及びベンジリデンアルコキシテトラヒドロフラン誘導体等が挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（化１）で示されるアルコキシテトラヒドロフラン誘導体からなる癌細胞増殖阻害剤。
【化１】
2006219459.tif 000016
（式中Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、芳香族置換基又は炭素数１〜１０のアルキル基を表す。Ｒ３は炭素数１〜１０のアルキル基、或は次式（化２）又は（化３）で表される置換基である。）
【化２】
2006219459.tif 000017
（式中ｎは１〜１０の整数、ｍは１〜１０の整数であり、式中Ｘは、‐ＣＯＯ‐（エステル）、‐Ｏ‐、‐ＮＲ４‐（Ｒ４は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又は芳香族置換基を表す）又は‐Ｓ‐を表す。）
【化３】
2006219459.tif 000018
（式中ｎは４〜１０の整数であり、式中Ｘは、‐ＣＨ２‐、‐ＣＯＯ‐（エステル）、‐Ｏ‐、‐ＮＲ４‐（Ｒ４は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又は芳香族置換基を表す）又は‐Ｓ‐を表す。）
【請求項２】
次式（化４）で示されるアルコキシテトラヒドロフラン誘導体からなるアポトーシス誘導剤。
【化４】
2006219459.tif 000019
（式中Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、芳香族置換基又は炭素数１〜１０のアルキル基を表す。Ｒ３は炭素数１〜１０のアルキル基、或は次式（化５）又は（化６）で表される置換基である。）
【化５】
2006219459.tif 000020
（式中ｎは１〜１０の整数、ｍは１〜１０の整数であり、式中Ｘは、‐ＣＯＯ‐（エステル）、‐Ｏ‐、‐ＮＲ４‐（Ｒ４は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又は芳香族置換基を表す）又は‐Ｓ‐を表す。）
【化６】
2006219459.tif 000021
（式中ｎは４〜１０の整数であり、式中Ｘは、‐ＣＨ２‐、‐ＣＯＯ‐（エステル）、‐Ｏ‐、‐ＮＲ４‐（Ｒ４は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又は芳香族置換基を表す）又は‐Ｓ‐を表す。）
【請求項３】
前記アルコキシテトラヒドロフラン誘導体が、前記式（化１）中のＲ１がフェニル基、Ｒ２が水素原子、或はＲ１が水素原子、Ｒ２がフェニル基であるベンジリデンアルコキシテトラヒドロフラン誘導体であることを特徴とする請求項１記載の癌細胞増殖阻害剤。
【請求項４】
前記アルコキシテトラヒドロフラン誘導体が、前記式（化４）中のＲ１がフェニル基、Ｒ２が水素原子、或は（化４）中のＲ１が水素原子、Ｒ２がフェニル基であるベンジリデンアルコキシテトラヒドロフラン誘導体であることを特徴とする請求項２記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項５】
前記アルコキシテトラヒドロフラン誘導体が、前記式（化１）中のＲ３がブチル基であるブトキシテトラヒドロフラン誘導体であることを特徴とする請求項１又は３記載の癌細胞増殖阻害剤。
【請求項６】
前記アルコキシテトラヒドロフラン誘導体が、前記式（化４）中のＲ３がブチル基であるブトキシテトラヒドロフラン誘導体であることを特徴とする請求項２又は４記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項７】
前記アルコキシテトラヒドロフラン誘導体が、次式（化７）で示される（Z）‐４‐ベンジリデン‐２‐ｎ‐ブトキシテトラヒドロフランであることを特徴とする請求項５記載の癌細胞増殖阻害剤。
【化７】
2006219459.tif 000022
【請求項８】
前記アルコキシテトラヒドロフラン誘導体が、次式（化８）で示される（Z）‐４‐ベンジリデン‐２‐ｎ‐ブトキシテトラヒドロフランであることを特徴とする請求項６記載のアポトーシス誘導剤。
【化８】
2006219459.tif 000023
【請求項９】
乳癌、前立腺癌、膵癌、胃癌、肺癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌、肛門癌）、食道癌、十二指腸癌、頭頚部癌（舌癌、咽頭癌）、脳腫瘍、神経鞘腫、非小細胞肺癌、肺小細胞癌、肝臓癌、腎臓癌、胆管癌、子宮癌（子宮体癌、子宮頸癌）、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、血管腫、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、甲状腺癌、骨腫瘍、血管腫、血管線維腫、網膜肉腫、陰茎癌、小児固形癌、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫のうちいずれかの治療或は予防のために用いられることを特徴とする請求項１，３，５又は７に記載の癌細胞増殖阻害剤。
【請求項１０】
乳癌、前立腺癌、膵癌、胃癌、肺癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌、肛門癌）、食道癌、十二指腸癌、頭頚部癌（舌癌、咽頭癌）、脳腫瘍、神経鞘腫、非小細胞肺癌、肺小細胞癌、肝臓癌、腎臓癌、胆管癌、子宮癌（子宮体癌、子宮頸癌）、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、血管腫、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、甲状腺癌、骨腫瘍、血管腫、血管線維腫、網膜肉腫、陰茎癌、小児固形癌、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫のうちいずれかの治療或は予防のために用いられることを特徴とする請求項２，４，６又は８に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項１１】
請求項１，３，５，７又は９記載の癌細胞増殖阻害剤を含有することを特徴とする医薬品。
【請求項１２】
請求項２，４，６，８又は１０記載のアポトーシス誘導剤を含有することを特徴とする医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、アルコキシテトラヒドロフラン誘導体からなる癌細胞増殖阻害剤及びアポトーシス誘導剤並びにこれらを含有する医薬品に係り、その目的は、悪性腫瘍・癌等の疾患に対する治療に有効な癌細胞増殖阻害剤及びアポトーシス誘導剤並びに該癌細胞増殖阻害剤及び／又はアポトーシス誘導剤を含有する医薬品を提供することにある。
【背景技術】
【０００２】
癌は、死亡原因が第一位の疾病であるため、その予防に対する人々の関心は非常に高い。一般に、癌細胞は正常細胞から悪性転化した初期の段階では、その増殖は非常にゆっくりしたものである。しかし、癌細胞が発生するとそれに向かって周囲の血管から新たに分岐した新生血管が癌細胞に向かって遊走することが観察される。そして、ひとたびこの病変部位に血管が到達すると、癌細胞に無尽蔵な栄養と酸素が供給され、爆発的に増殖を開始するだけでなく、その血管を介して遠隔転移なども起こすことになる。即ち、悪性腫瘍・癌細胞は無秩序な細胞増殖であるので、それらの細胞増殖を抑制することは、癌治療において必要不可欠であるといえる。
【０００３】
また、近年になり、癌研究の分野において、アポトーシスに関する研究が盛んになりつつある。アポトーシスとは、生体内における、正常な細胞交代のために生じる生理的な細胞死のことであり、病理的な細胞死である壊死（ネクローシス）とは区別されている。いわゆるプログラム細胞死は、生体内において予め死滅すべくプログラム化されている、ある種の細胞にみられる細胞死であるが、アポトーシスもそのひとつである。アポトーシスにおいて、核クロマチンの凝縮、染色体ＤＮＡの断片化等の現象が特徴的に観察される。
【０００４】
一般的に、細胞は、すべて正常に分化（differentiation）が誘導されて、特殊化された細胞になり、その結果個々に特有の機能を営んでいるものであるが、その際に、生体機能にとって不必要となった細胞は、アポトーシスを起こし、マクロファージ等により貪食されて除去されていく過程を経ている。
【０００５】
かかる細胞の正常の分化に対して、癌細胞（いわゆる腫瘍）は本来死ぬべき細胞が死ななくなったために生じると考えられる。即ち、癌細胞は、増殖の制御がきかずに異常増殖を起こすものであるから、癌細胞の増殖を抑えるための１つの方法として、アポトーシスを誘導することが挙げられる。そこで、例えば、特許文献１には、月見草抽出物を有効成分としたアポトーシス誘導剤が、また特許文献２には特定のペプチドを含むタンパク質を有効成分とした脳腫瘍治療剤がアポトーシスを誘導することが記載されている。
【０００６】
上記を鑑みると、癌細胞の増殖を抑えるために、癌細胞に対してアポトーシスを誘導でき得る薬物があるのであれば、理想的な抗癌剤となり得るといえる。即ち、癌細胞は異常増殖を抑制されつつ、正常な細胞死の過程を経て、効果的に消滅していくこととなる。今日、そのような効果的な薬剤の開発が期待されている。
【特許文献１】特開２００２−３０８７６３号公報
【特許文献２】特開２００３−１２８５７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
悪性腫瘍・癌等の疾患に対する治療に有効な癌細胞増殖阻害剤及びアポトーシス誘導剤並びにこれらを含有する
医薬品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１に係る発明は、次式（化１）で示されるアルコキシテトラヒドロフラン誘導体からなる癌細胞増殖阻害剤に関する。
【０００９】
【化１】
2006219459.tif 000002
（式中Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、芳香族置換基又は炭素数１〜１０のアルキル基を表す。Ｒ３は炭素数１〜１０のアルキル基、或は次式（化２）又は（化３）で表される置換基である。）
【００１０】
【化２】
2006219459.tif 000003
（式中ｎは１〜１０の整数、ｍは１〜１０の整数であり、式中Ｘは、‐ＣＯＯ‐（エステル）、‐Ｏ‐、‐ＮＲ４‐（Ｒ４は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又は芳香族置換基を表す）又は‐Ｓ‐を表す。）
【００１１】
【化３】
2006219459.tif 000004
（式中ｎは４〜１０の整数であり、式中Ｘは、‐ＣＨ２‐、‐ＣＯＯ‐（エステル）、‐Ｏ‐、‐ＮＲ４‐（Ｒ４は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又は芳香族置換基を表す）又は‐Ｓ‐を表す。）
請求項２に係る発明は、次式（化４）で示されるアルコキシテトラヒドロフラン誘導体からなるアポトーシス誘導剤に関する。
【００１２】
【化４】
2006219459.tif 000005
（式中Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、芳香族置換基又は炭素数１〜１０のアルキル基を表す。Ｒ３は炭素数１〜１０のアルキル基、或は次式（化５）又は（化６）で表される置換基である。）
【００１３】
【化５】
2006219459.tif 000006
（式中ｎは１〜１０の整数、ｍは１〜１０の整数であり、式中Ｘは、‐ＣＯＯ‐（エステル）、‐Ｏ‐、‐ＮＲ４‐（Ｒ４は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又は芳香族置換基を表す）又は‐Ｓ‐を表す。）
【００１４】
【化６】
2006219459.tif 000007
（式中ｎは４〜１０の整数であり、式中Ｘは、‐ＣＨ２‐、‐ＣＯＯ‐（エステル）、‐Ｏ‐、‐ＮＲ４‐（Ｒ４は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又は芳香族置換基を表す）又は‐Ｓ‐を表す。）
請求項３に係る発明は、前記アルコキシテトラヒドロフラン誘導体が、前記式（化１）中のＲ１がフェニル基、Ｒ２が水素原子、或はＲ１が水素原子、Ｒ２がフェニル基であるベンジリデンアルコキシテトラヒドロフラン誘導体であることを特徴とする請求項１記載の癌細胞増殖阻害剤に関する。
請求項４に係る発明は、前記アルコキシテトラヒドロフラン誘導体が、前記式（化４）中のＲ１がフェニル基、Ｒ２が水素原子、或は（化４）中のＲ１が水素原子、Ｒ２がフェニル基であるベンジリデンアルコキシテトラヒドロフラン誘導体であることを特徴とする請求項２記載のアポトーシス誘導剤に関する。
請求項５に係る発明は、前記アルコキシテトラヒドロフラン誘導体が、前記式（化１）中のＲ３がブチル基であるブトキシテトラヒドロフラン誘導体であることを特徴とする請求項１又は３記載の癌細胞増殖阻害剤に関する。
請求項６に係る発明は、前記アルコキシテトラヒドロフラン誘導体が、前記式（化４）中のＲ３がブチル基であるブトキシテトラヒドロフラン誘導体であることを特徴とする請求項２又は４記載のアポトーシス誘導剤に関する。
請求項７に係る発明は、前記アルコキシテトラヒドロフラン誘導体が、次式（化７）で示される（Z）‐４‐ベンジリデン‐２‐ｎ‐ブトキシテトラヒドロフランであることを特徴とする請求項５記載の癌細胞増殖阻害剤に関する。
【００１５】
【化７】
2006219459.tif 000008
請求項８に係る発明は、前記アルコキシテトラヒドロフラン誘導体が、次式（化８）で示される（Z）‐４‐ベンジリデン‐２‐ｎ‐ブトキシテトラヒドロフランであることを特徴とする請求項６記載のアポトーシス誘導剤に関する。
【００１６】
【化８】
2006219459.tif 000009
請求項９に係る発明は、乳癌、前立腺癌、膵癌、胃癌、肺癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌、肛門癌）、食道癌、十二指腸癌、頭頚部癌（舌癌、咽頭癌）、脳腫瘍、神経鞘腫、非小細胞肺癌、肺小細胞癌、肝臓癌、腎臓癌、胆管癌、子宮癌（子宮体癌、子宮頸癌）、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、血管腫、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、甲状腺癌、骨腫瘍、血管腫、血管線維腫、網膜肉腫、陰茎癌、小児固形癌、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫のうちいずれかの治療或は予防のために用いられることを特徴とする請求項１，３，５又は７に記載の癌細胞増殖阻害剤に関する。
請求項１０に係る発明は、乳癌、前立腺癌、膵癌、胃癌、肺癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌、肛門癌）、食道癌、十二指腸癌、頭頚部癌（舌癌、咽頭癌）、脳腫瘍、神経鞘腫、非小細胞肺癌、肺小細胞癌、肝臓癌、腎臓癌、胆管癌、子宮癌（子宮体癌、子宮頸癌）、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、血管腫、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、甲状腺癌、骨腫瘍、血管腫、血管線維腫、網膜肉腫、陰茎癌、小児固形癌、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫のうちいずれかの治療或は予防のために用いられることを特徴とする請求項２，４，６又は８に記載のアポトーシス誘導剤に関する。
請求項１１に係る発明は、請求項１，３，５，７又は９記載の癌細胞増殖阻害剤を含有することを特徴とする医薬品に関する。
請求項１２に係る発明は、請求項２，４，６，８又は１０記載のアポトーシス誘導剤を含有することを特徴とする医薬品に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本願発明のアルコキシテトラヒドロフラン誘導体からなる癌細胞増殖阻害剤は、癌細胞に対して濃度依存的な増殖阻害活性を有する。また、本願発明のアルコキシテトラヒドロフラン誘導体からなるアポトーシス誘導剤は、癌細胞にアポトーシスを誘導させる。
本願発明の癌細胞増殖阻害剤及び／又はアポトーシス誘導剤を含有する医薬品は、癌細胞に対して増殖阻害活性及び／又はアポトーシス誘導活性を有するため、悪性腫瘍・癌等の疾患に対する治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本願発明の癌細胞増殖阻害剤及びアポトーシス誘導剤はアルコキシテトラヒドロフラン誘導体（次式（化９）で示す）からなる。
【００１９】
【化９】
2006219459.tif 000010
（式中Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、芳香族置換基又は炭素数１〜１０のアルキル基を表す。Ｒ３は炭素数１〜１０のアルキル基、或は次式（化１０）又は（化１１）で表される置換基である。）
【００２０】
【化１０】
2006219459.tif 000011
（式中ｎは１〜１０の整数、ｍは１〜１０の整数であり、式中Ｘは、‐ＣＯＯ‐（エステル）、‐Ｏ‐、‐ＮＲ４‐（Ｒ４は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又は芳香族置換基を表す）又は‐Ｓ‐を表す。）
【００２１】
【化１１】
2006219459.tif 000012
（式中ｎは４〜１０の整数であり、式中Ｘは、‐ＣＨ２‐、‐ＣＯＯ‐（エステル）、‐Ｏ‐、‐ＮＲ４‐（Ｒ４は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又は芳香族置換基を表す）又は‐Ｓ‐を表す。）
【００２２】
前記式（化９）中のＲ1及びＲ２の芳香族置換基は、単環式或は縮合環であってもよく、また、炭化水素環でも複素環芳香族置換基であってもよい。また、前記芳香族置換基に含まれる炭素数は６〜１０が好ましく、さらに該芳香族置換基は置換可能な置換基を有していてもよく、該置換基として、例えば、アルキル基、ヒドロキシル基、アルコキシル基、エステル基、ニトロ基及びアミノ基が挙げられる。
前記式（化９）中Ｒ１がフェニル基、Ｒ２が水素原子、或はＲ１が水素原子、Ｒ２がフェニル基であるベンジリデンアルコキシテトラヒドロフラン誘導体がさらに好適に用いられる。
前記式（化９）中Ｒ1及びＲ２で示されるアルキル基は、炭素数が１〜１０であり、炭素数２〜８が特に好ましい。
【００２３】
前記式（化９）中Ｒ３は、アルキル基、或は前記式（化１０）又は（化１１）で示される置換基である。前記アルキル基は、炭素数１〜１０であり、炭素数２〜８が特に好ましい。また、前記式（化１０）中のｎは、整数１〜１０であり、整数２〜８が特に好ましい。前記式（化１０）中のmは、整数１〜１０であり、整数２〜８が特に好ましい。また、前記式（化１１）中のｎは、整数４〜１０であり、整数５〜８が特に好ましい。
本発明において、前記アルコキシテトラヒドロフラン誘導体のうち、前記式（化９）中のＲ１がフェニル基、Ｒ２が水素原子、或はＲ１が水素原子、Ｒ２がフェニル基であるベンジリデンテトラヒドロフラン誘導体が好ましく用いられる。
さらに、前記ベンジリデンテトラヒドロフラン誘導体のうち、前記式（８）中のＲ３がブチル基である、（Ｚ）‐４‐ベンジリデン‐２‐ｎ‐ブトキシテトラヒドロフラン（Ｃ１５Ｈ２０Ｏ２）が好適に用いられる。次式（化１２）に（Ｚ）‐4‐ベンジリデン‐2‐ｎ‐ブトキシテトラヒドロフランを示す。
【００２４】
【化１２】
2006219459.tif 000013
【００２５】
本願発明に係るアルコキシテトラヒドロフラン誘導体を得る方法としては特に限定されない。例えば、化学合成によって得ることができ、その合成方法もまた限定されない。
【００２６】
本願発明の癌細胞増殖阻害剤及びアポトーシス誘導剤は、癌（例えば、乳癌、前立腺癌、膵癌、胃癌、肺癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌、肛門癌）、食道癌、十二指腸癌、頭頚部癌（舌癌、咽頭癌）、脳腫瘍、神経鞘腫、非小細胞肺癌、肺小細胞癌、肝臓癌、腎臓癌、胆管癌、子宮癌（子宮体癌、子宮頸癌）、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、血管腫、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、甲状腺癌、骨腫瘍、血管腫、血管線維腫、網膜肉腫、陰茎癌、小児固形癌、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫等）、白血病等の悪性腫瘍の予防・治療において有用である。
【００２７】
本願発明の癌細胞増殖阻害剤及びアポトーシス誘導剤の癌細胞に対する有効量は、共に使用される溶媒等の活性、投与経路、治療される病態の重症度、患者の状態および病歴に応じて調整される。しかし、所望の治療的効果を達成するのに必要とされる用量よりも低いレベルの用量で開始し、かつ所望の効果が達成されるまで用量を漸増することが望ましい。尚、各患者においての具体的服用量レベルは、体重、全身の健康状態、食事、時間、投与経路、併用薬、或は治療される疾患の重症度等、様々な要因により決定されることが望ましい。
【００２８】
本願発明の癌細胞増殖阻害剤及びアポトーシス誘導剤は、製薬的に許容される担体等の添加剤を含有し、医薬品とすることが可能である。具体的な添加剤とは、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、増粘剤；液状製剤における溶剤、分散剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を用いることもできる。
【００２９】
本願発明の癌細胞増殖阻害剤及びアポトーシス誘導剤物を含有する医薬品は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤等の経口投与の他、静脈内点滴もしくは注射等の全身経路による投与、あるいは筋肉内注射等の非経口投与、経腸投与、局所投与し得る。本願発明の医薬品の具体例を以下に示す。
（１）錠剤、散剤、顆粒剤、カオウセル剤：本発明の癌細胞増殖阻害剤及びアポトーシス誘導剤に、例えば賦形剤、崩壊剤、結合剤または滑沢剤等を添加して圧縮成型し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のためのコーティングを行うことにより製造することができる。
（２）注射剤：本発明の癌細胞増殖阻害剤及びアポトーシス誘導剤を、例えば分散剤、保存剤、等張化剤等と共に水性注射剤として、あるいはオリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油等の植物油、プロピレングリコール等に溶解、懸濁あるいは乳化して油性注射剤として成型することにより製造することができる。
（３）外用剤：本発明の癌細胞増殖阻害剤及びアポトーシス誘導剤を固状、半固状または液状の組成物とすることにより製造される。例えば、上記固状の組成物は、該医薬組成物をそのまま、あるいは賦形剤、増粘剤などを添加、混合して粉状とすることにより製造される。
【００３０】
上記液状の医薬品は、注射剤の場合とほとんど同様で、油性あるいは水性懸濁剤とすることにより製造される。半固状の医薬品は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟膏状のものがよい。また、これらの組成物は、いずれも緩衝剤、防腐剤などを含んでいてもよい。
（４）座剤：本発明の癌細胞増殖阻害剤及びアポトーシス誘導剤を油性または水性の固状、半固状あるいは液状の組成物とすることにより製造される。このような組成物に用いる油性基剤としては、例えば、高級脂肪酸のグリセリド（例えば、カカオ脂、ウイテプゾル類等）、中級脂肪酸（例えば、ミグリオール類等）、あるいは植物油（例えば、ゴマ油、大豆油、綿実油等）等が挙げられる。水性ゲル基剤としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体等が挙げられる。
【００３１】
本願発明の癌細胞増殖阻害剤及びアポトーシス誘導剤は、当該技術分野において従来から用いられている公知の抗腫瘍剤を含む他の治療薬と組み合わせて使用してもよい。かかる従来から用いられている抗腫瘍剤の好適な例としては、アドリアマイシン、シスプラチン、コルヒチン、ＣＣＮＵ（Lomastine）、ＢＣＮＵ（Carmustine） 、アクチノマイシンＤ、５−フルオロウラシル、チオテパ、サイトシンアラビノシド、シクロホスファミド、マイトマイシンＣ等の一種又は二種以上の混合物が挙げられる。
【実施例】
【００３２】
<本願発明に係るアルコキシテトラヒドロフラン誘導体［（Ｚ）‐4‐ベンジリデン‐2‐ｎ‐ブトキシテトラヒドロフラン］の合成>
攪拌子を入れた２５ｍＬの枝付きフラスコに、酢酸パラジウム（２２．５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）と酢酸銅（１８．２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）とカテコール（０．１ｍｍｏｌ、１１．０ｍｇ）を加えた。酸素の入った風船をフラスコに取付け、フラスコ内を酸素置換した。このフラスコにアセトニトリル（１．０ｍＬ）をシリンジを用いて加え、溶液を室温で約30分間攪拌した。その後、酸素雰囲気下でn-ブチルビニルエーテル（２８３ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）をシリンジを用いて加え、続いてtrans-シンナミルアルコール（１３４ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で3時間攪拌した後、反応混合物をフロリジルカラム（フロリジル、３０ｇ：カラム、２０ｍｍ ｘ ２０．５ｍｍ：展開溶媒、酢酸エチル）を用いて濾過した。溶媒を除去すると、本願発明に係るアルコキシテトラヒドロフラン誘導体である（Ｚ）‐4‐ベンジリデン‐2‐ｎ‐ブトキシテトラヒドロフラン（２１２．０ｍｇ, ９１．２%）が得られた。
上記合成の化学反応式を次式（化１３）で示す。
【００３３】
【化１３】
2006219459.tif 000014
【００３４】
以下は前記（Ｚ）‐4‐ベンジリデン‐2‐ｎ‐ブトキシテトラヒドロフランを同定するための機器分析の結果である。図１に、１Ｈ  ＮＭＲチャート、図２に、１３Ｃ  ＮＭＲチャートを示す。
ｂｐ （ｂｕｌｂ−ｔｏ−ｂｕｌｂ）１７３-１７５ ℃ （５ｍｍＨｇ）; １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ０．９１ （ｔ, Ｊ= ６．６０Ｈｚ, ３Ｈ, ＣＨ３）, １．３６（ｓｅｘ, Ｊ= ６．６０ Ｈｚ, 2 Ｈ, ＣＨ２ＣＨ３）, １．５６（ｑｕｉ, Ｊ= ６．６０Ｈｚ, ２ Ｈ, ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、 ２．７１（ｄ, Ｊ= １６．４８, 1 Ｈ, Ｃ*ＨＣＨ２）, ２．９３ （ｄｄ, Ｊ= １６．４８, ５．１５ Ｈｚ, 1 Ｈ, Ｃ*ＨＣＨ２）, ３．４４ （ｄｔ, Ｊ= ９．５１, ６．６０ Ｈｚ, 1 Ｈ, -ＯＣＨ２ＣＨ２）, ３．７１ （ｄｔ, Ｊ= ９．５１, ６．６０ Ｈｚ, 1Ｈ, -ＯＣＨ２ＣＨ２）, ４．６８ （ｓ, 2 Ｈ, -ＯＣＨ２Ｃ＝）, ５．２１ （ｄ, Ｊ＝ ５．１５ Ｈｚ, 1 Ｈ, Ｃ*Ｈ）, ６．４２ （ｓ, 1Ｈ, Ｐｈ-ＣＨ）, ７．１３ （ｄ, Ｊ= ７．３３ Ｈｚ, 2 Ｈ, Ｐｈ）, ７．２０ （ｔ, Ｊ= ７．３３ Ｈｚ, 1 Ｈ, Ｐｈ）, ７．３４ （d, J= ７．３３ Ｈｚ, 2 Ｈ, Ｐｈ）; １３Ｃ｛1Ｈ｝ （１００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３）δ１３．９ （ＣＨ３）, １９．３ （ＣＨ２ＣＨ３）, ３１．７ （-ＯＣＨ２ＣＨ２）, ４１．１ （Ｃ*ＨＣＨ２）, ６７．０ （-ＯＣＨ２ＣＨ２）, ６７．９ （ＯＣＨ2Ｃ＝）, １０２．２ （Ｃ*Ｈ）, １２１．５ （Ｐｈ−ＣＨ）, １２６．４ （Ｐｈ）, １２７．８ （Ｐｈ）, １２８．４ （Ｐｈ）, １３７．４ （Ｐｈ）, １３９．１ （ＣＨ＝Ｃ）; ＧＣＭＳ ｍ／ｅ ２３２ （Ｍ+）; Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ２０Ｏ２: Ｃ, ７７．５５; Ｈ, ８．６８. Ｆｏｕｎｄ: C, ７７.５３; Ｈ, ８．６２.
【００３５】
<試験例１>  癌細胞増殖阻害試験
本試験において、Ｕ９３７細胞（ヒト単核球系白血病細胞）を用いた。
まず、１２穴プレートにＵ９３７細胞を３×１０４個／ｗｅｌｌ／ｍｌで播種し、上記合成で得た（Ｚ）‐4‐ベンジリデン‐２‐ｎ‐ブトキシテトラヒドロフランをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したものを、１００μＭ／ｗｅｌｌ及び２００μＭ／ｗｅｌｌの濃度となるように添加し、７２時間インキュベートした。
次に、各穴より３０μｌの培地をエッペンチューブに回収後、トリパンブルー液を加え、血球計算盤にて生細胞数をカウントした。同様に、実験開始時、コントロール（無添加）、ＤＭＳＯのみ添加したものも同様に細胞数をカウントし、結果を表１及び図３に示す。
尚、図３中においては、コントロールを１００％として細胞増殖率を示した。細胞増殖率は、DMSO及び１００μＭ及び２００μＭの濃度で本願発明癌細胞増殖阻害剤を添加し７２時間後の各細胞数を、７２時間後のコントロール（無添加）の細胞数で、割ったものに１００をかけてものである。
【００３６】
【表１】
2006219459.tif 000015
【００３７】
表１及び図３から明らかなように、本願発明の癌細胞増殖阻害剤は、癌細胞に対して濃度依存的に増殖阻害活性を有することがわかる。
【００３８】
<試験例２>  アポトーシス誘導活性試験
1）試験方法
ａ）DNAラダー検出
２４穴プレートに、Ｕ９３７細胞を２×１０５個／ｗｅｌｌ／５００μｌで播種した。次に、２０ｍＭの本願発明のアポトーシス誘導剤を5 μｌ（終濃度：２００μＭ）添加し，３０分、１時間、３時間及び６時間インキュベートしたＵ９３７細胞を用い、以下の方法により、それぞれＤＮＡラダーを検出した。
【００３９】
まず、以下の試薬及び酵素を用いて、以下のプロトコールによりＤＮＡを抽出した。
（試薬）
Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ
１Ｍｔｒｉｓ‐ＨＣｌ  ｐＨ７．４    ０．１ｍｌ
０．５  ＭＥＤＴＡ  ｐＨ８．０      ０．２ｍｌ
１０％ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００        ０．５ｍｌ
滅菌蒸留水                          ９．２ｍｌ
合計                              １０．０ｍｌ
ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ
１Ｍｔｒｉｓ‐ＨＣｌ  ｐＨ７．４    １．０ｍｌ
０．５  ＭＥＤＴＡ  ｐＨ８．０      ０．２ｍｌ
滅菌蒸留水                        ９８．８ｍｌ
合計                            １００．０ｍｌ
（酵素）
ＲＮａｓｅＡ                      ２０ｍｇ／ｍｌ
ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ            ２０ｍｇ／ｍｌ
【００４０】
（プロトコール）
１．５mlエッペンチューブに、本願発明で処理されたＵ９３７細胞を回収し、回転数２０００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、ＰＢＳで洗浄後、さらに回転数２０００ｒｐｍで３分間、遠心分離を行った。エッペンチューブ内の上清を取り除いた後、Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを１００μｌ加え、穏やかにピペッティングし細胞を溶解した。４℃で１５分間置き、回転数１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った。得られた上清を新しいチューブに全量移し、RNase（２０ｍｇ／ｍｌ）を２μｌ加えた。これを、３７℃で１時間インキュベートした。さらに、ProteinaseK（２０ｍｇ／ｍｌ）を２μl加え、３７℃で１時間インキュベートし、５Ｍ  ＮａＣｌを２０μｌ及びイソプロパノールを１２０μl加え、−２０℃で一晩放置した。次に、回転数１５０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離し、上清を廃棄した後、さらに、回転数１５０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、上清を完全に除去し、ペレットを、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ１０μlに溶解した。
得られた溶液を、２%アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、SYBR Green I（Molecular Probes）で３０分染色し、FluoroImager（Filter:530）（Mokecular Dynamics）でゲルの画像を取り込み、得たＤＮＡラダーを図４に示す。
【００４１】
図４に示すように、本願発明のアポトーシス誘導剤を添加していないＵ９３７細胞と比較し、本願発明のアポトーシス誘導剤を添加したＵ９３７細胞はＤＮＡラダーを形成していることから、本願発明のアポトーシス誘導剤がアポトーシス誘導を引き起こしていることが分かる。
【００４２】
ｂ）クロマチン凝集
２４穴プレートに、U９３７細胞を２×１０５個／ｗｅｌｌ／５００μlで播種した。次に、２０ｍＭの本願発明のアポトーシス誘導剤を５μｌ（終濃度：２００μＭ）添加し，３０分、１時間及び６時間インキュベートしたＵ９３７細胞を用い、以下の方法により、それぞれクロマチン凝集を確認した。
【００４３】
まず、上記の如く、本願発明で処理したＵ９３７細胞をＰＢＳで洗浄した。次に、１%グルタルアルデヒドで2時間以上固定し、遠心分離によりグルタルアルデヒドを除去し、さらにＰＢＳで洗浄した。ペレットをＰＢＳ２０μlに溶解し、１０μl取って、１ｍＭのヘキスト３３３４２溶液（Calbiochem）２μｌと混ぜた後、スライドガラスに滴下した。前記スライドガラスを蛍光顕微鏡Ｕ領域（Ultra violet: 励起光330-380nm, 観察光420nm以上）で観察した。得られた蛍光顕微鏡写真を図５に示す。
【００４４】
図５のコントロールにおける蛍光顕微鏡写真で示すように、本願発明のアポトーシス誘導剤を添加していないもの（図５中（ｄ））に比べ、本願発明で処理されたＵ９３７細胞における蛍光顕微鏡写真（図５中（ａ）〜（ｃ））は、クロマチンの断片と凝集が起こり粒状の像が見られることから、アポトーシスを起こしていることが分かる。
【００４５】
図４及び図５の結果から、本願発明のアポトーシス誘導剤は，癌細胞にアポトーシスを誘導させる、即ちアポトーシス誘導作用を有する物質であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】（Ｚ）‐4‐ベンジリデン‐2‐ｎ‐ブトキシテトラヒドロフランの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２】（Ｚ）‐4‐ベンジリデン‐2‐ｎ‐ブトキシテトラヒドロフランの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３】試験例１の細胞増殖阻害試験における、本願発明の癌細胞増殖阻害剤添加後のＵ９３７細胞増殖率を示すグラフである。
【図４】試験例２のアポトーシス誘導活性試験におけるDNAラダーを示す電気泳動像である。
【図５】試験例３のアポトーシス誘導活性試験におけるクロマチン凝集像を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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