(57)【要約】【課題】生産性および組成の変化したポリヒドロキシアルカノエート生産方法の提供。【解決手段】アセチル-CoAアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌を用いて、ポリヒドロキシアルカノエートを生産する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌。
【請求項２】
ポリヒドロキシアルカノエート生産菌であるシュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. ＹＮ２１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６９）の同質遺伝子系統であって、アセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が破壊されていることを特徴とするシュードモナス スピーシーズ ＦＡ１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. ＦＡ１、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７２）。
【請求項３】
アセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌を培養し、培養液からポリヒドロキシアルカノエートを回収することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項４】
下記（ａ）または（ｂ）に示す相同組換えのためのＤＮＡと、アセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼ遺伝子破壊のための部分と、ベクターと、を有し、これらが機能的に連結してなるアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクター；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部。
【請求項５】
ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対するアセチル-CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターであって、
（１）下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（２）外来性ＤＮＡ、
（３）該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、及び
（４）接合起点遺伝子及び
（５）ベクター、
を有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクター。
【請求項６】
ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対するアセチル-CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターであって、
（１）下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（２）該（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡに挿入された外来性ＤＮＡ、
（３）該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、
（４）感受性遺伝子、
（５）接合起点遺伝子及び
（６）ベクター、
を有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクター。
【請求項７】
感受性遺伝子がレヴァンスクラーゼ遺伝子である、請求項６に記載のアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクター。
【請求項８】
外来性DNAがゲンタマイシン耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子である請求項５から７のいずれかに記載のアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクター。
【請求項９】
請求項４から８に記載の遺伝子ターゲティングベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
原核性宿主である請求項９記載の宿主細胞。
【請求項１１】
大腸菌である請求項１０記載の宿主細胞。
【請求項１２】
ポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法であって、請求項４から８のいずれかに記載の遺伝子ターゲティングベクターＤＮＡとポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体ＤＮＡ上のアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼ遺伝子との相同組換えによりアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を破壊することを特徴とする、アセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の製造方法。
【請求項１３】
ポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法であって、請求項９から１１のいずれかに記載の宿主細胞とポリヒドロキシアルカノエート生産菌との接合により、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体ＤＮＡ上のアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼ遺伝子との相同組換えを惹起しアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を破壊することを特徴とする、アセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の製造方法。
【請求項１４】
アセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌を培養し、培養液から３−オキソアシル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシアシル−CoA、またはtrans−2,3−デヒドロアシル−CoAを回収することを特徴とする脂肪酸代謝中間体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌および該生産菌を用いたポリヒドロキシアルカノエートの生産方法に関する。またポリヒドロキシアルカノエート生産菌のアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を破壊するための遺伝子ターゲティングベクターおよび該遺伝子ターゲティングベクターを用いたポリヒドロキシアルカノエート生産菌のアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、多くの微生物がポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)あるいはその他のポリ-３-ヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡ)を生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,Ｐ178-197(1995))。これらのポリマーは従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。さらに、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全分解されるという利点を有しており、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。特に最近、微生物産生ＰＨＡのより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮して、アルキル基以外の置換基を側鎖に導入したＰＨＡ「unusual ＰＨＡ」が極めて有用であることが期待されている。このような置換基の例としては、芳香環を含むもの(フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基等)や、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシド、チオエーテルなどが挙げられる。微生物産生ＰＨＡは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、このようなPHAを産生する微生物については様々な研究が成され、PHAの生合成経路は比較的よく調べられてきた。これまでのところ微生物によるＰＨＡ生合成経路について、主に３つの経路が提唱されている。
【０００３】
「第1の経路」は、ポリ-３-ヒドロキシ酪酸(ＰＨＢ)を合成する経路で、糖から解糖系を経て生じたアセチル−CoAが、β-ケトチオラーゼにより縮合されてアセトアセチル−CoAを生じ、これがアセトアセチル−CoAレダクターゼによって（R）-３-ヒドロキシブチリル−CoAに変換され、次にポリヒドロキシブチレート合成酵素によってPHBへ変換される。
【０００４】
「第2の経路は」、糖からの脂肪酸合成経路を経て生じた（R）-3-ヒドロキシアシル-ACPが、（R）-3-ヒドロキシアシル-ACP−CoAトランスフェラーゼによって、（R）-3-ヒドロキシアシル−CoAに変換され、これがポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の基質となってPHAへ変換される [ACPはアシルキャリアタンパク質の略である]。
【０００５】
第1および第2の経路の出発物質が糖であるのに対し、「第３の経路」は、脂肪酸からβ酸化経路を経て生じた、trans-2,3-デヒドロアシル−CoA、（S）-３-ヒドロキシアシル−CoAあるいは３-ケトアシル−CoAが、それぞれ（R）-エノイル−CoAヒドラターゼ、３-ヒドロキシアシル−CoAエピメラーゼあるいは、ケトアシル−CoAレダクターゼによって（R）-３-ヒドロキシアシル−CoAに変換され、これがポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の基質となってPHAへ変換される。
【０００６】
一般に、unusual ＰＨＡを微生物により生産するには、導入しようとする置換基を有するアルカノエートを培養液に添加してPHA生産菌を培養する。したがって、unusualな置換基を有するアルカノエートは、主にβ酸化系を利用する上記「第３の経路」を経てPHAに合成されることになる。第3の経路の概略を図２に示す。
【０００７】
機能性ポリマーとして期待されているPHA(特にunusual PHA)を、安価にかつ大量に安定的に得るためには、微生物のＰＨＡ合成・代謝系を構成する中間代謝物が受ける生化学的変換の流れについて、ＰＨＡ生産性がもっとも高くなるように、全体として最適化を図る必要がある。このような視点にたって、これまで、unusual ＰＨＡを微生物により生産しようとする場合、生産量を向上させる目的で、導入しようとする置換基を有するアルカノエートを、ポリマー原料としての利用に加えて増殖用炭素源としても利用する方法が用いられている。
【０００８】
また、導入しようとする置換基を有するアルカノエートに加えて、増殖用炭素源として、オクタン酸やノナン酸といった中鎖長の脂肪酸等を共存させた培地で微生物を培養したのち、ＰＨＡを抽出する方法が一般に用いられている。
【０００９】
また、Journal of Bacteriology 182, 2978-2981(2000)には、「大腸菌」のfadA(アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ)遺伝子破壊株に、phaC2(Pseudomonas oleovolans由来、PHA合成酵素)およびfabG(Pseudomonas aeruginosa PAO1由来、3-ケトアシル−CoAレダクターゼ)を形質転換した結果、細胞内のPHA（usual mcl PHA）量（% cell dry weight）を向上できたことが示されている。
【非特許文献１】「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,Ｐ178-197(1995)
【非特許文献２】Journal of Bacteriology 182, 2978-2981(2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
生分解性を兼ね備えた、機能性ポリマーへのＰＨＡの応用を考慮した場合、「unusual ＰＨＡ」を高純度で得られる生合成方法の開発が必要であり、当該ポリマーを高純度で効率的に生合成し菌体内に蓄積し得る微生物の開発が有用かつ重要である。また、微生物産生ＰＨＡの利用範囲をさらに拡大していくためには、物性の改良をより幅広く検討していくことが重要であり、そのためには所望のモノマーユニットのみを含むＰＨＡと、その製造方法、ならびに所望のＰＨＡを効率的に生産しうる微生物の開発、探索が必須である。
【００１１】
従来、導入しようとする置換基を有するアルカノエートを、ポリマー原料としての利用に加えて増殖用炭素源としても利用する方法は、当然ながらモノマーの一部がエネルギー源として消費されてしまうので、合成されたＰＨＡの収率が低くなってしまう問題がある。また、この方法では当該アルカノエートからのβ酸化によるアセチル-ＣｏＡの生成に基づくエネルギー源の供給が期待されており、このような方法においては、ある程度の鎖長を有する基質でないとβ酸化によりアセチル-ＣｏＡを生成することができず、このためＰＨＡの基質として用いうるアルカノエートが限定されてしまうという問題もある。また、一般的に、β酸化により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった基質が新たに生成し、これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれるため、合成されるＰＨＡは鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ異なるモノマーユニットからなる共重合体となることが多い。例えば、８-フェノキシオクタン酸をモノマー基質として添加した培地でポリマーを生産させた場合、基質である８-フェノキシオクタン酸由来の３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸と、代謝産物由来の副生物である３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸及び３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸の３種類のモノマーユニットからなる共重合体が生産される。この点で、単一のモノマーユニットからなるＰＨＡを得ようとする場合、この方法を用いることは極めて難しい。
【００１２】
また、従来、導入しようとする置換基を有するアルカノエートに加えて、増殖用炭素源として、オクタン酸やノナン酸といった中鎖の脂肪酸等を共存させた培地で微生物を培養したのち、ＰＨＡを抽出する方法は、ＰＨＡの純度が低く、得られるポリマーの50％以上が、増殖用炭素源に由来するモノマーユニット(例えば、３-ヒドロキシオクタン酸や３-ヒドロキシノナン酸等)となる場合が多いという問題がある。これら「usual ＰＨＡ」のユニットであるｍｃｌ-３ＨＡユニットは、単独の組成においては常温で粘着性のポリマーであり、ＰＨＡに多量に混在した場合、ポリマーのガラス転移温度(Ｔg)を著しく降下させる。このため、常温で硬いポリマー物性を得ようとする場合、ｍｃｌ-３ＨＡモノマーユニットの混在は望ましくない。また、このようなヘテロな側鎖構造は分子内あるいは分子間での側鎖構造に由来する相互作用を妨害し、結晶性あるいは配向性に大きな影響を与えることが知られている。ポリマー物性の向上、機能性の付与を達成するにあたり、これらのヘテロなｍｃｌ-３ＨＡモノマーユニットの混在は従来製造法の大きな課題である。
この課題の解決手段として、特定の置換基を有するモノマーユニットのみで構成されたＰＨＡを取得するために、増殖用炭素源由来のｍｃｌ-３ＨＡモノマーユニット等の「目的外」のモノマーユニットを分離/除去するための精製工程を設けることが挙げられる。しかしながら、操作が煩雑となる上、収率の大幅な低下も避けられない点が課題となる。さらに大きな問題点は、目的のモノマーユニットと目的外のモノマーユニットとが共重合体を形成している場合、目的外のモノマーユニットのみを除去するのは極めて困難な点である。特に、不飽和炭化水素から得られる基、エステル基、アリル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン化炭化水素から得られる基、エポキシド等が導入された基を側鎖構造として有するようなモノマーユニットを含むＰＨＡの合成を目的とする場合、ｍｃｌ-３ＨＡモノマーユニットは目的のモノマーユニットと共重合体を形成する場合が多く、ＰＨＡ合成後のｍｃｌ-３ＨＡモノマーユニット除去は極めて困難である。
【００１３】
代謝工学的視点からＰＨＡの生産性を向上させるために成され、Journal of Bacteriology 182, 2978-2981(2000)に開示された、大腸菌のfadA(アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ)破壊株にphaC2およびfabGを形質転換した系では、usualなmcl ＰＨＡの合成量が向上しているが、大腸菌の脂肪酸合成系（前記第2の経路）をＰＨＡのモノマー供給系として利用しているので、unusualなＰＨＡを合成することは出来ない。
【００１４】
本発明は上記課題を解決するものであり、デバイス材料や医用材料等として有用な置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡ(unusual ＰＨＡ)を製造し得る微生物の提供、特には、目的外のモノマーユニットの混在が少なく、目的とする「unusual ＰＨＡ」を高純度で得ることができ、しかも高収率な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らはフェニル吉草酸を基質として用いて、３−ヒドロキシフェニル吉草酸モノマーユニットを含むＰＨＡを生産する能力を有する微生物の探索を行った。その結果、土壌より所望の能力を有する微生物株を分離することに成功し、ＹＮ２１株とした。
【００１６】
以下に述べる菌学的性質から、バージェーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー・第１巻（Ｂｅｒｇｅｙ‘ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ１）（１９８４年）、及び、バージェーズ・マニュアル・オブ・ディタミネーティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ‘ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第９版（１９９４年）に基づいて検索したところ、ＹＮ２１株はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属すると判明した。従って、この菌株をシュードモナス・スピーシーズ・ＹＮ２１株とそれぞれ命名した。
【００１７】
unusualな置換基を有するポリヒドロキシアルカノエート生産菌として本発明者らが土壌より分離した微生物である、シュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株（Pseudomonas sp. YN21）は寄託番号FERM ＢＰ−０８５６９として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨木県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。
【００１８】
ＹＮ２１株の菌学的性質を列挙すれば以下の通りである。
＜YN21株の菌学的性質＞
１）形態学的性質
細胞の形と大きさ：桿菌、0.8μｍ×1.5〜2.0μｍ
細胞の多形性：なし
運動性：あり
胞子形成：なし
グラム染色性：−
コロニー形状：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、半透明
２）生理学的性質
カタラーゼ活性：＋
オキシダーゼ活性：＋
O/F試験：酸化型
硝酸還元：＋
インドール産生：−
アルギニンジヒドロラーゼ：＋
エスクリン加水分解：−
ゼラチン加水分解：−
King's B寒天での蛍光色素産生：＋
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積：−
Tween 80 の加水分解：＋
41℃生育：−
グルコン酸還元：−
レバン産生：−
ジャガイモ腐敗：−
タバコ過敏感反応：−
スクロース：−
カゼイン：−
チロシナーゼ：＋
硫化水素：−
ペクチン：−
レシチナーゼ：−
リトマスミルク：B
デンプン：−
３）基質資化能
ブドウ糖：＋
Ｌ-アラビノース：＋
Ｄ-マンノース：＋
Ｄ-マンニトール：−
マルトース：−
グルコン酸：＋
D-キシロース：(＋)
ラフィノース：−
サリシン：−
グリセリン：＋
D-セロビオース：−
D-メレチトース：−
ラクトース：−
ガラクトース：＋
D-ソルビトール：−
α-メチル-D-グルコシド：−
D-リボース：(＋)
スクロース：−
イノシトール：−
D-フルクトース：＋
L-ラムノース：−
D-アラビノース：−
ズルシトール：−
メリビオース：−
アドニトール：−
デンプン：−
エリスリトール：−
トレハロース：−
ベタイン：＋
DL-乳酸：＋
D-酒石酸：−
L-酒石酸：(＋)
メソ酒石酸：＋
n-カプリン酸：＋
L-リンゴ酸：(＋)
クエン酸：＋
D-サッカラート：＋
レブリン酸：＋
メサコン酸：−
マロン酸：＋
コハク酸：＋
酢酸：＋
プロピオン酸：＋
n-酪酸：＋
ギ酸：−
グルタル酸：＋
D-キナ酸：＋
セバシン酸：＋
p-ヒドロキシ安息香酸：＋
アントラニル酸：−
ペラルゴン酸：＋
グリセリン酸：＋
γ-アミノ酪酸：＋
L-ロイシン：＋
L-セリン：＋
ヒスチジン：＋
L-イソロイシン：＋
L-アルギニン：＋
β-アラニン：＋
L-チロシン：＋
L-バリン：＋
ホモセリン：−
サルコシン：＋
トリアセチン：＋
トリゴネリン：＋
5-フェニル吉草酸：＋
3-ヒドロキシ酪酸：＋
L-アスパラギン：＋。
【００１９】
なお、YN21株は従来菌株であるPseudomonas cichorii YN2株（FERM BP-7375）と硝酸塩還元性、インドール生成、ブドウ糖酸性化、アルギニンジヒドロラーゼ活性、Ｄ-マンノース資化能などの生理学的性質及び基質資化能の違いを示すことができる。また同様に従来菌株であるPseudomonas cichorii H45 株（FERM BP-7374）とは硝酸塩の還元性、アルギニンジヒドロラーゼ活性、Ｌ-アラビノース資化能、Ｄ−マンニトール資化能において、Pseudomonas jessenii P161 株（FERM BP-7376）とはＤ−マンニトール資化能において、Pseudomonas putida P91 株（FERM BP-7373）とは硝酸塩還元性、Ｌ-アラビノース資化能、Ｄ−マンノース資化能においてそれぞれ特性を異にする。
【００２０】
本発明者らは、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌として発明者らが単離したシュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株(Pseudomonas sp. YN21)由来のアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡのクローニングを行った。アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて、これを遺伝子破壊（gene-disruption）するための遺伝子ターゲティングベクターを構築した。構築した遺伝子ターゲティングベクターを用いて、相同組換えによりＹＮ２１株のアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊された同質遺伝子系統 [ある特定の遺伝子（アセチル-CoAアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子）だけが異なり、他の遺伝子がすべて同一な系統群] を取得した。アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌においては、ポリヒドロキシアルカノエートの生産性が向上しており、生産されたポリヒドロキシアルカノエートも培養時に添加したアルカノエート由来のポリマーユニットを主に構成単位とするホモポリマーであって、従来製造できなかったものであることを見出したことによって、本発明の完成に至った。
【００２１】
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌は、アセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が破壊されていることを特徴とするものである。本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌の一態様は、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌であるシュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. ＹＮ２１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６９）の同質遺伝子系統であって、アセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が破壊されていることを特徴とするシュードモナス スピーシーズ ＦＡ１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. ＦＡ１、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７２）である。
【００２２】
本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、アセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌を培養し、培養液からポリヒドロキシアルカノエートを回収することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。
【００２３】
一方、本発明にかかるアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が破壊されているポリヒドロキシアルカノエート生産菌を得るために使用されるアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターは、下記（ａ）または（ｂ）に示す相同組換えのためのＤＮＡと、アセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼ遺伝子破壊のための部分と、ベクターと、を有し、これらが機能的に連結してなるアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターである。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部。
【００２４】
本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対するアセチル-CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターの他の態様は、
（１）下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（２）外来性ＤＮＡ、
（３）該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、及び
（４）接合起点遺伝子及び
（５）ベクター、
を有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターである。
【００２５】
本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対するアセチル-CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターの更に他の態様は、
（１）下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたはその一部、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはその一部、
（２）該（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡに挿入された外来性ＤＮＡ、
（３）該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、
（４）感受性遺伝子、
（５）接合起点遺伝子及び
（６）ベクター、
を有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターである。
【００２６】
本発明にかかる細胞接合による遺伝子組換えを用いたアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊のための宿主細胞（形質転換細胞）は、上記のターゲティングベクターによって形質転換された宿主細胞である。
【００２７】
本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法は、上記の遺伝子ターゲティングベクターＤＮＡとポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体ＤＮＡ上のアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼ遺伝子との相同組換えによりアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を破壊することを特徴とする、アセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の製造方法である。
【００２８】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法の他の態様は、上記のターゲティングベクターによって形質転換された宿主細胞とポリヒドロキシアルカノエート生産菌との接合により、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体ＤＮＡ上のアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼ遺伝子との相同組換えを惹起しアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を破壊することを特徴とする、アセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の製造方法である。
【００２９】
一方、本発明にかかる脂肪酸代謝中間体の製造方法は、アセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌を培養し、培養液から３−オキソアシル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシアシル−CoA、またはtrans−2,3−デヒドロアシル−CoAを回収することを特徴とする脂肪酸代謝中間体の製造方法である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によって提供されるアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌では、アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼが破壊されていることによって、脂肪酸のβ酸化系の内、アセチル−ＣｏＡの遊離と、鎖長がメチレン鎖２つ分短くなった基質であるacyl-CoAを新たに生成する機能が停止する。その結果、β酸化系の中間代謝産物であるトランス−2，３−デヒドロアシル−CoA （trans-2,3-dehydroacyl-CoA）、L−３−ヒドロキシアシル−CoA （L-3-hydroxyacyl-CoA）、および３−ケトアシル−CoA （3-ketoacyl-CoA）の細胞内への蓄積が惹起される。これらの中間体代謝産物は、ＰＨＡ生産菌のもつＰＨＡ合成酵素系に応じて、例えば、エノイル−CoA ヒドラターゼ （enoyl-CoA hydratase）
を発現しているＰＨＡ生産菌であればトランス−2，3−デヒドロアシル−CoA （trans-2,3-dehydroacyl-CoA）が、また３−ヒドロキシアシル−CoA エピメラーゼ （3-hydroxyacyl-CoA epimerase）を発現しているＰＨＡ生産菌であればL−３−ヒドロキシアシル−CoA （L-3-hydroxyacyl-CoA）が、またケトアシル−CoA レダクターゼ （ketoacyl-CoA reductase）を発現しているＰＨＡ生産菌であれば３−ケトアシル−CoA 3-ketoacyl-CoAが、それぞれ生化学的変換を受けることによって、いずれもＰＨＡ合成酵素の基質であるR−３−ヒドロキシアシル−CoA （R-3-hydroxyacyl-CoA）に変換される。
【００３１】
この結果、脂肪酸はエネルギー源としてではなく、ＰＨＡ合成のためにだけ利用されることになるので、別にエネルギー源として利用できる基質を加えておけば、ＰＨＡの生産量が増大することが期待できる。さらにまたアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼの機能停止により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった基質が新たに生成することが停止されるので、これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれることが抑制される。この結果、合成されるＰＨＡはメチレン鎖が同一鎖長のモノマーユニットからなるホモポリマーとなることが期待できる。
【００３２】
特に、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株は、本発明者らによって単離され、様々なunusualＰＨＡを合成することができることが判明している。したがってYN21株の同質遺伝子系統であってアセチル−CoAアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ ＦＡ１株を用いると、unusual PHAを従来より多量に生合成することができる。またそのポリマー組成も従来製造できなかったホモポリマーとしての新たな機能を付加し得るものである。
【００３３】
ＦＡ１株においても、脂肪酸を添加した培地で培養した場合、アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼが破壊されていることによって、脂肪酸のβ酸化系の内、アセチル−ＣｏＡの遊離と、鎖長がメチレン鎖２つ分短くなった基質（acyl-CoA）の新生が停止する。またβ酸化系の中間代謝産物であるtrans-2,3-dehydroacyl-CoA、L-3-hydroxyacyl-CoA、3-ketoacyl-CoAの細胞内への蓄積が惹起される。これらの中間体代謝産物は、ＦＡ１株のもつＰＨＡ合成酵素系によって利用され、ＰＨＡ合成酵素の基質であるR-3-hydroxyacyl-CoAに変換される。この結果、脂肪酸はエネルギー源としてではなく、ＰＨＡ合成のためにだけ利用されることになるので、別にエネルギー源として利用できる基質を加えておけば、相対的にＰＨＡの生産量が増大する。またアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼの機能停止により鎖長がメチレン鎖２つ分ずつ短くなった基質が新たに生成することが停止されるので、これらがＰＨＡのモノマーユニットとして取り込まれることが抑制される。この結果、合成されるＰＨＡはメチレン鎖長が同一のモノマーユニットからなるホモポリマーとなる。さらにunusual PHAのホモポリマーを従来より高い生産性で製造することが可能となる。
【００３４】
また本発明によれば、アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されているポリヒドロキシアルカノエート生産菌を培養し、培養液からポリヒドロキシアルカノエートを回収することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法が提供される。従来よりも高い生産能を有する生産菌株を用いることで、より高い生産性でPHAを製造することができる。
【００３５】
さらに本発明によれば、上記のようなアセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊に有用なターゲティングベクターを提供することができる。本発明の遺伝子ターゲティングベクターによれば、例えば、シュードモナス スピーシーズ YN21株のアセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子およびこれに相同性を有するアセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子をもつポリヒドロキシアルカノエート生産菌のアセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子を効率的に破壊することができる。
【００３６】
またさらに本発明の、アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法によれば、前記本発明の遺伝子ターゲティングベクターＤＮＡとポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体ＤＮＡ上のアセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子との相同組換えにより、アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を簡便に破壊することが出来る。
【００３７】
さらにまた本発明によって提供されるアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌は脂肪酸を添加した培地で培養した場合、アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼが破壊されていることによって、脂肪酸のβ酸化系の内、アセチル−ＣｏＡの遊離と、鎖長がメチレン鎖２つ分短くなった基質（acyl-CoA）の新生が停止しており、β酸化系の中間代謝産物であるtrans-2,3-dehydroacyl-CoA、L-3-hydroxyacyl-CoA、3-ketoacyl-CoAの細胞内への蓄積が惹起されるされているためこれらの脂肪酸代謝中間体を製造するのに好適に利用できる。これら脂肪酸代謝中間体はポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を用いたＰＨＡのin vitro合成の基質として利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明に供されるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）生産菌とは、従来よりポリヒドロキシアルカノエートを生産することが知れらている微生物の内、機能的な脂肪酸代謝系を具備し、脂肪酸から誘導される３−ヒドロキシアルカン酸を構成ユニットとして含有するポリヒドロキシアルカノエートを合成できるものであり、生産されるＰＨＡを分析することなどの手法により特定できるものである。
【００３９】
このような微生物としては、シュードモナス オレオボランス (Pseudomonas oleovorans) （Makromol.Chem.,191,1957-1965(1990)及びMacroｍolecules,24,5256-5260(1991)）、シュードモナス プチダ(Pseudomonas putida)（Can.J.Ｍicrobiol.,41，32-43(1995)及び Polymer International,39，205-213(1996)）、シュードモナス レジノボランス(Pseudomonas resinovorans)（Appl.Environ.Microbiol,５８(２),746 (1992)）、シュードモナス sp.61-3株(Pseudomonas sp.61-3 strain)（Int.Ｊ.Biol.Macromol.,１６(３)、119 (1994)）、シュードモナス チコリアイ ＹＮ2株(Pseudomonas cichorii ＹＮ2；ＦＥＲＭ ＢＰ-7375)、シュードモナス チコリアイ Ｈ45株(Pseudomonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シュードモナス ジェッセニイＰ161株(Pseudomonas jessenii Ｐ161、ＦＥＲＭ ＢＰ-7376)などが挙げられるが、機能的な脂肪酸代謝系を具備し、脂肪酸から誘導される３−ヒドロキシアルカン酸を構成ユニットとして含有するポリヒドロキシアルカノエートを合成できる性質を具備するものであれば、これらに限らず、また将来新たに見出されるポリヒドロキシアルカノエート生産菌も本発明に供することができる。
【００４０】
unusualな置換基を有するポリヒドロキシアルカノエート生産菌として本発明者らが土壌より分離した微生物である、シュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株(Pseudomonas sp. ＹＮ２１)は、特に本発明に好適に供し得る。
【００４１】
本発明に係るアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ (acetyl-CoA acyltransferase)とは、
3-oxoacyl-CoA ＋ CoA  → acyl-CoA + acetyl-CoA
なる化学反応を触媒するもので、酵素番号EC 2.3.1.16で表される酵素である。なおアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼは一般に別名、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼ(acetyl-CoA C-acyltransferase)、ベータ−ケトチオラーゼ(beta-ketothiolase)、３−ケトアシル−ＣｏＡ  チオラーゼ(3-ketoacyl-CoA thiolase)、KAT、ベータ−ケトアシル−ＣｏＡ  チオラーゼ(beta-ketoacyl-CoA thiolase)、ベータ−ケトアジピル−ＣｏＡ  チオラーゼ(beta-ketoadipyl-CoA thiolase)、３−ケトアシル  ＣｏＡ  チオラーゼ(3-ketoacyl CoA thiolase)、３−ケトアシル  チオラーゼ(3-ketoacyl thiolase)、３−ケトチオラーゼ(3-ketothiolase)、３−オキソアシル−ＣｏＡ  チオラーゼ(3-oxoacyl-CoA thiolase)、６−オキソアシル−ＣｏＡ  チオラーゼ(6-oxoacyl-CoA thiolase)、アセトアセチル−ＣｏＡ  ベータ−ケトチオラーゼ(acetoacetyl-CoA beta-ketothiolase)、ケトアシル−ＣｏＡ  アシルトランスフェラーゼ(ketoacyl-CoA acyltransferase)、ケトアシル−ＣｏＡ  チオラーゼ(ketoacyl-CoA thiolase)、長鎖  ３−オキソアシル−ＣｏＡチオラーゼ(long-chain 3-oxoacyl-CoA thiolase)、オキソアシル−ＣｏＡ  チオラーゼ(oxoacyl-CoA thiolase)、プロ−３−ケトアシル−ＣｏＡ  チオラーゼ(pro-3-ketoacyl-CoA thiolase)、チオラーゼ  Ｉ（thiolase I）などと呼ばれることもある。なおＰＨＢ合成に関与する、
2 acetyl-CoA → CoA + acetoacetyl-CoA
なる化学反応を触媒する酵素（酵素番号EC 2.3.1.9）もベータ−ケトチオラーゼ(beta-ketothiolase) と呼ばれ、その他一般に、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ(acetyl-CoA C-acetyltransferase)、アセトアセチル−ＣｏＡ  チオラーゼ(acetoacetyl-CoA thiolase)、ベータ−アセトアセチル  ＣｏＡ  チオラーゼ(beta-acetoacetyl CoA thiolase)、２−メチルアセトアセチル−ＣｏＡ  チオラーゼ(2-methylacetoacetyl-CoA thiolase)、３−オキソチオラーゼ(3-oxothiolase)、アセチル  ＣｏＡ  チオラーゼ(acetyl CoA thiolase)、アセチル−ＣｏＡ  アセチルトランスフェラーゼ(acetyl-CoA acetyltransferase)、アセチル−ＣｏＡ  Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ(acetyl-CoA:N-acetyltransferase)、チオラーゼ  ＩＩ(thiolase II)などと呼ばれることもあるが、これらは本発明に係るアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼとは異なる。本発明に係るアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼは、長鎖長または中鎖長脂肪酸の酸化代謝系を構成する酵素であり、実質生体内で
3-oxoacyl-CoA ＋ CoA  → acyl-CoA + acetyl-CoA
なる化学反応を触媒しているか否かによって区別される。
【００４２】
本発明のアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌は、アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼをコ−ドする遺伝子を有し、かつポリヒドロキシアルカノエート生産する菌に対して、アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼをコ−ドする遺伝子配列の変性に帰結する変異原処理や、該酵素をコ−ドする遺伝子配列へのトランスポゾンの組み込み、該酵素をコ−ドする遺伝子が発現しないような遺伝工学的変性、例えば、アンチセンス遺伝子阻害、さらにまたは選択的遺伝子破壊によって取得し得るものである。
【００４３】
突然変異を起こすのに有用な化学変異原は、例えば、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)、エチルメタンスルホネート(EMS)及びジエチルスルフェイト(DES)のようなアルキル化剤である。ヒドロキシルアミン、及び亜硝酸のようなDNA塩基を脱アミノ化する化学薬品もまた有用である。電離放射線（γ一及びＸ−線）並びに紫外線照射 (UV)は、突然変異誘発で有用な物理的誘発原である。
【００４４】
アセチル-ＣｏＡアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が破壊された変異株は、たとえば、脂肪酸を単一炭素源とする寒天プレート上で生育できない性質を利用して１次スクリーニングし、取得されたクローンについてアセチル-ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊されていることを確認することによって取得することができる。アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されていることは、例えば菌破砕液のアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ活性を測定することによって、確認することができる。アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ活性の測定は、例えば表１の組成を有する反応液を1.0ml容石英セルに加えて37℃とし、これに菌破砕液20μｌを加えて37℃にて反応せしめ、反応によつて消費される３−オキソパルミトイル−CoAの減少を波長303nmにて経時的に吸光度（OD303）測定することにより実施できる。
【００４５】
【表１】
2006204255.tif 000002
【００４６】
選択的遺伝子破壊によってアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌を取得するには、直鎖ＤＮＡを用いる相同組換えによる方法を用いることもできるが、特に本出願に係る発明の一つで開示されるアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターを用いると、菌に対するダメージを軽減し、より効率的に該遺伝子の破壊されているポリヒドロキシアルカノエート生産菌を取得することが出来る。
【００４７】
一般に遺伝子の機能解明や実用菌株の育種で望ましくない性質に関わる遺伝子を選択的に破壊するために、染色体上の標的部位への相同組み換えによる選択的遺伝子破壊法が利用されており、選択的遺伝子破壊の方法としては遺伝子挿入破壊法と遺伝子置換破壊法の二つが用いられている（図５）。これらの方法はいずれも、生物の生体において自然に起こり得る遺伝子相同組換えを、該生物の染色体上に存在する内在性ゲノムＤＮＡと外来性ターゲティングＤＮＡ（ターゲティングベクター）との間で人為的に起こさせることにより、該内在性ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列中に該外来性ターゲティングＤＮＡ中に含まれる所望の外来性遺伝子を組込むことを基本原理とするものである。本発明のアセチル-CoAアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌を製造するには、前記遺伝子挿入破壊法と前記遺伝子置換破壊法のいずれの方法も用いることができる。
【００４８】
本発明における遺伝子ターゲティングベクターとは、相同組換えにより、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌の内在性ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮＡ（アセチル-CoAアシルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子を破壊するために用いられるＤＮＡ構造体を意味する。ここで当該「破壊」（gene disruption）とはターゲティングＤＮＡと内在性ゲノムＤＮＡとの相同組換えにより、該内在性ゲノムの一部に導入される下記のようなＤＮＡ配列の改変を意味する。
【００４９】
（１）該標的ＤＮＡの一部ＤＮＡ配列の欠失
（２）該標的ＤＮＡの一部ＤＮＡ配列の外来性ＤＮＡとの置換
（３）該標的ＤＮＡのＤＮＡ配列中への外来性ＤＮＡの挿入
遺伝子挿入破壊法で達成されるDNA配列の改変は前記（３）による改変であり、遺伝子置換破壊法で達成されるDNA配列の改変は前記（１）、（２）または（３）による改変である。これらの改変によりポリヒドロキシアルカノエート生産菌の内在性ゲノムＤＮＡ中のアセチル-CoAアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は実質機能を失い、アセチル-CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子が転写・翻訳・あるいは活性を保持したアセチル-CoAアシルトランスフェラーゼタンパク質が生合成されることを無くすることができる。
【００５０】
本発明のアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターの基本構造は、どのような手法で遺伝子破壊を行うかによって異なり、次の３つの基本構造をとり得る。
（Ｉ）基本的に、下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部と、所望のＩ遺伝子破壊のための部分とをベクターに連結した構成とする；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ＩＩ）遺伝子挿入破壊法にて標的遺伝子を破壊する場合には、本発明の遺伝子ターゲティングベクターは、該標的DNA配列に相同なDNA配列（相同領域）として、下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
を含有し、さらに該内在性ゲノムDNAにとって外来である所望の外来性DNAを有するという基本構造とする。
（ＩＩＩ）遺伝子置換破壊法にて標的遺伝子を破壊する場合には、本発明の遺伝子ターゲティングベクターは、該標的DNA配列に相同なDNA配列（相同領域）として、下記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部；
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
を含有し、かつ該標的DNA配列に相同なＤＮＡ配列（相同領域）中に該内在性ゲノムＤＮＡにとって外来である所望の外来性ＤＮＡが挿入された基本構造とする。
ここで、基本構造（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）における「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズ」するＤＮＡとは、以下に示すＤＮＡをいう。すなわち、（１）高イオン濃度下[例えば、6xSSC(900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム)等が挙げられる。] に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより配列番号１で示される塩基配列を含むＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下[例えば、0.1xSSC(15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム)等が挙げられる。] に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも該ハイブリッドが維持されるＤＮＡをいう。具体的には、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、その一部が、所望とする遺伝子破壊機能を維持し得る範囲で、欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡなどが挙げられる。かかるＤＮＡは自然界からクローニングされたＤＮＡであってもよいし、自然界からクローニングされたＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加が人為的に導入されたＤＮＡであってもよく、また、人為的に合成されたＤＮＡであってもよい。また構成要件（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）における「（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部」はアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする必要はなく、生理的条件下、すなわち微生物細胞内で、染色体上のアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有していればよい。このような相同性としては、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性が挙げられる。またアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊株の作製に用いるＤＮＡは、染色体上のアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子を破壊できる程度の大きさであれば、本発明のＤＮＡの一部であってもよい。ここで一部とは、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の長さを有するもので、所望の遺伝子破壊機能を有する部分が挙げられる。
【００５１】
遺伝子ターゲティングベクターに設ける（a）または（b）に示すDNAの「一部」について具体的な配列を例示するならば、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５である。
【００５２】
基本構造（I）におけるベクターは特に限定されないが、一般的な広域宿主ベクターが使用可能であり、例えばpJRD215（Davidson et al.,Gene, 51,275-280(1987)）及びpBBR1MCSシリーズ（Kovach et al., Gene, 166,175-176(1995)）等を例示することができる。
【００５３】
基本構造（ＩＩ）、（ＩＩＩ）における「外来性ＤＮＡ」としては、例えばマーカー遺伝子、レポーター遺伝子、遺伝子増幅遺伝子、内在性ゲノムＤＮＡ中の標的DNA配列に対する欠失・置換または挿入により、アセチル-CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子の実質的な機能停止に至る様な性質を付加し得る遺伝子発現制御ＤＮＡ配列、あるいはそれらの１つ以上を含むＤＮＡ配列を挙げることができる。ここで「マーカー遺伝子」としては、遺伝子組換え技術分野において通常使用されるいかなるマーカー遺伝子も用いることができる。例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、ゲンタマイシンまたはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示される。また「レポーター遺伝子」としては、ルシフェラーゼや緑色蛍光タンパク質（GFP）、βラクタマーゼなどの遺伝子が例示される。さらにまた「遺伝子増幅遺伝子」としては、染色体DNAを鋳型としたPCR法による破壊株の特異的遺伝子増幅産物が得られるような所望のプライマー結合配列を有するDNA配列が例示される。
【００５４】
基本構造（ＩＩ）、（ＩＩＩ）の遺伝子ターゲティングベクターには、接合起点遺伝子（OriT）を含有するMobサイトを含有させることにより、大腸菌運動性株（mobilizer strain, 例えばＳ１７−１株(ATCC 47055)）に形質転換しプラスミド供与菌体として用いた場合、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌への効率的な導入が可能になり、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に与えるダメージを軽減し、より簡便にまた効率的にアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊された菌株を取得することができるのでより好ましい。これは大腸菌運動性株がtra遺伝子を有しているために、接合伝達における、mob+, tra- の遺伝子ターゲティングベクターをヘルパープラスミドの助けなしに接合伝達することができる(R.Simon et al.(1983) Bio-Technology 1: 784)からである。
【００５５】
基本構造（ＩＩＩ）の遺伝子ターゲティングベクターには、プラスミド受容菌をある条件下に致死に導く遺伝子（感受性遺伝子）を含有させることが望ましい。感受性遺伝子としては、例えばバチルス サブチルス （Buccilus subtilis）由来のレヴァンスクラーゼ（Levansucrase, sacB）が、多くのグラム陰性菌にとって、ショ糖が５重量％を超えて含有する培地において、致死にいたることが見出されており（Gay et al. J. Bacteriol.164, 918）、またシュードモナス スピーシーズ YN21株においても機能することが、発明者らによって確認されたので、本発明においても好適に用いることができる。
【００５６】
基本構造（ＩＩＩ）の遺伝子ターゲティングベクターでは、前記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部への選択マーカーの挿入位置は、該ベクターに組込まれた該（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部の長さを１０としたとき、１から９の間、好ましくは２から８の間、より好ましくは４から６の間である。選択マーカーの挿入位置が前記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部の一端に偏ると、感受性遺伝子の作用を利用した二重相同組換え体の取得効率が下がるので好ましくない。
【００５７】
基本構造（I）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）の遺伝子ターゲティングベクターを構築するには、上記基本構造の構成要件である各DNAを通常の分子生物学的手法を用いてベクターに組込んでいけばよいが、予めポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、接合起点遺伝子および感受性遺伝子を備えた可動性ベクターを利用すると、本発明のアセチル-CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターをより短い工程で作製することができるので有用である。このような可動性ベクターとして、たとえばpEX100T(ATCC 87436)、pJQ200（ATCC 77482）、pDMS197(ATCC 87694)、pRE107(ATCC 87691)などを挙げることができ、本発明のアセチル-CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターを構築する際に好適に用いることができる。
【００５８】
例えば基本構造（ＩＩＩ）の遺伝子ターゲティングベクターを構築するためには、上記可動性ベクターに、前記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部、及び選択マーカーを組込めばよい。これらを組込む順番について制限はないが、その手順の一例を示すならばまず、上記可動性ベクターに適当な制限酵素を作用させ、得られたベクターＤＮＡ断片と、前記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部とを混合し、これにＤＮＡリガーゼを作用させる。次に前記制限酵素とは別の認識部位を切断する制限酵素を作用させ、上記ベクターの一部、または上記ベクターに組込まれた前記（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡ、またはそれらの一部で切断する。得られたベクターＤＮＡ断片を、前記選択マーカーを含むDNA断片と混合し、これにＤＮＡリガーゼを作用させることによって選択マーカーを挿入する。なお以上の工程中、必要に応じ当該分野で知られたリンカー付与、ブラントエンド化等の処理を加えることもできる。
【００５９】
基本構造（Ｉ）の遺伝子ターゲティングベクターを用いてポリヒドロキシアルカノエート生産菌のアセチル-CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子を破壊するには、該遺伝子ターゲティングベクターをポリヒドロキシアルカノエート生産菌に導入する。遺伝子ターゲティングベクターを導入する方法としてはコンピテント細胞に接触せしめる方法や、エレクトロポレーション法など当業者によく知られた方法から適宜選択して用いることが出来る。続いてたとえば、脂肪酸を単一炭素源とする寒天プレート上で生育できない性質を利用して１次スクリーニングし、取得されたクローンについてアセチル-ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊されていることを確認する。
【００６０】
基本構造（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の遺伝子ターゲティングベクターを用いてポリヒドロキシアルカノエート生産菌のアセチル-CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子を破壊するには、基本構造（I）の遺伝子ターゲティングベクターを用いる場合と同様に行うこともできるが、まず該遺伝子ターゲティングベクターを前記大腸菌運動性株に形質転換する。次に形質転換された大腸菌運動性株とポリヒドロキシアルカノエート生産菌との接合転移を利用して、遺伝子ターゲティングベクターをポリヒドロキシアルカノエート生産菌体内に転移させる。
【００６１】
前記選択マーカーで選択することによって遺伝子ターゲティングベクターと染色体ＤＮＡとの相同組換えの結果、アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊された株を取得することができる。なお、宿主であるポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体と遺伝子ターゲティングベクターには前記選択マーカーの前後に２箇所の相同部位が存在するので、この段階で得られる相同組換え体の大部分は、遺伝子ターゲティングベクターに由来する配列が相異なる位置で挿入された染色体構造を有する相異なる2種類の組換え体であって、選択マーカー前後の２箇所の相同部位で同時に交叉の生じた相同組換え体の割合は非常に少ないと考えられる。ただし、遺伝子ターゲティングベクターに由来する配列が挿入されることにより、アセチル-ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子は破壊される。
【００６２】
基本構造（ＩＩＩ）の遺伝子ターゲティングベクターを用いた場合には、続いて感受性遺伝子の機能に基づいた選択を行う。この選択により、プラスミド受容菌から、前記選択マーカーで選択された組換え体の、染色体へ挿入された遺伝子ターゲティングベクターに由来する配列の内、可動性ベクター部分が欠失除去された変異株を取得することができる。これは前段階の相同組換えの際に、利用されなかった他方の相同部位での相同組換えが起こることにより成される。従ってこの段階で、前段階の相異なる染色体構造を有する2種類の組換え体は、同じ染色体構造の（アセチル-ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子が選択マーカーで分断された）組換え体になる。
【００６３】
本発明のアセチル-ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ酵素遺伝子ターゲティングベクターを用いて取得される組換え体の、アセチル-ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊されていることの確認は、前述の方法にて組換え体の菌破砕液のアセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ活性の消失を確認するか、組換え体の染色体ＤＮＡを制限酵素で切断した後、サザンハイブリダイゼーション法を用いるか、適当なプライマーを用いて染色体ＤＮＡに対してＰＣＲ法を用いるなどして実施することができる。
【００６４】
また本発明のアセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターは、適当な宿主細胞内で、自律的に複製、増幅するので、このベクターを宿主細胞中へ導入して形質転換を行って得られた形質転換体を培養することで、このベクターのコピーを製造することができる。このような宿主細胞としては、上記で得られたアセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターで形質転換でき、かつこのベクターの安定維持、複製が可能であるようなものであれば、グラム陰性菌あるいはグラム陽性菌の区別なく、さらには、下等細胞あるいは高等細胞の区別なく、動物由来細胞であろうと植物由来細胞であろうと使用できる。宿主細胞にアセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターを導入するためには、アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターをコンピテント細胞に接触せしめる、エレクトロポレーションなど当業者によく知られた方法から適宜選択して用いることが出来る。
【００６５】
本発明にかかるＰＨＡの製造方法に用いるアセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子破壊株の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる破壊株の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、破壊株の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地(肉汁培地、酵母エキスなど)や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。
【００６６】
培養は液体培養、固体培養等該破壊株が増殖し、ＰＨＡを生産する培養方法ならいかなる培養方法でも用いることができる。さらに、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。また、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
【００６７】
アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子破壊株を用いて生産できるPHAの組成や構造、特に側鎖に置換基を有するunusual PHAの種類は、この同質遺伝子系統であるアセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子非破壊株の性質により規定されるが、シュードモナス スピーシーズ YN21株の同質遺伝子系統でありアセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌であるシュードモナス スピーシーズ FA1株を用いると、例えば下記化学式[１]から[16]に示すポリマーユニットからなる群から選ばれた少なくとも１種類のポリマーユニットをポリマー分子中に含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートを製造することができる。
【００６８】
【化１】
2006204255.tif 000003
【００６９】
（ただし式中R1およびａの組合せが下記のいずれかであるポリマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。
（１）R1が水素原子（H）であり，aが1から10の整数のいずれかであるポリマーユニット、
（２）R1がハロゲン元素であり、aが1から10の整数のいずれかであるポリマーユニット、
（３）R1が、
【００７０】
【化２】
2006204255.tif 000004
【００７１】
であり、ａが1から8の整数のいずれかであるポリマーユニット)
【００７２】
【化３】
2006204255.tif 000005
【００７３】
(式中R2は芳香環への置換基を示し、R2は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、およびKのいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH=CH2基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中bは0から7の整数のいずれかを表す。)
【００７４】
【化４】
2006204255.tif 000006
【００７５】
(式中R3は芳香環への置換基を示し、R3は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、SCH3基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中cは0から7の整数のいずれかを表す。)
【００７６】
【化５】
2006204255.tif 000007
【００７７】
(式中R4は芳香環への置換基を示し、R4は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中dは0から7の整数のいずれかを表す。)
【００７８】
【化６】
2006204255.tif 000008
【００７９】
(式中R5は芳香環への置換基を示し、R5は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す）基、SO2R"（R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中eは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００８０】
【化７】
2006204255.tif 000009
【００８１】
(式中R6は芳香環への置換基を示し、R6は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す）基、SO2R"（R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中fは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００８２】
【化８】
2006204255.tif 000010
【００８３】
(式中gは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００８４】
【化９】
2006204255.tif 000011
【００８５】
(式中hは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００８６】
【化１０】
2006204255.tif 000012
【００８７】
(式中iは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００８８】
【化１１】
2006204255.tif 000013
【００８９】
(式中ｊは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００９０】
【化１２】
2006204255.tif 000014
【００９１】
(式中R7はシクロヘキシル基への置換基を示し、R7は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中kは0から8の整数のいずれかを表す。)
【００９２】
【化１３】
2006204255.tif 000015
【００９３】
(式中R8はシクロヘキシルオキシ基への置換基を示し、R8は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中mは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００９４】
【化１４】
2006204255.tif 000016
【００９５】
(式中nは1から8の整数のいずれかを表す。)
【００９６】
【化１５】
2006204255.tif 000017
【００９７】
(式中pは3または5のいずれかの整数を表す。)
【００９８】
【化１６】
2006204255.tif 000018
【００９９】
(式中q1は1から8の整数のいずれかを表し、q2は0から8の整数のいずれかを表す。)
【０１００】
【化１７】
2006204255.tif 000019
【０１０１】
(式中R9は水素原子(Ｈ)、Na原子またはK原子であり、式中rは1から8の整数のいずれかを表す。)
アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子破壊株を用いて、３-ヒドロキシアルカン酸ユニットをモノマーユニットとして含むＰＨＡを製造する場合は、ＰＨＡ生産用の原料としてそれぞれ対応するアルカン酸またはアルカンと、破壊株の増殖用炭素源とを少なくとも含んだ無機培地などを用いることができる。増殖用炭素源としては、酵母エキスやポリペプトン、肉エキス、カザミノ酸などの天然物由来の培地成分を用いることが可能であり、更に、糖類、ＴＣＡサイクルに関与する有機酸(ＴＣＡ回路中の中間体として生じる有機酸及びＴＣＡ回路から一段階ないしは二段階の生化学反応を経て生じる有機酸)或いはその塩等、β酸化サイクルを経ずにアセチルＣoＡを生じる化合物であれば、いかなる化合物でも用いることができ、用いる菌株に対する基質としての有用性で適宜選択することができる。また、ｍｃｌ-３ＨＡの混入の少ない組み合わせであれば、複数の化合物を選択して用いることも可能である。
【０１０２】
これらのうち、糖類としては、グリセロアルデヒド、エリスロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、グリセロール、エリスリトール、キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【０１０３】
また、有機酸或いはその塩としては、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸などがその例であり、或いはその塩から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【０１０４】
これらの中でも、特に糖類を用いるのが好ましく、中でもグルコース、フルクトース、マンノースからなる群から選択される少なくとも一つであることがより好ましい。
微生物にＰＨＡを生産・蓄積させる方法としては、一旦十分に増殖させて後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態で更に培養すると生産性が向上する場合がある。具体的には、前記の工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。例えば、Ｄ-グルコースを 0.05重量％から 5.0重量％程度、および、アルカン酸またはアルカンを 0.01重量％から 1.0重量％程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、菌体を遠心分離等で回収したのち、アルカン酸またはアルカンを 0.01重量％から 1.0重量％程度含んだ、窒素源を制限した、あるいは実質的に存在しない無機培地でさらに培養する方法がある。
【０１０５】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩等)、窒素源(例えば、アンモニウム塩、硝酸塩等)等、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、ＭＳＢ培地、Ｅ培地(J.Ｂiol.Ｃheｍ.,218，97-106(1956))、Ｍ９培地等を挙げることができる。
【０１０６】
なお、本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成は以下の通りである。
【０１０７】
Ｎa2ＨＰＯ4:    6.2g
ＫＨ2ＰＯ4 :    3.0g
ＮaＣl    ：    0.5g
ＮＨ4Ｃl  ：    1.0g
(培地１リットル中、pＨ 7.0)
更に、良好な増殖及びＰＨＡの生産のためには、上記の無機塩培地に培地に以下に示す微量成分溶液を 0.3％(v/v)程度添加するのが好ましい。
微量成分溶液
ニトリロ三酢酸:     1.5g
ＭgＳＯ4      :     3.0g
ＭnＳＯ4      :     0.5g
ＮaＣl        :     1.0g
ＦeＳＯ4      :     0.1g
ＣaＣl2       :     0.1g
ＣoＣl2       :     0.1g
ＺnＳＯ4      :     0.1g
ＣuＳＯ4      :     0.1g
ＡlＫ(ＳＯ4)2  :    0.1g
Ｈ3ＢＯ3       :    0.1g
Ｎa2ＭoＯ4     :    0.1g
ＮｉＣｌ2        :    0.1g
(１リットル中)
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば 15〜40℃、好ましくは 20〜35℃、更に好ましくは 20℃から 30℃程度が適当である。
【０１０８】
具体的な例としては、Ｄ-グルコースを 0.05重量％から 5.0重量％程度、および、アルカン酸またはアルカンを 0.01重量％から 1.0重量％程度含んだ無機培地等で培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは全くない所望のＰＨＡを抽出することができる。このようなＰＨＡは、一般にＲ-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。
【０１０９】
Ｄ-グルコースの代わりに同量のＴＣＡサイクルに関与する有機酸や、酵母エキス、ポリペプトンを与えても良い。また、それらの組み合わせを用いてもよい。
【０１１０】
本発明にかかる培養液からのＰＨＡの取得には、通常行なわれている方法を適用することができる。ＰＨＡが培養液中に分泌される場合は、培養液からの抽出精製方法が、また、菌体に蓄積される場合は、菌体からの抽出精製方法が用いられる。例えば、微生物の培養菌体からのＰＨＡの回収には、通常行なわれているクロロホルムなどの有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、クロロホルム以外にジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトンが用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡ等の薬剤による処理によってＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、ＰＨＡを回収する方法を用いることもできる。
【０１１１】
なお、本発明の微生物の培養、本発明の微生物によるＰＨＡの生産と菌体への蓄積、並びに、本発明における菌体からのＰＨＡの回収は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１１２】
本発明のアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌は脂肪酸を添加した培地で培養した場合、アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼが破壊されていることによって、脂肪酸のβ酸化系の内、アセチル−ＣｏＡの遊離と、鎖長がメチレン鎖２つ分短くなった基質（acyl-CoA）の新生が停止しており、β酸化系の中間代謝産物である３−オキソアシル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシアシル−CoA、またはtrans−2,3−デヒドロアシル−CoAの細胞内への蓄積が惹起されるされているためこれらの脂肪酸代謝中間体を製造するのに好適に利用できる。特にシュードモナス スピーシーズ YN21株の同質遺伝子系統でありアセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌であるシュードモナス スピーシーズ FA1株を用いると、例えば下記化学式[17]から[32]に示す３−オキソアシル−ＣｏＡを製造することができる。
【０１１３】
【化１８】
2006204255.tif 000020
【０１１４】
（ただし式中R1およびａの組合せが下記のいずれかである３−オキソアシルＣｏＡからなる群より選択される少なくとも一つである。
（１）R1が水素原子（H）であり、aが1から10の整数のいずれかである３−オキソアシルＣｏＡ、
（２）R1がハロゲン原子であり、aが1から10の整数のいずれかである３−オキソアシルＣｏＡ、
（３）R1が、
【０１１５】
【化１９】
2006204255.tif 000021
【０１１６】
であり、ａが1から8の整数のいずれかである３−オキソアシルＣｏＡ)
【０１１７】
【化２０】
2006204255.tif 000022
【０１１８】
(式中R2は芳香環への置換基を示し、R2は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、およびKのいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH=CH2基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中bは0から7の整数のいずれかを表す。)
【０１１９】
【化２１】
2006204255.tif 000023
【０１２０】
(式中R3は芳香環への置換基を示し、R3は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、SCH3基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中cは0から7の整数のいずれかを表す。)
【０１２１】
【化２２】
2006204255.tif 000024
【０１２２】
(式中R4は芳香環への置換基を示し、R4は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中dは0から7の整数のいずれかを表す。)
【０１２３】
【化２３】
2006204255.tif 000025
【０１２４】
(式中R5は芳香環への置換基を示し、R5は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す）基、SO2R"（R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中eは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１２５】
【化２４】
2006204255.tif 000026
【０１２６】
(式中R6は芳香環への置換基を示し、R6は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す）基、SO2R"（R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中fは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１２７】
【化２５】
2006204255.tif 000027
【０１２８】
(式中gは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１２９】
【化２６】
2006204255.tif 000028
【０１３０】
(式中hは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１３１】
【化２７】
2006204255.tif 000029
【０１３２】
(式中iは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１３３】
【化２８】
2006204255.tif 000030
【０１３４】
(式中ｊは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１３５】
【化２９】
2006204255.tif 000031
【０１３６】
(式中R7はシクロヘキシル基への置換基を示し、R7は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中kは0から8の整数のいずれかを表す。)
【０１３７】
【化３０】
2006204255.tif 000032
【０１３８】
(式中R8はシクロヘキシルオキシ基への置換基を示し、R8は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中mは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１３９】
【化３１】
2006204255.tif 000033
【０１４０】
(式中nは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１４１】
【化３２】
2006204255.tif 000034
【０１４２】
(式中pは3または5のいずれかの整数を表す。)
【０１４３】
【化３３】
2006204255.tif 000035
【０１４４】
(式中q1は1から8の整数のいずれかを表し、q2は0から8の整数のいずれかを表す。)
【０１４５】
【化３４】
2006204255.tif 000036
【０１４６】
(式中R9は水素原子(Ｈ)、Na原子またはK原子であり、式中rは1から8の整数のいずれかを表す。)
またポリヒドロキシアルカノエート生産菌であるシュードモナス スピーシーズ FA1株を用いると、例えば下記化学式[33]から[48]に示す３−ヒドロキシアシル−CoAを製造することができる。
【０１４７】
【化３５】
2006204255.tif 000037
【０１４８】
（ただし式中R1およびａの組合せが下記のいずれかである３−ヒドロキシアシル−CoAからなる群より選択される少なくとも一つである。
（１）R1が水素原子（H）であり、aが1から10の整数のいずれかである３−ヒドロキシアシル−CoA、
（２）R1がハロゲン原子であり、aが1から10の整数のいずれかである３−ヒドロキシアシル−CoA、
（３）R1が、
【０１４９】
【化３６】
2006204255.tif 000038
【０１５０】
であり、ａが1から8の整数のいずれかである３−ヒドロキシアシル−CoA)
【０１５１】
【化３７】
2006204255.tif 000039
【０１５２】
(式中R2は芳香環への置換基を示し、R2は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、およびKのいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH=CH2基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中bは0から7の整数のいずれかを表す。)
【０１５３】
【化３８】
2006204255.tif 000040
【０１５４】
(式中R3は芳香環への置換基を示し、R3は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、SCH3基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中cは0から7の整数のいずれかを表す。)
【０１５５】
【化３９】
2006204255.tif 000041
【０１５６】
(式中R4は芳香環への置換基を示し、R4は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中dは0から7の整数のいずれかを表す。)
【０１５７】
【化４０】
2006204255.tif 000042
【０１５８】
(式中R5は芳香環への置換基を示し、R5は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す）基、SO2R"（R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中eは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１５９】
【化４１】
2006204255.tif 000043
【０１６０】
(式中R6は芳香環への置換基を示し、R6は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す）基、SO2R"（R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中fは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１６１】
【化４２】
2006204255.tif 000044
【０１６２】
(式中gは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１６３】
【化４３】
2006204255.tif 000045
【０１６４】
(式中hは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１６５】
【化４４】
2006204255.tif 000046
【０１６６】
(式中iは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１６７】
【化４５】
2006204255.tif 000047
【０１６８】
(式中ｊは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１６９】
【化４６】
2006204255.tif 000048
【０１７０】
(式中R7はシクロヘキシル基への置換基を示し、R7は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中kは0から8の整数のいずれかを表す。)
【０１７１】
【化４７】
2006204255.tif 000049
【０１７２】
(式中R8はシクロヘキシルオキシ基への置換基を示し、R8は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中mは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１７３】
【化４８】
2006204255.tif 000050
【０１７４】
(式中nは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１７５】
【化４９】
2006204255.tif 000051
【０１７６】
(式中pは3または5のいずれかの整数を表す。)
【０１７７】
【化５０】
2006204255.tif 000052
【０１７８】
(式中q1は1から8の整数のいずれかを表し、q2は0から8の整数のいずれかを表す。)
【０１７９】
【化５１】
2006204255.tif 000053
【０１８０】
(式中R9は水素原子(Ｈ)、Na原子またはK原子であり、式中rは1から8の整数のいずれかを表す。)
またポリヒドロキシアルカノエート生産菌であるシュードモナス スピーシーズ FA1株を用いると、例えば下記化学式[49]から[64]に示すtrans−2,3−デヒドロアシル−CoAを製造することができる。
【０１８１】
【化５２】
2006204255.tif 000054
【０１８２】
（ただし式中R1およびａの組合せが下記のいずれかであるtrans−2,3−デヒドロアシル−CoAからなる群より選択される少なくとも一つである。R1が水素原子（H）でありaが1から10の整数のいずれかであるtrans−2,3−デヒドロアシル−CoA、R1がハロゲン原子でありaが1から10の整数のいずれかであるtrans−2,3−デヒドロアシル−CoA、
R1が、
【０１８３】
【化５３】
2006204255.tif 000055
【０１８４】
であり、ａが1から8の整数のいずれかであるtrans−2,3−デヒドロアシル−CoA)
【０１８５】
【化５４】
2006204255.tif 000056
【０１８６】
(式中R2は芳香環への置換基を示し、R2は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、およびKのいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH=CH2基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中bは0から7の整数のいずれかを表す。)
【０１８７】
【化５５】
2006204255.tif 000057
【０１８８】
(式中R3は芳香環への置換基を示し、R3は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、SCH3基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中cは0から7の整数のいずれかを表す。)
【０１８９】
【化５６】
2006204255.tif 000058
【０１９０】
(式中R4は芳香環への置換基を示し、R4は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中dは0から7の整数のいずれかを表す。)
【０１９１】
【化５７】
2006204255.tif 000059
【０１９２】
(式中R5は芳香環への置換基を示し、R5は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す）基、SO2R"（R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中eは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１９３】
【化５８】
2006204255.tif 000060
【０１９４】
(式中R6は芳香環への置換基を示し、R6は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'（R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す）基、SO2R"（R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す）基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中fは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１９５】
【化５９】
2006204255.tif 000061
【０１９６】
(式中gは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１９７】
【化６０】
2006204255.tif 000062
【０１９８】
(式中hは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０１９９】
【化６１】
2006204255.tif 000063
【０２００】
(式中iは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０２０１】
【化６２】
2006204255.tif 000064
【０２０２】
(式中ｊは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０２０３】
【化６３】
2006204255.tif 000065
【０２０４】
(式中R7はシクロヘキシル基への置換基を示し、R7は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中kは0から8の整数のいずれかを表す。)
【０２０５】
【化６４】
2006204255.tif 000066
【０２０６】
(式中R8はシクロヘキシルオキシ基への置換基を示し、R8は水素原子(Ｈ)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中mは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０２０７】
【化６５】
2006204255.tif 000067
【０２０８】
(式中nは1から8の整数のいずれかを表す。)
【０２０９】
【化６６】
2006204255.tif 000068
【０２１０】
(式中pは3または5のいずれかの整数を表す。)
【０２１１】
【化６７】
2006204255.tif 000069
【０２１２】
(式中q1は1から8の整数のいずれかを表し、q2は0から8の整数のいずれかを表す。)
【０２１３】
【化６８】
2006204255.tif 000070
【０２１４】
(式中R9は水素原子(Ｈ)、Na原子またはK原子であり、式中rは1から8の整数のいずれかを表す。)
本発明にかかる培養液からの脂質代謝中間産物である３−オキソアシル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシアシル−CoA、またはtrans−2,3−デヒドロアシル−CoAの取得には、通常行なわれている方法を適用することができる。すなわち、生産菌を培養し、菌体を回収する。次に超音波処理、酵素処理あるいはフレンチプレス処理等の物理的処理によって菌体を破砕し、可溶性画分を取得する。次に必要に応じて有機溶媒等による未反応の脂肪酸の抽出除去、限外ろ過等によるタンパク質成分の除去を行い、粗精製抽出液を調製する。次にたとえばC18等の逆相カラムにかけ、アセトニトリル等の直線濃度勾配によって目的物を溶出精製する。
【実施例】
【０２１５】
（実施例１）
ポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ YN２１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. ＹＮ２１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６９）の抗生物質耐性に関する予備検討の結果、アンピシリンとクロラムフェニコールに対しては耐性で、ゲンタマイシンに対しては感受性であることがわかったので、ゲンタマイシンに対する薬剤耐性遺伝子をマーカーにしてアセチル−ＣｏＡ アシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターを構築した。構築した遺伝子破壊ベクターは配列番号１に示す塩基配列の塩基番号２１６から塩基番号１１４４の部分配列を含む環状プラスミドDNA（ｐＦＡ１（配列番号１０））である。以下その手順について説明する。図１はその手順の概略について図示したものである。
１）ゲノムDNAの調製
シュードモナス  スピーシーズ  YN２１株を0.5％（w/v）ポリペプトンを含むM9培地で、３０℃、２４時間培養した。培養液から菌体を集菌した後、Wizard Genomic DNA Purification System(プロメガ(株)製)を用いて、YN2１株のゲノムDNAを調製した。
２）インサートDNA断片の調整
YN２１株のゲノムDNAをテンプレートとして、fadA-f1（配列番号２）およびfadA-r1（配列番号３）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いて、PCR（ポリメラーゼチェーン反応）を行った。以下の反応混合液を調製した。
【０２１６】
【表２】
2006204255.tif 000071
【０２１７】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６５℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で１分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、約４８０塩基対の断片が増幅された。約４８０塩基対のＰＣＲ産物をアガロースゲルから切出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてＤＮＡ断片を回収した。回収した約４８０塩基対のＤＮＡ断片およびfadA-r2（配列番号４）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用い、YN２１株のゲノムDNAをテンプレートとして、PCRを行った。以下の反応混合液を調製した。
【０２１８】
【表３】
2006204255.tif 000072
【０２１９】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６８℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で１分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。
ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、約９５０塩基対の断片が増幅された。約９５０塩基対のＰＣＲ産物をアガロースゲルから切出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてＤＮＡ断片を回収した。
約９５０塩基対のＰＣＲ増幅産物の塩基配列を、fadA-f1（配列番号２）、fadA-r1（配列番号３）、に示す塩基配列のDNA、配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNA、またはfadA-r2（配列番号４）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用い、ジェネティックアナライザーCEQ8000（ベックマン コールター製）で解析した。増幅産物は配列番号１のDNAの塩基番号２００から塩基番号１１４９までの部分配列に相当することが確認できた。上記PCRに用いたプライマー；fadA-f1（配列番号２）中には制限酵素BamHIの認識部位、fadA-r1（配列番号３）中には制限酵素XbaIの認識部位、fadA-r2（配列番号４）中には制限酵素SacIの認識部位がそれぞれ予め含まれている。約９５０塩基対のＰＣＲ増幅産物を制限酵素BamHIとSacIで消化した。
また、上記約９５０塩基対は、（１）高イオン濃度下[6xSSC(900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム)  に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより配列番号１で示される塩基配列を含むＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下[0.1xSSC(15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム)]  に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも該ハイブリッドが維持され、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡであることが確認された。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの検出はAlkPhos Direct Labelling and Detection System（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて行った。
【０２２０】
３）ベクターDNA断片の調製
pEX100T（ATCCナンバー87436）をテンプレートに、pEX-f1（配列番号５）およびpEX-r1（配列番号６）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いPCRを行った。
以下の反応混合液を調製した。
【０２２１】
【表４】
2006204255.tif 000073
【０２２２】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６５℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で6分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、約5.6kbの断片が増幅された。用いたプライマーpEX-f1（配列番号５）中には制限酵素BamHIの認識部位、pEX-r1（配列番号６）中には制限酵素SacIの認識部位がそれぞれ予め含まれている。約5.6kbのPCR産物を制限酵素BamHIとSacIで消化した後、Calf Intestine Alkaline Phosphatase（宝酒造（株）製）を用いて5'末端を脱リン酸化処理した。
【０２２３】
４）ライゲーション
前記２）で調製した約９５０塩基対のBamHI・SacI消化産物（インサート）と、前記３）で調整した約5.6kbのBamHI・SacI消化産物（ベクター）とを、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造（株）製）を用いてライゲーションした。
以下にライゲーション反応液の組成を示す。
【０２２４】
【表５】
2006204255.tif 000074
【０２２５】
ライゲーション反応液を１６℃の恒温槽で１時間保持した後、Escherichia coli JM109コンピテントセルに形質転換した。アンピシリン100μg/mlを含むLB寒天プレート上で増殖可能なコロニーを選択した。その結果、プラスミドpEX-fadA（配列番号７）を得た。プラスミドpEX-fadAの制限酵素切断地図を図３に示す。
５）ゲンタマイシンカセットの挿入
前記４）で調整したプラスミドpEX-fadAを制限酵素XbaIで消化したした後、Calf Intestine Alkaline Phosphatase（宝酒造（株）製）を用いて5'末端を脱リン酸化処理した。pDONR207(インビトロジェン(株)製)をテンプレートに、gen-f1(配列番号８)およびgen-r1（配列番号９）に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いてPCRを行った。
以下の反応混合液を調製した。
【０２２６】
【表６】
2006204255.tif 000075
【０２２７】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６５℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で1分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、約850塩基対の断片が増幅された。用いたプライマーgen-f1（配列番号８）およびgen-r1（配列番号９）中には制限酵素XbaIの認識部位が予め含まれており、制限酵素XbaIを用いて、約850塩基のPCR産物を消化した。前記約８５０塩基対のXbaI消化産物（インサート）と、pEX-fadAのXbaI消化産物（ベクター）とをライゲーションした。以下にライゲーション反応液の組成を示す。
【０２２８】
【表７】
2006204255.tif 000076
【０２２９】
ライゲーション反応液を１６℃の恒温槽で１時間保持した後、Escherichia coli JM109コンピテントセルに形質転換した。
ゲンタマイシン15μg/mlを含むLB寒天プレート上で増殖可能なコロニーを選択した。その結果、プラスミドpFA１（配列番号１０）を得た。プラスミドpFA1（アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクター）の制限酵素切断地図を図４に示す。
【０２３０】
（実施例２）
［アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ ＦＡ１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. ＦＡ１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５７２）の取得］
実施例１で構築したアセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクター（プラスミドpFA１、配列番号１０）で大腸菌mobilizing strain Escherichia coli S17-1（ATCCナンバー47055）をエレクトロポーレーション法により形質転換した。エレクトロポーレーションの条件は、2.5kV、25μF、200Ωで、0.2cmギャップのセル（ジーンパルサーキュベット0.2cm，バイオラッド社製）で市販のエレクトロポーレーション装置（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ，バイオラッド社製）を用いて行った。ゲンタマイシン15μg/mlを含むLB寒天プレート上で増殖可能なコロニーとして取得したS17-1株のpFA1形質転換体を、アンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地５mlで、３０℃、１２時間振とう培養した。同様にシュードモナス スピーシーズ ＹＮ２１株をアンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地５mlで、３０℃、１２時間振とう培養した。
【０２３１】
E. coli S17-1株のpFA1形質転換体の培養液１50μｌをアンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地150mlに接種し、600nmでの吸光度（対照として滅菌したＬＢ液体培地を用いた）を随時モニターしながら３０℃で振とう培養した。また、ＹＮ２１株の培養液１50μｌをアンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地150mlに接種し、600nmでの吸光度（対照として滅菌したＬＢ液体培地を用いた）を随時モニターしながら３０℃で振とう培養した。E. coli S17-1株のpFA1形質転換体の培養液（600nmでの吸光度は0.35であった）の4.5ｍｌと、ＹＮ２１株の培養液（600nmでの吸光度は0.39であった）の0.5ｍｌとを、混合し、ニトロセルロース製フィルター（ポアサイズ0.45μm、直径25mm、ミリポア製white surfactant free HATF）を用いて、ろ過して集菌した。
【０２３２】
ニトロセルロース製フィルターの集菌した面を上に向け、ＬＢ寒天プレート上に乗せて、乾燥しないように寒天プレートに蓋をかぶせ、30℃で90分間恒温保持した。アンピシリン100μg/mlを含むＬＢ液体培地の１ｍｌで、フィルター上の菌体をピペッティングにより懸濁し、懸濁液の適量を15μg/mlゲンタマイシン、および10μg/mlクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに蒔種した。30℃で2日間培養後出現したコロニーを、15μg/mlゲンタマイシン、10μg/mlクロラムフェニコール、および５％(w/v)シュークロースを含むＬＢ寒天プレートに画線して、30℃で2日間培養した。15μg/mlゲンタマイシン、および10μg/mlクロラムフェニコール、5％(w/v)シュークロースを含むＬＢ寒天プレート上に生育したコロニーの幾つかを、15μg/mlゲンタマイシン、10μg/mlクロラムフェニコールおよび0.5重量％ポリペプトンを含むM9培地で、３０℃、２４時間培養した。培養液から菌体を集菌した後、Wizard Genomic DNA Purification System(プロメガ(株)製)を用いて、ゲノムDNAを調製した。
【０２３３】
調製したゲノムＤＮＡ、および対照としてＹＮ２１株のゲノムＤＮＡ（前記１）で調製したもの）をテンプレートとして、fadA-f1（配列番号２）と fadA-r2（配列番号４）に示す塩基配列のＤＮＡをプライマーとして用いPCRを行った。
以下の反応混合液を調製した。
【０２３４】
【表８】
2006204255.tif 000077
【０２３５】
PCRは、変性[９８℃で２０秒間]、アニーリング[６４℃で２０秒間]、伸長反応[７２℃で２分間]からなる一連の処理を３０サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ産物の確認はアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１重量％）により行った。その結果、新たに取得したコロニーから調製したゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いた場合には約1.5kbのDNA断片が、また対照のYN21株から調製したゲノムDNAをテンプレートとして用いた場合には約740塩基対のDNA断片がそれぞれ増幅された。これは、新たに取得されたコロニーではアセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子の中程に、ゲンタマイシン耐性遺伝子を含むDNAが挿入され、この分だけPCRによって増幅されるDNA断片の長さが長くなったことを表しており、アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊されていることを意味する。
【０２３６】
（実施例３）
［アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズ ＦＡ１株を用いたPHA生産］
０．２％（w/v）ポリペプトン、０．２％（w/v）グルコース、０．１％（v/v）ノナン酸を含むＭ９培地 200ｍLに、ＦＡ１株または対照としてＹＮ21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振とう培養した。９０時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨＡの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラム:ポリマーラボラトリー ＰＬgel ＭIＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により測定した。得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。それらの結果を表９に示す。
【０２３７】
【表９】
2006204255.tif 000078
【０２３８】
表９の結果から明らかなように、アセチル-ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊されているため、ＦＡ１株によって生産されるＰＨＡは、「usualなモノマー基質」を使用しても、鎖長の短くなったユニットがほとんど混入せず、このようなポリヒドロキシアルカノエートのホモポリマーを生産する上で有用であることがわかった。
【０２３９】
（実施例４）
［アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズ ＦＡ１株を用いたPHA生産］
０．５％（w/v）ポリペプトン、０．２％（w/v）イーストエクストラクト、０．１％（w/v）7-フェニルヘプタン酸を含むＭ９培地 200ｍLに、ＦＡ１株または対照としてＹＮ21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振とう培養した。９０時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
得られたＰＨＡは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥI法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。それらの結果を表１０に示す。
【０２４０】
【表１０】
2006204255.tif 000079
【０２４１】
表１０の結果から明らかなように、アセチル-ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊されているため、ＦＡ１株によって生産されるＰＨＡは、「unusualなモノマー基質」を使用しても、鎖長の短くなったユニットがほとんど混入せず、従来のポリヒドロキシアルカノエートのモノマーユニット組成とは全く異なる組成のＰＨＡを生産する上で有用であることがわかった。
【０２４２】
（実施例５）
［脂肪酸代謝中間体の製造］
０．２％（w/v）ポリペプトン、０．２％（w/v）グルコース、０．１％（v/v）オクタン酸を含むＭ９培地 200ｍLに、ＦＡ１株または対照としてＹＮ21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振とう培養した。９０時間後、菌体を遠心分離によって回収し、PBS緩衝液に懸濁した。細胞懸濁液をフレンチプレス処理して細胞を破砕し、遠心分離して上清を可溶性画分として調製した。可溶性画分から、Amicon Centriprep membrane(molecular mass cutoff of 10,000)を用いて酵素等を分離除去した。次にC18カートリッジ(C18 silica Bondelut 500mg, 3ml, Valian Benelux)を用いて、３−オキソオクタノイル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシオクタノイル−CoA、およびtrans−2,3−デヒドロオクタノイル−CoAをメタノールで溶出して粗精製した。窒素気流下にメタノールを留去した後、残留物を50mM リン酸カリウム, pH5.5(BufferA)に溶解し、Econosphere C18カラム(150 x 4.6mm, 80Å, 5μm, Alltech)/Waters gradient HPLC systemにかけた。３−オキソオクタノイル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシオクタノイル−CoA、およびtrans−2,3−デヒドロオクタノイル−CoAはBufferA中アセトニトリルの直線濃度勾配で溶出し精製した。CoA誘導体中のアデニン量を259nmの吸光度(ε, 16,400M-1 cm-1)で測定することで、３−オキソオクタノイル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシオクタノイル−CoA、およびtrans−2,3−デヒドロオクタノイル−CoAの検出および分画を行った。分画精製された３−オキソオクタノイル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシオクタノイル−CoA、およびtrans−2,3−デヒドロオクタノイル−CoAは直接、あるいは25mMヒドロキシアミンを加えることによってチオエステル結合の選択的切断を惹起し、遊離したアシル基をLC-MS（LCQ Advantage, Thermo Finnigan）で分析することにより、それぞれの同定を行った。また、25mMヒドロキシアミンによるチオエステル結合の選択的切断によって遊離したCoAをDTNB（ε, 14,100M-1 cm-1）で検出することによって定量を行った。その結果、３−オキソオクタノイル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシオクタノイル−CoA、およびtrans−2,3−デヒドロオクタノイル−CoAのいずれも、FA1株の方がYN21株よりも生産性に優れていることが明らかになった。
【０２４３】
（実施例６）
[アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズ ＦＡ１株を用いたPHA生産]
０．５％（w/v）ポリペプトン、および０．５％（w/v）グルコースを含むＭ９培地 ５０ｍLに、次の表１１に示すアルカン酸を個別に加えた培地をそれぞれ調製した。
【０２４４】
【表１１】
2006204255.tif 000080
【０２４５】
ＦＡ１株または対照としてＹＮ21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で、96時間振盪培養した。それぞれの菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100ｍLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０２４６】
得られたＰＨＡのモノマーユニット比を、1H−NMR（FT−NMR：BrukerDPX４００；共鳴周波数：４００MHｚ；測定核種：１H；使用溶媒：CDCｌ３；ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：キャピラリ封入TMS／CDCｌ３；測定温度：室温）によってもとめた。ポリマー乾燥重量（PDW）およびモノマーユニット比の結果を表１２に示す。
【０２４７】
【表１２】
2006204255.tif 000081
【０２４８】
表１２の結果から明らかなように、アセチル-ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊されているため、ＦＡ１株によって生産されるＰＨＡは、「unusualなモノマー基質」を使用しても、鎖長の短くなったユニットがほとんど混入せず、従来のポリヒドロキシアルカノエートのモノマーユニット組成とは全く異なる組成のＰＨＡを生産する上で有用であることがわかった。
【０２４９】
（実施例７）
[変異型ターゲティングベクターを用いたアセチル-ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊]
実施例１で作製したプラスミドpEX-fadA（配列番号７）に対して、３６８５番目から３６８７番目の塩基配列ＧＧＣをＧＣＣに、３８５０番目から３８５２番目の塩基配列ＴＡＣをＣＡＴに、４０４２番目から４０４４番目の塩基配列ＡＣＣをＧＴＣにそれぞれ置換した。各塩基配列の置換はプラスミドをテンプレートとして、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて行った。変異導入したプラスミドのＢａｍＨＩとＳａｃＩ消化物（約８７０ｂｐ）は、（１）高イオン濃度下[6xSSC(900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム)  に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより配列番号１で示される塩基配列を含むＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下[0.1xSSC(15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム)]  に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも該ハイブリッドが維持され、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡであることが確認された。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの検出はAlkPhos Direct Labelling and Detection System（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて行った。
【０２５０】
変異導入したプラスミドのＸｂａＩサイトに実施例１で述べた方法により、ゲンタマイシンカセットを導入することによって、変異導入したアセチル-ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターを作製した。
【０２５１】
作製した遺伝子ターゲティングベクターを用いて実施例２で述べた方法によりアセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌を取得することができた。
【０２５２】
（実施例８）
［YN21株の取得］
ポリペプトン0．5％、フェニル吉草酸0．1％、ミネラル溶液0．3％、粉末寒天1.2%を含むＭ９培地をオートクレーブ滅菌し、50℃に冷却後、ナイルレッドを0.05%含有するDMSO溶液を0．1％添加し、滅菌シャーレに15mlずつ分注し、寒天を固化させて寒天培地を作製した。
【０２５３】
なお、M9培地及びミネラル溶液の組成は以下に示す。
[M9培地]
Ｎa2ＨＰＯ4：６.２g、ＫＨ2ＰＯ4：３.０ｇ、ＮaＣl：０.５g、ＮＨ4Ｃl：１.０g（培地１リットル中、pＨ７.０）
[ミネラル溶液]
ニトリロ三酢酸：1.5 g、ＭgＳＯ4：3.0 g、ＭnＳＯ4：0.5 g、ＮaＣl：1.0 g、ＦeＳＯ4：0.1 g、ＣaＣl2：0.1 g、ＣoＣl2：0.1 g、ＺnＳＯ4：0.1 g、ＣuＳＯ4：0.1 g、ＡlＫ(ＳＯ4)2：0.1 g、Ｈ3ＢＯ3：0.1 g、Ｎa2ＭoＯ4：0.1 g、ＮiＣl2：0.1 g（１リットル中、pH7.0）
次に、野外から採取した土壌試料5gを10mlの滅菌蒸留水に添加し、1分間攪拌した。この土壌懸濁液0．5mlを4．5mlの滅菌水に添加・攪拌し、10倍希釈液を作製した。同様の操作を繰り返し、100倍希釈液、1000倍希釈液、10000倍希釈液を作製した。10倍〜10000倍希釈液を先に作製した寒天培地に各0．1mlずつ分注し、寒天表面に均一になるように広げた。これを培養器に移し、30℃で5日間培養した。培養後、PHAを合成したと思われる赤色のコロニーのうち、形態の異なる株を分離した。こうして野生株を十数株取得した。次にポリペプトン0．5％、グルコース0．5％、フェニル吉草酸0．1％、ミネラル溶液0．3％を含むＭ９培地（pH7.0）50mlに上記野生株を保存寒天培地のコロニーから植菌し、500ml容坂口フラスコにて30℃、125ストローク／分で振盪培養した。また上記培地をpH5.0、pH8.5にそれぞれ調整した培地に関しても同様に培養を行った。72時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて洗浄した後、真空乾燥した。この乾燥菌体ペレットを酢酸エチル１０ｍｌに懸濁し、３５℃で１５時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を冷メタノール中に加えて、ＰＨＡを再沈澱させ、沈澱物のみを回収して真空乾燥し、得られたＰＨＡを秤量してポリマー乾燥重量（PDW）を求めた。得られたＰＨＡのモノマーユニット比を、１Ｈ−ＮＭＲ（ＦＴ−ＮＭＲ：ＢｒｕｋｅｒＤＰＸ４００；共鳴周波数：４００ＭＨｚ；測定核種：１Ｈ；使用溶媒：ＣＤＣｌ３；ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：キャピラリ封入ＴＭＳ／ＣＤＣｌ３；測定温度：室温）によって求めた。以上により得られたポリマー乾燥重量（PDW）及びモノマーユニット比を各野生株及び従来菌株に関して比較することで、PHA生産性を有するYN21株を取得した。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
【図１】実施例１で例示したアセチル-ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクターｐＦＡ1を構築する手順の概略を図示したものである。
【図２】微生物によるポリヒドロキシアルカノエート生合成経路について明細書中で説明した第3の経路の概略を図示したものである。
【図３】実施例１で構築したプラスミドpEX-fadAの制限酵素切断地図である。
【図４】実施例１で構築したプラスミドpFA1（アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティングベクター）の制限酵素切断地図である。
【図５】遺伝子挿入破壊法と遺伝子置換破壊法による選択的遺伝子破壊の方法を図示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2006204255.tif 000085
【図５】
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【配列表】
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