(57)【要約】【課題】  均一な粒径を有する金属化合物ナノ粒子が形成された金属化合物ナノ粒子を得るための方法を提供する。【解決手段】  まず、図２に示すように、ステップ１では、塩酸、りん酸水素一ナトリウム溶液、アポフェリチン溶液、インジウム溶液を用意する。次にステップ２において、塩酸、りん酸水素一ナトリウム溶液、アポフェリチン溶液、インジウム溶液を添加し、反応溶液を調整する。この後、反応溶液を１８時間放置する。【選択図】  図１
2006008436.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属イオンの化合物からなるナノ粒子であって、生体物質の空洞部内に形成されたことを特徴とするナノ粒子。
【請求項２】
金属イオンの化合物からなるナノ粒子であって、タンパク質の空洞部内に形成されたことを特徴とするナノ粒子。
【請求項３】
請求項１または２に記載のナノ粒子において、上記金属イオンが三価の金属イオンであることを特徴とするナノ粒子。
【請求項４】
請求項１または２に記載のナノ粒子において、上記金属イオンがIｎ３＋またはＴｉ３＋であることを特徴とするナノ粒子。
【請求項５】
三価の金属イオン溶液とタンパク質溶液とｐＨ緩衝剤を調整するステップ（ａ）と、上記溶液を混合することによって、上記タンパク質に上記金属イオンの化合物からなるナノ粒子を内包させるステップ（ｂ）とを含むナノ粒子の製造方法。
【請求項６】
Ｉｎ３＋またはＴｉ３＋溶液とタンパク質溶液とｐＨ緩衝剤を調整するステップ（ａ）と、上記溶液を混合することによって、上記タンパク質に上記金属イオンの化合物からなるナノ粒子を内包させるステップ（ｂ）とを含むナノ粒子の製造方法。
【請求項７】
請求項５または６に記載のナノ粒子の製造方法において、上記タンパク質はアポフェリチン、Ｄｐｓタンパク質、べん毛タンパク質、ＣＣＭＶまたはＴＭＶのうちいずれか一つであることを特徴とするナノ粒子の製造方法。
【請求項８】
請求項5から７のいずれかに記載のナノ粒子の製造方法において、上記金属イオンは、Ｉｎ３＋またはＴｉ３＋であることを特徴とするナノ粒子の製造方法。
【請求項９】
Ｉｎ３＋溶液と、タンパク質溶液と、塩酸と、りん酸水素一ナトリウムを調整するステップ（ａ）と、上記溶液を混合することによって、上記タンパク質に上記金属イオンの化合物からなるナノ粒子を内包させるステップ（ｂ）とを含むナノ粒子の製造方法。
【請求項１０】
Ｔｉ３＋溶液と、タンパク質溶液と、りん酸水素一ナトリウムと、りん酸二水素ナトリウムを調整するステップ（ａ）と、上記溶液を混合することによって、上記タンパク質に上記金属イオンの化合物からなるナノ粒子を内包させるステップ（ｂ）とを含むナノ粒子の製造方法。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載のナノ粒子の製造方法において、上記タンパク質はアポフェリチン、Ｄｐｓタンパク質、べん毛タンパク質、ＣＣＭＶまたはＴＭＶのうちいずれか一つであることを特徴とするナノ粒子の製造方法。
【請求項１２】
ナノ粒子とタンパク質とから構成されるナノ粒子−タンパク質複合体であって、上記タンパク質は、上記ナノ粒子を保持可能な保持部と、上記保持部と上記タンパク質の外部とを結ぶチャンネルを備え、上記ナノ粒子はＩｎ３＋またはＴｉ３＋の金属イオンの化合物から形成されていることを特徴とするナノ粒子−タンパク質複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はナノメートルサイズの粒径を有する粒子（本明細書では、ナノ粒子と称する）に関し、特に金属または金属化合物からなるナノ粒子を内包するナノ粒子−タンパク質複合体の作製方法、およびその関連技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ナノ粒子は化学では触媒作用を有する物質として、化粧品では紫外線除去作用を有する物質として、電子デバイスでは高密度ストレージデバイスを作製するための物質及び、量子効果デバイスを作製するための物質として注目されている。
【０００３】
現在までにおけるナノ粒子作製方法は物理的方法及び、化学的方法などによりおこなわれている。例えば、物理的方法の一つとして、磁性体物質をミルで粉砕することにより数１００ｎｍの磁性体ナノ粒子を作製することにより広く使われている。また化学的方法としては有機高分子に親水基と疎水基をもつミセルと塩化金酸を混ぜ、塩化金酸を還元する方法がある。ここでは、ミセルが金粒子の成長を阻害することにより巨大化を防いでいる。
【０００４】
電子デバイスに応用するには直径が均一なナノ粒子を得ることが必須である。高密度ストレージデバイスを作製するには、磁性体ナノ粒子が接することなく密に並び、ナノ粒子一個が磁化される必要があるため、直径が均一な磁性体ナノ粒子が必要とされる。また、量子効果デバイスを作製するためには、ナノ粒子一個において、電子の取るエネルギーレベルが直径に依存するため、直径が均一な半導体や金属や金属化合物のナノ粒子が必要とされている。
【０００５】
しかし、従来の物理的及び化学的作製法では直径が均一なナノ粒子を作製が困難である。例えば物理的破砕法では数１０ｎｍサイズの作製が困難である。上記ミセルを使ったナノ粒子作製方法では粒径の大きさが均一でなく、大きさにばらつきがある。
【０００６】
そこで近年、生物学的手法を用いて均一なナノ粒子を作製する方法が開発されているが、その一つとして、金属化合物を保持する機能を有するタンパク質アポフェリチンに、金属または金属化合物を取り込ませ、ナノオーダーの均一なサイズのナノ粒子を作製しようという研究がある。ナノ粒子の用途に応じて、種々の金属あるいは金属化合物等をアポフェリチンに導入することで種々の金属あるいは金属化合物等のナノ粒子を作製すべく研究が進められている。
【０００７】
ここでアポフェリチンについて説明する。アポフェリチンは生物界に広く存在するタンパク質の一つであり、生体では微量で必須な元素である鉄の量を調節する機能を持っている。鉄もしくは鉄化合物を持つアポフェリチンはフェリチンと呼ばれる。鉄イオンは生体内で必要以上に存在すると生体にとって有害になるため、過剰となった鉄イオンはフェリチンとして生体内に貯蔵される。そしてフェリチンは生体内で鉄が不足すると鉄イオンを放出し、アポフェリチンとして生体内で存在する。
【０００８】
図１はアポフェリチンの構造を示す模式図である。図１に示すように、アポフェリチン１は１本のポリペプチド鎖から形成されるモノマーサブユニットが非共有結合により２４個集合した分子量約４６万の球状タンパク質であり、その直径は約１２ｎｍで、通常のタンパク質に比べ高い熱安定性と高いｐＨ安定性を示す。アポフェリチン１の中心には直径約７ｎｍの空洞状の保持部１２があり、外部と保持部１２とはチャンネル１１を介してつながっている。例えば、アポフェリチン１に二価の鉄イオンが取り込まれる際、鉄イオンはチャンネル１１から入り、一部のサブユニット内にあるｆｅｒｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｅｎｔｅｒ（鉄酸化活性中心）と呼ばれる場所で酸化された後、保持部１２に到達し、保持部１２の内表面の負電荷領域で濃縮される。そして、鉄原子は３０００〜４０００個集合し、フェリハイドライト(５Ｆｅ２Ｏ３・９Ｈ２Ｏ)結晶の形で保持部１２に保持される。保持部１２に保持された金属原子を含むナノ粒子の直径は、保持部１２の直径とほぼ等しく、約７ｎｍとなっている。
【０００９】
このアポフェリチンを用いて、人工的に鉄以外の金属や金属化合物を担持させたナノ粒子−アポフェリチン複合体が作製されている。
【００１０】
現在までに、アルミニウム（非特許文献１を参照）、ベリリウム（非特許文献２を参照）、コバルト（非特許文献３を参照）、マンガン（非特許文献４及び５を参照）、ウラン（非特許文献６を参照）、亜鉛（非特許文献７を参照）、ニッケル（非特許文献８を参照）、クロム（非特許文献８を参照）といった金属あるいは金属化合物のアポフェリチンへの導入が報告されている。これらの金属あるいは金属化合物からなるナノ粒子の直径も、アポフェリチンの保持部１２の直径とほぼ等しく約７ｎｍとなる。
【００１１】
【非特許文献１】J.Fleming、１９８７年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８４、７８６６−７８７０ページ
【非特許文献２】D.J.Price、１９８３年、J. Biol. Chem.、２５８、１０８７３−１０８８０ページ
【非特許文献３】T.Douglas および V.T.Starak、２０００年、Inorg. Chem.、３９、１８２８−１８３０ページ
【非特許文献４】P.Mackle、１９９３年、J. Amer. Chem. Soc.、１１５、８４７１−８４７２ページ
【非特許文献５】F.C.Meldrumら、１９９５年、J. Inorg. Biochem. ５８、５９−６８ページ
【非特許文献６】J.F.Hainfeld、１９９２年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８９、１１０６４−１１０６８ページ
【非特許文献７】D.Price および J.G.Joshi、１９８２年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、７９、３１１６−３１１９ページ
【非特許文献８】M.Okudaら、２００３年、Biotechnology and Bioengineering、８４、１８７−１９４ページ  自然界において、鉄原子を含むナノ粒子がアポフェリチン内に形成される過程の概略は次の通りである。
【００１２】
アポフェリチン１の外部と内部とを結ぶチャンネル１１（図１参照）の表面には、pH７〜８の条件下でマイナス電荷を持つアミノ酸が露出しており、プラス電荷を持っているＦｅ２＋イオンは静電相互作用によりチャンネル１１に取り込まれる。
【００１３】
アポフェリチン１の保持部１２の内表面には、チャンネル１１の内表面と同じく、pH７〜８でマイナス電荷を持つアミノ酸残基であるグルタミン酸残基が多く露出しており、チャンネル１１から取り込まれたＦｅ２＋イオンはferroxidase centerで酸化され、内部の保持部４へと導かれる。そして、静電相互作用により鉄イオンは濃縮されて、フェリハイドライト(５Fe2O3・９H2O)結晶の核形成が起こる。
【００１４】
その後、順次取り込まれる鉄イオンがこの結晶の核に付着して酸化鉄からなる核が成長し、直径７ｎｍのナノ粒子が保持部１２内に形成される。以上が、鉄イオンの取り込みと酸化鉄からなるナノ粒子形成の概略である。
【００１５】
なお、ここまで鉄イオンのアポフェリチンへの取り込みメカニズムについて述べたが、これまでに導入が報告されている他の金属イオンは、いずれもプラスイオンであることから、これらの金属イオンのアポフェリチンへの取り込みは、鉄イオンとほぼ同じメカニズムで進むと考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
しかしながら、これまでに上記の方法で、インジウム（以下Inと記す）やチタン（以下Ｔｉと記す）等の溶液中に三価で存在する金属を含む、直径が均一なナノ粒子を得ることは難しい。
【００１７】
本発明は上記課題を解決すためになされたものであり、均一な直径を有するナノ粒子を得るための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明のナノ粒子は、金属イオン化合物からなるナノ粒子であって、ｐＨ緩衝剤を含む溶液中において、タンパク質の空洞内に形成されたものである。
【００１９】
本発明によれば、直径がタンパク質の空洞部により規定されるので、直径が均一なナノ粒子が得られる。
【００２０】
上記金属は三価の金属イオンのいずれかである。
【００２１】
上記金属はＩｎ３＋またはＴｉ３＋のいずれかである。
【００２２】
本発明のナノ粒子の製造方法は、金属イオンと、タンパク質と、ｐＨ緩衝剤を調整するステップ（ａ）と、上記溶液を混合することによって、上記タンパク質に上記金属イオンの化合物からなるナノ粒子を内包させるステップ（ｂ）とを含む。
【００２３】
上記ｐＨ緩衝剤は混合後、Ｉｎ３＋またはＴｉ３＋の沈殿状態のｐＨを維持できれば良い。
【００２４】
上記ｐＨ緩衝剤は混合後、Ｉｎ３＋またはＴｉ３＋の沈殿点付近のｐＨを維持できればより好ましい。
【００２５】
上記ｐＨ緩衝剤はＩｎ３＋反応溶液において、塩酸と、りん酸水素一ナトリウムの混合溶液であることが好ましい。
【００２６】
上記ｐＨ緩衝剤はＴｉ３＋反応溶液において、りん酸水素一ナトリウムと、りん酸二水素ナトリウムの混合液であることが好ましい。
【００２７】
タンパク質はＤＮＡ情報から作製され、公知の方法で多数複製することは容易である。また、同じＤＮＡから多数複製されたタンパク質が、オングストロームの精度で同じ構造であることは周知である。このため、同じＤＮＡから複製されたタンパク質が有する空洞部は、全て同じ形状である。従って本発明によれば、直径がタンパク質の空洞により規定されるので、直径が均一なナノ粒子が得られる。
【００２８】
上記タンパク質は、アポフェリチン、Ｄｐｓタンパク質、べん毛タンパク質、ＣＣＭＶまたはＴＭＶのうちいずれか一つであってもよい。
【００２９】
上記金属は三価の金属イオンのいずれかである。
【００３０】
上記金属イオンはＩｎ３＋またはＴｉ３＋である。
【００３１】
本発明のナノ粒子−タンパク質複合体は、ナノ粒子とタンパク質から構成されるナノ粒子−タンパク質複合体であって、上記タンパク質は、上記ナノ粒子を保持可能な保持部と、上記保持部と上記タンパク質の外部とを結ぶチャンネルとを備え、上記ナノ粒子は、Ｉｎ３＋またはＴｉ３＋のいずれかの金属イオンの化合物から形成されている。
【００３２】
タンパク質はＤＮＡ情報から作製され、公知の方法で多数複製することは容易である。また、同じＤＮＡから多数複製されたタンパク質が、オングストロームの精度で同じ構造であることは周知である。このため、同じＤＮＡから複製されたタンパク質が有する空洞部は、全て同じ形状である。従って本発明によれば、直径がタンパク質の空洞により規定されるので、直径が均一なナノ粒子が得られる。このため、例えば本発明のナノ粒子−タンパク質複合体を基板上に配列し、タンパク質部分を除去する等の操作を行うことにより、基板上にナノ粒子からなる微細なドット体を形成することができる。このドット体は、例えば不揮発性メモリのフローティングゲートに利用することができる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、均一な直径を有するナノ粒子を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
（実施形態１）
以下、図１および図２を参照しながら本実施形態のナノ粒子の製造方法を説明する。
【００３５】
まず、図２に示すように、ステップ１では、ミリQ水、ｐＨ緩衝液、アポフェリチン溶液、インジウム塩溶液を用意する。
【００３６】
次に、ステップ２では、上記ステップ１で作製したミリQ水、ｐＨ緩衝液、アポフェリチン溶液、インジウム塩溶液を添加し、反応溶液を調整する。この後、反応溶液を１８時間放置する。
【００３７】
なお、以上に説明したインジウム−アポフェリチン複合体を作製するための操作はすべて、室温もしくはアポフェリチンが変性しない温度範囲にて、スターラーで攪拌しながら行なう。
【００３８】
上記の操作によって、アポフェリチン１の保持部１２に水酸化インジウム（Ｉｎ（ＯＨ）３）が導入され、Ｉｎ（ＯＨ）３のナノ粒子とアポフェリチンとの複合体（以下、インジウム−アポフェリチン複合体と称する）が形成される。
【００３９】
アポフェリチンを含めて、タンパク質はＤＮＡ情報から作製され、公知の方法で多数複製することは容易である。また同じＤＮＡから多数複製されたタンパク質が、オングストロームの制度で同じ構造であることは周知である。このため、本実施形態で用いるアポフェリチンが有する空洞の保持部は、全て同じ形状である。
【００４０】
従って、本実施形態のように、タンパク質内にナノ粒子を作製すれば、ナノ粒子の直径がタンパク質により規定されるので、粒径が均一な半導体ナノ粒子や磁性体ナノ粒子が得られる。例えば本実施形態では、ナノ粒子の直径は、アポフェリチンの保持部と同じ、７ｎｍになる。
【００４１】
なお、本実施形態ではタンパク質としてアポフェリチンを用いたが、アポフェリチンの代わりにＤｐｓタンパク質（直径９ｎｍであり、内部に直径４．５ｎｍの保持部を有する球殻状タンパク質）を用いれば、直径４．５ｎｍのナノ粒子を作製することができる。さらに、アポフェリチンの代わりにＣＣＭＶおよびＴＭＶ等のウイルスタンパク質などを用いても、それぞれのタンパク質が有する内部の保持部の形状に応じたナノ粒子を作製することができる。
【００４２】
また、本実施形態ではＩｎ（ＯＨ）３からなるナノ粒子を作製する場合について説明したが、Ｔｉ（ＯＨ）３からなるナノ粒子を作製する場合にも、本実施形態とほぼ同じ方法を適用することができる。
【００４３】
なお、Ｔｉ（ＯＨ）３からなるナノ粒子を作製する場合、本実施形態で用いたインジウム塩溶液の代わりに、チタン塩溶液を反応溶液中に混合する。他の条件は、本実施形態に述べたとおりである。
【００４４】
ここで、インジウム−アポフェリチン複合体が形成されるメカニズムを説明する。このメカニズムを、図３を参照しながら説明する。図３はインジウム−アポフェリチン複合体が形成されるメカニズムを説明するための模式図である。
【００４５】
本実施形態では三価のプラスイオンであるＩｎ３＋溶液を用いて反応溶液を作製している。図３に示すように、アポフェリチン１の保持部１２にはマイナスに帯電したアミノ酸残基が多数存在するので、反応溶液中の三価のプラスイオンであるＩｎ３＋イオンは、アポフェリチン空洞内に多数存在することになる。従ってアポフェリチン１の外側のＩｎ３＋イオン濃度よりアポフェリチン１の保持部１２のＩｎ３＋イオン濃度より高くなる。
【００４６】
溶液のｐＨは緩衝液により一定であるので、アポフェリチン保持部１２とアポフェリチン外側のｐＨは同じである。このため、Ｉｎ３＋の水酸化物の形成はＩｎ３＋イオン濃度が高くなると劇的に早くなり、不溶性の水酸化物を生じる。このためアポフェリチン１の外側のＩｎ３＋の水酸化物の形成反応に比べて、アポフェリチン１の保持部１２のＩｎ３＋の水酸化物の形成反応が早くなる。従ってアポフェリチン１の外側に生じるＩｎ３＋の水酸化物の沈殿にアポフェリチンが取り込まれる速度よりも、アポフェリチン１の保持部１２にＩｎ３＋の水酸化物のナノ粒子が形成される速度が非常に大きくなる。
【００４７】
このメカニズムは、Ｉｎ３＋に代えてＴｉ３＋とした場合にも適用することが可能であると考えられる。
【００４８】
なお、本実施形態では、緩衝液としてＩｎ３＋反応溶液では塩酸と、りん酸水素一ナトリウムとの混合液を用いている。またＴｉ３＋反応溶液では、りん酸水素一ナトリウムと、りん酸二水素ナトリウムを用いている。しかし、これに限定されず、ｐＨを調整するための手段は何であってもよい。例えば１種類の緩衝剤を含む緩衝液を用いてもよく、複数種の緩衝剤の混合溶液を緩衝液としても用いてもよい。特に、複数種の緩衝剤の混合溶液を緩衝液として用いる方が、１種類の緩衝剤を含む緩衝液を用いるよりも、反応溶液のｐＨの調節が容易になる。従って複数の緩衝剤を緩衝液として用いることが好ましい。
【００４９】
さらに、本実施形態では、インジウム塩溶液を用いているが、チタン塩溶液を用いて、チタン−アポフェリチン複合体を形成することもできる。
【００５０】
なお、本実施形態に示したナノ粒子の製造方法について、より具体的な反応溶液の条件等は、実施例の欄で後述する。
【００５１】
（実施形態２）
本実施形態では、上記実施形態１において作製されたインジウム−アポフェリチン複合体および、チタン−アポフェリチン複合体を利用して形成されるドット体をフローティングゲートとして含む不揮発性メモリセルについて説明する。
【００５２】
図４（ａ）〜図４（ｄ）は、本実施形態の不揮発性メモリセルの製造方法を示す工程断面図である。
【００５３】
まず、図４（ａ）に示す工程で、ｐ型Ｓｉ基板１０１上に、ＬＯＣＯＳ法により、活性領域を取り囲む素子分離酸化膜１０２を形成した後、基板上にトンネル絶縁膜として機能するゲート酸化膜１０３を熱酸化法によって形成する。その後、７ｎｍ程度の直径を有するインジウム化合物もしくはチタン化合物のナノ粒子からなるドット体１０４を基板上に形成する。
【００５４】
次に、図４（ｂ）に示す工程で、基板上に、スパッタ法またはＣＶＤ法により、ドット体１０４を埋めるＳｉＯ２膜を堆積する。
【００５５】
次に、図４（ｃ）に示す工程で、基板上にＡｌ膜を堆積する。続いて、フォトレジストマスクＰｒ１を用いて、ＳｉＯ２膜およびＡｌ膜のパターンニングを行なって電極間絶縁膜となるシリコン酸化膜１０５及び制御ゲート電極となるＡｌ電極１０６を形成する。このとき、ゲート酸化膜１０３のうちフォトレジストマスクＰｒ１で覆われていない部分は除去されるので、その上のドット体１０４をも同時に除去される。その後、フォトレジストマスク及び、Ａｌ電極１０６をマスクとして不純物イオンの注入を行って、第１、第２ｎ型拡散層１０７ａ、１０７ｂを形成する。
【００５６】
その後、図４（ｄ）に示す工程で、周知の方法により、層間絶縁膜１０８の形成と、層間絶縁膜１０８へのコンタクトホール１０９の開口と、コンタクトホール１０９内へのテングステンの埋め込みによるタングステンプラグ１１０の形成と、第一、第二アルミニウム配線１１１ａ、１１１ｂの形成とを行なう。
【００５７】
本実施形態では、基板としてｐ型Ｓｉ基板を用いたが、ｎ型Ｓｉ基板を用いてもよく、さらにＧａＡｓを始めとする化合物半導体その他の半導体により構成される基板を用いてもよい。
【００５８】
図４（ｄ）に示すように、本実施形態のメモリセル１００は、制御ゲートとして機能するＡｌ電極１０６と、ソースまたはドレインとして機能する第一、第二ｎ型拡散層１０７ａ、１０７ｂとからなるＭＯＳトランジスタ（メモリセルトランジスタ）を備え、フローティングゲートとして機能するドット体１０４に蓄えられた電荷の量で上記メモリトランジスタの閾値電圧が変化することを利用した不揮発性メモリセルである。
【００５９】
この不揮発性メモリセルは、二値を記憶するメモリとしての機能が得られるが、ドット体１０４に蓄えられる電荷の有無のみだけでなく、電荷の蓄積量を制御することで、三値以上の多値メモリを実現することもできる。
【００６０】
データの消去の際には、酸化膜を介したＦＮ（Ｆｏｗｌｅｒ−Ｎｏｒｄｈｅｉｍ）電流や直接トンネリング電流を利用する。
【００６１】
また、データの書き込みには、酸化膜を介したＦＮ電流や直接トンネリング電流あるいはチャネルホットエレクトロン（ＣＨＥ）注入を用いる。
【００６２】
本実施形態の不揮発性メモリセルでは、フローティングゲートが量子ドットとして機能できる程度に粒径の小さいインジウムナノ粒子もしくはチタンナノ粒子で構成されているので、電荷の蓄積量がわずかである。従って書き込み、消去の際の電流量を小さくでき、低消費電力の不揮発性メモリセルを構成することができる。
【００６３】
また、本実施形態の不揮発性メモリセルでは、フローティングゲートを構成する、インジウムナノ粒子もしくはチタンナノ粒子のサイズが均一であるため、電荷の注入、引き抜きの際の特性が各ナノ粒子間で揃っており、これらの操作において制御が容易に行なえる。
【実施例１】
【００６４】
本実施例では、まず、塩酸、リン酸水素一ナトリウム溶液、市販のアポフェリチン溶液、および硫酸インジウム溶液の各溶液を調製した。各溶液の濃度は、表１に示すとおりである。
【００６５】
【表１】
2006008436.tif 000003
【００６６】
次にミリQ水を用意し、表１の溶液を混合して、表２に示す組成の反応溶液を調整した。なお、ここでは３通りの塩酸濃度を有する反応溶液を調製している。このことによって、３種類のpHの反応溶液を調製した。
【００６７】
【表２】
2006008436.tif 000004
【００６８】
また、表２に示す組成の各反応溶液を、総体積３mLとする場合、水と表１の各溶液との添加量は、表３に示す通りである。
【００６９】
【表３】
2006008436.tif 000005
【００７０】
以上のように得られた３種類のpHの各反応溶液を、２３℃で１８時間放置した。その後、各溶液を８０００ｇで３０分遠心し、それぞれの上清を採取し、上清の状態を観察した。
【００７１】
次に、得られた各上清を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）用の観察グリッド上にのせ、各上清をろ紙でふき取り、さらに２％金グルコースを上記観察グリットにのせることでアポフェリチンを染色した。各染色されたアポフェリチンがある上記観察グリットを、透過型電子顕微鏡を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるアポフェリチンと、インジウム−アポフェリチン複合体を区別することができる。
【００７２】
各上清を透過型電子顕微鏡で観察したところ、塩酸濃度４０ｍＭである反応溶液において、ドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見えるインジウムのナノ粒子を内包したアポフェリチンが多数観察された。透過型電子顕微鏡で観察できたアポフェリチンの約５０％程度が、アポフェリチンの保持部にインジウムのナノ粒子を形成していた。塩酸濃度６０ｍＭである反応溶液ではアポフェリチンが多数観察された。塩酸濃度２０ｍＭである反応溶液ではアポフェリチンがインジウムと凝集しているものが多数観察された。
【００７３】
上記３種の反応溶液は塩酸濃度６０ｍＭである反応溶液では沈殿がなく、塩酸濃度４０ｍＭである反応溶液では僅かにＩｎ（ＯＨ）３沈殿が起こっており、塩酸濃度２０ｍＭである反応溶液ではではＩｎ（ＯＨ）３の沈殿が多数観察された。
【００７４】
以上の観察結果を、塩酸濃度とインジウムのナノ粒子形成と関係して表４に示す。なお、ナノ粒子の形成率は、上清中のアポフェリチンのうち、Ｉｎ（ＯＨ）３のナノ粒子を内包したアポフェリチン（すなわち、インジウム−アポフェリチン複合体）の割合である。
【００７５】
【表４】
2006008436.tif 000006
【００７６】
塩酸濃度４０ｍＭである反応溶液の上清を透過型電子顕微鏡で観察した結果を図５に示す。図５に示すように、ドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見えるＩｎ（ＯＨ）３のナノ粒子を内包したアポフェリチンが観察された。
【００７７】
表４の結果と溶液の沈殿から、アポフェリチンを含む溶液において、Ｉｎ（ＯＨ）３の沈殿点はｐＨ２．５であることが考えられる。沈殿点付近のｐＨになるとＩｎ３＋はＩｎ（ＯＨ）３として析出し、アポフェリチン内の保持部にナノ粒子を形成することができると考えられる。しかし実際にはアポフェリチンの沈殿凝集を生じさせることなくＩｎ（ＯＨ）３のナノ粒子を保持部に形成するのは沈殿点付近のｐＨに調整することが重要である。
【００７８】
本実施例では塩酸濃度６０ｍＭである反応溶液ではｐＨが２．３であったが、沈殿点はｐH２．５であるため、塩酸濃度６０ｍＭである反応溶液はＩｎ（ＯＨ）３のナノ粒子を形成することができなかったと考えられる。
【００７９】
一方、塩酸濃度２０ｍＭの反応溶液では、アポフェリチン内の保持部にナノ粒子を形成することができると考えられる。しかし実際には、アポフェリチンの沈殿凝集を生じさせることなくＩｎ（ＯＨ）３のナノ粒子を形成することは極めて困難であり、工業的に利用するのは現実的でないと考えられる。
【００８０】
ただし、表４に示すように、塩酸濃度が４０ｍＭである反応溶液の上清では、５０％のアポフェリチンの保持部にＩｎ（ＯＨ）３のナノ粒子が形成されており、アポフェリチンの凝集も抑制されていることから、工業的に利用できる。
【００８１】
本実施例では、塩酸とりん酸水素一ナトリウム溶液を用いているが、上記溶液はインジウムと会合作用がない。すなわち塩酸とりん酸水素一ナトリウム溶液のｐＨ緩衝作用のみにより、インジウム−アポフェリチン複合体が形成したことがわかる。
【実施例２】
【００８２】
本実施例では、まず、塩酸、リン酸水素一ナトリウム溶液、市販のアポフェリチン溶液、アンモニア水および硫酸インジウム溶液の各溶液を調製した。各溶液の濃度は、表５に示すとおりである。
【００８３】
【表５】
2006008436.tif 000007
【００８４】
次にミリQ水を用意し、表５の溶液を混合して、表６に示す組成の反応溶液を調整した。なお、ここでは３通りの塩酸濃度を有する反応溶液を調製している。このことによって、３種類のpHの反応溶液を調製した。
【００８５】
【表６】
2006008436.tif 000008
【００８６】
また、表６に示す組成の各反応溶液を、総体積３mLとする場合、水と表５の各溶液との添加量は、表７に示す通りである。
【００８７】
【表７】
2006008436.tif 000009
【００８８】
以上のように得られた３種類のpHの各反応溶液を、２３℃で１８時間放置した。その後、各溶液を８０００ｇで３０分遠心し、それぞれの上清を採取し、上清の状態を観察した。
【００８９】
次に、得られた各上清を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）用の観察グリッド上にのせ、各上清をろ紙でふき取り、さらに２％金グルコースを上記観察グリットにのせることでアポフェリチンを染色した。各染色されたアポフェリチンがある上記観察グリットを、透過型電子顕微鏡を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるアポフェリチンと、インジウム−アポフェリチン複合体を区別することができる。
【００９０】
各上清を透過型電子顕微鏡で観察したところ、すべての反応溶液において、いずれもドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見えるインジウムのナノ粒子を内包したアポフェリチンが多数観察された。
【００９１】
以上の観察結果を、アンモニア水とナノ粒子形成率との関係として表８に示す。なお、ナノ粒子の形成率は、上清中のアポフェリチンのうち、Ｉｎ（ＯＨ）３のナノ粒子を内包したアポフェリチン（すなわち、インジウム−アポフェリチン複合体）の割合である。
【００９２】
【表８】
2006008436.tif 000010
【００９３】
上記３種の反応溶液は塩酸濃度１００ｍＭと８０ｍＭである反応溶液では沈殿がなく、塩酸濃度６０ｍＭである反応溶液ではＩｎ（ＯＨ）３沈殿が多数観察された。
【００９４】
沈殿点を探索した結果、Ｉｎ（ＯＨ）３の沈殿点の２．７であった。上記実施例１に比べて沈殿点のｐＨが上昇した理由は、アンモニウムイオンがＩｎ３＋と錯体を形成し、Ｉｎ３＋を保護するためだと考えられる。この沈殿点のｐＨからやや低いｐＨ範囲がＩｎ（ＯＨ）３のナノ粒子を形成する適切なｐＨ範囲である。アンモニア水を用いた反応溶液の上清が、上記最適なｐＨ範囲にあるとき、アポフェリチンの凝集は抑えられており、アポフェリチン保持部にＩｎ（ＯＨ）３のナノ粒子が形成されていることを確認できた。
【００９５】
アンモニア水を用いた反応溶液の上清のｐＨが沈殿点のｐＨ２．７よりも上昇すると、アポフェリチンが凝集し、工業的に利用することが困難となる。またアンモニア水を用いた反応溶液の上清のｐＨがナノ粒子を形成する最適なｐＨ範囲よりも低くなるにつれて、ナノ粒子の形成は減少していった。
【実施例３】
【００９６】
本実施例では、まず、ＣＡＰＳＯ緩衝液、遺伝子工学的に作製したＬ鎖のみのアポフェリチンを溶解したＬ鎖アポフェリチン溶液、および硫酸インジウム溶液の各溶液を調製した。各溶液の濃度は、表９に示すとおりである。
【００９７】
【表９】
2006008436.tif 000011
【００９８】
次にミリQ水を用意し、表９の溶液を混合して、表１０に示す組成の反応溶液を調整した。
【００９９】
【表１０】
2006008436.tif 000012
【０１００】
また、表１０に示す組成の反応溶液を、総体積３mLとする場合、水と表９の各溶液との添加量は、表１１に示す通りである。
【０１０１】
【表１１】
2006008436.tif 000013
【０１０２】
以上のように得られた反応溶液を、２３℃で１８時間放置した。その後、溶液を８０００ｇで３０分遠心し、それぞれの上清を採取し、上清の状態を観察した。
【０１０３】
次に、得られた上清を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）用の観察グリッド上にのせ、上清をろ紙でふき取り、さらに２％金グルコースを上記観察グリットにのせることでL鎖アポフェリチンを染色した。各染色されたL鎖アポフェリチンがある上記観察グリットを、透過型電子顕微鏡を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、L鎖アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるL鎖アポフェリチンと、インジウム−L鎖アポフェリチン複合体を区別することができる。
【０１０４】
上清を透過型電子顕微鏡で観察したところ、ドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見えるインジウムのナノ粒子を内包したL鎖アポフェリチンが多数観察された。透過型電子顕微鏡で観察できたＬ鎖アポフェリチンの約５０％程度が、アポフェリチンの保持部にインジウムのナノ粒子を形成していた。
【０１０５】
反応溶液のｐHを測定すると２．９であった。CAPSO緩衝液の緩衝能力のあるｐHは９．０以上であるが、CAPSOが緩衝能力のあるｐHより低いｐH８．８であるためインジウム溶液を添加するとｐHが急激に低下していた。
【０１０６】
しかし、インジウムの沈殿点近くのｐHで、反応溶液のｐHが一定になったため、Iｎ（OH）３のコア形成がおこなわれたと考えられる。すなわち緩衝液の種類によらず、インジウムの沈殿点付近のｐHで反応溶液のｐHを維持できればインジウムナノ粒子の形成が可能であることがわかる。
【実施例４】
【０１０７】
本実施例では、まず、りん酸水素一ナトリウム溶液、りん酸二水素ナトリウム溶液、市販のアポフェリチン溶液、アンモニア水、および塩化チタン溶液の各溶液を調製した。各溶液の濃度は、表１２に示すとおりである。
【０１０８】
【表１２】
2006008436.tif 000014
【０１０９】
次にミリQ水を用意し、表１２の溶液を混合して、表１３に示す組成の反応溶液を調整した。
【０１１０】
【表１３】
2006008436.tif 000015
【０１１１】
また、表１３に示す組成の反応溶液を、総体積３mLとする場合、水と表１２の各溶液との添加量は、表１４に示す通りである。
【０１１２】
【表１４】
2006008436.tif 000016
【０１１３】
以上のように得られた反応溶液を、２３℃で１８時間放置した。その後、溶液を８０００ｇで３０分遠心し、それぞれの上清を採取し、上清の状態を観察した。
【０１１４】
次に、得られた上清を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）用の観察グリッド上にのせ、上清をろ紙でふき取り、さらに２％金グルコースを上記観察グリットにのせることでアポフェリチンを染色した。各染色されたアポフェリチンがある上記観察グリットを、透過型電子顕微鏡を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるアポフェリチンと、チタン−アポフェリチン複合体を区別することができる。
【０１１５】
上清を透過型電子顕微鏡で観察したところ、ドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見えるＴｉ（ＯＨ）３のナノ粒子を内包したアポフェリチンが多数観察された。
【０１１６】
反応溶液をＴｉ（ＯＨ）３の沈殿点付近のｐHとしているため、反応溶液はわずかに沈殿を起こしていた。
【０１１７】
本実施例の条件では、約３０％のアポフェリチン内にTi（OH）３のナノ粒子を確認した。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】アポフェリチンの構造を示す模式図である。
【図２】実施形態１のインジウム−アポフェリチン複合体の作製方法を表すフローチャートである。
【図３】インジウム−アポフェリチン複合体が形成されるメカニズムを説明するための模式図である。
【図４】図４（ａ）〜図４（ｄ）は、不揮発性メモリセルの製造方法を示す工程断面図である。
【図５】ナノ粒子の形成状態を表す電子顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【０１１９】
１  アポフェリチン
１１  チャンネル
１２  保持部
１００、１００‘  メモリセル
１０１  ｐ型Ｓｉ基板
１０２  素子分離酸化膜
１０３  ゲート酸化膜
１０４ａ  ドット体
１０４ｂ  ナノ粒子
１０５  シリコン酸化膜
１０６  Ａｌ電極
１０７ａ  第１ｎ型拡散層
１０７ｂ  第２ｎ型拡散層
１０８  層間絶縁膜
１０９  コンタクトホール
１１０  タングステンプラグ
１１１ａ  第１アルミニウム配線
１１１ｂ  第２アルミニウム配線
【図２】
2006008436.tif 000017
【図３】
2006008436.tif 000018
【図４】
2006008436.tif 000019
【図１】
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【図５】
2006008436.tif 000021