(57)【要約】【課題】多数の予選択遺伝子の発現をモニタリングする方法を提供すること。【解決手段】２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異の確認方法であって、（ａ）表面に付加されたプローブオリゴヌクレオチドを包含する１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドアレイを提供し；（ｂ）上記核酸試料を上記の１つ又はそれ以上のアレイとハイブリダイズして、上記核酸試料中の核酸と上記の核酸又はその部分列と相補的である上記の１つ又はそれ以上のアレイ中のプローブオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッド二重鎖を形成し；（ｃ）上記の１つ又はそれ以上のアレイを核酸リガーゼと接触させ；そして（ｄ）ハイブリダイゼーションの上記差異が上記核酸レベルの差異を示す上記核酸試料間のハイブリダイゼーションの差異を確定する；工程を含んで成る方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）核酸を提供し；
（ｂ）上記核酸を増幅してアンプリコンを形成し；
（ｃ）上記のアンプリコンを断片化して上記アンプリコンの断片を形成し；そして
（ｄ）標識部分を少なくとも１つの上記断片と結合させる；
を含んで成る核酸の標識方法。
【請求項２】
以下の工程：
（ａ）核酸を提供し；
（ｂ）上記核酸を転写して転写核酸を形成し；
（ｃ）上記転写核酸を断片化して上記転写核酸の断片を形成し；そして
（ｄ）標識部分を少なくとも１つの上記の断片と結合させる；
を含んで成る核酸の標識方法。
【請求項３】
以下の工程：
（ａ）支持体と結合する少なくとも１つの核酸を提供し；
（ｂ）上記核酸にターミナルトランスフェラーゼで結合され得る標識部分を提供し；
（ｃ）上記ターミナルトランスフェラーゼを提供し；そして
（ｄ）上記ターミナルトランスフェラーゼを用いて上記標識部分を上記核酸と結合させる；
を含んで成る核酸の標識方法。
【請求項４】
以下の工程：
（ａ）支持体と結合する少なくとも２つの核酸を提供し；
（ｂ）上記核酸のモノマー単位の数を増大して上記の少なくとも２つの核酸上に共通核酸尾部を形成し；
（ｃ）上記共通核酸尾部を認識し得る標識部分を提供し；そして
（ｄ）上記の共通核酸尾部及び上記の標識部分を接触させる；
を含んで成る核酸の標識方法。
【請求項５】
以下の工程：
（ａ）支持体と結合する少なくとも１つの核酸を提供し；
（ｂ）上記核酸にリガーゼを用いて結合され得る標識部分を提供し；
（ｃ）上記リガーゼを提供し；そして
（ｄ）上記標識部分をリガーゼを用いて上記核酸部分に結合させる；
を含んで成る核酸の標識方法。
【請求項６】
次式：
【化１】
2006191932.tif 000026
（式中、Ｒ１は水素、ヒドロキシル、リン酸結合又はリン酸基であり；
Ｒ２は水素又はヒドロキシルであり；
Ｒ３は水素、ヒドロキシル、リン酸結合又はリン酸基であり；そして  Ｒ４は結合標識化部分である）
を有する化合物。
【請求項７】
次式：
【化２】
2006191932.tif 000027
（式中、Ｒ１は水素、ヒドロキシル、リン酸結合又はリン酸基であり；
Ｒ２は水素又はヒドロキシルであり；
Ｒ３は水素、ヒドロキシル、リン酸結合又はリン酸基であり；そして
Ｒ４は結合標識化部分である）
を有する化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する引照
本発明は、１９９６年１月２３日提出のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／０１０，４７１の一部継続であり、そして１９９７年１月９日提出の「Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」に対する暫定特許出願（発明者：Ｌｏｃｋｈａｒｔ、Ｃｒｏｎｉｎ、Ｌｅｅ、Ｔｒａｎ、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ、ＭｃＧａｌｌ及びＢａｒｏｎｅ）の一部継続である（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
本発明の開示内容の一部は、版権保護を受けるべき材料を含む。本版権所有者は、特許及び商標事務所の特許ファイル又は記録に現れるまさしくその形態での特許文書又は特許開示内容のいずれかによる電子写真式リダクションに対する異議はないが、そうでない場合にはいかなる版権もすべて、保有する。
【０００３】
多数の疾病状態は、遺伝子ＤＮＡのコピー数の変化による、又は特定の遺伝子の転写のレベルの変化による（例えば、イニシエーションの制御、ＲＮＡ前駆体の提供、ＲＮＡプロセッシング等）、種々の遺伝子の発現レベルの変化を特徴とする。例えば、遺伝物質の損失及び獲得は悪性形質転換及び進行に重要な役割を演じる。これらの獲得及び損失は、少なくとも２種類の遺伝子により「駆動」されると考えられる。癌遺伝子は腫瘍形成の正の調節因子であるが、一方腫瘍抑制遺伝子は腫瘍形成の負の調節因子である（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃｅｌｌ，６４：３１３−３２６（１９９１）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１１３８−１１４６（１９９１））。したがって、非調節性増殖の活性化の一つのメカニズムは、癌遺伝子タンパク質をコードする遺伝子の数を増大すること又はこれらの癌遺伝子の発現のレベルを増大すること（例えば、細胞又は環境の変化に対して）であり、別のメカニズムは遺伝物質を損失すること又は腫瘍抑制因子をコードする遺伝子の発現レベルを低減することである。このモデルは、神経膠腫の進行に関連した遺伝物質の損失及び獲得により支持される（Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．４６：３−８（１９９１））。したがって、特定の遺伝子（例えば腫瘍遺伝子又は腫瘍抑制因子）の発現（転写）レベルの変化は、種々の癌の存在及び進行の道標として役立つ。
【０００４】
同様に、細胞周期及び細胞発達の制御、並びに疾病は、特定遺伝子の転写レベルの変動を特徴とする。したがって、例えばウイルス感染はしばしば、特定ウイルスの遺伝子の発現の増大を特徴とする。例えば、単純ヘルペス、エプスタインーバーウイルス感染（例えば感染性単核球症）、サイトメガロウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス感染、パルボウイスル感染、ヒト乳頭腫ウイルス感染等は、すべて、それぞれのウイルス中に存在する種々の遺伝子の発現の増大を特徴とする。特徴的ウイルス遺伝子の発現レベル増大の検出は、疾病状態の有効な診断を提供する。特に、単純ヘルペスのようなウイルスは静止期に入り、短期間の迅速な複製中に出現するだけである。特徴的ウイルス遺伝子の発現レベルの増大は、このような活発な増殖（及びおそらくは感染）状態の検出を可能にする。
【０００５】
遺伝子発現をモニタリングする、又は定量するための「伝統的」ハイブリダイゼーションプロトコールの使用は問題である。例えばほぼ同一分子量の２つ又はそれ以上の遺伝子産物は、それらが電気泳動法により容易に分離されないために、ノーザンブロットで識別するのが難しいか又は不可能であることを立証する。
【０００６】
同様に、ハイブリダイゼーション効率及び交差反応性はプローブ中の遺伝子の特定サブ配列（領域）に伴って変化するので、標的遺伝子に対する１つのプローブに関して、あるいは２〜３つのプローブに関してさえ、正確且つ信頼できる測定値を得るのは難しい。
【０００７】
ＶＬＳＩＰＳＴＭ技術の開発は、非常に小さな表面積を占める多数の異なるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを合成するための方法を提供した（米国特許第５，１４３，８５４号明細書及び国際公開第９０／１５０７０号パンフレット参照）。米国特許出願公開第０８２，９３７号明細書（１９９３年６月２５日提出）は、標的核酸の完全配列を提供するために、そして特異的ヌクレオチド配列を含有する核酸の存在を検出するために用い得るオリゴヌクレオチドプローブのアレイの作製方法を記載する。
【０００８】
種々の遺伝子の発現における核酸存在量の差又は変化を測定する従来の方法（例えば、示差的表示、ＳＡＧＥ、ｃＤＮＡシーケンシング、クローンスポッティング等）は、適切な配列特異的プローブを設計するために、標的配列についての仮定を、あるいはそれに関する事前の知識を要する。他の方法、例えば差引きハイブリダイゼーションは事前の配列知識を要しないが、しかし示差的に発現される核酸に関する配列情報を直接提供する訳ではない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要約）
（項目１）  ２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異の確認方法であって、
（ａ）表面に付加されたプローブオリゴヌクレオチドを包含する１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドアレイを提供し；
（ｂ）上記核酸試料を上記の１つ又はそれ以上のアレイとハイブリダイズして、上記核酸試料中の核酸と上記の核酸又はその部分列と相補的である上記の１つ又はそれ以上のアレイ中のプローブオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッド二重鎖を形成し；
（ｃ）上記の１つ又はそれ以上のアレイを核酸リガーゼと接触させ；そして
（ｄ）ハイブリダイゼーションの上記差異が上記核酸レベルの差異を示す上記核酸試料間のハイブリダイゼーションの差異を確定する；
工程を含んで成る方法。
（項目２）  上記オリゴヌクレオチドアレイを１つ又はそれ以上の結紮可能オリゴヌクレオチドと接触させることをさらに包含する項目１の方法。
（項目３）  上記結紮可能オリゴヌクレオチドが予選択長の考え得るすべてのオリゴヌクレオチドのプールである項目２の方法。
（項目４）  上記確定が上記アレイに付着する１つ又はそれ以上の上記結紮可能オリゴヌクレオチドを検出することを包含する項目２の方法。
（項目５）  上記１つ又はそれ以上のアレイが少なくとも２つのアレイであって、上記アレイがプローブオリゴヌクレオチド組成物中で本質的に同一である項目１の方法。
（項目６）  上記プローブオリゴヌクレオチドの空間的配置が本質的に上記アレイと同一である項目５の方法。
（項目７）  上記核酸試料の各々が実質的に同一プローブオリゴヌクレオチド組成を有する異なるアレイとハイブリダイズされる項目１の方法。
（項目８）  ２つ又はそれ以上の上記核酸試料が単一オリゴヌクレオチドアレイとハイブリダイズされる項目１の方法。
（項目９）  上記核酸試料が単一オリゴヌクレオチドアレイと同時にハイブリダイズされる項目８の方法。
（項目１０）  上記プローブオリゴヌクレオチドが予選択ヌクレオチドで互いに異なるプローブオリゴヌクレオチドの対である項目１の方法。
（項目１１）  上記プローブオリゴヌクレオチド対が単一ヌクレオチドで互いに異なる項目１０の方法。
（項目１２）  上記確定が上記プローブオリゴヌクレオチド対の成員間の試料核酸ハイブリダイゼーション強度の差異を確定することを包含する項目１０の方法。
（項目１３）  ２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異を確認する方法であって、
（ａ）定常領域及び可変領域から成る上記プローブオリゴヌクレオチドを包含する１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドアレイを提供し；
（ｂ）上記核酸試料を上記の１つ又はそれ以上のアレイとハイブリダイズして、上記核酸試料中の核酸と上記核酸又はその部分列と相補的である上記可変領域との間にハイブリッド二重鎖を形成し；そして
（ｃ）上記ハイブリダイゼーションの差異が上記核酸レベルの差異を示す上記核酸試料間のハイブリダイゼーションの差異を確定する；
工程を含んで成る方法。
（項目１４）  上記可変領域が約３ヌクレオチド〜約５０オリゴヌクレオチドの長さで変化する項目１３の方法。
（項目１５）  上記プローブオリゴヌクレオチドの可変領域が予選択長の考え得るすべてのオリゴヌクレオチドを包含する項目１３の方法。
（項目１６）  上記可変領域が少なくとも５ヌクレオチドの長さである項目１５の方法。
（項目１７）  上記定常領域が３ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの長さの範囲である項目１３の方法。
（項目１８）  上記定常領域が制限エンドヌクレアーゼの認識部位のセンス又はアンチセンス配列と相補的なヌクレオチド配列を包含する項目１３の方法。
（項目１９）  上記オリゴヌクレオチドアレイを上記定常領域又はその部分列と相補的な定常オリゴヌクレオチドと接触させることをさらに包含する項目１３の方法。
（項目２０）  上記アレイをリガーゼと接触させることを包含する項目１９の方法。
（項目２１）  上記確定が上記定常オリゴヌクレオチドに付加された上記核酸試料の核酸を検出することを包含する項目１９の方法。
（項目２２）  上記プローブオリゴヌクレオチドが予選択ヌクレオチドで互いに異なるプローブオリゴヌクレオチドの対である項目１３の方法。
（項目２３）  上記確定が上記プローブオリゴヌクレオチド対の成員間の試料核酸ハイブリダイゼーション強度の差を確定することを包含する項目２２の方法。
（項目２４）  ２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異を確認する方法であって、
（ａ）プローブオリゴヌクレオチドの各対の成員が予選択ヌクレオチドで互いに異なるプローブオリゴヌクレオチドの対を包含するオリゴヌクレオチドの１つ又はそれ以上のアレイを提供し；
（ｂ）上記核酸試料を上記の１つ又はそれ以上のアレイとハイブリダイズして、上記核酸試料中の核酸と上記核酸又はその部分列と相補的である上記の１つ又はそれ以上のアレイ中のプローブオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッド二重鎖を形成し；そして
（ｃ）ハイブリダイゼーションの差異が上記核酸レベルの差異を示す上記核酸試料間のハイブリダイゼーションの差異を確定する；
工程を含んで成る方法。
（項目２５）  上記プローブオリゴヌクレオチドの各対の成員が中央に位置するヌクレオチドで互いに異なる項目２４の方法。
（項目２６）  ２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異の確認方法であって、
（ａ）１００以上の異なるプローブオリゴヌクレオチドを包含し；
異なるプローブオリゴヌクレオチドの各々がアレイの予定領域に位置し；
異なるプローブオリゴヌクレオチドの各々が末端共有結合を介して表面に付加され；
上記異なるプローブオリゴヌクレオチドの密度が約６０以上／ｃｍである
オリゴヌクレオチドアレイの１つ又はそれ以上のアレイを提供し；
（ｂ）上記核酸試料を上記の１つ又はそれ以上のアレイとハイブリダイズして上記核酸試料中の核酸と上記核酸又はその部分列と相補的な１つ又はそれ以上の上記アレイ中のプローブオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッド二重鎖を形成し；
（ｃ）上記ハイブリダイゼーションの差が上記核酸レベルの差を示す上記核酸試料間のハイブリダイゼーションの差異を確定する；
工程を含んで成る方法。
（項目２７）  上記の１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドアレイをリガーゼと接触させることをさらに包含する項目２６の方法。
（項目２８）  ２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異の確認方法であって、
（ａ）特定予選択遺伝子又はｍＲＮＡ由来の核酸とハイブリダイズするのに選択されないプローブオリゴヌクレオチドを各々包含する１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドアレイを提供し；
（ｂ）上記核酸試料を上記の１つ又はそれ以上のアレイとハイブリダイズして、上記核酸試料中の核酸と上記核酸又はその部分列と相補的である上記の１つ又はそれ以上のアレイ中のプローブオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッド二重鎖を形成し；そして
（ｃ）上記ハイブリダイゼーションの差異が上記核酸レベルの差異を示す上記核酸試料間のハイブリダイゼーションの差異を確定する；
工程を含んで成る方法。
（項目２９）  上記プローブオリゴヌクレオチドが予選択ヌクレオチドで互いに異なるプローブオリゴヌクレオチドの対である項目２８の方法。
（項目３０）  上記確定が上記プローブオリゴヌクレオチド対の成員間の試料核酸ハイブリダイゼーション強度の差異を確定することを包含する項目２９の方法。
（項目３１）  ２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異の確認方法であって、
（ａ）無作為選択、偶発的選択、ヌクレオチド組成偏向選択から成る群から選択される方法により選択されるヌクレオチド配列又は部分列を包含するプローブオリゴヌクレオチド及び予選択長の考え得るすべてのオリゴヌクレオチドを各々包含する１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドアレイを提供し；
（ｂ）上記核酸試料を上記の１つ又はそれ以上のアレイとハイブリダイズして、上記核酸試料中の核酸と上記核酸又はその部分列と相捕的である上記の１つ又はそれ以上のアレイ中のプローブオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッド二重鎖を形成し；そして
（ｃ）上記ハイブリダイゼーションの差異が上記核酸レベルの差異を示す上記核酸試料間のハイブリダイゼーションの差異を確定する；
工程を含んで成る方法。
（項目３２）  上記ヌクレオチド配列又はヌクレオチド部分列が以下の：
考え得るすべての６ｍｅｒｓ、考え得るすべての７ｍｅｒｓ、考え得るすべての８ｍｅｒｓ、考え得るすべての９ｍｅｒｓ、考え得るすべての１０ｍｅｒｓ、考え得るすべての１１ｍｅｒｓ及び考え得るすべての１２ｍｅｒｓから成る群から選択される特定長の考え得るすべてのオリゴヌクレオチドである項目３１の方法。
（項目３３）  多数の遺伝子の発現の同時モニタリング方法であって、
（ａ）１つ又はそれ以上の上記遺伝子のＲＮＡ転写体を包含する標的核酸又は上記ＲＮＡ転写体由来の核酸のプールを提供し；
（ｂ）上記核酸のプールを表面に固定されたプローブオリゴヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチドアレイとハイブリダイズし；
（ｃ）上記オリゴヌクレオチドアレイをリガーゼと接触させ；そして
（ｄ）上記核酸と上記アレイのハイブリダイゼーションを定量し、上記定量が上記遺伝子の転写のレベルの測定を提供する；
工程を含んで成る方法。
（項目３４）  上記プローブオリゴヌクレオチドが１つ又はそれ以上の上記遺伝子の予選択ＲＮＡ転写体と相補的なヌクレオチド配列又はヌクレオチド部分列、あるいは上記ＲＮＡ転写体由来の核酸を包含する項目３３の方法。
（項目３５）  多数の遺伝子の発現の同時モニタリング方法であって、
（ａ）定常領域及び可変領域から成る上記プローブオリゴヌクレオチドを包含する１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドアレイを提供し；
（ｂ）１つ又はそれ以上の上記遺伝子のＲＮＡ転写体を包含する標的核酸、又は上記ＲＮＡ転写体由来の核酸のプールを提供し；
（ｃ）核酸の上記プールをオリゴヌクレオチドプローブのアレイとハイブリダイズし；そして
（ｄ）上記核酸と上記アレイのハイブリダイゼーションを定量し、上記定量が上記遺伝子の転写のレベルの測定を提供する；
工程を含んで成る方法。
（項目３６）  上記プローブオリゴヌクレオチドが１つ又はそれ以上の上記遺伝子の予選択ＲＮＡ転写体と相補的なヌクレオチド配列又はヌクレオチド部分列あるいは上記ＲＮＡ転写体由来の核酸を包含する項目３５の方法。
（項目３７）  ２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異を確認するための核酸アレイの作製方法であって、
（ａ）定常領域及び可変領域から成るプローブオリゴヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチドアレイを提供し；
（ｂ）１つ又はそれ以上の上記核酸試料を上記アレイとハイブリダイズして上記可変領域と、上記可変領域と相補的な部分列を包含する上記核酸試料中の核酸とのハイブリッド二重鎖を形成し；
（ｃ）上記ハイブリッド二重鎖を包含する試料核酸を上記プローブオリゴヌクレオチドアレイに付着させ；そして
（ｄ）非付着核酸を除去して上記アレイに付加された試料核酸を保有する高密度オリゴヌクレオチドアレイを提供する；
工程を含んで成る方法。
（項目３８）  ２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異を確認するための核酸アレイの作製方法であって、
（ａ）１００以上の異なるプローブオリゴヌクレオチドを包含し；
各々の異なるプローブオリゴヌクレオチドは、アレイの予定領域に位置し；
各々の異なるプローブオリゴヌクレオチドは末端共有結合を介して表面に付着され；
上記異なるプローブオリゴヌクレオチドの密度は１ｃｍ２当たり約６０以上であるアレイを提供し；
（ｂ）上記アレイを上記の２つ又はそれ以上の核酸試料のうちの１つ又はそれ以上のと接触させて、それにより上記の２つ又はそれ以上の核酸試料のうちの一つの核酸が上記アレイ中でプローブオリゴヌクレオチドとハイブリッド二重鎖を形成し；
（ｃ）上記ハイブリッド二重鎖を包含する試料核酸を上記プローブオリゴヌクレオチドアレイに付着させ；そして
（ｄ）非付着核酸を除去して上記アレイに付加された試料核酸を保有する高密度オリゴヌクレオチドアレイを提供する
工程を包含する方法。
（項目３９）  ２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差を確認するためのキットであって、
表面に付加されたプローブオリゴヌクレオチドを包含する１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドアレイを含入する容器；及び
リガーゼを含入する容器；
を含んで成るキット。
（項目４０）  ２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差を確認するためのキットであって、
定常領域及び可変領域から成るプローブオリゴヌクレオチドを包含する１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドアレイを含入する容器
を含んで成るキット。
（項目４１）  上記定常領域又はその部分列と相補的な定常オリゴヌクレオチドをさらに包含する項目４０のキット。
（項目４２）  以下の工程：
（ａ）核酸を提供し；
（ｂ）上記核酸を増幅してアンプリコンを形成し；
（ｃ）上記のアンプリコンを断片化して上記アンプリコンの断片を形成し；そして
（ｄ）標識部分を少なくとも１つの上記断片と結合させる；
を含んで成る核酸の標識方法。
（項目４３）  以下の工程：
（ａ）核酸を提供し；
（ｂ）上記核酸を転写して転写核酸を形成し；
（ｃ）上記転写核酸を断片化して上記転写核酸の断片を形成し；そして
（ｄ）標識部分を少なくとも１つの上記の断片と結合させる；
を含んで成る核酸の標識方法。
（項目４４）  以下の工程：
（ａ）支持体と結合する少なくとも１つの核酸を提供し；
（ｂ）上記核酸にターミナルトランスフェラーゼで結合され得る標識部分を提供し；
（ｃ）上記ターミナルトランスフェラーゼを提供し；そして
（ｄ）上記ターミナルトランスフェラーゼを用いて上記標識部分を上記核酸と結合させる；
を含んで成る核酸の標識方法。
（項目４４）  以下の工程：
（ａ）支持体と結合する少なくとも２つの核酸を提供し；
（ｂ）上記核酸のモノマー単位の数を増大して上記の少なくとも２つの核酸上に共通核酸尾部を形成し；
（ｃ）上記共通核酸尾部を認識し得る標識部分を提供し；そして
（ｄ）上記の共通核酸尾部及び上記の標識部分を接触させる；
を含んで成る核酸の標識方法。
（項目４５）  以下の工程：
（ａ）支持体と結合する少なくとも１つの核酸を提供し；
（ｂ）上記核酸にリガーゼを用いて結合され得る標識部分を提供し；
（ｃ）上記リガーゼを提供し；そして
（ｄ）上記標識部分をリガーゼを用いて上記核酸部分に結合させる；
を含んで成る核酸の標識方法。
（項目４６）  次式：
【００１０】
【化３】
2006191932.tif 000002
（式中、Ｒ１は水素、ヒドロキシル、リン酸結合又はリン酸基であり；
Ｒ２は水素又はヒドロキシルであり；
Ｒ３は水素、ヒドロキシル、リン酸結合又はリン酸基であり；そして  Ｒ４は結合標識化部分である）
を有する化合物。
（項目４７）  次式：
【００１１】
【化４】
2006191932.tif 000003
（式中、Ｒ１は水素、ヒドロキシル、リン酸結合又はリン酸基であり；
Ｒ２は水素又はヒドロキシルであり；
Ｒ３は水素、ヒドロキシル、リン酸結合又はリン酸基であり；そして
Ｒ４は結合標識化部分である）
を有する化合物。
（項目４８）  ２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異の確認方法であって、
（ａ）無作為選択、偶発的選択、ヌクレオチド組成偏向選択から成る群から選択される方法により選択されるヌクレオチド配列又は部分列を包含するプローブオリゴヌクレオチド及び予選択長の考え得るすべてのオリゴヌクレオチドを各々包含する１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドアレイを提供し；
（ｂ）上記アレイ上のプローブオリゴヌクレオチドの位置及び配列を記載するソフトウエアを提供し；
（ｃ）上記核酸試料を上記の１つ又はそれ以上のアレイとハイブリダイズして、上記核酸試料中の核酸と上記核酸又はその部分列と相補的である上記の１つ又はそれ以上のアレイ中のプローブオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッド二重鎖を形成し；そして
（ｄ）上記ハイブリダイジングが上記核酸レベルの差異を示すように上記ソフトウエアを操作する；
工程を含んで成る方法。
【００１２】
本発明は、一実施態様において、多数の予選択遺伝子の発現をモニタリングする方法（本明細書中では「発現モニタリング」と呼ぶ）を提供する。別の実施態様では、本発明は２つ又はそれ以上の核酸（例えばＲＮＡ又はＤＮＡ）試料の組成の差を確認する方法を提供する。核酸存在量が試料が得られる生物学的試料中の発現レベルを反映する場合、本発明は２つ又はそれ以上の試料間の発現プロフィールの差異を確認する方法を提供する。これらの「一般的差異スクリーニング法」は、迅速で、適用が簡単で、発現が２試料間で異なる特定の配列に関する先験的仮定を必要とせず、そして存在量が試料間で異なる核酸に関する直接的配列情報を提供する。
【００１３】
一実施態様では、本発明は２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異の確認方法を提供する。本方法は、（ａ）表面に付着したプローブオリゴヌクレオチドを包含する１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドアレイを提供し；（ｂ）上記の核酸試料を上記の１つ又はそれ以上のアレイとハイブリダイズして、上記の核酸試料中の核酸と上記の核酸又はそのサブ配列と相補的である上記の１つ又はそれ以上のアレイ中の上記のプローブオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッド二重鎖を形成し；（ｃ）上記の１つ又はそれ以上のアレイを核酸リガーゼと接触させ；そして（ｄ）ハイブリダイゼーションの差異が上記の核酸レベルの差異を示す上記の核酸試料間のハイブリダイゼーションの差異を確定する工程を包含する。
【００１４】
別の実施態様では、２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異を確定する方法は、以下の工程を包含する：（ａ）定常領域及び可変領域から成るプローブオリゴヌクレオチドを包含する１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドアレイを提供し；（ｂ）上記の核酸試料を上記の１つ又はそれ以上のアレイとハイブリダイズして、上記の核酸試料中の核酸と上記の核酸又はそのサブ配列と相補的である上記の可変領域との間にハイブリッド二重鎖を形成し；そして（ｃ）ハイブリダイゼーションの差異が上記の核酸レベルの差異を示す上記の核酸試料間のハイブリダイゼーションの差異を確定する。
【００１５】
さらに別の実施態様では、２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異を確定する方法は、以下の工程を包含する：（ａ）１つ又はそれ以上の高密度オリゴヌクレオチドアレイを提供し；（ｂ）上記の核酸試料を上記の１つ又はそれ以上のアレイとハイブリダイズして、上記の核酸試料中の核酸と上記の核酸又はそのサブ配列と相補的である上記の１つ又はそれ以上のアレイ中のプローブオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッド二重鎖を形成し；そして（ｃ）ハイブリダイゼーションの差異が上記の核酸レベルの差異を示す上記の核酸試料間のハイブリダイゼーションの差異を確定する。
【００１６】
さらに別の実施態様では、２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異を確定する方法は、以下の工程を包含する：（ａ）特定予選択遺伝子又はｍＲＮＡ由来の核酸とハイブリダイズするのに選択されないプローブオリゴヌクレオチドを各々包含する１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドアレイを提供し；（ｂ）上記の核酸試料を上記の１つ又はそれ以上のアレイとハイブリダイズして、上記の核酸試料中の核酸と上記の核酸又はそのサブ配列と相補的である上記の１つ又はそれ以上のアレイ中のプローブオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッド二重鎖を形成し；そして（ｄ）ハイブリダイゼーションの差異が上記の核酸レベルの差異を示す上記の核酸試料間のハイブリダイゼーションの差異を確定する。
【００１７】
別の実施態様では、２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異を確定する方法は、以下の工程を包含する：（ａ）無作為選択、偶発的選択、ヌクレオチド組成偏向選択から成る群から選択される方法により選択されるヌクレオチド配列又はサブ配列を包含するプローブオリゴヌクレオチド及び予選択長の考え得るすべてのオリゴヌクレオチドを各々包含する１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドアレイを提供し；（ｂ）上記の核酸試料を上記の１つ又はそれ以上のアレイとハイブリダイズして、上記の核酸試料中の核酸と上記の核酸又はそのサブ配列と相補的である上記の１つ又はそれ以上のアレイ中のプローブオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッド二重鎖を形成し；そして（ｃ）ハイブリダイゼーションの差異が上記の核酸レベルの差異を示す上記の核酸試料間のハイブリダイゼーションの差異を確定する。
【００１８】
別の実施態様では、２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異を確定する方法は、以下の工程を包含する：（ａ）無作為選択、偶発的選択、ヌクレオチド組成偏向選択から成る群から選択される方法により選択されるヌクレオチド配列又はサブ配列を包含するプローブオリゴヌクレオチド及び予選択長の考え得るすべてのオリゴヌクレオチドを各々包含する１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチド配列を提供し；（ｂ）上記のアレイ上のプローブオリゴヌクレオチドの位置及び配列を記載するソフトウエアを提供し；（ｃ）上記の核酸試料を上記の１つ又はそれ以上のアレイとハイブリダイズして、上記の核酸試料中の核酸と上記の核酸又はそのサブ配列と相補的である上記の１つ又はそれ以上のアレイ中のプローブオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッド二重鎖を形成し；そして（ｄ）上記のハイブリダイジングが上記の核酸レベルの差異を示すように上記のソフトウエアを操作する。
【００１９】
本発明はさらに、多数の遺伝子の発現を同時にモニタリングする方法を提供する。一実施態様において、これらの方法は、（ａ）前記遺伝子の１又は複数のＲＮＡ転写物を含んで成る標的核酸、又は該ＲＮＡ転写物に由来する核酸のプールを提供し；（ｂ）前記核酸のプールを表面に固定化したプローブオリゴヌクレオチドを含んで成るオリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズせしめ；（ｃ）前記オリゴヌクレオチドアレイをリガーゼと接触せしめ；そして（ｄ）前記アレイへの前記核酸のハイブリダイゼーションを定量し、ここでこの定量が前記遺伝子の転写のレベルの測定値を提供する。
【００２０】
２以上の核酸サンプル間の核酸レベルの相違を同定するための他の実施態様は、（ａ）予選択ヌクレオチド中で各対の成員が互いに異なるプローブオリゴヌクレオチドの対を各々包含する１つ又はそれ以上の対のオリゴヌクレオチドを提供し；（ｂ）上記の核酸試料を上記の１つ又はそれ以上のアレイとハイブリダイズして、上記の核酸試料中の核酸と上記の核酸又はそのサブ配列と相補的である上記の１つ又はそれ以上のアレイ中の上記のプローブオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッド二重鎖を形成し；（ｃ）ハイブリダイゼーションの差異が上記の核酸レベルの差異を示す上記の核酸試料間のハイブリダイゼーションの差異を確定する工程を包含する。
【００２１】
多数の遺伝子の発現を同時にモニタリングする別の方法は、以下の工程を包含する：（ａ）定常領域及び可変領域から成るプローブオリゴヌクレオチドを包含する１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドアレイを提供し；（ｂ）１つ又はそれ以上の上記の遺伝子のＲＮＡ転写体を包含する標的核酸、又は上記のＲＮＡ転写体由来の核酸のプールを提供し；（ｃ）１つ又はそれ以上の核酸の上記のプールを表面上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイとハイブリダイズし；そして（ｄ）上記の核酸と上記のハイブリダイゼーションを定量するが、この場合、定量は上記の遺伝子の転写のレベルの測定を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異を確認するための核酸アレイの作製方法を提供する。一実施態様では、本方法は以下の工程を包含する：（ａ）定常領域及び可変領域から成るプローブオリゴヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチドアレイを提供し；（ｂ）１つ又はそれ以上の上記の核酸試料を上記のアレイとハイブリダイズして上記の可変領域と、上記の可変領域と相補的なサブ配列を包含する上記の核酸試料中の核酸とのハイブリッド二重鎖を形成し；（ｃ）上記のハイブリッド二重鎖を包含する試料核酸を上記のプローブオリゴヌクレオチドアレイに付着させ；そして（ｄ）非付着核酸を除去して上記のアレイに付着した試料核酸を保有する高密度オリゴヌクレオチドアレイを提供する。
【００２３】
別の実施態様では、２つ又はそれ以上の核酸試料間の核酸レベルの差異を確認するための核酸アレイの作製方法は、以下の工程を包含する：（ａ）高密度アレイを提供し；（ｂ）上記のアレイを上記の２つ又はそれ以上の核酸試料の１つ又はそれ以上のと接触させ、それにより上記の２つ又はそれ以上の核酸試料の１つの核酸が上記のアレイのプローブオリゴヌクレオチドとハイブリッド二重鎖を形成し；（ｃ）上記のハイブリッド二重鎖を包含する試料核酸を上記のプローブオリゴヌクレオチドアレイに付着させ；そして（ｄ）非付着核酸を除去して上記のアレイに付着した試料核酸を保有する高密度オリゴヌクレオチドアレイを提供する。
【００２４】
本発明はさらに、本明細書中に記載した方法の実行のためのキットを提供する。一キットは、表面に付着したプローブオリゴヌクレオチドを包含する１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドアレイを含入する容器、及びリガーゼを含有する容器を包含する。別のキットは、定常領域及び可変領域から成るプローブオリゴヌクレオチドを包含する１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドアレイを含有する容器を包含する。このキットは、上記の定常領域又はそのサブ配列と相補的な定常オリゴヌクレオチドを任意に含む。
【００２５】
本発明の好ましい高密度オリゴヌクレオチドアレイは、１００以上の異なるプローブオリゴヌクレオチドを包含する。この場合、各々の異なるプローブオリゴヌクレオチドは、アレイの予定領域に局在する。各々の異なるプローブオリゴヌクレオチドは末端共有結合を介して表面に付着する。そして上記の異なるプローブオリゴヌクレオチドの密度は１ｃｍ２当たり約６０以上の異なるオリゴヌクレオチドである。高密度アレイは、本明細書中に記載されたアレイベースの方法のすべてに用い得る。発現モニタリングに用いられる高密度アレイは、典型的には１つ又はそれ以上の予選択遺伝子由来の核酸と相補的であるよう選択されるオリゴヌクレオチドプローブを含む。これに対比して、一般的差スクリーニングアレイは、無作為に、偶発的に、恣意的に選択されるプローブオリゴヌクレオチドを含有し得るか、又は特定（予選択）長の考え得るすべての核酸配列を包含する配列又はサブ配列を含む。
【００２６】
好ましい実施態様では、特定長の考え得るすべての核酸を包含するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドサブ配列のプールは、考え得るすべての６ｍｅｒｓ、考え得るすべての７ｍｅｒｓ、考え得るすべての８ｍｅｒｓ、考え得るすべての９ｍｅｒｓ、考え得るすべての１０ｍｅｒｓ、考え得るすべての１１ｍｅｒｓ及び考え得るすべての１２ｍｅｒｓから成る群から選択される。
【００２７】
本発明はさらに、核酸の標識方法を提供する。一実施態様では、本方法は以下の工程を包含する：（ａ）核酸を提供し；（ｂ）上記の核酸を増幅してアンプリコンを形成し；（ｃ）上記のアンプリコンを断片化して上記のアンプリコンの断片を形成し；そして（ｄ）標識部分を少なくとも１つの上記の断片と結合させる。
【００２８】
別の実施態様では、本方法は以下の工程を包含する：（ａ）核酸を提供し；（ｂ）上記の核酸を転写して転写核酸を形成し；（ｃ）上記の転写核酸を断片化して上記の転写核酸の断片を形成し；そして（ｄ）標識部分を少なくとも１つの上記の断片と結合させる。
【００２９】
さらに別の実施態様では、本方法は以下の工程を包含する：（ａ）支持体と結合する少なくとも１つの核酸を提供し；（ｂ）上記の核酸とターミナルトランスフェラーゼで結合され得る標識部分を提供し；（ｃ）上記のターミナルトランスフェラーゼを提供し；そして（ｄ）上記のターミナルトランスフェラーゼを用いて上記の標識部分を上記の核酸と結合させる。
【００３０】
さらに別の実施態様では、本方法は以下の工程を包含する：（ａ）支持体と結合する少なくとも２つの核酸を提供し；（ｂ）上記の核酸のモノマー単位の数を増大して前記少なくとも２つの核酸上に共通の核酸テイルを形成し；（ｃ）上記の共通核酸尾部を認識し得る標識部分を提供し；そして（ｄ）上記の共通核酸尾部及び上記の標識部分を接触させる。
【００３１】
さらに別の実施態様では、（ａ）支持体と結合する少なくとも１つの核酸を提供し；（ｂ）上記の核酸にリガーゼを用いて結合され得る標識部分を提供し；（ｃ）上記のリガーゼを提供し；そして（ｄ）上記の標識部分をリガーゼを用いて上記の核酸部分に結合させる。
【００３２】
本発明はさらに、本明細書中に記載される式の化合物を提供する。
【００３３】
（定義）
本明細書中で用いる場合、オリゴヌクレオチドのアレイとは、１つ又はそれ以上の固体支持体に（好ましくは単一末端共有結合を介して）結合される多数の異なる（連続）オリゴヌクレオチドを示すが、ここで、多数の支持体が存在する場合には、各々の支持体は複数のオリゴヌクレオチドを保有する。「アレイ」という用語は、支持体（単数又は複数）上のオリゴヌクレオチドの全集合又はその部分集合を示す。「同一アレイ」という用語は、２つ又はそれ以上のアレイを指すために用いられる場合、実質的に同一の存在量でそこに同一オリゴヌクレオチド種を有するアレイを意味するよう用いられる。オリゴヌクレオチド種の空間的分布は２つのアレイ間で異なるが、しかし好ましい実施態様では、それは実質的に同一である。２つのアレイが同一であるよう設計され、合成される場合でさえ、オリゴヌクレオチドプローブの存在量、組成及び分布の変動が認められる、と認識される。これらの変動は、好ましくは、かすかであるかおよび／または本明細書中に記載されているような対照の使用により補償される。
【００３４】
「大量平行スクリーニング」という語句は、少なくとも約１００、好ましくは約１０００、さらに好ましくは約１０，０００、そして最も好ましくは約１，０００，０００の異なる核酸ハイブリダイゼーションの同時スクリーニングを示す。
【００３５】
「核酸」又は「核酸分子」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを示し、別記しない限り、天然ヌクレオチドと同様に機能し得る天然ヌクレオチドの公知の類似体を包含する。
【００３６】
オリゴヌクレオチドは、約２〜約１０００ヌクレオチド、さらに典型的には約２〜約５００ヌクレオチドの長さの範囲の一本鎖核酸である。
【００３７】
本明細書中で用いる場合、「プローブ」は１つ又はそれ以上の型の化学結合により、通常は相補的塩基対合により、通常は水素結合形成により相補的配列の標的核酸と結合し得るオリゴヌクレオチド、と定義される。本明細書中で用いる場合、オリゴヌクレオチドプローブは、天然塩基（即ちＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ）又は修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシン等）を包含し得る。さらに、オリゴヌクレオチドプローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを妨げない限り、ホスホジエステル結合以外の結合により連結される。したがって、オリゴヌクレオチドプローブは、構成塩基がホスホジエステル結合よりむしろペプチド結合により連結されるペプチド核酸である。
【００３８】
「標的核酸」という用語は、オリゴヌクレオチドプローブが特異的にハイブリダイズする核酸（しばしば生物学的試料に由来し、したがって試料核酸とも呼ばれる）を示す。標的核酸は本質的に核酸のあらゆる供給源（例えば化学合成、増幅反応、法試料等が挙げられるが、これらに限定されない）から得られる、と認識される。それは、検出されるべき１つ又はそれ以上の標的核酸の存在又は非存在であるか、あるいは定量されるべき１つ又はそれ以上の標的核酸の量である。検出される標的核酸は、それらが特異的に結合する（ハイブリダイズする）対応するプローブ（単数又は複数）の核酸配列と相補的であるヌクレオチド配列を優先的に有する。標的核酸という用語は、プローブが特異的にハイブリダイズする大型核酸の特異的サブ配列を、あるいは存在量（濃度）および／または発現レベルを検出するのが望ましい全配列（例えば遺伝子又はｍＲＮＡ）を示す。
【００３９】
「連結可能オリゴヌクレオチド」又は「連結可能プローブ」又は「連結可能オリゴヌクレオチドプローブ」とは、リガーゼ（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ）の使用により別のオリゴヌクレオチドに連結され得るオリゴヌクレオチドを示す。連結可能オリゴヌクレオチドは、好ましくはデオキシリボヌクレオチドである。連結可能オリゴヌクレオチドを包含するヌクレオチドは、好ましくは「標準」ヌクレオチド；Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴ又はＵである。しかしながら、誘導、修飾又は代替ヌクレオチド（例えばイノシン）は、その存在が連結反応を妨げない限りは、存在し得る。連結可能プローブは、標識が連結反応を妨害しない限り、標識されるか、そうでなければ修飾され得る。同様に、ヌクレオチド間結合は、修飾が連結を妨害しない限り、修飾される。したがって、いくつかの場合には、連結可能オリゴヌクレオチドはペプチド核酸である。
【００４０】
「サブ配列」とは、核酸の長い配列の一部を包含する核酸の配列を示す。
【００４１】
「ゆらぎ」（ｗｏｂｂｌｅ）とは、オリゴヌクレオチド中の特定位置での縮重を指す。完全縮重又は「４方向」ゆらぎとは、核酸の集合（例えば、ゆらぎ位置でＤＮＡに関してはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ、ＲＮＡに関してはＡ、Ｇ、Ｃ又はＵを有するオリゴヌクレオチドプローブ）を示す。ゆらぎは、ヌクレオチドを、Ａ、Ｇ、ＣあるいはＴ又はＵを有する塩基対であるイノシンと置換することにより近似する。典型的には、オリゴヌクレオチドの化学合成中に生じる完全縮重ゆらぎを含有するオリゴヌクレオチドは、ゆらぎが導入される特定結合段階で４つの異なるヌクレオチドモノマーの混合物を用いることにより調製される。
【００４２】
「架橋」という用語は、架橋核酸に関して用いられる場合、相補的核酸配列を変性するために用いられる典型的条件下で分離されないよう核酸を付着させることを示す。架橋は、好ましくは核酸間の共有結合の形成を包含する。核酸を架橋する方法は、本明細書中に示されている。
【００４３】
「支持体に結合される」という語句は、共有結合、水素結合、イオン相互作用、疎水性相互作用又はその他の方法による付着を含めて、直接的又は間接的にそこに結合されることを意味する。
【００４４】
「アンプリコン」は、ＰＣＲ又はその他の方法による核酸の増幅の産物である。
【００４５】
「核酸を転写する」とは、デオキシリボ核酸からリボ核酸の生成、そしてその逆（リボ核酸からデオキシリボ核酸の生成）を意味する。核酸は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素又はその他の方法により転写される。
【００４６】
標識部分とは、本明細書中に記載した又は当業界で公知の種々の方法により検出され得る部分を意味する。
【００４７】
「複雑性」という用語は、Ｂｒｉｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９：３６３（１９７４）により確定されたようなこの用語の標準的意味に従って、本明細書中で用いられ（核酸複雑性のさらなる説明に関しては、Ｃａｎｔｏｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｐａｒｔ  ＩＩＩ，１２２８−１２３０も参照）。
【００４８】
「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的ハイブリダイゼーションを示し、標的ポリヌクレオチド配列の所望の検出を達成するためにハイブリダイゼーション培地の緊縮性を低減することにより適応され得る小ミスマッチを包含する。
【００４９】
「〜との特異的ハイブリダイズ」という語句は、特定のヌクレオチド配列が複合混合物（例えば全細胞性）ＤＮＡ又はＲＮＡ中に存在する場合に緊縮条件下でその配列と優先的にある分子が結合、二重鎖化又はハイブリダイズすることを示す。
【００５０】
「緊縮条件」という用語は、プローブがその標的サブ配列と優先的にハイブリダイズし、他の配列とは少ししか、又は全くハイブリダイズしない条件を示す。
【００５１】
緊縮条件は配列依存性であり、異なる環境では異なる。配列が長いほどより高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、緊縮条件は、限定イオン強度及びｐＨでの特異的配列に関する融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が平衡状態（標的配列は一般に余分に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％は平衡状態で占められる）で標的配列とハイブリダイズする温度である（限定イオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下）。典型的には、緊縮条件は、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が少なくとも約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（又はその他の塩）であり、温度は短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃である。緊縮条件はさらに、脱安定化剤、例えばホルムアミドの付加により達成され得る。
【００５２】
「完全マッチプローブ」という用語は、特定の標的配列と完全に相補的である配列を有するプローブを示す。被験プローブは、典型的には標的配列の一部（サブ配列）と完全に相補的である。完全マッチ（ＰＭ）プローブは、「被験プローブ」、「正規化対照」プローブ、発現レベル対照プローブ等である。しかしながら、完全マッチ対照又は完全マッチプローブは、「ミスマッチ対照」又は「ミスマッチプローブ」と識別される。発現モニタリングアレイの場合には、完全マッチプローブは典型的には、標的核酸の特定の配列又はサブ配列（例えば、特定遺伝子）と相捕的であるように予選択（設計）される。これに対比して、一般的差異スクリーニングアレイでは、特定標的配列は、典型的には公知でない。後者の場合、完全マッチプローブは予選択されない。この情況での完全マッチプローブという用語は、下記のような１つ又はそれ以上の特定の予選択ヌクレオチドにおける完全マッチとは異なる対応する「ミスマッチ対照」からのプローブを識別するためである。
【００５３】
「ミスマッチ対照」又は「ミスマッチプローブ」という用語は、発現モニタリングアレイでは、配列が特定の標的配列と完全に相補的でないよう慎重に選択されるプローブを示す。高密度アレイ中の各々のミスマッチ（ＭＭ）対照に関しては、好ましくは、同一特定標的配列と完全に相補的である対応する完全マッチ（ＰＭ）プローブが好ましくは存在する。「一般的」（ｇｅｎｅｒｉｃ）（例えば無作為、恣意的、偶発的等）アレイでは、標的核酸（単数又は複数）は公知でないため、完全マッチ及びミスマッチプローブは先験的に確定、設計又は選択できない。この場合、プローブは好ましくは対として提供され、この場合、プローブの各対は１つ又はそれ以上の予選択ヌクレオチドが異なる。したがって、対のプローブのどれが完全マッチであるかは先験的には公知でないが、一方のプローブは特定の標的配列と特異的にハイブリダイズし、対の他方のプローブは標的配列に関してはミスマッチ対照として作用する。完全マッチ及びミスマッチプローブは対として提供される必要はないが、しかし特定予選択ヌクレオチド中で互いに異なるプローブの大きい方の集合（例えば、３、４、５又はそれ以上）として提供されると思われる。ミスマッチ（単数又は複数）はミスマッチプローブのどこにでも位置し得るが、末端ミスマッチは、それが標的配列のハイブリダイゼーションを妨害するとはあまり考えられないので、それほど望ましくない。特に好ましい実施態様では、ミスマッチは試験ハイブリダイゼーション条件下では標的配列との二重鎖を最も脱安定化すると思われるので、ミスマッチはプローブの中心又はその近くに位置する。特に好ましい実施態様では、完全マッチは単一の中心に位置するヌクレオチドにおいてはミスマッチ対照と異なる。
【００５４】
「バックグラウンド」又は「バックグラウンドシグナル強度」という用語は、標識標的核酸とオリゴヌクレオチドアレイの成分（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ、対照プローブ、アレイ基質等）との間の非特異的結合又はその他の相互作用に起因するハイブリダイゼーションシグナルを示す。バックグラウンドシグナルは、アレイ成分それ自体の固有の蛍光によっても生成される。単一バックグラウンドシグナルが全アレイに関して算出されるか、あるいは異なるバックグラウンドシグナルがアレイの各々の領域に関して算出される。好ましい実施態様では、バックグラウンドはアレイ又はアレイの領域中の最低１％〜１０％のプローブに関する平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として算出される。発現モニタリングアレイ（即ち、ここではプローブは特異的核酸（遺伝子）とハイブリダイズするよう予選択される）では、異なるバックグラウンドシグナルが各々の標的核酸に関して算出される。異なるバックグラウンドシグナルが各標的遺伝子に関して算出される場合、バックグラウンドシグナルは各遺伝子の最低１％〜１０％のプローブに関して算出される。もちろん、当業者は、プローブが特定の遺伝子と十分ハイブリダイズし、したがって標的配列と特異的に結合していると思われる場合、それらはバックグラウンドシグナル算出に用いられるべきでないと考える。あるいは、バックグラウンドは、試料中に見出されるいかなる配列とも相補的でないプローブ（例えば、反対センスの核酸又は試料中に見出されない遺伝子、例えば試料が哺乳類起源のものである場合には細菌遺伝子に向けられるプローブ）とのハイブリダイゼーションにより生じる平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として算出される。バックグラウンドはさらに、いかなるプローブをも欠いたアレイの領域により生成される平均シグナル強度として算出される。
【００５５】
「定量する」という用語は、核酸の存在量又は濃度（例えば、遺伝子の転写レベル）を定量する情況で用いられる場合、絶対又は相対定量化を示す。絶対定量化は、公知濃度の１つ又はそれ以上の標的核酸（例えば対照核酸、例えばＢｉｏＢ又は公知量での標的核酸それ自体）を含入し、そして非公知物のハイブリダイゼーション強度を公知の標的核酸に照会することにより（例えば、標準曲線の生成により）、成し遂げられる。あるいは、相対定量化は、２つ又はそれ以上の遺伝子間、あるいは２つ又はそれ以上の処理間のハイブリダイゼーションシグナルを比較して、ハイブリダイゼーション強度の変化を、そして含蓄的に転写レベルを定量することにより成し遂げられる。
【００５６】
「配列同一性のパーセンテージ」又は「配列同一性」は、比較ウインドウ又はスパン上の２つの最適に一直線に並べられた配列又はサブ配列を比較することにより確定されるが、この場合、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適整列のために参照配列（付加又は欠失を包含しない）と比較した場合、任意に付加又は欠失（例えばギャップ）を包含し得る。パーセンテージは、同一サブユニット（例えば核酸塩基又はアミノ酸残基）が両方の配列に生じてマッチ位置数を生じ、マッチ位置数を比較のウインドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを出す。配列同一性パーセンテージは、プログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴ（下記参照）を用いて算出する場合、デフォルトギャップ重量を用いて算出される。
【００５７】
比較のために配列を一直線に並べる方法は、当業界では十分公知である。比較のための配列の最適整列は、スミスとウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１））の局所的相同性算法により、ニードルマンとウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０））の相同性整列算法により、ピアソンとリップマン（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８））の同様の方法に関する吟味により、これらの算法のコンピューター処理実行（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａによるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムでのＣＬＵＳＴＡＬ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡでのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ等が挙げられるが、これらに限定されない）により、あるいは検閲により実施し得る。特に、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用いて配列を整列するための方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，（Ｇｅｎｅ，７３：２３７−２４４（１９８８）及びＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３（１９８９））により十分説明されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
（詳細な説明）
（Ｉ．発現モニタリング及び一般的差異スクリーニング）
本発明は、発現モニタリング及び一般的差異スクリーニングの方法を提供する。発現モニタリングという用語は、特定の、典型的には予め選択された遺伝子の発現のレベルの確定を示すために用いられる。好ましい実施態様では、本発明の発現モニタリング法は、発現レベルが検出される単数又は複数の遺伝子の予定サブ配列と相補的であるよう選択されるオリゴヌクレオチドの高密度アレイを用いる。核酸試料は、そのアレイとハイブリダイズされ、その結果生じるハイブリダイゼーションシグナルは当該する各遺伝子の発現のレベルの指標を提供する。高度のプローブ重複性（典型的には遺伝子当たり多数のプローブが存在する）のために、発現モニタリング法は本質的に正確な絶対測定値を提供し、参照核酸との比較を必要としない。
【００５９】
別の実施態様では、本発明は２つ又はそれ以上の核酸試料中の特定の核酸の存在量（濃度）の差を確認する一般的差異スクリーニング法を提供する。一般的差異スクリーニング法は、２つ又はそれ以上の核酸試料を同一アレイ高密度オリゴヌクレオチドアレイと、又は同一オリゴヌクレオチドプローブ組成を、そして任意に同一オリゴヌクレオチド空間分布を有する異なる高密度オリゴヌクレオチドアレイとハイブリダイズすることを包含する。その結果生じるハイブリダイゼーションを次に比較して、核酸が２つ又はそれ以上の試料間で存在量（濃度）が異なることを確定させる。
【００６０】
試料を包含する核酸の濃度が核酸が得られる試料中の遺伝子の転写レベルを反映する場合、一般的差異スクリーニング法は、２つ又はそれ以上の試料を包含する核酸の転写における（そして含蓄的に発現における）差異の確認を可能にする。このように確認された示差的に（例えば過剰又は過小）発現核酸は、発現レベルが２つ又はそれ以上の試料間で異なる遺伝子を確定および／または単離するために用い得る。
【００６１】
一般的差異スクリーニング法は、発現モニタリング法に対比して、アレイのプローブオリゴヌクレオチド組成についての先験的仮定を必要としない点で有益である。それとは反対に、プローブオリゴヌクレオチドの配列は、オリゴヌクレオチドプローブの無作為、偶発的又はあらゆる恣意的部分集合である。オリゴヌクレオチドプローブが十分短い（例えば１２ｍｅｒ以下）場合、アレイはその長さの考え得るすべての核酸を含有する。一般的差異スクリーニングアレイが恣意的又は無作為的であるという事実にも拘わらず、アレイ中の各プローブの配列が公知であるため、一般的差異スクリーニング法は依然として試料中の示差的発現核酸に関する直接配列情報を提供する。
【００６２】
本発明の発現モニタリング及び一般的差異スクリーニング法は、多数の（例えば１，０００以上）恣意的に選択された異なるオリゴヌクレオチドプローブ（プローブオリゴヌクレオチド）を含有するアレイを提供することを包含するが、この場合、各々の異なるプローブのアレイ中の配列及び位置は公知である。核酸試料（例えばｍＲＮＡ）はプローブアレイとハイブリダイズされ、ハイブリダイゼーションのパターンが検出される。
【００６３】
高密度オリゴヌクレオチドプローブアレイを用いるハイブリダイゼーションは、複合核酸集団中の特定の核酸の発現を検出および／または定量する有効な手段を提供することが、本明細書中及び同時係属出願米国特許第０８／５２９，１１５号（１９９５年９月１５日提出）及びＰＣＴ／ＵＳ９６／１４８３９に示されている。本発明の発現モニタリング及び差異スクリーニング法は、疾病の検出、２つの試料（例えば病理学的試料と健常試料の比較）間の示差的遺伝子発現の確認、特定遺伝子の発現をアップレギュレート又はダウンレギュレートする組成物に関するスクリーニング等を含めた広範囲の環境に用い得る。
【００６４】
好ましい一実施態様では、本発明の方法を用いて、発現が疾病状態で変わる核酸の発現（転写）レベルをモニタリングし得る。例えば、癌は、特定マーカー、例えば乳癌の場合にはＨＥＲ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２／ｎｅｕ）プロト癌遺伝子の過剰発現を特徴とする。同様に、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の過剰発現は、乳房、肝臓、膀胱、膵臓の癌、並びに神経膠芽細胞腫、肉腫及び扁平上皮癌を含めた多数の腫瘍の病因に関連する（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６：８８１−９１４（１９８７）参照）。逆に、癌（例えば結腸直腸、肺及び乳房）は、腫瘍抑制遺伝子、例えばＰ５３の突然変異又は過小発現を特徴とする（例えば、Ｔｏｍｉｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ，３：２５７−２８２（１９９２）参照）。
【００６５】
当該特定遺伝子が公知である場合、高密度アレイは好ましくは当該遺伝子の配列又はサブ配列と相補的であるように選択されるプローブオリゴヌクレオチドを含有する。各当該遺伝子の高プローブ重複性が達成され、各遺伝子の絶対発現レベルが確定される。
【００６６】
逆に、遺伝子が健常状態と疾病状態との間の発現で異なることが公知でない場合、本発明の一般的差異スクリーニング法が特に適している。健常及び病態核酸の本明細書中に開示した一般的差異スクリーニングアレイとのハイブリダイゼーション並びにハイブリダイゼーションパターンの比較は、病理学的状態で調節が変わる遺伝子を同定する。
【００６７】
同様に、本発明の発現モニタリング及び一般的差異スクリーニング法を用いて、限定的刺激、例えば薬剤、細胞活性化等に対する種々の遺伝子の発現をモニタリングし得る。本方法は、多数の遺伝子の発現の同時モニタリングを可能にするために、特に有益である。
【００６８】
これは、終点転写が複雑なもので、ある特定遺伝子が過剰発現されるか又は過小発現されるかを簡単に求められない場合に、薬剤検査に特に有用である。したがって、疾病状態又は薬剤の作用様式が十分に特性化されていない場合、本発明の方法は特に関連のある遺伝子を迅速に確定させる。さらに、当該遺伝子が公知であるか又は推測される場合、好ましくは発現モニタリング法が用いられるが、一方、当該特定遺伝子が公知でない場合には、一般的スクリーニング法が用いられる。
【００６９】
本明細書中に開示した一般的差異スクリーニング法を用いる場合、特定遺伝子に関する知識の欠如は有用な治療を確認する妨げとはならない。例えば、健常細胞に関する特定の高密度アレイ上のハイブリダイゼーションパターンが公知で、罹患細胞に関するパターンと有意に異なっている場合には、罹患細胞に関するパターンを健常細胞に関するもののようにさせるものに関して、化合物のライブラリーをスクリーニングし得る。これは、薬剤に対する細胞反応の非常に詳細な測定を提供する。
【００７０】
したがって、一般的差異スクリーニング法は、遺伝子発見のための、そして種々の刺激に対する複雑な細胞反応の基礎を成すメカニズムを解明するための強力な道具を提供する。例えば、一実施態様では、一般的差異スクリーニングは、「発現フィンガープリント法」に用い得る。ある種の細胞型からのｍＲＮＡが異なる条件下（例えば、疾病状態で、特定遺伝子の突然変異を有する場合）では異なる別々の全体的ハイブリダイゼーションパターンを示すことが判明したとしてみよう。その場合、発現のこのパターン（発現フィンガープリント）は、再現可能で、且つ異なる場合に明らかに鑑別可能であるならば、非常に詳細な診断として用い得る。パターンが十分に解釈可能であり、しかしまさに特定の細胞状態に特異的である（そして好ましくは診断的および／または予後的関連を有する）必要さえない。
【００７１】
発現モニタリング法も一般的差異スクリーニングもともに、薬剤安全試験に用いられる。例えば、新規の抗生物質を作る場合には、哺乳類細胞に関する発現プロフィールに有意の影響を及ぼすべきでない。ハイブリダイゼーションパターンは、細胞に及ぼす薬剤の影響の詳細な測定として用い得る。言い換えれば、毒物学的スクリーンとして用い得る。
【００７２】
本発明の発現モニタリング及び一般的差異スクリーニング法は、遺伝子発見に適している。例えば、上で説明したように、一般的差異スクリーニング法は、２つ又はそれ以上の試料中の核酸の存在量の差異を確認する。これらの差異は、従来公知でない遺伝子の発現レベルの変化を示す。差異スクリーニングアレイにより提供される配列情報は、本明細書中に記載されているように、公知でない遺伝子を同定するために用い得る。
【００７３】
発現モニタリング法は、今日までに発見された多数の遺伝子が配列の属性共有を基礎にして族に分類されたという事実を利用することにより、遺伝子発見に用い得る。プローブが非常に多数であるために、高密度アレイ中に入れることができるし、すべての種類の遺伝子からの公知の成員又は公知の成員の一部を表すオリゴヌクレオチドプローブを包含し得る。すでに公知のこのような「チップ」（高密度アレイ）遺伝子を利用する場合、可変領域及び共通領域の両方を含有する遺伝子座に正のシグナルを生じる。未知の遺伝子に関しては、遺伝子族の共通領域のみが正のシグナルを生じる。結果は、新規に発見された遺伝子の可能性を示す。
【００７４】
したがって、本発明の発現モニタリング及び一般的差異スクリーニング法はさらに、「動的」遺伝子データベースの開発を可能にする。ヒトゲノムプロジェクト及び商業的シーケンシングプロジェクトは、機能的又は遺伝的相互作用とは関係なく、数千の配列を列挙する大型静的データベースを生成した。本発明の方法を用いる分析は、遺伝子の機能及びその他の遺伝子とのその相互作用を定義する「動的」データベースを生成する。多数の遺伝子の発現を同時にモニタリングする能力を有さず、あるいは多数の「未知の」核酸の存在量の差異を検出する能力を持たねば、このようなデータベースを作成するのは法外に大きい仕事である。
【００７５】
発現パターンを確定するためにＤＮＡ配列分析を用いる冗長な特質は、当該細胞から単離したＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製し、次にライブラリーをシーケンシングすることを包含する。ＤＮＡがシーケンシングされると、オペレーターは得られた配列を列挙し、それらを計数する。数千の配列が確定されねばならず、次にそれらの遺伝子配列の頻度が試験中の細胞に関する遺伝子の発現パターンを限定する。
【００７６】
発現モニタリング又は一般的差異スクリーニングを用いて対照してみると、本発明の方法によりデータを得るためのアレイは相対的に速く且つ容易である。例えば一実施態様では、細胞は、発現を誘導するために刺激される。ＲＮＡが細胞から得られ、次に直接標識差あれるか又はｃＤＮＡコピーが作られる。ＤＮＡ重合中に蛍光分子が組み込まれる。標識ＲＮＡ又は標識ｃＤＮＡは次に、一夜実験で高密度アレイとハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションは、さらなるシーケンシングを伴わないハイブリダイズ化核酸のすべての単一鎖のレベルの定量的査定を提供する。さらに、本発明の方法は非常に高感受性で、１細胞当たり２〜３個の発現遺伝子のコピーを検出させる。この手順は、本明細書中に提示した実施例に示されている。本発明の方法のこれらの使用は、説明のためのものであって、いかなる意味においても限定されるものではない。
【００７７】
（ＩＩ．一般的差異スクリーニング及び発現モニタリングのための高密度アレイ）
上記のように、本発明は、多数の核酸の発現レベルをモニタリング（検出および／または定量化）し、および／または２つ又はそれ以上の試料間の核酸濃度（存在量）の差異を確定する方法を提供する。本方法は、１つ又はそれ以上の核酸試料（標的核酸）の、核酸プローブの１つ又はそれ以上の高密度アレイとのハイブリダイゼーション、そしてその後のアレイ中の各プローブとハイブリダイズされた標的核酸の量を定量することを包含する。
【００７８】
核酸ハイブリダイゼーションは種々の遺伝子の発現レベルを確定するために時々用いられる（例えば、ノーザンブロット）が、異質性核酸の大集団の存在下での核酸（例えば遺伝子）の存在量（例えば転写及び、含蓄的に、発現）の小変動の定量に高密度アレイが適しているということは、本発明の驚くべき発見であった。シグナル（例えば特定遺伝子又は遺伝子産物、あるいは示差的に豊富な核酸）は、約１，０００中約１未満、しばしば１０，０００中１未満、さらに好ましくは５０，０００中約１未満、最も好ましくは１００，０００中約１未満、さらには３００，０００中１又は１，０００，０００中１の濃度で存在する。
【００７９】
オリゴヌクレオチドアレイは、１０分子という短いオリゴヌクレオチドを有し、さらに好ましくは１５オリゴヌクレオチド、最も好ましくは２０又は２５オリゴヌクレオチドを用いて核酸発現レベルを特異的に検出する。連結識別法を用いる場合、オリゴヌクレオチドアレイはより短いオリゴヌクレオチドを含有する。この場合、６〜１５ヌクレオチド、さらに好ましくは約８〜約１２ヌクレオチドの範囲の長さのオリゴヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチドアレイが好ましい。もちろん、本明細書中に記載したように、より長いオリゴヌクレオチドを含有するアレイも適している。
【００８０】
特定の予選択遺伝子を検出するよう設計される発現モニタリングアレイは、少なくとも約１０，好ましくは少なくとも約１００，さらに好ましくは少なくとも約１０００，さらに好ましくは少なくとも約１０，０００，最も好ましくは少なくとも約１００，０００の異なる遺伝子の同時モニタリングを提供する。
【００８１】
Ａ）オリゴヌクレオチドアレイの利点
好ましい一実施態様では、本発明の方法に用いられる高密度アレイは化学合成オリゴヌクレオチドを包含する。化学合成オリゴヌクレオチドアレイの使用は、例えばゲノムクローンのブロット化アレイ、制限断片、オリゴヌクレオチド等と対照して、多数の利点を提供する。これらの利点は一般に、４つにわけられる：
１）製造効率；
２）アレイ間及びアレイ内差異の低減；
３）情報含量の増大；
４）シグナル対ノイズ比の改良
１）製造効率
好ましい実施態様では、アレイは空間処理平行合成の方法を用いて合成される（例えば、下記の第Ｖ節参照）。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され、高度平行様式で、共有的にアレイ表面に付着される。これは非常に効率のよいアレイ生成を可能にする。例えば、数千の特異的に選択された２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドのうちの数十（あるいは数百の場合さえある）の任意の集合体を含有するアレイが、８０以下の合成周期で合成される。アレイは、配列情報だけに基づいて設計され、合成される。したがって、ブロッティング法とは異なり、アレイ調製は生物学的材料の取り扱いを必要としない。クローニング工程、核酸精製又は増幅、クローン又は増幅産物の目録作り等の必要もない。したがって本発明における高密度オリゴヌクレオチドアレイの好ましい化学合成はブロッティング法より効率がよく、高度再現可能高密度アレイの製造を可能にする。
【００８２】
２）アレイ間及びアレイ内差異の低減；
本発明の方法における化学合成高密度オリゴヌクレオチドアレイの使用は、アレイ間及びアレイ内変異を改良する。本発明に好ましいオリゴヌクレオチドアレイは、高度制御再現可能的方法で、大型バッチ（目下、４９アレイ／ウエハで、多数のウエハが平行して合成される）で作られる。これは、異なる時間及び場所で実行される検定の直接比較を可能にする一般的診断及び検査用具としてそれらを適したものにする。
【００８３】
化学合成中に得られる正確な対照のために、本発明のアレイは、同一プローブ組成を有する高密度アレイ間（製造バッチ内又はバッチ間）で、約２５％未満、好ましくは約２０％未満、さらに好ましくは約１５％未満、より好ましくは約１０％未満、さらには約５％未満、最も好ましくは約２％未満の変異を示す。アレイ変異は、２つ又はそれ以上のアレイ間の１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプローブにおけるハイブリダイゼーション強度（標識対照標的核酸混合物に対する）の変異として検定される。さらに好ましくは、アレイ変異は、２つ又はそれ以上のアレイ間の１つ又はそれ以上の標的遺伝子に関して測定されるハイブリダイゼーション強度（標識対照標的核酸混合物に対する）の変異として検定される。
【００８４】
アレイ間及びアレイ内変異の他に、化学合成アレイはさらに、スポッティング法、特に細胞由来核酸（例えばｃＤＮＡ）を用いるスポッティング法に固有の相対的プローブ頻度の変異を低減する。多数の遺伝子は数千のコピー／細胞のレベルで発現されるが、一方その他は単一コピー／細胞のみで発現される。ｃＤＮＡライブラリーは、この物質から作られるので、この非常に大きな偏りを反映する。ライブラリーの正規化（参照ｃＤＮＡとの比較による各々の異なるプローブの量の調整）は、過剰発現配列の表現をある程度低減する一方、正規化は２又は３つのうちのおよそ一因子のみにより高度発現ｃＤＮＡを選択する確率を低下させることが示されている。これに対比して、化学合成法は、すべてのオリゴヌクレオチドプローブがほぼ等濃度で表現されるのを保証し得る。これは遺伝子内（アレイ間）変異を低減し、異なるオリゴヌクレオチドプローブに関するハイブリダイゼーションシグナル間の直接比較を可能にする。
【００８５】
３）情報含量の増大；
ｉ）発現モニタリングに関する利点
発現モニタリングのための高密度オリゴヌクレオチドアレイの使用は、他の方法では認められない多数の利点を提供する。例えば、特定標的遺伝子の転写産物と特異的に結合する多数の異なるプローブの使用は、特定標的遺伝子の有効な検出のためのプローブ組の最適化を可能にし、他の核酸種との交差反応による誤差の可能性を最小限にする高度の重複性及び内部対照を提供する。
【００８６】
明らかに適切なプローブがしばしば、ハイブリダイゼーションによる発現モニタリングに有効でないことを立証する。例えば、特定標的遺伝子のあるサブ配列がゲノムの他の領域に見出され、これらのサブ配列に向けられるプローブが他の領域と交差ハイブリダイズして、標的遺伝子の発現レベルの有意の測定値であるシグナルを提供しない。交差反応性をほとんど示さないプローブでさえ、それらは一般に有効なハイブリダイゼーションを妨げる構造の形成のために不十分なハイブリダイゼーションを示すために、適切でないことがある。最後に、多数のプローブを有する組では、組の中のすべてのプローブに関して最適であるハイブリダイゼーション条件を確認するのは難しい。各標的遺伝子に対する多数のプローブにより提供される高度の重複性のために、既定組のハイブリダイゼーション条件下で不十分に機能するプローブを排除し、その遺伝子の発現レベル（転写レベル）の非常に高感度の且つ信頼できる測定を提供するのに十分な特定標的遺伝子に対するプローブを依然として保持することができる。
【００８７】
さらに、各標的遺伝子に対する多数の異なるプローブの使用は、密に関連した核酸の族の発現のモニタリングを可能にする。族全体に保存されるサブ配列と、そして族中の異なる核酸においては異なるサブ配列とハイブリダイズするよう、プローブを選択し得る。したがって、このようなアレイとのハイブリダイゼーションは、種々の遺伝子がほぼ同一サイズで、高レベルの相同性を有する場合でさえ、遺伝子族の種々の成員の同時モニタリングを可能にする。このような測定は、伝統的ハイブリダイゼーション法では困難であるか又は不可能である。
【００８８】
ｉｉ）一般的利点
高密度アレイはこのような多数のプローブを含有するために、例えば、特定遺伝子中の変異又は突然変異に対する対照、全体的ハイブリダイゼーション条件に対する対照、試料調製条件に対する対照、核酸が得られる細胞の代謝活性に対する対照、及び非特異的結合又は交差ハイブリダイゼーションに対するミスマッチ対照を含めた多数の対照を提供することができる。
【００８９】
複合哺乳類細胞メッセージ集団中の遺伝子転写の有効な検出及び定量は、相対的に短いオリゴヌクレオチドを用いて、そして相対的に少ない（例えば４０以下、好ましくは３０以下、さらに好ましくは２５以下、最も好ましくは２０，１５さらには１０以下）オリゴヌクレオチドプローブ／遺伝子を用いて確定され得る。各遺伝子に対して強力に且つ特異的にハイブリダイズする多数のプローブがある。これは、多数のプローブが検出に必要であることを意味しないどころか、逆に選択するために多数があり、選択は例えばアレイ独自性（遺伝子族）、スプライス変数の点検、又は遺伝子型ホットスポット（ｃＤＮＡスポッティング法では容易に実行できないこと）といったその他の考慮点を基礎にし得る。
【００９０】
使用に際しては、各々約４００，０００プローブを含有する、発現モニタリングのための４つのアレイの組が作られる。公的データベース中にＥＳＴが存在する約４０，０００の遺伝子の各々と相補的である約４０のプローブの組（２０プローブ対）が選択される。この組のＥＳＴは、全ヒト遺伝子のおよそ１／３〜１／２を網羅し、これらのアレイは一夜ハイブリダイゼーションの平行組においてそれらのすべてのレベルをさせる。
【００９１】
４）シグナル対ノイズ比の改良
ブロット処理核酸は、時々、イオン性、静電気性及び疎水性相互作用に依って、ブロット化核酸を基質に付加する。結合は核酸に沿って多数の点で形成され、自由度を制限し、その相補的標的とハイブリダイズする核酸の能力を妨げる。これに対比して、本発明の好ましいアレイは、化学的に合成される。オリゴヌクレオチドプローブは単一末端共有結合により基質に付加される。プローブは自由度をより多く有し、それらの相捕的標的との複雑な相互作用に加わる。その結果として、本発明のプローブアレイはブロット化アレイよりも有意に高いハイブリダイゼーション効率を示す（１０倍、１００倍、そして１０００倍も効率が高いことさえある）。少ない標的オリゴヌクレオチドを用いて既定のシグナルを生成し、それによりシグナル対ノイズ比を劇的に改良する。その結果として、本発明の方法は、非常に複雑な核酸混合物中の核酸の２〜３コピーのみの検出を可能にする。
【００９２】
Ｂ）好ましい高密度アレイ
本発明の好ましい高密度アレイは、約１００以上、好ましくは約１０００以上、さらに好ましくは約１６，０００以上、最も好ましくは約６５，０００又は２５０，０００以上、あるいはさらに約１，０００，０００以上の異なるオリゴヌクレオチドプローブを包含する。オリゴヌクレオチドプローブは、約５〜約５０，又は約５〜約４５のヌクレオチド、さらに好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、最も好ましくは約１５〜約４０ヌクレオチド長の範囲である。特に好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブは２０又は２５ヌクレオチドの長さであるが、一方他の好ましい実施態様（特に、連結識別反応を用いる場合）では、オリゴヌクレオチドプローブは好ましくはより短い（例えば６〜２０，さらに好ましくは８〜１５ヌクレオチドの長さ）。相対的に短いオリゴヌクレオチドプローブは標的配列と特異的にハイブリダイズし、識別するのに十分であることが本発明の発見であった。したがって、好ましい一実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブは長さが５０ヌクレオチド未満、一般的に４６ヌクレオチド未満、さらに一般的には４１ヌクレオチド未満、最も一般的には３６ヌクレオチド未満、好ましくは３１ヌクレオチド未満、さらに好ましくは２６ヌクレオチド未満、そして最も好ましくは２１ヌクレオチド未満である。プローブはさらに１６ヌクレオチド未満、１３ヌクレオチド未満、９ヌクレオチド未満そして７ヌクレオチド未満の長さであってもよい。さらに、オリゴヌクレオチドプローブは相対的に長く、約１０００ヌクレオチド、さらに典型的には約５００ヌクレオチドまでの長さの範囲であることもあると認識される。
【００９３】
アレイ中の各々の異なるオリゴヌクレオチドプローブの場所、そしていくつかの実施態様では配列が公知である。さらに、多数の異なるプローブが相対的に小さな領域を占めて、一般的に約６０以上、さらに一般的には約１００以上、最も一般的には約６００以上、しばしば約１０００以上、さらにしばしば約５０００以上、最もしばしば約１０，０００以上、好ましくは約４０，０００以上、さらに好ましくは約１００，０００以上、そして最も好ましくは約４００，０００以上の異なるオリゴヌクレオチドプローブ／ｃｍ２のプローブ密度を有する高密度アレイを提供する。アレイの小表面積（しばしば約１０ｃｍ２未満、好ましくは約５ｃｍ２未満、さらに好ましくは約２ｃｍ２未満、そして最も好ましくは約１．６ｃｍ２未満）は、小試料容量及び非常に均一なハイブリダイゼーション条件（温度調節、塩含量等）の使用を可能にする一方、非常に多数のプローブはハイブリダイゼーションの大量平行処理を可能にする。
【００９４】
最後に、高密度アレイが占める小面積のために、非常に少量の液体容量（例えば２５０μｌ以下、さらに好ましくは１００μｌ以下、最も好ましくは１０μｌ以下）で実行し得る。さらに、ハイブリダイゼーション条件は試料全体を通して非常に均一で、ハイブリダイゼーションフォーマットは自動処理を施すことができる。
【００９５】
（ＩＩＩ．遺伝子発現モニタリング及び一般的差異スクリーニング）
上記で説明したように、本発明は遺伝子発現をモニタリングする（発現モニタリング）ための、そして２又はそれ以上の核酸試料中の核酸の存在量の差異を確認する（一般的差異スクリーニング）ための方法を提供する。一般的に、本発明の遺伝子発現をモニタリングする方法は、（１）１つ又はそれ以上の標的遺伝子（単数又は複数）のＲＮＡ転写物（単数又は複数）を包含する標的核酸の、あるいはＲＮＡ転写物（単数又は複数）由来の核酸のプールを提供し；
（２）核酸試料をプローブ（対照プローブを含めた）の高密度アレイとハイブリダイズし；そして（３）ハイブリダイズ化核酸を検出して、相対的発現（転写）レベルを算出する工程を包含する。これらの方法は、好ましくは特異的予選択遺伝子に対するプローブを含有する高密度オリゴヌクレオチドアレイの使用を包含する。
【００９６】
これに対比して、本発明の一般的差異スクリーニング法に用いられるアレイは、特異的標的遺伝子が同定される必要がない。それとは反対に、本方法は、同定される特定遺伝子が差異スクリーニングの実施前に公知でない場合には、種々の遺伝子の発現の変化又は差異を検出するよう設計される。
【００９７】
一般的差異スクリーニングの方法は、典型的には１）１つ又はそれ以上の高密度オリゴヌクレオチドアレイ（好ましくは、１つ又はそれ以上のヌクレオチドが異なるプローブ対を含めた）を提供し；２）２又はそれ以上の核酸試料を提供し；３）核酸試料を１つ又はそれ以上のアレイとハイブリダイズして核酸試料中の核酸とアレイ中のプローブオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッド二重鎖を形成し；そして４）核酸試料間のハイブリダイゼーションの差異を確定する工程を包含する。
【００９８】
核酸試料の提供、試料のアレイとのハイブリダイゼーション、及びハイブリダイズ化核酸（単数又は複数）の検出は、発現モニタリング及び一般的差異スクリーニング法においては本質的に同一のやり方で実行される。本明細書中に開示するように、好ましい実施態様では、本方法はオリゴヌクレオチドプローブ選択により部分的に、一般的差異スクリーニングにおける少なくとも２つの核酸試料の使用の点で、そしてその後の分析で区別される。
【００９９】
Ａ）核酸試料の提供
試料中の核酸濃度を測定するために、このような分析用の核酸試料を提供するのが望ましい。核酸濃度、又は異なる試料間の核酸濃度の差が遺伝子（単数又は複数）の転写レベル又は転写レベルの差を反映する場合、遺伝子（単数又は複数）のｍＲＮＡ転写物（単数又は複数）を包含する核酸試料、あるいはｍＲＮＡ転写物（単数又は複数）由来の格差案を提供するのが望ましい。本明細書中で用いる場合、ｍＲＮＡ転写物由来の核酸とは、その合成のためにｍＲＮＡ転写物又はそのサブ配列が最後に鋳型として役立った核酸を示す。したがって、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されるＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されるＤＮＡ、増幅ＤＮＡから転写されるＲＮＡ等はすべて、ｍＲＮＡ由来であって、このようにして得られる生成物の検出は試料中の元の転写物の存在および／または存在量を示す。したがって、適切な試料としては、遺伝子（単数又は複数）のｍＲＮＡ転写物、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されるｃＲＮＡ、遺伝子から増幅されるＤＮＡ、増幅ＤＮＡから転写されるＲＮＡ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
試料中の１つ又はそれ以上の遺伝子の転写レベル（及びそれにより発現を）を定量するのが望ましい、特に好ましい実施態様では、核酸試料は、単数又は複数の遺伝子のｍＲＮＡ転写物（単数又は複数）の濃度、あるいはｍＲＮＡ転写物（単数又は複数）由来の核酸の濃度がその遺伝子の転写レベル（したがって発現レベル）に比例するものの一つである。同様に、ハイブリダイゼーションシグナル強度がハイブリダイズ化核酸の量に比例するのが好ましい。比例性が相対的に厳密である（例えば、転写率の倍加が試料核酸プール中のｍＲＮＡ転写物の倍加及びハイブリダイゼーションシグナルの倍加を引き起こす）ことが好ましい一方、比例性はより寛大で、非線形でさえあると当業者は理解する。したがって、例えば標的ｍＲＮＡの濃度における５倍の差異がハイブリダイゼーション強度における３〜６倍の差異を生じる検定は、ほとんどの目的に対して十分である。より正確な定量が必要な場合には、適切な対照を用いて実行し、本明細書中に記載したような試料調製及びハイブリダイゼーションにおいて誘導される変異を修正し得る。さらに、「標準」標的ｍＲＮＡの連続希釈を用いて、当業者に公知の方法にしたがって校正曲線を調製し得る。もちろん、転写物の存在又は非存在の簡単な検出、あるいは核酸濃度の変化の大きな差異が所望される場合には、精巧な制御又は校正は必要ない。
【０１０１】
最も簡単な実施態様では、このような核酸試料は生物学的試料から単離されたおよび／またはそうでなければそれに由来する総ｍＲＮＡ又は総ｃＤＮＡである。「生物学的試料」という用語は、本明細書中で用いる場合、生物から又は生物の成分（例えば細胞）から得られる試料を指す。試料は、あらゆる生物学的組織または液体を有する。しばしば試料は、「臨床的試料」であって、これは患者から得られる試料である。このような試料としては、痰、血液、血液細胞（例えば白血球）、組織または微細針生検試料、尿、腹膜液又はそれからの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的試料としてはさらに、組織の切片、例えば組織学的目的のために採取された凍結切片が挙げられる。
【０１０２】
核酸（ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ）は、当業者に十分公知の多数のあらゆる方法により試料から単離され得る。遺伝子のコピー数の変化が検出される場合、ゲノムＤＮＡは好ましくは単離される、と当業者は理解する。逆に、１又は複数の遺伝子の発現レベルを検出しようとする場合、好ましくは、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が単離される。
【０１０３】
全ｍＲＮＡを単離する方法は、当業者には十分公知である。例えば、核酸の単離及び精製の方法は、Ｃｈａｐｔｅｒ  ３  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  １．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）及びＣｈａｐｔｅｒ  ３  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  １．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）に詳細に記載されている。
【０１０４】
好ましい実施態様では、例えば、酸性グアニジニウム−フェノール−クロロホルム抽出法を用いて与えられた試料から全核酸を単離し、そしてオリゴｄＴカラムクロマトグラフィーにより、又は（ｄＴ）ｎ磁気ビーズを用いてポリＡ＋ｍＲＮＡを単離する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９）又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）参照）。
【０１０５】
しばしば、ハイブリダイゼーション前に核酸試料を増幅するのが望ましい。いかなる増幅法を用いても、定量結果を所望する場合には、増幅核酸の相対的頻度を維持し又は制御する方法の使用には注意しなければならない、と当業者は理解する。
【０１０６】
「定量的」増幅の方法は、当業者には十分公知である。例えば、定量的ＰＣＲは、同一プライマーを用いる公知量の対照配列の同時増幅を包含する。これは、ＰＣＲ反応を校正するために用いられる内部標準を提供する。その場合、高密度アレイは、増幅核酸の定量のための内部標準に特異的なプローブを含む。
【０１０７】
好ましい内部標準の一つは、合成ＡＷ１０６ｃＲＮＡである。ＡＷ１０６ｃＲＮＡは、当業者に公知の標準技法に従って試料から単離されたＲＮＡと組合される。次に、逆転写酵素を用いてＲＮＡを逆転写して、コピーＤＮＡを提供する。次にｃＤＮＡ配列を標識プライマーを用いて増幅する（例えばＰＣＲにより）。典型的には電気泳動により、増幅産物を分離し、放射能の量（増幅産物の量に比例する）を確定する。次に、公知のＡＷ１０６ＲＮＡ標準により生成されるシグナルとの比較により、試料中のｍＲＮＡの量を算出する。定量的ＰＣＲのための詳細なプロトコールは、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．，（１９９０）に提示されている。
【０１０８】
その他の適切な増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，（１９９０））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４：５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７（１９８８）及びＢａｒｒｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９：１１７（１９９０）参照）、転写増幅（Ｋｗｏｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１１７３（１９８９））及び自己支持配列複製（Ｇａｕｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４（１９９０））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
特に好ましい実施態様では、逆転写酵素並びにオリゴｄＴ及びファージＴ７プロモーターをコードする配列から成るプライマーで試料ｍＲＮＡが逆転写されて、一本鎖ＤＮＡ鋳型を提供する。ＤＮＡポリメラーゼを用いて二次ＤＮＡ鎖を重合する。二本鎖ｃＤＮＡの合成後、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを付加し、ＲＮＡをｃＤＮＡ鋳型から転写する。各一本鎖ｃＤＮＡ鋳型から連続回転写すると、増幅ＲＮＡが得られる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ重合の方法は当業者には十分公知であり（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ上記、参照）、この特定の方法は、本方法によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅が種々のＲＮＡ転写物の相対頻度を保存することを立証したＶａｎ  Ｇｅｌｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１６６３−１６６７（１９９０））により、詳細に記載されている。さらに、Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３０１０−３０１４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写による２回の増幅を用いて元の出発物質の１０６倍以上の増幅を達成し、それにより生物学的試料が限定される場合でも発現モニタリングを可能にするプロトコールを提供する。
【０１１０】
上記の直接転写法はアンチセンス（ａＲＮＡ）プールを提供する、と当業者には理解される。アンチセンスＲＮＡを標的核酸として用いる場合、アレイ中に提供されるオリゴヌクレオチドプローブはアンチセンス核酸のサブ配列と相補的であるように選択される。逆に、標的核酸プールがセンス核酸のプールである場合、オリゴヌクレオチドプローブはセンス核酸のサブ配列と相補的であるように選択される。最後に、核酸プールが二本鎖化される場合、標的核酸はセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含むので、プローブはどちらかのセンスを有するものである。
【０１１１】
上記で引用したプロトコールはセンス又はアンチセンス核酸のプールを生成する方法を含む。実際、あるアプローチを用いて、所望のセンス又はアンチセンス核酸を生成し得る。例えば、ｃＤＮＡは、Ｔ３及びＴ７プロモーターが側面に位置するようにベクター（例えば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）ファージミド）中で指向的にクローン化され得る。Ｔ３ポリメラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は一方のセンスのＲＮＡを生成し（挿入物の配向によるセンス）、一方Ｔ７ポリメラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は反対のセンスを有するＲＮＡを生成する。その他の適切なクローニング系は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰプラスミドサブクローニングのために設計されたファージラムダベクターを含む（例えば、Ｐａｌａｚｚｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８８：２５−３６（１９９０））。
【０１１２】
特に好ましい実施態様では、高活性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７に関しては約２５００単位／μｌ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから販売）が用いられる。
【０１１３】
Ｂ）核酸の標識
ｉ）標識方法／戦略
好ましい実施態様では、試料核酸に付着された１つ又はそれ以上の標識を検出することにより、ハイブリダイズ化核酸を検出する。標識は、当業者に十分公知の多数の手段のいずれかにより組み入れられる。しかしながら、好ましい実施態様では、試料核酸の調製における増幅工程中に、標識は同時に組み入れられる。例えば、標識化プライマー又は標識化ヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標識化増幅産物を提供する。核酸（例えばＤＮＡ）は、標識化デオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在下で増幅されるべきものである。増幅核酸は断片化され、オリゴヌクレオチドアレイに曝露され、ハイブリダイゼーションの程度は、アレイにここで伴う標識の量により確定される。好ましい実施態様では、上記のように標識化ヌクレオチド（例えば、フルオレセイン標識化ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を用いる転写増幅は、標識を転写化核酸中に組み入れる。
【０１１４】
あるいは、標識は元の核酸試料（例えば、ｍＲＮＡ、ポリＡｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）に、又は増幅完了後に増幅産物に直接付加される。このような標識化は増幅産物の収量増大を引き起好ましい、増幅反応に必要な時間を低減する。標識を核酸に付加する手段としては、例えばニックトランスレーション、又は核酸のキナーゼ処理とその後の試料核酸を標識（例えばフルオロフォア）に連結させる核酸リンカーの付加（連結）による末端ラベリング（例えば標識化ＲＮＡを用いる）が挙げられる。末端ラベリングは、下記の第ＩＩＩ（Ｂ）（ｉｉｉ）項でさらに詳細に説明する。
【０１１５】
本発明での使用に適した検出可能な標識としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段により検出可能なあらゆる組成物が挙げられる。本発明における有用な標識としては、標識化ストレプトアビジン複合体による染色のためのビオチン、磁気ビーズ（例えばＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）、蛍光染料（例えばフルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等。例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ参照）、放射性標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ又は３２Ｐ）、酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ及びＥＬＩＳＡで一般的に用いられるその他のもの）及び発色性標識、例えば金コロイド（例えば直径４０〜８０ｎｍのサイズ範囲の金粒子は高効率で緑色光を発する）、あるいは着色ガラス又はプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号及び第４，３６６，２４１号が挙げられる。
【０１１６】
蛍光標識は、それが低バックグラウンドで非常に強力なシグナルを提供するために、好ましい。それはさらに、迅速走査手法により高解像度及び感度で光学的に検出可能である。核酸試料は、単一標識で、例えば蛍光標識ですべて標識され得る。あるいは、別の実施態様では、異なる核酸試料は、各核酸試料が異なる標識を有する場合には、同時にハイブリダイズされ得る。例えば、ある標的は緑色蛍光標識を有し、第二の標的は赤色蛍光標識を有し得る。走査工程は、赤色標識の結合のサイトと緑色蛍光標識のサイトを区別する。各核酸試料（標的核酸）は、互いに別々に分析される。
【０１１７】
用い得る適切な色原体としては、色が観察されるように波長の弁別的範囲で光を吸収する、あるいは特定の波長又は波長範囲の放射で照射された場合に光を発する分子及び化合物、例えば蛍光体が挙げられる。
【０１１８】
広範囲の適切な染料が利用可能であり、強度の色を提供し、それらの周囲に最小量吸収される。例示的染料としては、キノリン染料、トリアリールメタン染料、アクリジン染料、アリザリン染料、蓋レイン、昆虫染料、アゾ染料、アントラキノイド染料、シアニン染料、フェナザチオニウム染料及びフェナゾキソニウム染料が挙げられる。
【０１１９】
広範囲の蛍光体は、単独であるいは消光体分子と一緒に用い得る。当該蛍光体は、ある種の一次官能体を有する種々の部類に分けられる。これらの一次官能体としては以下のものが挙げられる：１−及び２−アミノナフタレン、ｐ，ｐ’−ジアミノスチルベン、ピレン、第四級フェナントリジン塩、９−アミノアクリジン、ｐ，ｐ’−ジアミノベンゾフェノンイミン、アントラセン、オキサカルボシアニン、マロシアニン、３−アミノエキレニン、ペリレン、ビスベンズオキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリルベンゼン、１，２−ベンゾフェナジン、レチノール、ビス−３−アミノピリジニウム塩、ヘレブリゲニン、テトラサイクリン、ステロフェノール、ベンズイミダゾリルフェニルアミン、２−オキソ−３−クロメン、インドール、キサンテン、７−ヒドロキシクマリン、フェノキサジン、サリチラート、ストロファンチジン、ポルフィリン、トリアリールメタン及びフラビン。リンキングのための官能体を有する、又はこのような官能体を組み入れるために修飾され得る個々の蛍光化合物としては、例えば以下のものが挙げられる：塩化ダンシル；フルオレセイン、例えば３，６−ジヒドロキシ−９−フェニルキサントヒドロール；ローダミンイソチオシアネート；Ｎ−フェニル  １−アミノ−８−スルホナトナフタレン；Ｎ−フェニル  ２−アミノ−６−スルホナトリウムナフタレン：４−アセトアミド−４−イソチオシアナトースチルベン−２，２’−ジスルホン酸；ピレン−３−スルホン酸；２−トルイジノナフタレン−６−スルホネート；Ｎ−フェニル、Ｎ−メチル  ２−アミノナフタレン−６−スルホネート；臭化エチジウム；ステブリン；アウロミン−０，２−（９’−アントロイル）パルミテート；ダンシルホスファチジルエタノールアミン；Ｎ，Ｎ’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン；Ｎ，Ｎ’−ジヘキシルオキサカルボシアニン；メロシアニン、４（３’ピレニル）ブチレート；ｄ−３−アミノデソキシ−エキレニン；１２−（９’アントロイル）ステアレート；２−メチルアントラセン；９−ビニルアントラセン；２，２’（ビニレン−ｐ−フェニレン）ビスベンズオキサゾール；ｐ−ビス［２−（４−メチル−５−フェニル−オキサゾイル）］ベンゼン；６−ジメチルアミノ−１，２−ベンゾフェナジン；レチノール；ビス（３’−アミノピリジニウム）１，１０−デカンジル  ジイオダイド；ヘリブリエニンのスルホナフチルヒドラゾン；クロロテトラサイクリン；Ｎ（７−ジメチルアミノ−４−メチル−２−オキソ−３−クロメニル）マレイミド；Ｎ−［ｐ−（２−ベンズイミダゾリル）−フェニル］マレイミド；Ｎ−（４−フルオランチル）マレイミド；ビス（ホモバニリン酸）；レサザリン；４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール；メロシアニン５４０；レゾルフィン；ローズベンガル；及び２，４−ジフェニル−３（２Ｈ）−フラノン。
【０１２０】
望ましくは、蛍光体は約３００ｎｍ以上、好ましくは約３５０ｎｍ、さらに好ましくは約４００ｎｍ以上で光を吸収し、通常は吸収された光の波長より約１０ｎｍ以上高い波長で発光すべきである。結合染料の吸光及び発光特性は非結合染料とは異なる、ということに留意する必要がある。したがって、種々の波長範囲及び染料の特性を示す場合は、用いた染料を示すものであって、任意の溶媒中で非結合及び特性化される染料ではないものとする。
【０１２１】
蛍光体は一般的に、光を蛍光体に照射することにより、複数の放出物を得ることができるために、選ばれる。したがって、単一標識が複数の測定可能事象を提供し得る。
【０１２２】
検出可能なシグナルは、化学発光及び生物発光源によっても提供される。化学発光源としては、化学反応により電子的に励起されて、その後検出可能なシグナルとして役立つ光を発するか、又はエネルギーを蛍光受容体に供与する化合物が挙げられる。多数の族の化合物が種々の条件下で化学発光を提供することが判明している。一族の化合物は、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンである。最も一般的な化合物はルミノールで、これは５−アミノ化合物である。その族の他の成員としては、５−アミノ−６，７，８−トリメトキシ−及びジメチルアミノ［ｃａ］ベンズ類似体が挙げられる。これらの化合物は、アルカリ性過酸化水素又は次亜塩素酸カルシウム及び塩基を用いて冷光を発するよう作られる。別の族の化合物は、２，４，５−トリフェニルイミダゾールで、これは親物質としてロフィンという一般名を有する。化学発光体類似体としては、パラ−ジメチルアミノ及び−メトキシ置換体が挙げられる。化学発光はさらに、シュウ酸塩、通常はオキサリル活性エステル、例えばｐ−ニトロフェニル、並びに過酸化物、例えば過酸化水素を用いて塩基性条件下で得られる。あるいは、ルシフェリンをルシフェラーゼ又はルシゲニンと一緒に用いて、生物発光を提供し得る。
【０１２３】
スピン標識は、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分光学により検出される不対電子スピンを有する環境指示分子により提供される。例示的スピン標識としては、有機フリーラジカル、遷移金属錯体、特にバナジウム、銅、鉄及びマンガン等が挙げられる。例示的スピン標識には、ニトロキシドフリーラジカルも含まれる。
【０１２４】
標識は、ハイブリダイゼーション前又は後に標的（試料）核酸（単数又は複数）に付加される。いわゆる「直接標識」は、ハイブリダイゼーション前に標的（試料）核酸に直接付加されるか又は取り込まれる検出可能な標識である。これに対比して、いわゆる「間接標識」は、ハイブリダイゼーション後にハイブリッド二重鎖に連結される。しばしば、間接標識は、ハイブリダイゼーション前に標的核酸に付加された結合部分に付加される。したがって、例えば標的核酸はハイブリダイゼーション前にビオチニル化され得る。ハイブリダイゼーション後、アビジン共役フルオロフォアはハイブリッド二重鎖を保有するビオチンを結合して、容易に検出される標識を提供する。核酸を標識し、標識化ハイブリダイズ化核酸を検出する方法の詳細な検討のためには、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９９３）を参照されたい。
【０１２５】
蛍光標識は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応中に選択され、容易に付加される。好ましい実施態様では、フルオレセイン標識ＵＴＰ及びＣＴＰを、上記のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応で生成されたＲＮＡ中に取り込ませる。
【０１２６】
標識は、直接、又はリンカー部分を介して付加される。概して、標識又はリンカー−標識付着の部位は、いかなる特定の部位にも限定されない。例えば、標識は、所望の検出又はハイブリダイゼーションを妨げないあらゆる位置に、ヌクレオシド、ヌクレオチド又はその類似体に付着される。例えば、ある種のラベルオン試薬（Ｌａｂｅｌ−ＯＮ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）は、オリゴヌクレオチドのホフフェート主鎖全体に散在した標識を、そして３’及び５’末端に末端標識を提供する。例えば本明細書中に示したように、標識は、リボース環上の位置に付加されるか、あるいはリボースは修飾され、所望により除去されることさえある。有用な標識試薬の塩基部分は天然のものであるか、あるいはそれらが配置される目的を妨げないような方法で修飾されるものである。修飾塩基としては７−デアザＡ及びＧ、７−デアザ−８アザＡ及びＧ、並びにその他の複素環式部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
ｉｉ）末端標識核酸
多数の適用において、増幅、転写又はその他の核酸変換工程を経ることなく核酸試料を直接標識することは有用である。このことは、細胞から全細胞質ＲＮＡ又はポリＡ＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出し、ｍＲＮＡ濃度の元の分布をゆがめるあらゆる中間工程を用いずにこの物質をハイブリダイズしたい場合のｍＲＮＡレベルのモニタリングについて特にいえることである。
【０１２８】
概して、末端標識法は、標識される核酸のサイズを最適化させる。末端標識法はさらに、ポリメラーゼ促進標識法に時として伴う配列の偏りを低減する。末端標識は、ターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いて実施し得る。
【０１２９】
末端標識はさらに、標識化オリゴヌクレオチド又はその類似体を標的核酸又はプローブの末端に連結することにより成し遂げ得る。その他の末端標識法としては、例えばリガーゼ又はターミナルトランスフェラーゼを用いた核酸に対する標識化又は非標識化「尾部」の作成が挙げられる。次に尾部処理核酸を、選択的に尾部と会合する標識化部分に曝露する。尾部及び尾部と選択的に会合する部分は、例えば核酸、ペプチド又は炭化水素のようなポリマーである。尾部及びその認識部分は２つの間の認識を可能にするものであり、その例としては配位子−基質関係を有する分子、例えばハプテン、エピトープ、抗体、酵素及びそれらの基質、並びに相補的核酸及びその類似体が挙げられる。
【０１３０】
尾部又は尾部認識部分に関連した標識は、検出可能部分を包含する。尾部及びその認識部分がともに標識される場合、各々に伴うそれぞれの標識は、それ自体、配位子−基質関係を有する。それぞれの標識はさらに、エネルギー移動試薬、例えば異なる分光学的特性を有する染料を包含する。エネルギー移動対は、所望の組合せスペクトル特性を得るために選択される。例えば、第二染料により吸収されるよりも短い波長で吸収する第一染料は、より短い波長で吸収する場合に、エネルギーを第二染料に移動させる。次に、第二染料は第一染料単独で発せられた波長より長い波長で電磁波を出す。エネルギー移動試薬は、同時係属中の米国特許出願（１９９６年１２月２３日提出、代理審理第２０１３．２号。これはＵＳＳＮ０８／５２９，１１５（１９９５年９月１５日提出）の一部継続である）、並びにＵＳＳＮ  ０７／６２４，１１４（１９９０年１２月６日提出。これはＵＳＳＮ  ０７／３６２，９０１（１９９０年６月７日提出）のＣＩＰである）の継続であるＵＳＳＮ  ０８／１６８，９０４（１９９３年１２月１５日提出）の一部であるＵＳＳＮ  ０８／６７０，１１８（１９９６年６月２５日提出）の一部継続である国際特許出願ＷＯ９６／１４８３９（１９９６年９月１３日提出）（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されているような二色標識法において特に有用である。
【０１３１】
したがって、本発明は核酸の標識方法及びそのための有用な試薬を提供する。本明細書中に開示された多数の方法は、末端標識を包含する。当業者は、本発明は、開示されたように、一般的に化学的及び分子生物的技術に適用可能である。
【０１３２】
一実施態様では、本方法は核酸を提供し、標識オリゴヌクレオチドを提供し、そしてオリゴヌクレオチドを酵素的に核酸に連結する工程を包含する。したがって、例えば核酸がＲＮＡである場合、標識リボオリゴヌクレオチドはＲＮＡリガーゼを用いて連結される。ＲＮＡリガーゼは５’リン酸基を有する一本鎖ＲＮＡ（又はＤＮＡ。しかしＲＮＡとの反応の方が効率がよい）とＲＮＡ（又はＤＮＡ）の別の小片の３’−ＯＨ末端との共有結合を触媒する。この酵素の使用のための特別な要件が、Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ＸＶ，Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ，Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｓｐｏｒｔ，ｐａｇｅｓ  ３１−５８及び５．６６−５．６９  ｉｎ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）に提示されている。
【０１３３】
したがって、本発明は、核酸重合中に標識ヌクレオチドを取り込ませると言うよりむしろ直接核酸（例えば抽出ＲＮＡ）に標識を付加する方法を提供する。これは、短い標識化オリゴヌクレオチドを一本鎖核酸の末端に付加することにより成し遂げられる。本方法は、より完全に試料を標識する；即ち、慣用的技法の場合よりも高いパーセンテージの利用可能な分子が標識される。
【０１３４】
Ｍｇ２＋の存在下で加熱してＲＮＡを無作為に断片化する。これは一般的に、５’ＯＨ基及びホスホリル化３’末端を有するＲＮＡ断片を生じる。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ又は同様の酵素を用い、標準プロトコールを用いて、リン酸基を断片の５’末端に付加する。５’−ホスホリル化ＲＮＡ断片のプールに、ＲＮＡリガーゼ＋３’ＯＨ基＋標識を５’末端に有する（例えば、フルオレセイン又はその他の染料、あるいはストレプトアビジン複合体を用いて後に標識するためのビオチン、あるいは標識化抗体で後に標識するためのジオキシゲニン）かあるいは１つ又はそれ以上の標識化塩基を有する短ＲＮＡオリゴヌクレオチドを付加する。５’末端でフルオレセイン又はビオチンを用いて標識したリボＡ６（デオキシリボ核酸６ｍｅｒポリＡ）は、特に好ましい標識を提供する。別の実施態様では、連結ＲＮＡオリゴヌクレオチドは連結端近くにリボヌクレオチドを有するが、デオキシリボヌクレオチドはさらに離れている。もちろん、ＲＮＡオリゴヌクレオチドはそれより長い場合も短い場合もあり、だいたいあらゆる配列を有し得る。しかしながら、連結反応は、受容体の３’末端にＡを有すると最も効率がよく、Ｕを有する場合は効率が最も低い。反応は標準条件下で進行させる。取込まれなかったＲＮＡ６−ｍｅｒは、簡単なサイズ選択工程（例えば、電気泳動、ＮＡＰカラム等）により除去し得る。
【０１３５】
この手法の利点は、抽出ｍＲＮＡを直接用い得ること、そして各断片は１回標識されるべきで、標識化塩基が重合反応中に取り込まれる場合のように配列によって何度も標識されるべきでない。
【０１３６】
別の実施態様では、断片化ＤＮＡは、異なる酵素で異なる手法を用いて末端標識され得る。ターミナルトランスフェラーゼは、標識され得るデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）を一本鎖ＤＮＡの３’ＯＨ端に付加する。一本鎖ｄＮＴＰは、修飾核酸が用いられる場合（例えばジデオキシヌクレオチドトリホスフェート）に付加されるか、又は所望により種々の塩基が付加される。ＤＮＡは、物理的（剪断）に又は酵素的（ヌクレアーゼ）に、あるいは化学的（例えば、酸加水分解）に断片化される。断片化後、方法によっては、３’ＯＨ端は生成する必要はない。次に、ターミナルトランスフェラーゼの存在下で標識化ｄＮＴＰ又はｄｄＮＴＰを用いて、ＤＮＡ断片を標識する。
【０１３７】
本明細書中に提示した実施例及びそれらに関連した図面により、種々のその他の実施態様を説明する。
【０１３８】
Ｃ）シグナル−ノイズ比を改良するための試料の修飾
試料の複雑性を低減し、それによりバックグラウンドシグナルを減少させて、測定感度を改良するために、高密度プローブアレイとのハイブリダイゼーション前に、核酸試料を修飾する。一実施態様では、発現モニタリング法のための複雑性低減は、バックグラウンドｍＲＮＡの選択的分解により達成される。これは、試料ｍＲＮＡ（例えば、ポリＡ＋ＲＮＡ）を、発現モニタリングアレイ中のプローブがハイブリダイズする領域を用いて特異的にハイブリダイズするＤＮＡオリゴヌクレオチドのプールを用いてハイブリダイズすることにより成し遂げられる。好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドのプールは、高密度アレイで見出されるのと同じプローブオリゴヌクレオチドから成る。
【０１３９】
オリゴヌクレオチドのプールは、多数の二本鎖化（ハイブリッド二重鎖）核酸を形成する試料ｍＲＮＡとハイブリダイズする。ハイブリダイズ化試料を次に、一本鎖ＲＮＡを特異的に消化するヌクレアーゼであるＲＮアーゼＡで処理する。その後、プロテアーゼおよび／または市販のＲＮアーゼ阻害剤を用いて、ＲＮアーゼＡを抑制し、次に二本鎖核酸を消化一本鎖ＲＮＡから分離する。この分離は、当業者に十分公知の多数の方法で成し遂げられ、その例としては電気泳動及び勾配遠心分離が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、好ましい実施態様では、ビーズに付着し、それにより核酸親和性カラムを形成するＤＮＡオリゴヌクレオチドのプールが提供される。ＲＮアーゼＡで消化後、ハイブリッド二重鎖を変性し（例えば加熱により又は塩を増量することにより）、予めハイブリダイズされたｍＲＮＡを溶離緩衝液中で洗い落とすことにより、ハイブリダイズ化ＤＮＡは簡単に除去される。
【０１４０】
高密度アレイ又はその他の固体支持体中のプローブとハイブリダイズする未消化ｍＲＮＡ断片は、次に、好ましくはＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡリンカーに付着されたフルオロフォアで末端標識される。この手法は、アレイ中のプローブに対応しない核酸が排除され、したがってバックグラウンドシグナルに関与するのに利用できない標識化試料ＲＮＡプールを生じる。
【０１４１】
試料複雑性を低減する別の方法は、高密度アレイプローブが向けられる領域にいずれかの側で隣接する領域とハイブリダイズするデオキシオリゴヌクレオチドを用いてｍＲＮＡをハイブリダイズすることを包含する。ＲＮアーゼＨによる処理は、二本鎖（ハイブリッド二重鎖）を選択的に消化して、デオキシオリゴヌクレオチドプローブにより以前に結合され、高電子密度アレイプローブの標的に対応する短い領域（例えば２０ｍｅｒ）に対応する一本鎖ｍＲＮＡのプールを、及び高密度アレイのプローブの標的間の領域に対応するより長いｍＲＮＡ配列を残す。次に、短いＲＮＡ断片を長い断片から分離し（例えば電気泳動により）、必要な場合には上記のように標識して、次に高密度プローブアレイを用いてハイブリダイゼーションのため用意する。
【０１４２】
第三のアプローチでは、試料の複雑性低減は、特定の（予選択）ｍＲＮＡメッセージの選択的除去を包含する。特に、高電子密度アレイ中のプローブにより特異的にプローブされない高度に発現されるｍＲＮＡメッセージは、好ましくは除去される。このアプローチは、３’（ポリＡ）末端に近接する予選択メッセージと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ポリＡ＋ｍＲＮＡをハイブリダイズする工程を包含する。プローブは、高度特異性及び低交差反応性を提供するように選択される。ＲＮアーゼＨによるハイブリダイズ化メッセージ／プローブ複合体の処理は、二本鎖領域を消化して、残りのメッセージからポリＡ＋を有効に除去する。次に、ポリＡ＋ＲＮＡを特異的に保持するか又は増幅する方法（例えば、オリゴｄＴカラム又は（ｄＴ）ｎ磁気ビーズ）で、試料を処理する。このような方法は、それらがもはやポリＡ＋尾部と関連がないので、選択されたメッセージ（単数又は複数）を保持又は増幅しない。これらの高度発現メッセージは試料から有効に除去されて、バックグラウンドｍＲＮＡの低減を示す試料を提供する。
【０１４３】
ＩＶ．ハイブリダイゼーションアレイ設計
Ａ）プローブ組成物
莫大な数のアレイ設計が本発明の実行に適している、と当業者は理解する。一般的差異スクリーニングアレイは、例えば無作為、偶発的選択、又は恣意的プローブ組を含む。あるいは、一般的差異スクリーニングアレイは、特定予選択長の考え得るすべてのオリゴヌクレオチドを含む。逆に、その他の発現モニタリングアレイは、典型的には、その発現を検出すべき核酸（単数又は複数）と特異的にハイブリダイズする多数のプローブを含む。好ましい実施態様では、アレイは１つ又はそれ以上の対照プローブを含む。
【０１４４】
１）被験プローブ
その最も簡単な実施態様では、高密度アレイは、長さ５塩基以上、好ましくは１０塩基以上、そしていくつかは４０塩基以上の「被験プローブ」（プローブオリゴヌクレオチドとも呼ばれる）を包含する。いくつかの実施態様では、プローブは長さ５０塩基未満である。いくつかの場合、これらのオリゴヌクレオチドは長さ約５〜約４５又は５〜約５０ヌクレオチド、さらに好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド長、最も好ましくは約１５〜約４０ヌクレオチドの範囲である。その他の特に好ましい実施態様では、プローブは長さ２０又は２５ヌクレオチドである。予選択発現モニタリングアレイでは、これらのプローブオリゴヌクレオチドは、検出するためにそれらが設計される遺伝子の発現の特定のサブ配列と相補的な配列を有する。したがって、被験プローブは、検出されるべき標的核酸と特異的にハイブリダイズすることができる。
【０１４５】
一般的差異スクリーニングのために設計された高密度オリゴヌクレオチドアレイでは、プローブオリゴヌクレオチドは遺伝子の特定の予選択サブ配列とハイブリダイズするために選択される必要がない。それと反対に、好ましい一般的差異スクリーニングアレイは、配列が無作為、恣意的又は偶発的であるプローブオリゴヌクレオチドを包含する。あるいは、プローブオリゴヌクレオチドは、既定の長さ（例えば、考え得るすべての４ｍｅｒ、考え得るすべての５ｍｅｒ、考え得るすべての６ｍｅｒｓ、考え得るすべての７ｍｅｒｓ、考え得るすべての８ｍｅｒｓ、考え得るすべての９ｍｅｒｓ、考え得るすべての１０ｍｅｒｓ、考え得るすべての１１ｍｅｒｓ及び考え得るすべての１２ｍｅｒｓ等）のすべての考え得るヌクレオチドを含む。
【０１４６】
無作為オリゴヌクレオチドアレイは、特定の長さのヌクレオチド配列のプールが、その長さの考え得るすべての配列の集合から無作為（即ちブラインド、不偏選択）に選択されるヌクレオチド配列のプールから有意に逸脱しないアレイである。
【０１４７】
プローブオリゴヌクレオチドの恣意的又は偶発的ヌクレオチドアレイは、プローブオリゴヌクレオチドが標的核酸を確認および／または予選択なしに選択されるアレイである。恣意的又は偶発的ヌクレオチドアレイは、近似するか又は無作為でさえあるが、しかしながら、それらが無作為の統計学的定義を満たすという保証はない。
【０１４８】
アレイは、本明細書に記載したようなプローブ組成、および／またはプローブの非重複性、および／またはコード配列偏向を基礎にしたいくつかのヌクレオチド選択を反映する。しかしながら、好ましい実施態様では、このような「偏向」プローブ組は依然として、あらゆる特定の遺伝子に特異的であるよう選択されない。
【０１４９】
特定の長さの考え得るすべてのオリゴヌクレオチドを包含するアレイは、配列の実質的にすべての順列に対応する配列を有するオリゴヌクレオチドを含有するアレイを示す。したがって、本発明のプローブオリゴヌクレオチドは、好ましくは４塩基まで（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）又は（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）あるいはこれらの塩基の誘導体を含むため、長さＸの考え得るすべてのヌクレオチドを有するアレイは、実質的に４Ｘの異なる核酸（例えば２ｍｅｒに関しては１６の異なる核酸、３ｍｅｒに関しては６４の異なる核酸、８ｍｅｒに関しては６５５３６の異なる核酸）を含有する。いくつかの少数の配列は、合成の問題、不注意な切断等のために、特定の長さの考え得るすべてのヌクレオチドのプールからうかつに存在しなくなる、と考えられる。したがって、長さＸの考え得るすべてのヌクレオチドを包含するアレイは、長さＸの考え得るヌクレオチドを実質的に有するアレイを示す、と理解される。実質的に、長さＸの考え得るすべてのヌクレオチドは、異なるヌクレオチドの考え得る数の９０％以上、典型的には９５％以上、好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、そして最も好ましくは９９．９％以上を含む。
【０１５０】
上記のプローブオリゴヌクレオチドは、定常ドメインをさらに含む。定常ドメインは、実質的にすべてのプローブオリゴヌクレオチドに共通のヌクレオチドサブ配列である。特に好ましい定常ドメインは、基質に最も近いオリゴヌクレオチドプローブの末端に位置する（即ち、リンカー／アンカー分子に付着する）。定常領域は、事実上あらゆる配列を包含し得る。しかしながら、一実施態様では、定常領域は制限部位のセンス又はアンチセンス鎖と相補的な配列又はサブ配列を包含する（制限エンドヌクレアーゼにより認識される核酸配列）。
【０１５１】
定常ドメインは、アレイ上に新規に合成される。あるいは、定常領域が別個の手法で調製されて、無傷でアレイに結合される。定常ドメインは別々に合成されて、次に無傷定常サブ配列が高密度アレイに結合されるため、無傷ドメインは事実上あらゆる長さを取りうる。いくつかの定常ドメインは、長さが３ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、さらに典型的には約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、最も典型的には３ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドの範囲である。特定の実施態様では、定常ドメインは長さ３ヌクレオチド〜約４５ヌクレオチド、さらに好ましくは３ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、最も好ましくは３〜約１５、又は１０ヌクレオチドの範囲でさえある。その他の実施態様では、好ましい定常領域は、長さが約５ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチドの範囲である。
【０１５２】
当該標的核酸（単数又は複数）を結合する被験プローブの他に、高密度アレイは多数の対照プローブを含有し得る。対照プローブは、本明細書中に示した３つの部類に分けられる：１）正規化対照；２）発現レベル対照；及び３）ミスマッチ対照。
【０１５３】
２）正規化対照
正規化対照は、核酸試料に付加される標識化参照オリゴヌクレオチドと完全に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブである。ハイブリダイゼーション後に正規化対照から得られるシグナルは、ハイブリダイゼーション条件、標識強度、「読み取り」効率、及び完全ハイブリダイゼーションのシグナルにアレイ間を変えさせるその他の因子の変異に関する対照を提供する。好ましい実施態様では、アレイ中のその他のすべてのプローブから読みとられるシグナル（例えば、蛍光強度）は対照プローブからのシグナル（例えば、蛍光強度）により分けられて、それにより測定を正規化する。
【０１５４】
事実上、あらゆるプローブが正規化対照として役立つ。しかしながら、ハイブリダイゼーション効率は塩基組成及びプローブ長に伴って変化する、と認識される。好ましい正規化プローブは、アレイ中に存在するその他のプローブの平均長を反映するよう選択されるが、しかしながらそれらは広範囲の長さを網羅するよう選択され得る。正規化対照（単数又は複数）はさらに、アレイ中のその他のプローブの（平均）塩基組成を反映するよう選択されるが、しかしながら好ましい実施態様では、１つだけ又は２〜３の正規化プローブが用いられ、それらは十分にハイブリダイズし（即ち二次構造を示さず）、いかなる標的特異的プローブにもマッチしないよう選択される。
【０１５５】
正規化プローブはアレイ中のあらゆる位置に、又はアレイ全体の多数の位置に存在して、ハイブリダイゼーション効率の空間的変異を制御し得る。好ましい実施態様では、正規化対照はアレイの隅又は縁、並びにその中間に位置する。
【０１５６】
３）発現レベル対照
発現レベル対照は、生物学的試料中で構成的発現遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブである。発現レベル対照は、細胞の全体的健康及び代謝活性を制御するよう設計される。発現レベル対照と標的核酸の発現レベルとの共分散の実験は、遺伝子の発現レベルの測定された変化又は変異がその遺伝子の転写率の変化によるものか又は細胞の健康の一般的変異によるものかを示す。したがって、例えば、細胞の健康状態が不十分であったりあるいは決定的な代謝物質を欠く場合、活性標的遺伝子及び構成的発現遺伝子の両方の発現レベルが低減すると予測される。この逆も言える。したがって、発現レベル対照と標的遺伝子の両方の発現レベルがともに減少するかあるいはともに増大すると思われる場合、その変化は全体としての細胞の代謝活性の変化に関与し、問題の標的遺伝子の示差的発現には関与しない。逆に、標的遺伝子及び発現レベル対照の発現レベルが同時変化しない場合、標的遺伝子の発現レベルの変異はその遺伝子の調節の差異に関与し、細胞の代謝活性の全体的変異には関与しない。
【０１５７】
事実上すべての構成的発現遺伝子が発現レベル対照に適した標的を提供する。典型的には、発現レベル対照プローブは構成的に発現される「ハウスキーピング遺伝子」のサブ配列と相補的な配列を有し、その例としてはβ−アクチン遺伝子、トランスフェリン受容体遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５８】
４）ミスマッチ対照
ミスマッチ対照は、標的遺伝子に対するプローブに対して、発現レベル対照に対して又は正規化対照に対して提供される。ミスマッチ対照は、１つ又はそれ以上のミスマッチ化塩基の存在を除いては、その対応する被験又は対照プローブと同一のオリゴヌクレオチドプローブである。ミスマッチ塩基は、そうでなければプローブが特異的にハイブリダイズする標的配列中の対応する塩基と相補的でないように選択される塩基である。１つ又はそれ以上のミスマッチは、適切なハイブリダイゼーション条件（例えば、緊縮条件）下で被験又は対照プローブがその標的配列とハイブリダイズすると予測されるが、しかしミスマッチプローブはハイブリダイズしない（又は有意に少ない程度にハイブリダイズする）よう選択される。好ましいミスマッチプローブは、中央ミスマッチを含有する。したがって、例えばプローブが２０ｍｅｒである場合、対応するミスマッチプローブは、位置６〜１４のいずれか（中央ミスマッチ）の単一塩基ミスマッチ（例えば、１つのＧ、Ｃ又はＴを１つのＡに置換する）を除いては、同一配列を有する。
【０１５９】
「一般的」（例えば無作為、恣意的、偶発的等）アレイでは、標的核酸（単数又は複数）は未知であるため、完全マッチ及びミスマッチプローブは先験的に確定、設計又は選択され得ない。この場合、プローブは好ましくは対として提供されるが、ここで各対のプローブは１つ又はそれ以上の予選択ヌクレオチドが異なる。したがって、対のどちらのプローブが完全マッチであるかが先験的に分からない一方、１つのプローブが特定の標的配列と特異的にハイブリダイズする場合には、対の他方のプローブはその標的配列に対するミスマッチ対照として作用することが分かる。完全マッチ及びミスマッチプローブは対として提供される必要はないが、しかし特定の予選択ヌクレオチドが互いに異なるプローブの大型集団（例えば３、４、５又はそれ以上）として提供され得る、と理解される。
【０１６０】
発現モニタリング及び一般的差異スクリーニングアレイの両方において、ミスマッチプローブは、プローブが相補的である標的以外の試料中の核酸との非特異的結合又は交差ハイブリダイゼーションに対する対照を提供する。したがって、ミスマッチプローブは、ハイブリダイゼーションが特異的か否かを示す。例えば、相補的標的が存在する場合、完全マッチプローブは一貫してミスマッチプローブより明るいはずである。さらに、全中央ミスマッチが存在する場合には、ミスマッチプローブを用いて突然変異を検出し得る。最後に、完全マッチ及びミスマッチプローブ間の強度の差（Ｉ（ＰＭ）−Ｉ（ＭＭ））は、ハイブリダイズ化物質の濃度の良好な測定値を提供するということも、本発明の発見である。
【０１６１】
５）試料調製／増幅／定量対照
高密度アレイはさらに、試料調製／増幅対照プローブを包含し得る。これらは、通常は検定中の特定の生物学的試料の核酸中に生じないために、選択された対照遺伝子のサブ配列と相補的であるプローブである。適切な試料調製／増幅対照プローブとしては、例えば当該試料が真核生物からの生物である場合、最近遺伝子に対するプローブ（例えばＢｉｏ  Ｂ）が挙げられる。
【０１６２】
ＲＮＡを、プロセッシング前に試料調製／増幅対照プローブが向けられる公知量の核酸でスパイクする。次に試料調製／増幅対照プローブのハイブリダイゼーションの定量は、プロセッシング工程（例えばＰＣＲ、逆転写、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写等）により引き起こされる核酸の存在量の変化の測定値を提供する。
【０１６３】
定量対照は同様である。典型的には、それらはハイブリダイゼーション前に公知量で試料核酸（単数又は複数）と組合される。それらは、定量参照を提供し、ハイブリダイゼーション量（濃度）を定量するための標準曲線を確定させるのに結うようである。
【０１６４】
Ｂ）プローブ選択及び最適化
ｉ）一般的差異スクリーニングアレイ
ａ）無想定プローブ選択
上記で説明したように、一般的差異スクリーニングアレイのためのプローブオリゴヌクレオチド選択は、無作為、恣意的、偶発的組成偏向であり、あるいは特定長の考え得るすべてのオリゴヌクレオチドを含む。したがって、プローブ選択は、本質的には想定できない。しかしながら、いくつかの実施態様では、特定のオリゴヌクレオチドはアレイから、又は分析から除外される。例えば、回文構造配列を含有するプローブ又は全てＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔなどである長い一続きを含有するプローブは除外される。除外するプローブは、単一アレイを同一試料と何回もハイブリダイズすることにより、および／またはアレイの異なるコピーを同一試料とハイブリダイズすることにより、同定し得る。同一試料に対するハイブリダイゼーション強度が許容不可能な変異（特定閾値以上の変異）を示すプローブは除外される（アレイ構築において又は単一分析において）。プローブが除外される変異レベルは、検定の所望の感度の一関数である。より高感度の検定を所望するほど、設定される除外閾値は低くなる。好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーション強度の変異がバックグラウンドの２倍を超え、相対変異が５０％以上を示す場合に、プローブは除外される。
【０１６５】
あるいは、このような除外は、被験核酸試料と参照核酸試料との間の差異が参照核酸試料とそれ自体との間の差異と比較される場合、示差的にハイブリダイズする配列の選択的同定に固有のものである。これは、以下のＩＸ（Ｂ）節でさらに詳細に記載する。
【０１６６】
ｂ）コドン縮重の利用
別の実施態様では、種特異的コドン使用を利用して、考え得るすべての配列とハイブリダイズするのに必要なプローブオリゴヌクレオチドの数を増大することなく、より長い（故により特異的且つ安定な）プローブを利用し得る。アミノ酸コドンはそれらのコドンの第一及び第二位置に保存されるが、一方第三位置は高度に冗長である。さらに、各々の種又は生物はいかなる特定のアミノ酸をコードするにも特定のコドンを好む。特定の種における特定のアミノ酸に対する好ましいコドンは、その種に関して最高頻度で用いられるコドンである。コドンの好みは、当業者には十分公知である。それらは、特定生物又は種のヌクレオチド配列の簡単な頻度分析により容易に確定される。
【０１６７】
同様に、特定の生物又は種のジ−、トリ−、テトラヌクレオチド頻度偏向を用いて、「組成偏向」一般的差異スクリーニングアレイに用いられるオリゴヌクレオチドプローブの選択を計量し得る。
【０１６８】
好ましい一実施態様では、各コドンの最初の２つのヌクレオチドは固定されているが三番目のヌクレオチドは変えられる（４方向ゆらぎを用いて、あるいはイノシン又はその他の非特異的ハイブリダイズ塩基を用いて）プローブオリゴヌクレオチドが調製される。好ましい実施態様では、プローブの各コドンは以下の一般式を有する：
３’−Ｘ１−Ｘ２−Ｉ−５’
（式中、Ｉはイノシン又は４方向ゆらぎであり、Ｘ１及びＸ２は、特定種に対する好ましいコドン使用にしたがって選択されるＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕである）。したがって、例えば特定の種のすべての核酸と実質的にハイブリダイズする１６ｍｅｒのアレイが調製され得るが、この場合、プローブは次式：
支持体−Ｉ１−Ｘ２Ｘ３Ｉ４−Ｘ５Ｘ６Ｉ７−Ｘ８Ｘ９Ｉ１０−Ｘ１１Ｘ１２Ｉ１３−Ｘ１４Ｘ１５Ｉ１６−３’
を有し、４１０個の異なるプローブオリゴヌクレオチドのみを有する。このプローブに関する適切なコドンを表１に示す。
【０１６９】
表１．一般的コード配列１６ｍｅｒプローブオリゴヌクレオチドに対する好ましい配列（アミノ酸コドン（遺伝子コード）の標準表より）
【０１７０】
【表１−１】
2006191932.tif 000004
プローブの親和性は、付加的イノシン（又は４方向、３方向又は２方向ゆらぎ、あるいはその他の一般的塩基）をオリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’末端に含入することにより、さらに増強される。これらのコドン使用偏向プローブをリガーゼ識別といっしょに用いて、獲得可能な配列情報をさらに増強し得る。したがって、例えば上記の１６ｍｅｒを包含するアレイとのハイブリダイゼーションがさらに、その配列が公知の、１つ又はそれ以上の連結可能な固定長Ｎのオリゴヌクレオチドとの連結を含む場合には、各々の連結が首尾よく行けば、１６＋Ｎヌクレオチドの配列情報が提供される。
【０１７１】
ｉｉ）発現モニタリングアレイ
好ましい実施態様では、発現モニタリング高密度アレイ中のオリゴヌクレオチドプローブは、用いられる特定のハイブリダイゼーション条件下で最小非特異的結合又は交差ハイブリダイゼーションを用いて、それらが向けられる核酸標的と特異的に結合するよう選択される。本発明の高密度アレイは１，０００，０００の異なるプローブを余分に含有するため、特定の核酸配列と結合する特徴的長さを有するすべてのプローブを提供することができる。したがって、例えば高密度アレイは、ＩＬ−２ｍＲＮＡと相補的な考え得るすべての２０ｍｅｒ配列を含有し得る。
【０１７２】
しかしながら、ＩＬ−２ｍＲＮＡに独特ではない２０ｍｅｒサブ配列が存在する。これらのサブ配列に向けられるプローブは、試料ゲノムの他の領域におけるそれらの相補的配列の生成物と交差ハイブリダイズすると予測される。同様に、その他のプローブは簡単に、ハイブリダイゼーション条件下で（例えば、二次構造、あるいは基質又は他のプローブとの相互作用により）、効率よくハイブリダイズするわけではない。したがって、好ましい実施態様では、このような不十分な特異性又はハイブリダイゼーション効率を示すプローブが確認され、そして高密度アレイそれ自体の中で（例えば、アレイの作製中に）あるいはハイブリダイゼーション後データ分析では含まれない。
【０１７３】
さらに、好ましい実施態様では、発現モニタリングアレイを用いて、数百塩基対長又はそれ以上長い遺伝子の存在及び発現（転写）レベルを確認し得る。ほとんどの適用のために、数千〜十万個の遺伝子の存在、非存在又は発現レベルを確認するのは有用である。アレイ当たりのオリゴヌクレオチド数は限定されているため、好ましい実施態様では、発現が検出さるべき各遺伝子に特異的な限定組の遺伝子のみを含有するのが望ましい。
【０１７４】
ａ）ハイブリダイゼーション及び交差ハイブリダイゼーションデータ
したがって、一実施態様において、本発明は、特定遺伝子の検出のためのプローブ組を最適化する方法を提供する。一般に、本方法は、標的遺伝子により転写されるｍＲＮＡのサブ配列と相補的である１つ又はそれ以上の特定の長さの多数のプローブを含有する高密度アレイを提供することを含む。一実施態様では、高密度アレイは、特定のｍＲＮＡと相補的である特定長のすべてのプローブを含有し得る。高密度アレイのプローブを次にそれらの標的核酸単独とハイブリダイゼーションし、次にプローブと相補的な標的を含有しない高複雑性、高濃度核酸試料とハイブリダイズする。したがって、例えば標的核酸がＲＮＡである場合、プローブを先ずそれらの標的核酸単独とハイブリダイズし、次にｃＤＮＡライブラリーから作られるＲＮＡ（例えば、逆転写ポリＡ＋ｍＲＮＡ）を用いてハイブリダイズするが、この場合、ハイブリダイズ化ＲＮＡのセンスは標的核酸とは反対である（高い複雑性のサンプルがプローブのための標的を含有しないことを確実にするため）。それらの標的との強力なハイブリダイゼーションシグナルを示し、高複雑性試料とは低交差ハイブリダイゼーションを示すか又は全く示さないプローブは、本発明の高密度アレイに用いるのに好ましいプローブである。
【０１７５】
高密度アレイはさらに、試験される各プローブに対するミスマッチ対照を含有する。好ましい実施態様では、ミスマッチ対照は中央ミスマッチを含有する。ミスマッチ対照と標的プローブの両方が高レベルのハイブリダイゼーション（例えば、ミスマッチとのハイブリダイゼーションが対応する被験プローブとのハイブリダイゼーションとほぼ等しいかそれ以上である）を示す場合、被験プローブは、好ましくは高密度アレイには用いられない。
【０１７６】
特に好ましい実施態様では、最適プローブは以下の方法にしたがって選択される：先ず、上記のように、標的核酸のサブ配列と相補的な多数のオリゴヌクレオチドプローブを含有するアレイが提供される。オリゴヌクレオチドプローブは、単一長であるか又は種々の長さの一続きである。高密度アレイは、特定のｍＲＮＡと相補的な特定長のすべてのプローブを含有し得るか、又は特定のｍＲＮＡの種々の領域から選択されるプローブを含有し得る。各々の標的特異的プローブに関しては、アレイはさらにミスマッチ対照プローブ、好ましくは中央ミスマッチ対照プローブを含有する。
【０１７７】
オリゴヌクレオチドアレイは、オリゴヌクレオチドプローブと相補的なサブ配列を有する標的核酸を含有する試料とハイブリダイズされ、そして各プローブとそのミスマッチ対照との間のハイブリダイゼーション強度の差が確定される。プローブとそのミスマッチ対照との間の差が閾値ハイブリダイゼーション強度（例えば、好ましくはバックグラウンドシグナル強度の１０％以上、さらに好ましくは２０％以上、最も好ましくは５０％以上）を越えるプローブだけが選択される。したがって、それらのミスマッチ対照に比して強いシグナルを示すプローブだけが選択される。
【０１７８】
プローブ最適化手順は、第二回目の選択を任意に包含し得る。個の選択においては、オリゴヌクレオチドプローブはプローブと相補的な配列を含有すると予測されない核酸試料を用いてハイブリダイズされる。したがって、例えばプローブがＲＮＡセンス鎖と相補的である場合、アンチセンスＲＮＡの試料が提供される。もちろん、特定の遺伝子を欠くことが公知の、あるいは特定遺伝子を発現しないことが公知の生物又は細胞株からの試料のような、その他の試料も提供され得る。
【０１７９】
プローブ及びそのミスマッチ対照の両方が閾値以下（例えば、バックグラウンドシグナル強度の約５倍未満、好ましくは約２倍以下、さらに好ましくは約１倍以下、最も好ましくは約半分以下）のハイブリダイゼーション強度を示すプローブだけが、選択される。この方法では、最小非特異的結合を示すプローブが選択される。最後に、好ましい実施態様では、両方の選択基準に合格し、各標的遺伝子に対して最高のハイブリダイゼーション強度を有するｎ個のプローブ（ｎは各標的遺伝子に望ましいプローブの数である）がアレイに組み込まれるために選択されるか、あるいはアレイ中にすでに存在する場合には、サブ配列データ分析のために選択される。もちろん、当業者は、両選択基準がプローブの選択のために単独で用いられる、と理解する。
【０１８０】
ｂ）発見的規則
上記のようにして得られたハイブリダイゼーション及び交差ハイブリダイゼーションデータを用いて、ハイブリダイゼーション及び交差ハイブリダイゼーション強度対種々のプローブ特性、例えば８塩基のウインドウ中のＡの数、Ｃの数、回文構造的強度等についてのグラフを作成し得る。次に、それらの特性とハイブリダイゼーション又は交差ハイブリダイゼーション強度との間の相関に関して、グラフを検査する。それを超えるとハイブリダイゼーションが常に不十分であるか、又は交差ハイブリダイゼーションが常に非常に強力である閾値を設定する。あらゆるプローブが判定基準の一つを満たせば、それはプローブ組から除外され、したがって、チップ上に置かれない。これは、発見的規則法と呼ばれる。
【０１８１】
この方法で２０ｍｅｒプローブに関して展開される一組の規則ｑを以下に示す：
ハイブリダイゼーション規則：
１）Ａの数が９未満である。
【０１８２】
２）Ｔの数が１０未満且つ０より大きい。
【０１８３】
３）Ａ、Ｇ又はＴの最大ランが１行中４塩基未満である。
【０１８４】
４）任意の２つの塩基の最大ランが１１塩基未満である。
【０１８５】
５）回文構造スコアが６未満である。
【０１８６】
６）群生スコアが６未満である。
【０１８７】
７）Ａの数＋Ｔの数が１４未満である。
【０１８８】
８）Ａの数＋Ｇの数が１５未満である。
【０１８９】
規則第４に関しては、任意の２つの塩基の最大ランに必要なのが１１塩基未満であることが、少なくとも３つの異なる塩基が任意の１２連続ヌクレオチド内に生じることを保証する。回文構造スコアは、オリゴヌクレオチドが自己相補性を最大にする点で折り畳み終わる場合には、相補的塩基の最大数である。したがって、例えば完全に自己相補的である２０ｍｅｒは回文構造スコアが１０である。群生スコアは既定の配列中の３ｍｅｒの同一塩基の最大数である。したがって、例えば５つの同一塩基のランは群生スコア３となる（塩基１〜３，塩基２〜４及び塩基３〜５）。
【０１９０】
任意のプローブがこれらの判定基準（１〜８）を満たす場合、そのプローブはチップ上に置かれるプローブの小集団の成員ではなかった。例えば、仮定上のプローブが５’−ＡＧＣＴＴＴＴＴＴＣＡＴＧＣＡＴＣＴＡＴ−３’であるとすると、それは４又はそれ以上の塩基のラン（即ち６のラン）を有するため、チップ上で合成されない。
【０１９１】
２０ｍｅｒに関して展開される交差ハイブリダイゼーション規則を以下に示す：
１）Ｃの数が８未満である。
【０１９２】
２）８塩基の任意のウインドウ内のＣの数が４未満である。
【０１９３】
したがって、任意のプローブがハイブリダイゼーション規則（１〜８）又は交差ハイブリダイゼーション規則（１〜２）を満たす場合、そのプローブはチップ上に置かれるプローブの小集団の成員ではなかった。これらの規則は、協力に交差ハイブリダイズする、又は低ハイブリダイゼーションを示す多数のプローブを除外し、弱度にハイブリダイズ中のプローブを除外するという中等度の仕事を実行した。
【０１９４】
これらの発見的規則は、手動計算により実行されるか、あるいはそれらは下記のＸＩＩ節に記載したようなソフトウエアで実行される。
【０１９５】
ｃ）ニューラルネット
別の実施態様では、ニューラルネットを訓練して、プローブの配列又はその他のプローブ特性を基礎にしてハイブリダイゼーション及び交差ハイブリダイゼーションを予測し得る。その場合、ニューラルネットを用いて、任意数の「最良」プローブを選び取る。このようなニューラルネットの一つは、２０ｍｅｒプローブを選択するために開発された。このニューラルネットは、予測強度と測定強度との間に中等度（０．７）の相関を生じ、ハイブリダイゼーションよりも交差ハイブリダイゼーションに関してより良好なモデルを示す。このニューラルネットの詳細は、実施例６に提示される。
【０１９６】
ｄ）ＡＮＯＶＡモデル
変異の分析（ＡＮＯＶＡ）モデルを構築して、構成的塩基対の一を基礎にして強度を模する。これは、融解エネルギーが連続した塩基のスタッキングエネルギーを基礎にしているという理論に基づく。ＡＮＯＶＡモデルを用いて、プローブ配列とハイブリダイゼーション及び交差ハイブリダイゼーション強度との間の相関が見出された。入力は、連続塩基対に分解されるプローブ配列であった。一モデルを作成して、ハイブリダイゼーションを、別のモデルで交差ハイブリダイゼーションを予測した。出力はハイブリダイゼーション又は交差ハイブリダイゼーション強度であった。
【０１９７】
考え得る２塩基の組合せが１４、そして組合せが見出される位置が１９で、それらで構成される３０４（１９＊１６）の考え得る入力が存在した。例えば、配列ａｇｇｃｔｇａ…は、最初の位置に「ａｇ」を、第二の位置に「ｇｇ」を、第三の位置に「ｇｃ」を、第四の位置に「ｃｔ」を、…と、有する。
【０１９８】
その結果生じるモデルは、出力強度の成分を考え得る入力の各々に割り当て、そのようにして既定配列に関する強度を概算するために、その１９の成分の各々に関する強度を単純に加える。
【０１９９】
ｅ）同様のプローブの削除（除去）
発現チップ中のプールシグナルの原因の一つは、モニタリング中の遺伝子以外の遺伝子がモニタリング中の配列の一部と非常によく似た配列を有することである。これを解決する最も簡単な方法は、一遺伝子より以上よく似たプローブを除去することである。したがって、好ましい実施態様では、一遺伝子異常の転写生成物とハイブリダイゼーションするプローブを除去（削減）するのが望ましい。
【０２００】
最も簡単な削減方法は、モニタリング中の生物に関するすべての公知の遺伝子を有する提議されたプローブを一列に並べることである。例えば、ある生物の遺伝子１に対するプローブ及びある生物の遺伝子２を以下に示すと：
【０２０１】
【化５】
2006191932.tif 000005
は、この列中に８つのマッチング塩基を有するが、以下の列中ではマッチング塩基は２０である：
【０２０２】
【化６】
2006191932.tif 000006
挿入又は欠失ミスマッチの検出を可能にするさらに複雑な算法もある。このような配列整列算法は、当業者には十分公知であり、その例としてはＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡ、あるいは定義の項に上記したようなその他の遺伝子マッチングプログラムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０３】
生物が非常によく似た多数の異なる遺伝子を有する場合には、非常によく似た遺伝子の一つだけの濃度を測定するようプローブ設定させるのは難しい。その場合、似ていない任意のプローブを切り取り、その族の遺伝子に対するプローブ組をプローブに設定させ得る。
【０２０４】
ｆ）合成周期削減
チップ用マスクを削減するためのコストは、合成周期の数にほぼ線状に関連する。正常組の遺伝子においては、あらゆるプローブが構築に専心する周期の数の分布は、ガウス分布に近似する。このため、マスクコストは一般に、プローブの約３％を投げ捨てることにより、１５％低減される。好ましい実施態様では、合成周期削減は、特定対象高密度オリゴヌクレオチドアレイの調製のために選択される合成周期の最大数より多い合成周期数を要するプローブを排除する（含まない）ことを、単に包含する。プローブの典型的合成は、記入された塩基の規則的パターン（ａｃｇｔａｃｇｔａｃｇｔ…）に従うため、プローブの構築に必要な合成工程数の計数は容易である。表１に示した一覧は、プローブが必要な合成周期数を計数するための典型的コードを提供する。
【０２０５】
表１．プローブの化学合成に必要な合成周期を計数するための典型的コード
【０２０６】
【表１−２】
2006191932.tif 000007
ｇ）選択法の組合せ
発見的規則、ニューラルネット及びａｎｎｏｖａモデルは、遺伝子の発現をモニタリングするためのプローブの数を削減又は低減する方法を提供する。これらの方法は必ずしも同一結果を生じないか、あるいは完全に独立した結果を生じるので、方法を組合せるのに有益である。例えば、１つ以上（例えば３つのうち２つ）の方法がプローブが良好な結果を生じるとは思えないと示す場合には、プローブは削減又は低減される。次に、合成サイクル削減が実行されて、コストが低減される。
【０２０７】
図１１は、プローブの数が低減又は削減された後に遺伝子の発現をモニタリングするためにプローブの数を増大する工程のフローを示す。一実施態様では、ユーザーは、各遺伝子の発現をモニタリングするためにチップ上に置くべき核酸プローブの数を特定できる。上記のように、良好な結果を生じるとは思えないプローブを低減するのは有益である。しかしながら、プローブの数は、実質的にプローブの所望の数より少なく低減し得る。
【０２０８】
工程４０２では、多数遺伝子をモニタリングするためのプローブの数が、発見的規則法、ニューラルネット、ａｎｎｏｖａモデル、合成周期削減、又は任意のその他の方法、あるいはそれらの組合せにより低減される。遺伝子は、工程４０４で選択される。
【０２０９】
選択遺伝子をモニタリングするための残りのプローブがプローブの所望数の８０％以上（変わることもあるし、ユーザーが限定することもある）であるか否かの確定がなされる。イエスの場合には、コンピューターシステムは、工程４０８で次の遺伝子に進むが、これは一般的に工程４０４に戻る。
【０２１０】
選択遺伝子をモニタリングするための残りのプローブがプローブの所望数の８０％以上の数値とならない場合には、選択遺伝子をモニタリングするための残りのプローブがプローブの所望数の４０％以上（変わることもあるし、ユーザーが限定することもある）であるか否かの確定がなされる。イエスの場合には、工程４１２で、削減後に、プローブが不完全であったことを示すために、遺伝子名の後ろに「ｉ」が添付される。
【０２１１】
工程４１４では、プローブを除去した束縛を弛めることにより、プローブの数が増大される。例えば、発見的規則の閾値は、１だけ増大される。したがって、プローブが予め除去された場合、それらは１行に４個のＡを有したならば、規則は弛められて、１行に５個のＡとなる。
【０２１２】
次に、工程４１６で、選択遺伝子をモニタリングするための残りのプローブがプローブの所望数の８０％以上であるか否かの確定がなされる。イエスの場合には、工程４１２で、遺伝子名の後ろに「ｒ」が添付されて、規則が弛められてその遺伝子のための合成プローブの数を生じたことを示す。
【０２１３】
工程４２０では、選択遺伝子をモニタリングするためのプローブが１つ又は２つの他の遺伝子と相反するだけであるか否かを見るためのチェックがなされる。イエスの場合、工程４２２で、遺伝子（又は標的配列）と相補的な全組のプローブが選び取られ、専らプローブの残りが選択遺伝子と正確に相補的であるように、削減される。
【０２１４】
次に、工程４２４で、選択遺伝子をモニタリングするための残りのプローブがプローブの所望数の８０％以上であるか否かの確定がなされる。イエスの場合には、工程４２６で、遺伝子名の後ろに「ｓ」が添付されて、２〜３の遺伝子だけが選択遺伝子と同様であったことを示す。
【０２１５】
工程４２８では、選択遺伝子をモニタリングするためのプローブは不一致により全く低減されない。次に、工程４３０で、選択遺伝子をモニタリングするための残りのプローブがプローブの所望数の８０％以上であるか否かの確定がなされる。イエスの場合には、工程４３２で、遺伝子名の後ろに「ｆ」が添付されて、プローブが遺伝子と完全に相補的な全族のプローブを包含することを示す。
【０２１６】
プローブの所望数の８０％が依然として存在しない場合には、工程４３４でエラーが報告される。任意数のエラー処理手続きが着手される。例えば、ユーザーに対してエラーメッセージが出され、遺伝子に対するプローブが保存されない。あるいは、ユーザーは新規の所望数のプローブを入れるよう促される。
【０２１７】
Ｖ．高密度アレイの合成
最小数の合成工程を用いて、オリゴヌクレオチド、ペプチド及びその他のポリマー配列の高密度アレイを形成する方法は公知である。オリゴヌクレオチド類似体アレイは、光指示化学カップリング、及び機械的指示カップリングを含めた、しかしこれらに限定されない種々の方法により、固体基質上に合成される（Ｐｉｒｒｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１４３，８５４号（さらにＰＣＴ公開ＷＯ  ９０／１５０７０参照）及びＦｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１００９２及びＷＯ  ９３／０９６６８参照）（これらは、例えば光指示合成技術を用いるペプチド、オリゴヌクレオチド及びその他の分子の巨大アレイを生成する方法を開示する）（Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，７６７−７７（１９９１）も参照）。ポリマーアレイの合成のためのこれらの手法は、ＶＬＳＩＰＳＴＭ法と現在呼ばれている。ＶＬＳＩＰＳＴＭアプローチを用いて、ポリマーのヘテロアレイを、多数の反応部位での同時カップリングを介して、異なるヘテロアレイに変換する（米国特許第０７／７９６，２４３号及び第０７／９８０，５２３号参照）。
【０２１８】
上記の米国特許第５，１４３，８５４号及びＰＣＴ公開ＷＯ  ９０／１５０７０及び９２／１００９２に記載されたようなＶＬＳＩＰＳＴＭ法の開発は、組合せ合成及び組合せライブラリーのスクリーニングの分野における草分け的技術であると考えられる。さらに近年、特許出願第０８／０８２，９３７号（１９９３年６月２５日提出）は、標的核酸の部分的又は完全配列をチェックし又は確定するために、そして特異的オリゴヌクレオチド配列を含有する核酸の存在を検出するために用い得るオリゴヌクレオチドプローブのアレイの製造方法を記載する。
【０２１９】
要するに、ガラス表面でのオリゴヌクレオチドアレイの光指示組合せ合成は、自動アミドリン酸塩化学及びチップ製造技術を用いて進行する。特異的一実行では、ガラス表面は、光不安定性保護基により遮断される官能基、例えばヒドロキシル又はアミン基を含有するシラン試薬で誘導される。写真平板マスクを介した光分解を用いて、官能基を選択的に曝露すると、これは次に流入する５’−光保護化ヌクレオシドアミドリン酸塩との反応が容易になる。アミドリン酸塩は照らされる（したがって、光不安定性遮断基の除去により曝露される）部位だけと反応する。したがって、アミドリン酸塩は、先行工程から選択的に曝露される領域に付加するだけである。これらの工程は、配列の所望のアレイが固体表面で合成されるまで、反復される。アレイ上の異なる位置での異なるオリゴヌクレオチド類似体の組合せ合成は、合成中の照明のパターン及びカップリング試薬の付加順序により確定される。
【０２２０】
ポリアミド主鎖を有するオリゴヌクレオチド類似体がＶＬＳＩＰＳＴＭ法に用いられる場合には、モノマーがリン酸結合を介して互いに付着しないため、アミドリン酸塩化学を用いて合成工程を実行するのは一般的に不適切である。その代わりに、ペプチド合成法が用いられる（例えば、Ｐｉｒｒｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１４３，８５４号参照）。
【０２２１】
ペプチド核酸は、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から市販されており、これはポリアミド主鎖と、天然ヌクレオシド中に見出される塩基を包含する。ペプチド核酸は高特異性を有する核酸と結合可能で、本開示のための「オリゴヌクレオチド類似体」と考えられる。
【０２２２】
前記の他に、単一基質上でオリゴヌクレオチドのアレイを生成するために用いられる別の方法は、同時係属中の出願第０７／９８０，５２３号（１９９２年１１月２０日提出）及び０７／７９６，２４３（１９９１年１１月２２日提出）、並びにＰＣＴ公開ＷＯ  ９３／０９６６８に記載されている。これらの出願に開示された方法では、試薬は、（１）予定領域上に限定されたチャネル内をフローイングするか、又は（２）予定領域に「スポッティング」することにより基質に供給される。しかしながら、その他のアプローチ、並びにスポッティングとフローイングの組合せが用いられる。各々の場合、基質のある活性化領域は、モノマー溶液が種々の反応部位に供給されると、他の領域から機械的に分離される。
【０２２３】
本発明の化合物及びライブラリーに適用される典型的「フローチャネル」法は一般的に、下記のように説明される。異なるポリマー配列は、適切な試薬が流れるか又は適切な試薬が置かれる基質の表面のフローチャネルを形成することにより、基質又は固体支持体の選択領域で合成される。例えば、モノマー「Ａ」が選択領域の最初の基で基質に結合されると仮定する。必要な場合には、選択領域の全部又は一部の基質の表面の全部又は一部は、例えば適切な試薬をチャネルの全部又はいくつかを通してフローイングすることにより、又は適切な試薬で全基質を洗浄することにより、結合のために活性化される。基質の表面にチャネルブロックを配置後、モノマーＡを有する試薬をチャネル全部又はチャネルのいくつかを通して流すか、又はそこに置く。チャネルは、第一選択領域に液体を接触させ、それにより第一選択領域中で直接的に又は間接的（空間を介して）に基質上のモノマーＡを結合する。
【０２２４】
その後、モノマーＢが、そのいくつかが第一選択領域に含まれる第二選択領域にカップリングされる。第二選択領域は、液体中で、基質表面のチャネルブロックの翻訳、回転又は置換中、あるいは化学物質又は光硬化性樹脂の層の沈着中、第二フローチャネルと接触する。必要な場合は、少なくとも第二領域を活性化するために工程を実行する。その後、モノマーＢを第二フローチャネルに通すかその中に置き、第二選択一でモノマーＢを結合させる。この特定の例では、その結果生じるプロセッシングのこの段階で基質に結合される配列は、例えばＡ、Ｂ及びＡＢである。工程を反復して、基質上の公知の位置で所望の長さの配列の巨大なアレイを形成する。
【０２２５】
基質が活性化された後、モノマーＡはいくつかのチャネルを通って流され、モノマーＢは他のチャネルを通って流され、モノマーＣはさらに別のチャネルを通って流される。この方法で、チャネルブロックが動かされねばならないか、又は基質が洗浄および／または再活性化されねばならない前に、多数の又はすべての反応領域がモノマーと反応する。多数の又はすべての利用可能な反応領域を同時に使用させることにより、洗浄及び活性化工程の数が最小限にされ得る。
【０２２６】
チャネルを形成するか、そうでなければ基質の表面の一部を保護する代替的方法がある、と当業者は認識する。例えば、いくつかの実施態様によれば、保護コーティング、例えば親水性又は疎水性コーティング（溶媒の性質によって）を、時には他の領域の反応体溶液により湿潤を促進する物質と組合せて、保護すべき基質の部分に用いる。このように、流動溶液はさらに、それらの設計された流動経路の外側を通るのを防止される。
【０２２７】
その他の実施態様によれば、半導体産業に広範に用いられるような電子又は光硬化性樹脂を沈着させることにより、チャネルが形成される。このような物質としては、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）及びその誘導体、並びに電子ビームレジスト、例えばポリ（オレフィン  スルホン）等が挙げられる（Ｃｈａｐｔｅｒ  １０  ｏｆ  Ｇｈａｎｄｉ，ＶＬＳＩ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗｉｌｅｙ（１９８３）にさらに詳細に説明されている）。これらの実施態様によれば、レジストが沈着され、選択的に曝露され、そして食刻されて、カップリングのために曝露された基質の一部を残す。レジストを沈着し、選択的にレジストを除去し、そしてモノマーカップリングするこれらの工程を反復して、所望の場所に所望の配列のポリマーを生成する。
【０２２８】
本発明の化合物及びライブラリーを調製する「スポッティング」法は、フローチャネル法と同様の方法で実行し得る。例えば、モノマーＡ、又は結合物質、あるいは二量体又は三量体又は四量体等、あるいは完全合成物質は、適切に活性化された反応領域の最初の基に供給され、そしてそれと結合し得る。モノマーＢは、活性化反応領域の第二の基に供給されて、それと反応する。上記のフローチャネル実施態様とは異なり、反応体は相対的に少量が選択領域中に直接沈着される（流すのではなく）ことにより供給される。いくつかの工程では、もちろん、全基質表面が噴霧されるか、そうでなければ溶液で被覆される。好ましい実施態様では、ディスペンサーが領域から領域に動いて、各停止時に必要な量だけモノマーを沈着する。典型的ディスペンサーとしては、モノマー溶液を基質及びロボットシステムに供給して基質に関してマイクロピペットの位置を制御するためのマイクロピペットが挙げられる。その他の実施態様では、ディスペンサーとしては、種々の試薬が反応領域に同時に供給されるような、一連の試験管、多岐管、ピペットのアレイ等が挙げられる。
【０２２９】
（ＶＩ．ハイブリダイゼーション）
核酸ハイブリダイゼーションは、単に、プローブ及びその相補的標的が相補的塩基対合により安定ハイブリッド二重鎖を形成し得る条件下で、変性プローブ及び標的核酸を提供することから成る。ハイブリッド二重鎖を形成しない核酸をその後洗い流して、典型的には付着した検出可能な標識の検出により検出されるハイブリダイズ化核酸を残す。核酸は、温度を上げることにより、又は核酸を含有する緩衝液の塩濃度を低下させることにより、あるいは化学物質の付加時に、あるいはｐＨを上げることにより変性される、と一般的に認識される。低緊縮条件（例えば、低温および／または高塩濃度および／または高標的濃度）下では、ハイブリッド二重鎖（例えばＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ又はＲＮＡ：ＤＮＡ）は、アニール化配列が完全には相補的でない場合でさえ、生成する。したがって、ハイブリダイゼーションの特異性は、低緊縮性で低減される。逆に、高緊縮性（例えば、高温又は低塩濃度）であるほど、低ミスマッチでハイブリダイゼーションがうまく行く。
【０２３０】
あらゆる程度の緊縮性を提供するよう、ハイブリダイゼーション条件は選択される、と当業者は理解する。好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは低温で実行され、この場合、６ｘＳＳＰＥ−Ｔ中で約４０℃〜約５０℃（０．００５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で、ハイブリダイゼーションが保証され、次に、高緊縮性（例えば、３７℃で１ｘＳＳＰＥ−Ｔ）で洗浄を実行して、ミスマッチハイブリッド二重鎖を除去する。所望のレベルのハイブリダイゼーション特異性が得られるまで、漸増的高緊縮性（例えば、３７℃〜５０℃で０．２５ｘＳＳＰＥ−Ｔという低濃度に下げて）で連続洗浄を実行する。緊縮性は、例えばホルムアミドのような薬剤を付加することにより、増大し得る。ハイブリダイゼーション特異性は、被験プローブのハイブリダイゼーションと存在し得る種々の対照（例えば発現レベル対照、正規化対照、ミスマッチ対照等）のハイブリダイゼーションとを比較することにより、評価し得る。
【０２３１】
概して、ハイブリダイゼーション特異性（緊縮性）とシグナル強度との間にはトレードオフが存在する。したがって、好ましい実施態様では、洗浄は、一貫した結果を生じ、バックグラウンド強度の約１０％以上のシグナル強度を提供する最高緊縮性で実行される。したがって、好ましい実施態様では、ハイブリダイズ化アレイは連続的に高緊縮性溶液で洗浄され、各洗浄間で読みとられる。このようにして生じたデータ組の分析により、それを超えるとハイブリダイゼーションパターンが評価できるほど変化し、当該する特定のオリゴヌクレオチドプローブに適切なシグナルを提供する洗浄緊縮性が明示される。
【０２３２】
好ましい実施態様では、非特異的結合を低減するためのハイブリダイゼーション中に洗剤（例えば、Ｃ−ＴＡＢ）又は遮断試薬（例えば、精子ＤＮＡ、ｃｏｔ−１  ＤＮＡ等）を使用することにより、バックグラウンドシグナルは低減される。特に好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは、約０．１〜約０．５ｍｇ／ｍｌＤＮＡ（例えば、ニシン精子ＤＮＡ）の存在下で実行される。ハイブリダイゼーションに遮断剤を使用することは、当業者には十分公知である（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  ８  ｉｎ  Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ上記、参照）。
【０２３３】
ＲＮＡ又はＤＮＡ間に形成される二重鎖の安定性は、一般的に、溶液中で、ＲＮＡ：ＲＮＡ＞ＲＮＡ：ＤＮＡ＞ＤＮＡ：ＤＮＡの順である。長いプローブは標的との良好な二重鎖安定性を有するが、短いプローブよりミスマッチ識別が不十分である（ミスマッチ識別とは、完全マッチプローブと単一塩基ミスマッチプローブとの間の測定ハイブリダイゼーションシグナル比を示す）。短いプローブ（例えば８ｍｅｒ）ほどミスマッチを非常によく識別するが、全体的二重鎖安定性は低い。
【０２３４】
例えば、公知のオリゴヌクレオチド類似体を用いて標的とプローブとの間に形成される二重鎖の熱安定性（Ｔｍ）を変えると、二重鎖安定性及びミスマッチ識別が最適化される。Ｔｍ変更の有用な一局面は、アデニン−チミン（Ａ−Ｔ）二重鎖がグアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）二重鎖より低Ｔｍを有するという事実から生じるが、これは一部はＡ−Ｔ二重鎖が塩基対当たり２つの水素結合を有するが、一方Ｇ−Ｃ二重鎖は塩基対当たり３つの水素結合を有するためである。塩基の不均一分布が認められるヘテロオリゴヌクレオチドアレイでは、各々のオリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーションを同時に最適化することは、一般的にできない。したがって、いくつかの実施態様では、Ｇ−Ｃ二重鎖を選択的に脱安定化し、および／またはＡ−Ｔ二重鎖の安定性を増大するのが望ましい。これは、例えばＧ−Ｃ二重鎖を形成するアレイのプローブ中のグアニン残基をヒポキサンチンと置換することにより、又はＡ−Ｔ二重鎖を形成するプローブ中のアデニン残基を２，６−ジアミノプリンと置換することにより、又はＮａＣｌの代わりに塩化アンモニウムテトラメチル塩（ＴＭＡＣｌ又はその他のアルキル化アンモニウム塩）を用いることにより、成し遂げ得る。
【０２３５】
オリゴヌクレオチド類似体プローブを用いることにより付与される二重鎖安定性変更は、例えば時間中に標的オリゴヌクレオチドを用いてハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド類似体アレイの蛍光シグナル強度を追跡調査することにより確認される。データは、特異的ハイブリダイゼーション条件、例えば室温の最適化を可能にする（将来、診断簡素化に適用するため）。
【０２３６】
二重鎖安定性の変更を立証する別の方法は、時間に伴ってハイブリダイゼーション時に生じたシグナル強度を追跡調査することによる。ＤＮＡ標的及びＤＮＡチップを用いる従来の実験は、シグナル強度が時間とともに増大し、安定性が高い二重鎖ほど、低安定性二重鎖より速く、より高いシグナル強度を生じる。すべての結合部位がいっぱいになるため、一定時間後にはシグナルはプラトー又は「飽和」に達する。これらのデータは、ハイブリダイズの最適化、及び特定温度での最高条件の確定を可能にする。
【０２３７】
ハイブリダイゼーション条件の最適化方法は、当業者には十分公知である（例えば、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９９３）参照）。
【０２３８】
（ＶＩＩ．検出方法）
検出方法は選択される標識に依り、そして当業者には公知である。したがって、例えば比色定量的標識を用いる場合、標識の簡単な可視化で十分である。放射能標識プローブを用いる場合、放射能の検出（例えば、写真フィルム又は固体状態検出器を用いて）で十分である。
【０２３９】
上記で説明したように、感度が非常に高く且つ簡便であるために、蛍光標識が好ましい。標準手法を用いて、標的配列と試薬との間の相互作用が起こる位置を確定する。例えば、標的配列が標識され、異なるオリゴヌクレオチドプローブのアレイに曝露されると、オリゴヌクレオチドが標的（試料核酸）と相互作用する位置だけが有意のシグナルを示す。標識を用いる他に、その他の方法を用いてマトリックスを走査し、相互作用が起きる位置を確定し得る。相互作用のスペクトルは、もちろん、多数の条件の各々で起きる相互作用の反復走査により、一時的方法で確定し得る。しかしながら、個々の相互作用の各々を別々に調べる代わりに、多数の配列相互作用をマトリックス上で同時に確定し得る。
【０２４０】
Ｂ．走査システム
好ましい実施態様では、ハイブリダイズ化アレイは特定の蛍光標識の励起波長での光源により励起され、その結果生じる発光波長での蛍光が検出される。特に好ましい実施態様では、励起光源は、蛍光標識の励起に適したレーザーである。
【０２４１】
蛍光シグナルの検出は、好ましくは同焦点顕微鏡を、さらに好ましくは完全高密度アレイを自動的に走査するためにコンピューター制御段階で自動化される同焦点顕微鏡を用いる。顕微鏡は、アレイ上の各オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションにより生じた蛍光シグナルを自動的に記録するために自動データ獲得システムに取り付けられる光変換器（例えばフォトマルチプライヤー、固体状態アレイ、ｃｃｄカメラ等）を装備する。このような自動システムは、米国特許第５，１４３，８５４号、ＰＣＴ出願２０  ９２／１００９２及び同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／１９５，８８９（１９９４年２月１０日提出）に詳細に記載されている。シグナル検出のために同焦点顕微鏡とともにレーザー照明を用いると、約１００μｍより良好な、さらに好ましくは約５０μｍより良好な、最も好ましくは約２５μｍより良好な解像度で検出できる。
【０２４２】
自動検出装置を用いると、特定位置標識の相関が、オリゴヌクレオチドが相互作用の特異性を有する配列の標的上の存在に変換される。したがって、位置情報がデータベースに直接変換されて、どのような配列相互作用が起きたかを示す。例えば、核酸ハイブリダイゼーション適用では、基質マトリックスと標的分子との間で相互作用した配列は、位置情報から直接列挙され得る。好ましい検出システムは、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１５０７０及びＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／６２４，１２０に記載されている。そこに記載された検出は蛍光検出器であるが、しかしその検出器は分光学的又はその他の検出器に取り換え得る。走査システムは、固定基質に対して移動する検出器、可動性基質を有する固定検出器又はその組合せを用い得る。あるいは、鏡又はその他の装置を用いて、シグナルを直接検出器に伝え得る（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／６２４，１２０参照）。
【０２４３】
検出方法は、典型的にはいくつかのシグナルプロセッシングを組み入れて、特定マトリックス位置でのシグナルが真正シグナルであるか、又は擬似シグナルであるかを確定する。例えば、実際に陽性シグナルを有する領域からのシグナルは、実際には陽性シグナルを有さない隣接領域に陽性シグナルを広げて、提供する傾向がある。これは、例えば、走査システムが、２つの領域を分けるのに十分高いピクセル密度の解像度で適正に識別していないところで起きる。したがって、空間領域でのシグナルは、陽性シグナルの位置及び実際の程度を確定するためにピクセル毎に評価される。真正シグナルは、理論的には、各ピクセル位置で均一シグナルを示す。したがって、実シグナル強度を有するピクセル数をプロッティングすることによる処理は、明瞭な均一シグナル強度を有するべきである。シグナル強度がわずかに広い分散を示す領域が特定的に推測され、走査システムがプログラムされて、その位置をより注意深く走査する。
【０２４４】
さらに高性能のシグナル処理技術が、陽性シグナルが存在するか否かの初期確定に適用され得る（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／６２４，１２０及び下記のＸＩＩ節の考察参照）。
【０２４５】
（ＶＩＩＩ．連結増強性シグナル検出）
Ａ）一般的連結反応
連結反応を用いて、完全相補性ハイブリッドと、特にミスマッチがプローブオリゴヌクレオチドの５’末端近クローニングある場合の、１つ又はそれ以上の塩基対が異なるものとを識別し得る。シグナル検出に連結反応を用いると、ハイブリッド二重鎖の安定性が増大され、ハイブリダイゼーション特異性（特に、短いプローブオリゴヌクレオチド、例えば５〜１２ｍｅｒに関して）が改良され、そして任意に付加的配列情報が提供される。
【０２４６】
連結反応を一般的差異アレイと組合せて用いるための種々の構成成分を、図１３ａに示す。その最も簡単な実施態様では、プローブオリゴヌクレオチド／連結反応系は、オリゴヌクレオチドプローブのアレイを包含する。上記のように、オリゴヌクレオチドプローブは無作為に選択され、偶発的に選択され、組成偏向性で、特定長の考え得るすべてのオリゴヌクレオチドを包括し得る。オリゴヌクレオチドプローブは、アレイ上の実質的にすべてのプローブオリゴヌクレオチドに対して実質的に同一配列を有する予定「定常」領域（図１３ａ参照）を任意に包含し得る。
【０２４７】
プローブが定常領域を有する場合、それはさらに、好ましくは、無作為に選択され、偶発的に選択され、組成偏向性で、特定長の考え得るすべてのオリゴヌクレオチドを包括し得る「可変領域」（図１３ａ参照）を包含する。定常及び可変領域が存在する場合、オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする試料核酸は、典型的には少なくとも可変領域と、そして任意に定常領域と同様にハイブリダイズする。
【０２４８】
プローブオリゴヌクレオチド／連結反応系はさらに、定常領域と相補的である核酸を任意に含む。この補体は、試料核酸のサブ配列であるか、又は別個のオリゴヌクレオチドである。定常領域に対する補体が別個のオリゴヌクレオチドである場合、定常領域とのハイブリダイゼーションは連結部位を提供する（図１３ａ、連結部位Ａ参照）。定常領域とハイブリダイズした補体は、任意に、架橋試薬（例えばソラレン）の使用により定常領域と恒久的に架橋される。試料核酸および／または連結可能オリゴヌクレオチドは、任意に標識される。両方が標識される場合、標識は同一であっても異なってもよい。
【０２４９】
プローブオリゴヌクレオチド／連結反応系は、任意に、可変領域の遊離端に連結され得る連結可能オリゴヌクレオチドを包含する（図１３ａ、連結部位Ｂ参照）。連結可能オリゴヌクレオチドは、公知のヌクレオチド配列の単一オリゴヌクレオチド、公知の配列のヌクレオチドの集合、又は特定長の考え得るすべてのオリゴヌクレオチドのプールである。
【０２５０】
プローブオリゴヌクレオチド／連結反応系のこれらの種々の成分を種々の方法で組合せて、ハイブリッド二重鎖の安定性を増大し、および／またはハイブリダイゼーション特異性（特に、短いプローブオリゴヌクレオチド、例えば５〜１２ｍｅｒに対する）を改良し、および／または配列情報を提供し得る。プローブオリゴヌクレオチド／連結反応系の種々の使用を、以下に詳細に説明する。
【０２５１】
図１３ａは固相における連結成分を説明しているが、同様のアプローチ及び成分は溶液相で用い得る。定常領域と可変領域の順序は変え得ると理解される。さらに、プローブオリゴヌクレオチドは多数の定常領域および／または多数の可変領域を包含し得る。さらに、図１３ａは、３’末端により固体支持体に付着されるプローブオリゴヌクレオチドを示すが、プローブは逆にされて、そして５’末端を介して付着され得る。
【０２５２】
可変領域が存在するか又は存在しないプローブオリゴヌクレオチドの配列又はサブ配列は、重合鋳型として残りのプローブオリゴヌクレオチドおよび／または連結オリゴヌクレオチドおよび／または試料核酸を用いた重合の開始のためのプライマー部位として作用し得る、と理解される。
【０２５３】
Ｂ）プローブ末端、標的末端又は両末端でのミスマッチを識別するための連結反応
一実施態様では、簡単な連結反応がプローブオリゴヌクレオチドの末端又は末端付近のミスマッチを識別した（図１３ｂ参照）。典型的には、試料核酸を包含する核酸断片はアレイ中のプローブオリゴヌクレオチドより長い。したがって、ハイブリダイズすると、標的核酸は典型的にはオーバーハングを有する。アレイがその３’末端を介して付着したプローブオリゴヌクレオチドを包含する場合、ハイブリダイズ化標的（試料）核酸は３’オーバーハングを提供する。この実施態様では、標的核酸は必ずしも標識されない（例えば、図１３ｂ参照）。
【０２５４】
オリゴヌクレオチドのアレイを標的核酸と組合せて標的−オリゴヌクレオチドハイブリッド複合体を形成すると、標的−オリゴヌクレオチドハイブリッド複合体はリガーゼ及び標識化連結可能オリゴヌクレオチドと、あるいは標識化連結可能プローブのプールと接触される。試料核酸及び連結可能プローブのハイブリダイゼーションは連続して実施され得るが、好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーション及び連結は同時に実行される（即ち、標的、連結可能オリゴヌクレオチド及び連結体はすべて一緒に付加される）。プールは特定の予選択プローブを包含するか、又は特定長（例えば、３ｍｅｒ〜１２ｍｅｒまで）の考え得るすべてのプローブの集合である（例えば、図１３ｂ参照）。
【０２５５】
標識化連結可能プローブの基質上でのオリゴヌクレオチドプローブのリン酸化５’末端への連結反応は、主に、標的：オリゴヌクレオチドハイブリッドがオリゴヌクレオチドプローブの５’末端近くで正しい塩基対合で生じた場合、並びに標的核酸の適切な３’オーバーハングが存在してハイブリダイゼーション及び連結のための鋳型として役立つ場合、リガーゼの存在下で起きる（図１２参照）。連結反応後、標的核酸及び標識化非連結化プローブを除去するのに適した条件下（例えば、４０℃〜５０℃以上、又はそうでなければ高緊縮条件下）で、基質は洗浄される（必要な場合には複数回）。
【０２５６】
その後、ハイブリダイゼーションパターンの蛍光画像（例えば、定量的蛍光画像）が、上記のＶＩＩ（Ｂ）項に記載したように得られる。標識化オリゴヌクレオチドプローブ、即ち標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチドプローブが同定される。ハイブリダイゼーションシグナルの存在、非存在および／または強度は、上記のように核酸試料中の核酸配列又はサブ配列の存在及びレベルに関する情報を提供する。
【０２５７】
二重鎖ＤＮＡの一本鎖切断の部位でのホスホジエステル結合の形成を触媒するあらゆる酵素を用いて、完全相補的ハイブリッドと１つ又はそれ以上の塩基対が異なるものとの間の識別を増強し得る。このようなリガーゼとしては、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、大腸菌から単離されたリガーゼ、並びにその他の細菌及びバクテリオファージから単離されたリガーゼが挙げられるが、これらに限定されない。リガーゼの濃度は、用いられる特定のリガーゼ、標的の濃度及び緩衝液条件によって変わるが、典型的には約５０単位／ｍｌ〜約５，０００単位／ｍｌの範囲である。さらに、標的：オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション複合体のアレイがリガーゼと接触する時間は変化する。典型的には、リガーゼ処理は数分から数時間の範囲の時間、実施する。リガーゼ識別の実施方法は、ＵＳＳＮ０８／５３３，５８２（１９９５年１０月１８日提出）に、そしてＪａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１６８５−１６１９に記載されている。
【０２５８】
上記の方法は主に、表面結合プローブオリゴヌクレオチドの５’末端又はその付近のミスマッチを識別し、標識（試料）核酸の５’末端又はその付近のミスマッチはほとんど識別しない、と理解される（図１３ｂ参照）。
【０２５９】
別の実施態様では、連結を用いて試料核酸の末端又はその付近のミスマッチを識別し得る（図１３ｃ）。この場合、プローブオリゴヌクレオチドは定常領域及び可変領域を包含する（例えば、可変領域は図１３ｃに示したように、考え得るすべての８ｍｅｒを含み得る）。定常オリゴヌクレオチド（定常領域又はそのサブ配列と相補的）は定常領域とハイブリダイズされ、その位置で架橋（例えば、共有結合）される。残りのプローブオリゴヌクレオチド（例えば可変領域又はそのサブ配列、及び任意に定常領域のサブ配列）は、核酸試料がハイブリダイズし得る５’オーバーハングを形成する。試料オリゴヌクレオチドの末端又はその付近にミスマッチが存在しない場合には、連結により試料オリゴヌクレオチドが定常オリゴヌクレオチドと連結する。遊離核酸を洗い落として、その後検出される結合ハイブリダイズ化試料オリゴヌクレオチドを残す。
【０２６０】
さらに別の実施態様では、二重連結（図１３ｄに示す）を用いてプローブオリゴヌクレオチドと標的核酸の両方の末端又はその付近のミスマッチを識別し得る。このアプローチでは、プローブオリゴヌクレオチドは各々、ＶＩＩＩ（Ａ）に記載したような定常領域及び可変領域を包含する。表面結合オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブの定常領域と相補的な配列を有する定常オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。試料（標的）核酸は、リガーゼの存在下でハイブリッド二重鎖と接触する。試料核酸と可変領域との間に末端ミスマッチが存在しない場合には、連結はうまくゆき、その結果、定常オリゴヌクレオチドと試料核酸との連結を引き起こす（図１３ｄの「一次連結」参照）。したがって、この連結は試料核酸の末端のミスマッチを識別する。
【０２６１】
ハイブリダイズ化二重鎖を、標識化連結可能オリゴヌクレオチドのプールと接触させる。連結可能プローブがハイブリダイズ化試料核酸により生じたオーバーハングと相補的であり、プローブオリゴヌクレオチドの可変領域の遊離末端又はその付近にミスマッチが存在しない場合、二次連結は標識化連結可能プローブを付加する（図１３ｄ参照）。したがって、二次連結は、プローブオリゴヌクレオチドの遊離末端付近のミスマッチに対して識別する。種々のハイブリダイゼーション及び連結反応は連続して又は同時に実施され、好ましい実施態様では同時に実施される、と理解される。
【０２６２】
前記の方法と同様に、二重鎖ＤＮＡの一本鎖切断の部位でのホスホジエステル結合の形成を触媒するあらゆる酵素を用いて、完全相補的ハイブリッドと１つ又はそれ以上の塩基対が異なるものとの間の識別を増強し得る。このようなリガーゼとしては、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、大腸菌から単離されたリガーゼ、並びにその他の細菌及びバクテリオファージから単離されたリガーゼが挙げられるが、これらに限定されない。リガーゼの濃度は、用いられる特定のリガーゼ、標的の濃度及び緩衝液条件によって変わるが、典型的には約５０単位／ｍｌ〜約５，０００単位／ｍｌの範囲である。さらに、標的オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドプローブハイブリッド複合体のアレイがリガーゼと接触する時間は変化する。典型的には、リガーゼ処理は数分から数時間の範囲の時間、実施する。さらに、２つの連結反応が連続して実施されるか、あるいは標的オリゴヌクレオチド、定常オリゴヌクレオチド、標識化連結可能プローブのプール及びリガーゼを含有する単一反応ミックス中で同時に実施されるということは、当業者には容易に明らかになる。
【０２６３】
この二元的連結方法では、一次連結反応は一般に、標的オリゴヌクレオチドの５’末端（即ち最後の３〜４塩基）がオリゴヌクレオチドプローブの可変領域とマッチする場合にのみ起こる。同様に、標識をプローブに付加する二次連結反応は、一般に、一次連結反応がうまく行き、連結化標的がプローブの５’末端と相補的である場合にのみ効率よく起こる。したがって、この方法は、可変領域の両端に特異性を提供する。さらに、この方法は、用いられる可変プローブ領域短くし、プローブ：標的特異性を増大し、標的を標識する必要をなくすという点で有益である。この種の二元的連結方法は、同時係属中のＵＳＳＮ０８／５３３，５８２（１９９５年１０月１８日提出）に詳細に記載されている。
【０２６４】
別の実施態様では、プローブオリゴヌクレオチドの定常領域と相補的なヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後、それにより形成されたハイブリッド二重鎖は、その後変性しないように恒久的に架橋される。試料核酸がこのように形成されたオーバーハングと連結されると、それはさらに固体支持体に恒久的に付着される。この実施態様では、連結可能オリゴヌクレオチドの使用が最適である。試料核酸は、それ自体標識されて、それにより連結化試料核酸の検出を可能にする。
【０２６５】
核酸の架橋方法は、当業者には十分公知である。このような方法としては、紫外線曝露、電離放射線曝露、及び化学的架橋試薬との接触が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい実施態様では、架橋は化学的架橋試薬を用いた共有結合の形成によりなしとげられる。好ましい架橋試薬としては二官能架橋試薬があげられ、架橋は、核酸を用いた架橋試薬の化学的又は光活性化により成し遂げられる。試薬はハイブリッド二重鎖形成後に適用されるが、好ましい実施態様では、架橋剤は、ハイブリダイゼーション前に、最初にプローブ又は（定常領域と）相補的核酸に付加される。
【０２６６】
架橋試薬は、テスター核酸をハイブリダイズ化ドライバー核酸と共有的に架橋する任意の二官能分子である。一般的に、架橋試薬は、テスター又はドライバー核酸に一付加されて光励起時に対応するハイブリダイズ化核酸と共有的に結合する二次光化学的反応性残基を残す二官能光試薬である。架橋分子はさらに、化学反応、例えばアルキル化、縮合又は付加によりプローブ又はテスター核酸に非光化学的に結合され、その後対応するハイブリダイズ化核酸と光化学的に結合する混合化学的及び光化学的二官能試薬である。ハイブリダイゼーション後に触媒的に又は高温により活性化される二官能化学的架橋分子も用い得る。
【０２６７】
二官能光試薬の例としては、フルオロクマリン、ベンゾジピロン及びビスアジド、例えばビスアジドエチジウムブロミドが挙げられる。化学的及び光化学的結合部分の両方を有する混合二官能試薬の例としては、ハロアルキルフルオロクマリン、ハロアルキルベンゾジピロン、ハロアルキルクマリン及び種々のアジドヌクレオシドトリホスフェートが挙げられる。
【０２６８】
特に好ましい架橋剤としては、線状フルオロクマリン（ソラレン）、例えば８−メトキシソラリン、５−メトキシソラリン及び４，５’，８−トリメチルソラリン等が挙げられる。その他の適切な架橋剤としては、シス−ベンゾジプロン及びトランス−ベンゾジピロンが挙げられる。ソロンＳｏｒｌｏｎとして商業的に公知の架橋剤も適切である。ハイブリダイズ化核酸の架橋の詳細な説明は、ＷＯ８５／０２６２８を参照していただきたい。
【０２６９】
連結反応の使用を包含する前記の増強識別法は、完全相補的ハイブリッドと１つ又はそれ以上の塩基対が異なるものとの間の識別の改良が役立つすべての場合に用い得る。さらに、このような方法は、配列のより正確な確定（例えば新生シーケンシング）、発現のモニタリング、突然変異のモニタリング又は標的核酸の再シーケンシングに用い得る（即ち、このような方法を第二のシーケンシング手法と一緒に用いて、別個の立証を提供し得る）。前記は、標的：オリゴヌクレオチドハイブリッド複合体のアレイがリガーゼ及び標識化連結可能プローブで処理されて高密度オリゴヌクレオチドアレイ上のハイブリダイゼーションシグナルを改良する方法を説明するためのものであって、本発明はそれらに限定されない。
【０２７０】
Ｂ）配列情報を付加するための連結反応
ｉ）単一連結からの配列情報の延長
上記の連結反応を用いて、ハイブリダイズ化核酸に関して得られた配列情報を増大し得る。高密度オリゴヌクレオチドアレイ上の各プローブオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は公知である、と理解される。試料核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズ化試料核酸がハイブリダイズ化プローブオリゴヌクレオチドと相補的な配列又はサブ配列を有することを示す。したがって、ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズ化試料中に存在する核酸（例えば遺伝子転写産物）を同定するために用い得る配列情報を提供する。概して、得られる配列情報は、プローブオリゴヌクレオチドの長さにより支配される。したがって、プローブオリゴヌクレオチドが８ｍｅｒである場合、８ヌクレオチドの配列情報が得られる。
【０２７１】
しかしながら、上記の連結識別反応を用いて別の配列情報を提供し得る。この実施態様では、既定の長さの考え得るすべての連結可能オリゴヌクレオチドというよりむしろ、アレイ及び試料核酸が、１つ又はそれ以上の位置のヌクレオチドが公知である予定連結可能オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる。したがって、標識オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及び連結が首尾よく行くと、ハイブリダイズ化試料核酸はプローブオリゴヌクレオチドの他に連結可能オリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有するようになる。
【０２７２】
したがって、例えばプローブオリゴヌクレオチドが８ｍｅｒであって、特異的６ｍｅｒ連結可能プローブが用いられる場合、その結果生じるハイブリダイゼーションは１４ヌクレオチドの価値の配列情報を提供する。
【０２７３】
この情況で異なる連結可能オリゴヌクレオチドを用いる場合は、種々の連結化オリゴヌクレオチド間を区別するのが望ましい。これは、各々の異なる種の連結可能プローブを用いて連続連結し、その後アレイを読みとることにより成し遂げ得る。あるいは、各種の連結可能オリゴヌクレオチドを異なる検出標識で標識して、種々の異なる標識の同時連結とその後の検出を可能にする。
【０２７４】
ｉｉ）複合（標的）試料核酸中の制限部位に隣接する配列を問い合わせるための一般的連結遺伝子チップの使用
一般的差異アレイを用いて、複合ＤＮＡクローンの指紋を採り、又は既定供給源からの遺伝子発現の複合パターンをモニタリングし得る。指紋採取の場合、既定制限酵素部位に隣接する核酸配列（例えば、８ｂｐ配列）をシーケンシングする。
【０２７５】
指紋採取に際しては、認識配列の長さによってある頻度で標的を切断する制限酵素が用いられる。したがって、制限消化は、ゲノムＤＮＡに沿ってほぼ均一に分布する核酸断片を生じる。例えば、Ｈｓｐ９２  ＩＩのような４−カッターは約数百塩基対毎に１回標的を切断し、一方６−カッター、例えばＳａｃＩはおよそ数千（４，０００）塩基対毎に１回標的を切断する。制限酵素断片を用いる場合、個々の断片は、典型的には非オーバーラップ性で、平均数千塩基対の長さである。指紋採取のためには、６−カッター制限酵素を用いると、２０００〜３０００断片ｘ４０００塩基／断片＝８００万〜１２００万塩基対／標的を検査できる。これは、香典し密度アレイ中の８００万〜１２００万塩基対標的をルーチンに分類して発現差を測定し、又は遺伝子発現をモニタリングし（例えは、図１４ｃ参照）、それにより試料核酸の各制限消化物に関する特徴的発現「指紋」又は存在量差指紋を提供し得る。したがって、指紋採取法は、ほぼ均一且つ再現可能な方法で核酸集団を準試料採取し、このように試料採取した標的核酸に関する発現プロフィールおよび／または存在量差を確定する手段を提供する。
【０２７６】
概して、本方法は、プローブオリゴヌクレオチドが上記のように定常領域及び可変領域を包含する高密度一般的差異スクリーニングアレイを提供することを含む。しかしながら、この場合、定常領域（アンカー配列）の最後の少数個の塩基は制限認識部位の５’末端と相補的であるよう選択され（例えば、図１４ａ及び１４ｂ参照）、相補的アンカー配列は適切な数の塩基により短縮される。可変領域は、上記のように無作為に選択され、偶発的に選択され、組成偏向性である。
【０２７７】
しかしながら、好ましい実施態様では、可変領域は特定長（例えば、考え得るすべての３ｍｅｒ、考え得るすべての４ｍｅｒ、…・考え得るすべての１２ｍｅｒ）の、さらに好ましくは考え得るすべての８ｍｅｒの考え得るすべての核酸を含有する。
【０２７８】
試料核酸は、制限酵素を用いて断片化することにより調製される。５’末端に０、１又は２個の塩基のみを有する好ましい制限酵素は、連結のより大きい特異性を提供する（即ち、ＳａｃＩはちょうど５’Ｃを残し、Ｈｓｐ９２  ＩＩは５’末端に認識部位塩基を何も残さない）。しかしながら、５’末端により多くの塩基を残す制限酵素が用いられる。いくつかの制限酵素は、それらがすべて、５’末端に同一認識塩基を残す場合には、同時に用い得る。例えば、Ａａｔ  ＩＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｈＩ、ＨｈａＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＡｐａＩ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｂａｎ  ＩＩ、はすべて、５’末端でちょうどＣを残して、これらの適合性酵素を成す。制限酵素及びそれらの特徴的認識／切断部位は、と業者には十分公知である（例えば、Ｃｌｏｎｅ  Ｔｅｃｈ  ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａ参照）。
【０２７９】
次に、消化標的を、好ましくは定常領域との補体の存在下で、標準条件（例えば、３０℃、ｏ／ｎ、８００Ｕ  Ｔ４リガーゼ、Ｔ４リガーゼ緩衝液）を用いて、高密度アレイとハイブリダイズし、連結する。ハイブリダイゼーションは、事実上、試料核酸を分類する（定めるおよび／または局在させる）。試料核酸の位置は、５’末端の制限部位に隣接する塩基の配列により確定される。ハイブリダイゼーションデータは、上記のように発現モニタリング法に直接用い得るし、あるいは同手法は一般的差異スクリーニングのために１つ又はそれ以上の試料核酸で実行し得る。
【０２８０】
好ましい実施態様では、２つのフォーマットのうちの１つが用いられる。フォーマットＩでは、連結断片（例えば試料核酸、任意に定常領域に対する補体）は補体との（ソラレンの使用による）その付着（例えば、架橋による）により、高密度アレイ中の場所に固定される。断片に対する相補的鎖は変性され、希釈塩基（例えば１Ｎ  ＮａＯＨ）によりアレイから洗い落とされる。次に、これらの架橋断片は１つ又はそれ以上の核酸試料との第回目のハイブリダイゼーションでプローブとして用いられる。次に、同一アレイ又は別個のアレイと同時に又は連続してハイブリダイズされた異なる核酸間のハイブリダイゼーションパターンを比較することにより、示差的核酸存在量（例えば示差的遺伝子発現）
をモニタリングし得る。
【０２８１】
第二のフォーマット（フォーマットＩＩ）では、特に試料核酸がデオキシ核酸試料である場合、ＤＮＡは上記のように制限消化され、次に一般的差異アレイと直接的にハイブリダイゼーション／連結される。強度差が生じる部位は、核酸存在量の差を示す。アレイ中のプローブ及び認識部位の配列の位置から得られる配列情報を基礎にしてその核酸に特異的なプライマーを設計することにより，示差的に豊富な（例えば、示差的に発現された）核酸をクローン化する。８ｍｅｒ（可変領域）及び６塩基制限酵素に関しては、これは１４ｍｅｒプライマー配列を生じる。短ゲノムに関しては、１４ｍｅｒプライマーを用いてクローンを単離し得る。長いゲノムは、プライマープローブ（可変領域）の長さが８ｍｅｒ以上に増大するので、より扱いやすくなる。
【０２８２】
制限酵素消化試料核酸は、好ましくは、指紋採取法で、そしてフォーマットＩＩで、標識され、高密度アレイと連結される（上記及び図１４ｄ参照）。フォーマットＩ検定の場合は、連結標的配列は、好ましくは標識されず、その代わりに標識化試料核酸の高密度アレイとの第２回目のハイブリダイゼーションでハイブリダイゼーションプローブとして役立つ。
【０２８３】
既定の制限酵素により切断されなかった部位は高密度アレイに連結しないことを保証するために、アルカリ性ホスファターゼを用いて制限酵素消化前に試料核酸を処理する。
【０２８４】
ｉｉｉ）一般的差異アレイ上の示差的表示断片の分析
示差的表示を支持する原則は、次式のアンカープライマーを用いてＲＮＡから転写される一次鎖ｃＤＮＡ集団からの一組の無作為プライマー処理増幅（例えばＰＣＲ）断片を生成することである：
（Ｔ）ｎＶＡ、（Ｔ）ｎＶＧ、（Ｔ）ｎＶＣ及び（Ｔ）ｎＶＴ
（式中、ＶはＡ、Ｇ又はＣであり、ｎは約６〜約３０の範囲、好ましくは約８〜約２０、さらに好ましくは約１０〜約１６の範囲であって、ｎ＝１４が最も好ましい）。どの無作為プライマー及びアンカープライマーが選択されるかによって、異なる組のｃＤＮＡ転写体が特定核酸断片組中に表される。これらの増幅断片は、断片の５’末端の配列を基礎にしてそれらがハイブリダイズする一般的スクリーニングオリゴヌクレオチドアレイ上の断片を分類することにより、分析される。
【０２８５】
本方法は、図１６ａ〜１６ｅに示されている。標準法にしたがって、アンカー化ポリ（ｔ）プライマーを用いてポリ（Ａ）ｍＲＮＡの逆転写により、一次鎖ｃＤＮＡを合成する（図１６ａ）。一次鎖ＤＮＡは、工学処理制限部位及び３’末端の１つ又はそれ以上の縮重塩基（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を包含する上流プライマーを用いて、増幅（例えば、ＰＣＲによる）のための鋳型として作用する。次に、上流プライマー、アンカープライマー及び無作為プライマー（例えば、アンカープライマー（Ｔ）１４ＶＡ、（Ｔ）１４ＶＧ、（Ｔ）１４ＶＣ、（Ｔ）１４ＶＴ、及び無作為プライマー、例えばＳａｃＩ部位：５’−ＣＡＴＧＡＧＣＴＣＮＮ）を用いて、無作為プライマー処理ＰＣＲを実行する。その結果生じた増幅断片を次に工学処理制限部位に対応する制限エンドヌクレアーゼで消化する。その結果生じた試料核酸を次に、上記のように一般的差異スクリーニングアレイとハイブリダイズする。
【０２８６】
本方法は、好ましくは２又はそれ以上の核酸試料に対して実行し、それにより本発明の一般的差異スクリーニング法の使用が可能になる。一実施態様では、プローブオリゴヌクレオチドは、存在する場合には試料核酸上の残りの制限部位と相補的な定常部位を包含する。残りの分析は、上記と同様に進行する。
【０２８７】
本方法は、数千の又はそれ以上の「バンド」（核酸）でさえ同時に分析し得る。さらに、示差的に豊富な核酸に関して、配列情報が提供される。例えば、切断がＳａｃＩによる場合には、９塩基尾部（ＣＡＴＧＡＧＣＴＣ）が提供されて、アレイは相補的９塩基定常領域及び考え得るすべての９ｍｅｒを包含する可変領域を有するプローブオリゴヌクレオチドを包含する。これは、各ハイブリダイゼーションに関して１７ヌクレオチドの配列情報を提供する（９ｍｅｒ定常＋８ｍｅｒ可変）。
【０２８８】
ｉｖ）制限選択核酸ハイブリダイゼーションからの付加配列情報を抽出するための連結の使用  連結反応を制限消化と組合せて用いて、ほぼ均一間隔で試料核酸を準試料採取し、同時に連結反応を用いて付加配列情報を提供し得る。この実施態様では、プローブオリゴヌクレオチドが制限部位のセンス又はアンチセンス鎖と相補的な核酸配列を包含する高密度アレイが提供される（例えば、図１４参照）。試料核酸はＤＮアーゼで無作為に、又は制限エンドヌクレアーゼで特異的に消化される（例えばＳａｕ３Ａ）。次に消化オリゴヌクレオチド高密度アレイとハイブリダイズする。定常領域と相補的な末端を有する核酸だけがプルオリゴヌクレオチドと結合する。したがって、制限断片は優先的に選択される。
【０２８９】
アレイはさらに、リガーゼの存在下で特定長（例えば６ｍｅｒ）の考え得るすべてのオリゴヌクレオチドを包含する連結可能オリゴヌクレオチドのプールを用いてハイブリダイズされ、それにより相補的連結可能オリゴヌクレオチドをプローブオリゴヌクレオチドの末端に連結する。これは、連結可能オリゴヌクレオチドの長さだけ長さが増大し、核酸試料中に存在することが公知の核酸と相補的なプローブオリゴヌクレオチドを生じる。
【０２９０】
次に、ＤＮＡをアレイから取り除き、延長プローブを用いて上記のような核酸試料の一般的差異スクリーニングを実行する。種々の試料中で示差的に発現される核酸に対応するプローブが同定された場合、公知のプローブ配列を用いて試料中で示差的に発現される核酸を同定し得る。
【０２９１】
一実施態様では、これは、定常領域＋公知の可変領域及び付加的ヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ）を一端に包含する４プライマーオリゴヌクレオチドを生成することにより、成し遂げられる。次に、ゲノムクローンを二次制限酵素で消化し、アダプター配列と連結する。４プライマーオリゴヌクレオチド及びアダプター配列をプライマーとして用いて、当該ゲノム配列をゲノムクローンから増幅（例えば、ＰＣＲを用いて）し得る。次にＰＣＲ増幅配列を用いて、ｃＤＮＡライブラリをプローブ（例えば、サザーンブロットで）して、当該する全ｃＤＮＡを得る。
【０２９２】
例えば、一実施態様では、１０ｍｅｒ高密度アレイは、それが１０ｍｅｒオリゴヌクレオチド（即ち、４１０＝１０４８５７６核酸）の考え得るすべての組合せ、及び各オリゴヌクレオチドの開始時に、その最初の４塩基が制限酵素の認識配列（例えば、Ｓａｕ３Ａ＋１塩基Ｔ）と相補的である定常配列（例えば３’−ＴＡＧＴ−５’）を包含するように消化される。
【０２９３】
大型ゲノムクローン又は簡素化ｃＤＮＡライブラリー（例えば、全ｍＲＮＡの５’末端又は３’末端を含有するだけのｃＤＮＡライブラリー）の、例えば４カッター酵素（本明細書中ではＳａｕ３Ａにより示される）を用いた完全消化は、５’オーバーハング配列（Ｓａｕ３Ａに関しては、オーバーハングはＧＡＴＣである）を有するＤＮＡ断片を生じる。認識部位は、約５００ｂｐ毎に存在する。
【０２９４】
ＤＮＡ断片が特定長（例えば６ｍｅｒ）の連結可能オリゴヌクレオチドの考え得るすべての組合せ及びＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で、１０ｍｅｒチップを用いてハイブリダイズされる場合、連結可能オリゴヌクレオチドはプローブオリゴヌクレオチド上で連結される。
【０２９５】
次に、ＤＮＡをチップから取り除き、上記のように核酸試料の一般的差異スクリーニングを実行する。これは、被験試料中に異なるレベルで存在する核酸とハイブリダイズするプローブオリゴヌクレオチドの同定を可能にする。
【０２９６】
アレイ中の当該プローブからのこの例（５ｍｅｒ定常領域塩基＋１０ｍｅｒ）
の１４ｂｐ配列を基礎にして、末端に塩基１つ（Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ）を付加することにより、４つの１６塩基プライマーを生成する。これらのプライマー及びアダプター配列をプライマーとして用いて、当該ゲノム配列を増幅し得る。次に増幅配列を用いて、ｃＤＮＡライブラリをプローブして、上記のように当該する全ｃＤＮＡを得る。
【０２９７】
（ＩＸ．シグナル評価）
Ａ）発現モニタリングのためのシグナル評価
ハイブリダイゼーション結果の評価方法は、使用する特異的プローブ核酸及び提供される対照の性質に伴って変わる、と当業者は理解する。最も簡単な実施態様では、各プローブの蛍光強度の簡単な定量が確定される。これは、高密度アレイ上の各位置（異なるプローブを表す）でのプローブシグナル強度を測定することにより簡単に成し遂げられる（例えばこの場合、標識は蛍光標識であり、アレイ上の各位置での固定励起照明により生じる蛍光の量（強度）を検出）。「被験」試料からの核酸とハイブリダイズするアレイの絶対強度と「対照」試料により生じる強度との比較は、各々のプローブとハイブリダイズする核酸の相対的存在量の測定を提供する。
【０２９８】
しかしながら、ハイブリダイゼーションシグナルは、ハイブリダイゼーションの効率、試料核酸上の標識の量及び試料中の特定の核酸の量に伴って強度が変わる、と当業者は理解する。典型的には、非常に低レベル（例えば、＜１ｐＭ）で存在する核酸は、非常に弱いシグナルを示す。いくつかの低レベル濃度では、シグナルは事実上バックグラウンドと区別できなくなる。ハイブリダイゼーションデータを評価する場合、閾値強度値は、バックグラウンドと本質的には区別できないので、シグナルが計数されない値より低く選択される。
【０２９９】
より低レベルで発現される核酸を検出したい場合、より低い閾値が選択される。逆に、高い発現レベルだけが評価される場合には、より高い閾値レベルが選択される。好ましい実施態様では、適切な閾値は平均バックグラウンドシグナルより約１０％高い値である。
【０３００】
さらに、適切な対照を用意すれば、ハイブリダイゼーション条件、細胞の健康、非特異的結合等の変異を制御するより詳細な分析が得られる。したがって、例えば好ましい実施態様では、ＩＶ（Ａ）（２）に上記したような正規化対照を用いてハイブリダイゼーションアレイが提供される。これらの正規化対照は、公知濃度で試料に付加される対照配列と相補的なプローブである。全体的ハイブリダイゼーション条件が不十分な場合、正規化対照はハイブリダイゼーション低減を反映してより小さなシグナルを示す。逆に、ハイブリダイゼーション条件が良好な場合には、正規化対照はハイブリダイゼーション改良を反映するより高いシグナルを提供する。したがって、正規化対照に対するアレイ中のその他のプローブから得られるシグナルの正規化は、アレイ合成における又はハイブリダイゼーション条件における変動に対する制御を提供する。典型的には、アレイ中のその他のプローブからの測定シグナルを正規化対照により生じた平均シグナルで割ることにより、正規化は成し遂げられる。正規化はさらに、試料調製及び増幅による変動に対する修正を含む。このような正規化は、シグナル測定値を試料調製／増幅対照プローブ（例えば、ＢｉｏＢプローブ）からの平均シグナルで割ることにより成し遂げ得る。その結果生じる値に定値を掛けて、結果を出す。
【０３０１】
上記のように、高密度アレイはミスマッチ対照を、あるいは総称的差異スクリーニングアレイの場合には、１つ又はそれ以上の予選択ヌクレオチドが異なる関連オリゴヌクレオチドプローブの対を包含し得る。好ましい発現モニタリングアレイでは、アレイ中のすべてのプローブ（正規化対照は除く）に関して中央ミスマッチが存在する。緊縮条件で洗浄後、プローブとハイブリダイズするのに完全マッチが予測されるがミスマッチは予測されない場合、ミスマッチ対照からのシグナルは主に、ミスマッチとハイブリダイズする核酸の試料中の非特異的結合又は存在を反映する、と予測される。発現モニタリング分析では、問題のプローブとその対応するミスマッチ対照がともに高シグナルを示すか、又はミスマッチがその対応する被験プローブより高いシグナルを示す場合には、それらのプローブからのシグナルは好ましくは無視される。標的特異的プローブとその対応するミスマッチ対照との間のハイブリダイゼーションシグナル強度の差は、標的特異的プローブの識別の測定値である。したがって、好ましい実施態様では、ミスマッチプローブのシグナルをその対応する被験プローブからのシグナルから引くと、被験プローブの特異的結合によるシグナルの測定値が得られる。同様に、下記のように、総称的差異スクリーニングでは、プローブ対間の差が算出される。
【０３０２】
次に、その核酸と特異的に結合するプローブの各々のシグナル強度を測定し、正規化対照に対して正規化することにより、特定の配列野濃度を確定し得る。プローブからのシグナルがミスマッチより大きい場合、ミスマッチが差し引かれる。ミスマッチ強度がその対応する被験プローブ以上である場合、シグナルは無視される。次に、正のシグナルの数（絶対又はそれ以上の閾値）、正のシグナルの強度（絶対又はそれ以上の選択閾値）又は両方の測定基準の組合せ（例えば、計量平均）により、特定遺伝子の発現レベルを採点し得る。
【０３０３】
正規化対照はしばしばハイブリダイゼーションシグナルの有用な定量を必要としないということは、本発明の意外な発見である。したがって、ＩＶ（Ｂ）（ｉｉ）（ａ）の項に上記したように、最適プローブが２つの工程選択方法で同定された場合、選択最適プローブにより生じる平均ハイブリダイゼーションシグナルはハイブリダイズ化核酸の濃度の良好な定量値を提供する。
【０３０４】
Ｂ）総称的差異スクリーニングに関するシグナル評価
上記の発現モニタリングと本質的には同じ方法で、総称的差異スクリーニングに関するシグナル評価を実施する。しかしながら、データは遺伝子毎にというよりむしろプローブ毎に評価される。
【０３０５】
好ましい実施態様では、各プローブオリゴヌクレオチドに関して、各プローブ対（Ｋ）の成員間のシグナル強度差は、以下のように計算される：
Ｘｉｊｋ１−Ｘｉｊｋ２
（式中、Ｘはプローブのハイブリダイゼーション強度であり、ｉはいずれかの試料（この場合は試料１又は２）を示し、ｊは各試料に対する複製を示し（各核酸試料に対して２つの複製がある実施例７の場合は、ｊは１又は２である）、Ｋはプローブ対ＩＤ数（実施例７の場合は、１…・３４，３２０）であり、１はプローブ対の一成員を示し、一方２はプローブ対の他方の成員を示す）。
【０３０６】
各資料に対する複製間の各プローブ対に関するシグナル強度の間の差を次に算出する。したがって、各プローブに関して例えば、試料１（例えば正常細胞株）
の複製１及び２間と、試料２（例えば腫瘍細胞株）の複製１及び複製２間との差は、ｋ−１〜総数のプローブに関して、以下のように算出される：
（Ｘ１１ｋ１−Ｘ１１ｋ２）−（Ｘ１２ｋ１−Ｘ１２ｋ２）
複製は、全プローブ対に関して、以下のように互いに正規化される（即ち、正規化後、平均比は約１である）：
試料１に関して（Ｘ１１ｋ１−Ｘ１１ｋ２）／（Ｘ１２ｋ１−Ｘ１２ｋ２）
試料２に関して（Ｘ２１ｋ１−Ｘ２１ｋ２）−（Ｘ２２ｋ１−Ｘ２２ｋ２）
最後に、２つの複製で平均を取った試料１と試料２の間の差を算出する。この値は、２つの試料間の正規化後、以下の：
（（Ｘ２１ｋ１＋Ｘ２２ｋ２）／２）−（（Ｘ１１ｋ１＋Ｘ１２ｋ２）／２）
のように計算するが、これは次式の平均比を基礎にしている：
［（Ｘ２１ｋ１＋Ｘ２２ｋ２）／２］／［（Ｘ１１ｋ１＋Ｘ１２ｋ２）／２］
このデータは、プローブ数（ＩＤ）の一関数としてプロットされ、示差的ハイブリダイズ化核酸を有するプローブは容易に識別できる（例えば、図１６ｃ参照）。
【０３０７】
しかしながら、データは濾過されて、バックグラウンドシグナルを低減する。この場合、複製間で正規化（上記）後、以下のように比を計算する：
（Ｘ１１ｋ１−Ｘ１１ｋ２）／（Ｘ１２ｋ１−Ｘ１２ｋ２）の絶対値＞１の場合には、
比＝（Ｘ１１ｋ１−Ｘ１１ｋ２）／（Ｘ１２ｋ１−Ｘ１２ｋ２）さもなくば、
比＝（Ｘ１２ｋ１−Ｘ１２ｋ２）／（Ｘ１１ｋ１−Ｘ１１ｋ２）（逆）
各オリゴヌクレオチド対の差に関する試料２の複製１及び２の比は、同様の方法で算出されるが、しかし以下の絶対値を基礎にする：
（Ｘ２１ｋ１−Ｘ２１ｋ２）／（Ｘ２２ｋ１−Ｘ２２ｋ２）及び
（Ｘ２２ｋ１−Ｘ２２ｋ２）／（Ｘ２１ｋ１−Ｘ２１ｋ２）。
【０３０８】
最後に、上記のように、各オリゴヌクレオチド対の差に関して２つの複製で平均を取った試料１と試料２の比は、上記と同様に正規化後に、図１７ａの場合と同様に、しかし以下の絶対値を基礎にして算出した：
［（Ｘ２１ｋ１＋Ｘ２２ｋ２）／２］／［（Ｘ１１ｋ１＋Ｘ１２ｋ２）／２］及び
［（Ｘ１１ｋ１＋Ｘ１２ｋ２）／２］／［（Ｘ２１ｋ１＋Ｘ２２ｋ２）／２］。
【０３０９】
２つの試料間で最大示差的ハイブリダイゼーションを示すオリゴヌクレオチド対は、観察されたハイブリダイゼーション比及び差異値を分類することにより確認し得る。最大変化（増加又は低減）を示すオリゴヌクレオチドは、比のプロットから容易に分かる（例えば、図１７ｃ参照）。
【０３１０】
（Ｘ．発現が変わる遺伝子の確認）
上記のように、高密度アレイを包含するプローブオリゴヌクレオチドの核酸配列は公知である。最大ハイブリダイゼーション差を示すプローブの配列（及びこのような差異の族）を用いて、多数の手段のいずれかにより比較試料における示差的発現遺伝子を同定し得る。
【０３１１】
したがって、例えば示差的ハイブリダイズプローブの配列を用いて、核酸データベースを精査できる（例えば、公知のすべての配列に対する断片のＢＬＡＳＴ又は関連精査により）。あるいは、同様の量だけ変えるプローブ族を用いたいくつかの配列の再構築も成し得る。ほとんどを変えるプローブと相補的（又はほぼ相補的）な配列を含有する公知の遺伝子に対するデータベース精査は難しくはなく、それが一般的に配列再構築より容易であるため、示差的発現配列を確認するには好ましい方法である。
【０３１２】
別の実施態様では、示差的ハイブリダイゼーションパターンは、被験試料間の全体的発現プロフィール（単数又は複数）に有意差が認められることを示し、そして差異に特異的なプローブを同定する。これらのプローブは、試料から異なる部分を抽出するための特異的親和性試薬として用い得る。これは、いくつかの方法でなしとげられる：
一アプローチでは、試料間の最大差を示すプローブとハイブリダイズされる物質が、高密度アレイからミクロ抽出される。例えば、ハイブリダイズ化核酸は、小毛管を用いて取り出される。あるいは、光不安定性リンカーを用いてチップに固定されるプローブは、高密度アレイの所望の部分での選択的照射により放出される。
【０３１３】
別のアプローチでは、高密度アレイ上のすべてのプローブの配列が公知であるため、そして示差的にハイブリダイズするプローブが確認されているため、後者プローブを親和性試薬として用いて、被験試料中で示差的にハイブリダイズする核酸を抽出し得る。一旦示差的ハイブリダイズプローブがアレイ中に確認されると、プローブ（単数又は複数）をビーズ（又はその他の支持体）上で合成し、試料とハイブリダイズし得る（この工程に関しては、必ずしも断片化されない―――全長クローンが望ましい）
。当業者に公知の方法にしたがって、抽出される物質をクローニングおよび／またはシーケンシングして、示差的発現種についての所望の情報を得る（例えば、クローンを標識化オリゴヌクレオチドを用いてスクリーニングして、適切な挿入物でそれを確定し、および／または無作為に選択して、シーケンシングする）。
【０３１４】
さらに別のアプローチでは、当該ハイブリダイズ化プローブの配列を用いて増幅プライマー（例えば、逆転写および／またはＰＣＲプライマー）を生成する。次に示差的発現配列を増幅し、プローブとして用いて、上記のように逆転写酵素ｃＤＮＡ工程中に付加される特異的配列（例えば、ポリＡを基礎にしたプライマー又は付加３‘配列）と組合せてアレイから確定される配列特異的プライマーを用いてゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを精査する。適切なクローニング及びシーケンシング技術、並びに多数のクローニング練習を通して熟練者を指導するのに十分な使用説明は、以下に記載されている：Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ‐Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．）Ｖｏｌ．１−３；ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９４  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）。生物試薬及び実験装置のメーカーからの製品情報も、公知の生物学的方法に有用な情報を提供する。このようなメーカーとしては、以下の各社が挙げられる：ＳＩＧＭＡ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ），Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ），ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ），Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ），Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ），Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ａｎｓｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、並びに多数のその他の熟練者に公知の供給元。
【０３１５】
要するに、上記の方法を用いて、どの遺伝子をモニタリングするかについての事前の想定もなく、そして配列についての事前の知識も持たずに、示差的発現遺伝子を同定し得る。一旦同定されれば（そして予めシーケンシングされていなければ遺伝子をシーケンシングすれば）、同時係属中の出願０８／５２９，１１５（１９９５年９月１５日提出）及びＰＣＴ／ＵＳ９６／１４８３９に記載されているのと同様の方法で、特異的遺伝子を検出し、定量するよう設計された高密度アレイ中に、新規の配列を包含し得る。したがって、２つのアプローチは相補的であって、１つはおそらくは未知の遺伝子の発現差に関して広範囲に精査するのに用いられ、他方は重要であるとして選択された遺伝子又は少なくとも部分的に予めシーケンシングされた遺伝子をより特異的にモニタリングするのに用いられる。
【０３１６】
（ＸＩ．発現モニタリング及び総称的差異スクリーニングのためのキット）
別の実施態様では、本発明は発現モニタリングおよび／または総称的差異スクリーニングのためのキットを提供する。キットとしては、本発明の１つ又はそれ以上の高密度オリゴヌクレオチドアレイを含有する単数又は複数の容器が包含されるが、これらに限定されない。総称的差異スクリーニングのための好ましいキットとしては、少なくとも２つの高密度アレイが含まれる。キットはさらに１つ又はそれ以上の核酸試料を標識するための単数又は複数の標識が含まれる。さらに、キットは、１つ又はそれ以上の結紮可能なオリゴヌクレオチドを包含する。ある実施態様では、キットは異なる結紮可能オリゴヌクレオチドのプール、好ましくは特定長の考え得るすべてのオリゴヌクレオチド（例えば考え得るすべての６ｍｅｒ）のプール、又は特異的結紮可能オリゴヌクレオチドの組を含有する。キットは、あらゆるその他の種々の遮断剤、標識、用具（例えば、トレー、顕微鏡フィルター、注射器等）、緩衝剤、そして本明細書中に記載したハイブリダイゼーション及び結紮反応を実行するのに有用なものを包含する、と当業者は理解する。さらに、キットは、本明細書中に記載したプローブの選択および／またはハイブリダイゼーションデータの分析のため記録媒体（例えば、光又は磁気ディスク）上に提供されるソフトウエアを含む。さらに、キットは、本発明の種々の方法（例えば、本明細書中に記載した種々の発現モニタリング法又は総称的差異スクリーニング法の実施）でキットの使用を教示する指導資料を含有する。
【０３１７】
（ＸＩＩ．コンピューター実行発現モニタリング）
本発明の遺伝子発現のモニタリング方法は、コンピューターを用いて実行する。コンピューターは、典型的には基板又はチップから測定したハイブリダイゼーション強度を分析し、したがって１つ又はそれ以上の遺伝子の発現をモニタリングし、又は核酸存在量の差をスクリーニングするために本発明を組み込んだコンピューターコードを包含するソフトウエアプログラムを実行する。以下に本発明の特定の実施態様を説明するが、それらは説明のためであって、本発明はそれらに限定されない。
【０３１８】
図６は、本発明の実施態様のソフトウエアを実行するために用いられるコンピューターシステムの一例を示す。図に示したように、コンピューターシステム１００は、モニター１０２、スクリーン１０４、キャビネット１０６、キーボード１０８及びマウス１１０を含む。マウス１１０は、１つ又はそれ以上のボタン、例えばマウスボタン１１２を有する。キャビネット１０６は、本発明を実行するコンピューターコードを組み込んでいるソフトウエアプログラム、本発明と一緒に使用するためのデータ等を保存及び検索するために利用されるＣＤ−ＲＯＭドライブ、１１４、システムメモリー及びハードドライブ（ともに図７に示す）を収容する。ＣＤ−ＲＯＭ１１６は好例のコンピューター読み取り可能記憶媒体として示されているが、フロッピー（登録商標）ディスク、テープ、フラッシュメモリー、システムメモリー及びハードドライブを含めた他のコンピューター読み取り可能記憶媒体も用い得る。キャビネット１０６はさらに、よく知られたコンピューター構成部品（図示せず）、例えば中央処理装置、システムメモリー、ハードディスク等を収容する。
【０３１９】
図７は、本発明の実施態様のソフトウエアを実行するために用いられるコンピューターシステム１００のシステムブロック図を示す。図６と同様に、コンピューターシステム１００はモニター１０２及びキーボード１０８を包含する。コンピューターシステム１００はさらに、サブシステム、例えば中央処理装置１２０、システムメモリー１２２、Ｉ／Ｏコントローラー１２４、ディスプレイアダプター１２６、取外し可能ディスク１２８（例えばＣＤ−ＲＯＭドライブ）、固定ディスク１３０（例えばハードディスク）、ネットワークインターフェイス１３２及びスピーカー１３４を含有する。本発明との使用に適したその他のコンピューターシステムは、付加的又はより少ないサブシステムを含有し得る。例えば、別のコンピューターシステムは、１つより多い処理装置１２０（即ち、多重処理装置システム）又はキャッシュメモリーを含有し得る。
【０３２０】
１３６のような矢印は、コンピューターシステム１００のシステムバスアーキテクチャーを表す。しかしながら、これらの矢印は、サブシステムを連結するために役立つあらゆる相互連絡機構を説明する。例えば、ローカルバスは、中央処理装置とシステムメモリー及びディスプレイアダプターを接続するために用いられる。図７に示したコンピューターシステム１００は、本発明とともに用いるのに適したコンピューターシステムの単なる一例である。本発明と用いるのに適したサブシステムのその他の構成は、当業者には容易に明らかになる。
【０３２１】
図８は、遺伝子の発現をモニタリングする工程のフローチャートである。本工程は、好ましくは共有的に基板又はチップの表面に付着される完全マッチ及びミスマッチプローブの対のハイブリダイゼーション強度を比較する。最も好ましくは、核酸プローブは、基板１ｃｍ２当たり約６０以上の異なる核酸プローブという密度を有する。フローチャートは平明にするために工程を並べたもので、この特定の順序で工程を実行しなければならないことを示すものではない。本発明から逸脱することなく、多数の工程が再注文され、組合せられそして削除される、と当業者は容易に認識する。
【０３２２】
最初に、標的配列（又は遺伝子）と相補的な核酸プローブが選択される。これらのプローブは完全マッチプローブである。標的配列と完全に相補的ではないよう意図された別の組のプローブが特定される。これらのプローブはミスマッチプローブで、各ミスマッチプローブは、完全マッチプローブと少なくとも１つのヌクレオチドで異なるミスマッチを含有する。したがって、それが得られたミスマッチプローブ及び完全マッチプローブは、一対のプローブを形成する。前記のように、ヌクレオチドミスマッチは、好ましくはミスマッチプローブの中央付近に存在する。
【０３２３】
完全マッチプローブのプローブ長は、典型的には標的配列と高ハイブリダイゼーション親和性を示すよう選択される。例えば、核酸プローブは、すべて２０ｍｅｒである。しかしながら、可変長のプローブが、曖昧さの解決を含めたどれほどかの数の理由のために基板上に合成され得る。
【０３２４】
標的配列は、典型的には断片化され、標識化されて前記のように核酸プローブを包含する基板に曝露される。次に核酸プローブのハイブリダイゼーション強度を測定し、コンピューターシステムに入力する。コンピューターシステムは、基板ハイブリダイゼーションを指図する同一システムであるか、又はそれは全く異なるシステムである。もちろん、本発明と用いるためのあらゆるコンピューターシステムはできるだけ遺伝子名、遺伝子配列、プローブ配列、基板上のプローブ位置等を含めた実験の利用可能なその他の詳細を有するべきである。
【０３２５】
図８を参照すると、ハイブリダイゼーション後、コンピューターシステムは工程２０２で完全マッチ及びミスマッチプローブの多重対のハイブリダイゼーション強度の入力を受け取る。ハイブリダイゼーション強度は、核酸プローブと標的核酸（遺伝子に対応する）の間のハイブリダイゼーション親和性を示す。各対は、標的核酸の一部と完全に相補的な完全マッチプローブ、及び少なくとも１つのヌクレオチドで完全マッチプローブと異なるミスマッチプローブを包含する。
【０３２６】
工程２０４で、コンピューターシステムは各対の完全マッチ及びミスマッチプローブのハイブリダイゼーション強度を比較する。遺伝子が発現される場合、対の完全マッチプローブのハイブリダイゼーション強度（又は親和性）は対応するミスマッチプローブより認識できる程度に高い必要がある。一般に、プローブの対のハイブリダイゼーション強度が実質的に同一である場合、それは遺伝子が発現されていないことを示す。しかしながら、確定はプローブの単一対を基礎にしておらず、遺伝子が発現されるか否かの確定は多重対のプローブの分析を基礎にする。プローブの対のハイブリダイゼーション強度を比較する好例の工程を、図９に関連してより詳細に記載する。
【０３２７】
システムが完全マッチ及びミスマッチプローブのハイブリダイゼーション強度を比較後、システムは工程２０６で遺伝子の発現を示す。一例として、遺伝子が存在する（発現される）か、限界的か又は存在しない（発現されない）ことを、システムはユーザーに示す。
【０３２８】
図９は、デシジョンマトリックスを用いて遺伝子が発現されるか否かを確定する工程のフローチャートを示す。工程２５２では、コンピューターシステムは、Ｎ対の完全マッチ及びミスマッチプローブの生走査データを受け取る。好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーション強度は基板上のプローブとハイブリダイズしたフルオレセイン標識化標的からの光子カウントである。分かり易くするために、完全マッチプローブのハイブリダイゼーション強度を「Ｉｐｍ」とし、ミスマッチプローブのハイブリダイゼーション強度を「Ｉｍｍ」とする。
【０３２９】
一対のプローブのハイブリダイゼーション強度を、工程２５４で検索する。工程２５６で、バックグラウンドシグナル強度を対のハイブリダイゼーション強度の各々から差し引く。バックグラウンド減算はさらに、同時に全生走査データに関しても実行し得る。
【０３３０】
工程２５８で、プローブ対のハイブリダイゼーション強度を差異閾値（Ｄ）及び比閾値（Ｒ）と比較する。対のハイブリダイゼーション強度間の差（Ｉｐｍ−Ｉｍｍ）が差異閾値以上であるか、そして対のハイブリダイゼーション強度の商（Ｉｐｍ／Ｉｍｍ）が比閾値以上であるかを確定する。差異閾値は、典型的には、単数又は複数の遺伝子の正確な発現モニタリングを生じるよう確定されたユーザー定義値である。一実施態様では、差異閾値は２０、比閾値は１．２である。
【０３３１】
Ｉｐｍ−Ｉｍｍ＞＝Ｄ及びＩｐｍ／Ｉｍｍ＞＝Ｒである場合、ＮＰＯＳ値は工程２６０で増大される。概して、ＮＰＯＳは、遺伝子が発現されそうであることを示すハイブリダイゼーション強度を有するプローブの対の数を示す値である。ＮＰＯＳは、遺伝子発現の確定に用いられる。
【０３３２】
工程２６２で、Ｉｍｍ−Ｉｐｍ＞＝Ｄ及びＩｍｍ／Ｉｐｍ＞＝Ｒであるか否かを確定する。この発現が正しい場合は、ＮＮＥＧ値が工程２６４で増大される。概して、ＮＮＥＧは、遺伝子が発現されそうでないことを示すハイブリダイゼーション強度を有するプローブの対の数を示す値である。ＮＮＥＧは、ＮＰＯＳと同様、遺伝子発現の確定に用いられる。
【０３３３】
遺伝子が発現されるか又は発現されないことを示すハイブリダイゼーション強度を示す各対に関して、対数比（ＬＲ）及び強度差値（ＩＤＩＦ）を工程２６６で算出する。ＬＲは、対のハイブリダイゼーション強度の商（Ｉｐｍ／Ｉｍｍ）の対数により算出される。ＩＤＩＦは、対のハイブリダイゼーション強度の差（Ｉｐｍ−Ｉｍｍ）により算出される。工程２６８でハイブリダイゼーション強度の次の対が存在する場合、それらは工程２５４で検索される。
【０３３４】
工程２７２で、デシジョンマトリックスを用いて遺伝子が発現されるか否かを示す。デシジョンマトリックスは、Ｎ、ＮＰＯＳ、ＮＮＥＧ及びＬＲ（多重ＬＲ）値を用いる。以下の４つの代入を実行する：
Ｐ１＝ＮＰＯＳ／ＮＮＥＧ
Ｐ２＝ＮＰＯＳ／Ｎ
Ｐ３＝（１０＊ＳＵＭ（ＬＲ））／（ＮＰＯＳ＋ＮＮＥＧ）
次にこれらのＰ値を用いて、遺伝子が発現されるか否かを確定する。
【０３３５】
説明のために、Ｐ値は範囲に分類される。Ｐ１が２．１以上である場合には、Ａが適正である。Ｐ１が２．１未満又は１．８以上である場合には、Ｂが適正である。そうでなければ、Ｃが適正である。したがって、Ｐ１は３つの範囲Ａ、Ｂ及びＣに分類される。これは、読者が本発明を理解しやすくするために成される。
【０３３６】
したがって、Ｐ値はすべて、以下による範囲に分類される：
Ａ＝（Ｐ１＞＝２．１）
Ｂ＝（２．１＞Ｐ１＞＝１．８）
Ｃ＝（Ｐ１＜１．８）
Ｘ＝（Ｐ２＞＝０．３５）
Ｙ＝（０．３５＞Ｐ２＞＝０．２０）
Ｚ＝（Ｐ２＜０．２０）
Ｑ＝（Ｐ３＞＝１．５）
Ｒ＝（１．５＞Ｐ３＞＝１．１）
Ｓ＝（Ｐ３＜１．１）
一旦Ｐ値が上記のブール値による範囲に分類されれば、遺伝子発現が確定される。
【０３３７】
遺伝子発現は、存在（発現）、限界値、又は非存在（非発現）として示される。以下の遺伝子発現が適正である場合には、遺伝子は発現したと示される：Ａ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）。言い換えれば、Ｐ１＞＝２．１、Ｐ２＞＝０．２０及びＰ３＞＝１．１である場合、遺伝子は発現したと示される。さらに、以下の発現が適正である場合、遺伝子は発現したと示される：Ｂ及びＸ及びＱ。
【０３３８】
前記の説明に関して、遺伝子発現指標の要約を以下に示す：
存在        Ａ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）
Ｂ及びＸ及びＩ
限界値      Ａ及びＸ及びＳ
Ｂ及びＸ及びＲ
Ｂ及びＹ及び（Ｑ又はＲ）
非存在      他のすべての場合（例えば、任意のＣの組合せ）
ユーザーへの出力に際して、工程２７４で、存在は「Ｐ」、限界値は「Ｍ」そして非存在は「Ａ」と示される。
【０３３９】
一旦全プローブ対が処理され、遺伝子の発現が示されれば、工程２７５で、１０回のＬＲの平均がコンピューター処理される。さらに、ＮＰＯＳ及びＮＮＥＧを増大したプローブに関するＩＤＩＦ値の平均が算出される。これらの値は、本実験と他の実験の定量的比較に用い得る。
【０３４０】
定量測定は、工程２７６で実行される。例えば、最新実験が過去の実験（例えば、工程２７０で算出した値）と比較される。さらに、実験は、公知量で生物学的試料中に存在するＲＮＡ（例えば細菌からの）のハイブリダイゼーション強度と比較される。このように、遺伝子発現指標又は呼出の正確さを立証し、閾値を修正し、又は前述の任意数の修正を実行し得る。
【０３４１】
分かり易くするために、図９は、単一遺伝子に関して記載した。しかしながら、本方法は生物学的試料中の多数の遺伝子に関して利用し得る。したがって、単一遺伝子の分析のいかなる考察も、本方法が多重遺伝子をプロセッシングするために拡張され得ないことを示すとは限らない。
【０３４２】
図１０Ａ及び１０Ｂは、ベースライン走査データと実験走査データを比較することにより遺伝子の発現を確定する方法の流れを示す。例えば、ベースライン走査データは、遺伝子が発現されることが公知の生物学的試料からのものである。したがって、この走査データを異なる生物学的試料と比較して、遺伝子が発現されるか否かを確定する。さらに、それは、単数又は複数の遺伝子の発現が生体内で時間中にいかに変化するかを確定する。
【０３４３】
工程３０２で、コンピューターシステムはベースラインからのＮ対の完全マッチ及びミスマッチプローブの生走査データを受け取る。ベースラインからの完全マッチプローブのハイブリダイゼーション強度を「Ｉｐｍ」とし、ベースラインからのミスマッチプローブのハイブリダイゼーション強度を「Ｉｍｍ」とする。工程３０４で、バックグラウンドシグナル強度をベースライン走査データの対のハイブリダイゼーション強度の各々から差し引く。
【０３４４】
工程３０６で、コンピューターシステムは実験生物学的試料からのＮ対の完全マッチ及びミスマッチプローブの生走査データを受け取る。実験からの完全マッチプローブのハイブリダイゼーション強度を「Ｊｐｍ」とし、実験からのミスマッチプローブのハイブリダイゼーション強度を「Ｊｍｍ」とする。工程３０８で、バックグラウンドシグナル強度を実験走査データの対のハイブリダイゼーション強度の各々から差し引く。
【０３４５】
Ｉ及びＪ対のハイブリダイゼーションは、工程３１０で正規化される。例えば、ＩＶ（Ａ）の項で考察したように、Ｉ及びＪ対のハイブリダイゼーション強度を対照のハイブリダイゼーション強度で割る。
【０３４６】
工程３１２で、Ｉ及びＪ対のプローブのハイブリダイゼーション強度を差異閾値（ＤＤＩＦ）及び比閾値（ＲＤＩＦ）と比較する。ある対（Ｊｐｍ−Ｊｍｍ）と他の対（Ｉｐｍ−Ｉｍｍ）のハイブリダイゼーション強度間の差が差異閾値以上であるか、そしてある対（Ｊｐｍ−Ｊｍｍ）と他の対（Ｉｐｍ−Ｉｍｍ）のハイブリダイゼーション強度の商が比閾値以上であるかが確定される。差異閾値は、典型的には、単数又は複数の遺伝子の正確な発現モニタリングを生じるよう確定されたユーザー定義値である。
【０３４７】
（Ｊｐｍ−Ｊｍｍ）−（Ｉｐｍ−Ｉｍｍ）＞＝ＤＤＩＦ及び（Ｊｐｍ−Ｊｍｍ）／（Ｉｐｍ−Ｉｍｍ）＞＝ＲＤＩＦである場合、ＮＩＮＣ値は工程３１４で増大される。概して、ＮＩＮＣは、遺伝子発現がベースライン試料より大きくなり（又は増大され）
そうであることを示すプローブの実験対が示すことを示す値である。ＮＩＮＣは、遺伝子の発現がベースライン試料と比較して実験試料では大きい（又は増大）
か、小さい（又は低減）か、あるいは変わらなかったかの確定に用いられる。
【０３４８】
工程３１６で、（Ｊｐｍ−Ｊｍｍ）−（Ｉｐｍ−Ｉｍｍ）＞＝ＤＤＩＦ及び（Ｊｐｍ−Ｊｍｍ）／（Ｉｐｍ−Ｉｍｍ）＞＝ＲＤＩＦであるか否かを確定する。この発現が適正である場合は、ＮＤＥＣ値が増大される。概して、ＮＤＥＣは、遺伝子発現がベースライン試料より少なくなる（又は低減される）ことを示すプローブの実験対を示す値である。ＮＤＥＣは、遺伝子の発現がベースライン試料と比較して実験試料では大きい（又は増大）か、小さい（又は低減）か、あるいは変わらなかったかの確定に用いられる。
【０３４９】
遺伝子が実験試料より多く又は少なく発現されることを示すハイブリダイゼーション強度を示す各対に関して、ＮＰＯＳ、ＮＮＥＧ及びＬＲ値をプローブの各対に関して算出する。これらの値は、図９に関して上記で考察したのと同様に算出される。「Ｂ」又は「Ｅ」の添字は、その値がそれぞれベースライン試料を示すか実験試料を示すかを標示するために、各値に付加した。工程３２２でハイブリダイゼーション強度の次の対が存在する場合、それらは図示したのと同様に処理される。
【０３５０】
ここで図１０Ｂを参照すると、絶対デシジョン計算は、工程３２４でベースライン及び実験試料の両方に関して実行される。絶対デシジョン計算は、ベースライン及び実験試料の各々において遺伝子が発現されるか、限界値か又は存在しないかの指標である。したがって、好ましい実施態様では、この工程は、試料の各々に関して図９からの工程２７２及び２７４の実行を要する。これが実行中、単独で得られた試料の各々に関する遺伝子発現の指標が存在する。
【０３５１】
工程３２６で、デシジョンマトリックスを用いて２つの試料間の遺伝子発現の差異を確定する。このデシジョンマトリックスは、上記で算出されたＮ、ＮＰＯＳＢ、ＮＰＯＳＥ、ＮＮＥＧＢ、ＮＮＥＧＥ、ＮＩＮＣ、ＮＤＥＣ、ＬＲＢ及びＬＲＥ値を用いる。デシジョンマトリックスは、ＮＩＮＣがＮＤＥＣ以上であるか否かによって、異なる計算を実行する。その計算を以下に示す。
【０３５２】
ＮＩＮＣ＞＝ＮＤＥＣである場合、以下の４つのＰ値が確定される：
Ｐ１＝ＮＩＮＣ／ＮＤＥＣ
Ｐ２＝ＮＩＮＣ／Ｎ
Ｐ３＝（（ＮＰＯＳＥ−ＮＰＯＳＢ）−（ＮＮＥＧＥ−ＮＮＥＧＢ））／Ｎ
Ｐ４＝１０＊ＳＵＭ（ＬＲＥ−ＬＲＢ）／Ｎ
次にこれらのＰ値を用いて、２つの試料間の遺伝子発現の差異を確定する。
【０３５３】
説明のために、Ｐ値は、前記でおこなったように、範囲に分類される。したがって、Ｐ値はすべて、以下による範囲に分類される：
Ａ＝（Ｐ１＞＝２．７）
Ｂ＝（２．７＞Ｐ１＞＝１．８）
Ｃ＝（Ｐ１＜１．８）
Ｘ＝（Ｐ２＞＝０．２４）
Ｙ＝（０．２４＞Ｐ２＞＝０．１６）
Ｚ＝（Ｐ２＜０．１６０）
Ｍ＝（Ｐ３＞＝０．１７）
Ｎ＝（０．１７＞Ｐ３＞＝０．１０）
Ｏ＝（Ｐ３＜０．１０）
Ｑ＝（Ｐ４＞＝１．３）
Ｒ＝（１．３＞Ｐ４＞＝０．９）
Ｓ＝（Ｐ４＜０．９）
一旦Ｐ値が上記のブール値による範囲に分類されれば、２つの試料間の遺伝子発現の差異が確定される。
【０３５４】
ＮＩＮＣ＞＝ＮＤＥＣである場合、遺伝子発現変化は、増大、限界的増大又は変化なしとして示される。遺伝子発現指標の要約を以下に示す：
増大    Ａ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）及び（Ｍ又はＮ又はＯ）
Ａ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ又はＳ）及び（Ｍ又はＮ）
Ｂ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）及び（Ｍ又はＮ）
Ａ及びＸ及び（Ｑ又はＲ又はＳ）及び（Ｍ又はＮ又はＯ）
限界的  Ａ又はＹ又はＳ又はＯ
増大    Ｂ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）及びＯ
Ｂ及び（Ｘ又はＹ）及びＳ及び（Ｍ又はＮ）
Ｃ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）及び（Ｍ又はＮ）
変化なし  他のすべての場合（例えば任意のＺの組合せ）
ユーザーへの出力に際して、増大は「Ｉ」、限界的増大は「ＭＩ」そして変化なしは「ＮＣ」と示される。
【０３５５】
ＮＩＮＣ＜ＮＤＥＣである場合、以下の４つのＰ値が確定される：
Ｐ１＝ＮＤＥＣ／ＮＩＮＣ
Ｐ２＝ＮＤＥＣ／Ｎ
Ｐ３＝（（ＮＮＥＧＥ−ＮＮＥＧＢ）−（ＮＰＯＳＥ−ＮＰＯＳＢ））／Ｎ
Ｐ４＝１０＊ＳＵＭ（ＬＲＥ−ＬＲＢ）／Ｎ
次にこれらのＰ値を用いて、２つの試料間の遺伝子発現の差異を確定する。
【０３５６】
Ｐ値は、ＮＩＮＣ＞＝ＮＤＥＣである他の場合と同様の範囲に分類される。したがって、Ｐ値は、この場合、同一範囲を示し、簡潔にするために繰り返さない。しかしながら、その範囲は一般的に、以下に示すように２つの試料間の遺伝子発現の異なる変化を示す。
【０３５７】
ＮＩＮＣ＜ＮＤＥＣである場合、遺伝子発現変化は、低減、限界的低減又は変化なしとして示される。遺伝子発現指標の要約を以下に示す：
低減    Ａ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）及び（Ｍ又はＮ又はＯ）
Ａ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ又はＳ）及び（Ｍ又はＮ）
Ｂ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）及び（Ｍ又はＮ）
Ａ及びＸ及び（Ｑ又はＲ又はＳ）及び（Ｍ又はＮ又はＯ）
限界的  Ａ又はＹ又はＳ又はＯ
低減    Ｂ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）及びＯ
Ｂ及び（Ｘ又はＹ）及びＳ及び（Ｍ又はＮ）
Ｃ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）及び（Ｍ又はＮ）
変化なし  他のすべての場合（例えば任意のＺの組合せ）
ユーザーへの出力に際して、低減は「Ｄ」、限界的増大は「ＭＤ」そして変化なしは「ＮＣ」と示される。
【０３５８】
上記で、ベースライン試料及び実験試料間の遺伝子発現間の相対的差異が確定され得ることを示した。遺伝子が両試料中で発現されると示され（例えば、工程３２４から）、以下の発現が適正である場合には、Ｉ、ＭＩ、Ｄ又はＭＤ（即ちＮＣはなし）呼出をＮＣに変える別の試験を実施し得る：
平均（ＩＤＩＦＢ）＞＝２００
平均（ＩＤＩＦＥ）＞＝２００
１．４＞＝平均（ＩＤＩＦＥ）／平均（ＩＤＩＦＢ）＞＝０．７
したがって、遺伝子が両試料中で発現される場合、増大又は低減（限界的か否か）の呼出は、各試料に関する平均強度差が相対的に大きいか又は実質的に両試料に関して同一である場合には、変化なし呼出に変えられる。ＩＤＩＦＢ及びＩＤＩＦＥは各試料に関するすべてのＩＤＩＦの合計をＮで割って算出される。
【０３５９】
工程３２８で、定量的差異評価に関する値が算出される。対の各々に関する（（Ｊｐｍ−Ｊｍｍ）−（Ｉｐｍ−Ｉｍｍ））を算出する。さらに、Ｊｐｍ−Ｊｍｍの平均とＩｐｍ−Ｉｍｍの平均の商を算出する。これらの値は、工程３３０で結果を他の実験と比較するのに用いられる。
【実施例】
【０３６０】
以下の実施例で本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【０３６１】
（実施例１．少数のネズミサイトカインに関するｍＲＮＡレベルを測定するために設計される第一世代オリゴヌクレオチドアレイ）
Ａ）標識ＲＮＡの調製
１）予選択遺伝子の各々から
１４個の遺伝子（ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＣＴＬＡ８、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ、ＩＬ−１１受容体及）ＢｉｏＢ）を各々ｐ  Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）ファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）中にクローン化した。挿入物の配向は、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼがセンス転写体を生じ、Ｔ７ポリメラーゼがアンチセンスを生じるようになされた。
【０３６２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応における標識リボヌクレオチド。ビオチン−又はフルオレセイン標識ＵＴＰ及びＣＴＰ（１：３標識化：非標識化）＋非標識化ＡＴＰ及びＧＴＰを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）２５００単位との反応に用いた。Ｍｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：７０３５−７０５６（１９８４）に記載されているのと同様の方法で、切断鋳型を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を実行した。典型的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応は、５μｇ  ＤＮＡ鋳型、Ａｍｂｉｏｎ’ｓ  Ｍａｘｉｓｃｒｉｐｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｈｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）に含まれているような緩衝液、及びＧＴＰ（３ｍＭ）、ＡＴＰ（１．５ｍＭ）並びにＣＴＰ及びフルオレセイン処理ＵＴＰ（全体で３ｍＭ、ＵＴＰ：Ｆ１−ＵＴＰ  ３：１）又はＵＴＰ及びフルオレセイン処理ＣＴＰ（全体で２ｍＭ、ＣＴＰ：Ｆ１−ＣＴＰ  ３：１）を用いた。Ａｍｂｉｏｎ緩衝液中で実行した反応は，２０ｍＭ  ＤＴＴ及びＲＮアーゼ阻害剤を含有した。反応は、約１．５〜約８時間実行した。
【０３６３】
反応後、サイズ選択膜（ミクロコン−１００）又はＰｈａｒｍａｃｉａミクロスピンＳ−２００カラムを用いて、取り込まれたヌクレオチドトリホスフェートを除去した。ＲＮＡの総モル濃度は，２６０ｎｍでの吸光度の測定値を基礎にした。ＲＮＡ量の定量後、４０ｍＭ  ＲＴｒｉｓ−酢酸ｐＨ８．１，１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ酢酸マグネシウム中で９４℃で３０〜４０分間加熱することにより、ＲＮＡを無作為に平均約５０〜１００塩基の長さに断片化した。断片化はＲＮＡ二次構造からの妨害の可能性を低減し、近接して間隔を置いたプローブ分子との多重相互作用の影響を最小限にする。
【０３６４】
２）ｃＤＮＡライブラリーから
２つのネズミ細胞株：Ｔ１０、即ちこの試験では標的遺伝子として用いられる遺伝子（但し、ＩＬ−１０，アクチン及びＧＡＰＤＨは除く）を発現しないことが公知のＢ細胞プラズマ細胞腫、及び２Ｄ６、即ちこの試験では標的遺伝子として用いられる遺伝子のほとんどを発現することが公知であるＩＬ−１２成長依存性Ｔ細胞株（Ｔｈ１型）の一方から標識ＲＮＡを産生した。したがって、Ｔ１０細胞株由来のＲＮＡは、特定の標的遺伝子からの公知量のＲＮＡを用いてスパイクするのに適した良好な総ＲＮＡベースライン混合物を提供した。これに対比して、２Ｄ６細胞株由来のｍＲＮＡは、標的遺伝子からの典型的内生的転写量のＲＮＡを提供する良好な陽性対照を提供した。
【０３６５】
ｉ）Ｔ１０ネズミＢ細胞株
ＩＬ−１１の存在下で選択することにより、ＩＬ−６依存性ネズミプラズマ細胞腫細胞Ｔ１１６５（Ｎｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：５６６−５６９）からＴ１０細胞株（Ｂ細胞）を得た。指向性ｃＤＮＡライブラリーを調製するために、ＲＮＡＳｔａｔ６０（Ｔｅｌ−ＴｅｓｔＢ）を用いて全細胞性ＲＮＡをＴ１０細胞から単離し、ＰｏｌｙＡｔｒａｃｔキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを選択した。両方の反応で５−メチルデオキシシチジン５’トリホスフェート（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）をＤＣＴＰの代わりに用いる以外は、Ｔｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３４２−３４７にしたがって、一次及び二次鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０３６６】
ｃＤＮＡ頻度を測定するために、Ｔ１０ライブラリーをプレート化し、ＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移して、３２Ｐ−標識βアクチン、ＧＡＰＤＨ及びＩＬ−１０プローブで精査した。アクチンは１：３０００，ＧＡＰＤＨは１：１０００そしてＩＬ−１０は１：３５０００の頻度で表示された。上記のようにＮｏｔＩ及びＳｆｉＩ切断ｃＤＮＡライブラリーｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応から、標識化センス及びアンチセンスＴ１０ＲＮＡ試料を合成した。
【０３６７】
ｉｉ）２Ｄ６ネズミヘルパーＴ細胞株
２Ｄ６細胞株は、Ｆｉｊｉｗａｒａ等により開発されたネズミＩＬ−１２依存性Ｔ細胞株である。細胞を、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、０．０５ｍＭ  Ｐ−メルカプトエタノール及び組換え体ネズミＩＬ−１２（１００単位／ｍＬ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。サイトカイン誘導のために、細胞をＩＬ−１２無含有培地中で一夜予備インキュベートし、次に再懸濁した（１０６細胞／ｍｌ）。５ｎＭカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）及び１００ｎＭ  ４−ホルボール−１２−ミリステート  １３−アセテート（Ｓｉｇｍａ）を含有する培地中で、０、２、６及び２４時間インキュベート後、遠心分離により細胞を収集し、ＲＮＡの単離前にリン酸緩衝塩水で１回洗浄した。
【０３６８】
Ｔ１０と同様の方法で、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから入手可能なα−ＺｉｐＬｏｘ、ＮｏｔＩ−ＳａｌＩアームを用いて２Ｄ６ｃＤＮＡを指向的にクローニングすることにより、標識化２Ｄ６ｍＲＮＡを産生した。線状化ｐＺ１１ライブラリーをＴ７を用いて転写して、上記のようにセンスＲＮＡを生成した。
【０３６９】
ｉｉｉ）ＲＮＡ調製
細胞性ＲＮＡから直接生成される物質に関しては、細胞質ＲＮＡをＦａｖａｌｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，６５：７１８−７４９の方法により細胞から抽出し、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをオリゴｄＴ選択工程（ＰｏｌｙＡｔｒａｃｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて単離した。  Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３０１０−３０１４（Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８７：１６６３−１６６７も参照）に記載された方法の変法を用いて、ＲＮＡを増幅した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を組み入れたオリゴｄＴプライムを含有するｃＤＮＡ合成キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、１μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換した。二次鎖合成後、反応混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、膜濾過工程（ミクロコン−１００，Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて二本鎖ＤＮＡを単離した。上記のようにＩＶＴ工程を用いてｃＤＮＡから直接、標識化ｃＲＮＡを作製した。標識化ｃＲＮＡの総モル濃度を２６０ｎｍでの吸光度から確定し、１０００リボヌクレオチドの平均ＲＮＡサイズを想定した。１  ＯＤがＲＮＡ  ４０μｇと等価で、細胞性ｍＲＮＡ  １μｇがＲＮＡ分子３ｐｍｏｌから成るという慣用的変換を用いて、ＲＮＡ濃度を算出した。
【０３７０】
さらに、いかなる中間体ｃＤＮＡ又はＲＮＡ合成工程も用いずに、細胞性ｍＲＮＡを直接標識した。上記と同様にしてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを断片化し、断片の５’末端をキナーゼ処理して、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下でビオチニル化オリゴリボヌクレオチド（５’−ビオチン−ＡＡＡＡＡＡ−３’）とともに一夜インキュベートした。あるいは、ビオチン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）に結合したソラレン誘導体とのＵＶ−誘導化架橋により、ｍＲＮＡを直接標識した。
【０３７１】
Ｂ）高密度アレイ調製
ＶＬＳＩＰＳ技術を用いて、２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブの高密度アレイを生成した。高密度アレイは、表２に列挙したオリゴヌクレオチドプローブを含む。中央ミスマッチ対照プローブが各遺伝子特異的プローブに対して提供され、その結果１６，０００以上の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイが生じる。
【０３７２】
表２．高密度アレイ設計。すべてのプローブに関して、中央一塩基ミスマッチを有するミスマッチ対照が存在した。
【０３７３】
【表２−１】
2006191932.tif 000008
【０３７４】
【表２−２】
2006191932.tif 000009
高密度アレイは平面ガラススライド上に合成された。
【０３７５】
Ｃ）アレイハイブリダイゼーション及び走査
ｃＤＮＡから転写されたＲＮＡを高密度オリゴヌクレオチドプローブアレイ（単数又は複数）と低緊縮でハイブリダイズして、より高い緊縮条件下で洗浄した。ハイブリダイゼーション溶液は、０．９Ｍ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．００５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有し、ｐＨ７．６に調整した（６ｘＳＳＰＥ−Ｔとして示される）。さらに、溶液は、０．５ｍｇ／ｍｌ非標識化分解ニシン精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を含有した。ハイブリダイゼーション前に、ＲＮＡ試料をハイブリダイゼーション溶液中で１０分間、９℃に加熱し、氷上に５分間放置して、ハイブリダイゼーション流動セル内に入れる前に、室温に平衡させた。ハイブリダイゼーション後、溶液を除去し、アレイを６ｘＳＳＰＥ−Ｔで２２℃で７分間洗浄した後、０．５ｘＳＳＰＥ−Ｔで４０℃で１５分間洗浄した。ビオチン標識ＲＮＡを用いた場合は、ハイブリダイズＲＮＡをストレプトアビジン−フィコエリトリン複合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）で読み取り前に染色した。ハイブリダイズ化アレイを、６ｘＳＳＰＥ−Ｔ中の２μｇ／ｍｌストレプトアビジン−フィコエリトリンで４０℃で５分間染色した。
【０３７６】
目的のために修正した走査同時焦点顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて、アレイを読みとった。スキャナーはアルゴンイオンレーザーを励起源として用い，５３０ｎｍバンドパスフィルター（フルオレセイン）又は５６０ｎｍロングパスフィルター（フィコエリトリン）を通して、光電子増倍管で発光を検出した。
【０３７７】
センス又はアンチセンス配向の核酸をハイブリダイゼーション実験に用いた。光化学工程の順序を逆にして、相補的ヌクレオチドを組み入れることにより、同一組の写真平板マスクをもちいて、いずれかの配向のアレイ（互いの逆補体）を作製した。
【０３７８】
Ｄ）ハイブリダイゼーションのパターン及び強度の定量分析
ハイブリダイゼーション結果の定量分析は、完全マッチプローブ（ＰＭ）が対応するミスマッチプローブ（ＭＭ）より明るい場合を計数し、各プローブ族（即ち、各遺伝子に関するプローブ収集物）に関する差（ＰＭ−ＭＭ）を平均し、そしてその値を非スパイク化試料（適用可能な場合には）を用いて同様に合成されたアレイに関する並行実験で得られた値と比較することを包含した。差の平均法は、無作為交差ハイブリダイゼーションからの信号は等しく、平均して、ＰＭ及びＭＭプローブに関与するが、一方特異的ハイブリダイゼーションはＰＭプローブの法により多く関与するというものである。対毎の差を平均することにより、実信号は構成的に加わり、一方、交差ハイブリダイゼーションからの関与が無効にされる傾向がある。
【０３７９】
差異（ＰＭ−ＭＭ）値の平均の変化の大きさは、スパイク実験の結果、並びに公知量で各試料中にスパイクされた内部標準細菌ＲＮＡに関して観察された信号
を比較することにより、解釈した。分析は、本明細書中に記載した算法及びソフトウエアを用いて実行した。
【０３８０】
Ｅ）プローブ選択の最適化
各標的遺伝子に関するプローブ選択を最適化するために、標的遺伝子の各々から転写された標識化ＲＮＡの混合物を用いて、オリゴヌクレオチドプローブの高密度アレイをハイブリダイズした。データ獲得システムに接続したレーザー照明走査同時焦点蛍光顕微鏡を用いて高密度アレイを走査することにより、高密度アレイ上の各位置での蛍光強度を測定した。
【０３８１】
次に二段階法でさらに別のデータに関してプローブを選択した。先ず、計数するために、プローブ及びその対応するミスマッチプローブ間の強度差は、閾値限界（この場合は、５０カウント又はバックグラウンドの約半分）を超えねばならなかった。これは、十分ハイブリダイズしなかったプローブ及びミスマッチ対照が完全マッチに匹敵する強度でハイブリダイズするプローブを考慮から排除した。
【０３８２】
高密度アレイを、原則的として、高密度アレイ上に配列を全く含有しない標識化ＲＮＡ試料とハイブリダイズした。この場合、センスＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドプローブが選択された。したがって、アンチセンスＲＮＡ集団はアレイ上のいかなるプローブともハイブリダイズできなかったはずである。プローブ又はそのミスマッチが閾値（バックグラウンドより１００カウント多い）以上のシグナルを示した場合、それはその後の分析には含まれなかった。
【０３８３】
次に、特定の遺伝子に関するシグナルを、各遺伝子に対して選択されたプローブに関して平均差（完全マッチ−ミスマッチ対照）として計数した。
【０３８４】
Ｅ）結果：高密度アレイは標的核酸の特異的及び高感度検出を提供する
上記で説明したように、初期アレイは、１２のネズミｍＲＮＡ−即ち、９サイトカイン、１サイトカイン受容体、２構成的発現遺伝子（５−アクチン及びグシセラルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）−１ラットサイトカイン及び定量参照として役立つ１細菌遺伝子（大腸菌ビオチンシンターゼ、ＢｉｏＢ）と相補的な１６，０００プローブ以上を含有した。これらの相対的に簡単なアレイを用いた初期実験は、短ｉｎ  ｓｉｔｕ合成オリゴヌクレオチドが複合細胞性ＲＮＡ集団中のＲＮＡを定量的に検出するのに十分な感受性及び特異性を有してハイブリダイズするよう作製され得るか否かを確定するよう意図された。これらのアレイは、意図的に非常に冗長で、発現レベルの確定に必要以上の多さであるＲＮＡ当たり数百のオリゴヌクレオチドを含有した。これは、多数のプローブのハイブリダイゼーション行動を検査し、実質的により多くの遺伝子を網羅する最小プローブ組の先験的選択のための一般配列規則を開発するために実施した。
【０３８５】
オリゴヌクレオチドアレイは、モニタリングされるＲＮＡの各々に対するプローブ対の収集物を含有した。各プローブ対は、好ましくは特定メッセイージの部分列と相補的である（完全マッチ又はＰＭプローブとして示される）２０−ｍｅｒ、及び中央一の単一塩基の差異を除いて同一である相手で構成された。各対のミスマッチ（ＭＭ）プローブは、ハイブリダイゼーション特異性に対する内部対照として役立った。ＰＭ／ＭＭ対の分析は、交差ハイブリダイゼーションシグナルの存在下で、まれなＲＮＡからの低強度ハイブリダイゼーションパターンを高感度に且つ正確に認識させた。
【０３８６】
アレイハイブリダイゼーション実験のために、上記のように、個々のクローン、クローン化ＣＤＮＡライブラリーから、又は直接、細胞性ｍＲＮＡから、標識ＲＮＡ標的試料を調製した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応に蛍光標識リボヌクレオチドを組み入れて、ＲＮＡを３０〜１００塩基の平均サイズに断片化することにより、アレイハイブリダイゼーションのための標的ＲＮＡを調製した。３０分〜２２時間の範囲の間、自己含有流動細胞（容量〜２００μｌ）中で、試料をアレイとハイブリダイズした。アレイの蛍光画像形成は、走査同時焦点顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて成し遂げられた。全アレイは、１５分未満で１１．２５μｍ（１００ｘ１００μｍ合成領域の各々での過剰試料採取の〜８０倍）の解像度で読みとられ、個々のハイブリダイゼーション反応の各々の迅速且つ定量的測定値が得られた。
【０３８７】
１）ハイブリダイゼーションの特異性
ハイブリダイゼーションの特異性を評価するために、上記の高密度アレイを、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、アクチン、ＧＡＰＤＨ及びＢｉｏＢ又はＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ｍＣＴＬＡ８及びＢｉｏＢの５０ｐＭのＲＮＡセンス鎖を用いてハイブリダイズした。ハイブリダイズ化アレイは、最小交差ハイブリダイゼーションにより被験標的核酸の各々に対して強力な特異的シグナルを示した。
【０３８８】
２）複合標的試料中の遺伝子発現レベルの検出
全哺乳類細胞メッセージ集団の存在下で、個々のＲＮＡ標的がどれくらい良好に検出され得るかを確定するために、スパイク実験を実施した。公知量の個々のＲＮＡ標的を、ネズミＢ細胞株Ｔ１０から作製された代表的ｃＤＮＡライブラリーから得られた標識ＲＮＡ中でスパイクさせた。Ｔ１０細胞株は、サイトカインがモニタリングされ、ＩＬ−１０だけが検出可能レベルで発現されるために、選択された。
【０３８９】
ＲＮＡ混合物を選択された標的遺伝子で一回スパイクし、次に直ちにハイブリダイゼーションが残りの混合物に対して読み取り値の人工的上昇を提供するために、スパイク化試料を一連の手順で処理して、ライブラリーＲＮＡと付加ＲＮＡとの間の差を軽減した。したがって、「スパイク」を試料に付加し、これを３７℃に加熱して、アニーリングした。次に試料を凍結させ、解氷して、５分間沸騰させ、氷上で冷却して、室温に戻し、その後ハイブリダイゼーションを実施した。
【０３９０】
図２Ａは、１３の標的ＲＮＡを全ＲＮＡプール中で１：３，０００（２００〜３００コピー／細胞と等価）のレベルでスパイクした。ＲＮＡ頻度は、個々のＲＮＡモル量／全ＲＮＡモルとして示された。図２Ｂは、インターロイキン−２及びインターロイキン−３（ＩＬ−２及びＩＬ−３）ＲＮＡに特異的なプローブを含有する小部分のアレイ（図２Ａの矩形領域）を示し、図２Ｃは、スパイク化標的の非存在下での同一領域を示す。ハイブリダイゼーションシグナルは、スパイク化及び非スパイク化画像間の比較により示されたように特異的で、より明るい行（ＰＭプローブに対応する）とより暗い行（ＭＭプローブに対応する）が交互に並ぶパターンで示されるように、完全マッチ（ＰＭ）ハイブリダイゼーションはミスマッチ（ＭＭ）から良好に識別された。異なる完全マッチハイブリダイゼーションシグナル間に観察された変異は高度に再現可能で、ハイブリダイゼーションの配列依存性を反映する。２〜３の場合、複合ＲＮＡ集団の他の成員との交差ハイブリダイゼーションのために、完全マッチ（ＰＭ）プローブはそのミスマッチ（ＭＭ）相手より有意に明るくはなかった。パターンが高度に再現可能であるために、そして検出がＲＮＡ当たり単一のプローブのみに依らないために、この型のまれな交差ハイブリダイゼーションは低レベルのＲＮＡでさえ、高感度に且つ正確に検出され得た。
【０３９１】
同様に、例えばＲＮＡ又はプローブ二次構造による低頻度の不十分なハイブリダイゼーション、多型又はデータベース配列エラーの存在は検出の妨げとならない。ハイブリダイゼーション及び交差ハイブリダイゼーションの観察されたパターンの分析から、本明細書中に記載した最良の感度及び特異性を有するオリゴヌクレオチドプローブの選択のための一般原則が形成される。
【０３９２】
３）標的濃度とハイブリダイゼーションシグナルとの関係
第二組のスパイク実験を実行して、ＲＮＡレベルの直接定量のためにハイブリダイゼーションシグナルが用いられる濃度の範囲を確定した。図３は、１０サイトカインＲＮＡを、１：３００〜１：３００，０００の範囲のレベルで、Ｂ細胞（Ｔ１０）ｃＤＮＡライブラリーからの０．０５ｍｇ／ｍｌの標識化ＲＮＡ中に一緒にスパイクした。１：３００，０００の頻度は、２〜３未満コピー／細胞で存在するｍＲＮＡのものである。１０μｇの全ＲＮＡ中で、２００μｌの容量で、１：３００，０００の頻度は特異的ＲＮＡの約０．５ピコモル及び０．１フェムトモル（〜６ｘ１０７分子又は約３０ピコグラム）の濃度に相当する。
【０３９３】
ハイブリダイゼーションは、４０℃で１５〜１６時間、平行して実行した。１０のサイトカインＲＮＡの各々の存在は、最低頻度でも、バックグラウンド以上に再現可能的に検出された。さらに、ハイブリダイゼーション強度は、１：３００，０００〜１：３０００の間でＲＮＡ標的濃度と線状に関連した（図３）。１：３０００〜１：３００では、プローブ部位が１５時間ハイブリダイゼーションの途中で高濃度で飽和するよう開始されたため、シグナルは１０という依りむしろ４〜５の因子により増大した。線状反応範囲は、ハイブリダイゼーション時間を低減することにより、高濃度にまで広げ得る。短時間ハイブリダイゼーションと長時間ハイブリダイゼーションを組合せて、１０４倍の範囲以上のＲＮＡ濃度を定量的に網羅し得る。
【０３９４】
盲検スパイク実験を実行して、複合ＲＮＡ集団中に広範囲の濃度で存在する多数の関連ＲＮＡを同時に検出し、低領する能力を調べた。ネズミＢ細胞ＣＤＮＡライブラリーから転写された０．０５ｍｇ／ｍｌのセンスＲＮＡ＋異なる濃度の１０のサイトカインＲＮＡの各々の組合せを含有する４つの試料の組を調製した。個々のサイトカインＲＮＡを下記のレベルのうちの１つでスパイクした：０、１：３００，０００、１：３０，０００、１：３０００又は１：３００。４つの試料＋非スパイク化参照試料を、４０℃で１５時間、別々のアレイとハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションのパターン及びそれが非スパイク化参照試料とどのように異なるかによりＲＮＡ標的の存在又は非存在を確定し、強度により濃度を検出した。４つの盲検試料中の１０のサイトカインの各々の濃度は正しく測定され、擬似陽性又は擬似陰性はなかった。
【０３９５】
特に注目に値する一例を挙げる：ＩＬ−１０は、ＣＤＮＡライブラリーを作製するために用いられるマウスＢ細胞中で発現され、１：６０，０００〜１：３０，０００の頻度でライブラリー中に存在することが公知であった。公知でないものの１つにおいて、付加量のＩＬ−１０ＲＮＡ（１：３００，０００の頻度に対応する）を試料中にスパイクした。固有のレベルより１０〜２０％だけ上回る増大が示された場合でも。スパイク化ＩＬ−１０ＲＮＡの量を正確に測定した。これらの結果は、発現の微妙な変化が同様に合成されたアレイ上の同様に調製された試料を用いた並行実験を実施することにより、高感度に測定されることを示す。
【０３９６】
（実施例２．刺激後の時間の一関数としてサイトカインｍＲＮＡを測定するＴ細胞誘導実験）
次に、本発明の高密度アレイを用いて、生化学的刺激後の異なる時間でのネズミＴ細胞におけるサイトカインＭＲＮＡをモニタリングした。ネズミＴヘルパー細胞株（２Ｄ６）からの細胞をホルボールエステル  ４−ホルボール−１２−ミリステート  １３−アセテート（ＰＭＡ）及びカルシウムイオノフォアで処理した。次にポリ（Ａ）＋ＭＲＮＡを、刺激後０、２、６及び２４時間目に単離した。単離ｍＲＮＡ（約１μｇ）を、二重鎖ｃＤＮＡ合成工程とその後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応とを組合せた方法を用いて、標識化アンチセンスＲＮＡに変換した。このＲＮＡ合成及び標識法は、全ｍＲＮＡ集団を、明らかに非偏向性及び再現可能性様式で、２０〜５０倍だけ増幅する（表２）。
【０３９７】
次に、４つの時点からの標識化アンチセンスＴ細胞ＲＮＡをＤＮＡプローブアレイと２〜２２時間ハイブリダイズした。４つのその他のサイトカインｍＲＮＡ（ＩＬ−３、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦα）の有意の変化とともに、γ−インターフェロンｍＲＮＡレベルの大きな増大が観察された。図４に示すように、サイトカインメッセージは、同一動力学では誘導されなかった。１：１３０，０００未満のサイトカインｍＲＮＡレベルの変化は、γ−インターフェロンに関して観察された非常に大きな変化とともに、はっきりと検出された。
【０３９８】
これらの結果は、本方法に固有の大きな実験的動的範囲の値を際だたせる。ハイブリダイゼーション結果からのＲＮＡレベルの定量的査定は直接的で、付加的対照ハイブリダイゼーション、試料操作、増幅、クローニング又はシーケンシングを伴わない。本方法はさらに、効率がよい。最新プロトコール、計器及び分析ソフトウエアを用いて、独りのユーザーが１つのスキャナーで１日に３０もの多数のアレイを読みとり、分析し得る。
【０３９９】
（実施例３．１００以上のネズミ遺伝子に関する６５，０００プローブを含有する高密度アレイ）
図５は、全ネズミＢ細胞ＲＮＡ集団とのハイブリダイゼーション後の６５，０００以上の異なるオリゴヌクレオチドプローブ（５０μｍの特徴サイズ）を含有するアレイを示す。この複雑性を有するアレイを、１５分未満に７．５ｌｉｍの解像度で読み取った。アレイは、上記のより簡単なアレイ上に示される１２のネズミ遺伝子、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１０２（）付加的ネズミ遺伝子、３つの細菌遺伝子、及び１つのファージ遺伝子を含めた１１８の遺伝子に対するプローブを含有する。約３００プローブ対／遺伝子が存在し、プローブは本明細書中に記載された選択規則を用いて選択される。各遺伝子の翻訳領域の３’末端の配列の６００個の塩基から、プローブを選択した。２１のネズミＲＮＡの全部が、約１：３００，０００〜１：１００の範囲のレベルで、Ｂ細胞ＲＮＡ集団中にはっきりと検出された。
【０４００】
Ｔ細胞誘導実験（図４）からの標識化ＲＮＡ試料をこれらのより複雑な１１８遺伝子アレイとハイブリダイズし、両方のチップ型に共通して、遺伝子組に関して同様の結果が得られた。図４に示したものの他に、２０以上のその他の遺伝子に関して、発現変化がはっきりと観察された。
【０４０１】
ＲＮＡの信頼できる検出のためには遺伝子当たり、もっと少ない組のプローブで十分か否かを確定するために、１１８遺伝子チップからのハイブリダイゼーション結果を、２０プローブ／遺伝子の１０の異なる小集団を用いて、分析した。即ち、アレイが遺伝子当たり２０対だけのプローブを含有するデータを分析した。２０対の１０の小集団をアレイ上の遺伝子当たり約３００プローブから選択した。初期プローブ選択は、上記と同様に、プローブ選択を用いて、算法を削減して、実行した。次に、選択及び削減で残ったプローブから、２０対のうちの１０の被験体を無作為に選択した。標識化ＲＮＡをネズミＢ細胞ＲＮＡ集団中で１：２５，０００、１：５０，０００及び１：１００，０００のレベルでスパイクした。スパイク化ＲＮＡに関するハイブリダイゼーションシグナルの変化は、より小さなプローブ組で、３レベルすべてで、一貫して検出された。予期されたように、ハイブリダイゼーション強度は、多数のプローブの平均を取った場合、ぴったりと密集しない。この分析は、遺伝子当たりの２０プローブ対の組が低レベルでの発現変化の測定に十分であるが、このような小プローブ組を用いた極最低レベルでＲＮＡをルーチンに検出するためにはプローブ選択及び実験手順の改良が好ましいことを示す。このような改良としては、進行中の、わずかに長いオリゴヌクレオチドプローブ（例えば，２５ｍｅｒプローブ）の使用と結びついたより高い緊縮性ハイブリダイゼーションが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０２】
（実施例４．数千の遺伝子へのスケールアップ）
約１６５０の異なるヒト遺伝子に対する２５−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブを含有する４つの高密度アレイの組の各々は、全部で６６２０の遺伝子に対するプローブを提供した。各遺伝子に対しては約２０プローブが認められた。アレイ上の特徴サイズは、５０μであった。この高密度アレイを、本質的に上記と同様のプロトコールを用いてｃＤＮＡライブラリーと首尾よくハイブリダイズした。すべての公知の発現配列タッグ（ＥＳＴ）に対するオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイの同様の組が準備中である。
【０４０３】
（実施例５．数千のＲＮＡのうちの１０の同時モニタリングのための直接スケールアップ）
高感度、特異的及び定量的であるのに加えて、本明細書中に記載されたアプローチは、非常に多数のｍＲＮＡのモニタリングに対して、本質的に平行で、容易に比例計算できる。モニタリング差あれるＲＮＡの数は、ＲＮＡ当たりのプローブ数を低減し、そしてアレイ当たりのプローブ数を増大することにより非常に増大され得る。例えば、上記の技術を用いて、１．６ｃｍ２（２０ｘ２０μｍ合成特徴）の面積に４００，０００もの多数のプローブを含有するアレイが一般に合成され、読み取られる。２０プローブ対／遺伝子を用いて、プローブ冗長性の重要な利点を保持しながら、単一アレイ上で１０，０００遺伝子がモニタリングされる。４つのこのようなアレイの組は、公的データベース中に発現配列タッグ（ＥＳＴＳ）が存在する４０，０００以上のヒト遺伝子を網羅し、新規のＥＳＴが、それらが利用可能になるように組み込まれる。化学合成の組合せ性のために、この複雑さを有するアレイが、ここで用いられるより簡単なものと同じ数の工程で同量の時間で作られる。遺伝子当たりさらに少ないプローブでそして高密度のアレイを用いると、単一又は少数の小チップ上で全シーケンシング化ヒト遺伝子の同時モニタリングが可能になる。
【０４０４】
多数の遺伝子に対する発現レベルの定量的モニタリングは、遺伝子機能を解明し、疾病の原因及びメカニズムを探査するのに、そして潜在的治療及び診断標的の発見のために有益であることを立証する。ゲノム情報の本体が成長すると、本明細書に記載した型の高度平行法は、細胞の根元的生理学を解明する手助けとなる配列情報を用いる有効且つ直接的方法を提供する。
【０４０５】
（実施例６．ニューラルネットを用いたプローブ選択）
プローブの塩基の配列又はその他のプローブ特性を基礎にしたプローブのハイブリダイゼーション及び交差ハイブリダイゼーション強度を予測するために、ニューラルネットを養成し得る。次に、ニューラルネットを用いて任意数の「最良」プローブを摘み取ることができる。ニューラルネットを養成してこれを実行すると、予測強度と実測強度との間に中等度の（０．７）相関が生じ、ハイブリダイゼーションより交差ハイブリダイゼーションに対するより良好なモデルとなる。
【０４０６】
Ａ）入力／出力マッピング
ニューラルネットを養成して、２０ｍｅｒプローブのハイブリダィゼーション特性を同定した。２０ｍｅｒプローブを８０ビット長入力ベクターにマッピングすると、最初の４ビットはプローブの最初の位置の塩基を示し、次の４ビットは第二の位置の塩基を…表した。したがって、４つの塩基は下記のようにコードされた：
Ａ：１０００  Ｃ：０１００  Ｇ：００１０  Ｔ：０００１
ニューラルネットワークは２つの出力：ハイブリダイゼーション強度及び交差ハイブリダイゼーション強度を生じた。出力は、実際の実験からの出力の９５％が０．〜１．の範囲におさまるように、線状に尺度を定められた。
【０４０７】
Ｂ）ニューラルネットアーキテクチャー
ニューラルネットは、８０の入力ニューロン、２０ニューロンを有する１つの隠れ層及び２ニューロンを有する出力層を有するバックプロパゲーションネットワークであった。Ｓ状伝達関数を用いた：（ｓ（ｘ）＝１／（１＋ｅｘｐ（−１＊ｘ）））これは非線状（Ｓ状）様式で、０〜１の入力値を一定基準で評価する。
【０４０８】
Ｃ）ニューラルネット養成
バックプロパゲーションネットワーク用のＮｅｕｒａｌ  Ｗｏｒｋｓ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ２．５（Ｎｅｕｒａｌ  Ｗｏｒｋｓ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌは、Ｎｅｕｒａｌ  Ｗａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡの製品である）からのデフォルトプログラムを用いて、ネットワークを養成した。養成組は、約８０００例のプローブ、関連ハイブリダイゼーション及び交差ハイブリダイゼーション強度で構成された。
【０４０９】
Ｄ）ニューラルネット重量
ニューラルネット重量は、２つのマトリックスに提示される：８１ｘ２０マトリックス（表３）（重量１）及び２ｘ２０マトリックス（表４）（重量２）。
【０４１０】
表３．ニューラルネット重量（８１ｘ２０マトリックス）（ウエイト１）
【０４１１】
【表３−１】
2006191932.tif 000010
【０４１２】
【表３−２】
2006191932.tif 000011
【０４１３】
【表３−３】
2006191932.tif 000012
【０４１４】
【表３−４】
2006191932.tif 000013
【０４１５】
【表３−５】
2006191932.tif 000014
【０４１６】
【表３−６】
2006191932.tif 000015
【０４１７】
【表３−７】
2006191932.tif 000016
表４．第二ニューラルネット計量マトリックス（２ｘ２１）（ウエイト２）
【０４１８】
【表４】
2006191932.tif 000017
Ｅ）ネット実行のためのコード
ニューラルネットを実行するためのコードを、下記の表５（ｎｅｕｒａａｌ  ｎ．ｃ）及び表６（ｌｉｎ  ａｌｇ．ｃ）に提示する。
【０４１９】
表５．ニューラルネット実行のためのコード（ｎｅｕｒａｌ  ｎ．ｃ．）
【０４２０】
【表５−１】
2006191932.tif 000018
【０４２１】
【表５−２】
2006191932.tif 000019
【０４２２】
【表５−３】
2006191932.tif 000020
【０４２３】
【表５−４】
2006191932.tif 000021
表６．ニューラルネット用コード（ｌｉｎ  ａｌｇ．ｃ）
【０４２４】
【表６−１】
2006191932.tif 000022
【０４２５】
【表６−２】
2006191932.tif 000023
（実施例７．総称的差異スクリーニング）
光指向性ポリマー合成に用いられるマスクを紛れ込ませて、総称的差異スクリーニングのための任意の（偶発的）プローブオリゴヌクレオチドを包含する高密度アレイを生成した。その結果生じたアレイは、３４，０００対以上の２５ｍｅｒ任意プローブオリゴヌクレオチドを含有した。各対中のオリゴヌクレオチドは、位置１３の単一ヌクレオチドが異なった。
【０４２６】
上記のようにハイブリダイゼーション、線状、染色及び走査後、データファイル（プローブ同一性及びハイブリダイゼーション強度に関する情報を含有）を作製した。
【０４２７】
各プローブ対Ｋ（Ｋは１〜３４，３２０の範囲）を包含する２つのオリゴヌクレオチド間の強度の差を算出した。さらに、試料ｉの複製ｊに対する対Ｋのオリゴヌクレオチド間の強度差を下記のように算出した：
Ｘｉｊｋ１−Ｘｉｊｋ２
（式中、Ｘはハイブリダイゼーション強度であり、ｉはいずれかの試料（この場合は試料１又は２）を示し、ｊはいずれかの複製（この場合は複製１又は各試料に対しては２つ）を示し、Ｋはプローブ対（この場合は、１…・・３４，３２０）であり、１はプローブ対の一方の成員を示し、２はプローブ対の他方の成員を示す）。
【０４２８】
図１６ａ及び１６ｂ及び１６ｃは、各プローブに関する試料１の複製１及び２間（図１６ａ、正常細胞株）の、そして試料２の複製１及び複製２間（図１６ｂ、腫瘍細胞株）の差異を示す。したがって、図１６ａは、縦軸上のＫ−１〜３４，３２０、並びに横軸上のＫに関する（Ｘ１１ｋ１−Ｘ１１ｋ２）−（Ｘ１２ｋ１−Ｘ１２ｋ２）の値をプロットする。２つの複製は、全プローブ対に関して、（Ｘ１１ｋ１−ＸＮ１１ｋ２）／（Ｘ１２ｋ１−Ｘ１２ｋ２）の平均比を基礎にして正規化される（即ち、正規化後、平均比は約１である）。同様に、図１５ｂは、（Ｘ２１ｋ１−Ｘ２１ｋ２）／（Ｘ２２ｋ１−Ｘ２２ｋ２）の平均比を基礎にして、２つの複製間の正規化後の（Ｘ２１ｋ１−Ｘ２１ｋ２）−（Ｘ２２ｋ１−Ｘ２２ｋ２）の値をプロットする。図１６ｃは、２つの複製を平均した試料１及び２間の差異をプロットする。この値は、［（Ｘ２１ｋ１＋Ｘ２２ｋ２）／２］／［（Ｘ１１ｋ１＋Ｘ１２ｋ２）／２］の平均比を基礎にした２つの試料間の正規化後の（（Ｘ２１ｋ１＋Ｘ２２ｋ２）／２）−（（Ｘ１１ｋ１＋Ｘ１２ｋ２）／２）として算出される。
【０４２９】
図１７ａ、１７ｂ及び１７ｃは、濾過されたデータを示す。図１６ａは、各オリゴヌクレオチド対の差に関する試料１の複製１及び２のハイブリダイゼーション強度の相対変化を示す。複製間で正規化（上記参照）後、以下のように比を算出する：（Ｘ１１ｋ１−Ｘ１１ｋ２）／（Ｘ１２ｋ１−Ｘ１２ｋ２）の絶対値が＞１である場合には、比＝（Ｘ１１ｋ１−Ｘ１１ｋ２）／（Ｘ１２ｋ１−Ｘ１２ｋ２）であるか、さもなくば比＝（Ｘ１２ｋ１−Ｘ１２ｋ２）／（Ｘ１１ｋ１−Ｘ１１ｋ２）（逆）。図１７ａと同様の方法で正規化し、濾過し、そしてプロットした各オリゴヌクレオチド対の差に関する試料２の複製１及び２の比を図１７ｂに示す。比は図１７ａで算出したものと同じであるが、（Ｘ２１ｋ１−Ｘ２１ｋ２）／（Ｘ２２ｋ１−Ｘ２２ｋ２）及び（Ｘ２２ｋ１−Ｘ２２ｋ２）／（Ｘ２１ｋ１−Ｘ２１ｋ２）の絶対値を基礎にした。図１７ｃは、各オリゴヌクレオチド対の差に関して２つの複製を平均した試料１及び試料２の比を示す。比率は図１７ａと同様に算出するが、しかし図１６ｃの場合と同様に、正規化後の［（Ｘ２１ｋ１＋Ｘ２２ｋ２）／２］／［（Ｘ１１ｋ１＋Ｘ１２ｋ２）／２］及び［（Ｘ１１ｋ１＋Ｘ１２ｋ２）／２］／［（Ｘ２１ｋ１＋Ｘ２２ｋ２）／２］の絶対値を基礎にした。
【０４３０】
２つの試料間の最大示差的ハイブリダイゼーションを示すオリゴヌクレオチド対は、観察されたハイブリダイゼーション比及び差異値を分類することにより、同定し得る。最大変化（増大又は低減）を示すオリゴヌクレオチドは、試料１及び２の比率プロットから容易に分かる（図１７ｃ）。これらの差異は、バックグラウンドノイズ中に存在するとは思えない。確認済みのオリゴヌクレオチド対配列を基礎にして、遺伝子又は疑わしい配列タッグを有するＥＳＴを、配列データベース、例えばＧＥＮＢＡＮＫ中で探索して、遺伝子がクローニング及び特性化されていたか否かを確定する。探索が陰性である場合には、適切なプライマーを作製して、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡから直接、又はｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡ又はｃＤＮＡの一部が得られる。
【０４３１】
図１６ａ及び１６ｂから、いくつかのオリゴヌクレオチド対が同一試料に対する２つの複製間に大きい差異を示すことが観察される。これは、与えられた組織中の示差的発現に起因する、と考えられる。これらのオリゴヌクレオチド対は、非常に高度に発現される遺伝子を検出し、したがってこれらの対に対する複製の偏差は、低レベルで発現されるヌクレオチドと結合するオリゴヌクレオチド対より大きい（即ち、平均の標準偏差は平均に比例する）。それが、２つの試料間の相対的変化が２つの試料間の示差的発現を検出する良好な指標である理由である（図１７ｃ）。どのオリゴヌクレオチド対が最大のものかを確定するために、絶対及び相対差測定を組合せて評価する。
【０４３２】
関連オリゴヌクレオチド対の数の増大（冗長性増大）及び二色ハイブリダイゼーション／検出図の使用は、バックグラウンド変異の低減に役立つと予期される。これは、小差の検出感度をより高くし、ノイズ及び擬陽性出現を低減する。この実施例に用いられる２５ｍｅｒアレイは考え得るすべての２５ｍｅｒの小集団で、したがってオリゴヌクレオチド対の総数の増大は、利用可能な配列空間をより完全な適用範囲とすることにより未知の配列の遺伝子の変化を検出する能力を大いに増大する。
【０４３３】
（実施例８．核酸末端標識）
マウス細胞からのいくつかのＲＮＡ転写物並びに完全ｍＲＮＡ標本を、Ｍｇ２＋の存在下で断片化した。フルオレセインか又はビオチンで５’末端を標識したリボＡ６（デオキシリボ核酸６ｍｅｒポリＡ）を、次に標準条件下でＲＮＡリガーゼを用いて断片化ＲＮＡと結紮した。
【０４３４】
標識は有効であると思われ、プローブとして標識化ＲＮＡを用いて得られたハイブリダイゼーションパターンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写工程で標識されたＲＮＡを用いて得られたものと同様であった。
【０４３５】
（実施例９．標識効率の定量）
特異的全長非断片化ＲＮＡ種を全ｍＲＮＡプール中で、異なる濃度でスパイクした後、末端標識して、標識効率の定量をおこなった。次に、上記のように調製した標的オリゴヌクレオチドの高密度アレイとのハイブリダイゼーションにより、プール中のスパイク化ＲＮＡの相対濃度を測定した。これにより、ｍＲＮＡプール中で低濃度で特定のＲＮＡ種を検出する能力を評価し得る。
【０４３６】
（実施例１０．核酸のＰＣＲ標識）
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
１０％ビオチン−ｄＵＴＰで置換した２０μｌＰＣＲ反応を実施し、各ＰＣＲ産物の量をゲル分析で概算した。約２５０ｆｍｏｌの各ＰＣＲ産物をプールした。３０００ｘｇで予備回転させ、その後２００μｌのＨ２Ｏで洗浄して３０００ｘｇでさらに１分間回転させて、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓ３００セファクリルカラム（型番２７−５１３０−０１）を調製した。プール化ＰＣＲ産物を入れて、３０００ｘｇで２分間回転させた。
【０４３７】
カラムの内容物を出し、溶出液を高速真空乾燥させた。
【０４３８】
ＤＮアーゼ断片化
乾燥させたＰＣＲプールを、ＮＥＮ  Ｄｕｐｏｎｔ末端標識キット（型番ＮＥＬ８２４）からの１３μｌのＨ２Ｏ中に再懸濁した。２．５μｌのＣｏＣｌ２及び１２．５μｌのＴｄＴ緩衝液を付加した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８を用いて、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  ＤＮアーゼ１を０．２５単位／μｌに希釈した。希釈ＤＮアーゼ１μｌをＰＣＲ産物プールに付加し、３７℃で６分間インキュベートして、９９℃で１０分間変性し、４℃に冷却した。全容量は２９μｌであった。
【０４３９】
末端トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）標識
断片化ＰＣＲプールに、２μｌのＴｄＴ酵素（ＮＥＮキット２単位／μｌストックから）を付加し、次に４μｌのＮＥＮキットビオチン−ｄｄＡＴＰを付加した。最終容量は３５μｌで、これを３７℃で１．５時間インキュベートした。
【０４４０】
ハイブリダイゼーション
３５μｌの標識化標的を２つの１７．５アリコートに分解し、一方をコードチップ（センス鎖配列及びその互換物を含有する遺伝子チップ）、他方を非コード（アンチセンス）チップとした。１８２．５μｌの２．５Ｍ  ＴＭＡＣｌ（Ｓｉｇｍａ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８を用いて１：２に希釈した５Ｍストック液）を付加した。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を付加して、最終濃度を０．００１％とした。ある実験では、４μｌの１００ｎＭ対照オリゴヌクレオチドを染色工程というよりむしろ、本溶液に付加した。
【０４４１】
混合物を９５℃で５分間変性させて、チップカートリッジに直接付加し、３７℃で６０分間混合してハイブリダイズさせた。
【０４４２】
染色及び洗浄
遺伝子チップシステム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に用いた流動セルからハイブリダイゼーション溶液を取り出して、６ｘＳＳＰＥ／０，００１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３回小室を洗浄して、ＴＭＡＣｌを除去した。
【０４４３】
フィコエリトリン染色溶液を以下のように調製した：１９０μｌの６ｘＳＳＰＥ／０．００１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋１０μｌの２０ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ＋０．４μｌのストックフィコエリトリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ型番Ｓ８６６）＋４μｌのフルオレセイン対照オリゴ１００ｎＭストック。
【０４４４】
室温で５分間混合しながら、染色溶液を流動セルに付加した。染色溶液を流動セルから除去し、洗浄緩衝液を用いて手動で３回洗浄した。
【０４４５】
３５℃で、６ｘＳＳＰＥ／０，００１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて、チップをハイブリダイゼーションステーション（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，）上で洗浄した。新鮮洗浄溶液をドレイン当たり９回変えて使用し、走査をこの緩衝液中でおこなった。この実験では、標的配列を正確に同定した。
【０４４６】
（実施例１１．末端標識ＰＣＲ産物）
ＰＣＲ産物を断片化し、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＭａｎｎｈｅｉｍからのＴｄＴを用いて標識した：ＰＣＲ増幅後、５μｌの５０μｌＰＣＲ反応液を１％アガロースゲル上で反応させて、増幅反応の総収量を概算した。ＤＮＡを断片化するために、残りの４５μｌの溶液をＤＮアーゼＩ（Ｈ２Ｏ中に希釈して、最終濃度を５単位ＤＮアーゼＩ／ＤＮＡμｇとした）と併合して、３１℃で１５分間反応させた。次にＤＮアーゼを９５℃で１０分間加熱して不活性化した。その後、ターミナルトランスフェラーゼ反応の用意ができるまで、断片化ＤＮＡ溶液を４℃に保持した。
【０４４７】
ターミナルトランスフェラーゼ反応混合物は、断片化ＰＣＲ試料、２０μＬの５ｘターミナルトランスフェラーゼ反応緩衝液、６μｌの２５ｍＭ  ＣｏＣｌ２（最終濃度１．５ｍＭ）、１μｌの蛍光ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ最終濃度１０μＭ）及び２μＬのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ、最終濃度５０単位／反応）で構成され、水を加えて最終容量を１００μｌにした。
【０４４８】
反応液を３７℃で３０分間インキュベートした。その後、全反応容量を１．７ｍｌ試験管に移し、５ｘＳＳＰＥ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎを加えて５００μｌとして、通常通りハイブリダイズし、走査した。
【０４４９】
５０μＬのＰＣＲ反応液用プロトコールは、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭＨＩＶ  ＰＲＴ検定（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）に添付される使用説明書に記載されている。
【０４５０】
（実施例１２．ＣＡＩＰは塩基呼出を改良する）
ある断片末端標識実験では、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＡＩＰ）をＤＮアーゼによる断片化中に用いて、ＧｅｎｅＣｈｉｐシステムでの塩基呼出の精度を改良した（図１８参照）。
【０４５１】
ＣＩＡＰは、いかなる従来の増幅、並びにポリメラーゼその上ポリメラーゼ反応にも組み込まれなかったあらゆるヌクレオチドを分解するのに有用である。このような分解はその後の反応、例えば尾部形成及び標識反応におけるヌクレオチドの取込みを防止する。
【０４５２】
（実施例１３．ハイブリダイゼーション後末端標識）
ハイブリダイゼーション後末端標識実験を実施した。ＧｅｎｅＣｈｉｐシステム中での標的とプローブアレイとのハイブリダイゼーション後、図１９に示すように、ターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴアーゼと示す）を用いて、標的を標識した。
【０４５３】
ハイブリダイゼーション後標識は、プローブアレイ（チップ）を図２０及び２１に示されているように予備反応させると、良好な結果得られることが示された。
【０４５４】
図２１は、ＤＮアーゼ滴定実験の結果を示す。種々の滴定実験を、下記の表７に示す。
【０４５５】
表７．ハイブリダイゼーション末端標識呼び出し精度。精度は、比＝次の算出強度に対する最大の１．２。算出強度＝調整強度から差し引かれるタイル組中のＡ、Ｃ、Ｇ又はＴの最小値。調整強度＝ＰＣＲの生強度−ＰＣＲなしの生強度。
【０４５６】
【表７】
2006191932.tif 000024
これらの結果は、塩基呼出精度が標的断片の長さにより強くなりうることを示す。
【０４５７】
その他の実験は、１単位のＤＮアーゼが理想的断片長を得るのに特に有用であることを示した。
【０４５８】
（実施例１４．ポリＴによる末端標識（テイリング））
実施例１３に記載したのと同様の方法を用いてポリ−Ａ類似体（標識化又は非標識化）でテイリング処理した核酸は、図２２に示すように、標識化ポリ−Ｔを用いて標識し得る。
【０４５９】
（実施例１５．蛍光トリホスフェート標識の合成）
０．５ｍｌエッペンドルフ試験管中の０．５μｍｏｌ（５０μＬの１０ｍＭ溶液）のアミノ誘導化ヌクレオチドトリホスフェート、３’アミノ−３’デオキシチミジントリホスフェート（１）又は２’−アミノ−２’−デオキシウリジントリホスフェート（２）に、メタノール中の２５μＬのホウ酸ナトリウムの１１Ｍ水性溶液，ｐＨ７、８７μＬのメタノール及び８８μＬ（１０μｍｏｌ，２０ｗｑｕｉｖ）の５−カルボキシフルオレセイン−Ｘ−ＮＨＳエステルの１００ｍＭ溶液を付加した。混合物を短時間回転させて、暗中で１５時間、室温に放置した。次にイオン交換ＨＰＬＣにより試料を精製して、フルオレセイン処理誘導体、次式３又は式４を、約７８〜８４％の収率で得た。
【０４６０】
【化７】
2006191932.tif 000025
実験は、これらの分子がターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）に対する基質ではないことを示唆する。しかしながら、これらの分子はポリメラーゼ、例えばクレノウ断片に対する基質であると考えられる。
【０４６１】
（実施例１０．アズ−トリアジン−３，５［２Ｈ，４Ｈ］−ジオンの合成）
類似体アズ−トリアジン−３，５［２Ｈ，４Ｈ］−ジオン（「６−アザーピリミジン」）ヌクレオチド（図２３ａ参照）を、Ｐｅｔｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２：４１１（１９９１）に用いられたのと同様の方法により、合成する。
【０４６２】
５−ブロモ−Ｕ／ｄＵＴＯ又はｄｄＵＴＰを含めた、その他の有用な標識試薬も合成される（例えば、Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｎｏｖａｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．２５：１８９−１９２（１９９４）；Ｌｉ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２０：１７２−１８０（１９９５）；Ｂｏｕｌｔｗｏｏｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｌ．１４８：６１ｆｆ．（１９８６）；Ｔｒａｉｎｃａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４０：３９９−４０５（１９８３）；及び図２３ａ及び２３ｂ参照）。
【０４６３】
上記の構造のすべてに対応するヌクレオチド類似体（特に、図２３ｂのもの）
の合成の詳細は、文献に説明されている。塩基にリンカーを付加するために、公知の手法が適用される。リンカー修飾ヌクレオチドを次にトリホスフェートアミンに変換させて、市販の活性化誘導体を用いて、染料又はハプテンを最終的に付着させる。
【０４６４】
その他の適切な標識としては、非リボース又は非−２’デオキシリボース含有構造（このうちのいくつかを図２３ｃに示す）、並びに糖修飾ヌクレオチド類似体（例えば図２３ｄ）が挙げられる。
【０４６５】
本明細書中に提示した指針を用いて、本発明の実施に有用な試薬の合成方法及び標識取込み方法（酵素的又はその他の方法）は、当業者には明らかである（例えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ３，Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｌ．Ｂ．ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ａｔ  ｃｈｐｔ．４，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｓ．Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ａｎｄ  Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｚｏｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９４）；Ｇｅｎ  Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ３，Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｌ．Ｂ．ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）；ｃａｎ  ｂｅ  ｍａｄｅ  ｂｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｓｉｍｌｉａｒ  ｔｏ  ｔｈｏｓｅ  ｓｅｔ  ｆｏｒｔｈ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ３，Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｌ．Ｂ．ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ａｔ  ｃｈｐｔ．４，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｓ．Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ａｎｄ  Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｚｏｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９４）；Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｎｏｖａｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ  ２５：１８９−１９２（１９９４）；Ｌｉ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２０：１７２−１８０（１９９５）；Ｂｏｕｌｔｗｏｏｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８：６１  ｆｆ．（１９８６）；Ｔｒａｉｎｃａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４０：３９９−４０５（１９８３）参照）。
【０４６６】
（実施例１１．ビオチン−ｃｈｅｍ  Ｌｉｎｋ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ））
標識密度は、１ビオチン／１０塩基と推測される。ビオチン−ｃｈｅｍ  Ｌｉｎｋのアデノシン及びグアノシンのＮ７との配位、非共有結合は、２０μｌ中の１μｇのＲＮＡ又はＤＮＡ＋１μｌのＢＣＬを３０分間８５℃に加熱する工程を包含する。
【０４６７】
ＲＮＡ標識実験（４組の４プール化ＲＮＡ転写物）
非常に不十分な標識および／またはハイブリダイゼーション（５ｐＭは観察できない。２０ｐＭは非常に弱い）。ミクロコン−１００ｓを用いて非組み込み標識を除去すると、標識後には試料が失われることがあった。標識後にＲＮＡを断片化した。これは問題とすべきことではないと思われる（ＢＭ  ｔｅｃｈ  ｈｅｌｐ）。
【０４６８】
ｄｓＤＮＡのＢＣＬ標識
全チップに亘る低シグナル、バックグラウンド。識別できない。
【０４６９】
高速タッグ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）（ＲＮＡ）
１ビオチン／１０〜２０塩基とする。５つの反応を実行した：
ａ）ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＲＮＡ３（各５ｐｍｏｌ、全体５．２μｇ）＋２５μｌ高速タッグ試薬；
ｂ）ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＲＮＡ３（各９ｐｍｏｌ、全体９．４μｇ）＋２５μｌ高速タッグ試薬；
ｃ）ＲＮＡ１＋ＲＮＡ２＋ＲＮＡ３（各々１８ｐｍｏｌ、全体で１９μｇ）＋４０μｌ高速タッグ試薬；
ｄ）ＲＮＡ４＋ＲＮＡ５＋ＲＮＡ６（各々１０ｐｍｏｌ、全体で８．７μｇ）
＋２５μｌ高速タッグ試薬；
ｅ）ＲＮＡ７＋ＲＮＡ８＋ＲＮＡ９（各々１０ｐｍｏｌ、全体で１１．４μｇ）＋２５μｌ高速タッグ試薬。
【０４７０】
加熱法を用いて、Ｓ−ＳをＲＮＡと結合させた。結果：ＩＶＴ法により標識された同一標的より２０倍低いハイブリダイゼーションシグナル。
【０４７１】
（実施例１２．ＲＮＡリガーゼ／ｂｉｏ−ａ６末端標識）
この実験は一般に、以下の工程を包含する：ａ）ＲＮＡを断片化し；ｂ）ＲＮＡ断片をポリヌクレオチドキナーゼ／ＡＴＰで５’リン酸化し；そしてｃ）ＲＮＡリガーゼを用いて、ＲＮＡの５’末端をＢｉｏＡ６の３’末端に結紮した。これは、次式で表される：
５’ビオチン−ＡＡＡＡＡＡ−ＯＨ３’＋５’Ｐ−ＲＮＡ−ＯＨ３’＝５’ｂｉｏＡＡＡＡＡＡ−ＲＮＡ３’
従来、この方法を用いて、全細胞性ｍＲＮＡを標識し、これを非包装チップ（高密度オリゴヌクレオチドアレイ）（２ｘ３スライド上）と１０μｌ中でハイブリダイズした。混合しないことは有意の問題であって、ハイブリダイゼーション強度を低くした。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）では、これらの条件下での標識化ＲＮＡは、ｂｉｏ−Ａ６／ＲＮＡリガーゼ標識標的より１０倍高いシグナルを生じた。
【０４７２】
その他の実験では、ｂｉｏ−Ａ６：ＲＮＡの３つの異なる比を用いた：
１）１ｘｂｉｏＡ６＝０．５ｎｍｏｌビオチン−Ａ６／１μｇＲＮＡ；
２）２ｘｂｉｏＡ６；そして
３）４ｘｂｉｏＡ６。
【０４７３】
標識後、試料をミクロコン−ＥＺ及びミクロコン−３により回転させて、酵素を除去し、緩衝液成分から希釈した。
【０４７４】
チップ（高密度オリゴヌクレオチドアレイ）とハイブリダイズしたｂｉｏ−Ａ６標識化標的は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）標識化標的とほぼ同一のハイブリダイゼーション強度を生じた。
【０４７５】
通常濃度のＰＥを用いて、１５分間染色した。有意に高いシグナル又はバックグラウンドは、ｂｉｏＡ６／１μｇＲＮＡの４倍では、観察されなかった。
【０４７６】
これらの実験用のために、ＢｉｏＡ６：（５’ビオチン−ＡＡＡＡＡＡＲＮＡ）はＧｅｎｓｅｔに注文した。
【０４７７】
（実施例１３．遺伝子特異的転写物の調製）
鋳型ＤＮＡ調製
ベクターの線状化：
挿入物と側面を接するＴ３及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を有するベクタ中で、遺伝子がすでにクローン化されてはいない場合は、下記のＰＣＲ増幅を参照。
【０４７８】
センス転写物に関しては挿入物の３’末端で、又はアンチセンスに関しては５’末端で切断する酵素でベクターを線状化する。挿入配列を調べて、ＲＥが内部で切断されていないことを立証する。好ましい実施態様では、３’突出端を生じない制限部位が選択された。
【０４７９】
線状化後、試料のアリコートをゲル上を動かして（非切断ベクターの次に）、完全消化を立証した。
【０４８０】
試料を任意にプロテイナーゼＫ（１００〜２００ｕｇ／ｍｌ）で５０℃で２０分〜１時間処理して、酵素又は残留ＲＮアーゼ（プラスミドミニ予備プロトコールに使用）を除去した。
【０４８１】
線状化ＤＮＡは、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿又は３〜４回のミクロコン−１００濃縮／再希釈による精製ＤＮＡである（下記参照）。
【０４８２】
ＰＣＲ増幅
遺伝子の所望領域がすでにＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するクローニングベクター内に無い場合には、増幅が唯一好ましい。
【０４８３】
ゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）で出発して、５’Ｔ３／Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列及び３’遺伝子特異的配列を有するＰＣＲプライマーを用いて、当該ＯＲＦ（又はチップ上に示された遺伝子の領域）を増幅した。
【０４８４】
以下の５’配列は十分働いた（１９〜２１遺伝子特異的塩基が３’末端に付加された）。
【０４８５】
５’−ＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧ−［＋１９〜２１遺伝子特異的塩基］−３’
５’末端は以下のもので構成される：
ａ）ユーザー選択の６つの５’側面位置塩基−プロモーター配列の一部ではないが、最大ＩＶＴ効率には必要
ｂ）コアＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の１７塩基
ｃ）転写される最初の６塩基（＋１〜＋６の配列が効率に影響を及ぼす）
その他のＰＣＲプライマーはその場合、５’末端にＴ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含有する。以下の配列がよく働いた：
５’−ＡＧＡＴＧＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＡ−（＋１９〜２１遺伝子特異的塩基）−３’
５’末端は以下のもので構成される：
ａ）６つの５’側面位置塩基（配列はこの例とは変わり得る）
ｂ）コアＴ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の１７塩基
ｃ）＋１〜＋６転写塩基
標準ＰＣＲ条件を用いて所望の配列を増幅。最初の５周期はプライマー単独の遺伝子特異的部分にもっともよく適したアニーリング温度（典型的には５５〜５８℃）で、その後２５周期は７０℃でアニーリング。アガロースゲル上のＰＣＲ産物を点検（３〜５ｕｌの１００μｌ  ｒｘｎ）。この段階で低領する必要はない。
【０４８６】
任意のプロテイナーゼＫ処理：
１ｕｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）（Ａｍｂｉｏｎ）を残りのＰＣＲ反応液に付加し、５０〜６０℃で２０分〜１時間インキュベートした。これは通常は必要ないが、しかしｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）産物が、キットに含まれる対照ＩＶＴ産物が完全長を有する場合には、この工程はミクロコン−１００及びＩＶＴ前に付加される。
【０４８７】
ミクロコン５０／１００精製
他の精製方法は試験中である。エタノール沈殿はミクロコン−５０精製に置換され得る。注意：ミクロコンは漏出する可能性がある。流出部分はすべて保守すること。
【０４８８】
３８０μｌのＲＮアーゼ無含有水をＰＣＲ産物に付加し、使用説明書（Ａｍｉｃｏｎ）に示唆されたようにミクロコン−１００又はミクロコン−５０を用いて濃縮する。希釈及び濃縮を２〜３回繰り返す。最終濃縮試料は５〜１００μｌとすべきである。
【０４８９】
ビオチンによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写標識
最大収量を上げるために、ＡｍｂｉｏｎのＴ３（＃１３３８）又はＴ７（＃１３３４）Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔシステムを用いる（それらの専売緩衝液はポリメラーゼを阻害せずにより高いヌクレオチド濃度を可能にする）（キット冊子中のＡｍｂｉｏｎ使用説明書及び示唆を読むこと）。
【０４９０】
示唆通りにＩＶＴを実行するが、しかし（１：３）ビオチニル化：非標識化ＣＴＰ及びＵＴＰを用いる。Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキットと一緒に入ってくるＴ３及びＴ７  １０ｘヌクレオチドを入れ替えてはいけない。
【０４９１】
例えば４つのＩＶＧＴ標識反応のためのＮＴＰミックスは以下のように製造する：
８μｌのＡｍｂｉｏｎのＴ７  １０ｘＡＴＰ［７５ｍＭ］
８μｌのＡｍｂｉｏｎのＴ７  １０ｘＧＴＰ［７５ｍＭ］
６μｌのＡｍｂｉｏｎのＴ７  １０ｘＣＴＰ［７５ｍＭ］
６μｌのＡｍｂｉｏｎのＴ７  １０ｘＵＴＰ［７５ｍＭ］
１５μｌのＢｉｏ−１１−ＣＴＰ［１０ｍＭ］（ＥＮＺＯ＃４２８１８）
１５μｌのＢｉｏ−１６−ＵＴＰ［１０ｍＭ］（ＥＮＺＯ＃４２８１４）
各ＩＶＴ標識反応のために、付加する（室温で−氷上でない）：
１４．５ｕｌのＮＴＰミックス
２．０ｕｌの１０ｘＴ７転写緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）
＊１．５ｕｌの精製ＰＣＲ産物（１μｇ以下）
２．０ｕｌの１０ｘＴ７酵素ミックス（Ａｍｂｉｏｎ）
＊  １ｕｇ以上のＤＮＡをＩＶＴ反応に付加してはならない。より高濃度のＤＮＡは実際に反応を阻害し、収率をより低くする。最終ｒＮＴＰ組成物：
７．５ｍＭ  ＡＴＰ  
７．５ｍＭ  ＧＴＰ  
５．６２５ｍＭ  冷ＵＴＰ／１．８７５ｍＭ  ｂｉｏ−ＵＴＰ
５．６２５ｍＭ  冷ＣＴＰ／１．８７５ｍＭ  ｂｉｏ−ＣＴＰ
３７℃で４〜６時間インキュベートする。いくつかの転写物に関しては、あるいは最大収率が重要でない場合は、短いインキュベーション時間で十分である。
【０４９２】
任意に：ＤＮアーゼ１処理
１μｌのＲＮアーゼ無含有ＤＮアーゼＩ（Ａｍｂｉｏｎキットと一緒に提供される）
を各反応に付加して、十分混合する。３７℃で１５〜２０分間インキュベートする。
【０４９３】
任意に−プロテイナーゼＫ処理
この工程は、チップに、及びストレプアビジン−フィコエリトリンと結合している非特異的タンパク質により引き起こされるバックグラウンドを低減するのに役立つ：
ＲＮアーゼ無含有水をＩＶＴ反応に付加して、最終容量を９９ｕｌとする。
【０４９４】
１ｕｌのＡｍｂｉｏｎの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを付加する。
【０４９５】
５０℃で２０〜３０分間インキュベートする。
【０４９６】
ミクロコン精製
いくつかのその他の精製法を試験した−多くの方法がｒＮＴＰを十分に除去しなかった、あるいは低収率を示した。カルボキシビーズベースの精製用プロトコール（Ａｒｃｈａｎａ  Ｎａｉｒ）は、非常に見込みがあり、ミクロコン精製の代わりにすぐに用いられる。
【０４９７】
注：さらに精製する前に、ＩＶＴ反応のアリコートを傍らに取りのけておく。１％を取りのけておけば、必要な場合に、この工程のトラブル発生を解決し得る。
【０４９８】
１．４００ｕｌのＤＥＰＣ水を試料に付加し、ミクロコン−５０又は−１００で試料を濃縮する（Ａｍｂｉｏｎの示唆通りに）。流出分画はすべて保守する。
【０４９９】
２．希釈／濃縮を３〜４回繰り返す。最終容量を１０〜１００μｌとする。
【０５００】
下記のコメント参照。
【０５０１】
ゲル上のＩＶＴ産物を点検
通常、非変性アガロース／ＴＢＥゲル上の〜０，０１〜１％の反応物を点検すれば十分である。電気泳動前に、試料を６５℃に１５分間加熱した。予測サイズ付近の単一バンドが通常観察される。ゲル上に十分な間隔があれば、非精製及び精製ＩＶＴ産物の両方の２又は３つの異なる希釈物をゲル上で処理する（各々の〜０．０１％、０．１％及び１％）。１ｘＴＢＥ緩衝液中で１：１０，０００希釈でＳｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（ＦＭＣ）でゲルを染色する（エチジウムブロミドより高感度）。
【０５０２】
転写物サイズの正確な測定が所望される場合には、変性ゲルをビオチニル化ＲＮＡ基準（Ａｍｂｉｏｎから入手）で処理し得る。
【０５０３】
Ａ２６０°による転写物収量の定量
７５〜１５０μｇＲＮＡ／１ｕｇ出発ＤＮＡ鋳型を除く。精製転写物の定量のために、最終容量６０〜７０ｕｌ（ミクロキュベット用）中に希釈される約１％の濃縮試料は、正確な範囲（０．１〜１  ＯＤ）内に吸光度読み取り値を示した。正確なピペット分取容量（＞１μｌ）のためには、先ず、一連の希釈液を作ることが通常は必要である（例えば、ユーザーのＲＮＡ試料の１／１０希釈液を作り、次に６０〜７０ｕｌの最終容量中の１０％希釈液を測定する）。通常は、同一キュベットでのブランク読み取りを確実にし、ＲＮＡ試料が希釈される同一緩衝液／水を使用する。
【０５０４】
純粋な転写物の正確な定量が有意のスパイク実験には不可欠であるため、よく注意してＩＶＴ反応から余分のヌクレオチドが十分除去され、Ａ２６０°に関与しないことを立証すべきである。
【０５０５】
ミクロコン流出は、Ａ２６０°に関して保守され、点検される必要がある。有意の吸光度が最終流出に認められる場合には、有意の吸光度が２６０ｎｍで検出されなくなるまで、ＲＮＡはさらにもう１回希釈及び濃縮を施されねばならない。
【０５０６】
ミクロコン濾過装置は時折漏出するため、流出分画すべてを保守するのが適切である。保持／収集試料中の転写体ＲＮＡ濃度が予測より非常に低い場合には、新しいカートリッジを用いて（次に少なくとも４回、希釈、濃縮して）、流出分画を再濃縮し得る。
【０５０７】
（実施例１４．細胞／組織からの全ｍＲＮＡの標識）
出発物質：少なくとも５ｘ１０５−１ｘ１０６細胞＊（０．１ｕｇ〜５ｕｇのポリＡ＋）からの良質ポリＡ＋ＲＮＡ。より多くのポリＡ＋ＲＮＡ（５μｇまで）を用いて開始するのがより経済的であるが、しかし物質が限定される場合には、０．１μｇという少ないポリ（Ａ）＋で十分量の標識化ＲＮＡ標的（ＩＶＴ標識／増幅後１０μｕｇ）を得ることができる。
【０５０８】
二本鎖ｃＤＮＡ合成：
本プロトコールは、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬＯｓ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍで提供される使用説明書の補足である。Ｇｉｂｃｏプロトコールを読み進める前に、ｃＤＮＡ合成のためのＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ’ｓ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍに従うが、但し、キットと一緒に提供されたオリゴ（ｄＴ）又は無作為プライマーの代わりに、逆転写一次鎖ｃＤＮＡ合成をプライミングするためのＴ７−（Ｔ）２４配列（下記）を用いた。
Ｔ７（Ｔ）２４プライマー：５’−ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧ−（Ｔ）２４−３’
第一鎖合成
ＢＲＬ使用説明書に指示されているように、０．１μｇ〜５μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡ、並びに調整量のＨ２Ｏ及び酵素を使用。例えば：
３μｌのＤＥＰＣ−水
４．５μｌ（１μｇ／μｌ）のｍＲＮＡ
１μｌ（１００ｐｍｏｌμｌ）のＴ７−（Ｔ）２４プライマー
１．７０℃で１０分間混合／回転／インキュベートする。
【０５０９】
２．氷上で冷却する。
【０５１０】
３．以下の成分を（氷上で）ＲＮＡ／プライマーに付加する。
【０５１１】
４μｌの５ｘ一次鎖ｃＤＮＡ緩衝液
２μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ
１μｌの［１０ｍＭ］ｄＮＴＰミックス
４．３７℃で２分間インキュベートする。
【０５１２】
５．４．５μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素／ミックスを十分付加する。（１ｕｌのＳＳＩＩ  ＲＴ／ＲＮＡｌｕｇ）を使用。＜１ｕｇＲＮＡに関しては、１ｕｌのＲＴを使用。
【０５１３】
６．３７℃で１時間インキュベートする。
【０５１４】
最終反応組成物（２０μｌ容量）：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３
７５ｍＭ  ＫＣｌ
３ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１０ｍＭ  ＤＴＴ
各々５００ｕＭ：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
１００ｐｍｏｌのＴ７−（Ｔ）２４プライマー
４．５ｕｇのｍＲＮＡ
９００単位のＲＴ（２００単位／ｍＲＮＡ  １μｇ）
第二鎖合成
１．一次鎖反応物を氷上に置く（迅速に回転沈降させる）
２．付加：
９５μｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ
３０μｌの５ｘ二次鎖緩衝液
３μｌの［１０ｍＭ］ｄＮＴＰミックス
１μｌの［１０単位／μｌ］大腸菌ＤＮＡリガーゼ
４μｌの［１０単位／μｌ］大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
１μｌの［２単位／μｌ］ＲＮアーゼＨ
最終組成物（１５０μｌ）：
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５
１００ｍＭ  ＫＣｌ
５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４
０．１５ｍＭ  ｂ−ＮＡＤ＋
各々２５０ｕＭ：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
１．２ｍＭ  ＤＴＴ
６５単位／ｍｌのＤＮＡリガーゼ
２５０単位／ｍｌのＤＮＡポリメラーゼＩ
１３単位／ｍｌのＲＮアーゼＨ
３．１６℃で２時間混合／回転沈降／インキュベートする。
【０５１５】
４．２μｌの［１０単位］Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを付加する。
【０５１６】
５．１６℃で５分間インキュベートする。
【０５１７】
６．１０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを付加／−２０℃で保存。
【０５１８】
クリーンアップ
フェノール／クロロホルム抽出
任意に：抽出中の試料損失を低減するためには、下記のＰＬＧプロトコールを参照。
【０５１９】
１．等容量（１６２ｕｌ）のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０／１ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｓｉｇｍａで飽和）を付加。
【０５２０】
２．攪拌／１４０００ｘｇで５分間回転。水性相を新しい１．５ｍｌ試験管に移す。
【０５２１】
ＰＬＧ−フェノール／クロロホルム抽出
Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ（ＰＬＧ）＊は、フェノールークロロホルム抽出物の水性相と有機相の間に不活性密閉バリアを形成する。固体バリアは試料（水性相）のより完全な回収を可能にし、試料の界面汚染を最小限にする。ＰＬＧＯは、１．５ｍｌ試験管中の予測定アリコートとして販売されており、ユーザーは、これに試料及びフェノール−クロロホルムを直接付加する。
【０５２２】
１．Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ（ＰＬＧ  Ｉ−軽を含有する１．５ｍｌ試験管）を微小遠心分離器中で２０〜３０秒間ペレット化する［ＰＬＧＩ−重も働くが、この適用に関しては我々は特に試験はしなかった］。
【０５２３】
２．全（１６２μｌ）ｃＤＮＡ試料をＰＬＧ管に移す。
【０５２４】
３．等容量（１６２μｌ）の（２５：２４：１）フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ８．０／１ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｓｉｇｍａで飽和）を付加。
【０５２５】
４．逆さにして混合する（攪拌しない）。ＰＬＧは懸濁液の一部にはならない。全速（１２，０００ｘｇ又はそれ以上）で２分間微小遠心分離。
【０５２６】
５．水性上相を新しい１．５ｍｌ管に移す。
【０５２７】
ＰＬＧ  Ｉは５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．，５０に関しては型番ｐ１−１７５８５０、２００に関しては型番ｐ１−１８８２３３から得られる。
【０５２８】
ミクロコン−５０精製
他の精製方法を試験中である。エタノール沈降はミクロコン−５０精製に置換し得る。注意：ミクロコンは漏出する可能性がある。流出部分はすべて保守すること。
【０５２９】
１．３００ｕｌの５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５を試料に付加する。
【０５３０】
２．Ａｍｉｃｏｎが供給した指示書にしたがって、ミクロコン−５０カラム（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−５０カラム、Ａｍｉｃｏｎ部品型番４２４１６）を通して回転させて濃縮する。
【０５３１】
３．希釈／濃縮を３〜４回繰り返し、収集し、カラム故障の場合の流出物を傍らに置く。
【０５３２】
濃縮して最終濃度を５〜１０ｕｌとし、可能な場合には、カートリッジを回転させて乾燥させないよう注意する。上層を収集する。
【０５３３】
ビオチンによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写標識
収量を最大にするために、ＡｍｂｉｏｎのＴ３（＃１３３８）又はＴ７（＃１３３４）Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔシステムを用いる（それらの専売緩衝液はポリメラーゼを阻害せずにより高いヌクレオチド濃度を可能にする）。
【０５３４】
示唆通りにＩＶＴを実行するが、しかし（１：３）ビオチニル化：非標識化ＣＴＰ及びＵＴＰを用いる。Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキットと一緒に入ってくるＴ３及びＴ７  １０ｘヌクレオチドを入れ替えてはいけない。先に進める前に、Ａｍｂｉｏｎの詳細な使用説明書及び示唆をよむこと。
【０５３５】
ＮＴＰ標識ミックス
４つのＩＶＴ標識反応のためのＮＴＰミックスの製造のためには、以下のものを組合せる：
８μｌのＡｍｂｉｏｎのＴ７  １０ｘＡＴＰ［７５ｍＭ］
８μｌのＡｍｂｉｏｎのＴ７  １０ｘＧＴＰ［７５ｍＭ］
６μｌのＡｍｂｌｏｎのＴ７  １０ｘＣＴＰ［７５ｍＭ］
６μｌのＡｍｂｉｏｎのＴ７  １０ｘＵＴＰ［７５ｍＭ］
１５μｌのＢｉｏ−１１−ＣＴＰ［１０ｍＭ］（ＥＮＺＯ＃４２８１８）
１５μｌのＢｉｏ−１６−ＵＴＰ［１０ｍＭ］（ＥＮＺＯ＃４２８１４）
ＩＶＴ標識反応
１．各反応のために、室温で−氷上でない以下のものを併合する：
１４．５μｌのＮＴＰ標識ミックス
２．０μｌの１０ｘＴ７転写緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）
＊１．５μｌのｄｓ  ｃＤＮＡ（０．１〜１μｇが最適：下記の注参照）
２．０μｌの１０ｘＴ７酵素ミックス（Ａｍｂｉｏｎ）
＊１ｕｇ以上のｃＤＮＡをＩＶＴ反応に付加してはならない。より高濃度のＤＮＡは実際に反応を阻害し、収率をより低くする。
【０５３６】
最終ｒＮＴＰ組成物：
７．５ｍＭ  ＡＴＰ
７．５ｍＭ  ＧＴＰ
５．６２５ｍＭ  冷ＵＴＰ／１．８７５ｍＭ  ｂｉｏ−ＵＴＰ
５．６２５ｍＭ  冷ＣＴＰ／１．８７５ｍＭ  ｂｉｏ−ＣＴＰ
２．３７℃で４〜６時間インキュベートする（いくつかの転写物に関しては、あるいは最大収率が重要でない場合は、短いインキュベーション時間で十分である）。
【０５３７】
３．未使用ＮＴＰ標識ミックスを−２０℃で保存する。
【０５３８】
クリーンアップ
任意のＤＮアーゼ１処理
１．１μｌのＲＮアーゼ無含有ＤＮアーゼＩ（Ａｍｂｉｏｎキットと一緒に提供される）を各反応に付加して、十分混合する。
【０５３９】
２．３７℃で１５〜２０分間インキュベートする。
【０５４０】
任意のプロテイナーゼＫ処理
この処理は、チップと、及びストレプアビジン−フィコエリトリンと結合している非特異的タンパク質により引き起こされるバックグラウンドを低減するのに役立つ：
１．ＲＮアーゼ無含有水をＩＶＴ反応に付加して、最終容量を９９ｕｌとする。
【０５４１】
２．１ｕｌのＡｍｂｉｏｎの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを付加する。
【０５４２】
３．５０℃で２０〜３０分間インキュベートする。
【０５４３】
ミクロコン精製
いくつかのその他の精製法を試験した−多くの方法がｒＮＴＰを十分に除去しなかったか、あるいは低収率を示した。カルボキシビーズベースの精製用プロトコール（Ａｒｃｈａｎａ  Ｎａｉｒ）は、非常に見込みがあり、ミクロコン精製の代わりにすぐに用いられる。
【０５４４】
注：さらに精製する前に、ＩＶＴ反応のアリコートを傍らに取りのけておく。１％を取りのけておけば、必要な場合に、この工程のトラブル発生を解決し得る。
【０５４５】
１．４００ｕｌのＤＥＰＣ水を試料に付加し、ミクロコン−５０又は−１００で試料を濃縮する（Ａｍｂｉｏｎの示唆通りに）。流出分画はすべて保守する。
【０５４６】
２．希釈／濃縮を３〜４回繰り返す。最終容量を１０〜１００μｌとする。
【０５４７】
３．ミクロコン濾過装置は時折漏出するため、流出分画すべてを保守するのが適切である。保持／収集試料中の転写体ＲＮＡ濃度が予測より非常に低い場合には、新しいカラムを用いて流出分画を再濃縮し、次に少なくとも４回、希釈、再濃縮する。
【０５４８】
収量に関する注記
１．ｄｓ  ｃＤＮＡ合成のために４〜５ｕｇのポリ（Ａ）＋で出発して、ＩＶＴのために２０％の精製ｄｓ  ｃＤＮＡ試料を用いたが、但し、ＩＶＴ反応当たり〜７５〜１２５ｕｇの標識化ＲＮＡを除く。
【０５４９】
２．水（又はＴＥ）で最終容量６０〜７０ｕｌ（ミクロキュベット用）中に希釈される〜１％の濃縮試料の読み取りにより、正確な範囲（０．１〜１  ＯＤ）内での吸光度読み取り値が得られた。正確なピペット分取容量（＞１μｌ）のためには、先ず、一連の希釈液を作ることが通常は必要である。例えば、ユーザーのＲＮＡ試料の１／１０希釈液を作り、次に６０〜７０ｕｌの最終容量中の１０％希釈液を測定する。同一キュベットでのブランク読み取りを確実にし、ＲＮＡ試料を希釈するのに用いた同一緩衝液／水を使用する。
【０５５０】
３．標識化ＲＮＡの正確な定量のために、よく注意してＩＶＴ反応から余分のヌクレオチドが十分除去され、Ａ２６０°に関与しないことを立証すべきである。
【０５５１】
ミクロコン流出は、Ａ２６０°に関して保守され、点検される必要がある。有意の吸光度が最終流出に認められる場合には、有意の吸光度が２６０ｎｍで検出されなくなるまで、ＲＮＡはさらにもう１回希釈及び濃縮を施されねばならない。
【０５５２】
ゲル上の非断片化試料の点検
断片化前に標識化ＲＮＡを電気泳動処理して、標識化転写物のサイズ分布を観察する。試料を６５℃で１５分間加熱し、アガロースゲル／ＴＢＥゲル上で電気泳動処理して、ほぼ理想通りの転写物サィズ範囲を得た。ゲル上に十分なスペースが存在する場合には、非精製及び精製ＩＶＴ産物の両方の２又は３つの異なる希釈物をゲル上で処理する（各々の〜０．０１％、０．１％及び１％）。１ｘＴＢＥ緩衝液中で１：１０，０００希釈でＳｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（ＦＭＣ）でゲルを染色する（エチジウムブロミドより高感度）。
【０５５３】
あるいは、断片化前及び後のＲＮＡ集団のサイズ分布のより正確な測定のためには、ビオチニル化ＲＮＡ分子量マーカー（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、変性ゲルを通して試料を電気泳動処理する。
【０５５４】
（実施例１５．ソラレン−ビオチンによるＤＮＡの直接標識）
ソラレン−ビオチン試薬は凍結乾燥されるようになり、「Ｒａｄ−Ｆｒｅｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｏｌｉｇｏ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）の一部として別々に入手できる。キットと一緒に購入すれば実際により安くなるので、余分のキット構成部品を手に入れて、節約できる。Ｒａｄ−Ｆｒｅｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｏｌｉｇｏ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：型番＃４８３１２２（２０ｎｍｏｌのソラレン−ビオチンを含有する）。ＵＶ長波３６５ｎｍランプを含む同一キット：＃４８３１２４。
【０５５５】
１．凍結乾燥ソラレン−ビオチン試薬を回転沈降させて、以下の：
ａ）断片化ＤＮＡ／ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドをいくつかの試薬（さらに濃縮が必要）で標識する場合には、１４ｕｌのＤＭＦか、又は
ｂ）断片化前に限定的に標識する場合には５６ｕｌのＤＭＦ
に再懸濁する。標識は、断片化前でも後でも、同様の結果が得られるが、しかし高濃度の塩（＞２０ｍＭ）中では標識されないため、断片化前におこなう方が容易である。
【０５５６】
２．ＲＮＡ／ＤＮＡ濃度を０．５ｕｇ／１０ｕｌ（１０ｕｇのＤＮＡに対して２００ｕｌ）に、塩を２０ｍＭ未満に調整する。ｐＨは問題なく（ｐＨ２．５〜１０）、したがって、ＲＮＡ／ＤＮＡを再懸濁又は希釈するのに滅菌又はＤＥＰＣ化水を用い得る。プラスミドＤＮＡは線状化する必要がある。ＲＮＡ／ＤＮＡが高塩中に存在する場合には、適切なサイズのミクロコン（ミクロコン３でも断片化物質に対して働くが、〜７０分／周期を要する）を用いて希釈、濃縮し得る。
【０５５７】
３．試料を１０分間沸騰させ、氷上で急速に冷却する（氷上で５分〜３時間保存）［重要−ｄｓＤＮＡは、標識前に鎖が分離されない場合には、試薬により架橋されるようになる］。
【０５５８】
４．弱光中でＤＮＡ／ＲＮＡ溶液２０ｕｌ当たり１ｕｌのソラレン−ビオチン試薬を付加する（ＤＮＡ／ＲＮＡ１ｕｇ当たり５６ｕｌのＤＭＦ中に再懸濁されたソラレン−ビオチンは１ｕｌであった）。ソラレン−ビオチンを１４ｕｌ中に再懸濁した場合、標識に必要な量をＤＭＦ中に１：３で希釈する（１ｕｌの濃縮ソラレン−ビオチン＋３ｕｌのＤＭＦ）。
【０５５９】
５．溶液を氷上の９６−ミクロウエルプレートのウエル中に移す（〜１５０ｕｌ／ウエル）。
【０５６０】
６．光源が試料から約２ｃｍの距離になるように、３６５ｎｍＵＶランプをプレート上部に直接置く。試料を１時間照射する。
【０５６１】
７．試料を微小遠心分離管に移して、２容量のＨ２Ｏ飽和ｎブタノールをふかして、非取込みソラレン−ビオチンを抽出する。攪拌／遠心分離１分間。
【０５６２】
８．ブタノール（上層）を捨てる。抽出を繰り返す。
【０５６３】
９．通常通りに断片化する。ハイブリダイゼーション前に正常な場合は変性させる（９９〜１００℃で１０分間）。
＊長ＵＶ照射は、結果を改良しない。
＊ＤＮＡ／ＲＮＡ  １ｕｇ当たりさらに多くのソラレン−ビオチンをふかしても、結果は改良されるとは思えない。
【０５６４】
（実施例１６．ソラレン−ビオチン標識実験）
標準プロトコールによるＲＮＡ標識
ソラレン−ビオチンで標識した４つの異なる断片化ＲＮＡ転写体のプール
チップ（各々５ｐＭ）とのハイブリダイゼーションの結果。ＰＢ標識標的は、ＩＶＴ（ｂｉｏ−Ｕ＋Ｃ）標識標的より約〜５倍低い強度を示した。
【０５６５】
断片化前対後標識
ハイブリダイゼーション強度に有意差は認められなかった。
【０５６６】
ソラレン−ビオチン対ＲＮＡ比
ＰＢ：ＲＮＡの比率より４倍高い値で標識してもチップ上のハイブリダイゼーション強度には有意の影響は認められなかった。
【０５６７】
標識反応時間／ＵＶランプ強度
１対３時間標識、あるいは３６５ｎｍでの１５〜２０ｍＷ／ｃｍ２（Ａｆｆｙランプ）対５〜７ｍＷ／ｃｍ２（Ｓ＆Ｓランプ）強度に、有意さは認められなかった。
【０５６８】
ソラレン−ビオチン
ソラレン：平面、三環式化合物。
【０５６９】
ソラレン−ビオチン：１４原子リンカーアームを介してビオチンと接合したソラレン。
【０５７０】
核酸に対して高親和性。
【０５７１】
ＤＮＡ／ＲＮＡ中の挿入体。
【０５７２】
長波ＵＶ光で照射されると、共有結合するようになる。
【０５７３】
（実施例１７．ターミナルトランスフェラーゼ末端標識プロトコール）
本プロトコールは、ＰＲＴ  ４４０Ｓチップのみを用いて試験し、最適化した。
【０５７４】
ＤＮアーゼ断片化
これは、４つの標識反応には十分である：
４ｐｍｏｌのＨＩＶ  ＰＣＲ標的（３．１７ｕｇの１．２ｋｂの挿入物）
Ｘｕｌ
ＤＮアーゼ（ＢＲＬ）                              Ｘｕｌ（１単位／ｕｇ）
ウシアルカリ性ホスファターゼ，１単位／ｕｌ（ＢＲＬ）
２．５ｕｌ（２．５単位／ｒｘ）
希釈ＣＡＰ緩衝液（ＢＲＬ）                    ２．５ｕｌ
ＭｇＣｌ２                                        Ｘｕｌ（１．２５ｍＭ）
Ｈ２Ｏで善良を１００ｕｌとする
３７℃で１５分間
９５℃で１０分間
４℃で保持。
【０５７５】
ＴｄＴ標識
Ｆ−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ、Ｆ−ｄｄＡＴＰ、Ｆ−ｄｄＣＴＰ及びＦ−ｄｄＵＴＰは、反応中で比較可能的に標識される。Ｆ−Ｎ６−ｄｄＡＴＰを用いることにした。
【０５７６】
断片ＤＮＡ試料                                  ２５ｕｌ（１ｐｍｏｌ）
５ｘＴｄＴ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）        ２０ｕｌ（１ｘ）
２５ｍＭ  ＣｏＣｌ２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）      １０ｕｌ（２．５ｍＭ）
Ｆ−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ（１ｍＭ）                  １ｕｌ（１０ｕＭ）
ＴｄＴ（２５Ｕ／ｕｌ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）  １ｕｌ（２５Ｕ／ｒｘ）
Ｈ２Ｏ                                          ４３ｕｌ
３７℃で３０分間
９５℃で５分間
４℃で保持。
【０５７７】
ＰＲＴ  ４４０Ｓハイブリダイゼーション（Ｒｅｌａステーション）
標識化試料                                      １００ｕｌ
１０ｘＳＳＰＥ；０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ３００ｕｌ
対照（１００ｎＭ）２１３オリゴ                  ５ｕｌ
Ｈ２Ｏ                                            １９５ｕｌ
４５℃ハイブリダイゼーション３０分。
【０５７８】
６ｘＳＳＰＥ、０．００５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で２０℃で洗浄；４周期／１０ドレイン充填。
【０５７９】
５３０ｎｍでチップを走査。ピクセルサイズ１１．２５ｕｍ。
【０５８０】
（実施例１８．他の標識法）
結紮検定
ＲＮＡリガーゼによる５’末端でのＡ６ＲＮＡオリゴヌクレオチドのビオチンとの結紮により、ＲＮＡを直接標識し得る。細菌遺伝子であるＣｒｅをＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写して、アンチセンスＲＮＡを生成した。ＲＮＡを断片化し、オリゴヌクレオチドキナーゼを用いてキナーゼ処理して、５’ホスホリル化末端を生成した。ビオチンＡ６ＲＮＡを次に、Ｔ４ＲＮＡを用いて結紮した。５ｐｍの結紮化ＲＮＡを標識化Ｃｒｅと一緒に遺伝し発現チップ上で試験した。
【０５８１】
ポリＡポリメラーゼを用いた３’ＲＮＡの直接標識
ポリＡポリメラーゼは、ＲＮＡの遊離３’ヒドロキシル末端上のポリＡ尾部を、前駆体としてＡＴＰを用いて、触媒するために用いられている。近年、ポリＡポリメラーゼをＣＴＰを有する３’ＲＮＡに首尾よく用いて、標識化標的を生じることが、Ｊｏｏｍｙｅｏｎｇ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３（１２）：２２４５−２２５１に報告されている。
【０５８２】
本方法の利点は、センスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）がビオチンＣＴＰにより直接標識され得ることである。ＣＴＰの消費は、ＩＶＴ反応に比して１／５節減される。
【０５８３】
（実施例１９．直接標識プロトコール）
ｍＲＮＡを直接標識するための試薬
１）１００μＭ  ｒＡＴＰ２００μｌ
１９８μＬ  ＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏ
２μＬ（１０ｍＭ）ｒＡＴＰ
２）１００μｇ／ｍｌＢＳＡ
ＮＥＢアセチル化ＢＳＡ
３）３０ｍＭ  ＤＴＴ
４）１０単位／μＬポリヌクレオチドキナーゼ
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ３’ホスフェート無含有型番＃８３８２
９
５）１ｎｍｏｌ／μＬ  ＢｉｏＡ６
Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
６）５単位／μＬ  Ｔ４ＲＮＡリガーゼ＋１０ｘＴ４ＲＮＡリガーゼ緩衝液
Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，型番＃ＬＲ５０２５
７）５ｘＲＮＡ断片化緩衝液
２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸塩，ｐＨ８．１
５００ｍＭ  ＫＯＡｃ
１５０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ
直接標識プロトコール
断片化
１．５ｍｌ滅菌試験管に付加する
ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ（１μｇ）中の８μＬポリ（Ａ）＋ＲＮＡ
２μＬ  ５ｘＲＮＡ断片化緩衝液
９４℃で３５分間加熱。
【０５８４】
キナーゼ反応
１０μＬ断片化ＲＮＡに付加：
２．４μＬｒＡＴＰ（１００μＭ）
２μＬ  ＢＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）
２μＬ  ＤＴＴ（３０ｍＭ）
１．６μＬ  ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ  ２μＬ  ポリヌクレオチドキナーゼ（１０単位／μＬ）
３７℃で２．５時間インキュベート。９４℃で２分間加熱（酵素を加熱により不活性化）。
【０５８５】
Ｔ４ＲＮＡリガーゼ反応
２０μＬキナーゼ処理ＲＮＡに付加：
０．５μＬ  ＢｉｏＡ６（ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ中１ｎｍｏｌ／μＬ）
３μＬ  ｒＡＴＰ（１９ｍＭ）
３μＬ  １０ｘＴ４ＲＮＡリガーゼ緩衝液
０．５μＬ  ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ
１７℃で一夜〜２日間。９４℃で２分間。
【０５８６】
（実施例２０．総称的ＤＮＡアレイとハイブリダイズ又は結紮した標的ＤＮＡ試料に関する塩基呼出を実施するためのコンピューター計算）
ｎ−ｍｅｒの総称的ＤＮＡ配列上に一組のｎ電子タイルアレイを作成することによるＤＮＡ標的の再シーケンシング
標的を再シーケンシングする本方法は、通例の再シーケンシングＧｅｎｅＣｈｉｐで用いられる方法と同様であるが、但し、チップ上に一続きのタイルプローブを物理的に配置する通例のＧｅｎｅＣｈｉｐと異なって、総称的ＧｅｎｅＣｈｉｐを用いて、コンピューターが総称的アレイ（総称的アレイは考え得るｎ−ｍｅｒ配列を含有する）から適切なプローブ情報を取り出すことにより、一組のｎタイルアレイを電子的に再構築する。概して、標的ＤＮＡを再シーケンシングするために、標的はタイルプローブのｎ−ｍｅｒ相補的ワードスペクトルに分解される。各タイルプローブに関しては、総称的チップ（総称的チップは、最高階の最も近い隣接体を含有する）上に一組の「一階の最も近い隣の」タイルプローブ（単一塩基置換を含有するプローブ）が存在する。この工程は、ｎ−ｍｅｒのワードを有する標的配列によるタイリングと呼ばれる（図２４）。標的内の既定位置で塩基呼出を成すために、その位置でのタイルプローブの強度を、その位置でのその「最も近い隣」の強度と比較する。単一塩基置換がプローブ内の異なる位置で起きるために、ｎ組のこのような「最も近い隣」が存在する。最高強度を生じるプローブ内の特定位置での塩基置換は、プローブ内のその位置に対して呼び出される塩基である（図２５）。標準通例ＧｅｎｅＣｈｉｐに対する総称的ＤＮＡアレイの使用の利点は、標的の各塩基呼出に対して高度の冗長性が達成されることである。ｎ−ｍｅｒ総称的アレイは、標的内の各塩基に対してｎの塩基呼出を成すが、一方通例再シーケンシングＧｅｎｅＣｈｉｐは、単一塩基呼出のみをおこなう。
【０５８７】
標的塩基の最終塩基呼出は、各標的位置のｎの異なる電子的タイリングからの塩基呼出の電子的票決により決定される（図２６）。
【０５８８】
不正確な電子的タイルを濾し出すためのｎの電子的タイルアレイから得られる塩基呼出の精度の経験的使用
既定の参照ＤＮＡ試料を総称的ＤＮＡアレイとハイブリダイズし／結紮した。一組のｎの電子的タイルを作成し、対応する塩基呼出をおこなった。既定タイル置換シリーズが正しい塩基呼出をおこなう場合にはスコア１，塩基呼出が正確でない場合にはスコア０として、精度スコア表を構築した（図２７）。任意の既定塩基呼出に対する塩基置換の強度の比によって、既定の塩基呼出に関する信頼レベルを、各採点に付加した。
【０５８９】
次に種々のＤＮＡ試料を第二総称的ＤＮＡアレイとハイブリダイズし／結紮した。さらに一組のｎの電子タイルが生成されたが、但し、この時点で、０精度スコアを有するすべてのタイルを廃棄し、精度スコア１を有するものだけを全塩基票決手順に含めた（図２８）。結果は、正確な塩基呼出の全体的パーセンテージを劇的に改良するというものであった。
【０５９０】
参照試料と変異体との間の「局所的」正規化タイルプローブ強度の比較は、突然変異を検出する高感度方法である。
【０５９１】
既定のｎ−ｍｅｒ総称的アレイに関して、標的の複雑性が増大すると、標的を正しく再シーケンシングする能力は低減する。標的複雑性が増大すると、標的内でそれ自体反復するｎ−ｍｅｒタイルプローブの数は増大し、異なる位置での最も近い隣の間の交差トークが増大し、そして全体的交差ハイブリダイゼーションが増大する。これらの因子はすべて、標的内の塩基のミスコールに関与する。参照標的に対する試料標的の比較は、再検出による非特異的ノイズをすべて「濾し取る」ための強力な方法を提供する。
【０５９２】
参照及び試料間を比較する一方法は、タイルプローブそれ自体を比較することである。しかしながら、直接比較をおこなう前に、いくつかの方法で強度を正規化して、チップ対チップ及び試料対試料変異を説明しなければならない。私は、「局所的」正規化法を用いて、シグナルを正規化した。「局所的」正規化により、簡単に、タイルプローブの強度をその最近隣接体の強度の和で割ることができる（図２９）。
【０５９３】
正規化のこの方法は、試料間に良好なシグナルトラッキングを生じ、「バブル」の形成により示される突然変異の存在に非常に感度が高い（図３０）。この「局所的」正規化タイルプローブ比較はさらに、差異分析及び仕上げにより、突然変異の存在がより容易に可視化されるフォーマットに変えられる。
【０５９４】
突然変異を検出するための誘導差異法
突然変異を片出するために参照及び試料間の比較を用いる別の方法は、タイルプローブとその最近隣接体との間の突然変異性「誘導」差異によるものである。この方法の一階最近隣接体タイル分析への適用は、参照標的中の「局所的正規化」プローブを試料標的中の対応するプローブとの比較を包含する。塩基をミスコールするために、パートＩＩでは非情報性であるタイルは、ここでは、そのタイル内のあるプローブ成員が参照及び試料間に誘導された（強度の増大又は低減を引き起こされる）ために情報性で、突然変異の存在を示す（図３１）。これらの誘導は既定標的位置に対して前方及び逆の鎖上の善タイルを合計したもので、その結果生じる数字は、突然変異が存在するか否かの測定値である（図３２、図３３）。
【０５９５】
（実施例２１．総称的結紮ＧｅｎｅＣｈｉｐ上の二重鎖安定性を増大し、その結果生じる結紮シグナルを増大するためのＭｅｎＰｏｃ合成プローブの５’末端上のイノシンの使用）
二重鎖安定性を増大するための縮重塩基、例えばイノシン（他のすべての塩基を有する対）のＭｅｎＰｏｃ合成プローブ末端への付加の使用を、我々は調べた。実際、プローブの末端上への１〜６イノシンの付加は、総称的結紮ＧｅｎｅＣｈｉｐ上のハイブリダイゼーション及び結紮反応の両方のシグナル強度を実際に増大したということを、我々は見出した。
【０５９６】
イノシン（０〜６）を製造中にプローブの５’末端に置き、これらの末端イノシンの作用を、ＤＮアーゼＩ消化、ＴｄＴ標識化７８８ｂｐＤＮＡ断片をチップに結紮することにより、検定した。２〜６イノシンを用いた場合の明るさの増大は、二重鎖安定性の増強を示した。６つのイノシンを用いると、２〜４つのイノシンに比して強度のわずかな低減が認められたが、これは末端イノシンがおそらくは四つ組様二次構造を形成し始めたためである。
【０５９７】
（実施例２２．総称的結紮ＧｅｎｅＣｈｉｐ上で用いた場合のＴ４リガーゼ及びＴａｑリガーゼの特異性の間の比較）
Ｔ４リガーゼ又はＴａｑリガーゼが総称的結紮ＧｅｎｅＣｈｉｐに対して標的を結紮するのにより特異的であるか否かを、我々は調べた。Ｔａｑリガーゼを用いるためには、４０℃又はそれ以上で結紮反応を実施する必要があった。したがって、二重鎖の熱安定性を増大するために、ＭｅｎＰｏｃプローブの末端に６つのイノシンを有する８ｍｅｒチップを、我々は用いた。これにより、４４℃でＴａｑリガーゼ反応を実施し、これと３７℃でのＴ４結紮反応とを比較することができた。その結果は、ＴａｑがＴ４リガーゼよりもさらに特異的で、Ｔ４リガーゼが結紮できない一組の標的末端を結紮した。
【０５９８】
Ｔａｑはあまり特徴を照らし出さないが、しかしＴ４より強度が明るく、このことはＴａｑ対Ｔ４の特異性を示す。
【０５９９】
標的内の既定位置でのタイルプローブ及び最接近隣接体置換の強度プロフィールは、ＴａｑがＴ４より特異的であり、ＴａｑはＴ４がシグナルを検出できなかったプローブでシグナル強度を検出することを示す。本明細書に記載した実施例及び実施態様は説明のためのものであり、その点に関しての種々の修正又は変更が当業者に示唆され、そしてそれらは本出願並びに添付の請求の範囲の精神及び範囲に含まれる、と理解される。本明細書中に引用した出版物、特許、特許出願はすべて、参照により本明細書中に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０６００】
【図１】図１は、オリゴヌクレオチドアレイを用いた発現モニタリングの略図を示す。抽出ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、次にこれを標識リボヌクレオチドトリホスフェートの存在下で転写する。Ｌは、ビオチン又は染料、例えばフルオレセインである。ＲＮＡを、マグネシウムイオンの存在下で加熱して断片化する。二次元ＤＮＡプローブアレイを含有する流動細胞中でハイブリダイゼーションを実行する。非ハイブリダイズ化ＲＮＡを除去するための短時間の洗浄工程後、走査共焦点顕微鏡を用いてアレイを走査する。ｃＤＮＡ中間体を用いずに細胞性ｍＲＮＡが直接標識される代替物が、実施例に記載されている。画像分析ソフトウエアは、走査アレイ画像を試験フィルムに変換するが、この場合、特異的物理的位置での観察強度は特定のプローブアレイに関連する。
【図２−１】図２Ａは、１６，０００以上の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイの蛍光画像を示す。本画像は、ネズミＢ細胞（Ｔ１０）ｃＤＮＡライブラリーから転写され、１３の特異的ＲＮＡ標的と１：３，０００（約１００コピー／細胞と等価の５０ｐＭ）のレベルでスパイクされるビオチン標識無作為断片化センスＲＮＡのハイブリダイゼーション（４０℃で１５時間）後に得られた。任意の位置での輝きは、特定のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズされた標識ＲＮＡの量を示す。図２Ｂは、ＩＬ−２及びＩＬ−３ＲＮＡに対するプローブを含有する小部分のアレイ（図２Ａの矩形領域）を示す。比較のために、図２Ｃは、非スパイク化Ｔ１０ＲＮＡ試料（Ｔ１０細胞はＩＬ−２及びＩＬ−３を発現しない）を用いたハイブリダイゼーション後のアレイの同一領域を示す。シグナル強度の変動は高度に再現可能で、ハイブリダイゼーション効率の配列依存性を反映した。アレイの中心十字及び四隅は、一定濃度（５０ｐＭ）でハイブリダイゼーション溶液に付加されたビオチン標識オリゴヌクレオチドと相補的である対照配列を含有する。図の境界付近の画像の鮮明度は、読み取り装置の解像度（１１．２５μｍ）により限定され、アレイ合成の空間的解像度にはよらなかった。各合成図の縁領域のピクセルは、画像の定量的分析においては故意に無視した。
【図２−２】図２Ａは、１６，０００以上の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイの蛍光画像を示す。本画像は、ネズミＢ細胞（Ｔ１０）ｃＤＮＡライブラリーから転写され、１３の特異的ＲＮＡ標的と１：３，０００（約１００コピー／細胞と等価の５０ｐＭ）のレベルでスパイクされるビオチン標識無作為断片化センスＲＮＡのハイブリダイゼーション（４０℃で１５時間）後に得られた。任意の位置での輝きは、特定のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズされた標識ＲＮＡの量を示す。図２Ｂは、ＩＬ−２及びＩＬ−３ＲＮＡに対するプローブを含有する小部分のアレイ（図２Ａの矩形領域）を示す。比較のために、図２Ｃは、非スパイク化Ｔ１０ＲＮＡ試料（Ｔ１０細胞はＩＬ−２及びＩＬ−３を発現しない）を用いたハイブリダイゼーション後のアレイの同一領域を示す。シグナル強度の変動は高度に再現可能で、ハイブリダイゼーション効率の配列依存性を反映した。アレイの中心十字及び四隅は、一定濃度（５０ｐＭ）でハイブリダイゼーション溶液に付加されたビオチン標識オリゴヌクレオチドと相補的である対照配列を含有する。図の境界付近の画像の鮮明度は、読み取り装置の解像度（１１．２５μｍ）により限定され、アレイ合成の空間的解像度にはよらなかった。各合成図の縁領域のピクセルは、画像の定量的分析においては故意に無視した。
【図３】図３は、１１の異なるＲＮＡ標的に関するハイブリダイゼーション強度（各遺伝子に関するＰＭ−ＭＭ強度差の平均）対濃度の対数／対数プロットを提示する。このハイブリダイゼーションシグナルは標的濃度に定量的に関連していた。実験は、本明細書の実施例及び図２に説明されているように実施した。１０サイトカインＲＮＡ（＋ｂｉｏＢ）を、１：３００，０００〜１：３０００の範囲のレベルで標識Ｔ１０ＲＮＡ中にスパイクした。シグナルは、１：３００の頻度まで濃度の上昇と共に増加し続けたが、しかし反応は、プローブ部位の飽和のために、高レベルで直線下になった。直線範囲は、短時間のハイブリダイゼーションを用いることにより、高濃度にまで拡張し得る。Ｔ１０細胞中で発現される遺伝子からのＲＮＡ（ＩＬ−１０、β−アクチン及びＧＡＰＤＨ）はさらに、ｃＤＮＡライブラリーをプローブすることにより得られた結果と一致するレベルで検出された。
【図４】図４は、ＰＭＡ及びカルシウムイオノフォアで刺激後の種々の時間でのネズミ２Ｄ６Ｔヘルパー細胞中のサイトカインｍＲＮＡレベルを示す。刺激後０、２、６及び２４時間目にポリ（Ａ）＋ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する二重鎖ｃＤＮＡに変換した。次に、ｃＤＮＡプールをビオチン標識リボヌクレオチドトリホスフェートの存在下で転写し、断片化して、２及び２２時間、オリゴヌクレオチドプローブアレイとハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション前に公知量で試料中にスパイクされた細菌ＲＮＡ（ビオチンシンセターゼ）に関して得られたシグナルを用いて比較することにより、蛍光強度をＲＮＡ度数に変換した。５０，０００のシグナルは、約１：１００，０００〜１：５，０００の度数に対応し、１００のシグナルは１：５０，０００の度数に対応する。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０に関するＲＮＡは、これらの実験においては約１：２００，０００のレベルより上では検出されなかった。誤差バーは、異なる時点での同一ＲＮＡに関するレベルに対する既定ＲＮＡに関するレベルでの概算不確定性（２５パーセント）を反映する。相対不確定性概算は、反復スパイク実験の結果を、そしてＴ１０及び２Ｄ６細胞（未刺激化）の両方からの標本中のＩＬ−１０、β−アクチン及びＧＡＰＤＨ  ＲＮＡの反復測定を基礎にした。絶対度数の不確定性は、ハイブリダイゼーション効率におけるメッセージ対メッセージ差、並びにｍＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、並びにＲＮＡ合成及び標識工程での差異を含む。絶対度数の不確定性は、３つのうちの１因子であると概算される。
【図５】図５は、１１８の遺伝子に対する６３，０００以上の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含有するアレイの蛍光画像を示す。標識ネズミＢ細胞ＲＮＡ試料を一夜ハイブリダイゼーション後に、画像を得た。各々の四角の合成領域は５０ｘ５０μｍで、特異的オリゴヌクレオチドの１０７〜１０８個のコピーを含有する。約１５分で、７．５μｍの解像度でアレイを走査した。明るい行は、高レベルで存在するＲＮＡを示す。低レベルＲＮＡは、ハイブリダイゼーションパターンの定量的評価を基礎にして、疑いの余地なく検出された。約１：３００，０００〜１：１００の範囲のレベルで。計２１のネズミＲＮＡを検出した。中心の十字、隅のチェックボード及び上部のＭＵＲ−１領域は、全試料に付加された標識対照オリゴヌクレオチドと相補的なプローブを含有する。
【図６】図６は、本発明の実施態様のソフトウエアを実行するために用いられるコンピューターシステムの例を示す。
【図７】図７は、本発明の実施態様のソフトウエアを実行するために用いられる典型的コンピューターシステムのシステムブロック図を示す。
【図８】図８は、完全マッチ及びミスマッチプローブの対のハイブリダイゼーション強度を比較することにより遺伝子の発現をモニタリングする工程の高レベルフローを示す。
【図９】図９は、デシジョンマトリックスを用いて遺伝子が発現されるか否かを確定する工程のフローを示す。
【図１０−１】図１０Ａ及び１０Ｂは、ベースライン走査データと実験走査データを比較することにより遺伝子の発現を確定する工程のフローを示す。
【図１０−２】図１０Ａ及び１０Ｂは、ベースライン走査データと実験走査データを比較することにより遺伝子の発現を確定する工程のフローを示す。
【図１１】図１１は、プローブの数が低減又は削減された後に遺伝子の発現をモニタリングするためにプローブの数を増大する工程のフローを示す。
【図１２】図１２ａ及び１２ｂは、プローブオリゴヌクレオチド／連結反応系を説明する。図１２は一般に、プローブオリゴヌクレオチド／連結反応系の種々の構成成分を説明する。図１２ｂは、プローブオリゴヌクレオチド／連結反応系を用いた非完全相補的標的：オリゴヌクレオチドハイブリッドの識別を説明する。
【図１３−１】図１３ａ、１３ｂ、１３ｃ及び１３ｄは、連結／ハイブリダイゼーション反応の種々の構成成分を説明し、種々の連結戦略を説明する。図１３ａは、そのいくつかが種々の実施態様において任意である連結／ハイブリダイゼーション反応の種々の構成成分を説明する。図１３ｂは、プローブオリゴヌクレオチドの末端のミスマッチを識別する連結戦略を説明する。図１３ｃは、試料オリゴヌクレオチドの末端のミスマッチを識別する連結戦略を説明する。図１３ｄは、プローブ末端と試料末端の両方での識別を改良するための方法を説明する。
【図１３−２】図１３ａ、１３ｂ、１３ｃ及び１３ｄは、連結／ハイブリダイゼーション反応の種々の構成成分を説明し、種々の連結戦略を説明する。図１３ａは、そのいくつかが種々の実施態様において任意である連結／ハイブリダイゼーション反応の種々の構成成分を説明する。図１３ｂは、プローブオリゴヌクレオチドの末端のミスマッチを識別する連結戦略を説明する。図１３ｃは、試料オリゴヌクレオチドの末端のミスマッチを識別する連結戦略を説明する。図１３ｄは、プローブ末端と試料末端の両方での識別を改良するための方法を説明する。
【図１３−３】図１３ａ、１３ｂ、１３ｃ及び１３ｄは、連結／ハイブリダイゼーション反応の種々の構成成分を説明し、種々の連結戦略を説明する。図１３ａは、そのいくつかが種々の実施態様において任意である連結／ハイブリダイゼーション反応の種々の構成成分を説明する。図１３ｂは、プローブオリゴヌクレオチドの末端のミスマッチを識別する連結戦略を説明する。図１３ｃは、試料オリゴヌクレオチドの末端のミスマッチを識別する連結戦略を説明する。図１３ｄは、プローブ末端と試料末端の両方での識別を改良するための方法を説明する。
【図１４−１】図１４ａ、１４ｂ、１４ｃ及び１４ｄは、試料核酸の制限消化と一緒に用いられる連結識別を説明する。図１４ａは、ＳａｃＩ（６カッター）及びＨｓｐ９２ＩＩ（４カッター）の認識部位及び切断パターンを示す。図１４ｂは、（標的）核酸試料に及ぼすＳａｃＩ切断の作用を説明する。図１４ｃは、ＳａｃＩ及びＳｐｈＩで消化され、５’Ｃを有する〜１ｋｂゲノム断片を生じる６Ｍｂゲノム（即ち大腸菌）を説明する。図１４ｄは、これらの断片の一般的差異スクリーニングチップとのハイブリダイゼーション／連結、並びに適切な核酸とハイブリダイズするためのプローブとしてのそれらのサブ配列の使用（フォーマットＩ）を、あるいは断片が標識され、オリゴヌクレオチドアレイとハイブリダイズ／連結され、そして直接分析される（フォーマットＩＩ）ことを説明する。
【図１４−２】図１４ａ、１４ｂ、１４ｃ及び１４ｄは、試料核酸の制限消化と一緒に用いられる連結識別を説明する。図１４ａは、ＳａｃＩ（６カッター）及びＨｓｐ９２ＩＩ（４カッター）の認識部位及び切断パターンを示す。図１４ｂは、（標的）核酸試料に及ぼすＳａｃＩ切断の作用を説明する。図１４ｃは、ＳａｃＩ及びＳｐｈＩで消化され、５’Ｃを有する〜１ｋｂゲノム断片を生じる６Ｍｂゲノム（即ち大腸菌）を説明する。図１４ｄは、これらの断片の一般的差異スクリーニングチップとのハイブリダイゼーション／連結、並びに適切な核酸とハイブリダイズするためのプローブとしてのそれらのサブ配列の使用（フォーマットＩ）を、あるいは断片が標識され、オリゴヌクレオチドアレイとハイブリダイズ／連結され、そして直接分析される（フォーマットＩＩ）ことを説明する。
【図１５−１】図１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ及び１５ｅは、一般的差異スクリーニングアレイ上の示差的表示ＤＮＡ断片の分析を説明する。図１５ａは、アンカー化ポリ（Ｔ）プライマーを用いたポリ（ａ）ｍＲＮＡの逆転写による一次鎖ｃＤＮＡ合成を示す。図１５ｂは、３’末端の工学処理制限部位及び縮重塩基（Ｎ−Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）を含有するＰＣＲ反応のための上流プライマーを説明する。図１５ｃは、一次ｃＤＮＡの無作為プライム化ＰＣＲを示す。図１５ｄはＰＣＲ産物の制限消化を示し、図１５ｅは、その５’末端による一般的連結アレイ上のＰＣＲ産物の分類を示す。
【図１５−２】図１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ及び１５ｅは、一般的差異スクリーニングアレイ上の示差的表示ＤＮＡ断片の分析を説明する。図１５ａは、アンカー化ポリ（Ｔ）プライマーを用いたポリ（ａ）ｍＲＮＡの逆転写による一次鎖ｃＤＮＡ合成を示す。図１５ｂは、３’末端の工学処理制限部位及び縮重塩基（Ｎ−Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）を含有するＰＣＲ反応のための上流プライマーを説明する。図１５ｃは、一次ｃＤＮＡの無作為プライム化ＰＣＲを示す。図１５ｄはＰＣＲ産物の制限消化を示し、図１５ｅは、その５’末端による一般的連結アレイ上のＰＣＲ産物の分類を示す。
【図１６−１】図１６ａ、１６ｂ及び１６ｃは、試料１及び試料２核酸に対する複製１及び複製２間の差を説明する。図１６ａは、正常細胞株である試料１に関する複製１及び複製２間の差を示す。図１６ｂは、試料２（腫瘍細胞株）に関する複製１及び複製２間の差を示す。図１６ｃは、２つの複製を平均した試料１及び２間の差をプロットする。
【図１６−２】図１６ａ、１６ｂ及び１６ｃは、試料１及び試料２核酸に対する複製１及び複製２間の差を説明する。図１６ａは、正常細胞株である試料１に関する複製１及び複製２間の差を示す。図１６ｂは、試料２（腫瘍細胞株）に関する複製１及び複製２間の差を示す。図１６ｃは、２つの複製を平均した試料１及び２間の差をプロットする。
【図１６−３】図１６ａ、１６ｂ及び１６ｃは、試料１及び試料２核酸に対する複製１及び複製２間の差を説明する。図１６ａは、正常細胞株である試料１に関する複製１及び複製２間の差を示す。図１６ｂは、試料２（腫瘍細胞株）に関する複製１及び複製２間の差を示す。図１６ｃは、２つの複製を平均した試料１及び２間の差をプロットする。
【図１７−１】図１７ａ、１７ｂ及び１７ｃは、濾過された図１６Ａ、１６ｂ及び１６ｃのデータを説明する。図１７ａは、各オリゴヌクレオチド対の差に関する試料１の複製１及び２のハイブリダイゼーション強度の相対変化を示す。図１７ｂは、図１７Ａと同様の方法で正規化し、濾過し、そしてプロットした各オリゴヌクレオチド対の差に関する試料２の複製１及び２の比を示す。図１７ｃは、各オリゴヌクレオチド対の差に関して２つの複製を平均した試料１及び試料２の比を示す。比率は図１７Ａと同様に算出するが、しかし図１６ｃの場合と同様に、正規化後の［（Ｘ２１ｋ１＋Ｘ２２ｋ２）／２］／［（Ｘ１１ｋ１＋Ｘ１２ｋ２）／２］及び［（Ｘ１１ｋ１＋Ｘ１２ｋ２）／２］／［（Ｘ２１ｋ１＋Ｘ２２ｋ２）／２］の絶対値を基礎にした。
【図１７−２】図１７ａ、１７ｂ及び１７ｃは、濾過された図１６Ａ、１６ｂ及び１６ｃのデータを説明する。図１７ａは、各オリゴヌクレオチド対の差に関する試料１の複製１及び２のハイブリダイゼーション強度の相対変化を示す。図１７ｂは、図１７Ａと同様の方法で正規化し、濾過し、そしてプロットした各オリゴヌクレオチド対の差に関する試料２の複製１及び２の比を示す。図１７ｃは、各オリゴヌクレオチド対の差に関して２つの複製を平均した試料１及び試料２の比を示す。比率は図１７Ａと同様に算出するが、しかし図１６ｃの場合と同様に、正規化後の［（Ｘ２１ｋ１＋Ｘ２２ｋ２）／２］／［（Ｘ１１ｋ１＋Ｘ１２ｋ２）／２］及び［（Ｘ１１ｋ１＋Ｘ１２ｋ２）／２］／［（Ｘ２１ｋ１＋Ｘ２２ｋ２）／２］の絶対値を基礎にした。
【図１７−３】図１７ａ、１７ｂ及び１７ｃは、濾過された図１６Ａ、１６ｂ及び１６ｃのデータを説明する。図１７ａは、各オリゴヌクレオチド対の差に関する試料１の複製１及び２のハイブリダイゼーション強度の相対変化を示す。図１７ｂは、図１７Ａと同様の方法で正規化し、濾過し、そしてプロットした各オリゴヌクレオチド対の差に関する試料２の複製１及び２の比を示す。図１７ｃは、各オリゴヌクレオチド対の差に関して２つの複製を平均した試料１及び試料２の比を示す。比率は図１７Ａと同様に算出するが、しかし図１６ｃの場合と同様に、正規化後の［（Ｘ２１ｋ１＋Ｘ２２ｋ２）／２］／［（Ｘ１１ｋ１＋Ｘ１２ｋ２）／２］及び［（Ｘ１１ｋ１＋Ｘ１２ｋ２）／２］／［（Ｘ２１ｋ１＋Ｘ２２ｋ２）／２］の絶対値を基礎にした。
【図１８】図１８は、ＣＩＡＰ処理を用いた断片化後標識を説明する。
【図１９】図１９は、高密度オリゴヌクレオチドアレイ上のハイブリダイゼーション後末端標識の略図を提示する。
【図２０】図２０は、ハイブリダイゼーション及び末端標識前に高密度アレイの予備反応を用いる末端標識の略図を提示する。
【図２１】図２１は、ハイブリダイゼーション後ＴｄＴアーゼ末端標識呼正確度の測定の結果を説明する。
【図２２】図２２は、高密度オリゴヌクレオチドアレイ上のオリゴｄＴ標識を説明する。
【図２３−１】図２３は、本明細書中に開示した方法に用いるのに適した種々の標識試薬を説明する。図２３ａは、種々の標識試薬を示す。図２３ｂは、さらに他の標識試薬を示す。図２３ｃは、非リボース又は非−２’−デオキシリボース含有標識を示す。図２３ｄは、糖修飾ヌクレオチド類似体標識２３ｄを示す。
【図２３−２】図２３は、本明細書中に開示した方法に用いるのに適した種々の標識試薬を説明する。図２３ａは、種々の標識試薬を示す。図２３ｂは、さらに他の標識試薬を示す。図２３ｃは、非リボース又は非−２’−デオキシリボース含有標識を示す。図２３ｄは、糖修飾ヌクレオチド類似体標識２３ｄを示す。
【図２３−３】図２３は、本明細書中に開示した方法に用いるのに適した種々の標識試薬を説明する。図２３ａは、種々の標識試薬を示す。図２３ｂは、さらに他の標識試薬を示す。図２３ｃは、非リボース又は非−２’−デオキシリボース含有標識を示す。図２３ｄは、糖修飾ヌクレオチド類似体標識２３ｄを示す。
【図２４】図２４は、１組の一般的ｎ−ｍｅｒタイルプローブを用いた標的ＤＮＡ分子の再シーケンシングを説明する。
【図２５】図２５は、４−ｍｅｒ一般的アレイ上に存在する４つのタイルアレイを説明する。
【図２６】図２６は、標的の第８位置での塩基呼出を説明する。
【図２７】図２７は、塩基得票表を説明する。
【図２８】図２８は、正確度スコア変換をＨＩＶデータに適用する効果を説明する。
【図２９】図２９は、強度比較による突然変異検出を説明する。
【図３０】図３０は、ＨＩＶゲノム中の突然変異のバブル形成検出を説明する。
【図３１】図３１は、誘導差異最近傍プローブスコアリングを説明する。
【図３２】図３２は、一般的連結ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ及び誘導差異分析を用いてＨＩＶ  ＰＣＲ標的（Ｂ）中に見出される突然変異を説明する。
【図３３】図３３は、参照標的と試料標的との間の比較を用いる突然変異検出を説明する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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