(57)【要約】      （修正有）【課題】神経欠損の修復に適した神経細胞を得るための、骨髄幹細胞を神経栄養因子および／またはジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）で処理することを含む神経分化誘導方法の提供。【解決手段】該神経栄養因子がグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）または下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）を含有する、神経分化誘導方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄幹細胞を神経栄養因子および／またはジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）で処理することを含む神経分化誘導方法であって、該神経栄養因子がグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）または下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）を含有する、神経分化誘導方法。
【請求項２】
骨髄幹細胞がヒト骨髄由来の篩分けされた幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒト骨髄由来の篩分けされた幹細胞が3μmの多孔性篩により篩分けされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
グリア細胞系由来神経栄養因子の投与量が２０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドの投与量が１０ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ジブチリルｃＡＭＰの投与量が１００μＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
神経分化がニューロフィラメント軽鎖タンパク質（ＮＦ−Ｌ）の増加、α−チューブリンの増加、小胞タンパク質であるシナプシン−１の産生、ニューロン前駆細胞マーカーであるインターネキシンの産生、細胞突起の伸長、および突起分枝の増加を含む請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主として毒性のない神経分化誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷後の神経細胞の消失は、ＣＮＳの修復を困難とする。種々のげっ歯類およびヒトＣＮＳ領域から分離された神経幹細胞（ＮＳＣ）に関する多数の研究により、成熟げっ歯類ＣＮＳにおいてはＣＮＳが環境および／または外因性成長因子の影響により神経細胞へと分化し得ることが示されている（Ｆ．Ｈ．Ｇａｇｅ，哺乳類の神経幹細胞，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７（２０００）１４３３−１４３８；Ｊ．Ｐｒｉｃｅ，Ｂ．Ｐ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，神経幹細胞，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１１（２００１）５６４−５６７）。このように、ＮＳＣの復元はヒトＣＮＳ治療にとって可能な戦略であると考えられている（Ｄ．Ａ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，脳の可塑性と修復における幹細胞，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２（２００２）３４−４２）。
【０００３】
ヒト骨髄由来幹細胞（ｈＢＭＳＣ）は形態学的に不均質である。骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、あるいは筋組織へと分化できる多能性を有し、さらにはニューロンを形成することができる（Ｅ．Ｍｅｚｅｙ，Ｋ．Ｊ．Ｃｈａｎｄｒｏｓｓ，Ｇ．Ｈａｒｔａ，Ｒ．Ａ．Ｍａｋｉ，Ｓ．Ｒ．ＭｃＫｅｒｃｈｅｒ，血液を脳へと変える：  骨髄から生体内で形成されたニューロン抗原を有する細胞，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９０（２０００）１７７９−１７８２；Ｅ．Ｍｅｚｅｙ，Ｓ．Ｋｅｙ，Ｇ．Ｖｏｇｅｌｓａｎｇ，Ｉ．Ｓｚａｌａｙｏｖａ，Ｇ．Ｄ．Ｌａｎｇｅ，Ｂ．Ｃｒａｉｎ，移植骨髄によるヒト脳内における新しいニューロンの形成，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１００（２００３）１３６４−１３６９；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓら，（２０００）；Ｄ．Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｅ．Ｊ．Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｉ．Ｂ．Ｂｌａｃｋ，成熟ラットおよびヒト骨髄間質細胞のニューロンへの分化，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６１（２０００）３６４−３７０）。最近、ヒトおよびマウスＢＭＳＣが、レチノイン酸および上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の刺激後にニューロン前駆細胞マーカー（ネスチン）、神経特異的核タンパク質（ＮｅｕＮ）、およびグリア線維細胞酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を発現することが報告された［Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓら、（２０００）］。また、移植されたＢＭＳＣが損傷されたＣＮＳにおいてニューロン系とグリア系とを区別できることが示されている（Ｊ．Ｒ．Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ，成人骨髄由来神経細胞と臍帯血，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６９（２００２）８８０−８９３）。さらに、Ｃｈｏｐｐらは、ＢＭＳＣの移植により局所性脳虚血を有するラット（Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｌｉ，Ｍ．Ｃｈｏｐｐ，ラットにおけるＭＣＡｏ後のＢＤＮＦを伴う骨髄の脳内移植，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３９（２０００）７１１−７１６）、外傷性脳損傷を有するラット（Ｄ．Ｌｕ，Ｙ．Ｌｉ，Ｌ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ａ．Ｍａｈｍｏｏｄ，Ｍ．Ｃｈｏｐｐ，外傷性脳損傷モデルラットにおける骨髄間質細胞の動脈内投与，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．１８（２００１）８１３−８１９）、パーキンソン病マウス（Ｙ．Ｌｉ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｌ．Ｗａｎｇ，Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｍ．Ｌｕ，Ｍ．Ｃｈｏｐｐ．１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン投与によるパーキンソン病モデルマウスにおける骨髄間質細胞の脳内移植，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３１６（２００１）６７−７）の機能回復に改善が見られることを見出した。これらの発見はヒトにおけるＣＮＳ細胞治療が有用な細胞源としての役割を果たす可能性を示唆している。
【０００４】
しかしながら、培養用ペトリ皿への付着によるｈＢＭＳＣの分離では、まず、不均質な集団が形成される（Ａ．Ｊ．Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｅ．Ｇｏｒｓｋａｊａ，Ｎ．Ｎ．Ｋｕｌａｇｉｎａ，正常および照射マウス造血器官における線維芽細胞前駆体，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４（１９７６）２６７−２７４）。したがって、その大きさの違いや表面特異的マーカーに基づいてセルソーティングにより均質な集団を形成するいくつかの方法が開発されている（Ｓ．Ｃ．Ｈｕｎｇ，Ｎ．Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｌ．Ｈｓｉｅｈ，Ｈ．Ｌｉ，Ｈ．Ｌ．Ｍａ，Ｗ．Ｈ．Ｌｏ，ヒト骨髄由来の篩分けされた細胞の分離と特徴付け，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２０（２００２）２４９−２５８；Ｒ．Ｚｏｈａｒ，Ｊ．Ｓｏｄｅｋ，Ｃ．Ａ．ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ，フローサイトメトリーにより濃縮された間質前駆細胞の特徴付け，Ｂｌｏｏｄ，９０（１９９７）３４７１−３４８１）。従って、Ｈｕｎｇら（２００２）は、最近、ヒト骨髄から細胞の大きさや粘着性に基づいてパーコールの密度勾配分離およびより小さな細胞を除去するための３μｍの多孔性篩を用いて均質な集団を効果的に分離する方法を開発した。形成された精製ｈＢＭＳＣ集団は、篩分けされた細胞（ＳＳＣ）と称され、ｈＢＭＳＣ不均質集団に比較してより優れた再生能力を有している［Ｈｕｎｇら、（２００２）］。ＳＳＣは２から３の経路において初期造血幹細胞表面マーカー、すなわちＣＤ３４およびＡＣ１３３を欠失しており、骨形成ＭＳＣおよび成熟骨前駆体に対するマーカーを発現できない［Ｈｕｎｇら、（２００２）］。しかしながら、これらの細胞はＴｈｙ−１、マトリックスレセプター（ＣＤ４４およびＣＤ１０５）、およびインテグリン（ＣＤ２９およびＣＤ５１）を発現する。ＳＳＣは多分化能を有し、環境シグナルの影響下に骨形成、脂肪細胞化、および軟骨形成の系統を立ち上げることができる［Ｈｕｎｇら、（２００２）］。ＳＳＣは、幹細胞の神経分化を誘発するためインビトロにおいてしばしば使用されるβ−メルカプトエタノール及びレチノイン酸などの抗酸化剤の刺激により電気的活性神経細胞を形成することも明らかにされている（Ｓ．Ｃ．Ｈｕｎｇ，Ｈ．Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．Ｙ．Ｐａｎ，Ｍ．Ｊ．Ｔｓａｉ，Ｌ．Ｓ．Ｋａｏ，Ｈ．Ｌ．Ｍａ，篩分けされた幹細胞の電気的活性神経細胞へのインビトロ分化，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２０（２００２）５２２−５２９）。β−メルカプトエタノールおよびレチノイン酸はＳＳＣの機能性ニューロンへの分化に対して強い影響を有するが、ＣＮＳ組織の修復における２つの因子の役割は明らかにされていない。
【０００５】
しかしながら、β−メルカプトエタノール及びレチノイン酸などの抗酸化剤によりＳＳＣを刺激して神経細胞を形成する方法はインビトロにおいてのみ応用できる方法である。β−メルカプトエタノールは有毒物質である。さらに、レチノイン酸は発癌性物質である。両抗酸化剤は動物に損傷を引き起こし、これらにより刺激された神経細胞の移植は受容者に死をもたらすことになる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、神経細胞の形態の変化を刺激する安全で効果的な神経栄養因子により線維芽細胞様形状から突起形成型へとＳＳＣを形態学的に形質転換するための新規な方法を提供する。さらに、本発明により得られる神経細胞は動物における神経欠損の修復に適している。
【０００７】
本発明の課題の一つは、神経栄養因子および／またはジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）により骨髄幹細胞を処理することを含む神経分化誘導方法を提供することであり、該神経栄養因子はグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）または脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）を含有する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、骨髄幹細胞を神経栄養因子および／またはジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）で処理することを含む神経分化誘導方法であって、該神経栄養因子がグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）または下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）を含有する、神経分化誘導方法を提供するものである。
【０００９】
本発明によれば、骨髄幹細胞を採取し機能性神経細胞を作製する。ヒト骨髄由来幹細胞はニューロンへ分化できる可能性を有しており、神経細胞再生に最適な物質であると考えられる。好ましくは、該骨髄幹細胞はヒト骨髄由来の篩分けされた(size-sieved)幹細胞である。篩分けされた幹細胞は骨髄幹細胞初代培養において不均質集団が形成されないように、セルソーティングを利用して大きさの違いと表面特異的マーカーに基づき均質な集団を形成するために開発される。さらに、篩分けされた幹細胞は不均質集団より優れた再生能力を有している。ヒト骨髄細胞由来の篩分けされた幹細胞は３μｍの多孔性篩により篩分けされているものがさらに好ましい。篩分けされた幹細胞は細胞の大きさや粘着性に基づいてパーコールの密度勾配分離、およびより小さな細胞を除去するための多孔性篩を用いてヒト骨髄から均質な集団として効果的に分離される。
【００１０】
本発明によれば、神経栄養因子は神経分化を誘導する刺激剤として働く。化学試薬に比べて損傷の少ない正常な生理学的条件に存在する微小環境因子である神経栄養因子という観点において、神経栄養因子は動物に移植する目的のために骨髄幹細胞を処理する安全な試薬とみなされている。本発明においては、神経栄養因子はグリア細胞系由来神経栄養因子または脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドを含有する。
【００１１】
多くのＣＮＳニューロン細胞集団にとって重要な生存因子であるグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は、種々のＣＮＳ機能障害の治療に使用できる可能性を有している。ＧＤＮＦの治療価値が最近ＡｉｒａｋｓｉｎｅｎおよびＳａａｒｍａにより再検討された（Ｍ．Ｓ．Ａｉｒａｋｓｉｎｅｎ，Ｍ．Ｓａａｒｍａ，ＧＤＮＦファミリー：シグナリング、生物学的機能、および治療価値，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３（２００２）３８３−３９４）。また、損傷した脊髄へＧＤＮＦを髄腔内注射することにより、脊髄損傷（ＳＣＩ）ラットにおいて後肢の回復に改善が見られたという報告もなされている（Ｈ．Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｐ．Ｗｕ，Ｓ．Ｆ．Ｔｚｅｎｇ，打撲による脊髄損傷におけるグリア細胞系由来神経栄養因子の神経細胞保護，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６９（２００２）３９７−４０５）。本発明によれば、ＧＤＮＦで処置することにより神経炎の拡がりや分枝する長い突起を改善することができる。神経特異的マーカーの見地において、ＧＤＮＦはニューロフィラメント軽鎖タンパク質（ＮＦ−Ｌ）、小胞タンパク質であるシナプシン−１および神経前駆マーカーであるインターネキシンの発現を刺激する効果を有している。ＧＤＮＦはまた、ＳＳＣに神経非特異的細胞骨格タンパク質α−チューブリンの発現を誘導する。好ましくは、グリア細胞系由来神経栄養因子の投与量は、２０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬである。
【００１２】
ｃＡＭＰ誘導神経ペプチドである下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）は、インビボおよびインビトロにおけるＣＮＳ神経分化に重要な役割を果たしている（Ｅ．Ｄｉｃｉｃｃｏ−Ｂｌｏｏｍ，Ｎ．Ｌｕ，Ｊ．Ｅ．Ｐｉｎｔａｒ，Ｊ．Ｚｈａｎｇ，ＰＡＣＡＰリガンド／レセプター系による大脳皮質神経発生の制御，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１（１９９８）２７４−２８９；Ｊ．Ａ．Ｗａｓｃｈｅｋ，神経系の発達と再生における脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチドの複数の働き，Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４（２００２）１４−２３）。さらに、軸索の再生には細胞内ｃＡＭＰの上昇が不可欠である（Ｗ．Ｄ．Ｓｎｉｄｅｒ，Ｆ．Ｑ．Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ｚｈｏｎｇ，Ａ．Ｍａｒｋｕｓ，再生経路のシグナリング，Ｎｅｕｒｏｎ．３５（２００２）１３−１６）。Ｇａｔｔｅｉらは、ＧＤＮＦレセプター−αおよびその受容体チロシンキナーゼＲＥＴがｈＢＭＳＣ内に発現されることを見出した（Ｖ．Ｇａｔｔｅｉ，Ａ．Ｃｅｌｅｔｔｉ，Ａ．Ｃｅｒｒａｔｏ，Ｍ．Ｄｅｇａｎ，Ａ．Ｄｅ  Ｉｕｌｉｉｓ，Ｆ．Ｍ．Ｒｏｓｓｉ，Ｇ．Ｃｈｉａｐｐｅｔｔａ，Ｃ．Ｃｏｎｓａｌｅｓ，Ｓ．Ｉｍｐｒｏｔａ，Ｖ．Ｚａｇｏｎｅｌ，Ｄ．Ａｌｄｉｎｕｃｃｉ，Ｖ．Ａｇｏｓｔｉ，Ｍ．Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｇ．Ｖｅｃｃｈｉｏ，Ａ．Ｐｉｎｔｏ，Ｍ．Ｇｒｉｅｃｏ，骨髄微小環境である正常および白血病ヒト造血細胞および間質細胞におけるＲＥＴ受容体チロシンキナーゼおよびＧＤＮＦＲ−αの発現，Ｂｌｏｏｄ．８９（１９９７）２９２５−２９３７）。本発明によれば、ＰＡＣＡＰはＳＳＣをニューロンへ形態学的に形質転換するためのＳＳＣの神経分化の刺激に用いられる。ＰＡＣＡＰはＰＡＣ１レセプターを介して細胞内ｃＡＭＰを上昇させ、神経発生を刺激する［Ｄｉｃｉｃｃｏ−Ｂｌｏｏｍら、（１９９８）］。本発明によれば、ＰＡＣＡＰによる処理は、神経炎の拡がりや分枝する長い突起を改善することができる。神経特異的マーカーの見地において、ＰＡＣＡＰはＮＦ−Ｌ、小胞タンパク質であるシナプシン−１および神経前駆マーカーであるインターネキシンの発現を刺激する効果を有している。ＰＡＣＡＰはまた、ＳＳＣ内にα−チューブリンの発現を誘導する。好ましくは、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドの投与量は、１０ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬである。
【００１３】
ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）はＳＳＣ内に非常に分枝した長い微細な突起を誘導する細胞透過性ｃＡＭＰ類似体である。本発明によれば、ｄｂｃＡＭＰで処理することは、ＮＦ−Ｌ、小胞タンパク質であるシナプシン−１および神経前駆マーカーであるインターネキシンの発現を高める。ｄｂｃＡＭＰはまた、ＳＳＣ内にα−チューブリンの発現を誘導する。また、ｄｂｃＡＭＰでの処理は、ＧＤＮＦ−およびＰＡＣＡＰ−処理ＳＳＣ培養において観察されたよりも突起の分枝、および伸長をさらに誘導するる。好ましくは、ジブチリルｃＡＭＰの投与量は、１００μＭである。
【００１４】
神経栄養因子は多くの神経疾患のニューロン生存および修復に対して効果を有している。したがって、神経栄養因子と細胞移植の組み合わせは、神経疾患の治療にとって有効な治療戦略であると考えられる。神経幹細胞の分化は神経栄養因子はによって誘導されることが明らかになっている（Ｎ．Ｙ．Ｉｐ，ニューロトロフィンおよび神経性サイトカイン：神経および造血細胞に作用する２つの成長因子ファミリー，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４０（１９９８）９７−１０６；Ａ．Ｍａｒｋｕｓ，Ｔ．Ｄ．Ｐａｔｅｌ，Ｗ．Ｄ．Ｓｎｉｄｅｒ，神経栄養因子および軸索成長，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１２（２００２）５２３−５３１；Ｈ．Ｔｈｏｅｎｅｎ，ニューロトロフィンと神経可塑性，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７０（１９９５）５９３−５９８）。しかしながら、神経細胞におけるＳＳＣの分化転換に対する神経栄養因子の作用については知られていない。本発明では、まず、ＧＤＮＦおよびＰＡＣＡＰがＳＳＣ分化を成熟ニューロン表現型へ刺激できることを示す。ｃＡＭＰ／ＰＫＡ、ＭＡＰキナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、およびＰＬＣ−γシグナリング経路を活性化することによって神経細胞保護を発揮し、軸索の再成長を刺激する２つの神経栄養因子が知られている［Ａｉｒａｋｓｉｎｅｎら、（２００２）およびＷａｓｃｈｅｋら、（２００２）］。さらに、細胞内ｃＡＭＰの上昇はＳＳＣ内の神経突起の形成を高めることができる。本発明は、ＩＴＳ培地中で培養されたＳＳＣが突起形成型であり、ニューロンシナプシン小胞タンパク質であるシナプシン−１陽性であることを明らかにした。ＩＴＳ培地中のＧＤＮＦまたはＰＡＣＡＰでの処理は、さらに、特有の突起を有するＳＳＣのニューロン様細胞への形質転換を誘導することができる。ほとんどのＣＮＳ成熟ニューロンにおいて発現されたＮＦタンパク質は、ニューロンの成長、組織化、形状、および可塑性において重要な役割を果たしていることが知られている。したがって、ＧＤＮＦまたはＰＡＣＡＰを含有するＩＴＳ培地により誘導されたＳＳＣ中のＮＦ−Ｌの付加発現はＳＳＣの神経分化に対する２つの分子の制御的役割を示している。長い突起中に広がる分枝およびＮＦ−Ｌの増加がｄｂｃＡＭＰ処理ＳＳＣに認められる。これは、細胞内ｃＡＭＰがＰＡＣＡＰ処理ＳＳＣのニューロン分化促進に関与している可能性を示すものである。ＳＳＣ中でのＮＦ−Ｌおよびα−チューブリンの産生においてＧＤＮＦのＰＡＣＡＰまたはｄｂｃＡＭＰとの併用による相乗効果は観察されなかったことに注意すべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
次に示す実施例は本発明の説明だけを目的とするものであって、本発明の権利範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００１６】
実施例１：ヒト骨髄由来の篩分けされた幹細胞
ＳＳＣをヒト骨髄から公知の方法［Ｈｕｎｇら、（２００２）］にしたがって単離した。すなわち、正常ドナーの腸骨稜からヒト骨髄を吸引採取し、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞を１．０７３ｇ／ｍＬのパーコール溶液（シグマ社、登録商標）に入れ、９００ｇで３０分間遠心分離を行った。単核細胞（ＭＮＣ）を界面から集め、１×１０６ＭＮＣ／ｃｍ２の密度で孔サイズ３μｍの篩（トランスウェルシステム、登録商標、コーニング社）が挿入されている１０ｃｍのプラスチック培養皿上に載せた。細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍＬのアムフォテリシンＢ（血清含有培地）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（低濃度グルコース）（ＤＭＦＭ−ＬＧ）中で培養した。７日後、挿入されている篩の上部に付着している細胞はより大きな、線維芽細胞様形態を有しており、これをＳＳＣと名付けた。しかしながら、篩を通過した細胞は小さく、多角形であり、再生度は低かった。ＳＳＣを０．２５％トリプシンおよび１ｍＭのＥＤＴＡにより収集し、１０ｃｍの培養ペトリ皿に移した。ＳＳＣを８０％飽和まで血清含有培地中で培養した後、細胞をウェスタン・ブロッティング法用には１×１０５細胞／皿の密度で３５ｍｍ培養ペトリ皿に、免疫蛍光法用には１×１０４細胞／ウェルの密度で８穴チャンバーに移した。
【００１７】
実施例２：ヒト骨髄由来の篩分けされた幹細胞の刺激
血清含有培地中で４８時間培養後、ＳＳＣを血清培地（ＩＴＳ培地）のみ、およびＧＤＮＦ（２０および５０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ、登録商標）、ＰＡＣＡＰ（１０および２０ｎｇ／ｍＬ、シグマ、登録商標）またはｄｂｃＡＭＰ（２０μＭ、シグマ、登録商標）を含有するＩＴＳ培地中で処理した。ＩＴＳ培地は５６％ＤＭＥＭ−ＬＧ（ライフ・バイオテク、登録商標）、４０％ＭＣＤＢ−２０１培地（シグマ、登録商標）、および１ｍｇ／ｍＬのインスリン、０．５５ｍｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン、０．５μｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム、１０ｎＭのデキサメタゾン（シグマ、登録商標）および１０μＭのアスコルビン酸（シグマ、登録商標）を含有する１倍ＩＴＳ培地サプリメントを含む。本発明者らは、無血清ＤＭＥＭ−ＬＧ培地中のＳＳＣがＧＤＮＦおよびＰＡＣＡＰにわずかに応答することを確認した。しかし、ＳＳＣをＩＴＳサプリメント含有無血清培地中で培養した場合、これらの細胞は培養プレート上によく付着し、突起の伸長がみられた。したがって、ＩＴＳ培地中での処理を行った。
【００１８】
ＳＳＣの形態を図１および図２に示す。図２に示すように、ＳＳＣを１０％ＦＢＳ含有培地中で培養した場合、細胞は平坦な、線維芽細胞様形態を示した。しかしながら、ＩＴＳ培地のみで培養する間にＳＳＣは神経突起を伸長形成することを見出した（図１および２）。更に、ＳＳＣをＧＤＮＦまたはＰＡＣＡＰを含有するＩＴＳ培地中で処理すると神経炎の伸長がさらに向上した。これは、ＳＳＣのＩＴＳ培地のみによる７日間の培養の際に、小胞タンパク質であるシナプシン−１がすでに観察されたことを示していた。上記のように、ＩＴＳ培地のみでもＳＳＣのニューロン分化はある程度誘導された。
【００１９】
実施例３：ニューロン特異的マーカーに対するＧＤＮＦ、ＰＡＣＡＰ、およびｄｂｃＡＭＰの効果
ＩＴＳ培地中でのＳＳＣのニューロン分化に及ぼすＧＤＮＦ、ＰＡＣＡＰおよびｄｂｃＡＭＰの効果について検討した。ＳＳＣにおけるニューロン特異的マーカー（ＮＦ−ＬおよびＮＦ−Ｈ）の量をウェスタン・ブロッティング法により求めた。ＳＳＣを１×１０５細胞／３５ｍｍペトリ皿の密度で新たにペトリ皿に取り、ＧＤＮＦ、ＰＡＣＡＰ、またはｄｂｃＡＭＰを上記の濃度で含有するＩＴＳ培地中で７日間培養した。細胞を収集し、１％のＳＤＳ、１ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのペプスタチン、２ｍＭのロイペプチンおよび０．７ｍＭのアプロチニンを含有するＰＢＳを用いて氷冷しながら穏やかにホモジナイズした。タンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ、ＤＣキット（登録商標）を用いて測定した。全タンパク質１０μｇを７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロース膜に転写した。膜を抗ＮＦ抗体（ケミコン、登録商標）と共に４℃で一晩インキュベートした後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を加え高感度ケミルミネッセンス溶液（ＮＥＮ・ライフサイエンス、登録商標）によりＮＦ−Ｌ（７０ｋＤａ）およびＮＦ−Ｈ（２００ｋＤａ）を同定した。
【００２０】
結果を図３および図４に示す。図３に示すように、ウェスタン・ブロッティングは、ＧＤＮＦまたはＰＡＣＡＰ処理はＳＳＣ中のＮＦ−Ｈに対する効果は低かったが、ＮＦ−Ｌタンパク質の発現を刺激する効果を有していることを示した。。
【００２１】
図４に示したように、細胞透過性ｃＡＭＰ類似体（ｄｂｃＡＭＰ）を含有するＩＴＳ培地はＩＴＳ培地単独の場合に比較して、非常に分枝した長い微細な突起をＳＳＣに誘導することが確認された。ＧＤＮＦおよびＰＣＡＣＰと同様に、ｄｂｃＡＭＰで処理することは、ＳＳＣ中のＮＦ−Ｌおよびα−チューブリン量を増大することもウェスタン・ブロッティング法により確認された。しかし、ＳＳＣ中でのＮＦ−Ｌおよびα−チューブリンの産生に対してＧＤＮＦとＰＡＣＡＰまたはｄｂｃＡＭＰとの組み合わせによる相乗効果は見られなかった。
【００２２】
その他のニューロン中間径フィラメントタンパク質であるα−インターネキシン（図５）の免疫蛍光染色をα−インターネキシンに対する抗体（１：２００、ケミコン、登録商標）を用いて行った。ＧＤＮＦおよびＰＡＣＡＰはＳＳＣに分枝した突起をある程度誘導できることが示された。しかしながら、ｄｂｃＡＭＰによる７日間の処理は、コントロールの培養に加えＧＤＮＦ処理およびＰＡＣＡＰ処理ＳＳＣ培養の場合と比較しても、より高度に分枝した長い突起を生じさせることができた。
【００２３】
実施例４：ＳＳＣの形態変化に対するＧＤＮＦおよびＰＡＣＡＰの効果
ＩＴＳ培地中で７日間、５０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦまたは２０ｎＭのＰＡＣＡＰで処理したＳＳＣの形態変化を検出するために、ＳＳＣを４％パラフォルムアルデヒド含有ＰＢＳ中で１０分間固定した。シナプス小胞タンパク質であるシナプシン−１の免疫蛍光法による測定は、０．１％トリトンＸ−１００および５％ウマ血清を含有するＰＢＳ中で抗シナプシン−１抗体（１：２００、ＢＤ・バイオサイエンス、登録商標）を４℃で一晩反応させた後、ビオチン化二次抗体（１：２００、ベクター、登録商標）およびＦＩＴＣ−アビジン（１：２００、ベクター、登録商標）により行った。結果は、ＳＳＣの突起および／または辺縁膜に処理の有無にかかわりなくシナプシン−１の強い免疫蛍光染色を示した。さらに、ＧＤＮＦまたはＰＡＣＡＰで処理した培養におけるシナプシン−１陽性細胞では分枝した伸長した突起が観察された（図６に示す）。
【００２４】
本発明を実施例により例示、説明したが、種々の変形および改良が当業者により可能である。本発明は説明のため用いた特別な形式に限定されるものではなく、本発明の精神および範囲から逸脱しない範囲における全て変形が添付した特許請求の範囲に定義される範囲に含まれることを意図している。。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＳＳＣのニューロン様形質転換の相コントラスト画像を示す。ＳＳＣはＩＴＳ培地のみ（０）、および５０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦまたは２０ｎｇ／ｍＬのＰＡＣＡＰを含有するＩＴＳ培地において突起形成型細胞になることが確認できる（倍率：２００倍）。
【図２】ＧＤＮＦ、ＰＡＣＡＰおよびｄｂｃＡＭＰによるＳＳＣのニューロン様形質転換の相コントラスト画像を示す。血清含有培地中のＳＳＣの形態は線維芽細胞様であり、血清除去培地（ＩＴＳ培地単独、０）では突起形成型になることが示された。さらに、ＧＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＰＡＣＡＰ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ｄｂｃＡＭＰ（０．１ｍＭ）、ＧＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）＋ＰＡＣＡＰ（２０ｎｇ／ｍＬ）、またはＧＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）＋ｄｂｃＡＭＰ（０．１ｍＭ）を添加したＩＴＳ培地中で７日間処理したＳＳＣの突起は伸長し高度に分枝している（倍率：２００倍）。
【図３】ニューロン特異的マーカーＮＦ−ＬおよびＮＦ−Ｈの発現の結果を示す。ウェスタン・ブロッティング分析はニューロン特異的マーカーＮＦ−Ｌが、ＩＴＳ培地単独（０）に比較して、ＩＴＳ培地中のＧＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）またはＰＡＣＡＰ（１０または２０ｎｇ／ｍＬ）による７日間の処理後に向上（upregulate）したことを示している。
【図４】ＮＦ−Ｌおよびα−チューブリンの発現の結果を示す。ウェスタン・ブロッティング分析はニューロン特異的マーカーＮＦ−Ｌは上記と同様に処理したＳＳＣにおいて７日間の処理後に向上（upregulate）したことを示している。さらに、ニューロン非特異的細胞骨格タンパク質α−チューブリンのＳＳＣ中濃度は、上記に示した種々の処置により増加している。ＩＴＳ培地のみによる処置を０として示している。
【図５】ＳＳＣ中のα−インターネキシンの免疫蛍光染色の結果を示す。ここでは、ＳＳＣをＩＴＳ培地単独（０）、またはＧＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＰＡＣＡＰ（２０ｎｇ／ｍＬ）およびｄｂｃＡＭＰ（０．１ｍＭ）を含有するＩＴＳ培地中で７日間処理し、培養物に対してα−インターネキシンに対する免疫蛍光染色を行っている。ＧＤＮＦおよびｄｂｃＡＭＰで処理したＳＳＣの突起の分枝（矢）および伸長（矢じり）はＩＴＳ培地のみ（０）におけるよりもはるかに大きい結果である。縮尺バー＝５０μｍ
【図６】ＳＳＣのニューロン様形質転換を示す画像である。小胞タンパク質であるシナプシン−１はＳＳＣをＩＴＳ培地のみ（０）で７日間培養したときすでに発現されている。さらに、ＧＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）またはＰＡＣＡＰ（２０ｎｇ／ｍＬ）含有ＩＴＳ培地中で７日間処理することによって、突起（矢）の伸長（矢じり）がさらに誘導されるとともに分枝が増大している。縮尺バー＝５０μｍ
【誤訳訂正書】
【提出日】平成17年9月14日(2005.9.14)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】追加
【訂正の内容】
【図１】
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【図２】
2006006333.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【外国語明細書】
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