(57)【要約】【課題】  医薬などの合成中間体として有用なD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸などのD-β-ヒドロキシアミノ酸（式２または式４）を効率よく製造する方法を提供することを課題とする。【化１】2006006216.tif 000009【解決手段】  Pseudomonas putida由来のL-フェニルセリンアルドラーゼを利用することにより、工業的な濃度のDL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を原料として、不要なL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を分解し、効率よくD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を製造することが可能となった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、該蛋白質を発現する微生物または形質転換株、およびそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも１つの酵素活性物質を、式１（式中Rは置換されても良いシクロヘキシル基、フェニル基、アルキル基、アリル基を表す）
【化１】
2006006216.tif 000007
で表されるDL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させ、そして残存する式２で表されるD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程を含む、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を製造する方法。
(a)配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(d)配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
(e)配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
【請求項２】
請求項１におけるRが置換されてもよいシクロヘキシル基であることを特徴とする、請求項１に記載のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
【請求項３】
下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、、該蛋白質を発現する微生物または形質転換株、およびそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも１つの酵素活性物質を、式３（式中Rは置換されても良いシクロヘキシル基、フェニル基、アルキル基、アリル基を表す）
【化２】
2006006216.tif 000008
で表されるDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させ、そして残存する式４で表されるD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程を含む、D-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を製造する方法。
(a)配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(d)配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
(e)配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
【請求項４】
請求項３におけるRが置換されてもよいシクロヘキシル基であることを特徴とする、請求項３に記載のD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
【請求項５】
請求項１または請求項３に記載のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、原料DL-β−ヒドロキシアミノ酸の反応液における濃度が３０g/L以上であることを特徴とする、請求項１または請求項３に記載のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
【請求項６】
請求項１または請求項３に記載のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、原料DL-β−ヒドロキシアミノ酸の濃度が５０g/L以上である事を特徴とする、請求項１または請求項３に記載のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
【請求項７】
請求項１または請求項３に記載のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、原料DL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の濃度が５０g/L以上であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項２または請求項４に記載のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、更に付加的に以下の工程を含む方法。
(1)反応終了後に反応液のｐＨを10以上にすることによりD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を溶解する工程、
(2)不溶物を分離する工程、および
(3)反応液のｐＨを２−９．５に調整することによって析出するD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程
【請求項９】
請求項２または請求項４に記載のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、更に付加的に以下の工程を含む方法。
(1)反応終了後に反応液のｐＨを１．５以下にすることによりD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を溶解する工程、
(2)不溶物を分離する工程、および
(3)ｐＨを２−９．５に調整することにより析出するD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬や農薬等の合成中間体として有用なD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸もしくはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
D-エリスロ-3-ヒドロキシアミノ酸は、従来、以下に述べるような化学合成法によって製造されていた。すなわち、アルデヒド誘導体とグリシンを強アルカリ存在下で縮合させることによりラセミ−スレオ/エリスロ−ヒドロキシアミノ酸誘導体混合物を得た後、スレオ/エリスロ体の相互分離操作を行う。得られたラセミ-エリスロ−ヒドロキシアミノ酸のアミノ基部分に置換基を導入し、キニン、ブルシン等の光学分割剤を用いて光学分割を行う。最後に、アミノ基部分の置換基を除去して製造することができる。しかし、上記プロセスは、工程が煩雑であり、収率が悪いばかりでなく、用いる光学分割剤も高価であり生産コストが高くなるという問題があった。
【０００３】
特許文献１、特許文献２では、グリシンまたはグリシン金属錯体とアルデヒド誘導体をＤ-スレオニンアルドラーゼの存在下、反応させ、D-β-ヒドロキシアミノ酸が製造されている。しかし、上記方法では、α−アミノ基はＤ体特異的に製造できるが、β−水酸基の立体はスレオ体、エリスロ体が共に生成し、ジアステレオマー選択性が低かった。
【０００４】
更に、特許文献３では、ラセミ-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸に、L-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応するアルデヒド誘導体に分解する酵素であるL-アロスレオニンアルドラーゼを作用させることにより、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を製造する方法が記載されている。しかしこの方法では、原料であるラセミ-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸が反応を著しく阻害しない濃度として1-100mMが例示されている。更に多量のラセミ体を与えた場合には、基質阻害、あるいは反応に伴って生成する反応生成物による阻害作用が予測された。またラセミ体が溶解性を超えて添加されたときには、酵素反応が起こりにくくなる心配もある。つまり公知の方法は、工業的に耐えうる製造法とは言い難かった。
【０００５】
【特許文献１】特開平1-317391
【特許文献２】特開平2-207793
【特許文献３】特開平6-165693
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、高い基質濃度においても、D-β-ヒドロキシアミノ酸を生成することができる方法の提供である。より具体的には、たとえば、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸、あるいはD-スレオ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸等の、D-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
さて、L-フェニルセリンを資化する微生物に関する検討の中で、土壌より得られたシュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株 (Pseudomonas putida biovar. A) が、L-フェニルセリンアルドラーゼを生産することが明らかにされている。L-フェニルセリンアルドラーゼは、L-フェニルセリンをベンズアルデヒドとグリシンに分解する作用を有する酵素である。この酵素は精製され、その酵素化学的性質が明らかにされた。更に、この酵素をコードする遺伝子がクローニングされ、その塩基配列とそれによってコードされるアミノ酸配列が決定された（Vitamin (Japan), 75, 51-61, 2001）。
【０００８】
本発明者らは、L-フェニルセリンアルドラーゼをDL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸（以下、DL-ACHPと略す）に作用させることによって、原料に含まれる一方のエナンチオマーであるL-ACHPがシクロヘキシルアルデヒドとグリシンに分解され、D-ACHPが残存することを見出した。すなわち光学純度の高いD-ACHPが生成された。L-フェニルセリンアルドラーゼは、工業的な生産においても十分に有用な、高度なD-β-ヒドロキシアミノ酸に対する反応特異性と酵素作用を有していた。たとえば、L-フェニルセリンアルドラーゼは、１５％という極めて多量の原料の存在下においても十分な酵素活性を維持した。すなわち本発明は、以下のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、並びにD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を製造する方法を提供する。
〔１〕 下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、該蛋白質を発現する微生物または形質転換株、およびそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも１つの酵素活性物質を、式１（式中Rは置換されても良いシクロヘキシル基、フェニル基、アルキル基、アリル基を表す）
【化１】
2006006216.tif 000002
で表されるDL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させ、そして残存する式２で表されるD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程を含む、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を製造する方法。
(a)配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(d)配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
(e)配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
〔２〕 〔１〕におけるRが置換されてもよいシクロヘキシル基であることを特徴とする、〔１〕に記載のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
〔３〕 下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、、該蛋白質を発現する微生物または形質転換株、およびそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも１つの酵素活性物質を、式３（式中Rは置換されても良いシクロヘキシル基、フェニル基、アルキル基、アリル基を表す）
【化２】
2006006216.tif 000003
で表されるDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させ、そして残存する式４で表されるD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程を含む、D-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を製造する方法。
(a)配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(d)配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
(e)配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
〔４〕 〔３〕におけるRが置換されてもよいシクロヘキシル基であることを特徴とする、〔３〕に記載のD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
〔５〕 〔１〕または〔３〕に記載のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、原料DL-β−ヒドロキシアミノ酸の反応液における濃度が３０g/L以上であることを特徴とする、〔１〕または〔３〕に記載のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
〔６〕 〔１〕または〔３〕に記載のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、原料DL-β−ヒドロキシアミノ酸の濃度が５０g/L以上である事を特徴とする、〔１〕または〔３〕に記載のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
〔７〕 〔１〕または〔３〕に記載のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、原料DL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の濃度が５０g/L以上であることを特徴とする方法。
〔８〕 〔２〕または〔４〕に記載のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、更に付加的に以下の工程を含む方法。
(1)反応終了後に反応液のｐＨを10以上にすることによりD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を溶解する工程、
(2)不溶物を分離する工程、および
(3)反応液のｐＨを２−９．５に調整することによって析出するD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程
〔９〕 〔２〕または〔４〕に記載のD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造において、更に付加的に以下の工程を含む方法。
(1)反応終了後に反応液のｐＨを１．５以下にすることによりD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を溶解する工程、
(2)不溶物を分離する工程、および
(3)ｐＨを２−９．５に調整することにより析出するD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、またはD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程
【０００９】
L-フェニルセリンアルドラーゼは、以下に示すような基質特異性を有していることが明らかにされている。まず、以下のような芳香族置換を有する化合物のL体に対しては効率よく作用する。
DL-スレオ-フェニルセリン、
DL-エリスロ−フェニルセリン、および
DL-チエニルセリンなど
しかし、L-スレオニン、L-アロ-スレオニンに対するL-フェニルセリンアルドラーゼの酵素活性は低い。更にL-フェニルセリンアルドラーゼは、L-セリンに対してはほとんど活性を示さない。つまりL-フェニルセリンアルドラーゼには、芳香族アミノ酸にしか高い酵素作用は認められない。したがって、芳香環を有しないL-ACHPに対してL-フェニルセリンアルドラーゼが高い酵素活性を有することは、予想できない結果であった。
【００１０】
また、一般にアルデヒドはアルドラーゼ反応を阻害する。つまりD-ACHPの酵素的な分解によって生成するシクロヘキシルアルデヒドは、L-フェニルセリンアルドラーゼの酵素作用を阻害する恐れがあった。阻害の程度は基質濃度が高いほど大きいと予測される。しかし実際には、１５％以上という極めて高い基質濃度においても極めて効率よくL-ACHPが分解されることも意外な結果であった。また本酵素は、カリウムイオン、アンモニウムイオン、マンガンイオンなどの一価もしくは二価のカチオンにより活性化されない。この特徴も、一般的なスレオニンアルドラーゼとは異なっている。
【００１１】
加えて構造的な特徴から見ても、L-フェニルセリンアルドラーゼのL-ACHPに対する高い酵素活性を予想することは難しい。たとえば前記特許文献３（特開平6-165693）において、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸の製造に利用されているL-アロスレオニンアルドラーゼのうち、アルカリゲネス・ジャディニィ由来のL-アロスレオニンアルドラーゼの塩基配列、およびアミノ酸配列が明らかにされている。そのアミノ酸配列情報をL-フェニルセリンアルドラーゼのそれと比較すると、ホモロジーは２０．４％であった。このように両者の構造には大きな隔たりがある。
また、本発明に用いるL-フェニルセリンアルドラーゼは、3-フェニルセリンのL−スレオ体とL−エリスロ体を良好な基質とするEC 4.1.2.26に分類される酵素である。一方、L-アロスレオニンアルドラーゼは、EC 2.1.2.1に分類され、L-アロスレオニンに最も強く作用する。したがって両者は生化学的にも酵素分類上も全く異なる酵素である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、DL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸あるいはDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を原料として、光学活性なD-β-ヒドロキシアミノ酸を酵素的に製造するための方法が提供された。本発明の方法によって製造されるD-β-ヒドロキシアミノ酸は、エリスロ体、およびスレオ体のいずれにおいても、高い光学純度を与える。すなわち、光学分割剤を利用する従来の方法に対して、高度な光学純度を安価に、かつ容易に達成することができる。
また本発明によれば、多量の原料を用いて、目的とする化合物を効率的に得ることができる。より具体的には、本発明に基づいて、たとえばD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を、実用的な添加量のラセミ体から、簡便、かつ経済的に、工業的に製造することが可能となった。すなわち、本発明における酵素活性物質は、多量の基質、並びに基質から生成する反応生成物による阻害作用を受けにくい。そのため、より多くの原料を用いて、目的とする化合物を効率的に得ることが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、L-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有する酵素活性物質(enzymatic active materials)を前記式１で表されるDL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させ、そして残存する前記式２で表されるD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程を含む、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を製造する方法である。あるいは本発明は、L-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有する酵素活性物質(enzymatic active materials)を前記式３で表されるDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させ、そして残存する前記式４で表されるD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を回収する工程を含む、D-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を製造する方法である。
【００１４】
本発明によるD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造方法において、原料となるDL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、および、DL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸は、下記式１および式３に示される構造を有する。なお本発明において、エリスロ体とスレオ体を特に区別しない場合には、エリスロ体およびスレオ体のいずれか、または両方を意味している。たとえば「D-β-ヒドロキシアミノ酸」は、「D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸およびD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸のいずれか、または両方」であることを意味する。
【００１５】
【化３】
2006006216.tif 000004
【００１６】
式１もしくは式３におけるＲ基としては、低級アルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、アルコキシ基、水酸基などで置換されてもよいシクロヘキシル基、フェニル基、アルキル基、アリル基などが挙げられる。より具体的には、例えば、シクロヘキシル基、フェニル基、チエニル基などが挙げられる。
【００１７】
式１に示されるDL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸は、例えば、式５に示すように、トランス−２，３−エポキシカルボン酸にアンモニア、ベンジルアミンなどのアミンを作用させることにより開環し、必要により脱保護することにより合成することができる。
【００１８】
【化４】
2006006216.tif 000005
【００１９】
また、式３に示されるDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸は、例えば、式６に示すように、アルデヒドとグリシンをアルドール縮合することによりスレオ体選択的に合成することができる。また、シス−２，３−エポキシカルボン酸にアンモニア、ベンジルアミンなどのアミンを作用させることにより開環し、必要により脱保護することにより合成することもできる。
【００２０】
【化５】
2006006216.tif 000006
【００２１】
式１もしくは式３に示されるＲ基がシクロヘキシル基である場合には、Ｒ基がフェニル基である式１もしくは式３に示されるβ−ヒドロキシアミノ酸を合成後、還元（水素付加）によってフェニル基をシクロヘキシル基とすることにより合成することも可能である。
【００２２】
本発明の好ましい態様においては、酵素活性物質を原料であるDL-エリスロ-2-アミノ-3-ヒドロキシプロピオン酸に作用させることによって、D-エリスロ-2-アミノ-3-ヒドロキシプロピオン酸が製造される。酵素活性物質をDL-β-ヒドロキシアミノ酸に作用させる条件として、その酵素作用の維持に好ましい条件を選択することができる。
【００２３】
まず、反応の原料であるDL-β-ヒドロキシアミノ酸の濃度は制限されない。通常０．１〜３０%程度、好ましくは０．５〜２０%、より好ましくは１〜１５%の濃度が用いられる。本発明において、原料として用いられているDL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸は、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸、およびL−エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸の混合物である。混合物中のD体とL体の比率は、D体：L体=10〜90：90〜10であり、好ましくは、D体：L体=25〜75：75〜25、より好ましくはD体：L体=50：50（ラセミ体）である。同様に、原料として用いられるDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸は、D−スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸、およびL−スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の混合物であり、その混合物中のD体とL体の比率は、D体：L体=10〜90：90〜10であり、好ましくは、D体：L体=25〜75：75〜25、より好ましくはD体：L体=50：50（ラセミ体）である。
【００２４】
具体的には、原料となるDL-β-ヒドロキシアミノ酸の反応液における濃度を、たとえば３０g/L以上、あるいは５０g/Lとすることができる。より具体的には、３０〜２００g/L、あるいは３０〜１５０g/L、たとえば６０〜１００g/Lの原料を添加することができる。原料は反応開始時に一括して添加することもできるし、あるいは反応液中に連続的、もしくは間欠的に添加することもできる。
【００２５】
本発明において、原料の濃度は、反応液中に存在する原料の割合を言う。原料は必ずしも完全に溶解していなくてもよい。つまり本発明においては、原料の溶解状態に関わらず、反応液の体積と、その反応液中に存在する原料の重量（添加量）によって決定される。原料の全量が溶解しない場合には、反応液の液相においては原料が飽和した状態にあると言える。
本発明においては、原料の少なくとも一部が反応液中に溶解していれば、必要な反応は進行する。溶解した原料中のD体とL体のうち、L体は酵素活性物質によって対応するアルデヒドとグリシンに分解される。その結果、反応液に溶解した原料の濃度は低下し、新たに原料が溶解し、そのうちのL体が順次分解されてゆく。一方で飽和状態に達したD体は結晶化してゆく。結果として反応系内のL体が順次消費されるため、溶解度が低い原料であっても、目的とするD体を効率的に得ることができる。たとえば、本発明において原料として用いられるDL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸、あるいはDL-スレオ−2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸は、通常の条件では、反応液を構成する溶媒中にはわずかしか溶解しない。しかし上記のようなメカニズムにより、本発明によって、目的とするD体を効率的に回収することができる。
【００２６】
なお、本発明における「%」は、いずれも「重量/容量(w/v)」を意味する。またe.e.は、D-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸の場合、次の式で求められる数値を意味する。
(([D-エリスロ体の濃度]-[L-エリスロ体の濃度])
/([D-エリスロ体の濃度]+[L-エリスロ体の濃度])) x 100
同様に、D−スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸の場合、e.e.は次の式で求められる数値を意味する。
(([D-スレオ体の濃度]-[L-スレオ体の濃度])
/([D-スレオ体の濃度]+[L-スレオ体の濃度])) x 100
【００２７】
使用するL-フェニルセリンアルドラーゼの量は、通常は0.01〜10000 U/mL、好ましくは0.1〜1000 U/mL、より好ましくは1〜500 U/mL程度とすることができる。反応温度は酵素活性物質がその酵素作用を維持できる温度を選択することができる。具体的には、通常5〜60℃、好ましくは10〜50℃、より好ましくは20〜40℃を示すことができる。また反応pHも、酵素活性物質がその酵素作用を維持できる範囲を選択することができる。通常はpH6〜11、好ましくは、pH7〜10、より好ましくはpH8〜9.5を示すことができる。反応は、攪拌下、あるいは静置下で行うことができる。
【００２８】
本発明において、酵素活性物質と原料を含む反応液に、任意の添加物を添加することができる。添加物は、酵素活性の増強、酵素活性の安定化、あるいは反応液の流動性の増加などを目的として添加される。本発明において使用するL-フェニルセリンアルドラーゼは、補酵素としてピリドキサール-5'-リン酸(PLP)を利用する。したがって反応液中にPLPを添加することによって、その酵素活性を増強し、そして安定化すことができる。PLPの反応液中の濃度は、通常0.0001〜１０mM、好ましくは0.001〜1mM、より好ましくは0.005〜0.1mMである。更に、反応液中にトリス-塩酸緩衝液やリン酸カリウム緩衝液などを添加することにより反応液の流動性を改善できる場合がある。
【００２９】
本発明のD-β-ヒドロキシアミノ酸の製造は、水系溶媒中、水に溶解しにくい有機溶媒中、あるいは水に溶解しにくい有機溶媒と水系溶媒の２相系中で実施することができる。本発明に利用することができる水に溶解しにくい有機溶媒として、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、n-ヘキサン、メチルイソブチルケトン、メチルターシャリーブチルエーテル、ジイソプロピルエーテルなどを示すことができる。一方、本発明における水系溶媒としては、水、あるいは酵素活性物質の酵素活性を維持する緩衝液などを示すことができる。
【００３０】
更に、水に溶解する有機溶媒中、あるいは水系溶媒と水に溶解する有機溶媒との混合系中で、原料と酵素活性物質を接触させることもできる。水に溶解する有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、アセトン、ジメチルスルホキシドなどを示すことができる。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
【００３１】
本発明においては、原料に酵素活性物質を作用させることによって、原料中のL-β-ヒドロキシアミノ酸が消費され、反応系には目的の化合物であるD-β-ヒドロキシアミノ酸が残される。本発明においては、立体特異的に目的とする化合物が残されることを、生成と言うことがある。本発明においては、D体とL体を含む原料のL体を酵素的に除去し、残存するD体が目的物として回収される。D体そのものは、もともと原料に含まれていた物質である。しかし、L体と混在するD体を、光学純度の高い状態とすることは、「D体の生成」に他ならない。
反応後に残存するD-β-ヒドロキシアミノ酸は、可溶化、遠心分離や濾過などによる分離、有機溶媒による抽出、イオン交換クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、吸着剤による吸着、凝集剤、脱水剤による脱水もしくは凝集、晶析、蒸留、などを適宜組み合わせることにより精製することができる。D-β-ヒドロキシアミノ酸は、アルカリ性化、もしくは、酸性化により可溶化することができる。
【００３２】
例えば、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の場合、本化合物の水に対する溶解度が低いために、本発明のL-フェニルセリンアルドラーゼが作用しうるｐＨでは大部分が沈殿として析出している。反応終了後、塩酸、硫酸、硝酸などの酸を反応液のｐＨが1．５以下になるまで下げることにより反応液中に残存しているD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を溶解させることができる。あるいは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリを加えることによって、反応液のｐＨを10以上にすることにより、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を溶解させることができる。
【００３３】
反応後の原料を溶解させた後、必要により凝集剤を添加した後に、遠心分離や膜濾過等により除菌、除タンパクを行うことができる。反応により生じたアルデヒドは、アルデヒドの溶解性が高く、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の溶解性が低い有機溶媒を用いて抽出すること等により除去することができる。本発明において、アルデヒドの除去のための有機溶媒として、キシレン、ヘキサン、トルエン、t-メチルブチルエーテル、メチルイソブチルケトン、酢酸エチル、および酢酸ブチルなどを、示すことができる。有機溶媒抽出したアルデヒドは回収して再利用することもできる。有機溶媒抽出後の水相からは、濃縮、等電点沈殿などによる晶析法やイオン交換樹脂処理、膜分離等の公知の方法によりD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を回収することができる。
【００３４】
一方、本発明における酵素活性物質は、例えば、シュードモナス・プチダ属に属し、下記（１）−（３）の性状により特徴づけられるL-フェニルセリンアルドラーゼ産生能を有する微生物より調製することができる。シュードモナス・プチダ属に属する微生物としては、シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株を好適に挙げることができる。すなわちシュードモナス・プチダ属から単離され、以下の性状によって特徴付けられるL-フェニルセリンアルドラーゼは、本発明における酵素活性物質として利用することができる。あるいは、当該酵素を産生するシュードモナス・プチダ属微生物そのもの、あるいはその処理物を本発明の酵素活性物質として利用することができる。
（１） 作用
L-フェニルセリンに作用し、ベンズアルデヒドとグリシンを生成する。
（２） 基質特異性
(a) L-スレオ-フェニルセリン、およびL-エリスロ-フェニルセリンに共に作用するが、D-スレオ-フェニルセリン、およびD-エリスロ−フェニルセリンには実質的に作用しない。
(b)DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸のうち、L-エリスロ体には作用するが、D-エリスロ体には実質的に作用しない。
（３） 分子量
ゲル濾過における分子量が190,000-210,000、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が35,000。
【００３５】
本発明におけるL-フェニルセリンアルドラーゼ活性は、例えば次のように確認することができる。
活性測定法：
20 mM DL-スレオ-フェニルセリン、200 mM TAPS-NaOH緩衝液(pH8.5)、20μM ピリドキサール-5'-リン酸（以下、PLPと省略する）および酵素を含む0.5 mLの反応液中で、30℃、10分間反応を行い、1 N HClを0.5 mL添加することによって反応を停止する。生成したベンズアルデヒドを次の方法によって定量する。1.0 mLの反応終了液に0.15 mLの0.1％ 2,4−ジニトロフェニルヒドラジンを含む2N塩酸溶液を加え、素早く攪拌し、30℃、20分静置する。更に、3 mLのエタノールを加え、素早く攪拌した後、0.85 mLの3 N NaOHを加え、10分間静置する。その溶液の475 nmにおける吸光度を測定する。酵素活性は、30℃において1分間に1 μmolのベンズアルデヒドの生成を触媒する酵素量を1ユニット(U)とした。
【００３６】
また本発明において、酵素が実質的に作用しないとは、上記の活性測定法において、基質として各化合物を与えたときに、同じ条件で測定された良基質に対する活性を１００としたときに、当該化合物に対する活性がたとえば１０％以下、好ましくは５％以下の場合に、実質的に作用しないと言う。具体的には、シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株由来のL-フェニルセリンアルドラーゼの、以下の化合物に対する活性は、それぞれ対応する良基質に対して以下のとおりである。
(a) L-スレオ-フェニルセリンまたはL-エリスロ-フェニルセリンに対する活性を１００とするとき、D-スレオ-フェニルセリンおよびD-エリスロ−フェニルセリンに対する活性は確認できない。
(b)DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸のうち、L-エリスロ体に対する活性を１００とするとき、D-エリスロ体に対する作用は確認できない。
【００３７】
シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株は、細菌の培養に用いられる一般的な培地で培養することができる。本酵素は、DL-スレオ-フェニルセリンなどにより誘導されるため、培地に誘導物質を添加することが好ましい。例えば、１．０％ペプトン、０．２％リン酸1水素2カリウム、０．２％リン酸２水素１カリウム、０．２％塩化ナトリウム、０．０１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．０１％酵母エキスを含むｐＨ７．２のペプトン培地に０．２％DL-スレオ-フェニルセリンを含む培地が好適に利用される。
【００３８】
L-フェニルセリンアルドラーゼは、微生物の培養物から、例えば、以下のようにして精製することができる。シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株を上記０．２％DL-スレオ-フェニルセリンを含むペプトン培地中で十分に増殖させた後に菌体を回収し、緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。このとき、緩衝液に以下のような成分を加えて酵素を保護するのが望ましい。
還元剤：2-メルカプトエタノール等
プロテアーゼ阻害剤：フェニルメタンフルホニルフルオリド、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、および金属キレーター等
ＰＬＰ
目的とする酵素は、こうして得られた無細胞抽出液から、たとえば以下のような各種の蛋白質の分画方法、およびクロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより精製することができる。
蛋白質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）
陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー
キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィー
より具体的には、たとえば、以下の各工程にしたがって、無細胞抽出液から目的とする酵素を電気泳動的に単一バンドにまで精製することができる。各工程の詳細な条件は、たとえば実施例に記載したとおりとすることができる。
４０−６０％硫安分割；
ＤＥＡＥ−セルロースイオン交換クロマトグラフィー；
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー；
ＤＥＡＥ−セルロース陰イオン交換クロマトグラフィー(２回目)
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー；(２回目)
ＭｏｎｏＱ陰イオン交換クロマトグラフィー；
【００３９】
シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株に由来するL-フェニルセリンアルドラーゼは、本発明に利用する酵素活性物質として好ましい。この酵素は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる。本発明に利用する酵素活性物質はまた、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログを含む。すなわち本発明におけるL-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有する酵素活性物質とは、下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、該蛋白質を発現する微生物または形質転換株、およびそれらの処理物からなる群から選択される少なくとも１つの酵素活性物質を含む。
(a)配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
(d)配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
(e)配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
【００４０】
あるいは配列番号：２に記載のアミノ酸配列に、更に付加的なアミノ酸配列を有する蛋白質も、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と同様の活性を有する限り、本発明における酵素活性物質として利用することができる。たとえば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列にHisタグなどを付加した蛋白質は、本発明における酵素活性物質に含まれる。更に、これらの蛋白質を発現する形質転換体、およびそれが産生する組み換え体は、本発明における酵素活性物質に含まれる。
【００４１】
本発明に利用するL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質を意味する。本発明において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等とは、当該蛋白質が前記（１）−（３）に示した物理化学的、酵素化学的性状を有することを意味する。
【００４２】
当業者であれば、配列番号：１記載のDNAに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982), Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。そのL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：２に記載のL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログを得ることが可能である。
【００４３】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、たとえば100以下、通常50以下、好ましくは30以下、より好ましくは15以下、更に好ましくは10以下、あるいは5以下のアミノ酸残基の変異は許容される。一般にタンパク質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は許容される。
【００４４】
また、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、前記理化学的性状（１）および（２）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：１に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したDNAをプローブDNAとし、例えばECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（例えば、wash：42℃、0.5x SSC を含むprimary wash buffer）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。より具体的な「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、42℃、2×SSC、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1％SDSの条件であり、さらに好ましくは、65℃、0.1×SSCおよび0.1％SDSの条件であるが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００４５】
さらに、本発明のL-フェニルセリンアルドラーゼのホモログとは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％以上のホモロジーを有する蛋白質をいう。蛋白質のホモロジー検索は、例えばSWISS-PROT、PIR、DADなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのDNA配列に関するデータベース、DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。
【００４６】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を元にBlastを用いて相同性検索を行った結果、最も高い相同性を示したのは、ラルストニア・ソラナシアラム(Ralstonia solanacearum)由来の予想低基質特異性アルドラーゼ（６８％）であった。機能が同定されている蛋白質の中では、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa) PAO1株由来の低基質特異性L-スレオニンアルドラーゼのアミノ酸配列は、配列番号：２に対する相同性が４１%であった。
【００４７】
L-フェニルセリンアルドラーゼをコードするポリヌクレオチドをプローブとして、土壌等の環境サンプルから直接得られたDNAからスクリーニングすることによっても目的のDNAを得ることができる。ライブラリーには、環境サンプルから得られたDNAの物理的消化物、酵素的消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーを利用することができる。スクリーニングには、コロニーハイブリダイゼーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを利用することができる。上記方法で、ハイブリダイズするＤＮＡを得た後、得られたＤＮＡ塩基配列を解析した結果、コードするアミノ酸配列がL-フェニルセリンアルドラーゼと７０％以上の相同性を有するものは、同様の機能を有することが期待できる。こうして得られたDNAをもつプラスミドによって形質転換された大腸菌も、本発明に利用することができる。
【００４８】
L-フェニルセリンアルドラーゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。たとえば配列番号：１に記載の塩基配列を元にPCR用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体DNAもしくは、cDNAライブラリーを鋳型としてPCRを行うことにより目的のDNAを得ることができる。
あるいは、PCRによって得られたDNA断片をプローブとして、酵素生産株のライブラリーをスクリーニングすることによって目的のDNAを得ることができる。ライブラリーには、染色体DNAの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやcDNAライブラリーを利用することができる。スクリーニングには、コロニーハイブリダイゼーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを利用することができる。
【００４９】
また、PCRにより得られたDNA断片の塩基配列情報に基づいて、その5'側あるいは3'側の塩基配列を取得することもできる。このような方法として、RACE法（Rapid Amplification of cDNA End、「PCR実験マニュアル」p25-33, ＨＢＪ出版局）を利用することができる。あるいは、既知の断片配列情報に基づいて未知の領域を取得するための方法として、逆PCR(Inverse PCR;Genetics 120, 621-623 ,1988）も公知である。逆PCRにおいては、自己環化によって環状化されたDNAライブラリーが用いられる。このようなライブラリーは、酵素生産株の染色体DNAを適当な制限酵素で消化後、自己環化させることにより得ることができる。一方、逆PCR用のプライマーは、既知のcDNAの塩基配列に対して、その外側（未知の領域）に向かって相補鎖合成反応が進むようにデザインされる。鋳型となるDNAは環状化されているので、逆PCRによって未知の領域を増幅産物として得ることができる。
なお本発明のポリヌクレオチドには、以上のような方法によってクローニングされたゲノムDNA、あるいはcDNAの他、合成によって得られたDNAが含まれる。
【００５０】
このようにして単離された、ホモログをコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、L-フェニルセリンアルドラーゼのホモログの発現ベクターを得ることができる。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、L-フェニルセリンアルドラーゼのホモログを組換え体として得ることができる。こうして得られた形質転換体、およびそれが産生するホモログの組み換え体は、本発明における酵素活性物質に含まれる。
【００５１】
本発明においてL-フェニルセリンアルドラーゼまたはそのホモログを発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、L-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、L-フェニルセリンアルドラーゼ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、例えば以下のような微生物を示すことができる。
【００５２】
エシェリヒア（Escherichia）属
バチルス（Bacillus）属
シュードモナス（Pseudomonas）属
セラチア（Serratia）属
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属
コリネバクテリイウム（Corynebacterium）属
ストレプトコッカス（Streptococcus）属
ラクトバチルス（Lactobacillus）属等宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス（Rhodococcus）属
ストレプトマイセス（Streptomyces）属等宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス（Saccharomyces）属
クライベロマイセス（Kluyveromyces）属
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属
チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属
ヤロウイア（Yarrowia）属
トリコスポロン（Trichosporon）属
ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属
ピキア（Pichia）属
キャンディダ（Candida）属等宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ（Neurospora）属
アスペルギルス（Aspergillus）属
セファロスポリウム（Cephalosporium）属
トリコデルマ（Trichoderma）属等宿主ベクター系の開発されているカビ
【００５３】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。
【００５４】
微生物菌体内などにおいて、本発明のL-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子を発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターまたはファージベクターへ本発明のDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−等に関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 （1990）、Yeast 8, 423-488 （1992）、等に詳細に記載されている。
【００５５】
エシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）においては、プラスミドベクターとして、例えばpBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac（β−ガラクトシダーゼ）、trp（トリプトファンオペロン）、tac、trc （lac、trpの融合）、λファージ PＬ、PＲ等に由来するプロモーター等が利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーター等を用いることができる。
【００５６】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミド等が利用可能であり、染色体にインテグレートさせることも可能である。また、プロモーターまたはターミネーターとしてapr（アルカリプロテアーゼ）、 npr（中性プロテアーゼ）、またはamy（α−アミラーゼ）等が利用できる。
【００５７】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）等の宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（RSF1010等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240等が利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子等が利用できる。
【００５８】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）においては、pAJ43（Gene 39, 281 （1985））等のプラスミドベクターが利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００５９】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）においては、pCS11（特開昭57-183799）、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175, 1984)等のプラスミドベクターが利用可能である。
【００６０】
ストレプトコッカス（Streptococcus）属においては、pHV1301（FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 （1985）、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 （1985））等がプラスミドベクターとして利用可能である。
【００６１】
ラクトバチルス（Lactobacillus）属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1(J. Bacteriol. 137, 614,1979)等が利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００６２】
ロドコッカス（Rhodococcus）属においては、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）から単離されたプラスミドベクター等が利用可能である(J. Gen. Microbiol. 138,1003,1992)。
【００６３】
ストレプトマイセス（Streptomyces）属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories （1985）に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）においては、pIJ486 （Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986）、pKC1064（Gene 103,97-99,1991)、pUWL-KS （Gene 165,149-150, 1995)等が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア（Streptomyces virginiae）においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53, 1997)。
【００６４】
サッカロマイセス（Saccharomyces）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae） においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミド等が利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH（アルコール脱水素酵素）、GAPDH（グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素）、PHO（酸性フォスファターゼ）、GAL（β−ガラクトシダーゼ）、PGK（ホスホグリセレートキナーゼ）、ENO（エノラーゼ）等のプロモーターおよびターミネーターが利用可能である。
【００６５】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド(J. Bacteriol. 145, 382-390, 1981)、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームDNA等との相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGK等に由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００６６】
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS （自律複製に関与する遺伝子）、およびサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクター等が利用可能である(Mol. Cell. Biol. 6, 80,1986)。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる(EMBO J. 6, 729, 1987)。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００６７】
チゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ （Zygosaccharomyces rouxii）由来の pSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267, 1985)などに由来するプラスミドベクター等が利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーター、およびチゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr（グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素）のプロモーター(Agri. Biol. Chem. 54, 2521, 1990)等が利用可能である。
【００６８】
ピキア（Pichia）属においては、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta、旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha））において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である(Yeast 7, 431-443, 1991)。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ）、FDH（ギ酸脱水素酵素）のプロモーター等が利用可能である。また、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 （PARS1、PARS2）等を利用した宿主ベクター系が開発されており(Mol. Cell. Biol. 5, 3376, 1985)、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる(Nucleic Acids Res. 15, 3859, 1987)。
【００６９】
キャンディダ（Candida）属においては、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ウチルス （Candida utilis） 等において宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニングされ(Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587,1987)、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターの強力なプロモーターが開発されている（特開平08-173170）。
【００７０】
アスペルギルス（Aspergillus）属においては、アスペルギルス・ニガー （Aspergillus niger） 、アスペルギルス・オリジー （Aspergillus oryzae） 等がカビの中で最もよく研究されており、プラスミド、および染色体へのインテグレーションの利用が可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287,1989)。
【００７１】
トリコデルマ（Trichoderma）属においては、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーター等が利用できる(Biotechnology 7, 596-603, 1989)。
【００７２】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されている。具体的には、蚕などの昆虫(Nature 315, 592-594,1985)、あるいは菜種、トウモロコシ、およびジャガイモ等の植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されている。これらの宿主・ベクター系も、本発明に利用できる。
【００７３】
本発明の方法においては、前記L-フェニルセリンアルドラーゼ活性を有する酵素活性物質を原料に作用させ、反応液中に残存する目的化合物を回収する工程を含む。すなわち酵素活性物質は、原料であるDL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸に作用し、基質であるL-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸を立体選択的に分解することによって、目的化合物であるD-エリスロ-β-ヒドロキシアミノ酸が残存する。あるいは酵素活性物質は、原料であるDL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸に作用し、基質であるL-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸を立体選択的に分解することによって、目的化合物であるD-スレオ-β-ヒドロキシアミノ酸が残存する。
【００７４】
本発明において、酵素活性物質と原料を含む反応溶液の接触形態は任意である。たとえば原料を含む溶媒に、酵素活性物質を混合することによって、両者を接触させることができる。酵素活性物質が溶媒に不溶性の場合には、溶媒中に酵素活性物質が分散され、必要に応じて両者を分離することができる。あるいは原料を含む溶媒と、酵素活性物質を、基質透過性の膜で分離して接触させることもできる。このような接触形態は、酵素活性物質の回収と再利用を容易にする。本発明において、両者の接触形態は、これらの具体例に限定されない。
本発明において、酵素活性物質としては、配列番号：２に記載の蛋白質、またはそのホモログを機能的に発現する形質転換体並びにその処理物を用いることができる。例えば、pKK-PSA1、またはpSE-PSA1により形質転換された大腸菌は、本発明における形質転換体として好ましい。
【００７５】
更に、本発明における配列番号：２に記載の蛋白質、またはそのホモログを発現する形質転換体の処理物には、具体的には以下に示す酵素活性物質が含まれる。
界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物；
凍結乾燥やスプレードライなどにより調製した乾燥菌体；
ガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液；
無細胞抽出液を部分精製したもの；
精製された酵素；
形質転換体あるいは酵素を固定化した固定化酵素、固定化微生物；
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００７６】
〔参考例１〕  シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株 (Pseudomonas putida biovar. A)の培養
シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株を１．０％ペプトン、０．２％リン酸1水素2カリウム、０．２％リン酸２水素１カリウム、０．２％塩化ナトリウム、０．０１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．０１％酵母エキスを含むｐＨ７．２のペプトン培地に植菌し、30℃、12時間振盪培養した。同ペプトン培地に０．２％DL-スレオ-フェニルセリンを含む培地に植菌し、更に３０℃、２４時間振盪培養し、遠心分離により菌体を得た。
【００７７】
〔参考例２〕  L-フェニルセリンアルドラーゼの精製
参考例１により調製した菌２８９ｇを、０．１Ｍ ＴＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．２）、２ｍＭ エチレンジアミン４酢酸(EDTA)、０．０２％ ２−メルカプトエタノールを含む菌体破砕液に懸濁し、超音波により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清画分を１０ｍＭ ＴＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．２）、１ｍＭ EDTA、０．０１％２−メルカプトエタノール、５０μＭ ＰＬＰを含む緩衝液１に透析し、無細胞抽出液とした。
無細胞抽出液に40%飽和まで硫安を添加し、遠心分離により沈殿を除去した。その上清に60%飽和まで硫安を添加し、遠心分離の沈殿画分として本酵素を回収した。
【００７８】
沈殿画分を緩衝液１に溶解し、同緩衝液に透析後、緩衝液１で平衡化したDEAE−セルロースカラム（４．８ ｘ ３８ｃｍ）に本酵素を吸着させた。緩衝液１、０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ塩化カリウムを含む緩衝液１で段階溶出した結果、本酵素は、０．１５Ｍ及び０．２Ｍ塩化カリウムを含む緩衝液１で溶出した。活性画分を集め、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、０．０１％２−メルカプトエタノールを含む緩衝液２に対して透析した。
【００７９】
次に、緩衝液２で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（１．７ x １８ｃｍ）に酵素を吸着させ、０．０１Ｍ、０．０２Ｍ、０．０３Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液で段階溶出した。０．０１Ｍ、０．０２Ｍ及び０．０３Ｍリン酸緩衝液で溶出した活性画分を回収し、濃縮後、緩衝液１に透析した。
【００８０】
緩衝液１で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（１．７ ｘ １９ｃｍ）に透析した酵素を吸着させ、同緩衝液で洗浄後、０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ塩化カリウムを含む緩衝液１で段階溶出を行った。本酵素は、０．１５Ｍ塩化カリウムを含む緩衝液１で溶出した。活性画分を濃縮後、緩衝液２に透析した。
【００８１】
緩衝液２で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（１．７ x １８ｃｍ）に酵素を吸着し、緩衝液２で洗浄後、０．０１Ｍ、０．０３Ｍ、０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液で溶出した。本酵素は、０．０３Ｍリン酸カリウムで溶出した。活性画分を回収、濃縮後、緩衝液１に対して透析した。
【００８２】
緩衝液１で平衡化したMonoQカラム（０．５ ｘ ５ｃｍ）に酵素を吸着し、同緩衝液で洗浄後、０から０．５Ｍ塩化カリウムの勾配溶出を行った。溶出した活性画分を回収し、精製酵素とした。
精製酵素をゲル電気泳動に供した結果、Native−ポリアクリルアミド、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドいずれの条件においても単一バンドを示した。
【００８３】
精製の要約を表１に示した。
〔表１〕
L-フェニルセリンアルドラーゼの精製
==================================================================
ステップ                       総蛋白質  総活性  比活性   収率 
(mg)     (U)    (U/mg)    (倍)
==================================================================
無細胞抽出液                    38100     25500     0.669    1    
40-60%硫安画分                  24200     25400     1.05     1.57 
DEAE-セルロース(1回目)           8670     21300     2.46     3.67 
ハイドロキシアパタイト(1回目)     803      8190    10.2     15.2  
DEAE-セルロース(2回目)             98.7    4690    47.5     71.0  
ハイドロキシアパタイト(2回目)      29.2    2180    74.7    112    
MonoQ                               8.8    2730   310      464    
==================================================================
【００８４】
〔参考例３〕  L-フェニルセリンアルドラーゼの分子量
精製酵素を、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷカラム(東ソー製)を用い、１０ｍＭ ＴＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．２）、０．０１％ ２−メルカプトエタノール及び０．１Ｍ塩化カリウムを含む溶離液でゲル濾過を行った結果、分子量は約210,000であった。同緩衝液を用い、セファデックスＧ−２００を用いてゲル濾過を行った結果、分子量は約190,000であった。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサブユニットの分子量を測定した結果、約35,000であった。これらの結果より、本酵素は、同一サブユニットの6量体と予想された。
【００８５】
〔参考例４〕  L-フェニルセリンアルドラーゼの至適ｐＨ
L-フェニルセリンアルドラーゼを、酢酸ナトリウム緩衝液、ＴＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、トリス-塩酸緩衝液、ＴＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液を用いて活性測定を行い、DL-スレオ-フェニルセリンに対する分解活性を測定し、図1に示した。
最適ｐＨは、ＴＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５）で得られた。
【００８６】
〔参考例５〕  L-フェニルセリンアルドラーゼの基質特異性
参考例２により精製したL-フェニルセリンアルドラーゼを用い、標準活性測定条件において基質を変えて活性を測定した。
DL-スレオ-β-フェニルセリンに対する活性を１００とした相対活性で表し、表２に示した。
【００８７】
〔表２〕
L-フェニルセリンアルドラーゼの基質特異性
==============================================
基質                                  相対活性
==============================================
DL-スレオ-β-フェニルセリン              100  
DL-エリスロ-β-フェニルセリン            130  
L-スレオニン                               2.1
D-スレオニン                               0  
L-アロ-スレオニン                          8  
D-アロ-スレオニン                          0  
L-セリン                                   0  
D-セリン                                   0  
DL-β-チエニルセリン                     170  
DL-β-ヒドロキシノルバリン                 0  
L-フェニル乳酸                             0  
DL-β-ヒドロキシフェニルエチルアミン       0  
==============================================
【００８８】
〔参考例６〕  L-フェニルセリンアルドラーゼの活性に及ぼすカチオンの影響
標準活性測定条件において、基質DL-スレオ-β-フェニルセリン及びＰＬＰを除く反応液に酵素とカチオンを添加し、３０℃、１０分間インキュベート後、DL-スレオ-β-フェニルセリン及びＰＬＰを添加して活性を測定した。カチオンを添加しない条件で活性測定した場合の活性値を１００とした相対活性で表し、表３に示した。
【００８９】
〔表３〕
L-フェニルセリンアルドラーゼ活性に及ぼすカチオンの影響
===================================
化合物            濃度    相対活性
(mM)       (%)  
===================================
無添加             -        100
塩化カリウム      50         94
塩化アンモニウム  50         92
塩化ナトリウム    50         88
硫酸アルミニウム  0.1        92
塩化バリウム      0.1        90
塩化マンガン      0.1        92
硫酸銅            0.1        89
硫酸ニッケル      0.1        91
塩化コバルト      0.1        98
塩化マグネシウム  0.1        98
硫酸鉄(II)        0.1        91
塩化亜鉛          0.1        92
===================================
【００９０】
〔実施例１〕  シュードモナス  プチダからの染色体ＤＮＡの精製
シュードモナス・プチダ・バイオバーＡ ２４−１株を１．５％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウムを含む培地で培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体DNAの精製は、Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)に記載の方法により行った。
【００９１】
〔実施例２〕  L-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子のコア配列のクローニング
参考例２で得られた精製酵素をトリプシン消化して得られたペプチドのアミノ酸配列（配列番号：３及び４）を元に、プライマー１２及びPrimerCを合成した。
配列番号：３
Gln-Ala-Gly-Pro-Tyr-Gly-Thr-Asp-Glu-Leu
配列番号：４
Phe-Gly-Phe-Tyr-His-Asp-Arg-Trp
配列番号：５ プライマー１２
GGGAATTCAGGCGGGCCCGTATGGCACCGACCGACGA
配列番号：６ プライマーＣ
AAGCCGAAGATAGTGCTGGGCGACCCCTAGGGG
【００９２】
各50 pmolのプライマーセット、10 nmolのdNTP、50 ngの染色体DNA、AmpliTaq DNAポリメラーゼ用緩衝液(パーキンエルマー社製)、3 mMのMgCl2、2.5 UのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)を含む50 μLの反応液を用い、変性(94℃、1分)、アニ−ル(50℃、2分)、伸張(65℃、3分)を30サイクル、DNA Thermal Cycler(パーキンエルマー社製)を用いてPCRを行った。
【００９３】
増幅したDNAの塩基配列を解析した。DNA塩基配列の解析には、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS ready Reaction Kit(パーキンエルマー社製)を用いてPCRを行い、DNAシーケンサーABI PRISMTM 310(パーキンエルマー社製)により行った。得られた配列を配列番号：７に示した。
【００９４】
〔実施例３〕  L-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子の全領域のクローニング
コア配列の塩基配列を元に、プローブU2及びプローブCの3つのオリゴヌクレオチドを合成した。これらの合成DNAをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。
配列番号８： プローブＵ２
TGATGACCGTCGACGGCCCG
配列番号９： プローブC
CGGCCTTCAGCAGCGCATCGA
【００９５】
すなわち、制限酵素SphIで消化した染色体DNAを泳動したアガロースゲルをナイロンメンブレンフィルター(デュポン社製)ブロッティングした。ブロッティングしたメンブレンを2×SSC溶液で洗浄後、0.4 M NaOHで1分間アルカリ処理し固定した。続いて0.2 M トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)-2×SSC溶液で中和処理後、風乾した。このメンブレンをハイブリダイゼーション液（0.1% 牛血清アルブミン、0.1% フィコール、0.1% ポリビニルピロリドン、0.75 mM NaCl、75 mM クエン酸ナトリウム、1% SDS）に浸し、45〜55℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った。次に、250 μgの熱変性サケ精子DNAと32Pでラベルしたプローブを加えたハイブリダイゼーション液で更に45〜55℃で一晩ハイブリダイゼーション処理した。ハイブリダイズしたメンブレンを6×SSC-0.5% SDS溶液で洗浄した。続いて同溶液で55℃、2分間洗浄し、2×SSC溶液で軽くすすいだ後、風乾し、オートラジオグラフィーを行った。
【００９６】
その結果、染色体DNAをSphIで消化して得られた約6.7 kbのDNA断片が、どちらのプローブとも強くハイブリダイズすることが確認されたため、該DNA断片部分をゲルから切り出し、同制限酵素SphIで消化したpUC19とTaKaRa DNA Ligation Kit(タカラバイオ製)を用いて、ライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、約700個のクローン株を得た。
【００９７】
得られた約700個のクローン株について、合成DNAプローブU2用いてコロニーハイブリダイゼーションを行った結果、放射活性が強い41個のコロニーを選択した。これらのクローン株から目的とする約6.7 kbの挿入DNA断片を含むプラスミドを選択し、pPSA2とした。
【００９８】
pPSA2の挿入DNA断片の塩基配列を解析した結果、コア配列を含む1074 bpのオープンリーディングフレーム（ORF）を確認できた。得られた塩基配列及びこの塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号：1及び２に示した。
【００９９】
〔実施例４〕  L-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子高発現プラスミドpKK-PSA1の構築
該L-フェニルセリンアルドラーゼの高発現株を構築した。まず、pPSA2の挿入DNA断片の塩基配列をもとに、該L-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子のORFの上流部位及び下流部位に対応するそれぞれのオリゴヌクレオチドPrimer PSA-ECO及びPrimer PSA-HINを合成した。
配列番号：１０ プライマー ＰＳＡ−ＥＣＯ
GGGAATTCGACCATCAGGCGAGCGTCAA
配列番号：１１ プライマー ＰＳＡ−ＨＩＮ
GGAAGCTTCCAGAGCGAGCACAGCCGCCAC
【０１００】
プラスミドpPSA2を鋳型として、各10 pmolのプライマーセット、0.2 mMのdNTP、AmpliTaq DNAポリメラーゼ用緩衝液(パーキンエルマー社製)、2.5 UのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)を含む50 μLの反応液を用い、変性(94℃、30秒)、アニ−ル(50℃、30秒)、伸張(72℃、1分)を30サイクル、DNA Thermal Cycler(パーキンエルマー社製)を用いてPCRを行った。増幅DNA断片を制限酵素EcoRI及びHindIIIを用いて2重消化し、同様に2重消化したpKK223-3にライゲーションしてpKK-PSA1を得た。該L-フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子を含むプラスミドpKK-PSA1は次のとおりFERM P-20054として寄託された。以下に、寄託物を特定するための情報を記載する。
(a)寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号中央第６（郵便番号305-8566）
(b)寄託日：平成１６年４月１３日
(c)受託番号：FERM P-20054
【０１０１】
〔実施例５〕  L-フェニルセリンアルドラーゼの活性確認
実施例４で得られたプラスミドpKK-PSA1で形質転換された大腸菌JM109株を、アンピシリン(50 mg/L)を含む液体LB培地（バクト−トリプトン１０/L、バクト−酵母エキス５g/L、塩化ナトリウム１０g/L、ｐＨ７．２）に植菌し、30℃で終夜培養した後、アンピシリン(50 mg/L)を含む2×YT培地（バクト−トリプトン２０g/L、バクト−酵母エキス１０g/L、塩化ナトリウム１０g/L、ｐＨ７．２）に植菌し、30℃で培養した後、0.1 mM IPTGにより誘導を4時間行い、遠心分離により集菌体を得た。集菌後、0.02% 2-メルカプトエタノール、2 mM EDTA、20 μM ピリドキサール-5'-リン酸を含む100 mM TES−NaOH緩衝液（pH7.2）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）を用いて3分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を無細胞抽出液としてL-フェニルセリンアルドラーゼ活性を測定した結果、２０．０U/mgの比活性を有することが確認できた。
【０１０２】
〔実施例６〕  該L-フェニルセリンアルドラーゼのDL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸に対する活性
実施例５で得られた無細胞抽出液を用いて、DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸に対する活性を測定した結果、６．２６Ｕ／ｍｇの活性を有し、DL-スレオ-フェニルセリンに対する活性を100%として31.3%の相対活性を有することを見出した。
【０１０３】
〔実施例７〕  大腸菌JM109 (pKK-PSA1)を用いたD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の合成
実施例６により得られたプラスミドpKK-PSA1を有する大腸菌JM109株を用いてD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の合成を行った。
【０１０４】
400 mM Tris-HCl緩衝液(ｐH8.5)、50 μM ピリドキサール-5’-リン酸、DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸および菌体を含む10 mLの反応液を、攪拌下、30℃で終夜反応させた。反応終了後、残存したD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の定量、及び光学純度を次のようにして分析した。
【０１０５】
反応終了液を1 N HClで希釈し、遠心分離上清をCROWNPAK CR(+)(０．４６ x １５ｃｍ、ダイセル化学工業株式会社製)を用いて分析した。D-エリスロ体は２４．２分に、L-エリスロ体は２８．０分に溶出した。
【０１０６】
結果を表４に示した。DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の濃度を１％、５％、１０％、１５％とした何れの場合においても、不要な異性体の分解は完全に進行し、残存したD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸が99％e.e.以上の光学純度で得られることが確認できた。
〔表４〕
=========================================================
基質                                        D-エリスロ体
DL-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-          光学純度
3-ヒドロキシプロピオン酸                                 
=========================================================
１％                                      99％e.e
５％                                      99％e.e
１０％                                      99％e.e
１５％                                      99％e.e
=========================================================
【０１０７】
〔実施例８〕  D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の精製−１
実施例７において基質15%で反応した反応終了液に硫酸を添加し、反応終了液のpHを0.5まで低下させることにより反応液中に残存するD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を溶解させた。遠心分離により菌体等の不要物を分離し、得られた上清に水酸化ナトリウムを添加して約pH6に中和することにより、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を結晶化させ、濾過により結晶を得た。結晶の純度は約96%、光学純度は>99%eeであった。
【０１０８】
〔実施例９〕  D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の精製−２
実施例７において基質15%で反応した反応終了液に水酸化ナトリウムを添加し、反応終了液のpHを12まで上げることにより反応液中に残存するD-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を溶解させた。遠心分離により菌体等の不要物を分離し、得られた上清に硫酸を添加して約pH6に中和することにより、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を結晶化させ、濾過により結晶を得た。結晶の光学純度は>99%eeであった。
【０１０９】
〔参考例７〕  ３−シクロヘキシル−２−プロペン酸の製造方法
マロン酸２３．９ｇにトルエン５８．１ｇ加え、６５℃まで昇温し、ピリジン２７．１ｇ、ピペリジン０．５４ｇを滴下した。さらにシクロヘキシルアルデヒド３０．０ｇを滴下後、１０時間反応させた。反応終了後冷却し、３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９３．３ｇを加え攪拌後、上層のトルエン相を除去した。下層にt-ブチルメチルエーテル５５．５ｇ、濃塩酸５５．８ｇを加え、攪拌後下層を除去した。上層のt-ブチルメチルエーテル相に水２４．８ｇ及び濃塩酸０．２９ｇを加え、攪拌後下層を除去した。上層のt-ブチルメチルエーテル相を減圧濃縮し、３−シクロヘキシル−２−プロペン酸３３．０ｇを得た。
【０１１０】
〔参考例８〕  ３−シクロヘキシル−２，３−エポキシプロピオン酸の製造
タングステン酸ナトリウム２水和物４．３ｇに水６４．４ｇを加え溶解させ、４０℃に加温した。これに３−シクロヘキシル−２−プロペン酸２０ｇ及びメタノール１５．８ｇを加え、さらに３０％過酸化水素水２９．４ｇを滴下した。２５％水酸化ナトリウム水溶液を用いて、反応液のｐＨを４．５〜５．０の範囲にコントロールしながら４０℃にて２０時間反応させた。反応終了後１０℃以下まで冷却し、３５％重亜硫酸ナトリウム及び２５％水酸化ナトリウム水溶液をｐＨ４．０〜６．０に保ちながら滴下し、過酸化水素を分解した。減圧条件下にてメタノールを留去した後、濃塩酸を用いてｐＨを２．０〜３．０に調整した。ｔ−ブチルメチルエーテル６７６ｇを加え３０分以上攪拌した後、３０分以上静置した。下層を分液した後、上層をろ過した。このろ液を減圧下で濃縮することで淡黄色油状の３−シクロヘキシル−２，３−エポキシプロピオン酸１６．２ｇを得た。
【０１１１】
〔参考例９〕  2-ベンジルアミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の製造
３−シクロヘキシル−２，３−エポキシプロピオン酸１０.０ｇに水２１.０ｇ及び２５％水酸化ナトリウム水溶液９．４ｇを加え溶解させ、４０−５５℃に昇温した。ベンジルアミン１８．９ｇを滴下し、９０℃で１０時間反応させた。反応後３０℃以下まで冷却した後、濃塩酸１７．１ｇ、水６１．１ｇ、ｔ−ブチルメチルエーテル９．９ｇの混合液に反応液を滴下した。滴化後２５％水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨを３．５に調整し、３０分攪拌した。析出した結晶をろ過し、結晶をアセトン、水で洗浄し、５０℃で減圧下乾燥することで2-ベンジルアミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸１３．９ｇを得た。
【０１１２】
〔参考例１０〕  2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸の製造方法
2-ベンジルアミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸１３．０ｇにメタノール６２．８ｇ、水３９．４ｇ、２５％水酸化ナトリウム水溶液７．５ｇ及び触媒として５０％含水水酸化パラジウム（活性炭担持物）０．７ｇを加え、水素ガスで５００ＫＰａまで加圧し、５０℃で４時間反応を行った。反応後１２％水酸化ナトリウム水溶液７．７ｇを加えて３０分攪拌後、濾過することで触媒を除去した。ろ液を減圧濃縮し、メタノール、トルエンを除去し、濃塩酸にてｐＨを５．８に調整した。析出した結晶を濾過し、水で洗浄後、減圧下乾燥することで2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸７．９ｇを得た。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明によって製造されるD-β-ヒドロキシアミノ酸は、医薬品あるいは農薬などの合成中間体として有用である。より具体的には、本発明によって、たとえば、D-エリスロ-2-アミノ-3-シクロヘキシル-3-ヒドロキシプロピオン酸を、工業的な規模で効率的に合成することができる。
【配列表】
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