(57)【要約】      （修正有）【課題】   ある種のオリゴ糖や糖タンパク質糖鎖上の末端ガラクトース等に対してα2,6の結合様式でシアル酸を転移できる植物由来の糖鎖合成酵素を提供する。【解決手段】  イネ由来の特定のアミノ酸配列を有する糖鎖合成酵素。又は該糖鎖合成酵素のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の何れかのアミノ酸配列から成る糖鎖合成酵素。
（１）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列：
【請求項２】
下記の何れかのアミノ酸配列から成るタンパク質を含む、糖鎖合成酵素試薬。
（１）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列：
【請求項３】
糖鎖合成酵素として使用するための、下記の何れかのアミノ酸配列から成るタンパク質。
（１）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列：
【請求項４】
下記の何れかのアミノ酸配列から成る、シアル酸転移酵素活性ドメインを含む糖鎖合成酵素。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２８〜３９３から成るアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２８〜３９３から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２６〜３８４から成るアミノ酸配列；又は
（４）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２６〜３８４から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列：
【請求項５】
請求項４に記載のシアル酸転移酵素活性ドメインを含む糖鎖合成酵素とシグナルペプチドとを含む細胞外分泌型の蛋白であって、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有する蛋白質。
【請求項６】
下記の何れかのアミノ酸配列から成るタンパク質を糖鎖合成酵素として使用する方法。
（１）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列：
【請求項７】
下記の何れかのアミノ酸配列から成る糖鎖合成酵素を用いて糖鎖を合成する方法。
（１）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列：
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物由来の新規な糖鎖合成酵素、および該酵素を用いた糖鎖の合成方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有する糖鎖合成酵素、および該酵素を用いた糖鎖の合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シアル酸は、たとえば細胞-細胞間伝達、細胞基質相互作用、細胞接着などの重要な生理作用を司る物質である。動物では発生、分化の過程に特異的な、あるいは臓器特異的なシアル酸含有糖鎖の存在が知られている。通常、シアル酸は糖タンパク質および糖脂質の糖鎖部分の末端位置に存在しており、これらの部位へのシアル酸の導入は、酵素的にCMP-Siaからの転移によってなされる。このシアル酸の酵素的導入（シアル酸転移）を担う酵素は、シアル酸転移酵素(sialyltransferase)と呼ばれる糖転移酵素である。哺乳類では現在までに20種類のシアル酸転移酵素の存在が知られているが、これらはシアル酸の転移様式から4つのファミリーに大別される(Tsuji, S. (1996) J. Biochem. 120, 1-13) 。すなわち、α2,3の結合様式でガラクトースにシアル酸を転移するβ-ガラクトシドα2,3-シアル酸転移酵素(ST3Gal-ファミリー)、α2,6の結合様式でガラクトースにシアル酸を転移するβ-ガラクトシドα2,6-シアル酸転移酵素(ST6Gal-ファミリー)、α2,6の結合様式でN-アセチルガラクトサミンにシアル酸を転移するGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素(ST6GalNAc-ファミリー)、およびα2,8の結合様式でシアル酸にシアル酸を転移するα2,8-シアル酸転移酵素(ST8Sia-ファミリー)である。また微生物由来のシアル酸転移酵素は、動物由来のシアル酸転移酵素と必ずしも一次構造上の類似点をもたないが、概ね同様のファミリーに分類できる。一方、植物からは、シアル酸転移酵素様のタンパク質の配列情報は知られていたが、実際にシアル酸転移能を有する酵素は単離されてこなかった。
【０００３】
ところでシアル酸含有糖鎖の中には、活性や機能を発現したり、他分子と相互作用する場合において、重要な役割を果たすものがあることが知られている。現在のところ、植物からはシアル酸転移酵素のみならずシアル酸自体が検出されていないが、植物由来の糖タンパク質の糖鎖にシアル酸を付加することによって、新たな活性や機能が発現する可能性も考えられる。しかし、植物細胞内において動物や微生物由来のシアル酸転移酵素遺伝子を発現させる場合、コドンの使用頻度の違いなどによって、当該酵素が必ずしも効率よく生産されるとは限らないし、翻訳されてもこれらの酵素が植物細胞内では正常に機能しない可能性もある。また植物由来の糖タンパク質が、動物や微生物由来のシアル酸転移酵素のよい基質にはならない可能性もある。即ち、上記のような糖鎖修飾を行う場合、シアル酸を転移する酵素も植物由来のものであることが望ましいときがあると考えられる。
【０００４】
【特許文献１】特開平08-154673号公報
【特許文献２】特開平10-234364号公報
【特許文献３】特開平10-234373号公報
【非特許文献１】Hamamoto, T. and Tsuji, S. (2001) ST6Gal-I in Handbook of Glycosyltransferases and Related Genes (Taniguchi, N. et al. Eds.) pp295-300
【非特許文献２】Takashima, S., Tsuji, S., and Tsujimoto, M. J. Biol. Chem. 277, 45719-45728 (2002)
【非特許文献３】Takashima, S., Tsuji, S., and Tsujimoto, M. J. Biochem. 134, 287-296 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来、微生物から高等動物に至る様々な生物からシアル酸転移酵素が単離されてきたが、植物からは単離されていなかった。本発明は、この植物由来のシアル酸転移酵素がないという問題点を解決し、ある種のオリゴ糖や糖タンパク質糖鎖上の末端ガラクトース等に対してα2,6の結合様式でシアル酸を転移できる植物由来の糖鎖合成酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒトおよびマウスの各種シアル酸転移酵素のアミノ酸配列の情報およびイネゲノム塩基配列情報を利用して作成したプライマーを用いてイネゲノムDNAを鋳型としたPCRを行い、イネ由来のシアル酸転移酵素をコードするDNAをクローニングすることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明によれば、下記の何れかのアミノ酸配列から成る糖鎖合成酵素が提供される。
（１）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列：
【０００８】
本発明の別の側面によれば、下記の何れかのアミノ酸配列から成るタンパク質を含む、糖鎖合成酵素試薬が提供される。
（１）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列：
【０００９】
本発明のさらに別の側面によれば、糖鎖合成酵素として使用するための、下記の何れかのアミノ酸配列から成るタンパク質が提供される。
（１）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列：
【００１０】
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのアミノ酸配列から成る、シアル酸転移酵素活性ドメインを含む糖鎖合成酵素が提供される。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２８〜３９３から成るアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２８〜３９３から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２６〜３８４から成るアミノ酸配列；又は
（４）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２６〜３８４から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列：
【００１１】
本発明のさらに別の側面によれば、上記したシアル酸転移酵素活性ドメインを含む糖鎖合成酵素とシグナルペプチドとを含む細胞外分泌型の蛋白であって、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有する蛋白質が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのアミノ酸配列から成るタンパク質を糖鎖合成酵素として使用する方法が提供される。
（１）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列：
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、下記の何れかのアミノ酸配列から成る糖鎖合成酵素を用いて糖鎖を合成する方法が提供される。
（１）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列：
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ある種のオリゴ糖や糖タンパク質糖鎖の末端ガラクトース等にα2,6の結合様式でシアル酸を選択的に導入することが可能になった。本発明は、各種糖鎖にシアル酸を付加することによって生理作用を改変したり、糖鎖分解酵素の分解活性を阻害する試薬として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施態様及び実施方法について詳細に説明する。
（１）本発明の酵素及び蛋白質
本発明の糖鎖合成酵素は、下記の何れかのアミノ酸配列から成り、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有することを特徴とする。
（１）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号２又は６に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列：
【００１６】
本発明の糖鎖合成酵素としては、イネ由来の天然型酵素やその変異体、または以下の実施例で作製したような遺伝子組み換え技術により製造された細胞外分泌型蛋白質などを挙げることができるが、これらはいずれも本発明の範囲に包含されるものである。
【００１７】
さらに、本発明の糖鎖合成酵素の活性ドメイン、あるいはそのアミノ酸配列の一部を改変又は修飾して得られる、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有する酵素は全て本発明の範囲に包含されることを理解すべきである。このような活性ドメインの好ましい例としては、配列表の配列番号２に記載したアミノ酸配列のアミノ酸番号２８〜３９３により特定される糖鎖合成酵素の活性ドメイン、並びに配列表の配列番号６に記載したアミノ酸配列のアミノ酸番号２６〜３８４により特定される糖鎖合成酵素の活性ドメインなどを挙げることができる。
【００１８】
即ち、本発明によれば、下記の何れかのアミノ酸配列から成る、シアル酸転移酵素活性ドメインを含む糖鎖合成酵素が提供される。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２８〜３９３から成るアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２８〜３９３から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２６〜３８４から成るアミノ酸配列；又は
（４）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号２６〜３８４から成るアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有するアミノ酸配列：
【００１９】
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００２０】
本発明の酵素の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換え蛋白質でもよい。
【００２１】
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号２及び６に記載したアミノ酸配列、及び配列番号１及び５に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、それらを用いて適当なｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の酵素をコードするＤＮＡを取得することができる。
【００２２】
例えば、 配列番号２又は配列番号６に記載したアミノ酸配列を有する糖鎖合成酵素をコードするDNAの単離する方法は以下の実施例に詳細に説明されている。もっとも、本発明の糖鎖合成酵素をコードするDNAの単離方法はこれらの方法に限定されることはなく、当業者は下記の実施例に記載された方法を参照しつつ、この方法を適宜修飾ないし変更することにより、容易に目的のDNAを単離することができる。
【００２３】
また、本発明の酵素をコードするＤＮＡの一部の断片を上記したＰＣＲにより得た場合には、作製したＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の酵素をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の酵素を産生することができる。発現系での発現については本明細書中後記する。
【００２４】
さらに、本発明の糖鎖合成酵素の活性ドメインであるポリペプチド部分とシグナルペプチドとを含む細胞外分泌型の蛋白であって、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有する酵素も本発明に含まれる。
【００２５】
本発明の糖鎖合成酵素は、発現後に細胞内に留まり、細胞外に分泌されない場合がある。また、細胞内濃度が一定以上になると、酵素の発現量が低下するという可能性がある。上記の糖鎖合成のシアル酸転移活性を有効に利用するために、本酵素の活性を維持し、かつ発現時に細胞から分泌される可溶性形態の蛋白を製造することができる。このような蛋白としては、本発明の糖鎖合成酵素の活性に関与する活性ドメインであるポリペプチド部分とシグナルペプチドとを含む細胞外分泌型の蛋白であって、糖鎖の末端ガラクトース部分にα2,6の結合様式でシアル酸を転移する触媒活性を有する蛋白質を挙げることができる。例えば、プロテインＡとの融合蛋白は本発明の分泌型蛋白の好ましい態様である。
【００２６】
これまでにクローニングされたシアル酸転移酵素は、他のグリコシルトランスフェラーゼと同様のドメイン構造を有している。すなわち、NH2 末端の短い細胞質中尾部、疎水性のシグナルアンカードメイン、蛋白分解感受性を有するステム(stem)領域、及び COOH-末端の大きな活性ドメインを有する(Paulson, J.C. and Colley, K.J., J. Biol. Chem., 264, 17615-17618, 1989)。本発明の 糖鎖合成酵素の経膜ドメインの位置を調べるためには、カイト及びドゥーリトル（Kyte, J. and Doolittle, R.F., J. Mol.Biol., 157, 105-132, 1982）の方法に従って作成した疎水性分布図を利用することができる。また、活性ドメイン部分の推定には、各種のフラグメントを導入した組換えプラスミドを作成して利用することができる。このような方法の一例は、例えばPCT/JP94/02182号の明細書に詳細に記載されているが、経膜ドメインの位置の確認や活性ドメイン部分の推定方法は、この方法に限定されることはない。
【００２７】
糖鎖合成酵素の活性ドメインであるポリペプチド部分とシグナルペプチドとを含む細胞外分泌型の蛋白の製造のためには、例えばシグナルペプチドとして免疫グロブリンシグナルペプチド配列を用い、糖鎖合成酵素の活性ドメインに対応する配列を該シグナルペプチドにインフレーム融合させればよい。このような方法としては、例えば、ジョブリンの方法(Jobling, S.A. and Gehrke, L., Nature(Lond.), 325, 622-625, 1987) を利用することができる。また、本明細書の実施例に詳細に説明されているように、プロテインＡとの融合蛋白を製造してもよい。もっとも、シグナルペプチドの種類やシグナルペプチドと活性ドメインの結合方法、または可溶化の方法は上記方法に限定されることはなく、当業者は、糖鎖合成酵素の活性ドメインであるポリペプチド部分を適宜選択することができるし、それらを利用可能な任意のシグナルペプチドと適宜の方法により結合することにより細胞外分泌型の蛋白を製造することができる。
【００２８】
（２）本発明の酵素をコードするＤＮＡ及びそれを用いた酵素の発現
本発明の酵素の具体例としては、下記の何れかの塩基配列によりコードされるタンパク質が挙げられる。
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列中の１３７番目から１３１５番目の塩基で特定される塩基配列；
（２）配列表の配列番号５に記載の塩基配列中の６３番目から１２１４番目の塩基で特定される塩基配列；
【００２９】
本発明で用いる遺伝子の取得方法は上記（１）に記載した通りである。また、所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができる。このような公知の技術は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、並びにCurrent Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)に記載されている。
【００３０】
本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００３１】
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰLプロモータ、大腸菌の lac、trp若しくはtacプロモータなどが挙げられる。
【００３２】
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-4cプロモータなどが挙げられる。
糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
【００３３】
また、本発明で用いる遺伝子には必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネータまたは真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネータ若しくはＡＤＨ３ターミネータのような適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配列（例えばアデノウイルス ＶＡ ＲＮＡ をコードするもの）のような要素を有していてもよい。
【００３４】
組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
【００３５】
組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
本発明の酵素をコードする遺伝子、プロモーター、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００３６】
本発明の酵素をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡを含む組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
ＤＮＡまたは組み換えベクターを導入される宿主細胞は、当該ＤＮＡを発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
【００３７】
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００３８】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００３９】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００４０】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）。
【００４１】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００４２】
上記の形質転換体は、導入されたＤＮＡ構築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の酵素を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
【００４３】
例えば、本発明の酵素が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００４４】
（３）本発明の酵素の使用方法
上記（１）で説明した本発明の酵素は、糖鎖合成酵素として使用することができる。即ち、本発明の酵素は、糖鎖合成酵素として、糖鎖を合成するために使用することができる。具体的には、基質として、各種の糖鎖(糖脂質、糖タンパク質、又はオリゴ糖など)を使用し、またシアル酸供与体と本発明の酵素とを上記の基質に作用させることにより、シアル酸を基質に転移させることができ、糖鎖の合成を行うことができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００４５】
本発明の実施例に用いた試薬、試料類は以下の通りである。Fetuin, asialofetuin, bovine submaxillary mucin (BSM), α1-acid glycoprotein, ovomucoid, lactosyl ceramide (LacCer), GA1, GM3, GM1a, Galβ1,3GalNAc, Galβ1,3GlcNAc, Galβ1,4GlcNAc, Triton CF-54はSigma社から購入した。Paragloboside, ラクトースは和光純薬から購入した。CMP-[14C]-NeuAc (12.0 GBq/mmol)はAmersham Pharmacia Biotech社から購入した。シアリダーゼ (NANase I, II) はGlyko Inc社から購入した。BSM, α1-acid glycoprotein, ovomucoidの脱シアル化（アシアロ）糖タンパク質は、これらを0.02N HCl中 80度、1時間で処理することにより調製した。
【００４６】
実施例１：STLP1, STLP2, 及びSTLP3のクローニング
ヒトおよびマウスの各種シアル酸転移酵素のアミノ酸配列を用いて、これらと相同性を示すタンパク質をコードしている遺伝子をNational Center for Biotechnology Informationの配列データベースで検索したところ、動物のほかにイネやシロイヌナズナなどの植物にも上記シアル酸転移酵素と相同性を示すタンパク質をコードしている遺伝子が存在することが確認された。イネについては3種類の遺伝子が存在していたため、それらの塩基配列情報をもとにポリメラーゼ連鎖反応法 (PCR)用のプライマーを作製し（図1の塩基番号131-160、CB265+: 5'-GCGATGAAGCGGCCGCTGCGGCGCCCGTTC-3'（配列番号７）, 1311-1340相当の相補鎖（ただしSalIサイトを導入するため、一部の塩基を別の塩基に置換している）、CB267-: 5'-GTCGACCACCTTGCGCGCACGCGCTCTAAT-3' （配列番号８）の組、図2の塩基番号35-64、CB361+: GGGATGAAGCGCCGCCACCTCCCGCCCGTC-3' （配列番号９）、1215-1244相当の相補鎖（ただしXhoIサイトを導入するため、一部の塩基を別の塩基に置換している）、CB363-: 5'-CACCTCGAGGTCACCGTCACCAGTGCAACC-3' （配列番号１０）の組、図3の塩基番号60-89、CB364+: 5'-GAGATGAAGAGGAGGCATTGGAGCCACCCG-3' （配列番号１１）、1197-1226相当の相補鎖（ただしSalIサイトを導入するため、一部の塩基を別の塩基に置換している）、CB366-: CGTCGACTGTCAGCGGTAGAACGACACGGG-3' （配列番号１２）の組）、イネゲノムDNAを鋳型としてPCRを行って、各々の遺伝子の翻訳領域全長を増幅した。これらのDNA断片をクローニングベクターpBluescript II SK(+)に挿入し、DNAシークエンスによりその塩基配列の確認を行った。これらの遺伝子は高等生物などのシアル酸転移酵素間で保存されているシアリルモチーフと類似した配列をもつシアル酸転移酵素様タンパク質(Sialyltransferase-like protein)をコードしていることから、それぞれSTLP1, STLP2, STLP3と便宜的に命名した（図1-4）。STLP1, STLP2, STLP3はそれぞれ393, 396, 384アミノ酸からなり、N末端側に膜貫通ドメインをもつII型膜タンパク質をコードしていた。またSTLP1はSTLP2, STLP3とそれぞれアミノ酸配列レベルで43.9％, 61.3％の、またSTLP2とSTLP3は48.2％の相同性を示した。STLP1の塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号１及び２に示し、 STLP2の塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号３及び４に示し、STLP3の塩基配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号５及び６に示す。
【００４７】
実施例２：STLP1, STLP2, 及びSTLP3の分泌型タンパク質の製造
つぎに各タンパク質の酵素学的諸性質を調べるため、分泌型タンパク質の製造を行った。STLP1についてはEcoRIサイトを含む合成DNA、CB266+: 5'-TCCGAATTCCGCAGGTCGGTGGGCCCGGCT-3' （配列番号１３）（図１の塩基番号206-235に相当、ただしEcoRIサイト導入のため塩基置換がある）とCB267-を用いて、STLP2についてはEcoRIサイトを含む合成DNA、CB362+: 5'-GAATTCCGCCGCCGCCTCCTCGTGCTGCAG-3'（配列番号１４）（図２の塩基番号98-127に相当、ただしEcoRIサイト導入のため塩基置換がある）とCB363-を用いて、STLP3についてはEcoRIサイトを含む合成DNA、 CB365+: 5'-GAATTCCGCTGCTCCCAGCTGCGCCATTCC-3' （配列番号１５）（図３の塩基番号135-164に相当、ただしEcoRIサイト導入のため塩基置換がある）とCB366-を用いてPCRを行い、膜貫通ドメインを欠いたタンパク質をコードするそれぞれのDNA断片を調製し、これらを哺乳動物発現ベクターpcDSAに挿入した。ここで各発現ベクターをpcDSA-STLP1, pcDSA-STLP2, pcDSA-STLP3と命名した。これらの発現ベクターは、マウス免疫グロブリンIgMのシグナルペプチドとStaphylococcus aureus protein A, および各STLPタンパク質の膜貫通ドメインを欠いた領域からなる分泌型融合タンパク質をコードする。つぎに発現ベクターとリポフェクトアミン(Invitrogen)を用いてCOS-7細胞でその一過性発現を行った(Kojima, N. et al. (1995) FEBS Lett. 360, 1-4)。ここで各発現ベクターを導入した細胞から細胞外に分泌されたタンパク質をそれぞれPA-STLP1, PA-STLP2, PA-STLP3と命名した。これらのタンパク質はIgG-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech社)に吸着させて培地より回収した。
【００４８】
実施例３：STLP1, STLP2, 及びSTLP3の酵素学的性質の分析
STLP1, STLP2, 及びSTLP3のシアル酸転移酵素活性はLeeらの方法に準じて以下のように行った(Lee, Y.-C. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 11958-11967)。50 mM MESバッファー(pH 6.0), 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0.5％ Triton CF-54, 100 μM CMP-[14C]-NeuAc, 基質糖鎖(糖脂質の場合は0.5 mg/ml, 糖タンパク質、オリゴ糖は1 mg/mlになるように添加), およびPA-STLP懸濁液を含む反応液(10μl)を37度で3-20時間インキュベートし、その後、糖脂質についてはC-18カラム(Sep-Pak Vac 100 mg; Waters社)を用いて精製したものを試料として、オリゴ糖、糖タンパク質については反応産物をそのまま試料として解析を行った。オリゴ糖、糖脂質はシリカゲル60HPTLCプレート(Merck社)にスポットし、1-プロパノール：アンモニア水：水=6:1:2.5の展開溶媒（オリゴ糖用)またはクロロホルム：メタノール：0.02% CaCl2=55:45:10の展開溶媒（糖脂質用）で展開した。糖タンパク質の場合はSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって解析を行った。これらの放射活性をBAS2000ラジオイメージアナライザー（フジフィルム）で可視化し、定量した。
【００４９】
結果を図５に示す。図５のＡは、各種糖タンパク質を基質とした場合のPA-STLP1のシアル酸転移酵素活性を示す。Fetuinは代表的な糖鎖として、NeuAcα2,3Galβ1,3GalNAc-Ｏ-Ser/Thr, NeuAcα2,3Galβ1,3(NeuAcα2,6)GalNAc-Ｏ-Ser/Thr, NeuAcα2,6(3)Galβ1,4GlcNAc-Rといった糖鎖をもつ。またα1-Acid glycoproteinは代表的な糖鎖として、NeuAcα2,6(3)Galβ1,4GlcNAc-Rといった糖鎖をもつ。ここでNeuAcはN-アセチルノイラミン酸（シアル酸の一種）、Galはガラクトース、GalNAcはN-アセチルガラクトサミン、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン、Serはセリン、Thrはスレオニン、Rは糖鎖残基(N-結合型糖鎖)の省略部分を示す。糖鎖末端のシアル酸部分を除去したものがAsialo-タンパク質である。図５のＢは、オリゴ糖を基質とした場合のPA-STLP1のシアル酸転移酵素活性を示す。図５のＣは、STLP1の結合特異性を示す。PA-STLP1を用いてGalβ1,4GlcNAcにシアル酸を転移させた（レーン左）後、α2,3結合を特異的に切断するシアリダーゼ（NANase I）で処理した場合（レーン中央）と、α2,3およびα2,6結合を特異的に切断するシアリダーゼ（NANase II）で処理した場合（レーン右）の反応産物を薄層クロマトグラフィーで展開した結果を示す。図５のＤは、STLP3の結合特異性を示す。PA-STLP3を用いてAsialofetuinにシアル酸を転移させた（レーン左）後、α2,3結合を特異的に切断するシアリダーゼ（NANase I）で処理した場合（レーン中央）と、α2,3およびα2,6結合を特異的に切断するシアリダーゼ（NANase II）で処理した場合（レーン右）の反応産物をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）した結果を示す。
【００５０】
シアル酸供与体としてCMP-[14C]-NeuAcを、シアル酸が転移される側の糖鎖基質として様々なオリゴ糖、糖タンパク質、糖脂質を用い、各PA-STLPのシアル酸転移酵素活性の有無を調べたところ、STLP1はオリゴ糖Galβ1,4GlcNAc、糖タンパク質のAsialo-fetuin、α1-acid glycoprotein、asialo-α1-acid glycoproteinなどに対してシアル酸転移酵素活性を示すことが判明した（図５のＡ及びＢ）。STLP1を用いてGalβ1,4GlcNAcにシアル酸を転移した場合、その反応産物中に導入されたシアル酸はα2,3-結合で結合しているシアル酸を特異的に切断するシアリダーゼ(NANase I)では切断されなかったが、α2,3-, α2,6-結合で結合しているシアル酸を特異的に切断するシアリダーゼ(NANase II)では切断された(図５のＣ)。このことはSTLP1がα2,6-結合様式でシアル酸を転移する活性をもつことを示している。一方、調べた限りにおいては、STLP2はいずれの基質に対してもシアル酸転移活性を示さなかった。またSTLP3は、調べた基質の中ではAsialo-fetuinに対してのみシアル酸転移酵素活性を示した。STLP3を用いてAsialo-fetuinにシアル酸を転移した場合、その反応産物中に導入されたシアル酸はα2,3-結合で結合しているシアル酸を特異的に切断するシアリダーゼ(NANase I)では切断されなかったが、α2,3-, α2,6-結合で結合しているシアル酸を特異的に切断するシアリダーゼ(NANase II)では切断された(図５のＤ)。このことはSTLP3がSTLP1と同様にα2,6-結合様式でシアル酸を転移する活性をもつことを示している。
【００５１】
現在のところ、植物からはシアル酸は検出されていないので、STLPが植物体内でシアル酸転移酵素として機能しているかどうかは不明である。むしろ、植物体内ではある種のシアル酸類似物質などの転移に関与しているのかもしれない。しかし、STLP1、STLP3は特定の基質に対しては実際にシアル酸を転移できることから、これらのタンパク質をシアル酸転移酵素として利用できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、イネSTLP1の塩基配列とアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、イネSTLP2の塩基配列とアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、イネSTLP3の塩基配列とアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、イネSTLP1, 2, 3のアミノ酸配列の比較を示す。太線、シアリルモチーフL様配列; 細線、シアリルモチーフS様配列; ＊、シアリルモチーフVS様配列。
【図５】図５は、STLP1, 3のシアル酸転移酵素活性を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００５３】
SEQUENCE LISTING
<110> RIKEN
<120> Sugar chain synthetase
<130> A51190A
<160> 15
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  1617
<212>  DNA
<213>  Rice
<220>
<221>  CDS
<222>  (137)..(1315)
<400>  1
actcggagct cagctcgcac ggcacggaac ggaacacaac cctccctgtg tctctctccc     60
tgatgcgccg ccccccatgc ggcggccccg acccacttag cccgcggcgg cggatgctgc    120
ggcggcggcg gcggcg atg aag cgg ccg ctg cgg cgc ccg ttc gcg gtg ctc    172
Met Lys Arg Pro Leu Arg Arg Pro Phe Ala Val Leu 
1               5                   10
ctc ttc gtc gtg ctg tgc gcc gcg gcc tcg ttc ccc tcc gtg ttg cgc      220
Leu Phe Val Val Leu Cys Ala Ala Ala Ser Phe Pro Ser Val Leu Arg 
15                  20                  25
agg tcg gtg ggc ccg gct ccc gtg ctc gcg acc ctg ccg ccg ctt gat      268
Arg Ser Val Gly Pro Ala Pro Val Leu Ala Thr Leu Pro Pro Leu Asp 
30                  35                  40
ccc gcg cgc ctc aac gcc acg ctc ctc cgc ctt gcc gcg gcc gat cca      316
Pro Ala Arg Leu Asn Ala Thr Leu Leu Arg Leu Ala Ala Ala Asp Pro 
45                  50                  55                  60
tcg gag gcg ccg ctg cgc cgc gac gtg gac gac ctc ctc gag ggc cgc      364
Ser Glu Ala Pro Leu Arg Arg Asp Val Asp Asp Leu Leu Glu Gly Arg 
65                  70                  75
ctc ccg gcg tcg tcc gcg cgc gcc cgc gcg tgg cgc ctc cgg ggc gac      412
Leu Pro Ala Ser Ser Ala Arg Ala Arg Ala Trp Arg Leu Arg Gly Asp 
80                  85                  90
agg ctc cac ctt cac ctc cgc cac cac cag ttc ccc gtc tac cgg cgc      460
Arg Leu His Leu His Leu Arg His His Gln Phe Pro Val Tyr Arg Arg 
95                  100                 105 
ggc cac cac ccg gat cac gac cac gac ccc ctc ctc cac ccg ctc ccg      508
Gly His His Pro Asp His Asp His Asp Pro Leu Leu His Pro Leu Pro 
110                 115                 120 
cgc cag gag ctc cac ctc gac cca tcc ctc cgc cgc gcg ctc cgc tcc      556
Arg Gln Glu Leu His Leu Asp Pro Ser Leu Arg Arg Ala Leu Arg Ser 
125                 130                 135                 140 
tgg cac cgc ctc cgc cgg cac gac ccc ggc gtc ctc cgc aat ctc cct      604
Trp His Arg Leu Arg Arg His Asp Pro Gly Val Leu Arg Asn Leu Pro 
145                 150                 155 
tcc ctc ctc tcc ctc ccc ggc cgc atc ccc tcc tgc gcc gtc gtg ggc      652
Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gly Arg Ile Pro Ser Cys Ala Val Val Gly 
160                 165                 170 
aac agc ggc atc ctc ctc ggc gcc agc cac ggc gcc ctc atc gac tcc      700
Asn Ser Gly Ile Leu Leu Gly Ala Ser His Gly Ala Leu Ile Asp Ser 
175                 180                 185 
cac gcc gcc gtc ttc cgc ctc aac aac gcc cgc atc tcc ggc ttc gcc      748
His Ala Ala Val Phe Arg Leu Asn Asn Ala Arg Ile Ser Gly Phe Ala 
190                 195                 200 
gcc aac gtc ggc gcc aag acc aac ctc tcc ttc atc aac agc aac gtc      796
Ala Asn Val Gly Ala Lys Thr Asn Leu Ser Phe Ile Asn Ser Asn Val 
205                 210                 215                 220 
ctc cat ctc tgc gcc cgc cgt ccc aac tgc ttc tgc cac ccc tac ggc      844
Leu His Leu Cys Ala Arg Arg Pro Asn Cys Phe Cys His Pro Tyr Gly 
225                 230                 235 
gac ggc gtc ccc atc ctg ctc tac atc tgc cag gcc gcg cac ttc ctc      892
Asp Gly Val Pro Ile Leu Leu Tyr Ile Cys Gln Ala Ala His Phe Leu 
240                 245                 250 
gac gtc gcc tcc tgc aac gcc tct tcc cgc tcc ctc cac gcc gca tcc      940
Asp Val Ala Ser Cys Asn Ala Ser Ser Arg Ser Leu His Ala Ala Ser 
255                 260                 265 
atc tcc gtc acc gat cca cgc ctc gac gtc ctc tgc gcg cgc atc gtc      988
Ile Ser Val Thr Asp Pro Arg Leu Asp Val Leu Cys Ala Arg Ile Val 
270                 275                 280 
aag tac tac tcg ctc cgc cgc ttc gtc gcc gag acg ggg cgc gcg gcc     1036
Lys Tyr Tyr Ser Leu Arg Arg Phe Val Ala Glu Thr Gly Arg Ala Ala 
285                 290                 295                 300 
gag gag tgg agc agc acg cgc gac gcg gcc atg ttc cac tac tcg tcg     1084
Glu Glu Trp Ser Ser Thr Arg Asp Ala Ala Met Phe His Tyr Ser Ser 
305                 310                 315 
ggg atg cag gcc atc atg gtc gcc gtg gga gtg tgc gac agg gtg agc     1132
Gly Met Gln Ala Ile Met Val Ala Val Gly Val Cys Asp Arg Val Ser 
320                 325                 330 
gtg ttc ggg ttc ggg aag gcg gcc gac gcg aag cac cat tac cac agc     1180
Val Phe Gly Phe Gly Lys Ala Ala Asp Ala Lys His His Tyr His Ser 
335                 340                 345 
aac cag aag gcg gag ctg gac ctc cac gac tac aag gcg gag tac gcc     1228
Asn Gln Lys Ala Glu Leu Asp Leu His Asp Tyr Lys Ala Glu Tyr Ala 
350                 355                 360 
ttc tac cgc gac ctc gcc gac cgg ccg gag gta gtc ccc ttc ctc aac     1276
Phe Tyr Arg Asp Leu Ala Asp Arg Pro Glu Val Val Pro Phe Leu Asn 
365                 370                 375                 380 
gac gcc ggt atc gcc gtc ccg ccc gtc gtg ttc tac cat tagagcgcgt      1325
Asp Ala Gly Ile Ala Val Pro Pro Val Val Phe Tyr His 
385                 390 
gcgcgcaagg tgctcgacgt tatgccactt ttttccggtg gaggattgtg ttgtattagt   1385
ggctcagtgt aaaatgttgc ttcgtaaggt gggttatttt ttgtgattag attgatagac   1445
gaattgaaat agtagcgaaa ttttgatatg atggtgggat tggaggtgtg tactaagcat   1505
taggatccct ccattagcat acgaggacga tttcttccgc ttttggcact gtaactgtaa   1565
tttagactga tctttcttcg taatttcatg aagaatcaat tgtacatctt ct           1617
<210>  2
<211>  393
<212>  PRT
<213>  Rice
<400>  2
Met Lys Arg Pro Leu Arg Arg Pro Phe Ala Val Leu Leu Phe Val Val 
1               5                   10                  15
Leu Cys Ala Ala Ala Ser Phe Pro Ser Val Leu Arg Arg Ser Val Gly 
20                  25                  30
Pro Ala Pro Val Leu Ala Thr Leu Pro Pro Leu Asp Pro Ala Arg Leu 
35                  40                  45
Asn Ala Thr Leu Leu Arg Leu Ala Ala Ala Asp Pro Ser Glu Ala Pro 
50                  55                  60
Leu Arg Arg Asp Val Asp Asp Leu Leu Glu Gly Arg Leu Pro Ala Ser 
65                  70                  75                  80
Ser Ala Arg Ala Arg Ala Trp Arg Leu Arg Gly Asp Arg Leu His Leu 
85                  90                  95
His Leu Arg His His Gln Phe Pro Val Tyr Arg Arg Gly His His Pro 
100                 105                 110 
Asp His Asp His Asp Pro Leu Leu His Pro Leu Pro Arg Gln Glu Leu 
115                 120                 125 
His Leu Asp Pro Ser Leu Arg Arg Ala Leu Arg Ser Trp His Arg Leu 
130                 135                 140 
Arg Arg His Asp Pro Gly Val Leu Arg Asn Leu Pro Ser Leu Leu Ser 
145                 150                 155                 160 
Leu Pro Gly Arg Ile Pro Ser Cys Ala Val Val Gly Asn Ser Gly Ile 
165                 170                 175 
Leu Leu Gly Ala Ser His Gly Ala Leu Ile Asp Ser His Ala Ala Val 
180                 185                 190 
Phe Arg Leu Asn Asn Ala Arg Ile Ser Gly Phe Ala Ala Asn Val Gly 
195                 200                 205 
Ala Lys Thr Asn Leu Ser Phe Ile Asn Ser Asn Val Leu His Leu Cys 
210                 215                 220 
Ala Arg Arg Pro Asn Cys Phe Cys His Pro Tyr Gly Asp Gly Val Pro 
225                 230                 235                 240 
Ile Leu Leu Tyr Ile Cys Gln Ala Ala His Phe Leu Asp Val Ala Ser 
245                 250                 255 
Cys Asn Ala Ser Ser Arg Ser Leu His Ala Ala Ser Ile Ser Val Thr 
260                 265                 270 
Asp Pro Arg Leu Asp Val Leu Cys Ala Arg Ile Val Lys Tyr Tyr Ser 
275                 280                 285 
Leu Arg Arg Phe Val Ala Glu Thr Gly Arg Ala Ala Glu Glu Trp Ser 
290                 295                 300 
Ser Thr Arg Asp Ala Ala Met Phe His Tyr Ser Ser Gly Met Gln Ala 
305                 310                 315                 320 
Ile Met Val Ala Val Gly Val Cys Asp Arg Val Ser Val Phe Gly Phe 
325                 330                 335 
Gly Lys Ala Ala Asp Ala Lys His His Tyr His Ser Asn Gln Lys Ala 
340                 345                 350 
Glu Leu Asp Leu His Asp Tyr Lys Ala Glu Tyr Ala Phe Tyr Arg Asp 
355                 360                 365 
Leu Ala Asp Arg Pro Glu Val Val Pro Phe Leu Asn Asp Ala Gly Ile 
370                 375                 380 
Ala Val Pro Pro Val Val Phe Tyr His 
385                 390 
<210>  3
<211>  1475
<212>  DNA
<213>  Rice
<220>
<221>  CDS
<222>  (38)..(1225)
<400>  3
accatcaccg acgacggcga cctcaccgcc gccgggg atg aag cgc cgc cac ctc      55
Met Lys Arg Arg His Leu
1               5
ccg ccc gtc ctc gtc ctc ctc ctc ctc tca atc ctc tcc ctc tcc ttc      103
Pro Pro Val Leu Val Leu Leu Leu Leu Ser Ile Leu Ser Leu Ser Phe 
10                  15                  20
cgc cgc cgc ctc ctc gtg ctg cag ggc ccc ccg tcg tcg tcg tcg tcg      151
Arg Arg Arg Leu Leu Val Leu Gln Gly Pro Pro Ser Ser Ser Ser Ser 
25                  30                  35
tcc cgc cac ccc gtc ggt gac ccc ctc ctc cgc cgc ctc gcg gcc gac      199
Ser Arg His Pro Val Gly Asp Pro Leu Leu Arg Arg Leu Ala Ala Asp 
40                  45                  50
gat ggc gcc gga tcc agc cag atc ctc gcc gag gcc gcc gcg ctg ttc      247
Asp Gly Ala Gly Ser Ser Gln Ile Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Phe 
55                  60                  65                  70
gcc aac gcg tcg atc tcg acg ttc ccc agc ctc ggc aac cac cac cgg      295
Ala Asn Ala Ser Ile Ser Thr Phe Pro Ser Leu Gly Asn His His Arg 
75                  80                  85
ctg ctc tac ctc cgc atg ccg tac gcc ttc tcc ccg cgc gcc ccg ccg      343
Leu Leu Tyr Leu Arg Met Pro Tyr Ala Phe Ser Pro Arg Ala Pro Pro 
90                  95                  100 
cgg ccc aag acc gtc gcc cgc ctc cgc gtc ccg gtc gac gcg ctc ccc      391
Arg Pro Lys Thr Val Ala Arg Leu Arg Val Pro Val Asp Ala Leu Pro 
105                 110                 115 
ccc gac ggg aag ctc ctc gcc tcg ttc agg gca tcg ctc ggg tcg ttc      439
Pro Asp Gly Lys Leu Leu Ala Ser Phe Arg Ala Ser Leu Gly Ser Phe 
120                 125                 130 
ctc gcc ggc cgc cgc cgc cgc ggc cgc ggg ggg aat gtg gcc ggc gtg      487
Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Gly Arg Gly Gly Asn Val Ala Gly Val 
135                 140                 145                 150 
atg cgc gac ctc gcg ggg gtc ctc ggc cgc cgg tac cgg acc tgc gcc      535
Met Arg Asp Leu Ala Gly Val Leu Gly Arg Arg Tyr Arg Thr Cys Ala 
155                 160                 165 
gtg gtc ggg aac agc ggc gtg ctc ctc ggc tcc ggc cgt ggc ccg cag      583
Val Val Gly Asn Ser Gly Val Leu Leu Gly Ser Gly Arg Gly Pro Gln 
170                 175                 180 
atc gac gcg cac gac ctc gtc atc cgc ctc aac aac gcg cgc gtc gcc      631
Ile Asp Ala His Asp Leu Val Ile Arg Leu Asn Asn Ala Arg Val Ala 
185                 190                 195 
ggg ttc gcc gcg gac gtc ggc gtc aag acc tcc ctc tcc ttc gtc aac      679
Gly Phe Ala Ala Asp Val Gly Val Lys Thr Ser Leu Ser Phe Val Asn 
200                 205                 210 
tcc aac atc ctc cac atc tgc gcc gcc cgc aac gcc atc acc cgc gcc      727
Ser Asn Ile Leu His Ile Cys Ala Ala Arg Asn Ala Ile Thr Arg Ala 
215                 220                 225                 230 
gcc tgc ggc tgc cac ccg tac ggc ggc gag gtg ccc atg gcg atg tac      775
Ala Cys Gly Cys His Pro Tyr Gly Gly Glu Val Pro Met Ala Met Tyr 
235                 240                 245 
gtc tgc cag ccc gcc cac ctc ctc gac gcg ctc atc tgc aac gcc acc      823
Val Cys Gln Pro Ala His Leu Leu Asp Ala Leu Ile Cys Asn Ala Thr 
250                 255                 260 
gcc acg ccg tcc tcc ccg ttc ccg ctc ctc gtc acc gac gcg cgc ctc      871
Ala Thr Pro Ser Ser Pro Phe Pro Leu Leu Val Thr Asp Ala Arg Leu 
265                 270                 275 
gac gcg ctg tgc gcg cgc atc gcc aag tac tac tcg ctg agg cgg ttc      919
Asp Ala Leu Cys Ala Arg Ile Ala Lys Tyr Tyr Ser Leu Arg Arg Phe 
280                 285                 290 
gtc tcc gcc acc ggc gag ccg gcg gcg aac tgg acg cgg agg cac gac      967
Val Ser Ala Thr Gly Glu Pro Ala Ala Asn Trp Thr Arg Arg His Asp 
295                 300                 305                 310 
gag agg tac ttc cac tac tcg tcg ggg atg cag gcg gtg gtg atg gcg     1015
Glu Arg Tyr Phe His Tyr Ser Ser Gly Met Gln Ala Val Val Met Ala 
315                 320                 325 
ctc ggc gtc tgc gac gag gtg agc ctc ttc ggc ttc ggc aag tcg ccc     1063
Leu Gly Val Cys Asp Glu Val Ser Leu Phe Gly Phe Gly Lys Ser Pro 
330                 335                 340 
ggc gcc aag cac cat tac cac acc aac cag aag aag gag ctg gac ctg     1111
Gly Ala Lys His His Tyr His Thr Asn Gln Lys Lys Glu Leu Asp Leu 
345                 350                 355 
cac gac tac gag gcg gag tac gac ttc tac ggc gac ctc cag gcg cgg     1159
His Asp Tyr Glu Ala Glu Tyr Asp Phe Tyr Gly Asp Leu Gln Ala Arg 
360                 365                 370 
ccg gcg gcg gtg ccc ttc ctc gac gac gcc cac ggc ttc acc gtg ccg     1207
Pro Ala Ala Val Pro Phe Leu Asp Asp Ala His Gly Phe Thr Val Pro 
375                 380                 385                 390 
ccg gtg agg ttg cac tgg tgacggtgac cccgacgtgg gtgtatgtgt            1255
Pro Val Arg Leu His Trp 
395 
agctgctgct gaattttgtt gtaaaattga aactgatttc atattcgata cgtagaatcc   1315
cattgtaatt tgtaaatcag ggggaatggg aggagatacg gacacaagat gtgtgtcaga   1375
tttgggagct ttgtaaggag aaatgtagct caattttgtt gtgaatttat tcgaaccatt   1435
gcagtgaact tgttgatcat ggaagcgctt attgattgtg                         1475
<210>  4
<211>  396
<212>  PRT
<213>  Rice 
<400>  4
Met Lys Arg Arg His Leu Pro Pro Val Leu Val Leu Leu Leu Leu Ser 
1               5                   10                  15
Ile Leu Ser Leu Ser Phe Arg Arg Arg Leu Leu Val Leu Gln Gly Pro 
20                  25                  30
Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg His Pro Val Gly Asp Pro Leu Leu 
35                  40                  45
Arg Arg Leu Ala Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ser Ser Gln Ile Leu Ala 
50                  55                  60
Glu Ala Ala Ala Leu Phe Ala Asn Ala Ser Ile Ser Thr Phe Pro Ser 
65                  70                  75                  80
Leu Gly Asn His His Arg Leu Leu Tyr Leu Arg Met Pro Tyr Ala Phe 
85                  90                  95
Ser Pro Arg Ala Pro Pro Arg Pro Lys Thr Val Ala Arg Leu Arg Val 
100                 105                 110 
Pro Val Asp Ala Leu Pro Pro Asp Gly Lys Leu Leu Ala Ser Phe Arg 
115                 120                 125 
Ala Ser Leu Gly Ser Phe Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Gly Arg Gly 
130                 135                 140 
Gly Asn Val Ala Gly Val Met Arg Asp Leu Ala Gly Val Leu Gly Arg 
145                 150                 155                 160 
Arg Tyr Arg Thr Cys Ala Val Val Gly Asn Ser Gly Val Leu Leu Gly 
165                 170                 175 
Ser Gly Arg Gly Pro Gln Ile Asp Ala His Asp Leu Val Ile Arg Leu 
180                 185                 190 
Asn Asn Ala Arg Val Ala Gly Phe Ala Ala Asp Val Gly Val Lys Thr 
195                 200                 205 
Ser Leu Ser Phe Val Asn Ser Asn Ile Leu His Ile Cys Ala Ala Arg 
210                 215                 220 
Asn Ala Ile Thr Arg Ala Ala Cys Gly Cys His Pro Tyr Gly Gly Glu 
225                 230                 235                 240 
Val Pro Met Ala Met Tyr Val Cys Gln Pro Ala His Leu Leu Asp Ala 
245                 250                 255 
Leu Ile Cys Asn Ala Thr Ala Thr Pro Ser Ser Pro Phe Pro Leu Leu 
260                 265                 270 
Val Thr Asp Ala Arg Leu Asp Ala Leu Cys Ala Arg Ile Ala Lys Tyr 
275                 280                 285 
Tyr Ser Leu Arg Arg Phe Val Ser Ala Thr Gly Glu Pro Ala Ala Asn 
290                 295                 300 
Trp Thr Arg Arg His Asp Glu Arg Tyr Phe His Tyr Ser Ser Gly Met 
305                 310                 315                 320 
Gln Ala Val Val Met Ala Leu Gly Val Cys Asp Glu Val Ser Leu Phe 
325                 330                 335 
Gly Phe Gly Lys Ser Pro Gly Ala Lys His His Tyr His Thr Asn Gln 
340                 345                 350 
Lys Lys Glu Leu Asp Leu His Asp Tyr Glu Ala Glu Tyr Asp Phe Tyr 
355                 360                 365 
Gly Asp Leu Gln Ala Arg Pro Ala Ala Val Pro Phe Leu Asp Asp Ala 
370                 375                 380 
His Gly Phe Thr Val Pro Pro Val Arg Leu His Trp 
385                 390                 395 
<210>  5
<211>  1346
<212>  DNA
<213>  Rice
<220>
<221>  CDS
<222>  (63)..(1214)
<400>  5
gtgctctctc tcctctgata ctgcagaggc gagctgtgct gggcgggagc ttacttggcg     60
ag atg aag agg agg cat tgg agc cac ccg tcg tgc ggc ctc ctc ctg       107
Met Lys Arg Arg His Trp Ser His Pro Ser Cys Gly Leu Leu Leu
1               5                   10                  15 
ctc gtc gcc gtc ttc tgc ctt ctc ctc gtc ttc cgc tgc tcc cag ctg      155
Leu Val Ala Val Phe Cys Leu Leu Leu Val Phe Arg Cys Ser Gln Leu 
20                  25                  30
cgc cat tcc ggc gat ggc gcc gcg gcc gcc gcg ccg gat ggt ggt gcg      203
Arg His Ser Gly Asp Gly Ala Ala Ala Ala Ala Pro Asp Gly Gly Ala 
35                  40                  45
gga cgg aac gat ggt gat gac gtt gac gag agg ctt gtg gag ctc gcg      251
Gly Arg Asn Asp Gly Asp Asp Val Asp Glu Arg Leu Val Glu Leu Ala 
50                  55                  60
gcc gtg gac ccg gcg gcg atg gcg gtg ctg cag gcg gca aag agg ctg      299
Ala Val Asp Pro Ala Ala Met Ala Val Leu Gln Ala Ala Lys Arg Leu 
65                  70                  75
ctc gaa ggg aac ctg gcg agg gcg ccg gag agg cac cgc gac gtc gcg      347
Leu Glu Gly Asn Leu Ala Arg Ala Pro Glu Arg His Arg Asp Val Ala 
80                  85                  90                  95
ctc cgg ggg ctg agg gag tgg gtc ggc aag cag gag cgg ttc gac ccc      395
Leu Arg Gly Leu Arg Glu Trp Val Gly Lys Gln Glu Arg Phe Asp Pro 
100                 105                 110 
ggc gtg atg tcc gag ctc gtg gaa ctc atc aag cgc ccc atc gat cgg      443
Gly Val Met Ser Glu Leu Val Glu Leu Ile Lys Arg Pro Ile Asp Arg 
115                 120                 125 
tac aac ggc gac ggt ggt ggc ggc ggc gag ggg gag ggc cgg agg tac      491
Tyr Asn Gly Asp Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Glu Gly Arg Arg Tyr 
130                 135                 140 
gcg tct tgc gcg gtg gtc ggg aac agc ggg atc ctg ctg gcg gcg gag      539
Ala Ser Cys Ala Val Val Gly Asn Ser Gly Ile Leu Leu Ala Ala Glu 
145                 150                 155 
cac ggc gag ctc atc gac ggg cac gag ctc gtg gtc cgc ctc aac aac      587
His Gly Glu Leu Ile Asp Gly His Glu Leu Val Val Arg Leu Asn Asn 
160                 165                 170                 175 
gcg ccg gcg ggg gac ggt cgg tac gcg cgc cac gtc ggc gcg agg acc      635
Ala Pro Ala Gly Asp Gly Arg Tyr Ala Arg His Val Gly Ala Arg Thr 
180                 185                 190 
ggc ctc gcg ttc ctc aac agc aac gtg ctg agc cag tgc gcc gtc ccg      683
Gly Leu Ala Phe Leu Asn Ser Asn Val Leu Ser Gln Cys Ala Val Pro 
195                 200                 205 
cgc cgc ggc gcc tgc ttc tgc cgc gcc tac ggc gag ggc gtg ccc atc      731
Arg Arg Gly Ala Cys Phe Cys Arg Ala Tyr Gly Glu Gly Val Pro Ile 
210                 215                 220 
ctg acg tac atg tgc aac gcc gcg cac ttc gtc gag cac gcc gtg tgc      779
Leu Thr Tyr Met Cys Asn Ala Ala His Phe Val Glu His Ala Val Cys 
225                 230                 235 
aac aac gcc tcc tcc tcc tcg tcg ggc gcc gcc gac gcc acc gcg gcg      827
Asn Asn Ala Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala Ala Asp Ala Thr Ala Ala 
240                 245                 250                 255 
gcg ccg gtg atc gtg acg gac ccg agg ctg gac gcg ctg tgc gcg cgg      875
Ala Pro Val Ile Val Thr Asp Pro Arg Leu Asp Ala Leu Cys Ala Arg 
260                 265                 270 
atc gtc aag tac tac tcg ctg cgg cgg ttc gcg cgg gag acg ggg cgg      923
Ile Val Lys Tyr Tyr Ser Leu Arg Arg Phe Ala Arg Glu Thr Gly Arg 
275                 280                 285 
ccg gcg gag gag tgg gcg cgg cgg cac gag gaa ggc atg ttc cac tac      971
Pro Ala Glu Glu Trp Ala Arg Arg His Glu Glu Gly Met Phe His Tyr 
290                 295                 300 
tcg tcg ggg atg cag gcg gtg gtg gcc gcg gcg ggc gtg tgc gac cgc     1019
Ser Ser Gly Met Gln Ala Val Val Ala Ala Ala Gly Val Cys Asp Arg 
305                 310                 315 
gtg tcg gtg ttc ggg ttc ggc aag gac gcg tcg gcg cgg cac cac tac     1067
Val Ser Val Phe Gly Phe Gly Lys Asp Ala Ser Ala Arg His His Tyr 
320                 325                 330                 335 
cac acg ctg caa cgg cgc gag ctg gac ctt cac gac tac gag gcg gag     1115
His Thr Leu Gln Arg Arg Glu Leu Asp Leu His Asp Tyr Glu Ala Glu 
340                 345                 350 
tac gag ttc tac cgt gac ctc gag tcg cgg ccc gag gcg ata ccc ttc     1163
Tyr Glu Phe Tyr Arg Asp Leu Glu Ser Arg Pro Glu Ala Ile Pro Phe 
355                 360                 365 
ctg cgc caa cgc aac tcc ggc ttc cgc ctg ccg ccc gtg tcg ttc tac     1211
Leu Arg Gln Arg Asn Ser Gly Phe Arg Leu Pro Pro Val Ser Phe Tyr 
370                 375                 380 
cgc tgacacgcca cgcacgcaac cccgcaaacg catagcatgc ataaaattct          1264
Arg 
tttttgtaat tagatacgtg ttttagtcat tgcaacaaag cgaagcaaac gtaaacaaca   1324
atccgtgaac atttgggtcg tg                                           1346
<210>  6
<211>  384
<212>  PRT
<213>  Rice 
<400>  6
Met Lys Arg Arg His Trp Ser His Pro Ser Cys Gly Leu Leu Leu Leu 
1               5                   10                  15
Val Ala Val Phe Cys Leu Leu Leu Val Phe Arg Cys Ser Gln Leu Arg 
20                  25                  30
His Ser Gly Asp Gly Ala Ala Ala Ala Ala Pro Asp Gly Gly Ala Gly 
35                  40                  45
Arg Asn Asp Gly Asp Asp Val Asp Glu Arg Leu Val Glu Leu Ala Ala 
50                  55                  60
Val Asp Pro Ala Ala Met Ala Val Leu Gln Ala Ala Lys Arg Leu Leu 
65                  70                  75                  80
Glu Gly Asn Leu Ala Arg Ala Pro Glu Arg His Arg Asp Val Ala Leu 
85                  90                  95
Arg Gly Leu Arg Glu Trp Val Gly Lys Gln Glu Arg Phe Asp Pro Gly 
100                 105                 110 
Val Met Ser Glu Leu Val Glu Leu Ile Lys Arg Pro Ile Asp Arg Tyr 
115                 120                 125 
Asn Gly Asp Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Glu Gly Arg Arg Tyr Ala 
130                 135                 140 
Ser Cys Ala Val Val Gly Asn Ser Gly Ile Leu Leu Ala Ala Glu His 
145                 150                 155                 160 
Gly Glu Leu Ile Asp Gly His Glu Leu Val Val Arg Leu Asn Asn Ala 
165                 170                 175 
Pro Ala Gly Asp Gly Arg Tyr Ala Arg His Val Gly Ala Arg Thr Gly 
180                 185                 190 
Leu Ala Phe Leu Asn Ser Asn Val Leu Ser Gln Cys Ala Val Pro Arg 
195                 200                 205 
Arg Gly Ala Cys Phe Cys Arg Ala Tyr Gly Glu Gly Val Pro Ile Leu 
210                 215                 220 
Thr Tyr Met Cys Asn Ala Ala His Phe Val Glu His Ala Val Cys Asn 
225                 230                 235                 240 
Asn Ala Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala Ala Asp Ala Thr Ala Ala Ala 
245                 250                 255 
Pro Val Ile Val Thr Asp Pro Arg Leu Asp Ala Leu Cys Ala Arg Ile 
260                 265                 270 
Val Lys Tyr Tyr Ser Leu Arg Arg Phe Ala Arg Glu Thr Gly Arg Pro 
275                 280                 285 
Ala Glu Glu Trp Ala Arg Arg His Glu Glu Gly Met Phe His Tyr Ser 
290                 295                 300 
Ser Gly Met Gln Ala Val Val Ala Ala Ala Gly Val Cys Asp Arg Val 
305                 310                 315                 320 
Ser Val Phe Gly Phe Gly Lys Asp Ala Ser Ala Arg His His Tyr His 
325                 330                 335 
Thr Leu Gln Arg Arg Glu Leu Asp Leu His Asp Tyr Glu Ala Glu Tyr 
340                 345                 350 
Glu Phe Tyr Arg Asp Leu Glu Ser Arg Pro Glu Ala Ile Pro Phe Leu 
355                 360                 365 
Arg Gln Arg Asn Ser Gly Phe Arg Leu Pro Pro Val Ser Phe Tyr Arg 
370                 375                 380 
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 7
gcgatgaagc ggccgctgcg gcgcccgttc                30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 8
gtcgaccacc ttgcgcgcac gcgctctaat                30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 9
gggatgaagc gccgccacct cccgcccgtc                30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 10
cacctcgagg tcaccgtcac cagtgcaacc                30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 11
gagatgaaga ggaggcattg gagccacccg                30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 12
cgtcgactgt cagcggtaga acgacacggg                30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 13
tccgaattcc gcaggtcggt gggcccggct                30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 14
gaattccgcc gccgcctcct cgtgctgcag                30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 15
gaattccgct gctcccagct gcgccattcc                30
【図１】
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【図２】
2006238810.tif 000003
【図３】
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【図４】
2006238810.tif 000005
【図５】
2006238810.tif 000006