(57)【要約】【課題】  個々の菌体に着目してピロリ菌の薬剤感受性を迅速に判定する方法を提供し、ピロリ菌の除菌を確実に行える薬剤の選択、新規薬剤の開発に寄与する。【解決手段】  ピロリ菌や精子など鞭毛や繊毛によって自走性を有する細菌、細胞と被験物質を接触させて、細菌（細胞）集団の中で特異的に自走性（運動能）を有する細菌（細胞）を観察する。具体的には、細菌（細胞）と被験物質とを、希釈度の異なる被験物質の溶液中において８時間以下もしくは１２時間接触させ、当該接触液を顕微鏡観察する。この結果、例えば、静止した細菌（細胞）集団中に際だって自走する１個の細菌（細胞）が観察された場合、当該被験濃度を薬剤非感受性濃度として判断する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個々の細菌または細胞が有する特異的運動能を指標とすることを特徴とする抗菌力試験方法。
【請求項２】
被験物質と接触させた後の細菌または細胞を観察し、観察した視野中に際だった運動能を示す細菌または細胞の存否を基準として感受性を判定することを特徴とする抗菌力試験方法。
【請求項３】
顕微鏡観察下において、１視野中に１個の存否を基準とすることを特徴とする請求項２に記載の抗菌力試験方法。
【請求項４】
細菌もしくは細胞と被験物質の接触時間が、８時間以下もしくは１２時間であることを特徴とする請求項２または３のいずれかに記載の抗菌力試験方法。
【請求項５】
濃度が段階的に調整された被験物質の溶液と接触させることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の抗菌力試験方法。
【請求項６】
２以上の被験物質を用いて、感受性を対比することを特徴とする請求項５に記載の抗菌力試験方法。
【請求項７】
前記細菌もしくは細胞の運動能を、撮像装置およびコンピューターを備えた画像処理システムにより判定することを特徴とする請求項２〜６のいずれかに記載の抗菌力試験方法。
【請求項８】
前記細菌もしくは細胞は、鞭毛もしくは繊毛を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の抗菌力試験方法。
【請求項９】
前記細菌は、ヘリコバクター ピロリ（Helicobacter pylori）、ヘリコバクター フェリス（Helicobacter felis）、ヘリコバクター ヘイルマンニ（Helicobacter heilmannii）、ヘリコバクター ムステレ（Helicobacter mustelae）、ヘリコバクター カニス（Helicobacter canis）、ヘリコバクター ビリス（Helicobacter bilis）、ヘリコバクター ヘパチクス（Helicobacter hepaticus）、ヘリコバクター ムリダルム（Helicobacter muridarum）、及びヘリコバクター トログンタム（Helicobacter troguntum）のいずれかである請求項１〜８のいずれかに記載の抗菌力試験方法。
【請求項１０】
梅抽出物と抗生物質を含むことを特徴とする抗耐性ピロリ菌薬。
【請求項１１】
梅抽出物と抗生物質とを併用して、特異的に運動能を有するピロリ菌の発生を予防もしくは抑制する方法。
【請求項１２】
抗生物質と併用することによって、特異的に運動能を有するピロリ菌の発生を予防もしくは抑制することを特徴とする梅抽出物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌力試験方法、具体的には、鞭毛や繊毛の運動により自走する細菌・細胞に対する抗菌力試験、および抗耐性ピロリ菌薬、ピロリ菌の発生を予防する方法ならびに梅抽出物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）はヒトの胃粘膜に生息し、消化器系潰瘍の起因菌とされている。最近では胃癌との関連性も指摘されている。ピロリ菌の除菌療法には、プロトンポンプ阻害剤であるランソアラゾールとアモキシシリン及びクラリスロマイシンの３剤併用療法が有効とされている。ピロリ菌は、幅０.５〜１μｍ、長さ約３μｍ程度の、大腸菌よりもやや小さい、琴曲もしくはＳ字型をしたグラム陰性悍菌である（図１参照）。その一端に４〜８本の鞭毛を有し、この鞭毛の働きにより自力で移動して、胃粘膜上席表層部のゲル状粘液層の中にもぐりこみ生息する。そして、栄養分の枯渇時や上記の抗菌剤投与時には、coccoid formと呼ばれる球状形態へと変化する。このcoccoid formでは、通常、感染力はないとされ、coccoid formへと変化したピロリ菌は増殖能も欠けていると言われている。
【０００３】
ところが、近年クラリスロマイシン耐性ピロリ菌(ＣＭ耐性菌)の出現が報告され、このＣＭ耐性菌の出現は、前記の３剤併用療法の成否を左右する大きな要因の一つと考えられている。
【０００４】
自走性を有するか否かに関係なく、薬剤感受性であるかどうかは、通例ＭＩＣ（Minimum Inhibitory Concentration）やＩＣ５０を基準として判定される。しかしながら、その判定には、少なくとも２４時間以上、通常４８〜７２時間の培養時間を必要とする。このため、耐性菌の治療に適切な薬剤の選択や耐性菌に対する新規化合物のスクリーニングには時間を要し、より迅速に薬剤感受性を判定できる方法が望まれている。
【０００５】
また、薬剤感受性を判定するために使用される菌株は遺伝学的に均一であり、ある薬剤濃度において薬剤と接触した菌は全て死滅または少なくとも増殖能を失っているものとして取り扱われている。ところが、実際にはその全てが死滅または増殖能を失っているものではなく、上記方法では見掛け上全ての菌が感受性ありとして判断されているにすぎない。すなわち、ＭＩＣ法やＩＣ５０法では、菌が生育しているか否かにより感受性が判定されるのであり、個々の菌体がすべて増殖能を失ったのかどうかを判断したものではない。このことからＭＩＣ法やＩＣ５０法で感受性ありと判断された場合においても、個々の菌体に着目して観察すれば薬剤非感受性の細菌が存在し、見掛け上感受性があるとされた非感受性の細菌が増殖し、再び感染状態に戻ることが懸念される。事実、上記３剤併用療法によりピロリ菌が除去された患者の中には、再びピロリ菌による感染が認められた患者が存在している。この患者におけるピロリ菌はいわゆる薬剤耐性を示すものではなかった。
【０００６】
一方、ピロリ菌の自走性に着目して薬剤感受性について評価を試みる方法が、ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Nov. 2000, p3069-3073に開示されている。この方法は、ガラススライドとカバーガラス間に形成した菌の培養液層中を泳動するピロリ菌を顕微鏡下に観察し、その運動量をコンピュータを用いた画像処理プログラムによって測定する方法である。この方法は、一視野について一定時間の分析時間、例えば０.０５秒ごとに所定回数連続的にピロリ菌の運動量を記録し（例えば１５回の記録、計０.７５秒間）、視野内にある各ピロリ菌の泳動速度（μｍ／秒）を計算して、ピロリ菌のブラウン運動の速度よりも１０倍高い運動速度を検出したピロリ菌の菌数から、ピロリ菌に対する薬剤感受性を判断する方法である。
【０００７】
この方法では、薬剤と接触したピロリ菌の自走性から判断しているため、比較的短時間で薬剤感受性を判断することができる。しかしながら、この方法は運動するピロリ菌の全体像（平均的なピロリ菌）を捉えている点ではＭＩＣ法等と異同はなく、薬剤非感受性である菌の存在を個別的に把握できず、薬剤非感受性であるピロリ菌が再び増殖を開始して再感染に至ることを完全に防止ないし予測することはできなかった。
【０００８】
このような背景の下、本発明者らは、ＭＩＣ法や上記ピロリ菌の運動能を基準とした方法を用いて、種々の化合物や植物抽出物のピロリ菌に対する抗菌力試験を行っていたところ、薬剤濃度を高めたときにも、coccoid formを形成した大多数のピロリ菌とは異なり、coccoid formを形成せずに特異的に自走するピロリ菌が存在することに気が付き、本発明を完成するに至った。
【非特許文献１】Nanako TSUTSUI et al. 「A Novel Action of the Proton Pump Inhibitor Rabeprazole and Its Thioether Derivative against the Motility of Helicobacter pylori」  Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Nov. 2000, p.3069-3073
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記従来技術を背景にしてなされたものであって、その目的とするところは、個々の菌体に着目してピロリ菌の薬剤感受性を迅速に判定する方法を提供し、ピロリ菌の除菌を確実に行える薬剤の選択、新規薬剤の開発に寄与することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の抗菌力試験方法は、個々の細菌または細胞が有する特異的運動能を指標としたことを特徴とするものであって、具体的には、被験物質と接触させた後の細菌または細胞を観察し、観察した細菌・細胞中に際だった運動能を示す細菌・細胞の存否を基準として、薬剤感受性を判定するものである。そしてこの試験方法を用いることによって、例えば２種以上の被験物質を用いて薬剤感受性を対比し、抗菌スペクトルを知ることができる。
【００１１】
より具体的には、細菌もしくは細胞と被験物質の接触時間が、８時間以下もしくは１２時間とすることができ、また、従来法と同様に、濃度が段階的に調整された被験物質の溶液と接触させればよい。そして、細菌・細胞の運動能は、撮像装置およびコンピューターを備えた画像処理システムにより判定することができる。
【００１２】
本発明は、鞭毛もしくは繊毛を有する細菌・細胞に適した方法であって、より具体的な対象として、特にピロリ菌、例えば、ヘリコバクター ピロリ（Helicobacter pylori）、ヘリコバクター フェリス（Helicobacter felis）、ヘリコバクター ヘイルマンニ（Helicobacter heilmannii）、ヘリコバクター ムステレ（Helicobacter mustelae）、ヘリコバクター カニス（Helicobacter canis）、ヘリコバクター ビリス（Helicobacter bilis）、ヘリコバクター ヘパチクス（Helicobacter hepaticus）、ヘリコバクター ムリダルム（Helicobacter muridarum）、及びヘリコバクター トログンタム（Helicobacter troguntum）を挙げることができる。
【００１３】
さらに、本発明の抗耐性ピロリ菌薬は梅抽出物と抗生物質とからなるものであり、梅抽出物と抗生物質とを併用することによって、特異的に運動能を有するピロリ菌の発生を予防もしくは抑制するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、個々の細菌や細胞が有する運動能を観察しているので、比較的短時間に薬剤に対する感受性を調べることができる。また、個々の細菌・細胞が有する特異的な運動能、すなわち、細菌・細胞の中で際だった運動能を有する細菌・細胞個体を観察しているので、薬剤耐性についてより正確な知見を得ることができる。このように、すべての個体に対して感受性のある薬剤が正確かつ速やかに判定し、細菌、特にピロリ菌の除去を確実に行える薬剤の選択、新規薬剤のスクリーニングに大きく寄与する。また、本発明の方法は、細胞の運動能を増大させる新規薬剤のスクリーニングにも応用可能であって、例えば精子の診断に用いて不妊治療にも役立たせることができる。
【００１５】
この結果、従来の方法では不可能であった再感染が懸念される特異的な運動能を有するピロリ菌を見出すことができ、例えば抗生物質と梅抽出物を併用することにより耐性ピロリ菌による再感染の予防を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明に係る抗菌力試験方法は、個々の細菌または細胞が有する特異的運動能を指標とするものであって、具体的には、被験物質と接触させた後の細菌または細胞を観察し、観察した細菌・細胞中に際だった運動能を示す細菌の存否を基準として、薬剤感受性を判断するものである。
【００１７】
ここで、個々の細菌または細胞が有する特異的運動能とは、１個１個の細菌個体、細胞個体が有する運動能であって、数多くの細菌（細胞）の中で、ある個体が他の個体に比して際だって有している運動能を意味する。すなわち、本発明の試験方法は、細菌集団の平均的な運動能を評価する従来の方法とは異なり、個々の細菌が有する運動能に着目した全く新たな概念を導入した方法である。したがって、本発明の測定対象となるのは、鞭毛や繊毛を有し、自走性を有する細菌や細胞であり、例えば、ヘリコバクター ピロリ、ヘリコバクター フェリス、ヘリコバクター ヘイルマンニ、ヘリコバクター ムステレ、ヘリコバクター カニス、ヘリコバクター ビリス、ヘリコバクター ヘパチクス、ヘリコバクター ムリダルム及びヘリコバクター トログンタムなどのピロリ菌を始めとする各種の細菌、ヒトや動物の精子、ゾウリムシ等の原核生物などが挙げられる。
【００１８】
通常、細菌・細胞と接触させる薬剤濃度を高めていくと、大多数の細菌・細胞は自己の運動を停止する。したがって、薬剤と接触させた状態で細胞を顕微鏡で観察した場合、薬剤濃度の上昇と共に自走する細菌の数は減少し、視野には運動している細菌はほとんど観察されない。例えば、ピロリ菌の場合には、そのほとんどがcoccoid formを形成することになる。ところが、ある濃度においては、ほとんどの細胞が運動を停止しているにもかかわらず、視野の中に１〜２，３個の細胞が特異的な運動能を示し、際だって移動する細胞が観察される場合がある（図２参照：図２のほぼ中央に長く見える菌体がそれである。）。そして、このような場合に薬剤非感受性であると評価することができる。本試験方法は、このように細菌・細胞と接触させる薬剤濃度を高めた場合に、顕微鏡観察下で観察される際だった運動能を示す細菌・細胞の有無を指標とするものである。
【００１９】
細菌・細胞が特異的な運動能を有するか否かの判断には、種々の基準が考えられるが、目視で確認することがもっとも簡便かつ確実な方法である。すなわち、運動能に影響を与えない濃度の薬剤と接触させた場合には、顕微鏡下で観察される細菌のほとんどは自走性を示し、視野に見える細菌の位置は絶えず変化している。ところが、薬剤の濃度を高めると、観察される細菌のほとんどがcoccoid formを示して運動を停止するようになり、位置の変化が見られない細胞が大多数を占めるようになる。しかしながら、このように運動しない細胞がほとんどを占める状況下でも、際立った自走性を示し、短時間の間に位置を大きく変化させる細菌を見つけることができる。このような場合に、特異的な運動能を有していると判断される。ちなみに、薬剤濃度を運動能に影響を与えない濃度から徐々に薬剤濃度を高めて行くと、ある濃度範囲ではこの特異的な運動能を示す細菌数はほとんど変化せず（概ね１〜数個程度で一定である。）、さらに高い濃度になるとこのような特異的な運動能を示す細菌は見られなくなる。
【００２０】
また、このような細菌・細胞は撮像装置およびコンピューターを備えた画像処理装置によっても検出することができる。この場合、例えば、１視野に観察できる細胞の平均運動量（単位時間当たりの移動量）を算出し、当該平均運動量の１０倍以上の運動量を有するか否かで判定するようにしてもよい。また、予想される運動量を予め設定しておき（基準運動量の設定）、その運動量以上の運動をした個体を検出するようにしてもよい。このような画像処理装置としては、例えば、精子の運動量を測定する装置（ニューロサイエンス社製  シーメン）、上記非特許文献１に示されたC-Imaging C-MEM（Complix Inc., Cramberry, Pa.）などを用いることができる。なお、細胞全体の平均運動量が大きい場合にこのような特異的運動能を示す細菌・細胞が観察されたとしても、薬剤濃度を高めた場合にこの個体が特異的な運動能を維持するとは限らない。このため、予想運動量を設定する場合には、対照として細胞全体の運動量を測定し、全体の運動量がほとんどないことを確認しておくのが好ましい。
【００２１】
また、観察対象となる視野は、観察対象である細菌等の大きさに合わせて通常選択される倍率におけるものであり、ピロリ菌や精子を対象とする場合には通常接眼５〜２０倍、対物１０〜４０倍の１００〜２００倍の倍率が用いられる。また、選択される視野は、カバーガラス上から観察されうる領域から任意に１ないし数カ所の視野を選択してもよく、また、観察されうる領域のすべてを対象としても差し支えない。
【００２２】
本発明の試験方法において、薬剤非感受性であると判定する基準、すなわち耐性菌であると判断できる基準として、特異的な運動能を基準とするため、少なくとも１視野の中に数個以内、好ましくは１〜３個の菌体、さらに厳格な評価をするならば１個の菌体である。そして、さらに厳格な判定基準とするのであれば、観察対象となる視野内における菌体数が数個、好ましくは１〜３個の存否で判定することにすればよい。すなわち、観察した視野内に特異的に運動能を示す菌体が上記個数のときに、薬剤非感受性濃度として判定すればよい。
【００２３】
次に、本発明の感受性試験について手順を追って説明する。まず、対象となる細菌や細胞を所定の濃度に調整する。次いで、この調整された菌液の一定量を、予め段階的に濃度を変化させた一連の被験物質溶液に添加し、被験物質と細菌等と接触させる。このとき、細菌が一定濃度（（例えば１０万細胞数／ｍｌ）となるように希釈系列を調整する。そして、接触開始から一定時間が経過したならば、この混合液を取り出し、顕微鏡観察下で細菌等の運動性について観察を行う。
【００２４】
被験物質の濃度は、作用効果がほとんど見られない濃度から完全に死滅もしくは運動能を停止する濃度までの範囲内で任意の段階的に、例えば２倍希釈や１０倍希釈で調整すればよい。また、被験物質との接触時間も任意であるが、通例、８時間以下もしくは１２時間程度とされる。試験の作業効率を考慮したものである。本発明においては細菌と被験物質とを十分に接触させ、大多数の細胞・細菌の運動能を低下させることができればよく、ＭＩＣ法のごとく細菌等の培養が不要なため２４時間以上の培養は不要である。また、被験物質の殺菌ないし運動抑制効果が高い場合には、１〜２時間程度の接触時間でも十分な判定を行うことが可能である。本発明の試験方法においては、被験物質と接触した細菌の大多数が運動を停止することが重要であって、細菌の全てが運動を停止する接触条件（時間および濃度）と９割程度の細菌が運動を停止する接触条件を見出ることができれば、この２つの接触条件の中間において、際だった自走性を有する個体を見つけ出すことができる。以上の手順により、特異的に有する走行性を有する細菌個体を見つけ出し、特異的運動能を有する個体に対する薬剤非感受性濃度を知ることができる。また、２以上の薬剤に対する薬剤非感受性を対比するのが目的であれば、一段階濃度の被験物質と接触させて、特異的な運動能を有する細菌の有無を観察すればよい。
【００２５】
このように、本発明の方法によると、従来の方法では薬剤感受性とされていた菌集団の中から、個別的に増殖可能性を有する細菌・細胞の存在を見出すことができる。これにより確実に抗菌力を発揮する薬剤を選択し、より適切な濃度で投与することができる。こうして、ピロリ菌の再感染を適切に防止できる。特に、従来の方法では、個々のピロリ菌の運動能に着目していなかったために、再感染の防止という観点では評価できなかったが、本発明の試験法は、従来の薬剤耐性菌とは全く異なる概念で判定することにより、再感染の防止に重要である薬剤耐性菌に対する適切な治療剤の選定、被験物質のスクリーニング作業が効果的に行える。また、短時間で薬剤非感受性を判定できるので、非常に効率よく、スクリーニング試験を行うことができる。
【００２６】
この試験方法によって、例えば梅抽出物と抗生物質とを併用することにより、上記のような特異的な運動能を有するピロリ菌（運動耐性ピロリ菌とも言う。）の出現を抑えることが見出せた。
【００２７】
抗生物質と併用される梅抽出物は、梅の果実を水やエタノール等のアルコールその他の抽出溶媒で抽出したものであって、梅の種類は特に限定されるものではなく、例えば古城種や南高種などが例示される。また、使用される抗生物質も限定されるものではなく、従来ピロリ菌に対して用いられるランソアラゾールやアモキシシリン、クラリスロマイシンなどが用いられる。これらの抗生物質は、１種以上もしくは２種以上を用いても差し支えないが、梅抽出物を併用すれば、いずれか１種との併用で十分である。
【００２８】
併用に際して、抗生物質は従来の単独使用の場合とほぼ同様の濃度で使用し、梅抽出物はこの濃度に対してほぼ０.０１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０.１〜１μｇ／ｌの濃度を添加すればよい。その投与比は、抗生物質によっても異なるが、抗生物質１に対して、梅抽出物０.０１〜１００の範囲内で適宜調整すればよい。
【００２９】
投与方法は従来の抗生物質と同様の投与方法が選択され、内服もしくは注射剤とされ、製剤化にあたっても従来法と同様な賦形剤を用いて製剤すればよい。
【００３０】
次に以下の実施例にしたがって本発明についてさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されないのは言うまでもない。
【実施例１】
【００３１】
ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）を、Brucella Brotho培地（ベクトンディキンソン社製、商品名BBL）で培養し、1.０×１０6cells／mlに調整した。次いで、アモキシシリンの水溶液に前記菌培養液を加え、最終菌濃度が1.０×１０5cells／ml、最終抗生物質の濃度が０.００１μｇ／ｍｌ〜１６μｇ／ｍｌの希釈系列（１２段階）となるように混合した。混合後、８時間経過したところで、混合液０.０２ｍｌを取り出し、ガラスプレートとカバーグラスとから構成されたチャンバー（Leja株式会社製、容量０.０２ｍｌ）に入れ２００倍（対物５倍×接眼４０倍）の顕微鏡観察を行った。
【００３２】
観察は、チャンバーの全ての視野について観察を行ったところ、抗生物質の濃度が０.５μｇ／ｍｌにおいて、特異的に運動能を発揮した１菌体（非感受性菌＝運動耐性ピロリ菌）が観察され、１.０μｇ／ｍｌでようやく運動能を発揮する菌体が観察されなくなった。
【００３３】
参考として、上記菌培養液をＭＩＣ法により測定したところ、ＭＩＣは０.０５μｇ／ｍｌと評価され、この濃度では、本発明の試験方法ではなお、薬剤非感受性として判断され、臨床的には従来の投与量より１０倍程度の高い抗生物質濃度となるような投与設計が必要と判断される。
【実施例２】
【００３４】
次に、抗生物質としてクラリスロマイシンを用いて、実施例１と同様な試験を行った。この場合には、ＭＩＣは０.１μｇ／ｍｌと評価され、抗生物質の濃度が０.１μｇ／ｍｌにおいて、特異的に運動能を発揮した３菌体が観察された。
【００３５】
この試験においては、ＭＩＣと本発明による方法とではほぼ一致した結果が見られた。なお、実施例１と比較すれば、実施例１より低濃度において運動能を特異的に発揮する菌体が観察されたことにより、アモキリシリン運動耐性であって、クラリスロマイシンの投与が望ましいと判断される。
【実施例３】
【００３６】
次に、抗生物質としてアモキシシリン及び梅抽出物を用いて、実施例１と同様な試験を行った。梅抽出物は、未熟梅（５０ｋｇ）をメタノールで１２時間還流して得られたものであり（抽出物１３８７ｇ）、抗生物質０.０５μｇ／ｍｌに対して、梅抽出物０.１〜３μｇ／ｍｌの４段階で添加した。この場合では、抗生物質単独使用の場合には各濃度で運動耐性菌が見られたが（図２参照）、梅抽出物を１μｇ／ｍｌを加えることによって、耐性菌が見られなくなった（図３参照）。また、梅抽出物を単独で投与した場合（３μｇ／ｌ）にも効果はなかった（図４参照）。このように、梅抽出物には、抗生物質の作用を助け運動耐性菌の出現を抑えることができた。この結果、抗生物質と梅抽出物の併用によって、ピロリ菌による再感染の発生を防止することができると言える。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、新規な抗ピロリ菌物質のスクリーニングや薬剤感受性について迅速な判断を行い、新規抗生物質の開発、運動耐性ピロリ菌の治療に大きく寄与できる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】正常な状態のピロリ菌を示す写真である。
【図２】抗生物質と接触したピロリ菌の一個体が特異的に自走している状態を写した写真である。
【図３】梅抽出物および抗生物質と接触したピロリ菌の状態を示す写真である。
【図４】梅抽出物のみと接触させたピロリ菌の状態を示す写真である。
【図１】
2006006131.tif 000002
【図２】
2006006131.tif 000003
【図３】
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【図４】
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