(57)【要約】【課題】  個体を構成する全ての細胞種でのイノシトールリン脂質（ＰＩｓ）代謝解析を可能とし、様々な内在性あるいは外来性の物質がＰＩｓ動態に与える作用を、非侵襲的な条件下で量的、時間的・空間的な側面から明らかにすることができるモデル動物を提供すること。【解決手段】  ＰＩｓ可視化プローブを発現するトランスジェニック動物（ＰＩｓ可視化動物）を作製する。ＰＩｓ可視化プローブ遺伝子としては、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３やＰＩ（３，４）Ｐ２を可視化するＡｋｔプロテインキナーゼＰＨドメインとＧＦＰとの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡや、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３を可視化するＢｔｋ−ＰＨドメインとＧＦＰとの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡや、ＰＩ（４，５）Ｐ２を可視化する配列番号５で示される塩基配列からなる、ホスフォリパーゼＣδＰＨドメインとＧＦＰとの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ等を例示できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イノシトールリン脂質可視化プローブ遺伝子が非ヒト動物に導入され、イノシトールリン脂質可視化プローブを恒常的に発現しているトランスジェニックモデル動物。
【請求項２】
イノシトールリン脂質可視化プローブが、イノシトールリン脂質蛍光（ＧＦＰ）プローブであることを特徴とする請求項１記載のトランスジェニックモデル動物。
【請求項３】
イノシトールリン脂質可視化プローブが、イノシトールリン脂質のイノシトール環の３位、４位、５位の水酸基がリン酸化されたイノシトールリン脂質であるＰＩ（３，４，５）Ｐ３を可視化するイノシトールリン脂質可視化プローブであることを特徴とする請求項１又は２記載のトランスジェニックモデル動物。
【請求項４】
イノシトールリン脂質可視化プローブ遺伝子が、配列番号１で示される塩基配列からなることを特徴とする請求項３記載のトランスジェニックモデル動物。
【請求項５】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のトランスジェニックモデル動物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載のトランスジェニックモデル動物に被検物質を投与し、動物の組織及び／又は細胞におけるイノシトールリン脂質の局在の状態及び／又は変化を測定・評価することを特徴とするイノシトールリン脂質代謝の異常に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【請求項７】
イノシトールリン脂質代謝の異常に起因する疾病が、イノシトールリン脂質のリン酸化酵素及び／又は脱リン酸化酵素の欠損による癌、免疫疾患、糖代謝異常、骨代謝異常、又は心機能異常であることを特徴とする請求項６記載のイノシトールリン脂質代謝の異常に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イノシトールリン脂質（ＰＩｓ）代謝系を作用点とした癌、糖代謝異常、免疫異常、心機能異常、骨代謝異常などの治療薬や診断薬の開発の上で有用性が見込まれる、イノシトールリン脂質可視化マウス等のトランスジェニックモデル動物や該モデル動物を用いたイノシトールリン脂質代謝系を作用点とした治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イノシトールリン脂質（ＰＩｓ）はホスファチジルイノシトールのリン酸化代謝産物の総称で、リン酸化部位の組合せによって８種類の分子が存在する（図１）。これらは細胞膜の構成成分であり、ホルモン、増殖・分化因子、神経伝達物質、走化性因子などの多様な細胞外生理活性物質による細胞の活性化に伴い、その代謝回転が亢進する。細胞の活性化に引き続く個々のＰｌｓの量的な変動や細胞内局在の変化が、様々な細胞生理応答の発現を仲介すると考えており、イノシトールリン脂質代謝系を作用点とした化合物は、様々な疾病の治療薬としての期待をかけることができる。
【０００３】
近年のイノシトールリン脂質研究には、（１）イノシトールリン脂質に制御されるシグナリング蛋白質の同定とイノシトールリン脂質の結合モジュールの同定、（２）細胞膜局所におけるイノシトールリン脂質局在化の発見（green fluorescent proteinとイノシトールリン脂質結合モジュールの融合蛋白質（ＰＩｓ可視化プローブ）を用いた培養細胞レベルでの研究）、（３）イノシトールリン脂質代謝酵素の生理機能と病態との関連（ヒト遺伝病のゲノム解析や遺伝子欠損マウス表現型の研究）という三つのトピックスを見ることができる。これらの研究から、種々のイノシトールリン脂質代謝酵素による細胞膜局所での生成・分解反応の均衡により成立するイノシトールリン脂質の局在化は、特定の生体膜コンパートメントでの情報伝達分子の集積、離散を規定し、多彩な細胞反応を制御しており、したがってイノシトールリン脂質動態の乱れは様々な病態を招くという概観が示されている。
【０００４】
本願発明者らは、イノシトール環の３位水酸基がリン酸化されたホスホイノシチド、なかでも３位、４位、５位の水酸基がリン酸化されたホスホイノシチドであるＰＩ（３，４，５）Ｐ３の癌、免疫応答、糖代謝における役割を明らかにするため、これまでに複数のイノシトールリン脂質代謝酵素遺伝子欠損マウスを作製し、イノシトールリン脂質リン酸化酵素や脱リン酸化酵素の欠損が、癌、免疫不全、糖代謝異常、骨代謝異常、心機能異常など幅広い疾病を導くことを見い出している（例えば、非特許文献１及び２参照）。その他、診断上のツール、マーカー、またはプローブとして使用するためのホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の調節サブユニットをコードするＤＮＡ配列であって、少なくとも一ヌクレオチドの突然変異を含有するＤＮＡ配列、または該突然変異を含むＤＮＡ配列の断片を含む核酸配列に関するもの（例えば、特許文献１参照）や優性ネガティブ変異形の調節性ホスファチジルイノシトール−３キナーゼｐ８５サブユニットを含むトランスジェニック動物に関するもの（例えば、特許文献２参照）などが報告されている。
【０００５】
【特許文献１】特表２０００−５０９９８６号公報
【特許文献２】特開２００２−３６０１２０号公報
【非特許文献１】蛋白質核酸酵素４６（１２），１８２０−１８２８，共立出版（２００１）
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１．４９５−５０１  （２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のようにイノシトールリン脂質代謝酵素（遺伝子、タンパク質）と様々な疾病との関連が示されている一方で、どのイノシトールリン脂質が如何にして細胞機能を制御し、イノシトールリン脂質代謝酵素欠損により導かれる病態に如何にして関与するのかという点は明らかではない。図１に示したように個々のイノシトールリン脂質の代謝は複雑に連関しており（各イノシトールリン脂質代謝酵素の発現量の相違から、各種細胞間で異なる代謝系を構成することが予想される）、ある酵素が触媒する反応の基質も生成物も共に生理活性性脂質である。また、ある酵素の欠損は基質、生成物以外のイノシトールリン脂質の量的変動や局在変化をも同時に導き、これが表現型の主たる原因となる可能性も考えられる。個々の疾病の発病を担う、イノシトールリン脂質の特定には、遺伝子欠損マウスでの表現型解析と、機能異常を呈する細胞内での個々のイノシトールリン脂質動態解析を平行して行うことが有益な情報を与えるものと期待されるが、これには技術的な障害がある。従来のイノシトールリン脂質動態解析は主に、細胞をラジオアイソトープラベル後に破壊し、抽出した脂質のクロマトグラフィー分析によりなされている。この方法では個体レベルでの解析が現実的に不可能であり、仮に個体をラジオアイソトープラベルして臓器からの抽出脂質を解析したとしても、臓器を構成する様々な細胞（例えば各種の分化細胞同士あるいは正常細胞とがん細胞）でのイノシトールリン脂質動態を個別に解析、比較することは不可能である。また培養細胞レベルでの解析においても従来の生化学的手法では、細胞の破壊により脂質の細胞内局在に関する情報が失われてしまうという欠点があり、煩雑な操作は数秒単位での時間的変化を解析することも妨げている。最近、green fluorescent protein(ＧＦＰ)と種々のタンパク質に見出されているイノシトールリン脂質結合モジュールの融合タンパク質をイノシトールリン脂質可視化プローブとして、イノシトールリン脂質の時空的動態解析が行われている。この手法は培養細胞株では極めて有効であるものの、より生理的多様な応答を解析することが出来る初代培養細胞や個体内で臓器を構成する細胞においては、プローブの利用に必要な、非侵襲的で効率的な遺伝子導入が困難であることが障害となっている。
【０００７】
すなわち、本発明の課題は、個体を構成する全ての細胞種でのイノシトールリン脂質代謝解析を可能とし、様々な内在性あるいは外来性の物質がイノシトールリン脂質動態に与える作用を、非侵襲的な条件下で量的、時間的・空間的な側面からも明らかにすることができるモデル動物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために、イノシトールリン脂質の可視化プローブを発現するトランスジェニック動物（イノシトールリン脂質可視化動物）の作製を試みた。イノシトールリン脂質の可視化プローブを発現するトランスジェニック動物（イノシトールリン脂質可視化動物）の作製に際しては、イノシトールリン脂質の可視化プローブがイノシトールリン脂質との結合活性を有するために、これらの脂質の本来の機能を阻害することが予想される。そのためか、これまでに全身性の発現を可能とするプロモータを用いてイノシトールリン脂質の可視化プローブを発現するトランスジェニック動物の作製に成功した例はない。本発明者らは、常法に従いイノシトールリン脂質の可視化プローブを発現するトランスジェニック動物を作製してみたが、予期したように、イノシトールリン脂質可視化プローブが毒性を示す発現レベルに達する胎児は胎生致死を示した。そこで、本発明者らは受精卵への注入ＤＮＡ量を減らすなど数多くの試行を繰り返し、実際に、全身性にイノシトールリン脂質の可視化プローブを発現するトランスジェニックマウスの作製に成功した。プローブの発現レベルはイノシトールリン脂質結合モジュールを付加しないＧＦＰを単独で発現するトランスジェニックマウスの場合と比較して著しく低いものであったが、得られたマウス由来の組織、細胞ではイノシトールリン脂質の局在を検出するに十分な蛍光を観察することが出来た（図２参照）。イノシトールリン脂質可視化プローブの非生理的な働きを危惧せずにこのトランスジェニックマウスを利用しうることは予想外のことであった。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）イノシトールリン脂質可視化プローブ遺伝子が非ヒト動物に導入され、イノシトールリン脂質可視化プローブを恒常的に発現しているトランスジェニックモデル動物や、（２）イノシトールリン脂質可視化プローブが、イノシトールリン脂質蛍光（ＧＦＰ）プローブであることを特徴とする請求項１記載のトランスジェニックモデル動物や、（３）イノシトールリン脂質可視化プローブが、イノシトールリン脂質のイノシトール環の３位、４位、５位の水酸基がリン酸化されたイノシトールリン脂質であるＰＩ（３，４，５）Ｐ３を可視化するイノシトールリン脂質可視化プローブであることを特徴とする請求項１又は２記載のトランスジェニックモデル動物や、（４）イノシトールリン脂質可視化プローブ遺伝子が、配列番号１で示される塩基配列からなることを特徴とする請求項３記載のトランスジェニックモデル動物や、（５）非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のトランスジェニックモデル動物や、（６）請求項１〜５のいずれか記載のトランスジェニックモデル動物に被検物質を投与し、動物の組織及び／又は細胞におけるイノシトールリン脂質の局在の状態及び／又は変化を測定・評価することを特徴とするイノシトールリン脂質代謝の異常に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法や、（７）イノシトールリン脂質代謝の異常に起因する疾病が、イノシトールリン脂質のリン酸化酵素及び／又は脱リン酸化酵素の欠損による癌、免疫疾患、糖代謝異常、骨代謝異常、又は心機能異常であることを特徴とする請求項６記載のイノシトールリン脂質代謝の異常に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のイノシトールリン脂質の可視化プローブを発現するトランスジェニックモデル動物（イノシトールリン脂質可視化動物）の利用により、イノシトールリン脂質代謝異常による疾病発症の分子基盤の解析が可能となる。すなわち、非侵襲的にイノシトールリン脂質可視化プローブが導入された生体資料を簡便に調整でき、個体を構成する全ての細胞種でのイノシトールリン脂質代謝解析が可能となり、様々な内在性あるいは外来性の物質がイノシトールリン脂質動態に与える作用を、時間的、空間的な側面からも明らかにできる。特に、遺伝子導入動物をマウスとすることで、従来得られている多数の病態モデルマウス、イノシトールリン脂質代謝酵素欠損マウスでの癌、糖代謝異常、骨代謝異常、心機能異常、免疫疾患（自己免疫、アレルギー、易感染症）などの病態発症におけるイノシトールリン脂質動態を明らかにすることが可能となる。このモデル動物を利用することにより、イノシトールリン脂質代謝系を作用点とした癌、糖代謝異常、免疫異常、心機能異常、骨代謝異常などの治療薬や診断薬の開発が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のトランスジェニックモデル動物としては、イノシトールリン脂質可視化プローブ遺伝子が非ヒト動物導入され、イノシトールリン脂質可視化プローブを恒常的に発現しているモデル動物であれば特に制限されるものではなく、ここで、イノシトールリン脂質可視化プローブを恒常的に発現するとは、イノシトールリン脂質可視化プローブを個体の幅広い種類の細胞において常に発現していることをいう。また、上記非ヒト動物としては、ラット，マウス，ウシ，ブタ，ニワトリ，カエル，ヒト，イヌ，ウサギ等を挙げることができるが、中でも取扱いが簡便なマウスが好ましい。
【００１２】
本発明のトランスジェニックモデル動物の好ましい態様として、イノシトールリン脂質可視化プローブが、イノシトールリン脂質蛍光（ＧＦＰ）プローブであるトランスジェニックモデル動物を挙げることができる。かかるＧＦＰには、ＥＧＦＰ（Enhanced GFP）、ＥＹＦＰ（Enhanced Yellow Fluorescent Protein）、ＥＣＦＰ(enhanced CYAN fluorescent protein)（青色）、ＤｓＲｅｄ（赤色）等の蛍光波長の異なる誘導体が存在し、多重ラベルを行うこともできる。ＧＦＰの利点は生細胞のままで非侵襲的に簡単に解析できることであり、そのため時間的、空間的な観察が容易となる。
【００１３】
上記イノシトールリン脂質可視化プローブとしては、イノシトールリン脂質のイノシトール環の３位、４位、５位の水酸基がリン酸化されたイノシトールリン脂質であるＰＩ（３，４，５）Ｐ３や、３位の水酸基がリン酸化されたイノシトールリン脂質であるＰＩ（３）Ｐや、３位、４位の水酸基がリン酸化されたイノシトールリン脂質であるＰＩ（３，４）Ｐ２や、３位、５位の水酸基がリン酸化されたイノシトールリン脂質であるＰＩ（３，５）Ｐ２や、４位の水酸基がリン酸化されたイノシトールリン脂質であるＰＩ（４）Ｐや、５位の水酸基がリン酸化されたイノシトールリン脂質であるＰＩ（５）Ｐや、４位、５位の水酸基がリン酸化されたイノシトールリン脂質であるＰＩ（４，５）Ｐ２や、イノシトール環の水酸基がリン酸化されていないイノシトールリン脂質であるＰＩに、それぞれ特異的に結合するタンパク質領域とＧＦＰとの融合タンパク質からなるイノシトールリン脂質可視化プローブを挙げることができるが、イノシトールリン脂質のイノシトール環の３位の水酸基がリン酸化されたイノシトールリン脂質、特にＰＩ（３，４，５）Ｐ３を可視化するイノシトールリン脂質可視化プローブが好ましい。
【００１４】
また、上記イノシトールリン脂質可視化プローブ遺伝子の由来としては、マウスの他、ラット，ウシ，ブタ，ニワトリ，カエル，ヒト，イヌ，ウサギ等特に制限されるものではないが、例えばＰＩ（３，４，５）Ｐ３やＰＩ（３，４）Ｐ２を可視化する配列番号１で示される塩基配列からなる、ヒト由来のＡｋｔプロテインキナーゼＰＨドメインとＧＦＰとの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡや、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３を可視化する配列番号２で示される塩基配列からなる、ヒト由来のＢｒｕｔｏｎ’ｓチロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）ＰＨドメインとＧＦＰとの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡや、ＰＩ（３）Ｐを可視化する配列番号３で示される塩基配列からなる、ＥＥＡ１のＦＹＶＥを３回繰り返してコードしたＤＮＡとＧＦＰ遺伝子を連結したｃＤＮＡや、ＰＩ（３，４）Ｐ２を可視化する配列番号４で示される塩基配列からなるＴＡＰＰ２ＰＨドメインとＧＦＰとの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡや、ＰＩ（４，５）Ｐ２を可視化する配列番号５で示される塩基配列からなる、ホスフォリパーゼＣδＰＨドメインとＧＦＰとの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを具体的に挙げることができるほか、ＰＩ（３，５）Ｐ２、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）Ｐ、ＰＩを可視化するｃＤＮＡを用いることもできる。
【００１５】
本発明のトランスジェニックモデルマウス等のトランスジェニックモデル動物の樹立方法としては、公知のトランスジェニック動物の作製方法（例えば、Proc. Natl. Acad.Sci. USA 77:7380-7384,1980）を用いた方法を挙げることができる。例えば、イノシトールリン脂質可視化プローブトランスジェニックマウスを創製する方法としては、ＡＫＴ−ＰＨ−ＧＦＰ（J. Cell. Biol. 143: 501-510, 1998）を鋳型としてＰＣＲにより、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３を可視化するプローブのｃＤＮＡを増幅し、哺乳動物発現ベクターに導入し、この遺伝子発現ベクターをリニアライズした導入遺伝子を含む直鎖ＤＮＡフラグメントをマウス受精卵雄性前核にマイクロインジェクションし、この受精卵あるいは２細胞期胚を仮親マウスの卵管に移植し、仔マウスを発生させ、その産仔の組織から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲ法等により、イノシトールリン脂質可視化プローブｃＤＮＡが組み込まれていることを確認する方法等を挙げることができる。また、トランスジェニックマウスを作製するためのマウスとしては種々のものが利用できるが、例えばＣ５７ＢＬ／６、ＤＢＡ／２などを挙げることができる。
【００１６】
また、本発明のトランスジェニックモデル動物の好ましい態様として、ホモ体であるトランスジェニックモデル動物を挙げることができる。かかる変異染色体をホモに有するホモ体は、染色体をヘテロに有するマウス等の非ヒト動物同士を交配することにより得ることができ、イノシトールリン脂質可視化プローブ発現量がヘテロ体よりも多いことから、モデル動物として特に好ましい。
【００１７】
本発明のイノシトールリン脂質代謝の異常に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法としては、本発明のトランスジェニックモデル動物に被検物質を投与し、動物の組織及び／又は細胞におけるイノシトールリン脂質の局在の状態及び／又は変化を測定・評価する方法であれば特に制限されるものではなく、上記イノシトールリン脂質代謝の異常に起因する疾病としては、イノシトールリン脂質のリン酸化酵素及び／又は脱リン酸化酵素の欠損による癌、免疫不全、糖代謝異常、骨代謝異常、又は心機能異常等を例示することができる。上記測定としては、蛍光検出手段、例えば共焦点レーザー顕微鏡下で観察などを挙げることができる。また、これらのスクリーニングに際して、野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物における場合と比較・評価することが、個体レベルで正確な比較実験をすることができることから好ましい。
【００１８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
［ＰＩ（３，４，５）Ｐ３可視化プローブ発現ベクターの作製］
Tamas Ball博士から入手したＡｋｔ−ＰＨ−ＧＦＰ（J. Cell. Biol. 143: 501-510, 1998）を鋳型としてＰＣＲにより、イノシトールリン脂質ＰＩ（３，４，５）Ｐ３を可視化するプローブのｃＤＮＡを増幅した。プライマーとしては、フォワードプライマー；５’−ｔａｇａａｔｔｃｔｇｃａｔｃａｇａｇｇｃｔｇｔｇｇ−３’(配列番号６)、リバースプライマー；５’−ｔａｇａａｔｔｃｔｔｔａｃｔｔｇｔａｃａｇｇ−  ３’(配列番号７)を用いた。Sigma社ＬＡ Ｔａｑを使用し、94℃1min, 65℃1min, 68℃1minのサイクルを25回行い増幅した。増幅されたＤＮＡをＥｃｏＲＩで処理した。ベクターは宮崎純一博士（大阪大学医学部栄養学教室）より入手したｐＣＡＧＧＳを用いた（FEBA Letters 470: 263-268, 2000）。ｐＣＡＧＧＳをＸｈｏＩで切断、アルカリホスファターゼ処理した。上記のＰＣＲ産物とＸｈｏＩ切断ｐＣＡＧＧＳをともにＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（TAKARA社製）を用いて、推奨方法に従い平滑化し、これらをつなぎ合わせた。得られたプラスミド内のイノシトールリン脂質可視化プローブＤＮＡ配列を、常法の配列決定法により確認した。
【実施例２】
【００２０】
［ＥＧＦＰ−Ａｋｔトランスジェニックマウスの作製］
ＨＩｎｄIII処理により直鎖化したベクターをマウス受精卵の前核（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）にマイクロピペットで導入した（処理卵数２４６）。それらの受精卵（１９１個）を偽妊娠雌マウスの卵管に移植し、５２匹のマウスが誕生した。離乳後のマウス尻尾の一部を切断し、蛍光実体顕微鏡（Leica社製）のＧＦＰ検出用フィルターセットを用いて緑色蛍光を確認し、３匹の蛍光陽性マウスを得た。これらの遺伝子導入マウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊと交配、繁殖させて、それぞれの系統を樹立した。蛍光陽性の子孫マウスを得て、常法に従いゲノムＤＮＡを精製し、ＰＣＲを行い、トランスジーンの導入を確認した。ＰＣＲのプライマーとしては、ＥＧＦＰｃＤＮＡに基づいたフォワードプライマー；５’−ｔｇａａｃｃｇｃａｔｃｇａｇｃｔｇａａｇｇｇ−３’ (配列番号８)、リバースプライマー；５’−ｔｃｃａｇｃａｇｇａｃｃａｔｇｔｇａｔｃｇｃ−３’ (配列番号９)及びｐＣＡＧＧＳに基づいたフォワードプライマー；５’−ＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡ−３’ (配列番号１０)、リバースプライマー；５’−ＴＴＣｔｇａｔａｇｇｃａｇｃｃｔｇｃａｃ−３’ (配列番号１１)を用いた。また、サザンブロットのプローブとしては、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Clontech社製）を鋳型に上記プライマーを用いて増幅したＤＮＡ断片を用いた（図２参照）。
【００２１】
なお、作製したトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）は、理化学研究所バイオリソースセンター（茨城県つくば市高野台３−１−１）に寄託されている。受託系統名及び受託番号（Ｒｅｇ＿Ｎｏ）は、以下のとおりである。
受託番号                  系統名                                    
０１１５５        ＥＧＦＰ−Ａｋｔ−２      トランスジェニックマウス      
０１１５６        ＥＧＦＰ−Ａｋｔ−３      トランスジェニックマウス      
０１１５７        ＥＧＦＰ−Ｂｔｋ−４      トランスジェニックマウス    
０１１５８        ＥＧＦＰ−Ｂｔｋ−８      トランスジェニックマウス    
０１１５９        ＥＧＦＰ−Ｂｔｋ−２８    トランスジェニックマウス    
０１１６０        ＥＧＦＰ−Ｂｔｋ−１００  トランスジェニックマウス    
０１１６１        ＥＧＦＰ−ＥＥＡ１−１    トランスジェニックマウス    
０１１６２        ＥＧＦＰ−ＥＥＡ１−１２  トランスジェニックマウス    
【実施例３】
【００２２】
［遺伝子発現の確認］
トランスジーン産物の発現は好中球の細胞溶解液を用いて抗ＧＦＰ抗体（MBL社製）によるウエスタンブロットを行い、確認した。また、各種臓器における発現を、凍結組織切片を蛍光顕微鏡で観察することで行った。Ｔ細胞、Ｂ細胞に関してはflow cytometerでＦＬ１蛍光チャネルを用いて高いレベルの発現を確認した（図２参照）。
【実施例４】
【００２３】
［遺伝子導入が困難な初代培養細胞におけるＰｌｓ動態解析（図４参照）］
好中球は生理的な感染宿主応答や炎症反応に関与する。本発明者らはＰＩ（３，４，５）Ｐ３産生酵素であるphosphoinositide 3-kinase（ＰＩ３Ｋ）γの欠損マウスを以前作製し解析した結果、このマウスでは腹腔内感染に伴う好中球、マクロファージなどの食細胞の集積が抑制されること、footpadでのＬＣＭウイルス感染に伴うＴ細胞集積が減弱すること、病態の成立に好中球が重要な位置を占めるエンドトキシンによる急性肺炎が軽減されることなどを見い出した。また、細胞の３２Ｐｉラベルにより測定できる走化性因子刺激による細胞内ＰＩ（３，４，５）Ｐ３レベルの上昇がこの遺伝子破壊マウスでは見られないことを示しているが、遊走中の好中球においてＰＩ（３，４，５）Ｐ３の動態を時間的・空間的に記述することは、単離した好中球においては不可能であった。それはＰＩ（３，４，５）Ｐ３可視化プローブのみならず外来のＤＮＡやタンパク質の細胞内への導入が、種々のウイルスやマイクロインジェクションなどのいかなる方法をとっても、これまで不可能であったからである。
【００２４】
Ｐｌｓ可視化マウスに２ｍｌの２．９％チオグリコール酸培地（日本製薬）を腹腔内投与し、１２時間後に腹腔浸潤細胞を回収し、Percoll 勾配遠心による常法に従って好中球の精製を行った。２×１０５細胞をGlass bottom culture dish（Mat Tek社製）に播種し、１０分間室温で静置し、付着させ、付着した細胞を３７℃に保温し、共焦点レーザー顕微鏡下で観察した。無刺激状態の細胞では、蛍光プローブの局在は細胞質に見られることから、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３が細胞膜に極微量しか存在しないことが示された。１０μＭｆＭＬＰの培地への添加後わずか１２秒において、蛍光プローブの形質膜への移行が検出されたこと、また、この移行がＰＩ３Ｋ阻害剤であるwortmannin（１００ｎＭ）前処理細胞においては観察されないことから、このイノシトールリン脂質可視化トランスジェニックマウス由来好中球を用いて、走化性因子刺激に伴い極めて迅速に細胞内で産生されるＰＩ（３，４，５）Ｐ３レベルを検出することが可能であることが示された。また、マイクロピペットに１００μＭ ｆＭＬＰを充填し、細胞近傍に緩やかに放出することで、走化性因子の濃度勾配を形成させた。図３に示すように、静止状態の細胞においては蛍光プローブの局在は細胞質に見られることから、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３が細胞膜に極微量しか存在しないことが示された。走化性因子を感知し、形態的に極性化した細胞では形質膜へと蛍光プローブは移行しており、また蛍光プローブの局在から、走化性因子依存的に細胞内に産生されたＰＩ（３，４，５）Ｐ３は、高濃度の走化性因子へと遊走中の好中球における先導端（細胞の進行方向前端）に局在することが示された。このように、イノシトールリン脂質可視化トランスジェニックマウス由来好中球は、時間的分解能、空間的分解能においてＰＩ（３，４，５）Ｐ３をはじめとするイノシトールリン脂質の代謝・動態に関する多くの情報をもたらす解析系であることが示された。
【実施例５】
【００２５】
［哺乳類動物個体内で臓器・組織を構成する細胞内でのイノシトールリン脂質動態解析（図５）］
これまでに、インスリンなどのホルモン、種々の増殖因子、サイトカイン、神経伝達物質などがイノシトールリン脂質代謝を介して、細胞内シグナリングを始動させることが知られている。インスリンは血糖値調節において中心的な役割を担うが、その糖取り込み促進作用、脂肪分解抑制作用などはＰＩ３Ｋによる細胞内ＰＩ（３，４，５）Ｐ３レベルの上昇に依存することが、培養細胞レベルの研究結果から確立されている。しかしながら、これまでに、インスリンの標的臓器・組織内の細胞が、インスリン刺激を受けてＰＩ（３，４，５）Ｐ３産生亢進を示すことは、実際に個体内において確認されていない。
【００２６】
イノシトールリン脂質可視化マウスに１．５Ｕ／ｋｇインスリンを腹腔内投与し、２０分後に頚椎脱臼によりマウスを屠殺した。腹部大動脈から４％パラホルムアルデヒド溶液を注入し肝臓を還流後、摘出した。ＯＣＴコンパウンドに包埋し、凍結後、常法にしたがって凍結組織切片を作製し、共焦点レーザー顕微鏡でＧＦＰ由来の蛍光を検出した。コントロール(ＰＢＳ投与)マウス由来の肝臓組織では、肝細胞の細胞質にＡＫＴ−ＰＨ−ＧＦＰ由来の蛍光が検出されたが、インスリン投与マウス由来の肝臓組織内の細胞では、インスリン投与後に蛍光プローブは形質膜へと局在した。またＰＩ３Ｋ阻害剤であるwortmanninをインスリン投与２０分前に投与したマウス由来の肝臓を構成する肝細胞においては、この形質膜への移行はみられなかった。これらの結果から、インスリンは実際に個体レベルにおいてもＰＩ３Ｋ活性化を導き、肝細胞内ではＰＩ（３，４，５）Ｐ３レベルが上昇することが示された。本発明により可能となった個体レベルでのイノシトールリン脂質動態のモニタリング系によって、既知、未知の薬剤、食品成分などの化合物や内在性の生理活性因子がイノシトールリン脂質動態に与える影響を個体内の臓器・組織レベルで簡便に解析、検証することが可能となる。
【実施例６】
【００２７】
［ＥＧＦＰ−Ｂｔｋトランスジェニックマウスの作製］
Cantley博士から入手したＢｔｋ−ＰＨを鋳型としてＰＣＲにより、イノシトールリン脂質ＰＩ（３，４，５）Ｐ３を可視化するプローブ用のｃＤＮＡを増幅した。プライマーとしては、ＰｓｔＩ制限酵素サイトをつぶすために一塩基変異をいれたフォワードプライマー；５’−ＡＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＴＧ  ＡＴＡ−３’（配列番号１２）、ストップコドンを付加したリバースプライマー；５’−ＴＴＧ  ＡＴＡ  ＴＣ  ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＴＣＣ−  ３’（配列番号１３）を用いた。このＰＣＲ増幅産物をＧＦＰ遺伝子と連結し、ＥｃｏＲＶを用いてｐＣＡＧＧＳに組み込み、実施例２と同様にしてＰＩ（３，４，５）Ｐ３可視化マウスを得た。このＰＩ（３，４，５）Ｐ３可視化マウス由来初代細胞で確認される蛍光と細胞内局在を図６（右上）に示す。
【００２８】
なお、作製したトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）は、理化学研究所バイオリソースセンター（茨城県つくば市高野台３−１−１）に寄託されている。受託系統名及び受託番号（Ｒｅｇ＿Ｎｏ）は、以下のとおりである。
受託番号                  系統名                                    
０１１５７        ＥＧＦＰ−Ｂｔｋ−４  トランスジェニックマウス    
０１１５８        ＥＧＦＰ−Ｂｔｋ−８  トランスジェニックマウス    
０１１５９        ＥＧＦＰ−Ｂｔｋ−２８  トランスジェニックマウス    
０１１６０        ＥＧＦＰ−Ｂｔｋ−１００  トランスジェニックマウス    
【実施例７】
【００２９】
［ＥＧＦＰ−ＥＥＡ１トランスジェニックマウスの作製］
Cantley博士から入手したＢｔｋ−ＰＨを鋳型としてＰＣＲにより、イノシトールリン脂質ＰＩ（３）Ｐを可視化するプローブ用のｃＤＮＡを増幅した。プライマーとしては、フォワードプライマー；５’−ＴＴＡＧＡＴＣＴＧＡＧＴＣＣＧＧＡＣＴＴＧＴＡ−３’（配列番号１４）、ストップコドンを付加したリバースプライマー；５’−ＴＧＴＡＣＡＡＧＴＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＴ−  ３’（配列番号１５）を用いた。このＰＣＲ増幅産物をＧＦＰ遺伝子と連結し、ＢｇｌＩＩＩを用いてｐＣＡＧＧＳに組み込み、実施例２と同様にしてＰＩ（３）Ｐ可視化マウスを得た。このＰＩ（３）Ｐ可視化マウス由来初代細胞で確認される蛍光と細胞内局在を図６（下）に示す。
【００３０】
なお、作製したトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）は、理化学研究所バイオリソースセンター（茨城県つくば市高野台３−１−１）に寄託されている。受託系統名及び受託番号（Ｒｅｇ＿Ｎｏ）は、以下のとおりである。
受託番号                  系統名                                    
０１１６１      ＥＧＦＰ−ＥＥＡ１−１      トランスジェニックマウス    
０１１６２      ＥＧＦＰ−ＥＥＡ１−１２  トランスジェニックマウス
【実施例８】
【００３１】
［ＥＧＦＰ−ＴＡＰＰ２トランスジェニックマウスの作製］
ヒト胸腺由来ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより、イノシトールリン脂質ＰＩ（３，４）Ｐ２を可視化するプローブ用のｃＤＮＡを増幅した。プライマーとしては、フォワードプライマー；５’−ＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＣＣＣＡＣＧＴＣＡ−３’（配列番号１６）、ストップコドンを付加したリバースプライマー；５’−ＴＴＧＡＴＡＴＣＣＴＡＡＡＴＧＧＡＣＣＴＴＧＡＡＡＡＧＧＡ−  ３’（配列番号１７）を用いた。このＰＣＲ増幅産物をＧＦＰ遺伝子と連結し、ＢｇｌＩＩＩを用いてｐＣＡＧＧＳに組み込み、実施例２と同様にしてＰＩ（３，４）Ｐ２可視化マウスを得た。
【実施例９】
【００３２】
［ＥＧＦＰ−ＰＬＣδ１トランスジェニックマウスの作製］
ｐｈＧＦＰ１０５／ＰＬＣｄｅｌｔａ１４１−７５６をＡｓｅＩとＢａｍＨＩで切断したものを平滑化後、ｐＣＡＧＧＳに組み込み、実施例２と同様にしてＰＩ（４，５）Ｐ２可視化マウスを得た。このＰＩ（４，５）Ｐ２可視化マウス由来初代細胞で確認される蛍光と細胞内局在を図６（左上）に示す。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ホスファチジルイノシトールのリン酸化代謝産物の総称であるイノシトールリン脂質（ＰＩｓ）の全種類（８種類）の分子を示す図である。
【図２】Ｐｌｓ可視化マウスとＧＦＰ飲み発現する対照マウスの実体顕微鏡写真を示す図である。
【図３】Ｐｌｓ可視化マウスの作製、具体的にはマウス作製に用いたベクター、新生児の蛍光実体顕微鏡像、サザンブロット及びウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図４】Ｐｌｓ可視化マウス由来初代培養細胞におけるＰｌｓ動態解析の結果を示す図である。
【図５】Ｐｌｓ可視化マウス由来臓器・組織を構成する細胞内でのＰｌｓ胴体解析の結果を示す図である。
【図６】Ｐｌｓ可視化マウス由来初代細胞で確認される蛍光と細胞内局在を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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