(57)【要約】【課題】  薬剤耐性遺伝子を用いて形質転換植物を選抜する場合において、形質転換植物と非形質転換植物との判別の難しさを解決し、効率的な形質転換植物の選抜方法を提供する。【解決手段】  ＧＥＫ１遺伝子を含む組換えＤＮＡをエタノール感受性植物に導入する工程と、前記植物を栽培して種子を採取する工程と、エタノールを含む植物育成用培地に前記種子を播種して形質転換植物を発芽させる工程とを含む。【選択図】            図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＥＫ１遺伝子を含む組換えＤＮＡをエタノール感受性植物に導入する工程と、前記植物を栽培して種子を採取する工程と、エタノールを含む植物育成用培地に前記種子を播種して形質転換植物を発芽させる工程とを含むことを特徴とする形質転換植物の選抜方法。
【請求項２】
前記エタノール感受性植物が、ゲノム内在性ＧＥＫ１遺伝子に突然変異を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物が単子葉植物又は双子葉植物である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記植物がヒマワリ、ウマゴヤシ、ジャガイモ、ワタ、ダイズ、トマト、イネ、ニラ、トウモロコシ、オオムギ、又はコムギである請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＧＥＫ１遺伝子が、配列番号２に示したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記アミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、かつ前記植物にエタノール耐性能を付与するタンパク質をコードするＤＮＡを含む請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記植物育成用培地が、０．００１〜１容量％のエタノールを含む請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
配列番号２に示したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記アミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、かつ植物にエタノール耐性能を付与するタンパク質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする植物の形質転換用ベクター。
【請求項８】
前記植物内で発現させる目的遺伝子を更に含む請求項７に記載の形質転換用ベクター。
【請求項９】
植物のゲノム内在性ＧＥＫ１遺伝子又はその遺伝子産物の機能が抑制された変異体植物を用意し、
前記変異体植物にＧＥＫ１遺伝子を含む組換えＤＮＡを導入する工程と、
前記植物を栽培して種子を採取する工程と、
エタノールを含む植物育成用培地に前記種子を播種する工程と、
前記エタノール含有培地で発芽した植物を選抜する工程と、を含むことを特徴とする植物の形質転換方法。
【請求項１０】
前記組換えＤＮＡが、前記植物内で発現させる目的遺伝子を更に含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の方法により形質転換したことを特徴とする形質転換植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＤＮＡを導入した形質転換植物を選抜する方法及びそのための植物の形質転換用ベクターに関し、特に、エタノール耐性を指標として形質転換植物を選抜する方法及びベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子組換え技術を用いて植物に外来遺伝子を導入し、優れた形質、例えば、環境ストレスに対する耐性等を付与する品種改良が行われている。このような形質転換植物を作製するには、目的とする遺伝子（ＤＮＡ断片）がゲノム上に挿入された細胞または個体を選択する必要がある。現在では、ハイグロマイシン耐性遺伝子（非特許文献１参照）、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子（非特許文献２参照）などの微生物由来の抗生物質耐性遺伝子が主に利用されている。これらのマーカー遺伝子を保持した形質転換体を選抜するには、一般的には種子を抗生物質などの薬剤を含んだ寒天培地上に播種し、数週間生育させる。薬剤耐性遺伝子を持たない個体は、発芽はするものの生育が阻害され次第に枯死するようになる。一方、薬剤耐性遺伝子を持つ個体は、よりよく生育し薬剤による影響はあるものの、枯死するようなことはない。
【０００３】
シロイヌナズナ(Arabidopsis)はアブラナ科の小型雑草で、ゲノムサイズも約１．３×１０８塩基対と高等植物で最も小さいこと、一世代に要する時間が約２ヶ月と短いことなどから植物研究のモデルとして世界的に広く使用されている。国際プロジェクトによりゲノムの全塩基配列も既に解読されている。この植物のゲノム内に存在する１つの遺伝子ＧＥＫ１の塩基配列（例えば、非特許文献３参照）はすでに知られているが、その推定遺伝子産物の機能や植物における生理的な役割については未だ解明されていない。
【０００４】
【非特許文献１】Gene、第２５巻２−３号、１７９頁−１８８頁、１９８３年
【非特許文献２】Nucleic Acids Research、第１１巻１３号、６９８１頁−６９９８頁、１９８５年
【非特許文献３】GenBank Accession No. AB091252[gi:28812212]、２００４年２月１４日
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記従来技術において、薬剤耐性遺伝子をマーカーとして形質転換植物を選択する場合の問題点は、第１に、耐性植物（耐性遺伝子を持つ植物）と非耐性植物（耐性遺伝子を持たない植物）を区別するためには、少なくとも７日ほど植物を生育させなければならないことである。また、場合によっては、選抜には訓練された識別能力が必要となる。第２に、薬剤耐性遺伝子と共に導入した目的遺伝子により生育が遅れるような場合、または緑化が抑制されるような場合、形質転換植物とそうでないものの判別が難しくなる。第３に、薬剤耐性遺伝子は、元々他の生物種の遺伝子であり、遺伝子組換え作物を作製する上で消費者の嗜好にあわない場合がある、等が挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために、高等植物が元々持っている１つの遺伝子ＧＥＫ１が植物のエタノール耐性に関わっていること、及びこのＧＥＫ１遺伝子を用い、エタノール耐性能を指標として形質転換植物を効率よく選抜できることを見出して本発明を完成した。例えば、この遺伝子産物が働かなくなった高等植物シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana Heinth L.)は、野生型に比べ、１００倍ほどエタノールに対する感受性が高まっており、０．００３％という低濃度のエタノールを含んだ培地上でも発芽が阻害される。ところが、この破壊株は他には表現型がなく、通常に生育し種子を形成する。この変異植物に、アグロバクテリウムを介した方法で、ＧＥＫ１遺伝子を導入すると、野性株と同様なエタノール耐性が復帰し、１％エタノール存在下でも、発芽できるようになる。本発明は、このシロイヌナズナＧＥＫ１遺伝子または他の植物のＧＥＫ１類似遺伝子に突然変異を持った植物体と、ベクターに組み込んだＧＥＫ１遺伝子を組み合わせて使用することにより、発芽時点で形質転換植物を選抜できる系を提供するものである。
【０００７】
すなわち、本発明の１つの視点における形質転換植物の選抜方法は、ＧＥＫ１遺伝子を含む組換えＤＮＡをエタノール感受性植物に導入する工程と、前記植物を栽培して種子を採取する工程と、エタノールを含む植物育成用培地に前記種子を播種して形質転換植物を発芽させる工程と、を含むことを特徴とする。前記エタノール感受性植物はゲノム内在性のＧＥＫ１遺伝子に突然変異を有することが好ましい。また、前記植物は単子葉植物又は双子葉植物であって、例えば、ヒマワリ、ウマゴヤシ、ジャガイモ、ワタ、ダイズ、トマト、イネ、ニラ、トウモロコシ、オオムギ、又はコムギであることが好ましい。
【０００８】
本発明の他の視点に係る植物の形質転換用ベクターは、配列番号２に示したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又は前記アミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、かつ植物にエタノール耐性能を付与するタンパク質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする。前記ベクターは、前記植物内で発現させる目的遺伝子を更に含むことが好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、植物由来の遺伝子を用いて、発芽の有無での選抜が可能になる。発芽の有無による選抜は、視覚的に非常に区別しやすく、画像認識装置による選抜の自動化も可能となる。また、すべての個体を生育させる必要がないので、単位面積当たりより多くの個体を選抜にかけることができる。更に、本発明の方法に用いるＧＥＫ１遺伝子は、元々宿主植物が有する遺伝子であるから、遺伝子交雑(introgression)によって形質転換植物から野生型植物へ異種生物の薬剤耐性遺伝子が浸透（移入）することがなく、遺伝子組換え作物への適用にも安全性が高いと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明に係る形質転換植物の選抜方法（「本発明の選抜方法」という）及び該方法に用いられる形質転換用組換えベクターの最良の実施形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１１】
＜植物にエタノール耐性を付与する遺伝子＞
本発明において、「ＧＥＫ１遺伝子」とは、配列番号２に示したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ又は当該アミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％、８０％、８５％、９０％、９７％、９８％以上の相同性を有するタンパク質をコードし、かつ前記植物にエタノール耐性能を付与する遺伝子をいう。タンパク質の相同性（ホモロジー）の程度は、２つのタンパク質のアミノ酸配列同士を適切に整列（アライメント）したときの同一性のパーセント値で表わすことができ、当該配列間の正確な一致の出現率を意味する。同一性比較のための配列間での適切な整列は種々のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定することができる（Altschul SF J Mol Biol 1990 Oct 5; 215(3):403-10）。このＧＥＫ１遺伝子は、本発明者らにより、シロイヌナズナにおいて最初に見出された遺伝子であって、ＧＥＫＯ１と名付けられた遺伝子座に存在する（日本語でお酒が飲めない人のことを称する「下戸」に由来する）。なお、本明細書において、「ＧＥＫ１」と表記した場合は、植物にエタノール耐性を付与し得る野生型（優性）の遺伝子又はタンパク質を意味し、「ｇｅｋ１」と表記した場合は、前記遺伝子に突然変異、例えば、塩基配列の欠失、付加、又は置換等が起こることによって機能が抑制（減衰）され、又は損なわれた変異体（劣性）の遺伝子又はタンパク質を意味する。
【００１２】
シロイヌナズナ由来のゲノムＧＥＫ１遺伝子から推定されるタンパク質は、３６１個のアミノ酸からなるが、このうちＮ末端から４５番目のメチオニン残基から始まる３１７個のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ配列を配列番号１に示した。ＧＥＫ１遺伝子は、双子葉植物、単子葉植物にかかわらず様々な植物種のゲノムに存在することが、データーベースを用いた解析により明らかになっている。現在までに、部分的にせよ配列が決定されたｃＤＮＡのうち、シロイヌナズナ由来のＧＥＫ１タンパク質（配列番号２）と類似のタンパク質（比較できるアミノ酸配列の７０％以上が同一）をコードしていると思われるものが、ヒマワリ、ウマゴヤシ、ジャガイモ、ワタ、ダイズ、トマト、イネ、ニラ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、から見つかっている。アミノ酸配列の類似性が高いことから、これらの遺伝子産物はシロイヌナズナ由来のＧＥＫ１タンパク質と同様の機能を持っていると考えられる。よって、ＧＥＫ１遺伝子の突然変異体を分離することにより、上記植物についても本発明の方法によりシロイヌナズナと同様な選抜方法を使用できると考える。例として、トマト（BE432622及びAW650002の２つのトマトＥＳＴ塩基配列から推定）及びイネ(GenBank accession BAD03648)の類似遺伝子との配列相同性を示す（図１）。図１に示したように、ＧＥＫ１タンパク質の４５番目のメチオニン残基以降の配列は、これらの植物の間で高い相同性を示す。また、４５番目のメチオニンをＮ末端として発現させたタンパク質は、１番目のメチオニンから始まるタンパク質と同様の活性を有することが実験的に確認されている。一方、これまで全ゲノム配列が解読された動物や微生物、例えば、ヒトやマウス、及び大腸菌や酵母にはＧＥＫ１類似遺伝子は存在しない。なお、ＧＥＫ１タンパク質の構造は、これまで知られている如何なるモチーフも含んでいない。
【００１３】
更に、上記各タンパク質において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物にエタノール耐性能を付与するタンパク質もＧＥＫ１タンパク質に含まれる。例えば、配列番号２に示したタンパク質のアミノ酸配列に当該タンパク質の生物学的機能を実質的に変化させることなく数個のアミノ酸に変更を加えて生物学的に等価なタンパク質を生成できることは当業者に良く知られている。本発明の１つの側面では、ＧＥＫ１タンパク質は保存的アミノ酸置換によって野生型ＧＥＫ１タンパク質と異なるタンパク質を含みうる。用語「保存的アミノ酸置換」はタンパク質の特定の位置におけるあるアミノ酸の他のアミノ酸による置換を意味する。このような置換は類似するアミノ酸による置換であり、アミノ酸の側鎖置換基の相対的類似度、例えば、大きさ、電荷、疎水性、親水性等に基づいて実行される。
【００１４】
上記ＧＥＫ１タンパク質の生物学的役割は未だ明らかではないが、このＧＥＫ１遺伝子が欠損した変異体の感受性はエタノール特異的であることから、エタノールの代謝産物との関連性が示唆された。培地中のエタノールはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）によってアセトアルデヒドに変換されると考えられる。そこで、ｇｅｋ１表現形とＡＤＨ活性について調べたところ、ＧＥＫ１遺伝子の欠損によりエタノール感受性となるためには、ＡＤＨ活性が必須であることが明らかとなった。即ち、ＡＤＨ欠損株ではＧＥＫ１の変異によるエタノール感受性が消失することから、ｇｅｋ１変異株では、エタノールが代謝されて生じるアセトアルデヒドによる毒性が原因でエタノール高感受性となると考えられる。
【００１５】
＜組換えベクターの作製＞
本発明において、植物、又は植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、当該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターやイネアクチンプロモーター等）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。また、本発明のベクターには、遺伝子発現調節機構やターミネーター領域を含んでいることが好ましい。ターミネーター領域としては、ノパリンターミネーターや３５Ｓターミネーター等を組み入れることができる。
【００１６】
本発明の１つの実施形態として、バイナリーベクターを使用することができる。バイナリーベクターは、アグロバクテリウムを介する形質転換法において用いられるベクターであって、Ｔ−ＤＮＡが植物細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれるのに必要なＴ−ＤＮＡの境界配列の間に目的とする外来遺伝子を挿入するように構築される。一方、Ｔ−ＤＮＡが植物細胞へ移行するのに必要なＴｉプラスミドのｖｉｒ領域を含む別個のプラスミドを構築し、この２つのプラスミドをアグロバクテリウムに導入しこのアグロバクテリウムを植物に感染させて、目的とする外来遺伝子を植物細胞の染色体ＤＮＡに組み込むことができる。このようなバイナリーベクター の例としては、例えばｐＢＩ１２１〔ＥＭＢＯ．Ｊ．，６，３９０１−３９０７（１９８７）〕がある。ｐＢＩ１２１は、Ｔ−ＤＮＡの境界配列の間にネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子とＧＵＳ遺伝子とを有し、この両者の遺伝子の間に外来遺伝子挿入用のクローニングサイトを有し、大腸菌及びアグロバクテリウム中で増殖可能なバイナリーベクターである。他のバイナリーベクター としては、例えばｐＵＣＤ２３４０〔Ｅ．Ｚｙｐｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，１５，２４５−２５６（１９９０）〕がある。ｐＵＣＤ２３４０はＴ−ＤＮＡの境界配列の間にｈｐｈ遺伝子を有し、ｈｐｈ遺伝子の下流側にマルチクローニングサイトを持っている。
【００１７】
更に本発明の好ましい実施形態において、上記組換えベクターは、上記植物内で発現させる目的遺伝子を更に含む。目的遺伝子としては、種々の外来遺伝子を導入することができ、元の植物の特性の他に、導入した外来遺伝子が発現することによる種々の特性が発揮されうる。例えば、導入した外来遺伝子が耐冷性遺伝子の場合には、耐冷性を有する形質転換植物が提供され、農薬耐性遺伝子の場合には、特定の農薬に対する耐性を有する形質転換植物が提供され、ウイルス耐性遺伝子の場合には、特定のウイルスの感染に対して抵抗性のある形質転換植物が提供されうる。
【００１８】
＜植物の形質転換＞
形質転換とは、細胞が保有する遺伝情報を１又は２以上の外来性核酸を当該細胞に導入することによって改変するプロセスである。例えば、本発明の組換えベクターをポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法等、当業者に公知の種々の方法（細胞工学別冊、新版モデル植物の実験プロトコール、２００１年、秀潤社発行等参照）により植物又は植物細胞に導入し形質転換することができる。例えば、減圧浸潤(vacuum infiltration)法を用いたin planta形質転換法は、まず、健康な植物を生育させ、抽台後、摘心により側枝を誘導する。誘導した側枝についた花が咲き始めたところで、植物体の地上部を導入したい組換えＤＮＡをもつアグロバクテリウムの懸濁液に浸して弱い減圧下におき、懸濁液の花の内部への浸透を図る（減圧浸潤）。減圧浸潤後、アグロバクテリウムの感染とＴ−ＤＮＡの移入が起こるが、花で起こったＴ−ＤＮＡの移入のみが結実を経て次世代の種子に伝えられ、種子中にある頻度で形質転換第１世代（ヘミ接合体）が含まれることになる。Clough, S.J. and Bent, A.F. (1998), Plant J. 16:735-743によれば、減圧は必ずしも必要ではない。このフローラルディップ(floral dip)法は、減圧浸潤法の場合と同様に、植物体地上部をアグロバクテリウムの懸濁液に浸けるが、３〜５秒間程度浸けて軽く揺するのみで植物をひきあげる。浸潤懸濁液の表面活性剤(Silwet L-77)の濃度を上げることで、減圧しなくても十分に高い形質転換体頻度が得られる。
【００１９】
また、組織培養法は、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法を用いて胚由来のカルスに組換えＤＮＡを導入し、この胚由来カルスを増殖、再分化させる。本発明の方法には、これら何れの形質転換法も用いることができるが、前者のin planta形質転換法が、簡便、迅速であり、実験者の熟練を特に必要としない点で好ましい。
【００２０】
＜エタノール耐性能を指標とした選抜方法＞
ＧＥＫ１遺伝子が欠損した変異体植物は、野生型植物と比べて１０〜１００倍もエタノールに対する感受性が増大するが、このエタノール感受性以外の形質は野生型と変わりがない。また、他の生物、例えば、動物や微生物では、このような大きなエタノール感受性を示す変異体は知られていない。酵母ではいくつかのエタノール高感受性変異体が取得され、その性質が明らかにされているが、これらの変異体は熱ショックタンパク質や細胞壁の完全性に関与することが知られている。しかしながら、本発明に係るＧＥＫ１遺伝子はこれらの何れのメカニズムにも関係ないことが分かっている。
【００２１】
従って、本発明の方法によれば、１つの形態として、上記ＧＥＫ１遺伝子に何らかの突然変異が生ずることによってエタノール感受性植物又は植物細胞を得ることができるが、これに限定されない。例えば、アンチセンスＲＮＡの発現やｓｉＲＮＡの導入等のＧＥＫ１遺伝子以外の要因により、結果としてゲノム内在性ＧＥＫ１遺伝子の発現が抑制されていてもよい。これらのエタノール感受性植物、又は植物細胞に外来性のＧＥＫ１遺伝子を含む組換えＤＮＡを導入し、エタノールを含む植物育成用培地を用いて形質転換された植物細胞を培養することにより、前記組換えＤＮＡが導入された細胞を選択的に選抜することができる。本発明において、「植物細胞」とは、種々の形態の植物細胞、例えば、培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス等が含まれる。「植物」とは、これらの植物細胞から構成されるか、又はこれらの植物細胞が増殖、再分化して形成される植物の個体をいう。本発明の方法によりエタノール含有培地にて選抜される形質転換細胞としては種々の植物細胞を用いることができるが、形質転換第１世代の種子（ヘミ接合体）を用いることが好ましい。カルスなどと異なり保存が容易な状態で、一時的に保存することができるからである。しかも後述する実施例において具体的に示されるように、エタノール含有培地上で発芽した種子のみを回収することによって容易に形質転換体を選別することができる。培地中のエタノール濃度は、０．００１〜１容量％の範囲において効率よく選抜することができ、好ましい濃度範囲は０．０１〜０．１容量％である。
【００２２】
＜形質転換植物の製造方法＞
本発明の１つの実施形態において、形質転換植物の製造方法が提供される。この方法は、まず、植物のゲノム内在性ＧＥＫ１遺伝子又はその遺伝子産物の機能が抑制された変異体植物を用意し、前記変異体植物にＧＥＫ１遺伝子を含む組換えＤＮＡを導入する工程と、前記植物を栽培して種子を採取する工程と、エタノールを含む植物育成用培地に前記種子を播種する工程と、を含み、前記組換えＤＮＡが導入された形質転換植物が前記エタノール含有培地で選択的に発芽することに基づく。ここで、宿主として用いる植物のＧＥＫ１遺伝子又はＧＥＫ１遺伝子産物の機能は、野生型と比較して５０％以上、好ましくは７０％、８０％、又は９０％以上抑制されていることが好ましく、最も好ましくはＧＥＫ１遺伝子が欠損していることである。このような変異体ＧＥＫ１遺伝子は種々の形態で存在することができ、例えば、コーディング領域内における塩基の付加、置換又は欠失によるＧＥＫ１タンパク質の１次構造の変化が挙げられる。タンパク質中の１つのアミノ酸が置換されることにより、前記タンパク質の機能が大きく損なわれる可能性があることはよく知られている。あるいは、ＧＥＫ１遺伝子のプロモーターやイントロン／エキソン境界領域等の発現調節領域に変異が生ずることによって、生成する遺伝子産物の量や機能が大きく変化することも知られている。
【００２３】
このような変異体植物の作製方法としては、当業者に公知の方法を用いることができ特に制限されないが、例えば、化学的方法、物理的方法及び生物学的方法により突然変異誘発処理を行って突然変異体を選択する。突然変異誘発処理は、通常、種子に対して行い、変異原処理された種子をＭ１種子、育った植物をＭ１世代の植物とよぶ。この植物から自家受粉によって得られた種子をＭ２種子、その種子から育てた植物をＭ２世代とよぶ。２倍体ゲノムを有する植物においては、Ｍ１種子に生じたｇｅｋ１変異は、Ｍ２世代の植物を調べたときにはじめてエタノール高感受性が観察される。
【００２４】
化学的突然変異誘発法としては、ＥＭＳ等のアルキル化剤、核酸塩基アナログ、アジ化ナトリウム等が、物理的方法としては電離放射線や紫外線等を用いる。生物学的方法は、Ｔ−ＤＮＡやトランスポゾンによって挿入突然変異を作製する方法である。ＧＥＫ１相同遺伝子の塩基配列が未知の植物においては、この方法で得られた突然変異体からトランスポゾンをプローブとして周辺のＤＮＡ断片を単離し、その断片近傍からＧＥＫ１相同遺伝子をクローン化することもできる（トランスポゾンタギング法）。このようにして作製した突然変異体は、エタノールを含有する培地上に種子を播種して発芽の有無を確認することによりｇｅｋ１変異株を容易に分離することができる。
【００２５】
本発明の他の１つの実施形態において、上記変異体植物を用いる代わりに野生型の植物を用いることも可能である。この場合には、宿主植物のゲノムＤＮＡに存在する内在性ＧＥＫ１遺伝子と、部分的に塩基配列の異なるＧＥＫ１遺伝子を用いて前記植物を形質転換し、その際、内在性のＧＥＫ１遺伝子の発現を特異的に抑制しておけばよい。このような抑制方法としては、例えば、ｓｉＲＮＡやアンチセンスＲＮＡを用いることができる。
【００２６】
本発明の更に異なる実施形態において、上記形質転換方法によって得られた又は得られうる形質転換植物が提供される。「形質転換体」又は「形質転換植物」とは、外来性核酸、例えば、本発明の組換えベクターの取り込みによって遺伝子的に改変された細胞又はその集合体若しくは子孫である。これらの用語は、他の突然変異又は改変の有無に関わらず、目的の遺伝子的改変が後の細胞の数世代に亘って保持されている形質転換細胞の子孫にも適用される。
【実施例】
【００２７】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
［実施例１］エタノール高感受性を示すシロイズナズナ変異株の作製
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)コロンビア型(Col:Columbia)又はランズバーグ型(Ler:Landsberg erecta)は、ＭＳ培地（ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類、２％（ｗ／ｖ）スクロース、０．５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．８）、及び０．８％（ｗ／ｖ）寒天を含む）、又は土壌にて、２２〜２３℃、昼１６時間／夜８時間のサイクルで生育させた。播種した種子は、発芽を促すため生育器でインキュベートする前に３日又は４日間、４℃に保った。
【００２９】
速中性子変異誘発Ｍ２種子は、LEHLE Seeds（米国テキサス州）から購入した。エチルメタンスルホネート(EMS:Ethylmethanesulfonate)処理は以下のように行った。種子を室温にて０．３％（ｖ／ｖ）ＥＭＳで１６時間処理し、水で完全に洗浄した後、土壌に播種し、Ｍ２世代の種子を収穫した。変異誘発したＭ２種子を、０．０４％（ｖ／ｖ）エタノールとアブサイシン酸等の種々の化学薬品を含むＭＳ培地に播種した。５〜７日間インキュベーションした後、発芽しなかった種子を集め、ＭＳ培地に移して発芽させた。このような方法で得られた変異体候補、即ち、ＥＭＳ処理したコロンビア型のＭ２集団、速中性子変異誘発コロンビア型のＭ２集団、及びＥＭＳ処理したランズバーグ型のＭ２集団から、ｇｅｋ１−１、ｇｅｋ１−２、及びｇｅｋ１−３の３つの独立したエタノール高感受性変異株を同定した。単離された変異株は３回戻し交配を行った。
【００３０】
このようにして得られたエタノール高感受性株（ｇｅｋ１）と野生型株との間で検定交配(test-cross)を行った子孫を解析した結果、この突然変異（ｇｅｋ１）は劣性変異であり、染色体遺伝子にコードされていることが分かった（耐性：感受性＝３０７：１０５、χ２＝０．０２、Ｐ＝０．８９）。図２（Ａ）に示したように、上記３つのｇｅｋ１変異株は何れもエタノール存在下では発芽できなかったが、エタノール非存在下では正常に発芽した。３種類の対立遺伝子の間でエタノール高感受性の程度は異なり、ｇｅｋ１−３が最も感受性が高く、ｇｅｋ１−１が最も感受性が低かった。ｇｅｋ１−２、及びｇｅｋ１−３変異株の発芽率は、０．００３％（ｖ／ｖ、約０．５ｍＭ）のエタノール存在下で顕著に低下したが、野生株は少なくとも０．３％（ｖ／ｖ）エタノール存在下で正常に発芽した（図２（Ｂ）参照）。
【００３１】
［実施例２］エタノール高感受性（ｇｅｋ１）変異株の性質
ｇｅｋ１の表現型は発芽段階に限定されない。ｇｅｋ１突然変異を有する実生(seedlings)を通常の培地で生育させた後０．０３〜０．１％（ｖ／ｖ）のエタノールを含む培地に移すと、それらの生育は著しく阻害され、ｇｅｋ１−２及びｇｅｋ１−３変異株は０．１％（ｖ／ｖ）のエタノール存在下において最終的に死滅した。このｇｅｋ１表現型は、エタノール及びその代謝産物に特異的であり、メタノール、ブタノール、イソプロパノール、ジメチルスルフォキシド、パラコート、過酸化水素、アブサイシン酸、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ、エチレンの前駆物質）又はジベレリンは、当該変異株の発芽や生育に影響を与えなかった。ｇｅｋ１変異株の高エタノール感受性は、日照条件や培地中のスクロース利用能によって影響を受けなかった。エタノール非存在下においてはその他の表現型を見出すことができなかった。
【００３２】
ｇｅｋ１突然変異が極めてエタノール特異的であることから、エタノールの代謝経路に与える影響について調べた。培地中のエタノールは細胞内でＡＤＨによって毒性のアセトアルデヒドに変換されると考えられる。タバコのＡＤＨ欠損変異株ではエタノール耐性能が亢進していることが報告されており、このことはエタノールからＡＤＨによって変換されたアセトアルデヒドが植物におけるエタノールストレスの原因であることが示唆される。そこで、ｇｅｋ１表現型とＡＤＨ活性との間に関連性があるかどうかを確認した。
【００３３】
まず最初に、ｇｅｋ１変異が起こった染色体上の位置を、ＰＣＲに基づく遺伝的マーカーを用いて調べ、第２染色体の上部(top)に存在することを見出した。この位置には、これまでエタノール代謝に関与する遺伝子は見つかっていない。そこで、ｇｅｋ１と、ａｄｈとの間の遺伝的関連性について調べた。これら２つの劣性変異株の間で検定交配を行って得られたＦ２世代を、発芽におけるエタノール感受性について調べたところ、エタノール耐性株と感受性株との割合で表わした分離割合が１３：３となり、ａｄｈ変異がｇｅｋ１を抑制することが示された。この結果は、ｇｅｋ１のエタノール高感受性表現型はＡＤＨ活性を必要とすることを示す。
【００３４】
［実施例３］ｇｅｋ１遺伝子の同定
シロイヌナズナｇｅｋ１遺伝子は、遺伝子地図に基づく染色体歩行により同定した。コロンビア型由来のｇｅｋ１−１及びｇｅｋ１−２をLerと交雑させ、複数のＦ２の子孫を取得した。エタノール高感受性株を０．１％（ｖ／ｖ）エタノールを含む培地で選択し、通常のＭＳ培地で発芽及び生育させた。これらのＦ２子孫からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法に基づくマーカー、例えば、単純塩基配列長多型(Bell, C. and Ecker, J.R. (1994) Arabidpsis. Genomics 19:137-144)を用いてマッピングを行った。その結果を図３に示した。図３（Ａ）はｇｅｋ１遺伝子の染色体上の位置と構造を模式的に示す。黒抜きの三角で示した数字は、遺伝子マーカーとＧＥＫ１遺伝子との間で起きた組換え比率を表わす。例えば、５／１１５２という表記は、調べた１１５２本の第２染色体のうち５本で、このマーカーとｇｅｋ１遺伝子との間で組換えが起きたことを表わす。組換えの数が少なくなればなるほど、マーカーが目的遺伝子に近いことを示す。ｇｅｋ１対立遺伝子の変異部位は一番下の棒線上に示した。「ａｔｇ」はArabidopsis Genome Initiative(2000)によって推定された翻訳開始コドンを示し、小さな白抜きの三角形は、図３（Ｂ）で示すＲＴ−ＰＣＲ実験に用いたオリゴヌクレオチドプライマーに対応する塩基配列の位置を示す。図３（Ｂ）は各種変異株におけるＧＥＫ１遺伝子の発現を示す。ＧＥＫ１コーディング領域の５’側の半分を増幅するためにF19-25.1（配列番号３）とF19-25.11（配列番号４）の２つのプライマーを用い、一方、ＧＥＫ１コーディング領域の全体を増幅するためにはF19-25.1（配列番号３）とF19-25.R（配列番号５）の２つのプライマーを用いてそれぞれＲＴ−ＰＣＲを行った。独立して行った上記２つのＰＣＲ産物を図２（Ｂ）の各レーンに示した。β−チューブリンはコントロールとして用いた。
【００３５】
F19-25.1: 5'-TTACGTTGGGAAGAAGCTACCG-3'（配列番号３）
F19-25.11: 5'-CTGCCTCCTAGCCCAAGACC-3'（配列番号４）
F19-25.R: 5'-ATGTTTTTAAGGGGGTCTCTCTAGA-3'（配列番号５）
βTUB-F:5'-ATCCCACCGGACGTTACAACG-3'（配列番号６）
βTUB-R:5'-TTCGTTGTCGAGGACCATGC-3'（配列番号７）
【００３６】
図３に示したように、ＧＥＫ１遺伝子は第２番染色体のＢＡＣクローンＦ１９Ｂ１１上に局在していた(Arabidopsis Genome Initiative 2000)。実施例１で作製した３種類の変異株から、独立したｇｅｋ１対立遺伝子ｇｅｋ１−１、ｇｅｋ１−２、及びｇｅｋ１−３を単離した。さらに別の変異株より異なる対立遺伝子ｇｅｋ１−４も単離された。ｇｅｋ１−２遺伝子は、推定翻訳開始コドンのＡから数えて１９７７位のAt2g03800からAt2g03810までの欠失があり、欠失部位に隣接してインフレームで終止コドンが生じていた。同一遺伝子上において、ｇｅｋ１−１ではＧ１３５からＡへの一塩基置換が、ｇｅｋ１−３ではＧ１６８５からＡへの一塩基置換が、さらにｇｅｋ１−４ではＧ１３８９からＡへの一塩基置換が見出された。ｇｅｋ１−１における一塩基置換はＭｅｔ４５からＩｌｅへのアミノ酸置換を引き起こし、ｇｅｋ１−３における一塩基置換は第７イントロンのスプライシングアクセプター部位を破壊し、さらにｇｅｋ１−４における一塩基置換はＴｒｐ２２９のコドンが終止コドン（ＴＧＡ）に変化し、ここで翻訳が終結していた。
【００３７】
［実施例４］ＧＥＫ１ｃＤＮＡクローン及びゲノムクローンの単離
ＧＥＫ１ｃＤＮＡクローンは、ラムダＺａｐベクターに構築されたｃＤＮＡライブラリーから、ＧＥＫ１ゲノムのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をプローブとして単離した。得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列を、アプライドバイオケミカルズ社のシーケンサー３１００により決定したところ、推定される最初のＡＴＧコドン（Ｍｅｔ１）を含んでいなかったので、当該ｃＤＮＡクローンの５’末端からＭｓｃＩ切断部位までの領域をゲノムＤＮＡの対応する領域、即ち、推定翻訳開始コドンの上流８３ｂｐからＭｓｃＩ切断部位までの領域と置換した。一方、ＧＥＫ１遺伝子を含む３．５ｋｂのゲノムクローンは、下記の２種類のオリゴヌクレオチドGEK1gEco（配列番号８）とGEK1gBam（配列番号９）をプライマーとして、高精度Ｔａｑポリメラーゼ(KOD-Plus；東洋紡株式会社製）を用いたＰＣＲにより取得した。ＰＣＲ増幅反応によって得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ塩基配列の変化は認められなかった。
【００３８】
GEK1gEco: 5'-GAGACGAATTCAATAGGTGGGTG-3'（配列番号８）
GEK1gBam: 5'-ATATGGATCCGTGGACTTACTTGGTC-3'（配列番号９）
【００３９】
［実施例５］ＧＥＫ１遺伝子の発現とエタノール耐性の付与
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のＧＥＫ１遺伝子を含む約３５００ｂｐの染色体ＤＮＡ断片を、アグロバクテリウムーバイナリーベクターpBI101のHIndIII-BamHI制限酵素認識部位に挿入した。この組換え体プラスミド（pNH677）により、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefacience, GV3101)を形質転換した。形質転換は、エレクトロポレーション法を用い、処理後菌液を２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢアガープレートに広げ、カナマイシンに耐性を示す菌を選抜した。形質転換したアグロバクテリウムをＬＢ液体培地で振盪培養した。培養液を遠心分離（５０００ｇ、１０分、４度）し、菌を沈殿させた。沈殿した菌を、５％スクロース、４４ｎＭの6benzylaminopurine、０．５ｍＭのＭＥＳを含むムラシゲ・スクーク培地（ｐＨ５．８）に懸濁した。菌懸濁液に０．０５％silwet L-77を添加し、感染用菌液とした。花芽を複数持ったシロイヌナズナｇｅｋ１−２植物体を感染用菌液に数分間浸すことで、感染を行った。感染させたシロイヌナズナを生育させ、第１世代の種子を得た。得られた種子を、０．１％エタノールを含む植物育成用培地に播種し、発芽を促した。その結果、図４に示したように、発芽する個体が認められた。図４（Ａ）は、茶色の小さな種子を上記培地に播種して発芽を誘導後、１週間後の写真である。図４（Ｂ）はその拡大図であり、緑色の形質転換植物（葉が展開した幼植物体）が生長し、形質転換体でない種子は発芽がほぼ完全に抑制されていることが分かる。発芽した個体を生育させ、ゲノムＤＮＡを抽出し導入された遺伝子の確認を行った。その結果、予想通り発芽した植物体のゲノムにはＧＥＫ１遺伝子が挿入されていることを示唆する結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】シロイヌナズナ、トマト、及びイネのＧＥＫ１類似タンパク質のアミノ酸配列を比較、整列化した図である。アミノ酸残基を示す一文字略号の下に示した記号は、＊が３種類すべての植物で保存されているアミノ酸残基を、：は類似したアミノ酸残基で保存されている残基を、．は３つの配列のうち２つで保存されているアミノ酸残基をそれぞれ示す。
【図２】シロイヌナズナの各種変異体の種子をエタノール含有培地で発芽させた写真（Ａ）及び発芽効率を示すグラフ（Ｂ）である。●：gek1-1、■：gek1-2、▲：gek1-3、○：野生型、エラーバーはn＝4の標準偏差を示す。
【図３】ＧＥＫ１遺伝子のマッピング及び構造を示した模式図（Ａ）及び各種変異体植物におけるＧＥＫ１遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにより検出した結果を示す図（Ｂ）である。
【図４】エタノール含有培地で発芽させることによりＧＥＫ１遺伝子が導入されたシロイヌナズナを選抜した結果（Ａ）及びその拡大図（Ｂ）である。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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【配列表】
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