(57)【要約】【課題】  中枢神経系損傷（特に、脊髄損傷およびＣＮＳに対する外傷から生じる二次的な組織変性）を処置するためのさらなる方法の提供。【解決手段】  被験体における中枢神経系損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法であって、該方法は、中枢神経系損傷に関連する二次的な組織変性を有する被験体に、１０ｋＤａのインターフェロン誘導性タンパク質（ＣＸＣＬ１０）に特異的な中和剤の有効量を投与する工程を包含する、方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における中枢神経系損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法であって、該方法は、中枢神経系損傷に関連する二次的な組織変性を有する被験体に、１０ｋＤａのインターフェロン誘導性タンパク質（ＣＸＣＬ１０）に特異的な中和剤の有効量を投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって授与された契約番号ＮＳ３７３３６−０１の元で政府の援助によってなされた。合衆国政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、免疫学に関しそして、より具体的には、ケモカインＣＸＣＬ１０の中和によって中枢神経系（ＣＮＳ）損傷と関連する二次的な組織変性の処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ＣＮＳは脳および脊髄からなり、これらは、神経細胞、支持細胞および神経線維を含む連続した系を形成する。脳は、明確な領域および層を有する認知器官であり、領域および層の各々は、感覚器官から受信される特定の刺激の受信および処理に関連する。ヒト脳は、３つの主要領域に分けられ、その各々は以下の明確な機能を有する：終脳（前脳）（ｆｏｒｅｂｒａｉｎ  （ｐｒｏｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ））、中脳（中脳）（ｍｉｄ−ｂｒａｉｎ（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ））および後脳（菱脳）（ｈｉｎｄｂｒａｉｎ（ｒｈｏｍｂｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ））。脊髄はセグメントに並び、このセグメントは、身体の上部における移動および感覚を制御するより高いにセグメント、ならびに身体の下部を制御するより低いセグメントを有する。ＣＮＳ損傷の結果は、その構成器官の組織化に反映する。
【０００４】
障害の型は、損傷の型および重大性、損傷を発症する脊髄のレベル、ならびに損傷された神経線維の経路に非常に依存する脊髄損傷に関連する。脊髄への重篤な損傷は、損傷点より下の脊髄セグメントによって制御される身体部分の麻痺および完全な感覚喪失を引き起こす。脊髄損傷はまた、多くの合併症（床ずれおよび呼吸疾患へ高い感受性を含む）を誘導し得る。脳損傷は、異なる領域（認知機能、身体能力、意思伝達、または社会的／挙動的機能を含む）における欠陥の広範な指標を誘導し得る。
【０００５】
中枢神経系に対する損傷は、最初の損傷の直後に止まらないが、最初の外傷後から数時間または数日間続く。これらの遅延した損傷プロセスは、脳および脊髄の損傷から生じる障害の程度を減少させることを目的とする処置のためのよい機会を提示する。外傷または疾患の非存在において、免疫細胞の主要な型はＣＮＳにほとんど進入しない。しかし、脳または脊髄が外傷または疾患によって損傷される場合、免疫細胞はその領域を飲み込み、細片（ｄｅｂｒｉｓ）を除去し、そして強力な調節化学物質（有益および有害の両方）を宿主に放出する。免疫細胞の進入は、急性のＣＮＳ損傷および関連する二次的な変性の両方に関連する。
【０００６】
急性脊髄損傷の現在標準の治癒処置は、高用量のメチルプレドニソロン（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）（ステロイド）であり、損傷の最初の３時間後に投与され、そして全体効力は最近疑問となっている。脊髄損傷の徴候処置は、カリウムチャネルのブロッカーである４−アミノピリジン（４−ＡＰ）で達成され得、神経作用潜在力の持続時間を延長し、そして脱髄した軸索における伝達を改善する。しかし、これらの薬剤のいずれも、ＣＮＳ外傷に関連する複雑な病理学的カスケードを防御しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、中枢神経系損傷（特に、脊髄損傷およびＣＮＳに対する外傷から生じる二次的
な組織変性）を処置するためのさらなる方法を有する必要が存在する。本発明は、この必要性を満足させ、そして関係する利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によって、以下が提供される：
（項目１）
被験体における中枢神経系損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法であって、該方法は、中枢神経系損傷に関連する二次的な組織変性を有する被験体に、１０ｋＤａのインターフェロン誘導性タンパク質（ＣＸＣＬ１０）に特異的な中和剤の有効量を投与する工程を包含する、方法。
（項目２）
前記被験体が哺乳動物である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記被験体がヒトである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記中枢神経系損傷が脊髄損傷である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記中枢神経系損傷が脳損傷である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記１０ｋＤａのインターフェロン誘導性タンパク質（ＣＸＣＬ１０）に特異的な中和剤が、抗ＣＸＣＬ１０抗体である、項目１に記載の方法。
（項目７）
被験体における中枢神経系損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法であって、該方法は、１０ｋＤａのインターフェロン誘導性タンパク質（ＣＸＣＬ１０）に特異的に結合し得る抗体またはそのフラグメントの有効量を、それらを必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目８）
前記中枢神経系損傷が、機械的損傷、脊髄挫傷、脊髄の圧迫損傷、脊髄の裂傷、脊髄の分断、および脱髄状態からなる群より選択される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記脱髄状態が多発性硬化症である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
被験体における病理学的中枢神経系状態に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法であって、該方法は、１０ｋＤａのインターフェロン誘導性タンパク質（ＣＸＣＬ１０）に特異的に結合し得る抗体またはそのフラグメントの有効量を、それらを必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１１）
前記病理学的状態がミエリン喪失である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ミエリン喪失が、急性播種性脳脊髄炎、感染後ミエリン喪失、ワクチン後ミエリン喪失、急性壊死性脳脊髄炎、および進行性壊死性ミエロパシーからなる群より選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記中和剤が、前記損傷の１時間以内に投与される、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記抗体またはそのフラグメントが、前記損傷の１時間以内に投与される、項目７に記載の方法。
（項目１５）
前記抗体またはそのフラグメントが、前記状態の診断の１日以内に投与され、そして該投与が、さらに２５日間まで毎日繰り返される、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記中和剤が、少なくとも損傷の２５日後まで毎日投与される、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記抗体またはそのフラグメントが、少なくとも損傷の２５日後まで毎日投与される、請
求項７に記載の方法。
（項目１８）
被験体における中枢神経系損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法であって、該方法は、細胞内の１０ｋＤａのインターフェロン誘導性タンパク質（ＣＸＣＬ１０）の量を減少させ得るポリヌクレオチド剤の有効量を、それらを必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１９）
前記薬剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムからなる群より選択され、ここで、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムはＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
被験体における病理学的中枢神経系状態に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法であって、該方法は、細胞内の１０ｋＤａのインターフェロン誘導性タンパク質（ＣＸＣＬ１０）の量を減少させ得るポリヌクレオチド剤の有効量を、それらを必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目２１）
前記薬剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムからなる群より選択され、ここで、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムはＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記薬剤が、該薬剤によって血液脳関門の浸透を増進し得るリポソームを含有する組成物で投与される、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記抗体またはそのフラグメントが、該抗体またはそのフラグメントによって血液脳関門の浸透を増進し得るリポソームを含む組成物で投与される、項目７に記載の方法。
（項目２４）
前記抗体またはそのフラグメントが、該抗体またはそのフラグメントによって血液脳関門の浸透を増進し得るリポソームを含む組成物で投与される、項目１０に記載の方法。
（項目２５）
前記抗体またはそのフラグメントが、該抗体またはそのフラグメントによって血液脳関門の浸透を増進し得るリポソームを含む組成物で投与される、項目１８に記載の方法。
（項目２６）
前記抗体またはそのフラグメントが、該抗体またはそのフラグメントによって血液脳関門の浸透を増進し得るリポソームを含む組成物で投与される、項目２０に記載の方法。
（項目２７）
中枢神経系損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させるのに使用するための組成物であって、該組成物は、ＣＸＣＬ１０中和剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
（項目２８）
中枢神経系損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法において使用するための、ＣＸＣＬ１０中和剤および指示書を備える、キット。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ＣＮＳ損傷に関連する二次的な組織変性を有するか、またはそれを発症する危険性のある被験体に、１０ｋＤａのインターフェロン誘導性タンパク質（ＣＸＣＬ１０）に特異的な中和剤の治療有効量を投与することによって、被験体における中枢神経系（ＣＮＳ）損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法を提供する。本発明の方法は、脊髄損傷および脳損傷の両方の処置のために有用である。
【００１０】
さらなる局面において、本発明は、被験体におけるＣＮＳ損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法を提供し、この方法は、ＣＮＳ損傷に関連する二次的な組織変性を有する被験体に、１０ｋＤａのインターフェロン誘導性タンパク質（ＣＸＣＬ１０）に特異的な中和剤の有効量を投与する工程を包含する。
【００１１】
特定の実施形態において、この被験体は哺乳動物である。他の実施形態において、この方法の被験体はヒトである。なおさらなる実施形態において、ＣＮＳ損傷は、脊髄損傷、脳損傷、またはその両方のいずれかである。
【００１２】
なおさらなる実施形態において、中和剤は抗ＣＸＣＬ１０抗体、抗ＣＸＣＬ１０抗体に対応するフラグメント、ＣＸＣＬ１０に対して特異的な低分子またはポリペプチドである。
【００１３】
本発明のさらなる局面は、被験体におけるＣＮＳ損傷に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法を提供し、この方法は、１０ｋＤａのインターフェロン誘導性タンパク質（ＣＸＣＬ１０）に特異的に結合し得る、抗体またはそのフラグメントの有効量を、重篤な二次的な組織変性の減少を必要とする被験体に投与する工程を包含する。
【００１４】
本発明の特定の実施形態において、ＣＮＳ損傷は、機械的損傷、脊髄挫傷、脊髄の圧迫損傷、脊髄の裂傷、脊髄の分断、または脱髄状態によって生じるか、または誘導される。１つの実施形態において、この脱髄状態は多発性硬化症である。
【００１５】
被験体における病理学的ＣＮＳ状態に関連する、重篤な二次的な組織変性を減少させる方法もまた、本発明によって提供され、この方法は、１０ｋＤａのインターフェロン誘導性タンパク質（ＣＸＣＬ１０）に特異的に結合し得る抗体またはそのフラグメントの有効量を、重篤な二次的な組織変性の減少を必要とする被験体に投与する工程を包含する。
【００１６】
特定の実施形態において、病理学的状態は、ミエリン喪失である。他の実施形態において、ミエリン喪失は、急性播種性脳脊髄炎、感染後ミエリン喪失、ワクチン後ミエリン喪失、急性壊死性脳脊髄炎、または進行性壊死性ミエロパシーに起因する。
【００１７】
さらなる実施形態では、本発明の中和剤が、損傷の少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、または８時間以内に投与される。なおさらなる実施形態では、中和剤は、損傷または診断の１２時間、１８時間、または２４時間以内に投与される。他の実施形態では、中和剤は、抗体または抗体フラグメントである。なおさらなる実施形態では、中和剤は、単独または抗炎症剤のようなさらなる薬剤と組合わせて投与され、そして投与は、少なくとも１回、および他の実施形態では、何日か繰り返して生じる。１つの実施形態では、日数は、１０日まで、１５日まで、２０日まで、２５日まで、または、少なくとも３０日まである。
【００１８】
本発明により提供されるものはまた、被験体におけるＣＮＳ損傷と関連する二次的な組織変性の重篤度を低下させる方法であり、この方法は、それを必要とする被験体に、細胞中の１０ｋＤａのインターフェロン誘導タンパク質（ＣＸＣＬ１０）の量を低下させ得るポリヌクレオチド剤の有効量を投与する工程を包含する。
【００１９】
種々の実施形態では、ポリヌクレオチド剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムであり得、ここで、このアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムは、ＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する。
【００２０】
なおさらなる局面では、本発明は、被験体における病理学的なＣＮＳ状態に関係する二次的な組織変性の重篤度を低下させる方法を提供し、この方法は、それを必要とする被験体に、細胞中の１０ｋＤａのインターフェロン誘導タンパク質（ＣＸＣＬ１０）の量を低下させ得るポリヌクレオチド剤の有効量を投与する工程を包含する。
【００２１】
特定の実施形態では、薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムであり得、ここで、このアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムは、ＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する。
【００２２】
なおさらなる実施形態では、本発明の中和剤は、血液脳関門の透過を増大し得る組成物（例えば、リポソーム）中で投与され得る。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、１０ｋＤＡのインターフェロン誘導性タンパク質（ＣＸＣＬ１０）を特定の中和剤を用いて中和することにより、脊髄損傷および脳損傷を含む、ＣＮＳ損傷を処置および／または軽減する方法に関する。本発明はまた、ＣＮＳ損傷または外傷と関連する二次的な組織変性を逆転させる方法、ならびに特定の中和剤を用いて１０ｋＤＡのインターフェロン誘導性タンパク質（ＣＸＣＬ１０）を中和することにより、神経細胞再生および再ミエリン化を促進する方法を提供する。
【００２４】
ＣＸＣＬ１０の中和は、ＣＮＳ損傷についての有意な処置オプションを提示する。なぜならば、これは、ＣＮＳ損傷または外傷後の組織損失と関連する神経学的変性の原因である、Ｔ細胞浸潤の程度を低下させるからである。ＣＸＣＬ１０の中和は、ＣＮＳ損傷または外傷に関連する二次的な変性の単なる症状よりもむしろ原因を標的とする。
【００２５】
ＣＮＳは、軸索と呼ばれる長い神経繊維により特徴付けられる、神経細胞、すなわち、ニューロン、を含む。脊髄中の軸索は、下行性の経路に沿って、脳から下向きに、および上行性の経路に沿って、脳に対して上向きにシグナルを運ぶ。これらの経路中の多くの軸索は、ミエリンと呼ばれる絶縁物質の鞘により覆われており、このミエリンは、白っぽい外観を与える；従って、これらがある領域は「白質」と呼ばれる。神経細胞自体は、他の神経細胞からシグナルを受容する樹状突起とよばれる木様の枝を有し、「灰白質」を構成する。灰白質は、脊髄の中心の蝶型の領域にある。脳および脊髄の両方は、３つの膜（髄膜）で囲まれている：軟膜、最も内側の層；クモ膜、繊細な中間層；および硬膜（これは強い外側の層である）。
【００２６】
脊髄は、その長さに沿ってセグメントへと組織化される。各セグメントからの神経は、身体の特定の領域に接続する。首のセグメント、すなわち、Ｃ１〜Ｃ８といわれる、頸部領域は、首、腕、および手へのシグナルを制御する。Ｔ１〜Ｔ１２といわれる、胸領域または上部背領域内のセグメントは、胴および腕のいくつかの部分へとシグナルをリレーする。Ｌ１〜Ｌ５といわれる、上腰領域または肋骨直下の中部背領域内のセグメントは、臀
部および肢へのシグナルを制御する。最後に、Ｓ１〜Ｓ５といわれる、仙骨セグメントは、中背内の腰セグメントの直ぐ下にあり、そして鼠径部、足指、および肢のいくつかの部分へのシグナルを制御する。異なるセグメントでの脊髄損傷の影響は、この構成を反映する。
【００２７】
いくつかの型の細胞が、ＣＮＳ機能を実行する。大きな運動神経は、首、胴、および肢内の骨格筋を制御する長い軸索を有する。脊髄神経節細胞と呼ばれる感覚神経（その軸索は、身体から脊髄へと情報を運ぶ神経を形成する）は、脊髄の直ぐ外側に見出される。脊髄の完全に中にある、脊髄の介在ニューロンは、感覚情報を統合し、そして筋肉を制御する協調シグナルを生じるのに役立つ。グリア、すなわち、支持細胞、は、脳および脊髄中のニューロンよりも数が多く、そして種々の機能を行う。グリア細胞の１つの型である、稀突起神経膠細胞は、軸索を絶縁し、そして神経シグナル伝達の速度および信頼性を高めるミエリン鞘を作る。他のグリアは、車輪のリムおよびスポーク様の脊髄を封入し、上行性神経線維管および下行性神経線維管についての区画を提供する。星状細胞（大きな星型のグリア細胞）は、神経細胞を取り囲む流体の組成を調節する。これらの細胞のいくつかはまた、損傷後の瘢痕組織を形成する。ミクログリアと呼ばれるより小さな細胞もまた、損傷に応答して活性化され、そして老廃物を片付ける助けとなる。これらのグリア細胞の全ては、ニューロン生存を支持しそして軸索成長に影響する物質を、生成する。
【００２８】
脳および脊髄は、これらを保護する骨腔（ｂｏｎｙ  ｃａｖｉｔｙ）内に閉じ込められるが、またこれらを、膨潤または激しい損傷により引き起こされる圧迫損傷に対して脆弱にもする。ＣＮＳの細胞は、非常に高い代謝速度を有し、そしてエネルギーについて血糖に依存する。健常な血流が正常な機能に必要とされる最低限を割る範囲は、他の組織においてよりも、ＣＮＳにおいてずっと小さいので、ＣＮＳ細胞は、虚血に対して特に脆弱である。ＣＮＳの他の固有に特徴は、「血液脳関門」および「血液脊髄関門」であり、これらは、ＣＮＳ内の血管を裏打つ細胞により形成され、そして潜在的に有害な物質および免疫系の細胞の進入を制限することにより、神経細胞を保護するように働く。外傷は、これらの関門を傷つけて、脳および脊髄におけるさらなる損傷を与える。
【００２９】
本明細書中で用いられる場合、用語「中枢神経系損傷」および「ＣＮＳ損傷」とは、損傷または病巣の部位での炎症性応答により特徴付けられる脊髄および／もしくは脳の損傷または状態をいうことが意図される。中枢神経系損傷は、一般的に、主に機械的損傷を伴うが、病理学的状態のような非外傷性事象により引起される病巣を包含する。ＣＮＳの損傷としては、脊髄の挫傷により引起される打撲傷、および脊髄に対する圧力により引起される圧迫損傷が挙げられる。脊髄損傷の他の型としては、断裂、分離、および脊髄中心症候群が挙げられ、これらは索の頚（首）領域に影響し、そして脳と脊髄との間のシグナルを運ぶ皮質脊髄路と呼ばれる神経線維の群に対する集中的な損傷から生じる。ＣＮＳ損傷または病巣は、ＣＮＳの１つ以上の細胞型または組織（ニューロン、グリア細胞およびミエリンを含む）に影響し得る。ＣＮＳの状態としては、多発性硬化症（ＭＳ）を含む脱髄状態が挙げられ、ここで、脱髄が脳および脊髄の白質で生じる。脱髄および局所的炎症は、多発性硬化症を含む、ＣＮＳの脊髄損傷および脱髄状態に共通し、そしてミエリン破壊の結果としてミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に特異的なＴ細胞の流入が、脊髄損傷および多発性硬化症の両方で実証されている。
【００３０】
脱髄疾患または脱髄状態は、これらが生じる頻度、およびこれらが引き起こす障害に起因して、神経学的障害の重要な群である。脱髄疾患は、炎症性応答により伴われ得るミエリン鞘の限局的破壊または斑状の（ｐａｔｃｈｙ）破壊という共通点を有する。ミエリンの損失はまた、他の状態、例えば、ミエリン代謝において遺伝的に決定される欠損において、および稀突起神経膠細胞またはシュワン細胞の毒素曝露および感染の結果として生じる。ＣＮＳの脱髄疾患としては、例えば、ＭＳ、感染後脳脊髄炎およびワクチン後脳脊髄
炎を含む急性の播種性脳脊髄炎（ＡＤＥ）、急性の壊死性出血性脳脊髄炎、および進行性（壊死性）のミエロパシーが挙げられる。
【００３１】
ＣＮＳに対する損傷は、ＤｕｓａｒｔおよびＳｃｈｗａｂ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，６（５）：７１２−７２４（１９９４）およびＳｃｈｎｅｌｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１１（１０）：３６４８−３４５８（１９９９）に記載されるように、ＣＮＳ実質に対する炎症細胞の流入を生じる。初期応答は、好中球により支配され、これは、損傷の１日後に最高になり、そして血液脳関門の崩壊、および血管内皮に対する細胞接着分子のアップレギュレーションを伴う。好中球は、細胞特性および殺菌特性を表し、そして微生物侵入者および微生物の残骸の除去のために重要である（Ｃｌａｒｋ，Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｃｌｉｎ．，１１（４）：６４７−６６（１９９４））。活性化した好中球は、以下により記載されるような、プロテアーゼ、サイトカイン、ケモカイン、およびフリーラジカルを含む、種々の炎症誘導性分子を生じる：Ｃａｓｓａｔｅｌｌａ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１６（１）：２１−２６  １９９４）；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，（６）：３２７−３３６（１９９５）；ＣｏｎｎｅｒおよびＧｒｉｓｈａｍ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １２（４）：２７４−２７７（１９９６）；これらの各々は、本明細書中で参考として援用される。これらの分子の放出は、以下により記載されるように、他の炎症細胞の漸増および活性化、ならびに神経損傷およびグリア細胞活性化に寄与する：Ｙｏｎｇ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ａｓｔｏｇｌｉｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＣＮＳ  ｔｒａｕｍａ，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＣＮＳ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｄｅｆｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９６）。血液由来のマクロファージおよび活性化したレジデントＣＮＳ小グリアは、損傷の２日後に始まる炎症応答に寄与し、そしてリンパ球を浸潤することを伴う。これらの細胞型についての化学誘引物質は、脊髄損傷の数時間以内にアップレギュレートされ、そして大脳の内皮に対する細胞の接着に必要とされる接着分子は、損傷後にアップレギュレートされる：ＢａｒｔｈｏｌｄｉおよびＳｃｈｗａｂ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９（７）：１４２２−１４３８  １９９７；Ｈａｍａｄａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６６（４）：１５２５−１５３１（１９９６）。ＣＸＣＬ１０（Ｔ細胞を誘因するＣＸＣケモカイン）およびＭＩＰ−１ａ（マクロファージを誘因するＣＣケモカイン）の発現は、脊髄損傷の数時間以内にアップレギュレートされることが示されている（Ｂａｒｔｈｏｌｄｉ，上述，１９９７；およびＭｃＴｉｇｕｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５３（３）：３６８−３７６（１９９８）を参照のこと）。
【００３２】
ＣＮＳ損傷に関して本明細書中で用いられる場合、用語「二次的な組織変性」とは、ＣＮＳに対する初期の外傷または病巣による、損害を受けていない、またはわずかに損傷を受けた、隣接する細胞および組織の二次的な損失をいう。この二次的な組織変性は、損傷または病巣の部位に存在する任意の細胞型（ニューロンおよびグリア細胞を含む）、ならびに組織（神経繊維および脈管構造を取り囲むミエリン組織を含む）に影響し得る。二次的な組織変性は、一般的に、炎症ならびに細胞型および組織の広範なアレイに対する特異性を有するＴ細胞のＣＸＣＬ１０が媒介するＴ細胞の漸増に関連する。ＣＮＳ損傷または外傷の後にＣＸＣＬ１０により媒介される二次的な組織変性はまた、血液脳関門破壊、水腫、脱髄、軸策損傷および神経の死（これらは、電圧依存チャンネルまたはアンタゴニストゲートチャンネルの活性化により先導され得る）、イオンリーク、カルシウム依存酵素（例えば、プロテアーゼ、リパーゼおよびヌクレアーゼ）の活性化、ミトコンドリア機能障害およびエネルギー枯渇、細胞死になることを引き起こす（Ｙｏｌｅｓら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３３（１３）：３５８６−３５９１（１９９２）；ＺｉｖｉｎおよびＣｈｏｉ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２６５（１）：５６−６３（１９９３）；Ｈｏｖｄａら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６７（１）：１−１０（１９９１）；Ｙｏｓｈｉｎｏら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓａｒｃｈ  ５
６１（１）：１０６−１１９（１９９１））（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。ＣＮＳ損傷または外傷後の二次的な組織変性と関連するＣＸＣＬ１０が媒介する神経細胞死としては、壊死、アポトーシス、パラトーシス（ｐａｒａｐｔｏｓｉｓ）または細胞死の任意のさらなる形態（例えば、筋萎縮性側索硬化症のトランスジェニックマウスモデルに記載されている（ＣａｎｔｏおよびＧｕｒｎｅｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １４５：１２７１−１２７９（１９９４）（これは、本明細書中で参考として援用される））ような、神経変性細胞死）を含む、任意の機構による死が挙げられ得る。
【００３３】
炎症は、ＣＮＳ損傷と関連する二次的な組織変性に寄与する（ＤｕｓａｒｔおよびＳｃｈｗａｂ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６（５）：７１２−７２４（１９９４）；Ｂｌｉｇｈｔ，Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｔｒａｕｍａ  ２（４）：２９９−３１５（１９８５）；Ｅｇｅｒｔｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１（１０）：３５３３−４０（１９９２）；Ｐｏｐｏｖｉｃｈら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３７７（３）：４４３−４６４（１９９７）、これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。炎症に対する首尾良い宿主応答は、一般的に、組織損傷の部位で分化した宿主細胞の蓄積を必要とする。損傷したＣＮＳにおける炎症は、流体蓄積、ならびに血漿タンパク質、好中球、Ｔリンパ球、およびマクロファージの流入により特徴付けられる。この細胞蓄積は、正常な炎症プロセスにおける重要な行程であり、そして共通の重要な構造的特性を有する、分泌型走化性サイトカインのファミリーにより媒介され、そして病原性の炎症における役割である。ＣＸＣＬ１０は、ケモカインとして公知である、４０を超える構造的および機能的に関連したタンパク質の、このタンパク質ファミリーに属する。
【００３４】
ケモカインは、２つのシステイン対を含む保存された構造モチーフを有する、８〜１０ｋＤａのヘパリン結合タンパク質に類似し、そして成熟タンパク質中のシステイン残基の相対的位置に基づいてサブファミリーに分けられる。ケモカインの少なくとも４つのサブファミリーが存在するが、２つ（α−ケモカインおよびβ−ケモカイン）のみが、十分に特徴付けられている。α−ケモカインにおいて、最初の２つのシステイン残基が、単一のアミノ酸により隔てられており（ＣＸＣ）、一方、β−ケモカインにおいて、最初の２つのシステイン残基は、互いに隣接している（ＣＣ）。Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインとしては、例えば、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ヒト血小板由来因子、ＣＸＣＬ１０およびＭｉｇが挙げられる。Ｃ−Ｃケモカインサブファミリーのメンバーとしては、例えば、マクロファージ化学誘引物質および活性化因子（ＭＣＡＦ）、マクロファージ炎症タンパク質−１α（ＭＩＰ−α）、マクロファージ炎症タンパク質−１β（ＭＩＰ−β）ならびにｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ（ＲＡＮＴＥＳ）が挙げられる。
【００３５】
ケモカインは、白血球のサブセットを選択的に誘引し；いくつかのケモカインは、好酸球に対して特異的に作用し、他のものは、単球、樹状細胞またはＴ細胞に対して特異的に作用する（Ｌｕｓｔｅｒ，Ａ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３８：４３６−４４５（１９９８）（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。概して、ＣＣケモカインは単球、好酸球、好塩基球、およびＴ細胞を化学誘引し；そしてそのケモカインレセプターであるＣＣＲ１〜ＣＣＲ９を介してシグナル伝達を行う。このＣＸＣケモカインファミリーは、ＣＸＣ配列の前のＮ末端付近にあるＥＬＲ配列（Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ）の存在または非存在に基づいてさらに２つのクラスに分類され得る。そのＥＬＲ含有ＣＸＣケモカイン（ＩＬ−８を含む）は、好中球を化学誘引し、その一方で、非ＥＬＲ  ＣＸＣケモカイン（ＣＸＣＬ１０およびＭｉｇを含む）は、リンパ球を化学誘引する。
【００３６】
ケモカインは、少なくともの２つの方法、すなわち第１に、直接的な化学誘引を介して
、そして、第２に、標的細胞上の特定のＧタンパク質共役細胞表面レセプターに結合することによって、細胞移動および細胞活性化を誘導する。１０を超える別個のケモカインレセプター（各々は、異なるサブセットの白血球上で発現されている）が、同定されている。ケモカインレセプターは、いくつかの細胞上で構成的に発現されており、その一方で、それらのケモカインレセプターは、他の細胞上では誘導性である。ＣＸＣＲ３（ＣＸＣＬ１０によって認識されているレセプター）は、Ｔヘルパー型１（Ｔｈ  １）表現型の活性化Ｔリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現されている。重要なことに、二次的な組織変性に関連する神経炎症の病理における主要な機構は、損傷または病巣である部位に対する活性Ｔ細胞の移動である。
【００３７】
本明細書において使用される場合、１０ｋＤａのインターフェロン誘導性タンパク質（ＣＸＣＬ１０）を参照する際に使用される場合の用語「有効量」は、ＣＮＳ損傷に関連する二次的な組織変性の重篤度を軽減するのに十分な、ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤の量を意味することが意図される。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「重篤度の低減」とは、ＣＮＳ損傷に関連する二次的な組織変性の、徴候または症状、生理学的指標、生化学的マーカーまたは代謝指標の、停止、減少または逆転をいうことが意図される。脊髄損傷において、脳から胴および四肢に対する運動の信号を伝える神経線維の破壊は、筋肉麻痺を導く。ＣＮＳ損傷に関わる二次組織損傷の生理学的症状としては、例えば、神経学的欠陥および神経性炎症が挙げられ、そして、臨床性症状は、その損傷の重篤度、損傷が存在する脊髄のセグメントおよび神経線維が損傷をうけている脊髄のセグメントに依存して劇的に変化する。感覚神経線維の破壊によって、感覚（例えば、触覚、圧力および温度）喪失を導き得；それはまた、時折、疼痛を生じる。他の重篤な結果としては、過度の反射；膀胱および腸の制御の喪失；性機能不全；呼吸能力の喪失または低下；咳反射の欠陥；および痙性が挙げられる。脊髄損傷を有する殆どの人は、損傷後１週間から６ヶ月の間でいくつかの機能は回復するが、自発的な回復の可能性は、６ヶ月を超えるとほとんどなくなる。脊髄損傷は、多くの臨床的合併症（床ずれを含む）、呼吸系疾患および自律神経反射欠陥（ａｕｔｏｎｏｍｉｃ  ｄｙｓｒｅｆｌｅｘｉａ）、血圧を上昇させ、発汗させる潜在性致命的疾患、ならびに腸の埋伏（ｉｍｐａｃｔｉｏｎ）またはいくつかの他の刺激に反応する他の自律神経性反射に対する増大した感受性を導き得る。
【００３９】
ＣＮＳ損傷に関わる二次的な組織変性の生理学的指標としては、血液脳関門破壊、水腫、脱髄、軸索損傷および神経死ならびに組織喪失が挙げられる。ＣＮＳ損傷に関わる二次的な組織変性の生物化学的マーカーは、例えば、神経細胞マーカー、ミエリン、γグロブリンまたはオリゴクローナルバンディングを生じる特異的な分子である。二次的な組織変性に関連するＣＮＳ組織喪失は、当該分野で公知の種々の臨床的方法によって検出され得る。神経細胞性マーカー（例えば、ＮｅｕＮ）は、ＣＮＳでの組織喪失を可視化するために使用され得る（Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４４：１１６７−１１７１（１９９６）（これは、本明細書中で参考として援用される）。さらに、誘発電位（ＥＰ）は、どのくらい迅速に神経インパルスが神経系の種々の部分における神経線維にそって伝達するのかを測定するために使用され得、そして、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）がＣＮＳを走査（スキャン）して細胞死または神経線維の脱髄によって引き起こされる組織喪失の領域を検出するために使用され得る。核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）もまた、ＣＮＳを走査するために使用され得るが、Ｘ線の使用はない。ＣＴスキャンよりも高感度である、ＭＲＩは、ＣＴスキャン機器によって観察し得ないＣＮＳ組織喪失の領域を検出し得る。さらに、腰椎穿刺または脊椎穿刺の処置が、脳脊髄液を抽出するために使用され得る。この髄液は、γグロブリンおよびオリゴクローナルバンディングの上昇したレベルについて調べられ得る。当該分野で周知のこれらまたは他の方法が、組織喪失（神経のグリア細胞の死および神経線維の脱髄によって引き起こされる組織喪失
を含む）を測定することによって、ＣＮＳ損傷に関わる二次的な組織変性の重篤度を決定するために使用され得る。
【００４０】
本明細書において使用される場合、用語「１０ｋＤａのインターフェロン誘導性タンパク質（ＣＸＣＬ１０）に特異的な中和剤」は、ＣＸＣＬ１０発現の程度、量または速度の減少を与えるかまたはＣＸＣＬ１０の活性の減少を与える因子をいうことが意図される。特許請求する発明を実施するのに有用な中和剤としては、例えば、ＣＸＣＬ１０に対する抗体のような結合分子が挙げられる。中和剤は、ＣＸＣＬ１０活性を減少するのに十分な親和性でＣＸＣＬ１０に結合する任意の分子であり得る。さらに、中和剤は、調節タンパク質または遺伝子領域の機能を阻害また促進し、そして、ＣＸＣＬ１０発現の程度または量または速度あるいはその活性の減少を与えるための調節分子または遺伝子領域に結合する任意の分子であり得る。例えば、ＣＸＣＬ１０活性を低下させるのに十分な親和性でＣＸＣＬ１０に結合するＣＸＣＲ３レセプターのフラグメントまたはペプチド模倣物は、特許請求している方法を実施するのに有用である。さらに、ＣＸＣＬ１０発現の減少を与える中和剤の例としては、アンチセンス核酸および転写インヒビターが挙げられ得る。
【００４１】
本発明は、ＣＮＳ損傷に関わる二次組織損傷の重篤度を低減する方法を提供する。本方法は、有効量の１０ｋＤａのインターフェロン誘導性タンパク質に特異的な中和剤（ＣＸＣＬ１０）を、ＣＮＳ損傷に関わる二次的な組織変性を有する被験体に投与する工程を包含する。
【００４２】
本明細書中に記載されるように、ＣＸＣＬ１０は、神経系の炎症に対する宿主防御を与える工程に関与する。具体的には、ＣＸＣＬ１０は、ＣＮＳ損傷、ＣＮＳ炎症、生理学的異常（例えば、感染因子または自己免疫細胞（ａｕｔｏａｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ））に応答してＣＮＳへのＴｈ１  Ｔリンパ球の輸送を調整する。Ｔリンパ球は、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞として知られている２つの主要なカテゴリーに細分され得る。ＣＤ４およびＣＤ８は、抗原に対するＴ細胞レセプターと抗原提示細胞によってＴ細胞に対して提示に対して提示されている抗原自体との間の相互作用を促進する表面タンパク質である。Ｔ細胞によって認識される抗原は、抗原提示細胞の表面に発現されている主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質のクレフト中に含まれる。ＣＤ４細胞は、クラスＩＩの組織適合性対立遺伝子によって提示されるペプチドフラグメントを認識し、ＣＤ８細胞は、クラスＩの組織適合性対立遺伝子によって提示されるフラグメントを認識する。ＤＲ２対立遺伝子は、多発性硬化症において過剰に提示される、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子であって、このことは、ＣＮＳにおける損傷形成におけるＣＤ４＋細胞に対する役割を示す。
【００４３】
ＣＤ４＋細胞は、Ｔｈ１サブタイプおよびＴｈ２サブタイプにさらに細分され得る。Ｔｈｌ細胞は、遅延型過敏性応答の原因となりかつ多くのサイトカイン（Ｔ細胞増殖の刺激因子であるインターロイキン２（ＩＬ−２）、およびマクロファージの活性化因子であるインターフェロン、および希突起神経膠細胞（ＣＮＳのミエリン形成細胞）に損傷を与える能力を有すタンパク質であるリンホトキシンを分泌する。インターフェロンは、ＩＬ−２と合わさって、ミエリンを神経線維から直接剥ぎ取るマクロファージを活性化し、そして、ミエリン形成性の希突起神経膠細胞に損傷させるサイトカインである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）を分泌する。
【００４４】
本明細書中に記載されるように、損傷部位または病巣（損傷）（図１）の中またはその周辺でＣＮＳ損傷後に発現されるＣＸＣＬ１０の中和によって、その損傷部位および周辺組織での組織喪失を介してそれ自体を露見させる（ｍａｎｉｆｅｓｔ）二次的な組織変性を減少させる（図３）。その結果、ＣＸＣＬ１０活性を中和することは、ＣＮＳ損傷に関わる二次的な組織変性の重篤度の低減を導き得る。ＣＸＣＬ１０中和剤（以下に記載の方
法によって同定される、抗体、アンチセンス核酸または他の化合物を含む）は、ＣＮＳ損傷に関わる二次組織損傷の重篤度を処置または低減するのに有用である。
【００４５】
ＣＸＣＬ１０中和剤の投与は、二次的な組織変性に関連する種々の別個のＣＸＣＬ１０媒介性破壊事象（例えば、電位依存性チャネルまたはアゴニストゲートチャネルの活性化、イオン漏洩、カルシウム依存性酵素（例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、おおよびヌクレアーゼ）の活性化、炎症、ミトコンドリア機能不全およびエネルギー涸渇、細胞死の完結（ｃｕｌｍｉｎａｔｉｎｇ）を含む）を標的化する。ＣＸＣＬ１０特異的中和剤の投与によって、単一の局面の二次的な組織変性というよりもこれらの別個のＣＸＣＬ１０媒介性事象の各々を標的化および処置することによって治療的改善を提示する、二次変性の重篤度を低減する増強された方法が提供する。
【００４６】
さらに、ＣＸＣＬ１０が二次的な組織変性に対するこのような劇的な効果を有するという予想外の知見に加え、驚くべき知見は、損傷が停止し得るだけでなく、ＣＸＣＬ１０中和剤がまた、ミエリンの再増殖を促進し、それによって、神経再形成および髄鞘再形成を誘導することである。従って、本発明はまた、１０ｋＤａのインターフェロン誘導性タンパク質（ＣＸＣＬ１０）を特異的な中和剤を使用して中和することによって、ＣＮＳ損傷に関わる二次的な組織変性または外傷を回復する方法ならびに神経細胞の再形成および髄鞘再形成を促進する方法を提供する。
【００４７】
成体哺乳動物の脊髄に対する機械的損傷によって、血管浸透性の上昇、ならびに炎症細胞の広範な活性化ならびに漸増を生じる（Ｄｕｓａｒｔ，ＩおよびＭ．Ｅ．Ｓｃｈｗａｂ（１９９４），「Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｄｏｒｓａｌ  ｈｅｍｉｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ６（５）：７１２−２４）（Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｌ．，Ｓ．Ｆｅａｒｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９），「Ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ
ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＮＳ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ」，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １１（１０）：３６４８−５８）。脊髄損傷に対するこの強い炎症応答の制御および結果は、十分には知られていない。神経免疫相互作用の十分な理解が多発性硬化症の研究の分野において見出され得、ここで、これは、多発性硬化症のＭＨＶモデルにおける脱髄の病理に対するＴリンパ球応答の減衰が異常組織発生および挙動欠陥を減少させることを近年、実証した（Ｌｉｕ，Ｍ．Ｔ．，Ｈ．Ｓ．Ｋｅｉｒｓｔｅａｄ，ｅｔ
ａｌ．（２００１），「Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｃｘｃ１１０  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｖｉｒａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７（７）：４０９１−７）。脊髄損傷の部位においてＴリンパ球が優勢であり（ＭｃＴｉｇｕｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｍ．Ｔａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８），「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ
ｍＲＮＡ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ａｆｔｅｒ  ｃｏｎｔｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ」，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ
５３（３）：３６８−７６）、そして、最近の研究によって、これらが脊髄外傷の構造上かつ機能上の結果における中心的な役割を担っていることを示唆されており（Ｈａｕｂｅｎ，Ｅ．，Ｏ．Ｂｕｔｏｖｓｋｙら（２０００），「Ｐａｓｓｉｖｅ  ｏｒ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍｙｅｌｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｃｏｎｔｕｓｉｏｎ」，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２０（１７）：６４２１−３０）（Ｈａｕｂｅｎ，Ｅ．，Ｕ．Ｎｅｖｏら（２０００），「Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａ
ｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ」，Ｌａｎｃｅｔ  ３５５（９２００）：２８６−７）、脊髄損傷部位にＴリンパ球をリクルートメントすることを阻害する結果がさらに調べられた。Ｔリンパ球化学誘引剤ＣＸＣＬ１０に対する抗体を機能的にブロックし得ること（Ｌｉｕ，Ｍ．Ｔ．，Ｈ．Ｓ．Ｋｅｉｒｓｔｅａｄら（２００１），「Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｃｘｃ１１０  ｒｅｄｕｃｅｓ
ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ
ｉｎ  ａ  ｖｉｒａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７（７）：４０９１−７）が、脊髄外傷の部位に対するＴリンパ球の補充におけるこのケモカインの役割、および外傷後の異常組織発生および挙動欠陥に対するＴリンパ球の寄与を試験する機会を提供した。本明細書中のデータによって、ＣＸＣＬ１０が成体哺乳動物の脊髄損傷後にアップレギュレートされた（図１）こと、および損傷動物におけるＣＸＣＬ１０の抗体媒介性中和は、脊髄損傷後に通常は発生する劇的なＴリンパ球浸潤を減少したこと（図５）を明瞭に実証した。これらのデータは、樹立されたウイルス誘導性脱髄を有するマウスに対する抗ＣＸＣＬ１０抗血清のＣＮＳへの投与がＣＤ４＋  Ｔリンパ球浸潤を有意に減少し、そしてＴＨ１関連プロ炎症性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインＩＦＮ−ｇの発現を減少させる（Ｌｉｕ，Ｍ．Ｔ．，Ｈ．Ｓ．Ｋｅｉｒｓｔｅａｄら（２００１），「Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｃｘｃ１１０  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｖｉｒａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ
１６７（７）：４０９１−７）という本発明者らの最近の実証を確定付けた。抗ＣＸＣＬ１０処置後の脊髄損傷部位に対するＴリンパ球の浸潤の減衰は、脊髄損傷の間のＣＸＣＬ１０が特に重要なＴリンパ球化学誘引剤であり、ＣＸＣＲ３レセプターの発現（Ｒｏｌｌｉｎｓ，Ｂ．Ｊ．（１９９７），「Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ」，Ｂｌｏｏｄ  ９０（３）：９０９−２８）と矛盾しないという強力な証拠を提供する（Ｌｕｓｔｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｊ．Ｃ．Ｕｎｋｅｌｅｓｓら（１９８５），「Ｇａｍｍａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ａｎ  ｅａｒｌｙ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｐｌａｔｅｌｅｔ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５（６０２１）：６７２−６）。
【００４８】
重要でありかつ予測不可能であるのは、本明細書中で開示されるデータは、抗ＣＸＣＬ１０処置単独が、外傷の後組織変性および損傷後の運動性欠陥を低減するのに十分であったことを示している。形態形成分析は、抗ＣＸＣＬ１０処置を受けた半側切除の損傷マウスが、未処置の半切除損傷マウス（図３）と比較して損傷部位の周囲の組織損傷において６８％の減少を有したことを示した。損傷部位の周辺のニューロン細胞数は、抗ＣＸＣＬ１０処置を受けた半切除損傷マウスにおける組織喪失の低減が、未処置の半切除損傷マウスよりも損傷部位の周辺で４３８％を超えるニューロンの存在と関連した。これらのデータは、抗ＣＸＣＬ１０処置は背側半切除後の外傷後組織喪失を有意に減少することを示す。
【００４９】
挙動分析によって、抗ＣＸＣＬ１０処置を受けた半切除損傷マウスが回復期の間で試験した運動学的パラメータの統計学的に有意な連続的な改善を示したことを示した（図２）。損傷後の１４日までに、全部で４つの運動学的パラメータにとっての挙動スコアは、損傷していないコントロールマウスと有意な差異をもたなかった。この回復は、重篤な線維の再構成よりも病巣（損傷）の尾側の感覚運動経路の再構成によって寄与されやすかった。生化学的再構成およびシナプスの再構成が、脊髄損傷後に実証され、そして、機能的改善に対して寄与し得る（Ｅｄｇｅｒｔｏｎ，Ｖ．Ｒ．，Ｒ．Ｄ．Ｌｅｏｎら（２００１）
「Ｒｅｔｒａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ」，Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５３３（Ｐｔ  １）：１５−２２）。損傷した脊髄におけるシナプス形成（ｓｙｎａｐｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関連するデータは殆ど存在しなかったが、脱神経された歯状回の良好に記録されたモデルを使用する定量的電子顕微鏡写真研究によって、実質的に多くの数の新規のシナプスが損傷後１０日までに脱神経されたニューロンにおいて形成される（Ｓｔｅｗａｒｄ，Ｏ．，Ｓ．Ｌ．Ｖｉｎｓａｎｔら（１９８８），「Ｔｈｅ
ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ  ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｎｔａｔｅ
ｇｙｒｕｓ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔｓ：ａｎ  ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ  ｔｅｒｍｉｎａｌｓ  ａｓ  ａ  ｒｅｓｕｌｔ  ｏｆ  ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ」，Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２６７（２）：２０３−１０）ことを示している。現在の研究における挙動の回復の機構は未知であるが、本明細書中で開示されたデータは、抗ＣＸＣＬ１０処置が脊髄損傷後の神経学的欠陥を低減することを明瞭に示している。
【００５０】
損傷したＣＮＳ実質への溢血後の免疫応答についての有害な役割は、多発性硬化症の病因学、および多発性硬化症の動物モデルにおいて見られる疾患状態によって示され、ここで、前炎症性細胞が疾患の発達の中心と見なされる（Ｏｌｓｓｏｎ，Ｔ．（１９９５），「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４５（６  補遺６）：Ｓ１１−５）（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｋｏｏｐｓ，Ｈ．，Ｐ．Ｅ．Ｌｉｐｓｋｙら（１９９５），「Ｅｌｅｖａｔｅｄ  Ｔｈ１−  ｏｒ  Ｔｈ０−ｌｉｋｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−  ＩＣＡＭ−１  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｅｎｅｆｉｔ」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５５（１０）：５０２９−３７））。外傷性の脊髄損傷における免疫応答についての有害な役割は、ケモカイン発現の一時的な関連および二次的な変性を伴う免疫細胞の流入によって示唆される（Ｄｕｓａｒｔ，Ｉ．およびＭ．Ｅ．Ｓｃｈｗａｂ（１９９４）「Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ
ｄｏｒｓａｌ  ｈｅｍｉｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ」Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ６（５）：７１２−２４）（Ｂｌｉｇｈｔ，Ａ．Ｒ．（１９８５）「Ｄｅｌａｙｅｄ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｖａｓｉｏｎ：  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｆｏｒ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ」Ｃｅｎｔ
Ｎｅｒｖ  Ｓｙｓｔ  Ｔｒａｕｍａ  ２（４）：２９９−３１５）（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ，Ｐ．Ｇ．，Ｐ．Ｗｅｉら（１９９７）「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ  ｒａｔｓ」Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ３７７（３）：４４３−６４））。
【００５１】
Ｐｏｐｏｖｉｃｈおよびその協力者らは、クロドロネート（ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ）媒介性の造血性マクロファージ除去が、脊髄損傷後の外傷性組織損失の低下および体制的移動運動（ｏｖｅｒｇｒｏｕｎｄ  ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ）の改善を導くことを、納得のいくように実証している。これらの発見は、著者らに浸潤性免疫細胞が深刻な二次的な変性のエフェクターであると結論付け、そして細胞特異的な免疫喪失が脊髄損傷に対する治療法であることを証明し得ることを示唆するよう導いた。（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ，Ｐ．Ｇ．，Ｐ．Ｗｅｉら（１９９７），「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ  ｒａｔｓ」Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ３７７
（３）：４４３−６４）。実際に、活性化した単球食細胞は、外傷性ＣＮＳ損傷の後に神経毒を放出し（Ｇｉｕｌｉａｎ，Ｄ．，Ｍ．Ｃｏｒｐｕｚら（１９９３），「Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ａｎｄ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ」Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ３６（６）：６８１−９３）、ＮＭＤＡレセプタター媒介性神経毒性を誘導し（Ｐａｉｎｉ，Ｄ．，Ｋ．Ｆｒｅｉ，ら（１９９１）「Ｍｕｒｉｎｅ  ｂｒａｉｎ
ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ＮＭＤＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ」Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  １３３：１５９−１６２）、そして活性化した白血球が、広範な種々の溶解酵素ならびに反応性酸素中間体および反応性窒素中間体を放出する（Ｍａｒｔｉｎｅｙ，Ｊ．Ａ．，Ｃ．Ｃｕｆｆら（１９９８），「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ」Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓ
２３（３）：３４９−５９）。
【００５２】
これらの発見は、抗ＣＸＣＬ１０処置が脊髄損傷の部位に対してＴリンパ球および造血性マクロファージの両方の浸潤の低下を導く（図５）という現在の確証の観点から興味深い。造血性マクロファージはＣＸＣＬ１０に対するＣＸＣＲ３レセプターを発現しないので、これらマクロファージの喪失はＴリンパ球喪失の下流の効果である可能性があり；このことは、活性化ＣＤ４＋  Ｔリンパ球がＲＡＮＴＥＳ（造血性マクロファージについての化学誘引物質）を分泌することを実証することによって、支援される。
【００５３】
ＣＮＳ疾患／外傷の部位内での免疫細胞の調節が複雑であり、そしてこのような部位内での免疫細胞活性化が下流の影響である場合、傷害部位への免疫細胞集団の漸増加（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）を標的化することは、ＣＮＳ傷害（ｉｎｓｕｌｔ）を従える二次的変性カスケードにおける特定の集団の役割を解明し得る。本明細書中に記載される結果は、ＣＮＳ損傷の間にＣＸＣＬ１０発現の機能的重要性についての新規の洞察を提供し、そしてさらにＣＸＣＬ１０に対して特異的な中和剤を用いてＣＮＳを処置する方法のための基礎を提供する。ＣＸＣＬ１０は本明細書中で、脊髄損傷の間の重要な化学誘引物質であることが示されている。本発明によって提供されるようにＣＸＣＬ１０を標的化する治療法は、ＣＮＳ損傷後の外傷後の異常組織発生および行動障害を低減するための、実行可能な処置ストラテジーを表す。
【００５４】
十分な親和性でＣＸＣＬ１０を結合するＣＸＣＬ１０中和剤は、免疫細胞の漸増加、組織喪失または脱髄に関するＣＸＣＬ１０の活性を低減し得る。ＣＸＣＬ１０特異的な中和剤は、高分子（例えば、ポリペプチド、核酸、炭水化物または脂質）であり得る。ＣＸＣＬ１０特異的中和剤はまた、ＣＸＣＬ１０活性がこの中和剤の存在下で低減される限り、誘導化合物、類似化合物または模倣的化合物、ならびに低分子有機化合物であり得る。中和剤のサイズは、ＣＸＣＬ１０に対して、この分子が選択的中和化活性を提示するかまたは選択的中和化を提示するように作製され得る限り、重要ではない。例えば、中和剤は、約１個と６個の間ほどのモノマー構築ブロック、および数１０個または数百個ほどのモノマー構築ブロックであり得、このモノマー構築ブロックは、高分子または化学結合分子を構成する。同様に、有機化合物は、活性を低減するのに十分な親和性でＣＸＣＬ１０に結合する限り、単一構造または複雑な構造であり得る。
【００５５】
ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤としては、例えば、免疫系のポリペプチドを結合する、抗体および他のレセプターまたはリガンドが挙げられ得る。免疫系のこのような他の分子としては、例えば、ＣＤ４細胞レセプターを含むＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）が挙げられる。ＣＸＣＬ１０についての中和剤はまた、ＣＸＣＬ１０とケモカインレセプター（例え
ば、ＣＸＣＲ３レセプター）との相互作用を阻害する分子であり得る。さらに、インテグリン、増殖因子レセプターおよびケモカインレセプターのような細胞表面レセプター、ならびにＣＸＣＬ１０を結合するかまたは活性を低減するのに十分な親和性で結合するように作製され得る、任意の他のレセプターまたはそのフラグメントもまた、本発明の方法を実施するために有用な中和剤である。さらに、例えば、ＣＸＣＬ１０もしくはそのレセプターの発現を阻害するレセプター、増殖因子、サイトカインまたはケモカインもまた、本発明の方法を実施するために有用な中和剤である。さらに、転写因子およびＤＮＡ複製因子のようなＤＮＡ結合性ポリペプチドは、これらがＣＸＣＬ１０に対する選択的な結合活性、ＣＸＣＬ１０の発現もしくは活性を制御する調節分子、またはＣＸＣＬ１０の発現を制御する遺伝子領域を有する限り、用語結合分子の規定内に含まれるようである。最終的に、ランダムライブラリーおよびコンビナトリアルライブラリーより選択されるような、ポリペプチド、核酸および化合物はまた、それら分子が活性を低下させるのに十分な親和性でＣＸＣＬ１０を結合する限り、その用語の規定内に含まれる。
【００５６】
種々のアプローチが、ＣＸＣＬ１０について選択的な中和剤の同定のために使用され得る。例えば、１つのアプローチは、ＣＸＣＬ１０の構造および機能に関して利用可能な情報を使用して、ケモカイン結合分子として機能することが知られる分子から結合性分子集団を作製するか、またはＣＸＣＬ１０に特異的な結合親和性を提示するかもしくは提示し得ることが知られる分子（例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＮＫ細胞上に見出されるＣＸＣＲ３レセプターのフラグメントまたは模倣物）からの結合分子集団を作製する。ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤は、抗体および免疫レパートリーの他の分子であり得る。このような免疫レセプターの通常の機能は、本質的に無限数の異なる抗体およびリガンドを結合することである。従って、免疫レパートリーからの結合分子の多様な集団を作製することは、例えば、ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤を同定するために有用であり得る。
【００５７】
ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤は、さらに、当該分野で周知の方法によって、未知の分子の大規模集団から同定され得る。このような集団は、ペプチドまたは低分子化合物のランダムライブラリーであり得る。この集団を、ＣＸＣＬ１０タンパク質またはそれらのそれぞれの核酸に結合する分子を含有するように、十分多様性な配列または構造を含むよう生成し得る。当業者は、どのサイズおよびどの多様性が意図される目的に必要または十分であるかを認知する。十分なサイズおよび複雑性の集団を、活性を低下させるのに十分な親和性でＣＸＣＬ１０を結合するＣＸＣＬ１０中和剤を高い可能性で含むように生成し得る。ライブラリーの分子集団の多くの他の型が存在し、そして以下にさらに記載される。
【００５８】
ＣＸＣＬ１０にか、ＣＸＣＬ１０レセプターにか、ＣＸＣＬ１０発現を制御する遺伝子領域にか、またはＣＸＣＬ１０の活性もしくは発現を調節する調節分子に結合するいずれかの分子、およびＣＸＣＬ１０レセプターの発現を調節するいずれかの調節分子は、本発明を実施するために有用なＣＸＣＬ１０特異的中和剤である。例えば、ＣＸＣＬ１０特異的中和剤は、ＣＸＣＬ１０の転写を制御するかアップレギュレートする転写因子の活性を低減または阻害することによって、ＣＸＣＬ１０発現に影響する調節分子であり得る。さらに、ＣＸＣＬ１０活性化を低減するのに、十分な親和性でＣＸＣＬ１０の活性化に関与する分子にｚ結合する調節分子は、本発明の方法を実行するために有用な中和剤である。
【００５９】
ＣＸＣＬ１０の活性を低下させるのに十分な親和性でＣＸＣＬ１０に結合し得る中和剤は、ＣＮＳ損傷に関連する二次的な組織変性の重篤度を低減する本願の方法を、ＣＮＳ損傷に関連する二次的な組織変性に罹患した被験体に実施するのに有用である。さらに、ＣＸＣＬ１０特異的中和剤は、ＣＸＣＬ１０レセプターにか、ＣＸＣＬ１０の活性もしくは発現を調節する調節分子にか、またはＣＸＣＬ１０発現を制御する遺伝子領域に結合することによって、ＣＸＣＬ１０の活性または発現を低下させ得る。例えば、本願発明を実施するために有用な中和剤は、ＣＸＣＬ１０の発現または活性を調節する調節分子に対する
抗体であり得る。さらに、本明細書中に記載されるように、抗ＣＸＣＬ１０抗体は、本発明の方法を実施するために有用な中和剤である。さらに、ＣＸＣＬ１０は特異的なＴ細胞レセプターに結合することが公知の分泌タンパク質であるので、本発明の実施に有用な中和剤は、レセプターの免疫グロブリンスーパーファミリーのうちの、いずれかの結合性ポリペプチド、レセプターまたはそのフラグメントであり得る。あるいは、ＣＸＣＬ１０に特異的なさらなる中和剤を同定するためのランダムなペプチド集団の集団を使用することが、所望され得る。当業者は、どの型のアプローチおよびどの型の中和剤が、ＣＮＳ損傷に関連した二次的な組織変性に罹患した被験体において、ＣＮＳ損傷に関連した二次的な組織変性の重篤度を低減するために、本発明の方法を実施するのに適切であるかを、認知するかまたは決定し得る。
【００６０】
ＣＸＣＬ１０特異的中和剤の同定のための中程度のサイズ化された集団は、その集団中で、数百および数千の異なる結合分子からなり得、一方、大規模なサイズ化結合分子集団は、数万および数百万の異なる結合分子種からなる。より具体的には、中和剤の同定のための結合分子の大規模かつ多様性の集団は、任意の約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０以上のいずれかの、異なる結合分子種を含み得る。当業者は、ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤を同定するのに十分な結合分子の集団の適切な多様性を認知する。
【００６１】
結合分子の組換えライブラリーを使用して、ＩＰ−１０に特異的な中和剤を同定し得る。なぜなら、大規模かつ多様性の集団が、ＣＸＣＬ１０を用いて迅速に生成され、そしてスクリーニングされ得るからである。ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤を同定するのに有用な発現ポリペプチドの組換えライブラリーを、当該分野で公知の非常に多くの異なる方法で作製し得る。組換えライブラリー方法は、同様に、天然に存在するレパートリーからの非常に多くの結合分子集団の生成を可能にする。組換えであってもまたはそれ以外であっても、結合分子集団の本質的に任意の供給源を、その供給源が、ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤を同定するために、十分なサイズおよび多様性の異なる結合分子を提供する限り、使用し得る。所望される場合、ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤を同定するのに有用な結合分子の集団を、Ｗａｔｋｉｎｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６（９２）：１６９−１７７（１９９８）（これは本明細書中で参考として援用される）によって記載されたように、固体支持体に選択的に固定化し得る。
【００６２】
溶菌性ファージが細菌によって発現された結合分子ポリペプチドの放出を生じるファージ発現ライブラリーは、ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤を同定するために使用され得る組換えライブラリーの１つの具体例である。別の型のファージ発現ライブラリーにおいて、非常に多くの潜在的結合分子が細菌細胞のペリプラズム表面上に融合ポリペプチドとして発現され得る。酵母および高等真核生物細胞におけるライブラリーもまた存在し、そして同様に本発明の方法に適用可能である。当業者は、どの型のライブラリーがＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤を同定するのに有用であるかを認知するかまたは決定し得る。
【００６３】
ＣＸＣＬ１０を特異的に結合する化合物について、その化合物のライブラリーをスクリーニングするために精製ポリペプチドを利用する上記の方法に加え、ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤を、抗体を生成するための精製ポリペプチドを使用することによって同定し得る。例えば、ＣＸＣＬ１０に特異的である抗体を、本発明の中和剤として使用し得、そして当該分野で周知の方法を使用して生成し得る。本発明の方法を実施するのに有用な中和剤としては、ＣＸＣＬ１０またはＣＸＣＬ１０の活性もしくは発現を調節する任意の分子に対する、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびＦｖフラグメントなどを含有するそのような抗体の抗原結合フラグメントが挙げられる。さらに、本発明の方法を実施するのに有用な中和剤は、例えば、単鎖抗体、キメラ抗体、二機能性抗体、相補性決定領域移植化（ＣＤＲ移植化）抗体およ
びヒト化抗体、ならびにそれらの抗原結合フラグメントを含む、天然には存在しない抗体を包含する。
【００６４】
ペプチド免疫原を使用して、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含めた抗体を調製および単離する方法は、当業者に周知であり、そして例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）（これは本明細書中で参考として援用される）によって記載される。天然に存在しない抗体を、固相ペプチド合成を使用して構築し得るか、組換え的に生成し得るか、または例えばＨｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）（これは本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって獲得し得る。例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植化抗体、単鎖抗体および二機能性抗体を作製する、これらおよび他の方法は、当業者に周知である（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９６年１０月１５日に発行された米国特許第５，５６４，３３２号；ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４：２４３−２４６（１９９３）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、１９８８）；Ｈｉｌｙａｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２）；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；それらの各々が本明細書中に参考として援用される）。
【００６５】
ＣＸＣＬ１０特異的中和剤を、天然供給源から調製され得るかもしくは組換え的に生成され得る、実質的に精製されたＣＸＣＬ１０タンパク質、または合成ペプチドを含むＣＸＣＬ１０タンパク質のペプチド部分を、免疫原として使用して惹起し得る。ＣＸＣＬ１０タンパク質の非免疫原性ペプチド部分は、ハプテンをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなキャリア分子もしくはキーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）と結合することによってか、または融合タンパク質としてペプチド部分を発現することによって、免疫原性にされ得る。ハプテンをキャリア分子に結合するための種々の他のキャリア分子および方法は、当該分野で周知である（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、１９８８を参照のこと；また、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６（これは本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。上記のように、ＣＸＣＬ１０の特異的な抗体中和剤を、また、ＣＸＣＬ１０に対して直接的ではなく、ＣＸＣＬ１０の発現または活性を調節する調節分子に対して惹起し得る。
【００６６】
ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤（例えば、抗体）は、当該分野で周知の方法を使用して、検出可能なように標識され得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、前出、１９９６；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、１９８８；第９章）。例えば、ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤は、当該分野で周知の方法によって、放射性同位元素または治療剤に連結され得る。可視化の可能な放射性同位元素または他の部分に連結された、ＣＸＣＬ１０に直接的に結合する中和剤は、器官特異的または組織特異的なＣＸＣＬ１０の存在または非存在によって特徴付けられる、ＣＮＳ損傷に関連した二次的な組織変性の臨床的病期の進行度を診断または病期決定するために有用であり得る。
【００６７】
ポリクローナル抗体を、例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物において惹起するための方法は当該分野で周知である（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、１９８８）。抗ペプチド抗体の産生は通常、ウサギ、マウス、モルモットまたはラットのような宿主動物の使用を含む。多量の血清が必要な場合には、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタまたはロバのようなより大きな動物が使用され得る。動物は通常、必要とされる抗血清の量に基
づいて選択される。適切な動物としては、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、およびハムスターが挙げられる。これらの動物は、１回の採血につき最大で２５ｍＬ、１００〜２００μＬ、および１〜２ｍＬの血清を産生する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、１９８８）。ウサギは、ポリクローナル抗血清の産生のために非常に有用である。なぜなら、ウサギは、安全にそして繰り返して採血され得、かつ高容量の抗血清を産生し得るからである。例えば、フロイント完全アジュバントのような適切なアジュバント中にある１５〜５０μｇの抗原を用いて、２〜４週間の間隔をあけて２回注射した後で、血液が収集され得、そして抗血清の分析がなされ得る。
【００６８】
さらに、モノクローナル抗体は、当該分野で周知でありかつ慣用的である方法を使用して入手され得る（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、１９８８）。免疫原として使用するためのタンパク質（例えば、ＣＸＣＬ１０）のペプチド部分は、当該分野で周知の方法によって決定され得る。ＣＸＣＬ１０で免疫されたマウスに由来する脾臓細胞が、適切な骨髄腫細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞を生成し得る。クローン化されたハイブリドーマ細胞株は、抗ＣＸＣＬ１０を分泌するクローンを同定するために、標識化ＣＸＣＬ１０タンパク質を用いてスクリーニングされ得る。所望の特異性および親和性を有する抗ＣＸＣＬ１０モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマが単離され得、そして抗体中和剤の持続的供給源として利用され得る。
【００６９】
ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤を使用して、哺乳動物（ヒト被験体を含む）におけるＣＮＳ損傷に関連した二次的な組織変性の重篤度を減少し得る。ヒト化抗体は、ヒト抗体フレームワークに本質的に任意の抗原結合特異性を付与することによって構築され得る。ヒト化抗体を構築する方法は、本発明の方法を実施するため、そして治療的に使用される場合に抗体中和剤に対する宿主の免疫応答を回避するために適切な抗体中和剤を調製するために有用である。
【００７０】
上記の抗体中和剤を使用して、当該分野で周知の方法（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）、ならびにフレームワークおよびＣＤＲ残基の最適化）によって、治療的なヒト中和剤を生成し得る。例えば、抗体中和剤のヒト化は、Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｉら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３（１）：４５−５９（１９９７）（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載のようなＣＤＲグラフティングによって達成され得る。簡潔には、ＣＤＲグラフティングは、得られるグラフト化された抗体またはその可変領域結合フラグメントに結合活性を付与するために、ヒトフレームワーク領域中に非ヒト抗体中和剤由来のＣＤＲを組換え的にスプライシングすることを含む。一旦、ＣＤＲグラフト化抗体または可変領域結合フラグメントが作製されると、非ヒト抗体中和剤に匹敵する結合親和性は、引き続く回の当該分野で公知の親和性変異ストラテジーによって再度獲得され得る。ウサギポリクローナル抗体の形態にある抗体中和剤のヒト化は、Ｒａｄｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（１８）：１３６６８−１３６７６（２０００）（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載される方法と類似の方法によって達成され得る。
【００７１】
非ヒトＣＸＣＬ１０抗体中和剤のヒト化はまた、Ｗｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４（１）：１５１−１６２（１９９９）（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載されるような、フレームワークおよびＣＤＲ残基の同時最適化（これは、フレームワークとＣＤＲ残基との協調的な相互作用の迅速な同定を可能にする）によって達成され得る。簡潔には、多数の潜在的に重要なフレームワーク位置を試験するコンビナトリアルライブラリーが、重鎖および軽鎖の第３のＣＤＲにおいてランダムに単一のアミノ酸変異を含む改変体からなる焦点化（ｆｏｃｕｓｅｄ）ＣＤＲライブラリーと同時に発現される。この方法によって、１つ程度の少数の非ヒトフレームワーク残基を含みかつ最初のキメラＦａｂよりも約５００倍まで高い親和性を示す複数のＦａｂ改変体が同定され得る。フ
レームワーク−ＣＤＲのコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって、機能について最適化された構造を有するモノクローナル抗体の同定が可能となる（抗原が、モノクローナル抗体においてコンフォメーション変化を誘導する場合を含む）。ヒト化を増強された改変体は、当該分野で公知の連続的なインビトロでのヒト化および親和性成熟によってヒト化された抗体よりも、少ない非ヒトフレームワーク残基を含む。
【００７２】
上記のように、本発明の抗体中和剤は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびにそれらの組換えバージョンおよび機能的フラグメントを含む。抗体中和剤の組換えバージョンは、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの単純な発現物およびコアセンブリから、デザイナー抗体と称される特殊な構築物に及ぶ広範な種々の構築物を含む。免疫グロブリンスーパーファミリー（特に、抗体）におけるポリペプチドの広範な特徴付けと組み合わせた組換え方法論により、免疫グロブリンの可変領域および定常領域の結合ドメインに由来する、莫大な数の異なる型、スタイルおよび特異性の結合分子を設計および構築する能力が提供される。特定の例としては、キメラ抗体（ここでは、１つの抗体の定常領域が、別の抗体の定常領域で置換される）および上記のヒト化抗体（ここでは、１つの抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）が、別の抗体に由来する相補性決定領域で置換される）が挙げられる。
【００７３】
抗体中和剤の他の組換えバージョンとしては、例えば、機能的な抗体改変体が挙げられ、ここでは、抗原結合の維持を担う可変領域結合ドメインまたは機能的フラグメントが、抗体定常領域に由来するＦｃレセプター結合ドメインに融合される。このような改変体は、基本的に、抗原結合およびＦｃレセプター結合に必須ではない領域を取り除いた、抗体の短縮形態である。短縮化された改変体は、例えば、適用および使用者の要求に依存して、単一の価数（ｖａｌｅｎｃｙ）を有し得るか、あるいは複数の価数で構築され得る。さらに、リンカーまたはスペーサーが、結合活性を最適化するため、およびＣＸＣＬ１０の中和以外の生物学的機能をもたらすために融合または付加されるさらなる機能的ドメインを含ませるために、抗原とＦｃレセプター結合ドメインとの間に挿入され得る。当業者は、抗体操作に関する当該分野での見識ならびに本明細書中で与えられる指針および教示に照らして、ＣＸＣＬ１０に特異的な組換え抗体中和剤を構築する方法を知る。組換え抗体、機能的なフラグメントおよび改変体、ならびに抗体様分子に関する記載は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版（Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）において見出され得る。
【００７４】
抗体中和剤として使用され得る抗体のさらなる機能的改変体としては、抗原結合ドメイン−Ｆｃレセプター結合ドメインの融合物以外の抗体様分子が挙げられる。例えば、Ｆｃレセプター結合ドメインを含む抗体、その機能的なフラグメントおよび融合物は、１つの可変領域結合ドメインが１つの抗原に対する結合活性を示しかつ他方の可変領域結合ドメインが第２の抗原に対する結合活性を示すという点で二重特異性であるように生成され得る。このような二重特異性の抗体中和剤は、本発明の方法において有益であり得る。なぜなら、単一の二重特異性抗体は、２つの異なる標的抗原結合種を含むからである。従って、単一の分子実体が投与されて、ＣＸＣＬ１０の中和を達成し得る。
【００７５】
ＣＸＣＬ１０に特異的な抗体中和剤はまた、免疫接着物（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ）または二重特異性の免疫接着物であり得る。免疫接着物は、非抗体ポリペプチドの結合ドメインを、抗体定常ドメインの抗体のエフェクター機能と組み合わせた、抗体様分子である。非抗体ポリペプチドの結合ドメインは、例えば、リガンドまたはリガンド結合活性を有する細胞表面レセプターであり得る。ＣＸＣＬ１０中和剤として使用するための免疫接着物は少なくとも、抗体定常ドメインのＦｃレセプター結合エフェクター機能を含み得る。免疫接着物中和剤の抗原結合ドメインに使用され得るリガンドおよび細胞表面レセ
プターの特定の例としては、例えば、ＣＸＣＬ１０を認識するＣＸＣＲ３レセプターのようなＴ細胞レセプターまたはＮＫ細胞レセプターが挙げられる。当該分野で公知の他のリガンドおよびリガンドレセプターが同様に、ＣＸＣＬ１０に特異的な免疫接着物中和剤の抗原結合ドメインに使用され得る。さらに、多価および多重特異性の免疫接着物が、ＣＸＣＬ１０中和剤として使用されるために構築され得る。ＣＸＣＬ１０特異的中和剤として使用され得る、二重特異性抗体、免疫接着物、二重特異性免疫接着物および他のヘテロマルチマー性ポリペプチドの構築は、例えば、米国特許第５，８０７，７０６号および同第５，４２８，１３０号（これらは、本明細書中で参考として援用される）の主題である。
【００７６】
本発明の１つの実施形態では、ＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチド、ＣＸＣＬ１０の発現もしくは活性を調節する調節分子、またはそれらの任意のフラグメント、あるいはアンチセンス分子が、治療目的のための中和剤として使用され得る。１つの局面では、ＣＸＣＬ１０のコード核酸に対するアンチセンス分子を使用して、そのｍＲＮＡの転写または翻訳をブロックし得る。詳細には、ＣＸＣＬ１０の核酸に対して相補的な配列により、細胞が形質転換され得る。このような方法は当該分野で周知であり、そしてセンスまたはアンチセンスのオリゴヌクレオチドまたはより大きなフラグメントが、ＣＸＣＬ１０をコードする配列のコード領域または制御領域に沿って種々の位置から設計され得る。従って、アンチセンス分子を使用して、ＣＸＣＬ１０活性を中和し得るか、または遺伝子機能の調節を達成し得る。
【００７７】
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスもしくはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌プラスミド由来の発現ベクターが、アンチセンスヌクレオチド配列の送達のために使用され得る。選択されるウイルスベクターは、ＣＮＳ細胞に感染し得、かつ宿主に対して安全であり、かつ最小の細胞トランスフォーメーションを引き起すべきである。レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスは、哺乳動物細胞に効率的に外来ヌクレオチド配列を導入しそしてそれを発現させる、効率的で、有用で、そして現在最も良く特徴付けられている手段を提供する。これらのベクターは当該分野で周知であり、そして非常に広範な宿主範囲および細胞型範囲を有し、安定かつ効率的に遺伝子を発現させる。当業者に周知の方法を使用して、このような組換えベクターを構築し得る。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）に記載されている。ＤＮＡへの組込みがない場合であっても、このようなベクターは、それらが内因性ヌクレアーゼによって機能停止にされるまで、ＲＮＡ分子を転写し続けることができる。一過的な発現は、非複製ベクターで１ヶ月以上持続し得、そして適切な複製エレメントがそのベクター系の一部にあれば、さらにより長い間持続し得る。
【００７８】
リボザイム（酵素性のＲＮＡ分子）もまた、ＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡまたはＣＸＣＬ１０の発現もしくは活性を調節する任意の調節分子のｍＲＮＡの特異的切断を触媒するために使用され得る。リボザイムの作用機構は、リボザイム分子のそのｍＲＮＡの相補性標的への配列特異的ハイブリダイゼーションと、続く内部ヌクレオチド鎖切断性切断とを含む。任意の潜在的ＲＮＡ標的内における特異的リボザイム切断部位は、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを含むリボザイム切断部位についてＲＮＡをスキャニングすることによって同定される。一旦同定されると、その切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを無能にさせ得る二次構造特性について評価され得る。候補標的の適合性はまた、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを使用して、相補性オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼー
ションに対する利用可能性を試験することによって評価され得る。本発明のアンチセンス分子およびリボザイムは、核酸分子の合成に関する分野で公知の任意の方法によって調製され得る。
【００７９】
本発明の方法を実施するために有用な中和剤は、処置される組織変性の重篤度；組織損傷の速度または量；被験体の体重、性別、年齢および健康状態；特定の化合物の生化学的性質、生物活性、バイオアベイラビリティおよび副作用；ならびに併用する処置レジメンに適合する様式において適切な様式および量で、当業者により処方および投与され得る。ヒトにおけるＣＮＳ損傷に関連した二次的な組織変性の重篤度を減少させるために適切な量および処方は、当該分野で公知の特定の障害に関する信頼性ある動物モデルから推定され得る。より低い結合親和性を有する中和剤に必要とされる投薬量と比較して、より少ない用量の有意により高い結合親和性を示す中和剤が投与され得るように、ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤の投薬量が、ＣＸＣＬ１０に対するその中和剤の結合親和性に基づいて調整されなければならないことが理解される。従って、適切な投薬量は、特定の処置に応じて、および所望される処置の期間に応じて変動する；しかし、１日あたり体重１ｋｇあたりで約１０μｇと約１ｍｇとの間の投薬量が治療的処置のために使用されることが予想される。治療的に有効な量は、代表的に、生理的に受容可能な組成物中において投与される場合に、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、または少なくとも約２μｇ／ｍｌ、そして通常は、５〜１０μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成するために十分である中和剤の量である。
【００８０】
被験体においてＣＮＳ損傷に関連した二次的な組織変性の重篤度を減少させる本発明の方法が、ＣＮＳ損傷に関連した二次的な組織変性を有する被験体に、１０ｋＤａのインターフェロン誘導タンパク質（ＣＸＣＬ１０）に特異的な中和剤の有効量を投与する工程を包含し、この方法がさらに、損傷または外傷の時点で開始する反復される処置から構成される時間経過的なレジメンを含み得ることが企図される。ＣＮＳ損傷に関連した二次的組織損傷は、損傷後の数日または早期の週に起こる進行性プロセスであるので、ＣＸＣＬ１０中和剤の投与は、迅速にまたは損傷後できるだけ早くに開始され得、そして適切な長さの時間にわたり毎日繰り返され得る。適切な時間の長さは、当業者に公知の種々の要因に対して決定され得、そして例えば、損傷後１日間、２日間、３日間、５日間、６日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、２０日間、２５日間またはそれより長い日数であり得る。処置はまた、２日間毎または３日間毎に投与され得、そして処置の日に、２回、３回またはそれより多くの回数で投与され得る。例えば、処置は、ＣＸＣＬ１０レベルがＣＮＳの損傷後または外傷後のそのベースレベルより上に上方制御される量の時間で継続される（Ｌｅｅら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ３６：４１７−４２５（２０００）を参照のこと（これは、本明細書中で参考として援用される））。従って、時間経過的なレジメンは、本願方法を実施するために有用である。なぜなら、１０ｋＤａのインターフェロン誘導タンパク質（ＣＸＣＬ１０）に特異的な中和剤は、ＣＮＳ損傷の直後（例えば、約１０分以内、約２０分以内、約３０分以内、約４０分以内、約５０分以内、または約１時間以内、約２時間以内、約３時間以内、約４時間以内、約５時間以内、約６時間以内、約７時間以内、約８時間以内、約１０時間以内、約１２時間以内、もしくはそれより長い時間の範囲内）に開始して投与され得、そしてＣＮＳ損傷後のＣＸＣＬ１０の上方制御と相関するように決定された時間にわたって繰り返され得るからである。
【００８１】
中和剤の総量は、単回投与として投与され得るか、または比較的短い時間にわたる注入により投与され得るか、あるいはより長時間にわたって投与される複数回投与で投与され得る。そのような考慮は、種々の症例特異的要因（例えば、その疾患カテゴリーが、急性エピソードにより特徴付けられるかまたは漸進性組織劣化により特徴付けられるか）に依存する。例えば、慢性組織劣化に罹患した被検体について、その中和剤は、徐放性マトリ
ックス中で投与され得、この徐放性マトリックスは、全身投与のために移植され得るかまたは標的組織部位に移植され得る。治療化合物の制御放出のために有用な企図されるマトリックスは、当該分野で周知である。そのようなマトリックスとしては、材料（例えば、ＤｅｐｏＦｏａｍＴＭ、生体ポリマー、マイクロポンプなど）が挙げられる。
【００８２】
本発明の中和剤は、当該分野で公知の多数の経路により被検体に投与され得る（例えば、全身投与（例えば、静脈内投与または動脈内投与））。ＣＸＣＬ１０特異的中和剤が、当業者に公知の処方方法を使用して、薬学的に受容可能な処方物中にある、単離され実質的に精製されたポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントの形態で、提供され得る。これらの処方物は、標準的経路（局所経路、経皮経路、腹腔内経路、頭蓋内経路、脳室内経路、脳内経路、膣内経路、子宮内経路、経口経路、直腸経路、または非経口経路（例えば、静脈内経路、脊髄内経路、皮下経路、もしくは筋肉内経路）を含む）により投与され得る。ＣＸＣＬ１０特異的中和剤の脊髄内投与および静脈内投与が、本発明の方法を実施するために特に適切な経路である。脊髄内投与は、損傷部位または外傷部位に上記中和剤の送達を標的化するために実施され得る。さらに、ＣＸＣＬ１０特異的中和剤改変体が、生分解性ポリマー中に組み込まれ得、これにより、ＣＮＳ損傷に関係する二次的な組織変性の重篤度を減少するために有用な化合物の徐放が可能になる。生分解性ポリマーおよびその使用は、例えば、Ｂｒｅｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７４：４４１〜４４６（１９９１）（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００８３】
ＣＸＣＬ１０特異的中和剤は、薬学的に受容可能な媒体と一緒に溶液または懸濁物として投与され得る。そのような薬学的に受容可能な媒体は、例えば、滅菌水性溶媒（例えば、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水、通常生理食塩水もしくはリンゲル溶液、または他の生理学的緩衝化生理食塩水）または他の溶媒もしくはビヒクル（例えば、グリコール、グリセロール、油（例えば、オリーブ油）もしくは注射可能な有機エステル）であり得る。薬学的に受容可能な媒体は、さらに、作用する生理学的に受容可能な化合物（例えば、中和剤を安定化する化合物、その溶解度を増加する化合物、もしくはその吸収度を増加する化合物）を含み得る。そのような生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、糖質（例えば、グルコース、スクロース、またはデキストラン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸またはグルタチオン）；レセプター媒介性透過剤（これは、血液−脳関門の透過度を増加するために使用され得る）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）（これは、微生物膜を破壊する）；二価金属イオン（例えば、カルシウムまたはマグネシウム）；低分子量タンパク質；脂質またはリポソーム；または他の安定化剤もしくは賦形剤が挙げられる。当業者は、薬学的に受容可能なキャリアの選択が、中和剤を含む化合物の投与経路、ならびにその特定の物理的特徴および化学的特徴に依存することを理解する。
【００８４】
非経口投与に適切な処方物としては、水性および非水性の滅菌注射溶液（例えば、上記の薬学的に受容可能な媒体）が挙げられる。その溶液は、さらに、例えば、緩衝剤、静菌剤、および処方物を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含み得る。他の処方物としては、例えば、懸濁剤および濃化剤を含み得る、水性および非水性の滅菌懸濁物が挙げられる。その処方物は、単位用量容器または多用量容器（例えば、密封アンプルおよび密封バイアル）中に提示され得、そして使用直前に例えば滅菌液体キャリアの添加を必要とする凍結乾燥状態で貯蔵され得る。即時注射溶液および即時注射懸濁物が、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。
【００８５】
ＣＸＣＬ１０中和剤が血液−脳関門を通り得る処方物の状態で投与され得る脳損傷に指向された適用のために、例えば、ＣＸＣＬ１０中和剤の親油性を増加する処方物の状態で投与され得る。例えば、上記中和剤は、リポソーム中に組み込まれ得る（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、第２版（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ（１９９３））。リン脂質または他の脂
質からなるリポソームは、作製および投与するのが比較的簡単である、非毒性で生理学的に受容可能で代謝可能なキャリアである。  
【００８６】
ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤もまた、ナノ粒子として調製され得る。ナノ粒子の表面上にペプチド化合物を吸着することは、ペプチド薬物を脳に送達する際に有効であることが示されている（Ｋｒｅｕｔｅｒら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６７４：１７１〜１７４（１９９５）を参照のこと）。例示的ナノ粒子は、ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤が表面上に吸着されそしてポリソルベート８０でコートされている、ポリブチルシアノアクリレートのコロイド状ポリマー粒子である。
【００８７】
脳中に選択された位置に脳−血液関門を通してＣＸＣＬ１０中和剤の画像誘導超音波送達が、米国特許第５，７５２，５１５号に記載されるように利用され得る。手短かに述べると、血液−脳関門を通してＣＸＣＬ１０中和剤を送達するために、脳中に選択された位置が標的化され、そしてその位置にあるＣＮＳ中で（ＣＮＳ）組織および／または流体を画像化することによって検出可能な変化を誘導するために超音波が使用される。選択された位置の近傍にある脳の少なくとも一部が、例えば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を介して、その変化の位置を確認するために画像化される。患者の血流中のＣＸＣＬ１０特異的中和剤が、その位置に脳−血液関門の開口をもたらし、それにより中和剤の取り込みを誘導するために超音波を適用することによって、確認された位置に送達され得る。
【００８８】
さらに、レセプター媒介性透過剤（ＲＭＰ）と呼ばれるポリペプチドが、例えば、米国特許第５，２６８，１６４号；同第５，５０６，２０６号；および同第５，６８６，４１６号に記載されるように、分子（例えば、治療剤または診断剤）へ、血液関門の透過性を増加するために使用され得る。これらのレセプター媒介透過剤が、所望の目的地が脳脊髄液である分子とともに、宿主に静脈内同時投与され得る。透過剤ポリペプチドまたはその立体構造アナログは、治療剤が血液−脳関門を透過してその標的目的地に到達するのを可能にする。
【００８９】
本発明の別の実施形態に従って、ＣＸＣＬ１０中和剤と、中枢神経系に関係する二次的な組織変性の重篤度を減少するための方法において使用するための指示書とを含む、治療システムが、好ましくは、キット形態で存在する。１つの実施形態において、例えば、その治療剤は、抗ＣＸＣＬ１０抗体である。本発明のキットは、中枢神経系損傷に関連する二次的な組織変性の重篤度を逆転するために有用である。
【００９０】
適切なキットは、少なくとも１つの治療適用に十分な量で、別個の包装された化学試薬として少なくとも１つのＣＸＣＬ１０中和剤を含む。包装されたキットの使用のための指示書もまた、代表的には含まれる。当業者は、ＣＸＣＬ１０中和剤を、本明細書中に記載されるような本発明の方法の実施のために適切な緩衝液および溶液と組み合わせてキットの形態に容易に組み込み得る。
【００９１】
ＣＮＳ損傷のための現在の処置レジメンにおいて、１つより多くの化合物は、しばしば、その疾患の同じの局面または異なる局面の管理のために、個体に投与される。同様に、二次的な組織変性の速度を減少する工程を包含する本発明の方法において、ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤は、第２の治療化合物（例えば、抗炎症化合物、免疫抑制化合物、またはその疾患の同じ局面もしくは異なる局面を管理する他の任意の化合物）とともに有利に処方され得る。そのような化合物としては、例えば、メチルプレドニソロンアセテート、ＧＭ−１ガングリオシドおよび４−アミノピリジン（４−ＡＰ）が挙げられる。ＣＮＳ損傷に関係する二次的な組織変性の重篤度を減少するための企図される方法は、ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤を、単独でか、そのような他の化合物と組み合わせてかまたは連続して、ならびに他の治療（例えば、リハビリおよび神経プロテーゼ）と組み合わせて、投与
する工程を包含する。あるいは、併用療法は、ＣＸＣＬ１０に特異的な中和剤が異種タンパク質（例えば、治療タンパク質）に結合している、融合タンパク質からなる。
【００９２】
以下の実施例は、本発明を例示することが意図されるが、本発明を限定することは意図されない。本発明の種々の実施形態の活性に実質的には影響を与えない改変もまた、本明細書中に提供される本発明の定義内に包含されることが、理解される。従って、以下の実施例は、本発明を例示することが意図されるが、本発明を限定することは意図されない。
【００９３】
下記に別個に記載されない限り、下記の実施例に対応する実験手順は、以下の通りである。
【００９４】
（抗体投与）  年齢が一致した成体雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスを、すべての研究に使用した。マウスに、損傷１日前およびその後屠殺するまで１日ごとに、１００ｍｇのモノクローナルＣＸＣＬ１０抗体（２００ｍｌの滅菌ＰＢＳ中に懸濁した）の腹腔内注射を与えた。これらの研究において使用したモノクローナル抗体は、ＣＸＣＬ１０に特異的であり、ＣＸＣＬ１０誘導性Ｔ細胞走化性をブロックする。
【００９５】
（脊髄損傷）  脊髄背面ヘミセクション損傷を、腹腔内注射を介して投与したＡｖｅｒｔｉｎ麻酔剤（０．６ｍｌ／２０ｍｇ）下で実施した。Ｔ４−Ｌ２の棘突起の上で中線切開を行い、脊椎傍筋肉を、椎骨から分離した。Ｔ９椎骨の完全後弓切除を、微細なハサミおよび骨鉗子を使用して実施した。柱を、微細マニピュレーターに取り付けたクランプを用いて安定化した。その後、微小切開ナイフを使用して、背面ヘミセクション損傷を作製した。その後、筋肉層を縫合し、そして表在組織および皮膚を、４−０シルクで閉じた。体温を、加熱パッド上で維持した。手術後のケアは、膀胱排尿および乳酸添加リンゲル溶液による水和を含んだ。
【００９６】
（運動学的分析）  すべてのマウスを、機能的試験の開始前の４日間、直線運動場に順応させた。運動学的分析を、損傷の１日前、およびその後屠殺するまで１日ごとにほぼ中日に行い、そして処置群について知らない２人の観察者により別個にスコア付けさせた。動物を、規定された１ｃｍグリッド線を保有するプレキシガラス表面下からＨｉｔａｃｈｉ  ８ｍｍ  Ｖｉｄｅｏ  Ｃａｍｃｏｒｄｅｒ  ＶＭ−Ｅ５５５ＬＡを使用して、ビデオテープに撮った。その後、そのビデオを、ＭＰＥＧ−２圧縮デバイスを使用してダウンロードし、そしてＦＭＶ２．０ソフトウェア（これは、ビデオを運動学的評価のためにフレームごとに観察するのを可能にする）を使用して分析した。４つの運動学的パラメーター（ストライド長；ストライド幅；足回転（ｐａｗ  ｒｏｔａｔｉｏｎ）および爪先幅（ｔｏｗ  ｓｐｒｅａｄ））をアッセイした。後足ストライド長を、後足を用いるステップの開始から同じ足を用いるステップの最後までの点として規定した（測定は、個々の側で、３つの連続ステップ（ｍｍ）の間行い、その後平均した）。ストライド幅を、後肢研究の幅（ｍｍ）（最も外側の左後肢足指から最も外側の右対側の後足指までの距離）として規定した。爪先幅を、後指の最も後ろの点から中指の最も中側の点までの後足中の幅（ｍｍ）（それぞれ、左後足および右後指の両方）として規定した。足回転を、後足の長手方向軸と身体の中線との間の角度（度）として規定した。ＳＰＳＳ  ４．０  Ｔ検定を使用して、処置群と未処置群との間での有意な差異を決定した。
【００９７】
（ＲＮＡＳＥ保護アッセイ）  マウスを、ＣＯ２固定および断頭による損傷後の以下の時点（６時間（ｎ＝３）、１２時間（ｎ＝３）、１８時間（ｎ＝３）、２４時間（ｎ＝３）、３日間（ｎ＝３）、７日間（ｎ＝３）、および１４日間（ｎ＝２））で殺傷した。２匹の非損傷マウスをコントロールとして使用した。脊髄を２つの片として除去し、すぐに凍結した。全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ）試薬を用いて抽出し、そしてエタノール沈殿した。そのペレットを、５０μｌのＲＮＡＳＥを含まない水中に溶解し、そ
してそのＲＮＡ濃度を決定した。マルチプローブセットｍＣＫ−５を使用して、ＣＸＣＬ１０  ｍＲＮＡ転写物を検出した。このマルチプローブセットは、ＲＮＡローディングについてのコントロールとして使用するためにＬ３２についてのプローブを含んだ。分析は、１０μｇタンパク質に対して実施した。フラグメントを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、そしてフィルムオートラジオグラフィーにより可視化した。オートラジオグラフをスキャンし、画像化ソフトウェアを使用して、そのバンドを定量した。
【００９８】
（単核細胞単離およびフローサイトメトリー）  単一細胞懸濁物を、抗ＣＸＣＬ１０抗体またはコントロール抗体のいずれかで処置したマウスの脊髄から、損傷後３日目および１４日目に得た。ＦＡＣＳ分析を、以前に記載された通りに実施した（Ｌａｎｅ，Ｌｉｕら、「Ａ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＣＤ４（＋）  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ
ＲＡＮＴＥＳ  ｉｎ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ
ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ」Ｊ
Ｖｉｒｏｌ，（２０００）７４（３）：１４１５〜２４）。簡単に述べると、脳を取り出し、その組織を破砕することによって、単一細胞懸濁物を得た。すべての技術は、氷上の滅菌組織培養プレート上で実施した。このプレートは、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地を含んだ。細胞懸濁物を１５ｍｌ三角チューブに移し、Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を、最終濃度３０％添加した。１ｍｌの７０％  Ｐｅｒｃｏｌｌを下層に置き、そして細胞を、４℃にて１３００×ｇで３０分間遠心分離した。細胞を境界面から取り出し、そして２回洗浄した。フルオレセインイソチオシアネート結合体化（ＦＩＴＣ）ラット抗マウスＣＤ４および（フィコエリトリン結合体化ＰＥ）ラット抗マウスＣＤ８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、それぞれ、浸潤性ＣＤ４＋  Ｔ細胞および浸潤性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を検出した。コントロールとして、アイソタイプが一致するＦＩＴＣ抗体およびＰＥ抗体を使用した。細胞を、４０℃で１時間、抗体とともにインキュベートし、洗浄し、１％パラホルムアルデヒド中に固定し、そしてＦＡＣＳｔａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）上で分析した。ＣＮＳ中に浸潤する細胞の割合を、Ｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔフローサイトメトリーソフトウェアにて決定した。ポジティブの細胞を、バックグラウンドサンプルおよびコントロールサンプルの蛍光から実験サンプルの蛍光を差し引くことによって、決定した。ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞の総数を、ゲートを通る集団内のポジティブ細胞の割合に、脊髄から単離した細胞の数を乗算することによって、決定した。データは、平均＋標準誤差平均として提示する。
【００９９】
（Ｈ＆Ｅ染色）  長手方向凍結脊髄切片を切断し、そして酢酸アルコール中に固定した。その切片を、Ｈａｒｒｉｓヘマトリキシン中で染色し、水道水で洗浄し、そして１％エオシン中で対比染色した。増加するアルコール中でスライドを脱水し、そしてパラマウント（ｐｅｒｍｏｕｎｔ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に封入した。
【０１００】
（免疫組織化学）  動物を、４％パラホルムアルデヒドを用いて、損傷後２４時間、３日間、および１４日間、経噴門還流した。脊髄を取り出し、２５％スクロース中に一晩沈めた。その後、この組織をＯＣＴ中に包埋し、１２μｍ厚の長手方向軸凍結切片を切断し、そしてスライド上に配置した。切片を、１０％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ：ＰＢＳで希釈）中にて室温で１時間ブロックした。一次抗血清（ラット抗マウスＣＤ４モノクローナル抗体、１０％  ＮＧＳ中に１：２００希釈、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ；ラット抗マウスＣＤ１１ｂ、Ｓｅｒｏｔｅｃ）を、４℃にて一晩切片に適用した。切片を、ＰＢＳで３回リンスし、そしてヤギ抗ラットＩｇＧビオチニル化抗血清（１０％  ＮＧＳ中１：２００希釈、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を適用し、スライドを、室温で１時間インキュベートした。切片をＰＢＳ中にて３回リンスし、そしてメタノール：３０％過酸化水素溶液（１００：１）中で１０分間インキュベートした。その切片をＰＢＳ中で３回リン
スし、そしてＡＢＣ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で室温にて３０分間インキュベートした。ＤＡＢ基質溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、抗体の結合を可視化した。切片を増加するアルコール中で脱水した。Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、封入のために使用した。一次抗体を除去した場合に、何の免疫反応も観察されなかった。以下の改変を含んで、同じ手順を使用してニューロンを染色した：切片を一晩ブロックし、そして使用した一次抗血清はマウス抗ＮｅｕＮモノクローナル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，１：１００希釈）であった。使用した二次抗体は、ビオチン化ラット吸着ウマ抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１：２００希釈）であった。損傷の各側１ｍｌ中のニューロンおよびＣＤ４ポジティブＴ細胞を、１０×倍率で計数した。明確に標識された細胞のみを計数した。
【実施例】
【０１０１】
（実施例Ｉ）
（ＣＮＳ損傷後のＣＸＣＬ１０レベルおよびＴ細胞数のアップレギュレーション）
この実施例は、ＣＮＳ損傷後のＣＸＣＬ１０レベルおよびＴ細胞数のアップレギュレーションを記載する。
【０１０２】
ＣＸＣＬ１０  ｍＲＮＡレベルが、ヘミセクション損傷後に増大したかどうかを決定するために、成体マウス脊髄のヘミセクション損傷を、先鋭小刀ブレードを使用して、Ｔ９にて、成体Ｃ５７Ｂ１６雌性マウスに対して実施し、その後、Ｔ９椎骨の背側半分を除去した。総ＲＮＡを、ヘミセクションした脊髄から、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して、損傷後６時間目、１２時間目、１８時間目、２４時間目、３日目、７日目および１４日目にて抽出し、そしてＩＰ−１０  ｍＲＮＡ転写物のレベルを、Ｌａｎｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（３）：４１５−４２４（２０００）（これは、本明細書中で参考として援用される）に以前に記載されたＣＫ−１ケモカインプローブセットを使用するリボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）によって各々の時点において決定した。ｍＲＮＡ転写物の量を、走査型オートラジオグラフィーによって決定して、ＮＩＨ１．６１画像ソフトウェアを使用して、内部Ｌ３２コントロールに関して、個々のバンドの強度を決定した。
【０１０３】
図１に示されるように、ＣＸＣＬ１０  ｍＲＮＡレベルは、損傷後６時間までに増加し、次いで徐々に減衰し、損傷の１４日後でさえ、基底レベルを上回ったままであった。ＣＸＣＬ１０  ｍＲＮＡは、未損傷の脊髄組織においては検出不能であった。
【０１０４】
脊髄をまた、手術時に印をつけた損傷部位が、解剖した組織内の中心に位置してするように、損傷後３日目および１４日目に解剖した。中心管が明らかに見える縦断面を選択し、デジタル化した。細胞計数について、損傷部位のいずれかの側に１ミリメートル延びた総組織面積内のＣＤ４免疫陽性細胞の数を、立体解析を使用して決定した。明らかに識別可能なヘキスト染色された核を有する、免疫標識された細胞のみを、スコア付けした。
【０１０５】
ＣＤ４で免疫染色した縦組織断面の定量的分析は、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、未損傷の脊髄と比較して、ヘミセクション損傷された脊髄において、損傷の３日後に、損傷部位のいずれかの側に１ｍｍ延びた領域内に、増加した密度で存在することを示した。上記の研究は、ＩＰ−１０レベルおよびＴ細胞数が、ＣＮＳ損傷後にアップレギュレートされることを示す。
【０１０６】
（実施例ＩＩ）
（ＣＮＳ損傷後の損傷部位内および損傷部位周辺の、ＣＸＣＬ１０レベルが低下したＴ細胞蓄積の中和）
背側ヘミセクション損傷後の抗ＩＰ−１０処置の効果を決定するために、ヘミセクション損傷された成体マウスに、損傷の１日前で開始し、そして１日おきに損傷の７日後まで継続する、抗ＩＰ−１０抗体（約０．５ｍｇ／ｍｌ）の腹腔内注射０．５ｍｌを行った。このマウスを、損傷の３日後または１４日後に屠殺し、そして損傷部位が解剖した組織内に中心に位置するように、脊髄を解剖した。中心管が明らかに見える縦断面を選択し、そしてデジタル化した。細胞計数について、損傷部位のいずれかの側に１ミリメートル延びた総組織面積内のＣＤ４免疫陽性細胞の数を、立体解析を使用して決定した。上記実施例Ｉに記載されるように、明らかに識別可能なヘキスト染色された核を有する、免疫標識された細胞のみを、スコア付けした。
【０１０７】
ＣＤ４で免疫染色した縦組織断面の定量的分析は、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、抗ＣＸＣＬ１０処置したヘミセクション損傷脊髄と比較して、未処置のヘミセクション損傷された脊髄において、損傷の３日後に、損傷部位のいずれかの側に１ｍｍ延びた領域内に、増加した密度で存在することを示した。これらの研究は、ＩＰ−１０の中和が、ＣＮＳ損傷後のＴ細胞補充を低減させたことを示す。
【０１０８】
ＣＮＳ損傷に関連する挙動欠損に対する、抗ＩＰ１０処置の効果を決定するために、抗ＣＸＣＬ１０抗体処置したヘミセクション損傷マウス、未処置のヘミセクション損傷マウスおよび未損傷のコントロールマウスを、ヘミセクション損傷の前にまず４日間順応させ、その後、処置群について盲目にした２人の観察者によって、ヘミセクション損傷後１日目から１３日目まで、毎日、運動学的分析に供した。動物を、規定されたグリッド線を有する４’×４’プレキシガラス表面の下方からビデオ撮影し、そしてＡｄｏｂｅ  Ｐｒｅｍｉｅｒｅビデオ編集ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して記録を分析した。
【０１０９】
４つの運動学的パラメータを評価した：ストライドの長さ、ストライドの幅、肢の回転およびつま先の広がり。図２に示されるように、抗ＩＰ−１０抗体で処置した全てのヘミセクション損傷マウスは、未処置のヘミセクション損傷マウスの次に、有意に大きいストライドの長さを有し、そして有意に小さいストライドの幅、つま先の広がりおよび肢の回転を有した。進行性の挙動の改善を、各運動学的パラメータについて、損傷後の最初の３日間にわたる全ての動物についてのデータ点を、損傷後の最後の３日間にわたる全ての動物についてのデータ点と比較することによって評価した。未処置のヘミセクション損傷マウスは、回復期間の間に、運動学的パラメータの変化を示さなかった（ｐ＞０．０５）。対照的に、処置したヘミセクション損傷マウスは、回復期間の間に、全ての運動学的パラメータについて統計学的に有意な進行性の改善を示した（ｐ＜＜０．０１）。
【０１１０】
損傷部位が解剖した組織内の中心に位置するように、脊髄を、損傷後１４日目に解剖した。中心管が明らかに見える縦断面を、選択およびデジタル化した。損傷部位のいずれかの側に１ｍｍ延びた総組織面積を、Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３７１：４８５−４９５（１９９６）（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、ＭＣＩＤ分析システムを使用して測定した。
【０１１１】
図３に示されるように、未処置のヘミセクション損傷マウスは、未損傷のコントロール脊髄と比較して、損傷のいずれかの側に１ｍｍ延びた総組織面積における平均４９．４％の減少を有した。対照的に、抗ＩＰ−１０抗体処置したヘミセクション損傷マウスの形態学的分析は、未損傷のコントロール脊髄と比較して、損傷のいずれかの側に１ｍｍ延びた総組織面積における２０．９％の減少を示し、これは、未処置のヘミセクション損傷マウスと比較して、６８％の組織喪失の減少に相当する。損傷部位のいずれかの側に１ｍｍ延びた総組織面積内で決定されたＮｅｕＮ免疫陽性ニューロンの数を、立体解析を使用して決定した。ニューロン特異的な核タンパク質を認識し、ほとんどの神経細胞型と反応する
ＮｅｕＮモノクローナル抗体（ＭＡＢ３７７、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）を、製造業者の指示に従って使用した。明らかに識別可能なヘキスト染色された核を有する、免疫標識された細胞のみを、スコア付けした。ＮｅｕＮを免疫染色した縦組織断面の定量的分析は、ＮｅｕＮ＋ニューロンが、未処置のヘミセクション損傷マウスと比較して、抗ＣＸＣＬ１０１０処置したヘミセクション損傷マウスにおける損傷部位のいずれかの側に１ｍｍ延びた領域内に、増加した密度で存在することを示した。
【０１１２】
これらのデータは、抗ＣＸＣＬ１０処置が、ヘミセクション損傷後の、外傷後の組織喪失を低減させたことを示す。
【０１１３】
（実施例ＩＩＩ）
（リンパ球浸潤に対するＣＸＣＬ１０抗体の効果）
ＣＸＣＬ１０  ｍＲＮＡレベルは、成体マウス脊髄に対するヘミセクション損傷の後に増大した。総ＲＮＡを、損傷後６時間目（ｎ＝３）、１２時間目（ｎ＝３）、１８時間目（ｎ＝３）、２４時間目（ｎ＝３）、３日目（ｎ＝３）、７日目（ｎ＝３）および１４日目（ｎ＝３）にて、ヘミセクション損傷脊髄から抽出し、そしてＣＸＣＬ１０  ｍＲＮＡ転写物のレベルを、ＣＫ−１ケモカインプローブセットを使用するリボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）（Ｌａｎｅ，Ｌｉｕら、「Ａ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＣＤ４（＋）Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ＲＡＮＴＥＳ  ｉｎ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、（２０００）７４（３）：１４１５−２４）によって、各時点について決定した。ｍＲＮＡ転写物の量を、走査型オートラジオグラフィーによって決定して、内部Ｌ３２コントロールと比較して、個々のバンドの強度を決定した。ＣＸＣＬ１０  ｍＲＮＡレベルは、損傷後６時間までに、７４．８±２１．７８の平均レベルまで上昇し、次いで徐々に減衰し、損傷の１４日後でさえも基底レベルを上回ったままであり、４１．５７±１．８０の平均レベルである（図１）。ＣＸＣＬ１０  ｍＲＮＡは、未損傷の脊髄組織においては検出不能であった。
【０１１４】
抗ＣＸＣＬ１０での処理は、リンパ球を減少させ、創傷後のＣＮＳへのマクロファージの浸潤を活性化した。ヘミセクションした成体マウスにおいて、縦方向の組織切片を免疫染色したＣＤ４の定量的な分析は、創傷３日後に創傷部分のいずれか一方の側が１ｍｍ拡張している領域内のＣＤ４＋Ｔリンパ球の総数が、２０５０＋／−１０２（ｎ＝３、図５）であることを示した。創傷していない脊髄組織において、ＣＤ４＋Ｔリンパ球は検出されなかった。これらのデータは、ＣＸＣＬ  １０レベルおよびＴリンパ球の数が、外傷後にアップレギュレートされることを示し、成体ラットに対する挫傷創傷の６時間後のＣＸＣＬ１０のアップレギュレーション、および創傷後の第１週以内のＴリンパ球浸潤のピークを実証した以前の研究を支持する（ＭｃＴｉｇｕｅ，Ｔａｎｉら，「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｍＲＮＡ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ
ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ａｆｔｅｒ  ｃｏｎｔｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ」Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，（１９９８）５３（３）：３６８〜７６）。
【０１１５】
ヘミセクションした抗ＣＸＣＬ１０処置を受けた成体マウスにおいて、縦方向の組織切片を免疫染色したＣＤ４の定量的な分析は、創傷３日後に創傷部分のいずれか一方の側が１ｍｍ拡張している領域内のＣＤ４＋Ｔリンパ球の総数が、６２２＋／−２０２（ｎ＝３）であったことを示し、処置しなかったヘミセクション創傷動物と比較して、７０％の減少を示した（図５）。
【０１１６】
ＦＡＣＳ分析は、抗ＣＸＣＬ１０処置したヘミセクション創傷マウスにおいて、創傷後３日および１４日の両方で、処置しなかったヘミセクション創傷マウスと比較して、ＣＤ４＋リンパ球、ＣＤ８＋リンパ球、およびＦ４８０／ＣＤ４５＋マクロファージの数が減
少したことを示した。
【０１１７】
特に、下記の表１に要約したＦＡＣＳデータは、処置しなかったヘミセクション創傷マウスにおけるＴリンパ球および活性化マクロファージ／小膠レベルと比較して、創傷３日後のこれらの動物の脊髄内に存在するＣＤ４＋Ｔリンパ球（６６．４％減少）、ＣＤ８＋Ｔリンパ球（５７．４％減少）および活性化マクロファージ／小膠細胞（３５．５％減少）において有意な減少を実証した。さらに、ＦＡＣＳデータは、処置しなかったヘミセクション創傷マウスにおけるＴリンパ球および活性化マクロファージ／小膠レベルと比較して、創傷１４日後の処置した動物の脊髄内に存在するＣＤ４＋Ｔリンパ球（５８％減少）、ＣＤ８＋Ｔリンパ球（６４％減少）および活性化マクロファージ／小膠細胞（４３．２％減少）において有意な減少を実証した（ｎ＝４；表１）。
【０１１８】
（表１．細胞の浸潤は抗ＣＸＣＬ１０処置マウスにおいて減少する）
【０１１９】
【表１】
2006008705.tif 000002
【０１２０】
（実施例ＩＶ）
（組織スペアリングおよび機能欠失に対するＣＸＣＬ１０処置の効果）
外傷性の脊髄創傷に応答して減弱したＣＤ４＋Ｔリンパ球が、組織スペアリングまたは機能的欠失の減少に関与したか否かを決定するために、ヘミセクションした成体マウスに、抗ＣＸＣＬ１０抗体を、創傷１日前から創傷９日後まで１日おきに腹腔内注射し、そして創傷１４日後に屠殺した（ｎ＝１１）。ヘミセクション創傷後の組織スペアリングは、処置しなかったヘミセクション創傷マウスと比較して、抗ＣＸＣＬ１０抗体で処置したマウスで、有意により大きかった（ｎ＝８）。中心管が明瞭に見える縦方向の組織切片の形態学的分析を、Ｚｈａｎｇら、（１９９６）（Ｚｈａｎｇ，Ｆｕｊｉｋｉら，「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ：ａ  ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｉｃｅ  ｉｓ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｉｎ
ｍｉｃｅ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ（Ｗｌｄｓ）ｔｈａｔ  ｃａｕｓｅｓ  ｄｅｌａｙｅｄ  Ｗａｌｌｅｒｉａｎ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，」Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，（１９９６）３７１（３）：４８５−９５）に記載されるようなＭＣＩＤ分析システムを用いて行った。処置していないヘミセクション創傷マウスは、創傷していないコントロール脊髄と比較して、創傷のいずれか一方の側が１ｍｍ拡張している組織領域全体で平均４９．４％の減少を有した（図３）。対照的に、抗ＣＸＣＬ１０抗体処置したヘミセクション創傷マウスの形態計測分析は、創傷していないコントロール脊髄と比較して、創傷のいずれか一方の側が１ｍｍ拡張している組織領域全体で２０．９％の減少を示し、組織の喪失においては、処置していないヘミセクション創傷マウスと比較して、６８％の減少を示す（図３）。
【０１２１】
より大きな組織スペアリングと合わせて、処置したヘミセクション創傷マウスは、創傷１４日後に、処置していないヘミセクション創傷マウスより、創傷部位周囲のより多くの神経細胞を有意に含む。処置していないヘミセクション創傷マウス由来の、縦方向の組織切片を免疫染色したＮｅｕＮの定量分析は、創傷１４日後において、創傷部位のいずれか
一方の側が１ｍｍ拡張している領域内のＮｅｕＮ＋ニューロンの平均総数が、２６７＋／−７２であることを示した。対称的に、抗ＣＸＣＬ１０抗体で処置したヘミセクション創傷マウスからの縦方向の組織切片を免疫染色したＮｅｕＮの定量分析は、創傷１４日後において、創傷部位のいずれか一方の側が１ｍｍ拡張している領域内のＮｅｕＮ＋ニューロンの平均総数が、１１７０＋／−１８４であることを示し、処置していないヘミセクション創傷動物よりも４３８％多くのニューロンが存在している。
【０１２２】
これらのデータは、背面のヘミセクション創傷の後の抗ＣＸＣＬ１０処置が、外傷後の組織の消失を有意に減少させたことを示す。
【０１２３】
（実施例Ｖ）
（挙動性欠損に対する抗ＣＸＣＬ１０抗体処置の効果）
抗ＣＸＣＬ１０抗体で処置したマウスにおけるヘミセクション創傷後の挙動欠損は、処置しなかったコントロールと比較して、漸進的に減少した。処置したヘミセクション創傷マウスおよび処置しなかったヘミセクション創傷マウス、ならびに非創傷コントロールマウス（ｎ＝８）を、ヘミセクション創傷１〜１３日後から、処置群について盲目である２人の観察者による毎日の運動学的分析に供した。動物を、規定の１ｃｍグリッド線を有する、３’×１’プレキシガラス表面の低部からビデオ撮影し、ビデオ編集ソフトウェアを用いて記録を分析した。４つの運動学的パラメータを評価した；前後肢のスライド長、前後肢のスライド、前後肢の回転および前後肢のつま先の広がり。これらの分析は、抗ＣＸＣＬ１０抗体で処置した全てのヘミセクション創傷マウスが、創傷１４日後における、処置しなかったヘミセクション創傷コントロールマウスよりも有意により大きな、前後肢のスライド長、有意に少ない前後肢のスライド、前後肢のつま先の広がりおよび前後肢の回転を有することを示した（図２）。進行性の挙動の改善を、創傷後の初めの３日間にわたる全ての動物についてデータ点を、創傷後の最後の３日間にわたる全ての動物についてのデータ点と、各々の運動学的パラメータについて比較することによって評価した。処置しなかったヘミセクション創傷マウスは、回復期間の間、運動学的パラメータにおいて、変化を示さなかった（ｐ＞０．０５）。対称的に、処置したヘミセクション創傷マウスは、回復期間の間、全ての運動学的パラメータにおいて、統計的に有意な進行性の改善を示した（ｐ＜０．０１）。創傷１４日後までに、処置したヘミセクション創傷マウスの４つの全ての挙動学的パラメータについて、挙動スコアは、非創傷コントロールマウスと有意に違わなかった。
【０１２４】
これらのデータは、抗ＣＸＣＬ１０抗体処置が、脊髄創傷後の神経学的障害を低減することを示す。
【０１２５】
本出願を通して、括弧内で、多様な刊行物を参照している。本出願において、本発明が関連する分野の水準、より完全に記載するために、これらの刊行物の開示の全体が、本明細書によって参考として援用される。
【０１２６】
本発明は、開示された実施形態を参照して記載されているが、当業者は、記述された特定の実験が、本発明の単なる例示であることを容易に理解する。本発明の精神を逸脱することなしに、多様な改変がなされ得ることを理解すべきである。従って、本発明は、添付の請求項によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】図１は、成体マウス脊髄に対する半側切断損傷の後の増加したＣＸＣＬ１０  ｍＲＮＡレベルを示す。
【図２−１】図２は、以下の４つの運動学的パラメーターにより測定される未処置コントロールマウスと比較して、抗ＣＸＣＬ１０抗体を用いて処置したマウスにおいて漸減した、成体マウス脊髄に対する半側切断損傷の後の挙動欠損を示す：２（Ａ）またぎ長（ｓｔｒｉｄｅ  ｌｅｎｇｔｈ）；２（Ｂ）趾の広がり（ｔｏｅ  ｓｐｒｅａｄ）；２（Ｃ）またぎ幅（ｓｔｒｉｄｅ  ｗｉｄｔｈ）；および２（Ｄ）後足回転（ｒｅａｒ  ｐａｗ  ｒｏｔａｔｉｏｎ）。
【図２−２】図２は、以下の４つの運動学的パラメーターにより測定される未処置コントロールマウスと比較して、抗ＣＸＣＬ１０抗体を用いて処置したマウスにおいて漸減した、成体マウス脊髄に対する半側切断損傷の後の挙動欠損を示す：２（Ａ）またぎ長（ｓｔｒｉｄｅ  ｌｅｎｇｔｈ）；２（Ｂ）趾の広がり（ｔｏｅ  ｓｐｒｅａｄ）；２（Ｃ）またぎ幅（ｓｔｒｉｄｅ  ｗｉｄｔｈ）；および２（Ｄ）後足回転（ｒｅａｒ  ｐａｗ  ｒｏｔａｔｉｏｎ）。
【図３】図３は、以下を示す：３（Ａ）未処置のマウスにおける損傷の１４日後の背面観点からの脊椎半側切断損傷の全体の病理；３（Ｂ）未処置のマウスにおける損傷の１４日後の脊椎の背側の半側切断損傷の長手方向の断面；３（Ｃ）抗ＣＸＣＬ１０抗体処置のマウスにおける損傷の１４日後の背面観点からの脊椎半側切断損傷の全体の病理；および３（Ｄ）抗ＣＸＣＬ１０抗体処置のマウスにおける、損傷の１４日後の脊椎の背側の半側切断損傷の長手方向の断面。外抗ＣＸＣＬ１０抗体に媒介された、傷性脊髄損傷に応答したＣＤ４＋  Ｔリンパ球の弱毒化は、組織節約（ｔｉｓｓｕｅ  ｓｐａｒｉｎｇ）に関係する。
【図４】図４は、以下を実証するＣＤ４＋の染色された光学顕微鏡写真を示す：４（Ａ）抗ＣＸＣＬ１０抗体処置は、４（Ｂ）の未処置マウスと比較して、処置したマウスにおける半側切断損傷の後の、強力なＴリンパ球の漸増を低下する。
【図５】図５は、抗ＣＸＣＬ１０抗体により媒介される、外傷性脊椎損傷に対するＣＤ４＋  Ｔリンパ球応答の弱毒化は、組織節約に関係することを示す。
【図１】
2006008705.tif 000003
【図２−１】
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【図２−２】
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【図５】
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【図３】
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【図４】
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