(57)【要約】【課題】  不飽和脂肪酸レベルが変化した植物油の提供【解決手段】  脂肪酸デサチュラーゼ酵素をコードする核酸断片の単離および使用が開示される。本発明は植物脂質組成を変更することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結されている単離された核酸断片であって、
（ｉ）配列番号１，３，５，７もしくは１５に示されるヌクレオチド配列を有する核酸断片、および
（ｉｉ）（ｉ）に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含んでなる核酸断片
からなる群より選ばれる単離された核酸断片、または
形質転換される植物における内因性のデルタ−１２デサチュラーゼ活性のアンチセンス阻害もしくはセンス抑制に有用な該核酸断片の一部、
を含むキメラ遺伝子で植物細胞を形質転換する工程、
（ｂ）工程（ａ）の形質転換された植物細胞から繁殖力のある植物を生育させる工程、
（ｃ）変化したレベルの不飽和脂肪酸について工程（ｂ）の繁殖力のある植物から子孫の種子をスクリーニングする工程、
（ｄ）工程（ｃ）の子孫の種子を加工して不飽和脂肪酸レベルの変化した脂肪酸を含有する種子油を取得する工程、
を含んで成る不飽和脂肪酸レベルの変化した脂肪酸を含有する種子油の生産方法。
【請求項２】
植物細胞が、大豆、菜種種子、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、ココア、ベニバナ、ココナッツ、アブラヤシ、アマ、およびピーナッツからなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項３】
（ａ）の単離された核酸断片が、大豆、菜種種子、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、ココア、ベニバナ、ココナッツ、アブラヤシ、アマ、およびピーナッツからなる群より選ばれる植物から単離される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
種子の脂肪酸含量が、少なくとも８０％の含量のオレインサンおよび５％以下の含量のパルミチン酸とステアリン酸の混合物を含んでなるブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の種子。
【請求項５】
少なくとも８０％の含量のオレインサンおよび５％以下の含量のパルミチン酸とステアリン酸の混合物を含んでなる、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の種子から得られる油。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物の脂質組成を改変する脂質酸デサチュラーゼ酵素をコードする核酸断片の調製および使用に関する。特に、本発明は、そのような核酸断片および適当な調節配列を含むキメラ遺伝子は不飽和脂質酸のレベルが変化したトランスジェニック植物を作成するための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物性の脂質は工業用および食用の広い用途を有し、そして植物膜機能および気候的適用の中心である。これらの脂質は莫大な化学構造の配列を表し、そしてこれらの構造が脂質の生理学的および工業的性質を決定している。これらの構造の多くは、脂質の不飽和度を変化させる直接的または間接的のいずれかの代謝過程で生じたものである。種々の植物中で種々の代謝型によりこれら変化した脂質が生成し、そして所望する脂質を大量に経済的に生産するためには通常、外来種の栽培植物化または作物学的な適合種の改良のいずれかが必要とされる。
【０００３】
植物性脂質の主な用途はトリアシルグリセロールの状態の食用油である。食用油の特別な高機能性および健康的貢献度は、その脂肪酸組成により主として決定される。様々な商用植物品種由来のほとんどの植物油は主にパルミチン酸（１６：０）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）およびリノレン酸（１８：３）である。パルミチン酸およびステアリン酸はそれぞれ１６−および１８−炭素長の飽和脂肪酸である。オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸はそれぞれ１つ、２つおよび３つの二重結合を含む１８−炭素長の不飽和脂肪酸である。オレイン酸はモノ−不飽和脂肪酸と呼ばれるが、リノール酸およびリノレン酸はポリ−不飽和脂肪酸と呼ばれる。通常使用される食用植物油中の飽和および不飽和脂肪酸の相対量を下の表に要約する（表１）：
【０００４】
【表１】
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最近の多くの研究努力により、飽和および不飽和脂肪酸の冠状心臓疾患の危険性を減少する役割が調査された。過去にはモノ−不飽和脂肪酸は、飽和およびポリ−不飽和脂肪酸と比較して血清コレステロールおよび冠状心臓疾患の危険性には効果が無いと思われて来た。幾つかの最近のヒトに関する臨床的な研究では、モノ−不飽和脂肪が高く、そして飽和脂肪が低い食事は“悪性”（低密度リポタンパク質）コレステロールを減少し、一方“良性”（高−密度リポタンパク質）コレステロールを維持することを示唆している（非特許文献１参照）。
【０００５】
総飽和物が低く、そしてモノ−不飽和物が高い植物油は有意に健康的な利点を消費者に提供し、そして油生産者には経済的な利点を提供する。例として、カノーラ油は大変健康的な油であると考えられている。しかし使用においては、カノーラ油中の高レベルのポリ−不飽和脂肪酸が油を不安定にし、容易に酸化させ、そして不快臭および不快な風味を発生し易くする（非特許文献２、非特許文献３参照）。ポリ−不飽和物のレベルは水素化により減少できるが、この工程は高価であり、そして栄養的に問題がある残りの不飽和脂肪酸のトランス異性体の同時生成により、総体的に水素化された油は望ましくなくなる（非特許文献４参照）。同様な問題は大豆およびトウモロコシ油でも存在する。
【０００６】
特定の使用には、高レベルのポリ−不飽和物が望ましい。リノール酸塩およびリノレン酸塩はヒトの食事に必須な脂肪酸であり、これらの脂肪酸が高い食用油は例えばベビーフードの栄養補助剤に使用できる。
【０００７】
いくつかの突然変異−育種プログラムでは、作物種の食用油中に見いだされるポリ−不飽和脂肪酸レベルの変更に成功した。商用的に生育させた植物の例は、高い（８５％）オレイン酸ヒマワリおよび低い（２％）リノレン酸アマである（非特許文献５参照）。表１に示す別の植物での同様な商業的方法は、方法の難しさ、ならびに植物ハーディネス（hardiness）および収量の増大に対する突然変異法の多様発現性作用に起因して大変わかりにくい。
【０００８】
主な植物脂質の生合成について、多くの研究がそそがれてきた（非特許文献６参照）。これらの研究では、可溶性のステアロイル−アシルキャリアータンパク質デサチュラーゼは特に除外すると、不飽和脂肪酸の生成段階の調節は主に膜−結合脂肪酸デサチュラーゼにより触媒されている。不飽和化反応はガラクトリピッド、スルホリピッドおよびホスホリピッドを含む様々な基質を使用してプラスチドおよび少胞体中で起こる。様々な脂肪酸不飽和化反応を欠失しているアラビドプシス  サリアナ（Arabidopsis thaliana）の核突然変異体の遺伝的および生理学的分析は、これらの反応のほとんどが植物中の単一の遺伝子座でコードされている酵素により触媒されていることを示している。さらにこの分析では、脂肪酸不飽和化の様々な欠失には深い意味があり、そして植物の超−構造的形態学、低温感受性および光合成能に影響を及ぼしうることを示している(非特許文献７参照)。しかしデサチュラーゼ反応の生化学的特徴付けは不十分なものであった。酵素の不安定性およびその適切なアッセイの行い難さから、研究者は粗膜調製物中の酵素活性を調査するのに限界があった。しかしこれらの調査により、２−オレイル−ホスファチジルコリンおよび２−リノレオイル−ホスファチジルコリンから、それぞれリノレートおよびリノレネートの生成におけるデルタ−１２デサチュラーゼおよびデルタ−１５デサチュラーゼ活性の役割が明らかにされた（非特許文献８参照）。したがって遺伝子工学により脂質不飽和化のレベルを変えるために、これらの酵素活性を修飾することは魅力のある目的である。
【０００９】
酵母、ラットおよびマウス由来のミクロソーム  デルタ−９ステアロイル−コエンザイム−Ａデサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列も記載されている（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１参照）。高等植物由来の可溶性のデルタ−９ステアロイル−アシルキャリアータンパク質デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列も記載さ
れている（非特許文献１２、非特許文献１３参照）。コリアンダー(coriander)植物由来の可溶性脂肪酸デサチュラーゼ（そのアミノ酸配列はステアロイル−アシルキャリアータンパク質デサチュラーゼのアミノ酸配列と高度に同一であり、そしてペトロセリン脂肪酸（１８：１、６ｃ）中に二重結合を導入する原因である）をコードするヌクレオチド配列も記載されている［非特許文献１４参照］。ラン色細菌（cyanobacterium）、シネコシステス（Synechocystis）ＰＣＣ６８０３由来の２つの脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子は記載されている。その１つはｄｅｓＡと命名され、そしてオレイン酸をガラクトリピッドのｓｎ−１位置でリノール酸に転換するのを触媒する脂肪酸デサチュラーゼをコードし［非特許文献１５参照］、もう１つはリノール酸をガラクトリピッドのｓｎ−１の位置でγ−リノレン酸（１８：２、６ｃ、９ｃ）に転換することを触媒するデルタ−６脂肪酸デサチュラーゼをコードする［特許文献１参照］。高等植物の膜−結合ミクロソームおよびプラスチドデルタ−１５脂肪酸デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列も記載されている［特許文献２参照、非特許文献１６参照］。可溶性デルタ−６およびデルタ−９デサチュラーゼならびに膜−結合（ミクロソームおよびプラスチド）デルタ−１５デサチュラーゼ以外の脂肪酸デサチュラーゼをコードする高等植物遺伝子の単離に関する報告は無い。可溶性デサチュラーゼ間には広範囲のアミノ酸配列の同一性が、ならびに高等植物ミクロソームおよびプラスチドデルタ−１５デサチュラーゼ間には有意なアミノ酸配列同一性がある一方、可溶性と膜−結合デサチュラーゼ間には有意な相同性が無い。ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼについては、デルタ−１５デサチュラーゼをコードする配列に基づく配列−依存的手法は配列をクローニングするのには成功しなかった。例えばハイブリダイゼーションプローブとしてのミクロソームまたはプラスチドデルタ−１５デサチュラーゼのヌクレオチド配列は、植物ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼのクローンを単離するのに成功しなかった。さらにプラスチドデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼを単離するために、高等植物の１２アミノ酸（これはすべての植物デルタ−１５デサチュラーゼと同一であり、そしてラン色細菌のｄｅｓＡデサチュラーゼに高度（１０／１２）に保存されている）に伸長するように作成した縮退オリゴヌクレオチドの１組をハイブリダイゼーションプローブとして使用したが、この方法はミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡの単離に失敗した。さらに高等植物デルタ−１５とｄｅｓＡデサチュラーゼ間に保存されているアミノ酸に伸長するように作成したＰＣＲプライマーを使用した植物ＤＮＡ、植物ＲＮＡまたは植物ｃＤＮＡライブラリー由来のポリメラーゼ鎖連鎖反応生成物を使用することによるミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼの単離は成功しなかった。したがって植物ミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼまたは植物脂肪酸デサチュラーゼ−関連酵素の単離を可能にする技術は無い。さらにデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼまたはヒドロキシラーゼをコードする核酸を使用して植物中のデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼまたは��ドロキシル化のレベルを制御する方法に関する証拠はない。
【００１０】
重要でない植物脂質の生合成はさらに研究されていない。何百もの様々な脂肪酸（多くは植物界から）が見いだされたが、すべての植物のわずかな分画のみがその脂質含量について調査された（非特許文献１７参照）。したがってこれらの変わった脂肪酸および脂肪酸誘導体の生合成については知られていない。そのような脂肪酸に見られる興味深い化学的特徴は、例えばアレン形かつ共役二重結合、アセチレン形結合、トランス二重結合、多二重結合、および多くの位置での単一二重結合、ならびに脂肪酸鎖に沿った配置である。同様に変わった脂質中に見られる多くの構造的修飾（例えばヒドロキシル化、エポキシ化、環状化など）は不飽和化による脂肪酸の化学的活性化後の代謝を介してさらに作成されるか、あるいはそれらは不飽和化と機構的に同様な化学反応に関与していることによる。そのような特徴をその構造中に持つ多くのこれらの脂肪酸および誘導体は、もし作物学的に生育能力のある種が適当なデサチュラーゼをコードする遺伝子の導入によりそれらの合成を誘導できるなら、商業的に有用であると証明できるだろう。特に興味深いのは１２−ヒドロキシオクタデカ−９−エン酸（リシノール酸）が豊富な植物油である。リシノール酸およびその誘導体は滑剤、ポリマー、化粧品、被覆剤および医薬品の製造において広く
使用されている（例えば非特許文献１８参照）。リシノール酸の唯一の商用源はひまし油であり、そして米国で使用されているひまし油の１００％が世界中、主にブラジルで生育されている豆由来のものである。カスター豆中のリシノール酸はオレイン酸のデルタ−１２位にヒドロキシル基を付加することにより合成される（非特許文献１９参照）。この反応はオレエートをデルタ−１２位で不飽和化してリノレートを生じることができるメカニズムの初期反応に似ている。なぜなら大腸菌のヒドロキシデカノイルデヒドラーゼに類似した酵素活性により１２−ヒドロキシオクタデカ−９−エン酸の脱水がリノール酸の形成を生じるからである（非特許文献２０参照）。真核生物での一般的な酵素−触媒不飽和化の部分であるヒドロキシル化反応の証明は、ステアリン酸のデルタ−９位の炭素を硫黄原子に置換することにより得られた。酵母細胞抽出物と一緒にインキュベーションした時、チオステアレートは９−スルホキシドに転換した（非特許文献２１参照）。このスルホキシド化はデルタ−９位の硫黄に特異的であり、そして酵母デルタ−９デヒドラーゼ欠失突然変異体では起こらなかった（非特許文献２２参照）。この９−スルホキシドは９−ヒドロキシオクタデカステアレートの硫黄類似体であり、ステアレート不飽和化の提案されている中間体である。
【００１１】
カスター豆細胞中のオレイン酸のレシノール酸へのヒドロキシル化は、植物中のオレイン酸塩のミクロソーム不飽和化と同様に、ミクロソーム中でホスファチジルコリンのｓｎ−２で脂肪酸のデルタ−１２位で起こる（非特許文献２３参照）。さらにカスターオレエートデルタ−１２ヒドロキシル化および植物オレエートミクロソームデルタ−１２不飽和化の両方が鉄錯体で阻害され、そして分子酸素を必要とする[非特許文献２４、非特許文献２５参照］。これらの生化学的な類似性は、シトクロームｂ５に対して生成した抗体が完全にベニバナミクロソーム中のオレエートデルタ−１２不飽和化およびカスターミクロソーム中のオレエートデルタ−１２ヒドロキシラーゼの両方の活性を完全に阻害するという観察［非特許文献２６参照］に関連し、ヒドロキシラーゼおよびデサチュラーゼが機能的に関連しているという強力な証拠を含むものである。したがって植物デルタ−１２デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列が、配列−依存的な手法によってカスターからオレエートヒドロキシラーゼ遺伝子をクローニングするのに有用となることを推定することは合理的であるように思われる。例えばデルタ−１２デサチュラーゼ間に保存されたアミノ酸領域またはデルタ−１２と他のデサチュラーゼとの間に保存された領域に基づくオリゴマーまたはデルタ−１２デサチュラーゼと既知の膜−結合ヒドロキシラーゼとの間に保存されたアミノ酸に基づいたオリゴマーでカスターＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによる。カスターオレエートヒドロキシラーゼｃＤＮＡを、配列依存的手法と“確認（differential）”ライブラリー研究法とを組み合わせることにより単離することはより効率的となるだろう。そのような確認ライブラリーの例がカスター種子の様々な発生段階に基づくのは、リシノール酸は大変若いカスター種子では合成されず（１２ＤＡＰ未満、非特許文献２７参照のスキームの第Iおよび第II段階の種子に対応する）、この初期段階の２０日後にリシノレート含有率は０％から全種子脂肪酸の９０％に上昇するからである（非特許文献２８,非特許文献２９参照）。したがってリシノール酸が高率で合成されている時の段階で存在するｍＲＮＡで作成したｃＤＮＡ確認ライブラリーを作ることは可能となったが、その中からは初期段階に存在するｍＲＮＡは除去されていた。初期段階のｍＲＮＡについては、リシノール酸は合成されないが別の不飽和脂肪酸は合成されている第２段階（１０ＤＡＰ）が適当である。ディファレンシャリーに（differentially）発現した遺伝子を含むライブラリーの構築は当該技術分野で周知である(非特許文献３０参照)。リシノイル−ＣｏＡを介する遊離リシノール酸のトリアシルグリセロールへの構成はカノーラおよびベニバナ種子ミクロソームにより容易に触媒され（非特許文献３１参照）、そしてリシノール酸は調査したすべてのオイルシードに共通のリパーゼによりホスファチジルコリンから除去される。したがって油穀物（oil crop：カノーラ種子および大豆のような）中でのカスター豆オレエートヒドロキシラーゼ遺伝子の発現は、リシノール酸を含有するトリグリセリドが豊富な油を生成すると期待される。
【特許文献１】国際特許出願公開第9306712号パンフレット
【特許文献２】国際特許出願公開第9311245号パンフレット
【非特許文献１】Mattsonら、Journal of Lipid Research(1985)26:194-202
【非特許文献２】Gailliard,1980、第４巻、第８５−１１６頁
【非特許文献３】Stumpf,P.K.編集、植物の生化学（Biochemistry of Plants）、アカデミック出版（Academic Press、ニューヨーク
【非特許文献４】Mensinkら、New England J.Medicine(1990) N323:439-445
【非特許文献５】Knowles,(1980)、第３５−３８頁：Applewhite,T.H.編集、脂肪および油の産業的応用に関する生化学についての世界会議（World Conferanceon Biotechnology for the Fats and Oils Industry Proceedings）、米国油脂化学者学会
【非特許文献６】Browseら、Ann.Rev.Plant Physiol.Mol.Biol.(1991)42:467-506
【非特許文献７】Ohlroggeら、Biochim. Biophys.Acta(1991)1082:1-26
【非特許文献８】Wangら、Plant Physiol.Biochem.(1988)26:777-792
【非特許文献９】Stukeyら、J.Biol.Chem.(1990)265:20144-20149
【非特許文献１０】Thiedeら、J.Biol.Chem.(1986) 261:13230-13235;
【非特許文献１１】Kaestnerら、J.Biol.Chem．(1989)264:14755-1476
【非特許文献１２】Thompsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)88:2578-2582;
【非特許文献１３】Shanklinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)88:2510-2514
【非特許文献１４】Cahoonら、(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11184-11188
【非特許文献１５】Wadaら、Nature(1990)347:200-203
【非特許文献１６】Arondel,V.ら(1992)Science258:1353-1355
【非特許文献１７】Gunstoneら、編集(1986)、脂質ハンドブック（The Lipids Handbook）、ChapmanおよびHall社、ケンブリッジ
【非特許文献１８】Gunstoneら、編集(1986)、脂質ハンドブック、ChapmanおよびHall社、ケンブリッジを参照にされたい
【非特許文献１９】Galliard & Stumpf(1966)J.Biol.Chem.241:5806-5812
【非特許文献２０】Cronanら、(1988)J.Biol.Chem.263:4641-4646
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【非特許文献２６】Somerville,C.(1992)MSU-DOE Plant Research LaboratoryAnnual Report
【非特許文献２７】Greenwood & Bewley,Can.J.Bot.(1982) 60:1751-1760
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【非特許文献３１】Baforら、Biochem.J.(1991)280:507-514、Wibergら、第１０回植物脂質の代謝、構造および機能に関するシンポジウム（10th International Symposiumon the Metabolism,Structure & Function of Plant Lipids）(1992),Jerba,Tunisia
【発明の開示】
【００１２】
植物中の不飽和脂肪酸の性質およびレベルを調節するための手段を見いだした。脂肪酸デサチュラーゼをコードするｃＤＮＡまたは遺伝子由来の核酸断片をキメラ遺伝子を作成するために使用する。このキメラ遺伝子は種々の植物を形質転換して植物の、または植物により生産された油産物の脂肪酸組成を変化させるために使用できる。より詳細には本発明の１つの態様は、配列番号１、３、５、７、９、１１または１５によりコード化された
ポリペプチドとアミノ酸同一性がそれぞれ５０％、６０％、９０％またはそれより高い脂肪酸デサチュラーゼあるいは脂肪酸デサチュラーゼ−関連酵素をコードする配列を含んで成る単離核酸断片である。より特別には本発明は植物ミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼまたはデサチュラーゼ−関連酵素の遺伝子配列に関する。この態様の植物はより具体的には大豆、脂肪種子ブラッシカ（Brassica）種、アラビドプシス  サリアナ（Arabidopsis thaliana）、ひまし油およびトウモロコシであることができる。
【００１３】
本発明の別の態様にはこれらの核酸断片を配列依存的な手法に使用することを含む。例には他の脂肪酸デサチュラーゼまたは脂肪酸デサチュラーゼ−関連酵素をコードするヌクレオチド配列を単離するためのハイブリダイゼーションプローブとしての断片の使用を含む。関連する態様には開示された配列を他の脂肪酸デサチュラーゼまたは脂肪酸デサチュラーゼ−関連酵素をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ断片の増幅のために使用することを含む。
【００１４】
本発明の別の観点には形質転換した植物の種子中の脂肪酸組成を変更できるキメラ遺伝子を含み、その遺伝子は適当な制御配列に対して適当な方向で操作可能に連結した脂肪酸デサチュラーゼをコードする配列番号１、３、５、７、９または１５に定義する配列に関連した核酸断片、あるいはデサチュラーゼまたはデサチュラーゼ関連酵素をコードする配列番号１１の核酸断片を含んで成る。好適であるのはミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼまたはデサチュラーゼ−関連酵素をコードする核酸断片を含むキメラ遺伝子である。
【００１５】
本発明のさらに別の態様は、変化したレベルの不飽和脂肪酸を含む種子油を生産する方法を関し、その方法は；（ａ）植物細胞を上記キメラ遺伝子で形質転換し；（ｂ）工程（ａ）の形質転換した植物細胞からの性的に成熟した植物を生育させ；（ｃ）所望するレベルの不飽和脂肪酸のために工程（ｂ）の性的に成熟した植物からの継代種子をスクリーニングし、そして（ｄ）工程（ｃ）の継代種子を加工して不飽和脂肪酸レベルが変化している脂肪種子を得る、工程を含んで成る。好ましい植物細胞および油は、大豆、菜種種子、ヒマワリ、綿、ココア、ピーナッツ、ベニバナ、ココナッツ、アマ、アブラヤシおよびトウモロコシ由来のものである。そのような植物を形質転換する好適な方法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）のＴｉおよびＲｉプラスミド、電気穿刺法および高速弾道衝撃法がある。
【００１６】
本発明はまた、油生産植物種の種子油中の変化したオレイン酸レベルを得るためにＲＦＬＰ育種法にて具体化される。この方法は（ａ）オレイン酸特性が異なる２種類の油生産植物種を交配させ；（ｂ）交配から生成した幾つかの継代植物から単離した制限酵素消化ゲノムＤＮＡのサザンブロットを作成し；そして（ｃ）サザンブロットを脂肪酸デサチュラーゼまたはデサチュラーゼ−関連酵素をコードする放射線標識核酸断片とハイブリダイズさせることを含む。
【００１７】
本発明はまた、本明細書に記載する単離ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡまたは関連するゲノム断片を使用するＲＦＬＰマッピング法で具体化される。
【００１８】
また本発明は本明細書に記載されたキメラ遺伝子を含有することにより変化した脂肪酸デサチュラーゼレベルを生産できる植物により具体化される。さらに本発明はそのような植物から得られた種子油により具体化される。
【００１９】
[発明の詳細な記述]
本発明は本出願の一部を形成する以下の詳細な説明および配列に関する記載からより完全に理解できる。配列の記載については、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されている
ように（これは引用により本明細書に編入される）アミノ酸について３つの文字コードを含む。
【００２０】
配列番号１は、ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼをコードするアラビドプシス
サリアナ（Arabidopsis thaliana）ｃＤＮＡの１３７２塩基対の５’から３’へのヌクレオチド配列を表す。ヌクレオチド９３−９５およびヌクレオチド１２４２−１２４４は、それぞれ読み取り枠（ヌクレオチド９３−１２４４）の推定上の開始コドンおよび終止コドンである。ヌクレオチド１−９２および１２４５−１３７２はそれぞれ５’および３’非翻訳ヌクレオチドである。
【００２１】
配列番号２は読み取り枠（配列番号１のヌクレオチド９３−１２４４）から派生した３８３アミノ酸タンパク質配列である。
【００２２】
配列番号３はプラスミドｐＣＦ２−１６５ｄ中のミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼをコードするブラッシカ  ナプス（Brassica napus）ｃＤＮＡの１３９４塩基対の５’から３’へのヌクレオチド配列を表す。ヌクレオチド９９−１０１およびヌクレオチド１２４８−１２５０は、それぞれ読み取り枠（ヌクレオチド９９−１２５０）の推定上の開始コドンおよび終止コドンである。ヌクレオチド１−９８および１２５１−１３９４はそれぞれ５’および３’非翻訳ヌクレオチドである。
【００２３】
配列番号４は配列番号３の読み取り枠（ヌクレオチド９９−１２５０）から派生した３８３アミノ酸タンパク質配列である。
【００２４】
配列番号５はプラスミドｐＳＦ２−１６９Ｋ中のミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼをコードする大豆（グリシン  マックス：Glycine max）ｃＤＮＡの１３６９塩基対の５’から３’へのヌクレオチド配列を表す。ヌクレオチド１０８−１１０およびヌクレオチド１２４５−１２４７は、それぞれ読み取り枠（ヌクレオチド１０８−１２４７）の推定上の開始コドンおよび終止コドンである。ヌクレオチド１−１０７および１２４８−１３６９はそれぞれ５’および３’非翻訳ヌクレオチドである。
【００２５】
配列番号６は配列番号５の読み取り枠（ヌクレオチド１１３−１２５８）から派生した３８１アミノ酸タンパク質配列である。
【００２６】
配列番号７はプラスミドｐＦａｄ２＃１中のミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼをコードするトウモロコシ（ゼア  メイズ：Zea mays）ｃＤＮＡの１７９０塩基対の５’から３’へのヌクレオチド配列を表す。ヌクレオチド１６５−１６７およびヌクレオチド１３２６−１３２８は、それぞれ読み取り枠（ヌクレオチド１６４−１３２８）の推定上の開始コドンおよび終止コドンである。ヌクレオチド１−１６３および１３２９−１７９０はそれぞれ５’および３’非翻訳ヌクレオチドである。
【００２７】
配列番号８は配列番号７の読み取り枠（ヌクレオチド１６４−１３２８）から派生した３８７アミノ酸タンパク質配列である。
【００２８】
配列番号９はプラスミドｐＲＦ２−１Ｃ中のミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼの一部をコードするカスター（リシヌス  コムニス：Ricinus communis）の不完全ｃＤＮＡの５’から３’へのヌクレオチド配列を表す。読み取り枠をコードする配列は塩基１から塩基６７３である。
【００２９】
配列番号１０は配列番号９の読み取り枠（ヌクレオチド１−６５７）から派生した２１９アミノ酸タンパク質配列である。
【００３０】
配列番号１１はプラスミドｐＲＦ１９７Ｃ−４２中のミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼまたはデサチュラーゼ−関連酵素の一部をコードするカスター（リシヌス  コムニス：Ricinus communis）ｃＤＮＡの１３６９塩基対の５’から３’へのヌクレオチド配列を表す。ヌクレオチド１８４−１８６およびヌクレオチド１３４０−１３４２は、それぞれ読み取り枠（ヌクレオチド１８４−１３４７）の推定上の開始コドンおよび終止コドンである。ヌクレオチド１−１８３および１３４８−１３６９はそれぞれ５’および３’非翻訳ヌクレオチドである。
【００３１】
配列番号１２は配列番号１１の読み取り枠（ヌクレオチド１８４−１３４２）から派生した３８７アミノ酸タンパク質配列である。
【００３２】
配列番号１３はＮＳ３と命名された６４−倍縮退２６ヌクレオチド−長のオリゴマーの組の配列であり、これは配列番号２のアミノ酸１０１−１０９を保存するために作成され、ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼまたはデサチュラーゼ−様酵素をコードする新規配列を単離するためにＰＣＲのセンスプライマーとして使用するように設計された。
【００３３】
配列番号１４はＮＳ９と命名された６４−倍縮退し、２６ヌクレオチド−長のオリゴマーの組の配列であり、これは配列番号２のアミノ酸３１３−３２１を保存するために作成され、そしてミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼまたはデサチュラーゼ−様酵素をコードする新規配列を単離するためにＰＣＲのアンチセンスプライマーとして使用するように設計された。
【００３４】
配列番号１５はプラスミドｐＡＧＦ２−６中に含まれるミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼ遺伝子を含有する２９７３ｂｐのアラビドプシス  サリアナ（Arabidopsis thaliana）ゲノム断片の５’から３’へのヌクレオチド配列を表す。このヌクレオチド４３３および２９３８はそれぞれ配列番号１の開始および終止に対応する。そのヌクレオチド５２１−１６５４は１１３４ｂｐイントロンである。
【００３５】
配列番号１６はＲＢ５ａと命名された２５６−倍縮退し、２５ヌクレオチド−長のオリゴマーの組の配列であり、これは配列番号２のアミノ酸３１８−３２６を保存するために作成され、そしてミクロソームデルタ−１２デササュラーゼまたはデサチュラーゼ−様酵素をコードする新規配列を単離するためにＰＣＲのアンチセンスプライマーとして使用するように設計された。
【００３６】
配列番号１７はＲＢ５ｂと命名された１２８−倍縮退し、２５ヌクレオチド−長のオリゴマーの組の配列であり、これは配列番号２のアミノ酸３１８−３２６を保存するために作成され、そしてミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼまたはデサチュラーゼ−様酵素をコードする新規配列を単離するためにＰＣＲのアンチセンスプライマーとして使用するように設計された。
【００３７】
出願人は植物脂肪酸デサチュラーゼをコードし、かつ油生産種子の脂肪酸組成を遺伝的形質転換により変化させるのに有用である単離核酸断片を有する。
【００３８】
したがって機能的酵素をコードする本発明の核酸断片またはその一部を、そのｍＲＮＡの転写を支配する適当な調節配列と一緒に生存細胞中に移すことにより、植物脂肪酸デサチュラーゼの生産または過剰−生産を導き、かつトリアシルグリセロールを含む細胞脂質の不飽和脂肪酸のレベルの上昇を生じるだろう。
【００３９】
本発明の核酸断片またはその一部を、そのアンチセンスＲＮＡの転写を支配する適当な
調節配列と一緒に植物中に移すことにより、実質的に転移した核酸断片に相同的な内生的な脂肪酸デサチュラーゼの発現の阻害をもたらし、かつトリアシルグリセロールを含む細胞脂質の不飽和脂肪酸のレベルの減少を生じるだろう。
【００４０】
本発明の核酸断片またはその一部を、そのｍＲＮＡの転写を支配する適当な調節配列と一緒に植物中に移すことにより、実質的に転移した核酸断片に相同的な内生的な脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子の発現のコーサプレッション（cosuppression）により阻害を導くことができ、かつトリアシルグリセロールを含む細胞脂質の不飽和脂肪酸のレベルの減少を生じることができる。
【００４１】
本発明の核酸断片は植物遺伝子マッピングおよび植物育種プログラムで、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカーとして使用することもできる。  本発明の核酸配列断片またはそれらから派生したオリゴマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは同じまたは異なる種からのクローン化したヌクレオチド配列のライブラリーを使用して、周知の配列依存的な手法（例えば核酸ハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応による増幅法を含む）により、他の関連する脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子を単離するために使用できる。
【００４２】
＜定義＞
本開示の内容において、多くの用語を使用する。脂肪酸は炭素原子の数および二重結合の位置により特定され、コロンの前および後の数は、それぞれ鎖の長さおよび二重結合の数を言う。脂肪酸の名前の次の数は脂肪酸のカルボキシル末端からの二重結合の位置を示し、接辞“ｃ”は二重結合のシス−配置を示す。例えばパルミチン酸（１６：０）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１，９ｃ）、ペトロセリン酸（１８：１，６ｃ）、リノール酸（１８：２，９ｃ，１２ｃ）、γ−リノレン酸（１８：３，６ｃ，９ｃ，１２ｃ）およびα−リノレン酸（１８：３，９ｃ，１２ｃ，１５ｃ）である。特に言及しないかぎり、１８：１、１８：２、および１８：３はオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸脂肪酸を言う。リノール酸はシス−９二重結合および１２−ヒドロキシル基を持つ１８炭素脂肪酸を言う。本明細書で使用する“脂肪酸デサチュラーゼ”とは炭素−水素結合を壊し、炭素−炭素二重結合を脂肪酸分子中に導入することを触媒する酵素を言う。脂肪酸は遊離、またはアシルキャリアータンパク質、コエンザイムＡ、ステロールおよびグリセロリピッドのグリセロール部分を含む（限定するわけではない）別の分子にエステル化されてもよい。本明細書で使用する用語“グリセロリピッドデサチュラーゼ”とはグリセロール骨格にエステル化された脂肪アシル部分に作用する脂肪酸デサチュラーゼの部分集合を言う。
【００４３】
“デルタ−１２デサチュラーゼ”とは炭素６および７位（メチル末端からの数）（すなわち１８炭素−長の脂肪アシル鎖の炭素１２および１３位（カルボニル炭素からの数）に対応する）の間に二重結合を形成することを触媒する脂肪酸デサチュラーゼを言う。“デルタ−１５デサチュラーゼ”とは炭素３および４位（メチル末端からの数）（すなわち１８炭素−長の脂肪アシル鎖の炭素１５および１６位（カルボニル炭素からの数）に対応する）の間に二重結合を形成することを触媒する脂肪酸デサチュラーゼを言う。脂肪酸デサチュラーゼは、限定されるものでないが、次のものを含む；ホスファチジルコリン脂質基質に作用するミクロソームのデルタ−１２およびデルタ−１５デサチュラーゼ；ホスファチジルグリセロールおよびガラクトリピッドに作用するクロロプラストまたはプラスチドのデルタ−１２およびデルタ−１５デサチュラーゼ；ならびにホスホリピッド、ガラクトリピッドおよびスルホリピッドのような脂肪酸基質に作用する他のデサチュラーゼ類。“ミクロソームのデサチュラーゼ”とは酵素の細胞質での局在を言い、一方“クロロプラストデサチュラーゼ”および“プラスチドデサチュラーゼ”とは酵素のプラスチドでの局在を言う。これらの脂肪酸デサチュラーゼは、限定されるものでないが、高等植物、珪藻植物ならびに種々の真核および原核微生物（真菌および光合成細菌および藻類のような）を
含む様々な生物に見いだすことができる。“相同的脂肪酸デサチュラーゼ”とは同じ脂質基質に対して同じ不飽和化を触媒する脂肪酸デサチュラーゼを言う。したがってたとえ異なる植物種であっても、ミクロソームのデルタ−１５デサチュラーゼ類は相同的な脂肪酸デサチュラーゼである。“異質な脂肪酸デサチュラーゼ”とは異なる位置および／または異なる脂質基質で不飽和化を触媒する脂肪酸デサチュラーゼを言う。すなわち例えばミクロソームのデルタ−１２およびデルタ−１５デサチュラーゼはホスファチジルコリン脂質に作用するが、たとえ同じ植物由来であっても異質な脂肪酸デサチュラーゼである。同様にホスファチジルコリン脂質に作用するミクロソームのデルタ−１５デサチュラーゼ、ガラクトリピッドに作用するクロロプラストのデルタ−１５デサチュラーゼは、それらが同じ植物由来であっても異質な脂肪酸デサチュラーゼである。これらの脂肪酸デサチュラーゼはこれまでに単離されたことがなく、“タンパク質として特性決定されていない。したがってデルタ−１２デサチュラーゼ”および“デルタ−１５デサチュラーゼ”という用語は、これらの破壊により引き起こされる表現型の効果に基づき単離された核酸断片によりコードされるタンパク質を説明するために便利であるので使用する。これらはいかなる触媒的メカニズムを意味するものではない。例えばデルタ−１２デサチュラーゼは、メチル、カルボキシル末端または第一の二重結合から“数えられ”ても、数えられなくても、１８炭素脂肪酸の１２と１３の炭素の間に二重結合を形成するのを触媒する酵素を言う。“脂肪酸デサチュラーゼ−関連酵素”とはその触媒産物が炭素−炭素二重結合ではないが、触媒作用のメカニズムが脂肪酸デサチュラーゼに似ている酵素を言う（すなわち脂肪酸の炭素−水素結合を置き換えて脂肪酸ヒドロキシアシル中間体または最終産物を形成する触媒）。例としてデルタ−１２ヒドロキシラーゼを意味するデルタ−１２ヒドロキシラーゼまたはオレイン酸からリシノール酸を合成するためのオレエートヒドロキシラーゼがある。
【００４４】
“核酸”という用語は、糖、リン酸塩および他のプリン又はピリミジンを含有する単量体ヌクレオチドから成る一本鎖または二本鎖であることができる巨大分子を言う。“核酸断片”とは与えられた核酸分子の分画である。高等植物では、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が遺伝物質であり、一方リボヌクレオチド（ＲＮＡ）はＤＮＡの情報をタンパク質に転写することに関与する。“ゲノム”とは各生物の細胞中に含有される遺伝物質の全体である。“ヌクレオチド配列”という用語はＤＮＡまたはＲＮＡポリマーの配列を言い、これは一本−または二本−鎖であることができ、場合によってはＤＮＡまたはＲＮＡポリマーに包含できる合成の、非−天然または変化したヌクレオチド塩基を含むことができる。“オリゴマー”という用語は通常最高１００塩基長までの短いヌクレオチド配列を言う。“相同的”という用語は２つの核酸分子のヌクレオチド配列間、または２つのタンパク質のアミノ酸配列の間の関連性を言う。そのような相同性の推定は、当業者に周知のストリンジェンシー条件下でのＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションのいずれかにより与えられる（HamesおよびHiggins編集、(1985) 核酸ハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridisation,IRL 出版、オックスフォード、英国）；あるいは例えばNeedlemanらの方法（Ｊ.Mol.Biol.(1970) 48;443-453）により２つの核酸またはタンパク質間の配列同一性を比較することにより提供される。本明細書で使用するように、“実質的に相同的な”という用語は、言及された配列のコーディング領域とヌクレオチドレベルで９０％より高い全体的な同一性を有するヌクレオチド配列を言い、これはコーディング領域に対応する遺伝子および擬−遺伝子である。本明細書に記載された核酸断片は人工的または天然の可能な変更を含んで成る分子を含むことができ、例えば限定するわけではないが（ａ）コードするアミノ酸は変化しない塩基の変更に関するもの、あるいは（ｂ）ＤＮＡ配列によりコードされたタンパク質の機能的特性には影響せずにアミノ酸を変更する塩基の変更に関するもの、（ｃ）核酸断片の欠失、再配列、増幅、無作為なまたは制御された突然変異体由来のもの、ならびに（ｄ）さらなる突発的なヌクレオチド配列の誤りがある。
【００４５】
“遺伝子”とは特別なタンパク質を発現できる核酸断片を言い、コーディング領域の（５’非−翻訳）から始まり、そして（３’非−翻訳）まで続く調節配列を含む。“脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子”という用語は、脂肪酸デサチュラーゼ活性を持つタンパク質を発現する核酸断片を言う。“天然”遺伝子という用語は自然に見いだされるその遺伝子が所有する調節配列と一緒に単離された遺伝子を言う。“キメラ遺伝子”とは自然には見られない異質な、調節およびコーディングを含む遺伝子配列を言う。“内因性”遺伝子とは天然のゲノムの位置で通常見られる天然遺伝子を言い、そして単離されていない。“外来”遺伝子とは宿主生物に通常見られないが、遺伝子転移により導入された遺伝子を言う。“擬−遺伝子”とは機能的な酵素をコードしないゲノムヌクレオチド配列を言う。
【００４６】
“コーディング配列”とは特別なタンパク質をコードし、そして非−コーディング配列を排除するＤＮＡ配列を言う。これは“非中断コーディング配列”を構成することができ、すなわちイントロンを欠くか、また適当なスプライス連結部により結合した１つ以上のイントロンを含んでもよい。“イントロン”という用語は第一転写物中に転写されるが、開裂により除去され、そして細胞中でＲＮＡの再結合によりタンパク質に翻訳されることができる成熟ｍＲＮＡを生成するヌクレオチド配列である。
【００４７】
“開始コドン”および“終止コドン”とはそれぞれタンパク質合成
（ｍＲＮＡ翻訳）の開始および鎖終止を特定するコーディング配列中の３つの隣接するヌクレオチド単位を言う。“読み取り枠”とはアミノ酸配列をコードする開始および終止コドンの間をイントロンにより中断されないコーディング配列を言う。
【００４８】
“ＲＮＡ転写物”とはＲＮＡポリメラーゼが触媒したＤＮＡ配列の転写から生成した生成物を言う。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーであるとき、第一転写物と言い、あるいはこれは第一転写物の翻訳後プロセッシングから派生したＲＮＡ配列であることができ、そしてこれを成熟ＲＮＡと言う。“メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）”はイントロンが無く、かつ細胞によりタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを言う。“ｃＤＮＡ”とはｍＲＮＡに相補的であり、それから派生した二本鎖ＤＮＡを言う。“センス”ＲＮＡとはｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写物を言う。“アンチセンスＲＮＡ”とは標的第一転写物の全部または一部あるいはｍＲＮＡに相補的であり、かつ標的遺伝子の発現を第一転写物またはｍＲＮＡのプロセッシング、転移および／または翻訳で妨害することにより遮断するＲＮＡを言う。アンチセンスＲＮＡの相補性は任意の特別な遺伝子転写物（すなわち、５’非−コーディング配列、３’非−コーディング配列、イントロン、またはコーディング配列）の部分を持つことができる。さらに本明細書で使用するように、アンチセンスＲＮＡはアンチセンスＲＮＡが遺伝子発現を遮断する効率を上昇させるリボザイム配列の領域を含んでもよい。“リボザイム”とは触媒的ＲＮＡを言い、そして配列−特異的エンドリボヌクレアーゼ類を含む。
【００４９】
本明細書で使用するように“適当な調節配列”とは本発明の核酸配列の（５’）上流、中、および／または（３’）下流に位置する天然またはキメラ遺伝子中のヌクレオチド配列を言い、これは本発明の核酸断片の発現を制御する。本明細書で使用する“発現”という用語は、本発明の核酸配列（１つまたは複数）から派生したセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を言い、これは細胞のタンパク質装置と共に、脂肪酸デサチュラーゼ（１つまたは複数）のレベルの変化を生じる。遺伝子の発現および過剰発現は、遺伝子の転写およびｍＲＮＡの前駆体または成熟脂肪酸デサチュラーゼタンパク質への翻訳が関与する。“アンチセンス阻害”とは標的タンパク質の発現を妨害できるアンチセンスＲＮＡ転写物の生成を言う。“過剰発現”とは正常または非−形質転換生物中での生産レベルを越えるトランスジェニック生物中での遺伝子産物の生産を言う。“コーサプレッション”とは内因性遺伝子に実質的な相同性を有する外来遺伝子の発現を言い、外来および内因性遺伝子の両方の発現のサプレッションを生じる。“変化したレベ
ル”とはトランスジェニック生物中の遺伝子産物（１つまたは複数）の、正常または非−形質転換生物とは異なる量または比率の生産について言う。
【００５０】
“プロモーター”とは遺伝子中のＤＮＡ配列を言い、通常そのコーディング配列の（５’）上流であり、ＲＮＡポリメラーゼおよび適切な転写に必要な他の因子の認識を提供することによりコーディング配列の発現を制御する。人工的なＤＮＡ構築物では、プロモーターはアンチセンスＲＮＡを転写するために使用することもできる。またプロモーターは生理学的または発生的な条件に反応して転写開始の効率を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列を含むこともできる。これはまたエンハンサー要素を含むこともできる。“エンハンサー”とはプロモーター活性を刺激できるＤＮＡ配列である。これは生来のプロモーター要素、またはプロモーターのレベルおよび／または組織−特異性を増強するために挿入された異質な要素であってよい。“構築プロモーター”とはすべての組織中で、かついつでも遺伝子発現を支配するものを言う。本明細書の“組織−特異的”または“発生−特異的”プロモーター”とは、特別な組織中（例えば葉または種子のような）で、あるいは組織の特別な発生段階（例えばそれぞれ胚発生の初期または後期で）でほとんど排他的に遺伝子発現を支配するものを言う。
【００５１】
“３’非−コーディング配列”とはポリアデニレーションシグナルおよびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響することができる任意の他の調節シグナルを含む遺伝子のＤＮＡ配列部分を言う。このポリアデニレーションシグナルは通常ｍＲＮＡ前駆体の３’末端のポリアデニル酸域の付加に影響することが特徴である。
【００５２】
本明細書の“形質転換”とは外来遺伝子の宿主生物のゲノム中への転移、ならびにその遺伝的に安定な存在を言う。“制限断片長多型”（ＲＦＬＰ）とは、遺伝子の変異体中または周りの変化したヌクレオチド配列ゆえに種々の大きさの制限断片長を言う。“分子育種”とは例えば育種でのＲＦＬＰ、ＲＡＰＤおよびＰＣＲのようなＤＮＡに基づく診断を言う。“受精能力のある”とは性的に増殖できる植物を言う。
【００５３】
“植物”とは真核または原核の両方の光合成生物を言い、一方“高等植物”とは真核植物を言う。本明細書の“油−生産種”とは、特別な器官中（主に種子）にトリアシルグリセロールを生産および保存できる植物種を言う。そのような植物には大豆（グリシン  マックス：Glycine max）、菜種およびカノーラ（ブラッシカ  ナプス：Brassica napus、ビー．カンペストリス：B.campestrisを含む）、ヒマワリ（ヘリアンタス  アナス：Helianthus annus）、綿（ゴシッピウム  ヒルストン：Gossypium hirsutum）トウモロコシ（ゼア  メイズ：Zea mays）、ココア（セオブローマ  カカオ：Theobroma cacao）、ベニバナ（カルタムス  チンクトリウス：Carthamus tinctorius）、アブラヤシ（エラエイス
グイニーンス：Elaeis guineensis）、ココナツ  ヤシ（ココス  ヌシフェラ：Cocos nucifera）、アマ（リヌム  ウシタチシム：Linum usitatissimum）、カスター（リシヌス
コムニス：Ricinus communis）およびピーナッツ（アラチス  ハイポガエア：Arachis hypogaea）。この群には適当な発現ベクターの開発に有用な植非−作物種（non-agronomic species）（タバコ、周期が早いブラッシカ（Brassica）種、およびアラビドプシス  サリアナ（Arabidopsis thaliana）および独自の脂肪酸源となりうる野生種）を含む。
【００５４】
“配列−依存的手法”とはヌクレオチド配列の利用性に依存した技術を言う。配列−依存的手法の例には制限するわけではないが、核酸およびオリゴマーハイブリダイゼーション法ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の種々の使用に例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡの増幅法がある。
【００５５】
実験操作に使用される種々の溶液は、“ＳＳＣ“、“ＳＳＰＥ”、
“デンハーツ溶液”等のそれらの通常の名前で言う。これらの溶液の組成はSambrookらの
添付Ｂ（モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル：Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第二版、（１９８９）、コールドスプリングハーバー  ラボラトリー  出版：Cold Spring Harbor Laboratory Press）を参照にすることにより理解できる。
【００５６】
＜Ｔ−ＤＮＡ突然変異誘発法およびミクロソームのデルタ−１２デサチュラーゼ欠失アラビドプシス（Arabidopsis）突然変異体の同定＞
Ｔ−ＤＮＡ突然変異誘発法（Feldmannら、Science(1989)243:1351-1354）では、Ｔ−ＤＮＡのゲノムへの組み込みは組み込み部位またはその近くの遺伝子の正常な発現を妨害できる。もし生成した突然変異体の表現型が検出、そして遺伝的にＴ−ＤＮＡ挿入物に強固に連結していることを示すことができれば、“標識した”突然変異体の位置およびその野生型の対を当業者による分子クローニングにより容易に単離できる。
【００５７】
アラビドプシス  サリアナ（Arabidopsis thaliana）種子をアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｃ５８Ｃｌｒｉｆ株（複製領域のオリジンにより置き換えられたＴ−ＤＮＡの右および左境界の間にＴ−ＤＮＡ領域、およびプラスミドｐＢＲ３２２のアノピシリン耐性遺伝子、細菌のカナマイシン耐性遺伝子、および植物カナマイシン遺伝子を持つ悪性ではないＴｉ−プラスミドｐＧＶ３８５０：：ｐＡＫ１００３を寄宿させている）により形質転換させた（Feldmannら、Mol.Gen.Genetics(1987)208:1-9）。処理した種子からの植物を自己−受精させ、そしてカナマイシンの存在中で発芽した生成した継代種子を自己−受精させて集団を作成し、これをＴ３と命名し、これはＴ−ＤＮＡ挿入物が分離していた。約１７００のＴ２植物からのＴ３種子を発芽させ、そして制御された環境下で生育させた。各系の各１０個体のＴ３植物からの１枚の葉をプールし、そして脂肪酸組成を分析した。１つの系を６５８と命名し、これは上昇したオレイン酸（１８：１）レベルを表した。６５８系の１２個の別個のＴ３種子の分析から、３６％より高いオレイン酸を含む２個の種子、一方残りの種子は１２−２２％のオレイン酸を含有することを確認した。６５８系およびＴ３種子中のその分離物中の葉および種子組織のオレイン酸レベルが上昇した突然変異体表現型は、６５８系がオレイン酸をリノール酸に、葉および種子の両方で不飽和化することに影響を与える突然変異体を宿していることを示唆した。６５８系からの約２００個のＴ３種子をカナマイシン存在下でそれらの発芽能力について試験した時、４個のカナマイシン−感受性種子を同定し、これらは恐らく３つの多Ｔ−ＤＮＡ挿入物を元のＴ２系中に有することを示した。１００個の別個のＴ３植物の継代種子をその脂肪酸組成、およびカナマイシンに対する発芽ついて分析し、１つの植物を６５８−７５と命名し、これはその継代が７つの野生株：２つの上昇オレイン酸レベルの突然変異体および２８のカナマイシン感受性：６０のカナマイシン耐性を分離することが確認された。約４００の６５８−７５のＴ４継代種子を生育させ、そしてその葉の脂肪酸組成を分析した。９１のこれらの種苗が突然変異体（高オレイン酸）表現型にホモ接合性であると確認された。８３のこれらのホモ接合性植物をノパリン、Ｔ−ＤＮＡに関する別のマーカー、の存在下で試験し、そしてそれらすべてがノパリン感受性であった。これらの遺伝学的研究に基づき、ミクロソームデルタ−１２不飽和化の突然変異はＴ−ＤＮＡに関連すると結論した。
【００５８】
＜ミクロソームデルタ−１２不飽和化を制御する破壊された遺伝子を含有するアラビドプシス（Arabidopsis）６５８−７５ゲノムＤＮＡの単離＞
野生型のアラビドプシス（Arabidopsis）からミクロソームのデルタ−１２不飽和化を制御する遺伝子を単離するために、宿主植物ＤＮＡ中に組み込まれたＴ−ＤＮＡの境界を含むＴ−ＤＮＡ植物ＤＮＡ“ジャンクション（junction）”断片を、アラビドプシス（Arabidopsis）の６５８−７５系のホモ接合性突然変異体植物から単離した。このために、突然変異体植物からのゲノムＤＮＡを単離し、そしてＢａｍＨIまたはＳａｌI制限酵素のいずれかで完全に消化した。各々の場合において、１つの生成断片がｐＢＲ３２２の複製
起源およびアンピシリン−耐性遺伝子、ならびにＴ−ＤＮＡ−植物ＤＮＡ左部のジャンクション断片を含むと思われた。そのような断片を、自己連結をし易くするために消化ゲノムＤＮＡ断片を希釈濃度で連結してプラスミドとして取り出し、そして次ぎに連結した断片を大腸菌細胞を形質転換するために使用した。ＳａｌI−消化植物ゲノムＤＮＡから取り出したプラスミドからはアンピシリン−耐性コロニーが得られないが、ＢａｍＨI−消化植物ゲノムＤＮＡから取り出したプラスミドから得たコロニーには１つのアンピシリン−耐性コロニーが得られた。この形質転換から得られたプラスミドをｐ６５８−１と命名した。プラスミドｐ６５８−１のＢａｍＨI、ＳａｌIおよびＥｃｏＲI制限酵素による制限分析では、このプラスミドが期待された１４．２ｋｂのＴ−ＤＮＡ部分（ｐＢＲ３２２配列を含む）および推定上の植物ＤＮＡ／左部Ｔ−ＤＮＡ境界断片を１．６ｋＢのＥｃｏＲI−ＢａｍＨI断片中に含むことが強く示唆された。この１．６ｋｂのＥｃｏＲI−ＢａｍＨI断片をSambrookら（モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル、第二版、（１９８９）、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版）に記載された標準的なクローニング法でpBluescript  SK［ストラタジーン：Stratagene］中でサブクローン化し、そして生成したプラスミドをｐＳ１６５８と命名した。
【００５９】
＜ミクロソームのデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡおよび野生型アラビドプシス（Arabidopsis）由来の遺伝子の単離＞
プラスミドｐＳ６５８−１中にＴ−ＤＮＡの周辺を含む推定上の植物ＤＮＡを含む１．６ｋｂのＥｃｏＲI−ＢａｍＨI断片を単離し、そして放射線標識ハイブリダイゼーションプローブとして使用して、上記アラビドプシス  サリアナ（Arabidopsis thaliana）植物の部分からのｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡに対して作成されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。これにより薹立ちし、ちょうど第一葉を開き、そして開花している植物からの大きさを確認した［Elledgeら、（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1731-1735］。ライブラリー中のｃＤＮＡ挿入物はラムダＹｅｓベクター中のＥｃｏＲI部位により周辺を含んだＸｈｏI部位に挿入された［Elledgeら、（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1731-1735］。
【００６０】
幾つかの陽性−ハイブリダイズプラークの中から、４つをプラーク精製に供した。プラスミドを精製したファージから部位特異的組換え法により、大腸菌ＢＮＮ１３２株中でｃｒｅ−ｌｏｘ組換えシステムを使用して切り出した［Elledgeら、（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1731-1735］。４つの切り出しプラスミドをＥｃｏＲI制限酵素により消化し、大きさが１ｋＢから１．５ｋＢの範囲のｃＤＮＡ挿入物が含まれることが示された。４つのすべてのｃＤＮＡの部分的ヌクレオチド配列決定法および制限酵素マッピングにより、それらに共通する同一性を明らかにした。
【００６１】
それぞれ約１．２ｋＢおよび約１．４ｋＢの挿入物を含有する２つのｃＤＮＡ（ｐＳＦ２ｂおよびｐ９２１０３）の部分的ヌクレオチド配列を決定した。これらのプラスミドに由来する混合配列は配列番号１であり、これはプラスミドｐ９２１０３中に完全に含まれるものと思われる。配列番号１はミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼをコードするアラビドプシス（Arabidopsis）ｃＤＮＡの１３７２塩基対の５’から３’ヌクレオチド配列を表す。ヌクレオチド９３−９５は読み取り枠（９３−１２４４）の推定上の開始コドンである（本出願中の他の植物デルタ−１２デサチュラーゼと比較により確認した）。ヌクレオチド１２４２−１２４４は終止コドンである。ヌクレオチド１−９２および１２４５−１３７２はそれぞれ５’および３’非翻訳ヌクレオチドである。配列番号２の３８３アミノ酸タンパク質配列は読み取り枠から派生し、そして分子量が４４ｋＤと推定される。
【００６２】
配列番号１に対応する遺伝子は、アラビドプシス（Arabidopsis）ゲノムＤＮＡライブラリーを放射線標識ｐＳＦ２ｂ  ｃＤＮＡ挿入物を使用してスクリーニングすることによ
り単離し、そして陽性−ハイブリダイズプラークを精製し、ファージＤＮＡからの６ｋＢのＨｉｎｄIII挿入断片をpBluescriptベクター中にサブクローン化した。遺伝子の２９７３ヌクレオチド配列を配列番号１５に表す。遺伝子の配列（配列番号１５）とｃＤＮＡ（配列番号１）とを比較すると、１１３４ｂｐの１つのイントロンがｃＤＮＡのヌクレオチド８８位と８９位との間に存在することが明らかになり、これは開始コドンに対しの４ヌクレオチド５’側である。
【００６３】
ｐＳ１６５８中の１．６ｋＢのＥｃｏＲI−ＢａｍＨIゲノム境界断片挿入物もＢａｍＨIおよびＥｃｏＲI末端から部分配列決定した。遺伝子（配列番号１５）、ｃＤＮＡ（配列番号１）、境界断片および報告されたＴ−ＤＮＡの左末端配列（Yadavら、(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.79:6322-6326）の比較により、ａ）ＢａｍＨI末端からの境界配列断片のはじめの４５１ヌクレオチドはｃＤＮＡのヌクレオチド５３９（ＢａｍＨI部位）−８９の対応する部分と同一線形順序に並んでおり、ｂ）ＥｃｏＲI末端から、境界断片はヌクレオチド１−６１からのＴ−ＤＮＡの左末端（境界断片中の４２位の９つの連続ヌクレオチドの欠失は除外する）の対応する部分と同一線形順序に並んでおり、そしてヌクレオチド５７−１０４からは、ｃＤＮＡ４１−８８ヌクレオチドの対応する部分と同一線形順序に並んでおり、そしてｃ）境界断片とｃＤＮＡとの間の配列の相違は境界断片中のイントロンによるものである、ことが明らかとなった。これらの結果はＴ−ＤＮＡがプロモーターとコーディング領域の間の転写領域中のミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼ遺伝子、および５’から非翻訳配列中のイントロンを破壊したことを表す。  アラビドプシス（Arabidopsis）ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼ遺伝子を含有するファージＤＮＡを、ＨｉｎｄIIIで消化した数種の継代アラビドプシス  サリアナ（Arabidopsis  thaliana）（生態型Wassileskijaおよびマーカー系Ｗ１００生態型Landesberg バックグラウンド）からのゲノムＤＮＡを含有するサザンブロットのＲＦＬＰマーカーとして使用した。これはミクロソームデルタ−１２デルタ−１２遺伝子を染色体３［Koorneef,M．ら、(1993)遺伝子マップについて(inGenetic Maps)、O'Brien,S.J.編集：Yadavら(1993）Plant Physiology 103:467-476］のｃ３８３８座に対し１３．６ｃＭ近位に、１Ａｔ２２８座に対し９．２ｃＭ遠位に、そしてＦａｄＤ座に対し４．９ｃＭ近位にマップした。この遺伝子座はすでに提案されたミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼ（Ｆａｄ２）についての位置にきわめて親密に対応する［Hugly,S.ら、(1991)Heredity 82:4321］。
【００６４】
配列番号１、ならびにアラビドプシス（Arabidopsis）ミクロソームデルタ−１５デサチュラーゼ［国際特許出願第9311245号］、アラビドプシス（Arabidopsis）プラスチドデルタ−１５デサチュラーゼ［国際特許出願第9311245号］およびラン色細菌（cyanobacterial）のデサチュラーゼ  ｄｅｓＡ［Wadaら、Nature(1990)347:200-203；ジーンバンクＩＤ：ＣＳＤＥＳＡ；ジーンバンク寄託番号：Ｘ５３５０８］をコードする配列中の読み取り枠ならびにそれから派生するアミノ酸配列を、Needlemanら［J.Mol.Biol.(1970)48:443-453］の方法により、ヌクレオチド配列には５．０および０．３の値のキャップ（ｇａｐ）重量およびギャップ長を使用して、そしてタンパク質配列にはそれぞれ３．０および０．１の値を使用して比較した。全体の同一性を表２にまとめる。
【００６５】
【表２】
2006238886.tif 000003
ａ２、ａ３、ａｄおよびｄｓｅＡはそれぞれ配列番号１／２、アラビドプシス（Arabidopsis）ミクロソームデルタ−１５デサチュラーゼ、アラビドプシス（Arabidopsis）プラスチドデルタ−１５デサチュラーゼ、およびラン色細菌（cyanobacterial）のデサチュラーゼ  ｄｅｓＡを言う。各々の比較での同一性の割合を、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルの両方で表す；比較により付記されたギャップの数は同一性の割合の後のカッコ中に示す。ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列を単離するためのハイブリダイゼーションプローブとしてのデルタ−１５脂肪酸ヌクレオチド配列を使用した失敗の試みに基づき予想したように、ミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号１）と他の３つのデサチュラーゼ間のヌクレオチドレベルでの全相同性は低い（４３％から４８％の範囲）。アミノ酸レベルでも、ミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号１）はラン色細菌（cyanobacterial）のデサチュラーゼ
ｄｅｓＡ（２４％未満の同一性）および植物デルタ−１５デサチュラーゼ（３９％未満の同一性）よりも関係が低い。
【００６６】
上記発明から派生したアミノ酸配列の全体的関連性および報告された脂肪酸デサチュラーゼは限られており、より重要な同一性は上記比較中のより短いアミノ酸配列長（stretches）に観察される。これらの結果は６５８−７５中のＴ−ＤＮＡが脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子の正常な発現を妨害することを確認するものであった。
【００６７】
ホモ接合性突然変異体６５８−７５系の脂肪酸表現型に基づき、配列番号１はデルタ−１２デサチュラーゼをコードすると結論した。さらに、それはミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼであり、クロロプラストのデルタ−１２デサチュラーゼではないと結論した。なぜならば：ａ）突然変異体の表現型は種子の中で強力に発現するが、６５８−７５系の葉ではあるとしてもわずかに発現するだけであり、そしてｂ）デルタ−１２デサチュラーゼポリペプチドは、ミクロソームおよびプラスチドデルタ−１５デサチュラーゼポリペプチド［国際特許出願第9311245号明細書］と比較することにより、核がコードするプラスチドデサチュラーゼについて期待される一時的なペプチドのＮ−末端ひろがり（extension）を持たなかったからである。
【００６８】
プラスミドｐ９２１０３は１９９２年１０月１６日にメリーランド州、ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクションにブタペスト条約に基づき寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ６９０９５を有する。
【００６９】
＜デルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼの突然変異を相補するためのアラビドプシス（Arabidopsis）Ｆａｄ２−１突然変異体でのミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼ
の発現＞
配列番号１（アラビドプシス（Arabidopsis）ミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼｃＤＮＡ）の同一性を確認するために、配列番号１を含んで成るキメラ遺伝子をミクロソームデルタ−１２脂肪デサチュラーゼが影響を受けているアラビドプシス（Arabidopsis）突然変異体中に形質転換した。このために、約１．４ｋｂのＥｃｏＲI断片（ｃＤＮＡ（配列番号１）を含む）をプラスミドｐ９２１０３から単離し、そしてｐＧＡ７４８ベクターにサブ−クローン化し［Anら、(1988)バイナリーベクター(Binary Vector)：植物分子生物学マニュアル(Plant MolecularBiology Manual)Gelvin,S.Bら編集、クルワー  アカデミック  プレス（Kluwer Academic Press）］、これはあらかじめＥｃｏＲI制限酵素で直線化したものであった。生成したバイナリープラスミドの１つ（ｐＧＡ−Ｆａｄ２と命名）で、ｃＤＮＡがベクターのＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの後部でセンス方向に位置し、構成的発現を提供した。
【００７０】
バイナリーベクターｐＧＡ−Ｆａｄ２を凍結／融解法［Holstersら、(1978)Mol.Gen.Genet.163:181-187］により、アグロバクテリウム  ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)R1000株（アグロバクテリウム  リゾジーンズ(Agrobacterium rhizogenes)からのＲｉプラスミドｐＲｉＡ４ｂ［Mooreら、(1979)プラスミド2:617-626］を持つ）中に形質転換し、形質転換体R1000/pGA-Fad2を生成した。
【００７１】
アグロバクテリウムR1000株およびR1000/pGA-Fad2をアラビドプシス（Arabidopsis）突然変異体ｆａｄ２−１を形質転換するために使用し［Miguel,M.& Browse,J.(1992)Journal of Biological Chemistry267:1502-1509］、そしてＲ１０００株を野生型アラビドプシス（Arabidopsis）を形質転換するために使用した。植物の若いボルト(bolt)を滅菌し、単一の節が各エクスプラントに存在するように切断した。エクスプラントをアグロバクテリアで接菌し、そして２５℃の暗室中で、薬剤−無しのＭＳ最少有機物培地中（３０ｇ／Ｌのシュクロースを含有する（ギブコ：Gibco）)でインキュベーションした。４日後、エクスプラントを新しいＭＳ培地（５００ｍｇ／Ｌのセホタキシム(cefotaxime)および２５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンをアグロバクテリウム(Agrobacterium)のカウンターセレクションのために含有する）に移した。５日後、根毛がR1000/pGA-Fad2から発生し、形質転換を摘出し、５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する同培地に移した。脂肪酸メチルエステルを５−１０ｍｍの根から調製し、この方法は本質的にはBrowseら（Anal.Biohcem.(1986)152:141-145）に記載されているものであるが、２.５％Ｈ２ＳＯ４（メタノール中）をメチル化試薬として使用し、そして種子のトリグリセリドがメタノリシスするように試料を８０℃で１．５時間加熱する点を変更した。結果を表３に表す。根の試料４１−４６、４８−５１、５８および５９はR1000/pGA-Fad2で形質転換したfad2-1植物由来であり：根の試料５２、５３および５７はR1000で形質転換したfad2-1植物由来ならびに対照であり、：根の試料６０は野生型アラビドプシス（Arabidopsis）をR1000で形質転換した根の試料、ならびに対照である。
【００７２】
【表３】
2006238886.tif 000004
これらの結果は、デルタ−１２脂肪酸不飽和化欠失突然変異体アラビドプシス（Arabidopsis）のアラビドプシス（Arabidopsis）ミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼの発現により、突然変異体に部分的から完全な相補を生じることがてきることを表している。トランスジェニック根のオレイン酸レベルの減少は、１８：２および１８：３の両レベルの増加によるものである。したがってこの遺伝子の別の脂肪植物中での過剰発現も、特にカノーラにおいては（これはアラビドプシス（Arabidopsis）に近縁であり、そして天然に高レベルの１８：１を種子に有する）、高レベルの１８：２を生成することが期待され、このことはミクロソームデルタ−１５脂肪酸デサチュラーゼが極めて高い１８：３を生成するだろうということに関連している。
【００７３】
＜他の植物種からミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼｃＤＮＡを単離するために、アラビドプシス（Arabidopsis）ミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼｃＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとしての使用＞
デルタ−１２デサチュラーゼ配列が種の間で保存されるという証拠は、pSF2からのアラビドプシス（Arabidopsis）ｃＤＮＡ挿入物をハイブリダイゼーションプローブとして使用してブラッシカ  ナプス（Brassica napus）および大豆由来の関連配列をクローン化ことにより提供された。さらに、トウモロコシおよびカスター豆ミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼを、ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼの保存領域に対して作成されたプライマーを使用してＰＣＲにより単離した。
【００７４】
＜種子ミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼをコードするブラッシカ  ナプス（Brassica napus）種子ｃＤＮＡのクローニング＞
種子ミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼをコードするブラッシカ  ナプス（Brassica napus）種子ｃＤＮＡクローニングのために、ｐＳＦ２ｂからのｃＤＮＡ挿入物を、ｐＳＦ２ｂをＥｃｏＲIで消化し、そして１．２ｋｂの挿入物をゲル電気泳動により精製して単離した。この１．２ｋｂ断片を放射線標識して、授粉２０−２１日後に発生したブラッシカ  ナプス（Brassica napus）種子からのｐｏｌｙＡ＋ ｍＲＮＡで作成したラムダファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして使用した。約600,000個のプラークを、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（50mM Tris pH7.6、6XSSC、５Ｘデンハーツ溶液、0.5%SDS、100ug変性ウシ胸腺ＤＮＡ、そして５０℃）でスクリーニングし、そして洗浄（2XSSC、0.5%SDS、室温でそれぞれ１５分間を２回、そして次に0.2XSSC、0.5%SDS、室温でそれぞれ１５分間を２回、そして0.2XSSC、0.5%SDS、５０℃でそれぞれ１５分間を２回）した。１０個の強く−ハイブリダイズしたファージをプラーク−精製し、そしてｃＤＮＡ挿入物の大きさを、ファージを鋳型とし、そしてＴ３／Ｔ７オリゴマーをプライマーとして使用して、挿入物をＰＣＲ増幅することにより測定した。これらの中の２つ（１６５Ｄおよび１６５Ｆ）がそれぞれ１．６ｋｂおよび１．２ｋｂのＰＣＲ増幅挿入物を有し、そして上記のようにこれらのファージを、ファジェミド（phagemid）を切り出すためにも使用した。ファージ１６５Ｄ由来のファジェミドはｐＣＦ２−１６５Ｄと命名されたが、これは１本鎖が完全に配列決定された１．５ｋｂの挿入物を含んでいた。配列番号３はデルタ−１２デサチュラーゼをコードするプラスミドｐＣＦ２−１６５Ｄ中のブラッシカ  ナプス（Brassica
napus）ｃＤＮＡの１３９４塩基対の５’−３’ヌクレオチド配列を表す。ヌクレオチド９９−１０１およびヌクレオチド１２４８−１２５０は、それぞれ読み取り枠（ヌクレオチド９９−１２５０）の推定上の開始コドンおよび終止コドンである。ヌクレオチド１−９８およびヌクレオチド１２５１−１３９４は、それぞれ５’および３’非翻訳ヌクレオチドである。配列番号３の読み取り枠から派生した３８３アミノ酸タンパク質配列を配列番号４に表す。確認するために他の鎖は容易に配列決定でき、配列番号１および３、ならびに配列番号２および４の比較により、たとえ起こり得る配列誤差を考慮しても、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルで約８４％の全相同性が示され、このことはｐＣＦ２−１６５Ｄがデルタ−１２デサチュラーゼをコードするブラッシカ  ナプス（Brassica napus）種子ｃＤＮＡであることを確認するものであった。プラスミドｐＣＦ２−１６５Ｄは１９９２年１０月１６日に、メリーランド州ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクションにプタペスト条約に基づき寄託され、受託番号ＡＴＣＣ６９０９４を有する。
【００７５】
＜種子ミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼをコードする大豆（グリシン  マックス:Glycine max）ｃＤＮＡのクローニング＞
発生している大豆種子から単離したｐｏｌｙＡ＋ ｍＲＮＡに対してｃＤＮＡライブラリーを作成し、上記のようにスクリーニングした。上記のように調製したｐＳＦ２ｂからの放射線標識プローブを加え、５０℃で１８時間ハイブリダイズさせた。プローブを上記のように洗浄した。フィルターのオートラジオグラフィーでは、１４個の強く−ハイブリダイズしているプラーク−および多くの弱くハイブリダイズしているプラークが示された。１４個の強くハイブリダイズした中の６個を上記のようにプラーク精製し、そしてｃＤＮＡ挿入物の大きさを、ファージを鋳型とし、そしてＴ３／Ｔ７オリゴマーをプライマーとして使用して、挿入物をＰＣＲ増幅することにより測定した。これらのファージの１つ（１６９Ｋ）が１．５ｋｂの大きさの挿入物を有し、そして上記のようにこれらのファージを、ファジェミドを切り出すためにも使用した。ファージ１６９Ｋ由来のファジェミドはｐＳＦ２−１６９Ｋと命名されたが、これは２本鎖が完全に配列決定された１．５ｋｂの挿入物を含んでいた。配列番号５はデルタ−１２デサチュラーゼをコードするプラスミドｐＣＦ２−１６９Ｋ中の大豆（グリシン  マックス：Glycine max）ｃＤＮＡの１４７３塩基対の５’−３’ヌクレオチド配列を表す。ヌクレオチド１０８−１１０およびヌクレオチド１２４５−１２４７は、それぞれ読み取り枠（ヌクレオチド１０８−１２４７）の推定上の開始コドンおよび終止コドンである。ヌクレオチド１−１０７およびヌクレオ
チド１２４８−１４６２は、それぞれ５’および３’非翻訳ヌクレオチドである。配列番号５の読み取り枠から派生した３８０アミノ酸タンパク質配列を配列番号６に表す。配列番号１および５、ならびに配列番号２および６の比較により、たとえ起こり得る配列誤差を考慮しても、ヌクレオチドレベルで６５％の全相同性を、そしてアミノ酸レベルでの７０％の全相同性が示され、このことはｐＳＦ２−１６９Ｋがデルタ−１２デサチュラーゼをコードする大豆種子ｃＤＮＡであることを確認するものであった。配列番号１、配列番号３および配列番号５の比較、ならびにＰＳＦ２−１６９Ｋの挿入物を包含する（センスまたはアンチセンス方向に、適当な調節配列とともに）キメラ遺伝子を使用することにより生産されたトランスジェニック植物の表現型を分析することにより、さらにこのクローンに関する知見を得ることができる。プラスミドｐＳＦ２−１６９Ｋは１９９２年１０月１６日に、メリーランド州ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクションにプタペスト条約に基づき寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ６９０９２を有する。
【００７６】
＜種子ミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼをコードするトウモロコシ（ゼア
メイズ：Zea mays）ｃＤＮＡのクローニング＞
トウモロコシミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼｃＤＮＡはＰＣＲ法を使用して単離した。このためLambda ZapIIベクター中に、発生しているトウモロコシ胚からｐｏｌｙＡ＋ ＲＮＡに対してｃＤＮＡライブラリーを作成した。このライブラリーはＰＣＲの鋳型として縮退オリゴマーＮＳ３（配列番号１３）およびＲＢ５Ａ／Ｂ（配列番号１６および１７）の組をそれぞれセンスおよびアンチセンスプライマーとして使用した。ＮＳ３およびＲＢ５Ａ／Ｂは、それぞれ配列番号２のアミノ酸１０１−１０９および３１８−３２６の広がり（Streches）に対応し、これらはほとんどのミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼ中(例えば配列番号２、４、６、８）に保存されている。ＰＣＲはＰＣＲキット（パーキン−エルマー：Perkin-Elmer）を使用して、９４℃で１秒、４５℃で１分そして５５℃で２分の４０回循環した。ＰＣＲ生成物のアガロースゲルでの分析では、期待された大きさ（７２０ｂｐ）の生成物の存在が示され、これはセンスまたはアンチセンスプライマーのいずれかだけを含む対照反応中には存在しなかった。断片をゲル精製し、そして上記のように６０℃でトウモロコシｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用した。１つの陽性にハイブリダイズしたプラークを精製し、そしてそのｃＤＮＡで部分配列決定することにより、これはミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列であるが３’末端が短縮されていることが示された。部分的デサチュラーゼをコードするこのｃＤＮＡ挿入物をゲル単離し、そして再度トウモロコシｃＤＮＡライブラリーを釣り上げるために使用した。幾つかの陽性プラークを回収し、特性を決定した。ＤＮＡ配列分析では、すべてのこれらのクローンが５’または３’末端の長さが異なる同じ配列を表すと思われることが明らかになった。最長の挿入物を含有するクローン（ｐＦａｄ２＃１と命名した）を、完全に配列決定した。ｃＤＮＡの全長は１７９０ｂｐ（配列番号７）であり、３８８アミノ酸のポリペプチドをコードする１６５−１３２８ｂｐのヌクレオチド由来の読み取り枠を含んで成るものである。派生したポリペプチド（配列番号８）のアミノ酸配列は、それぞれアラビドプシス（Arabidopsis）ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼ、アラビドプシス（Arabidopsis）ミクロソームデルタ−１５デサチュラーゼ、およびアラビドプシス（Arabidopsis）プラスチドデルタ−１５デサチュラーゼと７１％、４０％および３８％の同一性を共有した。さらにこれはＮ−末端アミノ酸の広がり（extension）を欠き、これはプラスチド酵素であることを示すものである。これらの考察に基づき、これはミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼをコードすると結論した。
【００７７】
＜カスター豆種子からデルタ−１２ミクロソーム脂肪酸デサチュラーゼおよびデサチュラーゼ−関連酵素をコードするｃＤＮＡの単離＞
ポリソームのｍＲＮＡを第I−II期（５−１０ＤＡＰ）のカスター豆および第IV−V期（２０−２５ＤＡＰ）のカスター豆から単離した。１０ｎｇの各ｍＲＮＡをパーキン−エル
マーＲＴ−ＰＣＲキットを使用する別個のＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した。逆転写酵素反応はランダムヘキサマーで釣り上げ、そしてＰＣＲ反応は縮退デルタ−１２デサチュラーゼプライマー（ＮＳ３およびＮＳ９：配列番号１３および１４）で行った。ＰＣＲ反応のアニーリング−伸長温度は５０℃であった。約７００ｂｐのＤＮＡ断片を第I−II期および第IV−V期の両方のｍＲＮＡから増幅した。１つの反応からの増幅ＤＮＡ断片をゲル精製し、ｐＧＥＭ−ＴベクターにプロメガｐＧＥＭ−Ｔ  ＰＣＲクローニングキットを使用してクローン化し、プラスミドｐＲＦ２−１Ｃを作成した。ｐＲＦ２−１Ｃ中の７００ｂｐの挿入物は上記のようにシークエンシングされ、その結果のＤＮＡ配列を配列番号９に示す。配列番号９中のＤＮＡは、配列番号２に記載されたアラビドプシス（Arabidopsis）ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼのアミノ酸１３５−３５３と８１％の同一性（９０％の類似性）を有する２１９アミノ酸（配列番号１０）をコードする読み取り枠を含む。したがってｐＲＦ２−１Ｃ中のｃＤＮＡ挿入物はカスター豆種子ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼをコードする６７６ｂｐの完全長ｃＤＮＡである。完全長カスター豆種子ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡはカスター種子ｃＤＮＡライブラリーを６０℃で、上記例に記載されたように標識したｐＲＦ２−１Ｃの挿入物でスクリーニングすることにより単離できる。またｐＲＦ２−１Ｃの挿入物はカスター豆ライブラリーを低温でスクリーニングしてデルタ−１２デサチュラーゼ−関連配列（デルタ−１２ヒドロキシラーゼのような）を単離するために使用できる。
【００７８】
発生中のカスター豆（第IV−V期、２０−２５ＤＡＰ）から単離したｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡに対して作成されたｃＤＮＡライブラリーを上記のようにスクリーニングした。ｐＳＦ２ｂまたはｐＲＦ２−１Ｃから上記のように調製した放射線標識プローブを加え、そして５０℃で１８時間ハイブリダイズさせた。フィルターを上記に記載されているように洗浄した。フィルターのオートラジオグラフィーでは、多くのハイブリダイズプラークがあり、これらは強くハイブリダイズしているか、または弱くハイブリダイズしていた。３つの強くハイブリダイズしているプラークを（１９０Ａ−４１、１９０Ａ−４２および１９０Ａ−４４）ならびに３つの弱くハイブリダイズしているプラーク（１９０Ｂ−４１、１９０ｂ−４３および１９７ｃ−４２）を上記のようにプラーク精製した。精製したファージのｃＤＮＡ挿入物の大きさは、挿入物のｐＣＲ増幅により、ファージを鋳型として、そしてラムダ−ｇｔ１１オリゴマー（クローンテック：Clontech ラムダ−ｇｔ１１アンプリマー：Amplimer）をプライマーとして使用して行った。増幅ファージのＰＣＲで増幅した挿入物を、すでにＥｃｏＲIで切断され、クレノウで満たされたpBluescript（ファルマシア：Pharmacia）（Sambrookら（モレキュラークローニング、ア ラボラトリーアプローチ、第二版、(1989)コールドスプリングハーバー出版編集）中にサブ−クローン化した。生成したプラスミドをｐＲＦ１９０ａ−４１、ｐＲＦ１９０ａ−４２、ｐＲＦ１９０ａ−４４、ｐＲＦ１９０ｂ−４１、ｐＲＦ１９０ｂ−４３およびｐＲＦ１９７ｃ−４２と呼ぶ。ｐＲＦ１９７ｂ−４２の挿入物が約１．５ｋｂであることを除いて、すべての挿入物は約１．１ｋｂであった。プラスミド中の挿入物を上記のように配列決定した。ｐＲＦ１９０ｂ−４３は読み取り枠を含まず、同定しなかった。ｐＲＦ１９０ａ−４１、ｐＲＦ１９０ａ−４２、ｐＲＦ１９０ａ−４４およびｐＲＦ１９０ｂ−４１中の挿入物は同一であった。ｐＲＦ１９７ｃ−４２中の挿入物はｐＲＦ１９０ａ−４１、ｐＲＦ１９０ａ−４２、ｐＲＦ１９０ａ−４４およびｐＲＦ１９０ｂ−４１挿入物のすべてのヌクレオチドに加えてさらに約４００ｂｐを含んだ。したがってｐＲＦ１９７ｃ−４２はｐＲＦ１９０ａ−４１、ｐＲＦ１９０ａ−４２、ｐＲＦ１９０ａ−４４およびｐＲＦ１９０ｂ−４１の挿入物のより長い変更物であり、すべては同じ完全長のｍＲＮＡに由来すると推定された。プラスミドｐＲＦ１９７ｃ−４２中の挿入物の完全なｃＤＮＡ配列を配列番号１１に示す。配列番号１１の予想されるアミノ酸配列（配列番号１２に示す）は、上記カスターミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼ（配列番号１０）とは７８．５％の同一性（９０％の類似性）であり、そして配列番号２のアラビドプシス（Arabidopsis）デルタ−１２デサチュラーゼアミノ酸配列とは６６％の同一性（８０％の類似性）である。このような類似性
はｐＲＦ１９７ｃ−４２がミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼまたはミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼ関連酵素（デルタ−１２ヒドロキシラーゼのような）をコードするカスター豆種子ｃＤＮＡであることを確認するものである。ｐＲＦ２−１ＣおよびｐＲＦ１９７ｃ−４２用の特異的なＰＣＲプライマーを作成した。ｐＲＦ２−１ｃ用は、上流プライマーが配列番号９中のｃＤＮＡ配列の１８０−１９７塩基であった。ｐＲＦ１９７ｃ−４２用は、上流プライマーが配列番号１１のｃＤＮＡ配列の７１７−７４３塩基であった。共通の下流プライマーを配列番号９に記載された配列の４６３−４７８ヌクレオチドの完全な相補鎖に対応して作成された。ＲＴ−ＰＣＲをランダムヘキサマーおよび上記プライマーを用いて行い、ｐＲＦ２−１Ｃに含まれるｃＤＮＡがカスター豆種子の第I−II期および第IV−V期の両方で発現するが、プラスミドｐＲＦ１９７ｃ−４２に含まれるｃＤＮＡはカスター豆種子の第IV−V期のみに発現し、すなわちこれは組織中でリシノール酸が活発に合成されている時のみに発現する。したがってこのｃＤＮＡはデルタ−１２ヒドロキシラーゼをコードすることができる。
【００７９】
配列番号２のアミノ酸３１１−３５３に対応する高度保存領域を比較するために、配列番号１０および配列番号１２に記載された２つのカスター配列から派生した十分なアミノ酸配列がある。配列番号２、４、６、８および１０を上記Hein法により整列させると、コンセンサス配列はちょうど配列番号２のアミノ酸３１１−３５３に対応する。上記の種子ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼのすべては、この領域にわたってコンセンサスと高度な同一性を有し、すなわちそれはアラビドプシス（Arabidopsis）（１００％同一性）、大豆（９０％同一性）、トウモロコシ（９５％同一性）、カノーラ（９３％同一性）、そしてカスター豆配列の１つ（ｐＲＦ２−１Ｃ）（１００同一性）である。しかし他のカスター豆種子デルタ−１２デサチュラーゼまたはデサチュラーゼ関連配列（ｐＲＦ１９７ｃ−４２）は、コンセンサスとの同一性は低く、すなわちｐＲＦ１９７ｃ−４２中の挿入物のアミノ酸配列（配列番号１２）については８１％である。したがってｐＲＦ１９７ｃ−４２中の挿入物はミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼをコードすることは可能であり続けるが、この考察はこれがデサチュラーゼ関連配列、すなわちデルタ−１２ヒドロキシラーゼをコードするという仮説も支持する。
【００８０】
カスター豆種子デルタ−１２ヒドロキシラーゼをクローニングするためのさらなる方法は、特異なｃＤＮＡ群のスクリーニングである。発生中のカスター豆の内胚乳（第IV−V期、２０−２５ＤＡＰ）から単離したポリソームｍＲＮＡに対して作成されたラムダ−Ｚａｐ（ストラタジーン）ｃＤＮＡライブラリーを、発生中のカスター豆の内胚乳（第I−II期、５−１０ＤＡＰ）から単離したポリソームｍＲＮＡから作成された３２Ｐ−標識ｃＤＮＡ、および発生中のカスター豆の内胚乳（第IV−V期、２０−２５ＤＡＰ）から単離したポリソームｍＲＮＡから作成された３２Ｐ−標識ｃＤＮＡでスクリーニングした。個々のプラークを単離するようにライブラリーを１３７ｍｍのプレートあたり２０００プラーク密度でスクリーニングした。約60,000プラークがスクリーニングされ、後期（第IV／V期）ｃＤＮＡとハイブリダイズするが、前期（第I／II期）とはしないプラーク（これは２００プラークあたり約１に相当した）をプールした。
【００８１】
様々に発現したｃＤＮＡのライブラリーを、上記カスターデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡおよび／またはデルタ−１２デサチュラーゼの中で保存されたアミノ配列に基づく縮退オリゴヌクレオチドでスクリーニングして、関連カスターｃＤＮＡ（デルタ−１２オレイン酸塩ヒドロキシラーゼ酵素コードするｃＤＮＡを含む）を単離できる。これらアミノ酸配列の保存領域は、制限するわけではないが配列番号２に記載されたアミノ酸配列のアミノ酸１０１−１０９、１３７−１４５および３１８−３２７を含むか、あるいは以下の表７に記載の任意の配列を含むことができる。そのようなオリゴマーの例は、配列番号１３、１４、１６および１７である。プラスミドｐＣＦ２−１９７ｃ中の挿入物をＥｃｏＲIで切断し、ベクター配列を取り出し、ゲル電気泳動で精製し、そして上記のように
放射線標識することができる。上記保存アミノ酸配列に基づく縮退オリゴマーは、上記のように３２Ｐで標識できる。発生中の内胚乳の特異ライブラリーからクローン化されたｃＤＮＡで、初期のｍＲＮＡプローブとはハイブリダイズしないが、後期ｍＲＮＡプローブおよびカスターデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡまたはデルタ−１２デサチュラーゼに基づくオリゴマーとハイブリダイズするものは、カスターデルタ−１２ヒドロキシラーゼであろう。推定のヒドロキシラーゼｃＤＮＡを含有するpBluescriptベクターを切り出し、その挿入物を上記のように直接シークエンシングすることができる。
【００８２】
ｐＲＦ２−１ＣおよびｐＲＦ１９７ｃ−４２のようなクローン、ならびに特異スクリーニングからの他のクローン（これはそのＤＮＡ配列に基づく）は、カスター豆種子ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼとの関連が低く、上記または国際特許出願第９３１１２４５に記載された周知の脂肪酸デサチュラーゼではなく、例えば大豆胚または別の適当な植物組織あるいは微生物（例えば酵母など）中で発現することができるが、これは適当な発現ベクターおよび形質転換法を使用して、通常リシノール酸を含有しない。カスターｃＤＮＡを発現している形質転換組織（１つまたは複数）中の新規リシノール酸の存在を、カスターｃＤＮＡの同一性をオレイン酸塩ヒドロキシラーゼを、コードするＤＮＡとして確認する。
【００８３】
＜種子ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼ間の配列比較＞
ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼをコードする完全長ヌクレオチド配列のコーディング領域間の全同一性の割合を、Needlemanら(J.Mol.Biol.(1970)48:443-453)の方法により、５．０および０．３のギャップ重量およびギャップ長の値を使用して、それらを整列することにより決定した(表４)。ここでａ２、ｃ２、ｓ２、ｚ２およびｄｅｓＡは、それぞれアラビドプシス（Arabidopsis）（配列番号１）、ブラッシカ  ナプス（Brassica napus）（配列番号３）、大豆（配列番号５）トウモロコシ（配列番号７）およびラン色細菌ｄｅｓＡ由来のミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列を言い、一方ｒ２はカスター豆由来のミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼまたはデサチュラーゼ−関連酵素を言う（配列番号１２）。
【００８４】
【表４】
2006238886.tif 000005
Needlemanら(J.Mol.Biol.(1970)48:443-453)の方法により、それぞれ３．０および０．１のギャップ重量およびギャップ長の値の使用による整合性により決定した本発明のミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼまたはデサチュラーゼ−関連酵素（すなわち配列番号２、４、６、８および１２）の推定されるアミノ酸配列間の全関連性を、表５に表す。ここでａ２、ｃ２、ｓ２、ｚ２およびｄｅｓＡは、それぞれアラビドプシス（Arabidopsis）（配列番号２）、ブラッシカ  ナプス（Brassica napus）（配列番号４）、大豆（配列番号６）トウモロコシ（配列番号８）およびラン色細菌ｄｅｓＡ由来のミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼを言い、一方ｒ２はカスター豆由来のミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼまたはデサチュラーゼ−関連酵素を言う（配列番号１２）。酵素間の関連性を、全同一性の割合／全類似性の割合で表す。
【００８５】
【表５】
2006238886.tif 000006
ブラッシカ  ナプス（Brassica napus）、大豆、カスターおよびトウモロコシ酵素とアラビドプシス（Arabidopsis）ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼ間のアミノ酸レベルでの高度な全同一性（６０％以上）、ならびに核にコードされたクロロプラストに期待される一時的なペプチドのＮ−末端のひろがり（extension）の欠失から、配列番号４、６、８、１０および１２はミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼまたはデサチュラーゼ関連酵素をコードすると結論する。さらにこれは生物的機能からも確認されるだろう。すなわち上記配列をセンスまたはアンチセンス方向に包含するキメラ遺伝子を使用して、適当な調節配列で作成したトランスジェニック植物または他の生物の表現型を分析することによる。したがって同じまたは異なる高等植物種、特に油−生産種由来の相同的な脂肪酸デサチュラーゼのｃＤＮＡまたは遺伝子を単離することができる。さらにこれらの比較に基づき、すべての高等植物種由来の高等植物ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼは、６０％以上の同一性を表し、配列番号１、３、５、７、９および１１を使用して、配列依存的な手法により相同的な脂肪酸デサチュラーゼ配列を容易に単離できると期待する。  上記整合法を使用した選択した植物デサチュラーゼ間のアミノ酸レベルでの全同一性の割合を表６に示す。
【００８６】
【表６】
2006238886.tif 000007
表６では、ａ２、ａ３、ａｄ、ｃ３、ｃＤおよびＳ３は、それぞれ配列番号２、アラビドプシス（Arabidopsis）ミクロソームデルタ−１５デサチュラーゼ、アラビドプシス（Arabidopsis）プラスチドデルタ−１５デサチュラーゼ、カノーラミクロソームデルタ−１５デサチュラーゼ、カノーラプラスチドデルタ−１５デサチュラーゼ、および大豆ミクロソームデルタ−１５デサチュラーゼを言う。これらの比較に基づき、ミクロソームおよびプラスチドの両方の型のデルタ−１５デサチュラーゼは同じ植物種からであってもアミノ酸レベルで６５％以上の同一性を有する。上記に基づき、すべての高等植物種由来のミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼは同様なレベルの同一性（すなわちアミノ酸レベルで６０％以上）を示し、そして配列番号１、３、５、７、および９も相同的なデルタ−１
２デサチュラーゼ配列およびおそらく脂肪酸デサチュラーゼ−関連酵素の配列(オレイン酸塩ヒドロキシラーゼのような)（これは５０％以上のアミノ酸相同性を有する）を単離するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用できると期待される。
【００８７】
植物ミクロソーム脂肪酸デルタ−１２デサチュラーゼ［配列番号２、４、６および８］ならびに植物デルタ−１５デサチュラーゼ［アラビドプシス（Arabidopsis）およびブラッシカ  ナプス（Brassica napus）、国際特許出願第9311245号明細書由来のミクロソームおよびプラスチドデルタ−１５デサチュラーゼ］のタンパク質配列の同様な整合性から、種々のデサチュラーゼ間に保存されたアミノ酸配列の同一性を表すことができる。
【００８８】
【表７】
2006238886.tif 000008
表７は保存アミノ酸配列の１２の領域（Ａ−Ｌと命名、カラム１）を表し、その配列番号２の中での位置をカラム２に表す。植物デルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼおよび植物デルタ−１５脂肪酸デサチュラーゼ中のこれらの領域については保存配列をカラム３および４にそれぞれ示し；アミノ酸は標準的な略号により表し、下線を付したアミノ酸はデルタ−１２およびデルタ−１５デサチュラーゼ間に保存されており、そしてカッコの中のアミノ酸はその位置で見られた置換を表す。これら領域のコンセンサス配列をカラム５に示す。これらの短い保存アミノ酸および関連する位置は、さらに単離したｃＤＮＡが脂肪酸デサチュラーゼをコードすることを確認するものである。
【００８９】
＜相同の、および異質の脂肪酸デサチュラーゼおよびデサチュラーゼ−様酵素をコードするヌクレオチド配列の単離＞
本発明の断片を、本発明の断片として同じ種由来の、あるいは異なる種由来の相同の、および異質の脂肪酸デサチュラーゼのｃＤＮＡおよび遺伝子を単離するために使用できる。配列依存的手法を使用する相同的遺伝子の単離は、当該技術分野で周知であり、アラビドプシス（Arabidopsis）ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡ配列がブラ
ッシカ  ナプス（Brassica napus）、大豆、トウモロコシおよびカスター豆由来の関連する脂肪酸デサチュラーゼのｃＤＮＡを単離するために使用できることを実証した。
【００９０】
さらに重要なことは配列番号１、３、５、７および９またはそれより小さい、より保存された領域を含むものを新規脂肪酸デサチュラーゼおよび脂肪酸デサチュラーゼ−関連酵素を単離するために使用できる。
【００９１】
本発明の特別な態様では、種々のデサチュラーゼ間に保存された本発明の核酸断片の領域は、相同の、または異質な脂肪酸デサチュラーゼｃＤＮＡまたは遺伝子をコードする核酸断片を単離するために、配列依存的な手法の使用において縮退オリゴマーの混合物を設計するために当業者により使用されることができる。例えばポリメラーゼ連鎖反応では（Innisら、編集(1990)ＰＣＲ法：方法および応用へのガイド（A Guide to Methods and Applications）、アカデミックプレス、サンディエゴ）、２つの短い本発明の断片を、ＤＮＡまたはＲＮＡからのより長い脂肪酸デサチュラーゼＤＮＡ断片を増幅するために使用できる。ポリメラーゼ連鎖反応は、本発明の断片に基づく１つのプライマーでクローン化したヌクレオチド配列のライブラリーについて行い、そしてもう一方はｐｏｌｙＡ＋テイルまたはベクター配列のいずれかについても行うこともできる。これらのオリゴマーは独自の配列または本発明の核酸断片由来の縮退配列であることができる。次に本方法により生成した相同的な脂肪酸デサチュラーゼＤＮＡのより長いものを、次にアラビドプシス（Arabidopsis）または他の種由来の関連する脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子またはｃＤＮＡを単離するためのプローブとして使用し、そして既知のデサチュラーゼ配列の特異スクリーニングおよびヌクレオチド配列決定法で実質的に同定することができる。ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応のためのオリゴマーの設計（デオキシイノシンを使用する長いオリゴマーを含む）および“ゲッセマーズ（guessmers）”は、当業者に周知であり、Sambrookら、（モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル、第二版、（１９８９）、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版）に考察されている。ラン色細菌のデルタ−１２デサチュラーゼ（Wadaら、Nature(1990)347:200-203）および植物デルタ−１５デサチュラーゼ［国際特許出願公開第9311245号明細書］の間に保存されたアミノ酸配列の短い広がり（stretches）は、すでに縮退した、かつ／またはデオキシイノシンを使用したオリゴヌクレオチドを作成するために使用された。ラン色細菌のデルタ−１２デサチュラーゼおよび高等植物デルタ−１５デサチュラーゼ間に保存されている１２アミノ酸に広がるように作成されたこれらのオリゴマーの１組は、プラスチドデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡをクローニングすることに成功した；これらの植物デサチュラーゼは、ラン色細菌のデルタ−１２デサチュラーゼに対し５０％より高い同一性を有する。これらのオリゴヌクレオチドの中には、植物由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物を作成するためにプライマーとして使用されるものもあった。しかしオリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ生成物のいずれも、放射線標識ハイブリダイゼーションプローブとしてミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列を単離するのに成功しなかった。したがって予想どおりアラビドプシス（Arabidopsis）デルタ−１２およびアラビドプシス（Arabidopsis）デルタ−１５デサチュラーゼ間に保存された４つ以上のアミノ酸の広がりはいずれもラン色細菌デサチュラーゼ中のものとは同一ではなく、これはちょうどアラビドプシ���（Arabidopsis）デルタ−１５とラン色細菌デサチュラーゼ間に保存された４つ以上のアミノ酸の広がりが配列番号２のものとは同一でないことと同じである。本発明とデルタ−１５デサチュラーゼ間に保存されたアミノ酸の広がりは、今、他のデサチュラーゼおよびデサチュラーゼ関連酵素をコードする配列を単離するために使用されるオリゴマーの設計を可能にする。例えばデルタ−１２デサチュラーゼとデルタ−１５デサチュラーゼとの間のアミノ酸の保存された広がり（表７に示す）は、ハイブリダイゼーションのための長いオリゴマーを設計するために有用であり、ならびにポリメラーゼ連鎖反応には短いプライマーとして使用するのに有用である。これに関して、デルタ−１２とデルタ−１５デサチュラーゼとの間
の保存配列（表７に示す）は特に有用である。当業者に知られている、例えばＬｙｓ／Ａｒｇ、Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ｇｌｎ／ＡｓｎおよびＳｅｒ／Ｔｈｒのようなコンセンサス配列も保存的置換として考慮されるだろう。４アミノ酸長のような短いアミノ酸配列はＰＣＲで成功裏に使用できる［Nunbergら、(1989)Journal of Virology 63:3240-3249］。デルタ−１２デサチュラーゼ間（配列番号２、４、６、８および１０）に保存されたアミノ酸配列は、脂肪酸デサチュラーゼおよびデルタ−１２デサチュラーゼにより関連していると思われる脂肪酸デサチュラーゼ−関連酵素（カスター豆由来のオレエートヒドロキシラーゼのような）を単離するための配列−依存的な手法にも使用できる。カラム３（表７）の保存配列はデルタ−１５デサチュラーゼ（カラム４、表７）間にも良く保存されているので特に有用である。
【００９２】
多様なデサチュラーゼから保存アミノ酸配列を決定することは、新規脂肪酸デサチュラーゼ［真菌、藻類（長鎖ｎ−３脂肪酸の不飽和化に関与するデサチュラーゼを含む）、およびラン色細菌、ならびに他の生物由来の他の膜−結合デサチュラーゼを含む］を非−植物源から単離する助けとな得るより多くの、より良いコンセンサス配列を同定可能にするだろう。
【００９３】
本発明を使用して単離できた脂肪酸デサチュラーゼまたはデサチュラーゼ−関連酵素をコードする多様なヌクレオチド断片の機能は、センスまたはアンチセンス方向に植物発現に必要な適当な制御配列に連結した単離した配列で植物を形質転換し、生成したトランスジェニック植物の脂肪酸表現型を観察すことにより確認できる。形質転換に好ましい標的植物は、目的がアンチセンス阻害またはコーサプレッションによる対応する内因性遺伝子の抑制を得ることであるならば、単離したヌクレオチド断片の起源と同じである。単離した核酸配列断片の発現または過剰発現に使用する好適な標的植物は、野生型植物または不飽和化反応に既知の突然変異をもつ植物であり、例えばアラビドプシス（Arabidopsis）突然変異体ｆａｄＡ、ｆａｄＢ、ｆａｄＣ、ｆａｄＤ、ｆａｄ２およびｆａｄ３；デルタ−１５不飽和化欠失のアマ突然変異体；またはデルタ−１２不飽和化欠失のヒマワリ突然変異体などである。あるいは単離した核酸断片の機能は他の生物（核酸配列断片および適当な調節配列を含有するキメラ遺伝子を持つ酵母、ラン色細菌のような）の形質転換介して、その後に脂肪酸組成および／または酵素活性を測定することができる。
【００９４】
＜トランスジェニック種での脂肪酸デサチュラーゼ酵素の過剰発現＞
機能的な脂肪酸デサチュラーゼ（１つまたは複数）をコードし、適当な調節配列をもつ本発明の核酸断片（１つまたは複数）は、トランスジェニック生物で酵素（１つまたは複数）の過剰発現に使用することができる。そのような発現または過剰発現の例はオレエート不飽和化を欠くアラビドプシス（Arabidopsis）突然変異体の形質転換により実証される。そのような組換えＤＮＡ構築物は、宿主生物と同じまたは異なる種から単離された天然の脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子またはキメラ脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子を含んでもよい。脂肪酸デサチュラーゼ（１つまたは複数）の過剰発現には、コーサプレッションのようなものを減少するために導入する遺伝子は異なる種由来のものが好ましい。例えば大豆、菜種または他のポリ不飽和化脂肪酸を生産する油−生産種のデルタ−１２デサチュラーゼ過剰発現はｐ９２１０３，ｐＣＦ２−１６５ＤおよびｐＳＦ２−１６９Ｋに見いだされる完全長ｃＤＮＡ由来のＲＮＡを発現させることにより達成できる。デルタ−１２デサチュラーゼを過剰発現しているトランスジェニック系は、デルタ−１５デサチュラーゼを過剰発現している系と交配させると１８：３の超高レベルを生じる。同様にアラビドプシス（Arabidopsis）、菜種および大豆由来の脂肪酸デサチュラーゼをコードする単離した核酸断片は、当業者に使用されて、もし未だ得られていないならば他の実質的に相同的な完全長ｃＤＮＡならびに対応する遺伝子を本発明の断片として得るために使用することができる。これらは次に植物中で対応するデサチュラーゼを過剰発現するために使用できる。当業者は、Sambrookら（モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル、第二
版(1989)、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版）に記載されているように制限エンドヌクレアーゼの部位を使用および／または作成することにより、本発明の断片（１つまたは複数）からコーディング配列（１つまたは複数）を単離することができる。
【００９５】
本発明の特に有用な応用は、種子油中に極めて高いオレエートレベルを含有する植物突然変異体の作物学的性能を補修することである。アラビドプシス（Arabidopsis）では、ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼの突然変異に起因するホスファチジルコリン中のリノレートの減少が、低温生存能に影響した［Miguel,M.ら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6208-6212］。さらに種子中に極めて高い（＞８０％）レベルのオレエートを含むカノーラ植物の作物学的機能の低さは、根および葉のホスファチジルコリン中のリノレートレベルを減少させるミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼ遺伝子の突然変異に起因するという証拠がある。すなわち突然変異は種子−特異的ではない。したがって、種子の油中に超高いレベルのオレエートがある脂質種子の突然変異体のミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼ活性の根および／または葉に特異的な発現（すなわち、種子では発現しない）は、種子油中に超高いレベルのオレエートを持つ作物学的に改良された突然変異植物を生むだろう。
【００９６】
＜アンチセンスＲＮＡの使用による植物標的遺伝子の阻害＞
アンチセンスＲＮＡは植物の標的遺伝子を組織−特異的な様式で阻害するために使用された（van der Krolら、Biotechniques(1988)6:958-976）。アンチセンス阻害は全ｃＤＮＡ配列（Sheehyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1988）85:8805-8809）ならびに部分的なｃＤＮＡ配列（Cannonら、Plant Molec.Biol.(1990)15:39-47）を使用して示された。３’非−コーディング配列（Ch'ngら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86:10006-10010）および１．８７ｋｂ  ｃＤＮＡのわずか４１塩基−対を含む５’コーディング配列の断片（Cannonら、Plant Molec.Biol.(1990)15:39-47）が、アンチセンス阻害に重要な役割を果たすことができるという証拠もある。
【００９７】
脂肪酸デサチュラーゼのアンチセンス阻害の使用には、標的植物の標的組織中に発現する１つ以上の標的脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子に関して転写された配列の単離が必要であるかもしれない。より高度に発現している遺伝子がアンチセンス阻害の最高の標的である。これらの遺伝子は当業者には周知のｍＲＮＡのレベルの定量分析または核ラン−オフ転写のような技術により遺伝子の転写レベルを測定することにより同定できる。
【００９８】
全大豆ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡを、大豆ｂ−コングリシニン、大豆ＫＴｉ３および豆ファセロリンプロモーターに関してアンチセンスの方向にクローン化し、そしてこのキメラ遺伝子をすでに大豆接合胚について良いモデル系を与えると示された大豆体胚中に形質転換し、そしてその種子組成を示す（表１１）。形質転換した体胚はリノレート生合成の抑制を示した。同様に全ブラッシカ  ナプス（Brassica napus）のミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡを、菜種ナピンプロモーターに関してアンチセンスの方向でクローン化し、そしてこのキメラ遺伝子をビー．ナプス（B.napus）中に形質転換した。形質転換したビー．ナプス（B.napus）植物の種子はリノレートの生合成の抑制を示した。したがってポリ不飽和脂肪酸レベルの変化を生じる油−生産種子（トウモロコシ、ブラッシカ  ナプス（Brassica napus）および大豆を含む）中のデルタ−１２デサチュラーゼのアンチセンス阻害は、ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼをコードする全または部分的ｃＤＮＡ由来のアンチセンスＲＮＡの発現により達成できる。
【００９９】
＜コーサプレッションによる植物標的遺伝子の抑制＞
コーサプレッションの現象も組織−特異的な様式で植物標的遺伝子を阻害するために使用された。全ｃＤＮＡ配列（Napoliら、The Plant Cell(1990)2:279-289;van der Krolら
、The Plant Cell(1990)2:291-299）ならびに部分的ｃＤＮＡ配列(1770bp cDNAの730bp)(Smithら、Mol.Gen.Genetics(1990)224:477-481）を使用する内因性遺伝子のコーサプレッションは知られている。
【０１００】
脂肪酸デサチュラーゼまたはその部分をコードする本発明の核酸断片は、適当な調節配列とともに脂肪酸デサチュラーゼのレベルを減少するために使用でき、これにより実質的に導入した核酸配列断片に相同的な内因性遺伝子を含むトランスジェニック植物中の脂肪酸組成を変化させることができる。これに必要な実際的な方法は、部分的ｃＤＮＡも使用できることを除いて、上記の脂肪酸デサチュラーゼ核酸断片の過剰発現の方法と同様である。例えば、ポリ不飽和脂肪酸のレベルの変化を生じるブラッシカ  ナプス（Brassica napus）および大豆のデルタ−１２デサチュラーゼのコーサプレッションは、ｐＣＦ２−１６５ＤおよびｐＳＦ２−１６５Ｋ中のセンス方向に、それぞれ全または部分的種子デルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡを発現させることにより行い得る。内因性遺伝子も導入された遺伝子コピーの非−コーディング領域により阻害できる［例えば、Brusslan,J.A.ら、Plant Cell 5:667-677;Matzke,M.A.ら、Plant Molecular Biology 16:821-830］。我々はｃＤＮＡ（配列番号１）に対応するアラビドプシス（Arabidopsis）遺伝子（配列番号１５）を単離できることを示した。当業者はこの遺伝子の周辺をも含むゲノムｃＤＮＡを容易に単離し、そしてそのようなトランス遺伝子（transgene）阻害法で、コーディングまたは非コーディング領域を使用することができる。
【０１０１】
ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼ欠失アラビドプシス（Arabidopsis）突然変異体の根および種子中の脂肪酸組成を分析することにより、それらの１８：２および１６：０レベルの減少が示される（野生型と比較して突然変異種では４０％も減少）［MiquelおよびBrowse(1990)、植物脂質生化学、構造および利用（Plant Lipid Biochemistry,Structure,and Utilization）、第456-458頁、Quinn,P.J.およびHarwood,J.L.,編集、ポートランド出版）。１６：０レベルの減少も、ビー．ナプス（B.napus）の超高オレエート突然変異体で観察される。したがって前述の配列を使用するアンチセンス阻害またはコーサプレッションに起因するトランスジェニック植物での超高１８：１レベルも、１６：０のレベルを減少するだろうと思われる。
【０１０２】
＜宿主、プロモーターおよびエンハンサーの選択＞
本発明の核酸断片の発現に好適な異質宿主の種類は、真核宿主、特に高等植物の細胞である。高等植物の中でも特に好ましいのは、大豆（グリシン  マックス；Glycine max）、菜種（ブラッシカ  ナプス：Brassica napus、ビー．カンペストリス：B.campestrisを含む）、ヒマワリ（ヘリアンテス  アヌス：Helianthus annus）、綿（ゴシッピウム  ヒルステム：Gossypium hirsutum）、トウモロコシ（ゼア  メイズ：Zea mays）、ココア（セオブローマ  カカオ：Theobroma cacao）、ベニバナ（カーサムス  チンクトリス：Carthamus tinctorius）、アブラヤシ（エラエイス  クイニーンス:Elaeis quineensis) アマ（リナム  ウシタチスシム：Linum usitatissimum）およびピーナッツ（アラチス  ハイポゲーラ：Arachis hypogaea）である。
【０１０３】
植物中での発現はそのような植物中で機能する調節配列を使用するであろう。
【０１０４】
植物中での外来遺伝子の発現は、よく確立されている（De Blaereら、Meth.Enzymol.(1987)153:277-291）。本発明の断片の発現を駆動するために選択されたプロモーターの起源は重要ではないが、ただしプロモーターは所望の宿主組織中で脂肪酸デサチュラーゼの転写可能なｍＲＮＡのレベルをそれぞれ増加または減少することにより発明を達成するための十分な転写活性を有する。好ましいプロモーターにはａ）カリフラワーモザイクウイルス中の１９Ｓおよび３５Ｓ転写物を支配するような強力な構成的植物プロモーター（Odellら、Nature(1985)313:810-812;Hullら、Virology(1987)86:482-493)、ｂ）組織−また
は発生的−（developmentally-）に特異的なプロモーター、およびｃ）例えば外来遺伝子を発現するためのバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を使用するような、植物中で工作される転写可能なプロモーター系がある。組織−特異的なプロモーターの例としてはリボース１，５−ビス−リン酸塩カルボキシラーゼの小さいサブユニットの光−誘導性プロモーター（発現が光合成組織中で所望される場合）、メイズ  ゼインタンパク質プロモーター（Matzkeら、EMBO J.(1984)3:1525-1532）およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質プロモーター（Lampaら、Nature(1986)316:750-752）。
【０１０５】
特に好適なプロモーターは種子−特異的発現を可能にするプロモーターである。これは種子が植物油の主要源であり、また種子−特異的発現は非−種子組織に有害な影響の可能性を避けるので特に有用となり得る。種子−特異的プロモーターの例には制限するわけではないが、多くの植物中に種子タンパク質の最高９０％を表すことができる種子保存タンパク質のプロモーターである。種子保存タンパク質は厳しく調節されており、種子中でほとんど排他的に組織−特異的および段階−特異的様式で発現されている（Higginsら，Ann.Rev.Plant Physiol.(1984)35:191-221;Goldbergら、Cell(1989)56:149-160）。さらに種々の種子保存タンパク質を種子発生の種々の段階で発現させることができる）。
【０１０６】
種子−特異的遺伝子の発現は極めて詳細に研究された（Goldbergら、Cell(1989)56:149-160およびHigginsら，Ann.Rev.Plant Physiol.(1984)35:191-221を総説として参照されたい）。現在では多くのトランスジェニック双子葉植物中で種子保存タンパク質遺伝子の種子−特異的発現の例がある。それらには豆ｂ−パセロインの双子葉植物由来の遺伝子（Sengupta-Gopalanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:3320-3324;Hoffmanら、Plant Mol.Biol.(1988) 11:717-729）、豆レクチン（Voelkerら、EMBO J.(1987) 6:3571-3577）、大豆レクチン（Okamuroら、Proc.Natl．Acad.Sci.USA(1986) 83:8240-8244）、大豆クニッツ（kunitz）トリプシンインヒビター（Perez-Grauら、Plant Cell(1988) 1:095-1109）、大豆ｂ−コングリシニン（Beachyら、EMBO J.(1985) 4:3047-3053;エンドウ  ビシリン（Higginsら、Plant Mol.Biol.(1988) 11:683-695）、エンドウ  コンビシリン（Newbiginら、Planta(1990) 180:461-470)、エンドウ  レグミン（Shirsatら、Mol.Gen.Genetics(1989) 215:326-311；菜種ナピン（Radkeら、Theor.Appl.Genet.(1988) 75:685-694）、ならびにメイズ１５ｋＤゼインのような単子葉植物由来の遺伝子（Hoffmanら、EMBO J.(1987) 6:3213-3221）、メイズ１８ｋＤオレオシン（Leeら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991) 888:6181-6185）、大麦ｂ−ホーデイン（Marrisら、Plant Mol.Biol.(1988) 10:359-366)および小麦グルテニン（Colotら、EMBO J.(1987) 6:3559-3564）。さらにキメラ遺伝子構築物中の異質コーディング配列に操作可能に連結された種子−特異的遺伝子のプロモーターは、トランスジェニック植物中での一時的および局在的発現パターンも維持する。そのような例にはアラビドプシス（Arabidopsis）およびビー．ナプス（B.napus）中でエンケファリンペプチドを発現するための、アラビドプシス  サリアナ（Arabidopsis thaliana）２Ｓ種子保存タンパク質遺伝子プロモーター（Vandekerckhoveら、Bio/Technology(1989) 7:929-932）、ルシフェラーゼを発現するための豆レクチンおよび豆ｂ−パセオリンプロモーター（Riggsら、Plant Sci.(1989)63:47-57）、およびクロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼを発現するための小麦グルテニンプロモーター（Colotら、EMBO J.(1987) 6:3559-3564）がある。
【０１０７】
本発明の核酸断片の発現で特に有用であるのは、例えばクニッツ  トリプシンインヒビター（Jofukuら、Plant Cell(1989)1:1079-1093；グリシニン（Neilsonら、Plant Cell(1989)1:313-328）、およびｂ−コングリシニン（Haradaら、Plant Cell(1989) 1:415-425）のような数種の大豆保存タンパク質遺伝子由来の異質プロモーターであろう。大豆ｂ−コングリシニン保存タンパク質のａ−およびｂ−サブユニットの遺伝子のプロモーターは、トランスジェニック植物で種子の中−から後期発生段階中の単子葉植物中でｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを発現するのに特に有用である（Beachyら、EMBO.J.(1985)4:304
7-3953)これはトランスジェニック種子にはそれらの発現に影響する位置が大変少なく、そしてこの２つのプロモーターが異なる一時的な調節を示すからである。ａ−サブユニット遺伝子のためのプロモーターはｂ−サブユニット遺伝子よりも２−３日早く発現する。これは油の生合成が種子保存タンパク質合成よりも約１週間早く開始するトランスジェニック菜種には重要である（Murphyら、J.Plant Physiol.(1989) 135:63-69）。
【０１０８】
初期の胚発生および油合成中に発現する遺伝子のプロモーターも特に有用であろう。当業者により本発明の核酸配列を発現する脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子の天然の調節配列（天然のプロモーターを含む）を、それらの単離後に使用できる。種子の油生合成に関与する他の遺伝子由来の異質プロモーターも有用であり、それにはビー．ナプス（B.napus）イソシアネート  リアーゼおよびマレイトシンターゼ(Comaiら、Plant Cell(1989)1:293-300)、ベニバナ(Thompsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991) 88:2578-2582)およびカスター(Shanklinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991) 88:2510-2514）由来のデルタ−９デサチュラーゼ、アラビドプシス（Arabidopsis）（Post-Bettenmillerら、Nucl.Acid.Res.(1989) 17:1777)、ビー．ナプス（B.napus）(Saffordら、Eur.J.Biochem.(1989) 174:287-295)およびビー．カンペストリス（B.campestris）（Roseら、Nucl.Acid.Res.(1987) 15:7197）由来のアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）、大麦由来のｂ−ケトアシル−ＡＣＰシンセターゼ（Siggaard-Andersenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991) 88:4114-4118)、ならびにゼア  メイズ（zea mays）(Leeら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1991)88:6181-6185)、大豆(ジーンバンク寄託番号:X60773)およびビー．ナプス(B.napus)(Leeら、Plant Physiol.(1991) 96:1395-1397)由来のオレオシンがある。対応する遺伝子の配列が開示されていない、あるいはそのプロモーター領域が同定されていないならば、当業者はプロモーターを含有する対応する遺伝子およびその断片を単離するために公開されている配列を使用できる。比較的豊富なエノイル−ＡＣＰレダクターゼおよびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの部分的なタンパク質配列も公開されている(Slabasら、Biochem.Biophys.Acta(1987) 877:271-280;Cottnghamら、Biochim.Biophys,Acta(1988) 954:201-207)、そして当業者は対応する種子遺伝子とそのプロモーターとを単離するためにこれらの配列を使用できる。同様に脂肪酸デサチュラーゼをコードする本発明の断片をキメラ遺伝子の発現に使用するために、対応する遺伝子のプロモーター領域を得るために使用できる。
【０１０９】
本発明の核酸断片の適切な発現レベルを達成するためには、種々のプロモーターを利用して種々のキメラ遺伝子の使用が必要になるかもしれない。そのようなキメラ遺伝子は単一の発現ベクターと一緒に、あるいは１つ以上のベクターを連続的に使用するかのいずれかにより、宿主植物に移動させることができる。
【０１１０】
エンハンサーまたはエンハンサー−様要素を本発明の天然のまたはキメラ核酸断片のプロモーター領域に導入することは本発明を達成するための発現の増加を生じるものと思われる。このようなエンハンサーには３５Ｓプロモーターに見られるようなウイルスエンハンサー（Odellら、Plant Mol.Biol.(1988) 10:263-272）、オピン（poine）遺伝子由来のエンハンサー（Frommら、Plant Cell(1988) 1:977-984）、または本発明の核酸断片に操作可能な状態で連結したプロモーター中に配置したときに転写の上昇を生じる任意の他の起源のエンハンサーである。
【０１１１】
特に重要なのは４０倍の種子−特異的増強を構築的プロモーターに付与することができるｂ−コングリシンのａ−サブユニットについて単離されたＤＮＡ配列要素である(Chenら、Dev.Genet.（1989) 10:112-122)。当業者は容易にこの要素を単離し、そしてトランスジェニック植物中のプロモーターとともに種子−特異的な増強された発現を得るための任意の遺伝子のプロモーター領域中に挿入できる。そのような要素をｂ−コングリシン遺伝子とは異なる時期に発現する種子−特異的遺伝子へ挿入することは、トランスジェニック植物に種子発生中により長期間の発現を生じるであろう。
【０１１２】
本発明は所望の結果を得るために他の種々の方法により達成することもできる。１つの形態では、本発明は本発明の核酸断片を含有する外来遺伝子の１つ以上のコピーを導入することにより、脂肪酸デサチュラーゼレベルの上昇をもたらすために、植物を改良（modifying）することに基づく。ポリ不飽和脂肪酸の所望レベルは、１種類以上の脂肪酸デサチュラーゼの外来遺伝子の導入が必要かもしれない場合もある。
【０１１３】
本発明の核酸断片の適切な発現のために必要であるかもしれないポリアデニレーションシグナルおよび他の調節配列を提供できる３’非−コーディング領域を、本発明を達成するために使用できる。これは天然脂肪酸デサチュラーゼ（１つまたは複数）の３’末端、３５Ｓまたは１９Ｓカリフラワーモザイクウイルス転写物由来のようなウイルス遺伝子、オピン合成遺伝子由来、リブロース１，５−ビホスフェイト  カルボキシラーゼまたはクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質を含む。３’非−コーディング領域の有用性を教示する当該技術の例は沢山ある。
【０１１４】
＜形質転換法＞
当業者は本発明の高等植物細胞の形質転換法を入手することができる（欧州特許出願公開第0295959A号明細書および0318341A1号明細書を参照のこと）。そのような方法はアグロバクテリウム  エスエスピー．(Agrobacterium ssp.)のＴｉおよびＲｉプラスミドを使用する形質転換ベクターに基づく方法を含む。これらのベクターのバイナリー型を使用することは特に好ましい。Ｔｉ−由来ベクターは広範な高等植物を形質転換し、その中には単子葉および双子葉植物を含む(Sukhapindaら、Plant Mol.Biol.(1987) 8:209-216:Potykus,Mol.Gen.Genet.(1985) 199:193)。当業者は他の形質転換法も可能であり、例えば外来ＤＮＡ構築物の直接的な取り込み（欧州特許出願公開第0295959A号明細書）、電気穿刺法(Frommら、Nature(1986)(ロンドン) 319:791）、または核酸構築物で被覆した金属粒子による高速度弾道衝撃法（Klineら、Nature(1987)(ロンドン)327:70）である。いったん形質転換したら、細胞は当該技術により再生できる。
【０１１５】
最近記載された外来遺伝子を市販の重要な作物に形質転換する方法の中で特に関連が深いのは、例えば菜種（De Blockら、Plant Physiol.(1989) 91:694-701）、ヒマワリ（Everettら、Bio/Technology(1987) 5:1201）および大豆（Christouら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989) 86:7500-7504）。
【０１１６】
＜分子育種＞
プラスミドｐＳＦ２−１６９Ｋから得られた１．６ｋｂの挿入物を、数種の制限酵素の１つで消化された大豆（グリシン  マックス：Glycine max（栽培変種  ボーナス：Bonus）、およびグリシン  ソージャ：Glycine soja（PI81762））由来のゲノムＤＮＡを含有するサザンブロットについて、放射線標識プローブとして使用する。ハイブリダイゼーションの種々のパターン（多型性）を、制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲIで処理された消化物で同定した。これらの多型性は、本質的にHelentjarisら（Theor.Appl,Genet.(1986) 72:761-769）に記載されたような大豆ゲノムに対する他の遺伝子座に対して、２つのｐＳＦ２−１６９座をマップするために使用された。１つは４４０４．００および１５０３．００座の間の連結群１１（それぞれ４４０４．００および１５０３．００から４．５ｃＭおよび７．１ｃＭ）にマップされ、そしてもう１つは４０１０．００および５３０２．００座の間の連結群１９（それぞれ４０１０．００および５３０２．００から１．９ｃＭおよび２．７ｃＭ）にマップされた［Rafalski,AおよびＴingey,S(1993)、遺伝マップ（Genetic Maps)O'Brien.S.J．編集］。植物育種での制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカーの使用は当該技術分野で詳細に記載された（Tanksleyら、Bio/Technology(1989) 7:257-264）。したがって本発明の核酸断片は脂肪酸デサチュラーゼの発現に関連する特徴（trait）のＲＦＬＰマーカーとして使用できる。これらの特徴には不飽和脂肪酸レベルの変
化を含む。本発明の核酸断片は不飽和脂肪酸レベルの変化を有する変更（突然変異を含む）植物から脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子を単離するためにも使用できる。これら遺伝子のシークエンシングでは、変化を引き起こす正常遺伝子とは異なるヌクレオチドが明らかになった。これらの差異をかこんで設計された短いオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブとして、または脂肪酸が変化した後のＤＮＡを基本とした診断のいずれかで、分子育種に使用できる。変更に関連した差異に基づくオリゴヌクレオチドは、これら変更体の油特性物の育種の分子マーカーとして使用できる。
【０１１７】
＜実施例＞
本発明は以下の実施例でさらに説明され、特に言及しない限りその中のすべての部および百分率は重量で、温度は摂氏で表す。これらの実施例は本発明の好適態様を示すものであり説明のみを目的とするものであることを理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を確認することができ、その精神から逸脱することなく様々な使用および条件に適合させるために、本発明の変更および修飾を行うことができる。特許明細書および特許明細書ではなものを含むすべての文献は、引用により本明細書に編入される。
【実施例１】
【０１１８】
アラビドプシス  サリアナ（Arabidopsis thaliana）突然変異体６５８系中の挿入物のＴ−ＤＮＡ周辺領域を含むゲノムＤＮＡの単離
高オレイン酸含量をもつアラビドプシス  サリアナ（Arabidopsis thaliana）Ｔ−ＤＮＡ突然変異体の単離
アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciencs）の修飾Ｔ−ＤＮＡを含有するアラビドプシス  サリアナ（Arabidopsis thaliana）（地種  Wassilewskija）形質転換体を、Felmannら、(Mol.Gene.Genetics(1987)208:1-9)に記載されるように種子形質転換により生成した。この集団で形質転換体はＴ−ＤＮＡ境界配列中にｐＢＲ３２２細菌ベクター、ノパリンシンターゼ、ネオマイシン  ホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ、カナマイシン耐性を付与する）およびｂ−ラクタマーゼ（アンピシリン耐性を付与する）をコードするＤＮＡ配列を含有する。Ｔ−ＤＮＡを個々の形質転換体の染色体の種々の領域への組み込みは、植物遺伝子機能の破壊を挿入部で、またはその付近で引き起こす。この遺伝子機能の損失に関連する表現型は、表現型に関する集団をスクリーニングすることにより分析できる。
【０１１９】
Ｔ３種子は、Felmannら、(Science(1989)243:1351-1354)に記載されたように、２回の自己受精によりアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciencs）で処理して野生型から生成した。これらの継代はＴ−ＤＮＡ挿入物について分離しており、したがってこの挿入物から任意の突然変異が生じていた。各１７００の系から約１０−１２枚の葉を混合し、そして各１７００のプールした試料の脂肪酸含量を、２．５％のＨ２ＳＯ４（メタノール中）をメチル化試薬として使用する以外はBrowseら、(Anal.Biochem(1986)152:141-145)に本質的に記載されるように脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフィーにより測定した。“６５８”と命名された系の試料が６５７および６５９から同時採取した試料と比較して変化した脂肪酸プロフィールを与えた(表８)。
【０１２０】
【表８】
2006238886.tif 000009
６５８系からの１２の個々のＴ３種子の脂肪酸組成分析では、６５８プールがこれらのクラスから分離されている種子から成ることが示された：“高い”、“中間範囲”および“低い”クラスはそれぞれ約３７％（１２種子）、２１％（７種子）および１４％（３種子）のオレイン酸を含有する（表９）。
【０１２１】
【表９】
2006238886.tif 000010
したがって高オレイン酸突然変異体表現型は、およそメンデル比で分離されている。独立的に分離している６５８系中のＴ−ＤＮＡ挿入物の数を測定するために、２００個のＴ３種子をカナマイシンの存在下での発芽および成長能力について試験した［Felmanら、(1989)Science 243:1351-1354］。この実験で、４個のカナマイシン−耐性個体植物が同定されただけであった。分離比は（約５０：１）は、６５８系が３つのＴ−ＤＮＡ挿入物を宿していることを示していた。この実験および他の２つの実験で、全部で５６個のカナマイシン−感受性植物が確認され；その中の５３の脂肪酸組成を分析し、そして少なくともの中の７個がこれらの条件下で成長する野生型種子に対して期待されるよりも高いオレイン酸レベルを示した。
【０１２２】
高オレイン酸を生じる突然変異がＴ−ＤＮＡ挿入によるものか否かをより正確に試験するために、脂肪酸表現型突然変異体から分離している誘導系および単一のカナマイシン耐性遺伝子座を同定した。このために約１００個のＴ３植物を個々に成熟するまで成長させ、種子を回収した。各Ｔ３植物の種子試料の１つを、カナマイシン存在下での発芽および成長能力について試験した。さらに、さらなる１０種の各系からの個々の種子の脂肪酸組成について測定した。１つのＴ３植物（６５８−７５と命名した）が、その継代種子が２
８個のカナマイシン−感受性から個の６０カナマイシン−耐性突然変異体を分離し、そして７個の低い、または中程度のオレイン酸から２個の高いオレイン酸を含有するものを分離した。
【０１２３】
６５８−７５系から派生した約４００個のＴ４継代種子を生育させ、そして葉の脂肪酸組成を分析した。全部で９１個の植物を高オレイン酸特性についてホモ接合性であると同定した（１８：２／１８：１、０．５未満）。残りの植物（１８：２／１８：１、１．２より高い）は、葉の脂肪酸組成からでは野生型およびホモ接合性のクラスを決定的に確認できず、したがってカナマイシンマーカーと脂肪酸突然変異との間の関係を試験するために使用できなかった。９１個の中で明らかにホモ接合性の高オレイン酸突然変異体の８３個を、葉抽出物中のノパリン、別のＴ−ＤＮＡマーカーの存在について試験した（Errampalliら、The Plant Cell(1991)3:149-157）、そしてすべての８３個の植物はノパリンの存在について陽性であった。この脂肪酸表現型突然変異体とＴ−ＤＮＡとの強固な関連は、６５８突然変異体中の高オレイン酸特性がＴ−ＤＮＡ挿入の結果であることの証拠を提供するものである。
【０１２４】
＜プラスミドの取り出し、および分析＞
葉の組織から調製した（Rogers,S.O.およびA.J.Bendich(1985) Plant Molecular Biology 5:69-76に記載されているように）６５８−７５系のホモ接合性突然変異植物由来のゲノムＤＮＡの０．５および１マイクログラムを、製造元の仕様により５０μＬの反応容量中の２０単位のＢａｍＨIまたはＳａｌI制限酵素（ベセスダリサーチラボラトリー：Bethesda Research Laboratory）で消化した。消化後、ＤＮＡを緩衝液−飽和フェノール（ベセスダリサーチラボラトリー）で抽出し、続いてエタノールで沈殿させた。０．５から１マイクログラムのＢａｍＨIまたはＳａｌI消化ゲノムＤＮＡを２００μＬまたは４００μＬのライゲーション緩衝液（50mM Tris-Cl pH8.0、10mM MgCl２、10mM ジチオスレイトール、1mMATPおよび４単位のT4 DNAリガーゼ（ベセスダリサーチラボラトリー）を含有する）に再懸濁した。希釈した約2.5ug/mL濃度のＤＮＡ（ライゲーション反応中）を分子内結合に反して環状化し易くするために選択した。反応物を１６℃で１６時間インキュベーションした。コンピテントなＤＨ１０Ｂ細胞（ベセスダリサーチラボラトリー）を１０ｎｇの連結ＤＮＡ（１００μＬのコンピテント細胞あたり）で製造元の仕様によりトランスフェクションした。ＳａｌIまたはＢａｍＨI消化物からの形質転換体を100μg/mLのアンピシリンを含有するＬＢプレート（10g バクト−トリプトン、5gのバクト−酵母エキス、5g
NaCl、15ｇの寒天／リットル、pH7.4）で選択した。一晩３７℃でインキュベーションした後、プレートをアンピシリン−耐性コロニーについて計数した。
【０１２５】
ＢａｍＨI−消化植物ＤＮＡ由来の１つのアンピシリン−耐性形質転換体を25mg/Lのアンピシリンを含有する３５ｍＬのＬＢ培地（１リットルあたり１０ｇのバクト−トリプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌ）で培養を開始するために使用した。培養は一晩３７℃で撹拌しながらインキュベーションし、そして次に細胞を１０００ｘｇで１０分間遠心して回収した。プラスミドＤＮＡ、（ｐ６５８−１と命名した）を細胞からBirmbiomら［Nucleic Acids Res(1979) 7:1513-1523］のアルカリ溶解法によりSambrookら（モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル、第二版(1989)コールドスプリングハーバーラボラトリー出版）に記載されているように単離した。プラスミドｐ６５８−１ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨI、ＥｃｏＲIおよびＳａｌI（ベセスダリサーチラボラトリー）で消化し、そして１ｘＴＢＥ緩衝液（０．０８９Ｍ  ｔｒｉｓ−ホウ酸、０．００２Ｍ
ＥＤＴＡ）中の１％アガロースゲルを通して電気泳動を行った。制限パターンはこのプラスミド中に期待された１４．２ｋＢのＴ−ＤＮＡ断片および１．６ｋＢの推定植物ＤＮＡ／Ｔ−ＤＮＡ境界断片の存在を示した。
【実施例２】
【０１２６】
アラビドプシス  サリアナ（Arabidopsis thaliana）
突然変異体６５８−７５系中の挿入物のＴ−ＤＮＡの周辺を含むゲノムＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブとして使用するアラビドプシス  サリアナ（Arabidopsis thaliana）ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡのクローニング
１００ナノグラムの１．６ｋＢのＥｃｏＲI−ＢａｍＨI断片を、ＥｃｏＲIおよびＢａｍＨIによるプラスミドの消化、およびアガロース中での電気泳動精製後、アルファ[32P]-dCTPで、ランダムプライミングラベリングキット（Random Priming Laveling Kit：ベセスダリサーチラボラトリー）を使用して製造元の仕様に従い放射線標識した。
【０１２７】
放射線標識ＤＮＡはプローブとして、上記の様々な成長段階の挽いた部分から単離したＲＮＡで作成されたアラビドプシス（Arabidopsis）ｃＤＮＡライブラリー（Elledgeら(1991)Proc.Natl Acad.Sci.,88:1731-1735）を、本質的にSambrookら（モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル、第二版(1989)コールドスプリングハーバーラボラトリー出版）に記載されているようにスクリーニングするために使用した。このために、約17,000プラ−ク形成単位をＮＺＹ寒天（１リットルあたり5g NaCl、2g MgSO4-7H2O、5g酵母エキス、10g カゼイン酸加水分解物、13g寒天）培体上に大腸菌ＬＥ３９２の生育を含む７つの９０ｍｍペトリ皿にまいた。ファージプラークのレプリカ用フィルターを、プラークをニトロセルロースフィルターに吸着させて調製し（BA85、シュライヒャー  アンド  シゥエル：Schleicher and Schuell）、次に連続的に５分間づつ、0.5M NaOH/1M NaCl、0.5M Tris(pH7.4)/1.5M NaClおよび2xSSPE(0.36M NaCl、20mM NaH2PO4(pH7.4)、20mM EDTA(1pH7.4))に含浸させた。このフィルターを次に風乾し、８０℃で２時間焼いた。焼いた後、フィルターを2X SSPE中で湿潤化し、そして次に４２℃でプレハイブリダイゼーション緩衝液（50％  ホルムアミド、5X SSPE、1% SDS、5X デンハーツ溶液、および100ug/mL変性サケ精巣ＤＮＡ）中で２時間インキュベーションした。フィルターをプレハイブリダイゼーション緩衝液から取り出し、そして次に変性放射線標識プローブ（上記）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液に移し（50％  ホルムアミド、5X SSPE、1% SDS、１X デンハーツ溶液、および100ug/mL変性サケ精巣ＤＮＡ）、そして４２℃で４０時間インキュベーションした。フィルターを2X SSPE/0.2%SDSで４２℃にて２回（各１５分間づつ）、そして0.2X SSPE/0.2%SDSで５５℃にて２回（各３０分間づつ）洗浄し、続いてコダックＸＡＲ−５フィルムで増感スクリーンと一緒に−８０℃で一晩オートラジオグラフィーを行った。１５個のプラークがレプリカフィルター上に陽性にハイブリダイズするものとして確認された。これらの中の５つを本質的にSambrookら（モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル、第二版(1989)コールドスプリングハーバーラボラトリー出版）に記載されているようにプラーク精製に供した。ラムダＹＥＳ−Ｒ  ｃＤＮＡクローンは、大腸菌ＢＮＮ−−１３２細胞中でファージを伝達することによりプラスミドに転換し、これはファージ中に存在する’ｌｏｘ’部位でｃｒｅ−が媒介するインビボ部位−特異的組換えによりｃＤＮＡ挿入物を二本鎖プラスミドとして切り出すＣｒｅタンパク質を発現する。ｃＤＮＡ挿入物を含有するアンピシリン−耐性プラスミドクローンを液体培養で成長させ、そしてプラスミドＤＮＡをアルカリ溶解法を使用してすでに記載したように調製した。生成したプラスミドの大きさをアガロースゲル電気泳動により分析した。アガロースゲルは0.5M NaOH/1M NaCl、および0.5M Tris(pH7.4)、1.5M NaClでそれぞれ１５分間処理し、そしてゲルを次にゲルドライヤーで６５℃にて完全に乾燥した。ゲルを2X
SSPE中で水和し、そして一晩４２℃にて変性放射線標識プローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液中でインキュベーションし、次に上記のように洗浄した。オートラジオグラフィーの後、精製ｃＤＮＡクローンの４つの挿入物がこのプローブにハイブリダイズすることが分かった。ハイブリダイズするクローンからのプラスミドＤＮＡをＣｓＣｌ／エチジウムブロミド勾配（上記参照）の平衡化により精製した。４つのｃＤＮＡクローンをシークエナーゼＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ（米国バイオケミカル社：Biochemical Corp.）を使用して、ｃＤＮＡ挿入物の両側を含むベクター配列に相同的であるプライマーから開始して、そして製造元の仕様に従い配列決定した。４つのクローンから得た挿入物
の部分配列を比較した後、各々が共通の配列を含むことが明らかになった。約１．４ｋＢのｃＤＮＡ挿入物を含む１つのｃＤＮＡクローン（ｐ９２１０３）を配列決定した。最長の３つのクローンをプラスミドベクターpBluescript（ストラタジーン）中にサブクローン化した。３つの中で約１．２ｋＢ  ｃＤＮＡ挿入物を含有する１つ（ｐＳＦ２ｂ）も、すでに行ったシークエンシング実験のように新たに獲得した配列から設計されたプライマーで連続的に配列決定された。ｐＳＦ２ｂおよびｐ９２１０３から派生した混合配列を配列番号１に示す。
【実施例３】
【０１２８】
アラビドプシス  サリアナ（Arabidopsis thaliana）ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡクローンをハイブリダイゼーションプローブとして使用する植物脂肪酸デサチュラーゼｃＤＮＡのクローニング
配列番号１のアラビドプシス（Arabidopsis）デルタ−１２デサチュラーゼのコーディング配列を含有する約１．２ｋｂ断片をプラスミドｐＳＦ２ｂから得た。このプラスミドをＥｃｏＲIで消化して、そして１．２ｋｂデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によりベクター配列から精製した。この断片を３２Ｐですでに記載したように放射線標識した。
【０１２９】
ミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼをコードするブラッシカ  ナプス（Brassica napus）種子ｃＤＮＡのクローニング
放射線標識プローブをブラッシカ  ナプス（Brassica napus）種子のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用した。ライブラリーを構築するために、ブラッシカ
ナプス（Brassica napus）種子を授粉２０−２１日後に収穫し、液体窒素中に置いて、そしてポリソームＲＮＡをKamalayら（Cell(1980)19:935-946)に従い単離した。ポリアデニル化ｍＲＮＡ画分をオリゴ−ｄＴセルロースでアフィニティークロマトグラフィーにより精製した（Avivら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1972) 69:1408-1411）。４マイクログラムのこのｍＲＮＡを種子ｃＤＮＡライブラリーをラムダファージ中に構築するために（Ｕｎｉ−ＺＡＰ(商標）ＸＲベクター）にＺＡＰ−ｃＤＮＡ（商標）合成キット（１９９１ストラタジーンカタログ、商品番号＃２００４００）を記載された手順を使用した。約600,000クローンが陽性にハイブリダイズしたプラークから、ｐＳＦ２ｂからの放射線標識ＥｃＲI断片をプローブとして使用して、本質的にSambrookら（モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル、第二版(1989)コールドスプリングハーバーラボラトリー出版）に記載されているようにスクリーニングし、しかし低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（50mM Tris、p7.6、6X SSC、5Xデンハーツ溶液、0.5% SDS、100μｇ変性ウシ胸腺ＤＮＡ、５０℃）を使用し、そしてハイブリダイゼーション後の洗浄は2X
SSＣ、0.5% SDSで室温にて１５分間２回、次に0.2X SSＣ、0.5% SDSで室温にて１５分間２回、そして次に0.2X SSＣ、0.5% SDSで５０℃で１５分間２回行った。強いハイブリダイゼーションを示す陽性プラークを取り出し、プレートにまいて、そしてスクリーニング法を繰り返した。２回目のスクリーニングから、９つの純粋なファージプラークを単離した。ｃＤＮＡ挿入物を含有するプラスミドクローンをヘルパーファージを使用してストラタジーンで提供しているインビボ切り出し法により得た。二本鎖ＤＮＡをアルカリ溶解法で前記のように調製し、そして生成したプラスミドのサイズをアガロースゲル電気泳動で分析した。９つの中の最長をものは（ｐＣＦ２−１６５Ｄと命名した）、上記のように配列決定された約１．５ｋｂの挿入物を含んでいた。ｐＣＦ２−１６５ＤのｃＤＮＡ挿入物の１３９４塩基配列を配列番号３に示す。挿入物中に含まれるが配列番号３に示さないものは、挿入物の５’非翻訳領域の５’端約４０塩基、および３’末端のｐｏｌｙＡテイルの約３８塩基である。
【０１３０】
ミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼをコードする大豆種子ｃＤＮＡのクローニング
ｃＤＮＡライブラリーを次のように作成した：大豆胚（新しい約５０ｍｇ重量）を莢から取り出し、そして液体窒素中で凍結した。凍結胚を微細粒子に液体窒素の存在下で挽いて、そしてポリトロンホモジネーションで抽出し、そしてChirgwinら（Biochemistry(1979)18:5294-5299）の方法により全ＲＮＡを濃縮するために分画した。核酸画分を全ＲＮＡをオリゴ−ｄＴセルロースカラムに通過させ、そして塩を含むｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡをGoodamanら、（Meth.Enzymol.(1979)68:75-90）に記載されるように溶出して濃縮した。ｃＤＮＡを精製したｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成システム（ベセスダリサーチラボラトリー）および製造元の指示に従い合成した。生成した二本鎖ＤＮＡをＥｃｏＲI  ＤＮＡメチラーゼ（プロメガ：Promega）によりメチル化し、そして次にその末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ベセスダリサーチラボラトリー）で満たし、そして平滑末端をリン酸化ＥｃｏＲIリンカーにＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ファルマシア：Pharmacia）を使用して連結した。この二本鎖ＤＮＡをＥｃｏＲI酵素で消化し、ゲル濾過カラム（Sepharose CL-4B）通過させることにより過剰なリンカーを除去し、そしてラムダＺＡＰベクター（ストラタジーン）に製造元の指示に従い連結した。連結したＤＮＡをファージに、Gigapakパッケージングエキストラクト（ストラタジーン）を使用して製造元の指示に従いパッケージングした。生成したｃＤＮＡライブラリーをストラタジーンの指示に従い増幅し、そして−８０℃に保存した。
【０１３１】
ラムダＺＡＰクローニングキットマニュアル（ストラタジーン）の指示に従い、ｃＤＮＡファージライブラリーを大腸菌ＢＢ４細胞を感染させるために使用し、そして約６００，０００プラーク形成単位を直径１５０ｍｍのペトリ皿にまいた。プレートから二重移しをニトロセルロースフィルター上（シュライヒャー  アンド  シュエル）に作成した。フィルターを２５ｍＬのハイブリダイゼーション緩衝液（6x SSPE、5xデンハーツ溶液、0.5% SDS、5% 硫酸デキストランおよび0.1mg/mLの変性サケ精巣ＤＮＡ（シグマ化学社：Sigma Chemical））で５０℃で２時間プレハイブリダイズさせた。上記のように調製したｐＳＦ２ｂからの放射線標識プローブを加え、５０℃で１８時間ハイブリダイズさせた。フィルターを上記と全く同じように洗浄した。フィルターのオートラジオグラフィーでは１４個の強くハイブリダイズしたプラークを示した。この１４個のプラークを前記のような第２回目のスクリーニングに供した。多くの強くハイブリダイズしたプラークが１４のフィルターの６つから観察され、そしてさらに分析するために６つの各プレートから他のファージからよく単離された１つを取り出した。
【０１３２】
ラムダＺＡＰクローニングキットのインストラクショクマニュアル(ストラタジーン）に従い、精製したファージからｃＤＮＡ挿入物を含むpBluescriptベクターの配列を、ヘルパーファージの存在下で切り出し、そして生成したファジェミドをを大腸菌ＸＬ−１ブルー細胞を感染させるために使用した。プラスミドからのＤＮＡをプロメガ“マジック  ミニプレップ(Magic Miniprep)”により製造元のインストラクショクにより作成した。制限分析ではプラスミドが１ｋｂから２．５ｋｂの大きさの範囲の挿入物を含むことを示した。これらの中の１つからのアルカリ−変性二本鎖ＤＮＡ（ｐＳＦ２−１６９Ｋと命名）は１．６ｋｂの挿入物を含有し、これを上記のように配列決定した。プラスミドｐＳＦ２−１６９Ｋ中のｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列を配列番号５に示した。
【０１３３】
種子ミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼをコードするトウモロコシ（ゼア  メイズ：Zea mays）ｃＤＮＡのクローニング
トウモロコシミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡを、ＰＣＲ法を使用して単離した。このために、ｃＤＮＡライブラリーを発生しているトウモロコシの胚由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡに対して、ラムダＺＡＰIIベクター（ストラタジーン）中に作成した。５−１０ｕｌのこのライブラリーをＰＣＲの鋳型として、１００pmolの各縮退オリゴマーＮＳ３の２組（配列番号１３）および等モル量のＲＢ５ａ／ｂ（すなわち等モル量の配列番号１６／１７）をそれぞれセンスおよびアンチセンスプライマーとして使用した。Ｎ
Ｓ３およびＲＢ５ａ／ｂはそれぞれ配列番号２のアミノ酸１０１−１０９および３１８−３２６の広がりに相当し、これはほとんどのミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼ（配列番号２、４、６、８）に保存されている。ＰＣＲはＰＣＲキット（パーキン  エルマー）を使用して、９４℃で１分間、４５℃で１分間、そして５５℃で２分間の４０循環を使用して行った。ＰＣＲ生成物をアガロースゲルで分析することにより、期待された大きさ（７２０ｂｐ）の生成物の存在が示され、これはセンスまたはアンチセンスプライマーのいずれかだけを含有する対照領域には無かった。ＰＣＲ生成物断片をゲル精製し、そして次に同じトウモロコシｃＤＮＡライブラリーを６０℃で上記のようにスクリーニングするために使用した。１つの陽性にハイブリダイズするプラークを精製し、そしてそのｃＤＮＡを部分配列決定し、これがミクロソームデルタ-１２デサチュラーゼをコードするが３'末端が短縮していることが示された。この部分的デサチュラーゼをコードするｃＤＮＡ挿入物をゲル単離し、そしてトウモロコシｃＤＮＡライブラリーを釣り上げるために再度使用した。数個の陽性プラークを回収し、そして特性決定した。ＤＮＡ配列分析では、これらすべてのクローンが同じ配列を表すが、異なる５’または３’末端の長さを持つことが明らかとなった。最長の挿入物を含有するクローン（ｐＦａｄ２＃１と命名）を、完全に配列決定した。配列番号７はプラスミドｐＦａｄ２＃１中にミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼをコードする、トウモロコシ（ゼア  メイズ：Zea mays）ｃＤＮＡの１７９０塩基対の５’−３’ヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド１６５−１６７およびヌクレオチド１３２６−１３２８は、それぞれ読み取り枠（ヌクレオチド１６４−１３２８）推定の開始コドンおよび終止コドンである。配列番号８は配列番号７の読み取り枠（ヌクレオチド１６４−１３２８）由来の３８７アミノ酸タンパク質配列である。このポリペプチド由来のアミノ酸配列はアラビドプシス（Arabidopsis）ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼ、アラビドプシス（Arabidopsis）ミクロソームデルタ−１５デサチュラーゼおよびアラビドプシス（Arabidopsis）プラスチドデルタ−１５デサチュラーゼと、それぞれ７１％、４０％および３８％の全同一性を共有する。さらにこれはＮ−末端アミノ酸の広がりを欠き、これがプラスチド酵素であることを示した。これらの考察に基づき、これがミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼをコードすると結論した。
【０１３４】
カスター豆種子由来のミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼをコードするｃＤＮＡおよびミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼ関連酵素をコードするｃＤＮＡのクローニング
カスターミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法を使用して単離した。ポリソームｍＲＮＡを第I−II期（５−１０ＤＡＰ）および第IV−V期（２０−２５ＤＡＰ）のカスター豆から単離した。１０ｎｇの各ｍＲＮＡを別個のＲＴ−ＰＣＲ反応に、パーキン−エルマーＲＴ−ＰＣＲキットをキットの手法が推薦する試薬濃度で使用した。逆転写酵素反応はランダムヘキサマーおよび１００pmolの各縮退デルタ−１２デサチュラーゼプライマー  ＮＳ３およびＮＳ９（それぞれ配列番号１３および１４）で釣り上げた。逆転写反応は２５℃で１０分間、４２℃で１５分間、９９℃で５分間そして５℃で５分間インキュベーションした。ＰＣＲ反応は９５℃で２分間インキュベーションし、続いて９５℃で１分間／５０℃で１分間の３５循環を使用して行った。最後のインキュベーションは６０℃で７分間で反応を完成させた。第I−II期および第IV−V期の両方のｍＲＮＡから７２０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅した。１つの反応から増幅したＤＮＡ断片をゲル精製し、そしてｐＧＥＭ−Ｔベクターに、プロメガ  ｐＧＥＭ−Ｔ  ＰＣＲクローニングキットを使用してクローン化し、プラスミドｐＲＦ２−１Ｃを作成した。ｐＲＦ２−１Ｃ中の７２０ｂｐ挿入物を上記のように配列決定し、生成したＤＮＡ配列を配列番号９に表す。配列番号９中のＤＮＡ配列は２１９アミノ酸（配列番号１０）をコードする非−翻訳領域を含み、これは配列番号２に記載されたアラビドプシス（Arabidopsis）ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼのアミノ酸１３５−３５３と８１％の同一性（９０％の類似性）を持つ。それゆえにｐＲＦ２−１Ｃ中のｃＤＮＡ挿入物はカスター豆ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼをコードする完全長ｃＤＮＡの６７３ｂｐ断片である。完
全長のカスター豆種子ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼｃＤＮＡはカスター種子ｃＤＮＡライブラリーを、６０℃で上記実施例に記載したｐＲＦ２−１Ｃの標識挿入物でスクリーニングすることにより単離できる。ｐＲＦ２−１Ｃ中の挿入物はデルタ−１２デサチュラーゼ関連配列（デルタ−１２ヒドロキシラーゼなど）を単離するために、低温でカスター豆ライブラリーをスクリーニングするためにも使用できる。
【０１３５】
発生しているカスター豆（第IV−V期、２０−２５ＤＡＰ）から単離されたｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡに対して作成されたｃＤＮＡライブラリーを上記のようにスクリーニングした。ｐＳＦ２ｂまたはｐＲＦ２−１Ｃから上記のように調製した放射線標識プローブを加え、そして５０℃デ１８時間ハイブリダイズさせた。フィルターは上記のように洗浄した。フィルターのオートラジオグラフィーは、多くのハイブリダイズプラークがあり、それらは強くまたは弱くハイブリダイズしていることを示した。強くハイブリダイズしている３つのプラーク（１９０Ａ−４１、１９０Ａ−４２および１９０Ａ−４４）およびを弱くハイブリダイズしている３つのプラーク（１９０Ｂ−４１、１９０ｂ−４３および１９７ｃ−４２）を上記のようにプラーク精製した。精製したファージｃＤＮＡ挿入物の大きさを挿入物のＰＣＲ増幅で、ファージを鋳型として、そしてラムダｇｔ１１オリゴマー（クローンテック  ラムダｇｔ１１アンプリマー）をプライマーとして測定した。増幅したファージのＰＣＲ−増幅挿入物を、すでにＥｃｏＲIで切断され、そしてクレノで満たされたpBluescript（ファルマシア）中にサブクローン化した（Sambrookら、（モレキュラークローニング、ア ラボラトリーアプローチ、第二版、（１９８９）コールドスプリングハーバーラボラトリー出版）。生成したプラスミドをｐＲＦ１９０ａ−４１、ｐＲＦ１９０ａ−４２、ｐＲＦ１９０ａ−４４、ｐＲＦ１９０ｂ−４１、ｐＲＦ１９０ｂ−４３、およびｐＲＦ１９７ｃ−４２と呼ぶ。ｐＲＦ１９０ａ−４２が約１．５ｋｂであったのを除いて、すべての挿入物は約１．１ｋｂであった。プラスミド中の挿入物を上記のように配列決定した。ｐＲＦ１９０ｂ−４３の挿入物はいかなる読み取り枠を含まず、同定しなかった。ｐＲＦ１９０ｂ−４１、ｐＲＦ１９０ａ−４２、ｐＲＦ１９０ａ−４４およびｐＲＦ１９０ｂ−４１中の挿入物は同一であった。ｐＲＦ１９７ｃ−４２中の挿入物はｐＲＦ１９０ｂ−４１、ｐＲＦ１９０ａ−４２、ｐＲＦ１９０ａ−４４およびｐＲＦ１９０ｂ−４１中の挿入物のすべてのヌクレオチドに加えてさらに約４００ｂｐを含んでいた。したがってｐＲＦ１９７ｃ−４２中の挿入物はｐＲＦ１９０ｂ−４１、ｐＲＦ１９０ａ−４２、ｐＲＦ１９０ａ−４４およびｐＲＦ１９０ｂ−４１の挿入物の長い変更体であり、それらはすべて同じ完全長のｍＲＮＡ由来であると推定された。プラスミドｐＲＦ１９７ｃ−４２中の挿入物の完全なｃＤＮＡ配列を配列番号１１に示す。配列番号１２に表される配列番号１１由来のアミノ酸配列は、上記カスター  ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼ（配列番号１０）と７８．５％の同一性（９０％の類似性）、そして配列番号２のアラビドプシス（Arabidopsis）デルタ−１２デサチュラーゼのアミノ酸配列と６６％の同一性（８０％の類似性）であった。これらの類似性はｐＲＦ１９７ｃ−４２が、ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼまたはミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼ関連酵素（デルタ−１２ヒドロキシラーゼのような）をコードするカスター豆種子ｃＤＮＡであることが確認される。ｐＲＦ２−１ＣおよびｐＲＦ１９７ｃ−４２の特異的ＰＣＲプライマーが作成された。ｐＲＦ２−１ｃについての上流プライマーは配列番号９のｃＤＮＡ配列の塩基１８０−１９７であった。ｐＲＦ１９７−４２についての上流プライマーは配列番号１１のｃＤＮＡ配列の塩基７１７−７４３であった。共通の下流プライマーは配列番号９に記載された配列のヌクレオチド４６３−４７８の完全な相補鎖に対応して作成された。ランダムヘキサマーおよび上記プライマーでのＲＴ−ＰＣＲを使用して、そして上記のインキュベーション温度で、ｐＲＦ２−１Ｃ中に含有されるｃＤＮＡに対して生じたｍＲＮＡが、第I−II段階および第IV−V段階の両方のカスター種子中に存在するが、プラスミドｐＲＦ１９７ｃ−４２中に含有されるｃＤＮＡに対して生じたｍＲＮＡは第IV−V段階のカスター種子中のみに存在することが観察され、したがってこれはレシノール酸合成が活性な組織中でのみ発現する。すなわちこのｃＤＮＡはデルタ−１２ヒドロキシラーゼをコ
ードすることができる。
【０１３６】
ｐＲＦ２−１ＣおよびｐＲＦ１９７ｃ−４２のようなクローン、および他の差異スクリーニングからのクローン（そのＤＮＡ配列に基づき、カスター豆種子ミクロソームデルタ−１２デサチュラーゼとは関係が低く、そして上記または国際特許出願公開第9311245号中のいずれの既知の脂肪酸デサチュラーゼとも関係がない）は、例えば大豆胚または別の適当な植物組織、あるいは微生物（例えば酵母）のような通常はリシノール酸を含有しないものの中で、適当な発現ベクターおよび形質転換法を使用して発現させることができる。カスターｃＤＮＡの発現する形質転換組織（１つまたは複数）中での新規リシノール酸の存在は、カスターｃＤＮＡとオレエートヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡとの同一性を確認するものである。
【実施例４】
【０１３７】
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるデルタ−１２  デサチュラーゼの遺伝子座の地図を作製するための制限断片長多形性（ＲＦＬＰ）としてのアラビドプシス  タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の  デルタ−１２  デサチュラーゼ  ゲノム  クローンの利用
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のミクロソームのデルタ−１２  デサチュラーゼをコード化する遺伝子を用いてアラビドプシス  タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のミクロソームのデルタ−１２  デサチュラーゼをコード化する遺伝子座の地図を作製した。アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のミクロソームのデルタ−１２  デサチュラーゼＤＮＡをコード化するｐＳＦ２ｂ  ｃＤＮＡ挿入断片を放射ラベル化し、そしてこれを用いてアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。強固なハイブリッド形成を示す数々の純粋なファージからのＤＮＡを単離した。放射ラベル化したｐＳＦ２ｂ  ｃＤＮＡ挿入断片をプローブとして用いる様々なファージからのＤＮＡのサザンブロット分析により、６ｋｂのＨｉｎｄ  ＩＩＩ挿入断片がその遺伝子のコーディング領域を含むことが同定された。この断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター内にサブクローン化させてプラスミドｐＡＧＦ２−６を作製し、そしてこれを部分的配列決定に用いた。この配列（配列番号１５）により、この挿入断片がミクロソームのデルタ−１２  デサチュラーゼ遺伝子であることが証明された。２つのファージからのＤＮＡを単離し、そしてＰｈａｒｍａｃｉａ社からのランダムプライミングキットを用い、製造業者により推奨される条件下において３２Ｐでのラベル化を行った。放射活性性ＤＮＡを用いて、数々の制限エンドヌクレアーゼの内の一つで消化させたアラビドプシス  タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（生態型Ｗａｓｓｉｌｅｓｋｉｊａおよび標識株Ｗ１００生態型Ｌａｎｄｅｓｂｅｒｇバックグラウンド）からのゲノムＤＮＡを含むサザンブロットの探索を行った。標準条件下でのハイブリッド形成および洗浄後（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．,Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒｔａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  ｅｄ．（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）にオートラジオグラムを作製した。ファージＤＮＡの内の一つのものを用いて異なるパターンのハイブリッド形成（多形性）をＨｉｎｄ  ＩＩＩ消化済みゲノムＤＮＡにおいて同定した。この多形性は、多形性を示すこのファージＤＮＡ中の７ｋｂ  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片に対するものとして存在していた。この７ｋｂ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター内にサブクローン化させてプラスミドｐＡＧＦ２−７を作製した。プラスミドｐＡＧＦ２−７をＨｉｎｄ  ＩＩＩ酵素で制限消化し、そして放射ラベル化プローブとして用いて、本質的にはＨｅｌｅｎｔｊａｒｉｓ ｅｔ ａｌ．、（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８６）７２：７６１−７６９）により記載される要領で多形性の地図を作製した。この放射ラベル化ＤＮＡ断片を既述のように、アラビドプシス  タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）標識株Ｗ１００と生態型Ｗａａｓｉｌｅｓｋｉｊａとの間の交雑から得られる１１７の組換え同系子孫
（Ｆ６世代までの単一種子血縁株から得られる）（Ｂｕｒｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８８）１１８：５１９−５２６）から単離したＨｉｎｄ  ＩＩＩ消化済みゲノムＤＮＡのサザンブロットに適用させた。オートラジオグラム上のバンドを、父性（生態型Ｗａａｓｉｌｅｓｋｉｊａ）もしくは母性（標識株Ｗ１００）のＤＮＡ、あるいはその両者（ヘテロ接合体）のいずれかの遺伝から生じるものとして解釈した。獲られる分離データを、コンピュータープログラムＭａｐｍａｋｅｒを用いる遺伝子分析に供した（Ｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９８７）１：１７４−１８１）。アラビドプシス  タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）における６３の無名ＲＦＬＰ標識および９つの形態学的標識について既に得られている分離データを組み合わせて（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９８８）８５：６８５６−６８６０；Ｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９８９）１：６９９−７０５）、ミクロソームのデルタ−１２  デサチュラーゼ遺伝子に相当する単一遺伝子座の位置を突き止めた。従って、ミクロソームのデルタ−１２  デサチュラーゼ遺伝子の位置は、第３染色体上の、遺伝子座ｃ３８３８の１３．６ｃＭ近位、遺伝子座１Ａｔ２２８の９．２ｃＭ遠位、およびＦａｄＤ遺伝子座の４．９ｃＭ近位に存在することを決定した［Ｋｏｏｒｎｅｅｆ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｐｓ、Ｅｄ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ、Ｓ．Ｊ．；Ｙａｄａｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １０３：４６７−４７６］。
【実施例５】
【０１３８】
制限断片長多形性（ＲＦＬＰ）標識としてのダイズ  ミクロソームのデルター−１２  デサチュラーゼｃＤＮＡ配列の利用
先に記載し多様にプラスミドｐＳＦ２−１６９Ｋから取得した１．６ｋｂの挿入断片を、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社からのランダムプライミングキット（Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｋｉｔ）を用いて製造業者により推奨される条件下において３２Ｐでのラベル化を行った。得られる放射ラベル化プローブを用いて、数々の制限酵素の内の一つで消化したダイズ（グリシン  マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（栽培品種Ｂｏｎｕｓ）およびグリシン  ソジャ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｏｊａ）（ＰＩ８１７６２））からのゲノムＤＮＡを含むサザンブロット（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄ．８１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）の探索を行った。低緊縮性条件下（ハイブリッド形成および初回洗浄のためには５６℃下で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、６×ＳＳＰＥ、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳを用い、最終洗浄用には２×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳへと変化させる）でのハイブリッド形成および洗浄後、オートラジオグラムを取得し、そして制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏ  ＲＩでの消化を施した消化物中に様々なパターンのハイブリッド形成（多形性）を同定した。これらの多形性を用いて、本質的にはＨａｌｅｎｔｊａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ．（１９８６）７２：７６１−７６９）により記載される要領でダイズゲノム上の他の遺伝子座に関連する２つのｐＳＦ２−１６９ｋ遺伝子座の地図を作製した。多形性の地図上での位置は、４４０４．００と１５０３．００遺伝子座との間の連鎖群１１（４４０４．００および１５０３．００から各々４．５ｃＭおよび７．１ｃＭ）、ならびに４０１０．００と５３０２．００遺伝子座との間の連鎖群１９（４０１０．００および５３０２．００から各々１．９ｃＭおよび２．７ｃＭ）であることを決定した［Ｒａｆａｌｓｋｉ、Ａ．およびＴｉｎｇｅｙ、Ｓ．（１９９３）ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｐｓ、Ｅｄ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ、Ｓ．Ｊ．］。
【実施例６】
【０１３９】
ダイズにおけるミクロソームのデルタ−１２  デサチュラーゼの発現  発芽中のダイズ種子のミクロソーム  デルタ−１２  デサチュラーゼの発現を低下させるためのグリシン  
マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）の形質転換用ベクターの作製
ダイズのクニッツ  トリプシン  インヒビター３（Ｋｕｎｉｔｚ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ３）（ＫＴｉ３）プロモーター（ＪｏｆｕｋｕおよびＧｏｌｄｂｅｒｇ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９８９）１：１０７９−１０９３）、ファセオルス  ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）の７Ｓ種子貯蔵蛋白質（ファセオリン）プロモーター（Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：３３２０−３３２４；Ｈｏｆｆｍａｎ
ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）１１：７１７−７２９）、およびダイズのベーター−コングリシニンプロモーター（Ｂｅａｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：３０４７−３０５３）の調節下にあるアンチセンスＧ．マックス（Ｇ．  ｍａｘ）ミクロソーム  デルタ−１２  デサチュラーゼｃＤＮＡ配列を含むプラスミドを作製した。これらのプロモーターの調節下にあるダイズのデルタ−１２  デサチュラーゼ  アンチセンスｃＤＮＡを発現するベクターの作製は、以下に示すプラスミド、ｐＭＬ７０、ｐＣＷ１０８、およびｐＣＷ１０９Ａを使用することにより容易に行うことができた。
【０１４０】
ｐＭＬ７０ベクターはＫＴｉ３プロモーターおよびＫＴｉ３の３’非翻訳領域を含み、そして中間体プラスミドｐＭＬ５１、ｐＭＬ５５、ｐＭＬ６４、およびｐＭＬ６５を介して市販品として入手可能なベクターｐＴＺ１８Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）から取得した。ダイズＫＴｉ３の全遺伝子（ＪｏｆｕｋｕおよびＧｏｌｄｂｅｒｇ（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：１０７９−１０９３）の２．４ｋｂのＢｓｔ  ＢＩ／Ｅｃｏ  ＲＩ断片は、５’非翻訳領域の全２０３９ヌクレオチド、およびＪｏｆｕｋｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：４２７−４３５において記載される塩基７５５−７６１の配列に相当するＥｃｏ  ＲＩ部位で終結するＫＴｉ３遺伝子のコーディング配列内の３９０塩基を含んでおり、これをｐＴＺ１８ＲのＡｃｃ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩ部位内に連結させてプラスミドｐＭＬ５１を作製した。このプラスミドｐＭＬ５１をＮｃｏ  Ｉで切断し、クレノウ断片を用いて末端重点を行い、そして連結させてＫＴｉ３挿入断片の５’非翻訳領域の中央にあるＮｃｏ  Ｉ部位をなくして、プラスミドｐＭＬ５５を取得した。このプラスミドｐＭＬ５５を、Ｘｍｎ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩで部分消化して先に引用した配列内の塩基７３２−７５５に相当する０．４２ｋｂの断片を切り出し、これを棄却した。Ｎｃｏ  Ｉ部位を含む合成Ｘｍｎ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩリンカーは、Ｅｃｏ  ＲＩ部位（５’−ＧＡＡＧＧ−３’）の一部分の前に直接つながるように、Ｘｍｎ  Ｉ部位（５’−ＴＣＴＴＣＣ−３’）およびＮｃｏ  Ｉ部位（５’−ＣＣＡＴＧＧＧ−３’）のためのコーディング配列を含んでなる相補的な合成オリゴヌクレオチドの２量体を作製することにより構築した。Ｘｍｎ  ＩおよびＮｃｏ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩ部位を短い介在配列（５’−ＡＴＡＧＣＣＣＣＣＣＡＡ−３’）により連結させた。この合成リンカーを４．９４ｋｂの断片のＸｍｎ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩ部位内に連結させてプラスミドｐＭＬ６４を作製した。ＫＴｉ３遺伝子の３’非翻訳領域をＪｏｆｕｋｕ  ｅｔ  ａｌ．（上述）において記載される配列から、標準的なＰＣＲ法（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  キット）により、プライマーＭＬ５１およびＭＬ５２を用いて増幅した。プライマーＭＬ５１は、先に引用した配列の内の塩基１０７２−１０９１に相当する２０ヌクレオチドに加えて、そのプライマーの５’端にＥｃｏ  ＲＶ（５’−ＧＡＴＡＴＣ−３’）、Ｎｃｏ  Ｉ（５’−ＣＣＡＴＧＧ−３’）、Ｘｂａ  Ｉ（５’−ＴＣＴＡＧＡ−３’）、Ｓｍａ  Ｉ（５’−ＣＣＣＧＧＧ−３’）、およびＫｐｎ  Ｉ（５’−ＧＧＴＡＣＣ−３’）部位に相当するヌクレオチドを含んでいた。プライマーＭＬ５２は、先に引用した配列の塩基１２４２−１２５９に相当するヌクレオチドに対して完全な相補性を示すヌクレオチドに加えて、そのプライマーの５’端にＳｍａ  Ｉ（５’−ＣＣＣＧＧＧ−３’）、Ｅｃｏ  ＲＩ（５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’）、Ｂａｍ  ＨＩ（５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’）、およびＳａｌ  Ｉ（５’−ＧＴＣＧＡＣ−３’）部位に相当するヌクレオチドを含んでいた。ＫＴｉ３遺伝子のＰＣＲ増幅済み３’端をｐＭＬ６４のＮｃｏ  
Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩ部位内に連結してプラスミドｐＭＬ６５を作製した。合成の多重クローニング部位リンカーを、Ｐｓｔ  Ｉ（５’−ＣＴＧＣＡ−３’）、Ｓａｌ  Ｉ（５’−ＧＴＣＧＡＣ−３’）、Ｂａｍ  ＨＩ（５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’）、およびＰｓｔ  Ｉ（５’−ＣＴＧＣＡ−３’）部位についてのコーディング配列を含んでなる相補的合成オリゴヌクレオチドの二量体を作製することにより構築した。このリンカーをｐＭＬ６５のＰｓｔ  Ｉ部位内に連結させて（ＫＴｉ３プロモーター領域に対して５’端を直接連結することになる）プラスミドｐＭＬ７０を作製した。
【０１４１】
ｐＳＦ２−１６９Ｋ（先に記載したダイズのデルタ−１２  デサチュラーゼｃＤＮＡ）からの１．４６ｋｂのＳｍａ  Ｉ／Ｋｐｎ  Ｉ断片をｐＭＬ７０中の対応する部位内に連結させてプラスミドｐＢＳ１０を取得した。このデサチュラーゼｃＤＮＡ断片は、ｐＢＳ１０中のＫＴｉ３プロモーターに関して逆（アンチセンス）の向きになっていた。このプラスミドｐＢＳ１０をＢａｍ  ＨＩで消化させ、そしてＫＴｉ３プロモーター／アンチセンス  デサチュラーゼｃＤＮＡ／ＫＴｉ３−３’端転写ユニットである３．４７ｋｂ断片をアガロースゲル電気泳動により単離した。このベクターｐＭＬ１８は、Ｂｅｃｋ  ｅｔ
ａｌ．，（１９８２）Ｇｅｎｅ  １９：３２７−３３６に記載されるネオマイシン  ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を指令する非組織特異的であって構成性のカリフラワーモザイクウイルス（３５Ｓ）プロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  （１９８５）３１３：８１０−８１２；Ｈｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８７）８６：４８２−４９３を含んでなり、その後にはＤｅｐｉｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．  １：５６１−５７４により記載されるヌクレオチド８４８−１５５０を含むノパリンシンターゼ遺伝子の３’端が続いている。この転写ユニットを市販のクローニングベクターｐＧＥＭ９Ｚ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）内に挿入し、そしてこの３５Ｓプロモーターの５’端に制限部位Ｓａｌ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｂａｍ  ＨＩ、およびＳｍａ  Ｉをこの順序でつなげた。追加的なＳａｌ  Ｉ部位がＮＯＳの３’配列の３’端に存在し、そしてＸｂａ  Ｉ、Ｂａｍ  ＨＩ、およびＳａｌ  Ｉ部位は非反復である。ｐＢＳ１０から放出される３．４７ｋｂの転写ユニットをベクターｐＭＬ１８のＢａｍ  ＨＩ部位内に連結させた。得られるプラスミドをＳｍａ  ＩおよびＫｐｎ  Ｉで二重消化させたところ、所望の向きで挿入断片を含むプラスミドから５．７４、２．６９、および１．４６ｋｂの３つの断片が生じた。転写ユニットが正しい向きになっているプラスミドを選択し、そしてそれをｐＢＳ１３と表示した。
【０１４２】
ｐＣＷ１０８ベクターはマメのファセオリンプロモーターおよび３’非翻訳領域を含み、そしてプラスミドＡＳ３およびｐＣＷ１０４を介して市販品として入手可能なｐＵＣ１８プラスミド（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）から取得した。ｐＵＣ１８のＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位内にクローン化させたプラスミドＡＳ３は、５’−ＴＧＧＴＣＴＴＴＴＧＧＴ−３’で始まるマメ（ファセオルス  ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））のファセオリン（７Ｓ種子貯蔵蛋白質）の内の４９５塩基対を含み、その後に同一遺伝子の３’非翻訳領域の全１１７５塩基対が続く（Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９２２８−９２３８、およびＳｌｉｇｈｔｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：１８９７−１９０１、を参照せよ。更に別の配列記述は国際公開第９１１３９９３号において見いだすことができる）。ｐＵＣ１８の多重クローニング領域の追加クローニング部位（Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｓｐｈ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ、およびＳａｌ  Ｉ）を、Ｅｃｏ  ＲＩおよびＳａｌ
Ｉでの消化、クレノウ断片での末端重点、および再連結により除去してプラスミドｐＣＷ１０４を取得した。新規の多重クローニング部位を、５’ファセオリン内の４９５ｂｐと３’ファセオリンの１１７５ｂｐとの間で、３つのフィラー塩基（ｆｉｌｅｒ  ｂａｓｅｓ）（５’−ＴＡＧ−３’）、Ｓｍａ  Ｉ部位（５’−ＣＣＣＧＧＧ−３’）についてのコーディング配列、Ｋｐｎ  Ｉ部位の最後３つの塩基（５’−ＴＡＣ−３’）、一つのシトシン、およびＸｂａ  Ｉ部位（５’−ＴＣＴＡＧＡ−３’）についてのコーディング
配列の前に入るように、Ｎｃｏ  Ｉ部位（５’−ＣＣＡＴＧＧ−３’）についてのコーディング配列を含んでなる相補的な合成オリゴヌクレオチドの２量体を挿入することにより作製して、プラスミドｐＣＷ１０８を作製した。このプラスミドは、ファセオリンプロモーターのすぐ後ろに非反復なＮｃｏ  Ｉ、Ｓｍａ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ、およびＸｂａ  Ｉ部位が付いている。ｐＳＦ２−１６９Ｋからの１．４ｋｂのＥｃｏ  ＲＶ／Ｓｍａ  Ｉ断片を、市販品として入手可能なファゲミドｐＢＣ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＳｍａ  Ｉ部位内に連結した。ｃＤＮＡが所望の向きになっているファゲミドをＰｆｌ  ＭＩ／Ｘｈｏ  Ｉでの消化により選択して約１ｋｂおよび４ｋｂの断片を生じ、そしてｐＭ１−ＳＦ２と表示した。ｐＭ１−ＳＦ２からの１．４ｋｂのＸｍｎ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉ断片をｐＣＷ１０８のＳｍａ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉ部位内に挿入してプラスミドｐＢＳ１１を取得したが、これはファセオリンプロモーターの後ろに逆（３’−５’）の向きでダイズのデルタ−１２  デサチュラーゼが入っている。このプラスミドｐＢＳ１１をＢａｍ  ＨＩで消化させ、そしてファセオリンプロモーター／アンチセンス  デサチュラーゼｃＤＮＡ／ファセオリン３’端転写ユニットである３．０７ｋｂの断片をアガロースゲル電気泳動により単離し、そしてｐＭＬ１８（既述）のＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位内に連結させた。得られるプラスミドをＸｂａ  Ｉで消化させると、所望の向きで挿入断片を含むプラスミドは８．０１および１．１８ｋｂの２つの断片を生じた。転写ユニットが正しい向きになっているプラスミドを選択し、そしてｐＢＳ１４と表示した。
【０１４３】
ベクターｐＣＷ１０９Ａはダイズのｂ−コングリシンプロモーター配列とファセオリンの３’非翻訳領域とを含み、そしてこれは市販品として入手可能なプラスミドｐＵＣ１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）から得られたベクターｐＣＷ１０９の改変版である。ベクターｐＣＷ１０９は、ｐＣＷ１０８について先に記載したＮｃｏ  Ｉ、Ｓｍａ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ、およびＸｂａ  Ｉについての制限エンドヌクレアーゼ部位を含む多重クローニング配列の前にあるクローニングベクターｐＵＣ１０８のＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位内にｂ−コングリシニン遺伝子の５５５ｂｐの５’非コーディング領域（プロモーター領域を含む）を挿入し、そしてその後にそのＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位内(既述)マメのファセオリンの共通３’非翻訳領域の１１７４ｂｐを挿入することにより作製した。用いたｂ−コングリシニンプロモーター領域は２７のヌクレオチドの位置が異なっていることが原因で、公表されているｂ−コングリシニン遺伝子（Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．(１９８６)２６１：９２２８−９２３８）の対立遺伝子となっている。この遺伝子の更に詳しい記載は、Ｓｌｉｇｈｔｏｍ（国際公開第９１１３９９３号）において見いだすことができる。アンチセンス構築における利用を容易にさせるために、プラスミドｐＣＷ１０９内のＮｃｏ  Ｉ部位および可能な翻訳開示部位をＮｃｏ  Ｉでの消化、ヤエナリ（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ）のエキソヌクレアーゼでの消化、および平滑部位の再連結によって失わせて、改変型プラスミドｐＣＷ１０９Ａを取得した。このプラスミドｐＣＷ１０９ＡをＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、そして得られるｂ−コングリシニン／アンチセンス  デルタ−１２  デサチュラーゼｃＤＮＡ／ファセオリン３’非翻訳領域を含む１．８４ｋｂの断片をゲルにより単離した。プラスミドｐＭＬ１８（既述）は、Ｘｂａ  Ｉ部位を除去する目的でＸｂａ  Ｉで消化させ、クレノウ断片を用いて末端充填を行い、そして連結させた。得られるプラスミドをｐＢＳ１６と表示した。プラスミドｐＣＷ１０９Ａ（既述）の１．８４ｋｂ断片をｐＢＳ１６のＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位内に連結させた。所望の向きに挿入断片が入っているプラスミドはＫｐｎ  Ｉで消化した際に３．５３ｋｂおよび４．４１ｋｂの断片を生じ、そしてこのプラスミドをｐＣＳＴ２と表示した。ｐＭＬ１−ＳＦ２（既述）のＸｍｎ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉ断片をｐＣＳＴ２のＳｍａ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉ部位内に連結させてベクターｐＳＴ１１を取得した。
【０１４４】
ダイズの体細胞胚芽培養物の形質転換およびダイズ植物の再生
ダイズ胚芽の懸濁培養物をロータリー式震盪機（１５０ｒｐｍ）内の３５ｍＬの液体培地（ＳＢ５５もしくはＳＢＰ６）中、２８℃下で１６：８時間の昼／夜計画で蛍光灯／白
熱灯を混合して用いて維持した。培養物は４週間毎に約３５ｍｇの組織を３５ｍＬの液体培地中に接種させることにより継代培養した。
【０１４５】
ダイズの胚芽懸濁培養物を粒子ガン衝撃法（Ｋｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０、を参照せよ）によりｐＣＳ３ＦｄＳＴ１Ｒで形質転換させた。ＤｕＰｏｎｔ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ１０００／ＨＥ装置（ヘリウム用改装部品）をこれらの形質転換用に用いた。
【０１４６】
５０ｍＬの６０ｍｇ／ｍＬの１ｍｍ金粒子懸濁液に対して、以下に示す、５μＬのＤＮＡ（１μｇ／μＬ）、２０μＬのスペルミジン（０．１Ｍ）、および５０μｌのＣａＣｌ２（２．５Ｍ）を順に添加した。この粒子調製物を３分間撹拌し、１０秒間微量用遠心機内で遠心し、そして上清を取り出した。その後、ＤＮＡ含有性粒子を４００μＬの７０％エタノール中で一回洗浄し、そして４０μＬの無水エタノール中に再懸濁させた。ＤＮＡ／粒子懸濁液を各１秒間、３回超音波処理にかけた。その後５μＬのＤＮＡ−金粒子を各マクロ担体ディスク上に乗せた。
【０１４７】
約３００−４００ｍｇの４週齢懸濁培養物を空の６０×１５ｍｍペトリ皿に入れ、そして残存している液体を、ピペットを用いて組織から除去した。各形質転換実験については、通常約５−１０プレート分の組織を衝撃法にかけた。膜破壊圧を１００ｐｓｉに設定し、チャンバーの排気を行い、２０インチの水銀圧にまで吸引した。組織を保持用スクリーンから約３．５インチ離れたところに入れ、そして３回衝撃を与えた。衝撃後、この組織を液体に戻し入れ、そして既述の要領で培養した。
【０１４８】
衝撃後１１日目には液体培地を、５０ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含む新鮮なＳＢ５５と交換した。選択培地は毎週新鮮なものと交換した。衝撃後７週間目には、壊死症状を呈する形質転換しなかった胚芽形成性クラスターから緑色を示す形質転換された組織が生育していることが観察された。緑色組織を単離して取り出し、そして個々のフラスコ内に接種して、新規にクローンとして継代する形質転換済み胚芽懸濁培養物を作製した。従って、新規の各株を個々の形質転換体として処理した。その後これらの懸濁物は、継代培養を通して未成熟な発生段階においてクラスターを形成している胚芽の懸濁物として維持することができるか、あるいは個々の体細胞胚芽の成熟および発芽により完全な植物へと再生させることができる。
【０１４９】
形質転換させた胚芽形成性クラスターを液体培養物から取り出し、そしてホルモンもしくは抗生物質を含まない固体アガロース培地（ＳＢ１０３）上に置いた。胚芽を８週間、２６℃下、１６：８時間の昼／夜計画で蛍光灯と白熱灯の混合光を用いて培養した。この期間中に個々の胚芽をクラスターから取り出し、そして胚芽発生の様々な段階での分析を行った。８週間後には体細胞胚芽が発芽に適するようになってくる。発芽のためには、８週齢の胚芽を成熟培地から取り出し、そして空のペトリ皿で１−５日間乾燥させた。その後乾燥済み胚芽をＳＢ７１−１培地中に植え込むが、この培地中ではそれらの胚芽は、既述のものと同一の電照および発芽条件下で発芽することができた。発芽した胚芽を滅菌した土壌に移し、そして種子を回収するために成熟するまで育成した。
【０１５０】
【表１０】
2006238886.tif 000011
アンチセンス  デルタ−１５  デサチュラーゼを含む形質転換グリシン  マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）の胚芽および種子の分析：
形質転換ダイズ体細胞胚芽の表現型によりこれらの胚芽から再生させた植物から得られる種子の表現型が予想されることの証明
既述の液体培養物中で球状胚芽状態である際には、ダイズの体細胞胚芽は成熟中のダイ
ズ接合体胚芽に典型的なトリアシルグリセロールもしくは貯蔵蛋白質を非常に微量にのみ含んでいるに過ぎない。この発生段階においては、極性脂質（リン脂質およびグリコリピド）に対する総トリアシルグリセリドの比率は約１：４であり、この比率は体細胞胚芽の培養を開始したばかりの発生段階でのダイズ接合体胚芽に典型的な比率である。その上この球状段階においては、顕著な種子蛋白質（ベーター−コングリシニンのアルファーサブユニット、クニッツ  トリプシン  インヒビター３、およびダイズ種子のレクチン）についてのｍＲＮＡが本質的に欠失している。先に記載されるような、成熟中の体細胞胚芽状態への分化を可能にするためにホルモン非含有性培地に移す場合には、トリアシルグリセロールは最も豊富な種類の脂質となっている。その上、ベーター−コングリシニンのアルファーサブユニット、クニッツ  トリプシン  インヒビター３、およびダイズ種子のレクチンについてのｍＲＮＡは総ｍＲＮＡ集団の内でも非常に豊富な伝達物質である。これらの点においては、ダイズの体細胞胚芽系はインビボでの成熟中のダイズ接合体胚芽に非常に類似した挙動を示し、そしてそのため脂肪酸生合成経路での遺伝子発現を改変させることの表現型効果を分析するための良好かつ迅速なモデル系となる。その上、このモデル系により形質転換胚芽から得られる植物からの種子の脂肪酸組成を予測することができる。逆の向きであってしかもダイズ  コングリシニンプロモーター（ｐＣＳ３ＦｄＳＴ  １Ｒ）の調節下にあるダイズのミクロソーム  デルタ−１５  デサチュラーゼを含むベクターで形質転換させた液体培養球状胚芽から１８：３含有量が減少している成熟胚芽が生じた（国際公開第９３１１２４５号）。株Ａ２８７２（ｐＣＳＴで形質転換させた対照組織）、ならびに株２９９／１／３、２９９／１５／１、３０３／７／１、３０６／３／１、３０６／４／３、３０６／４／５（プラスミドｐＣＳ３ＦｄＳＴ１Ｒで形質転換させた株２８７２）からの多数の胚芽を脂肪酸含有量について分析した。脂肪酸分析は、国際公開第９３１１２４５号に記載されている要領で、組織源として単一胚芽を使用して実施した。これらの株の各々からの成熟した体細胞胚芽も記載される要領で再生培地に移すことによりダイズ植物内で再生させた。これらの胚芽株から再生させた植物から採取した多数の種子を脂肪酸含有量について分析した。ｐＣＳ３ＦｄＳＴ１Ｒで形質転換させた組織から採取した胚芽の相対的脂肪酸組成を、ｐＣＳ３ＦｄＳＴ１Ｒで形質転換させた胚芽から取得した植物から採取した種子の相対的脂肪酸組成と比較した。更に、ｐＣＳ３ＦｄＳＴ１Ｒで形質転換させた胚芽および種子の相対的脂肪酸組成を、ｐＣＳＴで形質転換させた対照組織と比較した。全ての事例において、対照と比較して形質転換胚芽株では１８：３含有量が減少しており、また対照種子と比較した際に、その株から得られた植物の分離種子においても１８：３含有量の減少が観察された（表１１）。
【０１５１】
【表１１】
2006238886.tif 000012
従って本出願により、形質転換させた成熟体細胞胚芽株において観察されるポリ不飽和脂肪酸表現型の変化によって、その株から得られる植物の種子の脂肪酸組成の変化を予測することができるということが結論付けられる。
【０１５２】
ベクターｐＢＳ１３、ｐＢＳ１４、およびｐＳＴ１１は、先に記載するアンチセンス  ミクソローム  デルター−１２  デサチュラーゼ構築物を含む形質転換グリシン  マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）胚芽の分析から明らかなように、アンチセンスの向きになっていて、ダイズのクニッツ  トリプシン  インヒビター３（ＫＴｉ３）、ファセオルス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）のファセオリン、およびダイズのベーター−コングリシニンプロモーターの調節下にあるダイズのミクロソーム  デルタ−１２  デサチュラーゼｃＤＮＡを含む。ベクターｐＢＳ１３、ｐＢＳ１４、およびｐＳＴ１１で形質転換させた液体培養球状胚芽により先に記載の成熟胚芽株が生じた。脂肪酸分析は、国際公開第９３１１２４５号において記載される要領で、組織源として単一の成熟胚芽を使用して実施した。株Ａ２８７２（ｐＣＳＴで形質転換させた対照組織）ならびにベクターｐＢＳ１３、ｐＢＳ１４、およびｐＳＴ１１で形質転換させた株Ａ２８７２からの多数の胚芽を脂肪酸含有量について分析した。約３０％の形質転換株は既述のｐＣＳＴで形質転換させた対照株と比較した際に１８：１含有量の増加を示し、このことによりデルタ−１２  デサチュラーゼがこれらの株において阻害されていることが証明された。残りの形質転換株は、対照株のものに類似する相対的脂肪酸組成を示した。１８：１含有量の増加を示す株の相対的１８：１含有量は、対照胚芽株における最大値である１２．５％と比較すると５０％という高い値を示した。１８：１含有量が増加している胚芽株の平均１８：１含有量は約３５％であった（表１１）。１８：１含有量が増加している全ての株においては、相対的な１８：２含有量がそれに比例して減少していた（表１２）。他の主要脂肪酸（１６：０、１８：０、および１８：３）の相対比は対照のものに類似していた。
【０１５３】
【表１２】
2006238886.tif 000013
表１２においては、形質転換体の１８：１の平均値は、相対的１８：１含有量が最高対照値（１２．５）からの２つの標準偏差よりも大きい特別なベクターで形質転換させた全ての胚芽の平均値となっている。対照の平均値は１０のＡ２８７２胚芽の平均である（標準偏差＝１．２）。表１２のデータは、以下に示す表１３から取得したものである。
【０１５４】
【表１３】
2006238886.tif 000014
【０１５５】
【表１４】
2006238886.tif 000015
【０１５６】
【表１５】
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これらの胚芽株の内の一つであるＧ３３５／１／２５は、２０％を下回る平均１８：２含有量および４５％を上回る（そして５３．５％程の高い値の）平均１８：１含有量を有する。本出願者は、表のデータに基づき、このような株から再生させた植物から取得した種子は１８：１が等価であるかあるいはかなり増加しており、かつ１８：２含有量が等価であるかあるいはかなり減少しているであろうと期待している。
【０１５７】
＜実施例＞
カノーラ（ｃａｎｏｌａ）におけるミクロソームのデルタ−１２  デサチュラーゼの発現
発育中のカノーラ種子におけるミクロソームのデルタ−１２  デサチュラーゼの発現を減少させるためのブラッシカ  ナープス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）の形質転換用のベクターの作製
プラスミドｐＣＦ２−１６５Ｄ中に含まれるカノーラのデルタ−１２  デサチュラーゼ配列からポリＡテイル伸長部分を除去し、そしてクローニング用の追加制限部位を以下に記載するように導入した。配列番号３の塩基３５４から３７１までに対応するＰＣＲプライマーを合成した。５’端に１５の追加塩基（ＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＣＧＧＣＣ）が添加してある塩基１２５３から１２３１までの相補物としての第二ＰＣＲプライマーを合成した。この追加塩基はＥｃｏ  ＲＶ部位とＮｏｔ  Ｉ部位との両方をコード化している。これらのプライマーを用いるＰＣＲ増幅のための鋳型としてｐＣＦ２−１６５Ｄを用いた。ＰＣＲ増幅の９１４塩基対産物をＥｃｏ  ＲＶとＰｆｌ  ＭＩとで消化させて、Ｎｏｔ  Ｉ部位が追加されているｐＣＦ２−１６５Ｄの塩基４５０から１２５３までに相当する８１２塩基対を取得した。
【０１５８】
ｐＣＦ２−１６５ＤをＰｓｔ  Ｉで消化し、このＰｓｔ  Ｉの張り出し部分をクレノウ断片で平滑末端化させ、そしてＰｆｌ  ＭＩで消化させた。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに相当する３．５ｋＢ断片をカノーラＦａｄ２のｃＤＮＡの５’端の４５０塩基と共にゲル精製し、そして既述の８１２塩基対断片に連結させた。この連結産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換およびプラスミドＤＮＡの単離により増幅させた。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔとカノーラのＦａｄ２  ｃＤＮＡとの間のクローニング連結部に残存するＥｃｏ  ＲＩ部位を、消化、平滑末端作製、および再連結により消失させた。回収されるプラスミドをｐＭ２ＣＦｄ２と命名した。
【０１５９】
ｐＭ２ＣＦｄ２をＥｃｏ  ＲＶとＳｍａ  Ｉとで消化させて平滑末端断片としてＦａｄ
２挿入断片を取り出した。この断片をゲル精製にかけ、そしてｐＢＣ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）のＳｍａ  Ｉ部位内にクローン化させた。ｐＢＣ中に、現存のＮｏｔ  Ｉ部位から遠ざかる向きのＰＣＲによりＮｏｔ  Ｉ部位を導入してあるプラスミドをＮｏｔ  Ｉ消化により同定し、そしてこの消化物をゲル分離法にかけた。その後、得られる構築物はカノーラのＦａｄ２  ｃＤＮＡ断片の両端にＮｏｔ  Ｉ部位が存在し、そしてこれをｐＭ３ＣＦｄ２と命名した。
【０１６０】
アグロバクテリウム  ツメファキエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いる植物内への、β−コングリシニン、クニッツ  トリプシン  インヒビターＩＩＩ、ネピン、およびファセオリンのプロモーターの調節下にあるアンチセンス細胞質性デルタ−１２  デサチュラーゼ構築物の形質転換用のベクターは、２元性のＴｉプラスミドベクター系（Ｂｅｖａｎ、（１９８４）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２０）を構築することにより作製した。この系についてのある出発用ベクター（ｐＺＳ１９９）は、
（１）形質転換植物細胞用の選択標識としてのキメラ遺伝子であるノパリンシンターゼ／ネオマイシン  ホスホトランスフェラーゼ（Ｂｒｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０４：１８４−１８６）、（２）ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの左右の境界領域部分（Ｂｒｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓ．
１２：８７１１−８７２０）、（３）Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｂａｍ  ＨＩ、およびＳａｌ  Ｉについての非反復な制限エンドヌクレアーゼ部位を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃＺ  ａ−相補性形成性セグメント（Ｖｉｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｉｎｇ（１９８２）Ｇｅｎｅ  １９：２５９−２６７）、（４）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属のプラスミドｐＶＳ１からの細菌性複製起点（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｌａｓｍｉｄ  １１：２０６−２２０）、ならびに（５）形質転換を生じているＡ．ツメファキエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）についての選択標識としてのＴｎ５（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７２：３６２８−３６３２）からの細菌性ネオマイシン  ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、を含むベクターに基づくものである。植物の選択標識中のノパリン  シンターゼ  プロモータを、標準的な制限エンドヌクレアーゼ消化および連結手法により３５Ｓプロモーター(Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．(１９８５）Ｎａｔｕｒｅ、３１３：８１０−８１３）で置換した。この３５Ｓプロモーターは、以下に記載するようにブラッシカ  ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）の効率のよい形質転換に必要である。第二ベクター（ｐＺＳ２１２）は、ｐＺＳ１９９の非反復部位のクローニング領域中の制限部位の順番を逆にすることにより作製した。
【０１６１】
カノーラ  ネピンのプロモーター発現カセットは、以下に記載するように作製した。１０のオリゴヌクレオチドプライマーを、欧州特許出願第２５５３７８号において公開されているネピン  ラムダー  クローンＣＧＮ１−２のヌクレオチド配列を基にして合成した。それらのオリゴヌクレオチド配列は以下に記載のものである。
【０１６２】
・欧州特許出願第２５５３７８号の図２に列挙される配列の内の塩基１１３２−１１５６（ＢＲ４２）および塩基２２４８−２２７１（ＢＲ４３）の相補物に相当するＢＲ４２およびＢＲ４３。
【０１６３】
・欧州特許出願第２５５３７８号の図２に列挙される配列の内の塩基１１５０−１１７０（ＢＲ４６）および塩基２１２０−２１５５（ＢＲ４５）の相補物に相当するＢＲ４５およびＢＲ４６。その上、ＢＲ４６はＳａｌ  Ｉ部位（５’−ＧＴＣＧＡＣ−３’）に相当する塩基および幾つかの追加塩基（５’−ＴＣＡＧＧＣＣＴ−３’）がそのプライマーの５’端に付いており、そしてＢＲ４５はＢｇｌ  ＩＩ部位（５’−ＡＧＡＴＣＴ−３’）に相当する塩基および２つの（５’−ＣＴ−３’）追加塩基がそのプライマーの５’端に
付いている。
【０１６４】
・欧州特許出願第２５５３７８号の図２に列挙される配列の内の塩基２７０５−２７２３（ＢＲ４７）および塩基２６４３−２６６６（ＢＲ４８）に相当するＢＲ４７およびＢＲ４８。その上ＢＲ４７は、そのプライマーの５’端に２つの（５’−ＣＴ−３’）追加的な塩基、およびその後に続くＢｇｌ  ＩＩ部位（５’−ＡＧＡＴＣＴ−３’）に相当する塩基、およびその後に続く幾つかの追加塩基（５’−ＴＣＡＧＧＣＣＴ−３’）が付いている。
【０１６５】
・欧州特許出願第２５５３７８号の図２に列挙される配列の内の塩基３８７７−３８９７（ＢＲ４９）の相補物および塩基３９８５−３９１９（ＢＲ５０）の相補物に相当するＢＲ４９およびＢＲ５０。その上ＢＲ４９には、Ｓａｌ  Ｉ部位（５’−ＧＴＣＧＡＣ−３’）に相当する塩基および幾つかの追加塩基（５'−ＴＣＡＧＧＣＣＴ−３’)がその５’端に付いている。
【０１６６】
・欧州特許出願第２５５３７８号の図２に列挙される配列の内の塩基３８７５−３８８８（ＢＲ５７）の相補物および塩基２７００−２７１４(ＢＲ５８)に相当するＢＲ５７およびＢＲ５８。その上ＢＲ５７の５’端には、幾つかの余分な塩基（５’−ＣＣＡＴＧＧ−３’）、およびそれに続くＳａｃ  Ｉ部位（５’−ＧＡＧＣＴＣ−３’）に相当する塩基、およびそれに続く更に他の塩基（５’−ＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧ−３’）が付いている。ＢＲ５８の５’端には、追加塩基（５’−ＧＡＧＣＴＣ−３’）、およびその後に続くＮｃｏ  Ｉ部位（５’−ＣＣＡＴＧＧ−３’）に相当する塩基、およびその後に続く追加塩基（５’−ＡＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣ−３’）が付いている。
【０１６７】
・欧州特許出願第２５５３７８号の図２に列挙される配列の内の塩基１８４６−１８６５（ＢＲ６１）および塩基２０９４−２１１４（ＢＲ６２）に相当するＢＲ６１およびＢＲ６２。その上ＢＲ６２の５’端には、追加塩基（５’−ＧＡＣＡ−３’）、およびその後に続くＢｇｌ  ＩＩ部位に相当する塩基（５’−ＡＧＡＴＣＴ−３’）、およびその後に続く幾つかの追加塩基（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’）が付いている。
【０１６８】
カノーラ品種「Ｈｙｏｌａ４０１」（Ｚｅｎｅｃａ  Ｓｅｅｄｓ社）からのゲノムＤＮＡをネピン  プロモーターおよびネピン  ターミネーターのＰＣＲ増幅用の鋳型として用いた。このプロモーターを最初にプライマーＢＲ４２とＢＲ４３とを用いて増幅させ、そしてプライマー４５とＢＲ４６とを用いて再増幅させた。プラスミドｐＩＭＣ０１を、Ｓａｌ  Ｉ／Ｂｇｌ  ＩＩでの１．０ｋｂのプロモーターＰＣＲ産物の消化、およびＳａｌ
Ｉ／Ｂａｍ  ＨＩ消化済みｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）内への連結により取得した。ネピン  ターミネーター領域をプライマーＢＲ４８とＢＲ５０とを用いて増幅させ、そしてプライマーＢＲ４７とＢＲ４９とを用いて再増幅させた。プラスミドｐＩＭＣ０６を、Ｓａｌ  Ｉ／Ｂｇｌ  ＩＩでの１．２ｋｂのターミネーターＰＣＲ産物の消化、およびＳａｌ  Ｉ／Ｂｇｌ  ＩＩ消化済みｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ社）内への連結により取得した。ｐＩＭＣ０６を鋳型として用いて、このターミネーター領域を、プライマーＢＲ５７とプライマーＢＲ５８とを用いるＰＣＲにより再増幅させた。ネピンのプロモーターとターミネーターとの両方を含むプラスミドｐＩＭＣ１０１を、Ｓａｃ  Ｉ／Ｎｃｏ  ＩでのＰＣＲ産物の消化およびＳａｃ  Ｉ／Ｎｃｏ  Ｉ消化済みｐＩＭＣ０１内への連結により作製した。プラスミドｐＩＭ１０１は、ネピンの完全な５’および３’非翻訳配列、ならびに翻訳開始ＡＴＧに導入されたＮｃｏ  Ｉ部位を含む２．２ｋｂのネピン発現カセットを含む。プライマーＢＲ６１およびプライマーＢＲ６２を用いて、ネピン  プロモーターの３’端から〜２７０ｂｐの断片をＰＣＲ増幅した。プラスミドｐＩＭＣ４０１を、Ｅｃｏ  ＲＩ／Ｂｇｌ  ＩＩでの先より得られるＰＰＣＲ産物の消化、およびＥｃｏ  ＲＩ／Ｂｇｌ  ＩＩ消化済みｐＩＭＣ１０１内への連結により
取得した。プラスミドｐＩＭＣ４０１は、ネピンの５’非翻訳配列を欠失している２．２ｋｂのネピン発現カセットを含み、そして転写開始の位置にＮｏｔ  Ｉ部位を含んでいる。
【０１６９】
アンチセンス発現ベクターを作製するために、ｐＭ３ＣＦｄ２をＮｏｔ  Ｉで消化し、そして同様の消化反応をｐＩＭＣ４０１についても実施した。ｐＭ３ＣＦｄ２の消化物からの挿入断片を含むデルタ−１２  デサチュラーゼをゲル単離し、そしてＮｏｔ  Ｉ消化済みであってかつホスファターゼ処理済みであるｐＩＭＣ４０１内に連結させた。デルタ−１２  デサチュラーゼがネピン  プロモーターに対してアンチセンスの向きになっている単離物をＸｈｏ  ＩとＰｆｌ  ＭＩとでの消化により選択してプラスミドｐＮＣＦｄ２Ｒを取得した。ｐＮＣＦｄ２ＲをＳａｌ  Ｉで消化し、ホスファターゼ処理に付し、そして同一処理により既に開環してあるｐＺＳ２１２内に連結させた。導入済みのネピン：デルタ−１２  デサチュラーゼ  アンチセンス転写ユニットが選択標識に関して所望の向きになっているプラスミドをＰｖｕ  Ｉでの消化により選択し、そして得られる２元性ベクターをｐＺＮＣＦｄ２Ｒと命名した。
【０１７０】
プラスミドｐＭＬ７０（先の実施例６に記載）をＮｃｏ  Ｉで消化し、平滑末端を作製し、そしてその後Ｋｐｎ  Ｉで消化した。プラスミドｐ
Ｍ２ＣＦｄをＫｐｎ  ＩとＳｍａ  Ｉとで消化し、そして単離された断片を環化させてあるｐＭＬ７０内に連結させてアンチセンス発現カセットｐＭＫＣＦｄ２Ｒを取得した。このプロモーター：デルタ−１２  デサチュラーゼ：ターミネーター配列をＢａｍ  ＨＩ消化によりｐＭＫＣＦｄ２Ｒから取り出し、そして既にＢａｍ  ＨＩ消化およびホスファターゼ処理を施してあるｐＺＳ１９９内に連結させた。選択標識に関して所望の向きになっているものをＸｈｏ  ＩとＰｆｌ  ＭＩとでの消化により決定して発現ベクターｐＺＫＣＦｄ２Ｒを取得した。
【０１７１】
β−コングリシニンプロモーターを含む発現ベクターを、ｐＭ２ＣＦｄ２のＳｍａ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＶ消化、ならびにＳｍａ  Ｉ切断済みｐＭＬ１０９Ａ内への連結により作製した。アンチセンスの向きになっている単離物をＸｈｏ  ＩおよびＰｆｌ  ｍＩとの消化により同定し、そしてその転写ユニットをＳａｌ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＩ消化により単離した。単離したＳａｌ  Ｉ−Ｅｃｏ  ＲＩ断片をＥｃｏ  ＲＩ−Ｓａｌ  Ｉ消化済みｐＺＳ１９９内に連結させてｐＣＣＦｄ２Ｒを取得した。プロモーター含有性出発用ベクターとしてのｐＣＷ１０８およびベクターの２元性部分としてのｐＺＳ２１２とを用いる同様の方法を使用して、ファセオリン  プロモーターを含む発現ベクターを取得してｐＺＰｈＣＦｄ２Ｒを作製した。
【０１７２】
ブラッシカ  ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介在性形質転換
２元性ベクターであるｐＺＮＣＦｄ２Ｒ、ｐＺＣＣＦｄ２Ｒ、ｐＺＰｈＣＦｄ２Ｒ、およびｐＺＮＣＦｄ２Ｒを凍結／解凍法（Ｈｏｌｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  １６３：１８１−１８７）によりアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４（Ｈｏｃｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）、Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：１７９−１８０）内に転移させた。
【０１７３】
適切な２元性ベクターを保持する無感染化済みのアグロバクテリウム  ツメファキエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＬＡＢ４４０４と共に苗片を共栽培することによりブラッシカ  ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）培養物の品種「Ｗｅｓｔｅｒ」を形質転換させた。
【０１７４】
Ｂ．ナプス（Ｂ．  ｎａｐｕｓ）の種子を１０％クロロックス（Ｃｈｌｏｒｏｘ）、０
．１％ＳＤＳ中で３０分間撹拌し、そして滅菌済み蒸留水で完全にすすぐことにより滅菌した。この種子を、３０ｍＭのＣａＣｌ２および１．５％のアガロースを含む滅菌培地で発芽させ、そして２４℃の暗所で６日間生育させた。
【０１７５】
植物形質転換用のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の液体培養物を２８℃下で、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む最少Ａ培地中で一晩生育させた。細菌細胞を遠心によりペレット化させ、そして１００μＭのアセトシリンゴン（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ）を含む液体のムラシゲ  アンド  スツーグ  最少有機培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ）中１０８細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させた。
【０１７６】
Ｂ．  ナプス（Ｂ．  ｎａｐｕｓ）苗の胚軸を５ｍｍ片に切断し、これを即座に細菌懸濁物中に入れた。３０分後、胚軸片を細菌懸濁物から取り出し、そして１００μＭのアセトシリンゴンを含むＢＣ−３５カルス培地中に入れた。この植物組織とアグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）とを薄明かりの中、２４℃で３日間共栽培させた。
【０１７７】
胚軸片を、アグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）を殺すための２００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）および形質転換済み植物細胞増殖についての選択を行うための２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＢＣ−３５カルス培地に移すことにより共栽培を停止させた。この苗片を、継続光の下、２８℃で、この培地で３週間インキュベートした。
【０１７８】
４週間後にこれらのセグメントを、２００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンと２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＢＳ−４８再生培地に移した。植物組織は、カルス培地について記載してあるのと同一の培養条件下で、２週間毎に新鮮な選択再生培地で継代培養した。形質転換を生じたものと仮定される細胞は再生培地上で迅速に生育し、カリ（ｃａｌｌｉ）が約２ｍｍの直径に達した時点でそれらを苗軸片から取り出し、そしてカナマイシンを添加していない同一培地に入れた。
【０１７９】
ＢＳ−４８再生培地へ転移させた後７週間以内に苗条が現れ始めた。苗条が識別可能な茎を形成したらすぐにそれらをカリから切除し、ＭＳＶ−１Ａ伸長培地に移し、そして２４℃下の１６：８時間の光り周期下へと移した。
【０１８０】
苗条が数節間分にまで伸長したら、それらをアガロース表面より上の位置で切断し、そして切断末端をルートン（Ｒｏｏｔｏｎ）内に浸した。処理済み苗条を湿ったメトロ−ミックス３５０無土壌鉢植え培地（Ｍｅｔｒｏ−Ｍｉｘ  ３５０  ｓｏｉｌｅｓｓ  ｐｏｔｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）に植えた。この鉢をビニール袋で覆い、この袋は、その後約１０日目に植物が完全に成長した際に取り外した。
【０１８１】
植物を、昼時間温度が２３℃であって、かつ夜時間温度が１７℃である１６：８時間の光周期下で生育させた。最初の開花茎が伸長し始めたら、それをメッシュの花粉格納袋を被せて他配を防いだ。毎日数回植物を揺することにより自家授粉を容易にさせた。このようにしてこれまでに５１の植物がｐＺＣＣＦｄ２ＲおよびｐＺＰｈＣＦｄ２Ｒの両方を用いた形質転換から得られており、４０の植物がｐＺＫＣＦｄ２Ｒから得られており、そして２６の植物がｐＺＮＣＦｄ２Ｒから得られている。
最少Ａ細菌増殖培地
以下のものを蒸留水に溶解せよ：
１０．５グラムのリン酸カリウム、二塩基酸
４．５グラムのリン酸カリウム、一塩基酸
１．０グラムの硫酸アンモニア
０．５グラムのクエン酸ナトリウム、二水和物
蒸留水で９７９ｍＬにメスアップせよ。
【０１８２】
オートクレーブ処理を行うこと。
【０１８３】
２０ｍＬのフィルター滅菌済み１０％スクロースを添加せよ。
【０１８４】
１ｍＬのフィルター滅菌済み１Ｍ  ＭｇＳＯ４を添加せよ。
ブラッシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）のカルス培地ＢＣ−３５
リットル当たり：
ムラシゲ  アンド  スクーグの最少有機培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳ塩、１００ｍｇ／Ｌのｉ−イノシトール、０．４ｍｇ／Ｌのチアミン；ＧＩＢＣＯ社  ＃５１０−３１１８）
３０グラムのスクロース
１８グラムのマニトール
０．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ
０．３ｍｇ／Ｌのカイネチン
０．６％のアガロース
ｐＨ５．８
ブラッシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の再生培地ＢＳ−４８
ムラシゲ  アンド  スクーグの最少有機培地
ガンボルグ  Ｂ５  ビタミン（Ｇａｍｂｏｒｇ  Ｂ５  Ｖｉｔａｍｉｎｓ）（ＳＩＧＭＡ  ＃１０１９）
１０グラムのグルコース
２５０ｍｇのキシロース
６００ｍｇのＭＥＳ
０．４％のアガロース
ｐＨ５．７
フルター滅菌を行い、そして以下のものをオートクレーブ処理後に添加せよ：
２．０ｍｇ／Ｌのゼラチン
０．１ｍｇ／ＬのＩＡＡ
ブラッシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の苗条伸長培地ＭＳＶ−１Ａ
ムラシゲ  アンド  スクーグの最少有機培地
ガンボルグ  Ｂ５  ビタミン（Ｇａｍｂｏｒｇ  Ｂ５  Ｖｉｔａｍｉｎｓ）
１０グラムのスクロース
０．６％のアガロース
ｐＨ５．８
【０１８５】
アンチセンス  ミクロソーム  デルター−１２  デサチュラーゼ構築物を含む形質転換ブラッシカ  ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）の種子の分析
５１の植物がｐＺＰｈＣＦｄ２ＲとｐＺＣＣＦｄ２Ｒとの両方での形質転換から得られ、そして４０の植物がｐＺＫＣＦｄ２Ｒから得られ、そして２６の植物がｐＺＮＣＦｄ２Ｒから得られた。オレイン酸（１８：１）、リノレン酸（１８：２）、およびリノール酸（１８：３）の相対的レベルが発育中に変化しており、そのため種子脂肪酸表現型を高い信頼性を以て決定するには、正常な成熟および乾燥落種（ｄｒｙｄｏｗｎ）を受けた種子で実施するのが最良である。相対的にはほとんどの形質転換済み植物は成熟にまで達しないが、鉢に移し変えてから少なくとも８０日間が経過しており、そして黄色を呈ししかも黒色の沈着物を生じている種皮のある種子を含む莢が付いている植物から種子を採取した。プロモーターの種類、挿入されたデルタ−１２  デサチュラーゼ  アンチセンス遺伝子の存在およびコピー数、ならびにその植物の稔性に基づく初期分析用に植物を選択した。
【０１８６】
脂肪酸分析は、形質転換植物および対照植物からの個々の種子のいずれかのものについて、実施例６に記載されるように個々の植物からの４０ｍｇの種子混合物について実施した。カノーラのデルタ−１２  デサチュラーゼ  アンチセンス遺伝子の存在の検出用のサザン分析は、形質転換植物の葉から取得したＤＮＡについて実施した。形質転換ベクターからプロモーター：デルタ−１２  デサチュラーゼ断片を放出させるため、あるいはデルタ−１２  デサチュラーゼ  アンチセンス遺伝子のコーディング領域の外側を切断するかのいずれかのためにＤＮＡの消化処理を実施したが、ただしそれはそのベクターの左右のＴ−ＤＮＡ境界領域内においてのみの消化処理であった。
【０１８７】
【表１６】
2006238886.tif 000017
デルタ−１２  デサチュラーゼのアンチセンス抑制について予期された脂肪酸表現型では、１８：２の相対的含有量が減少しており、それに相関して１８：１の含有量が増加している。植物番号１５１−２２と１５８−８との両方は、植栽後８３日目にＷｅｓｔｅｒ対照と比較した際に、種子混合物の１８：２含有量が実質的に減少していた。植物１５１−２２も、Ｗｅｓｔｅｒ対照もしくは植物１５１−１２７（この植物は選択標識で形質転換させてあるがデルタ−１２  デサチュラーゼ  アンチセンス遺伝子での形質転換は行っていない）と比較した際に、成熟した時点ではこの種の違いを示す。
【０１８８】
脂肪酸分析を一次形質転換体からの種子について実施したため、個々の種子を導入遺伝子の単数コピーもしくは複数コピーの存在について分離するべきである。分離した表現型はデルタ−１２  デサチュラーゼ  アンチセンス遺伝子の効果についての内部対照として
役立つ。Ｗｅｓｔｅｒの１０の個々の種子、１５１−２２の１０の個々の種子、および１２の個々の１５８−８の種子についての脂肪酸表現型の相対比を以下の表１５に示す。
【０１８９】
【表１７】
2006238886.tif 000018
Ｗｅｓｔｅｒ対照は、１８：１もしくは１８：２の含有量についての種子毎の変化が比較的小さい。その上、１８：３／１８：２の比率が各種子間で約０．３５であり、この値
が常に維持されている。植物＃１５８−８は、１：２：１もしくは１：３のいずれかの分離比を示し、それは、サザン分析によるとその植物が単一の導入遺伝子を含んでいることがその理由となっている。１：２：１の比率は半優性のコピー数効果を示す一方で、１：３の比率は完全優性を示すものと思われる。野生型１５８−８の２つの分離個体が表１５において明らかに示されているが、一方で残りの種子は同一であるか、あるいは８４％を上回る１８：１の２つの種子はホモ接合性形質転換体であるかのいずれかの可能性がある。いずれの場合においても、それらの種子の脂肪酸表現型は、この世代における効率のよいデルタ−１２  デサチュラーゼ抑制について予測されたものである。植物１５１−２２の種子の脂肪酸表現型は、１８：１および１８：２の含有量においては変化が観察されており、１８：１は対照平均値よりも高く、かつ１８：２はそれよりも低くなっている。多重コピー形質転換植物の分離が非常に複雑であることは、予期されるとりに明白なことである。
【配列表】
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