(57)【要約】【目的】  牛胚を用いた性判別において、牛の雌雄を迅速かつ正確に判別することを目的とする。【解決手段】  本発明は、牛胚より分取した性判別用細胞を試験材料として、雄特異的塩基配列の標的核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドよりなるプライマー、該プライマーを用いた標的核酸の増幅法、牛胚より分取した性判別用細胞の雄特異的塩基配列の核酸の増幅を検出することによる牛の性判別方法及び牛胚を使用した性判別試薬キットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
牛胚の性判別のための核酸増幅法に用いる性判別用プライマーであって、雄牛の特異的塩基配列（配列番号１）の５６１〜１４８３番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列の核酸、またはその相補鎖から選ばれた標的領域配列の核酸を増幅し、
（１）第１領域として、雄牛の特異的塩基配列にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列、および
（２）第２領域として、第１領域の３’側の塩基配列の相補鎖よりなり、第１領域の５’側に位置する塩基配列
を含むことを特徴とする、プライマー。
【請求項２】
雄牛の特異的塩基配列プラスミドＳ４から選ばれた以下の塩基配列（配列番号２〜１７）あるいはそれと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基からなることを特徴とする、請求項１のプライマー。
CTTCTGAGCCACCAGGGA              配列番号２
ACCCAGGAATCAAACCC               配列番号３
TGCTGGGGTGGATTGT                配列番号４
TACTACTTCACACACATTAGCTTGGC      配列番号５
TGCAGAGGATGTGGAGAA              配列番号６
CCACTTTGGTTTGTCAGTACC           配列番号７
AGCCACAAAGAATACACCATCCA         配列番号８
GTCCATTCAAAAACAGTGTTCC          配列番号９
GCCATATGATCCAGAAATCTCA          配列番号１０
TGTTCACAATGGAGTTCATGTAAGCC      配列番号１１
AGCCAAGAAGTGGATGAATC            配列番号１２
GACTTCCCTGGAAATGTTTAAG          配列番号１３
GATCCCACATGCCACATAGCT           配列番号１４
CTTCCCTGGAAATGTTTAAGTG          配列番号１５
TAAAGCCAGACACAGAGGTCAC          配列番号１６
GAAGCAGGAAAGAGAAGCA             配列番号１７
GAGGAGGAAATGCACTGC              配列番号１８
【請求項３】
雄牛に特異的な性判別塩基配列の核酸を増幅できるプライマーとして、
配列番号２の塩基配列に相補的な配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号５の塩基配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号６の塩基配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号８の塩基配列に相補的な配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号１１の塩基配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号１２の塩基配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号１４の塩基配列に相補的な配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号１５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号１６の塩基配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号１７の塩基配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド
から選ばれた塩基配列を含むことを特徴とする、請求項１のプライマー。
【請求項４】
核酸増幅法がＬＡＭＰ法であることを特徴とする、請求項１から３のプライマー。
【請求項５】
請求項１から３のプライマーを用いることを特徴とする、ＬＡＭＰ法による雄牛に特異的な性判別塩基配列の核酸の増幅法。
【請求項６】
請求項５の雄牛に特異的な性判別塩基配列の核酸の増幅を検出することを特徴とする、牛の性判別方法。
【請求項７】
牛胚の性判別方法において、請求項１から４のプライマー、鎖置換型核酸合成酵素、および基質を含むことを特徴とする、牛胚性判別試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、雄牛に特異的な塩基情報に基づいて設計された新規プライマーと該プライマーを用いた牛胚の性判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
牛では，生まれた子牛が雄か雌かによりその経済価値が大きく変わる。乳用牛としては乳をよく出す雌牛を必要とし、肉用牛では良質肉を確保するために雄牛が必要とされる。したがって、牛の雌雄の産み分け技術が確立されれば、酪農家や肉用牛繁殖農家で目的とする性の子牛のみを生産することができる。そのために、Ｘ・Ｙ精子の分離を行ったり、牛の性別を受精前あるいは受精後の初期段階で判別し、必要な性のみを選択して育成することは、畜産において極めて重要である。
【０００３】
牛の性判別方法には大きく分けて、１）受精前の精子の段階で雌性精子あるいは雄性精子を分離判別する方法、２）受精卵からの細胞（胚）を調べる方法がある。
【０００４】
１）受精前の精子の段階で雌性精子あるいは雄性精子を分離判別する方法：
牛には染色体が６０本あり、そのうち性決定に関与する性染色体はＸ、Ｙの２種類が存在する。Ｘ染色体を２本持つと雌に、Ｘ染色体とＹ染色体を各々１本ずつ持つと雄になる。卵子にはＸ染色体が１本のみでＹ染色体は無いが、精子にはＸ染色体のみを持つ雌性精子とＹ染色体のみを持つ雄性精子があり、精子の種類によって性が決定される。Ｘ染色体はＹ染色体より重いため、雌性精子の方が比重が大きい。そこで比重差を利用した沈降法あるいは密度勾配遠心法で雌性精子と雄性精子が分離できる。しかし、この比重差は僅かであり、精子の大きさ、成熟度により精子の比重にもばらつきがあるため、確実に分離することは困難である。また、精子を染色しレーザー光を照射すると、Ｘ染色体がＹ染色体より少し大きいため雌性精子の蛍光が少し強くなることを利用したフローサイトメーター（細胞解析分離装置）による方法がある（非特許文献１）。さらにその判別精度を高めるために、精子の尾部を除去したいわゆる「精子核」のＤＮＡ含量の差により、雌性精子、雄性精子を分別する方法が報告されている。しかし、フローサイトメーター法の欠点として、レーザー光による精子の変性の可能性、前処理に手間がかかること、高価な機器を要すること等が挙げられる。
【０００５】
２）受精卵からの細胞（胚）を調べる方法：
胚を調べる方法としては、ａ）胚をそのまま用いる方法と、ｂ）胚の一部を取り出して調べる方法がある。ａ）の方法としては、雄のみが持つＨＹ抗原に対する抗体を利用する方法がある。ＨＹ抗体で胚を処理すると牛胚の形態変化が起こり、雄の判別が可能となる。しかし、この方法は、抗体の力価が低く、さらには性判別の精度が低い等で実用化されてない。一方、ｂ）の方法としては、染色体解析により、直接Ｘ染色体並びにＹ染色体を観察する核型判別方法が挙げられるが、この検査法は、多量の胚細胞が必要である、染色体標本作製の手技が煩雑である、胚を傷つけ妊娠の継続に支障をきたす可能性がある上、結果が出るまでに１０時間程度かかり、性別の判別率も約５０％と満足できるものではない。そこで、現在最も実用化している方法は、ｂ）の方法の一つで、ＰＣＲ法を用いた性判別方法である。これは、受精卵から細胞を採取し、雄の特異的塩基配列の存在をＰＣＲ法により確認する方法であり、核酸の増幅があれば雄、なければ雌と判別する。この方法は、判別まで数時間しか要さず、判別精度もほぼ１００％を示すため、現在の所、一番優れた方法といえる。
【０００６】
ＰＣＲ法は、標的配列の両端の一方のセンス鎖を認識するオリゴヌクレオチドと、両端の他方のアンチセンス鎖を認識するオリゴヌクレオチドを２種類のプライマーとして用いた核酸増幅法である。まず、相補的な２本鎖核酸を熱処理により１本鎖核酸に変性させる。次に、各々の１本鎖核酸に３’側からプライマーを相補的に結合（アニール）させ、引き続き、鋳型依存性核酸合成酵素により結合したプライマーからＤＮＡ伸長させる。ここまでの工程で、元の鋳型から増幅したい領域は２倍に増幅したことになる。ここまでを１サイクルとすると、ＰＣＲ法は、このサイクルを繰り返し行うことによって、標的配列を指数関数的に増幅することができる。ただし、ＰＣＲ法は各段階で反応温度が異なるため、反応の段階に応じて反応温度を制御する必要がある。
【０００７】
ＰＣＲ法を用いた牛の性判別方法は、雄に特異的な塩基配列の核酸を増幅できる１組のプライマーを用い、牛胚から得られたＤＮＡ試料を鋳型としてＰＣＲを行うものである。上記特異的配列を有する雄の牛胚では鋳型ＤＮＡが増幅されるが、雌の場合は増幅されない。しかし、プライマーの塩基配列によっては、目的以外の塩基配列にわずかでもアニールした場合、標的配列以外の塩基配列の核酸が増幅してしまう。したがって、プライマーの選定は特に重要となる。現在、牛胚の性判別用プライマーとしては、Ｙ染色体上の繰り返し配列を利用した「ＸＹセレクター」（特許文献１）が知られている。
【０００８】
また、胚の性別判定のために受精卵から採取できる細胞試料は非常に微量であるため、例えば、雄特異的な塩基配列の核酸を増幅するためのプライマーを用いて、期待した増幅が確認できなかった場合に、雌と判別すべきなのか、増幅酵素の失活や細胞試料の添加ミス等の他の要因によるものかが判断できない。そのため、実際に性判別を行う場合には、雄特異的なＤＮＡ断片とは別に、反応が正常に行われていることを確認するために、雄雌共通の塩基配列の核酸が増幅されるプライマーを用意し、２組のプライマーを同時に用いてＰＣＲ反応を行う方法が採られている。
【０００９】
本発明者らは、性別の判定と反応の確認をただ１組のプライマーを用いて行うことができる新規プライマーを開発した（特許文献２）。雄牛の白血球から抽出した、雌牛には存在しない配列番号１に示す１５４２塩基対の雄特異的核酸配列からプライマーを設計し、ＰＣＲ法による判別を行ったところ、染色体解析の結果と完全に一致し、精度が非常に高いことが判明した。
【００１０】
さらに、本発明者らはループ媒介等温増幅法（Loop-mediated isothermal AMPlification：ＬＡＭＰ法）を完成している（非特許文献２、特許文献３）。ＬＡＭＰ法は鋳型となるヌクレオチドに自身の３'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした。またＬＡＭＰ法では、プライマーの３'末端が常に試料に由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能する。その結果、特異性の高い遺伝子配列の核酸の増幅反応が可能となった。
【００１１】
【特許文献１】特開平７−１３２０８８号公報
【特許文献２】特開平８−２０５８９５号公報
【特許文献３】特許公報国際公開第００／２８０８２号パンフレット
【特許文献４】特許公報国際公開第２００２／２４９０２号パンフレット
【特許文献５】特開平２００１−２４２１６９号公報
【特許文献６】特許公報国際公開第０１／８３８１７号パンフレット
【特許文献７】特開平２００２−３４５４９９号公報
【非特許文献１】佐々木捷彦、家畜診療、２００４年、５１巻（２）、ｐ．７９−８６
【非特許文献２】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、 ２０００、 Ｖｏｌ．２８（１２）、ｅ６３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、本発明者らが発見した雄特異的塩基配列から設計された新規プライマーと該プライマーを用いたＬＡＭＰ法を用いた牛胚の性判別方法に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記問題を解決するため鋭意研究を行なった結果、雄牛に特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＬＡＭＰ法により雄牛に特異的な塩基配列を増幅する事により、胚の性を判別できる事を見出し本発明を完成した。
【００１４】
すなわち本発明は、雄牛の特異的塩基配列（配列番号１）の５６１〜１４８３番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、またはその相補鎖から選ばれた標的領域配列の核酸を増幅し、
（１）第１領域として、雄牛の特異的塩基配列にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列、および
（２）第２領域として、第１領域の３’側の塩基配列の相補鎖よりなり、第１領域の５’側に位置する塩基配列
の領域を含むプライマーを提供することを特徴とする。
【００１５】
また本発明は、雄牛の特異的塩基配列から選ばれた以下の塩基配列（配列番号２〜１７）あるいはそれと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基からなるプライマーを提供する。
CTTCTGAGCCACCAGGGA              配列番号２
ACCCAGGAATCAAACCC               配列番号３
TGCTGGGGTGGATTGT                配列番号４
TACTACTTCACACACATTAGCTTGGC      配列番号５
TGCAGAGGATGTGGAGAA              配列番号６
CCACTTTGGTTTGTCAGTACC           配列番号７
AGCCACAAAGAATACACCATCCA         配列番号８
GTCCATTCAAAAACAGTGTTCC          配列番号９
GCCATATGATCCAGAAATCTCA          配列番号１０
TGTTCACAATGGAGTTCATGTAAGCC      配列番号１１
AGCCAAGAAGTGGATGAATC            配列番号１２
GACTTCCCTGGAAATGTTTAAG          配列番号１３
GATCCCACATGCCACATAGCT           配列番号１４
CTTCCCTGGAAATGTTTAAGTG          配列番号１５
TAAAGCCAGACACAGAGGTCAC          配列番号１６
GAAGCAGGAAAGAGAAGCA             配列番号１７
GAGGAGGAAATGCACTGC              配列番号１８
【００１６】
さらに、雄牛に特異的な性判別塩基配列の核酸を増幅できる、
配列番号２の塩基配列に相補的な配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号５の塩基配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号６の塩基配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号８の塩基配列に相補的な配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号１１の塩基配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号１２の塩基配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号１４の塩基配列に相補的な配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号１５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号１６の塩基配列、塩基数０から５０の任意の塩基配列及び配列番号１７の塩基配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド
から選ばれた塩基配列を含むプライマーを提供する。
【００１７】
さらに、核酸増幅法がＬＡＭＰ法である該プライマー、該プライマーを用いるＬＡＭＰ法による雄牛に特異的な性判別塩基配列の核酸の増幅法並びに雄牛に特異的な性判別塩基配列の核酸の増幅を検出する事による性判別方法を提供し、さらに該プライマー、鎖置換型核酸合成酵素、および基質を含む牛胚性判別試薬キットを提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
核酸増幅法による牛の性判別用の試料としては、受精卵からバイオプシーで取り出された細胞の一部すなわち牛胚試料を使用する。ＬＡＭＰ法の試料としては、この牛胚試料から、熱、アルカリ等で適宜選択された処理法により抽出された核酸が使用される。
【００１９】
本発明において標的配列とは、増幅すべきポリヌクレオチドの塩基配列を意味する。一般にポリヌクレオチドの塩基配列は、５'側から３'側に向けてセンス鎖の塩基配列を記載する。本発明において、連続的に新たな標的塩基配列の核酸が合成される事を増幅と呼ぶ。更に本発明において、相補鎖合成の起点を与えることとは、鋳型となるポリヌクレオチドに対して、相補鎖合成に必要なプライマーとして機能するポリヌクレオチドの３'末端をハイブリダイズさせることを言う。また本発明において、３'末端、あるいは５'末端とは、単にいずれかの末端の１塩基のみならず、末端の１塩基を含み、かつ末端に位置する領域を意味する。本発明において、プライマーセットとは同時に用いられるプライマーの組み合せをいう。
【００２０】
ＬＡＭＰ法は、プライマーとして少なくとも４種類のオリゴヌクレオチドを用いる核酸増幅法で、２種類はインナープライマー（Inner Primer）、残りの２種類をアウタープライマー（Outer Primer）と呼ぶ。ＬＡＭＰ法は、これら４種のプライマー、鎖置換合成活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素、及び基質を用い、熱変性を必要とせずに、終始等温で速やかに特異性の高い遺伝子配列の核酸の増幅反応が進行することを特徴とする。
【００２１】
標的塩基配列の３'末端から当該ポリヌクレオチド鎖の３'末端方向に向かって順に、第１の任意配列Ｆ１ｃ、第２の任意配列Ｆ２ｃ、第３の任意配列Ｆ３ｃをそれぞれ選択し、標的領域の５'末端から当該ヌクレオチド鎖の５'末端方向に向かって順に、第４の任意配列Ｒ１、第５の任意配列Ｒ２、第６の任意配列Ｒ３それぞれ選択する。Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃの相補配列をそれぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３、またＲ１、Ｒ２、Ｒ３の相補鎖をＲ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃと呼ぶ。
【００２２】
インナープライマー（Inner Primer）とは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３'末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５'末端に有することを特徴としたオリゴヌクレオチドである。ここで、Ｆ２より選ばれた塩基配列、およびＦ１より選ばれた塩基配列と相補的な塩基配列を含むプライマーをインナープライマーＦ、Ｒ２より選ばれた塩基配列およびＲ１より選ばれた塩基配列と相補的な塩基配列を含むからなるプライマーをインナープライマーＲと呼ぶ。
【００２３】
アウタープライマー（Outer Primer）とは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の下流に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有することを特徴としたオリゴヌクレオチドである。Ｆ３より選ばれた塩基配列を含むプライマーをアウタープライマーＦ、Ｒ３より選ばれた塩基配列を含むプライマーをアウタープライマーＲと呼ぶ。インナープライマー及びアウタープライマーにおいて、Ｆは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマーの表示であり、Ｒは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマーの表示である。
【００２４】
標的塩基配列に選択的にアニールしたインナープライマーからの核酸合成反応が進行すると同時に、アウタープライマーを起点とするその下流からの核酸合成反応によって鎖置換反応が起こる。そのためにインナープライマーを起点とする伸長鎖が鋳型である標的塩基配列から分離し、自身の５'末端でループ構造を形成する。インナープライマーの３'末端を起点とした伸長鎖に、もうひとつのインナープライマーが選択的にアニールし、合成起点となり核酸合成が進行する。同時にもうひとつのアウタープライマーを起点とする核酸合成反応によって鎖置換反応が起こる。その結果、自己を鋳型としながら合成起点となる３'末端を有し、両端にそれぞれループ構造を有することを特徴とする「ダンベル型」ヌクレオチドが形成される。
【００２５】
上述の「ダンベル型」ヌクレオチドのループの塩基配列は、３'末端側のループの一本鎖部分にインナープライマーが相補的にアニールし合成起点を与えるので、ループ構造を有する中間産物は連続的にインナープライマーの鋳型として機能し、核酸合成が進行する。特に、ループ構造を複数有する中間産物は、複数の核酸合成反応が同時多発的に進行する鋳型となりながら、鎖置換反応によってまた新たなループ構造を有する中間産物を生成させる。このように等温条件下で連続的かつ大量に標的遺伝子配列の特定のヌクレオチド配列の核酸を増幅することを可能にしたのがＬＡＭＰ法である。
【００２６】
ＬＡＭＰ法においては、インナープライマーとアウタープライマーに加え、他のプライマーを用いることができる。ダンベル構造の５'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーをループプライマー（Loop Primer）と言う。これを用いると核酸合成の起点を増やす事になり、反応時間の短縮と検出感度の上昇ができる（特許文献４）。ループプライマーの塩基配列は上述のダンベル構造の５'末端側のループの１本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的遺伝子の塩基配列あるいはその相補鎖から選ばれてもよく、他の塩基配列でもよい。また、ループプライマーは１種類でも２種類でも良い。
【００２７】
本発明でインナープライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、３０塩基以上、好ましくは３５塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでもよい。Ｆ側のインナープライマーは、その塩基配列として標的遺伝子配列のある配列よりなるオリゴヌクレオチドを３'側に、そしてそれより下流の別の塩基配列の相補鎖よりなるオリゴヌクレオチドを５'側に持ち、その間には０から５０塩基よりなる任意のオリゴヌクレオチドを持っても良い。Ｒ側のインナープライマーの塩基配列は、Ｆ側のインナープライマーより下流の、標的遺伝子配列のある配列の相補鎖よりなるオリゴヌクレオチドを３'側に、そしてそれより上流の別の塩基配列を５'側に持ち、その間には０から５０塩基よりなる任意の塩基配列を持ってもよい。また、プライマーは特に検出用として標識されていてもよい。アウタープライマー並びにループプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでも良い。
【００２８】
ＬＡＭＰ法で使用する各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであっても良く、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であっても良い。
【００２９】
本発明者らは、牛の雄特異的塩基配列を迅速に増幅できるＬＡＭＰ法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、プライマーセットとしてＡ〜Ｃの３組を選定した。プライマーセットＣでは、ループプライマーＦとループプライマーＲも選定した。プラーマーセットＡ及びＢにおいても、ループプライマーを設計することが可能である。
プライマーセットＡ
インナープライマーＦ：TCCCTGGTGGCTCAGAAGAAACCCAGGAATCAAACCC          配列番号１９
インナープライマーＲ：TACTACTTCACACACATTAGCTTGGCTTCTCCACATCCTCTGCA   配列番号２０
アウタープライマーＦ：TGCTGGGGTGGATTGT                               配列番号４
アウタープライマーＲ：GGTACTGACAAACCAAAGTGG                          配列番号２１
プライマーセットＢ
インナープライマーＦ：TGGATGGTGTATTCTTTGTGGCTGTCCATTCAAAAACAGTGTTCC  配列番号２２
インナープライマーＲ：TGTTCACAATGGAGTTCATGTAAGCCGATTCATCCACTTCTTGGCT 配列番号２３
アウタープライマーＦ：GCCATATGATCCAGAAATCTCA                         配列番号１０
アウタープライマーＲ：CTTAAACATTTCCAGGGAAGTC                         配列番号２４
プライマーセットＣ
インナープライマーＦ：AGCTATGTGGCATGTGGGATCCTTCCCTGGAAATGTTTAAGTG    配列番号２５
インナープライマーＲ：TAAAGCCAGACACAGAGGTCACTTTTGCTTCTCTTTCCTGCTTC   配列番号２６
アウタープライマーＦ：AGCCAAGAAGTGGATGAATC                           配列番号１２
アウタープライマーＲ：GCAGTGCATTTCCTCCTC                             配列番号２７
ループプライマー  Ｆ：GGGATGGAAACTGTGCAT                             配列番号２８
ループプライマー  Ｒ：ATTGCATGTGGAAGAACTGTAG                         配列番号２９
【００３０】
本発明に使用するプライマーの塩基配列は、本発明者らが考案したプライマーの特許（特許文献２）の塩基配列と一部重複しているが、これらのオリゴヌクレオチドはＰＣＲ法のプライマーであるのに対し、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＬＡＭＰ法のプライマーであり異なる。
【００３１】
鋳型依存性核酸合成反応で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、Bst ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント)、Bca(exo-)ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡ ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Vent(Exo-)ＤＮＡポリメラーゼ（Vent ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、DeepVent(Exo-)ＤＮＡポリメラーゼ（DeepVent ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）及びKOD ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくはBst ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント)が挙げられる。Bst ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合は、その反応至適温度である65℃付近で反応を行うのが望ましい。
【００３２】
増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。たとえば増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドを用いたり、あるいは、反応終了後の反応液をそのままアガロース電気泳動にかけても容易に検出できる。ＬＡＭＰ法では塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。
【００３３】
さらに、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅は加速度的かつ効率的に行なわれるので、反応液中にあらかじめ二本鎖核酸の分子内に特異的に取り込まれるインターカレーターであるエチジウムブロマイドやSYBR Green（Molecular Probes 社製）等を添加することにより増幅を確認できる（特許文献５）。また、経時的に蛍光強度を観察することができるABI Prism 7700（Applied Biosystems社製）等の連続蛍光光度計で、増幅の有無の確認や速度論的解析をすることも可能である。
【００３４】
その他、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、肉眼でも確認できる程に白濁する。遺伝子増幅は、この白濁を反応終了後の観察、もしくは反応中の濁度の上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器例えば400nmの吸光度の変化を通常の分光光度計を用いて確認することが可能である（特許文献６）。
【００３５】
また、増幅された遺伝子配列を特異的に認識する担体固相オリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションまたはそれを起点とした伸長反応により、増幅の確認が可能である（特許文献７）。
【実施例】
【００３６】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
１.プライマーの合成
プライマーの塩基配列が設定されれば、市販のＤＮＡ合成機あるいはＤＮＡ合成を専門に取り扱う機関に委託することによって、慣用された方法で容易に合成することができる。プライマーセットＡ〜Ｃは、ＤＮＡ合成を専門に取り扱う機関に委託し、当該機関所有のＤＮＡ合成機で、ホスホアミダイド法により化学合成された。合成後の精製は、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行なわれた。
プライマーセットＡ
インナープライマーＦ：TCCCTGGTGGCTCAGAAGAAACCCAGGAATCAAACCC          配列番号１９
インナープライマーＲ：TACTACTTCACACACATTAGCTTGGCTTCTCCACATCCTCTGCA   配列番号２０
アウタープライマーＦ：TGCTGGGGTGGATTGT                               配列番号４
アウタープライマーＲ：GGTACTGACAAACCAAAGTGG                          配列番号２１
プライマーセットＢ
インナープライマーＦ：TGGATGGTGTATTCTTTGTGGCTGTCCATTCAAAAACAGTGTTCC  配列番号２２
インナープライマーＲ：TGTTCACAATGGAGTTCATGTAAGCCGATTCATCCACTTCTTGGCT 配列番号２３
アウタープライマーＦ：GCCATATGATCCAGAAATCTCA                         配列番号１０
アウタープライマーＲ：CTTAAACATTTCCAGGGAAGTC                         配列番号２４
プライマーセットＣ
インナープライマーＦ：AGCTATGTGGCATGTGGGATCCTTCCCTGGAAATGTTTAAGTG    配列番号２５
インナープライマーＲ：TAAAGCCAGACACAGAGGTCACTTTTGCTTCTCTTTCCTGCTTC   配列番号２６
アウタープライマーＦ：AGCCAAGAAGTGGATGAATC                           配列番号１２
アウタープライマーＲ：GCAGTGCATTTCCTCCTC                             配列番号２７
ループプライマー  Ｆ：GGGATGGAAACTGTGCAT                             配列番号２８
ループプライマー  Ｒ：ATTGCATGTGGAAGAACTGTAG                         配列番号２９
【００３７】
２.ＬＡＭＰ法で使用する試料及び試薬の調製
1)試料の調製（核酸抽出法）
牛受精卵から顕微操作で採取した性判別用細胞の一部を、10mＭ Tris-HCl（pH 8.0）緩衝液10μLに加え、95℃で5分間加温した後、直ちに氷中で急速冷却した溶液を試料とした。または、同細胞の一部を、30mＭ NaOH 溶液12μLに加えて懸濁させ、遠心後、室温で5分以上放置して試料とした。
【００３８】
2)対照用試料
溶媒対象として、滅菌水、並びに試料の入れ損ない等の操作ミスの確認用の着色前処理液すなわち10μＭブロモフェノールブルーを含むTris-HCl（10mＭ、pH 8.0）緩衝液または0.1mg/mＬアシッドイエローを含む30mＭ NaOH溶液を使用した。また陽性対照の鋳型ＤＮＡとして、雄由来プラスミドＤＮＡ（S4）及び雌雄共通プラスミドＤＮＡ（V00125）を用いた。雄由来プラスミドＤＮＡ（S4）は雄牛の白血球から抽出したＤＮＡより作製し、雌雄共通プラスミドＤＮＡ（V00125）は雌牛由来培養細胞よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによってクローニングを行い作製した。また各鋳型ＤＮＡの濃度は、各々の分子量から、雄由来プラスミドＤＮＡ（S4）は6000コピー、雌雄共通プラスミドＤＮＡ（V00125）は60万コピーになるように滅菌水で希釈して調製した。
【００３９】
3)プライマーセットＣを使用する場合のＬＡＭＰ法に用いる試薬組成及び濃度：
・10倍濃度の反応用緩衝液：200mＭ Tris-HCl（pH 8.8）、100mＭ KCl、100mＭ (NH4)2SO4、80mＭ MgSO4、1% Tween 20
・基質溶液：dATP、dCTP、dGTP、dTTPの混合溶液で、各濃度が25mＭ
・Betaine溶液：5Ｍ Betaine
・雄特異的プライマー混合溶液
インナープライマーＦおよびＲ：各1.6μＭ水溶液
アウタープライマーＦおよびＲ：各0.2μＭ水溶液
ループプライマーＦおよびＲ：各0.8μＭ水溶液
・雌雄共通プライマー混合溶液：Genbankに登録されている雌雄共通配列（Accession No. V00125）の塩基配列を基に設計
インナープライマーＦおよびＲ：各1.6μＭ水溶液
アウタープライマーＦおよびＲ：各0.2μＭ水溶液
ループプライマーＦおよびＲ：各0.8μＭ水溶液
・ＤＮＡポリメラーゼ：8unit/μＬ  Bst ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント)（New England BioLab社製）
・滅菌水
【００４０】
３.ＬＡＭＰ法による反応
10倍濃度反応用緩衝液 2.5μＬ、基質溶液 1.4μＬ、Betaine溶液 3μＬ、雄特異的あるいは雌雄共通の各プライマー混合溶液 6μＬ及びＤＮＡポリメラーゼ 1μＬに滅菌水 6.1μＬを加えて混合する。この混合溶液 20μＬを、0.2ｍLの専用チューブに分注する。これに、対照となる２種類の鋳型ＤＮＡあるいは試料を 5μＬ添加したものを反応溶液とした。また、溶媒対照として、滅菌水（図中ＮＣ）並びに着色前処理液（図中前処理液）の２種類を作製した。各反応試料 25μＬについて、65℃で30〜60分間ＬＡＭＰ反応を行い、分光光度計を用いて、波長650nmでの吸光度（濁度）を観察した。ＬＡＭＰ反応30分後の吸光度を測定し、カットオフ値を吸光度0.1とし、0.1未満のものを陰性とした。すなわち雌雄共通のプライマー混合溶液を用いた反応で、0.1以上のものは試料の添加が確実であったと判断し、雄特異的プライマー混合溶液を用いた反応で、0.1以上のものを陽性すなわち雄とした。なお、カットオフ値は、反応溶液のバックグランド（滅菌水及び前処理液）を測定した時の収束値が0.05であること、また染色体解析で雄と判別された牛胚試料及び陽性対照（雄由来プラスミドＤＮＡ（S4））が確実に越える吸光度領域であることを考慮し、0.1と設定した。
【００４１】
４.結果
表１及び図１に示すように、雌雄共通プライマーを使用した系では、溶媒対照（ＮＣ及び前処理液）の吸光度は0.1未満で、牛胚試料はすべて0.1以上であった。一方、表１及び図２に示すように、雄特異的プライマーを使用した系では、溶媒対照及び雌由来と考えられる牛胚試料では0.1未満、雄由来と考えられる牛胚試料はすべて0.1以上であった。これらの結果より、溶媒対照がすべて陰性であることから反応液中のコンタミネーションは見られず、そして、全ての牛胚試料での雌雄共通プライマーでの増幅が確認できたことから、試料中には確実にＤＮＡが存在し、また試料の取り損ないはなかったと考えられる。したがって、吸光度0.1をカットオフ値とし、雌雄共通プライマーが陽性（0.1以上）でかつ雄特異的プライマーが陽性（同）の場合は、雄と判定でき、雌雄共通プライマーが陽性（0.1以上）でかつ雄特異的プライマーが陰性（0.1未満）の場合は、雌と判定できる。
【表１】
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【比較例】
【００４２】
ＰＣＲ法との比較
表２に、ＰＣＲ法とＬＡＭＰ法との性判別結果の比較を示す。ＰＣＲ法での判別結果は、雄由来の配列（S4）からＰＣＲ用に開発された性判別プライマーを使用して得られた結果であり、雌雄を判別する際の確定的診断法である染色体解析との一致率が１００％を示している。雄特異的プライマーを用いたＬＡＭＰ法では、牛胚試料 No.３、７、８、１０、１１、１２が雄、牛胚試料 No.２、４、５、６、９が雌と判別され、ＰＣＲ法との一致率は１００％であった。したがって、本発明の雄特異的プライマーを用いたＬＡＭＰ法による性判別の精度は非常に高い。
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＬＡＭＰ法により牛胚の雄特異的塩基配列の核酸の増幅を確認することにより、牛の性判別を行う方法である。従来のＰＣＲ法は、増幅時間の短縮に限界があり、判別のために電気泳動が必要であるが、ＬＡＭＰ法では、操作が簡便で、非常に単時間に増幅できるため迅速な性判別が可能である。また、ＬＡＭＰ法副産物に由来する濁りが肉眼でも確認できるため、検出が非常に容易である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】雌雄共通プライマーでのＬＡＭＰ反応測定結果
【００４５】
【図２】雄特異的プライマーでのＬＡＭＰ反応測定結果
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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