(57)【要約】【課題】トランスポゾンを利用した遺伝子解析方法等を提供する。【解決手段】イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔと該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔを利用して、イネ品種におけるトランスポゾンの転移性に伴う遺伝子変異の変異性を解析することから成る遺伝子及び／又は遺伝子機能の解析方法、非自律性因子ｎＤａｒｔと自律性因子Ｄａｒｔを利用して、イネ優良品種において、その変異を利用して遺伝子機能を改変されたイネ品種を作出することから成るイネ品種の作出方法、非自律性因子ｎＤａｒｔと自律性因子Ｄａｒｔを利用して、イネ品種において、トランスポゾンの転移に伴い形成される変異型遺伝子を作出、単離することから成る変異型遺伝子の作出方法、及び非自律性因子ｎＤａｒｔ及び自律性因子Ｄａｒｔ。【選択図】図２
2006238804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔと該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔを利用して、イネ品種におけるトランスポゾンの転移性に伴う遺伝子変異の変異性を解析することを特徴とする遺伝子及び／又は遺伝子機能の解析方法。
【請求項２】
イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔを、該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔを有するイネ品種に導入し、トランスポゾンの転移性に伴う遺伝子変異の変異性を解析する請求項１に記載の遺伝子及び／又は遺伝子機能の解析方法。
【請求項３】
イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔと該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔを利用して、イネ優良品種において、その変異を利用して遺伝子機能を改変されたイネ品種を作出することを特徴とするイネ品種の作出方法。
【請求項４】
イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔを、該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔを有するイネ優良品種に導入し、その変異を利用して遺伝子機能を改変されたイネ品種を作出する請求項３に記載のイネ品種の作出方法。
【請求項５】
イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔと該因子を転移する活性型の自律性因子Ｄａｒｔを利用して、イネ品種において、トランスポゾンの転移に伴い形成される変異型遺伝子を作出、単離することを特徴とする変異型遺伝子の作出方法。
【請求項６】
イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔを、該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔを有するイネ品種に導入し、トランスポゾンの転移に伴い形成される変異型遺伝子を作出、単離する請求項５に記載の変異型遺伝子の作出方法。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の方法で作出した変異型遺伝子を、イネ優良品種に導入し、所定の遺伝子機能を発現するイネ品種を作出することを特徴とするイネ品種の作出方法。
【請求項８】
請求項３又は４に記載の方法で作出された、遺伝子機能の改変された、あるいは所定の遺伝子機能を発現することを特徴とするイネ品種。
【請求項９】
イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔと該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔを利用して、イネ以外の植物種に遺伝子導入し、遺伝子を作出、単離することを特徴とする変異型遺伝子の作出方法。
【請求項１０】
ｎＤａｒｔとして、ｎＤａｒｔ１−４（３−２）、ｎＤａｒｔ１−１２、ｎＤａｒｔ１−４（３−１）及びｎＤａｒｔ１−３（６）の中から選択された１種を用いる、請求項１から６又は９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１〜１４のいずれかの塩基配列を有する、又はそれと高い相同性を有する塩基配列を有し、かつ同一の活性を有することを特徴とするイネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔ。
【請求項１２】
配列番号１５〜６５の塩基配列を有する、又はそれと高い相同性を有する塩基配列を有し、かつ同一の活性を有することを特徴とするイネトランスポゾンの自律性因子Ｄａｒｔ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネトランスポゾンのｎＤａｒｔ／Ｄａｒｔを利用した遺伝子及び／又は遺伝子機能の解析方法、イネ品種の作出方法及び該方法で作出されたイネ品種等に関するものであり、更に詳しくは、イネのトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔと、該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔを利用した遺伝子の単離方法及び遺伝子機能の解析方法、変異型遺伝子の作出方法、及びイネ品種育成方法等に関するものである。本発明は、イネ品種の交配により、新しい遺伝的機能を発現するイネ品種を作出し、提供することを可能とする新しいイネ品種作出技術等を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
トランスポゾンは、転移性のＤＮＡ因子であり、トウモロコシで最初に発見され、その後、多くの生物種に見出されている。トランスポゾンは、ゲノムのある部位から別の部位に転移し、更にまた別の部位に転移するＤＮＡ断片である。このように、トランスポゾンは、ゲノム中を転移することにより、ＤＮＡに変異を生じさせる。そのため、トランスポゾンは、ゲノム進化において重要な役割を果たしていると考えられている。また、トランスポゾンは、遺伝子領域への挿入により、その遺伝子を不活性化させることができるため、遺伝子単離あるいは遺伝子の機能解析に多くの生物種で用いられている。このようなトランスポゾンの特性については、先行文献（非特許文献１及び２参照）に記載されている。
【０００３】
近年のゲノム解析により、ゲノム塩基配列において、トランスポゾンは大きな比重で存在することが明らかとなっている。また、トランスポゾンは、その転移様式から大きく２種類に分類される。１つは、転移の際ＲＮＡを介するクラス１トランスポゾンであり、もう１つは、ＤＮＡで転移するクラス２である。更に、それらの分類の中で、塩基配列、転移・挿入特性などにより、更に細分化される。
【０００４】
イネのゲノム塩基配列も解読され、イネにおいても、トランスポゾンは大きな比重で存在していることが明らかとなった。また、これまでに多くの生物種で同定されているトランスポゾンの殆どの種類に、相同性のある多種類のトランスポゾンが存在していた（非特許文献３及び４参照）。このように、ゲノム中には多種類のトランスポゾンが存在するが、現在においても、転移活性を示すトランスポゾンは、極希である。そのため、上述のような遺伝子の単離等に用いられるトランスポゾンは、限られている。イネにおいても、転移活性があるトランスポゾンは、Ｔｏｓ１７、Ｋａｒｍａ及びｍＰｉｎｇの僅か３種類だけである（非特許文献５〜９参照）。
【０００５】
これらは、それぞれに異なる特徴を有し、Ｔｏｓ１７及びＫａｒｍａは、組織培養により、転移活性が誘発されるトランスポゾンである。この場合、培養変異を生じるため、遺伝子単離等に用いる場合には、その効率が低下してしまう。一方の、ｍＰｉｎｇは、組織培養で転移活性が誘発されるが、ガンマ線照射によっても、誘発される。また、Ｋａｒｍａ及びｍＰｉｎｇは、転移が誘発されたのち、通常の栽培条件において転移することが知られている。イネは、食料供給において、世界的に重要な作物であり、品種育成を効率化させるために、ゲノムの全塩基配列の解読が行われた。今後、遺伝子の単離、機能解析等を行う上で、上述の特徴をもつトランスポゾンは、極めて有用な解析ツールである。
【０００６】
従来、特許文献には、例えば、イネ植物体で活発に転移するＬＩＮＬ型のレトロトランスポゾンが報告されている（特許文献１参照）。このトランスポゾンは、上述のイネのトランスポゾンと同じもので、レトロトランスポゾンに属するものであり、本発明のＤＮＡ型のｎＤａｒｔ／Ｄａｒｔとは、違う種類に属している。また、他の文献には、植物の中に存在するトランスポゾンの転移反応を特徴とする遺伝子改変を品種改良に利用することが提案されている（特許文献２参照）。また、他の文献には、イネゲノムの散在するトランスポゾンをマーカーとして利用することを特徴とするイネゲノムの構造解析方法が提案されている（特許文献３参照）。また、他の文献には、トランスポゾン遺伝子が転移して形質転換したシロイヌナズナ、タバコ、トマト、ペチュニア、アブラナ、ワタ、トウモロコシ又はイネ等の植物の形質転換体が報告されている（特許文献４参照）。更に、他の文献には、トランスポゾン転移酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが報告されている（特許文献５参照）。しかしながら、従来、イネトランスポゾンにおいて、同一品種内のｎＤａｒｔ／Ｄａｒｔで転移が生じている例は報告されていない。
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−３６９６９１号公報
【特許文献２】特開２００３−０９３０７４号公報
【特許文献３】特開２００４−１２１０３２号公報
【特許文献４】特開２００４−１８０５９２号公報
【特許文献５】特開２００５−０４６０９３号公報
【非特許文献１】Bennetzen JL (2000), Transposable element contributions to plant gene and genome evolution, Plant Mol. Biol., 42:251-269
【非特許文献２】Fedoroff N (2000), Transposons and genome evolution in plants, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:7002-7007
【非特許文献３】Mao L, Wood TC, Yu Y, Budiman MA, Tomkins J, Woo S-s, Sasinowski M, Presting G, Frisch D, Goff S, Dean RA, Wing RA (2000), Rice transposable elements: A survey of 73,000 sequence-tagged-connectors, Genome Res., 10:982-990
【非特許文献４】Turcotte K, Srinivasan S, Bureau T (2001), Survey of transposable elements from rice genomic sequences, Plant J., 25:169-179
【非特許文献５】Hirochika H, Sugimoto K, Otsuki Y, Tsugawa H, Kanda M (1996), Retrotransposons of rice involved in mutations induced by tissue culture, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7783-7788
【非特許文献６】Komatsu M, Shimamoto K, Kyozuka J (2003), Two-step regulation and continuous retrotransposition of the rice LINE-type retrotransposon Karma, Plant Cell, 15:1934-1944
【非特許文献７】Jiang N, Bao Z, Zhang X, Hirochika H, Eddy SR, McCouch SR, Wessler SR (2003), An active DNA transposon family in rice, Nature, 21:163-167
【非特許文献８】Kikuchi K, Terauchi K, Wada M, Hirano H (2003), The plant MITE mPing is mobilized in anther culture, Nature, 421:167-170
【非特許文献９】Nakazaki T, Okumoto Y, Horibata A, Yamahira S, Teraishi M, Nishida H, Inoue H, Tanisaka T (2003), Mobilization of a transposon in the rice genome, Nature, 421:170-172
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような状況下にあって、本発明者らは、イネの慣行栽培において、植物体で活発に転移するトランスポゾンを発見し、これを用いた遺伝子破壊方法を確立し、本発明を完成するに至った。変異体として緑の区域を持ったクロロフィル欠乏アルビノを用いた。この変異体の対立形質は、イネゲノムから活性トランスポゾンを分離するための新規材料を提供する。アルビノ遺伝子座に挿入されたトランスポゾンは、コーディング能を持たない６０７ｂｐの長さであった。トランスポゾンの配列を用いたデータベース検索により、一つのＯＲＦをコードするより長い因子が同定され、トランスポゾンｈＡＴスーパーファミリー（Essers L, Adolphs RH, Kunze R (2000), A highly conserved domain of the maize activator transposase is involved in dimerization, Plant Cell, 12:211-223）のトランスポゾンに見られる、ｈＡＴ二量化体の特徴を持つことが示された。本発明で同定された２因子トランスポゾンシステムは、イネの植物体中で活性を有している。本発明は、イネトランスポゾン非自律性因子ｎＤａｒｔと、該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔを利用した、遺伝子の単離方法及び遺伝子機能の解析方法、変異型遺伝子の作出方法、イネ品種作出及び育成方法、及びイネ品種、を提供することを目的とするものである。また、本発明は、特に、非自律性因子ｎＤａｒｔによる遺伝子変異の作出と、該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔとを利用して、イネ品種の交配により、新しい遺伝的機能を発現するイネ品種を作出し、提供することを可能とする新しいイネ品種作出技術を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔと該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔを利用して、イネ品種におけるトランスポゾンの転移性に伴う遺伝子変異の変異性を解析することを特徴とする遺伝子及び／又は遺伝子機能の解析方法。
（２）イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔを、該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔを有するイネ品種に導入し、トランスポゾンの転移性に伴う遺伝子変異の変異性を解析する前記（１）に記載の遺伝子及び／又は遺伝子機能の解析方法。
（３）イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔと該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔを利用して、イネ優良品種において、その変異を利用して遺伝子機能を改変されたイネ品種を作出することを特徴とするイネ品種の作出方法。
（４）イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔを、該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔを有するイネ優良品種に導入し、その変異を利用して遺伝子機能を改変されたイネ品種を作出する前記（３）に記載のイネ品種の作出方法。
（５）イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔと該因子を転移する活性型の自律性因子Ｄａｒｔを利用して、イネ品種において、トランスポゾンの転移に伴い形成される変異型遺伝子を作出、単離することを特徴とする変異型遺伝子の作出方法。
（６）イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔを、該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔを有するイネ品種に導入し、トランスポゾンの転移に伴い形成される変異型遺伝子を作出、単離する前記（５）に記載の変異型遺伝子の作出方法。
（７）前記（５）又は（６）に記載の方法で作出した変異型遺伝子を、イネ優良品種に導入し、所定の遺伝子機能を発現するイネ品種を作出することを特徴とするイネ品種の作出方法。
（８）前記（３）又は（４）に記載の方法で作出された、遺伝子機能の改変された、あるいは所定の遺伝子機能を発現することを特徴とするイネ品種。
（９）イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔと該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔを利用して、イネ以外の植物種に遺伝子導入し、遺伝子を作出、単離することを特徴とする変異型遺伝子の作出方法。
（１０）ｎＤａｒｔとして、ｎＤａｒｔ１−４（３−２）、ｎＤａｒｔ１−１２、ｎＤａｒｔ１−４（３−１）及びｎＤａｒｔ１−３（６）の中から選択された１種を用いる、前記（１）から（６）又は（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）配列番号１〜１４のいずれかの塩基配列を有する、又はそれと高い相同性を有する塩基配列を有し、かつ同一の活性を有することを特徴とするイネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔ。
（１２）配列番号１５〜６５の塩基配列を有する、又はそれと高い相同性を有する塩基配列を有し、かつ同一の活性を有することを特徴とするイネトランスポゾンの自律性因子Ｄａｒｔ。
【００１０】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、イネトランスポゾンの非自律的因子ｎＤａｒｔと、該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔとを利用した、遺伝子及び／又は遺伝子機能の解析方法、変異型遺伝子の作出方法、上記ｎＤａｒｔ／Ｄａｒｔをイネ優良品種に導入し、その変異を利用することによるイネ品種作出及び育成方法等を提供すること、また、本発明は、上記ｎＤａｒｔ／Ｄａｒｔをイネ以外の植物種（生物種）に遺伝子導入し、遺伝子を作出、単離する変異型遺伝子の作出方法を提供することを特徴とするものである。更に、本発明は、イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔ及び自律性因子Ｄａｒｔの新規遺伝子配列を提供することを特徴とするものである。
【００１１】
本発明では、イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔとして、植物体で活性な、６０７ｂｐのトランスポゾンが、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）において、同定された。後記する実施例に示されるように、このうち、４個は、塩基配列が全く同一であったが、その他は、数塩基置換、あるいは欠失により、それぞれ異なる塩基配列を有していた。これらのｎＤａｒｔは、イネ品種によって転移性が異なるが、例えば、イネ品種「日本晴」では、上記のうち、１０個については、体細胞レベルでの転移性（切り出し）は見られなかった。イネ品種「ほしのゆめ」では、ｎＤａｒｔ１−４（３−２）及びｎＤａｒｔ１−１２において、体細胞レベルでの転移性が見られた。
【００１２】
本発明では、上記ｎＤａｒｔの遺伝子座を利用して、その転移性を明らかにすることができる。例えば、各ｎＤａｒｔを増幅するＰＣＲプライマーを設計し、ＰＣＲ増幅を行い、そのとき得られる増幅産物により、転移性を判定することができる。すなわち、ｎＤａｒｔを含む大きさの１個のＰＣＲ産物が得られる場合は、転移性がないと判断され、一方、そのＰＣＲ産物と、ｎＤａｒｔを含まない大きさのＰＣＲ産物との２産物が得られる場合は、体細胞レベルでの転移性があると判断される。また、転移性が認められた場合、ｎＤａｒｔを含まない大きさのＰＣＲ産物をクローニングして塩基配列の決定を行うことで、トランスポゾンの転移性に伴う遺伝子変異を確認することが可能である。
【００１３】
トランスポゾンを、遺伝子あるいは遺伝子機能領域に挿入することにより、その機能は消失されるが、一方、その挿入部位から更にそのトランスポゾンが転移し、そのとき、トランスポゾンの転移性に伴う遺伝子変異が生じる。そこで、転移性が認められた品種及びｎＤａｒｔの遺伝子座について、ＰＣＲ増幅を行い、ｎＤａｒｔを含まない大きさのＰＣＲ産物をクローニングして、塩基配列の決定、比較を行い、ｎＤａｒｔの遺伝子変異の特性を解析することにより、例えば、変異型遺伝子、及び遺伝子機能の改変されたイネ品種の作出が可能である。
【００１４】
本発明において、植物体における活性トランスポゾンが、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉａ  Ｌ．）において同定され、ｎｏｎａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｉｃｅ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ（ｎＤａｒｔ）と命名された。この６０７ｂｐのトランスポゾンは、コーディング能を持たず、ジャポニカ品種の間の戻し交雑の後代から分離されたクロロフィル欠乏アルビノ（ａｌｂｉｎｏ）変異体における、Ｍｇ−プロトポルフィリンＩＸメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子中で見出された。ｎＤａｒｔは、１９ｂｐの末端逆位反復（ＴＩＲＳ）を有し、８ｂｐのターゲット重複配列（ＴＳＤ）を生じる。少なくとも１３のｎＤａｒｔ因子は、「日本晴」のイネゲノムの中で見出された。データベース検索により、本発明者らは、ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｉｃｅ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ（Ｄａｒｔ）と命名された、ｈＡＴ二量体化の特徴に高い類似性を持つ一つのＯＲＦを含む、大きな因子を見出した。
【００１５】
Ｄａｒｔは、ｎＤａｒｔのいくつかの構造を共有し、同一のＴＩＲＳ、類似のサブターミナル配列及び８ｂｐＴＳＤを含んでいる。これらの共有された構造は、非自律性因子ｎＤａｒｔは、自律性因子Ｄａｒｔの内部の欠如した誘導体であることを示している。本発明者らは、イネの植物体における、これらの活性トランスポゾン、ｎＤａｒｔ及びＤａｒｔは、クラス２トランスポゾンのｈＡＴスーパーファミリーに属すると結論付けた。このトランスポゾンは、イネの植物体では活性を有しており、イネの機能ゲノムにおける遺伝子の符号化（タギング）の突然変異誘発手段として、大きな利点を有する。次に、本発明のトランスポゾンを利用した遺伝子解析方法について、具体的に説明する。
【００１６】
（１）アルビノ変異体の分離
２つのイネ品種、「ほしのゆめ」と「Ｉｔａｌｉｃａ  Ｌｉｖｏｒｎｏ」の間の戻し交雑した後代からアルビノ変異体を得た。これらの２品種は、緑の葉を有し、表現型において野生型である。変異体植物は、発芽後１０−１４日のみ生存し、その後、しおれて、枯れた。アルビノ変異体は、劣性遺伝子で支配されていた。アルビノ植物では、緑のスポットが良く観察された。このアルビノ変異は、トランスポゾンのアルビノ遺伝子座への挿入によることを示唆している。図１に、野生型及びアルビノ変異体における葉身の表現型を示す。最も下の葉が野生型であり、他は班入りの緑の区域を持った個別のアルビノ植物である。
【００１７】
（２）アルビノ遺伝子のポジショナルクローニング
アルビノ表現型の原因遺伝子を同定するために、アルビノ遺伝子のポジショナルクローニングを行った。図２に、アルビノ遺伝子のポジショナルクローニングを示す。１次マッピングから、この遺伝子は、第６染色体の短腕に位置していることが分かった。高精度マッピングから、遺伝子は、ＰＡＣクローンＡＰ００２５４２の６０ｋｂゲノム領域に位置していることが分かった。この領域では、予測された１４の遺伝子のうちの１つだけがクロロフィル生合成と関連し、この遺伝子は、Ｍｇ−プロトポルフィリンＩＸメチルトランスフェラーゼ（ＭｇＰＩＸＭＴ）をコードしている。
【００１８】
この遺伝子は、深紅色バクテリア及びシアノバクテリアにおいて同定されており、酵素により、Ｍｇ−プロトポルフィリンＩＸは、Ｍｇ−プロトポルフィリンＩＸメチルエステルに変換される。タンパク質は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ及びホウレン草において、クロロプラスト外皮膜とチラコイドに二重に局在している。図２において、（ａ）は、１次マッピングで検出された遺伝子領域をイネ高密度遺伝子マップにおける第６染色体上に示したものである。（ｂ）は、５５８個体のマッピング集団を用いて検出された遺伝子の高精度マップを示す。（ｃ）は、ＰＡＣクローンＡＰ００２５４２における、遺伝子予測ソフト「Ｒｉｃｅ  ＧＡＡＳ」により予測される方向での、予測されたＭｇＰＩＸＭＴ遺伝子を示す。他の１３の関連しないと予測された遺伝子は除いた。
【００１９】
「Ｉｔａｌｉｃａ  Ｌｉｖｏｒｎｏ」におけるＭｇＰＩＸＭＴの配列は、「日本晴」におけるそれと同一であるので、アルビノ変異体における遺伝子の配列を調査した。プライマーＴＡ１２（図３）を用いて、ＰＣＲ増幅を行い、「ほしのゆめ」と「Ｉｔａｌｉｃａ  Ｌｉｖｏｒｎｏ」は、単一のＰＣＲ産物を生じた。これに対して、アルビノ変異体は、２つのＰＣＲ産物を生じた。１つは、予測された産物と同一であり、他は、それよりも長い産物であった。この長い産物は、トランスポゾンを含むと推定された。野生型と同じＰＣＲ産物がアルビノ変異体でクリアーに生じたが、このことは、植物の葉組織において高い頻度でＭｇＰＩＸＭＴ遺伝子座からトランスポゾンが切り出されたことを示唆している。
【００２０】
図３に、アルビノ変異体におけるＭｇＰＩＸＭＴの配列構造を示す。（ａ）は、ＭｇＰＩＸＭＴ遺伝子における位置＋８で挿入された６０７ｂｐであり、矢印はプライマーＴＡ１２の位置と方向を示す。（ｂ）は、ＭｇＰＩＸＭＴ遺伝子のためのＴＡ１２プライマーで増幅したＰＣＲ産物であり、レーン１−５は、「ほしのゆめ」、「Ｉｔａｌｉｃａ  Ｌｉｖｏｒｎｏ」、及び３つのアルビノ変異体である。白の三角印は期待されるバンドを示し、黒の三角は挿入によるバンドを示す。（ｃ）は、ＭｇＰＩＸＭＴにおける挿入領域の配列であり、小文字、アンダーライン、矢印及びボックスは、それぞれ、ｎＤａｒｔの両側の遺伝子領域、ＴＳＤＳ、ＴＩＲＳ及びｎＤａｒｔを示す。
【００２１】
（３）トランスポゾンの特徴
ＭｇＰＩＸＭＴ遺伝子における６０７ｂｐの挿入が、アルビノ変異体において見出された（図３）。配列は、ＡＴＧコドンから＋８位置に挿入され、フレーム−シフトによりストップコドンが生じる。挿入遺伝子は、トランスポゾンの構造：１９ｂｐの末端逆位反復（ＴＩＲＳ）と８ｂｐのターゲット重複配列（ＴＳＤ）を含み、ｎｏｎａｕｏｎｏｍｏｕｓ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｉｃｅ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ（ｎＤａｒｔ）と命名された。
【００２２】
ＭｇＰＩＸＭＴ遺伝子におけるｎＤａｒｔ配列（ｎＤａｒｔ１−Ａ）を用いたＢＬＡＳＴ検索により、ジャポニカイネ品種の「日本晴」のイネゲノムにおけるｎＤａｒｔと高い類似性を有する配列が、少なくとも１３個あった。ＴＩＲＳは、これら全ての配列中に保存されていた。１８の単一の塩基の置換と１つの１ｂｐの挿入が観察された。１０ｂｐと６ｂｐの欠失が、ｎＤａｒｔ１−１２とｎＤａｒｔ１−１１遺伝子座にそれぞれ観察された。１３配列のうち、４個、ｎＤａｒｔ１−３（６）、ｎＤａｒｔ１−３（８）、ｎＤａｒｔ１−４（３−２）及びｎＤａｒｔ１−４（３−１）は、完全にｎＤａｒｔ１−Ａと同一であった。
【００２３】
（４）２因子トランスポゾンシステム
ｎＤａｒｔ因子は、コーディング能のない非自律性因子である。更なるデータベース検索により、１個のＯＲＦ（図４）を含む因子を、「日本晴」のゲノムに少なくとも５１因子を見出した。この因子は、ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｉｃｅ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ（Ｄａｒｔ）と名付けられた。Ｄａｒｔ配列は、平均して３，５８４ｂｐ（３，５０１−３，６６９ｂｐの範囲）の長さで、ｎＤａｒｔと高い相同性で１９ｂｐのＴＩＲＳを含んでいた。Ｄａｒｔは、８ｂｐのＴＳＤも有していた。Ｄａｒｔの末端配列、ＴＩＲＳを含む両末端における１８３ｂｐは、ｎＤａｒｔのそれらとほとんど同一であった。Ｄａｒｔ因子のうち、末端配列及びＯＲＦは、高度に保存されていた（図４）。
【００２４】
これに対し、ＯＲＦと末端領域の境界となる２つの領域は、相対的に低い相同性の配列であった。これらの構造的な構成は、ｎＤａｒｔ因子は、ＯＲＦを含む内部領域の欠失によってＤａｒｔ因子から生じたことを示唆している。これは、トウモロコシ中のＡｃ／Ｄｓ及びＰＩＦ／ｍＰＩＦ、イネ中のＰｉｎｇ／ｍＰｉｎｇのような、クラス２トランスポゾンでも観察されている。
【００２５】
図４に、Ｄａｒｔの構造を示す。ｎＤａｒｔ因子と同一の配列は、Ｄａｒｔ因子の上に矢印として示した。グレーと黒のボックスは、ＯＲＦのエクソンとｈＡＴ二量体化の特徴と類似の領域をそれぞれ示す。Ｐのバーは、サザンブロット分析で用いられたプローブを示す。数字は、５１Ｄａｒｔ因子中の相同性を示す。Ｄａｒｔ中のＯＲＦは、ｈＡＴスーパーファミリーのトランスポゼースと著しい相同性を有している。
【００２６】
ＯＲＦは、推定されるｈＡＴ二量体化の特徴（Essers L, Adolphs RH, Kunze R (2000), A highly conserved domain of the maize activator transposase is involved in dimerization, Plant Cell, 12:211-223）を含んでおり、それは、ｈＡＴスーパーファミリーのメンバーの中に、高度に保存されている。８ｂｐのＴＳＤ、ＴＩＲＳ、及びｈＡＴ二量体化の特徴は、Ｄａｒｔ因子は、クラス２トランスポゾンのｈＡＴスーパーファミリーに属することを示している。１２の配列の推定されるトランスポゾンは、植物、菌類及び昆虫からの配列を含む、ＤａｒｔのＯＲＦを用いたホモロジー検索から得られた。集められた全ての配列は、ｈＡＴ二量体化の特徴を有していた。系統分類の関係は、Ｄａｒｔ因子は、ｈＡＴスーパーファミリーの植物タイプに属するという考えを示した。
【００２７】
図５に、Ｄａｒｔ因子のｈＡＴスーパーファミリーにおいて推定されるトランスポゾンの系統分類の関係を示す。これは、データベース検索により同定された配列を用いてＣＬＵＳＴＡＬＸアラインメントからｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ法で構築されたｕｎｒｏｏｔｅｄ  ｔｒｅｅである。Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ値（１，０００のくり返し）は、植物、菌類及び昆虫タンパク質のグルーピングを支持している。種及びＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、次の通りである：ｈＡＴ−ｅｌｅｍｅｎｔ，Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＣ０６８３２４；  Ｔａｍ３，Ａ．ｍａｊａｓ  Ｘ５５０７８；  Ｈｏｍｅｒ，Ｂ．ｔｒｙｏｎｉ  ＡＦ１１０４０３；  Ｃｒｙｐｔｌ，Ｃ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ  ＡＦ２８３５０２；  Ｈｏｂｏ，Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  Ｘ０４７０５；  ｈｅｒｍｉｔ，Ｌ．ｃｕｐｒｉｎａ  Ｕ２２４６７；  ｈｏｂｏ，Ｍ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ  ＡＦ４８７５０１；  Ｈｅｒｍｅｓ，Ｍ．ｄｏｍｅｓｔｉｃａ  Ｌ３４８０７；  Ｓｌｉｄｅ，Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ  Ｘ９７５６９；  ＴＨＥＬＭＡ１３，Ｓ．ｌａｔｉｆｏｌｉａ  ＡＹ１７２０３６；  Ｒｅｓｔｌｅｓｓ，Ｔ．ｉｎｆｌａｔｕｍ  Ｚ６９８９３。
【００２８】
（５）Ｄａｒｔ及びｎＤａｒｔの存在における多型性
予期されるように、Ｄａｒｔのサザンブロット分析により、多くのバンドがジャポニカ品種で検出された（図６）。インディカ品種でも、また、多くのバンドが検出された。しかし、インディカにおけるバンドのパターンは、ジャポニカにおけるそれと相違していた。
【００２９】
図６に、Ｄａｒｔの多型について、サザンブロット解析した結果を示す。レーン１−５は、「ＩＲ３６」、「Ｋａｓａｌａｔｈ」、「日本晴」、「ほしのゆめ」、「Ｉｔａｌｉｃａ  Ｌｉｖｏｒｎｏ」である。ＤＮＡは、ＸｂａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。図４に示されたＤａｒｔ中のＯＲＦの２９６ｂｐがプローブとして用いられた。Ｍは、λ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたサイズマーカーを示す。「日本晴」では、ｎＤａｒｔは、テストされた全ての１０の遺伝子座の上に存在していた（表１）。ｎＤａｒｔの存在における多型性は、ジャポニカ品種の中で観察された。「ほしのゆめ」は、ｎＤａｒｔの６つの因子を持ち、２つの遺伝子座、ｎＤａｒｔ１−４（３−２）及びｎＤａｒｔ１−１２は、高い頻度の切り出しがみられた。「ほしのゆめ」におけるｎＤａｒｔ１−４（３−１）遺伝子座の配列は、ｎＤａｒｔは、育種の過程の間に切り出されたことを示しており、ｎＤａｒｔ１−４（３−１）は、活性であることを示している（図７）。
【００３０】
「Ｉｔａｌｉｃａ  Ｌｉｖｏｒｎｏ」は、３つのｎＤａｒｔを持ち、それらは、ｎＤａｒｔ１−４（３−２）、ｎＤａｒｔ１−９及びｎＤａｒｔ１−１１の遺伝子座にあった。「Ｉｔａｌｉｃａ  Ｌｉｖｏｒｎｏ」では、体細胞での切り出しは、どの遺伝子座においても観察されなかった。「Ｉｔａｌｉｃａ  Ｌｉｖｏｒｎｏ」におけるｎＤａｒｔ１−１２遺伝子座の配列は、ｎＤａｒｔは育種の過程の間に切り出されたことを示している（図７）。これに対し、インディカ「Ｋａｓａｌａｔｈ」は、ｎＤａｒｔ１−７の１つの因子だけを有している。１０のテストされた遺伝子座で検出されたこれらの多型性は、２つの亜種への分化の後にｎＤａｒｔが増幅したことを示唆している。
【００３１】
【表１】
2006238804.tif 000003
【００３２】
ＭｇＰＩＸＭＴ遺伝子座に挿入されたｎＤａｒｔ−Ａの配列は、ｎＤａｒｔ１−３（６）、ｎＤａｒｔ１−３（８）、ｎＤａｒｔ１−４（３−２）及びｎＤａｒｔ１−４（３−１）と完全に同一であった。このうち、ｎＤａｒｔ１−４（３−２）遺伝子座のみが、親品種で存在した。加えて、「ほしのゆめ」のｎＤａｒｔ１−４（３−２）において、高い頻度の切り出しが観察された。本発明者らは、第３染色体上のｎＤａｒｔ１−４（３−２）が、アルビノ変異体における第６染色体のＭｇＰＩＸＭＴ遺伝子に転移したと結論付けた。
【００３３】
図７に、ＭｇＰＩＸＭＴ、ｎＤａｒｔ１−４（３−１）及びｎＤａｒｔ１−１２遺伝子座における、ｎＤａｒｔの挿入の種々の種類の遺伝子変異を示す。欠失された塩基は、バーで示される。挿入された塩基は、ｎＤａｒｔ領域の下にボックスで示される。ＭｇＰＩＸＭＴにおける番号は、一つのアルビノ個体、アルビノ３９からの１２クローンにおける配列の割合を示す。
【００３４】
（６）ＭｇＰＩＸＭＴ遺伝子における遺伝子変異
ＭｇＰＩＸＭＴ遺伝子におけるｎＤａｒｔの切り出しに伴う遺伝子変異を、一つのアルビノ植物から由来した１２のクローンの中で比較した（図７）。それらは、４つの異なる種類の配列に分けられた。これらの１１クローンにおいて、８ｂｐ及び６ｂｐの挿入が検出された（＃２−４）。これは、遺伝子にフレーム−シフトを起こし、遺伝子の機能の消失になると考えられた。あるいは、アミノ酸の付加によりタンパク質の機能の変化が生じると考えられた。一つのクローンのみがｎＤａｒｔ（＃５）の正確な欠如を示す配列を有していた。
【００３５】
（７）結論
アルビノ変異体を用いて、本発明者らは、植物体における活性な２因子トランスポゾンを同定した。このトランスポゾンは、クラス２トランスポゾンのｈＡＴスーパーファミリーに属していた。イネ植物体におけるｎＤａｒｔ活性の品種的な違いは、ジャポニカ品種で観察された。「ほしのゆめ」は、２つの活性ｎＤａｒｔ因子を持ち、また、「日本晴」は、非活性のｎＤａｒｔ因子を持っていた。これらの違いは、各品種での活性Ｄａｒｔの違いによると考えられる。「ほしのゆめ」は、活性Ｄａｒｔを持つ。「日本晴」におけるＤａｒｔは、遺伝的に又は後成的に不活性であると考えられる。
【００３６】
イネゲノムにおけるｎＤａｒｔ因子の数は少ないが、これは、イネの機能ゲノム学における遺伝子の符号化（タギング）のための突然変異誘発の手段として利点をもたらす。すなわち、転移したｎＤａｒｔ因子を生物学的手法でゲノム中を探索する場合に、既存の因子数が少ないと、新規因子を発見する上で、労力が少なくてすむ。
【００３７】
本発明のトランスポゾンは、トウモロコシのＡｃ／Ｄｓ、キンギョソウのＴａｍ３と同型のＤＮＡ型のトランスポゾンである。本トランスポゾンは、６０７ｂｐからなる非自律性因子ｎＤａｒｔと、約３，５００ｂｐからなる自律性因子Ｄａｒｔである。Ｄａｒｔは、転移酵素（トランスポボース）をコードすると考えられる遺伝子を有している。非自律性因子ｎＤａｒｔは、それ自身では転移することができない。自律性因子Ｄａｒｔの存在下において、非自律性因子ｎＤａｒｔは転移する。
【００３８】
本発明のトランスポゾンは、イネ品種「ほしのゆめ」と「Ｉｔａｌｉｃａ  Ｌｉｖｏｒｎｏ」の交雑後代で生じたアルビノ突然変異遺伝子から見出されたものであるが、両品種は、いずれも正常型の遺伝子を持っており、非自律性因子ｎＤａｒｔがクロロフィル合成遺伝子に転移（挿入）したことによって、機能を消失し、アルビノ突然変異となったものである。イネ品種「日本晴」のゲノム塩基配列に対して、相同性検索を行ったところ、ｎＤａｒｔは１３個、Ｄａｒｔは５１個見出された。しかしながら、「日本晴」では、いずれのｎＤａｒｔにおいても、転移が見られなかった。
【００３９】
１３個のｎＤａｒｔのうち、１０個について、稲品種「ほしのゆめ」を用いて転移活性を調べた結果、２個のｎＤａｒｔが転移活性を示した。このことから、「ほしのゆめ」には、転移活性のあるＤａｒｔが存在していると考えられた。本発明の非自律性因子には、配列番号１〜１４のいずれかの塩基配列を有するｎＤａｒｔ及びそれと高い相同性を有する塩基配列を有し、かつ同一の活性を有する非自律性因子が含まれる。また、本発明の自律性因子には、配列番号１５〜６５のいずれかの塩基配列を有するＤａｒｔ及びそれと高い相同性を有する塩基配列を有し、かつ同一の活性を有する自律性因子が含まれる。本発明において、上記配列番号の塩基配列と高い相同性を有する塩基配列を有し、かつ同一の活性を有するとは、上記配列番号で示される塩基配列の一部の塩基が置換、付加又は欠失し、かつ同一の活性を維持しているものを意味する。
【００４０】
自律性因子Ｄａｒｔ及び非自律性因子ｎＤａｒｔは、共に広く多くの栽培イネ品種に分布している。しかしながら、転移活性を有する自律性因子のＤａｒｔは、極限られた品種にしか存在していない。そのため、非自律性因子ｎＤａｒｔの転移を利用した遺伝子破壊法の開発においては、転移活性を有する自律性因子Ｄａｒｔが必要不可欠となるが、本発明のｎＤａｒｔ／Ｄａｒｔは、同一品種内のｎＤａｒｔ／Ｄａｒｔで転移が生じているので、従来のトランスポゾンと比べて、遺伝子解析、機能変異、機能消失、及び新品種育種等の試験を実施する上で、極めて有利であると言える。
【００４１】
本発明のイネトランスポゾンを特定の生物種に遺伝子導入することにより、遺伝子破壊が可能であり、また、それにより、遺伝子破壊体が作製される。この場合、遺伝子破壊は、イネに限らず、イネ以外の植物種、微生物、動物及びその組織にも適用可能であり、生物種の種類は特に制限されるものではない。本発明のトランスポゾンは、例えば、イネ遺伝子の機能解析に代表される遺伝子機能解析等の手法として、好適に利用することができる。
【発明の効果】
【００４２】
本発明により、（１）イネトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔが提供される、（２）該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔが提供される、（３）イネトランスポゾンｎＤａｒｔ／Ｄａｒｔを利用した遺伝子の単離方法及び遺伝子機能の解析方法を提供できる、（４）イネトランスポゾンｎＤａｒｔ／Ｄａｒｔを利用した変異型遺伝子の作出方法を提供できる、（５）イネトランスポゾンｎＤａｒｔ／Ｄａｒｔをイネ優良品種に導入し、その変異を利用することによるイネ品種作出及び育成方法を提供できる、（６）上記ｎＤａｒｔ及びＤａｒｔの新規塩基配列を提供できる、（７）イネ品種の交配により、非自律性因子ｎＤａｒｔを転移させることが可能となり、それにより、遺伝子機能の改変された品種を作出することが可能となる、（８）イネ品種の交配により、新しい遺伝子機能を発現する品種を作出することが実現できる、（９）上記ｎＤａｒｔ／Ｄａｒｔをイネ以外の植物種（生物種）に遺伝子導入し、変異型遺伝子を作出、単離する方法を提供することができる、という効果が奏される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
（１）アルビノ変異体の分離
アルビノ変異体は、野生型の表現型を示す、温帯ジャポニカイネ品種「ほしのゆめ」と「Ｉｔａｌｉｃａ  Ｌｉｖｏｒｎｏ」の間の戻し交雑された後代から分離された。これらの２つの品種の間のＦ１植物に「ほしのゆめ」を戻し交雑し、ＢＣ３Ｆ１を作出した。ＢＣ３Ｆ１植物の自家授粉から得られたＢＣ３Ｆ２集団において、劣性変異として、アルビノ変異体が観察された。
【００４５】
（２）ポジショナルクローニング
ＢＣ３Ｆ２集団における１６のアルビノ植物を用いて、アルビノ遺伝子の１次マッピングを行い、遺伝子は、第６染色体の短腕に位置し、ＳＳＲマーカーＲＭ１３６９近傍にあることが分かった。次に、ＢＣ２Ｆ２及びＢＣ３Ｆ２からの５５８個体を用いて、高精度マッピングを行った。公開されているＳＳＲマーカー及び独自開発の２つのＳＳＲ（Ｐ３−２，Ｐ３−１３）及び３つのＣＡＰＳ（ＣＡＰＳＸ，ＣＡＰＳＹ，ＣＡＰＳＺ）マーカーを用いて、連鎖分析を行った。連鎖分析とマーカーの開発を文献（Fujino K, Sekiguchi H, Sato T, Kiuchi H, Nonoue Y, Takeuchi Y, Ando T, Lin SY, Yano M (2004), Mapping of quantitative trait loci controlling low-temperature germinability in rice (Oryza sativa L.), Theor. Appl. Genet., 108:794-799）に記載の方法で行った。
【００４６】
（３）分子解析
アルビノ遺伝子座及び１０ｎＤａｒｔ遺伝子座における多型性の検出のために、ＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、葉組織の全ゲノムＤＮＡからＰＣＲ産物を増幅した。各遺伝子座におけるｎＤａｒｔの存在又は欠如は、シークエンシングにより確認した。ＰＣＲ産物は、ＴＡクローニングキット（プロメガ社）を用いてクローン化した。シークエンシングは、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ１．１（ＡＢＩ）を用いて行った。サザンブロット分析には、３つのジャポニカ品種、「日本晴」、「ほしのゆめ」及び「Ｉｔａｌｉｃａ  Ｌｉｖｏｒｎｏ」、２つのインディカ品種、「Ｋａｓａｌａｔｈ」及び「ＩＲ３６」を使用した。全ＤＮＡは、ＸｂａＩあるいはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＤａｒｔにおけるＯＲＦ中の２９６ｂｐをプローブとして用いた。ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ増幅及びサザンブロット分析は、文献（Fujino K, Sekiguchi H, Sato T, Kiuchi H, Nonoue Y, Takeuchi Y, Ando T, Lin SY, Yano M (2004), Mapping of quantitative trait loci controlling low-temperature germinability in rice (Oryza sativa L.), Theor. Appl. Genet., 108:794-799）に記載された方法に従って行った。尚、ｎＤａｒｔ調査のＰＣＲプライマーは、表４に示した。
【００４７】
（４）データベース解析
データベース検索は、ライス  ゲノム  リサーチ  プログラム（ＲＧＰ）（http://riceblast.dna.affrc.go.jp）あるいは日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）（http:ddbj.nig.ac.jp/）を用いた。系統分析は、ネイバージョイニング法及びＣＬＵＳＴＡＬＸアライメントで行った。
【実施例２】
【００４８】
（１）転移性ｎＤａｒｔの同定
本発明によるトランスポゾンの非自律性因子ｎＤａｒｔは、イネ品種「日本晴」には、少なくとも１３個存在する。このうち、４個は塩基配列が全く同一であったが、その他は数塩基置換あるいは欠失により、それぞれ異なる塩基配列を有していた。「日本晴」では、このうち１０個については、体細胞レベルでの転移性（切り出し）はみられなかった。イネ品種「ほしのゆめ」では、ｎＤａｒｔ１−４（３−２）及びｎＤａｒｔ１−１２において、体細胞レベルでの転移性（切り出し）がみられた。このことから、ｎＤａｒｔは、転移性のある因子とない因子があり、また、品種によっても各因子の転移性が異なることが考えられた。
【００４９】
「日本晴」のｎＤａｒｔ遺伝子座を利用して、その転移性を明らかにした。各ｎＤａｒｔを増幅するＰＣＲプライマーを設計し、ＰＣＲ増幅を行った。このとき、得られる増幅産物により体細胞レベルでの転移性（切り出し）が判定できる。すなわち、ｎＤａｒｔを含む大きさの１個のＰＣＲ産物が得られる場合は、転移性がない。一方、そのＰＣＲ産物に加え、ｎＤａｒｔを含まない大きさのＰＣＲ産物の２産物が得られる場合は、体細胞レベルでの転移性（切り出し）があると判断される。更に、体細胞レベルでの転移性（切り出し）が認められた場合には、ｎＤａｒｔを含まない大きさのＰＣＲ産物をクローニングして塩基配列の決定を行った。これにより、トランスポゾンの転移性（切り出し）に伴う遺伝子変異（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）を確認できる。
【００５０】
「日本晴」の１０個のｎＤａｒｔの遺伝子座について、７０種類のイネ品種を用いて、上記の解析を行った。その結果、表２の通りの４個のｎＤａｒｔの遺伝子座において、転移性が認められ、それらは、各品種においてのみ転移性があった。また、このことは、非自律性因子ｎＤａｒｔを転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔを、これら品種が有していることを示す。
【００５１】
【表２】
2006238804.tif 000004
【００５２】
（２）非自律性因子ｎＤａｒｔによる遺伝子変異の作出
トランスポゾンは、遺伝子あるいは遺伝子機能領域に挿入することによりその機能を欠失させる。一方、その挿入部位から更にそのトランスポゾンが転移（切り出し）する。このとき、トランスポゾンの転移性（切り出し）に伴う遺伝子変異（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）が生じる。この遺伝子変異の変異性を明らかにすることで、ｎＤａｒｔの利用性が示される。そこで、体細胞レベルでの転移性（切り出し）が認められた品種及びｎＤａｒｔの遺伝子座について、ＰＣＲ増幅を行い、ｎＤａｒｔを含まない大きさのＰＣＲ産物をクローニングして、塩基配列の決定を行った。この塩基配列を比較し、ｎＤａｒｔの遺伝子変異（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）の特性を解析した。
【００５３】
７品種、８遺伝子座、５６クローンについて、遺伝子変異の解析を行った。４３クローン（７６．８％）では、フレームシフトとなる塩基の挿入がみられた。１クローン（１．８％）において、正確なｎＤａｒｔの転移性（切り出し）がみられた。また、３ｂｐ及び６ｂｐの挿入は、１２クローン（２１．４％）でみられた。これは、アミノ酸で１及び２残基の挿入となり、遺伝子機能の改変が期待される変異であった。表３に、遺伝子変異体、表４に、ｎＤａｒｔ増幅プライマーを示す。
【００５４】
【表３】
2006238804.tif 000005
【００５５】
【表４】
2006238804.tif 000006
【００５６】
尚、本実施例で用いた実験手法は、以下の通りである。
（１）ＤＮＡ抽出方法；イネの葉から、ＣＴＡＢ法により抽出した。
（２）ＰＣＲ法；抽出したＤＮＡを鋳型として、目的領域のＰＣＲ増幅を行った。各ｎＤａｒｔ遺伝子座を増幅するプライマーを、表４に示した。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動を行い、判定した。
（３）塩基配列の決定法；目的のＰＣＲ産物をＴＡクローニングし、ＢｉｇＤｙｅＴｅｍｉｎａｔｅｒ（ＡＢＩ社）により、塩基配列の決定を行った。
【００５７】
本発明においては、ｎＤａｒｔとして、ｎＤａｒｔ１−１（配列番号１）、ｎＤａｒｔ１−１０（同２）、ｎＤａｒｔ１−１１（同３）、ｎＤａｒｔ１−１２（同４）、ｎＤａｒｔ１−２（同５）、ｎＤａｒｔ１−３（６）（同６）、ｎＤａｒｔ１−３（８）（同７）、ｎＤａｒｔ１−４（３−１）（同８）、ｎＤａｒｔ１−４（３−２）（同９）、ｎＤａｒｔ１−５（同１０）、ｎＤａｒｔ１−６（同１１）、ｎＤａｒｔ１−７（同１２）、ｎＤａｒｔ１−９（同１３）、ｎＤａｒｔ１−Ａ（同１４）が提供される。
また、Ｄａｒｔとして、図９及び配列表に示すＤａｒｔ０１〜Ｄａｒｔ５１（配列番号１５〜６５）が提案される。そして、本発明のｎＤａｒｔ及びＤａｒｔは、これらの塩基配列のみに限定されるものではなく、これらの塩基配列において、その活性が消失されない範囲内で、一又はそれ以上の塩基が付加、置換、又は欠失した塩基配列も本発明のｎＤａｒｔ及びＤａｒｔに包含される。即ち、本発明においては、本発明のｎＤａｒｔ及びＤａｒｔの活性が消失されない限り、そして、その塩基配列が実質的に変化しないものであれば、その塩基配列において、一部の塩基の配列を任意に変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
以上詳述したように、本発明は、トランスポゾンを利用した遺伝子解析方法に係るものであり、本発明により、イネトランスポゾン非自律性因子ｎＤａｒｔと、該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔを利用した、遺伝子の単離方法及び遺伝子機能の解析方法、変異型遺伝子の作出方法及び遺伝子機能の解析方法、変異型遺伝子の作出方法、イネ品種作出及び育成方法、及びイネ品種等を提供することが可能となる。本発明は、特に、非自律性因子ｎＤａｒｔによる遺伝子変異の作出と、該因子を転移させる活性型の自律性因子Ｄａｒｔとを利用して、イネ品種の交配により、新しい遺伝的機能を発現するイネ品種を作出し、提供することを可能とする新しいイネ品種作出技術を提供するものとして有用である。更に、本発明は、上記ｎＤａｒｔ／Ｄａｒｔをイネ以外の植物種（生物種）に遺伝子導入し、遺伝子の単離、解析等を行うことを可能にするものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】野生型及びアルビノ（ａｌｂｉｎｏ）変異体における葉身の植物表現型を示す。
【図２】アルビノ遺伝子のポジショナルクローニングを示す。
【図３】アルビノ変異体におけるＭｇＰＩＸＭＴの配列構造を示す。
【図４】Ｄａｒｔの構造を示す。
【図５】Ｄａｒｔ因子とｈＡＴスーパーファミリーに属するトランスポゾンの系統分類関係を示す。
【図６】Ｄａｒｔの多型性のバンドを示すサザンブロット解析の結果を示す。
【図７】ＭｇＰＩＸＭＴ、ｎＤａｒｔ１−４（３−１）及びｎＤａｒｔ１−１２遺伝子座におけるｎＤａｒｔ挿入の欠如の種類を示す。
【図８】ｎＤａｒｔの分布及び転移活性を示す。
【図９】「日本晴」ゲノムに見出されたＤａｒｔ因子（Ｄａｒｔ０１〜Ｄａｒｔ５１）とそのＴＳＤ及びＴＩＲ配列を示す。
【図１０】自律性因子Ｄａｒｔ（Ｄａｒｔ０１）の配列を示す。
【図１１】非自律性因子ｎＤａｒｔ１−１の配列を示す。
【図１２】非自律性因子ｎＤａｒｔ１−１０の配列を示す。
【図１３】非自律性因子ｎＤａｒｔ１−１１の配列を示す。
【図１４】非自律性因子ｎＤａｒｔ１−１２の配列を示す。
【図１５】非自律性因子ｎＤａｒｔ１−２の配列を示す。
【図１６】非自律性因子ｎＤａｒｔ１−３（６）の配列を示す。
【図１７】非自律性因子ｎＤａｒｔ１−３（８）の配列を示す。
【図１８】非自律性因子ｎＤａｒｔ１−４（３−１）の配列を示す。
【図１９】非自律性因子ｎＤａｒｔ１−４（３−２）の配列を示す。
【図２０】非自律性因子ｎＤａｒｔ１−５の配列を示す。
【図２１】非自律性因子ｎＤａｒｔ１−６の配列を示す。
【図２２】非自律性因子ｎＤａｒｔ１−７の配列を示す。
【図２３】非自律性因子ｎＤａｒｔ１−９の配列を示す。
【図２４】非自律性因子ｎＤａｒｔ１−Ａの配列を示す。
【図７】
2006238804.tif 000007
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【配列表】
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