(57)【要約】【課題】抗原ペプチドとＭＨＣ結合部位とが安定に結合されたペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を得ること。【解決手段】本発明のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は、ペプチド結合グルーブを形成するＭＨＣセグメントと、前記ペプチド結合グルーブに結合する抗原ペプチドと、少なくとも８のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むリンカーとからなり、該ペプチドは該リンカーによってＭＨＣクラスＩＩのα鎖及びβ鎖のうちの一方のＮ−末端と共有結合的に結合され、前記リンカーは、該ペプチドと該ペプチド結合グルーブとの結合を促進する。更に、該ＭＨＣクラスＩＩのα鎖及びβ鎖のうちの少なくとも一つと、該抗原ペプチドと、該リンカーとは、単一の核酸分子によってコード化され、該核酸分子は該抗原ペプチドのＮ−末端に付着されるシグナルセグメントをコード化する核酸配列を含む。【選択図】図２
2006094862.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１．ａ）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖の少なくとも一部とＭＨＣクラスＩＩα鎖の少なくとも一部とを含み、かつペプチド結合グルーブを形成するＭＨＣセグメントと、
ｂ）前記ペプチド結合グルーブに結合するとともに５から４０の間のアミノ酸残基からなる抗原ペプチドと、
ｃ）少なくとも８のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むリンカーと、
からなる分離されたペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子において、
前記ペプチドは前記リンカーによって前記ＭＨＣクラスＩＩα鎖及び前記ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のうちの一方のＮ−末端と共有結合的に結合されることと、前記リンカーは、前記ペプチド及び前記ＭＨＣセグメントがペプチド−Ｌ−ＭＨＣヘテロダイマーとＴ細胞レセプターとの間の相互作用を妨げることなく該Ｔ細胞レセプターによって認識されるコンフォメーションを形成するように、該ペプチドと前記ペプチド結合グルーブとの結合を促進することと、
前記ＭＨＣクラスＩＩα鎖及び前記ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のうちの少なくとも一つと、前記抗原ペプチドと、前記リンカーとは、単一の核酸分子によってコード化されることと、前記核酸分子は前記抗原ペプチドのＮ−末端に付着されるシグナルセグメントをコード化する核酸配列を含むことと、
を備える分離されたペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子。
【請求項２】
前記リンカーは少なくとも１５のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなる請求項１に記載の分離されたペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子。
【請求項３】
ａ）ＭＨＣクラスＩα鎖の少なくとも一部とＭＨＣクラスＩβ２ｍ鎖の少なくとも一部とを含み、かつペプチド結合グルーブを形成するＭＨＣセグメントと、
ｂ）前記ペプチド結合グルーブに結合するとともに８から２０の間のアミノ酸残基からなる抗原ペプチドと、
ｃ）少なくとも８のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むリンカーと、
からなる分離されたペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子において、
前記ペプチドは前記リンカーによって前記ＭＨＣクラスＩα鎖及び前記ＭＨＣクラスＩβ２ｍ鎖のうちの一方のＮ−末端と共有結合的に結合されることと、前記リンカーは、前記ペプチド及び前記ＭＨＣセグメントがペプチド−Ｌ−ＭＨＣヘテロダイマーとＴ細胞レセプターとの間の相互作用を妨げることなく該Ｔ細胞レセプターによって認識されるコンフォメーションを形成するように該ペプチドと前記ペプチド結合グルーブとの結合を促進することと、
前記ＭＨＣクラスＩα鎖及び前記ＭＨＣクラスＩβ２ｍ鎖のうちの少なくとも一つと、前記抗原ペプチドと、前記リンカーとは、単一の核酸分子によってコード化されることと、前記核酸分子は前記抗原ペプチドのＮ−末端に付着されるシグナルセグメントをコード化する核酸配列を含むことと、
を備える分離されたペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子からなるＴ細胞活性を抑制するための製剤であって、前記ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は、Ｔ細胞活性を媒介する二次蛋白質を備えていない細胞の原形質膜に固定される製剤。
【請求項５】
ａ）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖の少なくとも一部とＭＨＣクラスＩＩα鎖の少なくとも一部とを含み、かつペプチド結合グルーブを形成するＭＨＣセグメントと、
ｂ）前記ペプチド結合グルーブに結合するとともに５から４０の間のアミノ酸残基からなる抗原ペプチドと、
ｃ）少なくとも８のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むリンカーと、からなるペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子をコード化する核酸配列からなる核酸分子であって、
前記ペプチドは前記リンカーによって前記ＭＨＣクラスＩＩα鎖及び前記ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のうちの一方のＮ−末端と共有結合的に結合されることと、前記リンカーは、前記ペプチド及び前記ＭＨＣセグメントがペプチド−Ｌ−ＭＨＣヘテロダイマーとＴ細胞レセプターとの間の相互作用を妨げることなく該Ｔ細胞レセプターによって認識されるコンフォメーションを形成するように、該ペプチドと前記ペプチド結合グルーブとの結合を促進することと、
前記核酸分子は前記抗原ペプチドのＮ−末端に共有結合的に付着されるシグナルセグメントをコード化する核酸配列を含むことと、
を備える核酸分子。
【請求項６】
前記リンカーは少なくとも１５のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなる請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
ａ）ＭＨＣクラスＩα鎖の少なくとも一部とＭＨＣクラスＩβ２ｍ鎖の少なくとも一部とを含み、かつペプチド結合グルーブを形成するＭＨＣセグメントと、
ｂ）前記ペプチド結合グルーブに結合するとともに８から２０の間のアミノ酸残基からなる抗原ペプチドと、
ｃ）少なくとも８のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むリンカーと、からなるペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子をコード化する核酸配列からなる核酸分子であって、
前記ペプチドは前記リンカーによって前記ＭＨＣクラスＩα鎖及び前記ＭＨＣクラスＩβ２ｍ鎖のうちの一方のＮ−末端と共有結合的に結合されることと、前記リンカーは、前記ペプチド及び前記ＭＨＣセグメントがペプチド−Ｌ−ＭＨＣヘテロダイマーとＴ細胞レセプターとの間の相互作用を妨げることなく該Ｔ細胞レセプターによって認識されるコンフォメーションを形成するように、該ペプチドと前記ペプチド結合グルーブとの結合を促進することと、
前記核酸分子は前記抗原ペプチドのＮ−末端に共有結合的に付着されるシグナルセグメントをコード化する核酸配列を含むことと、
を備える核酸分子。
【請求項８】
発現ベクターに作動的に連結された核酸分子からなる組み換え体分子を有する組み換え体細胞であって、前記核酸分子は請求項５又は請求項７に記載のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子をコード化する核酸配列からなる組み換え体細胞。
【請求項９】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を含むＴ細胞活性を調整するための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、抗原ペプチドに安定して連結された主要組織適合遺伝複合体（ＭＨＣ）を利用するＴ細胞の活性化を調整するための製品及び製法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多くの内科療法は、患者の免疫反応の調整を必要とする。このような療法は、例えば、自己免疫疾患、免疫不全疾患及び免疫増殖疾患のための療法や、器官及び皮膚の移植を伴う療法を含む。患者の免疫反応を調整するのに使われる伝統的な試薬や方法は、しばしば好ましくない影響をもたらす。例えば、免疫抑制試薬、サイクロスポリンＡ、アザチオプリン及びプレドニゾンのようなものは、自己免疫疾患を伴った患者の免疫システム、或いは移植組織を受けた患者を鎮静するために使われる。しかし、このような試薬は患者の免疫反応全体を鎮静することから、その結果として、患者が起源病でない病原菌に対抗する免疫反応を保有するための能力を損なう。このような有害な影響や免疫調整に係る療法の重要性を理由に、免疫システムの特定部分を調整するための試薬や方法が、長年の間、研究の対象とされてきた。
【０００３】
宿主への抗原の導入は、免疫反応において完結する一連の事象を起こさせる。加えて、自己宿主の抗原は免疫反応の活性化を可能にする。免疫反応の大部分は、主要組織適合遺伝複合体（ＭＨＣｓ）による抗原の提示により調整される。ＭＨＣｓは、Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体により認識された複合体を形成するための抗原から得られたペプチドフラグメンツに結びつき、ＭＨＣにより限定されたＴ細胞を認識する現象をもたらす。与えられた抗原（応答性）に反応する宿主の能力は、宿主により示されたＭＨＣタンパク質のスペクトルに影響を受ける。応答性は、特別なＭＨＣタンパク質に結合するための特定のペプチドフレグメンツの能力に関連する。
【０００４】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲｓ）は、ＭＨＣにより束縛を受けた抗原を認識する。ＴＣＲによりペプチドと合成されたＭＨＣ（ＭＨＣ−ペプチド合成物）の認識は、ＴＣＲをもたらすＴ細胞の活性化を有効にすることができる。このように、ＭＨＣ−ペプチド合成物は、Ｔ細胞活性化の調整において、免疫反応の調整に重要である。
【０００５】
この発明以前には、ＭＨＣ−ペプチド合成物は製造が難しいことが明らかにされており、それ故に、大量生産は高価につく。人工に又は生体内で誘導されたペプチドは、内科使用のために要求される安定性及び信頼性を有する合成物のために考慮された方法によってはＭＨＣに結合しない。ＭＨＣ−ペプチド合成物は、膜結合のＭＨＣタンパクを表し、遊離されたタンパクを精製されたペプチドと溶解状態で混ぜ合わせる多数の細胞からＭＨＣタンパクを遊離することにより、目下、製造されている。ＭＨＣタンパクを分離することは骨の折れる仕事であり、複数の工程を必要とする方法であり、充分な量のＭＨＣタンパクを得るためには多数の細胞を必要とする。加えて、ＭＨＣタンパクと混ぜ合わせるために精製されたペプチドを得るにはかなりの労力が必要である。更に、個々のペプチドとＭＨＣとの間の結合は、不安定であることが示されている。
【０００６】
特別なＭＨＣペプチド合成物とそれらの製造方法は、様々な研究者、即ち１９９３年１１月９日に査定になった米国特許５，２６０，４２２号のクラーク等、１９９３年３月１６日に査定になった米国特許５，１９４，４２５号のシャルマ等、１９９２年７月１４日に査定になった米国特許５，１３０，２９７号のシャルマ等、１９９３年５月２７日に公開になったＰＣＴ出願ＷＯ９３／０９８１０号のナグ等、１９８３年８月２３日に公開になった米国出願４，４００，３７６号のサンダーソンによって提案されている。しかしながら、従前の研究者は、結合膜に対立するものとして、溶性のＭＨＣペプチド合成物を開示しただけである。更に、そのような合成物を製造する方法は、ＭＨＣとペプチドとの予測できない不安定な結合の害をこうむる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような理由で、ペプチドがＭＨＣタンパクと安定して結合されるところの溶性で膜結合された大量のＭＨＣ−ペプチド合成物に係る価格的に有利な生産を考慮に入れた製品及び製法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、ａ）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖の少なくとも一部とＭＨＣクラスＩＩα鎖の少なくとも一部とを含み、かつペプチド結合グルーブを形成するＭＨＣセグメントと、該ペプチド結合グルーブに結合するとともに５から４０の間のアミノ酸残基からなる抗原ペプチドと、ｃ）少なくとも８のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むリンカーと、からなる分離されたペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子において、該ペプチドは該リンカーによって該ＭＨＣクラスＩＩα鎖及び該ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のうちの一方のＮ−末端と共有結合的に結合されることと、該リンカーは、該ペプチド及び該ＭＨＣセグメントがペプチド−Ｌ−ＭＨＣヘテロダイマーとＴ細胞レセプターとの間の相互作用を妨げることなく該Ｔ細胞レセプターによって認識されるコンフォメーションを形成するように、該ペプチドと該ペプチド結合グルーブとの結合を促進することと、該ＭＨＣクラスＩＩα鎖及び該ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のうちの少なくとも一つと、該抗原ペプチドと、該リンカーとは、単一の核酸分子によってコード化されることと、該核酸分子は該抗原ペプチドのＮ−末端に付着されるシグナルセグメントをコード化する核酸配列を含むことと、を備える分離されたペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を提供する。
【０００９】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の分離されたペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子において、該リンカーは少なくとも１５のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなることをその要旨とする。
【００１０】
請求項３に記載の発明は、ａ）ＭＨＣクラスＩα鎖の少なくとも一部とＭＨＣクラスＩβ２ｍ鎖の少なくとも一部とを含み、かつペプチド結合グルーブを形成するＭＨＣセグメントと、ｂ）該ペプチド結合グルーブに結合するとともに８から２０の間のアミノ酸残基からなる抗原ペプチドと、ｃ）少なくとも８のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むリンカーと、からなる分離されたペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子において、該ペプチドは該リンカーによって該ＭＨＣクラスＩα鎖及び該ＭＨＣクラスＩβ２ｍ鎖のうちの一方のＮ−末端と共有結合的に結合されることと、該リンカーは、該ペプチド及び該ＭＨＣセグメントがペプチド−Ｌ−ＭＨＣヘテロダイマーとＴ細胞レセプターとの間の相互作用を妨げることなく該Ｔ細胞レセプターによって認識されるコンフォメーションを形成するように該ペプチドと該ペプチド結合グルーブとの結合を促進することと、該ＭＨＣクラスＩα鎖及び該ＭＨＣクラスＩβ２ｍ鎖のうちの少なくとも一つと、該抗原ペプチドと、該リンカーとは、単一の核酸分子によってコード化されることと、該核酸分子は該抗原ペプチドのＮ−末端に付着されるシグナルセグメントをコード化する核酸配列を含むことと、を備える分離されたペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を提供する。
【００１１】
請求項４に記載の発明は、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子からなるＴ細胞活性を抑制するための製剤であって、該ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は、Ｔ細胞活性を媒介する二次蛋白質を備えていない細胞の原形質膜に固定される製剤を提供する。
【００１２】
請求項５に記載の発明は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖の少なくとも一部とＭＨＣクラスＩＩα鎖の少なくとも一部とを含み、かつペプチド結合グルーブを形成するＭＨＣセグメントと、ｂ）該ペプチド結合グルーブに結合するとともに５から４０の間のアミノ酸残基からなる抗原ペプチドと、ｃ）少なくとも８のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むリンカーと、からなるペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子をコード化する核酸配列からなる核酸分子であって、該ペプチドは該リンカーによって該ＭＨＣクラスＩＩα鎖及び該ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のうちの一方のＮ−末端と共有結合的に結合されることと、該リンカーは、該ペプチド及び該ＭＨＣセグメントがペプチド−Ｌ−ＭＨＣヘテロダイマーとＴ細胞レセプターとの間の相互作用を妨げることなく該Ｔ細胞レセプターによって認識されるコンフォメーションを形成するように、該ペプチドと該ペプチド結合グルーブとの結合を促進することと、該核酸分子は該抗原ペプチドのＮ−末端に共有結合的に付着されるシグナルセグメントをコード化する核酸配列を含むことと、を備える核酸分子を提供する。
【００１３】
請求項６に記載の発明は、請求項５に記載の核酸分子において、該リンカーは少なくとも１５のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなることをその要旨とする。
請求項７に記載の発明は、ａ）ＭＨＣクラスＩα鎖の少なくとも一部とＭＨＣクラスＩβ２ｍ鎖の少なくとも一部とを含み、かつペプチド結合グルーブを形成するＭＨＣセグメントと、ｂ）該ペプチド結合グルーブに結合するとともに８から２０の間のアミノ酸残基からなる抗原ペプチドと、ｃ）少なくとも８のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むリンカーと、からなるペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子をコード化する核酸配列からなる核酸分子であって、該ペプチドは該リンカーによって該ＭＨＣクラスＩα鎖及び該ＭＨＣクラスＩβ２ｍ鎖のうちの一方のＮ−末端と共有結合的に結合されることと、該リンカーは、該ペプチド及び該ＭＨＣセグメントがペプチド−Ｌ−ＭＨＣヘテロダイマーとＴ細胞レセプターとの間の相互作用を妨げることなく該Ｔ細胞レセプターによって認識されるコンフォメーションを形成するように、該ペプチドと該ペプチド結合グルーブとの結合を促進することと、該核酸分子は該抗原ペプチドのＮ−末端に共有結合的に付着されるシグナルセグメントをコード化する核酸配列を含むことと、を備える核酸分子を提供する。
【００１４】
請求項８に記載の発明は、発現ベクターに作動的に連結された核酸分子からなる組み換え体分子を有する組み換え体細胞であって、該核酸分子は請求項５又は請求項７に記載のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子をコード化する核酸配列からなる組み換え体細胞を提供する。
【００１５】
請求項９に記載の発明は、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を含むＴ細胞活性を調整するための薬剤を提供する。
この発明は新規なリンカーにより主組織適合複合体（ＭＨＣ）に対して共有結合された抗原ペプチドに関する。そのような抗原ペプチドであるため、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識されうる、単体あるいは付加的ＭＨＣタンパク鎖との結合した安定ＭＨＣ複合体の組成が可能となる。そのような安定した複合体は治療目的、或いは実験目的として有益である。
【００１６】
本発明の１つの態様は、ペプチド、リンカー及びＭＨＣセグメントを備えてなるペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を含んでいる。ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子の一部のペプチドはリンカーによりＭＨＣセグメントに対して共有結合されている。更に、本発明の１つの面は本発明のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を生産する手段を含む。
【００１７】
本発明の１つの実施例はペプチド、リンカー及びＭＨＣクラスＩα鎖を備えるＭＨＣセグメントを備えてなるペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を含んでいる。好適な実施例において、ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は更にペプチド結合の官能基領域を有するペプチド−Ｌ−ＭＨＣα＋β２ｍ組成物を組成するためにＭＨＣクラスＩα鎖と結合するＭＨＣクラスＩβ２ｍサブユニットを含む。
【００１８】
他の実施例はペプチド、リンカー及びＭＨＣクラスＩＩβ鎖を備えるＭＨＣセグメントを備えてなるペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を含んでいる。好適な実施例において、ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は更にペプチド結合の官能基領域を有するペプチド−Ｌ−ＭＨＣα＋β組成物を組成するためにＭＨＣクラスＩＩβ鎖と結合するＭＨＣクラスＩＩαを含む。
【００１９】
更に本発明は、適合した担体と結合したペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を含んだ免疫反応を起させうる調剤として導かれる。そのような調剤は薬剤として例えば、自己免疫疾患、免疫刺激性疾患、免疫細胞増殖性疾患、移植拒絶等の病気の療法として有益である。また、調剤は実験試薬として有益である。１つの実施例では前記本発明の組成と分子とがＴ細胞反応を引き起こすことができない細胞の原形質膜に留め置かれている。Ｔ細胞反応を引き起こすことができない細胞は赤血球、繊維芽細胞、多分化能性前駆細胞、上皮細胞、神経細胞を含む。
【００２０】
他の実施例では前記本発明の組成と分子とがＴ細胞反応を引き起こすことができる細胞の原形質膜に留め置かれている。Ｔ細胞反応を引き起こすことができる細胞は、マイクロファージ、Ｂ細胞そして樹状細胞である。
【００２１】
本発明の１つの実施例ではペプチド−Ｌ−ＭＨＣα＋β２ｍ組成物がＴ細胞反応を引き起こすことができる細胞の原形質膜に留め置かれており、またＴ細胞反応を引き起こすことができない細胞の原形質膜に留め置かれている。本発明の他の実施例ではペプチド−Ｌ−ＭＨＣα＋β組成物がＴ細胞反応を引き起こすことができる細胞の原形質膜に留め置かれており、またＴ細胞反応を引き起こすことができない細胞の原形質膜に留め置かれている。
【００２２】
本発明の他の態様では、リンカーによりＭＨＣセグメントへ結合されたペプチド−を有する連続してコード化を行うペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を核酸分子は含んでいる。また、本発明では本発明の核酸分子と本発明の核酸分子を生産する方法を有する組換え体分子と組換え体細胞を含む。
【００２３】
本発明の他の態様では、リンカーによりＭＨＣセグメントへ結合された抗原ペプチド−を有するペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子及び／又はリンカーによりＭＨＣセグメントへ結合された抗原ペプチド−を有する組換え体分子をコード化するペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を有する化合物を含む薬剤を、動物に対する効果的な量だけ投与して免疫反応を調整する手段を含む。
【００２４】
特に、手段は赤血球、繊維芽細胞、多分化能性前駆細胞、上皮細胞、神経細胞からなるグループから選択された、好ましくは赤血球の細胞の表面に組換え体分子によってコード化されたタンパクが現れるような手法により組換え体分子を分配することを含む。この手段によって、動物は薬剤によって耐性化されうる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、本発明のリンカーを用いることにより、抗原ペプチドとＭＨＣ結合部位との結合が妨害されることもなく、しかもＴ細胞レセプターの認識を妨げることもない非常に安定かつ有用なペプチド−Ｌ−ＭＨＣ複合体を得ることができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は免疫応答を制御するための新たな生成物及び制御方法に関する。本発明は少なくとも３つの成分、即ち（１）免疫応答を形成し得る抗原ペプチド（ペプチド）と、（２）リンカー（Ｌ）と、（３）主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）セグメントとを有する新たなペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を含む。ペプチドはリンカーを介してＭＨＣセグメントに結合される。本発明はリンカーを介してＭＨＣタンパクに共有結合された抗原ペプチドを提供し、これにより安定したＭＨＣ及びペプチドの複合体（以下、安定ＭＨＣ−ペプチド複合体と称する）の形成を促進する点において効果的である。α／βＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は安定ＭＨＣ−ペプチド複合体を単独または別のＭＨＣタンパク鎖との組合せにおいて認識し得る。本発明に基づく新たなペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は単独または別のＭＨＣタンパク鎖との組合せにより機能ペプチド結合部位（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を形成し得る。この結果、ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子はＴ細胞受容体に対する結合が可能である。Ｔ細胞受容体に結合し得るペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子の実施の形態は以下に詳述するペプチド−Ｌ−ＭＨＣα＋β２ｍ組成物及びペプチド−Ｌ−ＭＨＣα＋β組成物を含む。図１はＭＨＣタンパクの結合部位に結合し、かつ同ＭＨＣタンパクに共有結合している抗原ペプチドの概略図である。
【００２７】
主要組織適合性複合体は主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパクと称する糖タンパクをコードする遺伝子の集合体である。生体内におけるＭＨＣタンパクの主な役割はＴＣＲが認識し得る形態をなす抗原を提供することにある。ＭＨＣタンパクはＭＨＣ−ペプチド複合体を形成すべく、抗原ペプチドの形態をなす抗原に結合し得る。本明細書中において、"ＭＨＣ−ペプチド複合体"はＭＨＣタンパクの１つまたは複数のペプチド結合部位に結合した抗原ペプチドを有する任意のＭＨＣタンパクを意味する。
【００２８】
本明細書中において、"ＴＣＲ認識"とはＭＨＣペプチド複合体に結合するＴＣＲの能力を意味する。Ｔ細胞に対してＭＨＣタンパクを含む抗原を提供した場合、クローン特異性を示すＴ細胞応答が常には生じる。正常なＴ細胞はＴ細胞ハイブリドーマとは区別される。Ｔ細胞ハイブリドーマはその活性化反応において正常なＴ細胞と異なる。本明細書中において、"抗原提示（Ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）"とは少なくとも一部をＴＣＲに結合させ得る抗原を提示することを意味する。Ｔ細胞応答は抗原ペプチドに結合したＭＨＣタンパクをＴＣＲが認識した際に生じ、これによりＴＣＲを有するＴ細胞の作用が変化する。本明細書中において、"Ｔ細胞応答"とはＭＨＣ−ペプチド複合体がＴ細胞上のＴＣＲに結合した際に生じる活性化、アネルギーの誘発及びＴ細胞の死のうちのいずれか１つを意味し得る。本明細書中において、Ｔ細胞の"活性化"とはＴ細胞内のシグナル導入経路の誘発を意味する。そして、この誘発によりＴ細胞は細胞生成物（例：インターロイキン２）を生成する。"アネルギー"とは抗原に対するＴ細胞の反応低下を意味する。例えば、活性化及びアネルギーはＭＨＣ−ペプチド複合体が細胞のＴＣＲに結合した後でＴ細胞が生成したＩＬ−２の量を測定することにより測定し得る。アネルギー細胞（Ａｎｅｒｇｉｃ  ｃｅｌｌｓ）は刺激されたＴ細胞より更に少ない量のＩＬ−２を生成する。アネルギーＴ細胞の活動の低下を測定する別の方法は、Ｔ細胞のＴＣＲ結合が発生した後で同Ｔ細胞が引き起こす細胞内カルシウム移動及び／または細胞外カルシウム移動を測定することを含む。本明細書中において、"Ｔ細胞の死"とはＴ細胞のほぼ全ての機能が永久停止した状態を意味する。
【００２９】
ＭＨＣタンパクは２つの種類、即ち、ＭＨＣクラスＩタンパク及びＭＨＣクラスＩＩタンパクに分類される。ＭＨＣクラスＩタンパクは膜内在性タンパク（Ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、同膜内在性タンパクは糖タンパク重鎖を含む。糖タンパク重鎖は３つの細胞外ドメイン（即ち、α１、α２及びα３）と、２つの細胞内ドメイン（即ち、膜内外ドメイン（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ；ＴＭ）及び細胞質ドメイン（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ；ＣＹＴ））とを有する。重鎖はβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）と称される可溶性サブユニットに対して非共有結合している。ＭＨＣクラスＩＩタンパクは非共有結合した１つのα鎖及び１つのβ鎖を有するヘテロダイマー膜内在性タンパク（Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）である。α鎖は２つの細胞外ドメイン（α１及びα２）及び２つの細胞内ドメイン（ＴＭドメイン及びＣＹＴドメイン）を有する。β鎖は２つの細胞外ドメイン（β１及びβ２）と、ＴＭ及びＣＹＴドメインとを有する。
【００３０】
抗原ペプチドはＭＨＣタンパクのペプチド結合部位への結合を介して同ＭＨＣタンパクに結合している。本明細書中において、"ペプチド結合部位"とはペプチドに結合し得るＭＨＣタンパクの部分を示す。ペプチド結合部位は内部結合部位（例：ペプチド結合グルーブ）または外部結合部位（例：ＭＨＣタンパクの外面に位置する結合部位）であり得る。ＭＨＣタンパク及びペプチドのうちの少なくともいずれか一方に対するＴＣＲの結合に重要な意味を持つアミノ酸残基の適切な整合を可能にすべく、ペプチド結合部位の立体配位を抗原ペプチドが結合した後で変更し得る。
【００３１】
クラスＩタンパク及びクラスＩＩタンパクのドメイン構成はペプチド結合部位を形成する。本発明の１つの実施の形態において、ペプチド結合部位はペプチド結合グルーブを有する。ペプチド結合グルーブはペプチドを結合させ得るキャビティを形成するＭＨＣタンパクの部分である。クラスＩタンパクのペプチド結合グルーブはα１ドメインの一部及びα２ドメインの一部を有する。クラスＩＩタンパクの結合グルーブは２つのβ−プリーツ・シート及び２つのαヘリックスを形成し得るα１ドメインの一部及びβ１ドメインの一部を含み得る。学説との結び付きはないが、α１ドメインの第１の部分及び第２の部分は第１のβ−プリーツ・シート及び第１のαヘリックスをそれぞれ形成すると考えられる。β１ドメインの第１の部分及び第２の部分は第２のβ−プリーツ・シート及び第２のαヘリックスをそれぞれ形成する。タンパクの結合グルーブにペプチドが結合した状態にあるクラスＩＩタンパクのＸ線結晶学的構造は、結合したペプチドの一方の端部または両方の端部がＭＨＣタンパクから延出し得ることを示す（１９９３年に発行されたネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ）第３６４刊の３３〜３９頁に記載されているブラウン他の記述を参照）。従って、クラスＩＩタンパクのα１αヘリックスの端部及びβ１αヘリックスの端部は開放されたキャビティを形成し、同キャビティは結合グルーブに結合したペプチドの端部がキャビティ内へ埋没することがないよう形成されている。更に、β鎖の最初の４つのアミノ酸残基をＸ線結晶学に基づいて割り当てられないため、クラスＩＩタンパクのＸ線結晶学的構造はＭＨＣβ鎖のＮ末端がＭＨＣタンパクの側部から無秩序に突出していることを示す。
【００３２】
別の実施の形態において、ペプチド結合部位は外部ペプチド結合部位を含む。外部ペプチド結合部位において、ＭＨＣタンパクの外面（ペプチド結合グルーブの大部分を含まない）は抗原ペプチドに対する結合が可能である。このような外面はＭＨＣタンパクの外面上に位置し、かつ抗原ペプチドとの結合に使用し得る任意のアミノ酸側鎖を有し得る。クラスＩタンパク上の外部結合部位はα鎖またはβ２ｍサブユニットの少なくとも一部の外面を有し得る。クラスＩＩタンパク上の外部結合部位はα鎖またはβ鎖の少なくとも一部の外面を有し得る。クラスＩＩタンパクの外部結合部位はα鎖のα１ドメインまたはα２ドメインと、β鎖のβ１ドメインまたはβ２ドメインと、これらのドメインの組合せとのうちのいずれか１つを有することが好ましい。
【００３３】
更に別の実施の形態において、結合部位は外部結合部位の一部及び結合グルーブの一部を有する"複合結合部位（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）"を含み得る。そして、複合結合部位は抗原ペプチドとの結合が可能である。
【００３４】
本発明の１つの実施の形態はペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を提供する。これは新たなペプチド−Ｌ−ＭＨＣの各種成分を個々に取り上げることにより最適に説明し得る。本発明のＭＨＣセグメントは単独またはＭＨＣタンパク鎖の適切な部分との組合せにより、ＴＣＲが認識し得る形態にて抗原ペプチドを提供し得るペプチド結合部位を形成するのに十分なＭＨＣタンパクの任意の部分であり得る。
【００３５】
１つの実施の形態において、本発明のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子のＭＨＣセグメントはクラスＩＭＨＣタンパクの少なくとも一部と、クラスＩＩＭＨＣタンパクの少なくとも一部と、これらのハイブリッドとのうちのいずれか１つを有し得る。本明細書中において、"ハイブリッド"とは１つのＭＨＣ機能タンパクを形成すべく、クラスＩＩＭＨＣタンパクの少なくとも一部に対してクラスＩＭＨＣタンパクの少なくとも一部が結合していることを意味する。本発明に基づく"少なくとも一部"とはペプチド結合部位を形成し得るか、またはＭＨＣタンパクの別の鎖を付加した後で結合部位を形成し得るＭＨＣタンパクの一部を意味する。本発明の好ましいＭＨＣセグメントはクラスＩタンパクの少なくとも一部を有するセグメントと、クラスＩＩＭＨＣタンパクの少なくとも一部を有するセグメントとを含む。
【００３６】
本発明の１つの実施の形態は可溶性ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を提供する。本発明の可溶性分子はペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を含み、同ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は脂質含有基質中に含まれない。分泌されたペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子はＭＨＣ膜内外ドメイン（ＭＨＣ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）及びＭＨＣ細胞質ドメイン（ＭＨＣ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）のうちの少なくともいずれか一方に代表される脂質含有基質内へペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子をアンカーリングし得る十分なアミノ酸配列が欠落したＭＨＣセグメントを使用して形成し得る。
【００３７】
更に別の実施の形態において、ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は脂質含有基質、好ましくはペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を形成する細胞の原形質膜に結合し得る。本明細書中において、"アンカーで固定した（Ａｎｃｈｏｒｅｄ）"という用語は脂質含有基質内へタンパクを挿入することを意味する。この結果、全ての細胞外ドメインは基質の外側に位置する。本明細書中において、脂質含有基質と結合し得る本発明のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を膜結合ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子と称する。膜結合ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子の形成に使用し得るＭＨＣセグメントはＭＨＣタンパクの細胞外ドメインに結合された脂質含有基質内へタンパクをアンカーリングし得る任意のアミノ酸配列を含み得る。ＭＨＣセグメントは少なくとも１つのＭＨＣ膜内外ドメインと、少なくとも１つのＭＨＣ細胞質ドメインの少なくとも一部とを有することが好ましい。
【００３８】
別の実施の形態において、本発明のＭＨＣセグメントはクラスＩα鎖、クラスＩＩα鎖、クラスＩＩβ鎖及びこれらのハイブリッドのうちのいずれか１つに代表される単鎖の少なくとも一部を有し得る。ハイブリッドはクラスＩＩβ鎖の一部に結合したクラスＩα鎖の一部を含む単鎖等、前記の部分の任意の組合せを含み得る。このようなＭＨＣセグメントを含むペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は機能ペプチド結合部位を有する複合体を形成すべく、ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子へ結合し得る適切なＭＨＣタンパク鎖に結合可能である。
【００３９】
本発明のクラスＩα鎖はクラスＩα１ドメイン、クラスＩα２ドメイン及びクラスＩα３ドメインを有することが好ましい。本発明のクラスＩＩα鎖はクラスＩＩα１ドメイン及びクラスＩＩα２ドメインを有することが好ましい。クラスＩＩβ鎖はβ１ドメイン及びβ２ドメインを有することが好ましい。本発明のハイブリッドＭＨＣセグメントはクラスＩα鎖の少なくとも一部と、クラスＩＩβ鎖の少なくとも一部とを有することが好ましい。
【００４０】
本発明のＭＨＣセグメントの好ましい実施の形態はβ１ドメイン及びβ２ドメインを含むクラスＩＩβ鎖を有するセグメントと、β１ドメイン、β２ドメイン、β鎖膜内外ドメイン及びβ鎖細胞質ドメインを含むクラスＩＩβ鎖を有するセグメントとを含む。
【００４１】
本発明の抗原ペプチドはＭＨＣペプチド複合体をＴＣＲに結合可能とし、かつＴ細胞応答を引き起こすべく、ＭＨＣタンパクへ結合し得る任意のペプチドを含み得る。本発明のペプチドは細胞による合成が可能であり、細胞外若しくは細胞内において加水分解された生成物または翻訳後修飾生成物（Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ）であり得る。
【００４２】
抗原ペプチドの例は、細胞内で合成された抗原ペプチドと、細胞外で合成された抗原ペプチドと、細胞内で加水分解された抗原ペプチドと、細胞外で加水分解された抗原ペプチドとのうちのいずれか１つを含み得る。この例は細胞内へ流入する外在性抗原（Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）に由来する抗原ペプチドと、細胞外に残留する外在性抗原に由来する抗原ペプチドとを含む。
【００４３】
抗原の加水分解によって生成された抗原ペプチドは、ＭＨＣタンパクに抗原が結合する以前に加水分解される。クラスＩＭＨＣタンパクは細胞が能動的に合成したタンパクに由来する抗原ペプチドを一般的に提供する。これとは対照的に、クラスＩＩＭＨＣタンパクは細胞の細胞質経路（Ｃｅｌｌ'ｓ  ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ）内へ流入する外在性タンパクに由来する抗原ペプチドを一般的に提供する。細胞内輸送（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）はＭＨＣタンパクに対する抗原ペプチドの結合を可能にする。これによって形成されたＭＨＣ−ペプチド複合体はＴＣＲとの相互作用が可能な細胞表面へ移動する。
【００４４】
１つの実施の形態において、細胞外で形成された抗原ペプチドは細胞表面上の開放されているＭＨＣタンパクに対して結合し得る。このような抗原ペプチドは血清等の細胞外流体内におけるタンパクの加水分解等により形成し得る。次いで、ＭＨＣ−ペプチド複合体をＴＣＲに対して提供し得る。別の実施の形態において、加水分解されていない抗原ペプチドはＴ細胞の表面上に位置し、かつ開放されているＭＨＣタンパクに結合し得るとともに、ＴＣＲに対して提供し得る。
【００４５】
本発明の別の実施の形態はグルーブ結合抗原ペプチドを提供する。グルーブ結合抗原ペプチドはＭＨＣタンパクのペプチド結合グルーブへ結合し得る抗原ペプチドであり、これによって形成されたペプチド−ＭＨＣ複合体はＴＣＲに対して結合可能である。ＭＨＣ−ペプチド結合グルーブに対する抗原ペプチドの結合はＴＣＲが認識し得るＭＨＣ及び／または抗原ペプチド・アミノ酸残基の空間的配置を制御可能と考えられる。このような空間的制御はペプチド及びＭＨＣタンパク間に形成された水素結合に部分的に基づく。グルーブ結合抗原ペプチドの長さは好ましくは約５〜４０個のアミノ酸残基、より好ましくは約６〜３０個のアミノ酸残基、更に好ましくは約８〜２０個のアミノ酸残基からなる。
【００４６】
好ましいグルーブ結合抗原ペプチドは自己免疫疾患、免疫不全疾患、免疫系細胞増殖疾患及び移植片対宿主拒絶反応に関与するＭＨＣタンパクに結合するグルーブ結合抗原ペプチドを含む。本発明の更に好ましいグルーブ特異性ペプチドはＡｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（配列番号１）、Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号２）、Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（配列番号３）、Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号４）及びＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｉｓｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ（配列番号５）、並びにこれらの機能等価体を含む。
【００４７】
前記のように、本発明に使用可能な抗原ペプチドは結合グルーブ、外部結合部位及び複合結合部位のうちのいずれか１つに対して結合可能である。本発明の外部抗原ペプチドはＴ細胞応答を形成し得る形態にてＴＣＲ及びＭＨＣタンパクの両方に結合し得る。本発明に使用可能なペプチドはＴ細胞応答を招来すべくＭＨＣタンパク及びＴＣＲに結合し得るＴ細胞刺激タンパクのファミリーである超抗原を含む。超抗原はクラスＩＩのα鎖の少なくとも一部と、クラスＩＩのβ鎖の少なくとも一部と、クラスＩＩのα鎖及びβ鎖の組合せの少なくとも一部とのうちのいずれか１つに結合すると考えられる。超抗原はＴＣＲのＶβドメインの少なくとも一部に結合すると考えられる。
【００４８】
本発明の好ましい外部ペプチドは少なくとも約５ｋＤ、より好ましくは少なくとも約１５ｋＤ、更に好ましくは少なくとも約２０ｋＤの分子量を有するポリペプチドを含む。本発明の適切な抗原ペプチドは自己抗原、感染因子、毒素、アレルゲン及びこれらの混合物からなるグループから選択された１つの抗原の少なくとも一部を有するペプチドを含む。本発明の好ましい自己抗原は全身性狼瘡、リウマチ性関節炎、重症筋無力症、多発性硬化症及びインスリン依存性糖尿病を招来する抗原を含むが、これらの抗原に限定されるものではない。
【００４９】
本発明の好ましい感染因子はバクテリア、ウイルス及び真核寄生生物を含むが、これらに限定されるものではない。好ましい寄生動物は寄生原虫、寄生蠕虫（例：線虫、条虫及び吸虫）、外部寄生生物及び菌類を含む。
【００５０】
本発明の好ましいアレルゲンは植物性寄生アレルゲン、動物性寄生アレルゲン、細菌性寄生アレルゲン及び金属性アレルゲンを含み、同金属性アレルゲンは接触感受性を引き起こす。但し、本発明の好ましいアレルゲンはこれらに限定されない。更に好ましいアレルゲンは雑草抗原、草抗原、木抗原、ピーナッツ抗原、ダニ抗原、ノミ抗原及び猫抗原を含む。
【００５１】
本発明の好ましい毒素はブドウ球菌エンテロトキシン、毒物ショック症候群を起こす毒素、レトロウイルス性抗原、連鎖球菌性抗原、マイコプラズマ、マイコバクテリア及びヘルペスウイルスを含むが、これらに限定されるものではない。レトロウイルス性抗原はヒト免疫不全ウイルスに由来する抗原を含む。更に好ましい毒素はＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥ１−３、ＳＥＤ及びＳＥＥを含む。
【００５２】
本発明のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は抗原ペプチドに対してＭＨＣセグメントを共有結合させるアミノ酸配列を有する新たなリンカーを有する。共有結合は抗原ペプチド及びリンカーの間と、リンカー及びＭＨＣセグメントの間とにおいてそれぞれ形成される。リンカーは２つのアミノ酸の間における化学的相互作用であるペプチド結合とは区別される。
【００５３】
新規のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子の開発以前、ＭＨＣペプチド複合体はペプチドの予測できないＭＨＣタンパクとの不安定会合の影響を受けていた。生の状態に於いて抗原ペプチドはＭＨＣタンパクと非共有結合し、それ自体が不安定なＭＨＣペプチド複合体となる。加えて、生体外で抗原ペプチドとＭＨＣタンパクとを混合することで得られるＭＨＣペプチド複合体は、より不安定となる。これは複合体の形成と安定が複合体と非複合体ペプチドとの平衡の影響を受けることがあるためである。生、及び、人工のＭＨＣ−ペプチド複合体は不安定であり、このため医学及び／又は実験に用いる信頼の高い試薬としての複合体の使用が制限される。この発明に於ける新規のリンカーは以上の問題を緩和し、治療および実験用の薬品としての使用に適したＭＨＣペプチド複合体の製造を可能にする。機能的なＭＨＣペプチド複合体を生成するために抗原ペプチドを、リンカーを介してＭＨＣセグメントに付着させるのは不可能であると思われていた。これは抗原ペプチドのＭＨＣペプチドの結合部位への会合が密であり慎重に定義されていると考えられているからである。当業者であればリンカーが、例えばステアリンにより、抗原ペプチドがＭＨＣペプチドの結合部位に結合するのを妨げることを予想するであろう。このステアリンによる結合の妨げは、抗原ペプチドとペプチド結合部位とに対するリンカーの大きさや位置、またはリンカーとＭＨＣタンパクとの間のアミノ酸荷電相互作用に起因する。又、当業者であれば、リンカーがステアリンによる妨害及び／又はアミノ酸荷電相互作用によって抗原ペプチドで結合されたＭＨＣタンパクとＴＣＲの相互作用を妨害することを予想できる。上記のような知識は当分野において広く受け入れられている。これに対して本出願の発明者は抗原ペプチドとＭＨＣ結合部位との会合を実質的に妨害せず、さらにペプチドとＭＨＣの会合を安定させるリンカーを同定し生成した。
【００５４】
ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子の生成過程で使用されるリンカーは抗原ペプチドとＭＨＣタンパクの結合を促進するアミノ酸配列であれば任意のものでよい。リンカーは例えば抗原ペプチドをＭＨＣペプチド結合部位からある距離に保つことで効率的な結合を促し抗原ペプチド結合を促進する。リンカーは結合された抗原ペプチドとＭＨＣタンパクのアグリゲートの能力を強め、所望の免疫反応を引き起こす単位のひとつとして作用させる。本発明のリンカーはペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子の抗原ペプチド部分と、ペプチド−Ｌ−ＭＨＣα＋β組成のＭＨＣタンパクセグメント、又はＴＣＲに認識され得るペプチド−Ｌ−ＭＨＣα＋β２ｍ組成（以下に詳述）のＭＨＣタンパクセグメントと、の結合を促進することができるのが望ましい。
【００５５】
本発明のリンカーは抗原ペプチドとＭＨＣペプチド結合部位との会合を安定させ、それによりＴＣＲに認識され得る安定した組成が生成される。本明細書中の「安定性」は、複合ペプチドとＭＨＣタンパクを解離させるような力が加わっている状態において、ペプチドとＭＨＣペプチド結合部位の会合が持続することを意味する。ＭＨＣペプチド結合部位に結合されたペプチドの安定性は当業者に知られる様々な方法で測定することができる。例えば、ＭＨＣペプチド複合体は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）サイジングカラムに掛けることができ、それによりその複合体の持続を測定することができる。加えて、ＭＨＣペプチド複合体を硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）内に温置し、同ＳＤＳを適当な温度に適当な時間保ちつつその濃度を上昇させることで複合体の安定性を測定することもできる。これに適したＳＤＳの濃度は約０．１％から約５％の範囲を含む。ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子（ペプチド−Ｌ−ＭＨＣα＋β２ｍ組成とペプチド−Ｌ−ＭＨＣα＋β組成とを含むが、それらに限定されない）の安定性はその複合体が生の状態であるときの安定性と略同等か、より大きいことが好ましい。好ましくは、そのような分子または組成の安定性は、そのタンパクをＨＰＬＣサイジングカラムに掛けた場合の溶離液タンパクのピーク位置を、同様の、或は実質的に類似するカラムに掛けた生の状態の類似タンパク（即ち、リンカーを持たないペプチド結合されたＭＨＣタンパク）と比較することで測定される。
【００５６】
ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子の生成過程で使用されるリンカーは抗原ペプチドとＭＨＣタンパクの相互作用を妨害しないアミノ酸配列、またはペプチドにより結合されたＭＨＣタンパクとＴＣＲの相互作用を妨害しないアミノ酸配列であれば任意のものでよい。本発明のリンカーの長さは抗原ペプチドとＭＨＣセグメントの結合を妨げない程度に、あるいはＴＣＲ認識を妨げない程度に短い（つまりサイズが十分小さい）ほうが良い。本発明のリンカーの長さは好ましくは約１アミノ酸残基分から約４０アミノ酸残基分の長さの間であり、より好ましくは約５アミノ酸残基分から３０アミノ酸残基分の長さであり、さらに好ましくは約８アミノ酸残基分から２０アミノ酸残基分の長さである。
【００５７】
更に、本発明のリンカーのアミノ酸組成は同リンカーがＭＨＣペプチド複合体の生成を、又は同複合体によるＴＣＲ認識を妨害しないように実質的に中性である。ここで「中性」とはアミノ酸残基が実質的に荷電されていない状態であるか、リンカーとＭＨＣセグメントの相互作用を妨げない程度にサイズが小さいことを意味する。本発明リンカーのアミノ酸残基は好ましくはグリシン残基、アラニン残基、ロイシン残基、セリン残基、バリン残基、トリオニン残基及びプロリン残基を含み、より好ましくはグリシン残基、セリン残基、ロイシン残基、バリン残基及びプロリン残基を含む。またリンカー組成はアルギニン残基等の追加のアミノ酸残基と共に散在させることができる。リンカーアミノ酸残基の配列は、抗原ペプチドとＭＨＣタンパクの結合または、結果としてのＭＨＣペプチド複合体とＴＣＲの結合への干渉がないような順序であればよい。Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号６）とＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号７）のアミノ酸配列を持つリンカーが特に好ましい。
【００５８】
本発明の一実施例は、タンパクを切断することができる酵素のための目標部位を有するアミノ酸配列を持ったリンカーに関する。このようなリンカーは以下「加工可能リンカー（ｐｒｏｃｅｓｓａｂｌｅ  ｌｉｎｋｅｒ）」と呼ぶ。加工可能リンカーは、ペプチド−Ｌ−ＭＨＣの分子が活動の目標部位（つまり炎症部位）に到達するまで、同ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子のＴＣＲ認識を禁止するように設計され得る。活動部位において加工可能リンカーはそこにある酵素によって切断され得る。これにより不活性ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子が活性化され、ＴＣＲによる認識が可能になる。ペプチド−Ｌ−ＭＨＣは、ＭＨＣタンパクに結合できない抗原ペプチドまたは、抗原ペプチドにより結合されるＭＨＣタンパクを認識するためのＴＣＲの不能による切断以前に不活性になっていても良い。荷電および／またはステアリンの妨害はリンカーが除去されると消滅し、それによってＭＨＣ−ペプチド複合体がＴＣＲによって認識されることが可能になる。加工可能リンカーはさらに異物決定基を形成する抗原配列を有してもよい。この決定基はリンカーに含まれる血清酵素目標部位を切断することで取り除くことができる。
【００５９】
本発明の加工可能リンカーは好ましくはコラゲナーゼ、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、カリクレイン、トロンビン及びプラスミノーゲン活性化物質等の酵素のための目標部位を有するリンカーを含む。本発明の加工可能リンカーはＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒのトロンビン切断部位を有するリンカーを含む。
【００６０】
本発明に使用できるリンカーは様々な方法によって設計され得る。例えば、ＭＨＣタンパクのＸ線結晶データが適当な長さと電荷を持ったリンカーを設計するのに使用することができる。このリンカーはＭＨＣペプチド複合体のＴＣＲ認識に干渉しない。適当なリンカーは抗原ペプチド、リンカー及びＭＨＣセグメントの異なった組合せを有する様々なペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を多数生成することで同定される。また適当なリンカーはそれらの分子が単独でも、他の異なるＭＨＣタンパク鎖と組み合わされている場合でも、ＴＣＲによって認識されるかどうかで同定される。更に、ひとつの特定のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子と協動して機能するリンカーは他の抗原ペプチド及びＭＨＣセグメントの組合せと結合される。また、それらのリンカーは結果としてのペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子の能力のためにテストされる。このテストはペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子が単独、または他のＭＨＣタンパク鎖との組合せにおいてＴ細胞反応に影響を及ぼすかどうかを判定する。
【００６１】
本発明の一実施例におけるペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は、単独或は他のＭＨＣタンパク鎖と組み合わせられる場合、ペプチド結合部位を形成することができる。本発明のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は別個のＭＨＣタンパク鎖と組み合わされ、それによりペプチド結合部位を持った組成が形成される。このような組成はＴＣＲによって認識される。本発明の一実施例においてＭＨＣクラスＩα鎖を備えたＭＨＣセグメントを有するペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は少なくともクラスＩβ２ｍのサブユニットの一部と会合されて機能的ペプチド結合部位を有するペプチド−Ｌ−ＭＨＣα＋β２ｍ組成を生成する。ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子とβ２ｍサブユニットの間の会合は共有でも非共有でもよい。
【００６２】
本発明の他の実施例においてＭＨＣクラスＩＩβ鎖を備えたＭＨＣセグメントを有する本発明のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は少なくともクラスＩＩαの一部と会合されて機能的ペプチド結合部位を有するペプチド−Ｌ−ＭＨＣα＋β組成を生成する。ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子とクラスＩＩβ鎖の間の会合は共有でも非共有でもよい。
【００６３】
さらに別の実施例において、ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は標識や毒素等のエフェクター成分を含む。エフェクター要素はＭＨＣセグメントまたはペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子のペプチドに抱合される。適当な毒素としては、ジフテリア毒素、リシン毒素、シュードモナス外毒素、モデシン毒素、アルビン毒素及びシガ毒素等の二重鎖毒素（つまりＡ及びＢ鎖を有する毒素）、ポークウィード抗ウイルスタンパク、アルファ−アマニチン及びリボソーム抑制タンパク等の単鎖毒素、メルファラン、メトトレキサート、窒素イペリット、ドキソルビシン及びダウノマイシン等の化学毒素が含まれるが、これらに限定されない。適当な標識は、蛍光標識、ビオチン、少なくとも少量の免疫グロブリンタンパク、金属化合物、ルシフェリン、放射線標識及び酵素を含むが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明のもうひとつの態様は核酸分子に関する。この核酸分子は、この発明のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を含むタンパクをコード化する。本発明では、核酸という語は核酸分子の意味でも使用される。核酸分子としてはＤＮＡ，ＲＮＡあるいはＤＮＡまたはＲＮＡのハイブリッドまたは派生物でもよい。本発明の核酸は、核酸分子の発現をコントロールする調節部位（例えば転写あるいは翻訳コントロール部位）、全長の（省略のない）あるいは部分的なコード化部位、あるいはそれらの組合せを含む。本発明の核酸分子は、（１）本来の位置からの分子の隔離；（２）組み替えＤＮＡ技術の使用；あるいは（３）化学合成方法の使用、で生成される。本発明の核酸は自然の核酸分子の機能的等価物を含む。この自然の核酸分子の等価物はＭＨＣセグメントまたはペプチドをコード化し、自然対立遺伝子変異体、修飾核酸分子を含むが、これらに限定されない。前記修飾核酸分子において、前記のような修飾が本発明のタンパクをコード化する核酸分子の能力に本質的には干渉しない方法で、ヌクレオチドは挿入、削除、置換および／あるいは逆位されている。本発明のタンパクはＴ細胞受容体によって認識される組成を生成する。好ましい機能的同等物は緊縮条件下での混成が可能な配列を含み、少なくとも核酸分子をコード化するペプチド−Ｌ−ＭＨＣを少量ふくむ。（参考のために全体をここに収めたコールドスプリングハーバーラブスプレス１９８９年出版のサムブルック他による「分子クローニングマニュアル」参照）。任意の特定の核酸分子に対してどの特定の修飾が行われるかの決定の指針として幾つかの要素を考慮に入れなければならない。これにより当業者は無駄な実験をせずに本発明の実行可能な実施例を正しく理解することができる。たとえば、そのような要素は核酸分子への修飾を含む。この修飾はコード化されたタンパクの特定の官能部位を保持するために行われる。コード化されたタンパクとしては作業ペプチド結合領域、ＴＣＲ結合領域及び所望の結合相互作用に実質的に干渉しないリンカー等が挙げられる。これらの幾つかの特徴への機能テスト（例えば結合の調査）をすれば、この分野の技術を用いて核酸配列にどの修飾が適するか、また適さないかを決定することができる。
【００６５】
本発明の一実施例は少なくとも（１）ひとつのＭＨＣセグメント、（２）ひとつのペプチド、及び（３）ひとつのリンカー、の３つの成分を有するペプチド−Ｌ−ＭＨＣをコード化する核酸分子を含む。本発明に適しており、好ましいセグメント、ペプチド及びリンカーは以下に開示される。本発明の核酸分子はＭＨＣセグメントをコード化する少なくともひとつの核酸配列を含む。この核酸配列は、リンカーをコード化する少なくともひとつの核酸配列に（塩基対連鎖によって）共有結合している。このリンカーをコード化する核酸配列はそれ自体、少なくともひとつの抗原ペプチドをコード化する核酸配列に（塩基対連鎖によって）共有結合している。これらの核酸配列は、枠組み構造領域内での転写になるように付着されている。これにより単独または他のＭＨＣタンパク鎖との組合せでペプチド結合部位を形成することができる機能的ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子が生成される。
【００６６】
ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子をコード化するのに好ましい核酸分子は、ＭＨＣクラスＩα鎖をコード化する核酸配列、リンカー、及びペプチドがリンカーによってクラスαＩ鎖に連結される抗原ペプチドを含む。好ましい核酸分子は又ＭＨＣクラスＩＩβ鎖、リンカー、及びペプチドがリンカーによってクラスＩＩベータ鎖に連結される抗原ペプチドを含む。好ましい核酸分子は、特に、ＩＥβｋまたはその機能的同等物、ＩＡβｄまたはその機能的同等物及びＩＡβｂまたはその機能的同等物をコード化する。ひとつの成分（つまりＭＨＣセグメント、リンカーまたは抗原ペプチド）をコード化する核酸分子のそれぞれの部分は、少なくとも別個の成分の一部分をコード化するものであればどの配列にも（標準組み替えＤＮＡ方法を用いて）共有結合され、これにより本発明のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子が生成される。リンカーをコード化する核酸配列は、好ましくは、ひとつのＭＨＣセグメント及びリンカーをコード化する核酸配列に（例えば連鎖反応した塩基対連鎖によって）共有結合される。一実施例においては本発明の抗原ペプチドをコード化する核酸分子の３'末端（Ｃ−末端をコード化する末端）はＭＨＣセグメントをコード化する核酸分子の５'末端に連結される。本発明でペプチド−Ｌ−ＭＨＣをコード化する核酸分子の実施例の幾つかは表２−６に示される。そのような分子の構造は例のなかで詳述される。図１には制限酵素部位と転写を調節する配列が示される。
【００６７】
別の実施例では本発明の核酸分子はペプチド−Ｌ−ＭＨＣα＋β組成をコード化する核酸分子を含む。この核酸分子中ではＭＨＣクラスＩＩα鎖をコード化する配列はＭＨＣクラスＩＩβ鎖をコード化する配列と同じ、あるいは別の核酸分子上に位置することができる。例えば、ペプチド−Ｌ−ＭＨＣα＋β組成をコード化する核酸分子は、β２ｍサブユニットをコード化する配列に連結されたＭＨＣクラスＩのＭＨＣα−Ｌ−ペプチド分子をコード化する配列、配列をコード化するＭＨＣクラスＩＩα鎖をコード化する配列に連結されたＭＨＣクラスのＭＨＣβ−Ｌ−ペプチド分子をコード化する配列、あるいは、配列をコード化するＭＨＣクラスＩＩβ鎖をコード化する配列に連結されたＭＨＣクラスＩＩのＭＨＣα−Ｌ−ペプチド分子を、含むことができる。
【００６８】
他のいくつかの実施例では、該当する細胞からペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子の分泌を促進するシグナルセグメントまたはリーダーセグメントをコード化する核酸配列が用いられる。リーダーセグメントまたはシグナルセグメントをコード化する核酸配列は核酸分子の５'末端に（塩基対連鎖によって）共有結合される。リーダーセグメントまたはシグナルセグメントは本来ＭＨＣセグメントに会合されているものであってもよく、また異種のものでもよい。本来会合しているセグメントがより望ましい。膜結合の実施例を得るために用いられる核酸配列は少なくともひとつのトランスメンブランスセグメントを有する。このトランスメンブランスセグメントはペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を、脂質を含んだ基質に固定することができる。この種のセグメントとしては少なくとも少量のトランスメンブランス領域と、少なくとも少量のＭＨＣ細胞質領域を含む。トランスメンブランスセグメントをコード化する核酸配列は、ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子の細胞外部分をコード化する核酸配列の３'末端に（塩基対連鎖によって）共有結合される。トランスメンブランスセグメントはＭＨＣセグメントに本来会合されているものであってもよく、異種のものであってもよい。好ましいトランスメンブランスセグメントは本来会合しているセグメントを含む。膜結合可能なペプチド−Ｌ−ＭＨＣをコード化する核酸分子は少なくともひとつの核酸配列を含み、その配列は細胞外領域の３'末端に連結されたセグメントをコード化する。これによりトランスメンブランスコード化配列が枠組み構造領域内で転写される。
【００６９】
また本発明の別の実施例では融合セグメントに固着された領域を有するペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を含んだ融合タンパクである。本発明にはペプチド−Ｌ−ＭＨＣの一部として融合セグメントが含まれるので生成、保存及び／または使用の間の分子の安定性が増す。さらに融合セグメントはペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子の精製を簡単にするという役割も果たす。これにより結果として得られる融合タンパクの精製はアフィニティークロマトグラフィーを用いて単純化することができる。所望の機能（増大された安定性及び／または精製手段）を有していれば、どんな大きさの領域でも融合セグメントとして適当である。一または複数の融合セグメントを使用することは本発明の範囲内である。融合セグメントはペプチド−Ｌ−分子のアミノ末端及び／またはカルボキシル末端に結合される。融合セグメントとペプチド−Ｌ−ＭＨＣ間の連結は分割の影響を受け易くされることによって、ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子の直接的な回復が可能になる。融合タンパクの生成方法としては、ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子のカルボキシル末端および／またはアミノ末端に固着された融合セグメントを含むタンパクをコード化する融合核酸配列によって形質転換された組み替え細胞を培養する方法が望ましい。
【００７０】
特に好ましい核酸分子としては、蛾シトクロームＣ（９１−１０３）ペプチドをコード化する配列を持つＮ−ＩＥｋｄ−ＭＣＣと、リンカーとＩＥβｋタンパク（実施例１にて詳述）と、を含むもの、ｃＯＶＡ（３２７−３３９）ペプチドをコード化する配列を持つＮ−ＩＡｄ−ＯＶＡと、リンカーと、ＩＡβｄタンパク（実施例１にて詳述）と、を含むもの、そしてＩＥαｄ（５６−７３）ペプチドをコード化する配列を持つＮ−ＩＡｂ−Ｅａと、リンカーとＩＡβｂタンパク（実施例２にて詳述）と、を含むものが挙げられる。
【００７１】
本発明はまた、宿主細胞中で発現されるベクターに機能的に連結されているペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子をコード化する核酸配列を有する組み替え体分子を含む。ここで「機能的に連結する」とは、配列が宿主細胞に形質転換されることができるように核酸配列を発現ベクターへ挿入することを意味する。ここで「発現ベクター」とは宿主細胞を形質転換することができ、適当な核酸配列を、好ましくは宿主細胞内で複製して、発現させることができるＲＮＡベクターまたはＤＮＡベクターを意味する。発現ベクターは原核でも真核でもよく典型的にはウイルスかプラスミドである。
【００７２】
本発明の組み替え体分子はｐＩＥｋｄ−ＭＣＣ（実施例１にて詳述）と、ｐＩＡｄ−ＯＶＡ（実施例１にて詳述）と、ｐＭ１２−ＩＡｂ−ＥＡ（実施例２にて詳述）と、ｐＦＩＢ−ＩＡｂ−Ｅａ（実施例２にて詳述）と、を含む。
【００７３】
所望の発現ベクターは当業者に知られている方法により生成され、発現は原核系中または真核系中のいずれにおいてでもよい。典型的に用いられる原核系はバクテリア株であり、様々な種類のＥ．大腸菌株や、様々な種類のかん菌株または様々な種類のシュードモナスを含むが、これらに限定されない。原核系においては、複製部位を有し、宿主細胞に適合した種に由来する配列を制御するプラスミドが用いられる。制御配列としてはプロモーター、オペレーター、エンハンサー、リボソーム結合部位およびシャイン・ダルガーノ配列を含むが、これらに限られない。真核宿主細胞において有用な発現系は適当な真核遺伝子に由来するプロモーターを含む。有用な哺乳類プロモーターは初期プロモーターおよび後期プロモーターを含む。これらのプロモーターはＳＶ４０または他のウイルスプロモーター、例えばバキュロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスまたはトリ肉腫ウイルスに由来するプロモーター等を含む。本発明の発現ベクターは本発明の組み替え細胞内で機能（つまり直接遺伝子発現）するものであればよい。本発明の組み替え細胞はバクテリア細胞、イースト細胞、他のカビ細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞を含む。本発明における特に好ましい発現ベクターは二プロモーターバキュロウイルス転移ベクター、クラスＩＩプロモーターを有するベクター、β−アクチンプロモーター、グロビンプロモーターまたは上皮細胞特殊プロモーターを含む。
【００７４】
発現系は、当業者に知られている方法を用いて本発明の核酸配列に機能的に連結されている上述の制御要素のいずれによっても生成することができる。（例えば本明細書中に記載のサムブルックとその他による著書を参照）
【００７５】
本発明の宿主細胞は、本来的にＭＨＣタンパクを生成できる細胞、または、ＭＨＣタンパクをコード化する核酸分子とトランスフェクションされるときにＭＨＣタンパクを生成することができる細胞のいずれでもよい。本発明の宿主細胞はバクテリア細胞、カビ細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞を含むが、これらに限定されない。適当な宿主細胞はＴ細胞反応を刺激することができる哺乳類細胞を含み、好ましくは抗原を示す細胞、例えば樹枝状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球等を含む。さらに適当な宿主細胞はＴ細胞反応を刺激することができない細胞、好ましくは繊維芽細胞、赤血球、多分化能性前駆細胞、上皮細胞および神経細胞を含む。
【００７６】
本発明の一実施例はペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子をコード化する組み替え分子により形質転換された宿主細胞に関する。ここでは組み替え分子のＭＨＣセグメントはクラスＩＩβ鎖である。この宿主細胞はＭＨＣクラスＩＩα鎖をコード化する組み換え分子と共に形質転換されることができる。このＭＨＣクラスＩＩα鎖はペプチド−Ｌ−ＭＨＣα＋β組成を形成するためペプチド−Ｌ−ＭＨＣと結合することができる。
【００７７】
本発明の一態様において組み替え細胞は少なくともひとつのペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を生成するのに用いられることができる。このペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は組み替え細胞をペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を生成するのに効果的な条件下で培養し、その分子を採集することで得られる。組み替え分子を生成するのに効果的な条件は、適当な培養媒体、バイオリアクター、温度、ｐＨそして酸素条件を含むが、これらに限定されない。用いられる発現ベクターによって、生成された分子は組み替え細胞に留まるか、組み替え細胞の表面に保持されるか、培養媒体の中に分泌されるか決まる。ここでは「タンパクを採集する」とはタンパクおよび／または組み替え細胞を含む発酵媒体を集めることである。採集は追加の分離工程や精製工程を含む必要はない。本発明のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は様々な標準的タンパク精製技術を用いて精製することができる。精製方法としてはアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、遠心分離、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、および微分可溶化などがあげられるが、これらに限られない。隔離されたペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は好ましくは「略純粋」な状態で採集される。ここで「略純粋」とはこれまで記述してきた分子が薬学組成や実験用試薬として効果的に使用されることを許容するような純度のことである。
【００７８】
本発明の溶性ペプチド−Ｌ−ＭＨＣは、例えば免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製される。脂質を含んだ基質に固定されたペプチド−Ｌ−ＭＨＣは、例えば、密度勾配遠心分離法によって採集される。
【００７９】
本発明のひとつの態様は本発明のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子および核酸分子を治療あるいは実験のための製剤としての使用に関する。ひとつの実施例においては、本発明のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子はタンパクでできた薬剤を生成するのに用いることができる。このタンパク薬剤は自己免疫疾患、免疫不全病、免疫増殖病あるいは移植・宿主拒絶反応等の患者への投与に使用することができる。タンパク薬剤は適当なキャリヤーに結合されたペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を含む。本発明のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子はタンパク実験用試薬を生成するのにも用いることができる。タンパク実験用試薬は薬品の開発や、免疫反応の色々な側面の研究に有用である。タンパク実験用試薬は薬学的条件に合った適当なキャリヤーと結合したペプチド−Ｌ−ＭＨＣを含む。「薬学的条件に合った」とは細胞や動物に害が無い（つまり毒性がない）ということを意味する。
【００８０】
ここで「キャリヤー」とは生体条件外および生体条件内の適当な活動部位に分子または組成を運搬するのに適した賦形剤を意味する。キャリヤーはペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子を有するタンパク薬剤またはタンパク実験試薬の製剤のための補形薬として機能することができる。好ましいキャリヤーはペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子をＴ細胞受容体に認識される形態に保つことができる。そのようなキャリヤーとしては水、リン酸緩衝食塩水、リンガー液、デキストロース液、血清含有液、ハンクス液および他の生理的に調整された水様液等が挙げられるが、これらに限られない。水様キャリヤーは受容者の生理的条件に合わせるため適当な補助物質を含むことができる。これらの補助物質は例えば化学的安定性や等浸透圧性を高めるのに使用される。適当な補助物質としては酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、およびリン酸緩衝液、トリス緩衝液、重炭酸塩緩衝液などを生成するのに用いられる物質などが挙げられるが、これらに限定されない。補助物質としては他にチメロサール、ｍ−またはｏ−クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコール等の保存液も挙げられる。エーロゾル投与での使用に好ましい補助物質は受容者に対して毒性のない界面活性物質を含む。この界面活性物質としては６個から２２個の炭素原子を持った脂肪酸のエステルまたは部分エステルが挙げられる。エステルの例としてはカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレル酸、オレステリック（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ）酸およびオレイン酸などが挙げられる。本発明の製剤は従来の方法で殺菌され、そして／あるいは凍結乾燥される。
【００８１】
本発明のキャリヤーはアジュバントを含む。アジュバントとしてはフロイトアジュバント、他の細菌細胞壁組成、アルミニウム塩、カルシウム塩、シリカ、ポリヌクレオチド、トキソイド、血清タンパク、ウイルス外殻タンパクおよび、その他の細菌に由来する製剤が挙げられるが、これらに限られない。
【００８２】
膜結合ペプチド−Ｌ−ＭＨＣのために有用なキャリヤーは人工あるいは自然の脂質を含む基質を含み、好ましくは細胞、細胞膜、リポゾーム、ミセルである。本発明の細胞キャリヤーは本質的にＴ細胞を刺激することができない細胞、例えばＴ細胞の活性化を仲介する二次タンパクを持たない細胞を含み、さらにＴ細胞を刺激しＴ細胞の活性化を仲介する二次タンパクを持つ細胞も含む。本発明における好ましい哺乳類細胞としては抗原付与細胞、繊維芽細胞、赤血球、多分化能前駆細胞、上皮細胞および神経細胞が挙げられるが、これらに限られない。抗原付与細胞とは、一般的にその表面にＭＨＣタンパクを発現させ、抗原を処理することができる細胞を意味する。好ましい抗原付与細胞は例えば樹枝状細胞、マクロファージおよびＢリンパ球を含む。
【００８３】
本発明の１つの実施例において、膜結合ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子は、Ｔ細胞活性を抑制することが可能な製剤を合成するために、人工的な及び／あるいは天然の脂質を含んだ担体に結合される。理論による結合がなければ、Ｔ細胞は活性化のための顕著なシグナルを必要とすると考えられている。そのようなシグナルの１つはＴＣＲによって伝達され、その伝達は本発明のペプチド−Ｌ−ＭＨＣのようなＭＨＣタンパクのコンテキスト（ｃｏｎｔｅｘｔ）に存在するペプチドとレセプターとの結合によってなされる。しかしながらＴＣＲのみによるシグナルはＴ細胞を最適に活性させるには不十分であると考えられている。従って、ＴＣＲ以外の表面タンパクから第２のシグナルが欠けていることは、ここにおいて以下に示す（１）Ｔ細胞の活性化の失敗、（２）Ｔ細胞のアレルギー状態への誘導あるいは（３）Ｔ細胞の死滅、のいずれか１つによってＴ細胞抑制という結果を来す。Ｔ細胞の表面における非ＴＣＲタンパクの多様性は、ＴＣＲへのペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子の結合とともに、Ｔ細胞活性をもたらすシグナル形質導入を媒介する。非ＴＣＲシグナル形質導入タンパクの例としては、Ｔ細胞タンパクＣＤ２８が挙げられる。ＣＤ２８はＴＣＲと共にＴ細胞を刺激し、Ｔ細胞活性をもたらすと考えられている。ＣＤ２８は抗原提示細胞において見られるＢ７タンパクに対するレセプターである。従って、ＭＨＣ−ペプチド複合体によるＴＣＲの結合及びＢ７タンパクによるＣＤ２８の結合はＴ細胞活性を引き起こすと考えられる。これに対して、ペプチド−ＭＨＣ複合体によるＴＣＲ結合の存在下にＢ７に対するＣＤ２８の結合が欠けていると、Ｔ細胞の活性は起こらない。
【００８４】
Ｔ細胞活性を抑制可能にするタンパク製剤に対する好ましい脂質を含んだ担体としては、例えばＴ細胞応答を刺激することが本質的に不可能なミセル、リポソーム、細胞及び細胞膜が含まれる。より好ましい担体としては、例えば赤血球、繊維芽細胞、多分化能性前駆細胞、上皮細胞及び神経細胞のようなほ乳類の細胞が含まれる。
【００８５】
別の実施例において、膜結合ペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子はＴ細胞活性を刺激することが可能なタンパク製剤を合成するために使用される。ここで述べられているＴ細胞刺激とは、例えばＩＬ−２（インターロイキン２）産生あるいは細胞毒活性のような生物学的な機能に起因するＴ細胞の活性を指している。好ましくは、例えばＴ細胞応答を刺激することが本質的に可能なミセル、リポソーム、細胞あるいは細胞膜のような脂質を含んだ担体がＴ細胞活性を刺激することが可能な製剤を合成するために使用される。より好ましい担体としては、例えば樹状突起細胞、マクロファージ及びＢリンパ球のようなほ乳類の抗原提示細胞が含まれる。
【００８６】
さらに別の実施例において、可溶性のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子がＴ細胞活性を抑制することが可能なタンパク製剤の合成に用いられる。可溶性のペプチド−Ｌ−ＭＨＣ分子の好ましい担体としては、生理学的に平衡状態にある溶液が含まれ、そしてより好ましい担体はリン酸緩衝生理食塩水である。
【００８７】
１つの実施例において、Ｔ細胞応答を刺激することが不可能な脂質を含んだ基質に固定される本発明の可溶性タンパク及び／あるいは膜結合タンパクを含んだタンパク薬剤は自己免疫疾患、免疫細胞増殖性疾患の治療及び移植の処置において特に有効である。Ｔ細胞応答を刺激することが可能な脂質を含んだ基質に固定される膜結合タンパクを含んだタンパク薬剤は、免疫不全疾患の治療に特に有効である。
【００８８】
本発明の別の実施例は、治療あるいは試験的な使用に対するヌクレオチド製剤として本発明の組換え分子を使用することに関し、ここで治療的な使用とは遺伝子療法を指している。本発明の組換え分子はヌクレオチド薬剤の合成に使用され得る。免疫機能に関連した疾患では、免疫応答に関する自己由来の或いは同種の細胞集団の遺伝子修飾によって治療される。例えば、自己免疫疾患、免疫不全疾患、免疫細胞増殖性疾患、移植宿主拒否反応及び免疫応答に関する細胞の欠損、過剰反応あるいは機能不全に関するその他の遺伝子病は、本発明の組換え分子の導入によって修復される。
【００８９】
遺伝子療法において使用される組換え分子は、宿主細胞のゲノムに組み込まれない、あるいは組み込む分子であり得る。細胞のゲノムに組み込む組換え分子は、例えば幹細胞あるいは多分化能性造血細胞のような多分化能性細胞への導入において特に有効である。宿主細胞のゲノムに組み込まれない組換え分子は、系統前駆細胞（例えば、成熟あるいは未成熟リンパ球、赤血球及び白血球）への導入に対して特に有効である。宿主細胞のゲノムに組み込まれない組換え分子は、ゲノム組み込み能力を欠くために遺伝的に操作される非複製ＤＮＡ配列あるいは特殊な複製配列であり得る。
【００９０】
特殊なプロモーターが形質転換される細胞の型に基づいて遺伝子療法の適用において使用される。それによって、形質転換された遺伝子によってコード化された所望の生成物の誘導合成が達成され得る。種々の脊椎系において使用される好適なプロモーターとして、ここにおいて詳細に開示されたプロモーターを含み、ヒトにおいて特に有効なプロモーターとしては、サイトメガロウイルスＩＥＰプロモーターが含まれる。
【００９１】
組換え分子は、（ａ）直接注射（例えば、ウォルフらによって示唆されたそのままのＤＮＡあるいはＲＮＡ分子として使用、１９９０年、サイエンス  ２４７巻、１４６５−１４６８頁）あるいは（ｂ）組換えウイルス粒子ワクチンあるいは組換え細胞ワクチンとして詰め込まれた形（すなわち組換えウイルス粒子ワクチン及び組換え細胞ワクチンから構成されるグループから選択された粒子によって細胞に送達される）を含む種々の方法にて動物に投与されるが、これらにのみ限定されるものではない。種々の組換えウイルス粒子が、組換えウイルス粒子ワクチンあるいは組換え細胞ワクチンとして使用され、アルファウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス及びレトロウイルスに基づく粒子が含まれるが、これらにのみ限定されるものではない。組換え分子はまた、動物に投与される前に脂質に基づく担体と結合され得る。本発明の組換え分子を投与するための好ましい脂質に基づく担体としてはリポソームが含まれる。本発明のヌクレオチド薬剤はさらに、ここで詳細に述べられたような水性担体から構成される。
【００９２】
本発明の薬剤はいかなる動物にも投与され得るが、好ましくはほ乳類、さらにより好ましくはヒトに投与され得る。効果的な方法にて薬剤を投与するために許容されるプロトコルとしては、個体の投与量、投与回数、用量投与の頻度及び投与形態が含まれる。投与の形態としては、疾病の予防あるいは治療に適合するいかなる方法も含まれる。投与の形態としては、非経口、経口、静脈内、局所あるいは例えばエアロゾル剤もしくは経皮による局部投与が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９３】
本発明の薬剤は、免疫応答の異常な刺激あるいは抑制によって部分的に引き起こされるいかなる疾病の治療に対しても有効である。そのような疾病には、自己免疫疾患、免疫不全疾患及び免疫細胞増殖性疾患が含まれる。本発明の薬剤はまた、臓器及び皮膚の移植に関する処置に対しても有効である。自己免疫疾患は、例えば、全身性狼瘡、重症筋無力症、関節リウマチ、ＩＤＤＭ（インスリン依存性糖尿病）及び実験的アレルギー性脳脊髄炎が含まれる。免疫不全疾患は、例えば、ヒトエイズ（ＡＩＤｓ）、低ガンマグロブリン血症、ディジョージ症候群、慢性粘膜皮膚カンジダ症、移植片宿主相関病、複合型免疫不全疾患、ネフローゼ症候群、偶発性リンパ球減少症並びに胸腺腫、湿疹、血小板減少症、ＡＤＡ（アデノシンデアミナーゼ）欠損症及びこびと症に関連した免疫不全が含まれる。免疫細胞増殖性疾患には、例えばリンパ腫及び白血病が含まれる。加えて、Ｔ細胞応答を刺激することが可能な本発明の薬剤は、例えば腫瘍、アレルギー応答及び炎症のような特殊な疾病の治療に対しても有効である。
【００９４】
本発明の実験的な試薬は、例えば、Ｔ細胞活性を調整することが可能なペプチド、ペプチドとの複合体であるＭＨＣタンパクと結合する抗生物質、ペプチドとの複合体であるＭＨＣタンパクと結合することが可能なＴＣＲ及びペプチドとの複合体であるＭＨＣタンパクに結合することが可能なＴＣＲを有するＴ細胞に対するスクリーニングに有効なタンパク製剤を含む。
【００９５】
Ｔ細胞活性を調整することが可能なペプチドをスクリーニングする方法は、（１）（ｉ）リンカーによってＭＨＣセグメントに結合される抗原ペプチドを備えたペプチド−Ｌ−ＭＨＣ、ここでＭＨＣセグメントは結合グルーブを形成することが可能である、（ｉｉ）（ｉ）のペプチド−Ｌ−ＭＨＣがＴ細胞応答を刺激することを本質的に不可能にする細胞の原形質膜に固定される製剤、（ｉｉｉ）（ｉ）のペプチド−Ｌ−ＭＨＣがＴ細胞応答を刺激することを可能にする細胞の原形質膜に固定される製剤、ここで接触されたＴ細胞は試薬のＭＨＣセグメントを認識することが可能である、から構成されるグループから選択された試薬とＴ細胞との接触、そして（２）その試薬がＩＬ−２活性を刺激するあるいはシグナル形質導入を変えるかを決定することを含む。
【００９６】
以下の実験結果は、例示のみの目的にて提供されたものであり、本発明の範囲を限定するためのものではない。
【実施例】
【００９７】
実施例１
この例は、リンカーによってＭＨＣクラスＩＩタンパクに共有結合されるペプチドの遺伝子暗号が、Ｔ細胞によって認識され得る安定な可溶性タンパクとして発現されることを示している。
【００９８】
ＩＥα鎖タンパク（ＩＥαｄ）、ＩＥβ鎖タンパク（ＩＥβｋ）、ＩＡα鎖タンパク（ＩＡαｄ）及びＩＡβ鎖タンパク（ＩＡβｄ）の細胞外ドメインをコード化するネズミのクラスＩＩ遺伝子は、クローン化された相補的ＤＮＡ鋳型のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅を用いて調製される。完全に組まれたαβ二量体の分泌を許容するためには、コドンがタンパクの膜間及び細胞質部分をコード化する前に最後のコドンにて端を切りとられる。ＩＥαｄ遺伝子のＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは、５'ＴＣＣＴＣＧＡＧＡＡＡＴＧＧＣＣＡＣＡＡＴＴＧＧＡＧ３'（配列番号９）及び３'ＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＴＣＴＴＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴ５'（配列番号１０）である。ＩＥβｋ遺伝子のＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは、５'ＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＣＣ３'（配列番号１１）及び３'ＡＧＡＣＧＴＴＣＴＴＧＴＴＧＣＡＴＴＣＧＴＡＣＧＣＣ５'（配列番号１２）である。それらの対応する相補的ＤＮＡ鋳型とプライマーとの配列は表１に示した。
【００９９】
ＩＡαｄ及びＩＡβｄタンパクをコード化する遺伝子はまた、ＰＣＲ増幅によって合成される。ＩＡαｄ遺伝子のＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは、５'ＴＣＣＴＣＧＡＧＡＧＧＡＴＧＣＣＧＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧ３'（配列番号１３）及び３'ＣＴＣＧＡＣＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴ５'（配列番号１４）である。ＩＡβｄ遺伝子のＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは、５'ＴＡＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡ３'（配列番号１５）及び３'ＴＣＡＧＡＣＧＧＧＣＣＴＣＧＴＴＣＡＴＴＣＧＴＡＣＧＣＣ５'（配列番号１６）である。それらの対応する相補的ＤＮＡ鋳型とプライマーとの配列は表１に示した。ＩＥαｄ、ＩＥβｋ、ＩＡαｄ及びＩＡβｄ遺伝子をバキュロウイルス伝達ベクターの新しい複数のクローニング部位（ＭＣＳ）へクローニングするために使用される制限酵素部位もまた、表１に示した。
【０１００】
【表１】
2006094862.tif 000003
ＰＣＲ増幅を用いて、ハイブリッドＩＥβｋ核酸分子が、ガのシトクロームＣのアミノ酸残基９１−１０３（ＭＣＣペプチド（９１−１０３））、トロンビン切断部位を含むリンカー及びＩＥβｋ遺伝子をコード化する配列を含んで合成される。ハイブリッド分子は、以下のように調製される。表２（配列番号１９及び配列番号２０）を参照して、第１のフラグメント（フラグメント２３４−３２８）は、ＩＥβｋ相補的ＤＮＡ鋳型上にあるプライマー＃２３４（５'ＴＡＣＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＣＣＣ３'  配列番号１７）及びプライマー＃３２８（５'ＡＣＣＧＧＡＣＧＡＡＧＴＴＴＡＴＣＣＧＴＴＡＧＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＣＣＣＴＣＡＧＡＧＡＣＴＧＧＴＴ３'  配列番号１８）を用いてリーダー、ＩＥβｋのβ１ドメインの最初の３つのコドンとＭＣＣペプチドの最初の１１のコドンとをコード化して合成される。プライマー＃２３４は、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含み、プライマー＃３２８は、ＸｍａＩ制限酵素部位を含む。フラグメント２３４−３２８は、該フラグメント２３４−３２８がプライマー＃３２９（５'ＧＧＧＧＣＡＣＣＧＴＧＡＴＣＡＣＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＧＡＣＧＡＡＧＴＴＴＡＴ３'  配列番号２１）を使用することによって加えられるＭＣＣペプチドの残り及びリンカーの最初の１０のコドンをコード化する配列を加えることによって延長される第２のＰＣＲフラグメント（フラグメント２３４−３２９）に対する鋳型として使用される。プライマー＃３２９は、ＳｐｅＩ部位を含む。フラグメント２３４−３２９は、該フラグメント２３４−３２９がプライマー＃３３０（５'ＴＴＴＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＣＴＣＧＧＧＧＣＡＣＣＧＴＧＡＴＣＡＣＴＣＧ３'  配列番号２２）を用いてリンカーの残り及びβ１ドメインの４−８残基をコード化する配列を加えることによって延長される第３のＰＣＲフラグメント（フラグメント２３４−３３０）に対する鋳型として使用される。プライマー＃３３０は、ＳｐｅＩ部位及びＮｃｏＩ部位を含む。その後、フラグメント２３４−３３０はＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩにて消化され、Ｐ１０プロモーターに従ってクローン化されたＩＥαｄと、ポリヘドリンプロモーターに従ってクローン化されたＩＥβｋを有するｐＢＡＣｐ１０Ｈベクターにて消化されたＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩにクローン化される（詳細は以下に説明される）。ガのシトクロームＣ（９１−１０３）ペプチド、リンカー並びにＩＥβｋβ１及びβ２ドメインをコード化するＩＥβｋ遺伝子をコード化する配列を有する核酸分子は、以下Ｎ−ＩＥｋｄ−ＭＣＣとして示される。
【０１０１】
【表２】
2006094862.tif 000004
ＰＣＲ増幅を用いて、ハイブリッドＩＡβｄ核酸分子は、ニワトリ卵白アルブミン（ｃＯＶＡペプチド（３２７−３３９））のアミノ酸残基３２７−３３９、トロンビン切断部位を含むリンカー及びＩＡβｄ遺伝子をコード化する配列を含むものとして合成される。ハイブリッド分子は以下のように調製される。表３（配列番号２５及び配列番号２６）を参照して、第１のフラグメント（フラグメント２６１−３３１）は、ＩＡβｄ相補的ＤＮＡ鋳型上にあるプライマー＃２６１（５'ＴＡＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡＴ３'  配列番号２３）及びプライマー＃３３１（５'ＡＧＡＧＴＣＧＴＡＣＣＣＧＴＣＧＴＡＣＡＴＧＣＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＴＣＡＧＧＧＣＣＣＣＧＡＣＧＡＧＴ３'  配列番号２４）を用いてリーダー、ＩＡβｄのβ１ドメインの最初の３つのコドンとｃＯＶＡペプチドの最初の７つのコドンとをコード化して合成される。プライマー＃２６１は、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含み、プライマー＃３３１は、ＸｍａＩ制限酵素部位を含む。フラグメント２６１−３３１は、該フラグメント２６１−３３１がプライマー＃３３２（５'ＣＣＧＴＧＡＴＣＡＣＴＣＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＧＧＡＧＴＡＡＣＴＡＧＡＧＴＣＧＴＡＣＣＣＧＴＣ３'  配列番号２９）を用いて加えられるｃＯＶＡペプチドの残り及びリンカーの最初の８つのコドンをコード化する配列を加えることによって延長される第２のＰＣＲフラグメント（フラグメント２６１−３３２）に対する鋳型として使用される。プライマー＃３３２は、ＳｐｅＩ部位を含む。
【０１０２】
【表３】
2006094862.tif 000005
ＰＣＲ増幅を用いて、第３のフラグメント（フラグメント３３３−２５９）は、ＩＡβｄβ１ドメイン（から最初の３つのコドンを引いたもの）及びＩＡβｄβ２ドメインの一部をコード化する配列を含むものとして合成される。フラグメント３３３−２５９は、ＩＡβｄ相補的ＤＮＡ鋳型上にあるプライマー＃３３３（５'ＧＧＣＴＣＡＣＴＡＧＴＧＣＣＣＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＴＣ３'  配列番号３０）及びプライマー＃２５９（５'ＧＧＣＧＴＡＣＧＡＡＣＧＡＡＴＧＡＡＣＧＡＧＧＣＣＣＧＴＣＴＧＡＧ３'  配列番号３１）を用いて合成される。プライマー＃３３３はＳｐｅＩ部位を含み、プライマー＃２５９はＳｐｈＩ部位を含む。
【０１０３】
フラグメント２６１−３３２及びフラグメント３３３−２５９は溶液中にて混合され、ＩＡβｄリーダー、ｃＯＶＡペプチド、リンカー及びＩＡβｄタンパクをコード化するフラグメント２６１−２５９を形成するプライマー＃２６１及びプライマー＃２５９のためのＰＣＲ鋳型として使用される。フラグメント２６１−２５９はＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩにて消化され、Ｐ１０プロモーターに従って既にクローン化されたＩＡαｄ遺伝子を有するｐＢＡＣｐ１０Ｈベクターのポリヘドリンプロモーターに従ってクローン化される（詳細は以下に説明される）。ｃＯＶＡ（３２７−３３９）ペプチド、リンカー並びにβ１及びβ２ドメイン含むＩＡβｄタンパクをコード化する配列を有する核酸分子は、以下Ｎ−ＩＡｄ−ＯＶＡとして示される。
【０１０４】
表４（配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５）に、プロモーター（以下に示す）から、リーダー、ペプチド及びリンカーを経てβ１ドメインに至るＩＥβｋ−ＭＣＣ及びＩＡβｄ−ＯＶＡの核酸及びタンパク配列を示す。抗原ペプチドあるいはリンカーをコード化する核酸配列を持たないＩＥβｋあるいはＩＡβｄに対する同様の配列を示した。
【０１０５】
【表４】
2006094862.tif 000006
ＩＥ及びＩＡのα及びβ鎖をコード化する核酸配列（ＩＥαｄ、ＩＥβｋ、ＩＥβｋ−ＭＣＣ、ＩＡαｄ、ＩＡβｄ及びＩＡβｄ−ＯＶＡ配列）は、二重プロモーターバキュロウイルス伝達ベクター、ｐＢＡＧｐ１０Ｈ（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））のＰ１０及びポリヘドリンのＭＣＳにクローン化される。ベクターはＰ１０プロモーターに従うＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩ部位及びポリヘドリンプロモーターに従うＢａｍＨＩ部位の両方を新しいＭＣＳにて置き換えるためにオリゴ核酸及びＰＣＲ増幅を用いて変えられる。新しいＭＣＳのＤＮＡ配列（配列番号３６及び配列番号３７）は、
【表５】
2006094862.tif 000007
である。
ＭＣＣペプチド及びリンカーを含むＩＥｋｄαβ二量体をコード化するｐＩＥｋｄ−ＭＣＣ組換え分子を形成するために、ＩＥαｄタンパクをコード化する遺伝子は、Ｐ１０プロモーターに従ってＸｈｏＩ及びＫｐｎＩ部位に結合され、ＩＥβｋ−ＭＣＣ核酸分子は、ポリヘドリンプロモーターに従ってＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩ部位に結合される。同様の操作が、ＩＥｋｄαβ二量体をコード化する組換え分子ｐＩＥｋｄを形成するためにＩＥβｋタンパクをｐＢＡＣｐ１０ＰＨにコード化する遺伝子を結合するために行われる。
【０１０６】
ｃＯＶＡペプチド及びリンカーを含むＩＡｄαβ二量体をコード化するｐＩＡｄ−ＯＶＡ組換え分子を形成するために、ＩＡαｄタンパクをコード化する遺伝子は、ポリヘドリンプロモーターに従ってＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩ部位に結合され、ＩＡβｄ−ＯＶＡ核酸分子は、ポリヘドリンプロモーターに従ってＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩ部位に結合される。同様の操作が、ＩＡｄαβ二量体をコード化するｐＩＡｄ組換え分子を形成するためにＩＡβｄタンパクをｐＢＡＣｐ１０ＰＨにコード化する遺伝子を結合するために用いられる。
【０１０７】
ｐＩＥｋｄ−ＭＣＣ、ｐＩＥｋｄ、ｐＩＡｄ−ＯＶＡ及びｐＩＡｄは、ウィスルの組換え株を合成するために、コトランスフェクションによってＳＦ９細胞のバキュロゴールドバキュロウイルス（ファーミンゲン）中に個々に組換えられる。最初の組換えウイルス株は、制限希釈にて、９６−ウェルプレート中にて、ＳＦ９細胞の感染によってクローン化される。クローンの大量のウイルス株は、分泌されたＩＥｋｄ−ＭＣＣ、ＩＥｋｄ、ＩＡｄ−ＯＶＡ及びＩＡｄタンパクのそれに続く大規模なタンパク合成によって合成される。
【０１０８】
ｐＩＥｋｄ−ＭＣＣ、ｐＩＥｋｄ、ｐＩＡｄ−ＯＶＡ及びｐＩＡｄ組換え分子を含む組換えウイルス株は、分泌されたタンパクを合成するためにバキュロウイルスに感染された昆虫細胞中に発現される。５−１０×１０５／ｍｌのＴＭＦ−ＦＨ培地中にハイ５（ｈｉｇｈ  ５）昆虫細胞（インビトロージェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））が、５−１０の複数の感染にてｐＩＥｋｄ、ｐＩＡｄ、ｐＩＥｋ／ｄ−ＭＣＣあるいはｐＩＡｄ−ＯＶＡ組換え分子を有するバキュロウイルスにて感染される。５〜６日後、培養液の上澄みが遠心分離にて収集される。
【０１０９】
分泌されたタンパクは、固定化された抗β鎖モノクロナール抗体（ＩＥβｋに特異的な１４−４−４及びＩＡβｄに特異的なＭ５／１１４）を用いて、免疫親和性により精製される。タンパクは、ｐＨ１０．５の標準緩衝液にて溶出され、直ちに中和される。タンパク回収量の相対量を測定するためにＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析がなされた。結果は、全ての場合において、αβヘテロ二量体の初期分泌を示す溶出されたタンパク中に等モルのα及びβ鎖が示された。総生成量は、１リットルの培地中０．５〜１．５ｍｇであった。
【０１１０】
免疫親和性にて精製されたαβ二量体の安定性は、ＨＰＬＣゲルろ過によって分析された。ゲルろ過分析において、２０ｕｌ（μｌ）中各々のタンパクの５０ｕｇ（μｇ）以下が、８ｍｍ×３００ｍｍの寸法（総容積１５ｍｌ以下）のソデックスプロテイン（Ｓｈｏｄｅｘ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）ＫＷ−８０４  ＨＰＬＣゲルろ過カラムにかけられた。カラムは、ＰＢＳにて０．５ｍｌ／分の速度にて溶出され、溶出物の吸光度（ＯＤ２８０）が測定された。示された４つの溶出曲線は、同一の総ＯＤ２８０に標準化された。図２において、分子量標品の溶出位置は図中の最上部に示され、それぞれウシ血清アルブミン，６７ｋＤ、卵白アルブミン，４３ｋＤ及びキモトリプシン，２５ｋＤである。図２（Ａ）において、ＩＥｄｋは、○−−−○、ＩＥｋ／ｄ−ＭＣＣは、●−−−●として示される。図２（Ｂ）において、ＩＡｄは、○−−−○、ＩＡｄ−ＯＶＡは●−−−●として示される。
【０１１１】
図２（Ｂ）に示された結果は、ＩＥｋ／ｄ及びＩＡｄタンパクはいずれも高分子量の凝集体であり、αβ二量体ピークにおいて明らかなサイズ異種抗体であることを示している。ＩＡｄは特に不安定で、免疫親和性カラムから溶出後、フリーのα及びβ鎖によってかなり解離されていることがわかる。ＩＥｋ／ｄ及びＩＡｄの安定性に欠けることは、その大部分において２つのタンパクの結合グルーブに結合する抗原ペプチドを欠くことによるものと考えられる。
【０１１２】
反対に、ＩＥｋ／ｄ−ＭＣＣタンパクは、均質なαβ異種二量体として迅速に移動する共有結合ＭＣＣペプチドによって、大幅に安定化された（図２（Ａ）参照）。同様に、ＩＡｄ−ＯＶＡはいくらかの高分子凝集体を生成したものの、タンパクの大部分が均質なαβ異種二量体として移動する共有結合ＯＶＡペプチドによって、かなりの程度まで安定化された。この安定化は、それらのペプチドがＩＥｋ／ｄ−ＭＣＣ及びＩＡｄ−ＯＶＡタンパクのペプチド結合グルーブに結合したことを示唆する。この実験の結果から、ＩＥｋ／ｄ−ＭＣＣ及びＩＡｄ−ＯＶＡタンパクはいずれもその結合グルーブに結合したペプチドを有し、これらのタンパクはいずれもその結合グルーブに結合したペプチドを有さないＩＥｋ／ｄ及びＩＡｄタンパクと比較してより安定している。
【０１１３】
また、ＭＨＣタンパクのペプチドとの相互作用における安定性を、室温または９４℃にてＩＥｋ／ｄ−ＭＣＣ及びＩＡｄ−ＯＶＡタンパクを１％ＳＤＳ中で培養することにより測定した。ＩＥｋ／ｄ−ＭＣＣタンパクにおいてこの方法による試験を行うと、室温では鎖は会合した状態に維持されたが、９４℃では維持されなかった。反対に、ＩＡｄ−ＯＶＡα及びβ鎖はいずれの温度においても解離した。これらの結果は、ＩＥｋ／ｄ−ＭＣＣタンパクを１％ＳＤＳ中で安定化するためには、ペプチドのみで十分であることを示唆している。しかしながら、恐らくα及びβ−鎖膜通過領域が存在しないことから、ＩＡｄ−ＯＶＡタンパクの安定化において、ペプチドは不十分である。
【０１１４】
次に、固定化したＩＥｋ／ｄ−ＭＣＣ及びＩＡｄ−ＯＶＡタンパクによる培養後にＴ細胞ハイブリドーマによるＩＬ−２産生量を測定することによって、ＩＥｋ／ｄ−ＭＣＣ及びＩＡｄ−ＯＶＡタンパクにおける本ペプチドに対する能力を測定した。免疫アフィニティーにより精製したＩＥｄｋ、ＩＡｄ、ＩＥｋ／ｄ−ＭＣＣ及びＩＡｄ−ＯＶＡを前記の方法により調製した。更に、（１）合成ＭＣＣ（８８−１０３）ペプチドをＩＥｄｋタンパクと混合し（ＩＥｄｋ＋ＭＣＣ）、（２）合成ＯＶＡ（３２７−３３９）をＩＡｄタンパクと混合する（ＩＡｄ＋ＯＶＡ）ことにより、ＩＥｄｋ及びＩＡｄＭＨＣ−ペプチド複合体を生成すべく試みた。これらの混合物を、１０μｇのクラスＩＩ分子と１０μｇのペプチドからなる濃度において、ｐＨ５．０、３７℃にて５０μｌのクエン酸緩衝液中で一晩培養した。培養後に混合物を中性化し、セントリコン１０フィルタユニットにより未結合ペプチドを除去した。
【０１１５】
複合体１０μｇを２ｘ１０−３ユニットのトロンビンによりｐＨ６．６にて２時間培養することにより、ＩＥｋ／ｄ−ＭＣＣ及びＩＡｄ−ＯＶＡタンパクのアリコートを消化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価すると、これらの条件下で少なくとも８０％の複合体が消化された。異なる量の種々のクラスＩＩ標本を、一晩、９６ウェルイミュロンＩＩ平板のウェル底に非特異吸収させることにより固定化した。９６ウェル平板のコーティングした各ウェルに、２５０ｕｌの組織培地中の５ＫＣ−７３．８（ＩＥｄｋ＋ＭＣＣ特異）（５ＫＣ）またはＤＯ−１１．１０（ＩＡｄ＋ＯＶＡ特異）Ｔ細胞ハイブリドーマ（１０５細胞）のいずれかを加えた。平板培養を一晩行い、ハイブリドーマによって産生されたＩＬ−２の量を評価した。結果を図３に示す。図３ａはＩＥｄｋ−ＭＣＣ（●）、ＩＥｄｋ＋ＭＣＣ（■）、トロンビンで処理したＩＥｄｋ−ＭＣＣ（★）、及びＩＥｄｋ（▼）、及び対照例としてのＩＡｄ−ＯＶＡ（＋）試料の存在下における５ＫＣ−７３．８細胞によるＩＬ−２産生量の結果を示す。結果は、精製したＩＥｄｋにＭＣＣペプチドを加えた混合物（ＩＥｄｋ＋ＭＣＣ）と比較して、ハイブリドーマの応答性は共有結合ＩＥｄｋ−ＭＣＣ複合体に対してより高かったことを示している。また、トロンビンによるリンカーの切断は、ＩＥｄｋ−ＭＣＣ複合体のＩＬ−２産生を誘導する能力に影響を及ぼさなかった。
【０１１６】
図３ｂは、ＩＡｄ−ＯＶＡ（■）、ＩＡｄ＋ＯＶＡ（×）、トロンビンで処理したＩＡｄ−ＯＶＡ（＋）、及びＩＥｄｋ−ＭＣＣ（●）、及び対照例としてのＩＡｄ（▲）試料存在下におけるＤＯ−１１．１０細胞によるＩＬ−２産生の結果を示す。結果は、ＩＡｄ−ＯＶＡとトロンビンで処理したＩＡｄ−ＯＶＡとはいずれも、Ｔ細胞ハイブリドーマによるＩＬ−２産生を誘導したことを示している。反対に、ＩＡｄ＋ＯＶＡ、ＩＥｄｋ−ＭＣＣ及びＩＡｄタンパクはＩＬ−２応答を誘導しなかった。
【０１１７】
その他２種類のＩＡｄ＋ＯＶＡペプチド特異Ｔ細胞ハイブリドーマにおいて、同様のアッセイによる試験を行った。一方は前述と同様に応答した。他方のハイブリドーマは、リンカーがトロンビンによって切断されるか否かに関わらず、ＩＡｄ−ＯＶＡに応答しなかった。このＴ細胞ハイブリドーマにおけるレセプターによるペプチド認識は、コンテクストに対する感受性を有し、即ちペプチドＮ末端に存在するいくつかのＩＡｄのβ１領域のアミノ酸のために、何らかの機序により阻止される可能性がある。
【０１１８】
図３に示す結果は、リンカーによるペプチド及びクラスＩＩタンパクの共有結合により、この組み合わせに特異なＴ細胞によって認識され得るペプチド−ＭＨＣ複合体が産生される。更に、共有結合ペプチド−ＭＨＣ複合体は、ペプチドを溶液中のＭＨＣタンパクと混合することにより産生される複合体と比較して、より良い免疫応答を誘導する。結果はまた、共有結合ペプチド−ＭＨＣ複合体はペプチドの存在しない場合のＭＨＣタンパクと比較してより安定していることを示している。いずれの場合も、ペプチド−ＭＨＣ共有結合複合体のリンカーを切断するためのトロンビンによる処理は、Ｔ細胞ハイブリドーマ認識をやや改善したのみであった。この事実は、リンカーは、クラスＩＩβ鎖のＮ末端に到達すべくクラスＩＩα鎖αヘリックスの上部にではなく、ペプチドのＣ末端からその両側に存在している可能性が最も高いことを示している（図１参照）。
【０１１９】
これらのデータは全て、リンカーによりＭＨＣクラスＩＩタンパクに共有結合したペプチドをコードする遺伝子は、Ｔ細胞により認識され得る可溶性タンパクとして発現し得ることを示している。データはまた、ＭＨＣタンパクにリンクされたペプチドは、ペプチドをＭＨＣタンパクと混合することにより生成された複合体と比較して、Ｔ細胞応答を刺激する上でより効果的な安定な複合体を生成することを示している。
【０１２０】
実施例２
本例は、リンカーによりＭＨＣクラスＩＩタンパクに共有結合したペプチドをコードする遺伝子は、Ｔ細胞により認識され得る可溶性タンパクとして発現し得ることを実証するものである。
【０１２１】
ＩＥαｄのアミノ酸残基５６−７３（ＩＥαｄペプチド（５６−７３））をコードする配列、トロンビン切断部位を有するリンカー、細胞外膜通過及び細胞質体領域を含むＩＡβｂ遺伝子を含むハイブリッドＩＡβｂ核酸分子を、ＰＣＲ増幅によって生成した。ハイブリッド分子を以下の方法により調製した。表５（配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４及び配列番号４５）に示すように、ＩＡβｂのリーダー部位及びβ１領域の最初の４コドンをコードすることにより第１のフラグメント（フラグメント３６２−３６３）を生成し、ＩＡβｂｃＤＮＡ鋳型にてプライマー＃３６２（５'ＣＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＡＧＡＴＧＧＣＴＣＴＧＣＡＧ３'  配列番号３８）及び＃３６３（５'ＴＴＡＣＡＡＣＣＧＧＴＣＡＣＧＴＧＧＧＡＣＴＣＧＧＡＧＴＴＴＣＧＡＴＣＧＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧ３'  配列番号３９）を用いてＩＥαｄペプチドの最初の１２コドンを生成した。プライマー＃３６２はＥｃｏＲＩ部位を含み、プライマー＃３６３はＮｈｅＩ部位を含む。フラグメント３６２−３６３を第２のＰＣＲフラグメント（フラグメント３６２−３６４）の鋳型として用いて、ＩＥαｄペプチドの残りの部分をコードする配列を加えることによってフラグメント３６２−３６４を延長し、プライマー＃３６４（５'ＧＧＴＧＧＣＣＴＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＴＣＧＴＴＡＣＡＡＣＣＧＧＴＣＡＣＧ３'  配列番号４６）によってリンカーの最初の７コドンを加えた。プライマー＃３６４はＳａｌＩ及びＢａｍＨＩ部位を含む。
【０１２２】
ＩＡβｂβ１をコードする配列（最初の４コドンを除いたもの）、β２、膜通過及び細胞質体領域を含む第３のフラグメント（フラグメント３６５−３６６）を、ＰＣＲ増幅によって生成した。フラグメント３６５−３６６をプライマー＃３６５（５'ＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＴＣＧＴＧ３'  配列番号４７）及びプライマー＃３６６（５'ＣＧＧＴＴＣＧＡＡＧＧＣＴＴＡＡＧＡＧＴＧＡＣＧＴＣＣＴＣＧＧＧＡＣＧ３'  配列番号４８）によって生成した。プライマー＃３６５はＢａｍＨＩ部位を含み、プライマー＃３６６はＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の両方を含む。ＩＥαｄ（５６−７３）ペプチドをコードする配列、リンカー、及びＮ−ＩＡｂ−Ｅａとして表されるＩＡβｂタンパクを含む上記のフラグメントから、核酸分子を生成した。
【０１２３】
【表６】
2006094862.tif 000008
Ｂ細胞へのトランスフェクションのため、ｐＴＺ−ＩＡｂ−Ｅａ（３６２−３６４）構造を形成するためにフラグメント３６２−３６４をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、消化されたフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩにより消化された担体ベクターｐＴＺ１８Ｒに結合することにより、組換え分子ｐＭ１２−ＩＡｂ−Ｅａを生成した。次にフラグメント３６５−３６６をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ｐＴＺ−ＩＡｂ−Ｅａ構造を形成するためにＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化されたｐＴＺ−ＩＡｂ−Ｅａ構造（３６２−３６４）に、消化されたフラグメントを連結した。次にＩＡｂ−Ｅａタンパクをコードする組換え分子ｐＭ１２−ＩＡｂ−Ｅａを生成するために、ｐＴＺ−ＩＡｂ−Ｅａ構造をＥｃｏＲＩにより消化し、発現ベクターｐＤＯＩ−５（ディ．マティス、シー．ベノワより入手、クラスＩＩプロモーター及びエンハンサー領域、β−グロブリンイントロン及びＥｃｏＲＩクローン化部位を含む）にサブクローン化した。正確な配向にてＩＡｂ−Ｅａタンパクをコードする配列を有するｐＭ１２−ＩＡｂ−Ｅａ組換え分子を、核酸塩基配列決定複対立（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ）ｐＭ１２−ＩＡｂ−Ｅａ組換え分子により同定した。
【０１２４】
繊維芽細胞へのトランスフェクションのため、前述したｐＴＺ−ＩＡｂ−Ｅａ構造をＥｃｏＲＩによりサブクローン化し、ＥｃｏＲＩフラグメントをＥｃｏＲＩにより消化された発現ベクターｐＨβＡｃＰｒ−１−ｎｅｏ（エス．ヘドリックより入手、ヒトβ−アクチンプロモーター及びエンハンサー、及びネオマイシン耐性をコードする配列を含む）にサブクローン化することにより、組換え分子ｐＦＩＢ−ＩＡｂ−Ｅａを生成した。クローン化した各挿入断片の配向を、核酸塩基配列決定によるクローニング後に決定した。
【０１２５】
表６（配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１及び配列番号５２）は、リーダーからペプチド及びリンカーを経てβ１領域までのＩＡβ鎖の核酸及びタンパク塩基配列を示す。対照例として、抗原ペプチドをコードする核酸塩基配列を含まない類似構造をＩＡβｂについて生成した。
【０１２６】
【表７】
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組換え分子ｐＭ１２−ＩＡｂ−ＥａまたはＩＡｂタンパクをコードする組換え分子により、Ｂ細胞系Ｍ１２．Ｃ３をトランスフェクトした。標準的な蛍光細胞分析分離装置分析（ＦＡＣＳ分析）により２つの異なる抗原を用いて、Ｍ１２細胞の表面におけるＩＡｂ−Ｅａタンパク、抗ＩＡαｄ抗体、ＩＥαｄペプチドが結合するＩＡｂタンパク特異抗体（５Ａ）の発現の有無を検出した。図４に示す結果は、ＩＡｂ−ＥａタンパクによりトランスフェクトされたＭ１２．Ｃ３細胞は、両抗体についてよく反応することを示している。トランスフェクトされていないＭ１２．Ｃ３細胞及び正常な脾臓細胞を、陰性対照として示す。従って、ＩＡｂ−ＥａタンパクはＭ１２．Ｃ３細胞にて発現し、細胞表面に到達する。更に、５Ａ抗体の結合によって示されるように、共有結合ペプチドはＩＡｂタンパクのペプチド結合グルーブに結合している。
【０１２７】
関連するＩＡｂタンパクの結合グルーブへの共有結合ＩＥαｄの結合度を測定するための試験を行った。ＩＡｂ−ＥａタンパクまたはＩＡｂタンパクのいずれかを有するＭ１２．Ｃ３細胞を、ｃＯＶＡペプチドが結合したＩＡｂタンパクに特異なＴハイブリドーマ細胞と混和した（ＢＯ．９７．１０）。ｃＯＶＡペプチド（例１に記載）または卵白アルブミンのいずれかを、濃度を増加しながら混合物に加え、ハイブリドーマによって産生されたＩＬ−２の量を測定した。ｃＯＶＡペプチドはＩＡｂタンパクの結合グルーブに結合し得ることが知られている。従って、ｃＯＶＡペプチドはペプチドが結合していないあらゆるＩＡｂタンパクに結合する。ＩＬ−２産生量は混合物中に存在しているｃＯＶＡペプチドが結合したＩＡｂタンパクの量を示す測定値である。結果を図５に示す。
【０１２８】
ＩＡｂ−Ｅａタンパク（■）を有するＭ１２．Ｃ３細胞は、卵白アルブミン存在下でＢＯ．９７．１０細胞によるＩＬ−２産生を刺激しなかった。ＩＡｂタンパク（□）を有するＭ１２．Ｃ３細胞は、実質的な濃度の卵白アルブミン存在下でＩＬ−２産生を刺激した。これらの結果は、卵白アルブミンはＭ１２．Ｃ３細胞により吸収され、ＩＡｂ−Ｅａタンパクに関連する細胞表面にて処理及び提示されるが、ＩＡｂ−Ｅａタンパクに関連しない場合は処理及び提示されないことを示している。従って、恐らくＩＡｂ−Ｅａタンパクの結合グルーブには共有結合ＩＥαｄペプチドが結合することから、ＩＡｂ−Ｅａタンパクは細胞内では卵白アルブミンペプチドに結合し得ない。
【０１２９】
予測されたように、ＩＡｂタンパク（□）を有するＭ１２．Ｃ３細胞は、ｃＯＶＡペプチド存在下でＩＬ−２産生を刺激した。ＩＡｂ−Ｅａタンパク（■）を有するＭ１２．Ｃ３細胞もまた、ｃＯＶＡ存在下でＩＬ−２産生を刺激した。しかしながら、ＩＡｂタンパクを有する細胞と比較して、ＩＡｂ−Ｅａタンパクを有する細胞に必要なｃＯＶＡ量は約１０倍多く、同細胞により刺激されるＩＬ−２産生量は約１０倍少なかった。従って、約１０％のＩＡｂ−ＥａタンパクのみがｃＯＶＡペプチドに結合し、約９０％のＩＡｂ−ＥａタンパクがＩＡｂタンパクの結合グルーブに結合したＩＥαｄを有していた。結果はまた、ＩＡｂ−Ｅａタンパクの共有結合ＩＥαｄペプチドはＩＡｂ結合グルーブに安定して結合することを示している。
【０１３０】
ＩＡｂ−Ｅａタンパクを有するＭ１２．Ｃ３細胞がペプチドを提示する能力を、ＩＡｂ−Ｅａタンパクに特異なＴ細胞ハイブリドーマによるＩＬ−２産生量を測定することによって調べた。ＩＡｂ−ＥａタンパクまたはＩＡｂタンパクを有するＭ１２．Ｃ３細胞（１０５細胞／ウェル）をＢＥ−２０．６Ｔハイブリドーマ細胞（１０５細胞／ウェル）と混和し、２４時間培養した。培養後、ハイブリドーマによって産生されたＩＬ−２の量を測定した。結果は、ＩＡｂ−Ｅａタンパクを有するＭ１２．Ｃ３細胞はハイブリドーマによりＩＬ−２産生を誘導することができるが、ＩＡｂタンパクを有するＭ１２．Ｃ３細胞はＩＬ−２産生を誘導することができなかったことを示す（図６参照）。従って、共有結合ペプチドはＩＡｂタンパクのペプチド結合グルーブに結合し、複合体によりＴ細胞応答が誘導されるように、Ｂ細胞の表面に発現する。
【０１３１】
第２の試験において、繊維芽細胞を組換え分子ｐＦＩＢ−ＩＡｂ−Ｅａによりトランスフェクトし、即ちＩＡｂタンパクをコードする組換え分子を繊維芽細胞にトランスフェクトした。繊維芽細胞表面におけるＩＡｂ−Ｅａタンパクの発現を、前述と同じ抗体を用いてＦＡＣＳ分析により分析した。図７に示すように、ＩＡｂ−Ｅａタンパクをコードする組換え分子によりトランスフェクトした繊維芽細胞は、抗ＩＡｂ抗体及びＩＥαｄペプチドが結合したＩＡｂタンパクに特異な抗体（５Ａ）のいずれにおいても良好に反応した。従って、トランスフェクトされたＩＡｂ−Ｅａ組換え分子によりコードされたタンパクは繊維芽細胞にてよく発現し、ＩＡｂ−Ｅａタンパクは繊維芽細胞の表面に到達した。
【０１３２】
Ｂ細胞について行った試験と同様に、ＩＡｂタンパク結合グルーブへの共有結合ＩＥαｄの結合度を測定するために、ＩＡｂ−ＥａタンパクまたはＩＡｂタンパクを有する繊維芽細胞について試験を行った。ＩＡｂ−ＥａタンパクまたはＩＡｂタンパクのいずれかを有する繊維芽細胞をＢＯ．９７．１０Ｔハイブリドーマ細胞と混和した。ｃＯＶＡペプチドを濃度を増加しながら混合物に加え、ハイブリドーマによって産生されたＩＬ−２の量を測定した。結果を図８に示す。予測されたように、ＩＡｂタンパク（□）を有する繊維芽細胞は、ｃＯＶＡペプチド存在下でＩＬ−２産生を刺激した。ＩＡｂ−Ｅａタンパク（■）を有する繊維芽細胞により刺激されるＩＬ−２産生量は約１０倍少なく、必要とされたｃＯＶＡペプチド量は約１０倍多かった。従って、Ｂ細胞において産生されるＩＡｂ−Ｅａタンパクと同様に、繊維芽細胞において産生されたＩＡｂ−Ｅａタンパクの約９０％がＩＥαｄペプチドに結合した。
【０１３３】
ＩＡｂ−ＥａタンパクまたはＩＡｂタンパクを有する繊維芽細胞において、３つの異なるＴ細胞ハイブリドーマであるＢＥ−２０．１５、ＢＥ−１６またはＢＥ−３６によりＩＬ−２産生を誘導する能力の試験を行った。前述の方法に従ってハイブリドーマ細胞及び繊維芽細胞を培養し、ＩＬ−２産生量を測定した。図９に示す結果はＩＡｂ−Ｅａタンパクを有する繊維芽細胞はＩＬ−２産生を誘導することができるが、ＩＡｂタンパクを有する繊維芽細胞はＩＬ−２産生を誘導しなかった。これらの結果は、リンカーを介して共有結合したペプチドを有するＭＨＣタンパクは、典型的にはＭＨＣタンパクを発現しない細胞型にて発現し得ることと、ペプチド−ＭＨＣ複合体はハイブリドーマによって認識され、その結果ＩＬ−２産生を刺激し得ることとを証明している。
【０１３４】
これらのデータを総合すると、ＭＨＣクラスＩＩタンパクにリンクしたペプチドをコードする遺伝子は、細胞内にて膜結合タンパクとして発現し得ることが示される。共有結合ペプチドはＭＨＣタンパクの結合グルーブに結合することができ、抗体またはＴ細胞によって認識され得る。
【０１３５】
実施例３
本例は、リンカーによってＭＨＣクラスＩＩタンパクに共有結合したペプチドをコードする遺伝子は、マウスにおいてトランスジーンとして発現し得ることを証明する。
Ａ．ＩＥβｋ−ＭＣＣトランスジェニック・マウス
ガのシトクロームｃにおける残基９１−１０３（ＭＣＣペプチド（９１−１０３）、リンカー、及び例１に詳述した遺伝子をコードするＩＥβｋによって核酸分子を生成し、ヘモグロビンβ鎖プロモーターによりサブクローン化した。その結果得られた組換え分子を、以下ｐＩＥβｋ−ＭＣＣ−Ｔｇとする。多数のコピーのｐＩＥβｋ−ＭＣＣ−Ｔｇを、（Ｂｌ／６ｘＳＪＬ）Ｆ２マウスから取り出した授精卵の核に注入し、その卵を母体に戻した。ＩＥβｋ−ＭＣＣトランスジーンを発現した２匹のマウスを同定した。これらのマウスを創立者（ｆｏｕｎｄｅｒｓ）とする。これら創立者から発生したトランスジェニック子孫は、創立者らと識別不能であった。次にトランスジェニック子孫をＨ−２ｋと交雑した。
【０１３６】
Ｂ．トランスジェニック・マウスにおけるＩＥβｋ−ＭＣＣ発現部位
第１の例において、トランスジーン陽性Ｈ−２ｋマウスの骨髄、脾臓及びリンパ節から細胞を分離した。次に分離細胞について、ＭＣＣ９１−１０３ペプチドと結合したＩＥｋに特異なＴ細胞ハイブリドーマを刺激する能力に関するアッセイを（例１に記載の方法に従い）行った。同細胞において、抗原（ＭＣＣ８８−１０３）を加えた場合と加えない場合のいずれについても試験を行った。
【０１３７】
図１０に示すように、抗原が存在しない場合、Ｔ細胞ハイブリドーマは骨髄及び脾臓から分離された細胞によく反応したが、リンパ節から分離された細胞にはあまり反応しなかった。結果は、ドナーのマウスが用いられた時点の週齢（５週間）では骨髄及び脾臓には多量の赤血球前駆細胞が存在するが、リンパ節においてはそうではないことから、トランスジーンは赤血球前駆細胞に発現することを示している。抗原を加えた対照サンプルによる結果から、分離されたリンパ節細胞集団は抗原を提示可能なＩＥｋを有する細胞を含んでいたが、トランスジェニックＩＥｋ−ＭＣＣは含まれなかったことが示される。
【０１３８】
トランスジェニックＩＥｋ−ＭＣＣタンパクが赤血球前駆細胞または赤血球上に発現されることを確認するために、Ｈ−２ｋマウスから分離した骨髄または脾臓トランスジーン陽性細胞においてＴｅｒ１１９抗原の有無を調べた。Ｔｅｒ１１９抗原は後期の赤血球前駆細胞または赤血球の表面に認められるが、その他の造血細胞には認められないタンパクである。
【０１３９】
標準的な蛍光細胞分析分離技術（ＦＡＣＳ）を用いて、骨髄または脾臓細胞集団をフルオレセインで標識した抗Ｔｅｒ１１９抗体により、当業者に公知の標準的な条件に基づき培養した。次に結合した抗Ｔｅｒ１１９抗体を有する細胞を得るために、標識細胞をＦＡＣＳにより分析した。次にＦＡＣＳにより分離されたＴｅｒ１１９陽性トランスジーン陽性細胞において、結合したＭＣＣ９１−１０３ペプチドを有するＩＥｋに特異なＴ細胞ハイブリドーマを刺激する能力のアッセイを、例１に記載の方法によって行った。
【０１４０】
結果は、Ｔｅｒ１１９陽性細胞はＭＣＣ８８−１０３ペプチドが加えられないとき、結合したＭＣＣ９１−１０３ペプチドを有するＩＥｋに特異なＴ細胞を刺激したことを示す（図１１参照）。従って、トランスジェニックＩＥｋ−ＭＣＣタンパクは、トランスジェニックＨ−２ｋマウスから分離された骨髄及び脾臓細胞集団に含まれる後期赤血球前駆細胞及び赤血球にて発現する。
【０１４１】
実施例４
本例では、マウスにおいて、ＭＣＣ９１−１０３に共有結合したＩＥｋタンパクにより、結合したＭＣＣ９１−１０３を有するＩＥｋに特異なＴ細胞数が減少することを証明する。
【０１４２】
トランスジェニックＩＥｋ−ＭＣＣタンパクを発現しているトランスジェニック子孫を、Ｈ−２ｋと、結合したＭＣＣ９１−１０３ペプチドを有するＩＥｋを認識する（即ち結合する）トランスジェニックＴ細胞レセプターとを発現しているマウス系と交雑した。その結果発生した子孫からリンパ節細胞を分離した。次に結合したＭＣＣ９１−１０３ペプチドを有するＩＥｋに特異なトランスジェニックＴ細胞レセプターのＶα１１（Ｖａ１１）またはＶβ３（Ｖｂ３）鎖に特異なフルオレセイン標識抗体、またはトランスジェニックＩＥｋ−ＭＣＣタンパク特異抗体により分離したリンパ節細胞を染色し、ＦＡＣＳにより分析した。
【０１４３】
結果を図１２に示す。結果から、ダブルトランスジェニックマウスから分離されたリンパ節細胞集団では、結合したＭＣＣ９１−１０３ペプチドを有するＩＥｋに特異なＴ細胞レセプターのみを発現しているシングルトランスジェニックマウスから分離されたリンパ節細胞集団と比較して、リンパ節に存在するＴ細胞数はより少ないことが示される。更に、ダブルトランスジェニックマウスから分離されたリンパ節細胞集団では、結合したＭＣＣ９１−１０３ペプチドを有するＩＥｋに特異なＴ細胞レセプターを発現している細胞数はより少なかった。従って、トランスジェニックＩＥｋ−ＭＣＣタンパクの存在により、マウスのリンパ節細胞集団において、総Ｔ細胞数及び結合したＭＣＣ９１−１０３ペプチドを有するＩＥｋに特異なＴ細胞レセプター陽性のＴ細胞数が減少した。
【０１４４】
実施例５
本例では、マウスにおいて、ＭＣＣ９１−１０３に共有結合したＩＥｋタンパクにより、結合したＭＣＣ９１−１０３ペプチドを有するＩＥｋに対する耐性が誘導されることを証明する。
【０１４５】
トランスジェニックＩＥｋ−ＭＣＣタンパクを発現しているトランスジェニック子孫を、ＩＥｋ及びＩＥｓを発現しているマウス系と交雑した。非トランスジェニックＩＥｓマウスは、ＭＣＣ９１−１０３ペプチドにて処理すると、ＩＥｋに結合したＭＣＣ９１−１０３ペプチド、及びＩＥｓに結合した同ペプチドに対して反応可能なＴ細胞を産生した。しかしながら、このようなＴ細胞は、２種類の異なる組のＴ細胞を含む。ＩＥｋ／ＩＥｓ（ｋｘｓ）マウス及びＩＥｋ−ＭＣＣトランスジェニックＩＥｋ／ＩＥｓ（ｋｘｓ）マウスを、ＩＥｋまたはＩＥｓのいずれかの存在下で、ＭＣＣ９１−１０３ペプチド、またはＴ細胞によって認識され得る陽性対照ヘモグロビン６４−７６ペプチド（Ｈｂβｄ）によって処理した。処理されたマウスからＴ細胞を分離し、例１に記載の方法により、ＩＥｋまたはＩＥｓを加えたＭＣＣ８８−１０４ペプチドまたはＨｂβｄ６４−７６ペプチドに応答する能力についてのアッセイを行った。
【０１４６】
結果を図１３に示す。結果から、トランスジェニックＩＥｋ−ＭＣＣタンパクを発現しているマウスから分離されたＴ細胞は、ＩＥｋまたはＩＥｓを加えたＨｂβｄ６４−７６ペプチドによく反応したことが示される。Ｔ細胞はまた、ＩＥｓを加えたＭＣＣ８８−１０４によく反応した。しかしながら、トランスジェニックＩＥｋ−ＭＣＣタンパクを発現しているマウスから分離されたＴ細胞のＭＣＣ８８−１０４ＩＥｋに対する応答を、正常なｋｘｓマウスから分離されたＴ細胞の応答と比較すると、トランスジェニックＴ細胞の応答は乏しかった。従って、結果から、トランスジェニックＩＥｋ−ＭＣＣタンパクにより、ＩＥｋ−ＭＣＣトランスジェニック・マウスにおける耐性が誘導されたことが示される。
【０１４７】
以上、本発明の種々の実施例を詳述したが、当業者によりこれら実施例の変形例または応用例が考えられ得ることは自明である。しかしながら、このような変形例及び応用例は、以下の請求項に記載する本発明の範囲内にあることを明白に理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】リンカーを介してＭＨＣタンパクの結合部位に対して共有結合されたペプチドの概略図である。
【図２】（Ａ）及び（Ｂ）は、共有結合されたペプチドによる可溶性ＭＨＣクラスＩＩ分子の安定化を示すグラフである。
【図３】リンカーを介して抗原ペプチドに結合された精製され、かつ固定化されたクラスＩＩタンパクによるＴ細胞ハイブリドーマの刺激を示すグラフである。
【図４】Ｍ１２．Ｃ３細胞によるＩＡｂ−Ｅａタンパクの発現を示すグラフである。
【図５】Ｍ１２．Ｃ３細胞上に発現したＩＡｂ−Ｅａタンパクに対して共有結合されたＯＶＡ及びオボアルブミンのペプチドによる阻害を示すグラフである。
【図６】Ｔ細胞ハイブリドーマＩＡｂ−Ｅａタンパクを有するＭ１２．Ｃ３細胞の刺激を示すグラフである。
【図７】繊維芽細胞上のＩＡｂ−Ｅａタンパクの発現を示すグラフである。
【図８】繊維芽細胞上に発現したＩＡｂ−Ｅａタンパクに結合するＯＶＡの共有結合されたペプチドが引き起こす阻害を示すグラフである。
【図９】ＩＡｂ−Ｅａタンパクを有する繊維芽細胞によるＴ細胞ハイブリドーマの刺激を示すグラフである。
【図１０】ＩＥｋ−ＭＣＣトランスジーンを骨髄及び脾臓個体群において発現させた様子を示すグラフである。
【図１１】ＩＥｋ−ＭＣＣトランスジーンをＴｅｒ１１９抗原陽性赤血球細胞内へ発現させた様子を示すグラフである。
【図１２】ＩＥｋ−ＭＣＣトランスジーン生成物の存在がトランスジェニック・マウスから分離されたリンパ節細胞個体群においてＴ細胞の数量を減少させる様子を示すグラフである。
【図１３】ＩＥｋ−ＭＣＣトランスジーン生成物の存在がトランスジェニック・マウス内においてＩＥｋ応答細胞の数量を減少させる様子を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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