(57)【要約】【課題】  被検試料の種別を問わず、慎重な取り扱いを有する試薬を使わずに短時間で処理を行うことができ、且つ、その後の分析に影響を与え難い核酸抽出方法を提供する。【解決手段】  グリココール酸を披検試料に接触させる工程を有する核酸抽出方法。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリココール酸を披検試料に接触させる工程を有する核酸抽出方法。
【請求項２】
前記グリココール酸の濃度が１〜１０ｍＭである請求項１記載の核酸抽出方法。
【請求項３】
タンパク質分解酵素を前記被検試料に接触させる工程を有する請求項１又は２記載の核酸抽出方法。
【請求項４】
前記被検試料が、動物由来の試料である請求項１〜３の何れか１項記載の核酸抽出方法。
【請求項５】
前記被検試料が、微生物を含む試料である請求項１〜３の何れか１項記載の核酸抽出方法。
【請求項６】
前記微生物がクリプトスポリジウムである請求項５記載の核酸抽出方法。
【請求項７】
グリココール酸を含む核酸抽出キット。
【請求項８】
使用時において終濃度が１〜１０ｍＭとなるようにグリココール酸を含む請求項７記載の核酸抽出キット。
【請求項９】
タンパク質分解酵素を含む請求項７又は８記載の核酸抽出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の核酸抽出方法においては、細胞壁や細胞膜を破壊した後にこれらを取り除き、タンパク質を変性させ、核酸を分離する等の多くの工程を必要としていた。この際使用される試薬には、強アルカリ性の水酸化ナトリウム溶液や腐食性の高いフェノール液等の慎重な取り扱いを要するものが含まれていた。
そこで、かかる問題を解決すべく、微生物菌体とファージの混合物からDNAを精製する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。具体的には、本法は、フェノールとエタノールとを用いたDNA濃縮工程に代えて、限外濾過膜に試料を通過させる工程を設けることによって、不純物を除去しDNAを濃縮するものである。
【特許文献１】特開平５−２３６９６３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、上述した従来のDNA抽出方法によれば、フェノール液の使用を回避することはできても、強アルカリ性の水酸化ナトリウム溶液は精製に必要であった。このように、慎重な取り扱いを要する試薬の種類を減らすことはできても、すべての試薬を取り扱いが容易なもので代替するのは困難であるという問題点があった。更には、微生物菌体、具体的には大腸菌、とファージとの混合物からDNAを精製するのは、夾雑物が少なく、細胞壁等の障害が少ないので、比較的容易であるが、他の試料に応用する場合には、その生物特有の構造物や試料に含まれる夾雑物が障害となって、広く生物の種別を問わず効率的に核酸を抽出する方法を提供することは困難であった。
【０００４】
更には、従来の抽出方法を用いて抽出した核酸試料に残存する試薬が、後の分析を阻害することがあり、更なる精製工程を必要としたり、分析精度が落ちたりするという問題点があった。特に、現在、バイオテクノロジーの分野では生物の遺伝子検査について細胞から遺伝子DNAを効率よく無傷で抽出する方法が必須であると認識されている。又、研究の迅速化のため、遺伝子抽出等の操作の自動化が図られているが、工程が増えると、遠心分離、吸引ろ過などの精製にかけるステップが煩雑なものなり、自動遺伝子検査機器の省力化、小型化の障害となっていた。
【０００５】
従って、本発明の目的は、上記問題点に鑑み、被検試料の種別を問わず、慎重な取り扱いを有する試薬を使わずに短時間で処理を行うことができ、且つ、その後の分析に影響を与え難い核酸抽出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この目的を達成するための本発明の核酸抽出方法の特徴手段は、請求項１に記載してあるように、グリココール酸を披検試料に接触させる工程を有する点にある。
【０００７】
上記特徴手段において、請求項２に記載されているように、前記グリココール酸の濃度が１〜１０ｍＭであることが好ましく、
請求項３に記載されているように、タンパク質分解酵素を前記被検試料に接触させる工程を有することが好ましく、
請求項４に記載されているように、前記被検試料が、動物由来の試料であることが好ましく、
請求項５に記載されているように、前記被検試料が、微生物細胞を含む試料であることが好ましく、
請求項６に記載されているように、前記微生物がクリプトスポリジウムであることが好ましい。
【０００８】
又、この目的を達成するための本発明の核酸抽出キットの特徴構成は、請求項７に記載してあるように、グリココール酸を含む点にある。
【０００９】
上記特徴構成において、請求項８に記載されているように、使用時において終濃度が１〜１０ｍＭとなるようにグリココール酸を含むことが好ましく、
請求項９に記載されているように、タンパク質分解酵素を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る核酸抽出方法は、哺乳類が持つ消化液の一つである胆汁酸に着目したものである。胆汁酸の主成分はタウロコール酸、デオキシコール酸、グリココール酸などコール酸類である。コール酸類は界面活性剤としての性質も持っており、とくにデオキシコール酸は膜タンパク質の抽出のための細胞膜破壊試薬として用いられていることもある。ところが、これまで知られているタウロコール酸やデオキシコール酸は、PCRなどの酵素反応を強く阻害するため、細胞破壊反応後に、取り除く必要がある。発明者らは、これに対して同じコール酸類であっても、グリココール酸は遺伝子増幅反応をほとんど阻害しないことを見出した。
【００１１】
グリココール酸の細胞破壊の分子化学的なメカニズムは、次のように推測される。細胞膜はリン脂質とたんぱく質から構成されており、グリココール酸がこの細胞膜のリン脂質の脂質二重層の中に入り込んで膜を壊れやすくする。このメカニズムは  動物、植物、微生物の別を問わず、すべての生物に共通であろう。従って、本法は、幅広い生物由来の被検試料に対してその効果を発揮すると考えられる。
更には、グリココール酸は、フェノール液や強アルカリ溶液等と比べて取り扱いが容易である。同時に、DNA抽出後の酵素反応を妨げないので、該反応に供する試料は精製工程を必要としない。これにより、核酸の抽出処理を短時間で行うことができ、自動遺伝子検査機器の省力化、小型化が実現される。
【００１２】
これらのことから、請求項１に記載してあるように、グリココール酸を披検試料に接触させる工程を有する核酸抽出方法は、慎重な取り扱いを有する試薬を使わずに短時間で処理を行うことができDNA抽出反応の自動化、省力化に大きく役立つものと考えられる。
尚、本願において、「核酸」とは、DNA、RNA、及びこれらの誘導体を含む概念として用いられる。
【００１３】
更に、請求項２に記載されているように、披検試料に接触させる際の前記グリココール酸の濃度が１〜１０ｍＭであると、確実に、抽出後の酵素反応を阻害せずに、核酸の抽出を行うことができ、最も効率がよい。
【００１４】
請求項３に記載されているように、タンパク質分解酵素を前記被検試料に接触させる工程を有すると、試料に混在するタンパク質を分解するので、膜の分子構造が完全に破壊され、更に確実に細胞を破壊できる。更に、タンパク質分解酵素を作用させる際に加温することが多く、タンパク質の分解と同時に熱による揺らぎで細胞膜の破壊が進むものと考えられる。
【００１５】
請求項４に記載されているように、動物由来の試料を被検試料とすることができるので、例えば、病気の診断等の医療分野での利用が可能であり、迅速、高精度の診断方法を提供することができる。
【００１６】
微生物細胞を含む試料は、その生物に特有の堅牢な構造物や、幾重にも重なる膜構造等が障害となって迅速且つ効率のよい核酸抽出が難しい場合があるが、請求項５に記載されているように、これら微生物に場合であっても本法は適用可能である。よって、本法を採用することによって、病気の診断等の医療分野や、環境汚染等の検査においても、迅速且つ高精度化を達成することができる。
【００１７】
請求項６に記載されているように、前記被検試料に含まれる微生物がクリプトスポリジウムであると、水道水の安全性検査等に利用できるので、疫学的見地から非常に有用である。前記クリプトスポリジウム(Cryptosporidium)は、胞子虫類のコクシジウム（Coccidium)目に属する、ヒト、ウシやブタ等の家畜、イヌ、ネズミ等の哺乳動物の消化管に寄生する寄生性原虫であり、本原虫にヒトが感染すると、腹痛を伴う水様性もしくは粘液性便を主徴とする症状が３日〜１週間程度持続し、時として、嘔吐や発熱を伴うこともある。本原虫に感染した患者、感染動物から糞便とともに排出される莫大な数のオーシストは、新たな個体への感染源となるため、クリプトスポリジウムの伝播経路は多岐にわたる。水中に存在するクリプトスポリジウムのオーシストは、塩素抵抗性を示し、浄水処理における塩素消毒は無効であるため、通常の浄水処理で完全に除去することは困難であり、水道水を介した大規模集団感染が生じることがある。
クリプトスポリジウムの種類や量を判定するために種々の方法が提案されており、オーシストから核酸を抽出しPCRによって同定、定量する方法もあった。この方法では、凍結融解、超音波処理などを繰り返すことでオーシストからスポロゾイトを脱嚢させた後、プロテアーゼでスポロゾイトを溶解させることにより、もしくは、フェノール抽出/エタノール沈殿等の公知のDNA精製処理により、行うのが一般的あった。そのため、各種処理が煩雑で時間がかかり、且つ、DNA精製処理過程においては、必ず、DNAの損失を生じるがため、検出感度の低下を招くという問題点もあった。
【００１８】
ところが、本法による脱嚢過程を顕微鏡で観察すると、グリココール酸をクリプトスポリジウムのオーシストに接触させることによって、オーシストの破壊だけでなく、そこから出てきたスポロゾイトも破壊していることが確認された。従って、本法において、前記被検試料がクリプトスポリジウムであると、検査において、その操作が簡便になり迅速な分析が可能となると共に、検出精度が向上するという顕著な効果を奏するものである。
【００１９】
上記核酸抽出方法を実施するに当たって、請求項７に記載してあるように、グリココール酸を含む核酸抽出キットを用いると、慎重な取り扱いを有する試薬を使わずに短時間で処理を行うことができDNA抽出反応の自動化、省力化に大きく役立つことができる。
【００２０】
更に、請求項８に記載されているように、前記核酸抽出キットにおいて、使用時において終濃度が１〜１０ｍＭとなるようにグリココール酸を含むことで、確実に、抽出後の酵素反応を阻害せずに、核酸の抽出を行うことができる。
【００２１】
更に、請求項９に記載されているように、前記核酸抽出キットがタンパク質分解酵素を含むと、試料に混在するタンパク質を分解するので、更に確実に細胞を破壊できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に本発明の実施の形態を説明する。
本発明に係る核酸抽出方法は、グリココール酸を披検試料に接触させる工程を有するものであり、好ましくは、濃度が１〜１０ｍＭとなる状態で、前記被検試料に前記グリココール酸を接触させる。被検試料の細胞膜が充分に破壊されるまで、この工程は続けられ、PCR試料の調製等の少量の試料の調製にあたっては、例えば、５〜６０分程度の接触時間があれば足りる。
【００２３】
被検試料の細胞膜の破壊を確実なものとするため、更に、タンパク質分解酵素を前記被検試料に接触させる工程を設けることができる。この工程は、グリココール酸を披検試料に接触させる工程と同時に行うこともできる。タンパク質分解酵素としては、例えば、プロテイナーゼＫが好適であり、例えば、これを50〜1200mAU/ml添加する。
【００２４】
本法は、動物（ヒトを含む）、植物、微生物（原虫、原生動物等も含む）の別を問わず、すべての生物において適用可能である。具体的には、血球細胞を含む血液、何らかの動物細胞を含む生検サンプル等の動物由来の被検試料から核酸を抽出すれば、医療分野における検査等に利用できるであろう。植物由来の被検試料から核酸を抽出すれば、品種、銘柄の特定等に利用できるであろう。微生物を含む被検試料は、微生物による環境汚染を検査するために利用可能であり、或いは、バイオレメディエーションの分野において、浄化対象である土壌中の汚染物質資化菌の存在を確認する等のために利用可能であろう。尚、これらの用途は、例示であって、前掲のものに限定されるものではない。
【００２５】
ここで、植物細胞や酵母などのカビの仲間、グラム陽性菌など細胞壁を有する生物から核酸を抽出する場合、被検試料とグリココール酸と接触させる前に、細胞壁を分解する前処理工程を設けることが好ましい。細胞壁は生物種によってその組成が異なるので、それぞれの組成に応じた細胞壁分解酵素(例えば、セルラーゼ、ザイモリアーゼ、リゾチウム等)を被検試料に接触させ、細胞壁を溶解させる。但し、これらの生物に対して細胞壁分解酵素を作用させなくとも、本法を適用することはできる。
【００２６】
本発明に係る核酸抽出方法を実施するにあたって、それぞれの工程を機械装置に実行させ、自動化することも可能であろう。このような場合、又は、人が操作を行う場合にあってはその人の便宜のため、グリココール酸を含む試薬を核酸抽出キットとして供給することができる。このキットにおいて、使用時における終濃度が１〜１０ｍＭとなるようにグリココール酸を配合することが好ましい。更には、この核酸抽出キットに、細胞壁分解酵素及び／又はタンパク質分解酵素を含ませることもできる。例えば、それらは、工程ごとに必要とされる緩衝液等の試薬と共に溶解し密封した液状物（溶液）の原液又は濃縮液として供給することができる。
【００２７】
本発明にかかる核酸抽出方法を用いた解析例として、以下に、クリプトスポリジウムの種識別的検出方法を説明する。この方法は、被検試料から核酸試料を調製するために、本発明に係る核酸抽出方法を用いる工程と、調製された核酸試料を、クリプトスポリジウム属に属する種の種間における一塩基変異を特定することにより設計されたプローブとハイブリダイズさせる工程と、前記DNAと前記各プローブとの間に生じるハイブリダイゼーションを標識を指標として検出する工程と、その検出結果を解析する工程を有する。更に、被検試料から核酸試料を調製する工程において、グリココール酸処理を行った後、プロテアーゼ処理を行うことにより、核酸抽出効率の向上と抽出に要する時間の短縮化を図り、更なる検出感度の向上と迅速な検出を達成するものである。ここで、種識別的検出とは、クリプトスポリジウムを検出すると同時に、クリプトスポリジウムの種をも識別することを意味し、種の識別とは、クリプトスポリジウム属に属する他の種と実質的に区別して、ある種に属する群であること同定することを意味するものとする。
【００２８】
ここで、検出の対象となるクリプトスポリジウムとは、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）属に属する微生物を指し、クリプトスポリジウムには具体的には、Cryptosporidium parvum種（以下、C. parvum と略する。）、Cryptosporidium muris種（以下、C. murisと略する。）、Cryptosporidium baileyi種（以下、C. baileyiと略する。）、  Cryptosporidium serpentis種（以下、C. serpentisと略する。）、Cryptosporidium meleagridis種（以下、C. meleagridisと略する。）、Cryptosporidium felis種（以下C. ferisと略する。）等が含まれ、本発明の方法は、これらの種を種識別的に検出するために核酸を調製する際に用いられる。
【００２９】
ここで使われる被検試料は、環境もしくは生体中に存在するクリプトスポリジウム汚染が疑われる試料の何れをも含む概念である。水道原水、河川水、湖沼水、井戸水、地下水、下水、廃水、プールの水、公園の水等の環境中に存在する水試料、または、牧場土、農地土、湖沼土、河川土等の環境中に存在する土壌試料等の環境試料、ヒト、家畜、ペット等の糞便等の生体試料、飲料食品、生野菜、果物等の食品試料等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
被検試料から核酸試料の調製する工程は、被検試料からクリプトスポリジウムのオーシストを回収し、回収されたオーシストから染色体DNAを抽出することにより行われるものである。被検試料からオーシストの回収は公知の何れの方法を用いて行うことができる。糞便試料の場合は、例えば、糞便をジエチルエーテル抽出後、ショ糖密度勾配遠心によって精製する方法が例示され、水試料の場合は、例えば、河川水20ｌを金属メッシュに通して1cm以上の侠雑物を除いた後、セルロース混合エステル製メンブレンフィルター（孔径1.2μｍ：ミリポア社製）直径90または142mmのものを使用して最終的に500μl〜2mlにし、そのうちの10〜50μlを分取して直接、本発明の方法に使用することができる。
【００３１】
オーシストから染色体DNAの抽出は、グリココール酸で処理した後、プロテアーゼで処理することが好ましく、特に、グリココール酸で処理した後、プロテイナーゼＫで処理することが好ましい。本発明において使用される上記試薬の濃度は、グリココール酸を使用する場合は、好ましくは、１〜１０ｍＭである。グリココール酸処理の条件は、好ましくは、24〜40℃にて5〜240分であり、特に好ましくは37℃にて15分間である。また、また、デオキシコール酸処理後の、プロテイナーゼK処理は、好ましくは、1〜50ｍＭのEDTAの存在下で、好ましくは、10ｍＭで行うものとし、処理条件は、37〜75℃にて5〜60分が好ましく、特に好ましくは70℃にて10分間インキュベートを行った後、更に、94℃で10分間インキュベートである。また、グリココール酸は、タウロコール酸のようなPCR反応を阻害する物質ではないため、本発明の方法により処理を行ったサンプルは、抽出されたDNAの精製過程を経ることなく、そのまま後の増幅反応に供することができ、各処理時間が従来報告されているタウロコール酸とトリプシンの混合液での処理（例えば、特開平２００１−２５２０９９号公報参照。）に比べ各処理時間が大幅に短縮されることと相俟って、抽出工程に要する時間の短縮化を図ることが可能となる。また、通常、DNA精製の過程においては必然的に核酸の損失が生じ、精製後のDNAの回収率は高くても80％程度であるが、本発明によれば、DNA精製によるDNAの損失を最小限に抑えることができるため、ほぼ100％のDNA抽出効率を保つことが可能となり、最終的な検出効率の向上を達成することが可能となる。
【００３２】
オーシストから抽出された核酸試料は、検出感度の向上のため、増幅しておくことが好ましい。DNAの増幅はPCRにより行うことが一般的であるが、これに限定されるものではないが、以下、PCRを用いる増幅に関して詳細に説明する。
【００３３】
PCRは上記で得られたDNAを鋳型として公知のPCR法に従って行うことができ、２段階で行うことが好ましく、２回目のPCRは、１回目のPCRで得られた増幅反応で得られた増幅産物を鋳型として行うことが好ましい。２回目のPCRに際しては、増幅対象配列の標識化反応を組み込むことが特に好ましく、標識に関しては、後で詳細に説明する。また、PCRに用いるプライマーは、標的とされる塩基配列（標的配列もしくは標的核酸という表現をも使用する場合がある。）、この例の場合、クリプトスポリジウムの塩基配列に基づいて設計されるものであり、そのような塩基配列は、クリプトスポリジウムの遺伝子の塩基配列が登録されている、例えば、DNA Databank of Japan(DDBJ)、GenBank、European Molecular Biology Laboratory(EMBL)などの遺伝子データベースの検索により入手することができる。PCRの増幅効率や特異性はプライマーの設定位置やプライマーの配列に依存するものであるのでクリプトスポリジウムの遺伝子の塩基配列を効率よく増幅することができる配列であり、かつ、クリプトスポリジウムのあらゆる種を増幅することが好ましいので、クリプトスポリジウム属の種間で共通して保存性の高い配列に基づいて設計することが好ましい。また、２段階でPCRを行う場合、２回目のPCRを、非特異的増幅産物を排除すべく、１回目のPCRにおいて増幅される標的配列の内側にプライマーを設定し、nested PCRにて行うことができる。このnested PCRに用いられるプライマーとしては、１回目のPCRにおいては、センスプライマーとして5'-GGAACCTGGTTGATCCTGCCAG-3'；配列識別番号１が、アンチセンスプライマーとして5'-GGTCGATCCCCTAACTTTCGTT-3'；配列識別番号２が好ましく例示され、また、２回目のPCRにおいては、センスプライマーとして5'-TCAAAGATTAAGCCATGCATGTCT-3'；配列識別番号３が、アンチセンスプライマーとして5'-GATTAATGAAAACATCCTTGGCAAA-3'配列識別番号４）が好ましく例示されるが、これらに限定されるものではない。PCR増幅後の増幅産物は、好ましくは、ゲル濾過等の公知の手段により精製した後、DNase、超音波処理、Mg２＋イオン処理等により断片化し、後で説明するハイブリダイゼーション実験に供する。
【００３４】
上記オリゴヌクレオチドプライマーは化学的に合成することが可能である。例えば、公知のホスホルアミダイト（phosphoramidite）法（Nucleic Acids Research, 17, 7059-7081 1989）を用いて固相合成により化学合成することができ、市販されている自動核酸合成装置により所望の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを自動的に合成することも可能である。合成後のオリゴヌクレオチドは、必要に応じてHPLC等の公知の方法により精製される。
【００３５】
種間で生じる一塩基変異に基づいてクリプトスポリジウムを種識別的に検出するため、プローブセット群は、DDBJ、GenBank、EMBL等の公知の遺伝子データベース等を利用してクリプトスポリジウム属に属する種の各１８Sリボソーム遺伝子の塩基配列を検索し、それぞれの相同性解析から種特異的な一塩基変異を特定し、特定された一塩基変異に基づいて設計されたものであり、かかる種特異的な一塩基変異が生じている部位を種識別的検出の検知部位として、一塩基変異を示すと特定された部位の塩基が４種の異なる変異（ａ、ｇ、ｃ、ｔ）を有するべく構成された４種類のプローブを１セットとして、少なくとも１以上のセットを含むものとして構成した。このように設計されたプローブセット群を構成する各プローブと標的核酸とを接触させ、一塩基が変異した４種のプローブからなる１のプローブセットの中でどの変異塩基を有するプローブと最もよく結合するか検出することにより、種識別的にクリプトスポリジウムを検出する。
【００３６】
特に好ましく利用可能なプローブセット群を表１にまとめるがこれらに限定されるものではない。また、これらのプローブセット群のうち、一部のプローブセットを有するものとして構成することができ、検出目的等に応じて適宜選択することができる。これらの配列中、小文字で示された塩基が一塩基変異を示す塩基である。
【００３７】
また、前記プローブセット群を構成するプローブは、必ずしも表１に記載の配列又はその相補配列の全てをプローブとして設計する必要はなく、Tm値などを選択して適当な領域を選択して適当な長さで使用すればよい。しかし、前記プローブは種特異的一塩基変異に基づき種を識別するものであるので、一塩基変異を特異性をもって検出する必要があることから、表１に記載の配列又はその相補配列中の、一塩基変異を示す塩基とその隣接する５’側の３塩基および３’側の3塩基からなる塩基配列を包含する少なくとも連続する１０塩基以上、更に好ましくは、１８塩基以上の長さを有する必要がある。したがって、かかる条件を満たす限り、配列表の配列から適当な長さの配列を選択して作成すればよく、表１に記載の塩基配列以外の塩基配列を付加することも可能である。この場合は、種特異的な領域以外にハイブリダイゼーションが起こりえないような配列を選択して付加することが必要である。プローブの長さは、標的核酸とのハイブリッドの安定性および取り扱いの簡便性の観点から、好ましくは、10〜70bpであり、特に好ましくは、10〜40bpとするものとする。また、種特異的な一塩基変異を示す塩基がプロ−ブを構成するオリゴヌクレオチドの中央部に位置するように設計されることが好ましい。このような観点から、プローブセット群が設計される。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
ここで、この明細書におけるプローブとは、標的核酸とハイブリダイズする領域を意味し、実際にプローブとして用いる核酸分子には、更にヌクレオチド以外の他の化学構造が付加されていてもよい。例えば、プローブ固相担体上に固定化したマイクロアレイを作製して検出を行う等、プローブを固相化して検出を行う場合には、固相化のための官能基がそのプローブの３’末端や５’末端の水酸基部分、更には塩基部分やリン酸ジエステル部分などに導入された形態等を例示することができる。
【００４０】
ここで用いられるプローブは化学的に合成することが可能である。例えば、公知のホスホルアミダイト（phosphoramidite）法（Nucleic Acids Research, 17, 7059-7081 1989）を用いて固相合成により化学合成することができ、市販されている自動核酸合成装置により所望の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを自動的に合成することも可能である。合成後のオリゴヌクレオチドは、必要に応じてHPLC等の公知の方法により精製される。
【００４１】
検出対象となる標的核酸もしくは、プローブのいずれか一方が標識されるものであり、核酸の標識化の方法は公知であり、標識の種類に応じて好適な方法により、標識されるものとする。後で説明するように、検出対象となる標的核酸を標識することが好ましい。標識として、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミン、Cy3、Cy５等の蛍光色素、３５P、１３１I、３５S等の放射線同位体、アルカリフォスファダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素等、核酸の標識に用いることが可能な何れの標識をも使用することができる。また、ジゴキシゲニンやビオチンなどの有機化合物での標識も、好ましく例示することができ、アルカリフォスファターゼ等により標識されたジゴキシゲニン抗体と免疫的に結合させることで抗体を介して酵素が核酸に結合し、ニトロテトラゾリウムブルーなどの発色基質を添加して発色させ検出を行うことができ、また、ビオチンの場合はストレプトアビジンとの相互反応を利用して同様に行うことができる。
【００４２】
標識化は、好ましくは、増幅反応の際に、増幅産物に標識を導入することにより行われる。核酸増幅時に標識を導入する方法としては、特に好ましくは、Cy3-dCTP等の蛍光標識ヌクレオチドを用いて増幅反応を行い、標識を増幅産物に取り込ませることにより、内部がランダムに標識された増幅産物を作成する方法を用いることができる。
【００４３】
上記のように調製した標的核酸を、前記プローブセット群を構成するプローブとハイブリダイズさせる工程は、リバースドットブロット法、ドットブロット法等、公知の全てのハイブリダイゼーション技術に従って行うことができる。好ましくは標的核酸もしくはプローブのいずれか一方が固相担体上に公知の方法を用いて固定化されている。固定に用いる担体としては、マイクロウェル、ビーズ、スライドガラス、メンブラン等の公知の担体の何れもが利用でき、マイクロアレイとして構成することが好ましく例示される。検出対象となる標的核酸を固相化して標識プローブを用いてハイブリダイズさせることも可能であるが、プローブを固相化して標識した標的核酸を接触させ、ハイブリダイズさせる方法が、操作の簡便性の観点から好ましい。環境診断、臨床検査のように多数の検体を処理する必要がある場合においては、各検出において共通の固相化したプローブを使用することができ、これらプローブを固相化したキット、好ましくはマイクロアレイを大量に生産しておくことにより、簡便に検査が可能となる点で、特に好ましい。
【００４４】
ハイブリダイゼーション条件、洗浄の条件は、ハイブリダイズされる配列の長さ、GCヌクレオチド配列の含有量に応じて経験的に適宜選択して設定されるものであり、プローブと相同性の高い塩基配列とが、特異的にハイブリダイズし、十分な検出感度、特異性を示す条件を適宜選択することができる。当該分野において、そのようなハイブリダイゼーション条件のバリエーションのための十分に確立された公式は周知であり、例えば、Sambrook et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 第２版、p.9.47-9.51, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。特に本発明は一塩基レベルでの変異に基づき、それらの変異に基づくハイブリダイゼーション強度の相違を検出することにより種識別を行う検出方法であるので、そのような一塩基レベルでの変異の検出に適合するように条件を設定する必要がある。具体的なハイブリダイゼーション条件、および、洗浄条件として実施例に記載の条件が例示されるが、これに限定されるものではない。
【００４５】
プローブにハイブリダイズした核酸の検出は、本発明のプローブを核酸試料とハイブリダイズさせ、未結合核酸を除去した後、各プローブにハイブリダイズした核酸を標識を指標として検出することにより行なわれ、標識の検出は標識の種類に応じた公知の方法を用いて、放射線、発色、蛍光、発光を測定することにより行うことができる。
【００４６】
検出結果を解析する工程は、種特異的な一塩基変異を示す塩基部位を４種類の異なる変異（ａ、ｇ、ｃ、t）を有するべく構成された４種のプローブを１のプローブセットとして構成していることから、４種のプロ−ブのうち、いずれか１つとクリプトスポリジウム由来のDNAは強く結合することとなり、これを利用して行われる。ここで、１のプローブセット中、最も強く結合するプローブが標的核酸と相補的な配列であると定義することとする。検出のために用いられたプローブはクリプトスポリジウムの種特異的な一の一塩基変異につき４つの変異部位を有するように設定されたものであり、これを種識別の検知部位とするものであるので、相補的な配列は種毎に相違することとなり、相補的な配列を検出することにより、クリプトスポリジウムの種識別が可能となる。したがって、検知部位が多くなるほど、検出感度、検出精度が向上することとなる。特に好ましく利用可能であるとして表１に例示したプローブセット群は、クリプトスポリジウムの１種につき最低でも２箇所以上の検知部位が設定された１０のプローブセットからなるものであるため、特に好ましく、高精度かつ、高感度に種識別的な検出が可能となる。また、検出される標識は定量化することが好ましく、プローブセットとして構成される４種のプローブと標的核酸との各ハイブリダイゼーションで観察される各蛍光強度等の標識強度の和を100％としてプローブ毎の相対標識強度を算出して、評価を行うことが好ましく、以下で示す実施例においては、相対標識強度が60％以上となるプローブを相補的配列とするとして、評価を行っている。
【００４７】
また、観察される標識量を定量することにより、被検試料中に含まれるクリプトスポリジウムの定量が可能となる。したがって、この明細書における検出とは、定量的な検出をも包含するものとする。
【００４８】
そして、クリプトスポリジウムの各種毎の標品を検出対象試料と同様の手段で前記プローブとハイブリダイズさせ、観察されるハイブリダイゼーションパターンもしくは、相補的配列の比較を行うことにより、検出および種の識別を行ってもよいし、また、種毎のハイブリダイゼーションパターンもしくは相補配列の情報をデーターベース化し、自動的に検出および種の識別を行うように構成してもよい。
【００４９】
また、検出は適切なポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブを加えて行うことが好ましい。ネガティブコントロールプローブはクリプトスポリジウムのいずれの種とも相補的でないように設計されたオリゴヌクレオチド配列であることが必要であり、例えば、大腸菌特有の遺伝子配列に基づいて設計されたのものを用いることができ、具体的には、大腸菌１６Sリボソーム遺伝子の配列から作製した5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(配列識別番号５５)を例示することができる。また、ポジティブコントロールプローブはクリプトスポリジウムのいずれの種とも相補的であるように設計されたオリゴヌクレオチド配列であることが必要であり、例えば、クリプトスポリジウムのすべての種に保存されたコンセンサス配列に基づいて設計されたものを用いることができ、具体的には、クリプトスポリジウムの18Sリボソーム遺伝子のコンセンサス配列に基づいて作製された5’-GGAACCTGGTTGATCCTGCCAG-3’（配列識別番号５６）を例示することができる。
【００５０】
以下、本発明を用いて抽出したクリプトスポリジウム核酸による種識別的検出方法をマイクロアレイを用いて実施する方法について詳細に説明する。
【００５１】
前記マイクロアレイは、本発明のプローブ群が固相担体上に適切に配置し、固定されている。特に解析の容易化の観点から、プローブセットを構成する一の一塩基変異につき4種類の変異部位を有するべく構成された4種のプローブを一列に配置することが好ましい。また、適切なポジティブプローブ、ネガティブプローブを配置することも可能である。マイクロアレイの担体としては、ガラス板、石英板、シリコンウェファーなどが好ましく例示されるが、従来用いられる何れの公知の材料をも用いることができる。
【００５２】
担体上にプローブを固定する方法は、公知の何れの方法を利用することができ、プローブの種類や担体の種類に応じて、適宜最適な方法が選択される。具体的方法としては、DNAの荷電を利用してポリリジン、ポリエチレンイミン等のポリ陽イオンで担体表面に静電結合させる方法、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有する各種シランカップリング剤で表面処理された担体に、末端に官能基としてアミノ基、アルデヒド基、SH基、ビオチン等が導入されたDNAとを共有結合させる方法等を好ましく例示することができる。その後、必要に応じて、紫外線照射によるクロスリンク形成、表面のブロッキング、洗浄等の処理を行うものとする。また、マイクロアレイは業者に委託することにより作製することもできる。
【００５３】
上記で調製されたマイクロアレイを用いたクリプトスポリジウムの検出方法は、上記のようにして調製した核酸試料をマイクロアレイに作用させ、担体上に固定されたプローブと核酸試料に含まれるDNAとをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの条件に関しては、上記で既に述べた。
【００５４】
ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイ上のプローブとハイブリダイズしたDNAを標識物質を指標として検出する。蛍光標識した場合は、蛍光イメージスキャナーで、また、放射性同位体標識をした場合には、RIイメージスキャナーで画像化し、コンピュータ解析により標識量を測定する。例えば、蛍光レーザ顕微鏡とCCDカメラにより蛍光を検出し、コンピュータにより蛍光強度を解析することにより測定でき、また、これらを連結した装置により自動的に簡便に測定することができ、蛍光強度を算出し、評価を行う。
【００５５】
上記したプローブセット群を構成する各プローブを固相化したキットには、ハイブリダイゼーションに必要な試薬、検出に必要な試薬等を含ませることができ、好ましくはマイクロアレイの形態である。
【実施例１】
【００５６】
以下に、クリプトスポリジウムのオーシストからのDNA抽出、及び、抽出したDNAを用いた一連の解析を例に挙げ、本発明の実施例を説明する。尚、特に記載のない限り、デオキシコール酸として、ナカライテスク社製デオキシコール酸ナトリウム一水和物（特級ＧＲ10712-12）を使用した。グリココール酸は、ナカライテスク社製グリココール酸ナトリウム（360512  Cal  96％（TLC）  17135-01）を使用した。タンパク質分解酵素は、ナカライテスク社製プロテイナーゼＫを使用した。PCR試薬は、タカラバイオ社製TaKaRa  Ex  Taq（RR001A）を使用した。
【００５７】
［検討例１］クリプトスポリジウムのオーシストからDNAの抽出方法の検討
グリココール酸/デオキシコール酸処理とそれに続くプロテアーゼ処理を組合わせて（以下、グリココール酸/デオキシコール酸処理・プロテアーゼ処理と略する。）オーシストからDNAを抽出した場合のDNAの抽出効率と、従来のDNA精製法に基づいてDNAを抽出した場合のDNA抽出効率との比較を行った。
【００５８】
グリココール酸/デオキシコール酸処理・プロテアーゼ処理は、2500個オーシスト/μｌのオーシスト懸濁PBS Buffer 10μｌに、デオキシコール酸を終濃度0.1mM、またはグリココール酸を終濃度１mMとなるように添加し、37℃で15分間インキュベートを行った後、プロテイナーゼＫ  (600mAU/ml, QIAGEN社製)および、EDTA（終濃度10mM）を添加し、70℃で10分間インキュベートの後、更に、94℃で10分間インキュベートすることで行った。従来のDNA精製法に基づくDNA抽出は、供給者の指示に従い、QIAGEN genomic DNA kit（QIAGEN）を用いて、上記オーシスト懸濁PBS Buffer 50μｌからDNAを抽出した。
【００５９】
次に、グリココール酸/デオキシコール酸処理・プロテアーゼ処理、従来のDNA精製法により抽出された各DNAサンプルから、それぞれ2.2μl、2μl分取し、同様の条件でPCR反応（全量25μl）を行い、ゲル電気泳動により抽出されたDNA量を目認した結果を図１に示す。レーン１が従来のDNA精製法に基づく処理方法により調製されたDNAサンプル由来のバンドであり、レーン２がグリココール酸/デオキシコール酸処理・プロテアーゼ処理に基づく処理方法により調製されたDNAサンプル由来のバンドを示している。この結果から、グリココール酸/デオキシコール酸処理・プロテアーゼ処理は、従来のDNA精製法に比べて、DNA抽出の効率が高く、オーシストから染色体DNAを抽出するのに有用な手段であることが判明した。
【００６０】
また、ここでは図示しないが、上記したグリココール酸/デオキシコール酸処理・プロテアーゼ処理における脱嚢過程を顕微鏡で観察すると、グリココール酸はオーシストの破壊だけでなく、そこから出てきたスポロゾイトも破壊していることが確認された。したがって、プロテアーゼ処理の効果も相俟って、完全に微細な細胞構造が破壊されることから、DNA抽出効率が高くなるものと推定される。
【００６１】
［検討例２］タウロコール酸、グリココール酸、デオキシコール酸のPCR反応への影響の検討
オーシストをタウロコール酸、グリココール酸、デオキシコール酸の各胆汁酸成分で処理することによりクリプトスポリジウムのオーシストからDNAを抽出した場合において、これらの胆汁酸成分のPCRによる増幅反応に与える影響を検討した。検討は、DNA精製によってこれらの胆汁酸成分を除去したサンプルと、これらの成分を除去しないサンプルとを、クリプトスポリジウムの18S リボソーム遺伝子の塩基配列の異なる部位の約100baseを増幅するよう設定された２のプライマー対（18F 5'-TGTCACTACCTCCCTGTATTAGGATTG-3'；配列識別番号57と95R 5'-CCTGAGAAACGGCTACCACATC-3'；配列識別番号58、96F 5'-CTCCCTCTCCGGAATCGAA-3'；配列識別番号59と174R 5'-CAGCTTTAGACGGTAGGGTATTGG-3'；配列識別番号60）を用いて増幅反応を行い、ゲル電気泳動により増幅産物を目認する事により行った。2500個オーシスト/μｌのオーシスト懸濁液10μｌを、それぞれ70mMのグリココール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸各溶液10μｌで37℃にて30分間処理した。これに20μｌの50% Triton X-100, 10mM EDTAを加えて室温で5分間反応させ、そのうちの5μｌをPCRに供し未精製試料のPCR産物とした。また、別の20μｌをGFX DNA purification kit (ファルマシア社製)を用いて精製し、等量の20μｌの精製DNA溶液を得た。そのうちの5μｌをPCRに供して精製試料のPCR産物とした。その結果を、図２に示す。100bp（18F-95R）が配列識別番号  57と58のプライマー対での未精製試料由来の増幅産物であり、Purified（18F-95R）が配列識別番号  57と58のプライマー対での精製試料由来の増幅産物であり、100bp（96F-174R）が配列識別番号  59と60のプライマー対での未精製試料由来の増幅産物であり、Purified（96F-174R）が配列識別番号  59と60のプライマー対での精製試料由来の増幅産物である。
【００６２】
その結果、いずれの部位の増幅においても、デオキシコール酸、グリココール酸での処理の場合は、DNA精製過程を経ないサンプル由来の増幅産物量の方が多かったのに対して、タウロコール酸処理の場合は、DNA精製を経ないサンプル由来の増幅産物はほとんど確認されなかった。かかる結果から、タウロコール酸はDNA増幅の阻害物質であることが、示唆された。
【００６３】
次に、クリプトスポリジウムオーシストから精製したDNAサンプルを用いて、このDNAサンプルにタウロコール酸、グリココール酸、デオキシコール酸の各胆汁酸成分を添加した後、通常のPCR反応を行うことにより、各胆汁酸成分のPCR増幅に与える影響を検討した。クリプトスポリジウムオーシストからのDNAの抽出、精製は、供給者の指示に従ってQIAGEN genomic DNA Kit（QIAGEN）を用いて行い、この精製DNAサンプルに、各70ｍMのタウロコール酸、グリココール酸、デオキシコール酸をx１、x1/2、x1/10、x1/100、x1/1000に希釈して（終濃度がそれぞれ、10、５、１、0.1、0.01mMに対応）添加した後、同様の条件でPCR反応(プライマー対  5'-GGAACCTGGTTGATCCTGCCAG-3'；配列識別番号  １および5'-GGTCGATCCCCTAACTTTCGTT-3'；配列識別番号  ２)を行った後、増幅産物をゲル電気泳動に目認することにより比較した。その結果を図３に示す。
【００６４】
タウロコール酸濃度が増大すると、増幅産物量の著しい減少が確認されたことから、タウロコール酸はPCR増幅（DNAポリメラーゼ）の強い阻害物質であることが判明した。一方、グリココール酸濃度による増幅産物量の変化は確認されなかった。また、デオキシコール酸濃度が増大すると、増幅産物量の減少が確認されたが、タウロコール酸による増幅産物の減少ほど顕著なものではなかった。
【００６５】
以上、検討した通り、タウロコール酸はPCR反応の強い阻害剤であることから、タウロコール酸を用いてオーシストの脱嚢を行った場合は、増幅反応の際には、従来のDNA精製手法に基づいてタウロコール酸をあらかじめ除去しておく必要がある。しかしながら、検討例１で検討した通り、従来のDNA精製方法は、DNA抽出効率の低下に起因する検出感度の低下を招くことから、クリプトスポリジウムのオーシストからのDNA抽出に際して採用することは好ましいことではない。したがって、オーシストから染色体DNAの抽出方法としては、DNA精製過程を経ず、脱嚢後、直接、PCR増幅に付すことが可能であり、かつ、オーシストからの高いDNA抽出効率を達成できるグリココール酸/デオキシコール酸処理・プロテアーゼ処理、特に、グリココール酸処理とこれに続くプロテアーゼ処理を採用することが適当であることが判明した。以下の実施例２のオーシストからの染色体DNAの抽出方法は、グリココール酸/デオキシコール酸処理・プロテアーゼ処理により行った。ここで、グリココール酸に少量のデオキシコール酸を混合して処理に用いたのは、PCR反応を阻害しない範囲で、それぞれの有する効果を相乗的に得るためである。
【実施例２】
【００６６】
クリプトスポリジウムの種識別的検出を以下のようにして行った。検出検体としては、Waterborne 社（USA）から購入した C. parvumおよびC. murisのオーシストを使用し、各クリプトスポリジウムのオーシスト20個を、PBS Bufferに懸濁し、全量10μｌの環境試料を調製し、以下の実験に供した。PBS Bufferは、x10 PBS Buffer（11.5g  Na２HPO４、2g  KH２PO４、80g  NaCl、2g KCl/１l）として調製していたものを、使用時に希釈して使用した。
【００６７】
（１）染色体DNAの調製
各環境試料に、４μlのデオキシコール酸（終濃度0.1mM）、またはグリココール酸（終濃度１ｍＭ）を添加し、37℃で15分間インキュベートをした。続いて、0.5μｌのプロテイナーゼＫ  (600mAU/ml, QIAGEN社製)および、3.5μｌのEDTA（終濃度10mM）を添加し、70℃で10分間インキュベートの後、更に、94℃で10分間インキュベートすることで、オーシストから抽出された染色体DNAを含有する核酸試料を得た。
【００６８】
（２）DNAの増幅
上記で調製した核酸試料を室温まで冷却し、そのうち２μｌを分取し、これを鋳型として、センスプライマーprimer1（5'-GGAACCTGGTTGATCCTGCCAG-3'；配列識別番号  １）、アンチセンスプライマーprimer2（5'-GGTCGATCCCCTAACTTTCGTT-3'；配列識別番号  ２）をプライマーセットとして用いて、PCRを行い、クリプトスポリジウムの遺伝子を含む増幅断片を得た。PCR反応液は、x10 Reaction Buffer（Ex Taq Buffer、タカラバイオ社製）を５μｌ、2.5mMの dNTPsを５μｌ、20pM/μｌ のプライマー（Primer1、primer２）を各１μｌ、5U/μｌのEx Taq（タカラバイオ社製）を0.5ml、上記（１）で調製した核酸試料を２μｌ、Ｈ2Ｏを36μｌを加えて、全量50μｌとして調製した。反応は、94℃で60秒での変性の後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の伸長を１サイクルとし、40サイクル行った後、72℃で240秒の最終伸長反応で、反応を終了させた。
【００６９】
（３）増幅産物の標識化
上記（２）で得られた増幅産物から1μlを分取し、これを鋳型として、標識物質としてCy3標識ヌクレオチドを、また、センスプライマー18Sf60nest(5'-TCAAAGATTAAGCCATGCATGTCT-3'；配列識別番号  ３)、アンチセンスプライマー18Sr925nest （5'-GATTAATGAAAACATCCTTGGCAAA-3'；配列識別番号  ４）をプライマーセットとして用いて、２回目のPCRを行い、クリプトスポリジウムの遺伝子を含む標識化増幅産物を得た。PCR反応液は、X10 Reaction Buffer（Ex Taq Buffer、タカラバイオ社製）を５μｌ、2.5mM のdNTPsを５μｌ、Cy3‐dCTP（ファルマシア社製）を２μｌ、20pM/μｌのプライマー（18Sf60nest、18Sr925nest）を各１μｌ、5U/μｌのEX Taq（タカラバイオ社製）を0.5ml、上記（２）で調製した増幅産物を１μｌ、Ｈ2Ｏを81μｌを加えて、全量100μｌとして調製した。反応は、94℃で60秒での変性の後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の伸長を１サイクルとし、25サイクル行った後、72℃で240秒の最終伸長反応で、反応を終了させた。
【００７０】
（４）増幅産物の断片化
上記（３）で得られた標識化増幅産物100μｌをMicroSpin（登録商標）S-200 HR（ファルマシア社製）を用いて、ゲル濾過精製した後に、DNase I(Promega社製)で断片化し、標識化DNA断片を得た。DNase処理は以下のように行った。ゲル濾過精製後の標識化増幅産物から36μｌを分取し、x10 Reaction Buffer(400mM Tris-HCl(pH 8.0)、100mM MgS0４、10mM CaCl2)を4μｌ、DNase Iを0.5μｌ添加して、37℃で5分間インキュベートした後、x10 Stop Buffer（20ｍM  EDTA(pH 8.0)）を4μｌ加え、65℃で10分間インキュベートし、DNaseIを失活させた。ここで、得られた標識化DNA断片を後のハイブリダイゼーション実験に供した。
【００７１】
（５）マイクロアレイの調製
マイクロアレイの基板として、Poly-L-lysinコーティングスライドガラス（Sigma, USA）を使用した。表１に示したプローブ各20pmolを、それぞれ1.5M Betain、3X SSC溶液中に混和後、スライドグラスにスポットし、120mJの強度で紫外線を照射することでプローブを基板に固定した。その後スライドグラスをコハク酸溶液(Succinic anhydride 6 g、 1-Methyl-2-pyrrolidinone 325 ml、Sodium borate (1M, pH 8.0) 15 ml)中で、室温にて10分間処理をしてブロッキングを行った。ブロッキング後、100%エタノールで1分間脱水した後、蒸留水ですすいで乾燥させることにより、プローブが固定されたマイクロアレイを作製した。また、ポジティブコントロールとして、クリプトスポリジウムのすべての種に保存された18Sリボソーム遺伝子のコンセンサス配列を有するポジティブコントロールプローブ（配列識別番号  ５５）を、ネガティブコントロールとして大腸菌１６Sリボソーム遺伝子の配列から作製したネガティブコントロールプローブ（配列識別番号５６）を上記と同様にマイクロアレイ上に固定した。
【００７２】
（６）ハイブリダイゼーション
上記（４）で調製した標識化DNA断片３μｌを分取し、６μｌのハイブリダイゼーションBuffer（12xSSPE、２％formamide）および３μｌのＨ2Ｏを添加し、混和後、上記（５）で調製したプローブをスライドグラスに固定化したマイクロアレイに滴下した。45℃で３時間インキュベートすることにより、ハイブリダイゼーションを行い、室温でスライドグラスを洗浄する。洗浄は、2ｘSSC, 0.1%SDS溶液中で10分間インキュベート、および、0.2ｘSSC中で４−５回リンスしたのち遠心分離または窒素ガスにて完全に乾燥させることによって行った。スライドガラス乾燥後、DNAマイクロアレイ専用スキャナーにて蛍光強度を励起波長550nm、蛍光波長570nmにて測定、画像処理を行い、画像または蛍光強度の定量値をもって評価を行った。画像処理図を図４に示す。図中のＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔは一塩基変異部位において設定された塩基をしめす。ここで使用したSSPEおよび、SSCは、20ｘSSPE(3.6 M NaCl, 0.2M NaH2PO4, 20 mM EDTA； 210.4g NaCl、24.0g Na H2PO4、7.4g EDTA/1l)、20ｘSSC(3 M NaCl、0.3M sodium citrate；88.3g  sodium citrate、175.4g  NaCl/１l)を作製し、使用時に希釈して使用した。
【００７３】
（７）結果の解析
評価は一塩基変異につき４種類の変異を有するべく構成された４種類のプローブに対応する４つのスポットの蛍光強度の和を100％として、各スポットの相対蛍光強度を算出することにより行い、相対蛍光強度が60％以上となるものを標的遺伝子の相補配列を有するプローブであるとして評価を行った。図４で示されるC.parvumの画像処理図をもとに相補的配列を特定した結果を図５に示す。
【００７４】
第５レーンにおいては、C. parvumは、５−Ａのスポットにおいて、また、C.murisは、５−Ｔのスポットにおいて、80％以上の相対蛍光強度が観察され、第８レーンにおいては、C. parvumは、８−Ｔのスポットにおいて、また、C.murisは、８−Ａのスポットにおいて、80％以上の相対蛍光強度が観察され、第10レーンにおいては、C. parvumは、10−Ｔのスポットにおいて、また、C.murisは、10−Ｃのスポットにおいて、80％以上の相対蛍光強度が観察された。これらのスポットに対応するプローブが各C. parvum、C.murisそれぞれに対する相補的な配列を有するものであり、両者間において相補的な配列は明らかに相違するものとして検出されたことから、C.parvum、C. murisを蛍光パターンから正確に識別可能であること確認された。本発明において多数の種特異的な一塩基変異を特定し、その一塩基変異につき４種の変異部位を有するプローブを開示しているので、本実施例において、具体的に示したC.parvum、C. muris以外の種の同定にも、同様の手順により行うことができることを当業者は理解できるであろう。
【００７５】
また、標的は、ネガティブコントロールのプローブとは全く反応せず、ポジティブコントロールのプローブのスポットは強い蛍光が観察された。以上の結果から、クリプトスポリジウムの属から種のレベルまで検出するのに有効な方法であることが判明した。
【実施例３】
【００７６】
〔レジオネラからの核酸抽出〕
レジオネラ属のLegionella pneumophila（L. pneumophila）SG3株、及び、これとは異なる種のレジオネラ属の細菌（Legionella sp.）の細胞から、以下の手順でDNAを抽出し、その存在を確認した。
（１）染色体DNAの調製
レジオネラ細胞をＰＢＳに懸濁して10μlの被検試料を作成した。この被検試料に、４μlの反応溶液Ａ（3.5mMグリココール酸（終濃度１ｍＭ）、0.35mMデオキシコール酸（終濃度0.1mM））を添加し、37℃で15分間インキュベートをした。続いて、４μlの反応溶液Ｂ（76.5mU  プロテイナーゼＫ(600mAU/ml, QIAGEN社製)、45mM  EDTA（終濃度10mM））を添加し、70℃で10分間インキュベートした。この後、更に、94℃で10分間インキュベートすることでプロテイナーゼＫを失活させ、レジオネラ細胞から抽出された染色体DNAを含有する核酸試料（実施例）を得た。尚、比較例に係る核酸試料は、グリココール酸、デオキシコール酸、プロティナーゼＫ、及びEDTAの代わりに、滅菌水を同容量添加した以外は、実施例と同様に処理して得た。
【００７７】
（２）DNAの増幅
上記で調製した核酸試料と比較試料とを室温まで冷却し、そのうち２μｌをそれぞれ分取し、これを鋳型として、PCRを行い、レジオネラの遺伝子を含む増幅断片を得た。１回目のPCR反応で、センスプライマー  Leg113F（5'- GCACGTGTGTAGCCCTACCC -3'；配列識別番号  61）、アンチセンスプライマー  Lrg1115R（5'-ACTGGAACTGAGACACGGTC-3'；配列識別番号  62）をプライマーセットとして用いた。２回目のPCR反応も、前記センスプライマー  Leg113Fと前記アンチセンスプライマー  Lrg1115Rとをプライマーセットとして用いた。PCR反応液は、x10 Reaction Buffer（Ex Taq Buffer、タカラバイオ社製）を５μｌ、2.5mMの dNTPsを５μｌ、20pM/μｌ のプライマー（Primer1、primer２）を各１μｌ、5U/μｌのEx Taq（タカラバイオ社製）を0.5ml、上記（１）で調製した核酸試料を２μｌ、Ｈ2Ｏを36μｌを加えて、全量50μｌとして調製した。反応は、94℃で60秒での変性の後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の伸長を１サイクルとし、40サイクル行った後、72℃で240秒の最終伸長反応で、反応を終了させた。
【００７８】
ゲル電気泳動により抽出されたDNA量を目認した結果を図６に示す。L. pneumophila  SG3株及びLegionella sp.のそれぞれについて、又、実施例と比較例とのそれぞれについて、３．０×１００、３．０×１０１、３．０×１０２、３．０×１０３、３．０×１０４個の細胞に相当する核酸試料を各レーンにロードした。尚、図中、Ｍは100bpラダーの分子量マーカーを示す。L. pneumophila  SG3株とLegionella sp.のそれぞれについて、本法に基づいて核酸抽出を行った実施例においては、少ない細胞からでも遺伝子の増幅が起こり、細胞数が増えるにつれて増幅されたDNAのバンドが太くなっており、細胞数に応じた定量的な増幅が起こった。このことから、本法は定量的PCR法として、レジオネラの検出・定量に応用可能であることがわかる。他方、比較例に係る方法で核酸抽出を行った場合、PCR産物は生じたが、細胞数と増幅されたDNAのバンドの太さの間に相関性がなく、DNAの抽出又はPCR反応が阻害されているおそれがある。
【００７９】
レジオネラ菌は、細胞内増殖性のグラム陰性桿菌である。原虫や藻類、ヒト体内では好中球やマクロファージ内で増殖し、肺炎（レジオネラ症）の原因となる。湿った環境に生息し、河川などの自然の水系のほか、クーリングタワーや循環式浴槽等で増殖し、ヒトでの肺炎の集団発生が起こることもある。かかる事情により、レジオネラ菌の迅速且つ正確な検出を行うため、本法を用いて核酸を抽出し分析に供することは疫学的見地からみて非常に有用である。特に、レジオネラ症はL. pneumophilaが原因となることが多く、かかる種の核酸抽出に本法を適用することで、ヒトへのレジオネラ感染、これに伴う肺炎の発生を効果的に抑制することができる。
【実施例４】
【００８０】
〔ヒト培養細胞からの核酸抽出〕
ヒト培養細胞（Hela  S3）から、以下の手順でDNAを抽出し、その存在を確認した。
（１）染色体DNAの調製
Hela  S3細胞をＰＢＳに懸濁して10μlの被検試料を作成した。この被検試料に、４μlの反応溶液Ａ（3.5mMグリココール酸（終濃度１ｍＭ）、0.35mMデオキシコール酸（終濃度0.1mM））を添加し、37℃で15分間インキュベートをした。続いて、４μlの反応溶液Ｂ（76.5mU  プロテイナーゼＫ(600mAU/ml, QIAGEN社製)、45mM  EDTA（終濃度10mM））を添加し、70℃で10分間インキュベートした。この後、更に、94℃で10分間インキュベートすることでプロテイナーゼＫを失活させ、Hela  S3細胞から抽出された染色体DNAを含有する核酸試料（実施例）を得た。尚、比較例に係る核酸試料は、グリココール酸、デオキシコール酸、プロティナーゼＫ、及びEDTAの代わりに、滅菌水を同容量添加した以外は、実施例と同様に処理して得た。
【００８１】
（２）DNAの増幅
上記で調製した核酸試料と比較試料とを室温まで冷却し、そのうち２μｌをそれぞれ分取し、これを鋳型として、ヒトグロビン遺伝子に基づいて設計したプライマーを用いてnested PCRを行い、Hela  S3細胞の遺伝子を含む増幅断片を得た。１回目のPCR反応は、センスプライマー  GH20（5'- GAAGAGCCAAGGACAGGTAC -3'；配列識別番号  63）、アンチセンスプライマー  GH21（5'-GGAAAATAGACCAATAGGCAG-3'；配列識別番号  64）をプライマーセットとして用いた。２回目のPCR反応は、センスプライマー  KM29（5'- GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG -3'；配列識別番号  65）、アンチセンスプライマー  PC04（5'- CAACTTCATCCACGTTCACC -3'；配列識別番号  66）をプライマーセットとして用いた。PCR反応液は、x10 Reaction Buffer（Ex Taq Buffer、タカラバイオ社製）を５μｌ、2.5mMの dNTPsを５μｌ、20pM/μｌ のプライマー（Primer1、primer２）を各１μｌ、5U/μｌのEx Taq（タカラバイオ社製）を0.5ml、上記（１）で調製した核酸試料を２μｌ、Ｈ2Ｏを36μｌを加えて、全量50μｌとして調製した。反応は、94℃で60秒での変性の後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の伸長を１サイクルとし、40サイクル行った後、72℃で240秒の最終伸長反応で、反応を終了させた。
【００８２】
ゲル電気泳動により抽出されたDNA量を目認した結果を図７に示す。実施例と比較例とのそれぞれについて、１×１００、１×１０１、１×１０２、１×１０３個の細胞に相当する核酸試料を各レーンにロードした。尚、図中、Ｍは100bpラダーの分子量マーカーを示す。本法に基づいて核酸抽出を行った実施例においては、少ない細胞からでも遺伝子の増幅が起こったことがわかる。他方、比較例に係る方法で核酸抽出を行った場合、PCR産物は生じたが、そのシグナルは実施例に比べると非常に弱く、DNAの抽出効率が悪いことがわかる。
【実施例５】
【００８３】
〔ヒト血液からの核酸抽出〕
ヒト血液試料から、以下の手順でDNAを抽出し、その存在を確認した。
（１）染色体DNAの調製
ヒト血液をＰＢＳに懸濁して10μlの被検試料を作成した。この被検試料に、４μlの反応溶液Ａ（3.5mMグリココール酸（終濃度１ｍＭ）、0.35mMデオキシコール酸（終濃度0.1mM））を添加し、37℃で15分間インキュベートをした。続いて、４μlの反応溶液Ｂ（76.5mU  プロテイナーゼＫ(600mAU/ml, QIAGEN社製)、45mM  EDTA（終濃度10mM））を添加し、70℃で10分間インキュベートした。この後、更に、94℃で10分間インキュベートすることでプロテイナーゼＫを失活させ、ヒト血液から抽出された染色体DNAを含有する核酸試料（実施例）を得た。尚、比較例に係る核酸試料は、ヒト血液の代わりに滅菌水を同容量添加した以外は、実施例と同様に処理して得た。
【００８４】
（２）DNAの増幅
上記で調製した核酸試料と比較試料とを室温まで冷却し、そのうち２μｌをそれぞれ分取し、これを鋳型として、ヒトグロビン遺伝子に基づいて設計したプライマーを用いてnested PCRを行い、ヒト血液に含まれる遺伝子の増幅断片を得た。１回目のPCR反応は、センスプライマー  GH20（5'- GAAGAGCCAAGGACAGGTAC -3'；配列識別番号  63）、アンチセンスプライマー  GH21（5'-GGAAAATAGACCAATAGGCAG-3'；配列識別番号  64）をプライマーセットとして用いた。２回目のPCR反応は、センスプライマー  KM29（5'- GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG -3'；配列識別番号  65）、アンチセンスプライマー  PC04（5'- CAACTTCATCCACGTTCACC -3'；配列識別番号  66）をプライマーセットとして用いた。PCR反応液は、x10 Reaction Buffer（Ex Taq Buffer、タカラバイオ社製）を５μｌ、2.5mMの dNTPsを５μｌ、20pM/μｌ のプライマー（Primer1、primer２）を各１μｌ、5U/μｌのEx Taq（タカラバイオ社製）を0.5ml、上記（１）で調製した核酸試料を２μｌ、Ｈ2Ｏを36μｌを加えて、全量50μｌとして調製した。反応は、94℃で３０分での変性の後、94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の伸長を１サイクルとし、30サイクル行った後、72℃で240秒の最終伸長反応で、反応を終了させた。
【００８５】
ゲル電気泳動により抽出されたDNA量を目認した結果を図８に示す。実施例について、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５個の細胞（赤血球、白血球、及び血小板細胞の総数）に相当する核酸試料を各レーンにロードした。右端のレーンは比較例にかかる核酸試料（細胞０個）である。尚、図中、Ｍは100bpラダーの分子量マーカーを示す。本法に基づいて核酸抽出を行った実施例においては、少ない細胞からでも遺伝子の増幅が起こったことがわかる。そして、比較例に係る核酸試料から増幅断片が得られていなかったことから、この増幅が特異的なものであることがわかる。
【００８６】
上述した２種の実施形態から明らかなように、本法を採用することによって、ヒト細胞及び血液からの核酸抽出及びその後の解析が効率よく行える。従って、治療等のために細胞を採取する場合、その採取量が少なくて済むので、患者への負担が軽くてすむ。又、本法をヒト細胞及び血液からの核酸抽出に適用することによって、迅速且つ正確な診断を行うことができる。
【実施例６】
【００８７】
〔マイクロアレイを用いた微生物の識別〕
担体（Poly-L-lysinコーティングスライドガラス（Sigma, USA））上の３mm×８mm角の領域に、検出対象となる微生物を特定するためのプローブを８個×２４個のスポットとして固定した。その内訳は、図９（ａ）に示すように、大腸菌のフラジェリン（Flagellin）遺伝子配列に基づいて作成された大腸菌遺伝子を検出するためのプローブのスポットが４個×１２個、硫酸還元菌のデハロゲナーゼ遺伝子配列に基づいて作成されたトリクロロエチレン資化能を有する硫酸還元菌遺伝子を検出するためのプローブのスポットが４個×１２個、クリプトスポリジウム全般に共通する保存領域（OWP遺伝子配列）に基づいて作成されたクリプトスポリジウム遺伝子を検出するためのプローブのスポットが４個×４個、クリプトスポリジウムの18Sリボソーム遺伝子配列に基づいて作成された種別にクリプトスポリジウム遺伝子を検出するためのプローブのスポットが４個×２０個である。
【００８８】
大腸菌（グラム陰性細菌）、デハロゲナーゼ遺伝子を持つ硫酸還元菌（グラム陽性細菌）、及び、複数種のクリプトストリジウム（グラム陰性細菌）を含むそれぞれの被検試料から、本発明に係る核酸抽出方法（グリココール酸/デオキシコール酸処理・プロテアーゼ処理）を用いて、染色体DNAを抽出した。これらの核酸試料を鋳型としてPCRを行い、得られたそれぞれの増幅産物を更に標識ヌクレオチドを含む系でPCRを行って標識化増幅産物を得た。これらをDNase I(Promega社製)で断片化し、標識化DNA断片を得た。これらの標識化DNA断片を、前記マイクロアレイに添加（滴下）し、インキュベートすることにより、ハイブリダイゼーションを行い、室温でスライドグラスを洗浄した。スライドガラス乾燥後、DNAマイクロアレイ専用スキャナーにて蛍光強度を測定、画像処理を行い、画像または蛍光強度の定量値をもって評価を行った。画像処理図を図９及び図１０に示す。
【００８９】
図９（ｂ）は、前記マイクロアレイに、硫酸還元菌由来の標識化DNA断片を添加したときの画像処理図である。硫酸還元菌のデハロゲナーゼ遺伝子由来の配列を有するプローブに対応するスポットからのみ強い蛍光が発生し、かかる微生物の検出が可能であった。図９（ｃ）は、前記マイクロアレイに、大腸菌由来の標識化DNA断片を添加したときの画像処理図である。大腸菌のフラゲリン遺伝子由来の配列を有するプローブに対応するスポットからのみ強い蛍光が発生し、かかる微生物の検出が可能であった。  図10（ａ）は、前記マイクロアレイに、複数種のクリプトスポリジウム由来の標識化DNA断片を添加したときの画像処理図である。上記複数種のクリプトスポリジウムの18ｓ ｒＤＮＡ遺伝子由来の配列（それぞれの列が、それぞれの種のクリプトスポリジウムを特徴付ける一塩基多型を検出する4種のプローブからなる）に対応するスポットは、一塩基多型のパターンに対応して、列を形成する何れかのプローブについてのみ強い蛍光が発生し、それぞれの種別に明確に検出・識別が可能であった。
【００９０】
図10（ｂ）は、クリプトストリジウムと大腸菌とを混合した被検試料から、本法に従って染色体ＤＮＡを抽出し、上述したのと同様に標識化DNA断片を得て、これを前記マイクロアレイに添加した結果である。クリプトスポリジウム全般に共通する保存領域（OWP遺伝子配列）由来の配列を有するプローブと大腸菌のフラジェリン遺伝子由来の配列を有するプローブとに対応するスポットからのみ強い蛍光が発生し、これら複数の微生物が混在した被検試料からもそれぞれの微生物の検出が可能であった。
【００９１】
図10（ｃ）は、デハロゲナーゼ遺伝子を持つ硫酸還元菌と大腸菌とを混合した被検試料から、本法に従って染色体ＤＮＡを抽出し、上述したのと同様に標識化DNA断片を得て、これを前記マイクロアレイに添加した結果である。硫酸還元菌のデハロゲナーゼ遺伝子由来の配列を有するプローブと大腸菌のフラジェリン遺伝子由来の配列を有するプローブとに対応するスポットからのみ強い蛍光が発生し、これら複数の微生物が混在した被検試料からもそれぞれの微生物の検出が可能であった。又、グラム陰性、陽性の何れの細菌においても、本法が適用可能であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】本発明のDNA抽出方法と従来法を比較した検討例１の結果を示す電気泳動図
【図２】タウロコール酸、デオキシコール酸および、グリココール酸のPCR増幅に与える影響を検討した検討例２の結果を示す電気泳動図
【図３】タウロコール酸、デオキシコール酸および、グリココール酸のPCR増幅に与える影響を検討した検討例２の結果を示す電気泳動図
【図４】本発明の方法により、C. parvum、C. murisの種識別的検出を行った結果を示す蛍光強度の画像処理図
【図５】図４のC. parvumの画像処理図をもとに相補的配列を特定した結果を示す図
【図６】レジオネラ細胞を被検試料として、本発明のDNA抽出方法と従来法を比較した結果を示す電気泳動図
【図７】ヒト培養細胞を被検試料として、本発明のDNA抽出方法と従来法を比較した結果を示す電気泳動図
【図８】ヒト血液を被検試料として、本発明のDNA抽出方法を用いた結果を示す電気泳動図
【図９】本発明の方法により、各種微生物の検出を行った結果を示す蛍光強度の画像処理図
【図１０】本発明の方法により、各種微生物の検出を行った結果を示す蛍光強度の画像処理図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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