(57)【要約】【課題】異なる複数の構成タンパク質が任意の比率で構成された多量体タンパク質の合成法及び複合タンパク質の効率的な合成法を提供する。【解決手段】複数の構成タンパク質からなる多量体タンパク質の作製方法であって、作製すべき前記多量体タンパク質における構成タンパク質の構成比と同じ比で、それぞれの構成タンパク質の鋳型を用いて、前記複数の構成タンパク質を単一の無細胞タンパク質合成系で合成することによって、任意の構成タンパク質比率を有する多量体タンパク質を作製する方法。得られた多量体タンパク質に非タンパク性物質を導入することによって複合タンパク質を作製する方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の構成タンパク質からなる多量体タンパク質の作製方法であって、
作製すべき前記多量体タンパク質における構成タンパク質の構成比と同じ比で、それぞれの構成タンパク質の鋳型を用いて、前記複数の構成タンパク質を単一の無細胞タンパク質合成系で合成することによって、任意の構成タンパク質比率を有する多量体タンパク質を作製する方法。
【請求項２】
前記鋳型がmRNA又はDNAである、請求項１に記載の多量体タンパク質を作製する方法。
【請求項３】
前記無細胞タンパク質合成系として、細菌又は真核生物細胞由来の無細胞タンパク質合成系を用いる、請求項１又は２に記載の多量体タンパク質を作製する方法。
【請求項４】
前記真核生物が昆虫である、請求項３に記載の多量体タンパク質を作製する方法。
【請求項５】
前記複数の構成タンパク質が、アポフェリチンＨ鎖とＬ鎖との組み合わせである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の多量体タンパク質を作製する方法。
【請求項６】
前記複数の構成タンパク質のうち少なくとも１つの構成タンパク質において遺伝子工学的に部分配列が改変されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多量体タンパク質を作製する方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法を用いて多量体タンパク質を作製し、得られた多量体タンパク質に非タンパク性物質を導入することによって複合タンパク質を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成に関する。また本発明は、複数のタンパク質を含む多量体タンパク質又は複合タンパク質を、任意の構成要素と構成比とで合成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
半導体素子の超高密度集積化を目的とした微細加工技術において、従来法の限界を超える数十ナノメートルという最小加工寸法で超微細構造を作成することが求められている。このような状況下、大きな設備と複雑な過程を経ずに、生体高分子を微細加工の極小部品と捉えたバイオ・ナノプロセスが注目を集めている。中でも、直径数ナノメートルオーダーの金属粒子を与える極小部品として、鉄貯蔵タンパク質フェリチンを用いる試みがなされている。このことは、http://adw3.aist-nara.ac.jp/EVENT/tokyo-sympo2002/fuyuki.htmや、http://www.nikkei-bookdirect.com/science/page/magazine/0311/nano_2.html等に記載されている。
【０００３】
フェリチンは、相同或いは相似な構成タンパク質（サブユニット）２４個が外径12nm、内径6nmの球状に会合したタンパク質であり、内径6nmの中空に最高4500原子の鉄を貯蔵することができる。哺乳類フェリチンの場合、H鎖、L鎖という二種類の構成タンパク質（サブユニット）が知られているため、H:L=23:1, 22:2, ・・・・ 2:22, 1:23の合計２３種類のヘテロ多量体と、H:L=24:0, 0:24の２種類のホモ多量体とが構成されうる。H鎖とL鎖との両サブユニットの構成比によって、鉄貯蔵能が変化することが知られている。すなわち、L鎖単独では鉄貯蔵能が微弱であり、効率的な鉄貯蔵には多量体中にH鎖が３５％以上含まれる必要がある。
【０００４】
従来半導体素子に用いる目的でフェリチンを調製する際、例えば特開２００３−３３１９１号公報に記載されているように、大腸菌等による生細胞でのタンパク質発現系によってアポフェリチンが調製される。そして、アポフェリチンに金属或いは金属化合物が導入される。例えば特開２００３−１１３１９８号公報には、アポフェリチンにコバルトを導入する方法が記載されている。
【０００５】
【非特許文献１】冬木隆、“自己組織化を活用したボトムアップ手法によるナノ構造作成プロセスの開発”、[online]、［平成１６年６月１５日検索］、インターネット<URL: http://adw3.aist-nara.ac.jp/EVENT/tokyo-sympo2002/fuyuki.htm>
【非特許文献２】山下一郎、“生体超分子が実現する未来の電子素子”、[online]、［平成１６年６月１５日検索］、インターネット<URL: http://www.nikkei-bookdirect.com/science/page/magazine/0311/nano_2.html>
【特許文献１】特開２００３−３３１９１号公報
【特許文献２】特開２００３−１１３１９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生細胞でのタンパク質発現系を用いた場合、二種類以上のタンパク質を同時に発現させることはできるが、目的タンパク質の発現量を厳密に調節することができない。このため、得られたアポフェリチンのサブユニット構成比が不均一になることが知られている。そこで本発明は、異なる複数の構成タンパク質が任意の比率で構成された多量体タンパク質の合成法及び複合タンパク質の効率的な合成法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明には、以下の発明が含まれる。
（１）複数の構成タンパク質からなる多量体タンパク質の作製方法であって、
作製すべき前記多量体タンパク質における構成タンパク質の構成比と同じ比で、それぞれの構成タンパク質の鋳型を用いて、前記複数の構成タンパク質を単一の無細胞タンパク質合成系で合成することによって、任意の構成タンパク質比率を有する多量体タンパク質を作製する方法。
（２）前記鋳型がmRNA又はDNAである、（１）に記載の多量体タンパク質を作製する方法。
（３）前記無細胞タンパク質合成系として、細菌又は真核生物細胞由来の無細胞タンパク質合成系を用いる、（１）又は（２）に記載の多量体タンパク質を作製する方法。
（４）前記真核生物が昆虫である、（３）に記載の多量体タンパク質を作製する方法。
（５）前記複数の構成タンパク質が、アポフェリチンＨ鎖とＬ鎖との組み合わせである、（１）〜（４）のいずれかに記載の多量体タンパク質を作製する方法。
（６）前記複数の構成タンパク質のうち少なくとも１つの構成タンパク質において遺伝子工学的に部分配列が改変されている、（１）〜（５）のいずれかに記載の多量体タンパク質を作製する方法。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の方法を用いて多量体タンパク質を作製し、得られた多量体タンパク質に非タンパク性物質を導入することによって複合タンパク質を作製する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、異なる複数の構成タンパク質が任意の比率で構成された多量体タンパク質の合成法及び複合タンパク質の効率的な合成法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、多量体タンパク質の作製法である。特に本発明は、内部に金属原子等の無機物粒子を保持することができる空洞を有する多量体タンパク質を作成することに向けられる。本発明においては、複数の異なる構成タンパク質を同時に合成することができる。
【００１０】
構成タンパク質としては、アポフェリチンを構成するアポフェリチンＨ鎖及びＬ鎖等、従来から知られている多量体を構成するタンパク質が挙げられる。さらに、構成タンパク質は遺伝子組み換えタンパク質であっても良い。すなわち、少なくとも１つの構成タンパク質において遺伝子工学的に部分配列が改変されたものであっても良い。
【００１１】
本発明においては、多量体タンパク質作製のために無細胞タンパク質合成技術が用いられる。すなわち、試験管内に生物の遺伝情報翻訳系を取り揃える（すなわち無細胞タンパク質合成系を構築する）ことにより、鋳型の遺伝子から所望の多量体タンパク質を合成する。無細胞タンパク質合成においては、細菌又は真核生物細胞から調整された無細胞タンパク質合成用抽出物を用いることができる。真核生物細胞に由来するものとしては、昆虫や植物組織から調製された無細胞タンパク質合成用細胞抽出物を用いることが好ましい。このような細胞抽出物の調製は、公知の方法によって行うことができる。
【００１２】
無細胞タンパク質合成法としては、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。例えば、上記細胞抽出物に基質アミノ酸、エネルギー源、エネルギー再生系酵素等を加えた無細胞タンパク質合成液に、鋳型を加えてタンパク質の合成を行う。無細胞タンパク質合成系で合成された構成タンパク質は、自己会合により多量体タンパク質となる。
【００１３】
鋳型としては、DNA又はmRNAを使用することができる。これら鋳型は、リボソーム結合配列、翻訳促進配列及び合成すべき構成タンパク質のオープンリーディングフレームを含むものを用いると良い。またこれら鋳型においては、その配列の一部が遺伝子工学的に改変されたものを用いることもできる。このような鋳型は、公知の方法によって調製することができる。遺伝子工学的改変については、得られる多量体タンパク質を複合タンパク質とする場合に、所望の金属等を蓄積することができる大きさの内部空洞を有するように改変することができる。また、金属等の保持能力の向上を図るために改変しても良い。  
【００１４】
本発明は、無細胞タンパク質合成技術を用いるため、以下のような利点を有する。
例えば、従来の生細胞発現系では出発物質がDNAであるが、本発明は無細胞合成系を用いるため、このようにmRNAを出発物としてタンパク質合成を行うことが可能になる。mRNAを出発物とすることは、タンパク質合成までに必要な過程が翻訳のみであり、２種以上のタンパク質の発現量をより正確にコントロールすることができるため、本発明においてより好ましく用いられる。
【００１５】
さらに、従来の代表的な生細胞発現系である大腸菌発現系においてアポフェリチンを作製する場合を挙げると以下のことがいえる。この系においては、H鎖又はL鎖のいずれかを構成要素としたホモ２４量体の作製は可能である。しかし、この系においてH鎖及びL鎖の両方を同時に発現させるために、両方のそれぞれの構成タンパク質に対応する遺伝子を大腸菌に導入し発現を誘導した場合、H鎖とL鎖との発現量は大きく異なる。これは、H鎖が大腸菌宿主細胞に対して鉄原子の欠乏を誘起する等、宿主の成育に対して悪影響を与えることが原因と考えられる。
【００１６】
一方無細胞合成系は、生成タンパク質の細胞に与える毒性が影響する度合いを、大腸菌発現系に比べてはるかに軽減するということが期待される。このため、実際に添加した鋳型の量にほぼ比例したタンパク質合成を行うことが可能となる。従って本発明においては、作製すべき多量体タンパク質における構成タンパク質の構成比と同じ比（個数比）でそれぞれの構成タンパク質の鋳型を用いればよい。このように使用する鋳型の量の調節が簡単になるため、所望の構成タンパク質比率を有する多量体タンパク質を従来よりもはるかに簡単にかつ正確に作製することが可能になる。
【００１７】
例えば、フェリチンH鎖及びL鎖からなるアポフェリチンを作成する場合、次のように行うことができる。まず、フェリチンH鎖、L鎖をコードするDNAから、それぞれmRNAへの転写を行い、H鎖をコードするDNAからH鎖鋳型mRNA、L鎖をコードするDNAからL鎖鋳型mRNAを得る。得られたそれぞれのmRNAを任意の比率で無細胞タンパク質合成系に添加することによって、フェリチンH鎖及びL鎖を所望の構成比で含むアポフェリチンを作成することができる。例えば、２４個のH鎖のみからなるアポフェリチンを合成するためには、系にH鎖の鋳型となるmRNAのみを用いればよく、１２個のH鎖と１２個のL鎖とからなる多量体を得るためには、H鎖の鋳型となるmRNAとL鎖の鋳型となるmRNAとを1:1の割合で用いればよい。
【００１８】
さらに、無細胞タンパク質合成技術は、デザインした核酸の情報を基にしてタンパク質を迅速・正確に合成することを可能にする。さらに、この技術の合成効率の高さにより、タンパク質の精製操作も著しく簡便化される。加えて、生命体が利用していないアミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となる。
【００１９】
このようにして、本発明では多量体タンパク質を無細胞タンパク質合成技術によって作製するため、多量体タンパク質を任意の構成タンパク質と構成比とで合成することができる。しかもこのような多量体タンパク質をより簡便に、正確に、かつ迅速に合成することが可能になる。
【００２０】
また本発明は、複合体タンパク質の作製法でもある。複合体タンパク質の作製においては、上述の多量体タンパク質の作製法によって得られた多量体タンパク質に、非タンパク性物質を導入する。非タンパク質物質としては、有機物の他、金属原子等の無機物が挙げられる。非タンパク質の導入方法については、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。
【００２１】
上述の多量体タンパク質の作製法において述べたように、本発明においては構成タンパク質を遺伝子工学的に改変した多量体タンパク質を得ることが可能である。従って、構成タンパク質の改変を行うことで、得られる多量体タンパク質の内部構造を多様化することが可能となる。そして、多量体タンパク質の内部構造の多様化によって、得られる複合体タンパク質に様々な金属について保持能或いは蓄積能を付与することが可能になる。従って、本発明によると、複合体タンパク質を任意の構成要素と構成比とで合成することができる。しかもこのような多量体タンパク質をより簡便に、正確に、かつ迅速に合成することが可能になる。
【００２２】
このようにして得られる複合体タンパク質は、例えば、次のように応用することができる。まず、複合体タンパク質の自己組織化能力を利用することにより基板上に配置して複合体タンパク質の微細構造を作製する。次に、タンパク質部分を除去することにより、保持されていた非タンパク質、例えば金属の微細構造を得る。このようにして得られる微細構造は、適切な化学処理等を行うことによって、半導体素子等のデバイスとして利用することができる。
【実施例】
【００２３】
［実施例１］  
本実施例においては、図１に示した概念図に従い、無細胞タンパク質合成系で多量体タンパク質（フェリチン）を調製した。
【００２４】
１．目的タンパク質のプラスミドへのクローニング
本実施例では、プラスミドはＤＮＡとして、プロメガ社製プラスミドＤＮＡのβ−グロビンリーダー配列部分をEoNPV由来の翻訳促進配列に置き換えたものを用いた。このプラスミドＤＮＡをEoNPV/pTNTMと表記する。ヒトフェリチンＨ鎖及びＬ鎖遺伝子（それぞれAccesion No. BC016009、BC016346）は、Open Biosystem社より購入した。Ｈ鎖遺伝子については、taro37_f及びtaro37_rをプライマーとして用いて増幅を行った。Ｌ鎖遺伝子については、taro38_f及びtaro38_rをプライマーとして用いて増幅を行った。それぞれのプライマーの配列を以下に示す。なお以下に示した配列において、pAの略号で示される塩基は、5’−アデニル酸を表す。
【００２５】
taro37_f  pATGACGACCG CGTCCACCTC GCAG（配列番号１）
taro37_r  GCGAAGGTACCTTAGCTTTCATTATCACTG（配列番号２）
taro38_f  pATGAGCTCCCAGATTCGTCAG（配列番号３）
taro38_r  GCGAAGGTACCTTAGTCGTGCTTGAGAGTG（配列番号４）
【００２６】
得られたＰＣＲ産物をそれぞれ、EoNPV/pTNTMのEoNPV由来の翻訳促進配列直下と制限酵素KpnIサイトとの間にクローニングした。このようにして作成したプラスミドのそれぞれを、pTFerH（Ｈ鎖由来）、pTFerL（Ｌ鎖由来）とする。
【００２７】
２．in vitro転写反応によるmRNAの合成
pTFerHを鋳型として、Rengo_f及びRengo_r をプライマーとして用いたＰＣＲにより、Ｔ７プロモータ（T7-p）、翻訳促進配列、ヒトフェリチンＨ鎖のＯＲＦ、及びＴ７ターミネーター（T7-t）を含む部分を増幅した。それぞれのプライマーの配列を以下に示す。
【００２８】
Rengo_f  CTCACATGGCTCGACAGATC（配列番号５）
Rengo_r  TGCGGGCCTCTTCGCTATTA（配列番号６）
【００２９】
得られたＰＣＲ産物3μgを鋳型として、T7RNAポリメラーゼによるin vitro転写反応を行った。３時間の転写反応後、系にDNaseを混入し鋳型ＤＮＡを消化した後、Nickカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）による脱塩処理、フェノールクロロフォルム抽出、エタノール沈殿により精製し、この結果生じたＨ鎖mRNAを2mg/mlに調製した。ヒトフェリチンＬ鎖ＤＮＡについては、pTFerLを鋳型とした以外は上述のＨ鎖mRNA調製と同様の操作を行い、Ｌ鎖mRNAを調製した。
【００３０】
３．in vitroタンパク質合成系を用いたタンパク質合成反応（ヒトフェリチンＨ鎖及びヒトフェリチンＬ鎖からなる多量体の合成）
本実施例においては、Ｈ鎖：Ｌ鎖＝24：0（参考例）、22：2、20：4、18：6、16：8、14：10、12：12、10：14、8：16、6：18、4：20、2：22、0：24（参考例）の１３種類の多量体を合成した。
【００３１】
無細胞タンパク質合成系においては、High Five細胞由来の昆虫細胞抽出液を用いた。昆虫細胞抽出液10μlに、表１に記載した成分を有するプレミックス液5μlと、リボヌクレアーゼインヒビター0.5μl（寶酒造製）とを加え、昆虫細胞抽出液混合物を１３個用意した。別途、上述の２．で得られた2mg/ml mRNA溶液を、Ｈ鎖mRNA：Ｌ鎖mRNA＝24：0、22：2、20：4、18：6、16：8、14：10、12：12、10：14、8：16、6：18、4：20、2：22、0：24の体積比でそれぞれ混合し、Ｈ鎖mRNA及びＬ鎖mRNAの比率が異なる１３個のmRNA混合液を得た。得られたmRNA混合液3.2μlを、用意したそれぞれの昆虫細胞抽出液混合物に添加し、１３個の反応液を調製した。この反応液中で合成されるタンパク質を特異的に蛍光標識するためのラベル化試薬Fluorotect Green Lys（プロメガ社製）0.3μlを反応液に加え、さらに純水を加えて、反応液全体をそれぞれ20μlとした。これら反応液について、２５℃、５時間の条件でタンパク質合成反応を行った。
【００３２】
【表１】
2006094791.tif 000003
【００３３】
４．結果
タンパク質合成反応後の反応液10μlを、SDS変性条件での12.5w/v％ゲルを用いたポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動による分離を行った。この結果を図２に示す。なお、Ｈ鎖の分子量は21kDa、Ｌ鎖の分子量は20kDaである。一方、同じ反応液10μlを、非変性条件での6 w/v％ゲルを用いたポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により分離を行った。このとき得られた結果を図３に示す。なお、表面電荷の関係でＨ鎖の方がＬ鎖と比較して移動度が大きくなる。
【００３４】
図２が示すように、添加したmRNAの比率と、合成された多量体の構成タンパク質の比率とはほぼ一致していた。また、図３が示すように、非変性条件での電気泳動の結果、Ｈ鎖に対するＬ鎖の割合が大きくなるに従って移動度が小さくなっていた。このように、添加したmRNAとほぼ等しい比率で多量体が形成されていることと、Ｈ鎖に対するＬ鎖の割合が大きくなるに従って移動度が小さくなるということとから、無細胞タンパク質合成系に添加するmRNAの種類と量とを調節することにより任意のＨ鎖／Ｌ鎖構成比を有するフェリチン多量体を作製することが可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本実施例の操作を概念的に示した図である。
【図２】本実施例によって調製されたフェリチン多量体の、変性条件下での電気泳動の結果を示す。
【図３】本実施例によって調製されたフェリチン多量体の、非変性条件下での電気泳動の結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００３６】
配列番号１〜６は、合成プライマーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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