(57)【要約】【課題】本発明は環境ストレス抵抗性調節遺伝子を利用して、植物の環境ストレス抵抗性を増加させる方法を提供する。【解決手段】シロイヌナズナ由来の環境ストレス抵抗性調節遺伝子を植物に導入し、植物の環境ストレス抵抗性を増加させる方法、環境ストレス抵抗性植物の製造方法及び前記方法により製造された環境ストレス抵抗性植物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の配列相同性を有するポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを植物に導入する段階を含むことを特徴とする植物の環境ストレス抵抗性を増加させる方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１で表示される塩基配列を有するものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記環境ストレスが旱魃によるストレスである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記環境ストレスが除草剤によるストレスである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドの導入は組換えベクターを利用して行う請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組換えベクターがpBI111L-AIAである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組換えベクターの植物への導入は、アグロバクテリウム(Agrobacterium sp.)媒介による方法、粒子銃衝撃法(particle gun bombardment)、シリコン炭化物ウィスカー法(Silicon carbide whiskers)、超音波処理法(sonication)、電気穿孔法(electroporation)及びＰＥＧ(polyethylene glycol)沈殿法からなる群から選ばれたいずれか一つを用いる請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記植物は単子葉植物又は双子葉植物である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記単子葉植物が稲、小麦、大麦、竹（筍）、トウモロコシ、里芋、アスパラガス、玉葱、ニンニク、葱、ニラ、ヒメニラ、長芋及び生姜からなる群から選ばれた請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記双子葉植物がシロイヌナズナ、茄子、煙草、唐辛子、トマト、牛蒡、春菊、チサ、桔梗、ホウレン草、不断草、サツマ芋、セロリ、人参、芹、パセリ、白菜、キャベツ、葉カラシナ、西瓜、真桑瓜、キュウリ、カボチャ、フクベ、苺、大豆、緑豆、インゲン豆、及び豌豆からなる群から選ばれた請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の配列相同性を有するポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを植物に導入する段階を含むことを特徴とする環境ストレス抵抗性植物の製造方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１で表示される塩基配列を有するものである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記環境ストレスが旱魃によるストレスである請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記環境ストレスが除草剤によるストレスである請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法により製造された環境ストレス抵抗性植物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の植物から由来した植物組織又は種子。
【請求項１７】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の配列相同性を有するポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、組換え細胞と試験製剤(test sample)を共に培養する段階；及び
（ｂ）試験製剤と共に培養された組換え細胞より発現されるポリヌクレオチドの発現水準を測定し、これを試験製剤無しに培養された組換え細胞より発現されるポリヌクレオチド水準と比較する段階を含むことを特徴とする植物の環境ストレス抵抗性に影響を及ぼす化合物の同定方法。
【請求項１８】
配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも７０％以上の配列相同性を有するポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをプライマー、又はプローブとして用いて遺伝工学的方法で植物体の環境ストレス抵抗性遺伝子をスクリーニングする方法。
【請求項１９】
前記遺伝工学的方法がＤＮＡチップ、蛋白質チップ、重合酵素連鎖反応、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、酵素免疫反応及び２−Ｄゲル分析からなる群より選ばれる請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は環境ストレス抵抗性調節遺伝子を利用して植物の環境ストレス抵抗性を増加させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境ストレスは植物の成長を阻害し、多くの重要な農業分野で収穫物の生産性を制限する要素の内の一つとして作用する。このような環境ストレスの内、代表的な一つの因子として旱魃ストレスがある。旱魃ストレスは植物細胞内の浸透圧不均衡とイオン不均衡を発生させ、植物の成長と光合成を阻害する。一方、植物はこのような旱魃ストレスに対する防御機構を有していて、生育に不適合な環境に置かれるとそれらの形態を調節したり、又は生理的代謝過程を調節することにより、環境に適応して生存しようとする傾向がある。前記植物の旱魃抵抗性機構にはＡＢＡ(abscisic acid)依存性信号伝達経路又はＡＢＡ非依存性信号伝達経路がある(Finkelstein et al., Plant Cell, 14, S15-S45, 2002; Himmelbach et al., Curr. Opin. Plant Biol., 6, 470-479, 2003; Kuhn and Schroeder, Curr. Opin. Plant Biol., 6: 463-469, 2003)。前記ＡＢＡは植物の代表的な旱魃関連遺伝子にして、植物の発芽(germination)、栄養生長(vegetative growth)及び孔辺細胞(guard cell)の開閉等とも関連があると知られている。孔辺細胞においてＡＢＡの濃度が増加すると細胞の外にカリウムイオン(K+)及び塩素イオン(Cl-)のようなイオンが排出され、細胞内のカルシウムイオン(Ca2+)が増加するようになる。これにより膨圧(tugor pressure)が減少しながら気孔が閉ざされ、増産が抑制され植物体より水分の損失が最小化される。しかしながら、旱魃が持続したりその程度が大きい場合には、植物の発達、成長及び作物の収穫率が減少するようになり、持続的な旱魃条件は植物代謝に変異を誘発する。このような代謝変異は結局は植物細胞を死に至らしめる。
【０００３】
従って、このよう旱魃ストレスに対して植物が抵抗性を有するようにする為に多くの研究が進められてきた。例えば国際公開第2005/048693パンフレットには植物のCap Binding Protein geneの機能を減少させたり又は抑制することにより、旱魃抵抗性が増加された植物の製造方法が開示されており、国際公開第2004/058963パンフレットにはOryzasativa由来のOSISAPI遺伝子で植物を形質転換することにより、旱魃抵抗性が増加された植物の製造方法が開示されている。
【０００４】
一方、植物の成長と発達において、主要制限因子の内、さらに他の一つである除草剤は植物の成長に必要な主要植物酵素又は蛋白質を直接的に阻害し、植物の成長を抑制したり又は枯死させる作用をする。例えば、除草剤グリホサート(glyphosate)は芳香族アミノ酸(aromatic amino acid)の合成に必要な酵素の活性を阻害することにより、植物を破壊する(Fillatti et al., Biotechnology, 5: 726-730, 1987)。更に、ホスフィノトリシン(phosphinothricin)はグルタミンの合成を阻害し、アトラジン(atrazine)は光合成機構を阻害し、パラコート(paraquat)(1,1'-dimethyl-4,4'-bipyridylium dichloride)は光の存在下で活性酸素種を多量に生成し植物の細胞損傷を誘発させる。
【０００５】
このような除草剤に対する植物の抵抗性を増加させるための方法には、主に、微生物より分離した除草剤抵抗性遺伝子を植物に形質転換する方法が用いられてきた。例えば、ストレプトマイセスハイグロスコピクス(Streptomyces hygroscopicus)から分離されたホスフィノトリシン除草剤を分解する除草剤抵抗性遺伝子で馬鈴薯、小麦、米、トウモロコシ等を形質転換して、除草剤抵抗性を付与したことがあった。
【０００６】
一方、最近では今まで研究してきた環境ストレスに対する防御機構が種特異的であったり、若しくは環境特異的な短点を克服して、より広範囲(broad spectrum)の抵抗性を誘導できる防御機構に対する研究が進められている。
【０００７】
【非特許文献１】Finkelstein et al., Plant Cell, 14, S15-S45, 2002
【非特許文献２】Himmelbach et al., Curr. Opin. Plant Biol., 6, 470-479, 2003
【非特許文献３】Kuhn and Schroeder, Curr. Opin. Plant Biol., 6: 463-469, 2003
【特許文献１】国際公開第２００５／０４８６９３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００４／０５８９６３号パンフレット
【非特許文献４】Fillatti et al., Biotechnology, 5: 726-730, 1987
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ここに、本発明者等は多様な環境ストレスに対する植物の抵抗性を増加させる方法の研究をしていた際、塩基配列は公知されているものの、その機能が解明されていないAIA遺伝子を植物に導入する場合、旱魃及び除草剤のような環境ストレスに対する植物の抵抗性を増加させる活性を有していることを解明することにより本発明を完成した。
【０００９】
従って、本発明の目的は本発明において、新たにその機能を解明した環境ストレス抵抗性調節遺伝子を利用して、植物の環境ストレス抵抗性を増加させる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記のような目的を達成する為に、本発明は植物の環境ストレス抵抗性を調節し、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも70%以上の配列相同性を有するポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを植物に導入する段階を含む植物の環境ストレス抵抗性を増加させる方法を提供する。
さらに、本発明は植物の環境ストレス抵抗性を調節し、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも70%以上の配列相同性を有するポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを植物に導入する段階を含む環境ストレス抵抗性植物の製造方法を提供する。
さらに、本発明は前記方法により製造された環境ストレス抵抗性が増加された植物、前記植物から由来した環境ストレス抵抗性が増加された植物組織又は種子を提供する。
さらに、本発明は配列番号２で表示されるアミノ酸配列と少なくとも70%以上の配列相同性を有するポリペプチド、又は配列番号２で表示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす物質を同定する方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は配列番号２で表示されるアミノ酸配列と少なくとも70%以上の配列相同性を有するポリペプチド、又は配列番号２で表示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用して植物の環境ストレス抵抗性と関連した遺伝子をスクリーニングする方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
用語の定義
他の定義がない限り、本発明で用いられるすべての技術的及び科学的用語は当業者等により通常的に理解される同一な意味を有する。下記の参考文献は本発明の明細書に用いられた種々の用語等の一般的な定義を有する技術(skill)の一つを提供する。
Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2nd ed.,1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed.,1988); 及びHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY。
【００１３】
本発明で用いられる用語“環境ストレス”とは、植物の成長又は生産性を低下させる外部的な要因を言う。好ましくは、本発明では旱魃又は除草剤によるストレスを言う。本発明で用いられた用語“環境ストレス抵抗性”とは、前記のような環境ストレスによる植物の成長低下又は生産性の低下が抑制されたり遅延される形質のことを言う。
【００１４】
本発明で用いられる用語“ポリヌクレオチド(polynucleotide)”とは、多数の重合されたヌクレオチド(plurality of polymerized nucleotides)を含む核酸分子を言う。例えば、ポリヌクレオチドはゲノムDNA, RNA, cDNA, PCR産物、クローニングされたDNA、合成DNA又はRNA等の場合もあり得る。好ましくは、前記ポリヌクレオチドはポリペプチド（又は蛋白質）又はこれのドメイン又はこれの単片をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００１５】
本発明で用いられる用語“ポリペプチド(polypeptide)”は“ペプチド(peptide)又は蛋白質(protein)”と互換性があるように(interchangeably)用いられ、例えば、アミノ酸残基の重合体を言う。
【００１６】
本発明で用いられる用語“過発現”とは、植物、植物細胞又は植物組織において、本発明に伴うポリヌクレオチド発現水準が野生型植物に比べてさらに高い水準で発現されることを言う。本発明で用いられた用語“野生型(wild type)”とは、遺伝工学的に変形されないか若しくは実験的(experimental sense)に処理されていない植物細胞、種子、植物成分(plant component)、植物組織、植物器官又は全体の植物（whole plant)を言う。
【００１７】
本発明で用いられた用語“発現ベクター”とは、本発明に伴うポリヌクレオチド配列が挿入又は導入できる当分野で公知されたプラスミド、ウイルス又はその他の媒介体を意味する。
【００１８】
本発明で用いられる用語“作動可能に連結(operably linked)”されると言うことは適切な分子が発現調節配列に結合される時、ポリヌクレオチドの発現を可能にする方式で連結されたポリヌクレオチド及び発現調節配列であることもあり得る。
【００１９】
本発明で用いられる用語“発現調節配列(expression control sequence)”とは、特定の宿主細胞において、作動可能に連結された核酸配列の発現を調節するDNA配列を意味する。
【００２０】
本発明者等は、シロイヌナズナより分離されたAP2/ERF系列の機能が、知られていないRAP2.12と呼ばれる公知の遺伝子が、植物の環境ストレス抵抗性を調節する機能のあることを初めて見出した。本発明者等は前記RAP2.12遺伝子をAIA(ABA Inducible AP2/ERF transcription factor)と新たに命名した。
【００２１】
本発明者等は前記AIA遺伝子の機能を解明する為に、先ず、野生型シロイヌナズナより分離した総RNAを鋳型にし、既知の塩基配列(GenBank accession no:At1g53910)を基にデザインしたプライマーを用いてRT-PCRを行うことにより、AIA遺伝子のcDNAを製造した（実施例１参照）。前記AIA遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は配列番号１及び配列番号２にそれぞれ示した通りである。
【００２２】
本発明者等は前記AIA遺伝子の特性を調査する為に、野生型シロイヌナズナより前記遺伝子の発現パターンをノーザンブロット及びRT-PCRを利用して分析した（実施例２参照）。その結果、前記遺伝子は野生型シロイヌナズナのすべての器官から発現され、特に、葉と根で高く発現されることが分かった（図１参照）。さらに、前記遺伝子は発芽初期及び発芽後期のシロイヌナズナの葉と根ですべて発現されることが分かった。従って、前記遺伝子は植物の大部分の組織に存在しながら、植物の生活周期全般に亙って特定機能を行うものと推定された。
【００２３】
ここに、本発明者等は前記遺伝子が植物の環境ストレス抵抗性を調節する活性があるか否かを調査するため下記のような実験を行った。
【００２４】
本発明の一実施例では、大部分の旱魃抵抗性関連遺伝子等が植物ホルモンであるABAの処理により、誘導される事実からシロイヌナズナにABAを含む種々の植物ホルモンを処理した後、ノーザンブロットを利用してAIA遺伝子の発現程度を分析した（実施例３参照）。その結果、前記遺伝子はABAの処理により誘導されることが確認できた（図３参照）。反面、オキシン、ジベレリン、ジャスモン酸及びエテフォンのようなホルモンを処理した場合には、AIA遺伝子の発現に大きな影響を与えなかった。これにより前記AIA遺伝子は植物体の旱魃抵抗性を調節する機能を行うものと推定された。
【００２５】
前記のような推定を確証するために、本発明者等はAIA遺伝子を過発現する形質転換体と（実施例４参照）、AIA遺伝子の発現が抑制された同形接合突然変異体を製造し（実施例５参照）、これらの旱魃抵抗性程度（実施例６参照）を調査した。
【００２６】
その結果、AIA遺伝子が過発現された形質転換体の場合、旱魃ストレス下においても大部分が生存するものとして現れた反面、野生型とAIA遺伝子の発現が抑制された突然変異体の場合には、80%以上が枯死するものと現れた（図12参照）。
【００２７】
さらには、本発明に伴うAIA遺伝子過発現形質転換体は、野生型シロイヌナズナと突然変異体に比べて時間経過に伴う水分の損失が少ないものとして表れた（図13参照）。
【００２８】
従って、前記AIA遺伝子は植物の旱魃抵抗性を増加させる機能のあることが知れた。
【００２９】
さらに、本発明の他の実施例では、AIA遺伝子が植物の除草剤抵抗性と関連があるか否かを確認するために、除草剤の処理に伴うAIA遺伝子過発現形質転換体の葉緑素分解程度を、野生型及びAIA遺伝子発現が抑制された突然変異体の場合と比較して調査した（実施例７参照）。その結果、本発明に伴うAIA遺伝子過発現形質転換体は野生型シロイヌナズナと、AIA遺伝子発現が抑制された突然変異体に比べて除草剤による葉緑素分解が抑制されるものとして表れた（図14及び図15参照）。
【００３０】
従って、AIA遺伝子は植物の除草剤抵抗性を増加させる機能のあることが分かった。
【００３１】
そこで、本発明は前記AIA遺伝子を利用して植物体の環境ストレス抵抗性を増加させる方法を提供する。
【００３２】
さらに、本発明は前記AIA遺伝子を利用して環境ストレス抵抗性植物体の製造方法を提供する。
【００３３】
前記環境ストレスは旱魃ストレス又は除草剤によるストレスであることが好ましい。前記除草剤はバイピリジウム(bipyridium)塩系列の除草剤であることが好ましく、このような系列の除草剤にはパラコート(paraquat)とダイコート(diquat)等がある。
【００３４】
前記にてAIA遺伝子の範疇には、配列番号２で表示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は前記ポリペプチドの機能的同等物をコードするポリヌクレオチドを含む。前記“機能的同等物”とは、アミノ酸の付加、置換又は欠失の結果、前記配列番号２で表示されるアミノ酸配列と少なくとも70%以上、好ましくは80%、さらに好ましくは90%以上の配列相同性を有するものにして、配列番号２で表示される蛋白質と実質的に同質の生理活性を示す蛋白質を言う。前記“実質的に同質の生理活性”とは、植物体内で植物の環境ストレス抵抗性を調節する活性を意味する。例えば、前記ポリヌクレオチドが植物で過発現されると環境ストレス抵抗性が増加する活性を言う。本発明に用いられるポリヌクレオチドは、配列番号１で表示される塩基配列を有するポリヌクレオチドが好ましい。
【００３５】
従って、本発明は、好ましくは植物の環境ストレス抵抗性を調節し、配列番号２で表示されるアミノ酸配列と少なくとも70%以上の配列相同性を有するポリペプチド、又は配列番号２で表示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを植物に導入する段階を含む植物の環境ストレス抵抗性を増加させる方法を提供する。
【００３６】
さらに、本発明は植物の環境ストレス抵抗性を調節し、配列番号２で表示されるアミノ酸配列と少なくとも70%以上の配列相同性を有するポリペプチド、又は配列番号２で表示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを植物に導入する段階を含む環境ストレス抵抗性植物の製造方法を提供する。
【００３７】
前記ポリヌクレオチドの植物への導入は、前記ポリヌクレオチドを適切な発現ベクター内に挿入し、これを利用して植物細胞を形質転換することにより行える。さらに、本発明に伴うポリヌクレオチド配列は発現調節配列に作動可能に連結することができ、前記作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列と発現調節配列は選別マーカ及び複製開始点(replication origin)を共に含んでいる一つの発現ベクター内に含まれることもあり得る。前記発現調節配列は転写を実施するためのプロモータ、転写を調節するための任意のオペレータ配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列及び転写並びに解読の終結を調節する配列を含む。前記において、プロモータでは植物体内に挿入遺伝子を過多発現させ得るものであれば特に制限されない。前記プロモータの例ではこれに限定はされないものの、CaMVの35S RNA及び19S RNAプロモータ；フィクワトモザイクウイルス(FMV)より由来した、全長転写プロモータ及びTMVのコート蛋白質プロモータが挙げられる。さらに、単子葉植物や木本植物体で遺伝子を過多発現するには、ユビキチン(ubiquitin)プロモータが用いられる。植物細胞内に本発明の遺伝子を導入するための適切なベクターはTiプラスミド及び植物ウイルスベクターがある。前記適切なベクターの例ではこれに限定はされないものの、pPZP, pGA及びpCAMBIA系列と同じバイナリベクターを用いるのが好ましい。当業者であれば本発明に伴う遺伝子の核酸配列を導入させるに適切なベクターを選択できる。
【００３８】
本発明の一実施例では CaMV 35SプロモータとNOSターミネータが含まれたPBI121ベクターでGUS遺伝子を除去したベクターpBI111Lに、AIA遺伝子を挿入して製造した組換えベクターpBI111L-AIAが例示されている（図４）。
【００３９】
前記組換えベクターの植物への導入は当分野で公知の方法を用いることができる。例えば、これに限定はされないものの、アグロバクテリウム(Agrobacterium sp.)媒介による方法、粒子銃衝撃法(particle gun bombardment)、シリコン炭化物ウィスカー(Silicon carbide whiskers)、超音波処理(sonication)、電気穿孔法(electroporation)及びPEG(Polyethylen glycol)による沈殿法を使用できる。本発明の一実施例ではアグロバクテリウム媒介による方法を用いて、本発明の組換えベクターでシロイヌナズナを形質転換した。
【００４０】
さらに、前記において本発明のポリヌクレオチドで植物を形質転換した後、形質転換された植物を選別して再分化することができる。
【００４１】
前記形質転換された植物の選別及び再分化は、当業界で公知された方法により行える。例えば、選別マーカーとして抗生剤抵抗性遺伝子を用いた場合、本発明に伴うポリヌクレオチドを導入した植物を抗生剤が含まれた培地で培養し、抗生剤抵抗性を示す植物のみを選択することにより、本発明に伴うポリヌクレオチドが導入された植物を選別できる。さらに、RT-PCR又はサザンブロット分析と同じ遺伝工学的な方法を通じて、植物内に望む遺伝子が挿入されたか否かを追加して確認できる。
【００４２】
選別された形質転換した植物の再分化は、当業界で公知された方法によりカルス(callus)の誘導、発根及び土壌醇化の過程を通じて行われる。
【００４３】
一方、前記本発明に伴う方法が適用できる植物には、単子葉植物又は双子葉植物が含まれる。前記単子葉植物の例ではこれに限定はされないものの、稲、小麦、大麦、竹（筍）、トウモロコシ、里芋、アスパラガス、玉葱、ニンニク、葱、ニラ、ヒメニラ、長芋、及び生姜がある。双子葉植物の例ではこれに限定されないものの、シロイヌナズナ、茄子、煙草、唐辛子、トマト、牛蒡、春菊、チサ、桔梗、ホウレン草、不断草、サツマ芋、セロリ、人参、芹、パセリ、白菜、キャベツ、葉からし菜、西瓜、真桑瓜、キュウリ、カボチャ、夕顔、苺、大豆、緑豆、インゲン豆及び豌豆がある。好ましくは前記環境ストレス抵抗性植物はシロイヌナズナであることもあり得る。
【００４４】
さらに、本発明は前記方法により製造された環境ストレス抵抗性植物を提供する。
より具体的には、本発明に伴う環境ストレス抵抗性植物は配列番号２で表示されるアミノ酸配列と少なくとも70%以上の配列相同性を有するポリペプチド、又は配列番号２で表示される、アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを植物に導入して形質転換した後、通常的な方法により形質転換された植物を選別し、選別された植物を再分化することにより収得することができる。好ましくはAIA遺伝子が含まれた組換えベクターで形質転換された植物の切片体を、当業界で公知された適切な培地に置床し，適正条件で培養してカルス(callus)の形成を誘導し、新芽が形成されるとホルモン無添加培地に移して培養する。約２週間後前記新芽を発根用培地に移して根を誘導する。根が誘導された後これを土壌に移植して醇化させることにより、環境ストレス抵抗性植物を収得することができる。
【００４５】
さらに、本発明は前記の形質転換された植物体より生産される植物組織、又は種子を提供する。前記植物組織又は種子は配列番号２で表示されるアミノ酸配列と少なくとも70%以上の相同性を有するポリペプチド、又は配列番号２で表示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを含んでいて環境ストレス抵抗性形質を有することを特徴とする。
【００４６】
さらに、本発明は配列番号２で表示されるアミノ酸配列と少なくとも70%以上の配列相同性を有するポリペプチド、又は配列番号２で表示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす物質を同定する方法を提供する。具体的に本発明の同定方法は、(ａ)配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも70%以上の配列相同性を有するポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、組換え細胞と試験製剤(test sample)を共に培養する段階；及び（ｂ）試験製剤と共に培養された組換え細胞より発現されるポリヌクレオチドの発現水準を測定し、これを試験製剤無しで培養された組換え細胞より発現される水準と比較する段階を含む。前記において、本発明に伴うポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼすと言うことは、前記ポリヌクレオチドの発現を促進させ、植物の環境ストレス抵抗性を増加させることが好ましい。試験製剤が本発明のポリヌクレオチドの発現に及ぼす影響は当分野で公知されたノーザンブロット分析、及びウェスタンブロット分析等を通じて測定できる。本発明で“製剤(agent)”又は“試験製剤”(test agent)”とは、任意の物質(substance)、分子(molecule)、元素(element)、化合物(compound)、実在物(entity)、又はこれらの組合せを含む。例えば、これに制限はされないものの、蛋白質、ポリペプチド、小有機物質(small organic molecule)、多糖類(polysaccharide)、ポリヌクレオチド等を含む。さらに、自然産物(natural product)、合成化合物又は化学化合物又は２個以上の物質の組合せであることもあり得る。別に指定されない限り、製剤、物質及び化合物は互換性があるように(interchangeably)使用できる。
【００４７】
さらに、本発明に伴う配列番号２で表示されるアミノ酸配列と少なくとも70%以上の配列相同性を有するポリペプチド、又は配列番号２で表示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知された遺伝工学的な方法を用いて植物の環境ストレス抵抗性と関連した形質改善及び他の植物体の環境ストレス抵抗性調節遺伝子の探索に有用に利用できる。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは配列番号１で表示されるAIA遺伝子であることもあり得、前記ポリヌクレオチドをプライマー又はプローブとして使用し、公知された遺伝工学的方法で植物体で環境ストレス抵抗性遺伝子をスクリーニングすることができる。前記遺伝工学的方法には、例えば、これに限定はされないものの、DNAチップ、蛋白質チップ、重合酵素連鎖反応、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、酵素免疫反応及び2-Dゲル分析等を含む多様な方法を使用できる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を下記実施例によりさらに詳しく説明する。
下記実施例は本発明を例示するものにして、本発明の内容がこれに限定されるものではない。
【００４９】
実施例１：AIA遺伝子のcDNA合成
AIA遺伝子のcDNAは、シロイヌナズナの葉から分離した総RNAを鋳型にしてRT-PCRを行い製造した。前記総RNAの分離はアールエヌイージープラントキット(RNeasy plant kit, Qiagen)を用いて行い、プライマーは公知された遺伝子配列(GenBank accession no:At1g53910)を基にしてデザインした。より具体的に、RT-PCRは前記にて分離した総RNA500ngを試料にし、下記のプライマーとワンーステップRT-PCRキット(Qiagen)を用いて行い、条件は50℃で30分、95℃で15分間反応させ逆転写し、前記逆転写結果収得したcDNAを鋳型にして94℃で30秒、60℃で30秒及び72℃で１分ずつ24回繰返すことによりPCR増幅産物を収得した。
正方向プライマー : AIA-ap3：配列番号３
5′-ATGTGTGGAGCTATAATATCCGAT- 3′
逆方向プライマー : AIA-jinw：配列番号４
5′-TCAGAAGACTCCTCCAATCATGGAAT- 3′
【００５０】
実施例２：野生型シロイヌナズナでAIA遺伝子の発現パターン分析
野生型シロイヌナズナの器官別及び発達段階に伴うAIA遺伝子の発現パターンをノーザンブロット及びRT-PCRを用いて分析した。
【００５１】
〈2-1〉ノーザンブロット分析
土壌で４週間育てた野生型シロイヌナズナの根、ロゼット葉(rosette)、幹(stem)、茎葉(cauline)、花(flower)及びシリク(silique)からアールエヌイージープラントキット(RNeasy plant kit, Qiagen)を用いて総RNAを分離した。さらに発芽後４日目のシロイヌナズナと、２週経ったシロイヌナズナの根と葉からそれぞれの総RNAを分離した。ノーザンブロットを行うために、前記にて分離したRNA10μgずつをローディングバッファー（ホルムアミド50%、1×MOPS、ホルムアルデヒド2,2%)と混合した後、1%ホルムアルデヒドアガロースゲル(formaldehyde agarose gel)にローディングして分離し、20×SSCを利用してナイロン膜(Hybond N+ membrance)に移した。前記ナイロン膜を軽く2×SSCで洗浄し、200mJエネルギーで架橋させた。安定化されたナイロン膜を前混成化バッファー(prehybridization buffer, 1% BSA, 1mM EDTA(pH8.0)、0.25M Na2HPO4(pH7,2)、7%SDS)で３時間処理した後、AIA遺伝子に特異的に表示された探針と65℃で一夜混成化した。前記探針は前記実施例１で製造したAIA遺伝子のcDNA（配列番号１）を鋳型にして、下記のプライマー（配列番号５及び配列番号６）を用いてAIA遺伝子の3′UTR部分をPCR増幅することにより製造し、［α-32P］dCTPを用いて表示した。  
【００５２】
正方向プライマー：配列番号５
5′-CGTTGATGCTGGATGTAATGGGTAT-3′
逆方向プライマー：配列番号６
5′-CCTGAGTCGTTACAGCATCTTCGTT-3′
混成化が完了した後、ナイロン膜を65℃で2×SSCと、0.1% SDSで５分間洗浄した後、Ｘ線フィルムに露出させ放射線で感光されたバンドを検出した。
実験の結果、AIA遺伝子は野生型シロイヌナズナの全ての器官で発現されるものとして表れ、特に根と花において、他の器官に比べて相対的に高く発現するものとして表れた（図１）。さらに、AIA遺伝子は発芽後、４日経ったシロイヌナズナと２週間経ったシロイヌナズナの葉と根の全てにおいて発現されるものとして表れた（結果未図示）。前記実験結果からAIA遺伝子は植物の全ての器官に存在しながら、植物の生活周期(life cycle)全般に亙って特定の機能を行うものと推定された。
【００５３】
〈2-2〉RT-PCR分析
前記実施例〈2-1〉において，AIA遺伝子がシロイヌナズナの花に高く発現された結果を基に、シロイヌナズナの花の発達段階に伴うAIA遺伝子の発現パターンをRT-PCRで分析した。この為、土壌で４週間育てた野生型シロイヌナズナの花から発達段階別（受精前5〜6日、受精前2〜3日、受精期、受精後6〜8日及び受精後13〜16日）に実施例１と同一な方法で総RNAを分離してRT-PCRを行った。
実験の結果、AIA遺伝子は受精前に最も高く発現されるものとして表れ、発達段階が進むにつれてその発現程度が漸次減少するものとして表れた（図２）。
【００５４】
実施例３：植物ホルモンの処理に伴うシロイヌナズナ内AIA遺伝子の発現変化
シロイヌナズナをMS培地（MS塩 2.15g, MES 0.5g, スクロース 10g, 0.7%フィトアガー, pH5.7）で２週間育てた後、植物ホルモンのABA、ジャスモン酸(jasmonic acid)及びエテフォン(ethephon)がそれぞれ100μMずつ、さらに、オーキシン(auxin)、ジベレリン酸(gibberellic acid;GA)はそれぞれ10μMが含まれた水溶液をスプレーした。その後、時間別（スプレー後30分、２時間、６時間、10時間及び24時間）にシロイヌナズナの幼植物体(seedling)より前記実施例〈2-1〉と同一な方法で総RNAを分離し、ノーザンブロットを行った。この際、ABAによりその発現量が増加するものとして知られたKIN2遺伝子を陽性対照群とし用いた。
実験の結果、ABAを処理した場合、２時間後からシロイヌナズナ内AIA遺伝子が初期水準に比べて高く発現されたものの、スプレー後24時間目にはその発現程度が初期水準程度に減少した(図３）。反面、オーキシン、ジベレリン、ジャスモン酸及びエテフォンのようなホルモンを処理した場合には、AIA遺伝子の発現程度が初期水準と大差がなかった (結果未図示）。
一般的に旱魃抵抗性関連遺伝子等はABAの処理により誘導されるものと知られている。従って、前記実験結果からAIA遺伝子も植物の旱魃抵抗性と関連があるものと推定された。
【００５５】
実施例４：AIA遺伝子を過発現する形質転換体の製造
AIA遺伝子が植物体の環境ストレス抵抗性と関連があるか否かを確認する為、AIA遺伝子が過発現する形質転換体を製造した。
【００５６】
〈4-1 〉AIA遺伝子を含む組換えベクターの製造
AIA遺伝子を過発現する形質転換体を製造する為に、前記実施例１のAIA遺伝子のcDNAを制限酵素Xba1及びXho1で切断し、CaMV 35SプロモータとNOSターミネータが含まれたベクターであるpBI111Lの同一な場に挿入して組換えベクターpBI111L-AIAを製造した（図４）。
【００５７】
〈4-2〉シロイヌナズナの形質転換
前記実施例〈4-1〉のAIA遺伝子を含む、組換えベクターをマイクロパルサー(electroporator, Biorad)を利用した電気穿孔法でアグロバクテリウムチュメファシエンスC58C1(Agrobacterium tumefaciens C58C1)に導入した。その後、前記アグロバクテリウムチュメファシエンスをカナマイシン(kanamycin)、ゲンタマイシン(gentamycine)及びリファンピシン(rifampicin)の最終濃度がそれぞれ30μg/ml, 100μg/ml及び100μg/mlずつ含まれたYEP培地（培地１リットル当り酵母抽出物10g、ペプトン10g及びNaCl5g含む）で培養して抗生剤抵抗性を示す形質転換体を選抜した。選抜されたアグロバクテリウム菌株を利用してフローラルディプ法(floral dip method)(Clough et al., Plant J., 16(6): 735-743, 1998)で野生型シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana ecotype Col-0)を形質転換した。つまり、AIA遺伝子を含む組換えベクターが導入されたアグロバクテリウム菌株をカナマイシン、ゲンタマイシン及びリファンピシンが含まれたYEP培地5mlに接種して１日間培養し、500μlを採り同一な条件のYEP培地500mlに接種し、600nmで吸光度が2.0以上になるように培養した。培養が完了した後、培養液を遠心分離して沈殿した細胞を収得し、前記細胞をインフィルタレーションバッファー(MS塩 2.2g/L, スクロース 50g/L, MES 0.5g/L, ベンジルアミノヒュリン 0.044M及びSilwet L-77 200μl/L, pH5.7)に懸濁した。４週間育てたシロイヌナズナを、この懸濁液に5〜7秒間３回浸水させ、ラップで覆い24時間培養した。前記のような方法で形質転換されたシロイヌナズナを継続培養して次世代の種子を収穫した。前記において収穫した種子をカナマイシンが含まれたMS培地に播種して７日間培養することにより、カナマイシン抵抗性を示す植物を９個選抜した。
【００５８】
〈4-3〉形質転換されたシロイヌナズナのRT-PCR
前記実施例〈4-2〉で選抜された９個のシロイヌナズナを土壌に移して４週間育て、葉(rosette)を採集して前記実施例１と同一な方法で総RNAを分離した後、RT-PCRを行うことによりAIA遺伝子の過発現の可否を調査した。
実験の結果、９個の形質転換体の内６個よりAIA遺伝子のバンドが現れ、この内で11番目の形質転換体のバンドの強度が最も大きいものと現れた（図５）。
【００５９】
〈4-4〉形質転換されたシロイヌナズナのサザンブロット分析  前記実施例〈4-3〉でAIA遺伝子のバンドが検出された６個の形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これを利用してサザンブロットを行うことにより、AIA遺伝子が前記形質転換体のゲノム内に挿入されたか否かを分析した。ゲノムDNAを抽出する為に６週経ったT1形質転換体から葉と茎約2gを切除した後、液体窒素を利用して粉砕し、CTABバッファ［2%(w/v) CTAB(cetyltrimethylammonium bromide), 100mM Tris-HCl, pH8.0、20mM EDTA, pH8.0、1.4M NaCl及び1%ポリビニルピロリジン(M.W.40,000)］10mlに入れ、65℃で３時間程放置した。反応終了後同量のクロロホルム(chloroform)を混合し、3000rpmで50分間遠心分離した。上層液を新たなチューブに写し、2/3嵩のイソプロパノール(Iso-propanol)を添加して混合し、12000rpmで5分間遠心分離した。上層液を除去して沈殿物を70%エタノールを利用して洗浄し、TEバッファーを利用して１次的にゲノムDNAを抽出した。さらに、残存するRNAを除去するためにRNase A(promega, USA)を最終濃度10μg/mlになるように添加して、37℃で30分間培養した後、さらにエタノール抽出法を利用して純粋ゲノムDNAを抽出した。サザンブロットの為、各形質転換体より収得したゲノムDNAを10μgずつ採り制限酵素EcoRI とPstIで24時間の間切断して0.7%アガロースゲルにローディングした。ローディングが終わったアガロースゲルを変性バッファー(1.5M NaCl, 0.5N NaOH)300mlに浸漬し、30分間軽く混合し、バッファーを捨てて２次蒸留水でアガロースゲルを洗浄した。さらに、アガロースゲルを中和バッファー(1M Tris-HCl(pH7.5), 1.5M NaCl)に30分間浸漬し、前記提示したノーザンブロットと同じ方法でサザンブロットを進めた。架橋されたナイロン膜をサザンブロット用前混成化バッファー(1%SDS, 1M NaCl, 10%デキストランソルフェート)を利用して３時間前処理させ、35S CaMVプロモータに特異的な部分を探針として65℃で１夜混成化した。前記探針はベクターpBI111Lに存在する 35S CaMVプロモータを鋳型にして、下記のプライマーを用いてPCRを利用して増幅し［α-32P］dCTPを用いて表示した。
正方向プライマー：配列番号７
5′-CTAACTGCATCAAGAACACAGAGAA-3′
逆方向プライマー：配列番号８
5′-AGATATCACATCAATCCACTTGCTT-3′
混成化が完了した後、ナイロン膜を65℃で2×SSCと0.1%SDSで５分間洗浄し、Ｘ線フィルムに露出させ放射線で感光されたバンドを検出した。
実験の結果、２番、４番及び11番形質転換体の場合、弱いバンドがしばしば表れるものの、強い一つのバンドが表れることが見られた（図６）。従って、AIA遺伝子はシロイヌナズナのゲノムで単一コピー(single-copy)遺伝子として存在することが分かった。
【００６０】
実施例５：AIA遺伝子活性が抑制された突然変異体の製造
〈5-1〉同型接合突然変異体の製造
AIA遺伝子が植物の環境ストレス抵抗性と関連があるか否かを確認する為に、AIA遺伝子活性が抑制された同型接合突然変異体を製造した。この為、AIA遺伝子のプロモータ部分にT-DNAが挿入された種子(Salk-019187)をソーク(http://signal.salk.edu-bin/tdnaexpress)から入手した（図７）。前記種子をカナマイシンが含まれたMS培地に播種し、２週間後土壌に移植してさらに２週間育てて葉よりゲノムDNAを分離した。前記ゲノムDNAの分離は次のような方法で行った。シロイヌナズナの葉２枚をE-チューブに入れ、液体窒素を入れてプラスチック探針を利用してチョッピング(chopping)し、ここに、抽出バッファー［100mM Tris-HCl,(pH8.5), 50mM EDTA(pH8.5)及び500mM NaCl］500μlと20%SDS 35μlを添加し、65℃で５分間放置した。これにさらに5M KOAc 130μlを添加して氷に５分間放置し、15000rpmで10分間遠心分離した。収得した上層液を新たなチューブに移し、イソプロパノール(Iso-propanol) 640μlと、3M NaOAc 60μlを添加して-20℃で10分間培養し、15000rpmで10分間遠心分離した。DNA沈殿物を70%エタノールで洗浄し、２次蒸留水でゲノムDNAを抽出した。前記のような方法で収得したゲノムDNAを鋳型にして下記のプライマーを用いてPCR増幅した後、収得したPCR増幅産物を電気泳動することにより、T-DNAが挿入された同型接合突然変異体を選抜した。PCR増幅の際用いたプライマーではT-DNA内部位置プライマーLB、周辺ゲノムに位置した正方向プライマーLP及び逆方向プライマーRPを用いた（図7B）。前記にてPCR増幅の条件としては94℃で30秒、56℃で30秒、72℃で2分ずつ35回繰返した。さらに、同一な条件下でT-DNA内部位置プライマーを除外し、ゲノムの正方向プライマーと逆方向プライマーを用いてPCR増幅してこれを電気泳動した。
【００６１】
ＬＢプライマー：配列番号９
5′-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT -3′
ＬＰプライマー：配列番号10
5′-TGTTAAATATCTGTTCTGCGTTGGC-3′
ＲＰプライマー：配列番号11
5′-AACCAATTCAATCGCTCAAAC-3′
【００６２】
前記のような方法により３種類のプライマーを全て用いて電気泳動すると、野生型の場合には900bp大(LPよりRPまで)の一つのバンドが検出される。同型接合突然変異体の場合には、410+N bp(N=0〜300)(RPより300+N個の塩基と、LBよりベクターの左方境界面の110個の塩基）大の一つのバンドが検出され、T-DNAが挿入された全体ゲノムの増幅産物はその大きさが大き過ぎて電気泳動の際検出されない。異型接合突然変異体の場合には、染色体の一筋は野生型と同一で残りの一筋のみにT-DNAが挿入されている為に、900bp大の一つのバントと410+N bp大のバンドが全て検出される（図８）。
一方、T-DNA内部位置プライマーを除外して、周辺ゲノムに位置した正方向及び逆方向プライマーを用いてPCR増幅した後、電気泳動すると野生型の場合には900bp大の一つバンドが検出されるものの、T-DNAが挿入されたゲノムを有する突然変異体の場合には、増幅産物の大きさが大き過ぎて電気泳動の際検出されない。
前記のような方法と原理により、３種類のプライマーを全て用いてPCR増幅して電気泳動した結果、総14個の植物系統の内12個の同型接合突然変異体が選抜された（図９）。
一方、T-DNA内部位置プライマーを除外し、周辺ゲノムに位置したプライマーのみを用いてPCR増幅した産物の電気泳動結果は野生型の場合にのみ900bp大のバンドが検出された（図９）。
前記にて選抜した12個の突然変異体から次世代の種子を収穫し、これをカナマイシンが含まれたMS培地に播種して、カナマイシンに抵抗性を有する突然変異体を最終的に選抜し、これをAIAと命名した（図10）。
【００６３】
〈5-2〉同型接合突然変異体のAIA遺伝子の発現程度測定
前記〈5-1〉で選抜した突然変異体(AIA)を土壌で４週間生育させ、葉から総 RNAを分離して前記実施例〈2-1〉と同一な方法でノーザンブロットを行い、AIA遺伝子の発現程度を測定した。
実験の結果、同型接合突然変異体 (AIA)のAIA遺伝子の発現程度は野生型に比べて極めて低く表れ、同型接合突然変異体のRNAを野生型に比べて４倍高い濃度で、ローディングする場合に野生型と似た水準の発現程度を示した（図11）。従って、前記同型接合突然変異体でAIA遺伝子の発現が抑制されたことが確認できた。
【００６４】
実施例６：AIA遺伝子活性が過発現された形質転換体の旱魃抵抗性調査AIA遺伝子が植物の旱魃抵抗性と関連があるか否かを確認する為に、AIA遺伝子過発現形質転換体の旱魃ストレスに伴う生育状態及び増産率を野生型及びAIA遺伝子の発現が抑制された突然変異体の場合と比較調査した。
【００６５】
〈6-1〉旱魃ストレスに伴う生育状態比較
土壌に野生型シロイヌナズナ、前記実施例〈4-2〉のAIA遺伝子過発現形質転換体及び前記実施例〈5-1〉の突然変異体を継続培養して次世代の種子を収穫した。前記それぞれの種子を土壌に100余個ずつ播種し、長日条件（16時間光/8時間暗）で23℃で２週間生育させた。その後、10日間水の供給を中断して旱魃ストレスを加え、水を再供給して２日後の生育状態を観察した。
実験の結果、野生型シロイヌナズナと同型接合突然変異体は80%以上が枯死するものととして表れた。反面、AIA遺伝子過発現形質転換体は大部分が生存するものとして表れた（図12）。
【００６６】
〈6-2〉各植物の増産率比較
本発明に伴うAIA遺伝子過発現形質転換体の旱魃抵抗性をより具体的に調査する為に、野生型シロイヌナズナ、実施例〈4-2〉のAIA遺伝子過発現形質転換体及び実施例〈5-1〉の突然変異体を２週間生育させ、3,4,5番目の葉をそれぞれ切断して、3Mペーパーの上に、葉の裏面(abaxial side)が上にくるようにして、１時間間隔で６時間葉の重さを測定することにより、時間の経過に伴う増産率を比較した。
実験の結果、AIA遺伝子過発現形質転換体は野生型と突然変異体に比べて、水分損失が少ないものとして表れた。つまり、６時間後に前記形質転換体の葉の重さは初期質量の約70%程度を維持するものとして表れた反面、野生型と突然変異体は約50%以下に減少するものとして表れた（図13）。
従って、本発明に伴うAIA遺伝子過発現形質転換体は、野生型やAIA遺伝子の発現が抑制された突然変異体に比べて、増産作用が抑制され旱魃ストレスに対する抵抗性が増加することが確認できた。
【００６７】
実施例７：AIA遺伝子が過発現された形質転換体の除草剤抵抗性調査
AIA遺伝子が植物の除草剤抵抗性と関連があるか否かを確認する為に、除草剤の処理に伴うAIA遺伝子過発現形質転換体の葉緑素分解程度を野生型及びAIA遺伝子発現が抑制された突然変異体の場合と比較して調査した。
除草剤のパラコート(Paraquat, methyl viologen)6μMを含むMS培地で４週間生育させた野生型シロイヌナズナ、前記実施例〈4-2〉のAIA遺伝子過発現形質転換体及び前記実施例〈5-1〉の突然変異体の葉を浮かべて、連続光条件で23℃で72時間培養させた。対照群にはメチルビオローゲンが含まれていないMS培地を用いた。前記メチルビオローゲンは商品名グラモクソンで良く知られている非選択的除草剤にして、葉緑素を有している全ての植物を枯死させるばかりでなく、人体に吸収された場合致命的な問題を引起こし得る毒性物質である。
除草剤ストレスによる葉緑素分解程度は下記のような方法により測定した。先ず、前記で培養が完了した各植物体の葉２ｇを採集し、0.1g CaCO3と共に、85%のアセトンを少しずつ添加しながら擂り鉢で粉砕し、3000rpmで５分間遠心分離した。上層液を分離した後公知された方法により葉緑素を定量した(Cunniff. P. A. Plant in Official Method of Analysis. vol1. 16th ed., pp26-28, 1995)。
実験の結果、除草剤を含む培地で培養した場合、野生型シロイヌナズナと同型接合突然変異体は対照群に比べて、60%以上の葉緑素が分解される反面、AIA遺伝子過発現形質転換体はこれ等に比べて10〜20%程度の損失が少な目なものとして表れた（図14及び15図）。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
以上、前記実施例を通じて説明した通り、本発明の方法はシロイヌナズナ由来の環境ストレス抵抗性遺伝子を植物に導入することにより、植物の環境ストレス抵抗性を増加できる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】野生型シロイヌナズナの各器官に伴うAIA遺伝子の発現パターンをノーザンブロットで分析した結果。
【図２】野生型シロイヌナズナの花の発達段階に伴うAIA遺伝子の発現パターンをRT-PCRで分析した結果（Ｍ：分子量マーカー，I：花芽形成期（受精前 5〜6日），II：受精及び開花期 I（受精前 2〜3日），III：受精及び開花期 II（受精期），IV：シリク発達期（受精後 6〜8日），V：シリク完成期（受精後13〜16日））。
【図３】植物ホルモンABAをシロイヌナズナに処理し、時間の経過に伴いAIA遺伝子の発現パターンをノーザンブロットで分析した結果。
【図４】本発明に伴うAIA遺伝子を含む組換えベクターの開裂地図を示した図。
【図５】本発明に伴うAIA遺伝子を含む組換えベクターで形質転換されたシロイヌナズナのRT-PCR分析結果（Ｗ：野生型シロイヌナズナ，Ｍ：分子量マーカー）。
【図６】本発明に伴うAIA遺伝子を含む組換えベクターで形質転換されたシロイヌナズナのノーザンブロット分析結果（Ｗ：野生型シロイヌナズナ）。
【図７】AIA遺伝子のプロモータ部分に挿入されるT-DNAの位置を示した図。
【図８】AIA遺伝子の活性が抑制された同形接合突然変異体の選抜のため、デザインしたプライマー及び前記プライマーにより、増幅される産物の大きさを示した図（ＷＴ：野生型，ＨＺ：異型接合突然変異体，ＨＭ：同型接合突然変異体）。
【図９】PCRを利用してAIA遺伝子の活性が抑制された同形接合突然変異体を選抜した結果。Ａ：T-DNA内部位置プライマー、周辺ゲノムに対する正方向プライマー及び逆方向プライマーをすべて用いてPCR増幅した結果。Ｂ：T-DNA内部位置プライマーを除外して周辺ゲノムに対する正方向プライマー及び逆方向プライマーのみを用いてPCR増幅した結果。
【図１０】PCRを利用して選抜したAIA遺伝子の活性が抑制された同型接合突然変異体の次世代の種子を、カナマイシンが含まれたMS培地で播種してカナマイシンに抵抗性を有する突然変異体を最終的に選抜した結果（Ａ：野生型シロイヌナズナ，Ｂ：カナマイシンに抵抗性を有する同型接合突然変異体，Ｃ：カナマイシンに抵抗性を有する同型接合突然変異体，Ｄ：カナマイシンに抵抗性を有する同型接合突然変異体）。
【図１１】本発明の方法により選抜された同型接合突然変異体のAIA遺伝子の発現程度をノーザンブロットで分析した結果（Ａ：野生型シロイヌナズナ(RNAローディング量10μg)，Ｂ：同型接合突然変異体(RNAローディング量10μg)，Ｃ：同型接合突然変異体(RNAローディング量40μg)）。
【図１２】旱魃ストレスに伴うAIA遺伝子の過発現形質転換体、同型接合突然変異体及び野生型シロイヌナズナの生育状態を比較した写真（Ａ：野生型シロイヌナズナ，Ｂ：同型接合突然変異体，Ｃ：過発現形質転換体１，Ｄ：過発現形質転換体２）。
【図１３】AIA遺伝子の過発現形質転換体、同型接合突然変異体及び野生型シロイヌナズナの時間の経過に伴う葉の重さを測定した結果。
【図１４】除草剤の処理に伴うAIA遺伝子の過発現形質転換体、同型接合突然変異体及び野生型シロイヌナズナの葉緑素分解程度を比較した写真。
【図１５】除草剤の処理に伴うAIA遺伝子の過発現形質転換体、同型接合突然変異体及び野生型シロイヌナズナの葉緑素を定量した結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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