(57)【要約】      （修正有）【課題】本質的にスギ花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープのみからなるペプチドを提供すること、及び、有効成分として上記ペプチドを含んでなる抗スギ花粉症剤を提供すること。【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むことから成るペプチド等、でありスギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に実質的に反応しないで、ヒトを含む哺乳類一般に投与すると、実質的にアナフィラキシーを引起こす事なく、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を活性化することができるペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列から成るペプチド。
【請求項２】
配列番号３のアミノ酸配列から成るペプチド。
【請求項３】
配列番号９のアミノ酸配列から成るペプチド。
【請求項４】
配列番号１０のアミノ酸配列から成るペプチド。
【請求項５】
配列番号１７のアミノ酸配列から成るペプチド。
【請求項６】
配列番号１８のアミノ酸配列から成るペプチド。
【請求項７】
配列番号１９のアミノ酸配列から成るペプチド。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項９】
配列番号３のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項１０】
配列番号４のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項１１】
配列番号５のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項１２】
配列番号６のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項１３】
配列番号９のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項１４】
配列番号１０のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項１５】
配列番号１１のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項１６】
配列番号１２のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項１７】
配列番号１３のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項１８】
配列番号１４のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項１９】
配列番号１５のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項２０】
配列番号１６のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項２１】
配列番号１７のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項２２】
配列番号１８のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項２３】
配列番号１９のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項２４】
配列番号２０のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項２５】
配列番号２１のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項２６】
配列番号２２のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項２７】
配列番号２３のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【請求項２８】
配列番号２４のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、スギ花粉アレルゲンに特異的に反応するＴ細胞を活性化するペプチド、及び、そのペプチドを有効成分として含んでなる免疫療法剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ここ数十年来、我国においては、春先になるとスギ花粉症による鼻炎や結膜炎を訴える人の数が増加し続けている。スギ花粉症はアルレギー症の一種であり、その主因はスギ花粉中の抗原性物質、すなわち、スギ花粉症アレルゲンであるといわれている。大気中に飛散したスギ花粉がヒトの体内に侵入すると、スギ花粉アレルゲンに対するイムノグロブリンＥ抗体が産生する。この状態で次にスギ花粉が侵入すると、その花粉中のアレルゲンとこのイムノグロブリンＥ抗体が免疫反応を起し、アレルギー症状を呈することとなる。
【０００３】
スギ花粉中に抗原性の相違する少なくとも二種類のアレルゲンの存在することが現在までに知られている。その一つは、ヤスエダ等が『ジャーナル・オブ・アレルギー・アンド・クリニカル・イムノロジー』、第７１巻、第１号、第７７〜８６頁（１９８３年）に報告しているアレルゲンであり、今日、これは「Ｃｒｙｊ１」と呼称されている（非特許文献１）。なお、Ｃｒｙｊ１ はその全長アミノ酸配列が決定され、国際出願されている（特許文献１：ＷＯ ９３／０１２１３）。
【０００４】
もう一つは、タニアイ等『エフ・イー・ビー・エス・レターズ』、第２３９巻、第２号、第３２９〜３３２頁（１９８８年）やサカグチ等『アレルギー』、第４５号、第３０９〜３１２頁（１９９０年）に報告されているアレルゲンであり、今日、これは「Ｃｒｙ ｊ ２」と呼称されている（非特許文献２及び３）。なお、Ｃｒｙ ｊ ２はその全長アミノ酸配列が決定され、国際出願されている（特許文献２：ＷＯ ９４／１１５１２）。また、 Komiyama らも別個にＣｒｙｊ２の全長アミノ酸配列を決定しているがBiochem. Biophys. Res, Comm., vol.201, No.2, 1021-1028, (1994)（非特許文献４）、ＷＯ ９４／１１５１２記載のアミノ酸配列とはアミノ酸残基が４か所異なっている。
【０００５】
スギ花粉中には、通常、Ｃｒｙｊ１とＣｒｙｊ２が約５０：１乃至５：１の割合で存在し、花粉症患者から採取した血清の殆どがＣｒｙｊ１にもＣｒｙｊ２にも反応すると云われている。澤谷らは、『アレルギー』、第４２巻、第６号、第７３８〜７４７頁（１９９３年）において、Ｃｒｙｊ２は、皮内反応試験やＲＡＳＴ試験において、Ｃｒｙｊ１と同程度の抗原性を発揮すると報告している（非特許文献５）。
【０００６】
このように、スギ花粉アレルゲンが既に幾つか単離され、その性質、性状もある程度解明されたことから、精製スギ花粉アレルゲンをヒトに投与して減感作することにより、スギ花粉症を治療・予防できる見通しがついてきた。最近ではそのための減感作剤も幾つか考案されており、例えば、特許文献３：特開平１−１５６９２６号公報や特許文献４：特開平３−９３７３０号公報には、Ｎ末端からのアミノ酸配列がＡｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ又はＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎで表わされるスギ花粉アレルゲンに糖質を共有結合せしめ、生成した複合体を減感作剤としてヒトに投与する提案が為されている。
【０００７】
しかしながら、アレルギー症の診断や減感作療法には、通常、高純度のアレルゲンが大量に必要とされ、スギ花粉中のアレルゲンは僅少であるうえに安定性が低く、スギ花粉症の診断剤や減感作剤をスギ花粉だけで賄おうとすると、多大の困難が伴なう。このようなことから、最近のアレルギー疾患の治療・予防においては、これまでのように、患者にアレルゲン全体を投与するのではなく、アレルゲン中のＴ細胞が特異的に認識する最小領域、すなわち、本質的にＴ細胞エピトープのみからなる低分子のペプチドを投与する免疫療法が注目されている。
【０００８】
一般に、アレルゲンは、マクロファージなどの抗原提示細胞に取込まれると、そこで消化され、消化断片が免疫提示細胞表層のＨＬＡ（Human Leucocyte Antigen ）蛋白質に結合し、抗原提示されることとなる。抗原提示される断片は、ＨＬＡ蛋白質に対する親和性などにより、アレルゲンにおける一部の特定領域に限られ、斯かる領域のうち、Ｔ細胞が特異的に認識する領域は、通常、「Ｔ細胞エピトープ」と呼称される。実質的にＴ細胞エプトープのみからなるペプチドを投与する免疫療法には、
(i) ペプチドがＢ細胞エピトープを欠いている、すなわち、アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体が反応しないので、従来の粗製又は精製アレルゲンで頻発していたアナフィラキシーなどの副作用が起こり得ない。
(ii) 少量からスタートし、有効投与量に達するまでの期間が、従来の減感作剤に比較して、大幅に短縮できる。
(iii) 経口免疫寛容を誘導し、アレルゲンに対するアレルギー反応を減弱することができる。などの利点がある。
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ ９３／０１２１３
【特許文献２】ＷＯ ９４／１１５１２
【特許文献３】特開平１−１５６９２６号公報
【特許文献４】特開平３−９３７３０号公報
【非特許文献１】ヤスエダ等、『ジャーナル・オブ・アレルギー・アンド・クリニカル・イムノロジー』、第７１巻、第１号、第７７〜８６頁（１９８３年）
【非特許文献２】タニアイ等、『エフ・イー・ビー・エス・レターズ』、第２３９巻、第２号、第３２９〜３３２頁（１９８８年）
【非特許文献３】サカグチ等、『アレルギー』、第４５号、第３０９〜３１２頁（１９９０年）
【非特許文献４】コミヤマ等、『バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション』第２０１巻、第２号、第１０２１〜１０２８頁（１９９４年）
【非特許文献５】サワタニ等、『アレルギー』、第４２巻、第６号、第７３８〜７４７頁（１９９３年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、上記Ｔ細胞エピトープを構成する最小単位のアミノ酸配列を見出し、本発明を完成した。この発明の第一の課題は、本質的のスギ花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープのみからなるペプチドを提供することにある。この発明の第二の課題は、有効成分として上記ペプチドを含んでなる抗スギ花粉症剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
（１）配列番号２のアミノ酸配列から成るペプチド。
（２）配列番号３のアミノ酸配列から成るペプチド。
（３）配列番号９のアミノ酸配列から成るペプチド。
（４）配列番号１０のアミノ酸配列から成るペプチド。
（５）配列番号１７のアミノ酸配列から成るペプチド。
（６）配列番号１８のアミノ酸配列から成るペプチド。
（７）配列番号１９のアミノ酸配列から成るペプチド。
【００１２】
（８）配列番号２のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（９）配列番号３のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（１０）配列番号４のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（１１）配列番号５のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（１２）配列番号６のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（１３）配列番号９のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【００１３】
（１４）配列番号１０のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（１５）配列番号１１のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（１６）配列番号１２のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（１７）配列番号１３のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（１８）配列番号１４のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（１９）配列番号１５のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（２０）配列番号１６のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（２１）配列番号１７のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【００１４】
（２２）配列番号１８のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（２３）配列番号１９のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（２４）配列番号２０のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（２５）配列番号２１のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（２６）配列番号２２のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（２７）配列番号２３のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
（２８）配列番号２４のアミノ酸配列から成るペプチドを有効成分とする抗スギ花粉症剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、スギ花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープのみからなるペプチド及びそれらを有効成分として含んでなる抗スギ花粉症剤を提供することができた。そして、本発明のペプチドは、スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に実質的に反応しないので、ヒトを含む哺乳類一般に投与すると、実質的にアナフィラキシーを引起こすことなく、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を活性化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳しく説明する。本発明における好ましいペプチドの例は表１の通りである。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
なお、上記のペプチド１は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド２は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド３は、配列表の配列番号３のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド４は、配列表の配列番号４のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド５は、配列表の配列番号５のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド６は、配列表の配列番号６のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド７は、配列表の配列番号７のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド８は、配列表の配列番号８のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド９は、配列表の配列番号９のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド１０は、配列表の配列番号１０のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド１１は、配列表の配列番号１１のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド１２は、配列表の配列番号１２のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド１３は、配列表の配列番号１３のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド１４は、配列表の配列番号１４のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド１５は、配列表の配列番号１５のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド１６は、配列表の配列番号１６のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド１７は、配列表の配列番号１７のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド１８は、配列表の配列番号１８のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド１９は、配列表の配列番号１９のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド２０は、配列表の配列番号２０のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド２１は、配列表の配列番号２１のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド２２は、配列表の配列番号２２のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド２３は、配列表の配列番号２３のアミノ酸配列で示されるペプチド、
上記のペプチド２４は、配列表の配列番号２４のアミノ酸配列で示されるペプチド、をそれぞれ表す。
【００１９】
上記（１）乃至（７）に記載のペプチドは、「固相法」又は「液相法」として知られる斯界において慣用のペプチド合成法により、容易に調製することができる。例えば、社団法人日本生化学会編『新生化学実験講座』、第１巻、「タンパク質ＶＩ」、第３〜４４頁、１９９２年、東京化学同人発行などにはペプチド合成の詳細が記載されている。また、該ペプチドは、マルチペプチドシンセサイザー SYMPHONY （プロティンテクノロジー社製）を用い、Fmoc (9-fluorenyl methyloxycarbonyl) 固相合成法にて同装置のプロトコールに従って合成することができる。すなわち、合成する各ペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸が導入されている Fmoc-L-アミノ酸 Wang 樹脂を上記ペプチド合成装置の反応容器にセットし、デプロテクション溶液を用いて Fmoc を除く。さらにＣ末端から２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸溶液とアクチベーター溶液を反応せしめ、反応後再び Fmoc 基のデプロテクションを行い、同様の操作を繰り返すことにより、目的とするペプチドを合成することができる。
【００２０】
本発明のペプチドは化学合成により調製されたものに限定されず、例えば、スギの花粉又は雄花から採取するか、組換えＤＮＡ技術により調製したスギ花粉アレルゲンを適宜分解し、分解物から採取したものであってもよく、例えば、上記（１）乃至（７）に記載されたペプチドをコードするＤＮＡを調製し、これを自律複製可能なベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母などの適宜宿主に導入して形質転換体とし、その培養物からこの発明のペプチドを採取してもよい。
【００２１】
さらに、この発明のペプチドは、斯くして得られるペプチドに糖質やポリエチレングリコールを付加して得られる複合体としての形態、さらには、ペプチドをアセチル化、アミド化及び／又は多官能試験により架橋重合させて得られる誘導体又は重合体としての形態であってもよい。
【００２２】
この発明のペプチドは、比較的粗な形態で投与しても所期の治療・予防効果を発揮するが、通常は使用に先立って精製される。精製には、例えば、濾過、濃縮、遠心分離、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などのペプチド乃至蛋白質を精製するための斯界における慣用の方法が用いられ、必要に応じて、これら方法を適宜組合せればよい。そして、最終使用形態に応じて、精製したペプチドを濃縮、凍結乾燥して液状又は固状にすればよい。
【００２３】
本発明のペプチドがＴ細胞エピトープとしての活性を有することは、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞の 3Ｈ−チミジンの取込みを計測することにより確認することができる。この計測には、例えば以下の方法を用いることができる。すなわち、フィコール・ハイパック比重遠心法等により花粉症患者の末梢血またはＣｒｙｊ２で免疫したマウス等の実験動物からＣｒｙｊ２に特異的なＴ細胞を含む単核細胞群を分離し、この細胞群をRPMI 1640 等の培地に浮遊させ、９６ウェルマイクロプレート上に分注する。次に被検物質であるペプチドを加えインキュベートする。このインキュベートの温度・時間は各実験毎に適宜調整することができるが、３７℃、２日間が好適である。その後 3Ｈ−チミジンを培地に加え、さらに一定時間インキュベーションを続け、単核細胞群における 3Ｈ−チミジンの取り込み量を測定することにより、本発明のペプチドのＴ細胞エピトープとしての活性を算定することができる。なお、本発明では、同時にペプチドを含まない系を設けてこれを陰性対照とし、 3Ｈ−チミジンの取り込み量が陰性対照の２倍以上に達した系を「陽性」、達しなかった系を「陰性」とした。
【００２４】
スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞の 3Ｈ−チミジンの取込みの計測は、以下の方法によっても行うことができる。予めマウス等の実験動物をＣｒｙｊ２で免疫し、その後顎下リンパ節等よりリンパ球を採取する。その後、上記と同様の方法により被検体であるペプチドで刺激し、 3Ｈ−チミジンの取り込み量を測定することにより、本発明のペプチドのＴ細胞エピトープとしての活性を算定することができる。ペプチドの「陽性」及び「陰性」の判定は、上記と同様の基準で行った。
【００２５】
本発明のペプチドが花粉症患者に予防効果を有することは、例えば以下の実験により確認することができる。予めマウス等の実験動物に対し本発明のペプチドを投与し、該ペプチドに対する免疫寛容を誘導しておく。一定期間経過後に当該実験動物にＣｒｙｊ２をコレラ毒素等のアジュバントとともに投与し免疫する。さらに、一定期間経過後に当該実験動物より顎下リンパ節細胞を摘出し細胞懸濁液を調製する。
【００２６】
また、これとは別の無処理の実験動物より脾臓を抽出し脾臓細胞懸濁液を調製して、これにＸ線を照射し細胞増殖活性を消失させこれを抗原提示細胞含有懸濁液とする。このものを先の顎下リンパ節細胞懸濁液と混合し、これにＣｒｙｊ２を添加して培養を継続し、さらに 3Ｈ−チミジンを添加して、このものの取り込みを測定し、Ｔ細胞の増殖を測定することができる。
【００２７】
予め本発明のペプチドで免疫寛容を誘導していない動物では、Ｃｒｙｊ２による免疫化によりそのＴ細胞が抗原提示細胞に結合したＣｒｙｊ２に反応し増殖する。一方、予め本発明のペプチドで免疫寛容を誘導した動物では、その後Ｃｒｙｊ２による免疫を行ってもＴ細胞が抗原提示細胞に結合したＣｒｙｊ２に反応せず増殖しない。その差を測定することにより、本発明のペプチドの花粉症に対する予防効果を確認することができる。
【００２８】
さらに、上述の免疫動物の顎下リンパ節細胞懸濁液と抗原提示細胞含有懸濁液の混合液にＣｒｙｊ２を添加して培養を継続した場合に培養液中にインターロイキン４等のサイトカインが分泌されるが、本発明のペプチドを前投与し免疫寛容誘導を行った実験動物と前投与しなかった実験動物とで、このサイトカインの分泌量を比較することによっても、本発明のペプチドの花粉症に対する予防効果を確認することができる。
【００２９】
本発明のペプチドが花粉症患者に治療効果を有することは、例えば以下の実験により確認することができる。予めマウス等の実験動物に対し、Ｃｒｙｊ２をコレラ毒素のアジュバンドとともに投与し免疫する。一定期間経過後に当該実験動物にＣｒｙｊ２をコレラ毒素のアジュバンドとともに投与し追加免疫する。さらに、一定期間経過後に当該実験動物より顎下リンパ節細胞を摘出し細胞懸濁液を調製した後、上記と同様の方法によりＴ細胞の増殖を測定する。
【００３０】
本発明のペプチドで治療を施していない動物では、Ｃｒｙｊ２による免疫によりそのＴ細胞が抗原提示細胞に結合したＣｒｙｊ２に反応し増殖する。一方、本発明のペプチドで治療した動物では、その後Ｃｒｙｊ２による免疫を行ってもＴ細胞が抗原提示細胞に結合したＣｒｙｊ２に反応せず増殖しない。その差を測定することにより、本発明のペプチドの花粉症に対する治療効果を確認することができる。
【００３１】
［作 用］
本発明のペプチドは、スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリンＥ抗体に実質的に反応しないので、ヒトを含む哺乳類一般に投与すると、実質的にアナフィラキシーを引起こすことなく、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を活性化することができる。有効成分としてかかるペプチドを含んでなる本発明の抗スギ花粉症剤は、ヒトを含む哺乳類一般に投与すると、実質的にアナフィラキシーを引起こすことなくスギ花粉症に対して顕著な治療・予防効果を発揮する。
【００３２】
有効成分としてこの発明のペプチドを含んでなる抗スギ花粉症剤は、スギ花粉症に罹患してヒトを含む哺乳類一般に投与すると、アナフィラキシーなどの副作用を実質的に引起こすことなく、スギ花粉症を治療することができる。一方、この発明の抗スギ花粉症例を、スギ花粉が飛散し始める前に健常な個体や潜在的なスギ花粉症の個体に投与するときには、スギ花粉症に対して顕著な予防効果を発揮するとともに、発症時のアレルギー症状の緩解に著効を発揮する。
【００３３】
この発明の抗スギ花粉症剤につきさらに詳しく説明すると、この発明の抗スギ花粉症剤は、通常、この発明によるペプチドの１種又は２種以上を０.０１乃至１００％(w/w) 、望ましくは、０.０５乃至５０％(w/v) 、さらに望ましくは、０.５乃至５.０％(w/w) 含んでなる。この発明の抗スギ花粉症剤は、当該ペプチド単独の形態はもとより、その以外の生理的に許容される、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、マンニトールなどの担体、賦形剤、免疫助成剤、安定剤、さらには、必要に応じて、ステロイドホルモンやクリモグリク酸ナトリウムなどの抗炎症剤や抗ヒスタミン剤を含む１種又は２種以上の他の薬剤との組成物としての形態を包含する。さらに、この発明の抗スギ花粉症剤は、投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、この発明のポリペプチドを、例えば、１日当たりの用量又はその整数倍（４倍まで）又はその約数（１／４０まで）に相当する量を含有し、投与に適する物理的に分離した一体の剤形にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、軟鋼剤、硬膏剤、パップ剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、注射剤などが挙げられる。
【００３４】
この発明の抗スギ花粉症剤の使用方法について説明すると、この発明の抗スギ花粉症剤は、スギ花粉症の治療・予防を目的に、ヒトを含む哺乳類一般に経皮、経口、点鼻、点眼又は注射投与される。ヒトにおける投与量は、投与の目的や症状に依っても変わるが、通常、対象者の症状や投与後の経過を観察しながら、成人１日当たり０.０１乃至１.０g 、望ましくは、０.０１乃至０.１g を目安に、毎週１回乃至毎月１回の頻度で、約１乃至６カ月間、通常、用量を増やしながら反復投与される。
【００３５】
本発明のポリペプチドの急性毒性
常法により、生後２０日のマウスに後述の製剤例１乃至４の方法により得た免疫治療剤を経口又は腹腔内投与した。その結果、これら免疫療法剤は、いずれの投与経路によって２００mg/kg 以上のLD50であることが判明した。このことは、この発明のペプチドが、ヒトを含むほ乳類に対する免疫療法剤に安全に配合使用し得ることを示している。
【００３６】
試験例１．
スギ花粉症患者より単離したＴ細胞を用い、本発明のペプチド１乃至ペプチド６、及びペプチド９乃至ペプチド２４がスギ花粉抗原Ｔ細胞エピトープ活性を有することを確認した。皮膚テストにおいて、スギ花粉アレルゲンに対し陽性を示し、かつ、抗スギ花粉アレルゲン IgE 反応に陽性を示す患者から２０mlの末梢血を採取した。遠心分離後、バフィーコートを得て、更にフィコール・パック比重遠心法により、末梢血単核球（Peripheral Blood Mononuelear Cells：ＰＢＭＣ）を採取した。このＰＢＭＣを培地（RPMI-1640 、５％の熱不活性化ヒトＡＢ型血清を含む。）に、7.５×１０5細胞／mlになるように懸濁した。
【００３７】
９６ウェルの丸底プレートにおいて、1.５×１０5 の細胞を、各ウェル２００μl の培地中で２０ngのペプチドと３７℃５％CO2存在下で４８時間培養した。その後、１μCiのトリチウム化チミジンを加え、さらに１６時間培養した。細胞に取り込まれたカウントを測定するため、セルハーベスターを用いて細胞をガラス繊維フィルター上に集め、液体シンチレーションカウンターで測定した。この結果を以下の表２に示す。
【００３８】
【表２】
2006008698.tif 000003
【００３９】
以上の結果より、これらのペプチドは、Ｃｒｙｊ２アレルゲンのＴ細胞エピトープを含有していることが示された。
【００４０】
試験例２．
Ｃｒｙｊ２を文献記載の方法（Allergy, 1990, 45, 309-312） で精製した。精製したＣｒｙｊ２ １μg とコレラ毒素Ｂサブユニット１μg （コレラ毒素0.５％含有）を0.01M リン酸緩衝液（pH 7.4） に溶解させた抗原溶液を、アバチン麻酔下の Balb/c マウス（５〜６週齢：チャールズリバージャパン社）に点鼻投与し免疫した。その２週間後、再び同様の方法により同マウスを追加免疫した。その１週間後、マウスの顎下リンパ節細胞を摘出した。これをナイロンメッシュに通し、さらに培地（RPMI 1640 10％子牛胎児血清含有）に懸濁して懸濁液を調製した。
【００４１】
また、Ｃｒｙｊ２で免疫化していないマウスより脾臓細胞を摘出し、上記と同様の方法でリンパ節細胞懸濁液を調製した。この懸濁液に3000 RadのＸ線を照射して細胞の増殖活性を消失させ、抗原提示細胞懸濁液として用いた。平底９６ウェルプレート（コーニング社）に、１ウェル当たりリンパ節細胞３×１０6、抗原提示細胞６×１０5 となるように分注し、ペプチド７又はペプチド８の存在下（0.５μg/ml）、あるいはこれらペプチドの非存在下で、３７℃、５％CO2の条件下３日間培養した。
【００４２】
最後の１６時間は、 3H-Thymidine 存在下で培養し、この間に細胞核内ＤＮＡに取り込まれた 3H-Thymidine 量を、ガラスフィルターに吸着したＤＮＡの放射線量を液体シンチレーション法により測定することにより算定した。ペプチド存在下での 3H-Thymidine 取り込み量を、ペプチド非存在下での取り込み量で割った値を反応倍率として、これを細胞増殖活性の指標とした。
【００４３】
リンパ節細胞は、ペプチド７に対しては３倍程度、ペプチド８に対しては５倍程度増殖率が増大した。従って、これらのペプチドは、Ｃｒｙｊ２アレルゲンのＴ細胞エピトープを含有していることが示された。
【００４４】
試験例３．
ペプチド７又は８について、 Balb/c マウスに対して免疫寛容を誘導した。すなわち、リン酸緩衝液（0.01M (pH 7.4)） に溶解させた各ペプチド溶液について、マウス尾静脈に一匹当たり２０μg のペプチド量となるように静脈投与を行った。または、同ペプチド溶液を、１匹１回当たり１mgのペプチド量となるように経口投与を行い、この経口投与を２週間に４回繰り返した。その後、当該マウスについて、試験例２と同様の方法で、Ｃｒｙｊ２による免疫を行った。
【００４５】
試験例２と同様の方法で該マウスより顎下リンパ節細胞を摘出して顎下リンパ節細胞懸濁液とし、また、ペプチドによる寛容化とＣｒｙｊ２による免疫誘導を行っていない別個のマウスより脾臓を摘出してＸ線により増殖活性を消失させ抗原提示細胞懸濁液として、これらをＣｒｙｊ２の存在（１μg/ml）下で共培養して、試験例２と同様の方法で 3H-Thymidine 取り込み量を測定し細胞増殖活性を算定した。
【００４６】
また、リンパ節細胞及び抗原提示細胞の懸濁液を調製培地により調製した。１ウェル当たりリンパ節細胞1.５×１０6、抗原提示細胞３×１０6 となるように、２４ウェルプレート（コーニング）に分注し、これらの細胞をＣｒｙｊ２（１μg/ml）と共に３７℃、５％CO2の条件下で３日間培養した。培養終了後、培養上清液を採取し、測定に用いるまで２０℃で凍結保存した。培養液中に含まれるインターロイキン４の量を市販の測定キット（Endogen 社）にて測定した。
【００４７】
（１）ペプチド７の静脈投与による免疫寛容の誘導
マウス尾静脈にペプチド７の溶液を投与した。対照群のマウスには、リン酸緩衝液（0.01M (pH 7.4)） のみを静脈投与した。その後、上記の方法に従って、両群のマウスをＣｒｙｊ２で経鼻的に免疫した。その後、当該マウスより摘出した顎下リンパ節細胞及び他のマウスより摘出した抗原提示細胞をＣｒｙｊ２と共に培養すると、あらかじめペプチド７を投与したマウスからのリンパ節細胞の増殖活性は、対照群に比較して29.5％低下していた。これによりペプチド７には、スギアレルゲンに対する免疫応答を抑制する活性があることが明らかとなった。
【００４８】
（２）ペプチド７の経口投与による免疫寛容の誘導
マウスにＴ細胞ペプチド７の溶液を２週間の間に４回、上記の方法に従い経口投与した。対照群のマウスには、リン酸緩衝液（0.01M (pH 7.4)） のみを経口投与した。その後、両群のマウスをＣｒｙｊ２で経鼻的に免疫した。その後、当該マウスより摘出した顎下リンパ節細胞及び他のマウスより摘出した抗原提示細胞をＣｒｙｊ２と共に３日間培養し、その培養上清中のサイトカイン量を測定した。その結果、あらかじめペプチド７を投与したマウスからのリンパ節細胞から産生されるインターロイキン４の量は、対照群に比較して49.8％低下していた。これによりペプチド７を経口的に投与することにより、スギアレルゲンに対する免疫応答を抑制することが示された。
【００４９】
（３）ペプチド８の静脈投与による免疫寛容の誘導
マウス尾静脈にペプチド８の溶液を投与した。対照群のマウスには、リン酸緩衝液（0.01M (pH 7.4)） のみを静脈投与した。その後、上記の方法に従って、両群のマウスをＣｒｙｊ２で経鼻的に免疫した。その後、当該マウスより摘出した顎下リンパ節細胞及び他のマウスより摘出した抗原提示細胞をＣｒｙｊ２と共に培養すると、あらかじめペプチド８を投与したマウスからのリンパ節細胞の増殖活性は、対照群に比較して30.9％低下していた。これによりペプチド８には、スギアレルゲンに対する免疫応答を抑制する活性があることが明らかとなった。
【００５０】
（４）ペプチド８の経口投与による免疫寛容の誘導
マウスにＴ細胞ペプチド８の溶液を２週間の間に４回、上記の方法に従い経口投与した。対照群のマウスには、リン酸緩衝液（0.01M (pH 7.4)） のみを経口投与した。その後、両群のマウスをＣｒｙｊ２で経鼻的に免疫した。その後、当該マウスより摘出した顎下リンパ節細胞及び他のマウスより摘出した抗原提示細胞をＣｒｙｊ２と共に培養すると、あらかじめペプチド８を投与したマウスからのリンパ節細胞の増殖活性は、対照群に比較して73.1％低下していた。これによりペプチド８には、スギアレルゲンに対する免疫応答を抑制する活性があることが明らかとなった。
【００５１】
試験例４
ペプチド８について、Balb/cマウスに対して、治療を施した。すなわち、精製したＣｒｙｊ２ １μｇとコレラ毒素Ｂサブユニット１μｇ（コレラ毒素０．５％含有）を0.01Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させた抗原溶液を、アバチン麻酔下の２群のBalb/cマウス（５〜６週齢：チャールズリバージャパン社）に点鼻投与し免疫した。一週間後より、実験群のマウスに対して、0.01Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させたペプチド８の溶液を、一匹について一回あたり200 μｇのペプチド量となるように経口投与し、この経口投与を２週間の間に４回繰り返した。対照群のマウスには、0.01Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）のみを同様に投与した。４回目の経口投与から４日後に、両群のマウスに再度Ｃｒｙｊ２で経鼻的に免疫した。一週間後、試験例３と同様の方法により当該マウスより摘出した顎下リンパ節細胞と他のマウスより摘出した抗原提示細胞とをＣｒｙｊ２と共に培養すると、実験群マウス由来のリンパ節細胞の増殖は、対照群に比較して46.0％低下していた。この結果より、ペプチド８は、スキアレルゲンで免疫された後のマウスに投与した場合にも、スキアレルゲンに対する免疫応答を抑制する活性を有することが明らかとなった。
【００５２】
以上のように、本発明のペプチドは、ヒトを含む哺乳類一般に投与すると、実質的にアナフィラキシーを引起こすことなく、スギ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞を活性化することができる。有効成分として斯かるペプチドを含んでなる本発明の抗スギ花粉症剤は、ヒトを含む哺乳類一般に投与すると、実質的にアナフィラキシーを引起こすことなくスギ花粉症に対して顕著な治療・予防効果を発揮する。
【００５３】
有効成分としてこの発明のペプチドを含んでなる抗スギ花粉症剤は、スギ花粉症に罹患してヒトを含む哺乳類一般に投与すると、アナフィラキシーなどの副作用を実質的に引起こすことなく、スギ花粉症を治療することができる。一方、この発明の抗スギ花粉症剤を、スギ花粉が飛散し始める前に健常な個体や潜在的なスギ花粉症の個体に投与するときには、スギ花粉症に対して顕著な予防効果を発揮するとともに、発症時のアレルギー症状の緩解に著効を発揮する。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例、製剤例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００５５】
実施例１
ペプチド１：
Lys-Val-Asp-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr-Gln-Asn-Pro-Ala-Ser
樹脂に固定したアミノ酸誘導体に１個ずつアミノ酸をカルボキシル末端側から結合させていく方法（固相合成法）でペプチドを化学合成した。各サイクルで使用するアミノ酸はαアミノ基及び残基部分の反応基が保護基でブロックされた特殊なアミノ酸誘導体を用いた。ここで、それぞれのαアミノ基が Fmoc (9-fluorenyl methyloxycarbonyl) によりブロックされているアミノ酸を用いた（Fmoc法）。また、ペプチド合成は樹脂に結合したアミノ酸のαアミノ基の Fmoc を脱保護し、次にカルボキシル基が活性化したアミノ酸誘導体を結合させるという反応を順次繰り返して行った。
【００５６】
実験に用いる各ペプチドは、マルチペプチドシンセサイザー SYMPHONY (Protein Technologies, Inc.)を用い上記の Fmoc 固相合成法にて同装置のプロトコールに従って合成した。すなわち、合成するペプチドのＣ末端残基に相当するアミノ酸（Ser）が導入されている Fmoc-Ser(tBu)-Wang-樹脂（0.52mmol/g） の２５μmol 相当を上記ペプチド合成装置の反応容器にセットし、デプロテクション溶液（20％ piperidine / Dimethyl formamide (DMF)） 1.25mlを５分間２回反応させ、樹脂に結合しているアミノ酸の Fmoc 基を除いた。DMF 液1.25mlで３０秒間６回洗浄後、Ｃ末側から２番目のアミノ酸に相当する２００mMの Fmoc-Ala/DMF 溶液1.25mlと２００mMのアクチベータ溶液(200mM O-Benzotriazole-N,N,',N',-Tetramethyl-Uronium-Hexafluoro phosphate ／400mM N-methylmorpholine／DMF )1.25mlを加え（それぞれ理論等量の10倍：250μmol 相当）、２０分間室温で反応させた。ここで生成した Fmoc-Ala-Ser(tBu)-Wang-樹脂をDMF 1.25mlにて３０秒間６回洗浄後、再び Fmoc 基のデプロテクションを用い、DMF 1.25mlにて３０秒間６回洗浄後、Fmoc-Pro 溶液とアクチベーター溶液を加え反応させた。同様の操作を繰り返すことにより、目的とするペプチド (Fmoc-Lys(Boc)-Val-Asp(OtBu)-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-Wang- 樹脂) を合成した。
【００５７】
ここで合成に使用したアミノ酸は以下のとおりである（日清紡（株）製）。(  ) 内は残基部分の反応基を保護する保護基を表す。
Fmoc-Ala,         Fmoc-Pro, 
Fmoc-Asn(Trt),    Fmoc-Gln(Trt),    Fmoc-Tyr(tBu), 
Fmoc-Ile,         Fmoc-Gly,         Fmoc-Asp(OtBu), 
Fmoc-Val,         Fmoc-Lys(Boc),
ペプチド合成装置 SYMPHONY を用い、装置内でクリべージ反応を行った。
【００５８】
まず、上記ように合成し得られた保護ペプチド樹脂（Fmoc-Lys(Boc)-Val-Asp(OtBu)-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-Wang- 樹脂）に、デプロテクション液1.25mlを５分間２回反応させてＮ末端Fmoc基を脱保護した。次に1.25mlのDMF にて３０秒間６回洗浄後、CH2Cl2にて同様に洗浄し、 N2を吹き付け１０分間乾燥後、クリべージ溶液（Trifluoroacetic acid：Phenol：水：Tioanisole：Ethanedithiol ＝82.5：５：５：５：2.5） を2.5ml加え室温で２時間反応させ（D.S.King, Int.J.Peptide Protein Reg., 36, 255(1990)）、樹脂からのペプチドの切断およびアミノ酸側鎖保護基の除去を行い、ペプチド（Lys-Val-Asp-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr-Gln-Asn-Pro-Ala-Ser）を得た。
【００５９】
反応終了後、このペプチド溶液をフィルターを用いて濾過し、樹脂と濾液に分けた。さらに樹脂を洗浄した液2.5mlと合わせ遠心管に回収した。回収したペプチド溶液を装置から取り出し、５mlの冷エーテルを加え、ペプチドを沈澱させた。しばらく冷却後これを遠心して（3000rpm 10分間）沈澱物を集め、再び冷エーテルを加えて分散させては回収することを５〜６回繰り返してペプチドを洗浄した。
【００６０】
得られたペプチドを乾燥させ、粗ペプチドを得た（50.5mg）。粗ペプチドは0.1％ TFAを含む１０％アセトニトリル水溶液に溶解後、ODS カラム(TSKgel ODS-12OT, 21.5mm×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む２１％アセトニトリルにて展開し（流速９ml／分、検出波長 220nm） 、３１〜３５分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（15.9mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００６１】
実施例２
ペプチド２：
Val-Asp-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr-Gln-Asn-Pro-Ala-Ser
実施例１と同様の操作でペプチド（Fmoc-Val-Asp(OtBu)-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-Wang-樹脂）を合成し、クリべージ反応を行いペプチド（Val-Asp-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr-Gln-Asn-Pro-Ala-Ser）を得、このペプチド溶液を遠心管に回収した。その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た（55.5mg）。
【００６２】
粗ペプチドは0.1％ TFAを含む１０％アセトニトリル水溶液に溶解後、ODS カラム(TSKgel ODS-120T, 21.5mm×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む２２％アセトニトリルにて展開し（流速９ml／分、検出波長 220nm） 、２６〜２９分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（7.1mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００６３】
実施例３
ペプチド３：
Asp-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr-Gln-Asn-Pro-Ala-Ser
実施例１と同様の操作でペプチド（Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-Wang-樹脂）を合成し、クリべージ反応を行いペプチド（Asp-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr-Gln-Asn-Pro-Ala-Ser）を得、このペプチド溶液を遠心管に回収した。その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た（47.9mg）。
【００６４】
粗ペプチドは0.1％ TFAを含む１０％アセトニトリル水溶液に溶解後、ODS カラム(TSKgel ODS-120T, 21.5mm×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む２１％アセトニトリルにて展開し（流速９ml／分、検出波長 220nm） 、２５〜２８分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（13.8mg） 。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００６５】
実施例４
ペプチド４：
Trp-Leu-Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu-Met-Gly
実施例１と同様の操作でペプチド（Fmoc-Trp-Leu-Gln-(Trt)-Phe-Ala-Lys(Boe)-Leu-Thr(tBu)-Gly-Phe-Thr(tBu)-Leu-Met-Gly-Wang- 樹脂）を合成した。ただし、Ｃ末端アミノ酸樹脂には Fmoc-Gly-Wang- 樹脂（0.50mol べージ/g）を２５μmol 相当用いた。合成に使用したアミノ酸は以下のとおりである。
Fmoc-Met,         Fmoc-Leu,         Fmoc-Thr(tBu), 
Fmoc-Phe,         Fmoc-Gly,         Fmoc-Lys(Boc), 
Fmoc-Ala,         Fmoc-Gln(Trt),    Fmoc-Trp,
【００６６】
実施例１と同様の操作でクリべージ反応を行いペプチド(Trp-Leu-Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu-Met-Gly )を得、このペプチド溶液を遠心管に回収し、その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た（63.3mg）。
【００６７】
粗ペプチドは0.1％ TFAを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、ODS カラム(TSKgel ODS-120T, 21.5mm×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む３８％アセトニトリルにて展開し（流速９ml／分、検出波長 220nm） 、２５〜３１分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（2.0mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００６８】
実施例５
ペプチド５：
Trp-Leu-Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu-Met
実施例１と同様の操作でペプチド（Fmoc-Trp-Leu-Gln-(Trt)-Phe-Ala-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gly-Phe-Thr(tBu)-Leu-Met-Wang- 樹脂）を合成した。ただし、Ｃ末端アミノ酸樹脂には Fmoc-Met-Wang- 樹脂（0.75mmol/g）を２５μmol 相当用いた。合成に使用したアミノ酸は実施例４と同じである。実施例１と同様の操作でクリべージ反応を行いペプチド(Trp-Leu-Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu-Met- )を得、このペプチド溶液を遠心管に回収し、その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た（29mg）。
【００６９】
粗ペプチドは0.1％ TFAを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、ODS カラム(TSKgel ODS-120T, 21.5mm×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む３６％アセトニトリルにて展開し（流速９ml／分、検出波長 220nm） 、３２〜３４分に溶出された画分を濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（1.1mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００７０】
実施例６
ペプチド６：
Trp-Leu-Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu
実施例１と同様の操作でペプチド（Fmoc-Trp-Leu-Gln(Trt)-Phe-Ala-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gly-Phe-Thr(tBu)-Leu-Wang-樹脂）を合成した。ただし、Ｃ末端アミノ酸樹脂には Fmoc-Leu-Wang- 樹脂（0.69mmol/g）を２５μmol 相当用いた。合成に使用したアミノ酸は実施例４と同じである。
【００７１】
実施例１と同様の操作でクリべージ反応を行いペプチド(Trp-Leu-Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu )を得、このペプチド溶液を遠心管に回収し、その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た（35.6mg）。粗ペプチドは0.1％ TFAを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、ODS カラム(TSKgel ODS-120T, 21.5mm×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む３８％アセトニトリルにて展開し、２６〜３０分に溶出された画分を濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（6.3mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００７２】
実施例７
ペプチド７：
His-Phe-Thr-Phe-Lys-Val-Asp-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr-Gln
実施例１記載の Fmoc 法により、Milligen / Biosearch社製 9050 ペプチド合成機を用い、粗ペプチド４００mgを得た。粗ペプチドは0.1％ TFA水溶液に溶解後、μBONDASPHERE ５μ C18C120 Aカラム（19×150mm）に供与し、0.1％ TFAを含む９０％アセトニトリル溶液にて展開し（流速５ml／分、検出波長214nm）、２８〜２９分に溶出された画分をエバポレート後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（36mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００７３】
実施例８
ペプチド８：
Arg-Ala-Glu-Val-Ser-Tyr-Val-His-Val-Asn-Gly-Ala-Lys-Phe
実施例１記載の Fmoc 法により、Milligen / Biosearch社製 9050 ペプチド合成機を用い、粗ペプチド５５０mgを得た。粗ペプチドは0.1％ TFA水溶液に溶解後、μBONDASPHERE ５μ C18C120 Aカラム（19×150mm）に供与し、0.1％ TFAを含む９０％アセトニトリル溶液にて展開し（流速５ml／分、検出波長214nm）、２６〜２７分に溶出された画分をエバポレート後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（60mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００７４】
実施例９
ペプチド９：
Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr-Gln-Asn-Pro-Ala-Ser
樹脂に固定したアミノ酸誘導体に１個ずつアミノ酸をカルボキシル末端側から結合させていく方法（固相合成法）でペプチドを化学合成した。各サイクルで使用するアミノ酸はαアミノ基及び残基部分の反応基が保護基でブロックされた特殊なアミノ酸誘導体を用いた。ここで、それぞれのαアミノ基が Fmoc (9-fluorenyl methyloxycarbonyl) によりブロックされているアミノ酸を用いた（Fmoc法）。また、ペプチド合成は樹脂に結合したアミノ酸のαアミノ基の Fmoc を脱保護し、次にカルボキシル基が活性化したアミノ酸誘導体を結合させるという反応を順次繰り返して行った。
【００７５】
実験に用いる各ペプチドは、マルチペプチドシンセサイザー SYMPHONY (Protein Technologies, Inc.)を用い上記の Fmoc 固相合成法にて同装置のプロトコールに従って合成した。すなわち、合成するペプチドのＣ末端残基に相当するアミノ酸（Ser）が導入されている Fmoc-Ser(tBu)-Wang-樹脂（0.52mmol/g） の２５μmol 相当を上記ペプチド合成装置の反応容器にセットし、デプロテクション溶液（20％ piperidine / Dimethyl formamide (DMF)） 1.25mlを５分間２回反応させ、樹脂に結合しているアミノ酸の Fmoc 基を除いた。DMF 液1.25mlで３０秒間６回洗浄後、Ｃ末側から２番目のアミノ酸に相当する２００mMの Fmoc-Ala/DMF 溶液1.25mlと２００mMのアクチベータ溶液(200mM O-Benzotriazole-N,N,',N',-Tetramethyl-Uronium-Hexafluoro phosphate ／400mM N-methylmorpholine／DMF )1.25mlを加え（それぞれ理論等量の10倍：250μmol 相当）、２０分間室温で反応させた。ここで生成した Fmoc-Ala-Ser(tBu)-Wang-樹脂をDMF 1.25mlにて３０秒間６回洗浄後、再び Fmoc 基のデプロテクションを用い、DMF 1.25mlにて３０秒間６回洗浄後、Fmoc-Pro 溶液とアクチベーター溶液を加え反応させた。同様の操作を繰り返すことにより、目的とするペプチド (Fmoc-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-Wang-樹脂) を合成した。
【００７６】
ここで合成に使用したアミノ酸は以下のとおりである（日清紡（株）製）。(  ) 内は残基部分の反応基を保護する保護基を表す。
Fmoc-Ala,        Fmoc-Pro, 
Fmoc-Asn(Trt),   Fmoc-Gln(Trt),        Fmoc-Tyr(tBu), 
Fmoc-Ile,        Fmoc-Gly,
ペプチド合成装置 SYMPHONY を用い、装置内でクリべージ反応を行った。
【００７７】
まず、上記ように合成し得られた保護ペプチド樹脂（Fmoc-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)- Wang- 樹脂）に、デプロテクション液1.25mlを５分間２回反応させてＮ末端Fmoc基を脱保護した。次に1.25mlのDMF にて３０秒間６回洗浄後、CH2Cl2にて同様に洗浄し、 N2を吹き付け１０分間乾燥後、クリべージ溶液（Trifluoroacetic acid：Phenol：水：Tioanisole：Ethanedithiol ＝82.5：５：５：５：2.5） を2.5ml加え室温で２時間反応させ（D.S.King, Int.J.Peptide Protein Reg., 36, 255(1990)）、樹脂からのペプチドの切断およびアミノ酸側鎖保護基の除去を行い、ペプチド（Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr-Gln-Asn-Pro-Ala-Ser）を得た。
【００７８】
反応終了後、このペプチド溶液をフィルターを用いて濾過し、樹脂と濾液に分けた。さらに樹脂を洗浄した液2.5mlと合わせ遠心管に回収した。回収したペプチド溶液を装置から取り出し、５mlの冷エーテルを加え、ペプチドを沈澱させた。しばらく冷却後これを遠心して（3000rpm 10分間）沈澱物を集め、再び冷エーテルを加えて分散させては回収することを５〜６回繰り返してペプチドを洗浄した。
【００７９】
得られたペプチドを乾燥させ、粗ペプチドを得た。得られた粗ペプチドのうち11mgを２mlの0.1％ TFAを含む１０％アセトニトリル水溶液に溶解後、３回に分けてODS カラム(TSKgel ODS-12OT, 7.8mm×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む２１％アセトニトリルにて展開し（流速２ml／分、検出波長 220nm） 、９．２〜１１分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（５mg ）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００８０】
実施例１０
ペプチド１０：
Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr-Gln-Asn-Pro-Ala-Ser-Trp
実施例９と同様の操作でペプチド（Fmoc-Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr(tBu)-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-Trp-Wang-樹脂）を合成した。ただし、Ｃ末端アミノ酸樹脂には Fmoc-Trp-Wang- 樹脂（0.66mmol/g）を２５μmol 相当用いた。合成に使用したアミノ酸は以下のとおりである。
Fmoc-Ala,        Fmoc-Pro,        Fmoc-Asn(Trt), 
Fmoc-Gln(Trt),   Fmoc-Tyr(tBu),   Fmoc-Ile, 
Fmoc-Gly,        Fmoc-Ser(tBu)
【００８１】
実施例９と同様の操作でクリべージ反応を行いペプチド(Gly-Ile-Ile-Ala-Ala-Tyr-Gln-Asn-Pro-Ala-Ser-Trp)を得、このペプチド溶液を遠心管に回収し、その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た。
【００８２】
得られた粗ペプチドのうち９mgを４mlの0.1％ TFAを含む１０％アセトニトリル水溶液に溶解後、２回に分けてODS カラム(TSKgel ODS-120T, 7.8mm ×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む２３％アセトニトリルにて展開し、３２〜３８分に溶出された画分を濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（2.5mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００８３】
実施例１１
ペプチド１１：
Ile-Trp-Leu-Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu
実施例９と同様の操作でペプチド（Fmoc-Ile-Trp-Leu-Gln(Trt)-Phe-Ala-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gly-Phe-Thr(tBu)-Leu-Wang-樹脂）を合成した。ただし、Ｃ末端アミノ酸樹脂には Fmoc-Leu-Wang- 樹脂（0.69mmol/g）を２５μmol 相当用いた。合成に使用したアミノ酸は以下のとおりである。
Fmoc-Leu,        Fmoc-Thr(tBu), 
Fmoc-Phe,        Fmoc-Gly,        Fmoc-Lys(Boc), 
Fmoc-Ala,        Fmoc-Gln(Trt),   Fmoc-Trp, 
Fmoc-Ile, 
【００８４】
実施例９と同様の操作でクリべージ反応を行いペプチド(Ile-Trp-Leu-Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu)を得、このペプチド溶液を遠心管に回収し、その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た。
【００８５】
得られた粗ペプチドのうち７mgを４mlの0.1％ TFAを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、３回に分けてODS カラム(TSKgel ODS-120T, 7.8mm ×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む３７％アセトニトリルにて展開し（流速２ml／分、検出波長 220nm） 、１７〜２０分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た ( 0.7mg) 。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００８６】
実施例１２
ペプチド１２：
Leu-Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu
実施例９と同様の操作でペプチド（Fmoc-Leu-Gln(Trt)-Phe-Ala-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gly-Phe-Thr(tBu)-Leu-Wang- 樹脂）を合成し、クリべージ反応を行いペプチド（Leu-Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu）を得、このペプチド溶液を遠心管に回収した。その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た。合成に使用したアミノ酸は以下のとおりである。
Fmoc-Leu,        Fmoc-Thr(tBu),        Fmoc-Phe, 
Fmoc-Gly,        Fmoc-Lys(Boc),        Fmoc-Ala, 
Fmoc-Gln(Trt),
【００８７】
得られた粗ペプチドのうち 9.6mgを２mlの0.1％ TFAを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、２回に分けてODS カラム(TSKgel ODS-120T, 7.8mm ×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む３２％アセトニトリルにて展開し（流速２ml／分、検出波長 220nm） 、１１〜１６分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（６.4mg） 。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００８８】
実施例１３
ペプチド１３
Leu-Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu-Met
実施例９と同様の操作でペプチド（Fmoc-Leu-Gln(Trt)-Phe-Ala-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gly-Phe-Thr(tBu)-Leu-Met-Wang-樹脂）を合成した。ただし、Ｃ末端アミノ酸樹脂には Fmoc-Met-Wang- 樹脂（0.75mmol/g）を２５μmol 相当用いた。合成に使用したアミノ酸は実施例１２と同じである。実施例９と同様の操作でクリべージ反応を行いペプチド(Leu-Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu-Met)を得、このペプチド溶液を遠心管に回収し、その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た。
【００８９】
得られた粗ペプチドのうち８mgを２mlの0.1％ TFAを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、２回に分けてODS カラム(TSKgel ODS-120T, 7.8mm ×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む３０％アセトニトリルにて展開し、２５〜３２分に溶出された画分を濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（1.1mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００９０】
実施例１４
ペプチド１４：
Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu
実施例９と同様の操作でペプチド（Fmoc-Gln(Trt)-Phe-Ala-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gly-Phe-Thr(tBu)-Leu-Wang-樹脂）を合成した。ただし、Ｃ末端アミノ酸樹脂には Fmoc-Leu-Wang- 樹脂（0.69mmol/g）を２５μmol 相当用いた。合成に使用したアミノ酸は実施例１２と同じである。実施例９と同様の操作でクリべージ反応を行いペプチド(Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu)を得、このペプチド溶液を遠心管に回収し、その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た。
【００９１】
得られた粗ペプチドのうち 2.5mgを１mlの0.1％ TFAを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、２回に分けてODS カラム(TSKgel ODS-120T, 7.8mm ×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む３０％アセトニトリルにて展開し、１０〜１２分に溶出された画分を濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（0.6mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００９２】
実施例１５
ペプチド１５：
Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu-Met
実施例９と同様の操作でペプチド（Fmoc-Gln(Trt)-Phe-Ala-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gly-Phe-Thr(tBu)-Leu-Met-Wang-樹脂）を合成した。ただし、Ｃ末端アミノ酸樹脂には Fmoc-Met-Wang- 樹脂（0.75mmol/g）を２５μmol 相当用いた。合成に使用したアミノ酸は実施例１２と同じである。実施例９と同様の操作でクリべージ反応を行いペプチド(Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu-Met)を得、このペプチド溶液を遠心管に回収し、その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た。
【００９３】
得られた粗ペプチドのうち７mgを４mlの0.1％ TFAを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、２回に分けてODS カラム(TSKgel ODS-120T, 7.8mm ×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む３０％アセトニトリルにて展開し、１５〜２０分に溶出された画分を濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（1.9mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００９４】
実施例１６
ペプチド１６：
Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu-Met-Gly
実施例９と同様の操作でペプチド（Fmoc-Gln(Trt)-Phe-Ala-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gly-Phe-Thr(tBu)-Leu-Met-Gly-Wang-樹脂）を合成した。ただし、Ｃ末端アミノ酸樹脂には Fmoc-Gly-Wang- 樹脂（0.50mmol/g）を２５μmol 相当用いた。合成に使用したアミノ酸は以下のとおりである。
Fmoc-Leu,        Fmoc-Thr(tBu),        Fmoc-Phe,
Fmoc-Gly,        Fmoc-Lys(Boc),        Fmoc-Ala,
Fmoc-Gln(Trt),   Fmoc-Met
【００９５】
実施例９と同様の操作でクリべージ反応を行いペプチド(Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu-Met-Gly)を得、このペプチド溶液を遠心管に回収し、その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た。
【００９６】
得られた粗ペプチドのうち13mgを６mlの0.1％ TFAを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、３回に分けてODS カラム(TSKgel ODS-120T, 7.8mm ×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む２９％アセトニトリルにて展開し、１７〜２０分に溶出された画分を濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（0.9mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【００９７】
実施例１７
ペプチド１７：
Ile-Phe-Ala-Ser-Lys-Asn-Phe-His-Leu-Gln-Lys-Asn
実施例９と同様の操作でペプチド（Fmoc-Ile-Phe-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Wang- 樹脂）を合成した。ただし、Ｃ末端アミノ酸樹脂には Fmoc-Asn(Trt)-Wang-樹脂（0.60mmol/g）を２５μmol 相当用いた。合成に使用したアミノ酸は以下のとおりである。
Fmoc-Leu,        Fmoc-Asn(Trt),        Fmoc-Ile,
Fmoc-Phe,        Fmoc-Lys(Boc),        Fmoc-His(Trt),
Fmoc-Ala,        Fmoc-Gln(Trt),        Fmoc-Ser(tBu),
【００９８】
実施例９と同様の操作でクリべージ反応を行いペプチド(Ile-Phe-Ala-Ser-Lys-Asn-Phe-His-Leu-Gln-Lys-Asn)を得、このペプチド溶液を遠心管に回収し、その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た。
【００９９】
得られた粗ペプチドのうち 3.8mgを４mlの0.1％ TFAを含む１０％アセトニトリル水溶液に溶解後、２回に分けてODS カラム(TSKgel ODS-120T, 7.8mm ×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む１８％アセトニトリルにて展開し（流速２ml／分、検出波長 220nm） 、１２〜１５分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（1.9mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【０１００】
実施例１８
ペプチド１８：
Phe-Ala-Ser-Lys-Asn-Phe-His-Leu-Gln-Lys-Asn-Thr
実施例９と同様の操作でペプチド（Fmoc-Phe-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Wang-樹脂）を合成した。ただし、Ｃ末端アミノ酸樹脂には Fmoc-Thr(tBu)-Wang-樹脂（0.50mmol/g）を２５μmol 相当用いた。合成に使用したアミノ酸は以下のとおりである。
Fmoc-Leu,        Fmoc-Asn(Trt),        Fmoc-Phe,
Fmoc-Lys(Boc),   Fmoc-His(Trt),        Fmoc-Ala,
Fmoc-Gln(Trt),   Fmoc-Ser(tBu),
【０１０１】
実施例９と同様の操作でクリべージ反応を行いペプチド(Phe-Ala-Ser-Lys-Asn-Phe-His-Leu-Gln-Lys-Asn-Thr)を得、このペプチド溶液を遠心管に回収し、その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た。
【０１０２】
得られた粗ペプチドのうち５mgを４mlの0.1％ TFAを含む１０％アセトニトリル水溶液に溶解後、２回に分けてODS カラム(TSKgel ODS-120T, 7.8mm ×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む１５％アセトニトリルにて展開し、２２〜３０分に溶出された画分を濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（3.5mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【０１０３】
実施例１９
ペプチド１９：
Phe-Ala-Ser-Lys-Asn-Phe-His-Leu-Gln-Lys-Asn
実施例９と同様の操作でペプチド（Fmoc-Phe-Ala-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-His(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Wang- 樹脂）を合成し、クリべージ反応を行いペプチド(Phe-Ala-Ser-Lys-Asn-Phe-His-Leu-Gln-Lys-Asn)を得、このペプチド溶液を遠心管に回収した。その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た。合成に使用したアミノ酸は実施例１８と同じである。
【０１０４】
得られた粗ペプチドのうち６mgを４mlの0.1％ TFAを含む１０％アセトニトリル水溶液に溶解後、２回に分けてODS カラム(TSKgel ODS-120T, 7.8mm ×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む１５％アセトニトリルにて展開し、２０〜２８分に溶出された画分を濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（3.8mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【０１０５】
実施例２０
ペプチド２０：
Leu-Lys-Leu-Thr-Ser-Gly-Lys-Ile-Ala-Ser-Cys-Leu
実施例９と同様の操作でペプチド（Fmoc-Leu-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Wang-樹脂）を合成した。ただし、Ｃ末端アミノ酸樹脂には Fmoc-Leu-Wang- 樹脂（0.69mmol/g）を２５μmol相当用いた。合成に使用したアミノ酸は以下のとおりである。
Fmoc-Leu,        Fmoc-Thr(tBu),        Fmoc-Asn(Trt),
Fmoc-Gly,        Fmoc-Lys(Boc),        Fmoc-Cys(Trt),
Fmoc-Ala,        Fmoc-Ser(tBu),        Fmoc-Ile
【０１０６】
実施例９と同様の操作でクリべージ反応を行いペプチド(Leu-Lys-Leu-Thr-Ser-Gly-Lys-Ile-Ala-Ser-Cys-Leu)を得、このペプチド溶液を遠心管に回収し、その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た。
【０１０７】
得られた粗ペプチドのうち 10mg を４mlの0.1％ TFAを含む１０％アセトニトリル水溶液に溶解後、３回に分けてODS カラム(TSKgel ODS-120T, 7.8mm ×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む２３％アセトニトリルにて展開し（流速２ml／分、検出波長 220nm） 、１８〜２２分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（0.9mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【０１０８】
実施例２１
ペプチド２１：
Lys-Leu-Thr-Ser-Gly-Lys-Ile-Ala-Ser-Cys-Leu
実施例９と同様の操作でペプチド（Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Wang- 樹脂）を合成し、クリべージ反応を行いペプチド（Lys-Leu-Thr-Ser-Gly-Lys-Ile-Ala-Ser-Cys-Leu ）を得、このペプチド溶液を遠心管に回収した。その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た。合成に使用したアミノ酸は実施例２０と同じである。
【０１０９】
得られた粗ペプチドのうち 6.6mgを２mlの0.1％ TFAを含む１０％アセトニトリル水溶液に溶解後、２回に分けてODS カラム(TSKgel ODS-120T, 7.8mm ×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む１９％アセトニトリルにて展開し（流速２ml／分、検出波長 220nm） 、１７〜２２分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（1.5mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【０１１０】
実施例２２
ペプチド２２：
Lys-Leu-Thr-Ser-Gly-Lys-Ile-Ala-Ser-Cys-Leu-Asn
実施例１と同様の操作でペプチド（Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Wang- 樹脂）を合成した。ただし、Ｃ末端アミノ酸樹脂には Fmoc-Asn(Trt)-Wang-樹脂（0.60mmol/g）を２５μmol 相当用いた。合成に使用したアミノ酸は実施例２０と同じである。実施例９と同様の操作でクリべージ反応を行いペプチド(Gln-Phe-Ala-Lys-Leu-Thr-Gly-Phe-Thr-Leu)を得、このペプチド溶液を遠心管に回収し、その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た。
【０１１１】
得られた粗ペプチドのうち 6.9mgを１mlの0.1％ TFAを含む１０％アセトニトリル水溶液に溶解後、２回に分けてODS カラム(TSKgel ODS-120T, 7.8mm ×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む２２％アセトニトリルにて展開し、９〜１２分に溶出された画分を濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（1.6mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【０１１２】
実施例２３
ペプチド２３：
Leu-Thr-Ser-Gly-Lys-Ile-Ala-Ser-Cys-Leu-Asn
実施例９と同様の操作でペプチド（Fmoc-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Wang-樹脂）を合成し、クリべージ反応を行いペプチド（Leu-Thr-Ser-Gly-Lys-Ile-Ala-Ser-Cys-Leu-Asn ）を得、このペプチド溶液を遠心管に回収した。その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た。合成に使用したアミノ酸は以下のとおりである。
Fmoc-Leu,        Fmoc-Thr(tBu),      Fmoc-Gly,
Fmoc-Cys(Trt),   Fmoc-Ala,           Fmoc-Ser(tBu),
Fmoc-Ile
【０１１３】
得られた粗ペプチドのうち６mgを１mlの0.1％ TFAを含む２０％アセトニトリル水溶液に溶解後、３回に分けてODS カラム(TSKgel ODS-120T, 7.8mm ×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む１９％アセトニトリルにて展開し（流速２ml／分、検出波長 220nm） 、１５〜１７分に溶出された画分を分取し、濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（０.9 mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【０１１４】
実施例２４
ペプチド２４：
Leu-Thr-Ser-Gly-Lys-Ile-Ala-Ser-Cys-Leu-Asn-Asp
実施例９と同様の操作でペプチド（Fmoc-Leu-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Ile-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Wang-樹脂）を合成した。ただし、Ｃ末端アミノ酸樹脂には Fmoc-Asp(OtBu)-Wang- 樹脂（0.42mmol/g）を２５μmol 相当用いた。合成に使用したアミノ酸は以下のとおりである。
Fmoc-Leu,        Fmoc-Thr(tBu),      Fmoc-Gly,
Fmoc-Cys(Trt),   Fmoc-Ala,           Fmoc-Ser(tBu),
Fmoc-Ile         Fmoc-Asn(Trt)
【０１１５】
実施例９と同様の操作でクリべージ反応を行いペプチド(Leu-Thr-Ser-Gly-Lys-Ile-Ala-Ser-Cys-Leu-Asn-Asp)を得、このペプチド溶液を遠心管に回収し、その後、ペプチドを沈澱させ、粗ペプチドを得た。
【０１１６】
得られた粗ペプチドのうち 7.5mgを１mlの0.1％ TFAを含む１０％アセトニトリル水溶液に溶解後、３回に分けてODS カラム(TSKgel ODS-120T, 7.8mm ×30cm：東ソー（株）製)に供与し、0.1％ TFAを含む１８％アセトニトリルにて展開し、１７〜１９分に溶出された画分を濃縮後、凍結乾燥を行い目的とするペプチドを得た（0.6mg）。この合成したペプチド 50 pmolについて、アミノ酸配列分析装置 PPSQ-10型(島津製作所(株) 製) を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、上記に示されるアミノ酸配列が確認された。
【０１１７】
製剤例１．
液剤
実施例１乃至２４記載の方法により得た２４種類のペプチドのいずれかを最終濃度0.1g/mlになるように安定剤として１％(w/v) 精製ゼラチンを含む蒸留水に溶解し、常法により滅菌濾過して２４種類の液剤を得た。
【０１１８】
本発明のペプチドに対する感受性は個体毎に変わるのが通例であるから、本品は個々の個体に最も適した組成になるよう、２４種類の液剤を適宜配合して使用する。本品は安定性に優れているので、スギ花粉症を治療・予防するための点眼剤、点鼻剤、口腔内噴霧剤用の液剤として有用である。
【０１１９】
製剤例２．
注射剤
安定剤として１％(w/v) ヒト血清アルブミンを含む生理食塩水に実施例１乃至２４記載の方法により得た２４種類のペプチドをそれぞれ最終濃度0.01、0.1又は１mg/ml になるように溶解し、滅菌濾過した後、滅菌バイアル瓶に２mlずつ分注し、凍結乾燥し、密栓した。
【０１２０】
本品は投与に先立ち、まず、バイアル瓶内に注射用蒸留水等を１ml加え、次いで、内容物を均一に溶解して使用する。安定性に優れ、有効成分として本発明による２４種類のポリペプチドを含んでなる本品は、スギ花粉症を治療・予防するための乾燥製剤として有用である。
【０１２１】
製剤例３．
錠剤
平均分子量約20,000ダルトンの精製プルラン２g を蒸留水１００mlに均一に溶解し、溶液に塩化シアヌルの1.７％(w/v) アセトン溶液を２ml加え、５％(w/v)炭酸ナトリウム水溶液でpHを７付近に保ちつつ、攪拌下、５℃で２時間反応させた。その後、同様にして反応物のpHを７付近に保ちながら、４℃の冷水に対して一晩透析し、活性化プルランを含む水溶液２０mlを得た。
【０１２２】
実施例１乃至２４記載の方法により得たペプチドをそれぞれ0.２mg加え、溶液のpHを７付近に保ちつつ、穏やかに攪拌しながら、３７℃で１２時間反応させた。反応後、反応物にグリシンを４g を加え、穏やかに攪拌しながら、３７℃で５時間インキュベートし、未反応の活性基をブロックした。反応物を濃縮し、あらかじめ0.1M リン酸緩衝液（pH 7.0） で平衡化させておいたセファデックス G-50 カラムに供与し、カラムに新鮮な同一緩衝液を通液して、この発明のペプチドとプルランの複合体を含む画分を採取した。収量は、原料ペプチド固形分当たり、約３０％であった。
【０１２３】
常法に従って、この画分を滅菌濾過し、濃縮し、凍結乾燥し、粉砕後、マンニトールを均一に混合し、混合物を打錠して製品１錠（200mg）当たり複合体を２、１０又は５０mg含む錠剤を得た。摂取性、安定性に優れた本品は、スギ花粉症を治療・予防するための舌下剤として有用である。
【０１２４】
製剤例４．
シロップ剤
大腸菌由来の精製リボ多糖１g を１０mMリン酸カルシウム溶液１００mlに溶解し、溶液に１００mM過ヨウ素酸ナトリウムを６ml加え、室温下で２０分間反応させてリボ多糖を活性化した。反応物を４℃の１M グリシン−塩酸緩衝液（pH 4.4） に対して一晩透析して未反応の過ヨウ素酸を除去した後、0.1M 炭酸水素ナトリウム緩衝液によりpH 9.5付近に調整する一方、別途、実施例１乃至２４記載の方法により得た２４種類のペプチドを0.1M リン酸緩衝液（pH 7.0） １００mlにそれぞれ１０mgずつ溶解し、活性化リボ多糖を含む上記反応物に加え、室温下で１２時間静置して反応させた。
【０１２５】
その後、新たに得られた反応物を製剤例３の方法により精製し、得られた本発明のペプチドとリボ多糖の複合体を含む画分を濃縮し、凍結乾燥し、粉砕して固状物とした。収量は、原料ペプチド固形分当たり、約３０％であった。この固形物を蔗糖をそれぞれ最終濃度が0.1若しくは１mg/ml 又は５０％(w/w) になるように安定剤として精製ゼラチンを１％(w/w) 含む蒸留水に溶解し、溶液を常法により滅菌濾過してシロップ状物を得た。このシロップ状物を２mlずつ滅菌バイアル瓶に分注し、密栓して製品とした。
【０１２６】
安定性に優れ、有効成分としてこの発明のペプチドとリボ多糖の複合体を含む本品は、スギ花粉症を治療・予防するためのシロップ剤として有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２７】
配列番号１−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号２−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号３−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号４−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号５−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号６−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号７−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号８−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号９−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１０−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１１−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１２−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１３−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１４−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１５−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１６−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１７−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１８−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１９−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号２０−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号２１−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号２２−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号２３−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号２４−人工配列の説明：合成ペプチド
【配列表】
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