(57)【要約】      （修正有）【課題】被験試料中における目的とする菌の生存を検定する方法の提供。【解決手段】該菌の染色体上に存在する遺伝子配列から、該菌の特異的配列を基にしてプライマーを複数作製、該菌の生育上限濃度を測定し、プライマーを用いて特異的配列を複製・増幅する際の上記菌の検出下限濃度を測定し、プライマーの中から検出下限濃度が生育上限濃度未満となるプライマーの組み合わせを選択し、被験試料中に存在する該菌の生菌濃度と死菌濃度の合計（全菌濃度）を測定し、全菌濃度を基にして、全菌濃度が検出下限濃度未満となるように被験試料を希釈し、希釈被験試料を培地に添加して培養し、培養液に含まれる菌から採取したＤＮＡ混合物と、選択した濃度依存型プライマー対とを用い、上記特異的配列が複製・増幅されるか否かを判定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料中における目的とする菌の生存を検定する方法であって、予め、
（１）目的とする菌の染色体上に存在する遺伝子配列から、該菌に特異的な配列（以下、「特異的配列」という）を基にしてプライマーを複数作製しておくと共に、
（２）上記菌の生育濃度の上限（以下、「生育上限濃度」という）を測定し、
（３）上記（１）で作製したプライマーを用いて上記特異的配列を複製・増幅する際の上記菌の濃度の検出下限（以下、「検出下限濃度」という）を測定し、該プライマーの中から検出下限濃度が上記生育上限濃度未満となるプライマーの組み合わせ（以下、「濃度依存型プライマー対」という）を選択しておき、
（４）被験試料中に存在する上記目的とする菌の生菌濃度と死菌濃度の合計（以下、「全菌濃度」という）を測定する工程、
（５）上記全菌濃度を基にして、上記被験試料中に存在する上記菌の生菌濃度と死菌濃度の合計が上記（３）で測定した検出下限濃度未満となるように該被験試料を希釈する工程、
（６）工程（５）で得た希釈被験試料を培地に添加して培養する工程、
（７）上記工程（６）で得られた培養液に含まれる菌から採取したＤＮＡ混合物と上記工程（３）で選択した濃度依存型プライマー対とを用い、上記特異的配列が複製・増幅されるか否かを判定する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
上記工程（６）で、上記希釈被験試料を段階的に希釈したものを夫々複数調製し、培地に添加して培養し、
夫々の培養液に含まれる菌から採取したＤＮＡ混合物と上記（３）で選択した濃度依存型プライマー対を用い、上記特異的配列が複製・増幅されるか否かを指標とするＭＰＮ法により上記被験試料中での上記菌の生菌濃度を測定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記工程（４）を、
（４−１）上記菌の濃度に関係なく上記特異的配列を複製・増幅しうるプライマーの組み合わせ（以下、「非濃度依存型プライマー対」という）を上記（１）で作製したプライマーの中から選択し、
（４−２）上記被験試料を段階的に希釈したものを夫々複数調製し、培地に添加して培養し、
上記培養液に含まれる菌から採取したＤＮＡ混合物と上記工程（４−１）で選択した非濃度依存型プライマー対とを用い、上記特異的配列が複製・増幅されるか否かを指標とするＭＰＮ法により行なう請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記（１）の特異的配列を、分解酵素をコードする遺伝子配列の中から選択する請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
上記（１）の特異的配列を、デハロゲナーゼ遺伝子の配列の中から選択する請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
上記（３）の濃度依存型プライマー対として、
ＯＲＦ０２０８−５３４Ｆ：5’AAGGAGGAGAAGCGAAGCG 3’と、
ＯＲＦ０２０８−８３２Ｒ：5’TCTGCCTCAATATGCGAAGG 3’
とを用いる請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５７３）の検定を行なうものである請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験試料中における目的とする菌の生存を検定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境分野や食品、医療などの分野では、特定の微生物による汚染の程度を把握する上で、被験試料中での特定の微生物（特に生きた微生物）の有無や濃度を正確に把握する方法の開発が求められている。
【０００３】
環境分野では、従来、汚染土壌や汚染水での汚染度を低減させる方法として、吸引吸着法など様々な処理方法が用いられてきたが、これらの方法では処理に要する費用が高いなどの欠点があった。そこで近年、より穏和な条件で安価に実施でき、さらに省エネルギーの観点から優れていることから、微生物を用いて汚染度を低減させる方法（バイオレメディエーション）が注目されている。その際、バイオレメディエーションをより効率よく行うには、環境試料中に存在する特定の微生物の有無や濃度を正確に把握する必要があった。
【０００４】
しかし環境試料中に存在する特定の微生物の有無や濃度を測定するための従来の方法では、目的とする微生物が特異的に分解しうる基質や目的とする微生物が耐性を示す物質を添加した選択培地に被験試料の一部を添加して培養し、基質濃度の変化や微生物の生育の度合いから環境試料中での目的とする微生物の有無や濃度を測定していた。
【０００５】
上記方法では、属や種ごとでの存在や濃度は特定できるものの、種以下（菌株レベル）での特定は困難であった。そこで特許文献１では、特定の菌株に特異的な遺伝子配列を基にしてプライマーを構築し、該プライマーと被験試料から抽出したＤＮＡとを使ってＰＣＲを行い、上記遺伝子が複製・増幅されるか否かを基にして、目的とする菌株が被験試料中に存在するか否かを判定している。
【特許文献１】特開平８−２５６７９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献１に記載の方法で得られた結果からでは、生きている菌と死んでいる菌とを区別することはできなかった。そのため特許文献１に記載の方法で被験試料中に目的とする菌株が存在すると検定できたとしても、被験試料中に存在している菌の多くが死んでいる菌であると、被験試料をバイオレメディエーションに供したとしても、十分な効果が得られなかった。
【０００７】
そこで本発明は被験試料中における目的とする菌の生存を検定する方法を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、被験試料をプライマーの検出下限濃度未満まで一旦希釈した上で培養したものから得たＤＮＡ混合物と、感度の低いプライマーとを用いて目的とする菌に特異的な遺伝子の複製・増幅を試みることで、死菌濃度に左右されることなく、目的とする菌の生存を検定できることを見出し、本発明に至った。
【０００９】
本発明の被験試料中における目的とする菌の生存を検定する方法では、予め、
（１）目的とする菌の染色体上に存在する遺伝子配列から、該菌に特異的な配列（以下、「特異的配列」という）を基にしてプライマーを複数作製しておくと共に、
（２）上記菌の生育濃度の上限（以下、「生育上限濃度」という）を測定し、
（３）上記（１）で作製したプライマーを用いて上記特異的配列を複製・増幅する際の上記菌の濃度の検出下限（以下、「検出下限濃度」という）を測定し、該プライマーの中から検出下限濃度が上記生育上限濃度未満となるプライマーの組み合わせ（以下、「濃度依存型プライマー対」という）を選択しておき、
（４）被験試料中に存在する上記目的とする菌の生菌濃度と死菌濃度の合計（以下、「全菌濃度」という）を測定する工程、
（５）上記全菌濃度を基にして、上記被験試料中に存在する上記菌の生菌濃度と死菌濃度の合計が上記（３）で測定した検出下限濃度未満となるように該被験試料を希釈する工程、
（６）工程（５）で得た希釈被験試料を培地に添加して培養する工程、
（７）上記工程（６）で得られた培養液に含まれる菌から採取したＤＮＡ混合物と上記工程（３）で選択した濃度依存型プライマー対とを用い、上記特異的配列が複製・増幅されるか否かを判定する工程を含むことを特徴としている。
【００１０】
上記工程（６）で、上記希釈被験試料を段階的に希釈したものを夫々複数調製し、培地に添加して培養し、
夫々の培養液に含まれる菌から採取したＤＮＡ混合物と上記（３）で選択した濃度依存型プライマー対を用い、上記特異的配列が複製・増幅されるか否かを指標とするＭＰＮ法により行なうことで、上記被験試料中での上記菌の生菌濃度を測定できる。
【００１１】
上記工程（４）を、
（４−１）上記菌の濃度に関係なく上記特異的配列を複製・増幅しうるプライマーの組み合わせ（以下、「非濃度依存型プライマー対」という）を上記（１）で作製したプライマーの中から選択し、
（４−２）上記被験試料を段階的に希釈したものを夫々複数調製し、培地に添加して培養し、
上記培養液に含まれる菌から採取したＤＮＡ混合物と上記工程（４−１）で選択した非濃度依存型プライマー対とを用い、上記特異的配列が複製・増幅されるか否かを指標とするＭＰＮ法により行なうことで、上記被験試料中での上記菌の生菌濃度を測定することもできる。
【００１２】
上記（１）の特異的配列は、分解酵素（特にデハロゲナーゼ遺伝子）をコードする遺伝子配列の中から選択することが好ましい。また上記（３）の濃度依存型プライマー対として、ＯＲＦ０２０８−５３４Ｆ：5’AAGGAGGAGAAGCGAAGCG 3’と、ＯＲＦ０２０８−８３２Ｒ：5’TCTGCCTCAATATGCGAAGG 3’とを用いることが好ましい。
【００１３】
上記検定方法では、目的とする菌をＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５７３）とすることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の検定方法では、被験試料をプライマーの検出下限濃度未満まで一旦希釈した上で、培養したものから得たＤＮＡ混合物と、感度の低いプライマーとを用いて目的とする菌に特異的な遺伝子の複製・増幅を試みているため、死菌濃度に左右されることなく、被験試料中における目的とする菌の生存を検定することができる。
【００１５】
従って本発明の検定方法を用いて目的とする菌の生存を検定した被験試料を用いることで、効率よくバイオレメディエーションを行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の検定方法では、被験試料中に存在する目的とする菌の濃度がある特定濃度以上であれば、目的とする菌の存在を検定できるプライマー対を予め作製する。そして上記被験試料中に存在する目的とする菌の濃度を上記特定の濃度未満となるように一旦希釈して培養し、培養液から抽出したＤＮＡ混合物と、上記プライマー対とを用いて上記特異的配列の複製・増幅を試みることで、被験試料中での目的とする菌の生存を検定することができる。
【００１７】
本発明の検定方法で対象とする菌とは、特定の養分を含んだ液体培地で増殖しうるものであり、具体的には細菌やスピロヘータ、マイコプラズマなどの原核菌類の中から選択することができる。中でも細菌が好ましく、さらにはＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属やＤｅｈａｌｏｃｏｃｏｉｄｅｓ属などの脱塩素化菌（特にＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ＫＢＣ−１株）が好ましい。
【００１８】
上記プライマーは、より具体的には目的とする菌に特異的な遺伝子配列を基にして構築したものであり、被験試料中に目的とする菌がある特定の濃度以上存在すれば該特異的配列を複製・増幅でき、特定濃度未満であれば該特異的配列を複製・増幅できないプライマー（濃度依存型プライマー対）である。上記特定の濃度とは、０よりも高く、かつ目的とする菌を特定の培地で培養した際に、該菌が増殖して増える濃度の上限（生育上限濃度）未満の範囲の中から選択された濃度である。
【００１９】
上記濃度依存型プライマー対は下記のようにして製造することができる。
（１）目的とする菌の染色体上に存在する遺伝子配列から、該菌に特異的な配列（以下、「特異的配列」という）を基にしてプライマーを複数作製する。具体的には、目的とする菌から公知の方法（アルカリプレップ法など）にてＤＮＡを抽出し、公知の方法（サンガー法など）で目的とする菌での遺伝子配列を決定する。得られた遺伝子配列を遺伝子バンクなどに登録されている他の菌での遺伝子配列と比較し、特に相同性が異なる配列（特異的配列）を特定する。そして特定した配列を基にして公知の遺伝子合成装置にてプライマーを作製する。プライマーの長さは、特に制限されないが２０〜３０塩基対程度で十分である。
【００２０】
上記特異的配列は、検定誤差を少なくする観点から、個体内でのコピー数が少ないことや個体間でのコピー数の差異が少ない、染色体上に存在する遺伝子配列（構造遺伝子や調節遺伝子）の中から選択することが好ましい。特に、多くの属や種で配列が調査されている構造遺伝子（特に分解酵素などのアミノ酸配列をコードする遺伝子）の中から選択することが好ましい。中でも目的とする菌の特性に関与する遺伝子の中から選択することで、検索対象を減らすことができる。脱塩素化菌（特にＰＣＥ脱塩素化菌）では、該菌で特異的に存在するデハロゲナーゼ遺伝子の中から選択することが好ましい。
【００２１】
次に（２）上記菌の生育濃度の上限（生育上限濃度）を測定する。生育上限濃度とは、目的とする菌を特定の培地で培養した際に、該菌が増殖して増える濃度の上限を意味し、特定の培地（以下、「生育検定培地」ともいう）に目的とする菌のみを植菌し、目的とする菌の増殖を経時的に測定することで決定できる。
【００２２】
上記測定方法は、例えば形態などに特徴があるものでは、顕微鏡観察法（セルカウント法やＦＩＳＨ法、ＤＡＰＩ法）やＰＣＲ（ＭＰＮ／ＰＣＲやｎｅｓｔｅｄＰＣＲ、定量ＰＣＲなど）で測定してもよいし、代謝に特徴があるものでは被験試料に基質を添加して生成される生成物の濃度から測定することができる。
【００２３】
上記生育検定培地は、目的とする菌の特性に応じて選択すればよく、ＬＢ培地などが挙げられる。その他の培養条件は、目的とする菌の特性や採用した培地の種類に応じて適宜選択すればよい。
【００２４】
そして（３）上記（１）で作製したプライマーを用いて上記特異的配列を複製・増幅する際の上記菌の濃度の検出下限（検出下限濃度）を測定し、該プライマーの中から検出下限濃度が上記生育上限濃度未満となるプライマーの組み合わせを選択する。
【００２５】
上記検出下限濃度とは、上記（１）で作製したプライマーと目的とする菌を含む溶液から抽出したＤＮＡとを用いて上記特異的配列の複製・増幅を試みた際に、該特異的配列を複製・増幅させるために、最小限必要な溶液中での菌濃度を意味し、下記する方法で測定することができる。初めに上記（１）で作製したプライマーの中から、任意にプライマーの組み合わせ（以下、「プライマー対」ともいう）を選択する。次に上記プライマー対と、目的とする菌の含有濃度を希釈させて調製した溶液から抽出したＤＮＡ混合物とを用いて上記特異的配列の複製・増幅を試みる。そして特異的配列を複製・増幅しうる限界での、目的とする菌の含有濃度をもって検出下限濃度とすることができる。
【００２６】
上記特定の培地は、目的とする菌の特性に応じて選択すればよいが、上記生育上限濃度の測定で採用した培養条件をそのまま適用できることから、上記生育検定培地と組成が類似または同一のものを用いることが好ましい。その他の培養条件は、目的とする菌の特性や採用した培地の種類に応じて適宜選択すればよい。
【００２７】
ＤＮＡ混合物の抽出は、上記（１）で述べたのと同様な方法（アルカリプレップ法など）で行なうことができる。上記特異的配列の複製・増殖させる方法としては、ＰＣＲ法が挙げられる。ＰＣＲ法で行なう場合、温度条件などは設計したプライマーのＴｍ値などを参考にして適宜決定すればよい。
【００２８】
上記濃度依存型プライマーの具体例としては、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ＫＢＣ−１株では、デハロゲナーゼ遺伝子を基にして構築した下記するＳＥＱ１およびＳＥＱ２の組み合わせからなるプライマーが挙げられる。
・ＯＲＦ０２０８−５３４Ｆ（ＳＥＱ１）
5’AAGGAGGAGAAGCGAAGCG 3’
・ＯＲＦ０２０８−８３２Ｒ（ＳＥＱ２）
5’TCTGCCTCAATATGCGAAGG 3’
また想定される目的とする遺伝子が複製・増幅されるか否かの判断は、該遺伝子の複製・増幅を試みたサンプルを、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルなどを用いた電気泳動に供することで行なうことができる。
【００２９】
なお、上記濃度依存型プライマー対を選択する際に排除した培養液中での目的とする菌の濃度に関係なく上記特異的配列を複製・増幅できるプライマー対（以下、「非濃度依存型プライマー対」ともいう）は、後述する被験試料中に存在する全菌濃度を測定するプライマーとして用いることができる。
【００３０】
次に被験試料をプライマーの検出下限濃度未満まで一旦希釈するために、
（４）被験試料中に存在する上記目的とする菌の生菌濃度と死菌濃度の合計（全菌濃度）を測定する工程と、
（５）上記全菌濃度を基にして、上記被験試料中に存在する上記菌の生菌濃度と死菌濃度の合計が上記（３）で測定した検出下限濃度未満となるように該被験試料を希釈する工程とを行なう。
【００３１】
上記工程（４）および（５）では被験試料中での目的とする菌の生菌濃度と死菌濃度の合計を検出下限濃度未満に一旦希釈しているため、培養前の被験試料と上記濃度依存型プライマー対とを用いた場合では、特異的配列が複製・増幅されない状態となっている。
【００３２】
上記全菌濃度を測定する方法は、必ずしも厳密に測定する必要はない。例えば形態などに特徴があるものでは、顕微鏡観察法（セルカウント法やＦＩＳＨ法、ＤＡＰＩ法）やＰＣＲ（ＭＰＮ／ＰＣＲやｎｅｓｔｅｄＰＣＲ、定量ＰＣＲなど）で測定してもよいし、代謝に特徴があるものでは被験試料に基質を添加して生成される生成物の濃度から測定することができる。また前述の非濃度依存型プライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動に供し、上記特異的配列に相当するバンドをエチジウムブロマイドなどで染色した際の光度を、予め濃度が判明している公知の菌から得たＤＮＡ断片をエチジウムブロマイドなどで染色した際の光度と比較して全菌濃度を測定することもできる。また、より正確に全菌数を測定できることから、上述の非濃度依存型プライマー対を用い、特異的配列が複製・増幅されるか否かを指標とし、後述する最確数法（ＭＰＮ法）にて測定することも好ましい。
【００３３】
なお被験試料の希釈には、上記生育培地と組成が同一または類似したものを用いることが好ましい。
【００３４】
そして、（６）工程（５）で得た希釈被験試料を培地に添加して培養する。
【００３５】
上記培地は、上記生育上限濃度の測定で採用した培養条件をそのまま適用できることから、上記検定培地と類似または同一の組成からなるものを用いることが好ましい。また培養条件（特に培養日数）は、目的とする菌の生育上限濃度と濃度依存型プライマー対の検出下限濃度の差や、判定培養液や検定培養液の種類に応じて適宜調節すればよい。具体的には、上記生育上限濃度と検出下限濃度の差が大きければ、培養日数を長くするなどして調節することができる。
【００３６】
そして（７）上記工程（６）で得られた培養液に含まれる菌から採取したＤＮＡ混合物と、上記工程（３）で選択した濃度依存型プライマー対とを用い、上記特異的配列が複製・増幅されるか試みる。
【００３７】
本工程を行なうことで、被験試料中に存在する目的とする菌が死菌のみであれば、培養液中での目的とする菌の含有濃度は上昇せず、培養後の培養液に含まれる菌から抽出したＤＮＡ混合物と上記濃度依存型プライマー対を用いれば特異的配列は複製・増幅されず、被験試料中には目的とする菌の生存は認められないと判定することができる。一方被験試料中に目的とする菌の中に生菌が存在すれば、培養によって培養液中で生菌が増殖し、培養液中での菌の濃度が上昇して目的とする菌の濃度が上記検出下限濃度以上に達し、培養後の培養液に含まれる菌から抽出したＤＮＡ混合物と上記濃度依存型プライマー対を用いることで特異的配列が複製・増幅され、被験試料中に目的とする菌の生存が認められると判定できる。
【００３８】
上記ＤＮＡ混合物を抽出する方法や特異的配列を複製・増殖させる方法は、上記（３）で述べたのと同様な方法で行なうことができる。
【００３９】
また上記工程（７）で、特異的配列が複製・増幅されているか否かを指標として、下記するＭＰＮ法を組み合わせることで、被験試料中での目的とする菌の定量を行なうこともできる。
【００４０】
上記全菌濃度や生菌濃度の測定で用いるＭＰＮ法は、公知の方法（３本法や５本法など）を適用することができる。
【００４１】
すなわち、検査試料（生菌濃度の測定では、上記工程（６）で得た希釈被験試料、全菌濃度の測定では被験試料）を段階的に希釈したものを夫々複数調製し、培地に添加して培養し、
夫々の培養液に含まれる菌から採取したＤＮＡ混合物とプライマー対（生菌濃度の測定では濃度依存型プライマー対、全菌濃度の測定では非濃度依存型プライマー対）を用い、上記特異的配列が複製・増幅されるか否かを指標とすることで行なうことで測定できる。
【００４２】
詳しくは、上記検査試料を特定の希釈率（５倍や１０倍）で希釈したものを複数（３本法であれば３本、５本法であれば５本）調製して第１希釈液を作製する。第１希釈液ごとに、さらに上記と同様な希釈率で希釈したものを調製して第２希釈液（３本法であれば３本、５本法であれば５本）を作製する。同様な操作を繰り返して第３希釈液を作製する。次に第１〜３希釈液を培地に添加して培養し、夫々の培養液からＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡ抽出物とプライマー対（生菌濃度の測定では濃度依存型プライマー対、全菌濃度の測定では非濃度依存型プライマー対）を用い特異的配列が複製・増幅されるか否かを判定する。そして第１〜３希釈液ごとに上記特異的配列が複製・増幅された希釈液の本数を数え、最確数表に照らし合わせて最確値（ＭＰＮ値）を求め全菌濃度または生菌濃度を測定することができる。上記最確数表は、Woodwardらが提唱している最確数表に限定されるものではなく、測定結果に応じてHurley & Roscoeらが提唱している最確数表やSalamaらが提唱している最確数表なども適用することができる。
【実施例】
【００４３】
・目的とする菌：Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５７３）
・液体培地の組成
本実施例では、培養液として下記する液体培地を作製し、１２０℃、２０分間、オートクレーブにて滅菌処理を施した。なお、下記Ｗｏｌｆｅｓ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎの調製では、フィルター滅菌を施した塩酸を適宜滴下して試薬を溶解させた。
【００４４】
【表１】
2006238838.tif 000002
ＳＬ-10  Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
【００４５】
【表２】
2006238838.tif 000003
Ｗｏｌｆｅｓ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
【００４６】
【表３】
2006238838.tif 000004
【００４７】
＜ＰＣＲ条件＞
・反応液：
ＤＮＡサンプル液       1μｌ
５３４Ｆプライマー   0.5μｌ
８３２Ｒプライマー   0.5μｌ
ＥＸ ｍｉｘ           25μｌ
蒸留水                23μｌ
計                  50μｌ
上記ＥＸ ｍｉｘは、Ｔａｋａｒａ社製のＰｒｅｍｉｘ  Ｔａｑを用いた。
・反応条件
９５℃×１０分を１回行い、９５℃×１分−５５℃×１分−７２℃×１分を２５サイクル行なった後、７２℃×７分を１回行い、４℃で保存した。
【００４８】
＜ＫＢＣ−１培養液の作製＞
上記液体培地にＫＢＣ−１株を植菌し、３０℃で３日間培養した。培養後、上記液体培地を用いて、ＫＢＣ−１株の濃度が１０9ｃｅｌｌ／ｍｌ、１０8ｃｅｌｌ／ｍｌ、１０7ｃｅｌｌ／ｍｌ、１０6ｃｅｌｌ／ｍｌである培養液を調製した。
【００４９】
＜ＤＮＡサンプル液の作製＞
ＤＮＡサンプル液は、被験試料または培養液を５００μｌ用い、ＢＩＯ  １０１社製  ＦａｓｔＤＮＡｋｉｔにて作製した。
【００５０】
＜ＭＰＮ法＞
検査試料を１０倍希釈したものを３本調製して第１希釈液を作製する。第１希釈液ごとに、さらに１０倍希釈したものを３本調製して第２希釈液を作製する。同様な操作を繰り返して第３希釈液を作製する。次に第１〜３希釈液を上記液体培地に添加して培養し、夫々の培養液からＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡ抽出物とプライマー対（生菌濃度の測定では濃度依存型プライマー対、全菌濃度の測定では非濃度依存型プライマー対）を用い特異的配列が複製・増幅されるか否かを判定する。そして第１〜３希釈液ごとに上記特異的配列が複製・増幅された希釈液の本数を数え、Woodwardらが提唱している最確数表に照らし合わせて最確値（ＭＰＮ値）を求め全菌濃度または生菌濃度を測定する。
【００５１】
Ａ．ＫＢＣ−１株に特異的な濃度依存型プライマーおよび非濃度依存型プライマーの作製
Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ＫＢＣ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５７３）が有するデハロゲナーゼ遺伝子の配列と他の菌でのデハロゲナーゼ遺伝子の配列とを比較し、相同性が異なる領域を基にして下記する４種類のプライマー（ＯＲＦ０２０８−５４６Ｆ、ＯＲＦ０２０８Ｒ１、ＯＲＦ０２０８−５３４Ｆ、ＯＲＦ０２０８−８３２Ｒ）を作製した。
ＯＲＦ０２０８−５４６Ｆ（ＳＥＱ１）
5’CGAAGCGTTGGAATAAGTCG 3’
ＯＲＦ０２０８Ｒ１（ＳＥＱ２）
5’TTAAAACAGCGACTCCCGTG3’
ＯＲＦ０２０８−５３４Ｆ（ＳＥＱ３）
5’AAGGAGGAGAAGCGAAGCG 3’
ＯＲＦ０２０８−８３２Ｒ（ＳＥＱ４）
5’TCTGCCTCAATATGCGAAGG 3’
【００５２】
次に上記ＫＢＣ−１培養液（ＫＢＣ−１株濃度：１０9、１０8、１０7、１０6ｃｅｌｌ／ｍｌ）を用いてＤＮＡサンプル液を作製した。
【００５３】
上記ＤＮＡサンプル液と上記プライマーの中から幾つかの組み合わせを作製してＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動に供し、泳動後、ゲルをエチジウムブロマイドにて染色したものを図１および２に記載した。
【００５４】
図１は、上記ＯＲＦ０２０８−５３４ＦとＯＲＦ０２０８−８３２Ｒからなるプライマー対を用いた場合の、培養液中でのＫＢＣ−１株の濃度の違いが特異的配列（約３００ｂｐ）の複製・増幅に与える影響について調べたものである。図中１はマーカー（ＮＥＷ  Ｅｎｇｌａｎｄ社製  １００ｂｐ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ）を示し、２はＫＢＣ−１株濃度が１０9ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いたもの、３は１０8ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いたもの、４は１０7ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いたもの、５は１０6ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いたものを示している。図１に示すように、培養液中にＫＢＣ−１株が１０8ｃｅｌｌ／ｍｌ以上存在すると、約３００ｂｐの特異的配列の複製・増幅が認められるが、それ以下では認められなかった。上記の結果から、本プライマー対はＫＢＣ−１株の検出に有用な濃度依存型プライマー対であり、その検出下限濃度は１０8ｃｅｌｌ／ｍｌであることが判明した。
【００５５】
図２は、ＯＲＦ０２０８−５３４ＦとＯＲＦ０２０８Ｒ１からなるプライマー対を用いた場合の、培養液中でのＫＢＣ−１株の濃度の違いが特異的配列（約５５０ｂｐ）の複製・増幅に与える影響について調べたものである。図中６はＫＢＣ−１株の濃度が１０9ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いたもの、７は１０8ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いたもの、８は１０7ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いたもの、９は１０6ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いたもの、１０は１０5ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いたものを示している。図２の結果、上記プライマー対は、培養液中でのＫＢＣ−１株の濃度に依存することなくＫＢＣ−１株を特異的に検出できるため、ＫＢＣ−１株の検出に有用な非濃度依存型プライマーといえる。
【００５６】
図３はＯＲＦ０２０８−５４６ＦとＯＲＦ０２０８−８３２Ｒからなるプライマー対を用いた結果である。図中１１はＫＢＣ−１株の濃度が１０9ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いたもの、１２は１０8ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いたもの、１３は１０7ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いたもの、１４は１０6ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いたもの、１５は１０5ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いたものを示している。上記プライマー対では、培養液中にＫＢＣ−１株が１０7ｃｅｌｌ／ｍｌ以下であれば上記特異的なバンドを検出できるが、１０8ｃｅｌｌ／ｍｌ以上では検出できない。
【００５７】
Ｂ．被験試料としてＫＢＣ−１株が存在する河川の水を想定した河川中に存在するＫＢＣ−１株の生菌の検定
上記液体培地にＫＢＣ−１株を植菌して３０℃で培養し、１日ごとに培養液の一部（５００μｌ）を採取しＭＰＮ法にて菌数を確認した。その結果、ＫＢＣ−１株は培養３日目に増殖が最大（１．０×１０9ｃｅｌｌ／ｍｌ）となり、培養５日目には全てのＫＢＣ−１株が死菌となった。
【００５８】
ＫＢＣ−１培養液を河川水に添加して被験試料を作製した。次にＡ．で作製した濃度依存型プライマー対（ＯＲＦ０２０８−５３４ＦとＯＲＦ０２０８―８３２Ｒからなるプライマー対）を用いてＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動に供し、泳動後、ゲルをエチジウムブロマイドにて染色し、ＫＢＣ−１株で特異的に検出される約２９０ｂｐでのバンドの有無を指標として、被験試料中でのＫＢＣ−１株の濃度を調べた。その結果、被験試料中でのＫＢＣ−１株の濃度が１．０×１０8ｃｅｌｌ／ｍｌであることを確認した。
【００５９】
上記被験試料１００μｌと上記液体培地２ｍｌとを５ｍｌのバイアル瓶に添加し（ＫＢＣ−１株濃度：５．０×１０6ｃｅｌｌ／ｍｌ）、３０℃で３日間培養した。培養後、培養液からＤＮＡを抽出し、Ａ．で作製した濃度依存型プライマー対（ＯＲＦ０２０８−５３４ＦとＯＲＦ０２０８−８３２Ｒからなるプライマー対）を用いてＰＣＲを行なった。なお比較サンプルとして被験試料を３０℃で５日間培養し、生菌が認められなくなったものを作製し、比較サンプル１００μｌと上記液体培地２ｍｌとを５ｍｌのバイアル瓶に添加し（ＫＢＣ−１株濃度：５．０×１０6ｃｅｌｌ／ｍｌ）、３０℃で３日間培養したものも作製した。これら比較サンプルから得たＤＮＡについても上記濃度依存型プライマー対を用いてＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ産物は２％アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルをエチジウムブロマイドにて染色したものを図４に記載した。
【００６０】
図中１６は３０℃で培養する前の被験試料から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった結果であり、１７は液体培地を添加した被験試料を３０℃で３日間静置培養を行なった後の培養液から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった結果であり、１８は比較サンプルから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった結果であり、１９は液体培地を添加した比較サンプルを３０℃で３日間培養した培養液から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった結果を示したものである。
【００６１】
上記の結果から、培養液中でのＫＢＣ−１株の濃度を、上記濃度依存型プライマー対の検出下限濃度（１０8ｃｅｌｌ／ｍｌ）未満に一旦希釈しているため、上記濃度依存型プライマー対を用いてもＫＢＣ−１株の検出はできない（１６）。しかし培養液中には生菌が存在しているため、被験試料に液体培地を添加して３０℃で３日間培養すると、培養液中に存在する生菌が増殖し、ＰＣＲで上記特異的配列が複製・増幅され、電気泳動にて該特異的配列に相当するバンド（約３００ｂｐ）が認められた（１７）。しかし比較サンプルでは、培養液中に存在するＫＢＣ−１株の全てが死菌であるため、３０℃・3日間の培養前（１８）および培養後（１９）のいずれにおいても上記特異的なバンドの出現は認められなかった。
【００６２】
なお濃度依存型プライマー対の代わりに非濃度依存型プライマー対を用いて、同様な実験を行なった結果を示したのが図５である。
【００６３】
図中２０は３０℃で培養する前の被験試料から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった結果であり、２１は液体培地を添加した被験試料を３０℃で３日間静置培養を行なった後の培養液から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった結果であり、２２は比較サンプルから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった結果であり、２３は液体培地を添加した比較サンプルを３０℃で３日間培養した培養液から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった結果を示したものである。
【００６４】
図５の結果から、レーン２０〜２３のいずれにおいてもＫＢＣ−１株に特異的なバンドの検出は認められ、生菌・死菌に係わらず、培養液中にＫＢＣ−１株が存在すると判断されてしまう
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ＯＲＦ０２０８−５３４ＦとＯＲＦ０２０８−８３２Ｒからなるプライマー対を用い、培養液中でのＫＢＣ−１株の濃度と特異的なバンドの出現との関係を示した図である。
【図２】ＯＲＦ０２０８−５３４ＦとＯＲＦ０２０８Ｒ１からなるプライマー対を用い、培養液中でのＫＢＣ−１株の濃度と特異的なバンドの出現との関係を示した図である。
【図３】ＯＲＦ０２０８−５４６ＦとＯＲＦ０２０８−８３２Ｒからなるプライマー対を用い、培養液中でのＫＢＣ−１株の濃度と特異的なバンドの出現との関係を示した図である。
【図４】ＯＲＦ０２０８−５３４ＦとＯＲＦ０２０８−８３２Ｒからなるプライマー対を用いて本発明の検定方法を行なった結果を示したものである。
【図５】ＯＲＦ０２０８−５３４ＦとＯＲＦ０２０８Ｒ１からなるプライマー対を用いて検定を行なった比較例を示したものである。
【符号の説明】
【００６６】
１：マーカー
２、６、１１：ＫＢＣ−１株濃度が１０9ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いた結果
３、７、１２：ＫＢＣ−１株濃度が１０8ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いた結果
４、８、１３：ＫＢＣ−１株濃度が１０7ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いた結果
５、９、１４：ＫＢＣ−１株濃度が１０6ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いた結果
１０、１５：ＫＢＣ−１株濃度が１０5ｃｅｌｌ／ｍｌの培養液から得たＤＮＡサンプル液を用いた結果
１６、２０：３０℃で培養する前の被験試料から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった結果
１７、２１：液体培地を添加した被験試料を３０℃で３日間静置培養を行なった後の培養液から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった結果
１８、２２：比較サンプルから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった結果
１９、２３：液体培地を添加した比較サンプルを３０℃で３日間培養した培養液から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行なった結果
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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