(57)【要約】【課題】機能性オリゴ糖として期待されるセロオリゴ糖を、セルロースまたはセルロース含有物質を基質に用いて、副生物であるグルコースの生成量を抑えながら、安価かつ容易に効率よく製造する方法を提供する。【解決手段】セルロースまたはセルロース含有物質にセルラーゼを反応させセロオリゴ糖を生成させる反応系において、反応系内に基質としてセルロースまたはセルロース含有物質および水性媒体を連続添加または逐次添加する一方、連続的または逐次的に反応系外にセロオリゴ糖を含む反応糖化液を抜き出すことを特徴とするセロオリゴ糖の製造方法。また、反応系内に反応初期段階および／または反応途中に添加するセルロースまたはセルロース含有物質に対し、セルラーゼに含まれる酵素成分のうちβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分を予め吸着させることを特徴とする前記製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースまたはセルロース含有物質にセルラーゼを反応させセロオリゴ糖を生成させる反応系において、反応系内にセルロースまたはセルロース含有物質および水性媒体を連続添加または逐次添加する一方、連続的または逐次的に反応系外に反応液を抜き出すことを特徴とするセロオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
反応系外に抜き出された反応液を、反応糖化液とセルロースまたはセルロース含有物質とに分離した後、分離したセルロースまたはセルロース含有物質を反応系内に戻すことを特徴とする請求項１記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【請求項３】
反応系内に反応初期段階および／または反応途中に添加するセルロースまたはセルロース含有物質に対し、セルラーゼに含まれる酵素成分のうちβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分を予め吸着させることを特徴とする請求項１または２記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
セルロースまたはセルロース含有物質に対し、セルラーゼに含まれる酵素成分のうちβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分を予め吸着させるにあたり、ｐＨ  ５．０〜１０．０かつスラリー濃度  １〜１０重量％に調整したセルローススラリーに対し、セルラーゼを対セルロース  ５〜３００重量％添加して処理することを特徴とする請求項３記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【請求項５】
反応系内のセルロース濃度を１重量％以上に保つことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【請求項６】
セルロースまたはセルロース含有物質として、フィブリル化処理、メカノケミカル処理、および化学的処理のうち、一つ以上の処理を施したパルプを用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一つに記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
セルロースまたはセルロース含有物質にセルラーゼを作用させ、セロオリゴ糖を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、健康志向の高まりから、ビフィズス活性等の機能性を有するオリゴ糖の提供が望まれている。本発明により製造されるセロオリゴ糖の主成分であるセロビオースは、グルコースが二個、β−１,４結合した二糖類であり、セルロースの構成オリゴ糖として知られている。セロビオースは、食品として長く用いられているセルロースの酵素分解物であり、かつ、トウモロコシの茎にも存在している天然物であるため、安全性には全く問題がない。また、人間の胃や小腸では全く分解されず、大腸に至り、大腸内で酪酸菌をはじめとする短鎖脂肪酸生成菌に選択的に資化され、短鎖脂肪酸が生成されることが知られている。近年、短鎖脂肪酸の各種生理機能が注目されている。
【０００３】
セロビオースをはじめとするセロオリゴ糖は、自然界に大量に生産されるバイオマスであるセルロースの構成成分でありながら、これまで工業的に生産されるに至っていない。ひとつの原因は、一般にセルラーゼは複合酵素系であり、セルロースに作用してセロオリゴ糖を生成する酵素（主にエンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼ）と、生成したセロビオースをグルコースに分解する酵素（β−グルコシダーゼ）から成っており、このβ−グルコシダーゼが存在することによりセロオリゴ糖の収率が著しく低下することが挙げられる。二つ目の原因は、基質であるセルロースが不溶性かつ結晶領域といわれる酵素に対し抵抗性が高い領域が存在することで、酵素反応が効率的に進みづらくなるとともに、生成したセロビオースがフィードバック阻害により、セルラーゼによるセルロース分解反応を阻害するなど、種々の困難な課題が存在しているためである。
そのような中、これまで上記の課題を克服するため、多くの試みがなされてきた。先ず、セルラーゼに含まれるβ−グルコシダーゼの影響を排除しようとする試みを以下に示す。
【０００４】
セルラーゼをｐＨ３．５〜ｐＨ５．０に平衡化した弱酸性陽イオン交換樹脂に吸着させることにより、セルラーゼ中に存在するβ−グルコシダーゼを除去したセルラーゼを用い、セルロースからセロビオースを選択的に生成せしめる方法（特許文献１）、セルラーゼによるセルロースの分解の際に、β−グルコシダーゼの阻害剤たるδ−グルコノラクトン又はグルコン酸を共存せしめ、セロビオースを製造する方法（特許文献２）、セルラーゼによるセルロースの分解の際に、グルコースオキシダーゼを共存させ、生成したグルコースからδ−グルコノラクトンを生成せしめ、結果的にβ−グルコシダーゼ活性を抑制しようとする方法（特許文献３）、不溶性セルロースにセルラーゼを３０〜６０℃の水溶性媒体中で１〜４時間保温した後、分解糖化反応完了前に水溶性媒体中の固形分を分離し、新たに基質を加えることなく、該固形分に水溶性溶液を加え、一定時間加温し該水溶液に生成したセロビオースを採取する方法（特許文献４）等が挙げられる。
【０００５】
しかし、これらの方法ではβ−グルコシダーゼの除去に費用と労力がかかるため、実用的とはいえず、δ−グルコノラクトンを共存させる方法では生成物であるセロビオースとの分離が煩雑であること、δ−グルコノラクトンが高価であることなどから、実用化は困難であった。また、セルロースに酵素を吸着させる方法では、はじめに加えたセルロース分のみからしかセロビオースが生成されず、収率が悪く、連続的な工業生産が出来ないという課題があった。
【０００６】
一方、β−グルコシダーゼの影響を排除するには、当該酵素を阻害するほかに、生成したセロビオースを反応系外に抜き出す方法も検討されている。
例として、セルロースとセルラーゼとを共存させた反応槽と限外濾過膜を組み合わせ、生成したセロビオースのみを選択的に取り出す方法（非特許文献１）等が挙げられる。
しかし、限外濾過膜を用いて、セロビオースを採取する方法では、装置が複雑になること、セルロース分解物により、限外濾過膜が閉塞するなどの課題があった。
【０００７】
なお、基質であるセルロースに対する酵素反応性の向上に関しては、乾燥工程を経ていないスラッシュパルプを原料に使用する方法（特許文献５）、セルロースに前処理を施し、結晶化度および保水度をある特定値内に調整した原料を使用する方法（特許文献６）等が挙げられる。
【０００８】
【特許文献１】特開平５−１１５２９３号公報
【特許文献２】特開平４−７５５９４号公報
【特許文献３】特開平８−３３４９６号公報
【特許文献４】特公平６−８３６７４号公報
【特許文献５】特公平８−２３１２号公報
【特許文献６】特開２００５−６８１４０号公報
【非特許文献１】Ｎｉｐｐｏｎ  Ｎｏｕｇｅｉｋａｇａｋｕ  Ｋａｉｓｈｉ（Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．６，１９８９  ｐ１１３３〜１１３５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、セルロースまたはセルロース含有物質から機能性オリゴ糖として期待されるセロオリゴ糖を製造する際に、副生物であるグルコースの生成量を抑えるとともに、安価かつ容易に、効率的にセロオリゴ糖の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、これらの課題を解決すべく鋭意検討した結果、セルラーゼと基質であるセルロースまたはセルロース含有物質を共存させた反応槽に、基質であるセルロースまたはセルロース含有物質および水性媒体を連続添加または逐次添加する一方、反応糖化液を連続的または逐次的に抜き出すことにより、セロオリゴ糖を効率的に製造出来ることを見出し、本発明を完成させるに至った。また、反応基質として、セルラーゼに含まれる酵素成分中、セロオリゴ糖の生産に必要な酵素成分のみを予め吸着させたセルロースまたはセルロース含有物質を用いることで、セロオリゴ糖を効率的に製造出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、以下の〔１〕から〔６〕を提供するものである。
〔１〕  セルロースまたはセルロース含有物質にセルラーゼを反応させセロオリゴ糖を生成させる反応系において、反応系内にセルロースまたはセルロース含有物質および水性媒体を連続添加または逐次添加する一方、連続的または逐次的に反応系外に反応液を抜き出すことを特徴とするセロオリゴ糖の製造方法。
〔２〕  反応系外に抜き出された反応液を、反応糖化液とセルロースまたはセルロース含有物質とに分離した後、分離したセルロースまたはセルロース含有物質を反応系内に戻すことを特徴とする前記〔１〕記載のセロオリゴ糖の製造方法。
〔３〕  反応系内に反応初期段階および／または反応途中に添加するセルロースまたはセルロース含有物質に対し、セルラーゼに含まれる酵素成分のうちβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分を予め吸着させることを特徴とする前記〔１〕または〔２〕記載のセロオリゴ糖の製造方法。
〔４〕  セルロースまたはセルロース含有物質に対し、セルラーゼに含まれる酵素成分のうちβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分を予め吸着させるにあたり、ｐＨ  ５．０〜１０．０かつスラリー濃度  １〜１０重量％に調整したセルローススラリーに対し、セルラーゼを対セルロース  ５〜３００重量％添加して処理することを特徴とする前記〔３〕記載のセロオリゴ糖の製造方法。
〔５〕  反応系内のセルロース濃度を１重量％以上に保つことを特徴とする前記〔１〕〜〔４〕のいずれか一つに記載のセロオリゴ糖の製造方法。
〔６〕  セルロースまたはセルロース含有物質として、フィブリル化処理、メカノケミカル処理、および化学的処理のうち、一つ以上の処理を施したパルプを用いることを特徴とする前記〔１〕〜〔５〕のいずれか一つに記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、セルロースまたはセルロース含有物質からセロオリゴ糖を製造する際に、セルラーゼに含まれるβ−グルコシダーゼ活性の阻害処理をすることなく、グルコースの生成量を抑え、効率的にセロオリゴ糖を製造することが出来る。さらに、反応系から抜き出す反応液中には、β-グルコシダーゼ以外のセルラーゼに含まれる酵素成分は、ほとんど含まれていないため、限外濾過膜で酵素のみを分離回収する必要はなく、安価かつ容易にセロオリゴ糖を製造することが出来る。また、反応系内において目詰まり等の閉塞を生じやすい限外濾過膜を用いる必要がないため、工業的にも連続して効率的にセロオリゴ糖を製造することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明に用いるセルラーゼは、セルロースをセロオリゴ糖（２〜１０数個のＤ−グルコピラノースがβ−１，４結合で連なった多糖）に分解するものであればよく、その起源は限定されることはなく、糸状菌、担子菌、細菌類等のセルラーゼを用いることができる。あえて例示するならば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｉｒｐｅｘ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属などの各種の起源のものおよび／または遺伝子組み換えにより製造したものを単独若しくは二種以上を混合して用いることも出来る。また、酵素源としては、一般に市販されているセルラーゼ製剤や上記菌の培養物やその濾過液を直接使用することも出来る。なお、その中でも、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ（トリコデルマ）属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（アスペルギルス）属由来のセルラーゼなどのようなセルロース分解力の強力なセルラーゼが好ましい。
【００１４】
市販の酵素としては、メイセラーゼ（明治製菓（株）製）、セルクラスト（ノボザイムズ（株）製）、セルラーゼアマノＡ（天野エンザイム（株）製）、セルラーゼアマノＴ（天野エンザイム（株）製）、セルラーゼ  ダイワ（大和化成（株）製）、セルライザー（ナガセ生化学工業（株）製）、ドリセラーゼ（協和発酵（株）製）、セルロシン（阪急バイオインダストリー（株）製）などを用いることが出来る。
【００１５】
基質として用いるセルロースまたはセルロース含有物質（以下、単に基質と言うことがある）とは、セルロースそのもの、またはその構成成分としてセルロースを含有する物質を意味する。セルロースは水不溶性のものでも、水可溶性のものでもよいが、天然セルロースに近い原料、即ち未変性かつ水不溶性のセルロースが好ましく、セルロース含有物質の場合、未変性かつ水不溶性のセルロースを多く含んでいる方がセロオリゴ糖の生成効率が高いので、好ましい。
【００１６】
水不溶性のセルロースとしては、リンターパルプ、クラフトパルプ、サルファイトパルプ、溶解パルプなどが価格、純度面で好ましく、また、これらは、乾燥、未乾燥でも構わない。溶解パルプとは、化学的に特別に精製されたパルプを意味し、主として薬品に溶解して使用する。溶解パルプは、木材中から純度の良いセルロースを取り出すことにより、製造される。すなわち、木材はセルロース、リグニン、ヘミセルロースの三大成分と少量の樹脂分、灰分を含んでいるので、まず、蒸解によって大部分のリグニン、ヘミセルロースを除去し、これに続く精製、漂白段階で残留するリグニン、ヘミセルロース、樹脂分、灰分を除去する。溶解パルプは、化学繊維、セロハン、プラスチック、合成糊料、その他いろいろなセルロース系誘導体の原料となる。
【００１７】
未乾燥のパルプ（スラッシュパルプ）としては、晒または未晒クラフトスラッシュ木材パルプ、晒または未晒サルファイトスラッシュ木材パルプ、晒または未晒溶解スラッシュ木材パルプ、晒または未晒クラフトスラッシュ非木材パルプ、晒または未晒サルファイトスラッシュ非木材パルプ、晒または未晒溶解スラッシュ非木材パルプ、粗または精製スラッシュリンターパルプを用いることが出来る。なお、パルプ中のリグニンが除去されることで細孔容積が増大すること、またヘミセルロースなどが除去されることにより、セルロース純分が高くなることから、例示したセルロース系材料の中でも、晒溶解スラッシュ木材パルプ、晒溶解スラッシュ非木材パルプ、精製スラッシュリンターパルプが好ましい。
【００１８】
また、スラッシュパルプに含まれる水分は、パルプ製造条件、即ち、脱水工程の条件によって左右されるが、５０〜９９重量％、より好ましくは６０〜９８重量％であるのが望ましい。水分５０重量％未満の場合、脱水工程によって生じるシェアによって、パルプ内の細孔容積が潰れ角質化を起す恐れがあり、セルロースのアクセシビリティーの低下を引き起こす可能性があるため、また、水分が９９重量％を超える場合は、それを基質として反応系内に添加した際、反応系内のパルプ濃度が低くなりすぎ、反応開始前に脱水等の水分を除去する処理が必要となるため、工程が煩雑となり好ましくない。
【００１９】
乾燥パルプ（ドライパルプ）としては、晒または未晒クラフト木材パルプ、晒または未晒サルファイト木材パルプ、晒または未晒溶解木材パルプ、晒または未晒クラフト非木材パルプ、晒または未晒サルファイト非木材パルプ、晒または未晒溶解非木材パルプ、粗または精製リンターパルプ、古紙パルプ、脱インキパルプ、ホヤセルロースおよび酢酸菌等の微生物によって生産されるセルロース等、または上記セルロース系材料を苛性ソーダ溶液、銅アンモニア溶液、モルホリン誘導体等の何らかの溶媒に溶解し、改めて紡糸された再生セルロース、苛性ソーダ溶液により処理されたマーセル化パルプ等を用いることが出来る。なお、パルプ中のリグニン分が除去されること、またヘミセルロースなどが除去されることにより、セルロース純分が高くなることから、例示したセルロース系材料の中でも、晒溶解木材パルプ、晒溶解非木材パルプ、精製リンターパルプ、再生セルロース、マーセル化パルプが好ましい。
【００２０】
ドライパルプに含まれる水分は、パルプ製造条件、即ち乾燥工程の条件によって左右されるが、５〜３０重量％であるのが好ましい。水分が５重量％未満の場合、パルプの角質化、即ち、分子間・分子内における水素結合が進行し、セルロースのアクセシビリティーが低下する恐れがあること、一方、水分が３０重量％を超える場合は、輸送コストが高く、腐敗しやすいために好ましくない。また、木粉や建築廃材、農産廃棄物などのセルロースを含むセルロース含有物質を基質として用いることも出来る。
【００２１】
上述のセルロースまたはセルロース含有物質は、一般に酵素に対し分解抵抗性を有する結晶部分を持つため、この結晶構造を壊す若しくは変化させたり、セルロースの表面積を増加させ、セルラーゼのセルロース表面への吸着を容易にする処理を施したりしたものを用いることで、セルラーゼへの反応性が高くなりセロオリゴ糖の生成速度を増すことが出来る。そのような処理としては、酸、アルカリ、オゾン処理などの化学的処理、爆砕処理、フィブリル化処理、粉砕処理などの機械処理、電子線、γ線等の放射線照射処理、メカノケミカル処理などが挙げられる。
【００２２】
結晶構造を壊す若しくは変化させる処理としては、主にメカノケミカル処理及び／または化学処理があり、セルロースの表面積を増加させ、セルラーゼのセルロース表面への吸着を容易にする処理としては、主にフィブリル化処理がある。これらの処理から適宜選択して実施することができ、一つの処理よりも複数の処理を組み合わせて行う方が、より効率よくセルロースの反応性を高めることができる。
【００２３】
各種パルプのセルロース結晶構造の変化についてはセルロースＩ型結晶化度という指標で、セルロースの比表面積については保水度という指標で測ることができ、セルロースＩ型結晶化度は低い方が、保水度は高い方がよい。保水度が低いと、パルプの膨潤および繊維表面の毛羽立ちが少なくなり、セルロースの表面積が小さくなるために、セルロースのアクセシビリティーの低下に繋がるため好ましくない。
本明細書において、保水度とは、Ｊ．ＴＡＰＰＩ  ＮＯ  ２６−７８で規定されるもので、一定量のパルプ懸濁液を遠心分離（３０００Ｇ）した後の、絶乾パルプに対するパルプの保有する水量を百分率で示したものである。保水度が高いほど、繊維間結合力が低く繊維内部に含まれる水量が多い、即ち、セルロースの表面積は大きくなる傾向にある。
【００２４】
パルプのセルロースＩ型結晶化度が高い場合は、前処理前後におけるパルプ中のセルロースの構造変化が小さいため、アクセシビリティーの向上が見られないので好ましくない。本明細書において、セルロースＩ型とは、天然セルロースの結晶形のことを意味する。また、結晶化度とは、セルロースの結晶領域量の全量に対する割合を意味し、Ｘ線回折法などにより測定することができる。結晶化度は、セルロースの物理的、化学的性質とも関係し、その値が大きいほど、セルロースの結晶性が高く、非結晶部分が少ないため、硬度、密度等は増すが、伸び、柔軟性、水や溶媒に対するアクセシビリティー、化学反応性は低下する。
【００２５】
フィブリル化処理は、セルロースの表面積を増加させ、セルラーゼのセルロース表面への吸着を容易にすることを目的として、パルプを磨砕・剪断するような機械を用いて、（１）セルロース繊維の微細構造をゆるませ、繊維内部に水を取り込んで膨潤させる（内部フィブリル化）、（２）セルロース繊維表面を毛羽立たせ、あるいは繊維を枝分かれさせ繊維表面積を増加させる（外部フィブリル化）、（３）微細繊維を生成させ、結果として繊維表面積を増加させることである。
【００２６】
フィブリル化処理は、湿式条件下でセルロース繊維を磨砕・剪断し、フィブリル化できるものであれば公知の機種を用いて構わない。あえて例示するならば、パルプの叩解機である、ビーター（ナイアガラビーター  熊谷理機工業製）、ＰＦＩミル（ＰＦＩミル  熊谷理機工業製）、リファイナー（ディスクリファイナー  東西精機製）や、高圧ホモジナイザー（ニロ・ソアビ製）、超高圧ホモジナイザー（シンマルエンタープライゼス製）、ナノマイザー（特殊機械工業製）、石臼型磨砕機（スーパーマスコロイダー、セレンディピター  共に増幸産業製)、等が挙げられる。
本発明においては、アルカリ処理とフィブリル化処理を組み合わせた処理を施したセルロース又はセルロース含有物質を基質に用いると、セロオリゴ糖の収率を高めることができる。
【００２７】
以下に、本発明の基質として各種パルプを用いた場合のフィブリル化処理について詳述する。
フィブリル化処理する際のパルプ濃度は、一般に、１．０〜２０重量％、より好ましくは、２．０〜１５重量％とすることができる。パルプ濃度が１．０重量％未満である場合、処理量が著しく増加するだけでなく、水が可塑剤として作用しフィブリル化処理の度合いが低下するため、また、パルプ濃度が２０重量％を超える場合はパルプ濃度が高過ぎて流動性が低下し、フィブリル化処理が行い難くなるために好ましくない。また、フィブリル化処理時間は、パルプ濃度および用いた機種によって最適値は異なるものの、３分〜５時間が好ましく、より好ましくは５分〜３時間である。フィブリル化処理時間が３分未満の場合、パルプの形態変化が少なく、保水度の上昇が余り見られないため、また、処理時間が５時間を超えると、セルラーゼの反応効率とパルプの処理コストを比較し、効果が著しく小さくなるために、好ましくない。なお、石臼型磨砕機のような連続処理を行う機種では、上記の処理時間になるように、複数回繰り返し処理または循環して処理を行うことが出来る。
【００２８】
本発明のメカノケミカル処理とは、セルロース繊維の結晶化度を低下させる目的で行うもので、セルロース繊維に強力なエネルギーを加えて、セルロース自体の結晶構造を変化させる、即ち、結晶化度を低下させることである。
メカノケミカル処理は、セルロースの結晶化度を低下させることができる処理であれば、公知の方法を用いて構わないが、媒体ミルを用いて処理することが好ましい。媒体ミルは、公知の機種を用いてよいが、あえて機種を例示するならば、振動ボールミル（中央化工機製）、Ｓ／Ｇミル（五十嵐機械製）、アペックスミル（コトブキ技研工業製）、スーパーアペックスミル（コトブキ技研工業製）、アクアマイザ（ホソカワミクロン製）、ウルトラビスコミル（アイメックス製）等が挙げられる。
【００２９】
以下に本発明の基質として、各種パルプを用いた場合のメカノケミカル処理について詳述する。
メカノケミカル処理は、パルプ１００部を水０〜１００００部、より好ましくは、水０〜５０００部に分散させた状態で行う。水が１００００部を超える場合は、処理量が著しく増加するだけでなく、水が可塑剤として作用しメカノケミカル処理が低下するために好ましくない。
【００３０】
メカノケミカル処理に使用される媒体ミルの媒体としては、市販されているφ１ｍｍ〜φ５０ｍｍのアルミナ製、セラミック製、チタン製、ジルコニア製、ガラス製等が使用でき、その充填率は５０体積％〜９５体積％が好ましい。充填率が５０体積％未満の場合、セルロースに対する接触頻度が小さくなり、メカノケミカル反応が生じ難くなるため、また、充填率が９５体積％を超えた場合は、媒体の動きが妨げられるために好ましくない。
【００３１】
処理時間は、５分〜５時間、より好ましくは１０分〜３時間が好ましい。本発明においては、メカノケミカル処理の時間が重要である。処理時間が５分未満の場合、セルロースの結晶構造にほとんど変化が見られず、５時間を超える場合は、セルロースＩ型結晶化度は低下し、結晶構造のアモルファス化は見られるものの、セルロース繊維が著しく凝集し、硬くなるため、保水度が著しく低下するために好ましくない。一般に、保水度とセルロースの表面積には、相関関係があり、保水度が低下すると表面積が少なくなるため、仮に結晶化度が低下してもセルラーゼの反応性は低下してしまう。
【００３２】
本発明において、化学的処理は、セルロースの結晶化度を下げることを目的としており、マーセル化処理に代表されるアルカリ処理が好ましい。
以下に本発明の基質として、各種パルプを用いた場合のアルカリ処理について詳述する。
【００３３】
アルカリ処理としては、パルプ濃度１．０〜２０重量％かつ苛性ソーダ濃度３〜３０重量％になるように調整し、５分〜５時間処理することが好ましい。より好ましくは、パルプ濃度２．０〜１５重量％かつ苛性ソーダ濃度５〜２０重量％になるように調整し、１０分〜３時間処理する。
【００３４】
パルプ濃度が１．０重量％未満の場合、処理量が著しく増加するだけでなく、苛性ソーダ濃度を保つために苛性ソーダ量が増加する、即ち、薬品コストが大幅にアップするため、また、パルプ濃度が２０重量％を超える場合はパルプ濃度が高過ぎで流動性が低下し、アルカリ化処理が不均一に進行するために好ましくない。
【００３５】
苛性ソーダ濃度が３重量％未満の場合、セルロースの結晶構造の変化は認められず、苛性ソーダ濃度が３０重量％を超えた場合、既にセルロースＩ型結晶は完全に消失し、アモルファス化していることから、過剰な高濃度処理は薬品コストの大幅な増大に繋がるために好ましくない。
【００３６】
アルカリ処理時間が５分より短い場合、マーセル化反応の進行度合いが小さく、セルロースＩ型結晶化度の低下度合いが小さいため、また、アルカリ処理時間が５時間を超えてもセルロースの更なる結晶構造の変化は見られないために好ましくない。
【００３７】
水に可溶性のセルロースとしては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース誘導体（変性セルロース）が挙げられるが、これに限られない。なお、水可溶性のセルロースを原料に使用した場合、前述のセルロースのみが沈殿するようなメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン等の溶媒の含水溶媒中に投入し、不溶化したセルロースを回収することで生成したセロオリゴ糖を分離することが出来る。
【００３８】
本発明の特徴は、セルロースまたはセルロース含有物質とセルラーゼを水性媒体中で反応させる反応系において、セルロースまたはセルロース含有物質および水性媒体を連続または逐次的に添加する一方、反応生成物であるセロオリゴ糖を含む反応液を連続あるいは逐次的に一定量抜き出して反応を行うことにある。これは、セルラーゼ中のβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分がセルロースへ吸着する性質に着目し、反応系内にβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分を残存させ、β−グルコシダーゼのみ系外に排出することを狙ったものである。一般的に、セルラーゼには、主にエンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼ、β−グルコシダーゼの３種類の酵素成分が含まれている。このうち、セロオリゴ糖の生成に関与するのはエンドグルカナーゼとセロビオハイドラーゼであり、β−グルコシダーゼは生成したセロオリゴ糖をグルコースに分解する酵素成分である。よって、セロオリゴ糖を生成させるためには、反応系内に存在するβ−グルコシダーゼが少ない方がよい。
【００３９】
本明細書において、反応液とは、反応系内に存在するセルロースまたはセルロース含有物質、水性媒体、反応生成物の混合物を意味し、反応糖化液とは反応液からセルロースまたはセルロース含有物質を除いたものを意味する。
【００４０】
本発明の主な態様の反応系の概略を図１及び図２に示す。
本発明において、反応の初段階では、生成したセロオリゴ糖が、セルラーゼに含有されているβ−グルコシダーゼにより分解されるため、セロオリゴ糖の生成率（セロビオース生産量／グルコース生産量）は低くなる。しかしながら、反応液中のセルロースに吸着していない遊離のβ−グルコシダーゼは、反応液を一定量抜き出すことにより系外に出るため、時間の経過と共に反応系内に残存するβ−グルコシダーゼが減少することで、セロオリゴ糖からのグルコースへの変換が抑制され、その結果、セロオリゴ糖の生成率が上昇する。
【００４１】
本発明において、反応系に用いる水性媒体は、酢酸緩衝液等の緩衝液、イオン交換水等が好ましいが、水道水等でも十分使用可能である。
【００４２】
反応系のセルロース濃度は、反応が継続している間は、１〜１０重量％、好ましくは１〜７重量％程度に保つことが必要である。セルロース濃度が１重量％未満の場合、基質が少な過ぎるためセロオリゴ糖の生成量が少なくなり、濃縮等の後処理にかかる労力が大きくなるため、またセルロース濃度が１０重量％を超えた場合、反応系内の粘度が高くなり過ぎて作業性が悪化、酵素反応率も低下するために好ましくない。セルロース含有物質を基質に使用する場合は、それに含まれるセルロースの含有量に合わせて、反応系のセルロース濃度が、前記範囲になるように調整する。また、反応途中でセルロースを添加する場合は、反応系に残存するセルロース量を計測し、系内のセルロース濃度が上記範囲になるよう調整する。添加量は、糖化された基質の０．３〜２．０倍程度が好ましい。同じく、反応系から抜き出した反応液に含まれるセルロースを再び系内に（図１及び図２の場合、反応槽に）戻す場合も、系内のセルロース濃度が上記範囲になるよう調節する。尚、反応速度が定常となってからは、添加量を調整することが可能であり、例えば糖化された基質の０．７〜１．５倍とすることができる。
【００４３】
反応系に添加する水性媒体は、反応系の基質濃度が上記範囲内になるように添加する。
反応系に添加するセルラーゼの量は、反応開始時に投入された基質（セルロース分）に対し、一般には、０．５〜５０重量％、好ましくは、０．５〜３０重量％程度である。セルラーゼの添加量が０．５重量％未満の場合、酵素反応性が遅く反応に必要な時間が長くなり過ぎて効率的でないため、またセルラーゼの添加量が５０重量％を超える場合、反応性は高まるが、費用対効果に課題があるため好ましくない。
【００４４】
反応温度およびｐＨは、用いるセルラーゼが作用する範囲であればよく、好ましくは各酵素の至適条件とすれば良い。市販の一般的な酵素を使用した場合、あえて例示するならば、反応温度は２０〜６０℃、ｐＨは３．０〜８．０であることが好ましい。また、反応時間は、セルラーゼや基質の種類、濃度、添加量などによって適宜定めることができ、基質などを連続添加する場合には添加速度にて、逐次添加する場合には添加間隔にて調整することができる。
【００４５】
反応開始後は、反応槽を撹伴することにより基質が系内に均一に分散するようにした方が、反応の進行を早めることができるので好ましい。撹伴方法は、回転、振とう、ポンプによる循環、酵素に影響を及ぼさないガスを用いた吹き込み等任意の方法で行えばよい。回転の場合は、羽根の形状、大きさにもよるが、例えば、５０〜４００ｒｐｍが適当である。あまり強力な撹伴は、酵素の失活につながるため、好ましくない。
【００４６】
反応系内へのセルロースまたはセルロース含有物質および水性媒体の添加の形式は、連続添加および逐次添加のいずれかとすることができる。連続添加の場合の添加速度、及び逐次添加の場合の添加間隔及び１回の添加量は、添加する基質の量や初発のセルラーゼ添加量、及び反応系内の基質及びセルラーゼの濃度その他の諸条件が上記範囲内になるように適宜設定することができる。添加間隔は、例えば、３〜４８時間とすることができる。
【００４７】
本発明においては、上述のように反応系内へセルロースまたはセルロース含有物質および水性媒体を添加する一方で、連続的または逐次的に反応系外に反応液を抜き出す（抜き取る）。連続的とは、継続して反応系から抜き出す形式を意味し、一方、逐次的とは所定のサイクルで反応系から抜き出すことを意味する。反応系から反応液を抜き取る量（速度）は、反応系内の反応液が３〜４８時間で入れ替わる程度の速度が好ましく、反応を通じて一定とする必要はなく、加える基質の量、初発のセルラーゼ添加量等の条件により任意に変えることが出来る。なお、加える水性媒体および抜き出す反応液の液量を多くすると、セロオリゴ糖の濃度は低くなるが、副生するグルコース量は低くなるため、基質に対するセロオリゴ糖収量率が向上する。
【００４８】
反応系内から反応液を抜き取る時は、反応槽からの出口に分離装置を設け、抜き取りと基質であるセルロースの固形分（つまり、セルロースまたはセルロース含有物質）とセロオリゴ糖を含む反応糖化液との分離を同時に行っても良いし（図１）、反応液を反応槽から抜き取り後、セルロース固形分とセロオリゴ糖を含む反応糖化液とを分離しても良い（図２）。抜き取りと分離を同時に行う方が、連続生産する上では好ましい。
抜き取りと分離を同時に行うときは、分離装置において、反応槽からの反応液と接触する面に膜やフィルターや濾布等を設置し、基質であるセルロースの固形分と反応糖化液を分離することができる。非セルロース製の不織布が、目詰まりをおこすことが少なく、反応の効率性の点から好ましいが、スクリーン、金属フィルター、セラミックフィルターなどももちろん使用出来る。また、デカンテーションにより清澄な反応糖化液のみを回収することも出来る。
【００４９】
また、抜き取り後に分離する場合は、その反応液を既知の装置や上記の如く膜、フィルター、濾布等を用いて分離する。このとき、分離したセルロース固形分は、反応系内に戻すことが好ましい。これにより、原料を節約し廃棄量を減らすことができると共に、該固形分は、反応系内において既にセルロースにセルラーゼが吸着した状態であるので、後述するようにβ−グルコシダーゼの影響を排除することができる。また、分離したセルロース固形分を反応系内に戻すことで、セルロースに吸着しているセロオリゴ糖の生成に有効な成分を回収、再利用することができる。
【００５０】
なお、該セルロースまたはセルロース含有物質の分離に用いる既知の装置としては、ディスクフィルター、ドラムフィルター、フィルタープレス、スクリュープレス、（傾斜）スクリーン、（連続）遠心機、デカンター、（真空）ベルトフィルター、シックナー、オリバーフィルター、プレコートフィルター、流体サイクロンなどが使用出来る。なお、例示した既知の装置にて粗分離した反応液を更に膜やフィルターや濾布等にて精密に固液分離すること、またデカンテーションにより清澄な反応糖化液を回収することも出来る。
【００５１】
反応糖化液には、セロオリゴ糖とグルコースが含まれるが、反応糖化液からのセロオリゴ糖の分離は、既知の方法で行うことが出来る。あえて例示するならば、逆浸透膜装置により、セロオリゴ糖分を濃縮後、エバポレーター等で更に濃縮し、濃縮液から晶析法またはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン等の溶媒の含水溶媒中にて沈殿させることにより採取することが簡便である。または、逆浸透膜処理後の溶液をクロマト分離装置、または活性炭等による吸着処理などで、セロオリゴ糖と共存するグルコースを分離することが可能である。他に、グルコースのみを選択的に資化する微生物、例えば酵母にグルコースを資化させ、セロオリゴ糖を分離することも出来る。もちろん、用途によってはセロオリゴ糖とグルコースを分離せずに用いても良い。なお、反応糖化液を濃縮液のまま使用しても、別途、公知の精製工程および／または乾燥工程を経ても良い。
【００５２】
本発明のもう一つの特徴として、反応初期段階または反応途中でのセルラーゼに含まれるβ−グルコシダーゼの影響を排除するためには、反応系に添加する基質として、セルラーゼに含まれる酵素成分のうちセロオリゴ糖生成に必要な酵素のみ（β−グルコシダーゼ以外の酵素、主にエンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼなど）をセルロースまたはセルロース含有物質に事前に吸着させたセルロースまたはセルロース含有物質を用いることができる。これにより、高収率でセロオリゴ糖を製造することが出来る。
【００５３】
セルロースに対し、セルラーゼに含まれる酵素成分のうちβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分を予め吸着させる方法としては、セルロースまたはセルロース含有物質を適当な液体（緩衝液、水など）に懸濁させて所定のｐＨ、濃度のセルローススラリーとし、これにセルラーゼを添加し、一定の温度、時間で保持した後、脱液及び水洗する方法が好ましい。
【００５４】
セルローススラリーのｐＨは、ｐＨ５．０〜１０．０、好ましくはｐＨ５．５〜９．０か更に好ましくはｐＨ６．０〜８．０、特に好ましくは、ｐＨ７．０付近である。ｐＨが５．０を下回るとβ−グルコシダーゼのセルロースに対する親和性が向上するため、またｐＨが１０．０を超える場合はセルラーゼの失活が懸念されるため、好ましくない。
【００５５】
セルローススラリー濃度は、１〜１０重量％、好ましくは１〜８重量％、さらに好ましくは１〜７重量％である。スラリー濃度が１重量％を下回ると希薄となることからセルラーゼとセルロースとの接触度合いが低下するため、またスラリー濃度が１０重量％を超える場合はセルロースの流動性が著しく低下し、作業性、またβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分の吸着量が悪化するため好ましくない。
【００５６】
セルロース又はセルロース含有物質に対するセルラーゼの添加量は、対セルロース５〜３００重量％、好ましくは７〜２００重量％、更に好ましくは１０〜１００重量％である。セルラーゼの添加量が５重量％未満の場合は酵素反応時におけるセロオリゴ糖の生産速度が遅くなるため、３００重量％を超える場合は吸着出来ないセルラーゼが増加するため好ましくない。
【００５７】
吸着処理温度は、通常、５〜６０℃、好ましくは１０℃〜５０℃、より好ましくは２０〜４０℃である。温度が５℃を下回る場合はセルラーゼの吸着速度が低下するため、温度が６０℃を超える場合はセルラーゼの失活が懸念されるため好ましくない。
【００５８】
吸着処理時間は、通常、１〜１５０分、好ましくは１〜１００分、更に好ましくは１〜６０分である。吸着処理時間が１分未満の場合はβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分（主にエンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼ）が完全に吸着しきれないため、吸着処理時間が１５０分を超えた場合は前述の酵素成分（主にエンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼ）の吸着量に変化が見られず、これ以上の処理は時間のロスに繋がるため好ましくない。なお、セルラーゼの吸着は撹伴しなくとも自然拡散により進行するが、撹伴することで促進される。なお、撹伴も酵素が失活しない条件であれば、特に限定されない。十分に攪拌され、セルロースにまんべんなくセルラーゼが接触する状態であれば、吸着時間は短くなる。
【００５９】
吸着処理後のセルローススラリーは公知の固液分離方法にて脱液及び水洗（洗浄）を行い、セルロースに吸着していない酵素成分、主にβ−グルコシダーゼを排除する。なお、更にβ−グルコシダーゼの除去を行うために、セルロースの５０〜１０００倍量の水にて１回若しくは複数回に分けて、洗浄、脱液を繰り返し行っても良い。
【００６０】
このようにして得られる、セルラーゼに含まれる酵素成分のうちβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分を予め吸着させたセルロースまたはセルロース含有物質を反応系に添加する時期は、反応初期段階（反応開始と同時または直後）、反応途中、または反応初期段階と反応途中の両方の時期とすることができる。反応途中とは、反応開始後〜反応終了時のいずれの時点であっても良い。また、添加の回数については特に限定されず、反応途中において添加する場合は２回以上添加することも可能である。
【００６１】
セルラーゼに含まれる酵素成分のうちβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分を予め吸着させたセルロースまたはセルロース含有物質を反応初期および／または反応途中に添加する場合の添加量は、酵素を吸着させないセルロースを添加する場合も含めて、反応系に添加するセルラーゼの全量が、反応開始時に投入された基質（セルロース分）に対し上述した範囲となるように調整することができる。また、これらを単独若しくは上記吸着処理を施していないセルロースまたはセルロース含有物質と任意の割合で配合して添加することが出来る。なお、その配合割合に関しては、全セルロース分に対しセルラーゼの添加量（酵素吸着処理時に添加されたセルラーゼ量）が０．５〜５０重量％、好ましくは０．５〜３０重量％になるように配合するのが好ましい。全セルロース分に対するセルラーゼの添加量（酵素吸着処理時に添加されたセルラーゼ量）が０．５重量％未満の場合、酵素反応性が遅く反応に必要な時間が長くなり過ぎて効率的でないため、またセルラーゼの添加量が５０重量％を超える場合、反応性は高まるが、費用対効果に課題があるため好ましくない。
【００６２】
［作用］
本発明においては、β−グルコシダーゼ以外のセルラーゼに含まれる酵素成分（主にエンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼ）は、抜き出した反応液中にほとんど見られず、そのため、高価な限外濾過膜で酵素のみを分離回収する必要はない。これは、エンドグルカナーゼやセロビオハイドラーゼに代表されるセロオリゴ糖の生産に大きく関与する酵素成分はセルロースに対し吸着部位（セルロースバインディングドメイン）を有すことから、セルロースに吸着したセルラーゼはセルロースの分解が生じた場合、反応系内に添加される新たな基質（セルロース）に結合することを繰り返すために、上記酵素成分のほとんどが反応系内に留まっているためと考えられる。また、反応系内の一部はセルロースまたはセルロース含有物質に吸着された酵素が、固定化酵素的に働いているとも考えられる。一方、系内のβ−グルコシダーゼは、理論上セルロースまたはセルロース含有物質への吸着性がほとんど無い（セルロースバインディングドメインを有さない）ため、抜き出された反応液とともに系外に排出され、反応終了時にはほぼ全量系外に抜き出される。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６４】
<セロビオース、グルコースの定量法>
高速液体クロマトグラフィーを用い、そのピーク面積より、セロビオースおよびグルコースの濃度を算出した。なお、カラムはＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＫ０４Ｓ（三菱化学（株）製）、溶離液は水、流速は０．３ｍｌ／ｍｉｎ、温度は４５℃の条件で分離を行い、示差屈折計（日本分光（株）製）にて測定を行った。
【００６５】
［実施例１］
溶解パルプ（日本製紙ケミカル（株）製）を５重量％程度となるように５００ｍｌの０．０５Ｍ濃度の酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）が入った１Ｌの三角フラスコに懸濁させ、該水溶液にセルクラスト（ノボザイムズ（株）社製）を２ｇ加え、恒温槽で５０℃に保温する。なお、三角フラスコは攪拌機により撹伴（２００ｒｐｍ）する。そこに、前述の溶解パルプを１２時間おきに２．５ｇ（乾燥重量）添加する。三角フラスコに２０ｍｌ／ｈｒの速度で、同緩衝液を連続的に添加する一方、同速度で反応液を連続的に抜き取る。なお、抜き取り口は非セルロース製の不織布で覆い、反応槽からパルプが抜き出ないようにした。反応は、継続して１０日間行った。１０日間の反応液を合計し、定法に従い、高速液体クロマトグラフによるゲル濾過カラムを用い、示差屈折計によりセロオリゴ糖を定量したところ、約３８ｇ含まれていた。加えたパルプに対するセロオリゴ糖収率は、５０重量％であった。抜き取った反応液を濃縮することにより、セロビオース純度９６体積％の結晶が約２２ｇ得られた。
【００６６】
経過日数毎のセロオリゴ糖の生成量を表１に示した。抜き出した反応液には、１０日間の反応で、一日平均約８ｍｇ／ｍｌのセロビオースと約３ｍｇ／ｍｌのグルコースが含まれていた。
【００６７】
【表１】
2006204294.tif 000002
【００６８】
表１より明らかなように、本発明によるとセロオリゴ糖比率の高い溶液を容易に連続的に採取できることが判明した。
【００６９】
［実施例２］
溶解パルプ（日本製紙ケミカル（株）製）を５重量％程度となるように３００ｍｌの０．０５Ｍ濃度の酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）が入った５００ｍｌの三角フラスコに懸濁させ、該水溶液にセルクラスト（ノボザイムズ（株）社製）を５ｇ加え、恒温槽で５０℃に保温する。なお、三角フラスコは攪拌機により撹伴（２００ｒｐｍ）する。２４時間反応後、三角フラスコの内容物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）により回収する。回収したセルロース部分を再び０．０５Ｍ濃度の酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）３００ｍｌが入った５００ｍｌの三角フラスコに懸濁させ、ここに新たに基質５ｇ（乾燥重量）を加え、恒温槽で５０℃に保温する。なお、三角フラスコは攪拌機により撹伴（２００ｒｐｍ）する。
【００７０】
この操作を７日間繰り返す。遠心操作で得られた、７日分の採取した反応液を分析したところ、セロオリゴ糖が約２３ｇ含まれていることが分かった。グルコースは約７ｇであった。パルプに対するセロオリゴ糖の収率は、約５１重量％であった。
【００７１】
［実施例３］
溶解パルプ（日本製紙ケミカル（株）製）を５重量％程度となるように５００ｍｌの０．０５Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．０が入った１Ｌの三角フラスコに懸濁させ、該水溶液にセルクラスト（ノボザイムズ（株）社製）を２ｇ加え、２０℃で３時間撹伴し、その後、桐山ロートを用いセルロース部分を回収する。回収したセルロース分に水１００ｍｌを用い、水洗を行った。セルラーゼが吸着された該セルロースを、５重量％程度となるように５００ｍｌの同緩衝液が入った１Ｌの三角フラスコに懸濁させ、５０℃に保温する。なお、三角フラスコは攪拌機により撹伴（２００ｒｐｍ）した。そこに、溶解パルプ（乾燥重量２．５ｇ）を１２時間おきに添加する。三角フラスコに２０ｍｌ／ｈｒの速度で、緩衝液（溶解パルプを含まない）を連続的に添加する一方、同速度で反応液を連続的に抜き取る。なお、抜き取り口は非セルロース製の不織布で覆い、反応槽からパルプが抜き出されないようにする。反応は、継続して１０日間行った。
【００７２】
１０日間の反応液を合計し、定法に従い、高速液体クロマトグラフによるゲル濾過カラムを用い、示差屈折計によりセロオリゴ糖を定量したところ、約４３ｇ含まれていた。加えたパルプに対するセロオリゴ糖収率は、５７重量％であった。
抜き取った反応液を濃縮することにより、セロビオース純度９７体積％の結晶約２３ｇが得られた。
経過日数毎のセロオリゴ糖の生成量を表２に示した。抜き出した反応液には、１０日間の反応で、一日平均９．０ｍｇ／ｍｌのセロビオースと２．９ｍｇ／ｍｌのグルコースが含まれていた。
【００７３】
【表２】
2006204294.tif 000003
【００７４】
表２の結果から、セルラーゼのβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分を吸着させたセルロースを用いることにより、より効率的にセロオリゴ糖を製造できることが分かった。
【００７５】
［実施例４］
パルプ濃度が５重量％になるように溶解パルプ（日本製紙ケミカル（株）製）を投入した５００ｍｌの０．０５Ｍ濃度の酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１Ｌの三角フラスコに入れ、該水溶液にセルクラスト（ノボザイムズ（株）製）を対パルプ  １０重量％添加し、恒温槽で５０℃に保温した。パルプスラリーを攪拌機により撹拌（２００ｒｐｍ）しつつ、前述の溶解パルプスラリー（スラリー濃度  １．０重量％）を２０ｍｌ／ｈｒの速度で、前述の三角フラスコに連続的に添加する一方、抜き取り口を非セルロース製の不織布で覆い、反応槽からパルプが漏出しないようにした状態にて、同速度で反応糖化液を連続的に抜き取った。反応は、１０日間連続して行い、定法に従い、セロビオースおよびグルコース濃度を１日毎に測定し、また抜き出し量より各糖分の生成量を算出した。なお、加えたパルプに対するセロビオース収率は、約５２重量％であった。
【００７６】
［実施例５］
パルプ濃度が５重量％になるように溶解パルプ（日本製紙ケミカル（株）製）を投入した１００ｍｌのイオン交換水（ｐＨ７．０）を５００ｍｌの三角フラスコに入れ、該水溶液にセルクラスト（ノボザイムズ（株）製）を対パルプ  ５０重量％添加し、２０℃で１０分間撹伴（２００ｒｐｍ）し、その後、桐山ロートを用いセルロース分を回収した。回収したセルロース分に水１００ｍｌを用い、水洗を行った。セルラーゼが吸着された該セルロースおよび前述の溶解パルプ  ２０ｇ（乾燥重量）を１Ｌ三角フラスコに投入し、５重量％となるように０．０５Ｍ濃度の酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を入れ、５０℃に保温した。パルプスラリーを攪拌機により撹伴（２００ｒｐｍ）しつつ、前述の溶解パルプを１２時間毎に２．５ｇ（乾燥重量）添加した。なお、前述の三角フラスコに２０ｍｌ／ｈｒの速度で、同緩衝液を連続的に添加する一方、抜き取り口を非セルロース製の不織布で覆い、反応槽からパルプが漏出しないようにした状態にて、同速度で反応糖化液を連続的に抜き取った。反応は、１０日間連続して行い、定法に従い、セロビオースおよびグルコース濃度を１日毎に測定し、また抜き出し量より各糖分の生成量を算出した。パルプに対するセロビオース収率は、約６０重量％であった。
【００７７】
［実施例６］
パルプ濃度が５重量％になるように溶解パルプ（日本製紙ケミカル（株）製）を投入した５００ｍｌの０．０５Ｍ濃度の酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１Ｌの三角フラスコに入れ、該水溶液にセルクラスト（ノボザイムズ（株）製）を対パルプ  １０重量％添加し、２０℃で１５０分間撹伴（２００ｒｐｍ）し、その後、桐山ロートを用いセルロース分を回収した。回収したセルロース分に水１００ｍｌを用い、水洗を行った。セルラーゼが吸着された該セルロースを１Ｌ三角フラスコに投入し、５重量％となるように同緩衝液を入れ、５０℃に保温した。パルプスラリーを攪拌機により撹伴（２００ｒｐｍ）しつつ、前述の溶解パルプを１２時間毎に２．５ｇ（乾燥重量）添加した。なお、前述の三角フラスコに２０ｍｌ／ｈｒの速度で、同緩衝液を連続的に添加する一方、抜き取り口を非セルロース製の不織布で覆い、反応槽からパルプが漏出しないようにした状態にて、同速度で反応糖化液を連続的に抜き取った。反応は、１０日間連続して行い、定法に従い、セロビオースおよびグルコース濃度を１日毎に測定し、また抜き出し量より各糖分の生成量を算出した。パルプに対するセロビオース収率は、約５２重量％であった。
【００７８】
［実施例７］
パルプ濃度１０重量％になるように調整した溶解パルプ（日本製紙ケミカル（株）製）スラリー３００ｍｌを、ＰＦＩミル（熊谷理機工業（株）製）にて１００００回転になるまで処理を行い、フィブリル化パルプを得た。
パルプ濃度が５重量％になるように前述のフィブリル化パルプを投入した５００ｍｌのイオン交換水（ｐＨ７．０）を１Ｌの三角フラスコに入れ、該水溶液にセルクラスト（ノボザイムズ（株）製）を対パルプ  １０重量％添加し、２０℃で１２０分間撹伴（２００ｒｐｍ）し、その後、桐山ロートを用いセルロース分を回収した。回収したセルロース分に水１００ｍｌを用い、水洗を行った。セルラーゼが吸着された該セルロースを１Ｌ三角フラスコに投入し、５重量％となるように０．０５Ｍ濃度の酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を入れ、５０℃に保温した。パルプスラリーを攪拌機により撹伴（２００ｒｐｍ）しつつ、前述のフィブリル化パルプを１２時間毎に２．５ｇ（乾燥重量）添加した。なお、前述の三角フラスコに２０ｍｌ／ｈｒの速度で、同緩衝液を連続的に添加する一方、抜き取り口を非セルロース製の不織布で覆い、反応槽からパルプが漏出しないようにした状態にて、同速度で反応糖化液を連続的に抜き取った。反応は、１０日間連続して行い、定法に従い、セロビオースおよびグルコース濃度を１日毎に測定し、また抜き出し量より各糖分の生成量を算出した。パルプに対するセロビオース収率は、約６３重量％であった。
【００７９】
［実施例８］
１Ｌ容ポットにφ３０ｍｍのセラミックボールを充填率が６５体積％になるように入れ、更に溶解パルプ（日本製紙ケミカル（株）製）をパルプ濃度６重量％になるように調整した水懸濁液３３３ｍｌを投入し、振動ボールミル（中央化工機製）にて３０分間処理を行い、メカノケミカル処理パルプを得た。
パルプ濃度が５重量％になるように前述のメカノケミカル処理パルプを投入した５００ｍｌのイオン交換水（ｐＨ７．０）を１Ｌの三角フラスコに入れ、該水溶液にセルクラスト（ノボザイムズ（株）製）を対パルプ  １０重量％添加し、２０℃で１２０分間撹伴（２００ｒｐｍ）し、その後、桐山ロートを用いセルロース分を回収した。回収したセルロース分に水１００ｍｌを用い、水洗を行った。セルラーゼが吸着された該セルロースを１Ｌ三角フラスコに投入し、５重量％となるように０．０５Ｍ濃度の酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を入れ、５０℃に保温した。パルプスラリーを攪拌機により撹伴（２００ｒｐｍ）しつつ、前述のメカノケミカル処理パルプを１２時間毎に２．５ｇ（乾燥重量）添加した。なお、前述の三角フラスコに２０ｍｌ／ｈｒの速度で、同緩衝液を連続的に添加する一方、抜き取り口を非セルロース製の不織布で覆い、反応槽からパルプが漏出しないようにした状態にて、同速度で反応糖化液を連続的に抜き取った。反応は、１０日間連続して行い、定法に従い、セロビオースおよびグルコース濃度を１日毎に測定し、また抜き出し量より各糖分の生成量を算出した。パルプに対するセロビオース収率は、約６０重量％であった。
【００８０】
［実施例９］
溶解パルプ（日本製紙ケミカル（株）製）をパルプ濃度５重量％になるように調整した１５重量％水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、室温下、３０分間攪拌（２００ｒｐｍ）し、遠心分離機にて余分なアルカリを除去した後、ｐＨが中性になるまでイオン交換水で洗浄し、アルカリ処理パルプを得た。
パルプ濃度が５重量％になるように前述のアルカリ処理パルプを投入した５００ｍｌのイオン交換水（ｐＨ７．０）を１Ｌの三角フラスコに入れ、該水溶液にセルクラスト（ノボザイムズ（株）製）を対パルプ  １０重量％添加し、２０℃で１２０分間撹伴（２００ｒｐｍ）し、その後、桐山ロートを用いセルロース分を回収した。回収したセルロース分に水１００ｍｌを用い、水洗を行った。セルラーゼが吸着された該セルロースを１Ｌ三角フラスコに投入し、５重量％となるように０．０５Ｍ濃度の酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を入れ、５０℃に保温した。パルプスラリーを攪拌機により撹伴（２００ｒｐｍ）しつつ、前述のアルカリ処理パルプを１２時間毎に２．５ｇ（乾燥重量）添加した。なお、前述の三角フラスコに２０ｍｌ／ｈｒの速度で、同緩衝液を連続的に添加する一方、抜き取り口を非セルロース製の不織布で覆い、反応槽からパルプが漏出しないようにした状態にて、同速度で反応糖化液を連続的に抜き取った。反応は、１０日間連続して行い、定法に従い、セロビオースおよびグルコース濃度を１日毎に測定し、また抜き出し量より各糖分の生成量を算出した。パルプに対するセロビオース収率は、約６２重量％であった。
【００８１】
［実施例１０］
溶解パルプ（日本製紙ケミカル（株）製）をパルプ濃度５重量％になるように調整した１５重量％水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、室温下、３０分間攪拌（２００ｒｐｍ）し、遠心分離機にて余分なアルカリを除去した後、ｐＨが中性になるまでイオン交換水で洗浄し、アルカリ処理パルプを得た。同アルカリ処理パルプを原料とし、パルプ濃度１０重量％になるように調整したパルプスラリー３００ｍｌを、ＰＦＩミル(熊谷理機工業（株）製)にて１００００回転になるまで処理を行い、アルカリ処理フィブリル化パルプを得た。
パルプ濃度が５重量％になるように前述のアルカリ処理フィブリル化パルプを投入した５００ｍｌのイオン交換水（ｐＨ７．０）を１Ｌの三角フラスコに入れ、該水溶液にセルクラスト（ノボザイムズ（株）製）を対パルプ  １０重量％添加し、２０℃で１２０分間撹伴（２００ｒｐｍ）し、その後、桐山ロートを用いセルロース分を回収した。回収したセルロース分に水１００ｍｌを用い、水洗を行った。セルラーゼが吸着された該セルロースを１Ｌ三角フラスコに投入し、５重量％となるように０．０５Ｍ濃度の酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を入れ、５０℃に保温した。パルプスラリーを攪拌機により撹伴（２００ｒｐｍ）しつつ、前述のアルカリ処理フィブリル化パルプを１２時間毎に２．５ｇ（乾燥重量）添加した。なお、前述の三角フラスコに２０ｍｌ／ｈｒの速度で、同緩衝液を連続的に添加する一方、抜き取り口を非セルロース製の不織布で覆い、反応槽からパルプが漏出しないようにした状態にて、同速度で反応糖化液を連続的に抜き取った。反応は、１０日間連続して行い、定法に従い、セロビオースおよびグルコース濃度を１日毎に測定し、また抜き出し量より各糖分の生成量を算出した。パルプに対するセロビオース収率は、約６４重量％であった。
【００８２】
［比較例１］
パルプ濃度が５重量％になるように溶解パルプ（日本製紙ケミカル（株）製）を投入した５００ｍｌの０．０５Ｍ濃度の酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１Ｌの三角フラスコに入れ、該水溶液にセルクラスト（ノボザイムズ（株）製）を対パルプ  １０重量％添加し、攪拌機により撹伴（２００ｒｐｍ）しつつ、恒温槽で５０℃に保温した。前述の三角フラスコに２０ｍｌ／ｈｒの速度で、同緩衝液を連続的に添加する一方、抜き取り口を非セルロース製の不織布で覆い、反応槽からパルプが漏出しないようにした状態にて、同速度で反応糖化液を連続的に抜き取った。反応は、１０日間連続して行い、定法に従い、セロビオースおよびグルコース濃度を１日毎に測定し、また抜き出し量より各糖分の生成量を算出した。なお、加えたパルプに対するセロビオース収率は、約４９重量％であった。
【００８３】
［比較例２］
パルプ濃度が５重量％になるように溶解パルプ（日本製紙ケミカル（株）製）を投入した５００ｍｌの０．０５Ｍ濃度の酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１Ｌの三角フラスコに入れ、該水溶液にセルクラスト（ノボザイムズ（株）製）を対パルプ  １０重量％添加し、攪拌機により撹伴（２００ｒｐｍ）しつつ、恒温槽で５０℃に保温した状態にて、１０日間反応を継続した。定法に従い、セロビオースおよびグルコース濃度を１日毎に測定し、また内容量より各糖分の生成量を算出した。なお、パルプに対するセロビオース収率は、約２重量％であった。
【００８４】
［比較例３］
パルプ濃度が５重量％になるように溶解パルプ（日本製紙ケミカル（株）製）を投入した５００ｍｌの０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１Ｌの三角フラスコに入れ、該水溶液にセルクラスト（ノボザイムズ（株）製）を対パルプ  １０重量％添加し、２０℃で１２０分間撹伴（２００ｒｐｍ）し、その後、桐山ロートを用いセルロース分を回収した。セルラーゼが吸着された該セルロースを１Ｌ三角フラスコに投入し、５重量％となるように同緩衝液を入れ、５０℃に保温した。パルプスラリーを攪拌機により撹伴（２００ｒｐｍ）しつつ、１０日間反応を継続した。定法に従い、セロビオースおよびグルコース濃度を１日毎に測定し、また内容量より各糖分の生成量を算出した。なお、パルプに対するセロビオース収率は、約３重量％であった。
【００８５】
［比較例４］
パルプ濃度が５重量％になるように溶解パルプ（日本製紙ケミカル（株）製）を投入した５００ｍｌの０．０５Ｍ濃度の酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に、セルクラスト（ノボザイムズ（株）製）を対パルプ１０重量％添加した反応液を、β−グルコシダーゼが反応系内に残存するよう分画分子量  １００００のポリスルフォン平膜をセットした攪拌機付き限外ろ過器（平膜型）に投入し、攪拌機の回転数２００ｒｐｍ、５０℃に保温した。前述の溶解パルプを１２時間毎に２．５ｇ（乾燥重量）添加しつつ、２０ｍｌ／ｈｒの速度で、同緩衝液を連続的に添加する一方、限外ろ過器を０．１〜０．３ＭＰａに加圧調整することにより、同速度で反応糖化液を連続的に抜き取った。反応は、１０日間連続して行い、定法に従い、セロビオースおよびグルコース濃度を１日毎に測定し、また抜き出し量より各糖分の生成量を算出した。なお、加えたパルプに対するセロビオース収率は、約４２重量％であった。
【００８６】
実施例４〜１０および比較例の試験結果を表３に、実施例及び比較例の反応系内のセルロース濃度の経時変化を表４に示す。
【００８７】
【表３】
2006204294.tif 000004
【００８８】
【表４】
2006204294.tif 000005
【００８９】
表３より明らかなように、本発明によるとセロビオース濃度の高い反応糖化液を容易にかつ連続的に採取出来ることが判明した。また、セルラーゼに含まれるβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分を予め吸着させたセルロースを用いることにより、より効率的にセロオリゴ糖（セロビオース）を製造出来ることを見出した。また、実施例７〜１０の結果から、基質として用いるセルロースに予めフィブリル化処理、アルカリ処理、メカノケミカル処理を施した場合には、セルロースの反応性が向上し、反応初期の段階からセロビオース濃度が高くなり、反応効率が上がることがわかった。
表４より、比較例１〜４のように、反応途中で基質の添加を行わない場合や、β−グルコシダーゼを系内から排出しない場合は、セルロース濃度を１重量％以上に保つことができなくなり、セロオリゴ糖の生成率は減少するのに対し、実施例１〜７ではいずれも、反応開始から１０日後もセルロース濃度を保持することができることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本発明の主な態様の反応系の概略を示す図である。
【図２】本発明の主な態様の反応系の概略を示す図である。
【図１】
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【図２】
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