(57)【要約】【課題】  老化に伴う正常細胞の機能低下を抑える効果に優れた老化抑制剤、及び酸化ストレスによる正常細胞の機能低下を抑える効果に優れた酸化ストレス抑制剤を提供する。【解決手段】  老化抑制剤は、冠元顆粒を有効成分として含有し、老化に伴って引き起こされる正常細胞の機能低下を抑える作用を有している。酸化ストレス抑制剤は、酸化ストレスによって引き起こされる正常細胞の機能低下を抑える作用を有している。前記正常細胞の機能低下を抑える作用としては、細胞周期の停止を抑える作用、正常細胞の分裂寿命の短縮を抑える作用、又は正常細胞の生存率の低下を抑える作用が挙げられる。冠元顆粒は、丹参、香附子、木香、紅花、芍薬及びセンキュウの各構成生薬を所定の配合割合（例えば重量比で４：１：１：２：２：２）で調合したものである。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
冠元顆粒を有効成分として含有する老化抑制剤であって、老化に伴う細胞周期の停止を抑える作用を有していることを特徴とする老化抑制剤。
【請求項２】
冠元顆粒を有効成分として含有する老化抑制剤であって、老化に伴う正常細胞の分裂寿命の短縮を抑える作用を有していることを特徴とする老化抑制剤。
【請求項３】
冠元顆粒を有効成分として含有する老化抑制剤であって、老化に伴う正常細胞の生存率低下を抑える作用を有していることを特徴とする老化抑制剤。
【請求項４】
冠元顆粒を有効成分として含有する老化抑制剤であって、老化に伴う正常細胞の形態学的変化、又は正常細胞内のミトコンドリア機能異常を抑える作用を有していることを特徴とする老化抑制剤。
【請求項５】
冠元顆粒を有効成分として含有する老化抑制剤であって、老化に伴う正常細胞の老化細胞特異的β−ガラクトシダーゼ活性の上昇、細胞内活性酸素量の増大、細胞内過酸化脂質量の増大、細胞内グルタチオン量の増大、核内転写因子ＮＦ−κＢの核移行、ヘムオキシゲナーゼ−１蛋白質の過剰発現、又はＢａｘ蛋白質の過剰発現を抑える作用を有していることを特徴とする老化抑制剤。
【請求項６】
丹参の水抽出物又は冠元顆粒を有効成分として含有する老化抑制剤であって、老化に伴う血清中の最終糖化産物濃度の上昇、血清中過酸化脂質濃度の上昇、肝臓中過酸化脂質濃度の上昇、肝臓中還元型グルタチオン／酸化型グルタチオン比率の低下、肝臓中グルタチオンペルオキシダーゼ活性の上昇、肝機能パラメーターの上昇、又は腎機能パラメーターの上昇を抑える作用を有していることを特徴とする老化抑制剤。
【請求項７】
冠元顆粒を有効成分として含有し、酸化ストレスによる正常細胞の機能低下を抑える作用を有する酸化ストレス抑制剤であって、
前記正常細胞の機能低下は、細胞周期の停止、分裂寿命の短縮、生存率の低下、又は細胞の形態学的変化であることを特徴とする酸化ストレス抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品や食品等の用途に利用される老化抑制剤及び酸化ストレス抑制剤に関する。より詳しくは、冠元顆粒を有効成分とする老化抑制剤及び酸化ストレス抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、冠元顆粒の薬理作用としては、血圧上昇抑制作用、脳血流量改善作用（脳卒中発症予防作用）、血液改善作用（抗トロンビン作用）等が知られている。また、特許文献１には、老化促進モデルマウスの学習・記憶障害改善作用に基づいた抗痴呆剤が開示されている。
【特許文献１】特開平６−５６６８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、本発明者らの鋭意研究の結果、冠元顆粒が持つ新規な薬理作用を解明したことによりなされたものである。その目的とするところは、老化に伴う正常細胞の機能低下を抑える効果に優れた老化抑制剤を提供することにある。別の目的とするところは、酸化ストレスによる正常細胞の機能低下を抑える効果に優れた酸化ストレス抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の老化抑制剤は、冠元顆粒を有効成分として含有する老化抑制剤であって、老化に伴う細胞周期の停止を抑える作用を有していることを要旨とする。
【０００５】
この構成によれば、老化抑制剤は、有効成分としての冠元顆粒が、老化に伴って引き起こされる正常細胞の機能低下を抑える作用を有している。即ち、この老化抑制剤は、細胞周期の停止を抑える作用を有しているため、細胞レベルでの老化を効果的に抑制することから、個体レベルでの老化の抑制に優れた効果を発揮することができる。
【０００６】
請求項２に記載の老化抑制剤は、冠元顆粒を有効成分として含有する老化抑制剤であって、老化に伴う正常細胞の分裂寿命の短縮を抑える作用を有していることを要旨とする。
この構成によれば、老化抑制剤は、有効成分としての冠元顆粒が、老化に伴って引き起こされる正常細胞の機能低下を抑える作用を有している。即ち、この老化抑制剤は、正常細胞の分裂寿命の短縮を抑える作用を有しているため、細胞レベルでの老化を効果的に抑制することから、個体レベルでの老化の抑制に優れた効果を発揮することができる。
【０００７】
請求項３に記載の老化抑制剤は、冠元顆粒を有効成分として含有する老化抑制剤であって、老化に伴う正常細胞の生存率低下を抑える作用を有していることを要旨とする。
この構成によれば、老化抑制剤は、有効成分としての冠元顆粒が、老化に伴って引き起こされる正常細胞の機能低下を抑える作用を有している。即ち、この老化抑制剤は、正常細胞の生存率の低下を抑える作用を有しているため、細胞レベルでの老化を効果的に抑制することから、個体レベルでの老化の抑制に優れた効果を発揮することができる。
【０００８】
請求項４に記載の老化抑制剤は、冠元顆粒を有効成分として含有する老化抑制剤であって、老化に伴う正常細胞の形態学的変化、又は正常細胞内のミトコンドリア機能異常を抑える作用を有していることを要旨とする。
【０００９】
この構成によれば、老化抑制剤は、有効成分としての冠元顆粒が、老化に伴って引き起こされる正常細胞の形態学的変化、又は正常細胞内のミトコンドリア機能異常を抑える作用を有している。即ち、この老化抑制剤は、細胞レベルやオルガネラレベルでの老化を効果的に抑制することから、個体レベルでの老化の抑制に優れた効果を発揮する。
【００１０】
請求項５に記載の老化抑制剤は、冠元顆粒を有効成分として含有する老化抑制剤であって、老化に伴う正常細胞の老化細胞特異的β−ガラクトシダーゼ活性の上昇、細胞内活性酸素量の増大、細胞内過酸化脂質量の増大、細胞内グルタチオン量の増大、核内転写因子ＮＦ−κＢの核移行、ヘムオキシゲナーゼ−１蛋白質の過剰発現、又はＢａｘ蛋白質の過剰発現を抑える作用を有していることを要旨とする。
【００１１】
請求項６に記載の老化抑制剤は、丹参の水抽出物又は冠元顆粒を有効成分として含有する老化抑制剤であって、老化に伴う血清中の最終糖化産物濃度の上昇、血清中過酸化脂質濃度の上昇、肝臓中過酸化脂質濃度の上昇、肝臓中還元型グルタチオン／酸化型グルタチオン比率の低下、肝臓中グルタチオンペルオキシダーゼ活性の上昇、肝機能パラメーターの上昇、又は腎機能パラメーターの上昇を抑える作用を有していることを要旨とする。
【００１２】
請求項５の構成によれば、老化抑制剤は、有効成分としての冠元顆粒が、老化に伴って引き起こされる様々な分子マーカーの挙動変化を抑える作用を有している。請求項６に記載の構成によれば、老化抑制剤は、有効成分としての丹参の水抽出物又は冠元顆粒が、老化に伴って引き起こされる様々な分子マーカーの機能変化を抑える作用を有している。即ち、これらの老化抑制剤は、分子レベルでの老化を効果的に抑制することから、細胞レベルの老化を抑制し、結果的に個体レベルでの老化の抑制に優れた効果を発揮する。
【００１３】
請求項７に記載の酸化ストレス抑制剤は、冠元顆粒を有効成分として含有し、酸化ストレスによる正常細胞の機能低下を抑える作用を有する酸化ストレス抑制剤であって、前記正常細胞の機能低下は、細胞周期の停止、分裂寿命の短縮、生存率の低下、又は細胞の形態学的変化であることを要旨とする。
【００１４】
この構成によれば、酸化ストレス抑制剤は、有効成分としての冠元顆粒が、酸化ストレスによって引き起こされる正常細胞の機能低下を効果的に抑制する作用を有している。即ち、この酸化ストレス抑制剤は、細胞周期の停止を抑える作用、正常細胞の分裂寿命の短縮を抑える作用、正常細胞の生存率の低下を抑える作用、又は酸化ストレスに伴う細胞の形態学的変化を抑える作用を有している。このため、この酸化ストレス抑制剤は、酸化ストレスによる機能低下を細胞レベルで抑える作用を発揮することから、個体レベルでの酸化ストレスの抑制に優れている。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、老化に伴う正常細胞の機能低下を抑える効果に優れた老化抑制剤を提供することができる。また、酸化ストレスによる正常細胞の機能低下を抑える効果に優れた酸化ストレス抑制剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を具体化した実施形態を詳細に説明する。
実施形態の老化抑制剤は、有効成分として冠元顆粒を含有している。この老化抑制剤は、有効成分としての冠元顆粒が、ヒトに対し細胞レベルでの老化（細胞老化）を抑制する作用を有しているため、個体レベルでの老化（個体老化）を抑える効果に優れている。前記細胞レベルでの老化を抑制する作用としては、老化に伴って引き起こされる正常細胞の機能低下を抑える作用であり、例えば、細胞周期の停止を抑える作用、正常細胞の分裂寿命の短縮を抑える作用、正常細胞の生存率の低下を抑える作用、老化に伴う正常細胞の形態学的変化を抑える作用等が挙げられる。
【００１７】
さらに、この老化抑制剤は、有効成分としての冠元顆粒が、ヒトの正常細胞に対しオルガネラレベルでの老化を抑制する作用を有しているため、細胞レベルでの老化を抑え、結果的に個体老化を抑える効果を発揮する。老化に伴って引き起こされるオルガネラレベルでの機能低下としては、例えばミトコンドリア膜電位異常に起因するミトコンドリアの機能低下が挙げられる。
【００１８】
さらに、この老化抑制剤は、有効成分としての冠元顆粒が、ヒトの正常細胞に対し分子レベルでの機能変化を抑える作用を有しているため、オルガネラレベル及び細胞レベルでの老化を抑え、結果的に個体老化を抑える効果を発揮する。老化に伴って引き起こされる分子レベルでの機能変化としては、例えば、老化に伴う細胞内老化細胞特異的β−ガラクトシダーゼ活性の上昇、細胞内活性酸素量の増大、細胞内過酸化脂質量の増大、細胞内グルタチオン（ＧＳＨ）量の増大、核内転写因子ＮＦ−κＢ（Nuclear factor-kappa B）の核移行、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）蛋白質の過剰発現、Ｂａｘ蛋白質の過剰発現等が挙げられる。また、血清中最終糖化産物（ＡＧＥｓ；advanced glycation endproducts）濃度の上昇、血清中過酸化脂質濃度の上昇、肝臓中過酸化脂質濃度の上昇、肝臓中還元型グルタチオン／酸化型グルタチオン比率（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）の低下、肝臓中グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）活性の上昇、肝機能パラメーターの上昇、腎機能パラメーターの上昇等も挙げられる。なお、前記ＡＧＥｓ濃度の上昇以降に列記した分子レベルでの機能変化を抑える作用は、冠元顆粒の構成生薬の１つである丹参が主に担っている。
【００１９】
実施形態の酸化ストレス抑制剤は、冠元顆粒を有効成分として含有している。この酸化ストレス抑制剤は、有効成分としての冠元顆粒が、酸化ストレスによって引き起こされる正常細胞の機能低下を抑える作用を有している。酸化ストレスによって引き起こされる正常細胞の機能低下としては、細胞周期の停止、分裂寿命の短縮、生存率の低下、酸化ストレスに伴う細胞の形態学的変化を抑える作用等が挙げられる。さらに、この酸化ストレス抑制剤は、有効成分としての冠元顆粒が、ヒトの正常細胞内においてオルガネラレベル及び分子レベルでの正常機能の低下を抑える作用を有している。従って、この酸化ストレス抑制剤は、酸化ストレスによる機能低下を細胞レベル、オルガネラレベル及び分子レベルで抑える作用を発揮することから、個体レベルでの酸化ストレスの抑制に優れている。また、この酸化ストレス抑制剤は、前記酸化ストレスが細胞レベルでの老化と密接な関連性（フリーラジカル説）を有しているため、上述したような理由で個体レベルでの老化を抑える効果も有している。
【００２０】
個体の老化（個体老化）とは、成熟期以後、加齢とともに各臓器の機能或いはそれらを統合する機能が低下し、個体の恒常性を維持することが不可能となり、ついには死に至る過程である。個体老化の特徴としては、成熟期以後加齢とともに死亡確率が指数関数的に増加すること、加齢とともに組織の生化学的機能が変化すること、身体的適応性の減衰、環境への即応能力の低下及び各種疾病への感受性の増加が挙げられる。この個体老化の原因については、現在、プログラム説、エラー説、クロスリンキング説、フリーラジカル説、免疫異常説、代謝調節説等の様々な老化学説が存在する。
【００２１】
前記個体老化において加齢とともに進行する臓器の機能低下や統合機能の低下は、個体が細胞の集合体から構成されているという事実より、細胞レベルでの老化によって引き起こされる。即ち、個体を構成する多種類の細胞のうち、個体の恒常性維持に重要な役割を果たしている細胞の機能が低下すると個体老化が引き起こされ、やがては死に至る。前記細胞レベルでの老化現象としては、細胞周期が停止する現象、正常細胞の分裂寿命が短縮される現象、正常細胞の生存率が低下する現象、老化に伴う正常細胞の形態学的変化が引き起こされる現象等が挙げられる。
【００２２】
前記細胞周期が停止する現象は、細胞老化や酸化ストレスによって細胞周期がＧ０／Ｇ１期で停止し易くなる現象により容易に把握される。そして、この細胞周期の停止を抑える作用は、細胞周期がＧ０／Ｇ１期で停止する（Ｇ０／Ｇ１ arrest）のを抑えて細胞周期の進行を促進させる作用であり、個体を構成する細胞の増殖（新生、入れ替わり又は新陳代謝）を活発化させて個体老化を抑制する効果を奏する。
【００２３】
前記正常細胞の分裂寿命が短縮される現象は、有限の分裂寿命（ヘイフリック限界）を持つ正常二倍体細胞が、細胞老化や酸化ストレスによって分裂寿命の短縮を引き起こす現象である。そして、この分裂寿命の短縮を抑える作用は、細胞の分裂寿命を前記ヘイフリック限界に近づける作用であり、細胞の増殖可能な期間を延長して個体老化を抑制する効果を奏する。
【００２４】
前記正常細胞の生存率が低下する現象は、細胞老化や酸化ストレスによって細胞の致死率が高められる現象である。そして、この生存率の低下を抑える作用は、組織や器官を構成する細胞数を高いレベルに保持し、当該組織や器官の機能低下を抑えることにより、個体老化を抑制する効果を奏する。老化に伴う正常細胞の形態学的変化が引き起こされる現象は、細胞老化や酸化ストレスによって細胞が肥大化及び扁平化する現象である。
【００２５】
これら細胞レベルでの老化現象には、細胞内で活性酸素が生成されて細胞を構成する成分に不可逆的な化学変化を引き起こすことにより細胞にダメージを与え、そのダメージが加齢とともに蓄積して細胞機能の低下を引き起こし、上述のような諸現象が引き起こされている場合が極めて多い。前記活性酸素としては、スーパーオキシド（Ｏ２−）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素（１Ｏ２）等が挙げられ、不対電子を持つスーパーオキシド及びヒドロキシルラジカルが特に細胞に対するダメージが大きな活性酸素として挙げられる。これら活性酸素は、細胞を構成する成分（脂質、蛋白質、核酸等）の酸化劣化を引き起こしたり、細胞内の抗酸化システムを破壊（グルタチオン（ＧＳＨ）、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）等を低減）する等の好ましくない状態を引き起こす。なお、細胞を活性酸素に曝すことにより、酸化ストレスによる細胞老化モデルを構築して細胞老化と同様な状態を人為的に引き起こすことが可能であり、老化研究のための一手法として利用されている。
【００２６】
冠元顆粒は、丹参（タンジン）、香附子（コウブシ）、木香（モッコウ）、紅花（コウカ）、芍薬（シャクヤク）及びセンキュウの各構成生薬を所定の配合割合で調合した漢方薬である。冠元顆粒に含まれる各構成生薬の配合割合は、丹参２．６〜６．８重量部、香附子０．６〜１．７重量部、木香０．６〜１．７重量部、紅花１．１〜３．４重量部、芍薬１．１〜３．４重量部、センキュウ１．１〜３．４重量部が好ましく、丹参、香附子、木香、紅花、芍薬及びセンキュウが重量比で４：１：１：２：２：２であるのが最も好ましい。この冠元顆粒は、中年以降又は高血圧傾向のあるものの頭痛、頭重、肩こり、めまい、動悸等の諸症状を改善する効能・効果を有している。
【００２７】
丹参はシソ科（Labiatae）の多年草タンジン（Salvia miltiorrhiza Bunge）の根からなる。香附子はカヤツリグサ科（Cyperaceae）の多年草ハマスゲ（Cyperus rotundus Linne）の根茎からなる。木香はキク科（Compositae）の多年草サウスレアラパア（Aucklandia lappa Decne (Saussurea lappa Clarke)）の根からなる。紅花はキク科（Compositae）の１〜２年草木ベニバナ（Carthamus tinctorius Linne）の管状花からなる。芍薬はボタン科（Paeoniaceae）の多年草シャクヤク（Paeonia lactiflora Pallas）の根からなる。センキュウはセリ科（Umbelliferae）の多年草センキュウ（Cnidium officinale Makino）の根茎からなる。
【００２８】
この冠元顆粒は、前記構成生薬を所定の配合割合で混合し、この混合物全重量の５〜３０倍量、好ましくは１０〜２０倍量の水にて熱水抽出した後、抽出された熱水抽出液（冠元顆粒エキス）を濃縮及び乾燥することにより製造される顆粒状品である。前記濃縮及び乾燥は常用手段、例えば減圧蒸発濃縮法、スプレードライ法、凍結乾燥法等により行われる。この冠元顆粒の製造方法によれば、例えば、丹参４．５ｇ、香附子１．１２５ｇ、木香１．１２５ｇ、紅花２．２５ｇ、芍薬２．２５ｇ及びセンキュウ２．２５ｇ（合計１３．５ｇ）から、固形分４．５ｇの冠元顆粒が得られる。
【００２９】
こうして得られた冠元顆粒（固形物）は、そのまま散剤、粉剤等の形態で老化抑制剤又は酸化ストレス抑制剤として使用してもよく、或いは適当な賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等の添加剤とともに顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤等の形態で老化抑制剤又は酸化ストレス抑制剤として使用してもよい。また、前記乾燥前の熱水抽出液又はその濃縮液を基にドリンク剤等の形態で老化抑制剤又は酸化ストレス抑制剤として使用することもできる。この老化抑制剤又は酸化ストレス抑制剤は、有効成分としての冠元顆粒を成人１日当たり好ましくは１〜２０ｇ、特に好ましくは４．５ｇ程度の摂取量を服用するとよく、好ましくは前記摂取量を１日複数回（３回程度）に分けて食間又は空腹時に服用するとよい。
【００３０】
冠元顆粒を有効成分として含有する老化抑制剤及び酸化ストレス抑制剤の用途としては、漢方薬等の医薬品、又は健康食品や一般食品等の食品が挙げられる。この老化抑制剤又は酸化ストレス抑制剤は、健康な人に服用させることにより、更年期障害等の老年疾患の予防や治療に用いることができる。前記健康な人としては、あらゆる年齢の人が含まれるが、特に成熟期以降の生理的な老化状態にある成人であるのが好ましい。また、この老化抑制剤又は酸化ストレス抑制剤は、ハッチンソン・ギルフォード症候群、ダウン症候群、ウェルナー症候群等の病的老化（老年病）の予防や治療に用いることもできる。
【００３１】
次に、冠元顆粒による老化抑制作用及び酸化ストレス抑制作用について説明する。なお、図３の白抜き太矢印は、いずれも冠元顆粒によって引き起こされる作用を示す。
図３に模式的に示すように、個体の細胞内では、ミトコンドリアによるエネルギー産生に伴って過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）や活性酸素が発生する。過酸化水素は、細胞質内に移行し、ＧＰｘやカタラーゼ（ＣＡＴ）により水（Ｈ２Ｏ）に分解される。このとき同時に、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）が酸化されて酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）になる。さらに、一部の過酸化水素は、より反応性の高い活性酸素へと変換される場合もある。また、ミトコンドリアで発生した活性酸素は、細胞質内に移行し、核内転写因子ＮＦ−κＢの核内への移行を促進させる。ＮＦ−κＢは、２つの蛋白質（ｐ５０及びｐ６５）からなり、核内でκＢサイトに結合し、ＨＯ−１遺伝子、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）遺伝子、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）遺伝子等の転写を活性化させてそれらの蛋白質の発現を誘導する。
【００３２】
ＨＯ−１は、ヘムの酸化的分解を担う酵素であり、ＣＡＴ等のヘム蛋白質を分解して細胞内を酸化状態にシフトさせると考えられる。ｉＮＯＳは、一酸化窒素（ＮＯ）を生成する反応を触媒し、その反応によって生成されたＮＯに前記活性酸素が反応してパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−）を生成させる。このパーオキシナイトライトは、ＮＯよりも強力な活性酸素であり、脂質や蛋白質の過酸化を引き起こす。ＣＯＸ−２は、炎症に関わるプロスタグランジンの生成に関与しており、多くの慢性疾患の病因ともなり得る。
【００３３】
ＮＦ−κＢは、細胞質内でＩ−κＢ（Inhibitor-kappa B）と結合することにより、核内への移行を阻害されている。そして、前記活性酸素は、ＮＦ−κＢとＩ−κＢとの結合を解離させ、ＮＦ−κＢによるＨＯ−１遺伝子、ＣＯＸ−２遺伝子及びｉＮＯＳ遺伝子の発現を促進させる。一方、正常な細胞内では、Ｂｃｌ−２蛋白質が活性酸素等に起因して引き起こされる細胞死（アポトーシス）を抑えている。Ｂｃｌ−２蛋白質は、アポトーシスを促進・誘導するＢａｘ蛋白質の働きを抑えることにより、細胞死を抑えている。
【００３４】
さて、老化した細胞内では、加齢に伴って過酸化水素及び活性酸素を消去する機構が弱体化するため、若い細胞と比べて活性酸素がリッチな状態にある。これに対し、冠元顆粒は、細胞に対して高い抗酸化作用を及ぼすため、活性酸素の発生を直接的に抑えることができる。また、冠元顆粒は、前記活性酸素の発生を抑える作用を介してＮＦ−κＢとＩ−κＢとの結合状態を維持することにより、ＮＦ−κＢの核移行を阻害する。或いは、冠元顆粒は、ＮＦ−κＢ（Ｉ−κＢが解離した状態）の核移行そのものを阻害している可能性もある。
【００３５】
また、老化した個体では、加齢に伴って代謝を始めとして様々な生理機能の低下により、血中や細胞内にＡＧＥｓや過酸化脂質が蓄積するとともに、肝機能及び腎機能が低下する傾向にある。ＡＧＥｓは、蛋白質のアミノ基と還元糖のアルデヒド基との間で起こる非酵素的な蛋白糖化反応（メイラード反応、グリケーション）に起因して生成される。蛋白糖化反応が、ＳＯＤやＣＡＴのような活性酸素の消去を行う酵素（蛋白質）をターゲットに進行すると、それらの酵素を変性させて酵素活性を低下させ、血中及び細胞内の活性酸素量を増大させる。過酸化脂質の蓄積は、例えばチオバルビツール酸反応物（ＴＢＡ−ＲＳ）濃度を測定することにより定量可能である。肝機能の低下については、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）活性やアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）活性等の肝機能パラメーターを測定することにより定量可能であり、腎機能の低下については、血中尿素窒素や血中クレアチニン濃度を測定することにより定量可能である。
【００３６】
冠元顆粒は、上述したＡＧＥｓ及び過酸化脂質の蓄積、肝臓中ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比率の低下、並びに肝臓中ＧＰｘ活性の上昇を抑えるとともに、肝機能及び腎機能の低下を抑える作用を有している。これらの作用はいずれも、加齢に伴って引き起こされる分子レベルでの正常細胞の機能変化を若齢の正常細胞に近づける。
【００３７】
前記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・  実施形態の老化抑制剤は、冠元顆粒を有効成分として含有している。この老化抑制剤は、有効成分としての冠元顆粒が、老化に伴って引き起こされる正常細胞の機能低下を抑える作用を有している。即ち、この老化抑制剤は、細胞周期の停止を抑える作用、正常細胞の分裂寿命の短縮を抑える作用、正常細胞の生存率の低下を抑える作用及び老化に伴う正常細胞の形態学的変化を抑える作用を有しているため、細胞レベルでの老化を効果的に抑制する。従って、この老化抑制剤は、個体レベルでの老化の抑制に優れた効果を発揮することができる。
【００３８】
・  実施形態の酸化ストレス抑制剤は、冠元顆粒を有効成分として含有している。この酸化ストレス抑制剤は、有効成分としての冠元顆粒が、酸化ストレスによる正常細胞の機能低下を抑える作用を有している。即ち、この酸化ストレス抑制剤は、細胞周期の停止を抑える作用、正常細胞の分裂寿命の短縮を抑える作用、正常細胞の生存率の低下を抑える作用及び老化に伴う正常細胞の形態学的変化を抑える作用を有している。従って、酸化ストレス抑制剤は、酸化ストレスによる機能低下を細胞レベルで効果的に抑制することができるため、個体レベルでの酸化ストレスの抑制にも優れた効果を発揮することができる。
【００３９】
さらに、冠元顆粒は、それ自体に抗酸化作用を有していることが知られているため、前記酸化ストレスによって引き起こされる正常細胞の機能低下を抑える作用とも協動して、細胞レベル及び個体レベルでの酸化ストレスの抑制に極めて高い効果を発揮することができる。加えて、この酸化ストレス抑制剤は、酸化ストレスと深い関連性のある細胞老化を抑制することができることから、個体老化にも優れた効果を発揮し得る。
【００４０】
・  老化抑制剤及び酸化ストレス抑制剤はいずれも、天然の植物を原料とするとともに既に広く使用されている漢方薬を基礎としていることから、副作用の心配がないうえ、その他の薬効（頭痛、頭重、肩こり、めまい、動悸等の諸症状を改善する効能・効果）を有している点にも優れている。また、これら老化抑制剤及び酸化ストレス抑制剤はいずれも、老化や酸化ストレスが引き起こされるどのタイミングで服用しても十分な効果が発揮されることから極めて有用である（下記実施例参照）。
【実施例１】
【００４１】
＜冠元顆粒の抗酸化活性及び老化抑制＞
（試薬と方法）
試薬：ＢＭＥ培地（Basal Medium of Eagle）はSigmaから購入。ＤＣＦＨ−ＤＡ（2’,7’-Dichlorofluorescin diacetate）、ｍＢＣｌ（monochlorobimane）及びＰＩ（propidium iodide）はMolecular Probesから購入。リン酸緩衝液（Ca,Mg-free PBS）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、チオバルビツール酸（thiobarbituric acid；ＴＢＡ）及びＭＴＴ（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide）は和光純薬から購入。ウシ胎児血清（Fetal bovine serum；ＦＢＳ）、トリプシン及びリボヌクレアーゼＡ（RNase A）はそれぞれ、Life Technology、Nakarai及びFunakoshiから購入。正常二倍体ヒト肺組織由来線維芽細胞ＷＩ-３８はHealth Science Research Resources Bankから購入。
【００４２】
冠元顆粒エキスの調製：本実験に用いた冠元顆粒の構成生薬及びその含有量は、２．２５ｇの芍薬（Paeoniae Radix）、２．２５ｇのセンキュウ（Cnidii Rhizoma）、２．２５ｇの紅花（Carthami Flos）、１．１２５ｇの香附子（Cyperi Rhizoma）、１．１２５ｇの木香（Aucklandiae Radix）及び４．５ｇの丹参（Salviae Miltiorrhizae Radix）からなる。これらの構成生薬を調合したものに２５倍量の水を加えて１００℃、１時間熱水抽出した。次いで、ろ過後に減圧濃縮して溶媒を留去したところ、収率４４％の冠元顆粒エキスが得られた。
【００４３】
細胞培養：ＷＩ-３８細胞は、１０ｍｍディッシュで１０％ＦＢＳ含有ＢＭＥ培地を用い、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。継代には０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いた。
【００４４】
酸化ストレス誘導による細胞老化モデルの構築：ＷＩ-３８細胞は、６穴又は９６穴プレートに１０５cells／ｍＬの濃度で播き、２時間インキュベートした。次に、試験群としてプレート内に前記冠元顆粒を５〜１００μg／ｍＬ添加し、対照群１，２としてプレート内にＢＭＥ培地のみを添加し、それぞれ３７℃で２４時間培養した。続いて、試験群及び対照群２のプレート内に終濃度３００μＭとなるように過酸化水素を添加して３７℃で６０分間インキュベートすることにより細胞を過酸化水素処理した。この過酸化水素処理は細胞集団倍加数（population doubling level；ＰＤＬ）が３７．２の細胞集団について行い、各群の比較は細胞生存率にて補正した。
【００４５】
（試験例１）形態学的変化の観察
過酸化水素処理後の各群の細胞を位相差顕微鏡下でそれぞれ観察した。その結果、対照群２の細胞は、対照群１と比べて肥大化及び扁平化されており、老化した細胞と同様の形態学的変化を引き起こしていた。これに対し、試験群の細胞では、冠元顆粒の濃度依存的に肥大化及び扁平化の程度が低下しており、対照群１に類似した形態となっていた。
【００４６】
（試験例２）老化細胞特異的β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）活性の調査
過酸化水素処理後の各細胞の培地を抜き取り、１０％ＦＢＳ含有ＢＭＥ培地に交換して培養した。２４時間、４８時間及び７２時間培養後の細胞のそれぞれについて、ＳＡ−β−Ｇａｌ（senescence associated-β-galactosidase）活性を顕微鏡下で調べた。その結果、対照群２の細胞では、培養時間に関わらず、対照群１よりもＳＡ−β−Ｇａｌ活性陽性細胞が増加していた。これに対し、冠元顆粒を１００μｇ／ｍＬ添加した試験群のＳＡ−β−Ｇａｌ活性陽性細胞は、対照群１とほぼ同様であった。
【００４７】
（試験例３）活性酸素産生量の測定
WangとJosephの方法（Wang,H. and Joseph,J.A.: Quantifying cellular oxidative stress by dichlorofluorescein assay using microplate reader. Free Radic. Biol. Med. 27,612-616,1999.）に従って、前記細胞老化モデルにおけるＷＩ-３８細胞の活性酸素量を測定した。この測定は、安定な酸化変化を測定する方法であり、非蛍光物質であるＤＣＦＨ−ＤＡが活性酸素存在下で強い蛍光を示す蛍光物質ＤＣＦ（2’,7’-Dichlorofluorescein）に変換されるという原理に基づく。本試験例３は、前記細胞老化モデルの構築において、ＷＩ-３８細胞に冠元顆粒又はＢＭＥ培地を添加して２４時間培養した後、１００μＭのＤＣＦＨ−ＤＡを加えて３７℃で１５分間インキュベートし、続いて各試験群及び対照群２の細胞に過酸化水素処理を６０分間行って酸化ストレスを与えた。各試験群及び対照群１，２のプレートについて、マイクロプレートリーダー（Tecan；励起波長:485nm、発光波長:535nm）にて蛍光物質ＤＣＦの蛍光強度を測定した。結果を図１（ａ）に示す。
【００４８】
図１（ａ）は、ＷＩ-３８細胞を冠元顆粒と過酸化水素で処理した時の活性酸素産生における冠元顆粒の効果を示す。ＷＩ-３８細胞を過酸化水素処理すると、活性酸素の産生が誘導される。しかしながら、過酸化水素処理する前にＷＩ-３８細胞を冠元顆粒で処理すると、濃度依存的に活性酸素の産生量が減少した。
【００４９】
（試験例４）過酸化脂質量の測定
培地中の過酸化脂質量は、MiharaとUchiyamaの方法（Mihara,M. and Uchiyama,M.: Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Anal. Biochem. 86,271-278,1978）に従って、チオバルビツール酸反応物（ＴＢＡ−ＲＳ）レベルを測定することにより求められる。本試験例４は、前記細胞老化モデルの構築において、ＷＩ-３８細胞に冠元顆粒又はＢＭＥ培地を添加して２４時間培養した後、各試験群及び対照群２の細胞に過酸化水素処理を６０分間行い、続いて各試験群及び対照群１，２の培地を集めて０．６７％ＴＢＡ及び２０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加え、１００℃で４５分間反応させた。次に、前記反応後の培地を氷上にて冷却して反応を停止させた後、ｎ−ブタノールを加えてＴＢＡ−ＲＳを抽出した。4,000×gで１０分間遠心した後、ｎ−ブタノール層の蛍光強度を蛍光スペクトロフォトメーター（Shimadzu, model RF-5300PC;励起波長:515nm、発光波長:553nm）にて測定した。結果を図１（ｂ）に示す。
【００５０】
図１（ｂ）に示すように、脂質過酸化のパラメーターであるＴＢＡ−ＲＳレベルは、対照群１に比べて対照群２で有意に増加した。また、５μｇ／ｍＬの冠元顆粒で処理した細胞では、ＴＢＡ−ＲＳレベルは劇的に減少したが、冠元顆粒の添加量に依存してＴＢＡ−ＲＳレベルが減少する傾向は見られなかった。
【００５１】
（試験例５）細胞内グルタチオン（ＧＳＨ）量の測定
細胞内ＧＳＨ量の測定は、Osseniらの方法（Osseni,R.A., Rat,P., Bogdan,A., Warnet,J.M. and Touitou,Y.: Evidence of prooxidant and antioxidant action of melatonin on human liver cell line HepG2. Life Sci. 68,387-399,2000.）に従って行った。この方法は、グルタチオントランスフェラーゼによりｍＢＣｌが還元型ＧＳＨと特異的に反応することを利用した方法であり、前記反応により蛍光物質が生成されるようになっている。本試験例５は、前記細胞老化モデルの構築において、ＷＩ-３８細胞に冠元顆粒又はＢＭＥ培地を添加して２４時間培養した後、各試験群及び対照群２の細胞に過酸化水素処理を６０分間行って酸化ストレスを与えた。次いで、各プレート内に１００μＭのｍＢＣｌを加え、６０分間インキュベートした後に、マイクロプレートリーダー（Tecan；励起波長:360nm、発光波長:480nm）にて蛍光強度を測定した。結果を図１（ｃ）に示す。
【００５２】
図１（ｃ）は、ＷＩ-３８細胞を冠元顆粒と過酸化水素で処理した時の細胞内ＧＳＨ量に対する冠元顆粒の効果を示す。過酸化水素処理することにより、対照群１と比較して細胞内ＧＳＨ量は有意に増加した（約１．５倍増加）。それに対し、冠元顆粒で前処理すると、濃度依存的に細胞内ＧＳＨ量が減少する傾向が見られた。
【００５３】
（試験例６）フローサイトメーターによる細胞周期の分析
前記細胞老化モデルの構築において、ＷＩ-３８細胞に冠元顆粒又はＢＭＥ培地を添加して２４時間培養した後、各試験群及び対照群２の細胞に過酸化水素処理を６０分間行って酸化ストレスを与えた。次いで、各試験群及び対照群１，２のプレート内から細胞を集めた後、７０％エタノールを加えて４℃で３０分間固定した。リン酸緩衝液で二回洗浄後、リボヌクレアーゼＡ溶液で３７℃、３０分間酵素反応を行った後、ＰＩ溶液を添加して４℃で３０分間インキュベートした。各群の細胞はFACSCaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson）で分析した。このとき、励起波長４８８ｎｍのレーザー光を用い、赤色のＰＩ蛍光（639nm）の蛍光強度を測定しながら細胞を分画した。種々の相に分画された細胞ついて、細胞周期（Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期又はＧ２／Ｍ期）をModFit LT ソフトウェア（Topsham, Verity Software House）で判別しその割合を求めた。結果を表１に示す。
【００５４】
【表１】
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表１は、ＷＩ-３８細胞を冠元顆粒と過酸化水素で処理した時の細胞周期に対する冠元顆粒の効果を示す。過酸化水素処理によって、Ｇ０／Ｇ１期の細胞が４６．１％（対照群１）から５４．３％（対照群２）へと有意に増加し、Ｇ０／Ｇ１期での細胞周期の停止（Ｇ０／Ｇ１arrest）が引き起こされた。しかしながら、１００μｇ／ｍＬの冠元顆粒で前処理した試験群では、Ｇ０／Ｇ１期の細胞が５４．３％から４９．５％へと有意に減少した。さらに、Ｓ期の割合は、過酸化水素処理により減少したが、１００μｇ／ｍＬの冠元顆粒で前処理した試験群では、対照群２よりも有意に高かった。また、過酸化水素処理によりＧ２／Ｍ期の割合はほとんど変化しなかったが、１００μｇ／ｍＬの冠元顆粒で前処理した対照群２では低下した。従って、冠元顆粒で前処理することによって、酸化ストレスによる細胞周期の停止が抑えられた。
【００５５】
（試験例７）細胞生存率の測定
細胞生存率の測定は、ＭＴＴ colorimetric assay（Mosmann,T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival :application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 65,55-63,1983.）にて行った。前記細胞老化モデルの構築において、ＷＩ-３８細胞に冠元顆粒又はＢＭＥ培地を添加して２４時間培養した後、各試験群及び対照群２の細胞に過酸化水素処理を６０分間行って酸化ストレスを与えた。次いで、各試験群及び対照群１，２のプレート内にＭＴＴ溶液を加えて３７℃で４時間インキュベートした後、ＭＴＴ溶液を取り除いた。各プレート内の生細胞中に取り込まれたホルマザンクリスタルをジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）で溶解し、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad, model 3550-UV）にて波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図２（ａ）に示す。
【００５６】
図２（ａ）のグラフは、対照群１の細胞生存率を１００％としたときの対照群２（０μｇ／ｍＬ 冠元顆粒）及び各試験群の細胞生存率を示す。図２（ａ）より、対照群２は対照群１と比較して、細胞生存率が有意に低下した（p<0.001）。一方、過酸化水素処理の前に冠元顆粒処理を行うと、細胞生存率が濃度依存的に増加した（61.9%から65.4, 67.0, 74.6%）。また、２５μｇ／ｍＬ以上の濃度で冠元顆粒を添加した試験群では、冠元顆粒の添加量に依存した細胞生存率の回復傾向は認められなかった。
【００５７】
（試験例８）細胞寿命の評価
CristofaloとCharpentierの方法（Cristofalo, V.J. and Charpentier, R. :A standard procedure for cultivating human diploid fibroblastlike cells to study cellular aging. J. Tissue Culture Methods 6,117-121,1980.）を用いて細胞寿命を評価した。本試験例８は、前記細胞老化モデルの構築を行った後、各試験群と対照群２のプレートについては、過酸化水素処理後に新鮮な培地と交換し、細胞集団倍加数をモニターしながらクライシスに達するまで培養を継続した。そして、各試験群及び対照群１，２における評価は、細胞を３週間連続して新鮮な１０％ＦＢＳ含有ＢＭＥ培地で培養し、４週間経過した時点でコンフルエントに達しない場合を以て細胞寿命であると定義した。ちなみに、ある時点での細胞集団倍加数（currentＰＤＬ）は、その時点での生存細胞数（collected cell number）、１回前の継代時の細胞集団倍加数（lastＰＤＬ）及びその継代時に播種した細胞数（seeded cell number）を用いて下記数１にて算出した。結果を図２（ｂ）に示す。
【００５８】
【数１】
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図２（ｂ）より、過酸化水素処理で誘導される細胞老化において、冠元顆粒が細胞寿命に及ぼす効果を検討するため、各試験群及び対照群１，２のＰＤＬを比較した。図２（ｂ）に示すように、過酸化水素処理した細胞では、対照群１と比較して細胞寿命が有意に短縮した（PDL 44.2からPDL 38.2）。それに対して、１００μｇ／ｍＬの冠元顆粒で処理した試験群では、ＷＩ-３８細胞の細胞寿命がＰＤＬ＝４０．２と劇的に延長した。
【００５９】
（試験例９）ミトコンドリア膜電位の測定
過酸化水素処理後の各細胞の培地を抜き取り、１０％ＦＢＳ含有ＢＭＥ培地に交換して培養した。０時間、２４時間及び４８時間培養後の各群の細胞のミトコンドリア膜電位を、蛍光法（ローダミン１２３を用いた）にて測定した。結果の一部を図４（ａ）に示す。その結果、対照群２の細胞では、培養時間に比例するようにローダミン蛍光強度（ミトコンドリア膜電位）が顕著に上昇（低下）していたが、対照群１ではローダミン蛍光強度（ミトコンドリア膜電位）の上昇（低下）はほとんど見られなかった。一方、冠元顆粒を１００μｇ／ｍＬ添加した試験群は、対照群１とほぼ同様であった。また、図４（ａ）は、過酸化水素処理後に２４時間培養したときのローダミン１２３の蛍光強度を示すグラフであり、前記結果を明確に支持している。さらに、図示するように、冠元顆粒は、濃度依存的にミトコンドリア膜電位の低下を抑え、対照群１に近い状態に保持していることも確認された。
【００６０】
（試練例１０）ＮＦ−κＢの核移行に関する調査
過酸化水素処理後の各群の細胞を固定した後、それぞれ抗ＮＦ−κＢ抗体及びＤＡＰＩ染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。その結果、対照群１の細胞では、ＮＦ−κＢの核移行がほとんど見られなかったのに対し、対照群２の細胞では、ＮＦ−κＢの顕著な核移行が観察された。これに対し、試験群の細胞では、冠元顆粒の濃度依存的にＮＦ−κＢの核移行が抑えられていた。
【００６１】
（試験例１１）細胞老化に関連する蛋白質発現の調査
過酸化水素処理後の対照群１，２の細胞の培地を抜き取り、１０％ＦＢＳ含有ＢＭＥ培地に交換して培養した。２４時間、４８時間及び７２時間培養後の細胞をそれぞれ集めて電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した後にウエスタンブロッティングを行った。ウエスタンブロッティングに用いた抗体は、図４（ｂ）に示した通りである。結果を図４（ｂ）の上段に示す。その結果、過酸化水素処理によって、ＨＯ−１蛋白質及びＢａｘ蛋白質の過剰発現が認められた。これらの蛋白質の過剰発現は、過酸化水素処理後の通常の培養によって元の状態に戻る傾向が認められた。
【００６２】
次に、ＨＯ−１蛋白質及びＢａｘ蛋白質の過剰発現に対する冠元顆粒の影響を調べるため、最も顕著な差が見られた２４時間培養後の細胞のみを調べた。即ち、過酸化水素処理後の対照群１，２及び各試験群の細胞の培地を抜き取り、１０％ＦＢＳ含有ＢＭＥ培地に交換して培養した。２４時間培養後の細胞をそれぞれ集めて同様に電気泳動した後にウエスタンブロッティングを行った。結果を図４（ｂ）の下段に示す。その結果、冠元顆粒には、過酸化水素処理に起因するＨＯ−１蛋白質及びＢａｘ蛋白質の過剰発現を抑える作用があることが示された。
【実施例２】
【００６３】
＜冠元顆粒の老化抑制２＞
上記実施例１のＷＩ-３８細胞に代えて、正常二倍体ヒト肺組織由来線維芽細胞ＴＩＧ-１（Health Science Research Resources Bankから購入）を用いた。その他の試薬と方法については特記しない場合には上記実施例１と同様である。
【００６４】
（試験例１２）細胞生存率の測定２
ＴＩＧ-１細胞に対し、過酸化水素処理を行った後に冠元顆粒を添加して冠元顆粒の効果を調べた。細胞生存率の測定は、ＭＴＴ colorimetric assayにて行った。ＴＩＧ-１細胞は、６穴プレートに２×１０５cells／ｍＬの濃度で播き、２時間インキュベートした。続いて、各プレート内に終濃度２０μＭ又は５０μＭとなるように過酸化水素を添加して３７℃で６０分間インキュベートすることにより細胞を過酸化水素処理した後、プレート内の培地を取り除いてＢＭＥ培地に交換し、３７℃で４８時間培養した。この過酸化水素処理はＰＤＬが３７．２の細胞集団について行い、細胞生存率にて補正した。
【００６５】
次に、試験群としてプレート内に前記冠元顆粒を０〜１００μg／ｍＬ添加し、３７℃で２４時間培養した。次いで、各プレート内にＭＴＴ溶液を加えて３７℃で４時間インキュベートした後、ＭＴＴ溶液を取り除いた。各プレート内の生細胞中に取り込まれたホルマザンクリスタルをＤＭＳＯで溶解し、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad, model 3550-UV）にて波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図２（ｃ）に示す。
【００６６】
図２（ｃ）のグラフは、過酸化水素処理及び冠元顆粒処理の両処理を行っていないＴＩＧ-１細胞（control）の細胞生存率を１００％としたときの各試験群の細胞生存率を示す。図２（ｃ）より、過酸化水素処理の後に冠元顆粒処理を行った場合でも、細胞生存率が有意に上昇したことが確認された（p<0.001）。
【００６７】
（試験例１３）細胞寿命の評価２
ＴＩＧ-１細胞に対し、過酸化水素処理及び冠元顆粒処理を反復して行った場合の冠元顆粒の効果を調べた。CristofaloとCharpentierの方法を用いて細胞寿命を評価した。ＴＩＧ-１細胞は、６穴プレートに２×１０５cells／ｍＬの濃度で播き、２時間インキュベートした。次に、各プレート内に終濃度５μＭとなるように過酸化水素を添加して３７℃で６０分間インキュベートすることにより細胞を過酸化水素処理した後、プレート内の培地を取り除いてＢＭＥ培地に交換し、さらに１０μg／ｍＬ又は１００μg／ｍＬの冠元顆粒を添加して３７℃で２４時間培養した。この過酸化水素処理及び冠元顆粒処理を合計３回反復して行った後、各プレート内を冠元顆粒添加または非添加の新鮮な培地と交換してＰＤＬをモニターしながらクライシスに達するまで培養を継続し、上記試験例８と同様に細胞寿命を求めた。結果を図２（ｄ）に示す。
【００６８】
図２（ｄ）のグラフより、過酸化水素処理で誘導される細胞老化において、冠元顆粒処理を反復して行った場合には、細胞寿命を劇的に延長させる効果を発揮することが確認された。この効果は上記試験例８の場合と比べて非常に高いものとなっており、酸化ストレス抑制及び老化抑制には冠元顆粒を継続して服用することが極めて良好な結果をもたらすことが容易に把握され得る。
【実施例３】
【００６９】
＜冠元顆粒及び丹参の老化抑制（in vivo）＞
８ヶ月齢のウイスター系雄性ラットをコントロール群と試験群とに分けた。さらに、試験群のラットを第一群〜第四群に分けた。コントロール群（図中ではＣ（１２）と略記）には通常の食餌を与え、第一群（図中ではＫＫ０．５（１２）と略記）には０．５％の冠元顆粒を含む食餌を与え、第二群（図中ではＫＫ１．０（１２）と略記）には１．０％の冠元顆粒を含む食餌を与え、第三群（図中ではＴ０．５（１２）と略記）には０．５％の丹参エキスを含む食餌を与え、第四群（図中ではＴ１．０（１２）と略記）には１．０％の丹参エキスを含む食餌を与え、４ヶ月間飼育した。丹参エキスは、４．５ｇの丹参に２５倍量の水を加えて１００℃、１時間熱水抽出した後、ろ過後に減圧濃縮して溶媒を留去することにより調製した。
【００７０】
各群の間には、食餌の摂取量及び体重の増加量ともにほとんど差異が認められなかった。４ヶ月間の飼育終了後、各群のラットから血液及び肝臓を採取した。また、対照群（図中ではＣ（２）と略記）として、２ヶ月齢のウイスター系雄性ラットから血液及び肝臓を採取した。採取した血液から血清を分離した後、該血清中のＡＧＥｓ濃度、ＴＢＡ−ＲＳ濃度、ＡＬＴ活性、ＡＳＴ活性、尿素窒素濃度及びクレアチニン濃度をそれぞれ測定した。また、採取した肝臓をすりつぶした後、該肝臓ホモゲネート中のＴＢＡ−ＲＳ濃度、ＧＳＨ濃度、ＧＳＳＧ濃度及びＧＰｘ活性をそれぞれ測定するとともに、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比率を求めた。また、肝臓ミトコンドリア画分のホモゲネート中のＴＢＡ−ＲＳ濃度についても測定した。これらの結果を図５〜図８にそれぞれ示す。
【００７１】
図５及び図６（ａ）、（ｂ）に示すように、冠元顆粒及び丹参はいずれも、加齢に伴って蓄積されるＡＧＥｓ及びＴＢＡ−ＲＳ（過酸化脂質）の蓄積量をともに有意に低下させる作用を有しており、それらの作用は冠元顆粒の方が若干高い傾向にあった。図７（ａ）〜（ｃ）に示すように、冠元顆粒及び丹参はいずれも、加齢に伴って低下するＧＳＨ／ＧＳＳＧ比率を有意に増加させる作用を有していた。図７（ｄ）に示すように、冠元顆粒及び丹参はいずれも、加齢に伴って増大するＧＰｘ活性を低下させ、若齢ラットのＧＰｘ活性に近づける作用を有していた。図８（ａ）、（ｂ）に示すように、冠元顆粒及び丹参はいずれも、加齢に伴って低下する肝機能を高める作用を有していた。図８（ｃ）、（ｄ）に示すように、冠元顆粒及び丹参はいずれも、加齢に伴って低下する腎機能を高める作用も有していた。以上の結果より、冠元顆粒は、抗老化作用を有することが明らかとなり、このような作用は、活性酸素や酸化ストレスによって引き起こされるミトコンドリアの機能異常（老化現象）に対して、その恒常性を維持し、生体内レドックス機構を良好に調節し得ることが示された。さらに、このような作用の一翼として、丹参が大きく関与していることも明らかになった。
【００７２】
また、データは示さないが、各群のラットの肝臓全体のホモゲネート、該ホモゲネート中の細胞質画分及び該ホモゲネート中の核画分に含まれる蛋白質について、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した後にウエスタンブロッティングを行った。ウエスタンブロッティングに用いた抗体は、肝臓全体のホモゲネートの場合はＢａｘ、Ｂｃｌ−２、ｉＮＯＳ、ＨＯ−１及びＣＯＸ−１，２に対する抗体であり、細胞質画分及び核画分の場合はＮＦ−κＢ、Ｉ−κＢ、シトクロムＣ及びＣＯＸ−１に対する抗体である。その結果、肝臓全体では冠元顆粒及び丹参を摂取した場合にＢｃｌ−２の発現が増大し、特に冠元顆粒で発現が顕著に増大した。
【００７３】
なお、本実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・  老化抑制剤の有効成分として、冠元顆粒の代わりに丹参の水抽出物を用いてもよい。また、丹参と、香附子、木香、紅花、芍薬及びセンキュウから選ばれる少なくとも１種とを有効成分として含有する老化抑制剤を提供することも可能である。
【００７４】
・  老化抑制剤及び酸化ストレス抑制剤は、ヒト以外にも、ウマ、ウシ、ブタのような家畜（非ヒト哺乳動物）やニワトリ等の家禽に投与してもよい。
・  冠元顆粒を、パン、ケーキ、スナック菓子等の嗜好品、牛乳やヨーグルト等の乳製品、清涼飲料等の飲料品に含有させてもよい。
【００７５】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・  冠元顆粒を有効成分として含有する酸化ストレス抑制剤であって、酸化ストレスによる細胞周期の停止を抑える作用を有することを特徴とする酸化ストレス抑制剤。冠元顆粒を有効成分として含有する酸化ストレス抑制剤であって、酸化ストレスによる正常細胞の分裂寿命の短縮を抑える作用を有することを特徴とする酸化ストレス抑制剤。冠元顆粒を有効成分として含有する酸化ストレス抑制剤であって、酸化ストレスによる正常細胞の生存率低下を抑える作用を有することを特徴とする酸化ストレス抑制剤。これらのように構成した場合には、酸化ストレスによる正常細胞の機能低下を抑える効果に優れた酸化ストレス抑制剤を提供することができる。
【００７６】
なお、本発明を応用した技術として、有効成分として香附子、木香、紅花、芍薬又はセンキュウのいずれか１種を含有する老化抑制剤を提供することも可能である。さらに、前記構成生薬のうち複数種（２〜５種）を有効成分として含有する老化抑制剤を提供することも可能である。即ち、上記実施例において、冠元顆粒が老化に伴う正常細胞の機能低下を抑える効果に優れていることが証明されているが、その冠元顆粒を構成する成分のいずれか１種又は複数種が特にその効果に優れている可能性が極めて高い。また同様に、有効成分として丹参、香附子、木香、紅花、芍薬及びセンキュウから選ばれる少なくとも１種を含有する酸化ストレス抑制剤を提供してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】（ａ）は実施例１における試験例３の結果を示す棒グラフ、（ｂ）は実施例１における試験例４の結果を示す棒グラフ、（ｃ）は実施例１における試験例５の結果を示す棒グラフ。
【図２】（ａ）は実施例１における試験例７の結果を示すグラフ、（ｂ）は実施例１における試験例８の結果を示すグラフ、（ｃ）は実施例２における試験例１２の結果を示すグラフ、（ｄ）は実施例２における試験例１３の結果を示すグラフ。
【図３】冠元顆粒による老化抑制作用及び酸化ストレス抑制作用についての説明図。
【図４】（ａ）は実施例１における試験例９の結果の一部を示すグラフ、（ｂ）は実施例１における試験例１１の結果を示すグラフ。
【図５】実施例３における血清蛋白中ＡＧＥｓ濃度の測定結果を示すグラフ。
【図６】（ａ）〜（ｃ）は実施例３のＴＢＡ−ＲＳ濃度の測定結果を示すグラフ。
【図７】（ａ）〜（ｄ）は実施例３におけるラット肝臓を調べた結果を示すグラフ。
【図８】（ａ）〜（ｄ）は実施例３における肝機能パラメーター及び腎機能パラメーターを調べた結果を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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