(57)【要約】【課題】  特に口腔内などの感染の恐れがある部位の骨欠損に充填されても感染を予防することができ、しかも、自然治癒よりも極めた優れた骨再生を可能とする。【解決手段】  キチンまたはその誘導体から成る繊維の集合体から成り、前記集合体の繊維間にリン酸カルシウム顆粒を担持しており、リゾチームを1ml中に10マイクログラム含有する燐酸緩衝生理食塩水中、37℃の温度条件下、120時間、浸漬したときに、前記キチンまたはそのキチン誘導体成分の30%〜８５％が溶出することを特徴とすることを骨欠損充填材。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチンまたはその誘導体から成る繊維の集合体から成り、前記集合体の繊維間にリン酸カルシウム顆粒を担持しており、リゾチームを1ml中に10マイクログラム含有する燐酸緩衝生理食塩水中、37℃の温度条件下、120時間、浸漬したときに、前記キチンまたはそのキチン誘導体成分の30%〜８５％が溶出することを特徴とすることを骨欠損充填材。
【請求項２】
前記キチンまたはその誘導体が、カルボキシメチルキチンまたはキトサンであることを特徴とする請求項１の骨欠損充填材。
【請求項３】
口腔内の骨欠損部に用いるための請求項１記載の骨欠損充填材。
【請求項４】
キチンまたはその誘導体の繊維を形成する工程と、該繊維を真空中で１３０℃〜１６０℃で架橋する工程と、該架橋繊維をリン酸カルシウム顆粒及び該架橋繊維の保水量以下の水と混合して略均一な混合物を形成する工程と、該混合物を凍結乾燥して多孔性材料とする工程とからなることを特徴とする請求項１に記載する骨欠損充填材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野における、骨欠損、骨吸収部、特には抜歯窩に充填し、その治癒を促進するための骨欠損充填材およびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍や壊死等の病変に対する骨組織の除去手術、または外傷による骨組織の欠損部位に対する治療方法として、従来は、自然治癒または生体不活性な埋植材の充填が行われてきた。
【０００３】
しかし、近年では、再生医療的手法が用いられるようになり、自己生体組織の再生による治療が試みられている。また、抜歯によって生ずる創傷部（抜歯窩）に対しても、従来は、脱脂綿による局部圧迫止血のみで、その後は自然治癒に任せていたが、近年は、抜歯創保護のため何らかの材料を充填する処置がなされることが多い。
【０００４】
すなわち、単なる止血による処置では、抜歯窩内の血液は凝固して血餅を形成し、外部からの汚染に対し創傷部を保護する作用を有するが、患者の症状、体質によっては、頻回の洗口や口腔の運動などにより血餅の保護力が弱められ、細菌感染症を起こすことがあった。これを防止するために、抗生物質錠剤を挿入した後、脱脂綿による圧迫止血を行う方法が提案されているが、この様な錠剤は血液によって完全には溶解されずに残留し、創傷の治癒を遅延させるという問題がある。
【０００５】
このような問題に対し、幾つかの新たな抜歯窩充填材(抜歯創保護材)が提案されている。すでに市販されているものとしては、アパタイト等のリン酸カルシウム顆粒や、コラーゲンスポンジがある。また、新たな技術として以下のようなものがある。例えば、特許文献１によれば、抜歯窩等に容易に充填でき、硬化後早期にアパタイトに転化するリン酸カルシウム顆粒セメントが示されている。
【０００６】
また、特許文献２には、粉末状ポリアクリル酸ナトリウムによる創傷保護材が示され、抜歯窩内に適用すると口腔内細菌の創傷深部侵入を阻止する作用を奏し、有用であるとされている。あるいは、特許文献３においては、生体適合性ポリマーマトリックス中に平均粒子径５０μｍ以下のハイドロキシアパタイト又は炭酸カルシウムを担持した複合材料を有効成分とする止血用組成物が示され、抜歯時の歯周部の創傷止血に有効であるとされている。
【０００７】
また、熱架橋したキチン又はその誘導体からなる吸収性生体材料、及び真空熱架橋処理を施すことが主特徴たる吸収性生体材料の製造方法が知られている（特許文献４参照）。
【０００８】
これによれば、比較的容易に生体内で安全な吸収性材料としての生体材料を提供するとともに、これを用いることによって骨生成を促進する環境を提供することができる、としている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
市販されているリン酸カルシウム顆粒や特許文献１に示されているリン酸カルシウム顆粒セメント、また、特許文献３のポリマーマトリックス中にハイドロキシアパタイト又は炭酸カルシウムを担持した複合材料を有効成分とする止血用組成物には、抜歯窩中の血餅形成を阻害するため、外部からの汚染に対し創傷部を保護する作用が損なわれ、感染を起こしやすいという問題点がある。
【００１０】
また、市販されているコラーゲンスポンジや特許文献２の粉末状ポリアクリル酸ナトリウムによる創傷保護材、特許文献４の熱架橋したキチン又はその誘導体からなる吸収性生体材料は、血餅形成を阻害しないもの、骨伝導性を持たないため、本来歯槽骨組織が再生すべき部分に歯肉組織が進入し、骨形態が維持できないという欠点がある。
【００１１】
また、ポリアクリル酸は生体内酵素による分解を受けないため、長期に残留する可能性もあり、同様の懸念は溶解速度を制御していないキチン誘導体にもあり得る。
【００１２】
このような従来技術の課題に鑑み本発明の骨欠損充填材およびその製造方法は、特に口腔内などの感染の恐れがある部位の骨欠損に充填されても感染を予防することができ、しかも、自然治癒よりも極めた優れた骨再生を可能とすることを目的とする。
【特許文献１】特開平５−１１６９９９号公報
【特許文献２】特開平６−３９０２８号公報
【特許文献３】特開２００４−２６６５３号公報
【特許文献４】特開平７−１１６２４１号公報
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記課題を解決するため本発明の骨欠損多孔質骨修復材は、キチンまたはその誘導体からなる繊維の集合体から成り、前記集合体の繊維間にリン酸カルシウム顆粒を担持しており、リゾチームを1ml中に10マイクログラム含有する燐酸緩衝生理食塩水中、37℃の温度条件下、120時間、浸漬したときに、前記キチンまたはそのキチン誘導体成分の30%〜８５％が溶出することを特徴とする。
【００１４】
また、本発明の製造方法は、キチンまたはその誘導体の繊維を形成する工程と、該繊維を真空中で１３０℃〜１６０℃で架橋する工程と、該架橋繊維をリン酸カルシウム顆粒及び該架橋繊維の保水量以下の水と混合して略均一な混合物を形成する工程と、該混合物を凍結乾燥して多孔性材料とする工程とからなることを特徴とする。
【００１５】
前記骨欠損充填材において、キチンまたはその誘導体が再生医療的手法における、足場となる材料であり、リン酸カルシウム顆粒は骨伝導能を有する材料である。
【００１６】
本発明において、キチンまたはその誘導体を繊維の集合体とするのは、次のような理由による。
【００１７】
すなわち、繊維の集合体の繊維間にリン酸カルシウム顆粒を担持する構成とすることにより、骨欠損充填材作製時に顆粒が沈降して顆粒の分布に偏りが生じてしまうことを防止することができる。また、繊維の集合体はほぼ完全に連続気孔を備えるので骨細胞の内部への侵入を盛んにすることができる。さらに、リン酸カルシウム顆粒が連続気孔内で露出する状態となるので、骨伝導能が十分に発揮され、早期の骨組織再生をもたらす。
【００１８】
キチンまたはその誘導体としては、中性の水に溶解可能なカルボキシメチルキチン(ナトリウム塩)や水溶性キトサンが製造工程上好ましい。その他、ヒドロキシエチルキチン(グリコールキチン)やグリコールキトサン等の水溶性キチン誘導体を用いても良い。
【００１９】
ここで、誘導体とは、天然に存在するキチンに対して化学修飾を行ったものを指す。
【００２０】
上記リン酸カルシウム顆粒は、アパタイト、β又はαリン酸３カルシウム、OCP, バイオガラス,AWガラスなどを単独又は組み合わせて用いることができる。
【００２１】
リン酸カルシウム顆粒の大きさとしては、2000マイクロメートル以下であれば適応可能であり、応用部位の骨種類(皮質骨、海綿骨)や部位の違いによる骨反応性の変動に合わせて、至適な大きさを選択可能である。
【００２２】
本発明において、繊維状のキチン誘導体の多孔体を用いるのは、次のような理由による。すなわち、繊維の集合体はほぼ完全に連続気孔を備えるので血液及び血中の細胞、骨髄中に存在する骨芽細胞の前駆細胞(間様系幹細胞)の材料内部への侵入を盛んにすることができる。材料中に浸潤した血液は、血餅を形成し、外部からの汚染に対し創傷部を保護する作用を有する。
【００２３】
繊維状のキチン誘導体の多孔体中では、担持されたリン酸カルシウム顆粒が連続気孔内で露出する状態となるので、該材料が持つ骨伝導能が十分に発揮され、骨芽細胞による骨基質形成を助長し、早期の骨組織再生をもたらす。
【００２４】
また、前記骨欠損充填材は、所定の溶出特性を付与することによって、自然治癒よりも非常に優れた骨再生を実現することができるようになる。
【００２５】
具体的に溶出特性として、リゾチームを1ml中に10マイクログラム含有する燐酸緩衝生理食塩水中、37℃の温度条件下、120時間、浸漬したときに、前記キチンまたはそのキチン誘導体成分の30%〜８５％が溶出するようにする。
【００２６】
すなわち、キチンの分解酵素の一つであるリゾチームを含んだ燐酸緩衝生理食塩水中での溶出特性を評価し、その測定方法としては、リゾチームを1ml中に10マイクログラム含有する燐酸緩衝生理食塩水中にて撹拌下(又は揺動下)37℃の温度条件で、１２０時間浸漬したときに前記溶出率を示すものが、自然治癒よりも非常に優れた骨再生を実現することができるようになる。なお、溶出率が３０％未満および８５％超過の場合、骨再生が自然治癒と同等程度の優れたものとすることができるが、それ以上にすることは難しい。
【００２７】
次に、水溶性キチン誘導体の繊維を形成する方法としては、該材料の水溶液をエタノールやアセトン等の水溶性有機溶媒と混合し、素早く撹拌することにより短繊維状の沈殿物を析出させ、この沈殿物を採取、洗浄した後、乾燥させて溶媒を除去することによって繊維を得ることができる。得られた繊維は、水溶性であるが、熱架橋又は架橋剤を用いることで、不溶化でき、架橋の程度によって生体内での溶出特性を調整することができる。架橋処理は、2kPa程度の減圧下にて、１３０℃から１６０℃の加熱により熱架橋を行うことで、前記の溶出特性を得ることができる。
【００２８】
架橋繊維とリン酸カルシウム顆粒の混合にあたっては、まず、架橋繊維の保水量以下の水を加える。ここで、架橋繊維の保水量とは、繊維集合体を多量の水に浸した後に引き上げた時に、繊維集合体が繊維間および繊維内に取り込んで保持している水の量を指す。保水量以上の水を加えると、リン酸カルシウム顆粒との混合を行った際、余剰の水が過度の流動性を持つために顆粒の重力による沈降や凝集が生じ、その分散が不均一となる。保水量以下の場合、繊維集合体が保持する水分は流動しにくく、リン酸カルシウム顆粒の凝集や沈降を抑制し、結果として均質な複合体が形成される。
【００２９】
架橋繊維とリン酸カルシウム顆粒の混合比は、1:0から1:10程度まで作製可能である。
【００３０】
この混合体を使用可能な形態とするため、混合体の凍結乾燥を行う。凍結乾燥は、医薬品や、乾燥食品の製造などで一般的に行われている工程であり、凍結乾燥機内部を混合体に含まれる水分の凝固点以下の温度(０℃以下)に保ち、真空ポンプなどを用いて減圧し、水分を昇華蒸発させる事により実現する。凍結乾燥の条件としては、温度、減圧度、乾燥時間など、特に制限はない。
【００３１】
本材料を抜歯窩など口腔内に適用した場合、これらの効果が合わさって、感染が無く早期の骨修復が可能となる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の骨欠損充填材によれば、多孔性材料としたことにより、血液の内部への侵入による血餅の形成を促進し、またキチン誘導体の持つ免疫活性能によって、抜歯窩のような感染の危険性が高い部位への応用においても、問題なく使用することができる。また、繊維の集合体の繊維間にリン酸カルシウム顆粒を担持する構成としたことにより、骨修復材作製時に顆粒が沈降して顆粒の分布に偏りが生じてしまうことを防止することができる。したがって、骨細胞の内部への侵入に偏りなく実現することができる。また、繊維の集合体はほぼ完全に連続気孔を備えるので骨細胞の内部への侵入を盛んにすることができる。さらに、リン酸カルシウム顆粒が連続気孔内で露出する状態となるので、骨伝導能が十分に発揮され、骨芽細胞による骨基質形成を助長し、早期の骨組織再生をもたらす。そして、溶出特性が適宜コントロールされたことにより自然治癒よりも極めて優れた骨再生が可能となった。
【００３３】
また、本発明の製造方法によれば、キチンまたはその誘導体の繊維を形成する工程と、該繊維を真空中で１３０℃〜１６０℃で架橋する工程と、該架橋繊維をリン酸カルシウム顆粒及び該架橋繊維の保水量以下の水と混合して略均一な混合物を形成する工程と、該混合物を凍結乾燥して多孔性材料とする工程とから、前記骨欠損充填材を製造することができる。以下に実施例を示す。
【実施例１】
【００３４】
以下に実施例を示すが、本発明の範囲は、以下の例に限定されるものではない。
【００３５】
ＣＭキチン原料を３g精秤し、ガラス製容器に純水(ミリQ水)７２ｇと共に加え、マグネチックスターラーにて撹拌、溶解して、４ｗｔ％のCMキチン水溶液を作製した。ＣＭキチンの溶解を早める目的で、容器をウォーターバスにて３０〜５０℃に加熱し、３〜５時間の撹拌を行い、目視レベルで均質な溶液を得た。
【００３６】
エタノールを１５０ｍｌ入れたビーカーに溶液を流し込みガラス棒にて素早く攪拌した。この操作により、短繊維状のＣＭキチン沈殿物が析出してきた。沈殿物を別容器に移し、さらにエタノール１００ｍｌを使って数回洗浄した。エタノールをできる限り除去した後、該沈殿物を４０℃の乾燥器中に１２時間以上置き、エタノール及び残留水分を蒸発させた。その後、真空熱処理装置にて減圧下(約 ２ｋＰa以下)、120〜170℃の所定温度にて１２時間処理した。
【００３７】
上述のＣＭキチンとβ-ＴＣＰ顆粒(粒径50〜150ミクロン)及び純水を重量比１:５：３２の割合で秤量してシャーレにとり、スパーテルにて攪拌混合した。該混合物を以後の実験に適したサイズのポリスチレン製円筒に充填し、円筒の両端をＰＥＴフィルムで封鎖した後、速やかに−８０℃の冷凍庫に入れた。１時間以上経過して混合物が完全に凍結した後、両端のＰＥＴフィルムを除いて凍結乾燥器に移し、凍結状態のまま水分を蒸発させた。           
その後、試験体をポリスチレン製円筒から取り出し、γ線滅菌後抜歯窩埋入試験に供した。
【００３８】
また、溶解測定用としてβ-TCP顆粒を含まないタイプを同様の手法にて作製した。
【００３９】
比較対照として、キトサン多孔体と、キチン多孔体を測定した。
【００４０】
キトサン多孔体は、市販のキトサン粉末(脱アセチル化度95%以上)を用い、キトサンの4%濃度の0.13mol/Ｌ蟻酸溶液を調整し、それにβ-TCP顆粒をキトサンに対して重量比5（TCP/キトサン＝5/1重量比）となるように加え、氷点付近で撹拌し、ポリスチレン製円筒に充填し、凍結乾燥した。その後、蟻酸を除去するため、120℃にて乾燥した後、γ線滅菌して抜歯窩埋入試験に供した。また、溶出率測定用としてβ-TCP顆粒を含まないタイプを同様の手法にて作製した。
【００４１】
キチン多孔体の作製方法は、以下の通りである。市販のキチン粉末を用い、塩化カルシウム2水塩飽和メタノール溶液に1wt%濃度で溶解した。その後、溶液を純水に滴下してキチンの微細結晶を析出させた。数回の遠心分離にて溶媒を除き、純水をキチンに対して重量比32（純水/キチン＝32/1重量比）、β-TCP顆粒をキチンに対して重量比5（TCP/キチン=5/1）となるように加え、ポリスチレン製円筒に充填し、凍結乾燥した。その後、γ線滅菌して抜歯窩埋入試験に供した。また、溶出率測定用としてβ-TCP顆粒を含まないタイプを同様の手法にて作製した。
【００４２】
[溶出実験]
顆粒を含まないタイプのCMキチン（真空熱処理温度170℃、160℃、140℃、130℃）
及びキチンとキトサンの試験体を用いた。試料10mg（1.8cm×1.8cm×1.8cmの大きさ）を精秤し、卵白リゾチームの燐酸緩衝生理食塩水 (10μg/ml)中、37℃の温度条件下撹拌しながら、120時間溶出させた。
【００４３】
その後、試験液をろ過し、フィルター上に残った残渣を乾燥し、重量測定した。試験前の重量から残渣の重量を引き、試験前重量で除して溶出率(%)を求めた。
【００４４】
製品から溶出率を測定する場合は製品より1.8cm×1.8cm×1.8cmのブロックを切り取り、重量（Ｗ１ｇ）を秤量する。その後、前記の溶出条件で溶出させ、フィルター上に残った乾燥物の重量（Ｗ２ｇ）を秤量した。乾燥物を燃焼させ、残渣重量（Ｗ３ｇ）を秤量した。
【００４５】
下記の式にてＣＭキチンの溶出率を求めることができる。
【００４６】
溶出率（％）＝{（Ｗ１−Ｗ２）／（Ｗ１−Ｗ３）}×１００
[イヌ抜歯窩への埋入実験]
実験動物はビーグル犬（成犬，体重約11 kg）を用い、実験部位は両側上顎小臼歯部(I1〜I3)とした。全身麻酔下で抜歯後、試験体埋群を実験群とした。また，同一個体で抜歯のみを行う部位を対照群とし，実験期間は4週とした。
【００４７】
実験期間中、数日おきに術部を観察し、感染による化膿、炎症の有無を調べ、感染が見られた場合には、以後の試験から除外した。実験期間終了後，観察部位を回収し、樹脂包埋の後組織切片を作製、トルイジンブルーにて染色し、新生骨量を計測した。骨量は、抜歯のみを行った群を100とした場合の比率として表した。
【００４８】
また、従来技術との比較として、市販のコラーゲンスポンジとハイドロキシアパタイト顆粒およびβ-TCP顆粒を同様に埋入して評価した。
【表１】
2006006757.tif 000002
【００４９】
表１から明らかなように、溶出率30%以上のCMキチンを用いた骨欠損充填材は、自然治癒と比べて骨欠損修復率が高く、また感染も見られなかった。
【００５０】
溶出率20％のCMキチン及びキトサン、キチン多孔体では、感染は押さえられるものの、生体内での材料の残留骨形成が阻害され、自然治癒よりも劣る結果となった。また、市販のコラーゲンスポンジとアパタイト顆粒による骨形成は自然治癒と同程度であった。アパタイト顆粒では感染高くなる傾向にあった。β-TCP顆粒は、骨修復率に勝るものの、感染が増加する傾向が明確に見られた。