(57)【要約】【課題】  簡便、迅速かつ低コストで核酸のミスマッチ塩基対の検出を行うことができる方法および当該方法を実施する試薬キットを提供する。【解決手段】  次の一般式（Ｉ）Ａ−Ｌ−Ｂ  ・・・（Ｉ）（式中、Ａは正常な塩基対を形成することができないミスマッチ塩基対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂはミスマッチ塩基対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌは化学構造部分ＡとＢとを結合するリンカー構造を示す。）で表される構造を有する化合物（ミスマッチ塩基対に結合する化合物）を担体に固定化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、ミスマッチを有する二本鎖核酸の分離を行う。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖核酸を含むサンプルから、ミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸の分離を行う分離工程を含んでおり、
当該分離工程では、次の一般式（Ｉ）
Ａ−Ｌ−Ｂ  ・・・（Ｉ）
（式中、Ａは正常な塩基対を形成することができないミスマッチ塩基対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂはミスマッチ塩基対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌは化学構造部分ＡとＢとを結合するリンカー構造を示す。）
で表される構造を有する化合物を担体に固定化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、二本鎖核酸の分離を行うことを特徴とする核酸のミスマッチ塩基対検出方法。
【請求項２】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物として、次に示す一般式群（ＩＩ）
【化１】
2006094725.tif 000006
（式中、Ｒ１およびＲ２は水素原子または炭素数１〜５の有機基を示し、Ｒ１およびＲ２の有機基では１つ以上の炭素原子が窒素原子および／または酸素原子で置換されていてもよい。Ｒ３は炭素数２〜２０の有機基を示し、Ｒ３の有機基では１つ以上の炭素原子が窒素原子、硫黄原子および／または酸素原子で置換されていてもよい。）
から選択される少なくともいずれかの化合物が用いられることを特徴とする請求項１に記載の核酸のミスマッチ塩基対検出方法。
【請求項３】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物として、次に示す化合物群（ＩＩＩ）
【化２】
2006094725.tif 000007
から選択される少なくともいずれかの化合物が用いられることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸のミスマッチ塩基対検出方法。
【請求項４】
上記アフィニティークロマトグラフィーにおける移動相の塩濃度が０．１ｍＭ以上５００ｍＭ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸のミスマッチ塩基対検出方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の核酸のミスマッチ塩基対検出方法を用いることを特徴とするＳＮＰ検出方法。
【請求項６】
二本鎖核酸を含むサンプルを調製するサンプル調製工程を含んでいることを特徴とする請求項５に記載のＳＮＰ検出方法。
【請求項７】
上記サンプル調製工程では、標的領域の塩基配列が既知の試料に由来する核酸と未知の試料に由来する核酸とを混合し、当該標的領域を挟むプライマーセットを用いて核酸の増幅を行うことを特徴とする請求項６に記載のＳＮＰ検出方法。
【請求項８】
次の一般式（Ｉ）
Ａ−Ｌ−Ｂ  ・・・（Ｉ）
（式中、Ａは正常な塩基対を形成することができないミスマッチ塩基対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂはミスマッチ塩基対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌは化学構造部分ＡとＢとを結合するリンカー構造を示す。）
で表される構造を有する化合物が固定化されていることを特徴とする担体。
【請求項９】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の核酸のミスマッチ検出方法、または請求項５ないし７のいずれか１項に記載のＳＮＰ検出方法を実施するために用いられるキットであって、少なくとも上記一般式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を担体に固定化したカラムを含むことを特徴とする試薬キット。
【請求項１０】
さらに、標的領域を増幅するためのプライマーセットと、標的領域を含み当該領域の塩基配列が確認されている核酸とを含むことを特徴とする請求項９に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、一本鎖の核酸がハイブリダイズして二本鎖を形成した場合に、正常な塩基対を形成することができないミスマッチ塩基対に結合する化合物を担体に固定化し、アフィニティークロマトグラフィーによりミスマッチを検出する方法および当該方法を実施するための試薬キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸（ポリヌクレオチド）がハイブリダイズして二本鎖となる場合には、対をなす塩基が決まっている。例えばＤＮＡでは、グアニン（Ｇ）にはシトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）にはチミン（Ｔ）が対をなす。それゆえ、核酸が二本鎖を形成している状態では、通常は、全ての塩基が上記のような対を形成しているが、状況によっては、当該核酸の塩基配列の一部が、このような対を形成することができない場合がある。
【０００３】
例えば、あるＤＮＡと他のＤＮＡをハイブリダイズし得る条件下においた場合に、これらのＤＮＡ同士が全く相補的な塩基配列を有するものであれば、全ての塩基において上記のような対が形成される。これに対して、これらＤＮＡ同士が、ほぼ完全に相補的な塩基配列を有するものであれば、大部分の塩基はこのような対を形成することができるが、１個または数個の塩基はこのような対を形成することができない。このように、正常な塩基対を形成することができない塩基対のことを、本発明では「ミスマッチ塩基対」または単に「ミスマッチ」と称する。
【０００４】
ところで、ヒトゲノムが解読され、ポストゲノムの大きな潮流は遺伝子発現、プロテオームおよび遺伝子多型であると言われている。遺伝子多型の中でも最も注目されているのがＳＮＰ（single nucleotide polymorphism＝１塩基多型）である。ＳＮＰはゲノムＤＮＡの塩基配列上、核酸の変異により個体間で１塩基が異なる現象をいう。
【０００５】
薬剤の効果がある患者と効果がない患者とをＳＮＰにより識別できるようになれば、従来のような画一的な投薬を行う必要がなくなる。例えば、抗癌剤の効果が期待できる患者だけに投薬すれば、無駄がなくなるだけでなく、無用な副作用をも抑えることができる。現に欧米の新薬開発においては、薬剤感受性ＳＮＰｓを臨床データに添付するための臨床試験が進んでいる。したがって、新たなＳＮＰの発見とともに、発見されたＳＮＰを用いて、特定の家系や集団でＳＮＰを解析して遺伝子型を決定する技術（ＳＮＰのタイピング）が重要となる。
【０００６】
本発明者らはＳＮＰを検出する手段としてミスマッチ塩基対に結合する化合物の開発を行ってきた（特許文献１〜２、非特許文献１〜３参照）。また、これらのミスマッチ塩基対に結合する化合物を用いた電気泳動法（特許文献１）や検出用チップの金属薄膜上にミスマッチ塩基対に結合する化合物を固定化した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：surface plasmon resonance）を用いてミスマッチを検出する方法（非特許文献１〜３参照）を提案してきた。
【０００７】
しかしながら、本発明者らが開発したミスマッチ塩基対に結合する化合物は特定のミスマッチ塩基対に対して特異性が高く、特異性の低いミスマッチ塩基対を検出することは困難であった。また、上記ミスマッチ塩基対に結合する化合物を用いた電気泳動法やＳＰＲ法は、実験準備に非常に手間がかかるという問題があった。
【０００８】
一方、ＳＮＰを検出する方法は、他にも多数開発されている。具体的には、例えばＤＮＡアレイ、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法などがある。しかしながら、既知の方法の多くは核酸を化学修飾（蛍光標識等）する必要があり、多大な手間とコストを要するものである。
【特許文献１】特開２００１−１４９０９６号公報（平成１３年６月５日公開）
【特許文献２】特開２００３−２５９８９９号公報（平成１５年９月１６日公開）
【非特許文献１】Nakatani, K., Sando, S. and Saito, I.  (2001) Nat. Biotechnol., 19, 51-55.
【非特許文献２】Hagihara, S., Kumasawa, H., Goto, Y., Hayashi, G., Kobori, A., Saito, I. and Nakatani, K. (2004) Nucleic Acids Res., 32, 278-286.
【非特許文献３】Kobori, A., Horie, S., Suda, H., Saito, I. and Nakatani, K. (2004) J. Am. Chem. Soc, 126, 557-562.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のように、本発明者らが開発したミスマッチ塩基対に結合する化合物を用いて電気泳動やＳＰＲによりＳＮＰを検出する方法は、特定のミスマッチに対する特異性が高いため、全てのミスマッチを検出するためには複数のミスマッチ塩基対に結合する化合物を用いなければならないという問題があった。
【００１０】
また、他のＳＮＰ検出方法の多くは核酸を化学修飾（蛍光標識等）する必要があり、操作が煩雑で、かつ高コストであるため、個人のＳＮＰ診断に適用することは非常に困難である。
【００１１】
それゆえ、ＳＮＰ診断に基づくオーダーメイド医療を実現するために、簡便かつ低コストのＳＮＰ検出技術の開発が待ち望まれている。
【００１２】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡便、迅速かつ低コストで核酸のミスマッチ塩基対の検出を行うことができる方法および当該方法を実施する試薬キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者らが開発したミスマッチ塩基対に結合する化合物を担体に固定化したカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、ミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸を分離できることを見出し、さらに検討した結果、バッファーの塩濃度を変化させることによりミスマッチ塩基対に結合する化合物との特異性が低いミスマッチをも分離できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明に係る核酸のミスマッチ塩基対検出方法は、二本鎖核酸を含むサンプルから、ミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸の分離を行う分離工程を含んでおり、当該分離工程では、次の一般式（Ｉ）
Ａ−Ｌ−Ｂ  ・・・（Ｉ）
（式中、Ａは正常な塩基対を形成することができないミスマッチ塩基対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂはミスマッチ塩基対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌは化学構造部分ＡとＢとを結合するリンカー構造を示す。）で表される構造を有する化合物を担体に固定化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、二本鎖核酸の分離を行うことを特徴としている。
【００１５】
上記一般式（Ｉ）で表される構造を有する化合物は、従来表面プラズモン共鳴法に適用できることが報告されていたが、本発明者らの研究によりアフィニティークロマトグラフィーの担体に固定化した場合にもミスマッチ塩基対と相互作用することが初めて明らかとなった。アフィニティークロマトグラフィーは、カラムの作製を含む準備過程および実施過程を通じて煩雑な操作を必要としない。また、核酸サンプルに蛍光標識等の化学修飾を施す必要がない。したがって、本発明の核酸のミスマッチ塩基対検出方法は、従来の方法と比較して迅速性、簡便性およびコストの面で大幅に改善された方法である。
【００１６】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物としては、次に示す一般式群（ＩＩ）
【００１７】
【化３】
2006094725.tif 000002
【００１８】
（式中、Ｒ１およびＲ２は水素原子または炭素数１〜５の有機基を示し、Ｒ１およびＲ２の有機基では１つ以上の炭素原子が窒素原子および／または酸素原子で置換されていてもよい。Ｒ３は炭素数２〜２０の有機基を示し、Ｒ３の有機基では１つ以上の炭素原子が窒素原子、硫黄原子および／または酸素原子で置換されていてもよい。）
から選択される少なくともいずれかの化合物が用いられることが好ましい。
【００１９】
また、上記一般式（Ｉ）で表される化合物としては、次に示す一般式群（ＩＩＩ）
【００２０】
【化４】
2006094725.tif 000003
【００２１】
から選択される少なくともいずれかの化合物が用いられることがさらに好ましい。
【００２２】
上記化合物は、いずれもミスマッチ検出能力について検証されており、本発明に好適に用いることができる。
【００２３】
上記アフィニティークロマトグラフィーにおける移動相の塩濃度は０．１ｍＭ以上５００ｍＭ以下であることが好ましい。塩濃度が０．１ｍＭ未満であればサンプルのハイブリダイゼーションが不完全になる可能性が高く、検出では擬陽性が出やすくなる、５００ｍＭを超えると二本鎖核酸の結合が強くなり溶出されにくくなる。当該範囲の中から最適な塩濃度を選択することにより、カラムの担体に固定化されたミスマッチ塩基対に結合する化合物との特異性が低いミスマッチ塩基対をも検出することが可能となる。
【００２４】
本発明に係るＳＮＰ検出方法は、上記本発明にかかるミスマッチ塩基対検出方法を用いるものであり、二本鎖核酸を含むサンプルを調製するサンプル調製工程を含んでいることが好ましい。当該サンプル調製工程では、標的領域の塩基配列が既知の試料に由来する核酸と未知の試料に由来する核酸とを混合し、当該標的領域を挟むプライマーセットを用いて核酸の増幅を行うことを特徴としている。
【００２５】
上記サンプル調製工程においては、１種類のプライマーセットを用いた１回の核酸増幅反応のみでＳＮＰを検出するためのサンプル調製が可能である。すなわち、多数の試薬類を管理する必要がなく、操作も簡便に短時間で行うことができ、標識等の化学修飾を施す必要もない。それゆえ、簡便、迅速かつ低コストでサンプル調製を行うことができる。
【００２６】
本発明に係る担体は、次の一般式（Ｉ）
Ａ−Ｌ−Ｂ  ・・・（Ｉ）
（式中、Ａは正常な塩基対を形成することができないミスマッチ塩基対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂはミスマッチ塩基対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌは化学構造部分ＡとＢとを結合するリンカー構造を示す。）
で表される構造を有する化合物が固定化されていることを特徴としている。
【００２７】
上記構成の担体を充填したカラムを用いて、上記本発明に係る核酸のミスマッチ検出方法またはＳＮＰ検出方法を実施することができる。
【００２８】
本発明に係る試薬キットは、上記本発明に係る核酸のミスマッチ検出方法、または上記本発明に係るＳＮＰ検出方法を実施するために用いられるキットであって、少なくとも上記一般式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を担体に固定化したカラムを含むものであればよい。さらに、本キットには、標的領域を増幅するためのプライマーセットと、標的領域を含み当該領域の塩基配列が確認されている核酸とを含むことが好ましい。
【００２９】
上記構成により、キットの使用者はＳＮＰの有無を調べようとする被検サンプルを準備するのみで迅速かつ簡便にＳＮＰの有無を判定することが可能となる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明に係る核酸のミスマッチ塩基対検出方法は、上記一般式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を担体に固定化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、二本鎖核酸の分離を行うものである。
【００３１】
アフィニティークロマトグラフィーは、カラムの作製、準備、実施を通じて煩雑な操作を必要としない。また、核酸サンプルに蛍光標識等の化学修飾を施さなくても検出が可能である。したがって、従来の方法と比較して迅速、簡便かつ低コストで実施することができるという効果を奏する。
【００３２】
さらに、本発明に係るミスマッチ塩基対検出方法を用いてＳＮＰを検出する場合、標的領域の塩基配列が既知の試料に由来する核酸と未知の試料に由来する核酸とを混合し、当該標的領域を挟むプライマーセットを用いて核酸の増幅を行うのみでサンプル調製を行うことができる。すなわち、１種類のプライマーセットを用いた１回の核酸増幅反応のみでＳＮＰを検出するためのサンプル調製が可能であるため、多数の試薬やプライマーを管理する必要がなく、操作も簡便に短時間で行うことができ、標識等の化学修飾を施す必要もない。したがって、サンプル調製も迅速、簡便かつ低コストで行うことができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３４】
〔核酸のミスマッチ塩基対検出方法〕
本発明に係る核酸のミスマッチ塩基対検出方法は、二本鎖核酸を含むサンプルから、ミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸の分離を行う分離工程を含んでおり、上記一般式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を担体に固定化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、二本鎖核酸の分離を行うものであればよい。
【００３５】
ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸が二本鎖を形成する場合には、対をなす塩基が決まっている。ＤＮＡでは、グアニン（Ｇ）にはシトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）にはチミン（Ｔ）が対をなし、ＲＮＡではグアニン（Ｇ）にはシトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）にはウラシル（Ｕ）が対をなす。
【００３６】
例えば、ある一本鎖ＤＮＡと他の一本鎖ＤＮＡをハイブリダイズし得る条件下においた場合に、これらの一本鎖ＤＮＡ同士が全く相補的な塩基配列を有するものであれば、全ての塩基において上記のような正常な塩基対が形成される。
【００３７】
これに対して、２つの一本鎖ＤＮＡ同士が、ほぼ完全に相補的な塩基配列を有するものであれば、大部分の塩基は正常な塩基対を形成することができるが、１個または数個の塩基は正常な塩基対を形成することができない。「ミスマッチ塩基対」とは、このように正常な塩基対を形成することができない塩基対のことを意味する（以下の説明においては、単に「ミスマッチ」と称する場合がある。）。
【００３８】
ここで、上記一般式（Ｉ）において、Ａは正常な塩基対を形成することができないミスマッチ塩基対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂはミスマッチ塩基対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌは化学構造部分ＡとＢとを結合するリンカー構造を示すものである。すなわち、上記式（Ｉ）の構造を有する化合物は、上述の「ミスマッチ塩基対に結合する化合物」と同義であり、以下の説明においては「ミスマッチ認識分子」と称する。
【００３９】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、正常な塩基対を形成することができないミスマッチ塩基対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分Ａと、ミスマッチ塩基対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分Ｂと、ＡとＢとを結合するリンカー構造部分Ｌとからなる構造を有するものであればよく、特に限定されるものではない。
【００４０】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物としては、例えば、上記一般式群（ＩＩ）に示される構造を有する化合物を挙げることができる。ここで、上記一般式群（ＩＩ）において、Ｒ１およびＲ２は水素原子または炭素数１〜５の有機基を示し、Ｒ１およびＲ２の有機基では１つ以上の炭素原子が窒素原子および／または酸素原子で置換されていてもよい。Ｒ３は炭素数２〜２０の有機基を示し、Ｒ３の有機基では１つ以上の炭素原子が窒素原子、硫黄原子および／または酸素原子で置換されていてもよい。これらの一般式群から選択される少なくともいずれかの化合物が用いられることが好ましい。
【００４１】
本発明者らは、このような構造を有するいくつかのミスマッチ認識分子を開発し発表している（非特許文献１〜３）。これらのミスマッチ認識分子はいずれも本発明に好適に用いることができる。具体的には、例えば上記化合物群（ＩＩＩ）のミスマッチ認識分子を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。なお、上記化合物群（ＩＩＩ）のミスマッチ認識分子は、上段がナフチリジンダイマー（ＮＤ）、中段がナフチリジンアザキノロン（ＮＡ）、下段がアミノナフチリジンダイマー（ａｍＮＤ）である。これらの化合物群（ＩＩＩ）から選択される少なくともいずれかの化合物が用いられることが特に好ましい。
【００４２】
上記ミスマッチ認識分子を固定化する担体は特に限定されるものではなく、公知のアフィニティークロマトグラフィー用担体を好適に用いることができる。例えば、本発明者らは、市販のHiTrap NHS-activated HP カラム（Amersham Biosciences）を用いている。
【００４３】
上記HiTrap NHS-activated HP カラムの担体にミスマッチ認識分子を固定化する場合、担体とリガンドはアミノ基を介して結合するので、アミノ基を有するリンカーをミスマッチ認識分子に付加すればよい。例えば、本発明者らは上記ナフチリジンダイマー（ＮＤ）に次に示すようなリンカーを付加して担体に結合させている。
【００４４】
【化５】
2006094725.tif 000004
【００４５】
また、担体にミスマッチ認識分子を固定化する方法は、選択した担体に応じて公知の方法を適用すればよい。なお、担体に固定化するミスマッチ認識分子は１種類に限定されるものではなく、２種類以上のミスマッチ認識分子が固定化された担体を用いてもよい。
【００４６】
ミスマッチ認識分子が固定化された担体を充填するカラムは特に限定されるものではない。素材、容量、径、長さなどは目的に応じて適宜選択すればよい。なお、上記HiTrap NHS-activated HP カラムのように、担体がカラムに充填された状態で市販されているものを用いてもよい。
【００４７】
上記のように作製したカラムには流路を接続することが好ましい。また、流速を一定に保つためのポンプ、溶出した核酸を検出するための検出器を流路の適切な位置に接続することがより好ましい。例えばAKTAexplorer system （Amersham Biosciences）のようなクロマトグラフィーシステムにカラムを取り付けて使用してもよい。検出器は核酸を検出できるものであれば特に限定されるものではない。例えばＵＶ検出器を挙げることができる。ＵＶ検出器は、核酸に標識等の化学修飾を施さなくても検出できるため、本発明には好適である。ただし、流路の接続、ポンプや検出器の接続は任意であり、必須事項ではない。
【００４８】
分析対象サンプルは二本鎖の核酸である。二本鎖の核酸であれば、二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッドであってもよい。二本鎖の核酸中にミスマッチがあれば、カラムの担体に固定化されたミスマッチ認識分子がミスマッチ塩基と結合するため保持時間（リテンションタイム）が長くなり、ミスマッチの有無を検出することができる。
【００４９】
サンプルの二本鎖核酸は適当な塩濃度の緩衝液（ランニングバッファー）に溶解（懸濁）してカラムに流せばよい。ランニングバッファーとしては、例えばリン酸バッファーを用いることができる。また、ミスマッチ認識分子に保持された核酸を溶出するためには、適当な溶出緩衝液（エリューションバッファー）に切替えればよい。エリューションバッファーとしては、例えばアルカリ溶液（NaOH溶液）を用いることができる。
【００５０】
本発明におけるアフィニティークロマトグラフィーの移動相の塩濃度は、０．１ｍＭ以上５００ｍＭ以下であることが好ましい。より好ましくは１０ｍＭ以上１００ｍＭ以下である。移動相とは担体（固定相）の間を流れる溶媒を意味し、上記ランニングバッファーおよびエリューションバッファーが該当する。移動相に用いる塩としては、アルカリ金属のハロゲン化物が好ましく、アルカリ金属の塩化物がより好ましい。具体的にはＮａＣｌ、ＫＣｌ等を挙げることができる。
【００５１】
ここで、本発明者らは、ランニングバッファーおよびエリューションバッファーの塩濃度がミスマッチ塩基対とカラムの担体に固定化されたミスマッチ認識分子との結合に影響を及ぼすことに気づいた。すなわち、塩濃度を変化させれば、ミスマッチ認識分子との特異性が低いため検出が困難であったミスマッチ塩基対もリテンションタイムが長くなり、検出可能となることを見出した。
【００５２】
具体的実験データは後述の実施例で示すが、上記ナフチリジンダイマー（ＮＤ）を固定化したカラムを用いた場合、バッファーの塩濃度を１００ｍＭにすれば、従来のＳＰＲ法にＮＤを適用した場合と同様に、Ｇ−ＧミスマッチおよびＧ−Ａミスマッチのみが分離可能であった。しかしながら、バッファーの塩濃度を２０ｍＭにすれば、上記２種類のミスマッチ以外にＣ−Ｃ、Ｇ−ＴおよびＴ−Ｃミスマッチが分離可能となった。
【００５３】
通常、核酸同士のハイブリダイゼーションの場合、塩濃度が高いとハイブリダイゼーションしやすくなる。すなわち、相補性の低い核酸同士であっても二本鎖を形成できるようになる。一方、塩濃度が低いと相補性の高い核酸同士でなければ二本鎖を形成できない。
【００５４】
上記核酸同士のハイブリダイゼーションにおける塩濃度の影響を考慮すれば、ミスマッチ認識分子との特異性が低いミスマッチ塩基対は、塩濃度が高いほうがミスマッチ認識分子と結合しやすくなるものと予想される。しかし、実際には予想に反して、塩濃度を低くしたほうがミスマッチ認識分子は当該分子と特異性の低いミスマッチ塩基対を長時間保持できることが明らかとなった。
【００５５】
このように、本発明に係る核酸のミスマッチ塩基対検出方法は、アフィニティークロマトグラフィーにおける移動相の塩濃度を最適化することにより、従来のＳＰＲ法等では検出が困難であった、ミスマッチ認識分子との特異性が低いミスマッチ塩基対も分離可能である点に顕著な特徴がある。
【００５６】
なお、ミスマッチ認識分子との特異性が低いミスマッチ塩基対も分離可能となる最適な塩濃度は、用いるミスマッチ認識分子、それを固定化する担体、カラムの形状や大きさ、検出対象の二本鎖核酸のサイズ等により異なる。したがって、作製したカラムと検出対象核酸ごとに最適な塩濃度を決定することが好ましい。
【００５７】
〔ＳＮＰ検出方法〕
本発明に係るＳＮＰ検出方法は、上記本発明に係る核酸のミスマッチ塩基対検出方法用いるものであればよい。すなわち、上記一般式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を担体に固定化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、二本鎖核酸の分離を行う分離工程を有するものであればよく、さらに、サンプル調製工程を含んでいることが好ましい。なお、分離工程については既に詳細に説明したので重複する説明は省略する。
【００５８】
サンプル調製工程においては、標的領域の塩基配列が既知の試料に由来する核酸と未知の試料に由来する核酸とを混合し、当該標的領域を挟むプライマーセットを用いて核酸の増幅を行うことが好ましい。
【００５９】
標的領域とは検出しようとする目的のＳＮＰを含む領域を意味し、塩基配列が既知とはＳＮＰ部位の塩基を含んで当該領域の塩基配列が既に明らかとなっていることを意味する。塩基配列が明らかとなっている領域の範囲は、当該領域を増幅できるようなプライマーセットが設計可能な範囲であれば特に限定されるものではない。当該標的領域の塩基配列が既知の試料に由来する核酸は、ＳＮＰ部位について、いわゆる正常な遺伝子型である野生型の塩基配列を有するものでもよく、上記正常な遺伝子型と異なる変異型の塩基配列を有するものでもでもよい。
【００６０】
一方、標的領域の塩基配列が未知とは、ＳＮＰ部位の塩基が未知であることを意味する。ここで、上記既知試料と未知試料とは同一種の試料であることはいうまでもないので、標的領域の塩基配列が未知の試料におけるＳＮＰ部位の塩基以外の塩基配列は、既知の試料の塩基配列と同一であることが前提である。
【００６１】
試料は、核酸を含むものであれば特に限定されることはない。例えば、血液、リンパ液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水等の体液類、皮膚、粘膜、各種臓器、骨等の組織、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨等を洗浄した後の洗浄液を挙げることができる。
【００６２】
上記試料に由来する核酸は特に限定されるものではなく、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。ＤＮＡとしてはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどを挙げることができる。ＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ、ｒＤＮＡ、ｔＲＮＡなどを挙げることができる。ＲＮＡの場合には、逆転写反応によりＤＮＡとして用いることが好ましい。
【００６３】
当該標的領域を挟むプライマーセットは、標的領域の塩基配列が既知の試料の塩基配列に基づいて、目的のＳＮＰ部位の上流側および下流側にそれぞれプライマーを設計し、それらを組み合わせればよい。プライマーの設計については公知の設計手法に基づいて設計すればよい。配列特異性が高く、増幅反応において非特異的な増幅産物が生じないプライマーが好ましい。
【００６４】
核酸の増幅方法は特に限定されるものではなく、公知の核酸増幅方法から適宜選択して用いればよい。具体的には、例えば、ＰＣＲ法、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、プライマーエクステンション法、転写（トランスクリプション）、複製（レプリケーション）等を挙げることができる。中でもＰＣＲ法が、本ＳＮＰ検出方法に用いる増幅方法として好適である。
【００６５】
上記サンプル調製工程においては、１種類のプライマーセットを用いた１回の核酸増幅反応のみでＳＮＰを検出するためのサンプル調製が可能であるため、多数の試薬やプライマーを管理する必要がなく、操作も簡便に短時間で行うことができ、標識等の化学修飾を施す必要もない。ただし、増幅される核酸に標識等の化学修飾を施すものであってもよく、この場合は、標識したプライマーを用いることにより、または増幅反応の基質となるヌクレオチドに標識したものを用いることにより行うことができる。
【００６６】
以下に、サンプル調製工程および分離工程の一例を具体的に説明するが、これに限定されるものではない。
【００６７】
例えば、ある薬剤の有効性に関連するＳＮＰが明らかになっており、当該薬剤が有効な集団は当該ＳＮＰ部位の塩基がＧ（相補鎖はＣ）であり、当該薬剤が有効でない集団は当該ＳＮＰ部位の塩基がＡ（相補鎖はＴ）である。
【００６８】
まず、標的領域の塩基配列が既知の試料として、ある薬剤が有効な集団に属する患者の血液を用いる。当該試料のＳＮＰ部位の塩基対はＧ−Ｃである。標的領域の塩基配列が未知の試料は、当該ＳＮＰ部位の遺伝子型を調べようとする対象の患者の血液である。この患者の当該ＳＮＰ部位の塩基対はＧ−ＣまたはＡ−Ｔのいずれかである。
【００６９】
血液からゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡ抽出の方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜選択して用いればよい。例えば、市販のゲノムＤＮＡ抽出キット等を用いれば、簡便に行うことができる。また、用いる既知試料について、既に抽出済みのゲノムＤＮＡが保存されている場合には保存ＤＮＡを用いればよく、新たにＤＮＡを抽出する必要はない。
【００７０】
次に、既知試料および未知試料から抽出したゲノムＤＮＡを混合する。ここで、それぞれのＤＮＡ濃度を測定し、等量のＤＮＡを混合することが好ましい。核酸増幅により増幅産物の偏りを生じ難くするためである。
【００７１】
この混合したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。プライマーは目的のＳＮＰ部位を含む断片が増幅されるように設計されたものであればよい。増幅産物の大きさは特に限定されるものではないが、大きすぎると目的としないＳＮＰを含む場合が生じるため、目的以外のＳＮＰが含まれないような大きさとすることが好ましい。
【００７２】
ＰＣＲ終了後、ＰＣＲ反応液から残余のプライマー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ等を除き、増幅産物のみを精製する。精製方法は特に限定されるものではなく、市販の精製キット等を用いればよい。得られた、増幅産物を熱処理し一旦一本鎖ＤＮＡとした後、温度を下げて各一本鎖ＤＮＡをハイブリダイズさせる。なお、この操作は精製前に行ってもよく、精製後に行ってもよい。
【００７３】
その結果、未知試料のＳＮＰ部位の塩基対が、既知試料と同じくＧ−Ｃであれば、増幅産物のＳＮＰ部位の塩基は一方がＧ、他方がＣであるため、全ての二本鎖ＤＮＡはミスマッチのない二本鎖ＤＮＡとなる。
【００７４】
一方、未知試料のＳＮＰ部位の塩基対が、Ａ−Ｔであれば、既知試料を鋳型とした増幅産物のＳＮＰ部位の塩基は一方がＧ、他方がＣとなり、未知試料を鋳型とした増幅産物のＳＮＰ部位の塩基は一方がＡ、他方がＴとなる。ＳＮＰ以外の塩基配列は既知試料および未知試料とも同一であるため、これらがランダムにハイブリダイズするとＳＮＰ部位にミスマッチのない（Ｇ−ＣまたはＡ−Ｔ）二本鎖ＤＮＡと、ＳＮＰ部位にミスマッチを有する（Ｇ−ＴまたはＡ−Ｃ）二本鎖ＤＮＡとが等しい確率で生じることになる。
【００７５】
以上のサンプル調製工程で調製したサンプルを適当な塩濃度のランニングバッファーに溶解し、ミスマッチ認識分子を担体に固定化したカラムに流すことにより、ＳＮＰの有無を検出することができる。すなわち、既知サンプルと比較して、標的部位にＳＮＰのない未知試料を用いた場合は全ての塩基対においてミスマッチのない（以下「フルマッチ」と称する場合がある。）二本鎖塩基対のみがサンプルに含まれるためミスマッチは分離されない。一方、既知サンプルと比較して、標的部位にＳＮＰを有する未知試料を用いた場合は、２種類のフルマッチＤＮＡと２種類のミスマッチＤＮＡとがサンプルに含まれる。したがって、２種類のミスマッチが検出された場合に、当該未知試料はＳＮＰを有する試料であると判定することができる。
【００７６】
以上のように、本発明に係るＳＮＰ検出方法は、既知のＳＮＰ検出方法と比較して簡便、迅速かつ低コストで実施できるものである。したがって、個人のＳＮＰ診断に非常に適した方法である。
【００７７】
〔担体〕
本発明に係る担体は、上記一般式（Ｉ）で表される構造を有する化合物が固定化されているものであればよい。
【００７８】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、正常な塩基対を形成することができないミスマッチ塩基対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分Ａと、ミスマッチ塩基対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分Ｂと、ＡとＢとを結合するリンカー構造部分Ｌとからなる構造を有するものであればよく、特に限定されるものではない。
【００７９】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物としては、例えば、上記一般式群（ＩＩ）に示される構造を有する化合物を挙げることができる。ここで、上記一般式群（ＩＩ）において、Ｒ１およびＲ２は水素原子または炭素数１〜５の有機基を示し、Ｒ１およびＲ２の有機基では１つ以上の炭素原子が窒素原子および／または酸素原子で置換されていてもよい。Ｒ３は炭素数２〜２０の有機基を示し、Ｒ３の有機基では１つ以上の炭素原子が窒素原子、硫黄原子および／または酸素原子で置換されていてもよい。これらの一般式群から選択される少なくともいずれかの化合物が固定化されていることが好ましい。
【００８０】
より具体的には、上記化合物群（ＩＩＩ）のミスマッチ認識分子を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。なお、上記化合物群（ＩＩＩ）のミスマッチ認識分子は、上段がナフチリジンダイマー（ＮＤ）、中段がナフチリジンアザキノロン（ＮＡ）、下段がアミノナフチリジンダイマー（ａｍＮＤ）である。これらの化合物群（ＩＩＩ）から選択される少なくともいずれかの化合物が固定化されていることが特に好ましい。
【００８１】
上記化合物を固定化する担体は特に限定されるものではなく、公知の担体を好適に使用することができる。具体的には、例えば、アガロース、ポリスチレン、ポリアクリルアミド等を挙げることができる。
【００８２】
また、担体にミスマッチ認識分子を固定化する方法は、選択した担体に応じて公知の方法を適用すればよい。なお、担体に固定化するミスマッチ認識分子は１種類に限定されるものではなく、２種類以上のミスマッチ認識分子が固定化された担体を用いてもよい。
【００８３】
本発明に係る担体は、クロマトグラフィー用担体として好適である。なかでも、アフィニティークロマトグラフィー用担体として用いること特に好ましい。本発明に係る担体を充填したカラムを用いて、上記本発明に係る核酸のミスマッチ検出方法またはＳＮＰ検出方法を実施することができる。
【００８４】
〔試薬キット〕
本発明に係る試薬キットは、上記本発明に係る核酸のミスマッチ検出方法またはＳＮＰ検出方法を実施するために用いられるキットであって、少なくとも上記一般式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を担体に固定化したカラムを含むものであればよい。これにより、本キットの使用者はミスマッチ認識分子を固定化した担体が充填されたカラムを作製する手間を省略することができ、より簡便かつ迅速に本発明の方法を実施することができる。
【００８５】
なお、標的のＳＮＰを特定したキットとする場合には、標的領域を増幅するためのプライマーセットと、標的領域を含み当該領域の塩基配列が確認されている核酸とを含むことが好ましい。これらを含むキットとすることで、本キットの使用者は、被検試料を準備するのみでより簡便かつ迅速にＳＮＰの検出を行うことが可能となる。
【００８６】
なお、キットにより検出しようとするＳＮＰは１種類に限定されるものではなく、目的の表現型に関連する複数のＳＮＰを検出するためのキットとしてもよい。この場合、標的領域を増幅するためのプライマーセットおよび標的領域を含み当該領域の塩基配列が確認されている核酸は検出対象とするＳＮＰの数に対応して数をキットの構成とすればよい。
【００８７】
標的領域を含み当該領域の塩基配列が確認されている核酸の形態は、断片としてもよく、プラスミド等のベクターに挿入したものでもよい。
【００８８】
キットの構成としては上記挙げたものに限定されるものではなく、他の試薬や器具を含むものとしてもよい。例えば、ＰＣＲ関連試薬・器具（ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ用バッファー、ＰＣＲ用チューブ等）、増幅核酸精製用試薬・器具、アフィニティークロマトグラフィー用ランニングバッファー、エリューションバッファー等を挙げることができる。
【００８９】
なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００９０】
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００９１】
〔ミスマッチ認識分子〕
上記化合物群（ＩＩ）のナフチリジンダイマー（ＮＤ）、ナフチリジンアザキノロン（ＮＡ）およびアミノナフチリジンダイマー（ａｍＮＤ）を用いた。
【００９２】
〔カラムの作製〕
上記ミスマッチ認識分子に短いアミンのリンカーを反応させた。
【００９３】
その後、HiTrap NHS-activated HP カラム（Amersham Biosciences）に、上記リンカーを付着させたミスマッチ認識分子を固定化した。カラムへの固定化は、HiTrap NHS-activated HP カラムの取り扱い説明書の記載に従って行った。
【００９４】
作製したカラムは、AKTAexplorer system （Amersham Biosciences）に取り付け、以下の実験を行った。
【００９５】
〔実施例１：ＮＤ固定化カラムおよびＮＡ固定化カラムを用いたミスマッチの検出〕
下記の塩基配列において、（Ｘ，Ｙ）が（Ｇ，Ｇ）、（Ｇ，Ａ）、（Ｇ，Ｔ）、（Ｇ，Ｃ）、（Ａ，Ａ）、（Ａ，Ｔ）、（Ａ，Ｃ）、（Ｔ，Ｔ）、（Ｔ，Ｃ）および（Ｃ，Ｃ）からなる１０種類のＤＮＡを用いた。
5’-CTAACXGAATGTTTTCATTCYGTTAG-3’（配列番号１）
上記配列からなるＤＮＡは、図１に示すようにヘアピン構造の二本鎖ＤＮＡとなる。なお、配列表においては、ＸおよびＹはともに、「Ａ」又は「Ｃ」又は「Ｇ」又は「Ｔ」を意味する記号「ｎ」で表す。
【００９６】
上記各ＤＮＡをそれぞれ５μＭの濃度でランニングバッファー（100 mM NaCl、10 mM Na phosphate pH = 7.0）に溶解し、１０種類のサンプル溶液を調製した。
【００９７】
上記サンプル溶液を流速1.0mL/min で３分間カラムに流した。その後、エリューションバッファー（100 mM NaCl、50 mM NaOH）を加えてアルカリ濃度を順次上げることにより保持されたＤＮＡを溶出した。すなわち、３〜４分をエリューションバッファー濃度０％〜１０％、４分〜１４分をエリューションバッファー濃度１０％〜３５％、１４分〜１６分をエリューションバッファー濃度３５％〜５０％のグラジエントとした。流速は1.0mL/min とした。溶出したＤＮＡは波長２６０ｎｍの吸光度を測定して検出した。
【００９８】
ＮＤ固定化カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーの結果を図２（Ａ）に示し、ＮＡ固定化カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーの結果を図２（Ｂ）に示した。なお、１０種類のＤＮＡはそれぞれ別個にアフィニティークロマトグラフィーに供したが、図２（Ａ）および図２（Ｂ）では１０種類全ての結果を１つの図に表した。また、リテンションタイム（tR:retention time）および各ＤＮＡのピークの半値幅（W1/2:half width）を表１にまとめた。
【００９９】
【表１】
2006094725.tif 000005
【０１００】
ＮＤ固定化カラムにおいては、図２（ａ）および表１から明らかなように、Ｇ−ＧミスマッチＤＮＡおよびＧ−ＡミスマッチＤＮＡが強く保持され、エリューションバッファーを流すことにより溶出した。他のミスマッチＤＮＡおよびフルマッチＤＮＡ（Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔ）はランニングバッファーにより溶出した。
【０１０１】
しかしながら、Ｃ−Ｃ、Ｇ−ＴおよびＴ−ＣミスマッチＤＮＡのリテンションタイム（1.32分〜1.84分）は、フルマッチＤＮＡのリテンションタイム（1.15分〜1.17分）と明らかに異なっており、また、Ｃ−Ｃ、Ｇ−ＴおよびＴ−ＣミスマッチＤＮＡの半値幅（0.44分〜0.87分）は、フルマッチＤＮＡの半値幅（0.35分）より広がっていた。これらの結果は、担体に固定化されたＮＤの表面とＤＮＡ間の弱い相互作用によりこれらのミスマッチＤＮＡが分離されたことを示唆するものである。
【０１０２】
ＮＡ固定化カラムにおいては、図２（ｂ）および表１から明らかなように、Ａ−Ａ、Ｇ−Ａ、Ｇ−ＧおよびＡ−ＣミスマッチＤＮＡはＮＡ表面に保持され、他のミスマッチＤＮＡおよびフルマッチはランニングバッファーにより溶出した。しかし、ランニングバッファーにより溶出したミスマッチＤＮＡのリテンションタイム（1.33分〜1.78分）は、フルマッチのリテンションタイム（1.22分〜1.28分）より長かった。
【０１０３】
これらのアフィニティークロマトグラフィーの結果は、ミスマッチ認識分子を固定化したカラムが、固定化されたミスマッチ認識分子と強く結合するミスマッチＤＮＡのみでなく、弱く結合するミスマッチＤＮＡの分離にも利用できることを示唆するものである。
【０１０４】
なお、ミスマッチ認識分子とミスマッチＤＮＡとの結合に関する基礎データとして、下記の塩基配列を有するＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡにおいて、ミスマッチ認識分子（ＮＤまたはＮＡ）が存在する場合の融解温度と、存在しない場合との融解温度とを測定し、その差（ΔＴｍ）を求めた（表１参照）。
5’-CTAACXGAATG-3’（配列番号２）
5’-CATTCYGTTAG-3’（配列番号３）
当該二本鎖ＤＮＡは、上記アフィニティークロマトグラフィーの検出対象としたヘアピン構造を有するＤＮＡのループ部分（TTTT）を除いたものであり、ＸとＹとの組み合わせは、上記の組み合わせと同じである。
【０１０５】
ここで、ミスマッチ認識分子が二本鎖ＤＮＡのミスマッチ部分に結合し、二本鎖が強く安定するほど融解温度が高くなるため、ミスマッチ分子が存在しない場合の融解温度との差が大きくなる。
【０１０６】
表１に示したΔＴｍの数値から明らかなように、ＮＤはＧ−Ｇミスマッチのみでなく、Ｇ−Ａ、Ｇ−ＴおよびＣ−Ｃミスマッチとも弱く結合する。一方、ＮＡはＡ−ＡおよびＧ−Ａミスマッチのみでなく、Ｇ−Ｇ、Ａ−ＣおよびＣ−Ｃミスマッチ弱く結合する。この
ΔＴｍの順序は、ミスマッチ認識分子固定化カラムにおけるミスマッチＤＮＡの移動度の順序とよく一致している。
【０１０７】
〔実施例２：ａｍＮＤ固定化カラムを用いたミスマッチの検出〕
下記の３種類のＤＮＡを合成した。
5’-GTTACAGAATCTCCGAAGCCTAATACG-3’（配列番号４）
5’-CGTATTAGGCTTCGGAGATTCTGTAAC-3’（配列番号５）
5’-CGTATTAGGCTTCCGAGATTCTGTAAC-3’（配列番号６）
上記配列番号４および配列番号５のＤＮＡのハイブリダイゼーションによりフルマッチの二本鎖ＤＮＡを調製し、上記配列番号４および配列番号６のＤＮＡのハイブリダイゼーションによりＣ−Ｃミスマッチの二本鎖ＤＮＡを調製した。フルマッチＤＮＡ、Ｃ−ＣミスマッチＤＮＡおよびフルマッチＤＮＡとＣ−ＣミスマッチＤＮＡとを１：１の割合で混合したＤＮＡをそれぞれ２００μＭの濃度でランニングバッファー（100 mM NaCl、10 mM Na phosphate pH = 7.0）に溶解し、３種類のサンプル溶液を調製した。
【０１０８】
アフィニティークロマトグラフィーの条件は上記実施例１に記載の条件と同一である。
【０１０９】
結果を図５に示した。図３（Ａ）はフルマッチＤＮＡの結果を示し、図３（Ｂ）はＣ−ＣミスマッチＤＮＡの結果を示し、図３（Ｃ）は両者を混合したサンプルの結果を示している。図３（Ａ）〜（Ｃ）から明らかなように、ａｍＮＤカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによりフルマッチＤＮＡとＣ−ＣミスマッチＤＮＡとを分離することができた。
【０１１０】
〔実施例３：バッファーの塩濃度の検討〕
上記実施例１および実施例２ではバッファー（ランニングバッファーおよびエリューションバッファー）の塩濃度（NaCl濃度）を100 mMとしたが、塩濃度を変化させることによりミスマッチＤＮＡの分離に何らかの変化が生じるか否かについて検討した。
【０１１１】
バッファー（ランニングバッファーおよびエリューションバッファー）のNaCl濃度を50mMおよび20mMとしてアフィニティークロマトグラフィーを実施した。すなわち、ランニングバッファーおよびエリューションバッファーのNaCl濃度を50mMまたは20mMに変更した以外は、上記実施例１と同一のＤＮＡサンプルを用い、同一の手順で行った。なお、カラムはＮＤ固定化カラムのみを用いた。
【０１１２】
NaCl濃度を50mMとした場合の結果を図４に示した。Ｇ−ＧおよびＧ−Ａ以外のミスマッチＤＮＡのリテンションタイムが長くなる傾向が認められた。
【０１１３】
NaCl濃度を20mMとした場合の結果を図５に示した。既に分離可能であったＧ−ＧおよびＧ−ＡミスマッチＤＮＡに加えて、Ｃ−Ｃ、Ｇ−ＴおよびＴ−ＣミスマッチＤＮＡが強く保持され、分離可能となった。
【０１１４】
以上の結果より、ミスマッチ認識分子を担体に固定化したカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、ミスマッチを有する二本鎖ＤＮＡを簡便かつ迅速に分離できることが示された。また、従来ミスマッチ認識分子を検出用チップの金属薄膜上にミスマッチ認識分子を固定化した表面プラズモン共鳴法では、ミスマッチ認識分子と特異性の低いミスマッチの検出が困難であったが、本発明の方法ではミスマッチ認識分子と特異性の低いミスマッチも検出可能となることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
以上のように、本発明は、ＳＮＰの検出を簡便、迅速かつ低コストで実施できる方法およびキットを提供するものである。したがって、個人のＳＮＰ情報を応用した医薬品の開発を目指す医薬品産業やＳＮＰを利用した個人認証等に利用化のであり、その他の様々な分野におけるＳＮＰの検出に利用可能である。特に、個人のＳＮＰ診断に非常に適した方法であり、オーダーメイド医療の実現に大きく貢献できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】0  実施例１および実施例３で使用したヘアピン構造の二本鎖ＤＮＡを示す図である。
【図２】図２（Ａ）はＮＤ固定化カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す図であり、図２（Ｂ）はＮＡ固定化カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図３】図３（Ａ）はａｍＮＤ固定化カラムを用いたフルマッチＤＮＡのアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す図であり、図３（Ｂ）はａｍＮＤ固定化カラムを用いたＣ−ＣミスマッチＤＮＡのアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す図であり、図３（Ｃ）はａｍＮＤ固定化カラムを用いたフルマッチＤＮＡとＣ−ＣミスマッチＤＮＡとの混合サンプルのアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図４】バッファーのNaCl濃度を50mMとした場合のＮＤ固定化カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図５】バッファーのNaCl濃度を20mMとした場合のＮＤ固定化カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図１】
2006094725.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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