(57)【要約】【課題】  光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸を製造する際に、反応工程数が少なく工業的にも有利な製造法を提供する。【解決手段】  Ｎ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステル（１）を不斉加水分解する能力を有する酵素の存在下に加水分解することを特徴とする光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸（２）の製造法。2006006134.tif 000018    （１）2006006134.tif 000019    （２）［式中、Ｐはイミノ基の保護基を表す。Ｒは炭素数１〜８の直鎖状アルキル基又は炭素数１〜８の分岐状アルキル基を表す。＊印は不斉炭素原子であることを示す。］【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（１）で示されるＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルを不斉加水分解する能力を有する酵素の存在下に加水分解し、得られた反応混合物から光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸を分離することを特徴とする下式（２）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸の製造方法。
2006006134.tif 000013
（１）
2006006134.tif 000014
（２）
［式中、Ｐはイミノ基の保護基を表す。Ｒは炭素数１〜８の直鎖状アルキル基又は炭素数１〜８の分岐状アルキル基を表す。＊印は不斉炭素原子であることを示す。］
【請求項２】
下式（１）で示されるＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルを不斉加水分解する能力を有する酵素の存在下に加水分解し、得られた反応混合物から光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルを分離することを特徴とする下式（１’）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルの製造方法。
2006006134.tif 000015
（１）
2006006134.tif 000016
（１'）
［式中、Ｐ、Ｒ及び＊印は、請求項１記載と同じ定義である。］
【請求項３】
不斉加水分解する能力を有する酵素が、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属及びＲｈｉｚｏｐｕｓ属からなる群より選ばれる酵素である請求項１に記載の式（２）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸の製造方法。
【請求項４】
不斉加水分解する能力を有する酵素が、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属及びＲｈｉｚｏｐｕｓ属からなる群より選ばれる酵素である請求項２に記載の式（１’）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルの製造方法。
【請求項５】
不斉加水分解する能力を有する酵素が、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＣ−ＹＭ−１（工業技術院  生命工学技術研究所  寄託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４００９）由来の酵素である請求項１又は３に記載の式（２）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸の製造方法。
【請求項６】
不斉加水分解する能力を有する酵素が、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＣ−ＹＭ−１（工業技術院  生命工学技術研究所  寄託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４００９）由来の酵素である請求項２又は４に記載の式（１’）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルの製造方法。
【請求項７】
不斉加水分解する能力を有する酵素が、下記（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のいずれかのＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有する酵素である請求項１、３又は５に記載の式（２）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸の製造方法。
（ｅ）配列番号１で示される塩基配列。
（ｆ）配列番号１で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目のアミノ酸が下記のＡ群から選ばれるアミノ酸に置換され、且つ１８９番目のアミノ酸が下記のＢ群から選ばれるアミノ酸に置換されてなるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｇ）前記（ｆ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、且つ前記（ｆ）によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素と同等な触媒機能を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（Ａ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びセリン
（Ｂ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン及びアルギニン
【請求項８】
不斉加水分解する能力を有する酵素が、下記（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のいずれかのＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有する酵素である請求項２、４又は６に記載の式（１’）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルの製造方法。
（ｅ）配列番号１で示される塩基配列。
（ｆ）配列番号１で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目のアミノ酸が下記のＡ群から選ばれるアミノ酸に置換され、且つ１８９番目のアミノ酸が下記のＢ群から選ばれるアミノ酸に置換されてなるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｇ）前記（ｆ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、且つ前記（ｆ）によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素と同等な触媒機能を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（Ａ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びセリン
（Ｂ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン及びアルギニン
【請求項９】
請求項１記載の式（１）で示されるＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルを不斉加水分解する能力を有する酵素の存在下に加水分解し、得られた反応混合物から光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルを除去して請求項１記載の式（２）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸を得、次いで該光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸を脱保護反応に付すことを特徴とする下式（３）で示される光学活性なピロリジン−３−カルボン酸又はその塩の製造方法。
2006006134.tif 000017
（３）
［式中、＊印は上記と同じ定義である。］
【請求項１０】
請求項１記載の式（１）で示されるＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルを不斉加水分解する能力を有する酵素の存在下に加水分解し、得られた反応混合物から式（２）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸を除去して請求項２記載の式（１’）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルを得、次いで該光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルを加水分解して請求項１記載の式（２）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸を得、次いで該光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸を脱保護反応に付すことを特徴とする請求項９記載の式（３）で示される光学活性なピロリジン−３−カルボン酸又はその塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸の製造方法、光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルの製造方法、及び該カルボン酸やカルボン酸エステルから誘導される光学活性なピロリジン−３−カルボン酸又はその塩の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸は、ＷＯ２００２０５３５３４号明細書に記載されているように、医薬品の中間体として有用な化合物である。また、光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸から誘導される光学活性なピロリジン−３−カルボン酸又はその塩もＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ （２００２）, １２（３）, ３８３−３８６ に記載されているように医薬品の中間体として有用な化合物である。
【０００３】
これらの化合物の製造法としては、下記ａ）〜ｄ）の反応ルートが公知である。
ａ）アスパラギン酸より出発し多段階の反応を経て製造する下記ルート（非特許文献１及び非特許文献２を参照）
2006006134.tif 000002
ｂ）プロキラルな３−ベンジルオキシメチルシクロブタノンを生体触媒によりＢａｙｅｒ−Ｖｉｌｌｉｇｅｒ酸化した後、多段階の反応を経て製造する下記ルート（非特許文献３を参照）
2006006134.tif 000003
ｃ）２−オキソピロリジン−３−カルボン酸エステル類を酵素水解した後、還元する方法（非特許文献４を参照）
2006006134.tif 000004
ｄ）光学活性なＮ−置換−３−ヒドロキシピロリジン類をトシルクロライド等と反応させた後に青酸ソーダ等と反応させて、対応するニトリル化合物に変換し、該ニトリル化合物を加水分解する下記ルート（特許文献１〜３及び非特許文献５を参照）
2006006134.tif 000005
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ, （１０）,１４９１−１４９６,１９９８
【非特許文献２】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ, ３６（３）, ３８１−３８２, １９９５
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, ６２（１５）, ５２１５−５２１８, １９９７
【非特許文献４】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ, １２, ３２４１−３２４９, ２００１
【非特許文献５】Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０ （２０００）, ２７５５−２７５８
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ  ０２／０５３５３４
【特許文献２】ＷＯ２００００７６９７４
【特許文献３】ＷＯ９２００２９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記ａ）の方法は、工程数が長く、また、毒性が強くて取り扱いに厳重な注意が必要な青酸ソーダ等を使う必要があるという問題があった。上記ｂ）の方法は、微生物を利用した酸化工程の生産効率が非常に悪く（酸化反応生成物の得量は、５ｌ当り３．２ｇ）、且つ、重金属であるクロムの処理が必要なクロム酸酸化が必須である等の問題があった。上記ｃ）の方法は、高価なボランを用いてラクタム基をアミンに還元する必要があり、また官能基の選択性が低下してエステル部位も反応してしまう場合がある等の問題があった。上記ｄ）の方法は、原料化合物である光学活性な３−ヒドロキシピロリジンを高温（１８０℃）で製造するため、耐熱性の特殊な材質の反応器等の設備が必要になるという問題があった。
【０００７】
本発明の目的は、光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸等を製造する際に、反応工程数が少なく工業的にも有利な製造法を提供することにある。また、上記のＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸を用いて、光学活性なピロリジン−３−カルボン酸又はその塩を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の（イ）は、下式（１）で示されるＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルを不斉加水分解する能力を有する酵素の存在下に加水分解し、得られた反応混合物から光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸を分離することを特徴とする下式（２）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸の製造方法を提供するものである。
2006006134.tif 000006
（１）
2006006134.tif 000007
（２）
［式中、Ｐはイミノ基の保護基を表す。Ｒは炭素数１〜８の直鎖状アルキル基又は炭素数１〜８の分岐状アルキル基を表す。＊印は不斉炭素原子であることを示す。］
【０００９】
また、本発明の（ロ）は、下式（１）で示されるＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルを不斉加水分解する能力を有する酵素の存在下に加水分解し、得られた反応混合物から光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルを分離することを特徴とする下式（１’）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルの製造方法を提供するものである。
2006006134.tif 000008
（１）
2006006134.tif 000009
（１'）
［式中、Ｐ、Ｒ及び＊印は、上記と同じ定義である。］
【００１０】
さらに、本発明の（ハ）は、式（１）で示されるＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルを不斉加水分解する能力を有する酵素の存在下に加水分解し、得られた反応混合物から光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルを除去して上記（イ）記載の式（２）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸を得、次いで該光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸を脱保護反応に付すことを特徴とする下式（３）で示される光学活性なピロリジン−３−カルボン酸又はその塩の製造方法を提供するものである。
2006006134.tif 000010
（３）
［式中、＊印は上記と同じ定義である。］
【００１１】
そして、本発明の（ニ）は、式（１）で示されるＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルを不斉加水分解する能力を有する酵素の存在下に加水分解し、得られた反応混合物から式（２）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸を除去して上記（ロ）記載の式（１’）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルを得、次いで該光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステルを加水分解して上記（イ）記載の式（２）で示される光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸を得、次いで該光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸を脱保護反応に付すことを特徴とする下式（３）で示される光学活性なピロリジン−３−カルボン酸又はその塩の製造方法を提供するものである。
2006006134.tif 000011
（３）
［式中、＊印は上記と同じ定義である。］
【発明の効果】
【００１２】
本発明の（イ）によれば、医薬品の中間体として有用な上記光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸（２）を、反応工程数が少なく工業的にも有利に製造することができる。
また、本発明の（ロ）によれば、上記（イ）記載のＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステル（１）を不斉加水分解する能力を有する酵素の存在下に加水分解し、得られた反応混合物から上述した光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステル（１’）を分離することにより、該光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステル（１’）を容易に製造することができる。
さらに、本発明の（ハ）及び（ニ）によれば、光学活性なピロリジン−３−カルボン酸（３）又はその塩を容易に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の（イ）におけるＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステル（１）は、例えば、ＷＯ２００３０６２２５２号明細書や特許第２９５８６５５号公報に記載の方法；特公平７−８４４６６号公報に記載の方法；Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．Ｃｈｉｍ．Ｆｒａｎｃｅ （３）, ５７９, １９８８に記載の方法等によって、製造することができる。
また、上記のＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステル（１）は、特許第２９５８６５５号公報等に記載の方法により調製されたピロリジン−３−カルボン酸を、例えばＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｊｏｈｎ ＆ Ｗｉｌｅｙ, １９９１）に記載されている方法か又は引用されている方法により、ピロリジン環中のイミノ基を保護基により保護した後の化合物を常法によってエステル化することによっても製造することができる。
【００１４】
Ｎ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステル（１）におけるイミノ基の保護基Ｐとしては、例えばＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｊｏｈｎ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ, １９９１）に記載されている基が挙げられる。
上述した保護基の具体例としては、以下のものが挙げられる。
ｉ）メチル基、メトキシメチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ベンズヒドリル基やトリフェニルメチル基等の置換又は無置換アルキル基、或いは、置換又は無置換のアラルキル基；
ｉｉ）ビニル基やアリル基等のアルケニル基；
ｉｉｉ）アセチル基、クロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基、フェニルアセチル基、フェニルプロピオニル基、ベンゾイル基やピコリノイル基等の置換又は無置換のアシル基；
ｉｖ）次に例示する置換又は無置換のアルキルオキシカルボニル基、置換又は無置換のアルケニルオキシカルボニル基やアリールオキシカルボニル基；
メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、１−アダマンチルオキシカルボニル基、ビニルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル基、２−メチルチオエチルオキシカルボニル基、２−メチルスルホニルエチルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基やフェニルオキシカルボニル基等。
ｖ）ベンゼンスルホニル基、ｏ−ニトロベンゼンスルホニル基やｐ−トルエンスルホニル基等のアリールスルホニル基、又はメタンスルホニル基等のアルキルスルホニル基等。
【００１５】
式（１）におけるＲとしては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−オクチル基、ｉ−プロピル基やｉ−ブチル基等の炭素数１〜８の直鎖状アルキル基又は炭素数１〜８の分岐状アルキル基が挙げられる。
また、式（２）における＊印は不斉炭素原子であることを示す。
Ｎ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステル類（１）としては、例えば、以下の化合物が挙げられる。
【００１６】
Ｎ−メチルピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−メチルピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−メチルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−メチルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−メチルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−メチルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−アルキル−メチルピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
Ｎ−（メトキシメチル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（メトキシメチル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（メトキシメチル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（メトキシメチル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（メトキシメチル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−（メトキシメチル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−（アルコキシアルキル）ピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
Ｎ−ベンジルピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−ベンジルピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−ベンジルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−ベンジルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−ベンジルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−ベンジルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−アラルキルピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
Ｎ−（メチルベンジル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（メチルベンジル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（メチルベンジル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（メチルベンジル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（メチル）ベンジルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−（メチルベンジル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−（アルキルアラルキル）ピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
Ｎ−（ｐ−メトキシベンジル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（ｐ−メトキシベンジル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（ｐ−メトキシベンジル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（ｐ−メトキシベンジル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（ｐ−メトキシベンジル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−（ｐ−メトキシベンジル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−（アルコキシアラルキル）ピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
【００１７】
Ｎ−ベンズヒドリルピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−ベンズヒドリルピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−ベンズヒドリルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−ベンズヒドリルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−ベンズヒドリルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−ベンズヒドリルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−ベンズヒドリルピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
【００１８】
Ｎ−トリフェニルメチルピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−トリフェニルメチルピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−トリフェニルメチルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−トリフェニルメチルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−トリフェニルメチルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−トリフェニルメチルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−トリアリールメチルピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
【００１９】
Ｎ−ビニルピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−ビニルピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−ビニルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−ビニルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−ビニルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピル、Ｎ−ビニルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル、Ｎ−アリルピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−アリルピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−アリルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−アリルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−アリルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−アリルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−アルケニルピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
【００２０】
Ｎ−アセチルピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−アセチルピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−アセチルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−アセチルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−アセチルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−アセチルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−アルキルカルボニルピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
【００２１】
Ｎ−クロロアセチルピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−クロロアセチルピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−クロロアセチルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−クロロアセチルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−クロロアセチルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピル、Ｎ−クロロアセチルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル、Ｎ−トリクロロアセチルピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−トリクロロアセチルピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−トリクロロアセチルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−トリクロロアセチルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−トリクロロアセチルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピル、Ｎ−トリクロロアセチルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル、Ｎ−トリフルオロアセチルピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−トリフルオロアセチルピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−トリフルオロアセチルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−トリフルオロアセチルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−トリフルオロアセチルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−トリフルオロアセチルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−ハロアルキルカルボニル−３−カルボン酸アルキル類；
【００２２】
Ｎ−（フェニルアセチル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（フェニルアセチル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（フェニルアセチル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（フェニルアセチル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（フェニルアセチル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピル、Ｎ−（フェニルアセチル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル、Ｎ−（フェニルプロピオニル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（フェニルプロピオニル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（フェニルプロピオニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（フェニルプロピオニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（フェニルプロピオニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−（フェニルプロピオニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−（アリールアルキルカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
【００２３】
Ｎ−ベンゾイルピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−ベンゾイルピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−ベンゾイルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−ベンゾイルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−ベンゾイルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−ベンゾイルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−ベンゾイルピロリジン−３−カルボン酸アルキル；
Ｎ−ピコリノイルピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−ピコリノイルピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−ピコリノイルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−ピコリノイルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−ピコリノイルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−ピコリノイルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−ピコリノイルピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
【００２４】
Ｎ−（メトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（メトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（メトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（メトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（メトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピル、Ｎ−（メトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル、Ｎ−（エトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（エトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（エトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（エトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（エトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピル、Ｎ−（エトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−（ｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−（アルコキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
【００２５】
Ｎ−（ビニルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（ビニルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（ビニルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（ビニルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（ビニルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピル、Ｎ−（ビニルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル、Ｎ−（アリルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（アリルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（アリルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（アリルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（アリルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−（アリルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−（アルケニルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
【００２６】
Ｎ−（１−アダマンチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（１−アダマンチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（１−アダマンチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（１−アダマンチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（１−アダマンチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−（１−アダマンチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−（１−アダマンチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
【００２７】
Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピル、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル、Ｎ−（ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピル、Ｎ−（ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル、Ｎ−（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピル、Ｎ−（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル、Ｎ−（ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−（ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−（置換又は無置換アラルキルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
【００２８】
Ｎ−（２−メチルチオエチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（２−メチルチオエチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（２−メチルチオエチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（２−メチルチオエチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（２−メチルチオエチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−（２−メチルチオエチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−（アルキルチオアルコキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
Ｎ−（２−メチルスルホニルエチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（２−メチルスルホニルエチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（２−メチルスルホニルエチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（２−メチルスルホニルエチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（２−メチルスルホニルエチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−（２−メチルスルホニルエチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−（アルキルスルホニルアルコキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
【００２９】
Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−（９−フルオレニルアルコキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
Ｎ−（フェニルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（フェニルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（フェニルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（フェニルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（フェニルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−（フェニルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−（フェニルオキシカルボニル）ピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
【００３０】
Ｎ−ベンゼンスルホニルピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−ベンゼンスルホニルピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−ベンゼンスルホニルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−ベンゼンスルホニルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−ベンゼンスルホニルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピル、Ｎ−ベンゼンスルホニルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル、Ｎ−（ｐ−トルエンスルホニル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（ｐ−トルエンスルホニル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（ｐ−トルエンスルホニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（ｐ−トルエンスルホニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（ｐ−トルエンスルホニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピル、Ｎ−（ｏ−ニトロベンゼンスルホニル）ピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−（ｏ−ニトロベンゼンスルホニル）ピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−（ｏ−ニトロベンゼンスルホニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−（ｏ−ニトロベンゼンスルホニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−（ｏ−ニトロベンゼンスルホニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピル、Ｎ−（ｏ−ニトロベンゼンスルホニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチルやＮ−（ｐ−トルエンスルホニル）ピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−（アリールスルホニル）ピロリジン−３−カルボン酸アルキル類；
Ｎ−メタンスルホニルピロリジン−３−カルボン酸メチル、Ｎ−メタンスルホニルピロリジン−３−カルボン酸エチル、Ｎ−メタンスルホニルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−プロピル、Ｎ−メタンスルホニルピロリジン−３−カルボン酸ｎ−ブチル、Ｎ−メタンスルホニルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−プロピルやＮ−メタンスルホニルピロリジン−３−カルボン酸ｉ−ブチル等のＮ−アルカンスルホニルピロリジン−３−カルボン酸アルキル類。
【００３１】
本発明におけるＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステル（１）は、ラセミ体であってもよく、光学異性体同士が任意の割合で混じった混合物であってもよい。これらのラセミ体や混合物は新たに調製されたものでもよく、分割後のものでもよい。
【００３２】
Ｎ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステル（１）を、不斉加水分解する能力を有する酵素の存在下に加水分解することにより、光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸（２）が得られる。
上記酵素としては、微生物や動植物由来のリパーゼ、エステラーゼやプロテアーゼ等が挙げられる。該酵素としては、例えば、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｆ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｅ Ｃｏｌｉ、豚、牛、羊、ウサギ、ヒトや小麦等に由来する酵素が挙げられる。
好ましい酵素としては、Rhizopus属、Aspergillus属、Chromobacterium属、Arthrobacter属由来のエステラーゼ、リパーゼやプロテアーゼ等が挙げられる。特に好ましい酵素としては、Rhizopus niveus、Aspergillus oryzae、Arthrobacter SC-6-98-28株やChromobacterium SC-YM-1（工業技術院  生命工学技術研究所  寄託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４００９）由来の酵素等が挙げられる。
【００３３】
上述したChromobacterium SC-YM-1由来の酵素の特に好ましい例としては、下記（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のいずれかのＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなる酵素を挙げることができる。
（ｅ）配列番号１で示される塩基配列。
（ｆ）配列番号１で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目のアミノ酸が下記のＡ群から選ばれるアミノ酸に置換され、且つ１８９番目のアミノ酸が下記のＢ群から選ばれるアミノ酸に置換されてなるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｇ）前記（ｆ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、且つ前記（ｆ）によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素と同等な触媒機能を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（Ａ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びセリン
（Ｂ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン及びアルギニン
【００３４】
配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡは、例えば、クロモバクテリウム（Chromobacterium）SC-YM-1株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４００９）等の微生物から通常の方法でＤＮＡライブラリーを作製し、このＤＮＡライブラリーを鋳型に用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。
このようにして得られたＤＮＡに上記Ａ群又はＢ群の部位特異的変異を導入するには、原型のＤＮＡ（ここでは野生型の遺伝子である）が組み込まれたプラスミドの１本鎖ＤＮＡを鋳型にして、変異を導入する塩基配列を含む合成オリゴヌクレオシドをプライマーとして変異型の遺伝子を合成すればよい。該合成法としては、例えば、Smithら（Genetic Engineering ３１ Setlow,J. and Hollaender,A Plenum: New York）、Vlasukら（Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouye,M :Academic Press, New York）やHos.N.Hunt ら（Gene, 77,51,1989）の方法等をあげることができる。
【００３５】
本発明においては、配列番号１で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目のアミノ酸が上記Ａ群から選ばれるアミノ酸に置換され、且つ１８９番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸に置換されるように変異プライマーを調製し、ＰＣＲ法による増幅を行えばよい。好ましくは、１６０番目のアミノ酸が上記のＡ群から選ばれるアミノ酸に置換され、且つ１８９番目のアミノ酸が上記のＢ群から選ばれるアミノ酸に置換されるような特異的変異を導入することが好ましい。
尚、配列番号１で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目及び１８９番目のアミノ酸に同時に部位特異的変異を導入してもよい。
【００３６】
本発明において、あるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９、農村文化社発行）等に記載されるサザンハイブリダイゼーション方法において、（１）高イオン条件下［例えば、６ＸＳＳＣ（９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム）等が挙げられる。］に６５℃の温度条件でハイブリダイズさせることによりあるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下［例えば、０．１Ｘ  ＳＳＣ（１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム）等が用いられる。］に６５℃の温度条件で３０分保温した後でも該ハイブリッドが維持されるようなＤＮＡをいう。
【００３７】
加水分解反応に供する酵素の形態は特に制限を受けるものではなく、単離されたものであってもよく、担体に固定化されたものであってもよく、これらの酵素を産生する微生物そのものの形であってもよく、該微生物の培養液等などの形であってもよい。
加水分解反応における温度は、酵素の性質によって異なるが、概ね０〜５０℃の範囲である。好熱菌等のように高温を好む微生物や該微生物由来の酵素を用いるときは、５０℃以上の反応温度であってもよい。
【００３８】
加水分解反応は、通常水の存在下に行われ、有機溶媒を共存させてもよい。共存させる有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノールや２−プロパノール等のアルコール系溶媒；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドやＮ−メチルピロリドン等のアミド系溶媒；ジメチルスルホキサイドやスルホラン等のスルホキサイド系溶媒；トルエン、ベンゼン、ヘキサンやヘプタン等の芳香族又は脂肪族の炭化水素系溶媒；ジエチルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラフラン、ジオキサンやポリエチレングリコール等のエーテル系溶媒；アセトニトリルやベンゾニトリル等のニトリル系溶媒；ピリジン、２−メチル−５−エチルピリジンやトリエチルアミン等のアミン系溶媒；及びこれらの溶媒の混合物が挙げられる。
Ｎ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステル類（１）が水中で自然に加水分解を受ける場合には、有機溶媒を共存させた方が上記の自然加水分解を抑制することができるので、望ましい。
また、反応の進行に伴い水層のｐＨ値が変化するのを防ぐため、リン酸塩等のバッファー中で反応を行ってもよく、水層のｐＨを一定に保つ為に、反応中に酸又はアルカリを添加してもよい。
【００３９】
加水分解反応終了後、Ｎ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステル類（１）における保護基Ｐが、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、アルキルオキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルスルホニル基又はアリールスルホニル基の場合には、必要に応じて反応混合物より酵素を濾別後、場合により水層をアルカリ性にすることによって、光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸類（２）を、未反応のＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステル類（１）と分離することができる。次いで、上記の水層を酸性にすることによって、光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸類（２）を有機層へ抽出するか、又は、結晶として単離することができる。
また、水層を分離した後の有機層を濃縮するか、又は光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸類を溶解しにくい溶媒を添加することによって、光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸類（２）を結晶として単離することもできる。
【００４０】
光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸類（２）における保護基Ｐがアルキル基、アラルキル基又はアルケニル基である場合は、反応により生成するＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸類（２）が中性アミノ酸となるため、反応中のｐＨの変化が非常に小さくなる。したがって、反応溶媒としての水にバッファーを添加したり、反応中にアルカリを加えたりする必要もなく、必要に応じて、反応混合物に有機溶媒を添加した後に分液することによって、光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸類（２）を未反応のＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステル類（１）と分離することができる。分液後の水層を濃縮するか、又は分液後の水層に上記の光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸類（２）を溶解しにくい溶媒を添加することによって、該光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸類（２）を結晶として単離することができる。該方法では無機塩を含まない光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸類（２）を得ることができるので、工業的な製造法として有利である。Ｎ−置換ピロリジン−３−カルボン酸類（２）を結晶として単離せず、次の脱保護反応に供してもよい。
【００４１】
光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸類（２）は、未反応のＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステル類（１’）を加水分解することによっても得られる。例えば、上記の後処理によって得られた有機層に含まれる未反応のＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸エステル類（１’）を、酸又はアルカリの存在下に加水分解することによって、上述した酵素による不斉水解で得られた生成物とは逆の立体配置を有する光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸類（２）を得ることができる。
このような加水分解に用いられる酸としては、塩酸、硫酸、硝酸やリン酸等の無機酸が挙げられる。また、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムや水酸化リチウム等のアルカリ金属の水酸化物や、水酸化バリウム又は水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属の水酸化物等が挙げられる。
上記の加水分解反応における温度は、通常は−７８〜１５０℃の範囲である。好ましい加水分解反応温度は、高温における副反応のラセミ化が進行しない温度範囲である。
【００４２】
加水分解反応終了後、光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸（２）における保護基Ｐがアルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、アルキルオキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルスルホニル基又はアリールスルホニル基である場合には、反応混合物を酸性にすることにより、上記の光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸（２）を有機層に抽出するか、又は結晶として単離することができる。
一方、光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸（２）における保護基Ｐがアルキル基、アラルキル基又はアルケニル基である場合には、反応混合物を中性にすることによって、上記カルボン酸（２）を得ることができる。この際、前記カルボン酸（２）を結晶として単離することなく、次の反応に使用してもよい。
【００４３】
本発明においては、光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸（２）を脱保護反応させることにより、光学活性なピロリジン−３−カルボン酸（３）又はその塩を得ることができる。脱保護反応は、例えば「ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｊｏｈｎ ＆ Ｗｉｌｅｙ, １９９１）」に記載されているか、又は、該文献に引用されている方法によって、行うことができる。
【００４４】
脱保護反応により得られる光学活性なピロリジン−３−カルボン酸（３）は水溶性である。したがって、脱保護反応の際に酸やアルカリを使用すると、生成する無機塩と光学活性なピロリジン−３−カルボン酸（３）とを分離する必要が生じるので、脱保護反応に際しては、酸やアルカリを使用しなくても脱離する保護基を用いることが好ましい。このような保護基としては、例えば、ベンジル基、メチルベンジル基、ベンズヒドリル基、アリル基、ベンジルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基や９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
【００４５】
光学活性なピロリジン−３−カルボン酸（３）のアンモニウム塩は、酸の存在下に脱保護反応させた後、生じたアンモニウム塩を濾別することによって単離することができる。この場合の好ましい保護基としては、例えば、メトキシメチル基、トリフェニルメチル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、１−アダマンチルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基やトリフルオロアセチル基等が挙げられる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
【００４７】
実施例１
ラセミ体のＮ−ベンジルピロリジン−３−カルボン酸エチルをメチル−ｔ−ブチルエーテルに溶かした溶液（０．４２％ｗ/ｖ）の５ｍｌを、５ｍｌの蒸留水とChromobacterium chocolatum IFO3758株由来の酵素液（１００ｍｇ）の混合物中に加えた後、４０℃で約２０時間攪拌した。反応混合物をメンブランフィルターで濾過した後、得られた濾液に約５ｍｌのメチル−ｔ−ブチルエーテルを加えて、分液した。分液後の水層及び油層を、それぞれ、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ）で分析した。
Ｎ−ベンジルピロリジン−３−カルボン酸エチルの分析には、ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＤ−Ｈカラム（４．６ｍｍΦｘ２５０ｍｍ ）を用いた。一方、Ｎ−ベンジルピロリジン−３−カルボン酸の分析には、ＣＨＩＲＯＢＩＯＴＩＣ Ｔ（４．６ｍｍΦｘ２５０ｍｍ）を用いた。結果は以下のとおりであった。これは、転化率６０％以上に相当する。
油層中のＮ−ベンジルピロリジン−３−カルボン酸エチルは１００％ｅ.ｅ.であり、対掌体は検出されなかった。一方、水層中のＮ−ベンジルピロリジン−３−カルボン酸は６７％ｅ.ｅ.であった。該カルボン酸は、ＨＰＬＣ分析において、先に溶出するエナンチオマーが主成分であった。
【００４８】
実施例２
反応温度と反応時間をそれぞれ２５℃と８．５時間に変更する以外は、実施例１と同様にして反応を行った。反応の結果は、次のとおりであった。
転化率４５％；油層中のＮ−ベンジルピロリジン−３−カルボン酸エチルは６７％ｅ.ｅ.；水層中のＮ−ベンジルピロリジン−３−カルボン酸は８０％ｅ.ｅ.；該カルボン酸は、ＨＰＬＣ分析において、先に溶出するエナンチオマーが主成分であった。
【００４９】
実施例３−５
Chromobacterium chocolatum IFO3758株由来の酵素液に代えて、下表１に記載の酵素を用いる以外は、実施例１と同様にして反応を行った。結果を表１に示した。
なお、エナンチオー選択性は、実施例５のみ実施例１とは逆であり、実施例３及び４は実施例１と同じであった。
【００５０】
【表１】
2006006134.tif 000012
【００５１】
調製例１
［Chromobacterium SC-YM-1（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４００９）由来の酵素液の調製］
上記の実施例で使用したChromobacterium SC-YM-1株由来のエステラーゼ遺伝子導入大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株は特開平７−２１３２８０号公報記載の方法に準して調製した。ここで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株が産生するエステラーゼとは、前述した配列番号１で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目のアミノ酸がセリンに置換され、且つ１８９番目のアミノ酸がチロシンに置換される特異的変異が導入された耐熱性酵素である。
【００５２】
試験管に、L-Broth培地（ＳＩＧＭＡ社製）１０ｍｌを入れて、滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｇ／ｍｌとなるように加え、さらにＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株のグリセロールストック０．１ｍｌを加え、３０℃で１６時間振盪培養した。
５００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコにL-Broth培地（ＳＩＧＭＡ社製）１００ｍｌを入れて滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｌ／ｍｌとなるように加え、さらに、ここに上記の試験管で培養した培養液を１ｍｌ加え、３０℃で攪拌培養した。培養開始から４時間後に、ＩＰＴＧを１ｍＭとなるように加えた。培養開始から１２時間培養することにより培養液を得、これを酵素液とした。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明により得られる光学活性なＮ−置換ピロリジン−３−カルボン酸（２）や、光学活性なピロリジン−３−カルボン酸又はその塩は医薬品の中間体化合物等として有用である。
【配列表】
2006006134000001.app