(57)【要約】【課題】本発明は、早期かつ正確にカンキツグリーニング病（ＣＧ病）を検出することができる方法、ＣＧ病を簡便に検出するためのＣＧ病検出キット、およびＣＧ病の検出に用いられる鉄濃度測定装置を提供することを目的とする。【解決手段】本発明のＣＧ病の検出方法は、ＣＧ病に罹ったカンキツ類等の樹木の葉部に含まれる鉄およびマンガンの濃度が、健全樹木のそれに比して有意に減少するという新規知見に基づくものであり、被検定樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度を測定する「測定工程」を包含する。また当該ＣＧ病の検出方法は、被検定樹から抽出液を取得する「抽出工程」、および上記測定工程において測定された被検定樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度と、健全樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度とを比較する「比較工程」を包含してもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検定樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度を測定する測定工程
を包含することを特徴とするカンキツグリーニング病の検出方法。
【請求項２】
上記測定工程は、被検定樹の葉部に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度を測定する工程であることを特徴とする請求項１に記載のカンキツグリーニング病の検出方法。
【請求項３】
上記鉄およびマンガンが、それぞれ水溶性鉄および水溶性マンガンであることを特徴とする請求項１または２に記載のカンキツグリーニング病の検出方法。
【請求項４】
上記測定工程において測定された被検定樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度と、
健全樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度とを比較する比較工程
をさらに包含することを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載のカンキツグリーニング病の検出方法。
【請求項５】
被検定樹から抽出液を取得する抽出工程
をさらに包含することを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載のカンキツグリーニング病の検出方法。
【請求項６】
上記抽出工程は、被検定樹の葉部から抽出液を取得する工程であることを特徴とする請求項５に記載のカンキツグリーニング病の検出方法。
【請求項７】
上記抽出工程は、水また緩衝液を用いて被検定樹から抽出液を取得する工程であることを特徴とする請求項５または６に記載のカンキツグリーニング病の検出方法。
【請求項８】
上記抽出工程は、リン酸緩衝液、2-morpolinoethanesulfonic acid緩衝液（ＭＥＳ緩衝液）、またはHomopiperazin-N,N'-bis-2-(ethansulfonsyre)緩衝液（HOMOPIPES緩衝液）を用いて被検定樹から抽出液を取得する工程であることを特徴とする請求項５または６に記載のカンキツグリーニング病の検出方法。
【請求項９】
鉄濃度測定手段およびマンガン濃度測定手段の一方または双方を備えることを特徴とするカンキツグリーニング病検出キット。
【請求項１０】
被検定樹から抽出液を取得する抽出手段をさらに備えることを特徴とする請求項９に記載のカンキツグリーニング病検出キット。
【請求項１１】
被検液が注入されるセル部、
被検液の吸光度を測定する吸光度測定部、および
鉄濃度測定用試薬と被検液とがその内部において反応する反応容器
を備えることを特徴とするカンキツグリーニング病の検出に用いられる鉄濃度測定装置。
【請求項１２】
被検液が注入されるセル部、
被検液の吸光度を測定する吸光度測定部、および
鉄濃度測定用試薬と被検液とがその内部において反応する反応容器
を備えることを特徴とする鉄含有植物の含有鉄分の濃度測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検定樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度測定し、当該いずれかの濃度の低下を指標として、カンキツグリーニング病を検出する方法、およびカンキツグリーニング病検出キット、並びに当該カンキツグリーニング病の検出に用いる鉄濃度測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カンキツグリーニング病（以下、適宜「ＣＧ病」という。）は、グラム陰性細菌であるLiberobacter asiaticum （L. asiaticum）またはLiberobacter africanum （L.africanum）がカンキツ類等の樹木に感染して起こる植物病である。その発生源は中国であるとされており、インド、アジア、インドネシアやフィリピンを含む東南アジア、アフリカ、アラビア半島において発生し、その猛威をふるっている。ＣＧ病はカンキツ類の難防除病害とされ、わが国では１９８６年に西表島、１９９４年に沖縄本島において発見された（非特許文献７）。
【０００３】
当該ＣＧ病に罹ったカンキツ類の果実は小さく、また熟しているにもかかわらず、その大部分が緑色のままであり、さらにその味も相当苦いものである。よって、ＣＧ病に罹ったカンキツ類の果実の商品価値は、ほとんどないといえる。また、ＣＧ病に罹った樹木は落葉し、やがて枯死する。よって当該ＣＧ病は、園芸農業に対して大打撃をもたらす深刻な病害であるといえる。なおＣＧ病は、カンキツキジラミ（Diaphorina citri、および Trizoa erytreae）が媒介して感染するということが知られており、その感染力は高い。またＣＧ病に罹ったカンキツ類等の樹木は、根からの亜鉛吸収が阻害され、亜鉛欠乏を起こすということが知られている。なお上記ＣＧ病については、例えば、非特許文献１、２、３、４等に開示されている。
【０００４】
現段階のＣＧ病に対する対処方法としては、罹病樹の早期発見および伐採、媒介虫であるカンキツキジラミの防除を行なうことが最善策とされている。ＣＧ病の検出方法としては、例えばわが国ではカンキツ葉部等の樹木の観察および接木による検出方法（例えば、非特許文献８〜１０参照）、罹病中に存在する蛍光物質をマーカーとして検出する方法およびその簡易検出法（非特許文献５、非特許文献１１〜１５参照）、モノクローナル抗体による検出（非特許文献６、非特許文献１６〜１８参照）、ＤＮＡプローブによるサザンハイブリダイゼーションおよびドットハイブリダイゼーション検出方法（非特許文献１９〜２１参照）、ＰＣＲ法による検出方法（非特許文献２２〜２６参照）、電子顕微鏡による病原体そのものを観察する方法および光学顕微鏡により罹病葉師管部異常形態を観察する方法（非特許文献２７〜３１参照）、またその他の方法としてヨウ素・デンプン反応を利用した検出方法（特許文献１参照）も考案されている。
【非特許文献１】James Planck, ”Citrus Greening (Huanglongbing) Watch out for this exotic disease”, September 1999, http://www.dpi.qld.gov.au/health/5639.html,（２００４年２月１６日検索）
【非特許文献２】Joseph L. Knapp, Susan Halbert, Richard Lee, Marjorie Hoy, Richard Clark and Michael Kesinger, “The Asian Citrus Psyllid and Citrus Greening Disease” January 9, 2004, http://ipm.ifas.ufi.edu/agricultural/fruit/citrus/ASP-hoy.htm, （２００４年２月１６日検索）
【非特許文献３】J. V. da Graca, “CITRUS GREENIG DISEASE” Annu. Rev. Phytopathol. 1991. 29: 109-36
【非特許文献４】FFTC NEWSLETTER 2000/128, “Micronutrients in crop production” June 2000
【非特許文献５】Schwarz, R. E. 1968. Indexing of greening and exocortis through fluorescent marker substances. Proc. Conf. Int. org. Citrus Virol., 4th pp. 118-24
【非特許文献６】Garnier, M., Martin-Gros, G., Bove, J. M. 1987. Monoclonal antibodies against the bacterial-link organism associated with citrus greening disease. Ann. Inst. Pasteur/ Microbiol. 138: 639-50
【非特許文献７】Kawano, S., Ctrus greening control project in Okinawa, Japan, Extension Bulletin- ASPAC, Food & Fertilizer Technology Center, Food and Fertilizer Technology Center for the Asian and Pacific Region, Taipei, Taiwan: 1998, 459, 7-10, 10 ref.
【非特許文献８】Tsunekuni Miyakawa, Experimentally-induced Symptoms and Host range of Ctirus Likubin (Greening Dsiease), Ann. Phytopath, Sco, Japan 46, 224-230, 1980
【非特許文献９】加納健、果樹ウイルス病の診断方の実際（１）カンキツウイルス病の検定方法（１）、植物防疫  第４３巻  第３号、３７−４１、
【非特許文献１０】加納健、果樹ウイルス病の診断方の実際（２）カンキツウイルス病の検定方法（２）、植物防疫  第４３巻  第６号、５４−５８
【非特許文献１１】Shama, R. C., Bakhshi, J. C., Jeyarajan, R. Periodic Changes in the concentration of fluorescent marker substance in relation to leaf chlorisis of swee-orange, Indian Jaournal of Agricultural Sciences, 1974, 44, 1, 18-21
【非特許文献１２】Sniassy, N., Lallmahomed, G.M. Confirmation of the citrus greening diseases in Mauritlus by identification of the marker substance gentiosyl glucose. Revue Agricole et Sucriere de I’Iie Maurice, 1972, 51, 3, 198-200
【非特許文献１３】Vuuren, S. P. van, Comparison of thin layer chromatographic methods for indexing citrus greening disease. Phytophylactica. 1977, 9, 4, 91-94..
【非特許文献１４】Cheema, S. S., Dhillon, R. S., Kapur, S. P. Flowers as source material in chromatographic detection of citrus greening disease. Current Science, 1982, 51, 5, 241
【非特許文献１５】Hooker, M. E., Lee, R. F., Civerolo E. L., Wang, S. Y. Reliability of gentisic acid, a fluorescent marker, for diagnosis of citrus greening disease. Plant Disease, 1993, 77, 2, 174-180.
【非特許文献１６】Nariani, T.K., Ghosh,S. K., Kumar, D., Raychaudhuri, S. P., viswanath, S.M. Detectio of possibilities of therapeutic control of the greening disease of citrus caused by mycoplasma. Proceedings of the Indian National Science Academy. B. 1975, 41, 4, 334-339
【非特許文献１７】Garnier，M.，Martin−Gros，G.，Iskra，M.L.，Zreik，L.，Gandar，J.，Fos，A.，Bove，J.M.Monoclonal antibodies against the MLOs associated with tomato stolbur and clover phyllody. Recent advances in mycoplasmology. Proceedings of the 7th congress of the International Organization for Mycoplasmology, Baden near Vienna, 1988.
【非特許文献１８】Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Germany; 1990, 263-269
【非特許文献１９】Villechanoux, S., Garnier, M., Renaudin, J., Bove, M. Detection of several strains of the bacterium-like organism of citrus greening disease by DNA probes. Current Microbiology, 1992, 24, 2, 89-95
【非特許文献２０】HungTingHsuan，WuMengLing，SuHongJi. Detection of fastidious bacteria causing citrus greening disease by non-radioactive DNA proves. Annals of the Phytopathological Sciety of Japan. 1999, 65, 2, 140-146
【非特許文献２１】Hung. T. H., Wu. M. L., Su. H. J. Identification of alternative hosts of the fastidious bacterium causing citrus greening disease. Journal of Phytopathology, 2000, 148, 6, 321-326
【非特許文献２２】Jagoueix, S., Bove, J.M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. International Journal of Systematic Bacteriology. 1994, 44, 3, 379-386
【非特許文献２３】Sandrine Jagoueix, Joseph M. Bove, and Monique Garnier. Comparison of the 16S/23S Ribosomal Intergenic Regions of “Candidatus Liberobacter asiaticum” and “Candidatus Liberobacter africanum,” the two Species Associated with Citrus Huanglongbing (Greening) Disease. International Fournal of Systematic Bacteriology, 1997, 224-227
【非特許文献２４】Agnes Hocquellet, Joseph M. Bove, Monique Garnier. Isolation of DNA from the uncultured “Candidatus Liberobacter” Species Associated with citrus Huanglongbing by RAPD. Current Microbiology 38, 176-182
【非特許文献２５】HungTingHsuan，WuMengLing，SuHongJi. Detection of fastidious bacteria causing citrus greening disease by non-radioactive DNA proves. Annals of the Phytopathological Sciety of Japan. 1999, 65, 2, 140-146, 15ref
【非特許文献２６】Hung. T. H., Wu M. L., Su. H. J. Development of a rapid method for the diagnosis of citrus greening disease using the polymerase chain reaction. Journal of Phytopathology, 199, 147, 10, 599-604, 13 ref
【非特許文献２７】Tanaka, s., Doi, Y. Studies on mycoplasma-like organisms suspected cause of citrus likubin and leaf-mottling. Bulletin of the Faculty of Agriculture, Tamagawa University, 1974, 14, 64-70
【非特許文献２８】Garnier, M., Bove, J. M. Trilamella structure of two membranes surrounding prokaryotic organisms associated with citrus greening disease. Fruits. 1977. 32, 12, 749-752, 10 ref
【非特許文献２９】Aubert. B., Bove, J. M., Etienne. J. Control of citrus greening disease in Reunion. Results and prospects. Fruits. 1980, 35, 10, 605-624. 78ref
【非特許文献３０】Garnier, M., Bove, J. M. Tranmission of the organisms associated with citrus greening disease from sweet orange to periwinkle by dodder. Phytopathology, 1983, 73, 10, 1358-1363
【非特許文献３１】Akhtar, M. A Ahmad, I. Incidence of citrus greening disease in Pakistan. Pakistan Journal of Phytopathology. 1999, 11, 1, 1-5
【特許文献１】特開２００４−２６４１０１号公報（公開日：平成１６年９月２４日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のごとく、ＣＧ病はカンキツ類等の樹木にとって深刻な病害であり、その被害を最小限に抑えるためには罹病樹をできるだけ早期に発見することが重要である。したがってＣＧ病の早期検出方法が求められている。また園芸農家がその検出を独自に行なう場合が多いため、ＣＧ病の検出方法としては、熟練した技術、および複雑な機器を必要としない簡便な検出方法が求められる。
【０００６】
しかしＣＧ病の検出方法としては、上述の方法を始めとして種々考案されているが、いずれにおいても満足のいくものとはなっていなかった。例えば、樹木の観察による検出方法では、実際に症状が現れるまで正確な判断することができず、早期検出を行なうことができない。また、早期検出可能な方法としては、上記蛍光物質をマーカーとして検出する方法（非特許文献１５）、ＤＮＡプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションおよびドットハイブリダイゼーション検出方法（非特許文献１９〜２１）、ＰＣＲ法による検出方法（非特許文献２２、２３、２４、２５、２６）等がある。しかし、蛍光物質をマーカーにする方法（非特許文献１５）や特許文献１に記載された方法では複雑な機器を必要としないが、正確性においてＰＣＲ技術に劣るという欠点を有している。現在、植物防疫所におけるＣＧ病の診断には、ＰＣＲ法が利用されているが、この手法はサーマルサイクラーなどの検出機器、高額な反応試薬や発色試薬、ある程度の検出技術が必要なことから、簡便・安価な迅速・高感度検出法として広く民間で利用されるに至っていない。
【０００７】
そこで本発明は、早期かつ正確にＣＧ病を検出することができる方法、ＣＧ病を簡便に検出するためのＣＧ病検出キット、およびＣＧ病の検出に用いる鉄濃度測定装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、ＰＣＲ法によってカンキツグリーニング病に罹ったと診断されたカンキツ類樹木の葉部に含まれる鉄およびマンガンの濃度が、健全樹木のそれに比して有意に減少していることを発見し、本発明を完成するに至った。なお、カンキツグリーニング病と亜鉛欠乏との関連については、非特許文献１および４等において開示されているが、カンキツグリーニング病と、鉄欠乏またはマンガン欠乏との関連に関してはこれまでに報告されていない。したがって本発明は、本発明者らが見出した上記新規知見に基づき完成されたものであるといえる。
【０００９】
すなわち本発明にかかるカンキツグリーニング病の検出方法は、上記課題を解決するために、被検定樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度を測定する測定工程を包含することを特徴としている。
【００１０】
また本発明にかかるカンキツグリーニング病の検出方法は、上記課題を解決するために、上記測定工程は、被検定樹の葉部に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度を測定する工程であってもよい。
【００１１】
また本発明にかかるカンキツグリーニング病の検出方法は、上記課題を解決するために、上記鉄およびマンガンが、それぞれ水溶性鉄および水溶性マンガンであってもよい。
【００１２】
また本発明にかかるカンキツグリーニング病の検出方法は、上記課題を解決するために、上記測定工程において測定された被検定樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度と、健全樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度とを比較する比較工程をさらに包含する方法であってもよい。
【００１３】
また本発明にかかるカンキツグリーニング病の検出方法は、上記課題を解決するために、被検定樹から抽出液を取得する抽出工程をさらに包含する方法であってもよい。
【００１４】
また本発明にかかるカンキツグリーニング病の検出方法は、上記課題を解決するために、上記抽出工程は、被検定樹の葉部から抽出液を取得する工程であってもよい。
【００１５】
また本発明にかかるカンキツグリーニング病の検出方法は、上記課題を解決するために、上記抽出工程は、水また緩衝液を用いて被検定樹から抽出液を取得する工程であってもよい。
【００１６】
また本発明にかかるカンキツグリーニング病の検出方法は、上記課題を解決するために、上記抽出工程は、リン酸緩衝液、2-morpolinoethanesulfonic acid緩衝液（ＭＥＳ緩衝液）、またはHomopiperazin-N,N'-bis-2-(ethansulfonsyre)緩衝液（HOMOPIPES緩衝液）を用いて被検定樹から抽出液を取得する工程であってもよい。
【００１７】
一方、本発明にかかるカンキツグリーニング病検出キットは、上記課題を解決するために、鉄濃度測定手段およびマンガン濃度測定手段の一方または双方を備えることを特徴としている。
【００１８】
また本発明にかかるカンキツリーニング病の検出キットは、被検定樹から抽出液を取得するための抽出手段をさらに備えるものであってもよい。
【００１９】
一方、本発明にかかるカンキツグリーニング病の検出に用いられる鉄濃度測定装置は、上記課題を解決するために、被検液が注入されるセル部、被検液の吸光度を測定する吸光度測定部、および鉄濃度測定用試薬と被検液とがその内部において反応する反応容器を備えることを特徴としている。
【００２０】
また、本発明にかかる鉄含有植物の含有鉄分の濃度測定装置は、上記課題を解決するために、被検液が注入されるセル部、被検液の吸光度を測定する吸光度測定部、および鉄濃度測定用試薬と被検液とがその内部において反応する反応容器を備えることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２１】
上記本発明にかかるカンキツグリーニング病の検出方法によれば、被検定樹中に含まれる鉄、マンガンの濃度を測定するだけで早期かつ正確にカンキツグリーニング病を検出することができる。また本発明にかかる方法は、現場において行ない得る簡便な方法である。それゆえ、カンキツグリーニング病に罹った樹木を伐採すること等の処置を早期に施すことによりカンキツグリーニング病の伝播を防止し、甚大な被害を未然に防ぐことができるという効果を奏する。
【００２２】
また本発明にかかるカンキツグリーニング病検出キットによれば、園芸農家において早期、正確かつ簡便にカンキツグリーニング病を検出することができる。よってカンキツグリーニング病による甚大な被害を未然に防止することができるという効果を奏する。
【００２３】
さらには、本発明にかかる鉄濃度測定装置によれば、特に複雑な機器を導入することなく、かつ簡便にカンキツグリーニング病を検出することができる。よってカンキツグリーニング病による甚大な被害を未然に防止することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の実施の形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２５】
（１．本発明にかかるカンキツグリーニング病の検出方法）
本発明にかかるカンキツグリーニング病の検出方法（以下、適宜「本発明の検出方法」という。）は、被検定樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度を測定する「測定工程」を包含することを特徴としている。また本発明の検出方法は、被検定樹から抽出液を取得する「抽出工程」をさらに包含する方法であってもよく、さらには上記測定工程において測定された被検定樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度と、健全樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度と、を比較する「比較工程」を包含する方法であってもよい。
【００２６】
本発明の検出方法は、上記「測定工程」、「抽出工程」、「比較工程」全てが含まれている必要はないが、以下の説明においては、上記全ての工程を含んだ方法について説明する。なお上記全ての工程を含む本発明の検出方法は、「抽出工程」→「測定工程」→「比較工程」の順で実施される。以下、各工程を実施の順序に従って説明する。
【００２７】
（１−１．抽出工程）
当該抽出工程は、被検定樹から抽出液を取得する工程である。
【００２８】
ここで「被検定樹」とは、本発明にかかる検出方法によりＣＧ病に罹っているか否かを検出する対象樹木のことである。かかる被検定樹としては、ＣＧ病に罹病する樹木（ＣＧ罹病性樹）であれば特に限定されるものではない。ＣＧ病はミカン亜科に分類される樹木に感染するといわれており、例えばミカン亜科に分類される樹木が上記被検定樹となる。ミカン亜科に属する樹木としては、例えばカンキツ類（真正カンキツ類）等が挙げられる。またカンキツ類としては、例えば温州ミカン，タンカン，シークワーシャー，レモン，ザボン，キンコウジ，ライム，ユズ，ポンカン等を始めとするカンキツ属、豆キンカン，長キンカン，長寿キンカン等を始めとするキンカン属、カラタチ，トゲナシカラタチ，ヒリュウ，ウンリュウ等を始めとするカラタチ属、エレモシトラス属、クリメリア属、およびミクロシトラス属等が挙げられる。
【００２９】
上記被検定樹から抽出液を取得する方法については、特に限定されるものではなく、例えば、被検定樹（例えば葉部）を破砕して水、または緩衝液で抽出してもよい（水系抽出）。また、被検定樹（例えば葉部）を硝酸−過塩素酸分解、あるいは硫酸によって加熱酸分解を行なって抽出液を調製してもよい（酸分解）。また、被検定樹（例えば葉部）を４５０−５００℃で灰化を行ない、希硝酸に溶解して抽出液としてもよい。また被検定樹（例えば葉部）を圧搾して抽出液を調製し取得してもよい（圧搾抽出）。
【００３０】
＜水系抽出＞
水系抽出は、例えば以下の通りにして行なうことができる。まず被検定樹の破砕を行なう。破砕は、被検定樹（例えば葉部）を乳鉢および乳棒（より好ましくはステンレス製または、めのう製乳鉢および乳棒）を用いて破砕してもよいし、公知のミキサーを用いて破砕してもよい。なお当該破砕は抽出工程において必須ではないが、抽出効率を向上させるために破砕を行なうことが好ましい。
【００３１】
次に上記破砕物から抽出液を調製する。抽出液の調製は、例えば、被検定樹の破砕物を水または緩衝液で懸濁後、当該懸濁液をろ過または遠心分離等で固液分離することによって、抽出液を取得することができる。なお上記操作のうち、ろ過、遠心分離等の固液分離は必須の操作ではないが、後に行なう測定工程（例えば吸光度を測定する場合、機器分析を行なう場合）においては、固体成分が除かれている必要があるために当該固液分離を行なうことが好ましい。
【００３２】
ここで抽出に用いる水は、水道水であってもよいが、後に行なう測定工程において抽出液中の鉄またはマンガンを測定するため、できるだけ鉄、マンガン等の微量元素を含まない水であることが好ましい。したがって蒸留水あるいはイオン交換水が好適である。
【００３３】
一方、抽出に用いる緩衝液は、抽出液の安定性が高いという理由から被検定樹の生体内ｐＨ付近、すなわちｐＨ５．８〜６．２、より好ましくはｐＨ６．０〜６．１が緩衝域である緩衝液を適宜選択の上、採用すればよい。かかる緩衝液としては、Homopiperazin-N,N'-bis-2-(ethansulfonsyre)緩衝液（HOMOPIPES緩衝液）、2-morpolinoethanesulfonic acid緩衝液（ＭＥＳ緩衝液）を始めとする各種Good’s buffer、あるいはリン酸緩衝液、等が利用可能である。上記Good’s bufferは、安定性が高く、抽出効率が高いために好ましい。また本発明者らの検討結果によれば、リン酸緩衝液は、Good’s bufferと同等の抽出効率を示し、さらに抽出液の安定性、また抽出液の着色度については、上記Good’s bufferのそれを上回るものであった。よってリン酸緩衝液は特に好ましいといえる。加えてリン酸緩衝液は、Good’s bufferに比して安価であるためにコスト面においても優れている。
【００３４】
上記緩衝液の濃度は、特に限定されるものではないが、例えば１ｍＭ程度が好ましい。上記１ｍＭ程度の濃度であれば、抽出効率を下げることなく、十分な緩衝作用が得られることとなる。なお緩衝液の濃度が濃くなればなるほど、水溶成分以外のイオン交換性の成分が溶出されてくるためなるべく緩衝液の濃度は薄いほうがよい。
【００３５】
また抽出温度については、特に限定されるものではなく、通常室温で行なえばよい。一般に抽出温度が高温であるほど抽出効率が上がるとされ、高温で抽出することが好ましいが、室温以上となると別途加熱手段が必要となること、および操作が増加すること等のデメリットがあるため、本発明の検出方法においては室温で抽出を行なえばよいといえる。また植物が最も利用し易い形態の元素（水溶性鉄、水溶性マンガン、水溶性亜鉛等）を抽出し、その濃度を分析するためには、植物が生活している温度、すなわち室温で抽出を行なうことが好ましい。
【００３６】
なお上記水系抽出によって得られる抽出液は、被検定樹に含まれる水溶性成分（例えば水溶性鉄、水溶性マンガン、水溶性亜鉛等）である。
【００３７】
＜酸分解＞
酸分解は、被検定樹（例えば葉部）および酸溶液を適当な容器に入れて加熱することにより行なうことができる。かかる酸分解により得られた被検定樹の分解物を抽出液とすればよい。
【００３８】
ここで上記酸溶液は、被検定樹を分解することができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、硝酸−過塩素酸分解は、以下のようにして行なう。まず被検定樹（例えば葉部）を７０℃から８０℃で乾燥後に、６０％(v/v)程度の硝酸を加えて加熱する。加熱は、試料が溶解して透明になるまで継続する。加熱後、試料を一旦冷却する。その後、６０％(v/v)程度の過塩素酸を、試料に加えて硝酸の時と同様に加熱する。発煙が生じた時点で分解終了とする。
【００３９】
また硫酸による加熱分解では、乾燥した被検定樹（例えば葉部）に、９５％(v/v)程度の硫酸を加えて加熱すればよい。また適宜、少量の過酸化水素水を加えて加熱分解してもよい。
【００４０】
なお分解終了後の試料は、加水して定容（メスアップ）することが好ましい。当該試料を原子吸光法で分析する際には、過塩素酸濃度が０．１％(v/v)以下になるまで加水を行なうことが好ましい（江副優香、高津章子、黒岩貴芳、恵山栄、内海昭「黒鉛炉原子吸光法による魚試料中の微量アルミニウムの定量」BUNSEKI KAGAKU, 48, 1013-1018, 1999.参照）。
【００４１】
また上記加熱は、被検定樹が分解されるように加熱すれば良く、例えば被検定樹（例えば葉部）および酸溶液を仕込んだ容器をコンロにかけることによって行なうことができる。なおこの時、撹拌操作を適宜行なうことが好ましい。被検定樹の分解効率が上がるためである。
【００４２】
被検定樹の分解物は、ろ過または遠心分離により固液分離を行なうことが好ましい。後に行なう測定工程（例えば吸光度を測定する場合、機器分析を行なう場合）においては、固体成分が除かれている必要があるからである。また被検定樹の分解物は、後に行なう測定工程（例えば吸光度を測定する場合、機器分析を行なう場合）を行なうために、適宜ｐＨ調整を行なってもよい。また抽出液に沈殿が生じた場合は、加熱して沈殿を溶解することが好ましい。
【００４３】
なお上記酸分解によって得られる抽出液は、既述の「水系抽出」により得られるものと異なり被検定樹に含まれる水溶性成分（例えば水溶性鉄、水溶性マンガン、水溶性亜鉛等）以外の成分をも含んでいる。
【００４４】
＜圧搾抽出＞
かかる圧搾抽出は、被検定樹（例えば葉部）を公知の圧搾器に仕込み、圧搾すればよい。この時得られる圧搾液が抽出液である。
【００４５】
なお当該抽出工程において、抽出液を取得する被検定樹の部位は、特に限定されるものではなく、維管束から抽出すればよい。ただし抽出液の調製がし易いこと、採取が容易であること等の理由から葉部、新梢、果実が好ましい。
【００４６】
また、後に行なう測定工程における測定値のバラツキを抑え、ＣＧ病の検出精度を上げるためには、抽出液を調製する被検定樹の部位を１つの部位に決定しておくことが好ましい。具体例としては、本発明の検定方法を行なう場合は、常に葉部から抽出液を調製することとが挙げられる。被検定樹の部位間で、含有成分・含有濃度等が異なっているため、任意の複数の部位から調製した抽出液に含まれる鉄、マンガンを測定すれば、その測定値にバラツキが生じてしまう可能性が高い。さらには、測定値間のバラツキを抑えるという理由から抽出条件、抽出方法についても、一定にしておくことが好ましい。
【００４７】
（１−２．測定工程）
本発明者らは、ＣＧ病に罹った樹木中に含まれる鉄およびマンガンの濃度が健全樹木（ＣＧ病に罹っていない樹木）のそれに比して有意に減少していることを発見した。当該測定工程では、ＣＧ病のマーカーとなる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度を測定する工程である。当該測定工程では、鉄またはマンガンのいずれかを測定すればよいが、ＣＧ病の検出精度が上がるという理由から、両者を測定することが好ましいといえる。
【００４８】
＜鉄濃度の測定＞
被検定樹に含まれる鉄濃度の測定法は、特に限定されるものではなく、公知の測定法を適宜選択の上、採用すればよい。例えば、原子吸光法、誘導結合高周波プラズマ分光分析（ＩＣＰ分光分析）、蛍光Ｘ線回析法等の機器分析法が挙げられる。この他、バソフェナントロリン法、オルトフェナントロリン法等の発色定量法も適用できる。ただし、前者の機器分析法は、分析機器の操作が必要であり、かつ機器が高価であるために後者の発色定量法が好ましいといえる。発色定量法であれば、園芸農家の従事者自身が測定工程を行なうことができ、その結果ＣＧ病の検出を簡便かつ早期に行なうことができる。また当該発色定量法であれば、所謂「鉄定量キット」が市販されており、当該キットを適宜選択の上、適用すればよい。例えば、パックテスト（登録商標；株式会社共立理化学研究所）、エフイーテストワコー（和光純薬工業株式会社製）、Ｆｅ Ｂテストワコー（和光純薬工業株式会社製）、Ｆｅ Ｃテストワコー（和光純薬工業株式会社製）が利用可能である。
【００４９】
上記のほか、株式会社藤原製作所のリフレクトクァント試験紙（リフレクトクァント鉄テスト）を使用して反射式光度計 RQフレックスまたはRQフレックスプラスで鉄濃度を測定する方法がある（http://www.fujiwara-sc.co.jp/catalog/rq2.html参照）。また単項目比色計ポータブル水質計（LaMotte Company製）、ポケット水質計（HACH社製）、Iron(ferrous) CHEMets Kit（chemetrics社製）、ＬＳＡ３０/５０/１００（DR.LANGE社製）、ＲＡＰＩＤ ＴＥＳＴＳ（MACHEREY-NAGEL社製）、モデルAQ4000ポータブル型色彩計（オリオン社製）を用いて鉄濃度を測定してもよい。
【００５０】
鉄濃度測定法については、『石井誠治「化学物質と環境」エコケミストリー研究会 NO26 1-3 1997年』や、『金子恵美子・礒江準一「水質分析キット」ぶんせき 360- ２００２年７月号』が参照できる。
【００５１】
＜マンガン濃度の測定＞
被検定樹に含まれるマンガン濃度の測定法は、特に限定されるものではなく、公知の測定法を適宜選択の上、採用すればよい。例えば、原子吸光法、誘導結合高周波プラズマ分光分析（ＩＣＰ分光分析）、蛍光Ｘ線回析法等の機器分析法が挙げられる。上記のほか、藤原製作所のリフレクトクァント試験紙（リフレクトクァントマンガンテスト）を使用して反射式光度計 RQフレックスまたはRQフレックスプラスでマンガン濃度を測定する方法がある（http://www.fujiwara-sc.co.jp/catalog/rq2.html参照）。また単項目比色計ポータブル水質計（LaMotte Company製）、ポケット水質計（HACH社製）、ＬＳＡ３０/５０/１００（DR.LANGE社製）、ＲＡＰＩＤ ＴＥＳＴＳ（MACHEREY-NAGEL社製）、モデルAQ4000ポータブル型色彩計（オリオン社製）を用いてマンガン濃度を測定してもよい。
【００５２】
マンガン濃度測定法については、『石井誠治「化学物質と環境」エコケミストリー研究会 NO26 1-3 1997年』や、『金子恵美子・礒江準一「水質分析キット」ぶんせき 360- ２００２年７月号』が参照できる。
【００５３】
なお、本発明の検出方法における測定工程は、被検定樹中に含まれる鉄濃度、マンガン濃度の値まで求める定量分析である必要はなく、鉄濃度、マンガン濃度の高低が分かる程度の半定量分析であってもよい。
【００５４】
測定工程に用いられる試料は、例えば上記抽出工程により得られた抽出液が利用可能である。抽出液としては、酸分解による抽出液であっても、水系抽出による抽出液であってもよいが、後者の水系抽出による抽出液の方がより好ましい。本発明者らの検討によれば、水系抽出による抽出液の方が、ＣＧ病に罹った樹木中に含まれる鉄およびマンガンの濃度と健全樹木（ＣＧ病に罹っていない樹木）のそれとの差が明瞭となることが分かった。よって後者の水系抽出による抽出液の方がより好ましいといえる。換言すれば、本測定工程においては、水溶性鉄および水溶性マンガンの一方または双方の濃度を測定することが好ましい。
【００５５】
なお、鉄およびマンガンの濃度の測定は一回の試行でもよいが、種々のサンプルについて複数回測定することが好ましい。検定樹における鉄およびマンガンの濃度は、その部位、場所によって異なっている場合が多い（同じ葉部であっても上葉と下葉では濃度差がある場合が多い）。よって、複数回濃度測定を行なって、平均値を出しておくことが好ましいといえる。
【００５６】
（１−３．比較工程）
当該工程は、上記測定工程において被検定樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度と、健全樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度とを比較する工程である。
【００５７】
比較の方法は、被検定樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度の値と、健全樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方ンガンの濃度の値とを比較してもよいし、例えば、発色法を用いて鉄およびマンガンの一方または双方の濃度を測定する場合においては、発色度を目視により対比してもよい。また被検定樹および健全樹の鉄およびマンガンの一方または双方の濃度を同日に測定してその高低を比較してもよいし、健全樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度を予め測定して標準値としておき、その値と被検定樹のそれとを比較してもよい。さらには、発色法を用いて鉄およびマンガンの一方または双方の濃度を測定する場合においては、健全樹の発色度の標準を予め作製しておき、被検定樹の発色度と比較してもよい。
【００５８】
当該比較工程によって、健全樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度に対して、測定工程において被検定樹中に含まれる測定された鉄およびマンガンの一方または双方の濃度が低ければ、当該被検定樹はＣＧ病に罹っていると判断することができる。なお、健全樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度と、測定工程において被検定樹中に含まれる測定された鉄およびマンガンの一方または双方の濃度との比較の際に有意差検定を行なうことが好ましい。有意差検定によって、健全樹中に含まれる鉄およびマンガンの一方または双方の濃度に対して、測定工程において被検定樹中に含まれる測定された鉄およびマンガンの一方または双方の濃度が有意に低いと判断できれば、さらに高い精度を持ってＣＧ病に罹っているか否かを判断することができるからである。
【００５９】
（２．本発明にかかるカンキツグリーニング病の検出キット）
本発明にかかるカンキツグリーニング病検出キット（以下、適宜「本発明の検出キット」という。）は、上記本発明の検出方法を行なうためのキットである。本発明にかかる検出キットには、例えば、「検定樹から抽出液を取得する抽出手段」や「鉄濃度測定手段、およびマンガン濃度測定手段の一方または双方」が含まれていることが好ましい。
【００６０】
（２−１．抽出手段）
当該抽出手段は、被検定樹から抽出液を取得する手段であり、既述「１−１．抽出工程」を行なうための手段である。
【００６１】
抽出手段には、例えば、被検定樹を破砕するために用いられる乳鉢と乳棒、あるいはホモジナイザー（ミキサー）等が含まれていてもよい。また、抽出用の水（蒸留水、イオン交換水）あるいは緩衝液が含まれていてもよい。また抽出液の固液分離を行なうために用いられる、ろ紙（メンブレンフィルター）、遠心分離用のチューブ等が含まれていてもよい。さらには既述「＜酸分解＞」の項で説示した酸溶液が含まれていてもよい。また酸分解を行なうための容器が含まれていてもよい。
【００６２】
（２−２．鉄濃度測定手段、マンガン濃度測定手段）
当該「鉄濃度測定手段」「マンガン濃度測定手段」は、既述「１−２．測定工程」を行なうための手段（物品）である。
【００６３】
＜鉄濃度測定手段＞
鉄濃度測定手段には、例えば、発色法により鉄濃度を測定するための試薬（鉄濃度測定用試薬）や、発色度を測る吸光度計等が含まれていることが好ましい。前記鉄濃度測定試薬は、市販の「鉄定量キット」（例えば、パックテスト 型番ＷＡＫ−Ｆｅ（Ｄ）（登録商標；株式会社共立理化学研究所）、エフイーテストワコー（和光純薬工業株式会社製）、Ｆｅ Ｂテストワコー（和光純薬工業株式会社製）、Ｆｅ Ｃテストワコー（和光純薬工業株式会社製）が挙げられる）に含まれる試薬類により構成してもよいし、バソフェナントロリン法、オルトフェナントロリン法等の発色定量法に必要な試薬類を適宜調製して構成してもよい。例えば、バソフェナントロリン法に必要な試薬としては、1，10‐フェナントロリン、塩化ヒドロキシルアンモニウム、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。またバソフェナントロリン法では、1，10‐フェナントロリンの代りにバソフェナントロリンを用いる以外はオルトフェナントロリン法と同様である。
【００６４】
一方、発色度の測定に用いられる吸光度計としては、特に限定されるものではなく、市販の吸光度計を適宜利用可能である。なお吸光度計は、単波長タイプのものであっても複数波長タイプのものであってもよい。かかる吸光度計の一例としては、本発明にかかる鉄濃度測定装置（以下、適宜「本測定装置」という。）が利用可能である。
【００６５】
本測定装置（一例）、および本測定装置を用いた鉄の濃度測定方法（一例）の概略を示す模式図を図１に示す。鉄濃度測定装置１は被検液（抽出液）が注入されるセル部２、被検液（抽出液）の吸光度を測定する吸光度測定部３、および鉄濃度測定用試薬と被検液（抽出液）とがその内部において反応する反応容器４を備えている。そのほか鉄濃度の測定値を示す表示部５を備えている。
【００６６】
本測定装置が備えるセル部２は、吸光度計に用いられている公知のセルを用いることができ、その材質は石英製であっても、樹脂製であってもよい。また微量の被検液を測定可能にするため、セル内壁がセル上部から底部にかけて絞り込まれているセルであってもよい。また吸光度測定部３内にセル部２が安定的に保持されるような形状を有していてもよい。
【００６７】
吸光度測定部３は、公知の吸光度計を用いて構成すればよい。吸光度計の測定様式は、一波長のみを測定する単波長タイプであっても、複数波長を測定する複数波長タイプであってもよい。またその測定波長についても特に限定されるものではなく、適宜目的に応じて設定すればよい。なお、本鉄濃度測定装置１はバソフェナントロリン法により鉄濃度を測定するように構成されているために５２５ｎｍの単波長に固定されている。被検液の吸光値は、予めインプットされている鉄の標準曲線を用いて鉄濃度値に変換された後に、表示部５に出力されるようになっている。
【００６８】
反応容器４は、その中にバソフェナントロリン法を行なうための試薬（鉄測定用試薬）が密閉チューブ内に充填された構成となっている。反応容器４の一箇所に孔を空け空気を押し出した後に、上記孔から被検液（抽出液）を吸い込むようになっている。なお、当該反応容器４は、公知のパックテスト 型番ＷＡＫ−Ｆｅ（Ｄ）（登録商標；株式会社共立理化学研究所）を適用すればよい。
【００６９】
次に本測定装置を用いた鉄の濃度測定方法（一例）の概略を説明する。（ａ）まず被検液（抽出液）をセル部２に入れて吸光度測定部３にセットし、０点調整（０調）を行なう。（ｂ）反応容器４の上部一箇所に孔を空け、空気を押し出した後に、上記孔から被検液（抽出液）を吸い込む。この時、被検液（抽出液）と鉄測定試薬とが反応する。（ｃ）３分後再びセル部２に被検液（反応後の抽出液）を戻して、セル部２を吸光度測定部３にセットして吸光度を測定する。（ｄ）測定した鉄濃度が表示部５に表示される。
【００７０】
なお前記（ｂ）の後、反応後の抽出液の発色度と、鉄濃度と発色度との対応を示す標準表６とを対比することによって、およその鉄濃度を求めることもできる。
【００７１】
また、鉄濃度測定手段は、原子吸光法、誘導結合高周波プラズマ分光分析（ＩＣＰ分光分析）等の機器分析の前処理に必要な試薬、機器類により構成されていてもよい。また、株式会社藤原製作所のリフレクトクァント試験紙（リフレクトクァント鉄テスト）、反射式光度計 RQフレックスまたはRQフレックスプラスが含まれていてもよい（http://www.fujiwara-sc.co.jp/catalog/rq2.html参照）。また鉄濃度測定手段は、単項目比色計ポータブル水質計（LaMotte Company製）、ポケット水質計（HACH社製）、Iron(ferrous) CHEMets Kit（chemetrics社製）、ＬＳＡ３０/５０/１００（DR.LANGE社製）、ＲＡＰＩＤ ＴＥＳＴＳ（MACHEREY-NAGEL社製）、モデルAQ4000ポータブル型色彩計（オリオン社製）により構成されていてもよい。
【００７２】
なお、本測定装置は、本発明にかかるＣＧ病の検出方法のみに利用されるものではなく、工場廃水・環境水等の水分析、食品等の成分分析を始めとして鉄濃度を測定する一般的な用途に幅広く利用可能であることはいうまでもない。
【００７３】
ところで、全ての動植物の生育には鉄は不可欠な元素であり、ヒトにとっても重要な元素である。ヒトは、食物から鉄分摂取しており、サニーレタス，ブロッコリー，大葉，ほうれん草等の野菜類は、代表的な鉄分含有植物である。ところが、産地や土壌によっては、これらの鉄含有植物中の鉄分含有量は相当異なっている。そこで、これらの鉄含有植物の鉄分含有量を本測定装置によって測定して表示することにより、鉄分含有量の多さをアピールする手段として用いることが可能となる。すなわち、同一野菜であっても鉄分含有量の少ない他の産地や他の農家の野菜との差別化手段（品質表示手段）として用いることが考えられる。
【００７４】
また近年、ほうれん草中の鉄濃度が減少しているということ問題となっている。かかる状況下、本発明の検出方法と同様の工程をおよび、本測定装置を用い、ほうれん草の鉄濃度を簡単に測定することができる。よって本測定装置は、ほうれん草等の鉄含有植物の含有鉄分の濃度測定装置とすることができる。かかる「鉄含有植物の含有鉄分濃度測定装置」は例えば、ほうれん草等の品質管理、品質表示に利用が可能である。
【００７５】
＜マンガン濃度測定手段＞
マンガン濃度測定手段には、例えば、マンガン濃度測定手段は、原子吸光法、誘導結合高周波プラズマ分光分析（ＩＣＰ分光分析）、蛍光Ｘ線回析法、等の機器分析の前処理に必要な試薬、機器類が含まれていることが好ましい。また、株式会社藤原製作所のリフレクトクァント試験紙（リフレクトクァントマンガンテスト）、反射式光度計 RQフレックスまたはRQフレックスプラスが含まれていてもよい（http://www.fujiwara-sc.co.jp/catalog/rq2.html参照）。またマンガン濃度測定手段は、単項目比色計ポータブル水質計（LaMotte Company製）、ポケット水質計（HACH社製）、ＬＳＡ３０/５０/１００（DR.LANGE社製）、ＲＡＰＩＤ ＴＥＳＴＳ（MACHEREY-NAGEL社製）、モデルAQ4000ポータブル型色彩計（オリオン社製）により構成されていてもよい。
【００７６】
なお本発明の検出キットには、上記「抽出手段」や「鉄濃度測定手段およびマンガン濃度測定手段の一方または双方」に加え、他の構成を含んでいてもよい。
【００７７】
上記本発明の検出キットによれば、本発明の検出方法を実施するために必要な構成が含まれているため、園芸農家が圃場において簡便に本発明の検出方法を実施することができ、ＣＧ病の早期検出を行なうことが可能となる。よってＣＧ病による甚大な被害を未然に防ぐことができるという効果を奏する。
【００７８】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００７９】
〔実施例１〕カンキツグリーニング病（ＣＧ病）罹病樹および健全樹の葉部に含まれる微量元素濃度
（方法）
ＣＧ病に罹ったタンカン（２本の樹木）と健全なタンカン（３本の樹木）から各々１０枚程度の葉を採取し、混合して１調査区または対照区とした。これを反復して行ない５個の調査区を作製した。
【００８０】
＜酸抽出＞
各調査区の葉を乾燥、細断後２０ｍｌ容のガラス製試験管に入れ、そこに６０％の硝酸を１ｍｌ添加し、３〜５時間、温度をゆっくり上昇させ、分解液が透明になるまで徐々に加熱を続けた。有機物が分解されたら、試料を室温程度まで冷却後、０．５ｍｌの過塩素酸を加えた。その後、徐々に加熱して１８０℃位まで上昇させ、白煙が出た時点で加熱を停止して分解を終了した。分解終了後、試料を２０ｍｌに定容（メスアップ）し、ＩＣＰ分光分析を行なって各元素を定量した。
【００８１】
＜ＭＥＳ緩衝液抽出＞
各調査区の葉を５ｍｍ以下にはさみで切り、よく撹拌して約５ｇを計りとり、１ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）２０ｍｌを加えてミキサーでホモジナイズを行なった。その破砕物を１０，０００ｒｐｍで、１５分間４℃で遠心し、上澄み液をＭＥＳ緩衝液で１０倍に希釈して測定に供した。
【００８２】
＜鉄、マンガンおよび亜鉛の定量法＞
鉄、マンガンおよび亜鉛の定量は、ＩＣＰ分光分析により行なった。具体的には酸分解液の希釈液あるいはＭＥＳ緩衝液の希釈液を、パーキンエルマー社OPTIMA3000を用いて定量を行なった。なお上記ＩＣＰ分光分析装置の運転条件は、所定のプログラムにより行なった。
【００８３】
各調査区の葉の含水率を求めておき、葉の単位乾燥重量当りの鉄、マンガンおよび亜鉛の乾燥重量を計算して結果とした。
【００８４】
（結果）
図２に結果を示す。図２（ａ）は酸分解による抽出液について鉄濃度（同図中「Ｆｅ」で示す）、マンガン濃度（同図中「Ｍｎ」で示す）、および亜鉛濃度（同図中「Ｚｎ」で示す）を測定した結果を示し、図２（ｂ）はＭＥＳ緩衝液による抽出液について鉄濃度（同図中「Ｆｅ」で示す）、マンガン濃度（同図中「Ｍｎ」で示す）、および亜鉛濃度（同図中「Ｚｎ」で示す）を測定した結果を示す。同図において斜線を付した棒グラフは罹病樹の結果であり、白抜きの棒グラフは健全樹の結果である。同図中Ｙ軸の単位中の『ＤＭ』は、Dry Matterの略であり、葉の単位乾燥重量当りの鉄、マンガン、亜鉛の乾燥重量を示している（以下の実施例、図において全て同じ）。
【００８５】
図２（ａ）および（ｂ）の結果によれば、酸分解による抽出液、およびＭＥＳ緩衝液による抽出液のいずれの場合においても、ＣＧ病の罹病樹における鉄濃度、マンガン濃度、および亜鉛濃度は、健全樹中のそれに比べて低いということが分かった。特に鉄およびマンガン濃度において、その濃度差が顕著であった。したがって、鉄濃度、マンガン濃度、および亜鉛濃度の低下がＣＧ病のマーカーとして利用できるということがわかった。
【００８６】
〔実施例２〕緑色葉を用いたＣＧ病の検出
＜材料＞
ＣＧ病に罹ったタンカン（ＣＧ罹病樹）の２本の樹木から、黄色葉または緑色葉を各々１０枚程度採取し、混合して１調査区とした。これを反復して行ない５個の調査区を作製した。また健全なタンカン（健全樹）の１本の樹木から対照区を、調査区と同様にして作製した。
【００８７】
＜方法＞
抽出液の調製は、酸分解により行なった。酸分解の方法は実施例１の方法に準じて行なった。
【００８８】
また鉄、マンガン、および亜鉛濃度の濃度測定についても実施例１の方法に準じて行なった。
【００８９】
＜結果＞
図３に結果を示す。同図中、白抜きの棒グラフは鉄濃度を示し、黒塗りの棒グラフはマンガン濃度を示し、斜線を付した棒グラフは亜鉛濃度を示した。また「ＣＧ黄色」はＣＧ病罹病樹の黄色葉中の各種濃度を示し、「ＣＧ緑色」はＣＧ病罹病樹の緑色葉中の各種濃度を示し、「健康緑」は健全樹の緑色葉中の各種濃度を示した。
【００９０】
図３の結果から、ＣＧ病罹病樹は黄色葉および緑色葉のいずれにおいても、鉄濃度、マンガン濃度、および亜鉛濃度は、健全樹中のそれに比べて低いということが分かった。特に鉄およびマンガン濃度において顕著であった。
【００９１】
よって緑色葉、すなわちＣＧ病の兆候が現れる前の段階の葉であっても、ＣＧ病を検出できるということが分かった。換言すれば本発明にかかるＣＧ病の検出方法は、ＣＧ病を早期に検出できる方法であるということが分かった。
【００９２】
〔実施例３〕酸分解による抽出液とＭＥＳ緩衝液抽出による抽出液の比較
＜材料＞
ＣＧ病に罹ると鉄欠乏を起こすということがこれまでの実施例において明らかとなったことから、鉄欠乏条件下の水耕栽培によって擬似的にＣＧ病罹病樹（シークワーシャー）を作製し、本実施例に用いた（ｎ＝３）。水耕栽培は、以下のようにした。シークワーシャーの実生を発芽させ、高さ１５ｃｍ程度の幼苗に仕立てたもの（１試験区１植物）を、１Ｌ容量のポットを用い、鉄を除いた状態で２４日間水耕栽培を行なった。試験は３反復した。なお対照として、鉄が除かれていない通常条件下の水耕栽培で栽培したシークワーシャーを用いた。
【００９３】
上記で作製した擬似ＣＧ罹病性樹の上位葉は黄色を呈しておりＣＧ病の兆候が見られた状態である。一方、下位葉は緑色でありＣＧ病の兆候が表れていない状態である。かかる上位葉と下位葉を用いて抽出液を調製した。
【００９４】
＜方法＞
抽出液の調製は、酸分解およびＭＥＳ緩衝液抽出により行なった。酸分解、およびＭＥＳ緩衝液抽出の方法は実施例１の方法に準じて行なった。また鉄の濃度測定についても実施例１の方法に準じて行なった。
【００９５】
＜結果＞
図４に結果を示す。図４（ａ）は、酸抽出による抽出液を用いて鉄濃度を測定し、ＣＧ病の検出を行なった結果を示した。また図４（ｂ）は、ＭＥＳ抽出による抽出液を用いて鉄濃度を測定し、ＣＧ病の検出を行なった結果を示した。同図中「上位」は上位葉の結果を示し、「下位」は下位葉の結果を示す。また白抜きの棒グラフは対照区の結果を示し、黒塗り棒グラフは擬似ＣＧ罹病性樹（調査区）の結果を示した。
【００９６】
図４（ａ）に示した対照区と調査区との鉄濃度の差に対して、図４（ｂ）に示した対照区と調査区との鉄濃度の差が顕著となっていた。このことは、ＭＥＳ緩衝液で抽出した抽出液の方が、罹病樹と健全樹との鉄濃度の差が顕著になるということを示しており、抽出液の調製にはＭＥＳ緩衝液による抽出が好ましいということが分かった。
【００９７】
ＭＥＳ緩衝液抽出等の水系抽出では水溶性鉄のみが抽出されるのに対して、酸分解による抽出液では水溶性鉄以外の鉄、すなわち葉に付着している不溶性の鉄分のほか、生体組織内で不溶化している（例えば維管束組織や細胞の液胞内などで）形態のものも抽出される。ＣＧ病で欠乏するのは維管束や葉脈中を流動する水溶性の鉄濃度が低下し、やがては細胞内の鉄濃度が低下すると考えられる。したがって、酸分解ではＣＧ病とは関連しない鉄を含めて抽出してしまうこととなり、罹病樹と健全樹との鉄濃度の差が表れにくくなる。
【００９８】
〔実施例４〕抽出用緩衝液の検討
実施例３によって抽出液の調製には水系抽出がより好ましいという結果が得られた。次に抽出に好ましい緩衝液を検討することとした。
【００９９】
＜材料＞
２００４年春出葉した青島（健全樹）を用いた（ｎ＝５）。
【０１００】
検討する緩衝液は、ＭＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、HOMOPIPES緩衝液、またはクエン酸緩衝液を用いた。なお各緩衝液の濃度はいずれも１ｍＭであり、また各緩衝液のｐＨはいずれも６．０とした。ｐＨ６．０を採用したのは、青島、ゲッキツ等のカンキツ類の生体内ｐＨが６．０付近だからである（発明者らの検討結果による）。
【０１０１】
＜方法＞
抽出液の調製方法、および鉄の濃度測定については、いずれも実施例１の方法に準じて行なった。
【０１０２】
＜結果＞
図５に結果を示す。リン酸緩衝液（同図中「リン酸」で示す）、およびHOMOPIPES緩衝液（同図中「Homopipes」で示す）はＭＥＳ緩衝液（同図中「ＭＥＳ」で示す）とほぼ同等の抽出効率を示した。よって、リン酸緩衝液、およびHOMOPIPES緩衝液を用いてＣＧ検出に用いる抽出液を調製することができるということがわかった。特にリン酸緩衝液は、抽出液の変色が少なく安定性が高いといえるために好ましい。さらにHOMOPIPES緩衝液、ＭＥＳ緩衝液に比してリン酸緩衝液は安価であるため、コスト面においても優れている。
【０１０３】
一方、クエン酸緩衝液（同図中「クエン酸」で示す）は、ＭＥＳ緩衝液の場合に比して高い値が得られた。これは、当該クエン酸緩衝液を用いた場合において、水溶性鉄以外の鉄が溶出されたことが原因であると推測される。よって、当該クエン酸緩衝液は、健全樹との相対比較によりＣＧ病を検出する際には利用可能であるが、ＣＧ病とは関連しない鉄を含めて抽出してしまうこととなり、罹病樹と健全樹との鉄濃度の差が表れにくくなる。
【０１０４】
〔実施例５〕温州ミカンおよびラフレモンに対するＣＧ病診断
＜材料＞
沖縄県本島のＣＧ病野外感染経歴のある果樹園から選抜された温州ミカン（健全樹４検体、罹病樹３検体）と、ＣＧ病罹病ラフレモンを接ぎ木接種したラフレモン（罹病樹５検体）および未接種のラフレモン（健全樹５検体）と、タンカン（健全樹１０検体、罹病樹２検体）とを調査対象樹木（結果を示す図および表においては「調査樹木」と表記する）とした。
【０１０５】
各調査対象樹木から、採取年春に出葉した葉であって、樹木中央部の枝先端部の葉を３〜４枚、および枝の根元部の葉を４〜５枚採取した。採取した葉を全て混ぜ合わせて検体とし、当該検体を以後の試験に用いた。
【０１０６】
なお、「Marjorie A. Hoy, Ayyamperumal Jeyaprakash, and Ru Nguyen (2001), Long PCR is a sensitive Method for Detecting Liberobacter asiaticum in Parasitoids Undergoing Risk Assessment in Quarantine. Biological Control 22, 278-287」に記載の方法に従ってＰＣＲ法によるＣＧ病診断（以下「ＰＣＲ診断」という）をあらかじめ行ない、陽性と判断された樹木を「罹病樹」とし、陰性と判断された樹木を「健全樹」とした。
【０１０７】
＜方法＞
上記各検体から、実施例１記載のＭＥＳ緩衝液抽出を行なって抽出液を調製し、当該抽出液中の銅、鉄、マンガン、亜鉛、カルシウム、およびマグネシウムの定量を行なった。上記各金属の定量は、実施例１に記載のＩＣＰ分光分析により行なわれた。
【０１０８】
＜結果＞
表１〜３に、各検体からの抽出液中の金属をＩＣＰ分光分析により定量した結果を示す。表１は温州ミカンの結果であり、表２はラフレモンの結果であり、表３はタンカンの結果である。表１〜３における「平均値」は検体中の各金属濃度（検体乾物重量あたりの濃度）であり、銅（Ｃｕ）、鉄（Ｆｅ）、およびマンガン（Ｍｎ）の単位は（μｇ/ｇ）で、カルシウム（Ｃａ）およびマグネシウム（Ｍｇ）の単位は（ｍｇ/ｇ）である。また健全樹の平均値および罹病樹の平均値について有意差検定（Ｔ検定）を行なっており、両者のデータ間に危険率５％で有意差があったものには「＊」、危険率１％で有意差があったものには「＊＊」、危険率０．５％で有意差があったものには「＊＊＊」、危険率０．1％で有意差があったものには「＊＊＊＊」、有意差がなかったものには「Ｎ」を表中に示した。また表１〜３における「比率」は、健全樹検体中の各金属濃度の平均値に対する罹病樹検体中の各金属濃度の平均値の比率である。なお、温州ミカンの罹病樹については、ＣＧ病の兆候が既に表れた黄色の葉について各金属濃度を測定した結果（表１中「罹病黄色」で示す）と、ＣＧ病の兆候が表れる前の緑色の葉について各金属濃度を測定した結果（表１中「罹病緑色」で示す）とに分けて検討を行ない、その結果を示した。またタンカンの罹病樹については、ＣＧ病の兆候が表れる前の緑色の葉について各金属濃度を測定した結果（表３中「罹病緑色」で示す）を示した。
【０１０９】
【表１】
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【０１１０】
【表２】
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【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
表１〜３の結果から、罹病樹葉中の鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、および亜鉛（Ｚｎ）濃度が、健全樹葉中のそれに比して有意に減少しているということが分かった。よって、上記金属の濃度の減少を指標として、調査対象樹木のＣＧ病診断を行なうことができるということが分かった。また表１および３の「罹病緑色」の結果においても罹病樹中の上記金属濃度が、健全樹中のそれに比して有意に減少していることから、上記金属濃度はＣＧ病の兆候が表れる前であってもＣＧ病診断を実施できるということが分かった。特に表１の鉄（Ｆｅ）については、健全樹中の濃度に対する罹病樹の濃度の比率が亜鉛（Ｚｎ）のそれに比して低い、すなわち健全樹と罹病樹との間での鉄濃度の差が亜鉛（Ｚｎ）に比して大きいため（表１中の「比率」参照）、鉄（Ｆｅ）濃度の減少を指標にすれば、より明瞭かつ正確にＣＧ病診断を行なうことができるといえる。
【０１１３】
なお、本実施例に用いたラフレモンの健全樹および罹病樹について、葉の色を目視によって比較したが、両者間で葉の色に差が認められず、健全樹と罹病樹とは目視によって区別することができなかった。
【０１１４】
〔実施例６〕鉄濃度測定によるＣＧ病診断とＰＣＲ法によるＣＧ病診断との比較
温州ミカン、およびタンカンについて鉄濃度測定によるＣＧ病診断（以下「鉄濃度診断」という）とＰＣＲ診断の結果とを比較した。
【０１１５】
＜方法＞
各調査対象樹木から任意に４〜５枚の葉を採取し、それを混ぜて１検体とした。一部の調査対象樹木を除き、同一の調査対象樹木から３または４検体を調製してＣＧ病診断を行なった。鉄濃度診断の方法およびＰＣＲ診断の方法は、実施例５と同様である。
【０１１６】
＜結果＞
その結果を、図６（温州ミカン）、図７（タンカン、採取樹園１）、および図８（タンカン、採取樹園２）に示す。なお図６〜８の各図（ａ）は鉄濃度診断を行なった結果を示し、（ｂ）はＰＣＲ診断の結果を示している。また図６〜８の各図（ａ）の縦軸は鉄濃度（μｇ/ｇＤＭ）を示し、横軸は各調査対象樹木を示す。なお上記横軸において、同一のアルファベットを示されるものは同一の調査対象樹木であることを意味し、さらに右に「Ｙ」が付されたものは調査対象樹木から特に黄色葉を採取して検体としたものであり、「Ｙ」が付されていないものは緑色葉を採取して検体としたものである。また上記横軸のアルファベット右に付された数字は、同一調査対象樹木から調製された検体数を示す。また各図（ａ）において白抜きで示す結果は罹病樹の結果であり、黒抜きで示す結果は健全樹の結果である。
【０１１７】
一方、図６〜８の各図（ｂ）において「陽性数」はＰＣＲ診断によってＣＧ病陽性と判断された検体の数を示し、「陰性数」はＰＣＲ診断によってＣＧ病陰性と判断された検体の数を示し、「検体数」は同一調査対象樹木から調製された検体数を示す。各図（ｂ）における「調査樹木」のアルファベットは、各図（ａ）のそれと対応する。
【０１１８】
図６〜８の各図（ｂ）の結果から、ＰＣＲ診断によってもＣＧ病診断を的確に行ない得るということがわかるが、罹病樹の緑色葉を用いた診断結果においてＣＧ病陰性と判断される場合があり（図６（ｂ）Ａ、Ｂ、Ｄおよび図８（ｂ）Ｎ参照）、検体によってはＰＣＲ診断に誤りが生じ得るということが分かった。
【０１１９】
一方、図６〜８の各図（ａ）の結果によれば、罹病樹葉中の鉄（Ｆｅ）濃度が、健全樹葉中のそれに比して明らかに減少しているということが分かる。またＣＧ病の兆候が表れる前の緑色葉を用いて診断を行なった場合でも、上記と同様の結果を示した。よって鉄濃度診断によれば、検体の状態によらず安定してＣＧ病診断を行なうことができるということが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
上記説示したように、本発明にかかるカンキツグリーニング病の検出方法によれば、カンキツ類等の樹木にとって深刻な病害であるカンキツグリーニング病を早期かつ正確に判定することが可能となる。また本発明にかかるカンキツグリーニング病検出キット、および鉄濃度測定装置によれば、上記本発明にかかるカンキツグリーニング病の検出方法を圃場において簡便に実施することができる。
【０１２１】
よって本発明は、カンキツ類の生産を行なう園芸農業、食品産業等に利用が可能である。
【０１２２】
さらには、ほうれん草等の鉄含有植物の品質表示、品質管理を行なう手段として利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】本発明にかかる鉄濃度測定装置の一例、および当該鉄濃度測定装置を用いた鉄濃度測定方法の一例の概略を示す模式図である。
【図２】図２（ａ）は酸分解による抽出液について鉄濃度、マンガン濃度、および亜鉛濃度を測定した結果を示すヒストグラムであり、図２（ｂ）は2-morpolinoethanesulfonic acid緩衝液（ＭＥＳ緩衝液）抽出による抽出液について鉄濃度、マンガン濃度、および亜鉛濃度を測定した結果を示すヒストグラムである。
【図３】カンキツグリーニング病の罹病樹の緑色葉および黄色葉、並びに健全樹の緑色葉からの抽出液中の鉄濃度、マンガン濃度、および亜鉛濃度を測定した結果を示すヒストグラムである。
【図４】図４（ａ）は鉄欠乏条件下の水耕栽培により栽培したシークワーシャー、および通常条件下の水耕栽培により栽培したシークワーシャーの酸抽出による抽出液を用いて鉄濃度を測定した結果を示すヒストグラムであり、図４（ｂ）は同シークワーシャーの2-morpolinoethanesulfonic acid緩衝液（ＭＥＳ緩衝液）抽出による抽出液を用いて鉄濃度を測定した結果を示すヒストグラムである。
【図５】各緩衝液（2-morpolinoethanesulfonic acid緩衝液（ＭＥＳ緩衝液）、リン酸緩衝液、Homopiperazin-N,N'-bis-2-(ethansulfonsyre)緩衝液（HOMOPIPES緩衝液）、クエン酸緩衝液）の抽出効率を検討した結果を示すヒストグラムである。
【図６】温州ミカンについてＣＧ病診断を行なった結果を示す図であり、（ａ）は鉄濃度診断を行なった結果を示すヒストグラムであり、（ｂ）はＰＣＲ診断の結果を示す図である。
【図７】タンカン（採取樹園１）についてＣＧ病診断を行なった結果を示す図であり、（ａ）は鉄濃度診断を行なった結果を示すヒストグラムであり、（ｂ）はＰＣＲ診断の結果を示す図である。
【図８】タンカン（採取樹園２）についてＣＧ病診断を行なった結果を示す図であり、（ａ）は鉄濃度診断を行なった結果を示すヒストグラムであり、（ｂ）はＰＣＲ診断の結果を示す図である。
【符号の説明】
【０１２４】
１      鉄濃度測定装置
２      セル部
３      吸光度測定部
４      反応容器
５      表示部
６      標準表
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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