(57)【要約】【課題】１本鎖のヌクレオチド鎖の３´末端のみならず、２本鎖ヌクレオチドの内の一方のヌクレオチド鎖の３´末端をも選択的に修飾する。【解決手段】修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端側に特定の塩基を含んだヌクレオチド配列を付加し、前記特定の塩基を含んだヌクレオチドに特異的な分解酵素を作用させて、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端に所望の修飾物質に対して結合能を有する官能基を付与し、前記官能基を有したヌクレオチド鎖の３´末端に前記修飾物質を結合させることを特徴とする。ヌクレオチド鎖自体の分解を伴うことなく、また付加するヌクレオチド配列を適宜に選択すれば不必要な塩基配列を取り込むことなく、所望のヌクレオチド鎖を簡便に修飾できる。よって、所望のヌクレオチド鎖を修飾物質でラベル化、標識化すること、また修飾物質をリンカーとして基板等に安定、強固に固定することが可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端側に特定の塩基を含んだヌクレオチド配列を付加し、前記特定の塩基を含んだヌクレオチドに特異的な分解酵素を作用させて、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端に所望の修飾物質に対して結合能を有する官能基を付与し、前記官能基を有したヌクレオチド鎖の３´末端に前記修飾物質を結合させるヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項２】
修飾対象とする１本鎖ヌクレオチドに、当該ヌクレオチド鎖の３´末端領域に相補的な配列を３´末端領域に有するヌクレオチド鎖をアニールし、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端側に特定の塩基を含んだ相補的ヌクレオチド配列を付加する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項３】
少なくとも一方のヌクレオチド鎖を修飾対象とする２本鎖ヌクレオチドを、修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端領域の塩基配列を特異的に認識する制限酵素で切断し、切断した修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端側に特定の塩基を含んだ相補的ヌクレオチド配列を付加する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項４】
２本鎖ヌクレオチドの少なくとも一方である修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端側に、特定の塩基を含んだヌクレオチド配列を５´末端領域に有した２本鎖ヌクレオチドをＤＮＡリガーゼで接合し、接合したヌクレオチド鎖の前記特定の塩基よりも３´末端側の塩基配列を特異的に認識する制限酵素で切断することにより、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端側に特定の塩基を含んだヌクレオチド配列を付加する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項５】
分解酵素としてＤＮＡグリコシダーゼを使用してヌクレオチド鎖の３´末端にアルデヒド基を付与する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項６】
ヌクレオチド配列の付加は、ＤＮＡポリメラーゼを用いてヌクレオチドを取り込むことにより行う請求項２または請求項３のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項７】
修飾物質が、ヌクレオチド鎖の３´末端に付与される官能基と結合を形成するアミノ基を有する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項８】
修飾物質が、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化する物質である請求項１または請求項７のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項９】
修飾物質が、蛍光性物質、ビタミン、脂質、アミノ酸、オリゴペプチド、タンパク質または、生体外因性物質である請求項８記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項１０】
修飾物質が、ヌクレオチド鎖を基板に結合させるために介在させる物質である請求項１または請求項７のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項１１】
修飾物質が、アミノアルカンチオールまたはアミノシランカップリング化合物である請求項１０記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオチド鎖修飾方法に関するものであり、特にヌクレオチド鎖の３´末端を修飾物質で直接的に修飾して、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化、固定化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、遺伝子解析においては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸等のヌクレオチド鎖をラベル化、標識化するための修飾物質として、放射性同位元素が採用されてきたが、半減期による取扱期間の制限、取扱場所の制限、被爆の問題、廃棄の問題等があるため、その利用は減少傾向にある。近年では、放射性同位元素に代替する修飾物質として、フルオレセイン等の蛍光物質あるいはビオチン等を用いて、ヌクレオチド鎖を修飾し、ラベル化、標識化する方法が汎用されるようになっている。ヌクレオチド鎖を修飾する方法は、５´末端修飾法、３´末端修飾法、内部修飾法の３つに大別できる。
【０００３】
５´末端修飾法としては、５´末端のリン酸基を介してビオチンで修飾する方法が考案されている（例えば、非特許文献１参照）。ビオチンについては、ビオチンとアビジンとの高親和性を利用して、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素で修飾し、これら酵素の化学発光を用いて遺伝子解析を高感度化する方法が報告されている（例えば、非特許文献２〜３参照）。ヌクレオチドの５´末端のリン酸基を介した修飾方法は、これら以外にも多数提案されている（例えば、特許文献１及び非特許文献４〜１３参照）。
【０００４】
しかし５´末端のリン酸基を介した修飾方法では、ヌクレオチド鎖への修飾物質の修飾量は基本的に１つなので、高感度化を実現するためのアルカリフォスファターゼの利用は基本的に避ける必要がある。アルカリフォスファターゼはヌクレオチドの５´末端のリン酸基を解離させるからである。アルカリフォスファターゼは、空気中に浮遊する細菌中にも存在しており、遺伝子解析中に夾雑した場合は、５´末端のリン酸基に結合した修飾物質が解離しやすい等、修飾状態に安定性を欠くことになり、バックグランドノイズの要因にもなる。
【０００５】
ヌクレオチドの３´末端修飾法としては、予めラベル化、標識化処理を施したデオキシヌクレオチド三リン酸あるいはジデオキシヌクレオチド三リン酸を合成し（例えば、非特許文献１４及び特許文献２参照）、このラベル化、標識化ヌクレオチドをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりヌクレオチド鎖の３´側に付加させるテーリング法が開発されている（例えば、特許文献３及び非特許文献１５〜１８参照）。このような３´末端修飾法は、５´末端修飾法に比べて修飾物質の保持安定性が高く、汎用されている。
【０００６】
しかしデオキシヌクレオチド三リン酸あるいはジデオキシヌクレオチド三リン酸のラベル化、標識化処理は煩雑であるため、任意のラベル化、標識化処理体は誰にでも容易に得られるものではなく、結果として修飾物質の種類が限定される。またテーリング段階でヌクレオチド鎖の３´側に不要なヌクレオチド配列が付加し、特にデオキシヌクレオチド三リン酸を利用した場合に、反応条件によってヌクレオチドの付加数がランダムになり（例えば、非特許文献１９参照）、遺伝子解析の高感度化は実現できるものの、定量性に課題がある。付加した不要な塩基配列は、遺伝子解析のハイブリダイゼーションの際にミスマッチの要因ともなる。
【０００７】
他の３´末端修飾法として、化学合成ヌクレオチド鎖を形成させる合成初期に、３´末端のヌクレオチドに直接的に、ラベル化、標識化のための修飾物質を結合させる方法もあり、ヌクレオチド鎖への修飾物質の高い保持安定性を実現している。しかし化学合成で得られるヌクレオチド鎖のヌクレオチド数は、合成副産物、収率等の合成能力の関係で１００程度であり、ここで使用されている３´末端への直接的な修飾物質の結合方法を、生体抽出及びＰＣＲ等で増幅したヌクレオチド数１００を超えるヌクレオチド鎖の３´末端修飾に適用することはできない。つまり、修飾されるヌクレオチド鎖の鎖長に制限がある。
【０００８】
内部修飾法としては、ヌクレオチド鎖を複製させる反応の際に、ラベル化、標識化のための修飾物質で予め修飾処理を施したデオキシヌクレオチド三リン酸をヌクレオチド鎖内に取り込ませることで、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化するランダムプライマー法あるいはニックトランスレーション法が開発されている（例えば、特許文献４及び非特許文献２０〜２２参照）。
【０００９】
この修飾方法は、遺伝子増幅反応であるポリメラーゼ連鎖反応、いわゆるＰＣＲ法（例えば、特許文献５〜８及び非特許文献２３〜２５参照）と組み合わせることで、ヌクレオチド鎖の増幅とラベル化、標識化とを同時に行なうことが可能であり（例えば、非特許文献２６参照）、それにより遺伝子解析の高感度化をもたらし、遺伝子マイクロアレイに代表される遺伝子解析のハイスループット化を実現している（例えば、特許文献９及び非特許文献２７〜２９参照）。
【００１０】
しかしＰＣＲ法による修飾物質のヌクレオチド鎖内への取り込みは、取り込み数が１０〜２０あるいは３０程度（例えば、非特許文献３０参照）とランダムであり、完全な定量化には至っていない。また３´末端を修飾するテーリング法と同様に、修飾物質（デオキシヌクレオチド三リン酸の任意のラベル化、標識化処理体）の入手が容易でなく、結果として修飾物質の種類が限定される。さらにヌクレオチド鎖内に修飾物質が取り込まれているため、遺伝子解析のハイブリダイゼーションの際に、つまりヌクレオチド鎖の二本鎖形成の際に、修飾物質による立体障害は避けられない。
【００１１】
一方、ヌクレオチド鎖の修飾は、ラベル化、標識化の他に、ヌクレオチド鎖を基板に固定化するために行なわれている。このための基板は当初、疎水性と正電荷の片方または両方を有するニトロセルロース、ナイロン、フッ化ポリビニリデンよりなるものが利用されていたが、固定化したヌクレオチド鎖が解離してしまうことがあった。近年では、ヌクレオチド鎖に５´末端のリン酸基を介してアミノ基を持たせる修飾処理を施す一方で、ガラス、シリコンなどの基板を用い、その表面がアルデヒド基あるいはエポキシ基になるように予め処理を施すことにより、ヌクレオチド鎖を基板に固定化する方法がとられる。このような方法で配列の異なるヌクレオチド鎖を基板単位面積当たり多数固定化することにより、遺伝子解析マイクロアレイを実現している。
【特許文献１】特許１７０６２８９号
【特許文献２】特開昭６１−１１５０９４号
【特許文献３】特公平７−３１１９４号
【特許文献４】特表２０００−５０８７０９号
【特許文献５】特許１８１４７１３号
【特許文献６】特許２０９３７３０号
【特許文献７】特許２０９３７３１号
【特許文献８】特許２６１３８７７号
【特許文献９】特表平１０−５０３８４１号
【特許文献１０】特願２００２−０４９０５５号
【特許文献１１】特許２１０３１５５号
【特許文献１２】特表２０００−５０２２５１号
【特許文献１３】特開平１１−１１３５９９号
【非特許文献１】チュ（Chu B.C.F）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１１巻、６５１３頁、１９８３年
【非特許文献２】ベック（Beck.S.）、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、２１６巻、１４３頁、１９９２年
【非特許文献３】ブロンシュタイン（Bronstein.I.）ら、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、２１７巻、３９８頁、１９９３年
【非特許文献４】アルブス（Alves.A.M.）ら、「テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）」、３０巻、３０８９頁、１９８９年
【非特許文献５】コクッザ（Cocuzza.A.J.）、「テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）」、３０巻、６２８７頁、１９８９年
【非特許文献６】タイセン（Theisen.P.）ら、「テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett.）」、３３巻、５０３３頁、１９９２年
【非特許文献７】ケンプ（Kempe.T.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１３巻、４５頁、１９８５年
【非特許文献８】スミス（Smith.L.M.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１３巻、２３９９頁、１９８５年
【非特許文献９】アンソージュ（Ansorge.W.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１５巻、４５９３頁、１９８７年
【非特許文献１０】クック（Cook.A.F.）、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１６巻、４０７７頁、１９８８年
【非特許文献１１】ロジェ（Roget.A）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１７巻、１９８９年
【非特許文献１２】ミシウラ（Misiura.K.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１８巻、４３４５頁、１９９０年
【非特許文献１３】ピールス（Pieles.U.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１８巻、４３５５頁、１９９０年
【非特許文献１４】ランガー（Langer.P.R.）ら、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA」、７８巻、６６３３頁、１９８１年
【非特許文献１５】ロイコウドリー（Roychoudhury.R.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、３巻、１０１頁、１９７６年
【非特許文献１６】ビンセント（Vincent.C.）ら、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）」、１０巻、６７８７頁、１９８２年
【非特許文献１７】ヨウサフ（Yousaf.S.I.）ら、「ジーン（Gene）」、３巻、３０９頁、１９８４年
【非特許文献１８】シュミッツ（Schmitz.G.G.）ら、「アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）」、１９２巻、２２２頁、１９９１年
【非特許文献１９】ジャクソン（Jackson.D.A.）ら、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA」、６９巻、２９０５頁、１９７２年
【非特許文献２０】ファインバーグ（Feinberg.A.P）ら、「アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）」、１３２巻、６頁、１９８３年
【非特許文献２１】ファインバーグ（Feinberg.A.P）ら、「アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）」、１３７巻、２６６頁、１９８４年
【非特許文献２２】リグビー（Rigby.P.W.J）ら、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、１１３巻、２３７頁、１９７７年
【非特許文献２３】ミュリス（Mullis.K.B.）ら、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）」、１５５巻、３３５頁、１９８７年
【非特許文献２４】サイキ（Saiki.R.）、「サイエンス（Science）」、２３９巻、４８７頁、１９８８年
【非特許文献２５】シーバート（Siebert.P.D.）ら、「ネイチャー（Nature）」、３５９巻、５５７頁、１９９１年
【非特許文献２６】デイ（Day.P.J.R.）ら、「バイオケミカル・ジャーナル（Biochem.J.）」、２６７巻、１１９頁、１９９０年
【非特許文献２７】シェナ（Schena.M.）ら、「サイエンス（Science）」、２７０巻、４６７頁、１９９５年
【非特許文献２８】シャロン（Schalon.D.）ら、「ゲノム・リサーチ（Genome Res.）」、６巻、６３９頁、１９９６年
【非特許文献２９】核酸マイクロアレイ特集  「ネーチャージェネティックス（Nature Genet.）」、２１巻 Supplement、１月、１９９９年
【非特許文献３０】アマーシャム・バイオサイエンス（Amersham Biosciences）社ウェブサイト（http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/microarrays_labelling%5Cmicroarrays_labelling_cyscribe_postlabelling?OpenDocument&hometitle=microarrays）、2003年4月14日アクセス
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述したように、ヌクレオチド鎖の修飾方法には、５´末端修飾法、３´末端修飾法及び内部修飾法の３種類があるが、それぞれに一長一短があるため、利用者は、利用目的に応じてそれぞれの方法を取捨選択しなければならないという負担がある。
【００１３】
５´末端修飾法として繁用されるホスホロアミダイト法は、反応が完全に進行しないため、未反応物を液体クロマトグラフィー等で分離除去する必要があるなど、操作が繁雑であるうえ、上述の通り修飾物質の安定性に問題がある。
【００１４】
内部修飾法は、ヌクレオチド鎖を当初より蛍光物質等で標識化することに用途が限定される欠点がある。
３´末端修飾法は、必要な状況に応じてヌクレオチド鎖を修飾可能であり、修飾の保持安定性も高く、修飾部位として好適であるものの、３´末端を修飾するためには、予め修飾物質で修飾したヌクレオチドを付加するテーリング法か、あるいは化学合成オリゴヌクレオチドの合成初期に３´末端に修飾物質を直接修飾する方法を採用するしかなく、前者のテーリング法では余分な塩基が付加してしまい、後者の化学合成による方法ではヌクレオチド鎖の鎖長に制限がある。
【００１５】
さらに、これら３種類の修飾方法は、ヌクレオチド鎖が２本鎖の状態で存在する時に、一方のヌクレオチド鎖のみを選択的に修飾するのは困難である。つまり、従来の方法でヌクレオチド鎖をラベル化、標識化する場合、通常は２本鎖の状態で存在しているヌクレオチド鎖の両鎖が同時に修飾されてしまい、どちらか一方のヌクレオチド鎖を選択的に修飾したり、もう一方のヌクレオチド鎖を分離除去することは困難である。そのため、２本鎖の内の一方のヌクレオチド鎖に含まれる遺伝子情報を解析する際に、情報を要さないもう一方のヌクレオチド鎖も解析に供され、擬似結果をまねく要因となっている。
【００１６】
本発明は上記問題を解決するもので、１本鎖のヌクレオチド鎖の３´末端のみならず、２本鎖を形成している一方のヌクレオチド鎖の３´末端をも選択的に簡便に修飾できるヌクレオチド鎖修飾方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題を解決するために、本発明のヌクレオチド鎖修飾方法は、修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端側に特定の塩基を含んだヌクレオチド配列を付加し、前記特定の塩基を含んだヌクレオチドに特異的な分解酵素を作用させて、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端に所望の修飾物質に対して結合能を有する官能基を付与し、前記官能基を有したヌクレオチド鎖の３´末端に前記修飾物質を結合させることを特徴とする。修飾対象のヌクレオチド鎖が１本鎖であるか２本鎖であるかにかかわらず、ヌクレオチド鎖の３´末端に限定して、修飾物質で簡便に修飾することが可能な方法である。付加するヌクレオチド配列を適宜に選択することで、不必要な塩基配列の取り込みも排除される。
【００１８】
詳細には、修飾対象とする１本鎖ヌクレオチドに、当該ヌクレオチド鎖の３´末端領域に相補的な配列を３´末端領域に有するヌクレオチド鎖をアニールするとともに、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端側に特定の塩基を含んだ相補的ヌクレオチド配列を付加することができる。
【００１９】
また、少なくとも一方のヌクレオチド鎖を修飾対象とする２本鎖ヌクレオチドを、修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端領域の塩基配列を特異的に認識する制限酵素で切断し、切断した修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端側に特定の塩基を含んだ相補的ヌクレオチド配列を付加することができる。
【００２０】
また、２本鎖ヌクレオチドの少なくとも一方である修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端側に、特定の塩基を含んだヌクレオチド配列を５´末端領域に有した２本鎖ヌクレオチドをＤＮＡリガーゼで接合し、接合したヌクレオチド鎖の前記特定の塩基よりも３´末端側の塩基配列を特異的に認識する制限酵素で切断することにより、前記修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端側に特定の塩基を含んだヌクレオチド配列を付加することができる。
【００２１】
分解酵素としてＤＮＡグリコシダーゼを使用してヌクレオチド鎖の３´末端にアルデヒド基を付与することができる。
ヌクレオチド配列の付加は、ＤＮＡポリメラーゼを用いてヌクレオチドを取り込むことにより行うことができる。
【００２２】
修飾物質として、ヌクレオチド鎖の３´末端に付与される官能基と結合を形成するアミノ基を有する物質を使用できる。
修飾物質は、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化する物質であってよい。そのような修飾物質として、蛍光性物質、ビタミン、脂質、アミノ酸、オリゴペプチド、タンパク質または、生体外因性物質を好適に使用できる。
【００２３】
また修飾物質は、ヌクレオチド鎖を基板に結合させるために介在させる物質であってよい。そのような修飾物質として、アミノアルカンチオールまたはアミノシランカップリング化合物を好適に使用できる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のヌクレオチド鎖修飾方法によれば、１本鎖ヌクレオチド、および２本鎖ヌクレオチドの内の選択した一方あるいは双方のヌクレオチド鎖の３´末端を、ヌクレオチド鎖の鎖長に関わらず修飾物質で直接に修飾することができる。よって、目的とする遺伝子情報を有したヌクレオチド鎖を限定してラベル化、標識化、固定化することが可能であり、遺伝子解析の擬似結果を防止できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。
（実施形態１）
図１は本発明の実施形態１におけるヌクレオチド鎖修飾方法の原理を示す反応原理図であり、図２は図１のヌクレオチド鎖の反応中心部の化学反応式を示す。
【００２６】
図１および図２において、Ｎ０はアデニン、グアニン、チミン、シトシンの内の任意の塩基を示し、Ｎ１はＮ０と相補的塩基対を形成するアデニン、グアニン、チミン、シトシンの内の任意の塩基を示す。Ｎ２はＮ０とは相補的塩基対を形成しないアデニン、グアニン、チミン、シトシンの内の任意の塩基を示し、Ｎ３はＮ２と相補的塩基対を形成するアデニン、ヒポキサンチン、チミン、シトシンの内の任意の塩基を示す。Ｃはシトシンを示し、Ｈｘはヒポキサンチンを示し、これらＮ０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｃ、Ｈｘはいずれも、２´−デオキシヌクレオチド（以下、単にヌクレオチドという）に含まれている。Ｎ０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３は一部のみ示したもので、個数を限定する意図はない。
【００２７】
また、ｄＩＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰはそれぞれ、２´−デオキシイノシン−５´−三リン酸、２´−デオキシアデノシン−５´−三リン酸、２´−デオキシシチジン−５´−三リン酸、２´−デオキシチミジン−５´−三リン酸を示す。ＮＨ２−Ｒは、アミノ基を有する任意の修飾物質を示す。修飾物質については後述する。
【００２８】
修飾対象のヌクレオチド鎖（２−１：図１中の番号を示す。以下同様）は、塩基Ｎ０の配列を３´末端領域に有している。このヌクレオチド鎖（２−１）に別途のヌクレオチド鎖（２−２）をアニールさせて、２本鎖ヌクレオチドを形成する。ヌクレオチド鎖（２−２）は、ヌクレオチド鎖（２−１）の３´末端領域の塩基Ｎ０と相補的な任意な塩基Ｎ１の配列を３´側に有し、そのすぐ５´側にシトシンＣを有し、続いて塩基Ｎ０とは相補的でない任意の塩基Ｎ２の配列を有していて、アニール後に５´末端領域が突出する。
【００２９】
この部分的２本鎖ヌクレオチドに、ＤＮＡポリメラーゼを触媒として、ｄＩＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを取り込ませることにより、完全な２本鎖ヌクレオチドを形成する。この際に形成されるヌクレオチド鎖（２−３）は、ヌクレオチド鎖（２−１）の３´末端に、ヌクレオチド鎖（２−２）の１本鎖領域に相補的なヌクレオチド配列が付加したものとなり、ヌクレオチド鎖（２−２）のシトシンＣに対応するヒポキサンチンＨｘを有する。
【００３０】
形成された完全２本鎖ヌクレオチドに対して、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシダーゼII型を作用させ、アルカリ熱処理することにより、ヒポキサンチンＨｘを含んだヌクレオチド（デオキシリボース）の１´位の炭素と酸素の間のグリコシド結合を特異的に分解し、これにより形成されるヌクレオチド鎖（２−４）の３´末端にアルデヒド基を付与する。
【００３１】
次いで、アミノ基を有した修飾物質（ＮＨ２−Ｒ）を添加して、それぞれのアルデヒド基とアミノ基とを反応させることにより、シッフ塩基を形成させる。この際に形成されるヌクレオチド鎖（２−５）が目的産物であり、出発物質であるヌクレオチド鎖（２−１）の３´末端に直接に修飾物質が結合したものとなる。
【００３２】
修飾終了後に、不要なヌクレオチド鎖（２−２）を分離除去する。このヌクレオチド鎖（２−２）の除去は、修飾物質が結合した２本鎖ヌクレオチドを熱処理するか、あるいはヌクレオチド鎖（２−２）の５´末端にリン酸基を存在させて、これを特異的に分解するラムダエキソヌクレアーゼを作用させることで、容易に行える。予めヌクレオチド鎖（２−２）の塩基Ｎ１、Ｎ２のグアニンの一部をヒポキサンチンに代えたものとしておくことにより、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシダーゼII型によって小断片化することもできる。
（実施形態２）
図３は、本発明の実施形態２におけるヌクレオチド鎖修飾方法であって、２本鎖ヌクレオチドの内、修飾対象とする一方のヌクレオチド鎖に、上述した３−メチルアデニンＤＮＡグリコシダーゼII型に対する基質となるヒポキサンチンを含んだヌクレオチド配列を付加する方法を示す。
【００３３】
図中、Ｎ０、Ｎ１、Ｎ２、Ｃ、Ｈｘ、５´および３´は前記と同意義であり、Ｎ４はＮ２と相補的塩基対を形成するアデニン、グアニン、チミン、シトシンの内のいずれかの塩基を示し、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンをそれぞれ示す。
【００３４】
２本鎖ヌクレオチドは、第１のヌクレオチド鎖（２−１１）と第２のヌクレオチド鎖（２−１２）とからなり、この内、ヌクレオチド鎖（２−１１）が修飾対象である。ヌクレオチド鎖（２−１１）は３´末端領域に塩基Ｎ０の配列を有し、ヌクレオチド鎖（２−１２）は５´末端領域に塩基Ｎ１の配列を有している。
【００３５】
この２本鎖ヌクレオチドを加熱処理あるいはアルカリ処理して１本鎖に解離させ、解離したヌクレオチド鎖（２−１１）に第３のヌクレオチド鎖（２−１３）をアニールさせて、部分的な２本鎖ヌクレオチドを形成する。第２のヌクレオチド鎖（２−１３）は、ヌクレオチド鎖（２−１１）の３´末端領域の塩基Ｎ０と相補的な任意の塩基Ｎ１の配列を３´側に有し、そのすぐ５´側にシトシンＣを有し、続いて塩基Ｎ０配列とは相補的でない任意の塩基Ｎ２の配列を有していて、アニール後にシトシンＣから５´側が１本鎖になる。
【００３６】
この部分的２本鎖ヌクレオチドに、ＤＮＡポリメラーゼを触媒として、ｄＩＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを取り込ませることにより、完全な２本鎖ヌクレオチドを形成する。この際に形成されるヌクレオチド鎖（２−１４）は、ヌクレオチド鎖（２−１１）の３´末端に、ヌクレオチド鎖（２−２）の１本鎖領域に相補的なヌクレオチド配列を付加したものとなり、ヌクレオチド鎖（２−２）のシトシンＣに対応する位置にヒポキサンチンＨｘを有する。
【００３７】
この完全２本鎖ヌクレオチドに対して、実施形態１と同様の操作を行うことで、ヌクレオチド鎖（２−１１）の３´末端にアルデヒド基を付与し、修飾物質を結合させ、不要なヌクレオチド鎖を除去することができる。
【００３８】
なおここでは一方のヌクレオチド鎖のみを修飾対象とする場合の修飾方法を例示したが、双方のヌクレオチド鎖を修飾対象とする場合も同様にして修飾可能であることは理解されよう。
（実施形態３）
図４は、本発明の実施形態３におけるヌクレオチド鎖修飾方法であって、２本鎖を形成しているヌクレオチド鎖に適当な制限酵素切断部位が存在する場合のヌクレオチド鎖修飾方法を示す。
【００３９】
図中、Ｎ０、Ｎ１、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｈｘは前記と同意義を有し、Ｎ２、Ｎ４はアデニン、グアニン、チミン、シトシン、ヒポキサンチン、ウラシルなどの塩基中から任意に選択した互いに相補的な塩基を示す。
【００４０】
２本鎖ヌクレオチドは、第１のヌクレオチド鎖（２−２１）と第２のヌクレオチド鎖（２−２２）とからなり、この内、ヌクレオチド鎖（２−２１）が修飾対象である。ヌクレオチド鎖（２−２１）の３´末端領域（ヌクレオチド鎖（２−２２）の５´末端領域）には、制限酵素ＢａｍＨＩが認識して切断する塩基配列（ＧＧＡＴＣＣ／ＣＣＴＡＧＧ）が存在している。
【００４１】
まず、２本鎖ヌクレオチドをＢａｍＨＩにより切断して、Ｎ０の３´側にＧのみが存在するヌクレオチド（２−２３）と、Ｎ１の５´側にＣＣＴＡＧが存在するヌクレオチド（２−２４）とからなる、部分的２本鎖ヌクレオチドを形成する。
【００４２】
この部分的２本鎖ヌクレオチドに、ＤＮＡポリメラーゼを触媒として、ｄＩＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを取り込ませることにより、完全な２本鎖ヌクレオチドを形成する。これにより形成されるヌクレオチド鎖（２−２５）は、ヌクレオチド鎖（２−２３）の３´末端に、ヌクレオチド鎖（２−２４）の１本鎖領域に相補的なヌクレオチド配列を付加したものとなり、ヌクレオチド鎖（２−２４）のシトシンＣに対応する位置にヒポキサンチンＨｘを有する。
【００４３】
この完全２本鎖ヌクレオチドに対して、実施形態１と同様の操作を行うことで、ヌクレオチド鎖（２−２１）の３´末端に１ヌクレオチドのみを付加してアルデヒド基を付与し、修飾物質を結合させ、不要なヌクレオチド鎖を除去することができる。
（実施形態４）
図５は、本発明の実施形態４におけるヌクレオチド鎖修飾方法であって、予めヒポキサンチンを塩基配列に取り込んだ２本鎖ヌクレオチドを接合する方法を示す。
【００４４】
図中、Ｎ０、Ｎ１、Ｃ、Ｈｘは前記と同意義を有し、Ｎ２、Ｎ４はアデニン、グアニン、チミン、シトシン、ヒポキサンチン、ウラシルなどの塩基中から任意に選択した互いに相補的な塩基を示す。
【００４５】
２本鎖ヌクレオチドは、第１のヌクレオチド鎖（２−３１）と第２のヌクレオチド鎖（２−３２）とからなり、この内、ヌクレオチド鎖（２−３１）が修飾対象である。ヌクレオチド鎖（２−３１）は、３´末端領域に塩基Ｎ０の配列を有し、ヌクレオチド鎖（２−３２）は、ヌクレオチド鎖（２−３１）の３´末端領域と相補的塩基対を形成する塩基Ｎ１の配列を５´側に有している。
【００４６】
この２本鎖ヌクレオチドに、ＤＮＡリガーゼを触媒にして別途の２本鎖ヌクレオチドを接合する。この別途の２本鎖ヌクレオチドは、ヒポキサンチンＨｘの両側に塩基Ｎ４の配列を有したヌクレオチド鎖（２−３３）と、シトシンＣの両側に、塩基Ｎ４に相補的な塩基Ｎ２の配列を有したヌクレオチド鎖（２−３４）とからなるものを用い、修飾対象のヌクレオチド鎖（２−３１）の３´側にヌクレオチド鎖（２−３３）が配置されるように接合する。これにより、ヌクレオチド鎖（２−３５）（ヌクレオチド鎖（２−３１）とヌクレオチド鎖（２−３３））と、ヌクレオチド鎖（２−３６）（ヌクレオチド鎖（２−３１）とヌクレオチド鎖（２−３３））とからなる２本鎖ヌクレオチドが形成される。
【００４７】
この完全２本鎖ヌクレオチドに対して、実施形態１と同様の操作を行うことで、ヌクレオチド鎖（２−３１）のＮ０配列の近傍の３´末端にアルデヒド基を付与し、修飾物質を結合させ、不要なヌクレオチド鎖を除去することができる。
【００４８】
なお、この実施形態４では、ヒポキサンチンＨｘの位置から５´側（およびシトシンＣの位置から３´側）に、３塩基対（Ｎ２−Ｎ４）に相応するヌクレオチド配列を持たせているが、この部分のヌクレオチド配列は省略することも可能である。
【００４９】
ただし、接合箇所に制限酵素による認識配列を形成すると、ＤＮＡリガーゼによる接合反応の効率が高くなるため、ヒポキサンチンＨｘの位置から５´側（およびシトシンＣの位置から３´側）に３〜４塩基対に相応するヌクレオチド配列を持たせておくのが好ましい。
【００５０】
例えば、ヌクレオチド鎖（２−３１）の３´末端の塩基Ｎ０の配列とヌクレオチド鎖（２−３２）の５´末端の塩基Ｎ１の配列とが配列（Ｉ）である場合に、ヌクレオチド鎖（２−３３）におけるヒポキサンチンＨｘの位置から５´側と、ヌクレオチド鎖（２−３４）におけるシトシンＣの位置から３´側とに配列（II）を持たせておくと、接合箇所に配列（III）が形成され、この配列（III）は制限酵素ＨｉｎｃIIが認識切断する配列であるため、リガーゼ反応が効率的に進行する。
【００５１】
【化１】
2006006179.tif 000002
【００５２】
接合する２組の２本鎖ヌクレオチドの末端は、上記したヌクレオチド鎖のような平滑末端であってもよいし、ＢａｍＨＩによる切断部位のような、一方のヌクレオチド鎖が突出した突出末端であってもよい。
【００５３】
このような制限酵素による切断とＤＮＡリガーゼによる接合は、従来より遺伝子のベクター等への組み込みに利用されている。本発明方法を併用することで、遺伝子（ヌクレオチド鎖）のベクター等への組み込みと修飾物質による修飾とを、同一の反応条件下で実現可能となり、わずかな検体からＰＣＲ法等により増幅した貴重なヌクレオチド鎖試料を、無駄に使用することなく有効に活用可能となる。例えば、遺伝子発現ベクターであるｐＥＴ系ベクター（Studier,F.ら、Methods Enzymol、185巻、60頁）はその遺伝子挿入部位にＢａｍＨＩサイトを有しているため、実施形態３に示す方法を適用することにより、ヌクレオチド鎖の修飾とベクターへの組み込みが同時に実現可能となる。
【００５４】
修飾対象のヌクレオチド鎖の鎖長は少なくとも３以上であればよいが、遺伝子解析の用途にはヌクレオチド鎖の配列を規定する必要があり、そのためにはヌクレオチド鎖の鎖長は少なくとも１０以上であるのが望ましい。
【００５５】
ヒポキサンチンＨｘよりも３´側に配置されるヌクレオチド配列は、実施形態１および実施形態２の方法を使用する場合は、少なくとも１塩基対に相応する鎖長であればよいが、実施形態３および実施形態４の方法を使用する場合は、２〜４塩基対以上の鎖長であるのが望ましい。制限酵素やリガーゼを十分に作用させるには、各酵素が認識する配列領域よりも幾分に長い鎖長が必要なためである。
【００５６】
上記した各実施形態では、ヒポキサンチンＨｘを含んだヌクレオチド配列を付加すること、またヒポキサンチンＨｘを含んだヌクレオチドを基質とする３−メチルアデニンＤＮＡグリコシダーゼII型を作用させることを例示したが、これに限定されない。たとえば、以下の表１に掲載した塩基を３´末端領域に含んだヌクレオチドとＤＮＡグリコシダーゼとの組み合わせでも、同様にしてヌクレオチド鎖の３´末端を所望の修飾物質で修飾可能である。
【００５７】
【表１】
2006006179.tif 000003
【００５８】
【表２】
2006006179.tif 000004
【００５９】
ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化するための修飾物質は、ヌクレオチド鎖の３´末端に付与される官能基に対する結合能を有していればよい。たとえば、蛍光性物質であるフルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、Ｃｙ３・Ｃｙ５に代表されるシアニン化合物、あるいは、非蛍光物質であるビオチン、ジゴキシゲニン等は、アミノ基を末端に形成することで、修飾物質として使用することができる。これらの修飾物質でラベル化（標識化）したヌクレオチド鎖をハイブリダイゼーションなどの遺伝子解析のためのプローブあるいはターゲットとして利用可能となる。
【００６０】
アミノ酸、ペプチド、タンパク質も修飾物質として使用可能である。アミノ酸の内、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンは蛍光性を有するため、ラベル化、標識化に使用できる。蛍光性を有しないアミノ酸やペプチドも、側鎖にフルオレセイン等（以下、標識化合物）を結合させることで、ラベル化、標識化に使用可能である。
【００６１】
アミノ酸が連鎖したペプチドは、その数に応じた側鎖が存在するため、複数の標識化合物を結合させることが可能となる。たとえば、トリリシンには側鎖にアミノ基が３つ存在するため、カルボキシル基、スクシンイミド基等を有する標識化合物を任意に合計３つまで結合させることが可能となる。
【００６２】
ペプチドに限らず、アミノ基を有するアルキル、アリル、シクロアルカン、芳香族、糖類等の炭化水素類を標識化合物で修飾した物質を修飾物質として用いて、ヌクレオチド鎖を修飾することも可能であり、ヌクレオチド鎖のラベル化、標識化を実現できる。
【００６３】
またたとえば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、有色性、蛍光性を有するトランスフェリン、ヘモグロビン、緑色蛍光タンパク、青色蛍光タンパク、エクオリン等のタンパク質を修飾物質として用いて、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化することも可能であり、遺伝子解析、とりわけイン・サイチューでのハイブリダイゼーションに有用である。
【００６４】
その他、表面にアミノ基を形成させた金コロイド、銀コロイド等の貴金属コロイド、磁性微粒子、ポリスチレンビーズ等の高分子微粒子に代表される微粒子なども、ヌクレオチド鎖の修飾物質として使用可能である。
【００６５】
ヌクレオチド鎖を貴金属に固定化したい場合は、修飾物質として、アルカンチオールと総称されるチオール化合物の内でアミノ基を有する化合物を採用可能である。修飾物質を介してヌクレオチド鎖を貴金属に固定化できるため、貴金属を基板として利用する電気化学的測定法、水晶発振子マイクロバランス法、表面プラズモン共鳴法等の測定法を、遺伝子解析に利用することが可能となる。
【００６６】
アルカンチオールは、貴金属と結合するチオール基とアミノ基とが存在すれば、構造等に特に限定なく使用することができる。アミノ基・チオール基間の炭化水素残基は、直鎖状、分岐鎖状、シクロ環状、アリル鎖状、芳香環状等、種々の形態であってよく、その炭素数、アミノ基の位置等も、種々可能である。
【００６７】
基板水晶発振子マイクロバランス法、表面プラズモン共鳴法等では、金の基板を汎用するが、測定法等に応じて、白金、銀、銅、パラジウム、インジウム、ニッケル、鉄、アルミニウム、及びそれらの合金等も基板として使用可能である。
【００６８】
修飾物質として、アミノ基を有するシランカップリング化合物を使用してもよく、それにより、ガラス、シリコン、シリカ、アルミナ、マイカ、及びポリスチレン、ナイロン、エポキシ等の高分子樹脂等の基板にヌクレオチド鎖を固定化することが可能となり、従来からの様々な遺伝子解析手法にも適用可能となる。
【００６９】
シランカップリング化合物は、アミノ基とアルコキシ基とを有する化合物であれば、アルカンチオールと同様に、構造等に特に制限なく使用可能である。使用可能なシランカップリング化合物はたとえば、ガンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−ベータ（アミノエチル）−ガンマ−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−ベータ（アミノエチル）−ガンマ−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−ベータ（アミノエチル）−ガンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン、ガンマ−アミノプロピルトリメトキシシラン等である。
【００７０】
本来はアミノ基を有しない物質も、アミノ基を有する適当なスペーサーを介することで、ヌクレオチド鎖を修飾可能である。たとえばカルボキシル基を有する物質は、スペーサーとして、１，２−ジアミノエタン、１，６−ジアミノヘキサン等のジアミノ構造を有する物質を介在させることで、ヌクレオチド鎖を修飾可能となる。
【００７１】
さらには、ヒドラジン基、アミノオキシル基、シアノ基を有する物質、あるいはＧｒｉｇｎａｒｄ試薬の様にハロゲン化マグネシウムを有する物質も、修飾物質として使用可能である。
【００７２】
以下、具体的な実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
（実施例１）
修飾対象のヌクレオチド鎖として、ヒトの骨格筋ミオシン重鎖１のｃＤＮＡ配列５８３１〜５８５０位（米国国立バイオテクノロジーインフォメーションセンターのＧｅｎＢａｎｋ、インターネットウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）、アクセッション番号：NM_005963、2004年2月現在）に相応するヌクレオチド数２０の一本鎖デオキシヌクレオチド鎖（Sigma-Genosys社にて委託合成）を用いた。このヌクレオチド鎖に相補的なヌクレオチド鎖として、ヌクレオチド数２９の一本鎖デオキシヌクレオチド鎖（Sigma-Genosys社にて委託合成）を用いた。修飾物質として、アミノオキシメチルカルボニルヒドラゾン−Ｃｙ５を用いた。各ヌクレオチド鎖は下記の塩基配列を有している。
【００７３】
被修飾ヌクレオチド鎖
ＴＧＣＴＧＡＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡ（配列１）
相補的ヌクレオチド鎖
ＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＴＣＡＧＣＡ（配列２）
（ステップ１）
被修飾ヌクレオチド鎖（以下、ＭＹＨ１と記す）と相補的ヌクレオチド鎖（以下、ＭＹＨ１-ＢａｍＨＩと記す）とを、最終濃度がそれぞれ１０μＭ、２０μＭになるように、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）の緩衝液に懸濁し（総量１００μｌ）、６５℃で１０分加温した後、３０分以上かけて室温まで冷却することにより、ｃＭＹＨ１-ＢａｍＨＩの５´領域（ＣＴＴＴＣＡＧＣＡ）が突出した２本鎖を形成した。
（ステップ２）
形成された２本鎖ヌクレオチドをエタノール沈殿により回収し、１０ｍＭ  ｄＩＴＰ、１０ｍＭ  ｄＡＴＰ、１０ｍＭ  ｄＴＴＰ、１０ｍＭ  ｄＣＴＰ、５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム、４０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）の溶液に入れ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ改変酵素シーケネースｖｅｒ．２．０（ＵＳＢ社）を最終濃度０．５ｕ／μｌになるよう添加し（総量１００μｌ）、３７℃で４時間反応させることにより、ＭＹＨ１の３´末端に、ＭＹＨ１-ＢａｍＨＩに相補的なヒポキサンチンを含んだヌクレオチド配列を付加して、完全な２９塩基対の２本鎖ヌクレオチドを形成した。この際に形成されるＭＹＨ１は（配列１）−ＨｘＨｘＡＴＣＣＨｘＡＴで表わされる。
（ステップ３）
形成された２本鎖ヌクレオチドをエタノール沈殿により回収し、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１ｍＭエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸、１ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸−水酸化カリウム（ｐＨ７．４）の溶液に入れ、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシダーゼII型（Trevigen社）を最終濃度０．２ｕ／μｌになるように添加し（総量１００μｌ）、３７℃で一昼夜反応させることにより、ヒポキサンチンを持ったデオキシリボースのグリコシド結合部分を加水分解して、ＭＹＨ１の３´末端にアルデヒド基を付与した。このＭＹＨ１は（配列１）−ＣＨＯで表わされる。
（ステップ４）
ＭＹＨ１の末端にアルデヒド基を持った２本鎖ヌクレオチドを、５０ｍＭ  ４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．２）の溶液に入れ、修飾物質としてのアミノオキシメチルカルボニルヒドラゾン−Ｃｙ５を最終濃度２４０μＭになるよう添加し（総量１００μｌ）、室温で一昼夜反応させることにより、ＭＹＨ１の３´末端のアルデヒド基とＣｙ５のアミンとの間でシッフ塩基を形成させた。このＭＹＨ１は（配列１）−ＣＨＨＮＯＣＨＮＨＮＨ−Ｃｙ５で表わされる。
【００７４】
各ステップのヌクレオチド鎖を１６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（９０ｍＭトリス−ホウ酸・２ｍＭエチレンジアミン四酢酸緩衝液）で追跡した結果を図６に示す。ヌクレオチド鎖は、ＳＹＢＲＧｏｌｄ（Molecular Probes社）により染色した。図中のＭは分子量マーカーを示し、２０ｂｐ、３０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐはそれぞれ、２本鎖ヌクレオチドの２０塩基対、３０塩基対、５０塩基対、１００塩基対の泳動位置を示している。
【００７５】
レーン１のバンドは被修飾ヌクレオチド鎖（ＭＹＨ１）を示し；レーン２のバンドは相補的ヌクレオチド鎖（ＭＹＨ１-ＢａｍＨＩ）を示し；レーン３において３０塩基対程度の位置に出現したバンドは、ステップ１で形成された部分的２本鎖ヌクレオチドを示し；レーン４における、レーン３に比べて移動度が若干遅いバンドは、ステップ２で形成された２９塩基対の完全２本鎖ヌクレオチドを示し；レーン５における、レーン４に比べて移動度が若干速いバンドは、アルデヒド基がＭＹＨ１に付与された２本鎖ヌクレオチドを示し；レーン６におけるバンドは、修飾物質でＭＹＨ１が修飾された２本鎖ヌクレオチドを示す。
【００７６】
レーン５とレーン６との間には移動度の有意な差は認められないが、電気泳動後の各レーンの２本鎖ヌクレオチドをＳｏｕｔｈｅｒｎの方法（J.Mol.Biol.、98巻、503頁、1975年）でナイロン膜（Schleicher ＆ Schuell 社）に転写し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識した抗シアニン抗体（Rockland社）を利用して、ルミノール反応による化学発光の有無をフィルム（商品名HyperfilmECL、Amersham Biosciences社）で調べたところ、フィルムの露光はレーン６の２本鎖ヌクレオチドによってのみ起こった（レーン６´）。この結果は、レーン６の２本鎖ヌクレオチドに、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識した抗シアニン抗体が結合していること、つまり、前記抗体が結合可能なアミノオキシメチルカルボニルヒドラゾン−Ｃｙ５がＭＹＨ１に結合していることを示す。
【００７７】
修飾物質であるアミノオキシメチルカルボニルヒドラゾン−Ｃｙ５（シアニン系色素）は、Ｃｙ５−ヒドラジン（Amersham Biosciences社）を出発物質として、イデら（Ide et al.、Biochemistry、32巻、8276頁、1993年）及びグルーバーら（Gruber et al.、Bioconjugate Chemistry、11巻、161頁、2000年）の方法に準じて、以下のようにして合成し、精製した。
【００７８】
【化２】
2006006179.tif 000005
【００７９】
１ｍＭ  Ｃｙ５−ヒドラジンと３ｍＭ  第三ブトキシカルボニルアミノオキシ酢酸（ｔ−Ｂｏｃ−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２ＣＯＯＨ）（Fluka社）とを、３ｍＭ  Ｎ，Ｎ´−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）と３ｍＭ  １−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾチアゾール（ＨＯＢｔ）との存在下（総量３００μｌ）、４℃で一昼夜反応させて縮合させ、この反応混合物を濃縮した後、５０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（２０００μｌ）を添加し、室温で１時間反応させることにより、縮合物の第三ブトキシカルボニル基（ｔ−Ｂｏｃ）を切断し、最後に反応物混合物を５％Ｎ，Ｎ´−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）で中和し、Ｃ１８シリカゲルカラムにて精製することにより、目的の化合物を得た。収率１３．４％。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明のヌクレオチド鎖修飾方法は、修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端を、ヌクレオチド鎖が１本鎖であるか２本鎖であるかに関わらず、任意の修飾物質で、定量的、安定的に修飾することが可能であり、ヌクレオチド鎖のラベル化、標識化、固定化等を要する遺伝子解析などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】本発明の実施形態１におけるヌクレオチド鎖修飾方法の原理を示す反応原理図
【図２】図１における反応中心部を化学式で示した反応原理図
【図３】本発明の実施形態２におけるヌクレオチド鎖修飾方法の原理を示す反応原理図
【図４】本発明の実施形態３におけるヌクレオチド鎖修飾方法の原理を示す反応原理図
【図５】本発明の実施形態４におけるヌクレオチド鎖修飾方法の原理を示す反応原理図
【図６】図１のヌクレオチド鎖修飾方法における各段階のヌクレオチド鎖の状態を示す電気泳動図およびフィルム露光図
【図１】
2006006179.tif 000006
【図２】
2006006179.tif 000007
【図３】
2006006179.tif 000008
【図４】
2006006179.tif 000009
【図５】
2006006179.tif 000010
【図６】
2006006179.tif 000011
【配列表】
2006006179000001.app