(57)【要約】   【課題】 試料中に含まれる過酸化水素を簡単に除き、その後の酵素反応により生成した過酸化水素を高精度で検出する。  【解決手段】 水溶液を一定流量で送液する機構と、前記水溶液中に一定量の測定対象物質を注入する機構を備え、該注入機構の下流に、過酸化水素電極と過酸化水素電極上流近傍に水溶液中に含まれる物質の酸化還元反応を触媒し、過酸化水素を生成する酵素固定化体を備え、酵素反応に伴う過酸化水素の濃度変化を前記過酸化水素電極で検出することにより前記測定対象物質の濃度を算出する装置において、前記注入機構と過酸化水素生成酵素固定化体の間に、水熱処理後に焼成もしくは焼結処理を加えたカオリナイト系セラミックスを充填したカラムを挿入したことを特徴とする分析装置。  【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液を一定流量で送液する機構と、前記水溶液中に一定量の測定対象物質を注入する機構を備え、該注入機構の下流に、過酸化水素電極と過酸化水素電極近傍に水溶液中に含まれる物質の酸化還元反応を触媒し、過酸化水素を生成する酵素固定化体を備え、酵素反応に伴う過酸化水素の濃度変化を前記過酸化水素電極で検出することにより前記測定対象物質の濃度を算出する装置において、前記注入機構と過酸化水素生成酵素固定化体の間に、水熱処理後に焼成もしくは焼結処理を加えたカオリナイト系セラミックスを充填したカラムを挿入したことを特徴とする分析装置。
【請求項２】
カオリナイト系セラミックスに過酸化水素生成反応に関与しない酵素を固定化し、該固定化体の下流に過酸化水素生成酵素固定化体を配置したことを特徴とする請求項１記載の分析装置。
【請求項３】
カオリナイト系セラミックス原料を水熱処理後に焼成もしくは焼結処理を行うことを特徴とする過酸化水素を分解するカオリナイト系セラミックスの製造方法。
【請求項４】
カオリナイト系セラミックスの過酸化水素生成反応に関与しない酵素を固定化するための担体としての使用
【請求項５】
カオリナイト系セラミックスを過酸化水素生成反応に関与する固定化酵素の上流に配置することを特徴とする、サンプル中に含まれる過酸化水素を除去する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過酸化水素を検知することにより物質濃度を定量する機構を備えたフロー方式分析装置において、簡単かつ安価に妨害成分の除去を実現し、高精度分析を可能とする装置を開示するものである。
【背景技術】
【０００２】
電気化学的検出器を利用した分析装置は、装置構成が単純であり、高感度かつ高精度分析が可能であることから多用されている。特に白金、カーボン、金などの固体電極をアノーディックに分極して、試料中の過酸化水素を分析する方法は、小型化が容易である、応答速度が速い、非常に高感度が得られるなどの利点がある。そこで過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素固定化体と組み合わせて、酵素の特異性を利用したバイオセンサが数多く提案されている。
【０００３】
しかし、過酸化水素は生体内の活性酸素の不均化反応や、還元性物質の酸化に伴って生成する可能性があり、微量の過酸化水素が正の誤差を生じる問題がある。
【０００４】
従来、不必要な過酸化水素をカタラーゼ等の酵素反応により除去することが知られているが、この方法は酵素の使用による分析コストの上昇をまねき、かつ時間がかかるという欠点があった。
【０００５】
また、酵素反応を介さない過酸化水素電極と、酵素反応で生成した過酸化水素を検知する電極を組み合わせて使用し、過酸化水素単独の応答を演算処理により除くことも提案されているが、装置構成が複雑になるとともに、微量の物質定量を行う際に誤差を大きくする問題点があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の技術において、過酸化水素検出により物質を定量する場合、試料中に含まれる過酸化水素自体が妨害成分となるが、それを簡単に除き、その後の酵素反応により生成した過酸化水素を高精度で検出することが困難であった。本発明はこの問題点を解決するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、水溶液を一定流量で送液する機構と、前記水溶液中に一定量の測定対象物質を注入する機構を備え、該注入機構の下流に、過酸化水素電極と過酸化水素電極近傍に水溶液中に含まれる物質の酸化還元反応を触媒し、過酸化水素を生成する酵素固定化体を備え、酵素反応に伴う過酸化水素の濃度変化を前記過酸化水素電極で検出することにより前記測定対象物質の濃度を算出する装置において、前記注入機構と過酸化水素生成酵素固定化体の間に、水熱処理後に焼成もしくは焼結処理を加えたカオリナイト系セラミックスを充填したカラムを挿入したことを特徴とする分析装置を開示する。
【０００８】
また、カオリナイト系セラミックスに過酸化水素生成反応に関与しない酵素を固定化し、該固定化体の下流に過酸化水素生成酵素固定化体を配置することが望ましい。
【０００９】
過酸化水素を分解するカオリナイト系セラミックスは、カオリナイト系セラミックス原料を水熱処理後に焼成もしくは焼結処理を行うことにより製造することができる。
【００１０】
さらに本発明は、カオリナイト系セラミックスの過酸化水素生成反応に関与しない酵素を固定化するための担体としての使用を開示する。
【００１１】
カオリナイト系セラミックスを過酸化水素生成反応に関与する固定化酵素の上流に配置することで、サンプル中に含まれる過酸化水素を除去することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、試料中に含まれる過酸化水素を簡単に除き、その後の酵素反応により生成した過酸化水素を高精度で検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
試料中の過酸化水素を除く方法の中で、迅速かつ再現性の良い方法を検討した結果、水熱反応後、焼成もしくは焼結したカオリナイト系セラミックスと試料を接触させることにより課題を解決できることを発見し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
粘土鉱物類を化学処理することにより、比表面積を増大させるなどの加工は古くから行われている。近年、水を高圧化で加熱し、臨界状態付近の水中で各種の反応を行わせることにより、さらに表面性状を改変する、いわゆる水熱反応処理も多用されるようになった。
【００１５】
カオリナイト系セラミックスの製造原料としては、天然カオリン、カオリナイト、ディッカイト、ナクライト、ハロイ石、耐火レンガなどが挙げられる。
【００１６】
天然カオリンなどの原料を酸性条件下で水熱反応処理すると一般的に比表面積が増大する。さらに水熱反応後、造粒を行い、焼結もしくは焼成を行ったものをカオリナイト系セラミックスという。比表面積を増大させることにより、酵素など生体触媒の固定化に利用できることは知られているが、カオリナイト系セラミックスが過酸化水素を効率よく分解できることは知られていない。
カオリナイト系セラミックスへの過酸化水素生成反応に関与しない酵素の固定化方法、或いは過酸化水素を生成する酵素のカオリナイト系セラミックス以外の担体への酵素の固定化方法としては、物理吸着法、イオン結合法、包括法、共有結合法などタンパク質の固定化方法として公知の方法を利用できるが、中でも共有結合法が長期安定性に優れ望ましい。タンパク質を共有結合させる方法としては、ホルムアルデヒド、グリオキザール、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド基を有する化合物を用いるか、多官能基性アシル化剤を利用する方法、スルフヒドリル基を架橋させる方法など各種の方法を利用できる。
【００１７】
カオリナイト系セラミックス表面にはシラノール基が露出しているので、該シラノール基にシランカップリング剤を反応させ、その末端にアミノ基を導入すると、多官能基性アルデヒドを用いて容易に酵素などの生体触媒を固定化できる。
【００１８】
過酸化水素生成酵素固定化体の形状としては、膜状に固定化し白金、金、カーボン等からなる電極上にのせることもできるし、セルロース、アガロース、キチン、カラギーナン、ポリアクリルアミド等の高分子有機材料、一般的な多孔質ガラス、セラミックス質等の無機材料等の公知の不溶性担体に固定化し、担体をカラムリアクターに充填して用いることもできる。
【００１９】
過酸化水素生成酵素固定化体に使用しうる酵素は、過酸化水素を生成する酵素であればよく、グルコースオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ等の過酸化水素を生成する酸化還元酵素が例示できる。
【００２０】
酵素固定化担体としてのカオリナイト系セラミックスの例として、トヨナイト２００（東洋電化工業社製）が例示でき、過酸化水素生成反応に関与しない酵素を固定化したトヨナイト２００をカラムリアクターに充填して用いることができる。
【００２１】
カオリナイト系セラミックス固定化体に使用しうる酵素は、過酸化水素生成反応に関与しない酵素であればよく、パパインやプロテイナーゼK等のタンパク質分解酵素、マルトースホスホリラーゼやインベルターゼ、β−ガラクトシダーゼ等過酸化水素生成反応に関与しない酵素が例示できる。これらの酵素は１種類でも良いし、２種類以上を組み合わせて固定化しても良い。
【００２２】
目的とする物質の検知に適当な酵素の組み合わせを選択し、これらの酵素固定化体を例えば図１の測定装置に組み込めばよい。緩衝液槽（１）より緩衝液をポンプ（２）により送液する。試料（５）にニードル（６）を挿入し、バルブ（９）を閉じ、バルブ（１０）を開けて、シリンジポンプ（１１）を引くことにより検体を計量バルブ（３）の計量ループ（４）に引き込む。次に計量バルブ（３）を切り替え、緩衝液によりループ（４）内に溜まった検体を押し出す。過剰の検体は一旦バルブ（９）を開けてバルブ（１０）を閉じ、洗浄液（８）をシリンジポンプ（１１）に引き込んだ後、バルブ（９）を閉じバルブ（１０）を開けて洗浄液を押し出すことにより、廃棄ポット（７）に押し出され、廃液ボトル（２０）に貯留される。注入された試料は緩衝液の流れにのって恒温槽（１２）内に設置された混合用配管（１３）を通り、温度調整と緩衝液との混合が行われ、カオリナイト系セラミックス酵素固定化カラム（２５）、過酸化水素生成酵素固定化カラム（１４）を順に通り、そこで生成した過酸化水素が過酸化水素電極（１５）で検知される。さらに背圧コイル（１８）をとおり廃液は廃液ボトル（１９）に溜まる。
【００２３】
２種以上の固定化酵素を使用する場合、緩衝液槽（１）は２種類以上の酵素反応に最適なｐＨを有する緩衝液を使用する。緩衝液としてはリン酸、酢酸、クエン酸等で酵素反応に最適なｐＨに合わせればよい。緩衝液に各種塩類や制菌剤を加えても良い。
【００２４】
カオリナイト系セラミックス酵素固定化カラム（２５）と過酸化水素生成酵素固定化カラム（１４）は恒温槽中に設置し、酵素反応に最適な温度で酵素反応を行わせても良い。
【００２５】
カオリナイト系セラミックス酵素固定化カラム（２５）と過酸化水素生成酵素固定化カラム（１４）に使用する酵素の組み合わせを選択することで、様々な物質の検出が可能になる。
・  乳糖の測定
カオリナイト系セラミックス酵素固定化カラム（２５）にβ−ガラクトシダーゼを固定化し、過酸化水素生成酵素固定化カラム（１４）にグルコースオキシダーゼを固定化する。図１の測定装置に固定化体を組み込んで試料を注入すると、試料中の乳糖はβ−ガラクトシダーゼによりグルコースに変換され、グルコースオキシダーゼにより生成したグルコースを過酸化水素に変換して検出すればよい。
・  スクロースの測定
カオリナイト系セラミックス酵素固定化カラム（２５）にインベルターゼとムタロターゼを固定化し、過酸化水素生成酵素固定化カラム（１４）にグルコースオキシダーゼを固定化する。（１）と同様に試料中のスクロースを過酸化水素に変換して検出すればよい。
・  糖化タンパク質中の糖化アミノ酸の測定
カオリナイト系セラミックス酵素固定化カラム（２５）にタンパク分解酵素を固定化し、過酸化水素生成酵素固定化カラム（１４）に糖化アミノ酸を過酸化水素に変換できるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを固定化する。これらの固定化体カラムを（１）と同様に組み込んで、試料をタンパク分解酵素でアミノ酸及び糖化アミノ酸に分解した後に、生成した糖化アミノ酸をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼで過酸化水素に変換して検出すればよい。
【００２６】
糖化タンパク質の中でも特に糖化ヘモグロビンは、糖尿病患者の長期間の血糖コントロールの指標に広く用いられている。糖化ヘモグロビンとはヘモグロビンに糖が非酵素的に結合した糖化タンパク質の一種で、中でも特にＨｂＡ１ｃと呼ばれる画分 はヘモグロビンＡのβ鎖Ｎ末端のバリン残基にグルコースがシッフ塩基を形成してアルジミン（不安定型）となり、さらにアマドリ転移を受けてケトアミン化合物を生成したものである。糖化ヘモグロビンの測定方法は多種多様であるが、酵素法は前記のように糖化タンパク質から糖化アミノ酸を何らかの手法で切り出した後、生じた糖化アミノ酸量を糖化アミノ酸オキシダーゼ等の酵素を用いて検出するものである。
【００２７】
糖化ヘモグロビン中の糖化アミノ酸を測定する際には、試料が血球や全血などであるので、生体内の活性酸素の不均化反応や還元性物質の酸化に伴って過酸化水素を生成する可能性があり、固定化酵素反応に由来しない微量の過酸化水素が正の誤差を生じることが問題となる。そこで、カオリナイト系セラミックス担体と試料を接触させることによって微量の過酸化水素を分解すると、より高精度で糖化アミノ酸を測定することができる。
【００２８】
また、糖化ヘモグロビン中の糖化アミノ酸の測定において、試料が血球や全血等のように過酸化水素電極を汚染して著しく感度が低下するものである場合には、注入機構（３，４，６）と過酸化水素生成酵素固定化体（１４）の間に半透膜等の分離機構を組み込み、連続的に汚染を防ぐのが好ましい。
【００２９】
このような機構を組み込んだ分析装置として図２の分析装置が考えられる。緩衝液槽（２１）より緩衝液Ｂをポンプ（２２）により送液し、試料（５）にニードル（６）を挿入し、バルブ（９）を閉じ、バルブ（１０）を開けて、シリンジポンプ（１１）を引くことにより検体を計量バルブ（３）の計量ループ（４）に引き込む。次に計量バルブ（３）を切り替え、緩衝液によりループ（４）内に溜まった検体を押し出す。過剰の検体は一旦バルブ（９）を開けてバルブ（１０）を閉じ、洗浄液（８）をシリンジポンプ（１１）に引き込んだ後、バルブ（９）を閉じバルブ（１０）を開けて洗浄液を押し出すことにより、廃棄ポット（７）に押し出され、廃液ボトル（２０）に貯留される。注入された試料は緩衝液Ｂの流れにのって恒温槽（１２）内に配置されたタンパク分解酵素のカオリナイト系セラミックス酵素固定化カラム（２５）を通り、試料中のタンパク質からフルクトシルアミノ酸を生成する。プロテアーゼの作用した試料はさらに下流に設置された透析モジュール（２６）に運ばれ、膜厚さ２０μｍ、分子量分画１２０００〜１４０００の再生セルロース膜で試料中の低分子成分のみがフルクトシルアミノ酸検出機構（１４,１５，１６，１７）に導かれる。なお、フルクトシルアミノ酸検出機構は（１４，１５）のみで構成されていてもよく（例えば、フルクトシルアミノ酸と過酸化水素電極の組み合わせ）、（１６，１７）は任意である。
【００３０】
緩衝液槽（１）より緩衝液Ａがポンプ（２）により送液されているので、透析モジュール（２６）で透析された試料中の低分子成分は第１の過酸化水素生成固定化酵素カラム（１４）、過酸化水素電極（１５）を通過し、第１の固定化酵素で生成した過酸化水素のみが検知される。さらに第２の過酸化水素生成固定化酵素カラム（１６）、過酸化水素電極（１７）を通過し、第２の固定化酵素で生成した過酸化水素のみが検知される。透析モジュール（２６）の透析膜を通過しなかった試料中の高分子成分は廃液ボトル（１９）に溜まる。
【００３１】
糖化タンパク質の中でも糖化ヘモグロビンの糖化アミノ酸、特にヘモグロビンβ鎖Ｎ末端のフルクトシルバリンを測定する場合、カオリナイト系セラミックス酵素固定化カラム（２５）には、糖化ヘモグロビンまたはそのフラグメントからＮ末端の糖化アミノ酸を生じる作用が大きいプロテアーゼを固定化するのがよく、アスペルギルス属のプロテアーゼが例示でき、アスペルギルス  オリゼ由来のアルカリ性プロテアーゼがより好ましい。アスペルギルス  オリゼ由来のアルカリ性プロテアーゼの固定化量は１〜２０ｍｇ／カラム、より好ましく５〜１０ｍｇ／カラムである。過酸化水素生成酵素固定化カラム（１４、１６）には、血清中に含まれるアルブミンが糖化されたものから、ε-アミノ基が糖化されたリジンが遊離してくる場合や、ヘモグロビンに含まれるリジン糖化物が妨害となる可能性があるので、ε-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用せず、α-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸に作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが好ましい。このような作用を有する酵素として、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが例示できる。
【００３２】
第１と第２の過酸化水素生成酵素としては、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼとアミノ酸オキシダーゼ（プロテアーゼの作用によりフルクトシルアミノ酸とともに生成する任意のアミノ酸のオキシダーゼ）の組み合わせが例示される。
【００３３】
タンパク質であるヘモグロビンはカオリナイト系セラミックス酵素固定化体のタンパク質分解酵素で分解されて、糖化アミノ酸を生成するとともに、試料中の妨害となる過酸化水素が分解される。生成した糖化アミノ酸を過酸化水素生成固定化体上のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼで過酸化水素を生成させ、アンペロメトリー等の電気化学的手法で過酸化水素を検知すればよい。
【００３４】
プロテアーゼ分解後の試料中の低分子成分分離機構（２６）で用いる半透膜は、プロテアーゼ分解の過程で共存すると考えられるペンタペプチドやヘキサペプチドやさらに大きなペプチド類が透過し難いもしくは透過せず、フルクトシルバリン及びアミノ酸が透過できるものであれば良い。用いる膜としては、再生セルロース製、アセチルセルロース製、ポリフッ化ビニリデン製などの透析膜が例示できる。透析膜の分子量分画は平衡透析を行った際に透過する最小分子量で表示される。一方分析用途に利用する場合は、透析の初速度の差で分離する場合が多く、必ずしも分画を希望する分子量と透析膜の性能表示が一致するとは限らない。本発明の目的には分画分子量３００以上５０万以下のものが利用できる。より好ましくは１０００以上１０万以下、さらに望ましくは１万以上２万以下のものが良い。
【００３５】
糖化ヘモグロビンを含む検体を処理する際に、検体を界面活性剤含有緩衝液と混合し、その混合された検体をアスペルギルス属タンパク質分解酵素が固定化された担体と接触させ、緩衝液流とともに分解処理された試料を得ることが望ましい形態である。
【００３６】
界面活性剤には、ヘモグロビンをプロテアーゼでアミノ酸及び糖化アミノ酸に分解する際に、２つの働きがある。溶血作用とヘモグロビン分子構造を変化させる作用である。ヘモグロビンは赤血球内に大部分が存在し、適切な濃度の界面活性剤存在下ではヘモグロビンが赤血球外に出てくる。また、ヘモグロビンは通常折りたたまれた状態で存在するが、適切な濃度の界面活性剤中では緩んだ状態で存在し、プロテアーゼによる分解が容易になると推測される。界面活性剤としては、非イオン系のポリオキシエチレンアルキルエーテル類[例えばポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル(トリトンX-100)、ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル等]やポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類[例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ツイーン４０）等]、陰イオン系のポリオキシエチレンアルキルエーテル類やアルキル硫酸塩［ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等）］、陽イオン系、両性イオン系があるが、陰イオン系界面活性剤が先に述べた２つの効果が高く、望ましい。その濃度は０．０１〜１０％、好ましくは０．０５〜５％である。
【実施例】
【００３７】
以下に実施例を挙げて、本発明の内容をさらに詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ 
（１）フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの製造
耐火レンガ（８０〜１００メッシュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうしてアミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデヒドに１時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ７．０、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で置き換え、この緩衝液をできるだけ除いておく。このホルミル化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（キッコーマン製）を１８ユニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液４００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムに充填しフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムとする。
（２）ウマミザイムＧ固定化カラム(トヨナイト)の製造
カオリナイト系セラミックス製の担体であるトヨナイト２００（平均粒径１７０μｍ、多孔質、東洋電化工業製）３００ｍｇを（１）と同様にしてアミノシラン化、ホルミル化する。このホルミル化したトヨナイトにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にウマミザイムＧ（アマノエンザイム製）を１００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液８００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムに充填しウマミザイムＧ固定化カラム(トヨナイト)とする。
（３）過酸化水素電極の製造
直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロン（登録商標）で被覆し、その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ硫酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）２０ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを０．２％になるように加える。この混合液を手早く先に用意した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥硬化する。これを過酸化水素電極とする。
【００３８】
また参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。
（４）測定装置
図２はウマミザイムＧ固定化カラムと透析モジュールを組み込んだフロー型のフルクトシルアミノ酸測定装置である。図２のカオリナイト系セラミックス酵素固定化カラム（２５）としてウマミザイムＧ固定化カラム（トヨナイト）を、第１の過酸化水素生成酵素固定化カラム（１４）としてフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムを各々配置した。本実施例では第２の過酸化水素生成固定化酵素カラム（１６）と過酸化水素電極（１７）は配置しない。緩衝液槽（２１）より緩衝液Ｂをポンプ（２２）により送液し、計量バルブ（３）を用いて試料１００μｌを注入する。注入された試料は緩衝液Ｂの流れにのって恒温槽（１２）内に配置されたウマミザイムＧ固定化カラム（トヨナイト）（２５）に運ばれて、ウマミザイムＧの作用により糖化アミノ酸を生成する。ウマミザイムＧが作用した試料は緩衝液Ｂの流れによってさらに下流に設置された透析モジュール（２６）に運ばれ、膜厚さ２０μｍ、分子量分画１２０００〜１４０００の再生セルロース膜で試料中の低分子成分のみがフルクトシルアミノ酸検出機構（１４,１５）に導かれる。緩衝液槽（１）より緩衝液Ａがポンプ（２）により送液されているので、透析モジュール（２６）で透析された試料中の低分子成分はフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラム（１４）と過酸化水素電極（１５）を通過し、試料中のフルクトシルアミノ酸から生成した過酸化水素を検知する。
【００３９】
この装置に流す緩衝液は、緩衝液Ａが１００ｍＭのリン酸、５０ｍＭの塩化カリウム、１ｍＭのアジ化ナトリウムを含み、ｐＨが８．０で流速が０．８ｍｌ／分である。緩衝液Ｂは５０ｍＭのリン酸、０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを含み、ｐＨが８．０で流速が０．８ｍｌ／分である。
恒温槽の温度は３７℃であった。
（５）ウマミザイムＧ固定化カラム(トヨナイト)の過酸化水素に対する応答
（４）の測定装置で、２、５、１０μＭの過酸化水素と２０、５０、１００μＭのフルクトシルグリシンの溶液を各１００μｌ注入し、検出値を得た。
【００４０】
得られた検量線を図３に示し、次式の検量線が得られた。ただし、Ｙは検出値（ｎＡ）、Ｘは試料中の濃度（μＭ）である。またｒは相関係数である。
【００４１】
過酸化水素検量線              Ｙ＝０．０００Ｘ＋０．０００
フルクトシルグリシン検量線    Ｙ＝０．１９０Ｘ＋０．００４    ｒ＝０．９９９９
フルクトシルグリシンに対しては良好な直線性が得られたが、過酸化水素に対する応答は全く得られなかった。トヨナイトは過酸化水素を分解することができる。
比較例１ 
（１）フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの製造
実施例１と同様にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（キッコーマン製）固定化カラムを作製した。
（２）ウマミザイムＧ固定化カラム(耐火レンガ)の製造
（１）と同様にして耐火レンガ１５０ｍｇをホルミル化する。このホルミル化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にウマミザイムＧ（アマノエンザイム製）を３０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液３５０μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムに充填しウマミザイムＧ固定化カラム(耐火レンガ)（２５）とする。
（３）過酸化水素電極の製造方法
実施例１と同様に過酸化水素電極を作製した。
（４）測定装置
実施例1と同様の測定装置でウマミザイムＧ固定化カラム（トヨナイト）に（２）で作製したウマミザイムＧ固定化カラム(耐火レンガ)を組み込んだ。
（５）ウマミザイムＧ固定化カラム(耐火レンガ)の過酸化水素に対する応答
（４）の測定装置で、２、５、１０μＭの過酸化水素と２０、５０、１００μＭのフルクトシルグリシンの溶液を各１００μｌ注入し、検出値を得た。
【００４２】
得られた検量線を図４に示し、次式の検量線が得られた。ただし、Ｙは検出値（ｎＡ）、Ｘは試料中の濃度（μＭ）である。またｒは相関係数である。
【００４３】
過酸化水素検量線              Ｙ＝０．１１５Ｘ−０．０３０    ｒ＝０．９９９７
フルクトシルグリシン検量線    Ｙ＝０．１６７Ｘ−０．０４５    ｒ＝０．９９９７
直線性は良好であり、トヨナイトとは異なり、過酸化水素に対して応答が得られた。
実施例２
（１）フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの製造
実施例１と同様にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（キッコーマン製）固定化カラムを作製した。
（２）ウマミザイムＧ固定化カラム(トヨナイト)の製造
実施例1と同様にウマミザイムＧ（アマノエンザイム製）をトヨナイトに固定化し、ウマミザイムＧ固定化カラム（トヨナイト）を作製した。
（３）過酸化水素電極の製造方法
実施例１と同様に過酸化水素電極を作製した。
（４）測定装置
図２の測定装置を使用し、第２の過酸化水素生成固定化酵素カラム（１６）、過酸化水素電極（１７）は配置せず、カオリナイト系セラミックス酵素固定化カラム（２５）にウマミザイムＧ固定化カラム（トヨナイト）、第１の過酸化水素生成固定化酵素カラム（１４）にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラム、過酸化水素電極（１５）を配置した。
（５）プロテアーゼ固定化カラム(トヨナイト)による糖化ヘモグロビンの測定
実施例１でカオリナイト系セラミックス（トヨナイト）が過酸化水素を分解できることが示され、比較例２にヘモグロビンを分解した際に試料中に正の妨害を与える過酸化水素が存在することが示されているので、糖化ヘモグロビンの測定にトヨナイトを適用する。
【００４４】
（４）の測定装置のカオリナイト系セラミックス固定化酵素カラム（２５）にウマミザイムＧ固定化カラム（トヨナイト）を組み込み、ヘモグロビンの溶血液を１００μｌ注入する。ヘモグロビンはプロテアーゼカラム（２５）でフルクトシルアミノ酸及びアミノ酸にまで分解されるとともに、溶血液中の過酸化水素がトヨナイトで分解される。生成したフルクトシルアミノ酸及びアミノ酸等の低分子成分は、半透膜を介して検出系に導かれる。透析されたフルクトシルＬ−バリンはフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定カラム（１４）で過酸化水素を生成し、生成した過酸化水素を過酸化水素電極（１５）で検出する。
【００４５】
ヘモグロビン溶液は、ヒトヘモグロビン（シグマ社製）をヘモグロビン濃度が３０ｍｇ／ｍｌとなるように所定量を秤量し、ドデシル硫酸ナトリウム２％を含む２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８．０に溶解して調製した。
【００４６】
３０ｍｇ／ｍｌのヒトヘモグロビン溶液中のフルクトシルバリン濃度を（４）の測定装置で測定すると、フルクトシルバリンは１５．１μＭであった。
【００４７】
プロテアーゼ固定化担体にトヨナイトを適用することによって試料中の過酸化水素及び電極活物質の妨害を除き、試料中のフルクトシルアミノ酸濃度を正確に測定できた。
比較例２ 
（１）フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムの製造
実施例１と同様にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（キッコーマン製）固定化カラムを作製した。
（２）過酸化水素電極の製造方法
実施例１と同様に過酸化水素電極を作製した。
（３）測定装置
図２の測定装置を使用し、カオリナイト系セラミックス酵素固定化カラム（２５）と第１の過酸化水素固定化酵素カラム（１４）は配置せず第２の過酸化水素生成酵素固定化カラム（１６）にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラムと過酸化水素電極（１５，１７）を配置した。
（４）標準ヘモグロビンプロテアーゼ処理液から生成する過酸化物
ヒトヘモグロビン溶液をプロテアーゼで一定温度、所定時間処理し、（３）の測定装置でプロテアーゼ処理液１００μｌを注入する。プロテアーゼ処理液中の低分子成分は半透膜を介して検出系に導かれ、試料中の過酸化水素は第１チャンネルの過酸化水素電極（１５）で、フルクトシルアミノ酸は第２チャンネルのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ固定化カラム（１６）と過酸化水素電極（１７）で検出される。
【００４８】
ヒトヘモグロビンのプロテアーゼ処理液は、実施例２と同様にしてヒトヘモグロビン（シグマ社製）をヘモグロビン濃度が３０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した後、プロテアーゼであるウマミザイムＧ（天野エンザイム製）を１ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で所定時間反応させる。
【００４９】
８、１７、２５、３３、４２、５１分間反応後、（４）の測定装置で試料中の過酸化水素とフルクトシルアミノ酸を検出した。結果を図５に示した。いずれの反応時間でも１μＭ程度の過酸化水素が検出でき、フルクトシルアミノ酸の検出に過酸化水素電極を用いる場合にはヘモグロビンの溶血液やプロテアーゼから生成する過酸化水素が妨害となることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】測定装置の概略図
【図２】透析を行う測定装置の概略図
【図３】実施例１で得られた検量線
【図４】比較例１で得られた検量線
【図５】比較例２の過酸化水素とフルクトシルアミノ酸の検出結果
【符号の説明】
【００５１】
１  緩衝液槽
２  緩衝液送液ポンプ
３  計量バルブ
４  計量ループ
５  試料管
６  試料吸引ニードル
７  廃棄ポット
８  洗浄液槽  
９  バルブ
１０  バルブ
１１  シリンジポンプ
１２  恒温槽
１３  混合用配管
１４  第１の固定化酵素カラム
１５  過酸化水素電極
１６  第２の固定化酵素カラム
１７  過酸化水素電極
１８  背圧コイル
１９  廃液ボトル
２０  廃液ボトル
２１  緩衝液槽
２２  緩衝液送液ポンプ
２３  ダンパー
２４  恒温化用配管
２５  カオリナイト系セラミックス酵素固定化カラム
２６  透析モジュール
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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