(57)【要約】【課題】微小管上にプローブとなる一本鎖DNAを修飾したDNAコンジュゲート微小管を開発した結果、選択性よく標的完全相補鎖DNAのみをハイブリダイゼーションすることができ、ハイブリダイゼーション後も、相補結合した標的DNAを移動させる分子モータシステムを提供する。【解決手段】  プローブDNAが微小管上に結合しているプローブDNAコンジュゲート微小管、キネシンが塗布された基板、緩衝液からなり、蛍光標識された標的DNAを含むサンプルDNAとプローブDNAコンジュゲート微小管とを反応させ、標的DNAがハイブリダイズされたDNAコンジュゲート微小管が、キネシンを塗布された基板上を移動することにより、選択的に目的の標的DNAを移動させる分子モータシステム。【選択図】  図３Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖のプローブDNAが微小管上に結合しているプローブDNAコンジュゲート微小管、キネシンが塗布された基板、緩衝液からなり、蛍光標識された標的DNAを含むサンプルDNAとプローブDNAコンジュゲート微小管とを反応させ、標的DNAがハイブリダイズされたDNAコンジュゲート微小管が、キネシンを塗布された基板上を移動することにより、選択的に目的の標的DNAを移動させる分子モータシステム。
【請求項２】
キネシンが塗布された基板上において、蛍光標識された標的DNAを含むサンプルDNAを一本鎖のプローブDNAコンジュゲート微小管と反応させる反応部位、移動したプローブDNAと相補結合した標的DNAを検出する検出部位が、通路で結ばれ、反応と移動と検出が緩衝液中で行われることを特徴とする請求項１に記載した分子モータシステム。
【請求項３】
基板がガラスであり、一本鎖のプローブDNAと微小管の結合が、アビジン化DNAとビオチン化微小管若しくは、ビオチン化DNAとアビジン化微小管により行われる請求項１又は請求項２に記載した分子モータシステム。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３のいずれかひとつに記載した分子モータシステムを用いて、移動した標的DNAを脱ハイブリダイゼーション（脱相補結合）して標的DNAを分離するDNAの精製方法。
【請求項５】
請求項１ないし請求項３のいずれかひとつに記載した分子モータシステムを用いて、移動した標的DNAを検出するDNAの検出方法。
【請求項６】
請求項１ないし請求項３のいずれかひとつに記載した分子モータシステムを用いて、移動させ１カ所に標的DNAを集中することで標的DNAを濃縮する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子モータシステムとその応用に関し、より詳しくは、DNAコンジュゲート微小管及びこれを移動させる基板を用いて、標的DNAを純度良く得ることができ、これに基づいて定性、定量分析をすることができる。
【背景技術】
【０００２】
生命活動は生体内のタンパク質が極めて複雑な反応を円滑に制御して営まれている。このタンパク質は、核内のデオキシリボ核酸(DNA)に書き込まれた遺伝情報によってその構造、機能が決定されている。重要な遺伝情報に欠陥があれば正常に機能するタンパク質の生成が起こらず重大な疾患を引き起こしてしまう。遺伝子解析を行うことは科学的興味に留まらず、個人にあった治療を行うテーラーメード医療、遺伝病の治療、ゲノム創薬など、実際に我々の生活に非常に恩恵をもたらす。基本的には遺伝子解析とは、興味のある遺伝子の片方の配列を準備しDNAが配列特異的に二重鎖を形成することを利用して、サンプル中のDNAとのハイブリダイゼーションを検出することでその存在を確認することである。遺伝子検出の際には、一塩基多型のようなたった1つの遺伝子配列の差異を判別する場合もあり、DNAチップの選択性が非常に重要になる。通常、プローブDNAを直接基板に固定化する方法が一般的であるが、この方法ではDNAが導入されない基板部分が標的DNAの非特異的吸着の要因となり、検出時のバックグラウンドが大きくなる。また均一系と異なり、基板表面でのハイブリダイゼーションは効率が低下してしまうことなどから結果の判別が困難となる。基板表面に機能するプローブDNAを導入することが重要で様々な工夫がなされたプローブDNA固定化法が提示されているが、これらは、特殊な基板の表面処理が必要、もしくは複数の煩雑な作業が必要になっている。
【０００３】
線維状のポリマーである微小管は、分子の運動を誘導する経路として細胞内の輸送機構に携わっている。分子の輸送は、微小管系モータータンパク質であるキネシン及びダイニンによって行われる。これらのタンパク質は、ATP加水分解によるエネルギーを利用して、微小管に沿って一方向に運動して特定の目的地に分子を輸送する。
直径24 nmの細胞骨格線維である微小管は細胞内で様々な役割を果たしている。例えば、微小管は神経細胞軸索の中を通っており、細胞体と神経末端の間で物質や膜小胞の双方向の輸送を可能にしている。微小管はGTP結合チューブリンタンパク質サブユニットからなる会合体である。各々のサブユニットは、α−チューブリンおよびβ−チューブリンのヘテロ二量体である。チューブリンは2つのGTP分子に2つの異なる部位で結合し、3つのチューブリンは、不変のグリシンリッチ領域を共有し、その領域はヌクレオチド結合部位の1つへのアクセスの制御に関与していると考えられる。
【０００４】
上記のキネシン-微小管系を用いて、目的物質を輸送させる研究が盛んに行われている。近年は、微小管を基板上に固定化し、キネシンの運動を観察する方法もあるが、微小管を固定化するのが難しい。そのため多くは、キネシンをガラス基板上に物理的に固定化させ、微小管を運動させるmotility assay(非特許文献１)が一般的に使用されている。
【０００５】
Gayatriらは、ガラス基板上に固定化されたプローブDNAと、アビジン結合微小管にビオチン化DNAを修飾したDNA結合微小管とのハイブリッド形成を行い、微小管のパターニングを行い、キネシンモーターを移動させた（非特許文献２）。
【０００６】
Bachandらは、ビオチン化微小管を用いて、アビジン化された量子ドットを微小管上に固定化し、輸送することに成功した（非特許文献３）。
【０００７】
微細加工技術を用いて、単一方向に微小管を運動させる報告もなされており、人工的に離れた別の場所に目的物質を輸送することは可能である（非特許文献４）。
【非特許文献１】Vale,R. D.; Reese, T. S.; Sheetz, M. P. Cell.1985, 42, 39-50.
【非特許文献２】Muthukrishnan, G.; Roberts, C.A.; Chen, Y.C.; Zahn,J. D.; Hancock, W. O. Nano lett.2004, 4, 2127-2132.
【非特許文献３】Bachand,G. D.; Rivera, S. B.; Boal, A. K.; Gaudioso, J.; Liu, J.; Bunker, B. C.; Nano Lett. 2004, 4, 817-821.
【非特許文献４】Hiratsuka, Y.; Tada, T.; Oiwa, K.;Kanayama, T.; Uyeda, T. Q. Biophys. J. 2001．81, 1555-1561.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
DNAチップは、タンパク質発現解析、一塩基多型検出など様々な遺伝子解析、診断に応用できることから非常に有用な道具として注目されている。従来のDNAチップは基板への非特異的吸着が原因で選択性に問題を抱えていた。この非特異的吸着をなくすことは、ハイブリダイゼーション（反応）と検出を、同一部位で行う限り解決は困難である。
本発明者は、キネシン-微小管の運動作用により生体物質を輸送できる方法に着目し、反応部位と検出部位を独立させることで選択性良く、また、輸送された標的DNAを脱ハイブリダイゼーションすることで簡便に目的物質の回収が行えることを見出した。また、これは、１カ所に目的のDNAを輸送する系であることから目的物質の濃縮にも用いることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために本発明は、微小管表面上プローブとなる一本鎖DNAを導入したDNAコンジュゲート微小管を開発し、微小管の運動を妨げることなく選択的な標的DNAのハイブリダイゼーションを可能にした。このことより、反応部位から検出部位までの微小管による標的の輸送が可能であることを見出した。
すなわち、本発明は、一本鎖のプローブDNAが微小管上に結合しているプローブDNAコンジュゲート微小管、キネシンが塗布された基板、緩衝液からなり、蛍光標識された標的DNAを含むサンプルDNAとプローブDNAコンジュゲート微小管とを反応させ、標的DNAがハイブリダイズされたDNAコンジュゲート微小管が、キネシンを塗布された基板上を移動することにより、選択的に目的の標的DNAを移動させる分子モータシステム。
また、本発明の分子モータシステムは、キネシンが塗布された基板上において、蛍光標識された標的DNAを含むサンプルDNAを一本鎖のプローブDNAコンジュゲート微小管と反応させる反応部位、移動したプローブDNAと相補結合した標的DNAを検出する検出部位が、通路で結ばれ、反応と移動と検出が緩衝液中で行われる。
さらに、本発明の分子モータシステムは、基板がガラスであり、一本鎖のプローブDNAと微小管の結合が、アビジン化DNAとビオチン化微小管若しくは、ビオチン化DNAとアビジン化微小管により行うことができる。
また、本発明は本発明の分子モータシステムを用いて、移動した標的DNAを脱ハイブリダイゼーション（脱相補結合）して標的DNAを分離するDNAの精製方法である。
さらに、本発明は本発明の分子モータシステムを用いて、移動した標的DNAを検出するDNAの検出方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の分子モータシステムは、微小管上にプローブDNAとなる一本鎖DNAを導入した形のDNAコンジュゲート微小管を用いて、標的DNAのハイブリダイゼーション（相補結合）させることができ、相補結合した標的DNAを移動させることができる。(図 1参照)。
また、ハイブリダイゼーション後の移動が可能になれば、微小管運動の方向制御技術（例えば非特許文献４）と併せることで、反応（ハイブリダイゼーション）部位と、検出部位を各々独立して設置した際に基板への標的DNAの非特異的吸着を考慮することなく、簡便に選択性良く目的の配列解析が行える。
例えば、一塩基多型解析のようにたった一つの塩基の違いを解析する際に、基板への非特異的吸着は解析を非常に困難にするものである。さらに、ハイブリダイゼーション後に微小管を基板の１点に集中させることで、標的DNAの濃縮効果も期待できる。また、標的DNA濃度依存性の応答を得られることからセンサー素子材料としての使用も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明で用いるDNAコンジュゲート微小管を製造するに際して、用いられる微小管は、何でも良いが、とくに、蛍光物質であるローダミン、もしくはビオチン化チューブリンで修飾されたものを好ましく用いることができる。
また、本発明において一本鎖のプローブDNAと微小管の結合は、どのような結合でも良いが、アビジン化DNAとビオチン化微小管若しくは、ビオチン化DNAとアビジン化微小管により行うことができる。好ましくは、アビジン化DNAとビオチン化微小管が良い。
さらに、本発明の分子モータシステムでは、キネシンが塗布された基板上において、蛍光標識された標的DNAを含むサンプルDNAを一本鎖のプローブDNAコンジュゲート微小管と反応させる反応部位、移動したプローブDNAと相補結合した標的DNAを検出する検出部位が、通路で結ばれ、反応と移動と検出が緩衝液中で行われるが、代表的には図１Ｂに示される装置が簡便である。すなわち、基板ガラスに一定間隔で２本の両面接着テープを張り付け、上からカバーグラスを載せる。ガラス基板面のカバーグラスに、微細加工により、反応部位と通路と検出部位を刻っておくと良い（図１C）。
緩衝液としては、一本鎖のプローブDNA、サンプルDNA、キネシン等が活発に動けるものあればどのようなものでも良いが、代表的のものは、アッセイバッファー (10 mM Tris-acetate (pH 7.5), 50 mM potassium acetate, 2.5 mM EGTA, 4 mM magnesium sulfate)を挙げることができる。
蛍光物質としては、何でも良いが、身近にあるものとしては、ローダミン、FITC、BODIPY、Oregon Green 514、Cy dyeシリーズを挙げることができる。とくにローダミンが好ましく用いられる。
微小管を構成するチューブリンモノマーのビオチン化に際して、リンカーの長さは特に限定されるものではないが、身近にあるものとしては、Pierce社製の、Biotin-(Long Arm)-NHS、EZ-link NHS-LC-LC-Biotinを挙げることができる。とくにBiotin-(Long Arm)-NHSが好ましく用いられる。
【実施例１】
【００１２】
（DNA修飾ストレプトアビジン（SA）の調製）
SAに共有結合的にDNAを修飾する方法を用いた(非特許文献  C.M. Niemeyer, T. Sano, C.L. Smith and C.R. Cantor, Nucleic Acid Reserch, 1994, 22, 5530-5539)。
SAにマレイミド基を付与するために、大過剰量の([N-e-maleimidocaproyloxy]sulfosuccinimide ester) (sulfo-EMCS) とSAを0.1M potassium phosphate/ 0.15 M NaCl, pH 7.3中、室温下で1時間反応させた。反応後、限外ろ過により未反応のEMCSを除去した。得られた溶液に末端チオール化修飾されたDNAを加えて45分間室温で反応させた。未反応のマレイミド基をつぶすために、メルカプトエタノール（100 mM）を添加し、30分間、室温で反応させた。 反応後、限外ろ過により、未反応のDNA、メルカプトエタノールを除去し、凍結乾燥することで目的のSA修飾DNA(SA-DNA)得た。得られたSA-DNAの反応及び概念図を図１Aに示す。
（微小管の調製）
用いた微小管は、ローダミン修飾／ビオチン化チューブリン (仕込み比 1:1)を BRP80 (80 mM PIPES, pH 6.8, 1 mM MgCl2,1 mM EGTA, 10 % glycerol, 5 mM GTP) 緩衝液に懸濁し 37 °C で40分間  インキュベートさせ、最後にタキソールで微小管を安定させることでローダミン修飾／ビオチン化-微小管(以下微小管)を調製した。 
微小管の運動性を評価するために、キネシンをガラス基板上に固定化して微小管の観察を行う方法(motility assay)を採用した。微小管には蛍光物質であるローダミンが修飾してあるため顕微鏡でその運動を可視化できる。
スライドガラス、カバーガラスを用いて作製した図１Bのようなフローチャンバーを用いてDNAコンジュゲート微小管の特性評価を行った。フローチャンバー内にアッセイバッファー (10 mM Tris-acetate (pH 7.5), 50 mM potassium acetate, 2.5 mM EGTA, 4 mM magnesium sulfate) 中に溶解したキネシン溶液を挿入し物理的に基板にキネシンを固定化した。その後、微小管溶液を同様にフローチャンバー内に挿入し微小管を基板上に固定化した。
(一本鎖DNA修飾微小管の調製と運動確認)
SA-DNA-(FITC)を上記の微小管固定化基板に加えて微小管上に一本鎖DNAを固定化した。
ローダミン（微小管）（図２A-(I)）と、FITC（DNA）（図２A-(II)）の蛍光をそれぞれ観察した。この際、微小管がキネシン上を移動しないようにassayバッファーにはATPは加えていない（図２A）。結果から、ローダミンと、FITCの蛍光をそれぞれ観察することができた。また、続けて、ATPを加えて微小管の運動を観察した。この際の微小管の運動を確認することができた（図２B）。運動速度は、(0.24 mm s-1)であった。これらのことから、微小管上に一本鎖DNAの固定化することに成功し、またDNAを修飾しても微小管の運動を阻害しないことがわかった。コントロールとして、ローダミン化チューブリンのみで調製したローダミン化微小管に、SA-DNAを修飾したが、この基板からは、ローダミンの蛍光は観察されたが、FITCの蛍光は観察できなかった。これらより、SA-DNAがビオチン-アビジン相互作用により、選択的に微小管に結合されたことが確認できた。
（一本鎖DNAコンジュゲート微小管について）
次に、このDNAコンジュゲート微小管の運動性能について評価した。実験は、全てATP存在下で行った。SA-DNAを1, 5, 10, 50 , 100, 200ng mL-1の濃度で微小管が固定化された基板（フローチャンバー）にインジェクションした。DNAを搭載した後も、各濃度で微小管はキネシン固定化基板上を移動した。その際の速度は、各々、0.36mm s-1, 0.28 mm s-1,0.28 mm s-1, 0.25 mm s-1,0.26 mm s-1, 0.24 mm s-1である。これは、プローブDNAを固定化していない微小管の速度(0.37 mm s-1)をコントロールとすると、各々、97 %, 76 %, 75 %, 68 %, 70 %, 65 %になる。
蛍光強度からみると、インジェクションするSA-DNAの濃度が減少するにつれてSA-DNAの蛍光強度もわずかに減少した。これらより、DNAコンジュゲート微小管の速度は、SA-DNAの固定化量に多少依存するが、ほぼコントロールとの差がないことから最適固定化濃度は、200 ng mL-1とした。また、微小管の側面に修飾されたDNA（アニオン性）が、基板表面のキネシン（カチオン性）とイオンコンプレックスを形成することが原因で速度が遅くなるものと考察される。
（標的DNAのハイブリダイゼーション）
DNAコンジュゲート微小管と、標的DNAとのハイブリダイゼーションを行った。この場合、SA-DNAに修飾されているプローブDNAは末端に蛍光物質が修飾されていないものを用いている。キネシン固定化基板に前述と同様にDNAコンジュゲート微小管を調製し、続けてOregon Green 514修飾-標的DNA［完全相補鎖、非相補鎖I（ランダム配列）、非相補鎖II（GC含量が完全相補鎖と同じ）、一塩基多型］の４種類をそれぞれ10ng mL-1 加えて、30分間、40℃でインキュベートした。洗浄後、蛍光顕微鏡を用いて、微小管の運動、DNAのハイブリダイゼーションを観察した。
【００１３】
完全相補鎖の場合は、微小管（図３A-１-I）の同じ位置から標的DNAに修飾されているOregon Green 514の蛍光が観察された（図３A-１-II）。しかし、非相補鎖I、またはII（図３A-２-II,３-IIの白点線は、微小管の存在位置を示す。）からは、微小管の蛍光は観察されたが（図３A-２-I, ３-I）、DNAの蛍光は観察されなかった（図３A-２-II,３-II）。一塩基多型については、ミスマッチハイブリダイゼーションにより、ごくわずかではあるが蛍光が観察された（図３A-４-II）。しかし、完全相補鎖の蛍光強度を比較すると一塩基多型のそれは９倍も低いものであった（図３B）。これらより、DNAコンジュゲート微小管が、選択性よく完全相補鎖のみとハイブリダイゼーションしていることが確認できる。また、非相補鎖、一塩基多型の蛍光が観察されなかった理由として、微小管、DNA共にアニオン性であるために、ハイブリダイゼーションと関係のない配列のDNAは静電的に微小管に近づくことが困難なためと考察できる。
次に、このDNAコンジュゲート微小管のハイブリダイゼーション後の運動性能について評価した。実験は、全てATP存在下で行った。結果より、DNAコンジュゲート微小管はハイブリダイゼーション後もキネシン固定化基板上を移動することができた（図４）。その際の速度は、0.24  mm s-1であった。これは、SA-DNAが結合した際の微小管の速度と同等であることから、ハイブリダイゼーションしたことで微小管の移動に影響がないことがわかる。
【００１４】
（感度実験）
本発明の分子モータシステムで用いるDNAコンジュゲート微小管が、バイオセンシング素子としても利用できることを確認するために、標的DNA濃度を、10, 5.0, 3.0, 1.5, 0.6, 0.3, 1.5×10-1, 5.0×10-2 ng mL-1  と変化させ、DNAコンジュゲート微小管とハイブリダイゼーションした後の蛍光強度を比較した。
結果より、完全相補鎖の濃度が増加するに従って蛍光強度も増加した。しかし、非相補鎖I,IIからは、濃度依存性の応答は得られず、各濃度でほぼゼロの値を示した。一塩基多型も、濃度依存性応答は得られず、各濃度でその蛍光強度はほぼゼロであった（図５）。
故に、本DNAコンジュゲート微小管は、単に選択性よく完全相補鎖DNAとハイブリダイゼーションするだけでなく、濃度依存性の応答も得られることから、新規バイオセンシング素子材料として十分に使用できる。
【産業上の利用可能性】
【００１５】
本発明の分子モータシステムは、標的DNAを純度良く取り出すことができ、DNAの精製方法やDNAの検出方法として有用なばかりか、この分野に広く応用できる可能性を秘めたものであり、産業上の利用可能性は極めて高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】本発明のDNAコンジュゲート微小管の概念図
【図１Ｂ】本発明の分子モータシステムの具体化の一例
【図１Ｃ】検出システムの概念図
【図２Ａ】DNAコンジュゲート微小管の蛍光像  (I)微小管に修飾されているローダミンの蛍光。(II)プローブDNAに修飾されているFITCの蛍光
【図２Ｂ】DNAコンジュゲート微小管のキネシン固定化基板上の移動
【図３Ａ】ハイブリダイゼーション後のDNAコンジュゲート微小管の蛍光像  (I)微小管に修飾されているローダミンの蛍光。(II)標的DNAに修飾されているOregonGreen514の蛍光。１；完全相補鎖ＤＮＡ。２；非相補鎖 I (ランダム配列)。３；非相補鎖 II(完全相補鎖と同GC含量)。４；一塩基多型
【図３Ｂ】各標的DNAのDNAコンジュゲート微小管へのインキュベート後の蛍光強度
【図４】ハイブリダイゼーション後のDNAコンジュゲート微小管のキネシン固定基板上の移動
【図５】各標的DNA濃度と蛍光強度
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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