(57)【要約】【課題】  簡便な培養器具により、低コスト、短時間でin vivoに近い表皮細胞の培養系を調製すること。【解決手段】  魚類より単離した鱗の表皮細胞付着面を、培養基材表面に接触させつつ、当該鱗の表皮細胞付着面以外の部分において、当該鱗を当該培養基材に固定する工程を含む、魚類の鱗からの表皮細胞の培養方法。【選択図】  図１
2006061005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類より単離した鱗の表皮細胞付着面と反対側の面を、培養基材表面に接触させつつ、当該鱗の表皮細胞付着面以外の部分において、当該鱗を当該培養基材に固定する工程
を含む、魚類の鱗からの表皮細胞の培養方法。
【請求項２】
両端が前記培養基材の表面に固定された、円状又は略円状の横断面を有する棒と、当該培養基材の表面との間に前記鱗の表皮細胞付着面以外の部分を挟み込むことにより前記の固定を行う、請求項１に記載の表皮細胞の培養方法。
【請求項３】
前記魚類より単離した鱗が複数枚よりなり、前記培養基材表面における各鱗からの表皮細胞のシート状遊走方向が互いに向き合うよう、当該鱗を少なくとも二つに分けて当該培養基材上に配置する、請求項１又は２に記載の表皮細胞の培養方法。
【請求項４】
前記一対の鱗同士の距離が、当該鱗の直径又は最大の対角線の長さの２〜６倍の範囲にある、請求項３に記載の表皮細胞の培養方法。
【請求項５】
前記培養基材及び/又は前記棒がガラス製である、請求項１乃至４の何れか一項に記載の表皮細胞培養方法。
【請求項６】
前記培養基材表面が、増殖因子、又は細胞外マトリックスを構成する物質によりコーティングされている、請求項１乃至５の何れか一項に記載の表皮細胞の培養方法。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか一項に記載の表皮細胞培養方法により形成された表皮細胞培養物。
【請求項８】
請求項３又は４に記載の表皮細胞培養方法により形成された皮膚シート。
【請求項９】
培養基材、及び横断面が円状又は略円状の棒を含み、当該棒がその両端において当該培養基材の表面に固定された、魚類の鱗固定用器具。
【請求項１０】
前記棒と、当該棒が固定される前記培養基材の表面とが、固定する魚類の鱗の厚みよりもわずかに小さい隙間を有して固定される、請求項９に記載の魚類の鱗固定用器具。
【請求項１１】
前記培養基材及び/又は前記棒がガラス製である、請求項９又は１０に記載の魚類の鱗固定用器具。
【請求項１２】
前記培養基材の表面が増殖因子又は細胞外マトリックスを構成する物質によりコーティングされている、請求項９乃至１１の何れか一項に記載の魚類の鱗固定用器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類の鱗固定器具、及び魚類の鱗からの表皮細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚の創傷治癒モデル系としては、ヒト皮膚のバイオプシーサンプルを利用した皮膚培養系、ヒトのプライマリーな表皮細胞（ケラチノサイト）及び真皮細胞（ファイブロブラスト）を用いた再構成皮膚培養系が知られている。また、これらの何れかにメラノサイトを加えた、色素沈着のモデル系も知られている。これらの系を用いて、創傷時の表皮の遊走や、創傷閉鎖、炎症、色素産生などの研究、更には医薬品・化粧品開発におけるスクリーニング等が行われている。
【０００３】
上記のバイオプシーサンプルを利用する培養系は、最もin vivoに近い系であるという利点があるが、バイオプシーサンプルを定常的に入手することは困難であり、この培養系を使用した実験では、結果を得るのに１〜２週間の期間が必要となる。一方、再構成皮膚培養系では、数日で結果を得られるという利点があること、更に確立された細胞株を組合せたものでは、培養ロットごとの差異が少なく、実験の再現性が高いといった有利な特徴があるものの、比較的高度な培養技術と高価な培養液が必要となる。また、マウス由来の皮膚や細胞を使った培養系もあるが、ヒト由来の皮膚や細胞での培養期間と同等の期間が必要になるため、同じく実験結果を得るには少なくとも数日間かかるという問題がある。
【非特許文献１】ストルら（Stoll, S.W. et al.,）、”Keratinocyte outgrowth from human skin explant cultures is dependent upon p38 signaling”、”Wound Repair and Regeneration”、2003年、第１１巻、第５号、p.346-353
【非特許文献２】ターチら（Turchi, L., et al.,）、”Dynamic Characterization of the Molecular Events During in vitro Epidermal Wound Healing”、”The Journal of Investigative Dermatology”、2002年、第１１９巻、第１号、p.56-63
【非特許文献３】ハッツネンら（Huttunen M, et al.,）、”Inhibition of keratinocyte growth in cell culture and whole skin culture by mast cell mediators”、”Experimental Dermatology”、2001年、第１０巻、第３号、p.184-192
【非特許文献４】キラックら（Quilhac, A., et al.,）、”Spreading, Proliferation, and Differentiation of the Epidermis After Wounding a Cichlid Fish, Hermichromis bimaculatus”、”The Anatomical Record”、1999年、第２５４巻、第３号、p.435-451
【非特許文献５】ファンら（Huang, C., et al.,）、”JNK phosphorylates paxillin and regulates cell migration”、”Nature”、2003年、第４２４巻、p.219-223
【非特許文献６】リーら（Lee, J., et al.,）、”Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels”、”Nature”、1999年、第４００巻、p.382-386
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って本発明は、簡便な培養器具により、低コスト、短時間でin vivoに近い培養系を調製し、皮膚の創傷治癒のモデルや、種々の化合物の安全性スクリーニング等に供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決し、目的を達成するために本発明は下記の通り構成されている。即ち、本発明の魚類の鱗からの表皮細胞の培養方法は、魚類より単離した鱗の表皮細胞付着面と反対側の面を、培養基材表面に接触させつつ、当該鱗の表皮細胞付着面以外の部分において、当該鱗を当該培養基材に固定する工程を含むことを特徴とする。
【０００６】
本発明の表皮細胞の培養方法においては、両端が前記培養基材の表面に固定された、円状又は略円状の横断面を有する棒と、当該培養基材の表面との間に前記鱗の表皮細胞付着面以外の部分を挟み込むことにより前記の固定を行うことができる。
【０００７】
本発明の表皮細胞の培養方法においては更に、前記魚類より単離した鱗が複数枚よりなり、前記培養基材表面における各鱗からの表皮細胞のシート状遊走方向が互いに向き合うよう、当該鱗を少なくとも二つに分けて当該培養基材上に配置することができる。この場合、前記二つに分けられた複数枚の鱗同士の距離が、当該鱗の直径又は最大の対角線の長さの２〜６倍の範囲にあることが望ましい。
【０００８】
本発明の表皮細胞の培養方法においてはまた、前記培養基材及び/又は前記棒をガラス製とすることができる。また、前記培養基材表面が、増殖因子、又は細胞外マトリックスを構成する物質によりコーティングされているものとすることができる。
【０００９】
本発明の表皮細胞培養物は、上記の何れかの方法により形成されたものである。また、一対の鱗を互いにむき合わせて表皮細胞を培養する態様の方法によれば、皮膚シートを形成することも可能である。
【００１０】
本発明の魚類の鱗固定用器具は、培養基材、及び横断面が円状又は略円状の棒を含み、当該棒がその両端において当該培養基材の表面に固定されていることを特徴とする。ここで、前記棒と、当該棒が固定される前記培養基材の表面とが、固定する魚類の鱗の厚みよりもわずかに小さい隙間を有して固定することが望ましい。また、当該培養基材及び/又は当該棒はガラス製とすることができ、更に当該培養基材の表面は、増殖因子又は細胞外マトリックスを構成する物質によりコーティングしたものとすることができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の魚類の鱗からの表皮細胞の培養方法によれば、短時間・低コストで鱗からの表皮細胞のシート状遊走（表皮組織の遊走）を生じさせることが可能になり、更に表皮細胞のシート状遊走後に細胞を分化させて皮膚シートを形成させることも可能になる。また、本発明の魚類の鱗固定用器具によれば、魚類の鱗を簡便に固定化して表皮細胞のシート状遊走、及び皮膚シートの形成を行わせることが可能になる。また、本発明の魚類の鱗からの表皮細胞の培養方法により形成された培養物や皮膚シートは、種々の評価対象物質のスクリーニングに供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の魚類の鱗からの表皮細胞の培養方法及び本発明の魚類の鱗固定用器具の詳細について説明する。
まず、利用する魚類動物を氷冷するか麻酔薬（例えばMS222等）により麻酔する。麻酔が利いた後、実体顕微鏡下でピンセットにより鱗を単離する。利用する魚類動物としては、表皮細胞が付着しているものであれば特に限定されないが、下記の実施例においてはメダカを例にして説明している。メダカ以外にも、鱗の表皮細胞が非常に早く運動することが知られている他の水棲魚類動物を利用することができ、例えばカワスズメ科の魚や、金魚、ゼブラフィッシュ、プラティー、グッピー、ハゼ等を挙げることができる。
【００１３】
次に、単離した鱗を培養基材へ固定する。固定には、本発明の魚類の鱗固定用器具を利用することが望ましい。この魚類の鱗固定用器具は、鱗の固定後の表皮細胞の培養及び顕微鏡下で当該培養細胞の観察などに適した培養基材と、当該培養基材表面に両端が固定された、横断面が円状又は略円状の棒からなるものであり、培養基材及び棒は、例えばガラス製のもの（カバーガラスとガラス棒の組合せ等）とすることができる。培養基材としては、カバーガラス以外では種々の培養用シャーレやフラスコ類を挙げることができるが、鱗の固定には、培養表面が開放されていて、鱗の導入・固定等の操作が行いやすいものが望ましい。また、魚類の鱗が、前記棒と前記培養基材の表面との間に密着して固定されるよう、前記棒と、当該棒が固定される前記培養基材の表面とが、固定する魚類の鱗の厚みよりもわずかに小さい隙間を有して固定されることが望ましい。
【００１４】
図１は、本発明の魚類の鱗固定用器具の一態様を示すものである。この態様の固定器具は、培養基材であるカバーグラス１上において、ガラス棒２の両端を接着剤３で固定したものとなっている。そしてガラス棒２とカバーガラス１との隙間に鱗４を差し込むことにより、当該鱗が固定されている。図２は、魚類動物より単離した鱗の概略図である。この図は、鱗４が真皮部分６とその上に付着した表皮細胞５とからなることを示している。鱗４の固定は、真皮部分６（即ち表皮細胞付着面以外の部分）を、図１のガラス棒２とカバーガラス１との隙間に挿し込むことにより行う。
【００１５】
鱗の固定の際、鱗の表皮細胞の付着した面とは反対側の面を当該培養基材の表面に接触させることが必要である。そして培養基材への鱗の固定は、鱗の表皮細胞付着面以外の部分を利用して行う。図３は、鱗４を本発明の魚類の鱗固定用器具に挿し込んだ状態を横から眺めたものを示す。鱗の固定に本発明の鱗固定用器具を使用する場合、当該棒と当該培養基材との間に、鱗の表皮細胞が付着していない面を挿し込むことで固定が行われる。鱗を当該培養基材と当該棒の間に差し込むため、当該棒の横断面は円状又は略円状であることが望ましい。当該棒の横断面の直径（又は対角線）は、固定する鱗の直径（又は対角線の長さ）の１/５〜1/３の範囲にあることが好ましい。当該棒の材質としては、培養基材と当該棒との間に鱗を挟みこむ際に必要な弾性を有するものであれば特に限定されるものではないが、例としては、軟質ガラス、硬質ガラス、各種プラスチック、ステンレス等の腐食性の低い金属などを挙げることができる。
【００１６】
本発明の魚類の鱗固定用器具以外の手段であっても、鱗の表皮細胞付着面が培養基材表面と接触しつつ、鱗が培養基材上においてズレないかぎり、利用することができる。また、表皮細胞のシート状遊走ではなく、個々の表皮細胞の遊走を観察することを主目的とする場合には、鱗を２枚のカバーガラスで挟み込むことによっても、鱗の固定を行うことが可能である。
【００１７】
また、当該棒両端を培養基材表面へ固定するには、例えば樹脂系の接着剤等を利用することができる。あるいは、培養基材のフレームで当該棒の両端を挟むなど、構造的な機構を利用することも可能である。
【００１８】
鱗の表皮細胞がシート状に遊走する培養基材表面は（図３の点線部分参照）、予め増殖因子や、細胞外マトリックスを構成する物質でコーティングしておくことができる。増殖因子としては、単一のものとすることも可能であり、またＦＢＳのような形態で種々の蛋白性物質との混合物の形態とすることも可能である。細胞外マトリックスとしては、コラーゲンやフィブロネクチンなどを挙げることができる。更に、これらのもの以外にも、細胞の付着性を向上させることが知られる種々の化学物質、例えばポリL-リジン、グルコサミノグリカン等によってコーティングすることも可能である。
【００１９】
鱗を培養基材へ固定した後、鱗が固定された培養基材の滅菌処理を行う。滅菌処理は、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）を適切な濃度で含む培養液に、必要な時間だけ、当該鱗が固定された培養基材を浸すことによって行うことができる。
【００２０】
滅菌処理後、鱗が固定された培養基材を、鱗の表皮細胞の培養に適した培養液を含むシャーレなどに移し、適切な温度で培養する。魚類の鱗の表皮細胞の場合、通常は室温で静置すると、約２、３時間で表皮細胞が鱗より培養基材へと遊走するのが観察される。
【００２１】
図４は、本発明の別の態様の魚類の鱗固定用器具を示すものである。この図においては、ガラス棒２が２本、互いに略平行してカバーガラス１上に接着剤３で固定されている。ガラス棒の間の距離は、固定に供する鱗の直径又は最大の対角線の長さの２〜６倍の範囲にあることが好ましい。この態様の鱗固定用器具を利用して鱗を固定し、適宜鱗表面の表皮細胞の培養を行うと、当該カバーガラス上のガラス棒２同士の間には、それぞれのガラス棒２に固定された鱗から表皮細胞が遊走する。遊走した細胞は、シート状でカバーガラス表面に広がり、それぞれの鱗から形成されるシート状の培養物が、ガラス棒２の略中間点で接触すると、表皮細胞からなる皮膚シートが形成される。このようにして形成された皮膚シートは、ガラス棒を１本のみで行った場合の培養物と比較して、シートの安定性が高いため、種々の実験に使用する場合には利用価値が高い。
【００２２】
本発明は、評価対象物質のスクリーニング方法をも提供する。このスクリーニング方法においては、本発明の表皮細胞培養方法により形成された表皮細胞培養物、又は本発明の表皮細胞培養方法により形成された皮膚シートを、評価対象物質を含めた培養液で培養する工程を行い、当該表皮細胞培養物又は当該皮膚シートへの影響を観察又は測定することが行われる。評価対象物質としては、表皮細胞や皮膚シートへの影響を調べようとするものであれば特に限定されることはないが、例としては、増殖因子や遊走の誘導因子等を挙げることができる。これらの因子を、無血清培地に含めて、因子が皮膚シート安定性や表皮細胞のシート状遊走へ与える影響を調べることが可能である。
【実施例１】
【００２３】
（メダカの鱗表皮細胞の培養）
実験材料
東邦大学理学部生物分子科学科杉本研究室にて繁殖維持している、北関東由来の野生のメダカ（体長2.5〜3.5cm、Oryzias latipes, 野生型）を、水温20〜25℃で飼育し、雌雄の区別なく実験動物として用いた。
【００２４】
実験方法
（培養）
メダカを氷麻酔し、ピンセットで背中側の鱗を採取した。鱗を下記のL-15 SK mediumで洗い、滅菌用L-15 SK mediumで10分間滅菌処理し、L-15 SK mediumで5分間洗浄後、培養に供した。培養は6 wellプレートに、培養液L-15 SK medium、FBS（0.5、2.0、5.0、10、又は20％）を6 ml / wellで入れて行い、培養時間は各実験に応じて決定した。一方、鱗から遊走する表皮細胞の培養には、図１に示される態様の鱗固定用器具を利用した。培養基材としては、１辺が２．２ｃｍのカバーグラス（松波硝子株式会社製）を使用し、ガラス棒は、直径が０．５ｍｍの軟質のものをガスバーナーを利用して引き伸ばし、直径を約０．３ｍｍにしたものを長さ２．５ｃｍに切断して使用した。ガラス棒の固定には樹脂接着剤を使用した。
培養鱗は、光学顕微鏡（CKX41, Olympus）を用いて観察・撮影（COOLPIX, Nikon）し、データ処理に用いた。
【００２５】
・L-15 SK 培地
L-15 培地LEIBOVITZ （L-グルタミン含有）(SIGMA CHEMICAL CO., St. Louis, MO) 14.8 g / L ; NaHCO3 (Wako Pure Chemical industries, Osaka) 1 mM ; L-アスコルビン酸 (NAKARAI CHEMICALS, Kyoto) 150 mg / ml ; HEPES (Wako Pure Chemical industries, Osaka) 10 mM ; ペニシリン(明治製菓、東京) 100 単位 / ml ; ストレプトマイシン (明治製菓、東京) 100 単位 / ml
・滅菌用L-15 SK 培地
L-15 培地LEIBOVITZ （L-グルタミン含有） (SIGMA CHEMICAL CO., St. Louis, MO) 14.8g / L ; NaHCO3 (Wako Pure Chemical industries, Osaka) 1 mM ; L-アスコルビン酸 (NAKARAI CHEMICALS, Kyoto) 150 mg / ml ; HEPES (Wako Pure Chemical industries, Osaka) 10mM ; ペニシリン(明治製菓、東京) 1000 単位 / ml ; ストレプトマイシン (明治製菓、東京) 1000 単位 / ml
・牛胎児血清（FBS ; fetal bovine serum）
SIGMA CHEMICAL CO., St. Louis, MO
【００２６】
（結果）
鱗上における表皮細胞を顕微鏡により観察したところ、それぞれが形態の異なる細胞からなる三層構造を有することが判った。表層は扁平な一層の細胞からなり、中間層は表層よりも厚みのある不定形な細胞が密に存在し、基底層は、立方体に近い形をし、培養基材と密着している細胞からなっていた（図示せず）。
鱗からの表皮細胞のシート状遊走については、培養開始後、１時間で遊走が観察された。また、表皮細胞のシート状遊走による表皮面積の増加率はFBSの濃度依存性を示し、FBS濃度が１０％の時に最も効果的であった。従って以下の実施例においては、特に言及しない限りFBS濃度を全て１０％としている。遊走した表皮の位相差写真を（3時間後）と動画（０〜１２時間）を撮影し、観察した（図示せず）。
位相差写真および動画の観察によって、複数の種類の細胞が確認できた。扁平な表皮細胞、突起を出す細胞、小型の細胞(鱗周辺部あるいは散在的に集団を作るもの)、顆粒をもつ細胞、明るく白く見える細胞などが存在した。
【実施例２】
【００２７】
（表皮細胞の染色）
実施例１と同様の方法（FBS濃度は１０％）で、鱗の表皮細胞を3時間または6時間培養した。この培養組織にアクチン、ビンキュリン、サイトケラチン、チューブリン蛍光染色を施し、鱗上、および遊走した表皮シートの細胞の骨格などを観察した。また、培養前の鱗についても同様に染色を行った。なお、培養前の鱗は生体内の無傷の鱗に近い形態をとっており、生体外鱗皮膚モデルの基本となると考えられる。また、PEP7を用いてチロシナーゼの蛍光染色を行い、さらに、BrdUを用いて培養1、3、6時間後に細胞増殖の有無を調べた。
培養細胞をPBSで軽く洗浄し、10% ホルマリン (3.7% ホルムアルデヒド) / PBSで30分間室温にて固定し、PBSで3回、各5分間洗浄した。さらに、0.1% TritonX-100 / PBSで4分間処理し、再びPBSで3回、各5分間洗浄した。その後、10% ヤギ血清/ PBS で37℃、30分間インキュベートし、抗-ビンキュリン抗体/10％ヤギ血清、抗-チューブリン抗体/ 10% ヤギ血清または抗-サイトケラチン抗体/ 10% ヤギ血清に替えて4℃で一晩インキュベートした。 翌日、PBSで3回、各5分間洗浄した後、二次抗体および蛍光ファロイジンを含む二次染色液(下記参照)で、37℃、60分間インキュベートした。PBSで1回5分間洗浄した後に、VectaSeald (Vector Laboratories, Burlingame, CA) で封入した。観察・撮影は画像解析装置 (Axioskop 2 plus, ZEISS, Germany) で行った。
【００２８】
・PBS (phosphate-buffered saline)
NaCl 136.9 mM ; Na2HPO4・12H2O 8.1 mM ; KH2PO4 1.5 mM
すべてWako Pure Chemical industries, Osaka
・TritonX-100 (polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether)
NACARAI TESQUE, Kyoto
・抗-ビンキュリン抗体
モノクローナル抗-ビンキュリン（マウスIgG1アイソタイプ）
SIGMA CHEMICAL CO., St. Louis, MO
・抗-チューブリン抗体
モノクローナル抗-β-チューブリン(マウスIgG1 アイソタイプ)
SIGMA CHEMICAL CO., St. Louis, MO
・抗-サイトケラチン抗体
抗-サイトケラチン (混合クローン、マウスIgG1/ IgG2a)
SIGMA CHEMICAL CO., St. Louis, MO
・PEP7 抗体
ウサギ抗-マウスチロシナーゼペプチド血清
Dr. Vincent Hearing (NIH, USA) から贈与された。
・二次染色液
Alexa Fluor 594 ヤギ抗-マウスIgG (H+L)
Alexa Fluor 488 phalloidin
（ともにMolecular Probes, Eugene, OR）
上記2種類の試薬を10% ヤギ血清で各々の希釈率に応じて希釈したものを用いた。
【００２９】
5-Bromo-2’-deoxy-uridine Labeling and Detection Kit  (Roche Molecular Biochemicals, Germany) を用いて増殖した細胞を検出した。
あらかじめ1、3、6時間培養してあった鱗皮膚をBrdU labeling medium(培養液で1:1000希釈したBrdU ラベリング試薬)でさらに1時間培養した。洗浄緩衝液で軽く洗浄し、-20℃のエタノール固定液で20分以上固定し、再び洗浄緩衝液で3回、各5分間洗浄した。抗-BrdU 作業溶液(インキュベーション緩衝液で1:10に希釈した抗-BrdU 溶液) で37℃、30分間インキュベートした。洗浄緩衝液で3回、各5分間洗浄した後、二次抗体および蛍光ファロイジンを含む二次抗体染色液(下記参照)で、37℃、60分間インキュベートした。洗浄緩衝液で1回5分間洗浄した後に、VectaSeald (Vector Laboratories, Burlingame, CA) で封入し、画像解析装置 (Axioskop 2 plus, ZEISS, Germany) で観察・撮影を行った。
【００３０】
（結果）
実施例１の結果と同様に、蛍光染色によるアクチン繊維の局在からも、培養前の鱗上の表皮が少なくとも三層の複数の層から構成されていることが観察された。表層、及び中間層に存在する表皮細胞の大きさや形に大きな差はなく、これらは円に近い正多角形の形をしていた。これらの細胞は互いに接着していたが、これは細胞膜近傍にビンキュリン及びアクチン繊維が顕著に検出されたことから、細胞間の接着装置の一つである接着帯によるものであると考えられる。また、表層の多くの表皮細胞の細胞質でサイトケラチンが強く染まり、細胞の輪郭も確認できた。これもやはり細胞間の接着装置の一つである、デスモソームの存在を示している。表皮細胞のデスモソーム構成部分の一つ接着斑板にはケラチンを成分とする中間径フィラメントが入り込んでおり、細胞にかかる力を分散させる働きがあると考えられる。基底層には、表面が滑らかな小型の丸い細胞が存在していた。
【００３１】
対照実験（無血清で培養）では、3時間あるいは6時間培養しても、表皮の遊走はほとんど引き起こされなかった。3時間後および6時間後とも表皮が三層構造であることが確認された。表層では多角形の扁平な表皮細胞が細胞接着によって接着し、一層のシートを形成していた。それらの細胞の中には、細胞質にアクチン繊維による微細な畝構造、マイクロリッジが認められるものもあった。これは、傷のない皮膚の表層細胞に見られる典型的な構造である（非特許文献４）ことから、マイクロリッジをもつ細胞は分化した表層細胞といえる。また、培養前の鱗と同様にサイトケラチンが強く染色された。中間層には不定形で表層の細胞より小型の細胞が存在していた。基底層には、培養前の鱗でも見られた小型の丸い細胞が認められたが、中間層の小型の細胞とは異なり、細胞質も均一にアクチン繊維が染色されていた。
【００３２】
１０％のFBS濃度で培養した系においては、鱗上では3時間後、6時間後ともに、表層では多角形型の表皮細胞同士が接着してシートが形成され、マイクロリッジを少数もつ細胞が認められ、サイトケラチンも染色された。また、基底層では小型の丸い細胞が見られた。表層と基底層については時間の経過によっても鱗上で大きな差異は認められなかった。それに対して、中間層では3時間後に多数存在していた小型の細胞が、6時間後にはほとんど見られなかった。培養前と3時間後の鱗の中間層と比較すると、細胞間の空間が拡大し、細胞が小型化した。一方、鱗より遊走して形成された表皮シートについては、3時間後および6時間後にビンキュリン及びアクチン繊維による多角形の細胞骨格が鮮明に染色され、堅固な細胞接着の存在が示された。３間後には少数の斑点状のマイクロリッジをもつ細胞が認められたが、6時間後にはさらに多数の明瞭な畝状のマイクロリッジをもつ細胞が比較的多く確認された。このことから、6時間後の表皮シート上には分化の進んだ表層表皮細胞が多いと考えられる。中間層では、3時間後に不定形の小型細胞が多数存在していたのに対し、6時間後にはその数が減少していた。また、チューブリン染色で強く染まる細胞が存在した。3時間後の表皮シートでは、部分的に表層と中間層が剥離したことにより、基底層の細胞を観察することができた。この細胞はラッフリング膜（ruffling membrane）と呼ばれる特徴的な膜をもつ不定形の表皮細胞であり、基質に接着して存在していた。細胞質およびラッフリング膜でサイトケラチンが検出された。また、アクチン繊維束からなるストレスファイバーが核周部に明瞭に観察され、ラッフリング膜の周辺に求められるビンキュリンに向かって微細なアクチン繊維が放射状に認められる。なお、この基底層の細胞はチューブリン（微小管）も検出された。6時間後の表皮シート先端部は一層の表皮細胞からなり、アクチン繊維およびサイトケラチンが染色された。
【００３３】
PEP7を用いてチロシナーゼの検出を行ったところ、表層側にある細胞が染色された。それらはいずれも細胞質が染色され、細胞質内に顆粒をもっているが、細胞膜のアクチン繊維束は染色されているものといないものが存在した。その形態から判断して明らかに表皮細胞とは異なる細胞と考えられた。
【００３４】
10% FBSで培養した場合、鱗上に存在する細胞はBrdU染色されなかった。この結果から表皮の遊走が誘導されても、表皮細胞は鱗上では増殖していないと分かった。
1時間後に表皮シート上の表層で染色された細胞が認められた。ヒト正常ケラチノサイトの創傷治癒モデルにおいては、細胞の増殖が創傷24時間後に誘導されると報告されているが、本実施例においては、魚類では創傷後１〜２時間の間に増殖した細胞が存在しうる可能性が示された。
3時間後および６時間後の表皮シートのそれぞれ表層と先端部においても同様に、染色された細胞が認められた。多角形の細胞の核が染まっていたことは、やはり増殖した表皮細胞が存在する可能性を示唆している。
【実施例３】
【００３５】
（実験方法）
図１に記載の本発明の鱗固定用器具を使用した。培養基材のカバーガラスの表面に細胞外基質タンパク質であるＩ型コラーゲン（新田ゼラチン株式会社製）、ファイブロネクチン（和光純薬工業株式会社製）、ラミニン（SIGMA CHEMICAL CO.製）を各々以下の方法でコートした。
（１）Ｉ型コラーゲンコート： 希塩酸（10-3M、pH3.0）中100μg／mlのＩ型コラーゲン溶液0.5mlでガラス面を一様に覆い、室温で１時間静置した後、余分なコラーゲン溶液を吸い取り乾燥させた。その後L-15 SK mediumで5分間２回洗浄後使用した。
（２）ファイブロネクチンコート：PBS中２0μg／mlのファイブロネクチン溶液0.5 mlでガラス面を覆い、室温で一晩静置し、その後L-15 SK mediumで5分間洗浄後乾燥せずに使用した。
（３）ラミニンコート：PBS中10μg／mlのラミニン溶液0.5 mlでガラス面を覆い、室温で一晩静置し、その後L-15 SK mediumで5分間洗浄後乾燥せずに使用した。
メダカを氷麻酔し、ピンセットで背中側の鱗を採取した。鱗をＩ型コラーゲン、ファイブロネクチン、又はラミニンのそれぞれ単独でコートした鱗固定用カバーグラスに装着し、L-15 SK mediumで洗い、滅菌用L-15 SK mediumで10分間滅菌処理し、L-15 SK mediumで5分間洗浄後、培養に供した。培養は6 wellプレートに、培養液L-15 SK mediumを6 ml / wellで入れて行い、培養時間は各実験に応じて決定した。培養鱗は、光学顕微鏡（CKX41, Olympus）を用いて観察・撮影（COOLPIX, Nikon）し、データ処理に用いた。
【００３６】
（結果）
培養１、２、３時間後の表皮シートの面積増加率を算出し比較した結果を表１に示した。実験には５個体のメダカを用いた結果を平均値±標準誤差で示した。
【００３７】
【表１】
2006061005.tif 000003
【００３８】
表に示される結果からFBS未添加でも基質をコートしてあると表皮シートがある程度遊走することがわかった。また、培養２時間後における面積増加率で比較した場合、Ｉ型コラーゲンおよびファイブロネクチンでは１０％FBS添加培養の１／３〜１／４程度の効果であった。またラミニンでは１０％FBS添加の１／７と、わずかな効果であったが、何れもコート無しの場合と比較して有意な効果を有していた。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明によれば、簡便な器具により略in vivoに近い実験結果を得られる表皮細胞の培養物、皮膚シートが短時間、低コストで得られ、これらの培養物、皮膚シートは、種々の物質の安全性等の評価や、創傷治療薬探索のためのスクリーニングに利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】この図は、本発明の鱗固定用器具の一態様を示すものである。
【図２】この図は、魚類動物から単離した鱗の状態の概略を示すものである。
【図３】この図は、本発明の鱗固定用器具に鱗を実際に固定化した状態を横から眺めたものである。
【図４】この図は、本発明の鱗固定用器具の別の態様を示すものである。
【符号の説明】
【００４１】
１・・・カバーガラス、２・・・ガラス棒、３・・・接着剤、４・・・鱗、５・・・鱗に表皮細胞が付着した部分、６・・・鱗の表皮細胞が付着していない部分
【図１】
2006061005.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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