(57)【要約】【課題】  芳香族化合物から簡便に且つ効率よく芳香族モノヒドロキシ体を得る。【解決手段】  遺伝子破壊や発現抑制、阻害剤の使用などによって、多環芳香族化合物分解酵素（ｂｐｈＢ）の酵素活性が抑制された微生物又はその微生物の細胞内容物、例えばSphingomonas属の微生物を、芳香族化合物、例えばジベンゾチオフェンと接触させて、芳香族モノヒドロキシ体、例えばモノヒドロキシジベンゾチオフェンを製造する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族化合物を、多環芳香族化合物分解酵素（ｂｐｈＢ）の酵素活性が抑制された微生物又はその微生物の細胞内容物と接触させることを特徴とする芳香族モノヒドロキシ体の製造方法。
【請求項２】
前記ｂｐｈＢの酵素活性の抑制が、ｂｐｈＢ遺伝子の発現抑制及び遺伝子破壊並びにｂｐｈＢ活性阻害剤の使用からなる群より選択された少なくとも１つによって行われることを特徴とする請求項１記載の芳香族モノヒドロキシ体の製造方法。
【請求項３】
前記微生物が、グラム陽性菌及びグラム陰性菌から成る群より選択された少なくとも１つであることを特徴とする請求項１又は２記載の芳香族モノヒドロキシ体の製造方法。
【請求項４】
前記微生物が、Sphingomonas属、Pseudomonas属、Rhodococcus属からなる群より選択された少なくとも１種であることを特徴とする請求項１又は２記載の芳香族モノヒドロキシ体の製造方法。
【請求項５】
前記微生物が、Sphingomonas属の株であることを特徴とする請求項１又は２記載の芳香族モノヒドロキシ体の製造方法。
【請求項６】
前記芳香族化合物が、多環芳香族化合物及び芳香族アミノ酸からなる群より選択されたものであることを特徴とする請求項１記載の芳香族モノヒドロキシ体の製造方法。
【請求項７】
前記芳香族化合物が、ヘテロ原子を含む又は含まない炭素数５〜５０の芳香族化合物であることを特徴とする請求項１記載の芳香族モノヒドロキシ体の製造方法。
【請求項８】
請求項１記載の製造方法によって得られた芳香族モノヒドロキシ体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、芳香族モノヒドロキシ体の製造方法及びそれにより得られた芳香族モノヒドロキシ体に関する。
【背景技術】
【０００２】
多環芳香族化合物にヒドロキシル基が付加した化合物は、石油製品をはじめ、除草剤、医薬品などさまざまな製品の原料となりうる物質であることから、常温常圧で生産可能である微生物を用いたバイオプロセス生産を目的とした研究が多数行われてきた。バイオプロセスを用いた工業製品の生産はコスト面で優れており、環境にも優しい技術として従来の化学合成に代わる技術として期待されている。
【０００３】
モノオキシゲナーゼによる多環芳香族化合物（ＰＡＨ）のヒドロキシ化について、森らは、白色腐朽菌（Phlebia lindtneri）のP450モノキシゲナーゼが、ジベンゾジオキシン（ＤＢＤ）、ジベンゾフラン（ＤＢＦ）、ビフェニル（ＢＰＨ）の位置特異的なヒドロキシル化を担っていることを報告している（非特許文献１）。また、糸状菌や酵母ではヒドロキシ化合物を介した多環芳香族化合物の分解に関する報告がいくつかある（例えば、非特許文献２）。
しかし、白色腐朽菌は、基質のヒドロキシル化のみを担っており、それ以降は分解が進行しない。
一方、単環のベンゼン、トルエンについては、モノヒドロキシ化合物を介した環開裂型分解経路が存在していることが明らかとなっている（非特許文献３）。また微生物を用いた各種芳香環ジオキシゲナーゼを用いてジヒドロジオール等を得ることができることが報告されている（特許文献１乃至４）。
【非特許文献１】Appl.Microbiol.Biotechnol., 60, 200-205, (2002)
【非特許文献２】Appl.Environ.Microbiol., 67(4), 1551-1557, (2001)
【非特許文献３】Aldrichimia Acta, Vol. 32,(2), 35-62, (1999)
【特許文献１】特開平５−１３０８７５号公報
【特許文献２】特開平６−１８１７８９号公報
【特許文献３】特開２００３−２６９号公報
【特許文献４】特開２００３−９３０８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
芳香族化合物を直接モノヒドロキシ化できれば、少ない工程で効率よくモノヒドロキシ体を得ることができる。
従って、本発明は、芳香族化合物から簡便に且つ効率よく芳香族化合物モノヒドロキシ体を得ることを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の芳香族モノヒドロキシ体の製造方法は、芳香族化合物を、多環芳香族化合物分解酵素（ｂｐｈＢ）の酵素活性が抑制された微生物又はその微生物の細胞内容物と接触させることを特徴としている。
ここで、前記ｂｐｈＢの酵素活性の抑制が、ｂｐｈＢ遺伝子の発現抑制及び遺伝子破壊並びにｂｐｈＢの活性阻害剤の使用からなる群より選択された少なくとも１つによって行われることが好ましい。
本発明の芳香族モノヒドロキシ体は、前記製造方法によって得られたものである。
【０００６】
本発明では、ｂｐｈＢの酵素活性が抑制された微生物又はその微生物の細胞内容物を用いるので、芳香族化合物の分解経路が不完全となる。この結果、ジヒドロキシ体ではなくモノヒドロキシ体が生成する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、芳香族化合物から、簡便に且つ効率よく芳香族モノヒドロキシ体を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の芳香族モノヒドロキシ体の製造方法は、芳香族化合物を、ｂｐｈＢの酵素活性が抑制された微生物又は微生物の細胞内容物と接触させることを含む。
一般に多芳香族化合物の分解経路としては、ジオールを介した経路のみが知られており、例えばジベンゾチオフェンの分解経路としては、図１に挙げるいわゆる児玉経路のみが科学的に証明されているにすぎない。
本発明の製造方法では、この経路に関与するｂｐｈＢの酵素活性が抑制されている微生物又は微生物の細胞内容物を用いる。この結果、芳香族化合物の分解経路が不完全となって、合成のメカニズムの詳細は不明であるが、ジヒドロキシ体を副生することなく芳香族化合物が直接ヒドロキシル化され、一段階反応で簡便に且つ効率よくモノヒドロキシ体が得られる。本方法により得られたモノヒドロキシ体は、例えば他の微生物由来のジオキシゲナーゼ等を用いた経路と比較して、高い純度のものである。
【０００９】
ｂｐｈＢは微生物に存在し、２以上の芳香環及びヘテロ原子を含む芳香環を有する多環芳香族化合物を分解することができる酵素であり、ｂｐｈＢタンパク質はいわゆる短鎖型脱水素酵素として知られている。ｂｐｈＢタンパク質の結晶構造は、HulsmeyerらによりBurkholderia sp. LB400株由来のｂｐｈＢで最初に決定された（Protein Sci., 7(6), 1286-93, (1998).）。Burkholderia sp. LB400株はさまざまなポリ塩化ビフェニル（ＢＰＨ）に対して基質特異性をもっており、下記のような環開裂型分解経路にてビフェニルを分解、資化する。
【００１０】
【化１】
2006314224.tif 000002
【００１１】
LB400のｂｐｈＢは四量体を成しており、補酵素としてＮＡＤ+を利用する。ＬＢ４００におけるｂｐｈＢの作用機構を以下に示した。ｂｐｈＢは以下の２ステップの反応機構により、ジヒドロジオールを脱水素化しているものと考えられている。
【００１２】
【化２】
2006314224.tif 000003
【００１３】
（Ａ）  Tyr155が脱プロトン化する。（Ｂ）脱プロトン化したTyrが基質の３−ヒドロキシル基と水素結合を形成する。次にＢＰＤＤ（ｃｉｓ−（２Ｒ，３Ｓ）−ジヒドロキシ−１−フェニルシクロヘキサ−４，６−ジエン）の３−ヒドロキシル基のプロトンをTyr155が取り込み、３−Ｈを遊離して、基質は補酵素であるＮＡＤ+と結合する。（Ｃ）水素を取り込んだＮＡＤ（Ｈ）は基質から遊離し、反応中間体であるα−ヒドロキシシクロヘキサ−２，４−ジエンが生じる。この物質はケト−エノール互変異性によって、亜反応でベンゼン環の再編成が起こり、２，３−ジヒドロキシＢＰＨ（ＤＨＢＰ）が生成する。
【００１４】
このｂｐｈＢの核酸配列及びアミノ酸配列は、配列番号１及び２として既に既知であるが、本発明におけるｂｐｈＢは、配列番号１及び２の配列のみに限定されず、同様の機能を有するものであれば、核酸又はアミノ酸の１つ以上が欠失、置換又は付加されたものであってよい。
【００１５】
本発明では、ｂｐｈＢの酵素活性が抑制されたものであればよく、この酵素活性の抑制としては、ｂｐｈＢ遺伝子の発現抑制及び遺伝子破壊並びに、ｂｐｈＢ活性阻害剤の使用からなる群から選択された少なくとも１つであることが好ましい。
【００１６】
破壊される遺伝子領域は、ｂｐｈＢの機能を破壊することができる程度の破壊であればよく、ｂｐｈＢ配列全体の破壊でなくてもよい。例えば、コーディング領域、触媒活性領域の配列の一部の欠損やプロモーター配列等の破壊を挙げることができ、このうち、効率よくｂｐｈＢの機能を破壊する観点から、触媒活性部位の領域の破壊が好ましい。
遺伝子の破壊及び遺伝子発現抑制は、この分野で通常行われている方法であれば、当業者によって適宜選択され、容易に用いることができる。例えば、遺伝子破壊としては、トランスポゾンを用いたランダムな遺伝子破壊や、相同組換えによる領域指定の破壊等を挙げることができる。また、遺伝子発現抑制としては、アンチセンス、ＲＮＡｉ等を挙げることができる。このような技術には、これらの手法の適用は、目的となる配列が明らかであるので、当業者であれば適宜用いることができる。
【００１７】
また、ｂｐｈＢの遺伝子の発現が行われてもその酵素活性を阻害できれば、前記と同様の効果を得ることができる。このため、ｂｐｈＢの酵素活性の阻害剤も、この機能を有する化合物であれば、特に限定なく使用することができる。
【００１８】
また、ｂｐｈＢの酵素活性を抑制する他の方法としては、ｂｐｈＢに相当する他の代謝酵素遺伝子の破壊や発現抑制を挙げることができ、このような代謝酵素遺伝子としては、ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼを挙げることができる。この代謝酵素遺伝子を破壊等することによっても、ｂｐｈＢの酵素活性を抑制することができる。
【００１９】
本発明では、ｂｐｈＢの酵素活性が抑制された微生物又は微生物の細胞内容物が用いられる。
本発明に使用可能な微生物としては、芳香族化合物分解能を有する微生物であれば特に限定されないが、生成物の生成・回収効率等の観点からグラム陰性菌及びグラム陽性菌から成る群より選択された少なくとも１つであることが好ましく、中でも、工業的にまた研究対象としての実績が豊富なSphingomonas属、Pseudomonas属、Rhodococcus属からなる群より選択された少なくとも１種であることが工業的価値及び利便性の観点から更に好ましい。これらの微生物は、目的とするモノヒドロキシ体の種類や、基質となる芳香族化合物の種類に応じて適宜選択可能である。また、これらの微生物のうち、特に、効率よく本発明の化合物を生成することができる観点から、Sphingomonas paucimobilis等のSphingomonas属であることが特に好ましい。
【００２０】
微生物の細胞内容物は、細胞内の酵素活性が失われない通常の方法に従って細胞の内容物を抽出したものであれば、特に限定されず、リゾチーム等の溶解酵素を用いた溶解物、超音波破砕機やフレンチプレスまたホモジナイザー等を用いた粉砕物を挙げることができる。
ここで、生成されたモノヒドロキシ体を容易に回収できる観点から、微生物をそのまま用いることが好ましい。
【００２１】
本発明で使用する微生物は、ｂｐｈＢの酵素活性が抑制されている以外は、天然のものと同一であってよく、この微生物における他の生物学的機能を用いて、本発明におけるモノヒドロキシ体を生成することができる。なお、本微生物における他の機能には、天然由来の酵素活性等を挙げることができるが、本発明の効果を損なわない程度の改変が行われたものであってもよい。このような改変には、他の酵素活性効率の向上や増殖速度の向上などを挙げることができる。これらの改変は、当業者であれば、適宜選択可能であり、容易に実施可能である。
【００２２】
本発明においてモノヒドロキシ体を得るには、上述のような微生物又はその細胞内容物を芳香族化合物と接触させればよい。
【００２３】
使用される芳香族化合物としては、目的とするモノヒドロキシ体の基礎となる芳香族化合物であり、分解経路にｂｐｈＢが関連するものであれば特に限定されない。
ここで芳香族化合物とは、分子中に１つ又は２つ以上、例えば三環、四環の縮合又は非縮合の芳香環を有するものをいい、工業的観点から多環芳香族化合物及び芳香族アミノ酸からなる群より選択されたものであることが好ましい。この芳香族化合物は、分子中に、窒素原子、酸素原子、硫黄原子等のヘテロ原子や、低級の飽和炭化水素基や脂環炭化水素基で構成された側鎖をそれぞれ単数又は複数有していてもよい。低級飽和炭化水素基としては、炭素数１〜６のアルキル基、アルケニル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル等を挙げることができる。また、低級の脂環炭化水素基としては、炭素数３〜８のシクロアルキル基、シクロアルケニル基、例えばシクロプロピル、シクロペンチル、シクロペンテン等を挙げることができる。化合物中に含まれる芳香環は、環状のものであれば特に制限されず、５員環、６員環から８員環までを好ましく挙げることができる。このような芳香族化合物としては、工業的観点及び効率よく生成することができることから、炭素数５〜５０、好ましくは炭素数６〜４０のものが該当し、多環芳香族化合物としてビフェニル、ジベンゾフラン、ジベンゾダイオキシン、ジベンゾチオフェン等、芳香族アミノ酸としてフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ヒスチジンを挙げることができる。
【００２４】
なお、本発明の製造方法では、合成経路においてｂｐｈＢの前段に関与する芳香族化合物酸化還元酵素は特に制限されない。このため、いずれの酸化還元酵素が関与する系であっても、前記同様に、モノヒドロキシ体を簡便に得ることができる。
【００２５】
芳香族化合物と上記微生物又は微生物の細胞内容物との接触の条件としては、使用する微生物による化合物の資化に必要な通常の条件をそのまま適用すればよく、当業者であれば、使用する微生物の種に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
上記接触工程によって生成された芳香族モノヒドロキシ体は、通常、単独の化合物として反応産物中に存在するので、芳香族モノヒドロキシ体の抽出は、容易に行うことができる。
ここで用いられる抽出手法は、一般的な低分子化合物の精製に用いられる方法であれば、いずれでもよい。例えば、培養濾液中の生成物についてはこれを水不混和性の有機溶媒、例えば酢酸エチルなどで抽出する方法、あるいは菌体内の生成物についてはろ過、遠心分離などで得た菌体をメタノール、エタノール、アセトンなどで回収する方法や、適当な溶媒を用いた向流分配法などを挙げることができる。なお菌体を分離せずに培養物そのままを上記の抽出操作に付すこともできる。また、既に液状となっている生成物含有物、例えば培養濾液や、抽出操作によって得られた抽出液を対象として、適当な吸着剤、例えばシリカゲル、活性炭、「ダイヤイオンHP-20」（三菱化成社製）などを用いて目的の生成物を吸着させ、その後適当な溶媒にて溶離させることもできる。このようにして得られた生成物溶液を減圧濃縮乾固すれば、生成物粗標品が得られる。この生成物粗標品を更に精製するためには、上記の抽出法および吸着法にゲル濾過法、高速液体クロマトグラフィーなどを必要に応じて組み合わせて必要回数行えばよい。例えばシリカゲルなどの吸着剤、「セファデックスLH-20」（ファルマシア社製）などのゲル濾過剤を用いたカラムクロマトグラフィー、「YMCパック」（山村科学社製）などを用いた高速液体クロマトグラフィーおよび向流分配法を適宜組み合わせて実施することができる。
【００２７】
本発明によって得られたモノヒドロキシ体は、1Ｈ  ＮＭＲ及び13Ｃ  ＮＭＲスペクトル分析、及び、ＭＳスペクトル分析等によって同定することができる。得られた芳香族化合物モノヒドロキシ体は、種々の分野の中心となる機能性物質、例えば医薬品の出発原料や導電性ポリマーの出発原料として使用されているものであるので、有用な芳香族化合物モノヒドロキシ体を効率よく提供することができる。
【００２８】
このように本発明の芳香族化合物モノヒドロキシ体の製造方法によれば、種々の芳香族化合物モノヒドロキシ体を一段階反応で短時間に得ることができる。また、芳香族化合物を効率よくモノヒドロキシ体に資化することができるため、環境改善にも効果的に適用することができる。
【実施例】
【００２９】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００３０】
［実施例１］
ＴＺＳ−７株におけるｂｐｈＢ遺伝子の破壊によるジベンゾチオフェン（ＤＢＴ）および各種芳香族モノヒドロキシ体の作製
（１）ＴＺＳ−７株における遺伝子破壊
多環芳香族化合物分解能を有することが既知、即ちｂｐｈＢ遺伝子の存在が確認されている菌株、Sphingomonas paucimobulis TZS-7株（Journal of Bioscience and Bioengineering 88: 293-299 (1999)）のｂｐｈＢ遺伝子に、微生物の遺伝子破壊法の定法の一つである相同組換え法を利用して、カナマイシン耐性遺伝子を導入した。具体的にはＯＲＦの２７番目と２８番目の塩基の間（図２参照）に薬剤耐性遺伝子カナマイシン耐性遺伝子を挿入したＤＮＡ断片を作製し、エレクトロポレーション法によりＴＺＳ−７株に導入し相同組換え体を得た。直接塩基配列を解析することにより、ｂｐｈＢ遺伝子が破壊されていることが確認された。この菌株を、Ｔｎ３９９とした。
【００３１】
（２）塩基配列の決定法
上記で得られたＴｎ３９９株を、ＬＢ培地４ｍｌに植菌し、３７℃で一晩振盪培養した後、培養液をGenElute Plasmid Mini-Prep Kit（シグマ株式会社）に供し、プラスミドの調製を行った。このプラスミド調製液、またはプラスミドを鋳型としたＰＣＲ反応産物を用いた。
ＰＣＲによるシークエンス用テンプレートの調製には、LA Taq polymerase（宝酒造株式会社）を用いた。反応液をLA Taq polymeraseに添付された説明書に従い、LA  Taq  polymerase ０．５Ｕ、滅菌水にて溶解したプラスミドを約５ｎｇ、５'−Ｍ１３プライマー（Ｍ１３−２０（5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'）：配列番号３）と３'−Ｍ１３プライマー（ＲＰ（5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'）：配列番号４）をそれぞれ終濃度０．２μＭで用いて、全量５０μｌに調製した。ＰＣＲ反応は、まず９４℃−３分間熱変性を行ったのち、９４℃−３分、６８℃−５分を１サイクルとして合計３０サイクル反応させた。続いて７０℃−１０分間にてＰＣＲ反応産物の補正伸長を行い、最後に４℃で保存した。
得られたＰＣＲ産物を、UltraClean PCR Clean-up DNA  Purification Kit（宝酒造株式会社製）に供し、不要なプライマー、未反応のdNTPなどを除去し、シークエンス用テンプレートとした。
【００３２】
以上のようにして調製したテンプレートとABI PRISM Big DyeTM  Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction ver.2（ＡＢＩ社製）を用いてサイクルシークエンス反応を行った。
まず、０．２ｍｌ容のマイクロテストチューブに、プラスミド調製液もしくはＰＣＲ反応産物、キットに付属しているBig Dye ver.2を４μｌ、それにEZ::TNTM〈KAN-2〉Tnp TransposomeTM Kit付属のKAN-2  FP-1  Forward  Primer、またはKAN-2 RP-1 Reverse Primer（0.2pmol/μl）を１μｌ添加し、超純水で全量１０μｌにして調製した。
次にこれらのサンプルをＰＣＲ反応に供した。まず９６℃で１分間熱変性したあと、９６℃，３０秒、４５℃，５秒、６０℃，４分を１サイクルとし、２５サイクル行い、反応終了後４℃で保存した。その後、シークエンス反応液に滅菌水１０μｌ、３．０Ｍの酢酸ナトリウムを２μｌと９９．５％のエタノールを添加し、混合後、常温にて１０分間静置した。続いて、１５，０００ｒｐｍ，１８℃，３０分間遠心し、沈殿物を７０％エタノールで洗浄して、エバポレーターでＤＮＡペレットを乾燥させた。乾燥させたＤＮＡペレットにＰＥ社製ＴＳＲを１５μｌ添加し、十分に溶解させ、９５℃、２分間インキュベートした後、氷中で急冷して、サンプル調製した。
【００３３】
（３）塩基配列のコンピュータ解析
上記のように調製したサンプルをＡＢＩ社製Genetic Analyzer 310に供して、挿入断片の塩基配列を決定した。
得られた塩基配列のデータは、SDCソフトフェア開発社製のコンピュータプログラム、GENETYX-MAC(Ver.11.0)を用いて解析した。また、DNA、アミノ酸のホモロジー解析にはBlastを用いた。
【００３４】
（４）ｂｐｈＢのアミノ酸配列のアライメント
ＴＺＳ−７株におけるｂｐｈＢをアミノ酸配列に変換したものと、相同性の高かった遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列との比較を行った。結果を図３に示す。
図３に示されるように、Sphingomonas  aromaticivorans  F199株のｂｐｈＢ（putative  dihydrodiol  dehydrogenase）と８９．５％、Sphingomonas  sp. BN6株のORF4（putative  1,2-dihydrodiol  dehydrogenase）と７５．６％、Pseudomonas  sp. KKS  102株のｂｐｈＢ（cis-2,3-dihydrobiphenyl-2,3-dehydrogenase )と４４．０％の相同性が確認された。これらの結果より、トランスポゾンで破壊された遺伝子はジヒドロジオールデヒドロゲナーゼをコードするｂｐｈＢであると示唆された。ＴＺＳ−７におけるｂｐｈＢのBlastドメイン検索の結果、ｂｐｈＢは短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリー（ＳＤＲファミリー）に分類された。ＳＤＲファミリーは、微生物からヒトまで保存されているが、その直接的な反応などは詳細には調べられていない。
【００３５】
ＳＤＲファミリーに共通した特徴は、補酵素であるＮＡＤ（Ｈ）、ＮＡＤＰ（Ｈ）の結合部位と考えられているGlyXXXGlyXGlyモチーフと、触媒活性部位であるTyrXXXLys構造をもっていることであることが知られている。ＴＺＳ−７株のｂｐｈＢ配列からもこれらのモチーフが確認された。
LB400におけるｂｐｈＢのLys159は、この反応機構に直接は関わっていないが、Lys159はTyr155を分極化することができ、静電相互作用によりヒドロキシル基の酸性度指数（ｐＫａ値）を低く保つ。この影響は、Tyr155の脱プロトン化を促進し、結果的に酵素の触媒を促進しているものと考えられる。
LB400におけるｂｐｈＢの立体構造解析により、Ser142、Tyr155、Lys159の３アミノ酸が触媒活性基であると考えられた。この可能性をさらに実験的に証明したのがVadaiらである（Biochemistry, 39(17), 5028-34, (2000)）。
【００３６】
Vadadiらは、ビフェニル（ＢＰＨ）、ポリ塩化ビフェニル分解菌であり、LB400のｂｐｈＢとも相同性の高いComamonas testosteroni B-356株のｂｐｈＢ（cis-2,3-Dihydro-2,3-dihydroxybiphenyl Dehydrogenase）のSer145、Tyr158、Lys161、それぞれに対し、部位特異的変異導入法によりアミノ酸の置換を行い、変異型ｂｐｈＢを作製して、その動態について解析している。その結果、これらのアミノ酸が触媒活性基であることが示唆された。彼らはこの３アミノ酸を“catalytic triad”（活性中心アミノ酸）と呼び、ｂｐｈＢの触媒活性に不可欠なアミノ酸であることを主張した。本実施例で用いられたＴＺＳ−７のｂｐｈＢにおいても、この“catalytic triad”が保存されていた（図３）。
【００３７】
［実施例２］
ｂｐｈＢ破壊によるモノヒドロキシＤＢＴの生成
（１）供試菌株
ＴＺＳ−７株およびＴＺＳ−７株におけるＤＢＴ分解関連酵素遺伝子（ｂｐｈＢ）の破壊株（Ｔｎ３９９）
（２）培地、培養条件
休止菌体反応によって、それぞれの基質の分解速度を算出した。まず、ＮＢ寒天培地に４℃で保存している菌株をかき取り、ＮＢ培地５ｍｌの入った中試験管に植菌し、３０℃にて定常期（ＯＤ660＝１．５）に達するまで培養した。その後、培養液２００μｌ、またＰＡＨ分解酵素誘導のため、トルエン２０ｐｐｍをＮＢ培地１００ｍｌ入った５００ｍｌ容三角フラスコに添加し、３０℃で回転振盪培養した。なお、トルエンはアセトンで希釈して１００μｌにしたものを添加した。
ＯＤが１．０に達したところで、再びトルエンを２０ｐｐｍ添加し、再誘導した。ＯＤが１．３になったところで４，５００ｒｐｍ，２０分間培養液を遠心し、菌体を回収した。次に、菌体に対して０．１Ｍリン酸−カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を１０ｍｌ加え、ボルテックスでよく撹拌したあと、再び４，５００ｒｐｍで２０分間遠心し、菌体を回収した。なお、この操作は二回繰り返した。洗浄後、同緩衝液でＯＤ660が１０になるように休止菌体懸濁液を調製した。なお、懸濁液を保存する際は−８０℃にてフリーズストックし、使用時は氷冷した水の中で融解させた。
【００３８】
以上のようにして調製した休止菌体５００μｌを、氷上で冷やした小試験管に添加し、そこへ５ｇ／ｌのＤＢＴ／ＤＭＦ溶液、もしくは４，６−ＤＭＤＢＴ／ＤＭＦ溶液を１０μｌ（終濃度１００ｐｐｍ）を加え、にて３０℃，６００ｒｐｍの回転振盪で休止菌体反応を行った。反応後、６ＮのＨＣｌを５０μｌ加え酸性化したのち、反応液と当量の酢酸エチルを添加してボルテックスにてよく撹拌した。５分間静置したあと、遠心にて水層と有機層を分離し、基質の抽出を行った。
【００３９】
（３）  試薬
ＤＢＴは、１０ｇ／ｌの濃度でアセトンに溶解させたものを用いた（未滅菌）。その他の試薬類は特記しない限り、フィルター滅菌、またはオートクレーブ滅菌したものを用いた。ＰＣＲに用いたＤＮＡ関連酵素、休止菌体調製に用いた緩衝液の試薬等は宝酒造株式会社、東洋紡績株式会社、もしくはInvitrogen社製のもの使用した。
（４）  分析条件
ＧＣは島津製作所製のGC-2010を用いた。ＧＣシステムは、水素炎イオン化検出器（Flame Ionization Detector, FID）とキャピラリーカラム（DB-1, J&W Scietific社）を備えている。カラム温度は２６０℃恒温、インジェクター及び検出器温度はそれぞれ３００℃とした。
Ｔｎ３９９の休止菌体反応における分解産物をＧＣ／ＭＳ用のサンプルとして用いた。
ＤＢＴ分解産物の構造解析は、質量分析ガスクロマトグラフィー（Gas chromatography/mass spectrometry,  GC/MS）によって決定した。ＧＣ／ＭＳシステム（Thermo Quest社）は、キャピラリーカラムを備え、カラムオーブンは１５０℃から２７５℃へ昇温（gradient、１０℃／ｍｉｎ）した。またマススペクトルの解析にはＧＣ／ＭＳ付属のスペクトル検索ソフト“Xcalibur”を用いた。
【００４０】
（４）ＴＺＳ−７と組換え株Ｔｎ３９９の生育曲線比較
ＴＺＳ−７（四角）及びＴｎ３９９（菱形）の生育曲線を図４に示した。ＮＢ培地において野生株と変異株の間で生育の違いは見られず、Ｔｎ３９９にてトランスポゾンによる破壊をうけた遺伝子は生育に影響を与えないものであることが明らかとなった。従って、ＴＺＳ−７において確立されている休止菌体調製法をＴｎ３９９にそのまま適応できることが明らかであった。
（５）Ｔｎ３９９におけるＤＢＴ分解産物のＧＣ／ＭＳ解析
ＧＣ／ＭＳ解析におけるＧＣクロマトグラム、及びＴｎ３９９に特有なピークのマススペクトルを図５に示す。マススペクトルより、この化合物は分子量（Ｍ+）が２００であると推定され、ＤＢＴ（ＭＷ＝１８４）のいずれかの位置に酸素原子が付加したものであると推定された。しかし、クロマトグラムの保持時間よりＤＢＴスルホキシドとは異なる物質であると思われ、ピーク１のマススペクトルより、Ｔｎ３９９にて蓄積している化合物はヒドロキシＤＢＴであると示唆された。
【００４１】
［実施例３］
1Ｈ−ＮＭＲによるＴｎ３９９のモノヒドロキシＤＢＴの解析
（１）休止菌体の調製、および休止菌体反応
ＴＺＳ−７、Ｔｎ３９９の休止菌体調製法については、実施例２で記述したものと同じ方法を用いた。休止菌体反応は、３００ｍｌ容の羽根つき三角フラスコに休止菌体を５０ｍｌ加え、そこへＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）にて溶解したＤＢＴを５ｍｇ（終濃度１００ｐｐｍ）添加し、３０℃２００ｒｐｍ、２４ｈ分解を行った。ＤＢＴの溶解に用いたＤＭＦ量は、菌体への有機溶媒の影響を最小限にするため、ＤＢＴが目視にて可溶化する最小量で溶解し、用時調製とした。
【００４２】
（２）ＤＢＴ分解産物の抽出
（１）の反応液を４，５００ｒｐｍ、４０分間遠心し、菌体と未分解基質を除去した。上清液を太型試験管に移し、６ＮのＨＣｌをサンプル量の１０分の１量添加して酸性化した後、サンプルと等量の酢酸エチルを加え、ボルテックスにてよく撹拌した。５分間静置した後、ガラス製の遠沈管に移し、４，５００ｒｐｍ、２０分間遠心し、水層と有機層を分離した。有機層を回収し、ＤＢＴ分解産物を抽出した。なお、この操作は２回繰り返した。
抽出したサンプルを１００ｍｌ容のガラス製の蓋付き三角フラスコにまとめ、無水硫酸ナトリウムを適当量くわえて一晩静置し、サンプル中の脱水を行った。続いて、サンプルをロータリーエバポレーターに供して、分解産物の濃縮を行った。
【００４３】
（３）シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる標的化合物の単離
調整したサンプルの重量を測定し、アセトンにて１，０００ｐｐｍになるようにサンプルを溶解した。溶解したサンプルをＴＬＣに供した。
まず５×２０ｃｍのＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ254（ＭＥＲＣＫ社）をガラス切りで５×３ｃｍ大に切断し、以下のＴＬＣ操作に用いた。展開層に２０％アセトン−クロロホルム溶液を加え、そこへサンプルおよび基質をスポットしたＴＬＣプレートを入れて、サンプルの展開を行い、サンプル中に含まれている化合物を予測した。次にヘキサン１００％、５％ジエチルエーテル−ヘキサン溶液、１０％ジエチルエーテル−ヘキサン溶液に順次展開し、標的化合物を単離可能な溶媒系の検討を行った。なお、シリカゲルにおける混合溶媒系の溶出力については入門クロマトグラフィー 第１版, 東京化学同人, (1971) pp.35.を参考にした。
【００４４】
ＴＬＣの結果を元に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行った。はじめに、ディスポーザブルのパスツールピペット（ＩＷＡＫＩ社製）に脱脂綿もしくはシリカウールを加え、その上層にシリカゲルをサンプル重量の１０倍量（ただし、シリカゲルは最低でも５００ｍｇとする）加え、簡易的なカラムを作成した。
ＴＬＣでの結果をもとに、カラムクロマトグラフィーの溶媒系を構築した。始めに展開を行う溶媒系（今回はヘキサン１００％）でサンプルの転溶を行い、同溶媒でシリカゲルを洗浄した。洗浄は、目視にてシリカゲル中の空気が完全に除去されるのを確認できるまで行った。
【００４５】
以上のようにして調製したカラムにサンプルを通し、その後ヘキサン１００％、５％ジエチルエーテル−ヘキサン溶液、１０％ジエチルエーテル−ヘキサン溶液、２０％アセトン−クロロホルム溶液をそれぞれ５ｍｌずつ用いて順次溶出を行った。溶出したサンプルはそれぞれの溶媒系ごとにガラス遠沈管（三洋株式会社製）に回収した。
回収したサンプルを再び２０％アセトン−クロロホルム溶液でＴＬＣに供し、標的化合物が単離されているかを確認した。またＴＬＣとともに、ＧＣ、ＧＣ／ＭＳでもサンプル中の化合物の検出、および構造の推定を行った。標的化合物の単離が確認できたら、ロータリーエバポレーターでサンプルを濃縮し、重量を測定したあと、４℃で保存し、1Ｈ−ＮＭＲ用のサンプルとした。
【００４６】
（４）シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる標的化合物の単離
上述の溶媒系にてカラムクロマトグラフィーを行ったところ、２０％アセトン−クロロホルム溶液にて溶出を行った系で、ヒドロキシＤＢＴと思われる物質の存在を確認した。ＧＣ／ＭＳ解析から、ヒドロキシＤＢＴのみが検出され（データ省略）、標的化合物を単離することができた。
（５）1Ｈ−ＮＭＲによるＴｎ３９９のＤＢＴ中間代謝物の解析
1Ｈ−ＮＭＲの解析から、図８に示めすように２−ヒドロキシＤＢＴの蓄積が確認された。このことから、酢酸エチルによって抽出された中間代謝産物は、２−ヒドロキシＤＢＴであることが明らかとなった。
強い酸性化ではジヒドロジオールが不安定になる可能性が高いため、抽出の際に６ＮのＨＣｌを加えず中性にて抽出をおこない解析を試みたが、やはり２−ヒドロキシＤＢＴのみが検出された。Ｔｎ３９９にて蓄積している中間代謝物がＤＢＴのジヒドロジオールであったとしても、そのすべてが２−ヒドロキシＤＢＴになってしまうという可能性は考えにくいことから、Ｔｎ３９９においてなんらかの反応により、２−ヒドロキシＤＢＴのみが生成しているものと考えられる。
従って、本実施例によれば、２−ヒドロキシＤＢＴのみを得ることができるので、混合物からの精製工程を用いることなく、直接目的とするモノヒドロキシ体を得ることができることが明らかであった。
【００４７】
［実施例４］
Ｔｎ３９９における各種芳香族化合物分解産物のＧＣ／ＭＳ解析（定性）
（１）実験方法
ＴＺＳ−７野生株、Ｔｎ３９９株を供試菌株として用いた。
これらＴＺＳ−７及びＴｎ３９９の休止菌体調製には、ＮＢ培地（Difco社）を用いた。培養条件はどちらも３０℃，２００ｒｐｍにて行った。
本実験に用いた基質を図７にまとめる。トルエンは和光純薬工業社製の特級品、ＢＴ、４，６−ＤＭＤＢＴ、ＤＢＦ、ＤＢＤ、ＢＰＨ、１，２−ＮＴ、２，１−ＮＴ、２，３−ＮＴ、ＡＮＴ、ＰＨＥ、ＢＮＴを用いた。その他、有機溶媒などの試薬類は和光純薬工業社製、ナカライテスク株式会社製の特級品、またはそれに準ずるものを用いた。
ＴＺＳ−７及びＴｎ３９９の休止菌体調製法、休止菌体反応、分解産物の抽出については前述と同様に行った。
抽出サンプルの解析にはＧＣ／ＭＳを用いた。分析条件は、実施例３と同様とした。
【００４８】
（２）  Ｔｎ３９９における単環芳香族化合物（mono-aromatic）の分解産物のＧＣ／ＭＳ解析
ＴＺＳ−７野生株またはＴｎ３９９株におけるトルエン、ＢＴの分解産物のＧＣ／ＭＳ解析より、これらの基質ではＤＢＴの分解させたときのようなヒドロキシ化合物の生成は確認できなかった。この結果より、ＤＢＴの分解とは異なりＴＺＳ−７によるトルエン及びＢＴの分解には、ＤＢＴ分解酵素遺伝子とは異なる遺伝子が関与しているものと思われた。
（３）  Ｔｎ３９９における２環芳香族化合物（di-aromatic）の分解産物のＧＣ／ＭＳ解析
図８に示すように、ＤＢＦ分解産物においても野生株では見られない未知ピーク（ピーク２）を確認した。ピーク１のマススペクトルパターンより、この化合物はヒドロキシＤＢＦであることが示唆された。したがって、ＤＢＦもＤＢＴと同様の分解経路により代謝されているものと考えられた。
図９にはＴｎ３９９におけるＤＢＤ代謝産物のクロマトグラムを示した。ＤＢＤでも同様にＴｎ３９９特有のピークが確認され、そのマススペクトルよりヒドロキシＤＢＤの蓄積が示された。
【００４９】
図１０に、Ｔｎ３９９におけるＢＰＨ代謝産物のクロマトグラムを示した。これまでの二環芳香族化合物では基質の分解に伴って生成するピークは一つのみであったが、ＢＰＨにおいてはＴｎ３９９特有のピークが２種類確認され、それぞれのマススペクトルよりどちらも置換位置の異なるモノヒドロキシ化合物、２−ヒドロキシＢＰＨ（ピーク４）、４−ヒドロキシＢＰＨ（ピーク５）であることが示唆された。これまでＢＰＨの中間代謝産物として、さまざまヒドロキシ化合物を生産する例はＤＢＦ、ＤＢＤ同様、糸状菌、酵母などの真核微生物において多く見られている。例えば、ＤＢＤよりヒドロキシＤＢＤを生産する微生物として紹介した白色腐朽菌、Paecilomyces lilacinusは、ＢＰＨの分解産物として２−、３−、４−ヒドロキシＢＰＨを生成することが報告されている。これらの化合物を中間代謝産物として、ヒドロキシル基が順次付加され、最終産物としてＢＰＨの片側のベンゼン環が開裂した化合物を生成する。しかし、原核微生物においてヒドロキシＢＰＨを生成する例は報告されていない。
【００５０】
図１１、図１２に石油汚染の代表的な芳香族化合物である１，２−ＮＴ、２，１−ＮＴのＴｎ３９９における代謝産物のＧＣ／ＭＳクロマトグラム、マススペクトルを示した。これらの化合物でも同様にＴｎ３９９特有のピークが確認され、それぞれヒドロキシ１，２−ＮＴ（図１１、ピーク６）、ヒドロキシ２，１−ＮＴ（図１２、ピーク７）の存在が示唆された。
【００５１】
（４）  Ｔｎ３９９における３環芳香族化合物（tri-aromatic）の分解産物のＧＣ／ＭＳ解析
図１３に示されるように、ＰＨＥにおいてもモノヒドロキシ化合物と思われる物質（ピーク８）が検出された。ピーク１のマススペクトルよりヒドロキシＰＨＥであるものと示唆された。また、図１４に示されるように、ＡＮＴではモノヒドロキシ化合物と思われるピークが２種類確認された（ピーク９、ピーク１０）。それぞれのマススペクトルは非常に類似していたため、いずれのヒドロキシＡＮＴの構造類似体であることが示唆された。
【００５２】
３環のＰＨＥ、ＡＮＴに対してもｂｐｈＢが基質特異性を有しているという結果より、ｂｐｈＢは２環から３環の広範な芳香族化合物に対して基質特異性を有することが示された。ｂｐｈＢがモノヒドロキシ化合物を如何にして代謝しているのか、またｂｐｈＢが本当にモノヒドロキシル化合物の代謝に関わっているのかは定かではないが、トランスポゾンによるｂｐｈＢのノックアウトにより、各種ＰＡＨの代謝系が阻害されたこと、さらにいずれのＰＡＨ代謝産物からもジヒドロジオールが検出されず、モノヒドロキシ化合物のみが検出されたことから、ＴＺＳ−７株がヒドロキシ化合物を介した代謝系を保有していることを強く示す結果が得られた。
【００５３】
［実施例５］
各種ＰＡＨの分解によるヒドロキシ体への変換効率測定（定量）
これまで述べてきたように、Ｔｎ３９９はさまざまなＰＡＨに対してヒドロキシル基を付加することができる優れた微生物である。しかしバイオプロセスによる工業生産を目的とした場合は、純粋なＰＡＨ−ＯＨを大量に得ることがまず重要である。したがって、Ｔｎ３９９によるさまざまなＰＡＨの変換効率について検証を行うこととした。
（１）休止菌体の調製、休止菌体反応、ＰＡＨ分解産物の抽出
Ｔｎ３９９の休止菌体調製法、休止菌体反応については、前述と同様に行った。ＰＡＨのヒドロキシ化合物への変換効率を測定するために、ヒドロキシ化合物の定量にヒドロキシＤＢＴの検量線を用いた。
Ｔｎ３９９によるＰＡＨの変換効率を、表１に示す。最も高い変換効率が確認されたのは１，２−ＮＴで、９０％前後であった。続いてＰＨＥ、ＤＢＴ、ＤＢＤ、２，１−ＮＴ、ＡＮＴの順で変換効率が高く、それぞれ３０〜６０％程度の効率が確認された。
【００５４】
【表１】
2006314224.tif 000004
【００５５】
これらのことから、本発明によれば、芳香族化合物のモノヒドロキシ体を効率よく製造できることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】従来知られているジゲンゾチオフェン環開裂分解経路を示した図である。
【図２】本実施例においてトランスポゾンにより破棄されるｂｐｈＢ遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図３】ＴＺＳ−７におけるｂｐｈＢと各種微生物のアミノ酸配列アライメントを示す図である。図中、矢印は、ＴＺＳ−７のｂｐｈＢ遺伝子にも保存されている核酸結合モチーフと触媒活性部位を示している。TZS-7 ｂｐｈＢ aa Seq：TZS-7株のｂｐｈＢ、pNL1： Sphingomonas  aromaticivorans  F199株のｂｐｈＢ、SDHD： Sphingomonas  sp. BN6株のORF4、DOXE： Pseudomonas  putida C18株のDoxE、KKS.ＢＰＨＢ： Pseudomonas  sp. KKS102株のｂｐｈＢをそれぞれ表す。
【図４】ＴＺＳ−７及びＴｎ３９９のＮＢ培地における生育曲線を示すグラフである。
【図５】Ｔｎ３９９におけるＤＢＴ分解産物のＧＣ／ＭＳ解析を示すグラフであり、（Ａ）は野生株のＤＢＴ分解産物ＧＣクロマトグラム、（Ｂ）はＴｎ３９９のＤＢＴ分解産物ＧＣクロマトグラム、（Ｃ）はＴｎ３９９において検出されたＤＢＴ中間代謝物（ピーク１）のマススペクトルをそれぞれ示す。
【図６】Ｔｎ３９９におけるＤＢＴ分解産物の1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルである。
【図７】本発明の実施例で用いられた芳香族化合物の一覧である。
【図８】Ｔｎ３９９におけるＤＢＦ分解産物のＧＣ／ＭＳ解析を示すグラフであり、（Ａ）はＤＢＦ分解産物のＧＣクロマトグラム、（Ｂ）は、（Ａ）におけるピーク２のマススペクトルを示す。
【図９】Ｔｎ３９９におけるＤＢＤ分解産物のＧＣ／ＭＳ解析を示すグラフであり、（Ａ）は、Ｔｎ３９９におけるＤＢＤ分解産物のＧＣクロマトグラム、（Ｂ）は、（Ａ）におけるピーク３のマススペクトルを示す。
【図１０】Ｔｎ３９９におけるＢＰＨ分解産物のＧＣ／ＭＳ解析を示すグラフであり、（Ａ）は、Ｔｎ３９９のＢＰＨ分解産物のＧＣクロマトグラム、（Ｂ）は、（Ａ）におけるピーク４のマススペクトル、（Ｃ）は、（Ａ）におけるピーク５のマススペクトルをそれぞれ示す。
【図１１】Ｔｎ３９９における１，２−ＮＴ分解産物のＧＣ／ＭＳ解析を示すグラフであり、（Ａ）は、Ｔｎ３９９の１，２−ＮＴ分解産物のＧＣクロマトグラム、（Ｂ）は、（Ａ）におけるピーク６のマススペクトルを示す。
【図１２】Ｔｎ３９９における２，１−ＮＴ分解産物のＧＣ／ＭＳ解析を示すグラフであり、（Ａ）は、Ｔｎ３９９の２，１−ＮＴ分解産物のＧＣクロマトグラム、（Ｂ）は、（Ａ）におけるピーク７のマススペクトルを示す。
【図１３】Ｔｎ３９９におけるＰＨＥ分解産物のＧＣ／ＭＳ解析を示すグラフであり、（Ａ）は、Ｔｎ３９９のＰＨＥ分解産物のＧＣクロマトグラム、（Ｂ）は、（Ａ）におけるピーク８のマススペクトルを示す。
【図１４】Ｔｎ３９９におけるＡＮＴ分解産物のＧＣ／ＭＳ解析を示すグラフであり、（Ａ）は、Ｔｎ３９９のＡＮＴ分解産物のＧＣクロマトグラム、（Ｂ）は、（Ａ）におけるピーク９及び１０のマススペクトルを示す。示すグラフである。
【図１】
2006314224.tif 000005
【図２】
2006314224.tif 000006
【図５】
2006314224.tif 000007
【図６】
2006314224.tif 000008
【図７】
2006314224.tif 000009
【図８】
2006314224.tif 000010
【図９】
2006314224.tif 000011
【図１０】
2006314224.tif 000012
【図１１】
2006314224.tif 000013
【図１２】
2006314224.tif 000014
【図１３】
2006314224.tif 000015
【図１４】
2006314224.tif 000016
【図３】
2006314224.tif 000017
【図４】
2006314224.tif 000018
【配列表】
2006314224000001.app