(57)【要約】【課題】  副作用の心配がなく、がん細胞に選択的に作用させることができる選択的作用組成物並びに可視レーザーによりがん細胞および病細胞を効果的に死滅させる治療用レーザー照射装置を提供する。【解決手段】  がん細胞に特異的にあるいは過剰に発現し、かつ、細胞内に取り込まれ、細胞核に輸送される膜蛋白質に反応するリガンドあるいは抗体１４を直径の大きさが４nmないし１０nmの半導体結晶１１に架橋させる。半導体結晶１１は、リガンドあるいは抗体１４ががん細胞の膜蛋白質と結合し、がん細胞の核付近に蓄積される。がん細胞の核付近に蓄積された半導体結晶は、可視光線照射により活性酸素を放出してがん細胞を選択的に死滅させる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん細胞に特異的にあるいは過剰に発現し、かつ、細胞内に取り込まれ、細胞核に輸送される膜蛋白質に反応するリガンドあるいは抗体が直径の大きさが４nmないし１０nmの半導体結晶に架橋されたことを特徴とするがん細胞への選択的作用組成物。
【請求項２】
レーザーと、該レーザーからの光を走査可能にするガルバノミラーあるいはアクチュエータを備えたレンズと、該レンズを通過した光を試料に照射するための対物レンズと、該対物レンズの直後に配置され、光照射により前記試料から放出される蛍光あるいは反射光を受けるダイクロックミラーあるいはハーフミラーと、該ダイクロックミラーあるいはハーフミラーを介して前記試料から放出される蛍光あるいは反射光を取得するためのフォトデテクターと、該フォトデテクターから出力される信号を取得し、該信号を参照信号とした速度で、前記ガルバノミラーあるいはアクチュエータを駆動させる波形出力装置を備え、前記フォトデテクターから出力される信号に応じて、前記レーザーの走査速度を変化させるようにしたことを特徴とする治療用レーザー照射装置。
【請求項３】
レーザーと、該レーザーからの光を走査可能にするガルバノミラーあるいはアクチュエータを備えたレンズと、該レンズを通過した光を試料に照射するための対物レンズと、該対物レンズの直後に配置され、光照射により前記試料から放出される蛍光あるいは反射光を受けるダイクロックミラーあるいはハーフミラーと、該ダイクロックミラーあるいはハーフミラーを介して前記試料から放出される蛍光あるいは反射光を取得するためのフォトデテクターと、該フォトデテクターから出力される信号を取得し、該信号を参照信号とした速度で、前記ガルバノミラーあるいはアクチュエータを駆動させる波形出力装置と、前記試料の発光あるいは反射光による顕微観察が可能な光学系と、該光学系により顕微観察像を取得できるビデオカメラと、該ビデオカメラからの画像信号を参照した制御信号により前記ガルバノミラーあるいはアクチュエータを制御することのできる画像処理装置を備え、前記フォトデテクターから出力される信号と前記画像処理装置から出力される信号に応じて、前記レーザーの走査速度を変化させるようにしたことを特徴とする治療用レーザー照射装置。
【請求項４】
前記レーザーの出力波長が、３４０ｎｍないし１０６４ｎｍであることを特徴とする請求項２ないし請求項３記載の治療用レーザー照射装置。
【請求項５】
請求項１に記載のがん細胞への選択的作用組成物を含むがん組織に対する光照射時間が、前記がん細胞への選択的作用組成物を含まない細胞に対する光照射時間より長くなるように、前記波形出力装置が前記ガルバノミラーあるいはアクチュエータを駆動するようにしたことを特徴とする請求項２ないし請求項４に記載の治療用レーザー照射装置。
【請求項６】
患部の細胞の光吸収強度が正常細胞光の光吸収強度と異なる病組織に対し光を照射し、該病組織における各細胞の反射光の強度に応じて前記波形出力装置が前記ガルバノミラーあるいはアクチュエータの駆動速度を制御して、前記病組織における細胞に対する光照射時間が、正常細胞に対するする光照射時間より長くなるようにしたことを特徴とする請求項２ないし請求項４に記載の治療用レーザー照射装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん細胞に選択的に輸送され、がん細胞に作用させることができる選択的作用組成物並びにがん細胞および病細胞を死滅させる治療用レーザー照射装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん化学療法は、抗がん剤の投与により、がん細胞の増殖を抑制、あるいは、死滅を図り病巣を消滅させる手法である。抗がん剤治療は、短期間に全てのがん細胞を死滅、除去することは出来ず、一定割合のがん細胞を死滅させる程度に留まっている。従って、患者は、抗がん剤の長期投与を余儀なくされる上、がん細胞を完全に消滅させることは困難である。長期間の投与は、変異により抗がん剤に感受性を示さなくなるがん細胞の出現の可能性を増大させる上、正常細胞への影響もあり副作用を引き起こす場合もある。
【０００３】
抗がん剤をがん細胞選択的に導入することができれば、正常細胞が侵されることなく、効果的に抗がん剤治療を行うことが可能である。
このような観点から、がん化学療法の他に、レーザー光と光感受性物質を用いた光線力学治療が開発されている。光感受性物質は、レーザーで励起することで、エネルギーを吸収し蛍光を発するが、その際に、吸収されたエネルギーの一部は、光感受性物質付近に存在する酸素にも渡される。
【０００４】
その結果、酸素は、活性酸素や１重項酸素へと変化して、生体にとって有毒性をもたらす。上記活性酸素を用いてがん細胞を選択的に死滅させる方法が特許文献１に開示されている。上記方法では、予めがん病巣に選択的に吸収され、かつ、特定波長のレーザー光照射によって励起されて活性酸素を発生する光感受性物質を患者に投与しておき、その上で、がん病巣部にレーザー光を照射することで、がん細胞は死滅する。この様な方法では、正常細胞よりがん細胞に対し強い親和性のあるヘマトポルフィリン誘導体が良く使われている。ヘマトポルフィリン誘導体は、正常細胞に比べがん細胞に多く取り込まれる上に、正常細胞では速やかに代謝されるため、がん細胞に多く蓄積されるとされている。
【０００５】
ヘマトポルフィリン誘導体等の光感受性物質による光線力学療法では、蛍光が微弱であるので、がん患部を可視化し診断するために、多量の光感受性物質をがん細胞に蓄積させる必要がある。しかし、ヘマトポルフィリン誘導体の代謝や蓄積のメカニズムが解明されておらず、それをがん細胞に蓄積させる方法は見つかっていない。
【０００６】
また、ヘマトポルフィリン誘導体等の光感受性物質は、レーザー光を照射すると退色し、退色した光感受性物質は、活性酸素を出す効果も蛍光を発する効果もなくなる。その為、数度の光感受性物質投与とレーザー照射を行う必要があった。加えて、皮膚下に蓄積されたルフィリン誘導体等の光感受性物質は、太陽光やハロゲン光などの強い光の下で一度に退色し、活性酸素を多量に放出し、正常細胞を破壊する。従って、光感受性物質を投与された患者は、投与後3〜5日間、直射日光や強い光への暴露を避ける必要があった。
【０００７】
上記問題点を解決するために、光感受性物質として量子ドットを利用して、がん細胞を可視化する方法等が開発されつつある。量子ドットとは、半導体結晶微小粒子である。量子ドットは、レーザーを照射することにより、その半径に依存した波長で発光する性質を持つ。溶液内で安定して発光する量子ドットとして、CdSe、CdTeが、Quantum dot社より製品化されている。上記量子ドットをがん細胞に特異的に発現する膜蛋白質の抗体を架橋させることで、がん細胞のみを選択的に蛍光標識できる(非特許文献１)。
【０００８】
また、最近になり、量子ドットを励起する際に放出される活性酸素を用いて、がん細胞を死滅させるという方法も開発された(非特許文献２)。量子ドットは、発光が通常の光感受性物質の20倍、退色するまでの時間は30倍以上である。この場合、量子ドットだけでは、がん細胞に対する選択性がないため、がん細胞特異的に結合するようなペプチドを量子ドットに架橋させている。しかしながら、死滅効果を有する上記量子ドットの濃度が数μＭであり、生体に応用するには毒性の心配がある等、臨床応用に十分な効果が得られていない。加えて、量子ドットを励起するためのレーザーが紫外線であるため、正常細胞にまで害を及ぼす危険性が怪訝される。
【特許文献１】特開平１０−２１６２５２
【非特許文献１】Jaiswal J.K. et al., Nat Biotechnol 21:47-51 (2003)
【非特許文献２】Rumiana B. et al., NANO LETTERS 4:1567-1573 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述の様に、抗がん剤あるいはヘマトポルフィリン誘導体等の光感受性物質は、副作用を生じるという問題があった。本発明は、副作用の心配がなく、がん細胞に選択的に輸送され、がん細胞に選択的に作用させることができる選択的作用組成物を提供することを目的としている。
また、本発明は、有害な紫外線レーザーを使用せずに、可視レーザーによりがん細胞および病細胞を効果的に死滅させる治療用レーザー照射装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、がん細胞に特異的にあるいは過剰に発現し、かつ、細胞内に取り込まれ、細胞核に輸送される膜蛋白質に反応するリガンドあるいは抗体が直径の大きさが４nmないし１０nmの半導体結晶に架橋されたことを特徴とするがん細胞への選択的作用組成物が得られる。
また本発明によれば、レーザーと、該レーザーからの光を走査可能にするガルバノミラーあるいはアクチュエータを備えたレンズと、該レンズを通過した光を試料に照射するための対物レンズと、該対物レンズの直後に配置され、光照射により前記試料から放出される蛍光あるいは反射光を受けるダイクロックミラーあるいはハーフミラーと、該ダイクロックミラーあるいはハーフミラーを介して前記試料から放出される蛍光あるいは反射光を取得するためのフォトデテクターと、該フォトデテクターから出力される信号を取得し、該信号を参照信号とした速度で、前記ガルバノミラーあるいはアクチュエータを駆動させる波形出力装置を備え、前記フォトデテクターから出力される信号に応じて、前記レーザーの走査速度を変化させるようにしたことを特徴とする治療用レーザー照射装置が得られる。
【００１１】
さらに本発明によれば、レーザーと、該レーザーからの光を走査可能にするガルバノミラーあるいはアクチュエータを備えたレンズと、該レンズを通過した光を試料に照射するための対物レンズと、該対物レンズの直後に配置され、光照射により前記試料から放出される蛍光あるいは反射光を受けるダイクロックミラーあるいはハーフミラーと、該ダイクロックミラーあるいはハーフミラーを介して前記試料から放出される蛍光あるいは反射光を取得するためのフォトデテクターと、該フォトデテクターから出力される信号を取得し、該信号を参照信号とした速度で、前記ガルバノミラーあるいはアクチュエータを駆動させる波形出力装置と、前記試料の発光あるいは反射光による顕微観察が可能な光学系と、該光学系により顕微観察像を取得できるビデオカメラと、該ビデオカメラからの画像信号を参照した制御信号により前記ガルバノミラーあるいはアクチュエータを制御することのできる画像処理装置を備え、前記フォトデテクターから出力される信号と前記画像処理装置から出力される信号に応じて、前記レーザーの走査速度を変化させるようにしたことを特徴とする治療用レーザー照射装置が得られる。
【００１２】
また本発明は、前記レーザーの出力波長が、３４０ｎｍないし１０６４ｎｍであることを特徴とする治療用レーザー照射装置を提供する。
さらに本発明は、前記がん細胞への選択的作用組成物を含むがん組織に対する光照射時間が、前記がん細胞への選択的作用組成物を含まない細胞に対する光照射時間より長くなるように、前記波形出力装置が前記ガルバノミラーあるいはアクチュエータを駆動するようにしたことを特徴とする治療用レーザー照射装置を提供する。
【００１３】
また本発明は、患部の細胞の光吸収強度が正常細胞光の光吸収強度と異なる病組織に対し光を照射し、該病組織における各細胞の反射光の強度に応じて前記波形出力装置が前記ガルバノミラーあるいはアクチュエータの駆動速度を制御して、前記病組織における細胞に対する光照射時間が、正常細胞に対するする光照射時間より長くなるようにしたことを特徴とする治療用レーザー照射装置を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、半導体結晶は、がん細胞に特異的にあるいは過剰に発現し、かつ、細胞内に取り込まれ、細胞核に輸送される膜蛋白質に反応するリガンドあるいは抗体が架橋されているので、がん細胞に散布されるとリガンドあるいは抗体ががん細胞の膜蛋白質と反応して結合し、膜蛋白質とともにエンドサイトーシスによりがん細胞内へと取り込まれ、がん細胞の核付近に蓄積される。
【００１５】
がん細胞の核付近に蓄積された半導体結晶は、直径の大きさが４nmないし１０nmのであるので、可視光線照射により活性酸素を放出してがん細胞を選択的に死滅させることができる。しかも、死滅効果を有する半導体結晶の濃度は、１０ｎＭ程度あるいはそれ以下であり、毒性の心配がなく、正常細胞の損傷あるいは副作用もない。
【００１６】
乳がん細胞に過剰発現するHER2あるいは白血がん細胞に発現する変異型KIT、PDGFRなどに反応するリガンドあるいは抗体が架橋された半導体結晶であれば、乳がん細胞あるいは白血がん細胞を死滅させることができる。半導体結晶としては、CdSe、CdTe結晶が好ましい。
【００１７】
また本発明によれば、レーザーからの光照射により試料から放出される蛍光あるいは反射光を取得し、その強度に応じてガルバノミラーあるいはアクチュエータを駆動し、レーザーの走査速度を変化させるようにしたので、試料中の光感受性物質の濃度分布を利用して、放射される蛍光が強くなる光感受性物質の濃度の高い領域に、選択的に長時間の光照射行わせることができる。従って、光感受性物質の濃度分布によらず一様に光照射する場合よりも効果的ながん治療が可能となる。
【００１８】
メラニン色素を過剰に発現している細胞(あざやホクロ、皮膚がん)であれば、正常細胞より光吸収が多いので、メラニン色素の濃度の高い領域に、選択的に長時間の光照射行わせることができる。従って、メラニン色素の濃度分布によらず一様に光照射する場合よりも効果的にあざやホクロ、皮膚がん等の治療などが可能となる。
【００１９】
尚、対物レンズは、観察試料によって、無限系対物レンズと結像レンズの対、あるいは有限系対物レンズのどちらかを選択すればよい。
さらに本発明によれば、レーザーからの光照射により試料から放出される蛍光あるいは反射光を取得し、その強度に応じてガルバノミラーあるいはアクチュエータを駆動し、レーザーの走査速度を変化させるようにするとともに、試料の発光あるいは反射光による顕微観察が可能な光学系により顕微観察像を取得できるビデオカメラを備え、ビデオカメラからの画像信号を参照した制御信号によりガルバノミラーあるいはアクチュエータを制御することができるようにしたので、ビデオカメラにて細胞の形状や位置を顕微観察しながら、多様な患部の治療を効果的に行うことが可能となる。
【００２０】
また、レーザーの出力波長が、紫外線より長波長の３４０ｎｍないし１０６４ｎｍであると、正常細胞に害を及ぼす危険性は回避できる。特に、６８０ｎｍを超える波長のレーザーであれば、細胞での透過効率が大きいので、正常細胞への影響を軽減できるとともに、光照射時に皮膚を開けるなどの処置が必要なく、臨床応用時に低侵襲での治療が可能となる。
【００２１】
さらに、がん細胞への選択的作用組成物を含むがん組織に対する光照射時間が、がん細胞への選択的作用組成物を含まない細胞に対する光照射時間より長くなるように、ガルバノミラーあるいはアクチュエータを駆動すると、がん細胞のみを選択的に死滅させることが可能となる。
【００２２】
また、患部の細胞の光吸収強度が異なる病組織に対し、病細胞に対する光照射時間が、正常細胞に対するする光照射時間より長くなるようにすると、病細胞のみを選択的に死滅させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
まず、本発明の実施の形態のがん細胞への選択的作用組成物の製造方法について説明する。
半導体結晶 (例えば、CdSe、CdTe、PbSeの結晶)微粒子（以下、半導体結晶微粒子を量子ドットと記す）の表面は、疎水性が高く、生体に害を及ぼす可能性が高い。そこで、量子ドットは、通常、周囲がPEG等の親水性ポリマーで覆われており、反応基として、カルボキシル基、またはアミノ基などが付加されている。このような親水性ポリマーで覆われた量子ドットの中から、半導体結晶の直径の大きさが４nmないし１０nmの量子ドットを選択する。
【００２４】
このサイズ統一された量子ドットに、がん細胞に特異的にあるいは過剰に発現し、かつ、細胞内に取り込まれ、細胞核に輸送される膜蛋白質(例えば、乳がん細胞に過剰発現するHER2、白血がん細胞に発現する変異型KIT,PDGFRなど)に反応するリガンドあるいは抗体（例えば、HER2の抗体はHerceptinである）を架橋させる。
架橋させる方法は、量子ドットを覆っている親水性ポリマーの種類などによって異なる。
【００２５】
図１は、本発明の実施の形態のがん細胞への選択的作用組成物の製造方法に係わる要部反応工程図であり、図１(ａ)に示すカルボキシル基１２を持つ量子ドット１１を用いる場合、まず、EDC(1-Ethyl-3[3-dimethylamino-propyl]carbodiimide hydrochloride)１３と反応させて、図１(ｂ)に示すように、量子ドット１１のカルボキシル基１２にEDC１３を結合させる。続いて、リガンドあるいは抗体１４と反応させて、図１(ｃ)に示すように、リガンドあるいは抗体１４のアミノ基１５と量子ドット１１のカルボキシル基１２とをペプチド結合により架橋する。
【００２６】
図２は、本発明の実施の形態のがん細胞への選択的作用組成物の他の製造方法に係わる要部反応工程図であり、図２(ａ)に示すアミノ基１７を持つ量子ドット１６の場合、まず、SMCC(Succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate)１８と反応させて、図２(ｂ)に示すように、アミノ基１７に代えてマレイミド基１９を結合する。続いて、マレイミド基１９をリガンドあるいは抗体２０のチオール基２１と反応させ、図２(ｃ)に示すように、ジスルフィド結合により架橋する。この反応は、システイン残基を持つペプチドに限られる。
【００２７】
リガンドあるいは抗体と量子ドットを架橋するこのような方法は、蛍光性量子ドットを販売しているQuantumdot社の製品に付属するマニュアル等に開示されているペプチドと量子ドットを架橋する方法を利用することができる。
次に、上述のがん細胞への選択的作用組成物の利用方法について説明する。
上述のリガンドあるいは抗体を架橋した量子ドットをがん細胞に散布すると、リガンドあるいは抗体が標的の膜蛋白質に結合し、細胞膜表面に結合する。
【００２８】
細胞膜表面に結合したリガンドあるいは抗体は、エンドサイトーシスにより細胞膜から細胞内へと移動し、更にモーター蛋白質によって細胞核周辺まで運ばれる。このとき量子ドットもリガンドあるいは抗体と架橋された状態で細胞核周辺にまで運ばれる。
【００２９】
このような量子ドットを核周辺に持つがん細胞にレーザー光を照射すると、量子ドットが励起され、活性酸素が放出され、がん細胞は損傷を受け、選択的に死滅する。１０ｎＭ程度の量子ドットが細胞内部にあれば、光照射によりがん細胞は死滅する。レーザー光は、半導体結晶の直径の大きさが４nmないし１０nmにサイズ統一されているので、波長が３４０nmないし１０６４ｎｍの可視光が使われる。
【００３０】
続いて、本発明の実施の形態の治療用レーザー照射装置について説明する。
図３は、本発明の第１の実施の形態の治療用レーザー照射装置の構成を示す要部ブロック線図であり、治療用レーザー照射装置は、図３に示すように、無限系対物レンズ２０１、照射レーザーを透過し照射位置における発光を反射するダイクロックミラー２０２、レーザーの照射軸に置かれた結像レンズ２０３、ダイクロックミラー２０２により反射された蛍光を集光するための結像レンズ２０４、結像レンズ２０３の後焦点面に焦点を結ぶように置かれた単レンズ２０５、レーザー光の照射位置を走査するためのガルバノミラー２０６、照射用のレーザー２０７、結像レンズ２０４により集光した蛍光の強さを電圧信号に変えるためのフォトデテクター２０８、フォトデテクター２０８から出される電圧信号Ｖを参照とした制御信号ＣＳをガルバノミラー２０６に送り制御する波形出力装置２０９から構成される。照射用のレーザー２０７の発光波長は、５６０ないし８５０ｎｍの可視光である。
【００３１】
図３に示すような無限光学系を用いる利点は、無限系対物レンズ２０１の配置を選ばない点にあり、カテーテルや硬性内視鏡など、観察位置と結像位置が遠く離れた場合などに利用できる。
ガルバノミラー２０６の代わりに音響光学素子を用いてレーザー光の方向を変えても構わない。
【００３２】
また、フォトデテクター２０８として、フォトダイオード、光子倍増管など、発光の強度を電圧信号に変換する装置であれば、その種類は問わない。波形出力装置２０９も同様であり、フォトデテクター２０８から発せられた電圧信号Ｖを参照とした制御信号ＣＳをガルバノミラー２０６に送ることができれば、コンピュータを用いても良いし、アナログ電子回路でも構わない。
【００３３】
このような構成のレーザー照射装置を用いてレーザー光を量子ドットが蓄積されたがん細胞を含む試料に照射すると、がん細胞を選択的に死滅させることができる。即ち、レーザー２０７から出た平行光は、ガルバノミラー２０６、単レンズ２０５を通して、結像レンズ２０３の後焦点面に焦点を結んだ後、結像レンズ２０３を通り再度平行光に戻り、無限系対物レンズ２０１に入る。
【００３４】
無限系対物レンズ２０１の焦点面と結像レンズ２０３の焦点面は共役の関係にあるので、レーザー２０７から出た光は無限系対物レンズ２０１の焦点面にて集光されている。レーザー２０７と単レンズ２０５の間に配置されているガルバノミラー２０６によりレーザー光を走査して、無限系対物レンズ２０１の焦点面に置かれたがん細胞を含む試料全体を照射する。集光されたレーザー照射によってがん細胞の核周辺の量子ドットは励起され、蛍光を発する。
【００３５】
量子ドットの蛍光は、ダイクロックミラー２０２によって反射され、結像レンズ２０４によって、フォトデテクター２０８の受光面に集光する。フォトデテクター２０８は、量子ドットから発せられた蛍光の強度に比例した電圧信号Ｖを波形出力装置２０９に送信する。波形出力装置２０９は、電圧信号Ｖを参照にして、レーザー照射の走査速度を制御するようにガルバノミラー２０６に制御信号ＣＳを送る。
【００３６】
電圧信号Ｖと制御信号ＣＳの関係は、試料毎に自由に変えることができる。例えば、逆数に比例した速度でレーザーの走査を行うようにガルバノミラー２０６を制御すれば、レーザーの照射時間は、量子ドットの発光強度に比例する。つまり、がん細胞に対して量子ドットを多く取り込んだ量に比例して、がん細胞に損傷を与えることができる。
【００３７】
電圧信号Ｖとガルバノミラー２０６の駆動速度との相関の一例を図４に記す。図４において、図４（a）の縦軸は電圧信号の相対値を、横軸は時間を（単位は秒）を示し、曲線イはフォトデテクター２０８から出力される電圧信号Ｖを示している。また、図４（ｂ）の縦軸は走査速度（単位はｎｍ/ｓ）を、横軸は図４（a）と同じ時間を（単位は秒）を示し、曲線ロはガルバノミラー２０６が電圧信号Ｖに対し反比例する大きさにて走査する場合の走査速度を示し、曲線ハはガルバノミラー２０６が電圧信号Ｖの振幅、オフセットを調節した信号に対し反比例した大きさにて走査する場合の走査速度を示し、曲線ニはガルバノミラー２０６がオフセットを調節した信号の二乗に対し反比例した大きさにて走査する場合の走査速度を示す。
【００３８】
曲線ロ、曲線ハあるいは曲線ニのように、蛍光強度が高く、フォトデテクター２０８から出力される電圧信号Ｖが大きい程、レーザーの走査速度を低下させると、蛍光強度が高い場所には、より多くの時間レーザーが照射される。電圧信号Ｖの振幅、オフセットを調節した信号に対し反比例した曲線ハの走査速度は、蛍光強度が高いところでは約３０ｎｍ／ｓであり、１０μｍを走査するのに約３分かかることになる。
【００３９】
同図において、走査速度が３００ｎｍ/ｓ以上の値を省いているが、計算の都合上１μｍ／ｓ以上の走査速度を１μｍ／ｓにすると、量子ドットを取り込んだ細胞と、そうでない細胞にレーザーが照射される時間は、約３０倍異なる。
このように、量子ドットを含むがん細胞のみに対し選択的に長時間のレーザー照射を行うことができるので、量子ドットが少量でもがん細胞に特異的に取り込まれているのであれば、選択的に、かつ、効率的にがん細胞のみを死滅させることができる。
【００４０】
第１の実施の形態の治療用レーザー照射装置のダイクロックミラー２０２をハーフミラーに代えることで、フォトデテクター２０８は蛍光強度ではなく反射強度を取得できる。図示を省略しているが、このような本発明の第２の実施の形態の治療用レーザー照射装置は、光感受性物質を用いないレーザー治療に利用できる。例えば、メラニン色素を過剰に発現している病細胞(あざやホクロ、皮膚がん)は、光吸収が多いため、フォトデテクター２０８に入る光強度は小さくなる。従って、メラニン色素を過剰発現した細胞などに対して、選択的に長時間のレーザー照射をするようにすると、病細胞のみを選択的に死滅させることが可能となる。
【００４１】
第１の実施の形態の治療用レーザー照射装置は、無限系対物レンズ２０１を用いているが、有限系対物レンズを用いることで、装置が簡素化される。図５は、このような本発明の第３の実施の形態の治療用レーザー照射装置の構成を示す要部ブロック線図であり、図５では、無限系対物レンズ２０１の代わりに有限系対物レンズ２１０を使用することにより、図３の結像レンズ２０３、結増レンズ２０４を省略している。
【００４２】
この場合、フォトデテクター２０８の受光面は、有限系対物レンズ２１０の後結像面に一致するように、また、単レンズ２０５はその焦点位置が有限系対物レンズ２１０の後結像面に一致するように厳しく配置する必要がある。尚、図３に示した構成要素と同じものには同一符号を付してその説明を省略しており、以下、図６および図７にても同様である。
【００４３】
第１の実施の形態の治療用レーザー照射装置おけるガルバノミラーや音響光学素子を用いず、アクチュエータにより直接レンズを動かすことで、レーザー照明を走査することもできる。図６は、このような本発明の第４の実施の形態の治療用レーザー照射装置の構成を示す要部ブロック線図である。同図では、図３のガルバノミラー２０６を除去し、単レンズ２０５をレーザーの照射軸に対して垂直な面に駆動させるためのアクチュエータ２１１を単レンズ２０５に付加し、一体化させた。この治療用レーザー照射装置は、ガルバノミラーや音響光学素子を用いる場合に比べ、簡素である上に安価である。
【００４４】
第４の実施の形態の治療用レーザー照射装置に比べてさらに簡素な構成とすることも可能である。図７は、このような本発明の第５の実施の形態の治療用レーザー照射装置の構成を示す要部ブロック線図である。同図に示す治療用レーザー照射装置は、図３に示す治療用レーザー照射装置のガルバノミラー２０６を除去し、第４の実施の形態の治療用レーザー照射装置と同様に、単レンズ２０５をレーザーの照射軸に対して垂直な面に駆動させるためのアクチュエータ２１１を単レンズ２０５に付加し、一体化させたものであり、極めて簡素な構成になる。
【００４５】
第１ないし第５の実施の形態の治療用レーザー照射装置は、レーザー光を量子ドットが蓄積されたがん細胞を含む試料に照射することができるが、顕微観察が不可能である。図８は、この点を改善した本発明の第６の実施の形態の治療用レーザー照射装置の構成を示す要部ブロック線図である。
【００４６】
図８に示す治療用レーザー照射装置は、反射光もしくは蛍光による顕微観察を可能とする光学系を付加したものであり、無限系対物レンズ７０１、レーザーの照射軸に置かれた結像レンズ７０２、照射レーザーを透過し照射位置における発光を反射するダイクロックミラー７０３、結像レンズ７０２の後焦点面に焦点を結ぶように置かれた単レンズ７０４、レーザー光の照射位置を走査するためのガルバノミラー７０５、照射用のレーザー７０６、結像レンズ７０２により集光した蛍光の強さを電圧信号に変えるためのフォトデテクター７０７、フォトデテクター７０７から出される電圧信号Ｖを参照とした制御信号ＣＳをガルバノミラー７０５に送り制御する波形出力装置７０８、照射用レーザー光、および、照射位置における発光を透過するダイクロックミラー７０９、ハーフミラーあるいはダイクロックミラー７１０、照射用レーザー光の波長と照射位置における発光波長に重ならない波長の顕微観察用のレーザー７１２、顕微観察用のレーザー７１２を集光するためのコンデンサレンズ７１１、結像レンズ７１３、ビデオカメラ７１４、画像処理装置７１５から構成される。
【００４７】
使用方法は、レーザー光を量子ドットが蓄積されたがん細胞を含む試料に照射することに関しては、第１の実施の形態の治療用レーザー照射装置の場合と同様である。レーザー光を量子ドットが蓄積されたがん細胞を含む試料に照射すると、レーザー７０６から出た平行光は、ガルバノミラー７０５、単レンズ７０４を通して、結像レンズ７０２の後焦点面に焦点を結んだ後、結像レンズ７０２を通り再度平行光に戻り、無限系対物レンズ７０１に入る。
【００４８】
無限系対物レンズ７０１の焦点面と結像レンズ７０２の焦点面は共役の関係にあり、レーザー７０６から出た光は無限系対物レンズ７０１の焦点面にて集光されている。レーザー７０６と単レンズ７０４の間に配置したガルバノミラー７０５によりレーザー光を走査して、無限系対物レンズ７０１の焦点面に置かれたがん細胞を含む試料全体を照射する。レーザー照射によってがん細胞の核周辺の量子ドットは励起され、蛍光を発する。
【００４９】
量子ドットの蛍光は、ダイクロックミラー７０３によって反射され、フォトデテクター７０７の受光面に集光する。フォトデテクター７０７は、量子ドットから発せられた蛍光の強度に比例した電圧信号Ｖを波形出力装置７０８に送信する。波形出力装置７０８は、電圧信号Ｖの逆数に比例するような速度でレーザーの走査を行うようにガルバノミラー７０５に制御信号ＣＳを送る。その結果、がん細胞は、量子ドットを取り込んだ量に比例して、損傷を受ける。
【００５０】
さらに、第６の実施の形態の治療用レーザー照射装置では、画像処理装置７１５が、制御信号ＣＳ２を出力することが可能であり、得られた顕微鏡像を参照にしてガルバノミラー７０５を制御する。ダイクロックミラー７０３、レーザー７０６、ダイクロックミラー７０９、レーザー７１２等の特性は、各波長の光が適切に透過・反射するように適時選択する。
【００５１】
例えば、波長８００ｎｍの発光波長を持つ量子ドットを含むがん細胞のみを選択的に死滅させたい場合は、照射用のレーザー７０６には細胞に吸収の少ない波長の６９３ｎｍ、ダイクロックミラー７０３には波長７００ｎｍ以上を反射するミラー、顕微観察用レーザー７１２には波長６９３ｎｍ以下である５３２ｎｍや４８８ｎｍ、ダイクロックミラー７０９には波長６８０ｎｍ以下を反射するミラーを選択すれば良い。レーザー７１２は、白色光源であるハロゲン光源やキセノン光源の光にフィルターを通して代替しても良い。
【００５２】
このような構成により、第６の実施の形態の治療用レーザー照射装置では、顕微観察用のレーザー７１２から出た光がコンデンサレンズ７１１と対物レンズ７０１によって、試料全体を照射し、試料によって反射された光が、ダイクロックミラー７０９、ハーフミラーあるいはダイクロックミラー７１０および結像レンズ７１３を通り、ビデオカメラ７１４に入るので、レーザー７０６のレーザー光を量子ドットが蓄積されたがん細胞を含む試料に照射しながら、ビデオカメラ７１４にてがん細胞を含む試料を同時に顕微観察することが出来る。
【００５３】
第６の実施の形態の治療用レーザー照射装置では、顕微観察が可能であるため、様々な用途に利用できる。第１ないし第５の実施の形態の治療用レーザー照射装置では、細胞の内部にまで量子ドットが輸送されている場合には、がん細胞の中心にレーザーが照射されるのだが、量子ドットが細胞の膜上で滞在している場合には、隣接した正常細胞にまでレーザーが照射されてしまうため、使用範囲が特定される。
【００５４】
これに対し、第６の実施の形態の治療用レーザー照射装置では、細胞の形状や位置を参照することが可能であり、量子ドットを結合させる標的の蛋白質が、細胞内部に取り込まれない膜蛋白質であったとすると、がん細胞の周りだけが円となって蛍光像を作るので、その円の重心位置にレーザーを照射させるように、ガルバノミラー７０５を制御すればよい。
【００５５】
また、第６の実施の形態の治療用レーザー照射装置は、量子ドット等の光感受性物質を用いないレーザー治療に利用できる。がん化によって正常細胞とは形状が異なるがん細胞(胃がん、乳がん等)に対しての選択的攻撃が可能である。
さらに、第６の実施の形態の治療用レーザー照射装置のダイクロックミラー７０３をハーフミラーに代えることで、第２の実施の形態の治療用レーザー照射装置と同様に、メラニン色素を過剰に発現している細胞(あざやホクロ、皮膚がん)に対して選択的に長時間のレーザー照射をするようにすると、病細胞のみを選択的に死滅させることが可能となる。
【実施例１】
【００５６】
（がん細胞への選択的作用組成物）
量子ドットとしてCdSe粒子を、リガンドあるいは抗体として抗HER2抗体を、がん細胞として乳がん細胞ＫＰＬ４細胞を選択し、その実施例について説明する。
乳がん細胞ＫＰＬ４細胞は、膜蛋白質HER2(Human Epidermal grows factor Receptor 2)を正常細胞の約２０倍程度過剰に発現しており、乳がんのモデル細胞として使用されている。抗HER2抗体を架橋したCdSe粒子（以下、抗HER2抗体-CdSeと記す）は、乳がん細胞に対して選択的に結合する。
【００５７】
（選択的作用組成物の乳がん細胞内部への蓄積）
ＫＰＬ４細胞を培養している培養液内に１０ｎＭの抗HER2抗体-CdSeを混合させ、３７℃、５％CO2条件下に１５分間静置させると、抗HER2抗体-CdSeは、ＫＰＬ４細胞の細胞膜に結合し、細胞膜がCdSeの蛍光により標識される。図９（a）は、上記細胞膜の共焦点蛍光顕微鏡像であり、１５分間静置後に、培養液を抗HER2抗体-CdSeを含まない溶液に交換した後、波長５３２ｎｍのレーザーにて励起した時の共焦点蛍光顕微鏡像である。抗HER2抗体-CdSeが結合したＫＰＬ４細胞の細胞膜は、図９（a）の８０１に示すように、CdSeの蛍光により径が２０μmないし６０μmリング状に標識される。
【００５８】
上述の抗HER2抗体-CdSeにより膜表面を標識されたＫＰＬ４細胞を、同条件でさらに２時間程度培養すると、細胞膜上にあった抗HER2抗体-CdSeは、HER2と供に細胞内部へと取り込まれる。細胞には、エキソサイトーシスと言う外敵から身を守る機能が備わっており、毒性のある金属などは、細胞の外に吐き出される場合がある。しかしながら、本実施例では、１２時間経っても抗HER2抗体-CdSeは、外に吐き出されることなく細胞内部に蓄積された。
【００５９】
抗HER2抗体-CdSeにより膜表面を標識されたＫＰＬ４細胞を、同条件でさらに12時間程度培養した時のＫＰＬ４細胞を波長５３２ｎｍのレーザーにて励起した共焦点蛍光顕微鏡像を図９（ｂ）に記す。細胞膜上にあった抗HER2抗体-CdSeは、点線で示す細胞膜８０２上から殆ど消える。それと同時に、細胞内部の細胞核８０３付近に輝点８０４が増え、抗HER2抗体-CdSeが細胞内部へと取り込まれたことが分かる。また、１２時間経過しても、抗HER2抗体-CdSeは細胞内部に残留している様子も分かる。
【００６０】
従って、培養液内の抗HER2抗体-CdSeの濃度を下げても、反応培養時間を延長することによって、抗HER2抗体-CdSeは、同程度がん細胞に蓄積される。本実施例の場合、ＫＰＬ４細胞を培養している培養液内に０．０５ｎＭの抗HER2抗体-CdSeを混合させ、３７℃、５％CO2条件下に２４時間静置させた場合、図９（ｂ）と同程度の抗HER2抗体-CdSeの蓄積が確認できた。
【００６１】
上記の抗HER2抗体-CdSeの細胞膜への取り込み、核への輸送は、モーター蛋白質と呼ばれる、細胞内に必ず存在する蛋白質の役割による。このように、量子ドットを結合させる標的としてがん細胞に過剰に発現し、かつ、細胞内に取り込まれ核に輸送されることが既知な膜蛋白質を選択することによって、がん細胞内部に量子ドットを蓄積させることが可能である。
【００６２】
（乳がん細胞の死滅）
量子ドットを核周辺に持つがん細胞に光照射を与えると、がん細胞は死滅する。
この実施例では、１０ｎＭの抗HER2抗体-CdSeを含む培養液内で、３７℃、５％CO2条件下に１２時間静置させたＫＰＬ４細胞に、波長４７０−４９０ｎｍを透過するフィルターを通した水銀ランプの光により光照射を行った。光照射の強度は、約７００ｍＷ／mm2である。その様子を図１０（ａ）に示す。同図は、上記光照射を行ったときのＫＰＬ４細胞の透過顕微鏡像であり、図１０（ａ）の下部に示した、０、３分後、６分後の表記は光照射直後、光照射から３分後および６分後の透過顕微鏡像である。
【００６３】
図中、細胞膜９０２により囲われた部分が細胞、９０４は細胞核であり、９０１は培養液を示している。光照射から３分後、ＫＰＬ４細胞に光照射直後に比べて形態的な変化は見られなかった。しかし、細胞内にある顆粒 (透過像では黒い斑点として観察される)９０３の運動が止まった。これは、細胞の死を示す。続いて、光照射６分後には、細胞９０２の膜の一部が破壊され、培養液９０１が細胞の内部へと流れ込み、細胞が破裂した。
【００６４】
図１０（ｂ）は、比較例である抗HER2抗体-CdSeを含まない通常の培養液内で同一条件下にて培養したＫＰＬ４細胞に、同条件の光照射を行ったときの、ＫＰＬ４細胞の透過顕微鏡像を示す。比較例では、光照射から6分後でも光照射直後に比べて形態変化は一切見られなかった。図１０（ａ）と図１０（ｂ）を比べると、１０ｎＭの抗HER2抗体-CdSeを含む培養液内で培養したＫＰＬ４細胞のみが、CdSeから放出された活性酸素により、細胞膜が破裂したことがわかる。
【００６５】
上記の方法で、１０ｎＭの抗HER2抗体-CdSeを含む培養液内で１２時間培養したＫＰＬ４細胞は光照射を開始してから顆粒の運動が停止するまでを死滅するまでの時間が、平均で約３分であった。一方、１０ｎＭの抗HER2抗体-CdSeを含まない培養液内で１２時間培養したＫＰＬ４細胞に同様の光照射を行った場合は、９分経過しても死滅は観察されなかった。つまり、細胞内部にCdSeを蓄積したＫＰＬ４のみを選択的に死滅させることができ、細胞内部にCdSeを蓄積しない細胞に損傷を与えないようにすることができる。
【００６６】
本実施例によると、１０ｎＭ程度の量子ドットが細胞内部にあれば、光照射によりがん細胞を死滅させることができる。これは顕微鏡下において、数分でがん細胞を死滅させる程の濃度であり、治療時の投与濃度はさらに低くできる。また、本手法は、モーター蛋白質により量子ドットを細胞内に運ばせ蓄積させるので、人体に影響の無い数ｐＭ程度の投与でも、時間と共に細胞内の量子ドットの濃度を上昇させることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明によると、副作用の心配がなく、がん細胞に選択的に輸送され、がん細胞に選択的に作用させることができる選択的作用組成物が得られる。また、治療用レーザー照射装置は、有害な紫外線レーザーを使用せずに、可視レーザーによりがん細胞およびメラニン色素を過剰に発現している病細胞(あざやホクロ、皮膚がん)細胞を効果的に死滅させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の実施の形態のがん細胞への選択的作用組成物の製造方法に係わる要部反応工程図である。
【図２】本発明の実施の形態のがん細胞への選択的作用組成物の他の製造方法に係わる要部反応工程図である。
【図３】本発明の第１の実施の形態の治療用レーザー照射装置の要部ブロック線図である。
【図４】本発明の第１の実施の形態の治療用レーザー照射装置の動作を説明するための説明図である。
【図５】本発明の第３の実施の形態の治療用レーザー照射装置の要部ブロック線図である。
【図６】本発明の第４の実施の形態の治療用レーザー照射装置の要部ブロック線図である。
【図７】本発明の第５の実施の形態の治療用レーザー照射装置の要部ブロック線図ある。
【図８】本発明の第６の実施の形態の治療用レーザー照射装置のブ要部ブロック線図である。
【図９】本発明のがん細胞への選択的作用組成物の実施例に係わるがん細胞の蛍光顕微鏡観察図である。
【図１０】本発明のがん細胞への選択的作用組成物の実施例並びに比較例に係わるがん細胞に、光照射を行った後のがん細胞の透過顕微鏡観察図である
【符号の説明】
【００６９】
１１、１６  量子ドット
１２  カルボキシル基
１３  1-Ethyl-3[3-dimethylamino-propyl]carbodiimide hydrochloride
１４、２０  リガンドあるいは抗体
１５、１７  アミノ基
１８  Succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate
１９  マレイミド基
２１  チオール基
２０１  無限系対物レンズ
２０２  ダイクロックミラー
２０３、２０４  結像レンズ
２０５  単レンズ
２０６  ガルバノミラー
２０７  レーザー
２０８  フォトデテクター
２０９  波形出力装置
２１０  有限系対物レンズ
２１１  レンズ駆動用アクチュエータ
７０１  無限系対物レンズ
７０２  結像レンズ
７０３  ダイクロックミラー
７０４  単レンズ
７０５  ガルバノミラー
７０６  レーザー
７０７  フォトデテクター
７０８  波形出力装置
７０９  ダイクロックミラー
７１０  ダイクロックミラー、もしくは、ハーフミラー
７１１  コンデンサレンズ
７１２  レーザー
７１３  単レンズ
７１４  ビデオカメラ
７１５  画像処理装置
８０１  細胞膜表面に結合した量子ドット
８０２、９０２  細胞膜
８０３、９０４  細胞核
８０４  細胞に取り込まれた量子ドット
９０１  培養液
９０３  細胞内顆粒
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2006334182.tif 000009
【図８】
2006334182.tif 000010
【図９】
2006334182.tif 000011
【図１０】
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