(57)【要約】【課題】  免疫原に応答し、ヒト抗体又はそのアナログを生成する非霊長類哺乳動物細胞及びその製造方法並びにその製造のために使用されるベクター及び細胞を提供する。【解決手段】  不活性化ベクターを用い相同組換え事象により非霊長類哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座を不活性化し、かつ、該非霊長類哺乳動物のゲノム中にヒト免疫グロブリン遺伝子を導入することにより、内在性免疫グロブリン遺伝子を産生する能力を欠き、ヒト免疫グロブリンを産生する能力を有するトランスジェニック非霊長類哺乳動物が得られる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活性化された内在性免疫グロブリン遺伝子座を有する細胞の製造方法であって、内在性免疫グロブリン遺伝子座の一部と相同性を有するＤＮＡ配列と該内在性免疫グロブリン遺伝子座との相同組換えにより該内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部に障害を導入することを特徴とする製造方法。
【請求項２】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
該細胞が、マウス由来の細胞であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
不活性化された内在性免疫グロブリン遺伝子座を有する細胞の製造方法であって、内在性免疫グロブリン遺伝子座の一部と相同性を有するＤＮＡ配列と該内在性免疫グロブリン遺伝子座との相同組換えにより該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部に障害を導入することを特徴とする製造方法。
【請求項７】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
該障害が、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多様性（Ｄ）領域の少なくとも一部における障害であることを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項６乃至請求項８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
該細胞が、マウス由来の細胞であることを特徴とする請求項６乃至請求項１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列がゲノム中に導入されている非霊長類哺乳動物細胞の製造方法であって、該ＤＮＡ配列が、該ＤＮＡ配列及び非霊長類哺乳動物細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子を含むイースト人工染色体（ＹＡＣ）ベクターを用いることにより導入されることを特徴とする製造方法。
【請求項１３】
該ＤＮＡ配列が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、少なくとも１つの連結領域（Ｊ）遺伝子セグメント及び少なくとも１つの不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
該ＤＮＡ配列が、さらにヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
該ヒト免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項１２乃至請求項１４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１６】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１７】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１８】
該少なくとも１つの不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが、Ｃμ不変領域遺伝子セグメントであることを特徴とする請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
非霊長類哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座を不活性化するためのベクターであって、該ベクターは、該哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座の一部と相同性を有するＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列と該哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座との相同組換えにより該内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部に障害を導入することにより、不活性化するものであることを特徴とするベクター。
【請求項２０】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項１９または請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項１９乃至請求項２２のいずれかに記載のベクター。
【請求項２４】
非霊長類哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部に障害を有することにより、該内在性免疫グロブリン遺伝子座が不活性化されていることを特徴とする非霊長類哺乳動物細胞。
【請求項２５】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部との置換であることを特徴とする請求項２４または請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項２４乃至請求項２７のいずれかに記載の細胞。
【請求項２９】
霊長類哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座を不活性化するためのベクターであって、該ベクターは、該哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座の一部と相同性を有するＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列と該哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座との相同組換えにより該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部に障害を導入することにより、不活性化するものであることを特徴とするベクター。
【請求項３０】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】
該障害が、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多様性（Ｄ）領域の少なくとも一部における障害であることを特徴とする請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項２９乃至請求項３１のいずれかに記載のベクター。
【請求項３３】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項２９乃至請求項３３のいずれかに記載のベクター。
【請求項３５】
非霊長類哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部に障害を有することにより、該内在性免疫グロブリン遺伝子座が不活性化されていることを特徴とする非霊長類哺乳動物細胞。
【請求項３６】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
該障害が、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多様性（Ｄ）領域の少なくとも一部における障害であることを特徴とする請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部との置換であることを特徴とする請求項３５乃至請求項３７のいずれかに記載の細胞。
【請求項３９】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項３８に記載の細胞。
【請求項４０】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項３５乃至請求項３９のいずれかに記載の細胞。
【請求項４１】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列及び非霊長類哺乳動物細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子を含むことを特徴するイースト人工染色体（ＹＡＣ）ベクター。
【請求項４２】
該ＤＮＡ配列が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、少なくとも１つの連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び少なくとも１つの不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、及び該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項４１に記載のベクター。
【請求項４３】
該ＤＮＡ配列が、さらにヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメント、及び該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項４２に記載のベクター。
【請求項４４】
該ヒト免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項４１乃至請求項４３のいずれかに記載のベクター。
【請求項４５】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項４２に記載のベクター。
【請求項４６】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項４３に記載のベクター。
【請求項４７】
該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが、Ｃμ不変領域遺伝子セグメントを含むことを特徴とする請求項４６に記載のベクター。
【請求項４８】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列がゲノム中に導入されている非霊長類哺乳動物細胞であって、該ＤＮＡ配列が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、少なくとも１つの連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び少なくとも１つの不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする非霊長類哺乳動物細胞。
【請求項４９】
該ＤＮＡ配列が、さらにヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項４８に記載の細胞。
【請求項５０】
該ヒト免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項４８または請求項４９に記載の細胞。
【請求項５１】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項４８に記載の細胞。
【請求項５２】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項４９に記載の細胞。
【請求項５３】
該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが、Ｃμ不変領域遺伝子セグメントを含むことを特徴とする請求項５２に記載の細胞。
【請求項５４】
内在性免疫グロブリン遺伝子座を不活性化するためのＤＮＡであって、該ＤＮＡは、該内在性免疫グロブリン遺伝子座の一部と相同性を有するＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列と該内在性免疫グロブリン遺伝子座との相同組換えにより該内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部に障害を導入することにより、不活性化するものであることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項５５】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項５４に記載のＤＮＡ。
【請求項５６】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項５４または請求項５５に記載のＤＮＡ。
【請求項５７】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項５６に記載のＤＮＡ。
【請求項５８】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が、マウスの内在性免疫グロブリン遺伝子座であることを特徴とする請求項５４乃至請求項５７のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項５９】
内在性免疫グロブリン遺伝子座を不活性化する方法であって、請求項５４に記載のＤＮＡと該内在性免疫グロブリン遺伝子座との相同組換えにより該内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部に障害を導入することを特徴とする方法。
【請求項６０】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項５９または請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が、マウスの内在性免疫グロブリン遺伝子座であることを特徴とする請求項５９乃至請求項６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つのコピー中の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部に障害を有するトランスジェニック非霊長類哺乳動物であって、該障害の結果、該遺伝子座のコピーが不活性化されていることを特徴とするトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項６５】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が、免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項６４に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項６６】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項６４または請求項６５に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項６７】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項６６に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項６８】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項６４乃至請求項６７のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項６９】
該トランスジェニック非霊長類哺乳動物が、さらに外来性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求項６４乃至請求項６７のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項７０】
該外来性免疫グロブリン遺伝子座が、外来性免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項６９記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項７１】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項６９または請求項７０に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項７２】
該外来性免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座であることを特徴とする請求項６９乃至請求項７１のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項７３】
該外来性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、少なくとも１つの連結領域（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び少なくとも１つの不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項６９に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項７４】
該ＤＮＡ配列が、さらにヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、該多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項７３に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項７５】
該ヒト免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項７３または請求項７４に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項７６】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項７３に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項７７】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項７４に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項７８】
内在性免疫グロブリン遺伝子座を不活性化するためのＤＮＡであって、該ＤＮＡは、該内在性免疫グロブリン遺伝子座の一部と相同性を有するＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列と該内在性免疫グロブリン遺伝子座との相同組換えにより該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部に障害を導入することにより、不活性化するものであることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項７９】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項７８に記載のＤＮＡ。
【請求項８０】
該障害が、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多様性（Ｄ）領域の少なくとも一部における障害であることを特徴とする請求項７９に記載のＤＮＡ。
【請求項８１】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項７８乃至請求項８０のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項８２】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項８１に記載のＤＮＡ。
【請求項８３】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が、マウスの内在性免疫グロブリン遺伝子座であることを特徴とする請求項７８乃至請求項８２のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項８４】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列及び非霊長類哺乳動物細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子を含むことを特徴とするイースト人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ。
【請求項８５】
該ＤＮＡ配列が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、少なくとも１つの連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び少なくとも１つの不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項８４に記載のＤＮＡ。
【請求項８６】
該ＤＮＡ配列が、さらにヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項８５に記載のＤＮＡ。
【請求項８７】
該ヒト免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項８４乃至請求項８６のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項８８】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項８５に記載のＤＮＡ。
【請求項８９】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項８６に記載のＤＮＡ。
【請求項９０】
該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが、Ｃμ不変領域遺伝子セグメントであることを特徴とする請求項８９に記載のＤＮＡ。
【請求項９１】
内在性免疫グロブリン遺伝子座を不活性化する方法であって、内在性免疫グロブリン遺伝子座の一部と相同性を有するＤＮＡ配列と該内在性免疫グロブリン遺伝子座との相同組換えにより該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部に障害を導入することを特徴とする方法。
【請求項９２】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
該障害が、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多様性（Ｄ）領域の少なくとも一部における障害であることを特徴とする請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項９１乃至請求項９３のいずれかに記載の方法。
【請求項９５】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が、マウスの内在性免疫グロブリン遺伝子座であることを特徴とする請求項９１乃至請求項９５のいずれかに記載の方法。
【請求項９７】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列を非霊長類哺乳動物細胞のゲノムに導入する方法であって、該ＤＮＡ配列が、該ＤＮＡ配列及び非霊長類哺乳動物細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子を含むイースト人工染色体（ＹＡＣ）ベクターを用いることにより導入されることを特徴とする方法。
【請求項９８】
該ＤＮＡ配列が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、少なくとも１つの連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び少なくとも１つの不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
該ＤＮＡ配列が、さらにヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
該ヒト免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項９７乃至請求項９９のいずれかに記載の方法。
【請求項１０１】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが、Ｃμ不変領域遺伝子セグメントであることを特徴とする請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つのコピーに障害を有するトランスジェニック非霊長類哺乳動物であって、該障害の結果、該遺伝子座のコピーが不活性化されていることを特徴とするトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１０５】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が、免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項１０４に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１０６】
該障害が、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多様性（Ｄ）領域における障害であることを特徴とする請求項１０５に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１０７】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項１０４乃至請求項１０６のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１０８】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項１０７に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１０９】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項１０４乃至請求項１０８のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１１０】
該トランスジェニック非霊長類哺乳動物が、さらに外来性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求項１０４乃至請求項１０８のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１１１】
該外来性免疫グロブリン遺伝子座が、外来性免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項１１０に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１１２】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項１１０または請求項１１１に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１１３】
該外来性免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座であることを特徴とする請求項１１０乃至請求項１１２のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１１４】
該ＤＮＡ配列が、該外来性免疫グロブリンの不変（Ｃ）領域以外のペプチドにペプチド結合で結合した可変部（Ｖ）を提供するＤＮＡ配列を含むものであることを特徴とする請求項１１０乃至請求項１１３のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１１５】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列がゲノム中に導入されているトランスジェニック非霊長類哺乳動物であって、該ＤＮＡ配列が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、少なくとも１つの連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び少なくとも１つの不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とするトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１１６】
該ＤＮＡ配列が、さらにヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項１１５に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１１７】
該ヒト免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項１１５または請求項１１６に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１１８】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項１１５に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１１９】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項１１６に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１２０】
該少なくとも１つの不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが、Ｃμ不変領域遺伝子セグメントであることを特徴とする請求項１１９に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１２１】
該トランスジェニック非霊長類哺乳動物が、さらに内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つのコピーに障害を有し、該障害の結果、該遺伝子座のコピーが不活性化されていることを特徴とする請求項１１５乃至請求項１２０のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１２２】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が、免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項１２１に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１２３】
該障害が、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多様性（Ｄ）領域の少なくとも一部における障害であることを特徴とする請求項１２２に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１２４】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項１２１乃至請求項１２３のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１２５】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項１２４に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１２６】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項１１５乃至請求項１２５のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項１２７】
特定の抗原に免疫反応性を有する異種タンパクの製造方法であって、下記のいずれかの工程を少なくとも含むことを特徴とする製造方法。
１）特定の抗原に対する免疫応答を刺激する条件下で請求項１１０乃至請求項１２６のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物を該抗原で免疫し、該トランスジェニック非霊長類哺乳動物の血中から該抗原に免疫反応性を有する異種タンパクを回収する。
２）(i)特定の抗原に対する免疫応答を刺激する条件下で請求項１１０乃至請求項１２６のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物を該抗原で免疫し、
(ii)該トランスジェニック非霊長類哺乳動物からＢ細胞を回収し、
(iii)該Ｂ細胞を不朽化し、
(iv)異種タンパクを産生する不朽化Ｂ細胞を取得し、
(v)該不朽化Ｂ細胞の培養物から該異種タンパクを回収する。
【請求項１２８】
該異種タンパクが、ヒトタンパクであることを特徴とする請求項１２７に記載の製造方法。
【請求項１２９】
該ヒトタンパクが、ヒト抗体またはヒト抗体サブユニットであることを特徴とする請求項１２８に記載の製造方法。
【請求項１３０】
請求項１１０乃至請求項１２６のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物のＢ細胞に由来する不朽化Ｂ細胞であって、該不朽化Ｂ細胞が特定の抗原に免疫反応性を有する異種タンパクを産生するものであることを特徴とする不朽化Ｂ細胞。
【請求項１３１】
該異種タンパクが、ヒトタンパクであることを特徴とする請求項１３０に記載の不朽化Ｂ細胞。
【請求項１３２】
該ヒトタンパクが、ヒト抗体またはヒト抗体サブユニットであることを特徴とする請求項１３１に記載の不朽化Ｂ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は種々の哺乳類宿主における異種移植された特異的結合たんぱく質の生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は診断および治療に有用である。それらの特異的エピトープに対する結合を利用してそのエピトープを有する分子を同定したり、またそれら自身または他のものと組合わせて特定の部分に指向させ診断や治療を行うこともできる。
【０００３】
モノクロナール抗体には重鎖と軽鎖があり、それらが結合してエピトープに対する結合領域を形成している。これらの鎖の各々は可変部と不変部から成り立っている。不変部のアミノ酸配列はその抗体を生産する宿主およびその抗体の特定のイソタイプに特異的である。
【０００４】
不変部の配列およびその抗体を生産する種との関係からその宿主の循環系への異種抗体の導入は免疫応答を起こす。異種抗体を慢性病などの場合に反復して導入するとそれが速やかに破壊されるか、また悪影響をもつためその抗体の投与は実際には行なえない。それゆえ、同系または同種抗体源を提供する努力がはらわれてきた。１つの方法として、その宿主由来の重鎖および軽鎖遺伝子を同定し、不変部をコードする領域を同定する組換えＤＮＡ技術がある。これらの領域を特定のエピトープを指向する他の種の免疫グロブリン遺伝子と結合させた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、生成した部分的異種キメラ抗体は全体的異種抗体よりも実質的に有用であるが多くの欠点も有している。その可変および不変部の同定、単離および結合は実質的な研究を必要とする。さらに、ある種の不変部の他の種の可変部への結合はその可変部の特異性やアフィニティーを変化させ、その可変部の望ましい性質を失うこともある。また、その可変部における種特異的な枠組みや超可変配列がある。これらの枠組みや超可変配列は不都合な抗原応答を示すかもしれない。それゆえ、目的の免疫原で宿主を免疫化して宿主に抗体する同種抗体を作ることがより好ましいことである。霊長類特にヒトにはこの方法は実践的ではない。生産されたヒト抗体は目的のエピトープに対して予め免疫化された宿主に由来する脾臓の偶発的な提供に基づいている。ヒトの末梢血液リンパ球をモノクロナール抗体の生産に使用し得るが特に融合はうまく行なわれておらず通常IgＭのみに限られる。さらにヒトのたんぱく質、すなわち多くの治療および診断における標的に対するヒトの抗体応答を生成させるのは特に難しい。それゆえヒトの同種抗体生成に対する別の経路を見つけることは興味深い。
【０００６】
（関連文献）
トーマス（Thomas）およびカペチ（Capecchi）、Cell、５１、５０３−５１２、１９８７。コラー（Koller）およびスミシーズ（Smithies）Proc．Natl．Acad．Sci ．ＵＳＡ、８６、８９３２−８９３５、１９８９。この文献は胚幹細胞における相同組換えによるＢ２ミクログロブリン遺伝子座の不活性化を報告している。バーマン（Berman）等、ＥＭＢＯ、Ｊ、７、７２７−７３８、１９８８、はヒトIgＶＨ部位について報告している。バーク（Burke)等、Science 、２３６、８０６−８１２、１９８７はイーストの人工的染色体ベクターについて報告している。またガルザ（Garza)等、Science 、２４６、６４１−６４６、１９８９およびブラウンスタイン（Brown Stein)等、Science 、２４４、１３４８−１３５１、１９８９参照。サカノ（Sakano) 等は免疫グロブリン重鎖遺伝子の多様性セグメントについて報告している。ターカー（Turcker)等、Proc．Natl．Acad．Sci ．ＵＳＡ、７８、７６８４−７６８８、１９８１はマウスIgＡ重鎖遺伝子配列について報告している。ブランケンスタイン（Blanken Stein)およびクルウィンケル(Kruwinkel) 、Eur ．J ．Immol ．、１７、１３５１−１３５７、１９８７はマウスの可変重鎖領域について報告している。また、ジョイナー(Joyner)等、Nature、３３８、１５３−１５５、１９８９、トラバー（Traver）等、Proc．Natl．Acad．Sci ．ＵＳＡ、８６、５８９８−５９・２、１９８９およびパンチス（Panchis)等、Proc．Natl．Acad．Sci ．ＵＳＡ、８７、５１・９−５１１３、１９９０参照。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
異種特異的結合たんぱく質を適当な免疫原で哺乳類宿主を免疫化することにより非霊長類の哺乳類宿主中で生産した。
【０００８】
この宿主は、（１）内在する免疫グロブリンを生産できない；（２）外来免疫グロブリン遺伝子座が少なくとも１つの免疫グロブリン不変部またはそのたんぱく質、軽鎖および重鎖の少なくとも１つの可変部成分を提供する免疫グロブリン配列、および機能性免疫グロブリンサブユニットの切断および構築を目的とする適当なスプライシング部位をもつ少なくとも１つのイントロンを含む、以上（１）および（２）を特徴とするものである。したがって、哺乳類宿主は内在または外来の免疫グロブリン遺伝子座の機能性Ｊ領域をスプライシングによって生成し得る少なくとも１つの異種不変部またはそのたんぱく質を含み、その宿主の全免疫グロブリン遺伝子座は一部または全部の異種免疫グロブリン遺伝子座で置換されていることもあるし、また宿主細胞の染色体および不活性化した内在免疫グロブリン領域に挿入した形で異種免疫グロブリン遺伝子座を有することもある。これらの種々の代替法は少なくとも部分的に重鎖および軽鎖について免疫グロブリン遺伝子座における相同組換えを使用することによって行なわれる。
【発明の効果】
【０００９】
以上の通り、本発明は免疫原に応答しヒト抗体またはそのアナログを生成する不活性化した内在性Ｉｇ遺伝子座及び機能性ヒトＩｇ遺伝子座を有することを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
霊長類以外、特にヒト以外の新しいトランスジェニック哺乳類宿主で、ある免疫原に対する免疫応答を発現し、その応答が霊長類、特にヒトの不変および、または可変部または目的とするそのような別のエクェクターペプチド配列を有する抗体を生成するものが提供される。この宿主は内在する免疫グロブリンサブユニットをコードする遺伝子座の置換および、または不活性化の結果として異種または修正した抗体を生産し得ることを特徴とする。この修正は機能性ペプチドへＣ末端で結合した可変部結合部位の構築を提供する不変部の少なくとも１部を維持している。この機能性ペプチドは多くの形や構造をとり得るし、また酵素、成長因子、結合たんぱく質、リガンド、サイトカイン、エフェクターたんぱく質、キレートたんぱく質などとしても働き得る。この抗体はどのイソタイプ、すなわち、IgＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭ、またはイソタイプのサブタイプもとり得る。目的のトランスジェニック宿主を得るために多くの戦術をとり得る。種々のトランスジェニック宿主を使用し得る。この中には特に、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコなど通常は霊長類以外のものが含まれる。ほとんどの場合、抗体の生産のための不朽化に使用するＢ−リンパ球の生産にはマウスが使用される。マウスは扱いやすく、大量に増やせ、かつ非常に広い免疫レパートリーを有することが知られているので、通常マウスが選ばれる。それゆえ以下の議論ではマウスに関して述べるが、同様の操作に従い他の動物、特に哺乳類もマウスと容易に置換し得る。１つの方策では各ステップとして、ヒトの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をマウスの生殖系列に導入するが、別のステップにおいて、対応するマウス遺伝子は機能を失わせられる。ヒトの重鎖および軽鎖遺伝子を適当な真核または原核性微生物中で再構築し、生成したＤＳＡフラグメントは受精したマウス卵母細胞または胚幹細胞の前核に導入し得る。内在性マウス免疫グロブリン遺伝子座の不活性化はマウス胚幹細胞における相同組換えによる適当な遺伝子の破壊によって行なわれる。各々の場合部分的に修正した胚幹細胞から誘導され、胚系列から遺伝的修正を伝達し得るキメラ動物ができる。ヒトの免疫グロブリン遺伝子座をもつマウスと不活性化したマウスとの生殖で純粋にヒトの抗体のみを作る動物が出来上る。
【００１１】
次の戦術では、ヒトの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子のフラグメントを用いてマウス胚幹細胞における相同組換えを利用し直接対応するマウス遺伝子を置換する。つづいて胚幹細胞由来の細胞が生殖系列に寄与するキメラトランスジェニック動物を作製する。
【００１２】
これらの戦術は、多くの動物における免疫グロブリン鎖遺伝子の既知の組織に基づいている。というのは組織、個々のドメインをコードするエクソンの相対的位置、スプライス部位や転写要素の位置などの理解の程度は様々である。ヒトの場合、免疫グロブリン重鎖遺伝子は染色体１４の上にある。転写の５´→３´方向で、この遺伝子座は大きな一群の可変部遺伝子（ＶＨ）、多様性（Ｄ）領域遺伝子、つづいて連結（ＪＨ）領域遺伝子および不変（ＣＨ）遺伝子群を含む。この遺伝子座の大きさは約２．５００キロベース(kb)と見積られる。Ｂ−細胞発生の際、生殖系列IgＨ遺伝子座由来の不連続な遺伝子セグメントはＤＮＡの物理的再配列により並置される。生産すべき機能性重鎖Igポリペプチドを得るため、ＶＨ、ＤおよびＪＨ領域由来の３つの不連続なＤＮＡセグメントは特定の配列ＶＨ−ＤＪＨで結合しなければならない。この配列は機能性ユニットＶＨＤＪＨを生ずる。一度ＶＨ−ＤＪＨが生成してしまえば、エクソンとイントロンを含む特異的ＶＨ−ＤＪＨＣＨをテンプレートとして用いて、Ig遺伝子座の転写につづいて特異的重鎖が生産される。Ig軽鎖にはヒト染色体２上のκ遺伝子座およびヒト染色体２２上のλ遺伝子座の２つがある。IgＬ遺伝子座の構造はＤ領域がないこと以外IgＨ遺伝子座の構造と同じである。IgＨの転位につづいて、軽鎖遺伝子座の転位も同様にκまたはλ鎖のＶＬおよびＪＬ結合によって行なわれる。λおよびκ遺伝子座のサイズは各々約１０００kbである。特定のＢ−細胞における転位IgＨおよびIgκまたはIgλ軽鎖の発現は抗体分子の生成を可能にする。IgＨｈｕ遺伝子座を単離、クローン化および転移させるためにイーストの人工的染色体を使用できる。１つまたは数個のイースト人工染色体（ＹＡＣ）クローンの中に全IgＨｈｕ遺伝子座を含ませる。このことはIg軽鎖遺伝子座についても同様である。つづいて適当な重鎖または軽鎖ＹＡＣクローンをイースト受容細胞に導入し、ホモロジーの重複領域間の相同組換えにより、本来の生殖系列Ig遺伝子座の再構成を行う。このようにしてヒトIg鎖をコードするＤＮＡフラグメントが単離できる。
【００１３】
広範囲の高アフィニティー抗体を得るために１つが全Ｖ領域を含む必要はない。種々のＶ領域遺伝子群がＶ領域クラスター内に散在している。したがって、Ｖ領域の全補足物よりもむしろヒト重鎖および軽鎖Ig遺伝子座の既知Ｖ領域遺伝子の一部を得ることにより（バーマン（Berman）等、ＥＭＢＯ．Ｊ．（１９８８）７：７２７−７３８）、トランスジェニック宿主は免疫化され、強い免疫応答を所持し、高アフィニティー抗体を提供し得る。この様にして、染色体の比較的小さいＤＮＡフラグメント、たとえば第１ｂ図に示したIgＨｈｕ遺伝子座の６７０kbフラグメントが使用できる。このNot Ｉ−Not Ｉ制限フラグメントは種々のＤおよびＪ領域の組換えおよび体細胞変異により多様性が増加する非常に多様なＶ領域を提供する。
【００１４】
異種宿主におけるヒト抗体の生産のためにはその宿主が抗体生産に関して必要な酵素や他の因子を提供し、一方では免疫グロブリンの重鎖および軽鎖サブユニットの発現と競合する内在性遺伝子を欠いている必要がある。したがって、生殖系列転位、スプライシング、体細胞変異などに関する酵素や他の因子は異種宿主中で機能的である。欠いているものは内在性免疫グロブリンサブユニットの生産に関する種々のエクソンを含む機能性天然領域である。
【００１５】
このヒトＤＮＡを受精した卵母細胞または胚幹細胞の前核に導入する。この組込みは採用する戦術によりランダムまたは相同的に行なわれる。反復ステップまたはブリーディングと組合せたトランスホーメーションを用いて宿主免疫グロブリンの軽鎖または重鎖サブユニットを実質的に含まないヒト抗体を生産し得るトランスジェニック動物が得られる。
【００１６】
このヒト免疫グロブリン遺伝子座を不活性化するために、内在性免疫グロブリンサブユニットの生産を阻害する免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座にＤＮＡを導入する相同組換えを用いる。２つの重鎖対立遺伝子および各２つの対立遺伝子を含む２つの軽鎖遺伝子座があるのでλ遺伝子座を無視することもできるが各々の対立遺伝子の不活性化を起こす多重トランスホーメーションがなければならない。（トランスホーメーションとはたとえば接合、トランスホーメーション、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、バイオリスティクスなど生細胞にＤＮＡを導入する技術を示している）。相同組換えを用いて胚幹細胞へ相同的ＤＮＡを導入し、その修正細胞を受容性胚盤胞に導入することによりその遺伝子座の各々を機能的に不活性化させる。つづく育生でその不活性化遺伝子座の生殖系列伝達が可能となる。それゆえ、ヘテロ接合体の子供を育てヘテロ接合体の親からホモ接合体の子供を選択するか、または再び匹敵する遺伝子座の相同組換えおよび不活性化のために胚幹細胞を使用し得る。
【００１７】
トランスホーメーションのステップ数は類似する内在性免疫グロブリンとの相同組換えのためのヒト免疫グロブリンサブユニット遺伝子座の少なくともフラグメントを提供することにより減少することができ、その結果ヒトの遺伝子座は宿主の免疫グロブリンサブユニット遺伝子座の不活性化を伴って宿主免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部の置換が起こる。単一の不活性化を起こすトランスホーメーションとホモ接合体の子供を生ずるヘテロ接合体の子供の育生は特に興味深い。ヒト遺伝子座を不活性化のための宿主遺伝子座に対する置換または挿入に使用する場合、トランスホーメーションの数は３回に限られ、またすでに示したようにあまり使用されないλ遺伝子座を無視しトランスホーメーションを２回に限ることもできる。それとは別に各遺伝子座の不活性化に予め１つ以上の不活性化した遺伝子座を有する子孫由来の胚幹細胞を用いた別のステップを行うこともできる。この場合はトランスホーメーションのみを使用し、ヒトの遺伝子座はランダムに宿主ゲノムに組込まれ、合わせて８回のトランスホーメーションを要してもよい。
【００１８】
不活性化のためにその遺伝子座の免疫グロブリンサブユニットの発現を阻止する標的遺伝子座におけるいかなる障害も使用し得る。したがって、この障害はＶ、ＪまたはＣ領域中のエンハンサー、たとえば５´側上流またはイントロンを含む領域中および重鎖（この機会はＤ領域に存在する）またはこれらを組合せた領域で起こる。したがって重要な因子はIg生殖系列遺伝子転位が阻害されるか、または免疫グロブリンサブユニットをコードする機能的メッセージが転写の失敗かまたはそのメッセージのグロセシングの失敗などにより生産されないことである。免疫グロブリンサブユニット遺伝子座の不活性化だけを考える場合、障害は免疫グロブリンサブユニット遺伝子座のＪ領域に導入することが望ましい。したがって、機能性Ｊ領域を欠き、かつＪ領域の上流または下流に隣接してＪ領域の配列を含むか、またはＪ領域に不活性化を起こす挿入があるその領域の全部または一部を含む構築物を作製する。この挿入は５０bp以上であり、このような挿入は機能性ｍＲＮＡの形成を破壊する。Ｊ領域全体または一部、通常この遺伝子座の少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約９０％を欠失していることが望ましい。好ましいなら、相同的領域である２つの隣接配列間の障害はＪ領域を越えて可変部および、または不変部まで拡張し得る。
【００１９】
マーカー遺伝子を用いてこのＪ領域を置換することが望ましい。様々なマーカーが使用できるが特にポジティブ選択が可能なものが良い。ネオマイシンホスホトランスフィラーゼ遺伝子を発現するＧ４１８耐性が特に興味深い。標的遺伝子構築物の上流および、または下流には２重交叉が起こっているかどうかを同定できる遺伝子を置く。この目的にはヘルペスシンプレックススウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子が使われる。というのはチミジンキナーゼ遺伝子を発現する細胞はアシクロビアまたはガンシクロビアなどのヌクレオシドアナログの使用、つまり機能性ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含む細胞へのこれらの細胞毒性により死滅するからである。これらヌクレオシドアナログに対する感受性の欠除はＨＳＶ−チミジンキナーゼ遺伝子の欠除を示し、つまり、相同組換えにより二重交叉が起こっていることを示している。
【００２０】
ゲノム中のマーカー遺伝子の存在は組込みが起こったことを示しているが、相同組込みが起こったかどうかを決定する必要がある。これはいくつかの方法で行うことができるが、ほとんどの場合、組込みの位置を決めるのにＤＮＡ分析が行われる。この構築物の隣接領域を越えた標的遺伝子座の存在に関し、挿入物に対するプローブを用い、かつその挿入物に隣接する５´側および３´側領域を配列決定することにより、または欠失が導入された場合その欠失を同定することにより望ましい組込みが起こったことを確認する。
【００２１】
相同組換えの検出にポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を使用できる。その構築物内の配列に相補的であるプローブと構築物の外側や標的遺伝子座の配列に相補的であるプローブが使用される。このようにして、相同組換えが起こった場合、相補鎖中に存在する両方のプライマーを有するＤＮＡ鎖のみを得ることができる。期待される大きさの配列を生ずるプローブの存在を示すことにより相同組換えが支持される。さらにこの構築物には哺乳類宿主細胞中で機能的な複製システムが含まれる。ほとんどの場合、これらの複製システムにはシミアンウイルス４０、エプスタインーバーウイルス、ポリオーマウイルス、パピローマウイルスなどのウイルス複製システムが含まれる。ＳＶ４０、メタラチオネイン−ＩおよびII遺伝子、β−アクチン遺伝子、アデノウイルス前期および後期遺伝子、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼII遺伝子などウイルスまたは哺乳類遺伝子由来の種々の転写開始システムが使用される。プロモーターに加えて、野生型エンハンサーを用いマーカー遺伝子の発現をさらに促進することができる。相同組換えのための構築物を作製する場合、この構築物の調製、各操作後のクローニング、制限地図作成や配列決定などの解析、目的配列の増幅や単離用に原核生物、特に大腸菌の複製システムが含まれる。この構築物が大きい場合、一般に約５０kbを越える場合、通常１００kbを越える場合で通常約１００kbp を越えない場合イーストの人工染色体（ＹＡＣ）をこの構築物のクローニングを使用する。
【００２２】
この構築物を調製し、かつ原核生物の配列など不都合な配列が除去されるとこれを標的細胞に導入する。ＤＮＡを標的細胞に導入する簡便な方法が採用される。この方法にはスフェロプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、カルシウム細胞法または直接的なマイクロインジェクションが含まれる。標的細胞のトランスホーメーションまたはトランスフェクション後、先に示したネオマイシン耐性やアシクロビアまたはガンシクロビア耐性などポジィティブおよび、またはネガティブマーカーにより標的細胞を選択する。望ましい発現型を示す細胞はさらに制限分析、電気泳動、サザン分析、ＰＣＲなどでさらに解析する。標的遺伝子座の障害を示すフラグメントを同定することにより相同組換えが起こり標的遺伝子座のコピーが不活性化した細胞を同定し得る。
【００２３】
上述の方法はまず胚幹細胞中の重鎖遺伝子座を用いて行い、ついでこの細胞を成熟させることにより成熟した増殖性宿主が提供される。ついでヘテロ接合性宿主を育生することにより、ホモ接合性宿主が得られることもあり、また胚幹細胞を単離し、かつトランスホームして第２のIgＨ遺伝子座を不活性化することもできる。そして望ましい全ての遺伝子座が不活性化するまでこのプロセスを繰り返した。それとは別に、軽鎖遺伝子座で始めることもできる。いずれの段階でもヒトの遺伝子座を導入し得る。すでに示したように標的遺伝子座を類似するヒト遺伝子座と置換できる。このようにして類似する宿主遺伝子座と同じ領域にヒト遺伝子座に置き、その結果その遺伝子座の位置に関するいかなる調節もヒト免疫グロブリン遺伝子座と実質的に同じとなる。たとえば全ＶＨ遺伝子座（Ｖ、ＤおよびＪ配列を含む）またはその一部を単離することおよびマウスの遺伝子座由来の配列とヒト遺伝子座を宿主遺伝子座中好ましくは少なくとも約５kbp 離して、より好ましくは少なくとも約１０kbp 離して置くことにより宿主免疫グロブリン遺伝子座の可変部とヒト免疫グロブリン遺伝子座を置換する組換え事象においてこの領域にヒトのフラグメントを挿入できる。このようにして宿主の内在性免疫グロブリンサブユニットを生産する能力を破壊できるが、ヒトの免疫グロブリン遺伝子座のプロモーターは宿主エンハンサーによって活性化されかつ宿主の調節システムで調節される。
【００２４】
相同組換えまたはランダム組込みにより宿主ゲノム中にヒト遺伝子座が導入され、かつ種々のトランスジェニックまたは変異動物を適当に育生させることにより内在性免疫グロブリン遺伝子座が不活性化した宿主動物ができれば内在性免疫グロブリンサブユニットを生産する本来の能力を欠くがヒトのレパートリーの少なくとも一部を含むヒト免疫グロブリンを生成する能力を有する宿主が得られる。  
【００２５】
宿主がヒトのIgＨおよびヒトのIgκおよび、またはλ遺伝子座を含む場合、３つの宿主Ig遺伝子座各々の２つのコピーを機能的に不活性化することは宿主または宿主／ヒトキメラ抗体を生産することなしに純粋にヒト抗体を生産し得る。特異的抗原で免疫化することによりこのような宿主株は特異的ヒト抗体を生産するマウスＢ細胞を生産するであろう。このＢ細胞はヒトモノクローナル抗体を継続的に生産させるためマウスミエローマ細胞と融合するか、またはいずれかの他の方法で不朽化する。
【００２６】
本方法および戦術は完全な免疫グロブリンの生産に限定する必要はなく、たとえばＣＨ１´、ＣＨ２´、ＣＨ３´またはＣＨ４´またはこれらの組合わせ物など不変部の一部に結合した領域を提供する機会を与える。それとは別に１つ以上のＣＨおよびＣκまたはＣλ領域のエクソンは；たとえばプラスミノーゲン活性化因子、スーパーオキサイドジスミューターゼなどの酵素；リシン、アブリン、ジフテリア毒などのトキシンＡ鎖；成長因子；ＴＮＦなどの細胞毒のような種々のたんぱく質をコードする配列と置き換わるか、または結合し得る。たとえばＷＯ  ８９／０７１４２；ＷＯ  ８９／０９３４４およびＷＯ  ８８／０３５５９参照。目的のたんぱく質を不変領域に挿入して可変部の修正不変部エクソンへのスプライシングを提供することにより、生成する結合たんぱく質は免疫グロブリンとは異なるＣ末端部分をもつことになる。挿入遺伝子に停止配列を与えることにより、このたんぱく質産物はＣ末端部分に挿入たんぱく質をもつことになる。望ましいなら、可変部を他のたんぱく質に結合するための適当なスプライス部位を含む構築物を作製することにより不変部を他のたんぱく質とそっくり置換することができる。抗体または抗体アナログを生産するトランスジェニック宿主由来のＢ細胞はマウスミエローマ細胞と融合しハイブリドーマを作るか、またはたとえばオンコジーンによるトランスフェクションなど他の簡便なプロセスにより不朽化するのに使用される。これらの不朽化細胞は連続培養するか、または腹水生産のために同様の宿主の腹腔に導入する。
【００２７】
本発明はポリクローナルヒト抗血清、またはヒトモノクローナル抗体または抗体アナログの生産を提供する。哺乳類宿主を免疫原で免疫化した場合に生成するヒト抗体はプロテインＡなどFc結合部を有するアクィニティーカラムなどを用いることにより他のたんぱく質から単離する。
【００２８】
胚幹細胞から動物を生産するためトランスホーメーション後にこの細胞をたとえばウシ胎児血清で活性化したＤＭＥＭなど適当な培地中の支持細胞層に置く。構築物を含む細胞は選択培地を用いて検出し、コロニー成長のための十分な時間の後このコロニーをピックアップし組込みまたは相同組換えの発生を分析する。先に示したように構築物の内または外にあるが標的遺伝子座にはないプライマーを用いたＰＣＲを使用できる。
【００２９】
相同組換えを示すコロニーは胚操作および胚盤胞注入に使用する。胚盤胞は排卵から３〜５日後子宮を洗い出すことにより母体から得られる。胚幹細胞をトリプシン処理した後修正した細胞を胚盤胞を含む液滴に加える。少なくとも１個最高３０個の修正・胚幹細胞を胚盤胞の胞胚腔に注入する。注入後、少なくとも１個、せいぜい約１５個の胚盤胞を擬似妊娠母体の各子宮に戻す。それからこの母体に子供を産ませ、構築物を含む変異細胞についてその子供をスクリーニングした。
【００３０】
哺乳類動物はヒト以外、特に霊長類以外のマウス、ラット、モルモットなどの実験動物、家畜、ペットなどが使用される。以下の例は説明を目的としたもので本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００３１】
［実施例１］マウス重鎖Ｊ遺伝子の不活性化
（１）不活性化ベクターの構築
マウス重鎖Ｊ遺伝子および隣接配列を含む６．４kb  ＥcoＲＩフラグメントをサカノ（Sakano）等、Nature２９０、５６２−５６５、１９８１に報告されているプローブを用いてBal b/c マウス胚ゲノムライブラリーからクローン化する。このフラグメント(mＤＪ）をＥcoＲＩ消化したｐＵＣ１９プラスミド（pmＤＪ）に挿入する。４Ｊ遺伝子を含む２．９kbフラグメントをＸhoＩ−ＳcaＩ消化によって欠失させる（pmＤＳＪＮeo、図Ｉ参照）。ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモーターおよびポリオーマエンハンサーでコントロールされるネオマイシン耐性遺伝子を含む１１５０bpＸhoＩ−ＢamＨＩフラグメントをp ＭＣ１Ｎeoから単離する（トーマス（Thomas）およびカペチ（Capecchi）、Cell、５１、５０３−５１２、１９８７）。合成アダプターをこのフラグメントに付加しＢamＨＩ末端をＳcaＩ末端に変換し、生成したフラグメントをＸhoＩ−ＳcaＩ  pmＤδＪに結合して、５´から３´方向のネオマイシンおよび重鎖プロモーターの順序が同じである不活性化ベクター（pmＤδＪ、Ｎeo）を作製する。このプラスミドをＥＳ細胞へのトランスフェクション前にＮdeＩ消化で線状化する。相同組換え事象を推進する配列は各々ネオマイシン遺伝子の５´側および３´側に存在する３kbおよび０．５kbフラグメントである。
【００３２】
基本的に報告されているマイトマイシン処理初期胚フィブロプラスト支持細胞層上で（ドーチマン（Doetschman）等、Ｊ．Embryol.Exp.Morphol.８７、２７−４５、１９８５）、ＥＳ細胞系列Ｅ１４ＴＧ２ａ（フーパー（Hooper）等、Nature、３２６、２９２−２９５、１９８７）を培養する。胚フィブロブラストは１４〜１７日前にネオマイシントランスジーンとホモ接合のオスと交配したメスのＣ５７ＢＬ／ｂ由来の胚から調製する（ゴスラー（Gossler)等、ＰＮＡＳ８３、９０６５−６０６９、１９８６）。これらの細胞はＧ４１８を含む培地で増殖し得る。エレクトロポーション条件はボグス（Boggs)等、Ex.Hematol. （ＮＹ）１４９、９８８−９９４、１９８６に報告されている。ＥＳ細胞をトリプシン処理し、４×１０７／ｍｌ濃度となるように培養培地に懸濁してから、最初の実験では１２ｎＭ濃度のＤＮＡ存在下で、また第２の実験では５ｎＭ  ＤＮＡの存在下でエレクトロポレーションする。１５０〜２５０μＦの容量で３００Ｖの電圧が５mm長および１００mm２断面積のエレクトロポレーションセルの場合至適条件であることが分った。５×１０６個のエレクトロポレーションした細胞を１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを補ったダルベコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む１００mmプレート中のマイトマイシン処理したフィブロブラスト上にプレーティングする。この培地はエレクトロポレーションから２４時間後２０μｇ／ｍｌＧ４１８を含む培地と置き換える。
【００３３】
エレクトロポレーションから１０〜１４日後に生ずるＥＳコロニーをキャピラリーピペットで吸いとりＰＣＲ分析に使用する。採取コロニーの半分を予めマイトマイシン処理支持細胞を接種した１４穴プレートに保存する。３〜４個のプールを合せた他の半分を約０．５ｍｌ  ＰＢＳを含むエッペンドルフチューブに移し、ＰＣＲによる相同組換えの分析に使用する。ＰＣＲ反応の条件は基本的にキム（Kim)およびスミシー（Smithies）、Nucleic Acids Res 、１６、８８８７−８８９３、１９８８に報告されている。ペレット化の後、ＥＳ細胞を５μｌのＰＢＳに懸濁し、各チューブに５５μｌの水を加えて溶解する。各チューブを９５℃で１０分間加熱することによりＤＮase を失活させる。５５℃で３０分間プロテインナーゼＫで処理した後、各溶解物３０μｌをＰＣＲバッファ（各プライマー１．５μｇ、３Ｕ  Ｔaqポリメラーゼ、１０％ＤＭＳＯおよび各０．２ｍＭのｄＮＴＰ）を含む２０μｌの反応混合物を含むチューブに移す。ＰＣＲ増幅は９２℃、６５秒のメルティング、６５℃１０分間のアニーリングおよび伸長の条件下サーモサイクラーを用いて５５サイクル行う。２つのプライマーオリゴヌクレオチド；TGGCGGACCGCTATCCCCCAGGAC  およびTAGCCTGGGTCCCTCCTTACを用いる。これらは各々ネオマイシン遺伝子の開始コドンの３´側６５０塩基の領域および挿入部位の３´側１１００塩基のところにあるマウス重鎖遺伝子に存在する配列に対応している。２０μｌの反応混合物をアガロースゲルで電気泳動しナイロンメンブレン（ゼータバインド）に移す。このメンブレンはＪ−Ｃ領域の３２Ｐラベルした９９１  bp×baＩフラグメントで探る。
【００３４】
［実施例２］ＥＳ細胞中のマウスIg重鎖Ｊ遺伝子の不活性化
（１）不活性化ベクターの構築
Ｂalｂ／ｃマウス胚ゲノムライブラリーからクローン化しｐＵＣ１８（ｐＪＨ）に挿入した、マウス免疫グロブリン重鎖Ｊ領域遺伝子および隣接配列を含む６．１kb  ＥcoＲＩフラグメントをＸhoＩおよびＮaeＩで消化し４個のＪ遺伝子を含む約２．３kbのフラグメントを欠失させた（図２（Ａ）参照）。ＢamＨＩ部位を平滑化し、ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモーターおよびポリオーマエンハンサーを含む約１．１kbｐ×hoＩ−ＢamＨＩフラグメントをｐＭＣ１Ｎeoから単離した（トーマス（Thomas) およびカペチ（Capecchi）、Cell、５１、５０３−５１２、１９８７）。このフラグメントをＸhoＩ−ＮaeＩ欠失化ｐＪＨに挿入し不活性化ベクターを生成した（pmＨδＪ、図２（Ｂ）参照）。これはネオマイシンおよび重鎖遺伝子の転写方向が同じである。このプラスミドをＥＳ細胞のトランスフェクション前にＮdeＩ消化で線状化した。相同組換え事象を起こす配列は各々ネオマイシン遺伝子の５´および３´側に位置する約２．８kbp および約１．１kbp フラグメントである。
【００３５】
（２）ＥＳ細胞の培養、エレクトロポレーションおよび選択
ＥＳ細胞系列Ｅ１４ＴＧ２ａ（コラー（Koller）およびスミシーズ（Smithies）１９８９、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８６、８９３２−８９３５）を報告されている方法でマイトマイシンＣ処理胚フィブロブラスト支持細胞層上で培養した（コラー（Koller）およびスミシーズ（Smithies）１９８９、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８６、８９３２−８９３５）。ＥＳ細胞をトリプシン処理し、２×１０７／ｍｌの濃度でＨＢＳバッファ（pH７．０５、１３７ｍＭ  NaCl、５ｍＭ  KCl 、２ｍＭ  CaCl２、０．７ｍＭ  Na２ＨＰＯ４、２１ｍＭＨＥＰＥＳ  pH７．１）に懸濁してから、線状化した不活性化ベクター５０μｇ／ｍｌ存在上エレクトロポレーションした。エレクトロポレーションは２４０Ｖ、５００μＦ容量条件下、バイオラッドジーンパルサーを用いて行った。５×１０６個のエレクトロポレーション細胞を１５％ウシ胎児血清および０．１ｍＭ２−メルカプトエタノールを補ったダルブコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む１００mmプレート内のマイトマイシンＣ処理フィブロブラスト上にプレーティングした。エレクトロポレーションから２４時間後培地を２００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む培地と置換した。エレクトロポレーションから１２〜１４日後生じたＧ４１８耐性ＥＳコロニーをキャピラリーピペットで吸い取りポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を用いて分析した。各採取コロニーの半分をマイトマイシンＣ処理した支持細胞を含む２４穴プレートの各ウェルに移した。４つのプールを合せたもう半分のコロニーは０．３ｍｌのＰＢＳを含むエッペンドルフチューブに移し、ジョイナー（Joyner）等（Nature、３３８、１５３−１５５、１９８９）によって報告された方法でＰＣＲ分析用に細胞溶解物を調製した。このＰＣＲ反応物には５〜２０μｌの細胞溶解物、１μＭの各プライマー、１．５ｕ  Tag ポリメラーゼおよび２００μＭ  ｄＮＴＰが含まれている。ＰＣＲ増幅は９４℃１分間のメルティング、５５℃２分間のアニーリングおよび７２℃、３分間の伸長の条件でサーマルサイクラー（パーキンエルマーシータス）を用い４５サイクル行った。２つのプライマーオリゴヌクレオチドの配列はACGGTATCGCCGCTCCCGAT  およびAGTCACTGTAAAGACTTCGGGTA であり、これらはネオマイシン遺伝子のＢamＨＩ部位の５´側約１２０塩基のところにある配列および挿入部位の３´側約１６０塩基のところに位置するマウス重鎖遺伝子に存在する配列に対応している。相同組換えが起こると約１．４kbp のフラグメントが生成する。２０μｌの反応混合物を１％アガロースゲルで電気泳動しエチジウムブロマイドで染色してからナイロンメンブレン（ジーンスクリーン）に移した。このフィルターを挿入部位の３´側マウス重鎖遺伝子中に存在する３２Ｐラベルした約１．４kbp のＥcoＲＩ−ＰstＩフラグメントで探った（図２参照）。さらに分析するため、ＥＳ細胞からゲノムＤＮＡを調製し、業者の推薦する方法に従って制限酵素で消化した後そのフラグメントを１％アガロースゲルで分離した。このＤＮＡをナイロンメンブレン（ジーンスクリーン）に移し、上述の３２Ｐラベル化フラグメントで探った。
【００３６】
（３）Ｇ４１８耐性ＥＳコロニーの分析
最初の実験ではプールしたコロニーのＰＣＲ分析で１３６個のＧ４１８は耐性コロニーを代表する３４個のプールから期待される大きさの（約１．４kbp)の１つのポジティブＰＣＲシグナルが検出された。このポジティブプールに寄与する４個のコロニーを各々ＰＣＲで分析し、ポジティブクローンＥＳ３３Ｄ５を同定した。第２の実験で得られた５４０個のＧ４１８耐性コロニーの分析でさらに４個のポジティブクローンが同定された（ＥＳ４１−１、ＥＳ６１−１、ＥＳ６５−１、ＥＳ１１０−１）。
【００３７】
目的とするＪ遺伝子の１つのコピーの破壊を確認するため（この遺伝子は常染色体性で２コピー存在する）、ＰＣＲポジティブクローンを増幅し、そのゲノムＤＮＡを調製後Ｈind IIIまたはＳcaＩで消化してＥcoＲＩ−ＰstＩプローブを用いたサザン分析で解析した。
【００３８】
相同組換えによるネオマイシン遺伝子の挿入によりＪ遺伝子の置換が起こり、欠失したＪ遺伝子領域に存在する２つのＨind III部位の消失により本来の遺伝子座にある等価なフラグメントよりも約１．９kbp 長いＥcoＲＩ−ＰstＩプローブで検出し得るＨind IIIフラグメントが生成する（図２（Ｃ）参照）。Ｈind III消化による５個のポジティブクローンのサザン分析は重鎖Ｊ遺伝子の２つのコピーが破壊されたことを示すパターンを示した。３つのラベル化したフラグメントが検出された。１つは同じ強度で未処理細胞中に存在するものと同じサイズのフラグメント（約７６０bp）で、もう１つは未処理細胞中に存在するものと同じサイズ（約２．３kbp ）であるがＰＣＲポジティブクローンの場合は強度が低いフラグメントであり、また別のフラグメントはＰＣＲポジティブクローンのみに存在し相同組換えによって期待されるサイズ（約４．２kbp)のものである。同様に相同組換えによるＪ遺伝子のネオマイシン遺伝子による置換で１つのＳacＩ部位の消失および本来の遺伝子座にある等価なフラグメントよりも約７０bp小さいＥcoＲＩ−ＰstＩプローブで検出可能なフラグメントの出現が起こる（図２（Ｃ）参照）。ＳacＩ消化によるクローンのサザン分析は１つは本来の対立遺伝子および１つは目的の対立遺伝子の予想されるパターンを示した。つまり未処理細胞に検出されるものと同じサイズであるが５個のポジティブクローンでは強度が減少している約４．０kbp のフラグメント、および同定されたクローンのみに存在し目的の相同組換えで期待されるサイズの約３．４kbp のフラグメントが出現した。ネオマイシン遺伝子に対するプローブを用いたサザンブロットの再ハイブリダイゼーションはＨind IIIおよびＳacＩ消化から生ずる各々４．２kbp および３．４kbp のフラグメントは目的の事象によって期待されるようにそのプローブにハイブリダイズすることを示す。
【００３９】
［実施例３］  マウスにおけるマウス免疫グロブリン重鎖Ｊ遺伝子の不活性化
（１）マウス胚盤胞への目的のＥＳ細胞の注入およびキメラ孫の生成
マウスはジャクソンラボラトリーズ（バーハーバー、ＭＥ）から購入した。日令３．５才のＣ５７ＢＬ／６胚盤胞はコラー（Koller）等、１９８９（上述）に報告されている方法で週令４〜５才の排卵誘発化したメスから入手した。ＥＳ細胞をトリプシン処理し、新鮮なＤＭＥＭ培地で１度洗浄した後Ｍ２培地中約１×１０６／ｍｌとなるように希釈した。約５μｌの細胞をパラフィン油の下の胚盤胞を含むＭ２培地１５０μｌの液滴に添加した。１０〜１５個の細胞を各胚盤胞の胞胚腔に注入した。６〜９個のＥＳ細胞含有胚盤胞を２．５日前に精管切除したオスと交配し擬似妊娠したＣ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ  Ｆ１の各子宮に戻した。注入した胚盤胞由来の子供は１６〜１８日後に産まれた。子供に対するＥＳ細胞の寄与は子供の色で判定した。胚盤胞は色が黒いＣ５７ＢＬ／６マウスから得た。目的の細胞系列が由来する親系列ＥＳ細胞系列Ｅ１４ＴＧ２ａは１２９／Ｄ／ａマウスから単離した。このマウスは３つのカラー遺伝子、アゴーチ遺伝子座の優性ＡＷ対立遺伝子、ｐ遺伝子座の劣性ピンク眼稀薄対立遺伝子およびＣ遺伝子座の劣性Ｃｃｈ対立遺伝子の組合せ効果でクリーム色である。動物の形成にＥＳ細胞が関与した子供は褐色とクリーム色を示している。不活性化したマウス免疫グロブリン重鎖を有するＥＳ細胞系列ＥＳ４１−１を先に述べたようにＣ５７ＢＬ／６マウス胚盤胞に注入した。１８の子供のうちの６個は高度の色のキメラ性を有していた（７０〜９０％）。不活性化ＥＳ細胞を注入した胚盤胞を移植したメス由来のキメラ新生児から単離したＤＮＡのＰＣＲ分析は変異した免疫グロブリン重鎖遺伝子座が脾臓、胸腺、腎臓、肝臓、脳および皮膚など種々の器官に存在することを示した。
【００４０】
（２）ＥＳ細胞におけるマウスＩｇカッパ鎖Ｊ遺伝子の不活性化
マウス免疫グロブリンカッパ鎖Ｊ領域遺伝子および３´隣接配列を含む５．６kbＨind III−ＢamＨＩフラグメントをＢalb ／ｃマウス胚ゲノムライブラリーからクローン化し、ｐＢlue script  ＳＫベクターに挿入してプラスミドｐＫＪを生成した。ｐＫＪをＨind IIIおよびＰstＩで消化し５Ｊ遺伝子を含む約１．７kbフラグメントを欠失させた（図３参照）。カッパＪ領域に隣接するＨind III部位の５´側領域を含む５７０bp平滑末端Ｈind IIIフラグメントをＰＣＲによりマウスゲノムＤＮＡからクローン化した。このフラグメントをＨind III−ＳmaＩ消化したｐＩｃクローニングベクターに挿入し（マーシュ（Marsh)等、１９８４、Gene、３２、４８１−４８５）、ＫpnＩ−ＸhoＩで切断した。ＢamＨＩ部位を平滑化したヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモーターおよびポリオーマエンハンサーで発現されるネオマイシン耐性遺伝子を含む約１．１kb  ＸhoＩ−ＢamＨＩフラグメントをｐＭＣ１Ｎeoから単離した（トーマス（Thomas) およびカペチ（Capecchi）、１９８７、上述）。ネオマイシンフラグメントをＨind III−ＰstＩ欠失化ｐＫＪに挿入し、カッパ配列の５´側にあるＰstＩ部位を平滑化した。このプラスミドをＫpnＩおよびＸhoＩで消化し、その５７０bpＫpnＩ−ＸhoＩカッパフラグメントをＫpnＩ−ＸhoＩ切断したベクターのネオマイシン遺伝子の５´側に挿入して不活性化ベクター（pmＫδＪ、図３参照）を生成した。pmＫδＪにおいてネオマイシンおよびカッパ鎖遺伝子の転写方向は同じである。ＥＳ細胞へのトランスフェクション前にこのプラスミドをＡpaＬＩで線状化した。この線状化配列は各々ネオマイシン遺伝子の３´および５´側に存在する細胞性配列と相同的な約３．８kbおよび５７０bpの配列を有している。
【００４１】
（３）Ｇ４１８耐性ＥＳコロニーの分析
カッパ不活性化ベクターのＥＳ細胞へのエレクトロポレーションおよび相同組換えに関するスクリーニングは免疫グロブリン重鎖の不活性化について述べた方法で行った。Ｇ４１８耐性ＥＳコロニーを２つのプライミングオリゴヌクレオチド：CGGTTGCTGTTGTATCCATAACTCおよびCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGを用いたＰＣＲにより相同組換えについて分析した。これらのオリゴヌクレオチドは挿入部位の５´側約６７bpのところにあるマウスカッパ鎖遺伝子に存在する配列およびネオマイシン遺伝子のＸhoＩ部位の３´側３７０bpのところにある配列に対応している。挿入部位の５´側約１０bpの位置から始まる３２Ｐラベル化した８０塩基のオリゴヌクレオチドをプローブとして用い目的とするＰＣＲ産物を検出した。相同組換えにより約１０３０bpフラグメントが生ずる。６５０個のＧ４１８耐性コロニーのＰＣＲ分析で３個のポジティブコロニー（ＥＳ５６−１、ＥＳ６９−４、ＥＳ１４７−１）が検出された。これらのコロニーのサザン分析でＪ領域の欠失に継がるカッパ免疫グロブリン遺伝子座への不活性ベクターの組込みが確認された。
【００４２】
［実施例４］トランスジェニックマウスにおけるヒトＩｇの生産
（１）例：トランスジェニックマウスＤＮＡベクターにおけるヒト重鎖の生産
ヒト重鎖ＶＨ６−Ｄ−Ｊ−Ｃμ−Ｃδ領域を含むＳpeＩ断片（バーマン（Berman）等、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８８）７、７２７−７３８、図４参照）をバーマン（Berman）等（ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８８）７、７２７−７３８）によって報告されているＤＮＡプローブを用いイーストの人工染色体（ＹＡＣ）ベクター（バルケ（Burke)等、Science 、２３６、８０６−８１２）にクローン化したヒトライブラリーから単離した。約１００kbと見積られる１つのクローンが得られた。この単離したＹＡＣクローンはヒト重鎖用の放射性ラベルしたプローブ（バーマン（Berman）等、上述）を用いたパルスフィールドゲル電気泳動（バルケ（Burke)等、上述、ブラウンスタイン（Brownstein) 等、Science 、２４４、１３４８−１３５１）で確認した。
【００４３】
（２）胚へのＹＡＣクローンの導入
目的のＹＡＣを含むイースト細胞からアガロース片に含まれる高分子量ＤＮＡを調製した（すなわちIgＨ遺伝子座由来の先に示したＳpeＩフラグメントを含むＹＡＣ）。このＤＮＡをＣＨＥＦゲル装置でサイズ分別し、低融点アガロースゲルからＹＡＣバンドを切り出した。このゲルフラグメントをポリアミンで平衡化し、融解後アガラーゼで処理してアガロースを消化した。このポリアミンコートしたＤＮＡを受精したマウスの胚のオスの前核に注入し、これを外科的に上述の擬似妊娠したメスの子宮に導入した。この新生児のトランスジェニック性を尾から単離したＤＮＡのスロット・ブロットによって分析し、またヒト重鎖の生産を少量の血清を採取し、ウサギの抗ヒト抗体を用いてIg鎖の存在を検定した。
【００４４】
マイクロインジェクションの代替法として、ＹＡＣ  ＤＮＡはＥＳ細胞：イーストプロトプラスト融合によりマウスのＥＳ細胞中に導入する（トレーバー（Traver）等、１９８９  Proc．Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ，８６、５８９８−５９０２、パクニス(Pachnis）等、１９９０、ibid  ８７、５１０９−５１１３）。まずｐＭＣ１Ｎeo由来のネオマイシン耐性遺伝子およびイースト選択可能マーカーをプラスミド中の本質的でないＹＡＣベクター配列に挿入する。この構築物を用いてＪｇＨ  ＹＡＣを含むイースト株をトランスホームし、また、ｐＭＣ１Ｎeoは相同組換えによってIgＨ  ＹＡＣのベクター配列に組込む。この修正ＹＡＣをプロトプラスト融合によってＥＳ細胞に移す（トレーバー(Traver)等、１９８９、パクニス(Pachnis）等、１９９０）。本来のヒトIgＨ配列を含むＧ４１８耐性ＥＳ細胞を用いてキメラマウスを作る。
【００４５】
［実施例５］キメラマウスによるヒトＩｇの生産
（１）ヒト重鎖置換ベクターの構築
ヒトの置換配列には先に述べたヒトーＹＡＣライブラリーから単離したヒトＶＨ６−Ｄ−Ｊ−Ｃμ−Ｃδ重鎖領域を含むゲノムＤＮＡのＳpeＩ１００kbp フラグメントが含まれる。相同組換え置換を起こす隣接するマウス重鎖配列としては、マウスＣε−Ｃα重鎖の１０kbp ＢamＨＩフラグメントおよびマウス重鎖可変部のＪ５５８フラグメントの５´側半分を含む５´Ｊ５５８がヒト配列のそれぞれ３´側と５´側に含まれる（図４）。これらのマウス配列は各々タカー（Tucker)等、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、７８、７６８４−７６８８、１９８１およびブランケンスタイン(Blankenstein)およびクラウィンケル(Krawinckel)（１９８７、上述）に報告されているプローブを用いてマウス胚ゲノムライブラリーから単離する。ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモーターおよびポリオーマエンハンサーで発現されるネオマイシン耐性遺伝子を含む１１５０bpＸhoＩ−ＢamＨＩフラグメントはｐＭＣ１Ｎeoから単離する（コラー(Koller)およびスミシーズ(Smithies)、１９８９、上述）。合成アダプターをこのフラグメントに付加してＸhoＩ末端をＢamＨＩ末端に変換し、これをプラスミド中のＢamＨＩマウスＣε−Ｃαに連結する。
【００４６】
ヒト重鎖遺伝子座を含むＹＡＣクローンから挿入物の各末端のＤＮＡ配列をインバースＰＣＲ（シルバーマン(Silverman) 等、ＰＮＡＳ、８６、７４８５−７４８９、１９８９）または大腸菌におけるプラスミドレスキュー（バルケ(Burke）等、１９８７、ガルザ（Garza)等、Science 、２４６、６４１−６４６、１９８９；トレーバー(Traver)等１９８９）により回収する（図４参照）。ＹＡＣの５´Ｖ６末端由来の単離したヒト配列をプラスミド中のマウスＪ５５８配列に連結し、同様に、ＹＡＣの３´Ｃδ末端由来のヒト配列を上述のＮeoおよびマウスＣε−Ｃαを含むプラスミド中のＮeo遺伝子に連結する。次に、ヒトＶ６−マウスＪ５５８セグメントを本来のIgＨ  ＹＡＣ中には存在しないイースト選択可能マーカー（ＨＩＳ３）、セントロメア（ＣＥＮ）および単一のテロメア（ＴＥＬ）を含むハーフＹＡＣクローニングベクターにサブクローン化する。同様にヒトＣδ−Ｎeo−マウスＣε−Ｃαを別のイースト選択可能マーカー（ＬＥＵ２）および単一のＴＥＬを含む別のハーフＹＡＣベクターにサブクローニングする。ヒトＶ６ＤＮＡを含むハーフＹＡＣベクターを線状化し、これを用いて染色体ＨＩＳ３およびＬＥＵ３遺伝子座を欠失し、かつIgＨ  ＹＡＣを有するイースト株をトランスホームする。ヒスチジン栄養要求性による選択でヒトＶ６ＤＮＡ配列間で相同組換えを起こし組換えＹＡＣを含むイーストコロニーを検出する。それからヒトＣδＤＮＡを含むハーフＹＡＣベクターを線状化し、これを用いて前のステップで生成したイースト株をトランスホームする。ロイシン栄養要求性による選択で完全なIgＨ置換ＹＡＣを含むイースト株を得る（図４）。このＹＡＣを単離し、胚について先に示したマイクロインジェクション法でＥＳ細胞に導入する。
【００４７】
上述の操作に従い、免疫化によりある抗原に特異的なヒト抗体またはそのアナログを生成し得る抗原的またはキメラ的非霊長類、特にマウス宿主を作る。この方法ではヒト宿主に使用できない免疫原でマウスを免疫化できるので、ヒトモノクローナル抗体を得るときに発生する問題が避けられる。さらに、ヒト宿主では許容されない二次免疫注射やアジュバントを使用し得る。
【００４８】
このＢ細胞を目的の抗体を連続的に生産するために不朽化する。不朽化した細胞は免疫グロブリンまたはそのアナログをコードし、かつインビトロ突然変異誘発や他の変異技術を用いて変異させ、その抗体の性質を改変するのに用いる遺伝子の単離に使用することができる。これらの変異遺伝子は相同組換えをするために不朽化細胞に戻し、哺乳類細胞の連続的な望ましい抗体原を提供するのに使用される。本発明はヒトの抗体がヒト宿主における抗体生産と同様の方法で生産される場合簡便なヒト抗体原を提供する。マウス細胞はヒト抗体の生産に関するマウス細胞中でのヒトＤＮＡの活性化および転位を簡便に提供する。
【００４９】
本明細書で引用する全ての刊行物および特許出願は各刊行物または特許出願が特定して、かつ個々に参考として引用されていることが示されているのと同様に参考として引用されている。
【００５０】
これまで示してきた発明は明確に理解されるように図および例を用いて詳細に説明されているが、本発明の精神または範囲を逸脱することなしに特定の変化や修正を行い得ることは当業者にとって明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】マウス重鎖Ｊ遺伝子及び不活性化ベクターの各制限酵素地図を示す図である。
【図２】マウス重鎖Ｊ遺伝子、不活性化ベクター、野生型ＥＳ細胞ゲノム及び目的のＥＳ細胞ゲノムの各制限酵素地図を示す図である。
【図３】マウスカッパ鎖遺伝子並びにカッパ鎖不活性化ベクターの各制限酵素地図を示す図である。
【図４】ヒト重鎖遺伝子座、マウス重鎖遺伝子座及びヒト重鎖置換ＹＡＣベクターの各制限酵素地図を示す図である。
【図１】
2006204301.tif 000002
【図２】
2006204301.tif 000003
【図３】
2006204301.tif 000004
【図４】
2006204301.tif 000005
【配列表】
2006204301000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月15日(2006.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活性化された内在性免疫グロブリン遺伝子座を有する細胞の製造方法であって、内在性免疫グロブリン遺伝子座の一部と相同性を有するＤＮＡ配列と該内在性免疫グロブリン遺伝子座との相同組換えにより該内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部に障害を導入することを特徴とする製造方法。
【請求項２】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
該細胞が、マウス由来の細胞であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
不活性化された内在性免疫グロブリン遺伝子座を有する細胞の製造方法であって、内在性免疫グロブリン遺伝子座の一部と相同性を有するＤＮＡ配列と該内在性免疫グロブリン遺伝子座との相同組換えにより該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部に障害を導入することを特徴とする製造方法。
【請求項７】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
該障害が、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多様性（Ｄ）領域の少なくとも一部における障害であることを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項６乃至請求項８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
該細胞が、マウス由来の細胞であることを特徴とする請求項６乃至請求項１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列がゲノム中に導入されている非霊長類哺乳動物細胞の製造方法であって、該ＤＮＡ配列が、該ＤＮＡ配列及び非霊長類哺乳動物細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子を含むイースト人工染色体（ＹＡＣ）ベクターを用いることにより導入されることを特徴とする製造方法。
【請求項１３】
該ＤＮＡ配列が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、少なくとも１つの連結領域（Ｊ）遺伝子セグメント及び少なくとも１つの不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
該ＤＮＡ配列が、さらにヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
該ヒト免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項１２乃至請求項１４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１６】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１７】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１８】
該少なくとも１つの不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが、Ｃμ不変領域遺伝子セグメントであることを特徴とする請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
非霊長類哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座を不活性化するためのベクターであって、該ベクターは、該哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座の一部と相同性を有するＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列と該哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座との相同組換えにより該内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部に障害を導入することにより、不活性化するものであることを特徴とするベクター。
【請求項２０】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項１９または請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項１９乃至請求項２２のいずれかに記載のベクター。
【請求項２４】
非霊長類哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部に障害を有することにより、該内在性免疫グロブリン遺伝子座が不活性化されていることを特徴とする非霊長類哺乳動物細胞。
【請求項２５】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部との置換であることを特徴とする請求項２４または請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項２４乃至請求項２７のいずれかに記載の細胞。
【請求項２９】
霊長類哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座を不活性化するためのベクターであって、該ベクターは、該哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座の一部と相同性を有するＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列と該哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座との相同組換えにより該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部に障害を導入することにより、不活性化するものであることを特徴とするベクター。
【請求項３０】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】
該障害が、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多様性（Ｄ）領域の少なくとも一部における障害であることを特徴とする請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項２９乃至請求項３１のいずれかに記載のベクター。
【請求項３３】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項２９乃至請求項３３のいずれかに記載のベクター。
【請求項３５】
非霊長類哺乳動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部に障害を有することにより、該内在性免疫グロブリン遺伝子座が不活性化されていることを特徴とする非霊長類哺乳動物細胞。
【請求項３６】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
該障害が、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多様性（Ｄ）領域の少なくとも一部における障害であることを特徴とする請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部との置換であることを特徴とする請求項３５乃至請求項３７のいずれかに記載の細胞。
【請求項３９】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項３８に記載の細胞。
【請求項４０】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項３５乃至請求項３９のいずれかに記載の細胞。
【請求項４１】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列及び非霊長類哺乳動物細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子を含むことを特徴するイースト人工染色体（ＹＡＣ）ベクター。
【請求項４２】
該ＤＮＡ配列が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、少なくとも１つの連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び少なくとも１つの不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、及び該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項４１に記載のベクター。
【請求項４３】
該ＤＮＡ配列が、さらにヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメント、及び該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項４２に記載のベクター。
【請求項４４】
該ヒト免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項４１乃至請求項４３のいずれかに記載のベクター。
【請求項４５】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項４２に記載のベクター。
【請求項４６】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項４３に記載のベクター。
【請求項４７】
該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが、Ｃμ不変領域遺伝子セグメントを含むことを特徴とする請求項４６に記載のベクター。
【請求項４８】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列がゲノム中に導入されている非霊長類哺乳動物細胞であって、該ＤＮＡ配列が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、少なくとも１つの連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び少なくとも１つの不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする非霊長類哺乳動物細胞。
【請求項４９】
該ＤＮＡ配列が、さらにヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項４８に記載の細胞。
【請求項５０】
該ヒト免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項４８または請求項４９に記載の細胞。
【請求項５１】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項４８に記載の細胞。
【請求項５２】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項４９に記載の細胞。
【請求項５３】
該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが、Ｃμ不変領域遺伝子セグメントを含むことを特徴とする請求項５２に記載の細胞。
【請求項５４】
内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つのコピー中の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部に障害を有するトランスジェニック非霊長類哺乳動物であって、該障害の結果、該遺伝子座のコピーが不活性化されていることを特徴とするトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項５５】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が、免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項５４に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項５６】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の不変（Ｃ）領域の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項５４または請求項５５に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項５７】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項５６に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項５８】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項５４乃至請求項５７のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項５９】
該トランスジェニック非霊長類哺乳動物が、さらに外来性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求項５４乃至請求項５７のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項６０】
該外来性免疫グロブリン遺伝子座が、外来性免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項５９記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項６１】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項５９または請求項６０に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項６２】
該外来性免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座であることを特徴とする請求項５９乃至請求項６１のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項６３】
該外来性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、少なくとも１つの連結領域（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び少なくとも１つの不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項５９に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項６４】
該ＤＮＡ配列が、さらにヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、該多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項６３に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項６５】
該ヒト免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項６３または請求項６４に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項６６】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項６３に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項６７】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項６４に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項６８】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列及び非霊長類哺乳動物細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子を含むことを特徴とするイースト人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ。
【請求項６９】
該ＤＮＡ配列が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、少なくとも１つの連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び少なくとも１つの不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項６８に記載のＤＮＡ。
【請求項７０】
該ＤＮＡ配列が、さらにヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項６９に記載のＤＮＡ。
【請求項７１】
該ヒト免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項６８乃至請求項７０のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項７２】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項６９に記載のＤＮＡ。
【請求項７３】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項７０に記載のＤＮＡ。
【請求項７４】
該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが、Ｃμ不変領域遺伝子セグメントであることを特徴とする請求項７３に記載のＤＮＡ。
【請求項７５】
内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つのコピーに障害を有するトランスジェニック非霊長類哺乳動物であって、該障害の結果、該遺伝子座のコピーが不活性化されていることを特徴とするトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項７６】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が、免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項７５に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項７７】
該障害が、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多様性（Ｄ）領域における障害であることを特徴とする請求項７６に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項７８】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項７５乃至請求項７７のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項７９】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項７８に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項８０】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項７５乃至請求項７９のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項８１】
該トランスジェニック非霊長類哺乳動物が、さらに外来性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求項７５乃至請求項７９のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項８２】
該外来性免疫グロブリン遺伝子座が、外来性免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項８１に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項８３】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項８１または請求項８２に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項８４】
該外来性免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座であることを特徴とする請求項８１乃至請求項８３のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項８５】
該ＤＮＡ配列が、該外来性免疫グロブリンの不変（Ｃ）領域以外のペプチドにペプチド結合で結合した可変部（Ｖ）を提供するＤＮＡ配列を含むものであることを特徴とする請求項８１乃至請求項８４のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項８６】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列がゲノム中に導入されているトランスジェニック非霊長類哺乳動物であって、該ＤＮＡ配列が、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、少なくとも１つの連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び少なくとも１つの不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とするトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項８７】
該ＤＮＡ配列が、さらにヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメントを含み、該可変部（Ｖ）遺伝子セグメント、多様性（Ｄ）領域遺伝子セグメント、該連結（Ｊ）領域遺伝子セグメント及び該不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが機能的ポリペプチドをコードするように再配列されることができるものであることを特徴とする請求項８６に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項８８】
該ヒト免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項８６または請求項８７に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項８９】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項８６に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項９０】
該ＤＮＡ配列が、Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃの順序であることを特徴とする請求項８７に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項９１】
該少なくとも１つの不変（Ｃ）領域遺伝子セグメントが、Ｃμ不変領域遺伝子セグメントであることを特徴とする請求項９０に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項９２】
該トランスジェニック非霊長類哺乳動物が、さらに内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つのコピーに障害を有し、該障害の結果、該遺伝子座のコピーが不活性化されていることを特徴とする請求項８６乃至請求項９１のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項９３】
該内在性免疫グロブリン遺伝子座が、免疫グロブリン重鎖遺伝子座であることを特徴とする請求項９２に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項９４】
該障害が、該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多様性（Ｄ）領域の少なくとも一部における障害であることを特徴とする請求項９３に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項９５】
該障害が、マーカー遺伝子と該内在性免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部との置換によるものであることを特徴とする請求項９２乃至請求項９４のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項９６】
該マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項９５に記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項９７】
該非霊長類哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項８６乃至請求項９６のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物。
【請求項９８】
特定の抗原に免疫反応性を有する異種タンパクの製造方法であって、下記のいずれかの工程を少なくとも含むことを特徴とする製造方法。
１）特定の抗原に対する免疫応答を刺激する条件下で請求項８１乃至請求項９７のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物を該抗原で免疫し、該トランスジェニック非霊長類哺乳動物の血中から該抗原に免疫反応性を有する異種タンパクを回収する。
２）(i)特定の抗原に対する免疫応答を刺激する条件下で請求項８１乃至請求項９７のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物を該抗原で免疫し、
(ii)該トランスジェニック非霊長類哺乳動物からＢ細胞を回収し、
(iii)該Ｂ細胞を不朽化し、
(iv)異種タンパクを産生する不朽化Ｂ細胞を取得し、
(v)該不朽化Ｂ細胞の培養物から該異種タンパクを回収する。
【請求項９９】
該異種タンパクが、ヒトタンパクであることを特徴とする請求項９８に記載の製造方法。
【請求項１００】
該ヒトタンパクが、ヒト抗体またはヒト抗体サブユニットであることを特徴とする請求項９９に記載の製造方法。
【請求項１０１】
請求項８１乃至請求項９７のいずれかに記載のトランスジェニック非霊長類哺乳動物のＢ細胞に由来する不朽化Ｂ細胞であって、該不朽化Ｂ細胞が特定の抗原に免疫反応性を有する異種タンパクを産生するものであることを特徴とする不朽化Ｂ細胞。
【請求項１０２】
該異種タンパクが、ヒトタンパクであることを特徴とする請求項１０１に記載の不朽化Ｂ細胞。
【請求項１０３】
該ヒトタンパクが、ヒト抗体またはヒト抗体サブユニットであることを特徴とする請求項１０２に記載の不朽化Ｂ細胞。