(57)【要約】      （修正有）【課題】ベネズエラウマ脳炎（VEE）ウイルスから弱毒化ワクチンを作製する事により、異種免疫原を発現する免疫応答の誘発方法を提供する。【解決手段】被験対象を病気から防御する方法は、免疫原性効果を発揮する量の組換えVEEウイルスを被験対象に投与することを含む。VEEウイルスは異種DNA断片を含み、異種DNA断片は、被験対象を病気から防御する効果を持つ免疫原性タンパク質またはペプチドをコードしているDNAに機能できるように結合された、被験対象内で作用するプロモーターを含む。好ましいプロモーターはVEE26Sサブゲノムプロモーターであり、好ましい免疫原はウイルス免疫原である。本発明の実施に有用な新しい弱毒化突然変異も開示されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチンとして使用するための組換えベネズエラウマ脳炎（VEE）ウイルスであって、被験対象を病気から防御する効果を持つ免疫原性タンパク質またはペプチドをコードしているRNAに機能できるように結合されたプロモーターを含む異種RNA断片を含み、かつ少なくとも１つの弱毒化突然変異を含む組換えベネズエラウマ脳炎（VEE）ウイルスであって、前記免疫原性タンパク質またはペプチドが、前記VEEウイルスの構造タンパク質とは別個のタンパク質またはペプチドとして発現する組換えVEEウイルス。
【請求項２】
前記病気がウイルス性疾患である請求項１記載の組換えVEEウイルス。
【請求項３】
前記免疫原性タンパク質またはペプチドが、インフルエンザ免疫原、レンチウイルス免疫原、コロナウイルス免疫原、フラビウイルス免疫原から成るグループから選択される請求項１または請求項２に記載の組換えVEEウイルス。
【請求項４】
前記異種RNAが少なくとも１キロベースの長さである請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の組換えVEEウイルス。
【請求項５】
前記異種RNAがインフルエンザ免疫原をコードしている請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の組換えVEEウイルス。
【請求項６】
前記異種RNAがインフルエンザウイルス血球凝集素（HA）表面タンパク質をコードしている請求項５に記載の組換えVEEウイルス。
【請求項７】
前記異種RNAがレンチウイルス免疫原をコードしている請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の組換えVEEウイルス。
【請求項８】
前記異種RNAがコロナウイルス免疫原をコードしている請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の組換えVEEウイルス。
【請求項９】
前記異種RNAがフラビウイルス免疫原をコードしている請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の組換えVEEウイルス。
【請求項１０】
前記異種RNAがウマ感染性貧血ウイルス免疫原をコードしている請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の組換えVEEウイルス。
【請求項１１】
前記プロモーターがベネズエラウマ脳炎ウイルス26Sサブゲノムプロモーターである請求項１ないし請求項１０のいずれかに記載の組換えVEEウイルス。
【請求項１２】
（ｉ）ウイルスRNAヌクレオチドの３番目におけるＧからＣへの突然変異、
（ii）E1領域における弱毒化突然変異、および／または、
（iii）E2領域における弱毒化突然変異
を含む群から選ばれる少なくとも１つの弱毒化突然変異を含む請求項１に記載の組換えVEEウイルス。
【請求項１３】
少なくとも１つの弱毒化突然変異が、弱毒化突然変異を特定するE2アミノ酸の76番目のコドン、弱毒化突然変異を特定するE2アミノ酸の209番目のコドン、弱毒化突然変異を特定するE2アミノ酸の120番目のコドン、ウイルスRNAヌクレオチドの３番目におけるＧからＣへの突然変異、弱毒化突然変異を特定するE1アミノ酸の272番目のコドン、弱毒化突然変異を特定するE1アミノ酸の81番目のコドン、および弱毒化突然変異を特定するE1アミノ酸の253番目のコドンから成るグループから選択される請求項１２に記載の組換えVEEウイルス。
【請求項１４】
薬剤学的に許容可能な担体中に有効な免疫原性量の請求項１〜１３のいずれかに記載の組換えVEEウイルスを含む医薬製剤。
【請求項１５】
ウイルス性ワクチンの製造のための、請求項１〜１３のいずれかに記載の組換えVEEウイルス、または請求項１４に記載の医薬製剤の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に弱毒化生ワクチンに関するもので、特にベネズエラウマ脳炎（VEE）ウイルスから作製される弱毒化ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
弱毒化生ワクチンは、ウイルス疾患を抑制する最も成功率の高い手段の１つである。しかし、一部のウイルス性病原体に関しては、生のウイルス株による免疫感作は実行不可能か、安全性に問題がある。それに代わる一方法は、このような病原体の免疫感作抗原をコードしている遺伝子を、別のウイルスのワクチン株に挿入する方法である。しかし、現在の所、利用可能なこのような系は比較的少ない。
【０００３】
Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 2679（1992）（非特許文献１）は、インフルエンザ血球凝集素タンパク質の先端の切れた形状のもの（truncated form）を発現するSindbisウイルス構成物を報告している。構成物は、in vitroおよびマウスにおいて、抗原のプロセシングと発現を研究するために使用されている。感染対抗量は検討されていないが、このような構成物を利用して、防御作用を持つＢ細胞とＴ細胞を介する免疫を誘発できる可能性も示唆されている。考察の章の最後のパラグラフには次のように記されている。「SINがヒト用ワクチンとして認可される可能性は低いが、本研究においてSINに用いられた方法と類似の方法を、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの弱毒化株のように、類似の複製法によりウイルスを利用する弱毒化生ワクチン株の開発に応用できるかも知れない（Davis et al. より引用）」。出願人が知る限り、Sindbisベクターの問題点は、異種挿入断片がベクター内で不安定で、ベクターから「排斥」される点であり、挿入断片の安定性を得るための実用的な限界値は約１kbである。
【０００４】
Davis et al.の米国特許第5,185,440号（特許文献１）は、ワクチン作製に使用するためにその中に組み入れることができるVEEウイルスと弱毒化突然変異をコードしているcDNAを報告している。サブゲノムの発現系の使用は示唆も開示もされていない。
【０００５】
【特許文献１】米国特許第5185440号明細書(1993)
【非特許文献１】Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 2679（1992）
【非特許文献２】Davis et al., Virology 183:20（1991）
【発明の開示】
【０００６】
本発明の第１の点は、病気の予防方法（被験対象を病気から防御する方法）である。この方法は、有効な免疫原性量の組換えベネズエラウマ脳炎（VEE）ウイルスを被験対象に投与することを含み、VEEウイルスは少なくとも１つの弱毒化突然変異（典型的には２つまたは３つの異なる弱毒化突然変異）を含み、またVEEウイルスは異種RNA断片を含む。異種RNA断片は、被験対象を病気から防御する効果を持つ免疫原性タンパク質またはペプチドをコードしているRNAに機能できるように結合した被験対象内で機能できるプロモーターを含む。異種挿入断片は、選択により、そのものが弱毒化突然変異として作用する。
【０００７】
好ましい一実施例において、VEEウイルスの異種RNA断片は、病原性微生物のゲノムに由来する。本実施例によれば、免疫原性タンパク質またはペプチドをコードしているRNAに機能できるように結合したプロモーターを含む異種RNA断片は、病原性微生物による疾患から被験対象を防御するのに有効である。
【０００８】
本発明の第二の点は、感染性ベネズエラウマ脳炎（VEE）ウイルスRNA転写物をコードしているcDNAクローンと、cDNAクローンの上流に位置し、機能できるようにcDNAクローンに結合している異種プロモーターとを含み、更に、弱毒化突然変異を特定するE1アミノ酸の272番目のコドン、弱毒化突然変異を特定するE1アミノ酸の81番目のコドン、弱毒化突然変異を特定するE1アミノ酸の253番目のコドンから成るグループから選択される少なくとも１つの弱毒化突然変異を含むDNAである。
【０００９】
本発明の第三の点は、感染性ベネズエラウマ脳炎（VEE）ウイルスRNA転写物をコードしているcDNAクローンと、cDNAの上流に位置し、機能できるようにcDNAクローンに結合している異種プロモーターとを含み、更に、（a）弱毒化突然変異を特定するE1アミノ酸の253番目のコドンである第一の弱毒化突然変異遺伝子と（b）不活化されたE3アミノ酸の56から59番目の切断認識部位である第二の弱毒化突然変異を含むDNAである。
【００１０】
本発明の更なる点は、本明細書中に示されるcDNAによりコードされている感染性VEEウイルスRNA転写物、このようなRNA転写物を含む感染性VEEウイルス粒子、および薬剤学的に許容可能な担体中に免疫原性を発揮する有効量のこのような感染性VEEウイルス粒子を含む医薬製剤を含む。
【００１１】
Frolov et al., 第9回国際ウイルス学会議会報、グラスゴー、スコットランド、1993年8月8〜13日、67ページ（Proceedings IXth International Congress of Virology, Glasgow, Scotland, Augst 8-13, 1993, pg. 67)には、Ｂ型肝炎ウイルス抗原タンパク質を発現する組換えVEEウイルスが検討されており、弱毒化VEEウイルスである、株230の利用が報告されている。しかし、弱毒化ウイルスそのもののヒトへの投与は示唆されていない。反対に、これらのウイルスは、抗原性Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質そのものを組織培養において作製し、次いでタンパク質を収集し、ヒトに投与するために利用されている。株230そのものは、ヒトにおいて複製するとしても僅かである。
【００１２】
本発明の前記およびその他の目的と内容に関しては、下記の明細書に詳細に説明されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
生のベネズエラウマ脳炎（VEE）ウイルスをコードしている相補的DNA配列と、それと同物質を含む薬剤学的に許容可能な医薬製剤は公知である。例えば、N. Davis et al. の米国特許第5,185,440号を参照（出願者は、本明細書中で引用されている全ての特許を引用することによって本明細書にすべて組み込むことを、特に意図している）。
【００１４】
本明細書に使用されている「弱毒化突然変異」と「弱毒化アミノ酸」という言葉は、本技術における標準的用語によれば（例えば、B. Davis et al., Microbiology, 132（第3版、1980年参照）、突然変異が置換による突然変異であろうと、フレーム内欠失突然変異であろうと、その宿主内で病気を引き起こす確率を低下させるような（すなわち病原性の喪失）、ヌクレオチドの突然変異またはそのような突然変異を起こすようにコードされたアミノ酸を意味する。「弱毒化突然変異」という言葉から、ウイルスにとって致死的となり得る突然変異は除外される。公知のVEE弱毒化突然変異の例には、弱毒化突然変異を特定するE2アミノ酸の76番目のコドン、弱毒化突然変異を特定するE2アミノ酸の209番目のコドン、弱毒化突然変異を特定するE2アミノ酸の120番目のコドン（例えば、N. Davis et al. の米国特許第5,185,440号を参照）、ウイルスRNAヌクレオチドの３番目におけるＧからＣへの突然変異が含まれる。
【００１５】
本発明を実施するために利用できる本明細書に開示されている新しい弱毒化突然変異には、弱毒化突然変異（好ましくは置換による突然変異、例えばトレオニンまたはセリン、最も好ましくはトレオニンの置換）を特定するE1アミノ酸の272番目のコドン、弱毒化突然変異（好ましくは置換による突然変異、例えばイソロイシンまたはロイシン、最も好ましくはイソロイシンの置換）を特定するE1アミノ酸の81番目のコドン、弱毒化突然変異（好ましくは置換による突然変異、例えばセリンまたはトレオニン、最も好ましくはセリン）を特定するE1アミノ酸の253番目のコドンが含まれる。
【００１６】
弱毒化VEEウイルスをコードしているcDNAクローンの中に一緒に挿入できる新しい弱毒化突然変異の組み合わせは、（a）弱毒化突然変異を特定するE1アミノ酸の253番目のコドンである第一の弱毒化突然変異、および（b）不活化されたE3アミノ酸の56から59番目の切断認識部位である第二の突然変異である。この弱毒化突然変異の組み合わせの利点は、不活化された切断部位そのものが、ウイルスにとって致命的である点である。従って、もしもE1アミノ酸の253番目の弱毒化突然変異が毒性を持つ野生型に戻ったとしても、残りの突然変異がウイルスを死滅させる。E3アミノ酸56から59番目の切断認識部位は、適切な方法のいずれによっても不活化できる。切断認識部位は全体または一部を欠失できる。置換による突然変異はその中で起こり得る（例えば、アミノ酸59におけるアルギニンからアスパラギン酸への置換による突然変異）。
【００１７】
弱毒化突然変異は、部位指定当然変異誘起法などの適切な方法により生のVEEをコードしているcDNAに導入できる（例えば、Kunkelの米国特許第4,873,192号を参照）。
【００１８】
免疫原性タンパク質またはペプチド、または「免疫原」は、微生物、細菌、原生動物、寄生虫、ウイルス性疾患を含むが、これらに限定されない疾患から、被験対象を防御するのに適した免疫原となり得る。例えば、免疫原はインフルエンザウイルス免疫原（例、インフルエンザ血球凝集素（HA）表面タンパク質、またはウマインフルエンザウイルス免疫原）、またはレンチウイルス免疫原（例、ウマ感染性貧血ウイルス免疫原、HIV-1免疫原またはHIV-2免疫原等のヒト免疫不全ウイルス（HIV）免疫原）。免疫原はコロナウイルス免疫原（例、ブタの伝染性胃腸炎ウイルス免疫原、またはニワトリの感染性気管支炎）、またはフラビウイルス免疫原（例、黄熱病ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免疫原）も可能である。所望であれば、本発明の利点は、上記の免疫原をコードしているDNAを含む異種挿入断片は、比較的大きくてもよいことで、少なくとも１kbの長さが可能である。
【００１９】
プロモーターは、好ましくは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの26Sサブゲノムプロモーターである。この定義は、プロモーターとしての活性が保持されている限り、その欠失突然変異等のこのプロモーターの誘導体を含むことを意図している。
【００２０】
本明細書に開示されている弱毒化生ウイルスとワクチン処方製剤を投与できる被験対象には、ヒトと動物（例えば、ウマ、ロバ、ブタ、マウス、ハムスター、サル、ニワトリ）の両者が含まれる。
【００２１】
本発明のワクチン製剤は、本明細書に開示されている免疫原性量の弱毒化生ウイルスと薬剤学的に許容可能な担体を含む。「免疫原性量」とは、免疫応答を惹起するのに十分な弱毒化ウイルスの量であり、特に、そのウイルスを投与された被験対象において、そのウイルスが保持する異種DNAによってコードされているタンパク質またはペプチドに対する免疫応答を惹起するのに十分な弱毒化ウイルスの量である。投与を受ける被験対象の年齢と種によって異なるが、１回の投与につき約101〜105プラーク形成単位の量の生ウイルスが適切である。薬剤学的に許容可能な担体の例として、発熱物質を含まない滅菌水と発熱物質を含まない無菌的な生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書に開示されている弱毒化生ウイルスの投与は、トリの場合には卵内注入によるが、非経口注入（腹腔内、皮下または筋肉内注入等）と気道表面へのウイルスの局所塗布（典型的には医薬製剤により実施される）の両方が可能である。ウイルスの気道への局所塗布は、鼻腔内投与により（例えば、医薬製剤を鼻腔内に蓄積させる点鼻器、綿棒、または吸入装置の使用により）実施できる。ウイルスの気道への局所塗布は、例えばエーロゾル懸濁液のようなウイルスを含む吸入可能な粒子の医薬製剤（固体粒子と液体粒子の両者を含む）を調製し、次いで吸入可能な粒子を被験対象に吸入させることによる、吸入投与によっても実施できる。吸入可能な粒子の医薬製剤を投与するための方法と装置は公知であり、いずれの従来の技術でも利用できる。例えば、D. Leithの米国特許第5,304,125号、C. Davis and R. Snyderの米国特許第5,299,566号、Fisher and W. Metzgerの米国特許第5,290,550号、R. Boucherの米国特許第5,292,498号を参照。
【実施例】
【００２３】
以下の具体例は本発明を説明するためのもので、それらを限定することを目的とするものではない。
【００２４】
［実施例１：「第二のプロモーター」発現ベクターの作製］
VEEのTRD株、pV3507由来であり、E2遺伝子内に３つの弱毒化突然変異を含む完全な長さのcDNAクローンを本研究において使用した。Davis et al., Virology 183:20（1991）（非特許文献２）に報告されているように、突然変異はE2の76番目のリジン、E2の120番目のリジンおよびE2の209番目のリジンに生じる。cDNAクローンは、Tth111Iで消化され、大腸菌DNAポリメラーゼのクレノウ断片により平滑末端に変換され、次いでEcoRIで消化される。3.9kbの断片が単離され、その後、HindIIIによる消化、クレノウ断片による処理、次いでEcoRIで消化されたM12 mp19 RF（増殖型）DNAと結合される。得られたM13ファージである、TE3はpV3507の構造遺伝子領域を含んでいたが、26Sプロモーター領域は含んでいなかった。HindIII部位は、結合時に再生された。ファージ由来の一本鎖DNAは、TE3による大腸菌CJ236（dut-ung-）の形質転換後に作製され、Kunkel、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488（1985）によって概説された手順により、以下の挿入断片（太字）を得るためにデザインされた合成オリゴヌクレオチドと共に使用された。
【化１】
2006006335.tif 000002
（配列番号１）Kinney et al., Virol. 170:19（1989）によって同定されたように、挿入配列を挟む領域は、完全な長さのVEE配列に基づき、ヌクレオチドの数によって同定された。
【００２５】
正しい挿入断片は、まずファージRF DNAのClaI消化によるスクリーニングによって同定され、一本鎖ファージDNAのE1遺伝子と3'非翻訳領域の間の結合部分の配列決定によって確認された。
【００２６】
その後、pV3507構造遺伝子と挿入された第二の26Sプロモーターを含むDNA断片は、HindIIIとEcoRIを用いて、pUC118の中にサブクローニングされた。HindIIIとEcoRI部位は消化により除去され、その後クレノウ断片により平滑末端に変換され、再結合され、pUC118第２のプロモータークローンが形成された。
【００２７】
開始AUGコドンを欠失している1.5kbのSalI-SalI「スタッファー（stuffer）」断片が、TR5000の完全な長さのSindbisクローンの糖タンパク質遺伝子領域から単離され（Schoepp et al., Virology 193:149（1993）により同定）、Cla12アダプタープラスミドのSalI部位の中に挿入された。ClaI部位によって挟まれたマルチクローニング部位（mcs）を含むCla12プラスミドが、Hughes et al., J. Virol. 61:3004（1987）によって同定された。
【００２８】
ClaIを用いて、挿入されたTR5000配列を含むマルチクローニング部位が、pUC118の第二のプロモータークローンのユニークなClaI部位の中にクローニングされた。SalIによる消化と自己結合により、図１に示す構造を持つシャトルベクターが生成された。
【００２９】
その後、３つの弱毒化突然変異を含む生存可能な完全な長さのVEEの第二のプロモーター発現ベクターが調製された。シャトルベクターから単離された、ウイルスの構造遺伝子の一部、つまり、挿入された下流の第二のプロモーターと3'非翻訳領域を含む3.4kbのAf1II-NotI断片を使用して、pV3507の完全な長さのクローンの相同なAf1II-NotI領域を置換した。形質転換体はClaIによりスクリーニングされた。ClaI部位を含むプラスミドは、ユニークなNotI部位で線状化され、T7 RNAポリメラーゼを用いてin vitroで転写された。転写物は、α-32P-標識UTPの取り込みにより定量された。その後、細胞単層は、陽イオンリポソーム（Lipofectin、BRL）を用いて転写物によりトランスフェクトされ、次いでプラーク形成の分析のために、アガロースで覆われた。転写物は、毒性のあるpV3000親クローンから生成されたものと同等の特異的感染力を持っていたことから、それらが完全に感染力があったことが示された。図２ａ〜２ｃはダブルプロモーターベクターを示している。図２ｂは、下流の第二のプロモーター発現ベクターの１つであるpV4002の図である。
【００３０】
［実施例２：インフルエンザHA遺伝子を含む発現ベクターの構成］
PGem4のBamHI部位の中にクローニングされたインフルエンザ株PR/8のHA遺伝子の完全なコーディング配列は、ウィスター研究所のAndy Caton博士から入手した。HA配列を含む1.7kbのBamHI断片は、BamHIにより消化された、脱燐酸化されたシャトルベクターDNAに結合された。V4002 DNAは、ClaIにより切断され、脱燐酸化された。その後、HA配列を含むClaI断片が、シャトルベクターから精製され、V4002 DNAを調製するために結合された。第二の26Sプロモーターの下流にあるマルチクローニング部位にHA遺伝子を含むクローンが、HpaIによる消化を利用して同定された。コーディング（pV4002HA）および非コーディング（pV4002AH）オリエンテーションの両方を含むクローンが同定された。これらのクローンからの転写物の特異的感染力のテストにより、これらが親転写物と同等の感染力を持つが、これらのHA含有ゲノムは幼若ハムスターの腎臓（BHK）細胞単層により小さなプラークを形成することが示された。これらの結果から、E2に３つの弱毒化突然変異と挿入された1.7kbのHA遺伝子を含むVEE発現ベクターは、なお複製能力を有しているが、挿入断片を持たないベクターよりもゆっくりと増殖するように見えることが明らかにされた。
【００３１】
［実施例３：組織培養における複製中のHA含有ベクターの安定性試験］
Sambrook et al., Molecular Cloning pp 7.39-7.52に報告されているように、VEEに特異的なプローブまたはHAに特異的なプローブを用いたノザンブロットにより、ベクター感染細胞から得られた全RNAをHA配列を含むサブゲノムRNA転写物を分析した。精製された細胞質RNAはグリオキシル化され、0.01Mの燐酸ナトリウム（pH7）を含むアガロースゲル上で電気泳動にかけられ、7.5Mの水酸化ナトリウムを含むBiotransナイロンメンブラン（Biotrans nylon membrane, ICN）に移された。VEEに特異的な32P-標識リボプローブは、pGEM3転写ベクターであるPGEM19におけるVEE糖タンパク質領域（nt 9493から10486）のサブクローンを用いて作製された。ウィスター研究所のAndy Caton博士から入手したpGEM4 HAクローンを使用して、HAに特異的な32P-標識リボプローブを作製した。（使用されたHAクローンは、１つのヌクレオチドが欠失しており、その結果先端の切れた（tluncated）タンパク質が翻訳された。この突然変異により、サブゲノムのHA含有ウイルスRNAは検出されたが、このベクターからのタンパク質の発現を検出することができなくなった。）２枚の膜をそれぞれどちらか一方のプローブとハイブリッド形成させ、乾燥させ、Ｘ線フィルムに露光した。結果を図３に示す。レーンＡとＤは、E2に３つの弱毒化突然変異を含むVEE株を感染させた細胞から得られた全細胞質RNAを含む。レーンＢとＥは、第二のサブゲノムプロモーターに続いてコーディングオリエンテーションのインフルエンザHA遺伝子（V40012HA）を含む同じ突然変異株を感染させた細胞から得られた全細胞質RNAを含む。レーンＣとＦは、非コーディングオリエンテーションでインフルエンザHA遺伝子（V40012AH）を含むVEEベクターにより感染させた細胞から得られた全細胞質RNAを含む。レーンＡ、Ｂ、Ｃは、遺伝子HA遺伝子の一部に相補的な32P-標識リボプローブを用いてプローブされた。レーンＤ、Ｅ、Ｆは、VEE糖タンパク質遺伝子の一部に相補的な32P-標識リボプローブを用いてプローブされた。リボゾームRNAマーカーの位置は、臭化エチジウムにより染色された平行なレーンにおいて決定された。VEEゲノムの長さのRNA（40S）はこの実験では検出できなかった。
【００３２】
結果から、V4002HAベクターとV4002AHベクターの両者の欠失突然変異が組織培養における複製中に生じていたことが示された。しかし、V4002HAを感染させた細胞内の幾つかのサブゲノムRNAはなおHA配列を含んでおり、これらの大部分が、完全なHA遺伝子を含めることができるサイズであった。結果から、挿入された配列が多少不安定なことが明らかにされた。
【００３３】
［実施例４：培養BHK細胞における２つの弱毒化突然変異を持つ下流のプロモーター発現ベクターからのインフルエンザPR/8HA遺伝子の発現］
pBR322のHindIII部位にクローニングされたインフルエンザPR/8由来のHA遺伝子の完全なコーディング配列は、Mt.Sinai医科大学のP. Palese博士から入手した。HA含有HindIII断片は、HindIIIで切断され、脱燐酸化されたシャトルベクターに結合された（図１参照）。次に、これらのHA配列をコーディング（V4036a）および非コーディング（V4036e）の両オリエンテーションで、２つの弱毒化突然変異、E2 lys 209とE1 thr 272を持つVEEの第二のプロモーター発現ベクターに挿入するために、CalIが使用された。これらのクローンからin vitroで転写されたRNAは、HA遺伝子を持たない親クローンからのRNAと同等の特異的感染力を示した。陽イオンリポソームによるBHK細胞の転写後に得られたウイルスを含む上清は、小さいプラークと大きなプラークの両方を含んでおり、時間の経過と共に大きなプラークの比率が増大した。V4036eよりもコーディングオリエンテーションでHAを持つV4036aの方が、大きなプラークの変異型の比率が大きかった。
【００３４】
卵で成長させたインフルエンザウイルス（PR/8株）、コーディングオリエンテーションでHA遺伝子を持つ第二のプロモーター発現ベクター、または挿入断片を持たないベクターのいずれかを、BHK細胞単層に感染多重度１で感染させた。感染後６時間目に、細胞単層を−20℃でメタノール：アセトン（1:1）により固定し、風乾した。西洋ワサビペルオキシダーゼ、ビオチン−アビジン検出システム（Vector Labs）を用いて、HAに特異的なモノクローナル抗体、またはVEEに特異的な超免疫マウス腹水を一次抗体として用いて、細胞のウイルス抗原の存在をテストした。次に細胞をメイヤーズヘマトキシリン（Meyer's hematoxylin）により対比染色した。インフルエンザPR/8またはコーディングHAベクターを感染させた細胞単層は、HAに関して陽性の染色を示した。結果を図４ａ〜４ｄに示す。図４ａは、インフルエンザPR/8を感染させ、抗HA抗体で染色した細胞を示す。図４ｂは、VEEHA-ベクターを感染させ、HA抗体で染色した細胞を示す。図４ｃは、挿入断片を含まないVEEベクターを感染させ、抗VEE抗体で染色した細胞を示す。図４ｄは、挿入断片を含まないVEEを感染させ、抗HA抗体で染色した細胞を示す。
【００３５】
HAベクターを感染させた細胞におけるHA染色は、細胞質染色で、これらの条件下で、インフルエンザを感染させた対照実験の単層のHAの染色と同程度の強さであった。これらの結果は、インフルエンザHAは、この抗HAモノクローナル抗体により検出可能な形態で、第二の26Sプロモーターから正常レベルで発現させることが可能であり、挿入された遺伝子を含む感染性VEEウイルスが作製可能であることを示している。
【００３６】
［実施例５：マウスにおけるインフルエンザ投与に対する防御作用］
４週令のCD-1マウスの各後肢肉趾に、1×104pfuの（1）希釈液（PBA）のみ、（2）HAを発現する二重に弱毒化されたベクター（V4036a）、または（3）挿入断片を含まないワクチンベクターを皮下接種した。３週間後、マウスに105EID50（50％卵感染量）のインフルエンザウイルスを鼻腔内投与した。結果を図５ａ〜５ｃに報告する。24匹の対照マウス全てが重度の疾患に罹り、50％が死亡した。12匹のHAベクターを接種されたマウスの内１匹だけが死亡し、もう１匹が疾病の徴候を１日示してから、回復した。
【００３７】
インフルエンザウイルス投与前の抗インフルエンザ血清IgGエリザ力価が測定され、結果が図６に示されている。HAベクターを接種されたマウスにおける抗HA血清IgGの数学的平均エリザ力価は246であり、対照マウス24匹中３匹から得られた血清だけが検出可能な力価を示し、それらは検討された最低希釈率（1:50）においてのみ陽性であった。インフルエンザウイルス投与により発病した２匹のHAベクター接種マウスは、抗HA IgGが検出されなかった。従って、12匹中10匹のマウスにおいて、HAベクターは検出可能な濃度の抗HA血清IgGを惹起し、12匹中11匹のマウスが致命的なインフルエンザ投与から防御された。
【００３８】
［実施例６：マウスにおけるインフルエンザ投与に対する防御作用］
４週令のCD-1マウスの各後肢肉趾に、1×104pfuの（1）希釈液（PBA）のみ、（2）HAを発現する二重に弱毒化されたベクター（V4036a）、または（3）挿入断片を含まないワクチンベクターを皮下接種した。３週間後、マウスに105EID50（50％卵感染量）のインフルエンザウイルスを鼻腔内投与した。インフルエンザウイルス投与４日後に肺を切除した。肺組織をPBS＋0.1％BSAの中にホモゲナイズし、20％懸濁液を得た。遠心分離し、アリコートに分けて、−70℃で凍結した。各動物の２つのアリコートを0.1％のトリプシンを含むアガロースの下でMDCK細胞のpfuを分析した。HAベクターで前もって免疫感作されたマウスの肺には、1.25×102pfu/gm 組織（25pfu／平均的肺）の検出レベルでは、インフルエンザ感染力は検出されなかった。測定可能なウイルス力価を持つ対照群の動物に関して計算された数学的平均力価（固体の点によって表される）は、PBS接種マウスに関しては3.04×106pfu/gm、VEEベクターのみを接種されたマウスに関しては1.93×106pfu/gmであった。結果を図７に示す。結果は、ワクチン投与された動物における非常に低レベルの投与ウイルスの複製を示唆している。
【００３９】
上記は、本発明を説明するものであり、それを制限するためのものではない。本発明は、以下の請求項と、そこに含まれるべき請求項と同等物によって定義される。
【００４０】
【化２Ａ】
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【化２Ｂ】
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【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、シャトルベクターの構造図である。シャトルベクターは、3.2kb pUC118プラスミドの中に、E2遺伝子内に３つの弱毒化突然変異を持つVEEの構造遺伝子と、E1のＣ末端の下流に直接挿入されている第二の26Sプロモーターとマルチクローニング部位を含む。
【図２】図２ａ〜２ｃは、ダブルプロモーターベクターを示している。
【図３】図３は、弱毒化VEE突然変異体を感染させた幼若ハムスター腎臓（BHK）細胞の細胞内RNA全体のノザンブロット分析である。突然変異体は、第二のサブゲノムプロモーターの下流に挿入されたHA遺伝子を含むか、あるいは非コーディングオリエンテーションでもって挿入されたHA遺伝子を含む。
【図４】図４ａ〜４ｄは、VEEベクターを感染させたBHK細胞単層の免疫細胞化学染色を示す。細胞は、インフルエンザPR/8/34、完全なインフルエンザHA遺伝子を含むVEEベクター、挿入断片を含まないVEEベクターのいずれかに感染させた。
【図５】図５ａ〜５ｃは、鼻腔内投与によりインフルエンザウイルスを投与された、接種を受けたマウスにおいて観察された臨床症状のグラフである。マウスは、PBS、挿入断片を含まないVEEベクター、あるいは完全なインフルエンザHA遺伝子を含むVEEベクターのいずれかを接種された。
【図６】図６は、接種を受けたマウスから得られた血清のウイルス投与前の抗インフルエンザIgGエリザ（ELISA）の力価を示すグラフである。マウスは、PBS、挿入断片を含まないVEEベクター、あるいは完全なインフルエンザHA遺伝子を含むVEEベクターのいずれかを接種された。
【図７】図７は、インフルエンザ投与４日後の、接種を受けたマウスの肺組織に観察された生存可能なインフルエンザウイルスの力価のグラフである。マウスは、PBS、挿入断片を含まないVEEベクター、あるいは完全なインフルエンザHA遺伝子を含むVEEベクターのいずれかを接種された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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