(57)【要約】      （修正有）【課題】異なったトマト黄化壊疽ウイルス（ＴＳＷＶ）単離株による感染に抵抗するトランスジェニック植物を作出すること。【解決手段】ＴＳＷＶ-Ｂ ＳのＲＮＡをクローニングし、配列決定して、他のＴＳＷＶ単離株の公表されている配列と比較することによって該ＴＳＷＶ-Ｂを特徴付けする。ＴＳＷＶヌクレオキャプシドのためのヌクレオチド配列が記載され、ＴＳＭＶ単離株からの該ヌクレオキャプシドのヌクレオチド配列を含有するトランスジェニック植物は、異なる血清群からのトスポウイルスに対する抵抗性を付与することが示された。加えて、ＴＳＷＶのレタス単離株からのヌクレオキャプシドの ヌクレオチド配列を含有するトランスジェニック植物を作出し、多量のヌクレオキャプシド蛋白質を産生する植物は、同種単離株および遠縁のツリフネソウ壊疽斑点ウイルス（ＩＮＳＶ）の単離株双方に対して中レベルの保護を有していた。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのゲノムに挿入されたトランス遺伝子を含むトスポウイルス抵抗性植物であって、該トランス遺伝子は、トスポウイルスの全長ヌクレオキャプシド蛋白質の長さの少なくとも約半分であるヌクレオキャプシドポリペプチド断片をコードする翻訳可能または翻訳不可能ｍＲＮＡいずれかを発現し、ここに、該トランス遺伝子は、該トスポウイルスに対する抵抗性を該植物に付与することを特徴とする該植物。
【請求項２】
宿主植物にトランス遺伝子を挿入することを含み、該トランス遺伝子は、トスポウイルスの全長ヌクレオキャプシド蛋白質の長さの少なくとも約半分であるヌクレオキャプシドポリペプチド断片をコードする翻訳可能または翻訳不可能ｍＲＮＡいずれかを発現し、ここに、該トランス遺伝子は該トスポウイルスに対する抵抗性を宿主植物に付与することを特徴とするトスポウイルスによる感染に対する抵抗性を宿主植物に供する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
トスポウイルス属のウイルスは広範な植物種、特に、タバコ、ラッカセイ、蔬菜および観賞植物に感染する。２種のウイルス種、トマト黄化壊疽ウイルス(ＴＳＷＶ)およびツリフネソウ属壊疽斑点ウイルス(ＩＮＳＶ)は、トスポウイルス属に属すると認識されている。
【背景技術】
【０００２】
トマト黄化壊疽ウイルス(ＴＳＷＶ)は、核酸-蛋白質複合体がリポ蛋白質エンベロープによって覆われており、かつ唯一のアザミウマ媒介ウイルスである点において植物ウイルスの中では特異である。最近、このウイルスは、ブニヤウイルス科のトスポウイルス属に分類された。ＴＳＷＶウイルス粒子には、２９Ｋのヌクレオキャプシド蛋白質(「ＮＰ」または「Ｎ」)、２種の膜関連糖蛋白質(５８Ｋおよび７８Ｋ)、ならびに恐らくウイルス逆転写酵素のための大きな２００Ｋ蛋白質が含まれる[ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー(Ｊ.Ｇen.Ｖirol.)第７１巻：２２０７頁(１９９１年)；バイロロジー(Ｖirol.)第５６：１２頁(１９７３年)；およびジャーナル・ジェネラル・バイロロジー(Ｊ.Ｇen.Ｖirol.)第３６巻：２６７頁(１９７７年)参照]。そのウイルスゲノムは、Ｌ ＲＮＡ(８９００ヌクレオチド)、Ｍ ＲＮＡ(５４００ヌクレオチド)およびＳ ＲＮＡ(２９００ヌクレオチド))と命名される３本の負鎖(-)ＲＮＡよりなり[ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー(Ｊ.Ｇen.Ｖirol.)第３６巻：８１頁(１９７７年)；ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー(Ｊ.Ｇen.Ｖirol.)第５３巻：１２頁(１９８１年)；およびジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー(Ｊ.Ｇen.Ｖirol.)第７０巻：３４６９頁(１９８９年)参照]、その各々はＮＰによって包まれている。３種のＴＳＷＶ単離株からのＳ ＲＮＡの部分配列または全長配列によって、両側センス(ambisense)遺伝子配置を有する２つのオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)の存在が明らかとなった[ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー(Ｊ.Ｇen.Ｖirol.)第７１巻：１頁(１９９０年)およびジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー(Ｊ.Ｇen.Ｖirol.)第７２巻：４６１頁(１９９１年)参照]。大きな方のオープンリーディングフレームはウイルスＲＮＡ鎖上に位置し、５２Ｋの非構造蛋白質をコードする余地を有している。小さな方のＯＲＦはウイルスの相補的ＲＮＡ鎖上に位置し、サブゲノムＲＮＡを通して２９ＫのＮＰに翻訳される。
【０００３】
５８Ｋおよび７８Ｋの膜関連糖蛋白質をコードするオープンリーディングフレームでの両側センス鎖暗号化戦略も、ＴＳＷＶ Ｍ ＲＮＡに特徴的である。ＴＳＷＶ Ｌ ＲＮＡは、恐らくはウイルス逆転写酵素のための大きな２００Ｋ蛋白質をコードすることが配列決定されている。
【０００４】
２種のＴＳＷＶ血清群である「Ｌ」および「Ｉ」が、構造蛋白質の血清学的分析および細胞病理学的な構造の形態学に基づいて同定され特徴付けられている[ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー(Ｊ.Ｇen.Ｖirol.)第７１巻：９３３頁(１９９０年)およびファイトパソロジー(Ｐhytopathology)第８１巻：５２５頁(１９９１年)参照]。それらは、血清学的に保存されたＧ１およびＧ２糖蛋白質を有しているが、「Ｉ」血清群のＮＰは「Ｌ」血清群のものとは血清学的に異なる。「Ｌ」および「Ｉ」血清群の間でＮＰを比較した結果、ヌクレオチドおよびアミノ酸のレベルで各々６２％および６７％の同一性が示された(ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー(Ｊ.Ｇen.Ｖirol.)第７２巻：２５９７頁(１９９１年)参照]。
【０００５】
ＴＳＷＶは広範な宿主範囲を有し、５０科の３６０植物種を超える植物に感染して、蔬菜および観賞植物に重大な経済的損失を全世界的に引き起こしている。「Ｌ」血清群が蔬菜およびタバコのごとき農作物に幅広く認められる一方、「Ｉ」血清群は観賞作物にたいてい限定されている。スイカおよび他のウリ科植物に全身感染し、かつそのＮＰはいずれの血清群のものとも血清学的に関連性がないために、区別される単離株としてウリ科植物単離株が最近同定された[プラント・ディジーズ(Ｐlant Ｄisease)第６８巻：１００６頁(１９８４年)参照]。抵抗性植物の育種または非遺伝的方法によってＴＳＷＶ病の拡大を低下させることが時々できることもあるが、これらの慣用的方法による病害の完全な制御は一般的に困難であることが証明されている[プラント・ディジーズ(Ｐlant Ｄisease)第７３巻：３７５頁(１９８９年)]。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
１９８６年以来、ウイルスの外皮蛋白質(ＣＰ)遺伝子を導入したトランスジェニック植物が該ウイルスによる感染に対してしばしば抵抗性を示すことを、膨大な報告が示してきた。この現象は、通常、外皮蛋白質-媒介保護(ＣＰＭＰ)と呼ばれている。保護の程度は、病徴発現の遅延から病徴およびウイルス蓄積の欠如までに及ぶ。最近の２報の独立した報告[バイオル・テクノロジー(Ｂiol.Ｔech-nology)第９巻：１３６３頁(１９９１年)およびモレキュラー・アンド・プラント-マイクローブ・インタラクションズ(Ｍol.Ｐlant-Ｍicrobe Ｉnteract.)第５巻:３４頁(１９９２年)]は、ＴＳＷＶのヌクレオキャプシド蛋白質(ＮＰ)遺伝子を発現するトランスジェニック・タバコ植物が同種の単離株による感染に対して抵抗性を示すことを示した。しかしながら、ＴＳＷＶは多種の生物的に多様な株に拡散しているため、異なったＴＳＷＶ単離株による感染に抵抗するトランスジェニック植物の有効性を試験することが非常に重要である。本発明の知見は、本発明によるトランスジェニック植物が、「Ｌ」血清群の２種の異種単離株および「Ｉ」血清群の１種の単離株に対して抵抗性を示したことを証明することによって、先行の報告のものを超えるものである。本発明者らは、高レベルのＮＰを蓄積するトランスジェニック植物が「Ｉ」血清群の単離株に抵抗性を示す一方、たとえあるとしても非常に低いレベルＮＰしか蓄積していない植物において、「Ｌ」血清群の２種の異種単離株に対する抵抗性が主に認められたことも示す。
【０００７】
しかしながら、高レベルのＮＰ蛋白質を蓄積する植物が病徴発現の遅延を示したにも拘わらず、ブラジリアン(Ｂrazilian)単離株に対する抵抗性は認められなかった。ＴＳＷＶ-Ｂと命名されたこのブラジリアン単離株は、「Ｌ」および「Ｉ」血清群とは血清学的に区別されるＮ蛋白質を有し、ＴＳＷＶ-Ｂがメロンおよびカボチャに全身感染しない点においてウリ科単離株とは生物学的に異なる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明の１つの態様は、ＴＳＷＶ-Ｂ ＳのＲＮＡをクローニングし、配列決定して、他のＴＳＷＶ単離株の公表されている配列と比較することによって該ＴＷＶ-Ｂを特徴付けすることである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の種々の態様は、以下の実施例、図面およびデータを包含する本発明の詳細な説明から容易に明らかとなるであろう。
図１は、本発明によるウイルスＲＮＡからＮＰ遺伝子をクローニングするための戦略を示す図である。
図２は、タバコ・プロトプラストにおける本発明によるトマト黄化壊疽病ウイルスのヌクレオキャプシド蛋白質(ＮＰ)遺伝子のイン・ビボ(in vivo)経時的発現を示す図である。
図３は、本発明によるＴＳＷＶ-Ｂ Ｓ ＲＮＡにおける、配列決定したｃＤＮＡクローンの位置を示す図である。
図４は、本発明によるＴＳＷＶ単離株の中での関係を示す樹系図である。
図５は、本明細書に記載したＴＳＷＶ単離株の血清学的な関係を示す図である。
図６は、トランスジェニック植物におけるヌクレオキャプシド蛋白質(ＮＰ)の蓄積のレベルとＴＳＷＶ単離株に対する抵抗性の度合との相関を示す図である。
図７は、本発明の１つの態様によりトランスジェニック植物に導入したＴＳＷＶ-ＢＬ Ｎ暗号配列を示す図である。
図８は、本発明の１つの態様によりトランスジェニック植物に導入したＴＳＷＶ-ＢＬの半分のＮ遺伝子断片を示す図である。
【００１０】
さらに詳細には、図２は、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を用いてタバコ葉肉プロトプラストに構築物が移入されたＮＰ遺伝子の経時的発現を図示している。続いて、ＮＰ遺伝子を発現させるためにその形質転換プロトプラストを２日間インキュベートした。プロトプラストから蛋白質を抽出し、ＴＳＷＶ ＮＰに対する抗体を用いた二重抗体サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ＤＡＳ-ＥＬＩＳＡ)によってＮＰについて試験した。ＮＰ−およびＮＰ＋は、各々プラスミドｐＢＩ５２５-ＮＰ−およびｐＢＩ５２５-ＮＰ＋で形質転換したプロトプラストを表す。コーティング用の抗体濃度は５μｇ/ｍl、酵素結合物の希釈率は１：２５０である。データは、基質添加後３０、６０および９０分に収集した。
【００１１】
図３において、５つの重複ｃＤＮＡクローンは、ＴＳＷＶ-ＢのＳ ＲＮＡ地図以下の尺度で示されている。これらのクローンは、ＴＳＷＶ-Ｂに感染したエヌ・ベンサミアーナ(Ｎ.benthamiana)から単離した二本鎖ＲＮＡからのランダムプライマーで合成した。
【００１２】
図４において、配列は、ＧＣＧシークエンス・アナリシス・ソフトウェア・パッケージ(ＧＣＧ Ｓequence analysis software package)のパイルアップ・プログラムを用いて比較した。水平線は遺伝子距離に比例するが、垂直線は任意の長さであり、有意性はない。
【００１３】
さらに詳細には、図５において、エヌ・ベンサミアーナ・ドミン(Ｎ.benthamianaＤomin)をＴＳＷＶ単離株[ＴＳＷＶ-ＢＬ(レタス単離株)、アルカンサス(Ａrkansas)、１０Ｗ体菜(pakchoy)(ＴＳＷＶ-１０Ｗ))、ベゴニアおよびブラジル(ＴＳＷＶ-Ｂ)]で感染させた。感染リーフディスク(０.０５ｇ)を１２ｍlの酵素結合緩衝液中にて摩砕し、ＴＳＷＶ-ＢＬビリオン(ＢＬ ビリオン)、またはＴＳＷＶ-ＢＬのＮＰ(ＢＬ-ＮＰ)もしくはＴＳＷＶ-ＩのＮＰ(Ｉ-ＮＰ)に対して生起させた抗体を用いるＤＡＳ-ＥＬＩＳＡにより分析した。コーティング用の抗体濃度は１μｇ/ｍl；ＢＬウイルス粒子については結合物の希釈率は１:２０００、ＢＬ-ＮＰについては希釈率は１:２５０、Ｉ-ＮＰについては希釈率は１:１０００であった。基質添加後１０分(ＢＬ)、５０分(ＢＬ-ＮＰ)または３０分に結果を収集した。
【００１４】
図６に関しては、ＴＳＷＶ-ＢＬのＮＰに対して生起させた抗体でＮＰ蓄積につきＤＡＳ-ＥＬＩＳＡでトランスジェニック植物をアッセイした。植物を基質添加後１５０分に判読し、該トランスジェニック植物を４つのカテゴリーにグループ分けした：０.０５０より低いＯＤ４０５ｎｍ値、０.０５０ないし０.２００の間のＯＤ４０５ｎｍ値、０.２００ないし０.４００の間のＯＤ４０５ｎｍ値、および０.４００よりも高いＯＤ４０５ｎｍ値。対照ＮＰ(-)植物のＯＤ４０５ｎｍ判読値は０ないし０.０５であった。同一の植物をアルカンサス(Ａrk)および１０Ｗ体菜(１０Ｗ)単離株またはベゴニア単離株で攻撃し、各植物の感受性を接種約１２日後に記録した。結果は、アルカンサスおよび１０Ｗチュウゴクキャベツ単離株で接種した５１個体のＲ１ ＮＰ(＋)植物、およびベゴニア単離株で接種した１３９個体のＲ１ ＮＰ(＋)植物から収集した。バー上の数字は、試験したＲ１ ＮＰ(＋)植物の合計数を表す。
【００１５】
実施例Ｉ
ＴＳＷＶ-ＢＬ ＲＮＡの単離：
ＴＳＷＶ-ＢＬ単離株は、ダチュラ・ストラモニウム・エル(Ｄatura stramonium Ｌ.)から以下のごとく精製した：感染組織を３倍容量の緩衝液(０.０３３ＭのＫＨ２ＰＯ４、０.０６７ＭのＫ２ＨＰＯ４、０.０１ＭのＮａ２ＳＯ３)と共にワーリング・ブレンダーで４５秒間摩砕した。そのホモジネートを前記緩衝液で湿らせた４層のチーズクローズを通して濾過し、７,０００ｒｐｍにて１５分間遠心した。そのペレットを組織の元の重量に等しい量の０.０１Ｍ Ｎａ２ＳＯ３に再懸濁し、８,０００ｒｐｍにて１５分間再度遠心した。その後に、上清を元の組織重量の１/１０に等しい量の０.０１Ｍ Ｎａ２ＳＯ３に再懸濁した。そのウイルス抽出液を９,０００ｒｐｍにて１５分間遠心し、その上清を、０.０１ＭのＮａ２ＳＯ３中に作成した１０-４０％スクロース段階勾配上に注意深く負荷した。２３,０００ｒｐｍにて３５分間遠心した後に、ウイルスゾーン(メニスカスより約３ｃｍ下)を採取し、２倍容量の０.０１Ｍ Ｎａ２ＳＯ３で希釈した。その半-精製ウイルスを２７,０００ｒｐｍにて５５分間ペレット化した。
【００１６】
実施例ＩＩ
ＴＳＷＶおよびウイルスＲＮＡの精製
ＴＳＷＶ-ＢＬ単離株[プラント・ディジーズ(Ｐlant Ｄisease)第７４巻：１５４頁(１９９０年)]は、実施例Ｉに記載のごとく、ダチュラ・ストラモニウム・エル(Ｄatura stramonium Ｌ)から精製した。０.０４％のベントナイト、１０μg/mlのプオテイナーゼＫ、０.１Ｍの炭酸アンモニウム、０.１％(ｗ/ｖ)のジエチルチオカルバミン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１％(ｗ/ｖ)のドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)の溶液中に精製したウイルスを再懸濁し、６５℃にて５分間インキュベートして、直ちにＨ２Ｏ-飽和フェノールから抽出し、続いてさらにクロロホルム/イソアミルアルコール(２４:１)から抽出した。ウイルスＲＮＡを２.５容量のエタノール中に沈殿させ、蒸留水に溶解した。
【００１７】
実施例ＩＩＩ
ｃＤＮＡおよびＰＣＲに基づくＮＰ遺伝子のクローニング：
第一鎖ｃＤＮＡは、グブラー(Ｇubler)およびホフマン(Ｈoffman)により記載されているランダム・プライマーを用いて、精製したＴＳＷＶ-ＢＬのＲＮＡから合成した[ジーン(Ｇene)第２５巻:２６３頁(１９８３年)参照]。第二鎖は、ＲＮアーゼ Ｈ/ＤＮＡポリメラーゼで試料を処理することにより作製した。得られた二重鎖ｃＤＮＡ試料を、スクロース濃度勾配遠心法によりサイズ-分画し、ＥcoＲＩメチラーゼによりメチル化し、ＥcoＲＩリンカーを付加した。ＥcoＲＩで消化した後に、子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理することによってその５'-末端リン酸基が除去されているｐＵＣ１８のＥcoＲＩ部位に、ｃＤＮＡ試料を連結した。イイ・コリ(Ｅ.coli)ＤＨ５αコンピテント・セル(ベセスダ・リサーチ研究所(Ｂethesda Ｒesearch Ｌaboratories))を形質転換し、ＴＳＷＶのｃＤＮＡインサートを含むクローンを、５０μｇ/ｍlのアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ-ｇａｌを含有する寒天培地上に平板培養することによって一次選抜した。アルカリ溶解法を用いて、選抜クローンからプラスミドＤＮＡを単離し[ビイアールエル・フォーカス(ＢＲＬ Ｆocus)第１１巻：７頁(１９８９年)参照]、ＥcoＲＩ制限酵素消化に続くジーンスクリーン・プラス(ＧeneＳcreen Ｐlus)・ナイロンフィルター(デュポン社(ＤuＰont))上へのＤＮＡトランスファーによってインサートのサイズを測定した。ＴＳＷＶ-ＢＬ Ｓ ＲＮＡのｃＤＮＡインサートを含むプラスミドクローンは、以下に記載するごとく、ＴＳＷＶ-ＣＰＮＨ１ Ｓ ＲＮＡのヌクレオチド配列(ＧＣＡＡＧＴＴＣＴＧＣＧＡＧＴＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴ)に相補的な３２Ｐ-標識オリゴマー(ＡＧＣＡＧＧＣＡＡＡＡＣＴＣＧＣＡＧＡＡＣＴＴＧＣ)に対するハイブリダイゼーションによって同定した[ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー(Ｊ.Ｇen.Ｖirol.)第７１巻：００１頁(１９９０年)参照]。幾つかのクローンをアガロースゲル上で同定し分析して、インサートのサイズを測定した。クローンｐＴＳＷＶＳ-２３は、約１.７ｋｂの長さの最も大きなｃＤＮＡインサートを含んでいることが判明した。
【００１８】
ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)を使用することにより全長ＮＰ遺伝子を得た。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、ＴＳＷＶ ＮＰ遺伝子の５'末端(ＴＳＷＶ-ＣＰＮＨ１のヌクレオチド２５７１ないし２７７３位)においてＳ ＲＮＡに相補的である(ＴＳＷＶ-１０Ｗのヌクレオキャプシド遺伝子を合成するのにも用いた)オリゴマー・プライマーＪＬＳ９０-４６(５'-＞３')ＡＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＴＡＡＧＣＴＣＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＧＣを用いて、２０μl反応混合液中、３７℃にて３０分間で行った。その反応混合物には、１.５μlのウイルスＲＮＡ、１μｇのオリゴマー・プライマー、０.２ｍＭの各ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液(ジーンアンプ・キット(ＧeneＡmp kit)、パーキン-エルマー-シータス社(Ｐerkin-Ｅlmer-Ｃetus))、リボヌクレアーゼ・インヒビター中の２０ＵのＲＮＡ(プロメガ社(Ｐromega))、２.５ｍＭのＭgＣl２、および２５ＵのＡＭＶ逆転写酵素(プロメガ・コーポレイション(Ｐromega Ｃorporation))が含まれていた。９５℃にて５分間加熱することによって反応を終了させ、氷上にて冷却した。次いで、各１μｇのオリゴマープライマーＪＬＳ９０-４６およびＪＬＳ９０-４７(５'-＞３')、(ＴＳＷＶ-１０Ｗのヌクレオチド遺伝子を合成するのにも用いた)(後者のオリゴマーは該遺伝子の３'非コーディング領域(ＴＳＷＶ-ＣＰＮＨ１の１９１９ないし１９３８のヌクレオチド位)のＳ ＲＮＡと同一である)を用いる業者の取り扱い説明書(パーキン-エルマー-シータス社(Ｐarkin-Ｅlmer-Ｃetus))に従って、１０μlのｃＤＮＡ/ＲＮＡハイブリッドを用いてＮＰ遺伝子をＰＣＲ増幅させた。典型的なＰＣＲサイクルは、９２℃にて１分間(変性)、５０℃にて１分間(アニーリング)、および７２℃にて２分間(重合)であった。試料は、１.２％アガロースゲル上に直接負荷して分離させた。分離したＮＰ遺伝子断片をアガロースゲルから抽出し、エタノール沈殿し、２０μlの蒸留水に溶解した。
【００１９】
実施例ＩＶ
植物発現ベクターおよび植物形質転換ベクターの構築
実施例ＩＩＩからゲル単離したＮＰ遺伝子断片を、５０μl反応緩衝液[５０ｍＭのトリス-ＨＣl(ｐＨ８.０)、１０ｍＭのＭｇＣl２、０.１ＭのＮａＣl]中の制限酵素ＮcoＩで３７℃にて３時間消化し、ＮcoＩで消化した植物発現ベクターｐＢ１５２５に直接クローン化した。得られたプラスミドを同定し、カリフラワー・モザイク・ウイルス(ＣaＭＶ)３５Ｓプロモーターに対してセンス向きであるプラスミドをpＢ１５２５-ＮＰ＋と命名し、逆向きであるものをpＢ１５２５-ＮＰ−と命名した。パン(Ｐang)らにより記載されているごとく[ジーン(Ｇene)、第１１２巻：２２９頁(１９９２年)参照]、ニコチアナ・タバカム(Ｎicotiana tobacum)プロトプラストにおけるＮＰ遺伝子の経時的発現により、この発現カセットのＮＰ産生能を測定した。次いで、(ＮＰ遺伝子は内部ＨindＩＩＩおよびＥcoＲＩ部位を含んでいるため)ＨindＩＩＩ/ＥcoＲＩでの部分消化によって、ＮＰ遺伝子を含有する発現カセットをｐＢ１５２５-ＮＰ＋から切り出し、同酵素で切断した植物形質転換ベクターpBIN１９(クロンテック・ラボラトリーズ,インコーポレイティド(Ｃlontech Ｌaboratories,Ｉnc.))に連結した。ホルスターズ(Ｈolsters)らにより記載されている方法[モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス(Ｍol.Ｇen.Ｇenet.)第１６３巻：１８１頁(１９７８年)参照]を用いて、得られたベクターｐＢＩＮ１９-ＮＰ＋および対照プラスミドｐBIN１９をエイ・チュメファシエンス(Ａ.tumefaciens)ＬＢＡ４４０４株に移入した。
【００２０】
クローンｐＴＳＷＶ-２３およびＰｂ１５２５-ＮＰ＋中のインサートのヌクレオチド配列分析は、ジデオキシ法、Ｔ７ポリメラーゼ(ユウエス・バイオケミカルズ社(Ｕ.Ｓ.Ｂiochemicals)、シークエナーゼ(Ｓequenase)ＴＭ)、ならびにシーミニアック(Ｓiemieniak)らにより記載されている二重鎖配列決定法[アナリティカル・バイオケミストリー(Ａnalyt.Ｂiochem.)第１９２巻：４４１頁(１９９１年)参照]を用いて測定した。ヌクレオチド配列は双方のＤＮＡ鎖から決定し、この情報をジェネティクス・コンピューター・グループ(ジイシイジイ(ＧＣＧ),ワイオミング州・マジソン(Ｍadison,ＷＩ))から販売されているコンピューター・プログラムを用いて、ＴＳＷＶ単離株ＣＰＮＨ１の公表されている配列と比較した。
【００２１】
タバコ・プロトプラストにおけるＮＰ遺伝子の経時的発現も調製した。大規模アルカリ法(large scale alkaline method)を用いて、クローンｐＴＳＷＶＳ-２３および(ＰＣＲ-構築ＮＰ遺伝子インサートを含んでいる)ｐＵＣ１８cpphasＴＳＷＶ-ＮＰについてのプラスミドＤＮＡを単離した。ＮcoＩ消化によってＰＣＲ-構築ＮＰ遺伝子インサートをクローンｐＢＩＮ２５-ＮＰ＋から切り出して、販売されている配列決定用のフランギング・オリゴマー・プライマーを利用した。発現カセットpUC１８cpphasは、ファゼオラス・ブルガリス(Ｐhaseolus vulgaris)種子貯蔵遺伝子であるファゼオリン由来のポリ(Ａ)付加シグナルをそれが利用する点を除いて、ｐＵＣ１８cpexpに同様である。これらのプラスミドＤＮＡを、ベックマンＴｉ ７０.１固定角ローターを用いて、２つのＣsＣl-エチジウムブロミド勾配分画に付した。ＤＮＡ配列は、前記したジデオキシ法および二重鎖プラスミドＤＮＡ配列決定法を用いて得た。ヌクレオチド配列反応物を１ｍ長のサーモスタット制御された(５５℃)配列決定用ゲル上で電気泳動し、平均約７５０ｂｐのヌクレオチド配列の読みを得た。ヌクレオチド配列は、双方のクローン化インサートの双方のＤＮＡ鎖から決定して、精度を確認した。ＴＳＷＶ-ＢＬ Ｓ ＲＮＡ単離株からのヌクレオチド配列情報を、以下に論じるごとく、コンピューター・プログラム(ジイシイジイ(GCG)、ワイオミング州・マジソン(Ｍadison,ＷＩ))を用いてＴＳＷＶ単離株ＣＰＮＨ１およびＬ３と比較した。
【００２２】
ＴＳＷＶ-ＢＬ Ｓ ＲＮＡのクローン化ｃＤＮＡおよびＰＣＲ-構築インサートのヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列ならびに、それらとＴＳＷＶ-ＣＰＨＮ１ Ｓ ＲＮＡのヌクレオチド配列との比較を以下に示す。シーミニアック(Ｓiemieniak)の二重鎖ジデオキシ配列決定法を用いてＴＳＷＶ-ＢＬ Ｓ ＲＮＡクローンｐＴＳＷＶＳ-２３(ＴＳＷＶ-２３)およびｐＢＩ１５２５-ＮＰ＋(ＴＳＷＶ-ＰＣＲ)のヌクレオチド配列を得、ジーンバンク(ＧeneＢank)登録番号Ｄ００６４５に報告されているＴＳＷＶ-ＣＰＮＨ１ Ｓ ＲＮＡのヌクレオチド配列の関連領域と比較した。ＴＳＷＶ-ＣＰＮＨ１ Ｓ ＲＮＡのヌクレオチド配列は、ド・ハーン(Ｄe Ｈaan)(１９９０年)により報告されており、以下の配列によって表される：
【００２３】
【化１】
2006006338.tif 000002
【００２４】
ＴＳＷＶ-ＣＰＮＨ１ Ｓ ＲＮＡ上の非構造蛋白質遺伝子の不完全な予想アミノ酸配列は、１位の核酸で始まり７８３位で終了する核酸コドンで終了し、これを以下に掲げる：
【００２５】
【化２】
2006006338.tif 000003
【００２６】
以下に図示するＴＳＷＶ-２３のヌクレオチド配列は、前記で得られたＴＷＳＶ配列と酷似しており、非構造遺伝子の１/２とヌクレオキャプシド蛋白質遺伝子の１/２を含んでいる。
【００２７】
【化３】
2006006338.tif 000004
【００２８】
以下に図示する本発明によるＴＳＷＶ-ＰＣＲの核酸配列も、前記で得られたＴＳＷＶ配列と酷似しており、ヌクレオキャプシド蛋白質遺伝子の全体をカバーしている。
【００２９】
【化４】
2006006338.tif 000005
【００３０】
合わせて、クローン化ＴＳＷＶ-２３インサートはＴＳＷＶ-ＰＣＲインサートと重複しており、合わせて、それらは本発明によるＴＳＷＶ-ＢＬ Ｓ ＲＮＡの２０２８個のヌクレオチドを表している。本発明によるこの２０２８個のヌクレオチド配列は、非構造遺伝子の一部分とヌクレオキャプシド蛋白質遺伝子の全体を含んでいる。合わせた配列は以下の通りである：
【００３１】
【化５】
2006006338.tif 000006
【００３２】
この比較により、クローンｐＴＳＷＶＳ-２３のｃＤＮＡインサートが約７６０ｂｐの５２Ｋ蛋白質のウイルス成分遺伝子、完全な遺伝子間(intergenic)領域(４９２ｂｐ)、および４５０ｂｐのＮＰ遺伝子(ＮＰ遺伝子の約半分)を含んでいることが示された。このクローン化インサートは、ＥcoＲＩ認識部位に正確に位置するその３'-末端を有しており、このことはｃＤＮＡクローニング工程の間の不完全なＥcoＲＩメチル化を示している。このクローンは完全なＴＳＷＶ-ＢＬのＮＰ遺伝子を含んでいないにも拘わらず、ＰＣＲ遺伝子構築ＮＰ遺伝子の配列と４５０ｂＰの重複をそれが有するため(ＴＳＷＶにつき、全２０２８ｂｐのＴＳＷＶ-ＢＬ Ｓ ＲＮＡがヌクレオチド配列中に示されている)、その配列はかなり重要であった。このＴＳＷＶ-ＢＬ ＰＣＲ-構築およびＴＳＷＶ-ＣＰＮＨ１ ＮＰ 遺伝子の間の配列比較により、合計２１ヌクレオチドの相違(２.７％)、およびその内の８個がアミノ酸置換(３.１％)をコードしているが明らかとなった。突然変異が導入されることが知られているＴaqポリメラーゼを用いてこのＰＣＲ構築ＮＰ遺伝子を得たため、これらの相違のうち幾つかはＰＣＲ増幅の間に導入された可能性がある。しかしながら、これらのヌクレオチド相違のうち１５個は、ＴＳＷＶ-ＢＬ ｃＤＮＡおよびＰＣＲクローンの間の重複領域内に位置し、これらのヌクレオチド相違の１つ(ＴＳＷＶの１７０２位;ＴＳＷＶ-ＰＣＲの４８５位)を除く全ては、双方のＴＳＷＶ-ＢＬ Ｓ ＲＮＡ起源のクローンによって共に保有されている。この比較は、これらの２つのクローン化ＮＰ遺伝子領域のヌクレオチド配列間の差異に全くそうではないにせよ大いには寄与しないことを明らかに示した。１７０２位におけるヌクレオチドの差異の結果、ＩleとＳerとのアミノ酸置換が起こり、この差異でさえＴＳＷＶ-ＢＬ単離株内の相同性の欠如によるものであろう。
【００３３】
実施例Ｖ
アグロバクテリウム媒介形質転換：
アグロバクテリウム株ＬＡＢ４４０４（クロン・テク（Clon Tech))の液状培地中に一晩浸漬することによって、ベクターｐＢｌＮ１９−ＮＰ＋または対照プラスミドｐＢｌＮ１９を含有する該アグロバクテリウム株と共にニコチアーナ・タバカム・バール・ハバナ・シイブイ(Ｎicotiana tabacum var Ｈavana cv)４２３の葉ディスクをインキュベートし、該接種したリーフディスクを非選択的ＭＳ培地上で３日間インキュベートした[サイエンス(Ｓcience)第２２７巻:１２２９頁(１９８５年）参照]。形質転換した細胞を選択し、苗条再生のために、３００μｇ/ｍlカナマイシンおよび５００μｇ/ｍlカルベニシリンを含有するＭＳ培地中で再生させた。小植物を無ホルモン培地に移した後、根を誘導した。根が出た形質転換体を土壌に移し、温室条件下で成長させた。該ＭＳ培地は、十分な強度のＭＳ塩（シグマ社（Ｓigma))、３０ｇ/lのグルコース、１ｍｇ/lのＢＡおよび１ｍlのＢ５ビタミン［１ｍｇ/ｍlのニコチン酸、１０ｍｇ/ｍlのチアミン(ＨＣｌ)、１ｍｇ/ｍlのピリドキシン（ＨＣｌ）、１００ｍｇ/ｍlのＭyo−イノシトール]を含有する。トランスジェニック植物を自家受粉させ、種子をカナマイシン培地上で選択的に発芽させた。
【００３４】
実施例ＶＩ
蛋白質の血清学的検出：
二重抗体サンドイッチ酵素結合免疫吸着法（ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ）を用いて、ＴＳＷＶ−ＢＬ ＮＰに対するポリクローナル抗体でトランスジェニック植物におけるＮＰ遺伝子の発現を検出した。各試料は、酵素結合緩衝液［リン酸緩衝セーライン、０.０５％ツイーン(Ｔween)２０、２％ポリビニルピロリドン４０、および０.２％オバルミン］の３ｍl中で、植物の頂部第２葉からのリーフディスク（約０.０５ｇ）を摩砕することによって調製した。タバコ・プロトプラストについては、遠心後の細胞抽出物をアッセイで直接用いた。トランスジェニック植物およびタバコ・プロトプラスト双方からの試料の１０倍および３倍希釈物をＤＡＳ−ＥＬＩＳＡの直前に作成した。
【００３５】
ウェスタンブロットについては、２×ＳＤＳ/試料緩衝液（０.１２６Ｍ トリス緩衝液、２０％グリセロール、２％ＳＤＳ、２％２−メルカプトエタノール、および０.０１ｍｇ/ｍlブロモフェノールブルー）の０.２５ｍl中でリーフディスク（約０.０５ｇ）を摩砕した。該ホモジネートを遠心し、負荷の前に上清を沸騰させた。蛋白質（１０〜２０μl試料/レーン）を分離し、膜上にブロットした。次いで、製造業者のimmunoselectキット指示マニュアル（ジブコ・ビイアールエル・ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（Ｇibco BRL Life Technologies Inc.)）に従って該膜を加工した。全ウイルス粒子に対する抗体を健康なタバコ植物からの細胞抽出物で予め吸収させ［プラント・ディジーズ（Ｐlant Ｄisease)第７０巻：５０１頁(１９８６年）参照]、２μｇ/ｍlの濃度にてウェスタンブロットで用いた。
【００３６】
ＴＳＷＶ−ＢＬウイルス粒子、またはＴＳＷＶ−ＢＬもしくはＴＳＷＶ−１に対して生起させた抗体を用い、ＴＳＷＶ単離株（ＴＳＷＶ−ＢＬ、アルカンサス、１０Ｗ体菜、ベゴニアまたはブラジル）の血清学的反応をＤＡＳ−ＥＬＩＳＡで検定した。
【００３７】
実施例ＶＩＩ
ＴＳＷＶ単離株でのトランスジェニック植物の接種
接種物は、ニコチアナ・ベンタミアナ・ドミン（Ｎicotiana benthamiana Ｄomin.)を異なるＴＳＷＶ単離株で感染させ、緩衝液（０.００３Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０.０６７Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４および０.０１Ｍ Ｎａ２ＳＯ３）１５ｍl中でエヌ・ベンタミアナ植物の感染させた葉（０.５ｇ）を摩砕する（接種１ないし２週間後）ことによって調製した。接種抽出物を、トランスジェニック植物のコランダム散布葉上で直ちに擦り、接種した葉を引き続いて水で濯いだ。ＴＳＷＶは摩砕後イン・ビトロでは高度に不安定であるので、接種物の各バッチを用いて、ＮＰ遺伝子を含有するＮＰ(+)植物をまず接種し；各接種物の最後の接種植物は、常に、ベクター配列単独を含有する対照ＮＰ(-)植物であって、特定のウイルス接種物はなお接種の最後において感染性であることを確実とした。
【００３８】
接種７〜１５日後に、局所病巣および全身感染についてのデータを採り、特に示す以外は、接種した植物の数にわたる全身感染した植物の数として以下の表に表した。この表において、「ＥＬＩＳＡ」の下で収集したデータは、それからＲ１植物が由来するＲ０系のデータであり；ベゴニア単離株はＲ１植物に局所病巣を誘導し、および抵抗性は、接種した植物の数にわたる局所病巣生成植物の数として表し；ＮＴはテストをしなかったことを示す。
【００３９】
ウイルス（ＴＳＷＶ）をスポットしたタバコのヌクレオキャプシド蛋白質
（ＮＰ）遺伝子を発現するＲ１植物のＴＳＷＶ単離株での接種に対する反応
ＴＳＷＶ単離株に対する反応
エライザ
(Ｒ０pl.)   BL   アルカンサス  10W体菜     ベゴニア    ブラジル
Ｒ０系
NP(+)    0.015     0/10      4/25       3/24        29/40       36/36
NP(+)4   0.386     6/30     21/23      18/21         9/48       42/42
NP(+)9   0.327     0/20      NT        20/20          -           -
NP(+)14  0.040     0/20       -         9/20         8/18       18/18
NP(+)21  0.042     0/15      5/15       3/15         2/4         6/6
NP(+)22  0.142     0/20       -        15/20        31/36       36/36
NP(+)23  0.317     0/20       -        16/20          -           -
NP(-)      -      42/42     24/24      62/62        66/66       54/54
【００４０】
前記したごとく、ＴＳＷＶのＳ ＲＮＡ成分中に存在するＴＳＷＶ−ＢＬ ＮＰ遺伝子の単離株は、２つの戦略を用いてアプローチした。ｃＤＮＡクローニング戦略は、ＴＳＷＶ−ＣＰＮＨ１ Ｓ ＲＮＡに相補的なオリゴマープローブに対するハイブリダイゼーションによって同定したところによると、ＴＳＷＶ−ＢＬ Ｓ ＲＮＡに由来するｃＤＮＡインサートを含有するいくつかのクローンを生じた。クローンｐＴＳＷＶＳ−２３は、約１.７ｋｂ長さにマップされる最長インサートを含有していた。第２の戦略は、ＴＳＷＶ−ＣＰＮＨｌ Ｓ ＲＮＡの公表された配列、および直接全ＴＳＷＶ−ＢＬ ＲＮＡからの発現のためにＮＰ遺伝子を増幅し、作成するＰＣＲを利用した。オリゴマープライマーＪＬＳ９０−４６および−４７を合成し、ＪＬＳ９０−４６はＮＰ遺伝子の５’暗号領域中のＳ ＲＮＡに相補的であり（ＴＳＷＶ−ＣＰＮＨ１の２０５１〜２０７３位）、一方、ＪＬＳ９０−４７はＮＰ遺伝子の３’非暗号領域のものである(ＴＳＷＶ-ＣＰＮＨ１の１２１８〜１２３７位）。両プライマーは、引き続いてのクローニングのための制限酵素Ｎｃｏ１についての認識部位を含有し、プライマーＪＬＳ９０−４６は植物コンセンサス翻訳開始コドン配列（ＡＡＸＸＡＴＧＧ）を有し、これは、翻訳に際して、ＮＰ遺伝子の第３コドン（ＧＴＴ）に翻訳開始コドンを融合させることが期待された。翻訳開始コドンのＴＳＷＶ−ＢＬ ＮＰ遺伝子の第３コドンへの融合を行って、いずれのアミノ酸コドンも取り込むことなくＮcoＩ認識部位を保持した。かくして、ＰＣＴで作成したＴＳＷＶ ＮＰ遺伝子の発現は、天然ＮＰよりもＮ末端で２のアミノ酸(Ｓer-Ｌys)だけ短いＴＳＷＶ-ＢＬ ＮＰを生じるであろう。
【００４１】
この特異的に増幅させた約８５０ｂｐのＤＮＡ断片をＮcoＩで消化し、植物発現ベクターｐＢ１５２Ｓにクローンした。ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターに対するＴＳＷＶ−ＢＬ ＮＰ遺伝子の向きは、制限酵素部位マッピング（ＥcoＲＩ、ＨindＩＩＩ、ＡvaＩおよびＡiwＮ１）によって決定した。適当な向きでインサートを含有するいくつかのクローンを単離し（ｐＢ１５２５−ＮＰ＋）、他のものは反対の向きでインサートを含有した（ｐＢ１５２５−ＮＰ−）。また、この制限酵素部位マッピングは、クローンｐＢ１５２５−ＮＰ＋のインサートが、ＴＳＷＶ-ＣＰＮＨ１ ＮＰ遺伝子で見い出されるものと同一の制限酵素部位を含有することを示した。かくして、ＴＳＷＶ−ＢＬ ＮＰ遺伝子の発現は、発現ベクターｐＢ１５２５のアルファルファモザイクウイルス（ＡＬＭＶ）の５’−非翻訳リーダー配列に融合した二重ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターによって制御された。重ねた二重ＣａＭＶ ３５Ｄプロモーター要素を利用する発現ベクターは、単一の３５Ｓプロモーター要素を利用する同様のベクターよりも高レベルのｍＲＮＡ転写を生じる。
【００４２】
３つのｐＢ１５２５−ＮＰ＋クローンを一時的にタバコ・プロトプラストで発現させて、増幅されたＤＮＡ断片がＮＰをコードすることを確認した。これを達成するために、ＰＥＧ法によってクローンをタバコ・プロトプラストに移入し、インキュベーションの２日後、全ＴＳＷＶ−ＢＬウイルス粒子に対する抗体を用い、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡによって発現されたＮＰを検出した。プラスミドpＢ1525-ＮＰ＋中にＮＰ遺伝子を保有するタバコ・プロトプラストで高レベルのＮＰが産生され：一方、アンチセンスＮＰ配列で形質転換したタバコ・プロトプラスト(ｐＢ１５２５−ＮＰ−）ではＮＰは検出されなかった。
【００４３】
前記したごとく、クローンｐＢ１５２５−ＮＰ＋のＰＣＲ構築インサートおよびクローンｐＴＳＷＶ−２３のtehｃＤＮＡインサートを二重鎖配列決定に付した。ｃＤＮＡおよびＰＣＲクローンの配列解析により、各々、１.７１ｋｂおよび８６５ｂｐのインサートが明らかにされ、これは、配列ＴＳＷＶ−ＣＰＮＨ１ Ｓ ＲＮＡと比較した場合、クローンｐＴＳＷＶ−２３のｃＤＮＡインサートが５２Ｋ蛋白質ウイルス粒子成分遺伝子、完全な遺伝子間領域（４９２ｂｐ）およびＮＰ遺伝子の４５０ｂｐ（該遺伝子の約半分）を包含することを示す。このクローン化インサートはＥcoＲＩ認識部位に正確に位置するその３’末端を有し、これは、ｃＤＮＡクローニング間における不完全なＥcoＲＩメチル化を示唆する。このクローンは完全なＴＳＷＶ−ＢＬ ＮＰ遺伝子を含有しないにも拘わらず、その配列は非常に重要である。というのは、それはＰＣＲ構築ＮＰ遺伝子の配列と４５０ｂｐの重複を有するからである。このＴＳＷＶ−ＢＬ ＰＣＲ構築ＮＰ遺伝子とＴＳＷＶ−ＣＰＮＨ１ ＮＰ遺伝子の間の配列の比較は、合計２１個のヌクレオチドの差異（２.７％）を明らかにし、そのうち８つはアミノ酸置換をコードする（３.１％）。このＰＣＲ−構築ＮＰ遺伝子は、突然変異を取り込むことが知られている、Ｔaqポリメラーゼを用いて得られたので、これらの差異のうちいくらかはＰＣＲ増幅の間に導入することができる。しかしながら、これらのヌクレオチド差異のうち１５はＴＳＷＶ−ＢＬ ｃＤＮＡクローンおよびＰＣＲクローンの間の重複領域内に位置し、これらの差異のうちの１つ（１７０２位）を除いたすべてが、両ＴＳＷＶ−ＢＬ Ｒ ＲＮＡ由来クローンに存在する。この比較は、明らかに、ＰＣＲ増幅は、これらの２つのＮＰ遺伝子のヌクレオチド配列間の差異に全てではないにせよ大いには寄与しないことを示す。１７０２位におけるヌクレオチドの差異の結果、ＩleのＳerでのアミノ酸置換が起こり、この差異でさえＴＳＷＶ−ＢＬ単離株内における相同性の欠如によるであろう。
【００４４】
ヌクレオチドの差異がＴＳＷＶ単離株間の発散に帰されるという可能性は、
ＴＳＷＶ−ＣＰＮＨ１、ＴＳＷＶ−Ｌ３、およびＴＳＷＶ−Ｂ１ Ｓ ＲＮＡの間の他の配列決定された領域との比較によって支持される。これらの比較は以下の表に示す：
【００４５】
【表１】
2006006338.tif 000007
【００４６】
ＣＰＮＨ１およびＬ３単離株からのＮＰ遺伝子のヌクレオチド配列は相互に３.１％だけ相違し、ＢＬ単離株とは、ほとんど同程度（２.５％）相違する。しかしながら、ＣＰＮＨ１およびＢＬ単離株の間のＮＰアミノ酸配列は、Ｌ３およびＢＬの間、またはＣＰＮＨ１およびＬ３単離株の間よりも、かなり相違する。また、前記表の結果は、これらのＴＳＷＶ単離株のＮＰ遺伝子領域が、５２Ｋ蛋白質のアミノ酸配列間の差異が７.９ないし１０.６％の範囲であるので５２Ｋ蛋白質よりも高い程度の選択圧に付されており、ＮＰのアミノ酸配列について見い出されているよりも２倍以上であることを明らかにする。ヌクレオチド配列の発散は遺伝子間領域の間で最大であり、これは、この領域が遺伝子領域よりも低い選択圧に付されてことを示す。
【００４７】
トランスジェニック植物におけるＮＰ遺伝子配列の存在は、まず、ＰＣＲ分析によって確認された。ＮＰ遺伝子を挟む配列に相同なプライマーを用い、約８００ｂｐのＮＰ ＤＮＡ断片がトランスジェニックＮＰ(+)植物の全ＤＮＡから特異的に増幅され、一方、対応する断片は対照ＮＰ(-)植物では検出されなかった。ＮＰ遺伝子の発現はＤＡＳ−ＥＬＩＳＡによって各Ｒ０トランスジェニック植物でアッセイし、結果は以下の表に示す：
【００４８】
トマト黄化壊疽ウイルス(TSWV)のヌクレオキャプシド蛋白質(NP)遺伝子を発現するＲ０トランスジェニック植物のTSWV-BL単離株での接種に対する反応
植物年齢   Ｒ０クローン  ＥＬＩＳＡａ    病巣/葉ｂ   NP(+):NP(-)ｃ
７〜８葉   NP(+)1        0.374            7(199)          1:28
NP(+)2        0.015            0(199)          0:199
NP(+)3        0.407           23(102)          1:4
NP(+)4        0.386            2(102)          1:51
NP(+)5        0.023            0(124)          0:124
NP(+)6        0.197           35(325)          1:9
NP(+)7        0.124            1(325)          1:325
９〜１０葉
NP(+)8        0.344           36(36)           1:1
NP(+)9        0.327            2(20)           1:10
NP(+)10       0.406           34(33)           1:1
NP(+)11       0.156            5(20)           1:4
NP(+)12       0.133            9(57)           1:6
NP(+)13       0.144            2(7)            1:4
NP(+)14       0.040            0(19)           0:19
NP(+)16       0.053            0(10)           0:10
５〜６葉
NP(+)20       0.487          203(117)          2:1
NP(+)21       0.042            0(117)          0:117
NP(+)22       0.142            0(208)          0:208
NP(+)23       0.317          223(208)          1:1
NP(+)24       0.051            0(35)           0:35
NP(+)25       0.286           13(35)           1:3
NP(+)26       0.037            0(22)           0:22
NP(+)27       0.425          305(22)          14:1
ａ  トランスジェニック植物におけるＮＰの産生は二重抗体サンドイッチ酵素結合免疫吸着法(ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ)によって検定した；コーティング用のウイルス粒子に対する抗体の濃度：１μｇ/ｍl；ＴＳＷＶ−ＢＬへのコンジュゲートの希釈：１：２５０；基質添加後１５０分に採取した結果；４０５ｎｍにおける読み
ｂ  接種した葉で発達した局所病巣は接種７日後に計数した。データは３つの接種した葉の平均を表す。括弧に入れたデータは、同一接種物で接種した対照ＮＰ(+)植物から生じた病巣の数である。
ｃ  ｐＢＩＮ１９−ＮＰ＋
で形質転換したＮＰ(+)植物で発達した局所病巣-対-同一接種物で接種した場合の対照ＮＰ(-)植物で発達した局所病巣の比率
【００４９】
２３のＮＰ(+)クローンのうち、１０は高レベルのＮＰを産生し、５は中レベルのＮＰを蓄積し、および残りの８は低レベルのＮＰを産生した。トランスジェニック植物で発現されたＮＰのサイズはウェスタンブロット法によって分析した。タバコ抽出物からの多くのポリペプチドは、抗体を健康なタバコ植物からの抽出物で予め吸収させたにも拘わらず、全ウイルス粒子に対する抗体に対して反応性であった。それらのうち、１つのバンドのみが、ＮＰ遺伝子で形質転換したタバコ植物からのポリペプチドのパターンに対してユニークであった。このポリペプチドは約２９ｋＤａであると評価され、これは、天然ＮＰの予測されるサイズに近い。同様のサイズの抗体反応性蛋白質バンドは、ベクターｐＢＩＮ１９を含有するトランスジェニック植物からの抽出物では見い出されなかった。
【００５０】
ＴＳＷＶ−ＢＬ単離株でのタバコ葉の接種の結果、天候条件および植物の生理学的段階に応じて、全身感染または壊死性局所病巣いずれかとなるであろう。Ｒ０植物をウイルス抵抗性につきＴＳＷＶ−ＢＬでテストした場合、ＴＳＷＶ−ＢＬは、接種６〜８日後に、対照ＮＰ(-)植物の接種した葉上に典型的な壊死性病巣を誘導した。しかしながら、トランスジェニックＮＰ(+)植物は、対照ＮＰ(-)植物に比して、ウイルスに対する抵抗性スペクトルを示した。２３のＮＰ(+)植物のうち７つはいずれの局所病巣も発生せず、あるいは発生した病巣の数は対応する接種したＮＰ(-)植物上のものよりも少なくとも２０倍小さかった。３つのＮＰ（＋）植物は中程度の反応を有していたが（対照よりも５−ないし１９−倍小さい）、残りの９の植物は低い抵抗性であるか、または全く抵抗性がなかった。接種したＮＰ（＋）またはＮＰ（−）植物のいずれも全身感染を示さなかった。無病徴Ｒ０植物をそのライフサイクルの最後までモニターし、そのライフサイクルを通じて病徴が観察されなかった。無病徴ＮＰ（＋）植物の接種した葉を、シイ・キノラ(C. quinola)植物の葉上のウイルスの存在についてチェックした。高度に抵抗性のＮＰ（＋）植物のＴＳＷＶ−ＢＬ−攻撃葉からウイルスは回収されず、これは、該ウイルスがこれらのＮＰ（＋）植物では複製もしくは増殖できないことを示す。
【００５１】
選択したＲ０植物からのリーフディスクを継代クローンし、再生した小植物を該ウイルスによって攻撃した。すべての継代クローンしたＲ０植物は、それらの対応するオリジナルのＲ０植物と同様のレベルの抵抗性を示した。
【００５２】
ＴＳＷＶは広く分布して、多くの生物学的距離の株が存在するので、異なるＴＳＷＶ単離株による感染に抵抗性を示すトランスジェニック植物の効果もテストした。５つのＴＳＷＶ単離株を本実験で選択して、カナマイシン含有培地上で発芽したＲ１植物を攻撃した：ＴＳＷＶ−ＢＬ、アルカンサス、１０Ｗ体菜、ベゴニアおよびブラジル。最初の３つの単離株は全ウイルス粒子およびＴＳＷＶ-ＢＬ(通常のＴＳＷＶ「Ｌ」血清群）に対する抗体に対して反応性であった（図５参照）。ベゴニア単離株はＴＳＷＶ−ＩのＮＰ（「Ｉ」血清群）に対する抗体と強く反応したが、ＴＳＷＶ−ＬＰ ＮＰに対して生起したものに対しては反応せず、従って、「Ｉ」血清群に属した。ブラジル単離株の、ＴＳＷＶ−ＢＬまたはＴＳＷＶ−Ｉ血清群のＮＰに対する抗体に対する検出可能な反応は見い出されず、それは、ＴＳＷＶ−ＢＬの全ウイルス粒子に対する抗体には弱い反応性であった。さらに、この単離株は感染したタバコおよびエヌ・ベンサミアーナ(Ｎ.benthamiana)の葉上で全身の斑および皺を引き起こしたが、カボチャまたはキュウリを感染せず、これは、それがウリ科植物単離株とは区別される単離株であることを示す。これらの結果は、この単離株が第３の血清群であると考えられることを示す。
【００５３】
７つのＲ０系に由来する実生をカナマイシン培地上で発芽させ、前記したＴＳＷＶ単離株で接種した。感染性データは接種７日後に開始し、毎日記録した。ＴＳＷＶ−ＢＬ、アルカンサス、１０Ｗ体菜またはブラジル単離株で接種した植物は、もしウイルス病徴が未接種葉で観察されれば、感受性とした。ベゴニア単離株で接種した植物は、局所病巣が接種葉で観察されれば、感受性とした。というのは、この単離株はタバコで全身性感染を引き起こさないからである。すべての接種した対照ＮＰ(-)Ｒ１植物は、これらの５つの単離株による感染に対して感受性であった。それらは、ベゴニアで接種したトランスジェニックＲ１植物が接種葉で局所病巣を生じたに過ぎないことを除き、接種１２日後に全身感染した。しかしながら、ほとんどすべてのＮＰ(+)Ｒ１植物は、同種単離株ＴＳＷＶ-ＢＬに対して高い抵抗性を示したが、かなり低いパーセントのＮＰ（＋）Ｒ１植物が異種単離株アルカンサス、１０Ｗ体菜およびベゴニアに対して抵抗性であった。他方、系ＮＰ(+)４からのＮＰ−高発現ＮＰ(+)Ｒ１植物のいくつかでは、病徴性発現においてわずかな遅延（１ないし２日）が観察されたにも拘わらず、７つのトランスジェニック系からのすべてのＮＰ（＋）Ｒ１植物はブラジル単離株に対して感受性であった。
【００５４】
抵抗性Ｒ１植物は、そのライフサイクルを通じて無病徴のままであった。１７のより低い病徴性のＮＰ（＋）植物の接種した葉を、チェノポジウム・キノア（Chenopodium quinoa)植物の葉上の逆接種によってウイルスの存在についてチェックした。無病徴ＮＰ（＋）植物の接種した葉からウイルスは回収されず、これは、該ウイルスがこれらのＮＰ（＋）植物で複製もしくは増殖できないであろうことを示す。
【００５５】
トランスジェニック植物におけるＮＰの蓄積レベルと異種ＴＳＷＶ単離株に対する抵抗性の程度との間の関係も調べた。
【００５６】
前記したデータの分析は、低レベルＮＰのＲ０系に由来するＲ１植物は「Ｌ」血清群（アルカンサスおよび１０Ｗ体菜)の異種単離株に最良の抵抗性を付与し、一方、高レベルＮＰのＲ０系からのＲ１は「Ｉ」血清群に属するベゴニア単離株に抵抗性であることを示す。例えば、低ＮＰ発現系ＮＰ（＋）２、１４および２１からの接種したＲ１植物の平均７６％はアルカンサスおよび１０Ｗ体菜による感染に対して抵抗性であり、一方、これらの単離株に対する抵抗性は、高ＮＰ発現系ＮＰ(+)４、９および２３からの同様に接種した植物の１１％のみで観察された。他方、ベゴニア単離株は、低ＮＰ発現系ＮＰ（＋）２、１４および２１からのＲ１植物の７９％に感染したが、高ＮＰ発現系ＮＰ（＋）４からのＲ１植物では１９％のみに感染した。
【００５７】
従って、低レベルのＮＰ遺伝子を発現するトランスジェニックＲ１植物は単離株１０Ｗ体菜(「Ｌ」血清群)での感染に対して高度に抵抗性であるが、ベゴニア単離株(「Ｉ」血清群）での感染に対しては抵抗性でなかったと結論された。対照的に、高ＮＰ発現Ｒ１植物はベゴニア単離株による感染に対して非常に抵抗性であったが、１０Ｗ体菜からの単離株による感染に対しては抵抗性でなかった。
【００５８】
かくして、異種単離株に対して抵抗性と個々の植物におけるＮＰ発現との関係を正確に定量するのは興味深かった。本明細書中で報告する多数の接種実験において、トランスジェニック植物の葉試料はアルカンサスおよび１０Ｗ体菜単離株での接種前に採取した。また、ＮＰ発現レベルと抵抗性との間の明らかな関係の観察を行った後に、ベゴニア単離株で接種した植物の非接種葉から試料を採取した。サンプリングの後者の方法は、ベゴニア単離株による感染からの干渉なくして行うことができた。何故ならば、この単離株はタバコにおいて全身感染を引き起こさないのみならず、ＴＳＷＶ−ＢＬ ＮＰに対する抗体とも反応しないからである。単離したＴＳＷＶ−ＢＬのＮＰに対して生起した抗体を用い、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡによって、すべての試料を相対的ＮＰレベルにつき検定した。図５および６はトランスジェニックＲ１植物（それらが由来するＲ０系を問わない）におけるＮＰレベルとアルカンサスおよび１０Ｗ体菜単離株に対する、またはベゴニア単離株に対するそれらの抵抗性との間の関係を示す。非常に低いまたは検出不可能なＥＬＩＳＡ反応性(０〜０.０５  ＯＤ４０５ｎｍ)を有するほとんどすべてのトランスジェニックＲ１植物はアルカンサスおよび１０Ｗ体菜単離株(「Ｌ」血清群)による感染に対して抵抗性であるが、ベゴニア単離株（「ｌ」血清群）に対しては感受性であった。対照的に、高ＥＬＩＳＡ反応性（０.４〜１.０  ＯＤ４０５ｎｍ）を与えるほとんどすべてのＲ１植物はベゴニア単離株に対して抵抗性であったが、アルカンサスおよび１０Ｗ体菜単離株に対して感受性であった。
【００５９】
ブドウ葉巻ウイルスで感染させた組織からのｄｓＲＮＡの単離で首尾よく用いられたことがある方法［アクタ・ホルティカルチャー（Ａcta Ｈorticulture)第１８６巻：５１頁(１９８６年)、およびカン・プラント・ディス・スルブ(Ｃan. Ｐlant Ｄis. Ｓurv.)第６８巻：９３頁(１９８８年)]の組合せを用い、ＴＳＷＶ−Ｂで感染させたエヌ・ベンサミアーナ(Ｎ.benthamiana)植物から二本鎖(ds)ＲＮＡを単離した。該ｄｓＲＮＡをｃＤＮＡ合成につき選択した。というのは、この単離株からのウイルス粒子の単離は可能ではなかったからである［プラント・ディジーズ(Ｐlant Ｄisease)第７４巻:１５４頁(１９９０年)参照]。ＴＳＷＶ-ＢのＳ  ＲＮＡに特異的なｃＤＮＡライブラリーを作成するために、二本鎖Ｓ ＲＮＡをゲル精製し、メチル水銀処理によって変性し、ランダムプライマーを用いてプロメガ社によって提供されたｃＤＮＡ合成手法に付した。合成したｃＤＮＡ断片をＥcoＲＩアダプターを介してＥcoＲＩ消化のλ ＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社(Ｓtratagene)) にクローン化し、ゲル精製Ｓ ＲＮＡの逆転写によって調製したｃＤＮＡプローブを用いるコロニーハイブリダイゼーションによって陽性クローンを同定した。数ダースの陽性クローンをアガロースゲル上で分析し、ほとんど全部のＴＳＷＶ−Ｂ Ｓ ＲＮＡをカバーする、最長インサート（Ｌ１、Ｌ２２およびＬ３０）を含有する３つの重複クローンのみを選択した(図３参照)。
【００６０】
クローンＬ１、Ｌ２２およびＬ３０中のインサートのヌクレオチド配列は、双方のＤＮＡ鎖から、最初はユニバーサルおよび逆プライマーによって、次いでＴＳＷＶ−ＢのＳ  ＲＮＡの配列決定のために設計された内部プライマーによって決定した。配列決定はサンガー(Ｓanger)のジデオキシ法、Ｔ７ポリメラーゼ（ユウ・エス・バイオケミカルズ（Ｕ.Ｓ.Ｂiochemicals)、シークエナーゼ(Ｓequenase)ＴＭ)、およびシーミニアック(Ｓiemieniak)によって記載された二本鎖の配列を決定する方法(アナリティカル・バイオケミストリー(Analyt.Biochem.)参照）を用いて行った。これらのクローンの配列解析は、それぞれ、１.９９４ｋｂ、２.３６８ｋｂおよび１.５７６ｋｂのインサートを示し、これらの配列はＳ ＲＮＡゲノムの９３％を示した（図３参照）。組み立てた配列をジェネティクス・コンピューター・グループ（Ｇenetics Ｃomputer Ｇroup）（ジイシイジイ、ウィスコンシン州（ＧＣＧ，Ｍadison,ＷＩ))から販売されているコンピューター・プログラムを用いてＴＳＷＶ単離株ＣＯＮＨ１、Ｌ３、ＩおよびＢＬの配列と比較することにより解析した。
【００６１】
コンピューター分析によって、２.８４２ｋｂの組み立てた配列は完全な５２Ｋ非構造蛋白質遺伝子、完全な遺伝子間領域（６２９ｂｐ）、および７３７ｂｐのＮＰ遺伝子（該ＮＰ遺伝子の３９のＮ−末端タクレオチドのみが表されなかった）をカバーすることが示された。Ｎ遺伝子のこの失われた領域を得るために、Ｎ遺伝子の開始コドンからの６２個のヌクレオチド配列と同一のプライマーＴＴＣＴＧＧＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＡＣＴＣＡをポリヌクレオチドキナーゼで末端標識して前記したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。５つの推定クローンが得られた。５つのクローンの配列解析は、クローンＳ６およびＳ７のみがＮ遺伝子のこれらの３９の失われたヌクレオチドを含有することを示した。また、後者のクローンはＳ ＲＮＡの３’極末端を包含した。
【００６２】
Ｓ ＲＮＡの５’極末端は、５’ＲＡＣＥシステム（ジブコ（GIBCO))を用いて得られた。ＴＳＷＶ−ＢのｓｓＲＮＡおよびＴＳＷＶ−Ｂで感染させたタバコ植物から単離した全ＲＮＡを共に用いて、te ＴＳＷＶ−Ｂ Ｓ ＲＮＡのヌクレオチド７４６−７６３位に相補的なオリゴヌクレオチド（５'-ＣＴＧＴＡＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧ）を持つ第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて第１鎖の３'−末端にｄＣＴＰをテールした。次いで、ホモポリマーテールにアニールするアンカープライマー、およびＴＳＷＶ−Ｂ Ｓ ＲＮＡのヌクレオチド５１２−５２９位にアニールするオリゴヌクレオチド（５'-ＴＴＡＴＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＡ）を用い、ＰＣＲによって、テールしたｃＤＮＡを増幅した。該ＰＣＲ増幅断片をゲル精製し、配列解析のために、Ｔ−ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバゲン（Novagen))に直接クローン化した。８つの独立したクローンを、Ｓ ＲＮＡの５’領域（ＴＳＷＶ−Ｂ Ｓ ＲＮＡのヌクレオチド４０−５７位）に密接なオリゴマープライマー（５'-ＧＴＴＣＴＧＡＧＡＴＴＴＧＣＴＡＧＴ）で配列決定した。得られたクローンのうち６つはＳ ＲＮＡの５’極末端を含有し、これらのクローンからの５'-末端ヌクレオチド配列は同一であった。かくして、ＴＳＷＶ−Ｂ Ｓ ＲＮＡの完全なヌクレオチド配列は３０４９ヌクレオチド長であった。
【００６３】
かくして、３つの従前に配列決定したクローンと共にこれらの２つのクローン（Ｌ１、Ｌ２２、Ｌ３０、Ｓ６およびＳ７）は、前記した全３０３２ヌクレオチドをカバーしていた。ＴＳＷＶ−ＣＰＮＨ１およびＴＳＷＶ−１の末端配列との比較により、１８ヌクレオチドの５'極末端は組み立てられた配列中には表されていないにも拘わらず、ＴＳＷＶ−Ｂ Ｓ ＲＮＡの３’−極末端はＴＳＷＶ-Ｉ Ｓ ＲＮＡの３'-極末端と同一であり、ＴＳＷＶ−ＣＰＮＨ１の３'−極末端とは１５ヌクレオチド異なることが明らかとなった。ＴＳＷＶ単離株間の末端配列の保存は、ブニヤウイルス属の他のメンバーの保存し一致し、これは、末端配列は安定な塩基対合構造を形成し、それはその複製およびキャプシド化に関与し得るという仮説を支持する。
【００６４】
本発明によるＴＳＷＶ−Ｂ（前記したブラジリアン単離株）のＳ ＲＮＡゲノムの完全なヌクレオチド配列は以下の通りである。
【００６５】
【化６】
2006006338.tif 000008
【００６６】
【化７】
2006006338.tif 000009
【００６７】
本発明による非構造（前記単一下線）およびヌクレオキャプシド蛋白質の帰結されるアミノ酸配列は以下の通りである。
【００６８】
【化８】
2006006338.tif 000010
【００６９】
および
【００７０】
【化９】
2006006338.tif 000011
【００７１】
前記したヌクレオキャプシド蛋白質遺伝子はウイルスの相補鎖上にあり、ＴＳＷＶ−Ｂのヌクレオキャプシド蛋白質遺伝子は以下の通りである。
【００７２】
【化１０】
2006006338.tif 000012
【００７３】
ＴＳＷＶ−Ｂの完全なＳ ＲＮＡは３０４９ヌクレオチド長であるべきであり、ＴＳＷＶ−ＣＰＮＨ１のＳ ＲＮＡよりも１３４ヌクレオチド長い。この差異はＴＳＷＶ−Ｂ Ｓ ＲＮＡの長い遺伝子間領域に主として帰せられる。ＴＳＷＶ−Ｂ Ｓ ＲＮＡの配列決定した領域の解析により、前記した２つのオープンリーディングフレームが明らかとされ、これは他のＴＳＷＶ単離株と同様である。より大きい方は、ヌクレオチド８８に始まり、ヌクレオチド１４９１で終わるウイルスＲＮＡ鎖上に位置していた。ウイルス相補鎖上のより小さい方は、ヌクレオチド２８９８における開始コドンおよびヌクレオチド２１２２の終止コドンによって境界が決せられた。２つのオープンリーディングフレームは６２９ヌクレオチドの遺伝子間領域によって分離されていた。ＴＳＷＶ−Ｂ Ｓ ＲＮＡの配置したヌクレオチドおよびアミノ酸配列と他の単離株のそれとのパーセント相同性比較を示すところの、全配列決定したＴＳＷＶ−Ｂ Ｓ ＲＮＡと以下の表中の他の単離株のＳ ＲＮＡ領域との比較は以下の通りである。
【００７４】
全５３Ｋ蛋白質遺伝子      遺伝子間      ２９Ｋ蛋白質遺伝子
比較ａ        nt    nt     aa           nt          nt     aa
B/CPNH1    76.4ｂ  80.0  86.1(78.3)ｃ  72.4       77.5   91.5(79.1)
B/L3       75.8    79.0  89.0(82.0)    76.4       78.0   91.1(79.9)
B/BL       76.3     -     -            72.8       77.6   90.3(79.5)
B/I        63.0     -     -             -         63.1   69.7(55.3)
CPNH1/L3   94.8    95.6  92.0(89.4)    89.2       96.8   99.6(98.5)
CPNH1/BL   96.4     -     -            95.9       97.2   98.8(96.9)
CPNH1/I    62.7     -     -             -         60.8   69.5(55.1)
L3/BL      95.1     -     -            92.6       97.3   99.2(98.5)
L3/I       60.9     -     -             -         60.9   69.5(55.1)
I/BL       61.7     -     -             -         60.9   68.8(53.9)
ａ  単離株ＴＳＷＶ−ＣＰＮＨ１(２.９１６ｋｂ)、ＴＳＷＶ−Ｌ３(２.８３７ｋｂ)、ＴＳＷＶ−ＢＬ(２.０３７ｋｂ)およびＴＳＷＶ−１(１.１４４ｋｂ)の部分的および完全なＳ ＲＮＡ配列を、ＴＳＷＶ−ＢのＳ ＲＮＡ配列(３.０４９ｋｂ)との比較のために用いた。
ｂ  パーセント類似性は、ＧＣＧ配列決定分析ソフトウェアパッケージのプログラムＢＥＳＴＦＩＴを用い、それらのヌクレオチドまたは予想されるアミノ酸配列の比較によって計算した。
ｃ  パーセント同一性は括弧に入れた。
【００７５】
前記したごとく、最大のヌクレオチド配列の類似性（７５.８％−７６.４％）はＬ−タイプの単離株（ＣＨＮＨ１、Ｌ３およびＢＬ）で示された。より程度が低いが、ＴＳＷＶ−Ｂ Ｓ ＲＮＡ  とＩ血清群に帰属させられたＴＳＷＶ−ＩのＳ ＲＮＡの間にヌクレオチド配列類似性（６３％）があった。比較すると、Ｌ-タイプの単離株（ＣＨＰＮ１、Ｌ３およびＢＬ）の配列決定したＳ ＲＮＡ領域は９４.８％−９６.４％のヌクレオチド配列類似性を保有していた。
【００７６】
７７７ヌクレオチドのオープンリーディングフームは予測される分子量が２８７００Ｄａの２５８アミノ酸のＮ蛋白質をコードする。ＴＳＷＶ単離株からのＮオープンリーディングフレームの配列比較により、ＴＳＷＶ単離株ＣＰＮＨ１、Ｌ３およびＢＬからのＮ遺伝子のヌクレオチド配列は、それらが相互に異なる（２.７％−３.２％）よりも、ＴＳＷＶ−Ｂとはかなり（２２％−２２.５％）異なっていることが明らかにされた。免疫学的分析の結果と一致して、ＣＰＮＨ１、Ｌ３およびＢＬ単離株のＮアミノ酸配列は、ＴＳＷＶ−Ｂに対する（９０.３％−９１.５％の類似性または７９.１％−７９.９％の同一性）よりも、相互に対してより密接である（９８.８％−９９.６％の類似性または９６.９％−９８.５％の同一性）。かなり低い相同性が、ヌクレオチド（６３.１％）およびアミノ酸（６９.７％の類似性または５５.３％の同一性）レベル双方においてＴＳＷＶ−Ｉに対して観察された。２６２アミノ酸をコードするＴＳＷＶ−ＩのＮオープンリーディングフレームを除き、他の単離株のＮオープンリーディングフームは２５８個のアミノ酸についてコードする。コンピューター解析は、ＴＳＷＶ−Ｉ Ｎオープンリーディングフームの余分な残基はアミノ酸配列の挿入の結果であることを示す（残基８２ないし８４および残基１１６）。１つの可能なＮ−グリコシル化部位が残基６８に見い出される。
【００７７】
１４０４ヌクレオチドの第２のオープンリーディングフレームは、分子量が５２５６６Ｄａと予測される４６７個のアミノ酸の非構造蛋白質をコードする。ＴＳＷＶ−ＣＰＮＨ１およびＴＳＷＶ−Ｌ３の相同オープンリーディングフレームの比較は、ヌクレオチドレベルで８０％および７９％の類似性、ならびにアミノ酸レベルで８６.１％(または７８.３％の同一性)および８９％(または８２.０％の同一性）の類似性を示した。このオープンリーディングフレームは４つの可能なグリコシル化部位を含有し、これはＴＳＷＶ-ＣＰＮＨ１およびＴＳＷＶ-Ｌ３と正確に同一の位置に存在する。
【００７８】
いくつかの挿入のため、ＴＳＷＶ−Ｂ Ｓ ＲＮＡの遺伝子間領域は、ＴＳＷＶ-ＣＰＮＨ１およびＴＳＷＶ−Ｌ３の対応物よりも各々１２６および４１ヌクレオチド長かった。プログラムＦＯＬＤによる配列解析は、遺伝子間領域は、当該遺伝子間領域のＡ−リッチのストレッチと共にＵ−リッチのストレッチを内部的に塩基対合させることによって、非常に複雑で安定なヘアピン構造を形成することができ、これは、最小自由エネルギー値によって表してＴＳＷＶ−ＣＰＮＨ１およびＴＳＷＶ−Ｌ３から得られたものと同様の安定性を有することを示した。この内部塩基対合構造は転写終始シグナルとして働き得る。
【００７９】
また、前記表の結果は、ＴＳＷＶ−ＢのＮ蛋白質は５２Ｋ蛋白質よりも高い選択圧に付されていることが明らかとなった；５２Ｋ蛋白質のアミノ酸配列の間の類似性はＮＰのアミノ酸配列で見い出されるものよりも低い。ヌクレオチド配列の発散は遺伝子間領域のうちで最も高く、これは、この領域がいずれの遺伝子領域よりも高い選択圧に付されていることを示す。
【００８０】
ＴＳＷＶ−Ｂおよび他の４つのＴＳＷＶ単離株の間の発展的な関係を解析し、これを図４に示すが、そこでは、発展的な系統樹組織はこれらのＴＳＷＶ単離株について収集された血清学的データの関連性と合致する。かくして、本発明におけるＴＳＷＶ−Ｂは、Ｉ−タイプの単離株ＴＳＷＶ−Ｉに対するよりもＬ−タイプの単離株に対してより密接であるが、Ｌ−タイプの単離株が相互に対するよりもＬ−タイプの単離株に対して類似性がかなり低い。
【００８１】
病徴性発現のわずかな遅延にも拘わらず、トランスジェニック植物はＴＳＷＶのブラジル単離株に対して抵抗性を示さなかった；血清学的結果は、この単離株が「Ｌ」および「Ｉ」タイプの単離株から区別され、ウリ科植物単離株から生物学的に異なることを示す。かくして、ブラジル単離株は、なお、ＴＳＷＶのもう１つの血清群に属するであろう。いずれにせよ、感染性の結果は、単一のＮＰ遺伝子がトスポウイルス属におけるすべての単離株に対する抵抗性を提供するようである。
【００８２】
低いまたは検出できないＥＬＩＳＡ反応性（０−０.０５ ＯＤ４０５ｎｍ）を与える本発明によるトランスジェニック植物は、「Ｌ」血清群の異種単離株（アルカンサスおよび１０Ｗ体菜)による感染に対して抵抗性であり、一方、これらの単離株に対する保護は高レベルのＮＰを蓄積する植物では見い出されなかった。対照ＮＰ（−）植物のＥＬＩＳＡの判読値（０.０５  ＯＤ４０５ｎｍ）に比較して、これらのトランスジェニック植物はもしあってもほとんどＴＳＷＶ−ＢＬ ＮＰを生産しないであろう。同様の結果がトランスジェニック植物で観察されており、そこでは、ＣＰの蓄積は検出されず：これらはウイルス感染に対して高い抵抗性を示した。この現象を基礎づける機構は現在知られていない。このタイプの抵抗性は、恐らくは、攻撃ウイルスのマイナスセンス複製ＲＮＡにハイブリダイズさせ、必須の宿主因子（例えば、レプリカーゼ）に結合するかあるいはウイルス粒子組立体に干渉することによって、トランスジェニック植物で生じるＣＰ ＲＮＡ分子とウイルス複製との干渉に帰すことができるようである。
【００８３】
しかしながら、同種ＴＳＷＶ−ＢＬ単離株に対する抵抗性は、明らかに、ＮＰ遺伝子の発現レベルから独立していることに注意されたい。ＴＳＷＶ−ＢＬで接種した個々のＲ１植物の相対的ＮＰレベルは測定しなかったが、これらの接種Ｒ１植物（合計１４５のテスト植物）で生じたＮＰは検出不可能ないし高度の範囲であると仮定するのは合理的である。
【００８４】
「Ｌ」血清群の異種単離株からの保護の場合とは対照的に、ＴＳＷＶ−Ｉ血清群のベゴニア単離株からの保護が高ＮＰ発現Ｒ１植物で見い出された。「Ｌ」血清群のＮＰヌクレオチド配列と「Ｉ」血清群のそれとの比較により、ヌクレオチドおよびアミノ酸における各々６２％および６７％の同一性が明らかにされた。２つの血清群のＮＰ遺伝子の差異は余りにも大きくて、トランスジェニック植物で生じたＮＰ（「Ｌ」血清群）は、「Ｉ」血清群のベゴニア単離株を攻撃するに際して機能不全蛋白質として働くであろう。この「欠陥」外皮蛋白質のウイルス粒子への取込みは、ウイルスの運動またはそのさらなる複製を阻害する欠陥ウイルスを生じるであろう。このタイプの相互作用は、保護には高レベルのＮＰを要すると予測される。また、ベゴニア単離株に対する抵抗性は、Ｒ１植物で産生されるＮＰ転写体の、ウイルス複製での干渉を含む。もしこれが真実であれば、異種ウイルスの複製を阻害するのに、（２つのＮＰ遺伝子の異種性質のため）より多くのＮＰ転写体を要するであろう。
【００８５】
「Ｌ」および「Ｉ」血清群の異種単離株に対する抵抗性に対する個々のＲ１植物におけるＮＰレベルの関係を示す結果について明らかな説明はないが、これらは明らかな傾向であると考えられる。というのは、データは多数（１９０）の植物から得られたものだからである。かくして、個々の植物におけるＣＰまたはＮＰレベルの測定はＮＰまたはＣＰレベルを抵抗性に関係付けるためのより正確な方法を提供すると考えられる。この形式のデータ解析によって、抵抗性は、それらが由来するＲ０系のＮＰレベルに対するよりも、各テスト植物におけるＮＰレベルに対してより密接に関係していることを示す。タバコにおけるＴＳＷＶ-ＢＬ Ｎｐ遺伝子については、少なくとも、植物染色体におけるＮＰ遺伝子の取込部位はウイスル抵抗性で重要でないかも知れないようである。
【００８６】
以下の単離株：ブラジル（距離のある関係のウイルス）、Ｔ９１（密接に関係するウイルス）およびＢＬ（同種単離株）に対する、本発明によるＴＳＷＶ−ＢＬのヌクレオキャプシド蛋白質遺伝子を含有するトランスジェニックＲ１およびＲ２トマトの反応性を決定する実験も行った。これらの実験において、トランスジェニックトマト（エル・エスクレンタム（Ｌ.esculentum)）は、公表された手法[プラント・セル・リポーツ(Ｐlant Ｃell Ｒeports)第５巻:８１頁(１９８６年)参照]を用い、トマト黄化壊疽ウイルスのレタス単離株のヌクレオキャプシド蛋白質(Ｎ)遺伝子を発芽した子葉にエイ・チュメファシエンス(Ａ.tumefaciens)媒介遺伝子移入することによって産生した。トマト系「Ｇenova８０」は形質転換につき選択した。何故ならば、それはＴＭＶに抵抗性を付与し、かくして多数のウイルス−抵抗性系を産生する可能性を生じるＴn-２２遺伝子を含有するからである。
【００８７】
形質転換体をカナマイシン培地で選択し、根が生えたトランスジェニックトマトをポットに入れ、温室に移した。Ｒ１およびＲ２トマト実生はＮＰＴ II遺伝子を発現し、これは、植物ゲノムにおけるこの遺伝子の多重挿入を示す。対照的に、１８％の実生のみが、検出可能なレベルのＮ蛋白質を生じた。
【００８８】
９つのＲ１系および３つのＲ２系を、以下の３つのトスポウイルス、特に、ＴＳＷＶ−ＢＬ、ＴＳＷＶ−Ｔ９１、およびＴＳＷＶ−Ｂに対する抵抗性についてテストした。感染性はテスト植物の目による観察に基づくものであった。少しの錆色環または昆虫の損害を除いて植物が健康に見える場合、これらの植物からの抽出物を、ウイルスの存在につきテストするために、エヌ・ベンサミアーナ（Ｎ.benthamiana)に対して接種した。以下の表に示すごとく、ほとんどすべての対照トマト植物は、ＴＳＷＶ−ＢＬ、ＴＳＷＶ−Ｔ９１またはＴＳＷＶ−Ｂでの接種の３ないし４週間後における植物萎縮、葉の黄色のモザイクおよび皺よりなる典型的な病徴を呈した。しかしながら、Ｒ１およびＲ２トランスジェニック植物の４％のみが、ＴＳＷＶ−ＢＬに感染状態となり、７％がＴＳＷＶ−Ｔ９１に感染状態となり、４５％がＴＳＷＶ−Ｂに感染状態となった。
【００８９】
トマト黄化壊疽ウイルス・レタス株の核蛋白質遺伝子を発現する
トランスジェニック・Ｒ１またはＲ２トマトにおけるウイルス抵抗性
接種単離株ａ
植物系                ＴＳＷＶ-ＢＬ  ＴＳＷＶ-Ｔ９１  ＴＳＷＶ-Ｂ
Ｒ１植物：
T13-1             0/22             1/26           7/24
T13-2             6/20              NTｂ            NT
T13-3             2/42             0/20          12/18
T13-4             0/25              NT             NT
T13-9             0/20              NT             NT
T13-10            1/50             2/26          11/26
T13-11            0/22              NT             NT
T13-12            1/29              NT             NT
T13-13            0/22              NT             NT
合計                     10/252            3/72          30/68
Ｒ２植物：
T13-1-7           0/8              2/8            5/8
T13-1-9           0/8              1/8            2/8
T13-1-11          0/8              1/9            5/9
合計                      0/24             4/25          12/25
対照                     92/95            51/53          52/53
ａ  エヌ・ベンサミアーナ(Ｎ.benthamiana)、Ｈ４２３タバコまたはトマトの５-、１０-または２０-倍希釈葉抽出液で、第一葉ないし第二葉段階の植物を接種した;同一の植物を７日後に再接種し、さらに１４日後に病徴を記録した；病徴を呈する植物数/試験植物数として反応性を表した。
ｂ  試験せず
【００９０】
従って、前記の記載は、ＴＳＷＶ-ＢＬのＮ遺伝子を発現するトランスジェニック・トマト植物が、ＴＳＷＶ-ＢＬ、ＴＳＷＶ-ＢＬに近縁の他のＴＳＷＶ単離株、ならびにさらに遠縁のＴＳＷＶ-Ｂへの感染に対して抵抗性を示すという知見を支持している。
【００９１】
さらなる単離株でのさらに限定された実験において、全てのトランスジェニック植物が１０Ｗ(体菜)単離株に対して抵抗性であったが、対照は感染した。これらの結果は、トランスジェニック・トマトが遠縁の単離株よりも近縁の単離株に対してより良好に保護されるということを示している。ＴＳＷＶ-ＢＬのＮ遺伝子を発現するトランスジェニック・タバコおよびエヌ・ベンサミアーナ(Ｎ.benthamiana)とは異なり、Ｎ蛋白質の発現レベルは、トランスジェニック・トマトにおいて観察された保護と相関がなかった；５５％のトランスジェニック・トマトが遠縁ＴＳＷＶ-Ｂ単離株にも抵抗性であり、このことはトランスジェニック・タバコおよびエヌ・ベンサミアーナ(Ｎ.benthamiana)植物においては認められなかった。これらの矛盾は、トマトは本来トスポウイルスに対して感受性が低いということを反映しているのかも知れない。
【００９２】
さらに、接種後５および７週の少数の植物においてウイルス分布を評価する実験も行った。各植物の全開葉の小葉から先端半分を摩砕し、エヌ・ベンサミアーナ(Ｎ.benthamiana)上に戻し接種した。接種７日後に得た結果は、ＴＳＷＶ-ＢＬ.-Ｔ９１または-Ｂ．のいずれかで接種した無病徴トランスジェニック植物のいずれの葉組織からもウイルスが回収できなかったということを示しており、前記に報告した観察知見を追認している。病徴を示すトランスジェニック植物において、ウイルスは植物全体を通して分布していない。例えば、視覚的に終局的に見積もることができないトランスジェニック植物は、８つの葉のうち２つにだけウイルスを含んでいた；植物の地表からの第二葉および先端葉。反対に、感染した対照植物の全ての葉にウイルスが存在し、健康な対照植物においてはウイルスは存在しなかった。
【００９３】
ウイルスを脈管系に導入した場合に、抵抗性のトランスジェニック植物が感染させることができるか否かを試験するために、移植接種(graft inoculation)を試みた。１:５、１:１０または１:２０の希釈率のＴＳＷＶ-ＢＬ、-Ｔ９１もしくは-Ｂで接種したＲ１およびＲ２植物を、同一の単離株および希釈率にて、感染させた対照植物に移植した。非-トランスジェニック対照が感染したにも拘わらず、３４個体のトランスジェニック植物は３１日後に無病徴であった。２３日後に、トランスジェニック植物の先端４６ｃｍを切り取り、新たな成長およびさらなるストレスを誘導した。若く、勢いよく成長している新しい苗芽は接種３１日後にいずれの病徴も示さなかったが、接種４５日後に各々３３％、３１％および４５％のＴＳＷＶ-ＢＬ、-Ｔ９１および-Ｂが葉病徴または茎病徴を示していた。これらの結果は、あるトランスジェニック植物は耐性で、またあるものは感染に対して免であることを示している。
【００９４】
かくして、本発明の１つの態様によれば、ＴＳＷＶ-ＢＬ単離株のＮＰ遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、同種のＴＳＷＶ-ＢＬ単離株および同一血清群の異種単離株(アルカンサスおよび１０Ｗ体菜)の感染に対して高い抵抗性を示した。さらに重要なことには、抵抗性は他の血清群からベゴニア単離株に至るまで有効である。略言すれば、ＴＳＷＶ-ＢＬの核蛋白質遺伝子を発現するトランスジェニック・タバコ植物はＴＳＷＶおよびＩＮＳＶの双方に抵抗性を示し、その保護は遠縁のＩＮＳＶに対する核蛋白質によって、ならびに同種および近縁のＴＳＷＶ単離株に対する核蛋白質遺伝子リボヌクレオチド配列によって媒介されているようであることを前記のことは明らかに記載している。異なったＴＳＷＶ単離株に対して広範囲スペクトル抵抗性の構築植物が示されたのはこれが初めてである。
【００９５】
一般的に、外皮蛋白質保護は、免疫ではなくて、感染および病徴発現における遅延および/低下を示すが、本発明は、無病徴でかつ感染ウイルスフリーである有意に高いパーセンテージのトランスジェニック植物を提供する。温室条件下におけるこれらの植物の抵抗性はそれらの生涯を通して保持され、より重要なことは、前記したごとくそれらの子孫にも受け継がれた。
【００９６】
たとえあるとしてもほとんどＴＳＷＶ-ＢＬ ＮＰを産生しないトランスジェニック植物が、同種の単離株、およびＴＳＷＶの同一血清群内の他の近縁の単離株による感染に高い抵抗性を示すことが本発明において認められた一方で、高レベルのＮＰ遺伝子を発現しているものにおいては保護が認められなかった。
【００９７】
ＴＳＷＶの生物学的多様性は詳細に報告されており、トマトのごとき栽培植物においては遺伝的抵抗性を克服することが報告されている。かくして、多種のＴＳＷＶ株に対して抵抗性を示すトランスジェニック植物を開発することが極めて重要である。本発明は、この抵抗性を付与するウイルスＮＰ遺伝子を利用してそれが行われるであろうこと、ならびに多様なＴＳＷＶ単離株にこの抵抗性が示されるであろうことを示している。かくして、ＴＳＷＶ ＮＰ遺伝子の発現が種々のＴＳＷＶ単離株に対して高レベルの抵抗性を付与できるという本発明の知見は、膨大な量の商業的重要性を有する。
【００９８】
他の研究のシリーズにおいて、プラスミドＢＩＮ１９−Ｎ＋を構築し、実施例IVに従ってアグロバクテリウム・チュメファシエンス(Ａ.tumefaciens)ＬＢ４４０４株に移入し、実施例Ｖに従いニコチアナ・ベンサミアーナ（Ｎicotiana benthamiana）に移入した。ＩＮＳＶ−Ｂegおよび−ＬＩのヌクレオキャプシド遺伝子をオリゴマープライマーＩＮＳＶ−Ａ（５'−ＴＡＣＴＴＡＴＣＴＡＧＡＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＴＴＡＣＣＡＡＧＧ）およびＩＮＳＶ−Ｂ（５'−ＴＡＣＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＴＡＴＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＴＴＡＴＡＡＡＡＧＣＡＣ）で増幅し、ＩＮＳＶ単離体のヌクレオキャプシド遺伝子の５'−コーディング領域および３'−非コーディング領域のそれぞれにハイブリダイズさせた。増幅したヌクレオキャプシド遺伝子断片を実施例IIIに従って精製し、実施例IVに従って消化して配列決定した。
【００９９】
合計２４のＮ＋（ｐＢＩＮ１９−Ｎ＋で形質転換された）および１８Ｎ−（ベクターｐＢＩＮ１９で形質転換された）形質転換エヌ・ベンサミアーナ植物を土壌に移し温室で発育させた。全てのＮ＋系列は４−５の葉段階において遺伝子配列を含んでいることがＰＣＲにより確認された。Ｎ蛋白質の蓄積の相対レベルはＴＳＷＶ−ＢＬＮ蛋白質の抗体を用い、各々独立したＲ０トランスジェニッククローン系においてＤＡＳ−ＥＬＩＳＡによって評価した。２４のＮ＋系のうち、２つが０.５０−１.００のＯＤ４０５ｎｍの値を有し、１７が０.０２−０.１０の間、残りの５つが０.０２より少なかった。健康なエヌ・ベンサミアーナまたはトランスジェニックＮ−植物は０.０２−０／０２のＯＤ４０５ｎｍの読みを与える。Ｒ０植物の全てが自家受粉され、以下のトランスジェニック系：（１）Ｎ−−２および−６、ｐＢＩＮ１９ベクターのみを含む対照トランスジェニック系、（２）Ｎ＋−２８、Ｎ蛋白質の検出不可能な量を産生したトランスジェニック系（ＯＤ４０５ｎｍ＝０.００５）；（３）Ｎ＋−２１、低レベルのＮ蛋白質を産生するトランスジェニック系（ＯＤ４０５ｎｍ＝０.０８５）；および（４）高レベルのＮ蛋白質を蓄積する２つのトランスジェニック系であるＮ＋−３４および−３７（ＯＤ４０５ｎｍ＝０.５０−１.００）からの種子を植菌試験のためのカナマイシン選択培地（３００μｇ/ｍl）上で発芽させた。次いで、これら６つの系をノーザン・ハイブリダイゼーションによって分析し;Ｎ遺伝子転写体の強度はＥＬＩＳＡ反応のレベルとよく相関していた。
【０１００】
６つのＲ０系からのトランスジェニック実生はカナマイシン選択培地上で種子を発芽させることによって選択し、これらの実生を５種のトスポウイルスで接種した。接種されたＲ１植物は、もしウイルス病徴が、接種葉に観察されれば感受性と見なした。漏れの可能性を排除するために、トランスジェニック対照Ｎ−植物をトランスジェニックＮ＋植物の各々の接種で常に用いた。加えて、各接種抽出物を、まずＮ＋植物を接種し、次いで対照Ｎ−植物を接種するのに常に用いた。この一連の研究の結果を以下に示す：
【０１０１】
エヌ・ベンサミアーナ黄化壊疽ウイルス（ＴＳＷＶ）のヌクレオキャプシド
(Ｎ)蛋白質を発現するＲ１植物の、トスポウイルスでの接種に対する反応性
感染植物数／接種植物数ｂ 
ＴＳＷＶ単離株  ＩＮＳＶ単離株   
Ｒ０系      ELISAａ         BL      10W     Beg    LI         TSWV-B
N--2/-6   <0.02           32/32   32/32   32/32   20/20       32/32
N+-28      0.005          16/16   16/16   15/16               16/16
N+-21      0.085           9/40   17/40   39/40   18/20       40/40
N+-34      0.715          25/28ｃ 28/28   23/28ｃ             28/28
N+-37      0.510          26/28ｃ 22/22   21/28ｃ 16/20ｃ     22/22 
ａ  Ｒ１植物が由来するＲ０系のａＥＬＩＳＡデータ;
ｂ  感染したエヌ・ベンサミアーナ植物の３０倍希釈葉抽出物を３−５葉段階の３枚の植物葉に適用した。各抽出物を常に用いてＮ＋植物を接種した。データは少なくとも接種後２カ月毎日収集し、全身感染植物数／接種植物数として表した；ｃほとんど全ての感受性Ｒ１植物は病徴の出現の顕著な遅延を示すことを示す。
【０１０２】
上記の表で示したように、対照系Ｎ−−２および−６からの全てのＲ１植物は、試験した全てのウイルスの接種後５−８で全身的な病徴を示した。Ｎ＋−２８系からのＲ１植物のいずれも検出可能な量のＮ蛋白質を産生せず、ＩＮＳＶ−Ｂegを接種した１の植物を除き全てがこれらのウイルスに感受性であった。接種前に採取したこのＮ＋−２８Ｒ１植物のリーフディスクのＥＬＩＳＡ分析により、ＩＮＳＶ−Ｂｅｇ抵抗性表現型を保有すると同定された植物が高レベルのＮ蛋白質を蓄積することが明白に示された（全ての他のＮ＋−２８Ｒ１植物に対しＯＤ４０５ｎｍが＜０.０２であるのと比較しＯＤ４０５ｎｍ＝０.７８）。
【０１０３】
Ｎ遺伝子を低いレベルで発現しているＮ＋−２１系は同種（７８％）および近縁のＴＳＷＶ−１０Ｗ（５７％）単離株に対して良好な抵抗性を示し、は２個のＩＮＳＶ単離株に対しほとんど耐性を示さず（３％および１０％）；３のＮ＋−２１植物のみが、ＩＮＳＶ単離株を接種した時に抵抗性の表現型を示した。これらのＩＮＳＶ−耐性Ｎ＋２１  Ｒ１植物からの葉の試料は非常に高いＥＬＩＳＡ反応を示し（ＯＤ４０５ｎｍ  ０.５ないし１.００）、かくして感受性Ｎ＋−２１植物よりも多量のＮ蛋白質を与えた（ＯＤ４０５ｎｍ  ０.０２ないし０.５０）。Ｎ遺伝子の発現が高い系はＩＮＳＶ単離株に対し最も高い抵抗性を示し(１８％-５％)、次いで同種ＴＳＷＶ−ＢＬ単離株（７％および１１％）であり、一方、植物のいずれもＴＳＷＬ−１０Ｗに対し抵抗性を示さず；しかしながら、ＩＮＳＶまたはＴＳＷＶ−ＢＬで感染されたＮ＋−３４および−３７Ｒ１植物は病徴の発現において様々な長さの遅れを示す。これらの４つのトランスジェニックＮ＋系からのＲ１植物のいずれもＴＳＷＶ−Ｂに抵抗性でなかった；Ｎ＋−３４および−３７系からのＲ１植物のいくつかは病徴の出現に少しの遅延を示した。
【０１０４】
Ｎ＋Ｒ１植物におけるＮ蛋白質産生レベルが異なるトスポウイルスに対する抵抗性と関連しているか否かを決定する実験において、上記表中の接種Ｎ＋Ｒ１植物は、元のＲ０植物とは関係なく接種前に採取された組織のそのＥＬＩＳＡ反応の強度に基づき４つの群に再び組織した。Ｎ蛋白質を低レベルで発現するＮ＋Ｒ１植物（０.０２−０.２ＯＤ）は、ＴＳＷＶ−ＢＬと−１０Ｗに対し高い抵抗性（１００％および８０％）を示すが、ＩＮＳＶ−Ｂｅｇおよび−ＬＩに対しては全て感受性であり、これは対照のＮ−植物に対する病徴出現において検出可能な遅延はないことを示す。対照的に、高いレベルのＮ蛋白質を有するほとんどすべてのＮ＋Ｒ１植物（０.２０−１.００ＯＤ）は、ＴＳＷＶ−ＢＬ、ＩＮＳＶ−ＢegおよびＬＩに対して様々なレベルの保護を示し、病徴の出現の短い遅延から、これらの植物のほとんどが対照Ｎ−植物に対する病徴の発展における遅延の様々な長さを示す、完全な耐性の範囲にある。ＴＳＷＬ−１０Ｗに対する高い発現因子において保護は観察されなかった。加えて、Ｎ遺伝子発現のレベルに拘らず、Ｎ＋植物はＴＳＷＶ−Ｂに対して抵抗性でなかった；しかしながら、高レベルでＮ蛋白質を産生するＮ＋Ｒ１植物では、短い遅延の病徴の出現が観察された。全ての対照Ｎ−Ｒ１植物および検出不可能なＥＬＩＳＡ反応を起こす（０ないし０.０２ＯＤ）トランスジェニックＮ＋Ｒ１植物は試験したすべてのトスポウイルスに対し感受性であった。
【０１０５】
ＴＳＷＶ−ＢＬヌクレオキャプシド遺伝子を発現するエヌ・ベンサミアーナプロトプラストにおいて遠縁ＩＮＳＶの複製阻害も実験した。これらの実験において、全てのＩＮＳＶ−ＬＩウイルス粒子を用いて３つのトランスジェニック系から単離したプロトプラストを感染させて、形質転換の産物が、いかに入って来るウイルスに影響するかを調べた。ウイルスの複製は、ＩＮＳＶ  Ｎ蛋白質に特異的な抗体を用いてトランスジェニックプロトプラストにおいてＩＮＳＶを感染するＮ蛋白質のレベルを測定することによって決定した。ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ分析は、与えられた系からの全ての子孫が比較的均一であって、ほとんど全てのＲ１の子孫が、その親であるトランスジェニック系と類似したトランスジェニックＮ遺伝子の発現レベルを与えることを示した。これらの結果は、その親系のそれに基づくＲ１の集団の発現レベルの予測を可能にした。低い発現因子の系Ｎ＋−２１のＲ１植物由来のプロトプラストはＩＮＳＶ−ＬＩの複製を支持するが、一方、高い発現因子系Ｎ＋−３７のＲ１植物からのプロトプラストは、低レベルのウイルスの複製が観察される接種の４２時間後までこれを支持しなかった。様々な時間間隔（例えば０、１９、３０および４２時間）で同じプロトプラストを、形質転換遺伝子の発現レベルを検査するために、ＴＳＷＬ−ＢＬ  Ｎ蛋白質に特異的な抗体を用いたＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ法によっても分析した。予測されるように、Ｎ＋-２１ Ｒ１植物からのプロトプラストは比較的低レベル(０.３３８-０.３９５，ＯＤ４０５ｎｍ）を産生するのに対し、Ｎ＋−３７  Ｒ１植物からのプロトプラストは高いレベルを蓄積した（０.８２２−０.８６５，ＯＤ４０５ｎｍ）。発現レベルは全ての時点で一定であることが判明した。
【０１０６】
本発明の本態様において、低量のＴＳＷＶ−ＢＬ  Ｎ蛋白質を蓄積するトランスジェニック・エヌ・ベンサミアーナ植物は同種および遠縁の(ＴＳＷＶ-１０Ｗ)単離株に高度に対して抵抗性であるが、一方この蛋白質を多く蓄積する植物は同種および遠縁の（ＩＮＳＶ−ＢｅｇおよびＩＮＳＶ−ＬＩ）ウイルスの両方に対する適度に保護を有することが示された。より重要なことには、これらの知見は、トランスジェニック・エヌ・ベンサミアーナ植物（ＩＮＳＶの系統的な宿主）はＩＮＳＶ−ＢｅｇおよびＩＮＳＶ−ＬＩ単離株に対し保護されることを示す。
【０１０７】
上記で示したように、本発明者らは、ＴＳＷＶのＮ遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、同種単離株に対して抵抗性であり、ＴＳＷＶ−ＢＬ遺伝子を発現するかかる植物はＴＳＷＶおよびＩＮＳＶの双方に抵抗性であることを示した。同種および近縁の単離株に対する最良の抵抗性はＮ蛋白質を低レベルで蓄積しているトランスジェニック植物で見い出されるが、一方ＴＳＷＶ−ＢＬ  Ｎ蛋白質の高レベルを有するトランスジェニック植物は血清学的に遠いＩＮＳＶ単離株により抵抗性であることも示された。この観察によって、本発明者らは、同種および近縁の単離株からの観察される保護における翻訳されたＮ蛋白質産物の役割に気付き、また植物ゲノムに挿入されたＮ遺伝子自体か、それともその転写物が保護に関与するかを憶測した。この仮説を試験するために、プロモーターを含まないＮ遺伝子を含むか、あるいはセンスまたはアンチセンスの翻訳不可能なＮコーディング領域を発現するトランスジェニック植物を作出した。発見されたことは、センスおよびアンチセンスの翻訳不可能なＮ遺伝子ＲＮＡは同種および近縁の単離株に対する保護を供給すること、およびこれらのＲＮＡ媒介保護は、それぞれのＲＮＡ種を低いレベルで合成する植物において最も有効であって、ウイルス複製の阻害を通じて達成されるようである、ということである。
【０１０８】
より具体的には、トランスジェニック植物に導入されたコーディング配列を図７に示す。示されるように、ｐＢＩＮ１９−Ｎ構築物は植物形質転換ベクターｐＢＩＮ１９に挿入された無プロモーターＮ遺伝子を含む（実施例IV参照）。全ての他の構築物は二重のＣａＭＶの３５Ｓプロモーター、アルファルファモザイクウイルスの５'−末端の翻訳リーダー配列およびノパリンシンターゼの３'−非翻訳/ポリアデニル化配列を含む。ｐＢＩ５２５は植物発現ベクターであって、この研究においては対照として用いられ；ｐＢＩ５２５−ｍＮはＮ遺伝子の変異（翻訳不能）形を含み；ｐＢＩ５２５−ａｓＮは翻訳不能Ｎ遺伝子のアンチセンス型を含む。変異体Ｎ遺伝子の５’末端における１個のヌクレオチドの欠失はダッシュの記号によって示される。ＡＴＧコドンに下線を施し、インフレームの終止コドンは太字で示す。
【０１０９】
実施例ＶＩＩＩ
ＴＳＷＬ−ＢＬ  Ｎ遺伝子のプライマー特異的突然変異誘発およびクローニングは以下のごとくに行った：
Ｎ遺伝子の全長は、ここに引用して本明細書の一部とみなすファイトパソロジー(Ｐhytopathology)第８２巻：１２２３頁（１９９２年）に記載されるごとく、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応により得た。翻訳不能Ｎ−コーディング配列は、オリゴマープライマーＡ、(ＡＧＣＡＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＴＡＡＣＡＣＡＣＴＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣ)(ＴＳＷＶ−ＢＬ  Ｎ遺伝子の３’−非暗号領域におけるＳ  ＲＮＡと同一)、およびＢ、(ＡＧＣＴＡＡＴＣＴＡＧＡＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＴＣＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴＧＴＴＧＣ）（Ｎ遺伝子の５'末端においてＳ  ＲＮＡに相補的）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより同様に作られた。後者のオリゴマープライマーは転写開始コドンの直後のフレームシフト変異および起こり得る翻訳のリードスルーを阻止するためのいくつかの終止コドンを含んでいる。無傷のおよび変異のＮ遺伝子断片は実施例ＩＩに記載したごとく１.２％アガロースゲルによって精製した。ゲル精製した無傷のおよび変異のＮ遺伝子断片を適当な制限酵素で消化し、それぞれ実施例IVに記載されているごとく、直接ＢamＨＩ/およびＸbaＩ消化の植物形質転換ベクターｐＢＩＮ１９およびＮcoＩ消化の植物発現ベクターｐＢＩ５２５にクローンした。得られたプラスミドを同定し、カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓプロモーターに対し、無傷の無プロモーターＮ遺伝子、およびセンスおよびアンチセンスの向きで変異コーディング配列を有するｐＢ１５２５−ｍＮおよびｐＢ１５２５−ａｓＮを含むｐＢＩＮ１９−Ｎと命名された。ニコチアナ・タバカム（Ｎicotiana tabacum）プロトプラストにおける一過性発現分析により発現カセット中の変異Ｎコーディング配列の翻訳可能性をチェックし；センスまたはアンチセンスの変異Ｎコーディング配列を含む発現カセットをＨindＩＩＩ/ＥcoＲＩによる部分消化（なぜならＮコーディング配列は内部のＨindＩＩＩおよびＥxoＲＩ配列を含むので)により切り出し、同酵素で既に切断されている植物形質転換ベクターｐＢＩＮ１９に連結した。ｐＢＩＮ１９-Ｎと同様得られたベクターを、実施例IVに記載した方法を用いてエイ・チュメファシエンスＬＢＡ４４０４株に移入した。エヌ・タバカム・バール・ハバナ・シイブイ（Ｎ.tabacum var Ｈavana cv 423）のリーフディスクを、様々な構築物を含有するエイ・チュメファシエンスのＬＢＡ４４０４株で接種し、得られたトランスジェニック植物を自家授粉させ、種子を選択的カナマイシン培地上で発芽させた。
【０１１０】
ＰＣＲは上記のごとく各Ｒ０トランスジェニック系で行った。オリゴマープライマーＡおよびＢを用いてＴＳＷＬ−ＢＬのＮ−コーディング配列の存在を決定した。オリゴマープライマー３５Ｓ−プロモーター（ＣＣＣＡＣＴＡＴＣＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣ）をオリゴマープライマーＡもしくはＢのいずれかと組み合わせて、植物ゲノムに挿入された変異体のＮコーディング配列の（ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに対する）向きを確認した。ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ法を用い、ＴＳＷＬ−ＢＬＮ蛋白質に対するポリクローナル抗体を用いてトランスジェニック植物においてＮ蛋白質を検出した。ノーザン・ブロットによるトランスジェニック植物におけるＲＮＡ転写レベルを見積もるために、全植物ＲＮＡをナポリ(Ｎapoli)の方法に従って単離し［ザ・プラント・セル（the Ｐlant Ｃell）第２巻：２７９頁（１９９０年）参照］、ホルムアルデヒド含有アガロースゲルで分離した（１０μｇ/レーン）。次いで、該アガロースゲルをエチジウムブロミドで染色して各レーンの全植物ＲＮＡの均一性を確認した。ハイブリダイゼーションの条件は製造者によるジーン・スクリーン・プラス（ＧeneＳcreen Ｐlus）のプロトコールに記載されている通りである。得られたシグナルブロットを各ブロットに含まれる対照レーンのＮ遺伝子転写物バンド（高レベルのＮ遺伝子を産生するｍＮＲ１植物）に基づき比較し標準化した。１００および１５０の間の密度値（ヒューレット・スカンジェット・アンド・イメージ・アナリシス・プログラム（Ｈewlet ＳcanＪet and Ｉmage Ａnalysis Ｐrogram））を示したトランスジェニック植物は高い発現因子と見積もり、一方１５および５０の間の密度値を有するものは低い発現因子と見積もった。
【０１１１】
トスポウイルスでのトランスジェニック植物の接種は、特記する以外は前記したごとく行い、接種は３−４葉段階において行った。
タバコ・プロトプラストはＲ１植物由来の表面を殺菌した葉から調製した
[ツェット・プフランツェフィジオル（Ｚ.Ｐflanzanphysiol）第７８巻:４５３頁（１９９２年）に変更を加えたので、参照のこと］単離されたプロトプラスト（６×１０６プロトプラスト）をＰＥＧ法［プラント・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Ｐlant Ｍol.Ｂiol.）第８巻：３６３頁（１９８７年）参照］を用いて、ＯＤ２６０ｎｍ値０.６８の精製したＴＳＷＬ−ＢＬウイルス粒子抽出物で形質転換した。次いで、形質転換したプロトプラストを暗所にて２６℃で終密度１×１０６プロトプラスト/ｍl培養培地になるまで培養した。様々な間隔のインキュベーションの後で、培養したプロトプラストをＷ５溶液で２度洗浄しエンザイム結合緩衝液中、浸透圧のショックにより溶解させた。ウイルスの増殖（複製）はＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ法を用いてウイルスのＮ蛋白質を測定することによって見積もった。
【０１１２】
記載したごとく、本発明の一の態様は、全く検出できないか僅かしか検出できない量のＮ蛋白質を生産するトランスジェニック・タバコは同種または近縁の単離株に対し抵抗性であることを示す。この結果は、観察された抵抗性が、入ってきたウイルスＮ遺伝子と、トランスジェニック植物で産生されたＮ遺伝子転写物またはＮコーディング配列それ自体のいずれかのトランス相互作用によるものであることを示唆する。核Ｎ遺伝子の存在が役割を果たすかどうかを試験するために、２つのＰ０Ｎ系からのトランスジェニックＰ０Ｎ  Ｒ０系およびＲ１植物を４種のトスポウイルス（ＴＳＷＶ−ＢＬ、ＴＳＷＶ−１０Ｗ、ＩＮＳＶ−ＢｅｇおよびＴＳＷＶ−Ｂ）で攻撃した。無病徴性の植物は抵抗性と評価されたのに対し、何らかの病候を示す植物は感受性であると評価した。全ての接種したＲ０およびＲ１植物はウイルスに感受性であった。
【０１１３】
さらにＮトランス遺伝子（transgene）の転写物が保護に関与する可能性を試験するために、センスまたはアンチセンスＮ遺伝子転写物いずれかを産生するが、Ｎ蛋白質は産生しない多数のＲ０トランスジェニック植物に同種単離株で接種した。結果を以下の表に示す：
【０１１４】
【表２】
2006006338.tif 000013
【０１１５】
接種後７ないし９日で典型的な全身的病徴を示す対照とは異なり、２１のｍＮ植物のうち１６、および８のａｓＮのうち５のがそのライフサイクルの間中ずっと無病徴であった。接種前に採取された葉の組織のノーザンブロット分析は、全ての抵抗性Ｒ０系が低レベルのセンスまたはアンチセンスのＮ遺伝子ＲＮＡを産生するが、一方感受性Ｒ０系はＲＮＡ種を産生しないかまたは高レベルで産生する。このデータは、トランスジェニック植物のＴＳＷＶ−ＢＬに対する抵抗性はＮ遺伝子転写物のその相対的なレベルに関連していることを示唆したので、高いまたは低いＮ遺伝子転写レベルの４種のｍＮおよび３種のａｓＮ  Ｒ０系からのトランスジェニックの子孫をカナマイシン含有培地上で発芽させることによって選択した。これらのトランスジェニック植物は、２種のａｓＮ系からのいくつかのＲ１植物は６ないし７葉段階で接種した以外は、３ないし４葉段階において４種のトスポウイルスに対する抵抗性を試験した。結果を以下の表にまとめる：
【０１１６】
【表３】
2006006338.tif 000014
【０１１７】
高い発現因子系ｍＮ−２およびｍＮ−７からの全てのＲ１植物は試験した全てのトスポウイルスによる感染に対して感受性であり、これらの植物は対照と比較して病徴の遅延を示さなかった。対照的に、低い発現因子系ｍＮ−１３および−１８からのＲ１植物の高い割合のものが同種（ＴＳＷＶ−ＢＬ）および近縁（ＴＳＷＶ−１０Ｗ）単離株に対して抵抗性であったが、遠縁トスポウイルス（ＩＮＳＶ−ＢｅｇおよびＴＳＷＶ−Ｂ）による感染に対しては抵抗性がない。低い発現因子のＲ０系からのａｓＮ  Ｒ１植物の抵抗性は接種に用いたＴＳＷＶ単離株によって顕著に影響された。低い発現因子系ａｓＮ-１および-９からの小さいＲ１植物(３-４葉段階)の１つを除いて全てが感染したが、同種ＴＳＷＶ−ＢＬまたは近縁ＴＳＷＶ−１０Ｗの単離株を接種した場合は病徴の出現の遅延があった。対照的に、系ａｓＮ−９からの大きいＲ１植物（６−７葉段階）のほとんどが両方の単離株に対して抵抗性であった。比較すると、対照Ｒ１植物およびａｓＮ−４のごとき高発現因子系からのＲ１植物は、植物の大きさによらずいずれの単離株に対しても抵抗性を示さなかった。アンチセンスＲＮＡ媒介される保護は遠縁のＩＮＳＶ−ＢｅｇおよびＴＳＷＶ−Ｂ単離株による感染に対して有効ではなかった。
【０１１８】
上記の２つの表に示されたデータの分析によって、センスおよびアンチセンスのＲＮＡ−媒介保護はＮ遺伝子の低い発現因子においてのみ観察されることが示された。高レベルのアンチセンスＮ遺伝子転写物を産生するＲ１ ａｓＮ植物は対照の植物と同程度に感受性があった。対照的に、ａｓＮの低い発現因子は、３−４葉段階で接種した場合は病徴の出現に遅延を示し、６−７葉段階で接種した場合はレベルの増加を示した。
【０１１９】
翻訳不可能Ｎコーディング配列のセンスまたはアンチセンス型を発現しているタバコ・プロトプラストのウイルス複製の阻害も認められた。この場合には、ＴＳＷＶ−ＢＬの全ウイルス粒子調製物を、トランスジェニック系から単離したプロトプラストをトランスフェクトするのに用いて、入って来るウイルスの複製に与えるセンスまたはアンチセンスのＮ遺伝子転写物の影響を調べた。ウイルス複製を、トランスフェクトしたプロトプラストに入って来るウイルスのＮ蛋白質のレベルを測定することによって決定し、高レベルの各ＲＮＡ転写物を産する植物（ｍＮ−７およびａｓＮ−４）からのプロトプラストはウイルスの複製を支持し、一方ｍＮの低い発現因子（ｍＮ−１８）からのプロトプラストは支持しないことが判明した。ａｓＮの低い発現因子（ａｓＮ−９）からのプロトプラストははるかに低いレベルのウイルス複製を支持した。
【０１２０】
従って、本発明の本態様において、本発明者らは、翻訳不可能Ｎ遺伝子コーディング配列のセンスまたはアンチセンス型を発現するトランスジェニック植物は、同種（ＴＳＷＶ−ＢＬ）または近縁（ＴＳＷＶ−１０Ｗ）トスポウイルスには抵抗性であるが、遠縁の（ＩＮＳＶ−ＢｅｇまたはＴＳＷＶ−Ｂ）トスポウイルスには抵抗性でないことを示した。以下の表は、様々な形態のＴＳＷＶ-ＢＬ  Ｎ遺伝子を発現するトランスジェニック・タバコ間のトスポウイルスに対する抵抗性の比較を示す：
【０１２１】
【表４】
2006006338.tif 000015
【０１２２】
これらの結果により、ＴＳＷＶでのＲＮＡ媒介保護のための本発明の前に述べた態様が確認され、拡大される。さらに、該保護は高レベルのＮ遺伝子転写物を生産する植物においてよりも、低レベルのＮ遺伝子転写物を生産する植物において観察され、本明細書中で報告する初期の研究は、高レベルのＴＳＷＶ−ＢＬ  Ｎ蛋白質を産生するタバコ植物がＩＮＳＶ−Ｂｅｇに対する抵抗を呈することを示すにも拘わらず、この付加的なデータは、ＩＮＳＶ−Ｂｅｇに対する抵抗性がセンスおよびアンチセンス型の翻訳不能Ｎ遺伝子を発現するトランスジェニック植物では観察されないことを示すので、かくしてＩＮＳＶ−ＢＥＧに対する保護はＮ蛋白質の存在によるものであって、Ｎ遺伝子転写物によるものではないことを明白に示唆することを示す。従って、２の異なる機構が、本発明によるＴＳＷＶおよびＩＮＳＶトスポウイルスに対する保護に関与しているように思われる。一の機構はＮ遺伝子転写物を含み（ＲＮＡ−媒介）、もう一個はＮ蛋白質を含む（蛋白質媒介）。加えて、プロトプラスト実験の結果は、Ｎ遺伝子のＲＮＡ−媒介保護は、ウイルス複製を阻害する過程を通じて達成されることと、上記の表に含まれるデータは、遠縁のＩＮＳＶ−Ｂｅｇ単離株に対する保護はＴＳＷＶ−ＢＩのＮ蛋白質によって授与されるのであって、遺伝子転写物によって授与されるのではないことを示唆する。
【０１２３】
最後に、本発明のもう一個の態様−すなわちトスポウイルス核蛋白質遺伝子の一部はトスポウイルスによる感染に対するトランスジェニック植物の保護を提供するためにさらに研究を行った。Ｎ遺伝子ＲＮＡは同種および近縁ＴＳＷＶ単離株に対して保護し、一方で、Ｎ蛋白質は同種単離株および遠縁のＩＮＳＶ単離株に対し保護すること；Ｎ遺伝子のＲＮＥ媒介保護は、Ｎ遺伝子を低いレベルで発現している植物で有効であるが、一方Ｎ蛋白質媒介保護はＮ蛋白質の高いレベルの蓄積を要すること；およびＮ遺伝子のＲＮＡ媒介保護は、ウイルス複製の阻害を通じて達成されることは上記ですでに示した。この以前のデータに基づき、本発明者らは次に、Ｎ遺伝子の一部がウイルスによる感染に対して働くかどうかを決定することに着手した。本発明らは、下記に議論するように、Ｎ遺伝子配列の約半分を発現しているトランスジェニック植物はウイルスに対して抵抗性であることを見い出した。
【０１２４】
以下に、本発明のこの最後の態様を示すためにＴＳＷＶ−ＢＬの半分のＮ遺伝子断片のクローニングを記載する。翻訳可能なまたは翻訳不可能なＮ遺伝子の両方の、第一および第二の半分を、上記に記載したように逆転写、および次いでのＰＣＲによって作成した。図８に示すように、翻訳不可能なＮ遺伝子断片の半分の５’末端でのヌクレオチドの欠失または挿入はダッシュの記号によって示し;ＡＴＧコドンは下線を施し、翻訳不可能なＮ遺伝子の半分の断片の開始コドンのすぐ後にある可能な終止コドンは太字で示す。
【０１２５】
Ｎ遺伝子の第一の半分はオリゴプライマーｉ（５'−ＴＡＣＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＴＡＡＧＧＴＡＡＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＴＧＡＣ）（これはＴＳＷＶ−ＢＬＮ遺伝子の中央領域に相補的）および翻訳可能な第一の半分のＮ遺伝子断片用のｉｉ（５'−ＡＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＴＡＡＧＣＴＣＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴＧＴＴＧＣ）、もしくはiii翻訳不可能なの第一の半分のＮ遺伝子断片のための（５'−ＡＧＣＴＡＡＴＣＴＡＧＡＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＴＣＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴＧＴＴＧＣ）を用いてＲＴ−ＰＣＲによって生産され、後の方の２つのオリゴマープライマーはＮ遺伝子の５'末端と同一である。同様に、Ｎ遺伝子の第二の半分は、オリゴマープライマーｉｖ（５'−ＡＧＣＡＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＴＡＡＣＡＣＡＣＴＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣ）（これはＴＳＷＶ−ＢＬＮ遺伝子の３'非コード領域に相補的）および翻訳可能な半分のＮ遺伝子断片のためのｖ（５'−ＴＡＣＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＣＡＡＡＧＴＣＴＧＴＧＡＧＧ）、または翻訳不可能な半分のＮ遺伝子断片のためのｖｉ（５'−ＡＧＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＴＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＴＣＴＧＴＧＡＧＧＣＴＴＧＣ）を用いてＲＴ−ＰＣＲによって生産し、後の方の２個のオリゴマープライマーはＮ遺伝子の中央領域と同一である。オリゴマープライマーiiiは翻訳コドンのすぐ後にフレームシフト変異および、可能な翻訳のリードスルーを阻害するためのいくつかのインフレームの終止コドンを含む。
【０１２６】
半分の遺伝子断片を上記のごとく１.２％アガロースゲルで精製し、ゲルで単離した断片を制限酵素ＮcoＩで消化し、ＮcoＩ消化した植物発現ベクターｐＢＩ５２５にクローンした。得られたプラスミドを同定し、（１）第一の半分の翻訳可能なＮ遺伝子を含むｐＢＩ５２５−１Ｎ、（２）第一の半分の翻訳不可能なＮ遺伝子を含むｐＢＩ５２５−１Ｎ'、（３）アンチセンスの向きで第一の半分の翻訳可能なＮ遺伝子を含むｐＢＩ５２５−１Ｎ−、（４）第二の半分の翻訳可能なＮ遺伝子を含むｐＢＩ５２５−２Ｎ、（５）第二の半分の翻訳不可能なＮ遺伝子を含むｐＢＩ５２５−２ｎ'、（６）アンチセンス向きでの第二の半分の翻訳可能なＮ遺伝子を含むｐＢＩ５２５−２Ｎ−と命名した。次いで、発現カセットをＨindＩＩＩ/ＥcoＲＩで消化することによってプラスミドｐＢＩ５２５から切り出し、上記のごとく、同じ酵素ですでに切断した植物形質転換ベクターpＢＩＮ１９に連結した。プラスミドｐＢＩＮ１９と同様得られたベクターを、ホルスターズ（Ｈolsters）（前掲）によって記載された方法を用いてエイ・チュメファシエンス（Ａ.tumefaciens)に移入した。エヌ・ベンサミアーナ（Ｎ.benthamiana）のリーフディスクに、様々な構築物を含むエイ・チュメファシエンスのＬＢ４４０４株を接種した。トランスジェニック植物を自家授粉させ、種子を上記のごとくカナマイシン上で発芽させた。
【０１２７】
ＰＣＲおよびノーザンハイブリダイゼーションＰＣＲによるトランスジェニック植物の分析を、以前記載されたごとく各Ｒ０トランスジェニック系において行った。オリゴマープライマーｉないしｖｉを、ＴＸＷＶ−ＢＬのＮコーディング配列の存在を決定するために用いた。オリゴマープライマー３５Ｓ−プロモーター（実施例ＶＩＩＩ照）を上記のオリゴマープライマーの一つと組み合わせて、植物ゲノムに挿入された半分の遺伝子配列の向き（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに対する）を確かめた。ノーザン分析は、実施例VIIIに記載されるごとくに行った。
【０１２８】
ＴＳＷＶ（ＴＳＷＶ−ＢＬ）のレタス単離株を用いてトランスジェニック植物を攻撃した。上記のごとく３−４葉段階のテスト植物を用いて接種した。逃避の可能性を防ぐために、対照の植物を各実験において用い、各接種抽出物を用いてが、まず第一にトランスジェニック植物、次いで対照植物に接種した。
【０１２９】
本発明の本態様におけるさまざまな構築物を図８に示す。翻訳可能および翻訳不可能な半分のＮ遺伝子断片をＲＴ−ＰＣＲにより合成し、次いで植物発現ベクターｐＢＩ５２５に直接クローンした。ＲＴ−ＰＣＲによる翻訳不可能な半分のＮ遺伝子断片の産生のために用いたオリゴマープライマーiiiおよびviは、翻訳開始コドンのすぐ後に変異を有し、得られたリーディングフレームは可能な翻訳のリードスルーを阻害するためのいくつかの終止コドンを含む。従って、第一および第二の半分の翻訳不可能なＮ遺伝子断片は共に、植物に導入された際に、端を切り取ったＮ蛋白質断片を産生するのは不可能であるに違いない。次いで、翻訳可能なおよび翻訳不可能な半分のＮ遺伝子断片を共にセンスまたはアンチセンスの向きでベクターｐＢＩ５２５のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流に入れた。ＴＳＷＶ−ＢＬの半分のＮコーディング配列の発現は、従って、発現ベクターｐＢＩ５２５のアルファルファモザイクウイルス(ＡＬＭＶ)の翻訳されないリーダー配列に融合した二重のＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターによって制御された。積み重ねられた二重のＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを用いる発現ベクターは、一個の３５Ｓプロモーター配列を有する類似のベクターよりも高レベルのｍＲＮＡ転写を起こすことが公知である。発現カセットをベクターｐＢＩ５２５からパント(pant)形質転換ベクターｐＢＩＮ１９に移入した。対照のプラスミドｐＢＩＮ１９と同様に、得られたプラスミドを次いでエイ・チュメファシエンスＬＢ４４０４株に移入した。トランスジェニック植物を図８に示すトランスジェニック系の命名と共に得た。
【０１３０】
全てのカナマイシン抵抗性トランスジェニック系はＰＣＲによって、期待される向きで適切なＮコーディング配列を含むことを確認した。種子用に成育させた各トランスジェニックＲ０系をノーザンブロットにより分析した。６つの１Ｎのうち６、６つの１Ｎ'のうち４、６つの１Ｎ−のうち６、６つの２Ｎのうち６、８つの２Ｎ'のうち７、および ７つの２Ｎ−トランスジェニックＲ０のうち６は、半分のＮ遺伝子ＲＮＡを産生することが判明した。 
【０１３１】
トランスジェニックＲ０植物の一組を同種単離株ＴＳＷＶ−ＢＬで攻撃した。無病徴の植物を抵抗性である評価し、一方でなんらかの病徴（局部の障害または全身的な感染）を示した植物を感受性であると評価した。全ての接種されたＲ０対照植物はウイルスに感受性であった；対照的に、９つの１Ｎ'のうち２、６つの１Ｎ−のうち２、１０つの２Ｎ’のうち４、および８つの２Ｎ−Ｒ０系のうち一つがウイルス感染に完全に抵抗性であった。１Ｎおよび２Ｎ  Ｒ０系のどちらとも高レベルの抵抗性を示したが、これらの植物のいくらかは病徴の出現に顕著な遅延を示した。
【０１３２】
トランスジェニックＲ０系のもう一組を種子の産生のために成熟させた。実生はカナマイシン含有培地で発芽させ、ＴＳＷＶ−ＢＬを接種した。以下の表に示すように、対照の実生およびいくつかのトランスジェニック系からの実生は単離株に感受性であるのに対し、１Ｎ-１５１、１Ｎ'-１２３、および２Ｎ'-１３４系からの実生は、病徴の発現の遅延から完全な抵抗性まで変化するさまざまなレベルの保護を示した。
【０１３３】
感染させた植物の数／接種した植物の数
Ｒ０系               ６ＤＰＩ      １５ＤＰＩ       ３０ＤＰＩ        
対照                 ５０／５０
１Ｎ −１４９        １７／１７
１Ｎ −１５１          ２／２０    １３／２０      １７／２０
１Ｎ'−１２３        １６／２０    １７／２０      １７／２０
１Ｎ'−１２４        ２０／２０
１Ｎ'−１２６        １９／１９
１Ｎ−−１３０       １２／１５    １５／１５
１Ｎ−−１３２       １８／１９    １９／１９
２Ｎ −１５５        ２０／２０
２Ｎ'−１３４          ０／２０    １０／２０      １０／２０
２Ｎ'−１３５        １９／１９
２Ｎ−−１４２       ２０／２０
２Ｎ−−１４３       ２０／２０
上記の表において、感染したエヌ・ベンサミアーナ（Ｎ.benthamiana)からの
３０倍希釈の抽出物を、３−４葉段階のトランスジェニック植物、次いで対照トランスジェニック植物に接種するのに用いた。ＤＰＩ＝接種後の日数
【０１３４】
要約として、本発明の本態様は、翻訳可能なまたは翻訳不可能なＮ遺伝子断片の第一のまたは第二のいずれかの半分を発現しているトランスジェニック植物は、同種ＴＳＷＶ−ＢＬ単離株に高度に抵抗性であることを示す。この結果は、Ｎ遺伝子の一部だけでウイルスに対する抵抗性に十分であることを示す。
【０１３５】
本発明の上記記載のすべての核酸およびアミノ酸配列のリストは以下の通りである：
【０１３６】
2006006338.tif 000016
2006006338.tif 000017
2006006338.tif 000018
2006006338.tif 000019
2006006338.tif 000020
2006006338.tif 000021
2006006338.tif 000022
2006006338.tif 000023
2006006338.tif 000024
2006006338.tif 000025
2006006338.tif 000026
2006006338.tif 000027
2006006338.tif 000028
2006006338.tif 000029
2006006338.tif 000030
2006006338.tif 000031
2006006338.tif 000032
2006006338.tif 000033
2006006338.tif 000034
2006006338.tif 000035
2006006338.tif 000036
【０１３７】
従って、本発明者らは本発明の好ましい具体例を例示し記載したが、本発明の変化および修飾が可能であることが理解されるべきであり、本発明者らはそれゆえ発表された正確な用語を限定することを望むのではなく本発明に様々な用途および状態を付与するためになされる変化および交替を我々に役立たせることを望むものである。このような変化および修飾は、例えば、構造的に類似した核酸配列の置換を含むであろうが、ここにおいて、示される配列および変化した配列間の相違は、もしその変化した配列、即ち、上記記載のものと実質的に類似の結果をうむ配列にほとんど利点をもたらさない。従って、具体的に上記したそれらの配列の機能を実質的に変更することはない塩基（塩基配列中の）またはアミノ酸（ペプチド配列中の）の置換、欠失、挿入あるいは付加は本発明の態様の中に含まれると思われる。加えて、本発明が、本発明に従い植物へのトスポウイルスの感染に対する耐性または免疫を供給する様々な単離株のＮ遺伝子を一個のカセットにつなぐように修飾されること、およびトスポウイルスに対する広い抵抗性、特にＴＳＷＶ−ＢＬ、ＴＳＷＶ−ＢおよびＩＮＳＶに対する抵抗性を供給するためのトランス遺伝子（transgene)としてこのカセットを用いることは本発明者らの努力である。従って、このような変化および交替は本発明と等価である十分な範囲内で適切に意図され、以下の請求の範囲内にある。
その分野、またはそれが最も密接に関連した分野に属するいかなる当業者にも、同じ事をさせ使用させることができるように、十分で、明瞭で、完結で、正確な術語を用いて、本発明およびそこにおいてなされた方法および過程を記載した；
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１は、本発明によるウイルスＲＮＡからＮＰ遺伝子をクローニングするための戦略を示す図である。
【図２】図２は、タバコ・プロトプラストにおける本発明によるトマト黄化壊疽病ウイルスのヌクレオキャプシド蛋白質(ＮＰ)遺伝子のイン・ビボ(in vivo)経時的発現を示す図である。
【図３】図３は、本発明によるＴＳＷＶ-Ｂ Ｓ ＲＮＡにおける、配列決定したｃＤＮＡクローンの位置を示す図である。
【図４】図４は、本発明によるＴＳＷＶ単離株の中での関係を示す樹系図である。
【図５】図５は、本明細書に記載したＴＳＷＶ単離株の血清学的な関係を示す図である。
【図６】図６は、トランスジェニック植物におけるヌクレオキャプシド蛋白質(ＮＰ)の蓄積のレベルとＴＳＷＶ単離株に対する抵抗性の度合との相関を示す図である。
【図７】図７は、本発明の１つの態様によりトランスジェニック植物に導入したＴＳＷＶ-ＢＬ Ｎ暗号配列を示す図である。
【図８】図８は、本発明の１つの態様によりトランスジェニック植物に導入したＴＳＷＶ-ＢＬの半分のＮ遺伝子断片を示す図である。
【図１】
2006006338.tif 000037
【図２】
2006006338.tif 000038
【図３】
2006006338.tif 000039
【図４】
2006006338.tif 000040
【図５】
2006006338.tif 000041
【図６】
2006006338.tif 000042
【図７】
2006006338.tif 000043
【図８】
2006006338.tif 000044