(57)【要約】【課題】  骨代謝に関連するタンパクをコードする遺伝子の遺伝子多型が、該タンパクによる骨代謝のメカニズムに影響している要素を実証できた上での骨代謝に関与するテーラーメイド医療の提供が求められている。【解決手段】  本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、ゲノムＤＮＡよりヒト組織非特異型アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）遺伝子の遺伝子多型が、ＴＮＳＡＬＰの基質親和性に影響を与えていることを実証すると共に、該遺伝子多型を検出することにより、骨密度変化を予測することができることを見いだした。同時に、骨疾患、特にヒト女性の閉経後における原発性の骨粗鬆症が発症する可能性を予測することが可能であることを見いだした。【選択図】図１
2006061090.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトから採取したヒト組織非特異型アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）コード遺伝子の遺伝子多型の測定結果から、測定対象の今後の骨密度変化を予測することを特徴とする骨密度予測方法。
【請求項２】
ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の遺伝子多型が、７８７番目または８７６番目であることを特徴とする請求項１に記載の骨密度予測方法。
【請求項３】
測定結果がヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＴ型またはＴＣ型、もしくは８７６番目の遺伝子多型がＡＡ型またはＡＧ型である場合、測定対象の骨密度が今後低下しやすい傾向にあることを予測することを特徴とする請求項２に記載の骨密度予測方法。
【請求項４】
ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＣ型または８７６番目の遺伝子多型がＡＧ型である測定対象よりも、ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＴ型または８７６番目の遺伝子多型がＡＡ型である測定対象の方が、今後骨密度が低下しやすい傾向にあることを予測することを特徴とする請求項３に記載の骨密度予測方法。
【請求項５】
測定結果がヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＣＣ型または８７６番目の遺伝子多型がＧＧ型である場合、測定対象の骨密度が今後低下しにくい傾向にあることを予測することを特徴とする請求項２に記載の骨密度予測方法。
【請求項６】
測定が、シーケンス法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＭＡＳＡ法、ＲＦＬＰ法またはＰＣＲ−ＲＦＬＰ法である請求項１に記載の骨密度予測方法。
【請求項７】
ヒトから採取したヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の遺伝子多型の測定結果から、測定対象が将来骨疾患を発症する可能性を予測することを特徴とする骨疾患予測方法。
【請求項８】
ヒト女性から採取したヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の遺伝子多型の測定結果から、測定対象が閉経後に原発性の骨粗鬆症を発症する可能性を予測することを特徴とする請求項７に記載の骨疾患予測方法。
【請求項９】
ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の遺伝子多型が、７８７番目または８７６番目であることを特徴とする請求項７に記載の骨疾患予測方法。
【請求項１０】
測定結果がヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＴ型またはＴＣ型、もしくは８７６番目の遺伝子多型がＡＡ型またはＡＧ型である場合、測定対象が将来骨疾患を発症する可能性が高いことを予測することを特徴とする請求項９に記載の骨疾患予測方法。
【請求項１１】
ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＣ型または８７６番目の遺伝子多型がＡＧ型である測定対象よりも、ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＴ型または８７６番目の遺伝子多型がＡＡ型である測定対象の方が、将来骨疾患を発症する可能性が高いことを予測することを特徴とする請求項１０に記載の骨疾患予測方法。
【請求項１２】
測定結果がヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＣＣ型または８７６番目の遺伝子多型がＧＧ型である場合、測定対象が将来骨疾患を発症する可能性が低いことを予測することを特徴とする請求項９に記載の骨疾患予測方法。
【請求項１３】
ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の遺伝子多型を含むＤＮＡを増幅するプライマー、該遺伝子多型を検出するプローブまたは該遺伝子多型を含む塩基配列を認識部位とする制限酵素のいずれかを含む遺伝子多型分析用試薬キット。
【請求項１４】
プライマーが、以下の（i）または（ii）である請求項１３に記載の遺伝子多型分析用試薬キット；
（i）  配列番号２のＤＮＡおよび配列番号３のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）  配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプライマー対。
【請求項１５】
制限酵素が、MvaIである請求項１３に記載の遺伝子多型分析用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）遺伝子の遺伝子多型を検出することにより、骨密度変化を予測する方法、その結果より骨疾患を予測する方法ならびに骨密度予測用遺伝子多型検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、患者の体質や環境、病態などを調べ、複数存在する薬剤中から最も効果的な薬剤の投与前における選択、薬剤投与後の副作用が将来起こる可能性の予測、または将来において特定の疾病にかかる可能性の予測など、患者に最適な医療を提供するテーラーメイド医療が注目を浴びている。特に、高血圧や癌、糖尿病など、生活習慣病の３〜４割は、遺伝的な要因によるものであるとされている。このような遺伝的な要因として、ヒトの遺伝子において塩基配列が個人によって異なる箇所が存在することが挙げられる。このような個人による特定の箇所における遺伝子配列の差は遺伝子多型と呼び、特に１箇所のみの塩基配列がことなることを一塩基多型（ＳＮＰ : Single Nucleotide Polymorphism）と呼ぶ。
【０００３】
上記テーラーメイド医療の対象として骨粗鬆症が挙げられる。骨粗鬆症は、骨に含まれるカルシウムを中心としたミネラルの量（骨密度）が減少し、骨の微細構造が変化したため、骨が脆くなり骨折しやすくなった病態である。特にホルモンのバランスが変化した閉経後の女性に多く、日本における推定患者数は１０００万人を超えるといわれている。
老年期の骨折は、寝たきりなどにつながるため、非常に重大な社会問題となっている。
【０００４】
１９９４年のMorrisonらの発表以来（非特許文献１）、骨粗鬆症と遺伝子多型の関連については、様々な研究がなされている。
例えば、ビタミンＤ受容体遺伝子のBsmI、ApaIおよびTaq1などの遺伝子多型と骨密度の関連（特許文献１）、TGF-β1遺伝子多型と骨密度の関連（特許文献２）などが知られている。
【０００５】
しかしながら、上記タンパクは骨密度と密接関連すると言われているが、その遺伝子多型と骨密度との関係は臨床的な結果から実証されたのみであり、骨代謝のメカニズムは解明されていない。
【０００６】
一方、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ : alkaline phosphatase, orthophosphoric-monoester phosphohydrolase, alkaline optimum EC 3.1.3.1.）も骨粗鬆症に関係していることが知られており、骨組織特異性のアルカリホスファターゼは、その活性を測定することにより、骨粗鬆症の治療の効果を検討するための骨代謝マーカーとして知られている。上記アルカリホスファターゼは、アルカリ性領域において、効率よくリン酸のエステル結合を切断する酵素であり、各組織・臓器に特異的なアイソザイムが存在していることが知られている。
【０００７】
上記アルカリホスファターゼと、遺伝子多型との関係に関しては、ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ : tissue-nonspecific alkaline phosphatase）の遺伝子異常が、低ホスファターゼ症に関連していることが知られている（非特許文献２）。ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼとは、骨、腎臓、肝臓などに発現しているアイソザイムである。
【０００８】
しかしながら、上記ヒトヒト組織非特異型アルカリホスファターゼの遺伝子多型と、骨密度との関係は明らかではなく、骨粗鬆症に関するテーラーメイド医療に関する技術は開示されていない。
【０００９】
【特許文献１】特表平８−５０１９３３号公報
【特許文献２】特開２０００−２７０８９７号公報
【非特許文献１】Morrison NA et al, Nature 367, 284-287,1994
【非特許文献２】Ito M, Amizuka N, Ozawa H, Oda K. Biochem J. 2002 Feb 1;361(Pt 3):473-80.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、骨代謝に関連するタンパクをコードする遺伝子の遺伝子多型が、該タンパクによる骨代謝のメカニズムに影響している要素を実証できた上での骨代謝に関与するテーラーメイド医療の提供が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、ゲノムＤＮＡよりヒト組織非特異型アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）遺伝子の遺伝子多型が、ＴＮＳＡＬＰの基質親和性に影響を与えていることを実証すると共に、該遺伝子多型を検出することにより、骨密度変化を予測することができることを見いだした。同時に、骨疾患、特にヒト女性の閉経後における原発性の骨粗鬆症が発症する可能性を予測することが可能であることを見いだした。
【００１２】
すなわち本発明は、
（１）  ヒトから採取したヒト組織非特異型アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）コード遺伝子の遺伝子多型の測定結果から、測定対象の今後の骨密度変化を予測することを特徴とする骨密度予測方法、
（２）  ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の遺伝子多型が、７８７番目または８７６番目であることを特徴とする（１）に記載の骨密度予測方法、
（３）  測定結果がヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＴ型またはＴＣ型、もしくは８７６番目の遺伝子多型がＡＡ型またはＡＧ型である場合、測定対象の骨密度が今後低下しやすい傾向にあることを予測することを特徴とする（２）に記載の骨密度予測方法、
（４）  ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＣ型または８７６番目の遺伝子多型がＡＧ型である測定対象よりも、ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＴ型または８７６番目の遺伝子多型がＡＡ型である測定対象の方が、今後骨密度が低下しやすい傾向にあることを予測することを特徴とする（３）に記載の骨密度予測方法、
（５）  測定結果がヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＣＣ型または８７６番目の遺伝子多型がＧＧ型である場合、測定対象の骨密度が今後低下しにくい傾向にあることを予測することを特徴とする（２）に記載の骨密度予測方法、
（６）  測定が、シーケンス法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＭＡＳＡ法、ＲＦＬＰ法またはＰＣＲ−ＲＦＬＰ法である（１）に記載の骨密度予測方法、
（７）  ヒトから採取したヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の遺伝子多型の測定結果から、測定対象が将来骨疾患を発症する可能性を予測することを特徴とする骨疾患予測方法、
（８）  ヒト女性から採取したヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の遺伝子多型の測定結果から、測定対象が閉経後に原発性の骨粗鬆症を発症する可能性を予測することを特徴とする（７）に記載の骨疾患予測方法、
（９）  ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の遺伝子多型が、７８７番目または８７６番目であることを特徴とする（７）に記載の骨疾患予測方法、
（１０）  測定結果がヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＴ型またはＴＣ型、もしくは８７６番目の遺伝子多型がＡＡ型またはＡＧ型である場合、測定対象が将来骨疾患を発症する可能性が高いことを予測することを特徴とする（９）に記載の骨疾患予測方法、
（１１）  ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＣ型または８７６番目の遺伝子多型がＡＧ型である測定対象よりも、ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＴ型または８７６番目の遺伝子多型がＡＡ型である測定対象の方が、将来骨疾患を発症する可能性が高いことを予測することを特徴とする（１０）に記載の骨疾患予測方法、
（１２）  測定結果がヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＣＣ型または８７６番目の遺伝子多型がＧＧ型である場合、測定対象が将来骨疾患を発症する可能性が低いことを予測することを特徴とする（９）に記載の骨疾患予測方法、
（１３）  ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子の遺伝子多型を含むＤＮＡを増幅するプライマー、該遺伝子多型を検出するプローブまたは該遺伝子多型を含む塩基配列を認識部位とする制限酵素のいずれかを含む遺伝子多型分析用試薬キット、
（１４）  プライマーが、以下の（i）または（ii）である（１３）に記載の遺伝子多型分析用試薬キット；
（i）  配列番号２のＤＮＡおよび配列番号３のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）  配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプライマー対、
および（１５）  制限酵素が、MvaIである（１３）に記載の遺伝子多型分析用試薬キットに関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の目的は、測定対象の今後の骨密度変化または骨疾患、特にヒト女性の閉経後における骨粗鬆症を発症する可能性を予測する手段を提供することができる。また、それにより、骨密度が低下する可能性がある人または骨疾患が発症する可能性の高い人は、若年時より予防することにより、老年時における骨密度の低下または骨疾患の発症を抑え、ＱＯＬを向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、ヒトから採取した生体試料中に含むヒト組織非特異型アルカリホスファターゼコード遺伝子（ＴＮＳＡＬＰ : Tissue-Nonspecific Alkaline Phosphatase）の遺伝子多型を測定する。尚、市販されている試薬を用いてアルカリホスファターゼ活性を測定したとしても、測定対象の今後の骨密度変化を予測することはできない。
【００１５】
本発明における生体試料とは、血液、唾液または毛髪などが挙げられ、好ましくは、血球細胞、表皮細胞および粘膜細胞などの各種ヒト細胞である。これらの生体試料からＤＮＡを抽出する方法は、公知の方法で行うことができ、例えばフェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法、バナジルリボヌクレオシド複合抽出法等が公知である。
【００１６】
上記ＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の遺伝子多型としては、エクソン７の７８７番目およびエクソン９の８７６番目の遺伝子多型が挙げられる。ここで、本発明における塩基番号はＴＮＳＡＰＬの開始コドンのメチオニン（ＡＴＧ）のアデニンを１番目としている。また、アミノ酸番号は、Ｎ末側のシグナルペプチドの１７残基を−１７とし、成熟タンパク質のコード領域における開始のアミノ酸であるロイシン（ＴＴＡ）を１番としている。
【００１７】
７８７番目の遺伝子多型は、エクソン７の領域に存在し、チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）であることが知られている。ヒトの染色体は二量体であることから、２つの染色体において７８７番目の塩基がチミン（Ｔ）であるＴＴ型、１つの染色体において７８７番目の塩基がチミン（Ｔ）であり、もう一方の染色体において７８７番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるＴＣ型、および２つの染色体において７８７番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるＣＣ型の３タイプの遺伝子多型が存在する。また、７８７番目の塩基がチミンの場合、該塩基を含むコドンがコードするアルカリホスファターゼの２４６番目のアミノ酸はチロシンであり、シトシンの場合、該塩基を含むコドンがコードする２４６番目のアミノ酸はヒスチジンである。
【００１８】
８７６番目の遺伝子多型は、エクソン９の領域に存在し、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）であることが知られている。ヒトの染色体は二量体であることから、２つの染色体において８７６番目の塩基がアデニン（Ａ）であるＡＡ型、１つの染色体において８７６番目の塩基がアデニン（Ａ）であり、もう一方の染色体において８７６番目の塩基がグアニン（Ｇ）であるＡＧ型、および２つの染色体において８７６番目の塩基がグアニン（Ｇ）であるＧＧ型の３タイプの遺伝子多型が存在する。また、８７６番目の塩基がアデニンまたグアニンのいずれの場合であっても、該塩基を含むコドンがコードするアルカリホスファターゼの２７５番目のアミノ酸はプロリンである。
【００１９】
また、上記エクソン７の７８７番目の遺伝子多型と、エクソン９の８７６番目の遺伝子多型は連鎖していることが知られている（Weiss MJ, Henthorn PS, Lafferty MA, Slaughter C, Raducha M, Harris H. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7182-7186 (1986)）。具体的には、エクソン７の７８７番目の遺伝子多型がＴＴ型であると、エクソン９の８７６番目の遺伝子多型はＡＡ型であり、エクソン７の７８７番目の遺伝子多型がＴＣ型であると、エクソン９の８７６番目の遺伝子多型はＡＧ型であり、エクソン７の７８７番目の遺伝子多型がＣＣ型であると、エクソン９の８７６番目の遺伝子多型はＧＧ型である。
【００２０】
したがって、本発明では、エクソン７の７８７番目の遺伝子多型またはエクソン９の８７６番目の遺伝子多型のどちらかを測定すればよい。
【００２１】
尚、配列番号１に示したＴＮＳＡＬＰの塩基配列は、７８７番目の遺伝子多型がチミン（Ｔ）であり、８７６番目の遺伝子多型がアデニン（Ａ）である場合の塩基配列を示しているが、現時点において野生型および変異型の特定はされていないため、配列番号１に示した塩基配列が野生型であるとは限らない。
【００２２】
本発明のＴＮＳＡＬＰの遺伝子多型を測定する方法は、例えば、シーケンス法、配列特異的オリゴプローブ（ＳＳＯＰ : sequence-specific oligonucleotide probes）法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、アレル特異的増幅（ＭＡＳＡ : mutant allele specific amplification）法、ＲＦＬＰ法およびＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などが挙げられ、好ましくはＰＣＲ−ＳＳＯＰ法およびＰＣＲ−ＲＦＬＰ法である。
【００２３】
シーケンス法では、まず、アルカリホスファターゼコード遺伝子のそれぞれの多型部位を内部に含む適当な長さの各遺伝子断片を増幅し得るような特異的プライマー対を合成する。該プライマー対は約１５〜約４０塩基であり、通常のＰＣＲプライマーに要求される好適な条件を満たすものであれば、特に制限されない。次いで、該プライマー対を用い、ヒト由来試料を鋳型としてＰＣＲを行い、目的の各遺伝子断片を増幅させる。ＰＣＲの反応条件は通常使用される範囲で適宜選択することができる。各遺伝子断片を適当なベクターにそれぞれサブクローニングし、マキサム・ギルバート法やジデオキシ法を用いた通常のシーケンスにより塩基配列を決定することができる。また、サブクローニングすることなく直接サイクリングシーケンス法により配列決定することもできる。
【００２４】
ＳＳＯＰ法は、多型部位を吹くむ約１５〜約１００塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相補的なプローブを作製し、ハイブリダイゼーション温度を厳密に制御しながらヒト由来試料から抽出したゲノムＤＮＡとサザンハイブリダイゼーションを行い、ハイブリッド形成の有無により遺伝子多型を判別する方法である。ハイブリダイゼーションは各遺伝子について別個に行っても、あるいは同時に行ってもよい。但し、上記２箇所の遺伝子多型は１塩基での置換であるので、ミスマッチによる不安定効果を最大限にするために、プローブの中央付近に多型部位が存在するようにプローブを設計することが望ましい。
【００２５】
ＳＳＯＰ法の好ましい変法として、ハイブリダイゼーションに先立って多型部位を含む断片をＰＣＲで増幅しておくＰＣＲ−ＳＳＯＰ法が挙げられる。また、両方の対立遺伝子に完全相補的な２つのプローブを作製し、その一方のみを標識して両者共存下にハイブリダイゼーション法は、ハイブリダイゼーション条件を厳密に制御することなく１塩基置換を判別することができる。
【００２６】
ＭＡＳＡ法は、多型部位を含む約１５〜約４０塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相同的（または完全相補的）なオリゴヌクレオチドを一方のプライマーとして合成し、アニーリング温度を厳密に制御しながら、ヒト由来試料を鋳型としてＰＣＲを行い、増幅産物の存在の有無により遺伝子多型を判別する方法である。該方法も上記と同様、交叉反応を防ぐためにＰＣＲの条件を高度に制御する必要があるが、自動サーマルサイクラー中で反応を行えば、比較的容易に正確な判別が可能である。
【００２７】
ＲＦＬＰ法は、ヒト由来試料から単離したゲノムＤＮＡを、一方の遺伝子多型部位で切断し得る酵素（さらに必要に応じて、該遺伝子多型の上流および下流の適当な部位でゲノムＤＮＡを切断し得る他の制限酵素）で消化し、当該遺伝子の部分配列または全配列をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行い、バンドの長さおよび数に基づいて多型を判別する方法である。本発明では、例えば、エクソン９の８７６番目の遺伝子多型を検出する場合は、ＭｖａＩが好適に使用することができる。
【００２８】
ＲＦＬＰ法の好ましい変法としては、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法が挙げられる。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法とは、遺伝子多型部位を内部に含む適当な長さの各遺伝子断片を増幅し得るような特異的プライマー対を合成し、該プライマー対を用い、ヒト由来試料を鋳型としてＰＣＲを行い、目的の各遺伝子断片を増幅させた後、増幅産物について上記のＲＦＬＰ法と同様の制限酵素処理を行い、ゲル電気泳動してバンドの長さおよび数から多型を判別する方法である。また、ＰＣＲに先立って制限酵素処理を行えば、制限酵素で切断されるＤＮＡは遺伝子増幅されないので、バンドの有無により多型を判別することができる。
【００２９】
本発明はまた、上記の分析方法を実施するのに有用なヒトゲノムＤＮＡ含有試料の遺伝子多型分析用試薬キットに関する。本発明の試薬キットは、アルカリホスファターゼコード遺伝子を特異的に増幅し得るプライマー対、および該遺伝子に特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブを含む。
【００３０】
多型分析にシーケンス法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法またはＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などを用いる場合、各プライマー対は、多型部位を含む各遺伝子断片を増幅し得るように、各遺伝子の多型部位よりも上流の配列と、多型部位よりも下流の配列と同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが使用される。例えばプライマー対の場合、上記で説明したエクソン７の７８７番目の遺伝子多型部位を含むＤＮＡを増幅する好ましい例としては配列番号２および３、エクソン９の８７６番目の遺伝子多型部位を含むＤＮＡを増幅する好ましい例としては配列番号４および５が挙げられる。一方、ＭＡＳＡ法を用いる場合は、プライマー対は、各遺伝子の多型部位を含む領域に完全相同的（＝センス）と、完全相補的（＝アンチセンス）な塩基配列を有するものである。
【００３１】
上記ＰＣＲ法は公知の手法により核酸を増幅することができる。例えば、（１）２本鎖ゲノムＤＮＡを約９２〜９５℃、約３０秒〜１分間の反応条件で熱処理することにより１本鎖にする変性工程、該１本鎖ＤＮＡのそれぞれに約５０〜６５℃を約２０秒〜１分間の反応条件で、（２）少なくとも２種類の増幅プライマーを結合させることによりＰＣＲの反応開始点となる２本鎖部分を作製するアニール工程、（３）約７０〜７５℃を約２０秒〜５分間の反応条件でＤＮＡポリメラーゼを用いて反応させる鎖伸張工程の（１）〜（３）の工程を通常の方法により２０〜４０回繰り返すことで核酸を増幅することができる。また、ここに説明した方法は以下の測定方法におけるＰＣＲ法においても準用することができる。
【００３２】
また、上記ＰＣＲ法以外にも、核酸を増幅する手法として、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などの公知の技術が挙げられ、本発明はこれらの手法を使用してもよい。
【００３３】
また、多型分析にＲＦＬＰ法を用いる場合、核酸プローブは各遺伝子の一部または全部の配列を含むものであれば、特に制限されず、多型部位の配列を必ずしも含む必要はない。一方、多型分析にＳＳＯＰ法またはＰＣＲ−ＳＳＯＰ法を用いる場合、核酸プローブは、各遺伝子の多型部位を含む領域の配列に完全相補的な塩基配列を有するものである。
【００３４】
上記プローブは、坦体表面上に物理的または化学的に固定されることで検出ストリップを含む。坦体は、ビニル系ポリマーまたはポリエステル、より詳しくは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレートもしくはニトロセルロースなどの有機材料、ガラスもしくはシリカなどの無機材料、金もしくは銀などの金属材料などが挙げられ、特に限定されるものではないが、成型加工性が容易である有機材料が好ましく、さらに好ましくは、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル類である。これらの坦体は、発色法での検知において、その発色を見やすくするために白色であることが好ましい。
【００３５】
これらの坦体表面にプローブを物理的に固定化する方法として、例えば、ポリリジンなどのポリカチオン性の高分子を坦体表面に被覆することで、ポリアニオンであるプローブとの静電相互作用により、固定化の効率を上げることができる、また、プローブに無関係な塩基配列（ポリチミン鎖など）を付加し、ＤＮＡの分子量を増大させることにより固定化の効率をあげることもできる。さらに、担体表面がガラスなどの場合、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤など、担体表面が金などの場合、２−アミノエタンチオールなどのアミノ基を有するチオールもしくはジスルフィド化合物などで坦体表面を処理することで、ポリアニオンであるプローブとの静電相互作用により、固定化の効率が良くなることが知られている。
【００３６】
一方で、プローブに官能基を導入して化学的に固定化する方法としては、例えば、担体の材料がガラス、シリコンなどの無機材料の場合には、核酸検出用プローブの末端にトリメトキシシラン、トリエトキシシランなどのシランカップリング反応が可能な官能基を修飾し、その溶液に２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄することによることもできる。または、ガラス、シリコンなどの無機材料坦体上に、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することで、坦体の表面をアミノ化し、末端にカルボン酸を導入したプローブとアミノカップリング反応させることで、固定化する方法などがある。さらに、担体の材料が金、銀などの金属材料の場合、核酸検出用プローブの末端にチオール基、ジスルフィド基などの金属と結合可能な官能基を修飾し、その溶液に２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄し、固定化することができる。
【００３７】
また、合成されたプローブを固定するのでなく、リソグラフィー技術を利用して、望む配列を固定表面上で直接プローブを合成する方法も知られており、本発明においてもこの方法も含む。
【００３８】
上記に説明した測定方法のいずれかを用いて、ＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の遺伝子多型を検出し、その結果から測定対象の骨代謝を予測する。
【００３９】
ＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＴ型またはＴＣ型もしくは８７６番目の遺伝子多型がＡＡ型またはＡＧ型である場合、測定対象の骨密度変化が年齢を重ねることにより低くなりやすい傾向にあることを予測することができる。それに伴い、測定対象が将来骨疾患を発症する可能性が高いことを予測することができる。特に、測定対象がヒト女性である場合は、閉経後における原発性の骨粗鬆症を発症する可能性が高いことを予測できる。
【００４０】
さらに厳密に述べると、ＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＣ型（８８７番目の遺伝子多型がＡＧ型）のヒトよりも、ＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＴ型（８８７番目の遺伝子多型がＡＡ型）のヒトの方が、年齢を重ねることによる骨密度低下の度合い大きい傾向にあることを予測することができる。それに伴い、ＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＣ型（８８７番目の遺伝子多型がＡＧ型）のヒトよりも、ＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＴ型（８８７番目の遺伝子多型がＡＡ型）のヒトの方が、将来骨疾患を発症する可能性が高く、特に測定対象がヒト女性の場合は閉経後の原発性の骨粗鬆症を発症する可能性が高いことが予測できる。
【００４１】
一方で、ＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＣＣ型または８７６番目の遺伝子多型がＧＧ型である場合、測定対象の骨密度変化が年齢を重ねることにより低くなりにくい傾向にあることを予測することができる。それに伴い、測定対象が将来骨疾患を発症する可能性が低いことを予測することができる。特に、測定対象がヒト女性である場合は、閉経後における原発性の骨粗鬆症を発症する可能性が低いことを予測できる。
【００４２】
上記の予測方法にて、測定対象の骨密度変化が年齢を重ねることにより低くなる傾向にある、または、測定対象がヒト女性である場合は、閉経後における原発性の骨疾患、主に骨粗鬆症が発症する可能性が高いと診断された場合、例えば、カルシウムを積極的に摂取するなどの食生活の改善、特に女性の場合は無理なダイエットを控えることを勧めるなどの対策を立てることができ、老年期における骨疾患の予防につながる。
【実施例】
【００４３】
以下に本発明を、参考例および実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４４】
参考例１：ＴＮＳＡＬＰ活性に対する遺伝子多型依存性
表１は、ＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の７８７番目の塩基がチミンのものと、シトシンのものをそれぞれプラスミドベクターに挿入し、リポフェクション法によりCOS-1細胞に一過性に強発現させ、ＴＮＳＡＬＰを抽出し、Ｋｍ値（ミカエリス定数）を測定した結果である。測定は、ｐ−ニトロフェニルリン酸の加水分解を、５ｍＭの塩化マグネシウム存在下、ｐＨ１０．０の緩衝液中で行った。得られた値は、１５回の測定の平均である。その結果、ＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の７８７番目の塩基がシトシンであるＴＮＳＡＬＰよりも、チミンであるＴＮＳＡＬＰの方が、Ｋｍ値が高かった。つまり、７８７番目の塩基がシトシンであるＴＮＳＡＬＰは、チミンであるＴＮＳＡＬＰよりも基質親和性が高いことが証明された。
【００４５】
【表１】
2006061090.tif 000003
【００４６】
参考例２：世代別の平均骨密度に対する遺伝子多型依存性
図１は、無作為に選んだ日本人（沖縄県）５０１名について、各世代における撓骨の平均骨密度に対するＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型依存性を解析した結果である。老年期になるほどＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＴ型のヒトが、ＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＣＣ型であるヒトよりも平均骨密度が低く、その差は年齢が高いほど顕著であった。
【００４７】
以上の参考例１および２の結果から、ＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＴＴ型のヒトは、ＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型がＣＣ型のヒトよりも、骨代謝が一般的に低く、老年期において骨密度が低くなりやすい傾向にあることが証明された。
【００４８】
実施例：ヒトの骨代謝予測
ある日本人から血液を採取し、血球細胞を分画して、常法によりゲノムＤＮＡを抽出精製する。該ゲノムＤＮＡにおけるＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の８７６番目の遺伝子多型をＰＣＲ−ＲＦＬＰ法にて測定する。例えば、配列番号４および５のプライマー対を用いて、ＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の８７６番目の遺伝子多型を含むＤＮＡを増幅する。ＰＣＲの条件は、例えば、変性過程を９４℃、３０秒、アニール過程を５５℃、２０秒、鎖伸長過程を７２℃、２０秒とし、この工程を３０サイクル行うことができる。
【００４９】
次に増幅したＤＮＡを制限酵素MvaIで処理し、アクリドアミドゲル電気泳動にて測定する。図２に示すようなアクリドアミドゲル電気泳動の結果において１６３ｂｐバンドを有する場合はＡＡ型、１９１ｂｐのバンドを有する場合はＧＧ型、上記の両方にバンドを有する場合はＡＧ型である。また、２１９ｂｐのバンドは制限酵素で切断されなかったものである。
【００５０】
以上の結果より、ＧＧ型およびＧＡ型のヒトに比べ、特にＡＡ型のヒトは若いうちからカルシウムの積極的摂取などによる生活習慣の改善、女性の場合は無理なダイエットを控えるように勧めることができ、老年期における骨疾患を予防することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、将来の骨密度の変化または骨疾患、特にヒト女性の閉経後における骨粗鬆症を発症する可能性を予測する手段を提供することができる。また、それにより、骨密度が低下する可能性がある人または骨疾患が発症する可能性の高い人は、若年時より予防することにより、老年時における骨密度の低下または骨疾患の発症を抑え、ＱＯＬを向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】７４歳以下、７５〜８４歳、８５歳以上の３群におけるＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の７８７番目の遺伝子多型と、骨密度との関係である。
【図２】ＰＣＲ法で増幅したＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の８７６番目の遺伝子多型を含むＤＮＡを、制限酵素MvaIで処理し、アクリドアミドゲル電気泳動で測定した結果である。
【符号の説明】
【００５３】
１    ＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の８７６番目の遺伝子多型がＴＴ型である場合の測定結果
２    ＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の８７６番目の遺伝子多型がＴＣ型である場合の測定結果
３    ＴＮＳＡＬＰコード遺伝子の８７６番目の遺伝子多型がＣＣ型である場合の測定結果
４    １６３ｂｐのバンド
５    １９１ｂｐのバンド
６    ２１９ｂｐのバンド
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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