(57)【要約】      （修正有）【課題】移植可能な角膜内皮細胞シートを提供する。【解決手段】ヒト角膜内皮細胞の培養細胞からなるシート。セルロース又はセルロース誘導体と、セルロース細胞接着作用を有するタンパク質及び/又はペプチドとからなる培養基材上でヒト角膜内皮細胞を培養して培養細胞のシートを形成し、次いでこのシートを前記培養基材から剥離することを含む、ヒト角膜内皮培養細胞シートの作製方法。前記ヒト角膜内皮細胞の培養が、増殖因子を含有する培地中で培養することで行われる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト角膜内皮細胞の培養細胞からなるシート。
【請求項２】
セルロース又はセルロース誘導体と、セルロース細胞接着作用を有するタンパク質及び/又はペプチドとからなる培養基材上でヒト角膜内皮細胞を培養して培養細胞のシートを形成し、次いでこのシートを前記培養基材から剥離することを含む、ヒト角膜内皮培養細胞シートの作製方法であって、
前記ヒト角膜内皮細胞の培養が、増殖因子を含有する培地中で培養することで行われる、前記方法。
【請求項３】
前記増殖因子が、塩基性線維芽増殖因子（bFGF）、及び表皮増殖因子（EGF）からなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記増殖因子を含有する培地が2.0 g/L 以下のグルコースを含有する請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒト角膜内皮細胞の培養が、37℃、5％CO2の条件で行われるものである請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記増殖因子を含有する培地中で培養されるヒト角膜内皮細胞が、ヒト角膜内皮細胞を、ウシ胎児血清、成長因子、及びグルコースを含有する培地で予め培養したものである、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
グルコースを含有する培地のグルコース濃度が2.0 g/L 以下である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記成長因子がB細胞増殖因子（BCGF）、上皮成長因子（EGF）、組換えEGF（rEGF）及び繊維芽細胞増殖因子（FGF）からなる群から選ばれる少なくとも1種である請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ヒト角膜内皮細胞の培養を、初代培養及び2〜10回の継代培養として行う請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
シートの培養基材からの剥離を、セルラーゼにより前記培養基材中のセルロースを分解することにより行う請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト角膜内皮培養細胞シート及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
角膜内皮細胞は、角膜の透明性の維持に関し最も重要な役割を果たしている。しかし、角膜内皮細胞は、生体内（人体内）で、ほとんど増殖、再生しないといわれている。また、角膜内皮細胞が損傷を受けると、損傷部分は増殖した細胞によって埋めることができず、創傷治癒機転は細胞の伸展移動と代償的拡大により細胞の表面積を大きくして隙間を埋めようとする。その結果、角膜内皮細胞の単位面積当たりの密度が減少する。従って、例えば、角膜内皮細胞の表面積を増やして創傷を治癒させた場合は、角膜の機能には自ずと限界が生じ、破綻すると水胞性角膜症などの疾患を引き起こすこととなる。それに対する従来の治療方法は、角膜移植である。しかし、少なくとも日本国内では、角膜ドナーが極端に不足しているという現状があり、また、移植には適合性の問題もあり、角膜移植による治療は、万全な治療法とは言い難い。
【０００３】
角膜１は、図1に示すように、複数の層状構造を形成しており、角膜上皮２、ボーマン膜３、角膜実質４、デスメ膜５及び角膜内皮細胞６から構成されている。角膜は、期間保存しておくと、角膜上皮層の脱落、実質の浮腫、内皮細胞の脱落が起こる。しかし、角膜上皮細胞及び実質細胞には再生能力があるため問題ないが、上記のように、角膜内皮細胞は、細胞増殖能が低いため、角膜を長期保存すると、内皮細胞が脱落するという問題もある。すなわち、角膜移植をするにしても、保存の仕方によっては内皮細胞の脱落という問題も生じる可能性がある。
【０００４】
このように、角膜内皮細胞は、その生体内での増殖能が極めて低い点に問題がある。そこで、生体内での増殖能が極めて低い角膜内皮細胞を再生する試みとして、内皮細胞を除去した角膜実質部分上で、培養角膜内皮細胞を播種し、実質上に角膜内皮細胞層を構築する、角膜の再構築方法が提案されている(特許文献1、特開2002-78723号公報)
【特許文献１】特開2002-78723号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、上記方法においても、内皮細胞を除去した角膜が必要であり、角膜ドナー不足や移植に伴う拒絶反応には対応できないという問題がある。また、患者自身の角膜を一時取り出して、その上で、角膜内皮細胞層を再構築することもあり得るが、その場合、角膜内皮細胞層を再構築する間、視力を失うことになり、患者の生活に対して大きな負担を強いることになる。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、これらの問題を解決するために、移植可能な角膜内皮細胞シートを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決する本発明は以下のとおりである。
［請求項１］ヒト角膜内皮細胞の培養細胞からなるシート。
［請求項２］セルロース又はセルロース誘導体と、セルロース細胞接着作用を有するタンパク質及び/又はペプチドとからなる培養基材上でヒト角膜内皮細胞を培養して培養細胞のシートを形成し、次いでこのシートを前記培養基材から剥離することを含む、ヒト角膜内皮培養細胞シートの作製方法であって、前記ヒト角膜内皮細胞の培養が、増殖因子を含有する培地中で培養することで行われる、前記方法。
［請求項３］前記増殖因子が、塩基性線維芽増殖因子（bFGF）、及び表皮増殖因子（EGF）からなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項２に記載の方法。
［請求項４］前記増殖因子を含有する培地が2.0 g/L 以下のグルコースを含有する請求項２または３に記載の方法。
［請求項５］前記ヒト角膜内皮細胞の培養が、37℃、5％CO2の条件で行われるものである請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
［請求項６］前記増殖因子を含有する培地中で培養されるヒト角膜内皮細胞が、ヒト角膜内皮細胞を、ウシ胎児血清、成長因子、及びグルコースを含有する培地で予め培養したものである、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
［請求項７］グルコースを含有する培地のグルコース濃度が2.0 g/L 以下である請求項６に記載の方法。
［請求項８］前記成長因子がB細胞増殖因子（BCGF）、上皮成長因子（EGF）、組換えEGF（rEGF）及び繊維芽細胞増殖因子（FGF）からなる群から選ばれる少なくとも1種である請求項６または７に記載の方法。
［請求項９］ヒト角膜内皮細胞の培養を、初代培養及び2〜10回の継代培養として行う請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１０］シートの培養基材からの剥離を、セルラーゼにより前記培養基材中のセルロースを分解することにより行う請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、角膜実質上に移植することで角膜内皮細胞と同様の機能を発揮し得る角膜内皮培養細胞シートが提供される。これにより、角膜移植によらずに角膜内皮の再生が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、ヒト角膜内皮細胞の培養細胞からなるシート（以下、ヒト角膜内皮培養細胞シートということがある）に関する。
【００１０】
本発明のヒト角膜内皮培養細胞シートは、ヒト角膜内皮細胞の培養細胞からなる。この培養細胞は、角膜内皮細胞様の細胞であり、細胞シートを角膜上に移植すると、角膜内皮細胞と同等の機能、即ち、角膜内の水分含有率を適切に維持する機能を有するものになる。
【００１１】
以下、本発明のヒト角膜内皮培養細胞シートの作製方法について説明する。
本発明のヒト角膜内皮細胞シートは、セルロース又はセルロース誘導体と、セルロース細胞接着作用を有するタンパク質及び/又はペプチドとからなる培養基材上でヒト角膜内皮細胞を培養して、培養細胞のシートを形成し、次いでこのシートを前記培養基材から剥離することを含む方法により作製できる。
但し、前記ヒト角膜内皮細胞の培養は、増殖因子を含有する培地中で培養することで行われる。
【００１２】
セルロース又はセルロース誘導体と、セルロース細胞接着作用を有するタンパク質及び/又はペプチドとからなる培養基材は、例えば、特開２００１−３２１１５７号公報に記載の物であることができる。
【００１３】
より具体的には、前記セルロース誘導体は、酢酸セルロース又は、カルボキシメチルセルロースであることができる。さらに、前記細胞接着作用を有するタンパク質は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、テイネシン、トロンボスポンジン、エンタクチン、オステオポンチン、フォンビルブラント因子、フィブリノーゲン、コラーゲン、ゼラチン及びエラスチンからなる群から選択される少なくとも1種であることができる。また、前記細胞接着作用を有するペプチドは、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−セリン、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸、ロイシン−アスパラギン酸−バリン、アルギニン−グルタミン酸−アスパラギン酸−バリン、アスパラギン酸−グリシン−グルタミン酸−アラニン、グルタミン酸−イソロイシン−ロイシン−アスパラギン酸−バリン、グリンシン−プロリン−アルギニン−プロリン、リジン−グルタミン−アラニン−グリシン−アスパラギン酸−バリン、グルタミン酸−イソロイシン−ロイシン−アスパラギン酸−バリン、チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン、及びバリン−グリシン−バリン−アラニン−プロリン−グリシンからなる群から選択される少なくとも1種であることができる。
【００１４】
本発明においては、上記セルロース又はセルロース誘導体をコーティングした基板、例えば、ガラスプレートを用意する。セルロース又はセルロース誘導体の基板へのコーティングは、例えば、基板上にセルロース又はセルロース誘導体と反応性を有する表面処理を予め行うことが好ましい。そのような表面処理として、アミノ基を有する化合物での表面コーティングを挙げることができる。アミノ基を有する化合物で表面コーティングしたガラス基板は、市販品としても入手可能である。
【００１５】
基板のセルロース又はセルロース誘導体コーティングにタンパク質又はペプチドを固定化する。タンパク質又はペプチドの固定化は、セルロースの多数の水酸基を利用して行うことができる。この多数の水酸基によって固定化を容易に行うことができる。固定化の方法は、まず、セルロースの活性化を行う。セルロースの活性化は、例えば、トレシルクロライド、アセトン、ピリジン混合溶液や、アセトン、クロロホルム、ジオキサン等の極性有機溶媒に溶解し、これらの溶液に0.5〜3時間浸漬して行うことができる。この浸漬時間は、セルロースが活性化されれば、特に限定されない。
【００１６】
トレシルクロライドを用いる場合、セルロースの水酸基をトレシル化し、トレシル化セルロースコーティング上にフィブロネクチン等のタンパク質又はペプチドを含む緩衝液を接触させることにより、セルロース上のトレシルとタンパク質又はペプチドとが反応し、セルロース上にタンパク質又はペプチドを固定化することができる。タンパク質又はペプチドを含む緩衝液としては、一級または二級アミノ基を含む緩衝液はトレシル化セルロースと反応するため好ましくはないが、これらを含まない緩衝液であれば、特に限定されない。好ましくは、リン酸緩衝生理食塩水、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液等を挙げることができる。
【００１７】
ヒト角膜内皮細胞の培養細胞の作製は、(1)予めヒト角膜内皮細胞を、ウシ胎児血清、成長因子及びグルコースを含有する培地で培養し、次いで(2)得られた細胞を、増殖因子を含有する培地中で培養する、ことで行われることが適当である。
【００１８】
本発明では、まず、ヒト角膜内皮細胞を、ウシ胎児血清、成長因子及びグルコースを含有する培地で培養する。
グルコースを含有する培地のグルコース濃度は、通常のグルコース含有培地におけるグルコース濃度よりも低濃度であり、2.0 g/L 以下であることが好ましく、具体的には、0.1〜2.0g/Lの範囲、より好ましくは0.1〜1.0g/L範囲とすることが適当である。
ウシ胎児血清(FBS)の濃度は、例えば、10〜15％とすることができる。
成長因子としては、例えば、B細胞増殖因子（BCGF）、上皮成長因子（EGF）、組換えEGF（rEGF）、繊維芽細胞増殖因子（FGF）が挙げられ、1つ又は複数の因子を適宜組み合わせて培地に含有させることができる。これらの成長因子の含有濃度は、１〜５ng/ml、好ましくは１〜２ng/mlであることが適当である。
【００１９】
培養温度は35〜38℃、好ましくは37℃である。そして、90〜100％湿潤（好ましくは100％湿潤）、5〜10％CO2（好ましくは10％CO2）のインキュベータ内で培養する。細胞が集密になった段階（定常状態７〜１０日後）で継代する。継代は、細胞増殖の状態を観察しながら適宜行うが、2回〜10回程度継代するとよい。このようにして得られた培養細胞を、次いで、前記セルロース又はセルロース誘導体と、セルロース細胞接着作用を有するタンパク質及び/又はペプチドとからなる培養基材上で、培養する。
【００２０】
培養細胞の培養は、増殖因子を含有する培養液中で行う。増殖因子は、例えば、塩基性線維芽増殖因子（bFGF）及び表皮増殖因子（EGF）からなる群から選ばれる少なくとも1種であることができる。培養液中の増殖因子の濃度は、例えば、１〜５ng/ml、好ましくは１〜２ng/mlとすることができる。
【００２１】
増殖因子を含有する培地は、2.0 g/L 以下のグルコースを含有する培地、例えば、低グルコース濃度ＤＭＥＭを用いることができる。
【００２２】
ヒト角膜内皮細胞の培養は、例えば、37℃、5％CO2の条件で行うことができる。
【００２３】
ヒト角膜内皮細胞の培養基材上での培養において、培養液中のヒト角膜内皮細胞の濃度は、例えば、１×１０3〜６×１０3個／ｍｌの範囲とすることができる。培養液中のヒト角膜内皮細胞の濃度と培養期間を適宜調整すること、例えば、１〜３週間とすることで、所望の厚さ（即ち、移植に適した厚さ）を有する培養細胞シートを作製することができる。
【００２４】
培養基材上で培養した内皮細胞がシートを形成した後に、内皮細胞シートを培養基材から剥離する。シートの培養基材からの剥離は、セルラーゼにより培養基材中のセルロースを分解することにより行うことができる。培養基材中のセルロースのセルラーゼによる分解は、例えば、以下のように行うことができる。培養液を吸引し洗浄した後、8mg/mlでPH７程度に調整したセルラーゼをdishに添加し、例えば、室温にて10〜20分程度放置することで培養基材の周辺部より徐々に内皮細胞が剥離し、シートとして回収することができる。
【００２５】
上記本発明の方法により、角膜上に移植すると、角膜内皮細胞と同等の機能、即ち、角膜内の水分含有率を適切に維持する機能を有するヒト角膜内皮培養細胞シートが得られる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００２７】
［ヒト角膜内皮細胞のための培地および培養条件］
１５％ウシ胎児血清(FBS)、２．５ｍｇ／Ｌのファンギゾン(fungizone)（ギブコ(Gibco) ＢＲＬ、グランドアイランド(Grand Island)、ＮＹ）、２．５ｍｇ／Ｌのドキシサイクリン、および２ｎｇ／ｍｌの塩基性(basic)線維芽細胞増殖因子（ｂFGF）（シグマ(Sigma)、セントルイス(St.Louis)、MO）を添加した、低グルコース濃度(Low glucose)ダルベッコ変性イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle medium)(DMEM)からなる成長培地中で、ヒト角膜内皮細胞のすべての初代培養および継代培養を行った。細胞を、加湿インキュベーター中で、３７℃、１０％ＣＯ2に保った。ウシ細胞外基質(ＥＣＭ)の生成のために使用した培地は、１０％ＦＢＳ、５％子牛血清（ギブコ(Gibco) ＢＲＬ）、２．５ｍｇ／ｌのファンギゾン、２．５ｍｇ／ｌのドキシサイクリン、２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、および２％デキストラン（シグマ(Sigma)）を含む、低グルコース濃度ＤＭＥＭからなるものであった。ヒト角膜内皮細胞の培養のための培地は、２〜３日毎に交換した。
【００２８】
［ヒト角膜内皮細胞の初代培養］
ヒト角膜内皮細胞の初代培養物を、文献(Miyata K, Osakabe Y et al., Cornea, 2001; 29:59-63)に記載されているように調製した。簡単に言うと、全層(full-thickness)角膜移植後のドナーの角膜の残りから、培養物を得た。ドナーの角膜はすべて、ロッキー・マウンテン・ライオンズ・アイバンク(Rocky Mountain Lions' Eye Bank)から得た。滅菌した外科手術用鉗子を用いて、デスメ膜を含む内皮細胞層から、小さな移植片を除去した。角膜当たり、約２００個の移植片を、ウシ細胞外基質で被覆した、４つの３５ｍｍ培養皿上に、内皮細胞側を下にして置き、それらの皿を、インキュベーター中に注意深く置いた。培地を、３日後に交換し、その後、一日おきに交換した。十分な増殖細胞密度に達したら、ヒト角膜内皮細胞を、１：１〜１：４の割合で継代させた。その後の継代を、割合を１：１６にした以外は同じ方法で行った。４回目および５回目の継代からの培養細胞を使用した。
【００２９】
[セルラーゼシート作製法]
１．ガラスプレートの洗浄
Piranha solution（洗浄液組成：濃硫酸７０％ 過酸化水素 ３０％）を用いて、５分間、室温でガラスプレートを侵漬し、ミクロレベルで汚れを分解した。その後、超純水、２−プロパノールで洗浄し、窒素ガス（綺麗な空気なら良い）で乾燥した。
【００３０】
２．アミノ基の付加
0.5％ AATS（N−２−（アミノ）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン）99.5％ヘキサンの溶液に浸漬して（約１分）、アミノ基をコーティングした。反応後、ヘキサンで３回洗浄し、その後、６０℃で一時間加熱した。
【００３１】
３．ＣＭＣコート
２×２．５cm程度のガラスプレートに２００μｌのＣＭＣ（カルボキシメチルセルロースナトリウム）溶液を滴下し、スピンコーターで６０００rpm、３０sec真空遠心を行い、ＣＭＣ溶液をガラスプレート上に均一に塗布した。この操作を２回行った。ＣＭＣ被膜は、６０℃で１２時間加温し、固定した。
【００３２】
４．フィブロネクチン、コラーゲンの固定
ＣＭＣコーティングの後、活性化（電子レンジで１分ほど加熱し、減圧放冷する。この操作を３回ほど）した脱水用試薬モルキュラーシーブ（ナカライ ０４１−７２）を用いて作製した脱水アセトンに１０分間浸し、洗浄した。その後、３mlのアセトンに９０μlのピリジンを加え、６０μｌのトレシルクロライドを入れ、すばやくＣＭＣコーティングガラスを漬けた。振盪しながら室温で６時間からオーバーナイト反応させた。反応後、脱水アセトンで３回洗い、トレシルクロライドを洗い流した。続いてＰＢＳで３回洗浄後、0.1 mg/mlのフィブロネクチン、またはコラーゲン10μg/mlなどの細胞外基質をいれ、コーティングして（４℃、１晩）、培養基材を得た。
【００３３】
［培養したヒト角膜内皮細胞の培養基材上への接種］
上記のように得られた培養基材をＰＢＳで洗浄して、余分なＥＣＭを洗い流した後、前述の培養細胞を播種し、さらに培養を行った。培養条件は以下の通りである。
使用培地は低グルコース濃度ＤＭＥＭ
ＦＢＳ  １５％、５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ
３７℃、５％ＣＯ2、２週間
ヒト角膜内皮細胞の培養のための培地は、２〜３日毎に交換した。
【００３４】
[培養細胞シートの剥離]
細胞培養後、ＰＢＳで２回ほど洗浄し、余分な培地を取り除いた。セルラーゼ溶液（至適pHが低いので、なるべく細胞に影響が無い範囲でpHを低くしたＰＢＳに溶かすことが好ましい。）でＣＭＣを分解した。セルラーゼ溶液のセルラーゼ濃度は8mg/mlであり、pHは７程度であった。剥がれた細胞シートをＰＶＤＦ(polyvinylidene fluoride)膜で回収した。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明のヒト角膜内皮細胞の培養細胞シートは、移植可能な内皮細胞シートを提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】角膜の断面説明図。
【図１】
2006204527.tif 000002