(57)【要約】【課題】  細胞培養、特に付着性動物細胞の三次元培養を行うに際して、細胞の足場となる細胞接着面を有しており、かつ、強度および耐水性に優れた繊維またはその集合体からなる細胞培養用基体、並びに、該細胞培養用基体を用いた細胞培養方法を提供すること。【解決手段】  エチレン成分の含有量が３０〜７０モル％のエチレン―ビニルアルコール共重合体（Ａ）と他の熱溶融型ポリマー（Ｂ）とが接合してなる繊維、もしくは該繊維を（Ａ）成分と（Ｂ）成分の接合面において少なくとも部分的に剥離、割繊されてなる繊維、またはその集合体からなる細胞培養基体、および該細胞培養基体を用いた細胞培養方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エチレン成分の含有量が３０〜７０モル％のエチレン―ビニルアルコール共重合体（Ａ）と他の熱溶融型ポリマー（Ｂ）とが接合してなる繊維、もしくは該繊維を（Ａ）成分と（Ｂ）成分の接合面において少なくとも部分的に剥離、割繊されてなる繊維、またはその集合体からなる細胞培養基体。
【請求項２】
請求項１記載の細胞培養基体を用いた細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養用基体に関するものであり、細胞培養、特に、付着性動物細胞の三次元培養を行うのに適した培養基体、並びに、該培養基体を用いた培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養技術は、１)細胞産生物の生産、２）生体病変部や欠損部への補綴材、３）薬剤の毒性及び薬理活性評価用のシミュレーターなどの分野で、研究、応用されている。
【０００３】
従来、細胞培養は、ガラス表面上或は種々の処理を行った合成高分子材料の表面上において行われていた。その一例として、ポリスチレンに対して種々の表面処理（例えば、プラズマ処理、コロナ処理、等）を施したもの、或はコラーゲン、フィブロネクチン、ポリリジンなどの細胞接着性タンパク質をコートしたものなどの、種々の形状の容器が細胞培養用基体として普及している。
【０００４】
また、細胞と細胞培養用基体との相互作用に関しては、細胞は基体表面の化学的な性質のみならず微細な形状によっても影響を受けることが知られている。そこで、半導体産業等に利用されているマイクロパターン技術を利用した細胞接着面のサイズコントロール、培養基板への微小溝構造の導入、マイクロスフィアによる微細凹凸の作製が行われ、細胞培養用基体として生産されている。しかし、これらのマイクロパターン技術を使った表面設定は、非常に高度な技術が必要であり、大量生産ができない、高コストになる、などの多くの問題を抱えているのが現状である。
【０００５】
一方、繊維を足場とした培養方法は、バイオリアクター内で使用される細胞培養基体、組織の修復や臓器培養のための細胞増殖もしくは細胞培養用基体として、研究が盛んに行われている。細胞基体として重要とされる要素として、疎水性／親水性のバランス、表面電荷、大きさ、方向、巨視的および微視的な物理的サイズ、幾何学的形態、弾性などがある。例えば、エレクトレット繊維や陰イオン親水特性をもつ極細繊維などが知られている（例えば特許文献１、２参照）。
【０００６】
また、繊維またはその構造体については、衣料用、または非衣料用（例えば研磨・カーシート用の繊維）として、発色性、手触り感、染色性などを向上させるため、異形断面をもつ繊維、紡糸後分割して得られる極細繊維の研究が従来から行われてきた。（例えば特許文献３〜５）参照）。
【０００７】
【特許文献１】特開平２−１５４６８５
【特許文献２】特開昭６４−３４２７６
【特許文献３】特開平４−１７４７１０
【特許文献４】特開２００３−２０５２４
【特許文献５】特開昭６０−９９６７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、細胞培養、特に付着性動物細胞の三次元培養を行うに際して、細胞の足場となる細胞接着面を有しており、かつ、強度および耐水性に優れた繊維またはその集合体からなる細胞培養用基体、並びに、該細胞培養用基体を用いた細胞培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、エチレン成分の含有量が３０〜７０モル％のエチレン―ビニルアルコール共重合体（Ａ）と他の熱溶融型ポリマー（Ｂ）とが接合してなる繊維、もしくは該成分を（Ａ）成分と（Ｂ）成分の接合面において少なくとも部分的に剥離、割繊されてなる繊維、またはその集合体を細胞培養基体として用いると、格段の細胞培養効率が得られることを見出し本発明に至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、
[１]エチレン成分の含有量が３０〜７０モル％のエチレン―ビニルアルコール共重合体（Ａ）と他の熱溶融型ポリマー（Ｂ）とが接合してなる繊維、もしくは該成分を（Ａ）成分と（Ｂ）成分の接合面において少なくとも部分的に剥離、割繊されてなる繊維、またはその集合体からなる細胞培養基体；ならびに
［２］前記［１］記載の細胞培養基体を用いた細胞培養方法
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、細胞培養、特に付着性動物細胞の三次元培養を行うに際して、細胞の足場となる細胞接着面を有しており、かつ、強度および耐水性に優れた繊維またはその集合体からなる細胞培養基体が提供される。該細胞培養基体をバイオリアクター等に用いることにより、より効率の良い細胞の増殖が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下本発明について詳細に説明する。本発明の細胞培養基体は、エチレン成分の含有量が３０〜７０モル％のエチレン―ビニルアルコール共重合体（Ａ）と他の熱溶融型ポリマー（Ｂ）とが接合してなる繊維、もしくは該成分を（Ａ）成分と（Ｂ）成分の接合面において少なくとも部分的に剥離、割繊されてなる繊維、またはその集合体からなることを一つの大きな特徴とする。
【００１３】
本発明において、エチレン―ビニルアルコール共重合体（Ａ）（本明細書において、（Ａ）成分と記載する場合がある）は、例えば後述の実施例１に記載した方法を用いて製造することができる。耐熱水性の観点から、エチレン―ビニルアルコール共重合体（Ａ）のけん化度は98モル％以上が好ましく、99.7モル％以上がより好ましい。エチレン―ビニルアルコール共重合体（Ａ）のエチレンの含有量が70モル％を越えて高くなるとビニルアルコール成分含量が低くなり、水酸基の減少のために親水性などの特性が低下することとなり、また逆にエチレン含量が30モル％より低くなってビニルアルコール成分含量が多くなり過ぎると溶融成型性が低下すると共に、熱溶融性ポリマーと複合繊維化する際曳糸性が不良となり、単糸切れ、断糸が多くなり好ましくない。従って、本発明において、エチレン―ビニルアルコール共重合体（Ａ）中のエチレン含有量は30〜70モル％が好ましく、32〜44モル％がより好ましい。
【００１４】
本発明で言う他の熱溶融型ポリマー（Ｂ）（本明細書において、（Ｂ）成分と記載する場合がある）としては、通常溶融紡糸可能なポリマーが用いられるが、望ましくはエチレン−ビニルアルコール共重合体（Ａ）より融点の高いポリマーが良く、例えばポリエチレンテレフタレート、80モル％以上がエチレンテレフタレート残基であり、酸成分またはグリコール成分の一部がテレフタル酸およびエチレングリコール以外の成分により変性された共重合ポリエステル、ポリブチレンテレフタレート、ポリヘキサメチレンテレフタレート及びそれらの共重合ポリエステル、ナイロン６、ナイロン66、ナイロン12及びそれらの共重合ポリアミド、ポリエステルエーテル、ポリエステルアミド、ポリフエニレンサルフアイド等が挙げられる。
【００１５】
そして、本発明に使用される繊維中における（Ａ）成分と（Ｂ）成分の断面における面積比は、細胞培養に適した疎水性および親水性のバランスがとれた環境を得、かつ目的とする断面形状を得るという観点から、10:90〜90:10が好ましく、15：85〜85：15がより好ましく、50：60〜60：50が更に好ましい。
【００１６】
本発明に用いられる繊維としては、例えば前記（Ａ）成分と前記（Ｂ）成分が繊維断面において交互に配置された複合繊維が例示される。該繊維の断面形状としては、特に限定はないが、前記（Ａ）成分または前記（Ｂ）成分がもう一方の成分を完全に包囲しない形状が好ましく、用途、性能に応じて例えば、多層型、中空多層型、花弁型、中空花弁型などが挙げられる。各断面形状の繊維は、それぞれに対応する口金ノズル孔構造を用いて紡糸することにより得ることができる。（Ａ）成分と（Ｂ）成分が均一に分散した構造を有する繊維であるため、このような繊維を使用することによって均一な性質を有する基体を提供できるという観点から、本発明に使用される繊維の断面形状としては、例えば図１に示されるように、（Ａ）成分と（Ｂ）成分が交互に配置されてなる多層型のものがより好ましい。
【００１７】
本発明に使用される繊維の単繊維直径は特に制限されないが、培養の対象として好ましい各種動物細胞は、数ミクロンの大きさであり、これらの動物細胞が培養基体に付着し、固定、伸展するのに適するという観点からは、直径は約5〜1000μmが好ましく、10〜200μmがより好ましく、20〜60μmが更に好ましい。また、本発明に使用される繊維は、長繊維であっても短繊維であってもよい。
【００１８】
また、本発明に使用される繊維は、単位体積あたりの細胞培養面積を増加させ、毛細管現象による栄養分の供給量を増加させる等の観点から、該（Ａ）成分と該（Ｂ）成分の接合面において少なくとも部分的に剥離、割繊されたものが好ましい。中でも、該（Ａ）成分と該（Ｂ）成分の接合面において10％以上剥離、割繊されたものが好ましく、50％以上剥離、割繊されたものがより好ましい。
【００１９】
上記の割繊比率は、例えば、以下の（1）〜（4）に示す一連の方法で算出することができる。
（1）測定対象の繊維について、長さ方向に任意の観測点を10点定め、各観測点について、該観測点を含む一定長さの観測区間を走査型電子顕微鏡（SEM）で観察する。
（2）エチレン−ビニルアルコール共重合体（Ａ）と他の熱溶融型ポリマー（Ｂ）とが接合してなる繊維は、（Ａ）成分と（Ｂ）成分との接合面（界面）を、1またはそれ以上の数、有するが、該繊維を剥離、割繊すると、少なくとも1つの接合面について、観測区間長さの全体または一部において剥離が観察される。このような観点で、各観測点における観測区間内の個々の接合面について、繊維の長さ方向に、剥離が生じている長さを計測する（なお、各接合面における接合が維持されている長さは、観測区間長さから、剥離が生じている長さを減じた値に相当する）。
（3）上記の剥離が生じている長さの計測値に基づき、以下の数式で、各観測点における割繊比率を算出する。
各観測点における割繊比率＝[(観測区間内の各接合面における剥離が生じている長さの計測値に基づく、当該区間内の全接合面を対象とする総和)／[(観測区間の長さ)×（接合面の数）]]×100（％）
（4）各観測点における割繊比率の加重平均値を、当該繊維の割繊比率とする。
【００２０】
例えば、特許文献４（19段落〜20段落）に記載されているように、前記（Ａ）成分と前記（Ｂ）成分のＳＰ値の差が1以上であれば、紡糸後の延伸時に繊維の長手方向に剥離、割繊を容易に生じさせることができる。ＳＰ値の差が1以下であれば、解離機を使用することにより剥離、割繊を行うことができる。すなわち、例えばＳＰ値の差を調整することで、剥離、割繊の割合を調整することができる。
【００２１】
また、繊維表面には、繊維断面形状を維持できる範囲で、細胞接着性タンパク質などの固定などの処理を行うことができる。
【００２２】
上記のようにして得られる繊維は、各種繊維集合体としても用いることができる。ここで繊維集合体とは、本発明の繊維単独よりなる織編物、不織布はもちろんのこと、前記の繊維を一部に使用してなる織編物や不織布、例えば、天然繊維、化学繊維、合成繊維など他の繊維との交編織布、あるいは、前記の繊維と他の天然繊維、化学繊維、合成繊維を混繊した織編物、混綿不織布などであってもよい。織編物や不織布中に占める前記の繊維の割合は、細胞の接着・伸展を抑制しないという観点から、50％以上が好ましく、99％以上がより好ましい。
【００２３】
本発明の細胞培養基体は、上記のようにして得られる繊維またはその集合体からなる。バイオリアクターを用いた物質生産を行うような場合、生産の効率を上げるため、高密度培養が要求されることから、本発明の細胞培養基体は、繊維の集合体であることが好ましい。
【００２４】
本発明はまた、該細胞培養基体を用いた培養方法に関する。本発明において培養とは、動物または植物の分化していない細胞および組織培養 物、細菌、放線菌、酵母、かび、きのこ、単細胞藻類、原生動物などの培養を包含するものである。培養は、例えば後述の実施例に記載の方法により行うことができる。
【００２５】
本発明の細胞培養基体を用いて培養される動物細胞としては、目的とする代謝生成物によって自由に選択することができ、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、キラー細胞、リンパ球、リンパ芽細胞などの浮遊性細胞や、ヒト腫瘍細胞、繊維細胞、ＥＢウイルス変異細胞、肝細胞、腎細胞、表皮細胞、骨髄細胞、マクロファージ、血管内皮細胞、平滑筋細胞、肝実質細胞、膵β細胞、上皮細胞、小腸細胞、乳腺細胞、乳腺上皮細胞、唾液腺細胞、甲状腺細胞、生体由来骨格筋細胞、皮膚細胞などの付着性細胞が挙げられる。これらの細胞は水や培養液等の溶媒に対して１０3〜１０6 セル／ｍｌ程度の濃度に混合、分散して前記細胞培養基体に付着させることができる。
【００２６】
さらに培養する動物細胞に供給する培養液の例としては、各種の必須アミノ酸、各種ビタミン類、グルコース等の糖類等の各主成分を含有する培地（例えば、ダルベッコ改良イーグル培地等）が挙げられる。培養液中における前記成分の含有量は、細胞の培養に適した量であればよい。これらは１〜１００ｇ／リットル程度の濃度の水溶液の形態で供給することが好ましい。また前記培地は、ウシ胎児血清培地、無血清培地、ヒト血清培地等のいずれであってもよい。
【実施例】
【００２７】
実施例１
容量50ｌの撹拌機付き耐圧重合槽に、ピバリン酸ビニル単量体20kg、メタノール4.5kg、エタノール1.5kgおよび重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル（AIBN）13gを仕込み、系内をエチレンで置換することによって酸素を十分除き、エチレン圧力を0.024 hPa（25kg/cm2）に保ち、撹拌しながら60℃で５時間重合反応を行った。素早く系内に重合禁止剤を投入して重合反応を停止した。ピバリン酸ビニルの重合率は50％であつた。当該共重合体をiso−プロパノールに溶解させ、減圧加熱して未反応単量体を追い出した。さらにアセトンを用いて再沈、精製した。当該重合体6kgを90kgのテトラヒドロフラン（THF）に溶かし、１時間窒素バブリングを行い酸素を十分に除去した。次に、水酸化カリウム（KOH）15.6kg（KOH使用量／ピバリン酸ビニル単位含有量のモル比6.5）を、45kgのメタノール（MeOH）に溶解させ同様に１時間窒素バブリングし酸素を十分に除去した。ついで両液を窒素置換した200ｌ耐圧反応槽に入れ、よく混合撹拌して75分、95℃でけん化を行い、得られたけん化物を純水で洗浄した後に105℃で20時間減圧乾燥した。なお、得られたけん化物のけん化度は99.7％であり、エチレン成分の含有量は32モル％であった。
【００２８】
この得られたエチレン−ビニルアルコール共重合体を（Ａ）成分とし、（Ｂ）成分としては、ポリエチレンテレフタレートでテトラクロロエタン：フエノール＝1.1の混合溶媒を用いて30℃で測定した固有粘度［η］＝0.59のチツプを用いた。（Ａ）成分と（Ｂ）成分との複合比率を2:3とし、その横断面は１１層の多層複合繊維となるよう、該複合ポリマーを紡糸温度285℃、紡糸巻取り速度2000m/分の紡糸条件で紡出した。紡出糸をホツトローラー80℃、ホツトプレート140℃で延伸倍率2.3倍の延伸を行い、56 dtex/36 fの接合型複合繊維を得た。なお、得られた接合型複合繊維の（Ａ）成分と（Ｂ）成分の断面における面積比は、（Ａ）成分：（Ｂ）成分 ＝6：5であった。
【００２９】
上記のごとく得られた、50％以上剥離、割繊された繊維を用いて、シート状の繊維集合体を作成した。この繊維集合体を蒸留水で３回洗浄した後、アルコール滅菌を行ったものを、直径２ｃｍの培養用ディッシュに敷いたものを培養基体とした。実験で使用するため、NIH3T3マウス線維芽細胞をダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ、１０％牛胎児血清含有、ＧＩＢＣＯ社製）を用いて、最終細胞濃度が、２×１０５細胞／ｍｌになるように細胞分散液を作成し、３７℃に保温した。この細胞分散液の２ｍｌを上記の方法で作製した培養床に注入した。これを素早く３７℃の炭酸ガスインキュベーター（５％炭酸ガス）に移し１０日間培養した。培地は３日に１回新鮮な培地と交換した。
【００３０】
以上のように培養した後、２．５％グルタールアルデヒドで固定し、次いで、凍結乾燥した後、走査型電子顕微鏡にて観察したところ、図２に示したように、細胞は培養基体に良好に接着しており、細胞の突起が良好に伸展していた。
【００３１】
比較例１
エチレン成分の含有量が３０〜７０モル％のエチレン―ビニルアルコール共重合体（Ａ）の代わりに、ポリプロピレンを用いて、接合型複合繊維を作成し、実施例１と同様のシート状の構造体を得、他の条件は同一で培養実験を行ったところ、図３に示したように、細胞の突起の伸展が図２に示した実施例１と比較して格段に少なかった。
【００３２】
実施例２
実施例１の培養基体を用いた培養4日後のサンプルを2.5％グルタールアルデヒドで固定し、次いで、凍結乾燥した後、走査型電子顕微鏡にて細胞の突起の長さを測定した。測定には、任意の細胞100個を用い、繊維偏平面に対して垂直方向から観察すべく、走査型電子顕微鏡の傾斜を調節した後、写真を撮影し、突起長を測定した。なお、ここでいう突起長とは、細胞の核中心部から最も離れた突起先端を結んだ直線の長さである。結果を図４に示す。
【００３３】
比較例２
実施例１の培養基体を用いる代わりに、比較例１の培養基体を用いた以外は実施例２と同様に行った。結果を図４に示す。
【００３４】
その結果、図４のように、実施例２の突起長は、比較例２の3倍となり、本発明の細胞培養基体を用いると、細胞の伸展がより効率的に進行することが定量的にも示された。
【００３５】
以上の結果から、エチレン成分の含有量が３０〜７０モル％のエチレン―ビニルアルコール共重合体（Ａ）と他の熱溶融解型ポリマー（Ｂ）と接合してなる繊維、もしくは該繊維を（Ａ）成分と（Ｂ）成分の接合面において少なくとも部分的に剥離、割繊されてなる繊維およびその集合体は、形態の制御に優れ、より効率の良い細胞の増殖が期待されるため、培養基体として非常に有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明のエチレン成分の含有量が３０〜７０モル％のエチレン―ビニルアルコール共重合体（Ａ）と他の熱溶融解型ポリマー（Ｂ）とが接合してなる繊維、もしくは該繊維を（Ａ）成分と（Ｂ）成分の接合面において少なくとも部分的に剥離、割繊されてなる繊維、例えば繊維断面において（Ａ）成分と（Ｂ）成分とが交互に配置されてなり、（Ａ）成分と（Ｂ）成分の接合面において５０％以上剥離、割繊した繊維、またはその集合体は、細胞培養、特に付着性動物細胞の三次元培養を行うに際して、細胞の足場となる細胞接着面を有しており、かつ、強度および耐水性に優れていることから、細胞培養用基体としてバイオリアクター等に用いることにより、より効率の良い細胞の増殖が可能となる。従って、細胞産生物の生産において、バイオリアクター用の三次元細胞培養用基体としての利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、本発明において使用される繊維の剥離、割繊前の複合繊維の切断面の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、培養10日後に観測された、本発明の細胞培養基体に接着したマウス線維芽細胞の電子顕微鏡写真である。
【図３】図３は、培養10日後に観測された、比較対照の細胞培養基体に接着したマウス線維芽細胞の電子顕微鏡写真である。
【図４】図４は、培養4日後に測定された、マウス線維芽細胞の突起長（μm）を示すグラフである。
【図１】
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【図４】
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【図２】
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【図３】
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