(57)【要約】      （修正有）【課題】補薬および非補薬したフィブリン膠などの組織シーラント(ＴＳｓ)、ならびにそれらの製造および用途の提供と成長因子−および／または薬物−補足ＴＳｓならびにそれらの製造および用途の提供。【解決手段】線維芽細胞成長因子−１、−２または４、および／または骨形生蛋白質を補足したフィブリン膠、およびＨＢＧＦ−１を含むフィブリン膠で加圧潅流させたポリテトラフルオルエチレン製移植用血管片、固体５−フルオロウラシルまたはテトラサイクリンに遊離塩基を補足したフィブリン膠、テトラサイクリン遊離塩基やシプロフロキサシン塩酸塩のような物質で処理または補足してなるフィブリン膠の寿命を延ばしたＴＳ。これらは骨の傷の治療、人工血管の内皮細胞形成、動物細胞の増殖および／または分化、および／または動物細胞の方向移動を促進させるために用いられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）少なくとも１つの寿命を延長する補薬（supplement）；および
（ii）フィブリンマトリックスを形成する量のフィブリノーゲン；
を含む生適合性の補足された（supplemented）フィブリン膠組織シーラント組成物であって、
該フィブリノーゲンはトロンビン、Ｃａ++および水の存在下にあった場合にフィブリンマトリックスを形成し、
該組成物は繊維素溶解阻害剤を実質的に含まず、
該補薬は該フィブリンマトリックスから、持続された期間の間、使用の外部環境に運搬され、該持続された期間は２４時間より長い組成物。
【請求項２】
全厚の皮膚創傷の治癒を抑制しない請求項１の組成物。
【請求項３】
該寿命を延長する補薬が薬物である請求項１または２の組成物。
【請求項４】
該組成物が該薬物の局所的運搬を促進する請求項３の組成物。
【請求項５】
該薬物が固体である請求項４の組成物。
【請求項６】
該寿命を延長する補薬が該補薬の水難溶性形である請求項１の組成物。
【請求項７】
該寿命を延長する補薬が抗生物質である請求項４、５または６の組成物。
【請求項８】
該寿命を延長する補薬がテトラサイクリン遊離塩基である請求項４、５、６または７の組成物。
【請求項９】
該抗生物質がテトラサイクリン塩酸塩である請求項７の組成物。
【請求項１０】
該抗生物質がシプロフロキサシン塩酸塩である請求項７の組成物。
【請求項１１】
該薬物が抗増殖剤である請求項４の組成物。
【請求項１２】
該薬物が５−フルオロウラシルである請求項４、５または１１の組成物。
【請求項１３】
物質組成物であって、該組成物は延長された寿命を有する補足されたフィブリン膠組織シーラント（ＴＳ）であって、ＴＳおよび有効量の寿命を延長する補薬を含み、その有効量は該補足されたＴＳの寿命を該寿命を延長する補薬のない場合の寿命の少なくとも２倍延長するのに効果的であり、そして該組成物は繊維素溶解阻害剤を実質的に含まない組成物。
【請求項１４】
該寿命がインビトロで延長される請求項１３の組成物。
【請求項１５】
該寿命を延長する補薬が固体である請求項１３の組成物。
【請求項１６】
該寿命を延長する補薬が該寿命を延長する補薬の水難溶性形である請求項１３の組成物。
【請求項１７】
該寿命を延長する補薬がテトラサイクリン遊離塩基である請求項１３、１４、１５または１６の組成物。
【請求項１８】
該寿命を延長する補薬がシプロフロキサシン塩酸塩である請求項１３、１４、１５または１６の組成物。
【請求項１９】
薬物を補足したフィブリン膠組織シーラントの製造方法であって、該薬物は寿命を延長する補薬でもあり、該組織シーラントは、（ｉ）少なくとも１つの寿命を延長する補薬、および（ii）トロンビン、カルシウムイオンおよび水が存在する場合に、フィブリンマトリックスを形成する量のフィブリノーゲンを含み、
該組成物は実質的に繊維素溶解阻害剤を含まず、
該薬物は該フィブリンマトリックスから持続された期間の間使用の外部環境に運搬され、該持続された期間は２４時間より長い方法。
【請求項２０】
該組織シーラント（ＴＳ）が固化する前に該組織シーラントと薬物を混合することを含む請求項１９の方法。
【請求項２１】
該薬物が固体である請求項１９または２０の方法。
【請求項２２】
該薬物が該薬物の水難溶性形である請求項１９の方法。
【請求項２３】
該薬物がテトラサイクリン遊離塩基である請求項１９、２０、２１または２２の方法。
【請求項２４】
該薬物がシプロフロキサシン塩酸塩である請求項１９、２０、２１または２２の方法。
【請求項２５】
該薬物が５−フルオロウラシルである請求項１９、２０、２１または２２の方法。
【請求項２６】
該フィブリン膠組織シーラントが固化する前に該薬物をフィブリノーゲン濃厚物、トロンビンおよび塩化カルシウムと混合する請求項１９の方法。
【請求項２７】
該組織シーラントを該薬物を含有する溶液に浸漬する請求項１９の方法。
【請求項２８】
該薬物が抗炎症薬である請求項１、３、４、５または６のいずれかの組成物。
【請求項２９】
該薬物が抗真菌性である請求項１、３、４、５または６のいずれかの組成物。
【請求項３０】
該補薬がペプチドである請求項１または３の組成物。
【請求項３１】
該薬物が抗増殖性または細胞毒性薬である請求項１９、２０、２１または２２のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
該薬物が抗真菌性である請求項１９、２０、２１または２２のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
該薬物が抗炎症性である請求項１９、２０、２１または２２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
（ｉ）有効量の少なくとも１つの寿命を延長する補薬、および
（ii）フィブリンマトリックスを形成する量のフィブリノーゲンを含む生適合性のフィブリン膠組織シーラント組成物、
を含む補薬運搬システムであって、
該フィブリノーゲンはトロンビン、Ｃａ++および水の存在下にある場合フィブリンマトリックスを形成し、
該寿命を延長する補薬は該フィブリンマトリックスから、持続された期間の間使用の外部環境に運搬され、
該組成物はプロテアーゼ阻害剤を実質的に含まず、そして該持続した期間は２４時間より長い補薬運搬システム。
【請求項３５】
該寿命を延長する補薬が薬物である請求項３４の補薬運搬システム。
【請求項３６】
該薬物が、抗生物質、鎮痛薬、細胞毒性薬、抗炎症剤、抗真菌薬、抗増殖薬およびペプチドよりなる群から選択される請求項３５に記載の補薬運搬システム。
【請求項３７】
抗生物質がテトラサイクリン遊離塩基である請求項３６の補薬運搬システム。
【請求項３８】
抗生物質がシプロフロキサシン塩酸塩である請求項３６の補薬運搬システム。
【請求項３９】
該抗増殖剤が５−フルオロウラシルである請求項３６の補薬運搬システム。
【請求項４０】
増殖因子、薬物、抗生物質、抗増殖剤、または抗炎症剤の運搬のための担体のビークルとしての請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項４１】
増殖因子、薬物、抗生物質、抗増殖剤、または抗炎症剤の運搬のための担体のビークルとしての請求項３４〜３９のいずれかに記載の補薬運搬システムの使用。
【請求項４２】
該担体が増殖因子、薬物、抗生物質、抗増殖剤、または抗炎症剤を４日以上の期間にわたって放出する請求項４０または４１に記載の使用。
【請求項４３】
局在化ドラッグデリバリーのための請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項４４】
局在化薬物運搬のための請求項３４〜３９のいずれかに記載の補薬運搬システムの使用。
【請求項４５】
血液損失を減少させるための、そして／または止血を維持するための、内部または外部の傷をシールするための請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項４６】
血液損失を減少させるための、そして／または止血を維持するための、内部または外部の傷をシールするための請求項３４〜３９のいずれかに記載の補薬運搬システムの使用。
【請求項４７】
該組成物が更に増殖因子を含む傷の治癒を促進するための請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項４８】
該組成物が更に増殖因子を含む傷の治癒を促進するための請求項３４〜３９のいずれかに記載の補薬運搬システムの使用。
【請求項４９】
組織シーラントの寿命を延長させるためのテトラサイクリン遊離塩基、シプロフロキサシン、および／または５−フルオロウラシルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は補足されていない（unsupplemented）及び補足された(supplemented)、フィブリン接着剤（ＦＧ）ようなＴＳ類（ＴＳ）、同様にそれらの製造法及び使用法に関する。ある１つの態様では、本発明は、全層の皮膚創傷の治癒を妨げないＴＳ類に関する。別の態様では、本発明は成長因子（類）及び／又は薬物（類）で補足されたＴＳ類に関し、同様にそれらの製造法及び使用法に関する。選択された特定の成長因子（類）又は薬物（類）はその使用の機能である。
【背景技術】
【０００２】
関連出願のクロス・リファレンス
本出願は、１９９０年１１月２７日に出願された米国出願番号０７／６１８，４１９号（現在、放棄）及び１９９１年１１月２７日にそれぞれ出願された同第０７／７９８，９１９号の一部継続出願であり、これらを参考のためにここに引用する。
【０００３】
本発明における米国政府の権利
米国赤十字社及び米国陸軍歯科研究所の間の共同研究及び開発の契約の下、米国政府は本発明の１つ又はそれ以上の態様において通常実施の、取り消し不能の、納付済みのライセンスを有する。
【０００４】
Ａ．創傷治癒及び成長因子
創傷治癒、即ち外傷の修復は、ほぼ手術直後に始まる。様々な細胞の機能の相次ぐ整合機能と緻密な減成調節及び再生段階を必要とする。細胞の増殖、分化及び移動は創傷治癒の基礎となる重要な生物学的過程であり、またこれは、線維増多、内皮形成、上皮形成などのフィブリン凝塊の形成、凝塊の吸収、組織の再設計も含む。創傷治癒は、特殊化した皮膚組織の形成だけでなく、多数の毛細管、多くの活発な線維芽細胞、及び多くのコラーゲン原線維を含む高度な血管化組織の形成に関わる。
【０００５】
創傷治癒の過程は、損傷細胞の外に流出するトロンボプラスチンによって開始される。トロンボプラスチンは血漿因子ＶＩＩに接触して因子Ｘ活性化因子を形成し、その後に、因子Ｖとともにリン脂質及びカルシウムとの複合体となり、プロトロンビンをトロンビンに変換する。トロンビンは、フィブリノペプチドＡ及びＢのフィブリノーゲンからの放出を触媒し、フィブリンモノマーを産生する。
【０００６】
トロンビンはまた、トランスグルタミナーゼ、因子ＸＩＩＩａを活性化し、これはフィブリンフィラメントに共有結合的に架橋するイソペプチド結合の形成を触媒する。次に因子ＸＩＩＩによってアルファ−抗プラスミンがフィブリンフィラメント上に結合し、それによってフィラメントをプラスミンによる変性から保護する（例えば、ドーリトル（Doolittle）ら，アニューアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ann．Rev．Biochem.）５３巻：１９５〜２２９頁（１９８４年）を参照されたい）。
【０００７】
組織が損傷した場合、一連の生物学的活性を示すポリペプチド成長因子は治療において決定的な役割を担っている創傷中へ放出される（例えば、ホルモナル・プロテイン・アンド・ペプチド(Hormonal Proteins and Peptides)(リー(Li)，C．H．ed)７巻，アカデミック・プレス・インコーポレイテッド（Academic Press，Inc.），ニューヨーク，ニューヨーク ２３１〜２７７頁（１９７９年）及びブラント（Brunt）ら，バイオケミストリー（Biotechnology）６巻：２５〜３０頁（１９８８年）を参照されたい）。これらの活性には、損傷領域中の白血球及び線維芽細胞などの再成長する細胞が含まれ、細胞の増殖及び分化を誘導する。
【０００８】
創傷治癒に関与し得る成長因子は、次のものを含むがこれに限定されない：血小板−誘導成長因子類（ＰＤＧＦ類）；インシュリン−結合成長因子−１（ＩＧＦ−１）；インシュリン−結合成長因子−２（ＩＧＦ−２）；表皮成長因子（ＥＧＦ）；変換成長因子−α（ＴＧＦ−α）； 変換成長因子−β（ＴＧＦ−β）；血小板因子４（ＰＥ−４）；及びヘパリン結合成長因子１及び２（それぞれＨＢＧＦ−１及びＨＢＧＦ−２）。
【０００９】
ＰＤＧＦ類は循環血小板のアルファ顆粒中に蓄えられ、血液の凝固中、創傷部位で放出される（例えば、リンチ（Lynch）ら，ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J．Clin．Invest.）８４巻：６４０〜６４６頁（１９８９年）を参照されたい）。ＰＤＧＦ類は次のものを含む：ＰＤＧＦ；血小板誘導脈管形成因子（ＰＤＡＦ）；ＴＧＦ−β；及びＰＦ−４、これは好中球の化学誘引剤である（ナイトン（Knighton）ら，イン・グロウス・ファクターズ・アンド・アザー・アスペクツ・オブ・ウーンド・ヒーリング（in Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing）：バイオロジカル・アンド・クリニカル・インプリケーションズ（Biological and Clinical Implications），アラン・アール・リス・インコーポレイテッド（Alan R．Liss，Inc.），ニューヨーク，ニューヨーク，３１９〜３２９頁（１９８８年））。ＰＤＧＦはミトゲン、化学誘引剤、及び線維芽細胞及び平滑筋を含む、間葉に由来する細胞におけるタンパク合成の剌激剤である（例えば、エイデルマン−グリル（Adelmann-Grill）ら，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Eur．J．Cell．Biol.）５１巻：３２２〜３２６頁（１９９０年）を参照されたい）。
【００１０】
ＩＧＦ−１はＰＤＧＦと組み合わさって有糸分裂誘発及び培養間葉細胞に於けるタンパクの合成を推進する。ＰＤＧＦ又はＩＧＦ−１のいずれか一方の皮膚創傷への適用では治癒が増強されないが、両方の因子をともに適用すると結合組織及び上皮組織の成長を推進するようである（リンチ（Lynch）ら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc．Natl．Acad．Sci）７６巻：１２７９〜１２８３頁（１９８７年））。
【００１１】
ＴＧＦ−βはマクロファージ及び単球の化学誘引剤である。他の成長因子の存在又は非存在に依存した、ＴＧＦ−βは多くの細胞型の成長を刺激又は阻害し得る。例えば、インビボで適用する場合、ＴＧＦ−βは治癒している皮膚創傷の引張強さを増加する。ＴＧＦ−βはまた、内皮細胞有糸分裂を阻害し、線維芽細胞によるコラーゲン及びグリコサミノグリカンの合成を剌激する。
ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＨＢＧＦ類及びオステオゲニンなどのその他の成長因子はまた、創傷の治療において重要である。胃の分泌物及び唾液に存在するＥＧＦ、及び正常な及び転換された細胞によりつくられるＴＧＦ−αは、構造的に関連があり、同じ受容体を認識し得る。これらの受容体は上皮細胞の増殖を媒介する。
【００１２】
両方の因子は、皮膚創傷の上皮の再形成を促進する。外因性のＥＧＦはケラチノサイト及び皮膚の線維芽細胞の増殖を剌激することによって創傷の治療を推進する（ナニー（Nanney）ら，ジャーナル・オブ・インベスティゲイティング・オブ・ダーマトロジー（J．Invest．Dermatol.）８３巻：３８５〜３９３頁（１９８４年）及びコフェイ（Coffey）ら，ネイチャー（Nature）３２８巻：８１７〜８２０頁（１９８７年））。ＥＧＦの局所的適用は、ヒトにおける部分的厚さの創傷の治療速度を促進する（シュルツ（Schulz）ら，サイエンス（Science）２３５巻：３５０〜３５２頁（１９８７年））。脱ミネラル化した骨から精製されるオステオゲニンは、骨の成長を推進するようである（ルイテン（Luyten）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem.）２６４巻：１３３７７頁（１９８９年）を参照されたい）。さらに血小板抽出物は、局所的適用のための軟膏（salve又はointment）の形になっている血小板−誘導創傷治療処方が記載されている（例えば、ナイトン（Kinghton）ら，アニューアル・オブ・サージェリー（Ann．Surg.）２０４巻：３２２〜３３０頁（１９８６年）を参照されたい）。
【００１３】
ヘパリン結合成長因子類（ＨＢＧＦ類）はまた、線維芽細胞成長因子類（ＦＧＦ類）としても知られ、酸性ＨＢＧＦ（ａＨＢＧＦもまたＨＢＧＦ−１又はＦＧＦ−１として知られる）及び塩基性ＨＢＧＦ（ｂＨＢＧＦもまたＨＢＧＦ−２として知られる）を含み、上皮細胞を含む中胚葉細胞及び神経外胚葉細胞に対する有効なミトゲンである（例えば、バーゲス（Burgess）ら，アニューアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ann．Rev．Biochem.）５８巻：５７５〜６０６頁（１９８９年））。さらにＨＢＧＦ−１は内皮細胞及び大グリア細胞に対して走化性である。ＨＢＧＦ−１及びＨＢＧＦ−２は両方ともヘパリンに結合し、タンパク質の分解からそれらを保護する。ＨＢＧＦ類によって示される一連の生物学的活性は、これらが創傷治癒において重要な役割を担っていることを示唆している。
【００１４】
塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）は脈管形成及び線維芽細胞の移動及び増殖の有効な刺激剤である（例えば、ゴスポダロウィッツ（Gospodarowicz）ら，モレキュラー・アンド・セルラー・エンドクリノロジー（Mol．Cell．Endocinol,.）４６巻：１８７〜２０４頁（１９８６年）及びゴスポダロウィッツ（Gospodarowicz）ら，エンドクライン・レビューズ（Endo．Rev.）８巻：９５〜１１４頁（１９８５年）を参照されたい）。酸性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−１）は内皮細胞の有効な脈管形成因子であると示されている（バーゲスら，前掲（１９８９年））。しかし、ＦＧＦ成長因子が線維芽細胞に対して化学走性であるにしても確立はされていない。
【００１５】
従って、成長因子は創傷治癒及び組織修復の特異的な促進に非常に有用である。しかし、これらの創傷治癒の促進への使用は矛盾した結果を与える（例えば、カーター（Carter）ら，イン・グロウス・ファクターズ・アンド・アザー・アスペクツ・オブ・ウーンド・ヒーリング：バイオロジカル・アンド・クリニカル・インプリケーションズ，アラン・アール・リス・インコーポレイテッド，ニューヨーク，ニューヨーク，３０３〜３１７頁（１９８８年）を参照されたい）。例えば、ブタにおいて標準化された皮膚創傷に別々に適用したＰＤＧＦ、ＩＧＦ−１、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β及びＦＧＦ（ＨＢＧＦとしても知られる）は、創傷において結合組織又は上皮の再生についてほとんど効果がなかった（リンチら，ジャーナル・クリニカル・インベステイゲーション ８４巻：６４０〜６４６頁（１９８９年））。残る因子については、ＴＧＦ−βは単独で最大きい応答を剌激する。しかしＰＤＧＦ−ｂｂホモダイマーとＩＧＦ−１又はＴＧＦ−αのようなファクターの組み合わせは、結合組織の再生及び外皮形成において劇的な増加をもたらす。（Id.）ツボイ（Tsuboi）らは、開いた創傷へのｂＦＧＦの日常的な適用は、治癒が減退したマウスにおいて創傷治癒を刺激するが、正常なマウスにおいては刺激しないことを報告している（ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メティスン（J．Exp．Med.）１７２巻：２４５〜２５１頁（１９９０年））。一方、恐らく成長因子を含んでいるであろうブタ又はウシの血小板溶解産物の粗調製物の、ヒトの皮膚の創傷への適用は創傷の閉鎖の速度を高め、治癒領域の細胞の数を増加し、血管の成長を増加させ、コラーゲンの沈着の全速度を増加させ、瘢痕組織の強度を強める（カーターら、前掲）。
【００１６】
このような矛盾した結果の理由はわかってはいないが、通常の一連の生物学的活性を示し得る方法による創傷への成長因子の適用における困難さの結果であろう。例えば、数種の成長因子受容体は、最大の生物学的作用の産出を少なくとも１２時間占有しなければならないと現在では考えられている（プレスタ（Presta）ら、Cell Regul．２巻：７１９〜７２６頁（１９９１年）及びルスナチ（Rusnati）ら、ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジー（J．Cell．Physiol.）１５４巻：１５２〜１６１頁（１９９３年））。このような矛盾した結果のために、創傷治癒の刺激における成長因子の外因的な適用による役割は明らかではない。さらに、創傷と成長因子の間の接触を長引かせるための、成長因子を創傷へ適用することによる方法は現在知られていない。
【００１７】
Ｂ．ＴＳ類 
血漿タンパクを含むＴＳ類及び外科手術用接着剤は、骨及び皮膚などにおける創傷の内部又は外部を密閉するために用いられ、血液の損失を減少し、止血を維持する。このようなＴＳ類は、血液凝固因子及び他の血液タンパクをを含む。フィブリンシーラントとも呼ばれているＦＧは、血漿から調製される天然の凝塊に類似するゲルである。各ＦＧの正確な成分は、出発物質として使用される特定の血漿画分の機能である。血漿成分の分画は、エタノール、ポリエチレングリコール、及び硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換及びゲル濾過クロマトグラフィーなどの標準的なタンパク精製法によって行う。典型的なＦＧは微量のアルブミン、フィブロネクチン、プラスミノーゲンを含有する。カナダ、欧州及び恐らくどの地域でも市販で入手可能なＦＧはまた、安定化剤としてアプロチニンも典型的に含有する。
【００１８】
ＦＧ類は通常、次のものから製造される：（１）フィブロネクチン、因子ＸＩＩＩ、及びフォンウィレブラント（von Willebrand）因子を含有するフィブリノーゲン濃縮物；（２）乾燥ヒト又はウシトロンビン；及び（３）カルシウムイオン。商業生産されたＦＧ類は通常、ウシの成分を含有する。フィブリノーゲン濃縮物は寒冷沈降反応、次いで濾過によって血漿から製造し、トロンビンとカルシウムイオンのようなトロンビン活性化剤の混合物の、シーラント又は凝塊の形の組成物を得る。フィブリノーゲン及びトロンビン濃縮物は凍結乾燥して製造され、使用する前に塩化カルシウムの溶液と速やかに混合する。混合したら、組織表面上で凝固させ、架橋フィブリンを含む凝塊を形成する組織に成分を適用する。フィブリノーゲン濃縮物に存在する因子ＸＩＩＩは架橋を触媒する。
【００１９】
オーストラリア特許第７５０９７／８７号は１成分の接着剤を記載している。これはフィブリノーゲンの水溶液、因子ＸＩＩＩ、アンチトロンビンＩＩＩのようなトロンビン阻害剤、プロトロンビン因子、カルシウムイオン、及び必要であればプラスミン阻害剤を含む。ストロエトマン（Stroetmann），米国特許第４，４２７，６５０号及び同第４，４２７，６５１号は、創傷の閉鎖及び治癒を増強する、フィブリノーゲン、トロンビン及び／又はプロトロンビン、及びフィビリン溶解阻害剤、及びまた血小板抽出物のような他の成分も含有する粉末また噴霧可能な製剤の形の濃血漿誘導体の製造について記載している。ローズ（Rose）らの米国特許第４，６２７，８７９号及び同第４，９２８，６０３号は、フィブリノーゲン及び因子ＸＩＩＩを含む寒冷沈降懸濁液の製造方法及びＦＧ製造のための該懸濁液の使用を開示している。ＪＰ １−９９５６５は、創傷治癒のためのフィブリン接着剤の製造のためのキットを開示している。アルターバウム（Alterbaum）（米国特許第４，７１４，４５７号）及びモース（Morse）ら（米国特許第５，０３０，２１５号）は、自系のＦＧ製造のための方法を開示している。さらに、改良ＦＧデリバリーシステムは、次のいずれかに開示されているミラー（Miller）ら，米国特許第４，９３２，９４２号及びモースら，ＰＣＴ出願ＷＯ９１／０９６４１号）。
【００２０】
イムノ ＡＧ（ＩＭＭＵＮＯ ＡＧ）（ウィーン、オーストリア）及びベーリングヴェルケ（ＢＥＨＲＩＮＧＷＥＲＫＥ）（ドイツ）（ギフル（Gibble）ら，トランスフュージョン（Transfusion）３０巻：７４１〜７４７頁（１９９０年））は、ＦＧ類を現在欧州及びほかの地域で市販している（例えは、イムノＡＧが所有する米国特許第４，３７７，５７２号及び同第４，２９８，５９８号を参照されたい）。ＴＳ類は米国では市販されていない。しかし、米国赤十字社及びバクスター／ハイランド（ＢＡＸＴＥＲ／ＨＹＬＡＮＤ）（ロサンジェルス，カリフォルニア）は最近ＦＧ（ＡＲＣ／ＢＨ ＦＧ）を共同開発し、現在臨床試験中である。
【００２１】
米国国外で臨床的に使用されているＴＳ類はある種の臨床上の危険性が持ち上がり、米国では使用のための食物又は薬物による投与は認可されていない。例えば、欧州で許可されているＴＳ類は、アプロチニン及びウシトロンビンなどの非−ヒト由来のタンパクを含んでいる。これらのタンパクは非−ヒト由来であるので、人々はこのタンパクに対してアレルギー反応を起こし得る。欧州では、ＦＧの成分中に存在するウイルスの不活性化に加熱失活を使用している。しかし、この加熱失活法は、アレルギーになり得る変性タンパクを生じ得る。さらに、この失活法は、ＴＳ類中にウシタンパクを使用しているためにＴＳ類中に存在し得る、ウシの海綿様脳症「狂牛病」を引き起こすプリオン（prion）が失活されないという心配がある。この病気は「スクレイピー（scrapies）」と呼ばれヒツジからウシへすでに交雑している考えらえているので、ヒトに感染し得るということは些細な問題ではない。
【００２２】
ＡＲＣ／ＢＨ ＦＧはウシタンパクを含んでいないので、欧州で入手可能なＴＳ類に勝るものである。例えば、ＡＲＣ／ＢＨ ＴＳはウシトロンビンの代わりにヒト・トロンビンを含み、アプロチニンを含まない。ＡＲＣ／ＢＨ ＦＧはウシタンパクを含まないので、欧州で入手可能なＴＳ類よりもヒトに於けるアレルギーが少ない。さらに、ＡＲＣ／ＢＨ ＦＧは、溶媒デタージェント法（solvent detergent method）によりウイルスが不活性化され、この方法は生成する変性タンパクがより少なく、従って欧州で入手可能なものよりもアレルギーが少ない。
【００２３】
従って、ＡＲＣ／ＢＨ ＦＧは、現在他の国で市販で入手可能なＴＳ類に勝っている。
【００２４】
ＦＧは、主として臨床の局所的な適用のために処方され、出血を抑え、止血を維持し創傷の治癒を推進するために用いられる。ＦＧの臨床的用途は最近、再検討されている（ギブルら，トランスフュージョン ３０巻：７４１〜７４７頁（１９９０年）；ラーナー（Lerner）ら，ジャーナル・オブ・サージカル・リサーチ（J．Surg．Res.）４８巻：１６５〜１８１頁（１９９０年））。組織を密閉することによりＦＧは空気又は体液漏出を防止し、止血を誘発し、出血、血腫、感染などの創傷治癒を妨害し得る事象を減少又は防止することによって創傷治癒に間接的に寄与する。ＦＧは止血を維持し、血液の損失を減少するけれども真の損失治癒特性を有することはまだ証明されていない。ＦＧは、骨及び皮膚の損傷のような内部と外部の両方の損傷に適しており、止血の維持に有用であるので、その創傷治癒特性の増強に望ましいものである。
【００２５】
フィブリノーゲン濃度が約３９ｇ／ｌであり、トロンビン濃度が２００〜６００Ｕ／ｍｌであるＦＧは著しく増加した応力、エネルギー吸収及び弾性値を有する凝塊を生じる（バイアン（Byrne）ら，ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・サージェリー（Br．J．Surg.）７８巻：８４１〜８４３頁（１９９１年））。フィブリン凝塊で満たされ（５ｍｇ／ｍｌ）、皮下に埋め込まれた貫通テトロンシリンダーは、空のシリンダーと比較したとき、コラーゲンの沈着増加の誘発を含む組織の肉芽形成を剌激する（ヘデリン（Hedelin）ら，ヨーロピアン・サージカル・リサーチ（Eur．Surg．Res.）１５巻：３１２頁（１９８３年））。
【００２６】
Ｃ．骨創傷とその修復 
一連の骨（bone induction）誘導は、ウリスト（Urist）らによって最初に記載され、脱ミネラル化した皮質性骨マトリックスを使用するものである（クリニカル・オルソペディクス・アンド・リレイテッド・リサーチ（Clin．Orthop．Rel．Res.）７１巻：２７１頁（１９７０年）及びプロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．USA）７０巻：３５１１頁（１９７３年））。同種異系のレシピエントに皮下的に埋め込まれた脱ミネラル化皮質性骨マトリックスは局所のミトゲンとして作用する因子を放出し間葉細胞の増殖を剌激する（ラス（Rath）ら，ネイチャー（ロンドン）２７８巻：８５５頁（１９７９年））。新たな骨形成が埋め込み後１２日から１８日の間に起こる。造血骨髄系統で充満した小骨の発達は２１日までに起こる（レデイー（Reddi），A.，イン・エクストラセルラー・マトリックス・バイオケミストリー（in Extracellular Matrix Biochemistry）（ピーツ（Piez）ら，ed.）エルセビアー（Elsevier），ニューヨーク，ニューヨーク，３７５〜４１２頁（１９８４年））。
【００２７】
脱ミネラル化骨マトリックス（ＤＢＭ）は骨形成タンパク（ＢＭＰ）として知られる骨誘発タンパク源であり、骨細胞の先祖の増殖を調節する成長因子である（例えば、ホイスカ（Hauschka）ら，ジャーナル・オブ・バイオケミストリー２６１巻：１２６６５〜１２６７４頁（１９８６年）及びカナリス（Canalis）ら，ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション ８１巻：２７７〜２８１頁（１９８８年）を参照されたい）。８つのＢＭＰが現在同定されており、ＢＭＰ−１からＢＭＰ−８と略記されている。ＢＭＰ−３及びＢＭＰ−７はまた、それぞれオステオゲニン（osteogenin）及び骨形成タンパク−１（ＯＰ−１）として知られている。
【００２８】
残念ながら、ＤＢＭ物質は粒子状骨髄自己移植と組み合わせない限り、臨床上の用途は殆ど無い。レシピエントの骨に外科的に注入し、治療効果をあげ得るＤＢＭの量は制限されている。さらに、吸収は少なくとも４９％であると報告されている（トリウミ（Toriumi）ら，アチーヴス・オブ・オトラリンゴロジー−ヘッド・アンド・ネック・サージェリー−（Arch．Otolaryngo．Head Neck Surg.）１１６巻：６７６〜６８０頁（１９９０年））。
【００２９】
ＤＢＭ粉末及びオステオゲニンは骨誘発潜在性が発現される前に、組織液により洗い流され得る。さらに、ＤＢＭパックされた骨腔への組織液の浸出又は創傷床への軟組織虚脱は、ＤＢＭ及びオステオゲニンの骨誘発特性に有意に影響し得る２つの因子である。創傷床への軟組織虚脱は、創傷床内への骨適応幹細胞の適切な移行を同様に阻害し得る。
【００３０】
粉末状のヒトＤＢＭはアメリカの歯科医によって、口腔手術の間にできた顎骨腔をパックするために現在使用されている。しかし、粉末状のＤＢＭは使用が困難である。
【００３１】
精製ＢＭＰ類は、ＦＧ（ハットリ（Hattori）ら，日本整形外科学会雑誌（Nippon．Seikeigeka．Gakkai．Zasshi.）６４巻：８２４〜８３４頁（１９９０年）；カワムラ（Kawamura）ら，クリニカル・オルソペディクス・アンド・リレイテッド・リサーチ２３５巻：３０２〜３１０頁（１９８８年）；シュラグ（Schlag）ら，クリニカル・オルソペディクス・アンド・リレイテッド・リサーチ２２７巻：２６９〜２８５頁（１９８８住）及びシュワルツら，クリニカル・オルソペディクス・アンド・リレイテッド・リサーチ２３８巻：２８２〜２８７頁（１９８９年））、及び全血凝塊（ワン（Wang）ら，ジャーナル・オブ・セルラー・バイオケミストリー（J．Cell．Biochem.）１５Ｆ：Ｑ２０ アブストラクト（１９９０年））を含む様々な方法によって投与されたとき、動物において骨誘発作用を有する。しかし、シュワルツら（前掲）は、異所性の骨誘発又はＢＭＰ依存性の骨再生におけるＦＧの明らかな正の作用も負の作用も実証してはいない。カワムラら（前掲）は、ＦＧ中の部分精製ＢＭＰを異所性の非骨部位中で試験した場合に、相乗効果を見いだした。
【００３２】
ＴＳはまた、創傷領域中へ移動し新しい組織を産生するために使用し得る細胞である「スカフォルド（scaffold）」としても供給し得る。しかし、市販で入手可能なＦＧ及び他のＴＳ類の調製品は非常に密度が濃いために、調製品中への及びそれを通る、細胞の移動が不可能になる。このことによってインビボ使用での調製品の効果が制限されることがある。
【００３３】
骨癒着欠損と呼ばれている骨創傷のあるタイプでは、その上に新たな骨形成が自然には起こらない極微の隙間が存在する。臨床上、これらの状況のための治療は骨移植である。しかし、骨自己移植源は普通限られており、同種異系の骨の使用はウイルス汚染の高い危険性を伴う。この状況のために脱ミネラル化された、ウイルスを不活性化した骨粉末を誘引溶液として用いる。
【００３４】
Ｄ．血管プロテーゼ 
人工血管プロテーゼは、通常ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）から製造され、ヒト及び他の動物の病的な血管の代わりに使用される。血管プロテーゼの開通性の程度を最大にし、凝塊形成を最小にするために、プロテーゼ上への非自己の内皮細胞の接種を含む様々な技術が用いられてきた。血管移植片と内皮細胞の両方に付着する様々な基質が、内皮細胞接種を増強する中間体基質として研究されてきた。これらの基質は凝固前の血液（ヘリング（Herring）ら，サージェリー（Surgery）８４巻：４９８〜５０４頁（１９７８年））、ＦＧ（ローゼンマン（Rosenman）ら，ジャーナル・オブ・バスキュラー・サージェリー（J．Vasc．Surg.）２巻：７７８〜７８４頁（１９８５年）；シュレンク（Schrenk）ら，ソーラシック・アンド・カーディオバスキュラー・サージェリー（Thorac．Card iovasc. Surg.) ３５巻：６〜１０頁（１９８６年）；ケベカー(Keveker)ら，ソーラシック・アンド・カーディオバスキュラー・サージェオン（Thorac．Cardiovasc．Surgeon）３４巻：４９〜５１頁（１９８６年）及びジラ（Zilla）ら，サージェリー １０５巻：５１５〜５２２頁（１９８９年））、フィブロネクチン（例えば、ケスラー（Kesler）ら，ジャーナル・オブ・バスキュラー・サージェリー ３巻：５８〜６４頁（１９８６年）；マセラク（Macarak）ら，ジャーナル・オン・セルラー・フィジオロジー（J．Cell．Physiol.）１１６巻：７６〜８６頁（１９８３年）及びラマナンジェノナ（Ramalanjenona）ら，ジャーナル・オブ・バスキュラー・サージェリー ３巻：２６４〜２７２頁（１９８６年）を参照されたい）、又はコラーゲン（ウィリアムス（Willams）ら，ジャーナル・オブ・サージカル・リサーチ ３８巻：６１８〜６２９頁（１９８５年））を含む。しかし、これらの技術に関するひとつの一般的な問題は、接種に非自己の細胞を用いるため組織拒絶反応の可能性が生じるということである（例えば、シュレンクら，前掲）。さらに、融合性の内皮は通常、決してつくられるものではなく、作られるとしても数カ月を要する。この遅れの結果、血管プロテーゼは大きい閉塞（occlusion）速度を有する（例えば、ジラら，前掲）。
【００３５】
Ｅ．脈管形成 
脈管形成は新たな血管を誘導する。ＨＢＦＧ−１及びＨＢＦＧ−２などの、ある成長因子は脈管形成性の成長因子である。しかし、コラーゲン海綿（トンプソン（Tompson）ら，サイエンス ２４１巻：１３４９〜１３５２頁（１９８８年））；ビーズ（ヘイエク（Hayek）ら，バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem．Biophys．Res．Commun.）１４７巻：８７６〜８８０頁（１９８７年））；海綿状構造に配列されたコラーゲンでコテーィングされた固形ＰＴＦＥファイバー（トンプソンら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．USA）８６巻：７９２８〜７９３２頁（１９８９年））を伴った投与；又は注入（プーマラ（Puumala）ら，ブレイン・リサーチ（Brain Res.）５３４巻：２８３〜２８６頁（１９９０年））は不規則で無秩序な血管の発生をもたらす。これらの成長因子は、インビボで一定の部位にて新しい血管の成長にうまく向かわせるように用いられていない。さらに、プラスチックガラスチェンバー中の皮下的に埋め込まれたフィブリンゲル（０．５〜１０ｍｇ／ｍｌ）は、空のチェンバー又は食塩水培養液で満たしたチェンバーと比較すると、埋め込みから４日以内で脈管形成を誘導する（ドボラク（Dvorak）ら，ラボラトリー・インベスティゲーション（Lab．Invest.）５７巻：６７３頁（１９８７年））。
【００３６】
Ｆ．部位指向的、局所化ドラッグデリバリー 
有効な、部位指向性のドラッグデリバリーシステムは医薬の幾つかの領域では非常に必要である。例えば、局所化ドラッグデリバリーは、歯周炎のような抗菌剤の全身的な投与が効かない局所的な感染の治療に必要である。全身的投与後の問題は、普通、標的部位に到達し得る抗菌剤の濃度の低さにある。局所的な濃度を上げるために全身的な用量を増加することは効果的ではあるだろうが、同時に毒性、微生物の耐性及び薬物不適合をもたらし得る。これらの問題を克服するために幾つかの別の方法が考案されているがどれも理想的ではない。例えば、非結晶の流動性マスとして、水性媒質に分散したコラーゲン及び／又はフィブリノーゲン及び安定な配置を可能にするタンパク様のマトリックス組成物もまた、薬物を局所的にデリバーすることが示されている（ルック（Luck）ら，米国再発行特許第３３，３７５号；ルックら，米国特許第４，９７８，３３２号）。
【００３７】
しかし、様々な抗生物質（ＡＢ）がＦＧから、比較的低い濃度で、数時間から数日の範囲の比較的短時間放出されると報告されている(クラム（Kram）ら，ジャーナル・オブ・サージカル・リサーチ５０巻：１７５〜１７８頁(１９９１年))。大部分のＡＢ類は自由に水に溶解し、調製するときはＴＳ類中に加えられてきた。しかし、ＴＥＴ ＨＣｌ及びＦＧ中への自由に水に溶解する他のＡＢ類の併合は、ＡＢ−添加ＦＧを形成する間のフィブリンの重合を妨害する(シュラグ（Schlag）ら，バイオマテリアルズ（Biomaterials） ４巻：２９〜３２頁(１９８３年))。この妨害は、ＡＢ−ＦＧ混合物中に達成し得るＴＥＴ ＨＣｌの量と濃度を制限し、ＡＢ濃度依存性であるようだった。ＦＧからのＡＢの比較的短い放出時間はＡＢ−添加ＴＳの比較的短い寿命及び／又はＡＢ−ＴＳ中のＡＢの形及び／又は量を反映し得る。
【００３８】
Ｇ．ＴＳ類からの薬物放出の制御 
幾つかの臨床的応用のために、制御され、局所化された薬物放出は望ましいものである。前記で論じたように、幾つかの薬物、特にＡＢ類はＦＧのようなＴＳ類に取り込まれ、そこから放出されている。しかし、薬物を補足したＦＧの比較的短い寿命を少なくとも部分的に明らかに反映する薬物放出の持続期間は、ほとんどあるいは全く制御されていない。したがって、延長された、局所的な薬物放出を可能にするためのＦＧ及び他のＴＳ類を安定化する方法は、ＴＳからの他の補足物の取り込みと延長された放出のための新しい技術と同様、望ましくそして必要なものである。
【発明の開示】
【００３９】
発明の要旨
一態様において、本発明は、シーラントが全層の皮膚創傷の治癒を阻害しない、ＴＳを含む、問題の組成物を提供する。
【００４０】
別の態様において、本発明は、シーラントの全タンパク質濃度が３０mg/ml未満である、ＴＳを含む、問題の組成物を提供する。
【００４１】
別の態様において、本発明は、全タンパク質濃度が３０mg/ml未満であり、補足物質が成長因子および／または薬物である補足ＴＳを含む、問題の組成物を提供する。
【００４２】
別の態様において、本発明は、全タンパク質濃度が３０mg/ml以上であり、補足物質が成長因子および／または薬物である補足ＴＳを含む、問題の組成物を提供する。
【００４３】
別の態様において、本発明は、ＴＳおよび有効濃度の少なくとも１つの成長因子を含む、動物細胞の指向性移動を促進させる、問題の組成物を提供する（該成長因子は動物細胞の指向性移動を促進させるのに有効である）。
【００４４】
別の態様において、本発明は、ＴＳおよび有効濃度の少なくとも１つの成長因子を含む、創傷治癒を促進させる、問題の組成物を提供する（該濃度は創傷治癒を促進させるのに有効である）。
【００４５】
別の態様において、本発明は、ＴＳおよび有効濃度の少なくとも１つの成長因子を含む、人工血管の内皮形成を促進させる、問題の組成物を提供する（該濃度は人工血管の内皮形成を促進させるのに有効である）。
【００４６】
別の態様において、本発明は、ＴＳおよび有効濃度の少なくとも１つの成長因子を含む、動物細胞の増殖および／または分化を促進させる、問題の組成物を提供する（該濃度は動物細胞の増殖および／または分化を促進させるのに有効である）。
【００４７】
別の態様において、本発明は、ＴＳおよび少なくとも１つの薬物を含む、少なくとも１つの薬物の局所的輸送を促進させる、問題の組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、ＴＳおよび少なくとも１つの成長因子を含む、少なくとも１つの成長因子の局所的輸送を促進させる、問題の組成物を提供する。
【００４８】
別の態様において、本発明は、ＴＳおよび有効濃度の少なくとも１つの成長因子を含有する組成物を創傷に適用することを含んでなる、創傷治癒を促進するための方法を提供する（該濃度は創傷治癒を促進させるのに有効である）。
【００４９】
別の態様において、本発明は、ＴＳおよび有効濃度の少なくとも１つの成長因子を含有する組成物を人工血管に適用することを含んでなる、人工血管の内皮形成を促進させるための方法を提供する（該濃度は人工血管の内皮形成を促進させるのに有効である）。
【００５０】
別の態様において、本発明は、有効濃度の少なくとも１つの成長因子を含有するＴＳの十分近くに細胞を置くことを含んでなる、動物細胞の増殖および／または分化を促進させるための方法を提供する（該濃度は該細胞の増殖および／または分化を促進させるのに有効である）。
【００５１】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つの薬物含有するＴＳを組織に適用することを含んでなる、少なくとも１つの薬物を組織へ局所的に輸送するための方法を提供する。
【００５２】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの成長因子含有するＴＳを組織に適用することを含んでなる、少なくとも１つの成長因子を組織へ局所的に輸送するための方法を提供する。
【００５３】
別の態様において、本発明は、有効濃度の少なくとも１つの成長因子を含有するＴＳを細胞の十分近くに置くことを含んでなる、動物細胞の指向性移動を得るための方法を提供する（該濃度は該細胞の所望の指向性移動を得るのに有効である）。
【００５４】
本発明の態様において、ＴＳはＦＧであってよい。
【００５５】
本発明の種々の態様において、局所的フィブリノーゲン・コンプレックス（ＴＦＣ）、ヒト・トロンビンおよび塩化カルシウムを混合することからＦＧを調製することができる。ＴＦＣ濃度を変化させることは、最終ＦＧマトリックスの密度に最も有意な影響を及ぼす。トロンビン濃度を変化させることは、最終ＦＧの全タンパク質濃度に有意な影響を及ぼさないが、ＴＦＣのフィブリノーゲン成分の、フィブリンへの重合に必要とされる時間に深い影響を及ぼす。この作用はよく知られているが、ＦＧを単独でかまたは補足されて用いる場合に、ＦＧの有効性を最大限にするために用いることは、一般に認識されていない。この作用のために、ＦＧ成分の混合およびＦＧ凝固間の時間を変化させることができる。従って、ＦＧを創傷の深い間隙中により自由に流動させ、ＦＧが凝固する前にＦＧを創傷に完全に満たすことができる。別法として、特に圧力下で創傷が液体を漏出している場合（即ち、血液、リンパ液、細胞間液等）、ＦＧが創傷部位を刺激させないぐらい十分迅速にＦＧを凝固させることができる。この性質はまた、長い通路（即ち、カテーテル、内視鏡等）を伴う輸送装置をＦＧによって詰まらせないために重要であり、ＦＧまたは添加ＦＧを外科手術によってのみ近付き易い身体の部位に適用するために重要である。この作用はまた、懸濁液中の不溶性添加物質を保有し、それがアプリケーターまたは組織部位で凝固するのを妨げるのに重要である。
【００５６】
本明細書中で用いるＴＦＣは、精製およびウイルス的に不活性化されているヒト血漿タンパク質の凍結乾燥混合物である。再構成したＴＦＣは、以下を含有する： 
全タンパク質：１００〜１３０mg/ml 
フィブリノーゲン （凝固可能タンパク質として）全タンパク質の８０％ （最小）
アルブミン（ヒト）：５〜２５mg/ml 
プラスミノーゲン：５mg/ml 
ＸIII因子：１０〜４０Ｕ/ml 
ポリソルベート−８０：０.３％（最大）
pＨ：７.１〜７.５ 
【００５７】
また、再構成したＴＦＣはトレース量のフィブロネクチンも含有する。
【００５８】
本明細書中に用いるヒト・トロンビンは、精製およびウイルス的に不活性化されているヒト血漿タンパク質の凍結乾燥混合物である。再構成したヒト・トロンビンは以下を含有する： トロンビンポテンシィ：３００±５０ IＵ/ml アルブミン（ヒト）：５mg/ml グリシン：０.３Ｍ±.０５Ｍ pＨ：６.５〜７.１ 塩化カルシウムを十分な濃度で加えて、トロンビンを活性化させる。カルシウムが十分量である限り、その濃度は重要でない。
【００５９】
成長因子を含有する本発明の組成物において、該組成物は阻害化合物および／または強化化合物を含有してもよく、ここで該阻害化合物は成長因子のどんな生物学的活性をも阻害するシーラントの活性を阻害し、強化化合物は成長因子のどんな生物学的活性をも強化するか、媒介（mediate）するか、または増進する（該阻害化合物または該強化化合物の濃度は阻害、強化、媒介または増進を達成するのに有効である）。
【００６０】
本発明の成長因子補足ＴＳは、創傷、特に糖尿病患者の皮膚潰瘍のような容易に治癒しない創傷の治癒を促進するのに有用であり、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ−bb、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＯＰ−１、ＴＧＦ−Ｂ、ＣＩＦ−Ａ、ＣＩＦ−Ｂ、ＯＩＦ、アンジオゲニン、エンドセリン、肝細胞成長因子およびケラチノサイト成長因子を含むがそれらに限定されない成長因子を輸送するのに有用であり、創傷部位および成長因子間の延長された接触のための媒体を提供する。成長因子を補足したＴＳは、熱傷および他の皮膚創傷を治療するのに用いられ、ＴＳおよび、成長因子に加えて、抗生物質および／または鎮痛薬等を含むことができる。成長因子を補足したＴＳは天然または人工移植片（例えば、皮膚創傷用皮膚）の移植を助けるのに用いられる。また、成長因子を補足したＴＳは美容的に用いられてもよく（例えば、毛髪移植において）、ここでＴＳはＦＧＦ、ＥＧＦ、抗生物質およびミノキシジル、ならびに他の化合物を含有することができる。さらに、皺および傷跡を治療するのに、シリコンまたは他の化合物を使用する代わりに、本発明の組成物を美容的使用する。この態様において、例えば、ＴＳはＦＧＦ−１、ＦＧＦ−４、および／またはＰＤＧＦ、および脂肪細胞を含有する。該成長因子を補足したＴＳは外科創傷、骨折、または胃潰瘍および他のこのような内部創傷に、それらの治癒を促進するために適用することができる。例えば移植片が天然組織からなる場合のように、人工または天然移植片のいずれかを動物体内に組み込むのを助けるのに、本発明のＴＳを用いることができる。ある症状、例えば歯周炎、即ち持続性感染、骨吸収、靭帯損失および歯根膜ポケットの早発の上皮再形成を伴う主な問題の幾つかと戦うのに、本発明のＴＳを用いることができる。
【００６１】
別の態様において、本発明はＦＧ、ＤＢＭ、および／または精製ＢＭＰの混合物を提供する。この混合物は、身体の細胞成分をその内に移動させ、従って必要とされる所で骨誘導を生じさせるマトリックスを提供する。タンパク質（例えば、フィブリノーゲンおよびＸIII因子）、酵素（例えば、トロンビンおよびプラスミン）、ＢＭＰ、成長因子およびＤＢＭ、ならびにそれらの濃度の点から、該マトリックス組成物は適切に配合されて、側頭骨骨格構造の寿命および発生する必要のある骨誘導を最適化する。全てのＦＧ成分は生分解され得るが、骨誘導の間、新しく形成された骨の位置および形を決定できる小形にできない骨格を、該混合物は提供する。従って、軟組織の、骨の再建手術において問題である骨の偽関節欠乏への虚脱は避けられるであろう。後述の、軟骨発達を促進する、ＣＩＦ−ＡおよびＣＩＦ−Ｂのような成長因子を補足したＴＳの使用は、損失または損傷した軟骨および／または損傷した骨の再建において有用であるだろう。
【００６２】
好ましい態様において、有効濃度のＨＢＧＦ−１をＦＧに加えて、創傷治癒能力を有する成長因子を補足したＴＳを得る。別の好ましい態様において、有効量の血小板由来抽出物をＦＧに加える。他の好ましい態様において、有効濃度の少なくとも２つの成長因子の混合物をＦＧに加え、有効量の成長因子を補足したＦＧを創傷組織に適用する。
【００６３】
成長因子に加えて、ＤＢＭおよびＢＭＰが含まれるがそれらに制限されない、薬物、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびに他の化合物をＴＳに加えてもよい。これらは創傷治癒を促進し、感染、新形成、および／または他の疾患過程に抵抗し、またはＴＳ中の成長因子の活性を媒介または増強し、および／またはＴＳ中の成長因子の活性を阻害するＴＳ成分を阻害する。これら薬物には以下に挙げるものが含まれるが、それらに制限されない：テトラサイクリンおよびシプロフロキサシンのような抗生物質；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、タキソールおよび／またはタキソテールのような抗増殖／細胞毒性薬物；ガングシクロビル、ジドブジン、アマンチジン、ビダラビン、リバラビン、トリフルリジン、アシクロビル、ジデオキシウリジン、およびウイルス成分または遺伝子産物に対する抗体のような抗ウイルス物質；α−またはβ−またはγ−インターフェロン、α−またはβ−腫瘍壊死因子、およびインターロイキンのようなサイトカイン；コロニー刺激因子；エリトロポイエチン；ジフルカン、ケタコニゾールおよびナイスタチンのような抗菌類物質；ペンタミジンのような抗駆虫物質；抗α−１−トリプシン、抗α−１−キモトリプシンのような抗炎症薬；ステロイド；麻酔薬；鎮痛薬およびホルモン。ＴＳに加えてもよい他の化合物には以下に挙げるものが含まれるが、それらに制限されない：ビタミンおよび他の栄養添加物質；ホルモン；糖タンパク質；フィブロネクチン；ペプチドおよびタンパク質；炭水化物（単純および／または複雑の両方）；プロテオグリカン；抗アンジオゲニン；抗原；オリゴヌクレオチド（センスおよび／またはアンチセンスＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）ＢＭＰ；ＤＢＭ；抗体（例えば、感染物質、腫瘍、薬物またはホルモンに対する）；ならびに遺伝子治療試薬。遺伝的に変化させた細胞および／または他の細胞もまた、本発明のＴＳに含ませることができる。本発明の実施に用いることのできる骨誘導化合物には、以下に挙げるものが含まれるが、それらに制限されない：オステオゲニン（ＢＭＰ３）；ＢＭＰ−２；ＯＰ−１；ＢＭＰ−２Ａ、−２Ｂ、および−７；ＴＧＦ−β、ＨＢＧＦ−１および−２；ならびにＦＧＦ−１および−４。さらに、ＴＳを破壊しないいずれのものをも、本発明のＴＳに加えることができる。
【００６４】
本明細書中で報告する研究によって、ＦＧ中に遊離塩基ＴＥＴまたはシプロフロキサシンＨＣlのような化合物を含有させ、またはそれらによりＦＧをしょりすると、補足されたＦＧに延長された寿命を与えることが図らずも示される。この現象を利用して、ＴＳからの薬物放出期間を増加させることができる。別法として、この現象を利用して、ＦＧを安定化させるのに用いる化合物とは異なる、別の薬物の放出を調節でき（該薬物もまたＴＥＴ−ＦＧに組み込まれている）、および／またはインビボまたはインビトロでＦＧをより長期間持続させることができる。
【００６５】
一般に、水に溶解し難い形態の薬物（例えば、遊離塩基のＴＥＴ）は、その水に自由に溶解する形態よりも、ＴＳからの薬物の輸送を増加させる。故に、薬物をフィブリノーゲンまたは活性炭のような不溶性担体にＴＳ中で結合させて、補足されたＴＳからの薬物の輸送を延長させることができる。
別の態様において、補足されたＴＳは小器官中に用いることができ、例えばＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、およびＯＰ−１のような成長因子を含有することができる。
【００６６】
別の態様において、本発明は、水難溶性形態の抗生物質（例えば、遊離塩基型のＴＥＴ）および他の薬物の局所的輸送を促進する、ＴＳおよび有効濃度の少なくとも１つの不完全水溶解形態の抗生物質を含む組成物を提供する。
【００６７】
本発明は、以前に用いられたＴＳ組成物および方法より幾つかの点で有利である。最初の有利な点は、本発明の成長因子および／または薬物を補足したＴＳが理想的生分解可能な担体の多くの特徴を有すること、即ち、ヒト・タンパク質のみ含有して製剤化することができ、従って免疫原性問題および異物反応を排除するまたは最小限にできる；該組成物の投与は融通が効く；ならびに該組成物は宿主自身の自然のフィブリン溶解系によって分解するので、宿主細胞からの除去が必要でないことである。
【００６８】
第二の有利な点は、内部または外部創傷に、延長した期間、成長因子および／または薬物を有効に輸送する、良い方法を本発明は提供することである。幾つかの成長因子受容体は、最大の生物学的効果を生じるのに少なくとも１２時間占有されなければならないと現在信じられている。以前は、これを実行する方法がなかった。本発明は、成長因子およびその受容体間の延長された接触を生じさせ、従って強力な生物学的効果を生じさせる。
【００６９】
本発明の第三の有利な点は、動物細胞が本発明のＴＳ中におよびＴＳを通って移動することができ、ＴＳ中で成長できることである。これは隣接した組織および人工器官に細胞を移植するのを助ける。欧州で利用可能なＴＳの組成物に基づいて、それらの製剤を用いては不可能であると予想される。その代わり、動物細胞は市販のＴＳを分解するか周囲を移動しなければならない。欧州から市販ＴＳを米国へ輸入することは不法であるので（米国における該市販ＴＳの使用は、米国ＦＤＡによって許可されていない）、出願人はこれを容易に実証できない。
【００７０】
第四の有利な点は、最初の液体の性質のために、本発明のＴＳが、多くの以前から利用可能な輸送系よりも、より徹底的かつ完全に表面を覆うことができることである。成長因子を補足したＦＧは人工血管の内部、外部、および細孔を覆うであろうから、生物材料の被覆および人工血管の内皮形成における本発明の使用について、これは特に重要である。この結果、ＴＳ中におよびＴＳを通って移動する内皮細胞の能力に加えて、自己内皮細胞の移植が人工血管の全長に沿って起こり、それによって血栓形成および抗原性が減少するであろう。以前に用いられたＴＳの場合、人工血管の末端で移植を開始し、少しでもその内部に進行させ、従って血栓形成および抗原性をより長期間発現させた。また、人工血管に対して以前に用いられたＴＳは最初、身体に拒絶され得、人工器官を通過する血液の剪断力によって容易に洗い落とされ得る非自己細胞でシード（seed）された。
【００７１】
第五の有利な点は、本発明の補足されたおよび補足されないＴＳを成型することができ、従って殆どどんな所望の形でも注文して作ることができる。例えば、ＦＧのようなＴＳはＢＭＰおよび／またはＤＢＭを補足でき、最も適当に骨創傷を治療するのに必要とされる形に注文して作ることができる。ＤＭＢ粉末はその形を維持できないであろうから、ＤＭＢ粉末単独でこれを行うことはできない。
【００７２】
第六の有利な点は、ＴＥＴ−ＦＧのような本発明のＡＢを補足したＦＧが、補足しないＦＧに比べてＦＧの寿命および安定性を予想外にも増していることである。認知できる量のＡＢがＦＧ中にもはや残っていない後にさえ、この増加した安定性は継続する。例えば、遊離塩基ＴＥＴから生成したＴＥＴ飽和溶液中にか、またはＣＩＰ ＨＣl溶液中に新しく形成したＦＧ塊を浸すことによって、実質的に全部のＴＥＴまたはＣＩＰがＦＧ塊に残っている後にさえ保存されかつ安定であるＦＧ塊を生成する。この効果をどのようにして得られるかに関して、どんな理論によっても拘束されることを望まないが、ＴＥＴまたはＣＩＰのようなＡＢがＴＦＣ中にあるプラスミノーゲンを阻害し、ＦＧを破壊すると信じられている。プラスミノーゲンを一度阻害すると、その継続された阻害はＦＧ中に残っている認知できる量のＴＥＴまたはＣＩＰに依存しないと思われる。この安定化効果の結果、ＴＳの増加した貯蔵可能期間、および恐らくインビボにおける増加した持続性が期待できるであろう。
【００７３】
本発明の第七の有利な点は、ＴＳの延長された寿命および安定性の直接的な結果である。この予想外であるＴＳの安定性の増加の結果、薬物および／または成長因子の局所的な長い期間の輸送を得るために、ＡＢを補足したＦＧを用いることができる。ＴＥＴまたはＣＩＰのような安定化薬物が実質的にＴＳを去った後にさえ、この輸送は継続するであろう。従って、例えばＴＥＴまたはＣＩＰによって安定化されているＴＳ中に固体形態、好ましくは遊離塩基のような水に難溶性形態の薬物を包含させることによって、安定化したＴＳに薬物（または成長因子）を延長された期間局所的に輸送させることができる。遊離塩基ＴＥＴのような薬物の幾つかの形態は、ＴＳの安定化および延長された薬物輸送の両方を可能にする。他の薬物は両方でなくどちらか一方を可能にすることができる。出願人の知る限りでは、延長された局所的薬物輸送を得るのに、ＴＳを安定化させる化合物を用いた者は他にいない。
【００７４】
出願人の発明の第八の有利な点は、部分指向的血管形成がインビボで起こり得ることである。局所的非特異的血管形成が証明されているが［同上］、出願人の知る限りでは、部分指向的血管形成を示している者は他にいない。
【００７５】
本明細書に使用する場合、傷は生存器官中の任意の組織の傷害を含む。組織は、胃裏層または骨のような内部組織もしくは皮膚のような外部組織であり得る。
【００７６】
このような傷は、胃腸管潰瘍、折れた骨、腫瘍、および皮膚の切傷または擦傷を含み得る。このような傷は、脾臓のような軟組織または骨のような硬組織中であり得る。傷は、外傷性傷を含む任意の薬剤、感染または外科的介入によるものであり得る。
【００７７】
好ましい実施態様の記載
定義 
他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的語量は、本発明が属する技術分野の技術者により通常理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載の全ての特許および公開は、参照して本明細書に包含する。
【００７８】
本明細書に使用する場合、ＴＳは、傷に適用して、傷を封鎖し、それにより血液の流失を減少させ、止血を維持する物質または組成物である。本明細書に使用する場合、ＦＧは、組換体または血漿タンパク質から調整され、傷に適用して血餅を作り、それにより傷を封鎖し、血液の流失を減少させ、止血を維持する組成物である。ＦＧ、前掲はＴＳの１つの形である。
【００７９】
本明細書に使用する場合、補足ＴＳは、実質的な修飾なしで、成長因子、医薬または他の化合物、またはそれらの混合物を送達させる担体媒体として働くことができ、その粘性または吸着特性により、補足ＴＳが所望の作用、例えば傷治癒の促進を産生するのに充分な時間その部位に接触し続けることができる任意のＴＳを含む。
【００８０】
本明細書に使用する場合、成長因子補足ＴＳは、少なくとも１種の成長因子が、その決まった目的に有効な濃度で添加されている任意のＴＳである。成長因子は、例えば傷治癒または組織(再)生を加速、促進または改善できる。成長因子補足ＴＳは、医薬、抗体、抗凝固剤および：１）ＴＳ中の成長因子の生理活性を強化し、刺激し、または媒介する；２）シーラント中の成長因子の生理活性を阻害しまたは破壊するであろう成長因子補足ＴＳの成分の活性を減少させる；または３）ＴＳからの補足剤の延長した送達を可能にする；４）他の所望の特性を有する他の化合物を含む付加成分をまた含み得る。
【００８１】
本明細書に使用する場合、強化化合物は、ＴＳ中の成長因子の生理活性を媒介し、またはそうでなければ増加させる化合物である。ヘパリンは、ＨＢＧＦ−１の生理活性を強化する化合物の例である。
【００８２】
本明細書に使用する場合、阻害化合物は、ＴＳ中の成長因子(複数もある)の生理活性を妨害し、または阻害するＴＳの成分の有害活性を阻害し、妨害し、またはそうでなければ破壊する化合物である。阻害化合物は、成長因子を破壊から守ることによりその効果を働かせ得る。阻害化合物は、しかしながら、例えば成長因子補足ＴＳの傷治癒のような所望の目的の本質である任意の活性を阻害しない。阻害化合物の例はヘパリンである。
【００８３】
本明細書に使用する場合、成長因子は、細胞増殖、細胞分化、組織再生、細胞親和力、傷回復および／または任意の発育または増殖過程を制御または媒介する任意の可溶性因子を含む。成長因子は、当業者に既知の、天然源からの抽出、化学合成による製造、組換ＤＮＡ技術を使用した製造および、ウィルスで不活化した成長因子に富む血小板遊離を含む他の技術を含む好適な手段により製造し得る。成長因子の語は、任意の前駆体、変異体、誘導体または同様の生理活性を有する他の形、または、成長因子が由来するまたはそうでなければ遊離されるそのサブセットを含むことを意味する。
【００８４】
本明細書に使用する場合、内皮細胞成長因子(ＥＣＧＦ)およびＦＧＦ−１のような別の名前で当分野の技術者に知られているＨＢＧＦ−１は、ＨＢＧＦ−１αの前駆体であるＨＢＧＦ−１βまたはＦＧＦのような他の切断された形を含むＨＢＧＦ−１の任意の生理活性形を意味する。本明細書に参照して包含する米国特許第４,８６８,１１３号、ジェーヤら、はＨＢＧＦの各々の形のアミノ酸配列を明らかにする。ＨＢＧＦ−１は、したがって、ＨＢＧＦ−１の前駆体、切断または他の変形、生理活性を示すその変異体、またはそのサブセットを含む任意の生理活性ペプチドを含む。
【００８５】
他の成長因子は、また当業者に別の学名で既知である。したがって、本明細書で一つの名前で言及されている特定の成長因子は、当業者に知られている成長因子の他の名前をまた含み、またその生理活性誘導体、前駆体、切断変異体またはその他の変形を含む。
【００８６】
本明細書に使用する場合、生理活性は、インビボおよび／またはインビトロで特定の成長因子が関与する１個または全ての活性を意味する。一般に、成長因子は、分裂誘発活性(細胞増殖を誘発または持続する能力)を含む数個の活性、ならびに分化および／または発育を誘発または持続する能力を含む非分裂誘発活性を示す。加えて、成長因子は増殖および発育過程が進行する特定の細胞を集めまたは引き付けることができる。例えば、好適な条件下で、ＨＢＧＦ−１は内皮細胞を集め、そこからの血管形成を指示することができる。この活性により、成長因子補足ＴＳは、それにより特定部位への血流および栄養を促進する手段を提供する。
【００８７】
本明細書に使用する場合、延長された寿命は、ＴＳの有用な寿命が、少なくとも２倍伸びることが視覚的に観察できることを意味する。
【００８８】
本明細書に使用する場合、脱鉱物骨マトリックス(ＤＢＭ)は、骨が塩酸または他の酸により脱カルシウムされた後の器官マトリックスを意味する。
【００８９】
本明細書に使用する場合、骨形態形成タンパク質(ＢＭＰ)は、ＤＢＭの骨誘導抽出物の存在により本来同定されるタンパク質に関する群を意味する。少なくとも８種の関連メンバーが同定され、ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−８と呼ばれる。ＢＭＰはまた他の名前でも既知である。ＢＭＰ−２はまたＢＭＰ−２Ａとして既知である。ＢＭＰ−４はまたＢＭＰ−２Ｂとして既知である。ＢＭＰ−３はまたオステオゲニンとして既知である。ＢＭＰ−６はまたＶgr−１として既知である。ＢＭＰ−７はまたＯＰ−１として既知である。骨形態形成タンパク質は、ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−８を意味するが、これに限定されない。
【００９０】
本明細書で使用する場合、増加は、補足または非補足ＴＳに使用して、動物の体の成分の内部または外部表面外形を変化することを意味する。
【００９１】
本明細書に使用する場合、損傷を受けた骨は、折れた、砕けた、一部が欠けたまたはそうでなければ健康でない正常骨を意味する。
【００９２】
本明細書に使用する場合、不完全な骨は、その機能を実行するために不充分な形または容量の骨を意味する。
【００９３】
本明細書に使用する場合、ＴＳに補足するのに使用する骨またはＤＢＭは、粉末、懸濁液、細長い形または塊またはその所望の機能を行うのに必要な他の形であることができる。
【００９４】
本明細書に使用する場合、細胞小器官は、天然、人工または天然および人工要素の組み合わせからなり得、天然細胞小器官の機能の完全または一部を代替する。例は、インシュリン遺伝子を含有する発現ベクターを形質導入された細胞で囲まれている毛細管のネットワークからなる人工膵臓である。このような細胞小器官は、Ｉ型糖尿病の患者の血流中にインシュリンを遊離する機能をする。
【００９５】
補足ＴＳの製造 
本明細書に記載の本発明の任意の態様を実施する場合の第１工程として、補足物およびＴＳを選択しなければならない。補足物およびＴＳは当業者に既知の方法で製造し得、その供給者から購入し得、または本発明の方法により製造し得る。好ましい態様において、成長因子、医薬またはＤＢＭ補足ＦＧを製造する。
【００９６】
本発明の態様のいずれの場合も、補足剤は混合してＴＳを形成する前に、フィブリノーゲン、トロンビン、カルシウムおよび／または水成分に添加し得る。別法として、補足剤は、混合してＴＳを形成する成分に添加できる。
【００９７】
本発明の態様において、カルシウムおよび／またはトロンビンが、例えば傷中の体液から、内因性に添加され得る。
【００９８】
ＴＳの製造 
これに限定はされないが、血管プロテーゼのような本発明のある実施態様ならびに骨および軟骨増加において、細胞がその中および／またはそれを通して移動するＴＳが使用するのに好ましい。
【００９９】
商業的に入手可能なＦＧのような任意のＴＳが、本発明のある実施態様において使用し得る。例えば、当業者に既知のＦＧ(すべて本明細書に引用して包含する米国特許第４,６２７,８７９号；第４,３７７,５７２号；および第４,２９８,５９８号参照)は、イムノ・アクチエンゲゼルシャフト(IMMUNO AG)(オーストリア、ウィーン)およびベーリングヴェルケ・アクチエンゲゼルシャフト(BEHRINGWERKE AG)(ドイツ)のようなその供給者または製造者から購入できる。局所医薬伝達のようなこれらの使用において、選択したＴＳの特定の組成は、その機能が所望である限り重要でない。商業的に入手可能なＦＧは、インビトロ細胞増殖および／または分化；医薬伝達；成長因子伝達等のこれらに限定されないが、これらを含む本発明の態様における使用のために、成長因子、抗生物質および／または他の医薬を添加できる。
【０１００】
本明細書に例示した実験のために、ＦＧは新鮮凍結血漿由来の氷点沈殿物から製造した。使用したＦＧの成分は；フィブリノーゲン濃縮物；トロンビン；およびカルシウムイオンを含んだ。
【０１０１】
本発明の好ましい態様において、製造ＦＧ中の全タンパク質濃度は約０.０１から５００mg／ＦＧmlである。更に好ましい態様において、製造ＦＧ中の全タンパク質濃度は約１から１２０mg／ＦＧmlである。最も好ましい態様において、製造ＦＧ中の全タンパク質濃度は約４から３０mg／ＦＧmlである。
【０１０２】
本発明の好ましい態様において、ＦＧを製造するために使用するフィブリノーゲン濃度は、約０.００９から４５０mg／溶液mlである。更に好ましい態様において、本予備溶液中のフィブリノーゲンの濃度は、約０.９から１１０mg／mlである。最も好ましい態様において、本予備溶液中のフィブリノーゲンの濃度は、約３から３０mg／mlである。
【０１０３】
好ましい態様において、ＦＧを製造するために使用するトロンビンの濃度は、０.０１から３５０Ｕ／mlである。更に好ましい態様において、トロンビン濃度は１から１７５Ｕ／mlである。最も好ましい態様において、トロンビン濃度は２−４Ｕ／mlである。
【０１０４】
カルシウムイオン濃度が、トロンビンの活性化を可能にするのに充分であることが重要である。好ましい態様において、ＵＳＰ塩化カルシウム濃度は０−１００mMである。更に好ましい態様において、ＵＳＰ塩化カルシウム濃度は１−４０mMである。最も好ましい態様において、ＵＳＰ塩化カルシウム濃度は２−４mMである。本発明のある態様において、カルシウムは、例えば傷周辺態様のように組織または体液から供給され得る。
【０１０５】
ＴＳの製造において、注射用滅菌水を使用すべきである。
【０１０６】
成長因子、医薬および他の化合物の濃度は所望の目的に依存して変化するが、濃度はその決まった目標の達成するために有効であるのに充分多くなければならない。本発明の好ましい態様において、成長因子濃度は約１ng／ＦＧmlから１mg／ＦＧmlである。更に好ましい態様において、成長因子濃度は約１μg／ＦＧmlから１００μg／ＦＧmlである。最も好ましい態様において、成長因子濃度は約５μg／ＦＧmlから２０μg／ＦＧmlである。本発明の好ましい態様において、ＴＥＴまたはＣＩＰ濃度は、０.０１から３００mg／ＦＧmlである。本発明の更に好ましい態様において、ＴＥＴまたはＣＩＰ濃度は０.０１−２００mg／mlである。本発明の最も好ましい態様において、ＴＥＴまたはＣＩＰの濃度は１−１５０mg／mlである。添加すべき補足剤の量は、種々の濃度で試験し、意図される目的および適用部位に有効であるものを選択することにより当業者が経験上決定できる。
【０１０７】
成長因子の製造 成長因子、またはその混合物は、当業者に既知の任意の製造法により製造し得、または商業的に購入し得る。任意の成長因子は、例えば、内皮細胞、線維芽細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、肝細胞および角膜細胞のようなある細胞型の増殖を刺激するおよび／または引き付ける成長因子および／または同じ細胞型および平滑筋細胞の成育を阻害する成長因子を含むものから選択され得るが、これに限定されない。このような選択は成長因子補足ＴＳが適用される特定の組織部位および／または所望の作用の型に依存し得る。例えば、ＥＧＦ補足ＴＳが、眼の傷へのへの適用および胃潰瘍の治療に好ましいが、一方オステオゲニン補足ＴＳが骨折および骨破壊の治癒の促進に好ましいものであり得る。
【０１０８】
他の好ましい態様において、ＨＢＧＦ−１βを製造し、ＦＧに添加した。ＨＢＧＦ−１βまたはＨＢＧＦ−１αまたは任意の他のＨＢＧＦ−１の活性形は、天然源から、ＨＢＧＦ−１またはその誘導体を発現する遺伝的に製造した細胞から、または当業者の既知の方法により精製できる。
【０１０９】
ＨＢＧＦ−１βは、組換ＤＮＡ法(ジェーエら、米国特許第４,８６８,１１３号；ジェーエら、J.Biol.Chem.262:16612−16617(１９８７))を使用して製造した。簡単には、ＤＮＡコードＨＢＧＦ−１βを原核発現ベクター、ｐＵＣ９誘導体にクローン化し、細胞内的に大腸菌内で発現させた。発現ペプチドを、次いで細胞から、高圧−減圧サイクルで作用する細胞分裂器を使用して、圧力により細胞を遊離させた。分裂の後、細胞残骸を濾過して回収し、ヘパリンセファロース（登録商標）親和性クロマトグラフィー、続いてＣＭ−セファロース（登録商標）クロマトグラフィーを含む標準タンパク質精製法を使用して、上清からＨＢＧＦ−１βを精製した。
【０１１０】
上記のＨＢＧＦ−１に加えて、ＦＧに加え得る他の成長因子は、ＨＢＧＦ−２、ＩＧＦ−１、ＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α、任意の血小板由来成長因子または抽出物、ＢＭＰおよび任意の成長因子の混合物を含むが、これに限定されない。後えば、成長因子の豊富な源として働く血小板由来抽出物を、ＴＳに、ＨＢＧＦ−１のような他の成長因子に加えて、またはこれに代えて添加し得る。
【０１１１】
好ましい態様において、当業者に既知の任意の方法で製造した血小板由来抽出物を、ＴＳに加える。このような抽出物は、ＦＧと使用するために、血漿由来血小板から製造し得る。
【０１１２】
ＰＤＷＨＦは、製造し、ＦＧに加え得る(キングトンら、Ann. Surg. 204: 322-33O (１９８６))。簡単には、ＰＤＷＨＦを製造するために、血液を抗凝固溶液に入れ、血小板豊富血漿を冷却遠心により製造する。血小板を単離し、トロンビンで刺激し、それはα顆粒球内容物の内容物を遊離する。血小板を回収し、残りの抽出物の有効な濃度をＴＳに加える。
【０１１３】
成長因子補足ＴＳの付加成分 
それらが本質的に血漿フラクションであるため、成長因子と共に使用することを計画したＴＳは、種々の要素を含み、その中のいくつかは選択された成長因子の生理活性を妨げる。例えば、ＦＧの本質的な成分であるトロンビンは、タンパク質分解酵素として働き得、特異的にＨＢＧＦ−１βを開裂する。したがって、選択した成長因子を、成長因子の生理活性を阻害しまたは破壊するＴＳの他の成分の活性から守るプロテアーゼまたは他の阻害剤のような付加成分を含むことが必要であり得る。
特定の阻害化合物の選択は、ＴＳ内の成長因子の生理活性を評価する下記の方法により経験的に決定できる。生理活性の評価法は当業者に既知である。
【０１１４】
加えて、ある成長因子が生理活性を発現するために、所望の活性を促進または媒介する化合物を含むことが必要であり得る。例えば、ヘパリンはＨＢＧＦ−１の生理活性をインビボで促進する(例えば、ブルゲスら、Annu. Rev. Biochem. 58: 575-606 (１９８９)参照)。
【０１１５】
本発明の補足ＴＳは、医薬、他の化学物質およびタンパク質を含み得る。それらは：ＴＥＴ、シプロフロキサシン、アミノキシチリンまたはメトロニダゾールのような抗生物質、活性化タンパク質Ｃ、ヘパリン、プロストラサイクリン(ＰＧＩ2)、プロスタグランジン、ロイコトリエン、抗トロンビンIII、ＡＤＰアーゼのような抗凝固剤およびプラスミノーゲンアクティベーター；デキサメタゾンのようなステロイド、プロスタサイクリン、プロスタグランジン、ロイコトリエンの阻害剤および／または炎症を阻害するためのキニン；カルシウムチャンネル阻害剤のような心臓血管薬；ブピバカインのような局所麻酔剤；および５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)、タクソールおよび／またはタクソトレートのような抗増殖／抗癌剤を含み得るが、これらに限定されない。これらの添加化合物は、ポリクローナル、モノクローナルまたはキメラ抗体または機能的誘導体またはフラグメントをまた含み得る。それらは、例えばＰＤＧＦおよび／またはＴＧＦ−βのような平滑筋増殖、またはＴＳで処理する領域内または近くの他の望ましくない細胞型の増殖を阻害する抗生物質であり得る。これらの抗生物質は、抗癌、抗血小板または抗炎症活性が必要な場合、また有用であり得る。一般に、効果が部位直接的送達により改善された任意の抗生物質が、ＴＳ送達系と共に使用するのに優れている。
【０１１６】
成長因子補足ＴＳの傷治癒特性の評価のためのアッセイ 特定の成長因子補足ＴＳが、傷治癒を促進するか否かを確認するため、およびそれを行うのに最適な成長因子の濃度を選択するために、組成物を、当業者に既知の任意の方法で試験し得る(例えば、ツボイら、J.Exp.Med.172:245-251(１９９０)；クサンダーら、J.Am.Acad.Dermatol.22:781-791(１９９０)；およびグリーンハルら、Am.J.Path.136:1235(１９９０)参照)。インビボおよびインビトロアッセイの両方を含み、それによりＴＳ組成物中の選択された成長因子の活性が評価できる任意の方法を使用し得る。例えば、ＨＢＧＦ−１βの活性は、２個の別々のインビトロアッセイを使用して評価する。第１に、成長因子補足ＦＧで飽和したプラスチック表面で覆われた浅い液体層中に懸濁した内皮細胞の増殖を測定した。第２に、ＨＢＧＦ−１存在下の培養線維芽細胞の3Ｈ−チミジン取り込みを測定した。
【０１１７】
インビボアッセイとして、ＨＢＧＦ−１βを添加したＦＧで、マウスをモデル系として使用して、インビボ治癒促進能力を測定した。本方法において、同一のパンチバイオプシーをマウスの背面領域に作り、それを次いで試験群、処理対象群および未処理対照群に分けた。試験群マウスの傷は成長因子補足ＴＳで処理した。処理対照群のマウスの傷は、非補足ＴＳで処理した。未処理群の傷はＴＳで処理しなかった。傷治癒の進行が測定可能になった、一般に１週間から１０日後、マウスを屠殺し、傷組織を顕微鏡試験し、各々の群の傷治癒の程度を組織学的に評価した。
【０１１８】
成長因子補足ＴＳの細胞増殖誘発および細胞増加能力をまた当業者に既知のインビトロ法で評価した。例えば、成長因子の生理活性の測定について上記のおよび実施例に詳述のインビトロアッセイを、ＴＳ組成物内の成長因子の活性の試験に使用し得る。
【０１１９】
一般に、阻害および／または強化化合物の補足の必要性は経験的に決定できる。例えば、下記の実験において、ＨＢＧＦ−１補足ＦＧ中のＨＢＧＦ−１βは、特異的に確率的方法で開裂され、ＦＧ調整物の成分、ほとんどトロンビンは、応答可能であったことを示唆する。ＨＢＧＦ−１に結合し、あるタンパク質分解活性から守ることが知られているヘパリンを、ＨＢＧＦ−１補足ＦＧに加えた。相対的に低い濃度のヘパリンが、ＨＢＧＦ−１βをＦＧ中のその活性を破壊する開裂から守った。したがって、ＨＢＧＦ−１を含むＴＳ組成物は、ヘパリンまたはＨＢＧＦ−１をＦＧ中のトロンビンまたは他のタンパク質分解物質による開裂から守る他の物質を含み得る。
【０１２０】
同様に、ＴＳ成分による分解から成長因子を守る選択阻害剤の能力は、当業者に既知の任意の方法により評価し得る。例えば、ヘパリンの、ＦＧの本質的な成分であるトロンビンによるＨＢＧＦ−１の開裂阻害能力を試験する。このようにして、種々のヘパリン濃度の混同物およびＨＢＧＦ−１補足ＦＧを製造し、種々の時間インキュベーションした。混合物中のＨＢＧＦ−１の生理活性およびＨＢＧＦ−１の無傷さをＳＤＳゲルのウエスタンブロットを使用して試験する。相対的に低い濃度、約１：１モル比のヘパリン：ＨＢＧＦ−１が、ＨＢＧＦ−１をＦＧ中の分解から守るのに十分である。
【０１２１】
ある化合物が、ＴＳ中の成長因子の生理活性を強化、媒介または促進するのに使用できるか否かもまた経験的に決定できる。
【０１２２】
内部または外部傷への成長因子補足ＴＳの局所的または内部的適用 臨床的使用の前に、成長因子およびＴＳ、または成長因子補足ＴＳを滅菌し、またはそうでなければウイルスのようにそれに混入している任意の病原菌を不活性にする処理をする。混入物を不活性にする方法は当業者に既知であり、溶媒−界面活性剤処理および熱処理を含むが、これに限定されない(例えば、タボールら、Thrombosis Res.22:233:238(１９８１)およびピッツキウィッチら、Transfusion28:198-199(１９８８))。
【０１２３】
補足ＴＳは、直接、傷、他の組織または他の所望の位置に適用する。外傷で典型的には、傷の上部にスプレーすることを含む任意の手段で直接適用できる。手術中のように、内部にまた適用できる。骨のように、内部に適用する場合、血餅は段階的に経時的に溶解する。
【０１２４】
以下の実施例は説明の目的のみで包含されており、本発明の範囲を限定する意図はない。
【実施例】
【０１２５】
実施例１
ＦＧへの補足のためのＨＢＧＦ−１の製造 
ＨＢＧＦ−１βコード化ＤＮＡ含有プラスミドを含む組換大腸菌の培養８００mlを製造した。誘発および２４時間３７℃で培養した後、細胞を遠心し、上清を捨てた。細胞ペレットを０.１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.３含有２０mMリン酸緩衝液２５mlに再懸濁した。懸濁細胞を細胞分裂器で分裂し、５０００ｇ、２０分遠心して細胞残骸を残った溶液から分離した。
【０１２６】
ペレットを捨て、可溶性ＨＢＧＦ−１βおよび他の細菌性タンパク質を含む上清を２.６cm直径、１０cm高のヘパリン−セファロース（登録商標）カラム(ファルマシア・ファイン・ケミカルズ、スエーデン、ウプサラ)に導入した。カラムを５カラム容量の２０mMリン酸緩衝液、ｐＨ７.３中の０.１５Ｍ ＮａＣｌで洗浄し、２０mMリン酸緩衝液中の０.１５Ｍ ＮａＣｌから２.０Ｍ ＮａＣｌ勾配で溶出した。
【０１２７】
溶出液を２８０nmの吸光度で追跡した。ＵＶ吸収材料の３回のピークが溶出し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。ピーク番号３は、約１７,４００ダルトンの単一バンドとして電気泳動し、実質的に純粋なＨＢＧＦ−１βを含んだ。
【０１２８】
ＨＢＧＦ−１βが混入細菌性タンパク質を含まないか更に確認するために、成長因子活性を含むピーク番号３を一晩２０mMヒスチジン、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.５に対して透析した。タンパク質２mgを１ml ＣＭ−セファロース（登録商標）(ファルマシア、スエーデン、ウプサラ)イオン交換カラムに掛けた。カラムを１０ベッド容量(０.５ml／分)の２０mMヒスチジン、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.５で洗浄し、２０mMヒスチジン、ｐＨ７.５中の０.１５Ｍ ＮａＣｌから１.０Ｍ ＮａＣｌ勾配で溶出した。溶出液を２８０nmの吸光度で追跡しＨＢＧＦ−１βがＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で同定された。
【０１２９】
本精製ＨＢＧＦ−１を、続く実施例においてＦＧに補足するのに使用した。
【０１３０】
実施例２ 
ＨＢＧＦ−１の安定性 
ＦＧの成分であるトロンビンによるＨＢＧＦ−１βの分解(ロブ、Biochem.27:2572-2578(１９８８))を妨げ、または予防する成分をＦＧに加えることが必要であった。ＨＢＧＦ−１に吸収されるヘパリンを選択し、それがＨＢＧＦ−１をトロンビンおよび他のＦＧ中のタンパク質分解成分による分解から守ることができるか否かを試験した。増加させた濃度のヘパリン存在下でのＨＢＧＦ−１の安定性を評価した。
【０１３１】
ＨＢＧＦ−１β(１０μg／ml)、トロンビン(２５０Ｕ／ml)および増加した濃度のヘパリン(０、０.５、５、１０、２０および５０Ｕ／ml)を含む溶液を３７℃でインキュベーションした。アリコートを一定時間にインキュベーション溶液から回収し、凍結し、−７０℃で更なる試験のために保存した。
【０１３２】
インキュベーションが終了した後、サンプルを融解し、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で、ラミリ(Nature227:680(１９７０))の方法に従った還元条件下で分離した。ゲルをニトロセルロース上に電気ブロットし、ＨＢＧＦ−１に対応するバンドを、ＨＢＧＦ−１に対する親和性精製ポリクローナルウサギ抗血清を使用して同定した。ウエスタンブロットを図１に示し、それに１７,４００mwでＨＢＧＦ−１バンドを見ることができる。結果は、５Ｕ／ml程低い濃度のヘパリン存在下で、ＨＢＧＦ−１がトロンビンによる分解から保護されていることを示唆する。加えて、実施例３に記載のようにその生理活性は変わらなかった。
【０１３３】
実施例３ 
ヘパリンおよびトロンビン存在下でインキュベーションした後のＨＢＧＦ−１βの生理活性
実施例２に記載の、ヘパリン５Ｕ／ml含有インキュベーション混合物中のＨＢＧＦ−１の生理活性を、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞の3Ｈ−チミジン取り込みアッセイを使用して測定した。
【０１３４】
ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を９６ウェルプレートに挿入し、３７℃で、０.５％ウシ胎児血清(ＢＣＳ；ＧＩＢＣＯ、ニューヨーク、グランド・アイランド)含有ダルベッコ修飾培地(ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ、ニューヨーク、グランド・アイランド)中で飢餓条件下で、細胞が３０から５０％コンフルエンスに到達するまでインキュベーションした。２日後、サンプル由来の実施例２中で製造した種々の希釈のＨＢＧＦ−１を各々のウェルに培地を代えずに添加した。希釈剤(インキュベーション緩衝液)を成長因子の場所に、陰性対照として加え、成育のために必要な成長因子含有１０％ＢＣＳ含有ＤＭＥＭをＨＢＧＦ−１の場所に、陽性対照として加えた。
【０１３５】
３７℃で１８時間インキュベーションした後、０.２５Ｃｉの3Ｈ−チミジン、特異的活性６.７μＣｉ／molを各々のウェルに加え、インキュベーションを３７℃で更に４時間続けた。プレートをリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で濯ぎ、冷１０％トリクロロ酢酸(ＴＣＡ)０.５mmolで１５分、４℃で固定した。ＴＣＡを除去し、プレートをＰＢＳで濯ぎ、酸沈殿物質を０.１Ｎ 水酸化ナトリウム０.５ml／ウェルで、１時間室温で溶解させた。サンプルをシンチレーションバイアルに移し、シンチレーション液(ニューイングランド・ヌクリアー、アクアシュア（登録商標）)１０mlをバイアル当たりに加えた。
【０１３６】
図２に示す結果は、トロンビンおよびヘパリン存在下でインキュベーションしたＨＢＧＦ−１が生理活性を残していることを証明する。観察されたチミジン取り込み濃度依存性は、インキュベーション時間と別であり、典型的には成長因子濃度の関数として細胞増殖に依存することが予期された。成長因子は典型的には細胞増殖が最大で最適濃度を示す。
【０１３７】
トロンビンおよびヘパリン存在下でのＨＢＧＦ−１の生理活性はまたは内皮細胞増殖観察により測定した。ペトリ皿表面をＨＢＧＦ−１補足ＦＧで飽和した。
【０１３８】
内皮細胞の浅い層を加え、細胞数を測定した。経時的に細胞数が増加した。加えて、細胞は血管に組織化するように見えた。
【０１３９】
したがって、ＨＢＧＦ−１はその生理活性を、ＨＢＧＦ−１をトロンビンの分会活性から守り成長因子補足ＦＧ中のＨＢＧＦ−１活性を促進し得るヘパリンを含むＨＢＧＦ−ＩＦＧ中で残す。
【０１４０】
実施例４ 
ＦＧ血餅からのＨＢＧＦ−１分散 
ヘパリン１０Ｕ／mlおよびトロンビンおよび４０mM ＣａＣｌ2含有フィブリノーゲン複合体０.３mlを混合することにより、５mlプラスチック試験官内でＦＧ血餅を形成させた。４個の試験官は下記の通りである：
(Ａ)トロンビン０.５Ｕ／mlおよびＨＢＧＦ−１ １０μg／ml；
(Ｂ)トロンビン０.５Ｕ／mlおよびＨＢＧＦ−１ ５０μg／ml；
(Ｃ)トロンビン５Ｕ／mlおよびＨＢＧＦ−１ １０μg／ml；
(Ｄ)トロンビン５Ｕ／mlおよびＨＢＧＦ−１ ５０μg／ml。
【０１４１】
各々の血餅は、０.２Ｍヒスチジン緩衝液、ｐＨ７.３で覆った。重層緩衝液のサンプル３０μlを各々の管から２時間毎に回収し、ウエスタンブロットを行った。
【０１４２】
実験の結果は、血餅から分散したＨＢＧＦ−１が時間の関数および血餅中のその濃度の関数であり、血餅中のトロンビン濃度はＨＢＧＦ−１が血餅から遊離する速度に影響を与えないことを証明する。
【０１４３】
実施例５
成長因子補足ＦＧ中のヒト臍帯静脈内皮細胞の行動： 野生型および変異体ＦＧＦ−１の効果 
酸性線維芽細胞成長因子(ＦＧＦ−１)補足ＦＧのヒト内皮細胞におけるインビトロでの効果を研究するために、これらの細胞の懸濁液を、均等に広げた層のフィブリノーゲン約９mg／mlおよびトロンビン０.２５ＮＩＨ単位／ml含有ＦＧを含む２.５ml直径１０cmのペトリ皿に加えた。ＦＧを以下の方法で添加した：
(Ａ)成長因子補足せず；
(Ｂ)１００ng／ml、活性、野生型ＦＧＦ−１補足；
(Ｃ)１００ng／ml、不活性変異体ＦＧＦ−１補足；
(Ｄ)１０ng／ml、活性、野生型ＦＧＦ−１補足。
【０１４４】
ＦＧ層上に蒔いた細胞を７日間、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ中に維持した。
【０１４５】
細胞は、生理活性ＦＧＦ−１補足ＦＧに接触させた場合、効率良く伸長し、増殖する(図３および４)。非補足ＦＧ(図５)または生理的不活性ＦＧＦ−１補足ＦＧ(図６)と接触させた場合、細胞は伸長するが、増殖は相対的に遅い。
【０１４６】
実施例６
ＦＧＦ−１補足ＦＧ中のヒト臍帯静脈内皮細胞の行動 
その成長を研究するために、１mlあたり１０5またはそれ以上の細胞のヒト臍帯内皮細胞を、そのタンパク質濃度が４mg／mlであるＦＧに着床させた。ＦＧ中のトロンビンの濃度は０.６ＮＩＨＵ／mlに調整した。全実験に使用する培養培地は、１０％ウシ胎児血清、ストレプトマイシン１０μg／ml、ペニシリン１００Ｕ／ml、ＦＧＦ−１ １ng／mlおよびヘパリン１０Ｕ／ml添加Ｍ１９９(シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ＭＯ)であった。
【０１４７】
ＦＧ中２４時間以内に細胞は伸長し、多足形になり、互いに接触した場合、細胞ネットワークを形成した(図７)。この成長は少なくとも５日間続いた。図８は４８時間のこの状態を示す。
【０１４８】
対照として、同一細胞懸濁液をフィブロネクチン１０μg／cm2で覆った表面で培養した。対照細胞は敷石状形を獲得し、本形態を少なくとも５日保った。図９および１０はそれぞれ２４時間および４８時間のこの状況を示す。
【０１４９】
実施例７ 
ＦＧ中のＰＭＥＸＮＥＯ−３Ｔ３−２.２細胞の行動 
ＰＭＥＸＮＥＯ−３Ｔ３−２.２細胞は、遺伝子操作したタンパク質の発現が可能な修飾ゲノムを含む線維芽細胞である(フォローら、J.Biol.Chem.268:2960-2968(１９９３))。本細胞のＦＧ中での行動を測定するために、ウェル当たり１０5細胞を３種の条件下で培養した：(１)ＦＧ中；(２)ＦＧの表面；および(３)ＦＧの非存在下(対照)着床させた。実験を、２４ウェルプレートで、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地(シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ＭＯ)中で２個ずつ行った。ＦＧタンパク質濃度は４mg／mlであった。同様の実験において、１.５％ＦＢＳ添加媒体を陰性対照として使用した。
【０１５０】
１０％ＦＢＳ添加媒体の存在下、３群全ての細胞は成育し、コンフルエントになった。１.５％ＦＢＳ添加培地の陰性対照実験において、細胞は成育し、ＦＧ存在下で少なくとも５日生存したが、それなしではしなかった。しかしながら、成育は、１.５％ＦＢＳ添加よりも１０％ＦＢＳ添加ＦＧにおいて速かった。ＦＧ非存在下、１.５％ＦＢＦ添加培地において、細胞は４８時間以内に死滅した。生存の基準は、試験細胞の１０％ＦＢＳ添加新鮮培地に移した時の細胞の増殖する能力であった。
【０１５１】
実施例８ 
ＨＢＧＦ−１予備処理による伸長ＰＴＦＥ血管移植片の内皮細胞化 
２種の研究は、血液接触生体材料の内皮細胞(ＥＣ)マイトジェンによる予備処理は、内皮細胞化を促進することを証明した。第１の研究は、ウサギ大動脈に移植した伸長ＰＴＦＥ移植片に適応したＨＢＧＦ−１補足ＦＧ懸濁液のインビボ崩壊特性を試験した。第２の研究において、同様の移植片をイヌの大動脈狭窄部位に移植した。脈管形成因子であるＨＢＧＦ−１を研究に使用した。ＦＧＦ、ＦＧＦ−４および／またはＯＰ−１のような他の成長因子もまた血管移植片の補足剤として使用できる。
【０１５２】
Ａ.崩壊研究 
一般に、修飾ＦＧを、ヒト組み替え125Ｉ−ＨＢＧＦ−１の内部および外部移植片表面約１mg／cm2領域、ブタ腸粘膜ヘパリン２０μg／cm2、およびフィブリノーゲン２.８６mg／mlを、再組成した、商業的に入手可能なヒト・トロンビン(１０００Ｕ／ml)２.８６×１０-2Ｕ／mlに加えることにより滅菌的に調整し、重合を誘発した。
【０１５３】
125Ｉ−ＨＢＧＦ−１は、以下のようにして特異的に製造した。フィブリノーゲンは、２５mlＰＢＳ中にフィブリノーゲン５００mgを加え、フィブリノーゲン濃度２０mg／ＰＢＳmlを作ることにより再組成した。フィブリノーゲン６０mgを含有する本溶液３mlを、１２個のエッペンドルフプラスチック管に入れ、−７０℃に維持した。これらの各々のアリコートを個々に使用した。
【０１５４】
商業的に入手可能な製造物(アルモール・ファーマシューティカル・カンパニー、カンカキー、ＩＬ)を希釈することにより、滅菌溶液中１：１０の割合で、１０００Ｕ／mlの濃度でトロンビンを再組成し、１００Ｕ／mlの濃度を産生した。本トロンビン溶液を再び１：１０に希釈し、１０Ｕ／mlの溶液を産生した。
ウシヘパリン(アップジョン、カラマズー、ＭＩ)を、通常の食塩水を使用して１：１０００の割合で１０００Ｕ／mlの濃度の製造物を希釈することにより再組成した。
【０１５５】
再組成フィブリノーゲン １および４８／１００(１.４８)ml、再組成ヘパリン６３μL、加えて125Ｉ−ＨＢＧＦ−１１５.６６μＬをガラスシンチレーション管に混合した。本混合物を、次いで３mlプラスチックシリンジに吸引した。本再組成トロンビン５mlをガラスシンチレーション管中に入れた。
【０１５６】
伸長ＰＴＦＥ移植片の一端を、プラスチック３方向栓ノズル上におき、そこで２−０絹縫合糸で結んだ。次いで、ＰＴＦＥを３×３平方cmのパラフィン（登録商標）で包み、それを次いで直線止血鉗子出止め、防水性封印を確立した。第２の２−０絹縫合糸を、パラフィルムの栓への接合の上に行い、他の封印を形成した。直線止血鉗子を、次いで、ＰＴＦＥ／パラフィルムの２mmの末端を止めるのに使用した。
【０１５７】
等量のフィブリノーゲンおよびトロンビン溶液を上記のように調整し、混合して約３０秒反応させ、その時、重合化が起こった。トロンビン−重合化フィブリンは、次いで不透明である。（この時間因子は、概算であり、一つのトロンビンロットと他のでは異なる。重合化する時間の好適な長さは、混合物の不透明さを見ることにより決定できる。）フィブリン／トロンビン混合物を、次いで１ccのシリンジに吸引した。（注：本移植片の容量は０.４２mlであった。より多くの移植片の容量のために、より大きいシリンジの使用が必要である。）シリンジをコック栓に付け、混合物を手で５秒にわたって、液体がＰＴＦＥの割れ目から「露を結ぶ」ように見えるまで注入し、ＰＴＦＥとパラフィルムの間の領域を満たした。３方向栓ノズルをＰＴＦＥ移植片に対して３秒間閉め、コック栓上のＰＴＦＥの末端の結び目を切断するために、外科用メス刃を使用した。ＰＴＦＥ移植片／パラフィルムを栓から除き、パラフィルムエンベロープからＰＴＦＥを回収するのに止血鉗子を使用した。残った成長因子補足ＦＧを移植片腔管から除くために、３番目の塞栓カテーテルを、移植片腔管が完全に奇麗になるまで、移植片に５回通した。成長因子補足ＦＧ処理ＰＴＦＥ移植片を、一晩、約１２時間層流フード下で乾燥させた。処理移植片は、次いで処理移植片は移植の用意ができた。
【０１５８】
あるいは、本ＨＢＧＦ補足ＦＧを３４mm(２４mm＋両端５mm)×４mm(内部直径)の薄い壁で囲まれた、伸長ＰＴＥＦ移植片中へ圧還流し、それにより移植片腔管表面を覆い、移植片外部表面まで節を通って伸長させた。これらの移植片は、次いで２４匹の３−５kgニュージーランドホワイドウサギの腎臓下部腹部大静脈中に挿入した。第１の研究において、動物を屠殺し、標本を０時間(外科的操作による損失を訂正するため)および、５、３０および６０分、１、７、１４および３０日後に外移植した。残った放射活性をガンマ計数により決定した。自然崩壊を訂正した残った125Ｉ−ＨＢＧＦ−１を、ゼロ時間の値に対するパーセントで示す。
【０１５９】
125Ｉ−ＨＢＧＦ−１の崩壊は、循環の再確立を伴う急速初期損失(％／分＝−２４.１、５および６０分の間)、続く、一週間後の残り１３.４％±６.９％および３０日後の残り３.８％±１.１％である１時間後の遅延損失(％／分＝−０.０３)である古典的動態に従う。
【０１６０】
Ｂ．インビボ内皮細胞化実験 
第２の実験は、ＨＢＧＦ−１補足ＦＧ懸濁液の効果を次の項目について評価した:イヌ大動脈腸骨内へ移植され広範囲に膨張した６０μm節間距離の膨張ＰＴＦＥ移植片の内皮細胞化速度、時間の関数としてこれら内皮細胞の増殖活性、および観察された内皮細胞増殖を刺激するＨＢＧＦ−１およびＦＧの相対的貢献度。
【０１６１】
３群の５０×４mm非強化膨張ＰＴＦＥ移植片を１２匹のイヌの大動脈腸骨位置に移植した。群１(６匹)にヘパリン２０μg／cm2、２.８６mg／cm2フィブリノーゲンおよび２.８６×１０-2Ｕ／cm2ヒトトロンビン＋１ng／cm2ＨＢＧＦ-１を投与した。群２(３匹)には、ＨＢＧＦ-１を除き、同じＦＧを投与した。群３(３匹)には同じであるが、未処理対照移植片を投与した。トリチウム化チミジン(3Ｈ−Ｔdr:０.５μＣi／kg)を１０時間、移植前に注入した。移植片を７および２８日において、ランダム高出力磁場で内皮細胞増殖に関し光線および電子顕微鏡、第VIII因子免疫歴化学およびエン・フェース(en face)オートラジオグラフィーのために移植した。各移植片は、処理群移植片がどれであるかを知らない３人の観察者によって観察した。内皮細胞増殖の相異は、統計学的に２方法ＡＮＯＶＡおよび独立(independent)ｔ検定で分析した。
【０１６２】
７日において、ＦＧおよびＨＢＧＦ補足ＦＧ移植片の両者の３３％は、内皮細胞が非連続的病巣であることが証明された(図１１)。対照移植片の表面はフィブリン血塊のままであった。２８日において、すべてのＨＢＧＦ−１補足ＦＧは、広範にわたり毛細管内方成長と内皮細胞化支流血管の表面との接触が観察され、これらは他の２群のいずれの試験片でも観察されなかった(図１１および１２)。
【０１６３】
図１２が証明するように、未処理移植片(２８日)はその表面において数個の可視的な内皮細胞を有する(パネルＧ)。ＦＧ単独で処理した移植片は内皮細胞を被覆した表面３３％を有し、これは、ＦＧの単独処理がある種の再内皮化を促進することを示す(パネルＨ)。しかしながら、ＨＢＧＦ-１を補足したＦＧで処理した移植片(パネル１)は、内皮細胞を完全に(９５％以上)被覆しているようであり、これは、内皮細胞の敷石状形態を示す。すなわち、ＦＧにより誘導された成長因子の組合わせは、生きている非血栓形成性内皮細胞により血管移植片を実質的に完全に被覆することを促進することができる。エン・フェース・オートラジオグラフィは、他の全ての群(時間および移植片処理の関数)に対する、２８日でのＨＢＧＦ-１-補足ＦＧ移植片における3Ｈ−ＴdＲの内皮細胞ＤＮＡへの組み込みに関し、統計学的に有意な増加(p＜０.５)を示した。
【０１６４】
これらのデータが証明するように、ＨＢＧＦ−１補足ＦＧ懸濁液の節間距離６０膨張ＰＴＦＥ移植片への圧縮還流は毛細管内方成長および内皮細胞増殖の増加を介し内皮化を促進する。
【０１６５】
以上の実験は、小直径の血管移植片の自発的再内皮化および移植内皮細胞のより急速な合流を刺激する方法を向上させる。
【０１６６】
実施例９ 
ＦＧにより使用のための血小板由来抽出物の製造 
血漿減少血小板を調製し、ペレット化した。上清血漿を除去した。ペレット化した血小板を洗浄し、緩衝液(５０mＭヒスチジンおよび０.１５Ｍ塩化ナトリウム、pＨ６.５)中に懸濁し、ウシトロンビンで処理した。処理の後、上清を遠心で集め、アリコートを−８０℃で凍結した。抽出物を溶解し、ＦＧまたは他のＴＳと混合した。
【０１６７】
この方法で得られた血小板抽出物は生理学的に活性であった。なぜなら、それは、放射活性標識チミジンの増殖ＮＩＨ３Ｔ３のＤＮＡへの組み込みを、対照に比し、増加させるからである。
【０１６８】
血小板抽出物の傷治療に対する効果を評価するため、ＨＢＧＦ−１βで実施例１０以下で実施したと同じ実験を、糖尿病マウスで血小板抽出物を用い、行った。これらの実験結果から、血小板抽出物中の所定の低能度の成長因子(１つの傷あたり１００μg以上の用量の血小板抽出物蛋白)が傷抽出物の促進に使用する必要性が明白である。
【０１６９】
実施例１０ 
皮膚創傷治癒におけるインビボでのＦＧ（フィブリン膠）の効果 
材料および試験方法
Ａ．補足なしのＦＧ
実験動物
雌性Ｃ５７ＢＬ/ＫsＪ-db/dbマウスをジャクソン・ラボラトリーズ（Jackson Laboratories）［メイン州バー・ハーバー(Bar Harbor)］から入手したが、該動物は試験開始時において８〜１２週齢であった。マウスは、検体の保護促進のために外科処置後は別々のケージで飼育した。
【０１７０】
これらのマウスに見られる代謝異常が、ヒトの糖尿病患者の代謝異常と類似しているため、糖尿病患者における創傷治癒のモデルとして用いる。さらに、細胞浸潤が著しく遅いこと、肉芽組織が形成されること、および傷口が閉じるのに必要となる時間を特徴とするこのマウスモデルにおける創傷治癒から、ヒト糖尿病患者における創傷治癒との関連性が示唆されるといえよう。
【０１７１】
ＦＧ 
本試験に用いた濃縮フィブリノーゲン複合体（ＴＦＣ）は、新鮮な冷凍保存したヒト血漿から製造されたものである。このＴＦＣ製品［カリフォルニア州ロサンゼルスのアメリカン・レッド・クロス（American Red Cross）−バクスター・ハイランド・ディビジョン（Baxte rHyland Division）製］は凍結乾燥体で提供される。凍結乾燥体を３.３mlの滅菌水で還元した後の本試験で用いたＴＦＣ溶液のタンパク質特性は次のとおりである：総タンパク質１２０mg/ml；フィブリノーゲン９０mg/ml；フィブロネクチン１３.５mg/ml；ＸＩＩＩ因子１７Ｕ/ml；およびプラスミノーゲン２．２μg/ml。
【０１７２】
ウシトロンビン［５００ユニットバイアル，イリノイ州カンカキーのアーマー・ファーマシューテイカル・カンパニー（Armour Pharmaceutical Co.）製］を５mlの滅菌水で再構成し、８０ｍＭの塩化カルシウム溶液［ニューヨーク州シャーリーのアメリカン・リエージェント・ラボラトリーズ（American Reagent Laboratories）製］で滅菌的に希釈し、濃度を１５Ｕ/mlにした。
【０１７３】
等体積のＴＦＣと再構成トロンビンを混合してＦＧを製造した。直径６mmの円い全厚（フル・シックネス）創傷をふさぐために、０．０５mlのＴＦＣを０．０１５mlのトロンビンと混合した。このように製造されたＦＧのタンパク質濃度は約６０mg/mlであった。
【０１７４】
タンパク質濃度を約１mg/mlに希釈したＦＧも用いた。
【０１７５】
外科処置 
マウスに、７mlのケタミン塩酸塩［１００mg/ml；Ketaset，アイオワ州フォート・ドッジのアヴェコ・カンパニー（Aveco Company）製］、３mlのキシラジン［２０mg/ml；Rompun，カンザス州シャウニーのモベイ・コーポレイション(Mobey Corp.)製］および２０mlの生理的食塩水の混合液を、体重１００g当たり０．１mlの投与量で筋肉内投与して麻酔した。背中の毛を刈り込み、皮膚をポビドン−ヨウ素溶液で洗浄し、７０％アルコール溶液で拭いた。２つの全厚の円い外科的創傷（直径６mm）を、マウスの背中の下部の両側に、それぞれ中心線から等距離の位置に作成した。２つの創傷の中央端部が、少なくとも１．５cmの非創傷皮膚部分で分離されているように創傷を作成した。
【０１７６】
創傷作成後すぐに、ＦＧおよび／または包帯（dressing）で該計画的創傷を覆った。包帯は透明な半透性の接着性ポリウレタン包帯［商品名：オプサイト（Opsite），オハイオ州マシロンのスミス・アンド・ネフュー（Smith and Nephew）製］を用いた。包帯の適用前に、創傷領域の周囲にベンゾイン化合物のチンキ剤[ミネソタ州ミネアポリスのパドック・ラボラトリーズ(Paddock Laboratories)製]を塗布した。ベンゾインによって傷口に炎症が生じる可能性を回避するために、創傷の縁から少なくとも０.５cmはチンキ剤を塗布しない領域を設けた。試験期間中、創傷に対して、もうこれ以上の処置は行わなかった。
【０１７７】
処置グループ 
マウスは４つのグループに分けて処置を行い、それぞれその個体自身を対照と設定した。
グループＩ：実験動物の創傷のうち、一方にＦＧ（６０mg/ml）を処置し、他方には何も処置をしなかった。両方の創傷をオプサイトで覆った。
グループII：創傷の一方に希ＦＧ（１.０mg/ml）を局所的に処置し、他方には何も処置をしなかった。両方の創傷をオプサイトで覆った。
グループIII：創傷の両方にＦＧ（６０mg/ml）を局所的に処置した。創傷の一方は何も覆いをせず、他方はオプサイトで覆った。
グループIV：両方の創傷に対して何も局所的処置をしなかった。創傷の一方は何も覆いをせず、他方はオプサイトで覆った。
【０１７８】
創傷の分析 
試験の９日目に実験動物を安楽死させた。０.５mmの非創傷皮膚も含めて、創傷を筋肉層まで切開し、緩衝１０％ホルマリン溶液に浸けた。組織学研究室にて標本を加工した。標本をパラフィンに埋め込み、創傷の中間部分を５μm毎に切断した。組織学的分析のために、ヘマトキシリンおよびエオシン、またはマッソンのトリクロム液を用いてスライドを染色した。
【０１７９】
各スライドに１〜１５までの組織学的評点を付与した（表１）。１は全く治癒しなかったに相当し、１５はコラーゲン繊維からなる瘢痕が生じたことに相当する。評点のスケールは既存のものを用いた。既存の評価基準に変更を施し、上皮形成、細胞侵入の度合、肉芽組織の形成、コラーゲン沈着、血管分布および創傷収縮の程度をさらに正確に反映するようにした。組織学的評点は、少なくとも３名の分析者が別々に付与した。創傷の治療結果を描写するコードは、全部の観測者の評点付与が完了してから解読した。
【０１８０】
【表１】
2006297130.tif 000002
【０１８１】
統計的分析 
分析者の組織学的評点を平均し、平均値±その標準誤差で表した。１対ｔ試験を用いて、異なる処置グループにおける１対平均を比較した。分析は、ＲＳ／１ リリース３.０統計ソフトウェアパッケージ［ＢＢＮソフトウェア・プロダクツ・コーポレイション製］を用いて行った。
【０１８２】
サンプル平均の差を試験するためにスタティスティカル・アナリシス・ソフトウェア（ＳＡＳ）システムを用いて変動を分析した。
【０１８３】
結果
結果創傷のふさがりにおけるＦＧの効果（グループＩ）
グループＩでは、各マウスの両方の創傷をオプサイトで覆った。このような条件下で、タンパク質濃度６０mg/mlのＦＧを片方の創傷のみに局所適用すると、ＦＧ処置側で（３.０６）、非処置側で（５.２６）と統計的に低い平均組織学的評点となった（Ｐ＜０.００５）（表２）。
【０１８４】
【表２】
2006297130.tif 000003
【０１８５】
創傷のふさがりにおける希ＦＧの効果（グループII） 
このグループでは、両方の創傷をオプサイトで覆い、片方の創傷に希ＦＧ（タンパク質含量１mg/ml）の局所適用を行った結果、非処置の創傷の平均組織学的評点（４.３６）と有意には異ならない値（４.０）が処置創傷において得られた（Ｐ＝０.１７）（表３）。
【０１８６】
【表３】
2006297130.tif 000004
【０１８７】
ＦＧ処置創傷におけるオプサイトの効果（グループIII） 
両方の創傷にタンパク質濃度６０mg/mlのＦＧを処置したこのグループでは、片方のみオプサイトを適用した結果、オプサイトで覆わなかった創傷の平均組織学的評点（４.９３）と有意には異ならない値（４.２）が、オプサイト適用創傷において得られた（ｐ＝０.１１）（表４）。
【０１８８】
【表４】
2006297130.tif 000005
【０１８９】
１対の非処置創傷のふさがりにおけるオプサイトの効果（グループIV） 
両方の創傷にＦＧの局所的処置を行わないこのグループでは、片方のみオプサイトを適用した結果、オプサイトで覆わなかった創傷の平均組織学的評点（６.３１）よりもかなり低い値（４.９２）が、オプサイト適用創傷において得られた。（Ｐ＜０.０００５）（表５）。
【０１９０】
サンプル平均の差における処置効果のＡＮＯＶＡは、＜０.０００１において有意であった。
【０１９１】
【表５】
2006297130.tif 000006
【０１９２】
論考 
本試験の結果から、マウスにおいて開口した創傷に適用した場合、（１）止血用に製剤された濃度（６０mg/ml）のＦＧを処置すると、９日目における組織学的評点は低く、すなわち非処置の創傷の治癒速度よりも治癒速度が遅いこと；（２）タンパク質濃度（１mg/ml）の希ＦＧを処置すると、９日目における組織学的評点は高く、すなわちこれによって治癒速度が速められること；および（３）この動物モデルにおいては、半透性包帯オプサイトの適用は、それ自身単独で創傷のふさがりを非常に妨害するものであることが示された。
【０１９３】
ＦＧを用いた試験の結果を比較する場合、ＦＧの総タンパク質濃度は重要な変数である。創傷治癒および組織修復の促進におけるフィブリンの優れた効果が報告されているが、本試験では、通常市販製剤におけるフィブリノーゲン濃度よりも低濃度のフィブリノーゲンを用いた。
【０１９４】
濃度６０mg/mlのＦＧは創傷のふさがりを遅らせた（グループＩ）。ヨーロッパで市販されているＦＧの総タンパク質濃度は、フィブリノーゲンとトロンビン成分とを混合した後では、３７.５〜５７.５mg/mlである。この試験で得られたデータは、現在、止血および接着用製剤として製剤化されているＦＧが開口性の皮膚創傷に適用した場合、その治癒を遅らせることを示すものである。この効果は、（１）創傷治癒過程に積極的に関係している細胞成分の移動あるいは増殖に対する機構的妨害、（２）創傷収縮の機構的阻害、または（３）１つ以上のＦＧ成分による創傷治癒上の化学的阻害効果によるものであろう。９日目において固体フィブリノーゲン由来の血餅が創傷表面に残っていることから、創傷のふさがりに対する機構的妨害および阻害の方が、治癒を遅らせることに対して、より実際性の高い説明であろう。
【０１９５】
これが原因であるかどうかを審査するために、ＦＧの総タンパク質濃度を１mg/mlに希釈した。この希ＦＧの局所的適用からは、非処置の創傷と余り異ならない組織学的評点が得られた(グループII)が、このことは、総タンパク質濃度が低いと、創傷治癒過程を有意であるほどには阻害しないことを示唆している。
【０１９６】
同じ濃度のＦＧ（６０mg/ml）で処置され、かつオプサイトで覆われた創傷であって、異なる処置グループ（グループＩおよびIII）に属する創傷の平均の組織学的評点が有意に差がある値である（グループＩでは３.０６、グループIIIでは４.２）ことも注目に値する。これらのデータは、幾らかの動物が、同じ処置を受けたにもかかわらず、他の動物よりも治癒が速かったり遅かったりするために、動物個体間の変動が、同じ処置変数をもつある動物群から明確な結論を導くのを困難にすることを示している。このことは、平均評点の標準誤差の範囲に反映される。このような理由で、各動物はそれ自身を対照とするのであり、たとえば同じ動物における創傷を相互に比較した。試験創傷として、同じ動物に対照となる創傷があることによって、動物個体間の変異性は最小化される。これらのデータはまた、オプサイトなどの接着性包帯が創傷のふさがりを有意に遅らせることも示している。しかし、ブタにおける部分的（partial）厚み皮膚創傷では、ＦＧのタンパク質濃度が、創傷治癒速度に関係するとは考えられないことにも注意すべきである。
【０１９７】
Ｂ．インビボでの創傷治癒における成長因子を補足されたＦＧ 
糖尿病マウスの創傷修復速度におけるＨＢＧＦ−ＩＢ成長因子補足ＦＧの効果を評価した。この試験に用いた方法は前記の試験と全く同じである。６匹の試験マウスの背中に２つの直径６mmの全厚皮膚バイオプシーを施し、５μgのＨＢＧＦ−１βを加えたＦＧを満たした。６匹のマウスにおける同一のバイオプシーには処置を行わず、６匹の対照マウスのバイオプシーにおいては、補足なしのＦＧを満たした。９日後、すべてのマウスを屠殺し、各創傷および周囲の皮膚からなる厚さ５ミクロンの組織学的プレパレーションを製造し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。各サンプルにおける創傷修復の程度、処置グループについては、どのグループ由来かは同定せずに、それぞれ３人の熟練した分析者が、ブラインドで評価をおこない、コラーゲン沈着、上皮形成、肉芽組織の厚みおよび炎症細胞，繊維芽細胞の密度ならびに血管分布を審査した。各サンプルに対して１〜１５の評点を付与した（修復なし〜完全修復）。補足なしのＦＧで処置した創傷からのサンプルは、一貫して低めの評点を付与され、非処置創傷または成長因子補足ＦＧで処置された創傷からのサンプルは、高い評点を付与された。
【０１９８】
実施例１１
インビボ系における骨誘導物質の運搬ベシクルとしてのＦＧ材料及び方法
フィブリンシーラント 
濃ヒトＴＦＣ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｙｌａｎｄ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｓａｎ Ｐｅｄｒｏ ＣＡ）及びヒトトロンビン（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｙｌａｎｄ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｇｌｅｎｄａｌｅ，ＣＡ）をスクリーンされた、凍結したばかりのプールされた血漿から米国赤十字のために製造した。それらの製造中、両方の成分は溶媒洗浄方法（ニューヨーク血液センター）を用いるウイルス不活性化を行い、凍結乾燥の形態で供給された。無菌水（３.３ｍｌ）を用いて再構成後、ＴＦＣ溶液の蛋白特性は以下の様であった。総蛋白＝１２０ｍｇ／ｍｌ；フィブリノーゲン＝９０ｍｇ／ｍｌ；フィブロネクチン＝１３.５ｍｇ／ｍｌ；因子ＸIII＝１７Ｕ／ｍｌ；及びプラスミノーゲン＝２.２μｇ／ｍｌ。
【０１９９】
ヒトトロンビン（１０００Ｕバイアル）を無菌水（３.３ｍｌ）を用いて再構成し、続いて４０ｍＭ塩化カルシウム溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｇｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｈｉｒｉｅｙ，ＮＹ）中に希釈して濃度を１５Ｕ／ｍｌとした。ヒトトロンビンを頭蓋冠の損傷上に置いた埋め込まれたディスクを調製するために使用した。
【０２００】
局所用牛トロンビン（５０００Ｕバイアル、Ａｒｍｏｕｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｋａｎｋａｋｅｅ，ＩＬ）を無菌水（５ｍｌ）を用いて再構成し、４０ｍＭ塩化カルシウム溶液中に希釈して濃度を１５Ｕ／ｍｌとした。牛トロンビンを筋肉内バイオアッセイのためのインプラントを調製するために使用した。
【０２０１】
本発明の態様を実施する場合にフィブリノーゲンは１から１２０ｍｇ／ｍｌＦＧの濃度で存在しなければならず、より好ましくは３から６０ｍｇ／ｍｌＦＧ、最も好ましくは１０から３０ｍｇ／ｍｌＦＧの濃度で存在しなければならない。ＤＢＭは約１から１０００ｍｇ／ｍｌＦＧ、より好ましくは５０から５００ｍｇ／ｍｌＦＧ、最も好ましくは３００から５００ｍｇ／ｍｌＦＧの近似濃度で存在しなければならない。決定された骨粉末のサイズは０.０１から１０００ミクロン、好ましくは２０−５００ミクロン及び最も好ましくは７０−２５０ミクロンでなければならない。骨誘導成長因子（群）又はＢＭＰ群は約１から１００μｇ／ｍｌの濃度で存在しなければならず、その濃度は所望の目的を達成するために効果的である。この態様において骨誘導物質として使用してもよい成長因子には以下のものが含まれるがそれらに限定されない：オステオゲニン（ＢＭＰ３）；ＢＭＰ−２；ＯＰ−１；ＨＢＧＦ−１；ＨＢＧＦ−２；ＢＭＰ２Ａ，２Ｂ及び７；ＦＧＦ−１；ＦＧＦ−４；及びＴＧＦ−β。骨修復における利用のためのＴＳを補うために抗生物質などの薬を追加して使用できる。
【０２０２】
インプラント調製 
ラットＤＢＭを以下の様に調製した。ラットの長い骨の骨端を後ろに骨幹のみを残して除去した。必要ならば骨幹を裂き、次に骨髄を脱イオン化水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ 水精製システム（登録商標）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅコーポレーション、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて徹底的に洗い流した。次に骨幹を室温にて洗浄した。４℃において脱イオン化水１０００ｍｌを骨１００ｇに加えた。この混合物を３０分間攪拌し、水を捨てた。このステップを２時間繰り返した。
【０２０３】
４℃において、冷無水エタノール（１リットル）（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌコーポレーション、Ｕ.Ｓ.Ｉ．Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｔｕｓｃｏｌａ，ＩＬ）を骨各１００ｇに加えた。１５分間攪拌後、エタノールを捨てた。これを計１時間の持続期間において４回繰り返した。
【０２０４】
フェームフード下、ジエチルエーテル（５００ｍｌ）（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ Ｃｈeｍｉｃａｌｓ，Ｐａｒｉｓ，ＫＹ）を骨に加えて骨を覆った。これを１５分間穏やかに攪拌し、次にエーテルを捨てた。骨にさらにエーテル５００ｍｌを加え、この混合物を１５分間攪拌した。エーテルを再度捨てた。発生するエーテルの蒸発用のフェームフード下に骨を残した。脱脂した骨は超低温フリーザー（−１３５℃）中に無期限に保管できる。
【０２０５】
次に骨を粉砕して骨粉末とした。この粉末をふるいにかけて７４から４２０ミクロンサイズの粒子を集めた。
【０２０６】
この骨粉末の１０グラムを遠心管（２５０ｍｌ）に入れた。泡立ちを避けるために各々の管に０.５ＮＨＣｌ（８ｍｌ）をゆっくり加えた。次に各々の管の内容物を穏やかに攪拌した。１５分後、各々の管に追加の０.５ＮＨＣｌ（１００ｍｌ）を１０分かけて加えた。次にこの管を穏やかにさらに３５分間攪拌した。
【０２０７】
この粉末がＨＣｌ中にある総時間は１時間を越えなかった。
【０２０８】
次に各々の混合物を４℃において３０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。
【０２０９】
次に上清のｐＨを調べた。もしもｐＨが２よりも大きければ、ペレットを妨害せずに、化学シンクに注いだ。ｐＨが２より小さい場合には、上清を有害廃棄容器に注いだ。ペレットが失われた場合には遠心分離時間を３０分に増加した。上清のｐＨが０.５Ｎ ＨＣｌと等しくなるまでこれらのステップを繰り返した。
【０２１０】
次にペレットを攪拌によって脱イオン水（１８０ｍｌ）を用いて洗浄し、一様な懸濁液を得た。次にこの懸濁液をさらに１５分間遠心分離した。次にこの上清を以前の様にデカントした。上清のｐＨが脱イオン水のｐＨと等しくなるまで、この洗浄を繰り返した。
【０２１１】
次にペレットをフリーザー中で−１８０℃にて凍結した。次に標準的手順を用いてそれらを凍結乾燥した。
【０２１２】
１ｍｍ厚及び８ｍｍ直径のディスク型インプラントを４片のアルミニウム型を用いて製造した（図１３）。ラットＤＢＭ粉末（２５ｍｇ）を型の穴に入れた。
【０２１３】
次にＴＦＣ（３０μｌ）をＤＢＭの上にピペットでおき、ＤＢＭが全溶液に取り込まれるまで混合した。使用したＴＦＣの濃度は１０、２０、４０、８０又は１２０ｍｇ／ｍｌであった。次にトロンビン溶液（３０μｌ）（４０ｍＭ塩化カルシウム中１５Ｕ／ｍｌ）をＤＢＭ−ＴＦＣ複合体に加え、混合し、ピストン形態のふたを用いてディスク型に圧縮した。ＤＢＭ粉末２５ｍｇが２０μｌの体積を有することが決定された。ＤＢＭがＦＧに添加された後、最終蛋白濃度は以下の様であった：
【０２１４】
【表６】
2006297130.tif 000007
【０２１５】
ＤＢＭのみ又はＦＧのみ（４，８，１５及び４５ｍｇ／ｍｌ総蛋白濃度）からなるディスクインプラントを同じ型を用いて同様に製造した。
【０２１６】
ＤＢＭ（５０ｍｇ）をアルミニウムの型に注ぎ、次にＴＦＣ（６０μｌ）をこのＤＢＭに加え、十分取り込まれるまで混合した。次にトロンビン（６０μｌ）をこのＤＢＭ−ＴＦＣ複合体に加えて混合し、ピストン形態のふたを用いて直径１ｃｍ及び厚さ２ｍｍのディスク型に圧縮した。次にこのディスクを手動で所望の型（三角、四角又はドーナツ形）に切り抜いた。
【０２１７】
筋肉内バイオアッセイ実験のために、７０ミクロンのメッシュサイズを有し、１ｃｍ×１ｃｍの大きさである無菌のナイロン袋にインプラントを入れた。
【０２１８】
動物 
雄のＬｏｎｇ−ＥｖａｎｓラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手した。筋肉内バイオアッセイのために２８から３５日齢のラットを使用した。３カ月齢のラットを開頭術実験のために使用した。
【０２１９】
手術 
塩酸ケタミン（１０ｍｌ）［ベタラー（Ｖｅｔａｌａｒ）、１００ｍｇ／ｍｌ，Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ，Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ］及びキシラジン（５ｍｌ）［ロムプン（Ｒｏｍｐｕｎ）、２０ｍｇ／ｍｌ、Ｍｏｂａｙコーポレーション、Ｓｈａｗｎｅｅ，ＫＮ］及び生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）からなる混合物を用いて、体重１００グラム当たり０.１ｍｌ用量にて筋肉内投与することにより動物を麻酔した。動物の手術部位を７０％アルコール溶液を用いて、その後ポビドン−イオジン溶液で準備した。その後、無菌技術を用いて手術手順を行った。
【０２２０】
筋肉内バイオアッセイ。中線腹切開を行い、平滑切開を用いて胸筋の間にスペースを作った。デザインされた実験物質を含むナイロンエンベロープを筋肉内のスペースに挿入し、３−０ Ｄｅｘｏｎ縫合を用いて固定した（図１４）。次に反対側面において同じ手順を繰り返した。次にステープルを用いて皮膚を閉じた。４週間後にインプラントを採集し、ｘ線にかけて組織学用の準備をした。
【０２２１】
ディスク型インプラントを無作為に配置し、それらは以下のものを含んでいた：ＤＢＭのみ（ｎ＝１２）；種々の濃度のＦＧのみ（４ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝１４；８ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝３；１５ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝３；及び４５ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝１２）及びＤＢＭ−ＦＧ複合体（４ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝１２；８ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝１２；１５ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝１２；及び４５ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝１２）。四角の、三角の及びドーナツの形のインプラントが各々４つあった。
【０２２２】
開頭術手順。 鼻の骨から中央矢状縫合稜へ線状切開を行った。柔らかい組織を穏やかに折り返して骨膜を開頭術部位（後頭の、前頭の、頭頂部の骨）から切開した。必要に応じて豊富な食塩水潅注を用いた遅い速度の回転ハンドピースの中でトレフィンを用いて８ｍｍの開頭術を調製した。頭蓋冠ディスクを切開してはずし、その間、硬膜の穿孔及び上位矢状縫合洞貫入を避けた。この８ｍｍの頭蓋冠の傷は対照として処理を行わないで放置するか又は１×８ｍｍＤＢＭ又はＤＢＭ−ＦＧディスクを詰める（図１５）。次に皮膚を皮膚ステープルで閉じた。
【０２２３】
手術後、各々のラットを耳のパンチにより識別し、ケージに戻し、そこで２−３時間の以内を歩行させた。
【０２２４】
第１のセットの頭蓋冠のインブラントはＤＢＭのみ（２５ｍｇ，ｎ＝３）又はＦＧマトリックス中のＤＢＭ（１５ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝２，３０ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝３；及び４５ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝３）からなり、２８日後に回収した。第２のセットの頭蓋冠のインプラントはＦＧマトリックス（３０ｍｇ／ｍｌ）中のＤＢＭ（２５ｍｇ）からなり、手術後の種々の時間（２８日、ｎ＝１０；３カ月、ｎ＝９；及び４カ月、ｎ＝５）に回収した。
【０２２５】
インプラントの回収 
指定された時間にラットを二酸化炭素室中で安楽死させた。実験受容体床（すなわち、大胸筋又は頭蓋冠）の周囲にて皮膚を切開し、柔らかい組織を受容体床から折り返した。オルトトピックの部位において、３−４ｍｍの隣接する骨を有する開頭術を正面−後頭−頭頂複合体から回収した。ヘテロトピックの部位において鋭い平滑な切開が、埋め込まれたナイロンエンベロープを回収するために用いられた。
【０２２６】
ラジオグラフィー 
このインプラントを、Ｘ−ＯＭＡＴＬ（登録商標）高コントラストのコダックｘ線フィルム（イーストマン コダックカンパニー、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を用いて、Ｍｉｎｉｓｈｏｔ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｃａｂｉｎｅｔｘ線システム（ＴＦＩコーポレーション、Ｗｅｓｔ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）中、３０ｋｖｐ、３Ｍａ及び１０秒においてラジオグラフィーを行った。灰色レベルの濃度の筋肉内及び開頭術部位のラジオグラフィーをケンブリッジ９２０像分析システム（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，ケンブリッジ、英国）を用いて分析した。
【０２２７】
組織学的分析 
回収された標本（柔らかい及び硬い組織）を直ちに保存液の入った適切にラベルされたバイアルに入れ、組織学処理を行った。組織学の標本は頭頂の直径を通って４.５ミクロメーターの厚さの切片であった。各々の受容体部位に対してヘマトキシリン及びエオジン染色を用いて１つの切片を調製した（細胞及び基質の細部のフォトマイクログラフィー及び試験のために）及びもう１つの切片はフォン・コッサ染色を用いて調製した。
【０２２８】
結果
筋肉内プラントのラジオグラフィー 
すべてのＤＢＭディスクは放射線−不透明（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）像を示した。４８個の埋め込まれたＤＢＭ−ＦＣディスクの内４５個（９３.７５％）が放射線−不透明であった。すべてのＤＢＭ−ＦＣディスクは蛋白質濃度（４−４５ｍｇ／ｍｌ）には無関係に放射線−不透明を誘き起こした（図１６）。いくつかのＤＢＭディスクの放射線−不透明測定（図１６）ではＤＢＭ−ＦＧディスクよりも高かったが、他の測定はＤＢＭ−ＦＧディスクの測定範囲内に良く入った。ＤＢＭが補充されていない３２個のＦＧディスクの内３０個（９３.７５％）が放射線−不透明を展開しなかった。
【０２２９】
四角、三角又はドーナツの形のＤＢＭ−ＦＧディスクはまた、ＤＢＭを補充していないＦＧディスクと比較して顕著に放射線−不透明であった。インプラントの元の形は一般に残っていた。
【０２３０】
筋肉内インプラントの組織学
骨髄で満たされた中心の洞を伴う小骨の形成及びあらかじめ埋め込まれたＤＢＭ粒子の吸収によって証明される様に、筋肉内のバイオアッセイはＤＢＭ及びＤＢＭ−ＦＧインプラントに対して陽性であった。
【０２３１】
頭蓋冠のインプラントのラジオグラフィー ＦＧマトリックス中のＤＢＭインプラントは、一般に、ＤＢＭインプラントのみ又は未処理の対照よりもより放射線−不透明であることがｘ線によって示された。ＤＢＭを運搬するために使用された種々のＦＧ濃度の間には認識できる違いはなかった。未処理の８ｍｍ直径の頭蓋冠の損傷のラジオグラフィーでは無視し得る量の放射線−不透明を示した。
【０２３２】
３０ｍｇ／ｍｌＦＧマトリックス中のＤＢＭを用いる第２のセットの頭蓋冠のインプラントは、２８日の頭蓋冠と比較して３カ月の又はは４カ月の頭蓋冠の開頭術の傷内における放射線−不透明部が顕著に増加していることを示した（図１７）。
【０２３３】
頭蓋冠のインプラントの組織学 
未処理の８ｍｍの開頭術の傷は繊維結合性組織が開頭術の傷を横切って発達していることのみを示した（図１８）。ＤＢＭインプラントの組織学は、ＤＢＭ粒子が全ての部位に拡散されていることを示した。いくつかのＤＢＭ粒子は宿主の骨の先端の上下に移動した（図１９）。しかし、大部分のＤＢＭ粒子は開頭術の傷の範囲内にあり、良く脈管形成された緩い結合性の組織に囲まれていた。破骨細胞によるＤＢＭの活性的な吸収が示された。多くのＤＢＭ粒子はまた肝細胞によって集団化されることがわかった。破骨細胞によって建造される新しい類骨及び骨は全く明白であった。
【０２３４】
ＦＧマトリックス中のＤＢＭインプラントの組織学によって、ＤＢＭ粒子が開頭術の傷内に局在し、より密なそしてより多くの細胞結合性の組織に囲まれていることが示された（図２０及び図２１）。類骨マトリックス及び骨の柱形成が全く明白であった。ＤＢＭインプラントのみを埋め込んだ開頭術の傷よりもＤＢＭ−ＦＧディスクを埋め込んだ開頭術の傷において、より多くの骨髄が形成されることが示された。また、ＤＢＭインプラントのみ又は未処理の対照よりもＤＢＭ−ＦＧディスクはより多くの新しい脈管形成があった。ＤＢＭを運搬するために用いた全ての濃度のＦＧにおいて骨再形成が明白であった。
【０２３５】
検討 
ＦＧの自然の生物適合性及び生物分解性は、それをＤＢＭ及びＢＭＰのための理想的な運搬ベシクルとする特性である。ＦＧは、骨の損傷を満たすために望ましい形態へのＤＢＭの形状化を促進し、その損傷内にＤＢＭを維持した、そしてＤＢＭと共同性であったかもしれない。さらには、柔らかい組織の脱出は起こらず、骨の輪郭が維持された。ＤＢＭが補充されたＦＧは、骨芽の補充及び骨再形成を助けるために適切なミクロ構造、生物分解性プロフィール及び放出速度論を有していた。
【０２３６】
全般的に、データによると、ＦＧ中のＤＢＭ運搬は、いかなる試験されたＦＣ蛋白質濃度においてもＤＢＭのみが誘導した骨形成と同量の骨形成を誘導することが示された。さらに、ＤＢＭをＦＧと共に遠心分離して、特定の手術前の形態とした場合、誘導された骨は手術後に元の形がよく維持された。
【０２３７】
ＤＢＭ−ＦＧマトリックスの形態が新しく形成された骨の形態学を決定したので、ＤＢＭ−ＦＧマトリックスはあらかじめ決定された形に作らなければならない。しかし、溶液の形態のＤＢＭ−ＦＧマトリックスは不規則的に形態化された損傷へ運搬するか又は注入でき、その場所において重合化し、ＤＢＭ−ＦＧが満たされた領域における骨形成を促進するだろう。
【０２３８】
実施例１２
ＦＧからの抗生物質（ＡＢ）の放出及びＡＢ補足ＦＧの寿命増加方法 
Ａ．ＡＢ−ＦＧの製造 
１．ＴＥＴフリー塩基
注射用の水３.５mlを米国赤十字より提供された凍結ヒト局所フィブリノーゲン濃縮物（ＴＦＣ）のバイアルに注入した。得られる溶液の蛋白濃縮物は約１２０mg/mlであった。
【０２３９】
米国赤十字／バクスター−ハイランド・インコーポレイテッド、グレンデイル、ＣＡより提供された凍結乾燥トロンビン濃縮物を、注射用の水で調製した塩化カルシウムの４０mＭ溶液３.５mlで再構成した。得られた溶液は約２５０Ｕ／mlを含有した。
【０２４０】
所望重量のＴＥＴを注射品質の塩化カルシウム（アメリカン・リエイジェント、シャーレイ、ＮＹから購入）の存在で、１mlの再構成ＴＦＣ溶液と、及び１mlの再構成トロンビン溶液と混合することにより、ＴＥＴ−ＦＧを調製した。ＴＥＴはフリー塩基形であり、シグマ・ケミカル・カンパニィ（セントルイス、ＭＯ）から購入した。直径１２mmのミリポア培養プレート（ミリポア・コーポレイション、ベッドフォード、ＭＡ）中のミリポア膜上、ジュオフロ（商標）ディスペンサー（ハマーディクス、ＣＡ）によってＴＦＣとトロンビンを混合することにより、ＴＥＴ−ＦＧを形成させた。混合物を２２℃で１時間放置した。ＴＥＴ−ＦＧ及びミリポア膜を含む６mm直径ディスクを６mmパンチバイオプシーを用い後者からカットした。ＴＥＴ−ＦＧ含有ディスクをＴＥＴ放出研究に用いた。
【０２４１】
ＴＥＴ−ＦＧからリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又は唾液へのＴＥＴの放出は、２つの異なる設定条件下、２４−ウエル細胞培養プレート（コーニング・グラス・ワークス、コーニング、ＮＹ）を用い測定した。一つの条件では、静止形態、２mlのＰＢＳ又は０.７５mlの唾液を毎日、２４−ウエル培養プレート中で置き換えた。他の条件では、連続変換形態、ＴＥＴ−ＦＧからのＴＥＴ放出を１日当り約３mlの速度で変換されるＰＢＳで測定した。試料は分析するまで−２０℃で貯えた。唾液は、１０人の異なる人達から収集し、まとめて、５,０００gで遠心により浄化した。次いで０.４５μm孔径膜で濾過し、毎日の使用に４℃で保存した。
【０２４２】
ＴＥＴ−ＦＧディスクから放出されたＴＥＴの濃度及び生物活性を測定するために、溶出ＴＥＴを解凍し、３２０nmでスペクトル光度測定法で、及び／又は寒天平板上、イー・コリの阻害により生物学的に分析した。これらのアッセイを較正するために、それぞれ０ないし５０及び０ないし５００μg／mlのＴＥＴ濃度をカバーする標準曲線を用いた。
【０２４３】
２．シプロフロキサシンＨＣl（ＣＩＰ）−、アモキサシリン（ＡＭＯ）− 及びメトロニダゾール（ＭＥＴ）補足ＦＧ 
ＣＩＰ ＨＣl、ＡＭＯ又はＭＥＴを含有するＦＧはＴＥＴについての前述の通りに製造した。これらＡＢの、対応するＡＢ−ＦＧから近接の環境への放出をモニターするため、ＡＢ−ＦＧディスクを、２４ウエル細胞培養プレートの個々のウエルに置き、分析するまで、前のように収集し、毎日置き換え、そして−２０℃で保存したＰＢＳ ２mlでカバーした。溶出液中のＣＩＰ、ＡＭＯ及びＭＥＴの濃度をそれぞれ２７５、２７４及び３２０nmでスペクトル光度測定法で測定し、対応するＡＢの０ないし５０μg／mlを含有する標準曲線と比較した。
【０２４４】
Ｂ．ＡＢ−ＦＧの構造的統合性 
ＦＧ及びＴＥＴ−ＦＧディスクの構造的統合性の維持は、小さなスパーテルでディスクを「つつく」（poking）ことによる視覚観察と物理的調査によって評価した。ディスクを保存している間に切り取った多孔膜をＴＥＴ−ＦＧに付着し、それらの構造的統合性の評価の間にディスクの位置を守るのに用いた。又、ディスクの上部及び側方視覚の写真をとり、評価に用いた。
【０２４５】
ＦＧ及びＴＥＴ−ＦＧの構造的統合性は、無菌及び非無菌の両条件下で測定した。非無菌実験については、分析までＰＢＳ及び唾液を凍結保存した。無菌実験については、全方法を無菌条件下で行う以外は同一の操作を用いた。システムの不稔性は０.２mlの試料と２mlのブロスを３７℃でインキュベートすることにより試験し、ブロスの濁度を４８時間モニターした。濁度の欠除はシステムの不稔性を示した。ＣＩＰ−、ＡＭＯ−及びＭＥＴ−ＦＧの安定性は、非無菌条件下のみで上記と同様に研究した。
【０２４６】
Ｃ．ＡＢ−ＦＧから放出されたＡＢのインビボ抗菌活性 
ＡＢ−ＦＧから放出されたＡＢの抗菌活性は、ＡＢ−ＦＧの回りの毎回収集されたＰＢＳ又は唾液からの６mm直径ディスクの溶出液によりもたらされる阻止の領域の直径を測定することによって評価した。未補足ＦＧからの溶出液をコントロールとして用いた。既知濃度のＡＢ溶液を標準として用いた。寒天平板上で培養したイー・コリは、放出されたＴＥＴ、ＣＩＰ及びＭＥＴのＡＢ活性を測定するのに用いた。培養プレートを作るために、約１０8時間／mlを含む１００μlの細菌細胞懸濁液と３mlの上面寒天とを５０℃で混合し、直ちに硬底面寒天平板（plate hard，bottom agar）上に移して細胞の均一層を作った。プレートを３７℃で１８時間インキュベートした。
【０２４７】
結果 
Ａ．ＴＥＴ 
１．ＴＥＴ放出データ 
「静置」実験でのＴＥＴ−ＦＧディスクから周囲のＰＢＳへのＴＥＴの放出は、毎日置き換えた２mlのＰＢＳで達成されたＴＥＴ濃度を測定することによるスペクトル光度測定法で測定した。ＴＥＴ−ＦＧに取り込まれた異なる量のＴＥＴについて得られたＴＥＴ濃度を図面２２に示す。５０mg／ml以下のＴＥＴ−ＦＧでのＴＥＴ濃度で、ＴＥＴの放出は、５日又はそれ以下で測定した。しかしながら、１００及び２００mg／mlのＴＥＴ濃度を含んだＴＥＴ−ＦＧディスクからのＴＥＴの放出は、それぞれ約２週間と３週間以上、生じた。ＴＥＴ−ＦＧディスクの構造的統合性は、３ないし５週間保持した。これらの結果は、ＴＥＴ放出がＦＧ産生と独立であること、及びＴＥＴ放出の速度がＴＥＴ−ＦＧディスクに残ったＴＥＴの量に依存することを示した。
【０２４８】
連続交換実験で収集したスペクトル光度測定データを図面２３に示す。これらのデータは、１００mg／mlＦＧのＴＥＴ濃度をもともと含有したＴＥＴ−ＦＧディスクからの連続ＴＥＴ放出が２週間にわたって生じたことを示す。ＦＧディスクは、この２週間以内、その構造的統合性を維持した。連続モード実験で得たＴＥＴ放出データも、ＴＥＴ放出状況の速度がＴＥＴ−ＦＧディスクに残ったＴＥＴの濃度に依存することを示した。
【０２４９】
理論に縛られることを望まないが、これらの実験で観察された初期の高ＴＥＴ濃度は、多分、ディスク表面又はその近くからのＴＥＴの拡散の結果であると信じられた。即ち、これらの位置で「トラップされた」ＴＥＴが消耗されたので、溶液化及び／又は拡散の速度が、ＴＥＴ濃度勾配により、又、ＦＧの形状は又は立体構造により多分測定されたやり方で減少した。
【０２５０】
温度及びＦＧ蛋白濃度もＴＥＴ−ＦＧディスクからのＴＥＴ拡散速度を測定するのに割役を演した（実施例１３及び１４参照）が、これら二つのパラメーターはこれらの実験で一定を保った。
【０２５１】
５０及び１００mg／mlのＴＥＴを含むＴＥＴ−ＦＧから唾液へのＴＥＴの放出は、静置実験で、毎日取り替えた０.７５mlの唾液中のＴＥＴ濃度を決定することにより測定した。これらの結果（Ｆig.２４）は、ＴＥＴの濃度が高かった以外、ＰＢＳで得られたものと同様で、放出ＴＥＴを収集するのに用いた少容量の唾液を多分反映している。さらに、ＦＧマトリックス中のＴＥＴの存在も、９日までに崩壊し始めて１５日までにほとんど完全に崩壊したコントロールＦＧディスクに関するものと比較して少なくとも１５日間ＴＥＴ−ＦＧマトリックスの構造的統合性を予期せずに延長した（図面２５）。
【０２５２】
２．ＴＥＴ抗菌データ 
ＰＢＳ中の幾つかのＴＥＴ濃度のイー・コリ生育に対する抗菌効果は図面２６に示される。本方法により検出可能な最低ＴＥＴ濃度は約５μg／mlであった。
【０２５３】
これらの結果は、明らかに、放出ＴＥＴが抗菌活性を有することを示す。これらのＴＥＴデータはスペクトル光度測定により得られたものを裏付け、ＦＧに取り込まれたＴＥＴの量がＴＥＴ−ＦＧの周囲の溶液中のＴＥＴ濃度を決定することを示す。これらのデータもＦＧ中のＴＥＴの量がＴＥＴ−ＦＧの周囲の媒体中の所望ＴＥＴ濃度を最小所望ＴＥＴ濃度で又はそれ以上で維持するのに適応できることを示す。
【０２５４】
３．ＴＥＴ−ＦＧマトリックス寿命
コントロールＦＧ及びＡＢ−ＦＧディスクの寿命は、ディスクの視覚評価により評価した。ディスクの製造の間に切り取った多孔膜は、依然ＦＧに付着し、それらの統合性評価の間にディスクを適当な位置に置くのを助けた。ＴＥＴを含まない（コントロール）及びmlのＦＧ当り５０又は１００mgのＴＥＴを含有するディスクの０、９及び１５日の上部展望を図面２５に示す。本図は、典型的な結果、即ち、ＦＧコントロールディスクが２週間以内に崩壊し、一方、ＴＥＴ−ＦＧディスクは１５日間又はその付近で依然無傷であったことを示す。付加的実験で、ＴＥＴ−ＦＧディスクは、少なくとも５週間又は付近で依然無傷であった（データ示さず）。ＦＧの寿命について有意な変化は無菌及び非無菌ＴＥＴ放出実験の間で観察されなかった。
【０２５５】
Ｂ．ＣＩＰ、ＡＭＯ及びＭＥＴデータ 
１．ＣＩＰ、ＡＭＯ及びＭＥＴ放出データ 
ＣＩＰ−、ＡＭＯ−及びＭＥＴ−ＦＧから放出された抗生物質を図面２７に示す。ＣＩＰは約４週間明らかな一定速度で放出され、次いで速度はさらに約１過間徐々に減少した。ＡＭＯ及びＭＥＴの放出は、完全に３日以内であった。
【０２５６】
２．ＣＩＰ及びＭＥＴ抗細菌活性 
放出されたＣＩＰ及びＭＥＴの抗菌活性（データ示さず）は同一のＡＢ−ＦＧディスクについてスペクトル光度測定で決定したプロフィルに近似している。
【０２５７】
３．補足−ＦＧマトリックス寿命 
ＣＩＰ−ＦＧについての結果は、ＴＥＴ−ＦＧについてのものと類似した。ＡＭＯ−及びＭＥＴ−ＦＧについての結果は、ＦＧコントロールについて得たものと類似した。ＦＧの寿命での有意な変化は、無菌及び非無菌実験の間で観察されなかった。
【０２５８】
検討 
結果は、ＣＩＰ及びＴＥＴの水難溶性形がそれらが混合されるＦＧマトリックスの最大ＡＢ負荷、放出期間及び寿命を有意に増加する因子の組合せを提供することを示した。これとは別に、ＦＧディスクはＡＢ、例えばＴＥＴ又はＣＩＰの溶液中にそれを浸漬することにより安定化できる。
【０２５９】
この結果も、ＡＢ−ＦＧにより導出されたＡＢがイー・コリ生育の阻害により示されるように、その抗菌活性を保持したことを明らかに示した。これらの結果は、ＦＧ及び他のＴＳのＴＥＴ及びＣＩＰ補足がそこからのドラッグデリバリィで制限(limiting)因子としてＦＧの崩壊に打ち勝つことができることを示した。即ち、これらのＡＢはＦＧを安定化し、それによりそれらの放出期間と放出ＡＢ濃度をＦＧ中のＡＢ濃度を用いてコントロールできる。これらの方法を用い、ＴＥＴ及びＣＩＰはＦＧに負荷でき、それらの放出は有効な抗菌濃度で数日又は数週間コントロールできる。
【０２６０】
ＴＥＴ−及びＣＩＰ−誘発ＦＧ安定化は、これらのＡＢについてだけでなく、その放出速度及び／又は全放出持続がＦＧマトリックスの寿命に依存するＦＧに加えられる他の薬物又は「補足物」についても、全放出時間をコントロールするのに利用できる。
【０２６１】
それらの結果は、ＦＧが局在ドラッグデリバリーシステムとして利用できる歯周及び他の条件で、臨床適用性を有する。ＴＥＴ−又はＣＩＰ−誘発ＦＧ安定化は、ＴＥＴ、ＣＩＰ及びＴＥＴ−ＦＧ又はＣＩＰ−ＦＧマトリックスに加えられた他の薬物又は補足物の全放出時間をコントロールするのに利用できる。
【０２６２】
実施例１３ 
ＴＥＴ−補足ＦＧからのＴＥＴ放出速度に対する温度の影響 ＦＧは５０mg／mlのＴＥＴ遊離塩基を補足し、本研究用に６×２.５mmディスクに形造った。ＦＧの蛋白濃度を６０mg／mlに調整した。ディスクを２mlのＰＢＳ、pＨ７.３に置き、４、２３及び３７℃で放置した。ディスクを洗浄するため、ＰＢＳは、１０分毎に６回、２mlの新鮮なＰＢＳで置き換えた。その後、ＰＢＳは１時間毎に４時間、置き換えた。収集した試料中のＴＥＴ濃度を前のように、標準曲線に対してスペクトル光度測定で測定した。
【０２６３】
結果及び結論 
結果は、ＴＥＴ放出の速度が温度に比例することを示した（図面２８）。
【０２６４】
実施例１４ 
ＴＥＴ−補足ＦＧからのＴＥＴ放出速度に対するＦＧ蛋白濃度の影響 １mg／mlのＴＥＴ ＨＣl溶液を補足したＦＧを調製し、本研究用に６×２.５mmディスクとして形造った。ＦＧの蛋白濃度を６０、３０及び１５mg／mlに調整した。各ディスクを３mlの蒸留水に置いた。水は、１０分毎に、全１時間、同容量の水で置き換えた。収集した試料中のＴＥＴ濃度を前のように標準曲線に対してスペクトル光度測定法で測定した。
【０２６５】
データ（図面２９）は、ＴＥＴ放出速度が最低全蛋白濃度のＦＧから最大で、逆であることを示す。即ち、ＴＥＴ放出速度はＦＧ蛋白濃度に反比例した。
【０２６６】
実施例１５ 
ＡＢ−補足ＦＧから放出されたＡＢのインビボ抗菌活性 
ＴＥＴ−及びＣＩＰ−ＦＧから放出されたＴＥＴ及びＣＩＰの抗菌活性を試験するため、これらのＡＢ−補足ＦＧの誘発腹膜炎からマウスを保護する能力を評価した。実験的に、１日目に、グループ当り５匹の動物の各１匹に０.５mlＰＢＳ（グループＩ）、ＦＧ（グループII）、ＴＥＴ−ＦＧ（グループIII）又はＣＩＰ−ＦＧ（グループIV）を腹膜内注射した。ＦＧ及びＡＢ−ＦＧを、１２０mg／mlのＴＦＣ０.２５ml及び２５０Ｕ／mlのヒトトロンビン０.２５mlを含むハマーデクスディスペンサーを用い投与した。ＴＥＴ−及びＣＩＰ−ＦＧの場合、トロンビン溶液は５０mgの各ＡＢを含有した。２日目に、全動物に２×１０8（実験１）又は４×１０8（実験２）コロニー形成単位（cfu）のエス．アウレウス２０２Ａを腹膜内注射した。結果：（実験１、実験２。動物は感染後４８時間、生存）：グループＩ、０及び１の生存；グループII、３及び１の生存；グループIII、３及び５の生存；及びグループIV、５及び４の生存。ほとんどの生存動物は実験（２週間）の間を通して生きたが、幾らかは死亡したか又は病気であったので故意に殺した。
【０２６７】
これらのデータは、マウスを死から守ったＴＥＴ−ＦＧ及びＣＩＰ−ＦＧがＡＢ−補足ＦＧの投与後、少なくとも４８時間、エス．アウレウス２０２Ａにより生じることを示した。
【０２６８】
実施例１６ 
ＦＧから細胞傷害／抗増殖薬物の長期部位指定送達 
フィブリノーゲンは、無菌水で、１グループについては１７mg／mlの濃度に５−ＦＵで飽和した水で可溶化した。トロンビン溶液は、無菌水で作り、次いで、４０mＭ ＣaＣl2中に１５Ｕ／mlの濃度に希釈し、又はトロンビンは１７mg／mlの濃度に５−ＦＵで飽和した４０mＭ ＣaＣl2に溶解した。
【０２６９】
コントロールＦＧクロット（凝塊、clots）は、５−ＦＵを含有せず、２００μlのＴＦＣ溶液（６０mg／mlで）を２００μlのトロンビン溶液（１５Ｕ／mlで）と混合し、２０分重合することにより生成した。これらのクロットは１２×７５mm試験管中で作り、次いで０.０５Ｍヒスチジン、０.１５Ｍ ＮaＣl、pＨ７.３（緩衝液）１０ml中に置いた。
【０２７０】
標準濃度の液体５−ＦＵを含むＦＧクロットは、２００μlのＴＦＣ（６０mg／ml＋１７mg／ml ５−ＦＵ）と２００μlトロンビン溶液（１５Ｕ／ml＋１７mg／ml５−ＦＵ)を混合し、クロットを２０分、完全に重合することにより作った。ＴＦＣ及びトロンビン溶液での飽和濃度の５−ＦＵの添加は、完全に不透明であったコントロールＦＧクロットに比べて、半透明であったクロットを生成するクロット形成を幾らか変えた。形成されたクロットは、ＦＧのみで作ったものと色以外は物理的に同一であった。クロットは１２×７５mm試験管中で作り、次いで１０mlの緩衝液中に置いた。
【０２７１】
５−ＦＵの飽和溶液により形成したクロットに含まれる量に等しい量の固体無水５−ＦＵを含む第二グループのＦＧクロットを作った。これらのクロットは、７mgの固体無水５−ＦＵを２００μlのＴＦＣ（６０mg／ml）と２００μlのトロンビン（１５Ｕ／ml）に添加することにより形成した。７mgの５−ＦＵを１２×７５mm試験管中に置いた。次いで２０μlのＴＦＣを、続けて２００μlのトロンビンを加えた。次いで、３成分を、均一混合物が観察され、そしてそれ以上の混合が凝固反応によって阻止されるまで、ピペットを前後させることにより混合した。次いでクロットを１０mlのヒスチジン緩衝液中に置いた。
最終グループはクロット当り５０mgの固体無水５−ＦＵを含有した。多量の５−ＦＵ（７mgの代わりに５０mg）のために、これまでに用いられた方法ではうまくいかなかった。均一のクロットを作る代わりに、クロットは試験管の底に固らせている大量の５−ＦＵで形成させた。この問題を避けるために、試験管の底を初めに１００μlのＴＦＣ（６０mg／ml）と１００μlのトロンビン（１５Ｕ／ml）で被覆した。これは試験管の凹形の底を被覆したクロットを形成した。次に、５０mgの固体無水５−ＦＵを２００μlクロットの表面に加えた。これに続いて１００μlのＴＦＣを１００μlのトロンビンと共に加えた。２つの溶液を、自動ピペッターを用い、蛋白がゲル化し始めるまで混合した。これが生じたとき、ピペット操作を終えてクロットを２０分間、重合した。最終生成物は、約５０mgの５−ＦＵの濃密なコアを含有するクロットであった。他のクロットに関しては、これらは次いで１０mlの緩衝液中に置いた。全グループ中のＦＧの最終全蛋白濃度は３０mg／mlであった。
【０２７２】
各グループは１０複製を含んだ。各複製は１０mlの緩衝液中、３７℃でインキュベートした。緩衝液は５、１０、２２、３３、５２、７５及び１１４時間に１０mlの新鮮な緩衝液で置き換えた。次いで溶出緩衝液のアリコートを２６０nmの波長セッティングで分光測光器で試験した。これまでの実験は５−ＦＵがこの波長で強く吸収するが、一方コントロールＦＧクロットからの溶出液は吸収しないことを示した。
【０２７３】
結果は図面３０に示す。５−ＦＵを含まないコントロールクロットは有意な解読を与えなかった。５−ＦＵの飽和溶液の形で又は同等量の固体無水５−ＦＵのいずれかの７mgの５−ＦＵで作られたクロットは５ないし１０時間の間、５−ＦＵのそれらの送達を完全にしたが、一方５０mgの固体無水５−ＦＵを含むクロットは少なくとも７５時間５−ＦＵを送達することを続けた。全ての場合での最高濃度は５時間点で生じた。
【０２７４】
理論に縛られることを望まないが、５−ＦＵ送達の持続はゲルに負荷された５−ＦＵの塊の作用であるようであった。結果として、溶液中に５−ＦＵを含むクロットから送達可能な５−ＦＵの量は、薬物の溶解性により限定された。即ち、５−ＦＵを飽和した液体から形成したクロットに存在する量に等しい固体無水形の量の含有は、ほとんど同一の送達動態となったが、一方、液体形を用いることが可能であるよりも大量の固体形５−ＦＵの含有は、３倍の送達の持続、典型的には与えられた濃度の薬物の送達の持続を１０倍増加した。大量の固体無水５−ＦＵの含有さえも大きな送達時間となることが期待された。他の実験では、我々はクロットに含まれる５−ＦＵの量が少なくとも５倍そして多分それ以上増加すること、及び５−ＦＵ−ＦＧ混合物も注射可能形に処方しうること（データ示さず）を見出した。さらに、無水形よりも周りの水性媒体に溶解しにくい、及び／又は低溶解速度を有する５−ＦＵの類似体又は他の形は、送達時間をさらに増加させることとなろう。
【０２７５】
この方法の結果は、液体形での薬物を使用できるよりも少なくとも１０倍長いフィブリンクロットからの抗増殖／細胞傷害薬物５−ＦＵの持続しうる送達である。本技術（即ち、固体形の薬物、多分、低溶解度及び／又は溶解速度のものの用途）は、薬物粒子が懸濁するマトリックス又は薬物自体と関係なく一般に適用できる筈である。
【０２７６】
実施例１７ 
線維芽細胞成長因子補足化ＦＧおよびフィブロネクチンに対する応答における線維芽細胞化学走性 
材料および方法 
材料 
ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、ミズーリ州、セント・ルイスのシグマ・ケミカルカンパニーから購入した。抗生物質−抗真菌溶液は、ＧＩＢＣＯ（ニューヨーク州、グランド・アイランド）から購入した。組換え線維芽細胞成長因子−１（ＦＧＦ−１）および−４（ＦＧＦ−４）は、メリーランド州、ロックビルのアメリカン・レッド・クロス、プラズマ・デリバーティブズ・ラボラトリー、レジナルド・キッド氏およびジェネティックス・インスティテュート（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）のご厚意によりそれぞれ頂戴した。組換え線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２、塩基性ＦＧＦまたはｂＦＧＦとしても知られている）は、アップステイト・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド（ニューヨーク州、レイク・プラシド）から購入した。培養物の滅菌増殖並びに化学走性アッセイに必要な全てのプラスチック製品は、フィッシャー・サイエンティフィック（デラウェア州、ニューアーク）から購入した。ミリセル−ＰＣＦ（１２.０μm）挿入物は、ミリポア・インコーポレイテッド（マサチューセッツ州、ベッドホード）から購入した。ヘパリンは、アップジョン・カンパニー（ミシガン州、カラマズー）から購入した。
【０２７７】
細胞培養 
継代１２６のＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞は、メリーランド州、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入した。継代１２９−１３３由来の培養物を化学走性アッセイに使用した。１０％ウシ血清および約１％抗生物質抗真菌溶液を補足したＤＭＥＭ中で培養物を増殖させた。ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦｓ）は、クロネティックス・インコーポレイテッド（カリフォルニア州、サンディエゴ）から継代２のものを購入した。継代３−５由来の培養物を化学走性アッセイに使用した。２０％ＦＢＳ（ユタ州、ローガンのハイクローン・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド）および約１％抗生物質抗真菌溶液（ニューヨーク、グランド・アイランドのジブコ）を補足したＤＭＥＭ中で培養物を培養した。
【０２７８】
細胞化学走性アッセイ 
細胞化学走性を測定するのに使用した方法は、既知の２つの方法体系を組み合わせたものであった。ボイデン・チェンバーを修飾したものを以下のようにして使用した：ミリセル−ＰＣＦ（ミリポア・インコーポレイテッド、マサチューセッツ州、ベッドホード）（１２.０μm）、直径１２.０mmの挿入物を２４ウェルプレートの個々のウェルに入れ、上部化学走性チェンバーと下部化学走性チェンバーを設けた。化学走性結果は、細胞と成長因子との各組み合わせ毎にチェッカー盤分析を実施することにより、得られた。材料の所で記載した全種類の細胞を伴うＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２（ヘパリン無し）およびＦＧＦ−４について、ヘパリン（１０Ｕ／ml）を加えた場合も／加えない場合も、０.１、１、１０、１００ng／mlの濃度範囲を採用した。要するに、培養物をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ＋０.１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ・ケミカル・カンパニー、ミズーリ州、セント・ルイス）中に入れて、約１時間、３７℃で５％ＣＯ2湿潤チェンバー中に置いた。５０μl中２から２.５×１０5細胞を２４ウェルプレートに設けた上部チェンバーに挿入添加した。上記のように、処置を加えた。アッセイを、３７℃で５％ＣＯ2湿潤チェンバー中４時間続けた。４時間終了時点で、プレートをインキュベーターから取り出し、フィルターをミリセル−ＰＣＦ挿入物と共に染色するためのプロトコールに従い染色した。要するに、ミリセル−ＰＣＦ挿入物の内側および外側を取り巻く流体を取り除いた。３パーセントのグルタルアルデヒド（シグマ・ケミカル・カンパニー、ミズーリ州、セント・ルイス）を約２０分間、挿入物の内側および外側に加えた。３.０％グルタルアルデヒドを除去後、０.５％トリトンＸ−１００（Ｅ．Ｍ．サイエンス、ニュージャージー州、チェリー・ヒル）を５−７分間加えた。０.５％トリトンＸ−１００を除去するときに、フィッシャー社のヘマトキシリン溶液ジル製剤（フィッシャー・サイエンティフィック、デラウェア州、ニューアーク）Ｎｏ.１を約１０分間加えた。
【０２７９】
この溶液を、蒸留水で５分間流して洗浄除去した。綿棒を用いて、フィルターの上面をぬぐい、移動しなかった細胞を取り除いた。フィルターをクリスタルマウントTM（バイオメダ・インコーポレイテッド、カリフォルニア州、フォスター・シティ）溶液におけるスライドに面する低部側にマウントし、フィルターの下面にある細胞を自動的に数え上げるイメージ・アナライジング・システムを用いて４００×および２００×の両方で可視的に、無作為の１０視野（フィールド）をスライドによりカウントした。
【０２８０】
チェッカー盤分析 
必須のものとして、チェッカー盤分析を実施し、無作為の移動および正および負の化学走性を測定した。成長因子を上部および／または下部チェンバーに加えて、細胞が、ＧＦ方向に単独で移動する（化学走性）かどうか、成長因子を上部または低部ウェルに加えたかどうか（ケモキネシス）、または細胞移動が化学走性勾配に逆らっているかどうか（負の化学走性）にかかわりなく、移動がランダムであるかどうかを観察した。
【０２８１】
ＦＧから放出されたＦＧＦに対する細胞移動アッセイ
化学走性チェンバーおよび細胞を上記の通り利用した。８mg／ml局所フィブリノーゲン複合体（ＴＦＣ、アメリカン・レッド・クロス、メリーランド州、ロックビル）５０μlを２４ウェルプレートの底に加えた。試験成長因子＋／−ヘパリン４０μlを最終濃度１０Ｕ／ml（ヘパリンを含むＦＧＦ−１、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−２単独）でＴＦＣに加え、勢いよく混合した。ウシ・トロンビン（アームア・ファーマシュウティカル・カンパニー、イリノイ州、カンカキー）１０μlを加え、勢いよく混合した。成分を室温で約３０分間ゲル化させた。下部および上部チェンバーの総容量は、ＤＭＥＭ＋０.１％ＢＳＡも含めて、それぞれ０.５mlまでにした。下式に定めるとおり、ＴＦＣに加えられたＦＧＦの濃度を調整して、所望の全体濃度とした：
【０２８２】
【数１】
2006297130.tif 000008
【０２８３】
アッセイは、５％ＣＯ2湿潤チェンバー中３７℃で約２４時間実施した。２４時間終了後、フィルターを取り出し、固定し、染色して、フィルターの下面の細胞数を、上記のようにして数えた。
【０２８４】
結果 
線維芽細胞の移動能力 
種々のよく知られた化学走性剤（chemotactic agents）の方向に移動するＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞の能力を測定して、このアッセイに使用した細胞がこの能力を維持したことを確認した。フィブロネクチンは、ＮＩＨ ３Ｔ３およびＨＤＦ類の両方について試験した中で、最も有効な化学走性剤であり、２０μg／mlで最大の応答を示した（図３１、表７）。従って、２０μg／mlのフィブロネクチンを、移動についての正の対照として使用した。
【０２８５】
ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞のＦＧＦ−１方向への化学走性 
ＦＧＦ−１によるＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞移動の最大刺激は、ヘパリン１０Ｕ／mlの存在下、１０ng／mlで観察された（図３２）。チェッカー盤分析により、ＦＧＦ−１が、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞に対する化学走性物質であることが明らかになった。
【０２８６】
ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞のＦＧＦ−２方向への化学走性 
ＦＧＦ−２によるＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞移動の最大刺激は、ＦＧＦ−２の１ng／mlで観察された（図３３）。チェッカー盤分析は、ＦＧＦ−２が、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞に対する化学走性物質であることを示した（データは示さない）。
ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞のＦＧＦ−４方向への化学走性 ＦＧＦ−４によるＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞移動の最大刺激は、１０ng／mlで観察された（図３４）。チェッカー盤分析により、ＦＧＦ−４が、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞に対する化学走性物質であることが明らかになった。
【０２８７】
ＨＤＦsのＦＧＦ−１方向への化学走性 
ＦＧＦ−１によるＨＤＦs移動の最大刺激は、１ないし１０ng／mlで観察された（図３５）。チェッカー盤分析は、ＦＧＦ−１が、ＨＤＦsに対する化学走性物質であることを示した（表９）。
【０２８８】
ＨＤＦsのＦＧＦ−４方向への化学走性 
ＦＧＦ−１によるＨＤＦs移動の最大刺激は、１０ng／mlで観察された（図３６）。チェッカー盤分析により、ＦＧＦ−２が、ＨＤＦsに対する化学走性物質であることが明らかになった（データは示さない）。
【０２８９】
ＨＤＦsのＦＧＦ−４方向への化学走性 
ＦＧＦ−４によるＨＤＦs移動の最大刺激が、１０ng／mlで観察された（図３７）。チェッカー盤分析は、ＦＧＦ−４が、ＨＤＦsに対する化学走性物質であることを示した（データは示さない）。
【０２９０】
ＦＧに組み込まれたＦＧＦ−１、−２および-４に対するヒト皮膚線維芽細胞移動 
ＦＧから放出されたＦＧＦに対する最大移動応答は、１ng／mlのＦＧ中、ＦＧＦ−４の組み込まれた濃度、および全体の濃度で引き起こされた（図３８）。ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２をＦＧに組み込んだ場合でも、化学走性応答ピークを生ぜしめるＦＧＦ−２の濃度が０.０１mg／mlであった以外は、同様の結果が得られた（データは示さない）。
【０２９１】
【表７】
2006297130.tif 000009
【０２９２】
【表８】
2006297130.tif 000010
【０２９３】
【表９】
2006297130.tif 000011
【０２９４】
考察 
ＦＧＦ類は、ＨＦＤsにおいて十分な化学走性応答を生ぜしめた。ＨＤＦsを用いて実施した各化学走性アッセイの場合、負の対照と、最大移動応答を生ぜしめたＦＧＦ濃度との間に非常に良好な差異が得られ、ＦＧＦ−１、−２および−４に対する応答では、それぞれ１８、１２および１０倍であった。
【０２９５】
成長因子による化学走性刺激は、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞の場合、ＨＤＦsの場合ほど高くはなかったが、これは恐らく、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞の入手可能なストック培養物の継代数が、ＨＤＦsの場合に比べて高いことが原因であると思われる。
ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２およびＦＧＦ−４が、線維芽細胞化学走性の強力な刺激物質であることが、見い出された。上記成長因子類の１つまたはその組み合わせにより線維芽細胞が方向性を持って移動するという結果を、損傷部位に存在する線維芽細胞に応用して、それにより、線維増殖、およびコラーゲンおよび細胞外マトリクスの産生を導くことが出来る。従って、その充分に認識されている血管形成誘導特性とは別に、ＦＧＦ類は、単独で、またはＰＤＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＴＧＦ−βおよび／またはその他の因子との組合せのいずれかで作用して、損傷治癒する役割を有し得るのである。
【０２９６】
損傷治癒を速めるためのＦＧＦ類の使用に関する従来研究では、有意な結果が得られたものはない（カーター等、１９８８年）。これは、最大応答を得るために細胞をイン・ビボで因子類に長い時間さらす必要が有ることが原因であり得る（プレスタ等、セル・レギュレーション、２巻：７１９−７２６巻（１９９１年）およびルスナチ等、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、１５４巻：１５２−１６１頁（１９９３年））。残念ながら、治癒工程を妨害しないような条件下で、長時間、成長因子を損傷箇所に届けるのは困難である。
【０２９７】
ＦＧＦ類をＦＧに組み込むものである本願発明は、細胞をＦＧＦ類に長い時間さらすことを可能にし、損傷箇所に適用され得るものである。生じたフィブリンコーティングは、組織損傷に対する本来の応答を擬態するものであり、その一方で成長因子を損傷箇所に直接届けるものである。本願出願人による従来研究では、ＦＧＦ−１を含むＦＧを、人工血管移植片の内側を覆うのに使用した（本明細書、実施例８）。これらの移植片をウサギの血管内に置くと、ＦＧＦ−１が、２８日間放出された。イヌ科の移植片に関する更なる研究では、ＦＧＦ−１を移植片壁へ組み込んだ結果、同期間内で人工移植片が全部内皮化した（グレイスラー等、サージェリー、１１２巻：２４４−２５５頁(１９９２年)）。従って、この適用形態は、イン・ビボにおける非常に有意な生物学的効果を導くことが出来るのである。本研究では、出願人は、線維芽細胞が、ＦＧから放出されるＦＧＦ類方向に引き付けられ得ることを示している。この特性は、ＧＦ−補足化ＴＳを用いた損傷の処置において有用なものである。
【０２９８】
実施例１８ 
脈管形成性物質を送達するためのＴＳシーラントを用いる、直接的な部位脈管形成 
この実施例では、新規血管を制御した方法によって体内で直接形成することができる。またこの実施例では、ＴＳは、脈管形成性物質、たとえば線維芽細胞成長因子-１(ＦＧＦ-１)を、補足ＴＳから放出される濃度が脈管形成の誘発に有効になるような量で含有し、送達する。
【０２９９】
この実施例は、心臓や脳や筋肉組織のような充分な血液供給が欠けている体内域において脈管形成を促進するような制御した方法に用いられる。またこの実施例は、移植器官や再結合四肢に対する循環を保持したり改善するのに用いる。さらにこの実施例は、つぎのようなものに関し血管網または「血管床」を発生させるのに使用することができる；人工器官／類器官の形成、遺伝子治療に用いられる細胞の送達および／または局在化および／または栄養補給、遺伝子治療の標的、組織拡大用の細胞の栄養補給および／または局在化。またこの実施例は、脈管形成やその下部器官の機能を損なうような異物や過剰な炎症反応を誘発しうる器具または物質の移植の必要性を排除することができる。
【０３００】
本発明は、フィブロネクチンおよび／またはコラーゲンを含むかまたは含まずに、組成の１つとしてフィブリノーゲン(好適にはフィブリンの形成用)を含み、これを、適した濃度のＦＧＦ-１のような脈管形成性物質に配合する。フィブリノーゲンは、また、トロンビンのたん白分解活性に抗して保護するための安定化剤を含有することができる。ＦＧＦ-１の場合、ヘパリン硫酸塩(１〜１０００Ｕ／ml)を安定化剤として、濃度範囲１ng／ml〜１mg／mlで用いることもできる。
【０３０１】
別の態様として、脈管形成物質を好適な濃度にてトロンビン、カルシウムまたは水成分中に含ませることもできる。この組成物をトロンビンと混合し、次いで所望の部位とつながる体内ラインまたは単一の部位へ迅速に適用する。フィブリノーゲン-トロンビン混合物を重合してＦＧを形成する。ＦＧＦ-１または他の脈管形成物質は、ＦＧマトリックス内に、遊離形または安定化剤もくしく混合物の他の成分に結合した状態で閉じ込めた状態のままにする。１つの実施例では、ＴＳ中のＦＧＦ-１の濃度は０.１ng／ml〜１mg／ml、好適には１ng／ml〜１００μg／ml、より好適には１００ng／ml〜１０μg／mlである。ＦＧＦ-１または他の脈管形成物質は、ＦＧ沈積体内で血管形成を誘発することができる。ＦＧは自然に生分解し、血管から排出される。
【０３０２】
実施例１９ 
直接的な軟骨部位誘発 
この実施例は、新規軟骨の制御した形成が可能であり、また体内における損傷した軟骨の制御した再生が可能である。この実施例では、ＴＳは、単数または複数の軟骨促進因子、たとえば軟骨誘発因子-Ａおよび／または-Ｂ(ＣＩＦ−ＡおよびＣＩＦ-Ｂ、各々、ＴＧＦ-Ｂ1およびＴＧＦ-Ｂ2としても知られている)および／または他の因子、たとえば骨有機基質誘発因子(ＯＩＦ)を、補足ＴＳから放出される当該誘発因子の濃度が軟骨形成を誘発するのに有効な量で含有し、送達することができる。１つの実施例では、誘発因子の濃度は、０.１ng／ml〜１mg／ml、好適には１ng／ml〜５００ng／ml、より好適には１００〜２５０ng／mlである。この実施例はまた薬剤、たとえば抗生物質、他の成長因子、たとえばＥＧＦ，ＰＤＧＦおよびbＦＧＦをＴＳ中に含むことができる。軟骨誘発物質は適した濃度で、ＴＳ製造に使用されるフィブリノーゲン、トロンビン、カルシウムまたは水成分中に含まれる。
【０３０３】
補足ＴＳは、移植前に所望の最終軟骨に予め形成するかまたはＴＳを被移植者の体内に、当該ＴＳが混合され重合される液体形で移植することができる。得られた形態は、次いで所望の形態に加工して、必要な軟骨に適した形態を得ることができる。軟骨誘発ＴＳ(ＣＩ−ＴＳ)混合物を用いて、従来からのインプラントに予め被覆することができ、生きた軟骨を有する従来形のインプラントを得ることができる。
【０３０４】
前記した任意の技術を用い、ＣＩ-ＴＳを次いで被移植者の体内に移植する。
この移植は異所または正位とすることができる。適当な間隔ののち、ＣＩ-ＴＳは、当初のＣＩ-ＴＳインプラントの形態の生存軟骨によって置き換えられる。
かかるインプラントを用いて、損傷した軟骨または失った軟骨を置換することができ、また人工インプラントの組織との一体性や機能を改善することができる。かかる用途の例示には、鼻組織や耳組織の置換または再構築、イン・ビボにおいて成長した骨インプラント上の機能的連結面の形成、人工インプラント上の同様な表面の形成が包含される。リウマチ性間接炎などの疾患によって損傷した軟骨の修復も、ＣＩ-ＴＳを用い、当該間接に新規で滑らかな軟骨面を形成することができる。プラスチック／再構築外科手術における空間充填用途を意図したインプラントは、ＣＩ-ＴＳから形成するか、またはＣＩ-ＴＳを被覆して組織の一体性を向上させて異物反応を減少させることができる。
【０３０５】
現在の技術では、制御された軟骨の再構築は不可能であるため、本発明は、身体の構造を完全に模写することが必要な軟骨組織の形成が可能である点で、充分に進歩性を有するものである。これは、整形外科的用途や他の用途の両方について、間接や人工間接や他のインプラントの改善された修復をもたらすことができる。
【０３０６】
たとえば、この実施例を用いて、外傷性損傷、先天性損傷もしくは病原性損傷の軟骨または機能不全の軟骨について、改善された整形外科インプラントや、改善されたプラスチック／再構築インプラントを形成でき、またペースメーカーインプラントおよびワイヤーの被膜を形成して組織の一体性を増加させるとともに異物反応を減少させることができる。同様な軟骨も、同様な目的のために任意の移植可能な器具に適用することができる。
【０３０７】
実施例２０
自己充足性ＴＳ傷用包帯 
この実施例は、自己充足性ＴＳ包帯またはバンデージ(bandage)であり、これは、ＦＧ成分のトロンビンとフィブリノーゲンの両方を含んでいる。カルシウムはトロンビンおよび／またはフィブリノーゲン成分のいずれかに含まれる。トロンビンまたはフィブリノーゲンのいずれかまたは一方は、成長因子、たとえばＦＧＦまたはbＦＧＦ、または薬剤、たとえば鎮痛剤、抗生物質または他の薬剤(これらは、感染を阻止し、傷の回復を促進しおよび／または傷跡の形成を阻止できる)を補足できるが、補足する必要性はない。補足物は、所期の目的、たとえば抗生物質で微生物の増殖を阻止したり、鎮痛剤で痛みを和らげたりするのに有効であるようなＴＳ中の濃度とする。
【０３０８】
トロンビンおよびフィブリノーゲンは、不浸透性膜で相互に分離し、１対として別の当該膜で被覆する。トロンビンおよびフィブリノーゲンは急速に蒸発するゲル(たとえばメチルセルロース／アルコール／水)中に含まれる。バンデージは、ゲルと接触するその表面を被覆して、使用の間に種々の位置でゲルパッドが残存するのを保証する(図３９参照)。
【０３０９】
処置に際し、２成分を分離する膜を除去して、２成分を混合する。次いで、外膜を除去し、バンデージを傷口にあてる。フィブリノーゲン製剤のトロンビンおよび他の成分の作用は、ＦＳの適用の場合と同様に、フィブリノーゲンをフィブリンへ変換させることである。これは、傷口からの出血や流体の損失を自発的に抑制し、また感染に対する天然のバリヤーを形成する。
【０３１０】
同様な実施例において、トロンビン成分および、トロンビンゲルとフィブリノーゲンゲルを分離するプラスック膜は、省略してもよい。予めトロンビンゲル中に存在するカルシウムは、所望によりフィブリノーゲンゲル中に含ませてもよく、含ませなくともよい。処置において、前記したように、不浸透性外膜を除去し、バンデージを傷口に直接あてる。トロンビンおよびカルシウムは当然傷口に存在し、前記したようにフィブリノーゲンのフィブリンへの変換を誘発するとともに、傷口からの出血や流体の損失を阻止する。この実施例は、簡易で安価で製造が容易である利点を有する。しかしながら、患者の傷に不充分なトロンビンが存在する状況がある。このような場合、本発明の先に記載の実施例を使用すべきである。
【０３１１】
この実施例は、成分の可溶化／混合に伴う時間の遅れが生じることなくＴＳの傷口への迅速な適用が可能である点で、現在実施の技術よりも、進歩性を有する。また、処置のため知識や熟練が不要である。これらの特徴によって、種々の分野で理想的に使用することができ、これらの分野として、兵士や救助作業や救急車／医学関係者のチームや消防士のための外傷用パックの用途や、一般公衆用の１次救助用キット、病院の緊急室職員による用途が挙げられる。小型の形態は一般公衆の用途に有用である。
【０３１２】
実施例２１ 
生体材料の表面被覆用としての補足ＴＳ 
この実施例は、補足ＴＳを、整形外科器具や動物体内へ移植される他の生体材料の表面被覆として使用する。これらの器具として、たとえば尿カテーテル、静脈カテーテル、縫合材、血管プロテーゼ、眼内レンズ、コンタクトレンズ、心臓弁、肩／ひじ／でん部／ひざ代替具、全人工心臓などが挙げられる。不幸にも、これら生体材料は、結局は動物の生命を危険にする臨床的感染につながりうる細菌付着やコロニー化の部位となる。この問題を最小にするため、生体材料に補足ＴＳを被覆する。
【０３１３】
この実施例において、ＴＳは成長因子、抗生物質などの薬剤、ＢＭＰおよび／または培養細胞などを補足することができる。ＴＳに組み込むことができる抗生物質の例示には、以下のものに制限されるものではないが、ペニシリン、セファロスポリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、メトロニダゾール、およびアミノグリコサイドが包含される。ＴＳに組み込むことができる成長因子の例示には、以下のものに制限されるものではないが、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ-βが包含される。ＴＳに組み込むことができるＢＭＰの例示には、以下のものに制限されるものではないが、ＢＭＰ１〜８が包含される。またＤＢＭをＴＳに添加することができる。ＴＳに組み込むことができる培養細胞の例示には、以下のものに制限されるものではないが、内皮細胞、骨芽細胞、線維芽細胞などが包含される。
【０３１４】
補足物は、トロンビン、フィブリノーゲン、カルシウムまたは水成分のいずれかに含めることができる。ＴＳ中の補足物の濃度は、所期の目的、たとえば、抗生物質によって生体材料上の微生物の増殖を抑制したり、成長因子によってＴＳ中および／または生体材料表面上に所望のセルタイプの増殖を誘発するのにに有効であるのに充分なものとする。
【０３１５】
本発明は、現存する生体材料製品を改善したもので、これには、チタンおよびチタン合金器具(たとえば、固定プレート、肩／ひじ／でん部／ひざ代替器具、骨一体歯科インプラントなど)、固体シリコン製品(たとえば、シラスチック鼻インプラント)、液体および／またはゲルシリコン製品(たとえば、乳房インプラント、こう丸インプラント)、および傷口の治療に通常の材料として使用される天然または合成ポリマーが包含され、またこれは、種々の形態をとることができ、たとえばモノフィラメント、線維アッセンブリイ(たとえば、綿、紙、不織布ファブリック)、フィルム、スポンジ、バッグなどが挙げられる。
【０３１６】
ＦＧは、次の３成分から製造することができる:フィブリノーゲン(たとえばＴＦＣとして)およびトロンビン(これら両者は凍結乾燥形とすることができる。)並びにカルシウム。凍結乾燥フィブリノーゲンは、滅菌水で再生できる一方、トロンビン成分は塩化カルシウム溶液で再生することができる。補足物は、混合前の３成分のいずれかに添加することができる。好適な容量のフィブリノーゲンとカルシウム含有トロンビンを混合して、ＦＧを製造する。次いで、ＦＧを生体材料の表面にその被膜として、たとえばスプレイ、塗装などにより適用する。別法として、インプラントを液体形のＦＧに浸漬処理する。補足物は、また生体材料表面に被覆する前後のＦＧに添加することもできる。たとえば、ＦＧ被覆インプラントを抗生物質溶液に所定の期間浸漬して、抗生物質をＴＳに分散させる。別の実施例では、培養細胞をフィブリン被膜に接種したのちに、インプラント器具にＴＳを被覆する。生体材料の被膜面は、動物内に移植されるが、これは、補足ＴＳとともに、以下のような種々の目的に有用である:生体材料に対する細菌付着の抑制、生体材料に付着した細菌増殖の抑制、局部的免疫刺激および／または正常化、傷治療の促進、生体材料の周囲組織への適合の促進。
【０３１７】
本発明の他の実施例も、本明細書記載の本発明の具体的な詳細を考慮に入れれば、当業者には明白である。種々の変形が当業者に明白であるため、本発明は、添付の請求の範囲に記載の範囲によってのみ制限されるものと、理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０３１８】
【図１】図１は、増加させた濃度のヘパリンの存在下でトロンビン２５０Ｕ／mlと共にＨＢＧＦ−１βをインキュベーションしたゲルのウエスタンブロットを示す。ＨＢＧＦ−１β(１０μg／ml)、トロンビン(２５０μg／ml)および増加させた濃度のヘパリン(０、０.５、５、１０、２０および５０単位／ml)を含む溶液を３７℃で７２時間インキュベーションした。各々のインキュベーション混合物からアリコートを定期的に回収し、レミリ(Nature２２７：６８０(１９７０))に記載のように調製し、走らせた８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに導入した。ゲルを、次いでニトロセルロース上に電気ブロットし、ＨＢＧＦ−１βに対応するバンドを、ＨＢＧＦ−１βに対する親和性精製ポリクローナルウサギ抗血清を使用して同定した。  インキュベーション混合物中のヘパリンの濃度は；パネルＡ）０単位／ml；パネルＢ）０.５Ｕ／ml；パネルＣ）５Ｕ／ml；パネルＤ）１０Ｕ／ml；パネルＥ）２０Ｕ／ml；およびパネルＦ）５０Ｕ／mlであった。各々のパネルＡ−Ｆに図示したゲルにおいて、各々のレーンは以下を含む：レーン１はＳＤＳ−ＰＡＧＥ低分子量標準を含む；レーン２はビオチニル化標準を含む；レーン３は１０μg／mlＨＢＧＦ−１βを含む；レーン４は２５０Ｕ／mlトロンビンを含む；およびレーン５−１３は０、１、２、４、６、８、２４、４８および７２時間にインキュベーション混合物から回収したサンプルを含む。
【図２】図２は、相対的ＨＢＧＦ−１β濃度の関数としての3Ｈ−チミジン取り込みを示す。ＨＢＧＦ−１βのサンプルを、図１および実施例２に記載のように、トロンビン２５０Ｕ／mlおよびヘパリン５Ｕ／mlの存在下、０、２４または７２時間インキュベーションした。これらのサンプルの希釈を、次いでＮＩＨ ３Ｔ３細胞に加え、それを実施例３に記載のように置いた。ＣＰＭは、ＨＢＧＦ−１濃度に対してプロットする。
【図３】図３は、活性、野生型ＦＧＦ−１ １００ng／ml補足ＦＧ上で７日間培養した後のヒト臍帯静脈内皮細胞の典型的なパターンである。多数の細胞およびその伸長した形に注目する。非補足ＦＧ上で成育させた少数の細胞と比較する(図５)。
【図４】図４は、活性、野生型ＦＧＦ−１ １０ng／ml補足ＦＧ上で７日間培養した後のヒト臍帯静脈内皮細胞の典型的なパターンである。多数の細胞およびその伸長した形に注目する。非補足ＦＧ上で成育させた少数の細胞と比較する(図５)。
【図５】図５は、非補足ＦＧ上で７日間培養した後のヒト臍帯静脈内皮細胞の典型的なパターンである。少数の細胞に注目し、図３および４の細胞数と比較すると、それは遅い増殖速度を示唆する。
【図６】図６は、不活性、変異体ＦＧＦ−１ １００ng／ml補足ＦＧ上で７日間培養した後のヒト臍帯静脈内皮細胞の典型的なパターンである。少数の細胞に注目し、図３および４の細胞数と比較すると、それは遅い増殖速度を示唆する。
【図７】図７は、１０5細胞／ＦＧmlの濃度でＦＧに着床させた２４時間後のヒト臍帯静脈内皮細胞の典型的なパターンである。ＦＧのタンパク質およびトロンビンの濃度は、それぞれ４mg／mlおよび０.６ＮＩＨ単位／mlであった。その伸長した、多足形態に注目し、それらは違いに接触している場所で細胞ネットワークを形成した。フィブロネクチン中で成育した同様の細胞の敷石状形と比較する(図９)。
【図８】図８は、１０5細胞／ＦＧmlの濃度でＦＧに着床させた４８時間後のヒト臍帯静脈内皮細胞の典型的なパターンである。培養条件は図７で記載したとおりであった。その更に強調された、伸長および多足形態および発達した細胞ネットワークの発展の増加に注目する。フィブロネクチン中で成育した細胞の敷石状形と比較し(図１０)、後者が細胞性ネットワークに欠けることに注目する。
【図９】図９は、フィブロネクチンで覆われた表面で成育させた２４時間後のヒト臍帯静脈内皮細胞の典型的なパターンである。敷石状の形および細胞ネットワークの欠如に注目する。図７と比較する。
【図１０】図１０は、通常使用されるフィブロネクチンのフィルム中で成育させた４８時間後のヒト臍帯静脈内皮細胞の典型的なパターンである。敷石状の形および細胞ネットワークの欠如に注目する。図８と比較する。
【図１１】図１１は、イヌから外移植したＰＴＦＥ血管移植片の７日後(パネルＡ、Ｃ、Ｅ)または２８日後(パネルＢ、Ｄ、Ｆ)の交差部位の顕微鏡写真である。移植の前に移植片は未処理(ＡおよびＢ)、ＦＧ単独で被覆(ＣおよびＤ)またはヘパリンおよびＨＢＧＦ−１補足ＦＧで被覆(ＥおよびＦ)の何れかであった。  未処理対照(ＡおよびＢ)は、最小間葉組織内成育を示し、両方の間隙は満たされ、それらの管腔表面は、フィブリン凝固物により覆われていた。ＦＧ−処理移植片は、間葉組織内成育を僅かに移植片の間隙の外半分でのみ示し、残りはフィブリン凝固物で満たされていた。非常に少ない間隙毛細管が存在した。比較して、ＦＧＦ−１含有ＦＧで処理した移植片は、更に豊富な間隙内部成育を示し、２８日までに多くの毛細管、筋線維芽細胞およびマクロファージを示し、筋線維芽細胞の数層からなる内部カプセルは、コンフルエント内皮細胞層に近付いた。移植１２８日後の同じ移植片の結果は同様であり、より多数の毛細管がＦＧ＋ＦＧＦ−１群であった(データは示していない)。
【図１２】図１２は、図１１で記載した移植２８日後の血管移植片の内部裏層の走査電子顕微鏡である。移植片は、未処理(Ｇ)、ＦＧ単独で被覆(Ｈ)またはヘパリンおよびＨＢＧＦ−１補足ＦＧで被覆(Ｉ)の何れかであった。未処理対照移植片(Ｇ)は、赤血球、血小板を含む血栓の内皮細胞範囲中心領域の希薄な領域、および暴露ＰＴＦＥ移植片材料の領域(図１１の中心および上に見ることができる)を示した。  ＦＧ単独で被覆された移植片(Ｈ)は、フィブリン凝固物の内皮細胞中心領域の島を示した。比較して、ＦＧ＋ＦＧＦ−１で処理した移植片は、血流の方向に沿って配置されたコンフルエント内皮細胞を示した。
【図１３】図１３は、アルミニウム鋳型を使用して製造した１mm厚および８mm直径のディスク型移植片の製造を示す。
【図１４】図１４は、ＤＢＭ単独、ＦＧ移植片またはＤＢＭ−ＦＧによるラットにおける骨形成の誘発の筋肉内生物検定を説明する図表である。
【図１５】図１５は、ＤＭＢ−ＦＧによる頭頂部移植片における骨形成の誘発を説明する図表である。
【図１６】図１６は、ＤＢＭ−ＦＧ、ＤＢＭまたはＦＧの筋肉内移植手術後２８日の放射線不透性データである。
【図１７】図１７は、手術後２８日、３カ月および４カ月後のＤＢＭ−ＦＧ(３０mg／ml)頭頂部移植片の放射線不透性データである。
【図１８】図１８は、Ａは、処理動物の手術後２８日の開頭部位の写真である。Ｂは、未処理対照の手術後２８日頭頂部傷の写真である。頭頂部傷に沿って、線維性結合組織のみが発達していることに注目する。
【図１９】図１９は、ＤＭＢ粒子のみで処理した動物の頭頂部傷の写真である。
【図２０】図２０は、ＤＢＭ−ＦＧ(１５mg／ml)に応答して頭頂部に形成された新しい骨の写真である。
【図２１】図２１は、ＤＢＭ−ＦＧ(１５mg／ml)に応答して頭頂部に形成された新しい骨の写真である。典型的に、ＤＢＭ移植片単独より、ＤＢＭ−ＦＧディスクを移植した頭頂部傷において、骨髄がより形成したことを注目する。
【図２２】図２２は、３×６mm直径のＦＧのディスクからの３７℃でのＴＥＴの遊離である。遊離ＴＥＴの濃度は、毎日取り換えるＰＢＳ２ml上清において分光光度的に測定した。これらのインビトロでの２回の「静止」実験は、別々の結果を導いた。その結果の一つをここに示す。
【図２３】図２３は、３×６mm直径のＦＧのディスクからの３７℃でのＴＥＴの遊離である。ディスクはＴＥＴ１００mg／mlを含み、ＰＢＳ２mlで満たした密封容器中に入れた。遊離ＴＥＴの濃度は、３ml／日の割合で連続して取り換えるＰＢＳ排出液において分光光度的に測定した。ＰＢＳ上清の用量は、常に約２mlに維持した。データは２回の実験の平均である。
【図２４】図２４は、５０または１００ＴＥＴmg／mlＦＧ含有３×６mm直径ディスクからの唾液へのＴＥＴの遊離である。ＴＥＴの濃度は、毎日取り換える唾液上清０.７５mlにおいて分光光度的に測定した。これらの実験に使用する唾液は、１０人の供給者から溜め、遠心し、濾過して４℃に維持した。
【図２５】図２５は、ＴＥＴなしならびに５０および１００mg／mlＴＥＴ有りの３×６mm直径ＦＧマトリックスの１５日間にわたる写真である。ＴＥＴ補足ＦＧの安定性は、対照ＦＧより増加した。ディスクは、毎日取り換える唾液０.７５ml中に維持した。唾液は１０人の供給者から溜めた。それを実験に使用する前に遠心し、濾過し、４℃に保存した。９日目に、ＴＥＴを含まないＦＧマトリックスが、ＴＥＴ５０または１００mg／ml何れかを含むマトリックスよりも衰えたことを注目する。１５日目に、ＴＥＴ非含有ＦＧマトリックスはほとんど完全に衰え、一方ＴＥＴ５０または１００mg／mlの何れかを含むＦＧマトリックスはほとんど変化しなかったことをまた注目する。したがって、ＴＥＴ５０または１００mg／mlの含有は、インビボで唾液内のＦＧマトリックスの寿命を劇的に延長する。
【図２６】図２６は、ＴＥＴ補足ＦＧから遊離したＴＥＴの抗菌活性を示す。３×６mmＴＥＴ補足ＦＧディスクを囲む２mlのＰＢＳを毎日取り換えた。遊離ＴＥＴの抗菌活性を試験するために、回収した溶出液で飽和した６mm紙ディスクを、大腸菌を含む寒天プレート上で３７℃で１８時間インキュベーションした。次いで、阻害区域の直径を測定した。
【図２７】図２７は、ＦＧマトリックスからのシプロフロキサシン、アミノキシチリンおよびメトロニダゾールの遊離を示す。別々の、各々の抗生物質１００mlを含む３×６mm直径のディスクをリン酸緩衝化食塩水２ml中に浸した。上清を毎日取り換え、抗生物質濃度をそれぞれ２７５、２７４および３２０nmで分光光度的に測定した。
【図２８】図２８は、ＴＥＴ補足ＦＧディスクからのＴＥＴの遊離が、ＴＥＴ−ＦＧディスクのＰＢＳ浴の温度に比例したことを示す。
【図２９】図２９は、ＴＥＴ−ＦＧからのＴＥＴの遊離におけるＦＧタンパク質濃度の効果を示す。高いＦＧタンパク質濃度は、ＴＥＴ−ＦＧからの遅いＴＥＴの遊離をもたらすことに注目する。
【図３０】図３０は、５−ＦＵ補足ＦＧからの５−ＦＵの遊離は、５−ＦＵの固体形を使用することにより延長した。
【図３１】図３１は、ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞のフィブロネクチンに対する走化性反応の用量依存関係を示す。フィブロネクチンの濃度増加の段階勾配を、変形ボイデンチャンバーの低いウェルに加えた。データは、ハイパワー領域当たりの移動細胞の平均±Ｓ.Ｅ.として示し、用量の関数として、フィブロネクチンはＮＩＨ ３Ｔ３細胞のそれに向かう走化性を誘発することを証明する。
【図３２】図３２は、ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞のＦＧＦ−１に対する走化性反応の用量依存関係を示す。ＦＧＦ−１の濃度増加の段階勾配を、ヘパリン存在下で、変形ボイデンチャンバーの低いウェルに加えた。データは、ハイパワー領域当たりの移動細胞の平均±Ｓ.Ｅ.として示し、用量の関数として、ＦＧＦ−１はＮＩＨ ３Ｔ３細胞のそれに向かう走化性を誘発することを証明する。
【図３３】図３３は、ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞のＦＧＦ−２に対する走化性反応の用量依存関係を示す。ＦＧＦ−２の濃度増加の段階勾配を、変形ボイデンチャンバーの低いウェルに加えた。データは、ハイパワー領域当たりの移動細胞の平均±Ｓ.Ｅ.として示し、用量の関数として、ＦＧＦ−２はＮＩＨ ３Ｔ３細胞のそれに向かう走化性を誘発することを証明する。
【図３４】図３４は、ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞のＦＧＦ−４に対する走化性反応の用量依存関係を示す。ＦＧＦ−４の濃度増加の段階勾配を、ヘパリン存在下で、変形ボイデンチャンバーの低いウェルに加えた。データは、ハイパワー領域当たりの移動細胞の平均±Ｓ.Ｅ.として示し、用量の関数として、ＦＧＦ−４はＮＩＨ ３Ｔ３細胞のそれに向かう走化性を誘発することを証明する。
【図３５】図３５は、ヒト皮膚線維芽細胞(ＨＤＦ)のＦＧＦ−１に対する走化性反応の用量依存関係を示す。ＦＧＦ−１の濃度増加の段階勾配を、ヘパリン存在下で、変形ボイデンチャンバーの低いウェルに加えた。データは、ハイパワー領域当たりの移動細胞の平均±Ｓ.Ｅ.として示し、用量の関数として、ＦＧＦ−１はＨＤＦのそれに向かう走化性を誘発することを証明する。
【図３６】図３６は、ＨＤＦのＦＧＦ−２に対する走化性反応の用量依存関係を示す。ＦＧＦ−２の濃度増加の段階勾配を、変形ボイデンチャンバーの低いウェルに加えた。データは、ハイパワー領域当たりの移動細胞の平均±Ｓ.Ｅ.として示し、用量の関数として、ＦＧＦ−２はＨＤＦのそれに向かう走化性を誘発することを証明する。
【図３７】図３７は、ＨＤＦのＦＧＦ−４に対する走化性反応の用量依存関係を示す。ＦＧＦ−４の濃度増加の段階勾配を、変形ボイデンチャンバーの低いウェルに加えた。データは、ハイパワー領域当たりの移動細胞の平均±Ｓ.Ｅ.として示し、用量の関数として、ＦＧＦ−４はＨＤＦのそれに向かう走化性を誘発することを証明する。
【図３８】図３８は、ＨＤＦのＦＧＦ−４に対する走化性反応の溶液中およびＦＧ中の用量依存関係を示す。ＦＧＦ−４をＦＧ中へ取り込み、走化性チャンバーの下部ウェルにおく。ＦＧ中のＦＧＦ−４の用量は、ＦＧおよび中および低チャンバーを通って均等に分散した場合、示唆する濃度をもたらすのに十分であった。陰性対照は培地のみおよびＦＧを含み、ＦＧＦを含まない。低チャンバーでＦＧＦ−４ １０ng／ml含有する培地は、陽性対照として使用した。データは、ハイパワー領域当たりの移動細胞の平均±Ｓ.Ｅ.として示し、用量の関数として、ＦＧＦ−４はＨＤＦのそれに向かう走化性を誘発することを証明する。
【図３９】図３９は、自己充足ＴＳ傷周辺の図表である。
【図２】
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【図５】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２５】
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