(57)【要約】【課題】細胞培養を行なうに際して、細胞の足場となる細胞接着面を有しており、かつ、強度及び耐水性に優れた含水ゲル化合物からなる細胞培養用担体、及び該細胞培養用担体を用いた細胞培養方法を提供すること。【解決手段】ポリビニルアセタール化合物からなる成形物又は該ポリビニルアセタール化合物と水溶性多糖類とからなる成形物からなり、該ポリビニルアセタール化合物のアセタール化度が２０〜６０モル％である、細胞培養用担体細胞培養用担体、並びに該細胞培養用担体を用いて、細胞を培養する、細胞培養方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリビニルアセタール化合物からなる成形物又は該ポリビニルアセタール化合物と水溶性多糖類とからなる成形物からなり、該ポリビニルアセタール化合物のアセタール化度が２０〜６０モル％である、細胞培養用担体。
【請求項２】
請求項１記載の細胞培養用担体を用いて、細胞を培養することを特徴とする、細胞培養方法。
【請求項３】
該細胞が、付着性動物細胞である、請求項２記載の細胞培養方法。
【請求項４】
該細胞を、細胞培養用担体に付着した状態で培養する、請求項３記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養用担体及び該細胞培養用担体を用いた細胞培養方法に関する。本発明は、詳しくは、付着性動物細胞の三次元培養を行なうに適した細胞培養用担体及び細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養技術は、１)細胞産生物の生産、２）生体病変部や欠損部への補綴材、３）薬剤の毒性及び薬理活性評価用のシミュレーター等の分野で、研究、応用されている。
【０００３】
従来、細胞培養は、ガラスの表面上又は種々の処理を施したポリスチレンの表面上で行なわれている（例えば、非特許文献１、２等参照）。その一例として、例えば、プラズマ処理、コロナ処理等により表面処理されたポリスチレン、コラーゲン、フィブロネクチン、ポリリジン等の細胞接着性タンパク質をコートしたポリスチレン等から構成される種々の形状の容器が細胞培養用基材として普及している。
【０００４】
また、半導体産業等に利用されているマイクロパターン技術を利用した細胞接着面のサイズコントロール、培養基板への微小溝構造の導入、マイクロスフィアによる微細凹凸の作製が行われ、細胞培養用担体として生産されている（例えば、特許文献１、２等を参照）。しかし、これらのマイクロパターン技術を使った表面設定は、非常に高度な技術が必要であり、大量生産ができないこと、高コストになること等の多くの欠点を有するのが現状である。
【０００５】
一方、高分子ゲルは、生体触媒の担体、保水剤、保冷剤、眼・皮膚・関節等の生体ゲルの代替、薬物の徐放材、アクチュエーターの基材として研究が盛んに行われている。含水ゲルの原料となる高分子素材としては、寒天、アルギン酸塩、カラギーナン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール（以下、ＰＶＡと略記する）、光硬化性樹脂等が知られているが、これらの中でも機械的強度が高く含水性に優れていることからＰＶＡ系ゲルを用いることが検討されている（例えば、特許文献３参照）。
【０００６】
また、ＰＶＡとアルギン酸ナトリウムと短繊維とからなる混合物を、塩化カルシウム水溶液に滴下させ、表面に短繊維が髭状に植え込まれた形態を有するゲルを製造することが記載されている（例えば、特許文献４参照）。
【特許文献１】特開平５−４９６８９号公報
【特許文献２】特開平７−３０８１８６号公報
【特許文献３】特開平１０−７５７７５号公報
【特許文献４】特開平７−２５１１９０号公報
【非特許文献１】フレッシュニー（Freshney, R.I）、「カルチャー  オブ  アニマル  セルズ；ア  マニュアル  オブ  ベーシック  テクニック (Culture of animal cells ; a manual of basic technique)」第２版、Wiley-Liss、ロンドン、８３頁（１９８７）
【非特許文献２】クーン（Kuhn, k.）、「ザ  クラシカル  コラーゲンズ：コラーゲンタイプの構造及び機能におけるＩ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型」、メインら(R. Mayne and R.E. Burgeson)編、アカデミック  プレス(Academic Press)、ＮＹ、第１頁（１９８７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、細胞培養、例えば、付着性動物細胞の三次元培養を行なうに際して、細胞の足場となる細胞接着面を有しており、かつ、強度及び耐水性に優れた含水ゲル化合物からなる細胞培養用担体、及び該細胞培養用担体を用いた細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、
〔１〕  ポリビニルアセタール化合物からなる成形物又は該ポリビニルアセタール化合物と水溶性多糖類とからなる成形物からなり、該ポリビニルアセタール化合物のアセタール化度が２０〜６０モル％である、細胞培養用担体細胞培養用担体、
〔２〕  前記〔１〕記載の細胞培養用担体を用いて、細胞を培養することを特徴とする、細胞培養方法、
〔３〕  該細胞が、付着性動物細胞である、前記〔２〕記載の細胞培養方法、並びに
〔４〕  該細胞を、細胞培養用担体に付着した状態で培養する、前記〔３〕記載の細胞培養方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞培養用担体は、優れた強度及び優れた耐水性を示すという優れた性質を発揮する。したがって、本発明の細胞培養用担体によれば、細胞、例えば、付着性動物細胞を効率よく増殖させることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の細胞培養用担体によれば、前記付着性動物細胞の三次元培養を効率よく行なうことができるという優れた効果を奏する。本発明の細胞培養方法によれば、細胞、具体的には、付着性動物細胞を効率よく増殖させることができるという優れた効果を奏する。また、本発明の細胞培養方法によれば、三次元培養を効率よく行なうことができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、１つの側面では、ポリビニルアセタール化合物からなる成形物又は該ポリビニルアセタール化合物と水溶性多糖類とからなる成形物からなり、該ポリビニルアセタール化合物のアセタール化度が２０〜６０モル％である、細胞培養用担体に関する。
【００１１】
本発明の細胞培養用担体は、ポリビニルアセタール化合物からなる成形物からなることに１つの大きな特徴がある。また、本発明の細胞培養用担体は、前記ポリビニルアセタール化合物のアセタール化度が２０〜６０モル％であるからなる粒子であることに１つの大きな特徴がある。
【００１２】
したがって、本発明の細胞培養用担体は、細胞培養に用いるに適した優れた強度及び耐水性を発現する。また、本発明の細胞培養用担体は、細胞の維持に適した培地、酸素等を透過させることができるという優れた性質を発現する。そのため、本発明の細胞培養用担体によれば、細胞、特に、付着性動物細胞の固定化、付着性動物細胞の三次元培養等が可能になるという優れた効果を発揮する。
【００１３】
すなわち、本発明の細胞培養用担体に用いられるポリビニルアセタール化合物からなる成形物は、含水ゲルである。前記成形物は、例えば、付着性動物細胞の三次元培養を行なうに際して、細胞の足場となる細胞接着面を有しており、かつ、強度及び耐水性に優れる。したがって、本発明の細胞培養用担体によれば、バイオリアクター等に用いることにより、より効率の良い細胞の増殖が可能になるという優れた効果を発揮する。
【００１４】
なお、本明細書において、前記付着性動物細胞とは、例えば、軟骨細胞、心筋細胞、造血細胞、筋原細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、間葉由来細胞等を意味する。
【００１５】
本発明の細胞培養用担体の形状は、特に限定されるものではなく、球状、繊維状、棒状、角型状、楕円状、円盤状、円筒状、円柱状等のあらゆる形状であってよい。これらの形状のなかでも球状が好ましい。本発明の細胞培養用担体をバイオリアクターに用いる場合、流動性型バイオリアクターでは、流動性が他の形状に比べて優れており、固定床型バイオリアクターでは、該固定床型バイオリアクターへの充填効果が高く、担体同士の接点が小さいことから、凝集が起こりにくく取扱性がよいという観点から、球状が好ましい場合が多い。
【００１６】
本発明の細胞培養用担体が球状である場合、該細胞培養用担体の平均粒径は、担体の分離及び回収を容易にする観点から、１ｍｍ以上であり、好ましくは、２ｍｍ以上であり、より好ましくは、３ｍｍ以上であることが望ましく、単位体積あたりの細胞培養表面積を大きくする観点から、２０ｍｍ以下であり、好ましくは、１０ｍｍ以下であり、より好ましくは、６ｍｍ以下であることが望ましい。なお、本明細書において、前記平均粒径は、無作為に選択した前記細胞培養用担体の最大径を、ノギスを用いて測定し、平均値を算出した値として得られる。
【００１７】
本発明の細胞培養用担体は、例えば、ポリビニルアルコール化合物含有溶液を用い、公知の方法によりゲル状に成形し、得られた産物をアセタール化することにより得られる。具体的には、本発明の細胞培養用担体は、例えば、球状のものであれば
（Ａ）ポリビニルアルコール化合物含有溶液を、硫酸ナトリウム・１０水和物（芒硝）、クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸アルミニウム、酒石酸ナトリウム、酒石酸アンモニウム、酒石酸カリウム、酒石酸マグネシウム、酒石酸アルミニウム等の少なくとも１種の化合物を含有する溶液等の溶液に滴下して、ポリビニルアルコール化合物からなる成形物を得る工程、又は
（Ａ’）ポリビニルアルコール化合物とカチオンの存在によりゲル化する水溶性多糖類との混合溶液を、カチオン含有化合物を含有する溶液に滴下して、ポリビニルアルコール化合物と水溶性多糖類とからなる成形物を得る工程、及び
（Ｂ）前記工程（Ａ）又は（Ａ’）で得られた成形物を、酸の存在下に、アルデヒド化合物と反応させる工程、
を含む、製造方法により得られる。
【００１８】
前記ポリビニルアルコール化合物の平均重合度は、特に限定されないが、得られる含水ゲル成形物について、細胞培養に用いるに適した十分な強度及び耐水性を得る観点から、１０００以上が好ましく、１５００以上がより好ましく、含水ゲル成形物の成形性を十分に得る観点から、５０００以下が好ましく、４５００以下がより好ましい。
【００１９】
また、前記ポリビニルアルコール化合物のけん化度は、前記工程（Ａ）又は（Ａ’）におけるポリビニルアルコール化合物含有溶液の調製が容易である観点及び得られる含水ゲル成形物について、細胞培養に適した強度を得る観点から、特に限定されないが、好ましくは、９８．５モル％以上、より好ましくは、９９．８５モル％以上であることが望ましい。
【００２０】
なお、本発明においては、前記ポリビニルアルコール化合物は、本発明の効果を妨げないものであれば、無変性ポリビニルアルコール化合物であってもよく、変性ポリビニルアルコール化合物であってもよい。
【００２１】
前記工程（Ａ）で用いられるポリビニルアルコール化合物含有溶液中におけるポリビニルアルコール化合物の含有量は、細胞培養に適した強度及び耐水性を得る観点から、１重量％以上、好ましくは、３重量％以上であることが望ましく、細胞培養に適した培地の成分、酸素等の透過性を十分に得る観点から、４０重量％以下、好ましくは、２０重量％以下であることが望ましい。なお、前記ポリビニルアルコール化合物含有溶液は、水溶液のほか、ポリビニルアルコール化合物を、エチレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール等の多価アルコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジエチレントリアミン等から選択された少なくとも１種（例えば、１種又は２種以上）の化合物を混合した溶媒に溶解させた溶液等の形態であればよい。
【００２２】
前記工程（Ａ’）で用いられる混合溶液中におけるポリビニルアルコール化合物の含有量は、前記工程（Ａ）で用いられるポリビニルアルコール化合物含有溶液の場合と同様であればよい。
【００２３】
また、前記工程（Ａ’）で用いられる混合溶液中における前記水溶性多糖類の含有量は、前記工程（Ａ’）においてゲル化による成形性を十分に得る観点から、０．２重量％以上、好ましくは、０．５重量％以上であることが望ましく、前記工程（Ａ’）において溶液の流動性を十分に得る観点から、４重量％以下、好ましくは、２重量％以下であることが望ましい。前記混合溶液において、前記水溶性多糖類は、前記工程（Ａ’）における成形性を十分に得る観点及び適切な網状構造を形成させる観点から、ポリビニルアルコール化合物  １００重量部に対して、０．２重量部以上、好ましくは、０．５重量部以上、より好ましくは、１重量部以上であることが望ましく、細胞培養に適した強度を得る観点から、３０重量部以下、好ましくは、２５重量部以下、より好ましくは、２０重量部以下であることが望ましい。なお、前記混合溶液は、水溶液のほか、エチレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール等の多価アルコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジエチレントリアミン等の少なくとも１種（例えば、１種又は２種以上）の化合物を混合した溶媒に溶解させた溶液等の形態であればよい。
【００２４】
なお、本発明における水溶性多糖類としては、カチオンの存在によりゲル化する水溶性多糖類が好ましく、例えば、アルギン酸アルカリ金属塩（例えば、アルギン酸ナトリウム等）、カラギーナン、マンナン、キトサン等が挙げられる。
【００２５】
なお、前記工程（Ａ）で用いられるポリビニルアルコール化合物含有溶液又は前記工程（Ａ’）で用いられる混合溶液には、ゲル化を阻害しないものであれば、細胞接着性タンパク質（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン等）、細胞培養用の培地、得られる成形物の強度を上げるための補強材（例えば、短繊維等）、含水ゲル成形物の比重を調節するための充填剤（例えば、タルク、ガラス粒子等）等をさらに含有してもよい。
【００２６】
前記工程（Ａ）において、硫酸ナトリウム・１０水和物（芒硝）、クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸アルミニウム、酒石酸ナトリウム、酒石酸アンモニウム、酒石酸カリウム、酒石酸マグネシウム、酒石酸アルミニウム等の少なくとも１種の化合物を含有する溶液への前記ポリビニルアルコール化合物含有溶液の滴下は、例えば、適切な内径の管と慣用のポンプとを用い、前記ポリビニルアルコール化合物含有溶液を、適切な流速で溶液に滴下することにより行なわれる。
【００２７】
前記管において、前記ポリビニルアルコール化合物含有溶液の滴下口における内径は、平均粒径約１ｍｍ以上の担体を得る観点から、約０．３ｍｍ以上、好ましくは、約０．５ｍｍ以上であり、平均粒径約２０ｍｍ以下の担体を得る観点から、約２０ｍｍ以下、より好ましくは、約５ｍｍ以下であることが望ましい。
【００２８】
前記流速は、平均粒径約１ｍｍ以上の担体を得る観点から、０．５ｍｌ／分以上、好ましくは、０．８ｍｌ／分以上であり、平均粒径約２０ｍｍ以下の担体を得る観点から、５ｍｌ／分以下、より好ましくは、２ｍｌ／分以下であることが望ましい。
【００２９】
前記工程（Ａ）におけるポリビニルアルコール化合物含有溶液が滴下される溶液は、硫酸ナトリウム・１０水和物（芒硝）の水溶液の場合、硫酸ナトリウム量として、ポリビニルアルコール化合物を十分に凝固させる観点から、５重量％以上であり、好ましくは、１０重量以上であり、より好ましくは、飽和芒硝水溶液となる量であることが望ましい。
【００３０】
前記工程（Ａ’）におけるカチオン含有化合物を含有する溶液への前記混合溶液の滴下も前記工程（Ａ）の場合と同様の手法により行なわれうる。
【００３１】
前記混合溶液の滴下対象となる溶液中におけるカチオン含有化合物の含有量は、前記水溶性多糖類ゲルによる成形性を十分に得る観点から、０．１重量％以上であり、好ましくは、０．５重量以上であり、前記成形工程における余剰塩類廃棄物量を低減させる観点から、２０重量％以下であり、好ましくは、１０重量％以下であることが望ましい。
【００３２】
前記カチオン含有化合物としては、前記水溶性多糖類のゲル化を行ないうるものであれば、特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム等のカルシウム塩、マグネシウム塩、ストロンチウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩類、アンモニウム塩、ニッケル塩、セリウム塩等の多価金属塩、カリウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００３３】
ついで、前記工程（Ａ）又は（Ａ’）で得られた成形物におけるポリビニルアルコール化合物をアセタール化する。
【００３４】
ポリビニルアルコール化合物のアセタール化は、例えば、前記工程（Ａ）又は（Ａ’）で得られた成形物を、酸の存在下に、アルデヒド化合物と反応させる工程〔工程（Ｂ）〕により行なわれうる。これにより、ポリビニルアセタール化合物からなる含水ゲル成形物又はポリビニルアセタール化合物と水溶性多糖類とからなる含水ゲル成形物が得られる。
【００３５】
前記アルデヒド化合物としては、例えば、ホルムアルデヒド、グリオキザール、マロンジアルデヒド、ベンズアルデヒド、スクシンアルデヒド、アジピンアルデヒド、テレフタルアルデヒド、ノナンジアール等の各種アルデヒド化合物又は該アルデヒド化合物のアセタール化合物、グルタルアルデヒド等が挙げられる。前記アルデヒド化合物のなかでも、得られる含水ゲル成形物について、細胞培養に用いるに適した十分な強度及び耐水性を得る観点から、好ましくは、ホルムアルデヒド、グリオキザール、マロンジアルデヒド又はそれらのアセタール化合物、グルタルアルデヒドである。
【００３６】
前記酸としては、例えば、硫酸、塩酸、硝酸等の強酸；酢酸、蟻酸、シュウ酸、リン酸等の弱酸；硫酸水素ナトリウム、硫酸水素アンモニウム等の酸性塩等が挙げられる。なかでも、前記酸としては、含水ゲル成形物を得るのに十分に速い反応速度を得る観点から、好ましくは、硫酸である。
【００３７】
ポリビニルアルコール化合物のアセタール化の度合（アセタール化度という）は、前記アルデヒド化合物の種類、前記酸の濃度、反応時間及び温度によって制御することができる。
【００３８】
本発明においては、アセタール化度は、細胞培養に用いるに適した強度及び耐水性を得る観点から、２０モル％以上、好ましくは、３０モル％以上、より好ましくは、４０モル％以上であり、細胞培養に適した培地成分、酵素等の透過性を十分に得る観点から、６０モル％以下、好ましくは、５０モル％以下、より好ましくは、４５モル％以下である。
【００３９】
前記ポリビニルアセタール化合物からなる含水ゲル成形物及びポリビニルアセタール化合物と水溶性多糖類とからなる含水ゲル成形物は、各種の形式の反応槽において、長期間にわたって変形や損壊をしない強度を有し、水や各種薬液に対しても実質的に侵されることがなく、維持され、極めて高い実用性を有する。そのため、本発明の細胞培養用担体を用いた細胞培養では、各種の形式の反応槽で、連続運転が可能となる。
【００４０】
本発明は、他の側面では、本発明の細胞培養用担体を用いて、細胞を培養することを特徴とする、細胞培養方法に関する。
【００４１】
本発明の細胞培養方法は、本発明の細胞培養用担体が用いられていることに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の細胞培養方法によれば、細胞、例えば、動物細胞等、具体的には、付着性動物細胞等を効率よく増殖させることができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の細胞培養方法によれば、三次元培養を効率よく行なうことができるという優れた効果を発揮する。
【００４２】
本発明の細胞培養用担体を用いて培養されうる細胞としては、培養の目的、目的とする付着性、代謝生成物等に応じて適宜選択され得、動物細胞等、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、キラー細胞、リンパ球、リンパ芽細胞等の浮遊性細胞；ヒト腫瘍細胞、繊維細胞、ＥＢウイルス変異細胞、肝細胞、腎細胞、表皮細胞、骨髄細胞、マクロファージ、血管内皮細胞、平滑筋細胞、肝実質細胞、膵β細胞、上皮細胞、小腸細胞、乳腺細胞、乳腺上皮細胞、唾液腺細胞、甲状腺細胞、生体由来骨格筋細胞、皮膚細胞等の付着性細胞等が挙げられる。
【００４３】
本発明の細胞培養方法においては、例えば、前記細胞を、水、培養液等の溶媒に対して、１０3〜１０6細胞／ｍｌ程度の濃度となるように懸濁し、得られた細胞懸濁液を、本発明の細胞培養用担体を含む培養床に付着させればよい。
【００４４】
ついで、培養対象の細胞に適した培養液を用いて、前記細胞の培養に適した条件下に培養すればよい。前記条件としては、例えば、「培養細胞ハンドブック  細胞培養の基本と解析法の全て」、黒木登志夫、許南浩編、羊土社、２００４年７月発行等に記載の条件等が挙げられる。
【００４５】
前記培養液としては、細胞に応じた慣用の培養液が挙げられる。具体的には、前記細胞が動物細胞である場合、前記培養液としては、例えば、各種の必須アミノ酸、各種ビタミン類、グルコース等の糖類等の各種成分を含有する培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地等）が挙げられる。培養液中における前記成分の含有量は、細胞の培養に適した量であればよい。また、前記培地は、ウシ胎仔血清培地、無血清培地、ヒト血清培地等のいずれであってもよい。
【００４６】
本発明の細胞培養方法によれば、付着性動物細胞の三次元培養を効率よく行なうことができる。したがって、本発明の細胞培養方法は、足場依存的に分化して生じる細胞（例えば、神経細胞等）、組織又は器官（血管等）の構築に有用である。
【００４７】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。
【製造例１】
【００４８】
株式会社クラレ製のＰＶＡ（平均重合度４１００、けん化度９９．８５モル％）を、４０℃の温水で約１時間洗浄した。その後、ＰＶＡの最終濃度が１０重量％になるように、前記ＰＶＡに水を添加して、全量を２００ｇにした。得られた混合物を、１０５℃で３０分間インキュベーションして、ＰＶＡを溶解させ、その後、室温（２３℃）まで放冷した。得られたＰＶＡ水溶液に、４重量％  アルギン酸ナトリウム水溶液  ２００ｇと水  ２００ｇとを添加し、混合し、充分に撹拌した。
【００４９】
得られた混合物を、先端に内径０．８ｍｍの注射針を取り付けた内径２ｍｍのビニル管１本を用い、ローラーポンプで、１ｍｌ／分で送液し、スターラーで撹拌した０．５／モル／リットルの塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）水溶液の表面５ｃｍの高さより滴下した。滴下した液滴は、ＣａＣｌ2水溶液中で直ちに球状化して沈降した。
【００５０】
得られた球状の成形物を、ＣａＣｌ2水溶液から分離し、蒸留水で軽く洗浄した。得られた成形物を、ホルムアルデヒド（ＨＣＨＯ）と硫酸（Ｈ2ＳＯ4）と芒硝（Ｎａ2ＳＯ4）とを含有した水溶液〔１リットルあたりの組成：ホルムアルデヒド  １モル、硫酸  １モル、芒硝  ０．１６モル〕中、５０℃で１０分間浸漬させた。その後、前記成形物を、水道水で洗浄して、硫酸等を除去し、不透明な白色の弾性に富んだ粘着性のない平均粒径３．８ｍｍの球状の含水ゲルを得た。
【００５１】
得られた含水ゲルの一部をサンプルとして取り出し、１０５℃で２時間乾燥させた。その後、乾燥した前記成形物  ０．２ｇを、２５重量％  硫酸水溶液を装填した蒸留装置に投入した。蒸留装置に蒸気を送りながら、前記成形物を１０５℃に加熱し、ホルマリンを遊離させた。遊離したホルマリンを、水と共に留出させ、得られた産物を２重量％  ＮａＨＳＯ3水溶液に吸収させた。余剰のＮａＨＳＯ3を、Ｉ2で逆滴定することにより、遊離ホルマリン量を求め、ゲル中の水酸基量に対する遊離ホルマリン量の割合（モル比）からアセタール化度を算出した。その結果、前記含水ゲルのアセタール化度は、３３．２モル％であった。かかる含水ゲルを細胞培養用担体とした。
【実施例１】
【００５２】
前記製造側１で得られた細胞培養用担体を、蒸留水で３回洗浄した。その後、前記細胞培養用担体を、１２１℃で１５分間、オートクレーブで滅菌した。次に、最終細胞濃度が１０6細胞／ｍｌになるように、ＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、１０重量％  ウシ胎仔血清含有、ＧＩＢＣＯ社製）に懸濁させて、細胞懸濁液を作製した。得られた細胞懸濁液を、３７℃で保温した。前記細胞懸濁液  ｌｍｌを、前記オートクレーブ後の細胞培養用担体に滴下した。その後、前記細胞培養用担体を、３７℃の炭酸ガスインキュベーター（５容積％  炭酸ガス）に素早＜移し、３日間インキュベーションした。インキュベーションを開始して１日後及び３日後に、前記細胞培養用担体中の細胞培養用担体を取り出した。その後、細胞数測定キット（商品名：ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏTM  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ、プロメガ社製）を用いて、ＡＴＰによる発光量を測定した。測定結果を表１に示す。
【比較例１】
【００５３】
最終細胞濃度が１０6細胞／ｍｌになるように、ＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞の細胞懸濁液を作製した。得られた細胞懸濁液  １ｍｌを、細胞培養用ポリスチレンシャーレ（商品名：マルチウェルTMセルカルチャープレート、標準細胞培養処理、２４ウェル、ベクトン・ディッキンソン社製）に滴下し、該細胞培養用ポリスチレンシャーレを、３７℃の炭酸ガスインキュベーター（５容積％  炭酸ガス）中で、３日間インキュベーションした。その後、実施例１と同様の方法にて細胞数測定キットを用いて、ＡＴＰによる発光量を測定した。測定結果を表１に示す。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
以上の結果から、実施例１の細胞培養用担体を用いることにより、細胞の増殖を効率よく行なうことが可能であることが示された。これは、実施例１の細胞培養用担体が、従来のポリスチレンシャーレと比較して親水性が高いことから、細胞培養に適した培地成分、酸素等の透過性を十分に得ることができるためと考えられる。
【実施例２】
【００５６】
製造例１で得られた含水ゲル成形物  ３０ｇに、水  ３００ｇを添加し、３０℃で７日間攪拌した。その後、含水ゲル成形物に由来する有機物の水中への溶出量を、全有機炭素計（商品名：ＴＯＣ−５０００、島津製作所社製）により測定した。その結果、７日間攪拌後の有機物の溶出量は、前記含水ゲル成形物  １ｋｇ（湿重量）あたり０．０２ｇ以下であった。また、同様の方法にて、１ヶ月攪拌後の有機物の溶出量は、前記含水ゲル成形物  １ｋｇ（湿重量）あたり０．０５ｇであった。
【製造例２】
【００５７】
製造例１と同様に、ＰＶＡを４０℃の温水で約１時間洗浄した。その後、ＰＶＡ濃度  ５重量％になるように、前記ＰＶＡに、水を添加して、全量を７９２ｇにした。得られた混合物に、水酸化カルシウム  ８ｇを添加した。得られた混合物のｐＨは、ｐＨ１２であった。得られた混合物を、攪拌しながら１１０℃で２時間インキュベーションして、ＰＶＡを溶解させた。
【００５８】
得られた混合物を、先端に内径０．８ｍｍの注射針を取り付けた内径２ｍｍのビニル管  １本と、ローラーポンプとを用い、１ｍｌ／分の速度で、スターラーで攪拌した３０ｇ／Ｌ  ホウ酸水溶液  ５Ｌの表面から５ｃｍの高さより、前記ホウ酸水溶液に滴下した。
【００５９】
その結果、滴下された液滴は、ホウ酸水溶液中で直ちに球状化した。得られた球状の成形物を、ホウ酸水溶液から分離し、蒸留水で軽く洗浄した。このようにして、アセタール化処理を行なっていない平均粒径約３．８ｍｍの不透明な白色球状の含水ゲルを得た。
【比較例２】
【００６０】
製造側２で得られた含水ゲルについて、有機物の水中への溶出量を実施例２と同様にして測定した。
【００６１】
その結果、７日間攪拌後の有機物の溶出量は、前記含水ゲル成形物（湿重量）  １ｋｇあたり２ｇであった。また、１ヶ月攪拌後の有機物の溶出量は、前記含水ゲル成形物  １ｋｇ（湿重量）あたり２０ｇであった。
【００６２】
以上の結果から、水中での攪拌に際して、製造例１で得られた含水ゲル成形物からの有機物の溶出量は、非常に少なく、細胞培養時における攪拌に対する耐久性に優れていることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の細胞培養用担体によれば、細胞の足場となる細胞接着面を有しており、かつ、強度及び耐水性に優れているため、細胞、例えば、付着性動物細胞の三次元培養を効率よく行なうことができる。したがって、本発明の細胞培養用担体によれば、バイオリアクター等に用いることにより、より効率の良い細胞の増殖が可能となる。また、本発明の細胞培養用担体は、細胞による産物の生産のためのバイオリアクター用の細胞培養用担体として利用できる。また、本発明の細胞培養方法によれば、三次元培養を効率よく行なうことができ、機能的な組織の生産等が可能になる。