(57)【要約】【課題】  7aβ-メチル-1,5-ジオキソ-8aα-ヘキサヒドロインダン-4α−プロピオン酸又はその類縁体の微生物による生産を目的とする。【解決手段】  下記の式（１）【化１】2006191920.tif 000035の化合物又はその類縁体の代謝関連遺伝子が破壊されたステロイド資化性コマモナス(Comamonas)属細菌を、培地中でステロイド化合物と接触させ、生成した式（１）の化合物又はその類縁体を単離することを含む、式（１）の化合物又はその類縁体を製造する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）
【化１】
2006191920.tif 000028
の化合物又はその類縁体の代謝関連遺伝子が破壊されたステロイド資化性コマモナス(Comamonas)属細菌を、培地中でステロイド化合物と接触させ、生成した前記式（１）の化合物又はその類縁体を単離することを含む、式（１）の化合物又はその類縁体を製造する方法。
【請求項２】
前記コマモナス属細菌が、コマモナス・テストステロニ(Comamonas testosteroni)である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記コマモナス・テストステロニが、コマモナス・テストステロニ TA441株、ATCC11996株又はそれらの変異株である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記代謝関連遺伝子が、前記コマモナス・テストステロニ TA441株、ATCC11996株又はそれらの変異株ゲノムのステロイド代謝系酵素遺伝子ORF18である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記代謝関連遺伝子が、前記コマモナス属細菌ゲノムのORF18ホモログである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記ステロイド化合物が、テストステロン代謝中間体化合物又はその誘導体である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記テストステロン代謝中間体化合物が、アンドロスタ-1,4-ジエン-3,17-ジオン又はアンドロスト-４-エン-3,17-ジオンである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記ステロイド化合物が、コール酸、ケノデオキシコール酸又はデオキシコール酸である、請求項６項記載の方法。
【請求項９】
前記式(1)の化合物の類縁体が、下記の式(11)、式(12)又は式(13)
【化２】
2006191920.tif 000029
【化３】
2006191920.tif 000030
【化４】
2006191920.tif 000031
の化合物である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記コマモナス属細菌が担体に固定化されている、請求項１〜９のいずれか1項記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌とステロイド化合物との接触が、回分式又は連続式で行われる、請求項１〜10のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
下記の式(11)の化合物又はそのジアステレオマー。
【化５】
2006191920.tif 000032
【請求項１３】
下記の式(12)の化合物又はそのジアステレオマー。
【化６】
2006191920.tif 000033
【請求項１４】
下記の式(13)の化合物又はそのジアステレオマー。
【化７】
2006191920.tif 000034
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステロイド資化性コマモナス(Comamonas)属細菌の遺伝子破壊株を使用してステロイド代謝産物、具体的には、光学活性7a-メチル-1,5-ジオキソヘキサヒドロインダン-4−プロピオン酸（以下、単に「インダンジオンプロピオン酸」とも称する）又はその類縁体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インダンジオンプロピオン酸は、医薬等のステロイド類の製造原料として有用である。
微生物によるこの化合物の製造について、特開昭53-69885号公報には、微生物として、アースロバクター(Arthrobacter)、バチルス(Bacillus)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、ノカルディア(Nocardia)、プロトアミノバクター(Protaminobacter)、セラチア(Serratia)及びストレプトミセス(Streptomyces)からなる細菌の突然変異株、特にミコバクテリウム・フォルトウイツムNRRL B-8129株を使用し、また原料ステロイド化合物として、シトステロール、コレステロール、スチグマステロール、カンペステロール、アンドロスト−４−エン-3,17-ジオン、アンドロスタ-1,4-ジエン-3,17-ジオン、デヒドロエピアンドロステロン及びテストステロンなどの、２〜10個の炭素原子を有する17-アルキル側鎖をもつ又はもたないステロイドを使用して、インダンジオンプロピオン酸を製造する方法が開示されている。この方法では、微生物による物質変換のために、約30℃の温度で約72時間〜13日の時間を要する。
【０００３】
さらに、特開昭60-24190号公報には、ニトロソグアニジン変異試薬を用いて得られた突然変異株アースロバクター・シンプレックスID-38-6を用いて、上記と同様のステロイドを原料としてインダンジオンプロピオン酸を製造する方法が開示されており、この方法では、28℃、120時間で85〜97％の収率で目的の化合物が得られる、と報告されている。
【０００４】
本発明者らは、コマモナス属細菌、特にコマモナス・テストステロニ(C. testosteroni)TA441株のステロイド代謝系酵素遺伝子群の解析を行ってきた。細菌によるステロイド代謝は、A.W. CoulterとP. Talalay (J. Biol. Chem. (1968), 243:3238-3247)らが主にノカルディアについて解析を行って明らかにした。本発明者らは、その結果を参考にTA441株によるステロイド代謝経路を明らかにした。また、TA441株のステロイド代謝系酵素遺伝子群を含む遺伝子クラスターの配列を決定し、この配列をDDBJ/EMBL/GeneBankにAB076368として登録した。この配列及びゲノムマップ情報に基いて、本発明者らはさらに、上記酵素遺伝子の破壊株、例えばTesA2-、TesA1-、TesD-、TesH-、ORF17-、ORF18-株などを構築し、テストステロンを基質として培養したのち各代謝産物を調べ、これによって前記遺伝子クラスターがステロイド代謝に専ら関わっていることを立証した(特開2003-61671号公報；M. Horinouchi, T. Hayashi, T. Yamamoto及びT. Kudo, Appl. Environ. Microbiol. (2003), 69:4421-4430)。この文献の中で、特にORF18-株によるテストステロンの代謝中間体蓄積物は、アンドロスト−４−エン-3,17-ジオン(4-AD)、アンドロスタ-1,4-ジエン-3,17-ジオン(ADD)及び17-ヒドロキシ-1,4-アンドロスタジエン-3-オン(17OH-ADD)であり、これらは他の多くの遺伝子破壊株で蓄積される一般的な蓄積物である（M. Horinouchiら,上記,図７参照）。ORF18-株に特徴的な蓄積物は、検出されていなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開昭53-69885号公報
【特許文献２】特開昭60-24190号公報
【特許文献３】特開2003-61671号公報
【非特許文献１】A.W. CoulterとP. Talalay, J. Biol. Chem. (1968), 243:3238-3247
【非特許文献２】M. Horinouchi, T. Hayashi, T. Yamamoto及びT. Kudo, Appl. Environ. Microbiol. (2003), 69:4421-4430
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の突然変異細菌株によるインダンジオンプロピオン酸の製造方法は、物質変換に長時間を要するため、水性培地に溶解し難いステロイド化合物を原料とするときには、工業的生産の支障となる。また、突然変異株は、どの遺伝子に変異が起こっているのか、変異が何ヶ所に入っているのかなどの情報が得られ難い上に、例えば１塩基のみの変異の場合には、自然に天然型に戻ることもあり、突然変異株を、安定的に、物質生産のために長期にわたって供給するには、いささか問題がある。
【０００７】
このような状況下において、突然変異株に頼らないで、比較的短期間にインダンジオンプロピオン酸を製造する方法が求められてきた。
【０００８】
本発明者らは、ORF18の機能解析を試み、様々なステロイド化合物を基質に用いた変換を検討していた際に、テストステロンの代わりに4-AD、ADD等を基質に用いるとORF18破壊株がこれらステロイド化合物を高収率でインダンジオンプロピオン酸に変換することを見出した。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、コマモナス属細菌由来のインダンジオンプロピオン酸又はその類縁体の代謝関連遺伝子の破壊株を用いて、インダンジオンプロピオン酸又はその類縁体を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の特徴は、要約すると以下のとおりである。
（１）下記の式（１）
【００１１】
【化１】
2006191920.tif 000002
の化合物又はその類縁体の代謝関連遺伝子が破壊されたステロイド資化性コマモナス属細菌を、培地中でステロイド化合物と接触させ、生成した前記式（１）の化合物又はその類縁体を単離することを含む、式（１）の化合物又はその類縁体を製造する方法。
【００１２】
（２）前記コマモナス属細菌が、コマモナス・テストステロニである、（１）の方法。
（３）前記コマモナス・テストステロニが、コマモナス・テストステロニ TA441株、ATCC11996株又はそれらの変異株である、（２）の方法。
【００１３】
（４）前記代謝関連遺伝子が、前記コマモナス・テストステロニ TA441株、ATCC11996株又はそれらの変異株ゲノムのステロイド代謝系酵素遺伝子ORF18である、（１）の方法。
【００１４】
（５）前記代謝関連遺伝子が、前記コマモナス属細菌ゲノムのORF18ホモログである、（１）の方法。
【００１５】
（６）前記ステロイド化合物が、テストステロン代謝中間体化合物又はその誘導体である、（１）〜（５）のいずれかの方法。
【００１６】
（７）前記テストステロン代謝中間体化合物が、アンドロスタ-1,4-ジエン-3,17-ジオン又はアンドロスト-４-エン-3,17-ジオンである、（６）の方法。
【００１７】
（８）前記ステロイド化合物が、コール酸、ケノデオキシコール酸又はデオキシコール酸である、（６）の方法。
【００１８】
（９）前記式(1)の化合物の類縁体が、下記の式(11)、式(12)又は式(13)
【化２】
2006191920.tif 000003
【００１９】
【化３】
2006191920.tif 000004
【００２０】
【化４】
2006191920.tif 000005
の化合物である、（１）の方法。
【００２１】
（１０）前記コマモナス属細菌が担体に固定化されている、（１）〜（９）のいずれかの方法。
【００２２】
（１１）前記細菌とステロイド化合物との接触が、回分式又は連続式で行われる、（１）〜（１０）のいずれかの方法。
（１２）下記の式(11)の化合物又はそのジアステレオマー。
【００２３】
【化５】
2006191920.tif 000006
【００２４】
（１３）下記の式(12)の化合物又はそのジアステレオマー。
【化６】
2006191920.tif 000007
【００２５】
（１４）下記の式(13)の化合物又はそのジアステレオマー。
【化７】
2006191920.tif 000008
【発明の効果】
【００２６】
本発明の方法は、コマモナス属細菌の遺伝子破壊株を使用するため、公知のアースロバクター属細菌やミコバクテリウム属細菌のニトロソグアニジン突然変異株と比べて、増殖及びステロイド変換に要する時間が著しく短縮され、かつ保存的変異がほとんどないか全くなく破壊株の安定的維持が容易であるし、並びに、上記式（１）の化合物又はその類縁体を高収率で得ることができ、かつインダンジオンプロピオン酸又はその類縁体以外のステロイド由来の中間代謝物の産生が非常に少ないか又はほとんどないため、生成物の精製が容易である、という利点を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明をさらに具体的に説明する。
本発明は、上述したとおり、下記の式（１）
【００２８】
【化８】
2006191920.tif 000009
の化合物、すなわち光学活性7a-メチル-1,5-ジオキソヘキサヒドロインダン-4−プロピオン酸、又はその類縁体の代謝関連遺伝子が破壊されたステロイド資化性コマモナス属細菌株を、培地中でステロイド化合物と接触させ、生成した式（１）の化合物又はその類縁体を単離することを含む、式（１）の化合物又はその類縁体を製造する方法を提供する。
【００２９】
コマモナス属細菌
本発明において、コマモナス属細菌は、ステロイド資化性であり、かつステロイド代謝系内に式（１）の化合物又はその類縁体を代謝中間体として含むものであれば、そのいずれも本発明の遺伝子破壊株の作製のための親株として使用できる。この親株ゲノム上で破壊すべき遺伝子は、ステロイド代謝系で式（１）の化合物又はその類縁体の代謝に関わる遺伝子、すなわち代謝関連遺伝子である。この遺伝子は、少なくとも構造遺伝子を含み、さらにその５'非翻訳領域、３'非翻訳領域及び／又は転写調節領域（例えばエンハンサー又はプロモーター）を含むことができる。本発明の目的のためには、構造遺伝子を破壊することが好ましいが、非翻訳領域又は転写調節領域の破壊であっても、転写が抑制もしくは阻止され、前記代謝関連遺伝子の発現が起こらなければ、構造遺伝子以外の領域のみの破壊も可能である。遺伝子破壊株の作製法については、後述する。
【００３０】
コマモナス属細菌には、例えば、コマモナス・テストステロニ(Comamonas testosteroni) (Tamaokaら, Int. J. Syst. Bacteriol.(1987), 37:58; ATCC 11996, ATCC 1740,DSM 50244など)及びその近縁種、例えばコマモナス・デニトリフィカンス(C. denitrificans)(Gumaeliusら, Int. J. Syst. Bacteriol. (2001), 51:1005; ATCC 700936)、コマモナス・ニトラチボランス（C. nitrativorans）(Etchebehereら, Int. J. Syst. Bacteriol. (2001), 51:982; DSM 13191)、コマモナス・テリジェナ(C. terrigena) (DeVosら, Int. J. Syst. Bacteriol. (1985), 35:450; ATCC 8461, DSM 7099)など、並びに、これらの変異株が含まれ、式（１）の化合物又はその類縁体を代謝中間体とするステロイド資化性細菌種が本発明で遺伝子破壊株作製のための親株として使用される。
【００３１】
本発明において、好ましいコマモナス属細菌は、コマモナス・テストステロニである。この菌株には、以下のものに限定されないが、例えばTA441株（特開2003-61671号公報）及びその近縁株、例えばATCC 11996、ATCC 17410、ATCC 15666株、ATCC 15667株、ATCC 17409株、ATCC 17510株、ATCC 27911株、ATCC 31492株、ATCC 33083株などが含まれる。ここでATCCとは、米国寄託機関であるアメリカンタイプカルチャーコレクションを意味し、ATCCの後の数字は、寄託された微生物の受託番号である。TA441株とATCC11996株又はATCC 17410株との間の％同一性はそれぞれ、ゲノムDNAレベルで99％以上、80%以上であると考えられる。ここで変異株とは、自然変異もしくは人為的変異によって得られた細菌株をいい、ステロイド代謝系酵素遺伝子群を含むゲノム配列の％同一性が、TA441株に対して少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%であるような細菌株である。
【００３２】
％同一性は、同一の重なり合う位置の数／位置の総数×100で表わされ、２種類の配列間の％同一性は、公知の数学的アルゴリズムを用いて決定されうる。数学的アルゴリズムの例は、BLASTnプログラムである(Altschulら, J. Mol. Biol. (1990), 215:403-410)。例えばスコア=100、ワード長＝12のBLASTnプログラムによりBLASTヌクレオチド検索を行い、目的の核酸配列と相同なヌクレオチド配列を得、％同一性を決定しうる。その他の例は、ギャップ付きアラインメントを得るためのGapped BLASTを利用する方法(Altschulら, Nucleic Acids Res. (1997), 25:3389-3402)、Pearson及びLipmanが記載したような配列比較のためのFASTA(Proc. Natl. Acad. Sci. (1988), 85:2444-2448)などである。
【００３３】
特に本発明の好適実施形態において、前記コマモナス・テストステロニは、コマモナス・テストステロニ TA441株、ATCC11996株又はそれらの変異株である。
【００３４】
本明細書中で使用される「変異株」は、自然変異によるか、又はUV、γ線などの照射、変異原物質処理、トランスポゾンなどで変異を生じさせて得られる、かつ親株と比べて遺伝子型に変化が生じた細菌株を意味し、上記式（１）の化合物又はその類縁体を代謝中間体として生成する細菌株である。
【００３５】
遺伝子破壊株
本発明で使用可能な遺伝子破壊株は、ステロイド代謝中間体である式（１）の光学活性7a-メチル-1,5-ジオキソヘキサヒドロインダン-4−プロピオン酸又はその類縁体の代謝関連遺伝子が破壊されていることを特徴とする。
【００３６】
式（１）で表わされる代謝中間体は、その７a位と４位に２つの不斉炭素が存在し、可能なジアステレオマーのいずれであってもよいが、好ましくは、7aβ-メチル-1,5-ジオキソ-8aα-ヘキサヒドロインダン-4α−プロピオン酸である。
【００３７】
本明細書中で使用する「類縁体」とは、式（１）の構造の任意の位置において、１もしくは複数の置換基、非限定的に、例えば-OH、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、フェニル、置換フェニル、ハロゲン、-OR（Rはアルキルもしくは置換アルキル）、-OCOR（Rはアルキルもしくは置換アルキル）などから選択される置換基、を含む式（１）の化合物の誘導体を指す。類縁体の例は、１位の>C=O基が-O-CO-、-C(OH)(CH3)-、>C-CH(OH)-CH3などの別の任意の基、１位と２位の-CO-CH2-が-O-CO-基、７位がOHなどの任意の基、あるいは、プロピオン酸基の３位の水素原子がOHなどの任意の基でそれぞれ置換された構造の化合物である。置換基の例は、以下に限定されないが、例えばハロゲン(F, Cl, Brなど)、低級アルキル基(C1〜C4)、ハロゲン、OHもしくはOR（ここで、Rは低級アルキルである。）などで置換された低級アルキル基などである。類縁体の例は、下記の式で表わされる8aβ-メチル-6-ケトペルヒドロクマリン-5α-プロピオン酸（式（２））、1β-オキシ-1α,7aβ-ジメチル-5-ケトペルヒドロインダン-4α-プロピオン酸（式（３））、1β-(1-オキシエチル)-7aβ-メチル-5-ケトペルヒドロインダン-4α-プロピオン酸（式（４））などであるが、これらに限定されない。
【００３８】
【化９】
2006191920.tif 000010
【００３９】
【化１０】
2006191920.tif 000011
【００４０】
【化１１】
2006191920.tif 000012
【００４１】
さらに別の類縁体の例は、下記の式(11)、式(12)及び式(13)の化合物である。
【化１２】
2006191920.tif 000013
【００４２】
【化１３】
2006191920.tif 000014
【００４３】
【化１４】
2006191920.tif 000015
【００４４】
本発明では、ステロイド資化性コマモナス属細菌ゲノムにおける式（１）の化合物もしくはその類縁体の代謝関連遺伝子がDNA組換え技術、特に相同組換え技術、によって破壊された細菌株が使用されうる。
【００４５】
好ましい代謝関連遺伝子は、コマモナス・テストステロニ TA441株、ATCC11996又はそれらの変異株ゲノムのステロイド代謝系酵素遺伝子ORF18、並びに、他のコマモナス属細菌ゲノムのORF18ホモログである。ORF18ホモログとは、コマモナス・テストステロニ TA441株、ATCC11996又はそれらの変異株以外のコマモナス属細菌由来の、ORF18と同等の機能をもつ同族体遺伝子を意味する。
【００４６】
以下に、本発明の遺伝子破壊株の作製について説明する。
本発明の遺伝子破壊株では、コモナス属細菌のステロイド代謝系酵素遺伝子群、より具体的にはテストステロン代謝系酵素遺伝子群、のなかで、式（１）の化合物もしくはその類縁体の代謝に関わる酵素のゲノム遺伝子が破壊される。
【００４７】
破壊される代謝関連遺伝子の具体例は、コマモナス・テストステロニTA441株のORF18である（M. Horinouchi, T. Hayashi, T. Yamamoto及びT. Kudo, Appl. Environ. Microbiol. (2003), 69:4421-4430；特に図２）。TA441株のORF18のヌクレオチド配列は、配列番号１として示されている。本発明ではこの特定例に制限されず、配列番号１に示される配列との％同一性が、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％である配列を含む代謝関連遺伝子もまた、本発明の目的のために使用できる。ただし、相同な代謝関連遺伝子は、式（１）のインダンジオンプロピオン酸もしくはその類縁体の代謝に関わる酵素をコードする。このような相同遺伝子を有するコマモナス属細菌はすべて、本発明における遺伝子破壊株の作製のために使用できる。好ましいコマモナス属細菌は、コマモナス・テストステロニ、例えばTA441株及びその近縁株、例えばATCC 11996株、ATCC 17410株、ATCC 15666株、ATCC 15667株、ATCC 17409株、ATCC 17510株、ATCC 27911株、ATCC 31492株、ATCC 33083株などであり、これらの細菌株から誘導された遺伝子破壊株が、本発明において好ましく使用できる。
【００４８】
コマモナス属細菌が、配列番号１と相同な代謝関連遺伝子をゲノム上に有することを調べるために、32P、125Iなどの放射性同位元素、ローダミン、フルオレサミン、それらの誘導体、Cy3、Cy5などの蛍光色素などによって標識された配列番号１の配列由来のプローブを作製し、コマモナス属細菌由来のゲノムDNA、mRNA、cDNA又はそれらの断片、とプローブとのハイブリダイゼーションを実施することができる。
【００４９】
プローブは、配列番号１の配列の相補的配列又はその断片配列からなるDNA分子であり、配列番号１の配列からの連続する少なくとも30ヌクレオチド（nt）、少なくとも50nt、少なくとも70nt、少なくとも100nt、少なくとも150ntのサイズである。
【００５０】
ハイブリダイゼーションは、特に制限されないが、公知のハイブリダイゼーション技術、例えばサザンハイブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーション、in situハイブリダイゼーション、DNAマイクロアレイなどによって行うことができる（中山広樹ら著、細胞工学別冊、バイオ実験イラストレイテッド、遺伝子解析の基礎、秀潤社、1995年；松村正明ら監修、細胞工学別冊、ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法、秀潤社、2000年）。相同性の高い代謝関連遺伝子を保有することを確認するために、ハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下で行うことが好ましい。
【００５１】
ストリンジェントな条件は、温度、イオン強度、洗浄条件などの条件の違いによって低、中又は高ストリンジェント条件としうるが、好ましくは高ストリンジェント条件である。ハイブリダイゼーション条件及び手順、試薬などについては、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989；Ausubelら,Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1998に記載されており、本発明においてそれらの記載を参考にしうる。また、ハイブリダイゼーション試薬は、市販のものを使用してもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、例えば約45〜50℃での２〜６×SSC（NaCl/クエン酸ナトリウム)中でのハイブリダイゼーションと、その後の約50〜65℃での約0.1〜１×SSC/約0.1〜0.2%SDS中での1回以上の洗浄が挙げられる。
【００５２】
ハイブリダイゼーションが陽性の場合、細菌のゲノムDNA断片の制限マップを作成し、所望の前記代謝関連遺伝子配列及び、必要により、その周辺配列を決定し、さらに必要ならばTA441株由来の配列番号１の配列との％同一性を決定する。配列決定のために、制限マップに基いて、所望遺伝子を制限的に切り出し、プラスミド、ファージ、コスミドなどのクローニングベクターに挿入し、大腸菌、バチルス属細菌（例えばバチルス・ブレビス、バチルス・ズブチリス）などの宿主細胞中に形質転換することを含む方法によって所望遺伝子を増幅することができる。また、このときポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用することによって、所望遺伝子を効率的に増幅することもできる。
【００５３】
クローニングベクターとして、例えば市販される、M13mp（ファージ）、Charomid9系（コスミド）、pMW系、pBluescript系、pBR322、pUC系、pDEL系（以上、プラスミド）などを使用することができる。ベクターには、所望遺伝子の他に、プロモーター、ターミネーター、開始コドン、停止コドン、複製開始点、選択マーカー、マルチプルクローニングサイトなどを適宜含むことができる。
【００５４】
形質転換は、公知の形質転換技術、例えばリン酸カルシウム法、塩化カルシウム法、エレクトロポレーションなどの手法を用いて行うことができる。
【００５５】
配列決定は、サンガー法、マキサム-ギルバート法などの慣用手法を用いて行うことができる。配列決定のために、CUGA（登録商標）シークエンシングキット（ニッポンジーン）などの市販キットを使用してもよい。
【００５６】
PCRは、DNAの変性、アニーリング、伸長反応からなり、変性は、二本鎖DNAを通常94℃、15秒〜1分で処理して一本鎖DNAに解離させる段階、アニーリングは、鋳型DNAにプライマーをアニーリングさせる段階であり、通常55℃、30秒〜1分の処理条件からなる段階、伸長は、プライマーの伸長を通常72℃、30秒〜10分の条件でTaq DNAポリメラーゼなどの耐熱性ポリメラーゼを使用して行う段階を含み、これを1サイクルとして通常25〜40サイクル繰り返してDNA増幅行う。プライマーは通常15〜30塩基長が好ましい。PCR技術は、例えば蛋白質核酸酵素増刊、PCR法最前線(1996), 41巻5号,共立出版に記載されており、本発明において参考にしうる。
【００５７】
目的遺伝子のクローニング、配列決定、PCRなどの技術に関しては、Sambrookら（上記）、Ausbelら（上記）に具体的に記載されており、それらの記載を本発明において参考にすることができる。
【００５８】
本発明において、遺伝子破壊は、ステロイド資化性コマモナス属細菌において、式（１）のインダンジオンプロピオン酸もしくはその類縁体の代謝関連遺伝子の破壊であり、この破壊のために、代謝中間体としてのこれら化合物が、培養液中に蓄積される。遺伝子を破壊するために、本発明では、ニトロソグアニジンなどの変異試薬を用いる突然変異による方法も利用できるが、好ましくはDNA組換え技術、特に相同組換え技術を使用して、所望遺伝子及び/又は５'非翻訳領域、３'非翻訳領域もしくは転写調節配列の一部又は全部を破壊し、所望遺伝子によってコードされる関連代謝酵素をin vivoで生成させないようにするかあるいは機能不全にする。破壊は、所望遺伝子の配列において、例えば該配列の一部の欠失（例えば脱落、部分分解）、異種DNAによる置換、及び／又は異種DNAの挿入によって実施できる。本発明の特定例では、相同組換え法によって、所望遺伝子の内部に異種DNAとして抗生物質耐性遺伝子を挿入することによって、所望遺伝子が破壊される。抗生物質耐性遺伝子の例は、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などである。この方法では、所望遺伝子内部の１つ又は複数の制限部位に、抗生物質耐性遺伝子配列と、その各末端に連結された、前記ユニーク制限部位の５'及び３'側に存在する所望遺伝子断片及びそれに隣接する非翻訳領域からの少なくとも約0.3kb、好ましくは少なくとも約0.6kb、さらに好ましくは少なくとも約１kbの各配列とを含む相同組換え用プラスミドを使用して、ゲノムへの抗生物質耐性遺伝子配列の挿入を行うことができる。プラスミドの例は、pGT系、pBluescript KS(+)、pUC系、pCT系などを含む。菌体内へのプラスミドの導入は、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法などの慣用技術によって実施できる。培養により、抗生物質耐性菌株を選択し、そのなかで所望遺伝子内部に抗生物質耐性遺伝子が挿入された遺伝子破壊株を得る。挿入の確認は、抗生物質耐性遺伝子及び所望遺伝子の各プローブを用いるサザンハイブリダイゼーションによって行うことができる。
【００５９】
なお、遺伝子破壊については、特開2003-61671号公報に記載される手順を参考にすることができる。
【００６０】
物質生産
上記の手法で得られたコマモナス属遺伝子破壊株を、通常、培地中で前培養し、その一部又は全部を、原料ステロイド化合物を含む培地に加えて培養し、式（１）の化合物もしくはその類縁体を生産し回収する。
【００６１】
培養は、コマモナス属細菌の公知の培養条件で行うことができる。
培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、天然培地、合成培地のいずれも使用可能である。一般に、細菌用の固体又は液体培地であれば、培地として使用できる。培地成分には、例えば、炭素源及び窒素源としてペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、肉エキス、バクトトリプトンなど、無機塩類としてNaCl, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4, CaCl2, FeSO4, MgSO4, MoO3, ZnSO4, CuSO4, MnSO4, CoCl2, H3BO3など、必要に応じてアガーを含むことができる。培地の例は、Luria-Bertani(LB)培地、C培地、LB/C混合培地などである。本発明では、培地中にさらに原料ステロイド化合物を含有させるが、ステロイドが炭素源として効率よく資化されるように、他の炭素源の含量を減らし、ステロイド化合物の含量を増やすことができる。培地のpHは、７〜7．3が好ましい。
【００６２】
本発明の遺伝子破壊株は、上記の培地成分を含む固体培地で保存菌を培養、増殖したのち、同様の成分の液体培地中で前培養し、さらに菌数を増やし、次いで、同様の液体培地中で物質生産のために使用される。菌量は、特に限定されないが、培地あたり約１〜約10％(w/v)である。
【００６３】
培養の方式としては、回分式又は連続式培養のいずれも使用できる。
回分式培養の場合、培養槽のなかに、滅菌培地、培養遺伝子破壊株もしくはその固定化菌体、原料ステロイド化合物を仕込み、振盪培養、攪拌培養、通気攪拌培養、深部通気攪拌培養などの培養方法で、約25℃〜約35℃の培養温度で、約15〜約100時間培養することができる。
【００６４】
連続式培養の場合、同様の培養温度で、膜型、流動層型、充填層型、横型などの種々のバイオリアクターの使用が可能である。具体的には、例えば中空糸膜などの半透膜で仕切られた培養槽の一方の区画に遺伝子破壊株を仕込み、他方の区画に原料ステロイド化合物を含む滅菌培地を連続的に流して、原料ステロイド化合物を、半透膜を介して遺伝子破壊株と接触させる方法、あるいは、遺伝子破壊株を担体に固定化した固定化遺伝子破壊株を作製し、この固定化菌体をカラムなどの連続式培養槽内に充填もしくは流動し、原料ステロイド化合物を含む滅菌培地を連続的に槽内に流して、固定化菌体とステロイド化合物とを接触させる方法などの方法を使用できる。
【００６５】
遺伝子破壊株を固定化するための担体には、多孔性無機粒状物、例えば軽石、ゼオライト、シリカゲルなど、有機粒状物、例えばポリマー類、例えばポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、不飽和ポリエステル、不飽和エポキシド、不飽和アクリル樹脂、ポリエチレングリコールと（メタ）アクリル酸とのポリエステル、親水性光硬化性樹脂、例えばポリエチレングリコールとメタアクリル酸２−ヒドロキシエチルとのウレタン化付加物などが含まれる。さらに特願平07-039376号公報、特願平10-296284号公報、特開2003-000237号公報に記載されるような固定化担体を使用することもできる。これらの固定化用担体に遺伝子破壊株を固定化する方法としては、吸着法、包括法、付着増殖法などの一般的手法を使用できる。本発明の遺伝子破壊株は、担体の孔表面に吸着もしくは付着されるか、あるいは、多孔性担体の内部に埋め込まれて、その場で増殖することが好ましい。
【００６６】
本発明で使用される原料ステロイド化合物は、本発明の遺伝子破壊株によって式（１）の化合物もしくはその類縁体に変換されるものであれば、その種類を問わない。原料ステロイド化合物の例は、テストステロン、シトステロール、カンペステロール、1,4-アンドロスタジエン-3,17-ジオン、4-アンドロステン-3,17-ジオン、プロゲステロン、胆汁酸、テストステロン代謝中間体化合物、又はそれらの誘導体であるが、これらに限定されない。ここで、誘導体は、上記のステロイド化合物の任意の位置において、１もしくは複数の置換基、非限定的に、例えば-OH、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、フェニル、置換フェニル、ハロゲン、-OR（Rはアルキルもしくは置換アルキル）、-OCOR（Rはアルキルもしくは置換アルキル）などから選択される置換基、を含むステロイド化合物の誘導体を指す。好ましくは、下記式のアンドロスタ-1,4-ジエン-3,17-ジオン（式（５））、アンドロスト-４-エン-3,17-ジオン（式（６））、又はその誘導体、例えばコール酸及びその誘導体、例えばケノデオキシコール酸、デオキシコール酸などであるが、これらに限定されない。
【００６７】
【化１５】
2006191920.tif 000016
【００６８】
【化１６】
2006191920.tif 000017
【００６９】
他の原料誘導体の例は、下記式のテストロラクトン（式（７））、17-メチルテストステロン（式（８））、3β,20β-ジオキシ-５-プレグネン（式（９））などである。
【００７０】
【化１７】
2006191920.tif 000018
【００７１】
【化１８】
2006191920.tif 000019
【００７２】
【化１９】
2006191920.tif 000020
【００７３】
原料ステロイドの濃度は、培養液あたり約0．01％〜約２％(w/v)、好ましくは約0．1％〜１％(w/v)であるが、この範囲に限定されない。
【００７４】
原料ステロイド化合物が、式（５）又は（６）の化合物である場合、式（１）の化合物が生成する。好ましい主生成物は、下記の式(10)の7aβ-メチル-1,5-ジオキソ-8aα-ヘキサヒドロインダン-4α−プロピオン酸であるが、そのジアステレオマーも本発明の生成物に含まれるものとする。
【００７５】
【化２０】
2006191920.tif 000021
【００７６】
さらに、原料ステロイド化合物がコール酸、ケノデオキシコール酸又はデオキシコール酸である場合、好ましい主生成物はそれぞれ、式(11)の化合物、式(12)の化合物又は式(13)の化合物である。しかし、本発明は、これらの化合物のジアステレオマーも包含する。
【００７７】
本明細書中で使用する「ジアステレオマー」とは、立体異性体のうちエナンチオマーを除くすべての異性体を意味する。例えば１分子中に２つの不斉炭素が存在する場合、可能なジアステレオマーは（S,S）、(S,R)、(R,S)及び(R,R)の4種類である。
【００７８】
さらにまた、原料ステロイド化合物が、式（５）、（６）の化合物の誘導体としての式（７）、式（８）、式（９）で表わされる誘導体である場合、式（２）、式（３）又は式（４）の化合物が生成すると推定される。
【００７９】
培養後、培養液を、塩酸などの酸にて酸性（例えばｐH約２）に調整したのち、酢酸エチルなどのエステル、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン、クロロホルム、ジクロロメタン、塩化メチレンなどのハロゲン化炭化水素、エチルエーテル、ジオキサンなどのエーテルなどの有機溶剤で抽出し、濃縮、結晶化を経て、目的の生成物を精製することができる。あるいは、培養液をイオン交換カラム（H+）に通し、樹脂に生成物を吸着させたのち、酢酸、塩酸などの酸にて生成物を溶出させてもよい。あるいは、HPLC、シリカゲルクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどのクロマトグフィー技術を適宜組み合わせて、目的の生成物を精製することもできる。
【００８０】
本発明を、以下の実施例においてさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されないものとする。
【実施例１】
【００８１】
コマモナス・テストステロニTA441由来のORF18遺伝子破壊株の作製
コマモナス・テストステロニTA441株のORF18遺伝子（配列番号１）を、該遺伝子のユニークXhoI制限部位にカナマイシン耐性遺伝子(Kmr)を挿入することによって、遺伝子破壊した。
【００８２】
Kmr挿入用プラスミドpORF18-Kmrは、図１の手順に従って構築された。具体的には、カルベニシリン耐性遺伝子Cbrを保有するプラスミドpUC19にORF18遺伝子を挿入したのち、ORF18遺伝子をXhoIで切断し、末端平滑化し、これにカナマイシン耐性遺伝子Kmr Smaインサート（配列番号２）を挿入した。このカナマイシン耐性遺伝子は、トランスポゾンTn5由来であり、遺伝子カセットを作製しやすくするために、その前後にSmaIサイトを連結し、また耐性遺伝子の最初にPstI, EcoRI, EcoRV, HindIIIの各制限酵素サイトを有している。エレクトロポレーションによってプラスミドをTA441株に導入し、相同組換えを行った。相同的に組み換えられた遺伝子ORF18-Kmr（ORF18にKmrを挿入した配列）は、配列番号３に示されている。
【００８３】
ORF18破壊株について、カナマイシン又はカルベニシリンを含有する別々のLB培地固体培地上で培養し、カナマイシンに耐性でカルベニシリンに感受性のTA441変異株を選択した。
【００８４】
ORF18遺伝子内へのKmr遺伝子の挿入は、Kmr Smaインサート（配列番号２）及びORF18（配列番号１）をプローブとして用いるサザンハイブリダイゼーションによって確認された。使用されたハイブリダイゼーション条件は、以下のとおりである。
【００８５】
（試薬）
10％ブロッキング試薬保存液
ブロッキング試薬10g/buffer 100 ml（オートクレーブ滅菌）
Buffer 1：0．1Mマレイン酸
0.15M NaCl, pH7.5(NaOHにより調整)（オートクレーブ滅菌）
高SDSハイブリダイゼーション溶液
SDS                                35g
100％ホルムアミド（脱イオン化）    250ml
30×SSC                            83ml
１Mリン酸ナトリウム, pH 7.0        25ml
N-ラウロイルサルコシン              0.5g
10％ブロッキング試薬保存液          100ml/蒸留水500ml
２×洗浄液：２×SSC, 0.1%SDS
0.1×洗浄液：0.1×SSC, 0.1%SDS
【００８６】
（操作）
高SDSハイブリダイゼーション溶液(20ml/100cm2メンブレン)中、42℃、少なくとも1時間プレハイブリダイゼーションを行ったのち、高SDSハイブリダイゼーション溶液(3.5ml/100cm2メンブレン)中、42℃一晩ハイブリダイゼーションを行った。メンブレンを２×SSC、0.1%SDSで室温、５分間、2回洗浄し、さらに0.1×SSC、42℃、15分間、２回洗浄した。
【００８７】
（検出）
メンブレンをbuffer 1（0.1Mマレイン酸, 0.15M NaCl, pH 7.5）で軽く濯ぎ、100mlのbuffer 2(10%(w/v)ブロッキング試薬保存液を10倍希釈したもの)で室温30分間ゆっくり振とうしブロッキングを行った。次いで、希釈標識抗体溶液（アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体150mU/ml buffer 2）で室温、30分間ゆっくり振とうした。Buffer 1で15分ずつ２回洗浄し、20mlのBuffer 3(0.1M Tris-HCl, pH 9.5, 0.1M NaCl)で２分間平衡化した。10mlの発色試薬（NBT溶液45μl＋X-リン酸溶液35μl/Buffer 3 10ml）を加えて暗所に静置した。バンドが検出されたら、TE50mlで５分間洗浄し、反応を停止させた。なお、NBT溶液は、ニトロブルー・テトラゾリウム塩75mg/ml 70%DMF、X-リン酸溶液は、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリルホスフェート、トルイジン塩50mg/mlDMFである。
【００８８】
上記の手法によって、コマモナス・テストステロニTA441由来のORF18遺伝子破壊株を作製した。
【実施例２】
【００８９】
ORF18遺伝子破壊株による7aβ-メチル-1,5-ジオキソ-8aα-ヘキサヒドロインダン-4α−プロピオン酸の製造
実施例１で得られたORF18遺伝子破壊株をLB試験管培地〔ポリペプトン 10 g；NaCl 5 g；酵母エキス5 g；pH 7.0 (NaOHで調整)／１Ｌ蒸留水〕10ml×３本で30℃、一晩培養した。培養液を、バッフルの無い500ml三角フラスコにLB培地とC培地〔(NH4)2SO4 5.0 g；K2HPO4 5.87 g；KH2PO4 2.93 g；MgSO4・7H2O (×100) 10 ml；NaCl 2 g；酵母エキス0.2 g；10g/L CaCl2 溶液1 ml (最終10 mg / L)；10g/L FeSO4溶液1 ml (最終 10 mg/L)；微量元素溶液 (×100) 20 μl；pH 7.0 (NaOHで調整)／１L 蒸留水；MgSO4・7H2O (×100) : MgSO4・7H2O 30 g / L；微量元素溶液 (×100) : MoO3 0.1 g、ZnSO4・5H2O 0.7 g、 CuSO4・5H2O 0.05 g、H3BO3 0.1 g、MnSO4・5H2O0.1 g、CoCl2・6H2O 0.1 g／１L 蒸留水〕を50mlずつ計100ml加えた培地５個に６mlずつ植菌し、0.1％(w/v)の1,4-アンドロスタジエン-3,17-ジオンを添加して、振盪数80rpm、培養温度30℃で、４日間培養した。
【００９０】
培養液（100ml×５）を遠心し、上清を６N  HCｌ溶液を用いてｐH２に調整後、酢酸エチル600mlで２回抽出した。酢酸エチル画分を合わせ、脱水した後、濃縮し淡青色油状残渣560mgを得た。
【００９１】
培養上清のHPLC分析結果を図２-１、酢酸エチル画分のHPLC分析結果を図２-２にそれぞれ示した。HPLCの分析条件は次のとおりである。
装置：Waters 2690 HPLC
カラム：Inertsil ODS-3 (2.1×150 mm)
展開溶剤：溶液A(CH3CN:CH3OH:TFA=95:5:0.05)、溶液B(H2O:CH3OH:TFA=95:5:0.05)
グラジエント：20％溶液A＋80％溶液Bから65％溶液A＋35％溶液Bのグラジエント10分；３分の保持；20％溶液Aへ５分間で変化させる
温度：40℃
流速：0.21ml/分
【００９２】
淡青色油状残渣560mgを微量のメタノールに溶解し、HPLCを用いて目的生成物のピーク322mgを分取した。HPLC条件は以下のとおりである。
HPLC（分取条件）：
HPLC:  Waters 600 HPLC 
カラム:Inertsil ODS-3 column (20 x 250 mm)
流速:  8 ml/min
温度： 40 ℃
展開溶剤 20%溶液A + 80%溶液B から 65%溶液A + 35%溶液B へ 25分間で変化, 10分保持, それから20%溶液A へ5分間で変化。
溶液A (CH3CN: CH3OH:TFA = 95:5:0.05) 
溶液B (H2O:CH3OH:TFA = 95:5:0.05) 
検出波長：210nm
【００９３】
上記HPLCによって精製された目的生成物のHPLC分析結果を図２-３に示した。
FAB-MS(装置：JEOL JMS-SX 102)、NMR(装置：JNM-ECP500, JNM-ECA600（JEOL製）)及びUV分析の結果、得られた生成物は、下記式（10）の7aβ-メチル-1,5-ジオキソ-8aα-ヘキサヒドロインダン-4α−プロピオン酸（収率76.8％）であった。
【００９４】
【化２１】
2006191920.tif 000022
【００９５】
（分析結果）
NMR分析(CDCl3又はCD3OD)：
【表１】
2006191920.tif 000023
【００９６】
FAB-MS分析:  実験値：m/z 239.1297[M+H]+；計算値：m/z 239.1283 (C13H18O4)
UV分析: 290 nm(e:58) (MeOH)
【実施例３】
【００９７】
ORF18遺伝子破壊株によるコール酸からの式（11）の化合物の製造
0.1％(w/v)の濃度のコール酸を基質にして、実施例１で作製したORF18遺伝子破壊株を、培地LB+C 100 ml×5、振盪数80rpm、培養温度30℃、３日間培養した。
【００９８】
培養液(500ml)を遠心(6500rpm)し、上清を酢酸エチルエステル550mlで1回抽出した後、6N HCl溶液を用いて水層をpH2に調整、再び酢酸エチルエステル550mlで3回抽出した。酢酸エチルエステル画分を脱水後濃縮し、 残渣460mgを得た。これをHPLCを用いて分取、精製した。
HPLC（分取条件）：
HPLC:  Waters 600 HPLC 
カラム:Inertsil ODS-3 column (20 x 250 mm)
流速:  8 ml/min
温度： 40 ℃
展開溶剤 20%溶液A + 80%溶液B から 65%溶液A + 35%溶液B へ 25分間で変化, 10分保持, それから20%溶液A へ5分間で変化。
溶液A (CH3CN: CH3OH:TFA = 95:5:0.05) 
溶液B (H2O:CH3OH:TFA = 95:5:0.05) 
検出波長：210nm
蓄積物は分取したフラクション（Fr）3、Fr4に含まれており、濃縮乾燥したFr3(油状物質)の重量は68mgであった。
【００９９】
Fr3のUVスペクトルは260nmに極大吸収をしめした。また重メタノール中でNMR測定した結果、式（１）の化合物の7位とそのプロピオン酸基の３位に１つずつOH基を有した類縁体であることが確認された。すなわち、基質に用いたコール酸の置換基であった7,12位のOH基がそのまま残存した類縁体(式（11）)が得られた。
【０１００】
【化２２】
2006191920.tif 000024
【０１０１】
分析結果は、次のとおりである。
HPLC（分析条件、3次元）：
HPLC:    Waters 2690 HPLC
カラム:  Inertsil ODS-3 column (4.6 x 250 mm)
流速:    1 ml/min
温度：  40 ℃
展開溶剤：20%溶液A + 80%溶液B から 65%溶液A + 35%溶液B へ 10分間で変化、3分保持、それから20%溶液A へ2分間で変化。15分から最初の状態20%溶液A + 80%溶液Bに戻る。
【０１０２】
代謝物はRT3.9分に特徴的なピークを示した。
NMR分析(CDCl3又はCD3OD)：
【０１０３】
【表２】
2006191920.tif 000025
【０１０４】
HR-FAB(negative)測定結果：
実験値: m/z 269.1032 [M-H]-；計算値: m/z 269.1025（C13H17O6）
【実施例４】
【０１０５】
ORF18遺伝子破壊株によるケノデオキシコール酸からの式（12）の化合物の製造
0.1％（w/v）の濃度のケノデオキシコール酸を基質にして、実施例１で作製したORF18遺伝子破壊株を、培地LB+C 100 ml×10、振盪数80rpm、培養温度30℃、４日間培養した。
【０１０６】
培養液(1000ml)を遠心(6500rpm)、上清を6N HCl溶液を用いてpH2に調整後、酢酸エチルエステル(EA) 1100mlで2回抽出した。EA 画分を脱水後濃縮し、 残渣1100mgを得た。これをHPLCを用いて分取、精製した(図3-1及び図3-2)。
HPLC（分取条件）：
展開溶剤の条件が一部異なる以外は実施例３の場合と同じ条件及び装置を使用した。
展開溶剤 10%溶液A + 90%溶液B から 65%溶液A + 35%溶液B へ 25分間；10分保持；20%溶液A へ5分間で変化させる。
溶液A (CH3CN: CH3OH:TFA = 95:5:0.05) 
溶液B (H2O:CH3OH:TFA = 95:5:0.05) 
【０１０７】
HPLC分取した各画分をそれぞれ濃縮し重量を測定した結果、保持時間（RT）5.2分の画分（油状物質）138mgで最大の蓄積物であり、その次がRT7.0の40mg、その他の画分は約10mg前後であり、最大の重量を有したピークRT5.2が本菌株の蓄積物と考えられた。
【０１０８】
RT5.2のHPLC溶剤中でのUVスペクトルは286.6nmに極大吸収を示した。
さらに、RT5.2画分を濃縮し、乾燥後、CDCl3中でNMR測定した結果、(12)の化合物(分子式C13H18O5及び分子量254)であることが判明した(表３)。
【０１０９】
【化２３】
2006191920.tif 000026
【０１１０】
分析結果は、次のとおりである。
HPLC（分析条件、3次元）：
HPLC:    Waters 2690 HPLC
カラム:  Inertsil ODS-3 column (4.6 x 250 mm)
流速:    1ml/min
温度：   40 ℃
展開溶剤：20%溶液A + 80%溶液B から 65%溶液A + 35%溶液B へ 10分間で変化、３分保持、それから20%溶液A へ２分間で変化。15分から最初の状態20%溶液A + 80%溶液Bに戻る。
【０１１１】
代謝物はRT5.2分に特徴的なピークを示した。
NMR分析(CDCl3)：
【表３】
2006191920.tif 000027
【０１１２】
また、２番目の重量を示したRT7.0の蓄積物は、同様にNMRスペクトルを測定解析した結果、実施例２で得られたものと同じ式(10)の化合物であると同定された。
【０１１３】
なお、上記実施例中、図2-1、2-2、2-3、3-1及び3-2に示すHPLCチャートはすべて分析用HPLC(三次元のWaters 2690)での分析結果であり、また文中のRTは三次元HPLCにおける保持時間を示している。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明の方法は、医薬品、健康食品、食品、化粧品、育毛剤、強壮剤、等のステロイド合成中間体としての上記式（１）の化合物又はその類縁体の工業的生産のために有利に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】破壊用プラスミドpORF18-Kmrの構築図を示す。
【図２−１】ORF18遺伝子破壊株による1,4-アンドロスタジエン-3,17-ジオンの変換生成物を含有する培養液の遠心上清のHPLC分析クロマトグラムを示す。矢印は式(10)の化合物を示す。
【図２−２】遠心上清をさらに酢酸エチルで抽出して得られた画分のHPLC分析クロマトグラムを示す。矢印は式(10)の化合物を示す。
【図２−３】精製された式(10)の化合物(7aβ-メチル-1,5-ジオキソ-8aα-ヘキサヒドロインダン-4α−プロピオン酸)(矢印)のHPLC分析クロマトグラムを示す。
【図３−１】ORF18遺伝子破壊株によるケノデオキシコール酸の変換生成物を含有する培養液の遠心上清のHPLC分析クロマトグラムを示す。RT5.2の矢印が式(12)の化合物を、またRT7.0の矢印が式(10)の化合物をそれぞれ示す。
【図３−２】遠心上清をさらに酢酸エチルで抽出して得られた画分のHPLC分析クロマトグラムを示す。RT5.2の矢印が式(12)の化合物を、またRT7.0の矢印が式(10)の化合物をそれぞれ示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１１６】
配列番号２：Kmr Smaインサート
配列番号３：ORF18-Kmr
【図１】
2006191920.tif 000036
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【配列表】
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