(57)【要約】【課題】hK２ポリペプチド変異体をコードする単離された核酸分子を提供する。【解決手段】本発明はプレ−プロ又はプロhK２ポリペプチド変異体をコードする単離された核酸分子であって、野生型hK２ポリペプチドと比べて少なくとも１個のアミノ酸置換を有し、そしてそのポリペプチド変異体が野生型hK２ポリペプチドよりも精製に対してより安定である、前記核酸分子を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレ−プロ又はプロhK２ポリペプチド変異体をコードする単離された核酸分子であって、野生型hK２ポリペプチドと比べて少なくとも１個のアミノ酸置換を有し、そしてこの置換がそのポリペプチド変異体を野生型成熟hK２ポリペプチドよりも精製に対してより安定なものにする、前記核酸分子。
【請求項２】
前記アミノ酸置換がhK２ポリペプチド変異体の成熟形態の中に存在する、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記アミノ酸置換がhK２ポリペプチド変異体の成熟形態の残基40と218 との間にあり、そしてここでこの置換が基質特異性ドメイン、触媒性トリアドドメイン、主鎖基質結合ドメイン又はオキシアニオンホールドメインを含んで成る残基にある、請求項２記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
SEQ ID NO : ３を有するプレ−プロhK２ポリペプチド変異体をコードする、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
SEQ ID NO : ５を有するプロhK２ポリペプチド変異体をコードする、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
183位のアスパラギン酸、 206位のグリシン、 217位のアラニン、 189位のセリン、96位のアスパラギン酸、41位のヒスチジン、 205位のセリン、 204位のトリプトファン、 187位のグリシン及び 188位のアスパラギン酸より成る群から選ばれるアミノ酸置換を有するhK２ポリペプチド変異体をコードする請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
SEQ ID NO : ４又はSEQ ID NO : ６を有する請求項６記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
183位のアスパラギン酸、 206位のグリシン、 217位のアラニン、 189位のセリン、96位のアスパラギン酸、41位のヒスチジン、 205位のセリン、 204位のトリプトファン、 187位のグリシン及び 188位のアスパラギン酸より成る群から選ばれるアミノ酸置換を有する成熟hK２ポリペプチド変異体をコードする単離された核酸分子。
【請求項９】
SEQ ID NO : １を有する成熟hK２ポリペプチド変異体をコードする請求項８記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
単離精製されたプレ−プロ又はプロhK２ポリペプチド変異体であって、野生型hK２ポリペプチドと比べて少なくとも１個のアミノ酸置換を有し、そしてこの置換がそのポリペプチド変異体を対応の野生型成熟hK２ポリペプチドよりも精製に対してより安定なものにする、前記ポリペプチド。
【請求項１１】
前記アミノ酸置換がhK２ポリペプチド変異体の成熟形態の中に存在する、請求項10記載の単離精製されたhK２ポリペプチド変異体。
【請求項１２】
前記アミノ酸置換がhK２ポリペプチド変異体の成熟形態の残基40と218 との間にあり、そしてここでこの置換が基質特異性ドメイン、触媒性トリアドドメイン、主鎖基質結合ドメイン又はオキシアニオンホールドメインを含んで成る残基にある、請求項11記載の単離精製されたhK２ポリペプチド変異体。
【請求項１３】
SEQ ID NO : ３又はSEQ ID NO : ５を有する請求項10記載の単離精製されたhK２ポリペプチド変異体。
【請求項１４】
183位のアスパラギン酸、 206位のグリシン、 217位のアラニン、 189位のセリン、96位のアスパラギン酸、41位のヒスチジン、 205位のセリン、 204位のトリプトファン、 187位のグリシン及び 188位のアスパラギン酸より成る群から選ばれるアミノ酸置換を有する請求項10記載の単離精製されたhK２ポリペプチド変異体。
【請求項１５】
183位のアスパラギン酸、 206位のグリシン、 217位のアラニン、 189位のセリン、96位のアスパラギン酸、41位のヒスチジン、 205位のセリン、 204位のトリプトファン、 187位のグリシン及び 188位のアスパラギン酸より成る群から選ばれるアミノ酸置換を有し、ここでこの置換はこのポリペプチド変異体を野生型成熟hK２ポリペプチドよりも精製に対して安定なものにする、単離精製された成熟hK２ポリペプチド変異体。
【請求項１６】
SEQ ID NO : １を有する請求項15記載の単離精製された成熟hK２ポリペプチド変異体。
【請求項１７】
請求項10又は15記載の単離されたhK２ポリペプチド変異体と薬理学的に許容される担体との組合せを含んで成る免疫原組成物又はワクチンであって、この免疫原組成物又はワクチンの動物への投与が前記hK２ポリペプチド変異体に対する抗体の産生を誘導する、前記組成物又はワクチン。
【請求項１８】
請求項10記載のhK２ポリペプチド変異体に特異的に結合し、そしてhK３には結合しない抗体。
【請求項１９】
hK２ポリペプチド変異体にも結合する、請求項18記載の抗体。
【請求項２０】
前記野生型hK２ポリペプチドのプレ−プロ又はプロ形態にも結合する、請求項18記載の抗体。
【請求項２１】
hK２ポリペプチド変異体の成熟形態には結合しない、請求項18記載の抗体。
【請求項２２】
請求項15記載のhK２ポリペプチド変異体に特異的に結合し、そしてhK３には結合しない抗体。
【請求項２３】
野生型hK２ポリペプチドの成熟形態にも結合する、請求項22記載の抗体。
【請求項２４】
hK２ポリペプチド変異体のプロ形態又は野生型hK２ポリペプチドのプロ形態には結合しない、請求項22記載の抗体。
【請求項２５】
hK２ポリペプチド変異体のプレ−プロ形態又は野生型hK２ポリペプチドのプレ−プロ形態には結合しない、請求項22記載の抗体。
【請求項２６】
モノクローナル抗体である請求項18又は22記載の抗体。
【請求項２７】
請求項18又は22記載の抗体を含んで成るポリクローナル抗体調製品。
【請求項２８】
請求項18又は22記載の抗体より本質的に成るモノクローナル抗体調製品。
【請求項２９】
請求項18又は22記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
【請求項３０】
キメラ発現ベクターであって、このベクターにより形質転換された宿主細胞により認識されるコントロール配列に作用可能式に連結された請求項１又は８記載の核酸分子を含んで成り、ここでこの宿主細胞は多細胞生物に由来する、前記ベクター。
【請求項３１】
hK２ポリペプチド変異体をコードする核酸分子を利用する方法であって、請求項１又は８記載の核酸分子を、キメラベクターであってこのベクターにより形質転換された宿主細胞により認識されるコントロール配列に作用可能式に連結された前記核酸分子を含んで成るキメラベクターにより形質転換された培養宿主細胞において発現させ、そして前記宿主細胞から前記hK２ポリペプチド変異体を回収することを含んで成り、ここでこの宿主細胞は多細胞生物に由来する、方法。
【請求項３２】
phK２を検出又は測定するための診断キットであって、独立に包装された：
（ａ）hK２のプロ形態には少なくとも結合し、そしてhK３には結合しない抗体を付加することのできる固相；及び
（ｂ）hK２のプロ形態に特異的に結合し、そしてhK３又はhK２には結合しない既知量の抗体、ここでこの抗体は検出可能式にラベルされているか、又は検出可能なラベルに結合するものである；
を含むパッケージングを含んで成る前記キット。
【請求項３３】
phK２を含むヒト生理学的流体サンプル中の phK２を検出又は測定するための方法であって：
（ａ）ヒト phK２に特異的に反応する一定量の精製抗体を用意する、ここでこの抗体はhK３又はhK２には有意に反応しない；
（ｂ）前記抗体を試験すべきサンプルと、この抗体の少なくとも一部と前記 phK２の一部との間で二重複合体の形成がされるのに十分な時間接触させる；そして
（ｃ）前記抗体と複合した phK２の存在又は量を検出又は測定する；
ことを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の背景
腺系カリクレインはセリンプロテアーゼのサブグループであって、特異的なポリペプチド前駆体のその生物活性形態に至る後翻訳プロセシングに関与するサブグループである。ヒトにおいて、このファミリーのうちの３つの構成員が同定され、そしてその特性の一部が特性決定されている（Clements, Endoc. Rev., 10, 343 (1989) ; Clements, Mol. Cell Endo., 99, 1 (1994) ; Jones らActa Endoc., 127, 481 (1992)) 。hKLK１遺伝子は組織カリクレインタンパク質hK１をコードし、hKLK２遺伝子は前立腺特異的腺系カリクレインタンパク質をコードし、そしてhKLK３遺伝子は前立腺特異的抗原タンパク質hK３(PSA) をコードする。mRNAのノーザンブロット分析はhK２及びPSA の双方がヒト前立腺において主として発現されることを示し、一方hK１の発現は膵臓、顎下腺、腎臓及びその他の非前立腺組織において見い出されている（Chapdelineら、FEBS Lett. 236, 205 (1988) ; YoungらBiochem. 31, 818 (1992））。
【０００２】
hKLK２とhKLK３とのエキソン間のヌクレオチド配列相同性は80％であり、一方hKLK２とhKLK１とのエキソン間のヌクレオチド配列相同性は65％である。PSA に対するhK２の推定アミノ酸配列相同性は78％であり、一方hK１に対するhK２の推定アミノ酸配列相同性は57％である。更に、hK２の推定アミノ酸配列は、hK２がトリプシン様プロテアーゼでありうることを示唆し、一方PSA はキモトリプシン様プロテアーゼである。
【０００３】
PSA レベルは前立腺癌腫の予後指標として幅広く利用されている。しかしながら、血清中のPSA の濃度は前立腺癌(pCa) 又は良性前立腺過形成(BPH) を有する患者において高揚しているため、PSA の高揚レベルの検出はこのような病気を区別できない。更に、PSA に対するhK２の高度の相同性はPSA のレベルを検出するのに現状利用されている抗体の特異性に対する疑問を投げかけている。循環するhK２のレベルがpCa 又はBPH と無関係なら、hK２の夾雑したPSA の調製品に対して、又はhK２に対する相同性をもつPSA の領域に対して生起させた抗体は偽陽性結果をもたらしうる。しかしながら、血清中のhK２のレベルの測定、及びpCa 又はBPH を有する患者におけるそのレベルの関係の解明は成し遂げられていない。
【０００４】
そこで、治療剤及び／又は診断剤として利用するためにhK２ポリペプチドを単離及び精製するための方法についてのニーズがある。
発明の概要
本発明は単離精製されたプレ−プロ又はプロhK２ポリペプチド変異体を提供する。「精製」なる語は以下に記載の手順を参照することにより理解される。本発明のプレ−プロ又はプロhK２ポリペプチド変異体は対応の野生型hK２ポリペプチドと比較して、少なくとも１個のアミノ酸置換を有する。更に、プレ−プロ又はプロhK２ポリペプチド変異体は対応の野生型hK２ポリペプチドよりも精製に対して安定である。本発明の好適な態様はSEQ ID NO : ３又はSEQ ID NO : ５を有する単離された均質hK２ポリペプチド変異体を含む。
【０００５】
hK２の三次元モデルはアミノ酸残基217 がこのタンパク質の基質特異性ドメインの一部であることを示す（Vinhinen, BBRC, 204, 1251 (1994) ; Bridon and Dowell, Urology, 45, 801 (1995））。この部位でのバリンのアラニンによる保存的置換は野生型hK２に免疫学的に類似するhK２の一層安定的な形態を生み出すであろうことは驚くべき、且つ予測できないことであった。更に、hK２の基質特異性又は触媒性ドメインを構成するその他の部位でのアミノ酸の置換もタンパク質の一層安定な形態をもたらしうる。タンパク質モデリングにより推論されるこのような部位はasp 183, gly 206, ala217(基質特異性ドメイン）；ser 189, asp 96, his 41(触媒性トリアド）；ser 205, trp 204 (主鎖基質結合性残基）；及びgly 187, asp 188 (オキシアニオンホール）である。
【０００６】
そこで、本発明の別の好適な態様は、単離精製されたプレ−プロ又はプロhK２ポリペプチド変異体であって、 183位のアスパラギン酸、 206位のグリシン、 217位のアラニン、 189位のセリン、96位のアスパラギン酸、41位のヒスチジン、 205位のセリン、 204位のトリプトファン、 187位のグリシン及び 188位のアスパラギン酸より成る群から選ばれるアミノ酸置換を有する変異体を含む。
【０００７】
更には、単離精製された成熟hK２ポリペプチド変異体であって、 183位のアスパラギン酸、 206位のグリシン、 217位のアラニン、 189位のセリン、96位のアスパラギン酸、41位のヒスチジン、 205位のセリン、 204位のトリプトファン、 187位のグリシン及び 188位のアスパラギン酸より成る群から選ばれるアミノ酸置換を有する変異体が提供される。
【０００８】
本発明は更にプレ−プロ又はプロhK２ポリペプチド変異体をコードする単離された核酸分子を提供する。このプレ−プロ又はプロhK２ポリペプチドは野生型プレ−プロ又はプロhK２ポリペプチドと比較して少なくとも１個のアミノ酸置換を有する。更に、本発明のプレ−プロ又はプロhK２ポリペプチド変異体は対応野生型hK２ポリペプチドよりも精製に対して一層安定である。本発明の別の態様は、アミノ酸置換が成熟形態のhK２ポリペプチド変異体のアミノ酸配列の中に存在しているプレ−プロ又はプロhK２ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む。本発明の好適な態様はSEQ ID NO: ４又はSEQ ID NO : ６を有する単離された核酸分子を含む。
【０００９】
本発明は更に、 183位のアスパラギン酸、 206位のグリシン、 217位のアラニン、 189位のセリン、96位のアスパラギン酸、41位のヒスチジン、 205位のセリン、 204位のトリプトファン、 187位のグリシン及び 188位のアスパラギン酸より成る群から選ばれるアミノ酸置換を有する成熟hK２ポリペプチド変異体をコードする単離された核酸分子を提供する。本発明の好適な態様はSEQ ID NO : １を有する成熟hK２ポリペプチド変異体をコードする単離された核酸分子である。
【００１０】
本発明の単離精製されたhK２ポリペプチドはヒト組織又は生理学的流体に由来するサンプル中のhK２の存在を検出するための診断アッセイにおける試薬として採用できうる。例えば、単離されたhK２は、1993年７月22日提出の米国特許出願第08/096,946号に記載の通り、検出可能ラベルに結合されてhK２についての競合イムノアッセイに採用されうる。
【００１１】
本発明の更なる別の態様は、薬理学的に許容される担体と組合さった本発明の単離精製されたプレ−プロ、プロ又は成熟hK２ポリペプチド変異体を含んで成る免疫原組成物又はワクチンである。この免疫原組成物又はワチクンの動物への投与はhK２ポリペプチド変異体に結合する抗体の産生を誘導する。
【００１２】
本発明は更に、本発明のプレ−プロ又はプロhK２ポリペプチド変異体に特異的に結合し、そしてhK３に結合しない抗体を提供する。本発明の好適な態様は本発明のプレ−プロ又はプロhK２ポリペプチド変異体に結合し、そして更にはhK２ポリペプチド変異体の成熟形態、野生型hK２ポリペプチドの成熟形態、又はその双方にも結合する抗体を提供する。本発明の別の好適な態様は本発明のプレ−プロ又はプロhK２ポリペプチドに結合し、そして更に野生型hK２ポリペプチドのプレ−プロ又はプロ形態にも結合する抗体を含む。本発明の更に好適な態様には本発明のプレ−プロ又はプロhK２ポリペプチド変異体に結合し、そしてhK２ポリペプチド変異体の成熟形態、野生型hK２ポリペプチドの成熟形態、又はこの変異体もしくは野生型hK２ポリペプチドの成熟形態には結合しない抗体を含む。
【００１３】
本発明の更なる別の態様は本発明の成熟hK２ポリペプチド変異体に特異的に結合し、そしてhK３に結合しない抗体である。本発明の好適な態様は本発明の成熟hK２ポリペプチド変異体に結合し、そして野生型hK２ポリペプチドの成熟形態にも結合する抗体を含む。本発明の別の好適な態様には本発明の成熟hK２ポリペプチド変異体に特異的に結合し、そしてhK２ポリペプチド変異体のプロ形態又は野生型hK２ポリペプチドのプロ形態には結合しない抗体を含む。本発明の更なる別の好適な態様は本発明の成熟hK２ポリペプチド変異体に特異的に結合し、そしてhK２ポリペプチドのプレ−プロ形態又は野生型hK２ポリペプチドのプレ−プロ形態に結合しない抗体を含む。
【００１４】
従って、本方法により製造されたhK２ポリペプチド、並びにその変異体及びサブユニットは、組織、例えば前立腺癌腫、細胞、例えば前立腺細胞系、又は流体、例えば精液もしくは血液に由来するサンプル中のhK２ポリペプチド（又は「タンパク質」）を検出及び定量するための直接又は競合アッセイを基礎として使用されうる。即ち、本発明はhK２ポリペプチドに特異的に結合するか、hK３には有意に結合しないモノクローナル又はポリクローナル抗体の集団を提供する。「有意」なる語は以下に記載の競合アッセイとの関連で定義する。これらの抗体は天然起源からそのhK２ポリペプチド結合性パートナーを精製するためのアフィニティークロマトグラフィーにおいて利用できうる。
【００１５】
更にはキメラ発現系を提供する。キメラ発現ベクターはこのベクターで形質転換された宿主細胞により認識されるコントロール配列に作用可能式に連結された本発明のプレ−プロ、プロ又は成熟hK２ポリペプチドをコードする核酸分子を含んで成る。
【００１６】
更に、hK２ポリペプチドをコードする核酸分子を利用する方法を提供する。この方法は、本発明のプレ−プロ、プロ又は成熟hK２ポリペプチド変異体をコードする核酸分子の培養宿主細胞の中での発現を含んで成る。この核酸分子は宿主細胞により認識されるコントロール配列に作用可能式に連結されている。次いでこのhK２ポリペプチド変異体を宿主細胞又は培養培地から回収する。
【００１７】
本発明の更なる別の態様は phK２を検出又は測定するための診断キットである。このキットは、別々に包装された（ａ）少なくともhK２のプロ形態に結合し、hK３には結合しない抗体の結合することのできる固体表層、及び（ｂ）hK２のプロ形態には特異的に結合するが、hK３又はhK２には結合しない既知量の抗体、を含むパッケージングを含んで成る。この抗体は検出可能式にラベルされているか、又は検出可能ラベルに結合する。
【００１８】
本発明の更なる態様は phK２を含むヒト生理学的流体のサンプル中の phK２を検出又は測定するための方法にする。この方法はヒト phK２と特異的に反応する所定量の精製抗体の用意を含んで成り、ここで前記抗体はhK３及びhK２には有意に反応せず、そしてここで前記抗体は固体表層に付加できるものである。これらの抗体を検査すべきサンプルと、前記抗体の少なくとも一部と前記 phK２の一部との二重複合体の形成を可能にするのに十分な時間接触させる。次いで前記抗体と複合した phK２の存在又は量を検出又は測定する。
【００１９】
hK２は分子モデリング研究と一般的に一致するトリプシン様活性を有する（Vinhinen前掲、1994 ; Bridon and Dosell前掲、1995）。hK２の酵素活性は選定のアルギニンに対して特異的であり、そしてトリプシンの基質特異性とは相違する。即ち、体液中のhK２を検出する活性系診断アッセイにおいて利用できうるhK２−特異的基質又はインヒビターを作製することが可能でありうる。
【００２０】
従って、本発明はhK２をin vitroで検出する方法も提供する。この方法は所定量のhK２ポリペプチドを所定量の合成ペプチド基質と、hK２ポリペプチドによるペプチド基質の切断を可能にするのに十分な時間接触させることを含んで成る。このペプチド基質は、hK２が結合する部位を形成する連続アミノ酸残基を含んで成る。ペプチド基質の切断の有無又は程度を次に検出又は測定する。
【００２１】
PSA はヒト血清中のACT 及びMGと共有結合複合体を形成する（Leinonenら、Clin. Chem., 34, 2098 (1993)）。血清中の様々な形態のPSA の割合のモニター（複合化、対、非複合体）はBPH とpCa との区別において有用である（Christenssonら、J. Urol., 150, 100 (1993））。
【００２２】
下記に示す結果はhK２ポリペプチドもACT 及びMGと複合体を形成することを示す。hK２とACT との複合体の形成は予測されず、その理由はACT が一般にキモトリプシン様プロテアーゼのインヒビターだからである。しかしながら、hK２はPSA とのコンホメーション的／構造的類似体を有することを示唆し、これはインヒビターとのその反応性を示唆する。ACT 及びMGに複合したhK２と遊離（未結合）hK２とは、ヒト血清中のhK２の主要免疫学的測定可能成分であると予測されるであろう。それ故、このような形態のモニターはpCa とBPH との区別において重要でありうる。
【００２３】
そこで、本発明の更なる態様は血漿タンパク質とのhK２複合体形成を検出する方法である。この方法は、サンプル中で、血漿タンパク質に結合しないhK２ポリペプチドを血漿タンパク質に結合するhK２ポリペプチドから分離することを含んで成る。次に、血漿タンパク質に結合しないhK２ポリペプチドの量と比較しての血漿タンパク質に結合したhK２ポリペプチドの量を決定する。
【００２４】
本発明の更なる別の態様は哺乳動物組織サンプル中のhK２を検出又は測定するための方法である。この方法は、hK２ポリペプチドに結合し、hK３に結合しない所定量の試薬を哺乳動物組織細胞のサンプルと混合してこの試薬及び細胞を含んで成る二重複合体を形成することを含んで成る。次いでサンプル中の複合体形成の有無又は程度を検出又は測定する。
【００２５】
更に、サンプルにおいて高度な前立腺上皮内新形成又は前立腺癌を検出又は測定するための方法を提供する。この方法は、hK２ポリペプチドには結合するがhK３には結合しない所定量の試薬を前立腺細胞のサンプルと混合してこの試薬及び細胞を含んで成る二重複合物を形成することを含んで成る。次に、サンプル中の複合体形成の有無又は程度を検出又は測定する。
【００２６】
また、哺乳動物組織細胞のサンプル中のhK２を検出するための診断キットを提供し、これは別々に（ａ）hK２ポリペプチドに結合しない既知量の第一試薬（ここでこの第一試薬は検出可能式にラベルされているか、又は検出可能ラベルに結合する）；及び（ｂ）hK２ポリペプチドに特異的に結合するが、hK３には結合しない既知量の第二試薬（ここでこの第二試薬は検出可能式にラベルされているか、又は検出可能ラベルに結合する）；を含むパッケージングを含んで成る。
【００２７】
本発明の更なる別の態様は哺乳動物組織細胞のサンプル中のhK２ポリペプチドを検出するための診断キットであり、これはhK２ポリペプチドに特異的に結合し、そしてhK３に結合しない既知量の試薬を含むパッケージングを含んで成り、ここでこの試薬は検出可能なラベルに検出可能式にラベルされているか、又は検出可能ラベルに結合している。
【００２８】
本発明は更に高度な前立腺上皮内新形成又は前立腺癌を検出するための診断キットも提供し、これはhK２ポリペプチドに特異的に結合し、そしてhK３に結合しない既知量の試薬を含むパッケージングを含んで成り、ここでこの試薬は検出可能式にラベルされているか、又は検出可能ラベルに結合する。
発明の詳細な説明
PSA に対するhK２の高度なアミノ酸配列同一性、並びにhK２及びPSA の双方の発現が本質的に前立腺に制約されるという事実は、双方のタンパク質の血清濃度の測定が前立腺癌(pCa）の診断及びモニターにおいて有用でありうることを示唆する。最近、pphK２が細菌において発現されている(Saediら、Mol. Cell. Endoc., 109, 237(1995)）。細菌由来のpphK２はhK２上の非コンホメーション依存性エピトープに対する抗体を作製するのに利用できうる。しかしながら、hK２の生合成に関与する工程を見きわめるため、及びhK２の完全にプロセシングされ、且つ分泌された形態に対して特異的な抗体を得るためには、哺乳動物細胞におけるhK２の発現が必須である。
【００２９】
本明細書において用いる語「hK２ポリペプチド」には組換プレ−プロ、プロ及び成熟hK２ポリペプチドが含まれる。成熟hK２ポリペプチドは、図１に示すアミノ酸配列を有し、そしてポリペプチド「変異体」はhK３と実質的に相同性な領域において、即ち、図１に示すバーで表示されるものでない領域においてSEQ ID NO : 12と90％以上の相同性を共有する。かかるhK２ポリペプチドは図１の成熟hK２分子と、そのポリペプチドがhK３（又はhK１）とは交差反応しないがそのポリペプチドに対して特異的に結合する抗体によっても規定されるという点で共通する抗原性機能をもつ。好ましくは、前記抗体は図１の成熟hK２分子上にも存在する抗原性部位又はエピトープと反応する。共通の抗原性機能を規定するのに有用な抗体は米国出願番号第08/096,946号に詳細され、即ち、hK２サブユニット41〜56に対してin vivo で調製したポリクローナル抗血清である。
【００３０】
「単離されたhK２核酸」は、生物学的に活性なhK２ポリペプチド又はそのフラグメント変異体をコードする、即ち、天然hK２ポリペプチドRNA もしくはDNA の非コード鎖に対して相補性である、又は前記RNA もしくはDNA とハイブリダイゼーションし、且つストリンジェンシー条件下で安定的に結合している15個より多くの、好ましくは20個以上の連続ヌクレオチド塩基を含むRNA 又はDNA である。即ち、RNA 又はDNA は、核酸の天然起源にそれが通常結合している一種以上の夾雑核酸を含まず、そして好ましくは任意のその他の哺乳動物RNA 又はDNA を実質的に含まない点で、単離されたものである。「それが通常結合している一種以上の夾雑起源核酸を含まず」とは、核酸が起源又は天然細胞の中に再導入されたが、異なる染色体位置にある場合、又はそうでなければ起源細胞においては通常見い出されない核酸配列が隣接している場合を含む。単離されたhK２核酸の例は、上記の図１のhK２ペプチドのhK３−相同性領域と90％以上の配列同一性を共有する生物学的に活性なhK２ポリペプチドをコードするRNA 又はDNA である。hK２ポリペプチドに関して用いる「単離精製された」なる語は下記の方法論との関連で定義する。
【００３１】
本明細書で用いる語「組換核酸」、即ち「組換DNA 」とは、in vitroでその後化学的に改変され、次いで標的宿主細胞、例えば動物、植物、昆虫、酵母、菌類又は細菌起源に由来する細胞に導入されうる任意の適当な組織起源に由来する又は単離された核酸、即ちDNA に関する。起源に「由来」する組換DNA の例はhK２又はそのフラグメントもしくは変異体をコードし、そして本質的に純粋な形態で化学合成される有用なフラグメントとして同定されるDNA 配列であろう。起源から「単離」されたかかるDNA の例は化学的手段により、例えば制限エンドヌクレアーゼの利用により前記起源から切除又は除去され、これによって遺伝子工学方法論により本発明における利用のために更に操作、例えば増幅されうるようになる有用なDNA配列であろう。
【００３２】
従って、「組換DNA 」には完全合成DNA 配列、半合成DNA 配列、生物起源から単離したDNA 配列、及び導入RNA に由来するDNA 配列、並びにそれらの混合物が含まれる。一般に、組換DNA 配列はDNAの受容体である宿主標的細胞のゲノムの中に本来存在していないか、又はそのゲノムの中に存在しているが、発現しないかもしくは高度に発現しないものである。
【００３３】
本明細書で用いる「キメラ」とは、ベクターが、２種以上の種に由来するDNA を含んで成るか、又は「天然」もしくは野生種では認められない態様で連結又は会合した同種由来のDNA を含んで成ることを意味する。
【００３４】
本発明における形質転換のために用いる組換DNA 配列は環式又は線形の二本鎖又は一本鎖であってよい。一般に、DNA 配列は結果としての細胞系の中に存在する組換DNA の発現を促進するコントロール配列が隣接するコード領域を含みうるキメラDNA 、例えばプラスミドDNA の形態にある。例えば、この組換DNA はそれ自体哺乳動物細胞の中で活性であるプロモーターを含んで成りうるか、又は形質転換標的であるゲノムの中に既に存在しているプロモーターを利用しうる。かかるプロモーターはCMV プロモーター、並びにSV40後期プロモーター及びレトロウィルスLTR(長期反復因子）を含む。hK２のための転写ユニットを担う組換DNA 配列又はその一部とは別に組換DNA の一部は未転写であってよく、調節又は構成的機能を担う。
【００３５】
「コントロール配列」は特定の宿主生物において作用可能式に連結されたコード配列の発現にとって必要なDNA 配列を意味する。原核細胞にとって適当なコントロール配列は、例えばプロモーターを含み、そして任意的にオペレーター配列、更にはリボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することで知られる。
【００３６】
「作用可能式に連結」とは、核酸が他の核酸配列と機能的な関係において配置されていることを意味するものと定義する。例えば、プレ配列又は分泌性リーダーのためのDNA は、ポリペプチドのためのDNA に、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるように、作用可能式に連結されている；プロモーター又はエンハンサーは配列の転写に影響を及ぼすようにコード配列に作用可能式に連結されている；又はリボソーム結合部位は翻訳を助長するように配置されたコード配列に作用可能式に連結されている。一般に、「作用可能式に連結」とは、DNA 配列がつらなっており、そして分泌リーダーの場合、連続し、且つ解読相となっていることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続性を有さない。連結は慣用の制限部位でのライゲーションにより成し遂げられる。かかる部位がないなら、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーは慣習に従って利用される。
【００３７】
hK２又はその一部のための転写ユニットを担う組換DNA 配列とは別に、組換DNA の一部は非転写であってよく、調節又は構成的機能を担う。
【００３８】
細胞の中に導入する組換DNA は更に一般に選択マーカー遺伝子もしくはリポーター遺伝子又はその双方を、形質転換しようとするつもりの細胞集団から形質転換細胞を同定及び選定することを促進するために含むであろう。他方、この選択マーカーは独立のDNA 断片上に担持されているか、又は共形質転換手順において利用できうる。選択マーカー及びリポーター遺伝子の双方には宿主細胞の中での発現を可能にする適当な調節配列が隣接しうる。有用な選択マーカーは当業界に周知であり、そして例えば抗生物質及び除草剤耐性遺伝子、例えばneo, hpt, dhfr, bar, aroA, dapA 等が含まれる。
【００３９】
リポーター遺伝子は潜在的に形質転換された細胞を同定するため及び調節配列の機能を評価するために利用される。容易にアッセイ可能なタンパク質をコードするリポーター遺伝子は当業界において公知である。一般に、リポーター遺伝子は受容生物又は組織には存在しない又は発現されないが、発現が多少容易に検出可能な特性、例えば酵素活性により評価されるタンパク質をコードする遺伝子である。好適な遺伝子にはＥ．コリ（E. coli)のTn９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(cat) 、Ｅ．コリのuidA座のベーターグルクロニダーゼ遺伝子(gus) 、及びほたるフォチヌス・ピラリス（Photinus pyralis) 由来のルシフェラーゼ遺伝子が含まれる。リポーター遺伝子の発現は、DNA を受容細胞に導入してから適当な時間経過後にアッセイする。
【００４０】
宿主細胞において機能的なその他の要素、例えばイントロン、エンハンサー、ポリアデニル化配列等も組換DNA の一部でありうる。かかる要素はDNA の機能にとって必須の場合又はそうでない場合があるが、転写、mRNAの安定性等に影響を及ぼすことによりDNA の向上した発現を供しうる。かかる要素は細胞内へのDNA の形質転換の最適な実施を獲得するように所望通りにDNA の中に含ませてよい。
【００４１】
標的細胞を形質転換しうる組換DNA を構築するための一般的な方法は当業者に周知であり、そして同一の組成物及び構築方法がここで有用なDNA を作製するのに利用されうる。例えば、J. Sambrookら、Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Gold Spring Harbor Laboratory Press (第２版、1989）は適当な構築方法を提供する。
【００４２】
組換DNA は、例えばC. Chen ら、Mol. Cell. Biol., ７，2745 (1987) の改良リン酸カルシウム沈殿手順により、hK２をコードするcDNAを含んで成る発現ベクターによるトランスフェクションにより標的細胞の中に容易に導入し得る。トランスフェクションは例えばBRL により供与される市販のキットを利用し、リポリフェクチンによっても成し遂げられうる。
【００４３】
hK２ポリペプチドの発現のために適当な宿主細胞は多細胞生物に由来する。かかる宿主細胞は複雑なプロセシング及びグリコシル化活性の発揮が可能である。原理的には、脊椎培養物又は無脊椎培養物に関係なく、あらゆる高等真核細胞培養物が本発明の実施において採用できうる。無脊椎細胞の例には植物及び昆虫細胞が含まれる。宿主、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda)（幼虫）、エデス・エジプチ（Aedes aegypti)（蚊）、エデス・アルボピクトゥス（蚊）、ドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster)（ミバエ）及びボンビクス・モリ（Bombyx mori)由来の数多くのバキュロウィルス株及び変異体並びに対応の許容の昆虫細胞が同定されている。例えばLuckowらBio/Technology，６，47 (1989) ; MillerらGenetic Engineering, J. K. Setlow ら編第８巻（Plenum Publishing, 1986)頁 277-279；及びMaeda らNature, 315, 592 (1985) を参照のこと。トランスフェクション用の様々なウィルス株例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Autograha californica) NPV及びボンビクス・モリNPV のBm−５のＬ−１変異体が公共的に入手でき、そしてかかるウィルスは好ましくはスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために利用されうる。
【００４４】
制限消化に由来するDNA の所定のフラグメントの回収又は単離はポリアクリルアミド又はアガロースゲル上での電気泳動による消化物の単離、既知の分子量のDNA フラグメントマーカーのそれに対するその泳動度の対応による注目のフラグメントの同定、所望のフラグメントを含むゲル区画の取り出し、及びDNA からゲル分離を利用しうる。例えば、Lawnら、Nucleic Acids Res., ９，6103（1981)及びGoeddel らNucleic Acids Res., ８，4057（1980) を参照のこと。
【００４５】
「サザン分析」又は「サザンブロット」は、それによりDNA 又はDNA 含有組成物の制限エンドヌクレアーゼ消化物中のDNA 配列の存在が既知のラベル化オリゴヌクレオチド又はDNA フラグメントへのハイブリダイゼーションにより確証する方法である。サザン分析は一般にアガロースゲル上でのDNA 消化物の電気泳動分離、電気泳動分離後のDNA の変性、及びSambrookら前掲の第9.37−9.52章に記載の放射性ラベル、ビオチニル化又は酵素ラベルプローブによる分析のためのニトロセルロース、ナイロン、又はその他の適当な膜支持体へのDNA の転写を包括する。
【００４６】
「ノーザン分析」又は「ノーザンブロット」は、既知のプローブ、例えばオリゴヌクレオチド、DNA フラグメント、cDNAもしくはそのフラグメント、又はRNA フラグメントにハイブリダイズするRNA配列を同定するために利用する方法である。このプローブは放射性アイソトープ、例えば32Ｐにより、ビオチニル化により、又は酵素によりラベルしておく。分析すべきRNA は通常アガロース又はポリアクリルアミドゲル上で電気泳動式に分離し、ニトロセルロース、ナイロン又はその他の適当な膜に転写し、そしてSambrookら前掲の第7.39−7.52章に記載の如き当業界周知の標準技術の利用してプローブとハイブリダイズさせることができる。
【００４７】
「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「PCR 」は核酸、RNA 及び／又はDNA の所定のフラグメントの量を米国特許第 4,683,195号に記載の通りにして増幅させる手順又は技術を意味する。一般に、注目の領域の末端又はそれを含む配列情報をオリゴヌクレオチドプライマーをデザインするために利用する。これらのプライマーは増幅する鋳型の対立鎖と同一又は類似の配列であろう。PCR は特異的なRNA 配列、全ゲノムDNA 由来の特異的なDNA 配列、及び全細胞RNA 、バクテリオファージ又はプラスミド配列から転写したcDNA等を増幅するために利用できうる。一般的にはMullisら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51, 263 (1987) ; Erlich編PCR Technology (Stockton Press, NY, 1989) を参照のこと。
【００４８】
「ストリンジェンシー条件」とは、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温を利用する条件、例えば 0.015ＭのNaCl／0.0015Ｍのクエン酸ナトリウム(SSC) ;  0.1％のラウリル硫酸ナトリウム(SDS) を50℃で利用する条件、又は（２）ハイブリダイゼーション中でホルムアミドの如き変性剤を利用する条件、例えば50％のホルムアミドと 0.1％の牛血清アルブミン／ 0.1％のフィコール／ 0.1％のポリビニルピロリドン／50mMのリン酸ナトリウムバッファーpH6.5と 750mMのNaCl，75mMクエン酸ナトリウムを42℃で利用する条件をいう。別の例は、50％のホルムアルデヒド、５×のSSC(0.75ＭのNaCl， 0.075Ｍのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH6.8)、 0.1％のピロリン酸ナトリウム、５×のデンハーツ溶液、音波処理サケ精子DNA(50μｇ／ml）、 0.1％のSDS 、及び10％の硫酸デキストランを42℃で使用し、 0.2×のSSC 及び 0.1％のSDSAで42℃で洗浄する。
【００４９】
hK２ポリペプチドをヒト起源、以外の組換細胞において発現するとき、hK２ポリペプチドはヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを全く含まない。しかしながら、hK２ポリペプチドとして実質的に均質な調製品を得るため、組換細胞タンパク質又はポリペプチドからhK２ポリペプチドを精製する必要がある。例えば、培養培地又はリゼートを遠心分離して粒状細胞塊を除去してよい。次いで膜及び溶解性タンパク質画分を分離する。次にhK２ポリペプチドを可溶性タンパク質画分から、そして必要なら、培養リガートの膜画分から分離する。次いでhK２ポリペプチドは夾雑可溶性タンパク質及びポリペプチドから、イムノアフィニティー又はイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相HPLC；シリカ又はアニオン交換樹脂、例えばDEAEでのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング； SDS−PAGE；硫酸アンモニウム沈殿； Sephadex Ｇ−75を利用するゲル濾過；リガンドアフィニティークロマトグラフィーにより精製されうる。
【００５０】
結果としての遺伝子導入宿主細胞から単離できたなら、hK２ポリペプチドの誘導体及び変異体は容易に調製できる。例えば、本発明のhK２ポリペプチドのアミドは当業界周知の技術により、カルボン酸基又は前駆体をアミドに変換させることによっても調製し得る。Ｃ末端カルボキシル基でのアミド形成のために好適な方法はポリペプチドに固相支持体から適当なアミンにより切断すること、又はアルコールの存在下で切断してエステルにし、次いで所望のアミンでアミノ分解することである。
【００５１】
hK２ポリペプチドのカルボキシル基の塩はペプチドを１又は数当量の所望の塩基、例えば水酸化金属系塩基、例えば水酸化ナトリウム；炭酸もしくは炭酸水素金属塩基、例えば炭酸ナトリウムもしくは炭酸水素ナトリウム；又はアミン塩基、例えばトリエチルアミン、トリエタノールアミン等との接触により通常の方式で調製し得る。
【００５２】
当該ポリペプチドのアミノ基のＮ−アシル誘導体は最終縮合のためにＮ−アシル保護化アミノ酸を利用することにより、又は保護もしくは未保護ペプチドのアシル化により調製し得る。Ｏ−アシル誘導体は例えば遊離ヒドロキシペプチド又はペプチド樹脂のアシル化により調製し得る。いづれのアシル化も標準のアシル化試薬、例えばアシルハライド、無水物、アシルイミダゾール等を利用することで実施し得る。Ｎ−及びＯ−アシル化は共に、所望するなら一緒に実施してよい。更に、図１の内部hK２アミノ酸配列は特定の位置のための１又は２個の保存性アミノ酸置換、例えばＬ形態でなくＤ形態を利用する置換により修飾し得る。本発明は更にhK２ポリペプチドの変異体又は修飾形態にも向けられる。抗原性機能が保持されている限り、このポリペプチドの一又は複数個の残基が保持されている。保存性アミノ酸置換、例えば酸性アミノ酸としてのアスパラギン酸−グルタミン酸；塩基性アミノ酸としてのリジン／アルギニン／ヒスチジン；疎水性アミノ酸としてのロイシン／イソロイシン、メチオニン／バリン、アラニン／バリン；親水性アミノ酸としてのセリン／グリシン／アラニン／トレオニンが好ましい。
【００５３】
ポリペプチドの酸付加塩はポリペプチドを１又は数当量の所望の無機又は有機酸、例えば塩酸と接触させることにより調製し得る。ポリペプチドのカルボキシル基のエステルは当業界公知の任意の通常の方法によっても調製し得る。
【００５４】
単離できたら、hK２ポリペプチド及びその抗原的に活性な変異体、その誘導体及びフラグメントを米国出願第08/096,946号に詳細に開示の通りにして、hK２又は抗hK２抗体を含むと予測される生物材料に由来するサンプルにおいてhK２についてのアッセイに利用できうる。例えば、このhK２ポリペプチドは検出可能ラベルにより、例えば１又は数種の放射性ラベル化ペプチド残基によりラベルでき、そして抗−hK２抗体に対する結合に関して内性hK２と競合するように、即ち、生理学的流体サンプル中の抗−hK２抗体に結合する「捕促抗原」として、固定化可能な抗−hK２抗体を利用するhK２についての様々な競合イムノアッセイ方式を介して、利用できうる。それは下記の通りに実施される：
（ａ）固体表層に付加できる一定量の抗−hK２抗体を用意する；
（ｂ）hK２を含んで成る生理学的流体サンプルを検出可能なラベルを含んで成る既知量のhK２ポリペプチドと混合し、混合サンプルを作る；
（ｃ）前記抗体を前記混合サンプルと、前記抗体と前記hK２との間で抗体−hK２複合体が形成し、且つ前記抗体と前記ラベル化ポリペプチドとの間で抗体−ラベル化ポリペプチド複合体が形成されるよう、免疫学的反応が起きるのに十分な時間接触させる；
（ｄ）hK２に結合した抗体及びラベル化ポリペプチドに結合した抗体を前記混合サンプルから分離させる；
（ｅ）前記固体表層上の抗体に結合した又は前記複合サンプルの中に残っているラベル化ポリペプチドのいづれかの存在又は量を検出又は測定する；そして
（ｆ）工程（ｅ）における結果から、前記サンプル中の前記hK２の存在又は量を決定する。
【００５５】
競合阻害イムノアッセイによりサンプル中の内性hK２を検出できる別の方式においては、既知量の抗−hK２抗体を未知量の内性hK２を含むサンプルに加える。この既知量は、存在すると予測されるhK２の全てが複合するのに必要な量、例えば前立腺癌であることのわかっている患者から獲得した同量の生理学的流体サンプルの中に存在しているであろう量よりも少なくなるように選定する。次に、検出可能ラベルを含んで成る既知量の本発明のhK２ポリペプチド又はそのサブユニットを加える。内性hK２がサンプルの中に存在しているなら、少ない量の抗体がラベル化hK２ポリペプチドに結合し、そしてそれは溶液の中で遊離し続けるであろう。もし内性hK２がないなら、添加したラベル化ポリペプチドは添加した抗−hK２抗体と複合し、二重複合体を形成するであろう。次に、二重抗体−抗原複合体を抗哺乳動物IgG 抗体（ヒツジ、ヤギ、マウス等）により沈殿させる。沈殿物（ターナリー複合体）の中の放射能又はその他のラベルの量はサンプルの中に存在している内性hK２の量に反比例する。例えば、少ない量の放射能を含むペレットは内性hK２の存在の指標となる。
【００５６】
実験室及び家畜においてポリクローナル抗体又は抗血清を調製するための慣用の技術の他に、公知のハイブリドーマ細胞培養技術を利用してhK２ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を調製できる。一般に、この方法は例えばミエローマ細胞の適合性連続系と融合した一次脾臓細胞の抗体産生融合細胞系を調製し、そしてこの融合細胞をマス培養又はミエローマ細胞系の由来するもしくは適合する動物種の中で増殖させることを含む。かかる抗体は動物の接種により産生されるもの比べて数多くの利点を供し、なぜならこれらは高特異性且つ高感度であり、そして免疫学的に比較的「純粋」だからである。当該抗体の免疫学的に活性なフラグメント、例えばｆ（ab）フラグメントも、部分ヒト化モノクローナル抗体として本発明の範囲に属する。
【００５７】
本発明を以下の詳細な実施例を参考に更に説明する。
実施例１
材料及び方法
哺乳動物hK２発現ベクターの構築
図２に示す全プレプロ−hK２（pphK２）をコードするcDNA（長さ約820bp)（pphK２転写体の開始部位に対し、ヌクレオチド＃40〜＃858)を、hK２特異性オリゴヌクレオチドプライマーの対
（5'ACGCGGATCCAGCATGTGGGACCTGGTTCTCT3'SEQ ID NO : ８及び
5'ACAGCTGCAGTTTACTAGAGGTAGGGGTGGGAC3' SEQ ID NO : ９）
による逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR)を利用してヒトBPH組織のRNA から合成した。このcDNAは５’及び３’末端（pphK２センス配列に対し）がBamHＩ及び PstＩ配列のそれぞれで包囲されるように作製した。次にこのcDNAをアガロースゲル電気泳動により精製し、そしてBamHＩ及び PstＩ制限酵素で消化した。制限処理したcDNAをBamHＩ− PstＩ消化pVL1393 プラスミドベクターとライゲーションし、そしてＥ．コリHB101 株に形質転換した。pphK２cDNA／pVL1393 プラスミドベクターを有するＥ．コリを選定した。pphK２含有インサートを配列決定した。プラスミドpphK２cDNA／pVL1393をＥ．コリの中で大量生産し、そしてCsCl勾配超遠心分離により精製した。
【００５８】
Ｅ．コリ HB101におけるプラスミドpphK２／pVL1393 はブダペスト条約の規則のもとで1994年５月２日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Rockville, MD, USAに寄託しており、そしてATCC 69614の寄託番号が付与されている。
【００５９】
全pphK２コード配列を示す 0.8kbのフラグメント（図２）を次のプライマー
Ａ（5'ATATGGATCCATATGTCAGCATGTGGGACCTGGTTCTCTCCA3') （SEQ ID NO : 10）及び
Ｂ（5'ATATGGATCCTCAGGGGTTGGCTGCGATGGT3')（SEQ ID NO : 11）
並びにpphK２含有プラスミドpVL1393 (Dr. Young, Mayo Clinic より贈程）を鋳型として用いるPCR により作製した。PCR 生成物をTA−クローニングベクター（Invitrogen Corp., San Diego, CA)に挿入し、そして全インサートのDNA を配列決定した。
【００６０】
哺乳動物hK２発現ベクターを得るため、hK２含有インサートを対応のTAクローンから単離し、そしてプラスミド pGT−ｄ（Bergら、Nucl. Acids Res., 20，54-85 (1992)）（Dr. Brian Grinnell, Lilly から贈程）の BclＩ部位にGBMTプロモーターのコントロール下で挿入した。哺乳動物発現ベクターPLNS−hK２及びPLNC−hK２をプラスミドpLNSX 及びpLNCX (Milerら、 Biotech. ９，980 (1989)）のそれぞれに、対応のTAベクター由来の 0.8kbの野生型hK２インサートをクローニングすることにより得た。全哺乳動物発現ベクター中のインサートの方向をDNA 配列決定により確認した。
組換クローンの作製
AV12−664(ATCC CRL−9595) 、シリアンハムスターにおけるアデノウィルス誘導腫瘍に由来する細胞系及びDU145 細胞を10％の胎児血清（D10F) の添加したダルベッコ改良イーグル培地（高グルコース）の中で培養した。PC３細胞を10％の胎児牛血清を含む最少イーグル培地の中で培養した。AV12細胞をリン酸カルシウム法（Maniatisら前掲（1989））を利用し、hK２発現ベクターでトランスフェクションした。３日後、トランスフェクション細胞をD10F＋200nM のメトトレキセート(MTX) の中に懸濁した。薬剤耐性クローン細胞を２〜３週間後に単離し、そしてその使用培地をウェスタンブロットにより分析した。PC３及びDU145 細胞をリポフェクタミン(Gibco−BRL, Gaithersburg, MD)を用いるhK２哺乳類発現ベクターによりトランスフェクションし、そしてクローン（PC３−hK２及び DU145−hK２）を 400μｇ／mlのG418を含む培地で選別した。
タンパク質の精製及び配列決定
AV12−hK２クローンをD10F＋200nM のMTX の中で増殖させた。約60％の集密度において、細胞をハンクバランス塩溶液で洗い、そして無血清HH４培地に再懸濁した。無血清培地を添加して７日後に消費培地を回収し、そして−20℃で保存した。タンパク質を精製するため、無血清消費培地を濃縮し、そして50mMの炭酸水素ナトリウムpH８と交換した。サンプルを 0.2μのフィルターで濾過し、そしてTSK DEAE−５PW HPLC カラム21mm×150mm に５ml／分の流速で直接汲み入れた。バッファーＡは50mMの炭酸水素ナトリウム pH7.9を含み、そしてバッファーＢは50mMの炭酸水素ナトリウムと 0.5ＭのNaCl pH7.6を含んだ。溶出プロフィールは35分にわたる０〜50％のバッファーＢの勾配；35〜40分にわたる50〜100 ％のバッファーＢの勾配；及び５分間の 100％のＢでのインクラチック溶出、それに次ぐバッファーＡでの再平衡化により展開させた。流速は全体を通じて５ml／分とした。上記手順において、硼酸バッファーが有意差を伴うことなく炭酸水素バッファーを代用しうる。
【００６１】
DEAE画分を、ウサギ抗−pphK２を利用する乾燥ELISA 法（下記参照）によりhK２の存在についてアッセイした(Saediら、Mol. Cell. Endoc., 109, 237 (1995)) 。hK２活性をもつ画分をプールし、そして膜（10kDのカットオフ値）による限外濾過により約５〜８mlまで濃縮した。次いで固形硫酸アンモニウムを 1.2Ｍの最終濃度にまで加えた。次いでこのサンプルをポリLC、ポリプロピルアスパルトアミドカラム1000Å孔径、 4.6mm×200mm に注入し、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC) によりタンパク質を分解した。バッファーＡは20mMのリン酸 Na, 1.2Ｍの硫酸Na pH6.3とし、そしてバッファーＢは50mMのリン酸Na，５％の２−プロパノール、pH7.4 とした。溶出勾配は５分にわたる０〜20％のＢ；５〜20分にわたる20〜55％のＢ；20〜23分の55％Ｂ，23〜25分の55〜100 ％のＢのイソクラチック；２分の 100％のＢのイソクラチック、次いでバッファーＡでの再平衡化とした。流速は１ml／分とした。約50％Ｂで溶出したhK２を含むHIC ピークを Centricon-10(Amicon) 10Ｋ MW カットオフ限外濾過による反復濃縮により50mMの硼酸バッファーpH８に交換した。純度を SDS−PAGE及びウェスタンブロット分析の双方により評価した。hK２v217濃度を評価するのに用いた励起係数は1.84＝１mg／mlのＡ280 とした。
【００６２】
あるケースにおいては、hK２を含むHIC ピークを10／30  Pharmacia Ｓ12カラムでサイズ排除クロマトグラフィー(SEC) により更に精製した。この場合、hK２を含むHIC ピークを上記のようにして限外濾過により１ml未満に濃縮し、次いで 100mMの酢酸アンモニウムpH７又は硼酸ナトリウムpH８で平衡にしたサイズ排除カラムに載せた。流速は 0.7ml／分とした。次いでhK２ピークを限界濾過により濃縮した。酢酸アンモニウム中のSEC 回収ピークを凍結乾燥してバッファーを除き、次いで水の中で再構成させた。このサンプルアリコートを気性６ＮのHCl において真空下で20時間 112℃で加水分解し、次いで 0.1ＮのHCl の中で再構成し、そしてHewlett PackardAminoquantアミノ酸分析器で第一アミンについてはOPA により、そして第二アミンについてはFMOCによるアミノ酸のプレ−カラム誘導化を利用して分析した。
【００６３】
hK２をアフィニティークロマトグラフィーにより精製するためにHK1G586.1 アフィニティー樹脂を使用した。HK1G586.1 モノクローナル抗体(mAb) をPharmacia GammaBind plus Sepharose (cat No.17−0886) に、Schneider (J. Biol. Che., 257, 10766 (1982））に従ってカップリングさせた。簡単に述べると、HK1G586.1 mAb 及び樹脂を回転させながら４℃で一夜インキュベーションした。樹脂を遠心分離し(500×ｇで５分、４℃）、そして 0.2ＭのトリエタノールアミンpH8.2 で２回洗った。アミン基を新鮮な架橋溶液(0.2ＭのトリエタノールアミンpH8.2 中の25mMのジメチルピメリミデート二塩酸塩）の中で45分室温（22℃）で架橋させた。この樹脂を20mMのエタノールアミンpH8.2 で室温で５分クエンチングし、次いで１Ｍの NaCl, 0.1ＭのPO4, pH7.0で２回洗った。樹脂をPBS で更に２回洗い、そして使用するまで0.05％のNaN3で４℃で保存した。
【００６４】
Applied Biosystems Model 477ａパルス液相シーケンサーをタンパク質及びペプチドを配列決定するために用いた。モデル 477ａはＮ末端から順次アミノ酸を遊離する自動式エドマン分解化学、それに次ぐPTH 誘導化及び逆相HPLCによるクロマトグラフィーを利用する。ペプチドサンプルをシーケンサーにバイオブレン処理ガラスファイバーフィルター支持体上に載せ、そして全タンパク質はバイオブレン処理フィルター又は予備活性化Portonフィルター（Beckman, Fullerton, CA) のいづれかに載せた。サンプルをブロット順にまずNovex システム（Novex, San Diego, CA) 上でミニ−ゲルとして泳動させ、次いでProblot PVDF膜に移し、クマジーブルーで目視化させ、適当なバンドを切り出し、そしてPVDF膜から直接配列決定した。
モノクローナル抗体の製造
Ａ／Ｊマウスに、１日目に完全フロインドアジュバント(CFA) 中の50μｌの phK２を腹腔内注射し、14日目に不完全フロインドアジュバント(IFA) 中の25μｇの phK２を腹腔内注射し、そして28日目にPBS 中の25μｇの phK２を腹腔内注射した。融合の３日前にマウスをPBV 中の10μｇの phK２の静脈内注射でブースティングした。マウスを殺し、そして単一細胞懸濁物を脾臓から調製した。免疫Ｂ細胞を当業界周知の技術を利用してP3.653ミエローマ細胞と融合させた。クローンをELISA によりスクリーニングし、そしてhK２v217及び phK２v217に対する上清液の反応性及びPSA との最少限の反応性に基づき選別した。このような基準により選定した２種のクローン、即ちクローンHK1G464 及びHK1G586 をFACStar plusセルソーターを用いてサブクローニングし、単一細胞をマウスの脾臓支持細胞層の上に載せた。サブクローンHK1G464.3 及びHK1G586.1 を更なる研究のために用いた。
【００６５】
免疫原をhK２v217とし、CFA 及びIFA の代わりにみょうばんを使用し、BALB／ｃマウスをＡ／Ｊマウスの代わりに使用することを除き上記と同じプロトコールを採用した別の融合はクローンHK1H247を製造した。
ELISA アッセイ
乾燥式ELISA 方式を、クローンの無血清消費培地中及びhK２精製の際に集めた画分中のhK２を測定するために用いた。マイクロタイタープレート（Becton Dickinson Labware, NJ) に50μｌの消費培地又はカラム画分を37℃で一夜かけてコーティングした。そのウェルを PBS＋0.1 ％のTween 20 (PBST) で洗い、そして50μｌの第一抗体と１時間インキュベーションした。そのウェルを再び PBS＋Ｔで洗い、そして37℃で１時間西洋ワサビペルオキシダーゼにカップリングした50μｌのヤギ抗マウス−IgG 又はヤギ抗ウサギ−IgG Fc抗体（１：500, Jackson Immunosearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) とインキュベーションした。ウェルをPBSTで洗い、Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（OPD, Sigma, MO) と５分間インキュベーションし、そして比色反応をELISA リーダー（Biotek Instruments, Inc., モデルEL310, VT)でＡ490 にて測定した。サンプルは全て二重測定でアッセイした。ベクターのみでトランスフェクションしたAV12細胞由来の無血清消費培地をネガティブコントロールとして使用した。
【００６６】
抗体をビオチニル化 phK２v217，hK２v217及びPSA を用いる溶液系ELISA 方式で試験した。PSA はSensabaugh and Blake (J. Urology, 144, 1523 (1990)）の方式により精製した。50μｌのバッファーＡ（8.82mMのクエン酸、82.1mMのリン酸ナトリウム（二塩基性）、10％のBSA, 0.1％のマンニトール、 0.1％のNonidet Ｐ−40，pH7.0)に希釈した20ngのビオチニル化hK２v217もしくは phK２v217、又はPBS 中の10％のウマ血清（HS) に希釈した0.25ngのビオチニル化 PSAを、50μｌのハイブリドーマ上清液、ネガティブコントロール上清液（即ち、 phK２v217及びhK２v217に関しては無関係なハイブリドーマ上清液、又はPSA に関してはHS中の20μｇの無関係な精製mAb)、又はポジティブコントロール（即ち、PSA に関してはHS中の20μｇ／mlの精製PSM773（抗−PSA) mAb、又は phK２v217及びhK２v217に関してはHK1D104(抗「hK２」）ハイブリドーマ上清液）とインキュベーションした。hCG に対するmAb であるHCO514をPSA アッセイにおいてネガティブコントロールとして用い、そしてtau に対するmAb であるZTG085をhK２アッセイにおいてネガティブコントロールとして用いた。
【００６７】
このような抗体及び抗原の混合物をストレプトアビジンコーティング化マイクロタイタープレート（Labsystems, Helsinki, Finland)の中で振盪させながら１時間インキュベーションした。このプレートを 300μｌのPSB, 0.1％の Tween−20（PBST）で３回洗い、そしてHSに１：10,000に希釈した 100μｌのガンマー特異性ヤギ抗マウスIgG −西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（JacksonImmunoResearch Laboratories, Inc., Westgrove, PA) と１時間振盪させながらインキュベーションした。２回のPBST洗浄後、振盪しながら50mMのリン酸−クエン酸バッファー、0.03％の過硼酸ナトリウム、pH5.0 (Sigma Chemical, St. Louis, MO) 中の 100μｌの１mg／mlのＯ−フェニレンジアミンを添加して30分かけて発色させた。反応は50μｌの４ＮのH2SO4 の添加によりクエンチングした。発色強度はマイクロタイタープレートリーダーを用い 490nm及び 540nmにおいて吸収を測定することにより決定した。 490nmで2.6 を超える吸収は 540nmの測定値により補正した。サンプル値は三重測定の平均±標準偏差である。コントロール値は二重測定の平均値である。
ウェスタンブロットアッセイ
ウェスタンブロットアッセイは標準の手順を利用して実施した。無血清消費培地をCentricon 10 (Amicon, Inc., Bevely, MA) を用いて10倍濃縮し、そして12％のゲル(Bio−Rad, Inc., Melville, NY)を用いて SDS／PAGEにかけた。分析目的のため、 SDS／PAGEは８〜25％勾配ゲルを用いてPharmacia PhastSystem で実施した。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、そしてPBS 中の２％の脱脂粉乳で４℃にて一夜ブロッキングした。ブロットをすすぎ、次いで第一抗体（腹水の１：1000希釈物又は１μｇ／mlの精製mAb もしくはポリクローナルAb）と22℃で１時間インキュベーションした。次いでブロットを洗い、そして第二抗体（ヤギ抗−マウス−HRP 又はヤギ抗−ウサギ−HRP,１：500 ; Jacksow Immunosearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)と45分インキュベーションした。免疫反応バンドをDAB (Sigma, St. Louis, MO)とH2O2を利用してブロットを発色させることにより、又はECL (Amersham, Buckinghamshire, England)システムを製造者の仕様に従って利用することにより検出した。
共有複合体形成
共有複合体形成について試験するため、 0.175μＭのhK２を20μＭのインヒビターとpH８で 100mMの硼酸バッファー中でインキュベーションした。試験したインヒビターは１−アンチキモトリプシン、１−アンチトリプシン、１−アンチプラスミン、アンチトロンビン及び２−マクログロブリンとした。５μｌのhK２（10μｇ／ml）に 100mMの硼酸バッファーの中に調製した計算μｇのインヒビターを加え、そして必要なら、各サンプルを10μｌの総容量にした。サンプルを37℃で３時間インキュベーションし、その後35％の２−メルカプトエタノールを含む 1.5μｌの７× PhastSystem SDSサンプルバッファーを加え、そしてこのサンプルを湯浴の中で３分煮沸した。サンプルを SDS／PAGE及びウェスタン分析に適用する前にSDSサンプルバッファーの化に１／４に希釈した。
ペプチド基質のタンパク質分解
hK２のペプチド基質を切断する能力を決定するため、ペプチドを10mg／mlにおいてDMSOの中に溶かし、次いで PSA, hK２又はトリプシンを含む 100mMの硼酸バッファーpH８の中に１：10に希釈した。典型的な実験は下記の通りに実施した：１μｌのペプチドを７μｌの 100mMの硼酸バッファーに加え、次いで２μｌのhK２（10μｇ／ml）、PSA (500μｇ／ml）又はトリプシン(0.5μｇ／ml）を加えた。一般にサンプルを37℃で16時間インキュベーションした。サンプルを 100μｌの 0.2％の TFA／水でクエンチングし、そしてそのクエンチングしたサンプルをAS100 オートサンプラー、デュアル1350ポンプ及びBiodimensionスキャニングUV−VIS 検出器の備ったBioRadモデル800 HPLCに取り付けたVydac Ｃ−18逆相カラムに直接載せた。溶媒Ａは 0.1％の TFA／水であり、そして溶媒Ｂは 0.1％のTFA を含むアセトニトリルとした。サンプルを90％の溶媒Ａの中に入れ、そして勾配を10分かけて60％の溶媒Ｂに至るまで展開させた。吸収を 220nm及び 280nmで同時にモニターした。HPLCで集めたピークを真空遠心分離又は凍結乾燥により濃縮し、次いでアミノ酸シーケンサーに入れて個々のフラグメントを同定した。あるケースにおいては10μｌのクエンチング済みサンプル混合物を配列決定膜に直接載せ、そしてその配列がわかっているため、各サイクルに存在するアミノ酸分布から切断部位を決定した。
発色原基質を用いるプロテアーゼアッセイ
パラ−ニトロアナリド誘導化基質の加水分解を測定するアッセイはプログラム式恒温型７−ポジションセルホルダーの備ったHP8452A UV−VIS 光度計を用いて実施した。アッセイは37℃にインキュベーションした 100mMの硼酸ナトリウムpH８の中で実施し、吸収上昇を 405nmでモニターした。メトキシスクシニル−Arg −Pro −Tyr−パラニトロアニリド(Meo−Suc −Ｒ−Ｐ−Ｙ−pNA)及びＨ−Ｄ−プロ−phe −arg −パラ−ニトロアニリド（Ｐ−Ｆ−Ｒ−pNa)はアッセイにおいて１mMとした。
【００６８】
標準のFast Moc化学を利用するABI モデル431Aペプチドシンセサイザーを図16に挙げる全ペプチドの合成のために採用したが、＃２アンジオテンシノーゲン及び＃５インスリンの酸化型ベーター鎖はSigma から入手した。各合成ペプチドの質量の質量スペクトル（University of Michigan, Core Facility)によりES／MSを用いて確認した。上記のシーケンサーABI モデル 477ａをペプチド配列の確認のために使用した。
phK２v217からhK２v217への変換
50mMの硼酸ナトリウム中の 100〜400 μｇ／mlの phK２v217のサンプルを１％  ｗ／ｗのトリプシン又はhK２と37℃でインキュベーションした。プロから成熟体に至る変換は１〜２μｇのhK２v217出発材料を 100μｌのHIC バッファーＡに希釈し、そして二形態を上記の通りにして HIC−HPLCにより分解することによりモニターした。hK２v217と phK２v217とのインキュベーションは同じようにして行ったが、但し、同等量の二形態を図17Ｂに示すように一緒にインキュベーションした。
実施例２
哺乳動物細胞中のhK２v217の発現及び精製
哺乳動物細胞系においてhK２を発現させるため、hK２の全コード配列（pphK２）（図２）をコードする 0.8kbのフラグメントをPCRを用いて増幅し、ベクターPCR II（TA）にサブクローニングし、そしていくつかのクローンを単離した。これらのクローンのうちのいくつかにおける全pphK２インサートのヌクレオチド配列を、PCR 増幅により生じうる任意の突然変異を検定するために決定した。一方の野生型hK２インサートを有するクローンTA−hK２、及び他方の突然変異hK２インサートを有するクローンTA−hK２v217の２つのクローンを更なる分析のために選別した。TA−hK２v217はhK２のコドン650 にＣのＴによる置換を含み、hK２のアミノ酸残基217 でのバリン(GTT) によるアラニン(GCT) の保存的置換がもたらされている（図２）。哺乳動物発現ベクターを得るため、TA−hK２及びTA−hK２v217のpphK２インサートをGBMTプロモーターのコントロール下でプラスミド PGT−ｄにサブクローニングし、プラスミド pGThK２及び pGThK２v217をもたらした。GBMTプロモーターはいくつかの調節配列より成り、そしてアデノウィルスE1a タンパク質により活性化される（Bergら、前掲（1992））。
【００６９】
pphK２v217遺伝子が哺乳動物細胞の中で発現されるかを調べるため、プラスミド pGThK２v217をAV12−664 細胞の中にトランスフェクションした。この細胞系はアデノウィルスタイプ12によりシリアンハムスターにおいて誘導された腫瘍に由来し、そしてアデノウィルスE1a タンパク質を発現する。Ela タンパク質はGBMTプロモーターを活性化し、このプロモーターのコントロール下での遺伝子産物の発現をもたらす。２〜３週間後、 MTX−耐性クローン細胞を単離し、そしてその消費培地をウェスタンブロットにより分析した。いくつかのクローンが同定され、それらは抗−pphK２抗血清に免疫反応性であるポリペプチドを培地の中に分泌する。一のクローン (AV12− pGThK２v217＃２）を更なる特性決定及びタンパク質精製のために選別した。
【００７０】
hK２ポリペプチドを精製するため、AV12− pGThK２v217クローン＃２由来の無血清消費培地を７日後に集め、濃縮し、そしてアニオン交換クロマトグラフィーにかけた（図４Ａ）。ELISA アッセイによる決定に従い、hK２活性のピークは約 0.2ＭのNaClにおいて溶出した（点線）。ELISA アッセイは同じ画分の SDS／PAGEにより認められるタンパク質の約34kDのバンドの出現とよく相関した。アニオン交換カラム由来のhK２陽性画分を集め、そして疎水性相互作用クロマトグラフィー (HIC)（図４Ｂ）にかけた。Ａ280 の大部分はHIC カラムに保持されなかった。22分目にて溶出したHIC 上に保持された主要ピークもELISA アッセイにより最大の活性ピークを示した（点線、図４Ｃ）。約34kDの主要タンパク質バンドが SDS−PAGEによっても観察された。HIC 由来の22分のピークをSEC により分解すると、一般にタンパク質Ａ280 の約80〜90％が19.4分において溶出し、保持時間は約34kDのタンパク質と一致した（図４Ｃ）。16.7分に溶出するSEC 上の唯一のその他のタンパク質ピークは事前の精製工程において観察された約70kDのタンパク質に相当する。
【００７１】
精製タンパク質を更に同定するため、約 2.5μｇのタンパク質を自動Ｎ末端分析にかけ、下記の配列が得られた。Val −Pro −Leu−Ileu−Gln −Ser −Arg −Ile −Val −Gly −Gly −Trp −Glu−。エドマン分解手順による順に遊離されるアミノ酸プロフィールからは競合する配列は認められなかった。PSA に対する分析により、このタンパク質は phK２v217であり、なぜなら成熟PSA(精液から単離）の既知の配列はIleu−Val −Gly で始まり、そしてpPSA及び phK２はＮ末端に更に７個のアミノ酸を有するものと推定される（図２）。このタンパク質のアミノ酸分析は phK２v217の推定配列と一致するアミノ酸組成をもたらした。この phK２ポリペプチドはmg量で精製された。
実施例３
phK２v217の特性決定及びhK２v217の作製
実施例２において採用した精製スキームの効率を調べるため、 1.5μｇの精製 phK２v217をベーターメルカプトエタノール(BME) の存在下又は非存在下で SDS／PAGEにかけ、そしてそのゲルを銀染色した。サンプル中の phK２v217を約95％の純度であることを結果は示した（図５）。 phK２v217はBME の非存在下で約30kDにて泳動し、そしてBME の存在下では約34kDにて泳動することも示された。このパターンは精液から精製したPSA について観察されたものと類似である（図５）。
【００７２】
cDNA配列から推定したhK２のアミノ酸配列は残基78にある一の潜在的なＮ−連結グリコシル化部位の存在を示す（Ｎ−Ｍ−Ｓ）。この部位がグリコシル化されているかを決定するため、 phK２v217を SDS／PAGEにかけ、ニトロセルロース紙に転写し、ジゴキシゲニン(DIG) −カップリング化レクチン、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼラベル化抗−DIG と反応させた。
【００７３】
図６において（レーン１）、２μｇの phK２をコンカナバリンＡ（ConA) で染色し、タンパク質中の２個の非置換又は２−Ｏ−置換α−マンノシル残基の存在を示唆した。レーン２は陽性コントロール糖タンパク質のZCE025mAB のConA染色を示す。このmAb の重鎖（50kD）及び軽鎖は共にマンノースコアを有するＮ連結化オリゴ糖を含むことで知られる。レーン３は非グリコシル化タンパク質(BSA)がConAレクチンと反応しないことを示した。 phK２v217は RCA (Gal ｂ１−４GlcNAc特異性）及びAAA(α（１−６）連結化フコース特異性）とも反応した。このレクチン反応性パターンは複合Ｎ−連結化オリゴ糖の存在と一致した。 phK２v217上のオリゴ糖はシアル酸も含み、なぜならSNA(ガラクトースにシアル酸がα（２−６）連結）及びMAA(ガラクトースにシアル酸がα（２−６）連結）は共に phK２v217と反応したからである。
【００７４】
hK２のプロ領域の配列はVPLIQSR である。このプロ配列におけるアルギニンのカルボキシ末端での酵素切断は phK２をhK２に変換させる。精製 phK２v217のペプチド結合をこの位置において加水分解するための温和なトリプシン消化を開発した。 phK２v217を１％のトリプシンとインキュベーションし、そしてその変換を HIC−HPLCによりモニターした（図７）。この手順は phK２v217からhK２v217に至る完全変換をもたらした。hK２v217と表示したピークをＮ末端配列決定し、そして配列IVGGWEで始まることが示され、それはhK２の成熟形態にとってのＮ末端である。上記以外の配列は検出されず、この温和なトリプシン処理が任意の有意なレベルの非特異的切断をもたらさないことを示した。トリプシン処理サンプルの SDS／PAGEは泳動度においてわずかではあるが認識できる増大を示し、概してプロペプチドの質量である 826ダルトンの質量のわずかな減少に相当した。
実施例４
hK２−特異的Abs の作製
phK２v217及びhK２v217をhK２に対するmAb を作製するための免疫原として用いた。ハイブリドーマをhK２v217又は phK２v217との高度な反応性及びPSA との最低限の反応性に基づきスクリーニングした。ハイブリドーマから獲得したmAb の代表例を表１に示す。 phK２v217による免疫はmAb HK1G586.1 及びHK1G464.3 をもたらした。HK1G586.1 はhK２−特異性であり、なぜならそれは phK２v217及びhK２v217の双方は認識するが、PSA は認識しないからである。他方、HK1G464 は phK２−特異性であり、なぜならそれは phK２v217のみを認識し、そしてhK２v217又はPSA は認識しないからである。
【００７５】
【表１】
2006314327.tif 000002
【００７６】
hK２v217による免疫はmAbHK1H247をもたらした。このmAb はhK２−特異的であり、なぜならこれはhK２v217のみを認識し、 phK２v217又はPSA は認識しないからである。これらの結果は phK２v217及びhK２v217が様々なhK２形態に特異的なmAb を作製するうえで免疫原として無価値だからである。
【００７７】
ウェスタンブロット分析を、HK1G580 が精液中のhK２を認識するかどうかを調べるために用いた（図８）。約22kD、約33kD及び約85kDのhK２−免疫反応性バンドがこのmAb により認識された。精液中の類似のhK２−免疫反応性パターンもDeperthes らBiochem. Biophy. Acta, 1245, 311 (1995) より報告されている。この結果はhK２v217に対して生起させたmAb が精液中の天然hK２を認識することを示唆した。hK２v217又は phK２v217に対して生起させた全ての抗体はhK２及び phK２の対応の形態も認識し、hK２v217及び phK２v217がそれぞれ免疫学的に類似していることを示唆した（下記参照）。
実施例５
哺乳動物細胞におけるhK２の発現
哺乳動物細胞において野生型hK２（hK２）を発現させるため、 pGThK２（図３）をAV12細胞でトランスフェクションした。hK２ポリペプチドを発現するいくつかのクローンを HK1D106.4（hK２のアミノ酸残基17〜71に対応するポリペプチドに対して生起させたhK２−特異的mAb)を用いるウェスタン分析により同定した。クローンAV12−hK２＃27（AV12−hK２）をその高度なhK２発現レベルに基づき更なる分析のために選別した。ベクターのみでトランスフェクションした細胞（pGTD）はHK1D106.4 との反応性を示さなかった。
【００７８】
HK1D106.4 mAb を利用するELISA は７日目でのAV12−hK２の無血清消費培地中の約 0.5〜１μｇ／mlのhK２ポリペプチドの存在を示唆した。AV12−hK２v217からの phK２v217の精製において利用した同じ方法をAV12−hK２の７日目の消費培地からhK２ポリペプチドを精製するために用いた。これは低収率の精製hK２ポリペプチドを供し、それは精製手順に対して非常に不安定であり、それ故免疫原として使用するには非現実的であった。
【００７９】
hK２ポリペプチドを上記の方法を利用して部分精製し、 SDS／PAGEにかけ、エレクトロブロッティングし、そしてＮ末端アミノ酸配列決定にかけた。この分析は７日目のAV12−hK２の消費培地の中にhK２ポリペプチドがＮ末端に配列IVGGWECEK を有することを示した。エドマン分解手順により順に遊離されるアミノ酸のプロフィールから競合配列は認められなかった。PSA との対比により、この配列は成熟hK２（hK２）に相当した。このタンパク質のアミノ酸分析はhK２のそれとも一致した。
【００８０】
この発見は興味深く、なぜなら７日目においてAV12−hK２v217の無血清消費培地の中に phK２v217が優先的に存在し、一方７日目のAV12−hK２の無血清消費培地にはhK２が優先的に存在していることが示されたからである。１日目のAV12−hK２の無血清培地の中に存在するhK２の形態を調べるため、この材料をHK1G586.1 mAb を用いるアフィニティー精製により部分精製した。約34kDのタンパク質をPVDF上に転写し、そしてＮ末端分析にかけ、配列VPLIQSRIVGG が示された。エドマン分解手順により順に遊離したアミノ酸のプロフィールからは競合配列が認められなかった。PSA との対比し、この配列は phK２に相当した。このことは、hK２ポリペプチドがAV12−hK２及びAV12−hK２v217の双方によりプロ形態として分泌されることを示唆した。しかしながら、 phK２v217は安定であり、そしてhK２v217に変換されないが、 phK２は不安定であり、そして細胞外でhK２に容易に変換した。
実施例６
hK２の生合成
哺乳動物細胞におけるhK２の生合成を更に研究するため、経時的試験を行い、それではAV12−hK２クローン＃27由来の無血清消費培地を８日間連続して毎日集め、濃縮し、そして SDS−PAGEにかけた。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、そしてHK1D106.4 又はHK1G464.3 mAb のいづれかでプロービングした（図９）。図９に示す通り、HK1D106.4 は phK２及びhK２を共に認識し、一方HK1G464.3 は phK２のみを認識し、なぜならそのエピトープはhK２の−７〜＋７領域にあるからである。hK２ポリペプチド（約34kD）の発現はHK1D106.43 mAbによる検出に従い、３日目にピークとなり、そしてその後プラトーとなった。約70kD〜約90kDで泳動する２本のその他の免疫反応性バンドも４日目以降に検出された。
【００８１】
他方、同一のサンプルをブロッティングし、そしてHK1G464.3 でプロービングすると、hK２レベルの暫進的な低下が４日目に検出された。８日目、非常に低レベルのhK２が消費培地の中で見い出された。この結果は、 phK２がAV12−hK２細胞により培地の中に分泌され、そして徐々にhK２に細胞外で変換されることを示す。驚くべきことに、約70kD及び約90kDのバンドはHK1G464.3 mAb では観察されず、これらのバンドがhK２のホモオリゴマーであるか、又は未だ未知のタンパク質に共有複合したhK２であることを示唆した。これらのバンドの同一性はこの時点ではまだわかっていないが、それらは消費培地中のhK２の存在についてのマーカーを担う。図９において、精製 phK２v217及びhK２v217タンパク質をコントロールとして用いた。
【００８２】
AV12細胞におけるhK２v217の生合成を研究するため、類似の経時的試験をAV12−hK２v217クローン＃２で行った。図10に示す通り、HK1D106.4 mAb による検出に従い、hK２v217の発現は３日目にピークとなり、そして４日目以降はさほど変化しなかった。ブロットをHK1G464.3 mAb でプロービングしたときに類似の結果が得られた（図10）。これはAV12− pGThK２v217クローン＃２細胞が１日目以降に phK２v217を発現し、そして少なくともその８日後において、このタンパク質が成熟形態に変換されていないことを示唆する。このような結果は、８日目までに培地の中に残っているとしてもhK２へと変換される phK２の結果と異なり、 phK２v217が37℃にて培地の中で８日間安定であることを示唆する。
【００８３】
phK２からhK２に至る細胞外変換が培養物中のAV12−hK２クローン＃27細胞の生存に相関するかを調べるため、クローン＃27細胞をトリパンブルー排除を利用して計算した。消費培地中のhK２の発現はHK1D106.4 及びHK1G464.3 mAb の双方を用いるELISA により測定した。図11に示す通り、生存細胞の数は３日目の培養物中での38,000,000個にてピークとなり、そしてその後徐々に減少した。８日目、生存細胞数は10,000,000未満に減少した。 phK２の発現（HK1G464.3 により測定）も３日目にピークとなり、そしてその後徐々に減少した。
【００８４】
他方、hK２の発現（HK1D106.4 により測定）は３日目にピークとなったが、その後プラトーに達した。この結果は、 phK２がAV12−hK２細胞により分泌され、そしてその一部が４日目にhK２へと細胞外で徐々に変換されたことを示唆する。更に、 phK２からhK２への変換は細胞生存の減少に明らかに相関し、死細胞により放出される細胞外プロテアーゼがこの変換を担う一つの要因でありうることを示唆する。hK２の発現は細胞が最も活発な時点で最高であった。hK２の減少は細胞生存率の減少と平行し、このような細胞によりhK２が分泌されることを示唆し、細胞の死及び溶解を経て放出されることと対立する。また、hK２の上昇は phKの降下に対応し、hK２のプロ形態が経時的に成熟形態へと自動的に変換したことを示唆する。
【００８５】
前立腺癌腫細胞におけるhK２の生合成を調べるため、hK２をDU145 及びPC３細胞系において発現させた。pphK２をプラスミドpLNCX及びpLNSX (Miller and Rosman, Bio Techniques, ７，980 (1989)) の中に、CMV 及びSV40プロモーターのそれぞれのコントロール下でクローニングした。得られるプラスミドpLNC−hK２及びpLNS−hK２をそれぞれPC３及びDU145 細胞のそれぞれにトランスフェクションし、そしてクローンをG418含有培地の中で選別した。高レベルのhK２を発現するクローンをELISA 及びウェスタンブロットにより選別した（PC３−hK２及び DU145−hK２）。
【００８６】
培地の中のhK２及び phK２のレベルを評価するため、PC３−hK２及び DU145−hK２細胞の無血清培地を HK1D106.4（hK２−特異性）及びHK1G464.3 (phK２−特異性）mAb を用いてウェスタンブロット分析にかけた（図12）。結果は、 phK２が DU145−hK２及びPC３−hK２の双方の消費培地の中に存在することを示した。このことは、前立腺癌腫細胞hK２が phK２として分泌され、そして細胞外で成熟形態に変換されることを示唆する。優先的な phK２は７日後でさえもPC３−hK２細胞の消費培地の中で検出されたが、優先的なhK２は１日目から DU145−hK２の無血清培地の中に存在した。これはおそらくはD145消費培地中の豊富な細胞外プロテアーゼに基づくのであろう。
【００８７】
上記の結果が一のクローンに限定されるかどうかを調べるため、AV12−hK２の３種類の別な独立に単離したクローン及びAV12−hK２v217の４種類の別な独立に単離したクローンをhK２ポリペプチドの発現について試験した。クローンの無血清培地を７日目に集め、そして HK1D106.4（hK２−特異性）及びHK1G464 (phK２−特異性）mAb を用いるウェスタンブロットによりhK２の発現について試験した（図13及び14）。全てのAV12−hK２クローンにおいて、HK1D106.4mAb は主要約34kDバンド（「hK２」）を検出したばかりでなく、約70kD及び約90kDをも検出し、これはhK２の存在の指標である（図13）。HK1G464.3 は全てのAV12−hK２クローンにおいて非常に低レベルの phK２を検出した（図14）。この結果は、優先的なhK２が全てのAV12−hK２クローンの消費培地の中に存在していることを示唆し、AV12−hK２＃27クローンについての確立された生合成メカニズムを確証せしめた。同じ分析をAV12−hK２v217クローンに対して用いた（図14）。結果は、これらのクローンの消費培地の中に７日目では phK２v217のみが存在することを示唆し、AV12−hK２v217クローンによる我々の発見を確証せしめた。
【００８８】
上記の結果は総合するとhK２が哺乳動物細胞の中でプロ形態として発現され、そして未だ未知のプロテアーゼにより細胞外で成熟形態に変換されることを示唆する。これらの結果は phK２が生物学的流体の中に存在し得、従ってpCa 及びBPH にとっての有用な診断マーカーでありうることも示唆する。
実施例７
hK２及びhK２v217の酵素活性及び特異性
少量のhK２を、その酵素活性及び基質特異性を確立するために十分な純度にまで精製した。hK２の一般活性をペプチドのｐ−ニトロアニリド誘導体に対する発色原的なそのアミド分解活性を決定することにより測定した（表２）。このような基質のタンパク質分解により遊離されるｐ−ニトリアニリドを吸収Ａ405 で測定する。キモトリプシン様プロテアーゼを測定するために基質メトキシスクシニル−Arg −Pro −Tyr −パラ−ニトロアニリド(MeO−Suc −Ｒ−Ｐ−Ｙ−pNA)を使用し、それはフェニルアラニンで切断する。この基質はPSA の活性を測定するために既に使用されている（Christenssonら、Eur. J. Biochem., 194, 755 (1990））。基質Ｈ−Ｄ−Pro−Phe −Arg −パラ−ニトロアニリド（Ｐ−Ｆ−Ｒ−pNA)はトリプシン様プロテアーゼに特異的であり、それはアルギニン（Ｒ）において切断される。
【００８９】
hK２はhK２v217よりもＰ−Ｆ−Ｒ−pNA に対して10倍以上の総合的な活性を有することが見い出され、そしてどのタンパク質もキモトリプシン基質 MeO−Suc −Ｒ−Ｐ−Ｙ−pNA を加水分解する能力を示さなかった。トリプシン様切断部位（リジン、アルギニン）を含むその他の同等な基質も試験し、そしてhK２は最大の率で基質Ｐ−Ｆ−Ｒ−pNA を加水分解することが見い出された。これらの発見はhK２がトリプシン様活性を有することを示唆する。
【００９０】
【表２】
2006314327.tif 000003
【００９１】
表２：発色原性基質に対するhK２，hK２v217，PSA 及びトリプシンのアミド分解活性。
【００９２】
hK２及びhK２v217の特異性は、どのペプチド結合が加水分解されるかを調べるため、ペプチド基質を利用すると共にＮ−末端アミノ酸配列分析を利用して一層詳しく調べた。図15はポリペプチドCALPEKPAVYTKVVHYRKWIKDTIAAN に対するアミド分解活性を示し、それは潜在的なトリプシン及びキモトリプシン切断部位の双方を有する。hK２v217はトリプシン（Ｒ−Ｋ）及びキモトリプシン（Ｙ−Ｒ）部位の双方を、２：１のトリプシン様切断対キモトリプシン様切断比で切断する。これらの実験におけるコントロールとして、 phK２v217をこのペプチドともインキュベーションし、そしてアミド分解活性は示されなかった。hK２はhK２v217とは異なる特異性をこのペプチド基質に対して示した。hK２に関してこの基質に対するキモトリプシン様特異性は認められず、そしてその活性はトリプシン様部位（Ｒ−Ｋ）に対してのみであった。このポリペプチド内のどのその他のリジン（Ｋ）残基も加水分解されず、hK２の特異性がアルギニン（Ｒ）残基に対してのみであることが示唆された。
【００９３】
コントロールとして、トリプシンもこの基質に対して試験し、そしてトリプシン切断にとって適切な部位であることの知られていないＫ−Ｐ結合を除く全てのリジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）部位が切断された。トリプシンは 210−236 基質（ペプチド＃１、図６）のＲ−Ｋ部位をhK２より約４倍速く、そしてhK２v217よりも約4000倍速い速度で切断した。どのキモトリプシン様結合もトリプシンによっては切断されなかった。PSA は主にＹ−Ｒ結合を切断した。PSA に関してはＲ−Ｋ結合に対するごくわずかなトリプシン様結合も認められた（図15）。このことは、発色原性基質に対するPSA に関して予め認められたわずかなトリプシン様活性と一致した（表２）。
【００９４】
いくつかのその他のペプチド基質もhK２及びPSA とインキュベーション（図16）。試験したペプチドの全てにおいて、hK２は特定のアルギニンに対してのみ特異的であり、そしてPSA は特定のチロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）及びロイシン（Ｌ）残基に対して主に特異的であった。図16においてはペプチド＃１のみがhK２v217により切断され、それは図15のクロマトグラフィー図に詳細してある。
実施例８
hK２による phK２v217の活性化
図16におけるペプチド＃３の配列は phK２のアミノ酸残基−７〜＋７に相当する。この領域はプロペプチドVPLIQSR を含み、それは phK２v217のＮ末端リーダーペプチドとして見い出された。上述の通り、hK２はこのペプチドを切断してプロペプチド領域を遊離させることができるが、hK２v217はできなかった。hK２が天然基質上のこのプロ配列を切断し得るかを調べるため、 phK２v217及びhK２v217を変換するその能力をモニターした。 phK２v217を１％のhK２とインキュベーションし、そしてその変換を HIC−HPLC法によりモニターした（図17Ａ）。結果は、hK２が phK２v217をhK２v217に変換することを示したが、速度はトリプシンの30分の１であった。 phK２v217を40％のhK２v217とインキュベーションすると、２種のhK２形態の比の相違は６時間でさえも認められなかった（図17Ｂ）。このことはペプチド基質についての前記の所見を確証せしめ、そして天然基質に対してさえも、hK２v217ではなく、hK２のみがhK２のプロ領域を切断した。
【００９５】
これらの結果は長期間のインキュベーションの際の phK２v217及びhK２v217の安定性を総合的に実証する。hK２v217と比較すると、hK２はより高いタンパク質分解活性、より高度な特異性、そして特に図15におけるプロペプチドに対する活性及び図17における phK２v217に対するその活性により実証される通り、hK２のプロ形態に対する特異性を有することが示された。
【００９６】
これらの結果はhK２とhK２v217との間での酵素活性の有意な相違を示し、そして phK２v217と比較してのhK２を培地から精製する試みに伴う低収率の説明に役立ちうる。hK２の高純度調製品はその他の活性プロテアーゼについて認められるのと同様に自己分解により安定でないことがある。このような結果は、免疫学的試験に加え、hK２−特異的基質に対する酵素活性が体液中のこのタンパク質のレベルをモニターするのに使用できることを更に示唆する。
実施例９
hK２とのインヒビター複合体の形成
PSA はα２マクログロブリン（MG）及びセリンプロテアーゼインヒビターのアンチキモトリプシン(ACT) と複合体を形成することが示された。その複合体形成を開拓するため、hK２をヒト血漿の中に存在する一連の一般的なプロテアーゼ(ACT，α２−アンチプラスミン、アンチトロンビンIII 、及びα１−アンチトリプシン）（Travis and Salvesen, Ann. Rev. Biochem., 52, 655 (1983））とインキュベーションし、そしてその混合物をウェスタンブロットにより分析した（図18）。hK２とこのようなセルビンとの任意の共有複合体は還元条件下での SDS／PAGEで約80〜100kD のバンドをもたらすであろう。
【００９７】
ACT 及びα２−アンチプラスミンはhK２と有意な複合体を形成した（図18、レーン１及び２）。アンチトロンビンIII （レーン３）及びα１−アンチトリプシン（α１プロテアーゼインヒビター、レーン４）はhK２と検出可能な複合体を形成しなかった。血漿の主要成分MGもhK２と直ちに複合した（レーン５）。この複合体は約 200kD及び 120kDのMrに相当し、それらはPSA を精製MGとインキュベーションしたときも形成された（図18、レーン８、下記参照）。hK２が広域なトリプシン様プロテアーゼを阻害するにもかかわらずα１−アンチトリプシンと複合体を形成しないことは極めて興味深い（Loebermannら、J. Mol. Biol., 177, 531 (1984) ; Carrell and Travis, TIBS, 10, 20 (1985)) 。
【００９８】
hK２がα２−アンチプラスミンと複合体を形成することは驚くべきことではなく、なぜならこのタンパク質はそのインヒビター活性部位にアルギニン残基を有するからである。（Hunt and Dayhoff,Biochem. Biophy. Res. Comm., 95, 864 (1980) ; Chandra ら、Biochemistry, 22, 5055 (1983) ; Potempa ら、Science, 241, 699(1985) ; Shiehら、J. Biol. Chem., 264, 13420 (1989) ; Mastら、Biochemistry, 30, 1723 (1991））。しかしながら、hK２がACTと複合体を形成することが予想し得ず、なぜならACT はそのインヒビター活性部位にロイシンを有するからである。明らかに、PSA とhK２との間での構造類似性は一般のインヒビターとの複合体形成を、たとえそのタンパク質分解特異性が図16及び表２に示されるように全体的に異なるにしても、影響を及ぼす。
【００９９】
女性ヒト血清の中に入ると、hK２はウェスタンブロットにより検出される通り、MGと直ちに複合体を形成する（図18）。レーン１及び３はそれぞれhK２及び血清のみのコントロールである。レーン２はACT とインキュベーションしたhK２であり、90kDのhK２−ACT 複合体及び残留hK２を示す。レーン４及び５は血清の中にそれぞれ15分及び１時間入れたhK２である。レーン６は精製MGと４時間インキュベーションしたhK２である。レーン７は血清の中に15分入れたPSA であり、そしてレーン８は精製MGと４時間インキュベーションしたPSA である。
【０１００】
これらの結果はMGが、hK２又はPSA をin vitro実験でヒト血清の中に入れたときの主要複合体であることを示す。ACT とのPSA 複合体は前立腺障害を有する患者の血清の中に認められることがわかっているため、血清の中に存在するhK２は若干のレベルのACT 複合体も形成するようである。
実施例10
前立腺組織とのモノクローナル抗体586 の免疫反応性
hK２が前立腺において発現され、そしてもしそうなら前立腺癌と相関するかを調べるため、264 の根治的(radical) 前立腺切除検体（そのうちの257 は未処置患者に由来し（図20）、そして７はアンドロゲン枯渇治療処置患者に由来する（図21））を対比試験において分析した。各検体を、良性上皮、高度前立腺内皮新形成(PIN) 及びアデノ癌腫を有する領域におけるhK２の細胞質発現について分析した。
【０１０１】
前立腺組織を秤量し、三次元で測定し、そしてインク塗りした。先端及び基底部を厚さ４〜５mmで切断し、そして３mmにて連続切片にした。残りの前立腺は前立腺の先端から精嚢の頂部に至るまで腺の長軸に対して垂直にナイフで４〜５mm間隔で連続切片にした。横断切片を調製し、そしてヘマトキシリンとエオシンとで染色した。癌及び良性組織を包括する各患者の根治的前立腺切除検体の一枚の切片を10％の中性緩衝ホルマリンの中で固定し、そして当業界周知の方法によりパラフィンに包埋した。
【０１０２】
スライド上の組織切片をキシレン及び95％のエタノールに浸してパラフィン除去した。内性ペルオキシダーゼ活性は、切片をメタノール／H2O2の中で10分インキュベーションし、次いで切片を水道水ですすぐことによりブロッキングした。切片を10mMのクエン酸バッファーpH6.0 の中に入れ、そして30分スチーム処理した。切片を５分間冷却し、次いで低温水道流水ですすいだ。非特異的タンパク質結合は切片を５％のヤギ血清と10分インキュベーションすることによりブロッキングした。次いでスライドを静かに排液した。第一抗体hK1G586 又はPSM773 0.5μｇ／mlを切片に室温で30分加えておき、次いで切片を水道水ですすいだ。切片をペルオキシダーゼコンジュゲーション化ストレプトアビジン（１：500)と30分インキュベーションし、次いで水道水ですすいだ。次に、切片を３−アミノ−９−エチルカルバゾール(ABC) 発色原溶液と15分インキュベーションし、次いで水道水ですすいだ。切片を無水銀ヘマトキシリンでカウンター染色し、そして流水で５分すすいだ。スライドを水性マウンティング媒体（グリセロールゼラチン）に載せた。染色された細胞の％を、良性上皮、高度PIN 及びアデノ癌腫について０〜100 ％の間で10％の間隔で記録した。
【０１０３】
良性萎縮腺は、特に炎症領域（そこでは事実上免疫反応がなかった）は最低量の染色を示した。萎縮の徴候のない過形成房腺及び良性房腺においては、往々にして管腔表層にまで広がる核のすぐ上の分泌性管腔細胞表層における顆粒模様で通常認められる、中程度から強い免疫反応性があった。尿道又はビバ・モンタヌム（viva montanum)の尿上皮の染色は、下層の腺が往々にして免疫反応性を示さないにもかかわらず、認められなかった。基底細胞は通常ネガティブであった。
【０１０４】
高度なPIN を示す検体は大半のケースにおいて細胞質全体を通じて及び細胞質先端小気胞において強い免疫反応性を示した。種々のPIN パターン間で、篩状パターンを除き免疫反応性において明確な相違はなく、かかる篩状パターンは通常、外周と比べて中央で強度が減少した。
【０１０５】
癌腫抗体は事実上全てのケースにおいて強い細胞質反応性を示した。豊富な細胞質小胞を有する細胞、例えば印環細胞及びムチンの領域は低い染色性を示した。その他では細胞質は強く染色された。最大の強度は高度アデノ癌腫において認められ(Gleasonパターン４）、それは事実上全ケースにおいて免疫反応性を示した。篩状癌腫を有する焦点は篩状PIN と、中央より外周に強めの強度がある点で類似していた。癌腫の周辺及びその手前の縁は常に強く免疫反応性であった。
【０１０６】
アンドロゲン枯渇治療を受けた患者由来の７検体において、良性萎縮房腺の大半において免疫反応性はほとんど又は全くなかったが、PIN 及びアデノ癌腫は往々にして強い細胞質染色を示した。
【０１０７】
良性上皮、高度PIN 及びアデノ癌腫におけるモノクローナル抗体HK1G586 により染色された細胞数のまとめを表３に示す。ペアー式分析、即ち、良性対PIN 、良性対癌腫、及びPIN 対癌腫は各カテゴリーについて有意な相違を示した（Ｐ＜0.001, Spearman 級相関）。
【０１０８】
【表３】
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【０１０９】
即ち、前立腺組織における細胞質hK２発現の上昇は前立腺新形成及び癌に相関する。アンドロゲン枯渇治療処置患者から獲得した前立腺由来のデーターはサンプルサイズの小ささを理由に統計学的に有意でないが、これらの患者においては、未処置患者と比べ、良性上皮、高度PIN 及びアデノ癌腫においてhK２発現の低下があった。即ち、前立腺におけるhK２発現の上昇は高度PIN 及び前立腺癌にとっての新規のマーカーである。
考  察
PSA 又はhK２についてのin vivo タンパク質プロセジング及び分泌メカニズムはわかっていない。ここに示す結果は phK２がAV12−hK２， DU145−hK２及びPC３−hK２細胞により分泌されることを示し、hK２が phK２として通常分泌され、そしてこのプロペプチドが細胞外で切断されることを示唆する。このことは phK２が生物流体の中に存在し、そしてpCa 又はBPH についての有用な診断マーカーでありうることを示唆する。
【０１１０】
hK２の突然変異形態（hK２v217）及びhK２の野生型の双方がAV12細胞から精製された。hK２は採用した精製手順に対して非常に不安定であり、それは他のプロテアーゼにより認められるように、その自己触媒特性に原因し得、そしてhK２又は phK２を免疫原及びキャリブレーターとして使用するのに十分な量で精製することを非常に困難なものとする。他方、 phK２v217は非常に安定であり、そしてトリプシン消化により、これも安定であるhK２v217に変換される。精製 phK２v217及びhK２v217はhK２及び phK２に特異的なmRNAを作製するための免疫原を担う。
【０１１１】
本発明を詳細に説明してきたが、本発明はその範囲を逸脱することなく改良及び変更されうる。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】野生型成熟hK２（SEQ ID NO : 12）及びhK３（SEQ ID NO: ７）のアミノ酸配列を示す。
【図２】野生型pphK２（それぞれSEQ ID NO : 14及びSEQ ID NO :15）、 phK２（SEQ ID NO : 16及びSEQ ID NO : 17）、並びにhK２（SEQ ID NO : 12及びSEQ ID NO : 13）のアミノ酸配列及び対応の核酸配列を示す。コドン217 (GCT, Ala)は太字で示し、そして下線を付した。
【図３】pGT 発現ベクター pGThK２及び pGThK２v217の模式図である。
【図４】phK２v217の精製に由来するクロマトグラフィープロフィールを示す。（Ａ）pphK２v217をコードするベクターでトランスフェクションされたAV12細胞由来の７日目の消費培地のDEAEクロマトグラフィー図。使用培地のサンプルを炭酸水素バッファーpH８に入れ、そして塩勾配で溶出させた。Ａ280 溶出プロフィールを実線で示す。点線は個々のカラム画分の一部のELISA アッセイの結果であり、それらの画分はマイクロタイタープレート上で乾かし、そしてウサギ抗−pphK２抗体で発色させたものである。（Ｂ）プールしたDEAE画分の疎水性相互作用プロフィール。（Ａ）のDEAEクロマトグラフィー溶出物由来の画分24〜30をプールし、濃縮し、そして 1.2Ｍの硫酸ナトリウムでHIC(疎水性相互作用カラム）に載せ、そして降下式塩勾配で溶出させた。溶出プロフィール（Ａ280 ）を実線で示す。点線は個々のカラム画分の一部のELISA アッセイ結果であり、画分はマイクロタイタープレート上で乾かし、そしてウサギ抗−hK２抗体で発色させたものである。（Ｃ）（Ｂ）からの22分ピーク由来のhK２含有画分を濃縮し、そしてPharmacia Ｓ12サイズ排除カラムに載せる。画分を集め、そして SDS／PAGEにより分析した。19.4分のピークは SDS−PAGEにより均質であることが明らかとされた。
【図５】精製したhK２及びPSA の SDS／PAGE分析である。精製 phK２v217又はPSA の 1.5mgのサンプルを１％のベーターメルカプトエタノール入りで（Ｒ）又は抜きで（Ｎ）サンプルバッファー中で煮沸した。サンプルを４〜20％のゲル上で SDS／PAGEにかけた。タンパク質バンドはゲルを銀染色により識別化した。
【図６】phK２v217のコンコナバリンＡ染色を示す。 phK２の推定位置を矢印で示す。ZCE(抗−CEAmAb) 及びBSA をそれぞれグリコシル化及び非グリコシル化タンパク質の例として含ませた。 phK２レーンにおける推定位置でのバンドの存在はこのタンパク質がグリコシル化されていることを実証する。
【図７】トリプシン切断によるプロから成熟hK２v217に至る変換を示す。トリプシン（１％  ｗ／ｗ）を phK２v217と10分間37℃において10mMの硼酸バッファーpH８中でインキュベーションし、次いで HIC−HPLCにかけた。破線はトリプシンとのインキュベーション前の phK２v217のプロフィールを示す。実線はトリプシン消化後の phK２のプロフィールである。プロフィールを対比のために重ね合わせた。二形態の同一性はタンパク質のＮ末端配列決定により確認した。
【図８】モノクローナル抗体(mAb) hK1G586.1 を利用する精液のウェスタンブロット分析を示す。処理済みの精液をPBS の中で１：１に希釈し、そして10,000×ｇで20分遠心分離した。上清液をPhastSystem (Pharmacia) を用い８〜25％のゲル上での SDS／PAGEにかけた。タンパク質をニトロセルロースに転写し、そしてプロテインＧ精製したHK1G586.1(１μｇ／ml）、次いでヤギ抗−マウス IgG−HRP(１：1000）とインキュベーションした。このブロットをECL 検出システム（Amersham) を用いて展開させた。
【図９】AV12細胞におけるhK２発現の経時的研究を示す。AV12−hK２クローン＃27を約60〜70％の集密度に至るまで増殖させ、次いで細胞をHBSSで洗い、そして無血清HH４培地を添加した。消費培地を毎日抜き取り、濃縮し、そして12％のゲル上での SDS／PAGEにかけた。タンパク質をエレクトロブロッティングし、そして phK２及びhK２（１：1000）の双方を検出するモノクローナル抗体HK1D106.4、又は phK２（１：1000）を検出するHK1G464.3 、次いでヤギ抗−マウス IgG−HRP(１：500)とプロービングした。このブロットをECL(Amersham) により、その製造者の仕様に従って展開した。精製した phK２v217及びhK２v217をコントロールとして用いた。hK２の位置は矢印で示す。
【図１０】トランスフェクションしたAV12細胞におけるhK２の変異形態の発現の経時的研究である。約60〜70％の集密度において、AV12−hK２v217細胞をHBSSで洗い、そして無血清HH４培地を加えた。消費培地を毎日抜き取り、濃縮し、そして12％ゲル上で SDS／PAGEにかけた。タンパク質をエレクトロブロッティングし、そしてモノクローナル抗体HK1D106.4 及びHK1G464.3 でプロービングした。ヤギ抗−マウス IgG−HRP(１：500)を第二抗体として用い、そしてブロットをECL(Amersham) により製造者の仕様に従って展開した。精製した phK２v217及びhK２v217をコントロールとして用いた。hK２の位置を矢印で示す。
【図１１】経時的なhK２発現及び細胞生存率のプロットである。AV12−hK２クローン＃27を60〜70％の集密度に至るまで増殖させ、HBSSで洗い、そして無血清HH４培地を加えた。消費培地を毎日抜き取り、そしてhK２濃度を第一抗体としてのHK1D106.4 又はHK1G464.3 及び第二抗体としてのヤギ抗−マウス IgG−HRP を用いるELISA により測定した。反応をOPD (Sigma, St. Louis, MO)で発色させた。生存細胞をトリパンブルー色素排出を利用して毎日計測した。
【図１２】PC３及びDU145 細胞におけるhK２の発現を示す。 pGThK２でトランスフェクションしたPC３及びDU145 細胞を約60〜70％の集密度に至るまで増殖させ、洗浄し、そして無血清HH４培地の中に再懸濁した。 pGThK２トランスフェクションしたDU145 細胞の消費培地を再懸濁の３日後に集め、そして pGThK２トランスフェクションしたPC３細胞の消費培地は再懸濁の５日後に集めた。上記の通りにしてタンパク質をエレクトロブロッティングし、そしてHK1D106.4又はHK1G464.3 でプロービングした。精製 phK２v217及び phK２v217をコントロールとして用いた。hK２の位置を矢印で示す。
【図１３】選定のhK２含有AV12クローンによるhK２の発現を示す。hK２含有AV12クローン番号10, 27, 31及び32を含む細胞を約60〜70％の集密度に至るまで増殖させ、そしてHBSSで洗い、次いで無血清HH４培地を加えた。無血清培地を添加して７日後に消費培地を抜き取り、濃縮し、そして12％のゲル上での SDS／PAGEにかけた。タンパク質をエレクトロブロッティングし、そしてHK1D106.4 及びHK1G464.3 でプロービングした。ヤギ抗−マウス IgG−HRP(１：500)を第二抗体として用い、そしてブロットをECL(Amersham) によりその製造者の仕様に従って展開した。精製した phK２v217及びpK２v217をコントロールとして用いた。hK２の位置を矢印で示す。
【図１４】選定のAV12−hK２v217クローンにおける phK２v217の発現を示す。AV12クローン番号２，３，４，45及び48由来の細胞を約60〜70％の集密度に至るまで増殖させ、そしてHBSSで洗い、そして無血清HH４培地を加えた。無血清培地を添加して７日後に消費培地を抜き取り、濃縮し、そして12％のゲル上での SDS／PAGEにかけた。タンパク質をエレクトロブロッティングし、そしてHK1D106.4 及びHK1G464.3 でプロービングした。ヤギ抗−マウス IgG−HRP(１：500)を第二抗体として用い、そしてそのブロットをECL(Amersham) により製造者の仕様に従って展開した。精製 phK２v217及びpK２v217をコントロールとして用いた。hK２の位置は矢印で示す。
【図１５】hK２の残基 210〜236 に対するhK２v217，hK２及びPSA のアミド分解特異性を示す。合成ペプチド（0.63mM）を37℃で一夜１μｇ／mlのhK２，40μｇ／mlのhK２v217又は 100μｇ／mlのPSA で消化し、そして消化生成物をRP−HPLCにより分離した。ピークを標準化して切断の定性的態様を比較した。
【図１６】様々なペプチド基質に対するhK２及びPSA の特異性を示す。白抜き矢印はPSA により切断したペプチド結合を示し；黒塗り矢印はhK２により切断した結合を示す。ペプチド＃１はhK２のアミノ酸残基 210〜236 を示す。ペプチド＃２はアンジオテンシノーゲンのアミノ酸残基１〜14、即ち、レニン基質テトラデカペプチドを示す。ペプチド＃３は phK２のアミノ酸残基−７〜＋７を示す。ペプチド＃４はhK２のアミノ酸残基41〜56を示す。ペプチド＃５はインスリンの酸化型ベーター鎖のアミノ酸配列を示す。ペプチド＃６はPMSAのアミノ酸残基 196〜213 を示す。
【図１７】hK２v217ではなく、hK２による phK２v217の活性化を示す。 phK２v217はhK２v217には存在しない配列であるプロリーターペプチド配列VPLIQSR を含む。パネルＡは１％  ｗ／ｗのhK２とインキュベーションした phK２v217を示す。パネルＢは phK２v217と６時間インキュベーションした40％  ｗ／ｗのhK２v217によるコントロールである。
【図１８】プロテアーゼインヒビターとインキュベーションしたhK２のウェスタンブロット分析を示す。各サンプルを８〜25％勾配 SDS−PAGEで分離し、ブロッティングし、そしてHK1G586.1 でプロービングした。hK２を37℃で４時間、下記のインヒビターとインキュベーションした：レーン１：アンチキモトリプシン(ACT) ；レーン２：アルファー２−アンチプラスミン；レーン３：アンチトロンビンIII ；レーン４：アルファー１−プロテアーゼインヒビター（アンチトリプシン）；レーン５：アルファー２−マクログロブリン；レーン１及び２は90〜100kD の推定Mrの共有複合体を示す。セルピンインヒビターは20μＭで、マクログロブリンは 2.8μＭで、そしてhK２は 0.175μＭで使用した。レーン５はhK２とアルファー２−マクログロブリンとの共有複合体形成を示す高Mr複合体を示す。
【図１９】ヒト血清中でのhK２の複合体形成を示す。hK２及びPSA のウェスタンブロットをヒト血清とインキュベーションした。hK２サンプルをHK1G586.1 により、そしてPSA サンプルをPSM773抗−PSAmAbでプロービングした。レーン１〜６はhK２サンプルを含み、そしてレーン７及び８はPSA サンプルを含む。レーン１はhK２コントロールである。レーン２はACT と４時間インキュベーションしたhK２を含む。レーン３はプロテアーゼの添加していない血清コントロールを示す。レーン４は血清と15分インキュベーションしたhK２を含む。レーン５は血清と４時間インキュベーションしたhK２を示す。レーン６は精製アルファー２マクログロブリンと４時間インキュベーションしたhK２を含む。レーン７は血清と４時間インキュベーションしたPSA を含む。レーン８は精製アルファー２−マクログロブリンと４時間インキュベーションしたPSA を含む。
【図２０】未処理ヒト前立腺のモノクローナル抗体hK1G586 の免疫反応性。ｎ＝257 。
【図２１】アンドロゲン枯渇治療−処理ヒト前立腺のモノクローナル抗体hK1G586 の免疫反応性。ｎ＝７。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月17日(2006.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型hK２ポリペプチドと比べて少なくとも１個のアミノ酸置換を有し、そしてこの置換がそのポリペプチド変異体を対応の野生型成熟hK２ポリペプチドよりも精製に対してより安定なものにする、単離精製されたプレ−プロ又はプロhK２ポリペプチド変異体に特異的に結合し、そしてhK３には結合しない抗体。
【請求項２】
hK２ポリペプチド変異体にも結合する、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
前記野生型hK２ポリペプチドのプレ−プロ又はプロ形態にも結合する、請求項１記載の抗体。
【請求項４】
hK２ポリペプチド変異体の成熟形態には結合しない、請求項１記載の抗体。
【請求項５】
183位のアスパラギン酸、 206位のグリシン、 217位のアラニン、 189位のセリン、96位のアスパラギン酸、41位のヒスチジン、 205位のセリン、 204位のトリプトファン、 187位のグリシン及び 188位のアスパラギン酸より成る群から選ばれるアミノ酸置換を有し、ここでこの置換はこのポリペプチド変異体を野生型成熟hK２ポリペプチドよりも精製に対して安定なものにする、単離精製された成熟hK２ポリペプチド変異体に特異的に結合し、そしてhK３には結合しない抗体。
【請求項６】
野生型hK２ポリペプチドの成熟形態にも結合する、請求項５記載の抗体。
【請求項７】
hK２ポリペプチド変異体のプロ形態又は野生型hK２ポリペプチドのプロ形態には結合しない、請求項５記載の抗体。
【請求項８】
hK２ポリペプチド変異体のプレ−プロ形態又は野生型hK２ポリペプチドのプレ−プロ形態には結合しない、請求項５記載の抗体。
【請求項９】
モノクローナル抗体である請求項１又は５記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１又は５記載の抗体を含んで成るポリクローナル抗体調製品。
【請求項１１】
請求項１又は５記載の抗体より本質的に成るモノクローナル抗体調製品。
【請求項１２】
請求項１又は５記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。